BR112020007327A2 - vesículas extracelulares modificadas geneticamente por proteína - Google Patents

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BR112020007327A2
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Abstract

A presente invenção se refere a vesículas extracelulares (EVs) como uma abordagem terapêutica inovadora para doenças do armazenamento lisossomal (LSD). Mais especificamente, a invenção se refere ao uso de várias estratégias de modificação genética de proteína para melhorar o carregamento de proteínas relacionadas a LSD difíceis de carregar e o alvejamento das EVs resultantes em tecidos e órgãos de interesse.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “VESÍCULAS EXTRACELULARES MODIFICADAS GENETICAMENTE POR PROTEÍNA” Campo técnico
[001] A presente invenção se refere a vesículas extracelulares modificadas geneticamente (EVs) como uma abordagem terapêutica inovadora para doenças do armazenamento lisossomal (LSD). Mais especificamente, a invenção se refere ao uso de várias estratégias de modificação genética de proteína para melhorar o carregamento de proteínas difíceis de carregar relacionadas a LSD, e o alvejamento das EVs resultantes em tecidos e órgãos de interesse.
Fundamentos da técnica
[002] Doenças do armazenamento lisossomal formam um subgrupo significante de erros congênitos de metabolismo. Estima-se que LSDs afetem 1 em cada 5.000 nascimentos vivos, entretanto, devido a casos não diagnosticados e mal diagnosticados, considera-se que esse valor seja maior. Todas as LSDs são causadas pelo acúmulo de macromoléculas específicas ou compostos monoméricos dentro das organelas do sistema endossomal-autofágico-lisossomal. Além dos erros no armazenamento de substrato, LSDs são tipicamente associadas com distúrbios e patologias neurológicas, sendo responsável por uma grande proporção de casos dos casos de neurodegeneração em todo o mundo. As duas décadas passadas passaram por avanços contra LSDs, particularmente em decorrência do desenvolvimento de terapias de substituição de enzima. Entretanto, existem ainda diversas doenças nas quais as terapias atuais precisam de desenvolvimento adicional, ou, pior ainda, não existem. Niemann-Pick tipo C é um exemplo de uma tal LSD, que é causada pela ausência ou mau funcionamento da proteína NPC-l. A proteína NPC-1 é envolvida na colocalização e transporte intracelular de grandes moléculas solúveis em água, tais como colesterol e glicolipídios. Consequentemente, em quadros de doença, colesterol livre e glicoesfingolipídios se acumulam em múltiplos tecidos e órgãos. A doença de Niemann Picks tem um amplo espectro clínico, que pode se manifestar como hepato-, espleno- ou hepatoesplenomegaila. Típico das LSDs, a Niemann Picks resulta em patologias neurológicas progressivas, resultando em morte prematura dentre todos os casos além de primeira infância. Atualmente não existe cura para Niemann Pick tipo C (NPC), e regimes de tratamento atuais implicam gerenciamento da doença.
[003] As estratégias de tratamento anteriores para NPC incluíram fármacos para aliviar sintomas, tais como antiepilépticos, anticolinérgicos ou antidepressivos. Desde então, diversos fármacos candidatos procuraram corrigir diferentes estágios dos trajetos de metabolismo de lipídio foram ou estão atualmente sendo avaliados em um quadro clínico, incluindo miglustat e hidroxipropil-bg- ciclodextrina (CD). Miglustat é um açúcar imino que inibe a atividade de glicosilceramida sintase, diminuindo, por meio disso, a produção de glicoesfingolipídios. Originalmente, miglustat foi desenvolvido para o tratamento de doença de Gaucher, e foi aprovado na Europa para uso em pacientes com NPC em 2009. CD é também atualmente submetida a experimentos clínicos para o tratamento de NPC, por meio de vias tanto intratecal quanto intravenosa de administração. Acredita-se que CD interage com colesterol e tanto remove-o da circulação quanto desloca sua distribuição. Diversos desafios são associados com todas as terapias existentes para NPC e, mais importantemente, eles não abordam adequadamente a patologia da doença subjacente.
[004] Os produtos biofarmacêuticos tais como biologias de proteína (das quais uma classe importante mas frequentemente insuficiente de fármacos são as terapias de substituição de enzima mencionadas anteriormente) e produtos terapêuticos de RNA podem prover um meio alternativo mais eficaz para tratar LSDs. A introdução de ERTs na prática clínica no início dos anos 1990 resultou em uma mudança transformadora em como certas LSDs (por exemplo, doença de Gaucher) são tratadas, mas ERTs ainda apresentam inconvenientes significantes, significando que muitas categorias de paciente com LSD são ainda pesadamente desmerecidas.
Embora muitas ERTs realizem seu efeito terapêutico dentro das células alvos, a internalização desses fármacos a base de proteína não é particularmente eficaz.
Além disso, devido ao grande tamanho e carga essencialmente de todas as biologias de proteína, ERTs não cruza a barreira sangue-cérebro e são, portanto, impedidas de entrar no sistema nervoso central (CNS), que é a chave para o tratamento de diversas LSDs, uma vez que as manifestações neurológicas dessas doenças são muito severas.
MWO2016/044947 descreve tentativas de utilizar exossomos como uma modalidade terapêutica para LSDs, e o dito pedido se refere a várias abordagens para intervenção terapêutica entretanto com diversas deficiências significantes na estratégia do projeto.
De fato, embora WO2016/044947 descreva superficialmente a modificação de exossomos para alvejar o lisossomo das células alvos usando construtos de proteína de fusão contendo (i) uma sequência de alvejamento de lisossomo fundida a (ii) uma proteína exossomal, o pedido é visivelmente destituído de revelações relativas ao carregamento e administração bioativa do mRNA e/ou agente a base de proteína terapêutico real.
Evidentemente, embora exossomos tenham sido mostrado ser excelentes carreadores de vários tipos de carga biomolecular, sua utilidade real para administração in vivo de proteínas e/ou mRNA terapêutico não é trivial e exige criteriosa modificação genética vesicular.
Sumário da invenção
[005] Consequentemente, é um objetivo da presente invenção superar os problemas identificados anteriormente associados com modificação genética de EVsS para administração de produtos terapêuticos de proteína para LSDs. A presente invenção aborda diversos dos aspectos chaves de produtos terapêuticos a base de EV para LSDs, a saber, embalagem e carregamento de complexo, carga de fármaco de proteína nas EVs; otimização da farmacocinética das próprias EVs; aproveitamento dos efeitos regenerativos das EVs; e administração bioativa da carga de fármaco (nesse caso proteínas lisossomais, por exemplo, transportadoras e enzimas) nas células alvos in vivo.
[006] A presente invenção alcança isso utilizando tecnologia de modificação genética de EV inédita para embalar e carregar, em um estado e configuração bioativos, o complexo e frequentemente proteínas lisossomais muito grandes “necessárias para tratar LSDs. Além disso, a presente invenção também envolve a seleção fortuita e perfilamento de EVS com características moleculares particulares das fontes de célula que fornecem um equilíbrio ideal entre propriedades farmacocinéticas e regenerativas adequadas, bem como a provisão de EVs compreendendo proteína adicional e componentes de ácido nucleico com atividade terapêutica em várias LSDs.
Os inventores da presente invenção perceberam que (i) certas fontes de célula inesperadas são superiores na produção de proteínas lisossomais corretamente enoveladas e, portanto, ativas, (ii) a capacidade de transportar tais proteínas lisossomais para EVs depende altamente do tipo de célula e isso pode ser melhorado usando construtos de proteína de fusão entre as proteínas lisossomais e proteínas exossomais terapêuticas, (iii) certos componentes de proteína de EV são chaves para atividade biológica da proteína de carga e das EVs per se, e (iv) EVs que derivam das fontes de células produtoras de EV aqui permite administração bioativa nos compartimentos intracelulares corretos.
Ao contrário, a técnica anterior, por exemplo, WO2016/044947, é completamente indiferente à seleção de fontes de célula ideais para administração bioativa de proteínas lisossomais, e o dito documento também aparentemente não está ciente da importância de fusão de polipeptídeos de enriquecimento de EV nas proteínas lisossomais terapêuticas per se.
Wo2016/044947 de fato propõe utilizar tecnologia de proteína de fusão, mas meramente para alvejar os compartimentos lisossomais de células alvos.
As fusões de WO2016/044947 são baseadas em sequências de peptídeos curtas que permitem o alvejamento dos exossomos como tal nos lisossomos de células alvos, mas as ditas proteínas de fusão não permitem carregamento bioativo das proteínas lisossomais terapêuticas reais per se em EVs. Assim, a técnica anterior claramente ignora (1) a importância de seleção de fonte de célula como um meio para alvejar na localização intracelular correta, (2) o fato de que proteínas lisossomais tipicamente não são enoveladas corretamente e/ou não são bioativas se modificada geneticamente em qualquer dada fonte de célula, e (3) o fato de que o carregamento de proteínas lisossomais terapêuticas nas EVs frequentemente exige fusão com um polipeptídeo/domínio de enriquecimento de EV para alcançar qualquer atividade enzimática e/ou transportadora nas EVs e importantemente em células alvos.
[007] Em um primeiro aspecto, a presente invenção assim se refere a EVs obteníveis de células estromais mesenquimais (MSCs), células epiteliais amnióticas (AE) ou células derivadas de placenta (P), em que as EVs compreendem uma pluralidade de construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal. As AE- EVs, as MSC-EVs e as P-EVSs como pela presente invenção podem ser modificadas geneticamente para conter vários construtos de polipeptídeo para otimizar a embalagem e carregamento em EVs, alvejar as EVs nos tecidos e/ou tipos de célula de interesse e/ou intensificar o tráfico das EVs para seus compartimentos alvos para tratar diferentes LSDs, isto é, tipicamente os compartimentos lisossomais de células alvos.
