BR112012033205A2 - uso de uma composição compreendendo agentes terapêuticos para liberação ao sistema nervoso central - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO AGENTES TERAPÊUTICOS PARA LIBERAÇÃO AO SISTEMA NERVOSO CENTRAL. A presente invenção refere-se a um método eficaz e menos invasivo para liberação direta de agentes terapêuticos para o sistema nervoso central (SNC). Em algumas modalidades, a presente invenção fornece métodos, incluindo uma etapa de administração MP4 a um indivíduo ou suscetível a uma doença de armazenamento lisossomal associada com nível reduzido ou atividade de uma enzima lisossômica, uma composição compreendendo uma enzima de substituição para a enzima lisossômica.

Description

USO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO AGENTES TERAPÊUTICOS

PARA LIBERAÇÃO AO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Este pedido reivindica a prioridade dos Pedidos de Patente Provisório dos Estados Unidos de números seriais 5 61/358,857 depositado em 25 de Junho de 2010; 61/360,786, depositado em 1 de Julho de 2010; 61/387,862, depositado em 29 de Setembro de 2010; 61/435,710, depositado em 24 de Janeiro de 2011; 61/442,115, depositado em 11 de Fevereiro de 2011; 61/476,210, depositado em 15 de Abril de 2011; e 61/495,268 depositado em 9 de Junho de 2011; a totalidade dos quais está incorporada aqui por referência. Este pedido refere-se aos pedidos dos EUA intitulados “Methods and Compositions for CNS Delivery of Heparan N-Sulfatase,” depositado na mesma data; “Methods and Compositions for CNS Delivery of Iduronate-2-Sulfatase,” depositado na mesma data; “Methods and Compositions for CNS Delivery of β- Galactocerebrosidase,” depositado na mesma data; “Methods and Compositions for CNS Delivery of Arylsulfatase A,” depositado na mesma data; “Treatment of Type B Sanfilippo Syndrome,” depositado na mesma data; a totalidade dos quais está incorporada aqui por referência.

FUNDAMENTOS A Terapia de substituição de enzima (ERT) envolve a administração sistêmica de proteínas e/ou enzimas liberadas de modo recombinante ou natural a um sujeito. Terapias aprovadas são tipicamente administradas a sujeitos por via intravenosa e são geralmente eficazes no tratamento de sintomas somáticos de deficiência de enzima subjacente. Como um resultado da distribuição limitada da proteína e/ou enzima administrada por via intravenosa nas células e tecidos do sistema nervoso central (CNS), o tratamento de doenças tendo uma etiologia de CNS foi especialmente desafiador devido às proteínas e/ou enzimas administradas por via intravenosa não atravessam adequadamente a barreira 5 hematoencefálica (BBB). A barreira hematoencefálica (BBB) é um sistema estrutural compreendido por células endoteliais que funcionam para proteger o sistema nervoso central (CNS) de substâncias deletérias na corrente sanguínea, tais como bactérias, macromoléculas (por exemplo, proteínas) e outras moléculas hidrofílicas, através da limitação da difusão de tais substâncias ao longo da BBB e para dentro do fluido cefalorraquidiano (CSF) e CNS subjacentes.

Há varias formas de se esquivar a BBB para melhorar a liberação cerebral de um agente terapêutico incluindo injeção intracraniana direta, permeabilidade transitória da BBB, e modificação do agente ativo para alterar a distribuição do tecido.

A injeção direta de um agente terapêutico no ultrapassa a vasculatura completamente, mas sofre primariamente do risco de complicações (infecção, dano ao tecido, resposta imune) incorridas pelas injeções intracranianas e baixa difusão do agente ativo a partir do local de administração.

Até o momento, a administração direta de proteínas na substância cerebral não obteve efeito terapêutico significativo devido às barreiras de difusão e o volume limitado de terapêuticos que podem ser administrados.

A difusão assistida por convecção foi estudada através de cateteres colocados no parênquima cerebral utilizando infusões lentas a longo prazo (Bobo, et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A 91, 2076-2080 (1994);

Nguyen, et al.

J.

Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), mas nenhuma terapia aprovada atualmente utiliza essa abordagem para terapia a longo prazo.

Adicionalmente, a colocação de cateteres intracerebrais é muito invasiva e menos desejável 5 como uma alternativa clínica.

A injeção por via intratecal (IT), ou a administração de proteínas ao fluido cefalorraquidiano (CSF), foi tentada, mas não rendeu ainda sucesso terapêutico.

Um desafio importante nesse tratamento foi a tendência do agente ativo de se ligar ao revestimento ependimal do ventrículo muito firmemente, o que evita a difusão subsequente.

Atualmente, não há produtos aprovados para o tratamento de doença cerebral genética pela administração diretamente ao CSF.

De fato, muitos acreditam que a barreira à difusão na superfície do cérebro, bem como a falta de métodos de liberação convenientes e eficazes, foram um obstáculo muito grande para a obtenção de um terapêutico adequado eficaz no cérebro para qualquer doença.

Muitos distúrbios de armazenamento lisossomal afeta o sistema nervoso e, assim, demonstra desafios únicos no tratamento dessas doenças com terapias tradicionais.

Há frequentemente um grande acúmulo de glicosaminoglicanos (GAGs) em neurônios e meninges de indivíduos afetados, levando a várias formas de sintomas de CNS.

Até o momento, nenhum sintoma de CNS resultando de um distúrbio lisossomal foi tratado com sucesso por nenhum meio disponível.

Assim, permanece uma grande necessidade de liberar agentes terapêuticos eficazmente ao cérebro.

Mais particularmente, há uma grande necessidade de liberar agentes ativos eficazmente ao sistema nervoso central para o tratamento de distúrbios de armazenamento lisossomal.

RESUMO A presente invenção prove uma abordagem eficaz e menos 5 invasiva para liberação direta de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (CNS). A presente invenção é, em parte, baseada na verificação de que uma enzima de substituição para uma doença de armazenamento lisossomal pode ser introduzida diretamente no fluido cefalorraquidiano (CSF) de um sujeito necessitando de necessitando de tratamento em uma concentração alta (por exemplo, superior a cerca de 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml ou mais) de modo que a enzima se difunde de modo eficaz e extensivo ao longo de várias superfícies e penetra em várias regiões ao longo do cérebro, incluindo regiões profundas do cérebro. Os presentes inventores demonstraram que a liberação de tais concentrações altas de proteína pode ser obtida utilizando formulações salinas simples ou à base de tampão e sem induzir efeitos adversos substanciais, tais como uma resposta imune grave, no sujeito. Portanto, a presente invenção prove uma abordagem amigável ao paciente e clinicamente desejável, altamente eficiente para liberação de CNS direta para o tratamento de várias doenças e distúrbios e que têm componentes de CNS, particularmente, doenças de armazenamento lisossomal. A presente invenção representa um avanço significativo no campo da visagem ao CNS e terapia de substituição de enzima. Dentre outras coisas, a presente invenção provê métodos de administração por via intratecal (IT) de um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) a um sujeito necessitando de tratamento.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição pode ser uma enzima natural, ativada por gene ou recombinante.

Conforme utilizado aqui, os termos “administração por via 5 intratecal,” “injeção por via intratecal,” “liberação por via intratecal,” ou equivalentes gramaticais, referem-se a uma injeção no canal espinhal (espaço intratecal cercando a medula espinhal). Em algumas modalidades, “administração por via intratecal” ou “liberação por via intratecal” de acordo com a presente invenção refere-se à Administração por via IT ou liberação via área ou região lombar, ou seja, administração ou liberação por via IT lombar.

Conforme utilizado aqui, o termo “região lombar” ou “área lombar” refere-se à área entre a terceira ou quarta vértebra lombar (parte inferior das costas) e, mais inclusivamente, à região L2-S1 da espinha.

Contempla-se que a administração ou liberação por via IT lombar distingue-se em liberação na cisterna magna (ou seja, injeção através do espaço em torno e abaixo do cerebelo através da abertura entre o crânio e a parte superior da espinha) em que a administração ou liberação por via IT lombar de acordo com nossa invenção provê liberação melhor e mais eficaz ao canal espinhal distal, enquanto que a liberação na cisterna magna, dentre outras coisas, tipicamente não libera bem para o canal espinhal distal.

Em um aspecto, a presente invenção provê métodos incluindo uma etapa de administração por via intratecal a um sujeito sofrendo de ou suscetível a uma doença de armazenamento lisossomal associada ao nível ou atividade reduzida de uma enzima lisossomal, uma composição compreendendo uma enzima de substituição para a enzima lisossomal em uma concentração superior a cerca de 5 mg/ml (por exemplo, superior a 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 5 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, ou 100 mg/ml). Em algumas modalidades, a composição adicionalmente compreende um ou mais dentre (i) um agente tamponador, (ii) um tensoativo, ou (iii) um tonificador.

Em algumas modalidades, a composição tem um pH de aproximadamente 3,0- 8,0 (por exemplo, 4,0-7,5, 5,0-7,5, 5,5-7,7, 5,5-7,0, 6,0- 7,0, 6,5-7,5, 6,5-7,0, ou 5,5-6,5). Em algumas modalidades, a composição compreende uma enzima de substituição em uma formulação que não é CSF sintético.

Em algumas modalidades, a composição é administrada em um volume de dose única inferior a cerca de 15 ml (por exemplo, inferior a cerca de 10 ml, 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1,5 ml, 1,0 ml, ou 0,5 ml). Em algumas modalidades, a administração por via intratecal da composição não resulta em efeito adverso substancial no sujeito.

Em certas modalidades, a administração por via intratecal da composição não resulta em uma resposta imune adaptativa mediada por células T.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê métodos incluindo uma etapa de administração a um sujeito sofrendo de ou suscetível a uma doença de armazenamento lisossomal associada ao nível ou atividade reduzida de uma enzima lisossomal, uma composição compreendendo uma enzima de substituição para a enzima lisossomal, em que a administração envolve a administração por via intratecal da composição na ausência de terapia imunossupressora simultânea.

Em algumas modalidades, o método não envolve uma indução de tolerância imunológica no sujeito sendo tratado.

Em certas modalidades, o método não envolve um pré-tratamento ou pré-condicionamento do sujeito utilizando 5 agente imunossupressor de células T.

Em um aspecto adicional, a presente invenção provê métodos incluindo uma etapa de administração por via intratecal a um sujeito sofrendo de ou suscetível a uma doença de armazenamento lisossomal associada ao nível ou atividade reduzida de uma enzima lisossomal, uma composição compreendendo uma enzima de substituição para a enzima lisossomal em uma dose terapêutica eficaz e um intervalo de administração de modo que pelo menos cerca de 10% (por exemplo, pelo menos cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%) de níveis ou atividades normais da enzima lisossomal em um ou mais tecidos do cérebro, medula espinhal e órgãos periféricos é obtido.

Em algumas modalidades, o um ou mais tecidos do cérebro ao qual a enzima é liberada compreende um tecido menegal.

Em algumas modalidades, o tecido menegal é selecionado a partir do grupo consistindo em tecido pia- máter, dura-máter e aracnoide.

Em algumas modalidades, o um ou mais tecidos do cérebro ao qual a enzima é liberada compreende um tecido do cérebro.

Em certas modalidades, o tecido do cérebro é um tecido de superfície ou superficial do cérebro.

Em certas modalidades, o tecido de superfície ou superficial do cérebro é selecionado a partir do grupo consistindo em tecidos da pia-máter, tecidos da faixa cortical cerebral,

hipocampo, tecidos dentro de 4 mm da superfície da superfície do cérebro, Espaço de Virchow Robin, vasos sanguíneos dentro do espaço de VR, o hipocampo, porções do hipotálamo na inferior superfície do cérebro, os tratos e 5 nervos ópticos, as projeções e bulbo olfativo, e combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, o tecido do cérebro ao qual a enzima é liberada um tecido profundo do cérebro.

Em certas modalidades, o tecido profundo do cérebro é selecionado a partir do grupo consistindo em tecidos internos à faixa cortical cerebral, tecidos abaixo de 4 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, tecidos abaixo de 6 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, tecidos abaixo de 10 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, o diencéfalo, o hipotálamo, tálamo, tálamo anterior e tálamo posterior, o metencéfalo, os pedúnculos cerebrais, o núcleo vermelho, o núcleo do nervo craniano III, substância cinzenta profunda, os núcleos lentiformes, o gânglio basal, caudado, putâmen, amídala, globo pálido, e combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, o um ou mais tecidos do cérebro aos quais a enzima é liberada compreende um tecido do cerebelo.

Em certas modalidades, o tecido do cerebelo é selecionado a partir do grupo consistindo em tecidos da camada molecular, os tecidos da camada de células de Purkinje, tecidos da camada de células granulares, dos pedúnculos do cerebelo, e combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, o tecido do cerebelo é um tecido profundo do cerebelo.

Em certas modalidades, o tecido profundo do cerebelo é selecionado a partir do grupo consistindo em tecidos da camada de células de Purkinje, tecidos da camada de células granulares, tecidos profundos de substância branca do cerebelo e tecido profundo do núcleo do cerebelo.

Em algumas modalidades, o um ou mais tecidos do 5 cérebro ao qual a enzima é liberada compreendem um tecido do tronco cerebral.

Em certas modalidades, o tecido do tronco cerebral é selecionado a partir do grupo consistindo em tecido de substância branca do tronco cerebral e/ou tecidos do núcleo do tronco cerebral.

Em algumas modalidades, o um ou mais tecidos da medula espinhal ao qual a enzima é liberada é um tecido de superfície ou superficial da medula espinhal.

Em certas modalidades, o tecido de superfície ou superficial da medula espinhal é selecionado a partir do grupo consistindo em pia-máter, os tratos da substância branca, e tecido dentro de 4 mm a partir da superfície da superfície da medula espinhal.

Em algumas modalidades, o um ou mais tecidos da medula espinhal é um tecido profundo da medula espinhal.

Em certas modalidades, o tecido profundo da medula espinhal é selecionado a partir do grupo consistindo em medula espinhal substância cinzenta e células ependimais, e tecido abaixo de 4 mm a partir da superfície da superfície da medula espinhal.

Em algumas modalidades, o um ou mais tecidos do cérebro ao qual a enzima é liberada compreende tecido de superfície ou superficiais.

Em certas modalidades, o tecido de superfície ou superficiais são selecionados a partir do grupo consistindo em tecidos pia-máter, dura-máter e aracnoide do menengal, tecidos da pia-máter, tecidos da faixa cortical cerebral, tecidos dentro de 4 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, e combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, os tecidos ao qual a enzima é liberada compreende tecidos profundos.

Em certas 5 modalidades, os tecidos cerebrais profundos são selecionados a partir da substância branca profunda, do cérebro, substância cinzenta profunda da medula espinhal, corpus callosum, tecido periventricular, tálamo, gânglio basal, diencéfalo, fímbria, tecidos abaixo da faixa cortical cerebral, tecidos abaixo de 4 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, tecidos abaixo de 6 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, tecidos abaixo de 10 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, camada de células de Purkinje, tecidos da camada de células granulares, tecidos profundos de substância branca do cerebelo, e tecido profundo do núcleo do cerebelo, e combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, a dose terapêutica eficaz varia de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 100 mg/kg de peso do cérebro.

Em certas modalidades, a dose terapêutica eficaz é superior a 1 mg/kg de peso do cérebro (por exemplo, superior a 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 mg/kg de peso do cérebro). Em certas modalidades, a dose terapêutica eficaz é superior a 10 mg/kg de peso do cérebro.

Em certas modalidades, a dose terapêutica eficaz é superior a 30 mg/kg de peso do cérebro.

Em algumas modalidades, o intervalo de administração é uma vez a cada duas semanas.

Em algumas modalidades, o intervalo de administração é uma vez a cada mês.

Em algumas modalidades, o intervalo de administração é uma vez a cada dois meses.

Em algumas modalidades, o intervalo de administração é duas vezes per mês.

Em algumas modalidades, o intervalo de administração é uma vez a cada semana.

Em algumas modalidades, o intervalo de administração é duas 5 vezes ou várias vezes por semana.

Em algumas modalidades, a administração é contínua, tal como através de uma bomba de perfusão contínua.

Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos incluindo uma etapa de administração a um sujeito sofrendo de ou suscetível a uma doença de armazenamento lisossomal associada ao nível ou atividade reduzida de uma enzima lisossomal, a composição compreendendo uma enzima de substituição para a enzima lisossomal, cuja administração envolve a administração por via intratecal da composição de modalidade que a enzima de substituição é liberada a um tecido cerebral profundo pelo menos 5 mm abaixo da superfície externa (por exemplo, pelo menos 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 12 mm, ou mais profundo, abaixo da superfície externa). Em algumas modalidades, a enzima de substituição é liberada a um tecido cerebral profundo pelo menos 10 mm abaixo da superfície externa.

Em certas modalidades, a enzima de substituição é especificamente liberada aos lisossomos celulares do tecido cerebral profundo.

Em algumas modalidades, os tecidos cerebrais profundos aos quais a enzima e liberada são selecionados a partir da substância branca profunda, do cérebro, substância cinzenta profunda da medula espinhal, corpus callosum, tecido periventricular, tálamo, fímbria, tecidos abaixo da faixa cortical cerebral, tecidos abaixo de 4 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, tecidos abaixo de 6 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, tecidos abaixo de 10 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, camada de células de Purkinje, tecidos da camada 5 de células granulares, tecidos profundos de substância branca do cerebelo, e tecido profundo do núcleo do cerebelo, e combinação dos mesmos.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê métodos incluindo a etapa de administração por via intratecal a um sujeito sofrendo de ou suscetível a uma doença de armazenamento lisossomal associada ao nível ou atividade reduzida de uma enzima lisossomal, uma composição compreendendo uma enzima de substituição para a enzima lisossomal que é produzida a partir de células humanas.

Em algumas modalidades, a doença de armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo em aspartilglicosaminuria, doença do armazenamento de éster de colesterol, doença de Wolman, cistinose, doença de Danon, doença de Fabry, lipogranulomatose de Farber, doença de Farber, fucosidose, tipos de galactosialidose I/II, tipos de doença de Gaucher I/II/III, Leucodistrofia de células globoides, doença de Krabbe, doença de armazenamento de glicogênio II, doença de Pompe, Gangliosidose GM1 tipos I/II/III, Gangliosidose GM2 tipo I, doença de Tay-Sachs, Gangliosidose GM2 tipo II, doença de Sandhoff, Gangliosidose GM2, α-manosidose tipos III, beta-manosidose, Leucodistrofia metacromática, mucolipidose tipo I, sialidose tipos III, mucolipidose tipos II, III, doença de célula I, pseudo-Hurler polidistrofia de mucolipidose tipo IIIC, mucopolissacaridose tipo I, mucopolissacaridose tipo

II, síndrome de Hunter, mucopolissacaridose tipo III, tipos de síndrome de Sanfilippo A, B ou C, mucopolissacaridose tipo IIIB, mucopolissacaridose tipo IIIC, mucopolissacaridose tipo IIID, mucopolissacaridose tipo 5 IVA, síndrome de Morquio, mucopolissacaridose tipo IVB, mucopolissacaridose tipo VI, mucopolissacaridose tipo VII, síndrome de Sly, mucopolissacaridose tipo IX, múltiplas deficiência de sulfatase, lpofuscinose de ceroide neuronal, doença de Batten CLN1, doença de Batten CLN2, doença de Niemann-Pick tipos A/B, doença de Niemann-Pick tipo C1, doença de Niemann-Pick tipo C2, picnodisostose, doença de Schindler tipos III, doença de Gaucher e doença de armazenamento de ácido siálico.

Em algumas modalidades, a doença de armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo em Síndrome de Hunters, doença de Leucodistrofia metacromática (MLD), Síndrome de Sanfilippo tipo A, síndrome de Sanfilippo tipo B e doença de Leucodistrofia de célula globoide (GLD). Em certas modalidades, a enzima de substituição é selecionada a partir do grupo consistindo em recombinante iduronato-2-sulfatase recombinante (I2S), arilsulfatase A (ASA), N-sulfatase de heparano (HNS), alfa- N-acetilglucosaminidase (Naglu) e β-galactosidase (GLC). Em algumas modalidades, a enzima de substituição contém resíduos de manose-6-fostato (M6P). Em algumas modalidades, a enzima de substituição é uma proteína de fusão compreendendo uma porção alvo dos lisossomos.

Em algumas modalidades, a enzima de substituição é liberada aos neurônios, células gliais, células perivasculares e/ou células menígenas.

Em certas modalidades, a enzima de substituição é adicionalmente liberada aos neurônios na medula espinhal.

Em algumas modalidades, a administração por via intratecal adicionalmente resulta em liberação sistêmica da 5 enzima de substituição in tecidos periféricos alvo.

Em certas modalidades, os tecidos periféricos alvo são selecionados dentre fígado, rim, e/ou coração, endotélio, medula óssea e células derivadas de medula óssea, baço, pulmão, nódulo linfático, osso e cartilagem, ovário e testículo.

Em algumas modalidades, a administração por via intratecal resulta em localização lisossomal da enzima de substituição em tecidos cerebrais alvo, neurônios da medula espinhal e/ou tecidos periféricos alvo.

Em algumas modalidades, a administração por via intratecal resulta na redução de armazenamento de GAG nos tecidos cerebrais alvo, neurônios da medula espinhal e/ou tecidos periféricos alvo.

Em certas modalidades, o armazenamento de GAG é reduzido em pelo menos 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1 vez, 1,5 vez ou 2 vezes em comparação com um controle.

Em algumas modalidades, a administração por via intratecal resulta em vacuolização reduzida em neurônios.

Em algumas modalidades, os neurônios compreendem células de Purkinje.

Em algumas modalidades, a administração por via intratecal resulta em aumento na atividade enzimática da enzima de substituição nos tecidos cerebrais alvo, neurônios da medula espinhal e/ou tecidos periféricos alvo.

Em certas modalidades, a atividade enzimática é aumentada em pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes em comparação com um controle.

Em certas modalidades, o aumento da atividade enzimática é pelo menos aproximadamente 10 nmol/h/mg, 20 nmol/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 5 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg ou 600 nmol/h/mg.

Em algumas modalidades, a atividade enzimática é aumentada na região lombar.

Em certas modalidades, o aumento da atividade enzimática na região lombar é pelo menos aproximadamente 500 nmol/h/mg, 600 nmol/h/mg, 700 nmol/h/mg, 800 nmol/h/mg, 900 nmol/h/mg, 1000 nmol/h/mg, 1500 nmol/h/mg, 2000 nmol/h/mg, 3000 nmol/h/mg, 4000 nmol/h/mg, 5000 nmol/h/mg, 6000 nmol/h/mg, 7000 nmol/h/mg, 8000 nmol/h/mg, 9000 nmol/h/mg, ou 10,000 nmol/h/mg.

Em algumas modalidades, a doença de armazenamento lisossomal é associada a sintomas periféricos e o método adicionalmente compreende a administração da enzima de substituição por via intravenosa ao sujeito.

Em certas modalidades, a administração intravenosa não é mais frequente que administração semanal (por exemplo, não mais frequente que bissemanalmente, mensalmente, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, ou uma vez a cada seis meses). Em certas modalidades, a administração intravenosa é mais frequente que administração mensal, tal como duas vezes semanalmente, semanalmente, a cada quinzena, ou duas vezes mensalmente.

Em algumas modalidades, administrações intravenosa e por via intratecal são desempenhadas no mesmo dia.

Em algumas modalidades, as administrações intravenosa e por via intratecal não são desempenhadas dentro de certa quantidade de vezes entre si, tal como não dentro de pelo menos 2 5 dias, dentro de pelo menos 3 dias, dentro de pelo menos 4 dias, dentro de pelo menos 5 dias, dentro de pelo menos 6 dias, dentro de pelo menos 7 dias, ou dentro de pelo menos uma semana.

Em algumas modalidades, administrações intravenosa e por via intratecal são desempenhadas em um cronograma alternante, tal como alternando administrações semanalmente, quinzenalmente, duas vezes mensalmente, ou mensalmente.

Em algumas modalidades, uma n administração por via intratecal substitui uma administração intravenosa em um cronograma de administração, tal como em um cronograma de administração intravenosa semanalmente, quinzenalmente, duas vezes mensalmente, ou mensalmente, cada terceira ou quarta ou quinta administração naquele cronograma pode ser substituído por uma administração por via intratecal em vez de uma administração intravenosa.

Em algumas modalidades, uma administração intravenosa substitui uma administração por via intratecal em um cronograma de administração, tal como em um cronograma de administração por via intratecal semanalmente, quinzenalmente, duas vezes mensalmente, ou mensalmente, cada terceira ou quara ou quinta administração naquele cronograma podendo ser substituída por uma administração intravenosa em vez de uma administração intravenosa.

Em algumas modalidades, administrações intravenosa e por via intratecal são desempenhadas sequencialmente, tal como desempenhando administrações intravenosas primeiro (por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, duas vezes mensalmente, ou mensalmente dosando para duas semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, ou um ano ou mais) seguida por administrações 5 por via intratecal (por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, duas vezes mensalmente, ou mensalmente dosando para mais de duas semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, ou um ano ou mais). Em algumas modalidades, administrações por via intratecal são desempenhadas primeiro (por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, duas vezes mensalmente, mensalmente, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses dosando para duas semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, ou um ano ou mais) seguida por administrações intravenosas (por exemplo, semanalmente, quinzenalmente, duas vezes mensalmente, ou mensalmente dosando para mais de duas semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, ou um ano ou mais). Em algumas modalidades, a doença de armazenamento lisossomal é associada a sintomas periféricos e o método includes a administração da enzima de substituição por via intratecal, mas não envolve a administração da enzima de substituição por via intravenosa ao sujeito.

Em certas modalidades, a administração por via intratecal da enzimas de substituição melhora ou reduz um ou mais dos sintomas periféricos da deficiência de substituição de enzima do sujeito.

Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento da Síndrome de Hunters incluindo uma etapa de administração por via intratecal a um sujeito necessitando de tratamento de uma enzima recombinante iduronate-2- sulfatase (I2S) enzima em uma dose terapêutica eficaz e um intervalo de administração de modo que pelo menos um 5 sintoma ou característica da Síndrome de Hunters é reduzido em, gravidade ou frequência, ou tem início postergado.

Em algumas modalidades, o pelo menos um sintoma ou característica da Síndrome de Hunters é debilitação cognitiva; lesões na substância branca; espaços perivasculares dilatados no parênquima cerebral, gânglio, corpus callosum, e/ou tronco cerebral; atrofia; e/ou ventriculomegalia.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento da doença de Leucodistrofia metacromática (MLD) incluindo uma etapa de administração por via intratecal a um sujeito necessitando de tratamento de uma enzima recombinante arilsulfatase A (ASA) em uma dose terapêutica eficaz e um intervalo de administração de modo que pelo menos um sintoma ou característica da doença de MLD é reduzida em intensidade, gravidade ou frequência, ou tem o início postergado.

Em algumas modalidades, o pelo menos um sintoma ou característica da doença de MLD é aumento da pressão intracraniana, hidrocefalia ex-vácuo, acúmulo de glicolipídeos sulfatados nas bainhas de mielina no sistema nervoso central e periférico e nos órgãos viscerais, desmielinização progressiva, perda axonal dentro do CNS e PNS, e/ou disfunção motora e cognitiva.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento da doença da síndrome de Sanfilippo tipo A (Sanfilippo A) incluindo uma etapa de administração por via intratecal a um sujeito necessitando de tratamento de uma enzima recombinante N-sulfatase de heparano (HNS) em uma dose terapêutica eficaz e um intervalo de administração de modo que pelo menos um sintoma ou característica da 5 doença de Sanfilippo A é reduzida em intensidade, gravidade ou frequência, ou tem o início postergado.

Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento da doença da síndrome de Sanfilippo tipo B (Sanfilippo B) incluindo a etapa de administração por via intratecal a um sujeito necessitando de tratamento de uma enzima recombinante alfa-N-acetilglucosaminidase (Naglu) em uma dose terapêutica eficaz e um intervalo de administração de modo que pelo menos um sintoma ou característica da doença de Sanfilippo B é reduzida em intensidade, gravidade ou frequência, ou tem o início postergado.

Em algumas modalidades, o pelo menos um sintoma ou característica da doença de Sanfilippo A ou Sanfilippo B é perda de audição, debilitação do desenvolvimento da fala, déficits em habilidades motoras, hiperatividade motora, debilitação cognitiva progressiva, agressividade e/ou distúrbios do sono.

Em algumas modalidades, a enzima recombinante Naglu é uma proteína de fusão compreendendo Naglu e uma porção alvo dos lisossomos.

Em certas modalidades, a porção alvo dos lisossomos é IGF-II.

Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos de tratamento da doença de Leucodistrofia de célula globoide (GLD) incluindo uma etapa de administração por via intratecal a um sujeito necessitando de tratamento de uma enzima recombinante β-galactosidase (GLC) em uma dose terapêutica eficaz e um intervalo de administração de modo que pelo menos um sintoma ou característica da doença de GLD é reduzida em intensidade, gravidade ou frequência, ou tem o início postergado.

Em algumas modalidades, o pelo 5 menos um sintoma ou característica da doença de GLD é irritabilidade, convulsão, deterioração mental, surdez, cegueira, ataques mioclônicos, tônus muscular excessivo, atraso no desenvolvimento, regressão de habilidades do desenvolvimento, hipersensibilidade, tremor, ataxia, convulsividade, vômito grave episódico, leucodistrofia, atrofia cerebral, debilitação do desenvolvimento das células globoides e/ou demielinação.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê dispositivos para administração por via intratecal, incluindo uma porta de acesso de fluido; um corpo oco tendo um primeiro orifício de fluxo em comunicação fluida com a porta de acesso de fluido e um segundo orifício de fluxo configurado para inserção na medula espinhal; e um mecanismo de fixação para fixar a inserção do corpo oco na medula espinhal.

Em algumas modalidades, o mecanismo de fixação compreende um ou mais cabeçotes montados na superfície do corpo oco e um anel suturado ajustável ao longo de um ou mais cabeçotes.

Em algumas modalidades, a porta de acesso de fluido compreende um reservatório.

Em certas modalidades, a porta de acesso de fluido é implantável.

Em certas modalidades, a porta de acesso de fluido é uma porta injetável.

Em algumas modalidades, a porta de acesso de fluido é uma bomba mecânica.

Conforme utilizado nesse pedido, os termos “cerca de” e “aproximadamente” são utilizados como equivalentes.

Quaisquer numerais utilizados nesse pedido com ou sem cerca de/aproximadamente são pretendidos para cobrir quaisquer flutuações normais apreciadas por alguém versado na técnica relevante. 5 Outras características, objetivos e vantagens da presente invenção são evidentes na descrição detalhada que segue. Deve-se ser compreendido, no entanto, que a descrição detalhada, enquanto indicando as modalidades da presente invenção, é dada para vias de ilustração apenas, não limitação. Várias alterações e modificações dentro do escopo da invenção se tornarão evidentes àqueles versados na técnica a partir da descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS As figuras são para propósitos de ilustração apenas, não para limitação. Figura 1 ilustra um diagrama exemplar de um dispositivo de liberação de droga por via intratecal (IDDD) com um mecanismo de fixação. Figura 2A mostra localizações exemplares dentro do corpo de um paciente em que um IDDD pode ser colocado; Figura 2B mostra vários componentes de um dispositivo de liberação de droga por via intratecal (IDDD); e Figura 2C mostra uma localização de inserção exemplar dentro do corpo de um paciente para injeção lombar via IT. Figura 3 mostra resultados exemplares resumindo os veículos testados em macacos adultos. Figura 4 mostra resultados exemplares ilustrando a estabilidade de hGalC em exame térmico de hGalC como uma função do pH. Figura 5 mostra resultados exemplares ilustrando a atividade específica de hGalC como uma função de pH.

Figura 6 mostra resultados exemplares ilustrando um exame térmico de hGalC como uma função da concentração de sal. 5 Figura 7 mostra resultados exemplares ilustrando series de velocidade de sedimentação de GalC comparando diferentes forças iônicas em 5mM de fosfato de Na, tampão de pH 6,0. Figura 7A mostra resultados exemplares utilizando 50mM de NaCl e hGalC.

Figura 7B mostra resultados exemplares ilustrando 150mM de NaCl e hGalC.

Figura 7C mostra resultados exemplares ilustrando 500 mM de NaCl e hGalC.

Figura 7D mostra resultados exemplares ilustrando 150 mM de NaCl e GalC de camundongo.

Figura 8 mostra resultados exemplares ilustrando o perfil de AUC de GalC como uma função da concentração de sal (1mg/ml de GalC, 5mM de fosfato de Na, pH 6,0)(eixo Y = s*g(s*); eixo X = s*). Figura 9 mostra resultados exemplares ilustrando uma série de diluição de hGalC em tampão universal, pH 6,0 (eixo Y = <g(s*)/C0>(1/svedberg); eixo X = s*(svedbergs)). Figura 10 mostra resultados exemplares ilustrando um perfil de AUC de GalC como uma função de pH (1 mg/ml, 3 mM de tampão de citrato, fosfato e borato com 50 mM de NaCl). Figura 11 mostra resultados exemplares ilustrando a leitura de linha de base a partir de uma análise de WDA na concentração mais alta em pH 6,0, em 5mM de fosfato de Na e 150 mM de NaCl.

Figura 12 mostra resultados exemplares ilustrando a leitura acentuada uma partir da análise de WDA na concentração mais alta em pH 6,0, em 5 mM de fosfato de Na e 150 mM de NaCl.

Figura 13 compara graficamente e cobre a linha de base e amostras de GalC pressionadas.

Figura 14 mostra resultados exemplares ilustrando uma 5 série de diluição de hGalC na presença de 1% de NaTC.

Figura 15 mostra resultados exemplares ilustrando uma série de diluição de hGalC na presença de 1% de NaTC (1,0mg/ml e 0,3mg/ml). Figura 16 mostra resultados exemplares ilustrando a fluorescência intrínseca de hGalC (1mg/ml) em diferentes tampões e pHs.

Figura 17 mostra resultados exemplares ilustrando o dicroísmo circular de hGalC como uma função do pH.

Figura 18 mostra resultados exemplares ilustrando a concentração media de grupo de radioatividade em soro, sangue e glóbulos vermelhos de ratos Sprague-Dawley machos 125 seguindo uma intratecal única de I-hGalC.

Figura 19 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de grupo de radioatividade em soro, coração, rins, fígado, pulmões, baço de ratos Sprague- 125 Dawley machos segundo uma dose intratecal única de I- hGalC.

Figura 20 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de grupo de radioatividade em soro, coração, rins, fígado, pulmões, baço de ratos Sprague- Dawley machos seguindo uma injeção de bolus intravenosa de 125 I-hGalC.

Figura 21 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de grupo de radioatividade em soro, coração, rins, fígado, pulmões, baço de ratos Sprague-

Dawley machos seguindo uma dose intratecal única e injeção 125 de bolus intravenosa de I-hGalC.

Figura 22 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro e vários 5 tecidos (tecidos adiposos (jejum de jejum de rim), glândulas adrenais, osso (fêmur), músculo (esqueletal), nervo ciático)) de ratos Sprague-Dawley machos segundo uma 125 dose intratecal única de I-hGalC.

Figura 23 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro e vários tecidos (tecidos adiposos (jejum de rim), glândulas adrenais, osso (fêmur), músculo (esqueletal), nervo ciático)) de ratos Sprague-Dawley machos segundo uma única 125 injeção de bolus intravenosa de I-hGalC.

Figura 24 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro e tecidos (tecidos adiposos (jejum de rim), glândulas adrenais, osso (fêmur), músculo (esqueletal), nervo ciático)) de ratos Sprague-Dawley machos segundo uma dose intratecal única e 125 injeção de bolus intravenosa de I-hGalC.

Figura 25 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro, fluido cefalorraquidiano e vários outros tecidos de ratos Sprague- 125 Dawley machos seguindo uma dose intratecal única de I- hGalC.

Figura 26 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro, fluido cefalorraquidiano e vários outros tecidos de ratos Sprague- Dawley machos segundo uma única injeção de bolus 125 intravenosa de I-hGalC.

Figura 27 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro, fluido cefalorraquidiano e tecidos de ratos Sprague-Dawley machos seguindo uma dose intratecal única e injeção de bolus 125 5 intravenosa de I-hGalC.

Figura 28 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro e tecidos de ratos Sprague-Dawley machos seguindo uma dose intratecal 125 única de I-hGalC.

Figura 29 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro e tecidos de ratos Sprague-Dawley machos seguindo um única injeção de 125 bolus intravenosa de I-hGalC.

Figura 30 mostra resultados exemplares ilustrando as concentrações médias de radioatividade em soro e tecidos de ratos Sprague-Dawley machos seguindo uma dose intratecal 125 única e injeção de bolus intravenosa de I-hGalC.

Figura 31 mostra resultados exemplares ilustrando que a administração via IP de rmGalC reduz os níveis de psicosina cerebral em camundongos twitcher.

Os dados representam média ± SEM para n=4 camundongos por grupo de tratamento.

Figura 32 mostra resultados exemplares ilustrando sobrevivência aumentada com ICV apenas e terapia de rmGalC ICV/IP.

Figura 33 mostra resultados exemplares ilustrando que a psicosina cerebral é reduzida significativamente após injeções ICV e ICV/IP de rmGalC em camundongos twitcher.

Figura 34 mostra resultados exemplares ilustrando melhoria em marcadores histológicos observados em camundongos twitcher tratados com 40 µg de rmGalC.

A proteína ácida fibrilária glial (GFAP) foi utilizada como um marcador de astrócitos.

Iba 1 foi utilizada como um marcador de microglia/macrófago.

A proteína associada à 5 membrana lisossomal-1 (LAMP-1) foi utilizada como um marcador lisossomal.

Figura 35 mostra resultados exemplares ilustrando reacúmulo de psicosina seguindo uma única injeção ICV de rmGalC ou veículo.

Figura 36 mostra resultados exemplares ilustrando a sobrevivência percentual em camundongos twitcher tratados com uma única injeção ICV de rmGalC em PND19/20. Os dados representam n= 8 por grupo.

Figura 37 mostra resultados exemplares ilustrando a sobrevivência percentual em camundongos tratados ICV/IP com rmGalC e rhGalC.

Figura 38 mostra resultados exemplares ilustrando análise de marcha de camundongos tratados com uma única injeção ICV de rmGalC e rhGalC.

Figura 39 mostra resultados exemplares ilustrando uma resposta antigênica a rmGalC ou rhGalC em camundongos twitcher.

Figura 40 mostra resultados exemplares ilustrando níveis de psicosina no CSF de cães GLD naturais e tratados rhGalC.

Figura 41 mostra resultados exemplares ilustrando coloração de IHC de GalC injetada via IT no cérebro com anticorpo policlonal do Grupo 1. Figura 42 mostra resultados exemplares ilustrando coloração de IHC de GalC injetada via IT no cérebro com anticorpo do Grupo 2. Figura 43 mostra resultados exemplares ilustrando coloração de IHC de GalC injetada via IT no cérebro com anticorpo monoclonal de Camundongo. 5 Figura 44 mostra resultados exemplares ilustrando coloração de IHC de GalC injetada via IT no cérebro com anticorpo monoclonal de Camundongo.

Figura 45 mostra resultados exemplares ilustrando coloração de IHC de GalC injetada via IT no fígado com anticorpo monoclonal de Camundongo.

Figura 46 mostra resultados exemplares ilustrando coloração de IHC de GalC injetada via IT no fígado com anticorpo policlonal do Grupo 2. Figura 47 mostra resultados exemplares ilustrando atividade de GalC média no cérebro.

Figura 48 mostra resultados exemplares ilustrando atividade de GalC média no fígado.

Figura 49 mostra resultados exemplares ilustrando imunocoloração de GalC no cérebro a 10X.

Figura 50 mostra resultados exemplares ilustrando imunocoloração de GalC no cérebro a 40X.

Figura 51 mostra resultados exemplares ilustrando coloração de Iba de microglia ativada a 40X.

Figura 52 mostra resultados exemplares ilustrando coloração e LFB/PAS no cérebro a 10X.

Figura 53 ilustra IHC I2S exemplar, o I2S demonstrado detectado nos neurônios (setas) no córtex cerebral e do cerebelo incluindo uma camada de células menígenas cobrindo a superfície do cérebro (cabeças da seta) seguindo as injeções por via intratecal de 3 doses de I2S.

A coloração de IHC I2S em cérebros injetados com 2 doses foi mais fraca (foto não mostrada). Não houve coloração I2S positiva observada para qualquer tipo de células no cérebro de animais de controle de veículo. 40X. 5 Figura 54 mostra a reversão exemplar de patologia no cérebro de Camundongos IKO após injeção I2S intratecal- lombar.

Tecidos cerebrais coloridos por H&E mostraram inúmeros vacúolos de armazenamento celular (setas) nos animais de controle de veículo.

A vacuolização celular foi reduzida através do cérebro em ambos os camundongos injetados com 2 doses (foto não mostrada) e com 3 doses.

A redução marcada foi encontrada naqueles injetados com 3 doses. 40X.

Figura 55 mostra a coloração imuno-histoquímica exemplar de LAMP-1, houve uma redução marcada da atividade lisossomal nos cérebros após 2 doses (foto não mostrada) e 3 doses de tratamento de I2S em comparação com os camundongos controlados por veículo.

A redução foi caracterizada pelo decréscimo no número de células positivas de LAMP-1 e a intensidade de coloração mais leve nas regiões ao longo do cérebro. 40X.

Figura 56 ilustra resultados morfométricos exemplares a partir de uma comparação da área positiva de LAMP-1 média entre os camundongos de I2S (2 e 3 doses) e não tratados de veículo de tipo selvagem (WT), no córtex cerebral (Córtex), núcleo caudado (CP), tálamo (TH), substância branca (WM) e cerebelo (CBL) confirmado que houve reduções significativas na coloração positiva de LAMP-1 em todas as áreas cérebro avaliadas.

Os dados são representados como a média ± s.d. # = P<0.05; * = P<0.01; ** = P<0.001.

Figura 57 mostra que micrográficos de elétron exemplares de células cerebrais mostraram melhorias patológicas no nível ultra-estrutural.

Os neurônios de camundongos tratados com veículo tinham inclusões 5 lameladas, estruturadas semelhantes ao corpo de zebra, e vacúolos contendo material de armazenamento granular (inserção), que foi reduzido em camundongos injetados com I2S.

Oligodendrócitos de camundongos tratados com veículo mostraram grandes vacúolos de armazenamento lucente de elétron (seta) enquanto que oligodendrócitos de camundongos injetados com I2S tinham vacuolização mínima.

Barra de escala: em neurônios, 2µm; em oligodendrócitos, 500 nm.

Figura 58 mostra resultados de imuno-histoquímica exemplares demonstrando I2S detectada em células sinusoidais do fígado seguindo a injeções por via intratecal de 3 doses de I2S.

A coloração de IHC de 2S em fígados injetados com 2 doses foi mais fraca (foto não mostrada). Não houve coloração I2S positiva observada no fígado de animais controlados com veículo. 40X.

Figura 59 mostra tecido exemplar do fígado.

A vacuolização celular grave e a atividade lisossomal anormalmente alta é revelada por coloração H&E e forte imuno-coloração de LAMP-1 foram encontrados em animais controlados com veículo em comparação com aqueles de WT.

A redução marcada de vacuolização celular e imuno-coloração de LAMP-1 foi encontrada após o tratamento por via intertecal com 3 e 2 (foto não mostrada) doses de tratamento de I2S.

A coloração H&E revelou que vacuolização intracitoplásmica desapareceu quase completamente com a estrutura celular do fígado quase normal.

H&E, 40X; LAMP-1,

20X.

Figura 60 mostra tecidos exemplares mostrando o cérebro de um animal do grupo de tratamento de 3mg.

A coloração I2S positiva foi observada em menígenas. 4X. 5 Figura 61 mostra tecidos exemplares mostrando o cérebro de animal do grupo de tratamento de 30mg.

A coloração I2S positiva foi observada em neurônios e células menígenas. 4X.

Figura 62 mostra tecidos exemplares mostrando o cérebro de um animal do grupo de tratamento de 100 mg.

A coloração I2S positiva em neurônios e células menígenas foi mais forte que nos animais tratados com 3 e 30 mg. 4X.

Figura 63 mostra tecidos exemplares mostrando o cérebro de um animal do grupo de tratamento de 150 mg.

Uma grande população de neurônios foi observada como sendo I2S positiva ao longo de células menígenas fortemente positivas.

Figura 64 mostra tecidos exemplares mostrando neurônios I2S positivos e células gliais, juntamente com células menígenas, dentro da camada I do cérebro em um animal do grupo de tratamento de 30mg. 40X.

Figura 65 mostra tecidos exemplares mostrando neurônios I2S positivos, células gliais, juntamente com células perivasculares, dentro da camada III do cérebro em um animal do grupo de tratamento de 30mg. 40X.

Figura 66 mostra tecidos exemplares mostrando neurônios I2S positivos e células gliais dentro da camada VI do cérebro adjacente à substância branca em um animal do grupo de tratamento de 30mg. 40X.

Figura 67 mostra tecidos exemplares mostrando coloração I2S fortemente positiva nos neurônios (cérebro) de um animal do grupo de tratamento de 150 mg. 100X.

Figura 68 mostra tecido exemplar mostrando imuno- coloração I2S da medula espinhal cervical em um grupo de 5 tratamento de 150 mg. 4X.

Figura 69 mostra tecido exemplar mostrando forte imuno-coloração I2S na medula espinhal lombar de um animal do grupo de tratamento de 150 mg. 4X.

Figura 70 mostra tecido exemplar mostrando imuno- coloração I2S fortemente positiva de células meningais, células gliais, e epi/peri/endoneuro (célula conectivas) na seção lombar de um animal do grupo de tratamento de 150 mg. 40X.

Figura 71 mostra uma imagem mostrando que os neurônios na medula espinhal lombar de um animal do grupo de tratamento de 150 mg foram fortemente I2S positivos. 40X . Figura 72 mostra resultados exemplares de um fígado de um animal do grupo de tratamento de 3mg.

Apenas as células sinusoidais foram I2S positivas. 40X.

Figura 73 mostra resultados exemplares de um fígado de um animal do grupo de tratamento de 30mg.

Células sinusoidais e hepatócitos foram I2S positivos. 40X.

Figura 74 mostra resultados exemplares de um fígado de um animal do grupo de tratamento de 100mg.

A imuno- coloração I2S foi forte nas células sinusoidais e nos hepatócitos. 40X.

Figura 75 mostra resultados exemplares de um fígado de um animal do grupo de tratamento de 150mg.

A coloração I2S fortemente positiva foi identificada em células sinusoidais e hepatócitos. 40X.

Figura 76 mostra resultados exemplares de um coração de um animal do grupo de tratamento de 3mg.

A imuno- coloração I2S foi negativa. 40X.

Figura 77 mostra resultados exemplares de um coração 5 de um animal do grupo de tratamento de 30mg.

Células intersticiais foram I2S positivas. 40X.

Figura 78 mostra resultados exemplares de um coração de um animal do grupo de tratamento de 100mg.

A coloração de célula intersticial positive para I2S foi observada. 40X.

Figura 79 mostra resultados exemplares de um coração de um animal do grupo de tratamento de 150mg.

A coloração de célula intersticial fortemente positiva para I2S foi observada. 40X.

Figura 80 mostra resultados exemplares de um rim de um animal do grupo de tratamento de 3mg.

A imuno-coloração I2S foi negativa. 40X.

Figura 81 mostra resultados exemplares de um rim de um animal do grupo de tratamento de 30mg.

Células intersticiais e glomerulares foram I2S positivas.

Figura 82 mostra resultados exemplares de um rim de um animal do grupo de tratamento de 100mg.

A coloração de célula intersticial e glomerular para I2S foi observada. 40X.

Figura 83 mostra resultados exemplares de um rim de um animal do grupo de tratamento de 150mg.

A coloração I2S positiva de células proximais tubulares, glomerulares e intersticiais foi observada. 40X.

Figura 84 ilustra resultados de estudos de imuno- histoquímica (IHC) avaliando os tecidos de CNS de macacos cynomolgus administrados semanalmente com doses de iduronate-2-sulfatase (I2S). Conforme determinado por (IHC), houve deposição celular de I2S ao longo do CNS.

Na substância cinzenta, I2S foi detectada nos neurônios do 5 cérebro, cerebelo, tronco cerebral, e medula espinhal de todos os grupos de um modo dependente da dose.

Na substância cinzenta de superfície de grupos de dose mais altas, números maiores de neurônios cerebrais foram positivos para coloração I2S no córtex de superfície (Figura 84A). I2S também foi detectada em neurônios no tálamo (Figura 84B), hipocampo (Figura 84C), núcleo caudado (Figura 84D) e medula espinhal (Figura 84E). Células perivasculares e meningais também foram positivas para coloração I2S (Figura 84F). A barra de escalas identificada corresponde a 25um.

Figura 85 compara graficamente a clareza de iduronate- 2-sulfatase (I2S) nos pools craniano e espinhal pelo gráfico da quantidade de I2S em tais pools em relação ao tempo seguindo a administração.

Figura 86 ilustra a deposição de substância cinzenta dependente da dose de iduronate-2-sulfatase (I2S) administrado por via intratecal a primatas não humanos ao longo de seis meses.

A intensidade de coloração ilustrada corresponde ao acúmulo de iduronate-2-sulfatase no tálamo.

Na presente Figura 86, os núcleos são contra-coloridos pro DAPI e aparecem como azul e a proteína (I2S) aparece com verde.

Figura 87 ilustra o acúmulo dependente da dose de iduronate-2-sulfatase (I2S) administrado por via intratecal a primatas não humanos seguindo uma injeção única e seguindo injeções múltiplas ao longo de um período de seis meses.

A intensidade de coloração ilustrada corresponde ao acúmulo de proteína de I2S no córtex cerebral.

Figura 88 demonstra a localização celular de 5 iduronate-2-sulfatase (I2S) ao longo do cérebro de um primata.

Figura 88A ilustra a visão em seção transversal do tecido cerebral extraído do cérebro do primata, enquanto que a Figura 88B ilustra que áreas particulares da região correspondente às três áreas do tecido de substância branca (designado W1, W2 e W3), os tecidos de substância branca próxima ao ventrículo (VW) e de substância cinzenta de superfície (SG) da seção identificada na Figura 88A.

Figura 89A – D ilustra a admissão neuronal e de oligodendrócito e associação axonal de iduronate-2- sulfatase (I2S) administrada por via intratecal a primatas segundo injeções mensais ao longo de um período de seis meses.

Particularmente, Figura 89A, Figura 89B, Figura 89C e Figura 89D são ilustrativas de uma coloração de filamento dos tecidos do cérebro do primata de iduronate-2-sulfatase (I2S) administrada por via intratecal e respectivamente corresponde às três áreas das regiões de substância branca (W1, W2 e W3) e de substância cinzenta de superfície (SG) identificadas na Figura 87B.

Figura 89A ilustra admissão de oligodendrócito de I2S administrada por via intratecal nos tecidos da substância branca (W1). Figura 89B e Figura 89C ilustram a admissão de oligodendrócito e associação axonal da I2S administrada por via intratecal nos tecidos de substância branca W2 e W3 respectivamente.

Figura 89D ilustra admissão neuronal da I2S administrada por via intratecal nos tecidos de substância cinzenta de superfície

(SG). Figura 90 ilustra a identificação celular de iduronate-2-sulfatase na substância branca próxima ao ventrículo (VW) de um primata não humano (setas no alto à 5 esquerda). Conforme mostrado pelas imagens superimpostas (setas embaixo à direita), a iduronate-2-sulfatase não é associada à mielina (alto à direita). Na presente Figura 90, os núcleos são contra-coloridos por DAPI (embaixo à esquerda), a Proteína (I2S) aparece na caixa superior à esquerda.

Figura 91 ilustra a coloração nos tecidos de cachorros Beagle saudáveis que foram administrados com uma injeção única de modo intracerebroventricular (ICV) ou por via intratecal (IT) de iduronate-2-sulfatase (I2S). Conforme mostrado nas imagens a-h, I2S foi amplamente distribuída ao longo da substância cinzenta de ambos os grupos IT e ICV conforme determinado por imuno-histoquímica (IHC). As imagens a e b ilustram que, no córtex cerebral, os neurônios foram positivos para I2S em todas as seis camadas neuronais, a partir da camada molecular de superfície para a camada interna profunda em ambos os grupos IT e ICV.

As imagens c e d ilustram que a I2S do córtex cerebelar dos grupos IT e ICV foi detectada em neurônios, incluindo células de Purkinje.

De modo semelhante, as imagens e e f ilustram em ambos os grupos IT e ICV que uma grande população de neurônios no hipocampo foi positiva para I2S.

Finalmente, as imagens g e h demonstram que os neurônios positivos para I2S também foram encontrados no tálamo e no núcleo caudado em ambos os grupos IT e ICV.

Na presente Figura 91, a coloração I2S é indicada com setas.

Figura 92 ilustra comparativamente os tecidos do corpus callosum de camundongos esgotados com iduronate-2- sulfatase (IKO) que não foram tratados ou que foram administrados com I2S por via intratecal.

Conforme 5 mostrado, os camundongos IKO tratados exibiram uma redução da vacuolização celular característica de certos distúrbios de armazenamento lisossomal no corpus callosum e tecidos do fórnix do camundongo IKO tratado com I2S.

Figura 93A ilustra uma redução marcada na presença de proteína associada à membrana lisossomal-1 (LAMP1), um biomarcador patológico de doença lisossomal, nos tecidos do córtex cerebral de superfície do camundongo IKO (Figura 93A) em relação ao camundongo IKO de controle não tratado (Figura 93B) sob magnificação tanto 20X quanto 40X.

Figura 94 mostra um dispositivo de liberação de droga por via intratecal (IDDD) exemplar.

Figura 95 mostra um sistema de acesso implantável por via intratecal de perfil baixo PORT-A-CATH® exemplar.

Figura 96 mostra um dispositivo de liberação de droga por via intratecal (IDDD) exemplar.

Figura 97 mostra um dispositivo de liberação de droga por via intratecal (IDDD) exemplar, que permite a administração em casa para a terapia de substituição de enzima (ERT) de CNS.

Figura 98 é uma ilustração exemplar mostrando o efeito da vacuolização após uma única injeção intra-cerebral de idursulfase em neurônios (células de Purkinje). Figura 99 é uma ilustração exemplar mostrando a atividade de I2S no cérebro por uma dose e região.

Figura 100 é uma ilustração exemplar mostrando os dados de localização imuno-histoquímica de Idursulfase em diferentes profundidades do córtex cerebral.

Figura 101 é uma ilustração exemplar mostrando a atividade de I2S na medula espinhal de macaco seguindo 5 dosagem intratecal com idursulfase.

Figura 102 é uma ilustração exemplar mostrando a atividade de I2S no fígado, coração e rim de após dosagem intratecal com Idursulfase.

Figura 103 mostra um esquema exemplar para um programa de teste Hunter-IT de escalação.

Figura 104 é uma ilustração exemplar mostrando as medições de concentrações de I2S em várias seções de tecido cerebral após dose de 30 mg.

Gráficos diferentes correspondem a tempos diferente de medições.

Figura 105 é uma ilustração exemplar mostrando as medições de concentração de I2S após a administração ao longo do tempo através de várias vias de administração para várias concentrações de produto.

Figura 106 mostra Imagem PET de Idursulfase-IT 124 rotulada por I em Macacos Cynomolgus em t=5 horas seguindo a dosagem por IV, IT-L, ou ICV.

Figura 107 é uma ilustração exemplar mostrando os dados de concentração de ASA em soro após a administração intravenosa.

Figura 108 é uma ilustração exemplar mostrando dados de concentração de ASA em soro após a administração lombar por IT.

Figura 109 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de ASA em CSF após a administração por IV.

Figura 110 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de ASA em CSF após a administração lombar via IT.

Figura 111 mostra foto-micrográficos exemplares de tecido cerebral, meninges, infiltrados (grupos de dose alta 5 e média, ambos os sexos) após o tratamento.

Figura 112 mostra outros foto-micrográficos exemplares de tecido cerebral, meninges, infiltrados (grupos de dose alta e média, ambos os sexos) após tratamento.

Figura 113 mostra foto-micrográficos exemplares de tecido cerebral, perivascular, infiltrados (machos de dose média; fêmeas de dose alta) após tratamento.

Figura 114 mostra a coloração azul Alcian exemplar da medula espinhal de Camundongos MLD imunotolerantes tratados com rhASA1 e resultados ilustrando a redução de sulfateto conforme determinado por coloração azul Alcian da medula espinhal cervical em animais que receberam injeções por via intratecal de rhASA nos dias 1, 8, 15 e 22 em doses de 520 mg/kg de peso do cérebro ou controle de veículo.

Conforme demonstrado, tratamento com rhASA injetado por via intratecal resultou na redução de acúmulo de sulfateto na medula espinhal, inclusive na região cervical da medula espinhal.

Figura 115 ilustra a análise de morfometria exemplar de seções de medula espinhal coloridas por azul a partir de Camundongos MLD imunotolerantes tratados com rhASA1 e resultados ilustrando densidade óptica de azul Alcian na medula espinhal total (T-Medula espinhal), substância cinzenta total (T-GM), substância cinzenta lombar (L-GM), substância cinzenta cervical (C-GM), substância branca total (T-WM), substância branca lombar (L-WM), e substância branca cervical (C-WM) conforme determinado por análise de morfometria.

Conforme demonstrado, uma redução estatisticamente significativa na coloração azul Alcian foi observado em animais tratados com rhASA em comparação para 5 um controle de veículo.

Figura 116 mostra a redução exemplar de coloração LAMP na substância branca (Fímbria) de Camundongos MLD imunotolerantes tratados com rhASA1 mostra resultados exemplares ilustrando níveis de LAMP-1 na fímbria conforme determinado por imuno-histoquímica.

Magnificação = 20X.

Conforme demonstrado, o tratamento com rhASA injetada por via intratecal resultou na redução de LAMP-1 na substância branca cerebral.

Figura 117 ilustra a análise de morfometria exemplar de coloração LAMP do cérebro de Camundongos MLD imunotolerantes tratados com rhASA1 e resultados ilustrando intensidade de coloração LAMP-1 no corpus callosum (CC), fímbria (F), cerebelo substância branca (CB-WM) e tronco cerebral (BS) de animais tratados com 20 mg/kg de rhASA intravenosa, 300 mg/kg de peso do cérebro de rhASA intratecal, 520 mg/kg de peso do cérebro de rhASA intravenosa, ou controle de veículo.

Figura 118 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de ASA em punções cerebrais de macacos Cynomolgus jovens dosados com veículo segundo a dosagem IT quinzenal (EOW) IT durante 6 meses (necrópsia principal). Figura 119 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de ASA em punções cerebrais de macacos Cynomolgus jovens seguindo a dosagem IT EOW de rhASA1 em 1,8 mg/dose durante 6 meses (necrópsia principal).

Figura 120 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de ASA em punções cerebrais de macacos Cynomolgus jovens seguindo a dosagem IT EOW de rhASA1 em 6,0 mg/dose durante 6 meses (necrópsia principal). 5 Figura 121 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções cerebrais de macacos Cynomolgus jovens seguindo a dosagem IT EOW de rhASA1 em 18,6 mg/dose durante 6 meses (necrópsia principal). Figura 122 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções cerebrais de macacos Cynomolgus jovens seguindo a dosagem IT EOW (controle de PBS) durante 6 meses (necrópsia principal). Figura 123 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções cerebrais de macacos Cynomolgus jovens segundo a dosagem IT EOW de veículo durante 6 meses (necrópsia principal). Figura 124 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções cerebrais de macacos cynomolgus 1 jovens seguindo a dosagem IT EOW de rhASA1 em 1,8 mg/dose durante 6 meses (necrópsia principal). Figura 125 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções cerebrais de macacos Cynomolgus jovens seguindo a dosagem IT EOW de rhASA1 em 6,0 mg/dose durante 6 meses (necrópsia principal). Figura 126 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções cerebrais de cynomolgus jovens seguindo a dosagem IT EOW de rhASA1 em 18,6 mg/dose durante 6 meses (necrópsia principal). Figura 127 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções selecionadas a partir da superfície do cérebro para controle de dispositivo, veículo, animais tratados com 1,8 mg, 6,0 mg e 18,6 mg. (macho e fêmea separados, dados de controle de dispositivo são a partir de necrópsia de recuperação, todos os outros 5 dados são a partir de necrópsia principal) Figura 128 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções selecionadas a partir da área branca profunda do cérebro para controle de dispositivo, veículo, animais tratados com 1,8 mg, 6,0 mg e 18,6 mg. (macho e fêmea separados, dados de controle de dispositivo são a partir de necrópsia de recuperação, todos os outros dados são a partir de necrópsia principal) Figura 129 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções selecionadas a partir da área cinzenta profunda do cérebro para controle de dispositivo, veículo, animais tratados com 1,8 mg, 6,0 mg e 18,6 mg. (macho e fêmea separados, dados de controle de dispositivo são a partir de necrópsia de recuperação, todos os outros dados são a partir de necrópsia principal) Figura 130 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em punções selecionadas a partir de várias regiões no controle de dispositivo, veículo, animais tratados com 1,8 mg, 6,0 mg e 18,6 mg. (macho e fêmea separados, dados de controle de dispositivo são a partir de necrópsia de recuperação, todos os outros dados são a partir de necrópsia principal) Figura 131 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA em seções da medula espinhal de macacos Cynomolgus jovens seguindo a dosagem IT EOW para 6- meses (necrópsia de recuperação).

Figura 132 é uma ilustração exemplar mostrando a concentração de rhASA no fígado de macacos Cynomolgus jovens seguindo a dosagem IT EOW para 6 meses (047-021) (necrópsia de recuperação). 5 Figura 133 é uma ilustração exemplar mostrando as localizações anatômicas de punções cerebrais no WM subcortical, WM periventricular (e substância branca profunda) e WM subcortical.

Figura 134 é uma ilustração exemplar mostrando as localizações anatômicas de punções cerebrais no corpus callosum e WM subcortical pericalosal, cápsula interna– GPi, cápsula interna – núcleo caudado, substância branca profunda, WM subcortical e córtex, putâmen, e WM subcortical temporal e córtex.

Figura 135 é uma ilustração exemplar mostrando as localizações anatômicas de punções cerebrais na substância cinzenta profunda, WM profundo (periventricular frontal e subcortical), e branco subcortical e córtex – sagital superficial.

Figura 136 é uma ilustração exemplar mostrando as localizações anatômicas de punções cerebrais no corpus callosum e WM subcortical pericalosal, WM subcortical profundo, cinzento profundo, WM periventricular, WM subcortical e hipocampo.

Figura 137 é uma ilustração exemplar mostrando as localizações anatômicas de punções cerebrais no corpus callosum e WM profundo.

Figura 138 é uma ilustração exemplar mostrando as localizações anatômicas de punções cerebrais no WM subcortical – lóbulo occipital e substância branca do cerebelo, incluindo o núcleo denteado (WM). Figura 139A-G ilustra a concentração de arilsulfatase A (ASA) humana recombinante em punções de tecido extraídas a partir dos tecidos cerebrais de macacos Cynomolgus jovens 5 e adultos administraram tanto um veículo, 1,8mg de rhASA ou 18,6mg de rhASA.

Cada uma das Figura 139A-G corresponde a uma região do tecido cerebral retratada na Figura 134. Figura 140A e Figura 140B são uma ilustração exemplar mostrando a comparação das concentrações de arilsulfatase A (ASA) humana recombinante detectada na substância branca profunda (Figura 140A) ou na substância cinzenta profunda (Figura 140B) tecidos cerebrais de macacos Cynomolgus jovens e adultos que foram rhASA administrada por via intratecal (IT) ou por via intracerebroventricular (ICV). Figura 141A é uma ilustração exemplar mostrando as concentrações de ASA detectada em vária punções de tecido obtidas a partir de macacos cynomolgus jovens (<12 meses de idade) administradas via IT de uma dose de 18,6 ou 1,8mg de arilsulfatase A recombinante humana (rhASA). Conforme ilustrado em ambas as Figura 140A-B, a concentração de ASA liberada aos tecidos estavam dentro de, ou do contrário excederam a concentração terapêutica alvo de 2,5ng/mg de rhASA.

As regiões anatômicas de tecido cerebral que correspondem a cada um dos números de punção retratados na Figura 140A e Figura 140B são as: substância branca subcortical (1); substância branca periventricular e substância branca profunda (2); substância branca subcortical (3); substância branca subcortical (4); cápsula interna (5); núcleo caudado de cápsula interna (6); substância branca profunda (7); substância branca subcortical e córtex (8); putâmen (9); substância branca subcortical temporal e córtex (10), substância cinzenta profunda (11), substância cinzenta profunda (12), frontal periventricular & subcortical (13); substância branca 5 subcortical, córtex superficial perifalxian (14); substância branca subcortical de corpus callosum e pericalosal (15); substância branca subcortical profunda (16); substância cinzenta profunda (17); substância cinzenta profunda (18); substância branca periventricular (19); substância branca subcortical profunda (20); hipocampo (21); corpus callosum (22); substância branca profunda (23); substância branca subcortical, lóbulo occipital (24); e substância branca do cerebelo (25). Figura 142A ilustra a área de tecido de substância branca profunda extraída a partir de um macaco cynomolgus administrado via IT com 1,8mg de ASA.

Figura 142B ilustra imunocoloração do tecido de substância branca profunda e distribuição de ASA em células relevantes.

Na Figura 142B, a proteína (ASA) é ilustrada na caixa inferior à direita.

Figura 142C ilustra que a ASA –localização da organela nos tecidos da substância branca profunda do macaco cynomolgus e particularmente nos lisossomos.

Na Figura 142C, a imunocoloração ASA é ilustrada na caixa superior à esquerda.

Figura 143 compara a distribuição de arilsulfatase A 124 (ASA) rotulada com I utilizando varredura PET, 24 horas seguindo a administração via IT ou ICV de tal ASA rotulada a um macaco cynomolgus.

Figura 144 ilustra a distribuição de ASA rotulada com 124 I seguindo imediatamente a administração via ICV a um macaco cynomolgus, e compara a distribuição de ASA rotulada 124 com I administrada via IT dentro de 2-5 horas.

Conforme demonstrado, a administração por via IT liberou a ASA 124 rotulada com I aos mesmos compartimentos iniciais 5 (cisterna e espinha proximal) como aquela mostrada para a administração via ICV.

Figura 145 mostra administração por via IT e ICV exemplar em um modelo de camundongo.

Figura 146A mostra um resultado exemplar ilustrando concentrações no CSF de HNS como uma função de tempo em doses de 1,5, 4,5 e 8,3 mg seguindo 6 meses de dosagem.

Figura 146B detalha um resultado exemplar ilustrando concentrações de anticorpo anti-HNS no CSF após 6 meses de administração por via IT de doses de 1,5, 4,5 e 8,3 mg em macacos.

Os dados são mostrados para machos e fêmeas combinados.

Figura 146C detalha um resultado exemplar concentrações de anticorpo anti-HNS no CSF após 6 meses de administração por via IT de doses de 1,5, 4,5 e 8,3 mg em macacos seguindo 6 meses de dosagem.

Os dados são mostrados são mostrados para machos e fêmeas combinados.

As duas concentrações mais altas (32,205 ng/ml e 15,467 ng/ml) pós dose 6 via IT 6 em 8.3 mg de HNS foram excluídas do gráfico devido a nenhuma amostra no CSF ter sido tirada antes da dose 6. Figura 147 mostra um resultado exemplar ilustrando imagens representativas de seções de tecido a partir das meninges e parênquima do cérebro colorido com hematoxilina e eosina.

Figura 147A mostra um resultado exemplar ilustrando uma visão de baixa potência de infiltrados neutrofílicos locais ao cateter IT em um macaco DC.

Figura

147B mostra um resultado exemplar ilustrando uma visão de alta potência de infiltrados eosinofílicos nas meninges de um macaco de dose alta (8,3 mg/dose); a gravidade geral dos infiltrados foi semelhante ao grupo de dose média (4,5 5 mg/dose) (não mostrado). Figura 147C mostra um resultado exemplar ilustrando uma visão de alta potência de um macaco de dose baixa (1,5 mg/dose) mostrando eosinófilos no espaço perivascular (parênquima cerebral). Figura 147D mostra um resultado exemplar ilustrando um macaco de dose baixa (1,5 mg/dose) mostrando eosinófilos no espaço perivascular e parênquima adjacente.

Figura 147E mostra um resultado exemplar ilustrando eosinófilos no parênquima de medula espinhal (indicado pelas) de um animal do grupo de dose baixa; neurônios na área são normais.

Figura 147F mostra um resultado exemplar ilustrando eosinófilos e uma área de microgliose (setas indicam eosinófilos; as caixas indicam uma área de microgliose) em um macaco de dose baixa (1,5 mg/dose). Há vários neurônios grandes na área, todos os quais são normais.

Barra de escalas: 200 um.

Figura 148 mostra um resultado exemplar ilustrando atividade da HNS enzima nas medulas espinhais e cérebros de macaco.

