TW201733614A

TW201733614A - 包含重組酸性α-葡萄糖苷酶之調配物

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Publication number: TW201733614A
Application number: TW106110788A
Authority: TW
Inventors: 亨查; 瑟吉泰斯勒; 溫蒂桑朵蘭德; 安立奎狄隆
Original assignee: 阿米庫斯醫療股份有限公司
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2017-10-01
Also published as: TWI813388B; PL3436053T3; EP3436053B1; CN109475607B; RS63362B1; TW202245832A; HUE059014T2; TWI774670B; HRP20220817T1; SI3436053T1; EP3436053A1; PT3436053T; CN109475607A; ES2921673T3; TW202402323A; TWI820564B; DK3436053T3; EP4098274A1; LT3436053T; TW202231296A

Abstract

提供了包含重組酸性α-葡萄糖苷酶的藥物調配物，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該重組酸性α-葡萄糖苷酶包括增加的含量的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元；至少一種選自下組的緩衝液，該組由以下各項組成：檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合；和至少一種選自下組的賦形劑，該組由以下各項組成：甘露醇、聚山梨醇酯80及其組合，其中該調配物具有從約5.0至約7.0的pH。亦提供了使用該等藥物調配物治療龐貝氏病之方法。

Description

包含重組酸性α-葡萄糖苷酶之調配物

本發明的原理和實施例總體上係關於包含重組酸性α-葡萄糖苷酶之調配物，並且特別是液體調配物。

龐貝氏病，又稱為酸性麥芽糖酶缺乏症或肝糖貯積症II型，係若干種溶酶體貯積失調之一。溶酶體貯積失調係一組常染色體隱性遺傳疾病，其特徵在於細胞的糖鞘脂、肝醣或黏多醣在細胞內的區室（稱為溶酶體）內的積累。患有該等疾病的個體攜帶編碼在催化一種或多種該等物質的水解方面有缺陷的酶的突變基因，該等物質隨後在溶酶體中積累。溶酶體失調的其他實例包括高歇氏病、GM1-神經節苷脂貯積症、岩藻糖沉積症、黏多醣貯積症（mucopolysaccharidoses）、胡爾勒-施埃爾病（Hurler-Scheie disease）、尼曼-匹克A和B病（Niemann-Pick A和B），以及法布裡氏病（Fabry disease）。龐貝氏病亦被分類為神經肌肉疾病或代謝性肌病。

龐貝氏病的發病率被估計為在40,000人中約1例，並且係由GAA基因的突變引起的，該GAA基因編碼酶溶酶體α-葡萄糖苷酶（EC:3.2.1.20），該酶也常被稱為酸性α-葡萄糖苷酶。酸性α-葡萄糖苷酶藉由在溶酶體內將肝醣催化水解為葡萄糖來參與肝醣（一種分支多糖，係動物中葡萄糖的主要儲存形式）的代謝。因為患有龐貝氏病的個體產生無活性的或具有減少的活性的突變的、缺陷的酸性α-葡萄糖苷酶，肝醣分解發生緩慢或根本不發生，並且在不同組織的溶酶體中（特別是在橫紋肌中）發生肝醣積累，導致了包括進行性肌無力和呼吸功能不全的廣譜臨床表現。組織（如，心臟和骨骼肌）特別受影響。

龐貝氏病可以在酶的缺乏程度、嚴重程度和發病年齡方面差別很大，並且已經鑒定了在GAA基因中的超過500種不同的突變，它們中的許多引起不同嚴重程度的疾病症狀。該疾病已經被分類為以下廣泛類型：早發型或嬰兒型，以及晚發型。早發型疾病和較低酶活性通常與更嚴重的臨床病程相關。嬰兒型龐貝氏病係最嚴重的，係由完全的或接近完全的酸性α-葡萄糖苷酶缺乏引起，並且出現包括肌肉張力嚴重缺乏、虛弱、肝臟和心臟增大以及心肌病的症狀。舌頭可能變得增大和突出，並且吞咽可能變得困難。多數染病的兒童在兩歲之前死於呼吸併發症或心臟併發症。晚發型龐貝氏病可以出現在大於12個月的任何年齡，並且其特徵在於缺乏心臟損害和更好的短期預後。症狀與進行性骨骼肌功能障礙相關，並且涉及全身性肌無力以及在軀幹、近端下肢和隔膜中的呼吸肌的消耗。一些成年患者缺乏主要症狀或運動限制。預後通常取決於呼吸肌損害的程度。大多數患有龐貝氏病的受試者最終發展為需要使用輪椅和輔助通氣的身體衰弱的狀態，其中由於呼吸衰竭而經常發生過早死亡。

針對龐貝氏病的最近的治療選項包括用重組人酸性α-葡萄糖苷酶（rhGAA）進行的酶替代療法（ERT）。常規的rhGAA產品在來自健贊公司（Genzyme,Inc.）的阿葡萄糖苷酶α（alglucosidase alfa）、Myozyme®或Lumizyme®名下係已知的。ERT係貫穿患者一生所必需的慢性治療，並且涉及藉由靜脈內輸注來投予替代酶。該替代酶隨後在循環中轉運，並且進入細胞內的溶酶體中，在溶酶體中該替代酶的作用係分解積累的肝醣，補償內源性缺陷突變型酶缺乏的活性，並且從而緩解疾病症狀。

該等替代酶（如rhGAA）的製備、儲存、轉運和投予患者的方式係困難的。在ERT中使用的該等酶通常是相對複雜和精細的，使得伴隨的緩衝液、賦形劑等的選擇至關重要。若沒有適當地保存酶，則可能需要大量的酶，就使得治療成本高並且低效。

將一些常規的rhGAA產品作為無防腐劑的一次性小瓶中的凍乾（冷凍-乾燥）粉末提供給患者。隨後必須將該rhGAA在小瓶中重構，隨後稀釋並且經靜脈內投予。儘管凍乾有助於在製造後保存酶，直到其準備好投予患者，但該方法過程中和該方法本身可能破壞酶。因此，必須非常小心地選擇rhGAA調配物中的組分，使得它們有助於保持蛋白質的濃度和活性。

此外，重組酶通常在結構上不同於野生型酶。即使在重組酶中的胺基酸與它的野生型對應物可能一致，在碳水化合物化學上也可能有差異。因此，當發現新的重組酶時，必須開發針對酶的調配物，該等調配物對新發現的酶具有化學特異性。

因此，存在對儲存和轉運重組酶（如rhGAA）的調配物的持續需要，該等調配物保持酶活性和濃度。

本發明的一態樣涉及一種藥物調配物。在實施例1中，該調配物包括： (a) 一種重組酸性α-葡萄糖苷酶，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該重組酸性α-葡萄糖苷酶包括增加的含量的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元； (b) 至少一種選自下組的緩衝液，該組由以下各項組成：檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合；和 (c) 至少一種選自下組的賦形劑，該組由以下各項組成：甘露醇、聚山梨醇酯80及其組合，其中該調配物具有從約5.0至約7.0的pH。

實施例2包括對實施例1所述之藥物調配物之修飾，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶係以約5 mg/mL至約50 mg/mL的濃度存在。

實施例3包括對實施例1或2所述之藥物調配物之修飾，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶係以約15 mg/mL的濃度存在。

實施例4包括對實施例1-3中的任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該調配物具有從約5.5至約7.0的pH。

實施例5包括對實施例1-4中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該調配物具有約6.0的pH。

實施例6包括對實施例1-5中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該至少一種緩衝液包括檸檬酸鹽。

實施例7包括對實施例1-6中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該至少一種緩衝液包括鉀、鈉或銨鹽。

實施例8包括對實施例1-7中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該至少一種緩衝液包括檸檬酸鈉。

實施例9包括對實施例1-8中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該至少一種緩衝液係以約10 mM至約100 mM的濃度存在。

實施例10包括對實施例1-9中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該至少一種緩衝液係以約25 mM的濃度存在。

實施例11包括對實施例1-10中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中排除了海藻糖、蔗糖、甘胺酸或其組合。

實施例12包括對實施例1-11中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該至少一種賦形劑係以約10 mg/mL至約50 mg/mL的濃度存在的甘露醇。

實施例13包括對實施例1-12中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該至少一種賦形劑係以約0.2 mg/mL至約0.5 mg/mL的濃度存在的聚山梨醇酯80。

實施例14包括對實施例1-13中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該甘露醇係以約20 mg/mL的濃度存在，並且該聚山梨醇酯80係以約0.5 mg/mL的濃度存在。

實施例15包括對實施例1-14中任一項所述之藥物調配物之修飾，進一步包括：(d)水。

實施例16包括對實施例1-15中任一項所述之藥物調配物之修飾，進一步包括：(d)鹼化劑；和/或(e)酸化劑，其中該鹼化劑和酸化劑係以保持該藥物調配物在從約5.0至約6.0的pH的量存在。

實施例17包括對實施例1-16中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中至少30%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子包括帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的一個或多個N-聚糖單元。

實施例18包括對實施例1-17中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該重組人酸性α葡萄糖苷酶包括每莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶中的平均從0.5至7.0莫耳的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。

實施例19包括對實施例1-18中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該重組人酸性α-葡萄糖苷酶包括每莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶中的平均至少3莫耳的甘露糖-6-磷酸殘基和每莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶中的至少4莫耳的唾液酸殘基。

實施例20包括對實施例1-19中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該重組人酸性α-葡萄糖苷酶包括七個潛在的N-糖基化位點，至少50%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在第一位點處包括帶有兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，至少30%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在第二位點處包括帶有一個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，至少30%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在第四位點處包括帶有兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，並且至少20%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在第四位點處包括帶有一個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。

實施例21包括對實施例1-20中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該藥物調配物基本上由以下各項組成： (a) 該重組酸性α-葡萄糖苷酶； (b1) 檸檬酸鈉； (b2) 檸檬酸單水合物； (c1) 甘露醇； (c2) 聚山梨醇酯80； (d) 水； (e) 視情況，一酸化劑；以及 (f) 視情況，一鹼化劑，其中該調配物具有從約5.0至約6.0的pH。

實施例22包括對實施例1-21中任一項所述之藥物調配物之修飾，其中該藥物調配物基本上由以下各項組成： (a) 該重組酸性α-葡萄糖苷酶，以約15 mg/mL的濃度存在； (b) 檸檬酸鈉緩衝液，以約25 mM的濃度存在； (c1) 甘露醇，以約20 mg/mL的濃度存在； (c2) 聚山梨醇酯80，以約0.5 mg/mL的濃度存在；和 (d) 水； (e) 視情況，一酸化劑；以及 (f) 視情況，一鹼化劑，其中該調配物具有從約5.0至約6.0的pH。

本發明的另一態樣涉及一種凍乾的藥物組成物。因此，實施例23涉及包括凍乾之後的、實施例1-22中任一項所述之調配物之藥物組成物。實施例24涉及一種包括凍乾混合物的藥物組成物，該凍乾混合物包括： (a) 一種重組酸性α-葡萄糖苷酶，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該重組酸性α-葡萄糖苷酶包括增加的含量的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元； (b) 一種選自下組的緩衝液，該組由以下各項組成：檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合；和 (c) 至少一種選自下組的賦形劑，該組由以下各項組成：海藻糖、甘露醇、聚山梨醇酯80及其組合。

本發明的另一態樣涉及治療龐貝氏病之方法。因此，實施例25包括向對其有需要的患者投予實施例1-22所述之藥物調配物。實施例26包括對實施例25所述之方法之修飾，該方法進一步包括在向患者投予之前稀釋該藥物調配物。實施例27涉及治療龐貝氏病之方法，該方法包括：重構實施例23或24所述之藥物組成物；並且向對其有需要的患者投予經重構的藥物組成物。

本發明的另一態樣涉及製備上述藥物調配物的方法。因此，實施例28涉及製備實施例1-22中任一項所述之藥物調配物之方法，該方法包括：向水中添加至少一種緩衝液、至少一種賦形劑和重組酸性α-葡萄糖苷酶以提供一種溶液；視情況調節該溶液的pH；並且視情況向該溶液中添加額外的水。實施例29包括對實施例28所述之方法的修飾，進一步包括對該溶液進行過濾。實施例30包括對實施例27或28所述之方法之修飾，進一步對該溶液進行儲存。

在描述本發明若干示例性實施例之前，應當理解的是，本發明不限於以下描述中列出的構建或方法步驟的細節。本發明能夠有其他的實施例，並且能夠以不同的方式被實施或進行。應當理解的是，以下列出的實施例不僅如下所列結合，而且可以根據本發明的範疇以其他合適的組合而結合。

出人意料地發現，藉由謹慎選擇緩衝液和賦形劑，可以提供針對重組GAA蛋白ATB200的調配物，該調配物表現出優異的穩定性並且可以經受與調配物製備、儲存、轉運、重構和投予相關的過程，同時保持酶活性和效力，但是最小化了酶的沈澱。因此，本發明的一個態樣涉及包括rhGAA、緩衝液和至少一種賦形劑的調配物。在一個或多個實施例中，該rhGAA包括ATB200。在一些實施例中，該調配物係液體調配物。關於調配物的各種成分的細節和各種實施例如下。定義

在本發明的上下文中以及在每個術語使用的特定上下文中,在本說明書中使用的術語通常具有其在本領域中的一般含義。某些術語在下文或說明書中的其他地方論述，以向從業者提供描述本發明的組成物和方法以及如何製作和使用它們的另外指導。

在本說明書中，除非上下文需要，否則歸因於表達語言或必要的含義，詞語「包括（comprises）」，或變化形式如「包括（comprises或comprising）」係以包容性的意義使用，亦即用於指明所述特徵的存在，但是不排除在本發明的不同實施例中存在或添加的其他特徵。

如本文中所使用，術語「龐貝氏病」亦稱為酸性麥芽糖酶缺乏症、肝糖貯積症II型（GSDII）和肝醣貯積病II型，意欲係指遺傳性的溶酶體貯積失調，其特徵在於在編碼人酸性α-葡萄糖苷酶的GAA基因的突變。術語包括但不限於該疾病的早發型和晚發型形式，包括但不限於嬰兒型、青年型和成年型龐貝氏病。

如本文中所使用，術語「酸性α-葡萄糖苷酶」意欲係指水解肝醣、麥芽糖和異麥芽糖的D-葡萄糖單元之間的α-1,4鍵的溶酶體酶。替代名包括但不限於：溶酶體的α葡萄糖苷酶（EC:3.2.1.20）；葡萄糖澱粉酶；1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶；澱粉葡萄糖苷酶；γ-澱粉酶和外切-1,4-α-葡萄糖苷酶。人酸性α葡萄糖苷酶係由GAA基因（美國國家生物技術資訊中心（NCBI）基因ID 2548）編碼的，該基因已經被定位至染色體17的長臂上（位置17q25.2-q25.3）。該全長野生型GAA胺基酸序列在SEQ ID NO: 1中展示，如美國專利案第8,592,362號中所描述，並且具有基因庫登錄號AHE24104.1（GI:568760974）。

目前已經在人類GAA基因中鑒定了超過500個突變，其中的許多突變與龐貝氏病有關。導致該酸性α-葡萄糖苷酶的錯折疊或錯加工的突變包括T1064C（Leu355Pro）和C2104T（Arg702Cys）。另外，影響酶的成熟和加工的GAA突變包括Leu405Pro和Met519Thr。在胺基酸殘基516-521處的保守六肽WIDMNE對於酸性α-葡萄糖苷酶蛋白的活性是必需的。如本文中所使用，縮寫「GAA」意欲係指酸性α-葡萄糖苷酶，而斜體縮寫「GAA 」意欲係指編碼人酸性α-葡萄糖苷酶的人類基因。因此，縮寫「rhGAA」意欲係指重組人酸性α-葡萄糖苷酶。

如本文中所使用，術語「阿葡萄糖苷酶α」意欲係指被鑒定為[199-精胺酸,223-組胺酸]先質原（prepro）-α-葡萄糖苷酶（人）的重組人酸性α-葡萄糖苷酶；化學文摘登記號420794-05-0。阿葡萄糖苷酶α被批准在美國由健贊公司在2016年1月作為產品Lumizyme®和Myozyme®進行市場行銷。

如本文中所使用，術語「ATB200」意欲係指共同未決的專利申請PCT/US2015/053252中所描述的重組人酸性α-葡萄糖苷酶，該專利申請的揭露內容藉由引用併入本文。

