CN109475607B - 包含重组酸性α-葡糖苷酶的配制品 - Google Patents

Abstract

提供了包含重组酸性α‑葡糖苷酶的药物配制品，其中该重组酸性α‑葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比于带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖‑6‑磷酸残基的N‑聚糖单元的含量时，该重组酸性α‑葡糖苷酶包括增加的含量的带有一个或两个甘露糖‑6‑磷酸残基的N‑聚糖单元；至少一种选自下组的缓冲液，该组由以下各项组成：柠檬酸盐、磷酸盐、及其组合；和至少一种选自下组的赋形剂，该组由以下各项组成：甘露醇、聚山梨醇酯80、及其组合，其中该配制品具有从约5.0至约7.0的pH。还提供了使用这些药物配制品治疗庞贝氏病的方法。

Description

包含重组酸性α-葡糖苷酶的配制品

技术领域

本发明的原理和实施例总体上涉及包含重组酸性α-葡糖苷酶的配制品，并且特别是液体配制品。

背景技术

庞贝氏病，又称为酸性麦芽糖酶缺乏症或糖原贮积症II型，是若干种溶酶体贮积失调之一。溶酶体贮积失调是一组常染色体隐性遗传疾病，其特征在于细胞的糖鞘脂、糖原、或黏多糖在细胞内的区室(称为溶酶体)内的积累。患有这些疾病的个体携带编码在催化一种或多种这些物质的水解方面有缺陷的酶的突变基因，这些物质随后在溶酶体中积累。溶酶体失调的其他实例包括戈谢病、GM1-神经节苷脂贮积症、岩藻糖苷贮积症、粘多糖贮积症、胡尔勒-施埃尔病(Hurler-Scheie disease)、尼曼-皮克A和B病(Niemann-Pick A和B)，以及法布里氏病(Fabry disease)。庞贝氏病还被分类为神经肌肉疾病或代谢性肌病。

庞贝氏病的发病率被估计为在40,000人中约1例，并且是由GAA基因的突变引起的，该GAA基因编码酶溶酶体α-葡糖苷酶(EC:3.2.1.20)，该酶也常被称为酸性α-葡糖苷酶。酸性α-葡糖苷酶通过在溶酶体内将糖原催化水解为葡萄糖来参与糖原(一种分支多糖，是动物中葡萄糖的主要储存形式)的代谢。因为患有庞贝氏病的个体产生无活性的或具有减少的活性的突变的、缺陷的酸性α-葡糖苷酶，糖原分解发生缓慢或根本不发生，并且在不同组织的溶酶体中(特别是在横纹肌中)发生糖原积累，导致了包括进行性肌无力和呼吸功能不全的广谱临床表现。组织(如，心脏和骨骼肌)特别受影响。

庞贝氏病可以在酶的缺乏程度、严重程度和发病年龄方面差别很大，并且已经鉴定了在GAA基因中的超过500种不同的突变，它们中的许多引起不同严重程度的疾病症状。该疾病已经被分类为以下广泛类型：早发型或婴儿型，以及晚发型。早发型疾病和较低酶活性通常与更严重的临床病程相关。婴儿型庞贝氏病是最严重的，是由完全的或接近完全的酸性α-葡糖苷酶缺乏引起，并且出现包括肌肉张力严重缺乏、虚弱、肝脏和心脏增大、和心肌病的症状。舌头可能变得增大和突出，并且吞咽可能变得困难。多数染病的儿童在两岁之前死于呼吸并发症或心脏并发症。晚发型庞贝氏病可以出现在大于12个月的任何年龄，并且其特征在于缺乏心脏损害和更好的短期预后。症状与进行性骨骼肌功能障碍相关，并且涉及全身性肌无力以及在躯干、近端下肢、和隔膜中的呼吸肌的消耗。一些成年患者缺乏主要症状或运动限制。预后通常取决于呼吸肌损害的程度。大多数患有庞贝氏病的受试者最终发展为需要使用轮椅和辅助通气的身体衰弱的状态，其中由于呼吸衰竭而经常发生过早死亡。

针对庞贝氏病的最近的治疗选项包括用重组人酸性α-葡糖苷酶(rhGAA)进行的酶替代疗法(ERT)。常规的rhGAA产品在来自健赞公司(Genzyme,Inc.)的阿葡糖苷酶α(alglucosidase alfa)、

或

名下是已知的。ERT是贯穿患者一生所必需的慢性治疗，并且涉及通过静脉内输注来给予替代酶。该替代酶随后在循环中转运，并且进入细胞内的溶酶体中，在溶酶体中该替代酶的作用是分解积累的糖原，补偿内源性缺陷突变型酶缺乏的活性，并且从而缓解该疾病症状。

这些替代酶(如rhGAA)的制备、储存、转运、和给予患者的方式是困难的。在ERT中使用的这些酶通常是相对复杂和精细的，使得伴随的缓冲液、赋形剂等的选择至关重要。如果没有适当地保存酶，则可能需要大量的酶，就使得治疗成本高并且低效。

将一些常规的rhGAA产品作为无防腐剂的一次性小瓶中的冻干(冷冻-干燥)粉末提供给患者。然后必须将该rhGAA在小瓶中重构，然后稀释并且经静脉内给予。虽然冻干有助于在制造后保存酶，直到其准备好给予患者，但该方法过程中和该方法本身可能破坏酶。因此，必须非常小心地选择rhGAA配制品中的组分，这样使得它们有助于保持蛋白质的浓度和活性。

此外，重组酶通常在结构上不同于野生型酶。即使在重组酶中的氨基酸与它的野生型对应物可能一致，在碳水化合物化学上也可能有差异。因此，当发现新的重组酶时，必须开发针对酶的配制品，这些配制品对新发现的酶具有化学特异性。

因此，存在对储存和转运重组酶(如rhGAA)的配制品的持续需要，这些配制品保持酶活性和浓度。

发明内容

本发明的一方面涉及一种药物配制品。在实施例一中，该配制品包括：

(a)一种重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比于带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量时，该重组酸性α-葡糖苷酶包括增加的含量的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元；

(b)至少一种选自下组的缓冲液，该组由以下各项组成：柠檬酸盐、磷酸盐、及其组合；和

(c)至少一种选自下组的赋形剂，该组由以下各项组成：甘露醇、聚山梨醇酯80、及其组合，

其中该配制品具有从约5.0至约7.0的pH。

实施例二包括对实施例一所述的药物配制品的修饰，其中该重组酸性α-葡糖苷酶是以约5mg/mL至约50mg/mL的浓度存在。

实施例三包括对实施例一或二所述的药物配制品的修饰，其中该重组酸性α-葡糖苷酶是以约15mg/mL的浓度存在。

实施例四包括对实施例1-3中的任一项所述的药物配制品的修饰，其中该配制品具有从约5.5至约7.0的pH。

实施例五包括对实施例1-4中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该配制品具有约6.0的pH。

实施例六包括对实施例1-5中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该至少一种缓冲液包括柠檬酸盐。

实施例七包括对实施例1-6中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该至少一种缓冲液包括钾、钠、或铵盐。

实施例八包括对实施例1-7中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该至少一种缓冲液包括柠檬酸钠。

实施例九包括对实施例1-8中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该至少一种缓冲液是以约10mM至约100mM的浓度存在。

实施例十包括对实施例1-9中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该至少一种缓冲液是以约25mM的浓度存在。

实施例11包括对实施例1-10中任一项所述的药物配制品的修饰，其中排除了海藻糖、蔗糖、甘氨酸、或其组合。

实施例12包括对实施例1-11中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该至少一种赋形剂是以约10mg/mL至约50mg/mL的浓度存在的甘露醇。

实施例13包括对实施例1-12中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该至少一种赋形剂是以约0.2mg/mL至约0.5mg/mL的浓度存在的聚山梨醇酯80。

实施例14包括对实施例1-13中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该甘露醇是以约20mg/mL的浓度存在，并且该聚山梨醇酯80是以约0.5mg/mL的浓度存在。

实施例15包括对实施例1-14中任一项所述的药物配制品的修饰，进一步包括：(d)水。

实施例16包括对实施例1-15中任一项所述的药物配制品的修饰，进一步包括：(d)碱化剂；和/或(e)酸化剂，其中该碱化剂和酸化剂是以保持该药物配制品在从约5.0至约6.0的pH的量存在。

实施例17包括对实施例1-16中任一项所述的药物配制品的修饰，其中至少30％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子包括带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的一个或多个N-聚糖单元。

实施例18包括对实施例1-17中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该重组人酸性α葡糖苷酶包括每摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶中的平均从0.5至7.0摩尔的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。

实施例19包括对实施例1-18中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶包括每摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶中的平均至少3摩尔的甘露糖-6-磷酸残基和每摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶中的至少4摩尔的唾液酸残基。

实施例20包括对实施例1-19中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该重组人酸性α-葡糖苷酶包括七个潜在的N-糖基化位点，至少50％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子在第一位点处包括带有两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，至少30％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子在第二位点处包括带有一个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，至少30％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子在第四位点处包括带有两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，并且至少20％的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子在第四位点处包括带有一个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。

实施例21包括对实施例1-20中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该药物配制品基本上由以下各项组成：

(a)该重组酸性α-葡糖苷酶；

(b1)柠檬酸钠；

(b2)柠檬酸一水合物；

(c1)甘露醇；

(c2)聚山梨醇酯80；

(d)水；

(e)任选地，一种酸化剂；以及

(f)任选地，一种碱化剂，

其中该配制品具有从约5.0至约6.0的pH。

实施例22包括对实施例1-21中任一项所述的药物配制品的修饰，其中该药物配制品基本上由以下各项组成：

(a)该重组酸性α-葡糖苷酶，以约15mg/mL的浓度存在；

(b)柠檬酸钠缓冲液，以约25mM的浓度存在；

(c1)甘露醇，以约20mg/mL的浓度存在；

(c2)聚山梨醇酯80，以约0.5mg/mL的浓度存在；和

(d)水；

(e)任选地，一种酸化剂；以及

(f)任选地，一种碱化剂，

其中该配制品具有从约5.0至约6.0的pH。

本发明的另一方面涉及一种冻干的药物组合物。因此，实施例23涉及包括冻干之后的、实施例1-22中任一项所述的配制品的药物组合物。实施例24涉及一种包括冻干混合物的药物组合物，该冻干混合物包括：

(a)一种重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比于带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量时，该重组酸性α-葡糖苷酶包括增加的含量的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元；

(b)一种选自下组的缓冲液，该组由以下各项组成：柠檬酸盐、磷酸盐、及其组合；和

(c)至少一种选自下组的赋形剂，该组由以下各项组成：海藻糖、甘露醇、聚山梨醇酯80、及其组合。

本发明的另一方面涉及治疗庞贝氏病的方法。因此，实施例25包括向对其有需要的患者给予实施例1-22所述的药物配制品。实施例26包括对实施例25所述的方法的修饰，该方法进一步包括在向患者给予之前稀释该药物配制品。实施例27涉及治疗庞贝氏病的方法，该方法包括：重构实施例23或24所述的药物组合物；并且向对其有需要的患者给予经重构的药物组合物。

本发明的另一方面涉及制备上述药物配制品的方法。因此，实施例28涉及制备实施例1-22中任一项所述的药物配制品的方法，该方法包括：向水中添加至少一种缓冲液、至少一种赋形剂、和重组酸性α-葡糖苷酶以提供一种溶液；任选地调节该溶液的pH；并且任选地向该溶液中添加另外的水。实施例29包括对实施例28所述的方法的修饰，进一步包括对该溶液进行过滤。实施例30包括对实施例27或28所述的方法的修饰，进一步对该溶液进行储存。

附图说明

从以下书面描述和附图中，本发明的其他特征将变得明显，其中：

图1A示出非磷酸化高甘露糖聚糖、单-M6P聚糖、和双-M6P聚糖。

图1B示出M6P基团的化学结构。

图2A描述了rhGAA经由带有M6P的聚糖对靶组织(例如，患有庞贝氏病的受试者的肌肉组织)的生产性靶向。

图2B描述了对非靶组织(例如，肝脏和脾)或通过非M6P聚糖与非靶组织的结合的非生产性药物清除。

图3A和3B分别是示出

和

的CIMPR亲和色谱的结果的图。虚线是指M6P洗脱梯度。用M6P洗脱替代经由包含M6P的聚糖结合到CIMPR的GAA分子。如在图2A中所示，

中78％的GAA活性在添加M6P前被洗脱。图2B示出73％的GAA

活性在M6P添加前被洗脱。在

或

中只有22％或27％的rhGAA，分别用M6P洗脱。这些图示出，在这两种常规rhGAA产品中大多数rhGAA缺乏具有在靶肌肉组织中靶向CIMPR所需M6P的聚糖。

图4示出了用于用编码rhGAA的DNA转化CHO细胞的DNA构建体。用编码rhGAA的DNA构建体转化CHO细胞。

图5A和5B分别是示出

和ATB200 rhGAA的CIMPR亲和色谱的结果的图。从图5B可以看出，在ATB200 rhGAA中约70％的rhGAA包含M6P。

图6是示出在阴离子交换(AEX)柱上被捕获和不被捕获的ATB200 rhGAA的CIMPR亲和色谱的结果的图。

图7是示出

和ATB200 rhGAA的波利韦克斯(Polywax)洗脱曲线的图。

图8是示出相比鉴定为BP-rhGAA、ATB200-1、和ATB200-2的ATB200 rhGAA的三种不同的制剂，

的N-聚糖结构的概述的表。

图9A-9H示出了ATB200 rhGAA的位点特异性N-糖基化分析的结果。

图10A是比较ATB200 rhGAA的CIMPR结合亲和力(左轨迹线)与

的CIMPR结合亲和力(右轨迹线)的图。

图10B是比较

和ATB200 rhGAA的双-M6P含量的表。

图11A是在不同GAA浓度下，比较在正常成纤维细胞内的ATB200 rhGAA活性(左轨迹线)与

rhGAA活性(右轨迹线)的图。

图11B是在不同GAA浓度下，比较来自患有庞贝氏病的受试者的成纤维细胞中的ATB200 rhGAA活性(左轨迹线)与

rhGAA活性(右轨迹线)的表。

图11C是比较来自正常受试者和患有庞贝氏病的受试者的成纤维细胞的K_摄取的表。

图12A是示出与运载体(阴性对照)，与20mg/ml的阿葡糖苷酶α

或与5mg/kg、10mg/kg、或20mg/kg的ATB200接触后，相对于在小鼠心肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量的糖原量的图。

图12B是示出与运载体(阴性对照)，与20mg/ml阿葡糖苷酶α

或与5mg/kg、10mg/kg、或20mg/kg ATB200接触后，相对于在小鼠四头肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量的糖原量的图。

图12C是示出与运载体(阴性对照)，与20mg/ml阿葡糖苷酶α

或与5mg/kg、10mg/kg、或20mg/kg ATB200接触后，相对于在小鼠三头肌中的重组人酸性α-葡糖苷酶的剂量的糖原量的图。

图13是示出ATB200 rhGAA和分子伴侣麦格司他(miglustat)的组合在GAA基因敲除小鼠中比用不具有麦格司他分子伴侣的

或ATB200 rhGAA的治疗提供显著更好的糖原清除的表。

图14是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心脏、隔膜和比目鱼肌的一系列电子显微图，示出溶酶体相关膜蛋白(LAMP-1)水平。

图15是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的心脏和比目鱼肌的一系列电子显微图，示出用过碘酸–希夫(Schiff)试剂(PAS)染色的糖原水平。

