JP2002531581A

JP2002531581A - ポンペ病の処置

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Publication number: JP2002531581A
Application number: JP2000586885A
Authority: JP
Inventors: ブレー，ヨハネスブレナルドゥスマティアスマリーファン; エドナアンリエットジェルメーヌフェネケル，; デイビッドピー．ミーカー，
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2002-09-24
Anticipated expiration: 2019-12-06
Also published as: PT1137762E; US20030007963A1; DK1137762T3; JP2017066160A; NL300382I1; WO2000034451A1; US20160243203A1; PT2020438T; JP2019172685A; EP1137762A1; EP2020438B1; AU3113700A; EP1137762A4; US7351410B2; CA2353522A1; JP2015134836A; DE69939705D1; JP4990434B2; US20140037611A1; EP2020438A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト酸性αグルコシダーゼを用いたポンペ病の処置の方法を提供する。好ましい処置養生法は、患者に１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ体重より多く投与する工程を含む。投与は、好ましくは静脈内投与である。この方法は、乳児性、若年性または成人性ポンペ病を有する患者の処置のために用いられ得る。ヒト酸性αグルコシダーゼは、好ましくは、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁において得られ、そして好ましくは、主に１１０ｋＤの形態である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の引用）本出願は、１９９８年１２月７日に出願された、ＵＳＳＮ６０／１１１２９１
からの優先権に由来し、これは、すべての目的のために、その全体において参考
として援用されている。本出願は、１９９６年７月２９日に出願された、ＵＳＳ
Ｎ０８／７００，７６０に関連し、これは、１９９５年８月２日に出願された、
ＵＳＳＮ６０／００１，７９６からの優先権に由来し、これらの両方は、すべて
の目的のために、それらの全体において参考として援用されている。

【０００２】（技術分野）本発明は、組換え遺伝学分野および医学分野に属し、そしてポンペ病を有する
患者の酵素置換治療に関する。

【０００３】（発明の背景）他の分泌タンパク質と同様に、リソソームタンパク質は、小胞体において合成
され、そしてゴルジ装置へ輸送される。しかし、たいていの他の分泌タンパク質
と異なり、リソソームタンパク質は、細胞外液へではなく、細胞内小器官へ分泌
することになっている。ゴルジ装置の内部において、リソソームタンパク質は特
別なプロセシングを受けて、それらの細胞内の行き先に到達するために必要なも
のを備える。ほとんどすべてのリソソームタンパク質が、末端のマンノース基の
６’位を介したグリコシル化およびリン酸化を含む、種々の翻訳後修飾を受ける
。リン酸化されたマンノース残基が、トランスゴルジ網の内部の表面上で、特異
的なレセプターによって認識される。リソソームタンパク質は、これらのレセプ
ターを介して結合し、そしてそれによって、他の分泌タンパク質から分離される
。その後、レセプターに結合したタンパク質を含む小さな輸送小胞が、トランス
ゴルジ網からつみ取られ、そしてそれらの細胞内の行き先へと標的化される。一
般に、Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１８、３６７
−３７４（１９９０）を参照のこと。

【０００４】３０を超えるリソソーム疾患が通常、遺伝子変異の結果として存在し、その各
々は、特定のリソソームタンパク質の欠損に起因する。例えば、Ｃｏｔｒａｎら
、ＲｏｂｂｉｎｓＰａｔｈｏｌｏｇｉｃＢａｓｉｓｏｆＤｉｓｅａｓｅ
（第４版１９８９）を参照のこと（すべての目的のために、その全体において
参考として援用される）。リソソームタンパク質における欠損は、通常、代謝産
物の有害な蓄積を生じる。例えば、フルラー症候群、ハンター症候群、モルキオ
症候群およびサンフィリポ症候群において、ムコ多糖の蓄積が存在し；テイ−サ
ックス症候群、ゴシェ症候群、クラッベ症候群、ニーマン−ピック症候群および
ファブリー症候群において、スフィンゴ脂質の蓄積が存在し；ならびに、フコー
ス蓄積症およびマンノシドーシスにおいて、それぞれ、フコース含有スフィンゴ
脂質および糖タンパク質フラグメントの蓄積、ならびにマンノース含有オリゴ糖
類の蓄積が存在する。

【０００５】ＩＩ型糖原病（ｇｌｙｃｏｇｅｎｓｔｏｒａｇｅｄｉｓｅａｓｅｔｙｐ
ｅＩＩ）（ＧＳＤＩＩ；ポンペ病；酸性マルターゼ欠損症）は、リソソーム
酵素の酸性α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）の欠損によって引き起こされ
る。２つの臨床的形態が識別される：早期発症（乳児性）および後期発症（若年
性および成人性）。乳児性ＧＳＤＩＩは、誕生直後にその発症を有し、そして
進行性の筋肉虚弱および心不全を示す。この臨床的改変（ｖａｒｉａｎｔｉｓ）
は、通常、生涯の最初の２年以内に致命的である。成人性患者および若年性患者
の後期発症における症状は、生涯においてより遅く生じ、そして骨格筋のみが関
与する。この患者は、最終的に、呼吸不全が原因で死亡する。患者は、例外的に
、６０年間を超えて生存し得る。疾患の重症度と、残留酸性α−グルコシダーゼ
活性との間には、十分な相関が存在し、この活性は、後期発症において、正常の
１０〜２０％であり、そしてこの疾患の初期発症形態において、２％未満である
（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ、ＴｈｅＭｅｔａｂｏｌｉｃａｎｄＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢａｓｅｓｏｆＩｎｈｅｒｉｔｅｄＤｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖ
ｅｒら（編）、第７版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９９５）、２４４３−２４
６４頁を参照のこと）。

【０００６】リソソーム貯蔵疾患の主要な原因としての、リソソーム酵素欠損の発見以来（
例えば、Ｈｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８６、１１−１６（１９６３）を参照
のこと）、リソソーム貯蔵疾患を有する患者を、失われている酵素の（静脈内）
投与（すなわち、酵素治療）によって、処置する試みがなされた。ポンペ病のた
めの酵素置換治療を用いるこれらの実験は、成功していない。免疫学的反応を与
えるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ由来の非ヒトα−グルコシダーゼ、ま
たは細胞によって効率的に取り込まれない酵素形態（ヒト胎盤由来の低取り込み
形態の成熟酵素；以下を参照のこと）のいずれかが用いられた。さらに、処置の
持続期間および／または投与された酵素の量の両方が、不十分であった（３〜５
）。天然の供給源（例えば、ヒトの尿およびウシの精巣）由来のリソソーム酵素
の産生は、理論上は可能であるが、低い収率を与え、そして精製された酵素は、
必ずしもレシピエント患者の組織によって取り込まれ得る形態というわけではな
い。

【０００７】上記の不確実性および困難にもかかわらず、本発明は、ヒト酸性αグルコシダ
ーゼを用いて、ポンペ病の患者を処置する方法を提供する。

【０００８】（請求の範囲に記載される発明の要旨）１つの局面において、本発明は、ポンペ病を有する患者を処置する方法を提供
する。このような方法は、治療的に有効な量のヒト酸性αグルコシダーゼを、患
者に投与する工程を必然的に伴う。投薬量は、好ましくは、１週間当たり少なく
とも１０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの方法において、投薬量は、１週間当
たり少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または１週間当たり少なくとも１
２０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの方法において、このような投薬量は、１
週間当たり１回投与され、そして他の方法においては、１週間当たり３回投与さ
れる。いくつかの方法において、処置は少なくとも２４週間続けられる。投与は
、好ましくは静脈内投与である。ヒト酸性αグルコシダーゼは、好ましくは、非
ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁において得られ、そして好ましくは、主
に１１０ｋＤの形態である。

【０００９】この方法は、乳児性、若年性または成人性ポンペ病を有する患者の処置のため
に用いられ得る。乳児性ポンペ病を処置するいくつかの方法において、有効性が
、少なくとも１歳まで生存する患者によって示される。

【００１０】いくつかの方法において、ヒト酸性αグルコシダーゼのレベルが、レシピエン
ト（ｒｅｃｕｏｕｅｂｔ）患者においてモニターされる。必要に応じて、ヒト酸
性αグルコシダーゼの第二の投薬量が、α−グルコシダーゼのレベルが、患者に
おいて閾値未満に減少する場合に、投与され得る。

【００１１】いくつかの方法において、ヒトαグルコシダーゼが、静脈内に投与され、そし
て投与の速度は、投与の時間の間に増加する。いくつかの方法において、投与の
速度は、投与の時間の間に、少なくとも１０倍増加する。いくつかの方法におい
て、投与の速度は、５時間の間以内に、少なくとも１０倍増加する。いくつかの
方法において、患者は、一連の少なくとも４つの投薬量を投与され、各々の投薬
量は、以前の投薬量よりも強度が高い。いくつかの方法において、投薬量は、第
一の投薬量が０．０３〜３ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が０．３〜１２ｍｇ
／ｋｇ／時間、第三の投薬量が１〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量
が２〜６０ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、投薬量は、第一
の投薬量が０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が１〜４ｍｇ／ｋｇ／時
間、第三の投薬量が３〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が６〜２０
ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、投薬量は、第一の投薬量が
０．２５〜４ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が０．９〜１．４ｍｇ／ｋｇ／時
間、第三の投薬量が３．６〜５．７ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が７
．２〜１１．３ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、投薬量は、
第一の投薬量が０．３ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が１ｍｇ／ｋｇ／時間、
第三の投薬量が４ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が１２ｍｇ／ｋｇ／時
間である。いくつかの方法において、第一、第二、第三および第四の投薬量が、
各々１５分〜８時間の間投与される。

【００１２】いくつかの方法において、第一、第二、第三および第四の投薬量が、それぞれ
、１時間、１時間、０．５時間および３時間の間投与される。

【００１３】別の局面において、本発明は、滅菌形態においてヒト酸性αグルコシダーゼ、
ヒト血清アルブミン、および糖を生理学的に受容可能な緩衝液中に含む薬学的組
成物を提供する。いくつかのこのような組成物は、ヒト酸性αグルコシダーゼ、
ヒト血清アルブミン、およびグルコースをリン酸ナトリウム緩衝液中に含む。い
くつかの組成物は、αグルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロースを水溶液
中に含む。いくつかの組成物において、糖は、マンニトールおよびスクロースを
含み、そしてマンニトールの濃度は、水溶液の１〜３％ｗ／ｗであり、そしてス
クロースの濃度は、水溶液の０．１〜１％ｗ／ｗである。いくつかの組成物にお
いて、マンニトールの濃度は、２％ｗ／ｗであり、そしてスクロースの濃度は、
０．５％ｗ／ｗである。

【００１４】本発明は、さらに、薬学的組成物（ヒト酸性グルコシダーゼ、マンニトールお
よびスクロースを水溶液中に含む）を凍結乾燥することによって産生される、凍
結乾燥された組成物を提供する。このような組成物は、第一の組成物（ヒト酸性
α−グルコシダーゼ、マンニトール、スクロースおよび水性溶液を含む）を凍結
乾燥して、第二の組成物を産生し；そして、生理食塩水中で凍結乾燥された組成
物を再構成して、第三の組成物を産生することによって調製され得る。いくつか
のこのような組成物において、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、第一の組成物お
よび第三の組成物の両方において、５ｍｇ／ｍｌであり、マンニトールは、第一
の組成物において、２ｍｇ／ｍｌであり、スクロースは、第一の組成物において
、０．５ｍｇ／ｍｌであり、そして再構成の工程において用いられる生理食塩水
は、０．９％ｗ／ｗである。

【００１５】（定義）用語「実質的な同一性」または「実質的な相同性」とは、デフォルトのギャッ
プウエイトを用いて、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって、
最適に整列される場合に、２つのペプチド配列が、少なくとも６５パーセントの
配列同一性、好ましくは少なくとも８０または９０パーセントの配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより高い配列同
一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ま
しくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

【００１６】用語「実質的に純粋な」または「単離された」とは、目的の種が同定され、そ
してその天然の環境の成分から分離および／または回収されたことを意味する。
通常、目的の種は、存在する主な種であり（すなわち、モル規準で、組成物中の
任意の他の個々の種よりも豊富である）、そして好ましくは、実質的に精製され
た画分が、組成物であり、ここでこの目的の種が、存在するすべての高分子種の
少なくとも約５０パーセント（モル規準で）を構成する。一般的に、実質的に純
粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種を約８０〜９０重量パーセ
ントを超えて含む。最も好ましくは、目的の種は、本質的に均質（混入物種が、
従来の検出方法によって、組成物中で検出され得ない）になるまで精製され、こ
こで、この組成物は、単一の高分子種の誘導体から、本質的になる。

【００１７】ＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントとの機能的な関係に置かれた場合
に、作動可能に連結されている。例えば、シグナル配列についてのＤＮＡは、ポ
リペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプ
チドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエン
ハンサーは、コード配列の転写を刺激する場合に、その配列に作動可能に連結さ
れている。一般的に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、そして
、シグナル配列の場合においては、隣接しており、かつ読み取り相にある。しか
し、エンハンサーは、転写を制御するコード配列と隣接する必要はない。連結は
、簡便な制限部位での連結、あるいはその代わりに挿入されたアダプターまたは
リンカーでの連結によって達成される。

【００１８】外因性のＤＮＡセグメントは、細胞に対して外来であるか、または細胞のＤＮ
Ａセグメントに対して相同であるが、宿主細胞ゲノム中で異常な位置にある、セ
グメントである。外因性のＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを回収する
ために発現される。

【００１９】トランスジェニック哺乳動物において、すべての、または実質的にすべての生
殖系列細胞および体細胞は、初期胚期で、哺乳動物または哺乳動物の祖先に導入
された導入遺伝子を含む。

