IT202000003371A1 - Composto per il trattamento di una glicogenosi - Google Patents

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IT202000003371A1
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polynucleotide
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IT102020000003371A
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Rosella Franconi
Giovanni Giuliano
Carmela Marino
Olivia Costantina Demurtas
Doriana Triggiani
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Enea Agenzia Naz Per Le Nuove Tecnologie Lenergia E Lo Sviluppo Economico Sostenibile
Aig Associazione Italiana Glicogenosi
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Description

DESCRIZIONE
Annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE avente per titolo
?Composto per il trattamento di una glicogenosi?
CAMPO DELL?INVENZIONE
La presente invenzione ha per oggetto un composto scelto tra un polinucleotide codificante per l?enzima deramificante il glicogeno (GDE), un vettore, una cellula ospite geneticamente ingegnerizzata in modo da esprimere l?enzima GDE. La presente invenzione riguarda inoltre l?uso del composto per il trattamento di una glicogenosi (GSD), preferibilmente della GSDIII.
STATO DELL?ARTE
Le glicogenosi (Glycogen Storage Disease, GSD) sono un gruppo di almeno quindici malattie metaboliche rare dovute ad alterazioni di enzimi che agiscono a diversi livelli della via metabolica di degradazione del glicogeno. Il glicogeno rappresenta la forma di deposito di zuccheri che, al bisogno, l?organismo utilizza per liberare glucosio al fine di mantenere la glicemia a livelli di normalit? a digiuno e/o a scopo energetico per la contrazione muscolare. Un accumulo di glicogeno nei tessuti provoca gravi alterazioni principalmente nel fegato, nei muscoli ed in altri organi.
In particolare, la glicogenosi di tipo III (GSDIII, o malattia di Cori o di Forbes), ? una malattia ultra-rara, con una prevalenza stimata di circa ? 1 su 80.000-100.000 nati, dovuta all?assenza dell?enzima deramificante il glicogeno (Glycogen Debranching Enzyme, GDE).
GDE ? una proteina monomerica citoplasmatica con due distinte attivit? catalitiche: essa contiene un dominio transferasico e un dominio glucosidasico. La mancanza o un?alterazione dell?attivit? dell?enzima GDE porta a glicogeno anormale con catene pi? corte (chiamato Phosphorylase limit dextrin, PLD) che si accumula nel muscolo scheletrico e/o cardiaco e/o nel fegato.
La malattia si manifesta a pochi mesi dalla nascita o durante l?infanzia con l?ingrossamento del fegato, ipoglicemia e ritardo nella crescita. I muscoli si indeboliscono generalmente a partire dalla seconda-terza decade di vita e, oltre all?ipotonia muscolare, alcuni malati possono sviluppare nel tempo una cardiomiopatia ipertrofica. I sintomi si presentano con una gravit? molto variabile. La malattia ? causata da mutazioni del gene ?AGL? (amylo-1,6-glucosidase, 4-alpha-glucanotransferase) codificante per l?enzima GDE, e si trasmette con modalit? autosomica recessiva: ? necessario che entrambi i geni, di origine paterna e materna, portino un cambiamento patologico nella sequenza perch? la malattia si manifesti. I genitori sono pertanto portatori sani.
Attualmente, per la GSDIII non esiste una cura ed ? disponibile solo un trattamento di tipo dietetico. Per diverse malattie genetiche (es. lisosomiali), di recente sono state sviluppate terapie enzimatiche di sostituzione (Enzyme Replacement Therapy, ERT). Ad esempio, per la GSDII (malattia di Pompe o glicogenosi lisosomiale) da pochi anni esiste un farmaco basato sull?enzima lisosomiale ?-glucosidasi ricombinante umana (GAA). Tuttavia, i problemi correlati con lo sviluppo di ERT, quando disponibile, sono gli alti costi dei trattamenti e il fatto che l?enzima ricombinante debba essere attivo e non immunogenico.
