MX2013000324A - Tratamiento del sindrome de sanfilippo tipo b. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos y composiciones para tratar síndrome de Sanfilippo tipo B (Sanfilippo B) por ejemplo, por administración intratecal (IT) de una proteína Naglu; una proteína Naglu adecuada puede ser una proteína recombinante, activada por gen o natural, en algunas modalidades, una proteína Naglu adecuada es una proteína Naglu recombinante; en algunas modalidades, una proteína Naglu recombinante es una proteína de fusión que contiene un dominio Naglu y una porción de objetivo lisosomal; en algunas modalidades, el dominio de objetivo lisosomal es una porción IGF-ll.

Description

TRATAMIENTO DEL SÍNDROME DE SANFILIPPO TIPO B REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad a las Solicitudes de Patente Provisionales Estadounidenses números de serie 61/358,857 presentada en Junio 25 de 2010; 61/360,786, presentada en Julio 1 de 2010; 61/387,862, presentada en Septiembre 29 de 2010; 61/435,710, presentada en Enero 24 de 201 1; 61/442,1 15, presentada en Febrero 1 1 de 2011 ; 61/476,210, presentada en Abril 15 de 201 1 ; y 61/495,268 presentada en Junio 9 de 2011 ; la totalidad de cada una de la cual se incorpora en la presente por referencia.

Esta solicitud se refiere a las solicitudes Estadounidenses tituladas "CNS Delivery of Therapeutic Agents", presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of Heparan N-Sulfatasa," presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of ß-Galactocerebrosidase," presentada en la misma fecha; "Methods and Compositions for CNS Delivery of Arylsulfatase A", presentada en la misma fecha; "Treatment of Sanfilippo Syndrome Type B," presentada en la misma fecha; la totalidad de cada una de las cuales está de este modo incorporada en por referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia de reemplazo de enzima (ERT) involucra la administración sistémica de proteínas naturales o recombinantemente derivadas y/o enzimas a un sujeto. Las terapias aprobadas son típicamente administradas a sujetos intravenosamente y son en general efectivas en el tratamiento de los síntomas somáticos de la deficiencia de enzima subyacente. Como un resultado de la distribución limitada de la proteina intravenosamente administrada y/o enzima en las células y tejidos del sistema nervioso central (CNS), el tratamiento de enfermedades que tienen una etiología del CNS ha sido especialmente estimulante debido a que las proteínas y/o enzimas intravenosamente administradas no cruzan adecuadamente la barrera hematoencefálica (BBB).

La barrera hematoencefálica (BBB) es un sistema estructural comprendido de células endoteliales que funciona para proteger el sistema nervioso central (CNS) de sustancias deletéreas en la corriente sanguínea, tales como bacterias, macromoléculas (por ejemplo, proteínas) y otras moléculas hidrofilicas, limitando la difusión de tales sustancias a través de la BBB y en el fluido cerebroespinal subyacente (CSF) y CNS.

Existen varias formas para eludir la BBB para mejorar el suministro cerebral de un agente terapéutico que incluye inyección intracraneal directa, permeabilización temporal de la BBB, y modificación del agente activo para alterar la distribución del tejido. La inyección directa de un agente terapéutico en el tejido cerebral deriva la complejidad de la vasculatura, pero sufre principalmente del riesgo de complicaciones (infección, daño al tejido, sensibilidad inmune) incurrida por inyecciones intra-craneales y pobre difusión del agente activo a partir del sitio de administración. A la fecha, la administración directa de proteínas en la sustancia cerebral no ha logrado efecto terapéutico significante debido a las barreras de difusión y al volumen limitado de terapéutico que puede ser administrado. La difusión asistida por convección se ha estudiado vía catéteres colocados en el parénquima cerebral usando infusiones a largo plazo, lentas (Bobo, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A 91 , 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), pero no terapias aprobadas usando actualmente este procedimiento para terapia a largo plazo. Además, la colocación de catéteres intracerebrales es muy invasiva y menos deseable como una alternativa clínica.

La inyección intratecal (IT), o la administración de proteínas al fluido cerebroespinal (CSF) también se ha intentado pero aún no ha sido proporcionado éxito terapéutico. Un desafío principal en este tratamiento ha sido la tendencia del agente activo para unir el revestimiento ependimal del ventrículo muy herméticamente el cual previene la subsecuente difusión. Actualmente, no existen productos aprobados para el tratamiento de enfermedades genéticas cerebrales por administración directamente al CSF.

En efecto, muchos creen que la barrera a la difusión en la superficie cerebral, así como también la carencia de métodos de suministro efectivos y convenientes, fueron también demasiado un obstáculo para lograr efecto terapéutico adecuado en el cerebro para cualquier enfermedad.

El síndrome de Sanfilippo, o mucopolisacaridosis III (MPS III), es un trastorno genético raro caracterizado por la deficiencia de enzimas involucradas en la degradación de glicosaminoglicanos (GAG). En la ausencia de la enzima, las moléculas GAG parcialmente degradadas no se pueden se parar del cuerpo y acumularse en lisosomas de varios tejidos, resultando en el progreso de la disfunción somática expandida (Neufeld y Muenzer, 2001).

Se han identificado cuatro formas distintas de MPS III, designadas MPS MIA, B, C y D. Cada una representa una deficiencia en una de las cuatro enzimas involucradas en la degradación del heparan sulfato de GAG. Todas las formas incluyen grados variantes de los mismos síntomas clínicos, que incluyen características faciales gruesas, hepatoesplenomegalia, opacidad corneal y deformidades esqueléticas. Más notablemente, sin embargo, es la pérdida severa y progresiva de la capacidad cognitiva, la cual está ligada no solamente a la acumulación de heparan sulfato en neuronas, sino también a la elevación subsecuente de los gangliósidos GM2, GM3 y GD2 causados por acumulación primaria de GAG (Walkley 1998).

La mucopolisacaridosis tipo III (MPS IIIB; enfermedad de Sanfilippo B) es un trastorno recesivo autosomal que está caracterizado por una deficiencia de la enzima alfa-N-acetil-glucosaminídasa (Naglu). En la ausencia de esta enzima, la heparan sulfato de GAG se acumula en los lisosomas de neuronas y células gliales, con acumulación reducida fuera del cerebro. A la fecha, ningún síntoma del CNS resultante de la enfermedad de Sanfilippo B ha sido exitosamente tratado por algunos medios disponibles.

De este modo, permanece una mayor necesidad para suministrar efectivamente agentes terapéuticos al cerebro. Más particularmente, existe una mayor necesidad para suministro más efectivo de agentes terapéuticos al sistema nervioso central para el tratamiento de la enfermedad de Sanfilippo B.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos para el tratamiento efectivo de la enfermedad de Sanfilippo B. La presente invención es, en parte, basada en el descubrimiento que la administración ¡ntratecal de una proteina alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu) (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu-IGFII) a un modelo de animal es inesperadamente efectiva en el tratamiento (por ejemplo, aliviar, inhibir o retardar el comienzo de) varios síntomas de la enfermedad de Sanfilippo B, que incluyen acumulación masiva de GAG en varios tejidos cerebrales.

Previo a la presente invención, se reportó que una proteína Naglu producida recombinantemente carece de manosa-6-fosfato (M6P) la cual es típicamente requerida para objetivo lisosomal. Por lo tanto, la terapia de reemplazo de enzima para la enfermedad de Sanfilippo B presenta un reto único debido a la manifestación predominante en el CNS y la carencia de residuos M6P. Como se discute abajo, los presentes inventores han demostrado que inyecciones intratecales de Naglu-IGFII han resultado en reducción sorprendentemente efectiva de acumulación de GAG en el cerebro, inversión del almacenaje lisosomal en el tejido cerebral, y penetración de Naglu-IGFII en el parénquima cerebral. Sin desear ser ligado por cualquier teoría particular, se contempla que una porción de objetivo lisosomal tal como una porción IGF-II puede superar la carencia de manosa-6-fosfato (M6P), resultando en objetivo lisosomal dependiente de M6P en tejidos objetivo. Estos resultados indican que la administración IT de una proteína Naglu, tal como, una proteina de fusión Naglu-IGFII, puede ser usada efectivamente para tratar la enfermedad de Sanfilippo B. De este modo, la presente invención representa un rompimiento significante en la terapia de reemplazo de la enzima de Sanfilippo B.

Aunque la administración IT se describe en los Ejemplos abajo, se contempla que una proteina de fusión Naglu de conformidad con la presente invención suministrada al CNS directamente o indirectamente vía varias técnicas y rutas incluyen, pero no se limitan a, administraciones intraparenquimales, intracerebrales, intraventricular cerebral (ICV), intratecal (por ejemplo, IT-lumbar, IT-cisterna magna) y cualquiera otras técnicas y rutas para inyección directamente o indirectamente al CNS y/o CSF.

En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar enfermedad de Síndrome de Sanfilippo tipo B (San B) que incluye una etapa de administrar intratecalmente a un sujeto en necesidad de tratamiento una proteína alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu). Como se usa en la presente, una proteína Naglu adecuada puede ser una proteína sintética, recombinante, activada por gen o natural.

En algunas modalidades, una proteina Naglu adecuada es una proteína Naglu recombinante. En algunas modalidades, la proteína Naglu recombinante es una proteína de fusión que comprende un dominio Naglu y una porción de objetivo lisosomal. En ciertas modalidades, el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido al menos 70% (por ejemplo, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 98%) idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteína Naglu humana madura). En algunas modalidades, el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteína Naglu humana madura). En algunas modalidades, el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteína Naglu humana madura).

En algunas modalidades, la porción de objetivo lisosomal es una porción IGF-II. En ciertas modalidades, la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido al menos 70% (por ejemplo, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 98%) idéntica a la IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3). En ciertas modalidades, la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica a la IGF-II humana (SEQ ID NO: 3). En ciertas modalidades, la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica a la IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3). En algunas modalidades, la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido que incluye los residuos 8-67 de IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3).

En algunas modalidades, la proteína de fusión además comprende un enlazador entre el dominio Naglu y la porción de objetivo lisosomal. En ciertas modalidades, el enlazador comprende una o más secuencias de aminoácido de GGGGGAAAAGGGG (SEQ ID NO: 4). En ciertas modalidades, la secuencia de aminoácido de GGGGGAAAAGGGG (SEQ ID NO: 4) está presente en repeticiones en serie.

En algunas modalidades, el enlazador además comprende una o más secuencias GAP. En ciertas modalidades, el enlazador comprende una secuencia de aminoácido de GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGG GGAP (SEQ ID NO: 5).

En algunas modalidades, la porción de objetivo lisosomal se fusiona directamente o vía el enlazador al C-término del dominio Naglu. En algunas modalidades, la porción de objetivo lisosomal se fusiona directamente o vía el enlazador al N-término del dominio Naglu.

En algunas modalidades, la proteína recombinante se produce de células humanas. En algunas modalidades, la proteína recombinante se produce de células CHO.

En algunas modalidades, la administración intratecal resulta en suministro de la proteína Naglu en uno o más tejidos cerebrales objetivo. En ciertas modalidades, uno o más tejidos cerebrales son seleccionados del grupo que consiste de tejidos de la materia gris, materia blanca, áreas periventriculares, pia-aracnoide, meninges, neocorteza, cerebelo, tejidos profundos en la corteza cerebral, capa molecular, región caudada/putamen, cerebro medio, regiones profundas de las protuberancias o médula, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, la proteína Naglu se suministra a neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meningeales. En algunas modalidades, la proteína Naglu es además suministrada a las neuronas en la médula espinal.

En algunas modalidades, la administración intratecal además resulta en suministro sistémico de la proteina Naglu en tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, los tejidos periféricos objetivos son seleccionados de hígado, riñon, bazo y/o corazón.

En algunas modalidades, la administración intratecal resulta en localización lisosomal en tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos.

En algunas modalidades, la administración intratecal resulta en reducción de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, sustrato de enzima acumulada) en el tejido cerebral objetivo, neuronas de la médula espinal y/o tejidos objetivo periféricos. En ciertas modalidades, el almacenaje lisosomal se determina por teñido LAMP-1. En algunas modalidades, el almacenamiento lisosomal se reduce por al menos 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1-vez, 1.5-veces, ó 2-veces comparada con un control.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en vacuolización reducida en neuronas. En algunas modalidades, las neuronas comprenden células Purkinje.

En algunas modalidades, la administración intratecal resulta en actividad enzimática Naglu incrementada en los tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, la actividad enzimática Naglu se incrementa por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control (por ejemplo, la actividad enzimática endógena de pre-tratamiento en el sujeto). En ciertas modalidades, la actividad enzimática Naglu incrementada es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg ó 600 nmol/hr/mg. Como se usa en la presente, nmol/hr/mg define la actividad específica de la enzima, la cual mide el sustrato de nmol hidrolizado por hora por mg de enzima.

En algunas modalidades, la actividad enzimática Naglu se incrementa en la región lumbar. En algunas modalidades, la actividad enzimática Naglu incrementada en la región lumbar es al menos aproximadamente 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, ó 10,000 nmol/hr/mg.

En algunas modalidades, la administración intratecal de la formulación resulta en intensidad reducida, severidad, o frecuencia, o comienzo retardado de al menos un síntoma o característica del Síndrome de Sanfilippo B. En algunas modalidades, al menos un síntoma o característica del Síndrome de Sanfilippo B es pérdida auditiva, desarrollo retardado del habla, deficiencias en habilidades motoras, hiperactividad, retraso mental, agresividad y/o alteraciones del sueño.

En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada dos semanas. En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada mes. En algunas modalidades, la administración intratecal toma lugar una vez cada dos meses. En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en conjunto con administración intravenosa. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada semana. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada dos semanas. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada mes. En algunas modalidades, la administración intravenosa no es más frecuente que una vez cada dos meses. En ciertas modalidades, la administración intravenosa es más frecuente que la administración mensualmente, tal como dos veces semanalmente, semanalmente, cada tercer semana, o dos veces mensualmente.

En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales se realizan en el mismo día. En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales no se realizan dentro de una cierta cantidad de tiempo de entre si, tal como no dentro de al menos 2 días, dentro de al menos 3 días, dentro de al menos 4 días, dentro de al menos 5 días, dentro de al menos 6 días, dentro de al menos 7 días, o dentro de al menos una semana. En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales se realizan en un esquema alterno, tal como administraciones alternadas semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente. En algunas modalidades, una administración intratecal reemplaza una administración intravenosa en un esquema de administración, tal como en un esquema de administración intravenosa semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente, cada tercera o cuarta o quinta administración en tal esquema puede ser reemplazada con una administración intratecal en lugar de una administración intravenosa.

En algunas modalidades, las administraciones intravenosas e intratecales se realizan secuencialmente, tal como realizar administraciones intravenosas primero (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más) seguido por administraciones intratecales (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por más de dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más). En algunas modalidades, administraciones intratecales son realizadas primero (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, mensualmente, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses dosificando por dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más) seguido por administraciones intravenosas (por ejemplo, semanalmente, cada tres semanas, dos veces mensualmente, o mensualmente dosificando por más de dos semanas, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses, o un año o más).

En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en ausencia de administración intravenosa.

En algunas modalidades, la administración intratecal se usa en ausencia de terapia inmunosupresora concurrente.

En algunas modalidades, la proteina de fusión Naglu se administra a una concentración mayor de aproximadamente 20 mg/ml.

En otro aspecto, la presente invención proporciona proteínas de fusión terapéuticas que incluyen un dominio Naglu; una porción de objetivo lisosomal, y en donde, una vez administrada, la proteína de fusión terapéutica se dirige a lisosomas y es terapéuticamente activa in vivo.

En algunas modalidades, el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido al menos 70% (por ejemplo, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 98%) idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteina Naglu humana madura). En algunas modalidades, el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteína Naglu humana madura). En algunas modalidades, la porción de objetivo lisosomal es una porción IGF-II. En algunas modalidades, la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido al menos 70% (por ejemplo, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 98%) idéntica a la IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3). En algunas modalidades, la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido que incluye residuos8-67 de la IGF-II humana madura (SEQ ID NO. 3).

En algunas modalidades, la proteína de fusión además comprende un enlazador entre el dominio Naglu y la porción de objetivo lisosomal. En algunas modalidades, el enlazador comprende una secuencia de aminoácido de GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGG GGAP (SEQ ID NO: 5).

En algunas modalidades, la proteina de objetivo lisosomal se fusiona directamente o vía el enlazador al C-término del domino Naglu. En algunas modalidades, En aún otro aspecto, la presente invención proporciona proteínas terapéuticas de fusión que incluyen una secuencia de aminoácido al menos 70% (por ejemplo al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ó 98%) idéntica a la SEQ ID NO: 6 (la proteína de fusión IGF-ll-Naglu de longitud completa), en donde, una vez administrada, la proteína de fusión terapéutica es dirigida a lisosomas y es terapéuticamente activa in vivo.

Como se usa en esta solicitud, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" son usados como equivalentes. Cualesquiera números usados en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente significan cubrir cualesquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por uno de habilidad ordinaria en la técnica relevante.

Otras características, objetos, y ventajas de la presente invención son aparentes en la descripción detallada que sigue. Se debe entender, sin embrago, que la descripción detallada, mientras indica modalidades de la presente invención, se da por medio de ilustración solamente, sin limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención llegarán a ser aparentes a aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras son para propósitos de ilustración solamente, no para limitación.

La Figura 1 ilustra un rhNaglu, Naglu-IGFII, Naglu-TAT y Naglu Kif ejemplar, y el resultado de la prueba de estudio de concepto (POC). (no.of aa/theori mw - número de aminoácido y peso molecular teórico).

La Figura 2 ilustra un PerT-Naglu y Naglu-ApoE ejemplar. Estas dos modificaciones de rhNaglu se produjeron para examinar el transporte de la enzima a través de BBB.

La Figura 3A ilustra una molécula IGFII ejemplar que muestra 8-67 (verde) secuencias de aminoácido como la secuencia de enlace al receptor IGF II (figura modificada de Hashimoto 1995, 20). La Figura 3B ilustra el receptor ejemplar de M6P/IGF II y sus 15 dominios. Los dominios 3 y 9 (verde) se unen a manosa-6-fosfato, mientras el dominio 5 se une al diéster manosa-6-fosfato. El dominio 1 1 (amarillo) se une a IGFII (figura modificada de Bohnsack 2009, 22).

La Figura 4 ilustra producción de onda ejemplar del clon de Naglu-IGFII 47dz2-15. La producción promedio de Naglu-IGFII fue 0.5 pcd (pictograma por millones de células por día). GH, recolección de crecimiento; H1 a H8; recolección 1-8.

La Figura 5 ilustra un análisis de manchado Western ejemplar de recolecciones de la producción de ondas en la Figura 2-5. Las lineas se normalizaron por el volumen del medio de cultivo.

La Figura 6 ilustra un análisis de manchado Western ejemplar de Naglu-IGFII antes y después de la desglicosilación con PNGase F. La banda dispersada antes de la digestión de PNGase F es la apariencia típica de proteínas lisosomales cuando se glicosinal. Después de la digestión de PNGase F, la banda de proteína llega a ser aguda y condensada, una apariencia consistente con aquella de una cadena de polipéptido uniforme. Los análisis con Naglu anti-humano y anticuerpo anti-IGFII confirman que solamente moléculas intactas de Naglu-IGFII se expresaron por el clon 47dz2-15. " -", indica recolección de material antes de la digestión de PNGaseF. "+", indica recolección de material después de la digestión PNGase F.

La Figura 7 ilustra un esquema de purificación ejemplar de Naglu-IGFII y el gel de SDS-PAGE ilustra la purificación en forma de etapas de Naglu-IGFII del medio acondicionado.

La Figura 8 ilustra cristales ejemplares de proteina Naglu-Kif.

La Figura 9 ilustra una estructura cristalina ejemplar de Naglu representada como un modelo de caricatura. Se indican tres dominios como Dominio I, Dominio II y Dominio III. Los glicanos se muestran como barras. Los residuos catalíticos son E316 y E446.

La Figura 10 ilustra una estructura trimérica ejemplar de Naglu. Los sitios activos de las tres moléculas están marcados.

La Figura 11 ilustra células de fibroblasto primario ejemplar a partir de humanos normales se usaron para estudio de internalización celular de rhNaglu y Naglu-IGFII. La absorción celular de rhNaglu fue mínima, mientras la absorción celular de Naglu-IGFII fue muy pronunciada. La curva de saturación de internalización de Naglu-IGFII indica una absorción mediada por el receptor. Esta absorción se inhibió por IGFII, pero no por manosa-6-fosfato.

La Figura 12 representa un estudio de microscopio confocal ejemplar usando una célula de fibroblasto del paciente con Sanfilippo (GM01426). Se observó la internalización extensiva de Naglu-IGFII, y co- localización de Naglu-IGFII con Lamp-1.

La Figura 13 ilustra actividad de Naglu en ratones tipo nativo (WT), Naglu-/- (KO) y Naglu+/- heterocigoto (Het). La deficiencia total de Naglu en Sanfilippo B se observó en cerebro, hígado, riñon y bazo.

La Figura 14 representa vistas superior y lateral del cerebro de ratón para indicar el sitio de inyección IC y el plano de seccionamiento para análisis histológicos. La gráfica media, una sección transversal de cerebro de ratón observada a amplitud 1x. El área cuadrada indica el campo para la imagen de microscopio 4x en la gráfica inferior. La gráfica inferior, imagen 4x de corte histológico. El Cuadro A indica el campo de imagen de microscopio 40x en la Figura 15 y la Figura 16.

La Figura 15 representa inmunohistoquímica ejemplar de la corteza cerebral en ratones con Sanfilippo B 7 días después de la inyección IC 40x. Tanto rhNaglu como Naglu-IGFII exhiben absorción celular extensiva en neuronas así como también en células gliales, y los patrones de absorción celular y distribución fueron muy similares entre las dos proteínas, (anticuerpo monoclonal Naglu anti-humano).

La Figura 16 representa inmunoteñido LAMP-1 ejemplar de la corteza cerebral a 40x. Comparando con el cerebro de ratón de tipo nativo, fue obvio el almacenamiento lisosomal incrementado en el cerebro de ratones con Sanfilippo B tratados con vehículo, como se demuestra por los trazos de inmunoteñido positivo de LAMP-1 incrementados. El cerebro de ratones con Sanfilippo B tratados con rhNalgu y Naglu-IGFII presenta una reducción de almacenamiento lisosomal que fue muy similar al ratón de wt.

La Figura 17A ilustra reducción dispersada de vacuolación celular en tejidos de la materia blanca de ratones deficientes en Naglu administrados IT con Naglu con relación a los mismos ratones deficientes de Naglu que fueron administrados al vehículo. La Figura 17B ilustra una reducción marcada en inmunoteñido de proteína 1 de membrana asociada lisosomal (LAMP1) en los tejidos de la materia blanca de ratones deficientes con Naglu intratecalmente administrados con Naglu con relación a los mismos ratones deficientes con Naglu que fueron administrados con un vehículo.

Las Figuras 18A-18B ilustran cuantitativamente y comparan la concentración de la laMP medida en la corteza cerebral, núcleo caudado y putamen (CP), tálamo (TH), cerebelo (CBL) y materia blanca (WM) de los ratones deficientes de Naglu los cuales fueron administrados con Naglu con relación a tanto los ratones de tipo nativo como deficientes con Naglu que fueron administrados con un vehículo. Las áreas positivas a LAMP en cada área del tejido cerebral analizada fueron además reducidas después de la administración intratecal de tres dosis de Naglu durante el curso de siete días (Figura 18A) con relación a dos dosis de Naglu durante el curso de dos semanas (Figura 18B).

