PT2318037E - Método de tratamento da doença de armazenamento de glicogénio - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODO DE TRATAMENTO DA DOENÇA DE ARMAZENAMENTO DE

GLICOGÉNIO

CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se, em geral, à Doença de Armazenamento de Glicogénio e, em particular, a composições e compostos adequados para a utilização no tratamento da Doença de Armazenamento de Glicogénio tipo III.

ANTECEDENTES A enzima de desramificação do glicogénio (GDE Glycogen Debranching Enzyme) é uma enzima multifuncional que funciona como 1,4-a-D-glucano: 1,4-a-D-glucano 4-a-D- glicosiltransferase (E.C 2.4.1.25) e amilo-1,6-glucosidase (E.C 3.2.1.33) na degradação de glicogénio. Parte-se do principio de que as duas atividades da enzima de desramificação residem em locais separados numa cadeia única de polipéptidos com uma massa molecular de 174 kDa. 0 domínio da função de estrutura não foi estudado em detalhe (Chen e Burchell, "Glycogen storage disease." Em: "The

Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease", C.R. Scriver et al. , eds., 7a Edição McGraw-Hill/Nova Iorque, págs. 935 a 965 (1995); Bates et al. , FEES Lett. 58:181 a 185 (1975); Gillard et al., Biochemistry 16:3978 a 3987 (1977); Capítulo 71 Kishnani PS, Koeberl D, Chen YT. "Glycogen Storage Diseases", em "The Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Disease", Valle D, Beaudet AL, Vogelstein B, Kinzler KW, Antonarakis SE, Ballabio A, Scriver CR, Sly WS, Childs B, Editors (2008)). A forma predominante de ADNc que codifica a enzima desramificadora humana tem uma região de codificação 4596 bp e uma região 3' não traduzida 2371 bp (Yang et al. , J. Biol. Chem. 267:9294 a 9299 (1992)). A enzima desramificadora específica do tecido ARNms existe. Estas isoformas diferem na região 5' não traduzida e parte-se do principio de que são geradas através da união (splicing) e transcrição ARN diferencial a partir de um único gene da enzima desramif icadora (Bao et al. , Gene 197:389 a 398 (1997)). 0 gene humano encontra-se no cromossoma lp21 (Yang-Feng et al., Genomics 13:931 a 934 (1992)). A estrutura genómica do gene GDE humano foi determinada e consiste em 35 exões que alcançam ~85 kb de ADN. A enzima de desramificação, juntamente com a fosforilase, é responsável pela degradação completa do glicogénio. 0 fígado e o músculo são os dois maiores órgãos mais ativos no metabolismo de glicogénio. A função essencial do glicogénio nestes órgãos é diferente. No músculo, o glicogénio fornece uma reserva de combustível local para consumo de energia a curto prazo. No fígado, mantém a homeostasia da glicose. A deficiência genética da enzima de desramificação do glicogénio (Doença de Armazenamento de Glicogénio tipo III, GSD-III) provoca uma glicogenólise incompleta que resulta na acumulação de glicogénio com uma cadeia exterior anormalmente curta em vários órgãos. Os órgãos geralmente afetados na GSD-III são o fígado, o músculoesquelético e o coração. A doença é caracterizada por hepatomegalia, hipoglicemia, estatura pequena, miopatia variável e cardiomiopatia. Os pacientes com esta doença variam de forma invulgar, tanto clinicamente como enzimaticamente (Markowitz et al., Gastroenterology 105:1882 a 1885 (1993); Shen et al., J. Clin. Invest. 98:352 a 357 (1996); Telente et al., Annals. Intern. Med. 120:218 a 226 (1994)). A maioria dos pacientes tem a doença envolvendo o fígado e o músculo (tipo Illa), alguns pacientes (-15% de todos os pacientes com GSD-III) têm apenas o envolvimento do fígado (tipo Illb) e, em casos raros, existe uma perda seletiva de apenas uma das duas atividades GDE (glicosidase, (tipo 111c) ou transferase (tipo Illd)) . Os sintomas hepáticos na GSD-III podem melhorar com a idade e podem desaparecer após a puberdade. A cirrose hepática evidente foi verificada em alguns pacientes, alguns desenvolveram carcinoma hepatocelular. A fraqueza muscular, embora mínima durante a infância, pode tornar-se predominante nos adultos com os primeiros sintomas na terceira ou quarta década. Estes pacientes têm uma fraqueza proximal lentamente progressiva e um enfraquecimento muscular distai, e alguns pacientes ficam limitados a uma