图16是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌的一系列电子显微图(1000x)，用亚甲蓝染色来示出囊泡(用箭头指示)。

图17是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌的一系列电子显微图(40x)，示出自噬标记物微管相关蛋白质1A/1B-轻链3磷脂酰乙醇胺共轭物(LC3A II)和p62，胰岛素依赖性葡萄糖转运体GLUT4和胰岛素非依赖性葡萄糖转运体GLUT1的水平。

图18A和18B是示出在麦格司他存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的线悬挂和握力肌数据的图。

图19A-19G是示出来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的四头肌、三头肌和心脏细胞中的糖原水平的图。

图20是来自在麦格司他存在和不存在的情况下，用运载体、阿葡糖苷酶α、和ATB200治疗的野生型小鼠和Gaa-基因敲除小鼠的股外侧肌(VL)的肌纤维的一系列显微照片(100x和200x)，示出抗肌萎缩蛋白信号。

图21示出一个开放标记、固定顺序、递增剂量、第一次在人类中研究的、1/2期研究的研究设计，以在患有庞贝氏病的成年人中评估安全性、耐受性、PK、PD、以及ATB200的静脉内输注与口服麦格司他共同给予的效力。

图22A-22B是示出在给药5mg/kg、10mg/kg、或20mg/kg ATB200，20mg/kg ATB200和130mg麦格司他，或20mg/kg ATB200和260mg麦格司他后，在人类受试者血浆中的GAA总蛋白的浓度-时间曲线的图。

图22C是示出在给药20mg/kg ATB200，20mg/kg ATB200和130mg麦格司他，或20mg/kg ATB200和260mg麦格司他后，在人类受试者血浆中的GAA总蛋白的AUC的图。

图22D是示出在给药20mg/kg ATB200和260mg麦格司他后，在两名个体人类受试者血浆中的GAA总蛋白的浓度-时间曲线的图。

图23是示出在给药130mg或260mg麦格司他后，在人类受试者血浆中的麦格司他的浓度-时间曲线的图。

图24A-24D是示出在给予递增剂量的ATB200(5mg/kg、10mg/kg、和20mg/kg)，随后共同给予ATB200(20mg/kg)和麦格司他(130mg和260mg)后，在人类患者中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸磷酸激酶(CPK)和己糖四糖(Hex4)水平的变化的图。

具体实施方式

在描述本发明若干示例性实施例之前，应当理解的是，本发明不限于以下描述中列出的构建或方法步骤的细节。本发明能够有其他的实施例，并且能够以不同的方式被实施或进行。应当理解的是，以下列出的实施例不仅如下所列结合，而且可以根据本发明的范围以其他合适的组合而结合。

出人意料地发现，通过谨慎选择缓冲液和赋形剂，可以提供针对重组GAA蛋白ATB200的配制品，该配制品表现出优异的稳定性并且可以经受与配制品制备、储存、转运、重构和给予相关的过程，同时保持酶活性和效力，但是最小化了酶的沉淀。因此，本发明的一个方面涉及包括rhGAA、缓冲液、和至少一种赋形剂的配制品。在一个或多个实施例中，该rhGAA包括ATB200。在一些实施例中，该配制品是液体配制品。关于配制品的各种成分的细节和各种实施例如下。

定义

在本发明的上下文中以及在每个术语使用的特定上下文中,在本说明书中使用的术语通常具有其在本领域中的一般含义。某些术语在下文或说明书中的其他地方讨论，以向从业者提供描述本发明的组合物和方法以及如何制作和使用它们的另外指导。

在本说明书中，除非上下文需要，否则归因于表达语言或必要的含义，词语“包括(comprises)”，或变化形式如“包括(comprises或comprising)”是以包容性的意义使用，即用于指明所述特征的存在，但是不排除在本发明的不同实施例中存在或添加的其他特征。

如本文中所使用，术语“庞贝氏病”还称为酸性麦芽糖酶缺乏症、糖原贮积症II型(GSDII)、和糖原贮积病II型，旨在是指遗传性的溶酶体贮积失调，其特征在于在编码人酸性α-葡糖苷酶的GAA基因的突变。术语包括但不限于该疾病的早发型和晚发型形式，包括但不限于婴儿型、青年型和成年型庞贝氏病。

如本文中所使用，术语“酸性α-葡糖苷酶”旨在是指水解糖原、麦芽糖和异麦芽糖的D-葡萄糖单元之间的α-1,4键的溶酶体酶。替代名包括但不限于：溶酶体的α葡糖苷酶(EC:3.2.1.20)；糖化酶；1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶；淀粉葡糖苷酶；γ-淀粉酶和外切-1,4-α-葡糖苷酶。人酸性α葡糖苷酶是由GAA基因(美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因ID2548)编码的，该基因已经被定位至染色体17的长臂上(位置17q25.2-q25.3)。该全长野生型GAA氨基酸序列在SEQ ID NO:1中示出，如美国专利号8,592,362中所描述，并且具有基因库登录号AHE24104.1(GI:568760974)。

目前已经在人类GAA基因中鉴定了超过500个突变，其中的许多突变与庞贝氏病有关。导致该酸性α-葡糖苷酶的错折叠或错加工的突变包括T1064C(Leu355Pro)和C2104T(Arg702Cys)。另外，影响酶的成熟和加工的GAA突变包括Leu405Pro和Met519Thr。在氨基酸残基516-521处的保守六肽WIDMNE对于酸性α-葡糖苷酶蛋白的活性是必需的。如本文中所使用，缩写“GAA”旨在是指酸性α-葡糖苷酶，而斜体缩写“GAA”旨在是指编码人酸性α-葡糖苷酶的人类基因。因此，缩写“rhGAA”旨在是指重组人酸性α-葡糖苷酶。

如本文中所使用，术语“阿葡糖苷酶α”旨在是指被鉴定为[199-精氨酸,223-组氨酸]前体原-α-葡糖苷酶(人)的重组人酸性α-葡糖苷酶；化学文摘登记号420794-05-0。阿葡糖苷酶α被批准在美国由健赞公司在2016年1月作为产品

和

进行市场营销。

如本文中所使用，术语“ATB200”旨在是指共同未决的专利申请PCT/US2015/053252中所描述的重组人酸性α-葡糖苷酶，该专利申请的披露内容通过引用并入本文。

如本文中所使用，术语“聚糖”旨在是指共价结合至蛋白质或多肽上的氨基酸残基的多糖链。如本文中所使用，术语“N-聚糖”或“N-联聚糖”旨在是指通过共价结合至氨基酸残基的氮原子而附接至蛋白质或多肽上的氨基酸残基的多糖链。例如，N-聚糖可以共价结合至天冬酰胺残基的侧链氮原子上。聚糖可以包含一个或若干个单糖单元，并且该单糖单元可以共价连接以形成直链或支链。在至少一个实施例中，附接至ATB200的N-聚糖单元可以包括每一独立地选自N-乙酰葡糖胺、甘露糖、半乳糖或唾液酸的一个或多个单糖单元。蛋白质上的该N-聚糖单元可以通过任何适当的分析技术(例如，质谱)来确定。在一些实施例中，N-聚糖单元可以通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，利用仪器，如赛默科技(ThermoScientific)Orbitrap Velos Pro^TM质谱仪、赛默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM质谱仪或沃特斯(Waters)

G2-XS QTof质谱仪来确定。

如本文中所使用，术语“高甘露糖N-聚糖”旨在是指具有一个至六个或更多个甘露糖单元的N-聚糖。在至少一个实施例中，高甘露糖N-聚糖单元可以包含结合至天冬酰胺残基，并且进一步结合至分支聚甘露糖链的双(N乙酰葡糖胺)链。如在本文可互换地使用，术语“M6P”或“甘露糖-6-磷酸盐”旨在是指在位置6处磷酸化的甘露糖单元；即，具有与位置6处的羟基基团结合的磷酸基基团。在至少一个实施例中，一个或多个N-聚糖单元的一个或多个甘露糖单元是在位置6处磷酸化以形成甘露糖-6-磷酸单元。

如本文中所使用，术语“复合N-聚糖”旨在是指包含一个或多个半乳糖和/或唾液酸单元的N-聚糖。在至少一个实施例中，复合N-聚糖可以是高-甘露糖N-聚糖，其中一个或多个甘露糖单元进一步结合至各自独立地选自N乙酰葡糖胺、半乳糖和唾液酸的一个或多个单糖单元。

如本文中所使用，该“治疗有效剂量”和“有效量”旨在是指足够导致受试者治疗反应的酸性α-葡糖苷酶的量。治疗反应可以是使用者(例如，临床医生)将会识别为对治疗的有效响应的任何反应，包括本文所述和本领域已知的任何替代性临床标记物或症状。因此，在至少一个实施例中，治疗反应可以是庞贝氏病的一个或多个症状或标记物(例如本领域已知的那些)的改善或抑制。庞贝氏病的症状或标记物包括但不限于：降低的酸性α-葡糖苷酶组织活性；心肌病；心脏肥大；进行性肌无力(尤其在躯干或下肢)；深度张力减退；巨舌(并且在一些病例中，舌突出)；吞咽、吮吸，和/或摄食困难；呼吸功能不全；肝肿大(中等的)；面肌松弛；无反射；运动不耐受；劳力性呼吸困难；端坐呼吸；睡眠性呼吸暂停；上午头痛；嗜睡；脊柱前凸和/或脊柱侧弯；减少的深腱反射；下腰痛；以及不满足发展性的动作发展指标。

如本文中所使用，术语“酶替代疗法”或“ERT”旨在是指将非天然的、经纯化的酶引入具有这种酶缺乏的个体中。给予的蛋白质可以从自然来源或通过重组表达而获得。该术语也指将经纯化的酶引入个体，该个体在其他情况下需要或受益于给予的经纯化的酶。在至少一个实施例中，这样的个体患有酶缺乏症。该引入的酶可以是在体外产生的经纯化的重组酶，或从离体组织或体液例如像胎盘或动物奶，或从植物纯化的蛋白质。

如本文中所使用，术语“药学上可接受的”旨在是指当给予人类时，生理上可耐受的，并且通常不会产生不良反应的分子实体以及组合物。优选地，如本文中所使用，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或者在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的，用于在动物体内并且更具体地在人体内的使用。

如本文中所使用，术语“赋形剂”是指除了包括在配制品中的活性成分以外的物质，并且通常是无活性的材料。赋形剂可以帮助将活性药物输送到药物旨在生效的位置、控制活性药物的释放、或帮助溶解、或者可以发挥各种其他的功能。赋形剂的实例包括，但不限于：缓冲剂、表面活性剂、抗微生物剂、抗氧化剂、膨胀剂、稳定剂、张力调节剂等。

如本文中所使用，术语“缓冲液”旨在是指包含弱酸和其共轭弱碱的溶液，该溶液的pH仅随着碱或酸的添加而略有变化。如将在以下进一步解释，在一些实施例中，在药物配制品中使用的缓冲液是柠檬酸盐和/或磷酸盐缓冲液。

如本文中所使用，术语“受试者”或“患者”旨在是指人类或非人类动物。在至少一个实施例中，受试者是哺乳动物。在至少一个实施例中，受试者是人类。

如本文中所使用，术语“约”和“大约”旨在是指对于给定测量的性质或精度的测量的量而言可接受程度的误差。例如，如本领域中所理解的，误差的程度可以由为测量提供的有效数字的数值来指示，并且包括但不限于对于测量所报告的最精确的有效数字中±1的变化。典型的示例性误差程度是在给定值或值范围的20％(％)内，优选在10％内，并且更优选在5％内。可替代地，并且特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以意指是在给定值的一个数量级内，优选在5倍以内，并且更优选在2倍以内的值。除非另有说明，本文给出的数字量是大约的，意指当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。

在整篇说明书中对“一个实施例”、“某些实施例”、“各种实施例”、“一个或多个实施例”、或“实施例”的引用意指与实施例相联系地描述的具体的特征、结构、材料、或特性是包括在本发明的至少一个实施例中的。因此，在整篇说明书中多个位置中出现的短语如“在一个或多个实施例中”、“在某些实施例中”、“在各种实施例中”、“在一个实施例中”、或“在实施例中”不一定是指本发明中的相同实施例。此外，在一个或多个实施例中，具体的特征、结构、材料、或特性可以是以任何适合的方式进行组合。

ATB200 rhGAA

该配制品包括ATB200，该ATB200是适合在酶替代疗法中使用的重组GAA(rhGAA)蛋白质。以下提供了关于ATB200的结构和产生的细节，以及变体。

在至少一个实施例中，该ATB200在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比于带有阿葡糖苷酶α的一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量时，该ATB200包括增加的含量的带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元。在rhGAA上存在七个潜在的N-联糖基化位点。由于每个糖基化位点在存在的N-联寡糖(N-聚糖)的类型中是异质的，所以rhGAA由具有N-聚糖的蛋白的复杂混合物组成，这些N-聚糖对M6P受体和其他碳水化合物受体具有不同结合亲和力。包含具有一个M6P基团(单-M6P)的高甘露糖N-聚糖的rhGAA以低(约6,000nM)亲和力结合至CIMPR，而在相同N-聚糖上包含两个M6P基团(双-M6P)的rhGAA以高(约2nM)亲和力来结合。非磷酸化的、单-M6P、和双-M6P聚糖的代表性结构如图1A所示。甘露糖-6-P基团如图1B所示。一旦在溶酶体内，rhGAA可以酶促降解积累的糖原。然而，常规rhGAA具有低总水平的带有M6P和双-M6P的聚糖，并且因此靶向肌细胞很差，导致rhGAA至溶酶体的较差递送。rhGAA的生产性药物靶向如图2A所示。这些常规产品中的大多数rhGAA分子不具有磷酸化的N-聚糖，从而缺乏对CIMPR的亲和力。非磷酸化的高甘露糖聚糖还可以被甘露糖受体清除，该甘露糖受体导致ERT的非生产性清除(图2B)。

包含半乳糖和唾液酸的其他类型的N-聚糖、复合碳水化合物，也存在于rhGAA上。由于复合N-聚糖没有被磷酸化，所以它们对CIMPR没有亲和力。然而，具有暴露的半乳糖残基的复合型N-聚糖对肝脏肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体具有中度至高度亲和力，这导致rhGAA的快速非生产性清除(图2B)。

在至少一个实施例中，该酸性α-葡糖苷酶是本文称为ATB200的重组人酸性α-葡糖苷酶，如在共同未决的国际专利申请PCT/US 2015/053252中描述。ATB200已经示出以高亲和力结合阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)(K_D约2-4nM)，并且由庞贝氏成纤维细胞和骨骼肌成肌细胞(K_摄取约7nM-14nM)有效内化。ATB200在体内表征，并且示出具有比阿葡糖苷酶α(t_1/2约60min)更短的表观血浆半衰期(t_1/2约45min)。

在一个或多个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO:2中所示的野生型GAA氨基酸序列，该氨基酸序列对应于氨基酸残基57-952，并且与去除包括信号肽和前体肽的初始56个残基的天然细胞内蛋白酶解加工后的野生型(WT)人GAA一致。已经通过胰蛋白酶消化，随后进行液相色谱/质谱，以及通过氨基酸测序来证实ATB200氨基酸序列。相比之下，护理rhGAA酶替代疗法(ERT)(包含阿葡糖苷酶α的可商购的产品在大多数国家是