La Figura 19 ilustra un diagrama anatómico sagital medio ejemplar del CNS humano que se usa como una referencia en esta figura, para demostrar el sitio de inyección IT en Rata canulada wt. La flecha azul indica la ubicación anatómica aproximada de inyección IT en la médula espinal, y la flecha roja indica la región de la corteza cerebral, donde los tejidos se tomaron para estudio inmunohistoquimico.

La Figura 20 ilustra actividad Naglu ejemplar en el cerebro después de la inyección IT. La actividad Naglu fue significantemente superior en el cerebro de ratas wt inyectadas con Naglu-TAT y Naglu-IGFII.

La Figura 21 representa inmunoteñido de Naglu ejemplar de la corteza cerebral de ratas canutadas wt tratadas con rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-kif y PerT-Naglu canuladas 24hr después de la inyección 20x. Naglu-IGFII fue la única proteína que exhibe distribución extensiva bien en el parénquima del cerebro. La absorción celular en las neuronas y células gliales también fueron evidentes en ratas tratadas con Naglu-IGFII. Por otro lado, en grupos tratados con rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu kif y PerT-Naglu, la proteína solamente permanece en las meninges (M).

La Figura 22 representa amplificación de alta potencia ejemplar de los cortes seleccionados de la Figura 21. Panel superior, en la rata canulada wt tratada con rhNaglu, la rhNaglu permanece en las meninges (M) solamente, no se encontró teñido positivo en el parénquima del cerebro. Panel inferior, en ratas canuladas wt tratadas con Naglu-IGFII, se observó distribución extensiva bien en el parénquima del cerebro, y la absorción celular se observó en neuronas y células gliales.

Las Figura 23 ilustran actividad Naglu ejemplar en cerebro e hígado 24hr después de la última inyección IT. Entre los tres grupos tratados, la actividad de Naglu en el cerebro no mostró diferencias significantes, lo mismo fue cierto para la actividad de Naglu en el hígado. Este resultado implicó que la actividad de Naglu detectada en el cerebro e hígado fue mayormente debido a la última inyección, la cual ocurre 24hrs previo al sacrificio. Es claro en este punto como porqué hubo actividad Naglu significantemente superior en el hígado comparado con el cerebro. Un estudio de farmacocinética completo después de la inyección IT puede ayudar a interpretar la diferencia.

La Figura 24 ilustra el nivel de GAG total ejemplar en el cerebro e hígado después de la inyección IT de Naglu-IGFII. El GAG total en el cerebro de ratones con Sanfilippo tratados con vehículo presenta incremento progresivo, una reflexión del efecto acumulativo conforme el ratón con Sanfilippo B envejece. Una reducción estadísticamente significante de GAG en el cerebro se observó en el grupo de inyección 3x (p<0.05). También se observaron reducciones estadísticamente significantes de GAG en hígado en grupos de inyección 2x y 3x (p<0.05). El cambio más rápido y más drástico del nivel de GAG en hígado que en el cerebro es un fenómeno que también se ha observado en suministro otros modelos de ratón en con enfermedad de almacenamiento lisosomal, tal como síndrome de hunter (comunicaciones internas).

La Figura 25 representa biodistribución ejemplar de Naglu en el cerebro de ratones con Sanfilippo después de la inyección IT. El teñido inmunofluorescente de Naglu reveló la proteína Naglu-IGFII en las meninges (M) y parénquima del cerebro. La absorción celular se observó en los grupos de inyección de 2x y 3x. G: células gliales.

La Figura 26 ilustra una sección de corona ejemplar del cerebro de ratón. Los cuadros indican en donde se tomaron las fotografías para inmunoteñido LAMP-1. Para demostrar la extensión de distribución de proteína y eficacia, los tejidos de la corteza cerebral y subcortical tales como núcleo caudado, tálamo y materia blanca fueron seleccionados para inmunoteñido LAMP1.

La Figura 27 representa el inmunoteñido LAMP-1 ejemplar de corteza cerebral a 40x. Comparando con el cerebro de ratones de tipo nativo, se observó almacenamiento de lisosoma incrementado en el cerebro de ratones con Sanfilippo B tratados con vehículo, como se observa por los puntos de inmunoteñido positivo con LAMP1 incrementado. La reducción de almacenamiento lisosomal después de inyección IT de Naglu-IGFII fue evidente por el tamaño reducido de manchas positivas de cerebro de ratón con Sanfilippo B tratados con inyección 2x, y el tamaño reducido y número de puntos positivos del cerebro de ratón con Sanfilippo B tratados con inyección 3x.

La Figura 28 representa el inmunoteñido de LAMP-1 del núcleo caudado ejemplar, un núcleo subcortical (40x). Similar a lo que se observa en la corteza cerebral, se observó almacenamiento lisosomal incrementado en el cerebro de ratones con Sanfilippo B tratados con vehículo, como se observa por los puntos de inmunoteñido positivo de LAMP1 incrementado. La reducción del almacenamiento lisosomal después de la inyección IT con Naglu-IGFII fue evidente por el tamaño reducido de puntos positivos de cerebro de ratón con Sanfilippo B tratado con inyección 2x y por el tamaño reducido y número de puntos positivos del cerebro de ratón con Sanfilippo tratados con inyección 3x.

La Figura 29 representa el inmunoteñido de LAMP-1 del tálamo ejemplar, un núcleo diencefálico (40x). La reducción de almacenamiento lisosomal después de la inyección IT de Naglu-IGFII fue evidente por el tamaño reducido de puntos positivos de cerebro de ratón con Sanfilippo B tratados con inyección 2x y por el tamaño reducido y número de puntos positivos del cerebro de ratón con Sanfilippo B tratado con inyección 3x.

La Figura 30 representa el inmunoteñido de LAMP-1 de materia blanca ejemplar (40x). El rastro longitudinal de fibras axonas neuronales distingue la materia blanca de la materia gris presentada en las Figuras 26-29. No obstante, el mismo patrón de incremento de almacenamiento lisosomal podría ser visto en el cerebro de ratón con Sanfilippo B tratado con vehículo cuando se compara con el ratón de tipo nativo. La reducción de almacenamiento lisosomal después de la inyección IT de Naglu-IGFII fue evidente por el tamaño reducido y número reducido de puntos positivos en el cerebro de ratones con Sanfilippo B tratados con inyección 2x y 3x.

La Figura 31 representa el inmunoteñido de LAMP-1 de la corteza cerebelar. Efectos similares de reducción de almacenamiento lisosomal se observaron en la corteza cerebelar como en las otras áreas del cerebro. La morfología de la corteza cerebelar fue evidente por las neuronas granulares densamente pobladas, la capa Molecular hipocelular, y la capa individual de neuronas Purkinje entre las neuronas granulares y la capa molecular. Las neuronas Purkinje fueron identificadas por el citoplasma grande y dendritas ocasionales que sobresalen en la capa Molecular.

La Figura 32 ilustra el teñido de Naglu ejemplar en el cerebro, médula espinal e hígado. En el cerebro y médula espinal, el Naglu inyectado se detectó en las meninges (M) solamente por IHC y no se detectó teñido positivo con Naglu en cualesquiera otras regiones. En el hígado, las células sinuoidales (S) fueron Naglu positivas y no se encontró absorción de Naglu en hepatocitos (H).

La Figura 33 ilustra el inmunoteñido de LAMP y teñido de H & E ejemplar del hígado y médula espinal. Comparado con los animales de vehículo, el teñido con LAMP fue reducido a través de tanto hígados como médulas espinales tratados con Naglu. El teñido de H & E mostró que la vacuolación celular en hepatocitos fue evidentemente reducida en el grupo tratado comparado con animales tratados con vehículo.

La Figura 34A y la Figura 34B demuestran teñido de H&E del cerebro ejemplar y mejoramiento de morfología del cerebro después de 6 inyecciones IT cada tres semanas de Nalgu suelta por 3 meses. En el cerebro tratado, la vacuolación celular (flechas) en todas las regiones examinadas reduce comparada con el vehículo de control.

La Figura 35A y la Figura 35B ilustran el inmunoteñido ejemplar de LAMP en varias regiones cerebrales después de 6 inyecciones con Naglu IT por 3 meses. Comparado con el grupo tratado con vehículo, la administración IT de Naglu a ratones Sanfilippo B resultó en una reducción de actividad lisosomal en todas las regiones examinadas reveladas por inmunoteñido de LAMP. Esta reducción se caracterizó por la reducción en el número de células la P positivas, de tamaño celular más pequeño y teñido más ligero. Se encontró una reducción marcada en el cerebelo y tallo cerebral, las cuales se localizaron en la parte caudada del cerebro cercana a la médula espinal, comparada con otras regiones cerebrales. También se encontró una clara reducción en las regiones cerebrales profundas, que incluyen la materia blanca, hipocampo, y tálamo.

La Figura 36A y la Figura 36B ilustra Iba IHC en varias regiones cerebrales ejemplares después de 6 inyecciones de Naglu IT por 3 meses, las cuales revelaron la activación de células microgliales. Comparado con el grupo tratado con vehículo, no se observó reducción en el número de células positivas e intensidad de teñido en el grupo tratado con Naglu. Sin embargo, la morfología celular de células microgliales cambia con el tamaño de células reducido en todas las regiones cerebrales examinadas comparadas con las grandes y vacuoladas en el grupo de vehículo (insertos).

La Figura 37A y la Figura 37B ilustran GFAP IHC ejemplar en varias regiones cerebrales después de 6 inyecciones de Naglu IT por 3 meses, lo cual reveló la activación astrocítica. Comparado con el grupo tratado con vehículo, el teñido GFAP positivo se redujo en el cerebelo y tallo cerebral, y redujo ligeramente en otras regiones examinadas.

La Figura 38 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD).

La Figura 39 representa un sistema de acceso implantable intratecal de bajo perfil PORT-A-CATH®.

La Figura 40 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD).

La Figura 41 representa un dispositivo de suministro de fármaco intratecal ejemplar (IDDD), el cual permite la administración en el hogar para terapia de reemplazo enzimático (ERT) de CNS.

La Figura 42 ilustra un diagrama ejemplar de un dispositivo de suministro de fármaco intratecal (IDDD) con un mecanismo de seguridad.

La Figura 43A representa ubicaciones ejemplares dentro del cuerpo del paciente en donde un IDDD se puede reemplazar; La Figura 43B representa varios componentes de un dispositivo de suministro del fármaco intratecal (IDDD); y la Figura 43C describe una ubicación de inserción ejemplar dentro de un cuerpo del paciente para inyección IT-lumbar.

Definiciones Para que se comprenda más fácilmente la presente invención, a continuación se definen primero ciertos términos. Definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos se establecen a lo largo de la especificación.

Aproximadamente o alrededor de: Como se utiliza aquí, el término "aproximadamente" o "alrededor de", según se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. En ciertas modalidades, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un rango de valores que caen dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o que sea evidente a partir del contexto (excepto donde tal número excedería 100% de un posible valor).

Mejora: Como se utiliza aquí, el término "mejora" denota la prevención, reducción o paliación de un estado, o la mejora del estado de un sujeto. La mejora incluye, pero no requiere la recuperación completa o la prevención completa de una condición del padecimiento (por ejemplo, síndrome de Sanfilippo B). En algunas modalidades, la mejora incluye incrementar los niveles de la proteina pertinente o su actividad (por ejemplo, Naglu) que es deficiente en los tejidos de padecimiento pertinentes.

Biológicamente activo: Como se utiliza aquí, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier agente que tiene actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo, se considera como biológicamente activo. En modalidades particulares, donde una proteína o un polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte al menos una actividad biológica de la proteína o el polipéptido típicamente se refiere como una porción "biológicamente activa".

Receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (Cl-MPR): Como se utiliza aquí, el término "receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR)" se refiere a un receptor celular que enlaza las etiquetas de manosa-6-fosfato (M6P) en los precursores de las hidrolasas ácidas en el aparato Golgi que se destinan para el transporte al lisosoma. Además de los manosa-6-fosfatos, el CI-MPR también enlaza otras proteínas incluyendo IGF-II. El CI-MPR también es conocido como "receptor M6P/IGF-II", "receptor CI-MPR/IGF-II", "receptor IGF-II" o "receptor IGF2". Estos términos y abreviaturas de los mismos se utilizan aquí de forma intercambiable.

Terapia inmunosupresora concurrente: Como se utiliza aquí, el término "terapia inmunosupresora concurrente" incluye cualquier terapia inmunosupresora utilizada como pre- tratamiento, pre-condicionamiento o en paralelo a un método de tratamiento.

Diluyente.

Como se utiliza aquí, el término "diluyente" se refiere a una sustancia diluyente farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, segura y no tóxica para la administración a un humano), útil para la preparación de una formulación reconstituida. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución amortiguada en pH (por ejemplo, solución salida amortiguada con fosfato), solución salina estéril, solución de inger o solución de dextrosa.

Forma de dosificación.

Como se utiliza aquí, los términos "forma de dosificación" y "forma de dosificación unitaria" se refieren a una unidad físicamente discreta de una proteína terapéutica para que el paciente sea tratado. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado. Se comprenderá, sin embargo, que la dosis total de la composición se decidirá por el médico tratante dentro del alcance del juicio médico razonable.

Terapia de reemplazo de enzima (ERT).

Como se utiliza aquí, el término "terapia de reemplazo de enzima (ERT)" se refiere a cualquier estrategia terapéutica que corrija una deficiencia enzimática proporcionando la enzima faltante. En algunas modalidades, la enzima faltante se proporciona mediante administración intratecal. En algunas modalidades, la enzima faltante se proporciona mediante infusión en el torrente sanguíneo. Una vez administrada, la enzima es tomada por las células y transportada al lisosoma, donde la enzima actúa para eliminar el material que se ha acumulado en los lisosomas debido a la deficiencia enzimática. Típicamente, para que la terapia de reemplazo de enzima lisosómica sea efectiva, la enzima terapéutica se suministra a los lisosomas en las células apropiadas en los tejidos objetivo donde se manifiesta el defecto de almacenamiento.

Mejorar, incrementar, o reducir.

Como se utiliza aquí, los términos "mejorar", "incrementar" o "reducir", o los equivalentes gramaticales, indican los valores que son relativos a una medición de línea de base, tal como una medición en el mismo individuo antes de la iniciación del tratamiento aquí descrito, o una medida en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento aquí descrito. Un "individuo de control" es un individuo afligido con la misma forma de padecimiento por almacenamiento lisosómico (por ejemplo, síndrome de Sanfilippo B) que el individuo que se trata, quien es de aproximadamente la misma edad que el individuo que se trata (para asegurar que las fases del padecimiento en el individuo tratado y el individuo(s) de control sean comparables).

Individuo, sujeto, paciente: Como se utiliza aquí, los términos "sujeto", "individuo" o "paciente" se refieren a un humano o un sujeto mamífero no humano. El individuo (también referido como "paciente" o "sujeto") que se trata es un individuo (feto, bebé, niño, adolescente, o adulto) que sufre de un padecimiento, por ejemplo síndrome de Sanfilippo B.

Administración intratecal: Como se utiliza aquí, el término "administración intratecal" o "inyección intratecal" se refiere a una inyección en el canal espinal (espacio intratecal que rodea la médula espinal). Se pueden utilizar diversas técnicas incluyendo, sin limitación, la inyección cerebroventricular lateral a través de un trepanado o punción cisternal o lumbar o similar. En algunas modalidades, la "administración intratecal" o el "suministro intratecal" de acuerdo con la presente invención se refiere al suministro o administración IT por medio de la región o área lumbar, es decir, el suministro o administración IT lumbar. Como se utiliza aquí, el término "región lumbar" o "área lumbar" se refiere al área entre las tercera y cuarta vértebras lumbares (parte trasera inferior) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral.

Enlazador.

Como se utiliza aquí, el término "enlazador" se refiere a, en una proteina de fusión, una secuencia de aminoácidos aparte de aquella que aparece en una posición particular en la proteina natural y que generalmente se diseña para ser flexible o para interponer una estructura, tal como una a-hélice, entre dos radicales de proteína. Un enlazador también se refiere como un espaciador.

Enzima lisosómica: Como se utiliza aquí, el término "enzima lisosómica" se refiere a cualquier enzima que sea capaz de reducir los materiales acumulados en los lisosomas mamíferos o que pueda rescatar o mejorar uno o más síntomas del padecimiento por almacenamiento lisosómico. Las enzimas lisosómicas adecuadas para la invención incluyen tanto las enzimas lisosómicas modificadas como las enzimas lisosómicas de tipo salvaje y se pueden producir utilizando métodos recombinantes y sintéticos o se pueden purificar a partir de fuentes naturales.

Deficiencia de enzima lisosómica: Como se utiliza aquí, "deficiencia de enzima lisosómica" se refiere a un grupo de desórdenes genéticos que resultan de la deficiencia en al menos una de las enzimas que se requieren para desdoblar las macromoléculas (por ejemplo, sustratos de enzima) a péptidos, aminoácidos, monosacáridos, ácidos nucleicos y ácidos grasos en los lisosomas. Como consecuencia, los individuos que sufren de las deficiencias de enzima lisosómica tienen materiales acumulados en diversos tejidos (por ejemplo, CNS, hígado, bazo, intestino, paredes de los vasos sanguíneos y otros órganos).

Padecimiento por almacenamiento Hsosómico Como se utiliza aquí, el término "padecimiento por almacenamiento lisosómico" se refiere a cualquier padecimiento que resulta de la deficiencia de una o más enzimas lisosómicas necesarias para metabolizar las macromoléculas naturales. Estos padecimientos típicamente dan como resultado la acumulación de moléculas no degradadas en los lisosomas, dando como resultado números incrementados de gránulos de almacenamiento (también llamados vejigas de almacenamiento). Estos padecimientos y diversos ejemplos se describen en más detalle debajo.

Polipéptido: Como se utiliza aquí, un "polipéptido", generalmente hablando, es una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí mediante un enlace de péptido. En algunas modalidades, un polipéptido puede incluir al menos 3-5 aminoácidos, cada uno de los cuales se une a los otros por medio de al menos un enlace de péptido. Aquellos de habilidad ordinaria en el arte apreciarán que, opcionalmente, los polipéptidos algunas veces incluyen aminoácidos "no naturales" u otras entidades que no obstante son capaces de integrarse a una cadena de polipéptidos.

Enzima de reemplazo: Como se utiliza aquí, el término "enzima de reemplazo" se refiere a cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar al menos en parte la enzima deficiente o faltante en un padecimiento a ser tratado. En algunas modalidades, el término "enzima de reemplazo" se refiere a cualquier enzima que pueda actuar para reemplazar al menos en parte la enzima lisosómica deficiente o faltante en un padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado. En algunas modalidades, una enzima de reemplazo es capaz de reducir los materiales acumulados en los lisosomas mamíferos o puede rescatar o mejorar uno o más síntomas del padecimiento por almacenamiento lisosómico. Las enzimas de reemplazo adecuadas para la invención incluyen tanto las enzimas lisosómicas modificadas como las enzimas lisosómicas de tipo salvaje y se pueden producir utilizando métodos recombinantes y sintéticos o se pueden purificar a partir de fuentes naturales. Una enzima de reemplazo puede ser una enzima recombinante, sintética, activada por genes o natural.

Soluble.

Como se utiliza aquí, el término "soluble" se refiere a la habilidad de un agente terapéutico para formar una solución homogénea. En algunas modalidades, la solubilidad del agente terapéutico en la solución dentro de la cual se administra y mediante la cual se transporta al sitio de acción objetivo (por ejemplo, las células y los tejidos del cerebro) es suficiente para permitir el suministro de una cantidad terapéuticamente efectiva del agente terapéutico al sitio de acción que se tiene como objetivo. Varios factores pueden impactar la solubilidad de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, los factores relevantes que pueden impactar la solubilidad de la proteína incluyen la fuerza iónica, la secuencia de aminoácidos y la presencia de otros agentes co-solubilizantes o sales (por ejemplo, sales de calcio). En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan tal que las sales de calcio se excluyen de tales composiciones. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos de conformidad con la presente invención son solubles en su composición farmacéutica correspondiente. Se apreciará que, mientras que las soluciones isotónicas son generalmente preferidas para los fármacos parenteralmente administrados, el uso de soluciones isotónicas puede limitar la solubilidad adecuada para algunos agentes terapéuticos y, en particular algunas proteínas y/o enzimas. Las soluciones ligeramente hipertónicas (por ejemplo, cloruro de sodio hasta 175mM en fosfato de sodio 5mM en pH 7.0) y las soluciones que contienen azúcar (por ejemplo, sacarosa hasta 2% en fosfato de sodio 5mM en pH 7.0) han demostrado ser adecuadamente toleradas en los monos. Por ejemplo, la composición de la formulación de bolo CNS más comúnmente aprobada es la solución salina (NaCI 150m en agua).

Estabilidad: Como se utiliza aquí, el término "estable" se refiere a la habilidad del agente terapéutico (por ejemplo, una enzima recombinante) para mantener su eficacia terapéutica (por ejemplo, toda o la mayor parte de su actividad biológica pretendida y/o su integridad fisioquímica) sobre periodos de tiempo extendidos. La estabilidad de un agente terapéutico, y la capacidad de la composición farmacéutica para mantener la estabilidad de tal agente terapéutico, se pueden evaluar durante periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, durante al menos 1 , 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses o más). En general, las composiciones farmacéuticas aquí descritas se han formulado tal que sean capaces de estabilizar, o alternativamente desacelerar o prevenir la degradación, de uno o más agentes terapéuticos formulados con las mismas (por ejemplo, las proteínas recombinantes). En el contexto de una formulación, una formulación estable es una en la cual el agente terapéutico ahí esencialmente retiene su integridad física y/o química y su actividad biológica tras el almacenamiento y durante los procesos (tales como el congelamiento/deshielo, mezclado mecánico y liofilización). Para la estabilidad de la proteína, se puede medir por la formación de agregados de alto peso molecular (HMW), la pérdida de actividad enzimática, la generación de fragmentos de péptido y el cambio de los perfiles de carga.

Sujeto: Como se utiliza aquí, el término "sujeto" significa cualquier mamífero, incluyendo humanos. En ciertas modalidades de la presente invención el sujeto es un adulto, un adolescente o un bebé. También se contempla por la presente invención la administración de las composiciones farmacéuticas y/o el desempeño de los métodos de tratamiento in-útero.

Homología sustancial: La frase "homología sustancial" se utiliza aquí para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, dos secuencias generalmente se consideran como "sustancialmente homologas" si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos que heredan características funcionales y/o estructurales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es bien conocido por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, ciertos aminoácidos típicamente se clasifican como aminoácidos "hidrofóbicos" o "hidrofílicos", y/o como que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo a menudo se puede considerar una sustitución "homologa".