Un?alternativa ? rappresentata dalla terapia genica, in particolare la terapia genica non-virale che, tra i vantaggi, mostra una scarsa immunogenicit?. Ad oggi esistono due principali sistemi di trasferimento del DNA: quello basato sui vettori virali e quello sui vettori non-virali. Alla base di diverse terapie geniche approvate di recente, vi sono i vettori basati su virus adeno-associati (AAV), considerati generalmente pi? sicuri. Infatti, con questi vettori, sono stati condotti studi clinici di fase I anche per la terapia genica delle glicogenosi I e II (GSDI e GSDII), mentre per la GSDIII ? stato condotto un solo studio preclinico su modello murino. Detto studio ha dimostrato che effettivamente l?acquisizione di un enzima GDE funzionale ripristina il fenotipo ?sano?. Tuttavia, poich? il limite di inserzione imposto dal vettore AAV ? di circa 5 kb, il cDNA del gene AGL ? stato diviso in due parti (con una regione sovrapposta) ed ? stato necessario introdurre un passaggio di un processo di ricombinazione omologa, vanificando in parte il vantaggio dell?alta efficienza di trasfezione propria del vettore virale. Sebbene i pi? recenti successi per il trattamento delle malattie rare dovute ad effetti genetici ereditari siano stati raggiunti utilizzando approcci di aggiunta del gene mediata da vettori virali ricombinanti, i problemi associati a questi sistemi (scarsa sicurezza, scarsa capacit? di accomodare il DNA esogeno ed elevati costi) stanno spingendo lo sviluppo di sistemi alternativi.
SOMMARIO DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda un composto scelto tra:
a) un polinucleotide codificante per l?enzima deramificante il glicogeno (GDE), un derivato ricombinante o sintetico di GDE, un frammento o una variante allelica di detto GDE;
b) un vettore comprendente detto polinucleotide;
c) una cellula ospite (host cell) geneticamente ingegnerizzata che esprime detto polinucleotide.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente il composto sopra descritto.
Un terzo aspetto della presente invenzione riguarda il composto come sopra descritto per l?uso come medicamento.
Un quarto aspetto della presente invenzione riguarda il composto sopra descritto o l?enzima GDE ricombinante per l?uso nel trattamento di una glicogenosi (GSD).
Preferibilmente, la GSD ? la GSDIII (malattia di Cori o di Forbes).
Un quinto aspetto della presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente il composto sopra descritto e/o l?enzima GDE, per l?uso nel trattamento di una glicogenosi (GSD). Preferibilmente, la composizione ? somministrata in associazione o in combinazione con elettropermeabilizzazione della membrana plasmatica.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento di una GSD, preferibilmente della GSDIII (malattia di Cori o di Forbes). Detto metodo comprende almeno una fase di somministrazione di una quantit? efficace del composto e/o dell?enzima GDE secondo la presente invenzione o di una composizione che comprenda il composto e/o l?enzima GDE come sopra descritti, ad un soggetto (individuo) affetto o sospettato per essere affetto da una GSD, preferibilmente da GSDIII, eventualmente in combinazione con elettropermeabilizzazione.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
A seguire la presente invenzione ? descritta dettagliatamente ed esemplificata con riferimento alle annesse figure, in cui:
La Figura 1 mostra l?espressione della proteina GDE ottenuta dall?espressione del gene sAGL (sGDE) in diversi ceppi di E. coli trasformati con opportuni vettori di espressione comprendenti il gene AGL con i codoni ottimizzati (sAGL; SEQ ID NO. 1): A. Immunoblotting su proteine totali solubili (TSP 10 ?g) estratte da cellule batteriche BL21 e BL21/Gro7, contenenti i costrutti pQE-30-His6-sAGL o pQE50-sAGL dopo induzione dell?espressione a 37 ?C o 28 ?C per 16 ore. B. Immunoblotting su frazione solubile (S) e insolubile (I) di proteine estratte dopo induzione a 28 ?C di cellule BL21/Gro7 contenenti il plasmide pQE-30-His6-sAGL. M: Marcatore di peso molecolare;
La Figura 2 mostra un confronto tra la proteina sGDE ricombinante purificata da batterio (His6-sGDE) e la proteina GDE endogena presente nei globuli rossi (?red cells?) e cellule bianche (?white cells?) di sangue umano;
La Figura 3 mostra il risultato del test enzimatico per la valutazione dell?attivit? deramificante il glicogeno. C3PV: linea cellulare di fibroblasti umani; WBC: cellule bianche di sangue umano; GM02523: fibroblasti da pazienti GSDIII.