如本文中所使用，術語「聚糖」意欲係指共價結合至蛋白質或多肽上的胺基酸殘基的多糖鏈。如本文中所使用，術語「N-聚糖」或「N-聯聚糖」意欲係指藉由共價結合至胺基酸殘基的氮原子而附接至蛋白質或多肽上的胺基酸殘基的多糖鏈。例如，N-聚糖可以共價結合至天冬醯胺殘基的側鏈氮原子上。聚糖可以包含一個或若干個單糖單元，並且該單糖單元可以共價連接以形成直鏈或支鏈。在至少一個實施例中，附接至ATB200的N-聚糖單元可以包括每一獨立地選自N-乙醯葡糖胺、甘露糖、半乳糖或唾液酸的一個或多個單糖單元。蛋白質上的該N-聚糖單元可以藉由任何適當的分析技術（例如，質譜）來確定。在一些實施例中，N-聚糖單元可以藉由液相層析-串聯質譜（LC-MS/MS），利用儀器，如賽默科技（Thermo Scientific）Orbitrap Velos Pro^TM 質譜儀、賽默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM 質譜儀或沃特斯（Waters）Xevo® G2-XS QTof質譜儀來確定。

如本文中所使用，術語「高甘露糖N-聚糖」意欲係指具有一個至六個或更多個甘露糖單元的N-聚糖。在至少一個實施例中，高甘露糖N-聚糖單元可以包含結合至天冬醯胺殘基，並且進一步結合至分支聚甘露糖鏈的雙(N-乙醯葡糖胺)鏈。如在本文可互換地使用，術語「M6P」或「甘露糖-6-磷酸鹽」意欲係指在位置6處磷酸化的甘露糖單元；亦即，具有與位置6處的羥基基團結合的磷酸基基團。在至少一個實施例中，一個或多個N-聚糖單元的一個或多個甘露糖單元係在位置6處磷酸化以形成甘露糖-6-磷酸單元。

如本文中所使用，術語「複合N-聚糖」意欲係指包含一個或多個半乳糖和/或唾液酸單元的N-聚糖。在至少一個實施例中，複合N-聚糖可以是高甘露糖N-聚糖，其中一個或多個甘露糖單元進一步結合至各自獨立地選自N-乙醯葡糖胺、半乳糖和唾液酸的一個或多個單糖單元。

如本文中所使用，「治療有效劑量」和「有效量」意欲係指足夠導致受試者治療反應的酸性α-葡萄糖苷酶的量。治療反應可以是使用者（例如，臨床醫生）將會識別為對治療的有效回應的任何反應，包括本文所述和本領域已知的任何替代性臨床標記物或症狀。因此，在至少一個實施例中，治療反應可以是龐貝氏病的一個或多個症狀或標記物（例如本領域已知的彼等）的改善或抑制。龐貝氏病的症狀或標記物包括但不限於：降低的酸性α-葡萄糖苷酶組織活性；心肌病；心臟肥大；進行性肌無力（尤其在軀幹或下肢）；深度張力減退；巨舌（並且在一些病例中，舌突出）；吞咽、吮吸和/或攝食困難；呼吸功能不全；肝腫大（中等的）；面肌鬆弛；無反射；運動不耐受；運動性呼吸困難；端坐呼吸；睡眠呼吸中止；上午頭痛；嗜睡症；脊柱前凸和/或脊柱側彎；減少的深腱反射；下腰痛；以及不滿足發展性的動作發展指標。

如本文中所使用，術語「酶替代療法」或「ERT」意欲係指將非天然的、經純化的酶引入具有此種酶缺乏的個體中。投予的蛋白質可以從自然來源或藉由重組表現而獲得。該術語也指將經純化的酶引入個體，該個體在其他情況下需要或受益於投予的經純化的酶。在至少一個實施例中，此類個體患有酶缺乏症。該引入的酶可以是在體外產生的經純化的重組酶，或從離體組織或體液例如像胎盤或動物奶，或從植物純化的蛋白質。

如本文中所使用，術語「藥學上可接受的」意欲係指當投予人類時，生理上可耐受的，並且通常不會產生不良反應的分子實體以及組成物。較佳的是，如本文中所使用，術語「藥學上可接受的」意指由聯邦或州政府的管理機構批准的或者在美國藥典或其他普遍認可的藥典中列出的，用於在動物體內並且更具體地在人體內的使用。

如本文中所使用，術語「賦形劑」係指除了包括在調配物中的活性成分以外的物質，並且通常是無活性的材料。賦形劑可以幫助將活性藥物輸送到藥物意欲生效的位置、控制活性藥物的釋放或幫助溶解，或者可以發揮各種其他的功能。賦形劑的實例包括，但不限於：緩衝劑、表面活性劑、抗微生物劑、抗氧化劑、膨脹劑、穩定劑、張力調節劑等。

如本文中所使用，術語「緩衝液」意欲係指包含弱酸和其共軛弱鹼的溶液，該溶液的pH僅隨著鹼或酸的添加而略有變化。如將在以下進一步解釋，在一些實施例中，在藥物調配物中使用的緩衝液係檸檬酸鹽和/或磷酸鹽緩衝液。

如本文中所使用，術語「受試者」或「患者」意欲係指人類或非人類動物。在至少一個實施例中，受試者係哺乳動物。在至少一個實施例中，受試者係人類。

如本文中所使用，術語「約」和「大約」意欲係指對於給定量測的性質或精度的量測的量而言可接受程度的誤差。例如，如本領域中所理解的，誤差的程度可以由為量測提供的有效數字的數值來指示，並且包括但不限於對於量測所報告的最精確的有效數字中±1的變化。典型的示例性誤差程度係在給定值或值範圍的20%（%）內，較佳的是在10%內，並且更較佳的是在5%內。可替代地，並且特別是在生物系統中，術語「約」和「大約」可以意指係在給定值的一個數量級內，較佳的是在5倍以內，並且更較佳的是在2倍以內的值。除非另有說明，本文給出的數字量係大約的，意指當沒有明確說明時，可以推斷出術語「約」或「大約」。

在整篇說明書中對「一個實施例」、「某些實施例」、「各種實施例」、「一個或多個實施例」或「實施例」的引用意指與實施例相聯繫地描述的具體的特徵、結構、材料或特性係包括在本發明的至少一個實施例中的。因此，在整篇說明書中多個位置中出現的短語如「在一個或多個實施例中」、「在某些實施例中」、「在各種實施例中」、「在一個實施例中」或「在實施例中」不一定係指本發明中的相同實施例。此外，在一個或多個實施例中，具體的特徵、結構、材料或特性可以是以任何適合的方式進行組合。 ATB200 rhGAA

該調配物包括ATB200，該ATB200係適合在酶替代療法中使用的重組GAA（rhGAA）蛋白質。以下提供了關於ATB200的結構和產生的細節，以及變體。

在至少一個實施例中，該ATB200在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該ATB200包括增加的含量的帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。在rhGAA上存在七個潛在的N-聯糖基化位點。由於每個糖基化位點在存在的N-聯寡糖（N-聚糖）的類型中是異質的，所以rhGAA由具有N-聚糖的蛋白的複雜混合物組成，該等N-聚糖對M6P受體和其他碳水化合物受體具有不同結合親和力。包含具有一個M6P基團（單-M6P）的高甘露糖N-聚糖的rhGAA以低（約6,000 nM）親和力結合至CIMPR，而在相同N-聚糖上包含兩個M6P基團（雙-M6P）的rhGAA以高（約2 nM）親和力來結合。非磷酸化的、單-M6P和雙-M6P聚糖的代表性結構如圖1A所示。甘露糖-6-P基團如圖1B所示。一旦在溶酶體內，rhGAA可以酶促降解積累的肝醣。然而，常規rhGAA具有低總水平的帶有M6P和雙-M6P的聚糖，並且因此靶向肌細胞很差，導致rhGAA至溶酶體的較差遞送。rhGAA的生產性藥物靶向如圖2A所示。該等常規產品中的大多數rhGAA分子不具有磷酸化的N-聚糖，從而缺乏對CIMPR的親和力。非磷酸化的高甘露糖聚糖亦可以被甘露糖受體清除，該甘露糖受體導致ERT的非生產性清除（圖2B）。

包含半乳糖和唾液酸的其他類型的N-聚糖、複合碳水化合物，也存在於rhGAA上。由於複合N-聚糖沒有被磷酸化，所以它們對CIMPR沒有親和力。然而，具有暴露的半乳糖殘基的複合型N-聚糖對肝臟肝細胞上的脫唾液酸糖蛋白受體具有中度至高度親和力，此導致rhGAA的快速非生產性清除（圖2B）。

在至少一個實施例中，該酸性α-葡萄糖苷酶係本文稱為ATB200的重組人酸性α-葡萄糖苷酶，如在共同未決的國際專利申請案PCT/US 2015/053252中描述。ATB200已經展示以高親和力結合陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）（K_D 約2-4 nM），並且由龐貝氏成纖維細胞和骨骼肌成肌細胞（K _攝取 約7 nM-14 nM）有效內化。ATB200在體內表徵，並且展示具有比阿葡萄糖苷酶α（t_1/2 約60 min）更短的表觀血漿半衰期（t_1/2 約45 min）。

在一個或多個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶具有如在SEQ ID NO: 2中所示的野生型GAA胺基酸序列，該胺基酸序列對應於胺基酸殘基57-952，並且與去除包括信號肽和先質肽的初始56個殘基的天然細胞內蛋白酶解加工後的野生型(WT)人GAA一致。已經藉由胰蛋白酶消化，隨後進行液相層析/質譜，以及藉由胺基酸測序來證實ATB200胺基酸序列。相比之下，護理rhGAA酶替代療法（ERT）（包含阿葡萄糖苷酶α的可商購的產品在大多數國家係Myozyme®，並且在美國係Lumizyme®，健贊公司，賽諾菲公司（Sanofi Company））的現行標準不同於WT GAA並且包含3個胺基酸殘基的取代：在位置199處組胺酸變為精胺酸、在位置223處精胺酸變為組胺酸以及在位置780處纈胺酸變為異白胺酸。

在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶在蛋白質的一個或多個胺基酸殘基處經歷翻譯後修飾和/或化學修飾。例如，甲硫胺酸和色胺酸殘基可以經歷氧化反應。作為另一個實例，天冬醯胺殘基可以經歷脫醯胺作用以形成天冬胺酸。作為又另一個實例，天冬胺酸可以經歷異構化作用以形成異天冬胺酸。因此，在一些實施例中，該酶初始表現為具有如在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列，並且該酶經歷該等翻譯後修飾和/或化學修飾中的一個或多個。此類修飾也在本揭露的範疇內。

在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶具有如在SEQ ID NO: 1中所示的野生型GAA胺基酸序列，如在美國專利案第8,592,362號中所描述的，並且具有基因庫登錄號AHE24104.1（GI:568760974）。在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶係葡萄糖苷酶α，此係由最主要的九個觀察到的GAA 基因的單倍型編碼的人酸性α-葡萄糖苷酶。

在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶初始表現為具有在如SEQ ID NO: 1中所示的野生型GAA的全長952胺基酸序列，並且該重組人酸性α-葡萄糖苷酶經歷去除一部分胺基酸，例如，前56個胺基酸的細胞內加工。因此，由宿主細胞分泌的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶可以具有比在細胞內初始表現的重組人酸性α-葡萄糖苷酶更短的胺基酸序列。在至少一個實施例中，該更短的蛋白質可以具有在SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO: 1不同僅在於已經去除了包括信號肽和先質肽的前56個胺基酸，因此產生具有896個胺基酸的蛋白質。胺基酸數目的其他變化也是可能的，如相對由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2描述的胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。在一些實施例中，該rhGAA產物包括具有不同胺基酸長度的重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子的混合物。

在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶在蛋白質的一個或多個胺基酸殘基處經歷翻譯後修飾和/或化學修飾。例如，甲硫胺酸和色胺酸殘基可以經歷氧化反應。作為另一個實例，N-末端麩醯胺酸可以形成焦麩胺酸。作為另一個實例，天冬醯胺殘基可以經歷脫醯胺作用以形成天冬胺酸。作為又另一個實例，天冬胺酸殘基可以經歷異構化作用以形成異天冬胺酸。作為又另一個實例，蛋白質中未配對的半胱胺酸殘基可以與游離麩胱甘肽和/或半胱胺酸形成二硫鍵。因此，在一些實施例中，該酶初始表現為具有如在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列，並且該酶經歷一個或多個該等翻譯後修飾和/或化學修飾。此類修飾也在本揭露的範疇內。

較佳的是，不多於70%、65%、60%、55%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%的總重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子缺少帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元，或缺少結合陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）的能力。可替代地，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、＜100%或更多的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子包括帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的至少一個N-聚糖單元，或具有結合CIMPR的能力。

該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在它們的聚糖上可以具有1、2、3或4個甘露糖-6-磷酸（M6P）基團。例如，在重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子上的唯一一個N-聚糖可以帶有M6P（單-磷酸化的），單個N-聚糖可以帶有兩個M6P基團（雙-磷酸化的），或相同的重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子上的兩個不同的N-聚糖可以各自帶有單個M6P基團。重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子亦可以具有不帶有M6P基團的N-聚糖。在另一個實施例中，平均來說，N-聚糖包含大於3 mol/mol的M6P和大於4 mol/mol的唾液酸，以使得該重組人酸性α-葡萄糖苷酶包括平均至少3莫耳的甘露糖-6-磷酸殘基/莫耳的重組人酸性α-葡萄糖苷酶，以及至少4莫耳的唾液酸/莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶。平均來說，在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上的至少約3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%的總聚糖可以處於單-M6P聚糖形式，例如，約6.25%的總聚糖可以攜帶單個M6P基團，並且平均來說，在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上的總聚糖的至少約0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%係處於雙-M6P聚糖形式，並且平均來說，少於25%的總重組人酸性α-葡萄糖苷酶不包含結合CIMPR的經磷酸化的聚糖。

該重組人酸性α-葡萄糖苷酶可以具有平均含量的攜帶M6P的N聚糖，該平均含量範圍從0.5至7.0 mol/mol重組人酸性α-葡萄糖苷酶，或子範圍的任意中間值，該子範圍包括0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0 mol/mol重組人酸性α-葡萄糖苷酶。可以將該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分級以提供以不同平均數量帶有M6P或帶有雙M6P的聚糖的重組人酸性α-葡萄糖苷酶製劑，從而藉由選擇特定級分或藉由選擇性組合不同級分以允許進一步定製靶向在目標群組織中的溶酶體的重組人酸性α-葡萄糖苷酶。

在一些實施例中，平均來說，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶將帶有每莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶中2.0至8.0莫耳的M6P。此範圍包括所有的中間值和子範圍，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0 mol M6P/mol重組人酸性α-葡萄糖苷酶。

在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上高達60%的N-聚糖可以被完全地唾液酸化，例如，高達10%、20%、30%、40%、50%或60%的N-聚糖可以被完全地唾液酸化。在一些實施例中，從4%至20%的總N-聚糖被完全地唾液酸化。在其他實施例中，在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上不多於5%、10%、20%或30%的N-聚糖攜帶唾液酸和末端半乳糖殘基（Gal）。此範圍包括所有的中間值和子範圍，例如，在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上7%至30%的總N-聚糖可以攜帶唾液酸和末端半乳糖。在又其他實施例中，在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上不多於5%、10%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的N-聚糖僅具有末端半乳糖，並且不包含唾液酸。此範圍包括所有的中間值和子範圍，例如，在組成物中重組人酸性α-葡萄糖苷酶上從8%至19%的總N-聚糖可以僅具有末端半乳糖，並且不包含唾液酸。

在本發明的其他實施例中，在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上的40%、45%、50%、55%至60%的總N-聚糖係複合物型N-聚糖；或重組人酸性α-葡萄糖苷酶上不多於1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的總N-聚糖係混合型N-聚糖；在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上不多於5%、10%或15%的高甘露糖型N-聚糖係非-磷酸化的；在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上至少5%或10%的高甘露糖型N-聚糖係單-M6P磷酸化的；和/或在重組人酸性α-葡萄糖苷酶上至少1%或2%的高甘露糖型N-聚糖係雙-M6P磷酸化的。該等值包括所有的中間值和子範圍。重組人酸性α-葡萄糖苷酶可以滿足上述描述的一個或多個含量範圍。

在一些實施例中，平均來說，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶將帶有2.0至8.0莫耳的唾液酸殘基/莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶。此範圍包括所有的中間值和子範圍，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0 mol殘基/mol重組人酸性α-葡萄糖苷酶。不受理論的約束，據信帶有唾液酸殘基的N-聚糖單元的存在可以藉由脫唾液酸蛋白受體來防止重組人酸性α-葡萄糖苷酶的非生產性清除。

