KR20010101131A - 폼페병의 치료 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 산 알파 글루코시다아제를 사용하여 폼페병을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 치료 요법은 환자에 주당 10㎎/㎏체중 이상을 주입하는 것을 포함한다.
Description
관련된 출원의 참조
본 출원은 모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된 1998년 7월 12일에 제출된 USSN 60/111291로부터 우선권을 얻는다. 본 출원은 1995년 8월 2일에 제출된 USSN 60/001,796으로부터 우선권을 얻는 1996S년 7월 29일에 제출된 USSN 08/700,760에 관한 것이고, 둘 다 모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된다.
다른 분비성 단백질과 같이, 리소좀 단백질은 소포체에서 합성되고 골지체로 보내진다. 그러나, 대부분의 다른 분비성 단백질과 달리, 리소좀 단백질은 세포외 유동체가 아니라 세포내 기관에 분비된다. 골지안에서, 리소좀 단백질은 세포내 목적지에 도달하기 위해 그들에 장치하는 특별한 과정을 겪는다. 대부분의 모든 리소좀 단백질은 글리코실화 및 말단 만노오스 기의 6' 위치를 통해 포스포릴화를 포함하는 번역 후 다양한 변형을 겪는다. 포스포릴화된 만노오스 잔류물은 트랜스 골지 네트워크(Trans Golgi Network)의 내부 표면에 특별한 수용기로 인해 인식된다. 리소좀 단백질은 상기 수용기를 통해 결합하고, 그러므로 다른 분비성 단백질로부터 분리된다. 그 후, 수용기-결합된 단백질을 포함하는 작은 운반체가 트랜스 골지 네트워크로부터 떨어져 세포내 목적지에 목표된다. 일반적으로 Kornfeld, Biochem. Soc. Trans. 18,367-374(1990)을 참조하라.
특별한 리소좀 단백질의 결핍의 각 결과인 30개 이상의 리소좀 질병이 있고, 흔히 유전적 돌연변이의 결과이다. 예를 들면, Cotran외, Robbins Pathologic Basis of Disease(4판, 1989)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)를 참조하라. 리소좀 단백질의 결핍은 대사물질의 해로운 축적을 일으킨다. 예를 들면, 헐러(Hurler), 헌터(Hunter), 모르키오(Morquio) 및 산필리포(Sanfilippo) 증후군에서, 뮤코폴리사카라이드 (mucopolysaccharide)의 축적이 있다; 테이삭스(Tay-Sachs), 고셔(Gaucher), 크라베(Krabbe), 니만-피크(Niemann-Pick) 및 파브리(Fabry) 증후군에서, 스핀고리피드(sphingolipid)의 축적이 있고; 및 푸코시도시스(fucosidosis) 및 만노시도시스(mannosidosis)에서, 푸코제-포함하는 스핀고리피드 및 글리코단백질 단편 및 만노제-포함하는 올리고사카라이드의 축적이 각각 있다.
글리코겐 저장 질병 타입 Ⅱ(GSD Ⅱ; 폼페병;산 말타제(maltase) 결핍)는 리소좀 효소 산 α-글루코시다아제(산 말타제)의 결핍에 의해 일어난다. 두개의 임상 형태는 구별된다: 유아의 빠른 발병 및 소년 및 성인의 늦은 발병. 유아 GSD Ⅱ는 생후 짧은 시간에 발병하고 점진적으로 근육 약화 및 심장 기능 부전을 나타낸다. 상기 임상 변이(변이)는 흔히 생후 첫 2년내에 치명적이다. 성인 및 소년환자에게서 늦은 발병의 증후는 생애에 더 늦게 일어나고, 골격근만이 포함된다. 환자들은 결국 호흡 기능 부전으로 죽는다. 환자들은 예외적으로 60년 이상 살 수도 있다. 병의 가혹함과 잔류 산 α-글루코시다아제 활성 사이의 상호 밀접한 관계가 있고, 활성은 늦은 발병에서 정상의 10-20% 및 병의 빠른 발병 형태에서 2%이하이다(Hirshhorn, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (Scriver외, 7판, McGraw-Hill, 1995), 2443-2464쪽).
리소좀 저장 질병의 1차 원인으로 리소좀 효소 결핍의 발견(예를 들면, Hers, Biochem. J. 86, 11-16(1963)를 참조하라) 때문에, 효소를 뺀 투여(정맥주사) 즉, 효소 치료법에 의해 리소좀 저장 질병의 환자를 치료하는 시도가 있어왔다. 폼페병에 대한 효소 대체 요법의 이 시험은 성공하지 못했다. 면역 반응을 주는, 아스퍼질러스(Aspergillus) 니거(niger)로부터 인간 아닌 α-글루코시다아제, 또는 세포에 의해 충분히 흡수되지 않는 효소의 형태(낮은 흡수 형태, 인간 태반으로부터 성숙한 효소; 하기를 참조하라)가 사용되었다. 또한, 치료하는 동안 둘다, 및/또는 투여된 효소의 양이 불충분하다(3-5). 천연 공급원 가령 인간 소변 및 소의 고환으로부터 리소좀 효소의 생산은 이론상 가능하지만 수득량이 낮고, 정제된 효소가 필수적으로 받아들이는 환자의 조직에 의해 흡수될 수 있는 형태는 아니다.
상기 불확실성 및 어려움에도 불구하고, 본 발명은 인간 산 알파 글루코시다아제를 사용하여 폼페병 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
청구된 발명의 요약
한 측면에서, 본 발명은 폼페병 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 인간 산 알파 글루코시다아제를 치료에 효과적인 양을 환자에게 투여하는 것을 수반한다. 투여량은 바람직하게는 적어도 주당 10㎎/㎏체중 이다. 일부 방법에서, 투여량은 적어도 주당 60㎎/㎏ 체중 및 적어도 주당 120㎎/㎏ 체중이다. 일부 방법에서, 상기 투여는 주당 1회 및 다른 방법에서는 주당 3회 이루어진다. 일부 방법에서, 치료는 적어도 24주동안 지속된다. 투여방법은 바람직하게는 정맥주사이다. 인간 산 알파 글루코시다아제는 바람직하게는 인간 아닌 유전자 변형 포유류의 젖에서 얻고, 바람직하게는 주로 110kD 형태이다.
본 방법은 유아, 소년 또는 성인 폼페병 환자 치료에 사용될 수 있다. 유아 폼페병 치료의 일부 방법에서 효력은 적어도 1살이 되기까지 살아남은 환자에 의해 나타난다.
일부 방법에서, 인간 산 알파 글루코시다아제의 수준은 레쿠오우엡트 (recuouebt) 환자에게서 모니터된다. 선택적으로, 만약 알파-글루코시다아제의 수준이 환자에게서 역치 값 이하로 떨어진다면 인간 산 알파 글루코시다아제의 두번째 투여량이 투여된다.
일부 방법에서, 인간 알파 글루코시다아제는 정맥주사로 투여되고 투여속도는 투여되는 기간 동안 증가한다. 일부 방법에서, 투여 속도는 적어도 투여되는 기간 동안 10배로 증가한다. 일부 방법에서, 투여 속도는 적어도 5시간 내에 10배로 증가한다. 일부 방법에서, 환자는 일련의 적어도 네번 투여되고, 각 투여량은 전 투여량보다 더 강하다. 일부 방법에서, 투여량은 1차가 0.03-3㎎/㎏/시, 2차가0.3-12㎎/㎏/시, 3차가 1-30㎎/㎏/시 및 4차가 2-60㎎/㎏/시이다. 일부 방법에서, 투여량은 1차가 0.1-1㎎/㎏/시, 2차가 1-4㎎/㎏/시, 3차가 3-10㎎/㎏/시 및 4차가 6-20㎎/㎏/시이다. 일부 방법에서, 투여량은 1차가 0.25-4㎎/㎏/시, 2차가 0.9-1.4㎎/㎏/시, 3차가 3.6-5.7㎎/㎏/시 및 4차가 7.2-11.3㎎/㎏/시이다. 일부 방법에서, 투여량은 1차가 0.3㎎/㎏/시, 2차가 1㎎/㎏/시, 3차가 4㎎/㎏/시 및 4차가 12㎎/㎏/시이다. 일부 방법에서, 1차, 2차, 3차 및 4차 투여가 각각 15분 내지 8시간동안 투여된다.
일부 방법에서, 1차, 2차, 3차 및 4차 투여가 각각 1시간, 1시간, 0.5시간 및 3시간 동안 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 멸균 형태에서 생리적으로 조건에 맞는 완충용액에 인간 산 알파 글루코시다아제, 인간 혈청 알부민 및 당을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 상기 조성물은 인산 나트륨 완충용액에 인간 산 알파 글루코시다아제, 인간 혈청 알부민 및 글루코즈를 포함한다. 일부 조성물은 수용액에 알파 글루코시다아제, 만니톨(mannitol) 및 수크로즈를 포함한다. 일부 조성물에서 당은 만니톨과 수크로즈를 포함하고 만니톨의 농도는 수용액의 1-3%w/w이고 수크로즈의 농도는 수용액의 0.1 내지 1%w/w이다. 일부 조성물에서, 만니톨의 농도는 2%w/w이고 수크로즈의 농도는 0.5%w/w이다.
본 발명은 추가로 수용액에서 인간 산 글루코시다아제, 만니톨 및 수크로즈를 포함하는 약학 조성물을 냉동건조하여 냉동건조된 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 2차 조성물을 생성하기 위해 인간 산 알파-글루코시다아제, 만니톨, 수크로즈 및 수용액을 포함하는 1차 조성물을 냉동건조; 및 3차 조성물을 생성하기 위해 염수에서 냉동 건조된 조성물을 재구성하여 제조될 수 있다. 일부 상기 조성물에서, 인간 산 알파-글루코시다아제는 1차 및 3차 조성물 모두에서 5㎎/㎖이고, 만니톨은 1차 조성물에서 2㎎/㎖이고, 수크로즈는 1차 조성물에서 0.5㎎/㎖이고, 재구성 단계에 사용된 염수는 0.9%w/w이다.
본 발명은 재조합 유전학 및 의학의 분야이고, 폼페병 환자의 효소-대체 치료에 관한 것이다.
도 1: 산 α-글루코시다아제 cDNA를 포함하는 변형유전자. αs1-카세인 엑손은 열린 상자에 의해 표시되고; α-글루코시다아제 cDNA는 음영 상자에 의해 표시된다. αs1-카세인 인트론(intron) 및 서열 측면은 굵은 선으로 표시된다. 점선은 IgG 수용기 사이트를 표시한다. 전사 개시 사이트는 (), 번역 개시 사이트(ATG), 종결 코돈(TAG) 및 폴리아데닐화(polyadenylation) 사이트(pA)로 표시된다.
도 2(패널 A, B, C): 산 α-글루코시다아제 게놈 DNA를 포함하는 세개의 변형 유전자. 어두운 음영 영역은 αs1 카세인 서열이고, 열린 상자는 산 α-글루코시다아제 엑손을 표시하고, 열린 상자 사이의 점선은 α-글루코시다아제 인트론을 표시한다. 다른 표시는 도 1과 같다.
도 3(패널 A, B, C): 게놈 변형 유전자의 구조. α-글루코시다아제 엑손은 열린 상자에 의해 표시되고; α-글루코시다아제 인트론 및 번역되지 않은 서열은 점선으로 표시된다. pKUN 수용기 서열은 굵은 선으로 표시된다.
도 4. 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 의해 유전자 변형 마우스의 젖에서 산 α-글루코시다아제의 검출.
정의
용어 "실제 동일" 또는 "실제 상동"은 최적값으로 배열할 때, 가령 디폴트 간격 중량(default gap weight)을 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 두개의 펩티드 서열이 적어도 65 퍼센트 서열 동일, 바람직하게는 적어도 80 또는 90 퍼센트 서열 동일, 더욱 바람직하게는 적어도 95 퍼센트 이상 서열 동일(예를 들면, 99 퍼센트 서열 동일)을 공유하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않는 잔류 위치는 보존적인 아미노산 치환에 의해 다르다.
용어 "실제 순수한" 또는 "분리된"은 목적 종(species)이 자연 환경의 구성요소로부터 확인되고 분리되고 및/또는 회복되는 것을 의미한다. 보통, 목적 종은 존재하는 주종이고(즉, 질량 기초에 조성물에 다른 개별적 종보다 더 풍부하다), 바람직하게는 실제로 순수한 분획은 상기 목적 종은 모든 존재하는 거대분자 종의 적어도 약 50퍼센트(질량 기초에)이상을 차지한다. 일반적으로, 실제로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대 분자 종의 약 80 내지 90 중량 퍼센트 이상을 차지하는 것이다. 가장 바람직하게는 목적 종이 본질적 정제(오염물질 종은 종래의 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없다)되고 여기서 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종의 유도체로 구성된다.
DNA 단편(segment)은 또 다른 DNA 단편과 기능적 관계에 놓일 때 실시 가능하게 연결된다. 예를 들면, 만약 폴리펩티드의 분비에 관여하는 프리단백질로 발현된다면 신호 서열에 대한 DNA는 실시 가능하게 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA에연결된다; 만약 서열의 전사를 자극한다면, 프로모터(promotor) 또는 인핸서(enhancer)가 실시 가능하게 코딩 서열에 연결된다. 일반적으로, 실시 가능하게 연결된 DNA 서열이 연속되고, 신호 서열의 경우 및 읽기 상 모두에서 연속된다. 그러나, 인핸서가 조절하는 전사의 코딩 서열은 연속될 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 사이트 또는 어댑터에서 결찰 또는 그것에 삽입된 링커(linker)로 이루어진다.
외부 원인에 의한 DNA 단편은 세포에 이질적이거나, 일치하더라도 숙주 세포 게놈에서 자연스럽지 않은 위치에 있다. 외부 원인에 의한 DNA 단편은 외부 원인에 의한 폴리펩티드를 발현한다.
