ES2921673T3 - Formulaciones que contienen alfa-glucosidasa ácida recombinante - Google Patents

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Abstract

Proporcionados se encuentran formulaciones farmacéuticas que comprenden un ácido recombinante α -glucosidasa, en el que el ácido recombinante Α -glucosidasa se expresa en las células de ovario de hámster chino (CHO) y comprende un mayor contenido de unidades de n-glucano que llevan una o dos manneis-6 -residuos de fosfato en comparación con un contenido de unidades N-glucano que llevan uno o dos residuos de manosa-6-fosfato de Alglucosidasa ALFA; al menos un tampón seleccionado del grupo que consiste en un citrato, un fosfato y combinaciones del mismo; y al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en manitol, polisorbato 80 y combinaciones del mismo, en la que la formulación tiene un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 7.0. También se proporcionan métodos para tratar la enfermedad de Pompe utilizando estas formulaciones farmacéuticas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Formulaciones que contienen alfa-glucosidasa ácida recombinante
CAMPO TÉCNICO
Los principios y realizaciones de la presente invención se refieren en general a formulaciones que comprenden aglucosidasa ácida recombinante, y en particular, a formulaciones líquidas.
ANTECEDENTES
La enfermedad de Pompe, también conocida como deficiencia de maltasa ácida o enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II, es una de varios trastornos de almacenamiento lisosomal. Los trastornos de almacenamiento lisosomal son un grupo de enfermedades genéticas autosómicas recesivas caracterizadas por la acumulación de glucoesfingolípidos celulares, glucógeno, o mucopolisacáridos dentro de compartimentos intracelulares llamados lisosomas. Las personas con estas enfermedades portan genes mutantes que codifican enzimas que son defectuosas para catalizar la hidrólisis de una o más de estas sustancias, que entonces se acumulan en los lisosomas. Otros ejemplos de trastornos lisosomales incluyen la enfermedad de Gaucher, la gangliosidosis GM1, la fucosidosis, las mucopolisacaridosis, la enfermedad de Hurler-Scheie, las enfermedades de Niemann-Pick A y B, y la enfermedad de Fabry. La enfermedad de Pompe también se clasifica como una enfermedad neuromuscular o una miopatía metabólica.
Se estima que la enfermedad de Pompe ocurre en aproximadamente 1 de cada 40.000 nacimientos, y es causada por una mutación en el gen GAA, que codifica la enzima a-glucosidasa lisosomal (EC:3.2.1.20), también conocida comúnmente como a-glucosidasa ácida. La a-glucosidasa ácida está implicada en el metabolismo del glucógeno, un polisacárido ramificado que es la principal forma de almacenamiento de glucosa en los animales, al catalizar su hidrólisis en glucosa dentro de los lisosomas. Debido a que las personas con la enfermedad de Pompe producen aglucosidasa ácida mutante y defectuosa que es inactiva o tiene una actividad reducida, la descomposición del glucógeno ocurre lentamente, o no ocurre en absoluto, y el glucógeno se acumula en los lisosomas de diversos tejidos, particularmente en los músculos estriados, lo que lleva a un amplio espectro de manifestaciones clínicas, incluyendo debilidad muscular progresiva e insuficiencia respiratoria. Los tejidos tales como el corazón y los músculos esqueléticos se ven particularmente afectados.
La enfermedad de Pompe puede variar ampliamente en el grado de deficiencia de la enzima, la gravedad y la edad de inicio, y se han identificado más de 500 mutaciones diferentes en el gen GAA, muchas de las cuales causan síntomas de enfermedad de diversa gravedad. La enfermedad se ha clasificado en grandes tipos: inicio temprano o infantil, e inicio tardío. El inicio más temprano de la enfermedad y la menor actividad enzimática generalmente se asocian con un curso clínico más severo. La enfermedad de Pompe infantil es la más grave, resultante de una deficiencia completa o casi completa de a-glucosidasa ácida, y se presenta con síntomas que incluyen falta grave de tono muscular, debilidad, agrandamiento del hígado y el corazón, y cardiomiopatía. La lengua puede agrandarse y sobresalir, y la deglución puede resultar difícil. La mayoría de los niños afectados mueren por complicaciones respiratorias o cardíacas antes de los dos años. La enfermedad de Pompe de inicio tardío puede presentarse a cualquier edad a partir de los 12 meses, y se caracteriza por una falta de afectación cardíaca y un mejor pronóstico a corto plazo. Los síntomas están relacionados con la disfunción progresiva del músculo esquelético, e implican debilidad muscular generalizada y atrofia de los músculos respiratorios en el tronco, la parte proximal de las extremidades inferiores, y el diafragma. Algunos pacientes adultos carecen de síntomas importantes o limitaciones motoras. El pronóstico generalmente depende de la extensión de la afectación de los músculos respiratorios. La mayoría de los sujetos con la enfermedad de Pompe finalmente progresan a un debilitamiento físico que requiere el uso de una silla de ruedas y ventilación asistida, y a menudo se produce una muerte prematura debido a una insuficiencia respiratoria.