并且在美国是

健赞公司，赛诺菲公司(Sanofi Company))的现行标准不同于WT GAA并且包含3个氨基酸残基的取代：在位置199处组氨酸变为精氨酸、在位置223处精氨酸变为组氨酸、以及在位置780处缬氨酸变为异亮氨酸。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶在蛋白质的一个或多个氨基酸残基处经历翻译后修饰和/或化学修饰。例如，甲硫氨酸和色氨酸残基可以经历氧化反应。作为另一个实例，天冬酰胺残基可以经历脱酰胺作用以形成天冬氨酸。作为又另一个实例，天冬氨酸可以经历异构化作用以形成异天冬氨酸。因此，在一些实施例中，该酶初始表达为具有如在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且该酶经历这些翻译后修饰和/或化学修饰中的一个或多个。此类修饰也在本披露的范围内。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有如在SEQ ID NO:1中所示的野生型GAA氨基酸序列，如在美国专利号8,592,362中所描述的，并且具有基因库登录号AHE24104.1(GI:568760974)。在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶是葡糖苷酶α，这是由最主要的九个观察到的GAA基因的单倍型编码的人酸性α-葡糖苷酶。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶初始表达为具有在如SEQ ID NO:1中所示的野生型GAA的全长952氨基酸序列，并且该重组人酸性α-葡糖苷酶经历去除一部分氨基酸，例如，前56个氨基酸的细胞内加工。因此，由宿主细胞分泌的该重组人酸性α-葡糖苷酶可以具有比在细胞内初始表达的重组人酸性α-葡糖苷酶更短的氨基酸序列。在至少一个实施例中，该更短的蛋白质可以具有在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，其与SEQ IDNO:1不同仅在于已经去除了包括信号肽和前体肽的前56个氨基酸，因此产生具有896个氨基酸的蛋白质。氨基酸数目的其他变化也是可能的，如相对由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2描述的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个缺失、取代和/或插入。在一些实施例中，该rhGAA产物包括具有不同氨基酸长度的重组人酸性α-葡糖苷酶分子的混合物。

在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶在蛋白质的一个或多个氨基酸残基处经历翻译后修饰和/或化学修饰。例如，甲硫氨酸和色氨酸残基可以经历氧化反应。作为另一个实例，N-末端谷氨酰胺可以形成焦谷氨酸。作为另一个实例，天冬酰胺残基可以经历脱酰胺作用以形成天冬氨酸。作为又另一个实例，天冬氨酸残基可以经历异构化作用以形成异天冬氨酸。作为又另一个实例，蛋白质中未配对的半胱氨酸残基可以与游离谷胱甘肽和/或半胱氨酸形成二硫键。因此，在一些实施例中，该酶初始表达为具有如在SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列，并且该酶经历一个或多个这些翻译后修饰和/或化学修饰。此类修饰也在本披露的范围内。

优选地，不多于70％、65％、60％、55％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％，或5％的总重组人酸性α-葡糖苷酶分子缺少带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元，或缺少结合阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)的能力。可替代地，30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、<100％或更多的该重组人酸性α-葡糖苷酶分子包括带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的至少一个N-聚糖单元，或具有结合CIMPR的能力。

该重组人酸性α-葡糖苷酶分子在它们的聚糖上可以具有1、2、3或4个甘露糖-6-磷酸(M6P)基团。例如，在重组人酸性α-葡糖苷酶分子上的唯一一个N-聚糖可以带有M6P(单-磷酸化的)，单个N-聚糖可以带有两个M6P基团(双-磷酸化的)，或相同的重组人酸性α-葡糖苷酶分子上的两个不同的N-聚糖可以各自带有单个M6P基团。重组人酸性α-葡糖苷酶分子还可以具有不带有M6P基团的N-聚糖。在另一个实施例中，平均来说，N-聚糖包含大于3mol/mol的M6P和大于4mol/mol的唾液酸，这样使得该重组人酸性α-葡糖苷酶包括平均至少3摩尔的甘露糖-6-磷酸残基/摩尔的重组人酸性α-葡糖苷酶，以及至少4摩尔的唾液酸/摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶。平均来说，在重组人酸性α-葡糖苷酶上的至少约3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％，或10％的总聚糖可以处于单-M6P聚糖形式，例如，约6.25％的总聚糖可以携带单个M6P基团，并且平均来说，在重组人酸性α-葡糖苷酶上的总聚糖的至少约0.5％、1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％是处于双-M6P聚糖形式，并且平均来说，少于25％的总重组人酸性α-葡糖苷酶不包含结合CIMPR的经磷酸化的聚糖。

该重组人酸性α-葡糖苷酶可以具有平均含量的携带M6P的N聚糖，该平均含量范围从0.5至7.0mol/mol重组人酸性α-葡糖苷酶，或子范围的任意中间值，该子范围包括0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0mol/mol重组人酸性α-葡糖苷酶。可以将该重组人酸性α-葡糖苷酶分级以提供以不同平均数量带有M6P或带有双M6P的聚糖的重组人酸性α-葡糖苷酶制剂，从而通过选择特定级分或通过选择性组合不同级分以允许进一步定制靶向在目标组织中的溶酶体的重组人酸性α-葡糖苷酶。

在一些实施例中，平均来说，该重组人酸性α-葡糖苷酶将带有每摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶中2.0至8.0摩尔的M6P。这一范围包括所有的中间值和子范围，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、和8.0mol M6P/mol重组人酸性α-葡糖苷酶。

在重组人酸性α-葡糖苷酶上高达60％的N-聚糖可以被完全地唾液酸化，例如，高达10％、20％、30％、40％、50％、或60％的该N-聚糖可以被完全地唾液酸化。在一些实施例中，从4％至20％的总N-聚糖被完全地唾液酸化。在其他实施例中，在重组人酸性α-葡糖苷酶上不多于5％、10％、20％或30％的N-聚糖携带唾液酸和末端半乳糖残基(Gal)。这一范围包括所有的中间值和子范围，例如，在重组人酸性α-葡糖苷酶上7％至30％的总N-聚糖可以携带唾液酸和末端半乳糖。在又其他实施例中，在重组人酸性α-葡糖苷酶上不多于5％、10％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的N-聚糖仅具有末端半乳糖，并且不包含唾液酸。这一范围包括所有的中间值和子范围，例如，在组合物中重组人酸性α-葡糖苷酶上从8％至19％的总N-聚糖可以仅具有末端半乳糖，并且不包含唾液酸。

在本发明的其他实施例中，在重组人酸性α-葡糖苷酶上的40％、45％、50％、55％至60％的总N聚糖是复合物型N-聚糖；或重组人酸性α-葡糖苷酶上不多于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％的总N-聚糖是混合型N-聚糖；在重组人酸性α-葡糖苷酶上不多于5％、10％、或15％的高甘露糖型N-聚糖是非-磷酸化的；在重组人酸性α-葡糖苷酶上至少5％或10％的高甘露糖型N-聚糖是单-M6P磷酸化的；和/或在重组人酸性α-葡糖苷酶上至少1％或2％的高甘露糖型N-聚糖是双-M6P磷酸化的。这些值包括所有的中间值和子范围。重组人酸性α-葡糖苷酶可以满足上述描述的一个或多个含量范围。

在一些实施例中，平均来说，该重组人酸性α-葡糖苷酶将带有2.0至8.0摩尔的唾液酸残基/摩尔重组人酸性α-葡糖苷酶。这一范围包括所有的中间值和子范围，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0mol残基/mol重组人酸性α-葡糖苷酶。不受理论的约束，据信带有唾液酸残基的N-聚糖单元的存在可以通过脱唾液酸蛋白受体来防止重组人酸性α-葡糖苷酶的非生产性清除。

在一个或多个实施例中，在重组人溶酶体蛋白质的某些N-糖基化位点处该rhGAA具有M6P和/或唾液酸单元。例如，在rhGAA上存在七个潜在的N-联糖基化位点。这些潜在的糖基化位点在SEQ ID NO:2的以下位置处：N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869。相似地，对于SEQ ID NO:1的全长氨基酸序列，这些潜在的糖基化位点是在以下位置处：N140、N233、N390、N470、N652、N882和N925。取决于天冬酰胺残基的位置，rhGAA的其他变体可以具有相似的糖基化位点。通常，除了X不能是HIS或PRO以外，在蛋白质氨基酸序列中的ASN-X-SER或ASN-X-THR序列指示潜在的糖基化位点。

在不同的实施例中，该rhGAA具有某一N-糖基化图。在一个或多个实施例中，在第一N-糖基化位点处至少20％的该rhGAA是经磷酸化的(例如，SEQ ID NO:2的N84以及SEQ IDNO:1的N140)。例如，在第一N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第一N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第一N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。

在一个或多个实施例中，在第二N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N177，以及SEQ ID NO:1的N223)，至少20％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，在第二N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第二N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第二N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。在一个或多个实施例中，在第三N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N334，以及SEQ ID NO:1的N390)至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第三N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是磷酸化的。例如，该第三N-糖基化位点可以具有作为主要种类的非-磷酸化的高甘露糖聚糖、二-、三-、和四-触角复合物聚糖，以及混合聚糖的混合物。在一些实施例中，在第三N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第四N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N414，以及SEQ ID NO:1的N470)，至少20％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，在第四N-糖基化位点处，至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA可以被磷酸化。这种磷酸化作用可以是单-M6P和/或双-M6P单元的结果。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有单-M6P单元。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA带有双-M6P单元。在一些实施例中，在第四N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第五N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N596，以及SEQ ID NO:1的N692)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第五N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，该第五N-糖基化位点可以具有作为主要种类的岩藻糖化的二-触角复合聚糖。在一些实施例中，在第五N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第六N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N826，以及SEQ ID NO:1的N882)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第六N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。例如，该第六N-糖基化位点可以具有作为主要种类的二-、三-、和四-触角复合聚糖的混合物。在一些实施例中，在第六N-糖基化位点处，至少3％、5％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的该rhGAA是经唾液酸化的。

在一个或多个实施例中，在第七N-糖基化位点处(例如，SEQ ID NO:2的N869，以及SEQ ID NO:1的N925)，至少5％的该rhGAA是经磷酸化的。在其他实施例中，在第七N-糖基化位点处，少于5％、10％、15％、20％或25％的该rhGAA是经磷酸化的。在一些实施例中，在第七N-糖基化位点处，少于40％、45％、50％、55％、60％或65％的该rhGAA具有任何聚糖。在一些实施例中，在第七N-糖基化位点处，至少30％、35％或40％的该rhGAA具有一个聚糖。

在各种实施例中，该rhGAA具有平均0-5mol的海藻糖含量/mol的rhGAA、10-30mol的GlcNAc含量/mol的rhGAA、5-20mol的半乳糖含量/mol的rhGAA、10-40mol的甘露糖含量/mol的rhGAA、2-8mol的M6P含量/mol的rhGAA、以及2-8mol的唾液酸含量/mol的rhGAA。在各种实施例中，该rhGAA具有平均2-3mol的海藻糖含量/mol的rhGAA、20-25mol的GlcNAc含量/mol的rhGAA、8-12mol的半乳糖含量/mol的rhGAA、22-27mol的甘露糖含量/mol的rhGAA、3-5mol的M6P含量/mol的rhGAA、以及4-7mol的唾液酸含量/mol的rhGAA。

该重组人酸性α-葡糖苷酶优选地由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，如CHO细胞系GA-ATB200或ATB200-001-X5-14，或由此类CHO细胞培养物的次代培养物或衍生物产生。表达酸性α-葡糖苷酶的等位变体或其他变体酸性α-葡糖苷酶氨基酸序列(如与SEQ ID NO:1具有至少90％、95％或99％一致性的那些)的DNA构建体可以在CHO细胞中构建并表达。这些变体酸性α-葡糖苷酶氨基酸序列相对SEQ ID NO:1可以包含缺失、取代和/或插入，如对于由SEQID NO:1描述的氨基酸序列具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个缺失、取代和/或插入。本领域普通技术人员可以选择适合于转化CHO细胞用于产生此类DNA构建体的替代载体。

可以使用不同比对算法和/或程序来计算两个序列之间的一致性，包括可用作GCG序列分析包(威斯康辛大学，麦迪逊市，威斯康辛州)的一部分的FASTA或BLAST，并且可以与例如，默认设置一起使用。例如，考虑与本文所述的特定多肽具有至少90％、95％、或99％一致性，并且优选地表现出基本相同功能的多肽，连同编码此类多肽的多核苷酸。除非另有说明，相似性分数将基于BLOSUM62的使用。当使用BLASTP时，相似性百分比是基于BLASTP阳性得分，并且序列一致性百分比是基于BLASTP一致性得分。BLASTP“一致性”示出相同的高分序列对中总残基的数量和分数；并且BLASTP“阳性”示出具有正值的比对分数并且彼此相似的残基的数量和分数。本披露考虑和涵盖具有与本文披露的氨基酸序列具有这些程度的一致性或相似性或任何中间程度的一致性或相似性的氨基酸序列。使用遗传密码推导出的相似多肽的多核苷酸序列，并且可以通过常规手段(具体地通过使用遗传密码来逆转录其氨基酸序列)获得。

在一些实施例中，可以使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生重组人酸性α-葡糖苷酶，该重组人酸性α-葡糖苷酶具有靶向阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CIMPR)和细胞溶酶体的优异能力，连同降低其体内非生产性清除的糖基化模式。可以诱导这些细胞表达比常规重组人酸性α-葡糖苷酶产物(如阿葡糖苷酶α)具有显著更高水平的带有一个或多个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的重组人酸性α-葡糖苷酶。由这些细胞产生的该重组人酸性α-葡糖苷酶，例如，由ATB200例证的，比常规的酸性α-葡糖苷酶(例如

)，具有显著更多的肌细胞靶向的甘露糖-6-磷酸盐(M6P)和双-甘露糖-6-磷酸盐N-聚糖残基。不受理论的约束，据信这种广泛的糖基化允许ATB200酶被更有效地吸收到靶细胞中，并且因此比其他重组人酸性α-葡糖苷酶(例如像，具有远远更低的M6P和双-M6P含量的阿葡糖苷酶α)更有效地从循环中清除。已经示出ATB200有效地结合CIMPR，并且被骨骼肌和心肌有效吸收，并且具有提供有利的药代动力学曲线并且减少体内非生产性清除的糖基化模式。

相比例如阿葡糖苷酶α，还考虑ATB200的大量糖基化可以有助于ATB200免疫原性的降低。如本领域普通技术人员将理解的，用保守的哺乳动物糖对蛋白质的糖基化通常增强产物溶解度，并且减少产物的聚集和免疫原性。糖基化通过最小化蛋白质聚集连同通过从免疫系统中屏蔽免疫原性蛋白质表位来间接改变蛋白质免疫原性(工业指导-治疗性蛋白质产品的免疫原性评估(Guidance for Industry-Immunogenicity Assessment forTherapeutic Protein Products)，美国卫生和人类服务部，食品与药品管理局，药物评估和研究中心，生物制剂评估和研究中心，2014年8月)。因此，在至少一个实施例中，该重组人酸性α-葡糖苷酶的给予不会引起抗药物抗体。在至少一个实施例中，相比通过给予葡糖苷酶α引起的抗药物抗体的水平，该重组人酸性α-葡糖苷酶的给予引起受试者中抗药物抗体的更低发生率。

如在共同未决的国际专利申请PCT/US 2015/053252中所述，可以使用细胞(如，CHO细胞)来产生其中所述的rhGAA，并且该rhGAA可以用于本发明。此类CHO细胞系的实例是产生如本文所述的rhGAA组合物的GA-ATB200或ATB200-001-X5-14，或其次代培养物。此类CHO细胞系可以包含编码GAA的多核苷酸的基因的多个拷贝，如5、10、15或20或更多个拷贝。

