ES2677343T3 - Tratamiento de la enfermedad de Pompe - Google Patents

Abstract

Alfa-glucosidasa ácida humana en la forma de 100 a 110 kD, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe, donde la alfa-glucosidasa ácida humana se administra por vía intravenosa y donde el tratamiento se continúa durante al menos 24 semanas.

Description

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DESCRIPCION

Tratamiento de la enfermedad de Pompe Campo tecnico

La presente invencion pertenece al campo de la genetica recombinante y la medicina, y se refiere a la terapia de reemplazo enzimatico de pacientes con la enfermedad de Pompe.

Antecedentes de la invencion

Al igual que otras protemas secretoras, las protemas lisosomales se sintetizan en el retmulo endoplasmatico y son transportadas al aparato de Golgi. Sin embargo, a diferencia de la mayona de las otras protemas secretoras, las protemas lisosomales no se destinan a la secrecion en los fluidos extracelulares sino en un organulo intracelular. Dentro del Golgi, las protemas lisosomales experimentan un procesamiento especial para dotarlas de lo necesario para alcanzar su destino intracelular. Casi todas las protemas lisosomales experimentan varias modificaciones postraduccionales, incluidas la glucosilacion y fosforilacion mediante la posicion 6' de un grupo de manosa terminal. Los residuos de manosa fosforilados son reconocidos por receptores espedficos en la superficie interna del entramado trans de Golgi. Las protemas lisosomales se unen mediante estos receptores y de esta manera son separadas de las otras protemas secretoras. Posteriormente, las pequenas vesmulas de transporte que contienen las protemas unidas al receptor se separan del entramado trans de Golgi y son direccionadas a su destino intracelular. Remftase de manera general a Kornfeld, Biochem. Soc. Trans. 18, 367-374 (1990).

Existen mas de treinta enfermedades lisosomales, cada una resultado de una deficiencia de una protema lisosomal particular, normalmente como resultado de una mutacion genetica. Remftase, por ejemplo, a Cotran et al., Robbins Pathologic Basis of Disease (4.a ed. 1989). La deficiencia en la protema lisosomal normalmente conlleva una acumulacion nociva de un metabolito. Por ejemplo, en los smdromes de Hurler, Hunter, Morquio y Sanfilippo, existe una acumulacion de mucopolisacaridos; en los smdromes de Tay-Sachs, Gaucher, Krabbe, Niemann-Pick y Fabry, existe una acumulacion de esfingolipidosis; y en la fucosidosis y manosidosis, existe, respectivamente, una acumulacion de esfingolipidosis que contienen fucosa y fragmentos de glucoprotemas, y de oligosacaridos que contienen manosa.

La enfermedad de glucogenosis de tipo II (GSD II; enfermedad de Pompe; deficiencia de la maltasa acida) esta provocada por una deficiencia de la enzima lisosomal a-glucosidasa acida (maltasa acida). Se distinguen dos formas clmicas: la infantil de aparicion temprana y la juvenil y del adulto de aparicion tardfa. La GSD II infantil aparece poco despues del nacimiento y se presenta con una debilidad muscular progresiva e insuficiencia cardiaca. Esta variante clmica es normalmente letal en los dos primeros anos de vida. Los smtomas en los pacientes adultos y juveniles de aparicion tardfa se presentan en etapas posteriores de la vida y unicamente estan implicados los musculos esqueleticos. Los pacientes mueren finalmente debido a la insuficiencia respiratoria. De manera excepcional, los pacientes pueden sobrevivir durante mas de seis decadas. Existe una buena correlacion entre la gravedad de la enfermedad y la actividad residual de a-glucosidasa acida, siendo la actividad un 10-20% de la normal en la forma de la enfermedad de aparicion tardfa y menos de un 2% en la de aparicion temprana (remftase a Hirschhorn, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (Scriver et al., eds., 7.a ed., McGraw-Hill, 1995), pags. 24432464).

Desde el descubrimiento de las deficiencias de las enzimas lisosomales como la causa principal de las tesaurismosis lisosomales (remftase, por ejemplo, a Hers, Biochem. J. 86, 11-16 (1963)), se ha intentado tratar a los pacientes que padedan tesaurismosis lisosomales mediante la administracion (intravenosa) de la enzima ausente, es decir, terapia enzimatica Estos experimentos con terapia de reemplazo enzimatica para la enfermedad de Pompe no tuvieron exito. Se utilizo bien a-glucosidasa no humana de Aspergillus niger, que origino reacciones inmunologicas o bien una forma de la enzima que no es incorporada con eficacia por las celulas (la forma de captacion baja, enzima madura de la placenta humana; remftase a mas adelante). Ademas, la duracion del tratamiento y/o la cantidad de enzima administrada fueron insuficientes (3-5). La produccion de enzimas lisosomales a partir de fuentes naturales tales como la orina humana y los testmulos bovinos es, en teona, posible pero proporciona rendimientos bajos y la enzima purificada no esta necesariamente en una forma que pueda ser incorporada por los tejidos de un paciente receptor.

A pesar de las dificultades e incertidumbres anteriores, la invencion proporciona alfa-glucosidasa acida humana para su uso en metodos para tratar pacientes con la enfermedad de Pompe.

Compendio de la invencion reivindicada

En la presente se divulgan metodos para tratar a un paciente con la enfermedad de Pompe. Tales metodos conllevan administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de alfa-glucosidasa acida humana. La dosificacion es preferentemente de al menos 10 mg/kg de peso corporal a la semana. En algunos metodos, la dosificacion es de al menos 60 mg/kg de peso corporal a la semana o de al menos 120 mg/kg de peso corporal a la semana. En algunos metodos, tales dosificaciones se administran en una unica ocasion a la semana y en otros metodos en tres ocasiones a la semana. En algunos metodos, el tratamiento se continua durante al menos 24

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semanas. La administracion es preferentemente intravenosa. La alfa-glucosidasa acida humana se obtiene preferentemente de la leche de un mairnfero transgenico no humano y esta preferentemente de manera predominante en una forma de 110 kD.

Los metodos se pueden utilizar para tratar pacientes con la enfermedad de Pompe infantil, juvenil o del adulto. En algunos metodos de tratamiento de la enfermedad de Pompe infantil la eficacia esta indicada por la supervivencia de un paciente hasta alcanzar al menos un ano de edad.

En algunos metodos, se controlan los niveles de la alfa-glucosidasa acida humana en el paciente recostado. Opcionalmente, se puede administrar una segunda dosificacion de la alfa-glucosidasa acida humana si el nivel de alfa-glucosidasa cae por debajo de un valor umbral en el paciente.

En algunos metodos, la alfa-glucosidasa humana se administra por via intravenosa y la tasa de administracion se incrementa durante el periodo de administracion. En algunos metodos, la tasa de administracion se incrementa en al menos un factor de diez durante el periodo de administracion. En algunos metodos, la tasa de administracion se incrementa en al menos un factor de diez en un periodo de cinco horas. En algunos metodos, al paciente se le administra una serie de al menos cuatro dosificaciones, cada dosificacion con una potencia superior a la dosificacion previa. En algunos metodos, las dosificaciones son una primera dosificacion de 0.03-3 mg/kg/h, una segunda dosificacion de 0.3-12 mg/kg/h, una tercera dosificacion de 1-30 mg/kg/h y una cuarta dosificacion de 2-60 mg/kg/h. En algunos metodos, las dosificaciones son una primera dosificacion de 0.1-1 mg/kg/h, una segunda dosificacion de 1-4 mg/kg/h, una tercera dosificacion de 3-10 mg/kg/h y una cuarta dosificacion de 6-20 mg/kg/h. En algunos metodos, las dosificaciones son una primera dosificacion de 0.25-4 mg/kg/h, una segunda dosificacion de 0.9-1.4

mg/kg/h, una tercera dosificacion de 3.6-5.7 mg/kg/h y una cuarta dosificacion de 7.2-11.3 mg/kg/h. En algunos

metodos, las dosificaciones son una primera dosificacion de 0.3 mg/kg/h, una segunda dosificacion de 1 mg/kg/h,

una tercera dosificacion de 4 mg/kg/h y una cuarta dosificacion de 12 mg/kg/h. En algunos metodos, la primera,

segunda, tercera y cuarta dosificaciones se administran cada una durante periodos de 15 min a 8 horas.

En algunos metodos, la primera, segunda, tercera y cuarta dosificaciones se administran, respectivamente, durante periodos de 1 h, 1 h, 0.5 h y 3 h.

Tambien se divulga en la presente una composicion farmaceutica que comprende alfa-glucosidasa acida humana, albumina serica humana y un azucar en un tampon fisiologicamente aceptable en forma esteril. Algunas composiciones de este tipo comprenden alfa-glucosidasa acida humana, albumina serica humana y glucosa en tampon de fosfato de sodio. Algunas composiciones comprenden alfa-glucosidasa, manitol y sacarosa en una solucion acuosa. En algunas composiciones, el azucar comprende manitol y sacarosa y la concentracion de manitol es de un 1-3% p/p de la solucion acuosa y la concentracion de sacarosa es de un 0.1 a un 1% p/p de la solucion acuosa. En algunas composiciones, la concentracion de manitol es de un 2% p/p la concentracion de sacarosa es de un 0.5% p/p.

Tambien se divulga en la presente una composicion liofilizada producida liofilizando una composicion farmaceutica que comprende glucosidasa acida humana, manitol y sacarosa en solucion acuosa. Se puede preparar una composicion de este tipo liofilizando una primera composicion que comprende alfa-glucosidasa acida humana, manitol, sacarosa y una solucion acuosa para producir una segunda composicion; y reconstituir la composicion liofilizada en solucion salina para producir una tercera composicion. En algunas composiciones de este tipo, hay 5 mg/mL de la alfa-glucosidasa acida humana tanto en la primera como en la tercera composicion, hay 2 mg/mL de manitol en la primera composicion, hay 0.5 mg/mL de sacarosa en la primera composicion y la solucion salina utilizada en el paso de reconstitucion es un 0.9% p/p.

En funcion de la divulgacion contenida en la presente, la presente invencion proporciona alfa-glucosidasa acida humana en la forma de 100 a 110 kD, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe, donde la alfa- glucosidasa acida humana se administra por via intravenosa y donde el tratamiento se continua durante al menos 24 semanas. La invencion y las realizaciones preferidas de esta se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripcion de los dibujos

Fig. 1: Un transgen que contiene ADNc de a-glucosidasa acida. Los exones de as1-casema estan representados por recuadros sin relleno; el ADNc de a-glucosidasa esta representado por un recuadro sombreado. El intron de as1- casema y las secuencias flanqueantes estan representados por una lmea gruesa. Una lmea fina representa el sitio aceptor de IgG. El sitio de iniciacion de la transcripcion esta marcado (1^), el sitio de iniciacion de la traduccion (ATG), el codon de parada (TAG) y el sitio de poliadenilacion (pA).

Fig. 2 (paneles A, B, C): Tres transgenes que contienen ADN genomico de a-glucosidasa acida. Las areas sombreadas oscuras son secuencias de as1 casema, los recuadros sin relleno representan exones de a-glucosidasa acida y la lmea delgada entre los recuadros sin relleno representa intrones de a-glucosidasa. Los otros sfmbolos son los mismos que en la Fig. 1.

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Fig. 3 (paneles A, B, C): Construccion de transgenes genomicos. Los exones de a-glucosidasa estan representados por recuadros sin relleno; los intrones de a-glucosidasa y secuencias no traducidas estan indicados por lmeas delgadas. Las secuencias del vector pKUN estan representadas por lmeas gruesas.

Fig. 4. Deteccion de a-glucosidasa acida en leche de ratones transgenicos mediante inmunoelectrotransferencia. Definiciones

La expresion «identidad sustancial» u «homoIog^a sustancial» significa que dos secuencias peptidicas, cuando se alinean de forma optima, tal como mediante los programas GAP o BESTFlT utilizando pesos del hueco por defecto, comparten al menos un 65 por ciento de identidad secuencial, preferentemente al menos un 80 o 90 por ciento de identidad secuencial, mas preferentemente al menos un 95 por ciento de identidad secuencial o mas (por ejemplo, 99 por ciento de identidad secuencial). Preferentemente, las posiciones de residuos que no son identicos difieren por sustituciones conservadoras de aminoacidos.

La expresion «sustancialmente puro» o «aislado» se refiere a una especie objeto que ha sido identificada y separada y/o recuperada a partir de un componente de su entorno natural. Normalmente, la especie objeto es la especie predominante presente (es decir, con un criterio molar es mas abundante que cualquier otra especie individual de la composicion) y preferentemente una fraccion sustancialmente purificada es una composicion donde la especie objeto comprende al menos aproximadamente un 50 por ciento (con un criterio molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Por lo general, una composicion sustancialmente pura comprendera mas de aproximadamente un 80 a un 90 por ciento en peso de todas las especies macromoleculares presentes en la composicion. De la manera mas preferente, la especie objeto esta purificada hasta ser esencialmente homogenea (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composicion mediante metodos de deteccion convencionales) donde la composicion esta constituida esencialmente por derivados de una unica especie macromolecular.