【００２０】（詳細な説明）本発明は、リソソームタンパク質を、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳
汁へ分泌する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。分泌は、リソソ
ームタンパク質をコードする導入遺伝子、および乳腺に対してこの遺伝子の発現
を標的化し得る調節配列の組み込みによって達成される。この導入遺伝子が発現
され、そして、発現産物が乳腺中で翻訳後修飾され、次いで乳汁へ分泌される。
翻訳後修飾は、グリコシル化およびリン酸化をして、マンノース−６リン酸を含
むリソソームタンパク質を産生する工程を含み得る。

【００２１】（Ａ．リソソーム遺伝子）本発明は、リソソーム酵素および以下を含む他の型のリソソームタンパク質を
コードする３０を超える公知の遺伝子のいずれかを含むＤＮＡセグメントを発現
する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する：α−グルコシダーゼ、α
−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ）−硫酸スルファタ
ーゼ、ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）Ａおよびヘキソサ
ミニダーゼＢ、ガングリオシドアクチベータータンパク質、アリールスルファタ
ーゼＡおよびアリールスルファターゼＢ、イズロネートスルファターゼ、ヘパラ
ンＮ−スルファターゼ、ガラクト−セラミダーゼ、α−ガラクトシルセラミダー
ゼＡ、スフィンゴミエリナーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、アス
パルチルグリコサミンアミド加水分解酵素、酸性リパーゼ、Ｎ−アセチル−α−
Ｄ−グルコサミン−６−スルフェートスルファターゼ、α−ガラクトシダーゼお
よびβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、セラ
ミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ
、および保護性タンパク質などを含む。公知のリソソームタンパク質の遺伝子配
列のいずれかの対立遺伝子改変体、同族改変体および誘導された改変体を発現す
るトランスジェニック哺乳動物もまた、含まれる。このような改変体は、通常、
アミノ酸レベルで、公知のリソソームタンパク質の遺伝子と、実質的な配列同一
性を示す。このような改変体は、通常、ストリンジェントな条件下で、公知の遺
伝子とハイブリダイズするか、または公知の遺伝子の１つによってコードされた
ポリペプチドに対する抗体と交差反応する。

【００２２】リソソームタンパク質をコードする公知の遺伝子のうちの多くのゲノムＤＮＡ
配列またはｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡクローンが、入手可能である（Ｓｃｏｔｔ
ら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４７、８０２−８０７（１９９０）；Ｗｉ
ｌｓｏｎら、ＰＮＡＳ８７、８５３１−８５３５（１９９０）；Ｓｔｅｉｎら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、１２５２−１２５９（１９８９）；Ｇｉｎ
ｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２３、５７４
−５８０（１９８４）；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯＪ．７、１６９７−
１７０４（１９８８）；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７２、
４７３−４７９（１９９０）；ＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚおよびＰｒｏｉａ、ＰＮＡ
Ｓ８１、５３９４−５３９８（１９８４）；Ｓｃｒｉｖｅｒら、前出、第１２
部、２４２７−２８８２頁ならびにそこで引用された参考文献）。ゲノムＤＮＡ
配列およびｃＤＮＡ配列の他の例は、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。さら
なるクローン化されたリソソーム遺伝子の配列が必要とされる範囲まで、公知の
リソソームタンパク質のＤＮＡ配列または、公知のリソソームタンパク質に対す
る抗体をプローブとして使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡラ
イブラリー（好ましくは、ヒト）から得られ得る。

【００２３】（Ｂ．リソソームタンパク質のコンホメーション）組換えリソソームタンパク質は、好ましくは、天然に存在するリソソームタン
パク質と同じかまたは類似の構造を有するようにプロセシングされる。リソソー
ムタンパク質とは、小胞体（ＲＥＲ）に結合した、リボソーム上で合成される糖
タンパク質である。リソソームタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドにより導
かれて、この細胞小器官に翻訳と同時に入る（Ｎｇら、ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉ
ｎｉｏｎｉｎＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ６，５１０−５１６（１９９４）
）。Ｎ結合型グリコシル化プロセスは、ＲＥＲにおいてドリコールキャリアから
の高マンノース型オリゴ糖の前駆体であるＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の一
塊としての移動と共に開始する。糖鎖の修飾は、ＲＥＲにおいて開始し、そして
グリコシダーゼＩおよびグリコシダーゼＩＩによる、一番外側から３つのグルコ
ース残基の除去を伴ってゴルジ装置において継続する。リン酸化とは、最初に、
Ｎ−アセチル−グルコ−サミン−１−リン酸がリソソームタンパク質特異的トラ
ンスフェラーゼにより、選択されたマンノース基へと結合する工程、そして２番
目に、Ｎ−アセチル−グルコ−サミンがジエステラーゼにより切断される工程（
Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ：ＴｈｅｉｒＲｏｌｅｉｎＰｒ
ｏｔｅｉｎＢｒｅａｋｄｏｗｎ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，
Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）１６３−１９１頁）の２工程の手順である。切断は、
認識マーカーとして、そして大部分のリソソームタンパク質の、リソソームへの
マンノース６−リン酸レセプター触媒輸送におけるリガンドとして、マンノース
６−リン酸を露出させる。（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒ
ａｎｓ．１８，３６７−３７４（１９９２））。

【００２４】糖鎖の修飾に加えて、大部分のリソソームタンパク質は、タンパク質分解プロ
セシングを受ける。このプロセシングの最初の事象は、シグナルペプチドの除去
である。大部分のリソソームタンパク質のシグナルペプチドは、シグナルペプチ
ダーゼによるトランスロケーション後に切断され、その後、そのタンパク質は可
溶性になる。酸性α−グルコシダーゼのシグナルペプチドは、その酵素がＲＥＲ
を離れた後に切断されるが、その前に、リソソームまたは分泌経路に入るという
、示唆的な証拠がある（Ｗｉｓｓｅｌａａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８，２２２３−２２３１（１９９３））。酸性α−グルコシダーゼのタンパク質
分解プロセシングは、複雑であり、そして細胞下の種々の位置で生じるシグナル
ペプチドの切断に加えて、一連の工程を含む。ポリペプチドは、Ｎ末端およびＣ
末端の両方で切断され、それによって、比触媒活性が増加する。認識される主な
種は、１１０／１００ｋＤの前駆体、９５ｋＤの中間体ならびに７６ｋＤの成熟
型および７０ｋＤの成熟型である（Ｈａｓｉｌｉｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２５５，４９３７−４９４５（１９８０）；ＯｕｄｅＥｌｆｅｒｉｎｋら、
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９，４８９−４９５（１９８４）；Ｒｅｕｓ
ｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，８３３６−８３４１（１９８５）；
Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯＪ．７，１６９７−１７０４（１９８８））
。天然のヒト酸性α−グルコシダーゼの翻訳後プロセシングとＣＯＳ細胞、ＢＨ
Ｋ細胞およびＣＨＯ細胞のような、培養された哺乳動物細胞において発現された
ような組換え型ヒト酸性α−グルコシダーゼの翻訳後プロセシングとは、類似す
る（Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（１９９０）前出；Ｗｉｓｓｅｌａａｒら（１９９３
）前出）。

【００２５】マンノース基の６’位がリン酸化されたリソソームタンパク質を産生する真正
のプロセシングは、マンノース６−リン酸に対するレセプターを保有する細胞に
よる、基質の取り込みを測定することによって試験され得る。正確に修飾された
基質は、修飾されない基質よりも早く取り込まれ、かつそれによって修飾された
基質の取り込みが、マンノース６−リン酸の添加により競合的に阻害され得るよ
うな様式で取り込まれる。

【００２６】（Ｃ．導入遺伝子の設計）組換えリソソームタンパク質の発現を、導入遺伝子を保有するトランスジェニ
ック非ヒト哺乳動物の乳腺へと標的化するために、導入遺伝子が設計される。基
本的なアプローチには、タンパク質をコードする外因性のＤＮＡセグメントを、
グナル配列、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結することが必要
である。そのＤＮＡセグメントは、ゲノム、ミニ遺伝子（１つ以上のイントロン
が除外されたゲノム）、ｃＤＮＡ、ＹＡＣフラグメント、２つの異なるリソソー
ムタンパク質遺伝子のキメラ、またはこれらの任意のハイブリッドであり得る。
ゲノム配列を含むことは、一般的に、より高レベルの発現を導く。非常に高レベ
ルの発現は、乳腺が、リソソームタンパク質の翻訳後修飾および分泌を行う能力
に負荷をかけ過ぎ得る。しかし、以下に示すデータは、ｍｇ／ｍｌの範囲におけ
る高い発現レベルにもかかわらず、マンノース６−リン酸基の形成を含む、実質
的な翻訳後修飾が生じることを示す。実質的な修飾とは、少なくとも約１０、２
５、５０、７５または９０％の分泌分子が、少なくとも１つのマンノース６−リ
ン酸基を保有することを意味する。従って、ゲノム構築物またはハイブリッドｃ
ＤＮＡ−ゲノム構築物は、一般的に好ましい。

【００２７】ゲノムの構築において、全ての介在配列を保持する必要はない。例えば、いく
つかの介在配列は、ＤＮＡの操作および引き続く微量注入を容易にする、より小
さい導入遺伝子を得るために除去され得る（Ａｒｃｈｉｂａｌｄら、ＷＯ９０
／０５１８８（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）
を参照のこと）。いくつかのイントロンの除去はまた、いくつかの例において、
発現レベルを減らし、そしてそれによって翻訳後修飾が実質的に完了することを
確かめるために有用である。他の例において、イントロン（例えば、酸性α−グ
ルコシダーゼのゲノム配列に由来するイントロン１）の除外は、成熟酵素の、よ
り高い発現を導く。いくつかのまたは全ての非コードエキソンを欠失させること
もまた、可能である。いくつかの導入遺伝子において、リソソームタンパク質コ
ード配列中の選択されたヌクレオチドは、タンパク質分解性切断部位を除去する
ために変異される。

【００２８】トランスジェニック哺乳動物により産生されるリソソームタンパク質の意図さ
れる用途が、通常、ヒトへの投与であるので、リソソームタンパク質配列をコー
ドするＤＮＡセグメントを得る種は、好ましくは、ヒトである。同様に、意図さ
れる用途が（例えば、ウマ、イヌまたはネコに対する）獣医治療である場合、Ｄ
ＮＡセグメントが同じ種に由来することが好ましい。

【００２９】プロモーターおよびエンハンサーは、乳腺においてもっぱら発現するか、また
は少なくとも優先的に発現する遺伝子（すなわち、乳腺特異的遺伝子）に由来す
る。プロモーターおよびエンハンサーの供給源として好ましい遺伝子としては、
β−カゼイン、κ−カゼイン、αＳ１−カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−ラク
トグロブリン、乳清酸性タンパク質およびα−ラクトアルブミンが挙げられる。
プロモーターおよびエンハンサーは、常にではないが、たいてい同じ乳腺特異的
遺伝子から得られる。この遺伝子は、必ずではないが、ときどき、導入遺伝子が
発現されるべき哺乳動物と、同じ種の哺乳動物に由来する。他の種由来の発現調
節配列（例えば、ヒト遺伝子由来の発現調節配列）もまた、使用され得る。この
シグナル配列は、乳腺からのリソソームタンパク質の分泌を指向し得ねばならな
い。適切なシグナル配列は、分泌タンパク質をコードする哺乳動物遺伝子に由来
し得る。驚くことに、リソソームタンパク質は通常、分泌されず、細胞内の細胞
小器官に標的にされるにもかかわらず、これらのタンパク質の天然のシグナル配
列は、適している。そのようなシグナル配列に加えて、シグナル配列の好ましい
供給源は、プロモーターおよびエンハンサーを得る遺伝子と、同じ遺伝子由来の
シグナル配列である。必要に応じて、さらなる調節配列が、発現レベルを最適化
するために、導入遺伝子中に含まれる。そのような配列としては、５’隣接領域
、５’の転写されるが、翻訳されない領域、介在配列、３’の転写されるが、翻
訳されない領域、ポリアデニル化部位および３’隣接領域が挙げられる。そのよ
うな配列は、通常、プロモーターおよびエンハンサーを得る、乳腺特異的遺伝子
、または発現されるリソソームタンパク質遺伝子からのいずれかから得られる。
そのような配列を含むことは、真正の乳腺特異的遺伝子の遺伝環境および／また
は真正のリソソームタンパク質遺伝子の遺伝環境をシュミレーションする遺伝環
境を生じる。この遺伝環境は、いくつかの場合（例えば、ウシαＳ１−カゼイン
）、転写された遺伝子の、より高い発現を生じる。あるいは、３’隣接領域およ
び非翻訳領域は、他の異種遺伝子（例えば、β−グロビン遺伝子またはウイルス
の遺伝子）から得られる。リソソームタンパク質遺伝子または他の異種遺伝子由
来の３’非翻訳領域および５’非翻訳領域を含むことはまた、転写物の安定性を
増加させ得る。

【００３０】いくつかの実施形態において、乳腺特異的遺伝子由来の５’隣接配列の約０．
５、１、５、１０、１５、２０または３０ｋｂは、発現されるリソソームタンパ
ク質遺伝子由来の３’隣接配列の約１、５、１０、１５、２０または３０ｋｂと
組み合せて含まれる。タンパク質がｃＤＮＡ配列から発現される場合、プロモー
ターとコード配列との間に介在配列を含むことは有利である。介在配列は、好ま
しくはプロモーターを得た乳腺特異的領域の第１イントロン由来の介在配列の５
’部分と、ＩｇＧ介在配列またはリソソームタンパク質遺伝子の介在配列由来の
３’部分とから形成されるハイブリッド配列である（ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ９
１／０８２１６（全ての目的のために、その全体において参考として援用される
）を参照のこと）。