cadeira de rodas. Mesmo no subgrupo de pacientes que desenvolvem miopatia/cardiomiopatia existe uma variabilidade clínica. Alguns pacientes têm cardiomiopatia assintomática, alguns têm cardiomiopatia sintomática prematura causando a morte, e alguns têm apenas envolvimento muscular e nenhum envolvimento cardíaco evidente. Um eletrocardiograma (ECG) anormal com hipertrofia ventricular é uma descoberta frequente e não se correlaciona com a gravidade clínica. Os níveis normais de creatina quinase no soro não excluem a deficiência da enzima muscular. Os subtipos bioquímicos não preveem a gravidade clínica. Não parece existir nenhuma correlação entre a quantidade de proteína da enzima desramificadora e a gravidade clínica (Yang et al. , Am. J. Hum. Genet. 41:A28 (1992)). Para prever com precisão no diagnóstico inicial se é possível a ocorrência de miopatia ou cardiomiopatia, tem de ser determinado se a atividade da enzima de desramificação é deficiente no músculo (Chen e Burchell, "Glycogen storage disease." Em: "The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease", C.R. Scriver et al., eds. , 7a Edição McGraw-Hill/Nova Iorque, págs. 935 a 965 (1995)). Parece que a doença muscular não se desenvolverá em pacientes com atividade GDE mantida no músculo (Coleman et al., "Annals of Internal Medicine" 116:896 a 900 (1992)). O fenótipo variável é, em parte, explicado pelas diferenças na expressão específica do tecido da enzima defeituosa. Conforme mencionado acima, no tipo Ilia, a enzima é defeituosa tanto no fígado como no músculo, em Illb existe deficiência da enzima apenas no fígado. Ao contrário da fosforilase, que tem isoenzimas específicas do tecido codificadas por genes diferentes, ao nível da proteína e ao nível molecular não parecem existir nenhumas isoenzimas GDE específicas do tecido em tecidos diferentes. Até ao momento, não foi compreendido na GSD-III como um único gene GDE, normalmente expressado em todos os tecidos, pode alterar a expressão em tecidos diferentes (Chen e Burchell, "Glycogen storage disease." Em: "The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease", C.R. Scriver et al. , eds., 7a Edição McGraw-Hill/Nova Iorque, págs. 935 a 965 (1995)). Duas mutações (17delAG e G6X), ambas situadas no exão 3 no codão de aminoácido 6, são exclusivamente detetadas na GSD-IIIb (Shen et al., J. Clin. Invest. 98:352 a 357 (1996)) sugerindo que o exão 3 é importante no controlo da expressão específica do tecido do gene GDE. A histologia do fígado nestes pacientes é caracterizada por uma distensão universal de hepatócitos por glicogénio e pela presença de septos fibrosos. Os estudos de microscopia eletrónica sobre os espécimes de músculo mostraram a presença de glicogénio acumulado por baixo do sarcolema e entre miofibrilas; o glicogénio em excesso não só se dispersa no citoplasma, como também é observado nos lisossomas (Cornelio et al. , Arch. Neurol. 41:1027 a 1032 (1984), Miranda et al., Ann. Neurol. 9:283 a 288 (1981)). A biologia estrutural detalhada de GDE não é conhecida, embora tenham sido propostos diversos domínios funcionais da enzima de desramificação do glicogénio a partir dos estudos enzimológicos e da comparação da sequência com outras enzimas com uma função catalítica semelhante (Yang et al., J. Blol. Chem. 267:929409299 (1992), Liu et al., Archives of Biochemistry and Biophysics 306:232 a 239 (1993), Liu et al., Biochemistry 34:7056 a 7061 (1995), Jespersen et al., Journal of Protein Chemistry 12(6):791 a 805 (1993)). Uma região no terminal COOH da enzima de desramificação pode ser um candidato para o local de ligação do glicogénio (Yang et al., J. Biol. Chem. 267:9294 a 9299 (1992)), e 4 regiões na metade N-terminal da enzima suportam a homologia da sequência para os locais catalíticos identificados ou propostos noutras enzimas amilolíticas (Liu et al. , Archives of Biochemistry and Biophysics 306:232 a 239 (1993), Jespersen et al. , Journal of Protein Chemistry 12(6):791 a 805 (1993)). 0 aspartato na posição 549 foi identificado como o nucleófilo catalítico no local de transferase da enzima de desramificação do glicogénio muscular de coelho (Braun et al., Biochemistry 35:5458 a 5463 (1996)).