유전자 변형(transgenic) 포유류에서, 모든, 또는 실제로 모든 생식세포라인(germline) 및 체세포는 빠른 태아 단계에서 포유류 또는 포유류의 조상에 도입된 변형 유전자를 포함한다.
본 발명은 유전자 변형 인간이 아닌 포유류가 분비하는 그들의 젖에서 리소좀 단백질을 제공한다. 분비물은 리소좀 단백질을 인코딩하는 변형 유전자 및 젖샘에 유전자의 목표화 발현할 수 있는 조절 서열을 혼합함으로 이루어진다. 변형 유전자는 발현되고, 발현 생성물은 번역 후에 젖샘 내에서 수정되고, 그 후 젖에 분비된다. 번역후 수정은 리소좀 단백질을 포함하는 만노오스-6 인산염을 생성하기 위해 글리코실화 및 포스포릴화의 단계를 포함할 수 있다.
A. 리소좀 유전자
본 발명은 리소좀 효소를 인코딩하는 30개 이상의 알려진 유전자 및 α-글루코시다아제, α-L-이듀로니다아제, 이듀로네이트-황산염 술퍼타아제, 헥소사미니다아제 A 및 B, 강글리오시드 활성제 단백질, 아릴술퍼타아제 A 및 B, 이듀로네이트 술퍼타아제, 헤파란 N-술퍼타아제, 갈락토-세라미다아제, α-갈락토실세라미다아제 A, 스핀고미엘리나제, α-푸코시다아제, α-만노시다아제, 아스팔틸글리코사민 아미드 히드롤라제, 산 리파제, N-아세틸-α-D-글루코사민-6-황산염 술퍼타아제, α-및 β-갈락토시다아제, β-글루큐로니다아제, β-만노시다아제, 세라미다아제, 갈락토-세레-브로시다아제, α-N-아세틸갈락토사미니다아제 및 보호하는 단백질 및 다른 것들을 포함하는 리소좀 단백질의 다른 형태를 포함하는 유전자 변형의 인간 아닌 포유류가 발현하는 DNA 단편을 제공한다. 대립, 동종 및 알려진 리소좀 단백질 유전자 서열의 유도된 변이형을 발현하는 유전자 변형의 포유류가 또한 포함된다. 상기 변이형은 보통 알려진 리소좀 단백질 유전자의 아미노산 수준에서 실제 서열 동일을 보인다. 상기 변이형은 보통 엄중한 조건(stringent conditon)하의 알려진 유전자에 하이브리다즈되거나 또는 알려진 유전자 하나로 인코딩한 폴리펩티드에 항체와 교차 반응한다.
리소좀 단백질을 인코딩하는 많은 알려진 유전자의 게놈 또는 cDNA 서열을 포함하는 DNA 클론을 이용할 수 있다. (Scott외, Am.J.Hum.Genet. 47,802-807(1990); Wilson외, PNAS 87,8531-8535(1990); Stein외, J.Biol.Chem.264,1252-1259(1989); Ginns외, Biochem.Biophys.Res.Comm. 123,574-580(1984); Hoefsloot외, EMBO J. 7,1697-1704(1988); Hoefsloot외, Biochem. J. 272,473-479(1990);Meyerowitz & Proia, PNAS 81,5394-5398(1984); Scriver외, 상기 12부, 2427-2882쪽 및 그 속에 인용된 참조) 게놈 및 cDNA 서열의 다른 예는 GenBank로부터 이용할 수 있다. 리소좀 유전자의 첨가된 클론 서열이 필요한 범위에, 탐색자로써 알려진 리소좀 단백질 DNA 서열 또는 알려진 리소좀 단백질에 항체를 사용하여 게놈 및 cDNA 라이브러리 (바람직하게는 인간)로부터 얻을 수 있다.
B. 리소좀 단백질의 구조
재조합 리소좀 단백질은 바람직하게 자연적으로 일어나는 리소좀 단백질과 같거나 유사한 구조를 갖기 위해 처리된다. 리소좀 단백질은 소포체(RER)에 결합된 리보솜에서 합성된 글리코단백질이다. N-말단 신호 펩티드(Ng외, Current Opinion in Cell Biology 6,510-516(1994))에 의해 공-번역으로 상기 기관에 들어간다. N-연결된 글리코실화 과정은 돌리콜(dolichol) 운반체로부터 높은-만노오스 올리고사카라이드 선구물질 Glc3Man9GlcNAc2를 총괄하는 전이의 RER에서 시작한다. 탄수화물 체인 수정은 RER에서 시작하고 글리코시다아제 Ⅰ 및 Ⅱ에 의해 세개의 가장 바깥쪽 글루코즈 잔류물을 제거하는 골지체에서 계속된다. 포스포릴화는 두-단계 과정으로 1차는 리소좀 단백질 특정 전이효소에 의해 만노오스 기를 선택하기 위해 N-아세틸-글루코-사민-1-포스페이트가 결합되고, 2차에서, 디에스테라제에 의해 N-아세틸-글루코-사민이 분해된다(Goldberg외, Lysosomes; Their Role in Protein Breakdown (Academic Press Inc., London, 1987), 163-191쪽). 분열은 인식 표시 및 리소좀에 대부분의 리소좀 단백질의 운반을 매개하는 만노오스 6-포스페이트 수용기에 대한 리간드로써 만노오스 6-포스페이트를 노출한다(Kornfeld,Biochem.Soc.Trans. 18,367-374(1992))
탄수화물 체인 수정에 추가로, 대부분의 리소좀 단백질은 단백질 분해 과정을 겪는데, 1차 경우에서 신호 펩티드가 제거된다. 대부분의 리소좀 단백질의 신호 펩티드는 단백질이 녹은 후 신호 펩티다아제에 의해 전위된 후 잘라진다. 효소가 RER을 남긴 후, 그러나 리소좀 또는 분비 경로에 들어가기 전에 산 α-글루코시다아제의 신호 펩티드가 잘라진다는 증거가 있다(Wisselaar외, J.Biol.Chem. 268,2223-2231(1993)). 산 α-글루코시다아제의 단백질 분해 과정은 복잡하고 다양한 부세포 위치에서 일어나는 신호 펩티드의 잘라짐에 추가로 일련의 단계가 포함된다. 특정 촉매 활성이 증가되는 N 및 C 말단 둘 다에서 폴리펩티드는 잘라진다. 인식된 주된 종은 110/100kD 선구물질, 95kD 중간체 및 76kD 및 70kD 성숙한 형태이다. (Hasilik외, J.Biol.Chem. 255,4937-4945(1980); Oude Elferink외, Eur.J.Biochem. 139,489-495(1984); Reuser외, J.Biol.Chem. 260,8336-8341(1985); Hoefsloot외, EMBO J. 7,1697-1704(1988)). COS세포, BHK세포 및 CHO세포와 같은 배양된 포유류 세포에서 발현되는 것과 같이 천연 인간 산 α-글루코시다아제 및 인간 산 α-글루코시다아제의 재조합 형태의 번역 후 과정은 유사하다(Hoefsloot외, (1990) 상기; Wisselaar외, (1993) 상기).
만노오스 기의 6' 위치에서 포스포릴화된 리소좀 단백질을 제조하기 위한 확실한 과정이 만노오스 6-포스페이트에 대한 수용기를 지탱하는 세포에 의해 기질의 흡수를 측정하여 시험될 수 있다. 옳게 수정된 기질은 수정되지 않은 기질보다 더 빠르게 흡수하고, 이 방법에서 수정된 기질의 흡수는 만노오스 6-포스페이트의 첨가에 의해 길항적으로 억제될 수 있다.
C. 변형 유전자 디자인
변형 유전자를 잠복하는 유전자 변형의 인간 아닌 포유류의 젖샘에 재조합 리소좀 단백질의 발현을 목표로 하게끔 유전자 변형은 디자인된다. 기초적인 방법은 실시 가능하게 신호 서열, 프로모터 및 인핸서의 단백질을 인코딩하는 외부 원인에 의한 DNA 단편을 연결하는 것을 수반한다. DNA 단편은 게놈, 미니 유전자(하나 이상의 인트론이 생략된 게놈), cDNA, YAC 단편, 두개의 다른 리소좀 단백질 유전자의 키메라(chimera) 또는 상기의 하이브리드일 수 있다. 게놈 서열의 포함은 일반적으로 더 높은 수준의 발현을 이끈다. 매우 높은 수준의 발현은 번역 후 변이 및 리소좀 단백질 분비를 형성하기 위해 젖샘의 용량에 지나치게 부하를 건다. 그러나, 하기에 나타낸 데이타는 실제 번역 후 변이가 ㎎/㎖ 범위에서 높은 발현 수준에도 불구하고, 만노오스 6-포스페이트 기의 형태를 포함하여 일어나는 것을 나타낸다. 실제 변이는 분비된 분자의 적어도 약 10, 25, 50, 75 또는 90%가 적어도 하나의 만노오스 6-포스페이트 기를 지탱하는 것을 의미한다. 따라서, 게놈 구조 또는 하이브리드 cDNA-게놈 구조는 일반적으로 바람직하다.
게놈 구조에서, 모든 인트론 서열을 보유할 필요는 없다. 예를 들면, 일부 인트론 서열은 DNA 촉진 및 이후 현미주사(microinjection)를 쉽게 하기 위한 더 작은 변형 유전자를 얻기 위해 제거될 수 있다. Archibald외, WO 90/05188 (모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)를 참조하라. 일부 인트론의 제거는 발현 수준을 감소하고 그것에 의해 번역 후 변이가 실제로 완벽하다는 것을 확인하는 일부예에서 또한 유용하다. 산 α-글루코시다아제의 게놈 서열의 인트론 같은 인트론을 제외한 다른 예에서 성숙한 효소의 더 높은 발현을 이끈다. 코딩하지 않은 엑손의 일부 또는 모두를 지우는 것이 또한 가능하다. 일부 변형 유전자에서, 서열을 인코딩하는 리소좀 단백질에서 선택된 뉴클레오티드는 단백질을 분해하는 분열 사이트를 제거하기 위해 변화된다.
변형 유전자 포유류에 의해 생성된 리소좀 단백질의 의도된 용도가 보통 인간에게 적용되기 때문에, 리소좀 단백질 서열을 인코딩하는 DNA 단편이 얻어지는 종이 바람직하게는 인간이다. 유사하게 만약 의도된 용도가 수의학 치료라면(예를 들면, 말, 개 또는 고양이), DNA 단편을 같은 종에서 얻는 것이 바람직하다.
프로모터 및 인핸서는 배타적으로 또는 적어도 우선적으로 젖샘(즉, 젖샘 특정 유전자)에서 발현된 유전자로부터이다. 프로모터 및 인핸서의 공급원으로 바람직한 유전자는 β-카세인, κ-카세인, αS1-카세인, αS2-카세인, β-락토글로불린, 유장 산 단백질 및 α-락탈부민을 포함한다. 프로모터 및 인핸서는 보통 같은 젖샘 특정 유전자로부터 얻지만 항상 얻지는 못한다. 상기 유전자는 때때로 변형 유전자가 발현되는 같은 종의 포유류에서 얻지만 필수적으로는 아니다. 인간 유전자로부터 얻는 것과 같은 다른 종의 발현 조절 서열이 또한 사용될 수 있다. 신호 서열은 젖샘으로부터 얻은 리소좀 단백질의 분비를 이끌 수 있어야만 한다. 적당한 신호 서열은 분비된 단백질을 인코딩하는 포유류 유전자로부터 유도될 수 있다. 놀랍게도, 상기 단백질이 보통 세포내 기관에 분비되지 않으나 목표됨에도 불구하고, 리소좀 단백질의 자연 신호 서열이 적당하다. 상기 신호 서열에 추가로, 신호서열의 바람직한 공급원은 얻어진 프로모터 및 인핸서과 같은 유전자로부터 얻는 신호 서열이다. 선택적으로, 추가 규정의 서열은 발현 수준을 최대화하기 위한 변형 유전자에 포함된다. 상기 서열은 5' 측면 영역, 번역되지 않은 것을 제외한 5' 전사 영역, 인트론 서열, 번역되지 않은 것을 제외한 3' 전사 영역, 폴리아데닐화 사이트 및 3' 측면 영역을 포함한다. 상기 서열은 흔히 프로모터 및 인핸서가 얻어지는 또는 리소좀 단백질이 발현되는 젖샘 특정 유전자로부터 얻어진다. 상기 서열의 포함은 믿을 만한 젖샘 특정 유전자 및/또는 믿을 만한 리소좀 단백질 유전자의 서열을 촉진하는 유전적 환경을 만든다. 상기 유전적 환경은 일부 경우에서 (예를 들면, 소 αS1-카세인) 전사된 유전자의 더 높은 발현을 일으킨다. 선택적으로, 3' 측면 영역 및 번역되지 않은 영역은 β-글로빈 유전자 또는 바이러스성 유전자와 같은 다른 이종 구조의 유전자로부터 얻는다. 리소좀 단백질 유전자의 3' 및 5' 번역되지 않은 영역 또는 이종 구조의 유전자의 포함이 또한 전사의 안정성을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 5' 측면 서열의 약 0.5, 1, 5, 10, 15, 20 또는 30kb가 리소좀 단백질 유전자가 발현하는 약 1, 5, 10, 15, 20 또는 30kb 또는 3' 측면 서열의 조합에 포유류 특정 유전자로부터 포함된다. 만약 단백질이 cDNA 서열로부터 발현된다면, 프로모터와 코딩 서열 사이의 인트론 서열을 포함하는 것이 우월하다. 인트론 서열은 바람직하게는 프로모터가 얻어지는 젖샘 특정 영역의 첫번째 인트론으로부터 조정하는 서열로부터 5' 부분으로부터 형성된 하이브리드 서열 및 IgG 조정하는 서열 또는 리소좀 단백질 유전자의 조정하는 서열로부터 3' 부분이다.DeBoer외, WO 91/08216 (모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)을 참조하라.