[008] Algumas das estratégias de enriquecimento de EVs chaves como pela presente invenção incluem utilizar proteínas de EV e partes de proteínas de EV tal como sintenina, a parte terminal N de sintenina, ou, altamente surpreendentemente, CD63, como parceiros de fusão para proteínas lisossomais terapêuticas. Em modalidades vantajosas, a presente invenção provê proteínas transmembranas lisossomais altamente difíceis de administrar de administração de EVs, tais como a proteína NPCl, cistinosina, as proteínas CLN e/ou a proteína LAMP2.
[009] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal e pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV e, em aspectos adicionais construtos de polinucleotídeo que codificam tais construtos de polipeptídeo.
[010] Mais especificamente, a proteína lisossomal do construto de polipeptídeo da presente invenção pode ser uma ou mais de NPCl, LAMP2, sialina, CIC5, CLN3, cistinosina, ou proteína ativadora de GM2. Pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV do construto de polipeptídeo pode ser sintenina, a porção terminal N de sintenina, e/ou CD63.
[011] Além disso, o polipeptídeo da presente invenção pode compreender adicionalmente pelo menos um peptídeo e/ou polipeptídeo de alvejamento.
[012] A presente invenção também diz respeito a vetores compreendendo os construtos de polinucleotídeo da invenção em que o vetor é um plasmídeo, um minicírculo, e/ou qualquer outro tipo de polinucleotídeo substancialmente circularizado; um vírus tal como um adenovírus, um vírus adeno-associado, um lentivírus, e/ou um vírus livre de capsídeo; um polinucleotídeo DNA e/ou RNA linear; um RNA mensageiro (mMRNA); e/ou um mRNA modificado.
[013] A presente invenção, ainda em um outro aspecto, também se refere as células compreendendo tais construtos de polipeptídeo e/ou polinucleotídeo. Tais células são preferivelmente MSCs, AEs e/ou células derivadas de placenta, e essas células são preferivelmente transfectadas e/ou transduzidas estavelmente com tais construtos de polinucleotídeo, para permitir produção consistente e reprodutível de EVs endogenamente carregadas com uma pluralidade dos construtos de polipeptídeo.
[014] Em aspectos adicionais, a presente invenção também se refere a composições farmacêuticas compreendendo uma pluralidade de EVs como pela presente invenção, e/ou construtos de polipeptídeo da invenção e/ou construtos de polinucleotídeo da invenção, e/ou qualquer tipo de vetores de acordo com a invenção. As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável. As EVsS e/ou tais composições farmacêuticas são particularmente adequadas para o tratamento de LSDs, mas podem também ser úteis no tratamento de várias doenças onde função lisossomal, morfologia, etc. são perturbadas, por exemplo, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, etc.
[015] Ainda em outros aspectos, a presente invenção se refere a métodos para aumentar a quantidade de um polipeptídeo lisossomal em lisossomos e/ou em qualquer outro compartimento celular de um mamífero, bem como vários métodos inventivos para tratar LSDs em um sujeito que necessita dos mesmos. Tais métodos compreendem poder selecionar, perfilar, dosar e administrar EVs a pacientes de uma maneira ideal.
[016] Em uma modalidade preferida, o método para aumentar a quantidade de um polipeptídeo lisossomal em lisossomos e/ou em qualquer outro compartimento celular de um mamífero compreende administrar ao mamífero uma composição compreendendo EVs de acordo com a presente invenção, pelo menos um construto de polipeptídeo de acordo com a presente invenção, pelo menos um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção, e/ou pelo menos um vetor de acordo com a presente invenção.
[017] Em resumo, a presente invenção provê tecnologia de modificação genética de EV altamente inventiva para embalar e carregar, em um estado e configuração bioativos, o complexo e frequentemente proteínas lisossomais muito grandes necessários para tratar LSDs, e selecionar fontes de célula regenerativa ideais com capacidades estabilização e administração de carga adequadas.
Breve descrição das figuras
[018] Figura 1. EVSs derivadas de NPCl amnióticas diminuíram significativamente os níveis de colesterol em células alvos administrando proteína NPCl bicoativa em altas quantidades nas células.
[019] Figura 2. EVs derivadas de MSC de geleia de Wharton (WJI-MSC-EVs, obteníveis da Wharton's jelly) foram modificadas geneticamente com um construto de polinucleotídeo que codifica um construto de polipeptídeo compreendendo a proteína lisossomal cistinosina e a proteína CD63 de enriquecimento de EV, mostrando efeitos de transporte de cisteína potentes in vitro.
[020] Figura 3. AE-EVS positivas para CD44, SSEA4, CD133, CD24 e modificada geneticamente para compreender uma pluralidade de construtos de polipeptídeo de NPCl-sintenina foram avaliadas in vivo em um modelo de camundongo knock- out duplo de doença de Niemann-Pick. As AE-EVs modificadas geneticamente mostraram um efeito terapêutico significante em patologia tanto do fígado quanto de CNS.
Descrição detalhada da invenção
[021] Usando tecnologia inventiva de modificação genética de EV acoplada com projeto seletivo e perfilamento de populações de EV bioativa, a presente invenção aborda diversos dos aspectos chaves de produtos terapêuticos a base de EV para LSDs.
[022] Para conveniência e clareza, certos termos empregados aqui são coletados e descritos a seguir. A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usado aqui têm o mesmo significado comumente entendido por um versado na técnica ao qual essa invenção diz respeito.
[023] Onde recursos, aspectos, modalidades ou alternativas da presente invenção são descritos em termos de grupos Markush, um versado na técnica perceberá que a invenção é também por meio disso descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush. Os versados na técnica perceberão adicionalmente que a invenção é também por meio disso descrita em termos de qualquer combinação de membros individuais ou subgrupos de membros de grupo Markushs. Adicionalmente, será notado que modalidades e recursos descritos com relação à um dos aspectos e/ou modalidades da presente invenção também se aplicam mutatis mutandis a todos os outros aspectos e/ou modalidades da invenção.
Por exemplo, deve-se entender que as proteínas lisossomais descritas aqui, por exemplo, com relação às EVs compreendendo tais proteínas lisossomais, são reveladas, relevantes e compatíveis com todos os outro aspectos, preceitos e modalidades aqui, por exemplo, aspectos e/ou modalidades referentes aos métodos para produzir EVs compreendendo tais proteínas lisossomais Ou aspectos referentes aos construtos de polipeptídeo e/ou polinucleotídeo aqui.
Além disso, todos os polipeptídeos e proteínas identificados aqui podem ser livremente combinados em construtos de polipeptídeo usando estratégias convencionais para fusão de polipeptídeos.
Como um exemplo não limitante, todas as proteínas lisossomais descritas aqui podem ser livremente combinadas em qualquer combinação com um ou mais polipeptídeos de enriquecimento de EV.
Também, toda e qualquer proteína lisossomal aqui pode ser combinada com qualquer outra proteína lisossomal para gerar construtos de polipeptídeo e/ou o polinucleotídeo correspondente, compreendendo mais que uma proteína lisossomal.
Além do mais, todo e qualquer recurso (por exemplo, todo e qualquer membro de um Grupo Markush) pode ser livremente combinado com todo e qualquer outro recurso (por exemplo, todo e qualquer membro de qualquer outro Grupo Markush). Adicionalmente, quando preceitos aqui se referirem a EVs no singular e/ou a EVs como vesículas tipo nanopartículas naturais discretas deve-se entender que todos os tais preceitos são igualmente relevantes e aplicáveis a uma pluralidade de EVs e populações de EVs.
Como um observação geral, as proteínas lisossomais, os polipeptídeos de enriquecimento de EV, os peptídeos e/ou polipeptídeos de alvejamento, as fontes de células produtoras de EV, e todos os outros aspectos, modalidades e alternativas de acordo com a presente invenção podem ser livremente combinados em toda e qualquer possível combinação sem desviar do escopo e o essência da invenção.
Além disso, qualquer polipeptídeo ou polinucleotídeo ou quaisquer sequências de polipeptídeo ou polinucleotídeo (sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos, respectivamente) da presente invenção podem desviar consideravelmente dos polipeptídeos, polinucleotídeos e sequências originais, desde que qualquer dada molécula mantenha a capacidade de realizar o efeito técnico desejado associado com a mesma.
Desde que suas propriedades biológicas sejam mantidas, as sequências de polipeptídeo e/ou polinucleotídeo de acordo com o presente pedido podem desviar em até 50% (calculado usando, por exemplo, BLAST ou ClustalW) comparadas com a sequência nativa, embora uma identidade de sequência que seja o mais alto possível seja preferível (por exemplo, 60%, 70%, 80%, ou por exemplo, 90%
ou mais). A combinação (fusão) de, por exemplo, pelo menos uma proteína lisossomal com pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV naturalmente implica que certos segmentos dos respectivos polipeptídeos possam ser substituídos e/ou modificados e/ou que as sequências possam ser interrompidas por inserção de outros trechos de aminoácido, significando que o desvio da sequência nativa pode ser considerável desde que as propriedades chaves (por exemplo, os efeitos nativos das proteínas lisossomais, tráfico e enriquecimento de EV, propriedades de alvejamento, etc.) são conservadas.
Raciocínio similar assim naturalmente se aplica às sequências de polinucleotídeos que codificam para tais polipeptídeos.
Todos os números de acesso e SEQ ID NOs mencionados aqui com relação aos peptídeos, polipeptídeos e proteínas devem ser vistos apenas como exemplos e apenas para informação, e todos os peptídeos, polipeptídeos e proteínas devem ser atribuídos com seu significado ordinário e os versados na técnica entenderiam.