【００３１】リソソームタンパク質を発現するための好ましい導入遺伝子は、カゼインプロ
モーターおよびカゼインエンハンサーの５’に結合したｃＤＮＡ−ゲノムハイブ
リッドリソソームタンパク質遺伝子を含む。このハイブリッド遺伝子としては、
リソソームタンパク質遺伝子由来のシグナル配列、コード領域および３’隣接領
域が挙げられる。必要に応じて、ｃＤＮＡセグメントは、５’カゼインとリソソ
ームタンパク質をコードする遺伝子の非翻訳領域との間に介在配列を含む。当然
、得られる融合体から連続したタンパク質が発現され得るのであれば、対応する
ｃＤＮＡおよびゲノムセグメントはまた、遺伝子中の他の位置で融合され得る。

【００３２】他の好ましい導入遺伝子は、カゼイン調節配列の５’に結合したゲノムリソソ
ームタンパク質セグメントを有する。このゲノムセグメントは通常、遺伝子の５
’非翻訳領域から３’隣接領域へと続く。従って、ゲノムセグメントにはリソソ
ームタンパク質の５’非翻訳配列の一部、シグナル配列、交互に続くイントロン
およびコードエキソン、３’非翻訳領域ならびに３’隣接領域が挙げられる。ゲ
ノムセグメントは、この５’非翻訳領域を介して、プロモーターおよびエンハン
サーならびに通常は、５’非翻訳領域を含むカゼインフラグメントに結合される
。

【００３３】ＤＮＡ配列情報は、少なくとも１種、そしてしばしば、様々な生物における上
記に列挙した全ての乳腺特異的遺伝子について利用可能である（例えば、Ｒｉｃ
ｈａｒｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，５２６−５３２（１９８１）
（ラットα−ラクトアルブミン）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓＲｅｓ．１２，８６８５−８６９７（１９８４）（ラットＷＡＰ）；Ｊ
ｏｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，７０４２−７０５０（１９８５
）（ラットβ−カゼイン）；Ｙｕ−ＬｅｅおよびＲｏｓｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２５８，１０７９４−１０８０４（１９８３）（ラットγ−カゼイン）
；Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４２，７３５-７４２（１９８７）（ヒト
α−ラクトアルブミン）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．１２，３８９（１９８４）（ウシαｓ１およびκカゼインのｃＤＮＡｓ）；
Ｇｏｒｏｄｅｔｓｋｙら、Ｇｅｎｅ６６，８７−９６（１９８８）（ウシβカ
ゼイン）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８，３９
５−４０１（１９８８）（ウシκカゼイン）；Ｂｒｉｇｎｏｎら、ＦＥＢＳＬ
ｅｔｔ．１８８，４８−５５（１９７７）（ウシαＳ２カゼイン）；Ｊａｍｉｅ
ｓｏｎら、Ｇｅｎｅ６１，８５−９０（１９８７），Ｉｖａｎｏｖら、Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ３６９，４２５−４２９（１９８８
），Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７，６７
３９（１９８９）（ウシβラクトグロブリン）；Ｖｉｌｏｔｔｅら、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｅ６９，６０９−６２０（１９８７）（ウシα−ラクトアルブミン）を
参照のこと（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）。
種々の乳タンパク質遺伝子の構造および機能は、ＭｅｒｃｉｅｒおよびＶｉｌｏ
ｔｔｅ，Ｊ．ＤａｉｒｙＳｃｉ．７６，３０７９−３０９８（１９９３）（全
ての目的のために、その全体において参考として援用される）に概説される。さ
らなる配列データが必要とされ得る範囲まで、すでに得られた領域に隣接する配
列は、既存の配列をプローブとして使用して、容易にクローン化され得る。異な
る生物由来の乳腺特異的調節配列は、同様に、公知の同族のヌクレオチド配列、
または同族タンパク質に対する抗体をプローブとして使用して、そのような生物
由来のライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。

【００３４】組換えタンパク質の発現を乳腺へと標的化するためにαＳ１−カゼイン調節配
列を使用する、一般的なストラテジー、および例示的な導入遺伝子は、ＤｅＢｏ
ｅｒら、ＷＯ９１／０８２１６およびＷＯ９３／２５５６７（全ての目的のた
めに、その全体において参考として援用される）においてより詳細に記載される
。他の乳腺特異的遺伝子由来の調節配列を使用する導入遺伝子の例としてもまた
、記載されている（例えば、Ｓｉｍｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６
，１７９−１８３（１９８８）およびＷＯ８８／００２３９（１９８８）（ヒツ
ジにおける発現のためのβ−ラクトグロブリン調節配列）；Ｒｏｓｅｎ，ＥＰ
２７９，５８２およびＬｅｅら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６，
１０２７−１０４１（１９８８）（発現のためのマウスにおけるβ−カゼイン調
節配列）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５，１１８３（１９８
７）（発現のためのマウスにおけるＷＡＰ調節配列）；ＷＯ８８／０１６４８（
１９８８）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，４３−４８（１９８９
）（発現のためのマウスにおけるα−ラクトアルブミン調節配列）を参照のこと
（全ての目的のために、その全体において参考として援用される））。

【００３５】導入遺伝子からの乳汁におけるリソソームタンパク質の発現は、翻訳後修飾お
よびリソソームタンパク質の標的化に関与する遺伝子の、同時発現または機能的
不活性化（すなわち、ノックアウト）により影響を受け得る。実施例におけるデ
ータは、驚くことに、乳腺は、高レベルでタンパク質を含むマンノース６−リン
酸の集合および分泌を得るのに十分な量で、すでに修飾酵素を発現することを示
す。しかし、高レベルでこれらのタンパク質を発現する、いくつかのトランスジ
ェニック哺乳動物において、導入遺伝子発現から生じるさらなる酵素を用いて、
プロセシング酵素の内因性のレベルを補うことが、ときどき好ましい。そのよう
な導入遺伝子は、プロセシング酵素コード配列について上記で議論された原理と
類似の原理を使用し、リソソームタンパク質コード配列を、導入遺伝子において
置換して用いて構築される。翻訳後プロセシング酵素が分泌されることは、一般
的には必要ではない。従って、リソソームタンパク質コード配列に連結された分
泌シグナル配列は、分泌を伴わずにプロセシング酵素を小胞体へと標的化するシ
グナル配列で置換される。例えば、これらの酵素に天然で結合しているシグナル
配列が適している。

【００３６】（Ｄ．トランスジェネシス）上記の導入遺伝子は、非ヒト哺乳動物中に導入される。ほとんどの非ヒト哺乳
動物（げっし類（例えば、マウスおよびラット）ウサギ、ヒツジ類（例えば、ヒ
ツジおよびヤギ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ならびにウシ類（ウシおよびバッ
ファロー）を含む）は適している。ウシ類は、大きな収量の乳汁という利点を提
供し、一方、マウスは、トランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）およ
び育種の容易さという利点を提供する。ウサギは、これらの利点の折衷物を提供
する。ウサギは、約１４％のタンパク質含量を有する乳を、１日に１００ｍｌ生
産し得（Ｂｕｈｌｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８，１４０（１９９
０）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）を参照の
こと）、そしてなお、マウスの場合と同じ原理および類似の設備を使用して操作
され得、そして育種され得る。非胎生哺乳動物（例えば、ハリモグラまたはカモ
ノハシ）は、代表的には使用されない。

【００３７】トランスジェネシスのいくつかの方法において、導入遺伝子は、受精した卵母
細胞の前核中に導入される。いくつかの動物（例えば、マウスおよびウサギ）に
ついては、受精はインビボで実施され、そして受精した卵は外科的に取り出され
る。他の動物（特にウシ類）においては、生きている動物または屠殺動物から卵
細胞を取り出し、そしてインビトロで卵を受精させることが好ましい（ＤｅＢｏ
ｅｒら、ＷＯ９１／０８２１６を参照のこと）。インビトロの受精は、導入遺伝
子は、組込むために最適な細胞周期の段階（Ｓ期より遅くない）で、実質的に同
調した細胞中に導入されることを可能にする。導入遺伝子は、通常、微量注入法
によって導入される（ＵＳ４，８７３，２９２を参照のこと）。次いで、受精
した卵母は、約１６〜１５０細胞を含む着床前胚が得られるまで、インビトロで
培養される。１６〜３２細胞期の胚は、桑実胚として記載される。３２を越える
細胞を含む着床前胚は、胚盤胞と呼ばれる。これらの胚は、代表的に、６４細胞
期で割腔の発生を示す。受精した卵母細胞を着床前段階まで培養するための方法
は、Ｇｏｒｄｏｎら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１０１，４１４（１９
８４）；Ｈｏｇａｎら、ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＭｏｕｓｅ
Ｅｍｂｒｙｏ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．
Ｎ．Ｙ．（１９８６）（マウス胚）；およびＨａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ３
１５，６８０（１９８５）（ウサギ胚およびブタ胚）；Ｇａｎｄｏｌｆｉら、Ｊ
．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１，２３−２８（１９８７）；Ｒｅｘｒｏａｄら
、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６，９４７−９５３（１９８８）（ヒツジ胚）なら
びにＥｙｅｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８５，７１５−７２０
（１９８９）；Ｃａｍｏｕｓら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．７２，７７９−
７８５（１９８４）；ならびにＨｅｙｍａｎら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ
２７，５９６８（１９８７）（ウシ胚）（全ての目的のために、その全体にお
いて参考として援用される）により記載される。ときどき、着床前胚は、着床ま
での間、凍結して保存される。着床前胚は、偽妊娠雌の卵管に移され、導入遺伝
子を組込んだ、発生段階に依存して、トランスジェニック動物またはキメラ動物
が誕生する。キメラ哺乳動物を交配して、真の生殖系列トランスジェニック動物
を形成し得る。

【００３８】あるいは、導入遺伝子は、胚幹細胞（ＥＳ）中に導入され得る。これらの細胞
は、インビトロで培養された、着床前の胚から得られる（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎ
ａｔｕｒｅ３０９，２５５−２５８（１９８４）（全ての目的のために、その
全体において参考として援用される））。導入遺伝子は、エレクトロポレーショ
ンまたは微量注入法によって、そのような細胞中に導入され得る。形質転換され
たＥＳ細胞は、非ヒト動物由来の胚盤胞と結合される。ＥＳ細胞は、その胚にコ
ロニーをつくり、そしていくつかの胚では、生じるキメラ動物の生殖系列を形成
する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１４６８−１４７４（１９
８８）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）を参照
のこと）。あるいは、ＥＳ細胞は、除核された受精卵母細胞中に移植し、トラン
スジェニック哺乳動物を発生させるための、核の供給源として使用され得る。

【００３９】２つ以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の産生については、その
導入遺伝子は、単一の導入遺伝子の場合と同じ手順を使用して、同時に導入され
得る。あるいは、導入遺伝子は、最初に別々の動物中に導入され得、次いで、こ
れらの動物を交配することにより、同じゲノム中に組み合わされ得る。あるいは
、導入遺伝子の一方を含む第１のトランスジェニック動物が、産生される。次い
で、２番目の導入遺伝子は、その動物由来の受精卵中または胚幹細胞中に導入さ
れる。いくつかの実施形態において、長さが他の点では約５０ｋｂを超える導入
遺伝子は、重複フラグメントとして構築される。そのような重複フラグメントは
、受精卵母細胞中または胚幹細胞中に同時に導入され、そしてインビボにおいて
相同組換えを受ける（Ｋａｙら、ＷＯ９２／０３９１７（全ての目的のために
、その全体において参考として援用される）を参照のこと）。

【００４０】（Ｅ．トランスジェニック哺乳動物の特徴）本発明のトランスジェニック哺乳動物は、上記のように、それらのゲノム中の
少なくとも１つの導入遺伝子を取り込む。導入遺伝子は、リソソームタンパク質
をコードするＤＮＡセグメントの発現を少なくとも主に乳腺に対して標的化する
。驚くことに、その乳腺は、オリゴ糖の添加およびリン酸化の工程を含む、真正
翻訳後プロセシングに必要とされるタンパク質を発現し得る。乳腺における酵素
によるプロセシングは、マンノース基の６’位のリン酸化を生じる。

【００４１】リソソームタンパク質は、少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００
、２０００、５０００または１０，０００μｇ／ｍｌという高レベルで分泌され
得る。驚くことに、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、実質的に正常な健
康を現わす。乳腺以外の組織におけるリソソームタンパク質の二次発現は、有毒
な効果を引き起こすのに十分な程度までは生じない。さらに、乳腺において産生
される外因性のリソソームタンパク質は、分泌装置を詰まらせる堆着により存在
する、有意な問題が示されない、十分な効率性で分泌される。

【００４２】当然、トランスジェニック哺乳動物が乳汁を産生し始め得る年は、動物の性質
に伴って異なる。トランスジェニックウシについては、その年齢は、通常、約２
歳半またはホルモンの刺激を用いて６ヶ月であり、一方、トランスジェニックマ
ウスについては、その年齢は、約５〜６週間である。当然、種の雌のメンバーの
みが、乳汁を産生するために有用である。しかし、トランスジェニック雄はまた
、雌の子孫を育種するために有用である。トランスジェニック雄由来の精子は、
続いてインビトロにおける受精および雌の子孫の産生のために冷凍保存され得る
。

【００４３】（Ｆ．乳汁からのタンパク質の回収）トランスジェニック成体雌哺乳動物は、高濃度の外因性リソソームタンパク質
を含む乳を産生する。所望であるなら、そのタンパク質は、識別する物理的特性
および化学的特性、ならびに標準的な精製手順（例えば、沈澱、イオン交換、分
子排除またはアフィニティークロマトグラフィー）によって乳汁から精製され得
る（一般的に、Ｓｃｏｐｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）を参照のこと）。

【００４４】乳汁からのヒト酸性α−グルコシダーゼの精製は、遠心分離および脂肪の除去
によるトランスジェニック乳汁の脱脂、続いて高速遠心分離、続いてのデッドエ
ンド（ｄｅａｄ-ｅｎｄ）な濾過（すなわち、フィルターの大きさを連続して小
さくして使用することによるデッドエンドな濾過）または直交流濾過によるカゼ
インの除去、あるいは直交流濾過によるカゼインの直接的な除去によって実施さ
れ得る。ヒト酸性α−グルコシダーゼは、クロマトグラフィー（例えば、ＱＳ
ｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（または他の陰イオン交換マトリックスを含む）、疎水
的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属キレートセファロースあるいは
セファロースに結合したレクチン（または他のマトリックス））によって精製さ
れる。