Como es bien conocido en este arte, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo aquellos disponibles en programas de computadora comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST de hendidura, y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410,1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al.., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein datábase search programs", Nucleic Acids Res, 25:3389-3402,1997; Baxevanis, et al.., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinfonvatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias homologas, los programas anteriormente mencionados típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunas modalidades, se considera que dos secuencias son sustancialmente homologas si al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son homólogos sobre un tramo pertinente de residuos. En algunas modalidades, el tramo pertinente es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo pertinente es al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65,70,75, 80, 85, 90, 95, 100,125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

Identidad sustancial: La frase "identidad sustancial" se utiliza aquí para referirse a una comparación entre las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por aquellos de habilidad ordinaria en el arte, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como es bien conocido en este arte, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo aquellos disponibles en programas de computadora comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST de hendidura, y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol, 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology, Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias idénticas, los programas anteriormente mencionados típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas modalidades, se considera que dos secuencias son sustancialmente idénticas si al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son idénticos sobre un tramo pertinente de residuos. En algunas modalidades, el tramo pertinente es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo pertinente es al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

CSF sintético: Como se utiliza aquí, el término "CSF sintético" se refiere a una solución que tiene pH, composición de electrólitos, contenido de glucosa y osmolaridad consistente con el fluido cerebroespinal. El CSF sintético también se refiere como CSF artificial. En algunas modalidades, el CSF sintético es una solución B de Elliott.

Adecuado para suministro al CNS: Como se utiliza aquí, la frase "adecuado para suministro al CNS" o "adecuado para suministro intratecal" que se refiere a las composiciones farmacéuticas de la presente invención generalmente se refiere a la estabilidad, tolerabilidad, y propiedades de solubilidad de tales composiciones, asi como la habilidad de tales composiciones para suministrar una cantidad efectiva del agente terapéutico contenido ahí al sitio de suministro que se tiene como objetivo (por ejemplo, el CSF o el cerebro).

Tejidos objetivo: Como se utiliza aquí, el término "tejidos objetivo" se refiere a cualquier tejido que sea afectado por el padecimiento por almacenamiento lísosómico a ser tratado o cualquier tejido en que la enzima lisosómica deficiente sea normalmente expresada. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales hay una cantidad detectable o anormalmente alta de sustrato de la enzima, por ejemplo almacenada en los lisosomas celulares del tejido, en pacientes que sufren de o susceptibles al padecimiento por almacenamiento lisosómico. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos que despliegan una característica, síntoma o patología asociada al padecimiento. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales la enzima lisosómica deficiente es normalmente expresada en un nivel elevado. Como se utiliza aquí, un tejido objetivo puede ser un tejido objetivo del cerebro, un tejido objetivo de la médula espinal y/o un tejido objetivo periférico. Los tejidos objetivo ejemplares se describen en detalle debajo.

Porción terapéutica: Como se utiliza aquí, el término "porción terapéutica" se refiere a una porción de una molécula que suministra el efecto terapéutico de la molécula. En algunas modalidades, una porción terapéutica es un polipéptido que tiene actividad terapéutica. Por ejemplo, una porción terapéutica de conformidad con la presente invención puede ser un péptido que puede ser sustituible para una proteína Naglu natural. En algunas modalidades, una porción terapéutica de conformidad con la presente invención puede ser un polipéptido que puede recatar uno o más fenotipos asociados con la deficiencia de Naglu. En algunas modalidades, una porción terapéutica de conformidad con la presente invención puede tratar uno o más síntomas en un paciente con síndrome de Sanfilippo B.

Cantidad terapéuticamente efectiva: Como se utiliza aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica (por ejemplo, Naglu) que confiere un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado, en una proporción de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por cualquier prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de o siente un efecto). Particularmente, la "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una proteina terapéutica o composición efectiva para tratar, mejorar, o prevenir una condición o padecimiento deseado, o para exhibir un efecto preventivo o terapéutico detectable, tal como mejorar los síntomas asociados con el padecimiento, prevenir o retardar el inicio del padecimiento, y/o también disminuir la severidad o frecuencia de los síntomas del padecimiento. Una cantidad terapéuticamente efectiva comúnmente se administra en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente efectiva (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. Además, la cantidad terapéuticamente efectiva específica (y/o la dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores incluyendo el desorden que se trata y la severidad del desorden; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición especifica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración, y/o la tasa de excreción o metabolismo de la proteina de fusión especifica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como es bien conocido en las artes médicas.

Tolerable: Como se utiliza aquí, los términos "tolerable" y "tolerabilidad" se refieren a la habilidad de las composiciones farmacéuticas de la presente invención para no producir como respuesta una reacción adversa en el sujeto a quién se administra tal composición, o alternativamente para no producir como respuesta una reacción adversa seria en el sujeto a quién se administra tal composición. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son bien toleradas por el sujeto a quién se administran tales composiciones.

Tratamiento: Como se utiliza aquí, el término "tratamiento" (también "tratar") se refiere a cualquier administración de una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima lisosómica) que parcialmente o completamente alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa el inicio de, reduce la severidad de y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de un padecimiento, desorden, y/o condición particular (por ejemplo, síndrome de Sanfilippo B). Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no exhibe signos del padecimiento, desorden y/o condición pertinente y/o de un sujeto que exhibe sólo signos anticipados del padecimiento, desorden, y/o condición. Alternativamente o adicionalmente, tal tratamiento puede ser de un sujeto que exhibe uno o más signos establecidos del padecimiento, desorden y/o condición pertinente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Entre otras cosas, la presente invención proporciona métodos y composiciones para tratar síndrome de Sanfilippo tipo B (Sanfilippo B) por ejemplo, por administración intratecal (IT) de una proteína Naglu. Una proteína Naglu adecuada puede ser una proteína recombinante, activada por gen o natural. En algunas modalidades, una proteína Naglu adecuada es una proteína Naglu recombinante. En algunas modalidades, una proteína Naglu recombinante es una proteína de fusión que contiene un dominio Naglu y una porción de objetivo lisosomal. En algunas modalidades, el dominio de objetivo lisosomal es una porción IGF-II.

Varios aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no significa limitar la invención. Cada sección puede aplicar a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se declare de otro modo.

Proteínas de fusión terapéuticas De conformidad con la presente invención, las proteínas de fusión adecuadas para el tratamiento de la enfermedad de Sanfilippo B pueden incluir un dominio Naglu (también referido como una porción terapéutica) y una porción de objetivo lisosomal.

Dominio Naglu Un dominio Naglu adecuado de conformidad con la presente invención puede ser cualquier molécula o una porción de una molécula que puede sustituirse para la actividad de la proteína Naglu que se origina naturalmente o rescatar uno o más fenotipos o síntomas asociados con deficiencia de Naglu. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la invención es un polipéptído que tiene un N-término y un C-término y una secuencia de aminoácido sustancialmente similar o idéntica a la proteína Naglu humana madura.

Típicamente, la Naglu humana se produce como una molécula precursora que se procesa a una forma madura. Este proceso ocurre en general removiendo el péptido señal de 23 aminoácidos conforme la proteína entra al retículo endoplásmico. Típicamente, la forma precursora es también referida como un precursor de longitud completa o proteína Naglu de longitud completa, la cual contiene 743 aminoácidos. Los 23 aminoácidos N-terminales son desdoblados conforme la proteína precursora ingresa al retículo endoplásmico, resultando en una forma madura. De este modo, se contempla que los 23 aminoácidos N-terminales son en general no requeridos para la actividad de la proteina Naglu. Las secuencias de aminoácido de la forma madura (SEQ ID NO: 1) y precursora de longitud completa (SEQ ID NO: 2) de una proteina Naglu humana que se origina naturalmente o de tipo nativo típica se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1 Naglu Humana De este modo, en algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es la proteína Naglu humana madura (SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada puede ser un homólogo o un análogo de una proteína Naglu humana madura. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de proteína Naglu humana madura puede ser una proteina Naglu humana madura modificada que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido comparada con una proteina Naglu que se origina naturalmente o de tipo nativa (por ejemplo SEQ ID NO: 1), mientras retiene la actividad sustancial de la proteína Naglu. De este modo, en algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente homologa a la proteína Naglu humana madura (SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologa a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la proteína Naglu humana madura (SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención contiene un fragmento o porción de la proteína humana madura Naglu.

Alternativamente, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es la proteína Naglu de longitud completa. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada puede ser homologa o un análogo de la proteina Naglu humana de longitud completa. Por ejemplo, un homólogo o un análogo de la proteina Naglu humana de longitud completa puede ser una proteína Naglu humana de longitud completa modificada que contiene una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácido comparada con una proteína Naglu de longitud completa que se origina naturalmente o de tipo nativa (por ejemplo, SEQ ID NO: 2), mientras retiene la actividad sustancial de la proteína Naglu. De este modo, en algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente homologa a una proteína Naglu humana de longitud completa (SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más homologa a la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención es sustancialmente idéntica a la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención tiene una secuencia de aminoácido al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, una porción terapéutica adecuada para la presente invención contiene un fragmento o una porción de una proteína Naglu humana de longitud completa. Como se usa en la presente, una proteina Naglu de longitud completa típicamente contiene una secuencia de péptido señal.

En algunas modalidades, una proteína terapéutica incluye una porción objetivo (por ejemplo, una secuencia de objetivo de lisosomal) y/o un péptido que penetra la membrana. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo y/o un péptido que penetra la membrana es una parte intrínseca de la porción terapéutica (por ejemplo, vía un enlace químico, vía una proteína de fusión). En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción de manosa-6-fosfato. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción IGF-I. En algunas modalidades, una secuencia de objetivo contiene una porción IGF-II.

Dominio de objetivo lisosomal En algunas modalidades, un dominio terapéutico (es decir, un dominio Naglu) es modificado para facilitar el objetivo lisosomal. Por ejemplo, un dominio Naglu adecuado puede ser fusionado a una porción de objetivo lisosomal, la cual puede dirigir el dominio Naglu a lisosomas en una manera independiente de manosa-6-fosfato. Los dominios de objetivo lisosomal adecuados pueden ser derivados de péptidos que incluyen, pero no se limitan a, IGF-II, IGF-I, Kif, ApoE, TAT, RAP, y péptido p97. En algunas modalidades, una porción de objetivo lisosomal es una proteína, péptido, u otra porción que se une al CI-MPR, el cual es también referido como el receptor IGF-II, en una manera independiente de manosa-6-fosfato.

En algunas modalidades, una porción de objetivo lisosomal se deriva de un factor II de crecimiento similar a insulina (IGF-II). En algunas modalidades, un extremo GLIT es un IGF-II humano maduro que se origina naturalmente o de tipo nativo (SEQ ID NO: 3).

IGF-II Maduro humano (SEQ ID NO: 3) AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSC DLALLETYCATPAKSE En algunas modalidades, una porción de objetivo lisosomal es un IGF-II humano maduro modificado que contiene sustituciones, inserciones o supresiones de aminoácido. En algunas modalidades, una etiqueta GILT tiene una secuencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de IGF-II humano maduro (SEQ ID NO: 3). En algunas modalidades, una porción de objetivo lisosomal es un fragmento de IGF-II humano maduro. En modalidades particulares, una porción de objetivo lisosomal contiene 8-67 aminoácidos de IGF-II humano maduro (SEQ ID NO: 3). En algunas modalidades, una porción de objetivo lisosomal contiene una supresión N-terminal, C-terminal o interna. Por ejemplo, una porción de objetivo lisosomal contiene una supresión de aminoácidos al N-término (por ejemplo ?2-7) de IGF-II humano maduro (SEQ ID NO: 3). En algunas modalidades, una porción de objetivo lisosomai es un péptido IGF-II humano modificado que ha disminuido la afinidad de enlace a otros receptores, tales como el receptor IGF-I, comparado con el IGF-II humano que se origina naturalmente.

Se conocen en la técnica varias porciones de objetivo lisosomai adicionales y pueden ser usadas para practicar la presente invención. Por ejemplo, ciertas porciones de objetivo lisosomai a base de péptido se describen en las Patentes Estadounidenses Nos. 7,396,81 1 , 7,560,424, and 7,629,309; Publicaciones de Solicitud Estadounidenses Nos. 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761 , 20040005309, 2005-0281805, 2005-0244400, y publicaciones internacionales WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077, WO/2009/13772 , la descripciones completas de las cuales se incorporan en la presente por referencia.

Enlazador o Espaciador Una porción de objetivo lisosomai puede ser fusionada al N-término o C-término de un péptido que codifica una enzima lisosomai, o insertado internamente. La porción de objetivo lisosomai puede ser fusionada directamente al polipéptido de enzima lisosomai o puede ser separada del polipéptido de enzima lisosomai por un enlazador o un espaciador. Un enlazador o espaciador de aminoácido es en general diseñado para ser flexible o para interponer una estructura, tal como una hélice-alfa, entre las dos porciones de proteínas. Un enlazador o espaciador puede ser relativamente corto, tal como la secuencia GGGGGAAAAGGGG (SEQ ID NO: 4), GAP, GGGGGP (SEQ ID NO: 7), o puede ser más largo, tal como, por ejemplo, 10-50 (por ejemplo, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50) aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, varias secuencias enlazadoras cortas pueden estar presentes en repeticiones en serie. Por ejemplo, un enlazador adecuado puede contener la secuencia de aminoácido de GGGGGAAAAGGGG (SEQ ID NO: 4) presente en repeticiones en serie. En algunas modalidades, tal enlazador puede además contener una o más secuencias GAP, las armazones de la secuencia de GGGGGAAAAGGGG (SEQ ID NO: 4). Por ejemplo, un enlazador adecuado puede contener la secuencia de aminoácido de GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGG GGAP (SEQ ID NO: 5).

En algunas modalidades, un enlazador o espaciador adecuado puede contener una secuencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ó 99% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 5.

En algunas modalidades, una proteína terapéutica adecuada para la presente invención puede contener residuos M6P. En algunas modalidades, una proteína terapéutica adecuada para la presente invención puede contener oligosacáridos bis-fosforilados que tienen mayor afinidad de enlace para el CI-MPR. En algunas modalidades, una enzima adecuada contiene hasta aproximadamente un promedio de aproximadamente al menos 20% de oligosacáridos bis-fosforilados por la enzima. En otras modalidades, una enzima adecuada puede contener aproximadamente 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% de oligosacáridos bis-fosforilados por la enzima. Mientras que tales oligosacáridos bis-fosforilados pueden estar presentes de manera natural en la enzima, se debe notar que las enzimas se pueden modificar para poseer tales oligosacáridos. Por ejemplo, las enzimas de reemplazo adecuadas se pueden modificar por ciertas enzimas que son capaces de catalizar la transferencia de N-acetilglucosamina-L-fosfato a partir de UDP-GIcNAc a la posición 6' de mañosas a-1 ,2-enlazadas en enzimas lisosómicas. Los métodos y composiciones para producir y utilizar tales enzimas se describen por, por ejemplo, Canfield et al. en la Patente Norteamericana No. 6,537,785, y en la Patente Norteamericana No. 6,534,300, cada una incorporada aquí por referencia.

En algunas modalidades, una proteína terapéutica adecuada para la presente invención es sobreglicosilada. Como se usa en la presente "sobreglicosilada" se refiere a una proteína o enzima en la cual una o más estructuras de carbohidratos (por ejemplo, residuos M6P) que podrían normalmente estar presentes en una enzima que se origina naturalmente se han omitido, removido, modificado o enmascarados. Las enzimas lisosomales sobre glicosiladas pueden ser producidas en un hospedero (por ejemplo, bacteria o levadura) que no glicosila proteínas como lo hacen las células de mamífero convencionales (por ejemplo, células de ovario de hámster Chino (CHO). Por ejemplo, las proteínas producidas por la célula hospedera pueden carecer de residuos de mañosa terminal, fucosa y/o N-acetilglucosamina, los cuales son reconocidos por el receptor de mañosa, o pueden ser completamente no glicosilados. En algunas modalidades, las enzimas lisosomales sobreglicosiladas pueden ser producidas en células de mamífero o en otros hospederos, pero tratadas químicamente o enzimáticamente para remover uno o más residuos de carbohidratos (por ejemplo, uno o más residuos M6P) o para modificar o enmascarar uno o más residuos de carbohidratos. Tales enzimas químicamente o enzimáticamente tratadas son también referidas como enzimas lisosomales desglicosiladas. En algunas modalidades, uno o más sitios de glicosilación potenciales son removidos por mutación del ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal, de este modo reduciendo la glicosilación de la enzima cuando se sintetiza en una célula de mamífero u otra célula que glicosila proteínas. En algunas modalidades, las enzimas lisosomales pueden ser producidas usando un péptido de señal secretora (por ejemplo, un péptido señal IGF-II) de manera que los niveles de glicosilación de las enzimas se reducen y/o modifican. Las enzimas de enzimas lisosomales sobreglicosiladas o desglicosiladas se describen en la Patente Estadounidense No. 7,629,309 y Solicitudes de Patente Estadounidenses Nos. 20090041741 y 20040248262, las descripciones de las cuales están de este modo incorporadas por referencia.

Producción de proteína Las proteínas terapéuticas adecuadas para la presente invención pueden ser producidas en cualquier célula de mamífero o tipos de células susceptibles a cultivo celular, y a expresión de polipéptidos, tales como, por ejemplo, células de riñon embriónico humano (HEK) 293, ovario de hámster Chino (CHO), riñon de mono (COS), HT1080, C10, HeLa, riñon de hámster bebé (BHK), 3T3, C127, CV-1 , HaK, NS/O, y L-929. Ejemplos no limitantes específicos incluyen, pero no se limitan a, linea de mieloma de ratón BALB/c humano (NSO/I, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, The Netherlands)); línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (células 293 ó 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata y búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano. (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una linea de hepatoma humano (Hep G2). En algunas modalidades, las enzimas son producidas en células CHO. En algunas modalidades, las enzimas son producidas en células derivadas de CHO tales como lineas de células deficientes de acidificación endosomal (por ejemplo, grupo de complementación END3 derivado de CHO-K1).

Las enzimas también pueden ser expresadas en una variedad de células hospederas no de mamífero tales como, por ejemplo, insecto (por ejemplo Sf-9, Sf-21 , Hi5), planta (por ejemplo, Leguminosa, cereal, o tabaco), levadura (por ejemplo, S. cerivisae, P. pastoris), procariota (por ejemplo, E. Coli, B. subtilis y otros Bacillus spp., Pseudomonas spp., Streptomyces spp), u hongos.

En otras modalidades, mamíferos no humanos transgénicos han sido mostrados por producir enzimas lisosomales en su leche. Tales mamíferos no humanos transgénicos pueden incluir ratones, conejos, cabras, ovejas, porciones u bovinos. Véase Patentes Estadounidenses Nos. 6,1 18,045 y 7,351 ,410, cada una de las cuales están en la presente incorporadas por referencia en su totalidad.

Suministro Intratecal De conformidad con la presente invención una proteina terapéutica, es decir, una enzima de reemplazo, que contiene un dominio Naglu es suministrada al CNS. Varías técnicas y rutas pueden ser usadas para suministro al CNS que incluyen pero no se limitan a, administraciones intraparenquimal, intracerebral, ¡ntraventricular cerebral (ICV), intratecal (por ejemplo, IT-Lumbar, IT-cisterna magna) y cualesquiera otras técnicas y rutas para inyección directamente o indirectamente al CNS y/o CSF.

En algunas modalidades, una enzima de reemplazo se suministra al CNS mediante administración en el fluido cerebroespinal (CSF) de un sujeto en necesidad de tratamiento. En algunas modalidades, la administración intratecal se utiliza para suministrar una enzima de reemplazo deseada en el CSF. Como se utiliza aquí, la administración intratecal (también referida como inyección intratecal) se refiere a una inyección en el canal espinal (el espacio intratecal que rodea la médula espinal). Se pueden utilizar diversas técnicas incluyendo, sin limitación, inyección cerebroventricular lateral a través de un trepanado o punción cisternal o lumbar o similar. Los métodos ejemplares se describen en Lazorthes et al., Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 y Omaya et al., Cáncer Drug Delivery, 1 :169-179, el contenido de las cuales se incorpora aquí por referencia.

De acuerdo con la presente invención, una enzima se puede inyectar en cualquier región que rodee el canal espinal. En algunas modalidades, una enzima se inyecta en el área lumbar o la cisterna magna o de manera ¡ntraventricular en un espacio del ventrículo cerebral. Como se utiliza aquí, el término "región lumbar" o "área lumbar" se refiere al área entre las tercera y cuarta vértebras lumbares (parte trasera inferior) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral. Típicamente, la inyección intratecal por medio de la región lumbar o el área lumbar también se refiere como "suministro IT lumbar" o "administración IT lumbar". El término "cisterna magna" se refiere al espacio alrededor y debajo el cerebelo vía la abertura entre el cráneo y la parte superior de la columna vertebral. Típicamente, la inyección intratecal vía la cisterna magna también se refiere como "suministro por cisterna magna". El término "ventrículo cerebral" se refiere a las cavidades en el cerebro que son continuas con el canal central de la médula espinal. Típicamente, las inyecciones vía las cavidades del ventrículo cerebral se refieren como suministro cerebral intraventricular (ICV).

En algunas modalidades, la "administración intratecal" o la "suministro intratecal" de acuerdo con la presente invención se refiere a la administración o suministro IT lumbar, por ejemplo, suministrada entre las tercera y cuarta vértebras lumbares (parte trasera inferior) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral. Se contempla que el suministro o administración IT lumbar se distingue sobre el suministro por cisterna magna en que el suministro o administración IT lumbar de acuerdo con esta invención proporciona un suministro mejor y más efectiva al canal espinal distante, mientras que el suministro por cisterna magna, entre otras cosas, típicamente no efectúa el suministro adecuadamente al canal espinal distante.

Formulaciones Estables para el suministro IT En algunas modalidades, las enzimas deseadas se suministran en formulaciones estables para la suministro intratecal. Ciertas modalidades de la invención se basan, al menos en parte, en el descubrimiento de que diversas formulaciones aquí divulgadas facilitan la distribución y suministro efectivo de uno o más agentes terapéuticos (por ejemplo, enzimas) a los tejidos, células y/o organelos que se tienen como objetivo del CNS. Entre otras cosas, las formulaciones aquí descritas son capaces de solubilizar altas concentraciones de agentes terapéuticos (por ejemplo, proteínas o enzimas) y son adecuadas para el suministro de tales agentes terapéuticos al CNS de sujetos para el tratamiento de padecimientos que tienen una etiología y/o componente CNS. Las composiciones aquí descritas adicionalmente se caracterizan por la estabilidad mejorada y la tolerabilidad mejorada cuando se administran al CNS de un sujeto (por ejemplo, de manera intratecal) en necesidad de las mismas.

Antes de la presente invención, la tradicional solución salina isotónica no amortiguada y la solución B de Elliott, que es CSF artificial, típicamente se utilizaron para la suministro intratecal. Una comparación que bosqueja las composiciones del CSF con relación a la solución B de Elliott se incluye en la Tabla 2 debajo. Como se muestra en la Tabla 2, la concentración de la solución B de Elliott se asemeja mucho a aquella del CSF. La solución B de Elliott, sin embargo, contiene una concentración de amortiguador muy baja y consecuentemente no puede proporcionar la capacidad de amortiguamiento adecuada necesaria para estabilizar los agentes terapéuticos (por ejemplo, las proteínas), especialmente sobre periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, durante las condiciones de almacenamiento). Además, la solución B de Elliott contiene ciertas sales que pueden ser incompatibles con las formulaciones pretendidas para suministrar algunos agentes terapéuticos, y en particular enzimas o proteínas. Por ejemplo, las sales de calcio presentes en la solución B de Elliott son capaces de mediar la precipitación de proteínas y reducir por consiguiente la estabilidad de la formulación.

TABLA 2 De esta manera, en algunas modalidades, las formulaciones adecuadas para la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención no son CSF sintético o artificial.