在一個或多個實施例中，在重組人溶酶體蛋白質的某些N-糖基化位點處該rhGAA具有M6P和/或唾液酸單元。例如，在rhGAA上存在七個潛在的N-聯糖基化位點。該等潛在的糖基化位點在SEQ ID NO: 2的以下位置處：N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869。相似地，對於SEQ ID NO: 1的全長胺基酸序列，該等潛在的糖基化位點係在以下位置處：N140、N233、N390、N470、N652、N882和N925。取決於天冬醯胺殘基的位置，rhGAA的其他變體可以具有相似的糖基化位點。通常，除了X不能是HIS或PRO以外，在蛋白質胺基酸序列中的ASN-X-SER或ASN-X-THR序列指示潛在的糖基化位點。

在不同的實施例中，該rhGAA具有某一N-糖基化圖。在一個或多個實施例中，在第一N-糖基化位點處至少20%的該rhGAA係經磷酸化的（例如，SEQ ID NO: 2的N84以及SEQ ID NO: 1的N140）。例如，在第一N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施例中，在第一N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施例中，在第一N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。

在一個或多個實施例中，在第二N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N177，以及SEQ ID NO: 1的N223），至少20%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，在第二N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施例中，在第二N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施例中，在第二N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。在一個或多個實施例中，在第三N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N334，以及SEQ ID NO: 1的N390）至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施例中，在第三N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係磷酸化的。例如，該第三N-糖基化位點可以具有作為主要種類的非-磷酸化的高甘露糖聚糖、二-、三-和四-觸角複合物聚糖，以及混合聚糖的混合物。在一些實施例中，在第三N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施例中，在第四N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N414，以及SEQ ID NO: 1的N470），至少20%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，在第四N-糖基化位點處，至少20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA可以被磷酸化。此種磷酸化作用可以是單-M6P和/或雙-M6P單元的結果。在一些實施例中，在第四N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有單-M6P單元。在一些實施例中，在第四N-糖基化位點處，至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA帶有雙-M6P單元。在一些實施例中，在第四N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施例中，在第五N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N596，以及SEQ ID NO: 1的N692），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施例中，在第五N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，該第五N-糖基化位點可以具有作為主要種類的岩藻糖化的二-觸角複合聚糖。在一些實施例中，在第五N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施例中，在第六N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N826，以及SEQ ID NO: 1的N882），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施例中，在第六N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。例如，該第六N-糖基化位點可以具有作為主要種類的二-、三-和四-觸角複合聚糖的混合物。在一些實施例中，在第六N-糖基化位點處，至少3%、5%、8%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的該rhGAA係經唾液酸化的。

在一個或多個實施例中，在第七N-糖基化位點處（例如，SEQ ID NO: 2的N869，以及SEQ ID NO: 1的N925），至少5%的該rhGAA係經磷酸化的。在其他實施例中，在第七N-糖基化位點處，少於5%、10%、15%、20%或25%的該rhGAA係經磷酸化的。在一些實施例中，在第七N-糖基化位點處，少於40%、45%、50%、55%、60%或65%的該rhGAA具有任何聚糖。在一些實施例中，在第七N-糖基化位點處，至少30%、35%或40%的該rhGAA具有一個聚糖。

在各種實施例中，該rhGAA具有平均0-5 mol的海藻糖含量/mol的rhGAA、10-30 mol的GlcNAc含量/mol的rhGAA、5-20 mol的半乳糖含量/mol的rhGAA、10-40 mol的甘露糖含量/mol的rhGAA、2-8 mol的M6P含量/mol的rhGAA以及2-8 mol的唾液酸含量/mol的rhGAA。在各種實施例中，該rhGAA具有平均2-3 mol的海藻糖含量/mol的rhGAA、20-25 mol的GlcNAc含量/mol的rhGAA、8-12 mol的半乳糖含量/mol的rhGAA、22-27 mol的甘露糖含量/mol的rhGAA、3-5 mol的M6P含量/mol的rhGAA以及4-7 mol的唾液酸含量/mol的rhGAA。

該重組人酸性α-葡萄糖苷酶較佳的是由中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，如CHO細胞系GA-ATB200或ATB200-001-X5-14，或由此類CHO細胞培養物的次代培養物或衍生物產生。表現酸性α-葡萄糖苷酶的等位變體或其他變體酸性α-葡萄糖苷酶胺基酸序列（如與SEQ ID NO: 1具有至少90%、95%或99%一致性的彼等）的DNA構建體可以在CHO細胞中構建並表現。該等變體酸性α-葡萄糖苷酶胺基酸序列相對SEQ ID NO: 1可以包含缺失、取代和/或插入，如對於由SEQ ID NO: 1描述的胺基酸序列具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個缺失、取代和/或插入。熟習該項技術者可以選擇適合於轉化CHO細胞用於產生此類DNA構建體的替代載體。

可以使用不同比對演算法和/或程式來計算兩個序列之間的一致性，包括可用作GCG序列分析包（威斯康辛大學，麥迪森市，威斯康辛州）的一部分的FASTA或BLAST，並且可以與例如，默認設置一起使用。例如，考慮與本文所述的特定多肽具有至少90%、95%或99%一致性，並且較佳的是表現出實質相同功能的多肽，連同編碼此類多肽的多核苷酸。除非另有說明，相似性分數將基於BLOSUM62的使用。當使用BLASTP時，相似性百分比係基於BLASTP陽性得分，並且序列一致性百分比係基於BLASTP一致性得分。BLASTP「一致性」展示相同的高分序列對中總殘基的數量和分數；並且BLASTP「陽性」展示具有正值的比對分數並且彼此相似的殘基的數量和分數。本揭露考慮和涵蓋具有與本文揭露的胺基酸序列具有該等程度的一致性或相似性或任何中間程度的一致性或相似性的胺基酸序列。使用遺傳密碼推導出的相似多肽的多核苷酸序列，並且可以藉由常規手段（具體地藉由使用遺傳密碼來逆轉錄其胺基酸序列）獲得。

在一些實施例中，可以使用中國倉鼠卵巢（CHO）細胞產生重組人酸性α-葡萄糖苷酶，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶具有靶向陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）和細胞溶酶體的優異能力，連同降低其體內非生產性清除的糖基化模式。可以誘導該等細胞表現比常規重組人酸性α-葡萄糖苷酶產物（如阿葡萄糖苷酶α）具有顯著更高水平的帶有一個或多個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的重組人酸性α-葡萄糖苷酶。由該等細胞產生的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶，例如，由ATB200例證的，比常規的酸性α-葡萄糖苷酶（例如Lumizyme®），具有顯著更多的肌細胞靶向的甘露糖-6-磷酸鹽（M6P）和雙-甘露糖-6-磷酸鹽N-聚糖殘基。不受理論的約束，據信此種廣泛的糖基化允許ATB200酶被更有效地吸收到靶細胞中，並且因此比其他重組人酸性α-葡萄糖苷酶（例如像，具有遠遠更低的M6P和雙-M6P含量的阿葡萄糖苷酶α）更有效地從循環中清除。已經展示ATB200有效地結合CIMPR，並且被骨骼肌和心肌有效吸收，並且具有提供有利的藥代動力學曲線並且減少體內非生產性清除的糖基化模式。

相比例如阿葡萄糖苷酶α，亦考慮ATB200的大量糖基化可以有助於ATB200免疫原性的降低。如熟習該項技術者將理解的，用保守的哺乳動物糖對蛋白質的糖基化通常增強產物溶解度，並且減少產物的聚集和免疫原性。糖基化藉由最小化蛋白質聚集連同藉由從免疫系統中遮罩免疫原性蛋白質表位來間接改變蛋白質免疫原性（工業指導-治療性蛋白質產品的免疫原性評估（Guidance for Industry-Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products），美國衛生和人類服務部，食品與藥品管理局，藥物評估和研究中心，生物製劑評估和研究中心，2014年8月）。因此，在至少一個實施例中，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶的投予不會引起抗藥物抗體。在至少一個實施例中，相比藉由投予阿葡萄糖苷酶α(alglucosidase alfa)引起的抗藥物抗體的水平，該重組人酸性α-葡萄糖苷酶的投予引起受試者中抗藥物抗體的更低發生率。

如在共同未決的國際專利申請案PCT/US 2015/053252中所述，可以使用細胞（如，CHO細胞）來產生其中所述的rhGAA，並且該rhGAA可以用於本發明。此類CHO細胞系的實例係產生如本文所述的rhGAA組成物的GA-ATB200或ATB200-001-X5-14，或其次代培養物。此類CHO細胞系可以包含編碼GAA的多核苷酸的基因的多個拷貝，如5、10、15或20或更多個拷貝。

該高M6P和雙-M6P rhGAA（如ATB200 rhGAA）可以藉由用編碼GAA的DNA構建體轉化CHO細胞來產生。儘管CHO細胞之前被用於製備rhGAA，但是沒有意識到轉化的CHO細胞可以按產生具有高含量的靶向CIMPR的M6P和雙-M6P聚糖的rhGAA的方式進行培養和選擇。

出人意料地，發現可以轉化CHO細胞系，選擇產生rhGAA的轉化體，該rhGAA包含高含量的帶有靶向CIMPR的M6P或雙-M6P的聚糖，並穩定表現該高-M6P rhGAA。因此，用於製備該等CHO細胞系的方法亦描述在共同未決的國際專利申請PCT/US 2015/053252中。該方法涉及用編碼GAA或GAA變體的DNA轉化CHO細胞，選擇將編碼GAA的DNA穩定整合到其染色體中並穩定表現GAA的CHO細胞，並且選擇表現具有高含量的帶有M6P或雙-M6P的聚糖的GAA的CHO細胞，以及視情況選擇具有含高唾液酸含量的N-聚糖和/或具有含低非磷酸化的高甘露糖含量的N-聚糖的CHO細胞。藉由培養該CHO細胞系，並且從CHO細胞培養物中回收所述的組成物，該等CHO細胞系可以用於產生rhGAA和rhGAA組成物。

在一個或多個實施例中，該ATB200以從約5 mg/mL至約50 mg/mL的範圍的量存在。在另外的實施例中，該ATB200在以從約5 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL或12 mg/mL至約18 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL或50 mg/mL的範圍的量存在。在一些實施例中，該ATB200以約5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL、9 mg/mL、10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL、15 mg/mL、16 mg/mL、17 mg/mL、18 mg/mL、19 mg/mL、20 mg/mL、21 mg/mL、22 mg/mL、23 mg/mL、24 mg/mL、25 mg/mL、26 mg/mL、27 mg/mL、28 mg/mL、29 mg/mL或30 mg/mL的量存在。在另外的實施例中，該ATB200以約15 mg/mL的量存在。 pH和緩衝液

該調配物的pH可以在從約5.0至約7.0或約5.0至約6.0的範圍內。在一個或多個實施例中，pH在從約5.5至約6.0的範圍內。在一些實施例中，該調配物具有約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5的pH。通常，所述組分的量將產生在從約5.0至約6.0範圍內的pH。然而，可以藉由使用pH調節劑（亦即，鹼化劑和酸化劑），如，氫氧化鈉和/或鹽酸，將pH調節至目標pH。

該調配物亦包括選自下組的緩衝液，該組由以下各項組成：檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合。如本文中所使用，「緩衝液」係指包含幫助防止pH變化的弱酸和其共軛鹼的緩衝溶液。該檸檬酸鹽和/或磷酸鹽可以是檸檬酸鈉或磷酸鈉。其他鹽包括鉀和銨鹽。在一個或多個實施例中，該緩衝液包括檸檬酸鹽。在另外的實施例中，該緩衝液包括檸檬酸鈉（例如，脫水檸檬酸鈉和檸檬酸單水合物的混合物）。在一個或多個實施例中，包括檸檬酸鹽的緩衝溶液可以包括檸檬酸鈉和檸檬酸。在一些實施例中，檸檬酸鹽和磷酸鹽緩衝液二者均存在。賦形劑

該調配物亦包括至少一種賦形劑。本發明的一些實施例包括有助於張力，充當膨脹劑或充當穩定劑的賦形劑。在一個或多個實施例中，至少一種賦形劑選自下組，該組由以下各項組成：甘露醇、聚山梨醇酯及其組合。

在一個或多個實施例中，該賦形劑包括可以充當張力調節劑和/或膨脹劑的成分，特別是甘露醇。張力劑係幫助保證該調配物具有與人血相似或相同的滲透壓的組分。膨脹劑係增加該等調配物（例如，凍乾的）的質量，並且為該塊狀物提供足夠結構的成分。

在一個或多個實施例中，張力劑和/或膨脹劑的總量在從約10 mg/mL至約50 mg/mL的量的範圍內。在另外的實施例中，張力劑和/或膨脹劑的總量在從約10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL或15 mg/mL至約16 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL或50 mg/mL的量的範圍內。在一些實施例中，該張力劑和/或膨脹劑包括甘露醇。在一個或多個實施例中，甘露醇以從約10 mg/mL至約50 mg/mL的量存在。在另外的實施例中，甘露醇以從約10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL或15 mg/mL至約16 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL或50 mg/mL的量存在。在又一另外的實施例中，甘露醇以約10 mg/mL、11 mg/mL、12 mg/mL、13 mg/mL、14 mg/mL、15 mg/mL、16 mg/mL、17 mg/mL、18 mg/mL、19 mg/mL或20 mg/mL的量存在。在一些實施例中，甘露醇係唯一的張力劑和/或膨脹劑。其他張力劑和/或膨脹劑的實例包括氯化鈉、蔗糖和海藻糖。

在一些實施例中，賦形劑包括可以充當穩定劑（如聚山梨醇酯80）的成分。穩定劑係可以防止或最小化在疏水的空氣-水的界面表面的聚集體形成的化合物。在一些實施例中，穩定劑係表面活性劑。在一個或多個實施例中，穩定劑的總量在從約0.1 mg/mL至約1.0 mg/mL的範圍內。在另外的實施例中，穩定劑的總量在從約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL或0.5 mg/mL至約0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL或1.0 mg/mL的範圍內。在又一另外的實施例中，穩定劑的總量係約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL或1.0 mg/mL。在一些實施例中，聚山梨醇酯80係唯一的穩定劑。因此，在一個或多個實施例中，聚山梨醇酯80在從約0.1 mg/mL至約1.0 mg/mL的範圍內。在另外的實施例中，聚山梨醇酯80在從約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL或0.5 mg/mL至約0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL或1.0 mg/mL的範圍內。在又一另外的實施例中，聚山梨醇酯80係約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL或1.0 mg/mL。

在一個或多個實施例中，可能希望從該調配物中排除某些化合物。例如，在製備用於治療給定疾病的調配物時，將希望排除會加重基礎性疾病的某些化合物。如上述所論述的，患有龐貝氏病的個體具有降低的分解肝醣的能力或缺乏分解肝醣的能力。若干通常使用的賦形劑，如蔗糖、海藻糖和甘胺酸，可以轉變為身體中的葡萄糖，該等葡萄糖反過來加重龐貝氏病。因此，在一些實施例中，從該調配物中排除蔗糖、海藻糖和/或甘胺酸。類似地，可以排除在給定的某些背景中不是最適合於該調配物的某些組分。例如，在一些實施例中，可以排除泊洛沙姆。示例性實施例

在一個或多個實施例中，該調配物包括以下各項或基本上由其組成： (a) ATB200（例如，一種重組酸性α-葡萄糖苷酶，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該重組酸性α-葡萄糖苷酶包括增加的含量的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元）； (b) 至少一種選自下組的緩衝液，該組由以下各項組成：檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合； (c) 至少一種選自下組的賦形劑，該組由以下各項組成：甘露醇、聚山梨醇酯80及其組合；和其中該調配物具有從約5.0至約6.0或7.0的pH。

在一些實施例中，該調配物包括以下各項或基本上由其組成： (a) ATB200（例如，一種重組酸性α-葡萄糖苷酶，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該重組酸性α-葡萄糖苷酶包括增加的含量的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元）； (b1) 檸檬酸鈉； (b2) 檸檬酸單水合物； (c1) 甘露醇； (c2) 聚山梨醇酯80； (d) 水； (e) 視情況，一酸化劑；以及 (f) 視情況，一鹼化劑，其中該調配物具有從約5.0至約6.0或7.0的pH。在另外的實施例中，該pH在從約5.5至約6.0的範圍內。在又一另外的實施例中，pH係約6.0。