Un segmento de ADN esta ligado operablemente cuando esta en una relacion funcional con otro segmento de ADN. Por ejemplo, el ADN para una secuencia senal esta ligado operablemente al ADN que codifica un polipeptido si se expresa como una preprotema que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta ligado operablemente a una secuencia codificante si estimula la transcripcion de la secuencia. Por lo general, las secuencias de ADN que estan ligadas operablemente estan contiguas y en el caso de una secuencia senal tanto contiguas como en fase en lo que se refiere a la lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores esten contiguos a las secuencias codificantes cuya transcripcion controlan. La union se logra ligando en sitios de restriccion convenientes o en adaptadores o conectores insertados en su lugar.

Un segmento de ADN exogeno es uno extrano respecto a la celula, u homologo respecto a un segmento de ADN de la celula, pero en una posicion no natural en el genoma de la celula hospedadora. Los segmentos de ADN exogenos se expresan para generar polipeptidos exogenos.

En un mairnfero transgenico, todas, o sustancialmente todas, las celulas somaticas y de la lmea germinal contienen un transgen introducido en el marnffero o un ascendiente del mamnfero en una etapa embrionaria temprana.

Descripcion detallada

En la presente se divulgan mamfferos no humanos transgenicos que secretan una protema lisosomal en su leche. La secrecion se logra incorporando un transgen que codifica una protema lisosomal y secuencias reguladoras capaces de direccionar la expresion del gen a la glandula mamaria. El transgen se expresa, el producto de la expresion se modifica postraduccionalmente en la glandula mamaria y a continuacion, se secreta en la leche. La modificacion postraduccional puede incluir los pasos de glucosilacion y fosforilacion para producir una protema lisosomal que contiene manosa-6-fosfato.

A. Genes lisosomales

En la presente se divulgan marnfferos no humanos transgenicos que expresan segmentos de ADN que contienen cualquiera de los mas de 30 genes conocidos que codifican enzimas lisosomales y otros tipos de protemas lisosomales, incluidas la a-glucosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato-sulfato sulfatasa, hexosaminidasa A y B, protema activadora de glangliosidos, arilsulfatasa A y B, iduronato sulfatasa, heparan W-sulfatasa, galacto-ceramidasa, a- galactosilceramidasa A, esfingomielinasa, a-fucosidasa, a-manosidasa, aspartilglucosamina amida hidrolasa, lipasa acida, W-acetil-a-D-glucosamino-6-sulfato sulfatasa, a- y p-galactosidasa, p-glucuronidasa, p-manosidasa, ceramidasa, galacto-cerebrosidasa, a-W-acetilgalactosaminidasa y protema protectora y otras. Tambien se incluyen mamfferos transgenicos que expresan variantes alelicas, analogas e inducidas de cualquiera de las secuencias genicas de protemas lisosomales conocidas. Tales variantes normalmente muestran una identidad secuencial sustancial a nivel de aminoacidos con genes de protemas lisosomales conocidos. Tales variantes se hibridan normalmente con un gen conocido en condiciones rigurosas o presentan reactividad cruzada con anticuerpos para un polipeptido codificado por uno de los genes conocidos.

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Estan disponibles clones de ADN que contienen secuencias genomicas o de ADNc de muchos de los genes conocidos que codifican protemas lisosomales. (Scott et al., Am. J. Hum. Genet. 47, 802-807 (1990); Wilson et al., PNAS 87, 8531-8535 (1990); Stein et al., J. Biol. Chem. 264, 1252-1259 (1989); Ginns et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 123, 574-580 (1984); Hoefsloot et al., EMBO J. 7, 1697-1704 (1988); Hoefsloot et al., Biochem. J. 272,473479 (1990); Meyerowitz y Proia, PNAS 81, 5394-5398 (1984); Scriver et al., supra, parte 12, paginas 2427-2882 y referencias citadas alft)). Otros ejemplos de secuencias genomicas y de ADNc se pueden adquirir de GenBank. En la medida en que se requieran secuencias clonadas adicionales de genes lisosomales, estas se pueden obtener a partir de colecciones genomicas o de ADNc (preferentemente humano) utilizando como sondas secuencias de ADN de protemas lisosomales conocidas o anticuerpos para protemas lisosomales conocidas.

B. Conformacion de protemas lisosomales

Las protemas lisosomales recombinantes se procesan preferentemente para que tengan una estructura similar o identica a las protemas lisosomales de origen natural. Las protemas lisosomales son glucoprotemas que se sintetizan en ribosomas unidos al retfculo endoplasmatico (RER, por sus siglas en ingles). Entran en este organulo de manera simultanea a la traduccion guiadas por un peptido senal N-terminal (Ng et al., Current Opinion in Cell Biology 6, 510-516 (1994)). El proceso de N-glucosilacion comienza en el RER con la transferencia en bloque del precursor oligosacandico rico en manosa Glc3Man9GlcNAc2 desde un portador dolicolico. La modificacion de la cadena de carbohidrato comienza en el RER y continua en el aparato de Golgi con la eliminacion de los tres residuos de glucosa mas exteriores por parte de las glucosidasas I y II. La fosforilacion es un proceso de dos pasos en el cual en primer lugar la N-acetil-glucosamino-1-fosfato es acoplada a ciertos grupos de manosa por una transferasa espedfica de protemas lisosomales y, en segundo lugar, la N-acetil-glucosamina es escindida por una diesterasa (Goldberg et al., Lysosomes: Their Role in Protein Breakdown (Academic Press Inc., London, 1987), pags. 163-191). La excision expone la manosa 6-fosfato como un marcador de reconocimiento y ligando para el receptor de la manosa 6-fosfato que media el transporte de la mayona de las protemas lisosomales a los lisosomas (Kornfeld, Biochem. Soc. Trans. 18, 367-374 (1992)).

Ademas de la modificacion de la cadena de carbohidrato, la mayona de las protemas lisosomales experimentan procesamiento proteolftico, en el cual el primer evento es la eliminacion del peptido senal. El peptido senal de la mayona de las protemas lisosomales es escindido despues de la traslocacion por una peptidasa senal despues de lo cual las protemas se vuelven solubles. Se dispone de evidencia que sugiere que el peptido senal de la a-glucosidasa acida es escindido despues de que la enzima haya abandonado el RER, pero antes de que haya entrado en el lisosoma o la ruta secretora (Wisselaar et al., J. Biol. Chem. 268, 2223-2231 (1993)). El procesamiento proteolftico de la a-glucosidasa acida es complejo y conlleva una serie de pasos ademas de la escision del peptido senal que tienen lugar en diversas ubicaciones subcelulares. Los polipeptidos experimentan escision tanto en los extremos N como C, y de esta manera aumenta la actividad catalftica espedfica. Las principales especies reconocidas son un precursor de 110/100 kD, un intermedio de 95 kD y formas maduras de 76 kD y 70 kD. (Hasilik et al., J. Biol. Chem. 255, 4937-4945 (1980); Oude Elferink et al., Eur. J. Biochem. 139, 489-495 (1984); Reuser et al., J. Biol. Chem. 260, 8336-8341 (1985); Hoefsloot et al., EMBO J. 7, 1697-1704 (1988)). El procesamiento postraduccional de la a- glucosidasa acida humana natural y de formas recombinantes de la a-glucosidasa acida humana tal como se expresan en celulas de mairftfero cultivadas como las celulas COS, celulas BHK y celulas CHO es similar (Hoefsloot et al., (1990) supra; Wisselaar et al., (1993) supra).

El procesamiento autentico para generar protemas lisosomales fosforiladas en la posicion 6' del grupo manosa se puede estudiar midiendo la captacion de un sustrato por parte de las celulas que portan un receptor para la manosa 6-fosfato. Los sustratos modificados de manera correcta son incorporados mas rapidamente que los sustratos no modificados y de una manera conforme a la cual la captacion del sustrato modificado puede ser inhibida de manera competitiva por la adicion de manosa 6-fosfato.

C. Diseno del transgen

Los transgenes se disenan para direccionar la expresion de una protema lisosomal recombinante a la glandula mamaria de un mairftfero no humano transgenico que alberga el transgen. La estrategia basica conlleva ligar operablemente un segmento de ADN exogeno que codifica la protema con una secuencia senal, un promotor y un potenciador. El segmento de ADN puede ser genomico, minigen (genomico en el que se han omitido uno o mas intrones), ADNc, un fragmento YAC, una quimera de dos genes de protemas lisosomales diferentes o un tftbrido de cualquiera de estos. La inclusion de secuencias genomicas por lo general da lugar a niveles mas elevados de expresion. Los niveles muy elevados de expresion pueden sobrecargar la capacidad de la glandula mamaria para realizar las modificaciones postraduccionales y la secrecion de las protemas lisosomales. Sin embargo, los datos presentados mas adelante indican que ocurre una modificacion postraduccional sustancial incluida la formacion de grupos de manosa 6-fosfato, a pesar de un nivel de expresion elevado en el rango de mg/mL. La expresion «modificacion sustancial» significa que al menos aproximadamente un 10, 25, 50, 75 o 90% de las moleculas secretadas portan al menos un grupo de manosa 6-fosfato. Por lo tanto, por lo general se prefieren los constructos genomicos o constructos tftbridos de ADNc-genomicos.

En los constructos genomicos no es necesario mantener todas las secuencias intronicas. Por ejemplo, se pueden eliminar algunas secuencias intronicas para obtener un transgen mas pequeno que facilite las manipulaciones del

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ADN y la posterior microinyeccion. Remftase a Archibald et al., documento WO 90/05188. La eliminacion de algunos intrones tambien es util en algunos casos para reducir los niveles de expresion y, de esta manera, garantizar que la modificacion postraduccional sea sustancialmente completa. En otros casos, excluir un intron tal como el intron uno de la secuencia genomica de la a-glucosidasa acida conlleva una expresion mas elevada de la enzima madura. Tambien es posible eliminar algunos o todos los exones no codificantes. En algunos transgenes, se mutan nucleotidos seleccionados en las secuencias que codifican protemas lisosomales para eliminar sitios de escision proteolftica.

Debido a que el uso previsto de las protemas lisosomales producidas por mairnferos transgenicos es normalmente la administracion a seres humanos, la especie a partir de la cual se obtiene el segmento de ADN que codifica una secuencia de una protema lisosomal es preferentemente la humana. De manera analoga, si el uso destinado fuera la terapia veterinaria (por ejemplo, en un caballo, perro o gato), es preferible que el segmento de ADN proceda de la misma especie.

El promotor y potenciador proceden de un gen que se expresa exclusivamente o al menos preferentemente en la glandula mamaria (es decir, un gen espedfico de la glandula mamaria). Los genes preferidos como una fuente del promotor y potenciador incluyen la p-casema, K-casema, aS1-casema, aS2-casema, p-lactoglobulina, protema acida del suero lacteo y a-lactalbumina. El promotor y el potenciador se obtienen normalmente, pero no siempre, del mismo gen espedfico de la glandula mamaria. Este gen procede a veces, pero no necesariamente, de la misma especie de mamferos que el mamfero en el cual se va a expresar el transgen. Tambien se pueden utilizar secuencias de regulacion de la expresion de otras especies tales como las que proceden de genes humanos. La secuencia senal debe ser capaz de dirigir la secrecion de la protema lisosomal desde la glandula mamaria. Las secuencias senal adecuadas se pueden obtener a partir de genes de mamferos que codifican una protema secretada. Sorprendentemente, las secuencias senal naturales de las protemas lisosomales son adecuadas, a pesar de que estas protemas no son secretas normalmente sino que se direccionan a un organulo intracelular. Ademas de tales secuencias senal, las fuentes preferidas de secuencias senal son la secuencia senal procedente del mismo gen del que se obtienen el promotor y el potenciador. Opcionalmente, se incluyen secuencias reguladoras adicionales en el transgen para optimizar los niveles de expresion. Tales secuencias incluyen regiones flanqueantes 5', regiones transcritas pero no traducidas 5', secuencias intronicas, regiones transcritas pero no traducidas 3', sitios de poliadenilacion y regiones flanqueantes 3'. Tales secuencias se obtienen normalmente a partir del gen espedfico de la glandula mamaria a partir del cual se obtienen el promotor y potenciador o a partir del gen de una protema lisosomal que se esta expresando. La inclusion de tales secuencias produce un medio genetico que simula el de un autentico gen espedfico de la glandula mamaria y/o el de un autentico gen de una protema lisosomal. Este medio genetico da como resultado en algunos casos (por ejemplo, aS1-casema bovina) una expresion mas elevada del gen transcrito. Como alternativa, las regiones flanqueantes y no traducidas 3' se obtienen a partir de otros genes heterologos tales como el gen de la p-globina o genes virales. La inclusion de regiones no traducidas 3' y 5' a partir de un gen de una protema lisosomal u otro gen heterologo tambien puede incrementar la estabilidad del transcrito.