【００４５】ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗクロマトグラフィーは、以下の
ように、濾過した乳清または乳清画分中に存在するヒト酸性α−グルコシダーゼ
を精製するために使用され得る：ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ
（ＱＦＦ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィー（ＰｈａｒｍａｃｉａＸ
Ｋ−５０カラム、１５ｃｍベッド高；２５０ｃｍ／時間流速）のカラムを、２０
ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）（緩衝液Ａ）中で平衡化し；Ｓ／
Ｄ−インキュベートした乳清画分（約５００〜約６００ｍｌ）を充填し、そして
このカラムを、４〜６カラム容量（ｃｖ）の緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０））で洗浄する。ヒト酸性α−グルコシダーゼ画分は、
１００ｍＭのＮａＣｌを含む２〜３ｃｖの緩衝液Ａを用いて、このＱＦＦカラム
から溶出される。

【００４６】このＱＦＦＳｅｐｈａｒｏｓｅのヒト酸性α−グルコシダーゼ含有画分は、
ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｆｏｒｍａｎｃｅクロマト
グラフィーを使用して、さらに精製され得る。例えば、１容量の１Ｍの硫酸アン
モニウムを、持続的に攪拌しながら、ＱＦＦＳｅｐｈａｒｏｓｅのヒト酸性α
−グルコシダーゼ溶出物に添加する。次いで、ＰｈｅｎｙｌＨＰ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）カラムクロマトグラフィー（ＰｈａｒｍａｃｉａＸＫ−５０カラム
、１５ｃｍベッド高；１５０ｃｍ／時間流速）は、０．５Ｍの硫酸アンモニウム
、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ｃ）（ｐＨ６．０）中でカラムを
平衡化し、（ＱＦＦＳｅｐｈａｒｏｓｅから）０．５Ｍの硫酸アンモニウム−
インキュベートしたヒト酸性α−グルコシダーゼ溶出物を充填し、２〜４ｃｖの
緩衝液Ｃでこのカラムを洗浄し、そしてヒト酸性α−グルコシダーゼ（これは、
３〜５ｃｖの緩衝液Ｄ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用
いてＰｈｅｎｙｌＨＰカラムから溶出された）を溶出することにより、室温に
て行われた。ヒト酸性α−グルコシダーゼをさらに精製するための代替的方法お
よびさらなる方法は、当業者には明らかである。例えば、英国特許出願９９８
０７４６４．４（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照
のこと。

【００４７】（Ｇ．組換えリソソームタンパク質の用途）本発明により産生される組換えリソソームタンパク質は、酵素置換治療手順に
おいて用途を見出す。機能的リソソーム酵素の不全を生じる、遺伝的または他の
欠損を有する患者は、この患者に外来性の酵素を投与することにより処置され得
る。このような処置の必要な患者は、症状（例えば、小人症、角膜混濁、肝脾腫
大症、弁病変、冠状動脈病変、骨格変形、関節硬直および進行性精神遅滞を含む
フルラー症候群の症状）から同定され得る。あるいは、またはさらに、患者は、
特定のリソソーム酵素によりプロセスされる特徴的な代謝物の過剰な蓄積を明ら
かにするため、組織サンプルの生化学的分析から診断され得るか、あるいは特定
のなリソソーム酵素活性の欠損を明らかにするための、人工の基質または天然の
基質を使用する酵素アッセイによって診断され得る。ほとんどの疾患について、
診断は、症状の発症または代謝物の過剰な蓄積の前に、特定の酵素の欠損を測定
することにより、またはＤＮＡ分析によりなされ得る（Ｓｃｒｉｖｅｒら、前出
、ｌｙｓｏｓｏｍａｌｓｔｏｒａｇｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓの章）。リソソー
ム貯蓄症の全ては、遺伝性である。従って、リソソーム疾患に罹患したメンバー
を有することが既知である家系由来の子孫において、最終診断がなされ得る前で
も、予防的処置を開始することは、時として有利である。

【００４８】（薬学的組成物）いくつかの方法において、リソソーム酵素は、薬学的成物として薬学的キャリ
アと共に、精製された形態で投与される。この好ましい形態は、投与および治療
的適用の意図される様式に依存する。この薬学的キャリアは、患者にポリペプチ
ドを送達するために適切な任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アル
コール、脂肪、ワックスおよび不活性固体が、キャリアとして使用され得る。薬
学的に受容可能なアジュバント、緩衝化剤、分散剤などもまた、この薬学的組成
物中へ組み込まれ得る。

【００４９】薬学的組成物中の酵素の濃度は、広範に変化し得る（すなわち、約０．１重量
％未満（通常は、少なくとも約１重量％）から、２０重量％以上程度まで）。

【００５０】経口投与のために、活性成分は、カプセル、錠剤および粉末のような固形投薬
形態、またはエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態で投与さ
れ得る。活性成分は、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デ
ンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステ
アリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムなどのような不活
性成分および粉末キャリアと共に、ゼラチンカプセル中にカプセル化され得る。
所望の色、味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の所望の特徴を提供するた
めに添加され得る、さらなる不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウ
リル硫酸ナトリウム、二酸化チタニウム、食用白インク（ｅｄｉｂｌｅｗｈｉ
ｔｅｉｎｋ）などである。同様の希釈剤が、圧縮剤を作製するために使用され
得る。錠剤およびカプセルの両方は、徐放生成物として製造されて、数時間にわ
たり薬物の持続的な放出を提供し得る。圧縮剤は、いかなる不快な味をも遮断す
るため、および大気からこの錠剤を保護するために、糖コーティングもしくはフ
ィルムコーティングされ得るか、または胃腸管中での選択的な分解のために腸溶
性コーティングされ得る。経口投与のための液体投薬形態は、患者の受け入れを
増加するために、着色剤および香味料を含み得る。

【００５１】静脈内注入のための代表的な組成物は、２０％アルブミン溶液および１００ｍ
ｇ〜５００ｍｇの酵素を必要に応じて補充した、１００〜５００ｍｌの滅菌した
０．９％のＮａＣｌまたは５％のグルコースを含むように調合され得る。筋肉内
注射のための代表的な薬学的組成物は、例えば、１ｍｌの滅菌緩衝水および１ｍ
ｇ〜１０ｍｇの本発明の精製されたαグルコシダーゼをむように調合される。非
経口的に投与可能な組成物を調製するための方法は、当該分野で周知であり、例
えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃ
ｅ（第１５版、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８
０）（全ての目的のためにその全体において参考として援用される）を含む種々
の供給源において、より詳細に記載される。

【００５２】ＡＧＬＵは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で処方され
得る。少量の硫酸アンモニウムは、必要に応じて存在（＜１０ｍＭ）する。酵素
は、代表的には約−７０℃にて凍結保存され、使用前に解凍される。あるいは、
この酵素は、溶液中で（例えば、約４℃〜８℃にて）冷却保存され得る。いくつ
かの実施形態においてＡＧＬＵ溶液は、緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム、リ
ン酸カリウムまたは他の生理学的に受容可能な緩衝液）、単純な炭水化物（例え
ば、スクロース、グルコース、マルトース、マンニトールなど）、タンパク質（
例えば、ヒト血清アルブミン）、および／または界面活性剤（例えば、ポリソル
ベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、クレモフォア（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）−Ｅ
Ｌ，クレモフォア（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）−Ｒ，ラブロフィル（ｌａｂｒｏｆ
ｉｌ）など）を含む。

【００５３】ＡＧＬＵはまた、凍結乾燥形態で保存され得る。凍結乾燥のために、ＡＧＬＵ
は、リン酸緩衝液中にマンニトールおよびスクロースを含む溶液中で処方され得
るべきである。スクロースの濃度は、再構成に際してＡＧＬＵの凝集を妨げるた
めに十分である。マンニトールの濃度は、さもなくば凍結乾燥のために必要とさ
れる時間を顕著に減少するために十分であるべきである。しかし、マンニトール
およびスクロースの濃度は、再構成に際して受容されない高浸透圧性を引き起こ
すに不十分であるべきである。それぞれ１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌおよび０．
１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのマンニトールおよびスクロースの濃度が、適
切である。好ましい濃度は、２ｍｇ／ｍｌのマンニトールおよび０．５ｍｇ／ｍ
ｌのスクロースである。ＡＧＬＵは、凍結乾燥前および再構成後に、好ましくは
、５ｍｇ／ｍｌである。好ましく０．９％での生理食塩水は、再構成のために好
ましい溶液である。

【００５４】ウサギの乳汁から精製されるＡＧＬＵについて、少量の不純物（例えば、約５
％まで）は容認され得る。可能性のある不純物は、ウサギの乳清タンパク質の形
態で存在し得る。他の可能性のある不純物は、ＡＧＬＵの構造的アナログ（例え
ば、オリゴマーおよび凝集体）および切断物である。現在のバッチは、トランス
ジェニックウサギにおいて産生されるＡＧＬＵが９５％より高く純粋であること
を示す。最も大きな不純物はウサギの乳清タンパク質であるが、ゲル電気泳動に
際して、異なる分子量のＡＧＬＵバンドもまた見られる。

【００５５】注入溶液は、層流空気流フード中で無菌的に調製されるべきである。適切な量
のＡＧＬＵは、フリーザーから取り出され、室温にて解凍されるべきである。注
入溶液は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびグルコースを含む、適切な量の
溶液と適切な量のＡＧＬＵ最終産物溶液を混合することにより、ガラス注入ボト
ル中で調製され得る。最終濃度は、２５ｍｇ〜２００ｍｇの用量に対して１％の
ＨＳＡおよび４％のグルコース、そして４００ｍｇ〜８００ｍｇの用量に対して
１％のＨＳＡおよび４％のグルコースであり得る。ＨＳＡおよびＡＧＬＵは、５
％グルコースを含む注入ボトルに移す前に、０．２μｍのシリンジフィルターを
用いて濾過され得る。あるいは、ＡＧＬＵは、生理食塩水溶液（注入のために、
好ましくは０．９％）中で再構成され得る。注入のためのＡＧＬＵの溶液は、室
温にて７時間まで安定であることが示されている。従って、このＡＧＬＵ溶液は
、好ましくは調製７時間以内に注入される。

【００５６】（治療方法）本発明は、ポンペ病を処置する有効な方法を提供する。これらの方法は、触媒
的に活性である形態での、および処置されている患者の組織、特に肝臓、心臓お
よび筋肉（例えば、平滑筋、横紋筋および心筋）により取り込まれ得る形態での
大量のヒト酸性α−グルコシダーゼの利用可能性を、一部前提とする。このよう
なヒト酸性α−グルコシダーゼは、例えば、実施例に記載されるトランスジェニ
ック動物から提供される。α−グルコシダーゼは、好ましくは、主に（すなわち
、＞５０％）約１００ｋＤ〜１１０ｋＤの前駆体形態である。（１００ｋＤ〜１
１０ｋＤの前駆体の見かけの分子量または相対的移動性は、使用される分析の方
法に依存して幾分変化し得るが、典型的には、９５ｋＤと１２０ｋＤの範囲内で
ある。）実施例において議論されるトランスジェニック動物中のヒト酸性α−グ
ルコシダーゼでの首尾よい結果を考慮すると、細胞発現系から生じるようなヒト
α−グルコシダーゼの他の供給源もまた使用され得ることが可能である。例えば
、ヒト酸性α−グルコシダーゼを生成する代替的方法は、適切なプロモーターに
作動可能に連結された、ｃＤＮＡまたはゲノム構築物として、安定な真核生物細
胞株（例えば、ＣＨＯ）中に、酸性α−グルコシダーゼ遺伝子をトランスフェク
トすることである。しかし、このようなアプローチによる臨床的な治療のために
必要とされる、大量のヒト酸性α−グルコシダーゼを生成することは、より困難
である。

【００５７】本発明の薬学的組成物は、通常、静脈内に投与される。皮内、筋肉内または経
口投与はまた、いくつかの場合において可能である。この組成物は、リソソーム
酵素欠損疾患を患っている、またはその危険のある個体の予防的な処置のために
投与され得る。治療的適用について、薬学的組成物は、蓄積された代謝物の濃度
を減少させるため、および／または代謝物のさらなる蓄積を予防もしくは防止す
るために十分な量で、確立された疾患に罹患している患者に投与される。リソソ
ーム酵素欠損疾患の危険のある個体に対して、この薬学的組成物は、代謝物の蓄
積を予防または阻害するいずれかのために十分な量で、予防的に投与される。こ
のことを達成するために適切な量は、「治療的有効量」または「予防的有効量」
として定義される。このような有効量は、状態の重症度および患者の健康状態の
全身性状態に依存する。

【００５８】この方法において、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、通常、患者に対して一週
間あたり患者体重に対して１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、投与される。しばしば
、用量は、一週間あたり１０ｍｇ／ｋｇを超える。投薬レジメンは、一週間あた
り１０ｍｇ／ｋｇ〜一週間あたり少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得
る。代表的な投薬レジメンは、一週間あたり１０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり１５
ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり２０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり２５ｍｇ／ｋｇ、一週
間あたり３０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり３５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり４０ｍｇ
／ｋｇ、一週間あたり４５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり６０ｍｇ／ｋｇ、一週間あ
たり８０ｍｇ／ｋｇおよび一週間あたり１２０ｍｇ／ｋｇである。好ましいレジ
メンにおいては、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ
／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇが、毎週１回、２回または３回投与される。処置は
、少なくとも４週間、時として２４週間、そして時として患者の生涯にわたり、
代表的に続けられる。処置は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される。必
要に応じて、ヒトα−グルコシダーゼのレベルは、処置後にモニターされ（例え
ば、血漿または筋肉において）、そして検出されるレベルが、実質的に正常なヒ
トにおける値未満（例えば、２０％未満）に低下した場合、さらなる用量が投与
される。