在具體的實施例中，該調配物包括 (a) ATB200（例如，一種重組酸性α-葡萄糖苷酶，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該重組酸性α-葡萄糖苷酶包括增加的含量的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元），以約5 mg/mL-30 mg/mL或約15 mg/mL的濃度存在； (b) 檸檬酸鈉緩衝液，以約10 mM-100 mM或約25 mM的濃度存在； (c1) 甘露醇，以約10 mg/mL-50 mg/mL或約20 mg/mL的濃度存在； (c2) 聚山梨醇酯80，以約0.1 mg/mL-1 mg/mL或約0.5 mg/mL的濃度存在；和 (d) 水； (e) 視情況，一酸化劑；以及 (f) 視情況，一鹼化劑，其中該調配物具有從約5.0至約6.0或7.0的pH。在另外的實施例中，該pH在從約5.5至約6.0的範圍內。在又一另外的實施例中，pH係約6.0。調配物的製備

本發明的另一態樣涉及製備本文所述的該等調配物的方法。在一個或多個實施例中，該調配物可以從酶溶液中製備。使用本領域已知的方法可以將該溶液濃縮，並可以根據需要將緩衝液更換為目標濃度和多種緩衝液。隨後可以添加另外的組分（例如，賦形劑和pH調節劑）。隨後可以過濾該調配物，並且置於儲存容器中並且儲存。

在一個或多個實施例中，製備本文所述的該等藥物調配物中的任一項的方法包括：向水中添加至少一種緩衝液、至少一種賦形劑和重組酸性α-葡萄糖苷酶以提供一溶液；視情況調節該溶液的pH；並且視情況向該溶液中添加額外的水。在另外的實施例中，該方法進一步包括對該溶液進行過濾。在又一另外的實施例中，該方法進一步對該溶液進行儲存。

用於生產如本文所述的調配物的示例性、非限制性的方法如下： 1. 在合適的製造容器中添加大約85%-90%的批量體積的注射用水。 2. 添加並且溶解所期望的賦形劑和緩衝液（例如，檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸單水合物、聚山梨醇酯80、甘露醇），並且將其混合直到溶解。 3. 添加ATB200藥品，並且混合。 4. 用調節劑（例如，鹽酸或氫氧化鈉溶液）根據需要將pH調節至目標pH（例如，6±0.1）。 5. 將足夠的注射用水添加至最終體積，並且混合。 6. 經由無菌濾器過濾該溶液至無菌接收器中。 7. 將藥物產品溶液無菌地裝入小瓶中，並且插入塞子。 8. 將所有小瓶蓋帽，並且在2°C-8°C下儲存。

在一個或多個實施例中，事先製備的該調配物將處於液體形式。亦即，該調配物包括水。該液體調配物可以經受凍乾（冷凍乾燥）過程，以提供塊狀物或粉末。因此，本發明的另一態樣涉及凍乾後的、包括以上所述的該等調配物中任一項的藥物組成物。該凍乾的混合物可以包括ATB200，緩衝液（選自下組，該組由以下各項組成：檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合），和至少一種賦形劑（選自下組，該組由以下各項組成：海藻糖、甘露醇、聚山梨醇酯80及其組合）。在一些實施例中，可以向該凍乾的混合物中添加其他成分（例如，其他賦形劑）。包括該凍乾調配物的藥物組成物能以小瓶提供，隨後可以將該藥物組成物儲存、轉運、重構和/或投予患者。治療和投予患者的方法

本發明的另一態樣涉及治療龐貝氏病的方法和/或用於治療龐貝氏病的本文所述的該等調配物之用途。該調配物可以按事先製備的或按凍乾和重構後投予。因此，在一個或多個實施例中，該方法包括向對其有需要的患者投予以上所述的該等藥物調配物中的任一項。在其他實施例中，該方法包括重構經凍乾的藥物組成物，並且將經重構的藥物組成物投予對其有需要的患者。在一些實施例中，該經重構的藥物組成物與凍乾之前和/或事先製備的藥物調配物具有相似或相同的組成。在任一情況下，在投予患者之前可以將該藥物調配物或經重構的藥物組成物稀釋。在另外的實施例中，將該藥物調配物或經重構的藥物組成物經靜脈內投予。

在一個或多個實施例中，用於靜脈內投予的組成物係在無菌等滲水緩衝液中的溶液。必要時，該組成物亦可以包括增溶劑和局部麻醉劑以緩解注射部位的疼痛。通常，成分以單位劑量形式分開或混合在一起提供，例如，作為在氣密容器中的乾燥凍乾粉或無水濃縮物，氣密容器如指明活性劑的量的安瓿或小藥囊。在藉由輸注投予組成物時，可以用包含無菌藥用級的水、鹽水或右旋糖/水的輸液瓶進行分配。在藉由注射投予組成物時，可以提供無菌注射用水或鹽水的安瓿，使得可以在投予前將該等成分混合。

在其他實施例中，藉由直接投予至靶組織（如至心臟或骨骼肌（例如，肌內））或神經系統（例如，直接注射到腦中；腦室內；鞘內）來投予藥物調配物或經重構的藥物組成物。若需要，可以同時使用多於一個途徑。

將該藥物調配物或經重構的組成物以治療有效量投予（例如，當以規律間隔投予時，足以治療疾病的劑量，如藉由減輕與疾病相關的症狀，預防或延遲疾病的發病，和/或減輕疾病的症狀的嚴重性或頻率實現的）。在治療疾病中治療有效的量將取決於疾病影響的性質和程度，並且可以藉由標準臨床技術來確定。另外，可以視情況採用體外或體內測定來幫助鑒定最佳劑量範圍。在至少一個實施例中，將該重組人酸性α葡萄糖苷酶以約1 mg/kg至約100 mg/kg，如約5 mg/kg至約30 mg/kg，典型地約5 mg/kg至約20 mg/kg的劑量藉由靜脈內輸注投予。在至少一個實施例中，將該重組人酸性α-葡萄糖苷酶以約5 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg或約100 mg/kg的劑量藉由靜脈內輸注投予。在至少一個實施例中，將該重組人酸性α-葡萄糖苷酶以約20 mg/kg的劑量藉由靜脈內輸注投予。對具體個體的有效劑量可以是隨著時間變化的（例如，增加的或減少的），此取決於該個體的需要。例如，在生理疾病或軀體應激的時候，或若抗-酸性α-葡萄糖苷酶抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，該量可以增加。

以規律的間隔投予重組人酸性α-葡萄糖苷酶（或包含重組人酸性α-葡萄糖苷酶的組成物或藥物）的治療有效量，取決於疾病影響的性質和程度，以及持續進行的基礎。如本文中所使用，以「規律的間隔」投予表示，將該治療有效量定期地投予（如區別於一次性劑量）。該間隔可以藉由標準臨床技術來確定。在較佳的實施例中，將重組人酸性α-葡萄糖苷酶以每月、每兩個月；每週；每週兩次；或每日投予。單個個體的投予間隔不需要係固定的間隔，但是可以是隨時間變化的，其取決於該個體的需要。例如，在生理疾病或軀體應激的時候，若抗-重組人酸性α-葡萄糖苷酶抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，可以減小劑量之間的間隔。

在一個或多個實施例中，將該藥物調配物或經重構的組成物與藥物伴護蛋白共同投予，如口服投予該伴護蛋白並且靜脈內投予該藥物調配物或經重構的組成物。在各種實施例中，該藥物伴護蛋白係麥格司他。在至少一個實施例中，將麥格司他以約200 mg至約400 mg的口服劑量，或以約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg或約400 mg的口服劑量投予。在至少一個實施例中，將麥格司他以約233 mg至約400 mg的口服劑量投予。在至少一個實施例中，將麥格司他以約250 mg至約270 mg的口服劑量，或以約250 mg、約255 mg、約260 mg、約265 mg或約270 mg的口服劑量投予。在至少一個實施例中，將麥格司他以約260 mg的口服劑量投予。

在至少一個實施例中，將麥格司他和該重組人酸性α-葡萄糖苷酶同時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他和該重組人酸性α-葡萄糖苷酶順序投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前少於三小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約兩小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前少於兩小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約1.5小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約一小時投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約50分鐘至約70分鐘投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約55分鐘至約65分鐘投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約30分鐘投予在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約25分鐘至約35分鐘投予。在至少一個實施例中，將麥格司他在該重組人酸性α-葡萄糖苷酶投予之前約27分鐘至約33分鐘投予。套組

本發明的另一態樣涉及包括本文所述的該等藥物調配物（包括凍乾後的）的套組（kit）。在一個或多個實施例中，該套組包括含有該等藥物調配物（凍乾之前或之後）的容器（例如，小瓶、管子、袋子等）以及重構、稀釋和投予的說明書。實例酶實例1：現有MYOZYME®和LUMIZYME® rhGAA產品的局限性

為了評估rhGAA在Myozyme®和Lumizyme®（目前僅有的針對龐貝氏病的批准的治療）中的能力，將該等rhGAA製劑注射到CIMPR柱（其結合具有M6P基團的rhGAA）上，並且隨後用游離M6梯度進行洗提。將級分在96孔板中收集，並且藉由4MU-α-葡萄糖底物測定GAA活性。結合和未結合的rhGAA的相對量係基於GAA活性來確定的，並且報告為總酶的分數。

圖3A至圖3B圖示了與常規的ERT（Myozyme®和Lumizyme®）相關的問題：在Myozyme®中73%的rhGAA（圖3B）和在Lumizyme®中78%的rhGAA（圖3A）未結合至CIMPR，參見在每個圖中最左側的峰。只有在Myozyme®中27%的rhGAA和在Lumizyme®中的22%的rhGAA包含M6P，該M6P可以有效地將它靶向至肌細胞上的CIMPR。

Myozyme®和Lumizyme®的有效劑量對應於包含M6P的rhGAA的量，該M6P靶向肌細胞上的CIMPR。然而，在此兩種常規的產品中大部分的rhGAA不靶向目標肌細胞上的CIMPR受體。投予常規rhGAA（其中大部分的rhGAA不靶向肌肉細胞）增加了對非靶向rhGAA的過敏反應或誘導免疫的風險。酶實例2：產生具有高含量的帶有單-或雙-M6P的N-聚糖的ATB200 rhGAA的CHO細胞的製備

用表現rhGAA的DNA轉染CHO細胞，隨後選擇產生rhGAA的轉化體。用於用編碼rhGAA的DNA轉化CHO細胞的DNA構建體在圖4中圖示。用表現rhGAA的DNA轉染CHO細胞，隨後選擇產生rhGAA的轉化體。

轉染後，用缺乏次黃嘌呤/胸苷（-HT）的介質來選擇包含穩定整合的GAA基因的DG44 CHO（DHFR-）細胞。

藉由甲胺喋呤處理（MTX，500 nM）來誘導在該等細胞中的GAA表現的擴增。藉由GAA酶活性測定來鑒定大量表現的GAA的細胞池，並且用於建立產生rhGAA的單個殖株。在半固體培養基板上產生單個殖株，藉由ClonePix系統挑選，並且轉移至24深孔板。針對GAA®活性測定單個殖株，以鑒定表現高水平GAA的殖株。用於確定GAA活性的條件培養基使用了4-MU-α-葡萄糖苷酶底物。針對生存力、生長能力、GAA生產率、N-聚糖結構和穩定的蛋白表現來進一步評估如藉由GAA酶測定所量測的產生更高水平的GAA的殖株。使用此程序分離表現具有增強的單-M6P或雙-M6P N-聚糖的rhGAA的CHO細胞系，包括CHO細胞系GA-ATB-200。酶實例3：ATB200 rhGAA的捕獲和純化

在搖瓶中及在灌注生物反應器中使用CHO細胞系GA-ATB-200產生根據本發明所述的多批次的rhGAA，並且量測CIMPR結合。針對來自不同生產批次的經純化的ATB200 rhGAA，觀察到與在圖5B和圖6中所示彼等相似的CIMPR受體結合（約70%），表明可以一致地產生ATB200 rhGAA。如圖3A至圖3B和圖5A至圖5B所示，Myozyme®和Lumizyme® rhGAA比ATB200 rhGAA表現出顯著更少的CIMPR結合。酶實例4：ATB200與LUMIZYME®的分析比較

根據末端磷酸根，使用弱陰離子交換（「WAX」）液相層析，進行ATB200 rhGAA的分級。藉由用增加量的鹽洗提ERT來產生洗提曲線。藉由UV（A280 nm）監測該曲線。從CHO細胞獲得ATB200 rhGAA，並且進行純化。Lumizyme®係自商業來源獲得。Lumizyme®在其洗提曲線的左側顯示出一高峰。ATB200 rhGAA顯示洗提在Lumizyme®右側的四個顯著的峰（圖7）。此證實ATB200 rhGAA被磷酸化到比Lumizyme®更大的程度，因為此種評估係藉由末端電荷而不是CIMPR親和力進行的。酶實例5：ATB200 rhGAA的寡糖特性

藉由MALDI-TOF來評估經純化的ATB200 rhGAA和Lumizyme®聚糖，以確定在每個ERT上發現的單個聚糖結構（圖8）。發現ATB200樣品比Lumizyme®包含更少量的非-磷酸化的高-甘露糖型N-聚糖。ATB200中比Lumizyme®中更高含量的M6P聚糖更有效地將ATB200 rhGAA靶向肌細胞。由MALDI確定的高百分比的單-磷酸化和雙-磷酸化的結構與CIMPR曲線一致，其說明ATB200與CIMPR受體的顯著更大的結合。經由MALDI-TOF質譜的N-聚糖分析證實了平均每個ATB200分子包含至少一個中性的雙-M6P N-聚糖結構。ATB200 rhGAA上的此種更高的雙-M6P N-聚糖含量與M6P受體板結合測定中與CIMPR的高親和力結合直接相關（KD約2-4 nM）（圖10A）。

亦使用兩種不同的LC-MS/MS分析技術，針對位點特異性N-聚糖曲線分析了ATB200 rhGAA。在第一次分析中，在LC-MS/MS分析之前，將該蛋白質變性、還原、烷基化並且消化。蛋白質變性和還原期間，將200 µg的蛋白質樣品、5 μL 1 mol/L tris-HCl（終濃度50 mM）、75 μL 8 mol/L胍HCl（終濃度6 M）、1 μL 0.5 mol/L EDTA（終濃度5 mM）、2 μL 1 mol/L DTT（終濃度20 mM）以及Milli-Q®水添加至1.5 mL試管中，以提供100 µL的總體積。在乾浴中，將該樣品混合，並且在56°C下培養30分鐘。烷基化作用期間，將該變性的和還原的蛋白質樣品與5 μL 1 mol/L碘乙醯胺（IAM，終濃度50 mM）混合，隨後在黑暗中在10°C-30°C下培養30分鐘。烷基化作用之後，將400 μL預冷的丙酮添加至該樣品中，並且將該混合物在-80°C製冷中冷凍4小時。隨後將該樣品以13000 rpm在4°C下離心5 min，並且去除該上清液。將400 μL預冷的丙酮添加至球粒中，隨後將其以13000 rpm在4°C下離心5 min，並且去除該上清液。隨後將該樣品在黑暗中，在冰上風乾以去除丙酮殘餘物。將40 μL的8 M尿素和160 μL的100 mM NH₄ HCO₃ 添加至該樣品中以溶解蛋白質。隨後，在胰蛋白酶消化期間，添加50 μg的該蛋白質使胰蛋白酶消化緩衝液達100 μL終體積，並且添加5 μL 0.5 mg/mL胰蛋白酶（20/1 w/w的蛋白與酶的比率）。將該溶液混合均勻，並且在37°C下培養過夜（16±2小時）。添加2.5 μL 20% TFA（終濃度0.5%）以淬滅該反應。隨後使用賽默科技Orbitrap Velos Pro^TM 質譜儀分析該樣品。

在第二LC-MS/MS分析中，根據相似的變性、還原、烷基化和消化程序來製備ATB200樣品（除了使用碘乙酸（IAA）代替IAM作為烷基化試劑之外），並且隨後使用賽默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM 質譜儀進行分析。

將第一和第二分析的結果在圖9A至圖9H中圖示。在圖9A至圖9H中，第一次分析的結果由左條（深灰色）表示，並且來自第二次分析的結果由右條（淺灰色）表示。在圖9B至圖9G中，代表聚糖的符號命名法係根據瓦爾基A（Varki, A.）、卡明斯，R.D.（Cummings, R.D.）、艾斯克J.D.（Esko J.D.）等人,糖生物學要領（Essentials of Glycobiology ），第2版（2009）。