리소좀 단백질을 발현하는 바람직한 변형 유전자는 카세인 프로모터 및 인핸서에 5'를 연결한 cDNA-게놈 하이브리드 리소좀 단백질 유전자를 포함한다. 하이브리드 유전자는 리소좀 단백질 유전자로부터 신호 서열, 코딩 영역 및 3' 측면 영역을 포함한다. 선택적으로, cDNA 단편은 리소좀 단백질을 인코딩하는 유전자의 5' 카세인과 번역되지 않은 영역 사이의 인트론 서열을 포함한다. 물론, 대응하는 cDNA 및 게놈 단편이 또한 결과의 융해물로부터 발현될 수 있는 연속되는 단백질을 제공하는 유전자 내에 다른 위치에서 녹는다.
다른 바람직한 변형 유전자는 카세인 조절 서열에 5'를 연결한 게놈 리소좀 단백질 단편을 갖는다. 게놈 단편은 보통 유전자의 5' 번역되지 않은 영역 내지 3' 측면 영역에 연속된다. 따라서, 게놈 단편은 리소좀 단백질 5' 번역되지 않은 서열, 신호 서열, 선택하는 인트론 및 코딩 엑손, 3' 번역되지 않은 영역, 및 3' 측면 영역의 일부를 포함한다. 게놈 단편은 프로모터 및 인핸서를 포함하는 카세인 단편에 5' 번역되지 않은 영역을 통해 및 흔히 5' 번역되지 않은 영역에 연결된다.
DNA 서열 정보는 상기 목록된 젖샘 특정 유전자의 모두, 적어도 하나 및 가끔 일부 유기체에 유용하다. 예를 들면, Richards외, J.Biol.Chem. 256,526-532(1981)(α-락탈부민 쥐(rat)); Campbell외, Nucleic Acids Res. 12,8685-8697(1984)(쥐 WAP); Jones외, J.Biol.Chem. 260,7042-7050(1985)(쥐 β-카세인); Yu-Lee & Rosen, J.Biol.Chem. 258,10794-10804(1983)(쥐 γ-카세인); Hall,Biochem.J. 242,735-742(1987)(α-락탈부민 인간); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389(1984)(소 αs1 및 κ카세인 cDNAs); Gorodetsky외, Gene 66,87-96(1988)(소 β카세인); Alexander외, Eur.J.Biochem. 178,395-401(1988)(소 κ카세인); Brignon외, FEBS Lett. 188,48-55(1977)(소 αS2 카세인); Jamieson외, Gene 61,85-90(1987), Ivanov외, Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369,425-429(1988), Alexander외, Nucleic Acids Res. 17,6739(1989)(소 β락토글로불린); Viotte외, Biochimie 69, 609-620(1987)(소 α-락탈부민)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)을 참조하라. 다양한 젖 단백질 유전자의 구조 및 기능은 Mercier & Vilotte, J.Dairy Sci. 76,3079-3098(1993)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)에 의해 재검토된다. 추가의 서열 데이타가 필요한 범위에, 이미 얻어진 서열 측면 영역은 탐색자로 존재하는 서열을 사용하여 쉽게 클론될 수 있다. 다른 유기체로부터 젖샘 특정 조절 서열은 똑같이 알려진 동족의 뉴클레오티드 서열 또는 탐색자로 동족 단백질에 항체를 사용하여 상기 유기체로부터 라이브러리를 스크리닝하여 얻는다.
젖샘에 재조합 단백질의 발현을 목표화하는 αS1-카세인 조절 서열을 사용하는 일반적인 전략 및 전형적인 변형 유전자는 DeBoer외, WO 91/08216 및 WO 93/25567 (모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)에서 더 자세히 기술된다. 다른 젖샘 특정 유전자로부터 조절 서열을 사용하는 변형 유전자의 예는 또한 기술되어왔다. 예를 들면, Simon외, Bio/Technology 6,179-183(1988) 및 WO 88/00239 (1988)(양에서 발현하는 β-락토글로불린 조절 서열); Rosen, EP 279,582 및 Lee외, Nucleic Acids Res. 16, 1027-1041(1998)(마우스에서 발현하는 β-카세인 조절서열); Gordon, Biotechnology 5, 1183(1987)(마우스에서 발현하는 WAP 조절 서열); WO 88/01648(1988) 및 Eur.J.Biochem. 186,43-48(1989)(마우스에서 발현하는 α-락탈부민 조절 서열)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)를 참조하라.
변형 유전자로부터 젖의 리소좀 단백질의 발현이 번역 후 변이 및 리소좀 단백질의 목표화를 포함하는 유전자의 공-발현 또는 기능적 비활성(즉, 녹아웃 (knock-out))에 의해 영향받을 수 있다. 실시예에서 데이타는 놀랍게도 젖샘이 이미 높은 수준에서 단백질을 포함하는 만노오스 6-포스페이트의 조합 및 분비를 얻기 위해 충분한 양에서 변이 하는 효소를 발현하는 것을 나타낸다. 그러나, 높은 수준에서 상기 단백질을 발현하는 일부 변형 유전자 포유류에서, 때때로 변형 유전자 발현으로부터 얻는 추가의 효소의 과정 효소가 내적 원인에 의한 수준을 보충하는 것이 바람직하다. 상기 변형 유전자는 변형 유전자에서 리소좀 단백질 코딩 서열을 대체하는 효소 코딩 서열 과정의 상기 언급된 것에 유사한 원칙을 적용하여 구조화된다. 일반적으로 번역 후 과정의 효소가 분비될 필요는 없다. 따라서, 리소좀 단백질 코딩 서열에 연결된 분비 신호 서열은 분비 없이 소포체에 과정 효소를 목표화하는 신호 서열로 대체된다. 예를 들면, 자연적으로 상기 효소와 연관된 신호 서열은 적당하다.
D. 유전자 변형
상기 기술된 변형 유전자는 인간 아닌 포유류로 받아들여진다. 마우스 및 쥐, 토끼 같은 설치류, 양(sheep) 및 염소와 같은 오바인(ovine), 돼지 같은 포신(porcine), 및 소 및 퍼팔로와 같은 보바인(bovine)을 포함하는 대부분의 인간아닌 포유류가 적당하다. 마우스가 , 유전자 변형 및 기르기가 쉬운 장점을 제공하는 반면, 보바인은 많은 양의 젖을 제공하는 장점이 있다. 토끼는 상기 장점의 절충을 제공한다. 토끼는 약 14%의 단백질 함량의 하루 100㎖ 젖을 만들 수 있고(Buhler외, Bio/Technology 8,140(1990))(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된), 마우스처럼 같은 원칙 및 유사한 시설을 사용하여 조정될 수 있고 기를 수 있다. 뾰족한 개미핥기 또는 오리너구리(duckbill platypus)와 같은 난태생 포유류가 전형적으로 사용되지 않는다.
유전자 변형 방법에서, 변형 유전자는 수정된 난모세포의 난핵에 주입된다. 마우스 및 토끼와 같은 몇 동물에 대해, 수정은 생체내에서 이루어지고 수정된 난자는 수술로 제거된다. 다른 동물, 특히 소에서, 살아있거나 도살장 동물에서 난자를 제거하는 것 및 시험관에서 난자를 수정하는 것이 바람직하다. DeBoer외, WO 91/08216을 참조하라. 시험관에서 수정은 변형 유전자가 완성에 대해 세포 순환의 최적한 상(S-상보다 더 늦지 않은)에서 동시에 발생하는 세포를 충분히 주입할 수 있게 한다. 변형 유전자는 보통 현미주사로 주입된다. US 4,873,292를 참조하라. 그 후 약 16-150 세포를 포함하는 프리-이식 태아가 얻어질 때까지 수정된 난모세포는 시험관에서 배양된다. 배(embryo)의 16-32 세포 단계는 상실배(morula)로 기술된다. 32 이상의 세포를 포함하는 프리-이식 배를 배반포라 불린다. 상기 배는 전형적으로 64 세포 단계에서 배반포 구멍이 커지는 것을 보인다. 프리-이식 단계에 수정된 난모세포를 배양하는 방법이 Gordon외, Methods Enzymol. 101,414(1984); Hogan외, Manipulation of the Mouse Embryo: A LaboratoryManual, C.S.H.L. N.Y.(1986)(마우스 배(mouse embryo)); 및 Hammer외, Nature 315,680(1985)(토끼 및 돼지의 배); Gandolfi외 J.Reprod.Fert. 81,23-28(1987); Rexroad외, J.Anim.Sci. 66,947-953(1988)(양의 배) 및 Eyestone외 J.Reprod.Fert. 85,715-720(1989); Camous외, J.Reprod.Fert. 72,779-785(1984); 및 Heyman외 Theriogenology 27,5968(1987)(소의 배)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)에 의해 기술된다. 때때로 프리-이식 배는 이식이 미정인 기간동안 동결 저장된다. 프리-이식 배는 변형 유전자가 완성될 때 성장 단계에 기초한 변형 유전자 또는 괴물의 태생을 낳는 의사 임신한 암컷의 나팔관으로 이동한다. 진짜 생식세포 유전자 변형 동물을 만들기 위해 괴물 포유류가 키워질 수 있다.
선택적으로, 변형 유전자는 배 줄기 세포(ES)에 주입될 수 있다. 상기 세포들은 시험관에서 배양된 프리이식 배로부터 얻는다. Bradley외, Nature 309,255-258(1984)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된). 변형 유전자들은 일렉트로포레이션(electoporation) 또는 현미주사로 상기 세포에 주입될 수 있다. 이동한 ES 세포들은 인간-아닌 동물로부터 배반포에 결합된다. ES 세포들은 배를 복제하고 일부 배에서 공사의 동물을 일으키는 생식세포라인을 형성한다. Jaenisch, Science, 240,1468-1474(1988)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)를 참조하라. 선택적으로, ES 세포가 유전자 변형 포유류를 일으키는 탈핵 수정된 난모세포 이식에 대해 핵의 공급원으로 사용될 수 있다.
두개 이상의 변형 유전자를 포함하는 유전자 변형 동물의 생산에 대해, 변형 유전자는 단일 변형 유전자에 대한 같은 방법으로 동시에 도입될 수 있다. 선택적으로, 변형 유전자들은 격리된 동물에 처음에 주입될 수 있고 그 후 동물을 번식함으로 같은 게놈에 결합된다. 선택적으로, 첫번째 유전자 변형 동물이 하나의 변형 유전자를 가지고 생성된다. 그 후 두번째 변형 유전자는 상기 동물로부터의 수정된 난자 또는 배의 줄기 세포에 도입된다. 일부 구체예에서, 반대로 약 50kb의 길이가 과한 변형 유전자들은 겹치는 단편으로 조립된다. 상기 겹치는 단편들은 수정된 난모세포 또는 배의 줄기 세포에 동시에 도입되고 생체내에서 상동 재조합을 겪는다. Kay외, WO 92/03917(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)를 참조하라.
E. 유전자 변형 포유류의 특징
본 발명의 유전자 변형 포유류는 상기 기술된 바와 같이 게놈에 적어도 하나의 변형 유전자를 가지고 있다. 변형 유전자는 젖샘에 적어도 주로 리소좀 단백질을 인코딩하는 DNA 단편의 발현을 목표화한다. 놀랍게도, 젖샘이 올리고사카라이드 및 포스포릴화의 단계를 포함하는 믿을 만한 번역 후 과정에 필요한 단백질을 발현할 수 있다. 젖샘에서 효소에 의한 과정이 만노오스 기의 6' 위치의 포스포릴화를 일으킨다.
리소좀 단백질은 적어도 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 5000 또는 10,000㎍/㎖의 높은 수준에 분비될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 유전자 변형 포유류는 충분히 보통의 건강상태를 보인다. 젖샘 외의 다른 조직에서 리소좀 단백질의 두번째 발현은 유해한 영향을 일으키는 충분한 범위에서 일어나지 않는다. 또한, 젖샘에서 생성된 외부 원인에 의한 리소좀 단백질은 분비기를 방해하는 것을억제함으로 중대한 문제가 일어나지 않는 충분한 효율로 분비된다.
물론, 젖을 생산할 수 있는 유전자 변형 동물의 나이는 동물의 성질에 따라 다양하다. 유전자 변형 마우스의 경우, 약 5-6주임에 반하여, 유전자 변형 소의 경우, 자연적으로 약 2년 반 또는 호르몬 자극으로 6개월이다. 물론, 종의 암컷만이 젖 생산에 유용하다. 그러나, 유전자 변형 수컷이 또한 암컷 자손을 번식하는데 중요하다. 유전자 변형 수컷의 정자는 차후 시험관에서 암컷 자손의 수정 및 생산을 위해 동결 저장할 수 있다.
F. 젖으로부터 단백질의 회복
유전자 변형 성숙한 암컷 포유류는 외부 원인에 의한 리소좀 단백질의 높은 농도를 포함하는 젖을 생산한다. 만약 요구된다면, 구별되는 물리 화학적 특성 및 침전, 이온 교환, 분자 축출 또는 친화력 크로마토그래피와 같은 기본적인 정제 방법으로 단백질을 젖으로부터 정제할 수 있다. 일반적으로 Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982)를 참조하라.
젖으로부터 인간 산 α-글루코시다아제의 정제는 원심분리로 유전자 변형 젖의 지방을 제거 및 데드-엔드(dead-end) 여과에 의한 빠른 속도의 원심분리로 카세인의 제거에 의한 지방 제거(즉, 연속적으로 감소하는 여과기 크기를 사용하는 데드-엔드 여과) 또는 교차-흐름 여과, 또는; 교차-흐름 여과에 의해 직접 카세인을 제거함으로 실시될 수 있다. 인간 산 α-글루코시다아제는 Q Sepharose FF (또는 다른 음이온-교환 물질), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 금속-킬레이트 Sepharose, 또는 Sepharose에 결합된 렉틴(lectin)(또는 다른 물질)을 포함한 크로마토그래피에 의해 정제된다.