En algunas modalidades, las formulaciones para la suministro intratecal se han formulado tal que sean capaces de estabilizar, o alternativamente desacelerar o prevenir la degradación, de uno o más agentes terapéuticos formulados con las mismas (por ejemplo, las proteínas recombinantes). Como se utiliza aquí, el término "estable" se refiere a la habilidad del agente terapéutico (por ejemplo, una enzima recombinante) para mantener su eficacia terapéutica (por ejemplo, toda o la mayor parte de su actividad biológica pretendida y/o su integridad fisioquimica) sobre periodos de tiempo extendidos. La estabilidad de un agente terapéutico, y la capacidad de la composición farmacéutica para mantener la estabilidad de tal agente terapéutico, se pueden evaluar durante periodos de tiempo extendidos (por ejemplo, preferiblemente durante al menos 1 , 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses o más). En el contexto de una formulación, una formulación estable es una en la cual el agente terapéutico ahí esencialmente retiene su integridad física y/o química y su actividad biológica tras el almacenamiento y durante los procesos (tales como el congelamiento/deshielo, mezclado mecánico y liofilización). Para la estabilidad de la proteina, se puede medir por la formación de agregados de alto peso molecular (HMW), la pérdida de actividad enzimática, la generación de fragmentos de péptido y el cambio de los perfiles de carga.

La estabilidad del agente terapéutico es de particular importancia. La estabilidad del agente terapéutico se puede evaluar adicionalmente con relación a la actividad biológica o integridad fisioquimica del agente terapéutico durante periodos de tiempo extendidos. Por ejemplo, la estabilidad en un punto de tiempo dado se puede comparar contra la estabilidad en un punto de tiempo anterior (por ejemplo, en el día 0 de formulación) o contra el agente terapéutico no formulado y los resultados de esta comparación se pueden expresar como un porcentaje. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención mantienen al menos 100%, al menos 99%, al menos 98%, al menos 97% al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55% o al menos 50% de la actividad biológica o integridad fisioquímica del agente terapéutico sobre un periodo de tiempo extendido (por ejemplo, según se mide sobre al menos aproximadamente 6-12 meses, a temperatura ambiente o bajo condiciones de almacenamiento aceleradas).

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas deseadas) son solubles en las formulaciones de la presente invención. El término "soluble" que se refiere a los agentes terapéuticos de la presente invención se refiere a la habilidad de tales agentes terapéuticos para formar una solución homogénea. Preferiblemente, la solubilidad del agente terapéutico en la solución dentro de la cual se administra y mediante la cual se transporta al sitio de acción objetivo (por ejemplo, las células y los tejidos del cerebro) es suficiente para permitir el suministro de una cantidad terapéuticamente efectiva del agente terapéutico al sitio de acción que se tiene como objetivo. Varios factores pueden impactar la solubilidad de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, los factores relevantes que pueden impactar la solubilidad de la proteína incluyen la fuerza iónica, la secuencia de aminoácidos y la presencia de otros agentes co-solubilizantes o sales (por ejemplo, sales de calcio). En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan tal que las sales de calcio se excluyen de tales composiciones.

De esta manera, las formulaciones adecuadas para la administración intratecal pueden contener un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima) de interés en varias concentraciones. En algunas modalidades, las formulaciones adecuadas pueden contener una proteína o enzima de interés en una concentración hasta aproximadamente 300 mg/ml (por ejemplo, hasta aproximadamente 250 mg/ml, hasta 200 mg/ml, hasta 150 mg/ml, hasta 100 mg/ml, hasta 90 mg/ml, hasta 80 mg/ml, hasta 70 mg/ml, hasta 60 mg/ml, hasta 50 mg/ml, hasta 40 mg/ml, hasta 30 mg/ml, hasta 25 mg/ml, hasta 20 mg/ml, hasta 10 mg/ml). En algunas modalidades, las formulaciones adecuadas pueden contener una . proteína o enzima de interés en una concentración que varía dentro del rango entre aproximadamente 0-300 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 1-250 mg/ml, aproximadamente 1-200 mg/ml, aproximadamente 1-150 mg/ml, aproximadamente 1-100 mg/ml, aproximadamente 10-100 mg/ml, aproximadamente 10-80 mg/ml, aproximadamente 10-70 mg/ml, aproximadamente 1-60 mg/ml, aproximadamente 1-50 mg/ml, aproximadamente 10-150 mg/ml, aproximadamente 1-30 mg/ml). En algunas modalidades, las formulaciones adecuadas para la suministro intratecal pueden contener una proteína de interés en una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, 3 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml o 300 mg/ml.

En algunas modalidades, se utilizan soluciones isotónicas. En algunas modalidades, las soluciones ligeramente hipertónicas (por ejemplo, cloruro de sodio hasta 300 mM (por ejemplo, hasta 250 mM, 200 mM, 175mM, 150 mM, 125 mM) en fosfato de sodio 5mM en pH 7.0) y las soluciones que contienen azúcar (por ejemplo, sacarosa hasta 3% (por ejemplo, hasta 2.4%, 2.0%, 1.5%, 1.0%) en fosfato de sodio 5mM en pH 7.0) han demostrado ser adecuadamente toleradas en los monos. En algunas modalidades, una composición de la formulación de bolo CNS adecuada es la solución salina (por ejemplo, NaCI 150mM en agua).

Muchos agentes terapéuticos, y en particular las proteínas y enzimas de la presente invención, requieren pH controlado y excipientes específicos para mantener su solubilidad y su estabilidad en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. La Tabla 3 de abajo identifica ciertos aspectos ejemplares de las formulaciones de proteina que se consideran importantes para mantener la solubilidad y la estabilidad de los agentes terapéuticos de proteína de la presente invención.

TABLA 3 El pH de la composición farmacéutica es un factor adicional que es capaz de alterar la solubilidad de un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima o una proteína) en una composición farmacéutica acuosa. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen un o más amortiguadores. En algunas modalidades, las composiciones de acuerdo con la invención contienen una cantidad de amortiguador suficiente para mantener el pH óptimo de dicha composición entre aproximadamente 4.0-8.0, entre aproximadamente 5.0-7.5, entre aproximadamente 5.5-7.0, entre aproximadamente 6.0-7.0 y entre aproximadamente 6.0-7.5. En otras modalidades, el amortiguador comprende hasta aproximadamente 50 mM (por ejemplo, hasta aproximadamente 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM) de fosfato de sodio. Los amortiguadores adecuados incluyen, por ejemplo acetato, succinato, citrato, fosfato, otros ácidos orgánicos y tris(hidroximetil)aminometano ("Tris"). Las concentraciones del amortiguador adecuadas pueden ser desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 100 mM, o desde aproximadamente 3 mM hasta aproximadamente 20 mM, dependiendo de, por ejemplo, el amortiguador y la isotonicidad deseada de la formulación. En algunas modalidades, un agente de amortiguamiento adecuado está presente en una concentración de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, o 100 mM.

En algunas modalidades, las formulaciones contienen un agente de isotonicidad para mantener las formulaciones isotónicas. Como se utiliza con respecto al suministro IT, por "isotónica" se tiene por entendido que la formulación de interés tiene esencialmente la misma osmolaridad que el CSF humano. Las formulaciones isotónica generalmente tendrán una osmolaridad desde aproximadamente 240 mOsm/kg hasta aproximadamente 350 mOsm/kg. La isotonicidad se puede medir utilizando, por ejemplo, una presión de vapor u osmómetros de tipo punto de congelación. Los agentes de isotonicidad ejemplares incluyen, pero no se limitan a, glicina, sorbitol, manitol, cloruro de sodio y arginina. En algunas modalidades, los agentes isotónicos adecuados pueden estar presentes en las formulaciones en una concentración desde aproximadamente 0.01 - 5% (por ejemplo, 0.05, 0.1 , 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0 o 5.0%) en peso.

En algunas modalidades, las formulaciones pueden contener un agente de estabilización para proteger la proteina. Típicamente, un agente de estabilización adecuado es un azúcar no reductor tal como sacarosa, rafinosa, trehalosa, o aminoácidos tales como glicina, arginina y metionina. La cantidad de agente de estabilización en una formulación es generalmente tal que la formulación será isotónica. Sin embargo, las formulaciones hipertónicas también pueden ser adecuadas. Además, la cantidad de agente de estabilización no debe ser muy baja tal que ocurra una cantidad inaceptable de degradación/agregación del agente terapéutico. Las concentraciones ejemplares del agente de estabilización en la formulación pueden variar dentro del rango desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 400 mM (por ejemplo, desde aproximadamente 30 mM hasta aproximadamente 300 mM, y desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 100 mM), o alternativamente, desde 0.1 % hasta 15% (por ejemplo, desde 1 % hasta 10%, desde 5% hasta 15%, desde 5% hasta 10%) en peso. En algunas modalidades, la proporción de la cantidad de masa del agente de estabilización y el agente terapéutico es aproximadamente 1 :1. En otras modalidades, la proporción de la cantidad de masa del agente de estabilización y el agente terapéutico puede ser aproximadamente 0.1 :1 , 0.2:1 , 0.25:1 , 0.4:1 , 0.5:1 , 1 :1 , 2:1 , 2.6:1 , 3:1 , 4:1 , 5: 1 , 10:1 , o 20: 1. En algunas modalidades, el agente de estabilización adecuado para la liofilización es también un lioprotector.

Las composiciones farmacéuticas, las formulaciones y los métodos relacionados de la invención son útiles para suministrar una variedad de agentes terapéuticos al CNS de un sujeto (por ejemplo, por vía intratecal, por vía intraventricular o por vía intracisternal) y para el tratamiento de los padecimientos asociados. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son particularmente útiles para suministrar proteínas y enzimas a sujetos que sufren de desórdenes por almacenamiento lisosómico.

En algunas modalidades, es deseable agregar un surfactante a las formulaciones. Los surfactantes ejemplares incluyen surfactantes no iónicos tales como los Polisorbatos (por ejemplo, Polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxamero 188); tritón; doceciisulfato de sodio (SDS); laurel sulfato de sodio; octil glucósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil-, o estearil-sulfobetaina; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, o cetil-betaina; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, o ¡soestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropil); miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil-taurato de sodio, o metil ofeil-taurato de disodio; y la serie MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilen glicol, polipropil glicol, y copolímeros de etilen y propilen glicol (por ejemplo, Pluronics, PF68, etc). Típicamente, la cantidad de surfactante agregado es tal que reduce la agregación de la proteina y minimiza la formación de particulados o efervescencias. Por ejemplo, un surfactante puede estar presente en una formulación en una concentración desde aproximadamente 0.001 - 0.5% (por ejemplo, aproximadamente 0.005 -0.05%, o 0.005 - 0.01%). Particularmente, un surfactante puede estar presente en una formulación en una concentración de aproximadamente 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, o 0.5%, etcétera.

En algunas modalidades, las formulaciones adecuadas pueden adicionalmente incluir uno o más agentes espesantes, en particular, para formulaciones liofilizadas. Un "agente espesante" es un compuesto que agrega masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada. Por ejemplo, un agente espesante puede mejorar la apariencia de la torta liofilizada (por ejemplo, una torta liofilizada esencialmente uniforme). Los agentes espesantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, lactosa, manitol, glicina, sacarosa, trehalosa, almidón de hidroxietilo. Las concentraciones ejemplares de los agentes espesantes son desde aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 10% (por ejemplo, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, y 10.0%).

Las formulaciones de conformidad con la presente invención se pueden evaluar con base en el análisis de la calidad del producto, el tiempo de reconstitución (si está liofilizado), la calidad de la reconstitución (si está liofilizado), el alto peso molecular, la humedad, y l temperatura de transición al vidrio. Típicamente, la calidad de la proteína y el análisis del producto incluyen un análisis de la tasa de degradación del producto utilizando métodos que incluyen, pero no se limitan a, HPLC de exclusión de tamaño (SE-HPLC), HPLC de intercambio de cationes (CEX-HPLC), difracción dé rayos X (XRD), calorimetría de exploración diferencial modulada (mDSC), HPLC en fase inversa (RP-HPLC), dispersión de la luz multi-ángulo ( ALS), fluorescencia, absorción ultravioleta, nefelometría, electroforesis capilar (CE), SDS-PAGE, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la evaluación del producto de conformidad con la presente invención puede incluir una etapa de evaluar la apariencia (ya sea apariencia de líquido o de torta).

Generalmente, las formulaciones (liofilizadas o acuosas) se pueden almacenar durante periodos de tiempo extendidos a temperatura ambiente. La temperatura de almacenamiento típicamente puede variar dentro del rango desde 0°C hasta 45°C (por ejemplo, 4°C, 20°C, 25°C, 45°C, etc.). Las formulaciones se pueden almacenar durante un periodo de meses hasta un periodo de años. El tiempo de almacenamiento generalmente será 24 meses, 12 meses, 6 meses, 4.5 meses, 3 meses, 2 meses o 1 mes. Las formulaciones se pueden almacenar directamente en el recipiente utilizado para la administración, eliminando etapas de transferencia.

Las formulaciones se pueden almacenar directamente en el recipiente de liofilización (si están liofilizadas), el cual también puede funcionar como el recipiente de reconstitución, eliminando etapas de transferencia. Alternativamente, las formulaciones del producto liofilizadas se pueden medir en incrementos más pequeños para el almacenamiento. El almacenamiento generalmente debería evitar circunstancias que conduzcan a la degradación de las proteínas, incluyendo pero no limitado a la exposición a la luz del sol, radiación UV, otras formas de radiación electromagnética, calor o frío excesivo, rápido choque térmico, y choque mecánico.

En algunas modalidades, las formulaciones de acuerdo con la presente invención están en una forma líquida o acuosa. En algunas modalidades, las formulaciones de la presente invención están liofilizadas. Tales formulaciones liofilizadas se pueden reconstituir agregando uno o más diluyentes a las mismas antes de la administración a un sujeto. Los diluyentes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua estéril, agua bacteriostática para inyección y solución salina estéril. Preferiblemente, tras la reconstitución, el agente terapéutico ahí contenido es estable, soluble y demuestra tolerabilidad tras la administración a un sujeto.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se caracterizan por su tolerabilidad. Como se utiliza aquí, los términos "tolerable" y "tolerabilidad" se refieren a la habilidad de las composiciones farmacéuticas de la presente invención para no producir como respuesta una reacción adversa en el sujeto a quién se administra tal composición, o alternativamente para no producir como respuesta una reacción adversa seria en el sujeto a quién se administra tal composición. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son bien toleradas por el sujeto a quién se administran tales composiciones.

Dispositivo para la Suministro intratecal Diversos dispositivos se pueden utilizar para la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención. En algunas modalidades, un dispositivo para la administración intratecal contiene un puerto de acceso de fluido (por ejemplo, un puerto inyectable); un cuerpo hueco (por ejemplo, un catéter) que tiene un primer orificio de flujo en comunicación fluida con el puerto de acceso de fluido y un segundo orificio de flujo configurado para la inserción en la médula espinal; y un mecanismo de aseguramiento para asegurar la inserción del cuerpo hueco en la médula espinal. Como un ejemplo no limitante mostrado en la Figura 42, un mecanismo de aseguramiento adecuado contiene uno o más pernos o nudos montados en la superficie del cuerpo hueco y un anillo suturado ajustable sobre los uno o más pernos o nudos para prevenir que el cuerpo hueco (por ejemplo, el catéter) se deslice fuera de la médula espinal. En diversas modalidades, el puerto de acceso de fluido comprende un depósito. En algunas modalidades, el puerto de acceso de fluido comprende una bomba mecánica (por ejemplo, una bomba de infusión). En algunas modalidades, se conecta un catéter implantado a ya sea un depósito (por ejemplo, para el suministro del bolo), o una bomba de infusión. El puerto de acceso de fluido se puede implantar o puede ser externo.

En algunas modalidades, la administración intratecal se puede realizar mediante ya sea punción lumbar (es decir, bolo lento) o por medio de un sistema de suministro de catéter con puerto (es decir, infusión o bolo). En algunas modalidades, el catéter se inserta entre las láminas de las vértebras lumbares y la punta se rosca hasta el espacio tecal al nivel deseado (generalmente L3-L4) (Figura 43A-Figura 43C).

Con relación a la administración intravenosa, un volumen de dosis única adecuado para la administración intratecal es típicamente pequeño. Típicamente, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención mantiene el balance de la composición del CSF así como la presión intracraneal del sujeto. En algunas modalidades, el suministro intratecal se realiza sin la remoción correspondiente de CSF a partir de un sujeto. En algunas modalidades, un volumen de dosis única adecuado puede ser por ejemplo, menor que aproximadamente 10 mi, 8 mi, 6 mi, 5 mi, 4 mi, 3 mi, 2 mi, 1.5 mi, 1 mi, o 0.5 mi. En algunas modalidades, un volumen de dosis única adecuado puede ser aproximadamente 0.5-5 mi, 0.5-4 mi, 0.5-3 mi, 0.5-2 mi, 0.5-1 mi, 1-3 mi, 1-5 mi, 1.5-3 mi, 1-4 mi, o 0.5-1.5 mi. En algunas modalidades, la suministro intratecal de acuerdo con la presente invención involucra una etapa de remover primero una cantidad deseada de CSF. En algunas modalidades, primero se remueven menos de aproximadamente 10 mi (por ejemplo, menos de aproximadamente 9 mi, 8 mi, 7 mi, 6 mi, 5 mi, 4 mi, 3 mi, 2 mi, 1 mi) de CSF antes de la administración IT. En esos casos, un volumen de dosis única adecuado puede ser por ejemplo, mayor que aproximadamente 3 mi, 4 mi, 5 mi, 6 mi, 7 mi, 8 mi, 9 mi, 10 mi, 15 mi, o 20 mi.

Diversos otros dispositivos se pueden utilizar para efectuar la administración intratecal de una composición terapéutica. Por ejemplo, las formulaciones que contienen enzimas deseadas se pueden administrar utilizando un depósito de Ommaya que es de uso común para administrar de manera intratecal fármacos para la carcinomatosis meníngea (Lancet 2: 983-84, 1963). Más específicamente, en este método, un tubo ventricular se inserta a través de un agujero formado en el cuerno anterior y se conecta a un depósito de Ommaya instalado bajo el cuero cabelludo, y el depósito se pincha subcutáneamente para suministrar de manera intratecal la enzima particular que se reemplaza, que se inyecta en el depósito. Otros dispositivos para la administración intratecal de formulaciones o composiciones terapéuticas a un individuo se describen en la Patente Norteamericana No. 6,217,552, incorporada aquí por referencia. Alternativamente, el fármaco se puede administrar por vía intratecal, por ejemplo, mediante una inyección sencilla, o una infusión continua. Se debe entender el tratamiento de la dosis puede estar en la forma de una sola administración de la dosis o múltiples dosis.

Para la inyección, las formulaciones de la invención se pueden formular en soluciones liquidas. Además, la enzima se puede formular en forma sólida y se puede re-disolver o suspender inmediatamente antes del uso. También se incluyen las formas liofilizadas. La inyección puede ser, por ejemplo, en la forma de una inyección en bolo o infusión continua (por ejemplo, utilizando bombas de infusión) de la enzima.

En una modalidad de la invención, la enzima se administra mediante inyección cerebroventricular lateral en el cerebro de un sujeto. La inyección se puede hacer, por ejemplo, a través de un trepanado hecho en el cráneo del sujeto. En otra modalidad, la enzima y/u otra formulación farmacéutica se administra a través de una derivación quirúrgicamente insertada en el ventrículo cerebral de un sujeto. Por ejemplo, la inyección se puede hacer en los ventrículos laterales, que son mayores. En algunas modalidades, la inyección también se puede hacer en los tercer y cuarto ventrículos menores.

En todavía otra modalidad, las composiciones farmacéuticas utilizadas en la presente invención se administran mediante inyección en la cisterna magna, o el área lumbar de un sujeto.

En otra modalidad del método de la invención, la formulación farmacéuticamente aceptable proporciona un suministro sostenida, por ejemplo, una "lenta liberación" de la enzima u otra composición farmacéutica utilizada en la presente invención, a un sujeto durante al menos una, dos, tres, cuatro semanas o periodos de tiempo más largos después de que la formulación farmacéuticamente aceptable se administra al sujeto.

Como se utiliza aquí, el término "suministro sostenido" se refiere al suministro continuo de una formulación farmacéutica de la invención in vivo durante un periodo de tiempo después de la administración, preferiblemente al menos varios días, una semana o varias semanas. El suministro sostenida de la composición se puede demostrar mediante, por ejemplo, el efecto terapéutico continuado de la enzima con el paso del tiempo (por ejemplo, el suministro sostenida de la enzima se puede demostrar por la cantidad reducida continuada de gránulos de almacenamiento en el sujeto). Alternativamente, el suministro sostenida de la enzima se puede demostrar detectando la presencia de la enzima in vivo con el paso del tiempo.

Suministro a los Tejidos Objetivo Como se discute anteriormente, una de las características sorprendentes e importantes de la presente invención es que los agentes terapéuticos, en particular, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, proteínas de fusión Naglu) administradas utilizando los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención son capaces de difundirse efectivamente y extensivamente a través de la superficie del cerebro y penetrar varias capas o regiones del cerebro, incluyendo regiones profundas del cerebro. Además, los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención suministran efectivamente las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) a diversos tejidos, neuronas o células de la médula espinal, incluyendo la región lumbar, que es difícil de tener como objetivo por los métodos de suministro al CNS existentes tales como la inyección ICV. Además, los métodos inventivos y las composiciones de la presente invención suministran una cantidad suficiente de enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteina de fusión Naglu) al torrente sanguíneo y a diversos órganos periféricos y tejidos.

De esta manera, en algunas modalidades, una enzima de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) se suministra al sistema nervioso central de un sujeto. En algunas modalidades, una enzima re reemplazo (por ejemplo una proteína de fusión) se suministra a uno o más de los tejidos objetivo del cerebro, médula espinal, y/u órganos periféricos. Como se utiliza aquí, el término "tejidos objetivo" se refiere a cualquier tejido que sea afectado por el padecimiento por almacenamiento lisosómico a ser tratado o cualquier tejido en que la enzima lisosómica deficiente sea normalmente expresada. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales hay una cantidad detectable o anormalmente alta de sustrato de la enzima, por ejemplo almacenada en los lisosomas celulares del tejido, en pacientes que sufren de o susceptibles al padecimiento por almacenamiento lisosómico. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos que despliegan una característica, síntoma o patología asociada al padecimiento. En algunas modalidades, los tejidos objetivo incluyen aquellos tejidos en los cuales la enzima lisosómica deficiente es normalmente expresada en un nivel elevado. Como se utiliza aquí, un tejido objetivo puede ser un tejido objetivo del cerebro, un tejido objetivo de la médula espinal y/o un tejido objetivo periférico. Los tejidos objetivo ejemplares se describen en detalle debajo.

Tejidos Objetivo del Cerebro En general, el cerebro se puede dividir en diferentes regiones, capas y tejidos. Por ejemplo, el tejido meníngeo es un sistema de membranas que envuelve el sistema nervioso central, incluyendo el cerebro. Las meninges contienen tres capas, incluyendo la duramadre, aracnoides y piamadre. En general, la función primaria de las meninges y del fluido cerebroespinal es proteger el sistema nervioso central. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a una o más capas de las meninges.

El cerebro tiene tres subdivisiones primarias, incluyendo el cerebro, el cerebelo, y el tallo cerebral. Los hemisferios cerebrales, que están situados por encima de la mayoría de las otras estructuras del cerebro y que están cubiertos con una capa cortical. Debajo del cerebro yace el tallo cerebral, el cual se parece a un tallo en el cual está adjunto el cerebro. En la parte trasera del encéfalo, debajo del cerebro y detrás del tallo cerebral, está el cerebelo.