La Figura 4 mostra la stabilit? dell?enzima ricombinante sGDE purificato da batterio. (+): omogenato di fegato di ratto; (-): GM02523, fibroblasti derivati da pazienti GSDIII; 1: sGDE preparazione fresca; 2: sGDE conservato a 4 ?C per 12 mesi; 3: sGDE liofilizzato e risospeso in tampone di reazione. La Figura 5 mostra la sovra-espressione dell?enzima ricombinante GDE in cellule umane (HEK 293) in coltura dopo trasfezione col plasmide contenente il gene sAGL con in codoni ottimizzati, pVAX-sAGL (H10, H11) e con quello contenente il gene AGL con la sequenza umana (hAGL), pVAX-hAGL (B4) rispetto alle cellule non trasfettate (Controllo), valutata mediante microscopia ad immunofluorescenza).
La Figura 6 mostra la sovra-espressione dell?enzima GDE ricombinante in cellule HEK trasfettate col plasmide pVAX-sAGL (H10, H11) rispetto alle cellule non trasfettate (controllo) o a quelle trasfettate col plasmide pVAX-hAGL (B4) valutata mediante immunoblotting (WB, ?Western blot) e colorazione con rosso Ponceau (controllo);
La Figura 7 mostra l?incremento dell?attivit? deramificante il glicogeno nelle cellule HEK trasfettate con il plasmide pVAX-sAGL (H10 e H11) e con il plasmide pVAX-hAGL (B4) rispetto alle stesse cellule non trasfettate (C) verificata mediante il test enzimatico specifico. Il controllo positivo ? rappresentato dalla proteina ricombinante GDE purificata da batterio (His6-sGDE).
La Figura 8 mostra l?espressione dell?enzima ricombinante GDE in cellule difettive per l?enzima GDE (fibroblasti derivati da pazienti GSDIII), GM00111 (a.) e GM02523 (b.) dopo trasfezione col plasmide pVAX-sAGL utilizzando l?agente trasfettante Mirus 1 (colonna 1) o Mirus 2 (colonna 2). C-: cellule non trasfettate (controllo negativo). La proteina His6-sGDE ricombinante purificata da batterio (sGDE) e le cellule HEK (C+) rappresentano il controllo positivo.
La Figura 9 mostra l?incremento/ripristino dell?attivit? deramificante il glicogeno in cellule GM00111 (a.) e GM02523 (b.) dopo trasfezione col plasmide pVAX-sAGL mediata da agenti trasfettanti (Mirus 1 o Mirus 2), e verificata mediante test enzimatico specifico. C-: cellule non trasfettate, controllo negativo; C+: cellule HEK, controllo positivo.
DEFINIZIONI
Nel contesto della presente invenzione per ?ortologhi? si intendono geni o proteine simili riscontrabili in organismi correlati tra loro.
Nel contesto della presente invenzione per ?ricombinante? si intende una proteina ottenuta in seguito alla trascrizione e traduzione di un frammento di DNA ricombinante.
Nel contesto della presente invenzione per ?DNA ricombinante? si intende una sequenza di DNA ottenuta artificialmente attraverso sintesi chimica oppure dalla combinazione di materiale genetico di origini differenti, come pu? avvenire per un plasmide contenente un gene d'interesse.
Nel contesto della presente invenzione per ?elettroporazione? o ?elettropermeabilizzazione? (reversibile) si intende l?applicazione di una repentina scarica elettrica a cellule e/o tessuti e/o organi al fine di aprire simultaneamente la membrana plasmatica delle cellule in numerosi punti, permettendo a molecole di DNA di penetrare.
Nel contesto della presente invenzione, per ?polinucleotide codificante per l?enzima deramificante il glicogeno? o ?sAGL? si intende il gene AGL con i codoni ottimizzati.
Nel contesto della presente invenzione, per ?hAGL? si intende il gene AGL con codoni umani non ottimizzati.
Nel contesto della presente invenzione, per ?sGDE? si intende la proteina GDE ottenuta dall?espressione del gene sAGL.
Nel contesto della presente invenzione, per ?His6-sGDE? si intende la: proteina sGDE fusa ad un tag di 6 istidine all?estremit? N-terminale.