Assim, como mencionado anteriormente, os versados na técnica também entenderiam que a presente invenção não engloba meramente o SEQ ID NOs e/ou números de acesso específicos referidos aqui, mas também variantes e derivados dos mesmos.
Todos os números de acesso referidos aqui são números de acesso UniProtKB como pela versão de 10 de novembro de 2017 da base de dados, e todas as proteínas,
polipeptídeos, peptídeos, nucleotídeos e polinucleotídeos mencionados aqui devem ser considerados de acordo com seu significado convencional entendido por um versado na técnica.
[024] Deve-se entender que as expressões "vesícula extracelular" ou "EV" ou "exossomo" são usadas indiferentemente aqui e se referem a qualquer tipo de vesícula que seja obtenível de uma célula em qualquer forma, por exemplo, um microvesícula (por exemplo, qualquer vesícula liberada pela membrana plasmática de uma célula), um exossomo (por exemplo, qualquer vesícula derivada do trajeto endo-lisossomal), um corpo apoptótico (por exemplo, obtenível de células apoptóticas), uma micropartícula (que pode ser derivada, por exemplo, de plaquetas), um ectossoma (derivável, por exemplo, de neutrófilos e monócitos em soro), prostatossoma (por exemplo, obtenível de células de câncer de próstata), ou um cardiossoma (por exemplo, derivável de células cardíacas), etc. Exossomos e microvesículas representam EVs particularmente preferíveis. Os tamanhos de EVs podem variar consideravelmente, mas uma EV tipicamente tem um raio hidrodinâmico de dimensão nanométrica, isto é, um raio abaixo de 1.000 nm. Claramente, EVs podem ser derivadas de qualquer tipo de célula, tanto in vivo, ex vivo, quanto in vitro. Entretanto, a presente invenção é predominantemente focada em EVs obteníveis de células epiteliais amnióticas (AE), de células estromais mesenquimais (MSCs), e de células derivadas de placenta.
Além disso, entende-se que os termos "EV" e/ou "exossomo" e/ou "microvesícula" também devem se referir a miméticos de vesícula extracelular, vesículas a base de membrana celular obtidas, por exemplo, por extrusão de membrana, sonicação, Ou Outras técnicas, etc.
Ficará claro aos versados na técnica que, quando se descrevem usos e aplicações médicas e científicas das EVs, a presente invenção normalmente se refere a uma pluralidade de EVs, isto é, uma população de EVs que pode compreender milhares, milhões, bilhões ou mesmo trilhões de EVs.
Como pode-se ver pela seção experimental a seguir, EVs podem estar presentes em concentrações tais como 10º, 10º, 10%º, 104, 10%, 10", 1044, 105, 10º, 10º”, 10%ºº EVs (frequentemente denominadas "partículas") por unidade de volume (por exemplo, por mL), ou qualquer outro número maior, menor ou em qualquer entre eles.
Na mesma veia, entende-se que o termo "população", que pode, por exemplo, se referir a uma EV compreendendo uma certa proteína lisossomal deve englobar uma pluralidade de entidades constituindo uma população como essa.
Em outras palavras, EVs individuais quando presentes em uma pluralidade constituem uma população de EV.
Assim, naturalmente, a presente invenção diz respeito tanto a EVs individuais quanto populações compreendendo EVs, como ficará claro aos versados na técnica. As dosagens de EVs quando aplicadas in vivo podem naturalmente variar consideravelmente dependendo da doença a ser tratada, da via de administração, da atividade e efeitos da proteína lisossomal de interesse, quaisquer frações de alvejamento presentes nas EVs, da formulação farmacêutica, etc.
[025] Deve-se entender que as expressões "polipeptídeo de enriquecimento de EV", "proteína de EV", "polipeptídeo de EV", "polipeptídeo exossomal" e "proteína exossomal" são usadas indiferentemente aqui, e devem ser entendidas como qualquer polipeptídeo que pode ser utilizado para transportar um construto de polipeptídeo (que tipicamente compreende, além da proteína de enriquecimento de EV, uma proteína lisossomal) para uma estrutura vesicular adequada, isto é, para uma EV adequada. Mais especificamente, deve-se entender que essas expressões compreendem qualquer polipeptídeo que permite transporte, tráfico ou ida e volta de um construto de proteína de fusão para uma estrutura vesicular, tal como uma EV. Exemplos de tais polipeptídeos exossomais são, por exemplo, CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1l, FLOT2, CD49d, CD71 (também conhecidos como o receptor de transferrina) e seu domínio de classificação endossomal, isto é, o domínio de receptor de transferrina de classificação endossomal (como um exemplo não limitante exemplificado por SEQ ID NO 3), CD133, CD138 (sindecan-1),
CD235a, ALIX, sintenina (como um exemplo não limitante exemplificado por SEQ ID NO 1) (também conhecido como sintenina-l), a porção terminal N de sintenina (como um exemplo não limitante exemplificado por SEQ ID NO 2) Lamp2b, sindecan-2, sindecan-3, sindecan-4, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD1I51, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH?2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CDlla, CDllb, CDllc, CD1I8/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CcD49e, CD51, CD61, CD104, receptores de Fc, receptores de interleucina, imunoglobulinas, componentes de MHC-I ou MHC-II, CD2, CD3 epsilon, CD3 zeta, CD13, CDI18, CD19, CD30, TSG101, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD1l10, CDlll1, CD1l15, CDl17, CD125, CD135, CD1I84, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6Al, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, ARRDCl, HLA-DM, HSPG2, L1l CAM, LAMBl, LAMC1, LFA-l, LGALS3BP, Mac-l alfa, Mac-l1 beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1l A, VTI1 B, outros polipeptídeos exossomais, e quaisquer combinações dos mesmos, mas inúmeros outros polipeptídeos capazes de transportar um construto de polipeptídeo para uma EV são compreendidos no escopo da presente invenção.
Tipicamente, em muitas modalidades da presente invenção, pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV é compreendido no construto de polipeptídeo compreendendo a proteína lisossomal, e esse construto de polipeptídeo de fusão pode vantajosamente também compreender vários outros componentes, incluindo adaptadores, domínios transmembrana, domínios cistólicos, domínios de multimerização, domínios de liberação, etc.
[026] Deve-se entender que as expressões "célula fonte" ou "célula fonte de EV" ou "célula parental" ou "fonte de célula" ou "célula produtora de EV" ou qualquer outra terminologia similar dizem respeito a qualquer tipo de célula que é capaz de produzir EVs em condições adequada, por exemplo, em cultura de suspensão, em cultura aderente ou qualquer em outro tipo de sistema de cultura, e/ou in vivo, ex vivo e/ou in vitro. As células fontes como pela presente invenção podem também incluir células que produzem exossomos in vivo, por exemplo, por meio de administração de um construto de polinucleotídeo em um sujeito para tradução subsequente e produção in vivo de EVs, por exemplo, no fígado. As células fontes mais vantajosas pela presente invenção são células MSCs, AE, e/ou células derivadas de placenta, todas as quais são de origem de mamífero, acima de tudo preferivelmente de humano. As MSCs podem ser obtidas de, por exemplo, medula óssea, tecido adiposo, geleia de Wharton, tecido perinatal (por exemplo, amnióticos, membrana amniótica, fluido amniótico, córion, placenta, cordão umbilical, geleia de Wharton), germes dentários, sangue do cordão umbilical, tecido da pele, etc.
Geralmente, EVs podem ser derivadas essencialmente de qualquer fonte de célula, ser uma fonte de célula primária ou uma linhagem celular imortalizada. As células fontes de EV podem ser quaisquer tipos de célula troco embriônica, fetal e somática adulta, incluindo células troncos pluripotentes induzidas (iPSCsS) e outras células troncos derivadas por qualquer método, bem como qualquer fonte de célula adulta. A célula fonte pode ser tanto alogênica, autóloga, quanto ainda xenogênica em natura ao paciente a ser tratado, isto é, as células podem ser do próprio paciente ou de um doador não compatível ou compatível, correspondente ou não correspondente. Em certos contextos, células alogênicas podem ser preferíveis de um ponto de vista médico, uma vez que elas podem prover efeitos imunomodulatórios que pode não ser obteníveis das células autólogas de um paciente que sofre de uma certa indicação.
[027] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a EVs obteníveis das MSCs, células de AE ou células derivadas de placenta, assim chamadas MSC-EVs, AE-EVs e P- EVs. As EVs como pela presente invenção são além disso endogenamente modificadas geneticamente para compreender uma pluralidade considerável de construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal, a fim de intensificar sua atividade terapêutica em vários diferentes LSDs. A expressão "endogenamente modificada geneticamente"
significa que células AE, MSC e/ou derivadas de placenta que produzem EV são modificadas geneticamente para conter um construto de polinucleotídeo que codifica para uma proteína lisossomal terapêutica, que é incorporada nas EVs com a ajuda do maquinário celular. A escolha de fontes de células produtoras de EV é chave para alcançar carregamento de ampla população, de alta eficiência de EVsS com a proteína lisossomal terapêutica. Ao contrário, a técnica anterior, por exemplo, WO2016/044947, meramente diz respeito a exossomos (de células dendríticas) que são carregadas com um enzima GAA por meio de carregamento exógeno mediado por eletroporação. Carregamento exógeno de proteínas têm diversas desvantagens, incluindo (i) baixa eficiência, (2) distribuição desigual através de toda a população de EV, e (3) maior risco de enovelamento imperfeito de proteína, especialmente uma vez que as proteínas lisossomais terapêuticas são altamente sensíveis a mudanças conformacionais.