El diencéfalo, que se localiza cerca de la línea media del cerebro y por encima del mesencéfalo, contiene el tálamo, el metatálamo, el hipotálamo, el epitálamo, el pretálamo, y el pretectum. El mesencéfalo, también llamado cerebro medio, contiene el tectum, tegumentum, mesocoelia ventricular, y pedúnculos cerebrales, el núcleo rojo, y el núcleo del nervio craneal III. El mesencéfalo se asocia con la vista, el oído, el control motor, el sueño/despertar, el estado de alerta, y la regulación de la temperatura.

Las regiones de tejidos del sistema nervioso central, incluyendo el cerebro, se pueden caracterizar con base en la profundidad de los tejidos. Por ejemplo, los tejidos del CNS (por ejemplo, el cerebro) se pueden caracterizar como tejidos superficiales o poco profundos, tejidos de profundidad media, y/o tejidos profundos.

De acuerdo con la presente invención, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) se puede suministrar a cualquier tejido(s) objetivo del cerebro apropiado asociado con un padecimiento particular a ser tratado en un sujeto. En algunas modalidades, una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro superficial o poco profundo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro de profundidad media. En algunas modalidades, una proteina terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro al tejido objetivo del cerebro profundo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a una combinación de tejido objetivo del cerebro superficial o poco profundo, tejido objetivo del cerebro de profundidad media, y/o tejido objetivo del cerebro profundo. En algunas modalidades, una proteína terapéutica de conformidad con la presente invención se suministro a un tejido del cerebro profundo al menos 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm o más abajo (o interno a) la superficie externa del cerebro.

En algunas modalidades, enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteina de fusión Naglu) se suministran a uno o más tejidos superficiales o poco profundos del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se localizan dentro de 4 mm de la superficie del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se seleccionan a partir de tejidos de la piamadre, tejidos de la cinta cortical cerebral, hipocampo, espacio de Virchow-Robin, vasos sanguíneos dentro del espacio VR, el hipocampo, porciones del hipotálamo en la superficie inferior del cerebro, los tractos y nervios ópticos, las proyecciones y el bulbo olfatorio, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) se suministran a uno o más tejidos profundos del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos superficiales o poco profundos que se tienen como objetivo del cerebro se localizan 4 mm (por ejemplo, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, o 10 mm) debajo de (o interno a) la superficie del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos profundos que se tienen como objetivo del cerebro incluyen la cinta cortical cerebral. En algunas modalidades, los tejidos profundos que se tienen como objetivo del cerebro incluyen uno o más del diencéfalo (por ejemplo, el hipotálamo, tálamo, pretálamo, subtálamo, etcétera), metencéfalo, núcleo Ientiforme, ganglios básales, núcleo caudado, putamen, amígdala, globo pálido, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteina de fusión Naglu) se suministran a uno o más tejidos del cerebelo. En ciertas modalidades, los uno o más tejidos que se tienen como objetivo del cerebelo se seleccionan a partir del grupo que consiste de tejidos de la capa molecular, tejidos de la capa de células de Purkinje, tejidos de la capa celular Granular, pedúnculos cerebelosos, y combinación de los mismos. En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteina de fusión Naglu) se suministran a uno o más tejidos profundos del cerebelo incluyendo, pero no limitado a, tejidos de la capa de células de Purkinje, tejidos de la capa celular Granular, tejido de la sustancia blanca cerebelosa profunda (por ejemplo, profunda con relación a la capa celular Granular), y tejido del núcleo cerebeloso profundo.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteina de fusión Naglu) se suministran a uno o más tejidos del tallo cerebral. En algunas modalidades, los uno o más tejidos que se tienen como objetivo del tallo cerebral incluyen tejido de la sustancia blanca del tallo cerebral y/o tejido del núcleo del tallo cerebral.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) se suministran a diversos tejidos del cerebro incluyendo, pero no limitado a, la materia gris, sustancia blanca, áreas periventriculares, pia-aracnoides, meninges, neocorteza, cerebelo, tejidos profundos en la corteza cerebral, capa molecular, región del núcleo caudado/putamen, cerebro medio, regiones profundas del puente de Varolio o la médula, y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) se suministran a diversas células en el cerebro incluyendo, pero no limitado a, las neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meníngeas. En algunas modalidades, una proteína terapéutica se suministra a los oligodendrocitos de la sustancia blanca profunda.

Médula Espinal En general, las regiones o tejidos de la médula espinal se pueden caracterizar con base en la profundidad de los tejidos. Por ejemplo, los tejidos de la médula espinal se pueden caracterizar como tejidos superficiales o poco profundos, tejidos de profundidad media, y/o tejidos profundos.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) se suministran a uno o más tejidos superficiales o poco profundos de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido superficial o poco profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal se localiza dentro de 4 mm desde la superficie de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido superficial o poco profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal contiene piamadre y/o los tractos de la sustancia blanca.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) se suministran a uno o más tejidos profundos de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal se localiza interno a 4 mm desde la superficie de la médula espinal. En algunas modalidades, un tejido profundo que se tiene como objetivo de la médula espinal contiene materia gris de la médula espinal y/o células ependimarias.

En algunas modalidades, las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) se suministran a las neuronas de la médula espinal.

Tejidos Periféricos Objetivo Como se utiliza aquí, los órganos o tejidos periféricos se refieren a cualquier órgano o tejido que no sea parte del sistema nervioso central (CNS). Los tejidos periféricos objetivo pueden incluir, pero no se limitan a, el sistema sanguíneo, hígado, riñon, corazón, endotelio, médula ósea y células derivadas de la médula ósea, bazo, pulmón, nodo linfático, hueso, cartílago, ovario y testículo. En algunas modalidades, una proteina terapéutica (por ejemplo, una enzima de reemplazo) de conformidad con la presente invención se suministro a uno o más de los tejidos periféricos objetivo.

Biodistribución y biodisponibilidad En diversas modalidades, una vez que se suministro al tejido objetivo, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) se localiza intracelularmente Por ejemplo, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima) se puede localizar en los exones, axones, lisosomas, mitocondria o vacuolas de una célula objetivo (por ejemplo, las neuronas tales como las células de Purkinje). Por ejemplo, en algunas modalidades, las enzimas administradas por vía intratecal demuestran una dinámica de translocación tal que la enzima se mueve dentro del espacio perivascular (por ejemplo, mediante mecanismos convectivos asistidos por pulsaciones). Además, los mecanismos de transporte axónico activos referentes a la asociación de la proteina o enzima administrada con los neurofilamentos, también pueden contribuir a o de otra manera pueden facilitar la distribución de las enzimas o proteínas administradas por vía intratecal en los tejidos más profundos del sistema nervioso central.

En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr actividades o niveles terapéuticamente o clínicamente efectivos en diversos tejidos objetivo aquí descritos. Como se utiliza aquí, una actividad o nivel terapéuticamente o clínicamente efectivo es una actividad o nivel suficiente para conferir un efecto terapéutico en un tejido objetivo. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por cualquier prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicación de o siente un efecto). Por ejemplo, una actividad o nivel terapéuticamente o clínicamente efectivo puede ser una actividad o nivel enzimático que es suficiente para mejorar los síntomas asociados con el padecimiento en el tejido objetivo (por ejemplo, almacenamiento GAG).

En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático que es al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de la actividad o nivel normal de la enzima lisosómica correspondiente en el tejido objetivo. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático que se incrementa por al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 yeces, 9 veces o 10 veces según se compara a un control (por ejemplo, las actividades o niveles endógenos sin el tratamiento). En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático incrementado al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg o 600 nmol/hr/mg en un tejido objetivo.

En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles para tener como objetivo la región lumbar. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede lograr una actividad o nivel enzimático incrementado en la región lumbar de al menos aproximadamente 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, o 10,000 nmol/hr/mg.

En general, los agentes terapéuticos (por ejemplo, las enzimas de reemplazo) suministrados de acuerdo con la presente invención tienen una vida media suficientemente larga en el CSF y los tejidos objetivo del cerebro, la médula espinal, y los órganos periféricos. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede tener una vida media de al menos aproximadamente 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, hasta 3 días, hasta 7 días, hasta 14 días, hasta 21 días o hasta un mes. En algunas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención puede retener una actividad o nivel detectable en el CSF o el torrente sanguíneo después de 12 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 66 horas, 72 horas, 78 horas, 84 horas, 90 horas, 96 horas, 102 horas, o una semana después de la administración. La actividad o el nivel detectable se puede determinar utilizando diversos métodos conocidos en el arte.

En ciertas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención logra una concentración de al menos 30 pg/ml en los tejidos del CNS y las células del sujeto después de la administración (por ejemplo, una semana, 3 días, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, o menos, después de la administración intratecal de la composición farmacéutica al sujeto). En ciertas modalidades, un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima de reemplazo) suministrado de acuerdo con la presente invención logra una concentración de al menos 20 pg/ml, al menos 15 pg/ml, al menos 10 pg/ml, al menos 7.5 pg/ml, al menos 5 pg/ml, al menos 2.5 pg/ml, al menos 1.0 pg/ml o al menos 0.5 pg/ml en los tejidos o células que se tienen como objetivo del sujeto (por ejemplo, los tejidos del cerebro o las neuronas) después de la administración a tal sujeto (por ejemplo, una semana, 3 días, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, o menos después de la administración intratecal de tales composiciones farmacéuticas al sujeto).

Tratamiento de Síndrome de Sanfilippo por Administración Intratecal El síndrome de Sanfilippo, o mucopolisacaridosis III (MPS III), es un trastorno genético raro caracterizado por la deficiencia de enzimas involucradas en la degradación de glicosaminoglicanos (GAG). En la ausencia de enzima, las moléculas GAG parcialmente degradadas no pueden ser separadas del cuerpo y acumularse en los lisosomas de varios tejidos, resultando en disfunción somática dispersada progresiva (Neufeld and Muenzer, 2001).

Se han identificado cuatro distintas formas de MPS III, designadas MPS MIA, B, C y D. Cada una representa una deficiencia en una de las cuatro enzimas involucradas en la degradación del heparan sulfato de GAG. Todas las formas incluyen grados variados de los mismos síntomas clínicos, que incluyen características faciales gruesas, hepatoesplenomegalia, opacidad corneal y deformidades esqueléticas. Más notable, sin embargo, es la severa y progresiva pérdida de la habilidad cognitiva, la cual es está unida n solamente a la acumulación de heparan sulfato en neuronas, pero también la subsecuente elevación de la gangliósidos GM2, GM3 y GD2 causados por acumulación de GAG primaria (Walkley 1998).

La mucopolisacaridosis tipo IIIB (MPS IIIB; síndrome de Sanfilippo B) es un trastorno recesivo autosomal que es caracterizado por una deficiencia de la enzima alfa-N-acetil-glucosaminidasa (Naglu). En la ausencia de esta enzima, la heparan sulfato de GAG se acumula en las lisosomas de neuronas y células gliales, con acumulación reducida fuera del cerebro.

Una característica clínica definitoria de este trastorno es la degeneración del sistema nervioso central (CNS), la cual resulta en la pérdida de, o la incapacidad para lograr, los niveles de desarrollo principales. La declinación cognoscitiva progresiva culmina en demencia y mortalidad prematura. La enfermedad típicamente se manifiesta la misma en niños pequeños, y la duración de vida de un individuo afectado en general no excede más allá de la adolescencia a los veinte años.

Composiciones y métodos de la presente invención se pueden usar para efectivamente tratar individuos que sufren de o son susceptibles al SanB. Los términos, "tratar" o "tratamiento", como se usa en la presente, se refieren a mejora de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, prevención o retraso del inicio de uno o más síntomas de la enfermedad, y/o disminución de la severidad o frecuencia de uno o más síntomas de la enfermedad En algunas modalidades, el tratamiento se refiere al alivio, mejora, inhibición retardo del inicio, reducción de la severidad yo la incidencia, completa, parcialmente o completamente, del deterioro neurológico en los pacientes con SanB. Como se usa aquí, el término "deterioro neurológico" incluye varios síntomas asociados con el deterioro del sistema nervioso central (por ejemplo, el cerebro y la médula espinal). Los síntomas del deterioro neurológico pueden incluir, por ejemplo, retardo del desarrollo, deterioro cognoscitivo progresivo, pérdida de la audición, desarrollo deteriorado del habla, déficit en las habilidades motoras, hiperactividad, agresividad yo perturbaciones del sueño, entre otros.

De este modo, en algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la reducción del almacenamiento lisosómico (por ejemplo, GAG) en varios tejidos. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a al almacenamiento lisosómico reducido en los tejidos objetivo del cerebro, las neuronas de la médula espinal yo los tejidos periféricos objetivo. En ciertas modalidades, el almacenamiento lisosómico se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles. En algunas modalidades, el almacenamiento lisosómico se reduce en al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces ó 10 veces, en comparación con los controles. En algunas modalidades, el almacenamiento lisosómico se determina por teñido de LAMP-1.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la vacuolización reducida en las neuronas (por ejemplo, las neuronas que contienen células de Purkinje). En ciertas modalidades, la vacuolización en las neuronas se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles. En algunas modalidades, la vacuolización se reduce en al menos 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces ó 10 veces, en comparación con los controles.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere una actividad incrementada de enzima Naglu en varios tejidos. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere una actividad incrementada de enzima Naglu en tejidos cerebrales objetivos, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos objetivos. En algunas modalidades, la actividad dé la enzima Naglu se incrementa por aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 1000% o más comparada con un control. En algunas modalidades, la actividad de la enzima Naglu se incrementa por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparada con un control. En algunas modalidades, la actividad enzimática Naglu incrementada es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg o más. En algunas modalidades, la actividad enzimática Naglu se incrementa en la región lumbar. En algunas modalidades, actividad enzimática Naglu incrementada en la región lumbar es al menos aproximadamente 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 10,000 nmol/hr/mg, o más.

En ciertas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en una reducción (por ejemplo, una reducción de aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% ó más) o la eliminación completa de la presencia, o alternativamente la acumulación, de uno o más marcadores patológicos o biológicos los cuales se asocian con las enfermedades por almacenamiento lisosómico. Tal reducción o eliminación puede ser particularmente evidente en las células y los tejidos del CNS (por ejemplo las neuronas y los oligodendrocitos). Por ejemplo, en algunas modalidades, después de administrar a los sujetos la composición farmacéutica de la presente invención, se demuestra o se logra una reducción en la acumulación del marcador lisosómico asociado con la proteína membranar 1 (LA P1) en las células y los tejidos del CNS de los sujetos (por ejemplo, en la corteza cerebral, el cerebelo, el núcleo caudal y el putamen, la materia blanca y/o el tálamo). La LAMP1 es una glicoproteína altamente expresada en las membranas lisosómicas y su presencia es elevada en muchos pacientes con un trastorno por almacenamiento lisosómico. (Meikle, et al., Clin. Chem. (1997) 43:1325-1335). La presencia o la ausencia de la LAMP1 en los pacientes (por ejemplo cuando se determina por teñido por LAMP) con una enfermedad por almacenamiento lisosómico, puede proporcionar por lo tanto un indicador útil de la actividad lisosómica y un marcador tanto para el diagnostico y el monitoreo de las enfermedades por almacenamiento lisosómico.

Por consiguiente, algunas modalidades de la presente invención se refieren a métodos para reducir o eliminar de otra manera la presencia o la acumulación de uno o más marcadores patológicos asociados con una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad por almacenamiento lisosómico). De forma similar, algunas modalidades de la invención se refieren a métodos para aumentar la degradación (o la velocidad de degradación) de uno o más marcadores patológicos o biológicos (por ejemplo, la LAMP1 ) asociados con las enfermedades por almacenamiento lisosómico.

En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la progresión reducida de la pérdida de la actividad cognoscitiva. En ciertas modalidades, la progresión de la pérdida de la habilidad cognoscitiva se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles. En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la reducción en el retardo del desarrollo. En ciertas modalidades, el retardo del desarrollo se reduce en aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más en comparación con los controles En algunas modalidades, el tratamiento se refiere a la supervivencia aumentada (por ejemplo, tiempo de supervivencia). Por ejemplo, el tratamiento puede resultar en una esperanza de vida aumentada de los pacientes. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en una esperanza de vida aumentada de los pacientes en más de aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 100%, aproximadamente 105%, aproximadamente 110%, aproximadamente 115%, aproximadamente 120%, aproximadamente 125%, aproximadamente 130%, aproximadamente 135%, aproximadamente 140%, aproximadamente 145%, aproximadamente 150%, aproximadamente 155%, aproximadamente 160%, aproximadamente 165%, aproximadamente 170%, aproximadamente 175%, aproximadamente 180%, aproximadamente 185%, aproximadamente 190%, aproximadamente 195%, aproximadamente 200%, o más, en comparación con la esperanza de vida promedio de uno o más individuos de control con enfermedades similares, sin tratamiento. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en una esperanza de vida aumentada de los pacientes en más de aproximadamente 6 meses, aproximadamente 7 meses, aproximadamente 8 meses, aproximadamente 9 meses, aproximadamente 10 meses, aproximadamente 11 meses, aproximadamente 12 meses, aproximadamente 2 años, aproximadamente 3 años, aproximadamente 4 años, aproximadamente 5 años, aproximadamente 6 años, aproximadamente 7 años, aproximadamente 8 años, aproximadamente 9 años, aproximadamente 10 años, o más, en comparación con la esperanza de vida promedio de uno o más individuos de control con enfermedades similares, sin tratamiento. En algunas modalidades, el tratamiento de acuerdo con la presente invención resulta en la supervivencia a largo plazo de los pacientes. Como se usa aquí, el término "supervivencia a largo plazo" se refiere a un tiempo se supervivencia o esperanza de vida mayor a aproximadamente 40 años, 45 años, 50 años, 55 años, 60 años, o más.

Los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir" como se usan aquí, indican valores que son relativos a los controles. En algunas modalidades, los controles adecuados son las mediciones de los niveles de referencia, como por ejemplo las mediciones en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito aquí, o una medición en un individuo de control (o en varios individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito aquí. Un "individuo de control" es un individuo que padece SanB, quién tiene aproximadamente la misma edad y/o el género que el individuo que está siendo tratado (para garantizar que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y el o los individuos de control, sean comparables).

El individuo (conocido también como "paciente" o "sujeto") que está siendo tratado es un individuo (un humano fetal, infante, niño, adolescente, o adulto) que tiene SanB o que tiene el potencial de desarrollar SanB. El individuo puede tener expresión y/o actividad residual endógena residual de Naglu, o no tiene actividad mensurable. Por ejemplo, los individuos que tienen SanB pueden tener niveles de expresión de Naglu que son menores a aproximadamente 30-50%, menores a aproximadamente 25-30%, menores a aproximadamente 20-25%, menores a aproximadamente 1 5-20%, menores a aproximadamente 10-15%, menores a aproximadamente 5-10%, menores a aproximadamente 0.1-5% de los niveles de expresión normales de Naglu.

En algunas modalidades, el individuo es un individuo quien ha sido recientemente diagnosticado con la enfermedad. Típicamente, el tratamiento temprano (comenzando tan pronto como sea posible después del diagnóstico) es importante para minimizar los efectos de la enfermedad y maximizar los beneficios del tratamiento.

Tolerancia Inmunolóqica Por lo general, la administración intratecal de un agente terapéutico (por ejemplo, una proteina de fusión Naglu) de acuerdo con la presente invención, no resulta en efectos adversos seros en el sujeto. Como se usa aquí, los efectos adversos severos inducen, pero no se limitan a, respuesta inmunológica sustancial, toxicidad, o muerte. Como se usa aquí, "respuesta inmunológica sustancial" se refiere a respuestas inmunológicas severas o serias, tales como respuestas inmunológicas de células T adaptativas.

Por lo tanto, en muchas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran terapia inmunosupresora concurrente (es decir, cualquier terapia inmunosupresora usada como pre- tratamiento/pre-condicionamiento o en paralelo con el método). En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran una inducción de la tolerancia inmunológica en los sujetos que están siendo tratados. En algunas modalidades, los métodos inventivos de acuerdo con la presente invención no involucran un pre-tratamiento o pre acondicionamiento de los sujetos usando agentes inmunosupresores de células T.

En algunas modalidades, la administración intratecal de agentes terapéuticos puede desarrollar una respuesta inmunológica contra estos agentes. Por lo tanto, en algunas modalidades, puede ser útil hacer que los sujetos que reciben la enzima de reemplazo, se vuelvan tolerantes a la terapia de reemplazo de enzimas. La tolerancia inmunológica puede ser inducida usando varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un régimen inicial de 30-60 días de un agente inmunosupresor de células T, tal como ciclosporina A (CsA) y un agente anti proliferativo, . tal como azatioprina (Aza), combinada con infusiones intratecales semanales de dosis bajas de una enzima de reemplazo.

Cualquier agente inmunosupresor conocido por los especialistas experimentados puede ser empleado junto con una terapia de combinación de la invención. Tales agentes inmunosupresores incluyen pero no se limitan a ciclosporina, FK506, rapamicina, CTLA4-lg, y agentes anti-TNF tales como etanercept (véase, por ejemplo, Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kulberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51 , 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret et al., 1999, Ann. N. Y. Acad. Sci 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1-24; Gaziev et al., 1999, Bone Marrow Transplant. 25, 689-696; Henry, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283). El anticuerpo del receptor anti-IL2 (subunidad alfa), daclizumab (por ejemplo, Zenapax.TM.), el cual ha demostrado resultar efectivo en los pacientes de trasplante, también puede ser usado como un agente inmunosupresor (véase, por ejemplo, Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999, Drugs R. D. 1 , 55-60; Berard et al., 1999, Pharmacotherapy 19, 1127-1137; Eckhoff et al., 2000, Transplantation 69, 1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int. 13, 151-159). Los agentes inmunosupresores adicionales incluyen, pero no se limitan a anti-CD2 (Branco et al., 1999, Transplantations 68, 1588-1596; Przepiorka et al., 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishwild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 238-152), y el ligando anti-CD40 (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164, 1230-1235).

Administración Los métodos inventivos de la presente invención contemplan administraciones individuales asi como múltiples de una cantidad efectiva terapéuticamente de enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteina de fusión Naglu) descritos aquí. Las enzimas de reemplazo (por ejemplo, una proteina de fusión Naglu) pueden ser administrados a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, la severidad y la extensión de la condición del sujeto. En algunas modalidades, una cantidad efectiva terapéuticamente de una enzima de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu) de la presente invención, puede ser administrada periódicamente de forma intratecal, a intervalos regulares (por ejemplo, una vez al año, una vez cada seis meses, una vez cada cinco meses, una vez cada tres meses, bimensualmente (una vez cada dos meses), mensualmente (una vez al mes), bisemanalmente (una vez cada dos semanas), semanalmente).

En algunas modalidades, la administración intratecal puede ser usada en conjunción con otras rutas de administración (por ejemplo, de forma intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, transdérmicos, o a través de las mucosas (por ejemplo, oralmente o nasalmente)). En algunas modalidades, esas otras rutas de administración (por ejemplo, la administración intravenosa) puede ser llevada a cabo no más frecuentemente que la administración bisemanalmente, mensualmente, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses.