Nel contesto della presente invenzione, per ?hGDE? si intende la proteina GDE ottenuta dall?espressione del gene hAGL.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
Un primo aspetto della presente invenzione riguarda un composto scelto tra:
a) un polinucleotide codificante per l?enzima deramificante il glicogeno (GDE), o un derivato ricombinante o sintetico di GDE, un frammento o una variante allelica di detto GDE;
b) un vettore comprendente detto polinucleotide;
c) una cellula ospite (host cell) geneticamente ingegnerizzata che esprime detto polinucleotide
In una forma di realizzazione, il polinucleotide codificante per detto GDE ? scelto tra DNA e RNA, preferibilmente ? DNA.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide comprende una sequenza nucleotidica sostanzialmente omologa o identica a SEQ ID NO.1 (Tabella 1). Per esempio, il polinucleotide comprende una sequenza nucleotidica omologa o identica per almeno il 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o pi? alla SEQ ID NO.1.
Preferibilmente, il polinucleotide comprende una sequenza nucleotidica omologa o identica per almeno l?80%, pi? preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.1.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide consiste in una sequenza nucleotidica sostanzialmente omologa o identica a SEQ ID NO.1. Per esempio, il polinucleotide consiste in una sequenza nucleotidica omologa o identica per almeno il 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o pi? alla SEQ ID NO. 1.
Preferibilmente, il polinucleotide consiste in una sequenza nucleotidica omologa o identica per almeno l?80%, pi? preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.1.
In una forma di realizzazione, il polinucleotide comprende almeno un promotore costitutivo o tessuto-specifico, in grado di controllare l?espressione del cDNA codificante il gene AGL.
In una forma di realizzazione, il vettore comprendente il polinucleotide sopra descritto ? scelto tra: vettore virale, plasmide, particelle virali e fago. Preferibilmente, il vettore ? un vettore plasmidico.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, la cellula ospite (host cell) geneticamente ingegnerizzata che esprime il polinucleotide sopra descritto ? scelta tra: cellula batterica, cellula fungina, cellula animale, cellula di insetto e cellula vegetale, preferibilmente la cellula ospite ? una cellula animale.
Un secondo aspetto della presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente il composto come sopra definito. Preferibilmente, la composizione oggetto della presente invenzione pu? ulteriormente comprendere almeno un eccipiente farmacologicamente accettabile, ovvero un composto, accettabile per uso farmaceutico, che sia utile nella preparazione della composizione e che sia generalmente biologicamente sicuro e non tossico.
Un terzo aspetto della presente invenzione riguarda il composto come sopra dettagliatamente descritto per l?uso come medicamento.
Un quarto aspetto della presente invenzione riguarda il composto come sopra dettagliatamente descritto o l?enzima deramificante il glicogeno (GDE), un ortologo o un enzima GDE sintetico, per l?uso nel trattamento di una glicogenosi (GSD).
Preferibilmente, la GSD ? caratterizzata da un accumulo di glicogeno nel muscolo, fegato, cuore e/o sistema nervoso centrale.
In una forma di realizzazione, la GSD ? scelta tra: GSDla (malattia di Von Gierke disease), GSDI non-a, GSDII (malattia di Pompe), GSDIlb (malattia di Danon), GSDIII (malattia di Cori o di Forbes), GSDIV (malattia di Andersen), GSDV (malattia di McArdle), GSDVI (malattia di Hers), GSDVII (malattia di Tarui), GSDIX, GSDXI (sindrome di Fanconi-Bickel), GSDXI (deficit di aldolasi), GSDXIII and GSD0.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la GSD ? la GSDIII (malattia di Cori o di Forbes).
In una forma di realizzazione, l?enzima GDE comprende una sequenza amminoacidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO.2. Per esempio, l?enzima GDE comprende una sequenza amminoacidica identica per almeno il 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o pi? alla SEQ ID NO.2.
In una forma di realizzazione preferita, l?enzima GDE comprende una sequenza amminoacidica identica per almeno l?80%, pi? preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.2.
In una forma di realizzazione, l?enzima GDE consiste in una sequenza amminoacidica sostanzialmente identica a SEQ ID NO. 2. Per esempio, l?enzima GDE consiste in una sequenza amminoacidica identica per almeno il 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o pi? alla SEQ ID NO.2.
In una forma di realizzazione preferita, l?enzima GDE consiste in una sequenza amminoacidica identica per almeno l?80%, pi? preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.2.