该高M6P和双-M6P rhGAA(如ATB200rhGAA)可以通过用编码GAA的DNA构建体转化CHO细胞来产生。尽管CHO细胞之前被用于制备rhGAA，但是没有意识到转化的CHO细胞可以按产生具有高含量的靶向CIMPR的M6P和双-M6P聚糖的rhGAA的方式进行培养和选择。

出人意料地，发现可以转化CHO细胞系，选择产生rhGAA的转化体，该rhGAA包含高含量的带有靶向CIMPR的M6P或双-M6P的聚糖，并稳定表达该高-M6P rhGAA。因此，用于制备这些CHO细胞系的方法还描述在共同未决的国际专利申请PCT/US 2015/053252中。该方法涉及用编码GAA或GAA变体的DNA转化CHO细胞，选择将编码GAA的DNA稳定整合到其染色体中并稳定表达GAA的CHO细胞，并且选择表达具有高含量的带有M6P或双-M6P的聚糖的GAA的CHO细胞，以及任选地选择具有含高唾液酸含量的N-聚糖和/或具有含低非磷酸化的高-甘露糖含量的N-聚糖的CHO细胞。通过培养该CHO细胞系，并且从CHO细胞培养物中回收所述的组合物，这些CHO细胞系可以用于产生rhGAA和rhGAA组合物。

在一个或多个实施例中，该ATB200以从约5mg/mL至约50mg/mL的范围的量存在。在另外的实施例中，该ATB200在以从约5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、或12mg/mL至约18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、或50mg/mL的范围的量存在。在一些实施例中，该ATB200以约5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、20mg/mL、21mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、24mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、27mg/mL、28mg/mL、29mg/mL、或30mg/mL的量存在。在另外的实施例中，该ATB200以约15mg/mL的量存在。

pH和缓冲液

该配制品的pH可以在从约5.0至约7.0或约5.0至约6.0的范围内。在一个或多个实施例中，pH在从约5.5至约6.0的范围内。在一些实施例中，该配制品具有约5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、或6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、或6.5的pH。通常，所述组分的量将产生在从约5.0至约6.0范围内的pH。然而，可以通过使用pH调节剂(即，碱化剂和酸化剂)，如，氢氧化钠和/或盐酸，将pH调节至目标pH。

该配制品还包括选自下组的缓冲液，该组由以下各项组成：柠檬酸盐、磷酸盐、及其组合。如本文中所使用，“缓冲液”是指包含帮助防止pH变化的弱酸和其共轭碱的缓冲溶液。该柠檬酸盐和/或磷酸盐可以是柠檬酸钠或磷酸钠。其他盐包括钾和铵盐。在一个或多个实施例中，该缓冲液包括柠檬酸盐。在另外的实施例中，该缓冲液包括柠檬酸钠(例如，脱水柠檬酸钠和柠檬酸一水合物的混合物)。在一个或多个实施例中，包括柠檬酸盐的缓冲溶液可以包括柠檬酸钠和柠檬酸。在一些实施例中，柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液二者均存在。

赋形剂

该配制品还包括至少一种赋形剂。本发明的一些实施例包括有助于张力，充当膨胀剂或充当稳定剂的赋形剂。在一个或多个实施例中，至少一种赋形剂选自下组，该组由以下各项组成：甘露醇、聚山梨醇酯、及其组合。

在一个或多个实施例中，该赋形剂包括可以充当张力调节剂和/或膨胀剂的成分，特别是甘露醇。张力剂是帮助保证该配制品具有与人血相似或相同的渗透压的组分。膨胀剂是增加这些配制品(例如，冻干的)的质量，并且为该块状物提供足够结构的成分。

在一个或多个实施例中，张力剂和/或膨胀剂的总量在从约10mg/mL至约50mg/mL的量的范围内。在另外的实施例中，张力剂和/或膨胀剂的总量在从约10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、或15mg/mL至约16mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、或50mg/mL的量的范围内。在一些实施例中，该张力剂和/或膨胀剂包括甘露醇。在一个或多个实施例中，甘露醇以从约10mg/mL至约50mg/mL的量存在。在另外的实施例中，甘露醇以从约10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、或15mg/mL至约16mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、或50mg/mL的量存在。在又一另外的实施例中，甘露醇以约10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL、或20mg/mL的量存在。在一些实施例中，甘露醇是唯一的张力剂和/或膨胀剂。其他张力剂和/或膨胀剂的实例包括氯化钠、蔗糖、和海藻糖。

在一些实施例中，赋形剂包括可以充当稳定剂(如聚山梨醇酯80)的成分。稳定剂是可以防止或最小化在疏水的空气-水的界面表面的聚集体形成的化合物。在一些实施例中，稳定剂是表面活性剂。在一个或多个实施例中，稳定剂的总量在从约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的范围内。在另外的实施例中，稳定剂的总量在从约0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、或0.5mg/mL至约0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、或1.0mg/mL的范围内。在又一另外的实施例中，稳定剂的总量是约0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、或1.0mg/mL。在一些实施例中，聚山梨醇酯80是唯一的稳定剂。因此，在一个或多个实施例中，聚山梨醇酯80在从约0.1mg/mL至约1.0mg/mL的范围内。在另外的实施例中，聚山梨醇酯80在从约0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、或0.5mg/mL至约0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、或1.0mg/mL的范围内。在又一另外的实施例中，聚山梨醇酯80是约0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、或1.0mg/mL。

在一个或多个实施例中，可能希望从该配制品中排除某些化合物。例如，在制备用于治疗给定疾病的配制品时，将希望排除会加重基础性疾病的某些化合物。如上述所讨论的，患有庞贝氏病的个体具有降低的分解糖原的能力或缺乏分解糖原的能力。若干通常使用的赋形剂，如蔗糖、海藻糖、和甘氨酸，可以转变为身体中的葡萄糖，这些葡萄糖反过来加重庞贝氏病。因此，在一些实施例中，从该配制品中排除蔗糖、海藻糖、和/或甘氨酸。类似地，可以排除在给定的某些背景中不是最适合于该配制品的某些组分。例如，在一些实施例中，可以排除泊洛沙姆。

示例性实施例

在一个或多个实施例中，该配制品包括以下各项或基本上由其组成：

(a)ATB200(例如，一种重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比于带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量时，该重组酸性α-葡糖苷酶包括增加的含量的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元)；

(b)至少一种选自下组的缓冲液，该组由以下各项组成：柠檬酸盐、磷酸盐、及其组合；

(c)至少一种选自下组的赋形剂，该组由以下各项组成：甘露醇、聚山梨醇酯80、及其组合；和

其中该配制品具有从约5.0至约6.0或7.0的pH。

在一些实施例中，该配制品包括以下各项或基本上由其组成：

(a)ATB200(例如，一种重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比于带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量时，该重组酸性α-葡糖苷酶包括增加的含量的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元)；

(b1)柠檬酸钠；

(b2)柠檬酸一水合物；

(c1)甘露醇；

(c2)聚山梨醇酯80；

(d)水；

(e)任选地，一种酸化剂；以及

(f)任选地，一种碱化剂，

其中该配制品具有从约5.0至约6.0或7.0的pH。在另外的实施例中，该pH在从约5.5至约6.0的范围内。在又一另外的实施例中，pH是约6.0。

在具体的实施例中，该配制品包括

(a)ATB200(例如，一种重组酸性α-葡糖苷酶，其中该重组酸性α-葡糖苷酶在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，并且当相比于带有阿葡糖苷酶α的一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元的含量时，该重组酸性α-葡糖苷酶包括增加的含量的带有一个或两个甘露糖-6-磷酸残基的N-聚糖单元)，以约5mg/mL-30mg/mL或约15mg/mL的浓度存在；

(b)柠檬酸钠缓冲液，以约10mM-100mM或约25mM的浓度存在；

(c1)甘露醇，以约10mg/mL-50mg/mL、或约20mg/mL的浓度存在；

(c2)聚山梨醇酯80，以约0.1mg/mL-1mg/mL、或约0.5mg/mL的浓度存在；和

(d)水；

(e)任选地，一种酸化剂；以及

(f)任选地，一种碱化剂，

其中该配制品具有从约5.0至约6.0或7.0的pH。在另外的实施例中，该pH在从约5.5至约6.0的范围内。在又一另外的实施例中，pH是约6.0。

配制品的制备

本发明的另一方面涉及制备本文所述的这些配制品的方法。在一个或多个实施例中，该配制品可以从酶溶液中制备。使用本领域已知的方法可以将该溶液浓缩，并可以根据需要将缓冲液更换为目标浓度和多种缓冲液。然后可以添加另外的组分(例如，赋形剂和pH调节剂)。然后可以过滤该配制品，并且置于储存容器中并且储存。

在一个或多个实施例中，制备本文所述的这些药物配制品中的任一项的方法包括：向水中添加至少一种缓冲液、至少一种赋形剂、和重组酸性α-葡糖苷酶以提供一种溶液；任选地调节该溶液的pH；并且任选地向该溶液中添加另外的水。在另外的实施例中，该方法进一步包括对该溶液进行过滤。在又一另外的实施例中，该方法进一步对该溶液进行储存。

用于生产如本文所述的配制品的示例性、非限制性的方法如下：

1.在合适的制造容器中添加大约85％-90％的批量体积的注射用水。

2.添加并且溶解所期望的赋形剂和缓冲液(例如，柠檬酸钠二水合物、柠檬酸一水合物、聚山梨醇酯80、甘露醇)，并且将其混合直到溶解。

3.添加ATB200药品，并且混合。

4.用调节剂(例如，盐酸或氢氧化钠溶液)根据需要将pH调节至目标pH(例如，6±0.1)。

5.将足够的注射用水添加至最终体积，并且混合。

6.通过无菌滤器过滤该溶液至无菌接收器中。

7.将药物产品溶液无菌地装入小瓶中，并且插入塞子。

8.将所有小瓶盖帽，并且在2℃-8℃下储存。

在一个或多个实施例中，事先制备的该配制品将处于液体形式。即，该配制品包括水。该液体配制品可以经受冻干(冷冻干燥)过程，以提供块状物或粉末。因此，本发明的另一方面涉及冻干后的、包括以上所述的这些配制品中任一项的药物组合物。该冻干的混合物可以包括ATB200，缓冲液(选自下组，该组由以下各项组成：柠檬酸盐、磷酸盐、及其组合)，和至少一种赋形剂(选自下组，该组由以下各项组成：海藻糖、甘露醇、聚山梨醇酯80、及其组合)。在一些实施例中，可以向该冻干的混合物中添加其他成分(例如，其他赋形剂)。包括该冻干配制品的药物组合物能以小瓶提供，然后可以将该药物组合物储存、转运、重构和/或给予患者。

治疗和给予患者的方法

本发明的另一方面涉及治疗庞贝氏病的方法和/或用于治疗庞贝氏病的本文所述的这些配制品的用途。该配制品可以按事先制备的或按冻干和重构后给予。因此，在一个或多个实施例中，该方法包括向对其有需要的患者给予以上所述的这些药物配制品中的任一项。在其他实施例中，该方法包括重构经冻干的药物组合物，并且将经重构的药物组合物给予对其有需要的患者。在一些实施例中，该经重构的药物组合物与冻干之前和/或事先制备的药物配制品具有相似或相同的组成。在任一情况下，在给予患者之前可以将该药物配制品或经重构的药物组合物稀释。在另外的实施例中，将该药物配制品或经重构的药物组合物经静脉内给予。

在一个或多个实施例中，用于静脉内给予的组合物是在无菌等渗水缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂以缓解注射部位的疼痛。通常，成分以单位剂量形式分开或混合在一起提供，例如，作为在气密容器中的干燥冻干粉或无水浓缩物，气密容器如指明活性剂的量的安瓿或小药囊。在通过输注给予组合物时，可以用包含无菌药用级的水、盐水或右旋糖/水的输液瓶进行分配。在通过注射给予组合物时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，这样使得可以在给予前将这些成分混合。

在其他实施例中，通过直接给予至靶组织(如至心脏或骨骼肌(例如，肌内))或神经系统(例如，直接注射到脑中；脑室内；鞘内)来给予药物配制品或经重构的药物组合物。如果需要，可以同时使用多于一个途径。

将该药物配制品或经重构的组合物以治疗有效量给予(例如，当以规律间隔给予时，足以治疗疾病的剂量，如通过减轻与疾病相关的症状，预防或延迟疾病的发病，和/或减轻疾病的症状的严重性或频率实现的)。在治疗疾病中治疗有效的量将取决于疾病影响的性质和程度，并且可以通过标准临床技术来确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α葡糖苷酶以约1mg/kg至约100mg/kg，如约5mg/kg至约30mg/kg，典型地约5mg/kg至约20mg/kg的剂量通过静脉内输注给予。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、或约100mg/kg的剂量通过静脉内输注给予。在至少一个实施例中，将该重组人酸性α-葡糖苷酶以约20mg/kg的剂量通过静脉内输注给予。对具体个体的有效剂量可以是随着时间变化的(例如，增加的或减少的)，这取决于该个体的需要。例如，在生理疾病或躯体应激的时候，或如果抗-酸性α-葡糖苷酶抗体存在或增加，或如果疾病症状恶化，该量可以增加。

以规律的间隔给予的重组人酸性α-葡糖苷酶(或包含重组人酸性α-葡糖苷酶的组合物或药物)的治疗有效量取决于疾病影响的性质和程度，以及持续进行的基础。如本文中所使用，以“规律的间隔”给予表示，将该治疗有效量定期地给予(如区别于一次性剂量)。该间隔可以通过标准临床技术来确定。在优选的实施例中，将重组人酸性α-葡糖苷酶以每月、每两个月；每周；每周两次；或每日给予。单个个体的给予间隔不需要是固定的间隔，但是可以是随时间变化的，其取决于该个体的需要。例如，在生理疾病或躯体应激的时候，如果抗-重组人酸性α-葡糖苷酶抗体存在或增加，或如果疾病症状恶化，可以减小剂量之间的间隔。

在一个或多个实施例中，将该药物配制品或经重构的组合物与药物分子伴侣共同给予，如口服给予该分子伴侣并且静脉内给予该药物配制品或经重构的组合物。在各种实施例中，该药物分子伴侣是麦格司他。在至少一个实施例中，将麦格司他以约200mg至约400mg的口服剂量，或以约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、或约400mg的口服剂量给予。在至少一个实施例中，将麦格司他以约233mg至约400mg的口服剂量给予。在至少一个实施例中，将麦格司他以约250mg至约270mg的口服剂量，或以约250mg、约255mg、约260mg、约265mg、或约270mg的口服剂量给予。在至少一个实施例中，将麦格司他以约260mg的口服剂量给予。

在至少一个实施例中，将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶同时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他和该重组人酸性α-葡糖苷酶顺序给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前少于三小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约两小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前少于两小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约1.5小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约一小时给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约50分钟至约70分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约55分钟至约65分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约30分钟给予在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约25分钟至约35分钟给予。在至少一个实施例中，将麦格司他在该重组人酸性α-葡糖苷酶给予之前约27分钟至约33分钟给予。

试剂盒

本发明的另一方面涉及包括本文所述的这些药物配制品(包括冻干后的)的试剂盒。在一个或多个实施例中，该试剂盒包括含有这些药物配制品(冻干之前或之后)的容器(例如，小瓶、管子、袋子等)以及重构、稀释和给予的说明书。