[028] A seleção de MSC-EVs, AE-EVs e P-EVs é baseada na descoberta inesperada que EVs dessas fontes de célula são capazes de carregar grande número de cópias de proteínas lisossomais corretamente enoveladas, com atividade terapêutica retida, ser atividade enzimática ou atividade transportadora ou qualquer outra atividade que as ditas proteínas lisossomais terapêuticas realizam. Também, os inventores perceberam inesperadamente que as ditas fontes de célula (células AEs, MSCs, e derivadas de placenta) produzem EVs modificadas geneticamente que estão ativamente administrando as proteínas lisossomais a sua localização correta de ação em células alvos. Sem querer se ligar a nenhuma teoria, supõe-se que essas propriedades sejam um resultado do alto teor de proteínas de choque térmico, particularmente proteína de choque térmico 8 de 70kda (também “conhecida como Hsp70-8, codificada pelo gene HSPA8), encontrada em EVs, em particular, em exossomos, dessas fontes de célula e a pegada proteômica que as ditas células exibem.
[029] O construto de polipeptídeo compreendido nas AE- EVs, nas MSC-EVs e nas P-EVs pode em modalidades vantajosas ser modificado geneticamente para compreender adicionalmente pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV, a fim de acionar a internalização em EVs da proteína lisossomal. Tais polipeptídeos de enriquecimento de EV podem ser selecionado essencialmente de qualquer polipeptídeo de EV, por exemplo, do grupo seguinte de polipeptídeos de enriquecimento de EV: CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1l, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, Sintenina-l, Sintenina-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD1I151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH?2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5,
ITGB6, ITGB7, CDlla, CDllb, CDllc, CDI8/ITGB2, CD41, CD49b, CcD49c, CcD49e, CD51, CD61, CD104, receptores de Fc, receptores de interleucina, imunoglobulinas, CD2, CD3 epsilon, CD3 zeta, CDl3, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD11 1, CD1l15, CDl17, CDlI25, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6Al, ARRDCl, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, Hsp70, Ll CAM, LAMBl, LAMC1, LFA-1l, LGALS3BP, Mac-l alfa, Mac-l beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTIl A, VTIl B, qualquer derivados e/ou domínios dos mesmos, e qualquer combinação dos mesmos.
[030] Os inventores perceberam que os polipeptídeos de enriquecimento de EV mais vantajosos são sintenina, várias porções de terminal N de sintenina, e CD63. Isto é altamente surpreendente, já que sintenina é uma proteína intraluminal solúvel de EV, enquanto CD63 é uma tetraspanina que está presente na membrana EV. O fato de que essas duas classes distintas de proteína de EV têm um profundo efeito como esse na embalagem de proteínas lisossomais de vários tipos (transmembrana, solúvel, etc.) em EVs é uma descoberta altamente feliz e parece ser relacionada a seleção criteriosa de células AE, MSC, e derivadas de placenta como as fontes de células produtoras de EV. A porção terminal N de sintenina e da própria sintenina são polipeptídeos de enriquecimento de EV particularmente vantajosos, já que eles são capazes de transportar membros de proteínas lisossomais excepcionalmente grandes para EVs quase independentemente de onde ela é inserida no construto de polipeptídeo de fusão. Além disso, ela é também capaz de transportar proteínas lisossomais associadas a membrana, transmembrana e solúveis para EVs, com bioatividade mantida.
[031] Em modalidades adicionais da presente invenção, a proteína lisossomal é selecionada do grupo compreendendo alfa-D-lanosidade, N-aspartil-beta-glicosaminidase, lipase ácida lisossomal, cistinosina, membrana proteína-2 associada ao lisossoma (LAMP2), alfa-galactosidase A, ceramidase ácida, alfa-fucosidase, catepsina A, beta- glicosidase ácida, beta-galactosidase, beta-hexosaminidase A, beta-hexosaminidase B, GlecNAc-l1-fosfotransferase, beta- galactosilceramidase, lipase ácida lisossomal, arilsulfatase A, alfa-L-iduronidase, iduronato-2-sulfatase, paran sulfamidase, acetil alfa-glicosaminidase, acetil CoA: alfa-glicosaminida-N-acetiltransferase, N-acetil glicosamina-6-sulfatase, N-acetil galactosamina-6- sulfatase, hialuronidase, acetil galactosamina-4-sulfatase, beta-glicuronidase, alfa-N-acetil neuraminidase, N- actilglicosamina-l-fosfotransferase, mucolipin-l, enzima de geração de formilglicina, palmitoil-proteína tioesterase-1l, tripeptidil peptidase I, proteína de cadeia de cisteína,
CLN3p, CLN5p, CLN6p, CLN7p, CLN8p, esfingomielinase ácida, NPC 1, NPC 2, alfa-glicosidase ácida, catepsina K, sialina, alfa-N-acetilgalactosaminidase, ativador de GM2, lipase ácida lisossomal, e derivados, regiões, domínios e/qualquer combinação dos mesmos.
[032] Em modalidades particularmente preferidas como pela presente invenção, a proteína lisossomal é uma proteína de membrana lisossomal, preferivelmente NPCl. NPC1 pode ser modificada geneticamente e carregada nas AE-EVs nas MSC-EVs e/ou nas P-EVs em seu estado nativo, mas pode também ser carregadas nas ditas EVs pelo uso de construto de polipeptídeo de fusão compreendendo a proteína NPC1l e qualquer um ou mais de sintenina, a porção terminal N de sintenina, e/ou CD63. Outras modalidades preferidas da presente invenção incluem EVs compreendendo construtos de polipeptídeo compreendendo qualquer um ou mais da proteínas lisossomais LAMP2 (para o tratamento, por exemplo, de doença de Danon), sialina (para o tratamento, por exemplo, de doença de Salla, doença de armazenamento ácido siálico livre forma infantil), CIC5 (nefrolitíase hipercalciúrica X-ligada), CLN3 (doença de Batten), ou cistinosina (cistinose) e/ou proteína ativadora de GM2 (GM2 gangliosidose).
[033] Em modalidades adicionais, as EVS como pela presente invenção são selecionadas para ser positivas para vários marcadores de proteína que surpreendentemente parecem ser associados com efeitos regenerativos e imune- modulatórios bem como com perfis de farmacocinética adequado para o tratamento de LSDs. As EV mais bioativas são positiva para um (mas frequentemente pelo menos três) dos seguintes polipeptídeos: CD63, CD8l, CD44, SSEA4, CD133, CD24.
[034] Ainda em modalidades adicionais, os inventores perceberam que EVs das fontes EV aqui têm efeito inerente em várias LSDs mesmo sem modificação genética. Isto supostamente é um resultado da presença nas EVs de várias proteínas de choque térmico (Hsps) das diferentes famílias de proteína Hsp, por exemplo, Hsp90, Hsp/70 - a mais importante proteína da dita família é a proteína de choque térmico 8 70 kDa (codificada pelo gene HSPA8 e também conhecida como Hsp70-8) - e/ou Hsp40. Entretanto, existem aparentemente outros fatores que são importantes para esta atividade inerente de AE-EVs, MSC-EVS e P-EVs não modificadas, já que efeitos terapêuticos similares não foram observados com EVs de outras fontes de célula.
[035] Proteínas de choque térmico são conhecidas por agir como chaperonas para assistir no enovelamento de proteínas em sua conformação adequada. Os presentes inventores descreveram pela primeira vez tipos específicos de célula que produzem EVs contendo níveis de proteínas de choque térmico particularmente altos que, quando modificadas para endogenamente produzir e carregar proteínas lisossomais em EVs, resultam na proteína lisossomal endogenamente produzida sendo devidamente enovelada e assim altamente bioativa. Um benefício secundário desta estratégia é que o tratamento de um paciente com um distúrbio de armazenamento lisossomal com EVS que são nativamente ricas em proteínas de choque térmico - tendo as modificações pós-translacionais criadas pela própria célula produtora de EV e sendo transportadas para a célula alvo no ambiente protegido das EVs - é considerado também melhorar o enovelamento de qualquer proteína lisossomal mutante já presente nas células do paciente. Isto poderia responsável pelos efeitos benéficos inerentes vistos em EVs geneticamente não modificadas dessas fontes de célula.
[036] Diferente da técnica anterior, por exemplo, WO2016/044947, a escolha de fontes de células produtoras de EV é chave para alcançar carregamento de ampla população, de alta eficiência de EVsS com proteína lisossomal terapêutica corretamente enovelada. Ao contrário de WO2016/044947, os presentes inventores perceberam que carregamento endógeno de EVs com proteínas lisossomais terapêuticas é uma abordagem superior para alcançar administração bioativa de proteínas lisossomais terapêuticas corretamente enoveladas e funcionais (tanto enzimas lisossomais quanto e transportadoras lisossomais). WO2016/044947 menciona que chaperonas (tais como proteínas de choque térmico) que são artificialmente, exogenamente adicionadas aos exossomos após sua formação podem facilitar o tratamento, mas é claro pela abordagem de carregamento exógeno feita em WO201 6/044947 que não existe entendimento do papel que as proteínas de choque térmico nativas e outros componentes EV nativos exercem na produção de EVs com proteínas corretamente enoveladas, que então localizam no correto compartimento intracelular com as proteínas lisossomais sendo mantidas no correto enovelamento com a ajuda das proteínas de choque térmico.