從圖9A至圖9G可以看出，此兩個分析提供了相似的結果，儘管結果之間存在一些變化。該變化可以歸因於多個因素，包括使用的儀器和N-聚糖分析的完整性。例如，若一些種類的磷酸化的聚糖未被鑒定和/或未被定量，則磷酸化聚糖的總數可能是未被充分表示的，並且在該位點帶有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是未被充分表示的。作為另一個實例，若一些種類的非-磷酸化的聚糖未被鑒定和/或未被定量，則非-磷酸化的聚糖的總數可能是未被充分表示的，並且在該位點帶有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是過度表示的。圖9A圖示了ATB200的N-糖基化位點佔有率。從圖9A可以看出，第一、第二、第三、第四、第五和第六N-糖基化位點大部分被佔據，其中此兩種分析偵測出超過90%且高達約100%的具有在每個潛在位點處偵測到的聚糖的ATB200酶。然而，該第七潛在的N-糖基化位點在大約一半的時間時被糖基化。

圖9B圖示了第一位點N84的N-糖基化圖。從圖9B可以看出，主要的聚糖種類係雙-M6P聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過75%的該ATB200在第一位點處具有雙-M6P聚糖。

圖9C圖示了第二位點N177的N-糖基化圖。從圖9C可以看出，主要的聚糖種類係單-M6P聚糖和非磷酸化高甘露糖聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過40%的該ATB200在第二位點處具有單-M6P聚糖。

圖9D圖示了第三位點N334的N-糖基化圖。從圖9D可以看出，該等主要的聚糖種類係非磷酸化高甘露糖聚糖，二-、三-和四-觸角複合聚糖，以及混合聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過20%的該ATB200在第三位點處具有唾液酸殘基。

圖9E圖示了第四位點N414的N-糖基化圖。從圖9E可以看出，主要的聚糖種類係雙-M6P和單-MGP聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過40%的該ATB200在第四位點處具有雙-M6P聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過25%的該ATB200在第四位點具有單-M6P聚糖。

圖9F圖示了第五位點N596的N-糖基化圖。從圖9F可以看出，主要的聚糖種類係海藻糖化的二-觸角複合聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過70%的該ATB200在第五位點處具有唾液酸殘基。

圖9G圖示了第六位點N826的N-糖基化圖。從圖9G可以看出，主要的聚糖種類係二-、三-和四-觸角複合聚糖。第一和第二分析二者偵測出超過80%的該ATB200在第六位點處具有唾液酸殘基。

在第七位點處，N869的糖基化分析展示了大約40%的糖基化，最常見的聚糖係A4S3S3GF（12%）、A5S3G2F（10%）、A4S2G2F（8%）和A6S3G3F（8%）。

圖9H圖示了在七個潛在的N-糖基化位點中的每個位點處的磷酸化作用的匯總。從圖9G可以看出，第一和第二分析二者偵測出在第一、第二和第四位點處的高磷酸化作用水平。兩個分析偵測出超過80%的該ATB200在第一位點處係單-或二-磷酸化的，超過40%的該ATB200在第二位點處係單-磷酸化的，並且超過80%的該ATB200在第四位點處係單-或二-磷酸化的。

根據親水相互作用液相層析-螢光偵測-質譜（HILIC-FLD-MS）法進行ATB200的另一個聚糖分析。

將HILIC-FLD-MS分析的結果提供於下表A中。在表A中，在三位數中的第一個數表明聚糖中的分支數目，第二個數表明核心海藻糖單元的數目，並且第三個數表明末端唾液酸單元的數目。使用該命名法，「303」代表三-觸角聚糖（第一個3），其具有0個核心海藻糖（第二個0）和3個末端唾液酸（最後一個3）；「212」代表1個二-觸角聚糖，其具有1個核心海藻糖和2個末端唾液酸；「404」代表四-觸角聚糖，其具有0個核心海藻糖和4個末端唾液酸，以此類推。表A

基於該HILIC-FLD-MS分析，預期所測試的ATB200具有平均2 mol-3 mol的海藻糖含量/mol ATB200、20 mol-25 mol的GlcNAc含量/mol ATB200、8 mol-12 mol的半乳糖含量/mol ATB200、22 mol-27 mol的甘露糖含量/mol ATB200、3 mol-5 mol的M6P含量/mol ATB200以及4 mol-7 mol的唾液酸含量/mol ATB200。酶實例6：ATB200的CIMPR親和力的特性

除了具有可以結合至CIMPR的更大百分比的rhGAA之外，重要的是理解該相互作用的質量。使用CIMPR板結合測定來確定Lumizyme®和ATB200 rhGAA受體結合。簡言之，使用CIMPR-包被的板來捕獲GAA。將不同濃度的rhGAA應用於固定的受體，並且洗去未結合的rhGAA。藉由GAA活性來確定剩餘rhGAA的量。如圖10A所示，ATB200 rhGAA比Lumizyme®結合CIMPR顯著更好。

圖10B圖示了根據本發明的Lumizyme®、常規rhGAA和ATB200中的雙-M6P聚糖的相對含量。對於Lumizyme®，平均只有10%的分子具有雙-磷酸化的聚糖。將其與ATB-200（其中平均每個rhGAA分子具有至少一個雙-磷酸化的聚糖）對比。酶實例7：ATB200 rhGAA比LUMIZYME®更有效地被成纖維細胞內化

使用正常的和龐貝氏成纖維細胞細胞系來比較ATB200和Lumizyme® rhGAA的相對細胞攝取。比較涉及5-100 nM的根據本發明的ATB200 rhGAA與10-500 nM常規rhGAA Lumizyme®。16-hr培養之後，用TRIS鹼將外部rhGAA滅活，並且在收穫細胞之前用PBS將細胞洗滌3次。藉由4MU-α-葡萄糖苷水解量測內化的GAA，並且相對於總細胞的蛋白質作圖，並且結果出現在圖11A至圖11B中。

亦展示ATB200 rhGAA有效內化到細胞中（圖11A和圖11B），分別地展示ATB200 rhGAA內化到正常的成纖維細胞和龐貝氏成纖維細胞中，並且其比常規的Lumizyme® rhGAA更大的程度進行內化。ATB200 rhGAA以約20 nM使細胞受體飽和，然而需要約250 nM的Lumizyme®。從該等結果外推的攝取效率常數(K_攝取 )對於ATB200為2-3 nm，並且對於Lumizyme®係56 nM，如圖11C所示。該等結果表明ATB200 rhGAA係針對龐貝氏病的良好靶向的治療。酶實例8：在GAA-基因敲除小鼠中的肝醣減少

圖12A至圖12C圖示了投予阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®）和ATB200對Gaa 基因敲除小鼠中肝醣清除的影響。投予動物兩次IV推注投予（每隔一週）；在最後一次劑量後兩週收穫組織，並且針對酸性α-葡萄糖苷酶活性和肝醣含量進行分析。

從圖12A至圖12C看出，發現ATB200以劑量依賴性方式在酸性α-葡萄糖苷酶（Gaa ）基因敲除小鼠中耗盡組織肝醣。在Gaa 基因敲除小鼠中，20 mg/kg劑量的ATB200一致地去除了比5和10 mg/kg劑量水平更大比例的儲存的肝醣。然而，如在圖12A至圖12C看出，相比以20 mg/kg投予Lumizyme®，以5 mg/kg投予ATB200展示小鼠心臟和骨骼肌（四頭肌和三頭肌）中相似的肝醣減少，然而相比Lumizyme®，以10 mg/kg和20 mg/kg給藥ATB200展示在骨骼肌中顯著更好的肝醣水平減少。

圖15圖示投予阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®）和ATB200對Gaa 基因敲除小鼠中肝醣清除的影響。用Lumizyme®或ATB200，20 mg/kg每隔一週IV注射4次治療十二週齡的GAA KO小鼠。在最後一次酶劑量後14天收集組織用於肝醣量測。圖13圖示在四頭肌和三頭肌骨骼肌中的肝醣的相對減少，相比Lumizyme®，ATB200比Lumizyme®提供更多的肝醣減少。酶實例9：GAA-基因敲除小鼠中的肌肉生理學和形態學

每隔一週以20 mg/kg向Gaa基因敲除小鼠投予兩次重組人酸性α-葡萄糖苷酶（阿葡萄糖苷酶α或ATB200）的IV推注。單獨用運載體治療對照小鼠。重組人酸性α-葡萄糖苷酶的最後一次給藥後兩週，收穫比目魚肌、四頭肌和隔膜組織。分析皮膚和隔膜組織，針對肝醣水平係藉由用高碘酸-希夫試劑（PAS）染色，並且針對溶酶體增殖係藉由量測溶酶體相關膜蛋白（LAMP1）標記物的水平，該標記物在在龐貝氏病中上調。將包埋入環氧樹脂（Epon）的四頭肌的半薄切片用亞甲基藍染色，並且藉由電子顯微鏡（1000x）觀察以確定囊泡存在的程度。用免疫組織化學來分析四頭肌肌肉樣品，以確定自噬標記物微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3磷脂醯乙醇胺共軛物（LC3A II）和p62、胰島素依賴性葡萄糖轉運蛋白GLUT4和胰島素非依賴性葡萄糖轉運蛋白GLUT1的水平。

在類似的研究中，每隔一週以20 mg/kg向Gaa基因敲除小鼠投予四次重組人酸性α-葡萄糖苷酶（阿葡萄糖苷酶α或ATB200）的IV推注。單獨用運載體治療對照小鼠。在重組人酸性α-葡萄糖苷酶最後一次給藥後兩週收穫心肌組織，並且進行分析，針對肝醣水平係藉由用高碘酸-希夫試劑（PAS）染色，並且針對溶酶體增殖係藉由量測LAMP1的水平。

如在圖14看出，相比用阿葡萄糖苷酶α的常規治療，投予ATB200展示心臟、隔膜和骨骼肌（比目魚肌）組織中溶酶體增殖的減少。另外，如在圖15中看出，相比用阿葡萄糖苷酶α的常規治療，投予ATB200展示心臟和骨骼肌（比目魚肌）組織中肝醣水平的點狀降低。

同樣，如在圖16中看出，相比未治療的小鼠和用阿葡萄糖苷酶α治療的小鼠，ATB200顯著降低了Gaa基因敲除小鼠的四頭肌的肌纖維中的囊泡數目。如在圖17看出，相比野生型小鼠，在Gaa敲除小鼠中，LC3 II和p62的水平均增加。另外，相比野生型小鼠，在Gaa基因敲除小鼠中，胰島素依賴性葡萄糖轉運體GLUT4和胰島素非依賴性葡萄糖轉運體GLUT1的水平增加。與酸性α-葡萄糖苷酶缺乏相關的升高的GLUT4和GLUT1水平可以有助於增加的葡萄糖攝取到肌纖維中和增加的基礎的和食物攝取後的肝醣合成。酶實例10：GAA-基因敲除小鼠中的肌肉功能

在12次每兩週投予的長期研究中，如藉由握力測試和線懸掛測試（圖18A至圖18B）所量測的，20 mg/kg ATB200加上10 mg/kg麥格司他從基線逐漸地增加了Gaa KO小鼠的功能性肌肉力量。在大部分的研究中，在相同的條件下，觀察到接受相同ERT劑量（20 mg/kg）的阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®）治療的小鼠下降（圖18A至圖18B）。至於短期研究，在3個月（圖19A至圖19C）和6個月（圖19D至圖19G）的治療後，ATB200/麥格司他比阿葡萄糖苷酶α具有實質更好的肝醣清除率。相比阿葡萄糖苷酶α，在3個月治療後，ATB200/麥格司他亦減少了自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白（dysferlin）的細胞內積累（圖20）。在圖18A中，^* 表示相比單獨Lumizyme®有統計學意義（p＜0.05，兩側t檢驗）。在圖19A至圖19G中，^* 表示相比單獨Lumizyme®有統計學意義（p＜0.05，在單向方差分析下使用鄧尼特（Dunnett）方法的多重比較）。

總之，該等資料表明ATB200/麥格司他有效地靶向肌肉來逆轉細胞功能障礙並且改進肌肉功能。重要的是，在肌肉構造中的明顯改進以及減少的自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白的細胞內積累可以是與功能性肌肉力量改進相關的改進的肌肉生理學的良好替代。該等結果表明，監測自噬和該等關鍵的肌肉蛋白可以是評估Gaa KO小鼠中龐貝氏病的有效性治療性治療的合理、實用的方法，其可以證明係來自臨床研究中肌肉活檢的有用的生物標記物。

圖20圖示在有或沒有麥格司他的情況下，6個月的ATB200投予降低了Gaa KO小鼠中抗肌萎縮蛋白的細胞內積累。與用Lumizyme®相比，ATB200±麥格司他的抗肌萎縮蛋白積累減少更多。調配物實例1：PH和緩衝液調配物實例的分析方法

除非另有說明，否則根據以下方法進行關於外觀、pH、蛋白質濃度等的本文所述的實例的分析。外觀

使用YB-2燈箱，在黑色和白色背景下，檢查樣品的外觀（包括澄清度、顏色和可見顆粒）。 pH

用SevenMulti^TM pH計量測樣品pH。蛋白質濃度

藉由UV280讀數，使用NanoDrop^TM 2000分光光度計確定蛋白質濃度。每次用2.5 μL樣品，將所有的量測重複兩次，並且取平均值。尺寸排阻高效液相層析（SEC-HPLC）

對於pH和緩衝液、凍融和賦形劑實例，使用TSKgel® G3000 SWXL柱（東曹生物科學公司（Tosoh Bioscience），7.8×300 mm，5 μm，25°C）在安捷倫（Agilent）1260 HPLC系統上進行蛋白質單體和其高分子量種類和片段的分離。該流動相由50 mM磷酸鈉、100 mM氯化鈉和20 mM檸檬酸鈉（pH 6.0±0.2）組成。該層析系統使用1.0 ml/min的流速、50-µL進樣量（典型地是1 mg/mL）以及具有等度梯度的20-min執行時間。藉由UV偵測器在280 nm（參照：360 nm）下偵測信號。

在PS80實例中，使用BioSep^TM -SEC-s3000柱（菲羅門（Phenomenex），7.8×300 mm，5 μm，25°C）在安捷倫1260 HPLC系統上進行蛋白質單體和其高分子量種類和片段的分離。該流動相由50 mM磷酸鈉和100 mM氯化鈉（pH 6.2±0.2）組成。該層析系統使用1.15 ml/min的流速、50-µL進樣量（典型地是1 mg/mL）以及具有等度梯度的25-min執行時間。藉由UV偵測器在280 nm下偵測信號。 SDS-PAGE（非還原的）

該等可報告的值係非還原的SDS-PAGE中的蛋白質的純度和分子量。在過量SDS的存在下將樣品變性成非還原的以獲得均勻的負電荷。在施加的電場（165 V）中，將該等SDS包被的種類基於它們的表觀分子量藉由聚丙烯醯胺凝膠進行分離。藉由考馬斯藍染色偵測該等分離的條帶。 4-MUG酶活性

將10 μl的樣品稀釋並且水解（藉由GAA，37°C持續60 min），以產生螢光產物4-MU。向其中添加125 μl的1 M甘胺酸或0.1 M NaOH，以終止該反應。

用樣品來分析一系列的4-MU標準，以產生基於螢光信號的標準校準曲線。藉由軟體介導的與標準曲線的比較來實現RFU至4-MU量的轉換，該轉換根據4參數邏輯回歸模型係回歸的。隨後基於該4-MU標準曲線計算在樣品中的GAA酶活性（nmol所釋放的4-MU/hr/ml GAA）。 4-MUG酶濃度

將10 μl的樣品和GAA參照標準品稀釋並且水解（藉由GAA，37°C持續60 min），以產生螢光產物4-MU。向其中添加125 μl的1 M NaOH，以終止該反應。

用樣品來分析一系列的GAA參照標準品，以產生基於螢光信號的標準校準曲線。藉由軟體介導的與標準曲線的比較來實現RFU至4-MU量的轉換，該轉換根據4參數邏輯回歸模型係回歸的。隨後基於該GAA標準曲線計算在樣品中的GAA酶濃度（nmol所釋放的4-MU/hr/ml GAA）。動態光散射（DLS）

使用微量移液器將40 μL未稀釋的樣品的等分試樣轉移至40 μL的一次性試管中。針對每個樣品進行一式三份的量測。顆粒：HIAC

用經過濾的參照緩衝液將200 μl的每個樣品稀釋成2000 μl。將該樣品測試三次，並且每次測試使用450 μl。報告每個尺寸（每ml中1 μm、3 μm、5 μm、10 μm和25 μm）的顆粒的平均數。米克羅卡（MicroCal）差示掃描量熱法（DSC）

藉由偵測作為溫度函數的增加樣品和參照的溫度所需的熱量差異，使用毛細管細胞差示掃描量熱法（DSC）來量測蛋白質的熱穩定性。具體地，它被用於量測熱轉換的中點（Tm），該中點係溶液中蛋白質的相對穩定性的指標。