Figura 148A/B mostra um resultado exemplar ilustrando a atividade nas medulas espinhais de macacos (A) macho e (B) fêmea.

Fatia -3 = lombar, fatias 3, 6 = torácica, e fatia 9 = cervical; 0 = ponta de cateter.

Figura 148C/D mostra um resultado exemplar ilustrando atividade de HNS nos cérebros de macacos (C) macho e (D) fêmea.

As fatias são numeradas de rostral a caudal (3 a 15). Todas as amostras de tecido foram coletadas aproximadamente 24 horas após a última dose ou 4 semanas após a última dose para a recuperação dos animais. DC, controle de dispositivo. Os dados representam média ± SEM para n = 4 macacos por grupo de tratamento. Figura 149 mostra um resultado exemplar ilustrando 5 atividade de enzima no cérebro e fígado de macaco. Figura 149A mostra um resultado exemplar ilustrando a distribuição de atividade de HNS no cérebro de macaco do grupo de dose alta (8,3 mg/dose). As mudanças na atividade para áreas do cérebro superficiais, profundas e muito profundas (periventricular) em comparação com níveis endógenos (grupo DC) são mostradas. Todas as amostras de tecido foram coletadas aproximadamente 24 horas após a última dose ou 4 semanas após a última dose para recuperação dos animais. Os dados representam ± SEM para n = 6 macacos (ambos os sexos), fatias de cérebro 6 e 9. Os dados para dois macacos não foram incluídos; na necrópsia os cateteres não foram encontrados em evidência. Figura 149B mostra a atividade de HNS no fígado de macaco. Todas as amostras de tecido foram coletadas aproximadamente 24 horas após a última dose ou 4 semanas após a última dose para a recuperação dos animais. DC, controle de dispositivo. Rec, recuperação. Os dados representam média ± SEM para n = 4 macacos por grupo de tratamento exceto para o grupo de fêmeas de baixa dose (4,5 mg/dose) (n = 3).

[0001]Figura 150 mostra um resultado exemplar ilustrando a localização de HNS no cerebelo de macacos cynomolgus jovens: coorte interino de 3 meses. Figura 150A mostra um resultado exemplar ilustrando cerebelo de um animal de controle de veículo (0 mg/dose) negativo para imunocoloração HNS; 20x de magnificação. Figura 150B mostra um resultado exemplar ilustrando cerebelo de um animal de baixa dose (1,5 mg/dose) - mostrando coloração positive mínima limitada à camada molecular; 20x de magnificação.

Figura 150C mostra um resultado exemplar ilustrando 5 cerebelo de um animal de dose média (4,5 mg/dose) mostrando coloração mínima na camada granular externa; 20x de magnificação.

Figura 150D mostra um resultado exemplar ilustrando coloração moderada no cerebelo de um animal de alta dose (8,3 mg/dose) incluindo células moleculares, camada granular externa e células de Purkinje; 20x de magnificação.

Figura 151 mostra um estudo exemplar da concentração de HNS na região da cabeça em gráfico com o tempo nos 124 primeiros 20 minutos após a dosagem via IT de I-HNS em 1 e 10 mg/kg.

Figura 152 mostra um estudo exemplar da concentração de HNS no cérebro em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg.

Figura 153 mostra um estudo exemplar da concentração de HNS na região do cérebro em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg.

Figura 154 mostra um estudo exemplar da concentração de HNS na região da cabeça em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg.

Figura 155 mostra um estudo exemplar da concentração de HNS na região da espinha proximal em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg.

Figura 156 mostra um estudo exemplar da concentração de HNS na região da espinha média em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg.

Figura 157 mostra um estudo exemplar da concentração de HNS na espinha distal em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg.

Figura 158 mostra um estudo exemplar da concentração 5 de HNS no fígado em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg.

Figura 159 mostra um estudo exemplar da concentração de HNS no cérebro em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg, indivíduo (top) e média ±SD (fundo). Figura 160 mostra um estudo exemplar da concentração hepática de HNS em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg, indivíduo (top) e média ±SD (fundo). Figura 161 mostra um estudo exemplar da concentração renal de HNS em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg, indivíduo (top) e média ±SD (fundo). Figura 162 mostra um estudo exemplar da concentração do coração de HNS em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg, indivíduo (top) e média ±SD (fundo). Figura 163 mostra um estudo exemplar da concentração de pele de HNS em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg, indivíduo (top) e média ±SD (fundo). Figura 164 mostra um estudo exemplar da concentração do cérebro de HNS em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg (top), e uma comparação com parâmetros PK compartimentais no cérebro (fundo).

Figura 165 mostra um estudo exemplar do concentração do fígado de HNS em gráfico com o tempo após a dosagem via IT de124I-HNS em 1 e 10 mg/kg (top), e uma comparação com parâmetros PK compartimentais no fígado (fundo). 5 Figura 166 ilustra células de fibroblasto primárias exemplares de humano normal que oram utilizadas para estudo de internalização celular de rhNaglu e Naglu-IGFII.

A admissão celular de rhNaglu foi mínima, enquanto que a admissão celular de Naglu-IGFII foi muito mais pronunciada.

A curva de saturação de internalização de Naglu-IGFII indicou uma admissão mediada por receptor.

Essa admissão foi inibida por IGFII, mas não por manose-6-fosfato.

Figura 167 mostra resultados de um estudo de microscopia confocal exemplar utilizando células de fibroblasto de um sujeito com Sanfilippo B (GM01426). A internalização extensiva de Naglu-IGFII, e a co-localização de Naglu-IGFII com Lamp-1 foram observadas.

Figura 168 é uma ilustração exemplar mostrando Atividade de Naglu em camundongo do tipo selvagem (WT), Naglu-/- (KO) Naglu+/- (Het) de heterozigoto.

A deficiência total de Naglu em camundongo com Sanfilippo B foi observada no cérebro, fígado, rim e baço.

Figura 169 mostra a visão superior e lateral do cérebro de camundongo para indicar o local da injeção intracisternal (IC) e o plano de corte para análises histológicas.

O micrográfico médio, uma seção transversal do cérebro do camundongo vista a 1x de magnitude.

As áreas em caixas indicam o campo para imagem de microscopia 4x no micrográfico de fundo.

Micrográfico de fundo, imagem 4x da lamina histológica.

Caixa A e B indica o campo de imagem de microscopia 40x na Figura 170 e Figura 171. Figura 170 mostra a imuno-histoquímica exemplar do córtex cerebral em camundongos com Sanfilippo B 7 dias após injeção intracisternal (IC) 40x.

Ambas a rhNaglu e a Naglu- 5 IGFII exibiram admissão celular extensiva em neurônios bem como em células gliais, e os padrões de distribuição e admissão celular foram muito semelhantes entre as duas proteínas. (anticorpo monoclonal Naglu anti-humano). Figura 171 mostra imuno-coloração exemplar de LAMP-1 do córtex cerebral em 40x de magnificação.

Comparando-se o cérebro do camundongo do tipo selvagem, aumento no armazenamento lisossomal aumentado foi observado no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratado com veículo, conforme demonstrado pelo aumento de pontos positivos para imuno-coloração de LAMP-1. O cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratado tanto com rhNalgu quanto com Naglu- IGFII exibiram a redução de armazenamento lisossomal que foi muito semelhante ao peso de camundongo.

Figura 172A ilustra a ampla redução da vacuolização celular nos tecidos da substância branca de camundongos deficientes de Naglu administrados via IT com Naglu em relação aos mesmos deficientes de Naglu que foram administrados com o veículo.

Figura 172B ilustra uma redução marcada na imunocoloração da proteína associada à membrana lisossomal-1 (LAMP1) nos tecidos da substância branca de camundongos deficientes de Naglu administrados com Naglu por via intratecal em relação aos mesmos camundongos deficientes de Naglu que foram administrados com um veículo.

Figura 173 ilustra e compara quantitativamente a concentração de LAMP medida no córtex cerebral, núcleo caudado e putâmen (CP), tálamo (TH), cerebelo (CBL) e substância branca (WM) dos camundongos deficientes de Naglu que foram administrados com Naglu em relação a ambos os 5 camundongos do tipo selvagem e camundongos deficientes de Naglu que foram administrados com um veículo.

As áreas positivas para LAMP em cada área de tecido cerebral analisada foram adicionalmente reduzidas seguindo a administração por via intratecal de três doses de Naglu no decorrer de sete dias (Figura 173A) em relação a duas doses de Naglu no decorrer de duas semanas (Figura 173B). Figura 174 ilustra um diagrama anatômico sagital mediano exemplar do CNS humano que é utilizado como uma referência nessa figura, para demonstrar o local da injeção via IT por peso de ratos canulados.

As setas indicam a localização anatômica aproximada da injeção via IT na medula espinhal da região do córtex cerebral em que os tecidos foram tirados para estudo imuno-histoquímico.

Figura 175 ilustra atividade de Naglu exemplar no cérebro após injeção via IT.

A atividade de Naglu foi significativamente maior no cérebro de ratos por peso injetados com Naglu-TAT e Naglu-IGFII.

Figura 176 mostra imunocoloração de Naglu exemplar do córtex cerebral de ratos canulados por peso tratados com rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-kif e PerT-Naglu 24hr após a injeção via IT 20x.

A Naglu-IGFII foi a única proteína que exibiu boa distribuição extensiva no parênquima do cérebro.

A admissão celular nos neurônios e células gliais foi também evidente em ratos tratados com Naglu-IGFII.

Por outro lado, grupos tratados com rhNaglu,

Naglu-TAT, Naglu kif e PerT-Naglu, a proteína permaneceu nas meninges (M). Figura 177 mostra magnificação de alta potência exemplar de lâminas selecionadas a partir da Figura 176. No 5 painel superior, em rato canulado por peso tratado com rhNaglu, a rhNaglu permaneceu nas meninges (M), nenhuma coloração positiva foi encontrada no parênquima do cérebro.

No painel inferior, em rato canulado tratado com Naglu- IGFII, distribuição extensiva foi bem observada no parênquima do cérebro, e a admissão celular foi observada em neurônios e células gliais.

Figura 178 ilustra a atividade de Naglu exemplar no cérebro e fígado 24hr após a última injeção via IT.

Dentre os três grupos tratados, a atividade de Naglu no cérebro não mostrou diferenças significativas, o mesmo é verdadeiro para a atividade de Naglu no fígado.

Esse resultado indicou que a atividade de Naglu detectada no cérebro e fígado foi amplamente devida à última injeção, que ocorreu 24hr antes do sacrifício.

Figura 179 ilustra o nível de GAG total no cérebro e fígado após injeção via IT de Naglu-IGFII.

A GAG total no cérebro de camundongos com Sanfilippo B tratados com veículo exibiram aumentos progressivos, um reflexo do efeito cumulativo conforme o envelhecimento dos camundongos com Sanfilippo B. uma redução estatisticamente significativa de GAG no cérebro foi observada em grupos de 3x de injeção (p<0,05). Reduções estatisticamente significativas de GAG no fígado foram também observadas em grupos com injeções 2x e 3x (p<0.05). a alteração mais rápida e drástica do nível de GAG no fígado do que no cérebro é um fenômeno que também foi observado na liberação via IT de I2S para a Síndrome de Hunter.

Figura 180 mostra a biodistribuição exemplar de Naglu no cérebro de camundongos com Sanfilippo B após a injeção 5 via IT.

A coloração imunofluorescente de Naglu revelou a proteína Naglu-IGFII nas meninges (M) e parênquima do cérebro.

A admissão celular foi observada em grupos de injeções de 2x e 3x.

G: células gliais.

Figura 181 é uma ilustração exemplar mostrando uma seção coronal do cérebro de camundongos.

As caixas indicam onde as figuras para imuno-coloração de LAMP-1 foram tiradas.

Para demonstrar a extensão da distribuição de proteína e a eficácia, os tecidos do córtex cerebral e subcortical tais como o núcleo caudado, tálamo e substância branca foram selecionados para imuno-coloração de LAMP-1. Figura 182 é uma ilustração exemplar mostrando a imuno-coloração de LAMP-1 do córtex cerebral em 40x de magnificação.

Comparando-se o cérebro do camundongo do tipo selvagem, o aumento do armazenamento lisossomal foi observado no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratado com veículo, conforme observado pelo aumento nos pontos positivos para imuno-coloração de LAMP-1. A redução do armazenamento lisossomal após injeção via IT de Naglu-IGFII foi evidente pelo tamanho reduzido de pontos positivos no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratados com injeção de 2x, e o número e tamanho reduzidos de pontos positivos no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratados com injeção de 3x.

Figura 183 é uma ilustração exemplar mostrando a imuno-coloração de LAMP-1 do núcleo caudado, um núcleo subcortical (40x). Semelhante ao que foi observado no córtex cerebral, o aumento no armazenamento lisossomal foi observado no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratado com veículo, conforme foi observado pelo aumento dos pontos 5 positivos para imuno-coloração de LAMP-1. A redução de armazenamento lisossomal após injeção via IT de Naglu-IGFII foi evidente pelo tamanho reduzido de pontos positivos no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratados com injeção de 2x e pelo número e tamanho reduzidos de pontos positivos no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratados com injeção de 3x.

Figura 184 é uma ilustração exemplar mostrando a imuno-coloração de LAMP-1 do tálamo, um núcleo diencefálico (40x). A redução do armazenamento lisossomal após a injeção via IT de Naglu-IGFII foi evidente pelo tamanho reduzido de pontos positivos no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratados com injeção de 2x e pelo número e tamanho reduzidos de pontos positivos no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratados com injeção de 3x.

Figura 185 é uma ilustração exemplar mostrando a imuno-coloração de LAMP-1 de substância branca (40x). O rastro longitudinal de fibras de axônio do neurônio distingue a substância branca das substâncias cinzentas apresentadas nas Figuras 181-184. Entretanto, o mesmo padrão de aumentos de armazenamento lisossomal pôde ser observado no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratado com veículo quando comparado ao camundongo do tipo selvagem.

A redução de armazenamento lisossomal após a injeção via IT de Naglu-IGFII foi evidente pelo tamanho reduzido e número reduzido de pontos positivos no cérebro de camundongo com Sanfilippo B tratados com injeção de 2x e 3x.

Figura 186 é uma ilustração exemplar mostrando a imuno-coloração de LAMP-1 do córtex cerebelar.

A morfologia 5 do córtex cerebelar foi evidente pelos neurônios granulares densamente popularizados, a Camada molecular hipocelular, e a única camada dos neurônios de Purkinje entre os neurônios granulares e a camada molecular.

Os neurônios de Purkinje foram identificados pelo citoplasma grande e os dendritos ocasionais projetando-se na Camada molecular.

Figura 187 é uma ilustração exemplar mostrando a coloração de Naglu no cérebro, medula espinhal e fígado.

No cérebro e na medula espinhal, a Naglu injetada foi detectada nas meninges (M) apenas por IHC e nenhuma coloração positiva para Naglu foi detectada em outras regiões.

No fígado, células sinusoidais (S) foram positivas para Naglu e nenhuma admissão de Naglu foi verificada nos hepatócitos (H). Figura 188 é uma ilustração exemplar mostrando a imunocoloração de LAMP e coloração de H & E do fígado e medula espinhal.

Em comparação com os animais de veículo, a coloração LAMP foi reduzida ao longo de ambos os fígados e medulas espinhais tratados com Naglu.

A coloração H & E mostrou que a vacuolização celular em hepatócitos foi reduzida no grupo tratado em comparação com os animais tratados com veículo.

Figura 189 A e Figura 189 B é uma ilustração exemplar mostrando coloração H & E do cérebro e melhoria na morfologia do cérebro após 6 injeções via IT quinzenalmente (EOW) de Naglu durante 3 meses.

No cérebro tratado, a vacuolização celular (setas) em todas as regiões examinadas diminuiu em comparação com o grupo de veículo.

Figura 190 A e Figura 190 B são ilustrações exemplares mostrando a imunocoloração LAMP em várias regiões do 5 cérebro após 6 injeções via IT de Naglu durante 3 meses.

Em comparação com o grupo tratado com veículo, a administração de Naglu por via IT a camundongos com Sanfilippo B resultou em uma redução da atividade lisossomal em todas as regiões examinadas reveladas pela imunocoloração LAMP.

Essa redução foi caracterizada pelo decréscimo no número de células positivas para LAMP, tamanho de células menor e colocação mais leve.

Uma redução marcada foi observada no cerebelo e tronco cerebral, que estão localizados na parte caudada do cérebro próximas à medula espinhal, em comparação com outras regiões do cérebro.

Uma redução clara foi observada nas regiões profundas do cérebro, incluindo a substância branca, hipocampo, e tálamo.

Figura 191 A e Figura 190 B são ilustrações exemplares mostrando IHC Iba em várias regiões do cérebro após 6 injeções via IT de Naglu durante 3 meses, que revelaram a ativação de microcélulas gliais.

Em comparação com o grupo tratado com veículo, nenhum decréscimo no número de células positivas e na intensidade de coloração foi observado no grupo tratado com Naglu.

No entanto, a morfologia celular de microcélulas gliais positivas alteraram com o tamanho de célula reduzido em todas as regiões do cérebro examinadas em comparação com aquelas vacuoladas e grandes no grupo de veículo (inserções). Figura 192 A e Figura 192 B são ilustrações exemplares mostrando IHC GFAP em várias regiões do cérebro após 6 injeções via IT de Naglu durante 3 meses, que revelaram a ativação astrocítica. Em comparação com o grupo tratado com veículo, a coloração GFAP positiva foi decrescida no cerebelo e tronco cerebral, e levemente decrescida em 5 outras regiões examinadas.

DEFINIÇÕES A fim de que a presente invenção seja mais prontamente compreendida, certos termos são definidos abaixo primeiramente. Definições adicionais para os seguintes termos e outro termos são expostos ao longo da especificação. Aproximadamente ou cerca de: Conforme utilizado aqui, os termos “aproximadamente” ou “cerca de,” conforme aplicado a um ou mais valore de interesse, referem-se a um valor que é semelhante a um valor de referência afirmado. Em certas modalidades, os termos “aproximadamente” ou “cerca de” referem-se a uma faixa de valores que caem dentro de 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos em qualquer direção (superior a ou inferior a) do valor de referência afirmado a menos que afirmado de outro modo ou evidente de outro modo a partir do contexto (exceto onde tal número excederia 100% de um valor possível). Melhoria: Conforme utilizado aqui, o termo “melhoria” significa a prevenção, redução ou alívio de um estado, ou melhoria do estado de um sujeito. A melhoria inclui, mas não requer a recuperação complete ou prevenção completa de uma condição de doença. Em algumas modalidades, a melhoria inclui o aumento dos níveis de proteína relevante ou de sua atividade que está deficiente em tecidos da doença relevante.

Biologicamente ativo: Conforme utilizada aqui, a frase “biologicamente ativo” refere-se a uma característica de qualquer agente que tenha atividade em um sistema 5 biológico, e particularmente em um organismo.

Por exemplo, um agente que, quando administrado a um organismo, tem um efeito biológico naquele organismo, é considerado como sendo biologicamente ativo.

Modalidades particulares, onde uma proteína ou polipeptídeo é biologicamente ativo, uma porção daquela proteína ou polipeptídeo que compartilha pelo menos uma atividade biológica da proteína ou polipeptídeo é tipicamente referida como uma porção “biologicamente ativa”. Agente de volume: Conforme utilizado aqui, o termo “agente de volume” refere-se a um composto que adiciona massa à mistura liofilizada e contribui à estrutura física do bolo liofilizado (por exemplo, facilita a produção de um bolo liofilizado essencialmente uniforme que mantém uma estrutura de poro aberto). Agentes de volume exemplar incluem manitol, glicina, cloreto de sódio, amido hidroxietílico, lactose, sacarose, trealose, polietilenoglicol e dextrano.

Receptor de manose-6-fosfato independente de cátion (CI-MPR): Conforme utilizado aqui, o termo “receptor de manose-6-fosfato independente de cátion (CI-MPR)” refere-se a um receptor celular que se liga sinalizadores de manose- 6-fosfato (M6P) em precursores de hidrolase ácidos no aparelho de Golgi que são destinados para o transporte ao lisossomo.

Adicionalmente aos manose-6-fosfatos, o CI-MPR também se liga a outras proteínas incluindo IGF-II.

O CI-

MPR é também conhecido como “receptor de IGF-II/M6P,” “receptor de IGF-II/CI-MPR,” “receptor de IGF-II” ou “Receptor de IGF2.” Esses termos e abreviações dos mesmos são utilizados de modo intercambiável aqui. 5 Terapia imunossupressora simultânea: Conforme utilizado aqui, o termo “terapia imunossupressora simultânea” inclui qualquer terapia imunossupressora utilizada como pré-tratamento, pré-condicionamento ou paralelamente a um método de tratamento.

Diluente: Conforme utilizado aqui, o termo “diluente” refere-se a uma substância diluente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, segura e não tóxica para administração a um humano) útil para a preparação de uma formulação reconstituída.

Diluentes exemplares incluem água estéril, água bacteriostática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo, salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer ou solução de dextrose.

Forma de dosagem: Conforme utilizado aqui, os termos “forma de dosagem” e “forma de dosagem unitária” referem-se a uma unidade fisicamente discreta de uma proteína terapêutica par ao paciente a ser tratado.

Cada unidade contém uma quantidade predeterminada de material ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado.

Será compreendido, no entanto, que a dosagem total da composição será decidida pelo médico em atendimento dentro do escopo do julgamento médico correto.

Terapia de substituição de enzima (ERT): Conforme utilizado aqui, o termo “terapia de substituição de enzima (ERT)” refere-se a qualquer estratégia terapêutica que corrige uma deficiência de enzima pelo provimento da enzima faltante.

Em algumas modalidades, a enzima faltante é provida pela administração por via intratecal.

Em algumas modalidades, a enzima faltante é provido pela infusão na 5 corrente sanguínea.

Uma vez administrada, a enzima é retirada pelas células e transportadas ao lisossomo, onde a enzima age para eliminar o material que acumulou nos lisossomos devido à deficiência de enzima.

Tipicamente, para que a terapia de substituição de enzima lisossomal seja eficiente, a enzima terapêutica é liberada aos lisossomos nas células apropriadas nos tecidos alvos onde o déficit de armazenamento se manifesta.

Aprimorar, aumentar ou reduzir: Conforme utilizado aqui, os termos “aprimorar,” “aumentar” ou “reduzir,” ou equivalentes gramaticais, indicam valores que são relativos à uma medição de linha de base, tal como uma medição no mesmo indivíduo antes da inicialização do tratamento descrito aqui, ou uma medição em um indivíduo de controle (ou múltiplos indivíduos de controle) na ausência do tratamento descrito aqui.

Um “indivíduo de controle” é um indivíduo que sofre da mesma forma de doença de armazenamento lisossomal que o indivíduo sendo tratado, que tem cerca da mesma idade do indivíduo sendo tratado (para assegurar que os estágios da doença no indivíduo tratado e no(s) indivíduo(s) de controle são comparáveis). Indivíduo, sujeito, paciente: Conforme utilizado aqui, os termos “sujeito”, “indivíduo” ou “paciente” referem-se a um sujeito mamífero humano ou não humano.

O indivíduo (também referido como “paciente” ou “sujeito”) sendo tratado é um indivíduo (feto, infante, criança, adolescente ou adulto humano) sofrendo de uma doença.

Administração por via intratecal: Conforme utilizado aqui, o termo “administração por via intratecal” ou “injeção por via intratecal” refere-se a uma injeção no 5 canal espinhal (espaço intratecal cercando a medula espinhal). Várias técnicas podem ser utilizadas incluindo, sem limitação, injeção cerebroventricular lateral através de uma trepanação ou punção cisternal ou lombar ou similares.

Em algumas modalidades, “administração por via intratecal” ou “liberação por via intratecal” de acordo com a presente invenção refere-se à administração por via IT ou liberação através da região ou área lombar, ou seja, administração ou liberação por via IT lombar.

Conforme utilizado aqui, o termo “região lombar” ou “área lombar” refere-se à área entre a terceira e quarta vértebras lombares (parte inferior das costas) e, mais inclusivamente, a região L2-S1 da espinha.

Ligante: Conforme utilizado aqui, o termo “ligante” refere-se a, em uma proteína de fusão, uma sequência de aminoácido outra que aquela aparecendo em uma posição particular na proteína natural e é geralmente projetada para ser flexível ou para interpor uma estrutura, tal como uma a-hélice, entre duas porções de proteína.

Um ligante é também referido como um espaçador.

Lioprotetor: Conforme utilizado aqui, o termo “lioprotetor” refere-se a uma molécula que previne ou reduz a instabilidade física e/ou química de uma proteína ou outra substância com a liofilização e armazenamento subsequente.

Lioprotetores exemplares incluem açúcares, tais como sacarose ou trealose; um aminoácido, tal como glutamato monossódico ou histidina; uma metilaminatal como betaína; um sal liotrópico, tal como sulfato de magnésio: um poliol, tal como alcoóis açucares trihídricos ou maiores, por exemplo, glicerina, eritritol, glicerol, 5 arabitol, xilitol, sorbitol, e manitol; propilenoglicol; polietilenoglicol; Plurônicos; e combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, um lioprotetor é um açúcar de não redução, tal como trealose ou sacarose.

Enzima lisossomal: Conforme utilizado aqui, o termo “enzima lisossomal” refere-se a qualquer enzima que é capaz de reduzir materiais acumulados em lisossomos de mamífero ou que pode resgatar ou melhorar um ou mais sintomas da doença de armazenamento lisossomal.

Enzimas lisossomais adequadas para a invenção incluem ambos os tipos enzima lisossomal selvagem ou modificada e podem ser produzidas utilizando métodos recombinantes e sintéticos ou purificados a partir de fontes naturais.

Enzimas lisossomais exemplares são listadas na Tabela 1. Deficiência de enzima lisossomal: Conforme utilizado aqui, “deficiência de enzima lisossomal” refere-se a um grupo de distúrbios genéticos que resultam da deficiência em pelo menos uma das enzimas que são requeridas para quebrar as macromoléculas (por exemplo, substratos de enzima) em peptídeos, aminoácidos, monossacarídeos, ácidos nucléicos e ácidos graxos em lisossomos.

Como um resultado, os indivíduos sofrendo de deficiências de enzima lisossomal acumularam materiais em vários tecidos (por exemplo, CNS, fígado, baço, vísceras, paredes de vasos sanguíneos e outros órgãos). Doença de armazenamento lisossomal: Conforme utilizado aqui, o termo “doença de armazenamento lisossomal” refere- se a qualquer doença resultante da deficiência de uma ou mais enzima lisossomais necessárias para metabolizar macromoléculas naturais.

Essas doenças tipicamente resultam 5 no acúmulo de moléculas não degradas nos lisossomos, resultantes em números aumentados de grânulos de armazenamento (também referidas com o termo vesículas de armazenamento). Essas doenças e vários exemplos são descritos em mais detalhes abaixo.

Polipeptídeo: Conforme utilizado aqui, um “polipeptídeo”, de forma geral, é uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos anexados entre si por uma ligação peptídica.

Em algumas modalidades, um polipeptídeo pode incluir pelo menos 3-5 aminoácidos, cada um dos quais é anexado a outros por meio de pelo menos uma ligação peptídica.

Aqueles comumente versados na técnica apreciarão que os polipeptídeos por vezes incluem aminoácidos “não naturais” ou outras entidades que, todavia, são capazes de integrar uma cadeia de polipeptídeo, opcionalmente.

Enzima de substituição: Conforme utilizado aqui, o termo “enzima de substituição” refere-se a qualquer enzima que pode atuar para substituir pelo menos em parte a enzima faltante ou deficiente em uma doença a ser tratada.

Em algumas modalidades, o termo “enzima de substituição” refere-se a qualquer enzima que pode atuar para substituir pelo menos em parte a enzima lisossomal faltante ou deficiente em uma doença de armazenamento lisossomal a ser tratada.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição é capaz de reduzir materiais acumulados em lisossomos de mamífero ou que podem recuperar ou melhorar um ou mais sintomas da doença de armazenamento lisossomal.

As enzimas de substituição adequadas para a invenção incluem enzimas lisossomais de ambos os tipos selvagem ou modifica e podem ser produzidas utilizando métodos recombinantes e 5 sintéticos ou purificados a partir de fontes naturais.

Uma enzima de substituição pode ser uma enzima recombinante, sintética, ativada por gene ou natural.

Solúvel: Conforme utilizado aqui, o termo “solúvel” refere-se à capacidade de um agente terapêutico de formar uma solução homogênea.

Em algumas modalidades, a solubilidade do agente terapêutico na solução à qual é administrado e por meio da qual é transportado ao local de ação alvo (por exemplo, as células e tecidos do cérebro) é suficiente para permitir a liberação de uma quantidade terapeuticamente eficiente do agente terapêutico ao local de ação alvo.

Vários fatores podem impactar na solubilidade dos agentes terapêuticos.

Por exemplo, fatores relevantes que podem impactar na solubilidade da proteína incluem a força iônica, sequência de aminoácido e a presença de outros agentes ou sais co-solubilizantes (por exemplo, sais de cálcio). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas de modo que os sais de cálcio são excluídos de tais composições.

Em algumas modalidades, agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção são solúveis em suas correspondentes composições farmacêuticas.

Será apreciado que, enquanto que as soluções isotônicas são geralmente preferenciais para drogas administradas de modo parenteral, o uso de soluções isotônicas podem limitar a solubilidade adequada para alguns agentes terapêuticos e, particularmente algumas proteínas e/ou enzimas.

Soluções levemente hipertônicas (por exemplo, até 175mM de cloreto de sódio em 5mM de fosfato de sódio em pH 7,0) e soluções contendo açúcar (por exemplo, até 2% de sacarose em 5mM de fosfato de sódio em pH 7,0) demonstraram ser bem toleradas 5 em macacos.

Por exemplo, a composição de formulação de bolus de CNS aprovada comum é salina (150mM de NaCl em água). Estabilidade: Conforme utilizado aqui, o termo “estável” refere-se à capacidade do agente terapêutico (por exemplo, uma enzima recombinante) de manter sua eficácia terapêutica (por exemplo, toda ou a maior parte de sua atividade biológica pretendida e/ou integridade fisioquímica) ao longo de períodos de tempo estendidos.

A estabilidade de um agente terapêutico, e a capacidade da composição farmacêutica para manter a estabilidade de tal agente terapêutico, pode ser avaliada ao longo de períodos de tempo estendidos (por exemplo, para pelo menos 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses ou mais). Em geral, composições farmacêuticas descritas aqui foram formuladas de modo que são capazes de estabilizar, ou alternativamente retardar ou prevenir a degradação, de um ou mais agentes terapêuticos formulados com o mesmo (por exemplo, proteínas recombinantes). No contexto de uma formulação, uma formulação estável é uma em que o agente terapêutico no mesmo retém essencialmente sua integridade física e/ou química e atividade biológica com o armazenamento e durante processos (tal como congelamento/derretimento, mistura mecânica e liofilização). Para a estabilidade da proteína, pode-se ser medida pela formação de agregados de alto peso molecular (HMW), perda de atividade enzimática, geração de fragmentos de peptídeos e deslocamento de perfis de carga.

Sujeito: Conforme utilizado aqui, o termo “sujeito” significa qualquer mamífero, incluindo humanos.

Em certas modalidades da presente invenção, o sujeito é um adulto, um 5 adolescente ou um infante.

Também é contemplada pela presente invenção a administração das composições farmacêuticas e/ou desempenho dos métodos de tratamento no útero.

Homologia substancial: a frase “homologia substancial” é utilizada aqui para se referir a uma comparação entre sequências de aminoácido ou ácido nucléico.

Conforme será apreciado por aqueles comumente versados na técnica, duas sequências são geralmente consideradas como sendo “substancialmente homólogas” caso contenham resíduos homólogos em posições correspondentes.

Resíduos homólogos podem ser resíduos idênticos.

Alternativamente, resíduos homólogos podem ser resíduos não idênticos terão características funcionais e/ou estruturais semelhantes.

Por exemplo, conforme é bem conhecido por aqueles comumente versados na técnica, certos aminoácidos são tipicamente classificados como aminoácidos “hidrofóbicos” ou “hidrofílicos”, e/ou como tendo cadeias de lado “polar” ou “não polar”. A substituição de um aminoácido por outro do mesmo tipo pode ser frequentemente considerada como uma substituição “homóloga”. Conforme é bem conhecido na técnica, as sequências de aminoácido ou ácido nucléico podem ser comparadas utilizando qualquer um de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais, tais como BLASTN para sequências de nucleotídeo e BLASTP, BLAST aberto, e PSI-BLAST para sequências de aminoácido.

Tais programas exemplares são descritos em Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J.

Mol.

Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., 5 Métodos in Enzymology; Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J.

Mol.

Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of proteína database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteínas, Wiley, 1998; e Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Adicionalmente à identificação de sequências homólogas, os programas mencionados acima tipicamente proveem uma indicação do grau de homologia.

Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas como sendo substancialmente homóloga caso pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de seus resíduos correspondentes são ao longo de um alcance relevante de resíduos.

Em algumas modalidades, o alcance relevante é uma sequência completa.

Em algumas modalidades, o alcance relevante é pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou mais resíduos.

Identidade substancial: A frase “identidade substancial” é utilizada aqui para se referir a uma comparação entre sequências de aminoácido ou ácido nucléico.

Conforme será apreciado por aqueles comumente versados na técnica, duas sequências são geralmente consideradas como sendo “substancialmente idênticas” caso contenham resíduos idênticos em posições correspondentes. 5 Conforme é de conhecimento na técnica, as sequências de aminoácido ou ácido nucléico podem ser comparadas utilizando qualquer um de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programa de computador comerciais, tais como BLASTN para sequências de nucleotídeo e BLASTP, BLAST aberto, e PSI-BLAST para sequências de aminoácido.

Tais programas exemplares são descritos em Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J.

Mol.

Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Métodos in Enzymology; Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J.

Mol.

Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of proteína database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteínas, Wiley, 1998; e Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Adicionalmente à identificação de sequências homólogas, os programas mencionados acima tipicamente proveem uma indicação do grau de homologia.

Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas como sendo substancialmente homóloga caso pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de seus resíduos correspondentes são ao longo de um alcance relevante de resíduos.

Em algumas modalidades, o alcance relevante é uma sequência completa.

Em algumas modalidades, o alcance relevante é pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 5 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou mais resíduos.

CSF sintético: Conforme utilizado aqui, o termo “CSF sintético” refere-se a uma solução que tem pH, composição de eletrólito, teor de glicose e osmalaridade consistente com o fluido cefalorraquidiano.

CSF sintético é também referido como um CSF artificial.

Em algumas modalidades, o CSF sintético é uma solução B de Elliott.

Adequado para liberação de CNS: Conforme utilizado aqui, a frase “adequado para liberação de CNS” ou “adequado para liberação por via intratecal” conforme se refere às composições farmacêuticas da presente invenção geralmente se refere às propriedades de estabilidade, tolerabilidade, e solubilidade de tais composições, bem como à capacidade de tais composições de liberar uma quantidade eficiente do agente terapêutico contido no mesmo para o local de liberação alvo (por exemplo, o CSF ou o cérebro). Tecidos alvo: Conforme utilizado aqui, o termo “tecidos alvo” refere-se a qualquer tecido que é afetado pela doença de armazenamento lisossomal a ser tratada ou qualquer tecido no qual a enzima lisossomal deficiente é normalmente expresso.

Em algumas modalidades, tecidos alvo incluem aqueles tecidos em que há uma quantidade detectável ou anormalmente alta de substrato de enzima, por exemplo, armazenadas nos lisossomos celulares do tecido, em pacientes sofrendo de ou suscetível à doença de armazenamento lisossomal.

Em algumas modalidades, os tecidos alvo incluem aqueles tecidos que demonstram a patologia associada à doença, sintoma ou característica.

Em algumas modalidades, os tecidos alvo incluem aqueles 5 tecidos em que a enzima lisossomal deficiente é normalmente expressa em um nível elevado.

Conforme utilizado aqui, um tecido alvo pode ser um tecido alvo do cérebro, um tecido alvo da medula espinhal e/ou um tecido alvo periférico.

Tecidos alvo exemplares são descritos em detalhes abaixo.

Porção terapêutica: Conforme utilizado aqui, o termo “porção terapêutica” refere-se a uma porção de uma molécula que rende o efeito terapêutico da molécula.

Em algumas modalidades, uma porção terapêutica é um polipeptídeo tendo atividade terapêutica.

Quantidade terapeuticamente eficiente: Conforme utilizado aqui, o termo “quantidade terapeuticamente eficiente” refere-se a uma quantidade de uma proteína terapêutica (por exemplo, enzima de substituição) que confere um efeito terapêutico no sujeito tratado, em uma proporção risco/benefício aplicável a qualquer tratamento médico.

O efeito terapêutico pode ser objetivo (ou seja, mensurável por algum teste ou marcador) ou subjetivo (ou seja, o sujeito dá alguma indicação de ou sente um efeito). Particularmente, a “quantidade terapeuticamente eficiente” refere-se a uma quantidade de uma proteína terapêutica ou composição efetiva para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição desejada, ou exibe um efeito preventivo ou terapêutico detectável, tal como através da melhoria de sintomas associados à doença, prevenção ou retardamento do início da doença, e/ou também reduzindo a gravidade ou frequência dos sintomas da doença.

Uma quantidade terapeuticamente eficiente é comumente administrada em um regime de dosagem que pode compreender doses unitárias múltiplas.

Para qualquer proteína terapêutica particular, 5 uma quantidade terapeuticamente eficiente (e/ou uma dose unitária apropriada dentro de um regime de dosagem efetivo) pode variar, por exemplo, dependendo da via de administração, ou combinação com outros agentes farmacêuticos.

Também, a quantidade terapeuticamente eficiente específica (e/ou dose unitária) para qualquer paciente particular pode depender de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio sendo tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do agente farmacêutico específico empregado; a composição específica empregada; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de administração, e/ou taxa de excreção ou metabolismo da proteína de fusão específica empregada; a duração do tratamento; e fatores semelhantes, conforme é bem conhecido nas técnicas médicas.

Tolerável: Conforme utilizado aqui, os termos “tolerável” e “tolerabilidade” referem-se à capacidade das composições farmacêuticas da presente invenção de não produzir uma reação adversa no sujeito a quem tal composição é administrada, ou alternativamente não produzir uma reação adversa séria no sujeito a quem tal composição é administrada.

Em algumas modalidades, como as composições farmacêuticas da presente invenção são bem toleradas pelo sujeito a quem tais composições são administrada.

Tratamento: Conforme utilizado aqui, o termo “tratamento” (também “tratar” ou “tratando”) refere-se a qualquer administração de uma proteína terapêutica (por exemplo, enzima lisossomal) que alivia parcialmente ou completamente, melhora, alivia, inibe, atrasa o início de, reduz a gravidade de e/ou reduz a incidência de um ou mais 5 sintomas ou características de uma doença, distúrbio, e/ou condição particular (por exemplo, Síndrome de Hunters, síndrome de Sanfilippo tipo B). Tal tratamento pode ser de um sujeito que não exibe sinais da doença, distúrbio e/ou condição relevante e/ou de um sujeito que exibe apenas sinais iniciais da doença, distúrbio e/ou condição. Alternativamente ou adicionalmente, tal tratamento pode ser de um sujeito que exibe um ou mais sinais estabelecidos da doença, distúrbio e/ou condição relevante.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção provê, dentre outras coisas, métodos aprimorados para liberação direta efetiva de um agente terapêutico para o sistema nervoso central (CNS). Conforme discutido acima, a presente invenção é baseada na verificação de que uma enzima de substituição para uma doença do armazenamento lisossomal pode ser diretamente introduzida no fluido cefalorraquidiano (CSF) de um sujeito necessitando de tratamento em uma concentração alta sem induzir efeitos adversos substanciais no sujeito. Os presentes inventores verificaram que a enzima de substituição pode ser liberada em uma formulação salina simples ou à base de tampão, sem utilizar CSF sintético. A liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção não resulta em efeitos adversos substanciais, tais como resposta imune grave, no sujeito. Portanto, em algumas modalidades, liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção pode ser utilizada na ausência de terapia imunossupressora simultânea (por exemplo, sem indução de tolerância imunológica através do pré-tratamento ou pré- condicionamento). 5 Em algumas modalidades, a liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção permite difusão eficiente ao longo de vários tecidos cerebrais resultando na liberação efetiva da enzima de substituição em vários tecidos alvo cerebrais na superfície, regiões superficiais e/ou profundas do cérebro.

Em algumas modalidades, a liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção resultou na quantidade suficiente de enzimas de substituição entrando na circulação periférica.

Como um resultado, em alguns casos, a liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção resultou na liberação da enzima de substituição em tecidos periféricos, tais como fígado, coração e rim.

Essa verificação pode ser particularmente útil para o tratamento de doenças de armazenamento lisossomal que têm componentes tanto do CNS quanto periféricos, que requeririam tipicamente tanto a administração regular por via intratecal quanto a administração intravenosa.

É contemplado que a liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção pode permitir a dosagem reduzida e/ou frequência de injeção via IV sem comprometer os efeitos terapêuticos no tratamento de sintomas periféricos.

A presente invenção provê várias características benéficas que permitem a liberação eficiente e conveniente de enzimas de substituição a vários tecidos cerebrais alvo, resultando no tratamento efetivo de doenças de armazenamento lisossomal que têm indicações para o CNS.

Vários aspectos da invenção são descritos em detalhes nas seções a seguir.

O uso de seções não pretende limitar a invenção.

Cada seção pode se aplicar a qualquer aspecto da 5 invenção.

Nesse pedido, o uso de “ou” significa “e/ou”, a menos que expresso de outro modo.

Doenças de armazenamento lisossomal e Enzimas de substituição Métodos da invenção de acordo com o presente podem ser utilizados para tratar quaisquer doenças de armazenamento lisossomal, particularmente aquelas doenças de armazenamento lisossomal tendo etiologia e/ou sintomas de CNS, incluindo, mas não limitados a, aspartilglicosaminúria, doença do armazenamento de éster de colesterol, doença de Wolman, cistinose, doença de Danon, doença de Fabry, Lipogranulomatose de Farber, doença de Farber, fucosidose, galactosialidose tipos I/II, doença de Gaucher tipos I/II/III, leucodistrofia de células globosas, doença de Krabbe, doença do armazenamento de glicogênio II, doença de Pompe, gangliosidose GM 1tipos I/II/III, gangliosidose GM2 tipo I, doença de Tay Sachs, gangliosidose GM2 tipo II, doença de Sandhoff, gangliosidosis GM2, α-manosidose tipos I/II, beta- manosidose, leucodistrofia metacromática, mucolipidose tipo I, sialidose tipos I/II, mucolipidose tipos II/III, doença da célula I, polidistrofia pseudo-Hurler mucolipidose IIIC, mucopolissacaridose tipo I, mucopolissacaridose tipo II, síndrome de Hunter, mucopolissacaridose tipo IIIA, síndrome de Sanfilippo (tipo A, B, C ou D), mucopolissacaridose tipo IIIB, mucopolissacaridose tipo IIIC, mucopolissacaridose tipo IIID, mucopolissacaridose tipo IVA, síndrome de Morquio, mucopolissacaridose tipo IVB, mucopolissacaridose tipo VI, mucopolissacaridose tipo VII, síndrome de Sly, mucopolissacaridose tipo IX, deficiência de múltiplas 5 sulfatases, lipofuscinose ceroide neuronal, doença de Batten CLN1, doença de Batten CLN2, doença de Niemann-Pick tipos A/B, doença de Niemann-Pick tipo C1, doença de Niemann-Pick tipo C2, picnodisostose, doença de Schindler tipos I/II, doença de Gaucher e doença do armazenamento de ácido siálico.

Em algumas modalidades, as doenças de armazenamento lisossomal a serem tratadas utilizando os métodos da invenção da presente invenção incluem a Síndrome de Hunters, doença de Leucodistrofia metacromática (MLD), síndrome de Sanfilippo tipo A, síndrome de Sanfilippo tipo B e doença de Leucodistrofia de célula globoide (GLD). Uma revisão detalhada da etiologia genética, manifestações clínicas e biologia molecular das doenças de armazenamento lisossomal são detalhadas em Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol.

II, McGraw Hill, (1995). Assim, as enzimas deficientes nas doenças acima são conhecidas daqueles versados na técnica, algumas dessas são exemplificadas na tabela abaixo: Tabela 1 Nome da doença Deficiência de enzima Substância armazenada

Doença de Pompe a1,4-Glucosidase ácida Oligossacarídeos ligados a Glicogênio α1-4

GM1 Gangliodsidose β-Galactosidase Gangliosídeos GM1

Doença de Tay-Sachs β-Hexosaminidase A Gangliosídeo GM2

GM2 Gangliosidose: Proteína Ativadora GM2 Gangliosídeo GM2

Variante AB

Doença de Sandhoff β-Hexosaminidase A&B Gangliosídeo GM2

Doença de Fabry α-Galactosidase A Globosídeos

Doença de Gaucher Glucocerebrosidase Glucosilceramida

Leucodistrofia Arilsulfatase A Sulfatídeos metacromática

Doença de Krabbe Galactosilceramidase Galactocerebrosídeo

Niemann Pick, Tipos A Esfingomielinase Ácida Esfingomielina

& B

Niemann-Pick, Tipo C Defeito na Esfingomielina esterificação do colesterol

Niemann-Pick, Tipo D Desconhecida Esfingomielina

Doença de Farber Ceramidase Ácida Ceramida

Doença de Wolman Lipase Ácida Ésteres de colesterol

Síndrome de Hurler α-L-Iduronidase Sulfatos de Heparano &

(MPS IH) Dermatano

Síndrome de Scheie α-L-Iduronidase Sulfatos de Heparano &

(MPS IS) Dermatano

Hurler-Scheie α-L-Iduronidase Sulfatos de Heparano &

(MPS IH/S) Dermatano

Síndrome de Hunter Iduronate Sulfatase Sulfatos de Heparano &

(MPS II) Dermatano

Síndrome de Heparano N-Sulfatase Sulfato de Heparano

Sanfilippo tipo A

(MPS IIIA)

Síndrome de α-N- Sulfato de Heparano

Sanfilippo tipo B Acetilglucosaminidase

(MPS IIIB)

Síndrome de Acetil-CoA- Sulfato de Heparano

Sanfilippo tipo C Glucosaminide

(MPS IIIC) Acetiltransferase

Síndrome de N-Acetilglucosamine - Sulfato de Heparano

Sanfilippo tipo D 6-Sulfatase

(MPS IIID)

Morquio B β-Galactosidase Sulfato de Queratano

(MPS IVB)

Maroteaux-Lamy Arilsulfatase B Sulfato de Dermatano

(MPS VI)

Síndrome de Sly β-Glucuronidase

(MPS VII)

α -Manosidose α -Manosidase Manose/

Oligossacarídeos β -Manosidose β-Manosidase Manose/

Oligossacarídeos

Fucosidose α -L-Fucosidase Fucosil

Oligossacarídeos

Aspartilglicosaminúri N-Aspartil- β - Aspartilglucosamina a Glucosaminidase Asparaginas

Sialidose α -Neuraminidase Sialiloligossacarídeos

(Mucolipidose I)

Galactosialidose Deficiência da Sialiloligossacarídeos

(Síndrome de Proteína Protetora

Goldberg) Lisossomal

Doença de Schindler α -N-Acetil-

Galactosaminidase

Mucolipidose II N-Acetilglucosamins-1- Sulfato de Heparano

(Doença da Célula I) Fosfotransferase

Mucolipidose III A mesma que ML II

(Polidistrofia

Pseudo-Hurler)

Cistinose Proteína de Transporte Cistina Livre de Cistina

Doença de Salla Proteína de Transporte Ácido Siálico Livre e de Ácido Siálico Ácido Glucurônico

Doença infantil do Proteína de Transporte Ácido Siálico Livre e armazenamento de de Ácido Siálico Ácido Glucurônico ácido siálico lipofuscinose ceroide Proteína Palmitoil Lipofuscinas neuronal infantil Tioesterase

Mucolipidose IV Desconhecida Gangliosídeos &

Ácido Hialurônico

Prosaposina Saposinas A, B, C ou D

Enzimas de substituição Os métodos da invenção de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para liberar quaisquer enzimas de substituição.

Conforme utilizado aqui, as 5 enzimas de substituição adequadas para a presente invenção podem incluir qualquer enzima que possa atuar para substituir pelo menos a atividade parcial da enzima lisossomal faltante ou deficiente em uma doença de armazenamento lisossomal a ser tratada.

Em algumas modalidades, a enzima de substituição é capaz de reduzir a substância acumulada nos lisossomos ou pode recuperar ou melhorar um ou mais sintomas da doença de armazenamento lisossomal.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição adequada pode ser qualquer enzima lisossomal conhecida por ser associada à doença de armazenamento lisossomal a ser tratada.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição adequada é uma enzima selecionada a partir das enzimas 5 listadas na Tabela 1 acima.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição adequada para a presente invenção é a iduronate-2-sulfatase (I2S), arilsulfatase A (ASA), N- sulfatase de heparano (HNS), alfa-N-acetilglucosaminidase (Naglu) ou β-galactosidase (GLC). Em algumas modalidades, uma enzima de substituição adequada para a invenção pode ter uma sequência do tipo selvagem ou de ocorrência natural.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição adequada para a invenção pode ter uma sequência modificada tendo uma homologia ou identidade substancial à sequência do tipo selvagem ou de ocorrência natural (por exemplo, tendo pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% de identidade de sequência com sequência do tipo selvagem ou de ocorrência natural). A enzima de substituição adequada para presente invenção pode ser produzida por qualquer meio disponível.

Por exemplo, as enzimas de substituição podem ser produzidas de modo recombinante através da utilizada de um sistema de célula hospedeira projetado para expressar um ácido nucléico codificando a enzima de substituição.

Alternativamente ou adicionalmente, enzimas de substituição podem ser produzidas através da ativação de genes endógenos.

Alternativamente ou adicionalmente, enzimas de substituição podem ser parcialmente ou completamente preparadas por síntese química.

Alternativamente ou adicionalmente, enzimas de substituição podem também ser purificadas a partir de fontes naturais.

Onde as enzimas são reproduzidas de modo recombinante, qualquer sistema de expressão pode ser utilizado.

Para dar alguns poucos exemplos, sistemas de expressão conhecidos 5 incluem, ovo, baculovírus, vegetal, levedura ou células de mamíferos.

Em algumas modalidades, as enzimas adequadas para a presente invenção são produzidas em células de mamíferos.

Exemplos não limitantes de células de mamíferos que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção incluem a linhagem de mieloma de camundongo BALB/c (NSO/l, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para o crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J.

Gen Virol., 36:59,1977); human fibrosarcoma cell line (por exemplo, HT1080); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células do ovário de hamster chinês +/- DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA, 77:4216, 1980); celulas de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol.

Reprod., 23:243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de rim cacnino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y.

Acad.

Sci., 383:44-68, 1982);

MRC 5 cells; FS4 cells; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Em algumas modalidades, os métodos da invenção de acordo com a presente invenção são utilizados para liberar 5 enzimas de substituição produzidas para células humanas.

Em algumas modalidades, os métodos da invenção de acordo com a presente invenção são utilizados para liberar enzimas de substituição produzidas a partir de células CHO.

Em algumas modalidades, as enzimas de substituição liberadas utilizando um método da invenção contêm uma porção que se liga a um receptor nas células da superfície do cérebro para facilitar a admissão celular e/ou alvo lisossomal.

Por exemplo, um receptor tal pode ser o receptor de manose-6-fosfato independente de cátion (CI- MPR) que se liga aos resíduos de manose-6-fostato (M6P). Adicionalmente, o CI-MPR também se liga a outras proteínas incluindo IGF-II.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição adequada para a presente invenção contém resíduos de M6P na superfície da proteína.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição adequada para a presente invenção pode conter oligossacarídeos bis- fosforilados que têm afinidade de ligação maior com o CI- MPR.

Em algumas modalidades, uma enzima adequada contém até cerca de uma média de cerca de pelo menos 20% de oligossacarídeos bis-fosforilados por enzima.

Em outras modalidades, uma enzima adequada pode conter cerca de 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% de oligossacarídeos bis-fosforilados por enzima.

Enquanto tais oligossacarídeos bis-fosforilados podem estar naturalmente presentes na enzima, deve-se notar que as enzimas podem ser modificadas para possuir tais oligossacarídeos.

Por exemplo, enzimas de substituição adequadas podem ser modificadas por certas enzimas que são capazes de catalisar a transferência de N-acetilglucosamina-L-fosfato a partir 5 de UDP-GlcNAc para a posição 6' de α-1,2-manoses ligadas em enzima lisossomais.

Os métodos e composições para produção e utilização de tais enzimas são descritas por, por exemplo, Canfield et al. em Pat. dos Estados Unidos No. 6,537,785, e Pat. dos Estados Unidos No. 6,534,300, cada uma incorporada aqui por referência.

Em algumas modalidades, as enzimas de substituição para uso na presente invenção podem ser conjugadas ou fundidas a uma porção alvo dos lisossomos que é capaz de se ligar a um receptor nas células da superfície do cérebro.

Uma porção alvo dos lisossomos adequada pode ser IGF-I, IGF-II, RAP, p97, e variantes, homólogos ou fragmentos da mesma (por exemplo, incluindo aqueles peptídeos tendo uma sequência de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% idênticos a uma sequência de peptídeo IGF-I, IGF-II, RAP, p97 humana madura do tipo selvagem). Em algumas modalidades, as enzimas de substituição adequadas para a presente invenção não foram modificadas para aprimorar a liberação ou transporte de tais agentes ao longo de BBB e para o CNS.

Liberação por via intratecal De acordo com a presente invenção, uma enzima de substituição é liberada ao CNS.

Em algumas modalidades, uma enzima de substituição é liberada ao CNS através da administração no fluido cefalorraquidiano (CSF) de um sujeito necessitando de tratamento.

Em algumas modalidades,

a administração por via intratecal é utilizada para liberar uma enzima de substituição desejada no CSF.

Conforme utilizado aqui, a administração por via intratecal (também referida como injeção por via intratecal) refere-se a uma 5 injeção ao canal espinhal (espaço intratecal cercando a medula espinhal). Várias técnicas podem ser utilizadas incluindo, sem limitação, injeção cerebroventricular lateral através de uma trepanação ou punção cisternal ou lombar ou similares.

Métodos exemplares são descritos em Lazorthes et al.

Advances in Drug Deliver Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 e Omaya et al., Cancer Drug Deliver, 1: 169-179, os conteúdos dos quais são incorporados aqui por referência.

De acordo com a presente invenção, uma enzima pode ser injetada em qualquer região cercando o canal espinhal.

Em algumas modalidades, uma enzima é injetada na área lombar ou cisterna magna ou de modo intraventricular em um espaço do ventrículo cerebral.

Conforme utilizado aqui, o termo “região lombar” ou “área lombar” refere-se à área entre a terceira e quarta vértebras lombares (parte inferior das costas) e, mais inclusivamente, a região L2-S1 da espinha.

Tipicamente, a injeção por via intratecal através da região lombar ou área lombar é também referida como “liberação por via IT lombar” ou “administração por via IT lombar.” O termo “cisterna magna” refere-se ao espaço em torno e abaixo do cerebelo através da abertura entre o crânio e a parte superior da espinha.

Tipicamente, a injeção por via intratecal através da cisterna magna é também referida como “liberação via cisterna magna.” O termo “ventrículo cerebral” refere-se às cavidades no cérebro que são contínuas com o central canal da medula espinhal.

Tipicamente, as injeções através das cavidades do ventrículo cerebral são referidas como Liberação via intraventricular cerebral (ICV). 5 Em algumas modalidades, “administração por via intratecal” ou “liberação por via intratecal” de acordo com a presente invenção refere-se à administração ou liberação por via IT lombar, por exemplo, liberada entre a terceira e quarta vértebras lombares (parte inferior das costas) e, mais inclusivamente, à região L2-S1 da espinha.

É contemplado que a administração ou liberação por via IT lombar distingue-se ao longo da liberação via cisterna magna naquela administração ou liberação por via IT lombar de acordo com nossa invenção provê liberação melhor e mais efetiva ao canal espinhal distal, enquanto a liberação via cisterna magna, dentre outras coisas, tipicamente não libera bem para o canal espinhal distal.

Formulações Estáveis para Liberação via IT Em algumas modalidades, as enzimas desejadas são liberadas em formulações estáveis para liberação por via intratecal.

Certas modalidades da invenção são baseadas, pelo menos em parte, na verificação de que várias formulações descritas aqui facilitam a liberação e distribuição efetivas de pelo menos um mais agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) para os tecidos alvo, células e/ou organelas ao CNS.

Dentre outras coisas, as formulações descritas aqui são capazes de solubilizar altas concentrações de agentes terapêuticos (por exemplo, proteínas ou enzimas) e são adequadas para a liberação de tais agentes terapêuticos ao CNS de sujeitos para o tratamento de doenças tendo um componente e/ou etiologia de CNS.

As composições descritas aqui são adicionalmente caracterizadas pela estabilidade aprimorada e tolerabilidade aprimorada quando administradas ao CNS de um 5 sujeito (por exemplo, por via intratecal) em necessidade das mesmas.

Antes da presente invenção, salina isotônica tamponada tradicional e a solução B de Elliott, que é CSF artificial, foram tipicamente utilizadas para liberação por via intratecal.

Uma comparação mostrando as composições de CSF em relação à solução B de Elliott está incluída na Tabela 2 abaixo.

Conforme mostrado na Tabela 2, a concentração de Solução B de Elliot é proximamente paralela àquela do CSF.

A Solução B de Elliot, no entanto, contém uma concentração de tampão baixa e, consequentemente, pode não prover a capacidade de tamponamento adequada necessária para estabilizar agentes terapêuticos (por exemplo, proteínas), especialmente ao longo de períodos de tempo estendidos (por exemplo, durante condições de armazenamento). Adicionalmente, a Solução B de Elliot contém certos sais que podem ser incompatíveis com as formulações pretendidas para liberar alguns agentes terapêuticos, e particularmente proteínas ou enzimas.

Por exemplo, os sais de cálcio presentes na Solução B de Elliot são capazes de mediar a precipitação de proteína e, desse modo, reduzir a estabilidade da formulação.

Tabela 2 Solução Na+ K+ Ca++ Mg++ HCO3- Cl- pH Fósforo Glicose mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mEq/L mg/L mg/L

CSF 117- 2,3 2,2 2,2 22,9 113- 7,31 1,2-2,1 45-80

Solução 149 2,6 2,7 2,4 22,6 132 6,0- 2,3 80

B de 7,5

Elliott

Assim, em algumas modalidades, as formulações adequadas para liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção não são CSF sintético ou artificial.

Em algumas modalidades, as formulações para liberação 5 por via intratecal foram formuladas de modo que são capazes de estabilizar, ou alternativamente retardar ou prevenir a degradação, um ou mais agentes terapêuticos formulados com as mesmas (por exemplo, proteínas recombinantes). Conforme utilizado aqui, o termo “estável” refere-se à capacidade do agente terapêutico (por exemplo, uma enzima recombinante) de manter sua eficácia terapêutica (por exemplo, toda ou a maior parte de sua atividade biológica e/ou integridade fisioquímica pretendida) ao longo de períodos de tempo estendidos.

A estabilidade de um agente terapêutico, e a capacidade da composição farmacêutica de manter a estabilidade de tal agente terapêutico, pode ser avaliada ao longo de períodos de tempo estendidos (por exemplo, preferencialmente para pelo menos 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses ou mais). No contexto de uma formulação, uma formulação estável é aquela em que o agente terapêutico no mesmo essencialmente retém sua integridade física e/ou química e atividade biológica com o armazenamento e durante os processos (tal como congelamento/derretimento, mistura mecânica e liofilização). Para a estabilidade da proteína, esta pode ser medida através da formação de agregados de alto peso molecular (HMW), perda da atividade enzimática,

geração de fragmentos de peptídeo e deslocamento de perfis de carga.

A estabilidade do agente terapêutico é de importância particular.

A estabilidade do agente terapêutico pode ser 5 adicionalmente avaliada em relação à atividade biológica ou integridade fisioquímica do agente terapêutico ao longo de períodos de tempo estendidos.

Por exemplo, a estabilidade em um dado ponto de tempo pode ser comparada em relação à estabilidade em um ponto de tempo anterior (por exemplo, com o dia 0 de formulação) ou em relação a um agente terapêutico não formulado e os resultados dessa comparação expressos como uma porcentagem.

Preferencialmente, as composições farmacêuticas da presente invenção mantêm pelo menos 100%, pelo menos 99%, pelo menos 98%, pelo menos 97% pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55% ou pelo menos 50% da atividade biológica ou a integridade fisioquímica do agente terapêutico ao longo de um período de tempo estendido (por exemplo, conforme medido ao longo de pelo menos cerca de 6- 12 meses, à temperatura ambiente ou sob condições de armazenamento aceleradas). Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas desejadas) são solúveis em formulações da presente invenção.

O termo “solúvel” conforme se relaciona com os agentes terapêuticos da presente invenção refere-se à capacidade de tais agentes terapêuticos de formar uma solução homogênea.

Preferencialmente, a solubilidade do agente terapêutico na solução na qual é administrado e através do qual é transportado ao local de ação alvo (por exemplo, as células e tecidos do cérebro) é suficiente para permitir a liberação de uma quantidade terapeuticamente eficiente do agente terapêutico ao local de ação alvo.

Vários fatores podem impactar na solubilidade dos agentes 5 terapêuticos.

Por exemplo, fatores relevantes que podem impactar na solubilidade da proteína incluem a força iônica, a sequência de aminoácido e a presença de outros agentes ou sais co-solubilizantes (por exemplo, sais de cálcio). Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são formuladas de modo que sais de cálcio são excluídos de tais composições.

Assim, formulações adequadas para a administração por via intratecal podem conter um agente terapêutico (por exemplo, enzima) de interesse em várias concentrações.

Em algumas modalidades, formulações adequadas podem conter uma proteína ou enzima de interesse em uma concentração até cerca de 300 mg/ml (por exemplo, até cerca de 250 mg/ml, até 200 mg/ml, até 150 mg/ml, até 100 mg/ml, até 90 mg/ml, até 80 mg/ml, até 70 mg/ml, até 60 mg/ml, até 50 mg/ml, até 40 mg/ml, até 30 mg/ml, até 25 mg/ml, até 20 mg/ml, até 10 mg/ml). Em algumas modalidades, formulações adequadas podem conter uma proteína ou enzima de interesse em uma concentração variando entre cerca de 0-300 mg/ml (por exemplo, cerca de 1-250 mg/ml, cerca de 1-200 mg/ml, cerca de 1-150 mg/ml, cerca de 1-100 mg/ml, cerca de 10-100 mg/ml, cerca de 10-80 mg/ml, cerca de 10-70 mg/ml, cerca de 1-60 mg/ml, cerca de 1-50 mg/ml, cerca de 10-150 mg/ml, cerca de 1-30 mg/ml). Em algumas modalidades, as formulações adequadas para a liberação por via intratecal pode conter uma proteína de interesse em uma concentração de aproximadamente 1 mg/ml, 3 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml ou 300 mg/ml.

Em algumas modalidades, soluções isotônicas são 5 utilizadas.

Em algumas modalidades, soluções levemente hipertônicas (por exemplo, até 300 mM (por exemplo, até 250 mM, 200 mM, 175mM, 150 mM, 125 mM) de cloreto de sódio em 5mM de fosfato de sódio em pH 7,0) e soluções contendo açúcar (por exemplo, até 3% (por exemplo, até 2,4%, 2,0%, 1,5%, 1,0%) de sacarose em 5mM de fosfato de sódio em pH 7,0) demonstraram ser bem toleradas em macacos.

Em algumas modalidades, uma composição de formulação de bolus de CNS adequada é salina (por exemplo, 150mM de NaCl em água). Muitos agentes terapêuticos, e particularmente as proteínas e enzimas da presente invenção, requerem pH controlado e excipientes específicos para manter sua solubilidade e estabilidade nas composições farmacêuticas da presente invenção.

A Tabela 3 abaixo identifica certos aspectos exemplares de formulações de proteína consideradas como sendo importantes para a manutenção da solubilidade e estabilidade dos agentes terapêuticos de proteína da presente invenção.

Tabela 3 Parâmetro Faixa Típica /Tipo Argumento pH 5 a 7,5 Para estabilidade Por vezes também para solubilidade Tipo tampão acetato, succinato, Para manter o pH ótimo citrato, histidina, Pode também afetar a fosfato ou Tris estabilidade

Concentração 5-50 mM Para manter o pH de Tampão Pode também estabilizar ou adicionar força iônica Tonificador NaCl, açúcares, Para tornar soluções iso- manitol osmóticas ou isotônicas Tensoativo Polisorbato 20, Para estabilizar contra as polisorbato 80 interfaces e cisalhamento Outro Aminoácidos (por Para solubilidade ou exemplo, arginina) estabilidade aprimorada em dezenas de centenas de mM O pH da composição farmacêutica é um fator adicional que é capaz de alterar a solubilidade de um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima ou proteína) em uma composição farmacêutica aquosa.

Em algumas modalidades, as 5 composições farmacêuticas da presente invenção contêm um ou mais tampões.

Em algumas modalidades, as composições de acordo com a invenção contêm uma quantidade de tampão suficiente para manter o pH ótimo da referida composição entre cerca de 4,0-8,0, entre cerca de 5,0-7,5, entre cerca de 5,5-7,0, entre cerca de 6,0-7,0 e entre cerca de 6,0- 7,5. Em outras modalidades, o tampão compreende até cerca de 50 mM (por exemplo, até cerca de 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM) de fosfato de sódio.

Tampões adequados incluem, por exemplo, acetato, succinato, citrato, fosfato, outros ácidos orgânicos e tris(hidroximetil)aminometano (“Tris”). Concentrações de tampão adequadas podem ser de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM, ou a partir de cerca de 3 mM a cerca de 20 mM, dependendo, por exemplo, do tampão e a isotonicidade desejada da formulação.

Em algumas modalidades, um agente tamponador adequado está presente em uma concentração de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 5 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, ou 100 mM.

Em algumas modalidades, as formulações contêm um agente de isotonicidade para manter as formulações isotônicas.

Conforme utilizado em conexão com a liberação via IT, por “isotônico” quer-se dizer que a formulação de interesse tem essencialmente a mesma osmolaridade que o CSF humano.

Formulações isotônicas geralmente terão uma osmolaridade a partir de cerca de 240 mOsm/kg a cerca de 350 mOsm/kg.

A isotonicidade pode ser medida utilizando, por exemplo, um osmômetro do tipo pressão de vapor ou ponto de congelamento a vapor.

Agentes de isotonicidade exemplares incluem, mas não se limitam a, glicina, sorbitol, manitol, cloreto de sódio e arginina.

Em algumas modalidades, agentes isotônicos adequados podem estar presentes em formulações em uma concentração a partir de cerca de 0,01 – 5 % (por exemplo, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0 ou 5,0%) em peso.

Em algumas modalidades, as formulações podem conter um agente de estabilização para proteger a proteína.

Tipicamente, um agente de estabilização adequado é um açúcar não redutor, tal como sacarose, rafinose, trealose, ou aminoácidos, tal como glicina, arginina e metionina.

A quantidade de agente de estabilização em uma formulação é geralmente de modo que a formulação será isotônica.

No entanto, formulações hipertônicas podem também ser adequadas.

Adicionalmente, a quantidade de agente de estabilização não deve ser muito baixa, de modo que uma quantidade inaceitável de degradação/agregação do agente terapêutico ocorre.

As concentrações de agente de 5 estabilização exemplares na formulação podem variar de a partir de cerca de 1 mM a cerca de 400 mM (por exemplo, a partir de cerca de 30 mM a cerca de 300 mM, e a partir de cerca de 50 mM a cerca de 100 mM), ou alternativamente, a partir de 0,1% a 15% (por exemplo, a partir de 1% a 10%, a partir de 5% a 15%, a partir de 5% a 10%) em peso.

Em algumas modalidades, a proporção da quantidade de massa do agente de estabilização e do agente terapêutico é de cerca de 1:1. Em outras modalidades, a proporção da quantidade de massa do agente de estabilização e do agente terapêutico pode ser cerca de 0,1:1, 0,2:1, 0,25:1, 0,4:1, 0,5:1, 1:1, 2:1, 2.6:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10;1, ou 20:1. Em algumas modalidades, adequado para a liofilização, o agente de estabilização é também um lioprotetor.

As composições farmacêuticas, formulações e métodos relacionados da invenção são úteis para liberação de uma variedade de agentes terapêuticos ao CNS de um sujeito (por exemplo, por via intratecal, por via intraventricular ou intracisternal) e para o tratamento das doenças associadas.

As composições farmacêuticas da presente invenção são particularmente úteis para a liberação de proteínas e enzimas a sujeitos sofrendo de distúrbios de armazenamento lisossomal.

Em algumas modalidades, é desejável adicionar um tensoativo às formulações.