In una forma di realizzazione dell?invenzione, l?enzima GDE comprende modifiche alla regione N-terminale e/o C-terminale, per esempio atte ad aumentare l?attivit? dell?enzima GDE. Dette modifiche sono scelte preferibilmente tra delezioni, addizioni, alterazioni di amminoacidi e loro combinazioni. Alternativamente detto GDE pu? essere modificato, preferibilmente nella struttura primaria, mediante acetilazione, carbossilazione, fosforilazione e loro combinazioni.
In una ulteriore forma di realizzazione, detto enzima GDE ? coniugato/legato con una molecola, con un metallo, con un marker, per esempio proteine, per la preparazione di proteine di fusione. In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, detto enzima GDE ? modificato tramite tecniche di biologia molecolare per migliorarne la resistenza alla degradazione proteolitica e/o per ottimizzarne la solubilit? o per migliorarne le caratteristiche farmacocinetiche.
Secondo una forma di realizzazione dell?invenzione, detto enzima GDE pu? essere modificato allo scopo di agevolare o migliorare la delivery, preferibilmente mediante PEGilazione, oppure utilizzando dei sistemi contenitore/navetta/carrier, preferibilmente di tipo liposomi, micelle, capsule, emulsioni, matrici, gel e similari.
In una ulteriore forma di realizzazione, detto enzima GDE ? rivestito con una struttura in grado di migliorarne la stabilit? e/o l?emivita e/o la solubilit? in acqua e/o le caratteristiche immunologiche. Detta struttura ? per esempio una microsfera sensibile al pH, una microsfera, una microtavoletta, un liposoma, oppure sistemi di ?nano-delivery? con particelle conduttive mediato da campi elettrici pulsati (CEP) oppure la fusione con peptidi che penetrano la cellula (?Cell-penetrating peptides? CPPs). In una di forma di realizzazione, l?enzima ? ottenuto tramite tecniche di DNA ricombinante note al tecnico del settore, preferibilmente tramite clonaggio del polinucleotide (cDNA) codificante per GDE in un vettore plasmidico per l?espressione dell?enzima ricombinante in batteri.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, l?enzima GDE ? ottenuto tramite clonaggio del polinucleotide con codoni umani non ottimizzati (hAGL) o del polinucleotide codificante GDE comprendente la SEQ ID NO.1 (sAGL), come sopra dettagliatamente descritto.
In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, detto enzima GDE ? sintetizzato tramite le tecniche convenzionali per la sintesi di proteine note al tecnico esperto. Per esempio, la proteina pu? essere sintetizzata tramite sintesi chimica utilizzando la sintesi peptidica su fase solida.
In una ulteriore forma di realizzazione dell?invenzione, l?enzima GDE ? isolato o purificato con metodi noti al tecnico del ramo. Per esempio, l?enzima GDE pu? essere purificato tramite metodi biochimici, quali filtrazione, affinit?, immunoaffinit? o tramite cromatografia liquida ad alta efficienza (HPLC, RP-HPLC, HPLC a scambio ionico, size-exclusion HPLC).
Tabella 1
In una forma di realizzazione, il composto o l?enzima GDE ? veicolato ad un tessuto bersaglio, preferibilmente un tessuto che contiene accumuli di glicogeno anomalo (PLD). Preferibilmente, il tessuto bersaglio ? scelto tra: muscolo, fegato, cuore e/o sistema nervoso centrale, pi? preferibilmente, il muscolo ? scelto tra: muscolo scheletrico, cardiaco e/o diaframma.
In una forma di realizzazione preferita, il polinucleotide o il vettore, come sopra descritti, ? veicolato ad un tessuto bersaglio che contiene accumuli di glicogeno.
Preferibilmente, il polinucleotide o il vettore, come sopra descritti, ? veicolato ad un tessuto bersaglio che contiene accumuli di glicogeno in associazione/combinazione con elettropermeabilizzazione, ovvero con l?applicazione di campi elettrici, preferibilmente campi elettrici pulsati (CEP).
In una forma di realizzazione preferita, i campi elettrici pulsati vengono applicati con combinazione di impulsi elettrici ad alto voltaggio e impulsi a basso voltaggio.