En algunos casos, se incluyen aproximadamente 0.5, 1, 5, 10, 15, 20 o 30 kb de la secuencia flanqueante 5' procedente de un gen espedfico de la mama en combinacion con aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20 o 30 kb de la secuencia flanqueante 3' procedente del gen de una protema lisosomal que se esta expresando. Si la protema se expresa a partir de una secuencia de ADNc, es conveniente incluir una secuencia intronica entre el promotor y la secuencia codificante. La secuencia intronica es preferentemente una secuencia hubrida formada a partir de una porcion 5' procedente de una secuencia intercalada procedente del primer intron de la region espedfica de la glandula mamaria a partir de la cual se obtiene el promotor y una porcion 3' procedente de una secuencia intercalada de una secuencia intercalada de IgG o gen de una protema lisosomal. Remftase a DeBoer et al., documento WO 91/08216. Un transgen preferido para expresar una protema lisosomal comprende un gen de una protema lisosomal hnbrido de ADNc-genomico ligado en 5' a un promotor y potenciador de casema. El gen hnbrido incluye la secuencia senal, region codificante y una region flanqueante 3' procedente del gen de una protema lisosomal. Opcionalmente, el segmento de ADNc incluye una secuencia intronica entre la casema 5' y la region no traducida del gen que codifica la protema lisosomal. Obviamente, los segmentos correspondientes de ADNc y genomicos tambien se pueden fusionar en otras ubicaciones dentro del gen siempre que se pueda expresar una protema contigua a partir de la fusion resultante.

Otros transgenes preferidos tienen un segmento de una protema lisosomal genomico ligado en 5' a secuencias reguladoras de casema. El segmento genomico esta normalmente contiguo a la region no traducida 5' y la region flanqueante 3' del gen. Por lo tanto, el segmento genomico incluye una porcion de la secuencia no traducida 5' de la protema lisosomal, la secuencia senal, intrones alternantes y exones codificantes, una region no traducida 3' y una region flanqueante 3'. El segmento genomico esta ligado mediante la region no traducida 5' a un fragmento de casema que comprende un promotor y un potenciador y normalmente una region no traducida 5'.

La informacion de la secuencia de ADN esta disponible para todos los genes espedficos de la glandula mamaria enumerados anteriormente en al menos uno y a menudo varios organismos. Remftase, por ejemplo, a Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981) (a-lactalbumina de rata); Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984) (WAP de rata); Jones et al., J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985)) (p-casema de rata); Yu-Lee y Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (Y-casema de rata)); Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987) (a-lactalbumina humana); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (ADNc de as1 y k casema bovinas); Gorodetsky et al., Gene

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66, 87-96 (1988) (p casema bovina); Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (k casema bovina); Brignon et al., fEbS Lett. 188, 48-55 (1977) (aS2 casema bovina); Jamieson et al., Gene 61, 85-90 (1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (p lactoglobulina bovina); Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620 (1987) (a-lactalbumina bovina). La estructura y funcion de los diversos genes de protemas de la leche son objeto de revision por Mercier y Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993) (incorporado a modo de referencia en su totalidad a todos los efectos). En la medida en que se puedan requerir datos secuenciales adicionales, las secuencias que flanquean las regiones ya obtenidas se podnan clonar facilmente utilizando las secuencias existentes como sondas. Las secuencias reguladoras espedficas de la glandula mamaria de diferentes organismos se obtienen asimismo cribando colecciones procedentes de tales organismos utilizando secuencias nucleotfdicas analogas conocidas o anticuerpos para protemas analogas como sondas.

Las estrategias generales y transgenes ejemplares que emplean secuencias reguladoras de aS1-casema para direccionar la expresion de una protema recombinante a la glandula mamaria se describen con mas detalle en DeBoer et al., documentos WO 91/08216 y WO 93/25567. Tambien se han descrito ejemplos de transgenes que emplean secuencias reguladoras de otros genes espedficos de la glandula mamaria. Remftase, por ejemplo, a Simon et al., Bio/Technology 6, 179-183 (1988) y el documento WO88/00239 (1988) (secuencia reguladora de la p- lactoglobulina para la expresion en ovejas); Rosen, documento EP 279 582 y Lee et al., Nucleic Acids Res. 16, 1027-1041 (1988) (secuencia reguladora de la p-casema para la expresion en ratones); Gordon, Biotechnology 5, 1183 (1987) (secuencia reguladora de WAP para la expresion en ratones); documento WO 88/01648 (1988) y Eur. J. Biochem. 186, 43-48 (1989) (secuencia reguladora de la a-lactalbumina para la expresion en ratones). La expresion de protemas lisosomales en la leche a partir de transgenes se puede influenciar mediante la coexpresion o inactivacion funcional (es decir, anulacion) de genes implicados en la modificacion postraduccional y direccionamiento de las protemas lisosomales. Los datos en los Ejemplos indican que sorprendentemente las glandulas mamarias ya expresan enzimas modificadoras en cantidades suficientes para obtener niveles elevados de ensamblaje y secrecion de protemas que contienen manosa-6-fosfato. Sin embargo, en algunos mamfteros transgenicos que expresan niveles elevados de estas protemas, a veces es preferible complementar los niveles endogenos de enzimas procesadoras con enzima adicional resultado de la expresion del transgen. Tales transgenes se construyen empleando principios similares a los analizados anteriormente con la secuencia que codifica la enzima procesadora reemplazando la secuencia que codifica la protema lisosomal en el transgen. De manera general, no es necesario que las enzimas de procesamiento postraduccional se secreten. Por lo tanto, la secuencia senal de secrecion ligada a la secuencia que codifica la protema lisosomal es reemplazada por una secuencia senal que direcciona la enzima procesadora al retmulo endoplasmatico sin secrecion. Por ejemplo, son adecuadas las secuencias senal asociadas de manera natural con estas enzimas.

D. Transgenesis

Los transgenes descritos anteriormente se introducen en mai^eras no humanos. Son adecuados la mayona de los mai^eras no humanos, incluidos roedores tales como ratones y ratas, conejos, ovidos tales como ovejas y cabras, suidos tales como cerdos, y bovidos tales como ganado y bufalos. Los bovidos ofrecen la ventaja de grandes producciones de leche, mientras que los ratones ofrecen la ventaja de facilidad de transgenesis y cna. Los conejos ofrecen un termino medio de estas ventajas. Un conejo puede producir 100 mL de leche al dfa con un contenido proteico de aproximadamente un 14% (remftase a Buhler et al., Bio/Technology 8, 140 (1990)) y sigue siendo posible manipularlos y criarlos utilizando los mismos principios e instalaciones similares a los ratones. Normalmente no se emplean mamfteros no vivfparos tales como un taquiglosido u ornitorrinco.

En algunos metodos de transgenesis, se introducen los transgenes en el pronucleo de los oocitos fertilizados. Con algunos animales, tales como ratones y conejos, la fertilizacion se realiza in vivo y los ovulos fertilizados se retiran quirurgicamente. En otros animales, particularmente bovidos, es preferible retirar los ovulos de animales vivos o de matadero y fertilizar los ovulos in vitro. Remftase a DeBoer et al., documento WO 91/08216. La fertilizacion in vitro permite que un transgen se introduzca en celulas sustancialmente sincronizadas en una fase optima del ciclo celular para la integracion (no mas tarde de la fase S). Los transgenes se introducen normalmente por microinyeccion. Remftase al documento US 4 873 292. Los oocitos fertilizados se cultivan a continuacion in vitro hasta que se obtiene un embrion preimplantacion que contiene aproximadamente 16-150 celulas. La etapa de 16-32 celulas de un embrion se describe como una morula. Los embriones preimplantacion que contienen mas de 32 celulas se denominan blastocitos. Estos embriones muestran el desarrollo de una cavidad blastocelica, normalmente en la etapa de 64 celulas. Los metodos para cultivar oocitos fertilizados hasta la etapa de preimplantacion son descritos por Gordon et al., Methods Enzymol. 101, 414 (1984); Hogan et al., Manipulation of the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, C.S.H.L. N.Y. (1986) (embrion de raton); y Hammer et al., Nature 315, 680 (1985) (embriones de conejos y porcinos); Gandolfi et al. J. Reprod. Fert. 81, 23-28 (1987); Rexroad et al., J. Anim. Sci. 66, 947-953 (1988) (embriones ovinos) y Eyestone et al. J. Reprod. Fert. 85, 715-720 (1989); Camous et al., J. Reprod. Fert. 72, 779785 (1984); y Heyman et al. Theriogenology 27, 5968 (1987) (embriones bovinos). A veces, los embriones preimplantacion se almacenan congelados durante un periodo a la espera de la implantacion. Los embriones preimplantacion se transfieren al oviducto de una hembra pseudoprenada lo que da como resultado el nacimiento de un animal transgenico o quimerico dependiendo de la etapa de desarrollo cuando se integra el transgen. Los mamfteros quimericos se pueden criar para formar verdaderos animales transgenicos de lmeas germinales.

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Como alternativa, los transgenes se pueden introducir en celulas madre embrionarias (ES, por sus siglas en ingles). Estas celulas se obtienen a partir de embriones preimplantacion cultivados in vitro. Bradley et al., Nature 309, 255258 (1984). Los transgenes se pueden introducir en tales celulas mediante electroporacion o microinyeccion. Las celulas ES transformadas se combinan con blastocitos de un animal no humano. Las celulas ES colonizan el embrion y en algunos embriones forman la lmea germinal del animal quimerico resultante. Remftase a Jaenisch, Science, 240, 1468-1474 (1988). Como alternativa, las celulas ES se pueden utilizar como una fuente de nucleos para el trasplante a un oocito fertilizado enucleado lo que da lugar a un mamftero transgenico.

Para la produccion de animales transgenicos que contienen dos o mas transgenes, los transgenes se pueden introducir simultaneamente utilizando el mismo procedimiento que para un unico transgen. Como alternativa, los transgenes se pueden introducir inicialmente en animales independientes y despues combinarlos en el mismo genoma apareando los animales. Como alternativa, se produce un primer animal transgenico que contiene uno de los transgenes. A continuacion, se introduce un segundo transgen en ovulos fertilizados o celulas madre embrionarias de ese animal. En algunas realizaciones, los transgenes cuya longitud excedeffa de otra manera los aproximadamente 50 kb, se construyen como fragmentos solapantes. Tales fragmentos solapantes se introducen en un oocito fertilizado o celula madre embrionaria simultaneamente y experimentan recombinacion homologa in vivo. Remftase a Kay et al., documento WO 92/03917.

E. Caracteristicas de mamiferos transgenicos

Los mai^eras transgenicos incorporan al menos un transgen en su genoma tal como se ha descrito anteriormente. El transgen direcciona la expresion de un segmento de ADN que codifica una protema lisosomal al menos predominantemente a la glandula mamaria. Sorprendentemente, las glandulas mamarias son capaces de expresar protemas requeridas para un autentico procesamiento postraduccional incluidos los pasos de adicion de oligosacaridos y fosforilacion. El procesamiento por enzimas en la glandula mamaria da como resultado la fosforilacion en la posicion 6' de los grupos de manosa.

Se pueden secretar niveles elevados de protemas lisosomales de al menos 10, 50, 100, 500, 1000, 2000, 5000 o 10 000 |jg/mL. Sorprendentemente, los mamferos transgenicos muestran sustancialmente una salud normal. La expresion secundaria de las protemas lisosomales en tejidos que no son la glandula mamaria no ocurre en un grado suficiente para provocar efectos perjudiciales. Ademas, la protema lisosomal exogena producida en la glandula mamaria se secreta con una eficacia suficiente de manera que no se produce un problema significativo debido a la obstruccion del aparato secretor por los depositos.

La edad a la cual los mai^eras transgenicos pueden empezar a producir leche vaffa, obviamente, con la naturaleza del animal. Para los bovidos transgenicos, la edad es aproximadamente dos anos y medio de manera natural o seis meses con estimulacion hormonal, mientras que para los ratones transgenicos la edad es aproximadamente 5-6 semanas. Obviamente, unicamente se utilizan los miembros femeninos de una especie para producir leche. Sin embargo, los machos transgenicos tambien son valiosos para procrear descendientes femeninos. El esperma de los machos transgenicos se puede almacenar congelado para la posterior fertilizacion in vitro y generacion de descendencia femenina.

F. Recuperacion de protemas a partir de la leche

Los marnfferos hembra adultos transgenicos producen leche que contiene concentraciones elevadas de la protema lisosomal exogena. La protema se puede purificar a partir de la leche, si se desea, en virtud de sus propiedades ffsicas y qmmicas distintivas y procedimientos de purificacion estandar tales como la precipitacion, cromatograffa por afinidad, exclusion molecular o intercambio ionico. Remftase de manera general a Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982).