【００５９】いくつかの方法において、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、初めは「高」用量
（すなわち、「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇｄｏｓｅ）」）で投与され、続いて
低用量（すなわち、「維持用量」）で投与される。負荷用量の例は、週（例えば
、１、２または３週間）あたり１〜３回、患者体重に対して少なくとも約４０ｍ
ｇ／ｋｇである。維持用量の例は、周あたり患者体重に対して少なくとも約５ｍ
ｇ／ｋｇ〜少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇであり、またはそれ以上（例えば、一週
間あたり２０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり３０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり４０ｍｇ
／ｋｇ）である。

【００６０】いくつかの方法において、用量は、投薬期間中に増加速度で投与される。この
ようなことは、静脈内注入の流速を増加することにより、または一定の速度で投
与される漸増する濃度のα−グルコシダーゼの勾配を使用することにより達成さ
れ得る。この様式での投与は、免疫原性反応の危険性を減少させる。いくつかの
用量において、単位時間あたりのα−グルコシダーゼの単位において測定される
投与速度は、少なくとも１０の係数により増加する。代表的に、静脈内注入は、
数時間の期間（例えば、１〜１０時間、および好ましくは２〜８時間、より好ま
しくは３〜６時間）にわたり行われ、そして注入速度は、投与の期間中に間隔を
おいて増加される。

【００６１】増加速度での注入についての適切な用量（全ては、ｍｇ／ｋｇ／時間）は、以
下の表１に示される。この表の第１欄は、投薬スケジュールにおける時間を示す
。例えば、０〜１時間への参照は、投薬の最初の時間を言及する。表の第５欄は
、それぞれの時間で使用され得る用量の範囲を示す。第４欄は、好ましい投薬量
の制限された内包範囲を示す。第３欄は、例示的な臨床的試行において投与され
る投薬量のより高い値とより低い値を示す。第２欄は、特に好ましい投薬量を示
し、それらは、表１の第３欄に示される範囲の平均を示す。

【００６２】

【表１】この方法は、早発性（幼児性）ポンペ病および遅発性（若年性および成人性）
ポンペ病の両方を有する患者に対して有効である。ポンペ病の幼児性形態を有す
る患者において、症状は、生涯の最初の４ヶ月において明らかになる。大半にお
いて、貧弱な運動発達および成長不全が、最初に認められる。臨床試験に際して
、筋肉消耗、胸骨退縮を伴う増加した呼吸速度、肝臓の中程度の膨大および舌の
突出を伴う全身性緊張低下が存在する。心臓の超音波試験は、進行性の肥大型心
筋症を示し、最終的に不十分な心拍出量を誘導する。ＥＣＧは、顕著な左軸偏位
、短いＰＲ間隔、大きなＱＲＳ複合体、反転Ｔ波、およびＳＴ低下により特徴付
けられる。この疾患は、生涯の最初の年において心臓性呼吸不全を誘導する、急
速な進行経過を示す。剖検での組織学的な試験に際して、リソソームのグリコー
ゲン蓄積が、種々の組織において観察され、心臓および骨格筋において最も明白
である。本発明の方法におけるてヒト酸性α−グルコシダーゼを用いる処置は、
そのような患者の寿命の延長を生じる（例えば、１、２、５年を超えて、正常な
寿命まで）。処置はまた、上で議論したように、ポンペ病の臨床学的特徴および
生化学的特徴の除去または減少を生じ得る。処置は、生後直ぐに、またはこの患
者が、それらの子孫を危険におかせる変異したα−グルコシダーゼ対立遺伝子を
保有することが既知である場合は、出生前に投与される。

【００６３】ポンペ病の遅発性の成人性形態を有する患者は、生涯の最初の二十年において
、症状を経験しないかもしれない。この臨床学的なサブタイプにおいて、主に骨
格筋が、肢帯、体幹および横隔膜のそれらの偏好に関連する。階段を登る際の困
難は、しばしば最初の病訴である。呼吸障害は、かなり変化する。これは、臨床
的容体を支配し得るか、またはこれは、患者によっては、晩年になるまで経験さ
れない。ほとんどのそのような患者は、呼吸不全のために死亡する。若年性サブ
タイプを有する患者において、症状は、通常、生涯の最初の１０年で明らかとな
る。成人性ポンペ病の場合、骨格筋衰弱が、主な問題であり；心臓肥大、肝腫大
および巨舌症が見られ得るが、稀である。多くの場合、毎晩の人工呼吸器支持が
、最終的に必要とされる。呼吸筋の萎縮を併発する肺感染は、生命を脅かし、大
半において、３０年の年数前には致死的になる。本発明の方法を用いた処置は、
遅延性の若年性ポンペ病患者または成人性ポンペ病患者の寿命を正常な寿命まで
延長する。処置はまた、疾患の臨床的症状および生化学的症状を除去または顕著
に減少する。

【００６４】（他の用途）トランスジェニック動物の乳汁中のリソソームタンパク質産物は、多くの他の
用途を有する。例えば、他のα−アミラーゼと共通してα−グルコシダーゼは、
デンプン、ビールおよび医薬品の生産において重要なツールである。Ｖｉｈｉｎ
ｅｎおよびＭａｎｔｓａｌａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．２４，３２９−４０１（１９８９）（全ての目的のためにその全体が参
考として援用される）を参照のこと。リソソームタンパク質はまた、実験化学薬
品または加工食品を生産するために有用である。例えば、酸性α−グルコシダー
ゼは、１，４α−糖質結合（ｇｌｕｃｉｄｉｃｂｏｎｄ）および１，６α−糖
質結合を分解し、そして、マルトース、イソマルトース、デンプンおよびグリコ
ーゲンのような、それらの結合を含む種々の炭水化物の分解に使用されて、グル
コースを産生し得る。酸性α−グルコシダーゼはまた、腸マルターゼ不全または
腸イソマルターゼ不全の患者に対する投与のために有用である。さもなくば消化
されないマルトースの存在から生じる症状は、回避される。そのような適用にお
いて、この酵素は、乳汁からの事前の画分化なしで、そのような乳汁から誘導さ
れる加工食品（例えば、アイスクリームまたはチーズ）として、または薬学的組
成物として投与され得る。精製された組換えリソソーム酵素はまた、組織サンプ
ル中のこのような酵素の未知量のアッセイのための診断キットにおけるコントロ
ールとして含まれるために有用である。

【００６５】（実施例）（実施例１：導入遺伝子の構築）（（ａ）ｃＤＮＡ構築物）ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築
は、プラスミドｐ１６，８ｈｌｆ３（ＤｅＢｏｅｒら（１９９１）および（１９
９３）、前出を参照のこと）を用いて開始した。このプラスミドは、ウシαＳ１
−カゼイン調節配列を含む。この親プラスミドのラクトフェリンｃＤＮＡ挿入物
を、図１において示されるような発現カセットのＣｌａＩ部位およびＳａｌＩ部
位において、ヒト酸性α−グルコシダーゼｃＤＮＡ（Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、Ｅ
ＭＢＯＪ．７，１６９７〜１７０４（１９８８））と交換した。α−グルコシ
ダーゼｃＤＮＡフラグメントの末端にこれらの適合可能な制限部位を得るために
、ヒトα−グルコシダーゼをコードする完全なｃＤＮＡを含むプラスミドｐＳＨ
ＡＧ２（同上）を、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いて消化して、そしてこの３
．３ｋｂｃＤＮＡフラグメントを、ベクターのヌクレオチド配列内の破壊され
たＣｌａＩ部位および新しく設計されたポリリンカー（ＨｉｎｄＩＩＩＣｌａ
ＩＥｃｏＲＩＳｐｈＩＸｈｏＩＥｃｏＲＩＳｆｉＩＳｆｉＩ／Ｓｍ
ａＩＮｏｔＩＥｃｏＲＩ^*（^*＝破壊された部位））を有する、ｐＫＵＮ７Δ
Ｃ（ｐＫＵＮＩ誘導体）（Ｋｏｎｉｎｇｓら、Ｇｅｎｅ４６、２６９〜２７６
（１９８６））中でサブクローン化した。生じたプラスミドｐαｇｌｕＣＥＳＸ
から、この３．３−ｋｂｃＤＮＡフラグメントを、ＣｌａＩおよびＸｈｏＩに
より切り出し得た。このフラグメントを、ＣｌａＩ部位およびＸｈｏＩ−適合可
能なＳａｌＩ部位で、図１において示される発現カセットに挿入した。結果とし
て、発現プラスミドｐ１６，８αｇｌｕは、図１において示されるようなウシα
Ｓ１−カゼイン配列に隣接される、ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードするｃ
ＤＮＡ配列からなる。完全な発現カセットを含むこの２７．３−ｋｂフラグメン
トを、ＮｏｔＩを用いた切断により、切り出し得る（図１を参照のこと）。

【００６６】（（ｂ）ゲノム構築物）構築物ｃ８αｇｌｕｅｘ１は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子（Ｈｏｅｆ
ｓｌｏｏｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．２７２，４９３〜４９７（１９９０））（
その転写開始部位のちょうど下流のエキソン１において始まる）を含む（図２、
パネルＡを参照のこと）。従って、この構築物は、ヒト酸性αグルコシダーゼ遺
伝子のほとんど完全な５’ＵＴＲをコードする。このフラグメントを、ウシαＳ
１−カゼイン遺伝子のプロモーター配列に融合した。このαＳ１−カゼイン開始
部位は、αＳ１−カゼイン／酸性α−グルコシダーゼ接合部の２２ｂｐ上流に存
在する。この構築物は、ヒト酸性α−グルコシダーゼポリアデニル化シグナル配
列および３’隣接配列を有する。構築物ｃ８αｇｌｕｅｘ２は、ヒト酸性α−グ
ルコシダーゼ遺伝子のエキソン２における転写開始部位に即座に融合されるウシ
αＳ１カゼインプロモーターを含む（図２、パネルＢを参照のこと）。従って、
αＳ１−カゼイン転写開始部位およびα−グルコシダーゼ転写開始部位は、この
構築物において２２ｂｐ離れている。従って、α−グルコシダーゼ５’ＵＴＲを
保存しない。この構築物はまた、図２、パネルＢにおいて示されるようなヒト酸
性α−グルコシダーゼポリアデニル化シグナル配列および３’隣接配列を含む。

【００６７】構築物ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０は、３’領域においてのみ、構築物ｃ８
αｇｌｕｅｘ２と異なる。エキソン２０におけるＳｐｈＩ部位を、ウシαＳ１−
カゼイン３’配列をヒト酸性α−グルコシダーゼ構築物と融合するために用いた
。このポリアデニル化シグナルは、この３’αＳ１−カゼイン配列中に位置する
（図２、パネルＣ）。

【００６８】構築物ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０は、３’領域においてのみ、構築物ｃ８
αｇｌｕｅｘ２と異なる。エキソン２０におけるＳｐｈＩ部位を、ウシαＳ１−
カゼイン３’配列をヒト酸性α−グルコシダーゼ構築物と融合するために用いた
。このポリアデニル化シグナルは、この３’αＳ１−カゼイン配列中に位置する
（図２、パネルＣ）。

【００６９】（ゲノム構築物の構築の方法）ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子を含む３つの連続したＢｇｌＩＩフラグメ
ントを、Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（前出）によって単離した。これらのフラグメン
トを、カスタマイズされたポリリンカー（ＨｉｎｄＩＩＩＣｌａＩＳｔｕＩ
ＳｓｔＩＢｇｌＩＩＰｖｎＩＮｃｏＩＥｃｏＲＩＳｐｈＩＸｈｏ
ＩＥｃｏＲＩ^* ＳｍａＩ／ＳｆｉＩＮｏｔＩＥｃｏＲＩ^*（^*＝破壊され
た部位））を有するｐＫＵＮ８ΔＣ（ｐＫＵＮ７ΔＣ誘導体）のＢｇｌＩＩ部位
中に連結した。この連結は、プラスミドｐ７．３αｇｌｕＢＥＳ、ｐ７．３αｇ
ｌｕＢＳＥ、ｐ８．５αｇｌｕＢＳＥ、ｐ８．５αｇｌｕＢＥＳ、ｐ１０αａｇ
ｌｕＢＳＥおよびｐ１０αｇｌｕＢＥＳを生成する、これらの２つの方向のフラ
グメントを生じた。

【００７０】発現カセットの末端の独特なＮｏｔＩ−部位が、マイクロインジェクションに
使用されるフラグメントの単離のために後で使用されることから、ヒト酸性α−
グルコシダーゼのイントロン１７における遺伝子内ＮｏｔＩ部位を、破壊しなけ
ればならなかった。従って、ｐ１０αｇｌｕＢＥＳを、ＣｌａＩおよびＸｈｏＩ
を用いて消化し；３’α−グルコシダーゼの末端を含むフラグメントを単離した
。このフラグメントを、ｐＫＵＮ１０ΔＣのＣｌａＩ部位およびＸｈｏＩ部位に
挿入し、ｐ１０αｇｌｕΔＮＶを生じた。前もって、ｐＫＵＮ１０ΔＣ（すなわ
ち、ｐＫＵＮ８ΔＣの誘導体）を、ＮｏｔＩを用いてｐＫＵＮ８ΔＣを消化し、
Ｋｌｅｎｏｗを用いて粘着末端を充填し、そして続いて、平滑末端連結によりこ
のプラスミドをアニーリングすることによって得た。最終的に、ｐ１０αｇｌｕ
ΔＮＶを、ＮｏｔＩを用いて消化した。これらの粘着末端をまた、Ｋｌｅｎｏｗ
で充填して、そしてこのフラグメントを連結し、プラスミドｐ１０αｇｌｕΔＮ
ｏｔＩを生じた。