Las opciones de tratamiento recientes para la enfermedad de Pompe incluyen la terapia de reemplazo enzimático (ERT) con a-glucosidasa ácida humana recombinante (rhGAA). Los productos convencionales de rhGAA se conocen con los nombres de alglucosidasa alfa, Myozyme® o Lumizyme®, de Genzyme, Inc. La ERT es un tratamiento crónico requerido durante toda la vida del paciente, e implica la administración de la enzima de reemplazo por infusión intravenosa. La enzima de reemplazo se transporta entonces en la circulación y entra en los lisosomas dentro de las células, donde actúa para romper el glucógeno acumulado, compensando la actividad deficiente de la enzima mutante defectuosa endógena, y por lo tanto aliviando los síntomas de la enfermedad.
La forma en la que se preparan, almacenan, transportan y administran a los pacientes las enzimas de reemplazo, tal como rhGAA, es difícil. Las enzimas usadas en ERT son en general relativamente complejas y delicadas, lo que hace que la selección de los amortiguadores, excipientes, etc., que las acompañan sea crítica. Si la enzima no se conserva adecuadamente, se pueden requerir grandes cantidades, lo que hace que el tratamiento sea costoso e ineficiente.
Algunos productos convencionales de rhGAA se proporcionan a los pacientes como polvo liofilizado (liofilizado) en viales de un solo uso sin conservantes. La rhGAA debe reconstituirse entonces en los viales, después diluirse y administrarse por vía intravenosa. Si bien la liofilización ayuda a preservar la enzima después de la fabricación hasta que esté lista para administrarla a un paciente, este procedimiento en sí y por sí mismo puede dañar la enzima. Por lo tanto, se debe tener mucho cuidado en la selección de los componentes en la formulación de rhGAA para que ayuden a preservar la concentración y la actividad de la proteína.
Además, las enzimas recombinantes son a menudo estructuralmente diferentes de las enzimas de tipo salvaje. Incluso si los aminoácidos en la enzima recombinante pueden ser idénticos a su contraparte de tipo salvaje, puede haber diferencias en la química de los hidratos de carbono. Por lo tanto, a medida que se descubren nuevas enzimas recombinantes, las formulaciones para las enzimas deben desarrollarse específicamente para la química de las enzimas recién descubiertas.
Por consiguiente, existe una necesidad constante de formulaciones para almacenar y transportar enzimas recombinantes, tales como rhGAA, que conserven la actividad y la concentración de la enzima.
SUMARIO
Un aspecto de la invención se refiere a una formulación farmacéutica. En un aspecto, la formulación comprende:
(a) una a-glucosidasa ácida recombinante, en la que la a-glucosidasa ácida recombinante se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) y comprende al menos 3 moles de restos de manosa-6-fosfato y al menos 4 moles de restos de ácido siálico, por mol de rhGAA
(b) amortiguador de citrato; y
(c) al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en manitol, polisorbato 80, y combinaciones de los mismos,
en la que la formulación tiene un pH de alrededor de 5,0 a alrededor de 7,0.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica liofilizada.