Tensoativos exemplares incluem tensoativos não iônicos, tais como Polisorbatos (por exemplo, Polisorbatos 20 ou 80); poloxâmeros (por exemplo, poloxâmero 188); Triton; dodecil sulfato de sódio (SDS); laurel sulfato de sódio; octilglicosídeo de sódio; lauril-, miristil-, linoleil-, ou estearil-sulfobetaína; lauril-, 5 miristil-, linoleil- ou estearil-sarcosina; linoleil-, miristil-, ou cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil-, ou isoestearamidopropil-betaína (por exemplo, lauroamidopropil); miristarnidopropil-, palmidopropil-, ou isostearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil taurato de sódio, ou metil ofeil taurate de dissódio; e a série MONAQUATTM (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilenoglicol, polipropilenoglicol, e copolímeros de etileno e propilenoglicol (por exemplo, Plurônicos, PF68, etc). Tipicamente, a quantidade de tensoativo adicionada é de modo que reduz a agregação da proteína e minimiza a formação de particulados ou efervescências.

Por exemplo, um tensoativo pode estar presente em uma formulação em uma concentração a partir de cerca de 0,001 – 0,5% (por exemplo, cerca de 0,005 – 0,05%, ou 0,005 – 0,01%). Particularmente, um tensoativo pode estar presente em uma formulação em uma concentração de aproximadamente 0,005%, 0,01%, 0,02%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, ou 0,5%, etc.

Em algumas modalidades, as formulações adequadas podem adicionalmente incluir um ou mais agentes de volume, particularmente, para formulações liofoilizadas.

Um “agente de volume” é um composto que adiciona massa à mistura liofilizada e contribui para a estrutura física do bolo liofilizado.

Por exemplo, um agente de volume pode aprimorar aparecimento do bolo liofilizado (por exemplo, bolo liofilizado essencialmente uniforme). Os agentes de volume adequados incluem, mas não se limitam a, cloreto de sódio, lactose, manitol, glicina, sacarose, trealose, amido 5 hidroxietílico.

Concentrações de agentes de volume exemplares são a partir de cerca de 1% a cerca de 10% (por exemplo, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0%, 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5%, e 10,0%). As formulações de acordo com a presente invenção podem ser avaliadas com base na análise de qualidade do produto, tempo de reconstituição (caso liofilizado), qualidade da reconstituição (caso liofilizado), alto peso molecular, umidade, e temperatura de transição de vidro.

Tipicamente, a qualidade de proteína e análise de produto incluem a análise da taxa de degradação do produto utilizando métodos incluindo, mas não limitado a, exclusão de tamanho HPLC (SE-HPLC), HPLC de troca de cátion (CEX-HPLC), difração de raios X (XRD), calorimetria de varredura diferencial modulada (mDSC), HPLC de fase reversa (RP-HPLC), dispersão de luz de ângulos múltiplos (MALS), fluorescência, absorção ultravioleta, nefelometria, eletroforese capilar (CE), SDS- PAGE, e combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, a avaliação do produto de acordo com a presente invenção pode incluir uma etapa de avaliação do aparecimento (tanto do aparecimento de bolo ou líquido). Geralmente, as formulações (liofilizadas ou aquosas) podem ser armazenadas durante períodos de tempo estendidos à temperatura ambiente.

A temperatura de armazenamento pode tipicamente variar de 0°C a 45°C (por exemplo, 4°C, 20°C,

25°C, 45°C, etc.). As formulações podem ser armazenadas durante um período de meses a um período de anos.

O tempo de armazenamento geralmente será de 24 meses, 12 meses, 6 meses, 4,5 meses, 3 meses, 2 meses ou 1 mês.

As formulações 5 podem ser armazenadas diretamente no recipiente utilizado para administração, eliminando as etapas de transferência.

As formulações podem ser armazenadas diretamente no recipiente de liofilização (caso liofilizadas), que podem também funcionar como o vasilhame de reconstituição, eliminando as etapas de transferência.

Alternativamente, formulações de produto liofilizado podem ser medidas em incremento menores para armazenamento.

O armazenamento deve geralmente evitar circunstâncias que levem à degradação das proteínas, incluindo, mas não limitadas a, exposição à luz solar, radiação UV, outras formas de radiação eletromagnética, calor ou frio excessivo, choque térmico rápido e choque mecânico.

Em algumas modalidades, as formulações de acordo com a presente invenção estão em uma forma líquida ou aquosa.

Em algumas modalidades, as formulações da presente invenção são liofilizadas.

Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas pela adição de um ou mais diluentes às mesmas antes da administração a um sujeito.

Diluentes adequados incluem, mas não se limitam a, água estéril, água bateriostática para injeção e solução salina estéril.

Preferencialmente, com a reconstituição, o agente terapêutico contido no mesmo é estável, solúvel e demonstra tolerabilidade com a administração a um sujeito As composições farmacêuticas da presente invenção são caracterizadas por sua tolerabilidade.

Conforme utilizado aqui, os termos “tolerável” e “tolerabilidade” referem-se à capacidade das composições farmacêuticas da presente invenção para não produzir uma reação adversa no sujeito a quem tal composição é administrada, ou alternativamente não 5 produzir uma reação adversa séria no sujeito a quem tal composição é administrada.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção são bem toleradas pelo sujeito a quem tais composições são administradas.

Dispositivo para Liberação por via intratecal Vários dispositivos podem ser utilizados para liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção.

Em algumas modalidades, um dispositivo para administração por via intratecal contém uma porta de acesso de fluido (por exemplo, porta injetável); um corpo oco (por exemplo, cateter) tendo um primeiro orifício de fluxo em comunicação fluida com a porta de acesso de fluido e um segundo orifício de fluxo configurado para inserção na medula espinhal; e um mecanismo de fixação para fixar a inserção do corpo oco na medula espinhal.

Como um exemplo não limitante mostrado na Figura 1, um mecanismo de fixação adequado contém uma ou mais cabeças montadas na superfície do corpo oco e um anel suturado ajustável ao longo de uma ou mais cabeças para evitar que o corpo oco (por exemplo, cateter) escape para fora da medula espinhal.

Em várias modalidades, a porta de acesso de fluido compreende um reservatório.

Em algumas modalidades, a porta de acesso de fluido compreende uma bomba mecânica (por exemplo, uma bomba de infusão). Em algumas modalidades, um cateter implantado está conectado a um reservatório (por exemplo,

para liberação de bolus) ou a uma bomba de infusão.

A porta de acesso de fluido pode ser implantada ou externa.

Em algumas modalidades, a administração por via intratecal pode ser desempenhada pode punção lombar (ou 5 seja, bolus lento) ou através de um sistema de liberação de cateter por porta (ou seja, infusão ou bolus). Em algumas modalidades, o cateter é inserido entre a lâmina das vértebras lombares e a ponta é roscada até o espaço tecal ao nível desejado (geralmente L3-L4) (Figura 2). Em relação à administração intravenosa, um volume de dose única adequado para administração por via intratecal é tipicamente pequeno.

Tipicamente, a liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção mantém o equilíbrio da composição do CSF, bem como a pressão intracraniana do sujeito.

Em algumas modalidades, a liberação por via intratecal é desempenhada ausente da remoção correspondente de CSF a partir de um sujeito.

Em algumas modalidades, um volume adequado de dose única pode ser, por exemplo, inferior a cerca de 10 ml, 8 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1,5 ml, 1 ml, ou 0,5 ml.

Em algumas modalidades, um volume de dose única adequado pode ser cerca de 0,5-5 ml, 0,5-4 ml, 0,5-3 ml, 0,5-2 ml, 0,5-1 ml, 1-3 ml, 1-5 ml, 1,5-3 ml, 1-4 ml, ou 0,5-1,5 ml.

Em algumas modalidades, a liberação por via intratecal de acordo com a presente invenção envolve uma etapa de remoção de uma quantidade desejada de CSF primeiro.

Em algumas modalidades, menos de cerca de 10 ml (por exemplo, menos de cerca de 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml) de CSF é primeiramente removido antes da administração por via IT.

Nesses casos, um volume de dose única adequado pode, por exemplo, mais que cerca de 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, ou 20 ml.

Vários outros dispositivos podem ser utilizados para efetuar a administração por via intratecal de uma 5 composição terapêutica.

Por exemplo, formulações contendo enzimas desejadas podem ser dadas utilizando um reservatório de Ommaya que é de uso comum para drogas de administração por via intratecal para carcinomatose meníngea (Lancet 2: 983-84, 1963). Mais especificamente, nesse método, um tubo ventricular é inserido através de um orifício formado trompa anterior e está conectado a um reservatório de Ommaya instalado sob o escalpo, e o reservatório é pungido de modo subcutâneo para liberação por via intratecal da enzima particular sendo substituída, que é injetada ao reservatório.

Outros dispositivos para administração por via intratecal de composições ou formulações terapêuticas a um indivíduo são descritos na Pat. dos Estados Unidos No. 6,217,552, incorporada aqui por referência.

Alternativamente, a droga pode ser dada por via intratecal, por exemplo, através de uma injeção única, ou infusão contínua.

Deve-se compreender que o tratamento de dosagem pode ser na forma de administração de uma única dose ou de doses múltiplas.

Para injeção, as formulações da invenção podem ser formuladas em soluções líquidas.

Adicionalmente, a enzima pode ser formulada na forma sólida e redissolvida ou suspense imediatamente antes do uso.

Formas liofilizadas também são incluídas.

A injeção pode ser, por exemplo, na forma de uma injeção de bolus ou infusão contínua (por exemplo, utilizando bombas de infusão) da enzima.

Em uma modalidade da invenção, a enzima é administrada através de injeção cérebro ventricular lateral no cérebro de um sujeito.

A injeção pode ser feita, por exemplo, através de uma trepanação feita no crânio do sujeito.

Em 5 outra modalidade, a enzima e/ou outra formulação farmacêutica é administrada através de um desvio inserido cirurgicamente no ventrículo cerebral de um sujeito.

Por exemplo, a injeção pode ser feita nos ventrículos laterais, que são maiores.

Em algumas modalidades, a injeção no terceiro e quarto ventrículos menores pode ser feita também.

Em ainda outra modalidade, as composições farmacêuticas utilizadas na presente invenção são administradas por injeção na cisterna magna, ou área lombar de um sujeito.

Em outra modalidade do método da invenção, a formulação farmaceuticamente aceitável provê liberação prolongada, por exemplo, “soltura lenta” da enzima ou outra composição farmacêutica utilizada na presente invenção, a um sujeito durante pelo menos uma, duas, três, quatro semanas ou períodos mais longos de tempo após a formulação farmaceuticamente aceitável ser administrada ao sujeito.

Conforme utilizado aqui, o termo “liberação prolongada” refere-se à liberação contínua de uma formulação farmacêutica da invenção in vivo ao longo de um período de tempo seguindo administração, preferencialmente pelo menos vários dias, uma semana ou várias semanas.

A liberação prolongada da composição pode ser demonstrada através, por exemplo, do efeito terapêutico continuado da enzima ao longo do tempo (por exemplo, a liberação prolongada da enzima pode ser demonstrada através da quantidade reduzida contínua de grânulos de armazenamento no sujeito). Alternativamente, a liberação prolongada da enzima pode ser demonstrada pela detecção da presença da 5 enzima in vivo ao longo do tempo.

Liberação aos Tecidos alvo Conforme discutido acima, uma das características importantes da presente invenção é que os agentes terapêuticos, particularmente, as enzimas de substituição administradas utilizando os métodos da invenção e composições da presente invenção são capazes de se difundir efetivamente e extensivamente ao longo da superfície do cérebro e penetrar as várias camadas ou regiões do cérebro, incluindo regiões profundas do cérebro.

Adicionalmente, os métodos da invenção e composições da presente invenção liberam efetivamente os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas de substituição) a vários tecidos, neurônios ou células da medula espinhal, incluindo a região lombar, que é difícil de ter como alvo pela existência de métodos de liberação ao CNS, tais como injeção ICV.

Adicionalmente, os métodos da invenção e composições da presente invenção liberam quantidade suficiente de agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas de substituição) à corrente sanguínea e vários órgãos periféricos e tecidos.

Assim, em algumas modalidades, uma proteína terapêutica (por exemplo, uma enzima de substituição) é liberada ao sistema nervoso central de um sujeito.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica (por exemplo, uma enzima de substituição) é liberada a um ou mais dos tecidos alvo do cérebro, medula espinhal e/ou órgãos periféricos.

Conforme utilizado aqui, o termo “tecidos alvo” refere-se a qualquer tecido que seja afetado pela doença de armazenamento lisossomal a ser tratada ou qualquer tecido em que a enzima lisossomal deficiente está 5 normalmente expressa.

Em algumas modalidades, os tecidos alvo incluem aqueles tecidos em que há uma quantidade detectável ou anormalmente alta de substrato de enzima, por exemplo, armazenada nos lisossomos celulares do tecido, em pacientes sofrendo de ou suscetíveis à doença de armazenamento lisossomal.

Em algumas modalidades, os tecidos alvo incluem aqueles tecidos que exibem patologia associada à doença, sintoma ou característica.

Em algumas modalidades, os tecidos alvo incluem aqueles tecidos em que a enzima lisossomal deficiente está normalmente expressa em um nível elevado.

Conforme utilizado aqui, um tecido alvo pode ser um tecido alvo do cérebro, um tecido alvo da medula espinhal e/ou um tecido periférico alvo.

Os tecidos alvo exemplares são descritos em detalhes abaixo.

Tecidos cerebrais alvo Em geral, o cérebro pode ser divide em diferentes regiões, camadas e tecidos.

Por exemplo, o tecido menegal é um sistema de membranas que envolve o sistema nervoso central, incluindo o cérebro.

As meninges contêm três camadas, incluindo a dura-máter, a aracnoide, e pia-máter.

Em geral, a função primária das meninges e do fluido cefalorraquidiano é proteger o sistema nervoso central.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica de acordo com a presente invenção é liberada a uma ou mais camadas das meninges.

O cérebro tem três subdivisões primárias, incluindo o cérebro, cerebelo e o tronco cerebral.

Os hemisférios cerebrais, que estão situadas acima da maioria das estruturas cerebrais e estão cobertas com uma camada cortical.

Abaixo do cérebro está o tronco cerebral, que 5 lembra um caule ao qual cérebro está anexado.

Na parte traseira do cérebro, abaixo do cérebro e atrás do tronco cerebral, está o cerebelo.

O diencéfalo, que está localizado próximo à linha média do cérebro e acima do mesencéfalo, contém o tálamo, metatálamo, hipotálamo, epitálamo, pretálamo, e área pré- tectal.

O mesencéfalo, também chamado de cérebro intermediário, contém o tectum, tegumento, mesocoelia ventricular, e pedúnculos cerebrais, o núcleo vermelho, e o núcleo do nervo craniano III.

O mesencéfalo está associado à visão, audição, controle motor, adormecer/despertar, vigilância e regulação de temperatura.

As regiões de tecidos do sistema nervoso central, incluindo o cérebro, podem ser caracterizadas com base na profundidade dos tecidos.

Por exemplo, os tecidos do CNS (por exemplo, cérebro) podem ser caracterizados como tecidos superficiais ou rasos, tecidos de profundidade média e/ou tecidos profundos.

De acordo com a presente invenção, uma proteína terapêutica (por exemplo, uma enzima de substituição) pode ser liberada a qualquer(quaisquer) tecido-alvo(s) do cérebro apropriado(s) associado(s) a uma doença particular a ser tratada em um sujeito.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica (por exemplo, uma enzima de substituição) de acordo com a presente invenção é liberada ao tecido-alvo superficial ou raso do cérebro.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica de acordo com a presente invenção é liberada ao tecido-alvo de profundidade média do cérebro.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica de acordo com a presente invenção é liberada ao 5 tecido-alvo profundo do cérebro.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica de acordo com a presente invenção é liberada a uma combinação de tecido-alvo superficial ou raso do cérebro, tecido-alvo de profundidade média do cérebro, e/ou tecido-alvo profundo do cérebro.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica de acordo com a presente invenção é liberada a um tecido profundo do cérebro pelo menos 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm ou mais abaixo (ou interno à) da superfície externa do cérebro.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberadas a um ou mais tecidos de superfície ou superficiais do cérebro.

Em algumas modalidades, o tecido alvo de superfície ou superficiais do cérebro estão localizados dentro de 4 mm a partir da superfície do cérebro.

Em algumas modalidades, o tecido alvo de superfície ou superficiais do cérebro são selecionados dentre os tecidos da pia-máter, tecidos da faixa cortical cerebral, hipocampo, espaço de Virchow Robin, vasos sanguíneos dentro de do espaço de VR, o hipocampo, porções do hipotálamo na superfície inferior do cérebro, os nervos ópticos e tratos, as projeções e bulbo olfativo, e combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a um ou mais tecidos profundos do cérebro.

Em algumas modalidades, o tecido alvo de superfície ou superficiais do cérebro estão localizados 4 mm (por exemplo, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, ou 10 mm) abaixo da (ou interno à) superfície do cérebro.

Em algumas modalidades, os tecidos alvo profundos do cérebro incluindo 5 a faixa cortical cerebral.

Em algumas modalidades, os tecidos alvo profundos do cérebro incluem um ou mais dentre o diencéfalo (por exemplo, o hipotálamo, tálamo, pretálamo, subtálamo, etc.), metencéfalo, núcleos lentiformes, o gânglio basal, caudado, putâmen, amígdala, globo pálido, e combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a um ou mais tecidos do cerebelo.

Em certas modalidades, o um ou mais tecidos alvo do cerebelo são selecionados a partir do grupo consistindo em tecidos da camada molecular, tecidos da camada de células de Purkinje, tecidos da camada de células granulares, do pedúnculos do cerebelo, e combinação dos mesmos.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a um ou mais tecidos profundos do cerebelo incluindo, mas não limitado a, tecidos da camada de células de Purkinje, tecidos da camada de células granulares, tecidos profundos de substância branca do cerebelo (por exemplo, profunda em relação à camada de células Granulares), e tecido profundo do núcleo do cerebelo.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a um ou mais tecidos do tronco cerebral.

Em algumas modalidades, o um ou mais tecidos alvo do tronco cerebral incluem o tecido de substância branca do tronco cerebral e/ou tecidos do núcleo do tronco cerebral.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a vários tecidos cerebrais incluindo, mas não limitados a, substância cinzenta, 5 substância branca, áreas periventriculares, pia-aracnoide, meninges, neocórtex, cerebelo, tecidos profundos no córtex cerebral, camada molecular, região caudada/putâmen, mesencéfalo, regiões profundas das pontes ou medula, e combinações dos mesmos.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a várias células no cérebro incluindo, mas não limitadas a, neurônios, células gliais, células perivasculares e/ou células menígenas.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica é liberada aos oligodendrócitos da substância branca profunda.

Medula espinhal Em geral, as regiões ou tecidos da medula espinhal podem ser caracterizadas com base na profundidade dos tecidos.

Por exemplo, os tecidos da medula espinhal podem ser caracterizados como tecidos superficiais ou rasos, tecidos de profundidade média, e/ou tecidos profundos.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a um ou mais tecidos de superfície ou superficiais da medula espinhal.

Em algumas modalidades, um tecido alvo de superfície ou superficial da medula espinhal está localizado dentro de 4 mm a partir da superfície da medula espinhal.

Em algumas modalidades, um tecido alvo de superfície ou superficial da medula espinhal contém pia-máter e/ou os tratos da substância branca.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a um ou mais tecidos profundos da medula espinhal.

Em algumas modalidades, um tecido alvo profundo da medula espinhal está localizado interno a 4 mm da superfície da medula espinhal.

Em algumas 5 modalidades, um tecido alvo profundo da medula espinhal contém substância cinzenta da medula espinhal e/ou células ependimais.

Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados aos neurônios da medula espinhal.

Tecidos periféricos alvo Conforme utilizado aqui, os órgãos ou tecidos periféricos referem-se a quaisquer órgãos ou tecidos que não são parte do sistema nervoso central (CNS). podem incluir, mas não se limitam a, sistema sanguíneo, fígado, rim, coração, endotélio, medula óssea e células derivadas de medula óssea, baço, pulmão, nódulo linfático, osso, cartilagem, ovário e testículo.

Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica (por exemplo, uma enzima de substituição) de acordo com a presente invenção é liberada a um ou mais dos tecidos periféricos alvo.

Biodistribuição e biodisponibilidade Em várias modalidades, uma vez liberado ao tecido alvo, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) está localizado de modo intracelular.

Por exemplo, um agente terapêutico (por exemplo, enzima) pode estar localizado éxons, axons, lisossomos, mitocôndria ou vacúolos de uma célula-alvo (por exemplo, neurônios tal como células de Purkinje). Para éxons, áxons, lisossomos, mitocôndria ou vacúolos de uma célula-alvo (por exemplo,

neurônios, tais como Células de Purkinje). Por exemplo, em algumas modalidades, enzimas administradas de modo intratecal demonstram dinâmica de translocação de modo que a enzima move-se dentro do espaço perivascular (por 5 exemplo, através de mecanismos convectivos assistidos por pulsação). Adicionalmente, mecanismos de transporte axonal ativo relativos à associação da proteína ou enzima administrada com neurofilamentos podem também contribuir com ou, de outro modo, facilitar a distribuição das proteínas administradas de modo intratecal ou enzimas em tecidos mais profundos do sistema nervoso central.

Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção pode obter níveis ou atividades terapeuticamente ou clinicamente eficientes em vários tecidos visados descritos aqui.

Conforme utilizado aqui, um nível ou atividade terapeuticamente ou clinicamente eficiente é um nível ou atividade suficiente para conferir um efeito terapêutico em um tecido alvo.

O efeito terapêutico pode ser objetivo (ou seja, mensuráveis por algum teste ou marcador) ou subjetivo (ou seja, o sujeito dá uma indicação de ou sente um efeito). Por exemplo, um nível ou atividade terapeuticamente ou clinicamente eficiente pode ser um nível ou atividade enzimática que é suficiente para melhorar os sintomas associados à doença no tecido-alvo (por exemplo, armazenamento de GAG). Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção pode obter um nível ou atividade enzimática que é pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,

60%, 70%, 80%, 90%, 95% do nível normal ou atividade da enzima lisossomal correspondente no tecido alvo.

Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção 5 pode obter um nível ou atividade enzimática que é aumentado em pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes em comparação com um controle (por exemplo, níveis endógenos ou atividades sem o tratamento). Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção pode obter um nível ou atividade enzimática aumentada de pelo menos aproximadamente 10 nmol/h/mg, 20 nmol/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg ou 600 nmol/h/mg em um tecido alvo.

Em algumas modalidades, os métodos da invenção de acordo com a presente invenção são particularmente úteis para ter como alvo a região lombar.

Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção pode obter um nível ou atividade enzimática aumentada na região lombar de pelo menos aproximadamente 500 nmol/h/mg, 600 nmol/h/mg, 700 nmol/h/mg, 800 nmol/h/mg, 900 nmol/h/mg, 1000 nmol/h/mg, 1500 nmol/h/mg, 2000 nmol/h/mg, 3000 nmol/h/mg, 4000 nmol/h/mg, 5000 nmol/h/mg, 6000 nmol/h/mg, 7000 nmol/h/mg, 8000 nmol/h/mg, 9000 nmol/h/mg, ou 10,000 nmol/h/mg.

Em geral, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas de substituição) liberados de acordo com a presente invenção têm meio tempo suficientemente longo em CSF e tecidos alvo do cérebro, medula espinhal, e órgãos 5 periféricos.

Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção pode ter meia vida de pelo menos aproximadamente 30 minutos, 45 minutos, 60 minutos, 90 minutos, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, até 3 dias, até 7 dias, até 14 dias, até 21 dias ou até um mês.

Em algumas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção pode reter nível ou atividade detectável no CSF ou corrente sanguínea após 12 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 42 horas, 48 horas, 54 horas, 60 horas, 66 horas, 72 horas, 78 horas, 84 horas, 90 horas, 96 horas, 102 horas, ou uma semana seguindo administração.

O nível ou atividade detectável pode ser determinado utilizando vários métodos conhecidos na técnica.

Em certas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção obtém uma concentração de pelo menos 30µg/ml nos tecidos e células do CNS do sujeito seguindo a administração (por exemplo, uma semana, 3 dias, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, ou menos, seguindo administração por via intratecal da composição farmacêutica ao sujeito). Em certas modalidades, um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) liberado de acordo com a presente invenção obtém uma concentração de pelo menos 20µg/ml, pelo menos 15µg/ml, pelo menos 10µg/ml, pelo menos 7,5µg/ml, pelo menos 5µg/ml, 5 pelo menos 2,5µg/ml, pelo menos 1,0µg/ml ou pelo menos 0,5µg/ml nos tecidos alvos ou células do sujeito (por exemplo, tecidos cerebrais ou neurônios) seguindo a administração a tal sujeito (por exemplo, uma semana, 3 dias, 48 horas, 36 horas, 24 horas, 18 horas, 12 horas, 8 horas, 6 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas, 1 hora, 30 minutos, ou menos seguindo administração por via intratecal de tais composições farmacêuticas ao sujeito). Tratamento de Doenças de armazenamento lisossomal através da Administração por via intratecal As doenças de armazenamento lisossomal representam um grupo de distúrbios metabólicos hereditários relativamente raros que resultam de defeitos na função lisossomal.

As doenças lisossomais são caracterizadas pelo acúmulo de macromoléculas não digeridas, incluindo aqueles substratos de enzimas, dentro dos lisossomos (vide Tabela 1), que resultam em um aumento no tamanho e número de tais lisossomos e, em última análise, em disfunção celular e anormalidades clínicas.

Os métodos da invenção descritos aqui podem facilitar vantajosamente a liberação de um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, uma ou mais enzimas de substituição) para as organelas alvo.

Por exemplo, devido aos distúrbios de armazenamento lisossomal, tais como a síndrome de Hunter, serem caracterizados por um acúmulo de glicosaminoglicanos (GAG) nos lisossomos das células afetadas, os lisossomos representam uma organela alvo desejada para o tratamento dos distúrbios de armazenamento lisossomal.

Os métodos da invenção e composições da presente 5 invenção são particularmente úteis no tratamento daquelas doenças tendo uma etiologia ou componente de CNS.

As doenças de armazenamento lisossomal tendo uma etiologia ou componente de CNS, incluem, por exemplo e sem limitação, a síndrome de Sanfilippo Tipo A, síndrome de Sanfilippo tipo B, síndrome de Hunter, leucodistrofia metacromática e leucodistrofia de células globosas.

Antes da presente invenção, terapias tradicionais são limitadas por serem administradas aos sujeitos por via intravenosa, e serem geralmente apenas efetivas no tratamento de sintomas somáticos da deficiência de enzima subjacente.

As composições e métodos da presente invenção podem vantajosamente serem administrados diretamente ao CNS de um sujeito sofrendo de uma doença tendo uma etiologia de CNS tal, desse modo, obtendo uma concentração terapêutica dentro das células afetadas e tecidos do CNS (por exemplo, o cérebro), superando assim as limitações associadas com a administração sistêmica tradicional de tais agentes terapêuticos.

Em algumas modalidades, os métodos da invenção e composições da invenção são úteis para o tratamento tanto de sequelas quanto de sintomas somáticos de distúrbios de armazenamento lisossomal.

Por exemplo, algumas modalidades da invenção relacionam-se com composições e métodos de liberação de um ou mais agentes terapêuticos ao CNS de um sujeito (por exemplo, por via intratecal, intraventricular ou intracisternal) para o tratamento das sequelas ou manifestações neurológicas ou do CNS de uma doença de armazenamento lisossomal, enquanto também trata as manifestações somáticas ou sistêmicas daquela doença de 5 armazenamento lisossomal.

Por exemplo, algumas composições da presente invenção podem ser administradas a um sujeito por via intratecal, liberando assim um ou mais agentes terapêuticos ao CNS do sujeito e tratando as sequelas neurológicas, acopladas com a administração intravenosa de um ou mais agentes terapêuticos para liberar tais agentes terapêuticos a ambas as células e tecidos da circulação sistêmica (por exemplo, células e tecidos do coração, pulmões, fígado, rim ou nódulos linfáticos) para, desse modo, tratar as sequelas somáticas.

Por exemplo, um sujeito tendo ou sendo afetado de outro modo por uma doença de armazenamento lisossomal (por exemplo, síndrome de Hunter) pode ser administrado com uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, iduronate-2-sulfatase) por via intratecal pelo menos uma vez por semana, bissemanalmente, mensalmente, bimensalmente ou mais para tratar as sequelas neurológicas, enquanto um agente terapêutico diferente é administrado ao sujeito por via intravenosa em uma base mais frequente (por exemplo, uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias, três vezes por semana ou semanalmente) para tratar as manifestações somáticas ou sistêmicas da doença.

Por exemplo, os pacientes sofrendo da síndrome de Hunter exibem alterações histológicas no cérebro, que podem incluem atrofia, inchaço neuronal cortical, redução da substância branca cerebral, espaços perivasculares dilatados e inchaço do dendrito da célula de Purkinje.

Estudos de espectroscopia/imagem de ressonância magnética mostraram que lesões difusas graves envolvendo a substância branca, atrofia do cérebro, e hidrocefalia foram mais 5 comuns em pacientes com debilitação cognitiva em comparação àqueles sem debilitação. (Vedolin, L., et al., AJNR Am J Neuroradiol (2007) 28, 1029-1033). Até mesmos pacientes sem sequelas neurológicas extremas, tais como retardo mental ou atrasos no desenvolvimento mostraram ter cérebro com anormalidades que incluíram atrofia, ventriculomegalia, e espaços perivasculares aumentados. (Matheus, MG, et al., Neuroradiology (2004) 46, 666-672.) Como um exemplo não limitante, mucopolissacaridose tipo IIIA (MPS IIIA; síndrome de Sanfilippo tipo A) é a forma mais grave de síndrome de Sanfilippo tipo A e afeta aproximadamente 1 a cada 100,000 pessoas ao redor do mundo.

A síndrome de Sanfilippo tipo A (Sanfilippo A) é caracterizada por uma deficiência da enzima N-sulfatase de heparano (HNS), uma exosulfatase envolvida no catabolismo lisossomal de sulfato de heparano de glicosaminoglicano (GAG) (Neufeld EF, et al.

The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001) pp. 3421-3452). Na ausência dessa enzima, o sulfato de heparano de GAG se acumula em lisossomos de neurônios e células gliais, com acúmulo menor no exterior do cérebro.

Como um exemplo não limitante, a mucopolissacaridose tipo IIIB (MPS IIIB; doença da síndrome de Sanfilippo tipo B) é um distúrbio recessivo autossômico que é caracterizado por uma deficiência da enzima alfa-N-acetil-glucosaminidase (Naglu). Na ausência dessa enzima, o sulfato de heparano de

GAG se acumula em lisossomos de neurônios e células gliais, com acúmulo menor no exterior do cérebro.

Como um exemplo não limitante, a Leucodistrofia de célula globoide (GLD) é um distúrbio do armazenamento 5 lisossomal recessivo autossômico causado por uma função deficiente de galactocerebrosidase (GALC). A GALC é uma enzima de hidrolase ácida lisossomal solúvel que degrada a galactosilceramida, um componente normal da mielina, em galactose e ceramida, e a psicosina (galactosilsfingosina), um subproduto tóxico da síntese de galactosilceramida, em galactose e esfingosina.

A deficiência de GALC leva ao ferimento neurológico do sistema nervoso central e periférico (CNS e PNS respectivamente) em duas vias relacionadas, mas distintas.

A primeira via leva ao acúmulo de psicosina excessivo com apoptose resultante de células de células de mielinização.

Na segunda via, a galactosilceramida se acumula e é fagocitada em microglia ativada, produzindo a célula globoide característica pela qual a doença é nomeada.

Em contraste com outras doenças de armazenamento lisossomal que acumulam substrato não degradado, não há geralmente aumento na galactosilceramida total no tecido neural.

Uma característica clínica definidora desse distúrbio é a degeneração do sistema nervoso central (CNS), que resulta em perda de, ou falha para obter, marcos de desenvolvimento principais.

O declínio cognitivo progressivo culmina em demência e mortalidade prematura.

A doença pode se manifestar em crianças jovens (GLD de início prematuro), ou em indivíduos de qualquer idade (GLD de início tardio). A expectativa de vida de um indivíduo afetado pela GLD de início prematuro tipicamente não se estende além da idade de dois anos.

A GLD de início tardio pode aparecer em indivíduos de qualquer idade e a progressão da doença pode variar bastante. 5 A Doença da Leucodistrofia metacromática (MLD), é um distúrbio recessivo autossômico resultante de uma deficiência da enzima Arilsulfatease A (ASA). A ASA, que é codificada pelo gene ARSA em humanos, é uma enzima que quebra a cerebrosídeo 3-sulfato ou esfingolipídio 3-O- sulfogalactosilceramida (sulfateto) em cerebrosídeo e sulfato.

Na ausência da enzima, os sulfatetos se acumulam no sistema nervoso (por exemplo, bainhas de mielina, neurônios e células gliais) e, em menor extensão, nos órgãos viscerais.

A consequência desses eventos celulares e moleculares é a demielinização progressiva e perda axonal dentro do CNS e PNS, que é acompanhada clinicamente pela disfunção cognitiva e motora grave.

Uma característica clínica definidora desse distúrbio é a degeneração do sistema nervoso central (CNS), que resulta em debilitação cognitiva (por exemplo, retardo mental, distúrbios nervosos e cegueira, dentre outros). Como um exemplo não limitante, a MLD pode se manifestar em crianças jovens (forma infantil tardia), em que as crianças afetadas tipicamente começam a mostrar sintomas logo após o primeiro ano de vida (por exemplo, aos cerca de 15-24 meses), e geralmente não sobrevivem além da idade de 5 anos.

A MLD pode se manifestar em crianças (forma juvenil), em que as crianças afetadas tipicamente apresentam debilitação cognitiva em torno da idade de 3-10 anos, e a expectativa de vida pode variar (por exemplo, na faixa de 10-15 anos após o início dos sintomas). A MLD pode se manifestar em adultos (forma de início em adulto) e pode aparecer em indivíduos de qualquer idade (por exemplo, tipicamente na idade de 16 e depois) e a progressão da 5 doença pode variar bastante.

Assim, em algumas modalidades, os métodos da invenção e composições liberam um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, uma ou mais enzimas de substituição) a uma ou mais organelas (por exemplo, os lisossomos) de tecidos alvo e células do cérebro, medula espinhal e/ou órgãos periféricos para efetuar o tratamento de várias doenças de armazenamento lisossomal.

Conforme utilizado aqui, os termos “tratar” ou “tratamento” referem-se à melhoria de um ou mais sintomas associados à doença, prevenção ou atraso no início de um ou mais sintomas da doença, e/ou redução da gravidade ou frequência de um ou mais sintomas da doença.

Em algumas modalidades, o tratamento refere-se ao alívio parcial ou completo, melhoria, mitigação, inibição, atraso no início, redução da gravidade e/ou incidência da debilitação neurológica em um paciente sofrendo de ou suscetível a uma doença lisossomal.

Conforme utilizado aqui, o termo “debilitação neurológica” inclui vários sintomas associados à debilitação do sistema nervoso central (por exemplo, o cérebro e a medula espinhal). Sintomas da debilitação neurológica podem incluir, por exemplo, atraso no desenvolvimento, debilitação cognitiva progressiva, perda da audição, desenvolvimento da fala debilitado, déficits em habilidades motoras, hiperatividade, agressividade e/ou distúrbios do sono, dentre outros.

Em algumas modalidades, o tratamento refere-se ao armazenamento lisossomal reduzido (por exemplo, macromoléculas armazenadas, tais como GAG) em vários tecidos.

Em algumas modalidades, o tratamento refere-se ao 5 armazenamento lisossomal reduzido em tecidos cerebrais alvo, neurônios da medula espinhal e/ou tecidos periféricos alvo.

Em certas modalidades, o armazenamento lisossomal é reduzido em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais em comparação com um controle.

Em algumas modalidades, o armazenamento lisossomal é reduzido em pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes em comparação com um controle.

Em algumas modalidades, o armazenamento lisossomal é medido através da presença de grânulos de armazenamento lisossomal (por exemplo, morfologia de listras de zebra). Em algumas modalidades, o tratamento refere-se à vacuolização reduzida em neurônios (por exemplo, os neurônios contendo células de Purkinje). Em certas modalidades, a vacuolização em neurônios é reduzida em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais em comparação com um controle.

Em algumas modalidades, a vacuolização é reduzida em pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes em comparação com um controle.

Em certas modalidades, o tratamento de acordo com a presente invenção resulta em a redução (por exemplo, redução de cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%,

55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais) ou uma eliminação completa da presença, ou alternativamente o acúmulo, de um ou mais marcadores biológicos ou patológicos que estão associados às doenças de 5 armazenamento lisossomal.

Tal redução ou eliminação pode ser particularmente evidente nas células e tecidos do CNS (por exemplo, neurônios e oligodendrócitos). Por exemplo, em algumas modalidades, com a administração a um sujeito, as composições farmacêuticas da presente invenção demonstraram ou obtiveram uma redução no acúmulo da proteína biomarcadora associada à membrana lisossomal-1 (LAMP1) nas células e tecidos do CNS do sujeito (por exemplo, no córtex cerebral, cerebelo, núcleo caudado e putâmen, substância branca e/ou tálamo). LAMP1 é uma glicoproteína altamente expressa em membranas lisossomais e sua presença é elevada em muitos pacientes com um distúrbio do armazenamento lisossomal (Meikle, et al.

Clin Chem. (1997)43:1325-1335). A presença ou ausência de LAMP1 em pacientes (por exemplo, conforme determinado por coloração LAMP) com uma doença de armazenamento lisossomal, portanto, pode prover um indicador útil da atividade lisossomal e um marcador tanto para o diagnóstico quanto para o monitoramento de doenças de armazenamento lisossomal.

Consequentemente, algumas modalidades da presente invenção referem-se a métodos de redução ou, de outro modo, eliminação da presença ou acúmulo de um ou mais marcadores biológicos ou patológicos associados a uma doença (por exemplo, uma doença de armazenamento lisossomal). De modo semelhante, algumas modalidades da invenção referem-se a métodos de aumento da degradação (ou da taxa de degradação)

de um ou mais marcadores biológicos ou patológicos (por exemplo, LAMP1) associados a doenças de armazenamento lisossomal.

Em algumas modalidades, o tratamento refere-se à 5 progressão reduzida da perda de capacidade cognitiva.

Em certas modalidades, a progressão da perda de capacidade cognitiva é reduzida em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais em comparação com um controle.

Em algumas modalidades, o tratamento refere-se ao atraso no desenvolvimento reduzido.

Em certas modalidades, atraso no desenvolvimento é reduzido em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais em comparação com um controle.

Em algumas modalidades, o tratamento refere-se ao aumento da sobrevivência (por exemplo, tempo de sobrevivência). Por exemplo, o tratamento pode resultar em um aumento da expectativa de vida de um paciente.

Em algumas modalidades, o tratamento de acordo com a presente invenção resulta em um aumento na expectativa de vida de um paciente superior a cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 100%, cerca de 105%, cerca de 110%, cerca de 115%, cerca de 120%, cerca de 125%, cerca de 130%, cerca de 135%, cerca de 140%, cerca de 145%, cerca de 150%, cerca de 155%, cerca de 160%, cerca de 165%, cerca de 170%, cerca de 175%, cerca de 180%, cerca de 185%, cerca de 190%, cerca de

195%, cerca de 200% ou mais, em comparação com a expectativa de vida média de um ou mais indivíduos de controle com doença semelhante, sem tratamento.

Em algumas modalidades, o tratamento de acordo com a presente invenção 5 resulta em um aumento da expectativa de vida de um paciente superior a cerca de 6 meses, cerca de 7 meses, cerca de 8 meses, cerca de 9 meses, cerca de 10 meses, cerca de 11 meses, cerca de 12 meses, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, cerca de 5 anos, cerca de 6 anos, cerca de 7 anos, cerca de 8 anos, cerca de 9 anos, cerca de 10 anos ou mais, em comparação com a expectativa de vida média de um ou mais indivíduos de controle com doença semelhante, sem tratamento.

Em algumas modalidades, o tratamento de acordo com a presente invenção resulta em sobrevivência a longo prazo de um paciente.

Conforme utilizado aqui, o termo “sobrevivência a longo prazo ” refere-se a um tempo de sobrevivência ou expectativa de vida mais longo que cerca de 40 anos, 45 anos, 50 anos, 55 anos, 60 anos ou mais.

Os termos “aprimorar,” “aumentar” ou “reduzir,” conforme utilizado aqui, indicam valores que são relativos a um controle.

Em algumas modalidades, um controle adequado é uma medição de linha de base, tal como uma medição no mesmo indivíduo antes do início do tratamento descrito aqui, ou uma medição em um indivíduo de controle (ou múltiplos indivíduos de controle) na ausência do tratamento descrito aqui.

Um “indivíduo de controle” é um indivíduo afetado pela mesma doença, que tem cerca da mesma idade e/ou é do mesmo sexo que o indivíduo sendo tratado (para assegurar que os estágios da doença no indivíduo tratado e o indivíduo de controle(s) sejam comparáveis). O indivíduo (também referido como “paciente” ou “sujeito”) sendo tratado é um indivíduo (feto, infante, criança, adolescente ou adulto humano) tendo a doença ou 5 tendo potencial para desenvolver a doença.

O indivíduo pode ter expressão e/ou atividade lisossomal de enzima endógena residual, ou nenhuma atividade mensurável.

Por exemplo, o indivíduo tendo a síndrome de Sanfilippo tipo A pode ter níveis de expressão de HNS que são inferiores a cerca de 30-50%, inferiores a cerca de 25-30%, inferiores a cerca de 20-25%, inferiores a cerca de 15-20%, inferiores a cerca de 10-15%, inferiores a cerca de 5-10%, inferiores a cerca de 0,1-5% dos níveis de expressão de HNS normais.

Tolerância imunológica Geralmente, a administração por via intratecal de um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição) de acordo com a presente invenção não resulta em efeitos adversos graves no sujeito.

Conforme utilizado aqui, efeitos adversos graves induzem, mas não se limitam a, resposta imunológica substancial, toxidade ou morte.

Conforme utilizado aqui, o termo “resposta imunológica substancial” refere-se a respostas imunológicas sérias ou graves, tais como respostas imunológicas de célula T adaptativa.

Assim, em muitas modalidades, os métodos da invenção de acordo com a presente invenção não envolvem a terapia imunossupressora simultânea (ou seja, qualquer terapia imunossupressora utilizada como pré-tratamento/pré- condicionamento ou em paralelo com o método). Em algumas modalidades, os métodos da invenção de acordo com a presente invenção não envolvem uma indução de tolerância imunológica no sujeito sendo tratado.

Em algumas modalidades, os métodos da invenção de acordo com a presente invenção não envolvem um pré-tratamento ou pré- 5 condicionamento do sujeito utilizando o agente imunossupressor de células T.

Em algumas modalidades, a administração por via intratecal de agentes terapêuticos pode montar uma resposta imunológica contra esses agentes.

Assim, em algumas modalidades, pode ser útil tornar o sujeito recebendo a enzima de substituição tolerante à terapia de substituição de enzima.

A tolerância imunológica pode ser induzida utilizando vários métodos conhecidos na técnica.

Por exemplo, um regime de 30-60 dias inicial de um agente imunossupressor de células T, tal como ciclosporina A (CsA) e um agente antiproliferativo, tal como azatioprina (Aza), combinado com infusões por via intratecal semanal de doses pequenas de uma enzima de substituição desejada, pode ser utilizado.

Qualquer agente imunossupressor conhecido daquele versado na técnica pode ser empregado juntamente com uma terapia de combinação da invenção.

Tais agentes imunossupressores incluem, mas não se limitam a ciclosporina, FK506, rapamicina, CTLA4-Ig, e agentes anti- TNF, tais como etanercepte (vide por exemplo, Moder, 2000, Ann.

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Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283). O 5 anticorpo receptor anti-IL2 (.alfa.-subunidade) daclizumab (por exemplo, Zenapax.TM.), que demonstrou ser efeitvo em pacientes transplantados, pode também ser utilizado como um agente imunossupressor (vide por exemplo, Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N.

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Immunol. 164, 1230-1235). Administração Os métodos da invenção da presente invenção contemplam administrações únicas bem como múltiplas de uma quantidade terapeuticamente eficiente dos agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas de substituição) descritas aqui.

Os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas de substituição) podem ser administrados em intervalos regulares, dependendo da natureza, gravidade e extensão da condição do sujeito

(por exemplo, uma doença de armazenamento lisossomal). Em algumas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficiente dos agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas de substituição) da presente invenção pode ser administrada 5 por via intratecal periodicamente em intervalos regulares (por exemplo, uma vez a cada ano, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada três meses, bimensalmente (uma vez a cada dois meses), mensalmente (uma vez a cada mês), bissemanalmente (uma vez a cada duas semanas), semanalmente). Em algumas modalidades, a administração por via intratecal pode ser utilizada em conjunção com outras vias de administração (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parenteral, transdermal ou transmucosal (por exemplo, oral ou nasal)). Em algumas modalidades, aquelas outras rotas de administração (por exemplo, administração intravenosa) não podem ser desempenhadas com mais frequência que administradas bissemanalmente, mensalmente, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada seis meses, anualmente.

Conforme utilizado aqui, o termo “quantidade terapeuticamente eficiente” é amplamente determinado com base na quantidade total do agente terapêutico contido nas composições farmacêuticas da presente invenção.

Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficiente é suficiente para obter um benefício significativo ao sujeito (por exemplo, tratamento, modulação, cura, prevenção e/ou melhoria da doença ou condição subjacente). Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficiente pode ser uma quantidade suficiente para obter um efeito profilático e/ou terapêutico desejado, tal como uma quantidade suficiente para modular os receptores de enzima lisossomal ou sua atividade para, desse modo, tratar tal doença de 5 armazenamento lisossomal ou os sintomas da mesma (por exemplo, uma redução ou eliminação da presença ou incidência de “corpos de zebra” ou vacuolização celular segundo a administração das composições da presente invenção a um sujeito). Geralmente, uma quantidade de um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima recombinante lisossômica) administrada a um sujeito em necessidade da mesma dependerá das características do sujeito.

Tais características incluem a condição, gravidade da doença, saúde geral, idade, sexo e peso corporal do sujeito.

Aquele comumente versado na técnica será prontamente capaz de determinar as dosagens apropriadas dependendo desses ou outros fatores.

Adicionalmente, ambas as análises objetiva e subjetiva podem opcionalmente ser empregadas para identificar faixas de dosagem ótimas.

Uma quantidade terapeuticamente eficiente é comumente administrada em um regime de dosagem que pode compreender dosagens unitárias múltiplas.

Para qualquer proteína terapêutica particular, uma quantidade terapeuticamente eficiente (e/ou uma dose unitária apropriada dentro de um regime de dosagem efetivo) pode variar, por exemplo, dependendo da via de administração, em combinação com outros agentes farmacêuticos.

Também, a quantidade terapeuticamente eficiente específica (e/ou dose unitária) para qualquer paciente particular pode depender de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio sendo tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do agente farmacêutico específico sendo empregado; a composição específica empregada; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de 5 administração, e/ou taxa de excreção ou metabolismo da proteína de fusão específica empregada; a duração do tratamento; e fatores semelhantes como é de conhecimento nas técnicas médicas.

Em algumas modalidades, uma dose terapêutica eficaz varia em cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 500 mg/kg de peso do cérebro, por exemplo, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 400 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 300 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 200 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 100 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 90 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 80 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 70 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 60 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 50 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 40 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 30 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 25 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 20 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 15 mg/kg de peso do cérebro, a partir de cerca de 0,005 mg/kg de peso do cérebro a 10 mg/kg de peso do cérebro. 5 Em algumas modalidades, uma dose terapêutica eficaz é superior a cerca de 0,1 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 0,5 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 1,0 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 3 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 5 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 10 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 15 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 20 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 30 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 40 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 50 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 60 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 70 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 80 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 90 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 100 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 150 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 200 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 250 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 300 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 350 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 400 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 450 mg/kg de peso do cérebro, superior a cerca de 500 mg/kg de peso do cérebro.

Em algumas modalidades, uma dose terapêutica eficaz pode também ser definida por mg/kg de peso corporal.

Conforme algum versado na técnica apreciaria, os pesos do cérebro e os pesos corporais podem ser correlacionados.

Dekaban AS. “Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights,” Ann Neurol 1978; 4:345-56. Assim, em algumas modalidades, as dosagens podem ser convertidas conforme 5 mostrado na Tabela 4. Tabela 4 Conversão de dosagem Correlação entre os Pesos do cérebro, pesos corporais e idades dos machos Idade (ano) Peso do cérebro Peso corporal (kg) (kg) 3 (31-43 meses) 1,27 15,55 4-5 1,30 19,46 Em algumas modalidades, uma dose terapêutica eficaz pode também ser definida em mg/15 cm3 de CSF.

Conforme alguém versado na técnica apreciaria, as doses terapêuticas eficazes com base nos pesos do cérebro e pesos corporais podem ser convertidas em mg/15 cm3 de CSF.

Por exemplo, o volume de CSF em adultos humanos é aproximadamente 150 ml ((Johanson CE, et al. “Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease,” Cerebrospinal Fluid Res. 2008 May 14;5:10). Portanto, injeções de dose única de 0,1 mg a 50 mg de proteína em adultos seriam aproximadamente doses de 0,01 mg/15 cm3 de CSF (0,1 mg) a 5,0 mg/15 cm3 de CSF (50 mg) em adultos.

Será adicionalmente compreendido que, para qualquer sujeito particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade do indivíduo e o julgamento profissional da pessoa administrado ou supervisionando a administração da terapia de substituição de enzima e que as faixas de dosagem exibidas aqui são exemplares apenas e não são pretendidas como limitando o escopo ou prática da invenção reivindicada.

Kits 5 A presente invenção adicionalmente provê kits ou outros artigos de manufatura que contêm a formulação da presente invenção e provê instruções para sua reconstituição (caso liofilizada) e/ou uso.

Os kits ou outros artigos de manufatura podem incluir um recipiente, um IDDD, um cateter e quaisquer outros artigos, dispositivos ou equipamento útil na administração por via intratecal e cirurgia associada.

Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas (por exemplo, seringas pré-preenchidas), ampolas, cartuchos, reservatórios, ou liojatos.

O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico.

Em algumas modalidades, um recipiente é uma seringa pré-preenchida.

Seringas pré-preenchidas adequadas incluem, mas não se limitam a seringas de vidro de borossilicato com revestimento de silicone cozido, seringas de vidro de borossilicato com silicone aspergido, ou seringas de resina de plástico sem silicone.

Tipicamente, o recipiente pode manter as formulações e um rótulo, ou associado com, o recipiente que pode indicar direções para reconstituição e/ou uso.

Por exemplo, o rótulo pode indicar que a formulação é reconstituída para concentrações de proteína conforme descrito acima.

O rótulo pode adicionalmente indicar que a formulação é útil ou pretendida para, por exemplo, administração por via IT.

Em algumas modalidades, um recipiente pode conter uma dose única de uma formulação estável contendo um agente terapêutico (por exemplo, uma enzima de substituição). Em várias modalidades, uma dose única da formulação estável está presente em um volume inferior a cerca de 15 ml, 10 5 ml, 5,0 ml, 4,0 ml, 3,5 ml, 3,0 ml, 2,5 ml, 2,0 ml, 1,5 ml, 1,0 ml ou 0,5 ml. Alternativamente, um recipiente mantendo a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite administrações repetidas (por exemplo, a partir de 2-6 administrações) da formulação. Os kits ou outros artigos de manufatura podem adicionalmente incluir um segundo recipiente compreendendo um diluente adequado (por exemplo, BWFI, salina, salina tamponada). Com a mistura do diluente e da formulação, uma concentração final de proteína na formulação reconstituída geralmente será pelo menos 1 mg/ml (por exemplo, pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 25 mg/ml, pelo menos 50 mg/ml, pelo menos 75 mg/ml, pelo menos 100 mg/ml). Os kits ou outros artigos de manufatura podem adicionalmente incluir outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, IDDDs, cateteres, seringas e inserções de embalagem com instruções para uso. A invenção será mais completamente compreendida com referência aos exemplos a seguir. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitante do escopo da invenção. Todas as citações da literatura são incorporadas aqui por referência.

EXEMPLOS Exemplos de Liberação via IT de Proteína GalC Exemplo 1: Caracterização Fisioquímica de Formulação para Liberação por via intratecal de Galc O presente exemplo descreve a caracterização fisioquímica de GalC a fim de compreender seu comportamento e estabilidade sob diferentes condições de solução durante 5 a liberação por via intratecal (IT) da proteína.

Dentre outras coisas, o presente exemplo descreve uma formulação de GalC que é importante para uma liberação via IT de GalC bem sucedida.

Em algumas modalidades, essa formulação inclui 5 mM de fosfato de Na + 150 mM de NaCl, pH 6,0 + 0,005% de polissorbato 20. Em algumas modalidades, essa formulação inclui <5 mM, <10 mM, <15 mM e <20 mM de fosfato de Na.

Em algumas modalidades, essa formulação inclui um pH ≥ 5,5 e ≤ pH 7,0. com 150 mM de NaCl.

A liberação veículos PBS de molaridade de fosfato e pH variáveis foram testadas em macacos cynomologous adultos (Figura 3). 5 mM de fosfato em uma faixa de pH de 5,5-7,0 não mostrou efeito adverso, enquanto que 20 mM de fosfato entre pH 7,0-7,5 e 10-20 mM de fosfato entre pH 7,5-8,0 mostrou um efeito adverso nos macacos (Figura 3). A estabilidade térmica de hGalC (1mg/ml) em 3 mM de tampão de citrato, fosfato e borato com 50 mM de NaCl, foi investigada como uma função do pH dentro da faixa de pH 5,0-8,0 (Figura 4). A atividade de hGalC específica foi medida na linha de base (20-25°C) e em 2 semanas a 40˚C com a atividade específica mais alta retida entre o pH 6,0-6,5 (Figura 4). A atividade de hGalC específica foi adicionalmente medida em 3 meses a 5˚C com a atividade específica mais alta retida entre o pH 6.0-6.5 (Figura 5). A temperatura de fusão de hGalc foi medida como uma função de pH (Tabela 5) e também medida independentemente em diferentes formulações (Tabela 6). Tabela 5: Temperatura de Fusão de hGalC (1mg/ml) como uma função do pH pH de Tampão T (ºC) Universal 4,5* 61,6 5,0* 63,0 6,0 60,8 6,5 58,9 7,0 57,3 7,5 56,5 *[GalC]<1 mg/ml devido à precipitação 5 Tabela 6: Temperatura de Fusão de hGalC (1mg/ml) em Diferentes Formulações Formulação (pH 6.0) Tm (ºC) 5 mM de fosfato, 50 mM de NaCl 61,6 5 mM de fosfato, 150 mM de NaCl 60,2 5 mM de fosfato, 500 mM de NaCl 59,5 5 mM de fosfato, 5% de Dextrose 63,8 5 mM de fosfato, 150 mM de NaCl,1%de NaTC 56,8 A estabilidade térmica de hGalC, conforme determinado por retenção de atividade de hGalC específica em ~3 semanas a 5˚C e 2 semanas em 40˚C, foi também avaliada como uma função da concentração de sal (Figura 6). Os resultados mostraram que a hGalC reverte atividade específica alta após 3 semanas a 5˚C em uma variedade de concentrações de sal variando de 5 mM de fosfato + 50 mM de NaCl (abreviado aqui como 5+50) a 50 mM de fosfato + 150 mM de NaCl (abreviado aqui como 50+150), no pH 6,5 (Figura 6). Análise de Sedimentação de hGalC

A velocidade de sedimentação é um método de ultracentrifugação analítica (AUC) que mede a taxa em que as moléculas movem em resposta às forces centrífugas geradas em uma centrífuga e é uma técnica útil para 5 determinar o estado de associação da proteína em solução.

A primeira série de velocidade de sedimentação foi uma série de diluição de GalC humana em 5 mM de fosfato de Na, pH 6,0 com 150 mM de NaCl (Figura 7) para avaliar a amostra de auto-associação e/ou não idealidade.

A série de diluição foi colocada em gráfico como curvas (g(s*)) vs s*) normalizadas g(s*) em cada concentração.

O deslocamento geral nas curvas com valores s menores com diluição indicam dissociação, e este é um sistema de auto-associação rapidamente reversível.

Ao comparar forças iônicas diferentes (Figura 7A, B e C), é evidente que os conjuntos de deslocamentos de curva para valores s menores aumentam a força iônica indicando que as interações iônicas estão também envolvidas no processo de associação e que a auto- associação é diminuída em concentrações de sal maiores.

O camundongo GalC foi também verificado ao mesmo tempo em 150 mM de NaCl para comparar com hGalC.

Comparando forças iônicas correspondentes (150 mM de NaCl), é evidente que a energia livre de auto-associação de mGalC é inferior àquela de hGalC.

As curvas na Figura 7 foram cortadas em torno de 20S para mostrar a dissociação mais claramente; no entanto, quando essas verificações foram analisadas utilizam análise de distribuição ampla (WDA) e os resultados foram colocados em gráficos em uma escala de log, agregados maiores (s*>20S) podem ser claramente observados.

A agregação para oligômeros maiores (Figura 8)

é especificamente visível em 50 mM de NaCl, de alguma forma diminuída em 10 mM de NaCl e reduzida significativamente, mas presente, em 500 mM de NaCl em pH 6,0. A curva de WDA a partir da concentração mais alta a partir de cada uma das 5 forças iônicas é colocada em gráfico na Figura 8. Auto-associação em tampão universal em pH 6.0 Sob essas condições no tampão universal, a auto- associação aparece como sendo de cerca da mesma magnitude que o tampão de fosfato, pH 6,0, conforme observado na Figura 9. O efeito de pH nas energéticas de auto-associação de hGalC em tampão universal foi também investigada.

As séries de diluição foram desempenhadas em pH 4,5, 5,0, 6,0, 6,5, 7,0 and 7,5. As amostras em pH 4,5 e 5,0 foram insolúveis com essencialmente 100% da hGalC tendo precipitado deixando nada para medir no sobrenadante.

O efeito de pH é claramente mostrado na Figura 10 em que pelo menos a quantidade de auto-associação é observado em pH 7,5 e auto-associação considerável é observada em pH 6,0. A tendência é semelhante àquela observada com variações na força iônica com pH maior.

Aumentando tanto a força iônica quanto o pH desloca o equilíbrio para favorecer oligômeros menores na concentração mais alta (todos em torno de 1,0 mg/ml). O decréscimo na concentração em 1/3 de diluições seriais (vide Figura 7) desloca o equilíbrio em direção às espécies menores que aparecem como tendo um coeficiente de sedimentação de cerca de 5,2S.

O pico que ocorre em torno de 10-13S provavelmente representa um tetrâmero da espécie 5S.

Os esforços para encaixar esses dados em um modelo de auto-associação não foram bem sucedidos até o momento e é provavelmente devido à micro-

heterogeneidade inerente surgindo a partir de graus variáveis de glicosilação.

Auto-associação em tampão universal em pH 6,0 As amostras tensionadas e de linha de base de GalC in 5 5mM de fosfato de Na, pH 6,0, com 150 mM de NaCl foram comparadas em um experimento de série de diluição (vermelho azul verde preto). Os resultados para a menor concentração (preto) ~0,03mg/ml foram suavizados, que é o motivo pelo qual a curva para ter menos.

Na amostra tensionada, há um agregado em torno de ln(s*) =3,0 (~20S) que está presente em concentração muito maior que a amostra de linha de base.

Ele representa uma fração aproximadamente constante da amostra conforme evidenciado por sua persistência com a diluição nos gráficos normalizados (Figura 11, Figura 12, Figura 13). É, portanto, um agregado irreversível com uma massa molar de pelo menos 500 kg/mol. hGalC com tauclorato de sódio em solução Em tauclorato de sódio (NaTC)(1%), a auto-associação é reduzida significativamente.

A fronteira principal é deslocada para valores s menores e a oligomerização mais alta é suprimida (Figura 14). hGalC com 5% de dextrose A adição de 5% de dextrose para GalC em 5mM de fosfato de Na, pH 6,0 resultou na formação de agregados maiores (Figura 15). O pico em 18S corresponde à massa molar mínima de cerca de 440 kDa e o pico em 56S corresponde à massa molar mínima de cerca de 2.4 MDa com uma cauda estendendo- se além de 150S, correspondente a massas molares superiores a 10.0 MDa.

Há muito pouca alteração nesse padrão com a diluição a partir de 1,0 a 0,3 mg/ml indicando que esses oligômeros são principalmente irreversíveis na escala de tempo do experimento de sedimentação, um período de 5-6 horas Fluorescência intrínseca de hGalC 5 Estudos de fluorescência intrínseca de hGalC (utilizando 23 Trp) foram desempenhados para avaliar o papel do pH e da concentração de sal nas interações moleculares (Figura 16 e Figura 17). As interações moleculares foram mínimas (maior fluorescência relativa entre 330nm-350nm) tanto em 500mM de NaCl quanto em 1% de NaTC (Figura 16). Uma pequena alteração na estrutura secundária foi observada como uma função do pH.

A precipitação foi observada em pH 4,5 e 5,0 (Figura 17). Resumo Para avaliar a solubilidade relativa do hGalC e mGalC, um polietileno glicol (PEG) em abordagem de fase sólida induzida foi usado (Middaugh et al., J.

Biol.

Chem. 1979, 254, 367-370). Esta abordagem permite que a solubilidade relativa de proteínas seja medida de um modo quantificável.

Medições de solubilidade foram realizadas através da introdução de soluções tamponadas (5 mM de fosfato de sódio com 150 mM de NaCl, pH 6,0) de cada GalC para as diferentes concentrações de PEG (10 kDa). Gráficos da solubilidade de proteína versus concentrações de PEG produziram uma tendência linear.

A extrapolação da solubilidade aparente para a concentração de PEG zero foi feita para se obter a solubilidade relativa de cada proteína.

A solubilidade relativa do mGalC versus hGalC não mostrou qualquer diferença.

Em experimentos de solubilidade de hGalC, nenhuma precipitação ou perda de atividade foi observada após 3 semanas a 2-8˚C (em 5 mM de fosfato de sódio com diferentes concentrações de sais, pH 6,0-6,5). Solubilidade em ~30mg/mL foi alcançada com a formulação 5 mM de fosfato de Na + 150 mM de NaCl, pH 6,0, e nenhuma precipitação foi 5 observada após 50 dias a 2-8°C. Os dados AUC sugerem que o estado "nativo" de GalC é uma associação reversível, dependente da concentração, a oligômeros de ordem superior. Os dados biofísicos sugerem que pode haver uma importância estrutural e funcional aos oligômeros de ordem superior. A valores de pH superiores, há menos de retenção da atividade, valores mais baixos de Tm e um sistema mais homogêneo, conforme determinado por AUC. Em 5 mM de fosfato de sódio com 150 mM de NaCl, pH 6,0, provavelmente há um equilíbrio entre monômero, tetrâmero e outras espécies de ordem superior. Além disso, o pH não afeta dramaticamente os perfis de AUC na variação de pH de 6,5-7,5. Em geral, o sistema GalC é um sistema rapidamente reversível, altamente autoassociável nos tampões testados. EXEMPLO 2: FARMACOCINÉTICA E DISTRIBUIÇÃO TECIDUAL DE RADIOATIVIDADE EM RATOS SPRAGUE-DAWLEY APÓS UMA ÚNICA DOSE

INTRATECAL OU UMA ÚNICA INJEÇÃO DE BOLUS INTRAVENOSO DE 125 I-HGALC O presente Exemplo descreve um resultado exemplar 125 ilustrando farmacocinética e distribuição tecidual de I- HGALC em ratos machos Sprague-Dawley após uma única dose intratecal ou uma única injeção de bólus intravenoso. A concentração e teor de radioatividade no sangue total, soro, glóbulos vermelhos, líquido cefalorraquidiano (CSF) e tecidos foram medidos e análises farmacocinéticas não compartimentais foram realizados sobre os dados resultantes.

As vias intratecal e intravenosa foram selecionadas por serem as vias pretendidas de administração em humanos.

Os níveis das doses foram selecionados com base 5 na exposição humana potencial, toxicidade existente e dados de farmacocinética e quaisquer limitações impostas pelo artigo de teste.

O rato foi selecionado para o estudo por ser uma espécie aceita para utilização em estudos de farmacocinética e de distribuição tecidual.

O número de animais usados neste estudo foi o mínimo necessário para avaliar adequadamente a variabilidade prevista em cada ponto de tempo e atender os objetivos experimentais.

Materiais e Métodos Sistema de Teste 82 ratos machos Sprague Dawley (Rattus norvegicus) foram recebidos de Charles River Canada Inc. (St.

Constant, Quebec, Canadá) em 15 de abril de 2009. No início do tratamento, os animais tinham aproximadamente 10-11 semanas de idade. 9 ratos machos adicionais foram recebidos de Charles River Canada em 28 de Abril de 2009; estes animais tinham aproximadamente 9 semanas de idade no momento da chegada e foram necessários para assegurar que animais canulados suficientes estavam disponíveis a fim de completar a dosagem do estudo.

Os pesos corporais dos ratos machos variou de 342 a 453g no início do tratamento.

Os pesos corporais de todos menos um dos ratos machos em dosagem foram superiores à variação indicada no protocolo (250-350 g), entretanto, este pequeno desvio não foi considerado como tendo afetado o estudo ou os dados obtidos, já que os animais eram saudáveis e o peso corporal real foi usado para a administração da dose.

Gerenciamento de Animais Após a chegada a PCS-MTL, todos os animais foram 5 submetidos a um exame físico geral por um membro qualificado da equipe de veterinários.

Nenhuma anormalidade significativa foi detectada nos animais recebidos.

Os animais foram alojados individualmente em gaiolas de aço inoxidável com um piso de fundo de malha de arame e uma válvula de irrigação automática.

O programa de enriquecimento ambiental estava em conformidade com o SOP apropriado.

Cada gaiola foi claramente identificada com um cartão de gaiola de código de cores indicando o estudo, o grupo, os números dos animais e sexo.

Cada animal foi identificado exclusivamente pela AIMS® sistema de tatuagem.

Condições ambientais durante a condução do estudo foram controladas a uma temperatura-alvo e umidade relativa de 19 a 25°C e 30 a 70%, respectivamente.

O fotoperíodo foi de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão, exceto quando interrompida devido às atividades programadas.

Dieta Todos os animais tiveram livre acesso a uma dieta de laboratório comercial sedimentada certificada padrão (Dieta de Roedores Certificada PMI 5002: PMI Nutrition International Inc.), exceto durante procedimentos designados.

Concentrações máximas admissíveis de contaminantes na dieta (por exemplo, metais pesados, aflatoxina, organofosfato, hidrocarbonetos clorados, PCBs) são controladas e analisadas rotineiramente pelos fabricantes.

A água de torneira, adequada para consumo humano (filtrada através de um filtro de policarbonato bacteriostático de 0,5 µm) estava disponível para os animais ad libitum, exceto durante procedimentos.

Considerou-se que não existiam contaminantes conhecidos nos 5 materiais da dieta que pudessem interferir nos objetivos do estudo.

Aclimatação e distribuição aleatória Pelo menos 6 dias (para os animais recebidos em 15 de Abril de 2009) ou 3 dias (para os 9 animais adicionais recebidos em 28 de Abril de 2009) foram permitidos entre a recepção dos animais e a cirurgia para colocar a cânula intratecal, para permitir que aos animais se aclimatar às condições físicas e ambientais.

Durante o período de aclimatação, os animais foram pesados e distribuídos aleatoriamente, através de um computador baseado no procedimento de aleatorização.

A distribuição aleatória foi realizada seguindo estratificação usando o peso corporal como parâmetro.

Os animais nos extremos da variação de peso corporal não foram atribuídos a grupos.

Os animais foram distribuídos em grupos de estudo como segue: Tabela 7 Via de Administração e Volume de Dose Números de Númer Dose Projetado Animais o de Intraveno Intrate Grupo Intraveno Intratecal sa cal Machos sa (mL/kg) (mL) 1 - 60 µg - 0.02 1001-1024 2 1 mg/kg - 3.33 - 2001-2024 3a 1 mg/kg 60 µg 3.33 0.02 3001-3024 a: A dose IV foi administrada dentro de 5 minutos depois da dose intratecal.

Cada rato nos Grupos 1 e 2 recebeu uma dose nominal radioquímica de aproximadamente 3 µCi/animal.

Cada rato do Grupo 3 recebeu uma dose nominal radioquímica de aproximadamente 6 µCi/animal. 5 Formulação em dose intratecal A formulação de dose intratecal foi preparada no dia 125 da primeira administração da dose intratecal.

Solução I- hGALC suficiente foi medida e adicionada à solução hGALC não marcada medida.

Um volume medido do veículo foi adicionado e o todo misturado suavemente.

Uma solução de concentração de 3 mg/mL a um nível de radioatividade alvo de aproximadamente 150 µCi/mL foi preparada.

A formulação resultante foi filtrada através de um filtro de baixa ligação de proteína (PVDF de 0,22 µm GV unidade de filtro PVDF) para um recipiente estéril e mantida refrigerada (2- 8°C), ao abrigo da luz, aguardando utilização para dosagem.