Un quinto aspetto della presente invenzione riguarda una composizione farmaceutica comprendente il composto o l?enzima GDE come sopra definiti per l?uso nel trattamento di una glicogenosi. Preferibilmente, la composizione oggetto della presente invenzione pu? ulteriormente comprendere almeno un eccipiente farmacologicamente accettabile, ovvero un composto, accettabile per uso farmaceutico, che sia utile nella preparazione della composizione e che sia generalmente biologicamente sicuro e non tossico.
In una forma di realizzazione, la composizione comprende almeno un ulteriore agente terapeutico per il trattamento delle GSD, in particolare della GSDIII (malattia di Cori o di Forbes).
Secondo una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione ? formulata in forma liquida, preferibilmente come soluzione, emulsione o sospensione sterile.
In una forma di realizzazione, la composizione ? in forma liofilizzata per essere ricostituita ed ottenere una formulazione liquida.
In una forma di realizzazione, la composizione ? somministrata per via parenterale scelta tra via intravenosa, sottocutanea, intramuscolare.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione, preferibilmente comprendente il polinucleotide o il vettore, come sopra descritti, ? somministrata localmente, preferibilmente, per iniezione locale, direttamente nel tessuto/organo da trattare.
Preferibilmente la composizione ? somministrata come bolo o per infusione continua.
In una forma di realizzazione, il tessuto/organo da trattare ? un tessuto/organo che contiene accumuli di glicogeno. Preferibilmente, il tessuto/organo da trattare ? scelto tra: muscolo, fegato, cuore e/o sistema nervoso centrale, pi? preferibilmente, il muscolo ? scelto tra: muscolo scheletrico, cardiaco e/o diaframma.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione ? somministrata in associazione o in combinazione con elettropermeabilizzazione.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione preferibilmente comprendente il polinucleotide o il vettore, preferibilmente il vettore, ? somministrata nel tessuto/organo bersaglio in associazione o in combinazione con elettropermeabilizzazione ovvero con l?applicazione di campi elettrici, preferibilmente di campi elettrici pulsati (CEP).
Preferibilmente, l?elettropermeabilizzazione ? applicata localmente, ovvero al tessuto/organo da trattare.
In una forma di realizzazione, l?elettropermeabilizzazione ? applicata direttamene al tessuto/organo che contiene accumuli di glicogeno.
In una forma di realizzazione preferita, i campi elettrici pulsati vengono applicati con combinazione di impulsi ad alto voltaggio e impulsi a basso voltaggio.
L?elettropermeabilizzazione ? in grado di aumentare in modo transiente la permeabilit? delle membrane cellulari, rendendo possibile l?ingresso del polinucleotide o del vettore nelle cellule e nei tessuti/organi trattati. Un approccio non-virale, per esempio utilizzando un vettore plasmidico in associazione o in combinazione con elettroporazione, risulta particolarmente vantaggioso, in quanto pi? sicuro rispetto ai vettori virali e permette un migliore controllo della diffusione del vettore nei tessuti/organi. Inoltre, un trattamento locale con metodi non virali, quali i plasmidi, in associazione o in combinazione con elettroporazione, aumenta l?efficacia della terapia, riduce i costi sanitari e gli effetti avversi dovuti ad una somministrazione sistemica.
In altre parole, le Richiedenti hanno dimostrato che il composto della presente invenzione veicolato tramite metodi fisici o chimici (non virali) ? in grado di aumentare significativamente l?espressione dell?enzima GDE nelle cellule/ trattate.
Alternativamente, la composizione ? formulata per una somministrazione enterale, preferibilmente per la somministrazione orale. In particolare, la composizione ? formulata in forma solida, preferibilmente in forma di compresse, capsule, tavolette, polvere granulare, opercoli, granuli orosolubili, bustine o confetti.
Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per il trattamento di una GSD, preferibilmente della GSDIII (malattia di Cori o di Forbes). Detto metodo comprende almeno una fase di somministrazione di una quantit? efficace del composto o dell?enzima GDE secondo la presente invenzione o di una composizione che lo comprenda come sopra dettagliatamente descritti, ad un soggetto (individuo) affetto o sospettato per essere affetto da una GSD, preferibilmente da GSDIII.
In una forma di realizzazione, la composizione ? somministrata per via intravenosa come bolo o per infusione continua. Preferibilmente, la composizione ? somministrata per iniezione locale, direttamente nel tessuto affetto da accumulo di glicogeno anomalo.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione ? somministrata per iniezione o infusione in associazione o in combinazione con elettropermeabilizzazione.