Otro aspecto se refiere a un método para tratar la enfermedad de Pompe. Otro aspecto comprende diluir la formulación farmacéutica antes de la administración al paciente. Un aspecto adicional se refiere a un método para tratar la enfermedad de Pompe, que comprende: reconstituir la composición farmacéutica, y administrar la composición farmacéutica reconstituida a un paciente que lo necesite.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para preparar las formulaciones farmacéuticas anteriores. Por consiguiente, un aspecto se refiere a un método para preparar la formulación farmacéutica, comprendiendo el método: añadir al agua el al menos un amortiguador, al menos un excipiente, y a-glucosidasa ácida recombinante, para proporcionar una disolución; ajustar opcionalmente el pH de la disolución; y opcionalmente añadir agua adicional a la disolución. Un aspecto adicional incluye una modificación del método, que comprende además filtrar la disolución, que opcionalmente comprende además almacenar la disolución. La invención se define en las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Otras características de la presente descripción se harán evidentes a partir de la siguiente descripción escrita y las figuras adjuntas, en las que:
La Figura 1A muestra un glicano rico en manosa no fosforilado, un glicano mono-M6P, y un glicano bis-M6P.
La Figura 1B muestra la estructura química del grupo M6P.
La Figura 2A describe el direccionamiento productivo de rhGAA a través de glicanos que portan M6P a tejidos diana (por ejemplo, tejidos musculares de sujetos con enfermedad de Pompe).
La Figura 2B describe la eliminación no productiva del fármaco en tejidos no diana (por ejemplo, hígado y bazo), o mediante la unión de glicanos no M6P a tejidos no diana.
Las Figuras 3A y 3B, respectivamente, son gráficos que muestran los resultados de la cromatografía de afinidad CIMPR de Lumizyme® y Myozyme®. Las líneas discontinuas se refieren al gradiente de elución de M6P. La elución con M6P desplaza las moléculas de GAA unidas a través de un glicano que contiene M6P a CIMPR. Como se muestra en la Figura 2A, el 78% de la actividad de GAA en Lumizyme® eluyó antes de la adición de M6P. La Figura 2B muestra que el 73% de la actividad de GAA Myozyme® eluyó antes de la adición de M6P. Solo el 22% o el 27% de la rhGAA en Lumizyme® o Myozyme®, respectivamente, se eluyó con M6P. Estas figuras muestran que la mayoría de la rhGAA en estos dos productos de rhGAA convencionales carecen de los glicanos que tienen M6P necesarios para dirigir CIMPR a los tejidos musculares diana.
La Figura 4 muestra una construcción de ADN para transformar células CHO con ADN que codifica rhGAA. Las células CHO se transformaron con una construcción de ADN que codifica rhGAA.
Las Figuras 5A y 5B, respectivamente, son gráficos que muestran los resultados de la cromatografía de afinidad CIMPR de las rhGAA Myozyme® y ATB200. Como es evidente en la Figura 5B, alrededor del 70% de la rhGAA en rhGAA ATB200 contenía M6P.
La Figura 6 es un gráfico que muestra los resultados de la cromatografía de afinidad CIMPR de rhGAA ATB200 con y sin captura en una columna de intercambio aniónico (AEX).
La Figura 7 es un gráfico que muestra los perfiles de elución de Polywax de las rhGAA Lumizyme® y ATB200.
La Figura 8 es una tabla que muestra un resumen de las estructuras de N-glicano de Lumizyme® en comparación con tres preparaciones diferentes de ATB200 rhGAA, identificadas como BP-rhGAA, ATB200-1 y ATB200-2.
Las Figuras 9A-9H muestran los resultados de un análisis de N-glicosilación específica del sitio de ATB200 rhGAA.
La Figura 10A es un gráfico que compara la afinidad de unión a CIMPR de ATB200 rhGAA (traza izquierda) con la de Lumizyme® (traza derecha).
La Figura 10B es una tabla que compara el contenido de Bis-M6P de Lumizyme® y ATB200 rhGAA.
La Figura 11A es un gráfico que compara la actividad de ATB200 rhGAA (traza izquierda) con la actividad de Lumizyme® rhGAA (traza derecha) dentro de fibroblastos normales a diversas concentraciones de GAA.
La Figura 11B es una tabla que compara la actividad de ATB200 rhGAA (traza izquierda) con la actividad de Lumizyme® rhGAA (traza derecha) dentro de fibroblastos de un sujeto que tiene la enfermedad de Pompe a diversas concentraciones de GAA.
La Figura 11C es una tabla que compara Kcaptación de fibroblastos procedentes de sujetos normales y sujetos con enfermedad de Pompe.