用參照緩衝液將樣品稀釋至約1 mg/mL。將400 μL的參照緩衝液的等分試樣添加至96孔板的每個奇數孔中，同時將400 μL的每個樣品的等分試樣添加至對應的偶數孔中。該掃描溫度範圍係從10°C至110°C。調整的差示掃描量熱法（mDSC）

使用耐馳（Netzsch）差示掃描量熱儀（DSC 204 F1）測試玻璃化轉變（Tg’）溫度和共晶溫度（Te）。將15 μL的樣品載入於載入盤中用於測試。首先，將該溫度以10°C/min的速率從20°C降至-60°C，並且在此步驟過程中從冷卻曲線上獲得Te值。其次，將該溫度以10°C/min的速率從-60°C升至40°C，並且從加熱曲線來分析Tg’值。 M6P

藉由水解（4 M TFA，100°C，4 h），將M6P從樣品中釋放，並且藉由離心真空蒸發器進行乾燥。在分析之前，將經乾燥的M6P和參照標準品懸浮於經純化的水中。使用CarboPac PA10 BioLCTM分析柱（4 mm×250 mm，3.5 μm，100 Å，30°C）和CarboPac PA10 BioLCGuard柱（4 mm×50 mm，3.5 μm，100 Å，30°C）。該流動相由相A（100 mM NaOH）和相B（1 M NaOAc，100 mM NaOH）組成。該層析系統使用1 ml/min的流速、25-µL進樣量和具有梯度的30-min執行時間。藉由脈衝安培偵測來偵測信號。基於該標準曲線來計算樣品中的M6P含量。唾液酸藉由水解（2 M HAc，80°C，2 h）將唾液酸從藥物分子中釋放，並且隨後標記所有樣品，並且用DMB（50°C，在黑暗中17±0.5 h）將標準溶液混合，隨後使用Zorbax Eclipse Plus C18柱（安捷倫公司，4.6 mm×100 mm，3.5 μm，45°C）在安捷倫1260 HPLC系統上進行分離。該流動相由相A（9% ACN，7% MeOH）和相B（100% ACN）組成。該層析系統使用0.5 ml/min的流速、20 µL進樣量和具有梯度的20 min執行時間。藉由螢光偵測器（λex=373 nm，λem=448 nm）偵測信號。基於標準曲線計算樣品中的Neu5Gc和Neu5Ac含量。

製備十種緩衝液調配物，該等緩衝液調配物具有從4.0至8.0範圍的pH，含有25 mM磷酸鈉或25 mM檸檬酸鈉，具有或不具有50 mM NaCl，如表1所示。ATB200 4-MUG酶濃度係1 mg/mL。表1調配物組成： ^* 使用HCl將pH調節至4.0。

樣品製備

用於在pH和緩衝液評估研究中使用的材料如在下表2中所述。表2 pH和緩衝液評估研究的原材料資訊： ^* 該ATB200酶溶液的緩衝液係50 mM磷酸鈉（pH 6.2）、50 mM NaCl、2%甘露醇。^** 消光係數係1.51 AU*mL*mg^-1 *cm^-1

製備25 mM磷酸鈉緩衝液，該緩衝液包含處於pH 4.0（P40）、5.0（P50）、6.0（P60）、7.0（P70）和8.0（P80）的50 mM NaCl，處於pH 6.0（無NaCl的P60）的25 mM磷酸鈉緩衝液，和包含50 mM NaCl的處於pH 5.0（C50）、5.5（C55）、6.0（C60）和6.5（C65）的檸檬酸鈉緩衝液。對於pH 4.0，使用HCl調節在磷酸鈉緩衝液中的pH（pH 4.0）。

在15°C和3500 rpm下，將該ATB200酶溶液首先使用超濾離心裝置濃縮40 min。之後，在15°C和3500 rpm下藉由兩輪超過濾（持續50 min和55 min），將經濃縮的酶溶液進行緩衝液更換成為以上描述的三種不同的緩衝液。隨後針對蛋白質濃度和4-MUG酶濃度來分析經緩衝液更換的酶溶液。

最後，添加合適體積的每種緩衝液以將最終ATB200酶濃度調節至1.0 mg/mL。最終的ATB200濃度藉由UV_A280吸光度和4-MUG酶濃度二者證實。

用0.22-μm聚醚碸（PES）濾器無菌過濾該等溶液。

根據分析測試的樣品量要求，將每種調配物以500 μL至1000 μL的填充體積無菌地填充到生物安全罩中的2-mL玻璃小瓶中。在填充後立即將小瓶塞好蓋子，並且隨後捲曲密封。

樣品測試

將每個調配物的小瓶在5°C和40°C下儲存長達8週，並且在25°C下以100 rpm在定軌搖床上攪動長達5天（參見表3）。將該等調配物在初始（T0）、5天（5D）、2週（2W）、4週（4W）和8週（8W）取樣,如在表3中所描述，用於外觀、pH、UV濃度、4-MUG酶濃度、SEC、HIAC、DLS、4-MUG酶活性和DSC的測試。表3在ATB200 pH和緩衝液評估研究中的研究參數： X：外觀、pH、UV濃度、4-MUG酶濃度、SEC、HIAC*、DLS、4-MUG酶活性 Y：DSC^* ：僅針對T0樣品和攪動樣品來測試HIAC。

結果

熱穩定性結果-米克羅卡（MicroCal）DSC

熱穩定性量測的結果展示在下表4中：表4：

更高的Tm_發生表明在具體調配物中的蛋白質的更好的熱穩定性。因此，表現出最高熱穩定性的調配物係P50、C55、C50、無NaCl的P60、P60和C60。該等結果表明ATB200酶在弱酸性緩衝液中比在鹼性條件下具有更好的熱穩定性。

外觀-攪動

將該攪動研究的外觀的結果展示在下表5中：表5：

從表中可以看出，5天攪動後，無NaCl的P60、C50、C55、C60和C65保持無色、清澈，並且無可見顆粒，但是在P40、P50、P60、P70和P80中觀察到可見顆粒。該資料展示攪動後，檸檬酸鈉緩衝液比磷酸鈉緩衝液更好地穩定調配物。

pH

pH量測的結果展示在下表6中：表6：

從該資料看出，具有50 mM NaCl的範圍從pH 5.0至6.5的磷酸鹽和檸檬酸鹽緩衝液能夠自始至終保持指定的pH。在緩衝液更換，濃度調節，在5°C和40°C下儲存8週，以及攪動過程中，該等樣品的pH沒有顯著變化。

相比之下，在5°C和40°C下儲存8週後，無NaCl的P60中pH下降，並且在緩衝液更換和在兩種溫度下儲存8週後，P40中pH增加。然而，攪動不會導致P40和無NaCl的P60二者的pH的任何變化。

蛋白質濃度

蛋白質濃度量測的結果展示在以下表7中：表7：

在5°C下儲存8週，並且攪動5天不會影響該蛋白質濃度。在所有的調配物中沒有觀察到顯著變化。

相比之下，在40°C儲存期間，蛋白質濃度在P50、P60、無NaCl的P60、C60和C65中略微增高，在C50中略微降低，並且在P40、P70、P80、C55中保持不變。因為在40°C樣品中形成了可見顆粒的，在12000 rpm下離心1分鐘後再次測試40°C/8週樣品。該等結果展示離心後，在包含顆粒的樣品中蛋白質濃度的降低，其表明在該樣品中存在的顆粒對在280 nm處的吸附有影響。

4-MUG酶濃度

4-MUG酶濃度量測的結果在下表8中展示：表8：

緩衝液更換後，P80的4-MUG酶濃度立即降至0.27 mg/mL。此表明pH 8.0顯著影響酶活性。在5°C和40°C下儲存2週後，酶濃度降至零。除了P80，在5°C下儲存8週後，大多數調配物的酶濃度係穩定的，並且在P40中的酶濃度略微下降。

相比之下，40°C儲存明顯影響酶濃度。2週後，P70中的酶濃度不存在了，P40和C65中的酶濃度顯著下降，並且P50中的酶濃度明顯降低。4週後，酶濃度繼續下降。最後，8週後，酶濃度接近零（P40和C65中），在pH 5.0緩衝液中降至0.33 mg/mL（P50和C50），並且在pH 5.5至6.0緩衝液中降至0.5 mg/mL至0.7 mg/mL（P60、無NaCl的P60、C55和C60）。它們中，最終無NaCl的P60具有最高的酶濃度（0.73 mg/mL）。該等結果表明酶濃度在關於pH 5.5至6.0範圍內的4-MUG酶濃度下被絕大部分地保護，但是在磷酸鈉緩衝液和檸檬酸鈉緩衝液之間沒有顯著差異。

攪動研究期間，除了P80，酶濃度沒有顯著變化。

4-MUG酶活性

4-MUG酶活性量測的結果在下表9中展示：表9：

4-MUG酶活性的變化趨勢與4-MUG酶濃度的變化趨勢平行。

在測試條件下，P80展示在4-MUG酶活性中的最差穩定性。緩衝液更換後，P80的酶活性具有大約70%的下降。隨後，在5°C和40°C下儲存2週後，酶活性幾乎全喪失。鹼性條件顯著地影響酶活性。

在5°C下儲存8週後，PS80的酶活性幾乎完全喪失；在P40中發現20%的降低；在其他調配物中沒有觀察到顯著的變化。

相比之下，40°C儲存導致在所有調配物中酶活性的明顯降低。2週後，P70中的酶活性幾乎完全喪失，P40和C65中的酶活性顯著降低，並且P50中的酶活性明顯下降。酶活性從2週至4週以不同程度持續下降。在研究末期，C65中的酶活性幾乎完全喪失，P40中的酶活性降至211.5 U/L，P50和C50中的酶活性降至約1550 U/L，並且C60、P60和C55中的酶活性降至2500至3000 U/L。在該等調配物中，無NaCl的P60保持了3549.7 U/L的最高活性。

基於4-MUG酶活性的測試結果，該酶在pH在pH 5.5至6.0的範圍內的是最穩定的，但是在磷酸鈉緩衝液和檸檬酸鈉緩衝液之間沒有看出差別。

純度：SEC-HPLC

SEC量測的結果在下表10中展示：表10：

緩衝液更換後，相比起始材料（SEC單體：98.9%），一些調配物中的SEC純度顯著降低。在P80中，SEC純度降至44.9%，並且形成54.5%的聚集體；在P40中，相比更換DS前，存在4.9%的單體百分比下降，其中相比HMW分子（4.7% VS 1.3%）形成更多的LMW片段；在P70中，發現單體百分比的略微降低（1.2%），對應於聚集體的增加；在無NaCl的P60中，存在2.3%的單體百分比降低。

8週，5°C儲存後，相比T0，調配物P60、無NaCl的P60和C65的SEC純度保持良好，但是其他調配物的SEC純度顯著降低。在P40中，SEC純度顯著降至74.3%（T0：94.0%），並且形成23.4%的LMW片段；在P50和C50中，存在單體的輕微下降（5%至7%），和LMW片段的增加（5%至7%）。在P80中，發現18.2%的下降，其主要轉移至聚集（14.8%）。從而在P70中，存在10.7%的單體下降，和9.2%的HMW片段增加。在C55中，單體、HMW和LMW百分比輕微變化。

40°C下儲存導致所有調配物的戲劇性單體百分比變化。在P70和P80中，2週後，該SEC單體降至0至0.5%，並且在C65中剩餘22.4%，並且8週後它們主要轉變為聚集體。在P40、P50和C50中，單體顯著下降（50%至90%），主要歸因於LMW片段的形成。8週後，在P60、無NaCl的P60和C60中，SEC單體百分比分別降至80.8%、83.6%和77.5%。

該等SEC結果表明對於ATB200穩定性，pH 6.0表現最好，並且在磷酸鈉緩衝液和檸檬酸鈉緩衝液之間沒有發現顯著性差異。此外，在該等調配物中氯化鈉的不存在不會影響ATB200穩定性。

攪動研究期間，在P60和無NaCl的P60中SEC純度略微下降。在P40、P50、P70、P80、C50、C60和C65中，單體百分比明顯降低。

多分散性：DLS

DLS量測的結果在下表11中展示：表11：

DLS資料反映蛋白質分子的流體動力學半徑和顆粒的多分散性。在一些樣品中觀察到乳白色，因此使用DLS來分析不可見顆粒。該DLS結果與來自外觀的指征通常是一致的。

在8週的5°C儲存期間，在P60、P70、P80、無NaCl的P60和C60中，蛋白質分子的流體動力學半徑和多分散性指標（PDI）二者係穩定的並且係可比較的。在所有其他五種調配物中，流體動力學半徑從約10 nm轉變為幾百nm，特別是在8週後的P40中。

在8週的40°C儲存期間，在所有調配物中，流體動力學半徑和PDI發生了巨大的變化。然而，由於聚集體的複雜特徵，基於該結果很難比較彼等調配物。

在攪動研究中，P80的流體動力學半徑和PDI顯著增加；在P40、P50和C50中，流體動力學半徑和PDI略微增加；在P60、P70、無NaCl的P60、C55、C60和C65中，沒有觀察到顯著變化。

根據所有的上述DLS資料，P60、P70、無NaCl的P60、C55、C60和C65比P40、P50、P80和C50更好。

顆粒：HIAC

該攪動研究的HIAC量測的結果在下表12中展示：表12：

該攪動研究期間，在25°C下攪動5天后，P70具有顯著增加的顆粒數，並且所有其他的調配物具有可比較的顆粒數。

概述

總的來說，相比其他，P60和C60作為最穩定的調配物最突出。因此，得出結論ATB200在5.0-6.0的範圍內係最穩定的。然而，在磷酸鹽和檸檬酸鹽緩衝液之間沒有加以區別。另外，調配物中氯化鈉的不存在沒有展示對ATB200穩定性的顯著影響。調配物實例2：凍融

評估三種調配物在凍融過程中的穩定性。下文將三種調配物匯總於下表13中。ATB200酶的目標濃度係5 mg/mL。表13：

樣品製備

使用透析盒（20000 MWCO），將ATB200 DS進行緩衝液更換成為3種調配物緩衝液。在5°C下進行透析同時輕輕攪拌，每次使用三種緩衝液更換，每6至10小時一次。

每次透析後，添加合適體積的調配物緩衝液以調節最終UV濃度至5 mg/mL。隨後用0.22-μm PES濾器無菌過濾該等溶液。根據分析測試的樣品量要求，隨後將每種調配物以500 μL至1000 μL的填充體積無菌地填充到生物安全罩中的2-mL玻璃小瓶中。在填充後立即將小瓶塞好蓋子，並且隨後捲曲密封。

凍融之前，取出每個調配物的小瓶，並且使剩餘樣品小瓶經受設計的凍融循環。凍融之後，在預定義的取樣點取出樣品小瓶。

樣品測試

測試三種凍融過程，如下所列：

過程1：非受控的冷凍和融解。將樣品在-80°C冷凍機中冷凍，並且在25°C室內融解。

過程2：受控的冷凍和非受控的融解。將樣品置於弗羅斯蒂（Frosty）容器中，並且在-80°C冷凍機中冷凍。該弗羅斯蒂容器使用異丙醇以達到1°C/min的受控的冷凍速率。將弗羅斯蒂容器置於25°C室內以融解該等樣品。溫度增加速率係大約1°C/min。

過程3：受控的冷凍和融解。使用冷凍乾燥儀冷凍和融解該等樣品。冷凍期間達到的最低樣品溫度係-47°C。樣品溫度被升至25°C。將冷凍和融解二者的溫度變化速率控制在約0.5°C/min。結果藉由重複該實驗來證實。

使用每個過程進行5個或3個凍融循環。在凍融之前和之後針對該等樣品進行以下測試：外觀、濃度（UV & 酶）和SEC-HPLC。在表14中，測試參數匯總如下：表14： X：外觀、濃度（UV & 酶）、酶活性、SEC^* ：重複該實驗，第一個實驗3個FT循環，並且第二個實驗5個FT循環。

結果

外觀-第1輪

外觀量測的第1輪的結果在下表15A和表15B中展示：表15A：表15B：

在T0（凍融之前）時，使用對應的調配物緩衝液作為參照，所有調配物出現無色、輕微乳白色和無可見顆粒。

快速凍融（過程1）的5個循環後，相比其T0，所有調配物似乎包含更多的可見顆粒。5 FT後，在三個中CP60含有最少的顆粒。

在5個循環的緩慢凍融（過程2）後，所有調配物似乎比T0包含更多的可見顆粒，然而少於由過程1處理的彼等。5 FT循環後的CP60樣品中比1 FT循環後的P60和C60樣品中觀察到較少的顆粒。