In una forma di realizzazione preferita dell?invenzione, la composizione comprendente il polinucleotide o il vettore, preferibilmente il vettore, pi? preferibilmente il plasmide, ? somministrata in associazione o in combinazione con elettroporazione (nota anche come ?elettropermeabilizzazione?) ovvero con l?applicazione di campi elettrici, preferibilmente di campi elettrici pulsati (CEP).
Preferibilmente, l?elettropermeabilizzazione ? applicata localmente, ovvero sul tessuto/organo da trattare.
In una forma di realizzazione, l?elettropermeabilizzazione ? applicata direttamene al tessuto/organo che contiene accumuli di glicogeno.
In una forma di realizzazione preferita, i campi elettrici pulsati vengono applicati con combinazione di impulsi ad alto voltaggio e impulsi a basso voltaggio.
Esempio
Espressione dell?enzima GDE funzionale in batterio e sua caratterizzazione biochimica.
Il gene sintetico sAGL (ottimizzato nei codoni per l?espressione in cellule di insetto Spodoptera frugiperda) codificante l?enzima sGDE ? stato fatto sintetizzare dalla ditta americana Genscript Co. Il gene ? stato quindi clonato sotto il controllo di promotori inducibili in opportuni vettori plasmidici per l?espressione dell?enzima ricombinante in batterio, fuso o meno ad un ?tag? di sei istidine (His6) all?estremit? N-terminale, per consentire la purificazione mediante cromatografia di affinit?. Tali vettori sono stati impiegati per la trasformazione di diversi ceppi di E. coli. In seguito ad induzione dell?espressione proteica a diverse temperature di crescita ? stata ottenuta l?espressione di una proteina di 176 KDa solo quando presente il ?tag? His6 (Fig. 1). In assenza di ?tag?, la proteina GDE risultante ? di dimensioni inferiori (circa 120 KDa) (Fig.1).
La proteina His6-sGDE espressa in batterio ? stata purificata mediante cromatografia di affinit? e ha mostrato all?incirca lo stesso peso molecolare della proteina GDE umana presente nelle cellule del sangue di persone sane (Fig.2). Il mantenimento dell?attivit? catalitica (Fig.3) ? stato valutato utilizzando un protocollo adattato da quello usato per diagnosi presso il dipartimento di Biochimica dell?Universit? di Manchester, NHS Foundation Trust, Manchester, Regno Unito, e reso disponibile dalla Dott.ssa Fiona Ivison. Come precedentemente descritto, l?enzima deramificante il glicogeno presenta due distinte attivit? catalitiche, transferasica e glucosidasica. In particolare, il test impiegato misura l?attivit? glucosidasica dell?enzima che, agendo a livello dei punti di ramificazione del suo substrato specifico (PLD, fosforilasi destrina limite), libera molecole di glucosio. Tali molecole, in seguito ad una reazione colorimetrica con gli enzimi glucosio ossidasi e perossidasi, e ABTS (acido 2,2?-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonico) sono misurate mediante letture allo spettrofotometro alla lunghezza d?onda di 740 nm: i valori di assorbanza misurati, infatti, sono direttamente correlati alla concentrazione delle molecole di glucosio liberate dall?enzima. Come controllo negative del test, ? stata utilizzata una linea cellulare umana difettiva per GDE (GM02523, fibroblasti derivati da pazienti GSDIII).
Inoltre, His6-sGDE ? dotata di una notevole stabilit?, come dimostrato dal mantenimento dell?attivit? catalitica anche dopo conservazione a 4 ?C per 12 mesi o dopo liofilizzazione (Fig.4).
Espressione dell?enzima GDE funzionale in cellule di mammifero.