Formulação de dose intravenosa A formulação de dose intravenosa foi preparada no dia 125 da administração da primeira dose intravenosa.

Solução I- hGALC suficiente foi medida e adicionada à solução suficiente não marcado medido hGALC.

Um volume medido do veículo foi adicionado e o todo misturado suavemente.

Uma solução de concentração de 0,3 mg/mL a um nível de radioatividade alvo de aproximadamente 3 µCi/mL foi preparada.

A formulação resultante foi filtrada através de um filtro baixo de proteína de ligação (PVDF de 0,22 µm GV unidade de filtro) para um recipiente estéril e mantido refrigerado (2 8°C), ao abrigo da luz, aguardando utilização para dosagem.

Análise das Formulações de dose Cada uma das formulações de dose rotulada radioativamente foi analisada em PCS MTL em cada dia de 5 dosagem por espectroscopia de cintilação líquida para determinar a concentração de radioatividade antes e depois do tratamento.

A concentração de radioatividade foi determinada através da preparação de diluições apropriadas da formulação da dose em veículo e alíquotas duplicadas de cada diluição foram analisados.

As formulações de doses restantes foram descartadas após a conclusão da análise (incluindo repetir análise). Cálculo da Atividade Específica do Artigo de Teste A atividade específica do artigo de teste nas formulações de dose foi calculada a partir dos níveis médios (pré e pós dose) de radioatividade medidos e a massa total do artigo de teste (com base nas concentrações previstas) nas formulações de dose.

Observações Clínicas Todos os animais foram examinados duas vezes ao dia quanto à mortalidade e sinais de doença e reação ao tratamento em todo o período de aclimatação e de estudo, exceto nos dias de chegada e de término do estudo, dias em que os animais foram examinados apenas uma vez.

Um exame detalhado foi realizado semanalmente.

Peso Corporal Pesos corporais individuais foram medidos uma vez durante a aclimatação, antes da cirurgia e no dia anterior à administração da dose.

Apenas os pesos corporais registrados no dia anterior à administração da dose foram relatados.

Cirurgia Um mínimo de 6 dias (ou 3 dias para os 9 animais adicionais) foi permitido entre a recepção dos animais e a 5 cirurgia para que os animais pudessem se acostumar às condições de laboratório ambiental.

Todos os animais, incluindo os sobressalentes, receberam uma única injeção intramuscular de antibiótico penicilina benzatina G + penicilina procaína G no dia da cirurgia e, novamente, dois dias após a cirurgia.

Em geral, a buprenorfina 0,05 mg/kg foi administrada por via subcutânea antes da cirurgia e cerca de 8 horas após a primeira administração, e depois disso, como julgado necessário.

Para alguns animais, Buprenorfina foi administrada cerca de 6 horas após a primeira administração, em vez de 8 12 horas.

Considerando a semi-vida de buprenorfina em ratos, este desvio do protocolo não afetou a saúde dos animais, e, portanto, não teve impacto sobre a validade ou os dados obtidos no estudo.

Os animais foram preparados para cirurgia raspando a partir do crânio até região torácica do dorso do pescoço.

Os animais foram anestesiados com o gás oxigênio/isoflurano antes da cirurgia e mantidos sob anestesia de gás isofluorano durante todo o procedimento cirúrgico.

Antes da cirurgia, e no final da intervenção cirúrgica, enquanto sob anestesia, um agente oftálmico lubrificante brando foi administrado a cada olho.

Antes da cirurgia, e em duas outras ocasiões em intervalos de aproximadamente 24 horas após a primeira administração, cada animal recebeu um anti inflamatório (Carprofeno, a 5 mg/kg), por injeção subcutânea.

O animal foi posicionado no interior do quadro estereotáxico.

A incisão da pele, de aproximadamente 2 cm, foi feita a partir da extremidade caudal do crânio para o 5 pescoço.

Os músculos do pescoço dorsal foram separados, a fim de expor a membrana atlanto occipital.

Um retrator foi usado para facilitar o acesso à membrana.

A membrana atlanto occipital foi cortada e o cateter intratecal foi lentamente introduzido caudalmente até que o cateter foi localizado na região lombar.

O fluido em excesso foi removido usando hastes flexíveis com ponta de algodão e a membrana atlanto occipital foi seca.

Imediatamente depois disso, o adesivo foi usado para ancorar o cateter bulbo à membrana.

Uma vez que a cola ter secado e o cateter foi solidamente ancorada, os afastadores foram removidos.

Um pequeno laço foi feito com o cateter sobre o crânio e a lâmpada foi ligada usando uma sutura de material não absorvível.

Uma vez que o cateter foi fixado, que foi passado para a região torácica dorsal, onde foi feita uma incisão para colocar uma porta de acesso.

Este foi suturado no local usando o material não absorvível.

Antes de fechar os músculos do pescoço, uma lavagem de 2mL de solução salina quente (ou seja, cerca de 37,5°C) foi feito no ferimento.

Os músculos foram fechados usando suturas interrompidas simples de material absorvível.

O local da porta de acesso foi lavado com 2mL de solução salina morna e a pele foi fechada com uma sutura contínua subcuticular de material de sutura absorvível.

Uma pomada antibiótica tópica foi administrada nos locais de cirurgia após a cirurgia e uma vez diariamente a partir daí até considerada desnecessária.

O volume morto do cateter e porta de acesso foi determinado no momento da cirurgia.

Uma verificação de patência foi realizada uma vez durante o período de pré- 5 tratamento entre o dia da cirurgia e no dia do tratamento.

Tratamento Um período de pelo menos 7 dias foi deixado entre o implante cirúrgico do cateter/porta acesso e o início do tratamento para permitir a recuperação adequada.

Antes da administração intratecal, a área da porta de acesso foi raspada, se necessário.

O local de punção foi limpo usando gluconato de clorexidina e água, e o local limpo com gaze embebida de água estéril, seguido de 3 passagens de iodo- povidona a 10%. A porta de acesso foi perfurada com uma agulha conectada à seringa dosadora e o artigo de teste foi administrado lentamente.

Após a administração, o local foi limpo com iodo, a fim de limitar a contaminação.

No dia 1 do estudo, foi administrado aos animais do 125 Grupo 1 o formulado I-hGALC através de injeção lenta de bolus intratecal na porta de acesso lombar subcutânea seguida por um fluxo de solução salina de 0,04mL para entregar uma dose alvo de 60 µg/animal e uma dose de radioatividade de cerca de 3 µCi/animal.

No dia 2 do estudo, foi administrado aos animais do 125 Grupo 3 o formulado I-hGALC através de injeção lenta de bolus intratecal na porta de acesso lombar subcutânea seguida por uma lavagem de solução salina de 0,04mL para entregar uma dose alvo de 60 µg/animal e uma dose de radioatividade de aproximadamente 3 µCi/animal.

Dentro de 5 minutos após a injeção lenta de bolus intratecal, os animais do Grupo 3 também receberam uma injeção intravenosa através de um cateter intravenoso na veia da cauda (3,33mL/kg), seguida por uma lavagem de solução salina de 0,6mL para entregar uma dose alvo de 1 mg/kg, com um nível 5 de radioatividade aproximado de 3 µCi/animal.

No dia 3 do estudo, foi administrado aos animais do 125 Grupo 2 o formulado I-hGALC por injeção intravenosa através de um cateter intravenoso na veia da cauda (3,33mL/kg), seguido por uma lavagem de solução salina de 0,6mL para entregar uma dose alvo de 1 mg/kg de animal, e uma dose de radioatividade de cerca de 3 µCi/animal.

O volume administrado foi baseado no peso corporal real mais recente de cada animal.

Os pesos das seringas 125 preenchidas com o formulado I-hGALC e esvaziadas após a entrega aos animais foram registrados.

A dose administrada a cada animal foi calculada baseada no peso líquido da formulação de dosagem expelida da seringa e da concentração de radioatividade medida na dose formulada.

Durante a dosagem, gazes estavam disponíveis para absorver quaisquer pequenas quantidades de refluxo da formulação da dose e a perda de artigo de teste foi representada pela contagem de cintilação líquida de acordo com um procedimento específico do projeto.

As seringas e cateteres intravenosos usados para a administração do artigo de teste formulado foram retidos.

Os cateteres intravenosos e porta de acesso/cateteres intratecal selecionados foram analisados quanto ao nível de radioatividade de acordo com um procedimento específico do projeto.

Coleta de Amostras

Sangue/Soro e Tecidos Uma amostra de sangue de terminal (volume máximo possível) foi coletada 10 minutos, 30 minutos e 1, 3, 6, 24, 48 e 96 h pós-dose, de 3 animais/ponto de tempo para os 5 Grupos 1 a 3. A administração intratecal precedeu a administração intravenosa no Grupo 3, e o tempo para a amostra de sangue terminal foi baseado no tempo de administração intravenosa.

As amostras de sangue terminais foram coletadas do terminal a partir da aorta abdominal de ratos (Grupos 1, 2 e 3, e 3 animais sobresselentes) sacrificados sob anestesia com isoflurano por exsanguinação da aorta abdominal.

Cerca de 3mL de sangue (Grupos 1, 2 e 3) foram transferidos para um tubo apropriado contendo EDTA K3, para fornecer amostras de sangue total e foram mantidos em gelo aguardando processamento.

Para os Grupos 2 e 3, e os animais sobressalentes, um adicional de 1,5mL de sangue foi transferido para tubos contendo citrato de sódio para a análise do tempo de protrombina (PTT), tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT) e fibrinogênio.

As amostras de sangue foram armazenadas em gelo, aguardando centrifugação a 2700 rpm e a 4°C durante 15 minutos.

As amostras de plasma foram armazenadas congeladas a cerca de 80°C, antes do transporte e da análise em um laboratório designado pelo Requerente.

O plasma dos animais sobressalentes serviu como amostras em branco para a análise de PTT, APTT e fibrinogênio.

Onde foi obtido volume de sangue insuficiente para realizar todas as análises (Grupos 1, 2 e 3), o sangue para a análise de radioatividade teve prioridade.

O sangue restante (Grupos 1, 2 e 3, e 3 animais sobresselentes) foram transferidos para tubos contendo ativador de coagulação para a produção de soro e deixou-se coagular, à temperatura ambiente, durante um período de aproximadamente 30 minutos antes da centrifugação.

As 5 amostras coletadas a partir dos animais sobressalentes foram usadas para avaliar a coagulação das amostras de sangue de animais não tratados.

Após a exsanguinação, os seguintes tecidos foram coletados a partir de 3 animais/ponto de tempo dos Grupos 1 a 3, conforme indicado: tecido adiposo (gordura renal), as glândulas adrenais, ossos (fêmur), cérebro, olhos, coração, rins, intestino grosso, teor de intestino grosso, fígado, pulmões, músculo (esquelético), nervo ciático, intestino delgado, teor do intestino delgado, medula espinhal (lombar, torácica, cervical), baço, estômago, teor do estômago, glândula tireoide/paratireoide, teor de bexiga urinária.

Após a coleta, os tecidos foram pesados e depois processados e analisados quanto à radioatividade total.

Todos os tecidos acima mencionados, bem como sangue terminal e soro, também foram coletados a partir de um animal sobressalente e foram usados para determinar os níveis de radioatividade natural.

As carcaças remanescentes foram mantidas congeladas (10°C a 20°C) no congelador designado, a fim de permitir a desintegração radioativa, antes de ser eliminado como um resíduo biológico.

A carcaça do primeiro animal em cada ponto de tempo dos Grupos 1 e 3 foi recuperada do congelador, descongelada e a porta de acesso e o cateter removidos, lavada com água e verificada quanto à radioatividade residual.

Líquido cefalorraquidiano Amostras de líquido cefalorraquidiano (CSF) foram coletadas de todos os animais em necropsia imediatamente antes da eutanásia.

Três animais/ponto de tempo dos Grupos 5 1-3 foram sacrificados 10 minutos, 30 minutos e 1, 3, 6, 24, 48 e 96 h pós-dose.

Uma amostra (volume máximo possível) de CSF foi removida através da cisterna magna, usando uma tabela estereotáxica foi necessária para manter a cabeça em alinhamento.

CSF foi transferido para um tubo liso e colocado em gelo.

Uma porção (cerca de 20mL) foi processada e analisada quanto ao teor de radioatividade total.

CSF foi também coletado a partir de um animal sobressalente e foi usado para determinar os níveis de radioatividade natural.

Determinação dos Níveis de Radioatividade Natural O sangue, soro e tecidos coletados a partir do animal sobressalente foram usados para a determinação dos níveis de radioatividade natural para o sangue, soro e tecidos de animais nos Grupos 1, 2 e 3. O CSF coletado a partir do animal sobressalente, foi usada para a determinação dos níveis de radioatividade natural para CSF.

Processamento de Amostras para Medições de Radioatividade Todas as amostras foram pesadas após a coleta, com exceção de sangue, plasma, soro e CSF.

Para todos os grupos, alíquotas duplas pesadas de 100µl de sangue total coletadas em EDTA K3 foram levadas para a análise da radioatividade.

A precipitação de proteínas por meio de ácido tricloroacético (TCA) de sangue total foi realizada como se segue: um volume equivalente de uma solução aquosa a 15% de TCA foi adicionado para duplicar alíquotas pesadas de 100µl de sangue total.

As amostras de sangue (100µl de sangue total + 100µl de TCA) foram agitadas em vórtex e depois centrifugadas a 4°C durante cerca de 15 minutos a 5 10000 rpm, e o sobrenadante foi decantado para um tubo separado.

Tanto o sobrenadante quanto o sedimentar foram analisados quanto ao teor de radioatividade.

O sangue para coleta de soro foi mantido à temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos, para permitir a coagulação, antes de ser centrifugado a 4°C a 2700 rpm (1250 rcf) durante cerca de 10 minutos para separar o soro.

As amostras de soro foram então mantidas em gelo aguardando separação de alíquotas para análise da radioatividade (alíquotas pesadas 2 x 100µl). Os glóbulos vermelhos concentrados (obtidos após a separação do soro) foram mantidos em gelo aguardando processamento para a análise de radioatividade.

O soro restante foi armazenado congelado (10°C a 20°C). Alíquotas pesadas de 100µl de sangue total e glóbulos vermelhos (obtidos após a separação do soro, misturaram com um volume igual de água desionizada (w/v) e homogeneizaram com um emulsificante Polytron) foram solubilizados em Soluene 350, descoloridos com peróxido de hidrogênio (30 % w/v), e misturados com fluido de cintilação de líquido para análise de radioatividade.

O sedimento precipitado de sangue de TCA foi solubilizado em hidróxido de tetraetilamônio a 35% (TEAH), descolorido com peróxido de hidrogênio (30% w/v), e misturado com fluido de cintilação líquida para medir a radioatividade.

Teores da bexiga urinária, sobrenadante de sangue de TCA, alíquotas pesadas duplicadas de formulações de dose (diluídas) e soro foram misturados diretamente com fluido de cintilação líquida para a medição de radioatividade.

Alíquotas pesadas duplicadas de CSF (cerca de 10µl/alíquota) foram solubilizadas em 35% TEAH antes da 5 mistura com o fluido de cintilação líquida para medir a radioatividade.

As amostras de tecido foram solubilizadas em toto TEAH em 35%. Alíquotas duplicadas foram então misturadas com o fluido de cintilação líquida, antes da medição da radioatividade.

Teores do intestino grosso foram homogeneizados em um volume conhecido de água.

Alíquotas pesadas duplicadas de teor de intestino grosso (LINC) homogeneizadas, teores estomacais (STC) e teores do intestino delgado (SINC) foram solubilizados em 35% TEAH e misturados com o fluido de cintilação líquida para medir a radioatividade.

Medidas de radioatividade Medições de radioatividade foram realizadas por espectroscopia de cintilação em meio líquido de acordo com Procedimentos Operacionais Padrão (POP). Cada amostra foi contada, durante 5 minutos, ou a um erro de sigma dois de 0,1%, o que ocorrer primeiro.

Todas as contagens foram convertidas a radioatividade absoluta (DPM) através de correção automática de atenuação com base no deslocamento do espectro para o padrão externo.

Os valores de DPM naturais apropriados foram subtraídos de todos os valores da amostra de DPM.

Seguindo subtração natural, as amostras que exibiram radioatividade inferior ou igual aos valores naturais foram consideradas como sendo zero para todas as manipulações subsequentes.

Análise de Dados Concentração de Radioatividade Todas as medições de radioatividade foram inseridas em um programa de computador de banco de dados padrão (Debra 5 Versão 5.2) para o cálculo das concentrações de radioatividade (dpm/g e massa eq/g) e porcentagem de radioatividade administrada em amostra.

Sangue, soro, tecidos e concentrações de CSF de radioatividade em dpm/g e de massa eq/g foram calculados com base na atividade medida específica (dpm/mg ou unidade de massa apropriada) do artigo de teste rotulado radioativamente nas soluções de dose.

A concentração de radioatividade nas amostras de sangue foi convertida em massa eq/mL com base na densidade do sangue de ratos.

Teor tecidual total foi calculado para os pesos dos órgãos totais.

Farmacocinética O perfil (PK) farmacocinético da radioatividade total em sangue, soro, CSF e tecidos foi caracterizado por análise não compartimental dos dados de concentração versus tempo, usando software de computador validado (WinNonlin, versão 3.2, Pharsight Corporation, Mountain View, Califórnia, EUA). Os modelos foram selecionados com base nas vias de administração intravenosa e extravascular.

Valores de concentração relatados como não detectáveis ou quantificáveis não foram estimados, pois foram tratados como amostras ausentes.

Dados de concentração foram obtidos a partir de diferentes animais em cada ponto de tempo, e os valores médios foram usados para gerar um perfil farmacocinético de compósito.

A amostragem de 10 minutos para o Grupo 1 (animais nº 1001, 1002, 1003) e no Grupo 2

(animais n° 2001, 2002, 2003), e de 48 horas para o grupo 1 (animais nº 1019, 1020) desviou mais de 10% ou 6 minutos do ponto de tempo nominal.

Este desvio do protocolo não afetou a validade do estudo ou os dados obtidos, uma vez que o 5 tempo médio foi calculado e usado nas análises farmacocinéticas.

A área abaixo da concentração de radioatividade versus curva de tempo (AUC) foi calculada pelo método trapezoidal linear (interpolação linear). Sempre que possível, a fase de eliminação terminal do perfil PK foi identificada com base na linha de melhor ajuste (R2), usando pelo menos os três valores de concentração observados finais.

A inclinação da fase de eliminação terminal foi calculada por regressão log linear usando os dados de concentração não ponderados.

Parâmetros que dependem da determinação de kel não foram relatados se o coeficiente de determinação (R2) foi menor que 0,8, ou se a extrapolação da AUC para o infinito representou mais de 20% da área total.

Resultados Análise das Formulações de dosagem (Tabela 8) Em cada dia de dosagem, alíquotas de cada uma das formulações foram analisadas por espectroscopia de cintilação em meio líquido, antes e após a administração da dose para todos os grupos, e a atividade específica do artigo de teste calculada a partir destas análises.

A concentração de radioatividade média total (± SD) na formulação para administração intratecal foi 345,4 ± 4,92 x 106 x 106 dpm/g (155,60 µCi/g) para o Grupo 1 e 334,4 x 106 ± 5,87 x 106 dpm/g (150,62 µCi/g) para o Grupo 3. A concentração de radioatividade média total da formulação para administração intravenosa foi de 4,4 x 106 ± 4,22 x 105 dpm/g (1,97 µCi/g) para o grupo 2 e 4,7 x 106 ± 2,31 x 105 dpm/g (2,11 µCi/g) para o Grupo 3. A atividade específica do artigo de teste na formulação intratecal foi 5 calculada como 51,16 µCi/mg para a dose de Grupo 1 e 49,53 µCi/mg para a dose de grupo 3. A atividade específica do artigo de teste na formulação intravenosa foi calculada como 6,53 µCi/mg para a dose de Grupo 2 e 6,99 µCi/mg para a dose de grupo 3. Tabela 8: Resumo dos Resultados da Concentração de Radioatividade nas Formulações de Dosagem por Espectroscopia de Cintilação Líquida

Pesos corporais dos animais e doses administradas (Tabela 9)

Os pesos corporais médios dos ratos dos Grupos 1, 2 e 3, no dia anterior à dosagem foram 405g (variação de 373g a 452 g), 410g (variação de 367g a 453g), e 395g (variação de 342g a 444g), respectivamente.

A dose média calculada de 125 5 I-hGALC administrada por via intratecal de animais do Grupo 1 foi de 41 ± 0,014 µg/animal, isto era equivalente a uma dose radioquímica de 2,12 ± 0,72 µCi/animal.

A dose 125 média de I-hGALC administrada por via intravenosa a animais do Grupo 2 foi de 1,00 ± 0,02 mg/kg (2,69 ± 0,14 125 µCi/animal). Para o Grupo 3, a dose média calculada de I- hGALC administrada por via intratecal e intravenosa foi de 1,08 ± 0,04 mg/kg (5,72 ± 0,31 µCi/animal). Tabela 9: Média de Pesos Corporais do Grupo e 125 Especificações da Dose de I-hGALC Administrada para Ratos Machos Sprague-Dawley

A dose média de produto químico e a dose média radioquímica administrada a ratos do Grupo 1 foram mais baixas (cerca de 32% e 29%, respectivamente) do que os níveis de dose-alvo e isto constituiu um desvio do protocolo.

Entretanto, uma vez que as doses reais administradas aos animais foram usadas em todos os cálculos, estes valores mais baixos foram considerados não afetar a validade do estudo ou os dados obtidos.

Observações Clínicas Nenhum sinal clínico relacionado ao tratamento foi observado em qualquer um dos ratos após a administração de 125 I-hGALC via intratecal de 60 µg/animal e/ou por via intravenosa de 1 mg/kg.

Avaliação de Coagulação 5 Nos pontos de tempo anteriores (10 minutos a 6 horas pós-dose), observou-se que o sangue coletado de animais tratados não coagulou totalmente dentro dos 30 minutos permitidos.

Entretanto, o sangue coletado de três ratos não tratados sobressalentes coagulado rapidamente, sugerindo alguma interferência do artigo de teste com o processo de coagulação.

Os tempos de coagulação menores ou maiores do que 30 minutos constituíram um desvio do protocolo.

Entretanto, os tempos de coagulação maiores foram necessários para algumas amostras, a fim de proporcionar algum soro para análise.

Uma revisão dos resultados obtidos não revelou qualquer correlação entre os valores de concentração obtidos no soro e a duração de tempo que o sangue levou para coagular.

Portanto, este tempo de coagulação prolongado ou encurtado não afetou a validade do estudo ou os dados obtidos.

Farmacocinética de Radioatividade Total no Sangue, Soro, Glóbulos Vermelhos, CSF e Tecidos Concentrações de Radioatividade Total no Sangue, Soro e Glóbulos Vermelhos (Tabela 10, Tabela 11, Tabela 12, Figuras 18-21) Concentrações médias de material rotulado radioativamente no soro de ratos machos após doses 125 intratecal e/ou intravenosa de I-hGALC são mostradas na Tabela 10. Concentrações médias de material rotulado radioativamente no sangue total e em glóbulos vermelhos são apresentadas na Tabela 11. Dados médios são apresentados graficamente na Figura 18. A porcentagem média de radioatividade recuperada no sobrenadante e sedimento de sangue após precipitação com TCA é apresentada na Tabela 5 12. Grupo 1 (Dose Média Intratecal de 41 µg/animal) Após a dosagem intratecal, a maior concentração média máxima (Cmax) de material rotulado radioativamente no soro e no sangue foi observada 3 horas após a dosagem (0,108 ± 0,026 µg eq/g e 0,093 ± 0,023 µg eq/g, respectivamente). Níveis de radioatividade no sangue permaneceram relativamente constantes entre 3 e 6 horas pós-dose enquanto os níveis de radioatividade no soro diminuíram ligeiramente.

Depois disso, as concentrações de radioatividade no soro e no sangue diminuíram e ficaram abaixo do limite de quantificação (LOQ) 48 horas pós-dose.

Para os glóbulos vermelhos, a Cmax foi observada a 6 horas pós-dose e foi 0,089 ± 0,024 µg eq/g.

Depois disso, as concentrações de radioatividade em glóbulos vermelhos diminuíram e foram inferiores ao LOQ 48 horas pós-dose.

As proporções médias de sangue para soro após a dose intratecal foram inferiores a 1 durante todo o período do estudo (variação de 0,7 a 0,9), indicando que o material rotulado radioativamente não foi particularmente associado aos glóbulos.

Os valores da proporção dos glóbulos vermelhos para soro (variando de 0,8 a 0,9) também confirmaram que a radioatividade não era substancialmente associada aos glóbulos.

A porcentagem da dose encontrada no sangue foi estimada, usando-se um padrão de sangue de peso/volume do corpo (isto é, 64,0mL/kg). À tmax (o momento em que a maior concentração de radioatividade ocorreu), cerca de 6% da dose administrada foi associada ao sangue.

Grupo 2 (Dose Média Intravenosa de 1,00 mg/kg) Após a administração intravenosa, a maior concentração 5 média máxima (Cmax) de material rotulado radioativamente no soro (14,864 ± 0,853 µg eq/g) e sangue (10,228 ± 0,447 µg eq/g) foram observadas 10 minutos após a dosagem (isto é, o primeiro ponte de tempo analisado). Depois disso, as concentrações de radioatividade no soro e sangue diminuíram lentamente, mas ainda eram detectáveis 96 horas pós-dose (soro: 0,088 ± 0,006 µg eq/g, 0,59% da Cmax; sangue: 0,051 ± 0,002 µg eq/g, 0,50% da Cmax), com a porcentagem estimada de doses no sangue diminuindo de 68,4% para 0,3%. Para os glóbulos vermelhos, uma Cmax de 5,136 ± 1,529 µg eq/g foi observada 10 minutos pós-dose.

Depois, as concentrações de radioatividade os glóbulos vermelhos estavam abaixo do LOQ 96 horas pós-dose.

A média das proporções de sangue para soro após a dose intravenosa foram inferiores a 1 durante todo o período de estudo (variação de 0,6 a 0,8), indicando que o material rotulado radioativamente não era particularmente associado com as células sanguíneas.

Os valores das proporções de glóbulos vermelhos para soro (variando de 0,4 a 0,6), também confirmaram que a radioatividade não era substancialmente associada aos glóbulos.

Grupo 3 (Dose Intratecal Seguida por Dose Intravenosa: 1,08 mg/kg (dose combinada) Após a dose intratecal (alvo de 60 µg/animal) e a dose intravenosa (1 mg/kg), a concentração média mais alta (Cmax) de material rotulado radioativamente no soro (14,675 ±

0,810 µg eq/g) e sangue (9,974 ± 0,558 µg eq/g) foi observada 10 minutos após a dosagem (isto é, o primeiro ponto de tempo analisado.

Depois disso, as concentrações de radioatividade no soro e no sangue diminuíram lentamente, 5 mas ainda eram detectáveis 96 horas pós-dose (soro: 0,077 ± 0,010 µg eq/g, 0,52% de Cmax; sangue: 0,037 ± 0,033 µg eq/g, 0,37% de Cmax), com a porcentagem extrapolada da dose no sangue diminuindo de 32,6% para 0,1%. Para os glóbulos vermelhos, uma Cmax de 6,113 ± 1,748 µg eq/g foi observada 10 minutos pós-dose.

A partir daí, as concentrações de radioatividade dos glóbulos vermelhos diminuíram e ficaram abaixo do limite de quantificação 96 horas pós-dose.

O material rotulado radioativamente não estava particularmente associado aos glóbulos, como mostrado pelas proporções médias de sangue para soro e glóbulos vermelhos para soro inferiores a 1 (entre 0,7 e 0,8 e 0,4 e 0,7, respectivamente). Tabela 10a - Concentração Média da Radioatividade no Soro do Grupo de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Dose 125 Intratecal Única de I-hGALC

Tabela 10b - Concentração Média de Radioatividade no Soro do Grupo de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma 125 Injeção de Bolus Intravenoso Única de I-hGALC

5

Tabela 10C - Concentração Média de Radioatividade no Soro do Grupo de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma 125 Injeção de Bolus Intravenoso e Intratecal Única de I- hGALC

Tabela 11 a - Concentração Média do Grupo e Teor de Radioatividade no Sangue e Proporções de Sangue para Soro de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Dose Intratecal 125 Única de I-hGALC 5

Tabela 11b - Concentração Média do Grupo e Teor de Radioatividade no Sangue e Proporções de Sangue para Soro de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Injeção de Bolus 125 Intravenoso Única de I-hGALC

Tabela 11-C - Concentração Média do Grupo e Teor de Radioatividade no Sangue e Proporções de Sangue para Soro de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Injeção de Bolus 125 Intravenoso e Dose Intratecal Única de I-hGALC 5

Tabela 11d - Concentração Média do Grupo e Teor de Radioatividade em Glóbulos Vermelhos e Proporções de Glóbulos Vermelhos para Soro de Ratos Sprague-Dawley Machos 125 após uma Dose Intratecal Única de I-hGALC

Tabela 11e - Concentração Média do Grupo e Teor de Radioatividade em Glóbulos Vermelhos e Proporções de Glóbulos Vermelhos para Soro de Ratos Sprague-Dawley Machos 125 após uma Injeção de Bolus Intravenoso Única de I-hGALC 5

Tabela 11f - Concentração Média do Grupo e Teor de Radioatividade em Glóbulos Vermelhos e Proporções de Glóbulos Vermelhos para Soro de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal e Injeção de Bolus 125 Intravenoso de I-hGALC

Tabela 12a – Radioatividade Percentual Média Recuperada em Sobrenadante e Sedimentação de Sangue de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Dose Intratecal Única 125 de I-hGALC 5

Tabela 12b - Radioatividade Percentual Média Recuperada em Sobrenadante e Sedimentação de Sangue de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Injeção de Bolus 125 Intravenoso Única de I-hGALC

Tabela 12c - Radioatividade Percentual Média Recuperada em Sobrenadante e Sedimentação de Sangue de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal 125 e Injeção de Bolus Intravenoso de I-hGALC 5

125 I Precipitável em Sangue Total (Tabela 12) Os valores médios para a recuperação de radioatividade no sedimento e sobrenadante após a precipitação no sangue total através de ácido tricloroacético (TCA) para os Grupos 1, 2 e 3 estão resumidos na Tabela 12. Quando usando uma solução aquosa a 15% de TCA para precipitar as proteínas no sangue total, a radioatividade foi recuperada principalmente no sedimento do sangue (variando de 100% a 67% no Grupo 1; 100% a 91% no Grupo 2; 100 % a 88% no Grupo 3), sugerindo que a maioria de atividade circulante foi 125 associada à proteína e, portanto, não refletora de iodo livre.

Concentração radioatividade em tecidos e líquido cefalorraquidiano (CSF)

(Tabela 13, Tabela 14, Tabela 15, Figuras 19 - 30) As concentrações médias de radioatividade nos tecidos e CSF de ratos, após uma única dose intratecal e/ou 125 intravenosa de I-hGALC são mostradas na Tabela 13. Os 5 dados médios são apresentados graficamente nas Figuras 19-

30. A média de proporções tecido para soro são apresentadas na Tabela 14 e a recuperação da dose administrada nos tecidos, CSF e teores da bexiga urinária e gastrintestinais são mostrados na Tabela 15. Tabela 13a - Concentração Média de Radioatividade em Tecidos, Líquido Cefalorraquidiano de Ratos Sprague-Dawley 125 machos após uma Única Dose Intratecal de I-hGALC

Tabela 13b – Concentração Média de Radioatividade em Tecidos, Líquido Cefalorraquidiano de Ratos Sprague-Dawley 125 Machos após uma Única Injeção de Bólus Intravenoso de I- hGALC 5

Tabela 13c – Concentração Média de Radioatividade em Tecidos, Líquido Cefalorraquidiano de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal e Única Injeção de 125 Bolus Intravenoso de I-hGALC

Tabela 14a – Tecido Médio do Grupo, Proporções de Líquido Cefalorraquidiano para Soro de Ratos Sprague-Dawley 125 Machos após uma Única Dose Intratecal de I-hGALC

Tabela 14b - Tecido Médio do Grupo, Proporções de Radioatividade de Soro para Líquido Cefalorraquidiano de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Injeção de Bólus 125 Intravenoso de I-hGALC

Tabela 14c - Tecido Médio do Grupo, Proporções de Radioatividade de Líquido Cefalorraquidiano para Soro de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal 125 e Injeção de Bólus Intravenoso de I-hGALC 5

Tabela 15a – Teor de Radioatividade Média do Grupo em Tecidos, Líquido Cefalorraquidiano, Trato Gastrointestinal e Teores de Bexiga Urinária de Ratos Sprague-Dawley Machos 125 após uma Única Dose Intratecal de I-hGALC

Tabela 15b - Teor de Radioatividade Média do Grupo em Tecidos, Líquido Cefalorraquidiano, Trato Gastrointestinal e Teores de Bexiga Urinária de Ratos Sprague-Dawley Machos 125 após uma Única Injeção de Bólus Intravenoso de I-hGALC

Tabela 15c – Teor de Radioatividade Média do Grupo em Tecidos, Líquido Cefalorraquidiano, Trato Gastrointestinal e Teores de Bexiga Urinária de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal e Injeção de Bólus 125 Intravenoso de I-hGALC

Grupo 1 (Dose Média Intratecal de 41 µg/animal) Após a dose intratecal, houve uma distribuição geral 125 de material rotulado I em todos os tecidos examinados, entretanto, os níveis de radioatividade no CSF foram inferiores1 ao LOQ.

As maiores concentrações médias de 125 material rotulado I em tecidos de ratos machos foram observadas 48 horas pós-dose na glândula tireoide/paratireoide (4,127 ± 1,635 µg eq/g) e 3 horas pós-dose no estômago (0,203 ± 0,101 µg eq/g), rins (0,096 ±

0,014 µg eq/g) e pulmões (0,058 ± 0,014 µg eq/g). Os níveis foram menores nos outros tecidos com valores tmax geralmente observados entre 3 e 6 horas pós-dose.

Os menores valores de Cmax foram observados no cérebro (0,005 ± 0,001 µg eq/g) 5 e gordura renal (0,006 ± 0,000 µg eq/g). 48 e 96 horas pós- dose os níveis de radioatividade na maioria dos tecidos ficaram abaixo do limite de detecção, sendo as exceções glândula tireoide/paratireoide, rins e estômago. 96 horas pós-dose, a concentração média máxima foi observada na glândula tireoide/paratireoide (1,927 ± 1,585 µg eq/g, 46,7% de Cmax) seguida pelos rins (0,005 ± 0,001 µg eq/g, 5,2% da Cmax) e estômago (0,002 ± 0,001 µg eq/g, 1% da Cmax). As proporções de tecidos para soro foram geralmente inferiores a 1 para os tecidos até 24 horas pós-dose intratecal.

As exceções foram a glândula tireoide/paratireoide, rins e estômago.

As maiores proporções foram, de longe, observados para a glândula tireoide/paratireoide. 48 e 96 horas pós-dose, as proporções de tecidos para soro não puderam ser calculadas porque as concentrações de soro eram inferiores ao LOQ.

Os níveis de radioatividade recuperada em todos os tecidos foram inferiores a 1% da dose administrada com maiores proporções observadas no fígado (0,91%) 3 horas pós-dose. 1 hora após a administração, proporções superiores a 1% da dose administrada foram encontrada apenas no teor do estômago (1,8%). 3 horas após a dosagem, as proporções superiores a 1% da dose administrada foram detectadas no teor do intestino delgado (2,6%), teor do estômago (5,0%) e teores da bexiga (1,2%). 6 horas após a dosagem, as proporções superiores a 1% da dose administrada foi encontrada no teor do intestino delgado (1,7%) e os teores do estômago (4,0%). 96 horas pós-dose, pequenas 125 quantidades de radioatividade derivada de I-hGALC (menos de 0,1%) foram ainda recuperadas nos rins, glândula 5 tireoide/paratireoide, estômago e teor da bexiga urinária, com as maiores recuperações observadas na glândula tireoide/paratireoide (0,09%). Grupo 2 (Dose Média Intravenosa de 1,00 mg/kg) Após a administração intravenosa, a maior concentração média máxima (Cmax) de material rotulado radioativamente nos tecidos dos ratos do Grupo 2 foi observada nas glândulas tireoide/paratireoide (294,521 ± 52,953 µg eq/g; 48 horas pós-dose), seguidas dos pulmões (20,629 ± 2,125 µg eq/g, 30 minutos pós-dose), fígado (11,335 ± 1,436 µg eq/g, 10 minutos após a administração), glândulas adrenais (8,827 ± 2,435 µg eq/g, 10 minutos pós-dose), baço (6,595 ± 0,625 µg eq/g, 10 minutos pós-dose) e rins (3,027 ± 0,330 µg eq/g, 10 minutos). Os valores de Tmax para os tecidos ocorreu entre 10 minutos e 3 horas pós-dose, exceto para as glândulas tireoide/paratireoide (48 horas pós-dose). Os menores valores de Cmax de radioatividade foram observados na gordura renal (0,158 ± 0,019 µg eq/g), CSF (0,210 ± 0,363 µg eq/g), cérebro (0,252 ± 0,041 µg eq/g), músculo esquelético (0,275 ± 0,025 µg eq/g) e medula espinhal (0,293 ± 0,028 µg eq/g). 96 horas após a dosagem, a radioatividade foi detectada ainda em 7 dos 18 tecidos analisados, com as maiores concentrações médias sendo detectadas nas glândulas tireoide/paratireoide (218,917 ± 45,098 µg eq/g, 74,3% de Cmax), seguidas pelo fígado (0,126 ± 0,014 µg eq/g, 1,1% da Cmax), baço (0,111 ± 0,009 µg eq/g,

1,7% da Cmax) e rins (0,099 ± 0,010 µg eq/g, 3,3% da Cmax). 10 minutos pós-dose, as proporções médias de tecido para soro foram inferiores a 1 para todos os tecidos analisados. 30 minutos e 1 hora pós-dose, a proporção média 5 de tecido para soro foi superior a 1 para pulmões e glândula tireoide/paratireoide. 3 e 6 horas pós-dose, a proporção média de tecido para soro foram superiores a 1 para o fígado, pulmões e glândula tireoide/ paratireoide. 24 e 48 horas pós-dose fígado, pulmões, baço e glândula tireoide/paratireoide continham proporções medias de tecido para soro acima de 1. 96 horas pós-dose, as proporções médias de tecido para soro foram superiores a 1 para os rins, fígado, baço e glândula tireoide/paratireoide.

As proporções maiores de tecido para soro foram observadas nas glândulas tireoide/paratireoide (2485 a 96 horas), pulmões (6,5 a 24 horas) e fígado (2,2 a 24 horas). Em termos de proporção da radioatividade administrada, os maiores valores médios em tecidos foram observados no fígado (41,7% a 10 minutos pós-dose), pulmões (7,0% a 30 minutos), rins (2,2% a 10 minutos), intestino delgado (1,5% a 1 hora) e glândulas tireoide/paratireoide (1,4% a 48 horas). Em teores do trato gastrointestinal, os maiores valores médios foram de 10,3% da dose em teores do estômago (3 horas pós-dose), 5,4% em teores do intestino delgado (3 horas pós-dose) e 1,1% em teores do intestino grosso (6 horas). 96 horas após a dosagem, as maiores proporções da dose administrada foram detectadas nas glândulas tireoide/paratireoide (1,0%), no fígado (0,5%) e rins (0,1%). Neste ponto de tempos pós-dose, menos de 0,01% da dose administrada permaneceu no estômago e teores da bexiga urinária.

Grupo 3 (Dose Intratecal Seguida por Dose Intravenosa: 1,08 mg/kg (Dose Combinada) Após a dose intratecal e a dose intravenosa, a 5 concentração máxima média (Cmax) de material rotulado radioativamente nos tecidos dos ratos do Grupo 3 foi observada nas glândulas tireoide/paratireoide (296,957 ± 57,793 µg eq/g; 24 horas pós-dose), seguidas pelo fígado (10,181 ± 0,600 µg eq/g, 10 minutos pós-dose), glândulas adrenais (9,567 ± 1.678µg eq/g, 10 minutos pós-dose), pulmões (5,305 ± 0,194 µg eq/g, 1 hora pós-dose), baço (5,042 ± 0,902 µg eq/g, 10 minutos pós-dose), estômago (4,454 ± 1,455 µg eq/g; 3 horas, pós-dose), rins (3,390 ± 0,183 µg eq/g; 1 hora) e CSF (2,087 ± 2.912µg eq/g, 10 minutos). Os valores de tmax para os tecidos ocorreram entre 10 minutos e 3 horas pós-dose, exceto para o intestino grosso (6 horas pós-dose) e glândulas tireoide/paratireoide (24 horas a pós a dose). Os menores valores de Cmax de radioatividade média foram observados na gordura renal (0,188 ± 0,020 µg eq/g), cérebro (0,283 ± 0,062 µg eq/g), medula espinhal (0,327 ± 0,062 µg eq/g) e músculo esquelético (0,411 ± 0,009 µg eq/g). 96 horas após a dosagem, a radioatividade ainda foi detectada, em 8 dos 18 tecidos analisados, as maiores concentrações médias sendo detectadas nas glândulas tireoide/paratireoide (43,962 ± 23,164 µg eq/g, 14,8% da Cmax), seguidas pelo fígado (0,137 ± 0,018 µg eq/g, 1,3% da Cmax), rins (0,124 ± 0,005 µg eq/g, 3,7% da Cmax), baço (0,083 ± 0,009 µg eq/g, 1,6% da Cmax) e glândulas adrenais (0,069 ± 0,016 µg eq/g, 0,7% da Cmax). 10 minutos pós-dose, as proporções médias de tecido para soro foram inferiores a 1 para todos os tecidos analisados. 30 minutos e 1 hora pós-dose, as proporções médias de tecido para soro foram superiores a 1 para glândula tireoide/paratireoide. 3 e 6 horas pós-dose, as 5 proporções médias de tecido para soro foram superiores a 1 para o estômago e glândula tireoide/paratireoide. 24 horas pós-dose, fígado e glândula tireoide/paratireoide continham proporções médias de tecido para soro acima de 1. 48 e 96 horas pós-dose, as proporções médias de tecido para soro foram superiores a 1 para rins, fígado e glândula tireoide/paratireoide e para o baço (96 horas). As maiores proporções de tecido para soro foram observadas em glândulas tireoide/paratireoide (854, 48 horas), no fígado (1,8 a 48 horas) e rins (1,6 a 96 horas). Em termos de proporção da radioatividade administrada, os maiores valores médios nos tecidos foram observados no fígado (19,0% a 10 minutos pós-dose), rins (1,2% 1 hora) e no intestino delgado (1,2 a 3 horas) . Em teores do trato gastrointestinal, os maiores valores médios foram de 8,8% da dose em teores do estômago (3 horas pós-dose), 4,3% em teores do intestino delgado (3 horas pós-dose) e 1,0% no teor do intestino grosso (6 horas). 96 horas após a dosagem, as maiores proporções da dose administrada foram detectadas no fígado (0,3%), na glândula tireoide/paratireoide (0,1%) e rins (0,05%). Neste ponto de tempo pós-dose, menos de 0,01% da dose administrada permaneceu nas glândulas adrenais, coração, pulmões, baço, estômago e teores da bexiga urinária.

Farmacocinética de Radioatividade no Sangue, Soro, Glóbulos Vermelhos, CSF e Tecidos

(Tabela 16 e Tabela 17) Parâmetros farmacocinéticos médios para a radioatividade no sangue, soro, glóbulos vermelhos, CSF e tecidos de ratos após uma única dose intratecal e/ou 125 5 intravenosa de I-hGALC são mostrados na Tabela 16 e na Tabela 17. Tabela 16: Cinética de Disposição da Radioatividade Total no Soro, Sangue e Glóbulos Vermelhos de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal de 125 I-hGALC

Tabela 16b: Cinética de Disposição da Radioatividade Total no Soro, Sangue e Glóbulos Vermelhos de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Injeção de Bólus 125 Intravenoso de I-hGALC

Tabela 16c: Cinética de Disposição da Radioatividade Total no Soro, Sangue e Glóbulos Vermelhos de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal e 125 Injeção de Bólus Intravenoso de I-hGALC

Tabela 17a: Cinética de Disposição da Radioatividade Total em Tecidos e Fluido Cefalorraquidiano de Ratos

Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal de 125 I-hGALC

5

Tabela 17b: Cinética de Disposição da Radioatividade Total em Tecidos e Fluido Cefalorraquidiano de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Injeção de Bólus 125 Intravenoso de I-hGALC

Tabela 17c: Cinética de Disposição da Radioatividade Total em Tecidos e Fluido Cefalorraquidiano de Ratos Sprague-Dawley Machos após uma Única Dose Intratecal e 125 Injeção de Bólus Intravenoso de I-hGALC 5

Sangue, Soro e Glóbulos Vermelhos Após a dose intratecal (Grupo 1: 41 µg/animal), as áreas calculadas médias sob a concentração de radioatividade versus curvas de tempo de tempo zero até o último ponto de tempo mensurável (AUC0-tlast) para soro, sangue total e glóbulos vermelhos foram 1,48 µg eq • h/g, 1,33 µg eq • h/g e 1,24 µg eq • h/g, respectivamente.

Os valores terminais t1/2 aparentes relatados para a radioatividade no soro, sangue total e glóbulos vermelhos foram 5,34, 5,02 e 4,08 horas, respectivamente.

A taxa de eliminação constante, k, foi calculada como 0,130 h-1, 0,138 h-1 e 0,170 h-1 no soro, sangue total e glóbulos vermelhos, respectivamente.

AUC0-inf foi calculado como 1,54 µg eq • h/g, 1,37 µg eq • h/g e 1,25 µg eq • h/g no soro, o sangue total e glóbulos vermelhos, respectivamente.

As fases de eliminação de radioatividade a partir de soro, sangue total e glóbulos vermelhos foram bem definidas, conforme evidenciado pelos percentuais muito baixos de valores de extrapolação (4,0, 3,2 e 1,4%, respectivamente), 5 necessários para o cálculo de AUC0-inf.

Após a dose intravenosa (Grupo 2: 1,00 mg/kg), os valores de AUC0-tlast médios para soro, sangue total e glóbulos vermelhos foram 71,1 µg eq • h/g, 51,2 µg eq • h/g e 33,9 µg eq • h/g, e os valores terminais t1/2 aparentes foram 30,7, 27,1 e 10,9 horas, respectivamente.

O valor de k foi calculado como 0,0226 h-1, 0,0256 h-1 e 0,0635 h-1 no soro, sangue total e glóbulos vermelhos, respectivamente.

As fases de eliminação de radioatividade a partir de soro, sangue total e glóbulos vermelhos foram bem definidas e AUC0-inf foi calculado como 75,0 µg eq • h/g (extrapolação de 5,21%), 53,2 µg eq • h/g (extrapolação de 3,75%) e 35,7 µg eq • h/g (extrapolação de 4,94%) em soro, sangue total e glóbulos vermelhos, respectivamente.

O volume aparente de distribuição (Vz) foi maior no sangue total (735mL/kg), seguido de soro (591mL/kg) e glóbulos vermelhos (441mL/kg). A depuração do artigo de teste foi estimada em 13,3 mL/h/ kg de soro e de 18,8mL/h/kg para sangue total.

Após a dose intratecal e a dose intravenosa (combinados 1,08 mg/kg) para os animais do grupo 3, os valores de AUC0-tlast médios para soro, sangue total e glóbulos vermelhos foram 89,8 µg eq • h/g, 66,9 µg eq • h/g e 49,2 µg eq • h/g, respectivamente.

Os valores terminais t1/2 aparentes relatados para a radioatividade no soro, sangue total e glóbulos vermelhos foram 25,5, 20,9 e 9,61 horas, respectivamente, com k como 0,0272 a h-1, 0,0332 h-1 e 0,0721 h-1. Novamente, as fases de eliminação de todas as três matrizes foram bem definidas, com AUC0-inf calculado como 92,6 µg eq • h/g, 68,0 µg eq • h/g e 51,0 µg eq • h/g (extrapolação de 3,06%, 1,64% e 3,69%) no soro, sangue 5 total e glóbulos vermelhos, respectivamente.

O Vz foi maior no sangue total (478mL/kg), seguido de soro (429mL/kg) e glóbulos vermelhos (293mL/kg). Os valores de depuração foram 15,9mL/h/kg de sangue total e 11,7mL/h/kg para soro.

Tecidos O valor mais alto AUC0-tlast em tecidos de ratos, após 125 uma dose intratecal de I-hGALC (Grupo 1: 41 µg/animal), foi observada na glândula tireoide/paratireoide (313 µg eq • h/g), seguido pelo estômago (2,60 µg eq • h/g) e os rins (1,84 µg eq • h/g). Para vários tecidos, não foi possível estimar k ou quaisquer parâmetros derivados de k (isto é, t1/2 e AUC0-inf) uma vez que a % de extrapolação da AUC para o infinito foi superior a 20%, ou devido à falta de dados na fase terminal . Para aqueles tecidos em que pode ser estimado (olhos, coração, rins, intestino grosso, pulmões, intestino delgado e estômago), k variou de 0,01 a 0.17 h-1 e o t1/2 geralmente variou de 4 a 6 horas, sendo as exceções 58,6 h para os rins e 39,1 h para o estômago.

Após a dose intravenosa (Grupo 2; 1,00 mg/kg), os valores mais elevados AUC0-tlast foram observados na glândula tireoide/paratireoide (24989 µg eq • h/g), seguido pelos pulmões (165 µg eq • h/g), fígado (100 µg eq • h/g), baço (56,1 µg eq • h/g), glândulas adrenais (43,1 µg eq • h/g) e rins (40,7 µg eq • h/g). Os menores valores de AUC0-tlast foram observados para gordura renal (0,617 µg eq • h/g) e cérebro (0,735 µg eq • h/g). Parâmetros derivados de k não foram relatados para tecidos onde a fase de eliminação foi mal definidas (glândula tireoide/paratireoide e CSF), ou onde a extrapolação para AUC0-inf foi superior a 20% (gordura renal e cérebro). Apenas os valores de AUC0-inf 5 para o fígado e pulmões foram maiores do que aqueles de soro (75 µg eq • h/g). O maior valor relatado AUC0-inf foi para os pulmões (167 µg eq • h/g; extrapolação 0,832%), seguido pelo fígado (105 µg eq • h/g; extrapolação 4,15%), baço (61,2 µg eq • h/g; extrapolação 8,33%), glândulas adrenais (46,8 µg eq • h/g; extrapolação 7,89%) e rins (46,7 µg eq • h/g; extrapolação 12,7%). O menor valor reportado para AUC0-inf foi calculado para medula espinhal (2.51µg eq • h/g; extrapolação% 4,87), seguido do músculo (2,69 µg eq • h/g; extrapolação 1,93%) e dos olhos (5.64µg eq • h/g; extrapolação 5,19%). O maior t1/2 calculável nos tecidos foi de 41,6 horas para os rins, seguidos por 34,6 horas para as glândulas adrenais e 31,8 horas para o baço.

O menor t1/2 relatado foi de 4,18 horas para nervo ciático.

Para o Grupo 3, após uma dose intratecal e uma dose intravenosa (1,08 µg/kg dose, combinado), os maiores valores de AUC0-tlast foram observados na glândula tireoide/paratireoide (16776 µg eq • h/g) seguido de fígado (96,5µg eq • h/g), estômago (72,1 µg eq • h/g), rins (57,9 µg eq • h/g), baço (46,9 µg eq • h/g), pulmões (44,1 µg eq • h/g) e glândulas adrenais (43,9 µg eq • h/g). Os menores valores de AUC0-tlast foram observados para gordura renal (0,954 µg eq • h/g) e cérebro (1,03 µg eq • h/g). Parâmetros derivados de k não foram reportadas para tecidos onde a extrapolação para AUC0-inf foi superior a 20%

(gordura renal e cérebro) ou R2 inferior a 0,8 (CSF). Apenas os valores de AUC0-inf para glândula tireoide/paratireoide e fígado foram maiores do que aqueles de soro (92,6 µg eq • h/g). O maior valor de AUC0-inf 5 relatado foi para glândula tireoide/paratireoide (18.390 µg eq • h/g; extrapolação 8,78%), seguido por fígado (102 µg eq • h/g; extrapolação 5,0%), estômago (72,6 µg eq • h/g; extrapolação 0,766%), rins (64,4 µg eq • h/g; extrapolação 10,1%), baço (49,3 µg eq • h/g; extrapolação 4,85%), glândulas adrenais (45,8 µg eq • h/g; extrapolação 4,25%) e pulmões (45,4 µg eq • h/g; extrapolação 2,88%). O valor mais baixo relatado para valor de AUC0-inf foi calculado para medula espinhal (3,77 µg eq • h/g; extrapolação 6,55%), seguido de músculo (4,66 µg eq • h/g; extrapolação 6,25%). O t1/2 mais longo calculável em tecidos foi de 36,4 horas para rins, seguido de 27,5 horas para pulmões, 25,7 horas para fígado e 25,4 horas para glândula tireoide/paratireoide.

O menor t1/2 relatado foi 4,71 horas para o nervo ciático.

Discussão Após a administração por via intratecal, as maiores concentrações médias de radioatividade no soro e sangue total foram observadas às 3 horas pós-dose, sugerindo distribuição relativamente rápida dos materiais relacionados com a dose para a circulação sistêmica.

Após a administração intravenosa, as maiores concentrações médias de radioatividade no soro e sangue total foram observadas no primeira ponto de tempo medido.

As concentrações no soro foram sempre superiores às existentes no sangue total, tal como refletido nas proporções de sangue para soro inferiores a 1. Isto indicou que o material relacionado à dose não estava particularmente associado às células sanguíneas de quaisquer grupos a qualquer tempo após a dose. Seguindo TCA precipitado de proteínas sanguíneas, a 5 radioatividade foi recuperada principalmente na sedimentação sugerindo que a maioria da radioatividade circulante era associada à proteína, indicando que a distribuição de radioatividade observada não foi amplamente 125 reflexiva da disposição de iodo livre. Quando se compara o Grupo 2 (dose intravenosa 1,00 mg/kg) ao Grupo 3 (dose intratecal e intravenosa combinada de 1,08 mg/kg), as concentrações no soro e sangue total do Grupo 3 parecem ser geralmente similares àquelas do Grupo

2. A diminuição de radioatividade em ambas as matrizes para ambos os grupos também foi muito similiar, tal como avaliado pelas proporções de sangue soro. Comparações de AUC0-tlast e AUC0-inf para o soro e sangue do Grupo 2 e do Grupo 3 indicaram que exposição a material relacionado à dose foi ligeiramente maior para animais do Grupo 3. No grupo 1, os níveis de radioatividade no CSF eram muito baixos, uma descoberta que não parece estar de acordo com a administração do artigo de teste diretamente para o espaço intratecal, embora níveis muito baixos foram observados no cérebro. Entretanto, a radioatividade foi observada na circulação sistêmica e em tecidos sistêmicos, pouco tempo após a dosagem, sugerindo que o material relacionado à dose foi distribuído bem rapidamente desde o espaço intratecal seguinte. Níveis mais elevados no estômago e no teor intestinal sugeriram que o material relacionado à dose foi excretado pelas fezes, embora a medição direta da excreção não tenha sido realizada neste estudo.

Além disso, os níveis elevados nos teores da bexiga urinária também sugerem excreção através da urina.

Exceto níveis elevados nas glândulas tireoide/paratireoide, 5 consideradas por refletir a perda do rótulo de iodo e persistência do rótulo neste tecido em vez de distribuição/persistência do artigo de teste propriamente dito, níveis elevados de radioatividade foram observados no fígado, pulmões, glândulas adrenais, baço e rins, tecidos que provavelmente seriam envolvidos no metabolismo e/ou excreção do artigo de teste.

A distribuição de radioatividade foi geral e difundida pelo primeiro ponto de tempo após a dose nos grupos 2 e 3. As maiores concentrações foram geralmente associadas ao fígado, pulmões, rins, baço, glândulas adrenais e, em particular, às glândulas da tireoide/paratireoide.

Assim, o padrão de distribuição de radioatividade em tecidos de todos os três grupos foi muito semelhante.

Novamente, níveis elevados de radioatividade observados nas glândulas tireoide/paratireoide de todos os animais, em particular, considerando o aumento da concentração rotulada com o aumento do tempo após a dose, provavelmente indicou a perda do rótulo de iodo e persistência do rótulo, neste tecido, em vez de distribuição/persistência do artigo de teste em si.

Níveis de CSF foram maiores nestes grupos, em comparação com o Grupo 1, a pontos de tempo iniciais após a dose, sugerindo que o material rotulado radioativamente foi capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica.

Níveis ligeiramente mais elevados foram observados nessa matriz no Grupo 3, em comparação com o grupo 2, novamente a tempos iniciais após a dose, sugerindo que esta concentração era representada pela material relacionado ao artigo de teste que se distribui a partir da dose intravenosa e material diretamente injetado no espaço intratecal.

Os valores 5 abaixo de LOQ observados para o grupo 1 podem, portanto, ser uma consequência de concentrações muito baixas em volumes de amostras muito pequenas, sendo abaixo da quantificação possível por este método analítico.

As proporções de tecido para soro foram geralmente inferiores a 1, na maioria dos tecidos de todos os grupos 96 horas pós-dose, indicando que o material relacionado à dose foi distribuído para os tecidos e foi em geral limpo mais facilmente dos tecidos do que do soro.

Para todos os grupos, a exposição da maioria dos tecidos ao material relacionado à dose (tal como avaliado por AUC0-tlast) foi inferior àquela do soro.

Conclusão Após a administração de uma única dose intratecal (60 125 µg nominal/animal) e/ou de bolus intravenoso de I hGALC a ratos machos (concentrações nominais de 1 mg/kg), as concentrações de radioatividade no sangue, soro, glóbulos vermelhos, CSF e tecidos foram determinadas.

As concentrações mais elevadas de radioatividade observadas tanto no soro quanto no sangue total ocorreram 3 horas pós-dose seguindo a administração intratecal, indicando distribuição relativamente rápida para a circulação sistêmica, ou na primeira vez após a dose ponto (10 minutos), após administração intravenosa.

As concentrações no soro foram maiores do que no sangue, indicando que o material relacionado ao artigo de teste não foi particularmente associado às células sanguíneas.

A distribuição de radioatividade nos tecidos foi geral e difundida através de pontos de tempo iniciais após a dose e, em geral, o padrão de distribuição para tecidos foi 5 similar entre os três grupos.

Para todos os grupos, a exposição da maioria dos tecidos ao material relacionado à dose (tal como avaliado por AUC0-tlast) foi inferior àquela do soro.

Concentrações elevadas nas glândulas tireoide/paratireoide para todos os três grupos foram consideradas como indicadoras da perda do rótulo de iodo em vez de distribuição e persistência de material relacionado à dose neste tecido. 96 horas pós-dose intravenosa, a radioatividade ainda foi detectada em alguns dos tecidos examinados.

EXEMPLO 3: ESTUDO PRÉ-CLÍNICO DE ICV E INJEÇÃO DE ICV/IP RMGALC E SOBREVIDA ESTENDIDA EM CAMUNDONGOS TWITCHER O presente Exemplo demonstra uma modalidade de um estudo pré-clínico que ilustra sobrevida prolongada em camundongos twitcher providos semanalmente com injecções IP de rmGALC.

Na presente modalidade, a mielinização melhorada foi observada no nervo ciático, em conjunto com níveis reduzidos de psicosina e melhoria de função motora grosseira (isto é, a marcha). Em algumas modalidades, os camundongos twitcher tratados com uma única injeção ICV ou ICV/IP de rmGALC exibiram aumento de sobrevida e uma redução de até 63% nos níveis de psicosina cerebral.

Os resultados positivos em pontos extremos importantes (por exemplo, sobrevida, níveis de psicosina cerebral) após uma única administração ICV de rmGALC, juntamente com a melhoria mínima nestes pontos extremos após a adição de administração sistêmica (ICV/IP) sugerem que um regime único de CNS é uma opção clínica viável para o tratamento de GLD.

Introdução 5 Leucodistrofia Celular Globoide (GLD) é um distúrbio de depósito lisossômico autossômico recessivo que ocorre com uma incidência de cerca de 1:100.000 nascimentos (1.9:100. 000 nascimentos em países escandinavos). Um distúrbio do sistema nervoso periférico (PNS) e central (CNS) progressivo, a GLD é o resultado de mutações genéticas que fazem com que uma deficiência na atividade enzimática de galactocerebrosidase (GALC) degrade lípidos de substrato [isto é, galactosilceramida para galactose e ceramida; galactosilesfingosina (psicosina) para galactose e esfingosina]. Este distúrbio é caracterizado por uma perda completa de oligodendrócitos e mielina, bem como a presença de macrófagos de galactosilceramida (células "Globoides"). As características clínicas da doença se apresentam em duas formas: infantil e de início tardio.

A forma infantil da GLD (também conhecida como doença de Krabbe) ocorre em 90% de todos os pacientes diagnosticados com deficiência de GALC, e os sintomas são geralmente observados dentro de 3-6 meses após o nascimento; há relatos de sintomas que se manifestam mais cedo, como 2-3 semanas de idade (Wenger, D.A. et al., 2001, Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R.

Scriver, Beaudet, A.

L., Sly, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687; aqui incorporados como referência). A variante de início tardio desta doença geralmente apresenta-se clinicamente aos 10 anos de idade, entretanto, pacientes diagnosticados aos 40 anos de idade têm sido relatados (Wenger, D.A. et al., 2001, 5 Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R.

Scriver, Beaudet, A.

L., Sly, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687; aqui incorporados como referência). O declínio da função em pacientes de início tardio procede gradualmente ao longo de um período de vários anos.

A terapia de substituição enzimática sistêmica (ERT) proporcionou benefícios para os pacientes que sofrem de distúrbios de armazenamento lisossomal (LSDs), tais como a doença de Gaucher, doença de Fabry e síndrome de Hunter (Wenger, D.A. et al., 2001, Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R.

Scriver, Beaudet, A.

L., Sly, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687; Neufeld, E.F., 2004, Enzyme Replacement therapy.

Lysosomal disorders of the Brain, ed.

F.M.a.W.

Platt, S.V. 2004: Oxford University Press. 327-338; Desnick, R.J., 2004. J.

Inherit.

Metab.

Dis., 27(3): p. 385-410; todos os quais são aqui incorporados como referência). ERT para GLD não foi perseguido com rigor, talvez porque a doença afeta ambos o PNS e o CNS.

Os tratamentos atuais para doentes com GLD incluem transplante de células hematopoiéticas (HCT), entretanto, este procedimento tem suas limitações devido a eventos adversos significativos (isto é, 30% de mortalidade relacionada ao tratamento, terapia imunossupressora ao longo da vida) e eficácia apenas em doentes pré- sintomáticos.

O camundongo twitcher é o modelo animal experimental 5 mais comum usado para estudar GLD, e constitui a maior parte do trabalho experimental sobre esta doença (Wenger, D.A., 2000, Mol.

Med.

Today, 6(11): p. 449-451; aqui incorporada como referência), mas outros modelos de GLD de animais que ocorrem naturalmente existem com graus variáveis de caracterização.

A mutação espontânea existe em West Highland White/Cairn Terriers (Kobayashi T., et al., 1980, Brain Res., 202:479-83, aqui incorporado como referência), ovelhas Polled Dorset (Pritchard D., et al., 1980, Vet.

Pathol., 17:399-405), o gato doméstico (Johnson K., 1970, J.

Am.

Vet.

Med.

Assoc., 157:2057-64; aqui incorporado como referência), e primatas não humanos Rhesus macaque (Baskin G., et al., 1998, Lab Anim.

Sci., 48:476- 82; aqui incorporado como referência). Os estudos iniciais de aloenxerto de nervo demonstraram que a capacidade de melhorar a função do nervo periférico de células de Schwann de camundongo twitcher foi mediada pela substituição de enzimas em células de aloenxerto twitcher in situ e que a recuperação a longo prazo de células mielínicas periféricas twitcher lesadas era possível.

Esta tecnologia, entretanto, não pode ser generalizada como uma terapia global do camundongo twitcher (Baskin G., et al., 1998, Lab Anim.

Sci., 48:476-82; aqui incorporado como referência). Em camundongos afetados, HCT demonstrou uma melhoria significativa no tempo de vida e ganho de peso dos animais afetados, contudo a eficácia variável é observada com a viabilidade documentada entre 44 dias até mais de 100 dias (em camundongos que receberam condicionamento mieloredutor) (Lin, D., et al., 2007, Mol.

Ther., 15(1): p. 44-52; Hoogerbrugge, P.M., et al., 1998, 5 J.

Clin.

Invest., 81(6): p. 1790-4; ambos aqui incorporados como referência). O tempo de vida normal de camundongos não tratados nestas investigações foi de aproximadamente 40 dias.

Nestes e em outros estudos, nem a taxa de remielinização nem patologia cerebral existente foi melhorada nos camundongos tratados versus controles não tratados (Yeager A., et al., 1984, Science, 225:1052-4; Toyoshima, E., et al., 1986, J.

Neurol.

Sci., 74(2-3), p. 307-18; ambos aqui incorporados como referência). A inibição pelo substrato tendo como alvo a síntese de esfingosina usando L-ciclo-serina, por si só ou em combinação com HCT, aumenta a duração de vida do camundongo twitcher (LeVine S., et al., 2000, J.

Neurosci.

Res., 60:231-6; Biswas S., et al., 2003, Neurosci.

Lett., p347:33-6; ambos aqui incorporados como referência). L- ciclo-serina é demasiado tóxico para uso humano, ao contrário do seu enantiômero D-cicloserina, indicado para o tratamento da ansiedade.

Experimentos de terapia genética têm demonstrado a capacidade de gerar enzima em células transfectadas e melhorar o tempo de vida em camundongos twitcher, quer em monoterapia ou em combinação com HCT (L Lin, D., et al., 2007, Mol.

Ther., 15(1): p. 44-52; aqui incorporado como referência). Redução do substrato, HCT, e terapia gênica fornecem todos a eficácia mais significativa quando usados em animais pré-sintomáticos, com nenhum impacto ou com impacto limitado em doenças em animais sintomáticos. Portanto, ERT pode prover uma opção viável para o tratamento de GLD, especialmente quando administrado a pacientes pré-sintomáticos. 5 Resultados A terapia de substituição de enzima administrada sistemicamente usando um derivado HEK 293 GALC murino (rmGALC, 5 mg/kg), fornecido perifericamente como múltiplas injeções intraperitoneals (IP) melhorou o tempo de vida dos camundongos twitcher e diminuiu o acúmulo de psicosina em 15% quando comparado com animais tratados com veículo (Tabela 18, Figura 31). Tabela 18: Administração IP de rmGALC melhora a sobrevida em camundongos twitcher Sobrevida (dias) Análise Mann- Grupo de Whitney (vs. Dose Variação Média veículo) Min Max Não

42.6 39 45 0.49 tratados Veículo 43.2 37 48 n/a 1 mg/kg 43.0 40 46 0.61 5 mg/kg 48.9 46 54 0.0003 10 mg/kg 49.2 47 54 0.0003 Os camundongos tratados IP com rmGALC tiveram melhor desempenho em testes de marcha, e a histopatologia do nervo ciático foi melhorada em comparação com animais não tratados ou tratados com veículo. RmGALC administrado (IP)

perifericamente foi minimamente entregue ao cérebro resultando em uma ligeira diminuição da psicosina cerebral.

Entretanto, não parecia haver nenhuma alteração na histopatologia cerebral.

Portanto, os resultados observados 5 em camundongos twitcher tratados com administração (IP) sistêmica semanalmente repetida de rmGALC (5 mg/kg) resultou em um benefício de sobrevida, uma ligeira diminuição nos níveis de psicosina cerebral, e uma melhoria na função motora grosseira.

ICV única e ICV/IP combinada de rmGALC em camundongos twitcher Os resultados indicam que o grupo de tratamento ICV/IP de alta dose sobreviveu em média 50 dias (120 mg/5 mpk), com os animais tratados com veículo sobrevivendo apenas 36 dias (Figura 32). Os camundongos tratados com ICV de rmGALC mostrou apenas um tempo médio de sobrevida em resposta à dose de 42 dias (40 µg) e 48 dias (120 mg). Uma única injeção ICV de 120 µg reduziu o nível de psicosina cerebral (63%), enquanto uma única injeção ICV de 40 µg de rmGALC resultou em um decréscimo de 39% na psicosina (Figura 33). Embora a administração ICV/IP não tenha provido qualquer benefício adicional de redução de psicosina em comparação com ICV sozinho, uma redução observada de 48% nos níveis de psicosina observados com o regime combinado foi significativamente mais baixa do que aquela observada com tratamentos IP semanais isoladamente (15%). Além disso, uma melhoria da histologia cerebral em locais distais ao local de injeção foi observada com os tratamentos ICV ao nível de 40 µg (Figura 34). Estes resultados confirmaram a atividade e biodistribuição no cérebro de rmGALC após injeção ICV direta.