Q Sepharose 빠른 흐름 크로마토그래피는 하기의 여과된 유장 또는 유장 단편에 존재하는 인간 산 α-글루코시다아제를 정제하는데 사용될 수 있다: Q Sepharose 빠른 흐름(QFF; Pharmacia) 크로마토그래피(Pharmacia XK-50 컬럼, 15㎝ 층 높이; 250㎝/시 흐림 속도) 컬럼은 20mM 인산 나트륨 완충용액, pH 7.0(완충용액 A)에서 평형을 이루었다; S/D-배양된 유장 단편(약 500내지 600㎖)이 축적되고 컬럼을 완충용액 A(20mM 인산 나트륨 완충용액, pH 7.0)의 4-6 컬럼 부피(cv)로 씻는다. 인간 산 α-글루코시다아제 단편은 100mM NaCl을 포함하는 2-3cv 완충용액 A의 Q FF 컬럼으로부터 추출된다.
단편을 포함하는 Q FF Sepharose 인간 산 α-글루코시다아제는 추가로 페닐 세파로즈 고기능 크로마토그래피(Phenyl Sepharose High Performance chromatography)를 사용하여 정제될 수 있다. 예를 들면, 계속해서 교반하는 동안 황화 암모늄 1M의 1부피를 Q FF Sepharose 인간 산 α-글루코시다아제 추출물에 넣는다. 0.5M 황화 암모늄, 50mM 인산 나트륨 완충용액 pH 6.0 (완충용액 C)을 평형시키고 0.5M 황화 암모늄-배양된 인간 산 α-글루코시다아제 추출물(Q FF Sepharose로부터)을 넣고, 완충용액 C의 2-4cv로 컬럼을 씻고, 인산 산 α-글루코시다아제를 추출함으로 실온에서 행해진 페닐 HP(Pharmacia) 컬럼 크로마토그래피(Pharmacia XK-50 컬럼, 15㎝ 층 높이; 150㎝/시 유속)가 완충용액 D의 3-5cv(pH 6.0에서 50mM 인산 나트륨 완충용액)로 페닐 HP 컬럼으로부터 추출된다. 추가로 인산 산 α-글루코시다아제를 정제하는 선택적인 방법 및 추가의 방법은 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들면, 영국 특허 출원 998 07464.4(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)를 참고하라.
G. 재조합 리소좀 단백질의 용도
본 발명에 따라 제조된 재조합 리소좀 단백질은 효소 대체 치료 과정에서 용도가 발견된다. 유전자 또는 기능적 리소좀 효소의 부족에 의한 다른 결핍의 환자에게 외부 원인에 의한 효소를 투입함으로 치료될 수 있다. 상기 치료가 필요한 환자들은 증상(예를 들면, 헐러 증후군 증상은 왜소 발육증, 각막 흐림, 헤파토스플레노메칼리(hepatosplenomegaly), 심장판막 손상, 관상동맥 손상, 골격 기형, 관절 경직 및 점진적인 정신지체)로 확인될 수 있다. 선택적으로, 또는 추가로, 환자들은 특별한 리소좀 효소 활성의 결핍을 나타내는 인공 또는 자연 기질을 사용하는 특별한 리소좀 효소 또는 효소 검사에 의해 진행된 특징적인 대사물의 과도한 축적을 보이는 조직 샘플의 생화학적 분석으로 진단될 수 있다. 대부분의 병에 대해, 진단은 증상 발생 전 또는 대사물의 과도한 축적 전에 특별한 효소 결핍 측정 또는 DNA 분석에 의해 이루어진다(Scriver외, 상기에서, 리소좀 저장 장애에 대한 부분). 모든 리소좀 저장 질병은 유전적이다. 따라서, 리소좀 질병을 앓는 가족이 있는 것으로 알려진 가족의 자녀들에게서, 명확한 진단이 이루어질 수 있기 전에 예방 치료를 시작하는 것이 때때로 적당하다.
약학 조성물
일부 방법에서, 리소좀 효소는 약학 조성물로써 약학 운반체와 함께 정제된 형태로 투여된다. 바람직한 형태는 투여 및 치료 적용의 예정된 방법에 따른다.약학 운반체는 환자에게 폴리펩티드를 운반하기에 적당한 융화성, 비독성 물질일 수 있다. 중성 물, 알콜, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 운반체로 사용될 수 있다. 약학적으로-조건에 맞는 보조제, 완충제, 분산제등이 또한 약학 조성물로 혼합될 수 있다.
약학 조성물의 효소 농도는 넓게 즉, 약 0.1 중량%이하부터, 보통 적어도 약 1 중량%내지 20 중량%이상 다양할 수 있다.
경구 투입에 대해, 활성 성분이 고체 투여 형태, 가령 캡슐, 정제 및 가루, 또는 액체 투여 형태, 가령 엘릭시르(elixir), 시럽 및 현탁액으로 투여될 수 있다. 활성 성분(들)이 비활성 성분 및 분말 운반체, 가령 글루코즈, 락토즈, 수크로즈, 만니톨, 녹말, 셀룰로즈 또는 셀룰로즈 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테르산, 나트륨 사카린, 탈쿰(talcum), 탄산 마그네슘등과 함께 젤라틴 캡슐 안에 쌓일 수 있다. 요구된 색, 맛, 안정성, 완충 용량, 분산 또는 다른 알려진 요구하는 형태를 제공하기 위해 추가될 수 있는 추가의 비활성 성분의 예들은 붉은 철 산화물, 실리카겔, 나트륨 라우릴 황산염, 티타늄 이산화물, 식용 흰 잉크등이다. 유사한 희석제가 압축된 정제를 만들기 위해 사용될 수 있다. 정제 및 캡슐 둘다 장시간 약물이 지속적인 방출을 제공하기 위해 유지된 방출 생성물로 제조될 수 있다. 압축된 정제는 불쾌한 맛을 덮고 대기로부터 정제를 보호하기 위해 코팅된 당 또는 코팅된 필름일 수 있고, 또는 위장에서 선택적인 분해에 대해 장용 코팅될 수 있다. 경구 투여에 대한 액체 투여 형태는 환자 수용을 증가하기 위한 색 및 맛을 포함할 수 있다.
정맥 주입에 대한 전형적인 조성물은 선택적으로 20% 알부민 용액 및 100 내지 500㎎의 효소로 보충된 100 내지 500㎖ 중성 0.9% NaCl 또는 5% 글루코즈를 포함하도록 제조될 수 있다. 근육내 주입에 대한 전형적인 약학 조성물은 예를 들면, 1㎖ 중성 완충처리된 물 및 1 내지 10㎎ 정제된 본 발명의 알파 글루코시다아제를 포함하도록 만든다. 비경구로 투여할 수 있는 조성물을 제조하는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고 다양한 문헌 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Science(15판, Mack Publishing, Easton, PA, 1980)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)에서 더 자세히 기술된다.
AGLU는 10mM 인산 나트륨 완충용액 pH 7.0에서 형성될 수 있다. 적은 양의 황산 암모늄이 선택적으로 존재한다(<10mM). 효소는 전형적으로 약 -70℃에서 동결 유지되고 사용 전에 녹인다. 선택적으로, 효소는 용액내에서 차갑게(예를 들면, 약 4℃ 내지 8℃) 저장될 수 있다. 일부 구체예에서, AGLU 용액은 완충용액 (예를 들면, 인산 나트륨, 인산 칼륨 또는 다른 생리학적으로 받아들여지는 완충용액), 간단한 탄수화물 (예를 들면, 수크로즈, 글루코즈, 말토즈, 만니톨등), 단백질 (예를 들면, 인간 시럽 알부민) 및/또는 표면 활성제 (예를 들면, 폴리소베이트(polysorbate) 80 (Tween-80), 크레모포르(cremophore)-EL, 크레모포르-R, 라브로필(labrofil)등)을 포함한다.
AGLU는 또한 냉동 건조된 형태로 저장될 수 있다. 냉동 건조에 대해, AGLU는 만니톨 및 인산염 완충용액내의 수크로즈를 포함하는 용액에서 제조될 수 있다. 수크로즈의 농도는 재구성에 AGLU의 집합을 막기에 충분하다. 만니톨의 농도는 반대로 냉동건조에 필요한 시간을 실질적으로 줄이는데 충분하다. 그러나, 만니톨 및 수크로즈의 농도는 재구성에서 받아들이기 어려운 고혈압을 일으키는데 불충분하다. 1-3㎎/㎖ 및 0.1-1.0㎎/㎖의 만니톨 및 수크로즈의 농도 각각은 적합하다. 바람직한 농도는 2㎎/㎖ 만니톨 및 0.5㎎/㎖ 수크로즈이다. AGLU는 바람직하게는 냉동건조 전 및 재구성 후 5㎎/㎖이다. 0.9%에서 염수가 재구성에 바람직한 용액이다.
토끼 젖으로부터 정제된 AGLU에 대해, 적은 양의 불순물 (예를 들면, 약 5%이상)은 허용될 수 있다. 가능한 불순물은 토끼 유장 단백질의 형태에서 존재할 수 있다. 다른 가능한 불순물은 구조적으로 유사체 (예를 들면, 올리고머 및 집합체) 및 AGLU의 끊기이다. 현재 배치(batch)는 변형 유전자 토끼에서 생성된 AGLU가 >95% 순수하다고 나타낸다. 비록 겔 전기 이동법에서, 분자량이 다른 AGLU 밴드(band)가 또한 보이지만, 가장 큰 불순물은 토끼 유장 단백질이다.
주입 용액은 층류 후드(laminar air flow hood)내에서 무균으로 제조된다. AGLU의 적당한 양은 냉장고에서 꺼내어 실온에서 녹인다. 주입 용액은 인간 시럽 알부민(HSA) 및 글루코즈를 포함하는 적당량의 용액에 생성물 용액을 끝낸 적당량의 AGLU를 혼합함으로 유리 주입 병에서 제조될 수 있다. 마지막 농도는 1% HSA 및 25-200㎎ 투여량에 대해 4% 글루코즈 및 1% HSA 및 400-800㎎ 투여량에 대해 4% 글루코즈일 수 있다. HSA 및 AGLU는 5% 글루코즈를 포함하는 주입 병에 옮기기 전에 0.2㎛ 시린지 여과기로 여과될 수 있다. 선택적으로, AGLU가 염수용액에서, 바람직하게는 주입에 대해 0.9%에서 재구성될 수 있다. 주입에 대한 AGLU 용액은 실온에서 7시간 이상 안정하게 보여진다. 그러므로 AGLU 용액은 바람직하게는 제조 7시간 이내에 주입된다.
치료 방법
본 발명은 효과적인 폼페병 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 형태 촉매로 활성된 형태 및 치료되는 환자의 조직, 특히, 간, 심장 및 근육 (예를 들면, 민무늬근, 가로무늬근 및 심근)에서 떼어낼 수 있는 형태에서 많은 양의 인간 산 알파 글루코시다아제의 유효성에서 부분적으로 제안된다. 상기 인간 산 알파-글루코시다아제는 예를 들면, 실시예에서 기술된 유전자 변형 동물로부터 제공된다. 알파-글루코시다아제는 바람직하게는 주로 (즉, >50%) 약 100-110kD의 선구물질 형태에서이다. (명백한 분자량 또는 100-110kD 선구물질의 상대적인 이동성은 사용된 분석 방법에 따라 다소 다양할 수 있지만 특별하게 95kD 내지 120kD 범위내에서다.) 유전자 변형 동물에서 인간 산 알파-글루코시다아제의 주어진 성공적인 결과는 실시예에 기술되었고, 인간 알파-글루코시다아제의 다른 공급원은 가령 세포 발현 시스템에서 얻는 것이 또한 사용될 수 있는 것이 가능하다. 예를 들면, 인간 산 α-글루코시다아제를 생산하는 선택적인 방법은 cDNA 또는 적당한 프로모터에 실시 가능하게 연결된 게놈 구조물로써 적당한 진핵 세포 라인(예를 들면, CHO)에 산 α-글루코시다아제 유전자를 트랜스펙션하는 것이다. 그러나, 상기 방법으로 임상 치료에 필요한 많은 양의 인간 산 알파 글루코시다아제를 제조하는 것은 더 많은 힘이 든다.
본 발명의 약학 조성물은 보통 정맥주사로 투여된다. 피부내, 근육내 또는경구 투여는 또한 일부 환경에서 가능하다. 조성물은 리소좀 효소 결핍 질병을 겪거나 또는 겪을 위험이 있는 개인들의 예방 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료 적용에 대해, 약학 조성물은 축적된 대사물의 농도를 줄이기 위해 및/또는 대사물 추가의 축적을 방지 또는 저지하기 위한 충분한 양이 질병을 겪는 환자에게 투여된다. 리소좀 효소 결핍 질병의 위험에 있는 개인을 위해, 약학 조성물은 예방적으로 대사물의 축적을 방지하거나 억제하기에 충분한 양을 투여된다. 상기를 이루기 위한 적당한 양은 "치료에-" 또는 "예방에-효과적인 투여"로 정의된다. 상기 효과적인 투여는 주위 환경의 엄격함 및 환자의 일반적인 건강 상태에 따를 것이다.
본 방법에서, 인간 산 알파 글루코시다아제는 보통 환자에게 주당 10㎎/㎏ 환자 체중 이상이 투여된다. 종종 투여량은 주당 10㎎/㎏ 이상이다. 투여량은 주당 10㎎/㎏ 내지 적어도 주당 1000㎎/㎏의 범위일 수 있다. 전형적으로 투여량은 주당 10㎎/㎏, 주당 15㎎/㎏, 주당 20㎎/㎏, 주당 25㎎/㎏, 주당 30㎎/㎏, 주당 35㎎/㎏, 주당 40㎎/㎏, 주당 45㎎/㎏, 주당 60㎎/㎏, 주당 80㎎/㎏ 및 주당 120㎎/㎏의 범위이다. 바람직한 범위에서, 주당 10㎎/㎏, 주당 15㎎/㎏, 주당 20㎎/㎏, 주당 30㎎/㎏, 주당 40㎎/㎏이 주당 한번, 두 번 또는 세 번 투여된다. 치료는 전형적으로 적어도 4주 때때로 24주 및 때때로 환자 일생 동안 지속된다. 치료는 바람직하게는 정맥주사로 투여된다. 선택적으로, 인간 알파-글루코시다아제의 수준은 하기 처리 (예를 들면, 플라즈마(plasma) 또는 근육에서)를 모니터링하고 추가의 투여는 검출된 수준이 일반인의 값 이하(예를 들면, 20%이하)로 충분히 떨어질 때 투여된다.