【００７１】（ｃ８αｇｌｕｅｘ１の構築） αグルコシダーゼ遺伝子の最初のエキソンにおけるＳｓｔＩ部位を、ウシαＳ
１−カゼイン配列との融合のために選択したことから、ｐ８．５αｇｌｕＢＳＥ
を、ＢｇｌＩＩを用いて消化し、その後、ＳｓｔＩを用いて部分消化した。エキ
ソン１〜３を含むフラグメントを単離し、そしてｐＫＵＮ８ΔＣのＢｇｌＩＩ部
位およびＳｓｔＩ部位に連結した。この生じたプラスミドを、以下のように命名
した：ｐ５’αｇｌｕｅｘ１（図３、パネルＡを参照のこと）。

【００７２】次の工程（図３、パネルＢ）は、３’部分のｐ５’αｇｌｕｅｘ１への連結で
あった。第１に、ｐ１０αｇｌｕΔＮをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて消
化した。エキソン１６〜２０を含むこのフラグメントを、単離した。第２に、ｐ
５’αｇｌｕｅｘ１を、ＢｇｌＩＩを用いて消化し、そして自己連結を防ぐため
に、および粘着ＢｇｌＩＩ末端を脱リン酸化するために、ホスホリラーゼ（ＢＡ
Ｐ）を用いて処理した。ＢａｍＨＩ粘着末端は、ＢｇｌＩＩ粘着末端と適合可能
であるから、これらの末端は互いに連結する。この生じたプラスミド（すなわち
、ｐ５’３’αｇｌｕｅｘ１）を、選択した。このプラスミドは、最終の構築工
程のために利用可能な独特なＢｇｌＩＩ部位を有する（図３、パネルＢおよびパ
ネルＣ）。

【００７３】 αグルコシダーゼ遺伝子の中間部分を、その後の構築物に挿入した。この工程
のために、ｐ７．３αｇｌｕＢＳＥをＢｇｌＩＩを用いて消化し、８．５−ｋｂ
フラグメントを単離し、そしてＢｇｌＩＩ−消化および脱リン酸化されたｐ５’
３’αｇｌｕｅｘ１プラスミドに連結した。この生じたプラスミドが、ｐαｇｌ
ｕｅｘ１である（図３、パネルＣ）。

【００７４】このウシαＳ１カゼインプロモーター配列を、３つのフラグメントを含む連結
を介して次の工程において組み込んだ。ｐＷＥ１５コスミドベクターを、Ｎｏｔ
Ｉを用いて消化し、そして脱リン酸化した。ウシαＳ１−カゼインプロモーター
を、８ＲｂＮｏｔＩ−ＣｌａＩフラグメントとして単離した（ｄｅＢｏｅ
ｒら、１９９１、（前出）を参照のこと）。ヒト酸性α−グルコシダーゼフラグ
メントを、同じ酵素を用いてｐαｇｌｕｅｘ１から単離した。これらの３つのフ
ラグメントを、連結して、そして１０４６Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において、Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅＧｉｇａｐａｃｋＩＩキットを用いてパッケージングした
。この生じたコスミドｃ８αｇｌｕｅｘ１を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α中で、増
殖させた。このベクターを、マイクロインジェクションの前にＮｏｔＩを用いて
線状化した。

【００７５】（ｃ８αｇｌｕｅｘ２およびｃ８．８αｇｌｕｅｘ２−２０の構築）他の２つの発現プラスミドの構築（図２、パネルＢおよびパネルＣ）は、ｃ８
αｇｌｕｅｘ１の構築と類似のストラテジーに従った。このプラスミドｐ５’α
ｇｌｕＳｔｕＩを、ｐ８，５αｇｌｕＢＳＥから、ＳｔｕＩを用いたこのプラス
ミドの消化、それに続く、エキソン２〜３およびこのベクター配列を含む、単離
されたフラグメントの自己連結により誘導した。プラスミドｐ５’αｇｌｕＳｔ
ｕＩを、ＰｇｌＩＩを用いて消化し、それに続いて、ＮｃｏＩを用いてこの線状
フラグメントを部分消化して、いくつかのフラグメントを生じた。エキソン２お
よび３を含む２．４ｋｂフラグメントを単離し、そしてベクターｐＫＵＮ１２Δ
ＣのＮｃｏＩ部位およびＢｇｌＩＩに連結し、ｐ５’αｇｌｕｅｘ２を生じた。
ｐＫＵＮ１２ΔＣが、ポリリンカー（ＣｌａＩＮｃｏＩＢｇｌＩＩＨｉｎ
ｄＩＩＩＥｃｏＲＩＳｐｈＩＸｈｏＩＳｍａＩ／ＳｆｉＩＮｏｔＩ）
を含むｐＫＵＮ８ΔＣの誘導体であることに留意すること。

【００７６】プラスミドｐ１０αｇｌｕΔＮｏｔＩを、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを
用いて消化した。このエキソン１６〜２０を含むフラグメントを単離し、そして
ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化されたｐ５’αｇｌｕｅｘ２中に
連結した。この生じたプラスミドが、ｐ５’３’αｇｌｕｅｘ２であった。ｐ５
’３’αｇｌｕｅｘ２における中間のフラグメントを、ｐαｇｌｕｅｘ１につい
てのように挿入した。このために、ｐ７．３αｇｌｕを、ＢｇｌＩＩを用いて消
化した。このフラグメントを単離し、そしてＢｇｌＩＩ−消化および脱リン酸化
されたｐ５’３’αｇｌｕｅｘ２に連結した。この生じたプラスミド、ｐαｇｌ
ｕｅｘ２を、ｃ８αｇｌｕｅｘ−２０およびｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０の構
築において使用した（図２、パネルＢおよびパネルＣ）。

【００７７】第３の発現プラスミドｃ８，８α ｇｌｕｅｘ２−２０の構築のために（図２
、パネルＣ）、α−グルコシダーゼの３’隣接領域を欠失した。これを達成する
ために、ｐαｇｌｕｅｘ２を、ＳｐｈＩを用いて消化した。このエキソン２−２
０を含むフラグメントを単離し、そして自己連結して、ｐαｇｌｕｅｘ２−２０
を生じた。その後に、ウシαｓ１−カゼイン遺伝子の３’隣接領域を含むフラグ
メントを、ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩを用いた消化により、ｐ１６，８αｇｌｕか
ら単離した。このフラグメントを、ポリリンカー配列におけるＳｐｈＩ部位およ
びＮｏｔＩ部位を用いて、ｐαｇｌｕｅｘ２−２０に挿入し、ｐαｇｌｕｅｘ２
−２０−３αＳ１を生じた。

【００７８】ｃ８，８ｇｌｕｅｘ２−２０を生成するこの最終工程は、ｃ８αｇｌｕｅｘ１
を導く構築における最終工程のような、３つのフラグメントの連結であった。ｐ
αｇｌｕｅｘ２−２０−３’αＳ１およびｐαｇｌｕｅｘ２におけるＣｌａＩ部
位が、メチル化のために切断可能でないようであったことから、プラスミドを、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＡＭ（−）株ＥＣＯ３４３において増殖しなければならなかっ
た。その株から単離されたｐαｇｌｕｅｘ２−２０−３’αＳ１を、ＣｌａＩお
よびＮｏｔＩを用いて消化した。エキソン２〜２０および３’αカゼイン隣接領
域を含むフラグメントを、ベクター配列から精製した。このフラグメント（ウシ
αｓ１プロモーター（ＤｅＢｏｅｒ（１９９１）および（１９９３）、前出を参
照のこと）を含む８ｋｂＮｏｔＩ−ＣｌａＩフラグメント）およびＮｏｔＩ−
消化、脱リン酸化されたｐＷＥ１５を連結し、そしてパッケージングした。この
生じたコスミドが、ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０である。

【００７９】コスミドｃ８αｇｌｕｅｘ２（図２、パネルＢ）を、２つの異なる工程を介し
て構築した。第１に、コスミドｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０を、ＳａｌＩおよ
びＮｏｔＩを用いて消化した。αＳ１−プロモーターおよび酸性α−グルコシダ
ーゼ遺伝子のエキソン２〜６の部分を含む１０．５ｋｂフラグメントを、単離し
た。第２に、プラスミドｐαｇｌｕｅｘ２を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて
消化し、酸性αグルコシダーゼ遺伝子の３’部分を含むフラグメントを得た。最
後に、コスミドベクターｐＷＥ１５を、ＮｏｔＩを用いて消化して、脱リン酸化
した。これらの３つのフラグメントを、連結して、そしてパッケージングした。
この生じたコスミドが、ｃ８αｇｌｕｅｘ２である。

【００８０】（実施例２：トランスジェネシス）ｃＤＮＡ構築物およびゲノム構築物を、ＮｏｔＩを用いて線状化して、そして
受精マウス卵母細胞の前核に注入し、次いで、この卵母細胞を、偽妊娠マウスの
養母の子宮の中に移植した。この子孫を、クリップテイル（ｃｌｉｐｐｅｄｔ
ａｉｌ）から単離されたＤＮＡのサザンブロットによって、ヒトα−グルコシダ
ーゼｃＤＮＡ遺伝子構築物またはゲノムＤＮＡ遺伝子構築物の挿入について分析
した。トランスジェニックマウスを選択し、そして育種した。

【００８１】ＮｏｔＩを用いて線状化されたゲノム構築物をまた、受精ウサギ卵母細胞の前
核に注入し、これを偽妊娠ウサギの養母（ｆｏｓｔｅｒｍｏｔｈｅｒ）の子宮
に移植した。この子孫を、α−グルコシダーゼＤＮＡの挿入について、サザンブ
ロットにより分析した。トランスジェニックウサギを、選択し、そして育成した
。

【００８２】（実施例３：トランスジェニックマウスの乳汁中の酸性α−グルコシダーゼの
分析）トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックコントロールからの乳
汁をウェスタンブロットによって分析した。このプローブは、ヒト酸性α−グル
コシダーゼに対して特異的な（すなわち、マウス酵素には結合しない）マウス抗
体であった。導入遺伝子１６７２および１６７３は、乳汁中にヒト酸性αグルコ
シダーゼの発現を示した（図４）。１００〜１１０ｋＤおよび７６ｋＤにおける
大きいバンドおよび小さいバンドが、α−グルコシダーゼについて予測されるも
のとして観察された。非トランスジェニックマウス由来の乳汁中に、バンドは観
察されなかった。

【００８３】ヒト酸性α−グルコシダーゼの活性を、トランスジェニックマウス系統の乳汁
中の人工基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを用いて
測定した（Ｇａｌｉａａｒｄ、ＧｅｎｅｔｉｃＭｅｔａｂｏｌｉｃＤｉｓｅ
ａｓｅ，ＥａｒｌｙＤｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄＰｒｅｎａｔａｌＡｎａ
ｌｙｓｉｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ、Ａｍｓｔｅｒｄ
ａｍ、８０９〜８２７頁（１９８０）を参照のこと）。このｃＤＮＡ構築物（図
１）を含むマウスは、１時間あたり０．２μｍｏｌ／ｍｌ〜２μｍｏｌ／ｍｌで
変化する。このゲノム構築物（図２、パネルＡ）を含むマウス系統は、１時間あ
たり１０μｍｏｌ／ｍｌ〜６１０μｍｏｌ／ｍｌまでのレベルで発現した。これ
らの図は、１８０μｍｏｌ／ｍｇの組換え酵素の推定される比活性（Ｖａｎｄ
ｅｒＰｌｏｅｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２３５：３９２〜３９６（１９８８）
）に基づいて、１．３ｍｇ／ｌ〜１１．３ｍｇ／ｌまでの産生（ｃＤＮＡ構築物
）および０．０５ｇ／ｌ〜３．３ｇ／ｌの産生（ゲノム構築物）と同等である。

【００８４】この組換え酸性α−グルコシダーゼを、ＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TMおよ
びＳｅｐｈａｄｅｘ^TMＧ２００上での乳汁の連続クロマトグラフィーにより、ト
ランスジェニックマウスの乳汁から単離した。７ｍｌの乳汁を、１０ｍＭリン酸
ナトリウム、ｐＨ６．６および１００ｍＭＮａＣｌからなる３ｍｌのＣｏｎ
Ａ緩衝液を用いて、１０ｍｌに希釈した。次いで、ＣｏｎＡ緩衝液中のＣｏｎ
Ａセファロースの１：１懸濁液を加え、そしてその乳汁を穏やかな振とうで、
一晩、４度に置いた。次いで、ＣｏｎＡセファロースビーズを、遠心分離によ
って収集し、そしてＣｏｎＡ緩衝液を用いて５回、１００ｍＭの代わりに１Ｍ
ＮａＣｌを含むＣｏｎＡ緩衝液を用いて３回、１００ｍＭの代わりに０．５
ＭＮａＣｌを含むＣｏｎＡ緩衝液を用いて１回洗浄し、そして次いで、０．
５ＭＮａＣｌおよび０．１Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含むＣｏｎ
Ａ緩衝液を用いてバッチ形式で抽出した。抽出されたサンプル中の酸性α−グ
ルコシダーゼ活性を、人工の４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピ
ラノシド基質を用いて測定した（上記を参照のこと）。酸性α−グルコシダーゼ
活性を含む画分をプールし、濃縮し、２０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５および２
５ｍＭＮａＣｌからなるＳｅｐｈａｄｅｘ緩衝液に対して透析し、そしてＳｅ
ｐｈａｄｅｘ^TM２００カラムにアプライした。このカラムに、同じ緩衝液を流し
（ｒｕｎ）、そして画分を酸性α−グルコシダーゼ活性およびタンパク質含量に
ついてアッセイした。酸性α−グルコシダーゼ活性に富み、そして実質的に他の
タンパク質を含まない画分を、プールし、そして濃縮した。記載されるような方
法は、Ｒｅｕｓｅｒら、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．１５５：１７８〜１７９（
１９８４）によって公開された方法と基本的に同じである。この方法のいくつか
の改変は、緩衝液系の正確な組成およびｐＨ、ならびに精製工程の数およびカラ
ム材料における選択に関して可能である。