Como se usa aquí, el término "cantidad efectiva terapéuticamente" se determina en gran medida con base en la cantidad total del agente terapéutico contenido en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. En general, una cantidad efectiva terapéuticamente es suficiente para lograr un beneficio significativo a los sujetos (por ejemplo, tratar, modular, curar, evitar y/o aliviar la enfermedad o la condición subyacente). Por ejemplo, una cantidad efectiva terapéuticamente puede ser una cantidad suficiente para lograr un efecto terapéutico y/o profiláctico suficiente, tal como una cantidad suficiente para modular los receptores de la enzima lisosómica o sus actividad para tratar por ello tal enfermedad por almacenamiento lisosómico o los síntomas de la misma (por ejemplo, una reducción o eliminación de la presencia o la incidencia de "los cuerpos cebra" o la vacuolización celular enseguida de la administración de las composiciones de la presente invención a los sujetos). En general, la cantidad un agente terapéutico (por ejemplo, una enzima lisosómica recombinante) administrada a los sujetos en necesidad de la misma, dependerá de las características de los sujetos. Tales características incluyen la condición, la severidad de la enfermedad, la salud general, la edad, el sexo y el peso corporal de los sujetos. Las personas con experiencia ordinaria en la técnica serán capaces de determinar fácilmente las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores relacionados. Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos tanto objetivos y subjetivos para identificar los rangos de dosificación óptimos.

Una cantidad efectiva terapéuticamente se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender varias dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad efectiva terapéuticamente (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. También, la cantidad efectiva terapéuticamente (y/o la dosis unitaria), para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores incluyendo el trastorno que está siendo tratado y la severidad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición especifica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo la dieta del paciente; el tiempo de administración, la ruta de administración, y/o la tasa de expresión o de metabolismo de la proteina de fusión especifica empleada; la duración del tratamiento; y los factores similares que son bien conocidos en las técnica médicas.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente varía desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 500 mg/kg en peso del cerebro, por ejemplo, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 400 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 300 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 200 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 100 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 90 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 80 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 70 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 60 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 50 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 40 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.05 mg/kg en peso del cerebro a 30 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 25 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 20 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 15 mg/kg en peso del cerebro, desde aproximadamente 0.005 mg/kg en peso del cerebro a 10 mg/kg en peso del cerebro.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente es mayor a aproximadamente 0.1 mg/kg, mayor a aproximadamente 0.5 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 1.0 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 3 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 5 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 10 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 15 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 20 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 30 mg/kg en peso del cerebro, mayos a aproximadamente 40 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 50 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 60 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 70 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 80 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 90 mg/kg en peso del cerebro, mayor a 100 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 150 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 200 mg/kg en peso del cerebro, mayor a 250 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 300 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 350 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 400 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 450 mg/kg en peso del cerebro, mayor a aproximadamente 500 mg/kg en peso del cerebro.

En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente también puede ser definida por los mg/kg en peso del cerebro. Como apreciaran las personas experimentadas en la técnica, el peso del cerebro y el peso corporal pueden estar correlacionados. Dekaban AS. "Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights", Ann Neurol 1978; 4:345-56. Por lo tanto, en algunas modalidades, las dosis pueden ser convertidas como se muestra en la Tabla 4.

TABLA 4 Correlación entre el Peso del Cerebro, el peso corporal y las edades de hombres En algunas modalidades, la dosis efectiva terapéuticamente también puede ser definida por mg/15 ce de CSF. Como apreciarán las personas experimentadas en la técnica, las dosis efectivas terapéuticamente con base en los pesos del cerebro y los pesos corporales, pueden ser convertidas a mg/15 ce de CSF. Por ejemplo, el volumen de CSF en humanos adultos es aproximadamente 150 ml_ (Johanson CE, et al. , "Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease", Cerebrospinal Fluid Res. 2008 Mayo 14; 5: 10). Por lo tanto, las inyecciones de dosis unitarias de 0.1 mg a 50 mg de proteina a adultos, serian dosis de aproximadamente 0.01 mg/15 ce de CFS (0.1 mg) a 5.0 mg/15 ce de CSF (50 mg) dosis en adultos.

Se debe entender que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ser ajustados en el transcurso del tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el juicio profesional de las personas que administran o que supervisan la administración de la terapia de reemplazo de enzimas y aquellos rangos de dosificación establecidos aquí, son solo ejemplificantes y no tienen la intención de limitar el ámbito o la práctica de la invención reivindicada.

Kits La presente invención proporciona además kits y otros artículos de fabricación, los cuales contienen la formulación de la presente invención y proporcionan instrucciones para su reconstitución (si están liofilizadas) y/o uso. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir un recipiente, un IDDD, un catéter y cualquier otro artículo, dispositivo o kit útiles en la administración intratecal y la cirugía asociada. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas (por ejemplo, jeringas pre llenadas), ampolletas, cartuchos, depósitos o lyo-jects. El recipiente puede ser formado de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. En algunas modalidades, los recipientes son jeringas pre-llenadas. Las jeringas pre-llenadas incluyen, pero no se limitan a, jeringas de vidrio de borosilicato con revestimiento de silicona horneada, jeringas de vidrio de borosilicato con silicona rociada, o jeringas de resina plástica sin silicona.

Típicamente los recipientes contienen formulaciones y una etiqueta sobre, o asociada con el recipiente que puede indicar las instrucciones para la reconstitución y/o el uso. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación se reconstituye a las concentraciones de la proteína como se describen anteriormente. La etiqueta puede indicar además que la formulación es útil o deseada para, por ejemplo, la administración IT. En algunas modalidades, los recipientes pueden contener una dosis única de una formulación estable que contiene una enzima de reemplazo (por ejemplo, una proteína de fusión Naglu). En varias modalidades, una dosis única de la formulación estable está presente en un volumen menor a aproximadamente 15 mi, 10 mi, 5.0 mi, 4.0 mi, 3.5 mi, 2.5 mi. 2.0 mi, 1.5 mi, 1.0 mi, 0 0.5 mi. Alternativamente, los recipientes que contiene la formulación pueden ser frascos de usos múltiples, los cuales hacen posible la administración repetida (por ejemplo, de 2-6 administraciones) de la formulación. Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir además un segundo recipiente que comprende un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI, solución salina, solución salina amortiguada). Después del mezclado del diluyente y la formulación, la concentración final de proteina en la formulación reconstituida será por lo general de al menos 1 mg/ml (por ejemplo, al menos 5 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml). Los kits u otros artículos de fabricación pueden incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, que incluyen, otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, IDDDs, catéteres, jeringas, y prospectos con instrucciones de uso.

La invención se entenderá de forma más completa haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Los cuales no deben, sin embargo, ser considerados como limitantes del ámbito de la invención, todas las citas de la literatura se incorporan como referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión de proteínas de fusión rhNaqlu y Naqlu Este ejemplo demuestra el desarrollo de una proteina Naglu humana recombinante planeada para administración directa en el sistema nervioso central de pacientes con Sanfilippo B por medio de inyecciones intratecales.

Sanfilippo tipo B (Sanfilippo B) es un trastorno recesivo autosomal que es causado por la deficiencia de alfa-N-acetil-glucosaminidasa (Naglu). La Naglu es la enzima que remueve la alfa-Nácetil-glucosamina del extremo no reductor de oligosacáridos en la trayectoria de degradación de sulfato de heparina. El gen humano que codifica la Naglu tiene seis exones que abarcan sobre 8.2 kb de largo en el cromosoma 17q21.1. La Naglu humana es sintetizada en las células como un precursor de 743 aminoácidos que contienen un péptido de señal. La secuencia de aminoácido de longitud completa de Naglu se proporciona en la Tabla 5 debajo: TABLA 5 MEAVAVAAAVGVLLLAGAGGAAGDEAREAAAVRALVARLLGPGPAADFSVS VERALAAKPGLDTYSLGGGGAARVRVRGSTGVAAAAGLHRYLRDFCGCHV AWSGSQLRLPRPLPAVPGELTEATPNRYRYYQNVCTQSYSFVWWDWARW EREIDWMALNGINLALAWSGQEAIWQRVYLALGLTQAEINEFFTGPAFLAWG RMGNLHTWDGPLPPSWHIKQLYLQHRVLDQMRSFGMTPVLPAFAGHVPEA VTRVFPQVNVTKMGSWGHFNCSYSCSFLLAPEDPIFPIIGSLFLRELIKEFGTD HIYGADTFNEMQPPSSEPSYLAAATTAVYEA TAVDTEAVWLLQGWLFQHQ PQFWGPAQIRAVLGAVPRGRLLVLDLFAESQPVYTRTASFQGQPFIWCMLH NFGGNHGLFGALEAVNGGPEAARLFPNSTMVGTGMAPEGISQNEWYSLMA ELGWRKDPVPDLAAWVTSFAARRYGVSHPDAGAAWRLLLRSVYNCSGEAC RGHNRSPLVRRPSLQMNTSIWYNRSDVFEAWRLLLTSAPSLATSPAFRYDLL DLTRQAVQELVSLYYEEARSAYLSKELASLLRAGGVLAYELLPALDEVLASDS RFLLGSWLEQARAAAVSEAEADFYEQNSRYQLTLWGPEGNILDYANKQLAG LVANYYTPRWRLFLEALVDSVAQGIPFQQHQFDKNVFQLEQAFVLSKQRYPS QPRGDTVDLAKKIFLKYYPRWVAGSW (SEQ ID NO: 2) El péptido señal de 23 aminoácidos es removido ya que la proteina entra al reticulo endoplásmico. La proteina Naglu madura resultante se ordena a lisosomas en donde la degradación enzimática de sulfato de heparina toma lugar o es secretada en el espacio extracelular. El peso molecular de la Naglu humana recombinante madura es 80.2 kDa con glicosilación y aproximadamente 93.4 kDa con el peso de glicosilación agregado. La secuencia de proteína Naglu, en la cual los residuos de aminoácido 1 -23 son desdoblados, se proporciona debajo en la Tabla 6.

TABLA 6 DEAREAAAVRALVARLLGPGPAADFSVSVERALAAKPGLDTYSLGGGGAAR VRVRGSTGVAAAAGLHRYLRDFCGCHVAWSGSQLRLPRPLPAVPGELTEAT PNRYRYYQNVCTQSYSFXAAAA/DWARWEREIDWMALNGINLALAWSGQEAI WQRVYLALGLTQAEINEFFTGPAFLAWGRMGNLHTWDGPLPPSWHIKQLYL QHRVLDQMRSFGMTPVLPAFAGHVPEAVTRVFPQVNVTKMGSWGHFNCSY SCSFLLAPEDPIFPIIGSLFLRELIKEFGTDHIYGADTFNEMQPPSSEPSYLAAA TTAVYEAMTAVDTEAVWLLQGWLFQHQPQFWGPAQIRAVLGAVPRGRLLVL DLFAESQPVYTRTASFQGQPFIWCMLHNFGGNHGLFGALEAVNGGPEAARL FPNSTMVGTGMAPEGISQNEVWSLMAELGWRKDPVPDLAAVWTSFAARR YGVSHPDAGAAWRLLLRSVYNCSGEACRGHNRSPLVRRPSLQMNTSIWYN RSDVFEAWRLLLTSAPSLATSPAFRYDLLDLTRQAVQELVSLYYEEARSAYLS KELASLLRAGGVLAYELLPALDEVLASDSRFLLGSWLEQARAAAVSEAEADF YEQNSRYQLTLWGPEGNILDYANKQLAGLVANYYTPRWRLFLEALVDSVAQ GIPFQQHQFDKNVFQLEQAFVLSKQRYPSQPRGDTVDLAKKIFLKYYPRWVA GSW (SEQ ID NO: 1) Para generar Naglu humana recombinante (rhNaglu), se inserta el ADNc de Naglu humana en un vector de expresión y se transfecta en la línea celular HT1080. Se usa un ensayo de actividad enzimática Naglu seleccionar elevada expresión de clones HT1080. La proteina secretada generada por Naglu que expresa células HT1080 en la forma madura de Naglu humana. Es glicolizada la Naglu humana recombinante producida por las células HT1080. La rhNaglu es completamente activa hacia un sustrato sintético, alfa-D-glucosamida de 4- U-N-acetilo.

La diferencia más significante entre la Naglu recombinante y la aislada de las fuentes naturales, tal como Naglu de orina, placenta e hígado es carente de glicano de manosa-6-fosfato (M6P). La carencia de M6P en Naglu recombinante se ha reportado por varios investigadores en el estudio de rhNaglu derivadas de célula CHO y HEK 293. rhNaglu que expresa HT1080 también se encuentra ser derivada de glicano M6P. El mecanismo para la carencia de M6P en Naglu recombinante no es conocido. Los actuales inventores han desarrollado varias proteínas de fusión y modificaciones de glicano en un esfuerzo para superar la dependencia de M6P para suministro celular en Naglu recombinante (Figuras 1-3B).

Naalu-TAT Una proteína de fusión de Naglu y el dominio de transducción de proteína de VIH es llamada Naglu-TAT. La Naglu-TAT se diseña y produce, y purifica. El péptido TAT ha sido mostrado para facilitar la transducción de proteína a través de membranas celulares en el citoplasma. Se ha demostrado previamente que el péptido TAT fusionado con la beta-glucosidada de la enzima lisosomal (GUS-TAT) resulta en mayor reducción de almacenaje lisosomal mayor en el Riñón que GUS después de la inyección IV en ratones MPSVII (Grubb JH et al., Rejuvenation Research 13:2, 2010). Experimentos separados demuestran absorción celular mejorada de Naglu TAT en fibroblastos del paciente con Sanfilippo B comparado a rhNaglu (datos no mostrados). Sin embargo, estudios de biodistribución ¡n vivo indican que en inyección IT, Naglu-TAT muestra biodistribución similar como rhNaglu y solamente absorción celular ligeramente mejorada. En este estudio, la mayoría de las proteínas restante en las meninges con penetración muy limitada al parénquima del cerebro. Este resultado indica que el suministro mediado por péptido TAT no es suficiente para reemplazar la absorción celular medida por el receptor de Naglu.

Naalu Kif Naglu-Kif se produce usando un proceso de cultivo de célula modificada con la adición de Kifunensina a la media. Se propuso Naglu-Kif y produjo y purificó. La adición de Kifunensine altera la trayectoria de glicosilación de rhNaglu para mejorar la producción de glicano de alta mañosa y reprimir la adición de carbohidratos complejos. La Kifunensine inhibe la actividad de alfa-manosidada I de Golgi, y de este modo inhibe la remoción del glicano de alta mañosa, conduciendo a la represión del acoplamiento de los glicanos complejos. Como un resultado, Naglu-Kif contiene principalmente glicanos de alta manos. La absorción celular usando líneas de células derivadas de macrófago confirmó la asorción dependiente del receptor de mañosa de Naglu-Kif. Sin embargo, un experimento in vivo indica que después de la inyección intratecal en el fluido cerebroespinal de ratas canaladas de tipo nativo, el Naglu-Kif falla para mostrar distribución mejorada en el parénquima del cerebro sobre rhNaglu. Se concluye que la absorción mediada por el receptor de mañosa de Naglu-Kif no facilitará el suministro de rhNaglu en el CNS.

Naglu-ApoE El dominio de enlace al receptor de ApoE (Apolipoproteína E) se fusionó al C-término de Naglu para utilizar el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) para la absorción celular de Naglu. Este procedimiento se basa en estudios que soportan la presencia de LDLR en el BBB (Begley DJ et al., Current Pharmaceutical Design, 2008, 14, 1566-1580). Un estudio in vivo preliminar de ratón indica que Naglu-ApoE administrado intravenosamente en ratones Sanfilippo B no se transporta en el cerebro.

Administración IV de rhNaglu Se condujeron experimentos in vivo para investigar rhNaglu y Naglu-IGFII en el transporte a través del BB. El estudio indica que la administración IV de rhNaglu y Naglu-IGFII en ratones con Sanfilippo B no resulta en alguna enzima en el cerebro, y no se encontraron mejoramientos histo-patológicos en el cerebro de los ratones tratados.

Naglu-IGFII Se construyó Naglu-IGFII usando una porción de la secuencia del Factor de Crecimiento II similar a la insulina (aa 8 a 67, 8-67IGFII) al C-término de la secuencia Naglu. Comparado con la molécula IGFII de longitud completa, se reportó 8-67IGFII por unirse al receptor M6P/IGF II con una afinidad 2-10 veces superior mientras su capacidad para unirse al receptor IGF I se reduce 30 veces (Hashimoto R, JBC 1995 270(30):18013-18018).

La molécula de Naglu-IGFII contiene una secuencia enlazadora que se inserta entre Naglu y 8-67IGFII. Esta secuencia enlazadora consiste de tres repeticiones en serie de "GGGGGAAAAGGGG" (SEQ ID NO: 4) con dos secuencias "GAP" flanqueando cada extremo y una secuencia "GAP" entre cada repetición. La secuencia actual del enlazador se proporciona en la Tabla 7 abajo: TABLA 7 Secuencia enlazadora Naglu-GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGG GGAP-IGFII (SEQ ID NO: 5) Para generar fusión de Naglu-IGFII recombinante, el ADNc se insertó en un vector de expresión, pXD671 , y transfectó en una línea de células de fibroblasto humano. La secuencia de proteína de la proteína de fusión Naglu-IGFII recombinante se proporciona abajo en la Tabla 8: TABLA 8 Secuencia de Proteína de la Proteína de Fusión de Naglu-IGFII Recombinante DEAREAAAVRALVARLLGPGPAADFSVSVERALAAKPGLDTYSLGGGGAAR VRVRGSTGVAAAAGLHRYLRDFCGCHVAWSGSQLRLPRPLPAVPGELTEAT PNRYRYYQNVCTQSYSFVWWDWARWEREIDWMALNGINLALAWSGQEAI WQRVYLALGLTQAEINEFFTGPAFLAWGRMGNLHTWDGPLPPSWHIKQLYL QHRVLDQMRSFGMTPVLPAFAGHVPEAVTRVFPQVNVTKMGSWGHFNCSY SCSFLLAPEDPIFPIIGSLFLRELIKEFGTDHIYGADTFNEMQPPSSEPSYLAAA TTAVYEAMTAVDTEAVWLLQGWLFQHQPQFWGPAQIRAVLGAVPRG LLVL DLFAESQPVYTRTASFQGQPFIWCMLHNFGGNHGLFGALEAVNGGPEAARL FPNSTMVGTGMAPEGISQNEWYSLMAELGWRKDPVPDLAAWVTSFAARR YGVSHPDAGAAWRLLLRSVYNCSGEACRGHNRSPLVRRPSLQMNTSIWYN RSDVFEAWRLLLTSAPSLATSPAFRYDLLDLTRQAVQELVSLYYEEARSAYLS KELASLLRAGGVLAYELLPALDEVLASDSRFLLGSWLEQARAAAVSEAEADF YEQNSRYQLTLWGPEGNILDYANKQLAGLVANYYTPRWRLFLEALVDSVAQ GIPFQQHQFDKNVFQLEQAFVLSKQRYPSQPRGDTVDLAKKIFLKYYPRWVA GSWGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGG AAAAAGGGGGGAPLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVE ECCFRSCDLALLETYCATPAKSE (SEQ ID NO: 6) Se usó ensayo de actividad enzimática de Naglu para seleccionar clones HT1090 de alta expresión. Para además incrementar la expresión de Naglu-IGFII, la línea de célula seleccionada se transfectó nuevamente con plásmido de expresión adicional que lleva la misma unidad de transcripción. En tanto las líneas de células transfectadas únicas como las células transfectadas dobles, la Naglu-IGFII secretada contiene la secuencia Naglu madura de longitud completa e IGFII 8-67 de longitud completa. La proteina de fusión Naglu-IGFII mostró actividad enzimática hacia el mismo sustrato sintético, 4-MU-N-acetil alfa-D-glucosaminida. Las Figuras 4-6 representan una corrida de producción de ondas ejemplar usando la linea de células Naglu-IGFII transfectadas dobles. La producción de ondas de esta linea de células Naglu-IGFII presentada en la Figura 4 logró 0.5 pcd (pictograma por millón de células por día) de Naglu-IGFII.

Purificación de rhNaqlu y Naqlu-IGFU Se aplicó un proceso de purificación similar para rhNaglu, Naglu-IGFII, Naglu-ApoE y Naglu Kif. Se aplicó un proceso de purificación modificado para Naglu-TAT. La purificación de la proteína rhNaglu y Naglu-IGFII se resumen a continuación.

Para la purificación de rhNaglu y Naglu-IGFII, se utilizó un proceso de tres etapas (Figura 7). Primero, el medio acondicionado se concentró usando un dispositivo de Ultra-filtración (UF). El medio concentrado entonces se aplicó a una columna de cromatografía de butil sefarosa (Butil), y después subsecuentemente, una columna de cromatografía de sefarosa Q (Q). La proteina purificada se intercambió en una formulación de PBS (11.9mM de fosfato de sodio, 2.7 mM de fosfato de potasio, 137 mM de cloruro de sodio a pH 7.4) para almacenamiento. El rhNaglu y Naglu-IGFII purificado tiene una pureza de 99% y 95% respectivamente como se evalúa por cromatografía líquida de alta presión (datos no mostrados).

Propiedad bioquímica de rhNaglu y Naglu-IGFII Todas las variantes de Naglu, rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-Kif y Naglu-ApoE presentan actividad biológica similar hacia el sustrato sintético, 4-metilumbeliferil-N-acetil-a-D-glucosaminida. Todas las variantes fueron negativas para glicosilaciones fosforiladas como se determina por análisis de glicano a través de cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución y por análisis de monosacárido.

La siguiente sección resume las propiedades bioquímicas de rhNaglu y Naglu-IGFII solamente (Tabla 9). Como se observa en la Tabla 9, la comparación bioquímica de rhNaglu y Naglu-IGFII indica actividad enzimática similar y estabilidad entre las dos proteínas. El pH óptimo para estabilidad térmica medida por Calorimetría de Barrido Diferencial para rhNaglu fue pH 5 - pH 6.5, y pH 6 a pH 6 5 para Naglu-IGFII. Este resultado está de acuerdo con los requerimientos para hidrolasa lisosomal para exhibir estabilidad óptima en el ambiente acídico de las lisosomas.

Comparación bioquímica de rhNaglu y Naglu-IGFII Adicionalmente, se concentró Naglu-IGFII exitosamente hasta 26 mg/ml como se determina por un ensayo de proteína Bradford y sin signos de agregación o pérdida actividad después de almacenarse a 4°C por hasta 3 meses. Una formulación (por ejemplo, para administración IT) de 5 mM de fosfato de sodio pH 6.5, 150 mM de cloruro de sodio, 0.005% de polisorbato 20 también se probó para formulación de Naglu-IGFII. Se observaron estabilidad y solubilidad similar entre Naglu-IGFII en la formulación de PBS y las formulaciones IT (datos no mostrados).

Estructura cristalina de Naglu Uno de los avances en el desarrollo de rhNaglu es la determinación de la estructura cristalina de Naglu por PERP. Estos resultados proporcionan penetración a la estructura de Naglu, y ayuda en la estabilidad de proteina pronosticada y requerimiento de formulación. Se contempla que la alineación de mutaciones del paciente con Sanfilippo B en estructura 3D de Naglu puede proporcionar penetración y una herramienta para el desarrollo del fármaco.

Los cristales (Figura 8) se obtienen de la proteina rhNaglu purificada del medio de cultivo tratado con inhibidor de manosidada-l. Kifunensina. Naglu Kif contiene secuencias de proteina idéntica como rhNaglu, pero diferente patrón de glicosilación. Los cristales adquiridos de Naglu Kif se hicieron crecer a pH 7.5 y la estructura de Naglu Kif se resolvió a resolución de 2.4 A por cristalografía de rayos X. La estructura Naglu (Figura 9) es identificada por tener tres distintos dominios, un dominio N-terminal (Dominio-I, aa 24-126) seguido por un dominio de barril (a/ß)8 que contiene los glutamatos catalíticos (Dominio-ll, aa 127-467) y en todos los dominios c-terminales hélices (Dominio-lll, aa 468-743). Estructura de domino similar se ha observado para otra proteína de familia 89 Glicósido Hidrolasa, cpGH89, una bacteria homologa de Naglu (Ficko-Blean E., et al., PNAS Mayo 66, 2008, vol. 105 no. 18, 6560-6565). El sitio activo está en una hendidura entre los dominios II y llly los residuos catalíticos son identificados como E316 y E446 localizado en el dominio II.