緩慢凍融（過程3）的3個循環後，相比T0，全部調配物似乎具有更多的可見顆粒。三種調配物之間無差異。

外觀-第2輪

外觀量測的第2輪的結果在表23中展示：表16：

相比第1輪，在緩慢凍融研究的第2輪（過程3）中，進行更多FT循環。相比T0，5 FT後，有大量的可見顆粒出現在P60中，然而在C60和CP60二者中觀察到少量的顆粒。

4-MUG酶濃度和活性

4-MUG酶濃度和活性量測的結果展示在下表17（過程1-2和過程3的第一輪）和表18（過程3的第二輪）中：表17：表18：

快速凍融（過程1）的5個循環後，當相比T0樣品時，在P60中觀察到4-MUG酶濃度的輕微下降，然而在C60和CP60中沒有觀察到顯著差異。

使用弗羅斯蒂（Frosty）容器的緩慢凍融的5個循環（過程2）後，相比T0樣品，在3種調配物的任一者中沒有觀察到顯著差異。

使用冷凍乾燥儀的緩慢凍融3個循環（過程3）後，當相比T0時，在P60和CP60二者中存在明顯的酶濃度減少，但是在C60中無顯著變化。將具有過程3的凍融重複5個循環，並且觀察到相同的趨勢。F/T的1個循環後，P60樣品的酶濃度下降18.8%，並且3個循環（減少53.1%）和5個循環（減少68.9%）後酶濃度變得更糟。在CP60中，3個循環後酶濃度開始下降，並且最終減少至與5個循環後P60相同水平。在C60中，緩慢凍融的5個循環後幾乎沒有任何變化。

該等4-MUG酶濃度結果展示冷凍/加熱速率、F/T的循環數目和緩衝液類型可能影響ATB200穩定性。檸檬酸鹽緩衝液系統（C60）提供了良好的穩定效果，而不論使用的凍融過程如何。

4-MUG酶活性變化趨勢與4-MUG酶濃度係相同的。

在快速凍融研究（過程1）期間，5個循環後在P60中發生酶活性的略微減少，在C60和CP60中沒有觀察到顯著變化。

在以1°C/min溫度變化的緩慢凍融研究（過程2）期間，在任何樣品中沒有觀察到明顯的變化。

在用冷凍乾燥儀的緩慢凍融研究（過程3）中，P60中的酶活性明顯降低，並且CP60中的酶活性略微減少。然而，在C60中幾乎無變化。在過程3緩慢凍融研究的第2輪期間，1個循環後，P60的酶活性降低19.1%，3個循環後降低54.1%，並且5個循環後降低71.2%。在CP60中，3個循環後酶活性開始下降，5個循環後降至與P60的相似水平。5個循環後，在C60中存在可忽略不計的變化。

純度：SEC-HPLC

該等純度量測的結果展示在下表20（過程1-2和過程3的第一輪）和表21（過程3的第二輪）中：表20：表21：

在多達5個循環的快速F/T（過程1）或緩慢F/T（過程2）後，在任何樣品中沒有偵測到SEC單體百分比變化。

在第一緩慢F/T研究（過程3）中，3個循環後，P60樣品展示明顯的SEC單體百分比下降（主要歸因於HMW種類的形成）。並且在C60和CP60中沒有發生明顯的變化。在第2過程3的緩慢F/T研究（0.5°C/min）中，1個循環後，P60樣品中的單體開始下降，並且5個循環後最終下降68.1%。並且在CP60中，3個循環後單體百分比開始下降，但是比P60中的少得多；然而，5個循環後，達到與P60中相同水平。在多至5個循環後，在C60中的單體百分比無變化。

該等SEC純度結果與酶濃度和活性的表現一致，表明在凍融過程中，冷凍/加熱速率、F/T的循環數目和緩衝液類型可能影響ATB200穩定性。基於該等SEC結果，在凍融循環期間，包含磷酸鈉的緩衝液也不保護ATB200。

概述

相比其他兩種緩衝液（P60和CP60），配製於檸檬酸鹽緩衝液（C60）中的ATB200更好地經受多個凍融循環。不論凍融過程如何，ATB200在檸檬酸鹽緩衝液中保持穩定。調配物實例3：賦形劑

用各種賦形劑製備八種調配物（E1-8）。賦形劑評估研究中的ATB200酶濃度係5 mg/mL。選擇三種緩衝液、兩種穩定劑和一種表面活性劑來評價下表22中所述的調配物的蛋白質穩定性。表22：

樣品製備

分別製備包含50 mM NaCl的25 mM磷酸鈉緩衝液（pH 6.0）、包含50 mM NaCl的25 mM檸檬酸鈉緩衝液（pH 6.0）和包含50 mM NaCl的25 mM磷酸鈉-檸檬酸鹽組合緩衝液（pH 6.0）。使用透析盒，將該ATB200酶溶液更換成三種緩衝液。在5°C下進行透析同時輕輕攪拌，每次使用3種緩衝液更換，每6至10小時一次。

透析後，將海藻糖、甘露醇或PS80添加至透析液中，以製備如在表22中列出的調配物。最後，添加合適體積的調配物緩衝液以將最終的ATB200濃度調節至5 mg/mL。用0.22-μm PES濾器無菌過濾該等溶液。

將每個調配物無菌地填充到具有約1 mL填充體積的生物安全罩中的2-mL小玻璃瓶中。在填充後立即將小瓶塞好蓋子，並且隨後捲曲。

樣品測試

在4種不同條件下，測試調配物E1-8。將每個調配物的小瓶在5°C下儲存12週（12W），並且在40°C下儲存8週（8 W），凍融（0.5°C/min）5個循環，並且在25°C下以100 rpm攪動5天。將取樣和測試計畫描述於表23中。將樣品按初始（T0）、2週（2W）、4週（4W）、8週（8W）和12週（12W）進行測試。表23： X：外觀量測

結果

外觀

針對凍融研究量測的外觀的結果在下表24（使用冰箱）和下表25（使用冷凍乾燥儀）中展示：表24：表25：

在該凍融研究期間，在不含有PS80的F5和F6中，隨著凍融循環的增加，可見顆粒略微增加。在其他調配物中沒有觀察到差別。

概述

由多個凍融循環後可見顆粒的形成而證實，在凍融研究中，不含PS80（F5和F6）的調配物與含有PS80的調配物表現不同。調配物實例4：人全血中的溶血

在鹽水中製備來自人類供體的血液的一系列稀釋液（1:2、1:3、1:4、1:5和1:10）。當與去離子水混合時，在該測定中使用導致在540 nm處介於0.8和1.2之間的OD的稀釋液，並且將該稀釋液稱為血液底物。測試樣品的四種類型：測試品、安慰劑、陽性對照和陰性對照。該測試品特徵在於調配物中的ATB200 rhGAA具有25 mM檸檬酸鈉、2%甘露醇和0.05%聚山梨醇酯80，pH為6.0。安慰劑與測試品相同，除了不含ATB200 rhGAA以外。陽性對照品係無菌注射用水，並且pH為5。陰性對照品係鹽水（0.9 NaCl），並且pH為5。

將處於300 μg/ml、600 μg/ml和1000 μg/ml的具有鹽水的測試品（ATB200），具有鹽水的安慰劑，陰性對照（鹽水），和陽性對照（水）與來自人類供體的血液底物混合。在37°C下，將樣品不攪動培養1小時。培養後，將該等試管在室溫下以大約100x g離心10分鐘。在540 nm處，用分光光度法分析每個樣品上清液中的血紅蛋白的量。

藉由公式確定該測試品的溶血百分比：

水加血液的溶血百分比係100%。鹽水係陰性對照。少於或等於10%的溶血被認為係不顯著的。針對測試品的每個濃度和針對安慰劑計算溶血百分比。

下表26展示了所測試的該等樣品的結果。表26： a = 溶血的陰性對照 b = 溶血的陽性對照 c = 在鹽水中按與300 μg/mL測試品相同的比率稀釋的安慰劑 d = 在鹽水中按與600 μg/mL測試品相同的比率稀釋的安慰劑 e = 在鹽水中按與1000 μg/mL測試品相同的比率稀釋的安慰劑^* 溶血%係使用水的OD作為陽性對照來確定。

將人血底物與安慰劑的三種樣品培養，該人血底物按與三種測試品劑量相同的比率稀釋於鹽水中，不會導致人血的任何顯著的溶血。將安慰劑-稀釋樣品的溶血百分比分別計算為-1.3%、-1.3%和0.9%。將人血底物與300 μg/ml、600 μg/ml和1000 μg/ml的ATB200一起培養不會引起該人血的任何顯著的溶血。將測試品樣品的溶血百分比分別計算為-0.1%、-1.5%和-1.5%。

總之，該ATB200調配物與處於所有稀釋的人血液係可相容的。調配物實例5：人血漿和血清中的絮凝

將測試品給藥溶液（3種濃度）和安慰劑（3種濃度）與相同體積的來自供體的人血漿和血清混合。該測試品特徵在於調配物中的ATB200 rhGAA具有25 mM檸檬酸鈉、2%甘露醇和0.05%聚山梨醇酯80，pH為6.0。安慰劑與測試品相同，除了不含ATB200 rhGAA以外。

將一毫升每一劑量的測試品或安慰劑與等體積的血漿、血清和鹽水混合。在室溫下，將樣品培養30分鐘。培養後，針對沈澱或凝結，將該等試管用肉眼和顯微鏡進行檢查。將來自每個試管的等分試樣(aliquot)在微型離心機中以14,000 rpm離心10分鐘。針對球粒的存在或缺失檢查每個試管。沈澱/凝結和球粒評分如下： 0 = 無 1 = 非常輕微的沈澱或球粒 2 = 最低限度的沈澱或球粒 3 = 中等程度的沈澱或球粒 4 = 顯著的沈澱或球粒

下表27展示了所測試的該等樣品的結果。表27： a = 將安慰劑按與300 μg/mL終濃度的測試品給藥調配物相同的比率稀釋於鹽水中 b = 將安慰劑按與600 μg/mL終濃度的測試品給藥調配物相同的比率稀釋於鹽水中 c = 將安慰劑按與1000 μg/mL終濃度的測試品給藥調配物相同的比率稀釋於鹽水中

當與每種ATB200濃度混合時，在人血漿或血清中用肉眼或顯微鏡沒有觀察到沈澱。在安慰劑樣品中沒有注意到沈澱。當離心所有的安慰劑或ATB200樣品時，沒有觀察到球粒。

基於本研究的該等結果，發現ATB200調配物可與高達並包括1000 μg/ml終濃度的人血漿和血清相容。實例：在患有龐貝氏病的經歷過ERT的以及初次接受ERT的患者中，與麥格司他共同投予的重組酸性α-葡萄糖苷酶ATB200的藥物代謝動力學和安全性資料

設計本研究主要評估與麥格司他共同投予的ATB200的安全性、耐受性和藥物代謝動力學（PK）。來自Gaa基因敲除小鼠的PK/藥效（PD）翻譯模型預測出，在人體中ATB200 20 mg/kg與高劑量（例如，260 mg）的麥格司他的組合會提供最佳的肝醣減少。

在以下描述中，「高劑量」的麥格司他係指約260 mg的劑量且「低劑量」的麥格司他係指約130 mg的劑量。

目的是評估該1/2期研究中來自10名患者的初步總GAA蛋白、ATB200和麥格司他PK資料，以及安全性標記物。

此係一個開放標記、固定順序、遞增劑量、第一次在人類中研究的、1/2期研究，以在患有龐貝氏病的成年人中評估ATB200的靜脈內輸注與口服麥格司他共同投予的安全性、耐受性、PK、PD以及效力（圖21）。評價來自在隨訪9中前8個群組1的患者和前2個群組3患者的平均總GAA蛋白質和麥格司他PK結果。^a 在群組2和3中給藥之前，將來自群組1的2名哨兵患者的安全性資料在每個劑量水平下進行評估。^b 在階段2和3期間，在ATB200靜脈內輸注開始之前，口服投予麥格司他。對於所有的劑量，將ATB200靜脈內輸注持續4小時。^c 在群組2和3中，前2名患者充當他們各自群組的哨兵患者。主要入選標準： • 被診斷患有龐貝氏病的18-65歲的男性和女性係基於記錄的GAA酶活性的缺乏或藉由GAA基因分型 • 在試驗開始（群組1）之前，接受用阿葡萄糖苷酶α進行的ERT持續2-6年（或對於群組2為≥2年） • 目前以每隔一週的頻率接受阿葡萄糖苷酶α，並且完成最後2次輸注，同時沒有導致劑量中斷的藥物相關的不良事件（群組1和2） • 在6分鐘步行測試中，必須能夠行走介於200和500米之間（群組1和3） • 直立的用力肺活量必須是預測的正常值的30%-80%（群組1和3） • 必須是坐輪椅的並且不能無輔助地行走（群組2） PK分析： • 收集血漿總GAA蛋白質和活性濃度的血液樣品 • 階段1：在ATB200輸注開始之前和輸注開始後1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8、10、12和24小時 • 階段2和3：麥格司他口服投予後1、2、3、4、4.5、5、6、7、9、11、13和25小時 • 在麥格司他口服投予（時間0）之前立即並且在麥格司他口服投予後1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、9、11和25小時，針對血漿麥格司他濃度對血液樣品進行取樣。藉由經驗證的LC-MS/MS測定來確定血漿麥格司他 • 藉由一個或多個rhGAA-特異性「簽名」肽的經驗證的LC-MS/MS定量來確定血漿中針對ATB200 5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg的總GAA蛋白質濃度

在完成了階段1和2的群組1的8名患者中以及開始階段3的群組3的2名患者中完成了初步分析 • 初始ERT轉換的患者係龐貝氏病群體的代表，接受ERT平均5.02年（表28）表28：基線特徵 ^a n = 在間歇期資料分析中來自群組1的10名（非臥床的ERT轉換）；n = 來自群組3的2名（初次）。總GAA蛋白

當單獨投予時，ATB200以略微高於劑量比例的方式增加（表29和圖22A至圖22D）。變異似乎隨著麥格司他劑量而增加（圖22C）。相對於20 mg/kg的單獨的ATB200，20 mg/kg的ATB200與高劑量的麥格司他（260 mg）的共同投予增加了總GAA蛋白質暴露（AUC）大約25%。分佈半衰期（α-期）增加了45%，表明高劑量的麥格司他穩定血漿中的ATB200。從達到最大血漿濃度至劑量後大約12小時的時間，分佈半衰期的增加伴隨著AUC的增加。在末端消除期期間，AUC和半衰期的增加可以在對數標度上觀察到（圖22B）。ATB200表明了相對高的分配容積。血漿總GAA蛋白質的分佈在初次接受ERT（群組3）和經歷過ERT的患者（群組1）之間看起來相似（圖22A和圖22D）。表29：總GAA蛋白 AUC=曲線下面積；CL_T =全身清除率；C_max =最大藥物濃度；CV=變異係數；MD=多劑量；SD=單劑量；t_1/2 =半衰期；t_max =達到最大藥物濃度的時間；V_ss =以穩態分佈的表觀體積。^a 幾何平均數（CV%）.^b 中值（最小值-最大值）.^c 算數平均數（CV%）^d n=8.^e n=7.^f n=2. 麥格司他PK

麥格司他表明劑量比例的動力學（表30和圖23）。血漿麥格司他在單個劑量和多個劑量之間看起來相似。表30：麥格司他PK匯總藥效學

在來自群組1的經歷過ERT的患者中的第11次隨訪（圖24A和圖24B）： • 在8名患者中5名丙胺酸胺基轉移酶（ALT）減少；4/4患者具有提高的標準化基線水平 • 在8名患者中6名天冬胺酸轉胺酶（AST）減少；3/4患者具有提高的標準化基線水平 • 在8名患者中6名肌酸磷酸激酶（CPK）減少；2/6患者具有提高的標準化基線水平 • 在8名患者中8名尿糖四糖（HEX4）水平減少

在第4週，在初次接受治療的群組（群組3）的2名患者中所有4種生物標記物水平下降（圖24C和圖24D）。

在圖24A至圖24D中，資料被表示為平均值±標準誤。

安全性 • 在所有患者中155+總輸注後，沒有報告嚴重的不良事件（AE）或輸注相關的反應。 • 在11/13（84%）患者中報告的治療突發性AE通常是輕度和短暫的。 • 在7/13（53%）患者中報告的治療相關的AE：噁心（n=1）、疲勞（n=1）、頭痛（n=1）、震顫（n=2）、痤瘡（n=1）、心動過速（n=1）和低血壓（n=1）。