La purificacion de la a glucosidasa acida humana a partir de la leche se puede llevar a cabo desnatando la leche transgenica por centrifugacion y separacion de la grasa, a lo que sigue la separacion de casemas por centrifugacion a velocidad elevada a lo que sigue la filtracion a traves de lecho o membrana (dead-end filtration) (es decir, filtracion a traves de lecho o membrana utilizando sucesivamente tamanos de filtro descendentes) o filtracion de flujo tangencial o separacion de las casemas directamente por filtracion de flujo tangencial. La a-glucosidasa acida humana se purifica mediante cromatograffa, que incluye Q Sepharose FF (u otra matriz de intercambio anionico), cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC, por sus siglas en ingles), Sepharose que quela metales o lectinas acopladas a Sepharose (u otras matrices).

Se puede utilizar cromatograffa de flujo rapido con Q Sepharose para purificar a-glucosidasa acida humana presente en el suero lacteo filtrado o fraccion del suero lacteo de la siguiente manera: se equilibro una columna cromatografica (columna Pharmacia XK-50, altura del lecho de 15 cm; tasa de flujo de 250 cm/h) con Q Sepharose de flujo rapido (QFF; Pharmacia) en tampon de fosfato de sodio 20 mM, pH 7.0 (tampon A); la fraccion del suero lacteo con incubacion S/D (de aproximadamente 500 a 600 mL) se carga y la columna se lava con 4-6 volumenes de columna (cv, por sus siglas en ingles) de tampon A (tampon de fosfato de sodio 20 mM, pH 7.0). La fraccion con a- glucosidasa acida humana se eluye de la columna Q FF con 2-3 cv de tampon A, que contiene NaCl 100 mM.

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La fraccion que contiene a-glucosidasa acida humana de Q FF Sepharose se puede purificar adicionalmente utilizando cromatograffa de alta resolucion con Fenil Sepharose. Por ejemplo, se anade 1 vol. de sulfato de amonio 1 M al eluido de a-glucosidasa acida humana Q FF Sepharose a la vez que se agita continuamente. A continuacion se lleva a cabo la cromatograffa en columna con Fenil HP (Pharmacia) (columna Pharmacia XK-50, altura del lecho de 15 cm; tasa de flujo de 150 cm/h) a temperatura ambiente equilibrando la columna en sulfato de amonio 0.5 M, tampon de fosfato de sodio 50 mM pH 6.0 (tampon C), cargando el eluido de a-glucosidasa acida humana que se ha incubado con sulfato de amonio 0.5 M (de QFF Sepharose), lavando la columna con 2-4 cv de tampon C y eluyendo la a-glucosidasa acida humana de la columna Fenil HP con 3-5 cv de tampon D (tampon de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.0). Para los expertos en la tecnica seran evidentes metodos alternativos y metodos adicionales para purificar aun mas la a-glucosidasa acida humana. Por ejemplo, remftase a la solicitud de patente del Reino Unido 998 07464.4.

G. Usos de las proteinas lisosomales recombinantes

Las proteinas lisosomales recombinantes producidas de acuerdo con la divulgacion son utiles en los procedimientos terapeuticos de reemplazo enzimatico. Un paciente que padece una deficiencia genetica o de otro tipo que resulta en una insuficiencia de enzima lisosomal funcional se puede tratar administrando al paciente enzima exogena. Los pacientes que necesitan un tratamiento de este tipo se pueden identificar a partir de los smtomas (por ejemplo, los smtomas del smdrome de Hurler incluyen enanismo, turbidez cornea, hepatosplenomegalia, lesiones valvulares, lesiones arteriales coronarias, deformidades esqueleticas, rigidez articular y retraso mental progresivo). Como alternativa, o ademas, los pacientes se pueden diagnosticar a partir del analisis bioqmmico de una muestra tisular con el fin de revelar una acumulacion excesiva de un metabolito caractenstico procesado por una enzima lisosomal particular o mediante un ensayo enzimatico que utiliza un sustrato artificial o natural con el fin de revelar la deficiencia de una actividad enzimatica lisosomal particular. Para la mayona de las enfermedades, el diagnostico se puede realizar midiendo la deficiencia de la enzima particular o por analisis de ADN antes de que se presenten los smtomas o una acumulacion excesiva de metabolitos (Scriver et al., supra, capftulos sobre tesaurismosis lisosomales). Todas las tesaurismosis lisosomales son hereditarias. Por lo tanto, en la descendencia de familias con miembros de los que se sabe que padecen enfermedades lisosomales, a veces es recomendable comenzar el tratamiento profilactico incluso antes de que se pueda realizar un diagnostico definitivo.

Composiciones farmaceuticas

En algunos metodos, las enzimas lisosomales se administran en forma purificada junto con un portador farmaceutico en forma de una composicion farmaceutica. La forma preferida depende del modo de administracion y la aplicacion terapeutica previstos. El portador farmaceutico puede ser cualquier sustancia compatible y atoxica adecuada para suministrar los polipeptidos al paciente. Como el portador se puede utilizar agua esteril, alcohol, grasas, ceras y solidos inertes. Tambien se pueden incorporar adyuvantes farmaceuticamente aceptables, agentes tamponantes, agentes de dispersion y similares a las composiciones farmaceuticas.

La concentracion de la enzima en la composicion farmaceutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente un 0.1% en peso, siendo normalmente al menos aproximadamente un 1% en peso hasta un 20% en peso o mas.

Para la administracion oral, el principio activo se puede administrar en formas farmaceuticas solidas, tales como capsulas, comprimidos y polvos o en formas farmaceuticas ffquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. El(los) componente(s) activo(s) se puede(n) encapsular en capsulas de gelatina junto con ingredientes inactivos y portadores en polvo tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidon, celulosa o derivados de celulosa, estearato de magnesio, acido estearico, sacarina sodica, talco, carbonato de magnesio y similares. Son ejemplos de ingredientes inactivos adicionales que se pueden anadir para proporcionar color, sabor, estabilidad, capacidad tamponante o dispersion deseables u otras caractensticas conocidas deseables el oxido de hierro rojo, gel de sflice, laurilsulfato de sodio, dioxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Se pueden utilizar diluyentes similares para preparar comprimidos prensados. Tanto los comprimidos como las capsulas se pueden producir como productos de liberacion sostenida para proporcionar una liberacion continua de la medicacion a lo largo de un periodo de horas. Los comprimidos prensados pueden estar recubiertos con azucar o recubiertos con peffculas para enmascarar cualquier sabor desagradable y proteger el comprimido de la atmosfera, o con un recubrimiento enterico para una desintegracion selectiva en el tubo gastrointestinal. Las formas farmaceuticas ffquidas para la administracion oral pueden contener colorantes y saborizantes para aumentar la aceptacion por parte del paciente.

Se podna preparar una composicion ffpica para infusion intravenosa para que contuviera de 100 a 500 mL de NaCl al 0.9% o glucosa al 5% esteril complementados opcionalmente con una solucion de albumina al 20% y de 100 a 500 mg de una enzima. Se podnan preparar composiciones farmaceuticas ffpicas para inyeccion intramuscular para que contuvieran, por ejemplo, 1 mL de agua tamponada esteril y de 1 a 10 mg de alfa-glucosidasa purificada de la presente divulgacion. Los metodos para preparar composiciones que se pueden administrar por via parenteral son muy conocidos en la tecnica y se describen mas detalladamente en varios medios, incluido, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15.a ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980). Se puede formular AGLU en tampon de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.0. Pequenas cantidades de sulfato de amonio estan presentes de manera opcional (<10 mM). La enzima se mantiene normalmente congelada a aproximadamente -70 °C y se descongelan

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antes de su uso. Como alternativa, la enzima se puede almacenar fna (por ejemplo, de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 8 °C) en solucion. En algunas realizaciones, las soluciones de AGLU comprenden un tampon (por ejemplo, fosfato de sodio, fosfato de potasio u otros tampones fisiologicamente aceptables), un carbohidrato simple (por ejemplo, sacarosa, glucosa, maltosa, manitol o similares), protemas (por ejemplo, albumina serica humana) y/o surfactantes (por ejemplo, polisorbato 80 (Tween-80), cremophore-EL, cremophore-R, labrofil y similares).

Se puede almacenar AGLU en forma liofilizada. Para la liofilizacion, se puede formular AGLU en una solucion que contiene manitol y sacarosa en un tampon de fosfato. La concentracion de sacarosa debena ser suficiente para prevenir la agregacion de AGLU tras la reconstitucion. La concentracion de manitol debena ser suficiente para reducir significativamente el tiempo que se necesitana de otra manera para la liofilizacion. Sin embargo, las concentraciones de manitol y sacarosa debenan ser insuficientes para provocar una hipertonicidad inaceptable tras la reconstitucion. Son adecuadas concentraciones de manitol y sacarosa de 1-3 mg/mL y 0.1-1.0 mg/mL, respectivamente. Las concentraciones preferidas son 2 mg/mL de manitol y 0.5 mg/mL de sacarosa. La concentracion de AGLU es preferentemente de 5 mg/mL antes de la liofilizacion y despues de la reconstitucion. Una solucion preferida para la reconstitucion es la solucion salina preferentemente al 0.9%.

Para AGLU purificada a partir de leche de conejo, se puede tolerar una pequena cantidad de impurezas (por ejemplo, de hasta aproximadamente un 5%). Las posibles impurezas pueden estar presentes en forma de protemas del suero lacteo de conejo. Otras impurezas posibles son analogos estructurales (por ejemplo, oligomeros y agregados) y truncamientos de AGLU. Los lotes actuales indican que la AGLU producida en ratones transgenicos tiene una pureza >95%. Las mayores impurezas son protemas del suero lacteo de conejo, aunque en la electroforesis en gel tambien se pueden ver bandas de AGLU con diferentes pesos moleculares.

Las soluciones para la infusion se debenan preparar asepticamente en una campana de flujo de aire laminar. Se debena retirar del congelador la cantidad apropiada de AGLU y descongelarla a temperatura ambiente. Las soluciones para infusion se pueden preparar en botellas de infusion de vidrio mezclando la cantidad apropiada de la solucion del producto final de tipo AGLU con una cantidad adecuada de una solucion que contiene albumina serica humana (HSA, por sus siglas en ingles) y glucosa. La concentracion final puede ser de un 1% de HSA y un 4% de glucosa para dosis de 25-200 mg y de un 1% de HSA y un 4% de glucosa para dosis de 400-800 mg. La HSA y AGLU se pueden filtrar con un filtro de jeringa de 0.2 pm antes de transferirlas a la botella de infusion que contiene glucosa al 5%. Como alternativa, se puede reconstituir AGLU en solucion salina, preferentemente al 0.9% para infusion. Se ha mostrado que las soluciones de AGLU para infusion son estables durante hasta 7 horas a temperatura ambiente. Por lo tanto, la solucion de AGLU se infunde preferentemente en las siete horas siguientes a la preparacion.

Metodos terapeuticos

En la presente se divulgan metodos eficaces para tratar la enfermedad de Pompe. Estos metodos tienen como premisa en parte la disponibilidad de grandes cantidades de alfa-glucosidasa acida humana en una forma que es catalfticamente activa y en una forma que pueda ser captada por los tejidos, especialmente el hfgado, corazon y musculo (por ejemplo, musculo liso, musculo estriado y musculo cardiaco) de un paciente que este siendo tratado. Tal alfa-glucosidasa acida humana se obtiene, por ejemplo, a partir de los animales transgenicos descritos en los Ejemplos. La alfa-glucosidasa esta preferentemente de manera predominante (es decir, >50%) en la forma precursora de aproximadamente 100-110 kD. (El peso molecular aparente o movilidad relativa del precursor de 100110 kD puede variar en cierta medida dependiendo del metodo de analisis utilizado, pero normalmente esta en el intervalo entre 95 kD y 120 kD). Teniendo en cuenta el exito de los resultados con alfa-glucosidasa acida humana en los animales transgenicos que se analizan en los Ejemplos, es posible que tambien se puedan utilizar otras fuentes de alfa-glucosidasa humana, tales como las que son el resultado de los sistemas de expresion celular. Por ejemplo, una manera alternativa de producir a-glucosidasa acida humana es transferir el gen de la a-glucosidasa acida a una lmea celular eucariota estable (por ejemplo, CHO) como un constructo genomico o de ADNc ligado operablemente a un promotor adecuado. Sin embargo, resulta mas laborioso producir las grandes cantidades de alfa-glucosidasa acida humana necesarias para la terapia clmica mediante una estrategia de este tipo.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion se administran normalmente por via intravenosa. En algunas circunstancias tambien es posible la administracion intradermica, intramuscular u oral. Las composiciones se pueden administrar para el tratamiento profilactico de individuos que padecen una enfermedad por una deficiencia enzimatica lisosomal o que estan en riesgo de padecerla. Para las aplicaciones terapeuticas, las composiciones farmaceuticas se administran a un paciente que padece una enfermedad establecida en una cantidad suficiente para reducir la concentracion de metabolito acumulado y/o prevenir o detener una acumulacion adicional del metabolito. Para los individuos en riesgo de padecer una enfermedad por una deficiencia enzimatica lisosomal, las composiciones farmaceuticas se administran de manera profilactica en una cantidad suficiente para prevenir o inhibir la acumulacion del metabolito. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una «dosis eficaz desde un punto de vista terapeutico» o «desde un punto de vista profilactico). Las dosificaciones eficaces de este tipo dependeran de la gravedad de la afeccion y del estado general de salud del paciente.