实例

酶实例1：现有

和

rhGAA产品的局限性

为了评估rhGAA在

和

(目前仅有的针对庞贝氏病的批准的治疗)中的能力，将这些rhGAA制剂注射到CIMPR柱(其结合具有M6P基团的rhGAA)上，并且随后用游离M6梯度进行洗脱。将级分在96孔板中收集，并且通过4MU-α-葡萄糖底物测定GAA活性。结合和未结合的rhGAA的相对量是基于GAA活性来确定的，并且报告为总酶的分数。

图3A-B示出了与常规的ERT(

和

)相关的问题：在

中73％的rhGAA(图3B)和在

中78％的rhGAA(图3A)未结合至CIMPR，参见在每个图中最左侧的峰。只有在

中27％的rhGAA和在

中的22％的rhGAA包含M6P，该M6P可以有效地将它靶向至肌细胞上的CIMPR。

和

的有效剂量对应于包含M6P的rhGAA的量，该M6P靶向肌细胞上的CIMPR。然而，在这样的两种常规的产品中大部分的rhGAA不靶向目标肌细胞上的CIMPR受体。给予常规rhGAA(其中大部分的rhGAA不靶向肌肉细胞)增加了对非靶向rhGAA的过敏反应或诱导免疫的风险。

酶实例2：产生具有高含量的带有单-或双-M6P的N-聚糖的ATB200rhGAA的CHO细胞 的制备

用表达rhGAA的DNA转染CHO细胞，随后选择产生rhGAA的转化体。用于用编码rhGAA的DNA转化CHO细胞的DNA构建体在图4中示出。用表达rhGAA的DNA转染CHO细胞，随后选择产生rhGAA的转化体。

转染后，用缺乏次黄嘌呤/胸苷(-HT)的介质来选择包含稳定整合的GAA基因的DG44CHO(DHFR-)细胞。通过

甲氨蝶呤处理(MTX，500nM)来诱导在这些细胞中的GAA表达的扩增。通过GAA酶活性测定来鉴定大量表达的GAA的细胞池，并且用于建立产生rhGAA的单个克隆。在半固体培养基板上产生单个克隆，通过ClonePix系统挑选，并且转移至24深孔板。针对GAA酶活性测定单个克隆，以鉴定表达高水平GAA的克隆。用于确定GAA活性的条件培养基使用了4-MU-α-葡糖苷酶底物。针对生存力、生长能力、GAA生产率、N-聚糖结构和稳定的蛋白表达来进一步评估如通过GAA酶测定所测量的产生更高水平的GAA的克隆。使用这一程序分离表达具有增强的单-M6P或双-M6P N-聚糖的rhGAA的CHO细胞系，包括CHO细胞系GA-ATB-200。

酶实例3：ATB200rhGAA的捕获和纯化

在摇瓶中产生根据本发明所述的多批次的rhGAA，并且在灌注生物反应器中使用CHO细胞系GA-ATB-200和CIMPR来测量结合。针对来自不同生产批次的经纯化的ATB200rhGAA，观察到与在图5B和图6中所示那些相似的CIMPR受体结合(约70％)，表明可以一致地产生ATB200 rhGAA。如图3A-B和5A-B所示，

和

rhGAA比ATB200rhGAA表现出显著更少的CIMPR结合。

酶实例4：ATB200与

的分析比较

根据末端磷酸根，使用弱阴离子交换(“WAX”)液相色谱，进行ATB200 rhGAA的分级。通过用增加量的盐洗脱ERT来产生洗脱曲线。通过UV(A280nm)监测该曲线。从CHO细胞获得ATB200 rhGAA，并且进行纯化。

获得自商业来源。

在其洗脱曲线的左侧显示出一个高峰。ATB200 rhGAA显示洗脱在

右侧的四个显著的峰(图7)。这证实ATB200 rhGAA被磷酸化到比

更大的程度，因为这种评估是通过末端电荷而不是CIMPR亲和力进行的。

酶实例5：ATB200 rhGAA的寡糖特性

通过MALDI-TOF来评估经纯化的ATB200 rhGAA和

聚糖，以确定在每个ERT上发现的单个聚糖结构(图8)。发现ATB200样品比

包含更少量的非-磷酸化的高-甘露糖型N-聚糖。ATB200中比

中更高含量的M6P聚糖更有效地将ATB200rhGAA靶向肌细胞。由MALDI确定的高百分比的单-磷酸化和双-磷酸化的结构与CIMPR曲线一致，其说明ATB200与CIMPR受体的显著更大的结合。经由MALDI-TOF质谱的N-聚糖分析证实了平均每个ATB200分子包含至少一个中性的双-M6P N-聚糖结构。ATB-200 rhGAA上的这种更高的双-M6P N-聚糖含量与M6P受体板结合测定中与CIMPR的高亲和力结合直接相关(KD约2-4nM)(图10A)。

还使用两种不同的LC-MS/MS分析技术，针对位点特异性N-聚糖曲线分析了ATB200rhGAA。在第一次分析中，在LC-MS/MS分析之前，将该蛋白质变性、还原、烷基化并且消化。蛋白质变性和还原期间，将200μg的蛋白质样品、5μL 1mol/L tris-HCl(终浓度50mM)、75μL8mol/L胍HCl(终浓度6M)、1μL 0.5mol/L EDTA(终浓度5mM)、2μL 1mol/L DTT(终浓度20mM)以及

水添加至1.5mL试管中，以提供100μL的总体积。在干浴中，将该样品混合，并且在56℃下孵育30分钟。烷基化作用期间，将该变性的和还原的蛋白质样品与5μL 1mol/L碘乙酰胺(IAM，终浓度50mM)混合，然后在黑暗中在10℃-30℃下孵育30分钟。烷基化作用之后，将400μL预冷的丙酮添加至该样品中，并且将该混合物在-80℃制冷中冷冻4小时。然后将该样品以13000rpm在4℃下离心5min，并且去除该上清液。将400μL预冷的丙酮添加至球粒中，然后将其以13000rpm在4℃下离心5min，并且去除该上清液。然后将该样品在黑暗中，在冰上风干以去除丙酮残余物。将40μL的8M尿素和160μL的100mM NH₄HCO₃添加至该样品中以溶解蛋白质。然后，在胰蛋白酶消化期间，添加50μg的该蛋白质使胰蛋白酶消化缓冲液达100μL终体积，并且添加5μL 0.5mg/mL胰蛋白酶(20/1w/w的蛋白与酶的比率)。将该溶液混合均匀，并且在37℃下孵育过夜(16±2小时)。添加2.5μL 20％TFA(终浓度0.5％)以淬灭该反应。然后使用赛默科技Orbitrap Velos Pro^TM质谱仪分析该样品。

在第二LC-MS/MS分析中，根据相似的变性、还原、烷基化和消化程序来制备ATB200样品(除了使用碘乙酸(IAA)代替IAM作为烷基化试剂之外)，并且然后使用赛默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM质谱仪进行分析。

将第一和第二分析的结果在图9A-9H中示出。在图9A-9H中，第一次分析的结果由左条(深灰色)表示，并且来自第二次分析的结果由右条(浅灰色)表示。在图9B-9G中，代表聚糖的符号命名法是根据瓦尔基A(Varki,A.)，卡明斯，R.D.(Cummings,R.D.),艾斯克J.D.(Esko J.D.)等人,糖生物学要领(Essentials of Glycobiology)，第2版(2009)。

从图9A-9G可以看出，这两个分析提供了相似的结果，尽管结果之间存在一些变化。该变化可以归因于多个因素，包括使用的仪器和N-聚糖分析的完整性。例如，如果一些种类的磷酸化的聚糖未被鉴定和/或未被定量，则磷酸化聚糖的总数可能是未被充分表示的，并且在该位点带有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是未被充分表示的。作为另一个实例，如果一些种类的非-磷酸化的聚糖未被鉴定和/或未被定量，则非-磷酸化的聚糖的总数可能是未被充分表示的，并且在该位点带有磷酸化的聚糖的rhGAA的百分比可能是过度表示的。图9A示出了ATB200的N-糖基化位点占有率。从图9A可以看出，第一、第二、第三、第四、第五和第六N-糖基化位点大部分被占据，其中这两种分析检测出超过90％且高达约100％的具有在每个潜在位点处检测到的聚糖的ATB200酶。然而，该第七潜在的N-糖基化位点在大约一半的时间时被糖基化。

图9B示出了第一位点N84的N-糖基化图。从图9B可以看出，主要的聚糖种类是双-M6P聚糖。第一和第二分析二者检测出超过75％的该ATB200在第一位点处具有双-M6P聚糖。

图9C示出了第二位点N177的N-糖基化图。从图9C可以看出，主要的聚糖种类是单-M6P聚糖和非磷酸化高甘露糖聚糖。第一和第二分析二者检测出超过40％的该ATB200在第二位点处具有单-M6P聚糖。

图9D示出了第三位点N334的N-糖基化图。从图9D可以看出，这些主要的聚糖种类是非磷酸化高甘露糖聚糖，二-、三-、和四-触角复合聚糖，以及混合聚糖。第一和第二分析二者检测出超过20％的该ATB200在第三位点处具有唾液酸残基。

图9E示出了第四位点N414的N-糖基化图。从图9E可以看出，主要的聚糖种类是双-M6P和单-MGP聚糖。第一和第二分析二者检测出超过40％的该ATB200在在第四位点处具有双-M6P聚糖。第一和第二分析二者检测出超过25％的该ATB200在第四位点具有单-M6P聚糖。

图9F示出了第五位点N596的N-糖基化图。从图9F可以看出，主要的聚糖种类是海藻糖化的二-触角复合聚糖。第一和第二分析二者检测出超过70％的该ATB200在第五位点处具有唾液酸残基。

图9G示出了第六位点N826的N-糖基化图。从图9G可以看出，主要的聚糖种类是二-、三-、和四-触角复合聚糖。第一和第二分析二者检测出超过80％的该ATB200在第六位点处具有唾液酸残基。

在第七位点处，N869的糖基化分析示出了大约40％的糖基化，最常见的聚糖是A4S3S3GF(12％)、A5S3G2F(10％)、A4S2G2F(8％)、和A6S3G3F(8％)。

图9H示出了在七个潜在的N-糖基化位点中的每个位点处的磷酸化作用的汇总。从图9G可以看出，第一和第二分析二者检测出在第一、第二、和第四位点处的高磷酸化作用水平。两个分析检测出超过80％的该ATB200在第一位点处是单-或二-磷酸化的，超过40％的该ATB200在第二位点处是单-磷酸化的，并且超过80％的该ATB200在第四位点出是单-或二-磷酸化的。

根据亲水相互作用液相色谱-荧光检验-质谱(HILIC-FLD-MS)法进行ATB200的另一个聚糖分析。

将HILIC-FLD-MS分析的结果提供于下表A中。在表A中，在三位数中的第一个数字表明聚糖中的分支数目，第二个数字表明核心海藻糖单元的数目，并且第三个数字表明末端唾液酸单元的数目。使用该命名法，“303”代表三-触角聚糖(该第一个3)，其具有0个核心海藻糖(该第二个0)和3个末端唾液酸(该最后一个3)；“212”代表1个二-触角聚糖，其具有1个核心海藻糖和2个末端唾液酸；“404”代表四-触角聚糖，其具有0个核心海藻糖和4个末端唾液酸，以此类推。

表A

基于该HILIC-FLD-MS分析，预期所测试的ATB200具有平均2mol-3mol的海藻糖含量/mol ATB200、20mol-25mol的GlcNAc含量/mol ATB200、8mol-12mol的半乳糖含量/molATB200、22mol-27mol的甘露糖含量/mol ATB200、3mol-5mol的M6P含量/mol ATB200、以及4mol-7mol的唾液酸含量/mol ATB200。

酶实例6：ATB200的CIMPR亲和力的特性

除了具有可以结合至CIMPR的更大百分比的rhGAA之外，重要的是理解该相互作用的质量。使用CIMPR板结合测定来确定

和ATB200 rhGAA受体结合。简言之，使用CIMPR-包被的板来捕获GAA。将不同浓度的rhGAA应用于固定的受体，并且洗去未结合的rhGAA。通过GAA活性来确定剩余rhGAA的量。如图10A所示，ATB200 rhGAA比

结合CIMPR显著更好。

图10B示出了根据本发明的

常规rhGAA、和ATB200中的双-M6P聚糖的相对含量。对于

平均只有10％的分子具有双-磷酸化的聚糖。将其与ATB-200(其中平均每个rhGAA分子具有至少一个双-磷酸化的聚糖)对比。

酶实例7：ATB200 rhGAA比

更有效地被成纤维细胞内化

使用正常的和庞贝氏成纤维细胞细胞系来比较ATB200和

rhGAA的相对细胞摄取。比较涉及5-100nM的根据本发明的ATB200 rhGAA与10-500nM常规rhGAA

16-hr孵育之后，用TRIS碱将外部rhGAA灭活，并且在收获细胞之前用PBS将细胞洗涤3次。通过4MU-α-葡萄糖苷水解测量内化的GAA，并且相对于总细胞的蛋白质作图，并且结果出现在图11A-B中。

还示出ATB200 rhGAA有效内化到细胞中(图11A和11B)，分别地示出ATB200 rhGAA内化到正常的成纤维细胞和庞贝氏成纤维细胞中，并且其比常规的

rhGAA更大的程度进行内化。ATB200 rhGAA以约20nM使细胞受体饱和，然而需要约250nM的

从这些结果外推的摄取效率常数(K_摄取)对于ATB200为2-3nm，并且对于

是56nM，如图11C所示。这些结果表明ATB200 rhGAA是针对庞贝氏病的良好靶向的治疗。

酶实例8：在GAA-基因敲除小鼠中的糖原减少

图12A至12C示出了给予阿葡糖苷酶α

和ATB200对Gaa基因敲除小鼠中糖原清除的影响。给予动物两次IV推注给予(每隔一周)；在最后一次剂量后两周收获组织，并且针对酸性α-葡糖苷酶活性和糖原含量进行分析。

从图12A至12C看出，发现ATB200以剂量依赖性方式在酸性α-葡糖苷酶(Gaa)基因敲除小鼠中耗尽组织糖原。在Gaa基因敲除小鼠中，20mg/kg剂量的ATB200一致地去除了比5和10mg/kg剂量水平更大比例的储存的糖原。然而，如在图12A至12C看出，相比以20mg/kg给予

以5mg/kg给予ATB200示出小鼠心脏和骨骼肌(四头肌和三头肌)中相似的糖原减少，然而相比

以10mg/kg和20mg/kg给药ATB200示出在骨骼肌中显著更好的糖原水平减少。

图15示出给予阿葡糖苷酶α

和ATB200对Gaa基因敲除小鼠中糖原清除的影响用

或ATB200，20mg/kg每隔一周IV注射4次治疗十二周龄的GAA KO小鼠。在最后一次酶剂量后14天收集组织用于糖原测量。图13示出在四头肌和三头肌骨骼肌中的糖原的相对减少，相比