Entretanto, camundongos tratados com ICV rmGALC só não conseguiram demonstrar a restauração da morfologia ou mielinização da fibra do nervo ciático e apenas ligeiras melhorias na função motora grossa (por exemplo, análise de 5 marcha). A melhoria significativa em pontos extremos-chave (isto é, sobrevida, níveis de psicosina cerebral) após uma administração ICV única de rmGALC sugere uma falta de concentração de enzima suficiente para a circulação sistêmica.

Parâmetros de Dosagem Clínica: Taxa de Reacúmulo de Psicosina em Ratos twitcher Os seguintes estudos foram realizados no modelo de camundongo twitcher em um esforço para definir um intervalo de dose clínica apropriado: - Taxa de re-acúmulo de psicosina cerebral em camundongos twitcher após uma única injeção ICV a PND19. - Estudos para determinar a dose usando injeções intracerebroventricular (ICV) + intraperitoneal (IP) combinadas de rmGALC em camundongos twitcher.

A fim de avaliar a taxa de reacúmulo de psicosina no sistema nervoso central, os camundongos twitcher foram tratados com uma única injeção ICV de 12 µg ou 40 µg de rmGALC a PND19. Grupos de camundongos (n = 3) foram sacrificados 24 horas após a injeção (PND20) e depois, a cada três dias, subsequentemente.

O tecido cerebral foi removido e submetido à análise psicosina, histopatologia e análise de atividade enzimática.

Um subconjunto de animais foi monitorado para a verificar a sobrevida (n = 8), e a função motora (análise de marcha) foi analisada a PND 40. Os níveis de psicosina em homogenato cerebral após uma única injeção ICV foram analisados através de espectrometria de massa (LCMS Ltd., Carolina do Norte), e sugerem uma diminuição rápida na psicosina dentro de 24 horas da administração de rmGALC (Figura 35). A tendência 5 de redução de psicosina foi mantida por um período de 24 dias após a administração enzimática.

Além disso, a diminuição na concentração de psicosina apareceu dependente da dose durante esse período, em comparação com animais tratados com veículo: tratado com veículo (média: 4,5 ng/mL de psicosina) versus 12 µg de rmGALC (média: 2,5 µg/mL de psicosina) versus 40 µg/mL de rmGALC (média: 1,6 ng/mL de psicosina). De interesse, os níveis crescentes de psicosina observados em ambos os grupos de dose no fim do estudo (dias 28-32 pós-tratamento) sugerem que ERT pode não ser bem sucedida se for administrada mensalmente.

Um esquema de dosagem mais frequente pode ser necessários.

Devido ao pequeno número de animais em cada ponto de tempo de amostragem, a variabilidade dos resultados foi evidente.

Entretanto, com base nestes resultados, é evidente que o reacúmulo de psicosina ocorre aproximadamente em um cronograma de 4 semanas (28 dia). Quando o tempo de sobrevida foi analisado, os resultados indicaram que ambos os grupos de tratamento de 12 µg/mL e 40 ng/mL de rmGALC tiveram uma média de sobrevida de 48 dias (12 µg/mL) e 50,5 dias (40 µg/mL) com animais tratados com veículo sobrevivendo de 40 dias (Figura 36). Inesperadamente, os camundongos tratados com 40 µg de GALC humano (rhGALC) mostrou um benefício de sobrevida de apenas 42 dias, em comparação com os animais tratados com veículo sobrevivendo 40 dias.

A(s) razão(ões)

para esta eficácia reduzida com rhGALC não é conhecida, mas será discutido em uma seção posterior.

Entretanto, a partir dos resultados deste estudo, é aparente que, mesmo doses menores de rmGALC são eficazes para mostrar um benefício de 5 sobrevida no modelo do camundongo twitcher.

Parâmetros de dosagem clínica: estudo de variação de dose de rmGALC e rhGALC em camundongos twitcher Os resultados anteriores indicaram que os ratos twitcher tratados com ICV/IP de rmGALC (120 µg e 5 mpk) viveram 14 dias mais do que animais tratados com veículo.

Entretanto, os camundongos twitcher tratados apenas com injecções diretas no CNS mostraram uma melhoria de resposta à dose em sobrevida média de 12 dias (120 µg ICV) e 6 dias (40 µg ICV). Uma dose de 120 µg no cérebro murino se traduz em uma dose de 300 mg/kg de cérebro em pacientes; era, portanto, importante investigar a eficácia de doses mais baixas de rmGALC.

Além disso, o lote inicial de rhGALC foi examinado quanto à eficácia nos camundongos twitcher.

Grupos de camundongos foram tratados com injecções IP semanais (5 mg/kg) de rmGALC iniciando em PND 10, mais uma única injeção ICV tanto de 12 µg (30 mg/kg de peso cerebral) quanto de 26 µg (60 mg/kg de peso cerebral) de rmGALC ou rhGALC em PND19. No PND39, um subconjunto de camundongos (n = 3/grupo) foi sacrificado para a coleta de tecidos (cérebro, nervo ciático, fígado, soros). Tecido cerebral foi submetido à análise de psicosina, histopatologia e quantificação da atividade enzimática.

Os animais restantes (n = 8) foram monitorados quanto à sobrevida e análise da marcha.

Discussão

Os resultados deste estudo de determinação da dose mostram um benefício de sobrevida para a administração de rmGALC com uma tendência para a dependência da dose (Figura 37). As doses de combinação 12µg/5 mpk e 26µg/5 mpk de 5 rmGALC estenderam o tempo de vida médio do camundongo twitcher para 44,5 e 45,5 dias, respectivamente, em comparação com 40,5 dias para os animais tratados com veículo.

Não houve benefício de sobrevida para as doses de 12µg/5 mpk (38 dias) e 26µg/5 mpk (39,5 dias) de rhGALC.

A dose de 26µg/5 mpk derhGALC estendeu o tempo de vida dos camundongos twitcher afetados em 1,5 dias, entretanto nenhuma dose de rhGALC atingiu os dias de sobrevida para os animais tratados com veículo (Figura 37). Tal como observado anteriormente com os animais tratados sistemicamente (IP) com rmGALC, uma melhoria na análise da marcha foi observada para todos os animais que receberam a administração ICV/IP combinada de rmGALC, enquanto que os animais tratados com uma única injeção ICV mostraram menos benefício na função motora (Figura 38). Tal como observado para o benefício de tempo de vida, nenhum benefício na análise da marcha foi observado em camundongos tratados com rhGALC.

Entretanto, a atividade específica de rhGALC foi determinada como sendo aproximadamente 33% da atividade in vitro de rmGALC (Tabela 19). Portanto, estes resultados atuais sugerem que mesmo em doses menores de rmGALC, há um benefício em ambas a sobrevida e função motora e reforça a oportunidade para da ERT para o tratamento de GLD.

É evidente que o reacúmulo de psicosina ocorre aproximadamente em um cronograma de 4 semanas (28 dia). Tabela 19: rmGALC e atividade rhGALC

Atividade média % Lote (µmol/h/mg) rmGALC rmGALC R5 (3.44 154.48 ± 87.5 n/a mg/mL) Lote 73 rhGALC

51.35 ± 16.2 33 (8.74 mg/mL) A antigenicidade de rmGALC e rhGALC é esperada, já que o camundongo twitcher é um modelo nulo [isto é, eles negativos ao material imunológico de reação cruzada (CRIM)]. No geral, o título de anticorpo de soro máximo em 5 camundongos tratados com rhGALC (regime ICV/IP) foi significativamente superior àquele dos camundongos tratados com um regime comparável de ICV/IP de rmGALC (Figura 39). Embora os anticorpos também estivessem presentes nos camundongos tratados com injecções diretas no CNS, o título máximo foi várias vezes inferior ao dos animais recebendo tratamento ICV/IP. Existe a possibilidade de que anticorpos neutralizantes possam ter sido gerados. Um estudo com caninos deficientes de GALC foi iniciado para caracterizar a antigenicidade de rhGALC. Neste estudo, os animais afetados (6 semanas após o nascimento) foram tratados com administração IT de 2 mg/kg semanalmente IV e/ou 2,25 mg (30 mg/kg de peso cerebral) de GALC humano ou do veículo sozinho. Tratamentos adicionais foram administrados a oito semanas e mensalmente até ao final do estudo (até ~ 16 semanas após o nascimento). CSF foi removido antes da eutanásia e analisado quanto à formação de anticorpos e níveis de psicosina (Figura 40). Os estudos anteriores com o recombinante humano de heparina N-sulfatase no modelo de cão de Huntaway de 5 MPSIIIA demonstraram uma resposta de anticorpo marcada à enzima exógena, resultando na necessidade de tolerização dos animais em estudo. Entretanto, os resultados preliminares que examinaram CSF a partir de cães sem tratamento prévio e tratados com rhGALC- mostraram uma redução aparente nos níveis de psicosina em comparação com os controles não tratados (Figura 40). EXEMPLO 4: CÉREBRO E HISTOLOGIA HEPÁTICA/ROTULAGEM DE

GALC INJETADO IT EM CAMUNDONGOS O presente Exemplo descreve uma modalidade de hGalC injetado IT e mGalC nos camundongos e a detecção e localização correspondente de anticorpo GalC em vários tecidos. Desenho Experimental

Coleta de tecidos e coloração histológica Houve apenas três animais disponíveis para análise histológica do Grupo B e C, respectivamente. As amostras cerebrais e fígado foram fixas em 10% de formalina 5 tamponada neutra para inclusão em parafina subsequente. Cinco seções de parafina µm foram preparadas para imuno- histoquímica (IHQ) de I2S para detectar proteínas injetadas. Três anticorpos anti-GalC foram usados para a coloração de IHC GalCA.

1. Anticorpo monoclonal de camundongo (gerado pelo laboratório do Dr. Eckman)

2. Anticorpo policlonal de coelho (gerado por Grupo 1)

3. Anticorpo policlonal de coelho (gerado por Grupo 2) Um método altamente sensível de amplificação elevada de fluorescência de ABC + tiramida de foi usado para marcar a proteína alvo. Os resultados de coloração mostraram células GalC positivas como verde, com núcleos como contracorante azul DAPI, e áreas de fundo como preto. Resultados O anticorpo policlonal do grupo 1 teve uma forte reação cruzada com proteínas endógenas no cérebro do camundongo. Mesmo em cérebros de controle de veículo, todas as células do CNS foram coradas fortemente positivas. As proteínas injetadas não foram identificadas com tal fundo forte (Figura 41). O anticorpo policlonal do grupo 2 teve reação cruzada mais fraca com as proteínas endógenas em cérebros de camundongo, mas as células do CNS em cérebros de controle de veículo ainda eram positivas. As proteínas injetadas não foram detectadas acima do fundo (Fig. 42). O anticorpo monoclonal de camundongo tinha especificidade aceitável, com sinais muito mais baixos em cérebros de controle de veículo (dados não mostrados). Após a injeção IT, todas as proteínas foram detectadas nas meninges na superfície do cérebro.

Ambos hGalC do Grupo 1 e do Grupo 2 5 foram detectados nas células do CNS (neurônios e células da glia) nas regiões abaixo das meninges, com sinais relativamente mais fortes em animais do Grupo 1 tratados com hGalC.

Nenhum neurônio positivo e célula da glia foram detectados em cérebros tratados com mGalC (Figura 43). No cerebelo, hGalC produziu coloração nas meninges e sobre a superfície da zona granular, enquanto mGalC não o fez (Figura 44). O anticorpo monoclonal de camundongo trabalhou no cérebro do camundongo, mas mostrou forte reatividade cruzada com as células sinusoidais no fígado e não poderia ser usado para avaliar a absorção celular de proteínas injetadas por via IT no fígado (Figura 45). O anticorpo policlonal do Grupo 2 apresentou especificidade de tecidos do fígado com sinais muito mais baixos em cérebros de controle de veículo.

Todas as proteínas injetadas por via IT foram detectadas tanto em células sinusoidais quanto hepatócitos no fígado após o tratamento, com menos células positivas e sinais mais fracos nos animais do Grupo 1 tratados com hGalC (Figura 46). Apesar de não ter sido encontrada atividade maior de GalC em nenhum dos grupos tratados, coloração positiva foi encontrada nas meninges e células do CNS nas regiões cincundantes, indicando que IHC é sensível na detecção de proteína injetada que foi levada até o nível celular (Figura 47). No fígado, mGalC demonstrou maior atividade entanto IHC via Grupo 2 Ab detectou muito pouca diferença entre mGalC e hGalC (Figura

48). Baixa atividade detectável com o Grupo 1 Ab em hGalC foi consistente com os baixos níveis de IHC observados. Resumo Após a injeção IT, todas as proteínas injetadas foram 5 detectadas nas meninges do cérebro por meio de IHC. A atualização celular de hGalC injetado ambos no Grupo 1 e no Grupo 2 foi detectada em células do CNS (neurônios e células da glia), com sinais relativamente mais fortes em cérebros do Grupo 1 tratados com hGalC. Nenhum neurônio positivo e células da glia foram detectados em cérebros tratados com mGalC. No cerebelo, além de sinal positivo nas meninges, hGalC injetado de ambos Grupo 1 e Grupo 2 foi encontrado em uma camada de células na superfície da zona granular. Nos fígados de todos os grupos tratados, proteínas injetadas foram detectadas nas células sinusoidais e hepatócitos sugerindo absorção eventual de I2S intratecal para o sistema circulatório. mGalC e hGalC do Grupo 2 tiveram sinais de coloração forte semelhantes versus hGalC do Grupo 1. EXEMPLO 5: HISTOLOGIA CEREBRAL/ROTULAGEM DE GALC

INJETADO POR VIA IT EM CÃES O presente Exemplo descreve uma modalidade de GalC injetado por via IT em cães e a detecção e localização correspondente de anticorpo GalC no cérebro. Nesta modalidade, a proteína injetada por via IT foi detectada nas meninges e nas regiões do córtex de superfície abaixo das meninges. A proteína injetada por via ICV foi encontrada em regiões periventriculares (Figura 49). IHC de GalC mostrou padrão de coloração extracelular difuso no córtex após injeção IT, com sinal negativo em neurônios

(circulado) (Figura 50). Uma diminuição limitada de células da microglia ativadas com coloração Iba positiva foi observada em regiões periventriculares injetadas por via ICV e córtex injetado por via IT (Figura 51). Nenhuma 5 alteração morfológica (células Globoides) foi encontrada no córtex com LFB/PAS no grupo do veículo e nenhuma diferença foi observada entre os grupos.

Células Globoides (seta) marcadas por coloração Iba foram diminuídas após tratamento ICV em 4 áreas limitadas de regiões periventriculares (Figura 52). Exemplos de Entrega IT de Proteína I2S EXEMPLO 6: BIODISTRIBUIÇÃO DE I2S ENTREGUE POR VIA IT O objetivo principal deste estudo foi determinar se recombinante humano I2S poderia ser entregue para o cérebro de camundongos adultos MPS II pela via intratecal-lombar.

Tabela 20: SEIS GRUPOS DE CAMUNDONGOS MACHOS DE 8-12 SEMANAS DE IDADE FORAM TRATADOS COMO SEGUE:

Linhagem Dose/Peso Grupo N Tratamento Volume Dose Via cerebral

A 3 IKO I2S 10 µL 260 µg 520 mg/kg IT-lombar

B 3 IKO I2S 10 µL 260 µg 520 mg/kg IT-lombar

C 3 IKO Não tratado N/A N/A N/A N/A

D 1 IKO I2S 10 µL 260 µg 520 mg/kg IT-lombar

E 3 IKO Não tratado N/A N/A N/A N/A

F 3 C57Bl/6 Não tratado N/A N/A N/A N/A

Cronograma de injeção: Animais receberam até 3 injeções de idursulfase (10µl) por via intratecal-lombar: Grupos A & D: Administrado 3 doses de I2S nos dias 1, 8, e 15 Grupo B: Administrado 2 doses de I2S, nos dias 1 e 8

Grupos C & E: Camundongos (IKO) de controle não tratados o Grupo F: Camundongos-controle selvagens não tratados

MATERIAIS E MÉTODOS 5 Animais: Os camundongos foram alojados em grupos de até 4 por gaiola em uma sala colônia sob um ciclo de 12 horas de luz- escuridão. Dieta de roedores (LabDiet-5001, St. Louis, MO) e água (Lexington, MA água de torneira purificada por osmose reversa) estavam disponíveis ad libitum durante todo o período do experimento. Cuidados com animais foi conduzido de acordo com as orientações descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington DC, 1996). A colônia de criação de IKO atual foi estabelecida a partir de quatro camundongos IKO fêmeas heterozigóticos para a mutação que foram obtidos do Dr. Joseph Muenzer (Universidade da Carolina do Norte). As portadoras fêmeas foram criados com camundongos machos da linhagem de origem C57BL/6 (C57BL/6NTac, Taconic, Hudson, NY), produzindo fêmeas heterozigotas e camundongos hemizigóticos knockout do sexo masculino, bem como ninhadas de fêmeas e machos do tipo selvagem. Toda a prole eram genótipos por análise de PCR de DNA de tecido. Todos os camundongos IKO usados neste experimento foram identificados tanto como hemizigotos (- /0) ou ninhada do tipo selvagem (WT) (+/0) camundongos de 8 a 12 semanas de idade. Idursulfase: Vinte e dois mL de I2S [recombinante humano idursulfase] foram dialisados contra quatro mudanças de 2L de solução salina tamponada de fosfato (PBS). O I2S foi então concentrado pela coluna Vivaspin e ressuspenso em um volume final de 1mL de PBS, seguido de esterilização por filtração usando um filtro de 0,2 µm.

A concentração final 5 foi de 51 mg/mL.

Injeções Lombares Intratecais: Camundongos adultos foram anestesiados com 1,25% 2,2,2 tribromoetanol (Avertin), 200-300µl/10 gramas de peso corporal (250-350 mg/kg) por injeção intraperitoneal.

O pelo dorsal foi removido entre a base da cauda e as omoplatas e a área raspada foi esfregada com esfrega de povidona/betadine seguida de álcool isopropílico.

Uma pequena incisão na pele da linha média (1-2 cm) foi feita sobre a espinha lombossacra e a interseção da linha média dorsal e o aspecto cranial das asas do ilea (íleo singular) identificado.

O músculo na fossa ilíaca (glúteo médio) é um músculo em forma de coração e os dois lados da parte superior do "coração" se aproximam da localização das asas do ilea.

Uma agulha de calibre 32 anexada a uma seringa Hamilton estanque a gases, de vidro, 10-20 µl foi inserida até que a resistência foi sentida a partir do osso subjacente.

A injeção de 10µl de artigo de teste a uma taxa aproximada de 2 µL/20 segundos (10µl/2 minutos) foi realizada.

A incisão na pele foi fechada com grampos de sutura, conforme apropriado, e o animal foi deixado para recuperar de uma câmara de recuperação antes de ser retornado para a gaiola apropriada.

Procedimentos de Histologia: Os animais foram sacrificados uma hora após a injeção final.

Tecidos cerebrais e fígado foram coletados e fixados em 10% de formalina tamponada neutra, em seguida, processados e embebidos em parafina.

Cinco seções µm foram preparadas para coloração de hematoxilina/eosina (H&E) e 5 imuno-histoquímica (IHC). Coloração de Hematoxilina e Eosina: Seções do cérebro e do fígado foram coradas com H&E.

Os resultados de coloração mostraram núcleos como roxo e citoplasma como do rosa ao vermelho.

Lâminas coradas com H&E foram usadas para avaliação de morfologia histopatológica.

Imuno-histoquímica: Para a avaliação de biodistribuição de I2S, seções do cérebro e do fígado desparafinizadas e re-hidratadas foram incubadas durante a noite com o anticorpo monoclonal de camundongo 2C4-2B2 (Maine Biotechnology Services, Portland, ME) contra recombinante humano I2S para detectar I2S injetado (ou uma IgG de camundongo irrelevante como um anticorpo de controle negativo; Vector Laboratories, Burlingame, CA). Após uma incubação durante a noite a 2- 8°C, uma IgG anti-camundongo de cabra secundária conjugada com peroxidase de rábano foi adicionada.

Depois de 30 minutos adicionais de incubação a 37°C, solução de rotulagem Tiramida-Alexa Flúor 488 (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) foi adicionada durante um período adicional de 10 minutos.

As seções foram cobertas com lamela usando um meio de montagem anti-desbotamento (Vectashield, Vector Laboratories) contendo 1,5 µg/mL de 4'-6-diamidino-2- fenilindol (DAPI) como um contracorante nuclear e observadas com um microscópio fluorescente Nikon de múltiplos canais.

Os resultados de coloração mostraram células positivas I2S como verde, com núcleos em azul, e as áreas de fundo como preto.

Para análise de eficácia, as seções do cérebro e do 5 fígado foram coradas com uma IgG anti-LAMP-1 de rato (proteína de membrana associada a lisossoma como um marcador lisossomal) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califórnia) como anticorpo primário.

Uma IgG de rato como um anticorpo irrelevante foi usada como controle negativo.

O método ABC (kits de complexo avidina-biotina de Vector Labs, Burlingame, Califórnia) foi usado para amplificar o marcador-alvo.

Resumidamente, as seções desparafinizadas foram re- hidratadas e incubadas com o anticorpo primário.

Após incubação durante a noite a 2-8°C, uma IgG anti-rato de coelho biotinilado secundária (Vector Labs, Burlingame, Califórnia) foi adicionada e incubada 30 minutos a 37°C, depois as amostras foram lavadas e tratadas com complexo avidina-biotina-peroxidase (Vector Laboratories) durante 30 minutos.

Para o desenvolvimento da cor, tetracloridrato 3,3-diaminobenzidina (DAB) foi usado como o cromogênio.

As seções foram então contracoradas com hematoxilina e cobertas com lamínulas.

Os resultados de coloração mostraram células positivas LAMP-1 como marrom e núcleos como azul.

As fotografias representativas foram tiradas e da área de células positivas LAMP-1 foi analisada com o software Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD) e estatísticas comparativas foram realizadas usando testes t de estudante.

Método de Microscópio Eletrônico: Tecidos cerebrais de 3 doses de animais tratados com I2S foram fixados em glutaraldeído a 2,5% PFA/2.5% em 0,1 M de tampão de cacodilato de sódio pH 7,4 a 4 graus para 5 durante a noite.

Em seguida, as amostras foram lavadas em tampão de cacodilato (0,1 M, pH 7,4) e pós-fixadas em tetróxido de ósmio, desidratadas em alcoóis e óxido de propileno e embebidas em resina Epon.

Seções ultrafinas foram cortadas a 100 nm, coradas com citrato de chumbo e examinadas em um Tecnai™ G² Espírito BioTWIN microscópio eletrônico de transmissão.

Resultados No cérebro, tal como determinado por imuno- histoquímica (IHC), não foi encontrado I2S em animais de controle de veículo.

Em contraste, as células meníngeas, neurônios do cérebro e cerebelo foram positivamente coradas quanto à I2S em animais injetados com I2S.

O sinal de coloração foi mais forte nos animais com 3 doses administradas (Figura 53). Em tecidos cerebrais de camundongos IKO tratados com veículo, vacuolização celular, uma característica histopatológica de doenças de armazenamento lisossômicas, foi encontrado por todo os cérebros em comparação com os animais de tipo selvagem.

Em camundongos IKO tratados com I2S houve uma redução generalizada de vacuolização celular a partir da superfície do córtex cerebral, núcleo caudado, tálamo, cerebelo, até a substância branca em comparação com as não tratadas (Figura 54). Atividade lisossomal anormalmente elevada foi encontrado pela coloração de proteína 1 (LAMP-1) de membrana associada a lisossoma, um indicador da atividade lisossômica e estado da doença, em células da microglia, meníngeas e perivasculares de camundongos IKO tratados com veículo quando comparado com animais de tipo selvagem (Figura 55). Os camundongos 5 tratados com I2S intratecal tinham reduções marcadas em imunocoloração LAMP-1. Esta redução foi caracterizada pela diminuição do número de células positivas de LAMP-1 e coloração mais clara.

A redução foi observada por todo o cérebro a partir da superfície do córtex cerebral, núcleo caudado, tálamo, cerebelo, até a substância branca (Figura 56) em ambos as doses 2 e 3 de animais tratados com I2S.

A análise morfométrica de imunocoloração de LAMP-1 de várias regiões do cérebro confirmou que houve reduções significativas na coloração positiva de LAMP-1 em todas as áreas do cérebro avaliadas (Figura 56). Exame de microscopia eletrônica de células cerebrais em camundongos IKO tratados com veículo revelou os vacúolos dilatados contendo material de armazenamento granular amorfo e inclusões com estruturas lameladas e padrão zebrado.

Estas características patológicas típicas de armazenamento lisossomal no nível ultra-estrutural foram reduzidas em camundongos injetados com I2S por via intratecal-lombar (Figura 57). No fígado, não houve coloração positiva de I2S nos animais tratados com veículo.

Nos camundongos injetados com I2S por via intratecal, uma grande quantidade de I2S injetado foi claramente encontrada em células sinusoidais (Figura 58), que indicou que o I2S injetado no interior do espaço intratecal circulou com CSF e foi então absorvido através das granulações aracnoides para o sistema circulatório.

Em tecidos do fígado de camundongos IKO tratados com o veículo, vacuolização celular severa e atividade lisossomal anormalmente elevada demonstrada pela coloração de H&E e 5 forte imunomarcação de LAMP-1 foram encontradas em comparação com camundongos WT.

Redução marcada de vacuolização celular e imunomarcação de LAMP-1 em fígados foi encontrada após tratamento intratecal com I2S.

A coloração de H&E revelou vacuolização intracitoplasmática que quase desapareceu completamente com uma estrutura das células do fígado quase normal (Figura 59). Em camundongos IKO, recombinante humano I2S foi entregue ao cérebro por via intratecal-lombar e I2S injetado causa melhoria histopatológica generalizada em uma variedade de regiões do cérebro. • I2S injetado foi detectado em células meníngeas e neurônios no cérebro. • Vacuolização celular reduzida em todo o cérebro em ambos os níveis de luz microscopia eletrônica óptica. • Marcador lisossômico LAMP-1 reduzido em todo o cérebro. • I2S injetado por via intratecal entrou na circulação periférica e melhorou a morfologia do fígado e marcador histológico.

EXAMPLO 7: TOXICOLOGIA DE ENTREGA DE I2S POR VIA IT Este exemplo ilustra os sinais clínicos associados com idursulfase via doses mensais de bolus intratecal lombar em macacos caranguejeiros.

Para alcançar este objetivo, 14 macacos caranguejeiros machos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de tratamento como mostrado a seguir na Tabela 21. Tabela 21: Desenho Experimental Grupo Número de Animais Dose Nominal (mg) Volume de Dose (mL)

1 3 0 1

5 2 3 3 1

3 3 30 1

4 3 150 1

5 2 100 1

Os animais em todos os grupos foram dosados três vezes a intervalos IT mensais ao nível da coluna lombar.

O volume de dose de 1mL foi purgado do sistema de cateter, com 0,3mL de PBS.

Um ou dois dias antes de cada dose, cerca de 2mL de CSF foram coletados a partir de uma torneira IT espinal ao nível da cisterna magna.

As amostras de sangue (2mL) também foram coletada neste momento.

Sangue (2mL) e CSF (0,1mL) foram coletados de animais pré-dose do Grupo 5, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, e 48 horas pós-dose, depois da primeira dose.

Os sinais clínicos foram registrados pelo menos duas vezes por dia.

Uma necropsia foi realizada aproximadamente 24 horas após a terceira dose e tecidos selecionados foram coletados e guardados.

No dia 1, todos os três os animais do Grupo 4 (150 mg) exibiram tendência mínima para os quartos traseiros dentro de 3-12 minutos após a administração, com a duração de 5-15 minutos; este sinal foi considerado relacionado ao artigo de teste.

Não houve alterações no peso corporal, consumo de alimento e parâmetros de exame neurológico/físico que foram considerados relacionados com o artigo de teste.

A análise de soro e de amostras de CSF e as análises da solução de dosagem são apresentadas.

Variações na atividade de idursulfase endógena foram observadas em tecidos diferentes do macaco caranguejeiro; cérebro e medula espinhal tiveram maior atividade endógena do que outros órgãos periféricos examinados, incluindo fígado, 5 coração e rim.

A administração de idursulfase foi associada com aumentos dependentes da dose na atividade de idursulfase em várias regiões do cérebro, bem como no tronco cerebral e na medula espinhal.

A entrega IT não resultou em uma diferença observável na distribuição entre os hemisférios cerebrais direito e esquerdo.

Houve um claro aumento dependente da dose na atividade de idursulfase nos seguintes órgãos: cérebro, fígado, coração e rim.

A imunocoloração para idursulfase no cérebro demonstrou um aumento dependente da dose na intensidade da coloração.

No grupo de 3 mg, células meningiais e coloração celular glial limitada por baixo das meninges foram observadas; coloração neuronal não foi evidente nos animais do grupo de tratamento de 3 mg.

A coloração de idursulfase foi positiva e dependente da dose na medula espinhal, com a maior intensidade de coloração na região lombar, onde a administração IT de idursulfase ocorreu.

A intensidade da coloração de idursulfase no fígado, rim e coração foi dependente da dose e consistente com o aumento da atividade de idursulfase nestes órgãos.

Em conclusão, a administração IT de idursulfase em doses de até 150 mg entregues em intervalos mensais não teve efeitos adversos.

Assim, o nível de efeito adverso não observado (NOAEL) foi interpretado como sendo de 150 mg, a dose mais elevada testada neste estudo.

A administração de idursulfase foi associada com aumentos dependentes da dose na atividade de idursulfase no CNS e resultou em níveis sistêmicos no fígado, coração e rim.

O artigo de teste, idursulfase, foi fornecido como soluções de dosagem em 154 mM de NaCl, 0,005% de 5 Polisorbato 20, pH 5,3 – 6,1. As concentrações nominais das soluções de dosagem fornecidas foram de 0, 3, 30 ou 150 mg/mL.

O artigo de teste foi armazenado em um congelador a -82° a -79°C.

Salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, foi usada como agente de lavagem após as doses serem administradas e depois das coletas de CSF em série.

O PBS foi obtido de Gibco, Invitrogen Corporation.

Preparação de Dosagem de Artigo de Teste No primeiro dia de dosagem para cada intervalo de tempo, um frasco de cada concentração foi removido do congelador horizontal de -80°C e deixado descongelar sobre a bancada à temperatura ambiente.

Uma vez descongelados, os frascos dos Grupos 1, 2, e 3 foram marcados, pesados e 1mL foi retirado através de um filtro de 0,22 µm para cada animal programado para dosagem.

Depois que todas as doses foram administradas, os frascos foram novamente pesados e colocados no refrigerador.

No dia seguinte (dia de dosagem para Animal 003, Grupo 4, Grupo 5) soluções de dosagem para os Grupos 1 e 4 foram removidas do refrigerador e colocadas na bancada para atingir a temperatura ambiente.

Uma vez obtida a temperatura ambiente, os frascos para os Grupos 1 e 4 foram pesados, o frasco do Grupo 4 foi rotulado, e 1mL foi retirado através do filtro para cada animal programado para dosagem nos Grupos 1 e 4. A solução de dosagem para o Grupo 5 foi então preparada através de injeção da quantidade apropriada de solução de dosagem do Grupo 4 e Grupo 1 (veículo) em um frasco estéril de polipropileno.

A quantidade adicionada dos Grupos 1 e 4 foi registrada.

A solução foi misturada invertendo suavemente o frasco e duas 5 doses de 1mL foram retiradas através do filtro para os animais do Grupo 5. Os frascos para os Grupos 1 e 4 foram pesados novamente após a conclusão da dosagem e todos os frascos (Grupos 1-5) foram colocados em um congelador.

Catorze animais foram aleatoriamente atribuídos a grupos de tratamento, tal como descrito na Tabela 21. A via de administração IT foi selecionada porque esta é uma via pretendida para a administração humana.

As doses de idursulfase que foram selecionadas para este estudo (3, 30, 100 e 150 mg/mL) foram escolhidas para avaliar a biodistribuição de níveis de doses variáveis de enzima dentro do sistema nervoso central (CNS) de primata não- humano após três injeções mensais consecutivas de bólus IT lombar.

Observações Clínicas A incidência global dos sinais clínicos foi mínima.

Nenhum dos animais no Grupo 1 (controle), Grupo 2 (3 mg), o Grupo 3 (30 mg), ou Grupo 5 (100 mg) apresentou sinais clínicos que foram considerados relativos ao artigo de teste em qualquer momento durante o estudo.

No dia 1, todos os três animais (012-014) do Grupo 4 (150 mg) apresentaram tendência mínima para quartos traseiros dentro 3-12 minutos pós-dose, durando 5-15 minutos.

Este sinal foi considerado relacionado com o artigo de teste e não foi observado em nenhum dos grupos de dose mais baixa.

Não foram observados outros sinais clínicos imediatamente após a primeira dose ou nos dias imediatamente após a administração do artigo de teste.

O único sinal observado para os outros animais do grupo 4 foi um único episódio de êmese para o Animal 013 no dia 35. 5 A administração do artigo de teste como um único bolus intratecal mensal não foi associada a qualquer alteração adversa macroscópica ou microscópica quando se toma em consideração as alterações inerentes com um dispositivo de entrega de droga implantado.

Todos os grupos, incluindo o grupo de controle, tiveram alterações microscópicas nas meninges indicando reações inflamatórias ao sistema de entrega de drogas.

Nos animais que receberam doses do artigo de teste de 30 mg e maiores, houve uma tendência da reação inflamatória nas meninges ter um componente eosinofílico mais pronunciado, mas esta diferença não foi considerada como sendo biologicamente significativa.

Como as diferenças entre os animais tratados com artigo de teste e os de controle foram tão pequenas, o nível de efeito adverso não observado (NOAEL) foi interpretado como sendo de 150 mg, a maior dose testada neste estudo.

A reação inflamatória global nas meninges em todos os grupos (incluindo controles) foi ligeiramente mais pronunciada do que geralmente encontrada em um estudo intratecal desta duração em macacos.

Entretanto, isto foi considerado ser possivelmente relacionado a alguma característica do veículo ao ato de dosar 24 horas antes da necropsia.

A coloração de idursulfase cerebral foi positiva em todos os animais tratados, com exceção de um animal no grupo de 3 mg, com a maior intensidade de coloração observada no grupo de 150 mg (Figuras 60, 61, 62 e 63). No grupo de 3 mg, apenas células meningial e poucas células gliais por baixo das meninges foram positivas; idursulfase 5 injetada não foi detectada nos neurônios.

Nos grupos de dose mais elevada (30, 100 e 150 mg), grandes populações de neurônios cerebrais foram fortemente positivas para a coloração de idursulfase, juntamente com as células meningial, células gliais e células perivasculares.

A imunocoloração de idursulfase revelou uma ampla distribuição de idursulfase injetada em neurônios cerebrais a partir dos neurônios dentro da camada I na superfície perto das meninges, para aqueles dentro da camada mais profunda VI adjacente à substância branca (Figuras 64, 65 e 66). A coloração marcada dos neurônios também foi observada no grupo de dose de 150 mg (Figura 67). Em todos os animais (grupo de dose de 30-150 mg), não foi encontrada diferença marcada na coloração idursulfase neuronal entre as seções frontal, central e posterior do cérebro.

A coloração Idursulfase foi positiva na medula espinhal de todos os animais, com a maior intensidade de coloração na região lombar (Figuras 68 e 69). A imunomarcação idursulfase também foi dependente da dose.

Neurônios, células meningiais, células gliais, células perivasculares e epi/peri/endoneuro (células conjuntivas) que envolvem as fibras nervosas foram fortemente positivas para a coloração idursulfase no grupo de 150 mg (Figuras 70 e 71). No fígado, a coloração positiva para idursulfase foi encontrada em células sinusoidais (células de Kupffer e células endoteliais) de todos os animais. Idursulfase, entretanto, não foi detectada nos hepatócitos para o grupo de tratamento de 3 mg (Figura 72), enquanto que a coloração idursulfase positiva nos hepatócitos foi encontrada nos 5 grupos de dosagem mais elevada, com a maior intensidade de coloração no grupo de tratamento de 150 mg (Figuras 73, 74 e 75). Não houve coloração positiva para idursulfase em animais do grupo de tratamento de 3 mg (Figura 76). Em contraste, as células intersticiais foram positivamente coradas para idursulfase nos grupos de 30, 100 e 150 mg, com coloração marcada sendo observadas no grupo de 150 mg - em termos do número de células positivas e intensidade da coloração (Figuras 77, 78 e 79). Rim Pouca ou nenhuma idursulfase injetada foi detectada em animais do grupo de dose de 3 mg (Figura 80). Coloração idursulfase positiva, entretanto, foi encontrada nas células glomerulares e das células intersticiais nos grupos de 30 e 100 mg (Figuras 81 e 82). No grupo de 150 mg, a imunocoloração idursulfase revelou adicionalmente coloração idursulfase de células tubulares proximais, juntamente com coloração marcada de células glomerulares e intersticiais (Figura 83).

DISCUSSÃO Não houve sinais clínicos relacionados com o artigo de teste ou efeitos sobre o peso corporal, consumo de alimentos, constatações por exame físico e constatações por exame neurológico. No Dia 1, os animais do Grupo 4 (150 mg) exibiram tendência mínima para quartos traseiros dentro de

3-12 minutos após a dosagem, durando de 5 a 15 minutos; este sinal foi considerado estar relacionado com o artigo de teste.

A administração de idursulfase foi associada com 5 aumentos dependentes da dose na atividade de idursulfase em várias regiões do cérebro, assim como o tronco cerebral e a medula espinhal.

O nível mais elevado de intensidade de coloração na medula espinhal foi na região lombar, onde a administração IT de idursulfase ocorreu.

A administração IT de idursulfase também resultou na exposição sistêmica com intensidade da coloração dependente da dose no fígado, rim e coração.

Os animais que receberam doses do artigo de teste de 30 mg e maiores tiveram uma tendência da reação inflamatória nas meninges ter um componente eosinofílico mais pronunciado.

A administração IT de idursulfase em doses de até 150 mg entregues em intervalos mensais não teve efeitos adversos.

Assim, o nível de efeito adverso não observado (NOAEL) foi interpretado como sendo de 150 mg, a dose mais elevada testada neste Exemplo.

A administração de idursulfase foi associada com aumentos dependentes da dose na atividade idursulfase no CNS e resultou em níveis sistêmicos no fígado, rim e coração.

EXEMPLO 8: PK (soro e CSF) de IT entregues I2S Este exemplo provê análise de soro e líquido cefalorraquidiano (CSF) associada com um Estudo de Toxicidade de 6 Meses de ldursulfase Administrada via lnjeções de Bolus lntratecal Lombar Mensais e Injeções Intravenosas de Bolus Semanal em Macaco Caranguejeiro quanto à concentração de artigo de teste (TA).

DESENHO EXPERIMENTAL O objetivo de t foi avaliar repetir a administração de dose intratecal (IT) de idursulfase (12s) a partir de uma perspectiva de toxicologia e farmacologia de segurança 5 durante um período de seis meses.

O desenho do estudo é apresentado na Tabela 22. Tabela 22: Desenho de Estudo

Artigo de Teste Identificação: Dosagem IV de ldursulfase - Lote nº FDC06-001 (2,0 mg/mL) Dosagem IT - idursulfase (0 mgImL) idursulfase (3 mg/mL) idursulfase (30 mg/mL) idursulfase (100 mg/mL) Métodos de ensaio: As análises foram conduzidas usando um ELlSA (Enzyme Linked lmmunosorbent Assay) para determinar a concentração de idursulfase.

O limite de detecção (LOD) = 1,25 ng/mL, antes da multiplicação pelo fator de diluição.

As amostras foram testadas a uma diluição de 1:50, portanto, a sensibilidade do ensaio é de 62,5 ng/mL.

As amostras que recaem além da extremidade elevada da curva de calibração foram ainda diluídas e testadas novamente a uma diluição adequada, que resultou em um valor dentro do intervalo da curva. Amostras selecionadas foram adicionalmente analisadas usando um ensaio de atividade da enzima. O LOD para este ensaio é de 0,18 mU/mL a uma diluição da amostra 5 mínima de 1:150. Os animais dos grupos 1 e 2, que foram dosados com salina ou veículo, respectivamente, todos tinham níveis de idursulfase no soro variando entre 138 ng/mL e <62,5 ng/mL (ou <LOD) durante todo o período de dosagem IV e IT. De 200 amostras de CSF testadas em animais do grupo 1 e 2, 62 níveis demonstraram níveis de I2S acima do ensaio LOD. Destes, 7 valores eram elevados (> 1000 ng/mL). Uma outra amostra de CSF coletada antes da dose IT 3 testada acima de

1.000 ng/mL de I2S. As amostras foram então testadas quanto à atividade de idursulfase. Em cada caso, os resultados indicaram a presença de atividade de I2S e quando a concentração aproximada de I2S foi calculada com base nos níveis de atividade, os resultados estavam dentro de 20% daqueles obtidos pelo antígeno ELISA. (Ver Tabela 23). Amostras de CSF adicionais escolhidas aleatoriamente com resultados de antígeno ELISA <LOD também foram testados usando o ensaio de atividade enzimática para descartar qualquer atividade não-específica. Tabela 23: Resultados de investigação de amostras de

CSF Número Grupo Dose Número Modo Ponto Resul- Resul- ng/mL Calcu- do da da de tado tado calcu- lado Animal Dose Dose Tempo ELISA Ativi- lado como % (mg/mL) dade baseado de (mU/mL) na medido ativi-

dade

Sali- Pré-

003 1 na 5 IT dose 1392 4.7 1173 119%

Sali- Pré-

003 1 na 6 IT dose 7322 29.9 7469 96%

Sali-

004 1 na 2 IT 2h após 17045 62.1 15527 110%

Sali-

006 1 na 6 IT 4h após 16435 70.7 17682 93%

Sali- Pré-

006 1 na 1 IT dose 1320 5.3 1319 100%

Veí-

0016 2 culo 1 IT 2h após 3070 11 2743 112%

Veí-

017A 2 culo mo. 3 IV 4h após 2236 8.8 2194 102%

100 Pré-

046 5 mg/kg 3 IT dose 2086 7 1750 119%

No presente estudo, as amostras de soro e CSF foram analisadas quanto à concentração de idursulfase.

As amostras de soro foram coletadas de acordo com o seguinte cronograma: 5 Doses IV: pré-dose e 2 horas após as doses de 1 a 10, pré-dose e 4 horas após as doses de 11 a 23, e na necropsia.

Doses IT: pré-dose e 2 horas após as doses 1 e 2, pré- dose e 4 horas após as doses de 3 a 6, e na necropsia.

Amostras de CSF foram coletadas de acordo com o seguinte cronograma: Doses IV: pré-dose e 2 horas pós-dose 1 e 4 horas após as doses 3 e 6. Doses IT: pré-dose e 2 horas após as doses 1 e 2, pré- dose e 4 horas após as doses de 3 a 6, e na necropsia. Em geral, a idursulfase no soro pareceu clarear mais 5 rápido do que a idursulfase no CSF. Níveis de idursulfase no soro nos animais dos grupos 1 e 2 que foram dosados com salina ou veículo, respectivamente, foram inferiores ou iguais a 138 ng/mL em todos os pontos de tempo testados. Alguns animais apresentaram níveis abaixo do limite de detecção do ensaio (LOD). Menos amostras de CSF dos grupos 1 e 2 foram acima do LOD ensaio, com 7 exceções notáveis, que resultaram em níveis altos (> 1.000 ng/mL). Uma amostra de CSF coletada a partir de um animal pré-dose IT 3, também testado acima de

1.000 ng/mL de idursulfase. As amostras que deram estes resultados fora de tendência foram testadas e confirmadas. Além disso, estas amostras foram testadas para a atividade da enzima idursulfase. Estes resultados também confirmaram níveis elevados da atividade de idursulfase dentro de 20% daqueles obtidos através do ensaio de massa de idursulfase (Tabela 23). A especificidade do ensaio de atividade foi validada dentro deste grupo de amostra testando aleatoriamente amostras de CSF, com unidades de massa de idursulfase abaixo do LOD e confirmou que os níveis de idursulfase nestas amostras eram de fato LOD (dados não mostrados). EXEMPLO 9. BIODISTRIBUIÇÃO DE ENTREGA DE I2S POR VIA

IT Tendo demonstrado com sucesso que a administração intratecal é uma maneira eficaz de proporcionar I2S aos tecidos do CNS, estudos adicionais foram conduzidos para determinar se I2S administrado por via IT é capaz de se distribuir nos tecidos profundos do cérebro e se há 5 localização celular de I2S administrado por via IT.

Um recombinante humano de formulação iduronato-2-sulfatase (I2S) foi preparado e formulado em um veículo de 154 mM de NaCl, 0,005% de polissorbato 20, com um pH de 6,0. Os primatas não humanos foram administrados com 3 mg, 30 mg, ou 100 mg de I2S mensalmente, por meio de uma porta intratecal implantada, durante seis meses consecutivos.

O desenho do estudo está resumido na Tabela 24 abaixo.

Tabela 24

Último Dia no Estudo Dose IV Dose IT Grupo Nº (número de animais) (mg/kg)a (mg)a 6 Recuperação Meses

1 6 DC (NS) DC (PBS) 6 -

0 (veículo 2 12 0 (veículo) 6 6 IT)

3 12 0.5 3 6 6

4 6 0.5 30 6 -

5 12 0.5 100 6 6 a Idursulfase a menos que especificado de outra forma.

DC (controle de dispositivo); IT (intratecal); IV (intravenosa); NS (salina normal); PBS (salina de tampão de fosfato, pH 7,2). A administração mensal repetida de I2S para os primatas não-humanos, por seis meses, foi bem tolerada na dose mais elevada testada e não associada a quaisquer eventos toxicológicos adversos significativos.

Vinte e quatro horas após a administração da sexta e última dose de 5 I2S, os sujeitos de primatas não humanos foram sacrificados e os tecidos do CNS de tais primatas não humanos foram examinados.

Conforme determinado por imuno-histoquímica (IHC), houve uma deposição celular generalizada de I2S por todas as células e tecidos do CNS.

Proteína I2S foi detectada em todos os tecidos do cérebro por IHC, com um gradiente de deposição do córtex cerebral até a matéria branca ventricular.

Na matéria cinzenta I2S foi detectado nos neurônios do cérebro, cerebelo, tronco cerebral e na medula espinhal de todos os grupos, de maneira dependente da dose.

Na matéria cinzenta superficial dos grupos de dosagem mais elevada, um grande número de neurônios cerebrais foi positivo para coloração I2S no córtex superficial (Figura 84A). I2S também foi detectado em neurônios do tálamo (Figura 84B), hipocampo (Figura 84C), núcleo caudado (Figura 84D) e medula espinhal (Figura 84E). Células meningial e perivascular também foram positivas para coloração I2S (Figura 84F). Como representado na Figura 85 e Figura 86, a distribuição de I2S administrado por via IT para dentro dos tecidos do CNS, em particular, a deposição na matéria cinzenta, tálamo e córtex cerebral dos sujeitos primatas não-humanos é evidente.

Além disso, a Figura 86 e Figura 87 ilustram que o I2S administrado por via IT acumula-se nos tecidos do CNS representado dos sujeitos primatas não-

humanos, de uma forma dependente da dose. A coloração de co-localização revelou também que a administração por via IT de I2S se associa com ambos os neurônios e os oligodendrócitos. O I2S administrado por via IT também se 5 distribui e localiza em todo o cérebro dos sujeitos primatas não-humanos como evidenciado pela Figura 88. Em particular, as Figuras 89A-D ilustram a absorção neuronal e associação axonal do I2S após a administração via IT para os primatas não humanos, como demonstrado pela coloração de filamento. Também de interesse particular, os presentes estudos mostram que I2S é seletivo para as células neuronais e tais células neuronais facilitam a distribuição de I2S administrado intratecalmente para os tecidos profundos do cérebro e parece estar associado com as estruturas axonais, indicando um transporte axonal anterógrado de I2S. A tabela 25 abaixo apresenta os dados farmacocinéticos de diferentes vias de administração e doses para estudo de um animal separado. Tabela 25 Peso Peso Dose AUClast Corporal Corporal Dose mg/kg mg/kg unidade hr*ng/mL kg kg BW Br p

0.5 mg/kg 8331 2.7 0.1 0.5 5 1 mg, IT 1933 3.1 0.1 0.32 10 10 mg, IT 31316 2.7 0.1 3.66 100 30 mg, IT 140345 2.9 0.1 10.34 300 124 I2S rotulado I foi administrado aos animais de teste, como mostrado na Tabela 26 abaixo, e os resultados da verificação de PET são mostrados na Figura 106 Tabela 26

Grupo Animais/ Via Artigo de Teste Dose Grupo

1 1 ICV [124I]- idursulfase 3 mg

2 4 IT-L [124I]- idursulfase 3 mg

3 4 IV [124I]- idursulfase 0.1 mg/kg

4 4 IV [124I]- idursulfase 1 mg/kg

O presente estudo também demonstrou a identificação celular de I2S administrado via IT no tecido cerebral de 5 matéria branca perto dos ventrículos do sujeito primata não-humano após a administração IT.

Enquanto a densidade de coloração I2S na matéria branca foi geralmente inferior àquela da matéria cinzenta, I2S foi detectado dentro de oligodendrócitos (Figura 90). Em particular, a Figura 90 ilustra a identificação celular de I2S nos tecidos cerebrais de matéria branca e ainda demonstra que I2S não parece associar-se com a mielina.

Além de demonstrar a distribuição de I2S administrado via IT profunda nos tecidos do cérebro, os presentes estudos também confirmaram a localização de I2S nas organelas-alvo, e mais importante, a localização de I2S nos lisossomas, que são organelas afetadas nas disfunções de armazenamento lisossomal, como a síndrome de Hunter.

Em particular, I2S foi localizado dentro dos lisossomas e também detectado dentro de axônios.

A Figura 90 ilustra a localização de I2S administrado por via IT dentro dos lisossomos de oligodendrócitos do sujeito primata não- humano, confirmando assim que o I2S administrado por via IT é capaz de se distribuir nos tecidos profundos do cérebro e é capaz de localização celular.

A fim de discernir se o I2S entregue reteve a atividade biológica, os níveis de I2S no cérebro foram 5 medidos usando um ensaio de atividade específica.

A atividade no cérebro do grupo IT de 3 mg 24 horas após a última dose não foi aparentemente diferente dos níveis basais no controle de dispositivo e animais de controle de veículo.

A atividade enzimática no cérebro de 30 mg e 100 mg de animais dosados por via IT ficou acima da linha de base no momento da necropsia (24 horas pós-dose). Outros testes em animais para discernir o local de entrega de I2S para o cérebro são mostrados na Figura 104 e na Tabela 27 abaixo.

Tabela 27: Localização das amostras Número Número Número

Número da da da da

Amostra Estrutura Fatia Amostra Estrutura Fatia

Córtex Cerebral -

1 Superficial (L) 4 14 Tálamo (L) 8

Córtex Cerebral -

2 superficial (R) 4 15 Tálamo (R) 8

3 Núcleo Caudado (R) 6 16 Hipotálamo (L) 8

4 Núcleo Caudado (L) 6 17 Hipotálamo (R) 8

5 Corpus callosum 6 18 Hipocampo (L) 8

Córtex Cerebral

(frontal) -

6 superficial (L) 8 19 Hipocampo (R) 8

Córtex Cerebral Matéria Branca -

7 (frontal) - 8 20 Profunda (L) 10 superficial (R) Matéria Branca - Matéria Branca - 8 superficial (L) 8 21 superficial (R) 10 Matéria Branca - 9 superficial (R) 8 22 Corpus callosum 10 Matéria Branca - Matéria Branca - 10 Profunda(L) 8 23 Profunda (L) 12 Matéria Branca - Matéria Branca - 11 Profunda (R) 8 24 Profunda (R) 12 Córtex Cerebral (temporal) - 12 superficial (L) 8 25 Cerebelo (R) 14 Córtex Cerebral (temporal)- 13 superficial (R) 8 EXEMPLO 10. BIODISTRIBUIÇÃO DE ENTREGA IT EM CÃES

BEAGLE Os padrões de distribuição de I2S observados no exemplo anterior também foram recapitulados em cães Beagle 5 saudáveis que receberam uma única dose por via IT ou ICV. Cães da raça Beagle machos foram distribuídos aleatoriamente usando o números gerados por computador em dois grupos (Grupo 1 (ICV), N = 3; Grupo 2 (IT), N = 4). Todos tiveram cateteres implantados no espaço subaracnoide na coluna lombar ou no ventrículo cerebral lateral esquerdo (para dosagem) e na cisterna magna (por amostragem). Todos os cateteres terminaram em uma porta de acesso de titânio subcutânea. Um cão adicional foi usado como um controle cirúrgico não-dosado. Uma única injeção de bolus de 1mL de I2S (30 mg/mL em

20 mM de fosfato de sódio, pH 6,0; 137 mM de cloreto de sódio; 0,02% de polissorbato-20), foi administrado via IT ou ICV, seguido por uma lavagem com 0,3mL de salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2). Os sinais clínicos 5 foram monitorados e sacrifício ocorreu 24 horas pós-dose.

Amostras de tecidos cerebrais e da medula espinhal foram coletadas para análises quantitativas de I2S conforme determinado por ELISA, a atividade enzimática de I2S e IHC, e comparadas entre os grupos de estudo.

I2S foi amplamente distribuído por toda a matéria cinzenta de ambos os grupos IT e ICV como determinado por IHC.

No córtex cerebral, neurônios foram positivos para I2S em todas as seis camadas neuronais, da camada de superfície molecular até a camada interna profunda em ambos os grupos IT e ICV, como ilustrado pela Figura 91 (imagens a e c). No córtex cerebelar dos grupos IT e ICV, I2S foi detectado nos neurônios, incluindo as células de Purkinje, como ilustrado pela Figura 91 (imagens c e d). Em ambos os grupos IT e ICV uma grande população de neurônios no hipocampo foram positivas para I2S, como demonstrado na Figura 91 (imagens e e f). Neurônios positivos para I2S foram também encontrados no tálamo e núcleo caudado em ambos os grupos, como ilustrado na Figura 91 (g imagens e h). Os presentes estudos, portanto, confirmam a capacidade das enzimas administradas por via IT de se distribuir para as células e os tecidos profundos do cérebro e suportam a utilidade de enzimas administrado por via IT, tais como I2S, para o tratamento das manifestações do CNS associadas com distúrbios de armazenamento lisossomal, tais como a síndrome de Hunter.

EXEMPLO 11. EFICÁCIA IN VIVO DE I2S ENTREGUE POR VIA

IT Modelo de Camundongo Deficiente de Iduronato-2- sulfatase 5 Tendo demonstrado que a administração de I2S por via IT é capaz de se distribuir nos tecidos profundos do cérebro e localização celular de I2S, estudos adicionais foram conduzidos para determinar a eficácia terapêutica da administração de I2S por via IT. Um modelo de camundongo knock out (IKO) iduronato-2-sulfatase geneticamente modificado de síndrome de Hunter foi desenvolvido para estudar a capacidade do I2S administrado por via IT de alterar a progressão da doença. O modelo do camundongo I2S knock-out foi desenvolvido usando uma ruptura direcionada do lócus I2S que resulta em um acúmulo de glicosaminoglicanos (GAG) em tecidos e órgãos. O modelo de camundongo IKO apresenta muitas das características físicas da síndrome de Hunter observados em seres humanos, incluindo as características grosseiras e defeitos esqueléticos. Além disso, o modelo do camundongo IKO demonstra elevados níveis de glicosaminoglicano (GAG) na urina e nos tecidos por todo o corpo, bem como vacuolização celular generalizada que foi observada na histopatologia. No presente estudo, I2S comercialmente disponível (Elaprase ®) foi concentrado e re-suspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Seis grupos de camundongos machos IKO, 8-12 semanas de idade, foram tratados com I2S (10µl, 26 mg/mL). Os grupos A e B (N = 3) foram administrados por via intratecal com três doses de 260µg (nos dias 1, 8 e 15) e duas doses de 260µg (nos dias

1 e 8) de I2S, respectivamente.

Grupo D também foi tratado com três doses de 260µg administradas por via intratecal nos dias 1, 8, e 15. Grupo C e E (N = 3) foram grupos de controle não tratados e grupo C (N = 3) foi um controle de 5 tipo selvagem não tratado.

Os camundongos de controle foram administrados com um veículo sem I2S.

Os camundongos foram sacrificados após 1 hora depois da última injeção, seguido de preparação do tecido para análise imuno-histoquímica (IHQ) e histopatológica.

Após a terceira injeção, houve redução generalizada de vacuolização celular no córtex cerebral superficial, núcleo caudado, tálamo e cerebelo em camundongos tratados com I2S comparado com camundongos tratados com veículo.

Reduções de vacuolização celular também foram encontradas na substância branca após tratamento IT.

A distribuição de I2S para os tecidos cerebrais do camundongo IKO era evidente após a administração IT.

Três administrações IT semanais de I2S nos camundongos IKO também demonstraram uma redução marcada na vacuolização celular do CNS em ambos os níveis de microscópicos eletrônicos e luz.

Após a administração IT de I2S, uma redução de vacuolização celular foi relativamente evidente para camundongos IKO não tratados, sugerindo que I2S administrado por via IT é capaz de alterar a progressão da doença.

Como ilustrado na Figura 92, uma redução de vacuolização celular era evidente no corpus callosum e fórnix dos camundongos IKO após a administração IT de I2S.

Adicionalmente, a microscopia eletrônica demonstrou uma redução na presença de inclusões de armazenamento nos neurônios na matéria cinzenta e vacuolação em oligodendrócitos na matéria branca.

Em particular, os camundongos IKO administrados com I2S por via IT também demonstraram uma redução em corpos lamelares em paliçada ("corpos zebrado"), que são característicos de certas 5 doenças de armazenamento lisossomal.

Em particular, a Figura 57 representa um microscópio eletrônico de varredura que ilustra uma redução dos corpos zebrados característicos nos neurônios do camundongo IKO que foi administrado com I2S, em relação ao camundongo IKO não tratado.

Da mesma forma, a figura 57 ilustra um microscópio eletrônico de varredura de oligodendrócitos no corpus callosum.

Além disso, as administrações IT de I2S aos camundongos IKO também demonstraram uma redução marcada no biomarcador patológico de doença lisossômica associada à imunomarcação da proteína de membrana 1 (lâmpada1), um indicador da atividade lisossômica e estado da doença, na superfície do córtex cerebral, núcleo caudado, tálamo, cerebelo e matéria branca.

Como ilustrado na Figura 93A, uma redução marcada na imunomarcação de LAMP1 é evidente no tecido do córtex cerebral superficial de camundongo IKO tratado em relação ao tecido do córtex cerebral superficial do camundongo IKO não tratado ilustrado na Figura 93B, refletindo uma melhoria na patologia da doença.

A Figura 56 ilustra e compara quantitativamente a concentração de LAMP1 medido em áreas µm2 de tecido cerebral.

A análise morfométrica de LAMP-1 de imunocoloração de várias regiões do cérebro confirmou que houve reduções significativas na coloração de LAMP-1 positiva em todas as áreas do cérebro avaliadas.

Como mostrado na Figura 56, em cada área de tecido cerebral avaliada (córtex, núcleo caudado e putâmen (CP), tálamo (TH), cerebelo (CBL) e da matéria branca (WM) a área de LAMP-positiva foi reduzida em camundongos IKO tratados em relação aos camundongos de controle não tratados, e 5 aproximou-se da área de LAMP positiva dos camundongos IKO do tipo selvagem. Particularmente notável é que as áreas de LAMP positivas em cada área de tecido cerebral analisado foram adicionalmente reduzida com a duração do tratamento continuado. A redução da atividade lisossomal anormalmente elevada correlacionou-se com melhorias morfológicas dramáticas em todas as áreas do cérebro. Estes resultados confirmam que I2S administrado por via IT é capaz de alterar a progressão de distúrbios de armazenamento lisossomal, em um modelo de camundongo IKO geneticamente modificado, confirmando ainda mais a capacidade de enzimas administradas por via IT, tais como I2S, de tratar as manifestações do CNS associadas com doenças de armazenamento lisossomal, tais como a síndrome de Hunter. EXEMPLO 12 - TRATAMENTO DE PACIENTES COM DOENÇA DE

HUNTER Administração do CNS direta através de, por exemplo, entrega IT pode ser usada para tratar eficazmente os pacientes da doença de Hunter. Este exemplo ilustra um estudo de escalonamento de dose multicêntrico desenhado para avaliar a segurança de níveis de até 3 doses a cada duas semanas (EOW) durante um total de 40 semanas de I2S administrado por meio de um dispositivo intratecal de entrega da droga (IDDD) para os pacientes com a doença de Hunter infantil tardia. Vários exemplos de dispositivos intratecais de entrega de drogas adequados para o tratamento humano estão apresentados na Figura 89 - Figura

92. Até 20 pacientes serão incluídos: 5 Grupo 1: 5 pacientes (menor dose) Grupo 2: 5 pacientes (dose intermediária) Grupo 3: 5 pacientes (maior dose) 5 pacientes serão distribuídos aleatoriamente para nenhum tratamento. Os pacientes são selecionados para o estudo com base na inclusão dos seguintes critérios: (1) aparecimento dos primeiros sintomas antes de 30 meses de idade, (2) ambulatório no momento de triagem (definida como a capacidade de suportar-se por si só e andar para a frente 10 passos com uma mão presa), (3) presença de sinais neurológicos no momento da triagem. Tipicamente, os históricos de pacientes de transplante de células-tronco hematopoiéticas são excluídos. A segurança de doses ascendentes de I2S administrado por injeção IT por 40 semanas em crianças com doença de Hunter infantil tardia é determinada. Além disso, a atividade clínica da I2S sobre a função motora grossa e farmacocinética de dose única e repetida em soro e concentrações no líquido cefalorraquidiano (CSF) é avaliada. Entrega IT de Proteína rhASA EXEMPLO 13: ESTUDO TOXICOLOGIA DE ENTREGA IT DE

RECOMBINANTE ASA Para avaliar a capacidade de outras enzimas recombinantes administradas intratecalmente para se distribuir para as células e tecidos do sistema nervoso central, o estudo de GLP foi conduzido para avaliar administração intratecal (IT) de doses repetidas de arilsulfatase A humana (rhASA) preparada de modo 5 recombinante a partir de uma perspectiva de toxicologia e de farmacologia de segurança ao longo de um período de um mês, em macacos caranguejeiros jovens (menos de 12 meses de idade). A formulação de rhASA foi preparada e formulada em um veículo de 154 mM de NaCl, 0,005% de polissorbato 20, com um pH de 6,0. Para conseguir isto, nove machos e nove fêmeas de macacos caranguejeiros jovens foram aleatoriamente distribuídos por peso de corpo a um dos três grupos de tratamento como mostrado na seguinte Tabela 28. Os animais (com exceção de um animal macho para Dose 1) receberam 0,6mL de infusão IT de curto prazo de 0, 3 ou 31 mg/mL de rhASA (dose total de 0 mg, 1,8 ou 18,6) a cada duas semanas por um total de três doses por animal.

Pesos corporais, observações clínicas, exames neurológicos e físicos, patologia clínica, exames oftalmológicos, e amostragem toxicocinética foram monitorados.

Todos os animais foram necropsiados no Dia 29, 30 ou 31 (~ 24 horas após a última dose IT). Tecidos selecionados foram coletados, salvos e examinados microscopicamente.

Tabela 28

Concentração Dose Número de de Dose Volume de Grupo Administrada Animais Nominal Dose (mL) (mg) (mg/mL)

1 3M, 3F 0 0.6 0 2 3M, 3F 3 0.6 1.8 3 3M, 3F 31 0.6 18.6

As concentrações de rhASA detectado nos tecidos do sistema nervoso central dos macacos caranguejeiros foram analisadas por ELISA e comparados com um alvo terapêutico de 10% de concentrações normais de rhASA humano, 5 correspondendo a aproximadamente 2,5ng/mg de tecido.

As amostras de tecidos ou punções foram extraídas de diferentes áreas dos cérebros dos macacos caranguejeiros e depois analisadas quanto à presença de rhASA.

Figura 133 – Figura 138 ilustra os tecidos a partir dos quais as punções foram extraídas.

As amostras de tecidos punçado refletiram um aumento nas concentrações de rhASA, como refletido na Figura 139A-G, com um gradiente de deposição do córtex cerebral até a de matéria branca profunda e matéria cinzenta profunda.

Concentrações de rhASA detectadas usando a mesma punção de ambas as vias de administração IT e ICV de seis macacos administrados com dose de 18.6mg de rhASA, estão ilustradas na Figura 140A-B.

As concentrações de rhASA detectadas na matéria branca profunda (Figura 140a) e na matéria cinzenta profunda (Figura 140B) dos tecidos cerebrais de macacos caranguejeiros adulto e jovens administrados com rhASA por via intratecal (IT) ou intracerebroventricular (ICV) foram comparáveis.

As amostras de tecido punçado extraídas dos cérebros de macacos caranguejeiros adultos e jovens foram então analisadas para determinar as concentrações de rhASA depositado na amostra de tecido extraída e comparar essas concentrações à concentração terapêutica alvo de 2.5ng de rhASA por mg de proteína (que corresponde a 10% da concentração normal de rhASA em um indivíduo saudável). Como ilustrado na Figura 141A, em cada punção de amostra de 5 tecido analisada a dose de 18.6mg de rhASA administrado por via IT resultou em uma concentração de rhASA que excedeu a concentração terapêutica alvo de 2.5ng/mg de proteína.

Similarmente, quando uma dose de 1.8mg de rhASA foi administrada via IT a macacos caranguejeiros jovens, cada punção de amostra de tecido analisada demonstrou uma concentração de rhASA dentro ou excedendo a concentração terapêutica de 2.5ng/mg de proteína e as concentrações médias de rhASA ficaram acima do alvo terapêutico para todas as punções de tecido testadas (Figura 141b). Para determinar se rhASA administrado por via IT estava se distribuindo para as células relevantes, o tecido foi analisado a partir da matéria branca profunda de um macaco caranguejeiro administrado por via IT com 1.8mg de rhASA, a partir da área ilustrada na Figura 142A.

A imunocoloração do tecido de matéria branca profunda revelou distribuição de rhASA no macaco caranguejeiro em células de oligodendrócitos, como ilustrado pela Figura 142B.

Do mesmo modo, a Figura 142C ilustra que rhASA administrado por via IT demonstrou co-localização nos tecidos profundos da matéria branca do macaco caranguejeiro.

Em particular, sob coloração de co-localização em organelas-alvo, tais como o lisossoma, é evidente (Figura 142C), apoiando a conclusão de que a RhASA administrado por via IT é capaz de se distribuir para as relevantes células, tecidos e organelos do CNS, incluindo os lisossomos de oligodendrócitos.

EXEMPLO 14. ADMINISTRAÇÃO POR VIA IT VERSUS ICV 124 rhASA rotulado com o emissor de pósitrons I foi preparado e formulado em um veículo de 154 mM de NaCl, 0,005% de polissorbato 20, com um pH de 6,0. Um volume da 5 formulação equivalente a 3 mg de rhASA (correspondente a cerca de 38mg/kg de cérebro) foi administrado a macacos caranguejeiros adultos por vias de administração intracerebroventricular (ICV) e intratecal (IT). Os macacos caranguejeiros foram submetidos a estudos de imagem (microPET P4) de varredura PET de alta resolução para 124 determinar a distribuição do rhASA rotulado I administrado.

Dados de imagem de PET (Figura 143) ilustram que rhASA 124 rotulado I administrado por ambas as vias ICV e IT foi eficazmente distribuído para os tecidos do CNS, e em 124 particular o rhASA rotulado I administrado através do cateter IT-lombar imediata e uniformemente se espalhou no líquido cefalorraquidiano (CSF) ao longo do comprimento da coluna vertebral.

Em particular, como representado na Figura 143, após a administração ICV e IT, concentrações 124 terapêuticas de rhASA rotulado I foram detectadas nos tecidos do CNS do sujeito macaco caranguejeiro, incluindo o cérebro, a medula espinhal e CSF.

As concentrações de rhASA detectadas em tais tecidos do CNS, e em particular nos tecidos do cérebro, excedeu a concentração terapêutica alvo da 2.5ng/mg de proteína.

Enquanto a distribuição da proteína rhASA foi comparável para ambas as vias IT e ICV de administração, ICV resultou em, notavelmente, menos deposição na da coluna vertebral, como evidencia a Figura 143.

Vinte e quatro horas após a administração da 124 formulação, rhASA rotulado I administrado por ambas as vias ICV e IT foi distribuído eficazmente para os tecidos do CNS.

Em particular, 24 horas após administração IT de 5 12,4% da dose administrada estava na região craniana, em comparação com 16,7% da dose administrada ICV.

Consequentemente, as concentrações de rhASA detectadas em tecidos do sistema nervoso central tais, e em particular nos tecidos do cérebro, quando rhASA foi administrado por via IT se aproximou daquelas concentrações detectadas após a administração ICV da mesma dose. 124 A injeção ICV rhASA rotulado I resulta na injeção ICV resulta na transferência imediata do volume injetado para a coluna cisterna magna, cisterna basal, cisterna interpeduncularis e espinha proximal, tal como ilustrado na Figura 144. Como também ilustrado na Figura 144, dentro de 124 2-5 horas a administração IT entregou o rhASA rotulado I para os mesmos compartimentos iniciais (cisterna e espinha proximal), como mostrado para a administração ICV.