En los metodos de la presente, la alfa-glucosidasa acida humana se administra a un paciente normalmente con una dosificacion de 10 mg/kg de peso corporal del paciente o mas a la semana. A menudo las dosificaciones son

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mayores que 10 mg/kg a la semana. Las pautas posologicas pueden variar de 10 mg/kg a la semana a al menos 1000 mg/kg a la semana. Normalmente, las pautas posologicas son de 10 mg/kg a la semana, 15 mg/kg a la semana, 20 mg/kg a la semana, 25 mg/kg a la semana, 30 mg/kg a la semana, 35 mg/kg a la semana, 40 mg/kg a la semana, 45 mg/kg a la semana, 60 mg/kg a la semana, 80 mg/kg a la semana y 120 mg/kg a la semana. En las pautas preferidas, se administran 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg o 40 mg/kg una, dos o tres veces a la semana. El tratamiento se prolonga normalmente durante al menos 4 semanas, a veces 24 semanas y a veces durante el resto de vida del paciente. El tratamiento se administra preferentemente i.v. Opcionalmente, los niveles de alfa-glucosidasa humana se controlan tras el tratamiento (por ejemplo, en el plasma o musculo) y se administra una dosificacion adicional cuando los niveles detectados caen sustancialmente por debajo (por ejemplo, menos de un 20%) de los valores en personas normales.

En algunos metodos, la alfa-glucosidasa acida humana se administra con una dosis «elevada» inicialmente (es decir, una «dosis de carga»), seguida por la administracion de dosis mas bajas (es decir, una «dosis de mantenimiento»). Un ejemplo de una dosis de carga es al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal del paciente de 1 a 3 veces a la semana (por ejemplo, durante 1, 2 o 3 semanas). Un ejemplo de una dosis de mantenimiento es de al menos aproximadamente 5 a al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del paciente a la semana, o mas, tal como 20 mg/kg a la semana, 30 mg/kg a la semana, 40 mg/kg a la semana.

En algunos metodos, se administra una dosificacion con una tasa creciente durante el periodo de dosificacion. Esto se puede conseguir incrementando la tasa de flujo de la infusion intravenosa o utilizando un gradiente de concentracion creciente de alfa-glucosidasa administrada con una tasa constante. La administracion de esta manera reduce el riesgo de reaccion inmunogena. En algunas dosificaciones, la tasa de administracion medida en unidades de alfa-glucosidasa por unidad de tiempo aumenta en al menos un factor de diez. Normalmente, la infusion intravenosa ocurre a lo largo de un periodo de varias horas (por ejemplo, 1-10 horas y preferentemente 2-8 horas, mas preferentemente 3-6 horas) y la tasa de infusion se hace aumentar a intervalos durante el periodo de administracion.

Las dosificaciones adecuadas (todas en mg/kg/h) para la infusion con tasas crecientes se muestran a continuacion en la tabla 1. La primera columna de la tabla indica periodos de tiempo en la programacion posologica. Por ejemplo, la referencia a 0-1 h se refiere a la primera hora de la dosificacion. La quinta columna de la tabla muestra el intervalo de dosis que se pueden utilizar en cada periodo de tiempo. La cuarta columna muestra un intervalo incluido mas estrecho de las dosificaciones preferidas. La tercera columna indica los valores superior e inferior de las dosificaciones administradas en un ensayo clmico a modo de ejemplo. La segunda columna muestra dosificaciones especialmente preferidas, representando estas la media del intervalo mostrado en la tercera columna de la tabla 1.

Tabla 1

Tiempo

Dosis medias (I) Valores inferior y superior Intervalo preferido Intervalo

0-1 h:

0.3 mg/kg/h 0.25-0.4 0.1-1 0.03-3

1-2 h:

1 mg/kg/h 0.9-1.4 1-4 0.3-12

2-2.5 h:

4 mg/kg/h 3.6-5.7 3-10 1-30

2.5-5.6hr.

12 mg/kg/h 7.2-11.3 6-20 2-60

Los metodos son eficaces en pacientes con la enfermedad de Pompe tanto de aparicion temprana (infantil) como de aparicion tardfa (juvenil y del adulto). En pacientes con la forma infantil de la enfermedad de Pompe los smtomas se vuelven evidentes en los primeros 4 meses de vida. Principalmente, al principio se nota un desarrollo motor deficiente y la incapacidad de prosperar. En el examen clmico, se observa una hipotoma generalizada con atrofia muscular, aumento de la velocidad de respiracion con retraccion esternal, aumento moderado del hngado y protrusion de la lengua. La ecograffa del corazon muestra una cardiomiopatfa hipertrofica progresiva, que conlleva en ultima instancia un rendimiento cardiaco insuficiente. El ECG esta caracterizado por una desviacion marcada del eje izquierdo, un intervalo PR corto, complejos QRS grandes, ondas T invertidas y depresion de ST. La enfermedad muestra un curso que progresa rapidamente y que conlleva insuficiencia cardiorrespiratoria en el primer ano de vida. En el examen histologico de la autopsia se observa almacenamiento de glucogeno lisosomal en varios tejidos y mas pronunciado en el corazon y musculo esqueletico. El tratamiento con alfa-glucosidasa acida humana en los metodos de la presente da como resultado una prolongacion de la vida de estos pacientes (por ejemplo, superior a 1, 2, 5 anos y hasta una longevidad normal). El tratamiento tambien da como resultado la eliminacion o reduccion de las caractensticas clmicas y bioqmmicas de la enfermedad de Pompe tal como se ha realizado anteriormente. El tratamiento se administra poco despues del nacimiento o de manera antenatal si se sabe que los padres portan alelos de la alfa-glucosidasa variantes que ponen a su progenie en riesgo.

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Los pacientes con la forma del adulto de aparicion tardfa de la enfermedad de Pompe puede que no experimenten smtomas en las dos primeras decadas de vida. En ese subtipo clmico, estan implicados principalmente los musculos esqueleticos con predileccion por los de la cintura y extremidades, el tronco y el diafragma. La queja inicial es a menudo la dificultad para subir escaleras. La insuficiencia respiratoria vana considerablemente. Puede dominar el cuadro clmico o que el paciente no la experimente hasta una etapa posterior de su vida. La mayona de los pacientes fallecen debido a la insuficiencia respiratoria. En los pacientes con subtipo juvenil, los smtomas normalmente se vuelven evidentes en la primera decada de vida. Al igual que la enfermedad de Pompe del adulto, la debilidad de los musculos esqueleticos es el principal problema; se pueden observar cardiomegalia, hepatomegalia y macroglosia, pero son raras. En muchos casos, se necesita con urgencia soporte respiratorio durante la noche. Las infecciones pulmonares combinadas con la atrofia de los musculos respiratorios son potencialmente letales y en la mayona de los casos causan la muerte antes de la tercera decada. El tratamiento con los metodos de la presente prolonga la vida de los pacientes con la enfermedad de Pompe juvenil o del adulto de aparicion tardfa hasta una longevidad normal. El tratamiento tambien elimina o reduce significativamente los smtomas clmicos o bioqmmicos de la enfermedad.

Otros usos

Las protemas lisosomales producidas en la leche de animales transgenicos tienen varios usos diferentes. Por ejemplo, la a-glucosidasa, en comun con otras a-amilasas, es una herramienta importante para producir almidon, cerveza y agentes farmaceuticos. Remftase a Vihinen y Mantsala, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24, 329-401 (1989). Las protemas lisosomales tambien son utiles para producir agentes qmmicos de laboratorio o productos alimentarios. Por ejemplo, la a-glucosidasa acida degrada enlaces gluddicos 1,4- y 1,6-a y se puede utilizar para degradar diversos carbohidratos que contienen esos enlaces tales como maltosa, isomaltosa, almidon y glucogeno, para generar glucosa. La a-glucosidasa acida tambien es util para administrar a pacientes con una deficiencia de maltasa o isomaltasa intestinal. Se evitan los smtomas que de otra manera senan el resultado de la presencia de maltosa no digerida. En tales aplicaciones, la enzima se puede administrar sin un fraccionamiento previo a partir de la leche, como un producto alimentario derivado a partir de tal leche (por ejemplo, helado o queso) o como una composicion farmaceutica. Las enzimas lisosomales recombinantes purificadas tambien son utiles para su inclusion como controles en kits diagnosticos para someter a ensayo cantidades desconocidas de tales enzimas en muestras tisulares.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construccion de transgenes

(a) Constructo de ADNc

La construccion de un vector de expresion que contiene ADNc que codifica la a- glucosidasa acida humana comenzo con el plasmido p16,8h1f3 (remftase a DeBoer et al. (1991) y (1993), supra). Este plasmido incluye las secuencias reguladoras de la aS1-casema bovina. El inserto de ADNc de lactoferrina del plasmido progenitor fue intercambiado por el ADNc de la a-glucosidasa acida humana (Hoefsloot et al. EMBO J. 7,1697-1704 (1988)) en el sitio Clal y Sall del casete de expresion que se muestra en la Fig. 1. Para obtener sitios de restriccion compatibles en los extremos del fragmento de ADNc de la a-glucosidasa, se digirio el plasmido pSHAG2 (id.) que contema el ADNc completo que codificaba la a-glucosidasa humana con EcoRI y Sphl y el fragmento de ADNc de 3.3 kb se subclono en pKUN7AC un derivado de pKUN1 (Konings et al., Gene 46, 269-276 (1986)), con un sitio Clal destruido dentro de las secuencias nucleotfdicas del vector y con un policonector recien disenado: Hindlll Clal EcoRI Sphl Xhol EcoRI Sfil Sfil/Smal Notl EcoRI*(*= sitio destruido). A partir del plasmido pagluCESX resultante, el fragmento de ADNc de 3.3 kb podna ser escindido por Clal y Xhol. Este fragmento se inserto en el casete de expresion que se muestra en la Fig. 1 en el sitio Clal y sitio Sall compatible con Xhol. Como resultado, el plasmido de expresion p16,8aglu esta constituido por la secuencia de ADNc que codifica la a-glucosidasa acida humana flanqueada por las secuencias de aS1-casema bovina tal como se muestra en la Fig. 1. El fragmento de 27.3 kb que contiene el casete de expresion completo se puede escindir mediante escision con Notl (remftase a la Fig. 1).

(b) Constructos genomicos

El constructo c8agluex1 contiene el gen de la a-glucosidasa acida humana (Hoefsloot et al., Biochem. J. 272, 493497 (1990)); comenzando en el exon 1 adyacente en direccion 3' respecto a su sitio de inicio de la transcripcion (remftase a la Fig. 2, panel A). Por lo tanto, el constructo codifica casi una 5' UTR completa del gen de la a- glucosidasa acida humana. Este fragmento se fusiono con las secuencias promotoras del gen de aS1-casema bovina. El sitio de iniciacion de la aS1-casema esta presente 22 pb en direccion 5' respecto a la union aS1- casema/a-glucosidasa acida. El constructo tiene la senal de poliadenilacion y las secuencias flanqueantes 3' de la a- glucosidasa acida humana. El constructo c8agluex2 contiene el promotor de la aS1-casema bovina fusionado inmediatamente con el sitio de iniciacion de la traduccion en el exon 2 del gen de la a-glucosidasa acida humana (remftase a la Fig. 2, panel B). Asf pues, el sitio de iniciacion de la transcripcion de la aS1-casema y el sitio de iniciacion de la traduccion de la a-glucosidasa estan separados por 22 pb en este constructo. Por lo tanto, no se conserva la 5' UTR de la a-glucosidasa. Este constructo tambien contiene la senal de poliadenilacion y las secuencias flanqueantes 3' de la a-glucosidasa acida humana tal como se muestra en la Fig. 2, panel B.

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El constructo c8,8agluex2-20 difiere del constructo c8agluex2 unicamente en la region 3'. Se utilizo un sitio Sphl en el exon 20 para fusionar la secuencia 3' de la aS1-casema bovina con el constructo de a-glucosidasa acida humana. La senal de poliadenilacion se ubica en esta secuencia 3' de aS1-casema (Fig.2, panel C).