Atualmente, não existe nenhum tratamento eficaz para a doença. A hipoglicemia pode ser controlada por refeições frequentes com alto teor de hidratos de carbono com suplementos de amido de milho ou administrações intravenosas gástricas à noite. Os pacientes com miopatia foram submetidos a dietas com alto teor de proteínas durante o dia mais uma infusão entérica durante a noite. Em alguns pacientes, a melhoria transitória nos sintomas foi documentada, mas não existem nenhuns dados a longo prazo que demonstrem que a dieta com alto teor de proteínas previne ou trata a miopatia progressiva (Chen e Burchell, "Glycogen storage disease." Em: "The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease", C.R. Scriver et al. , eds. , 7a Edição Mc-Graw-Hill/Nova Iorque, págs. 935 a 965 (1995)). A miopatia progressiva e/ou cardiomiopatia é uma das causas principais da morbidade nos adultos, e foram referidos pacientes com cirrose hepática progressiva e carcinoma hepático. Embora uma administração de terapia genética de um gene normal e funcional no órgão doente possa, em última análise, curar a doença, atualmente não há nenhum veículo de administração de genes ideal disponível que seja fidedigno. Não existe nenhum modelo de animal vivo para esta doença. Os cães afetados com GSD-III foram comunicados (Gregory et al. , J. Vet. Intern. Med. 21(1):40 a 46 (2007)), e está atualmente a ser estabelecida uma colónia de reprodução. A terapia de substituição enzimática tem sido eficaz nas doenças em que as enzimas/proteínas responsáveis exercem as respetivas funções nos fluidos extracelulares, tais como deficiência de adenosina desaminase, hemofilia e deficiência de αΐ-antitripsina, ou numa localização lisossomal, tal como uma doença de armazenamento lisossomal. A substituição enzimática não foi explorada nas doenças em que a enzima defeituosa está presente em citosol (tal como a enzima de desramificação em GSD-III), presumivelmente devido à falta de um mecanismo de absorção celular eficaz e específico que distribui enzima exógena através da membrana de plasma no citoplasma. Os lipossomas podem fundir-se na membrana de plasma e distribuir o respetivo conteúdo, mas a utilização de lipossomas é comprometida pela falta de remoção e tropismo específico do órgão através do sistema reticuloendotelial (Mumtaz et al., Glycobiology 1(5):505 a 510 (1991)). Para um tratamento eficaz de GSD-III, a enzima deve ser capaz de visar o músculo e o coração, bem como o fígado. O glicogénio citoplasmático é normalmente digerido pela fosforilase e a enzima de desramificação; o glicogénio em excesso absorvido pelos lisossomas através de autofagia pode ser digerido por α-glicosidase ácida (GAA) lisossomal. A deficiência da atividade da enzima de desramificação resulta na acumulação em massa de glicogénio com ramificações exteriores anormalmente curtas. O glicogénio em excesso em GSD-III reside não só no citoplasma, como também nos lisossomas (citoplasma > lisossoma) (Cornelio et al. , Arch. Neurol. 41:1027 a 1032 (1984), Miranda et al. , Ann. Neurol. 9:283 a 288 (1981)). Isto sugere que a atividade GAA "normal" em GSD-III pode não ser suficiente para digerir todo o glicogénio em excesso. GAA é uma exo 1,4-a-D-glicosidase lisossomal que hidrolisa as ligações a-1,4 e oí-1,6 de glicogénio e pode digerir completamente o glicogénio com e sem ramificações exteriores anormalmente curtas (Onodera et al., J. Biochem. 116:7-11 (1994)). Deste modo, GAA atua no glicogénio com ramificações exteriores anormalmente curtas, de modo a acumular-se em GSD-III. Uma vez que este glicogénio em GSD-III se acumula tanto no citoplasma como nos lisossomas, o fornecimento de mais GAA pode ajudar a digerir o glicogénio lisossomal e, por isso, igualmente o glicogénio citoplasmático. É exigido que, à medida que o glicogénio é removido dos lisossomas, o glicogénio do citoplasma se misture nos mesmos, diminuindo assim a quantidade total de glicogénio acumulado nos pacientes com GSD-III. A deficiência de GAA causa a doença de Pompe (doença de armazenamento de glicogénio tipo II), uma miopatia metabólica fatal com acumulação de glicogénio no lisossoma e no citoplasma (lisossoma > citoplasma) (Hirschhorn, "Glycogen Storage Disease Type II: Acid α-glucosidase (Acid Maltase) Deficiency." Em: "The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease", C.R. Scriver et al., eds., 7a Edição McGraw-Hill/Nova Iorque, págs. 2443 a 2464 (1995)). A terapia de substituição enzimática com GAA humana recombinante precursora rica em manose-6-Fosfato (man-6-F) resulta na endocitose mediada pelo recetor man-6-F eficaz da enzima seguida pela redução do glicogénio lisossomal e citoplasmát ico nos fibroblastos (Van Hove et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 93:65 a 70 (1996)). In vivo, esta enzima visa o coração e o músculo, bem como o fígado e o baço, a seguir à injeção intravenosa em animais e em pacientes humanos com a doença de Pompe. A remoção rápida do glicogénio nos fibroblastos com a doença de Pompe quando cultivados num meio livre de glicose sugere uma mobilização fácil do glicogénio de ambos os compartimentos lisossomal e citoplasmát ico (Van Hove et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 93:65 a 70 (1996), DiMauro et al., Pedatr. Res. 7:739 a 744 (1973)). Parte-se do princípio de que o glicogénio citoplasmático se mistura continuamente através dos lisossomas mediante a autofagia para degradação. A presente invenção resulta, pelo menos em parte, da compreensão de que a GAA administrada pode reduzir o glicogénio lisossomal em pacientes com GSD-III e, em última análise, reduzir igualmente o glicogénio citoplasmático. Alguma da GAA administrada também pode entrar diretamente no citosol e reduzir o glicogénio. A invenção permite o tratamento da GSD-III com base na utilização de GAA.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente a GSD. Mais especificamente, um primeiro aspeto da invenção fornece a-glicosidase ácida humana para a utilização no tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo III num indivíduo, mediante a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz num intervalo regular, de preferência, mensalmente, duas vezes por mês, semanalmente, duas vezes por semana ou diariamente.