[037] Assim, em uma modalidade preferida, tanto as células produtoras de EV da presente invenção quanto as EVs produzidas por essas células compreendem um construto de polipeptídeo compreendendo a proteína lisossomal terapêutica bem como pelo menos uma proteína de choque térmico, preferivelmente, proteína de choque térmico 8 de 70 kDa. O fato de que, diferente de WO201 6/044947, as proteínas de choque térmico são nativamente presentes nas células produtoras de EV significa que essas proteínas de choque térmico endógenas estão presentes nas EVs desde o momento de sua biogênese e assim asseguram que o complexo e proteínas lisossomais terapêuticas sensíveis são corretamente enoveladas desde o início, isto é, antes da incorporação em EVs, e que elas mantêm a conformação corretamente enovelada durante a produção das EVs pela célula, mesmo após secreção das EVs das células, bem como durante o processo de purificação, que espera-se aumente o prazo de validade do produto manufaturado.
[038] Além disso, o fato de que as próprias proteínas de choque térmico são endógenas e, portanto, devidamente pós-translacionalmente modificadas pelo célula produtora de EV produz melhor atividade de chaperona e assim provavelmente melhor atividade terapêutica das proteínas lisossomais. Considerado conjuntamente, o fato de que as células da presente invenção empregam proteína lisossomal endogenamente produzida em combinação com as proteínas de choque térmico endogenamente presentes no tipos de células produtoras selecionados, isto resulta em proteínas lisossomais carregadas nas EVs que são significativamente mais bem enoveladas, e assim mais estáveis, de maior vida e bioativas, do que proteínas lisossomais que são exogenamente carregadas. Além disso, as proteínas lisossomais endogenamente carregadas e endogenamente chaperonadas continuam a ser mantidas nesta conformação devidamente enovelada uma vez distribuídas na célula alvo novamente prolongando a bioatividade da proteína terapêutica.
[039] Assim, a combinação na presente invenção de uma pegada proteômica de EV que contribui para administração intracelular no compartimento correto, as proteínas lisossomais corretamente enoveladas terapêuticas, e a presença da ampla população de altos números de proteínas lisossomais representam uma abordagem única com implicações de longe variando em termos de administração intracelular intensificada de proteínas terapêuticas com alta potência, efeitos imunemodulatórios inerentes melhorados, e custo reduzido de bens.
[040] Assim, em uma modalidade vantajosa, a presente invenção se refere a composições compreendendo uma população de EVs derivadas de AE, MSC e/ou P, em que pelo menos 50%, 60%, ou 70% das EVs são positivas para uma proteína lisossomal terapêutica, mais preferivelmente em que pelo menos 75% das EVs são positivas para uma proteína lisossomal terapêutica, ainda mais preferivelmente em que pelo menos 90% das EVs são positivas para uma proteína lisossomal terapêutica, e/ou mesmo ainda mais preferivelmente em que pelo menos 95% das EVs são positivas para uma proteína lisossomal terapêutica. Importantemente, as proteínas lisossomais terapêuticas da presente invenção são corretamente enoveladas, em decorrência do carregamento endógeno das ditas proteínas em EVs compreendendo proteínas de choque térmico, que ajudam a manter um enovelamento correto da proteínas em questão.
[041] Exemplos não limitantes de EVs altamente potentes para o tratamento de LSDs como pela presente invenção incluem: - MSC-EVS ou AE-EVs compreendendo múltiplas cópias de um construto de polipeptídeo compreendendo uma proteína lisossomal terapêutica, bem como pelo menos uma proteína de choque térmico nativa, tal como proteína de choque térmico 8 70 kDa.
- AE-EVSs compreendendo um construto de polipeptídeo compreendendo proteína lisossomal- sintenina, porção terminal N de proteína lisossomal de sintenina, ou proteína lisossomal-CD63. Um exemplo particularmente preferido são AE-EVsS compreendendo um construto de polipeptídeo compreendendo NPCl-sintenina, porção terminal N de NPCl de sintenina, ou NPC1-CD63.
- AE-EVSs compreendendo um construto de polipeptídeo compreendendo NPCl -sintenina, porção terminal N de NPC1 - de sintenina, ou NPC1I-CD63 e sendo positivas para pelo menos um de CD63, CD8l, CD44, SSEA4, CDl33, CD24. Outras proteínas lisossomais podem naturalmente substituir a proteína NPCl durante o desenvolvimento de terapias para outras LSDs.
- AE-EVSs compreendendo um construto de polipeptídeo como pelo exposto, e compreendendo adicionalmente pelo menos um Hsp, preferivelmente tanto um quanto mais de Hsp40, Hsp/70 (preferivelmente Hsp70-8), e/ou Hsp90 ou derivados ou domínios dos mesmos.
- AE-EVs e/ou MSC-EVs modificadas geneticamente para compreender um construto de polipeptídeo compreendendo uma pluralidade de qualquer proteína lisossomal, preferivelmente uma proteína lisossomal transmembrana tais como proteína ativadora de LAMP2, sialina, CIC5, CLN3, cistinosina, GM2, ou NPC1l - AE-EVS e MSCs nativas (obteníveis de, por exemplo, tecido amniótico, tecido placentário, geleia de Wharton, medula Óssea, ou tecido adiposo) podem também ser utilizadas terapeuticamente em forma não modificada, em particular se elas compreenderem pelo menos um Hsp.
[042] Importantemente, as estratégias de modificação genética da presente invenção para otimizar as células AE, MSC, e derivadas de placenta de produção de EV resulta em um carregamento altamente eficaz da(s) proteína (s) lisossomal (1s5) nas AE-EVs, MSC-EVs e P-EVs. Tipicamente, toda e qualquer EV como pela presente invenção compreende pelo menos cinco a dez cópias dos construtos de polipeptídeo (e, portanto, da proteína lisossomal), mas mais frequentemente bem acima de dez cópias, por exemplo,
cerca de 20-30 cópias, ou 30-50 cópias, ou também acima de 50 cópias, por exemplo, cerca de 75 ou cerca de 100 cópias da proteína lisossomal em questão. Claramente, isso é altamente importante para o efeito terapêutico e não seria alcançável sem a seleção proposital de estratégias ideais de modificação genética, fontes de célula, e perfis de EV, bem como métodos inventivos para produzir e colher tais EVs.
[043] Em uma modalidade adicional, as EVsS podem compreender adicionalmente um peptídeo e/ou polipeptídeo que alveja órgão, tecido ou célula. Um exemplo de um peptídeo de alvejamento que tem se demonstrado potente no transporte de EVs para o cérebro e o CNS é o peptídeo de glicoproteína do vírus Rabies (RVG), mas outros peptídeos e polipeptídeos estão também no escopo da presente invenção. Importantemente, o tecido peptídeo e/ou polipeptídeo de alvejamento pode ser compreendido no construto de polipeptídeo que também compreende o polipeptídeo lisossomal (e opcionalmente o polipeptídeo de enriquecimento de EV) e/ou pode estar presente como um construto de polipeptídeo separado nas EVs. Quando o peptídeo e/ou polipeptídeo de alvejamento é parte de um construto de polipeptídeo separado é preferivelmente fundido a uma proteína exossomal, para assegurar carregamento eficiente nas EVs.
[044] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal e pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV. Como mencionado anteriormente, tais construtos de polipeptídeo podem compreender qualquer proteína de EV (isto é, polipeptídeo de enriquecimento de EV), embora certos polipeptídeos de enriquecimento de EV tais como CD63 e sintenina e regiões de sintenina sejam altamente preferíveis. Além disso, como mencionado anteriormente, elementos adicionais podem ser incluídos nos construtos de polipeptídeos como pela presente invenção, por exemplo, (1) peptídeos e/ou polipeptídeos de alvejamento, (ii) domínios de multimerização tais como domínios de enovelamento ou domínios de zíper de leucina, (iii) adaptadores e clivagem ou domínios de liberação, etc. Em modalidades vantajosas, o construto de polipeptídeo compreende uma proteína lisossomal tal como tanto uma quanto mais de NPC1l, LAMP2, sialina, CIC5, CLN3, cistinosina, ou proteína ativadora de GM2.
[045] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção se refere a construtos de polinucleotídeo que codificam para os construtos de polipeptídeo como pela presente invenção. Tais construto de polinucleotídeo podem naturalmente ser expressos in vivo, ex vivo, e/ou in vitro, usando vários vetores. Os vetores adequados compreendendo os construtos de polinucleotídeo como pela presente invenção incluem, ainda em um outro aspecto: plasmídeos; minicírculos; qualquer tipo de polinucleotídeo substancialmente circularizado; vírus tais como adenovírus, vírus adeno- associados, lentivírus, e/ou vírus livres de capsídeos; DNA e/ou RNAs de polinucleotídeo linear; RNAs mensageiros (MRNAS); e/ou mRNA modificados.
[046] Ainda em aspectos adicionais, a presente invenção se refere as células compreendendo um ou mais dos construtos de polipeptídeo, os construtos de polinucleotídeo, ou os vetores como descrito aqui. Naturalmente, as células produtoras de EV como pelo presente são preferivelmente células estromais mesenquimais (MSCs), célula epitelial amniótica (AEs) e/ou uma célula derivada de placenta, mas qualquer outra célula pode também ser usada. As células produtoras de EV podem estar presentes tanto in vitro, por exemplo, em cultura celular, quanto em qualquer sistema ex vivo ou in vivo. As células como pela presente invenção podem opcionalmente ser imortalizadas, para permitir produção sustentada das EVs.