Se puede observar un arreglo trímero asimétrico empaquetado cerrado de moléculas Naglu en la estructura cristalina (Figura 10), la cual está en acuerdo con el estado de asociación nativo observado de ultracentrifugación analítico (AUC) y cromatografía de exclusión de tamaño con experimentos (SEC-MALS) de esparcido ligero de ángulo múltiple en línea. La interacción hidrofóbica y uniones de hidrógeno en dominio II mantienen la conformación trimérica de la proteína. H227 parece formar interacciones de apilado con R297 de una molécula adyacente durante la trimerización. Adicionalmente, E302 forma interacción de uniones de hidrógeno intermolecular con K301.

Naglu tiene seis sitios de N-glicosilación potenciales (N261 , N272, N435, N503, N526 y N532) y todos los seis sitios son glicosilados en la estructura cristalina. La separación de densidades del electrón para dos moléculas NAG entre sí de N272 y N435 y una molécula NAG unida entre sí a N261 , N503, N526 y N532 se observan en el mapa de densidad de electrón a resolución 2.4 A. El resto de las estructuras de glicano no son claramente visibles en el mapa de densidad de electrón debido a la naturaleza flexible de porciones de azúcar expuestas resueltas.

La información estructural de Naglu ayuda en el análisis de estabilidad y caracterización de nivel molecular de Naglu. Existen ocho cisteinas en Naglu, cuatro de estas forman dos puentes de disulfuro (Cys273-Cys277 y Cys504-Cys509). Las otras cuatro, C97, C99, C136 y C405 parecen cisteinas reducidas en la estructura de cristal aún a través de agentes no reductivos se usan durante el proceso de purificación y cristalización. C97 y C99 están cercanas entre sí y son parcialmente expuestas cerca de la superficie. Sin embargo C136 y C405 están enterradas y es improbable que formen uniones de disulfuro intermolecular en base a la estructura.

Se contempla que, en base a la información estructural actualmente disponible, el mapeo de mutaciones del paciente con Sanfilippo B puede arrojar a la luz en potenciales desarrollos de fármaco futuro para esta enfermedad tal como diseño rotacional de chaperonas moleculares pequeñas. Se reportan arias mutaciones de San B de la literatura (Yogalingam 2001 ) se mapearon en la estructura cristalina. Unas pocas agrupaciones de mutaciones pueden estar relacionadas a las regiones estructurales o funcionales, tal como el sitio activo, un bucle que contiene tres sitios de glicoslación en el dominio-III, y la interfaz entre los tres dominios (Figura 10). Además, las agrupaciones de mutaciones pueden ser observadas en el dominio I N-terminal y dominio-lll de bulto de hélice C-terminal. La mayoría de estos residuos que son mutados son parte de uniones de hidrógeno y otras interacciones no covalentes y están involucradas en la estabilización estructural de Naglu.

EJEMPLO 2 Estudio in vitro de rhNaqlu y Naqlu-IGFII El mecanismo de absorción celular por cada una de las variantes de Naglu se estudió usando dos cepas de células de fibroblasto de paciente con síndrome de Sanfilippo B, GM02391 (P359L) y GM 01426 (E153K), y una línea de células de fibroblasto humano normal. Atribuidos a la expresión del receptor M6P en la línea celular, las células de fibroblasto son tradicionalmente usadas por los investigadores para el estudio de absorción celular de enzimas celulares.

Los estudios de absorción celular fueron hechos por incubación de células de fibroblasto con rhNaglu o Naglu-IGFII por cuatro horas a 37°C. Las células fueron lavadas y lisadas después de la incubación, y se midió la actividad enzimática de Naglu en lisados celulares. La incubación de rhNaglu con células de fibroblasto resultó en cantidad apenas detectable de enzima intracelularmente. Por el contrario, la incubación de Naglu-IGFII con células de fibroblasto resultó en nivel pronunciado de enzima intracelularmente (Figura 11). La cantidad de Naglu-IGFII internalizada alcanzó la saturación conforme la cantidad de enzima usada para incubación se incrementa. La dosis dependiente de la absorción de saturación es un hallazgo típico para la absorción celular mediada por el receptor. Además, la internalización de Naglu-IGFII no se inhibió por M6P exógeno, pero se inhibió por IGFII exógeno completamente (Figura 11 ). Este resultado indica que la internalización de Naglu-IGFII en células de fibroblasto es dependiente del receptor M6P/IGFII en una manera dependiente de la glicosilación.

Se condujo también un experimento para estudiar el tráfico de rhNaglu y Naglu-IGFII a lisosomas. Las células de fibroblasto de pacientes con Sanfilippo B (GM01426) fueron usadas para este estudio. La detección de rhNaglu y Naglu-IGFII se examinó tiñendo las células con anticuerpo policlonal Naglu anti-humano después de la incubación inicial de las proteínas con las células. El teñido inmunofluorescente de LAMP-1 (proteína 1 de membrana asociada lisosomal) se usó para la detección de lisosomas. La co-localización de rhNaglu y Naglu-IGFII con lisosomas se visualizó por microscopio confocal (Figura 12).

Se demostró la internalización extensiva de Naglu-IGFII se observó después de 4 horas de incubación de la proteína con las células, colocalización de Naglu-IGFII con lisosomas. Contrariamente, rhNaglu falló para mostrar la internalización en el mismo marco de tiempo, y no se observó colocalización con los lisosomas. Este resultado además proporciona la evidencia de que Naglu-IGFII se internalizó en las células y transportó al compartimiento celular correcto, las lisosomas. La vida media de Naglu-IGFII internalizado en células de fibroblasto de pacientes con Sanfilippo B se determinó por ser 1.5 días (datos no mostrados).

EJEMPLO 3 Estudios in vivo en modelos de ratón Rata canutada de tipo nativa (wt) Además del modelo de ratón con Sanfilippo B, la rata canulada wt, un modelo de animal no deficiente, también se usó para la selección de molécula in vivo. Las ratas canuladas wt tienen implantada quirúrgicamente cánula en la región torácica inferior y lumbar superior de la médula espinal, y se hizo una inyección única de 35ul al CSF a través de la cánula. Los criterios valorados para la selección de molécula usando este modelo animal fueron el ensayo de actividad Naglu e inmunohistoquímica del cerebro y médula espinal.

Modelo de ratón con Sanfilippo B Se generó el modelo de ratón con Sanfilippo B (Naglu-/- ratón, ratón con Sanfilippo B) por E. Neufeld y colegas (Li HH, et al., PNAS 96(25): 14505-14510; 1999). El exón 6 del gen Naglu de ratón se rompió por inserción de un gen resistente a neomicina, marcador de selección. Los Naglu-/- ratones homocigotos resultantes son completamente deficientes en Naglu (Figura 13), y tienen acumulación GAG total en el hígado y riñon. Debido a la deficiencia total de Naglu, estos ratones son en general sanos y tienen una vida útil de 8-12 meses. Los cambios de otra expresión de enzimas lisosomales ocurren en la edad de aproximadamente 5 meses, estos cambios incluyen incremento compensatorio de ß-galactosidasa, a-glucosidasa, ß-glucuronidasa y ß-hexosaminidasa en hígado y cerebro, elevación de a-L-iduronidasa en hígado pero no en cerebro, y la reducción de neuraminidasa en hígado y cerebro. La muerte usualmente ocurre como un resultado de retención urinaria e infección urinaria. El modelo de ratón con Sanfilippo B ha sido estudiado extensivamente en la literatura para representar los cambios patológicos de Sanfilippo B. El fenotipo relacionado con la patología del CNS de Naglu-/- ratón se reporta por ser hipo-actividad en la edad de 4.5 meses, pero la hiperactividad en otras edades también se ha observado.

Los cambios neuro-patológicos en Naglu-/- ratón son descritos como vacuolas y cuerpos de inclusión en neuronas, macrófagos y células epiteliales como se observa por EM (microscopio de electrón). Estos cambios patológicos típicamente inician a 33 días de edad, y progresivamente empeoran conforme los animales se vuelven más viejos. Las células microgliales y astrocitos activados también se demostraron por análisis histopatológicos. Los análisis bioquímicos de dos gangoliósidos, GM2 y GM3, mostró 5 veces y 9 veces incremento en el cerebro. (Puesto que GM2 y GM3 no son sustratos directos de Naglu, y podría ser estimulante demostrar reducción significante después de ERT por periodo corto de tiempo, no fueron usados como biomarcadores finales para POC).

El análisis bioquímico se hizo por medición de actividades enzimáticas de Naglu y niveles de GAG, el análisis histológico se hizo por inmunohistoquímica de anticuerpo Naglu anti-humano, anticuerpo anti-LAMP-1, anticuerpo anti-la-1 y anticuerpo anti-GFAP. El anticuerpo Naglu antihumano usado para este estudio fue un anticuerpo monoclonal de ratón que no se une a Naglu murino endógeno en ratones wt o el Naglu mutado en el ratón con Sanfilippo B. El inmunoteñido LAMP-1 usado como un anticuerpo se une a la proteina de membrana lisosomal, proteina- de membrana asociada lisosomal. El teñido lba-1 usado como un anticuerpo se une a la proteina adaptadora de unión al calcio ionizado que es específica para las células de macrófago y microgliales. El teñido GFAP usa un anticuerpo que se une a la proteína acídica fibrilar glial la cual es específica para astrocitos.

Selección de actividad biológica in vivo por invección intracraneal HC) en ratones con Sanfilippo B El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad biológica de enzimas Naglu in vivo. En este estudio, las proteínas fueron administradas a través de inyección IC en el cerebro del ratón con Sanfilippo. La edad de ratones con Sanfilippo para el estudio fue estrechamente igualada para estar en 8 semanas de edad. La ruta de inyección IC ofrece el mejor escenario del caso para evaluar la eficacia de las moléculas. Las proteínas Naglu fueron valoradas por la capacidad para ser recuperadas en las células neuronales y reducir el almacenamiento lisosomal. La inmunohistoquímica se usó para valorar la biodistribución. Y el almacenamiento lisosomal se caracterizó por el número y el tamaño de teñido positivo usando inmunoteñido con LAMP-1.

Se hizo inyección IC por inyección directa a través del cráneo del ratón con Sanfilippo B en la corteza cerebral derecha. Se inyectaron dos microlitros, o 35pg de proteína Naglu en cada animal. Los sacrificios de los animales tomaron lugar 7 días después de la inyección. El tiempo del sacrificio se predeterminó en un estudio piloto en donde los sacrificios del animal tomaron lugar 3, 7, y 14 días después de la inyección. Después del estudio piloto, se determinó que 7 días posteriores a la inyección es el tiempo óptimo para el estudio inmunohistoquímico. Secciones del cerebro fueron cortadas transversalmente (Figura 14), y se realizaron inmunoteñidos con Naglu y Lamp- . La absorción celular en tanto neuronas como las células gliales en ratón con Sanfilippo B tratado con rhNaglu y Naglu-IGFII se demostró por inmunohistoquímica usando un anticuerpo Naglu anti-humano (Figuras 14-16). No se observó diferencia significante entre ratón con Sanfilippo tratado con rhNaglu y Naglu-IGFII con respecto a la absorción celular. Adicionalmente, el ¡nmunoteñido con LAMP-1 del tejido cerebral de ratones tratados tanto con rhNaglu como Naglu-IGFII indica nivel significante de reducción de almacenamiento lisosomal. El nivel de reducción de almacenamiento lisosomal en grupos tratados tanto con rhNaglu como Naglu-IGFII fue casi en el mismo nivel del ratón wt normal.

La reducción de almacenamiento lisosomal también se observó en ratones con Sanfilippo B tratados con Naglu-TAT, Naglu-Kif y PerT-Naglu después de la inyección IC (datos no mostrados). Este estudio demuestra la actividad biológica in vivo de todas las variantes de Naglu.

En un estudio separado, ratones deficientes de Naglu fueron administrados IT con un vehículo o alternativamente con una, dos o tres dosis semanalmente de un constructo de proteina de fusión recombinante Naglu-IgF-ll (Naglu) en PBS. Un grupo de ratones de tipo nativo no tratados sirvió como un control de tipo nativo no tratado y fueron administrados con un vehículo sin Naglu. Los ratones fueron sacrificados después de 24 horas después de la inyección final, seguida por preparación de tejido por análisis de inmunohistoquímica (IHC) e histopatológicos.

La distribución de Naglu a los tejidos cerebrales de los ratones deficientes de Naglu fue evidente después de la administración IT del Naglu recombinante. Como se ¡lustra en la Figura 17A, la administración IT del Naglu recombinante a los ratones deficientes con Naglu resultó en la reducción dispersada de vacuolación celular en los tejidos de materia blanca comparados con ratones deficientes en Naglu los cuales fueron administrados IT con el vehículo. De manera similar, y como se ilustra en la Figura 17B, el análisis morfométrico reveló una reducción marcada en inmunoteñido con LAMP1 en los tejidos de la materia gris de los ratones tratados con relación a los ratones deficientes de Naglu no tratados, de este modo reflejando un mejoramiento en la patología de la enfermedad.

Como se muestra en la Figuras 18A-18B, en cada área del tejido del cerebro evaluada (la corteza, núcleo caudado y putamen (CP), tálamo (TH), cerebelo (CBL) y materia blanca (WM)), el área LAMP-positiva se redujo en los ratones tratados con Naglu con relación a los ratones de control deficientes de Naglu no tratados, y enfocó el área LAMP-positiva del ratón de tipo nativo. Particularmente notable es que las áreas positivas en LAMP en cada área del tejido del cerebro analizadas fueron además reducidas después de la administración IT de dos o tres dosis (Figura 18B) con relación a una dosis única (Figura 18A) de Naglu.

Estos resultados también confirman que el Naglu administrado IT es capaz de alterar el progreso de enfermedades de almacenamiento lisosomal tales como síndrome de Sanfilippo tipo B en el modelo de ratón deficiente en Naglu, confirmando además la capacidad de enzimas administradas IT tales como Naglu para tratar las manifestaciones del CNS asociadas con enfermedades de almacenamiento lisosomal, tales como síndrome de Sanfilippo tipo B.

Molécula de selección por invección intratecal (IT) en Rata canulada wt Este estudio imita directamente un procedimiento mediado por el puerto para administración del fármaco. La proteína Naglu se administró vía inyecciones IT en ratas canuladas wt para determinar la biodistribución en el parénquima del cerebro.

La cánula en estos animales se colocó en la porción torácica inferior y lumbar superior de la médula espinal (Figura 19). Los animales fueron inyectados con 35µ?, ó 385 pg de rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII y PerT-Naglu, a través de la cánula (debido a la limitación de solubilidad, se inyectó Naglu Kif con solamente 38.5 ug, lo cual es 10 veces menor que el resto del Naglu). Los sacrificios ocurrieron 4hr y 24hr después de las inyecciones.

Los tejidos de cerebro y médula espinal fueron recolectados y medidos por el ensayo de actividad Naglu. En el cerebro de animales tratados, los animales tratados con Naglu-TAT y Naglu-IGFII presentan actividad superior que el rhNaglu y los otros animales tratados con variantes Naglu (Figura 20). Como una tendencia general, la actividad de Naglu fue significantemente superior en la médula espinal que en el cerebro para todos los animales tratados (datos no mostrados). Este fenómeno puede indicar que las proteínas fueron tomas más en el sitio más cercano a la inyección IT.

El análisis de inmunohistoquimica indica que la biodistribución del grupo tratado con Naglu-IGFII fue más extensiva en el cerebro que en todos los otros grupos tratados con variantes de Naglu 24 hr después de las inyecciones IT (Figuras 21 y 22). En los animales tratados con rhNaglu la proteina se observó en las meninges del cerebro solamente. En la sección de médula espinal, el IHC indica alguna absorción celular de rhNaglu en las neuronas de la materia gris, pero en una extensión mucho menor que la absorción de Naglu-IGFII en las neuronas de la médula espinal (datos no mostrados).

En el grupo inyectado IT con Naglu-TAT, aún a pesar que se observó actividad Naglu más alta en el tejido del cerebro por análisis bioquímico, pero falló el IHC para indicar cualquier penetración de Naglu-TAT en el parénquima del cerebro, otras permanecen en las meninges. Además de Naglu-IGFII, todas las otras variantes de Naglu fallan para mostrar la distribución más allá de las meninges, un fuerte testimonio de la dependencia en los receptores M6P/IGFII para la absorción celular de Naglu en el cerebro después de la inyección IT. Este estudio señala a Naglu-IGFII como la molécula líder para el desarrollo del fármaco para Sanfilippo B.

EJEMPLO 4 Prueba de estudio de concepto usando NAGLU-IGFII Diseño experimental La prueba de estudio de concepto se diseñó para mostrar tanto la biodistribución como la reversión del almacenamiento lisosomal después de la inyección IT de Naglu-IGFII en ratones con Sanfilippo. Para este estudio, tres grupos de ratones con Sanfilippo B a 8 semanas de edad fueron tratados con una inyección IT de Naglu-IGFII. Cada inyección IT constituye un volumen de 10ul ó 260 ug de Naglu-IGFII. Hubo tres grupos tratados, grupos de inyección 1x, inyección 2x e inyección 3x. Para el grupo de inyección 1x, una dosis única de la proteína se administró al dia 0. Los animales fueron sacrificados 24hr después de la inyección. Para el grupo de inyección 2x, dos inyecciones IT fueron administradas al día 0 y día 7, y los animales fueron sacrificados 24hr después de la última inyección. Para el grupo de inyección 3x, las inyecciones IT fueron administradas al día 9, día 7 y día 14, y los animales fueron sacrificados 24hrs después de la última inyección. También se incluyeron tres grupos de ratones tratados con vehículo. Para los grupos de control de vehículo, ratones con Sanfilippo B fueron inyectados con vehículo al mismo intervalo de tiempo como los grupos tratados y sacrificados de la misma forma como los grupos tratados.

Los análisis tanto bioquímicos como histológicos fueron aplicados para evaluar el resultado del estudio. Los análisis bioquímicos incluyen un ensayo de actividad Naglu para medir la cantidad de enzimas en el tejido y un ensayo GAG total para evaluar la reducción del almacenamiento lisosomal. El hígado y cerebro fueron los dos tejidos objeto para análisis bioquímico (Figura 23 y 24). Los análisis histológicos incluyen teñido H&E de tejidos para evaluación morfológica (datos no mostrados), y teñido inmunohistoquímico con anticuerpo Naglu anti-humano, LAMP, Iba y GFAP (datos para teñido Iba y GFAP no mostrados).

El anticuerpo Naglu anti-humano usado para este estudio fue un anticuerpo monoclonal de ratón que no se une al Naglu murino endógeno en ratones wt o el Naglu mutado en ratón con Sanfilippo B. El inmunoteñido con LAMP-1 usó un anticuerpo que se une a la proteina de membrana asociada lisosomal. El teñido lba-1 usó un anticuerpo que se une a la proteína adaptadora de unión a calcio ionizado que es especifica para células de macrófago y microgliales. El teñido GFAP usó un anticuerpo que se une a la proteína acídica fibrilar glial el cual es específico para los astrocitos.

Las fotografías microscópicas representativas de inmunofluorescencia de Naglu se muestran en la Figura 25. Las áreas ejemplares del cerebro se representan en la Figura 26. Aún a pesar de que se detectó Naglu-IGFII en la corteza cerebral la cual es más cercana a las meninges, no se encontró en la región subcortical tal como el núcleo caudado, el tálamo y la materia blanca (datos no mostrados). Puesto que el inmunoteñido de LAMP-1 , lba-1 y GFAP de las mismas áreas subcorticales demostró reversión del almacenamiento lisosomal, se cree que el inmunoteñido negativo de Naglu en las áreas profundas del cerebro fue probablemente debido a la sensibilidad de la inmunofluorescencia de Naglu.

Las fotografías microscópicas representativas de inmunoteñido con Lamp-1 se muestran en las Figuras 27-31. Para demostrar la extensión de la distribución y eficacia de la proteína, las regiones de la corteza cerebral y subcorticales, tales como núcleo caudado y materia blanca, y corteza cerebelar fueron seleccionadas para análisis inmunohistológico. El resultado de inmunoteñido lba-1 y GFAP (datos no mostrados) indica que los se observó en el inmunoteñido LAMP-1 fue el efecto combinado de los cambios de células microgliales y astrocitos, los dos tipos de células que fueron reportados por ser afectadas en el modelo de ratón con Sanfilippo B (Li 2002, Ohmi 2002) además de las neuronas. Debido a limitaciones técnicas, el inmunoteñido con LAMP-1 no fue capaz de revelar el almacenamiento lisosomal en neuronas. Para observar mejor la acumulación lisosomal en neuronas, tales vacuolas e inclusiones, el microscopio de electrón es usualmente utilizado (no se incluye EM en el estudio actual).

Se apreciará que la identificación de tipos celulares se limitó a neuronas y células gliales. Las neuronas fueron típicamente identificadas por el núcleo relativamente grande y pálido que contiene uno o más nucléolos densamente teñidos, y el citoplasma frecuentemente detectable. Las células gliales fueron en general identificadas por el núcleo denso pequeño y el citoplasma inconspicuo. La distinción entre los diferentes tipos de células gliales, tales como astrocitos, células microgliales, células ependimales y oligodendrocitos, se hace típicamente mejor por teñido con marcadores específicos del tipo celular.

Además de la reducción de almacenamiento lisosomal exhibido por el inmunoteñido con LAMP-1 , el inmunoteñido con lba-1 indica la reducción del tamaño de célula y número de procesos en las células microgliales, y el inmunoteñido con GFAP indica la inducción del tamaño de la célula y longitud/número de procesos en los astrocitos, en la corteza cerebral, núcleo caudado, tálamo, materia blanca y cerebelo después de las inyecciones IT de Naglu-IGFII (datos no mostrados). Además, los análisis histopatológicos por teñido H&E (hematoxilina y eosina) del tejido cerebral de las mismas áreas como las examinadas por inmunohistoquimica, demuestran la reducción de vacuolas en células gliales después de la inyección IT 3x de Naglu-IGFII. Todos los resultados mencionados anteriormente también sugieren el efecto relacionado con la dosis de inyecciones IT de Naglu-IGFII.

Los análisis bioquímicos de ratones con Sanfilippo B después de la inyección IT de Naglu-IGFII detectan actividad Naglu en el cerebro e hígado. La eficacia del Naglu-IGFII se demostró por la reducción de GAG total en el cerebro e hígado. La inmunohistoquimica demostró la biodistribución de Naglu-IGFII en el parénquima del cerebro. El inmunoteñido de LA P-1 , lba-1 , GFAP y análisis histopatológico por teñido H&E exhibe reducción del almacenamiento lisosomal, la reducción del tamaño y procesos por astrocitos microgliales en no solamente el área cortical cerebral del cerebro, sino también en las áreas subcorticales, materia blanca y corteza cerebelar del cerebro.