일부 방법에서, 인간 산 알파 글루코시다아제는 개시로 "높은" 투여량 (즉, 쌓은 투여량")이 투여되고, 더 낮은 투여량 (즉, "유지 투여량")의 투여에 의해 허용된다. 쌓은 투여량의 예는 적어도 약 40㎎/㎏ 환자 체중을 주당 1 내지 3회(예를 들면, 1,2 또는 3주 동안)이다. 유지 투여량의 예는 주당 적어도 약 5 내지 적어도 약 10㎎/㎏ 환자 체중 이상, 가령, 주당 20㎎/㎏, 주당 30㎎/㎏, 주당 40㎎/㎏이다.
일부 방법에서, 투여량은 투여 기간동안 속도를 증가하여 투여된다. 상기는 흐름 피부내 주입 속도를 증가하여 또는 일정한 속도에서 투여된 알파-글루코시다아제의 농도를 증가시키는 성분을 사용함으로 이룰 수 있다. 상기 방법에서 투여는 면역 반응의 위험을 감소시킨다. 어떤 투여량에서는, 단위 시간당 알파 글루코시다아제의 단위에서 측정된 투여 속도는 적어도 10배로 증가한다. 전형적으로, 피부내 주입은 7시간(예를 들면, 1-10시간 및 바람직하게는 2-8시간, 더욱 바람직하게는 3-6시간) 이상을 일으키고, 주입 속도는 투여기간동안 간헐적으로 증가된다.
증가하는 속도에서 주입에 대한 적당한 투여량(모두 ㎎/㎏/시)은 하기 표 1에서 개시된다. 표의 첫번째 컬럼은 투여 일정에서 시간 기간을 나타낸다. 예를 들면, 0-1시에 참고는 투여 1차 시간으로 나타난다. 표의 다섯번째 컬럼은 각 시간 기간에 사용될 수 있는 이상의 투여량 범위를 개시한다. 네번째 컬럼은 바람직한 투여량 범위를 포함하는 더 좁은 범위를 개시한다. 세번째 컬럼은 본보기의 임상 시험에서 투여된 투여량의 더 높은 및 더 낮은 값을 나타낸다. 두번째 컬럼은특히 바람직한 투여량을 보이고, 이는 표 1의 세번째 컬럼에서 보인 범위의 평균을 나타낸다.
| 시간 | 평균 투여량(l) | 더 낮은 & 더 높은 값 | 바람직한 범위 | 범위 |
| 0-1시 | 0.3㎎/㎏/시 | 0.25-0.4 | 0.1-1 | 0.03-3 |
| 1-2시 | 1㎎/㎏/시 | 0.9-1.4 | 1-4 | 0.3-12 |
| 2-2.5시 | 4㎎/㎏/시 | 3.6-5.7 | 3-10 | 1-30 |
| 2.5-5.6시 | 12㎎/㎏/시 | 7.2-11.3 | 6-20 | 2-60 |
방법은 빠른 발병 (유아) 및 늦은 발병 (소년 및 성인) 폼페병 환자 모두에게 효과적이다. 유아 환자에 폼페병 증상의 형태는 생후 첫 4 개월 이내에 명확하다. 대부분, 낡은 모터 증가 및 번영의 실패가 우선 알려진다. 임상 시험에서, 소모하는 근육, 흉부 수축의 증가된 호흡작용 속도, 간의 보통의 확대 및 혀의 융기의 일반화된 저장이 있다. 심장의 초음파 검사는 점진적인 비대성 심근증, 실제로 불충분한 심장 배출을 이끄는 것을 보여준다. ECG는 표시된 왼쪽 축 일탈, 짧은 PR 간격, 큰 QRS 콤플렉스, 전환한 T 파(wave) 및 ST 기능저하에 의해 특징지워진다. 질병은 생후 1년내에 심폐의 실패를 이끄는 빠르게 진행되는 과정을 보인다. 검시에서 조직구조 검사에서 리소좀 글리코겐 저장은 다양한 조직에서 관찰되고, 심근 및 골격근에서 대부분 공표된다. 본 방법에서 인간 산 알파 글루코시다아제의 처리는 상기 환자의 생명(예를 들면, 보통 수명에 1, 2, 5년 이상)을 연장시킨다. 치료는 또한 상기에 언급된 바와 같이 폼페병의 임상 및 생화학 특징의 제거 또는 감소를 일으킬 수 있다. 생후 곧, 또는 임신중에 만약 부모가 위험한 상태로 그들의 자손에 변이형 알파 클루코시다아제 대립 유전자를 가지고 있다는 것을 안다면 치료는 이루어진다.
폼페병의 늦은 발병 성인 형태의 환자들은 생후 첫 20년내에 증상을 나타내지 않을 수도 있다. 이런 임상 특이형에서, 주로 골격근이 수족 환상골(limb girdle), 몸통 및 횡격막의 증상의 편애에 포함된다. 계단 오르기의 어려움이 종종 병의 시작이다. 호흡 장애는 상당히 다양하다. 임상도(clinical picture)를 좌우할 수 있고, 또는 생의 후반까지 환자가 겪지 않는다. 대부분의 상기 환자들은 호흡 부족으로 죽는다. 유아 특이형의 환자에서, 증상은 보통 생후 첫 10년에 분명해진다. 성인 폼페병에서처럼, 골격근 약화는 주된 문제이고; 심장계, 간비대(hepatomegaly) 및 대설증(macroglossia)이 보여질 수 있지만 흔하지 않다. 많은 경우에서, 밤에 환기 장치가 있는 지원이 최후에 필요하다. 호흡 근육의 소모와 조합에서 폐 감염은 생명을 위협하고 대부분 30년전에 죽게된다. 본 방법의 치료가 늦은 발병 소년 또는 성인 폼페병 환자의 생명을 보통 수명까지 연장한다. 치료는 또한 병의 임상 및 생화학 증상을 제거하거나 또는 상당히 감소시킨다.
다른 용도
유전자 변형 동물의 젖에서 생성한 리소좀 단백질은 많은 다른 용도가 있다. 예를 들면, 다른 α-아밀라제와 같은 α-글루코시다아제는 녹말, 맥주 및 약의 제조에 중요한 도구이다. Vihinen & Mantsala, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24, 329-401(1989)(모든 목적에 대해 전체에 참조로 포함된)를 참조하라. 리소좀 단백질은 또한 실험실 화학제품 또는 음식 생성물을 제조하는데 유용하다. 예를 들면, 산 α-글루코시다아제는 1,4 및 1,6 α-글루시딕 결합을 없애고 글루코즈를 얻는 상기 결합, 가령 말토즈, 이소말토즈, 녹말 및 글리코겐을 포함하는 다양한 탄수화물의 감소에 사용될 수 있다. 상기 출원에서, 효소는 젖으로부터 사전 분할 없이, 상기 젖으로부터 유도된 음식 생성물(예를 들면, 아이스크림 또는 치즈) 또는 약학 조성물처럼 투여될 수 있다. 정제된 재조합 리소좀 효소는 또한 조직 샘플에서 상기 효소의 모르는 양의 분석을 위해 진단 키트에서 제어되는 것처럼 포함되어 유용하다.
실시예 1: 변형 유전자의 구조
(a)cDNA 구조
cDNA 인코딩 인간 산 α-글루코시다아제를 포함하는 발현 벡터의 구조는 플라스미드 p16,8hlf3으로 시작했다(DeBoer외.(1991)&(1993),상기를 참고하라). 상기 플라스미드는 소 αS1-카세인 조절 서열을 포함한다. 모(parent) 플라스미드의 락토페린 cDNA 삽입물은 도 1에서 보여지는 바와 같이 발현 카세트(cassette)의 ClaⅠ 사이트 및 SalⅠ 사이트에서 인간 산 α-글루코시다아제 cDNA(Hoefsloot외 EMBO J. 7,1697-1704(1988))로 교환되었다. α-글루코시다아제 cDNA 단편의 말단에서 융화성 제한 사이트를 얻기 위해, 완벽한 cDNA 인코딩 인간 α-글루코시다아제를 포함하는 플라스미드 pSHAG2(id.)는 EcoRI 및 SphI와 정리되고 3.3kb cDNA-단편은 pKUN7ΔC에서 pKUN1 유도체 (Konings외, Gene 46, 269-276(1986)를 벡터 뉴클레오티드 서열내 파괴된 ClaI 사이트 및 새롭게 디자인된 폴리링커(polylinker); HindⅢ ClaI EcoRI SphI XhoI EcoRI SfiI SfiI/SmaI NotI EcoRI*(*=파괴된 사이트)로 서브클론(subclone)되었다. 플라스미드 pαgluCESX를 일으키는 것으로부터, 3.3-kb cDNA-단편이 ClaI 및 XhoI에 의해 잘릴 수 있다. 상기 단편은 ClaI 사이트 및 XhoI-융화성 SalI 사이트에서 도 1에 보여진 발현 카세트에 삽입되었다. 결과로, 발현 플라스미드 p16,8αglu는 도 1에서 보여진 것과 같이 소 αS1-카세인 서열에 의해 접한 인간 산 α-글루코시다아제를 인코딩하는 cDNA 서열로 구성된다. 완벽한 발현 카세트를 포함하는 27.3-kb 단편은 NotI의 분열에 의해 잘릴 수 있다(도 1을 참조하라).
(b) 게놈 구조
구조 c8αgluex1은 인간 산 α-글루코시다아제 유전자를 포함하고(Hoefsloot외, Biochem. J. 272,493-497(1990); 엑손 1에서 전사 개시 사이트의 단지 다운스트림(downstream)을 시작한다(도 2, 패널 A를 참조하라). 그러므로, 구조는 대부분 인간 산 α-글루코시다아제 유전자의 완벽한 5'UTR을 인코딩한다. 상기 단편은 소 αS1-카세인 유전자의 프로모터 서열에 융합된다. αS1-카세인 개시 사이트는 αS1-카세인/산 α-글루코시다아제 접합의 22 bp 업스트림(upstream)이 존재한다. 구조는 인간 산 α-글루코시다아제 폴리아데닐화 신호 및 3' 측면 서열을 갖는다. 구조 c8αgluex2는 인간 산 α-글루코시다아제 유전자의 엑손 2에서 번역 개시 사이트에 즉시 융해된 소 αS1-카세인 프로모터를 포함한다(도 2, 패널 B를 참조하라).
따라서, αS1-카세인 전사 개시 사이트 및 α-글루코시다아제 번역 개시 사이트는 상기 구조에서 떨어진 22-bp이다. 그러므로 α-글루코시다아제 5'UTR은 보존되지 않는다. 상기 구조는 또한 도 2, 패널 B에서 보여지는 것과 같이 인간 산 α-글루코시다아제 폴리아데닐화 신호 및 3' 측면 서열을 포함한다.
구조 c8,8αgluex2-20은 구조 c8αgluex2와 단지 3' 영역에서 다르다. 엑손 20에서 SphI 사이트는 인간 산 α-글루코시다아제 구조에 소 αS1-카세인 3' 서열을 융해하는데 사용되었다. 폴리아데닐화 신호는 상기 3'αS1-카세인 서열에 위치된다(도2, 패널 C).
구조 c8,8αgluex2-20은 구조 c8αgluex2와 단지 3' 영역에서 다르다. 엑손 20에서 SphI 사이트는 인간 산 α-글루코시다아제 구조에 소 αS1-카세인 3' 서열을 융해하는데 사용되었다. 폴리아데닐화 신호는 상기 3'αS1-카세인 서열에 위치된다(도2, 패널 C).
게놈 구조의 구조화 방법
인간 산 α-글루코시다아제 유전자를 포함하는 세개의 지속되는 BglII 단편은 Hoefsloot외, 상기에 의해 분리되었다. 상기 단편은 pKUN8ΔC의 BglII-사이트, 주문해서 만들어진 폴리링커: HindIII ClaI StuI SstI BglII PvnI NcoI EcoRI SphI XhoI EcoRI*SmaI/SfiI NotI EcoRI*(*=파괴된 사이트)의 pKUN7ΔC 유도체에서 결찰되었다. 상기 결찰은 플라스미드 p7.3αgluBES, p7.3αgluBSE, p8.5αgluBSE, p8.5αgluBES, p10αagluBSE 및 p10αgluBES를 제조하는 단편의 두 방향을 일으켰다.