[047] Em modalidades preferidas da presente invenção, a célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV compreende pelo menos um construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal terapêutica, pelo menos um construto de polinucleotídeo que codifica o dito construto de polipeptídeo e/ou pelo menos um vetor de acordo com a invenção. As células da presente invenção são tipicamente modificadas geneticamente para compreender o construto de polinucleotídeo (que pode estar presente na forma de um vetor tal como um plasmídeo, um mMRNA, uma molécula de DNA linear, um vírus ou um genoma viral, etc.), que é expresso pelo maquinário celular no construto de polipeptídeo correspondente e por meio disso incorporado nas EVs, normalmente os exossomos e/ou o microvesículas, produzidas pelas células. Assim, as células normalmente inicialmente compreendem —o construto de polinucleotídeo (ou um vetor compreendendo o dito construto) e, uma vez que a expressão e tradução do construto de polipeptídeo é completa, a célula compreenderia tanto o polinucleotídeo quanto os construtos de polipeptídeo correspondentes, que é normalmente secretado da célula por meio de exocitose mediada por EV, em que toda e qualquer EV compreende uma pluralidade de cópias do construto de polipeptídeo.
[048] O construto de polipeptídeo compreende pelo menos uma proteína lisossomal terapêutica, e opcionalmente compreende a proteína lisossomal terapêutica combinado em um construto de polipeptídeo com pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV, por exemplo, CD63, sintenina, sindecan, Alix, ou qualquer outro polipeptídeo de enriquecimento de EV que pode ser operacionalmente ligado à proteína lisossomal terapêutica tanto em nível de um polinucleotídeo quanto de um polipeptídeo.
[049] À célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV da presente invenção pode preferivelmente compreender: (a) um construto de polinucleotídeo que codifica para um construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal que é estavelmente inserida na célula produtora de EV; e/ou (b) um construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal, que, como mencionado anteriormente, pode opcionalmente compreender adicionalmente pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV. A criação de uma fonte de célula produtora de EV estavelmente modificada (geneticamente) é chave para produção consistente e de alto rendimento de EVs com um efeito terapêutico reprodutível e com uma identidade reprodutível de um ponto de vista de química, fabricação e controle (CMC). As células estáveis são normalmente imortalizadas usando, por exemplo, estratégias de imortalização de hTERT, imortalização viral e/ou imortalização condicional. A fim de permitir produção de EV em escala, prefere-se que as células produtoras de EV estavelmente compreendam o construto de polinucleotídeo (preferivelmente em um vetor adequado) em um certo número de duplicações de população (PDLs), preferivelmente pelo menos 20 PDLs, mais preferivelmente pelo menos 50 PDLs, ainda mais preferivelmente pelo menos 70 PDLs, mesmo ainda mais preferivelmente pelo menos 100 ou até pelo menos 200 PDLs.
[050] Em um aspecto preferível da presente invenção, pelo menos 50% ou 60%, preferivelmente pelo menos 70% ou 80%, ainda mais preferivelmente 90% ou 95% ou mais das EVs produzidas pelas células MSC, AE ou derivadas de placenta produtoras de EV compreendem um construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal.
[051] Em um outro aspecto preferível da presente invenção as EVs produzidas pelas células MSC, AE ou derivadas de placenta produtoras de EV compreendem pelo menos 10, 20, 30 ou 40 cópias, preferivelmente pelo menos 50 cópias da proteína lisossomal, mais preferivelmente pelo menos 70, 80 ou 100 cópias do construto de polipeptídeo compreendendo a proteína lisossomal. O alto número de cópia de proteína lisossomal terapêutica nas EVs e a presença de ampla população da proteína lisossomal terapêutica resulta da seleção inovadora das fontes de célula da presente invenção, mas também pela inclusão potencial de polipeptídeos de enriquecimento de EV quando necessário, bem como pela criação de células estavelmente modificadas geneticamente para produção de EV contínua.
[052] Em um outro aspecto, as células MSC, AE ou derivadas de placenta produtoras de EV preferivelmente compreendem um ou mais das seguintes proteínas nativas: CD63, CD81, CD44, CD49%, CD1I05, SSEA4, CD133, CD24, e/ou proteína de choque térmico de 870 KkDa. Preferivelmente adicionalmente, as células MSC, AE ou derivadas de placenta produtoras de EV compreenten as seguintes proteínas nativas: CD63, CD8l, e proteína de choque térmico de 8 70 kDa. A combinação dessas três proteínas nativas tanto em células quanto em suas EVS correspondentes (e mais geralmente tetraspaninas combinadas com Hsp70-8) é estritamente associada com produção de EV de alto rendimento, enovelamento correto e atividade por períodos de tempo prolongado da proteína lisossomal terapêutica, bem como administração bioativa eficaz no compartimento direito nas células alvos.
[053] A presença nativa, contínua de proteínas de choque térmico, por exemplo, proteínas de choque térmico da família Hsp70 tal como proteína de choque térmico 8 70 kDa, tanto nas células quanto nas EVS correspondentes é importante para o enovelamento e atividade de toda as proteínas lisossomais terapêuticas, mas é de particular importância para proteínas transmembranas — lisossomais terapêuticas, tais como NPCl, cistinosina, sialina, LAMP1, LAMP2, LAMP2A, PPTl, TPPl, CLN3, CLN6, CLN8, MFSD8,
glicosilceramidase, LIMP2, Lgp85, Flotilina-l, ATP6V1 Bl, ATP13A2, CLCN7, OSTM1, HGNSAT, LMBRDl, TRPML1, TRPML3, DIRC2, SPPL2A, DIRC2, DNAJC5, e/ou CLN5, etc. Sem querer se ligar a nenhuma teoria, supõe-se que a presença de proteínas nativas de choque térmico (tal como Hsp70-8) nas células e nas EVs da células já mediante tradução da proteína lisossomal transmembrana é chave para gerar e manter subsequentemente enovelamento correto da proteína. A adição exógena subsequente de proteínas de choque térmico ou outras chaperonas, tais como chaperonas de molécula pequena, não seriam capazes de salvar uma proteína já com enovelamento incorreto, que assim teriam ramificações negativas significantes para a atividade da proteína lisossomal transmembrana terapêutica em questão. Consequentemente, a seleção na presente invenção de fontes de células produtoras de EV com um alto nível de proteínas nativas de choque térmico tanto na células quanto nas EVs correspondentes produzidas pelas ditas células.
[054] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere adicionalmente a uma composição farmacêutica compreendendo uma pluralidade de EVs como descrito aqui, pelo menos um construto de polipeptídeo, pelo menos um polinucleotídeo, e/ou pelo menos um vetor, e um carreador farmaceuticamente aceitável. Importantemente, todos os componentes biológicos aqui (EVs, polipeptídeos,
polinucleotídeo, vetores, células, etc.) podem vantajosamente ser incluídos em uma composição farmacêutica, tanto sozinhos quanto juntos em qualquer combinação. Normalmente, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma população de EVs e um carreador, aditivo, e/ou excipiente farmacêutico adequados.
[055] Em uma outra modalidade, as composições farmacêuticas podem vantajosamente compreender adicionalmente agentes farmacêuticos tais como miglustat, arimoclomol, heparina, trealose, e/ou ciclodextrina e/ou quaisquer derivados dos mesmos. Esses tipos de combinações podem resultar em efeito terapêutico altamente sinergístico, uma vez que as EVs distribuem um proteína lisossomal funcional cujo efeito é então potencializado por tais agentes farmacêuticos. Interessantemente, os presentes inventores também perceberam que o miglustat, arimoclomol, e ciclodextrina podem ser adicionados à cultura das células produtoras de EV, resultando em carregamento endógeno dos ditos agentes nas EVs e efeito terapêutico intensificado. Esse é um método muito fácil para carregamento dos fármacos nas EVs e essencialmente compreende cultivar as AE, MSC, ou células derivadas de placenta de produção de EV na presença de uma concentração adequada do fármaco em questão. Naturalmente, as composições farmacêuticas da presente invenção são particularmente adequadas para tratar doenças do armazenamento lisossomal, mas outras doenças com envolvimento lisossomal podem também ser tratadas usando as invenções aqui. Tais doenças incluem doença de Parkinson, Parkinson's com GBA, doença de Alzheimer, doença de Crohn, etc.
[056] LSDs de particular interesse para tratamento usando as EVsS como pela presente invenção incluem a seguinte lista não limitante de doenças: Alfa-manosidase, Beta-manosidase, Aspartilglicosaminuria, Doença do Armazenamento de Éster Colesterílico, Cistinose, Doença de Danon, Doença de Fabry, Doença de Farber, Fucosidose, Galactosialidose, Doença de Gaucher Tipo II, Doença de Gaucher Tipo II, Doença de Gaucher Tipo III, Gangliosidose GM1 Tipo I, Gangliosidose GMl1l Tipo II, Gangliosidose GM1l Tipo III, GM2 - doença de Sandhoff, GM2 - doença de Tay- Sachs, GM2 -Gangliosidose, variante de AB, Mucolipidiose II, Doença de Krabbe, Deficiência de lipase ácida lisossomal, Leucodistrofia Metacromática, Síndrome de MPS I -Hurler, Síndrome de MPS IL - Scheie, Síndrome de MPS [ Hurler-Scheie, Síndrome de Hunter MPS II, Síndrome MPS MA - Sanfilippo Tipo A, Síndrome MPS NIB - Sanfilippo Tipo B, Síndrome MPS NIB -Sanfilippo Tipo C, Síndrome MPS NIB - Sanfilippo Tipo D, MPS IV -Morquio Tipo A, MPS IV - Morquio Tipo B, MPS IX - Deficiência de Hialuronidase, MPS VI - Maroteaux-Lamy, Síndrome MPS VII - Sly, Mucolipidiose I -
Sialidose, Mucolipidiose NIC, Mucolipidiose Tipo IV, Deficiência de Sulfatase Múltipla, Lipofuscinose Ceróide Neuronal Tl, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T2, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T3, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T4, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T5, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T6, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T7, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T8, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T9, Lipofuscinose Ceróide Neuronal T10, Doença de Niemann-Pick Tipo A, Doença de Niemann-Pick Tipo B, Doença de Niemann-Pick Tipo C, Doença de Pompe, Picnodisostose, Doença de Salla, Doença de Schindler e Doença de Wolman.