Metodos para construir constructos genomicos

Se aislaron tres fragmentos BgIII contiguos que conteman el gen de la a-glucosidasa acida humana segun Hoefsloot et al., supra. Estos fragmentos se ligaron en el sitio BgIII de pKUN8AC, un derivado de pKUN7AC con un policonector personalizado: HindIII Clal StuI SstI BglII PvnI Ncol EcoRI SphI Xhol EcoRI* Smal/Sfil Notl EcoRI* (*= sitio destruido). Esta ligacion dio como resultado dos orientaciones de los fragmentos que generaron los plasmidos p7.3agluBES, p7.3agluBSE, p8.5agluBSE, p8.5agluBES, p10aagluBSE y p10agluBES.

Debido a que los sitios NotI unicos en los extremos del casete de expresion se utilizan posteriormente para el aislamiento de los fragmentos utilizados para la microinyeccion, el sitio NotI intragenico en el intron 17 de la a- glucosidasa acida humana tuvo que ser destruido. Por lo tanto, p10agluBES se digirio con Clal y Xhol; se aislo el fragmento que contema el extremo 3' de la a-glucosidasa. Este fragmento se inserto en los sitios ClaI y XhoI de pKUN10AC, lo que dio como resultado p10agluANV. Previamente, se obtuvo pKUN10AC (es decir, un derivado de pKUN8AC) digiriendo pKUN8AC con NotI, rellenando los extremos adhesivos con Klenow y posteriormente hibridando el plasmido mediante ligacion de extremos romos. Finalmente, se digirio p10agluANV con NotI. Estos extremos adhesivos tambien se rellenaron con Klenow y el fragmento se ligo, lo que dio como resultado el plasmido p10agluANotI.

Construccion de c8agluex1

Ya que se eligio el sitio Sstl en el primer exon del gen de la a-glucosidasa para la fusion de la secuencia de la aS1- casema bovina, se digirio p8.5agluBSE con BgIII a lo que siguio una digestion parcial con Sstl. Se aislo el fragmento que contema el exon 1-3 y se ligo en los sitios BglII y SstI de pKUN8AC. El plasmido resultante se denomino: p5'agluex1 (remftase a la Fig. 3, panel A).

El siguiente paso (Fig. 3, panel B) fue la ligacion de la parte 3' a p5'agluex1. En primer lugar, se digirio p10agluAN con BglII y BamHI. Se aislo el fragmento que contema el exon 16-20. En segundo lugar, se digirio p5'agluex1 con BgIII y para prevenir la autoligacion, y se trato con fosforilasa (BAP) para desfosforilar los extremos BglII adhesivos. Ya que los extremos adhesivos BamHI son compatibles con los extremos adhesivos BglII, estos extremos se ligan entre sft Se selecciono el plasmido resultante, es decir, p5'3'agluex1. El plasmido tiene un sitio BglII unico disponible para el paso de construccion final (remftase a la Fig. 3, paneles B y C).

La parte media del gen de la a-glucosidasa se inserto en el ultimo constructo. Para este paso, se digirio p7.3agluBSE con BglII, se aislo el fragmento de 8.5 kb y se ligo en el plasmido p5'3'agluex1 desfosforilado y digerido con BglII. El plasmido resultante es pagluexl (Fig. 3, panel C).

Las secuencias del promotor de la aS1-casema bovina se incorporaron en el siguiente paso mediante una ligacion en la que participaron los tres fragmentos. El vector de tipo cosmido pWE15 se digirio con NotI y se desfosforilo. El promotor de la aS1-casema bovina se aislo como un fragmento 8 Rb NotI-ClaI (remftase a Boer et al., 1991, supra). El fragmento de la a-glucosidasa acida humana se aislo a partir de pagluex1 utilizando las mismas enzimas. Estos tres fragmentos se ligaron y empaquetaron utilizando el kit Stratagene GigapackII en celulas hospedadoras de E. coli 1046. El cosmido resultante c8agluex1 se propago en la cepa DH5a de E. coli. El vector se linealizo con NotI antes de la microinyeccion.

Construccion de c8agluex2 y c8,8agluex2-20

La construccion de los otros dos plasmidos de expresion (Fig. 2, paneles B y C) siguio una estrategia similar a la de c8agluex1. El plasmido p5'agluStuI se obtuvo a partir de p8,5agluBSE por digestion del plasmido con StuI, a lo que siguio la autoligacion del fragmento aislado que contema el exon 2-3 mas las secuencias vectoriales. Se digirio el plasmido p5'agluStuI con PglII, a lo que siguio la digestion parcial del fragmento lineal con NcoI lo que dio lugar a varios fragmentos. Se aislo el fragmento de 2.4 kb, que contema el exon 2 y el 3, y se ligo en los sitios NcoI y BglII del vector pKUN12AC, lo que dio como resultado p5'agluex2. Notese que pKUN12AC es un derivado de pKUN8AC que contiene el policonector: ClaI NcoI BglII HindIII EcoRI SphI XhoI SmaI/SfiI NotI.

Se digirio el plasmido p10agluANotI con BglII y HindIII. Se aislo el fragmento que contema los exones 16-20 y se ligo en p5'agluex2 digerido con BglIII y HindIII. El plasmido resultante fue p5'3'agluex2. El fragmento de la parte central en p5'3'agluex2 se inserto como para pagluex1. Para esto, se digirio p7.3aglu con BglII. Se aislo el fragmento y se ligo en el p5'3'agluex2 desfosforilado y digerido con BglII. El plasmido resultante, pagluex2, se utilizo en la construccion de c8agluex-20 y c8,8agluex2-20 (Fig. 2, paneles B y C).

Para la construccion del tercer plasmido de expresion c8,8a gluex2-20 (Fig. 2, panel C), se elimino la region flanqueante 3' de la a-glucosidasa. Para conseguir esto, se digirio pagluex2 con SphI. Se aislo el fragmento que contema el exon 2-20 y se autoligo lo que dio como resultado pagluex2-20. Posteriormente, se aislo el fragmento que contema la region flanqueante 3' del gen de la as1-casma bovina a partir de p16,8aglu mediante digestion con

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SphI y Notl. Este fragmento se inserto en pagluex2-20 utilizando el sitio SphI y el sitio Notl en la secuencia del policonector, lo que dio como resultado pagluex2-20-3aS1.

El paso final en la generacion de c8,8agluex2-20 fue la ligacion de tres fragmentos como en el paso final en la construccion que dio lugar a c8agluex1. Ya que el sitio Clal en pagluex2-20-3'aS1 y pagluex2 parecio no ser susceptible a la escision debido a metilacion, los plasmidos tuvieron que ser propagados en la cepa DAM(-) de E. coli ECO343. El pagluex2-20-3'aS1 aislado a partir de esa cepa fue digerido con Clal y Notl. El fragmento que contema los exones 2-20 mas la region flanqueante 3' de aS1-casema se purifico a partir de las secuencias vectoriales. Este fragmento, un fragmento Notl-Clal de 8 kb que contema el promotor de asl bovina (remftase a DeBoer (1991) y (1993), supra) y pWE 15 desfosforilado y digerido con Notl se ligaron y empaquetaron. El cosmido resultante es c8,8agluex2-20.

El cosmido c8agluex2 (Fig. 2, panel B) se construyo mediante un par de pasos diferentes. En primer lugar, el cosmido c8,8agluex2-20 se digirio con Sall y Notl. Se aislo el fragmento de 10.5 kb que contema el promotor de aS1 y los exones 2-6 parte del gen de la a-glucosidasa acida. En segundo lugar, se digirio el plasmido pagluex2 con Sall y Notl para obtener el fragmento que contema la parte 3' del gen de la a-glucosidasa acida. Finalmente, el vector de tipo cosmido pWE15 se digirio con Notl y se desfosforilo. Estos tres fragmentos se ligaron y empaquetaron. El cosmido resultante es c8agluex2.

Ejemplo 2: Transgenesis

Los constructos genomicos y de ADNc se linealizaron con Notl y se inyectaron en el pronucleo de oocitos de raton fertilizados, los cuales se implantaron a continuacion en el utero de ratones hembra pseudoprenadas que hicieron de madre adoptiva. Se analizo la descendencia para detectar la insercion del constructo genico de ADN genomico o ADNc de la a-glucosidasa humana mediante transferencia de Southern de ADN aislado a partir de cortes en la cola. Se seleccionaron y criaron los ratones transgenicos.

Los constructos genomicos linealizados con Notl tambien se inyectaron en el pronucleo de oocitos de conejo fertilizados, los cuales se implantaron en el utero de conejos hembra pseudoprenadas que hicieron de madre adoptiva. Se analizo la descendencia para detectar la insercion del ADN de la alfa-glucosidasa mediante transferencia de Southern. Se seleccionaron y criaron los conejos transgenicos.

Ejemplo 3: Analisis de la a-glucosidasa acida en la leche de ratones transgenicos

Se analizo la leche de ratones transgenicos y controles no transgenicos mediante inmunoelectrotransferencia. La sonda fue un anticuerpo de raton espedfico para la a-glucosidasa acida humana (es decir, no se une a la enzima de raton). Los transgenes 1672 y 1673 mostraron expresion de la a-glucosidasa acida humana en leche (Fig. 4). Se observaron bandas importantes y secundarias a 100-110 kD y 76 kD tal como se esperaba para la a-glucosidasa. En la leche procedente de ratones no transgenicos, no se observaron bandas.

La actividad de la a-glucosidasa acida humana se midio con el sustrato artificial 4-metilumbeliferil-a-D- glucopiranosido en la leche de lmeas de ratones transgenicos (remftase a Galiaard, Genetic Metabolic Disease, Early Diagnosis and Prenatal Analysis, Elsevier/Holanda del Norte, Amsterdam, pags. 809-827 (1980)). Los ratones que conteman el constructo de ADNc (Fig. 1) variaron de 0.2 a 2 pmol/mL por h. Las lmeas de ratones que conteman el constructo genomico (Fig. 2, panel A) lo expresaron con niveles de 10 a 610 pmol/mL por h. Estas figuras son equivalentes a una produccion de 1.3 a 11.3 mg/L (constructo de ADNc) y de 0.05 a 3.3 g/L (constructo genomico) en funcion de una actividad espedfica estimada de la enzima recombinante de 180 pmol/mg (Van der Ploeg et al., J. Neurol. 235:392-396 (1988)).

La a-glucosidasa acida recombinante se aislo a partir de la leche de ratones transgenicos, mediante cromatograffa secuencial de la leche en ConA-Sepharose™ y Sephadex™ G200. Se diluyeron 7 mL de leche hasta 10 mL con 3 mL de tampon Con A constituido por fosfato de sodio 10 mM, pH 6.6 y NaCl 100 mM. A continuacion, se anadio una suspension 1:1 de Con A sepharose en tampon Con A y la leche se dejo durante toda la noche a 4 °C con una agitacion moderada. A continuacion, se recogieron por centrifugacion las microesferas de Con A sepharose y se lavaron 5 veces con tampon Con A, 3 veces con tampon Con A que contema NaCl 1 M en lugar de 100 mM, una vez con tampon Con A que contema NaCl 0.5 M en lugar de 100 mM y despues se eluyeron en lotes con tampon Con A que contema NaCl 0.5 M y metil-a-D-manopiranosido 0.1 M. Se midio la actividad de la a-glucosidasa acida en las muestras eluidas utilizando el sustrato artificial 4-metilumbeliferil-a-D-glucopiranosido (remftase a la parte anterior). Las fracciones que conteman actividad de a-glucosidasa acida se combinaron, concentraron y dializaron contra tampon Sephadex constituido por acetato Na 20 mM, pH 4.5 y NaCl 25 mM, y se aplicaron sobre una columna Sephadex™ 200. Se eluyo la columna con el mismo tampon y las fracciones se sometieron a ensayo para detectar la actividad de la a-glucosidasa y el contenido proteico. Las fracciones ricas en actividad de la a-glucosidasa acida y practicamente exentas de otras protemas se combinaron y concentraron. El metodo tal como se describe es esencialmente el mismo que el publicado por Reuser et al., Exp. Cell Res. 155:178-179 (1984). Son posibles varias modificaciones del metodo respecto a la composicion y pH exactos de los sistemas tamponantes y a la eleccion del numero y material de la columna de los pasos de purificacion.