발현 카세트의 말단에서 유일한 NotI-사이트가 충분히 현미주사를 위해 사용된 단편의 분리에 사용되기 때문에, 인간 산 α-글루코시다아제의 인트론 17에서유전자내의 NotI 사이트는 파괴되어야했다. 그러므로, p10αgluBES는 ClaI 및 XhoI로 정리되었다; 3' α-글루코시다아제 말단을 포함하는 단편이 분리되었다. 상기 단편은 p10αgluΔNV를 일으키는 pKUN10ΔC의 ClaI 및 XhoI 사이트에 삽입되었다. 먼저 pKUN10ΔC(즉, pKUN8ΔC의 유도체)가 Klenow와 접착성의 말단에 채워지는 및 계속해서, 무딘-가장자리 결찰에 의해 플라스미드를 단련하는 Noti의 pKUN8ΔC를 정리함으로 얻어졌다. 마지막으로, p10αgluΔNV는 NotI로 정리되었다. 상기 접착성 말단은 또한 Klenow로 채워졌고 단편은 결찰되었고, 플라스미드 p10αgluΔNotI를 일으킨다.
c8αgluex 1의 구조
α-글루코시다아제 유전자의 첫번째 엑손에 SstI 사이트가 소 αS1-카세인 서열에 용해에 대해 선택되었기 때문에, p8.5αgluBSE는 SstI로 부분적 정리로 허용된 BglII로 정리되었다. 엑손 1-3을 포함하는 단편은 분리되었고 pKUN8ΔC의 BglII 및 SstI 사이트에 결찰되었다. 결과의 플라스미드는 이름지어졌다: p5'αgluex1(도 3, 패널 A를 참조하라)
다음 단계 (도 3, 패널 B)는 p5'αgluex1에 3' 부분의 결찰이었다. 우선, p10αgluΔN이 BglII 및 BamHI로 정리되었다. 엑손 16-20을 포함하는 상기 단편이 분리되었다. 두번째, p5'αgluex1은 BglII로 정리되었고 자기-결찰을 막기 위해, 및 접착성 BglII 말단을 탈인하기 위해 포스포릴라아제(BAP)로 처리되었다. BamHI 접착성 말단이 BglII 접착성 말단과 융화성이기 때문에, 상기 말단은 서로에게 결찰한다. 결과의 플라스미드, 즉, p5'3'αgluex1는 선택되었다. 상기 플라스미드는 마지막 구조화 단계에 대해 유용한 유일한 BglII 사이트를 갖는다(도 3, 패널 B 및 C를 참조하라).
α-글루코시다아제 유전자의 중간 부분이 후자 구조에 삽입되었다. 상기 단계에 대해, p7.3αgluBSE가 BglII로 정리되었고, 8.5-kb 단편은 분리되었고 정리된 BglII 및 탈인산염의 p5'3'αgluex1 플라스미드에 결찰되었다. 결과의 플라스미드는 pαgluex1(도 3, 패널 C)이다.
소 αS1-카세인 프로모터 서열은 세개의 단편을 포함하는 결찰에 의해 다음 단계에서 만들어졌다. pWE15 코스미드 벡터는 NotI로 정리되었고 탈인산염되었다. 소 αS1-카세인 프로모터는 8 Rb NotI-ClaI 단편으로 분리되었다(de Boer외, 1991,상기를 참조하라). 인간 산 α-글루코시다아제 단편은 같은 효소를 사용하여 pαgluex1로부터 분리되었다. 상기 세개의 단편들은 결찰되었고 1046 E.coli 숙주 세포에 Stratagene GigapackII 키트를 사용하여 포장된다. 결과의 코스미드 c8αgluex1은 E.coli 균주 DH5α에서 번식되었다. 벡터는 현미주사 전에 NotI와 실모양을 이룬다.
c8αgluex2 및 c8,8αgluex2-20
다른 두개의 발현 플라스미드의 구조(도2, 패널 B 및 C)는 c8αgluex1의 그것에 유사한 전략을 허용했다. 플라스미드 p5'αgluStuI는 StuI와 플라스미드의 정리에 의해 p8,5αgluBSE로부터 유도되었고, 벡터 서열에 더해서 엑손 2-3을 포함하는 분리된 단편의 자기-결찰에 의해 허용되었다. 플라스미드 p5'αgluStuI는 일부 단편을 일으키는 NcoI와 선형 단편의 부분적 정리에 의해 허용된 PglII와 정리되었다. 엑손 2 및 3을 포함하는 2.4kb 단편은 분리되었고 p5'αgluex2를 일으키는 벡터 pKUN12ΔC의 NcoI 및 BglII 사이트에 결찰되었다. pKUN12ΔC가 폴리링커: ClaI NcoI BglII HindIII EcoRI SphI XhoI SmaI/SfiI NotI를 포함하는 pKUN8ΔC의 유도체임을 주의하라.
플라스미드 p10αgluΔNotI는 BglII 및 HindIII로 정리되었다. 엑손 16-20을 포함하는 단편이 분리되었고 BglIII 및 HindIII로 정리된 p5'αgluex2에 결찰되었다. p5'3'αgluex2에 중간 단편은 pαgluex1처럼 삽입되었다. 이에 대해, p7.3αglu는 BglII로 정리되었다. 단편은 분리되었고 BglII-정리된 및 탈인산염 p5'3'αgluex2에 결찰되었다. 결과의 플라즈마 pαgluex2는 c8αgluex-20 및 c8,8αgluex2-20의 구조화에 사용되었다(도 2, 패널 B 및 C).
세번째 발현 플라스미드 c8,8αgluex2-20의 구조화에 대해(도 2, 패널 C) α-글루코시다아제의 3' 측면 영역이 삭제되었다. 이를 이루기 위해, pαgluex2가 SphI로 정리되었다. 엑손 2-20을 포함하는 단편은 분리되었고 pαgluex2-20을 일으키는 자기-결찰되었다. 그 후, 소 αs1-카세인 유전자의 3'측면 영역을 포함하는 단편은 SphI 및 NotI로 정리하여 pl6,8αglu로부터 분리되었다. 상기 단편은 pαgluex2-20-3αS1를 일으키는 폴리링커 서열에서 SphI 사이트 및 NotI 사이트를 사용하여 pαgluex2-20에 삽입되었다.
c8,8αgluex2-20을 제조하는 마지막 단계는 c8αgluex1을 이끄는 구조화의 마지막 단계에서처럼 세개의 단편의 결찰이었다. pαgluex2-20-3'αS1 및 pαgluex2에서 ClaI 사이트가 메틸화에 분열하지 않고 나타났기 때문에 플라즈마는E.coli DAM(-) 균주 ECO343에서 번식되어야했다. 상기 균주로부터 분리된 pαgluex2-20-3'αS1은 ClaI 및 NotI로 정리되었다. 3'αS1-카세인 측면 영역에 더해서 엑손 2-20을 포함하는 단편이 벡터 서열로부터 정제되었다. 소 αs1 프로모터(DeBoer(1991)&(1993), 상기를 참조하라) 및 NotI-정리된, 탈인산염 pWE15를 포함하는 상기 단편, 8 kb NotI-ClaI 단편이 결찰되었고 포장되었다. 결과의 코스미드는 c8,8αgluex2-20이다.
코스미드 c8αgluex2(도 2, 패널 B)가 다른 단계의 결합을 통해 구조화되었다. 첫째로, 코스미드 c8,8αgluex2-20이 SalI 및 NotI로 정리되었다. αS1-촉매제 및 산 α-글루코시다아제 유전자의 엑손 2-6 부분을 포함하는 10.5-kb 단편이 분리되었다. 두번째로, 플라스미드 pαgluex2가 산 α-글루코시다아제 유전자의 3'부분을 포함하는 단편을 얻기 위해 ShlI 및 Notl로 정리되었다. 마지막으로, 코스미드 벡터 pWEl5가 NotI로 정리되었고 탈인산염화되었다. 상기 세개의 단편은 결찰되었고 포장되었다. 결과의 코스미드는 c8αgluex2이다.
실시예 2:유전자 변형(Transgenesis)
cDNA 및 게놈 구조는 NotI와 선형이었고 그 후 의사 임신한 마우스 수양 어미의 자궁에 주입된 수정된 마우스 난모세포의 난핵에 주입되었다. 자손은 짧게 자른 꼬리로부터 분리된 DNA의 서든 블롯팅(Southern blotting)에 의해 인간 α-글루코시다아제 cDNA 또는 게놈 DNA 유전자 구조의 삽입이 분석되었다. 유전자 변형 마우스는 선택되었고 사육되었다.
NotI로 선형인 게놈 구조는 또한 의사 임신한 토끼 수양 어미의 자궁에 주입된 임신한 토끼 난모세포의 난핵에 주입되었다. 자손은 서든 블롯팅에 의해 알파-글루코시다아제 DNA의 삽입이 분석되었다. 유전자 변형 토끼는 선택되었고 사육되었다.
실시예 3:유전자 변형 마우스의 젖에서 산 α-글루코시다아제의 분석
유전자 변형 마우스와 유전자 변형하지 않은 대조군의 젖을 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)으로 분석하였다. 탐색자는 인간 산 α-글루코시다아제에 대한 마우스 항체 특이성(즉, 마우스 효소에 결합하지 않는)이다. 변형 유전자 1672 및 1673이 젖에 인간 산 α-글루코시다아제의 발현을 보였다(도 4). 100-110kD 및 76kD에서 큰 띠와 적은 띠는 α-글루코시다아제에 대해 기대된 것처럼 관찰되었다. 유전자 변형 없는 마우스의 젖에서 띠는 관찰되지 않는다.
인간 산 α-글루코시다아제의 활성이 유전자 변형 마우스 라인의 젖에서 인공 기질 4-메틸움벨리페릴-α-D-글루코피라노시드로 측정되었다(Galiaard, Genetic Metabolic Disease, Early Diagnosis and Prenatal Analysis, Elsevier/North Holland, Amsterdam, 809-827쪽 (1980)을 참조하라). cDNA 구조를 포함하는 마우스(도 1)는 시간당 0.2 sowl 2μmol/㎖로 다양하다. 게놈 구조를 포함하는 마우스 라인(도 2, 패널 A)은 시간당 10 내지 610μmol/㎖ 수준에서 발현하였다. 상기 형태는 180μmol/㎖의 재조합 효소의 추정된 특이 활성에 기초하여 1.3 내지 11.3㎎/ℓ(cDNA 구조) 및 0.05 내지 3.3g/ℓ(게놈 구조)의 생산에 등가이다(Van der Ploeg외, J.Neurol. 235:392-396(1988)).
재조합 산 α-글루코시다아제가 ConA-SepharoseTM및 SephadexTMG200에서 젖의 연속적인 크로마토그래피에 의해 유전자 변형 마우스의 젖에서 분리되었다. 7㎖ 젖을 10mM 황산 나트륨, pH 6.6 및 100mM NaCl로 구성된 3㎖ Con A 완충용액으로 10㎖로 희석하였다. 그 후 Con A 완충용액에 Con A 세파로즈(sepharose)의 1:1 현탁액이 첨가되었고 젖은 가볍게 흔들면서 4℃에서 밤새 남겨놓았다. 그 후 Con A 세파로즈 비드가 원심분리에 의해 수집되었고 Con A 완충용액으로 5번, 100mM 대신 1M NaCl을 포함하는 Con A 완충용액으로 3번, 100mM 대신 0.5M NaCl을 포함하는 Con A 완충용액으로 한번 씻겼고 그후 0.5M NaCl 및 0.1M 메틸-α-D-매노피라노시드를 포함하는 Con A 완충용액으로 배치크기로 추출되었다. 추출된 샘플에서 산 α-글루코시다아제 활성은 인공 4-메틸-움벨리페릴-α-d-글리코피라노시드 기질을 사용하여 측정되었다(상기를 참조하라). 산 α-글루코시다아제 활성을 포함하는 단편들은 함께하고 농축되고 20mM Na 아세테이트, pH 4.5 및 25mM NaCl로 구성된 Sephadex 완충용액에 투석되었고 SephadexTM200 컬럼에 적용되었다. 상기 컬럼은 같은 완충용액으로 실시되었고 단편들은 산 α-글루코시다아제 활성 및 단백질 함량에 대해 분석되었다. 산 α-글루코시다아제 활성 및 실제 다른 단백질의 유리된 단편들은 함께하고 농축되었다. 기술된 바와 같은 방법은 충분히 Reuser외, Exp. Cell Res. 155:178-179*1984)공고된 것과 같다. 방법의 일부 수정이 정확한 조성물 및 완충 시스템의 pH 및 수와 컬럼 재료에서 정제 단계의 선택에 따라서 가능하다.
그 후 젖으로부터 정제된 산 α-글루코시다아제는 GSD Π(내부 원인에 의한 산 α-글루코시다아제)의 환자로부터 배양된 결합 조직 형성 세포에 효소를 투입함으로 포스포릴화하여 시험되었다. 상기 시험에서 단백질을 포함하는 만노오스 6-포스페이트는 결합 조직 형성 세포의 세포 표면에 만노오스 6-포스페이트 수용기에 의해 결합된다. 결합이 유리 만노오스 6-포스페이트에 의해 억제된다(Reuser외, Exp. Cell Res. 155:178-189(1984)). 유전자 변형 마우스의 젖에서 분리된 산 α-글루코시다아제의 포스포릴화에 대한 전형적인 시험에서, 산 α-글루코시다아제는 20시간동안 매시간 1㎛ole 4-메틸-움벨리페릴-α-D-글루코피라노시드를 대사시키기에 충분한 양에 50㎕ 배양기(Ham F10, 10% 태아 송아지 혈청 및 3mM 기관(pipe)으로 공급된)에 104-106 결합 조직 형성 세포에 첨가되었다. 시험은 경쟁물질로써 5mM 만노오스 6-포스페이트로 또는 없이 실제로 Reuser외, 상기(1984)에 기술된 바와 같이 시행되었다. 상기 조건하에서 환자 결합 조직 형성 세포의 산 α-글루코시다아제가 건강한 일반으로부터 결합 조직 형성 세포에서 측정된 수준까지 회복되었다. 마우스 젖에서 분리된 산 α-글루코시다아제에 의한 내부 원인에 의한 산 α-글루코시다아제 활성의 회복은 소 고환, 인간 소변 및 트랜스펙션된 CHO 세포의 배양기로부터 정제된 산 α-글루코시다아제에 의한 회복만큼 효율적이다. α-글루코시다아제 형태 젖에 의한 회복은 다른 문헌으로부터 α-글루코시다아제에 대해 관찰된 바와 같이 5mM 만노오스 6-포스페이트에 의해 억제되었다. (Reuser외, 상기; Van der Ploeg외, (1988), 상기; Van der Ploeg외, Ped. Res. 24:90-94(1988)).