【００８５】次いで、乳汁から精製された酸性α−グルコシダーゼを、ＧＳＤＩＩ（内因
性の酸性α−グルコシダーゼにおける欠陥）を有する患者由来の培養された線維
芽細胞に対してこの酵素を投与することにより、リン酸化について試験した。こ
の試験において、マンノース６−ホスフェート含有タンパク質が、線維芽細胞の
細胞表面上のマンノース６−ホスフェートレセプターに結合され、そしてその後
、内部移行される。この結合は、遊離マンノース６−ホスフェートにより阻害さ
れる（Ｒｅｕｓｅｒら、Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．１５５：１７８−１８９（
１９８４））。トランスジェニックマウスの乳汁から単離された酸性α−グルコ
シダーゼのリン酸化についての代表的な試験において、この酸性α−グルコシダ
ーゼを、２０時間の間で、１時間あたり１μｍｏｌの４−メチル−ウンベリフェ
リル−α−Ｄ−グルコピラノシドを代謝するのに十分な量で、５００μｌ培養培
地（１０％ウシ胎仔血清および３ｍＭＰｉｐｅｓを供給されたＨａｍＦ１０
）中の１０４〜１０６の線維芽細胞に添加した。この実験を、本質的に、Ｒｅｕ
ｓｅｒら、（前出）（１９８４）により記載されるように、競合因子として５ｍ
Ｍマンノース６−ホスフェートを用いて、または用いないで行った。これらの条
件下で、患者の線維芽細胞の酸性α−グルコシダーゼは、健康な個体由来の線維
芽細胞において測定されるレベルに回復した。マウス乳汁から単離された酸性α
−グルコシダーゼによる内因性の酸性α−グルコシダーゼ活性の回復は、ウシ精
巣、ヒト尿およびトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培地から精製された酸性
α−グルコシダーゼによる回復と同様に有効であった。乳汁由来のα−グルコシ
ダーゼによる回復は、他の供給源由来のα−グルコシダーゼについて観察される
ように、５ｍＭマンノース６−ホスフェートにより阻害された（Ｒｅｕｓｅｒら
、前出；ＶａｎｄｅｒＰｌｏｅｇら、（１９８８）、前出；Ｖａｎｄｅｒ
Ｐｌｏｅｇら、Ｐｅｄ．Ｒｅｓ．２４：９０−９４（１９８８））。

【００８６】この乳汁において産生されるα−グルコシダーゼの確実性のさらなる実証とし
て、マウスの乳汁において産生される組換えα−グルコシダーゼのＮ末端アミノ
酸配列が、Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯＪ．７：１６９７−１７０４（１
９８８）によって公開されたように、ＡＨＰＧＲＰで開始するヒト尿由来のα−
グルコシダーゼの前駆体のＮ末端アミノ酸と同様であると示された。

【００８７】（実施例４：α−グルコシダーゼの動物試行）最近、ポンペ病についてのノックアウトマウスモデルが、利用可能になった（
２５）。このモデルは、マウスα−グルコシダーゼ遺伝子の標的化された破壊に
よって産生された。グリコゲン含有リソソームが、肝臓、心臓および骨格筋にお
いて、誕生後すぐに検出された。明白な臨床症状は、比較的遅い年齢（＞９ヶ月
）でのみ明らかになるが、心臓は代表的に拡大し、そして心電図は異常である。

【００８８】実験を、トランスジェニックウサギの乳汁から精製されたＡＧＬＵのインビボ
での効果を研究するため、ノックアウト（ＫＯ）マウスモデルを用いて実行した
。これらの実験における組換え酵素を、基本的にトランスジェニックマウスから
の精製について上記されるように、トランスジェニックウサギの乳汁から精製し
た。

【００８９】（１．ＫＯマウスモデルにおける短期の研究）６日間隔で、単回または複数回の注射を、尾静脈を介してＫＯマウスに投与し
た。最後の酵素の投与の２日後に、その動物を殺し、そして器官をリン酸緩衝化
生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて灌流した。組織ホモジェネートを、ＧＬＵ酵素活
性アッセイおよび組織グリコゲン含量のために作製し、そして種々の器官の薄切
片を、リソソームグリコゲン含量の蓄積を（電子顕微鏡を介して）可視化するた
めに作製した。内部移行されたＡＧＬＵの局在をまた、ヒト胎盤成熟α−グルコ
シダーゼに対するウサギポリクローナル抗体を用いて決定した。

【００９０】この結果は、０．７ｍｇのＡＧＬＵおよび１．７ｍｇのＡＧＬＵの単回用量（
それぞれ実験ＣおよびＡ）が、静脈内に注入した場合、２つのノックアウトマウ
スの群の種々の器官において、インビボで効率的に取り込まれることを示した。
実験Ａはまた、２つの独立したウサギ乳汁供給源から精製したＡＧＬＵの取り込
みおよび分布には違いがないことを示した。

【００９１】ＡＧＬＵ活性における増加は、肝臓、脾臓、心臓、および骨格筋のような器官
において見られたが、脳においては見られなかった。２つのＫＯ動物に対する１
．７ｍｇのＡＧＬＵの単回注射の２日後に、２つのＰＢＳ注射した正常コントロ
ールマウスまたは２つの異種ＫＯマウスの器官において観察される内因性のα−
グルコシダーゼ活性レベルに近いかまたはずっと高いレベルを、観察した（実験
Ａ）。試験された器官のうち、肝臓および脾臓は、定量的に、取り込みに関わる
主要な器官であるが、心筋および胸筋ならびに大腿筋もまた、有意な量の酵素を
取り込む。脳組織における有意な増加の欠如は、ＡＧＬＵが血液脳関門を通過し
ないことを示唆する。この結果を、表２において要約する。

【００９２】

【表２】２匹のＫＯマウスに、６日毎に４回注射（実験Ｂ）し、全細胞グリコーゲンの
顕著な減少を、心臓および肝臓の両方において観察した。骨格筋組織における全
グリコーゲンに関する効果は、観察されなかった。しかし、一般的に、これらの
組織におけるＡＧＬＵの取込みは、試験された他の組織よりもより低かった。

【００９３】４回注射されたＫＯマウスの透過型電子顕微鏡は、肝細胞および心筋細胞の両
方におけるリソソームのグリコーゲンの顕著な減少を示した。心臓のいくつかの
領域では、リソソームのグリコーゲンの減少が、これらの短期間の投与の後に観
察されなかったので、心臓組織において観察された効果は、局在していた。

【００９４】ヒト胎盤成熟α−グルコシダーゼに対するウサギポリクローナル抗体を用いた
ウエスタンブロット分析は、試験された全ての器官の成熟酵素に対して注射され
たＡＧＬＵ完全なプロセシングを示した。このことは標的組織への取込み、なら
びにリソソームへの局在およびプロセシングを強く示唆している。毒性効果は、
３回の実験のいずれおいて観察されなかった。

【００９５】ＡＧＬＵの免疫組織化学的染色は、ヒトα−グルコシダーゼに対するポリクロ
ーナルウサギ抗体を用いた肝実質細胞のリソソームにおいて明白であった。心臓
および骨格組織におけるＡＧＬＵの存在は、より低い取込みのために明らかに、
この技術を用いた可視化にはより困難である。

【００９６】（２．ＫＯマウスモデルを用いた長期実験）長期実験において、酵素を、１週間に１回、２５週までの期間、２または３匹
のＫＯマウスの群の尾静脈に注射した。最初の用量は、２ｍｇ／マウス（６８ｍ
ｇ／ｋｇ）、続いて１２週間に渡って０．５ｍｇ／マウス（１７ｍｇ／ｋｇ）で
あった。マウスの２つの群においては、さらに４週またはさらに１１週のいずれ
かで、マウス当たり２ｍｇの処置が続いた。注射を、マウスが、６〜７月齢のと
きに開始した。この齢のとき、ＫＯモデルにおいて明確な組織病理学を行った。
最後の酵素投与の２日後に、動物を殺し、そして器官をリン酸緩衝化生理食塩水
を用いて灌流した。組織ホモジネートを、ＡＧＬＵ酵素活性アッセイおよび組織
グリコーゲン含量のために作製し、そして種々の器官の切片を、リソソームのグ
リコーゲン蓄積を（光学顕微鏡を介して）可視化するために作製した。

【００９７】結果は、０．５ｍｇ／マウスで１３週間処理したマウス（群Ａ、３動物／群）
が、肝臓および脾臓における活性の上昇ならびに肝臓およびおそらく心臓におい
てグリコーゲンレベルの減少を有することを示した。１匹の動物は、筋肉におけ
る顕著なグリコーゲンの減少がなかったが、筋肉において上昇した活性を示した
。

【００９８】０．５ｍｇ／マウスで１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで４週間処置したマウ
ス（群Ｂ、３動物／群）は、上昇した活性が心臓および骨格筋において測定され
、そしてグリコーゲンレベルの減少が脾臓でもまた見られたことを除いて、１３
週間のみ処置されたマウスと同様の結果を示した。

【００９９】０．５ｍｇ／マウスで１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで１１週間処置したマ
ウス（群Ｃ、２動物／群）は、処置したマウスが、肝臓、脾臓、心臓および骨格
筋のグリコーゲンレベルにおいて明確な減少を示したことを除いて、他の２群と
同様の結果を示した。脳においては、最も高い用量であっても、活性化を検出し
得なかった。

【０１００】各群（群の平均）における処置した動物および処置していない動物の結果を、
表３に要約する。

【０１０１】

【表３】さらに、組織病理学的な症状における非常に確証的な改良を、群Ｃのマウス（
０．５ｍｇ／マウスで最初の１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで１１週間の処置
）で観察した。病理学の明らかな逆転が、種々の組織（例えば、心臓および胸筋
）において示された。

【０１０２】残留したリソソームのα−グルコシダーゼ活性が、平均コントロール値（１４
）の２０％より大きい場合、ポンペ病は起こらないと報告されている。ＫＯマウ
スのモデルを用いて得られたデータは、これらのレベルが、組換え前駆体酵素を
用いて非常に十分達成可能であることを示す。

【０１０３】（実施例５：ヒト臨床試験）単一（ｓｉｎｇｌｅ）フェーズＩ研究（ＡＧＬＵ１１０１−０１）を、１５人
の健康な男性ボランティアにおいて実施した。ＡＧＬＵの用量は、２５〜８００
ｍｇの範囲で、静脈内注入によって健康な男性成人ボランティアに投与した。ア
レルギーおよび過敏症の病歴を有する被験体は、本研究から除外した。被験体を
、５つの用量群に無作為化し、そしてＡＧＬＵを受ける各用量群（４被験体）ま
たは各用量レベルのプラセボ（１被験体）に無作為化した。全ての被験体は、２
用量の研究薬物を受け、これは、２週間をおいて投与した。用量のレジメンは以
下の通りである：Ａ２５ｍｇ：群１、処置期間１Ｂ５０ｍｇ：群１、処置期間２Ｃ１００ｍｇ：群２、処置期間１Ｄ２００ｍｇ：群３、処置期間１Ｅ４００ｍｇ：群２、処置期間２Ｆ８００ｍｇ：群３、処置期間２Ｐプラセボ（１群および処置期間当たり１被験体）。

【０１０４】被験体に、各処置期間の１日目に、注入としてＡＧＬＵまたはプラセボを投与
した。注入は、３０分間の時間にわたって投与し、そして被験体を、注入の中止
後少なくとも２時間の間、半横臥の位置に保持した。

【０１０５】有害事象を、注入開始の直前、３０分（注入の最後）に、ならびにその後３、
１２、２４、３６および４８時間に、その後ならびに５および８日目（第１期間
）、ならびに５、８および１５日目（第２期間）に記録した。生命徴候、ＥＣＧ
および身体的な診察もまた、処置期間を通して定期的にモニターした。

【０１０６】血液サンプルを、標準的な範囲の臨床的な実験室試験および薬物動態分析のた
めに採取した。被験体の尿を収集し、そして標準的な範囲の実験室分析を行った
（ＡＧＬＵの決定を含む）。

【０１０７】（ａ）実験室安全性および有害事象任意の用量群の任意の被験体において、実験室パラメーター、臨床的徴候およ
びＥＣＧ測定の臨床的に有意な変化はなかった。全ての用量の全ての被験体でモ
ニタリングした有害事象の結果を、表４に要約する。

【０１０８】

【表４】ＩＩ型糖原病を有する乳児患者および若年患者の酵素置換療法としての組換え
酸性α−グルコシダーゼの安全性および効果に関する試験を実施した。４人の乳
児患者および３人の若年患者を募集した。乳児に、滴定された１５〜２０ｍｇ／
ｋｇの開始用量〜４０ｍｇ／ｋｇを投与し、そして若年者には１０ｍｇ／ｋｇを
投与する。患者を、２４週間処置する。

【０１０９】患者を以下のパラメーターによって評価した。

【０１１０】・疑わしい有害事象を含む、報告された標準的な有害事象・血液学、臨床化学および抗体検出を含む実験室パラメーター・筋におけるα−グルコシダーゼ活性・筋組織病理学・１２−リードＥＣＧ（１２−ｌｅａｄＥＣＧ）・神経学的検査を含む臨床状態・ノンパラメトリックなＰＫパラメーター・救命（ｌｉｆｅｓａｖｉｎｇ）の介入幼児患者は、以下のさらなるパラメーターについて評価する。

【０１１１】・左後部の心室壁の厚さおよび左心室質量インデックス（ｍａｓｓｉｎｄｅ
ｘ）・神経筋の発達・生存・筋内のクリゴーゲン含量若年患者を、以下のさらなるパラメーターについて評価する。