結論 • 單獨的和與麥格司他組合的ATB200係安全的，並且耐受良好，迄今沒有輸注相關的反應。 • 在暴露方面，單獨ATB200展示暴露高於劑量比例的增加，該暴露進一步用麥格司他增強，表明伴護蛋白對ATB200的穩定效果。 • 從標準護理轉換至ATB200/麥格司他後，患者通常展示在肌肉損傷的生物標記物方面的改進，同時許多的患者在第18週證明正常化。 • 用ATB200/麥格司他治療的初始的2名初次接受試驗治療的患者表明肌損傷的所有生物標記物的穩定下降。序列

無

從以下書面描述和附圖中，本發明的其他特徵將變得明顯，其中：

圖1A圖示非磷酸化高甘露糖聚糖、單-M6P聚糖和雙-M6P聚糖。

圖1B圖示M6P基團的化學結構。

圖2A描述了rhGAA經由帶有M6P的聚糖對靶組織（例如，患有龐貝氏病的受試者的肌肉組織）的生產性靶向。

圖2B描述了對非靶組織（例如，肝臟和脾）或藉由非M6P聚糖與非靶組織的結合的非生產性藥物清除。

圖3A和圖3B分別是圖示Lumizyme®和Myozyme®的CIMPR親和層析的結果的圖。虛線係指M6P洗提梯度。用M6P洗提替代經由包含M6P的聚糖結合到CIMPR的GAA分子。如在圖2A中所示，Lumizyme®中78%的GAA活性在添加M6P前被洗提。圖2B圖示73%的GAA Myozyme®活性在M6P添加前被洗提。在Lumizyme®或Myozyme®中只有22%或27%的rhGAA，分別用M6P洗提。該等圖圖示，在此兩種常規rhGAA產品中大多數rhGAA缺乏具有在靶肌肉組織中靶向CIMPR所需M6P的聚糖。

圖4圖示了用於用編碼rhGAA的DNA轉化CHO細胞之DNA構建體。用編碼rhGAA的DNA構建體轉化CHO細胞。

圖5A和圖5B分別是圖示Myozyme®和ATB200 rhGAA的CIMPR親和層析的結果之圖。從圖5B可以看出，在ATB200 rhGAA中約70%的rhGAA包含M6P。

圖6係圖示在陰離子交換（AEX）柱上被捕獲和不被捕獲的ATB200 rhGAA的CIMPR親和層析的結果之圖。

圖7係圖示Lumizyme®和ATB200 rhGAA的波利韋克斯（Polywax）洗提曲線之圖。

圖8係圖示相比鑒定為BP-rhGAA、ATB200-1和ATB200-2的ATB200 rhGAA的三種不同的製劑，Lumizyme®的N-聚糖結構的概述之表。

圖9A至圖9H圖示了ATB200 rhGAA的位點特異性N-糖基化分析之結果。

圖10A係比較ATB200 rhGAA的CIMPR結合親和力（左軌跡線）與Lumizyme®的CIMPR結合親和力（右軌跡線）之圖。

圖10B係比較Lumizyme®和ATB200 rhGAA的雙-M6P含量之表。

圖11A係在不同GAA濃度下，比較在正常成纖維細胞內的ATB200 rhGAA活性（左軌跡線）與Lumizyme® rhGAA活性（右軌跡線）之圖。

圖11B係在不同GAA濃度下，比較來自患有龐貝氏病的受試者的成纖維細胞中的ATB200 rhGAA活性（左軌跡線）與Lumizyme® rhGAA活性（右軌跡線）之表。

圖11C係比較來自正常受試者和患有龐貝氏病的受試者的成纖維細胞的K_攝取之表。

圖12A係圖示與運載體（陰性對照），與20 mg/ml的阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®），或與5 mg/kg、10 mg/kg或20 mg/kg的ATB200接觸後，相對於在小鼠心肌中的重組人酸性α-葡萄糖苷酶的劑量的肝醣量之圖。

圖12B係圖示與運載體（陰性對照），與20 mg/ml阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®），或與5 mg/kg、10 mg/kg或20 mg/kg ATB200接觸後，相對於在小鼠四頭肌中的重組人酸性α-葡萄糖苷酶的劑量的肝醣量的圖。

圖12C係圖示與運載體（陰性對照），與20 mg/ml阿葡萄糖苷酶α（Lumizyme®），或與5 mg/kg、10 mg/kg或20 mg/kg ATB200接觸後，相對於在小鼠三頭肌中的重組人酸性α-葡萄糖苷酶的劑量的肝醣量的圖。

圖13係圖示ATB200 rhGAA和伴護蛋白麥格司他（miglustat）的組合在GAA基因敲除小鼠中比用不具有麥格司他伴護蛋白的Lumizyme®或ATB200 rhGAA的治療提供顯著更好的肝醣清除之表。

圖14係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心臟、隔膜和比目魚肌的一系列電子顯微圖，圖示溶酶體相關膜蛋白（LAMP-1）水平。

圖15係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心臟和比目魚肌的一系列電子顯微圖，圖示用過碘酸–希夫（Schiff）試劑（PAS）染色的肝醣水平。

圖16係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四頭肌的一系列電子顯微圖（1000x），用亞甲藍染色來圖示囊泡（用箭頭指示）。

圖17係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四頭肌的一系列電子顯微圖（40x），圖示自噬標記物微管相關蛋白質1A/1B-輕鏈3磷脂醯乙醇胺共軛物（LC3A II）和p62，胰島素依賴性葡萄糖轉運體GLUT4和胰島素非依賴性葡萄糖轉運體GLUT1之水平。

圖18A和圖18B係圖示在麥格司他存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的線懸掛和握力肌資料之圖。

圖19A至圖19G係圖示來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四頭肌、三頭肌和心臟細胞中的肝醣水平之圖。

圖20係來自在麥格司他存在和不存在的情況下，用運載體、阿葡萄糖苷酶α和ATB200治療的野生型小鼠和Gaa -基因敲除小鼠的股外側肌（VL）的肌纖維的一系列顯微照片（100x和200x），圖示抗肌萎縮蛋白信號。

圖21圖示一開放標記、固定順序、遞增劑量、第一次在人類中研究的、1/2期研究的研究設計，以在患有龐貝氏病的成年人中評估安全性、耐受性、PK、PD以及ATB200的靜脈內輸注與口服麥格司他共同投予的效力。

圖22A至圖22B係圖示在給藥5 mg/kg、10 mg/kg或20 mg/kg ATB200，20 mg/kg ATB200和130 mg麥格司他，或20 mg/kg ATB200和260 mg麥格司他後，在人類受試者血漿中的GAA總蛋白的濃度-時間曲線之圖。

圖22C係圖示在給藥20 mg/kg ATB200，20 mg/kg ATB200和130 mg麥格司他，或20 mg/kg ATB200和260 mg麥格司他後，在人類受試者血漿中的GAA總蛋白的AUC之圖。

圖22D係圖示在給藥20 mg/kg ATB200和260 mg麥格司他後，在兩名個體人類受試者血漿中的GAA總蛋白的濃度-時間曲線之圖。

圖23係圖示在給藥130 mg或260 mg麥格司他後，在人類受試者血漿中的麥格司他的濃度-時間曲線之圖。

圖24A至圖24D係圖示在投予遞增劑量的ATB200（5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg)，隨後共同投予ATB200（20 mg/kg）和麥格司他（130 mg和260 mg）後，在人類患者中的丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天冬胺酸轉胺酶（AST）、肌酸磷酸激酶（CPK）和己糖四糖（Hex4）水平的變化的圖。

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(請換頁單獨記載) ＜110＞阿米庫斯醫療股份有限公司（Amicus Therapeutics, Inc.）＜120＞包含重組酸性α-葡萄糖苷酶之調配物＜130＞ AT-P8700-TW ＜160＞ 2 ＜170＞ PatentIn 版本3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 952 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 1 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly 290 295 300 Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val 305 310 315 320 Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile 325 330 335 Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln 340 345 350 Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly 355 360 365 Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr 370 375 380 Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val 385 390 395 400 Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe 405 410 415 Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser 435 440 445 Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg 450 455 460 Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val 465 470 475 480 Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu 485 490 495 Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe 500 505 510 Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly 515 520 525 Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val 530 535 540 Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser 545 550 555 560 Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly 565 570 575 Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly 580 585 590 Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg 595 600 605 Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu 610 615 620 Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro 625 630 635 640 Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu 645 650 655 Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg 660 665 670 Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser 675 680 685 Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala 690 695 700 Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly 705 710 715 720 Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser 725 730 735 Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile 740 745 750 Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro 755 760 765 Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly 770 775 780 Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser 785 790 795 800 Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val 805 810 815 His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr 820 825 830 Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr 835 840 845 Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser 850 855 860 Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala 865 870 875 880 Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly 885 890 895 Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala 900 905 910 Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr 915 920 925 Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly 930 935 940 Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 945 950 ＜210＞ 2 ＜211＞ 896 ＜212＞ PRT ＜213＞智人＜400＞ 2 Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro 1 5 10 15 Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser 20 25 30 Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu 35 40 45 Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala 50 55 60 Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu 85 90 95 Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg 100 105 110 Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys 115 120 125 Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val 130 135 140 His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu 145 150 155 160 Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu 165 170 175 Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu 195 200 205 Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn 210 215 220 Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro 225 230 235 240 Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu 245 250 255 Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu 260 265 270 Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly 275 280 285 Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr 290 295 300 Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp 305 310 315 320 Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr 325 330 335 Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met 340 345 350 Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe 355 360 365 Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met 370 375 380 Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg 385 390 395 400 Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr 405 410 415 Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro 420 425 430 Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala 435 440 445 Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn 450 455 460 Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn 465 470 475 480 Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu 485 490 495 Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His 500 505 510 Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His 515 520 525 Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg 530 535 540 Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp 545 550 555 560 Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu 565 570 575 Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly 580 585 590 Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu 595 600 605 Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu 610 615 620 Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg 625 630 635 640 Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu 645 650 655 Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe 660 665 670 Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu 675 680 685 Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys 690 695 700 Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln 705 710 715 720 Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala 725 730 735 Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro 740 745 750 Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile 755 760 765 Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro 770 775 780 Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu 785 790 795 800 Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala 805 810 815 Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu 820 825 830 Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val 835 840 845 Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly 850 855 860 Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp 865 870 875 880 Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 885 890 895

Claims

一種藥物調配物，包含： (d) 一重組酸性α-葡萄糖苷酶，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α(alglucosidasw alfa)的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該重組酸性α-葡萄糖苷酶包括增加的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量； (e) 至少一選自下組的緩衝液，該組由以下各項組成：檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合；以及 (f) 至少一選自下組的賦形劑，該組由以下各項組成：甘露醇、聚山梨醇酯80及其組合，其中該調配物具有從約5.0至約7.0的pH。
如申請專利範圍第1項所述之藥物調配物，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶係以約5 mg/mL至約50 mg/mL的一濃度存在。
如申請專利範圍第1或2項所述之藥物調配物，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶係以約15 mg/mL的一濃度存在。
如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之藥物調配物，其中該調配物具有從約5.5至約7.0的pH。
如申請專利範圍第1-4項中任一項所述之藥物調配物，其中該調配物具有約6.0的pH。
如申請專利範圍第1-5項中任一項所述之藥物調配物，其中該至少一緩衝液包含檸檬酸鹽。
如申請專利範圍第1-6項中任一項所述之藥物調配物，其中該至少一緩衝液包含鉀、鈉或銨鹽。
如申請專利範圍第1-7項中任一項所述之藥物調配物，其中該至少一緩衝液包含檸檬酸鈉。
如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之藥物調配物，其中該至少一緩衝液係以約10 mM至約100 mM的一濃度存在。
如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之藥物調配物，其中該至少一緩衝液係以約25 mM的一濃度存在。
如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之藥物調配物，其中排除了海藻糖、蔗糖、甘胺酸或其組合。
如申請專利範圍第1-11項中任一項所述之藥物調配物，其中該至少一賦形劑係以約10 mg/mL至約50 mg/mL的一濃度存在的甘露醇。
如申請專利範圍第1-12項中任一項所述之藥物調配物，其中該至少一賦形劑係以約0.2 mg/mL至約0.5 mg/mL的一濃度存在的聚山梨醇酯80。
如申請專利範圍第1-13項中任一項所述之藥物調配物，其中該甘露醇係以約20 mg/mL的一濃度存在，並且該聚山梨醇酯80係以約0.5 mg/mL的一濃度存在。
如申請專利範圍第1-14項中任一項所述之藥物調配物，進一步包括： (d) 水。
如申請專利範圍第1-15項中任一項所述之藥物調配物，進一步包括： (e) 一鹼化劑；和/或 (f) 一酸化劑，其中該鹼化劑和酸化劑係以保持該藥物調配物在從約5.0至約6.0的pH的量存在。
如申請專利範圍第1-16項中任一項所述之藥物調配物，其中至少30%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子包含帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的一個或多個N-聚糖單元。
如申請專利範圍第1-17項中任一項所述之藥物調配物，其中該重組人酸性α葡萄糖苷酶包括每莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶中的平均從0.5至7.0莫耳的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元。
如申請專利範圍第1-18項中任一項所述之藥物調配物，其中該重組人酸性α-葡萄糖苷酶包括每莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶中的平均至少3莫耳的甘露糖-6-磷酸殘基和每莫耳重組人酸性α-葡萄糖苷酶中的至少4莫耳的唾液酸殘基。
如申請專利範圍第1-19項中任一項所述之藥物調配物，其中該重組人酸性α-葡萄糖苷酶包括七個潛在的N-糖基化位點，至少50%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在第一位點處包括帶有兩個甘露糖-6-磷酸殘基的一N-聚糖單元，至少30%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在第二位點處包括帶有一個甘露糖-6-磷酸殘基的一N-聚糖單元，至少30%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在第四位點處包括帶有兩個甘露糖-6-磷酸殘基的一N-聚糖單元，並且至少20%的該重組人酸性α-葡萄糖苷酶分子在第四位點處包括帶有一個甘露糖-6-磷酸殘基的一N-聚糖單元。
如申請專利範圍第1-20項中任一項所述之藥物調配物，其中該藥物調配物基本上由以下各項組成： (a) 該重組酸性α-葡萄糖苷酶； (b1) 檸檬酸鈉； (b2) 檸檬酸單水合物； (c1) 甘露醇； (c2) 聚山梨醇酯80； (d) 水； (e) 視情況，一酸化劑；以及 (f) 視情況，一鹼化劑，其中該調配物具有從約5.0至約6.0的pH。
如申請專利範圍第1-21項中任一項所述之藥物調配物，其中該藥物調配物基本上由以下各項組成： (a) 該重組酸性α-葡萄糖苷酶，以約15 mg/mL的一濃度存在； (b) 檸檬酸鈉緩衝液，以約25 mM的一濃度存在； (c1) 甘露醇，以約20 mg/mL的一濃度存在； (c2) 聚山梨醇酯80，以約0.5 mg/mL的一濃度存在；和 (d) 水； (e) 視情況，一酸化劑；以及 (f) 視情況，一鹼化劑，其中該調配物具有從約5.0至約6.0的pH。
一種藥物組成物，該藥物組成物包括凍乾之後的、如申請專利範圍第1-22項中任一項所述之藥物調配物。
一種包括一凍乾混合物的藥物組成物，該凍乾混合物包括： (a) 一重組酸性α-葡萄糖苷酶，其中該重組酸性α-葡萄糖苷酶在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且當相比於帶有阿葡萄糖苷酶α的一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量時，該重組酸性α-葡萄糖苷酶包括增加的帶有一個或兩個甘露糖-6-磷酸殘基的N-聚糖單元的含量； (b) 一選自下組的緩衝液，該組由以下各項組成：檸檬酸鹽、磷酸鹽及其組合；和 (c) 至少一選自下組的賦形劑，該組由以下各項組成：海藻糖、甘露醇、聚山梨醇酯80及其組合。
一種治療龐貝氏病的方法，該方法包括以下步驟：向對其有需要的一患者投予如申請專利範圍第1-22項所述之藥物調配物。
如申請專利範圍第25項所述之方法，該方法進一步包括以下步驟：在向該患者投予之前稀釋該藥物調配物。
一種治療龐貝氏病的方法，該方法包括以下步驟： (a) 重構如申請專利範圍第23或24項所述之藥物組成物；以及 (b) 向對其有需要的一患者投予該重構的藥物組成物。
一種製備如申請專利範圍第1-22項中任一項所述之藥物調配物的方法，該方法包括以下步驟：向水中添加該至少一緩衝液、至少一賦形劑和重組酸性α-葡萄糖苷酶以提供一溶液；視情況調節該溶液的pH；並且視情況向該溶液中添加額外的水。
如申請專利範圍第28項所述之方法，該方法進一步包括以下步驟：過濾該溶液。
如申請專利範圍第28或29項所述之方法，該方法進一步包括以下步驟：儲存該溶液。