Um segundo aspeto da invenção fornece a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de a-glicosidase ácida humana para o fabrico de um medicamento para o tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo III num indivíduo, o referido medicamento sendo preferencialmente preparado para ser administrado num intervalo regular, ou seja, mensalmente, duas vezes por mês, semanalmente, duas vezes por semana ou diariamente. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 . O aspeto microscópico de luz da biopsia

musculoesquelética de um paciente com GSD-IIIa. O glicogénio com coloração púrpura está presente como lagos citoplasmáticos nos miócitos. 0 glicogénio não é ligado à membrana nos lisossomas, mas circula livremente no citoplasma.

Figura 2. Glicogénio citoplasmático formando lagos no miócito em EM num paciente com GSD-III.

Figura 3. 0 glicogénio lisossomal foi observado no miócito de um paciente com GSD-III.

Figuras 4A e 4B. Padrão de acumulação de glicogénio nas células musculares obtidas a partir de uma pessoa normal e 3 pacientes com GSD-III. As culturas duplicadas foram colhidas nos momentos indicados. A atividade GAA celular (Fig. 4A) e o teor de glicogénio (Fig. 4B) foram determinados nos duplicados para cada cultura (média ± DP).

Figuras 5A e 5B. Depleção de glicogénio nas células musculares não tratadas mediante inanição de glicose. A atividade GAA (Fig. 5A) e o teor de glicogénio (Fig. 5B) foram analisados nas células musculares com GSD-III após uma cultura de 48 horas (entre o Dia 13 e o Dia 15) no meio de diferenciação com (c/) glicose ou sem (s/) glicose (*, valor p <0,01; **, p <0,001).

Figuras 6A e 6B. Absorção de rhGAA e redução de glicogénio nas células musculares com GSD-III após um tratamento de 48 horas (entre o Dia 13 e o Dia 15) com 100 pg de rhGAA. As células musculares da pessoa normal foram tratadas entre o Dia 7 e o Dia 10 (*, valor p <0,05; **, p <0,005; ***, p <0,001).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao tratamento de GSD-III através da administração de GAA a um indivíduo que sofre da doença. A invenção refere-se igualmente à utilização da enzima, GAA, no fabrico de um medicamento para o tratamento de GSD-III. Conforme aqui descrito, os pacientes que sofrem de, por exemplo, GSD-III podem ser tratados mediante a administração de GAA numa base regular. É esperado que os pacientes tratados deste modo apresentem uma melhoria em termos de hipoglicemia, hepatomegalia, função hepática, estado cardíaco e/ou força muscular, bem como uma redução dos níveis de glicogénio no tecido. A invenção torna possível o tratamento de GSD-III, incluindo GSD tipo Ilia, tipo Illb, tipo IIIc ou tipo Illd.

Os termos "tratar" e "tratamento", conforme aqui utilizado, referem-se ao melhoramento de um ou mais sintomas associados à doença, à prevenção ou ao adiamento do início de um ou mais sintomas da doença, e/ou à diminuição da gravidade ou frequência de um ou mais sintomas da doença. Por exemplo, o tratamento pode referir-se a melhoramento da hipoglicemia, atraso de crescimento, hepatomegalia e função hepática (p. ex., redução de SGOT, SGPT); estado cardíaco (p. ex., redução, melhoramento ou prevenção da cardiomiopatia progressiva, arritmia e outras manifestações cardíacas que podem ser encontradas em GSD-III), miopatia (p. ex., tolerância ao exercício), redução dos níveis de glicogénio no tecido (p. ex., fígado e músculo) do indivíduo afetado pela doença, ou qualquer combinação destes efeitos. Além disso, o tratamento pode prevenir complicações a longo prazo, tais como cirrose hepática, carcinoma hepatocelular devido à remoção de glicogénio com uma estrutura anormal. Numa forma de realização preferida, o tratamento inclui o melhoramento de sintomas hepáticos, particularmente, na redução ou prevenção de hipoglicemia associada a GSD-III, hepatomegalia e função hepática anormal. Os termos "melhorar", "prevenir" ou "reduzir, conforme aqui utilizado, indicam valores que são relativos a uma medição de linha de base, tal como uma medição no mesmo indivíduo antes da iniciação do tratamento aqui descrito, ou uma medição num indivíduo de controlo (ou múltiplos indivíduos de controlo) na ausência do tratamento aqui descrito. Um indivíduo de controlo é um indivíduo com a mesma forma da doença GSD-III do indivíduo que está a ser tratado, que tem aproximadamente a mesma idade do indivíduo que está a ser tratado (para garantir que os estádios da doença no indivíduo tratado e no(s) indivíduo(s) de controlo são comparáveis). 0 indivíduo que está a ser tratado pode ser um indivíduo (um ser humano bebé, criança, adolescente ou adulto) com GSD-III. 0 indivíduo pode ter uma atividade GDE residual ou nenhuma atividade que possa ser medida. Noutra forma de realização preferida, o indivíduo é um indivíduo que foi recentemente diagnosticado com a doença. 0 tratamento precoce (tratamento que começa o mais cedo possível após o diagnóstico) é importante para minimizar os efeitos da doença e para maximizar os benefícios do tratamento.