【０１１２】・肺機能・筋の強度／回数試験および筋機能・ＰＥＤＩ／Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ９−アイテムスケール（ｉｔｅｍｓｃａ
ｌｅ）次に、同じ患者をαグルコシダーゼのさらなる投与に供し、乳児は１５、２０、
３０または４０ｍｇ／ｋｇを受け、そして若年者には、２４週間のさらなる期間
に対して１０ｍｇ／ｋｇを用いかつ上記に示したパラメーターによって評価した
。

【０１１３】さらなるフェーズＩＩ臨床試験を、齢が６ヶ月未満の８人の患者に、診断後の
２ヶ月以内の投薬量が４０ｍｇ／ｋｇで実施する。患者を２４週間の間処置し、
次の診断基準によって評価する：安全性パラメーター実験室安全性データ記録した有害事象初期効果パラメーター：正常または穏和な遅延性の運動機能（ｍｏｔｏｒｆ
ｕｎｃｔｉｏｎ）を組合せた診断後６ヶ月の、救命の介入（すなわち、２４時間
より長い機械的人工呼吸器）無しでの生存（ＢＳＩＤＩＩ）。

【０１１４】第２次効果：神経筋発達における変化；左後部の心室壁の厚さおよび左心室質
量インデックスにおける変化；骨格筋酸性α−グルコシダーゼ活性およびグリコ
ーゲン含量における変化。

【０１１５】効果は、正常遅延または穏和な遅延として分類されたＢＳＩＤＩＩと組合せ
た背景（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）コントロール群における１０％の生存に比較し
た場合、α−グルコシダーゼ群中へ救命の介入無しに診断後６ヶ月において５０
％の生存であることによって示され得る。

【０１１６】さらなる臨床試験を若年患者に実施した。患者は、年齢が１歳より大きくかつ
３５歳未満であり、ＩＩｂ型ＧＳＤの若年発症を有する。患者に、２４週間の処
置期間の間、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで投与した。処置は、以下の
パラメーターによってモニターした。安全性パラメーター実験室安全性データ記録した有害事象初期効果肺機能パラメーター（例えば、ＦＶＣ、人工呼吸器上の時間）筋強度第２次効果救命の介入パラメーター生活の質骨格筋酸性α−グルコシダーゼ活性定量的目標ベースラインを超えた初期効果パラメーターにおける２０％の相対
的改善効果に関する全ての定量的測定は、好ましくは、同時発生するコントロールまた
は背景のコントロールに対して統計学的に顕著であり、好ましくは、ｐが０．０
５未満である。

【０１１７】（実施例６薬学的処方物） α−グルコシダーゼを以下のように処方した：５ｍｇ／ｍｌ □−Ｇｌｕ、１
５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｗ）マンニトール、および
０．５％（ｗ／ｗ）スクロース。上記の処方物を最終体積１０．５ｍｌに満たし
て２０ｃｃチュービングバイアルに入れ、そして凍結乾燥した。放出および臨床
使用の試験に関しては、注射のために各バイアルを１０．３ｍｌの滅菌生理食塩
水（０．９％）を用いて再構築し（ＵＳＰまたは当量）、１０．５ｍｌの５ｍｇ
／ｍｌ □−Ｇｌｕ溶液を生じ、これを、直接投与し得るか、または患者特異的
な標的用量濃度に滅菌生理食塩水を用いて引き続いて希釈し得る。１０．５ｍｌ
一服（バイアル中に総αグルコシダーゼが５２．５ｍｇ）は、ＵＳＰが推奨する
過剰量を含み、これは１０ｍｌ（５０ｍｇ）の抽出および送達（または、移動）
を可能にする。マンニトールは、適切なバルキング薬剤として機能を果たし、（
スクロース単独と比較して）凍結乾燥サイクルを短くする。スクロースは、クリ
オ／リオプロテクタント（ｃｒｙｏ／ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として機能
を果たし、再構築後の凝集の有意な上昇を生じない。マンニトール（単独）処方
物の再構築は、繰り返して、凝集のわずかな上昇を生じた。凍結乾燥後、ケーキ
クオリティ（ｃａｋｅｑｕａｌｉｔｙ）は、受容可能であり、そして引き続く
再構築の回数は、有意に減少した。注入溶液のために、ＨＳＡ／デキストロース
のよりも、生理食塩水が好ましい。生理食塩水が、２％マンニトール／０．５％
スクロース中での凍結乾燥と組合せて使用される場合、溶液は、静脈投与に関し
て受容可能な張度を有する。２％マンニトール／０．５％スクロース処方物を含
む凍結乾燥されたバイアルを、０．９％の滅菌生理食塩水（注射のための）を用
いて再構築し、５ｍｇ／ｍｌ □−Ｇｌｕを生じる。

【０１１８】（実施例７：注入スケジュール）溶液を、留置の静脈カミューレを介して投与する。患者を、注入期間中、近接
にモニターし、そして、有害事象または有害事象と疑われる事象において適切な
臨床的介入をとる。４８時間のウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を、各注入に関して
可能にする。注入の比率を回数と共に増加させた注入スケジュールによって、有
害事象を減少または排除する。

【０１１９】乳児に対する注入を、以下のスケジュールに従って投与し得る：・６０分間、５ｃｃ／時間・６０分間、１０ｃｃ／時間・３０分間、４０ｃｃ／時間以上・残りの注入の間、８０ｃｃ／時間以上。

【０１２０】若年者に対する注入を、以下のスケジュールに従って投与し得る：・６０分間、０．５ｃｃ／ｋｇ／時間・６０分間、１ｃｃ／ｋｇ／時間・３０分間、５ｃｃ／ｋｇ／時間・残りの注入の間、７．５ｃｃ／ｋｇ／時間。

【０１２１】前述の発明は、明確さおよび理解の目的のために、いくぶん詳細に記載してき
たが、形式および詳細における種々の変化が、本発明の真の範囲から逸脱するこ
となくなされ得るということは、この開示を読むことより当業者には明らかであ
る。本出願に引用される全ての刊行物および特許文書は、あたかも各個々の刊行
物または特許文書がそのように個々に示される程度まで、全ての目的に関してそ
の全体が参考として援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】酸性α−グルコシダーゼのｃＤＮＡを含む導入遺伝子。αｓ１−カゼインのエ
キソンが、白い四角によって表される；α−グルコシダーゼのｃＤＮＡが、陰を
付けた四角によって表される。αｓ１−カゼインのイントロンおよび隣接配列が
、太線によって表される。細線は、ＩｇＧのアクセプター部位を表す。転写開始
部位は、（１^→）と記され、翻訳開始部位は、（ＡＴＧ）と記され、終始コドン
は、（ＴＡＧ）と記され、そしてポリアデニル化部位は、（ｐＡ）と記される。

【図２】パネルＡ、Ｂ、Ｃ。酸性α−グルコシダーゼのゲノムＤＮＡを含む３つの導入
遺伝子である。暗く陰を付けた領域は、αｓ１カゼイン配列であり、白い四角は
、酸性α−グルコシダーゼのエキソンを表し、そして白い四角の間の細線は、α
−グルコシダーゼのイントロンを表す。他の記号は、図１中の記号と同じである
。

【図３】パネルＡ、Ｂ、Ｃ。ゲノム導入遺伝子の構築。α−グルコシダーゼのエキソン
は、白い四角によって表される；α−グルコシダーゼのイントロンおよび非翻訳
配列は、細線によって示される。ｐＫＵＮベクター配列は、太線によって表され
る。

【図４】ウエスタンブロッティングによる、トランスジェニックマウスの乳汁中の酸性
α−グルコシダーゼの検出。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 47/04 Ａ６１Ｋ 47/18 47/18 47/26 47/26 Ａ６１Ｐ 3/00 Ａ６１Ｐ 3/00 9/04 9/04 11/00 11/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 9/26 // Ｃ１２Ｎ 9/26 Ａ６１Ｋ 37/54 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ファンブレー，ヨハネスブレナルドゥスマティアスマリーオランダ国エヌエル−2153 エーエスニュー−フェネップ，ドッテルブルームストラート 27 (72)発明者フェネケル，エドナアンリエットジェルメーヌオランダ国エヌエル−3952 エーエーマールン，サトゥルナスホーフ 15 (72)発明者ミーカー，デイビッドピー．アメリカ合衆国マサチューセッツ 01942，コンコード，サウスフィールドサークル 39 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA12 CA04 DA02 EA04 EA06 GA12 GA18 HA03 4B050 CC01 CC03 DD11 EE01 FF05E FF12E FF14E KK02 KK07 KK08 KK09 KK19 LL01 LL03 LL05 4C076 AA12 AA99 BB13 CC11 CC15 CC29 DD38 DD51 DD63 DD67 EE30 GG07 4C084 AA02 AA03 AA06 BA44 CA17 CA23 CA53 DC22 MA05 MA17 MA44 MA66 NA14 ZA361 ZA362 ZA591 ZA592 ZC211 ZC212 ZC541 ZC542 4C087 AA02 BB39 CA47 MA05 MA16 MA44 MA66 NA14 ZA36 ZA59 ZC21 ZC54

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポンペ病を有する患者を処置する方法であって、該方法が、
治療的に有効な量のヒト酸性αグルコシダーゼを該患者に投与する工程を包含す
る、方法。
【請求項２】前記患者に、１週間当たり少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ体重で
投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記患者に、１週間当たり少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ体重で
投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記患者に、１週間当たり少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ体重
で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記患者に、１週間当たり単一投薬量のα−グルコシダーゼ
が投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】前記患者に、１週間当たり３投薬量のα−グルコシダーゼが
投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】前記量が、少なくとも２４週の期間にわたって１週間当たり
で投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】前記α−グルコシダーゼが、静脈内に投与される、請求項１
に記載の方法。
【請求項９】前記α−グルコシダーゼが、トランスジェニック哺乳動物の
乳汁中に産生された、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】前記患者が、乳児性ポンペ病を有する、請求項１に記載の
方法。
【請求項１１】前記患者が、少なくとも１歳になるまで生存する、請求項
１０に記載の方法。
【請求項１２】前記患者が、若年性ポンペ病を有する、請求項１に記載の
方法。
【請求項１３】前記患者が、成人性ポンペ病を有する、請求項１に記載の
方法。
【請求項１４】前記α−グルコシダーゼが、主に１１０ｋＤ型である、請
求項１に記載の方法。
【請求項１５】前記患者におけるヒト酸性αグルコシダーゼのレベルをモ
ニタリングする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】前記患者においてα−グルコシダーゼの前記レベルが閾値
未満に低下した場合に、第２投薬量のヒト酸性αグルコシダーゼを投与する工程
をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記ヒトαグルコシダーゼが静脈内に投与され、そして投
与期間の間に投与速度が上昇する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】前記投与速度が、前記投与期間の間に少なくとも１０倍上
昇する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】前記投与速度が、５時間の間に少なくとも１０倍上昇する
、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】前記患者に、一連の少なくとも４投薬量が投与され、各投
薬量は前回の投薬量よりも高い強度である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】前記投薬量が、０．０３〜３ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬
量、０．３〜１２ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、１〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間の
第３投薬量および２〜６０ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、請求項２０に
記載の方法。
【請求項２２】前記投薬量が、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量
、１〜４ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、３〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬
量および６〜２０ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、請求項２１に記載の方
法。
【請求項２３】前記投薬量が、０．２５〜４ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬
量、０．９〜１．４ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、３．６〜５．７ｍｇ／ｋｇ
／時間の第３投薬量および７．２〜１１．３ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量であ
る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記投薬量が、０．３ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、１
ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、４ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量および１２ｍ
ｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】前記第１投薬量、前記第２投薬量、前記第３投薬量および
前記第４投薬量が、１５分間〜８時間の時間にわたって、各々投与される、請求
項２０〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】前記第１投薬量、前記第２投薬量、前記第３投薬量および
前記第４投薬量が、それぞれ、１時間、１時間、０．５時間および３時間の時間
にわたって投与される、請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】滅菌形態の、生理学的に受容可能な緩衝液中にヒト酸性α
グルコシダーゼ、ヒト血清アルブミン、および糖を含む、薬学的組成物。
【請求項２８】リン酸ナトリウム緩衝液中にヒト酸性αグルコシダーゼ、
ヒト血清アルブミン、およびグルコースを含む、請求項２７に記載の薬学的組成
物。
【請求項２９】水溶液中にαグルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロ
ースを含む、薬学的組成物。
【請求項３０】前記糖が、マンニトールおよびスクロースを含み、そして
マンニトールの濃度が前記水溶液の１〜３％ｗ／ｗであり、そしてスクロース
の濃度が前記水溶液の０．１〜１％ｗ／ｗである、請求項２７に記載の薬学的
組成物。
【請求項３１】マンニトールの濃度が２％ｗ／ｗであり、そしてスクロ
ースの濃度が０．５％ｗ／ｗである、請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】水溶液中にヒト酸性グルコシダーゼ、マンニトールおよび
スクロースを含む薬学的組成物を凍結乾燥することによって産生される、凍結乾
燥された組成物。
【請求項３３】薬学的組成物であって、該組成物が、ヒト酸性α−グルコ
シダーゼ、マンニトール、スクロースおよび水溶液を含む第１組成物を凍結乾燥
して第２組成物を産生する工程；ならびに、生理食塩水中で該凍結乾燥された組
成物を再構成して第３組成物を産生する工程によって調製される、薬学的組成物
。
【請求項３４】前記ヒト酸性α−グルコシダーゼが、前記第１組成物およ
び前記第３組成物の両方において５ｍｇ／ｍｌであり、前記マンニトールが、前
記第１組成物において２ｍｇ／ｍｌであり、前記スクロースが、前記第１組成物
において０．５ｍｇ／ｍｌであり、そして前記再構成工程において使用される前
記生理食塩水が、０．９％ｗ／ｗである、請求項３３に記載の薬学的組成物。