젖에서 생산된 α-글루코시다아제의 확실한 추가의 증거로는 마우스의 젖에서 생산된 재조합 α-글루코시다아제의 N-말단 아미노산 서열이 AHPGRP로 시작하는 Hoefsloot외, EMBO J. 7:1697-1704(1988)에 의해 공개된 바와 같이 인간 소변으로부터 α-글루코시다아제 선구물질의 그것과 같다는 것을 보여졌다.
실시예 4:알파-글루코시다아제의 동물 시험
최근, 폼페병에 대한 녹아웃 마우스 모델은 (25) 이용되어왔다. 상기 모델은 뮤린(murine) 알파-글루코시다아제 유전자의 목표된 분열에 의해 생산되었다. 글리코겐-포함하는 리소좀은 간, 심장 및 골격근에서 생후 곧 검출된다. 분명한 임상 증후는 상대적으로 늦은 나이(>9개월)에 분명해지지만 심장은 전형적으로 커지고 심전도는 이상이 있다.
시험은 유전자 변형 토끼 젖에서 정제된 AGLU의 생체내 효과를 연구하기 위해 녹아웃(KO) 마우스 모델을 사용하여 실시되어왔다. 상기 시험에서 재조합 효소는 유전자 변형 마우스로부터 정제에 대한 상기 기술된 바와 같이 충분히 유전자 변형 토끼의 젖으로부터 정제되었다.
1.KO 마우스 모델에서 짧은 기간 연구
6일 간격으로 단일 또는 멀티 주입이 꼬리 정맥을 통해 KO 마우스에 이루어졌다. 마지막 효소 주입 후 이틀 후 동물을 죽이고, 기관에 인산염 완충된 염수(PBS)를 살포했다. 조직 균질화액은 GLU 효소 활성 검사 및 조직 글리코겐 함량으로 만들어졌고, 다양한 기관의 극박 부분은 축적(전자 현미경을 통해) 리소좀 글리코겐 함량을 절개하여 보여졌다. 또한 내화된 AGLU의 위치 측정은 인간 태반성숙한 α-글루코시다아제에 대한 토끼 다 복제 항체를 사용하여 결정되었다.
결과는 0.7 및 1.7㎎ AGLU(시험 C 및 A 각각)의 1회 투여량이 정맥주사로 주입될 때 두개의 녹아웃 마우스의 그룹의 다양한 기관에서 생체내 효율적으로 흡수되는 것을 보였다. 시험 A는 또한 두개의 개별 토끼 젖으로부터 정제된 AGLU의 흡수 및 분배에 차이가 없음을 보였다.
AGLU 활성의 증가는 기관 가령, 간, 비장, 심장 및 골격근에서 보여졌지만 뇌에서는 아니다. 두마리의 KO 동물에 1.7㎎ AGLU의 1회 주입 후 이틀, 두마리의 PBS-주입된 보통 대조군 마우스 또는 두마리의 이형 KO 마우스의 기관에서 관찰된 내부 원인에 의한 알파-글루코시다아제 활성 수준과 가까운 수준 또는 훨씬 이상을 얻었다(시험 A). 시험된 기관중 간 및 비장은 양적으로 흡수에 포함된 주된 기관이지만 또한 심장 및 가슴 및 대퇴부 근육은 효소를 충분히 흡수한다. 뇌 조직에서 중대한 증가의 결여는 AGLU가 혈액-뇌 장애를 통과하지 못 하는 것을 시사한다. 결과는 표 2에서 요약된다.
| 그룹 | 간 | 비장 | 심장 | 흉근 | 대퇴부 근육 | 혀 | 뇌 | |||||||
| Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | |
| 시험 A 1.7㎎ AGLU의 1회 투여 처리된 동물(2 공급원으로부터) | ||||||||||||||
| 처리된 KO마우스 공급원 1 | 674410 | - | - | - | 26317 | - | - | - | 243.1 | - | - | - | 0.80.4 | - |
| 처리된 KO마우스 공급원 2 | 454604 | - | - | - | 7648 | - | - | - | 1210 | - | - | - | 0.80.4 | - |
| 처리되지 않은 KO마우스 | 3.1 | - | - | - | 0.2 | - | - | - | 0.2 | - | - | - | 0.2 | - |
| 처리되지 않은보통 마우스 | 5837 | - | - | - | 2317 | - | - | - | 118.2 | - | - | - | 5757 | - |
| 시험 B 6일 후 AGLU의 4 투여(1.0, 2.0, 1.0 및 1.4㎎)처리된 동물 | ||||||||||||||
| 처리된 KO마우스(13주된) | 1132944 | 7013 | - | - | 2410 | 12591082 | 12546 | 87116 | - | -- | 8935 | - | 0.40.2 | 163163 |
| 처리된 KO마우스 (34주된) | 3375 | 23 | - | - | 60 | 1971 | 49 | 90 | - | - | 207 | - | 0.7 | 374 |
| 처리되지 않은 KO마우스 (13주와34주된) | 2.02.0 | 406147 | - | - | 0.20.3 | 32331748 | 1.01.0 | 8687 | - | - | 1.01.0 | - | 0.20.2 | 487168 |
| 처리되지 않은보통 마우스(34주된) | 35 | 6 | - | - | 8.2 | 0 | 6.0 | 1.0 | - | - | 14 | - | 18 | 0 |
| 시험 C 0.7㎎의 1회 투여 처리된 동물 | ||||||||||||||
| 처리된 KO마우스 | 582558 | - | 462313 | - | 4650 | - | - | - | 5.13.6 | - | - | - | 0.40.4 | - |
| 처리되지 않은 KO마우스 | 1.11.6 | - | 0.80.7 | - | 0.30.3 | - | - | - | 0.20.3 | - | - | - | 0.20.2 | - |
KO 마우스 모델에서 짧은 기간 처리를 따르는 AGLU 및 글리코겐 함량의 조직 흡수
표의 숫자는 각 동물에 관한 것이다
Act: AGLU 활성(시간당 ㎎ 단백질 당 nmoles 4MU)
Glc: 글리코겐 함량(㎍/㎎ 단백질)
n.d 미검출
- 이용할 수 없는 데이타
두개의 KO 마우스가 매 6일에 4번 주입되었을 때(시험 B), 전체 세포 글리코겐의 뚜렷한 감소가 심장과 간 모두에서 관찰되었다. 전체 글리코겐에 관련해서 골격근 조직에서는 영향이 관찰되지 않았다. 그러나, 일반적으로 상기 조직에서 AGLU의 흡수는 시험된 다른 조직에서보다 더 낮았다.
4번 주입된 KO 마우스의 트랜스미션 전자 현미경은 간세포 및 심근 세포 모두에서 리소좀 글리코겐의 뚜렷한 감소를 보인다. 심장의 일부 영역에서 리소좀 글리코겐의 감소가 상기 짧은 기간 투여 후에 관찰되지 않기 때문에 심근에서 관찰된 효과는 국한된다.
인간 태반 성숙한 알파-글리코시다아제에 대한 토끼 다복제 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석이 목표 조직에 강하게 제안하는 흡수를 시험한 모든 기관에서 성숙한 효소에 대한 주입된 AGLU의 완벽한 과정 및 리소좀 국한 및 과정을 나타낸다. 독성 효과는 세개 시험에서 관찰되지 않는다.
AGLU의 면역조직화학적 스테인은 인간 알파-글루코시다아제에 대한 다복제 토끼 항체를 사용하여 간세포의 리소좀에 분명하였다. 심장 및 골격 조직에서 AGLU의 존재는 상기 기술로 더 낮은 흡수에 분명하게 보이는 것이 더 어렵다.
2.KO 마우스 모델로 긴-기간 시험
긴 기간 시험에서, 효소는 둘 또는 셋 KO 마우스의 그룹의 꼬리 정맥에 25주 이상의 기간동안 매주 한번씩 주입된다. 개시 투여량은 12주 동안0.5㎎(17㎎/㎏)/마우스를 따르는 2㎎(68㎎/㎏)이었다. 마우스의 두 그룹에서, 상기는 2㎎/마우스의 처리의 4 또는 11 추가 주에 의해 따랐다. 마우스의 나이가 6-7개월일 때 주입을 시작했다. 상기 나이에서, 분명한 조직병리는 KO 모델에서 발전되었다. 마지막 효소 투여후 이틀 후 동물을 죽이고 기관에 인산염 완충된 염수(PBS)를 살포했다. 조직 동질성은 AGLU 효소 활성 분석 및 조직 글리코겐으로 만들었고, 다양한 기관의 영역이 리소좀 글리코겐 축적을 보였다(빛 현미경을 통해).
결과는 0.5㎎/마우스(그룹 A, 3 동물/그룹)의 13주 처리된 마우스가 간 및 비장에서 활성이 증가하고 간과 아마 심장의 글리코겐 수준이 감소되었다는 것을 보였다. 비록 근육에서 글리코겐의 뚜렷한 감소가 없었지만, 하나의 동물이 근육에서 증가된 활성을 보였다.
2㎎/마우스(그룹 B, 3 동물/그룹)의 4주에 따른 0.5㎎/마우스의 14주 처리된 마우스가 증가된 활성이 심장 및 골격근에서 측정되고 글리코겐 수준의 감소가 또한 비장에서 보이는 것을 제외하고 13주 동안 처리된 마우스와 유사한 결과를 보였다.
2㎎/마우스(그룹 C 2 동물/그룹)의 11주에 따른 0.5㎎/마우스의 14주 처리된 마우스가 처리된 마우스가 간, 비장, 심장 및 골격근에서 글리코겐 수준에 명확한 감소를 보인 것을 제외하고 다른 두 그룹과 유사한 결과를 보였다. 가장 높은 투여량에서조차 뇌에서는 활성이 검출되지 않았다.
각 그룹 (그룹 평균)에서 처리된 동물과 처리되지 않은 동물의 결과는 표 3에 요약된다.
| 그룹 | 간 | 비장 | 심장 | 흉근 | 대퇴부근육 | 뇌 | ||||||||
| Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | Act | Glc | |
| 그룹 A 13주 동안 0.5㎎/마우스/주 로 처리된 동물 | ||||||||||||||
| 처리한 | 713 | 2 | 463 | n.d | 3 | 86 | 9 | 81 | 6 | 40 | 14 | 66 | - | - |
| 처리하지 않은 | 2 | 24 | 1 | n.d | 1 | 111 | 1 | 66 | 1 | 50 | 1 | 61 | - | - |
| 그룹 B 4주 동안 2㎎/마우스/주를 따르는 14주 동안 0.5㎎/마우스/주 로 처리된 동물 | ||||||||||||||
| 처리한 | 2705 | 1 | 1628 | 0 | 59 | 288 | 49 | 120 | 30 | 128 | 44 | 132 | - | - |
| 처리하지 않은 | 3 | 11 | 31 | 6 | 1 | 472 | 1 | 113 | 1 | 162 | 1 | 142 | - | - |
| 그룹 C 11주 동안 2㎎/마우스/주를 따르는 14주 동안 0.5㎎/마우스/주 로 처리된 동물 | ||||||||||||||
| 처리한 | 1762 | 1 | 1073 | 2 | 66 | 211 | 99 | 113 | 37 | 18 | 109 | 32 | 1 | 32 |
| 처리하지 않은 | 2 | 45 | 1 | 21 | 1 | 729 | 1 | 291 | 0 | 104 | 0 | 224 | 0 | 44 |
KO 마우스 모델에서 긴 기간 처리를 따르는 AGLU 및 글리코겐 함량의 조직 흡수
표의 숫자는 3 동물(그룹 A 및 B)의 평균 또는 2 동물(그룹 C)의 평균이다.
Act AGLU 활성(시간당 ㎎단백질당 nmoles 4MU)
Glc: 글리코겐 함량(㎍/㎎단백질)
n.d. 미검출
- 이용할 수 없는 데이타
추가로, 조직병리 조건에서 매우 설득력 있는 향상이 그룹 C의 마우스(2㎎/마우스에서 11주를 따라 0.5㎎/마우스에서 첫 14주 동안 처리한)에서 관찰되었다. 병리의 분명한 반전은 다양한 조직, 가령 심근 및 흉근에서 보여졌다.
잔류 리소좀 α-글루코시다아제 활성이 평균 대조군 값(14)의 >20%일 때 폼페병이 일어나지 않는다고 보고되어왔다. KO 마우스 모델로 얻어진 데이타는 상기수준이 재조합 선구물질 효소를 사용하여 매우 잘 이루어진다는 것을 나타낸다.
실시예 5:인간 임상 시험
단일 임상 Ⅰ 연구(AGLU1101-01)는 15명의 건강한 남자 지원자들에게 실시되어왔다. AGLU의 투여량은 25 내지 800㎎이고, 건강한 성인 남자 지원자들에게 정맥 주입으로 투여된다. 알레르기 및 과민성의 병력이 있는 피실험자는 연구에 배제되었다. 피실험자들은 5 투여 그룹에서 임의로 뽑히고 각 투여 그룹은 각 투여 수준에서 AGLU(4 피실험자) 또는 위약(placebo)(1 피실험자)을 받았다. 모든 피실험자들은 연구 약의 두개의 투여량을 받았고, 개별로 2주 투여되었다. 투여 견본은 다음과 같다:
A
25㎎: 그룹 1, 처리 기간 1
B
50㎎: 그룹 1, 처리 기간 2
C
100㎎: 그룹 2, 처리 기간 1
D
200㎎: 그룹 3, 처리 기간 1
E
400㎎: 그룹 2, 처리 기간 2
F
800㎎: 그룹 3, 처리 기간 2
P
위약 (그룹당 1 피험자 및 처리 기간)
피실험자들은 각 처리 기간의 Day 1에서 주입으로 AGLU 또는 위약이 투여되었다. 주입은 30분 이상 이루어졌고 피실험자들은 주입이 끝난 후 적어도 2시간 동안 반쯤 가로누운 상태로 있어야한다.
반대의 결과가 주입 시작, 30분(주입 끝) 및 3, 12, 24, 36 및 48시간 그후 뿐만 아니라 5일 및 8일(첫번째 기간) 및 5, 8 및 15일(두번째 기간) 전에 기록되었다. 생명 신호, ECG 및 물리적 검사가 또한 처리기간 동안 정기적으로 모니터되었다.