[057] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a métodos para aumentar a quantidade de uma proteína lisossomal em lisossomos e/ou em qualquer outro compartimento celular de um mamífero, compreendendo administrar ao mamífero uma composição compreendendo tanto um quanto mais de: (i) EVs, (ii) pelo menos um construto de polipeptídeo, (iii) pelo menos um construto de polinucleotídeo, e/ou (iv) pelo menos um vetor. Além disso, a presente invenção também se refere a métodos de tratamento de um LSD em um sujeito que necessita dos mesmos, compreendendo as etapas de: (i) prover uma composição farmacêutica compreendendo uma população de EVs como pela presente invenção e (ii) administrar a um paciente uma dose de pelo menos 10'6 EVs por kg de peso corpóreo. Importantemente, como mencionado anteriormente, a intervenção terapêutica pode alternativamente compreender administrar a um paciente qualquer dos construtos de polipeptídeo, os construtos de polinucleotídeo, e/ou os vetores compreendendo tais construtos de polinucleotídeo. Isso pode ser realizado usando vários vetores de administração, por exemplo, nanopartículas de lipídio ou vetores de administração poliméricos ou a base de peptídeo. As composições, as EVs, o polinucleotídeo e/ou construtos de polipeptídeo podem ser administrados ao sujeito por meio de várias vias de administrações, por exemplo, administração subcutânea, administração intravascular e/ou intravenosa, por administração os, administração intraperitoneal, administração intratecal, administração intracerebroventricular, etc.
Experimental e exemplos Materiais e métodos
[058] Projeto e clonagem de construto: Vários construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal e opcionalmente outros domínios de polipeptídeo (tais como polipeptídeos de enriquecimento de EV) foram construídos, clonados em vetores e produzidos em diversas diferentes fontes de células produtoras de EV, em particular células AE, MSCs e células derivadas de placenta. ORFs foram tipicamente gerados por síntese e clonados no vetor de expressão de mamífero PpSF-CAG-Amp. Resumidamente, plasmídeo de DNA e vetor sintetizados foram digeridos com enzimas Notl e Sail de acordo com instrução dos fabricantes (NEB). Fragmentos de DNA purificados, restritos foram ligados entre si usando ligase T4 de acordo com instrução dos fabricantes (NEB). Eventos de ligação bem sucedidos foram selecionados por transformação bacteriana em placas suplementadas com ampicilina. Plasmídeo para transfecção foi gerado por 'maxi-prep', de acordo com instrução dos fabricantes.
* Cultura e transfecção celular
[059] Dependendo do projeto e ensaios experimentais, em certos casos, transfecção transiente não viral e produção de exossomo foram realizados em cultura celular 2D convencional, enquanto em outros casos transdução mediada por vírus foi empregada para criar linhagens celulares estáveis, que foram tipicamente cultivadas em biorreatores de tipo diferente. Células produtoras de EV estavelmente modificadas geneticamente podem também ser produzidas usando transfecção não viral do construto de polinucleotídeo da presente invenção e/ou vetores adequados nos quais o construto de polinucleotídeo é compreendido. Para concisão, apenas alguns exemplos são mencionados aqui.
[060] No caso de transdução viral e criação viral de linhagens celulares estáveis para várias combinações de proteínas lisossomais e polipeptídeo de EVs, fontes de célula tais como BM-MSCs, WJ-MSC, células epiteliais amnióticas, células estromais mesenquimais amnióticas, Ou células derivadas de placenta foram transduzidas por vírus, tipicamente usando lentivírus (LV). Tipicamente, 2 ul de LV e opcionalmente Polibreneo (ou brometo de hexadimetrina, concentração final no poço de 8 ug/mL) são adicionados às culturas celulares, e 24 horas pós transdução o meio celular de células transduzidas ser mudado para meios completos frescos.
A 72 horas pós transdução, seleção de puromicina (4-6 ug/mL) é realizada, normalmente por 7 dias seguido por análise de expressão estável da proteína de interesse, tipicamente o construto de polipeptídeo compreendendo a proteína lisossomal e opcionalmente outros polipeptídeos tais como polipeptídeos de enriquecimento de EV.
MSCs estavelmente modificadas (por exemplo, de medula óssea, geleia de Wharton, tecido adiposo, tecido amniótico tais como membrana amniótica, fluido amniótico, etc.), células AE ou células derivadas de placenta foram também criadas usando métodos não virais, empregando, por exemplo, transfecções de base química e/ou métodos de transfecção física.
Métodos de transfecção química compreendidos introduzindo um polinucleotídeo e/ou um vetor compreendendo o dito polinucleotídeo usando, por exemplo, agentes a base de lipídio tais como lipídios catiônicos e/ou lipossomos (frequentemente referidos como lipofecção), polímeros catiônicos, dendrímeros, fosfato de cálcio, dietilaminoetil-dextrano e/ou qualquer combinação dos mesmos. Métodos físicos incluíram eletroporação, prensagem de célula, microinjeção, etc., bem como vários outros métodos físicos para criar linhagens celulares estáveis conhecidas por um versado na técnica. Métodos físicos e químicos para criar linhagens celulares estáveis podem também ser combinados, por exemplo, combinando lipofecção ou polímeros catiônicos com eletroporação, ou qualquer outro tipo de combinação para criar células estáveis conhecidas por um versado na técnica.
[061] Células estáveis foram cultivadas tanto em cultura 2D quanto em biorreatores, tipicamente biorreatores de fibra oca e/ou biorreatores de tanque de agitação e/ou biorreatores de agitação tais como sacos Wave, e meios condicionados foram subsequentemente colhidos para preparação de exossomo. Quando as células foram crescidas em suspensão (por exemplo, células amnióticas-derivadas) várias etapas de preparação e purificação foram realizadas. O fluxo de trabalho padrão compreende as etapas de pré- limpeza do sobrenadante, concentração a base de filtração, remoção a base de cromatografia de contaminantes de proteína, e formulação opcional da composição de exossomo resultante em um tampão adequado para ensaios in vitro e/ou in vivo.
* Ensaios e análise
[062] Western blot é um método analítico altamente conveniente para avaliar o construtos de polipeptídeo de enriquecimento em EVsS. Resumidamente, SDS-PAGE foi realizada de acordo com instrução do fabricante (Invitrogen, Novex PAGE 4-12% gels), por meio do qual exossomos 1 x 1,0" e 20 ug de lisato celular foram carregados por poço. Proteínas do gel SDS-PAGE foram transferidas para membrana PVDF de acordo com instrução do fabricante (Immobilon, Invitrogen). As membranas foram bloqueadas em tampão de bloqueio Odyssey (Licor) e sondadas com anticorpos contra a proteína lisossomal e/ou a proteína exossomal de acordo com instrução do fornecedor (Anticorpos Primários - Abeam, Anticorpos Secundários - Licor). Sondas moleculares visualizadas a comprimentos de onda de 680 e 800 nm. Para determinação de tamanho de EV, análise de rastreamento de nanopartícula (NTA) foi realizada com um instrumento NanoSight equipado com software analítico. Para todos os registros, um nível de câmara de 13 ou 15 e função automática foram usados para todos as definições pós- aquisição. Microscopia eletrônica e microscopia de fluorescência foram frequentemente usadas para entender localização e liberação intracelular e para quantificar e analisar EVs.
[063] EVs foram isoladas e purificadas usando uma variedade de métodos, tipicamente uma combinação de filtração, tais como TFF e LC, em particular, eluição de glóbulos LC e cromatografia de troca iônica. Tipicamente, meios contendo EV foram coletados e submetidos a uma centrifugação a baixa velocidade de 300g por 5 minutos, seguido por centrifugação de 2.000g por 10 minutos para remover grandes partículas e resíduos celulares. Alternativamente, vários s foram usado para pré-limpeza do sobrenadante, especialmente no caso de células de suspensão. O sobrenadante foi então filtrado com um filtro de seringa de 0,22 m e submetido a diferentes etapas de purificação. Grandes volumes foram diafiltrados e concentrados a aproximadamente 20 mL usando o dispositivo Vivaflow 50R (TFF) (Sartorius) com filtros de corte de kDa ou o sistema KR2i TFF (SpectrumLabs) com filtros de fibra oca de corte de 100 ou 300 kDa. O meio preconcentrado foi subsequentemente carregado nas colunas de eluição de glóbulos (coluna HiScreen ou HiTrap Capto Core 700, GE Healthcare Life Sciences), conectada a um sistema de cromatografia AKTAprime plus ou AKTA Pure 25 (GE Healthcare Life Sciences). As definições de vazão para equilibração da coluna, carregamento de amostra e limpeza da coluna no procedimento no lugar procedure foram escolhidas de acordo com as instruções do fabricante. A amostra foi coletada de acordo com o cromatograma de absorbância UV e concentrada usando um filtro de centrifugação de corte de peso molecular 10 kDa Amicon Ultra-15 (Millipore) a um volume final de 100 ul e armazenada a -80ºC para análise à jusante posterior. Para avaliar os perfis de eluição da proteína e RNA, o meio foi concentrado e diafiltrado com sistema KR2i TFF usando filtros de fibra oca de 100 kDa e 300 kDa e uma amostra analisada em uma coluna Tricorn 10/300 Sepharose 4 Fast Flow (S4FF) (GE Healthcare Life Sciences).