Vinte e quatro horas após a administração ICV e IT de distribuição 124 de rhASA rotulado I foi comparável na cisterna e área da coluna proximal, tal como ilustrado na Figura 145. Estes resultados confirmam que rhASA pode ser entregue a um sujeito usando a via de administração IT menos invasiva e, assim, atingir concentrações terapêuticas em células alvo e tecidos.

As doenças de amazenamento lisossômico representam uma família de distúrbios genéticos causados por falta ou defeito de enzimas que resultam em acúmulo de substrato anormal.

Embora os sintomas periféricos associados com várias destas doenças possam ser eficazmente mitigados pela administração intravenosa de enzimas recombinantes, não se espera que a administração intravenosa de tais enzimas recombinantes tenha um impacto significativo nas 5 manifestações do CNS associadas com uma maioria dos distúrbios de armazenamento lisossomal.

Por exemplo, o recombinante humano iduronato-2-sulfatase (Idursulfase, Elaprase ®; Shire Human Genetic Therapies, Inc.

Lexington, MA) foi aprovado para o tratamento dos sintomas somáticos da síndrome de Hunter, mas não há nenhuma terapia farmacológica para o tratamento das manifestações neurológicas da Síndrome de Hunter, que pode incluir atraso no desenvolvimento e deficiência mental progressiva.

Isto é em parte devido à natureza de I2S, que é uma enzima grande, altamente glicosilada com um peso molecular de aproximadamente 76kD e que não atravessa a barreira hematoencefálica após a administração intravenosa.

Os presentes inventores, portanto, empreenderam um programa para investigar a entrega intratecal (IT) de formulações intratecais de enzimas recombinantes humanas, tais como, por exemplo, iduronato-2-sulfatase (I2S), arilsulfatase A (rhASA) e alfa-N-acetilglucosaminidase (Naglu). Os resultados aqui apresentados representam os primeiros a demonstrar que a administração IT-lombar de um recombinante de proteínas lisossômicas resulta na entrega de uma fração significativa da proteína administrada ao cérebro e, em particular, resulta na deposição disseminada de tais proteínas em neurônios do cérebro e da medula espinhal em ambos os macacos caranguejeiros e cães.

As análises imuno-histoquímica de tecidos do CNS demonstrou que a proteína se destina ao lisossoma, o local do acúmulo patológico glicosaminoglicano nos distúrbios de armazenamento lisossomal.

Além disso, as melhorias morfológicas demonstradas no modelo de camundongo IKO de 5 síndrome de Hunter, o modelo de camundongo deficiente em Naglu de síndrome Sanfilippo tipo B, e o modelo de camundongo knockout ASA de leucodistrofia metacromática (MLD) reforça a observação de que a enzima administrada por via IT é distribuída aos os tecidos apropriados e transportada para os compartimentos celulares e organelas apropriados.

As similaridades observadas nos padrões de distribuição cerebrais detectados após a administração por via IT-lombar e ICV da I2S é sugestivo de fluxo de massa e remixagem ativa da CSF.

Assim, em um cenário clínico, ambas as vias de administração IT e ICV são potencialmente viáveis, entretanto, a deposição observada de I2S na medula espinhal após a administração IT provê uma clara vantagem no tratamento de sequelas da coluna vertebral e componentes de doenças de armazenamento lisossômicas como a síndrome de Hunter.

Além disso, as portas de injeção espinhal são menos invasivas e espera-se que sejam mais adequadas para o uso crônico, especialmente em sujeitos pediátricos.

Evidências de coloração celular perivascular e dinâmica de translocação de proteína observada pelos estudos de imagem PET precedentes indicam que movimentos de enzimas dentro do espaço perivascular, presumidamente por mecanismos convectivos assistidos por pulsação.

Um mecanismo adicional de transporte é sugerido pela associação observada de I2S com neurofilamentos, indicativa de transporte axonal ativo.

Este último presumidamente começa com a interação de proteínas com receptores neuronais manose-6-fosfato (M6P), que são amplamente expressos em células da medula espinhal e do cérebro, e que 5 após a administração direta para o parênquima cerebral podem forçar a enzima I2S a ser facilmente absorvida por células alvo. (Begley, et al, Curr Pharm Des (2008) 14: 1566-1580). Enquanto o transporte axonal de enzimas lisossomais já foi implicado por métodos indiretos in vivo e por imagem in vitro, os estudos atuais proveem a primeira evidência direta de transporte axonal de enzimas não-viralmente ou expressas entregues através do CSF.

Assim, a entrega de proteína a partir do CSF para a superfície do cérebro e mais profundamente para os tecidos cerebrais para depender de processos de transferência de ativos, nenhum dos quais foram anteriormente descritos ou elucidados para entrega de proteína ou enzima para as células, tecidos e organelos do cérebro.

Ao contrário do ponto de vista prevalecente de que a dinâmica de fluxo do interstício parênquima e CSF impediria a distribuição de proteínas administradas por via IT-lombar para a substância branca do cérebro, os estudos do momento demonstram claramente que a entrega IT de uma enzima lisossomal resulta em distribuição de proteínas e acúmulo de todos os tecidos do cérebro e deposição no compartimento lisossomal de células alvo que são o local do acúmulo patológico de glicosaminoglicano. (Ver, por exemplo, Fenstermacher et al., Ann NY Acad Sci (1988) 531:29-39 e DiChiro et al., Neurology (1976) 26:1-8.) Juntamente com a natureza menos invasiva da entrega IT-lombar, esta via oferece um meio clinicamente relevante de entregar terapias biológicas para o cérebro, particularmente em crianças.

EXEMPLO 15 - TOXICOLOGIA 5 Este exemplo ilustra repetir a administração de dose intratecal (IT) de rhASA a partir de uma perspectiva de toxicologia e farmacologia de segurança durante um período de seis meses.

O artigo de teste IT para este estudo foi rhASA.

Trinta e seis macacos caranguejeiros machos e 36 fêmeas foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de tratamento.

Os animais do Grupo 1 eram controle do dispositivo de implante não tratados (porta e cateter) e não foram dosados com o veículo ou o artigo de teste; entretanto, esses animais foram dosados com 0,6mL de PBS em um cronograma correspondente ao cronograma de dosagem do artigo de teste.

Os animais nos Grupos 2-5 receberam 0,6mL de infusão IT de 0, 3, 10 ou 31 mg/mL de rhASA (dose total de 0, 1,8, 6,0, ou 18,6 mg) a cada duas semanas (ou seja, um total de 12 doses). Os animais foram necropsiados aos 6 meses (24 horas após a última dose IT), e os 4 animais/sexo/grupos restantes foram necropsiados no final de um período de recuperação de 4 semanas.

Tecidos selecionados foram coletadas, salvos e examinados microscopicamente.

Em geral, as alterações relacionadas com o artigo de teste poderiam ser classificadas em dois tipos principais e estavam presentes em todos os níveis de doses (1,8, 6,0 e 18,6 mg/dose). O aumento de infiltrados (glóbulos brancos, normalmente com um componente eosinofílico proeminente) nas meninges, na parênquima cerebral, na parênquima da medula espinhal, gânglio trigeminal, e, ocasionalmente, nas raízes/gânglios do nervo espinhal (ou o epineuro circundando essas estruturas). Este aumento foi interpretado como sendo devido à presença do artigo de 5 teste (uma proteína) no espaço intratecal e nos tecidos do sistema nervoso.

Aumento ligeiro, focal de células da microglia na medula espinhal e do cérebro em animais ocasionais (microgliose não foi observada em todos os animais de dose elevada). Ambas as categorias de alterações morfológicas foram interpretadas como uma resposta à presença do artigo de teste.

Não houve evidência de necrose neuronal em qualquer animal.

Nenhuma das alterações relacionadas ao artigo de teste foi relacionada a quaisquer reações biologicamente adversas no cérebro, medula espinhal, raízes nervosas da coluna vertebral ou gânglios.

Especificamente, não houve evidência de necrose neuronal nem uma resposta glial biologicamente importante.

Não houve lesões relacionadas com o artigo de teste nos tecidos do sistema não-nervoso.

Após um período de recuperação de um mês (um período livre de dosagem), as alterações relacionadas com o artigo de teste tinham totalmente se resolvido ou eram limitadas a remanescentes do aumento prévio da resposta inflamatória associada com a presença do artigo de teste.

Não foram observados efeitos morfológicos adversos nos animais em recuperação.

Como baseada em um exame microscópico cego atribuindo um escore de coloração semi-quantitativa, a coloração imuno-histoquímica para Arilsulfatase A (rhASA, o artigo de teste) foi aumentada no cérebro e na medula espinhal em vários tipos de células, com exceção de neurônios, para todos grupos tratados com artigo de teste no sacrifício terminal.

Este aumento também foi aparente nas células de Kupffer do fígado.

Após o período de recuperação de 1 mês, a coloração rhASA nos animais 5 tratados com artigo de teste (todos os grupos de dose) tinham voltado para os níveis de controle (controle de veículo e/ou dispositivo). Em um macho em recuperação de baixa dose havia múltiplos focos de perda de astrocitose e neuronal, indicando múltiplas áreas de isquemia anterior, no córtex cerebral.

Embora a patogênese exata destas lesões neste animal não fosse aparente, a ausência de lesões similares em qualquer outro animal tratado com o artigo de teste, incluindo os animais de doses elevadas que receberam 10X a dose, indicou que estas lesões não foram relacionadas com o artigo de teste.

O artigo de teste de IT para este estudo foi rhASA.

Trinta e seis macacos caranguejeiros machos e 36 fêmeas foram divididos aleatoriamente em cinco grupos de tratamento.

Os animais do Grupo 1 eram controle do dispositivo de implante não tratados (porta e cateter) e não foram dosados com o veículo nem com o artigo de teste; entretanto, esses animais foram dosados com 0,6 mL de PBS em um cronograma correspondente ao cronograma de dosagem do artigo de teste.

Os animais nos grupos 2-5 receberam 0,6mL de infusão IT de 0, 3, 10 ou 31 mg/mL de rhASA (dose total de 0, 1,8, 6,0, ou 18,6 mg) a cada duas semanas (ou seja, um total de 12 doses) . Os animais foram necropsiados aos 6 meses (24 horas pós-dose IT último), e os restantes 4 animais/sexo/grupo foram necropsiados no final de um período de recuperação de 4 semanas.

Tecidos selecionados foram coletados, salvos e examinados microscopicamente.

A tabela a seguir reflete o desenho do estudo, uma vez que pertence ao aspecto de patologia deste estudo.

No momento do sacrifício, o cérebro foi cortado em uma 5 matriz cerebral a aproximadamente 3 milímetros de espessura do corte coronal.

A primeira fatia e cada segunda fatia na sequência foram fixadas em formol para avaliação histopatológica e imuno-histoquímica.

O cérebro foi processado como seções coronais completas.

Estas seções incluíram no mínimo as seguintes regiões do cérebro. • Neocórtex (incluindo córtex frontal, parietal, temporal e occipital): seções cerebrais 1 a 8 (e fatia 9 quando presente) • Paleocórtex (bulbos olfatórios e/ou lobo piriforme): seções cerebrais 1 a 3 • Gânglios basais (incluindo caudado e putâmen): seções cerebrais 3 e 4 • Sistema Límbico (incluindo hipocampo e giro do cíngulo): seções cerebrais 4 e 5 • Tálamo/hipotálamo e regiões do mesencéfalo incluindo substância negra: seções cerebrais 4 e 5 • Cerebelo, ponte e medula oblonga: seções cerebrais 6 a 8 (e fatia 9 quando presente). As seções cerebrais são listadas nas tabelas de dados como seções 1 a 8/9 (uma seção 9 foi provida pela instalação de teste para alguns animais). O seccionamento variou ligeiramente entre os animais.

As seções do cérebro (de 1 a 8/9) foram providas acima foram a localização aproximada das várias áreas anatômicas.

As seções do cérebro estão listadas nas tabelas de dados como seções individuais, com diagnósticos pertinentes a essa seção, para facilitar a futura, adicional, potencial revisão (se houver) de lâminas.

Durante a interpretação dos dados, os locais anatômicos cerebrais individuais (como listados 5 acima), foram comparados a fim de identificar quaisquer efeitos singulares do artigo de teste (isto é, singulares para uma região particular do cérebro). No TPS, todas as seções do cérebro de todos os animais foram embebidas em parafina, seccionadas a 5 microns, corados com hematoxilina e eosina (H&E) e examinadas microscopicamente.

Além disso, os cérebros dos animais de controle e de doses elevadas foram corados com Fluoro-Jade B (um corante aumentando a sensibilidade da avaliação do cérebro quanto à degeneração neuronal) e um corante prata Bielschowsky (um procedimento que permite a visualização direta de axônios, dendrites e filamentos neuronais) e examinados.

A medula espinhal (cervical, torácica e lombar) foi cortada em seções de um centímetro.

A primeira fatia e cada outra alternada, posteriormente foram fixadas em formol para avaliação histopatológica e imuno-histoquímica.

As seções da medula espinhal (cervical, torácica (incluindo a ponta do cateter) e lombar) de todos os animais foram seccionadas em aproximadamente 5 microns, corados com H&E e examinadas com seções transversais e oblíquas tomadas a cada nível.

Seções em série da medula espinhal de grupos de controle e de doses elevadas foram também corados com corante prata Bielschowsky e corante anti-GFAP (um corante imuno-histoquímico que permite a visualização direta de astrócitos e seus processos). As raízes nervosas da espinha dorsal e dos gânglios

(tomados na médio-cervical, médio-torácica e média-lombar) foram embebidos em parafina, com seções seriais corados com H&E.

Além disso, seções seriais dos grupos de controle e de dose elevada foram coradas com corante prata Bielschowsky. 5 Para as seções do nervo ciático, tibial e sural de todos os animais: uma seção longitudinal de cada nervo foi embebida em parafina, seccionada a cerca de 5 microns e corada com H&E.

Uma seção transversal de cada nervo foi pós-fixada em ósmio, embebida em resina Spurr, seccionada em aproximadamente 1 a 2 microns e corada com azul de toluidina.

Ósmio pós-fixação e embutir em resina proveem a preservação superior da mielina em nervos periféricos e, consequentemente, uma análise mais pormenorizada do nervo.

Todos os tecidos coletados e lesões macroscópicas coletadas na necropsia de todos os animais também foram embebidos em parafina, corados com H&E e examinados ao microscópio.

Processamento histopatológico e avaliações e análises imunohistoquímicas foram realizadas por TPS.

Métodos: Coloração de Arilsulfatase A (rhASA) Lâminas de controle positivo foram fornecidas pelo patrocinador do estudo.

As lâminas eram seções de fígado de camundongos injetado com rhASA.

As lâminas de controle positivo mostraram todas ampla evidência de rhASA em células de Kupffer (macrófagos sinusoidais) no fígado.

As lâminas de controle positivo são armazenadas com as outras lâminas deste estudo.

Todas as avaliações das seções coradas de rhASA foram inicialmente conduzidas às cegas para o grupo de tratamento do animal.

Isto foi conseguido fazendo o patologista inicialmente ler as lâminas coradas rhASA com o número de animais no rótulo obscurecido (por um assistente com conhecimento do animal real sendo avaliado), ditando o escore (grau de severidade) durante a avaliação, e tendo o mesmo assistente imediatamente registrando a marcação com o escore de coloração (grau de severidade) nas 5 tabelas de dados.

A identificação animal foi verificada tanto pelo neuropatologista do estudo quanto pelo assistente para garantir a entrada de dados precisos.

Este procedimento foi conduzido de modo a não apresentar qualquer tendência para o julgamento da intensidade geral da coloração com a coloração imuno-histoquímica para a detecção de rhASA intracelular.

O grau relativo de coloração de neurônios, macrófagos meníngeas, macrófagos perivasculares e células gliais (astrócitos e células da microglia, mas provavelmente predominantemente as células da microglia) foi graduado em todo o cérebro e seções da medula espinhal.

Os escores de gravidade média em cada cérebro e nível de medula espinhal para cada grupo foi totalizado (por grupo) e registrado como um total sob o título de tecido cerebral, geral, coloração rhASA e medula espinhal, geral, coloração rhASA.

Em geral, a coloração rhASA em neurônios do cérebro foi uma medição dos neurônios no córtex cerebral e outras áreas nucleares no cérebro.

A coloração rhASA em macrófagos meníngeos foi evidência de absorção do artigo de teste por macrófagos meníngeos e/ou rhASA endógeno em macrófagos meníngeos.

A coloração rhASA dos macrófagos perivasculares foi uma medição de absorção de rhASA por macrófagos da medula cerebral/espinhal (ou rhASA endógeno), mas deve notar-se que o espaço perivascular no cérebro e medula espinhal (o espaço Virchow-Robins) é contínuo com as meninges.

Em geral, a gradação da coloração rhASA nas células gliais era predominantemente uma medida da absorção do artigo de teste/penetração do artigo de teste na matéria cinzenta e/ou branca, especialmente do córtex cerebral (a 5 coroa radiada é a substância branca abaixo do córtex cerebral). A coloração rhASA na substância branca parecia estar em astrócitos e células da microglia.

O esquema de gradação seguinte foi usado para pontuar o grau de coloração rhASA dos vários tipos de células (neurônios, células gliais, macrófagos). Explicação de Grau (% da coloração das possíveis células) 1 Inferior a 10% 2 Superior a 10 a 25% 3 Superior a 25 a 50% 4 Superior a 50 a 75% 5 Superior a 75% Note-se que esse esquema não é estritamente quantitativo.

Foi usado como um método semi-quantitativo para avaliar o cérebro e a medula espinhal quanto ao grau de coloração com rhASA.

Notou-se que o Estudo Neuropatologista que nem todas as áreas neuronais tinham coloração rhASA igual.

Notou-se também que houve coloração neuronal endógena em alguns animais de controle e que as células do plexo coroide e neurônios dos gânglios da raiz dorsal tenderam a fortemente a corar para rhASA mesmo em animais de controle.

Coloração do plexo coroide e gânglios da raiz dorsal não foi graduada, mas foi observado pelo estudo neuropatologista a ser proeminente, mesmo em animais de controle.

Nota: Todos os grupos de dosagem: dose baixa=1,8 mg/dose; dose média=6,0 mg/dose; Dose elevada=18,6 mg/dose.

Não havia lesões relacionadas com o artigo de teste nos tecidos do sistema não-nervoso, exceto pelo aumento da 5 coloração de rhASA no fígado de todos os grupos de dose (macho e fêmea, ver abaixo). ANIMAIS DE SACRIFÍCIO TERMINAL (6 MESES DE DOSAGEM A CADA DUAS SEMANAS): SEÇÕES CORADAS rhASA Houve um aumento de coloração rhASA nos seguintes tipos de tecidos/ células.

Ao considerar um efeito de artigo de teste no grau de coloração rhASA em um tipo particular de célula, em um grupo de dose em particular, os níveis de coloração no controle de veículo concorrente e o dispositivo de controle (sacrificados com os animais sacrificados em recuperação) foram considerados para comparação.

Cérebro, Meninges, Macrófagos (todos os grupos de dose, machos e fêmeas) • Cérebro, Perivascular, Macrófagos (todos os grupos de dose, machos e fêmeas) • Cérebro, Células da Glia (todos os grupos de dose, machos e fêmeas) • Medula Espinhal, Meninges, Macrófagos (todos os grupos de dose, machos e fêmeas) • Medula Espinhal, Perivascular, Macrófagos (todos os grupos de dose, machos e fêmeas) • Medula Espinhal, Células Gliais (doses médias e altas, machos e fêmeas) • Fígado, Células de Kupffer (todos os grupos de dose, machos e fêmeas)

Devido a coloração endógena, os níveis de coloração ARSA nos neurônios do cérebro e da medula espinhal foram os mais difíceis de definir especificamente. A coloração rhASA demonstrou níveis de rhASA consistentemente elevados nos 5 macrófagos perivasculares de meninges e cérebro/medula espinhal e também dentro de células gliais. Não houve diferenças detectáveis de coloração rhASA em neurônios entre os animais de controle e os animais tratados com artigo de teste. ANIMAIS DE SACRIFÍCIO EM RECUPERAÇÃO (6 MESES DE

DOSAGEM A CADA DUAS SEMANAS SEGUIDOS POR UM PERÍODO DE UM MÊS SEM DOSAGEM) Em geral, as alterações relacionadas com o artigo de teste ou foram totalmente resolvidas ou foram notavelmente diminuídas naqueles animais deixados por um período de um mês sem dosagem antes da necropsia. As seguintes alterações microscópicas estavam presentes em um incidente e/ou severidade que indicou uma possível relação com o artigo de teste. Alterações Microscópicas Relacionadas com o Artigo de Teste (Animais em Recuperação) • Cérebro, Meninges, Infiltrados (grupos de dose média e alta, ambos os sexos) (Figura 111 e Figura 112) • Cérebro, Meninges, Infiltrados, Eosinófilos% (machos de dose média; fêmeas de dose elevada) • Cérebro, Perivascular, Infiltrado (machos de dose média; fêmeas de dose elevada) (Figura 113) • Cérebro, Perivascular, Infiltrado, Eosinófilos% (machos de dose média; fêmeas de dose elevada) • Cérebro, Matéria cinzenta, Infiltrados (todos os grupos de dosagem, ambos os sexos) • Cérebro, Infiltrados Matéria cinzenta, Eosinófilos% (machos dose baixa) • Cérebro, Matéria cinzenta, Eosinófilos, Necrose 5 (machos de dose baixa) • Medula Espinhal, Meninges, Infiltrados (machos de doses média e alta, fêmeas de doses baixa e alta) • Medula Espinhal, Meninges, Infiltrados, Eosinófilos% (machos de dose média, fêmeas de dose baixa) • Medula Espinhal, Matéria cinzenta, Infiltrados (fêmeas de dose baixa) • Medula Espinhal, Matéria cinzenta, Infiltrados, Eosinófilos% (fêmeas de dose baixa) • Gânglio da Raiz Dorsal e Raízes, Epineuro, Infiltrados (fêmeas de dose média) • Raízes Nervosas da Coluna Vertebral e Gânglios, Infiltrados, Eosinófilos (machos de dose média e alta; todas as doses, fêmeas) • Gânglio Trigeminal, Infiltrados, Eosinófilos (machos e fêmeas de dose média) Todas essas mudanças foram interpretados para representar remanescentes das alterações inflamatórias aumentadas observado nos animais de sacrifício terminais.

Tal como nos animais de sacrifício terminais, não houve evidência de aumento dos infiltrados de células inflamatórias ainda presentes em alguns animais em recuperação representado alterações morfológicas que estavam causando quaisquer efeitos adversos.

Não houve lesões relacionadas com o artigo de teste nos tecidos do sistema não-nervoso.

ANIMAIS DE SACRIFÍCIO EM RECUPERAÇÃO (6 MESES DE CADA

DOSAGEM OUTRA SEMANA SEGUIDO POR UM PERÍODO DE UM MÊS SEM DOSAGEM):

COLORAÇÃO ARSA 5 Não houve qualquer indicação de aumento da coloração rhASA nos machos ou fêmeas em recuperação quando comparado com o dispositivo e/ou controles de veículo. No cérebro dos machos em recuperação de doses baixas, médias e elevadas, havia, na verdade, uma indicação de coloração rhASA diminuída em alguns tipos de células (isto variou entre os grupos de tratamento), em comparação com o dispositivo e/ou controles de veículo. A razão para isso, incluindo se este foi ou não um efeito real, não era aparente. Uma explicação possível seria a de que a administração exógena de rhASA pode causar alguma redução na produção endógena de rhASA. Uma constatação similar não estava presente na medula espinhal dos machos. Nos machos e fêmeas em recuperação, a coloração no fígado foi similar àquela observada nos controles. Em geral, as alterações relacionadas com artigos de teste poderiam ser classificadas em dois tipos principais e estavam presentes em todos os níveis de dose (1,8, 6,0 e 18,6 mg/dose). O aumento de infiltrados (de glóbulos brancos, normalmente com um componente eosinofílico proeminente) nas meninges, na parênquima cerebral, parênquima da medula espinhal, gânglio trigeminal, e, ocasionalmente, as raízes do nervo espinhal/gânglios (ou o epineuro circundando essas estruturas). Este aumento foi interpretado como sendo devido à presença do artigo de teste (uma proteína) no espaço intratecal e nos tecidos do sistema nervoso.

O aumento ligeiro, focal de células da microglia na medula espinhal e do cérebro em animais ocasionais (microgliose não foi observada em todos os animais de dose 5 elevada). Ambas as categorias de alterações morfológicas foram interpretadas como uma resposta à presença do artigo de teste.

Não houve evidência de necrose neuronal em qualquer animal.

Avaliação das seções corados de rhASA está pendente a partir da escrita deste relatório intercalar.

Nenhuma das alterações relacionadas com o artigo de teste foi relacionada a quaisquer reações biologicamente adversas no cérebro, medula espinhal, raízes nervosas da coluna vertebral ou gânglios.

Especificamente, não houve evidência de necrose neuronal nem uma resposta glial biologicamente importante.

Não houve lesões relacionadas com o artigo de teste nos tecidos do sistema não-nervoso.

Após um período de recuperação de um mês (um período livre de dosagem), as alterações relacionadas com o artigo de teste tinham se resolvido totalmente ou eram limitadas a remanescentes do aumento prévio da resposta inflamatória associada com a presença do artigo de teste.

Não foram observados efeitos morfológicos adversos nos animais em recuperação.

Como baseada em um exame microscópico cego atribuindo um escore de coloração semi-quantitativa, a coloração imuno-histoquímica para Arilsulfatase A (rhASA; o artigo de teste) foi aumentada no cérebro e na medula espinhal em vários tipos de células, com exceção de neurônios, para todos grupos tratados com artigo de teste.

Este aumento também foi aparente nas células de Kupffer do fígado.

Após o período de recuperação de 1 mês, a coloração rhASA nos animais tratados com artigo de teste (todos os grupos de dose) tinham voltado para os níveis de controle (controle de veículo e/ou dispositivo). Em um macho em recuperação de baixa dose havia múltiplos focos de perda de astrocitose e 5 neuronal, indicando múltiplas áreas de isquemia anterior, no córtex cerebral.

Embora a patogênese exata destas lesões neste animal não fosse aparente, a ausência de lesões similares em qualquer outro animal tratado com o artigo de teste, incluindo os animais de doses elevadas que receberam 10X a dose, indicou que estas lesões não foram relacionadas com o artigo de teste.

No momento da emissão deste relatório preliminar, e com base estritamente nas constatações microscópicas e macroscópicas (na inclusão em parafina, e seções de coloração em hematoxilina e eosina) neste estudo, o nível de efeito adverso não observado (NOAEL) foi de 18,6 mg.

EXEMPLO 16 - DADOS FARMACINÉTICOS Dados de Animais de 6 meses Este exemplo provê uma análise interpretativa para concentrações de rhASA no soro e CSF e anticorpos anti- rhASA no soro da Northern Biomedical Research, Inc.

O objetivo do exemplo foi avaliar a administração de dose intratecal (IT) repetida de rhASA de uma perspectiva de toxicologia e farmacologia de segurança em macaco caranguejeiro juvenil (<12 meses de idade). Um total de 12 doses foram fornecidas em um período de seis meses.

Os animais foram necropsiados 24 horas ou um mês após a administração da última dose.

O desenho do estudo é apresentado na Tabela 29. Tabela 29: Desenho de Estudo de 047-021 (rhASA 1-09-

015)

Desenho de Estudo Nº de Concentração Nº de Dose Animais, Nº de de Dose Animais, Grupo Administrada Sacrifício Animais Nominal Sacrifício (mg) 1 Mês em (mg/mL) 6 Meses recuperação 1 4M, 4F DC 0 - 4M, 4F 2 8M, 8F 0 0 4 M, 3 Fa 4M, 4F 3 8M, 8F 3 1.8 4 M, 4 F 4M, 4F 4 8M, 8F 10 6.0 4 M, 4 F 4M, 4F 5 8M, 8F 31 18.6 4 M, 4 F 4M, 4F

DC = Controle de dispositivos; Animais do Grupo 1 não foram dosados com veículo ou artigo de teste. a Animal de Controle de Veículo nº 044 foi sacrificado 5 antes no Dia 50 devido a um vazamento de cateter Métodos de Ensaio - Análise de Anticorpos A quantificação de anticorpos anti-rhASA no soro e CSF de macaco caranguejeiro foi realizada usando um método validado.

Resumidamente, o ensaio começa pelo bloqueio de uma placa de MSD revestida por estreptavidina, seguido da incubação com rhASA rotulado de biotina.

Após uma etapa de lavagem, as amostras diluídas, os calibradores e QCs são adicionadas à placa e incubados.

Após um passo de lavagem adicional, a droga rotulada de SULFO TAG é adicionada e incubada.

Uma etapa de lavagem final é realizada e o buffer de leitura MSD é adicionado.

As placas são lidas imediatamente.

Os dados de sinal em unidades de luminescência relativa (RLU) são analisados usando modelos Softmax Pro.

Concentração no Soro e CSF A quantificação de rhASA no soro e CSF de macaco caranguejeiro foi conduzida usando um método validado.

O método baseia-se na tecnologia Enzyme-Linked Immunosorbent 5 Assay (ELISA). Resumidamente, uma placa de microtitulação é revestida com um anticorpo policlonal de coelho (SH040) criado contra recombinante humano Arilsulfatase A (rhASA). Depois da incubação com amostras de teste e padrões de referência de rhASA, a proteína rhASA ligada é detectada pelo anticorpo monoclonal anti-ASA(clone 19-16-3) conjugado com peroxidase de rábano (HRP). A placa é então incubada com um substrato de HRP, TMB peroxidase.

Esta reação enzima-substrato é interrompida pela adição de ácido sulfúrico 2N (H2SO4) e a absorbância de cada poço é medida no comprimento de onda de absorbância de 450 nm com um comprimento de onda de referência de 655 nm.

As concentrações de rhASA em amostras são calculadas usando a curva de calibração rhASA na mesma placa.

O resumo das concentrações de rhASA no soro é apresentado na Tabela 30. O resumo das concentrações de rhASA no CSF é apresentado na Tabela 31. O resumo das concentrações de anticorpos anti-rhASA no soro é apresentado na Tabela 32. O resumo das concentrações de anticorpos anti-rhASA no CSF é apresentado na Tabela 33. Incidência de anticorpos por grupo e sexo é apresentada na Tabela 36. Tabela 30: Resumo da concentração de rhASA no soro em macaco caranguejeiro

Grupo 1: Controle de veículo Macho Fêmea

Média SD n Média SD n

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 0 0 4 0 0 4

Pós-dose 2 0 0 4 0 0 4

Pré-dose 4 0 0 4 0 0 4

Pós-dose 4 0 0 4 0 0 4

Pré-dose 6 0 0 4 0 0 4

Pós-dose 6 0 0 4 0 0 4

Pré-dose 8 0 0 4 0 0 4

Pós-dose 8 0 0 4 0 0 4

Pré-dose 10 0 0 4 0 0 4

Pós-dose 10 0 0 4 0 0 4

Pré-dose 12 0 0 4 0 0 4

Pós-dose 12 0 0 4 0 0 4

Recuperação média 0 0 4 0 0 4

Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Grupo 2: 0 mg Macho Fêmea

Média SD n Média SD n

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 0 0 8 0 0 7

Pós-dose 2 0 0 8 0 0 7

Pré-dose 4 0 0 8 0 0 7

Pós-dose 4 0 0 8 0 0 7

Pré-dose 6 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 6 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 8 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 8 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 10 0 0 8 0 0 7

Pós-dose 10 0 0 8 0 0 7

Pré-dose 12 0 0 8 0 0 7

Pós-dose 12 (Necropsia antes de

6 meses) 0 0 8 0 0 8

Recuperação média 0 0 4 0 0 4

Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Tabela 30 (cont.): Resumo da concentração de rhASA no soro em macaco caranguejeiro Grupo 3: 1.8 mg Macho Fêmea

Média SD n Média SD n

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 2 49.2 46.8 8 40.3 27.3 8

Pré-dose 4 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 4 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 6 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 6 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 8 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 8 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 10 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 10 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 12 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 12 (Necropsia antes de

6 meses) 0 0 8 0 0 8

Recuperação média 0 0 4 0 0 4

Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Grupo 4: 6.0 mg Macho Fêmea

Média SD n Média SD n

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 2 173.6 69.5 8 143.2 89.0 8

Pré-dose 4 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 4 17 49 8 63.8 119.9 8

Pré-dose 6 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 6 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 8 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 8 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 10 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 10 0 0 8 0 0 8

Pré-dose 12 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 12 (Necropsia antes de

6 meses) 0 0 8 0 0 8

Recuperação média 0 0 4 0 0 4

Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Tabela 30 (cont.): Resumo da concentração de rhASA no soro em macaco caranguejeiro Grupo 5: 18.6 mg Macho Fêmea

Média SD n Média SD n

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 2 348.0 272.9 8 562.3 204.3 8

Pré-dose 4 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 4 105.7 274.6 8 172.0 141.3 8

Pré-dose 6 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 6 20.4 38.4 8 88.6 121.4 8

Pré-dose 8 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 8 0 0 8 54.0 89.4 8

Pré-dose 10 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 10 0 0 8 6 18 8

Pré-dose 12 0 0 8 0 0 8

Pós-dose 12 (Necropsia antes de

6 meses) 0 0 8 0 0 8

Recuperação média 0 0 4 0 0 4

Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Tabela 31: Resumo das concentrações de CSF em macaco caranguejeiro Grupo 1: Controle de veículo Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Pré-dose 2 0 0 4 0 0 4 Pós-dose 2 0 0 4 0 0 4 Pré-dose 4 0 0 4 0 0 4 Pós-dose 4 0 0 4 0 0 4 Pré-dose 6 0 0 4 0 0 4 Pós-dose 6 0 0 4 0 0 4 Pré-dose 8 0 0 4 0 0 4 Pós-dose 8 0 0 4 0 0 4 Pré-dose 10 0 0 4 0 0 4 Pós-dose 10 0 0 3 0 0 4 Pré-dose 12 0 0 3 0 0 4 Pós-dose 12 0 0 3 0 0 4 Recuperação média 0 0 3 0 0 4 Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Grupo 2: 0 mg Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Pré-dose 2 0 0 6 0 0 7 Pós-dose 2 0 0 5 0 0 7 Pré-dose 4 0 0 5 0 0 6 Pós-dose 4 0 0 5 0 0 5 Pré-dose 6 0 0 5 0 0 5 Pós-dose 6 0 0 5 0 0 5 Pré-dose 8 0 0 5 0 0 5 Pós-dose 8 0 0 5 0 0 5 Pré-dose 10 0 0 4 0 0 5 Pós-dose 10 0 0 4 0 0 5 Pré-dose 12 0 0 4 0 0 5 Pós-dose 12 (Necropsia antes de 6 meses) 0 0 5 0 0 5 Recuperação média 0 0 2 0 0 3 Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4 Tabela 31 (cont.): Resumo das concentrações de CSF em macaco caranguejeiro Grupo 3: 1.8 mg Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Pré-dose 2 42491 59255 7 42217 47300 6 Pós-dose 2 95886 22626 7 125717 61723 6 Pré-dose 4 17664 24372 6 50829 41891 6 10678 Pós-dose 4 3 42823 6 138400 49908 6 Pré-dose 6 39400 50105 4 45817 38404 6

Pós-dose 6 95275 12836 4 104080 37423 5 Pré-dose 8 25799 31589 4 58086 43821 5 14875 Pós-dose 8 0 34664 4 119200 66556 5 Pré-dose 10 25927 31380 4 30380 30328 5 Pós-dose 10 89975 29494 4 105200 44603 5 Pré-dose 12 29746 34267 4 82780 65906 5 Pós-dose 12 (Necropsia antes de 6 meses) 32030 39155 7 47331 49015 6 Recuperação média 0 0 3 0 0 2 Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Grupo 4: 6.0 mg Macho Fêmea

Média SD n Média SD n

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 75203 67002 8 146979 233673 6

Pós-dose 2 360000 179276 8 267667 103369 6

Pré-dose 4 58064 77210 8 53285 73340 5

Pós-dose 4 369250 241251 8 305517 152232 6

Pré-dose 6 77253 91407 8 97987 146762 6

Pós-dose 6 418600 200098 5 369000 232238 5

Pré-dose 8 66342 80374 5 11592 23072 4

Pós-dose 8 329400 209841 5 340500 135128 4

Pré-dose 10 119420 148408 5 74031 104609 2

Pós-dose 10 412000 149278 5 245500 161927 2

Pré-dose 12 68651 92902 5 74577 105251 2

Pós-dose 12 (Necropsia antes de

6 meses) 141833 173933 7 58986 99016 4

Recuperação média 0 0 3 0 NA 1

Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Tabela 31 (cont.): Resumo das concentrações de CSF em macaco caranguejeiro Grupo 5: 18.6 mg Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL 28991 29118 Pré-dose 2 7 8 7 201339 250774 8 73442 29835 Pós-dose 2 9 2 7 920143 448409 7 15023 21030 Pré-dose 4 8 2 7 169895 185675 6 98485 57003 Pós-dose 4 7 9 7 965167 425924 6 26547 25206 Pré-dose 6 9 7 7 288879 226889 6 75814 10200 127000 Pós-dose 6 3 9 7 0 558533 6 19052 24008 Pré-dose 8 9 1 7 196021 199396 6 10034 53827 Pós-dose 8 29 1 7 989800 585072 5 17629 27250 Pré-dose 10 7 0 7 168864 191087 6 10130 39067 Pós-dose 10 00 3 7 773400 103717 5 14233 19679 Pré-dose 12 4 3 5 430542 436534 6 Pós-dose 12 (Necropsia 29152 35025 antes de 6 meses) 5 1 7 252142 381200 6

Recuperação média 0 0 3 0 0 2 Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4 Tabela 32: Resumo da concentração de anticorpos Anti- rhASA no soro Grupo 1: Controle de veículo Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/ML ng/mL ng/mL Pré-dosagem 2 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 4 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 6 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 8 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 10 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 12 0 0 4 0 0 4 Recuperação média 0 0 4 0 0 4 Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Grupo 2: 0 mg Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Pré-dosagem 2 0 0 8 0 0 8 Pré-dosagem 4 0 0 8 0 0 8 Pré-dosagem 6 0 0 8 0 0 7 Pré-dosagem 8 0 0 8 0 0 7 Pré-dosagem 10 0 0 8 0 0 7 Pré-dosagem 12 0 0 8 0 0 7 Necropsia (24h após a última dose) 0 0 4 0 0 4

Recuperação média 0 0 4 0 0 4 Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Grupo 3: 1.8 mg Macho Fêmea

Média SD n Média SD N

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dosagem 2 0 0 8 0 0 8

Pré-dosagem 4 18409 21371 8 27648 37504 8

Pré-dosagem 6 75913 64863 8 85625 79871 8

Pré-dosagem 8 132163 95576 8 151900 97818 8

Pré-dosagem 10 392338 606626 8 290675 186213 8

Pré-dosagem 12 499438 735028 8 524438 569523 8

Necropsia (24h após a última dose) 261625 157865 4 733550 928411 4

Recuperação média 339250 265888 4 377175 218955 4

110712

Necropsia de recuperação 712500 9 4 295525 174718 4

Tabela 32 (cont.): Resumo da concentração de anticorpos Anti-rhASA no soro Grupo 4: 6.0 mg Macho Fêmea

Média SD n Média SD N

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dosagem 2 0 0 8 0 0 8

Pré-dosagem 4 30419 30561 8 64000 89510 8

Pré-dosagem 6 143693 128094 8 191750 150511 8

Pré-dosagem 8 325750 190651 8 305850 224707 8

Pré-dosagem 10 669125 515458 8 832188 846241 8

Pré-dosagem 12 946125 651530 8 1060775 1088889 8

Necropsia (24h após a última dose) 713500 598812 4 1047568 1132048 4

Recuperação média 1566000 708132 4 975500 1149734 4

Necropsia de recuperação 1113250 554510 4 793000 991450 4

Grupo 5: 18.6 mg Macho Fêmea

Média SD n Média SD N

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dosagem 2 0 0 8 0 0 8

Pré-dosagem 4 56873 39107 8 39994 53411 8

Pré-dosagem 6 311638 237796 8 193263 208952 8

Pré-dosagem 8 482875 270130 8 399363 360425 8

Pré-dosagem 10 1006750 857916 8 866875 894776 8

Pré-dosagem 12 1419000 1382276 8 1341500 1373771 8

Necropsia (24h após a última dose) 165000 147463 4 407300 268570 4

Recuperação média 2884250 1363128 4 2101500 2090420 4

Necropsia de recuperação 2504250 1118042 4 1506000 1524682 4

Tabela 33: Resumo da concentração de anticorpos Anti- rhASA no CSF Grupo 1: Controle de veículo Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Cirurgia 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 2 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 4 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 6 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 8 0 0 4 0 0 4

Pré-dosagem 10 0 0 4 0 0 4 Pré-dosagem 12 0 0 3 0 0 4 Recuperação média 0 0 3 0 0 4 Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Grupo 2: 0 mg Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Cirurgia 0 0 7 0 0 6 Pré-dosagem 2 0 0 6 0 0 7 Pré-dosagem 4 0 0 5 0 0 6 Pré-dosagem 6 0 0 5 0 0 5 Pré-dosagem 8 0 0 5 0 0 5 Pré-dosagem 10 0 0 4 0 0 5 Pré-dosagem 12 0 0 4 0 0 5 Necropsia (24h após a última dose) 0 0 3 0 0 2 Recuperação média 0 NA 1 0 0 3 Necropsia de recuperação 0 0 4 0 0 4

Grupo 3: 1.8 mg Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Cirurgia 0 0 7 0 0 8 Pré-dosagem 2 0 0 7 0 0 6 Pré-dosagem 4 0 0 6 41 101 6 Pré-dosagem 6 685 1317 4 632 1413 5

Pré-dosagem 8 2238 2596 4 2180 4875 5 Pré-dosagem 10 3393 5038 4 5560 12433 5 Pré-dosagem 12 6436 8266 4 12700 28398 5 Necropsia (24h após a última dose) 14848 12401 4 21442 32382 4 Recuperação média 29307 40617 3 18700 283 2 Necropsia de recuperação 21060 30010 3 13078 7181 4 Tabela 33 (cont.): Resumo da concentração de anticorpos Anti-rhASA no CSF Grupo 4: 6.0 mg Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Cirurgia 0 0 7 0 0 8 Pré-dosagem 2 0 0 7 0 0 6 Pré-dosagem 4 99 172 7 84 187 5 Pré-dosagem 6 1117 1862 8 1473 2775 6 Pré-dosagem 8 3987 5580 5 20824 27320 4 Pré-dosagem 10 6600 9679 5 2715 1237 2 Pré-dosagem 12 5285 7279 5 955 1237 2 Necropsia (24h após a última dose) 16870 16350 4 63000 63000 3 Recuperação média 66233 42238 3 16800 NA 1 Necropsia de recuperação 53600 14388 3 28880 29890 4

Grupo 5: 18.6 mg Macho Fêmea Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Cirurgia 0 0 7 0 0 6 Pré-dosagem 2 0 0 7 0 0 8 Pré-dosagem 4 102 192 7 0 0 6 Pré-dosagem 6 233 351 7 1506 3234 6 Pré-dosagem 8 3378 5931 7 6367 9865 6 Pré-dosagem 10 16327 24035 7 19567 27542 6 Pré-dosagem 12 11596 16406 5 15143 24351 6 Necropsia (24h após a última dose) 5168 7427 4 12135 10341 4 Recuperação média 54700 26439 3 46315 62770 2 Necropsia de recuperação 50725 29217 4 37790 35967 4 Tabela 34: Soro e CSF concentrações de rhASA, combinado masculino e feminino (ng/mL) Grupo 1: Controle de RhASA no soro RhASA no CSF veículo (ng/mL) (ng/mL) Grupo no total Grupo no total Ponto de tempo Média SD n Média SD n ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Pré-dose 2 0 0 8 0 0 8 Pós-dose 2 0 0 8 0 0 8 Pré-dose 4 0 0 8 0 0 8 Pós-dose 4 0 0 8 0 0 8 Pré-dose 6 0 0 8 0 0 8 Pós-dose 6 0 0 8 0 0 8 Pré-dose 8 0 0 8 0 0 8 Pós-dose 8 0 0 8 0 0 8 Pré-dose 10 0 0 8 0 0 8 Pós-dose 10 0 0 8 0 0 7

Pré-dose 12 0 0 8 0 0 7 Pós-dose 12 0 0 8 0 0 7 Recuperação média 0 0 8 0 0 7 Necropsia de recuperação 0 0 8 0 0 8

RhASA no soro RhASA no CSF Grupo 2: 0 mg (ng/mL) (ng/mL) Grupo no total Grupo no total Ponto de tempo Média SD n Média SD n ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Pré-dose 2 0 0 16 0 0 13 Pós-dose 2 0 0 16 0 0 12 Pré-dose 4 0 0 16 0 0 11 Pós-dose 4 0 0 16 0 0 10 Pré-dose 6 0 0 15 0 0 10 Pós-dose 6 0 0 15 0 0 10 Pré-dose 8 0 0 15 0 0 10 Pós-dose 8 0 0 15 0 0 10 Pré-dose 10 0 0 15 0 0 9 Pós-dose 10 0 0 15 0 0 9 Pré-dose 12 0 0 15 0 0 9 Pós-dose 12 (Necropsia antes de 6 meses) 0 0 15 0 0 10 Recuperação média 0 0 8 0 0 5 Necropsia de recuperação 0 0 8 0 0 8 Tabela 34 (cont.): concentrações de rhASA no soro e CSF, combinado masculino e feminino (ng/mL) RhASA no soro RhASA no CSF

Grupo 3: 1.8 mg (ng/mL) (ng/mL)

Grupo no total Grupo no total

Ponto de tempo Média SD n Média SD n ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 0 0 16 42365 51844 13

Pós-dose 2 44.7 37.3 16 109654 45639 13

Pré-dose 4 0 0 16 34247 36982 12

Pós-dose 4 0 0 16 122592 47311 12

Pré-dose 6 0 0 16 43250 40831 10

Pós-dose 6 0 0 16 100167 27992 9

Pré-dose 8 0 0 16 43736 40298 9

Pós-dose 8 0 0 16 132333 53926 9

Pré-dose 10 0 0 16 28401 28890 9

Pós-dose 10 0 0 16 98433 37220 9

Pré-dose 12 0 0 16 59209 58253 9

Pós-dose 12 (Necropsia antes de

6 meses) 0 0 16 39092 42786 13

Recuperação média 0 0 8 0 0 5

Necropsia de recuperação 0 0 8 0 0 8

RhASA no soro RhASA no CSF

Grupo 4: 6.0 mg (ng/mL) (ng/mL)

Grupo no total Grupo no total

Ponto de tempo Média SD n Média SD n ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 0 0 16 105964 157408 14

Pós-dose 2 158.4 78.7 16 320429 153832 14

Pré-dose 4 0 0 16 56226 72638 13

Pós-dose 4 40.6 91.7 16 341936 203284 14

Pré-dose 6 0 0 16 86139 113563 14

Pós-dose 6 0 0 16 393800 206033 10

Pré-dose 8 0 0 16 42009 65286 9

Pós-dose 8 0 0 16 334333 169995 9

Pré-dose 10 0 0 16 106452 130375 7

Pós-dose 10 0 0 16 364429 160707 7

Pré-dose 12 0 0 16 70344 87227 7

Pós-dose 12 (Necropsia antes de

6 meses) 0 0 16 111707 151129 11

Recuperação média 0 0 8 0 0 4

Necropsia de recuperação 0 0 8 0 0 8

Tabela 34 (cont.): concentrações de rhASA no soro e CSF, combinado masculino e feminino (ng/mL) RhASA no soro RhASA no CSF

Grupo 5: 18.6 mg (ng/mL) (ng/mL)

Grupo no total Grupo no total

Ponto de tempo Média SD n Média SD n ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Pré-dose 2 0 0 16 242676 264338 15

Pós-dose 2 455.1 257.8 16 827286 378379 14

Pré-dose 4 0 0 16 159311 191264 13

Pós-dose 4 138.8 213.7 16 975769 488021 13

Pré-dose 6 0 0 16 276279 231010 13

Pós-dose 6 54.5 93.8 16 994385 453568 13

Pré-dose 8 0 0 16 193064 213058 13

Pós-dose 8 27.0 67.1 16 997750 531567 12

Pré-dose 10 0 0 16 172866 228817 13

Pós-dose 10 3.2 13 16 913167 319975 12

Pré-dose 12 0 0 16 299538 365275 11

Pós-dose 12 (Necropsia antes de 0 0 16 273348 349718 13

6 meses)

Recuperação média 0 0 8 0 0 5

Necropsia de recuperação 0 0 8 0 0 8

Tabela 35: anticorpo anti-rhASA no Soro e CSF, Combinado Masculino e Feminino (ng/mL) Grupo 1: Controle Anticorpo anti-rhASA Anticorpo anti-rhASA de veículo no Soro (ng/mL) no CSF (ng/mL) Grupo no total Grupo no total Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Cirurgia 0 0 8 Pré-dosagem 2 0 0 8 0 0 8 Pré-dosagem 4 0 0 8 0 0 8 Pré-dosagem 6 0 0 8 0 0 8 Pré-dosagem 8 0 0 8 0 0 8 Pré-dosagem 10 0 0 8 0 0 8 Pré-dosagem 12 0 0 8 0 0 7 Recuperação média 0 0 8 0 0 7 Necropsia de recuperação 0 0 8 0 0 8

Anticorpo anti-rhASA Anticorpo anti-rhASA Grupo 2: 0 mg no Soro (ng/mL) no CSF (ng/mL) Grupo no total Grupo no total Média SD n Média SD n Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL Cirurgia 0 0 13 Pré-dosagem 2 0 0 16 0 0 13 Pré-dosagem 4 0 0 16 0 0 11

Pré-dosagem 6 0 0 15 0 0 10 Pré-dosagem 8 0 0 15 0 0 10 Pré-dosagem 10 0 0 15 0 0 9 Pré-dosagem 12 0 0 15 0 0 9 Necropsia (24h após a última dose) 0 0 8 0 0 5 Recuperação média 0 0 8 0 0 4 Necropsia de recuperação 0 0 8 0 0 8 Tabela 35 (cont.): Soro e Anticorpo Anti-rhASA no CSF, Combinado Machos e Fêmeas (ng/mL) Anticorpo Anti-rhASA Anticorpo Anti-rhASA

Grupo 3: 1.8 mg no Soro (ng/mL) no CSF (ng/mL)

Grupo no total Grupo no total

Média SD n Média SD n

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Cirurgia 0 0 15

Pré-dosagem 2 0 0 16 0 0 13

Pré-dosagem 4 23028 29871 16 21 72 12

Pré-dosagem 6 80769 70467 16 656 1284 9

Pré-dosagem 8 142031 93979 16 2206 3796 9

Pré-dosagem 10 341506 436656 16 4597 9386 9

Pré-dosagem 12 511938 635340 16 9916 20970 9

Necropsia (24h após a última dose) 497588 666122 8 18145 22972 8

Recuperação média 358213 226397 8 25064 29302 5

Necropsia de recuperação 504013 766860 8 16499 18552 7

Anticorpo anti-rhASA no Anticorpo anti-rhASA no

Grupo 4: 6.0 mg Soro (ng/mL) CSF (ng/mL)

Grupo no total Grupo no total

Média SD n Média SD n

Ponto de tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Cirurgia 0 0 15

Pré-dosagem 2 0 0 16 0 0 13

Pré-dosagem 4 47209 66899 16 93 170 12

Pré-dosagem 6 167721 137276 16 1269 2205 14

Pré-dosagem 8 315800 201572 16 11470 19344 9

Pré-dosagem 10 750656 682110 16 5490 8143 7

Pré-dosagem 12 1003450 868860 16 4048 6328 7

Necropsia (24h após a última dose) 880534 857199 8 36640 45439 7

Recuperação média 1270750 938646 8 53875 42430 4

Necropsia de recuperação 953125 763122 8 39474 26274 7

Tabela 35 (cont.): Soro e Anticorpo Anti-rhASA no CSF, Combinado Machos e Fêmeas (ng/mL) Anticorpo Anti-rhASA Anticorpo Anti-rhASA

Grupo 5: 18.6 mg no Soro (ng/mL) no CSF (ng/mL)

Grupo no total Grupo no total

Média SD n Média SD n

Ponto de Tempo ng/mL ng/mL ng/mL ng/mL

Cirurgia 0 0 13

Pré-dosagem 2 0 0 16 0 0 15

Pré-dosagem 4 48433 46054 16 55 146 13

Pré-dosagem 6 252450 224723 16 821 2204 13

Pré-dosagem 8 441119 310702 16 4757 7781 13 Pré-dosagem 10 936813 849893 16 17822 24652 13 Pré-dosagem 12 1380250 1331905 16 13531 20189 11 Necropsia (24h após a última dose) 286150 238760 8 8652 9129 8 Recuperação média 2492875 1686472 8 51346 36819 5 Necropsia de Recuperação 2005125 1347857 8 44258 31114 8 Tabela 36: Incidência de Anticorpos Anti-rhASA na Necropsia Anticorpo no Soro–Animais Anticorpo no CSF–Animais Positivos Positivos (positivo/total testado) (positivo/total testado)

M F M F Necro Necro Necro Necro Necro Necro Necro Necro Grupo psia psia psia psia psia psia psia psia de 6 de de 6 de de 6 de de 6 de meses recup meses recup meses recup meses recup era- era- era- era- ção ção ção ção 1 (DC) NA 0/4 NA 0/4 NA 0/4 NA 0/4 2 (veículo 0/4 0/4 0/4 0/4 0/3 0/4 0/2 0/4 ) 3 (1.8 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 3/3 3/4 4/4 mg IT) 4 (6.0 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 3/3 2/3 4/4 mg IT) (18.6 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 4/4 4/4 4/4 mg IT)

O limite de quantificação para rhASA em soro de macaco caranguejeiro é 39,1 ng/mL, e todas as amostras de soro dos Grupos 1 e 2 foram abaixo do limite de quantificação (BQL), ver Tabela 30. Os níveis séricos de rhASA foram testados 5 antes e 24 horas após as doses 2, 4, 6, 8, 10 e 12 (6 meses, necropsia), no meio do período de recuperação, e antes da necropsia de recuperação.

Os níveis rhASA foram indetectáveis no Grupo 3 (1,8 mg/dose), Grupo 4 (6,0 mg/dose) e Grupo 5 (18,6 mg/dose), antes das Doses 2, 4, 6, 8, 10 e 12, pós-dose 12, no meio do período de recuperação, e antes da necropsia de recuperação.

Depois da Dose 2, os níveis de rhASA no soro foram em relacionados à dose.

Depois da Dose 4 (Grupo 3), Dose 6 (Grupos 3 e 4), e Doses 8 e 10 (Grupos 3 e 4 e machos do Grupo 5), os níveis de rhASA foram indetectáveis.

Os níveis séricos de rhASA declinaram no Grupo 4 (6,0 mg/dose) após a Dose 4 e no Grupo 5 (18,6 mg/dose) após as Doses 4 e 6 para machos e Doses 4, 6, 8 e 10 para fêmeas.

Este declínio aparente nos níveis de rhASA no soro pode estar relacionado ao aumento da concentração de anticorpos anti-rhASA.

Não se observaram diferenças por sexo aparentes nos níveis séricos de rhASA, dada a variabilidade da amostra e os números de grupos pequenos neste estudo.

O limite de quantificação para rhASA no CSF de macaco caranguejeiro é de 19,5 ng/mL, e todas as amostras de CSF dos Grupos 1 e 2 foram BQL, ver Tabela 31. rhASA foi detectável no CSF antes e após as Doses 2, 4, 6, 8, 10 e 12 (necropsia de 6 meses) em todos os grupos dosados.

Os níveis no CSF foram maiores após a dose (aproximadamente 24 horas pós-dose) e relacionadas com a dose.

Os níveis no CSF foram muito maiores do que aqueles no soro.

Não houve diferenças por sexo aparentes nos níveis de CSF de rhASA, dada a variabilidade da amostra e números de grupos pequenos neste estudo. rhASA não era detectável no meio do 5 período de recuperação e antes da necropsia de recuperação em todos os grupos dosados.

Os níveis de CSF nas coletas da Dose 12 (necropsia) para grupos tratados com rhASA foram inferiores aos níveis após a Dose 8 e 11. Razões potenciais para os níveis mais baixos de rhASA na necropsia incluem o maior volume tomado (~ 2,25mL no total de contagens de células, química, rhASA e anticorpo anti-RHASA) na necropsia versus aqueles tomadas no intervalo de dosagem na vida (até 0,5mL antes ou após a dose para concentração de rhASA). Além disso, alguns animais não tiveram cateteres de patentes na necropsia, e foram tomadas amostras por meio de uma torneira de CM em vez de através do cateter.

Esta via consistentemente rendeu concentrações mais baixas de rhASA em comparação com amostragem através do cateter.

Isto é provavelmente devido à direção rostrocaudal limitado de fluxo em massa de CSF que é reconhecido por ocorrer em animais orientados verticalmente como macacos e no homem (por exemplo, é bem conhecido que os constituintes de CSF exibem gradientes rostrocaudais marcados ao longo de um tempo de vida de indivíduos). Anticorpos anti-rhASA no soro foram detectados em todos os animais tratados com RHASA em algum ponto de tempo, ver Tabela 32. Os animais são definidos como positivos para anticorpos anti-rhASA se o nível de anticorpo anti-rhASA estava acima do limite de quantificação (78,1 ng/mL). Os animais permaneceram positivos para anticorpos anti-rhASA, uma vez que apresentaram soroconversão.

Nenhum animal foi positivo para anticorpos anti-rhASA no ponto de tempo 2 pré-dose.

Todos os animais rhASA, exceto o macho nº 026 (Grupo 4; 6,0 5 mg/dose) foram positivos para anticorpos anti-soro rhASA no ponto de tempo pré-dose 4. O macho nº 026 do sexo masculino foi positivo para anticorpo de soro no ponto de tempo 6 pré-dose.

No grupo 5 (18,6 mg/kg), as amostras de anticorpos de necropsia tiveram níveis mais baixos de anticorpos.

Esta redução aparente pode ser devido à presença de rhASA interferindo com o ensaio.

O título foi em geral mais elevado nos grupos de média e de alta dose (6,0 e 18,6 mg/dose) do que os animais de dose baixa (1,8 mg/dose). A presença de anticorpos anti-rhASA é um resultado esperado do tratamento de macaco caranguejeiro com uma proteínai humana recombinante.

Dada a variabilidade nos resultados, não houve diferenças aparentes por sexo.

Todos os animais com anticorpos anti- rhASA no CSF tinham anticorpos rhASA detectáveis no soro também, com a exceção das fêmeas nº 049 (Grupo 3; 1,8 mg/dose) e 057 (Grupo 4; 6,0 mg/dose) . A variabilidade na concentração de anticorpos e incidência exclui a determinação de uma resposta à dose.

Os animais são definidos como positivos para anticorpos anti-RHASA se o nível de anticorpo anti- rhASA estava acima do limite de quantificação (78,1 ng/mL). Os valores combinados para machos e fêmeas para o soro e os níveis de RHASA no CSF e para os anticorpos anti-RHASA são mostrados na Tabela 34 e Tabela 35. Resultados combinados de machos e fêmeas são semelhantes para os sexos individuais, discutidos acima.

EXEMPLO 17 – EFICÁCIA Neste exemplo, 11 camundongos-controle (mASA +/+ hASA -/-) selvagens foram atribuídos ao Grupo A e não receberam nenhum tratamento. Trinta e quatro (34) camundongos 5 hASAC69S/ASA -/- foram atribuídos a cada um dos 5 grupos de dose e receberam veículo (Grupo B) ou rhASA em doses de 20 mg/kg (intravenosas [IV]; Grupo C) ou 0,04, 0,12 e 0,21 mg (Grupos D, E e F, respectivamente) nos Dias 1, 9, 15/16 e

22. Todas as doses IV foram administradas via uma veia caudal. Todas as doses intratecais (IT) foram administradas como uma infusão em um volume de 12 µL a uma taxa aproximada de 2 µL/20 segundos (Tabela 37). Tabela 37: Plano do estudo No. Dose em Total mg/kg de de peso No. de Tipo de Trata- Inje- Sacri- cerebral a Grupo Animais Animal mento Dose Via ções fício Controle selvagem (mASA A 11 Nenhum NA NA NA NA NA +/+ hASA -/- ) Controle Veí- IT 4 B 9 24 horas 0 hASAC69S Veículo culo lombar (Dias após a / 2 I 1, 9, r quarta N 5 ASA -/- 0 V (veia 15/16b hASA dose A mg/kg caudal) , e

0 22)

IT 5 rhASA .04 100 lombar mg 0

IT 5 rhASA .12 300 lombar mg 0

IT 10 rhASA .21 520 lombar mg NA = Não aplicável; IT = intratecal; IV = intravenoso. a Peso cerebral para camundongos é aproximadamente 0,0004 kg b Grupos C, D e E foram dosados no Dia 15; Grupos B 5 e E foram dosados no Dia 16. O camundongo knockout ASA hASAC69S/ASA (-/-) é um modelo reconhecido de LDM, e tem sido usado para testar tratamentos em potencial para essa doença. A via intratecal é a via de administração destinada para seres humanos. A via de administração intravenosa foi testada para esse composto e um composto semelhante em camundongos LDM. Um grupo-controle intravenoso foi adicionado como um controle positivo para alterações histológicas esperadas em órgãos periféricos. Os animais receberam 100, 300, ou 520 mg/kg de peso cerebral (0,04, 0,12, 0,21 mg, respectivamente) de rhASA. Os níveis de dose normalizados para o peso cerebral selecionado para esse estudo correspondem a doses que estão previstas para utilização em seres humanos ou que tenham sido usadas em estudos de toxicologia ou em modelos de eficácia anteriores de doenças de armazenamento lisossomal. Não era de se esperar que essas doses tivessem qualquer toxicidade.

Recibo Espécie Camundongo (Mus musculus) Cepa Camundongos hASAC69S/ASA (-/-) e 5 controles selvagens Idade Aproximadamente 14-17 meses na chegada No. de grupos 6 No. de Animais 34 camundongos knockout ASA + 11 controles selvagens Após a chegada, cada animal foi examinado para avaliar o estado de saúde.

Alojamento Os animais foram alojados em grupo em gaiolas de policarbonato de alta temperatura com filtro na tampa, com forro de papel CareFresh e garrafas de água.

Cada gaiola foi identificada claramente com uma placa de identificação indicando o projeto, grupo e número de animais, e sexo.

Cada animal foi identificado individualmente usando um sistema de perfuração da orelha.

As condições específicas do ambiente dos animais e fotoperíodo foram as seguintes: Temperatura 22ºC ± 3ºC Umidade 50% ± 20% Ciclo de luz 12 horas de luz e 12 horas de escuridão Todos os animais selvagens disponíveis (11) foram atribuídos ao grupo A e foram numerados de 35 a 45. Foram atribuídos números consecutivos (1 a 34) a animais ASA (-/- ) hASA (+/-) à medida em que foram sendo removidos das gaiolas, pesados, e tendo a orelha perfurada durante a aclimatação.

Os animais foram então atribuídos aos grupos de tratamento usando Research Randomizer (www.randomizer.org) em 3 de janeiro de 2011. Os 9 5 primeiros números foram atribuídos ao Grupo B, os 5 seguintes ao Grupo C, os 5 seguintes ao Grupo D, os 5 seguintes ao Grupo E, e os 10 finais ao Grupo F.

Os animais foram distribuídos da seguinte forma: Tabela 38: Distribuição dos animais

Grupo N Números dos Animais

A 11 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 B 9 7, 13, 17, 22, 23, 24, 28, 29, 30 C 5 6, 16, 19a, 21, 32 D 5 5, 9, 14, 18, 27 E 5 1, 2, 4, 8, 11 F 10 3b, 10, 12, 15, 20, 25, 26, 31, 33, 34 a Não foi possível localizar o animal No. 19 no momento da dosagem. b O animal No. 3 morreu antes do início da dosagem.

Artigo de Teste e Veículo Artigo de Teste Identidade rhASA Descrição Arilsulfatase A humana recombinante (ARSA) Condições de armazenamento Aproximadamente 4º Veículo Identidade Veículo rhASA (NaCl 154 mM, polissorbato 20 0,005%, pH ~6,0) Condição de armazenamento Aproximadamente 4ºC Preparação do veículo

O veículo foi usado como fornecido.

O veículo foi aquecido sobre a bancada (ambiente). Uma vez que o veículo foi aquecido, o material foi misturado por meio de agitação suave e inversão.

Os frascos não foram agitados em vortex 5 ou chacoalhados.

O frasco foi secado antes do acesso ao material.

Qualquer veículo remanescente foi recolocado no refrigerador (1ºC-8ºC). Preparação da Formulação da Dose rhASA foi diluída com veículo para alcançar as concentrações necessárias.

O artigo de teste foi aquecido sobre a bancada (ambiente). Uma vez que o artigo de teste foi aquecido, o material foi misturado por agitação suave e inversão.

Os frascos não foram agitados em vortex ou chacoalhados.

Corantes para rastrear injeções: Um corante infravermelho (como IRDye®, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE), foi utilizado para rastrear as injeções.

Corantes como esse têm sido usados em injeções intratecais como um procedimento de sobrevivência após a administração intratecal.

O corante foi misturado com o artigo de teste antes da administração; 1 nmol de corante em 1 µL foi adicionado ao artigo de teste.

Além do corante infravermelho, 1 µL de azul FD&C #1 (0,25%) foi utilizado para rastrear as injeções.

Esse corante azul é um aditivo alimentar comum e é geralmente considerado seguro e não tóxico.

Injeção IT lombossacral de rhASA ou veículo Os animais nos Grupos B, D, E, e F receberam injeções intratecais nos Dias 1, 9, 15 ou 16, e 22. Camundongos adultos foram anestesiados com 2,2,2 tribromoetanol (Avertin) 1,25% a 200-300 µL/10 gramas de peso corporal (250-350 mg/kg) por meio de injeção intraperitoneal.

O pelo dorsal foi removido entre a base da cauda e as escápulas com o uso de um cortador.

A área 5 depilada foi limpa esfregando-se povidine/betadine seguido de álcool isopropílico.

Uma pequena incisão mediana (1-2 cm) foi feita na pele sobre a coluna lombo sacra, e a interseção da linha mediana dorsal com o aspecto craniano das asas dos ílios (ílio singular) foi identificada.

O músculo na fossa ilíaca (glúteo médio) é um músculo com o formato de um coração.

Os dois lados da parte superior do "coração" aproximam a localização das asas do ílio.

Uma agulha de 32 gauge ligada a uma seringa de vidro 10-20 µL gas tight Hamilton foi inserida até sentir-se resistência do osso subjacente.

Foi feita uma injeção de 10 µL de artigo de teste, 1 µL de corante infravermelho, e 1 µL de azul FD&C #1 (volume total de injeção de 12 µL) a uma taxa aproximada de 2 µL/20 segundos (12 µL/2 minutos). A incisão na pele foi fechada com grampos de sutura.

O êxito da injeção foi avaliado por imagem para determinar se o corante infravermelho se distribuiu por todo o CNS, assim como o corante azul visível.

Após a imagem, deixou-se o animal se recuperar em uma câmara de recuperação.

Injeção intravenosa de rhASA Os animais do grupo C receberam injeções intravenosas nos dias 1, 9, 15 e 22. Para as injeções IV, os animais foram anestesiados com isoflurano, se necessário, e foram colocados em um imobilizador.

A veia caudal foi dilatada por meio de aquecimento através de piparotes suaves com o dedo na cauda.

O local de injeção foi então limpo com etanol 70%. Alternativamente, o animal foi colocado em uma câmara quente (40ºC) por 1-1,5 minutos.

Uma agulha de 28 a 30 gauge foi usada para injetar o material de teste.

O volume 5 de injeção foi de 5-10 mL/kg.

Aproximadamente 24 horas após a quarta dose, os animais nos Grupos B-F foram sacrificados.

Os animais foram submetidos a diferentes procedimentos de coleta de tecidos, como detalhado abaixo.

Os animais do Grupo A não foram tratados; no entanto, eles foram sacrificados no dia 27 ou 28 de janeiro de 2011 e submetidos a procedimentos de coleta de tecidos, como detalhado abaixo.

Soro (todos os animais) Uma amostra de sangue terminal (aproximadamente 0,5 mL) foi coletada de todos os animais (Grupos A-F) através de punção retro-orbital sob anestesia com isoflurano.

Um tubo de vidro foi colocado na órbita, penetrando gentilmente a área atrás do olho, interrompendo, assim, a drenagem venosa localizada atrás do olho.

O sangue foi coletado por ação capilar e/ou fluxo gravitacional.

Após a coleta de sangue, foi aplicada pressão à órbita para parar o sangramento.

As amostras de sangue total foram processadas para a obtenção de soro e congeladas a <-80ºC.

O soro foi armazenado a -80ºC e analisado para anticorpos.