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La a-glucosidasa acida purificada a partir de la leche se estudio a continuacion para determinar la fosforilacion administrando la enzima a fibroblastos cultivados procedentes de pacientes con GSD II (deficientes en la a- glucosidasa acida endogena). En esta prueba, las protemas que contienen manosa 6-fosfato se unen mediante los receptores de la manosa 6-fosfato a la superficie celular de los fibroblastos y son internalizadas posteriormente. La union esta inhibida por manosa 6-fosfato libre (Reuser et al., Exp. Cell Res. 155:178-189 (1984)). En una prueba tfpica para determinar la fosforilacion de la a-glucosidasa acida aislada de la leche de ratones transgenicos, se anadio la a-glucosidasa acida a 104-106 fibroblastos en 500 pL de medio de cultivo (Ham F10, complementado con un 10% de suero bovino fetal y Pipes 3 mM) en una cantidad suficiente para metabolizar 1 pmol de 4- metilumbeliferil-a-D-glucopiranosido por hora durante un periodo de tiempo de 20 horas. El experimento se realizo con o sin manosa 6-fosfato 5 mM como competidor, esencialmente tal como describen Reuser et al., supra (1984). En estas condiciones, se restituyo la a-glucosidasa acida de los fibroblastos de pacientes hasta el nivel medido en fibroblastos de individuos sanos. Esta restitucion de la actividad de la a-glucosidasa acida endogena mediante a- glucosidasa acida aislada de leche de raton fue tan eficaz como la restitucion con a-glucosidasa acida purificada de testfculos bovinos, orina humana y medio de celulas CHO transfectadas. La restitucion con a-glucosidasa de la leche estuvo inhibida por manosa 6-fosfato 5 mM tal como se ha observado para a-glucosidasa de otras fuentes. (Reuser et al., supra; Van der Ploeg et al., (1988), supra; Van der Ploeg et al., Ped. Res. 24:90-94 (1988).

Como una demostracion adicional de la autenticidad de la a-glucosidasa producida en la leche, la secuencia aminoaddica N-terminal de la a-glucosidasa recombinante producida en la leche de ratones mostro ser la misma que la del precursor de a-glucosidasa de orina humana tal como lo publico Hoefsloot et al., EMBO J. 7:1697-1704 (1988) que comienza con AHPGRP.

Ejemplo 4: Ensayo en animales de alfa-glucosidasa

Desde hace poco, se puede disponer de un modelo en ratones inactivados para la enfermedad de Pompe (25). Este modelo se genera mediante una alteracion dirigida del gen de la alfa-glucosidasa murina. Los lisosomas que contienen glucogeno se detectan poco despues del nacimiento en el hngado, corazon y musculo esqueletico. Los smtomas clmicos claros solamente se vuelven evidentes a una edad relativamente tardfa (>9 meses), pero el corazon esta normalmente agrandado y el electrocardiograma es anomalo.

Se han llevado a cabo experimentos utilizando el modelo en ratones inactivados (KO) con el fin de estudiar el efecto in vivo de AGLU purificada a partir de leche de conejos transgenicos. La enzima recombinante en estos experimentos se purifico a partir de leche de los conejos transgenicos esencialmente tal como se ha descrito anteriormente para la purificacion a partir de ratones transgenicos.

1. Estudios a corto plazo en un modelo en ratones KO

Se administraron inyecciones sencillas o multiples con un intervalo de 6 dfas a ratones KO mediante la vena de la cola. Dos dfas despues de la ultima administracion enzimatica se sacrificaron los animales y los organos se perfundieron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Se prepararon homogeneizados tisulares para los ensayos de la actividad enzimatica de GLU y del contenido de glucogeno tisular, y se obtuvieron cortes ultrafinos de diversos organos para visualizar la acumulacion (mediante microscopfa electronica) del contenido de glucogeno lisosomal. Tambien se determino la ubicacion de la AGLU internalizada utilizando anticuerpos policlonales de conejo contra la a-glucosidasa madura de placenta humana.

Los resultados mostraron que las dosis unicas de 0.7 y 1.7 mg de AGLU (experimentos C y A, respectivamente) fueron incorporadas de manera eficaz in vivo a varios organos de grupos de dos ratones inactivados cuando se inyectaron por via intravenosa. El experimento A tambien mostro que no hubo diferencias en la captacion y distribucion de AGLU purificada a partir de dos fuentes de leche de conejo independientes.

Se observaron aumentos en la actividad de AGLU en organos tales como el hngado, bazo, corazon y musculo esqueletico, pero no en el cerebro. Dos dfas despues de una unica inyeccion de 1.7 mg de AGLU a dos animales KO, se obtuvieron niveles cercanos o muy superiores a los niveles de actividad alfa-glucosidasa endogena observados en organos de dos ratones de control normales inyectados con PBS o dos ratones KO heterocigoticos (experimento A). De los organos estudiados, el tngado y el bazo son, cuantitativamente, los principales organos implicados en la captacion, pero el corazon y los musculos pectorales y femorales tambien incorporan cantidades significativas de la enzima. La ausencia de un aumento significativo en el tejido cerebral sugiere que AGLU no cruza la barrera hematoencefalica. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2: Captacion tisular de AGLU y contenido de glucogeno tras el tratamiento a corto plazo en el modelo en ratones KO

Grupo

Higado Bazo Corazon Musculo pectoral Musculo femoral Lengua Cerebro

Act

Glc Act Glc Act Glc Act Glc Act Glc Act Glc Act Glc

Experimento A animales tratados con una unica dosis de 1.7 mg de AGLU (de 2 fuentes)

fuente 1 de ratones KO tratados

674 410 263 17 CM CO 00 O O

fuente 2 de ratones KO tratados

454 604 CD OO h- 12 10 oo o o

ratones KO no tratados

3.1 - - - 0.2 - - - 0.2 - - - 0.2 -

ratones normales no tratados

58 37 23 17 11 8.2 cn cn

Experimento B animales tratados con 4 dosis de AGLU (1.0, 2.0,1.0 y 1.4 mg) con una diferencia de 6 dias

ratones KO

1132 70 - - 24 1259 125 87 - - 89 - 0.4 163

tratados (13 semanas de edad)

944 13 10 1082 46 116 35 0.2 163

ratones KO tratados (34 semanas de edad)

3375 23 - - 60 1971 49 90 - - 207 - 0.7 374

ratones KO

2.0 406 - - 0.2 3233 1.0 86 - - 1.0 - 0.2 487

no tratados (13 y 34 semanas de edad)

2.0 147 0.3 1748 1.0 87 1.0 0.2 168

ratones normales no tratados (34 semanas de edad)

35 6 - - 8.2 0 6.0 1.0 - - 14 - 18 0

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Tabla 2: Captacion tisular de AGLU y contenido de glucogeno tras el tratamiento a corto plazo en el modelo en ratones KO (continuacion)

Grupo

Higado Bazo Corazon Musculo pectoral Musculo femoral Lengua Cerebro

Act Glc Act Glc Act Glc Act Glc Act Glc Act Glc Act Glc

Experimento C animales tratados con una unica dosis de 0.7 mg

ratones KO

582 - 462 - 46 - - - 5.1 - - - 0.4 -

tratados

558 313 50 3.6 0.4

ratones KO

1.1 - 0.8 - 0.3 - - - 0.2 - - - 0.2 -

no tratados

1.6 0.7 0.3 0.3 0.2

Las cifras en la tabla se refieren a animales individuals

Act: actividad de AGLU (nmoles de 4MU por mg de protema por hora)

Glc: contenido de glucogeno (|jg/mg de protema) n.d. no detectado - datos no disponibles

Cuando se inyectaron dos ratones KO 4 veces cada 6 dfas (experimento B) se observo un marcado descenso del glucogeno celular total tanto en el corazon como en el tugado. No se observaron efectos en los tejidos musculoesqueleticos en lo que se refiere al glucogeno total. Sin embargo, en general la captacion de AGLU en estos tejidos fue inferior respecto a otros tejidos estudiados.

La microscopfa electronica de transmision de los ratones KO inyectados 4 veces indico un marcado descenso en el glucogeno lisosomal tanto en las celulas hepaticas como en las celulas del musculo cardiaco. Los efectos observados en el tejido cardiaco estan localizados ya que en algunas areas del corazon no se observo descenso en el glucogeno lisosomal despues de estas administraciones a corto plazo.

Los analisis por inmunoelectrotransferencia utilizando anticuerpos policlonales de conejo contra alfa-glucosidasa madura de placenta humana indicaron un procesamiento completo de la AGLU inyectada hacia la enzima madura en todos los organos estudiados lo que sugiere firmemente captacion en los tejidos diana, y localizacion y procesamiento lisosomales. No se observaron efectos toxicos en ninguno de los tres experimentos.

La tincion inmunohistoqmmica de AGLU fue evidente en los lisosomas de hepatocitos utilizando un anticuerpo de conejo policlonal contra la alfa-glucosidasa humana. La presencia de AGLU en los tejidos cardiaco y esqueletico es mas diffcil de visualizar con esta tecnica, aparentemente debido a la menor captacion.

2. Experimentos a largo plazo con el modelo en ratones KO

En los experimentos a plazo mas largo, se inyecto la enzima en la vena de la cola de grupos de dos o tres ratones KO, una vez a la semana durante periodos de hasta 25 semanas. La dosis inicial fue de 2 mg (68 mg/kg), seguida por 0.5 mg (17 mg/kg)/raton durante 12 semanas. En dos grupos de ratones, a esto siguieron 4 u 11 semanas adicionales de tratamiento de 2 mg/raton. Las inyecciones comenzaron cuando los ratones teman 6-7 meses de edad. A esta edad, se habfa desarrollado una histopatologfa clara en el modelo KO. Dos dfas despues de la ultima administracion enzimatica se sacrificaron los animales y los organos se perfundieron con solucion salina tamponada con fosfato (PBS). Se prepararon homogeneizados tisulares para los ensayos de la actividad enzimatica de AGLU y del contenido de glucogeno tisular, y se obtuvieron cortes de diversos organos para visualizar (mediante microscopfa optica) la acumulacion del contenido de glucogeno lisosomal.

Los resultados mostraron que los ratones tratados 13 semanas con 0.5 mg/raton (Grupo A, 3 animales/Grupo) presentaron una mayor actividad en el tugado y el bazo y menores niveles de glucogeno en el tugado y tal vez en el corazon. Un animal mostro una mayor actividad en los musculos, aunque no hubo un descenso significativo de glucogeno en el musculo.

Los ratones que fueron tratados 14 semanas con 0.5 mg/raton y despues 4 semanas con 2 mg/raton (Grupo B, 3 animales/Grupo) mostraron resultados similares a los tratados unicamente durante 13 semanas, excepto en que se

midio una mayor actividad en el corazon y los musculos esqueleticos y tambien se observaron descensos de los niveles de glucogeno en el bazo.

Los ratones que se trataron 14 semanas con 0.5 mg/raton y despues 11 semanas con 2 mg/raton (Grupo C, 2 animales/Grupo) mostraron resultados similares a los otros dos grupos excepto en que los ratones tratados 5 mostraron descensos claros en los niveles de glucogeno en el hugado, bazo, corazon y musculo esqueletico. No se pudo detectar actividad, incluso con la dosis mas elevada, en el cerebro.

Los resultados de los animales tratados y no tratados en cada Grupo (medias del Grupo) se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3: Captacion tisular de AGLU y contenido de glucogeno tras el tratamiento a largo plazo en el modelo en ratones KO

Grupo

Higado Bazo Corazon Musculo pectoral Musculo cuadriceps Musculo gastrocnemi o Cerebro

Act

Gl c Act Glc Act Glc Act Glc Act Glc Act Gl c Act Glc

Grupo A animales tratados con 0.5 mg/raton/semana durante 13 semanas

tratado s

713 2 CD co n.d 3 86 9 81 6 40 14 66 - -

no tratado s

2 24 1 n.d 1 11 1 1 66 1 50 1 61

Grupo B animales tratados con 0.5 mg/raton/semana durante 14 semanas y despues con 2 mg/raton/semana durante 4 semanas

tratados

2705 1 1628 0 59 288 49 120 30 128 4 4 132 - -

no tratados

3 11 31 6 1 472 1 113 1 162 1 142 - -

Grupo C animales tratados con 0.5 mg/raton/semana durante 14 semanas y despues con 2 mg/raton/semana durante 11 semanas

tratados

1762 1 1073 2 66 21 1 99 11 3 37 18 109 32 1 32

no tratados

2 45 1 21 1 72 9 1 29 1 0 104 0 CM cm 0 44

10 Las cifras en la tabla se refieren a la media de 3 animales (Grupos A y B) o la media de 2 animales (Grupo C)

Act: actividad de AGLU (nmoles de 4MU por mg de protema por hora)

Glc: contenido de glucogeno (pg/mg de protema) n.d. no detectado - datos no disponibles

15 Ademas, se observo una mejora muy convincente en el estado histopatologico observado en los ratones del Grupo C (tratados durante las primeras 14 semanas con 0.5 mg/raton y despues durante 11 semanas con 2 mg/raton). Se demostro un retroceso claro de la patologfa en diversos tejidos, tales como el corazon y musculo pectoral.

5

10

15

20

25

30

35

Se ha publicado que la enfermedad de Pompe no se produce cuando la actividad de la a-glucosidasa lisosomal residual es >20% del valor de control promedio (14). Los datos obtenidos con el modelo en ratones KO indican que estos niveles se pueden conseguir perfectamente utilizando la enzima precursora recombinante.