혈액 샘플은 임상 실험실 시험 및 약물 동력학 분석의 표준 범위에 대해 취해졌다. 피실험자의 소변을 수집하였고 실험실 분석의 표준 범위(AGLU의 결정을 포함하는)가 실시되었다.
(a) 실험실 안전 및 반대 사건
투여 그룹의 피실험자에서 실험실 요인, 임상 신호 및 ECG 측정에 임상적으로 중요한 변화는 없었다. 모든 투여량의 모든 피실험자들을 모니터하는 반대 사건의 결과는 표 4에서 요약된다.
| 투여량(㎎) | 반대 사건 |
| 25 | 기록된 사건은 근육 약화, 비정상 시력 및 피로이었다. 모든 사건은 가벼웠고 연구자에 의해 시험 항목과 관련없는 것으로 간주되었다. |
| 50 | 기록된 사건은 두통, 비염, 코피 및 둔감각증이었다. 모든 사건은 가벼웠고 연구자에 의해 보통으로 구분되고 시험 항목에 가능하게 관련 있다고 간주하는 둔감각증을 제외하고 시험 항목에 관련 없거나 희미한 관계라 있는 것으로 간주되었다. |
| 100 | 기록된 사건은 비염, 두통, 피로, 혈종 및 충혈 사이트 반응이었다. 모든 사건은 가볍게 구분되었다. 혈종, 충혈 사이트 반응 및 간헐적인 두통의 경우는 연구자에 의해 시험 항목으로 가능하게 또는 대개 관련 있는 것으로 간주하였다. 다른 사건들은 관련 없는 것으로 간주되었다. |
| 200 | 기록된 사건은 메스꺼움, 두통, 현기증, 피로, 비염, 광선 공포증, 시력 비정상 및 도취증이었다. 모든 사건은 강도에서 가볍거나 보통으로 구분되었다. 7 사건(현기증, 메스꺼움 및 비정상 시력의 경우를 포함하여)은 시험 항목에 가능하게 또는 대개 관련 있다고 간주되었다. |
| 400 | 기록된 사건은 피로 및 둔감각증이었다. 피로의 기록이 시험 항목에 관련 없는 것으로 간주되었고 둔감각증이 가능하게 관련 되어있다 |
| 800 | 기록된 사건은 메스꺼움, 졸음, 현기증, 증가한 발한, 무력증, 전율 및 간헐적인 두통이었다. 모든 사건은 강도에서 가볍거나 보통으로 구분되었다. 8 사건(졸음, 메스꺼움 및 무력증의 경우를 포함하여)은 시험 항목에 가능하게 관련 있다고 간주되었다. |
반대 사건 기록
글리코겐 저장 병 타입 Ⅱ의 유아 및 소년 환자에 효소 대체 치료로 재조합 산 α-글루코시다아제의 안전 및 효험 시험이 실시된다. 유아 환자 4명 및 소년 환자 3명이 회복되었다. 유아는 40㎎/㎏에 적정된 15-20㎎/㎏의 투여량으로 시작하고 소년은 10㎎/㎏으로 투여하였다. 환자들은 24주 동안 치료된다.
환자들은 하기 요인에 의해 평가된다.
·의심된 반대 사건을 포함하여 기록하는 표준 반대 사건
·혈액학, 임상 화학 및 항체 검출을 포함하는 실험실 요인
·근육에서 α-글루코시다아제 활성
·근육 조직병리
·12-리드(lead) ECG
·신경 검사를 포함하는 임상 조건
·요인이 아닌 PK 요인
·구명 간섭
유아 환자는 하기의 추가 요인에 의해 평가된다.
·남겨진 뒤의 비대한 벽 두께 및 남겨진 비대한 부피 지수
·신경운동(neuromotor) 증가
·생존
·근육에서 글리코겐 함량
소년 환자는 하기의 추가 요인에 의해 평가된다.
·폐 기능
·근육 강도/시간 시험 및 근육 기능
·PEDI/Rotterdam 9-항목 규모
그 후 같은 환자들은 알파 글루코시다아제의 추가 투여의 피실험자이고 유아는 15, 20, 30 또는 40㎎/㎏ 및 소년은 추가의 24주 기간동안 10㎎/㎏을 받고 상기 나타난 요인에 의해 평가된다.
추가의 Ⅱ기 임상 시험은 40㎎/㎏의 투여량 진단 후 2개월 이내에 나이 6개월 미만의 환자 8명에 실시되었다. 환자는 24주 동안 처리되고 하기 기준에 의해 평가된다.
안전 요인
실험실 안전 데이타
반대 사건 기록
1차 효험 요인: 정상 또는 가볍게 연기된 운동 기능(BSID Ⅱ)과 조합에 진단 후 6개월 구명 간섭(즉, 기계적 환기>24시간) 없이 생존.
2차 효험 요인: 신경 운동 증가에 변화; 남겨진 부피 지수에 변화; 골격근 산 α-글루코시다아제 활성 및 글리코겐 함량에 변화.
효험은 정상 또는 가볍게 연기된 것과 같이 구분된 BSID Ⅱ와 조합에 역사적 대조군에 10% 생존에 비교된 α-글루코시다아제 그룹에 구명 간섭 없이 진단 후 6개월에 50% 생존에 의해 보여질 수 있다.
추가의 임상 시험은 소년 환자에 실시된다. 환자들은 GSD 타입 Ⅱb의 소년 발병의 나이 1세 이상 35세 이하이다. 환자들은 24주 치료 기간 동안 10㎎/㎏ 또는 20㎎/㎏이 투여된다. 치료는 하기 요인으로 모니터된다.
안전 요인 실험실 안전 데이타
반대 사건 기록
1차 효험 폐 기능 요인 (예를 들면, FVC, 환기장치에 시간)
근육 강도
2차 효험 구명 간섭 요인:
삶의 질
골격근 산 α-글루코시다아제 활성
양적인 목적 베이스라인 위의 1차 효험 요인에서 20% 상대적 향상
효험에 관련된 모든 양적인 측정은 바람직하게는 동시 또는 역사적 대조에상대적 통계학적으로 중요하고, 바람직하게는 p < 0.05이다.
실시예 6 약학 형성
알파-글루코시다아제는 하기와 같이 형성된다:5㎎/㎖ ?-Glu, 15mM 인산 나트륨, pH 6.5, 2%(w/w)만니톨, 및 0.5%(w/w)수크로즈. 상기 형성을 20cc 관 유리병에 10.5㎖의 마지막 부피로 채우고 냉동 건조한다. 시험동안, 방출 및 임상 용도, 각 유리병은 환자 특이 목표 투여량 농도에 직접 투여되거나 중성 염수로 중분히 희석된 5㎎/㎖ ?-Glu의 10.5㎖를 얻기 위해 주입(USP 또는 등가)에 대해 중성 염수(9%)의 10.3㎖*로 재구성된다. 10.5㎖ 양(유리병 안에 52.5㎎ 알파 글루코시다아제 전체)은 10mls(50㎎)의 추출 및 운반(또는 이동)이 허용되는 과잉 권고된 USP를 포함한다. 만니톨은 냉동 건조 순환(수크로즈 혼자에 상대적)을 줄이는 적당한 증량제(bulking agent)로 이용된다. 수크로즈는 하기 재구성 집합에 중대한 증가를 일으키지 않는 저온/리오(lyo) 예방보호제로 이용된다. 만니톨 형성의 재구성은 반복적으로 집합에 약간의 증가를 일으켜왔다. 하기 냉동건조, 케이크 질은 받아들여질 수 있고 차후 재구성 시간은 충분히 줄어든다. 염수는 바람직하게 주입 용액에 대해 HSA/포도당이다. 염수가 2% 매티톨/0.5% 수크로즈에 냉동 건조로 조합에 사용될 때, 용액은 정맥 투여로 적당한 건강을 갖는다. 2% 만니톨/0.5% 수크로즈 형성을 포함하는 냉동 건조된 유리병은 0.9% 중성 염수(주입에 대해)로 5㎎/㎖ ?-Glu를 얻기 위해 재구성되었다.
실시예 7: 주입 계획
용액은 내재하는 정맥 캐뉼라를 통해 공급된다. 환자들은 주입되는 동안 가까이서 모니터되고 적당한 임상 간섭은 반대의 사건 또는 의심된 반대 사건의 사건에 취해진다. 48시간의 창이 각 주입에 따른다. 주입 속도가 시간에 증가하는 주입 계획은 감소하거나 또는 반대 사건을 제거한다.
유아에 대한 주입은 하기 계획에 따라 공급될 수 있다:
·60분 동안 5cc/시
·60분 동안 10cc/시
·30분 동안 ≥40cc/시
·주입의 생각나게 하는 것에 대해 ≥80cc/시
소년에 대해 주입은 하기 계획에 따라 공급될 수 있다:
·60분 동안 0.5cc/㎏/시
·60분 동안 1cc/㎏/시
·30분 동안 5cc/㎏/시
·주입의 생각나게 하는 것에 대해 7.5cc/㎏/시
앞의 발명이 명료함 및 이해의 목적에 일부 상세함에 기술되어왔는한, 형태 및 세부에 다양한 변화가 본 발명의 진짜 범위로부터 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것이 당분야의 기술자가 상기 명세서를 읽으면 명백할 것이다. 본 출원에 인용된 모든 공개 및 특허 문헌이 각 개별 공개 또는 특허 문헌이 개별적으로 표시되듯이 같은 범위에 모든 목적에 전체가 참고로 포함된다.
Claims (34)
- 인간 산 알파 글루코시다아제를 치료에 효과적인 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 환자가 적어도 주당 10㎎/㎏체중이 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 환자가 적어도 주당 60㎎/㎏체중이 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 환자가 적어도 주당 120㎎/㎏체중이 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 환자에 주당 알파-글루코시다아제가 한번 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 환자에 주당 알파-글루코시다아제가 세번 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 투여량이 적어도 24주 동안 매주 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 알파-글루코시다아제가 정맥주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 알파-글루코시다아제가 유전자 변형 포유류의 젖에서 생산되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 환자가 유아 폼페병을 갖는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 10 항에 있어서,상기 환자가 적어도 1살이 되기까지 살아남는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 환자가 소년 폼페병을 갖는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 환자가 성인 폼페병을 갖는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 알파-글루코시다아제가 주로 110kD 형태인 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,환자에게 인간 산 알파 글루코시다아제의 수준을 모니터링을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 15 항에 있어서,만약 알파-글루코시다아제의 수준이 환자에게 역치 값 이하로 떨어진다면, 인간 산 알파 글루코시다아제의 2차 투여를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 인간 알파 글루코시다아제가 정맥주사로 주입되고 주입 속도는 주입되는 동안 증가하는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서,상기 주입 속도가 주입되는 동안 적어도 10배로 증가하는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서,상기 주입 속도가 5시간내에 적어도 10배로 증가하는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 17 항에 있어서,상기 환자는 적어도 4번 투여되고, 각 투여량은 이전 투여량보다 더 높은 강도인 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 20 항에 있어서,상기 투여량은 1차가 0.03-3㎎/㎏/시, 2차가 0.3-12㎎/㎏/시, 3차가 1-30㎎/㎏/시 및 4차가 2-60㎎/㎏/시 인 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 21 항에 있어서,상기 투여량은 1차가 0.1-1㎎/㎏/시, 2차가 1-4㎎/㎏/시, 3차가 3-10㎎/㎏/시 및 4차가 6-20㎎/㎏/시 인 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 22 항에 있어서,상기 투여량은 1차가 0.25-4㎎/㎏/시, 2차가 0.9-1.4㎎/㎏/시, 3차가 3.6-5.7㎎/㎏/시 및 4차가 7.2-11.3㎎/㎏/시 인 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 23 항에 있어서,상기 투여량은 1차가 0.3㎎/㎏/시, 2차가 1㎎/㎏/시, 3차가 4㎎/㎏/시 및 4차가 12㎎/㎏/시 인 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 1, 2, 3 및 4차 투여가 각각 15분 내지 8시간의 기간 동안 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 제 20 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 1, 2, 3 및 4차 투여가 1시간, 1시간, 0.5시간 및 3시간 동안 개별적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 폼페병 환자 치료 방법.
- 무균의 생리적으로 적당한 완충용액에서 인간 산 알파 글루코시다아제, 인간 혈청 알부민 및 당을 포함하는 약학 조성물.
- 제 17 항에 있어서,인산 나트륨 완충용액에서 인간 산 알파 글루코시다아제, 인간 혈청 알부민 및 글루코즈를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 수용액에서 알파 글루코시다아제, 만니톨 및 수크로즈를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제 27 항에 있어서,상기 당에는 만니톨 및 수크로즈를 포함하고 만니톨의 농도가 수용액의 1-3%w/w이고 수크로즈의 농도가 수용액의 0.1 내지 1%w/w인 것을 특징으로 하는 약학조성물.
- 제 27 항에 있어서,만니톨의 농도가 2%w/w이고 수크로즈의 농도가 0.5%w/w인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 수용액의 인간 산 글루코시다아제, 만니톨 및 수크로즈를 포함하는 약학 조성물을 냉동 건조하여 제조한 냉동 건조 조성물.
- 2차 조성물을 제조하기 위해 인간 산 알파-글루코시다아제, 만니톨, 수크로즈 및 수용액을 포함하는 1차 조성물을 냉동 건조하고; 3차 조성물을 제조하기 위해 염수에서 냉동 건조한 조성물을 재구성하여 제조한 약학 조성물.
- 제 33 항에 있어서,상기 인간 산 알파-글루코시다아제는 1차 및 3차 조성물 둘다에서 5㎎/㎖이고, 만니톨은 1차 조성물에서 2㎎/㎖이고, 수크로즈는 1차 조성물에서 0.5㎎/㎖이고 재구성 단계에서 사용된 염수는 0.9%w/w인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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