De acordo com a invenção, é administrada GAA (preferencialmente, GAA humana) no indivíduo. A GAA encontra-se numa forma que, quando administrada, visa tecidos, tais como os tecidos afetados pela doença (p. ex., fígado, coração ou músculo). Numa forma de realização preferida, a GAA humana é administrada na respetiva forma precursora, uma vez que o precursor contém motivos que permitem uma absorção eficaz mediada pelo recetor de GAA. Em alternativa, é possível administrar uma forma madura de GAA humana que foi modificada para conter motivos para permitir uma absorção eficaz de GAA nas células. Numa forma de realização particularmente preferida, a GAA é a forma precursora de GAA humana recombinante. A GAA pode ser obtida a partir de uma variedade de origens. Numa forma de realização particularmente preferida, é utilizada a α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) produzida nas culturas de células de ovário de hamster chinês (CHO) (consulte, p. ex., Fuller, M. et al., Eur. J. Biochem. 234:903 a 909 (1995); Van Hove, J. L. K. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 93:65 a 70 (1996) e o documento USP 7.056.712) . A produção de GAA em células CHO produz um produto com uma glicosilação que permite uma absorção significativa e eficaz de GAA nos tecidos, tais como coração e músculo. MYOZYME (alfa-alglicosidase) (Genzyme Corp.), ou outra GAA humana recombinante, pode ser utilizado de acordo com a invenção. A GAA tem uma atividade de enzima específica que varia entre cerca de 1,0 e 8,0 :mol/min/mg de proteína, preferencialmente varia entre cerca de 4,0 e 8,0 :mol/min/mg de proteína. Numa forma de realização preferida, a GAA tem uma atividade de enzima específica de, pelo menos, cerca de 1,0 :mol/min/mg de proteína; mais preferencialmente, uma atividade de enzima específica de, pelo menos, cerca de 4,0 :mol/min/mg de proteína; ainda mais preferencialmente, uma atividade de enzima específica de, pelo menos, cerca de 6,0 pmol/min/mg de proteína; e mais preferencialmente ainda, uma atividade de enzima específica de, pelo menos, cerca de 8,0 pmol/min/mg de proteína. A GAA pode ser administrada sozinha, ou em composições ou medicamentos compreendendo a GAA, conforme aqui descrito. As composições podem ser formuladas com um excipiente ou portador fisiologicamente aceitável para preparar uma composição farmacêutica. O portador e a composição podem ser estéreis. A formulação deve adaptar-se ao modo de administração.

Os portadores farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não se limitam a, água, soluções salinas (p. ex., NaCl), soro fisiológico, soro fisiológico tamponado, álcoois, glicerol, etanol, goma-arábica, óleos vegetais, álcoois benzílicos, polietilenoglicóis, gelatina, hidratos de carbono, tais como lactose, amilose ou amido, açúcares, tais como manitol, sacarose ou outros, dextrose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, óleo de perfume, ésteres de ácidos gordos, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona, etc., bem como combinações dos mesmos. Se desejado, as preparações farmacêuticas podem ser misturadas com agentes auxiliares, p. ex. , lubrificantes, conservantes, estabilizadores, agentes de humedecimento, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, substâncias de corantes, aromatizantes e/ou aromáticas, e afins, gue não reagem deleteriamente com os compostos ativos. Numa forma de realização preferida, é utilizado um portador solúvel em água adeguado para administração intravenosa.