ATB200比

提供更多的糖原减少。

酶实例9：GAA-基因敲除小鼠中的肌肉生理学和形态学

每隔一周以20mg/kg向Gaa基因敲除小鼠给予两次重组人酸性α-葡糖苷酶(阿葡糖苷酶α或ATB200)的IV推注。单独用运载体治疗对照小鼠。重组人酸性α-葡糖苷酶的最后一次给药后两周，收获比目鱼肌、四头肌和隔膜组织。分析皮肤和隔膜组织，针对糖原水平是通过用高碘酸-希夫试剂(PAS)染色，并且针对溶酶体增殖是通过测量溶酶体相关膜蛋白(LAMP1)标记物的水平，该标记物在在庞贝氏病中上调。将包埋入环氧树脂(Epon)的四头肌的半薄切片用亚甲基蓝染色，并且通过电子显微镜(1000x)观察以确定囊泡存在的程度。用免疫组织化学来分析四头肌肌肉样品，以确定自噬标记物微管相关蛋白1A/1B-轻链3磷脂酰乙醇胺共轭物(LC3A II)和p62，胰岛素依赖性葡萄糖转运蛋白GLUT4和胰岛素非依赖性葡萄糖转运蛋白GLUT1。

在类似的研究中，每隔一周以20mg/kg向Gaa基因敲除小鼠给予四次重组人酸性α-葡糖苷酶(阿葡糖苷酶α或ATB200)的IV推注。单独用运载体治疗对照小鼠。在重组人酸性α-葡糖苷酶最后一次给药后两周收获心肌组织，并且进行分析，针对糖原水平是通过用高碘酸-希夫试剂(PAS)染色，并且针对溶酶体增殖是通过测量LAMP1的水平。

如在图14看出，相比用阿葡糖苷酶α的常规治疗，给予ATB200示出心脏、隔膜、和骨骼肌(比目鱼肌)组织中溶酶体增殖的减少。另外，如在图15中看出，相比用阿葡糖苷酶α的常规治疗，给予ATB200示出心脏和骨骼肌(比目鱼肌)组织中糖原水平的点状降低。

同样，如在图16中看出，相比未治疗的小鼠和用阿葡糖苷酶α治疗的小鼠，ATB200显著降低了Gaa基因敲除小鼠的四头肌的肌纤维中的囊泡数目。如在图17看出，相比野生型小鼠，在Gaa敲除小鼠中，LC3 II和p62的水平均增加。另外，相比野生型小鼠，在Gaa基因敲除小鼠中，胰岛素依赖性葡萄糖转运体GLUT4和胰岛素非依赖性葡萄糖转运体GLUT1的水平增加。与酸性α-葡糖苷酶缺乏相关的升高的GLUT4和GLUT1水平可以有助于增加的葡萄糖摄取到肌纤维中和增加的基础的和食物摄取后的糖原合成。

酶实例10：GAA-基因敲除小鼠中的肌肉功能

在12次每两周给予的长期研究中，如通过握力测试和线悬挂测试(图18A-18B)所测量的，20mg/kg ATB200加上10mg/kg麦格司他从基线逐渐地增加了Gaa KO小鼠的功能性肌肉力量。在大部分的研究中，在相同的条件下，观察到接受相同ERT剂量(20mg/kg)的阿葡糖苷酶α

治疗的小鼠下降(图18A-18B)。至于短期研究，在3个月(图19A-19C)和6个月(图19D-19G)的治疗后，ATB200/麦格司他比阿葡糖苷酶α具有实质更好的糖原清除率。相比阿葡糖苷酶α，在3个月治疗后，ATB200/麦格司他还减少了自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白(dysferlin)的细胞内积累(图20)。在图18A中，^*表示相比单独

有统计学意义(p<0.05，两侧t检验)。在图19A-19G中，^*表示相比单独

有统计学意义(p<0.05，在单向方差分析下使用邓尼特(Dunnett)方法的多重比较)。

总之，这些数据表明ATB200/麦格司他有效地靶向肌肉来逆转细胞功能障碍并且改进肌肉功能。重要的是，在肌肉构造中的明显改进以及减少的自噬和LAMP1和戴斯富林蛋白的细胞内积累可以是与功能性肌肉力量改进相关的改进的肌肉生理学的良好替代。这些结果表明，监测自噬和这些关键的肌肉蛋白可以是评估Gaa KO小鼠中庞贝氏病的有效性治疗性治疗的合理、实用的方法，其可以证明是来自临床研究中肌肉活检的有用的生物标记物。

图20示出在有或没有麦格司他的情况下，6个月的ATB200给予降低了Gaa Ko小鼠中抗肌萎缩蛋白的细胞内积累。与用

相比，ATB200±麦格司他的抗肌萎缩蛋白积累减少更多。

配制品实例1：PH和缓冲液

配制品实例的分析方法

除非另有说明，否则根据以下方法进行关于外观、pH、蛋白质浓度等的本文所述的实例的分析。

外观

使用YB-2灯箱，在黑色和白色背景下，检查样品的外观(包括澄清度、颜色、和可见颗粒)。

pH

用SevenMulti^TM pH计测量样品pH。

蛋白质浓度

通过UV280读数，使用NanoDrop^TM 2000分光光度计确定蛋白质浓度。每次用2.5μL样品，将所有的测量重复两次，并且取平均值。

尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)

对于pH和缓冲液、冻融、和赋形剂实例，使用

G3000 SWXL柱(东曹生物科学公司(Tosoh Bioscience)，7.8×300mm，5μm，25℃)在安捷伦(Agilent)1260HPLC系统上进行蛋白质单体和其高分子量种类和片段的分离。该流动相由50mM磷酸钠、100mM氯化钠、和20mM柠檬酸钠(pH 6.0±0.2)组成。该色谱系统使用1.0ml/min的流速、50-μL进样量(典型地是1mg/mL)、以及具有等度梯度的20-min运行时间。通过UV检测器在280nm(参照：360nm)下检测信号。

在PS80实例中，使用BioSep^TM-SEC-s3000柱(菲罗门(Phenomenex)，7.8×300mm，5μm，25℃)在安捷伦1260HPLC系统上进行蛋白质单体和其高分子量种类和片段的分离。该流动相由50mM磷酸钠和100mM氯化钠(pH6.2±0.2)组成。该色谱系统使用1.15ml/min的流速、50-μL进样量(典型地是1mg/mL)、以及具有等度梯度的25-min运行时间。通过UV检测器在280nm下检测信号。

SDS-PAGE(非还原的)

这些可报告的值是非还原的SDS-PAGE中的蛋白质的纯度和分子量。在过量SDS的存在下将样品变性成非还原的以获得均匀的负电荷。在施加的电场(165V)中，将这些SDS包被的种类基于它们的表观分子量通过聚丙烯酰胺凝胶进行分离。通过考马斯蓝染色检测这些分离的条带。

4-MUG酶活性

将10μl的样品稀释并且水解(通过GAA，37℃持续60min)，以产生荧光产物4-MU。向其中添加125μl的1M甘氨酸或0.1M NaOH，以终止该反应。

用样品来分析一系列的4-MU标准，以产生基于荧光信号的标准校准曲线。通过软件介导的与标准曲线的比较来实现RFU至4-MU量的转换，该转换根据4参数逻辑回归模型是回归的。然后基于该4-MU标准曲线计算在样品中的GAA酶活性(nmol所释放的4-MU/hr/mlGAA)。

4-MUG酶浓度

将10μl的样品和GAA参照标准品稀释并且水解(通过GAA，37℃持续60min)，以产生荧光产物4-MU。向其中添加125μl的1M NaOH，以终止该反应。

用样品来分析一系列的GAA参照标准品，以产生基于荧光信号的标准校准曲线。通过软件介导的与标准曲线的比较来实现RFU至4-MU量的转换，该转换根据4参数逻辑回归模型是回归的。然后基于该GAA标准曲线计算在样品中的GAA酶浓度(nmol所释放的4-MU/hr/ml GAA)。

动态光散射(DLS)

使用微量移液器将40μL未稀释的样品的整分试样转移至40μL的一次性试管中。针对每个样品进行一式三份的测量。

颗粒：HIAC

用经过滤的参照缓冲液将200μl的每个样品稀释成2000μl。将该样品测试三次，并且每次测试使用450μl。报告每个尺寸(每ml中1μm、3μm、5μm、10μm、和25μm)的颗粒的平均数。

米克罗卡(MicroCal)差示扫描量热法(DSC)

通过检测作为温度函数的增加样品和参照的温度所需的热量差异，使用毛细管细胞差示扫描量热法(DSC)来测量蛋白质的热稳定性。具体地，它被用于测量热转换的中点(Tm)，该中点是溶液中蛋白质的相对稳定性的指标。

用参照缓冲液将样品稀释至约1mg/mL。将400μL的参照缓冲液的整分试样添加至96孔板的每个奇数孔中，同时将400μL的每个样品的整分试样添加至对应的偶数孔中。该扫描温度范围是从10℃至110℃。

调整的差示扫描量热法(mDSC)

使用耐驰(Netzsch)差示扫描量热仪(DSC 204F1)测试玻璃化转变(Tg’)温度和共晶温度(Te)。将15μL的样品加载于加载盘中用于测试。首先，将该温度以10℃/min的速率从20℃降至-60℃，并且在此步骤过程中从冷却曲线上获得Te值。其次，将该温度以10℃/min的速率从-60℃升至40℃，并且从加热曲线来分析Tg’值。

M6P

通过水解(4M TFA，100℃，4h)，将M6P从样品中释放，并且通过离心真空蒸发器进行干燥。在分析之前，将经干燥的M6P和参照标准品悬浮于经纯化的水中。使用CarboPacPA10 BioLCTM分析柱(4mm×250mm，3.5μm，

30℃)和CarboPac PA10 BioLCGuard柱(4mm×50mm，3.5μm，

30℃)。该流动相由相A(100mM NaOH)和相B(1M NaOAc，100mMNaOH)组成。该色谱系统使用1ml/min的流速、25-μL进样量、和具有梯度的30-min运行时间。通过脉冲安培检测来测试信号。基于该标准曲线来计算样品中的M6P含量。

唾液酸

通过水解(2M HAc，80℃，2h)将唾液酸从药物分子中释放，并且然后标记所有样品，并且用DMB(50℃，在黑暗中17±0.5h)将标准溶液混合，然后使用Zorbax Eclipse PlusC18柱(安捷伦公司，4.6mm×100mm，3.5μm，45℃)在安捷伦1260HPLC系统上进行分离。该流动相由相A(9％ACN，7％MeOH)和相B(100％ACN)组成。该色谱系统使用0.5ml/min的流速、20μL进样量、和具有梯度的20min运行时间。通过荧光检测器(λex＝373nm，λem＝448nm)检测信号。基于标准曲线计算样品中的Neu5Gc和Neu5Ac含量。

制备十种缓冲液配制品，这些缓冲液配制品具有从4.0至8.0范围的pH，含有25mM磷酸钠或25mM柠檬酸钠，具有或不具有50mM NaCl，如表1所示。ATB200 4-MUG酶浓度是1mg/mL。

表1配制品组成：

^*使用HCl将pH调节至4.0。

样品制备

用于在pH和缓冲液评估研究中使用的材料如在下表2中所述。

表2 pH和缓冲液评估研究的原材料信息：

^*该ATB200酶溶液的缓冲液是50mM磷酸钠(pH 6.2)、50mM NaCl、2％甘露醇。

^**消光系数是1.51AU*mL*mg^-1*cm^-1

制备25mM磷酸钠缓冲液，该缓冲液包含处于pH 4.0(P40)、5.0(P50)、6.0(P60)、7.0(P70)、和8.0(P80)的50mM NaCl，处于pH 6.0(无NaCl的P60)的25mM磷酸钠缓冲液，和包含50mM NaCl的处于pH 5.0(C50)、5.5(C55)、6.0(C60)、和6.5(C65)的柠檬酸钠缓冲液。对于pH 4.0，使用HCl调节在磷酸钠缓冲液中的pH(pH 4.0)。

在15℃和3500rpm下，将该ATB200酶溶液首先使用超滤离心装置浓缩40min。之后，在15℃和3500rpm下通过两轮超过滤(持续50min和55min)，将经浓缩的酶溶液进行缓冲液更换成为以上描述的三种不同的缓冲液。随后针对蛋白质浓度和4-MUG酶浓度来分析经缓冲液更换的酶溶液。

最后，添加合适体积的每种缓冲液以将最终ATB200酶浓度调节至1.0mg/mL。最终的ATB200浓度通过UV_A280吸光度和4-MUG酶浓度二者证实。

用0.22-μm聚醚砜(PES)滤器无菌过滤这些溶液。

根据分析测试的样品量要求，将每种配制品以500μL至1000μL的填充体积无菌地填充到生物安全罩中的2-mL玻璃小瓶中。将小瓶塞好盖子，并且然后在填充后立即卷曲密封。

样品测试

将每个配制品的小瓶在5℃和40℃下储存长达8周，并且在25℃下以100rpm在定轨摇床上搅动长达5天(参见表3)。将这些配制品在初始(T0)、5天(5D)、2周(2W)、4周(4W)、和8周(8W)取样,如在表3中所描述，用于外观、pH、UV浓度、4-MUG酶浓度、SEC、HIAC、DLS、4-MUG酶活性、和DSC的测试。

表3在ATB200pH和缓冲液评估研究中的研究参数：

X：外观、pH、UV浓度、4-MUG酶浓度、SEC、HIAC*、DLS、4-MUG酶活性

Y：DSC

^*：仅针对T0样品和搅动样品来测试HIAC。

结果

热稳定性结果-米克罗卡(MicroCal)DSC

热稳定性测量的结果示出在下表4中：

表4：

<u>样品</u>	<u>Tm发生(℃)</u>	<u>TM1(℃)</u>
			P40	56.34	66.25
P50	63.49	73.42
			P60	60.47	72.05
P70	47.55	64.09
			P80	37.21	47.72
无NaCl的P60	61.22	72.25
			C50	62.66	72.60
C55	62.89	73.39
			C60	59.26	70.83
C65	53.45	67.24

更高的Tm_发生表明在具体配制品中的蛋白质的更好的热稳定性。因此，表现出最高热稳定性的配制品是P50、C55、C50、无NaCl的P60、P60、和C60。这些结果表明ATB200酶在弱酸性缓冲液中比在碱性条件下具有更好的热稳定性。

外观-搅动

将该搅动研究的外观的结果示出在下表5中：

表5：

从表中可以看出，5天搅动后，无NaCl的P60、C50、C55、C60、和C65保持无色、清澈、并且无可见颗粒，但是在P40、P50、P60、P70、和P80中观察到可见颗粒。该数据示出搅动后，柠檬酸钠缓冲液比磷酸钠缓冲液更好地稳定配制品。

pH

pH测量的结果示出在下表6中：

表6：

从该数据看出，具有50mM NaCl的范围从pH 5.0至6.5的磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能够自始至终保持指定的pH。在缓冲液更换，浓度调节，在5℃和40℃下储存8周，以及搅动过程中，这些样品的pH没有显著变化。

相比之下，在5℃和40℃下储存8周后，无NaCl的P60中pH下降，并且在缓冲液更换和在两种温度下储存8周后，P40中pH增加。然而，搅动不会导致P40和无NaCl的P60二者的pH的任何变化。

蛋白质浓度

蛋白质浓度测量的结果示出在以下表7中：

表7：

在5℃下储存8周，并且搅动5天不会影响该蛋白质浓度。在所有的配制品中没有观察到显著变化。

相比之下，在40℃储存期间，蛋白质浓度在P50、P60、无NaCl的P60、C60、和C65中略微增高，在C50中略微降低，并且在P40、P70、P80、C55中保持不变。因为在40℃样品中形成了可见颗粒的，在12000rpm下离心1分钟后再次测试40℃/8周样品。这些结果示出离心后，在包含颗粒的样品中蛋白质浓度的降低，其表明在该样品中存在的颗粒对在280nm处的吸附有影响。