Il cDNA con la sequenza ottimizzata per l?espressione in cellule di insetto e quello con la sequenza originale del gene AGL umano, sono stati clonati in un vettore di espressione in cellule di mammifero ottenendo i costrutti pVAX-sAGL e pVAX-hAGL, rispettivamente. Il veicolamento intracellulare di questi costrutti ? stato effettuato con metodi chimici (formulazioni a liposomi cationici, Lipofectamina) su una linea cellulare umana (Human Embryonic Kidney cells 293, HEK). A seguito della trasfezione, solo la sequenza sintetica, e non quella originale del gene umano, ? risultata essere espressa ad alti livelli (Fig. 5, 6). Le cellule umane trasfettate hanno anche mostrato una attivit? catalitica superiore rispetto al ?background? (infatti, le cellule HEK esprimono la GDE a bassi livelli) (Fig. 7).
ln aggiunta, due linee cellulari umane difettive per GDE (GM00111 e GM02523), da noi caratterizzate a livello biochimico e ultrastrutturale (dati non mostrati), sono state usate per esperimenti di veicolamento tramite Lipofectamina. La trasfezione in questo caso non ha avuto un esito positivo (dati non mostrati) e, per questo, su queste linee sono stati sperimentati due nuovi agenti trasfettanti (MIRUS 1: TransIT-X2? System; MIRUS 2: -TransIT?-2020 Reagent). A seguito della trasfezione, le cellule umane difettive per GDE hanno mostrato l?espressione dell?enzima (Fig.8) ed un?aumentata attivit? catalitica rispetto alle cellule non trasfettate (Fig. 9).
Attualmente si sta sperimentando anche il veicolamento tramite elettroporazione.

Claims (16)

  1. RIVENDICAZIONI 1.Un composto scelto tra: a) un polinucleotide codificante per un enzima deramificante il glicogeno (GDE), un derivato ricombinante o sintetico di GDE, un frammento o una variante allelica di detto GDE, comprendente una sequenza nucleotidica identica almeno per l?80% alla SEQ ID NO: 1; b) un vettore comprendente detto polinucleotide; c) una cellula ospite (host cell) geneticamente ingegnerizzata che esprime detto polinucleotide.
  2. 2. Il composto secondo la rivendicazione 1, dove il polinucleotide comprende una sequenza nucleotidica identica almeno per il 90% alla SEQ ID NO: 1.
  3. 3. Il composto secondo la rivendicazione 1 o 2, dove il polinucleotide comprende una sequenza nucleotidica che consiste nella SEQ ID NO: 1.
  4. 4. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 per l?uso come medicamento.
  5. 5. Il composto secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3 o l?enzima GDE, un ortologo o un enzima GDE sintetico, per l?uso nel trattamento di una glicogenosi (GSD).
  6. 6. Il composto o l?enzima GDE per l?uso secondo la rivendicazione 5, dove l?enzima GDE comprende una sequenza amminoacidica identica per almeno l?80%, preferibilmente per almeno il 90% alla SEQ ID NO.2.
  7. 7. Il composto o l?enzima GDE per l?uso secondo la rivendicazione 5 o 6, dove la GSD ? la GSDIII (malattia di Cori o di Forbes).
  8. 8. Il composto o l?enzima GDE per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-7, in combinazione o associazione ad elettropermeabilizzazione.
  9. 9. Il composto o l?enzima GDE per l?uso secondo la rivendicazione 8, dove l?elettropermeabilizzazione comprende una combinazione di impulsi elettrici ad alto voltaggio e impulsi elettrici a basso voltaggio.
  10. 10. Il composto o l?enzima GDE per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-9, dove un tessuto/organo da trattare contiene accumuli di glicogeno.
  11. 11. Il composto o l?enzima GDE per l?uso secondo la rivendicazione 10, dove il tessuto/organo da trattare ? scelto tra: muscolo, fegato, cuore e/o sistema nervoso centrale, preferibilmente il muscolo ? scelto tra: muscolo scheletrico, cardiaco e diaframma.
  12. 12. Il composto o l?enzima GDE per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 8-11, dove l?elettropermeabilizzazione ? applicata localmente al tessuto/organo da trattare, preferibilmente direttamene al tessuto/organo che contiene accumuli di glicogeno.
  13. 13. Una composizione farmaceutica comprendente il composto per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 4-12.
  14. 14. Una composizione farmaceutica comprendente l?enzima GDE per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 5-12.
  15. 15. La composizione per l?uso secondo la rivendicazione 13 o 14 formulata in forma liquida, preferibilmente in forma di soluzione, emulsione o sospensione sterile oppure in forma liofilizzata per essere ricostituita ed ottenere una formulazione liquida.
  16. 16. La composizione per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 13-15, somministrata per via parenterale scelta tra via intravenosa, sottocutanea, intramuscolare, preferibilmente somministrata localmente per iniezione direttamente nel tessuto/organo da trattare.
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