Se desejado, a composição ou o medicamento também pode conter guantidades menores de agentes emulsionantes ou de humedecimento, ou de agentes de tamponamento pH. A composição pode ser uma solução liguida, uma suspensão, uma emulsão, um comprimido, uma drageia, uma cápsula, uma formulação de libertação prolongada ou um pó. A composição também pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes tradicionais e portadores, tais como triglicéridos. A formulação oral pode incluir portadores normais, tais como classes farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. A composição ou o medicamento pode ser formulado de acordo com os procedimentos habituais como uma composição farmacêutica adaptada para a administração nos seres humanos. Por exemplo, numa forma de realização preferida, uma composição para a administração intravenosa é habitualmente uma solução em tampão aguoso isotónico estéril. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente de solubilização e um anestésico local para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos em separado ou misturados uns com os outros na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água num recipiente hermeticamente selado, tal como uma ampola ou saqueta, com a indicação da quantidade de agente ativo. Quando a composição tiver de ser administrada por infusão, a mesma pode ser distribuída com um frasco de infusão contendo água de classe farmacêutica estéril, soro fisiológico ou dextrose/água. Quando a composição é administrada por injeção, é possível fornecer uma ampola de água estéril para injeção ou soro fisiológico, de modo a que os ingredientes possam ser misturados antes da administração. A GAA pode ser formulada como formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com grupos amino livres, tais como os derivados de ácidos clorídricos, fosfóricos, acéticos, oxálicos, tartáricos, etc., e os formados com grupos carboxilo livres, tais como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, hidróxidos de ferro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaina, etc. A GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) é administrada por uma via apropriada. Numa forma de realização, a GAA é administrada de forma intravenosa. Noutras formas de realização, a GAA é administrada por administração direta num tecido-alvo, tal como coração ou músculo (p. ex. , intramuscular) . Ainda noutra forma de realização, a GAA é administrada oralmente. Se desejado, é possível utilizar mais de uma via em simultâneo. A GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) pode ser administrada sozinha, ou em conjunto com outros agentes, tais como anti-histaminas (p. ex., difenidramina) ou imunossupressores ou outros agentes imunoterapêuticos que contrariam os anticorpos anti-GAA. As estratégias possíveis de imunomodulação incluem indução de tolerância preventiva com iniciação de terapia, ou modulação de tolerância após o desenvolvimento de anticorpos inibitórios. 0 termo "em conjunto com" indica que o agente é administrado aproximadamente ao mesmo tempo da GAA (ou composição contendo GAA) . Por exemplo, o agente pode ser misturado numa composição contendo GAA e, desse modo, administrado em simultâneo com a GAA; em alternativa, o agente que pode ser administrado em simultâneo, sem mistura (p. ex., mediante administração "a reboque" do agente na linha intravenosa através da qual a GAA é igualmente administrada, ou vice-versa). Noutro exemplo, o agente pode ser administrado separadamente (p. ex., não misturado), mas num curto período de tempo (p. ex., em 24 horas) de administração da GAA. Numa forma de realização, a GAA (ou composição contendo GAA) é administrada em conjunto com um regime imunossupressor ou imunoterapêutico concebido para reduzir as quantidades de, ou prevenir a produção de, anticorpos anti-GAA. Por exemplo, é possível utilizar um protocolo semelhante aos utilizados nos pacientes com hemofilia (Nilsson, I. M. et al. , N. Engl. J. Med. 318:947 a 50 (1988)) para reduzir os anticorpos anti-GAA. Numa forma de realização particularmente preferida, o regime imunossupressor ou imunoterapêutico é iniciado antes da primeira administração de GAA, de modo a minimizar a possibilidade de produção de anticorpos anti-GAA. Como um exemplo, é possível a utilização de Rituximab, que elimina células B maduras que expressam CD20, de metotrexato, que atua tanto nas células B como T, ou de diferentes combinações desses agentes (Mendehlson et al., N. Engl. J. Med. 360(2): 194 a 195 (2009)). A GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) é administrada numa quantidade terapeuticamente eficaz (isto é, uma quantidade de dosagem que, quando administrada, por exemplo, em intervalos regulares, é suficiente para tratar a doença, tal como melhorando os sintomas associados à doença, prevenindo ou adiando o início da doença, e/ou igualmente diminuindo a gravidade ou frequência dos sintomas da doença, conforme descrito acima). A quantidade que será terapeuticamente eficaz no tratamento da doença irá depender da natureza e do grau dos efeitos da doença, e pode ser determinada através de técnicas clinicas padrão. Além disso, os ensaios in vitro ou in vivo podem ser opcionalmente utilizados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideais. A dose precisa que deve ser utilizada também pode depender da via de administração, bem como da gravidade da doença, e deve ser decidida de acordo com avaliação de um médico e das circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir das curvas dose-resposta obtidas a partir de sistemas de teste em modelo de animal ou in vitro. Numa forma de realização preferida, a quantidade terapeuticamente eficaz é inferior a cerca de 40 mg de enzima/kg de peso corporal do indivíduo, preferencialmente varia entre cerca de 1 e 40 mg de enzima/kg de peso corporal, e ainda mais preferencialmente é de cerca de 20 mg de enzima/kg de peso corporal ou de cerca de 10 mg de enzima/kg de peso corporal. A dose eficaz para um determinado indivíduo pode ser alterada (p. ex., aumentada ou diminuída) ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo. Por exemplo, em alturas de doença física ou stress, ou se surgirem ou aumentarem anticorpos anti-GAA, ou se os sintomas da doença piorarem, a quantidade pode ser aumentada. A quantidade terapeuticamente eficaz da GAA (ou composição ou medicamento contendo GAA) pode ser administrada em intervalos regulares, dependendo da natureza e do grau dos efeitos da doença, e numa base contínua. A administração num "intervalo regular", conforme aqui utilizado, indica que a quantidade terapeuticamente eficaz é administrada periodicamente (fazendo a distinção de uma dose única). O intervalo pode ser determinado através de técnicas clínicas padrão. Nas formas de realização preferidas, a GAA é administrada mensalmente, duas vezes por mês, semanalmente, duas vezes por semana ou diariamente. 0 intervalo de administração para um único indivíduo não necessita de ser um intervalo fixo, mas pode ser alterado ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo. Por exemplo, em alturas de doença física ou stress, se surgirem ou aumentarem anticorpos anti-GAA, ou se os sintomas da doença piorarem, o intervalo entre doses pode ser diminuído.

Numa forma de realização preferida, a quantidade terapeut icamente eficaz de 20 mg de enzima/kg de peso corporal é administrada duas vezes por mês. Noutra forma de realização preferida, uma quantidade terapeuticamente eficaz de 10 mg de enzima/kg de peso corporal é administrada semanalmente, ou uma quantidade de 5 mg de enzima/kg de peso corporal é administrada duas vezes por semana. A invenção refere-se adicionalmente a uma composição farmacêutica compreendendo GAA humana, conforme aqui descrito, num recipiente (p. ex., um recipiente de vidro, um frasco, um saco para administração intravenosa, uma seringa, etc.) com um rótulo que contém instruções de administração da composição para o tratamento de GSD-III, tal como através dos métodos aqui descritos.

Determinados aspetos da invenção são descritos mais detalhadamente nos Exemplos que se seguem. (Consulte igualmente o documento USP 7.056.712.) EXEMPLO 1 A GAA é uma exo 1, 4-a-D-glicosidase lisossomal que hidrolisa as ligações a-1,4 e a-1,6 de glicogénio. Um sistema altamente eficaz foi desenvolvido para a produção de GAA humana que visa o coração e o músculo e corrige a acumulação de glicogénio em pacientes com a doença de Pompe. O glicogénio em excesso em GSD-III reside não só no citoplasma, como também no lisossoma (Cornelio et al. ,

Arch. Neurol. 41:1027 a 1032 (1984), Miranda et al. , Arm.

Neurol. 9:283 a 288 (1981)). Isto sugere que o glicogénio citoplasmático em excesso se mistura mais eficazmente nos lisossomas em comparação com o que pode ser removido através da atividade GAA "normal" nas células GSD-III. Parte-se do principio de que o glicogénio citoplasmático se mistura continuamente através dos lisossomas mediante a autofagia para degradação, e que a GAA administrada pode reduzir o glicogénio lisossomal na GSD-III e, em última análise, reduzir igualmente o glicogénio citoplasmático. Origem da Enzima

As células CHO que produzem GAA elevada podem ser desenvolvidas na enzima recombinante e de cultura expandida purificada a partir do meio. As quantidades em miligrama de GAA purificada estão disponíveis semanalmente como parte de um projeto em curso sobre o desenvolvimento da terapia de substituição enzimática para a doença de Pompe. MYOZYME (Genzyme Corp.), ou outra rhGAA (preferencialmente produzida em CHO), é adequado para a utilização na invenção imediata.