Tecidos para investigações por microscopia de luz (Grupos A-F; 5 camundongos por grupo) Após a coleta de sangue, os animais foram sacrificados por meio de asfixia por CO2. Um pedaço da cauda foi coletado anteriormente à perfusão e congelado para uma possível genotipagem.

A cavidade pericárdica foi exposta.

Três (3) camundongos por grupo foram transcardiacamente perfundidos com solução salina heparinizada (1 U/mL de heparina sódica em NaCl 0,9%, esterilizada por filtração) 5 gelada e, em seguida, com paraformaldeído 4% a cerca de 4ºC.

O cérebro foi removido e o abdome foi cortado para expor ainda mais os órgãos internos.

O cérebro e a carcaça foram colocados em paraformaldeído, com exceção do pedaço da cauda o qual foi congelado.

Tecidos para análise de lipídios (Grupos A, B, e F; 6, 4, e 5 animais, respectivamente) Após a coleta de sangue, os animais foram sacrificados por meio de asfixia por CO2. Um pedaço da cauda foi coletado antes da perfusão e congelado para uma possível genotipagem.

A cavidade pericárdica foi exposta.

Para as análises de lipídios, 4-6 camundongos por grupo foram transcardiacamente perfundidos com solução salina heparinizada (1 U/mL de heparina sódica em NaCl 0,9%, esterilizada por filtração) gelada.

Tabela 39: Tecidos coletados para análise de lipídios

Tecidos coletados para análise de lipídios

Cérebro (separado em hemisférios Rim (2) esquerdo e direito e pesado) Medula espinhal (removida da coluna espinhal) Pedaço da cauda Nervo ciático (2) (separado do (anteriormente à músculo por dissecação) perfusão)

Mediante a coleta, os tecidos foram pesados e então congelados, ou em gelo seco ou colocando-os em um freezer a

-80ºC.

O cérebro foi separado em hemisférios esquerdo e direito.

O direito será utilizado para análise de lipídios por MS.

O esquerdo será analisado para uma possível análise de N-acetil-L-aspartato (NAA). Os tecidos foram armazenados 5 a -80ºC até a análise.

Tabela 40: Condições de armazenamento das amostras

Tipo de amostra Temperatura de armazenamento

Soro Congelado a cerca de -80ºC Tecidos para análise de Congelado a cerca de -80ºC lipídios Pedaços da cauda Congelado a cerca de -80ºC Tecidos para microscopia de luz Aproximadamente 4ºC

Armazenamento do sulfatídio reduzido rhASA na medula espinal de camundongos MLD, em particular na substância branca, Figura 114. A análise morfométrica da medula espinal demonstrou que a densidade óptica da coloração com azul de alcian foi estatisticamente significativamente reduzida após a dosagem de rhASA, Figura 115. Camundongos MLD tratados com rhASA também exibiram atividade lisossomal reduzida no cérebro, Figura 116. Essa redução foi estatisticamente significativa no grupo de dose elevada (0,21 mg-520 mg/kg de peso cerebral) em comparação a animais tratados com veículo, Figura 117. Camundongos MLD imunotolerantes (hASAC69S/ASA (-/-)) com mais de 1 ano de idade receberam administração intratecal-lombar de rhASA uma vez por semana por 4 semanas (um total de 4 doses). As doses foram de veículo (NaCl 154 mM, polissorbato 20 0,005%, pH ~6,0), 0,04, 0,12, 0,21 mg/dose (doses normalizadas foram de 100, 300 e 520 mg/kg de peso cerebral, respectivamente). Em pontos de tempo terminais, a eficácia foi avaliada por avaliação imuno- histoquímica da depuração de sulfatídio e da atividade lisossomal no interior do cérebro e da medula espinhal.

Seções da medula espinhal e do cérebro foram coradas com 5 azul de alcian visando sulftatídios nos tecidos.

As seções cerebrais também foram coradas para a presença da proteína de membrana associada a lisossomos (LAMP), um indicador de processos lisossomais.

Adicionalmente, foi realizada análise morfométrica em seções da medula espinhal (cervical, torácica e lombar) e cérebro coradas com azul de alcian e LAMP.

Esses resultados preliminares demonstram eficácia da administração intratecal lombar de rhASA.

Em comparação a camundongos-controle veículo, camundongos MLD tratados com rhASA exibem evidência de melhora nos marcadores histológicos de doença, tais como armazenamento reduzido de sulfatídios (observado por meio de coloração com azul de alcian) e atividade lisossomal no cérebro.

Essas alterações histopatológicas foram observadas perto do local de administração (região lombar da medula espinhal), na medula espinhal distal, bem como nas porções distais do cérebro.

EXEMPLO 18 – BIODISTRIBUIÇÃO 2 Visão geral Neste estudo, 36 macacos cynomolgus jovens machos e 36 fêmeas (<12 meses na iniciação) foram atribuídos a cada um dos 5 grupos de dose e receberam rhASA em doses de 0 (controle dispositivo; animais foram dosados com 0,6 mL de PBS), 0 (controle veículo), 1,8, 6,0, ou 18,6 mg (Grupos 1, 2, 3, 4, e 5, respectivamente) a cada duas semanas por 6 meses para um total de 12 doses.

Todas as doses foram administradas como uma infusão em um volume de 0,6 mL, seguidas por uma lavagem de 0,5 ml de PBS feita ao longo de aproximadamente 10 minutos (Tabela 41). Tabela 41: Plano do estudo Plano do estudo No. de Concentração No. de Dose Animais, No. de de dose Animais, Grupo administrada Sacrifício Animais nominal sacrifício (mg) Recuperação (mg/mL) 6 meses 1 Mês 1 4M, 4F DC 0 - 4M, 4F 2 8M, 8F 0 0 4 M, 3 Fa 4M, 4F 3 8M, 8F 3 1.8 4 M, 4 F 4M, 4F 4 8M, 8F 10 6.0 4 M, 4 F 4M, 4F 5 8M, 8F 31 18.6 4 M, 4 F 4M, 4F 5 DC = Controle dispositivo; animais no Grupo 1 não foram dosados com veículo ou artigo de teste. a Animal-controle veículo No. 044 foi sacrificado antecipadamente no Dia 50 devido a um vazamento no cateter.

MATERIAIS E MÉTODOS Coleta de tecido Os cérebros foram cortados em uma matriz cerebral em espessuras de fatia coronal com 3 mm de espessura. Cada cérebro foi seccionado em fatias coronais completas incluindo: neocórtex (incluindo os córtices frontal, parietal, temporal e occipital), paleocórtex (bulbos olfatórios e/ou lobo piriforme), gânglios basais (incluindo caudado e putâmen), o sistema límbico (incluindo hipocampo e giros cingulados), tálamo/hipotálamo, regiões cerebrais medianas (incluindo a substância negra), cerebelo, ponte e bulbo.

Os locais de onde as amostras de tecido individuais foram obtidas (por meio de punção de biópsia de 4 mm) são mostrados nas Figuras 133-138. As imagens das Figuras 133- 138 são da University of Wisconsin and Michigan State 5 Comparative Mammalian Brain Collections, (também do National Museum of Health and Medicine). A punção número 22 não foi recolhida, uma vez que essa estrutura não estava presente durante a necropsia.

Todas as amostras cerebrais foram congeladas e armazenadas a -60ºC ou menos antes da análise para rhASA usando de enzyme-linked immunosorbent assay.

A primeira fatia de cérebro e cada segunda fatia depois desta foram fixadas em formalina para avaliação histopatológica e imuno-histoquímica.

A segunda fatia do cérebro e cada segunda fatia depois desta foram congeladas para análise da concentração do artigo de teste.

Antes do congelamento, amostras de cérebro foram retiradas da porção direita das fatias cerebrais para análise do artigo de teste de números pares para análise de biodistribuição.

As localizações das amostras cerebrais foram fotografadas na necropsia e o número da fatia cerebral foi gravado.

As amostras foram obtidas usando uma punção circular de 4 mm ou cortadas com um bisturi para otimizar a quantidade de substância branca coletada.

Todas as punções foram congeladas e armazenadas a -60ºC ou menos para análise do artigo de teste.

O restante da fatia cerebral foi congelado e armazenado a -60ºC ou menos para uma possível análise do artigo de teste.

A medula espinhal (cervical, torácica e lombar) foi cortada em seções de um centímetro.

A primeira fatia e cada segunda fatia depois desta foi fixada em formalina para análise histopatológica e imuno-histoquímica.

A segunda fatia de medula espinhal e cada segunda fatia depois desta foi congelada e armazenada a -60ºC ou menos, para análise 5 do artigo de teste.

A distribuição das fatias foi ajustada de modo que a fatia com a ponta do cateter intratecal (Fatia 0) foi fixada em formalina e analisada para histopatologia.

Preparação do cérebro, fígado, e extratos espinhais e determinação da concentração de rhASA Punções do cérebro, medula espinhal, e amostras de fígado foram analisados usando um método validado de acordo com os regulamentos 21 CFR, Parte 58 das Boas Práticas de Laboratório (GLP) da Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos, e com procedimentos operacionais padrão Midwest BioResearch aplicáveis.

As amostras de tecido foram homogeneizadas em tampão de lise, centrifugadas para remover quaisquer restos de tecido e armazenadas a -80ºC até serem testadas.

A concentração de rhASA nas frações solúveis dos homogenatos foi determinada por meio de ELISA usando anticorpo policlonal de coelho SH040 como anticorpo de captura e anticorpo monoclonal antiASA 19-16-3 conjugado com HRP (peroxidase de rábano silvestre) como o anticorpo de detecção.

Após um passo de lavagem para remover os materiais não ligados, solução de substrato de tetrametilbenzidina (TMB) reagiu com o peróxido na presença de anticorpo conjugado com HRP para produzir um sinal colorimétrico que foi proporcional à quantidade de rhASA ligada ao anticorpo antiASA no passo inicial.

A quantidade resultante de rhASA em cada homogenato de tecido foi interpolada a partir de uma curva-padrão.

As amostras foram analisadas também por meio de um teste do ácido bicinconínico (BCA) de determinação de proteínas para obter a concentração de proteína na amostra. 5 A concentração de proteína para cada amostra foi determinada por interpolação de uma curva-padrão de albumina.

Os resultados da concentração de rhASA foram então normalizados para proteína total em extratos de tecidos, tal como determinado pelo teste do ácido bicinconínico.

Os níveis de rhASA de todas as punções para o veículo, grupos 1,8 mg/dose, 6,0 mg/dose e 18,6 mg/dose são mostrados na Figura 118, Figura 119, Figura 120 e Figura 121, respectivamente.

Os níveis de rhASA de todas as punções para os animais em recuperação para os controles dispositivo, veículo, grupos 1,8 mg/dose, 6,0 mg/dose e 18,6 mg/dose são mostrados na Figura 122, Figura 123, Figura 124, Figura 125, e Figura 126, respectivamente, Os níveis de rhASA para as punções selecionadas que foram coletadas perto da superfície (meninges) do cérebro são mostrados na Figura 127. Os níveis de rhASA para as punções selecionadas consideradas como contendo são mostrados na Figura 128. A substância branca é composta de feixes mielinizados de processos de células nervosas (ou axônios). Punções selecionadas que contêm na sua maior parte material da substância branca cerebral profunda são mostrados na Figura 129. A substância cinzenta contém corpos celulares de neurônios, em contraste com a substância branca.

Os valores de rhASA nas punções selecionadas a partir da superfície, branca profunda e cinzenta profunda são mostrados para cada grupo de dose na Figura 130. Os dados da concentração na medula espinhal são mostrados na Figura 131. 5 Os dados da concentração no fígado são mostrados na Figura 132. Os níveis de concentração de rhASA no fígado, medula espinhal e cérebro dos grupos de controle dispositivo e dosados com veículo foram mensuráveis em alguns casos.

Os níveis no fígado e na medula espinhal foram mais baixos do que qualquer um dos grupos tratados com rhASA.

O nível de rhASA medido nos animais controle dispositivo e dosados com veículo representa uma reatividade cruzada entre o anticorpo anti-rhASA utilizado no ELISA com a proteína natural de macaco cynomolgus.

Os valores relatados nos tecidos do controle dispositivo e veículo não representam valores quantitativos para rhASA de macaco cynomolgus nos tecidos, devido ao fato de que o grau de reatividade cruzada entre o anticorpo e a ASA de cynomolgus não é conhecida, e ao fato de que os padrões de teste usam rhASA.

No entanto, a variação nos níveis de rhASA detectada nos tecidos entre o controle dispositivo e dosado com veículo é pode ser interpretada como a variabilidade demonstrada nas quantidades relativas de rhASA de cynomolgus em tecidos e regiões anatômicas diferentes.

Os níveis de rhASA em fatias da medula espinhal variou de 160-2352, 1081-6607 e 1893-9252 ng/mg de proteína em machos e de 0-3151, 669-6637, e 1404-16424 ng/mg de proteína em fêmeas para os grupos de dose 1,8, 6,0, e 18,6 mg/dose, respectivamente (Figura 127). Os níveis de rhASA foram maiores na região lombar da medula do que na região cervical.

Os níveis de proteína rhASA detectados no fígado foram sensíveis à dose nos grupos tratados com rhASA e foram muito baixos no grupo veículo.

Níveis médios de rhASA 5 foram 88, 674 e 2424 nos machos e 140, 462 e 1996 ng/mg de proteína nas fêmeas para os grupos de dose 1.8, 6.0 e 18,6 mg/dose, respectivamente (Figura 128). Em geral, o nível de rhASA pareceu estar relacionado à dose em amostras preparadas a partir das fatias da medula espinhal e no fígado dos grupos dosados com rhASA.

Muitas das regiões do cérebro testadas demonstraram uma clara relação de dose entre os níveis de rhASA e a administração de rhASA, enquanto outras eram mais equívocas.

Em geral, os níveis de rhASA no cérebro aumentaram com a dose de rhASA.

EXEMPLO 19: FARMACOCINÉTICA (PK) E BIODISTRIBUIÇÃO DE RHASA ADMINISTRADA VIA IT VS.

IV O objetivo deste estudo é avaliar a biodistribuição e a farmacocinética (PK) de várias enzimas de substituição terapêuticas após a administração intratecal (IT) e intravenosa (IV) em macacos cynomolgus.

Neste estudo, um total de 12 macacos cynomolgus machos e 12 fêmeas com cateteres intratecais lombares (IT-L) foram aleatoriamente distribuídos por peso corporal em quatro grupos de tratamento para a Fase 1a (administração I2S) e Fase 1b (administração rhASA). Foram coletados sangue e CSF (de cateter IT-CM) em intervalos específicos pós-dosagem para ambas as fases.

Depois de recolhidas as últimas amostras da Fase 1a, os animais passaram por um período de washout de 7 dias antes do início da Fase 1b.

Após a coleta das últimas amostras da Fase 1b, os animais passarão por um período de washout de 7 dias entre o início da Fase 2. Um total de 12 macacos cynomolgus machos e fêmeas da Fase 1b foram aleatoriamente 5 distribuídos por peso corporal em 12 grupos de tratamento de I2S (Grupos 1a-6a) e rhASA (Grupos 1b-6b). A biodisponibilidade absoluta de rhASA no soro após a administração IT-L é ~30 a 40%. Em contraste, apenas 0,5% da dose IV encontra-se biodisponível no CSF.

A exposição a rhASA no soro aumenta de forma mais que proporcional após a administração IT-L.

Após a administração IT-L, a exposição a rhASA no CSF de forma menos que proporcional com o aumento da dose.

Tabela 42 – Resumo dos parâmetros PK de rhASA no soro de macacos cynomolgus Média (CV%) Arilsulfatase A sérica

Arilsulfatase A Arilsulfatase A Arilsulfatase A Arilsulfatase A

(Fase 1b: IV 1 (Fase 1b: IT-L (Fase 1b: IT-L 6 (Fase 1b: IT-L mg/kg) 1,8 mg) mg) 18,6 mg)

N 8 6 8 8

AUC0-t (ng•h/mL) 10505 (16,9) 2219 (41,9) 10352 (31,9) 17583 (28,2)

AUC0-∞ (ng•h/mL) 11069 (17,2) NC (NC)b 9634 (28,9)c 20789 (27,8)d

Cmax (ng/mL) 11911 (20,0) 363 (40,4) 1160 (29,9) 1621 (25,1)

4,00 (2,00, 4,00 (1,00, 3,00 (1,00, Tmaxa (h) 0,08 (0,08, 0,08) 4,00) 4,00) 4,00)

t1/2 (h) 6,55 (31,8) NC (NC)b 6,77 (21,4)c 7,40 (32,8)d

CL ou CL/F (mL/h) 261 (17,0) NC (NC)b 654 (25,0)c 944 (25,4)d

Vz ou Vz/F (mL) 2418 (32,4) NC (NC)b 6523 (41,3)c 9686 (25,8)d

Tabela 43 – Resumo dos parâmetros PK de rhASA no CSF de macacos cynomolgus Média (CV%) Arilsulfatase A CSF Arilsulfatase A Arilsulfatase A Arilsulfatase A Arilsulfatase A (Fase 1b: IV 1 (Fase 1b: IT-L (Fase 1b: IT-L 6 (Fase 1b: IT-L mg/kg) 1,8 mg) mg) 18,6 mg) N 4 6 8 8 AUC0-t (ng•h/mL) 1629 (179,8) 1267266 (86,6) 5334329 (68,8) 8028775 (71,2) AUC0-∞ (ng•h/mL) 8221 (NC)b 1595942 (79,1)c 4291829 (84,2)d 9406664 (64,5)e Cmax (ng/mL) 69,3 (94,2) 345167 (48,7) 1039079 (73,6) 1841125 (62,8) 6,00 (1,00, 0,29 (0,08, 2,04 (0,08, Tmaxa (h) 0,08 (0,08, 4,00) 8,00) 4,00) 4,00) t1/2 (h) 37,6 (NC)b 23,6 (68,3)c 17,1 (31,3)d 13,4 (29,3)e CL ou CL/F (mL/h) 392 (NC)b 1,95 (74,1)c 38,1 (214,8)d * 3,04 (66,1)e Vz ou Vz/F (mL) 21237 (NC)b 80,6 (110,4)c 1090 (215,1)d 67,6 (81,2)e Tabela 44 – Biodisponibilidade de rhASA no soro e no

CSF Comparação da biodisponibilidade absoluta Arilsulfatase A Arilsulfatase A Arilsulfatase A (Fase 1b: IT-L 1,8 (Fase 1b: IT-L (Fase 1b: IT-L 18,6 mg) 6 mg) mg) Fabs NC 39,9 27,3 (%) A biodisponibilidade de rhASA no soro após a administração IT-L é de ~30-40%. Em contraste, apenas 0,5% da dose administrada via IV encontra-se biodisponível no CSF. Tabela 45 – Distribuição CSF:soro Distribuição CSF:soro Arilsulfatase A Arilsulfatase A Arilsulfatase A Arilsulfatase A

(Fase 1b: IV 1 mg/kg) (Fase 1b:IT-L 1,8 mg) (Fase 1b: IT-L 6 mg) (Fase 1b:IT-L 18,6 mg)

0,74 NC 445 452

EXEMPLO 20 – TRATAMENTO DE PACIENTES MLD Administração direta no CNS através de, por exemplo, entrega IT pode ser usada para tratar efetivamente os pacientes MLD.

Este exemplo ilustra um estudo de 5 intensificação da dose multicêntrico desenvolvido para avaliar a segurança de até 3 doses a cada duas semanas (EOW) por um total de 40 semanas de rhASA administrada através de um dispositivo de entrega de drogas por via intratecal (IDDD) a pacientes com MLD infantil tardia.

Vários exemplos de dispositivos para administração de medicamentos via intratecal adequados para o tratamento em humanos estão representados na Figura 94, Figura 95, Figura 96 e Figura 97. Até 20 pacientes serão inscritos: Coorte 1: 5 pacientes (menor dose) Coorte 2: 5 pacientes (dose intermediária) Coorte 3: 5 pacientes (maior dose) 5 pacientes serão randomizados para nenhum tratamento.

Os pacientes são selecionados para o estudo com base na inclusão dos seguintes critérios: (1) aparição dos primeiros sintomas antes de 30 meses de idade, (2) ambulatorial no momento em ambulatório da triagem (definido como a capacidade de ficar em pé sozinho e andar 10 passos para a frente com o apoio de uma mão), (3) presença de sinais neurológicos no momento da triagem.

Tipicamente, os pacientes com histórico de transplante de células-tronco hematopoiéticas são excluídos.

É determinada a segurança de doses ascendentes de rhASA administradas por injeção IT por 40 semanas em crianças com MLD infantil tardia.

Além disso, a atividade clínica da rhASA na função motora bruta e a farmacocinética de dose única e repetida no soro e concentrações no líquido 5 cefalorraquidiano (CSF) são avaliadas.

Exemplos de entrega IT de HNS EXEMPLO 21: ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL CRÔNICA DE HEPARAN-N-SULFATASE Este exemplo demonstra que a administração intratecal pode ser usada para entregar efetivamente uma enzima lisossomal, tal como heparan N-sulfatase (rhHNS) recombinante de humano, em tecidos cerebrais para o tratamento dos sintomas neurológicos de mucopolissacaridose IIIA (MPS IIIA; síndrome de Sanfilippo tipo A), a característica clínica que define essa doença.

Experimentos descritos neste exemplo demonstram que a administração crônica IT de rhHNS foi bem tolerada, com atividade enzimal relacionada à dose detectada no cérebro, medula espinhal e fígado.

Em resumo, uma formulação intratecal (IT) de heparan N-sulfatase (HNS) recombinante de humano foi desenvolvida para o tratamento dos sintomas neurológicos de mucopolissacaridose IIIA (MPS IIIA; síndrome de Sanfilippo tipo A), a característica clínica que define essa doença.

Uma vez que a idade média dos pacientes MPS IIIA é de 4,5 anos, os principais estudos de toxicologia para HNS foram conduzidos em macacos cynomolgus jovens para avaliar os efeitos sobre o cérebro em desenvolvimento.

Os macacos foram implantados com um dispositivo de entrega de drogas via intratecal (IT)-lombar e dosados a cada duas semanas por infusão de curto prazo (1,5, 4,5, ou 8,3 mg/dose de HNS por 6 meses, 12 doses), com controles dispositivo e veículo recebendo solução salina tamponada com fosfato ou veículo, respectivamente.

Oito animais por grupo (4/sexo) foram 5 necropsiados em 3 e 6 meses (grupo de controle dispositivo necropsiado em 3 meses) e 8 animais do grupo veículo e os 3 grupos de dose de HNS foram necropsiados 1 mês após a dose IT final.

Nenhum sinal clínico relacionado a HNS ou lesões macroscópicas no sistema nervoso central foram observados.

Em comparação aos controles, houve infiltrados celulares de gravidade média de baixa a mínima nas meninges/perineuro que envolvem o cérebro/medula espinhal correlacionando-se com aumentos transitórios de leucócitos no líquido cefalorraquidiano (CSF), predominantemente eosinófilos, o que foi em grande parte resolvido 1 mês após a dose final.

Essas alterações não foram associadas a nenhuma variação morfológica adversa no cérebro ou medula espinhal.

Pareceu haver uma tendência relacionada à dose para níveis médios mais altos de HNS no CSF e nos níveis de atividade de HNS tecidual no cérebro, medula espinhal e fígado.

O nível para efeito adverso não observado foi de 8,3 mg/dose administrado a cada duas semanas, a dose administrada mais elevada, indicando que a HNS pode ser administrada com segurança por via intratecal em várias concentrações, incluindo concentrações superiores a 8,3 mg/dose.

Síndrome de Sanfilippo tipo A Mucopolissacaridose tipo IIIA (MPS IIIA; Síndrome de Sanfilippo tipo A), um distúrbio raro de armazenamento lisossomal que afeta aproximadamente 1 em cada 100.000 pessoas no mundo, resulta da ausência ou função defeituosa de heparan N-sulfatase (HNS) (Neufeld EF, et al . The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001) pp 3421-3452), uma exosulfatase envolvida no catabolismo lisossomal do glicosaminoglicano (GAG) heparan sulfato.

Na 5 ausência desta enzima, o GAG heparan sulfato acumula nos lisossomos dos neurônios e células gliais, com menor acumulação do lado de fora do cérebro.

A característica clínica que define essa doença é a degeneração do sistema nervoso central (CNS), o que resulta na perda, ou incapacidade de atingir, dos principais marcos do desenvolvimento.

O declínio cognitivo progressivo culmina em demência e mortalidade prematura.

Entrega IT de rhHNS Uma vez que a idade média dos pacientes MPS IIIA é de 4,5 anos, os principais estudos de toxicologia para HNS foram realizados em macacos cynomolgus jovens (seleção de espécie com base na similaridade genética e anatômica para com seres humanos) para avaliar os efeitos sobre o cérebro em desenvolvimento.

A equivalência de idade de macacos para com seres humanos como citado na literatura varia de 7,6 meses a 12,1 meses para crianças de 30 a 40 meses de idade (Hood RD, Developmental and Reproductive Toxicology: A practical approach (2006) p 276). Como parte desse esforço, um estudo de toxicologia de 6 meses foi realizado em macacos cynomolgus jovens para avaliar a administração IT lombar de HNS.

Os dados obtidos a partir de um estudo de toxicidade prévio de 1 mês em macacos cynomolgus jovens orientou a seleção do nível da dose e projeto do estudo de dose repetida de 6 meses em macacos jovens.

Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo envolvendo a administração IT crônica de ERT em primatas não humanos jovens.

Cinquenta e seis macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) jovens do sexo masculino e 56 do sexo 5 feminino com aproximadamente de 6 a 9 meses de idade e pesando de 0,82 a 1,81 kg foram usados neste estudo.

Os macacos foram alimentados com 15 biscoitos de PMI-Certified Primate Diet 5048 (Richmond, IN) diariamente.

Água foi provida à vontade através de um sistema automático de água filtrada e foi retida durante períodos de coleta de urina.

Os macacos foram alojados em grupo (dois por gaiola) por 2 a 4 semanas em gaiolas de aço inoxidável na chegada, com a exceção dos macacos de 3 meses, os quais foram alojados individualmente em gaiolas de aço inoxidável.

No período de duração do estudo, todos os macacos foram alojados em gaiolas individuais de aço inoxidável em salas com temperatura e umidade controladas com um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão.

Antes do início do estudo, todos os macacos foram implantados cirurgicamente com ports-a-cath SC e cateteres IT.

Succinato de sódio de prednisolona (IV, 30 mg/kg) e flunixin meglumine (intramuscular [IM], 2 mg/kg) foram administrados antes da cirurgia.

Os macacos foram pré- tratados com sulfato de atropina SC (0,04 mg/kg), sedados com cetamina HCl IM (8 mg / kg), entubados, e mantidos em oxigênio a cerca de 1 L/min. e 2,0% de isoflurano.

Foi feita uma incisão sobre os processos dorsais da coluna lombar (L4, L5, ou L6) e uma semilaminectomia foi feita para a inserção de um cateter cônico de poliuretano (25 cm de comprimento, 0,9 mm de diâmetro externo x 0,5 mm de diâmetro interno, com seis orifícios laterais de 0,33 mm de diâmetro) em L3, L4 ou L5. O cateter foi inserido através de uma pequena incisão dural e foi avançado aproximadamente 10 cm anterógrado à área de junção toracolombar.

Um port-a- 5 cath de titânio SC foi unido ao cateter IT e implantado no tecido SC.

A colocação apropriada do cateter foi confirmada por mielograma usando Isovue-300 (0,8 ml; Bracco Diagnostics, Inc., Princeton, NJ). Após a recuperação da cirurgia, os macacos receberam tartarato de butorfanol (IM, 0,05 mg/kg) e ceftiofur sódico (IM, 5,0 mg/kg duas vezes por dia por 2 dias). Neste exemplo, HNS foi provida em um veículo de formulação IT incluindo fosfato de sódio 5 mM, cloreto de sódio 145 mM, e polissorbato 20 0,005% (pH 7,0). Doses EOW de HNS foram administradas como uma infusão de curto prazo por aproximadamente onze minutos: 0,6 mL (4 minutos), seguida de uma lavagem com 0,5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (7 minutos). Os macacos do grupo de controle veículo receberam somente a formulação IT; macacos DC receberam PBS (pH 7,2) IT.

Morbidade e mortalidade Não houve mortes relacionadas a HNS ou sacrifícios prematuros.

Não houve sinais clínicos relacionados à HNS observados à dosagem ou durante as observações diárias.

Deslocamento, prurido, tremores e ataxia observados durante e após a dosagem foram resolvidos dentro de alguns minutos a aproximadamente 4 horas de administração e foram considerados como uma resposta relacionada ao volume em vez de uma reação à HNS ou ao veículo.

Sinais clínicos observados durante e imediatamente após a dosagem foram observados com uma incidência comparável nos grupos controle (DC e/ou grupo dosado com veículo); não houve nenhuma evidência de uma resposta à dose.

Em geral, a incidência de sinais clínicos na dosagem diminuiu com cada 5 dose subsequente.

Não houve mudanças relacionadas à HNS no peso corporal, consumo de alimentos e resultados físicos e neurológicos, ou alterações em exames ECG ou oftalmológicos.

Patologia clínica Não houve alterações consideradas relacionadas à HNS em hematologia, química sérica, coagulação, ou parâmetros de exame de urina em nenhum intervalo.

Contagens de células no CSF e química Houve aumentos relacionados à dose nas contagens médias de leucócitos no CSF em todos os grupos, incluindo os grupos DC e 0 mg/dose, 24 horas após a dosagem.

Houve um aumento geral nas contagens de leucócitos com cada dose administrada.

A coleta de CSF de aproximadamente metade dos macacos antes da dosagem demonstrou que esses efeitos haviam diminuído nas 2 semanas desde a dose anterior.

Após a dose 5, além de um aumento dos leucócitos, uma maior média de grupo de proteína total e albumina no CSF foram observadas para os machos dosados com HNS nos grupos 4,5 e 8,3 mg/dose (até 4 a 5 vezes) em comparação à média pré- dose (P ≤ 0,05 em relação ao grupo DC e 0 mg/dose), menos de uma tendência foi evidente nos grupos de fêmeas dosadas com HNS.

Concentrações de HNS e análise de anticorpos Tipicamente, os níveis médios de HNS no soro foram < limite de detecção (LOD) em todos os grupos de teste em todos os pontos de tempo. A concentração de HNS no CSF de macacos nos grupos controle DC e dosado com veículo foi geralmente abaixo do limite de quantificação (LOQ). Embora análises estatísticas não tenham sido realizadas, pareceu 5 haver uma tendência relacionada à dose para níveis médios de HNS mais elevados no CSF nos grupos 1,5, 4,5, e 8,3 mg/dose. Os níveis médios de HNS no CSF pré-dose foram significativamente menores do que os níveis pós-dose no CSF. As concentrações médias de HNS para a coorte de 6 meses (ambos os sexos) no final do estudo (necropsia principal e de recuperação) são resumidas na Tabela 46. A um dado nível de dose, as concentrações médias de HNS no CSF pareceram ser mantidas na mesma faixa (Figura 146A) apesar dos níveis de anticorpo anti-HNS no soro e CSF, os quais continuaram a aumentar ao longo do estudo. Tabela 46: Concentrações de HNS no CSF no final do estudo (necropsias principais e de recuperação). Necropsia de Necropsia Principal Recuperação Média ± SDa Média ± SD Grupo n n (ng/mL) (ng/mL) Veículo 8 8 NA -

516.366 ± 1,5 mg IT 8 8 NA

1.024.084

377.460 4,5 mg IT 7 7 NA ± 304.996

419.492 8,3 mg IT 8 8 NA ± 345.975 CSF, líquido cefalorraquidiano; HNS, heparan N-

sulfatase humana; n = número de amostras acima do LOQ; IT, intratecal; SD, desvio-padrão. a = amostras coletadas aprox. 24 horas após a dosagem.

NA = nenhuma amostra disponível para análise ou 5 amostras abaixo do LOQ.

Na coorte de 6 meses/recuperação, nenhum dos macacos no grupo controle dispositivo (somente PBS) ou aqueles dosados com veículo desenvolveram anticorpos anti-HNS no soro ou CSF em nenhum ponto de tempo testado.

Todos os macacos nos grupos 1,5, 4,5 e 8,3 mg/dose testaram negativo (<LOD) para anticorpos anti-HNS nas amostras de soro e CSF coletadas antes do estudo (para CSF) e na pré-dosagem 2. Ao final do estudo, todos os macacos testaram positivo para anticorpos anti-HNS no soro.

Todos os macacos nos grupos 1,5 mg/dose e 8,3 mg/dose e seis de oito macacos no grupo 4,5 mg/dose testaram positivo para anticorpos anti-HNS no CSF em um ou mais pontos de tempo.

Uma vez que dois macacos do grupo 4,5 mg não tiveram amostras coletadas em nenhum ponto do tempo incluindo a necropsia, esses resultados pareceriam indicar que todos os macacos dosados com HNS produziram uma resposta de anticorpos.

Em todos os três níveis de dose, as concentrações de anticorpos anti-HNS no soro foram detectadas após a dose 2 e os níveis aumentaram acentuadamente após a dose 4. Embora nenhuma análise estatística tenha sido realizada, pareceu haver uma tendência relacionada à dose para a concentração mais elevada de anticorpo no soro; ao final do estudo, os níveis eram comparáveis entre os 3 grupos de dose de HNS (Figura 146B). Níveis de anticorpo anti-HNS no soro foram sempre maiores do que no CSF ao longo do curso de tempo deste estudo (de 9 a 236 vezes as concentrações de anticorpo no soro/CSF); as maiores proporções de concentrações soro/CSF (98 e 236 vezes) foram observadas no 5 nível de dose de 8,3 mg no curso inicial de dosagem (6 e 10 semanas). As concentrações de anticorpo anti-HNS no soro aumentaram de 9, 16, e 16 vezes nos níveis 1,5 mg, 4,5 mg e 8,3 mg/dose, respectivamente, no tempo inicial de dosagem (da semana 6 à semana 14). Durante o mesmo período de tempo, as concentrações de anticorpos no CSF aumentaram 30, 41, e 52 vezes nos níveis 1,5 mg, 4,5 mg e 8,3 mg/dose, respectivamente (Figura 146B); níveis substanciais permaneceram após a fase de recuperação de 1 mês livre de dosagem (Tabela 47). Tabela 47: Concentrações de anticorpos anti-HNS no CSF ao final do estudo (necropsias principal e de recuperação).

Necropsia de Necropsia Principala Recuperação Grupo n Média ± SD n Média ± SD (ng/mL) (ng/mL) Veículo 8 - 8 - 1,5 mg 351.456 ± 299.512 ± 8 8 IT 244.171 226.654 4,5 mg 147.187 ± 193.045 ± 7 7 IT 213.095 157.896 8,3 mg 185.227 ± 238.727 ± 8 8 IT 315.858 185.785 CSF, líquido cefalorraquidiano; HNS, heparan N- sulfatase humana; IT, intratecal; n, número de amostra acima do limite de quantificação; SD, desvio-padrão. a Amostras coletadas aproximadamente 1 semana antes da dosagem.

Anticorpos anti-HNS apareceram mais tarde no CSF do 5 que no soro (Figura 146C). Não foi observada nenhuma diferença relacionada à dose aparente de concentrações de anticorpos no soro ou no CSF (a análise estatística não foi feita devido ao pequeno tamanho das amostras); não houve diferença observável em respostas de anticorpos entre machos e fêmeas.

Na presença de anticorpo anti-HNS no CSF, as concentrações médias de HNS no CSF pareceram ser mantidas, sugerindo que a presença de anticorpos anti-HNS no soro e CSF não alterou o nível de concentração do HNS dosado via IT.

As análises da coorte 6 meses/recuperação da administração de dose repetida de 6 meses de HNS indicaram que as concentrações de anticorpos anti-HNS para os macacos do ínterim de 3 meses e de sacrifício de coorte de 6 meses foram comparáveis (Figura 146C). Verificações macroscópicas e histopatológicas Em todos os níveis de dosagem (embora não em todos os intervalos de sacrifício e nem de forma específica por sexo ou relacionada à dose), infiltrados eosinofílicos (Figura 147A) estavam presentes no parênquima cerebral (predominantemente na substância cinzenta), medula espinhal (substância cinzenta e branca), raízes/gânglios de nervos espinhais dorsais e os gânglios do trigêmeo (apenas nos machos de dose média) (Figura 147B-D). Os infiltrados foram interpretados como secundários aos infiltrados meníngeos/perineurais e/ou à presença de (penetração por)

HNS dentro do parênquima do tecido.

Apesar de ter havido numerosas alterações de tipo inflamatório, os macacos pareceram tolerar a administração de HNS e nenhum dos infiltrados foi considerado relacionado a ou como causando 5 alterações morfológicas adversas no parênquima do sistema nervoso.

Especificamente, não houve evidência de necrose/degeneração neuronal e nenhuma resposta glial relacionada à administração de HNS.

Microgliose na substância cinzenta do cérebro e da medula espinhal, em associação com infiltrados celulares, predominantemente eosinofílicos, foi relativamente comum em um estudo de 1 mês de toxicidade em macacos jovens realizado anteriormente; essas alterações foram relativamente incomuns até o sacrifício do ínterim de 3 meses no estudo de 6 meses, mas a evidência residual de tal resposta ainda podia ser vista na coorte de 6 meses (Figura 147F). reações microgliais tendem a ser um evento relativamente prematuro na reação a alguns artigos de teste (normalmente à base de proteínas) centralmente administrados (ou centralmente reativos). Os infiltrados eosinofílicos se correlacionaram ao maior número de eosinófilos no CSF de macacos dosados com HNS, embora as células não estivessem presentes em números suficientes para provocar uma reação adversa.

Em todos os níveis de doses, infiltrados eosinofílicos foram observados nas raízes/gânglios nervosos da medula dorsal para a maioria dos grupos dosados com HNS, independentemente do sexo.

Os infiltrados nos vários tecidos do sistema nervoso central foram interpretados como secundários aos infiltrados meníngeos/perineurais e/ou à presença de (penetração por) HNS dentro do parênquima do tecido.

Nos macacos de sacrifício de recuperação, efeitos relacionados a HNS foram geralmente ausentes ou reduzidos a níveis de controle.

Algumas alterações, tais como 5 microgliose na medula espinhal, foram completamente resolvidas após o período de recuperação.

Nenhuma das alterações relacionadas a HNS pareceu estar associada a quaisquer alterações microscópicas estruturais adversas no cérebro ou na medula espinhal.

Não houve nenhuma necrose neuronal observada no cérebro, medula espinhal ou gânglios.

Atividade da enzima HNS Nas coortes 6 meses/recuperação, a atividade enzimática da HNS na medula espinal e no cérebro do grupo dosado com veículo (0,0-0,154 nmol/h/mg de proteína) foi semelhante aos níveis mostrados em tecidos da coorte do ínterim de 3 meses (0,0-0,0,154 nmol/h/mg de proteína). Os níveis de atividade enzimática na medula foram mais elevados (aproximadamente uma ordem de magnitude mais elevados na medula lombar) do que os níveis medidos no cérebro ou no fígado, os grupos 4,5 mg e 8,3 mg/dose tendo níveis semelhantes.

A atividade da enzima HNS em fatias da medula espinhal variou de 3,9-18,6, 13,1-67,1 e 3,6-69,2 nmol/h/mg de proteína em machos (Figura 148A) e de 1,8- 16,2, 4,5-61,2 e 21,1-66,0 nmol/h/mg de proteína em fêmeas (Figura 148B) para os grupos 1,5, 4,5, e 8,3 mg/dose, respectivamente.

No tecido espinhal após um período de recuperação de 1 mês, os níveis de atividade enzimática retornaram a níveis consistentes com os valores de controle do veículo.

A atividade da enzima HNS em fatias de cérebro variou de 0,03-16,0, 0,30-55,7 e 0,15-21,2 nmol/h/mg de proteína em machos (Figura 148C), e de 0,04-5,1, 0,0-14,4 e 0,9-33,2 nmol/h/mg de proteína em fêmeas (Figura 148D) para os grupos 1,5, 4,5, e 8,3 mg/dose, respectivamente.

No tecido 5 cerebral após a recuperação, os níveis de atividade enzimática retornaram a níveis consistentes com valores de controle.

A alteração de multiplicação da atividade para diferentes áreas do cérebro em comparação aos níveis endógenos (grupo DC) é mostrada na Figura 149A.

Embora uma tendência em direção a uma distribuição aumentada tenha sido observada em amostras de superfície, mostrou-se que a HNS administrada via IT lombar penetrou áreas periventriculares do cérebro.

Nas coortes coorte de 6 meses/recuperação, os níveis médios de atividade no fígado foram 0,50, 2,41, e 6,65 nmol/h/mg de proteína em machos e 1,04, 4,15, e 7,62 nmol/h/mg de proteína em fêmeas para os grupos 1,5, 4,5, e 8,3 mg/dose, respectivamente (Figura 149B). Níveis em macacos controle veículo foram 0,089 nmol/h/mg de proteína para machos e 0,083 nmol/h/mg de proteína para fêmeas.

Após o período de recuperação, os níveis de atividade da HNS no fígado foram comparáveis aos níveis de controle base para todos os grupos de dose.

Imuno-histoquímica A entrega de HNS ao CNS através de injeção IT de bolus nas coortes ínterim de 3 meses e 6 meses/recuperação resultou na entrega do artigo de teste imunorreativo aos tecidos pia-aracnoide da medula espinhal e do cérebro.

Nos macacos que receberam HNS IT, o material imunorreativo estava consistentemente presente em macrófagos meníngeos e perivasculares (cérebro/medula espinhal) e variavelmente presente nas populações de células gliais e neuronais adjacentes.

A ausência de coloração em macacos controle 5 dosados com veículo (Figura 150A) demonstrou a especificidade do anticorpo por HNS humana.

Geralmente, a imunorreatividade foi relacionada à dose (isto é, utilizando uma escala de classificação semi-quantitativa, o aumento da coloração imuno-histoquímica foi observado de um modo geralmente dependente da dose). A entrega de HNS ao CNS via IT de bolus resultou em uma imunocoloração positiva no córtex cerebral e cerebelo (Figura 150B-D); no entanto, a imunorreatividade não foi evidente consistentemente na região caudado/putâmen, mesencéfalo, ou regiões mais profundas da ponte ou medula.

A imunorreatividade foi evidente nos fígados (em células de revestimento sinusoidais, incluindo células de Kupffer, mas não nos hepatócitos) de todos os macacos administrados com HNS.

A imunorreatividade não foi evidente na única fêmea sacrificada prematuramente (grupo 4,5 mg/dose) devido a um cateter com vazamento, que não pôde ser reparado.

No grupo 1,5 mg/dose, essencialmente a recuperação total foi evidente com a exceção do fígado e das meninges do cérebro e da medula espinhal, onde alguma imunorreatividade residual foi evidente.

Em doses mais elevadas (4,5 e 8,3 mg/dose), a intensidade e as incidências de imunorreatividade foram menores do que no final da dosagem.

Em todos os níveis de dose, os níveis de HNS na medula espinhal, cérebro e fígado se aproximaram às observadas em controles dosados com veículo após o período de recuperação de 1 mês.

Neste estudo, a entrega EOW de HNS administrada via IT durante 6 meses foi geralmente bem tolerada.

Nenhuma alteração marcante foi observada no peso corporal, estado 5 clínico, exames oftalmológico/neurológico/físico, ECGs, peso de órgãos ou aparência macroscópica dos órgãos.

As verificações foram limitadas a alterações transitórias da patologia clínica do CSF acompanhadas por infiltrados meníngeos de leves a moderados e inflamação epidural, com inversão quase completa em todos os grupos exceto o grupo de maior dose após o período de recuperação.

Foi observada uma ampla distribuição de HNS em todo o cérebro e medula espinhal.

A administração IT de EOW HNS induziu uma resposta inflamatória caracterizada por uma infiltração de leucócitos residuais e efusão de albumina observada em 24 horas após a dosagem e na necropsia.

Sem o desejo de se ater a nenhuma teoria particular, isso presumivelmente reflete uma abertura incompleta, localizada e transitória da BBB relacionada a alterações nas junções apertadas perto da ponta do cateter, o que resulta na entrada de leucócitos e proteínas plasmáticas no CSF (Simard JM, et al Lancet Neurol. (2007) 6, 258-268; Stamatovic SM, et al Curr.

Neuropharmacol. (2008) 6, 179-192). Isso pode ser o resultado de dois componentes: um relacionado aos procedimentos ou volume de administração de dose e outro relacionado à administração de uma proteína.

As alterações transitórias na permeabilidade da BBB (não há diferenças significativas entre os grupos de dose e controles 24 horas após a dosagem na necropsia principal),

não foram acompanhadas por quaisquer sinais clínicos.

Pareceu haver uma tendência relacionada à dose para maiores níveis médios de HNS no CSF; a um dado nível de dose, as concentrações médias de HNS no CSF pareceram ser 5 mantido no mesmo nível apesar dos níveis crescentes de anticorpos anti-HNS no soro e CSF.

Foi observada uma infiltração celular meníngea de gravidade média baixa a mínima nos cérebros e medulas espinhais de macacos jovens dosados com HNS.

Essa alteração microscópica foi também observada em controles dosados com veículo, indicando que alguma resposta foi relacionada à colocação do cateter IT, assim como uma resposta inflamatória não específica a proteína estranha.

A introdução de um biológico/proteína dentro do espaço IT, especialmente uma que penetra no SNC, provoca quase sempre um grau de resposta inflamatória (Hovland DN, et al Toxicol.

Pathol. (2007) 35, 1013-1029; Butt MT, Toxicol.

Pathol. (2011) 39, 213-219), a qual, se presente em quantidades que danificam tecidos adjacentes, representaria um efeito adverso.

No presente estudo, no entanto, essas células (predominantemente eosinófilos) pareceram representar um marcador de reação/penetração de tecido e não foram encontradas em quantidades suficientes para se qualificar como um efeito adverso.

Nenhuma das alterações relacionadas à HNS pareceu estar associada a quaisquer alterações microscópicas estruturais adversas no cérebro ou na medula espinhal.

Não houve nenhuma necrose neuronal observada no cérebro, medula espinhal ou gânglios.

A avaliação de anticorpos antiartigo-de-teste é um aspecto importante dos estudos de toxicidade devido ao impacto potencial de anticorpos neutralizantes ou de ligação na depuração ou biodistribuição do artigo de teste (Ponce RP, et al.

Regul.

Toxicol.

Pharmacol. (2009) 54, 164-182). No presente estudo, uma vez que níveis 5 relacionados à dose e quantitativamente semelhantes de atividade enzimática da HNS foram observados no cérebro e na medula espinhal das coortes ínterim de 3 meses e 6 meses e as concentrações médias de HNS no CSF pareceram ser mantidas no mesmo intervalo, apesar dos crescentes níveis de anticorpos anti-HNS no soro e LCR, sugerindo que não há atividade neutralizante.

Pareceu haver uma tendência relacionada à dose em direção a níveis mais elevados de atividade enzimática da HNS na medula espinhal, cérebro e fígado, que foi a mais alta próximo ao local da injeção na região lombar da medula espinhal e uniforme no cérebro, sem diferenças significativas rostral a caudal e entre os hemisférios direito e esquerdo.

Nenhuma evidência de acumulação de HNS foi observada no tecido cerebral e medular na coorte de 6 meses em comparação à coorte de ínterim de 3 meses.

Apesar de que uma tendência em direção a uma distribuição aumentada foi observada em amostras de superfície, a HNS administrada via IT lombar penetrou em áreas profundas, periventriculares do cérebro.

A atividade da enzima HNS no fígado sugeriu que a HNS foi redistribuída sistemicamente após a entrega IT; nenhum efeito adverso relacionado a HNS foi observado no fígado após a avaliação de parâmetros clínicos e anatômicos de patologia nos estudos de toxicidade principais.

Em geral, os resultados imuno-histoquímicos corroboraram a atividade enzimática do tecido devido a que a imunorreatividade relacionada à dose foi observada nas meninges pia-aracnoide da medula espinhal e do cérebro e nos tecidos nervosos (neurônios, células gliais), na 5 proximidade imediata das meninges.

Houve uma boa penetração na substância cinzenta do cérebro e cerebelo após a injeção IT de bolus ou infusão IT de curto prazo.

Embora a imunorreatividade não tenha sido evidente nas estruturas mais profundas, tais como os gânglios da base ou as regiões centrais do tálamo/hipotálamo mesencéfalo, ou a ponte/medula, resultados de atividade enzimática indicam que a HNS administrada via IT lombar penetrou em áreas profundas, periventriculares do cérebro.

Assim, a imuno- histoquímica pode ser uma técnica menos sensível para detectar biodistribuição de um artigo de teste.

A imunorreatividade foi evidente em células de Kupffer e nas células endoteliais (células capazes de fagocitose) do fígado, mas não nas células parenquimatosas (hepatócitos). As análises da coorte 6 meses/recuperação do estudo de toxicidade de dose repetida IT de 6 meses em macacos jovens indicaram que alterações relacionadas a HNS nos macacos do ínterim de 3 meses e de sacrifício de 6 meses foram comparáveis, incluindo parâmetros em vida, patologia clínica e anatômica, concentrações de HNS e anticorpos anti-HNS no CSF e soro e distribuição/localização subcelular de HNS na medula espinhal, cérebro e fígado.

Nos macacos sacrifício de recuperação, os efeitos da HNS foram ausentes ou significativamente reduzidos.

Assim, o nível de efeito adverso não observado no estudo em macacos jovens de 6 meses foi de 8,3 mg / dose, a dose mais alta administrada. Monitorar alterações na celularidade do CSF e concentrações de proteína parece ser um correlato confiável das alterações morfológicas observadas na avaliação 5 histopatológica e pode ser útil em pacientes tratados via IT com HNS; essas alterações foram consideradas como sendo uma reação esperada para uma proteína administrada via IT e foram em grande parte resolvidas após o período de recuperação. Esses dados de modelos animais provêm confiança para buscar a terapia IT como uma estratégia de tratamento para as manifestações neurológicas das doenças de armazenamento lisossomal. Este estudo de toxicologia em primatas não humanos jovens demonstra a viabilidade e tolerabilidade da administração de HNS através de um dispositivo de entrega lombar de droga via IT em pacientes pediátricos. A patologia não adversa do CNS e a falta de sinais clínicos adversos apoiaram a recente aprovação do dossiê de investigação de produto médico e indicaram que a HNS administrada via IT pode tratar com segurança e efetivamente os sintomas do CNS da síndrome de Sanfillippo A.

MATERIAIS E MÉTODOS Exemplos de materiais e os métodos usados em vários experimentos descritos nestes exemplos são providos abaixo. Projeto do estudo e dosagem de HNS Os macacos foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos de tratamento: o grupo 1 não foi tratado (controle dispositivo de implante [DC], port-a-cath e cateter) e não foi dosado com o veículo ou o artigo de teste. Os grupos de 2 a 5 receberam 0,6 mL de 0, 2,5, 7,5 ou 13,8 mg/mL de HNS

IT (isto é, uma dose total de 0, 1,5, 4,5, ou 8,3 mg), EOW.

Quatro macacos/sexo/grupo foram necropsiados em 3 meses (necropsia de ínterim; 24 horas após a 6ª dose), quatro macacos/sexo/grupo (exceto o grupo DC, os quais foram 5 necropsiados em 3 meses) foram necropsiados em 6 meses de dosagem (necropsia principal; 24 horas após a 12ª dose), e os quatro macacos restantes/sexo/grupo foram necropsiados ao final de um período de recuperação de 1 mês.

Na necropsia, tecidos selecionados foram colhidos, processados e analisados microscopicamente.

HNS foi provida em um veículo de formulação IT que consiste de fosfato de sódio 5 mM, cloreto de sódio 145 mM, e polissorbato 20 0,005% (pH 7,0). A cada duas semanas as doses de HNS foram administradas como uma infusão de curto prazo ao longo de aproximadamente onze minutos: 0,6 mL (4 minutos) seguido de uma lavagem de 0,5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (7 minutos). Os macacos do grupo controle veículo receberam somente a formulação IT; macacos DC receberam PBS (pH 7,2) via IT.

Avaliação clínica Observações de sinais clínicos e morbidade e mortalidade foram registradas pelo menos duas vezes por dia a partir da primeira dose.

Os pesos corporais foram medidos antes da cirurgia, no dia da cirurgia, semanalmente durante o estudo, e na necropsia.

O consumo alimentar foi monitorizado diariamente iniciando antes da cirurgia.

Exames físicos (freqüência cardíaca, respiração, temperatura corporal, auscultamento, andar, disposição, palpação abdominal, gânglios linfáticos, e aparência geral) e neurológicos (nível de consciência, rastreamento), foram realizados antes do início do estudo, a cada mês durante o estudo e antes de necropsia.

Funções motoras, reflexos cerebrais (pupilar, cócleo-palpebral, e reflexo da córnea) e reflexos espinhais (pé sensorial, reflexo patelar, 5 cutâneo, proprioceptivo e reflexo caudal) também foram avaliados.

Exames eletrocardiográficos (ECG; levas I, II e III) e oftalmológicos foram concluídos antes da primeira dose de HNS e na semana antes da necropsia de ínterim (3 meses) ou da necropsia principal (6 meses). Exames oftalmológicos foram realizados por oftalmoscópio indireto, os macacos foram sedados com cetamina HCI (IM, 8 mg/kg), e os olhos foram dilatados com tropicamida 1%. Patologia clínica Amostras de sangue foram coletadas de macacos em jejum para hematologia e química sérica antes do início do estudo, após as doses IT 1, 3, 5, 7, 9 e 11, em meados da recuperação e na necropsia.

Amostras de urina foram coletadas pré-dose por meio de um recipiente, uma vez por mês durante o período de dosagem e de recuperação, e antes da autópsia.

As amostras de CSF foram coletadas por meio do cateter lombar para contagem total de células e análise química no momento da cirurgia e 24 horas após as doses IT 1, 3, 5, 7, 9, 11, em meados da recuperação e na necropsia; na ocasião, amostras não foram coletadas devido a uma obstrução parcial do cateter.

Devido a que contagens de leucócitos no CSF maiores do que o esperado foram observadas, amostras de CSF de dose 5 de 3 meses foram recolhidas de metade dos macacos em cada grupo antes da dosagem e dos macacos restantes 24 horas após a dosagem.

A coleta de amostras pré-dose ocorreu pelo menos 1 dia antes da dosagem de modo a não alterar significativamente o volume do CSF imediatamente antes da dosagem.

Para os macacos de 6 meses e recuperação, CSF para contagem total de células e química foi coletado de metade dos macacos em 5 cada grupo antes da dosagem e dos macacos restantes 24 horas após a dosagem.

Se um macaco tinha um cateter não destinado a amostragem devido a uma obstrução, uma punção lombar (cisterna magna) era realizada na necropsia.

Análise de HNS Amostras de sangue para análise de HNS foram coletadas a partir de uma veia periférica antes e 24 horas após as doses IT 2, 4, 6, 8, 10, 12; em meados da recuperação e na necropsia.

Amostras de CSF foram coletadas por meio do cateter lombar antes e 24 horas após as doses IT 2, 4, 6, 8, 10, 12, em meados de recuperação e na necropsia.

As concentrações de HNS foram determinadas por enzyme-linked immunosorbent assay.

O anticorpo de captura foi um anti-HNS IgG policlonal de coelho e o anticorpo de detecção foi um conjugado de peroxidase de rábano do mesmo anti-HNS IgG de coelho.

O LOD foi de 0,22 ng/mL; portanto, o LOQ foi calculado como sendo de 0,66 ng/mL.

As amostras de soro e CSF foram selecionadas em duplicata em diluições de 1:100 e 1:5; amostras que excederam o limite superior da curva de calibração foram mais diluídas e testadas novamente.

Análise de anticorpos anti-HNS O sangue para a análise de anticorpo foi coletado de uma veia periférica aproximadamente 1 semana antes das doses IT 2, 4, 6, 8, 10, 12; meados da recuperação, e na necropsia.

As amostras de CSF para a análise de anticorpo foram coletadas na cirurgia e, por meio do cateter lombar,

aproximadamente 1 semana antes das doses IT 2, 4, 6, 8, 10, 12; meados da recuperação e na necropsia.

Um teste de ponte de tecnologia eletroquimioluminescente Meso Scale Discovery (MSD®) foi usado para a detecção de anticorpos anti-HNS.

O 5 ensaio é um método geral, mas sensível, de triagem para anticorpos anti-HNS de qualquer espécie e todos os isotipos de imunoglobulinas.

O LOD foi de 5 ng/mL, e as amostras foram selecionadas em duplicata, a uma diluição de 1:20, resultando em uma sensibilidade de ensaio efetiva de 100 ng/mL.

Amostras que excederam o limite superior da curva de calibração foram diluídas e testadas novamente.

Necropsia e preparação de tecidos Os macacos foram submetidos a uma necropsia total ou 24 horas após a dose final IT (necropsia principal) ou ao final do período de recuperação de 1 mês (necropsia de recuperação). Todos os macacos foram sedados com cetamina HCI (IM, 8 mg/kg), mantidos em uma mistura de isoflurano/oxigênio, e receberam um bolus IV de heparina sódica (200 UI/kg). Os macacos foram perfundidos por meio do ventrículo cardíaco esquerdo com nitrito de sódio 0,001% a temperatura ambiente a uma taxa de 200 mL/min., por 12 minutos (~ 2400 mL). Após a coleta, as amostras de tecido foram fixadas em formalina tamponada neutra 10% para exame histopatológico/análise imuno-histoquímica, ou foram congeladas em gelo seco e armazenadas a -60°C ou menos para a análise da atividade da HNS.

O cérebro foi cortado em uma matriz cerebral (MBM- 2000C, ASI Instruments, Inc., Warren, MI) a uma espessura de fatia coronal de 3 mm.

As fatias foram numeradas, com a fatia mais rostral designada como fatia 1. As fatias 1, 4,

7, 10, 13 e 16 foram processadas para histopatologia e as fatias 2, 5, 8, 11, 14 e 17 (se disponível) foram processadas para imuno-histoquímica.

As fatias 3, 6, 9, 12 e 15 foram congeladas para análise de atividade da HNS.

As 5 medulas espinhais (porções cervical, torácica e lombar) foram cortadas em seções de 1 cm.

A primeira fatia e cada terceira fatia após aquela foram processadas para avaliação histopatológica e a segunda fatia e cada terceira fatia após aquela foram processadas para análise imuno- histoquímica.

A terceira fatia e cada terceira fatia após aquela foram congeladas para análise de HNS.

A distribuição das fatias foi ajustada de modo que a fatia que contém a ponta do cateter intratecal (fatia 0) foi fixada em formalina e analisada para histopatologia.

Amostras duplicadas de ~5 g do fígado foram tomadas de dois lóbulos separados e congeladas para a análise de HNS e uma amostra adicional de ~5 g foi fixada para análise imuno- histoquímica.

Histopatologia Os cérebros, medulas espinhais, raízes/gânglios nervosos da coluna dorsal, nervos ciático, tibial e sural, uma lista completa de tecidos (típica para estudos pré- clínicos de segurança de medicamentos dessa duração nessa espécie), e quaisquer lesões macroscópicas foram colhidas de todos os macacos na necropsia.

As seções de tecido foram embebidas em parafina e coradas com hematoxilina e eosina (em adição a quaisquer procedimentos especiais de coloração/incorporação notados abaixo), para uma avaliação microscópica abrangente.

As seções cerebrais dos blocos de parafina preparados dos grupos controle dispositivo e veículo e os macacos de altas doses foram coradas com Fluoro-Jade B (uma coloração que aumenta a sensibilidade de avaliar a degeneração neuronal) e prata de Bielschowsky (um procedimento que 5 permite visualização direta de axônios, dendritos e filamentos neuronais). As fatias coradas com Fluoro-Jade B foram examinadas sob luz fluorescente usando um cubo de filtro de isotiocianato de fluoresceína.

As medulas espinhais foram seccionadas em série, com seções transversais e oblíquas tomadas nas regiões cervical, torácica e lombar (uma fatia examinada em cada nível), incluindo seções na ponta do cateter; uma seção transversal adicional foi tirada da região da cauda equina.

Raízes e gânglios da espinha dorsal (cervical média, torácica média e lombar média) foram processados e analisados.

Nervos periféricos (ciático, tibial e sural) foram seccionados longitudinalmente, embebidos em parafina e corados com hematoxilina e eosina (H&E). Seções transversais foram pós-fixadas em ósmio, embebidas em resina de Spurr, seccionadas (2 µm) e coradas com azul de toluidina.

Seções em série da medula espinhal, assim como raízes e gânglios nervosos da espinha dorsal, dos grupos controle dispositivo e veículo e do grupo de alta dose foram corados com prata de Bielschowsky.

Seções da medula espinhal provenientes desses grupos também foram coradas com anti-proteína ácida fibrilar glial, uma coloração imuno-histoquímica que permite a visualização direta de astrócitos e seus processos.

Preparação de extratos de tecido para a análise quantitativa

Fatias de cérebro congeladas 3, 6, 9, 12 e 15 foram dissecadas separando-se os hemisférios esquerdo e direito.

Tecido da superfície foi tomado medindo-se 4 mm a partir da superfície e o tecido restante em cada hemisfério foi 5 considerado tecido profundo.

Se presente (por exemplo, fatias 6 e 9), uma amostra periventricular adicional foi cortada das fatias coronais.

Uma vez que apenas uma metade do cérebro (o lado direito) foi processada (o lado esquerdo foi mantido congelado), o seccionamento resultou em duas a três amostras por fatia: superfície direita, profunda direita e, se presente, periventricular direita (isto é, de dentro do ventrículo; Vdeep). Tecidos do cerebelo e do tronco cerebral, quando presentes, foram isolados antes da separação dos hemisférios e foram processados de forma independente.

Seções da medula espinhal foram preparadas de forma semelhante, pesadas e homogeneizadas.

As amostras de tecido foram homogeneizadas em tampão de lise (1 mL/0,25 g de tecido) formulado com Tris 10 mM, ácido etilenodiaminotetracético 5 mM, Igepal 0,1% suplementado com minitabletes inibidores de protease Alfa Completos (Alpha Complete) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) usando tubos TeenA Lysing Matrix A ou tubos de polipropileno cônicos.

As amostras foram processadas por 40 segundos no homogeneizador automatizado Fastprep-24 (MP Biomedicals, Solon, OH) ou homogeneizador motorizado PowerGen Model 125 (Omni International, Kennesaw, GA). Uma vez homogeneizadas, as amostras foram submetidas a cinco ciclos de congelação-descongelação, usando um banho de etanol/gelo seco e um banho de água a 37ºC e, em seguida, centrifugadas a 4ºC para sedimentar restos de tecido; os sobrenadantes foram armazenados a - 80ºC até o ensaio.

A atividade da HNS foi determinada usando um substrato específico (4-metilumbeliferil-α-D-N- sulfoglicosaminida) com um ensaio fluorométrico de duas 5 fases.

Processamento de tecidos e coloração para imuno- histoquímica Seis fatias cerebrais coronais fixadas em formalina (fatias de números 2, 5, 8, 11, 14 e 17) com uma espessura de 3 mm de cada macaco foram numeradas 1-6 rostral a caudal.

Geralmente, as fatias de 1 a 4 continham núcleos da base/tálamo/mesencéfalo e cérebro, e as duas fatias caudais continham tecido de cerebelo e tronco cerebral (bulbo). Seções do cérebro, medula espinhal e fígado (dos mesmos blocos de parafina usados para H&E e as várias colorações especiais) foram imuno-histoquimicamente coradas para HNS.

Um anticorpo monoclonal de rato específico (clone 2C7; Maine Biotech, Portland, ME) foi usado para detectar a absorção intracelular de HNS administrada via IT; esse reagente não demonstrou reatividade cruzada com HNS de macaco cynomolgus endógena.

Os controles negativos foram realizados usando uma IgG de camundongo irrelevante.

Fatias desparafinizadas foram incubadas com anticorpo primário anti-HNS de camundongo por uma noite a 2 a 8ºC.

Uma imunoglobulina G secundária biotinilada anti-camundongo de cabra foi adicionada e incubada por 30 minutos a 37ºC.

Complexo de peroxidase avidina/biotinilado de rábano foi adicionado e incubado por 30 minutos.

As fatias foram incubadas em solução de substrato de peroxidase diaminobenzidina até que a intensidade de coloração desejada se desenvolvesse. Os núcleos foram contrastados com hematoxilina. Análises estatísticas Os pesos corporais, alterações de peso corporal, 5 consumo alimentar, frequência respiratória, temperatura corporal, freqüência cardíaca, contagem de células do CSF, química do CSF, dados de patologia clínica, dados de urina e pesos absoluto e relativo de órgãos foram analisados por uma análise simples de variância one-way e uma comparação dos grupos controle dispositivo e veículo a cada grupo dosado com HNS por meio do teste de Dunnett. Além disso, a análise estatística comparou os dois grupos controle entre si. A análise foi bicaudal para níveis de significância de 5% e 1%. Todos os dados são apresentados como média ± desvio-padrão. EXEMPLO 22: BIODISTRIBUIÇÃO DE HEPARAN N-SULFATASE E

ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS Os experimentos neste exemplo foram desenvolvidos para determinar a distribuição tecidual de HNS em ratos após uma dose única intravenosa ou intratecal (1 ou 10 mg/kg) de HNS. Por exemplo, entre outras coisas, os objetivos desses experimentos foram: caracterizar as propriedades de biodistribuição (BD) de HNS em ratos usando tomografia de emissão de pósitrons (PET), comparar padrões de distribuição de HNS quando administrada por vias diferentes (IV ou IT) e em doses diferentes (1 ou 10 mg/kg) e determinar as propriedades farmacocinéticas da HNS em cada um dos órgãos de interesse nesses regimes de dosagem. Os perfis farmacocinético (PK) e de biodistribuição 124 (BD) de I-sulfamidase (HNS) foram estudados por imagem

PET em ratos após administração intravenosa (IV) ou 124 intratecal (IT) única de 1 ou 10 mg/kg de I- HNS.

Dados de tempo de radioatividade na região de interesse foram obtidos a partir de imagens dinâmicas nos primeiros 20 5 minutos e a partir de imagens estáticas em 0,05 (apenas para a administração IT), 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 e 192 horas pós-dosagem IV ou IT.

Quatro ratos em cada um dos quatro grupos (1 mg/kg IV, 1 mg/kg IT, 10 mg/kg IV e 10 mg/kg IT) foram usados neste estudo.

Dados de tempo de radioatividade foram medidos nas regiões da cabeça, cérebro (incluindo líquido cefalorraquidiano, CSF), medula espinhal e fígado após a administração IT, e no sangue, cérebro (incluindo CSF), fígado, rim, coração (incluindo os pulmões) e pele após a administração IV.

Os dados foram corrigidos pelo decaimento de meia-vida de iodo-124 (100,2 horas), expresso como porcentagem de dose injetada (%ID) de uma região de interesse ou %ID por grama (%ID/g) dos tecidos analisados por imagem, e então normalizados para o peso corporal de 200 gramas.

As quantidades totais (µg) ou concentrações (µg/g) da proteína dosada na região de interesse foram calculadas a partir dos dados ID% ou%ID/g correspondentes.

Nos primeiros 20 minutos após a administração IT, a quantidade total de HNS na região da cabeça foi reduzida a uma taxa constante de 0,002/min. - 0,011/min. (λz) para 1 e 10 mg/kg.

As taxas de depuração e volumes de distribuição não foram utilizados para comparações farmacocinéticas entre as duas doses e as duas vias de administração neste relatório (ver seção Resultados para mais informações). As taxas constantes de eliminação do cérebro foram essencialmente as mesmas em duas doses de teste (λz: 0,016/h contra 0,014/h para 1 e 10 mg/kg, respectivamente) com uma meia-vida semelhante de cerca de dois dias, conforme determinado por imagem estática até 192 horas após 5 a dosagem IT.

Os valores de Cmax e AUC (0-último ou 0- infinito) foram proporcionais às doses administradas.

Um comportamento PK linear foi apontado na faixa de doses de 1 a 10 mg/kg administrada nesses regimes de dosagem IT única.

Gradientes de concentração foram observados em seções de proximal a distal da medula espinhal em ambos os níveis de dose.

Depois da dosagem IT, a proteína HNS foi mensurável no fígado até 96 horas a 1 mg/kg e até 192 horas a 10 mg/kg de HNS.

As concentrações no fígado atingiram o pico em 2 horas a 1 mg/kg e 7 horas a 10 mg/kg.

A eliminação foi de 0,030 ± 0,011/h (média λz) a 1 mg/kg, o que não foi significativamente diferente do que a 10 mg/kg (λz 0,017 ± 0/h) (p = 0,10), com um t1/2 correspondente (28 contra 42 horas nas doses de 1 e 10 mg/kg, respectivamente). Após a dosagem IV, as meias-vidas de eliminação no fígado, rim, coração e pele foram de 47 ± 10 e 38 ± 13 horas para o fígado, 54 ± 25 e 29 ± 16 horas para o rim, 36 ± 15 e 42 ± 19 horas para o coração e 40 ± 21 e 31 ± 13 horas para a pele a 1 e 10 mg/kg, respectivamente, enquanto as meias-vidas no cérebro foram de 71 ± 23 e 60 ± 53 horas.