4-MUG酶浓度

4-MUG酶浓度测量的结果在下表8中示出：

表8：

缓冲液更换后，P80的4-MUG酶浓度立即降至0.27mg/mL。这表明pH 8.0显著影响酶活性。在5℃和40℃下储存2周后，酶浓度降至零。除了P80，在5℃下储存8周后，大多数配制品的酶浓度是稳定的，并且在P40中的酶浓度略微下降。

相比之下，40℃储存明显影响酶浓度。2周后，P70中的酶浓度不存在了，P40和C65中的酶浓度显著下降，并且P50中的酶浓度明显降低。4周后，酶浓度继续下降。最后，8周后，酶浓度接近零(P40和C65中)，在pH 5.0缓冲液中降至0.33mg/mL(P50和C50)，并且在pH 5.5至6.0缓冲液中降至0.5mg/mL至0.7mg/mL(P60、无NaCl的P60、C55、和C60)。它们中，最终无NaCl的P60具有最高的酶浓度(0.73mg/mL)。这些结果表明酶浓度在关于pH 5.5至6.0范围内的4-MUG酶浓度下被绝大部分地保护，但是在磷酸钠缓冲液和柠檬酸钠缓冲液之间没有显著差异。

搅动研究期间，除了P80，酶浓度没有显著变化。

4-MUG酶活性

4-MUG酶活性测量的结果在下表9中示出：

表9：

4-MUG酶活性的变化趋势与4-MUG酶浓度的变化趋势平行。

在测试条件下，P80示出在4-MUG酶活性中的最差稳定性。缓冲液更换后，P80的酶活性具有大约70％的下降。随后，在5℃和40℃下储存2周后，酶活性几乎全丧失。碱性条件显著地影响酶活性。

在5℃下储存8周后，PS80的酶活性几乎完全丧失；在P40中发现20％的降低；在其他配制品中没有观察到显著的变化。

相比之下，40℃储存导致在所有配制品中酶活性的明显降低。2周后，P70中的酶活性几乎完全丧失，P40和C65中的酶活性显著降低，并且P50中的酶活性明显下降。酶活性从2周至4周以不同程度持续下降。在研究末期，C65中的酶活性几乎完全丧失，P40中的酶活性降至211.5U/L，P50和C50中的酶活性降至约1550U/L，并且C60、P60、和C55中的酶活性降至2500至3000U/L。在这些配制品中，无NaCl的P60保持了3549.7U/L的最高活性。

基于4-MUG酶活性的测试结果，该酶在pH 5.5至6.0的范围内的是最稳定的，但是在磷酸钠缓冲液和柠檬酸钠缓冲液之间没有看出差别。

纯度：SEC-HPLC

SEC测量的结果在下表10中示出：

表10：

缓冲液更换后，相比起始材料(SEC单体：98.9％)，一些配制品中的SEC纯度显著降低。在P80中，SEC纯度降至44.9％，并且形成54.5％的聚集体；在P40中，相比更换DS前，存在4.9％的单体百分比下降，其中相比HMW分子(4.7％VS1.3％)形成更多的LMW片段；在P70中，发现单体百分比的略微降低(1.2％)，对应于聚集体的增加；在无NaCl的P60中，存在2.3％的单体百分比降低。

8周，5℃储存后，相比T0，配制品P60、无NaCl的P60、和C65的SEC纯度保持良好，但是其他配制品的SEC纯度显著降低。在P40中，SEC纯度显著降至74.3％(T0：94.0％)，并且形成23.4％的LMW片段；在P50和C50中，存在单体的轻微下降(5％至7％)，和LMW片段的增加(5％至7％)。在P80中，发现18.2％的下降，其主要转移至聚集(14.8％)。从而在P70中，存在10.7％的单体下降，和9.2％的HMW片段增加。在C55中，单体、HMW、和LMW百分比轻微变化。

40℃下储存导致所有配制品的戏剧性单体百分比变化。在P70和P80中，2周后，该SEC单体降至0至0.5％，并且在C65中剩余22.4％，并且8周后它们主要转变为聚集体。在P40、P50、和C50中，单体显著下降(50％至90％)，主要归因于LMW片段的形成。8周后，在P60、无NaCl的P60、和C60中，SEC单体百分比分别降至80.8％、83.6％、和77.5％。

这些SEC结果表明对于ATB200稳定性，pH 6.0表现最好，并且在磷酸钠缓冲液和柠檬酸钠缓冲液之间没有发现显著性差异。此外，在这些配制品中氯化钠的不存在不会影响ATB200稳定性。

搅动研究期间，在P60和无NaCl的P60中SEC纯度略微下降。在P40、P50、P70、P80、C50、C60、和C65中，单体百分比明显降低。

多分散性：DLS

DLS测量的结果在下表11中示出：

表11：

DLS数据反映蛋白质分子的流体动力学半径和颗粒的多分散性。在一些样品中观察到乳白色，因此使用DLS来分析不可见颗粒。该DLS结果与来自外观的指征通常是一致的。

在8周的5℃储存期间，在P60、P70、P80、无NaCl的P60、和C60中，蛋白质分子的流体动力学半径和多分散性指标(PDI)二者是稳定的并且是可比较的。在所有其他五种配制品中，流体动力学半径从约10nm转变为几百nm，特别是在8周后的P40中。

在8周的40℃储存期间，在所有配制品中，流体动力学半径和PDI发生了巨大的变化。然而，由于聚集体的复杂特征，基于该结果很难比较那些配制品。

在搅动研究中，P80的流体动力学半径和PDI显著增加；在P40、P50、和C50中，流体动力学半径和PDI略微增加；在P60、P70、无NaCl的P60、C55、C60、和C65中，没有观察到显著变化。

根据所有的上述DLS数据，P60、P70、无NaCl的P60、C55、C60、和C65比P40、P50、P80、和C50更好。

颗粒：HIAC

该搅动研究的HIAC测量的结果在下表12中示出：

表12：

该搅动研究期间，在25℃下搅动5天后，P70具有显著增加的颗粒数，并且所有其他的配制品具有可比较的颗粒数。

概述

总的来说，相比其他，P60和C60作为最稳定的配制品最突出。因此，得出结论ATB200在5.0-6.0的范围内是最稳定的。然而，在磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液之间没有加以区别。另外，配制品中氯化钠的不存在没有示出对ATB200稳定性的显著影响。

配制品实例2：冻融

评估三种配制品在冻融过程中的稳定性下文将三种配制品汇总于下表13中。ATB200酶的目标浓度是5mg/mL。

表13：

样品制备

使用透析盒(20000MWCO)，将ATB200 DS进行缓冲液更换成为3种配制品缓冲液。在5℃下进行透析同时轻轻搅拌，每次使用三种缓冲液更换，每6至10小时一次。

每次透析后，添加合适体积的配制品缓冲液以调节最终UV浓度至5mg/mL。然后用0.22-μm PES滤器无菌过滤这些溶液。根据分析测试的样品量要求，然后将每种配制品以500μL至1000μL的填充体积无菌地填充到生物安全罩中的2-mL玻璃小瓶中。将小瓶塞好盖子，并且然后在填充后立即卷曲密封。

冻融之前，取出每个配制品的小瓶，并且使剩余样品小瓶经受设计的冻融循环。冻融之后，在预定义的取样点取出样品小瓶。

样品测试

测试三种冻融过程，如下所列：

过程1：非受控的冷冻和融解。将样品在-80℃冷冻机中冷冻，并且在25℃室内融解。

过程2：受控的冷冻和非受控的融解。将样品置于弗罗斯蒂(Frosty)容器中，并且在-80℃冷冻机中冷冻。该弗罗斯蒂容器使用异丙醇以达到1℃/min的受控的冷冻速率。将弗罗斯蒂容器置于25℃室内以融解这些样品。温度增加速率是大约1℃/min。

过程3：受控的冷冻和融解。使用冷冻干燥仪冷冻和融解这些样品。冷冻期间达到的最低样品温度是-47℃。样品温度被升至25℃。将冷冻和融解二者的温度变化速率控制在约0.5℃/min。结果通过重复该实验来证实。

使用每个过程进行5个或3个冻融循环。在冻融之前和之后针对这些样品进行以下测试：外观、浓度(UV&酶)、和SEC-HPLC。在表14中，测试参数汇总如下：

表14：

X：外观、浓度(UV&酶)、酶活性、SEC

^*：重复该实验，第一个实验3个FT循环，并且第二个实验5个FT循环。

结果

外观-第1轮

外观测量的第1轮的结果在下表15A和15B中示出：

表15A：

表15B：

在T0(冻融之前)时，使用对应的配制品缓冲液作为参照，所有配制品出现无色、轻微乳白色、和无可见颗粒。

快速冻融(过程1)的5个循环后，相比其T0，所有配制品似乎包含更多的可见颗粒。5FT后，在三个中CP60含有最少的颗粒。

在5个循环的缓慢冻融(过程2)后，所有配制品似乎比T0包含更多的可见颗粒，然而少于由过程1处理的那些。5FT循环后的CP60样品中比1FT循环后的P60和C60样品中观察到较少的颗粒。

缓慢冻融(过程3)的3个循环后，相比T0，全部配制品似乎具有更多的可见颗粒。三种配制品之间无差异。

外观-第2轮

外观测量的第2轮的结果在表23中示出：

表16：

相比第1轮，在缓慢冻融研究的第2轮(过程3)中，进行更多FT循环。相比T0，5FT后，有大量的可见颗粒出现在P60中，然而在C60和CP60二者中观察到少量的颗粒。

4-MUG酶浓度和活性

4-MUG酶浓度和活性测量的结果示出在下表17(过程1-2和过程3的第一轮)和表18(过程3的第二轮)中：

表17：

表18：

快速冻融(过程1)的5个循环后，当相比T0样品时，在P60中观察到4-MUG酶浓度的轻微下降，然而在C60和CP60中没有观察到显著差异。

使用弗罗斯蒂容器的缓慢冻融的5个循环(过程2)后，相比T0样品，在3种配制品的任一者中没有观察到显著差异。

使用冷冻干燥仪的缓慢冻融3个循环(过程3)后，当相比T0时，在P60和CP60二者中存在明显的酶浓度减少，但是在C60中无显著变化。将具有过程3的冻融重复5个循环，并且观察到相同的趋势。F/T的1个循环后，P60样品的酶浓度下降18.8％，并且3个循环(减少53.1％)和5个循环(减少68.9％)后酶浓度变得更糟。在CP60中，3个循环后酶浓度开始下降，并且最终减少至与5个循环后P60相同水平。在C60中，缓慢冻融的5个循环后几乎没有任何变化。

这些4-MUG酶浓度结果示出冷冻/加热速率、F/T的循环数目、且缓冲液类型可能影响ATB200稳定性。柠檬酸盐缓冲液系统(C60)提供了良好的稳定效果，而不论使用的冻融过程如何。

4-MUG酶活性变化趋势与4-MUG酶浓度是相同的。

在快速冻融研究(过程1)期间，5个循环后在P60中发生酶活性的略微减少，在C60和CP60中没有观察到显著变化。

在以1℃/min温度变化的缓慢冻融研究(过程2)期间，在任何样品中没有观察到明显的变化。

在用冷冻干燥仪的缓慢冻融研究(过程3)中，P60中的酶活性明显降低，并且CP60中的酶活性略微减少。然而，在C60中几乎无变化。在过程3缓慢冻融研究的第2轮期间，1个循环后，P60的酶活性降低19.1％，3个循环后降低54.1％，并且5个循环后降低71.2％。在CP60中，3个循环后酶活性开始下降，5个循环后降至与P60的相似水平。5个循环后，在C60中存在可忽略不计的变化。

纯度：SEC-HPLC

这些纯度测量的结果示出在下表20(过程1-2和过程3的第一轮)和表21(过程3的第二轮)中：

表20：

表21：

在多达5个循环的快速F/T(过程1)或缓慢F/T(过程2)后，在任何样品中没有检测到SEC单体百分比变化。

在第一缓慢F/T研究(过程3)中，3个循环后，P60样品示出明显的SEC单体百分比下降(主要归因于HMW种类的形成)。并且在C60和CP60中没有发生明显的变化。在第2过程3的缓慢F/T研究(0.5℃/min)中，1个循环后，P60样品中的单体开始下降，并且5个循环后最终下降68.1％。并且在CP60中，3个循环后单体百分比开始下降，但是比P60中的少得多；然而，5个循环后，达到与P60中相同水平。在多至5个循环后，在C60中的单体百分比无变化。

这些SEC纯度结果与酶浓度和活性的表现一致，表明在冻融过程中，冷冻/加热速率、F/T的循环数目、和缓冲液类型可能影响ATB200稳定性。基于这些SEC结果，在冻融循环期间，包含磷酸钠的缓冲液也不保护ATB200。

概述

相比其他两种缓冲液(P60和CP60)，配制于柠檬酸盐缓冲液(C60)中的ATB200更好地经受多个冻融循环。不论冻融过程如何，ATB200在柠檬酸盐缓冲液中保持稳定。

配制品实例3：赋形剂

用各种赋形剂制备八种配制品(E1-8)。赋形剂评估研究中的ATB200酶浓度是5mg/mL。选择三种缓冲液、两种稳定剂、和一种表面活性剂来评价下表22中所述的配制品的蛋白质稳定性。

表22：

样品制备

分别制备包含50mM NaCl的25mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)、包含50mM NaCl的25mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)、和包含50mM NaCl的25mM磷酸钠-柠檬酸盐组合缓冲液(pH 6.0)。使用透析盒，将该ATB200酶溶液更换成三种缓冲液。在5℃下进行透析同时轻轻搅拌，每次使用3种缓冲液更换，每6至10小时一次。

透析后，将海藻糖、甘露醇、或PS80添加至透析液中，以制备如在表22中列出的配制品。最后，添加合适体积的配制品缓冲液以将最终的ATB200浓度调节至5mg/mL。用0.22-μm PES滤器无菌过滤这些溶液。

将每个配制品无菌地填充到具有约1mL填充体积的生物安全罩中的2-mL小玻璃瓶中。将小瓶塞好盖子，并且然后在填充后立即卷曲。

样品测试

在4种不同条件下，测试配制品E1-8。将每个配制品的小瓶在5℃下储存12周(12W)，并且在40℃下储存8周(8W)，冻融(0.5℃/min)5个循环，并且在25℃下以100rpm搅动5天。将取样和测试计划描述于表23中。将样品按初始(T0)、2周(2W)、4周(4W)、8周(8W)、和12周(12W)进行测试。

表23：

X：外观测量

结果

外观

针对冻融研究测量的外观的结果在下表24(使用冰箱)和下表25(使用冷冻干燥仪)中示出：

表24：

表25：

在该冻融研究期间，在不含有PS80的F5和F6中，随着冻融循环的增加，可见颗粒略微增加。在其他配制品中没有观察到差别。

概述

由多个冻融循环后可见颗粒的形成而证实，在冻融研究中，不含PS80(F5和F6)的配制品与含有PS80的配制品表现不同。

配制品实例4：人全血中的溶血

在盐水中制备来自人类供体的血液的一系列稀释液(1:2、1:3、1:4、1:5、和1:10)。当与去离子水混合时，在该测定中使用导致在540nm处介于0.8和1.2之间的OD的稀释液，并且将该稀释液称为血液底物。测试样品的四种类型：测试品、安慰剂、阳性对照、和阴性对照。该测试品特征在于配制品中的ATB200 rhGAA具有25mM柠檬酸钠、2％甘露醇、和0.05％聚山梨醇酯80，pH为6.0。安慰剂与测试品相同，除了不含ATB200 rhGAA以外。阳性对照品是无菌注射用水，并且pH为5。阴性对照品是盐水(0.9NaCl)，并且pH为5。