Conclusiones Entre otras cosas, se ha demostrado que la proteina de fusión, Naglu-IGFII, exhibe actividad enzimática in vitro hacia un sustrato que tiene estructura similar al sustrato nativo de Naglu. El estudio de absorción celular in vitro demostró que la molécula se tomó hasta las células por el receptor M6P/IGFII en una manera que fue independiente de la glicosilación de M6P. El Naglu-IGFII internalizado se mostró por co-localizarse con lisosomas. El Naglu-IGFII se mostró por reducir el almacenamiento lisosomal in vivo después de la inyección IC en el ratón con Sanfilippo B. En comparación con rhNaglu y otras fusiones y modificaciones de Naglu, el Naglu-IGFII los superó a todos en penetración en el parénquima del cerebro de rata canulada wt después de la inyección IT. Finalmente, la inyección IT de fusión de Naglu-IGFII en ratones con Sanfilippo B demostró la distribución extensiva bien más allá de las meninges, y reversión observada de almacenamiento lisosomal en la corteza cerebral asi como también en las regiones subcorticales. Tomados juntos, estos datos indican que Naglu-IGFII es un fármaco candidato para el tratamiento de la enfermedad de Sanfilippo B.

EJEMPLO 5 Estudios de toxicidad, farmacocinéticas (PK) y biodistribución de NAGLU-IGFII suministrado IT Prueba de Estudios de Concepto en Ratones Tres grupos (n=3) de ratones Naglu (-/-) fueron inyectados con 10 uL que contiene 260 ug de Naglu-IGFII dado como una inyección lumbar IT de bolo único. La dosis de 260 ug se traduce en una dosis de 520 mg/kg por peso del cerebro (cerebro de ratón = 0.0005 kg). Un grupo se inyectó al Día 0 y sacrificó 24 hr post-inyección. Un segundo grupo se inyectó en los Días 0 y 7, y sacrificó 24 hr después de la última inyección. El tercer grupo se inyectó en los Días 0, 7, y 14, y sacrificó 24 hr después de la última inyección. Cada grupo dosificado con Naglu-IGFII se apareó con un grupo de control de vehículo para controlar la severidad de la enfermedad/edad.

La actividad enzimática de Naglu en el cerebro y el hígado fue similar para los tres grupos dosificados con Naglu-IGFII. Comparando la actividad de la enzima rhNaglu en el hígado al cerebro, se encontró más de 10 veces la actividad de la enzima rhNaglu en el hígado. Se contempla que puesto que los niveles de la actividad de la enzima rhNAGLU fueron comparables en el cerebro e hígado después de 1-, 3-, y 6-meses de dosificación en los estudios de toxicidad pívotal en ratas y monos juveniles, alguna porción de dosis de rhNaglu dada al ratón Naglu (-/-) puede no haber sido suministrada IT, sino preferiblemente sistémicamente. Sin embargo, el nivel de GAG total en el cerebro mostró una reducción estadísticamente significante (p < 0.05) después de 3 inyecciones IT. Una tendencia relacionada con la dosis para reducción del nivel de GAG total se observó en los hígados, los cuales fueron estadísticamente significantes (p < 0.05) en los grupos que recibieron 2 ó 3 dosis.

La biodistribución de Naglu-IGFII después de la inyección IT se observó también más allá de las meninges en el parénquima del cerebro, per regiones subcorticales profundas fueron negativas para inmunoteñido de anticuerpo anti-Naglu. Se observó una reducción de actividad lisosomal por inmunoteñido de proteina de membrana asociada lisosomal (LAMP) en los grupos dados 2 ó 3 dosis solamente. Las áreas de reducción de actividad lisosomal incluyen regiones de la corteza cerebral y subcortical profundas de núcleo caudado, tálamo y materia blanca. De este modo, la reducción de varios parámetros de inmunoteñido en animales dosificados con Naglu-IGFII sugiere que los niveles terapéuticos de NAGLU podrían ser debido a la ausencia de inmunoteñido anti-NAGLU. Se evidencio una respuesta inflamatoria atenuada por reducción de inmunoteñido de proteina acidica fibrilar glial (GFAP) de astrocitos y reducción de teñido de molécula adaptadora de unión a calcio ionizada (Iba) de microglia/macrófagos en grupos dados 2 ó 3 dosis solamente. Las áreas de análisis incluyen regiones de la corteza cerebral y subcortical profundas de núcleo caudado, tálamo y materia blanca.

Estudios en Ratas Las ratas S-D se seleccionaron como las especies roedoras para evaluación toxicológica de Naglu-IGFII administrado IT. Como un resultado, dieciséis ratas (ocho por sexo) son dosificadas con Naglu-IGFII recombinante a la dosis máxima factible (MFD)), y a aproximadamente 1/4 y 1/2 del MED (niveles de dosis baja y media, respectivamente) cada 4 días por un total de 8 dosis.

El estudio de PK/biodistribución de dosis única en ratas S-D se realizó para determinar CSF y concentración de suero, o distribución de tejidos, respectivamente, después de la administración IT-L a animales machos y hembras.

Se diseñaron estudios de toxicologia para evaluar la administración IT-L de Naglu-IGFII a partir de una perspectiva de farmacología de seguridad y toxicologia (seguridad neurológica, respiratoria y cardiovascular) en tanto animales machos como hembras. La evaluación toxicológica en estos estudios incluye observaciones clínicas, pesos corporales, consumo de alimento, patología clínica, valoraciones de farmacología de seguridad apropiadas (por examinación física o electrocardiografía), tejido grueso y evaluación microscópica. Un número limitado de muestras de suero y CSF se recolectaron y analizaron para Naglu-IGFII, y para anticuerpos al artículo de prueba. La distribución del tejido Naglu-IGFII y localización subcelular se cuantificaron por ensayo de actividad enzimática e inmunohistoquímica, respectivamente. Adicionalmente, estudios seleccionados incluyen un periodo de recuperación para valorar la reversibilidad, o aparición retardada potencial, de cualquiera de los hallazgos toxicológicos significantes observados.

Estudios en Monos Los monos cinomólogos han sido seleccionados como las especies no roedoras para evaluaciones toxicológicas de Naglu-IGFII administrado IT debido a su similitud genética y anatómica a humanos y por lo tanto se piensa son las especies más relevantes. Dado que la población de pacientes planeados para los ensayos clínicos del síndrome de Sanfilippo B es pediátrica, se realiza un estudio de toxícología crónica de 6 meses en monos cinomólogos juveniles que caracteriza la administración del dispositivo de suministro de fármaco intratecal (IDDD) de Naglu-IGFII. Los monos cinomólogos juveniles son en general de menos de 1 año de edad al inicio del estudio (aproximadamente 7-9 meses de edad) y pesan entre 900 g a 1 ,500 g al inicio del estudio. Los datos obtenidos de un estudio de toxicidad en monos cinomólogos juveniles de dosis repetida de 1 mes guian la selección del nivel de dosis y diseño del estudio de monos juveniles de 6 meses. Los estudios de toxícología de dosis repetida son diseñados para imitar la ruta clínica esperada (bolo IT-L) y frecuencia de administración (cada tercer semana; EOW9 durante un periodo de 1 hasta 6 meses.

Como se describe anteriormente, se diseñaron estudios de toxícología para evaluar la administración IT-L de Naglu-IGFII a partir de una perspectiva de farmacología de seguridad y toxicológica (seguridad neurológica, respiratoria y cardiovascular) en tanto animales machos como hembras. La evaluación toxicológica en estos estudios incluye observaciones clínicas, pesos corporales, consumo de alimento, patología clínica, valoraciones de farmacología de seguridad apropiada (por examínación física o electrocardiografía), tejido grueso y evaluación microscópica. Un número limitado de muestras de CSF y suero se recolectaron y analizaron para Naglu-IGFII, y para anticuerpos en el artículo de prueba. La distribución del tejido Naglu-IGFII y localización subcelular se cuantifícaron por el ensayo de actividad enzimática e inmunohistoquimica, respectivamente. Adicionalmente, estudios seleccionados incluyen un periodo de recuperación para valorar la reversibilidad, o aparición retardada potencial, de cualquiera de los hallazgos toxicológicos significantes observados.

EJEMPLO 6 Administración intratecal EOW de NAGLU-IGFII Este ejemplo se diseñó para determinar la factibilidad de dosificación EOW lumbar-IT para 6 inyecciones (estudio de 3 meses) en el modelo Naglu -/- ratón. Este régimen de dosificación puede ser más clínicamente relevante comparado con la dosificación semanalmente.

Se estudiaron ratones macho y hembra -/- Naglu de 8 semanas de edad, de conformidad con el siguiente diseño experimental: Tabla 10 Diseño experimental para Suministro IT EOW de Naglu-IGFII Se realizaron estudios fisiológicos, que incluyen ensayo de actividad Naglu en hígado, cerebro y suero, ensayo de anticuerpo anti-Naglu en suero y ensayo BCA en hígado y cerebro. Se realizaron estudios histológicos que incluyen Naglu IHC en cerebro, médula espinal e hígado, y teñido con Lamp en cerebro y médula espinal.

Cerebro, médula espinal e hígado fueron recolectados y fijados en 10% de NBF. Secciones de parafina de 5 pm fueron preparadas para teñido histológico. El teñido inmunohistoquimico (IHC) de Naglu se usó para detectar absorción celular de la proteína inyectada. El teñido H&E se usó para observar cambios morfológicos. LAMP, un indicador de actividad lisosomal y estado de enfermedad, GFAP y lba-1 , dos marcadores patológicos del CNS para astrocitos activados y células microgliales, fueron usados para evaluación de mejoramiento histopatológico.

El teñido Naglu de cerebro, médula espinal e hígado de ratones tratados con vehículo y Naglu-IGFII demostró que, en el cerebro y médula espinal, se detectó Naglu inyectado en meninges (M) solamente por IHC y no se detectó teñido positivo Naglu en cualquiera de las otras regiones (Figura 32). En el hígado, las células sinoidales (S) fueron Naglu positivas y no se encontró absorción Naglu en hepatocitos (H).

El inmunoteñido con LAMP y teñido con H & E del hígado y médula espinal de ratones tratados con vehículo y Naglu-IGFII demostró que, comparado con los animales de vehículo, el teñido con LAMP se redujo a través de tanto hígados como médulas espinales tratadas con Naglu. El teñido H&E mostró que la vacuolación celular en hepatocitos fue evidentemente reducida en el grupo tratado comparado con animales tratados con vehículo (Figura 33 y Figuras 34A-34B).

El teñido con H&E del cerebro de ratones tratados con vehículo y Naglu-IGII demostró un mejoramiento de morfología en el cerebro después de 6 inyecciones cada tercer semana de Naglu-IGFII por 3 meses. En el cerebro tratado, la vacuolación celular (flechas) en todas las regiones examinadas se reduce comparada con el grupo de vehículo (Figuras 35A-35B) El LAMP IHC en varias regiones del cerebro después de 6 inyecciones de Naglu IT por 3 meses demostró que, comparado con el grupo de vehículo tratado, la administración IT Naglu a ratones SFB resultó en una reducción de actividad lisosomal en todas las regiones examinadas reveladas por inmunoteñido con LAMP (Figuras 35A-35B). Esta reducción se caracterizó por la reducción en el número de células positivas a LAMP, tamaño de célula más pequeño y teñido más ligero. Se encontró una marcada reducción en el cerebelo y tronco cerebral, los cuales se localizan en la parte caudada del cerebro cercana a la médula espinal, comparada con las otras regiones del cerebro. Se encontró también una clara reducción en las regiones profundas del cerebro, que incluyen la materia blanca, hipocampo y tálamo.

El Ib IHC en varias regiones del cerebro después de 6 inyecciones de Naglu IT por 3 meses revela la activación de células microgliales (Figuras 36A-36B). Comparado con el grupo tratado con vehículo, no se observa reducción en el número de células positivas e intensidad de teñido en el grupo tratado con Naglu. Sin embargo, la morfología celular de células microgliales positivas camia con el tamaño de célula reducida en todas las regiones del cerebro examinadas comparada con las grandes y vacuoladas en el grupo de vehículo (insertos).

El GFAP IHC en varias regiones del cerebro después de 6 inyecciones de Naglu IT por 3 meses reveló activación astrocítica (Figuras 37A-37B). Comparado con el grupo tratado con vehículo, el teñido GFAP positivo fue reducido en el cerebelo, y tronco cerebral, y ligeramente reducido en otras regiones examinadas.

Con respecto a la absorción celular, estos datos demuestran que en el cerebro y médula espinal, se detectó Naglu en células meningeales solamente después de la inyección IT de Naglu IGFII 6 veces cada tercer semana por 3 meses. El Naglu fue indetectable por IHC en cualquiera de las otras regiones del cerebro y médula espinal. En el hígado, se encontró teñido positivo a Naglu en células sinusoidales.

En el cerebro y médula espinal, después de 6 inyecciones IT cada tercer semana de Naglu-IGFII por 3 meses, se observó mejoramiento histopatológico a través del cerebro y médula espinal aún a pesar que el Naglu inyectado fue indetectable por IHC. El teñido con H&E demostró reducción de vacuolación celular en todas las regiones del cerebro examinadas. El teñido con LAMP reduce a través de las médulas espinales tratadas y en todas las regiones del cerebro evaluadas que incluyen la materia blanca, hipocampo y tálamo las cuales son áreas profundas del cerebro, con reducción marcada en el cerebelo y tronco cerebral en el grupo tratado con Naglu-IGFII. El patrón de teñido reducido del teñido con GFAP para astrocitos fue consistente con el teñido con LAMP mientras no fue dramáticamente reducido como LAMP. El teñido lba-1 mostró reducción del tamaño de la célula de células microgliales en todas las regiones del cerebro examinadas. En el hígado, el teñido con H&E de mostró reducción de vacuolación celular con marcada reducción en teñido con LAMP en el grupo tratado con Naglu.

EJEMPLO 7 Tratamiento de pacientes con Sanfilippo B La administración al CNS directa a través de por ejemplo, suministro IT puede ser usada para tratar efectivamente pacientes con síndrome de Sanfilippo tipo B (Sanfilippo B). Este ejemplo ilustra un estudio de escalación de dosis de centro múltiple diseñado para evaluar la seguridad de hasta 3 niveles de dosis cada tercer semana (EOW) por un total de 40 semanas de Naglu-IGFII y/o rhNaglu administrado vía dispositivo de suministro de fármaco intratecal (IDDD) a pacientes con síndrome de Sanfilippo B. Varios dispositivos de suministro de fármaco intratecal ejemplares adecuados para tratamiento humano son representados en la Figuras 38-41.

Hasta 20 pacientes serán enrollados: Cohorte 1 : 5 pacientes (Dosis más baja) Cohorte 2: 5 pacientes (Dosis intermedia) Cohorte 3: 5 pacientes (Dosis más alta) 5 pacientes serán aleatorizados a ningún tratamiento.

Los pacientes se seleccionaron para el estudio con base en la inclusión del siguiente criterio: Se determinaron las dosis de seguridad de ascenso de Naglu administrado por inyección IT por 40 semanas en pacientes con SanA. Además, se valoró la actividad clínica de Naglu-IGFII y/o rhNaglu en la función cognitiva y farmacocinéticas de dosis repetida y única en suero y concentraciones en fluido cerebroespinal (CSF).

Mientras ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente han sido descritos con especificidad de conformidad con ciertas modalidades, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los compuestos de la invención y no están propuestos para limitar los mismos.

Los artículos "un" y "uno" como se usan en la presente en la especificación y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deben ser entendidos por incluir los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo son consideradas satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, empleados en, o de otro modo relevantes a un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o de otro modo sea evidente del contexto. La invención incluye modalidades en las cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, empleado en, o de otro modo relevante a un producto o proceso dado. La invención también incluye modalidades en las cuales más de uno, o los miembros del grupo completo están presentes en, empleados en, o de otro modo relevantes a un producto o proceso dado. Además, se entiende que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las cuales una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones listadas se introducen en otra reivindicación dependiente en la misma reivindicación base (o, como sea relevante, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique de otro modo o amenos que podría ser evidente para uno de habilidad ordinaria en la técnica que una contradicción o consistencia podría originarse. Donde los elementos están presentes como listas (por ejemplo, en un grupo Markush o formato similar) se entiende que cada subgrupo de los elementos también se describe, y cualesquiera de los elementos pueden ser removidos del grupo. Se entiende que, en general, donde la invención, o aspectos de la invención, es/son referidos como que comprenden elementos particulares, características, etc., ciertas modalidades de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente de, tales elementos, características, etc. Para propósitos de simplicidad estas modalidades no han sido en cualquier caso específicamente expuestas en así muchas palabras en la presente. Se debe entender también que cualquier modalidad o aspecto de la invención puede ser explícitamente excluido de las reivindicaciones, con respecto de si la exclusión especifica se menciona en la especificación. Las publicaciones, sitios de red y otros materiales de referencia aquí referenciados para describir el antecedente de la invención y proporcionar detalle adicional con respecto a su práctica están de este modo incorporados por referencia.

Claims (55)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. El uso de una proteína alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu) recombinante, en la preparación de un medicamento para tratar la enfermedad del Síndrome de Sanfilippo tipo B (San B) en un sujeto en necesidad del mismo, en donde el medicamento se adapta para ser administrable intratecalmente.

2. El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la proteína Naglu recombinante es una proteína de fusión que comprende un dominio Naglu y una porción de objetivo lisosomal.

3. El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteína Naglu humana madura).

4. El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido al menos 95% idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteina Naglu humana madura).

5. El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteína Naglu humana madura).

6. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde la porción de objetivo lisosomal es una porción IGF-II.

7. El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3).

8. El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica a IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3).

9. El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido al menos 90% idéntica a IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3).

10. El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido que incluye los residuos 8-67 de IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3).

11. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2-10, en donde la proteína de fusión además comprende un enlazador entre el dominio Naglu y la porción de objetivo lisosomal.

12. El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el enlazador además comprende una o más secuencias GAP.

13. El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde el enlazador comprende una secuencia de aminoácido de GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAA AAGGGGGGAP que corresponde a los residuos 721-777 de SEQ ID NO: 6.

14. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2-13, en donde la porción de objetivo lisosomal se fusiona directamente o vía el enlazador al C-término del dominio Naglu.

15. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 2-13, en donde la porción de objetivo lisosomal se fusiona directamente o vía el enlazador al N-término del dominio Naglu.

16. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteina recombinante se produce a partir de células humanas.

17. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteina recombinante se produce a partir de células CHO.

18. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para el suministro de la proteína Naglu en uno o más tejidos cerebrales objetivo.

19. El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en donde uno o más tejidos cerebrales objetivos se seleccionan a partir del grupo que consiste de tejidos de la materia gris, materia blanca, áreas periventriculares, pia-aracnoides, meninges, neocorteza, cerebelo, tejidos profundos en la corteza cerebral, capa molecular, región caudada/putamen, cerebro medio, regiones profundas de las protuberancias o médula, y combinaciones de los mismos.

20. El uso como el que se reclama en la reivindicación 18 ó 19, en donde la proteína Naglu en el medicamento se adapta para ser suministrado a neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meningeales.

21. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína Naglu en el medicamento se adapta para ser suministrado además a las neuronas en la médula espinal.

22. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para el suministro sistémico de la proteína Naglu en tejidos periféricos objetivos.

23. El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde los tejidos periféricos objetivos se seleccionan de hígado, riñon y/o corazón.

24. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para la localización lisosomal en tejidos objetivos cerebrales, neuronas de la médula espinal y/o tejidos periféricos de objetivo.

25. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para reducir el almacenamiento lisosomal en los tejidos objetivos del cerebro, neuronas de la médula espinal y/o tejidos objetivos periféricos.

26. El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde el almacenamiento lisosomal se determina por teñido LAMP-1.

27. El uso como el que se reclama en la reivindicación 26, en donde el almacenamiento lisosomal se reduce por al menos 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1-vez, 1.5-veces, ó 2-veces comparado con un control.

28. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para reducir la vacuolización en neuronas.

29. El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde las neuronas comprenden células Purkinje.

30. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para incrementar la actividad enzimática de Naglu en los tejidos objetivos del cerebro, neuronas de la médula espinal y/o tejidos objetivos periféricos.

31. El uso como el que se reclama en la reivindicación 30, en donde la actividad enzimática de Naglu en el medicamento se incrementa por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces ó 10-veces comparado con un control.

32. El uso como el que se reclama en la reivindicación 30 ó 31 , en donde la actividad enzimática incrementada de HNS en el medicamento es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg ó 600 nmol/hr/mg.

33. El uso como el que se reclama en la reivindicación 30, en donde la actividad enzimática de Naglu en el medicamento se incrementa en la región lumbar.

34. El uso como el que se reclama en la reivindicación 33, en donde la actividad enzimática de Naglu incrementada en la región lumbar es al menos aproximadamente 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, ó 10,000 nmol/hr/mg.

35. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para reducir la intensidad, severidad o frecuencia o comienzo retardado de al menos un síntoma o característica del Síndrome de Sanfilippo B.

36. El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en donde al menos un síntoma o característica de la enfermedad San B es pérdida auditiva, desarrollo retardado del habla, deficiencia en habilidades motoras, hiperactividad, retardo mental, agresividad y/o alteraciones del sueño.

37. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para ser administrable una vez cada dos semanas.

38. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para ser administrable una vez cada mes.

39. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para ser administrable una vez cada dos meses.

40. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para ser administrable en conjunto con administración intravenosa.

41. El uso como el que se reclama en la reivindicación 40, en donde el medicamento se adapta para ser administrable no más frecuente que una vez cada mes.

42. El uso como el que se reclama en la reivindicación 40, en donde el medicamento se adapta para ser administrable no más frecuente que una vez cada dos meses.

43. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para ser administrable intratecalmente en la ausencia de administración intravenosa.

44. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento se adapta para ser administrable intratecalmente en ausencia de terapia inmunosupresora concurrente.

45. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteína de fusión Naglu en el medicamento está a una concentración mayor de aproximadamente 20 mg/ml.

46. Una proteína de fusión terapéutica que comprende un dominio Naglu; una porción de objetivo lisosomal, y en donde, una vez administrada, la proteina de fusión terapéutica se dirige a lisosomas y es terapéuticamente efectiva in vivo.

47. La proteina de fusión terapéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada además porque el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteína Naglu humana madura).

48. La proteína de fusión terapéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada además porque el dominio Naglu comprende una secuencia de aminoácido idéntica a la SEQ ID NO: 1 (proteína Naglu humana madura).

49. La proteina de fusión terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-48, caracterizada además porque la porción de objetivo lisosomal es una porción IGF-II.

50. La proteína de fusión terapéutica de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada además porque la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 3).

51. La proteína de fusión terapéutica de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada además porque la porción IGF-II comprende una secuencia de aminoácido que incluye los residuos 8-67 de IGF-II humano maduro (SEQ ID NO: 3).

52. La proteína de fusión terapéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46-51 , caracterizada además porque la proteína de fusión además comprende un enlazador entre el dominio Naglu y la porción de objetivo lisosomal.

53. La proteína de fusión terapéutica de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque el enlazador comprende una secuencia de aminoácido de GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAA AAGGGGGGAP que corresponde a los residuos 721-777 de SEQ ID NO: 6.

54. La proteína de fusión terapéutica de conformidad con la reivindicación 52 ó 53, caracterizada además porque la porción de objetivo lisosomal se fusiona directamente o vía el enlazador al C-término del dominio Naglu.

55. Una proteína de fusión terapéutica dirigida a lisosomas y es terapéuticamente activa in vivo, que comprende una secuencia de aminoácido al menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 6 (la proteína de fusión Naglu-IGF-ll de longitud completa).