Origem do Tecido

As amostras de músculo podem ser obtidas a partir de pacientes com GSD-IIIa, cuja doença foi anteriormente diagnosticada demonstrando a deficiência da atividade da enzima desramificadora tanto no fígado como no músculo. É possível efetuar a biopsia do músculo com agulha em pacientes com o diagnóstico. Espera-se que, pelo menos, 3 pacientes com um diagnóstico confirmado de GSD-IIIa sejam estudados. A biopsia do músculo com agulha pode obter 50 a 70 mg de tecidos suficientes para a análise. O procedimento é menos invasivo do que uma biopsia aberta. Atualmente, encontram-se disponíveis os fibroblastos da pele de 9 pacientes com GSD-IIIa. Existe um protocolo aprovado IRB disponível que torna possível a obtenção de tecido muscular e da pele de pacientes com GSD III.

Cultura de Células

As células musculares e os fibroblastos da pele cultivados podem ser utilizados para testar a possibilidade da utilização de GAA para tratar GSD-III. 0 foco será, particularmente, nos pacientes com Ilia que, além de hepatomegalia, têm miopatia progressiva (fraqueza muscular cada vez maior através de testes de força muscular num acompanhamento de 6 meses a 1 ano e/ou queixas clínicas de uma diminuição na força muscular) e cardiomiopatia (aumento na massa ventricular esquerda num período de 6 a 12 meses no acompanhamento), e igualmente nos pacientes com doença hepática progressiva. A deficiência da enzima de desramificação e a acumulação de glicogénio estão presentes nos fibroblastos da pele e nas células musculares desenvolvidos na cultura de pacientes com GSD-III (Miranda et al. , Ann. Neurol. 9:283 a 288 (1981), DiMauro et al. , Pedatr. Res. 7:739 a 744 (1973), Yang et al., Am. J. Hum.

Genet. 47:735 a 739 (1990), Brown, "Diagnosis of glycogen storage disease", Em: Wapnir PA, (ed)., "Congenital

Metabolic Disease Diagnosis and Treatment", Dekker, Nova Iorque, págs. 227 a 250 (1985)). As células musculares cultivadas refletem igualmente as conclusões da biopsia do músculo, uma vez é observado tanto o glicogénio citoplásmico como o lisossomal (Cornelio et al. , Arch. Neurol. 41:1027 a 1032 (1984), Miranda et al., Ann. Neurol. 9:283 a 288 (1981)). Por conseguinte, as culturas de músculos e fibroblastos da pele podem ser utilizadas para melhorar a compreensão da patogénese da doença e para avaliar as abordagens à terapia. As culturas de músculos podem ser estabelecidas a partir de amostras de biopsia do músculo utilizando um protocolo semelhante ao isolamento de mioblastos de codorniz (Konigsberg, Methods In Enzymology 45:511 a 527 (1979)). A nova colocação em placas das culturas primárias pode ser efetuada para selecionar fibroblastos. Se a amostra de biopsia for demasiado pequena, é possível efetuar um método de isolamento de mioblastos mais eficaz utilizando a seleção de células ativadas por fluorescência (Webster, Experimental Cell Research 174:252 a 265 (1988)). Os mioblastos podem diferenciar-se dos miotubos alterando o meio para 2% de soro de cavalo. As células musculares no estádio apropriado serão utilizadas para a realização das experiências.

Efeito no glicogénio com tratamento GAA

As concentrações de glicogénio nos fibroblastos da pele variam com o número de passagem e a confluência das células (DiMauro et al., Pedatr. Res. 7:739 a 744 (1973)). As experiências podem ser efetuadas numa confluência próxima, e cada paciente pode servir como respetivo controlo através de testes de duplicado simultâneos com e sem tratamento GAA. A resposta da dose (de 500 a 5000 nmol/h/ml de GAA) e o período de duração (1 a 10 dias) podem ser testados relativamente ao efeito da redução de glicogénio. O teor de glicogénio pode ser medido nas substâncias homogeneizadas de célula totais, bem como individualmente nas frações lisossomais de produto bruto e citosol (van der Ploeg et al., J. Neurol. Sei. 79:327 a 336 (1987)). O exame eletromicroscópico pode ser efetuado para demonstrar a remoção no citoplasma e nos lisossomas.

Para evitar a ocultação dos resultados através da síntese de glicogénio contínua que ocorre nas células cultivadas na presença de glicose no meio, as células podem ser mudadas para um meio livre de glicose 24 horas após o tratamento GAA. A privação de glicose resultou numa queda de glicogénio superior a 80% nas células normais, mas numa redução de apenas 30% nas células GSD-III (Yang et al., Am. J. Hum. Genet. 47:735 a 739 (1990), Brown, "Diagnosis of glycogen storage disease", Em: Wapnir PA, (ed)., "Congenital Metabolic Disease Diagnosis and Treatment", Dekker, Nova Iorque, págs. 227-250 (1985)). Deste modo, os níveis suficientemente elevados de glicogénio mantêm-se, o que permite uma avaliação precisa do tratamento GAA. 0 glicogénio persistente nas células GSD-III tem ramificações exteriores curtas que podem ser avaliadas utilizando glicose-l-fosfato formada a partir de polissacárido endógeno mediante fosforilase (Yang et ai., Am. J. Hum. Genet. 47:735 a 739 (1990)). O Exemplo 2 abaixo inclui uma descrição de estudos que foram realizados. EXEMPLO 2