将处于300μg/ml、600μg/ml、和1000μg/ml的具有盐水的测试品(ATB200)，具有盐水的安慰剂，阴性对照(盐水)，和阳性对照(水)与来自人类供体的血液底物混合。在37℃下，将样品不搅动孵育1小时。孵育后，将这些试管在室温下以大约100x离心10分钟。在540nm处，用分光光度法分析每个样品上清液中的血红蛋白的量。

通过公式确定该测试品的溶血百分比：

水加血液的溶血百分比是100％。盐水是阴性对照。少于或等于10％的溶血被认为是不显著的。针对测试品的每个浓度和针对安慰剂计算溶血百分比。

下表26示出了所测试的这些样品的结果。

表26：

a＝溶血的阴性对照

b＝溶血的阳性对照

c＝在盐水中按与300μg/mL测试品相同的比率稀释的安慰剂

d＝在盐水中按与600μg/mL测试品相同的比率稀释的安慰剂

e＝在盐水中按与1000μg/mL测试品相同的比率稀释的安慰剂

^*溶血％是使用水的OD作为阳性对照来确定。

将人血底物与安慰剂的三种样品孵育，该人血底物按与三种测试品剂量相同的比率稀释于盐水中，不会导致人血的任何显著的溶血。将安慰剂-稀释样品的溶血百分比分别计算为-1.3％、-1.3％、和0.9％。将人血底物与300μg/ml、600μg/ml、和1000μg/ml的ATB200一起孵育不会引起该人血的任何显著的溶血。将测试品样品的溶血百分比分别计算为-0.1％、-1.5％、和-1.5％。

总之，该ATB200配制品与处于所有稀释的人血液是可配伍的。

配制品实例5：人血浆和血清中的絮凝

将测试品给药溶液(3种浓度)和安慰剂(3种浓度)与相同体积的来自供体的人血浆和血清混合。该测试品特征在于配制品中的ATB200 rhGAA具有25mM柠檬酸钠、2％甘露醇、和0.05％聚山梨醇酯80，pH为6.0。安慰剂与测试品相同，除了不含ATB200 rhGAA以外。

将一毫升每一剂量的测试品或安慰剂与等体积的血浆、血清和盐水混合。在室温下，将样品孵育30分钟。孵育后，针对沉淀或凝结，将这些试管用肉眼和显微镜进行检查。将来自每个试管的整分试样在微型离心机中以14,000rpm离心10分钟。针对球粒的存在或缺失检查每个试管。沉淀/凝结和球粒评分如下：

0＝无

1＝非常轻微的沉淀或球粒

2＝最低限度的沉淀或球粒

3＝中等程度的沉淀或球粒

4＝显著的沉淀或球粒

下表27示出了所测试的这些样品的结果。

表27：

a＝将安慰剂按与300μg/mL终浓度的测试品给药配制品相同的比率稀释于盐水中

b＝将安慰剂按与600μg/mL终浓度的测试品给药配制品相同的比率稀释于盐水中

c＝将安慰剂按与1000μg/mL终浓度的测试品给药配制品相同的比率稀释于盐水中

当与每种ATB200浓度混合时，在人血浆或血清中用肉眼或显微镜没有观察到沉淀。在安慰剂样品中没有注意到沉淀。当离心所有的安慰剂或ATB200样品时，没有观察到球粒。

基于本研究的这些结果，发现ATB200配制品可与高达并包括1000μg/ml终浓度的人血浆和血清配伍。

实例：在患有庞贝氏病的经历过ERT的以及初次接受ERT的患者中，与麦格司他共 同给予的重组酸性α-葡糖苷酶ATB200的药物代谢动力学和安全性数据

设计本研究主要评估与麦格司他共同给予的ATB200的安全性、耐受性、和药物代谢动力学(PK)。来自Gaa基因敲除小鼠的PK/药效(PD)翻译模型预测出，在人体中ATB20020mg/kg与高剂量(例如，260mg)的麦格司他的组合会提供最佳的糖原减少。

在以下描述中，“高剂量”的麦格司他是指约260mg的剂量且“低剂量”的麦格司他是指约130mg的剂量。

目的是评估该1/2期研究中来自10名患者的初步总GAA蛋白、ATB200和麦格司他PK数据，以及安全性标记物。

这是一个开放标记、固定顺序、递增剂量、第一次在人类中研究的、1/2期研究，以在患有庞贝氏病的成年人中评估ATB200的静脉内输注与口服麦格司他共同给予的安全性、耐受性、PK、PD、以及效力(图21)。评价来自在随访9中前8个群组1的患者和前2个群组3患者的平均总GAA蛋白质和麦格司他PK结果。

^a在群组2和3中给药之前，将来自群组1的2名哨兵患者的安全性数据在每个剂量水平下进行评估。

^b在阶段2和3期间，在ATB200静脉内输注开始之前，口服给予麦格司他。对于所有的剂量，将ATB200静脉内输注持续4小时。

^c在群组2和3中，前2名患者充当他们各自群组的哨兵患者。

主要入选标准：

·被诊断患有庞贝氏病的18-65岁的男性和女性是基于记录的GAA酶活性的缺乏或通过GAA基因分型

·在试验开始(群组1)之前，接受用阿葡糖苷酶α进行的ERT持续2-6年(或对于群组2≥2年)

·目前以每隔一周的频率接受阿葡糖苷酶α，并且完成最后2次输注，同时没有导致剂量中断的药物相关的不良事件(群组1和2)

·在6分钟步行测试中，必须能够行走介于200和500米之间(群组1和3)

·直立的用力肺活量必须是预测的正常值的30％-80％(群组1和3)

·必须是坐轮椅的并且不能无辅助地行走(群组2)

PK分析：

·收集血浆总GAA蛋白质和活性浓度的血液样品

·阶段1：在ATB200输注开始之前和输注开始后1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8、10、12和24小时

·阶段2和3：麦格司他口服给予后1、2、3、4、4.5、5、6、7、9、11、13、和25小时

·在麦格司他口服给予(时间0)之前立即并且在麦格司他口服给予后1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、9、11、和25小时，针对血浆麦格司他浓度对血液样品进行取样。通过经验证的LC-MS/MS测定来确定血浆麦格司他

·通过一个或多个rhGAA-特异性“签名”肽的经验证的LC-MS/MS定量来确定血浆中针对ATB200 5mg/kg、10mg/kg、和20mg/kg的总GAA蛋白质浓度

在完成了阶段1和2的群组1的8名患者中以及开始阶段3的群组3的2名患者中完成了初步分析

·初始ERT转换的患者是庞贝氏病群体的代表，接受ERT平均5.02年(表28)

表28：基线特征

^an＝在间歇期数据分析中来自群组1的10名(非卧床的ERT转换)；n＝来自群组3的2名(初次)。

总GAA蛋白

当单独给予时，ATB200以略微高于剂量比例的方式增加(表29和图22A-22D)。变异似乎随着麦格司他剂量而增加(图22C)。相对于20mg/kg的单独的ATB200，20mg/kg的ATB200与高剂量的麦格司他(260mg)的共同给予增加了总GAA蛋白质暴露(AUC)大约25％。分布半衰期(α-期)增加了45％，表明高剂量的麦格司他稳定血浆中的ATB200。从达到最大血浆浓度至剂量后大约12小时的时间，分布半衰期的增加伴随着AUC的增加。在末端消除期期间，AUC和半衰期的增加可以在对数标度上观察到(图22B)。ATB200表明了相对高的分配容积。血浆总GAA蛋白质的分布在初次接受ERT(群组3)和经历过ERT的患者(群组1)之间看起来相似(图22A和22D)。

表29：总GAA蛋白

麦格司他PK

麦格司他表明剂量比例的动力学(表30和图23)。血浆麦格司他在单个剂量和多个剂量之间看起来相似。

表30：麦格司他PK汇总

V_z＝以终态分布的表观体积.^a几何平均数(CV％).^b中值(最小值-最大值).^c算数平均数(CV％)

药效学

在来自群组1的经历过ERT的患者中的第11次随访(图24A和24B)：

·在8名患者中5名丙氨酸氨基转移酶(ALT)减少；4/4患者具有提高的标准化基线水平

·在8名患者中6名天冬氨酸转氨酶(AST)减少；3/4患者具有提高的标准化基线水平

·在8名患者中6名肌酸磷酸激酶(CPK)减少；2/6患者具有提高的标准化基线水平

·在8名患者中8名尿糖四糖(HEX4)水平减少

在第4周，在初次接受治疗的群组(群组3)的2名患者中所有4种生物标记物水平下降(图24C和24D)。

在图24A-24D中，数据被表示为平均值±标准误。

安全性

·在所有患者中155+总输注后，没有报告严重的不良事件(AE)或输注相关的反应。

·在11/13(84％)患者中报告的治疗突发性AE通常是轻度和短暂的。

·在7/13(53％)患者中报告的治疗相关的AE：恶心(n＝1)、疲劳(n＝1)、头痛(n＝1)、震颤(n＝2)、痤疮(n＝1)、心动过速(n＝1)、和低血压(n＝1)。

结论

·单独的和与麦格司他组合的ATB200是安全的，并且耐受良好，迄今没有输注相关的反应。

·在暴露方面，单独ATB200示出暴露高于剂量比例的增加，该暴露进一步用麦格司他增强，表明分子伴侣对ATB200的稳定效果。

·从标准护理转换至ATB200/麦格司他后，患者通常示出在肌肉损伤的生物标记物方面的改进，同时许多的患者在第18周证明正常化。

·用ATB200/麦格司他治疗的初始的2名初次接受试验治疗的患者表明肌损伤的所有生物标记物的稳定下降。

Claims (27)

1.一种药物配制品，包括：

(a) 一群重组人酸性α-葡糖苷酶（rhGAA）分子，其中这些rhGAA分子在中国仓鼠卵巢细胞中表达，其中这些rhGAA 分子上的40%-60%的N-聚糖是复合物型N-聚糖，其中所述rhGAA分子包含位置分别对应SEQ ID NO.2的N84、N177、N334、N414、N596、N826和N869的氨基酸处的第一、第二、第三、第四、第五、第六和第七潜在的N-糖基化位点，其中至少50%的rhGAA分子在第一潜在的N-糖基化位点处包含带有双-甘露糖-6-磷酸（bis-M6P）的聚糖，并且其中所述rhGAA分子在每mol的rhGAA中包含3.0-5.0mol的甘露糖-6-磷酸（M6P）残基；

(b)一柠檬酸盐缓冲液；和

(c) 至少二种赋形剂，其中该至少二种赋形剂包括甘露醇和聚山梨醇酯80，

其中该配制品具有从5.0至7.0的pH。

2.如权利要求1所述的药物配制品，其中所述rhGAA分子是以从5 mg/mL至50 mg/mL的浓度存在。

3.如权利要求1所述的药物配制品，其中所述rhGAA分子是以从12 mg/mL至18 mg/mL的浓度存在。

4.如权利要求1所述的药物配制品，其中所述rhGAA分子是以15 mg/mL的浓度存在。

5.如权利要求1所述的药物配制品，其中所述配制品具有从5.5至7.0的pH。

6.如权利要求1所述的药物配制品，其中所述配制品具有从5.5至6.0的pH。

7.如权利要求5所述的药物配制品，其中该配制品具有6.0的pH。

8.如权利要求1所述的药物配制品，其中该柠檬酸盐缓冲液包括钾、钠、或铵盐。

9.如权利要求7所述的药物配制品，其中该柠檬酸盐缓冲液包括柠檬酸钠。

10.如权利要求1所述的药物配制品，其中该柠檬酸盐缓冲液以10mM至100mM的浓度存在。

11.如权利要求9所述的药物配制品，其中该柠檬酸盐缓冲液以25mM的浓度存在。

12.如权利要求1所述的药物配制品，其中不含海藻糖、蔗糖、甘氨酸或其组合。

13.如权利要求12所述的药物配制品，其中至少一种赋形剂是以10 mg/mL至50 mg/mL的浓度存在的甘露醇。

14.如权利要求12所述的药物配制品，其中至少一种赋形剂是以0.2 mg/mL至0.5 mg/mL的浓度存在的聚山梨醇酯80。

15.如权利要求12所述的药物配制品，其中该甘露醇是以20 mg/mL的浓度存在，并且该聚山梨醇酯80是以0.5 mg/mL的浓度存在。

16.如权利要求1所述的药物配制品，其进一步包括

（a）一种碱化剂和/或

(b)一种酸化剂，

其中该碱化剂和酸化剂是以足以保持该药物配制品在从5.0至6.0的pH的量存在。

17.如权利要求1所述的药物配制品，其中所述rhGAA分子在每mol的rhGAA中包含至少4mol的唾液酸残基。

18.如权利要求1所述的药物配制品，其中所述rhGAA分子在每mol的rhGAA中包含从2.0mol至8.0 mol的唾液酸残基。

19.如权利要求2所述的药物配制品，其中进一步：

(a) 至少30%的所述rhGAA分子在第二潜在的N-糖基化位点处包含带有单-M6P的N-聚糖单元；或

(b) 至少30%的所述rhGAA分子在第四潜在的N-糖基化位点处包含带有双-M6P的N-聚糖单元；或

(c) 至少20%的所述rhGAA分子在第四潜在的N-糖基化位点处包含带有单-M6P的N-聚糖单元。

20.如权利要求1所述的药物配制品，其中该药物配制品由以下各项组成：

(a) 该群rhGAA分子；

(b) 柠檬酸钠；

(c) 柠檬酸单水合物；

(d) 甘露醇；

(e) 聚山梨醇酯80；

(f) 水；

(g) 任选地，一种酸化剂；以及

(h) 任选地，一种碱化剂，

其中该配制品具有从5.0至6.0的pH。

21.如权利要求1所述的药物配制品，其中该药物配制品由以下各项组成：

(a) 该群rhGAA分子，以15 mg/mL的浓度存在；

(b) 柠檬酸钠缓冲液，以25 mM的浓度存在；

(c) 甘露醇，以20 mg/mL的浓度存在；

(d) 聚山梨醇酯80，以0.5 mg/mL的浓度存在；

(e) 水；

(f) 任选地，一种酸化剂；以及

(g) 任选地，一种碱化剂，

其中该配制品具有从5.0至6.0的pH。

22.一种药物组合物，该药物组合物包括冻干之后的、如权利要求1-21中任一项所述的药物配制品。

23.如权利要求1-21任一项所述的药物配制品在制备用于在患者中治疗庞贝氏病的药物中的用途。

24.如权利要求23所述的用途，其中在向该患者给予之前稀释该药物配制品。

25.如权利要求22所述的药物组合物在制备用于治疗庞贝氏病的药物中的用途，其中重构该药物组合物。

26.一种制备如权利要求1-21中任一项所述的药物配制品的方法，该方法包括：

(a) 制备包含该柠檬酸盐缓冲液、该至少二种赋形剂、和该群rhGAA分子的溶液；

(b) 任选地调节该溶液的pH；

(c) 任选地向该溶液中添加另外的水；

（d）任选地过滤该溶液；并且

（e）任选地储存该溶液。

27.一种制备冻干的药物组合物的方法，该方法包括冻干如权利要求1-21中任一项所述的药物配制品。

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