Os valores médios da Cmax para o fígado, pele, rim, coração e cérebro foram de 9,6, 0,30, 0,25, 0,22 e 0,08 µg/g a 1 mg/kg e 132, 7,9, 3,9, 3,7 e 1,8 µg/g a 10 mg/kg.

Depois que os valores de Cmax de animais individuais foram normalizados para dose, os valores de Cmax/dose a 10 mg/kg foram significativamente maiores do que a 1 mg/kg em todos esses órgãos (a maioria dos valores p <0,05, p = 0,06 para o fígado). Os valores de AUClast para o fígado, pele, rim, coração e cérebro foram de 525, 16, 14, 9 e 7 h.µg/g a 1 5 mg/kg, e 6747, 276, 183, 201 e 86 h. µg/g a 10 mg/kg.

Após a normalização, os valores AUClast/dose a 10 mg/kg foram significativamente maiores do que a 1 mg/kg na pele (p <0,01), ligeiramente diferentes no coração (p = 0,06) e não significativamente diferentes no fígado, cérebro e rim (todos os valores p > 0,34). Quando a mesma dose de HNS foi injetada, a administração intratecal resultou em uma exposição cerebral três-log maior do que a administração intravenosa.

O tempo de meia-vida de eliminação no cérebro foi de 2 dias por via IT e de 3 dias por administração IV.

No entanto, as exposições hepáticas após a dosagem IT foram semelhantes àquelas após a administração IV com a mesma dose de HNS.

As exposições (Cmax e AUClast) para o fígado por via IT/IV a 1 mg/kg e 10 mg/kg foram a uma faixa de 0,4-1,2. Projeto Experimental O sistema nervoso central (CNS) é vulnerável na maioria de doenças de armazenamento lisossomal e é gravemente danificado em alguns tipos dessas doenças, tais como síndrome de Sanfilippo tipo A ou B (mucopolissacaridose III), Leucodistrofia Metacromática (MLD) e síndrome de Hunter.

Tal como descrito aqui, é contemplado que, devido à fraca penetração através da barreira hematoencefálica quando administradas perifericamente, a administração direta de proteínas enzimáticas no CNS pode aumentar as suas concentrações nos tecidos nervosos centrais e melhorar ainda mais os seus efeitos terapêuticos.

A administração intratecal (IT, ou cisterna magna) foi investigada e comparada com a administração intravenosa a níveis de dose diferentes neste 5 estudo.

PET é uma tecnologia não-invasiva, reproduzível e quantitativa para prover uma alteração dinâmica de concentração de drogas ao longo do tempo, no órgão de interesse.

Os dados dinâmicos de concentração-tempo a partir de órgãos-alvo (sítios ativos em vez de na circulação sanguínea) são valiosos e estão diretamente relacionados à atividade biológica da droga dosada.

Além disso, as informações sobre as exposições teciduais a partir de estudo PET em animais podem ser usadas para orientar a seleção da primeira dose em humanos.

Materiais e Métodos Artigos de teste A heparin N-Sulfatase (HNS) foi formulada a uma concentração de 20 mg/mL de HNS em 5 mM de tampão fosfato de sódio com cloreto de sódio 145 mM a pH 7,0. O material foi purificado por RP-HPLC e continha 98,7% de heparin N- Sulfatase com 99,9% de dímero.

A HNS foi marcada com 124 iodo.

Fonte de amostra As imagens de radioatividade foram de ratos após a 124 dosagem IV e IT de I-H-N-sulfatase a 1 e 10 mg/kg.

Animais Dezesseis ratos machos Sprague-Dawley foram adquiridos dos Laboratórios Charles River (190 ± 60 g, n = 16) e foram separados em quatro grupos (n = 4). Foi dada uma única injeção IV ou IT em duas doses diferentes (1 mg/kg e 10 mg/kg) a cada grupo desses ratos (total de 4 grupos). A dose e volume injetado foram individualizadas com base no peso corporal de cada animal.

Em dois grupos tratados por 5 via IV a sedação foi induzida por injeção IV de pentobarbital sódico em uma dose de 35 mg/kg.

Doses intravenosas foram injetadas em um bolus através de uma veia caudal.

Em dois grupos tratados por via IT os animais foram anestesiados por administração intra-peritoneal de pentobarbital sódico em uma dose de 50 mg/kg.

Doses intratecais foram administradas ao longo de 1 minuto ao nível da cisterna magna através da membrana atlanto- occipital.

A radioatividade real administrada foi medida por PET e serviu como dose injetada.

Método(s) experimental(is) e/ou de ensaio(s) Imagens dinâmicas (a cada 2 minutos) foram obtidas nos primeiros 20 minutos nas regiões do coração (incluindo os pulmões), fígado e rins após injeção IV, e na região da cabeça após a administração IT de ambas as doses.

Imagem estática foi obtida nas regiões incluindo o cérebro (incluindo líquido cefalorraquidiano, CSF), fígado, rim, coração (incluindo os pulmões), músculo, pele e osso no grupo tratado por via IV, e na região da cabeça, cérebro (incluindo CSF) e fígado de animais tratados por via IT em 0,05 (disponível apenas para os grupos IT), 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 e 192 horas após a dosagem.

As imagens foram reconstruídas e as três seções corporais foram fundidas em uma só imagem.

Análise dos dados Os dados PET foram expressos em nanocurie (nCi) por mL

(para líquido) ou por grama (para tecidos). A atividade relativa foi obtida para o cérebro, fígado, rins, músculo esquelético, estômago, coração (com pulmões) e regiões da pele em imagens estáticas.

A atividade absoluta nas regiões 5 completas da cabeça ou cérebro foi obtida para os animais que receberam injeções IT.

A radioatividade por milímetro da medula espinhal foi determinada em animais injetados por via IT em três seções selecionadas: a medula proximal (pescoço), média (contra a borda superior do fígado) e distal (1 cm a partir da extremidade distal do compartimento contendo proteína). Todos os dados foram corrigidos pela meia-vida de 124 decaimento de I (100,2 horas) e normalizados para eficácia de registro com base em calibração com uma fonte 124 de I com atividade medida externamente.

Os dados foram então expressos como porcentagem de dose injetada (%ID) de uma região completa (cabeça e cérebro) ou %ID por grama (%ID/g) de um tecido, e então normalizados para um peso corporal de 200 gramas [normalização de dados: (%ID ou %ID/g)/peso corporal do animal x 200]. A normalização foi adotada para reduzir a variabilidade dos dados, uma vez que apenas quatro animais foram usados em cada grupo.

Neste exemplo, as concentrações ou quantidade de proteína HNS foram calculadas usando a dose de proteína injetada para cada animal: concentração de proteína (µg/g) = (%ID/g) x (mg/kg de dose injetada x 1000 x 0,2); quantidade total da proteína dosada (µg) em uma região de interesse = %ID x (mg/kg de dose injetada x 1000 x 0,2), aqui a dose injetada foi de 1 mg/kg ou 10 mg/kg e 0,2 é o fator de normalização para o peso corporal.

A média de grupo e desvio-padrão para cada parâmetro PK foram calculados com base nos dados individuais não compartimentais em cada um dos quatro grupos.

Um teste t de Student foi realizado para comparar os valores de λz, t1/2, 5 Cmax e AUC entre as duas doses de teste e as duas vias de administração.

A significância estatística foi definida como um p-valor menor que 0,05 (p<0,05). Resultados As quantidades (µg) ou concentrações (µg/g) de HNS nas seguintes tabelas, figuras e análises de PK foram calculadas multiplicando-se a dose de proteína injetada (1 mg/kg ou 10 mg/kg) pelos valores correspondentes de %ID ou %ID/g. 124 Tratamento intratecal com I-HNS em doses de 1 e 10 mg/kg A quantidade de proteína dosada (µg) na região da cabeça a partir de imagens dinâmicas foi representada graficamente como uma função do tempo na Figura 151. A concentração (µg/g) nas regiões do cérebro a partir de imagens estáticas foi representada graficamente como uma função do tempo na Figura 152. A quantidade total de proteína injetada (µg) nas regiões da cabeça e cérebro a partir de imagens estáticas foi representada graficamente ao longo do tempo na Figura 153 e na Figura 154, respectivamente.

Curvas de tempo-concentração (µg/mm) na medula proximal, média e distal são mostradas na Figura 155 a Figura 157. A Figura 158 mostra as alterações na concentração de HNS (µg/g) no fígado com tempo após a 124 administração IT de I-HNS, 1 e 10 mg/kg.

Os dados da quantidade total de tempo (µg) ou da concentração-tempo (µg/g) foram analisados por meio de modelos não compartimentais (WinNonlin 5,2, Pharsight, Mountain View, CA). Os parâmetros PK, tais como a constante de taxa de eliminação (λz), a concentração máxima (Cmax), 5 meia-vida terminal (t1/2), área sob a curva (AUClast e AUC0-inf) e outros foram estimados a partir dos dados de cada animal individual.

As taxas de depuração e volumes de distribuição foram estimados, no entanto, eles não foram usados para comparações PK entre as duas doses e as duas vias de administração neste relatório por duas razões: (1) este estudo se focou na biodistribuição da HNS em tecidos sólidos ao invés de na PK sanguínea, e (2) a radioatividade na região do cérebro foi a soma daquelas do tecido cerebral (sólido) e CSF (líquido), que não puderam ser separados um do outro no estudo.

A λz foi avaliada e usada para comparação, uma vez que indicou uma porcentagem da dose injetada eliminada por unidade de tempo.

As médias de grupo e os desvios-padrão (SD) foram calculados e comparados entre as duas doses de teste.

Esses parâmetros farmacocinéticos estão tabulados na Tabela 48 abaixo.

Tabela 48

Nos primeiros 20 minutos após a dosagem, a quantidade total (µg) de HNS na região da cabeça foi reduzida a uma taxa constante de 0,002-0,011 por minuto (λz, 0,005 ± 0,004/min.) a 1 mg/kg e 0,003 - 0,010 por minuto (0,007 ± 0,003/min.) a 10 mg/kg.

Essas taxas constantes de eliminação não foram significativamente diferentes para esses dois níveis de dose (p = 0,57, Figura 151). A curva concentração-tempo (µg/g de 0,05 a 192 horas)

para o cérebro indicou um perfil bifásico (Figura 152). A fase inicial tem duração de cerca de duas horas.

A fase terminal segue uma cinética de primeira ordem.

As taxas constantes de eliminação do cérebro foram muito semelhantes 5 em duas doses testadas (0,0016 ± 0,003 e 0,014 ± 0,001 por hora) com uma meia-vida semelhante de cerca de dois dias (45 ± 7 e 49 ± 4 horas a 1 e 10 mg/kg, respectivamente). Os valores das concentrações máximas (257 ± 90 e 2628 ± 265 µg/g) e AUClast (8393 ± 2457 e 83962 ± 10083 hr.µg/g a 1 e 10 mg/kg, respectivamente) aumentam cerca de dez vezes quando a dose foi aumentada de 1 para 10 mg/kg.

Essas observações indicaram um comportamento PK linear na faixa de dose de 1 a 10 mg/kg administrados nesses regimes de dosagem única IT.

A concentração máxima apareceu no cérebro 3 minutos (Tmax) após a dosagem IT.

A curva quantidade total-tempo (µg de 0,05 a 192 horas) nas regiões do cérebro e da cabeça seguiu o mesmo padrão bifásico como visto com as curvas concentração-tempo (µg/g) no cérebro (Figura 153 e Figura 154). Os valores de Cmax na região cerebral foram significativamente mais baixos do que na região da cabeça (69 ± 8 versus 200 ± 0 a 1 mg/kg, p<0,01; e 836 ± 117 versus 1844 ± 314 µg, p<0.01 a 10 mg/kg, respectivamente). As taxas de eliminação constantes foram de 0,017 ± 0,002/h e 0,014 ± 0,001/h para o cérebro, e 0,016 ± 0,002 e 0,010 ± 0,001/h para a região da cabeça a 1 e 10 mg/kg, respectivamente.

Os valores de tempo residual médio foram de 42 ± 5 versus 51 ± 5 horas para o cérebro (p = 0,048) e de 45 ± 7 versus 70 ± 9 horas para a cabeça (p <0,01) a 1 e 10 mg/kg, respectivamente.

Essas observações sugeriram que a proteína dosada foi eliminada de ambas as regiões mais rapidamente em dose mais baixa do que em doses mais elevadas.

As meias-vidas médias foram em uma faixa de 42 a 70 horas nessas regiões após a dosagem IT de 1 mg/kg e 10 mg/kg de HNS. 5 Um gradiente de concentração foi observado a partir da seção proximal às seções média e distal da medula espinhal em ambos os níveis de dose (dados não mostrados). Depois da dosagem IT, a concentração máxima (µg/mm de medula espinhal) foi observada cerca de 30 minutos (de 0 a 1 hora) na seção proximal, 1 a 4 horas na seção média (com exceção de um rato sendo 24 horas) e 1 a 8 horas na seção distal.

As meias-vidas nessas seções foram variáveis (t1/2 médio: 32 ± 13 e 45 ± 18 horas para a seção proximal, 39 ± 16 e cerca de 50 horas para a seção média e 30 ± 12 e cerca de 123 horas para a seção distal de medula a 1 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente). Os valores médios das concentrações máximas foram aproximadamente proporcionais às doses em cada uma dessas três seções a 1 e 10 mg/kg de 124 I-HNS (0,5 contra 6,0, 0,2 versus 0,9 e 0,1 versus 0,5 µg/mm nas seções proximal, média e distal da medula, respectivamente). Os valores médios de AUClast seguiram o mesmo padrão proporcional, conforme visto na concentração máxima (9,5 versus 83, 6,8 versus 35 e 2 versus 38 h.µg/mm nas seções proximal, média e distal, respectivamente). Embora a HNS não tenha sido detectável na maioria dos órgãos periféricos, ela foi mensurável no fígado logo a partir de 1 hora (o primeiro ponto de tempo de imagem após a dosagem) a 96 horas (três de quatro animais) a 1 mg/kg e a 192 horas (todos os quatro ratos) a 10 mg/kg após a dosagem IT (Figura 158). As concentrações no fígado alcançaram o máximo 2 horas após a dosagem IT de 1 mg/kg e 7 horas após a dosagem IT de 10 mg/kg, a qual foi seguida por uma fase de eliminação com cinética de primeira ordem.

A taxa constante de eliminação foi mais rápida a 1 mg/kg 5 (λz 0,030 ± 0.011/h) do que aquela à dose de 10 mg/kg (λz 0,017 ± 0/h) (p = 0,10), com um t1/2 correspondente mais curto (28 ± 16 versus 42 ± 1 horas nas doses de 1 e 10 mg/kg, respectivamente, p = 0,76). O valor de AUClast a 1 mg/kg reduziu cerca de 40 vezes em comparação àquele a 10 mg/kg (204 ± 50 versus 7987 ± 3276 µg/g, respectivamente). 124 Tratamento intravenoso com I-HNS em doses de 1 e 10 mg/kg A concentração no cérebro, fígado, rim, coração (incluindo tecido pulmonar) e pele foram representados graficamente como uma função do tempo após a dosagem IV de 1 e 10 mg/kg de HNS como mostrado na Figura 159 à Figura 163, respectivamente.

Uma vez que o primeiro ponto de tempo de imagem estática para esses órgãos foi de uma hora após a dosagem, a fase inicial dessas curvas de concentração-tempo não pode ser observada no presente estudo.

As curvas de concentração-tempo para o fígado, rim, coração e pele mostraram uma fase plana de 1 a 8 horas após a dosagem IV.

Essa fase plana durou 24 horas no cérebro após a dosagem, o que sugere que o cérebro absorveu a proteína dosada por via IV mais lentamente do que os órgãos periféricos.

Os dados restantes indicaram uma fase de eliminação terminal com uma cinética aproximadamente de primeira ordem.

As meias-vidas de eliminação no fígado, rim, coração e pele 47 ± 10 e 38 ± 13 horas para o fígado, 54 ± 25 e 29 ± 16 horas para o rim, 36 ± 15 e 42 ± 19 horas para do coração e de 40 ± 21 e 31 ± 13 horas para a pele a 1 e 10 mg / kg, respectivamente, enquanto as meias-vidas no cérebro foram de 71 ± 23 e 60 ± 53 horas (Rato 3 no grupo de 10 mg/kg foi excluído devido a dados insuficientes para 5 determinar o t1/2) a 1 e 10 mg/kg, respectivamente.

Não foram observadas diferenças estatísticas entre as meias- vidas a 1 e 10 mg/kg nesses órgãos, com uma exceção de p- valor <0,03 para o rim.

Os valores médios da Cmax para o fígado, pele, rim, coração e cérebro foram de 9,6, 0,3, 0,25, 0,22, e 0,08 µg/g a 1 mg/kg e de 132, 7,9, 3,9, 3,7 e 1,8 µg/g a 10 mg/kg.

As razões de Cmax a 10 mg/kg para os valores correspondentes a 1 mg/kg foram de 14, 26, 16, 17 e 23 para esses órgãos.

Depois que os valores de Cmax de animal individual foram normalizadas para dose, os valores de Cmax/dose a 10 mg/kg foram significativamente maiores do que a 1 mg/kg em todos esses órgãos (a maioria dos p- valores <0,05, p = 0,06 para o fígado). Os valores de AUClast para o fígado, pele, rim, coração e cérebro foram de 525, 16, 14, 9,3 e 7 h.µg/g a 1 mg/kg e 6747, 276, 183, 201 e 86 h.µg/g a 10 mg/kg.

As razões de AUClast a 10 mg/kg para os valores correspondentes de AUClast a 1 mg/kg foram de 13, 17, 13, 22 e 12 para esses órgãos, respectivamente.

Após a normalização, os valores de AUClast/dose a 10 mg/kg foram significativamente maiores do que a 1 mg/kg na pele (p <0,01), ligeiramente diferentes no coração (p = 0,06) e não significativamente diferentes no fígado, cérebro e rim (todos os p-valores > 0,34). Essas observações sugeriram: (1) as meias-vidas na maioria dos órgãos foram de cerca de 2 dias, com a exceção do cérebro (cerca de 3 dias); (2) a exposição por grama no fígado foi maior do que aquela na pele, coração e rim, as quais são maiores do que aquela no cérebro; (3) com um aumento de dez vezes na dose (10/1 mg/kg), os valores de 5 Cmax a 10 mg/kg de todos os órgãos testados aumentaram mais de 10 vezes do que aqueles a 1 mg/kg.

A concentração máxima no cérebro foi alcançada em 1-24 horas (Tmax) após a dosagem IV.

Comparação de tratamentos IV versus IT As curvas de concentração-tempo no cérebro e no fígado após administração IV e IT de 1 e 10 mg/kg são comparadas na Figura 164 e na Figura 165, respectivamente.

As razões de Cmax no cérebro por IT/IV a 1 e 10 mg/kg foram de 3212 e 1501, respectivamente.

Essas razões de AUC0-192h foram de 1136 e 978. Essas observações indicaram que, quando a mesma dose de HNS foi injetada, a administração intratecal resultou em uma exposição de cerca de três-log maior do cérebro do que com a administração intravenosa.

O tempo de meia-vida de eliminação no cérebro foi de 2 dias (45 a 49 horas a 1 e 10 mg/kg) por via IT e de 3 dias (71 a 60 horas a 1 e 10 mg/kg) por administração IV em ambos os níveis de dose.

No entanto, as exposições hepáticas após a dosagem IT foram semelhantes àquelas após a administração IV à mesma dose de HNS.

As razões de Cmax no fígado por via IT/IV a 1 mg/kg e 10 mg/kg foi de 0,5 e 0,8 e as razões de AUClast foram de 0,4 e 1,2, respectivamente.

Conclusões 124 Os perfis farmacocinético e de biodistribuição de I- sulfamidase (HNS) foram estudados por meio de imagens PET teciduais em ratos após uma administração intravenosa ou 124 intratecal única de 1 ou 10 mg/kg de I-sulfamidase.

Dados de concentração-tempo foram obtidos tanto de forma dinâmica (primeiros 20 minutos) e estatística nas regiões de 5 interesse em 0,05, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 e 192 horas após a dosagem.

Por meio de imagem dinâmica após a dosagem IT, a quantidade total de HNS na região da cabeça foi reduzida a uma taxa semelhante constante de 0,005/min. - 0,007/min. (λz média) nos primeiros 20 minutos.

Por meio de imagem estática, as taxas de eliminação do cérebro foram essencialmente as mesmas em duas doses testadas (λz: 0,016/h versus 0,014/h para 1 e 10 mg/kg, respectivamente), com uma meia-vida semelhante de cerca de dois dias.

Os valores de Cmax e AUClast foram proporcionais às doses administradas e um comportamento PK linear foi indicado na faixa de doses de 1 a 10 mg/kg administrados nesses regimes de dosagem única IT.

Gradientes de concentração foram observados na medula proximal a distal em ambos os níveis de dose.

Após a dosagem IT, a concentração máxima foi observada em cerca de 20 minutos na seção proximal, 1 a 4 horas na seção média e 1 a 8 horas na seção distal.

Um comportamento PK linear também foi indicado nas diferentes seções da medula espinhal.

Após a dosagem IT, a proteína HNS foi mensurável no fígado a partir de um tempo muito prematuro a até 96 horas a 1 mg/kg e em 192 horas a 10 mg/kg.

A taxa de eliminação foi mais rápida a 1 mg/kg (λz 0,030/h) do que a 10 mg/kg (λz 0,017/h), com um t1/2 correspondente mais curto na dose mais baixa (28 ± 16 versus 42 ± 1 horas nas doses de 1 e 10 mg/kg, respectivamente). Após a dosagem IV, as meias-vidas de eliminação no fígado, rim, coração e pele 47 ± 10 e 38 ± 13 horas para o fígado, 54 ± 25 e 29 ± 16 horas para o rim, 36 ± 15 e 42 ± 5 19 horas para o coração e de 40 ± 21 e 31 ± 13 horas para a pele a 1 e 10 mg/kg, respectivamente; enquanto as meias- vidas no cérebro foram de 71 ± 23 e 60 ± 53 horas.

Os valores médios da Cmax para o fígado, pele, rim, coração e cérebro foram de 9,6, 0,30, 0,25, 0,22, e 0,08 µg/g a 1 mg/kg e 132, 7,9, 3,9, 3,7 e 1,8 µg/g a 10 mg/kg.

Depois que os valores de Cmax de animal individual foram normalizados para dose, os valores de Cmax/dose a 10 mg/kg foram significativamente maiores do que a 1 mg/kg em todos esses órgãos (a maioria dos p-valores <0,05, p = 0,06 para o fígado) . Os valores de AUClast para o fígado, pele, rim, coração e cérebro foram 525, 16, 14, 9,3 e 7 h.µg/g a 1 mg/kg e 6747, 276, 183, 201 e 86 h.µg/g a 10 mg/kg.

Após a normalização, os valores AUClast/dose a 10 mg/kg foram significativamente maiores do que a 1 mg/kg na pele (p <0,01), ligeiramente diferentes no coração (p = 0,06) e não significativamente diferentes no fígado , cérebro e rim (todos os p-valores > 0,34). EXEMPLO 23: TRATAMENTO DE PACIENTES COM SÍNDROME DE SANFILIPPO TIPO A (SANFILIPPO A) COM HNS Administração direta no CNS através de, por exemplo, entrega IT pode ser usada para tratar efetivamente pacientes Sanfilippo A.

Este exemplo ilustra um estudo de escalonamento de dose multicêntrico projetado para avaliar a segurança de um máximo de 3 níveis de dose a cada duas semanas (EOW) por um total de 40 semanas de rhHNS administrada através de um dispositivo de entrega de drogas por via intratecal (IDDD) a pacientes com Sanfilippo A.

Vários dispositivos exemplares de entrega intratecal de drogas adequados para o tratamento humano estão 5 representados nas Figuras 94-97. Até 20 pacientes serão inscritos: Coorte 1: 5 pacientes (menor dose) Coorte 2: 5 pacientes (dose intermediária) Coorte 3: 5 pacientes (maior dose) 5 pacientes serão selecionados aleatoriamente para nenhum tratamento.

Os pacientes são selecionados para o estudo com base na inclusão dos seguintes critérios: É determinada a segurança de doses ascendentes de HNS administradas por injeção IT por 40 semanas em pacientes com Sanfilippo A.

Além disso, a atividade clínica da HNS sobre a função cognitiva e a farmacocinética de dose única e repetida no soro e concentrações no líquido cefalorraquidiano (CSF) são avaliadas.

EXEMPLOS DE ENTREGA IT DE NAGLU-IGFII EXEMPLO 24: Estudo in vitro de rhNaglu e Naglu-IGFII O mecanismo de absorção celular de cada uma das variantes Naglu foi estudado usando duas cepas de fibroblastos de pacientes Sanfilippo B, GM02391 (P359L) e GM 01426 (E153K), e uma linha de fibroblastos humanos normais.

Devido à expressão do receptor M6P na linha de células, fibroblastos são tradicionalmente usados pelos investigadores para o estudo da absorção celular de enzimas lisossomais.

Estudos de absorção celular foram realizados por incubação de fibroblastos com rhNaglu ou Naglu-IGFII por quatro horas a 37ºC.

As células foram lavadas e lisadas após a incubação, e a atividade enzimática da Naglu em lisados celulares foi medida.

A incubação de rhNaglu com 5 fibroblastos resultou em uma quantidade quase indetectável de enzima intracelularmente.

Em contraste, a incubação de Naglu-IGFII com fibroblastos resultou em níveis pronunciados de enzima intracelularmente (Figura 166). A quantidade de Naglu-IGFII internalizada alcançou a saturação conforme a quantidade de enzima usada para incubação aumentou.

A saturação de absorção dependente de dose é um achado típico para a absorção celular mediada por receptor.

Além disso, a internalização de Naglu-IGFII não foi inibida por M6P exógeno, mas foi completamente inibida por IGFII exógena (Figura 166). Esse resultado indicou que a interiorização de Naglu-IGFII em fibroblastos é dependente do receptor M6P/IGFII de uma maneira independente de glicosilação.

Um experimento foi também conduzido para estudar o tráfico de rhNaglu e Naglu-IGFII para lisossomos.

Fibroblastos de pacientes Sanfilippo B (GM01426) foram usados para este estudo.

A detecção de rhNaglu e Naglu- IGFII foi examinada por meio de coloração das células com anticorpo policlonal antiNaglu humana após incubação inicial das proteínas com as células.

A coloração por imunofluorescência de LAMP-1 (proteína de membrana associada a lisossomos 1) foi usada para a detecção de lisossomos.

A colocalização de rhNaglu e Naglu-IGFII com lisossomos foi visualizada por microscopia confocal (Figura 167).

A internalização extensiva de Naglu-IGFII foi observada após 4 horas de incubação da proteína com as células, a colocalização de Naglu-IGFII com lisossomos foi demonstrada.

De forma contrária, a rhNaglu não conseguiu 5 demonstrar internalização no mesmo período de tempo, e nenhuma colocalização com os lisossomos foi observada.

Esse resultado proporcionou a evidência de que Naglu-IGFII foi internalizada em células e transportada para o compartimento celular correto, os lisossomos.

A meia-vida de Naglu-IGFII internalizada nos fibroblastos de pacientes Sanfilippo B foi determinada como sendo de 1,5 dias (dados não mostrados). EXEMPLO 25: Estudos in vivo em modelos de camundongos Rato canulado do tipo selvagem (wt) Além do modelo de camundongo Sanfilippo B, o rato canulado wt, um modelo animal não deficiente, também foi usado para a triagem molecular in vivo.

Foram cirurgicamente implantadas cânulas nas regiões lombar superior e torácica inferior da medula espinhal dos ratos canulados wt e uma única injeção de 35ul ao CSF foi feita através da cânula.

Os critérios avaliados para a triagem molecular usando esse modelo animal foram ensaio de atividade da Naglu e imuno-histoquímica do cérebro e da medula espinhal.

Modelo de camundongo com síndrome de Sanfilippo tipo B O modelo de camundongo com síndrome de Sanfilippo tipo B (camundongo Naglu-/-, camundongo Sanfilippo B) foi gerado por E.

Neufeld e colega (Li HH, et al, PNAS 96(25):14505- 14510; 1999). O exon 6 do gene Naglu de camundongo é rompido por meio da inserção de um marcador de seleção,

gene resistente a neomicina.

Os camundongos homozigotos resultantes Naglu-/- são completamente deficientes em Naglu (Figura 168) e têm acumulação total de GAG no fígado e no rim.

Apesar da deficiência total de Naglu, esses 5 camundongos são geralmente saudáveis e têm um tempo de vida de 8-12 meses.

Alterações da expressão de outras enzimas lisossomais acontecem em uma idade em torno de 5 meses, essas alterações incluem aumento compensatório de ß- galactosidase, α-glucosidase, ß-glucuronidase e ß- hexosaminidase no fígado e no cérebro, elevação da α-L- iduronidase no fígado, mas não no cérebro, e a redução de neuraminidase no fígado e no cérebro.

A morte geralmente ocorre como resultado da retenção urinária e infecção urinária.

O modelo de camundongo Sanfilippo B tem sido extensivamente estudado na literatura para descrever mudanças patológicas da Sanfilippo B.

O fenótipo relacionado à patologia no CNS do camundongo Naglu-/- é relatado como sendo hipoatividade na idade de 4,5 meses, mas hiperatividade em outras idades também tem sido observada.

As alterações neuropatológicas em camundongos Naglu-/- são descritas como vacúolos e corpos de inclusão em neurônios, macrófagos e células epiteliais, como observado por EM (microscopia eletrônica). Essas alterações patológicas normalmente começam aos 33 dias de idade e se agravam progressivamente conforme os animais ficam mais velhos.

Astrócitos e células da micróglia ativados são também demonstrados por análise histopatológica.

A análise bioquímica de dois gangliosídeos, GM2 e GM3, mostrou um aumento de 5 vezes e 9 vezes no cérebro. (Uma vez que GM2 e

GM3 não são substratos diretos da Naglu e pode ser um desafio demonstrar uma redução significativa após ERT por um curto período de tempo, eles não foram usados como biomarcadores finais para POC). 5 A análise bioquímica foi feita por meio de medição das atividades enzimáticas da Naglu e níveis de GAG, a análise histológica foi feita por imuno-histoquímica de anticorpo antiNaglu humana, anticorpo antiLAMP-1, anticorpo anti-Iba- 1 e anticorpo antiGFAP.

O anticorpo antiNaglu humana usado para este estudo foi um anticorpo monoclonal de camundongo não ligante à Naglu murina endógena em camundongos wt ou à Naglu mutante em camundongos Sanfilippo B.

A imunocoloração LAMP-1 usou um anticorpo ligante à proteína de membrana lisossomal, proteína de membrana associada lisossomal-1. A coloração Iba-1 usou um anticorpo ligante à proteína adaptadora de ligação a cálcio ionizado que é específica para as células da micróglia e macrófagos.

A coloração GFAP usou um anticorpo ligante à proteína ácida fibrilar glial que é específica para os astrócitos.

Triagem de atividade biológica in vivo por injeção intracranial (IC) em camundongos Sanfilippo B O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade biológica de enzimas Naglu in vivo.

Neste estudo, as proteínas foram administradas através de injeção IC no cérebro do camundongo Sanfilippo B.

A idade dos camundongos Sanfilippo B para o estudo foi cautelosamente combinada para ser de 8 semanas de idade.

A via de injeção IC ofereceu o melhor cenário de caso para avaliar a eficácia das moléculas.

Proteínas Naglu foram avaliadas pela sua capacidade de ser absorvidas pelas células neuronais e reduzir o armazenamento lisossomal.

Imuno-histoquímica foi usada para avaliar a biodistribuição.

E o armazenamento lisossomal foi caracterizado pelo número e tamanho de colorações positivas com imunocoloração LAMP-1. 5 A injeção IC foi feita por injeção direta através do crânio do camundongo Sanfilippo B no córtex cerebral direito.

Dois microlitros, ou 35µg, de proteína Naglu foram injetados em cada animal.

Os sacrifícios dos animais aconteceram 7 dias após a injeção.

O tempo de sacrifício foi pré-determinado em um estudo piloto onde os sacrifícios do animal ocorreram 3, 7 e 14 dias após a injeção.

A partir do estudo piloto, determinou-se que 7 dias após a injeção é o tempo ótimo para estudo imuno-histoquímico.

Seções cerebrais foram cortadas transversalmente (Figura 169), e imunocolorações Naglu e LAMP-1 foram realizadas.

A absorção celular tanto nos neurônios como nas células gliais em camundongo Sanfilippo B tratado com rhNaglu e Naglu-IGFII foi demonstrada por imuno-histoquímica usando um anticorpo anti-Naglu humana (Figura 170 e Figura 171). Não houve diferença significativa entre em camundongo Sanfilippo B tratado com rhNaglu e Naglu-IGFII em relação à absorção celular foi observada.

Além disso, a imunocoloração LAMP-1 do tecido cerebral do camundongo tratado tanto com rhNaglu quanto com Naglu-IGFII indica um nível significativo de redução do armazenamento lisossomal.

O nível de redução de armazenamento lisossomal em ambos os grupos tratados com rhNaglu e Naglu-IGFII foi quase o mesmo nível do camundongo wt normal.

A redução do armazenamento lisossomal também foi observada em camundongos Sanfilippo B testados com Naglu-

TAT, Naglu Kif e PerT-Naglu após a injeção IC (dados não mostrados). Este estudo demonstrou a atividade biológica in vivo de todos os variantes de Naglu.

Em um estudo separado, camundongos deficientes em 5 Naglu foram administrados via IT com um veículo ou, alternativamente, com uma, duas ou três doses semanais de um construto de proteína de fusão Naglu-IGF-II recombinante (Naglu) em PBS.

Um grupo de camundongos do tipo-selvagem não tratado serviu como um controle do tipo selvagem não tratado e foi administrado com um veículo sem Naglu.

Os camundongos foram sacrificados após 24 horas após a última injeção, seguido pela preparação de tecido para imuno- histoquímica (IHC) e a análise histopatológica.

A distribuição de Naglu para os tecidos cerebrais dos camundongos deficientes em Naglu foi evidente após a administração IT da Naglu recombinante.

Como ilustrado na Figura 172A, a administração IT da Naglu recombinante aos camundongos deficientes em Naglu resultou na redução generalizada de vacuolização celular nos tecidos de substância branca em comparação a camundongos deficientes em Naglu aos quais foi administrado veículo por via IT.

Da mesma forma, e como ilustrado na Figura 172B, a análise morfométrica revelou uma redução acentuada na imunocoloração LAMP1 nos tecidos da substância branca dos camundongos tratados em relação aos camundongos deficientes em Naglu não tratados, refletindo, assim, uma melhoria na patologia da doença.

Como mostrado nas Figuras 173A-B, em cada área de tecido cerebral avaliada (o córtex, núcleo caudado e putâmen (CP), tálamo (TH), cerebelo (CBL) e substância branca (WM)), a área positiva para LAMP foi reduzida nos ratos tratados com Naglu em relação aos camundongos- controle deficientes em Naglu não tratados, e aproximou-se da área positivo para LAMP dos camundongos do tipo 5 selvagem.

Particularmente notável é que as áreas positivas para LAMP em cada área de tecido cerebral analisada foram reduzidas após a administração IT de duas ou três doses (Figura 173B) em relação a uma única dose (Figura 173A) de Naglu.

Esses resultados confirmam que a Naglu administrada por via IT é capaz de modificar a progressão de doenças de armazenamento lisossomal tais como a síndrome de Sanfilippo tipo B no modelo de camundongo deficiente em Naglu, confirmando ainda mais a capacidade de enzimas administradas por via IT, tais como a Naglu, em tratar as manifestações associadas ao sistema nervoso central em doenças de armazenamento lisossomal, tais como a síndrome de Sanfilippo tipo B.

Triagem molecular por via intratecal (IT) em ratos canulados wt Este estudo imita diretamente uma abordagem mediada por porta para a administração de drogas.

A proteína Naglu foi administrada em injeções via IT em ratos wt canulados para determinar a biodistribuição no parênquima do cérebro.

A cânula nesses animais foi colocada na porção lombar superior e torácica inferior da medula espinhal (Figura 174). Os animais foram injetados com 35 µL, ou 385 µg de rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII e PerT-Naglu, através da cânula (devido à limitação de solubilidade, Naglu Kif foi injetada com apenas 38,5 µg, que é 10 vezes menos do que o resto das Naglu). Os sacrifícios aconteceram em 4h e 24h após as injeções.

Tecidos cerebrais e da medula espinhal foram coletados e medidos para o ensaio de atividade da Naglu.

No cérebro 5 de animais tratados, animais tratados com Naglu-TAT e Naglu-IGFII exibiram maior atividade do que os animais tratados com rhNaglu e todas as outras variantes de Naglu (Figura 175). Como uma tendência geral, a atividade da Naglu foi significativamente mais elevada na medula espinhal do que no cérebro para todos os animais tratados (dados não mostrados). Esse fenômeno poderá indicar que as proteínas foram mais captadas no local mais próximo à injeção IT.

A análise imuno-histoquímica indicou que a biodistribuição no grupo tratado com Naglu-IGFII foi mais extensa no cérebro do que em todos os grupos tratados com outras variantes de Naglu 24 h após as injeções IT (Figura 176 e Figura 177). Nos animais tratados com rhNaglu, a proteína foi observada apenas nas meninges do cérebro.

Na seção da medula espinal, a IHC indicou alguma absorção celular de rhNaglu nos neurônios da substância cinzenta, mas em um grau muito menor do que a absorção de Naglu-IGFII nos neurônios da medula espinhal (dados não mostrados). No grupo injetado com Naglu-TAT via IT, embora a maior atividade da Naglu tenha sido observada em tecido cerebral por análise bioquímica, mas a IHC não indicou nenhuma outra penetração de Naglu-TAT no parênquima do cérebro que não a permanência nas meninges.

Além de Naglu-IGFII, todas as outras variantes de Naglu falharam em mostrar biodistribuição além das meninges, um forte testemunho da dependência de receptores M6P/IGFII para a absorção celular de Naglu no cérebro após a injeção IT. Este estudo apontou à Naglu-IGFII como a molécula principal para o desenvolvimento de drogas para Sanfilippo B. 5 EXEMPLO 26: ESTUDO DE PROVA DE CONCEITO USANDO NAGLU-

IGFII Projeto experimental O estudo de prova de conceito foi projetado para mostrar tanto a biodistribuição quanto a reversão do armazenamento lisossomal após a injeção IT de Naglu-IGFII em camundongo Sanfilippo B. Para este estudo, três grupos de camundongos Sanfilippo B com 8 semanas de idade foram tratados com uma injeção IT de Naglu-IGFII. Cada injeção IT se constituiu em um volume de 10ul ou 260 µg de Naglu- IGFII. Houve três grupos tratados: grupo de 1x injeção, 2x injeções e 3x injeções. Para o grupo de 1x injeção, uma dose única de proteína foi administrada no dia 0. Os animais foram sacrificados 24 horas após a injeção. Para o grupo de 2x injeções, duas injeções IT foram administradas no dia 0 e no dia 7, e os animais foram sacrificados 24 horas após a última injeção. Para o grupo de 3x injeções, injeções IT foram administradas no dia 0, dia 7 e no dia 14, e os animais foram sacrificados 24 horas após a última injeção. Três grupos de camundongos tratados com veículo também foram incluídos. Para os grupos de controle veículo, os camundongos Sanfilippo B foram injetados com veículo no mesmo intervalo de tempo que os grupos tratados e foram sacrificados da mesma forma que os grupos tratados. Ambas as análises bioquímicas e histológicas foram aplicadas para avaliar o resultado do estudo. As análises bioquímicas incluíram um ensaio de atividade da Naglu para medir a quantidade de enzimas no tecido e um ensaio de GAG total para avaliar a redução do armazenamento lisossomal.

Fígado e cérebro foram os dois tecidos submetidos às 5 análises bioquímicas (Figura 178 e Figura 179). As análises histológicas incluem coloração H&E dos tecidos para avaliação morfológica (dados não mostrados), e coloração imuno-histoquímica com o anticorpo anti-Naglu humana, LAMP, Iba e GFAP (dados para coloração Iba e GFAP não mostrados). O anticorpo anti-Naglu humana usado para este estudo foi um anticorpo monoclonal de camundongo não ligante a Naglu murina endógena em camundongo wt ou a Naglu mutante em camundongo Sanfilippo B.

A imunocoloração LAMP-1 usou um anticorpo ligante a proteínas de membrana associadas lisossomais.

A coloração Iba-1 usou um anticorpo ligante à proteína adaptadora de ligação a cálcio ionizado que é específica para as células da micróglia e macrófagos.

A coloração GFAP usou um anticorpo ligante à proteína ácida fibrilar glial que é específica para os astrócitos.

Figuras microscópicas representativas da imunofluorescência da Naglu são mostradas na Figura 180. A Figura 181 mostra uma seção representativa esquemática do cérebro.

Embora a Naglu-IGFII tenha sido detectada no córtex cerebral, que é mais próximo das meninges, ela não foi encontrada na região subcortical, tais como o núcleo caudado, tálamo e substância branca (dados não mostrados). Uma vez que a imunocoloração LAMP-1, Iba-1 e GFAP das mesmas áreas subcorticais demonstrou a inversão do armazenamento lisossomal, acreditou-se que a imunocoloração negativa de Naglu nas áreas profundas do cérebro foi provavelmente devida à sensibilidade da imunofluorescência por Naglu.

Figuras microscópicas representativas de imunocoloração LAMP-1 são mostradas nas Figuras 182 à 5 Figura 186. Para demonstrar a extensão da distribuição de proteínas e eficácia, o córtex cerebral e regiões subcorticais, tais como o núcleo caudado, tálamo e substância branca e córtex cerebelar foram selecionados para análise imuno-histológica.

O resultado da imunocoloração Iba-1 e GFAP (dados não mostrados) indicou que o que foi visto na imunocoloração LAMP-1 foi o efeito combinado das alterações de células da micróglia e astrócitos, os dois tipos de células que foram relatados de serem afetados no modelo de camundongo Sanfilippo B (Li 2002, Ohmi 2002), além de neurônios.

Devido a limitações técnicas, a imunocoloração LAMP-1 não foi capaz de revelar o armazenamento lisossomal em neurônios.

Para observar melhor o acúmulo lisossomal em neurônios, tais vacúolos e inclusões, a microscopia eletrônica é geralmente usada (EM não foi incluída no presente estudo). Deve-se notar que a identificação de tipos celulares foi limitada a neurônios e células gliais.

Os neurônios foram tipicamente identificados pelo núcleo relativamente grande e pálido que contém um ou mais nucléolos densamente corados e o citoplasma frequentemente detectável.

As células gliais foram geralmente identificadas pelo núcleo pequeno e denso e citoplasma imperceptível.

A distinção entre os diferentes tipos de células gliais, tais como astrócitos, células da micróglia, células ependimais e oligodendrócitos, é tipicamente feita melhor por coloração com marcadores específicos do tipo celular.

Além da redução do armazenamento lisossomal exibida pela imunocoloração LAMP-1, a imunocoloração Iba-1 indicou a redução do tamanho celular e o número de processos em 5 células da micróglia, e a imunocoloração GFAP indicou a redução do tamanho celular e do comprimento/número de processos em astrócitos no córtex cerebral, núcleo caudado, tálamo, substância branca e cerebelo após as injeções IT de Naglu-IGFII (dados não mostrados). Além disso, a análise histopatológica por coloração H&E (hematoxilina e eosina) dos tecidos cerebrais das mesmas áreas examinadas para imuno-histoquímica demonstrou a redução de vacúolos nas células gliais após 3x injeções IT de Naglu-IGFII.

Todos os resultados mencionados acima também sugeriram o efeito relacionado à dose de injeções IT de Naglu-IGFII.

As análises bioquímicas de camundongos Sanfilippo B após a injeção IT de Naglu-IGFII detectaram atividade de Naglu no cérebro e no fígado.

A Eficácia da Naglu-IGFII foi demonstrada pela redução de GAG total no cérebro e no fígado.

A imuno-histoquímica demonstrou a biodistribuição de Naglu-IGFII no parênquima do cérebro.

A imunocoloração de LAMP-1, Iba-1, GFAP e análise histopatológica por coloração H&E exibiram redução do armazenamento lisossomal, a redução do tamanho e processos por microgliais e astrócitos, não só na área cortical cerebral do cérebro, mas também nas áreas sub-corticais, substância branca e córtex cerebelar do cérebro.

Conclusões Entre outras coisas, foi demonstrado que a proteína de fusão, Naglu-IGFII, exibiu uma atividade enzimática in vitro em relação a um substrato que tem uma estrutura semelhante àquela do substrato nativo de Naglu. O estudo de absorção celular in vitro demonstrou que a molécula foi captada pelas células através do receptor M6P/IGFII de uma 5 maneira que foi independente da glicosilação de M6P. Foi mostrado que a Naglu-IGFII internalizada colocaliza com lisossomos. Foi mostrado que a Naglu-IGFII reduz o armazenamento lisossomal in vivo após a injeção IC em camundongo Sanfilippo B. Em comparação à rhNaglu e a outras fusões e modificações da Naglu, a Naglu-IGFII ultrapassou todas na penetração do parênquima do cérebro de ratos wt canulados após a injeção IT. Finalmente, a injeção IT de Naglu-IGFII em camundongos Sanfilippo B demonstrou extensa distribuição bem além das meninges e observou reversão de armazenamento lisossomal no córtex cerebral, bem como nas regiões subcorticais. Tomados em conjunto, esses dados indicam que a Naglu-IGFII é uma droga candidata para o tratamento da doença de Sanfilippo B. EXEMPLO 27: TOXICIDADE, FARMACOCINÉTICA (PK) E ESTUDOS DE BIODISTRIBUIÇÃO EM TECIDOS DE NAGLU-IGFII ENTREGUE VIA

IT Estudos de prova de conceito em camundongo Três grupos (n=3) de camundongos Naglu (-/-) foram injetados com 10 uL contendo 260 µg de Naglu-IGFII dada como uma injeção de bolus IT lombar única. A dose de 260 µg se traduz em uma dose de 520 mg/kg de peso cerebral (cérebro do camundongo=0,0005 kg). Um grupo foi injetado no Dia 0 e sacrificado 24 horas após a injeção. Um segundo grupo foi injetado nos Dias 0 e 7 e sacrificado 24 horas após a última injeção. O terceiro grupo foi injetado nos

Dias 0, 7 e 14 e sacrificado 24 horas após a última injeção.

Cada grupo dosado com Naglu-IGFII foi emparelhado com um grupo controle veículo a fim de controlar por idade/gravidade da doença. 5 A atividade da enzima Naglu no cérebro e no fígado foi semelhante para os três grupos dosados com Naglu-IGFII.

Comparando a atividade enzimática da rhNaglu no fígado àquela no cérebro, uma atividade enzimática da rhNaglu mais de 10 vezes maior foi encontrada no fígado.

Foi contemplado que uma vez que os níveis de atividade da enzima rhHNS foram comparáveis no cérebro e no fígado após 1, 3, e 6 meses de dosagem nos estudos principais de toxicidade em ratos e macacos jovens, alguma porção da dose de rhNaglu dada aos camundongos Naglu (-/-) pode não ter sido entregue via IT, mas sistemicamente.

No entanto, o nível de GAG total no cérebro mostrou uma redução estatisticamente significativa (p<0,05) após 3 injeções IT.

Uma tendência relacionada à dose para a redução do nível de GAG total foi observada nos fígados, o que foi estatisticamente significativo (p<0,05) nos grupos que receberam 2 ou 3 doses.

A biodistribuição da Naglu-IGFII após a injeção IT foi observada bem além das meninges dentro do parênquima do cérebro, mas regiões subcorticais profundas foram negativas para a imunocoloração com anticorpo anti-Naglu.

Uma redução da atividade lisossomal por imunocoloração por proteínas de membrana associadas lisossomais (LAMP) foi observada nos grupos que receberam apenas 2 doses ou 3. Áreas de redução da atividade lisossomal incluíram o córtex cerebral e regiões subcorticais profundas do núcleo caudado, tálamo e substância branca.

Portanto, a redução de vários parâmetros de imunocoloração em animais dosados com Naglu-IGFII sugeriu que os níveis terapêuticos de NAGLU podem estar presentes mesmo na ausência de imunocoloração anti-NAGLU. 5 Uma resposta inflamatória atenuada foi evidenciada pela diminuição da imunocoloração por proteína ácida fibrilar glial (GFAP) de astrócitos e redução da coloração por molécula adaptadora de ligação a cálcio ionizado (Iba) de micróglia/macrófagos apenas em grupos tratados com 2 ou 3 doses.

Áreas de análise incluíram o córtex cerebral e regiões subcorticais profundas do núcleo caudado, tálamo e substância branca.

Estudos em rato O rato S-D foi selecionado como a espécie de roedor para a avaliação toxicológica de Naglu-IGFII administrada via IT.

Como resultado, dezesseis ratos (oito por sexo) são dosados com Naglu-IGFII recombinante na máxima dose possível (MFD) e a cerca de ¼ e ½ da MFD (níveis baixos e médios de dose, respectivamente) a cada 4 dias para um total de 8 doses.

O estudo da PK/biodistribuição de dose única em ratos S-D é realizado para determinar a concentração no CSF e no soro, ou a distribuição tecidual, respectivamente, após a administração IT-L a animais do sexo masculino e do sexo feminino.

Os estudos toxicológicos são projetados para avaliar a administração IT-L de Naglu-IGFII a partir de uma perspectiva farmacológica de segurança e toxicologia (segurança neurológica, respiratória e cardiovascular) tanto em animais machos quanto fêmeas.

A avaliação toxicológica nesses estudos inclui observações clínicas, pesos corporais, consumo de alimento, patologia clínica, avaliações farmacológicas de segurança adequadas (por exame físico ou eletrocardiograma), tecido macroscópico e 5 avaliação microscópica.

Um número limitado de amostras de CSF e soro é coletado e analisado para Naglu-IGFII e para anticorpos contra o artigo de teste.

A distribuição tecidual de Naglu-IGFII e localização subcelular são quantificadas por ensaio de atividade enzimática e imuno- histoquímica, respectivamente.

Adicionalmente, os estudos selecionados incluem um período de recuperação para avaliar a reversibilidade, ou potencial aparecimento tardio, de quaisquer achados toxicológicos significativos notados.

Estudos em macacos O macaco cynomolgus foi selecionado como a espécie não roedora para as avaliações toxicológicas de Naglu-IGFII administrada via IT devido à sua semelhança genética e anatômica aos seres humanos e, portanto, é considerado como a espécie mais relevante.

Levando-se em conta que a população de pacientes planejada para os ensaios clínicos para a Síndrome de Sanfilippo tipo B é pediátrica, é realizado um estudo toxicológico crônico de 6 meses em macacos cynomolgus jovens apresentando uma administração de Naglu-IGFII por meio de um dispositivo de entrega de droga por via intratecal (IDDD). Macacos cynomolgus jovens têm geralmente menos de 1 ano de idade no início do estudo (cerca de 7-9 meses de idade) e pesam entre 900 g a 1.500 g no início do estudo.

Os dados obtidos a partir de um estudo de toxicidade de dose repetida de 1 mês em macaco cynomolgus jovem orientam a seleção do nível de dose e do projeto do estudo de seis meses em macaco jovem. Os estudos de toxicologia de dose repetida são projetados para imitar a via clínica esperada (bolus IT-L) e frequência de administração (semanas alternadas; EOW) durante um período 5 de 1 a 6 meses. Como descrito acima, os estudos de toxicologia são projetados para avaliar a administração IT-L de Naglu-IGFII a partir de uma perspectiva farmacológica de toxicologia e segurança (neurológicas, respiratórias, cardiovasculares e de segurança) tanto em animais do sexo masculino e do sexo feminino. Avaliação toxicológica desses estudos inclui observações clínicas, os pesos corporais, consumo de alimento, patologia clínica, avaliações farmacológicas de segurança adequadas (por exame físico ou eletrocardiograma), tecido macroscópico e avaliação microscópica. Um número limitado de amostras de CSF e soro é coletado e analisado para Naglu-IGFII e para anticorpos contra o artigo de teste. A distribuição tecidual de Naglu- IGFII e localização subcelular são quantificadas por ensaio de atividade enzimática e imuno-histoquímica, respectivamente. Adicionalmente, os estudos selecionados incluem um período de recuperação para avaliar a reversibilidade, ou potencial aparecimento tardio, de quaisquer achados toxicológicos significativos notados. EXEMPLO 28: ADMINISTRAÇÃO INTRATECAL DE NAGLU-IGFII

EOW Este exemplo foi projetado para determinar a viabilidade da dosagem IT lombar EOW de 6 injeções (estudo de 3 meses) no modelo de camundongo Naglu -/-. Esse regime de dosagem pode ser clinicamente mais relevante em comparação à dosagem semanal.

Camundongos Naglu -/- machos e fêmeas com oito semanas de idade foram estudados de acordo com o seguinte projeto experimental: 5 Tabela 49: Projeto experimental para entrega IT de Naglu-IGFII EOW Grupo N Tratamento Dose Frequência Sacrifício A 3 Veículo N/A Injeção IT 24h após a EOW por 3 última meses (total injeção de 6 injeções) B 6 Naglu-IGFII 60 mg/kg peso Injeção IT 24h após a cerebral (30 EOW por 3 última µg) meses (total injeção de 6 injeções) Estudos fisiológicos, incluindo o ensaio de atividade da Naglu no fígado, cérebro e soro, ensaio de anticorpo anti-Naglu no soro e ensaio BCA no fígado e no cérebro, foram realizados.

Estudos histológicos, incluindo IHC da Naglu no cérebro, medula espinhal e fígado e coloração LAMP no cérebro e na medula espinhal, foram realizados.

Cérebro, medula espinhal e fígado foram coletados e fixados em NBF 10%. Cinco seções de parafina µM foram preparadas para coloração histológica.

Coloração imuno- histoquímica (IHC) de Naglu foi usada para detectar a absorção celular da proteína injetada.

Coloração H&E foi usada para observar alterações morfológicas.

LAMP, um indicador da atividade lisossomal e estado da doença, GFAP e Iba-1, dois marcadores patológicos do CNS para os astrócitos ativados e células da micróglia, foram usados para a avaliação de melhoria histopatológica.

A imunocoloração Naglu do cérebro, medula espinhal e 5 fígado de camundongos tratados com veículo e Naglu-IGFII demonstrou que, no cérebro e na medula espinhal, a Naglu injetada foi detectada em meninges (M) apenas por IHC e nenhuma coloração Naglu positiva foi detectada em quaisquer outras regiões (Figura 187). No fígado, as células sinusoidais (S) foram Naglu positivas e nenhuma absorção de Naglu foi encontrada em hepatócitos (H). A imunocoloração LAMP e a coloração H&E da medula espinhal e do fígado de camundongos tratados com veículo e com Naglu-IGFII demonstraram que, em comparação com os animais-veículo, a coloração LAMP diminuiu completamente tanto nos fígados quanto nas medulas espinhais tratados com Naglu.

A coloração H&E demonstrou que a vacuolização celular nos hepatócitos foi evidentemente reduzida no grupo tratado em comparação a animais tratados com veículo (Figura 188 e Figura 189). A coloração H&E do cérebro de camundongos tratados com veículo e com Naglu-IGFII demonstrou uma melhoria da morfologia no cérebro após 6 injeções IT de Naglu-IGFII a cada duas semanas por 3 meses.

No cérebro tratado, a vacuolização celular (setas) em todas as regiões examinadas diminuiu em comparação ao grupo veículo (Figura 190). IHC LAMP em várias regiões do cérebro após 6 injeções IT de Naglu por 3 meses demonstrou que, em comparação ao grupo tratado com veículo, a administração IT de Naglu a camundongos SFB resultou em uma redução da atividade lisossomal em todas as regiões examinadas reveladas pela imunocoloração LAMP (Figura 190). Essa redução foi caracterizada pela diminuição do número de células positivas para LAMP, o tamanho celular menor e coloração 5 mais clara.

Uma redução marcada foi encontrada no cerebelo e no tronco cerebral, os quais estão localizados na parte caudada do cérebro perto da medula espinhal, em comparação a outras regiões do cérebro.

Uma clara redução também foi encontrada nas regiões profundas do cérebro, incluindo a substância branca, hipocampo e tálamo.

IHC Iba em várias regiões do cérebro após 6 injeções IT de Naglu por 3 meses revelou ativação das células microgliais (Figura 191). Em comparação ao grupo tratado com veículo, não foi observada nenhuma diminuição no número de células positivas e na intensidade da coloração no grupo tratado com Naglu.

No entanto, a morfologia celular de células microgliais positivas mudou com o tamanho celular reduzido em todas as regiões do cérebro examinadas em comparação a uma morfologia grande e vacuolada no grupo veículo (inserções). IHC GFAP em várias regiões do cérebro após 6 injeções IT de Naglu por 3 meses revelou ativação astrocitária (Figura 192). Em comparação ao grupo tratado com veículo, A coloração GFAP positiva foi reduzida no c e no tronco cerebral e uma ligeiramente reduzida em outras regiões examinadas.

Com respeito à absorção celular, esses dados demonstram que no cérebro e na medula espinhal, a Naglu foi detectada em células meníngeas apenas após a 6ª injeção IT de Naglu IGFII a cada duas semanas por 3 meses.

A Naglu foi indetectável por IHQ em quaisquer outras regiões do cérebro e da medula espinhal.

No fígado, uma coloração Naglu positiva foi encontrada em células sinusoidais.

Na medula espinhal e no cérebro, após 6 injeções IT de 5 Naglu-IGFII a cada duas semanas por 3 meses, uma melhora histopatológica foi vista em todo o cérebro e medula espinhal, embora a Naglu injetada tenha sido indetectável por IHQ.

A coloração H&E demonstrou uma redução na vacuolização celular em todas as regiões cerebrais examinadas.

A coloração LAMP diminuiu ao longo das medulas espinhais tratadas e em todas as regiões do cérebro avaliadas, incluindo a substância branca, o hipocampo e o tálamo, que são áreas profundas do cérebro, com uma diminuição acentuada no cerebelo e no tronco cerebral no grupo tratado com Naglu-IGFII.

O padrão de coloração reduzido de coloração GFAP para astrócitos foi consistente com a coloração LAMP, embora não tenha diminuído dramaticamente como a LAMP.

A coloração Iba-1 mostrou uma redução no tamanho celular de células da micróglia em todas as regiões cerebrais examinadas.

No fígado, a coloração H&E demonstrou uma redução na vacuolização celular com diminuição acentuada na coloração LAMP no grupo tratado com Naglu.

EXEMPLO 29: TRATAMENTO DE PACIENTES SANFILIPPO B Administração direta no CNS através de, por exemplo, entrega IT pode ser usada para tratar efetivamente pacientes com a síndrome de Sanfilippo tipo B (Sanfilippo B). Este exemplo ilustra um estudo multicêntrico de escalonamento de dose projetado para avaliar a segurança de até 3 níveis de dose a cada duas semanas (EOW) por um total de 40 semanas de Naglu-IGFII e/ou rhNaglu administradas por meio de um dispositivo de entrega de drogas por via intratecal (IDDD) a pacientes com síndrome de Sanfilippo B.

Vários exemplos de dispositivos de entrega de drogas por 5 via intratecal adequados para o tratamento humano estão representados nas Figuras 94-97. Até 20 pacientes serão inscritos: Coorte 1: 5 pacientes (menor dose) Coorte 2: 5 pacientes (dose intermediária) Coorte 3: 5 pacientes (maior dose) 5 pacientes serão selecionados aleatoriamente para nenhum tratamento.

Os pacientes são selecionados para o estudo com base na inclusão dos seguintes critérios: É determinada a segurança de doses ascendentes de Naglu-IGFII administradas por injeção IT por 40 semanas em pacientes com Sanfilippo B.

Além disso, a atividade clínica de Naglu- IGFII e/ou rhNaglu na função cognitiva e a farmacocinética de doses única e repetida no soro e concentrações no líquido cefalorraquidiano (LCR) são avaliadas.

Tipicamente, uma quantidade terapeuticamente efetiva de Naglu-IGFII e/ou rhNaglu é administrada por via intratecal em intervalos regulares, dependendo da natureza e extensão dos efeitos da doença, e de forma permanente.

A administração em um "intervalo", tal como aqui usada, indica que a quantidade terapeuticamente efetiva é administrada periodicamente (distintamente de uma dose única). O intervalo pode ser determinado por técnicas clínicas padrão.

Em algumas modalidades, Naglu-IGFII e/ou rhNaglu é administrada por via intratecal a cada dois meses, mensalmente, duas vezes por mês, a cada três semanas, a cada duas semanas, semanalmente, duas vezes por semana, três vezes por semana ou diariamente.

O intervalo 5 de administração para um único indivíduo não precisa ser um intervalo fixo, mas pode ser variado ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo.

Por exemplo, em situações de doença física ou estresse, se os anticorpos anti-Naglu tornam-se presentes ou aumentam ou se os sintomas da doença pioram, o intervalo entre doses pode ser diminuído.

Embora certos compostos, composições e métodos aqui descritos tenham sido descritos com especificidade de acordo com certas modalidades, os seguintes exemplos servem apenas para ilustrar os compostos da invenção e não se destinam a limitar a mesma.

Os artigos "um" e "uma" como aqui usados na especificação e nas reivindicações, a menos que claramente indicado em contrário, devem ser entendidos como incluindo os referentes plurais.

Reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um, ou todos os membros do grupo estão presentes em, empregados no, ou de outra forma relevantes a um dado produto ou processo, a menos que indicado em contrário ou caso contrário evidente no contexto.

A invenção inclui modalidades em que exatamente um membro do grupo está presente em, empregado em, ou de outra forma relevante a um dado produto ou processo.

A invenção também inclui modalidades em que mais do que um, ou todos os membros do grupo estão presentes em,

empregados em, ou de outra forma relevantes a um dado produto ou processo.

Além disso, deve-se entender que a invenção abrange todas as variações, combinações e permutações em que uma ou mais limitações, elementos, 5 cláusulas, termos descritivos, etc., de uma ou mais das reivindicações listadas, é introduzida em outra reivindicação dependente da mesma reivindicação-base (ou, como relevante, qualquer outra reivindicação), a menos que seja indicado o contrário ou a menos que seja evidente para alguém versado na técnica que uma contradição ou incompatibilidade surja.

Onde os elementos estão apresentados como listas, (por exemplo, em grupo Markush ou formato similar), deve-se entender que cada um dos subgrupos dos elementos é também descrito e qual(is)quer elemento(s) pode(m) ser removido(s) do grupo.

Deve-se entender que, em geral, onde a invenção, ou aspectos da invenção, é/são referido(s) como compreendendo elementos particulares, características, etc., certas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente de, tais elementos, características, etc.

Com propósitos de simplificação, tais modalidades não foram definidas especificamente em tantas palavras aqui.

Também deve-se entender que qualquer modalidade ou aspecto da invenção podem ser explicitamente excluídos das reivindicações, não importando se a exclusão específica é mencionada na especificação.

As publicações, websites e outros materiais de referência aqui mencionados para descrever os fundamentos da invenção e para prover detalhes adicionais sobre a sua prática são incorporados aqui por referência.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de uma composição compreendendo uma enzima que é uma substituição para uma enzima lisossômica, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um 5 medicamento para administração por via intratecal a um indivíduo que sofre de ou suscetível a uma doença de armazenamento lisossomal associada ao nível ou atividade reduzida da enzima lisossômica, em que a composição compreende uma enzima presente em uma concentração de pelo menos 5 mg/ml, e até 50 mM de fosfato.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima está presente em uma concentração de pelo menos 10 mg/ml.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima está presente em uma concentração de pelo menos 30 mg/ml.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o fosfato está presente em uma concentração de até 30 mM.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o fosfato está presente em uma concentração de até 10 mM.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que adicionalmente a composição tem um pH de 5,5 a 7,0.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que adicionalmente a composição tem um pH de cerca de 6.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que adicionalmente a composição compreende um tensoativo e um tonificador.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que adicionalmente o tensoativo compreende um polissorbato ou poloxâmero. 5

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que adicionalmente o polissorbato ou poloxâmero está presente em uma concentração de 0,005% a 0,2%.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que adicionalmente o polissorbato ou poloxâmero está presente em uma concentração de 0,005% a 0,02%.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que (i) a composição é administrada em um volume de dose única de menos de 5 mL ou menos de 3 mL; (ii) a administração por via intratecal da composição não resulta em um efeito adverso substancial no indivíduo; e/ou (iii) a administração por via intratecal da composição não resulta na resposta imune adaptativa mediada por células T.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a enzima é liberada a um tecido profundo do cérebro pelo menos 10 mm abaixo da superfície externa, ou a enzima de substituição é especificamente liberada aos lisossomos do tecido profundo do cérebro.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os tecidos profundos do cérebro são selecionados a partir de substância branca profunda, do cérebro, substância cinzenta profunda da medula espinhal, corpo caloso, tecido periventricular, tálamo, fimbria, tecidos abaixo da faixa cortical cerebral, 5 tecidos abaixo de 4 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, tecidos abaixo de 6 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, tecidos abaixo de 10 mm a partir da superfície da superfície do cérebro, camada de células de Purkinje, tecidos da camada de célula granular, tecido profundo de substância branca cerebelar, e tecido profundo do núcleo cerebelar, e combinação dos mesmos.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima de substituição é administrada em uma dose terapêutica eficaz e um intervalo de administração tal que pelo menos 10% dos níveis normais ou atividades da enzima lisossômica em um ou mais tecidos do cérebro, medula espinhal e órgãos periféricos são alcançados.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a dose terapêutica eficaz: (i) varia de 0,005 mg/kg do peso do cérebro a 100 mg/kg do peso do cérebro; (ii) é maior do que 1 mg/kg do peso de cérebro; (iii) é maior do que 10 mg/kg do peso do cérebro; ou (iv) é maior do que 30 mg/kg do peso do cérebro.

17. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a enzima de substituição: (i) contém resíduos de manose-6-fosfato (M6P); (ii) é uma proteína de fusão compreendendo uma porção alvo lisossomal; (iii) é liberada aos neurônios, células gliais, células perivasculares e/ou células meníngeas; e/ou (iv) é adicionalmente liberada aos neurônios na medula 5 espinhal.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que: (i) a doença de armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo em Síndrome de Hunters, doença de leucodistrofia metacromática (MLD), Síndrome de Sanfilippo tipo A, síndrome de Sanfilippo tipo B, e doença de leucodistrofia de célula globoide (GLD) e em que a enzima de substituição é opcionalmente selecionada a partir do grupo consistindo em iduronato-2- sulfatase recombinante (I2S), arilsulfatase A (ASA), heparan N-sulfatase (HNS), alfa-N-acetilglicosaminidase (Naglu) e β-galactosidase (GLC); ou (ii) a doença de armazenamento lisossomal é selecionada a partir do grupo consistindo em aspartilglicosaminuria, doença de armazenamento de ésteres de colesterol, doença de Wolman, cistinose, doença de Danon, doença de Fabry, lipogranulomatose de Farber, doença de Farber, fucosidose, galactosialidose tipos I/II, doença de Gaucher tipos I/II/III, leucodistrofia de células globoides, doença de Krabbe, doença de armazenamento de glicogênio II, doença de Pompe, gangliosidose GM1 tipos I/II/III, gangliosidose GM2 tipo I, doença de Tay Sachs, gangliosidose GM2 tipo II, doença de Sandhoff, gangliosidose GM2, α-manosidose tipos I/II, beta- manosidose, leucodistrofia metacromática, mucolipidose tipo

I, sialidose tipos I/II, mucolipidose tipos II/III, doença na célula I, pseudo-Hurler polidistrofia de mucolipidose tipo IIIC, mucopolissacaridose tipo I, mucopolissacaridose tipo II, síndrome de Hunter, mucopolissacaridose tipo IIIA, 5 síndrome de Sanfilippo tipos A, B ou C, mucopolissacaridose tipo IIIB, mucopolissacaridose tipo IIIC, mucopolissacaridose tipo IIID, mucopolissacaridose tipo IVA, síndrome de Morquio, mucopolissacaridose tipo IVB, mucopolissacaridose tipo VI, mucopolissacaridose tipo VII, síndrome de Sly, mucopolissacaridose tipo IX, deficiência múltipla de sulfatase, lipofuscinose ceroide neuronal, doença de Batten CLN1, doença de Batten CLN2, doença de Niemann-Pick tipos A/B, doença de Niemann-Pick tipo C1, doença de Niemann-Pick tipo C2, picnodisostose, doença de Schindler tipos I/II, doença de Gaucher e doença de armazenamento de ácido siálico; e/ou (iii) a doença de armazenamento lisossomal está associada a sintomas periféricos e o método compreende adicionalmente a administração da enzima de substituição intravenosamente ao indivíduo, opcionalmente em que a administração intravenosa não é mais frequente do que administração mensal; ou (iv) a doença de armazenamento lisossomal está associada a sintomas periféricos e o método não envolve a administração da enzima de substituição intravenosamente ao indivíduo.

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