As culturas primárias de musculoesquelético humano de pacientes com GSD-IIIa foram estabelecidas como um modelo in vitro para avaliar a eficácia de rhGAA relativamente ao tratamento de GSD-III. Foram isolados mioblastos de três pacientes com GSD-IIIa e um voluntário saudável. A histopatologia destas biopsias de músculo foi examinada através de microscopia eletrónica (EM) e de luz para confirmar a acumulação de glicogénio anormal nestes pacientes GSD-IIIa. O aspeto microscópico de luz das biopsias do musculoesquelético de pacientes com GSD-IIIa apresentava uma acumulação de glicogénio abundante nos pools citoplasmáticos (Fig. 1) . Em EM, verificou-se que a grande maioria do glicogénio circulava livremente no citoplasma juntamente com uma pequena quantidade de glicogénio ligado à membrana (Figs. 2 e 3). A diferenciação de mioblastos nos miotubos maduros (miogénese) foi induzida mediante incubação das células musculares no meio de diferenciação de baixo soro (DMEM de baixa glicose (GIBCO) contendo 2% de soro de cavalo Hl Hyclone (Sigma), 0,5 mg/ml de Fetuin, 0,5 mg/ml de BSA, 0,025 mg/ml de gentamicina e 0,125 pg/ml de Anfotericina B (Clonetics). O glicogénio foi armazenado em células musculares GSD-III totalmente diferenciadas quando existia glicose suficiente no meio (Fig. 4). A glicogenólise incompleta foi observada nas células GSD-III, mas não em células de controlo normais após uma inanição de glicose de 48 horas (Fig. 5), indicando uma falta de atividade da enzima de desramificação nos pacientes com GSD-III. Os miotubos GSD-III totalmente diferenciados foram tratados durante 48 horas, adicionando 100 pg de rhGAA (isto é, MYOZYME (Genzyme)) no meio de cultura. A atividade da enzima GAA e o teor de glicogénio foram analisados de forma bioguimica e histológica nestas células. O tratamento com rhGAA reduziu significativamente o nivel de glicogénio em 48%, 35% e 17%, respetivamente, nas células musculares dos três pacientes com GSD-IIIa (Fig. 6). Estes dados sugerem a função de GAA na remoção de glicogénio em condições em gue o defeito primário resulta na acumulação de glicogénio citoplasmático.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US P7056712 B [0022] [0035]

Documentos não relacionados com patentes citados na descrição • Glycogen storage disease. CHEN ; BURCHELL et al. The

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Lisboa, 23 de Abril de 2015

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES 1. α-glicosidase ácida humana para a utilização no tratamento de doença de armazenamento de glicogénio tipo III num indivíduo, mediante a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz num intervalo regular, de preferência, mensalmente, duas vezes por mês, semanalmente, duas vezes por semana ou diariamente.
2. 2. α-glicosidase ácida humana para a utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de α-glicosidase ácida humana é inferior a cerca de 40 mg de α-glicosidase ácida por quilograma de peso corporal do indivíduo.
3. 3. α-glicosidase ácida humana para a utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a α-glicosidase ácida humana corresponde à α-glicosidase ácida humana recombinante ou a um precursor de α-glicosidase ácida humana recombinante, a referida α-glicosidase ácida humana recombinante sendo preferencialmente produzida nas células de ovário de hamster chinês.
4. 4. α-glicosidase ácida humana para a utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a α-glicosidase ácida humana se destina à administração através de uma via selecionada a partir do grupo que consiste em: intravenosa, intramuscular, intratecal e intraventricular.
5. 5. α-glicosidase ácida humana para a utilização de acordo com a Reivindicação 1, em que a α-glicosidase ácida humana se destina à administração em conjunto com a administração de um imunossupressor, ou subsequente à mesma.
6. 6. Utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz de α-glicosidase ácida humana para o fabrico de um medicamento para o tratamento da doença de armazenamento de glicogénio tipo III num indivíduo, o referido medicamento sendo preferencialmente preparado para ser administrado num intervalo regular, ou seja, mensalmente, duas vezes por mês, semanalmente, duas vezes por semana ou diariamente.
7. 7. A utilização de acordo com a Reivindicação 6, em que a quantidade terapeuticamente eficaz de α-glicosidase ácida humana é inferior a cerca de 40 mg de α-glicosidase ácida por quilograma de peso corporal do indivíduo.
8. 8. A utilização de acordo com a Reivindicação 6, em que a α-glicosidase ácida humana corresponde a uma a-glicosidase ácida humana recombinante ou a um precursor de a-glicosidase ácida humana recombinante, a referida a-glicosidase ácida humana recombinante sendo preferencialmente produzida nas células de ovário de hamster chinês.
9. 9. A utilização de acordo com a Reivindicação 6, em que o medicamento é preparado para ser administrado através de uma via selecionada a partir do grupo que consiste em via intravenosa, intramuscular, intratecal e intraventricular.
10. 10. A utilização de acordo com a Reivindicação 6, em que o medicamento compreende ainda um imunossupressor. Lisboa, 23 de Abril de 2015