* Exemplos
[064] Exemplo 1. Células epiteliais amnióticas (AE), obteníveis de placenta post partum, foram modificadas geneticamente (usando transdução lentiviral) com um construto de polinucleotídeo que codifica um construto de polipeptídeo compreendendo a proteína NPCl e a porção terminal N de proteína sintenina (NPCl S) de enriquecimento de EV (SEQ ID NO 2). AE-EVs produzidas pelas células AE foram colhidas, purificadas e avaliadas in vitro quanto à sua capacidade de intensificar o transporte de colesterol em fibroblastos derivado de paciente (PDF). Como pode-se ver na Figura 1, as NPCl AE-EVsS diminuíram significativamente os níveis de colesterol nas células alvos administrando a proteína NPCl bioativa em altas quantidades às células. Interessantemente, durante uso de AE-EVs e MSC-EVs apenas (e nenhuma outra fonte de célula) foi também possível alcançar redução dependente de dose no acúmulo de colesterol por modificação genética da células AE para expressar a proteína NPCl por se, sem a presença de nenhum polipeptídeo de enriquecimento de EV (dados não mostrados). As células produtoras de EV e suas EVsS bioativas correspondentes foram todas positivas para várias proteínas de choque térmico, importantemente da família Hsp70 e mais especificamente para Hsp70-8.
[065] Exemplo 2. EVs derivadas de MSC de geleia de Wharton (WJI-MSC-EVs, obteníveis da geleia de Wharton) foram modificadas geneticamente com um construto de polinucleotídeo que codifica um construto de polipeptídeo compreendendo a proteína lisossomal cistinosina e a proteína CD63 de enriquecimento de EV. As MWJI-MSC-EVs contendo cistinosina (CYS EVs) foram colhidas da cultura celular do biorreator de fibra oca do WI-MSCS, purificadas e avaliadas in vitro contra fibroblastos de pele derivados de paciente (PDSF) para avaliar a redução no acúmulo de cistina em um modelo in vitro de cisinose. A Figura 2 ilustra a forte diminuição na cisteína vista quando se aplica as WJI-MSC-EVs compreendendo o construto de polipeptídeo de CD63-cistinosina. Como no Exemplo 1, as WJ- MSCs e as WI-MSC-EVs foram positivas para proteínas Hsp70,
e especificamente Hsp70-8, bem como para as tetraspaninas CD63 e CD81.
[066] Exemplo 3. AE-EVsS positivas para CD44, SSEAA4, CD133, CD24 e Hsp/0-8 e modificadas geneticamente para compreender uma pluralidade de construtos de polipeptídeo NPCl-sintenina foram avaliadas in vivo em um modelo duplo de camundongo knock-out de doença de Niemann-Pick. As AE- EVsS modificadas geneticamente mostraram um efeito terapêutico significante tanto na patologia do fígado quanto CNS (Figura 3). AE-EVSs não modificadas geneticamente também mostraram potência terapêutica, derivável do alto teor de várias proteínas de choque térmico nas AE-EVs.

Claims (27)

REIVINDICAÇÕES
1. Vesículas extracelulares (EVs) obteníveis de células estromais mesenquimais (MSCs), células epiteliais amnióticas (AE) ou células derivadas de placenta, caracterizadas pelo fato de que as EVs compreendem uma pluralidade de construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal.
2. EVsS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que o construto de polipeptídeo compreende adicionalmente pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV.
3. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que a proteína lisossomal é selecionada do grupo compreendendo alfa-D- manosidase, N- aspartil-beta-glicosaminidase, lipase ácida lisossomal, cistinosina, proteína-2 de membrana associada lisossomal, alfa-galactosidase A, ceramidase ácida, alfa- fucosidase, catepsina A, beta-glicosidase ácida, beta- galactosidase, beta-hexosaminidase A, beta-hexosaminidase B, GlecNAc-1 - fosfotransferase, beta-galactoilceramidase, lipase ácida lisossomal, arilsulfatase A, alfa-L- iduronidase, iduronato-2-sulfatase, paran sulfamidase, acetil alfa-glicosaminidase, acetil CoA: alfa- glicosaminida-N-acetiltransferase, N-acetil glicosamina-6- sulfatase, N-acetil galactosamina-6-sulfatase,
hialuronidase, acetil galactosamina-4-sulfatase, beta- glicuronidase, alfa-N-acetil neuraminidase, N- acetilglicosamina-l-fosfotransferase, mucolipina-l, enzima de geração de formilglicina, palmitoil-proteína tioesterase-l, tripeptidil peptidase I, proteína de cadeia de cisteína, CLN3p, CLN5p, CLN6p, CLN7p, CLN8p, esfingomielinase ácida, NPC 1, NPC 2, alfa-glicosidase ácida, catepsina K, sialina, alfa-N- acetilgalactosaminidase, ativador de GM2, lipase ácida lisossomal e derivados, regiões, domínios e/qualquer combinação dos mesmos.
4. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que o polipeptídeo de enriquecimento de EV é selecionado do grupo compreendendo CD9, CD53, CD63, CD81l, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, Sintenina (SEQ ID NO 1), a porção terminal N de sintenina (SEQ ID NO 2), Sintenina-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPANI4, CD37, CD82, CD151, CD231, CD1I02, NOTCH 1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CDlla, CDllb, CDllc, CDI8/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49%e, CD51 CD61, CD1I04, receptores de Fc, receptores de interleucina, imunoglobulinas, CD2, CD3 epsilon, CD3 zeta, CDl13, CDI18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CDA45RA, CD47, CD86, CD1l10, CDlIl 1, CD1I15, CDll17, CDl25, CD135,
CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6Al, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, Hsp70, L1 CAM, LAMBl, LAMC1I, LFA-l, LGALS3BP, Mac-l alfa, Mac-l beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTIl A, VTI1l B, qualquer derivado e/ou domínio dos mesmos, e qualquer combinação dos mesmos.
5. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizadas pelo fato de que o polipeptídeo de enriquecimento de EV é sintenina, a parte terminal N de sintenina, ou CD63.
6. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que a proteína lisossomal é uma proteína de membrana lisossomal.
7. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que as EVs são positivas para um ou mais dos seguintes polipeptídeos: CD63, CD81, CD44, SSEA4, CD133, CD24, e proteína de choque térmico 8 de 70 kDa.
8. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que as EVsS compreendem "adicionalmente pelo menos uma proteína de choque térmico.
9. EVS, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadas pelo fato de que pelo menos uma proteína de choque térmico é proteína de choque térmico 8 de 70 kDa.
10. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas pelo fato de que compreende adicionalmente um peptídeo e/ou polipeptídeo de alvejamento de tecido.
11. EVS, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato de que o peptídeo e/ou polipeptídeo de alvejamento de tecido são compreendidos no construto de polipeptídeo e/ou estão presentes como um construto de polipeptídeo separado.
12. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizadas pelo fato de que os construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal são substancialmente corretamente enovelados.
13. EVs, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizadas pelo fato de que uma EV única compreende: (i) pelo menos 10 cópias do construto de polipeptídeo; (ii) pelo menos 50 cópias do construto de polipeptídeo; e/ou (iii) pelo menos 100 cópias do construto de polipeptídeo.
14. Método para produzir EVs, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (i) introduzir em uma célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV um construto de polinucleotídeo que codifica para um construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal, e (ii) obter da célula produtora de EV, as EVs compreendendo uma pluralidade de construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as EVs compreendendo uma pluralidade de construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal compreendem: (i) pelo menos 10 cópias da proteína lisossomal; (ii) pelo menos 50 cópias da proteína lisossomal; e/ou (iii) pelo menos 100 cópias da proteína lisossomal.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que os construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal também compreendem pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV.
17. Célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal, pelo menos um construto de polinucleotídeo que codifica pelo menos uma proteína lisossomal, e/ou pelo menos um vetor compreendendo um construto de polinucleotídeo que codifica pelo menos uma proteína lisossomal.
18. Célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que um construto de polinucleotídeo que codifica para um construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal, e/ou um vetor compreendendo um construto como esse, é estavelmente inserido na célula produtora de EV.
19. Célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que os construtos de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal também compreendem pelo menos um polipeptídeo de enriquecimento de EV.
20. Célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizada pelo fato de que: (i) pelo menos 50%; (ii) pelo menos 70%; e/ou (iii) pelo menos 90%; das EVs produzidas pela célula compreendem o construto de polipeptídeo compreendendo pelo menos uma proteína lisossomal.
21. Célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a
20, caracterizada pelo fato de que as EVs produzidas pela célula compreendem: (i) pelo menos 10 cópias da proteína lisossomal; (ii) pelo menos 50 cópias da proteína lisossomal; e/ou (iii) pelo menos 100 cópias do construto de polipeptídeo compreendendo a proteína lisossomal.
22. Célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21, caracterizada pelo fato de que a célula é imortalizada.
23. Célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizada pelo fato de que as células e as EVsS produzidas pelas células compreendem uma ou mais das seguintes proteínas nativas: CD63, CD8l, CD44, CD49%e, CD105, SSEA4, CD133, CD24, e/ou proteína de choque térmico 8 de 70 kDa.
24. Célula MSC, AE ou derivada de placenta produtora de EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 23, caracterizada pelo fato de que as células e as EVsS produzidas pelas células compreendem as seguintes proteínas nativas: CD63, CD8l, e proteína de choque térmico 8 de 70 kDa.
25. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de EVs conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente miglustat, arimoclomol, heparina, trealose, e/ou ciclodextrina e/ou derivados dos mesmos.
27. EVS conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e/ou composição farmacêutica conforme definida nas reivindicações 25 ou 26, caracterizadas pelo fato de que são para uso no tratamento de uma ou mais doença de armazenamento lisossomal.
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