Ejemplo 5: Ensayo clinico en seres humanos

Se ha llevado a cabo un unico estudio de fase I (AGLU1101-01) en 15 voluntarios masculinos sanos. Se administraron dosis de AGLU comprendidas en el intervalo de 25 a 800 mg mediante infusion intravenosa a los voluntarios adultos masculinos sanos. Los sujetos con un historial de alergias e hipersensibilidades fueron excluidos del estudio. Los sujetos se distribuyeron aleatoriamente en grupos de dosis de 5 y cada Grupo de dosis recibio AGLU (4 sujetos) o placebo (1 sujeto) en cada nivel de la dosis. Todos los sujetos recibieron dos dosis del farmaco del estudio, las cuales se administraron con una diferencia de dos semanas. La pauta posologica fue la siguiente:

A

25 mg: Grupo 1, periodo de tratamiento 1 B

50 mg: Grupo 1, periodo de tratamiento 2 C

100 mg: Grupo 2, periodo de tratamiento 1 D

200 mg: Grupo 3, periodo de tratamiento 1 E

400 mg: Grupo 2, periodo de tratamiento 2 F

800 mg: Grupo 3, periodo de tratamiento 2 P

placebo (1 sujeto por Grupo y periodo de tratamiento)

A los sujetos se les administro AGLU o placebo como una infusion en el dfa 1 de cada periodo de tratamiento. Se administraron las infusiones a lo largo de un periodo de 30 minutos y los sujetos se mantuvieron en una posicion semirrecostada durante al menos 2 horas despues del cese de la infusion.

Se registraron los eventos adversos justo antes del comienzo de la infusion, a los 30 minutos (final de la infusion) y 3, 12, 24, 36 y 48 horas despues, asf como tambien en los dfas 5 y 8 (primer periodo) y los dfas 5, 8 y 15 (segundo periodo). Tambien se controlaron las senales vitales, ECG y examenes ffsicos de manera regular a lo largo del periodo de tratamiento.

Se tomaron muestras de sangre para una gama estandar de pruebas clmicas de laboratorio y analisis farmacocineticos, Se recogio la orina de los sujetos y se realizaron una gama estandar de analisis de laboratorio (incluida la determinacion de AGLU).

(a) Seguridad en laboratorio y eventos adversos

No hubo cambios significativos desde un punto vista clinico en los parametros de laboratorio, senales clmicas y medidas de ECG en ninguno de los sujetos en ningun Grupo de dosis. Los resultados del control de eventos adversos en todos los sujetos con todas las dosis se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4: Informes de eventos adversos

Dosis (mg)

Eventos adversos

25

Los eventos de los que se informo fueron debilidad muscular, vision anomala y fatiga. Todos los eventos fueron leves y el investigador considero que no estaban relacionados con el artfculo de prueba.

Dosis (mg)

Eventos adversos

50

Los eventos de los que se informo fueron cefaleas, rinitis, epitaxis y parestesia. Todos los eventos fueron leves y el investigador considero que no estaban relacionados con el artfculo de prueba o estaban remotamente relacionados, excepto la parestesia que se clasifico como leve y se considero que posiblemente estaba relacionada con el artfculo de prueba.

100

Los eventos de los que se informo fueron rinitis, cefaleas, fatiga, hematoma y reaccion en el sitio de la inyeccion. Todos los eventos se clasificaron como leves. El investigador considero que los casos de hematoma, reaccion en el sitio de inyeccion y cefaleas intermitentes posible o probablemente estaban relacionados con el artfculo de prueba. Se considero que los otros eventos no estaban relacionados.

200

Los eventos de los que se informo fueron nauseas, cefaleas, mareos, fatiga, rinitis, fotofobia, anomalfas de la vision y euforia. Todos los eventos se clasificaron como de intensidad leve o moderada. Se considero que siete eventos (incluidos los casos de mareos, nauseas y anomalfas en la vision) posible o probablemente estaban relacionados con el artfculo de prueba.

400

Los eventos de los que se informo fueron fatiga y parestesia. Se considero que el informe de fatiga no estaba relacionado con el artfculo de prueba y se juzgo que la parestesia probablemente estaba relacionada.

800

Los eventos de los que se informo fueron nauseas, somnolencia, mareos, aumento de la sudoracion, astenia, escalofnos y cefaleas intermitentes. Todos los eventos se clasificaron como de intensidad leve o moderada. Se considero que ocho eventos (incluidos los casos de somnolencia, nauseas y astenia) posiblemente estaban relacionados con el artfculo de prueba.

5

10

15

Se lleva a cabo un ensayo sobre la seguridad y eficacia de la a-glucosidasa acida recombinante como terapia de reemplazo enzimatico en pacientes infantiles y juveniles con enfermedad de glucogenosis de tipo II. Participan cuatro pacientes infantiles y tres pacientes juveniles. A los infantiles se les administra una dosis inicial de 15-20 mg/kg que se ajusta hasta 40 mg/kg y a los juveniles se les administran 10 mg/kg. Se trata a los pacientes durante 24 semanas.

Se evaluan los siguientes parametros en los pacientes.

• Informe de eventos adversos estandar que incluye la sospecha de eventos adversos

• Parametros de laboratorio incluidas la hematologfa, qmmica clinica y deteccion de anticuerpos

• Actividad de a-glucosidasa en el musculo

• Histopatologfa del musculo

• ECG de 12 derivaciones

• Estado clmico que incluye un examen neurologico

• Parametros PK no parametricos

• Intervenciones para salvar la vida

En los pacientes infantiles se evaluan los siguientes parametros adicionales.

• Grosor de la pared ventricular posterior izquierda e mdice de masa ventricular izquierda

• Desarrollo neuromotor

• Supervivencia

• Contenido de glucogeno en el musculo

En los pacientes juveniles se evaluan los siguientes parametros adicionales.

• Funcion pulmonar

• Pruebas cronometradas/de fuerza muscular y funcion muscular

20

5

10

15

20

25

30

35

• Escala de 9 puntos de PEDI/Rotterdam

Los mismos pacientes se someten despues a dosificaciones adicionales de alfa-glucosidasa recibiendo los infantiles 15, 20, 30 o 40 mg/kg y los juveniles: 10 mg/kg durante un periodo adicional de 24 semanas y se evaluan en funcion de los parametros indicados anteriormente.

Se lleva a cabo un ensayo clmico de fase II adicional en ocho pacientes con una edad < 6 meses de edad en los 2 meses posteriores al diagnostico con una dosificacion de 40 mg/kg. Los pacientes se tratan durante 24 semanas y se evaluan en funcion de los siguientes criterios:

Parametros de seguridad

Datos de seguridad en laboratorio

Registro de eventos adversos

Parametro de eficacia primaria: supervivencia sin intervenciones para salvar la vida (es decir, ventilacion mecanica > 24 horas) 6 meses despues del diagnostico en combinacion con una funcion motora normal o ligeramente retrasada (BSID II).

Eficacia secundaria: Cambios en el desarrollo neuromotor; cambios en el grosor de la pared ventricular posterior izquierda e mdice de la masa ventricular izquierda; cambios en el contenido de glucogeno y actividad de a- glucosidasa acida en el musculo esqueletico.

La eficacia se puede mostrar mediante una supervivencia de un 50% 6 meses despues del diagnostico sin intervenciones para salvar la vida en el grupo de la a-glucosidasa en comparacion con la supervivencia de un 10% en el grupo de control historico en combinacion con una BSID II clasificada como normal o ligeramente retrasada.

Se realiza un ensayo clmico adicional en los pacientes juveniles. Los pacientes tienen una edad >1 ano y <35 anos de edad con aparicion juvenil de GSD de tipo IIb. A los pacientes se les administran 10 mg/kg o 20 mg/kg durante un periodo de tratamiento de veinticuatro semanas. El tratamiento se monitoriza mediante los siguientes parametros.

Parametros de seguridad Datos de seguridad en laboratorio

Registro de eventos adversos

Eficacia primaria Parametros de la funcion pulmonar (por ejemplo, FVC, tiempo en el ventilador)

Fuerza muscular

Eficacia secundaria Parametros de las intervenciones para salvar la vida:

Calidad de vida

Actividad de a-glucosidasa acida en el musculo esqueletico

Objetivo cuantitativo Mejora relativa de un 20% en los parametros de eficacia primaria respecto a la

lmea base

Preferentemente, todas las medidas cuantitativas referidas a la eficacia son estadfsticamente significativas respecto a controles historicos o contemporaneos, preferentemente con p <0.05.

Ejemplo 6 Formulaciones farmaceuticas

La alfa-glucosidasa se formula de la siguiente manera: 5 mg/mL de a-Glu, fosfato de sodio 15 mM, pH 6.5, 2% (p/p) de manitol y un 0.5% (p/p) de sacarosa. Un vial tubular de 20 cc se rellena con la formulacion anterior hasta un volumen final de 10.5 mL y se liofiliza. Para las pruebas, liberacion y uso clmico, cada vial se reconstituye con 10.3 mL* de solucion salina esteril (0.9%) para inyeccion (USP o equivalente) para generar 10.5 mL de una solucion de a- Glu con la concentracion de 5 mg/mL que se puede administrar directamente o diluir posteriormente con solucion salina esteril hasta una concentracion de la dosis diana espedfica del paciente. El relleno de 10.5 mL (52.5 mg de alfa-glucosidasa total en el vial) incluye el excedente recomendado por USP, que permite la extraccion y suministro (o transferencia) de 10 mL (50 mg). El manitol actua como un agente espesante adecuado que acorta el ciclo de liofilizacion (respecto a la sacarosa sola). La sacarosa actua como un crio/lioprotector que da como resultado un aumento no significativo de la agregacion tras la reconstitucion. La reconstitucion de las formulaciones de (solo) manitol ha dado como resultado repetidas veces un ligero aumento de la agregacion. Tras la liofilizacion, la calidad

10

15

20

de la masa fue aceptable y se redujeron de manera significativa los tiempos de reconstitucion posteriores. Se prefiere la solucion salina a la HSA/dextrosa para la solucion para infusion. Cuando se utiliza solucion salina combinada con liofilizacion en un 2% de manitol/0.5% de sacarosa la solucion tiene una tonicidad aceptable para la administracion intravenosa. Los viales liofilizados que contienen la formulacion con un 2% de manitol/0.5% de sacarosa se reconstituyeron con solucion salina esteril al 0.9% (para inyeccion) para generar 5 mg/mL de a-Glu.

Ejemplo 7: Programacion de la infusion

La solucion se administra mediante la canula intravenosa permanente. Los pacientes se controlan atentamente durante el periodo de infusion y se toman las intervenciones clmicas apropiadas en el caso de un evento adverso o sospecha de evento adverso. Se permite un intervalo de 48 horas para cada infusion. Una programacion de la infusion en la cual la tasa de infusion aumenta con el tiempo reduce o elimina los eventos adversos.

Las infusiones para los pacientes infantiles se pueden administrar de acuerdo con la siguiente programacion:

• 5 cc/h durante 60 minutos

• 10 cc/h durante 60 minutos

• >40 cc/h durante 30 minutos

• > 80 cc/h durante el resto de la infusion

Las infusiones para los pacientes juveniles se pueden administrar de acuerdo con la siguiente programacion:

• 0.5 cc/kg/h durante 60 minutos

• 1 cc/kg/h durante 60 minutos

• 5 cc/kg/h durante 30 minutos

• 7.5 cc/kg h durante el resto de la infusion

Las realizaciones preferidas de la presente invencion se discuten a continuacion y se denominan realizacion E1 hasta realizacion E34.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Alfa-glucosidasa acida humana en la forma de 100 a 110 kD, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe, donde la alfa-glucosidasa acida humana se administra por v^a intravenosa y donde el tratamiento se continua durante al menos 24 semanas.

   5 2. La alfa-glucosidasa acida humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la alfa-glucosidasa acida

   humana se va a administrar como un medicamento que esta adaptado para proporcionar al menos 10 mg/kg de alfa- glucosidasa acida humana a la semana.
2. 3. La alfa-glucosidasa acida humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la alfa-glucosidasa acida humana se va a administrar como un medicamento que esta adaptado para proporcionar al menos 20 mg/kg de alfa-

   10 glucosidasa acida humana a la semana.
3. 4. La alfa-glucosidasa acida humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la enfermedad de Pompe es enfermedad de Pompe infantil.
4. 5. La alfa-glucosidasa acida humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la enfermedad de Pompe es enfermedad de Pompe juvenil.

   15 6. La alfa-glucosidasa acida humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la enfermedad de

   Pompe es enfermedad de Pompe del adulto.
5. 7. La alfa-glucosidasa acida humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde las dosis de la alfa- glucosidasa acida humana se van a administrar tres veces a la semana.
6. 8. La alfa-glucosidasa acida humana para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde las dosis de la alfa- 20 glucosidasa acida humana se van a administrar una vez a la semana.