La Figura 12A es un gráfico que muestra la cantidad de glucógeno con respecto a la dosis de a-glucosidasa ácida humana recombinante en músculo cardíaco de ratón después del contacto con el vehículo (control negativo), con 20 mg/ml de alglucosidasa alfa (Lumizyme®), o con 5, 10 o 20 mg/kg de ATB200.
La Figura 12B es un gráfico que muestra la cantidad de glucógeno con respecto a la dosis de a-glucosidasa ácida humana recombinante en el músculo cuádriceps de ratón después del contacto con el vehículo (control negativo), con 20 mg/ml de alglucosidasa alfa (Lumizyme®), o con 5, 10 o 20 mg/kg de ATB200.
La Figura 12C es un gráfico que muestra la cantidad de glucógeno con respecto a la dosis de a-glucosidasa ácida humana recombinante en el músculo tríceps de ratón después del contacto con el vehículo (control negativo), con 20 mg/ml de alglucosidasa alfa (Lumizyme®), o con 5, 10 o 20 mg/kg de ATB200.
La Figura 13 es una tabla que muestra que la combinación de ATB200 rhGAA y chaperona miglustat proporcionó una eliminación de glucógeno significativamente mejor en ratones con desactivación génica de GAA que los tratamientos con las rhGAA Lumizyme® o ATB200 sin la chaperona miglustat.
La Figura 14 es una serie de micrografías electrónicas de corazón, diafragma y músculo sóleo de ratones de tipo salvaje y ratones con desactivación génica de Gaa tratados con vehículo, alglucosidasa alfa y ATB200 en presencia y ausencia de miglustat, que muestran niveles de proteína de membrana asociada a lisosomas (LAMP-1).
La Figura 15 es una serie de micrografías electrónicas de corazón y músculo sóleo de ratones de tipo salvaje y ratones con desactivación génica de Gaa tratados con vehículo, alglucosidasa alfa y ATB200 en presencia y ausencia de miglustat, que muestran niveles de glucógeno mediante tinción con ácido peryódico - reactivo de Schiff (PAS).
La Figura 16 es una serie de micrografías electrónicas (1000x) del músculo cuádriceps de ratones de tipo salvaje y ratones con desactivación génica de Gaa tratados con vehículo, alglucosidasa alfa y ATB200 en presencia y ausencia de miglustat, teñido con azul de metileno para mostrar vacuolas (indicadas por flechas).
La Figura 17 es una serie de micrografías electrónicas (40x) del músculo cuádriceps de ratones de tipo salvaje y ratones con desactivación génica de Gaa tratados con vehículo, alglucosidasa alfa y ATB200 en presencia y ausencia de miglustat, que muestran los niveles de los marcadores de autofagia, conjugado de cadena ligera 3 de proteína 1A/1B asociada a microtúbulos con fosfatidiletanolamina (LC3A II) y p62, el transportador de glucosa dependiente de insulina GLUT4, y el transportador de glucosa independiente de insulina GLUT1. Las Figuras 18A y 18B son gráficos que muestran datos musculares de fuerza de agarre y de suspensión desde alambre para ratones de tipo salvaje y ratones con desactivación génica de Gaa tratados con vehículo, alglucosidasa alfa y ATB200 en presencia de miglustat.
Las Figuras 19A-19G son gráficos que muestran los niveles de glucógeno en células del cuádriceps, tríceps y cardíacas de ratones de tipo salvaje y ratones con desactivación génica de Gaa tratados con vehículo, alglucosidasa alfa y ATB200 en presencia y ausencia de miglustat.
La Figura 20 es una serie de fotomicrografías (100x y 200x) de fibras musculares del vasto lateral (VL) de ratones de tipo salvaje y ratones con desactivación génica de Gaa tratados con vehículo, alglucosidasa alfa y ATB200 en presencia y ausencia de miglustat, que muestran señales de distrofina.
La Figura 21 muestra el diseño del estudio de un estudio abierto, de secuencia fija, de dosis ascendente, primero en humanos, de fase 1/2, para evaluar la seguridad, tolerabilidad, PK, PD y eficacia de las infusiones intravenosas de ATB200 co-administrada con miglustat oral en adultos con enfermedad de Pompe.
Las Figuras 22A-22B son gráficos que muestran los perfiles de concentración frente al tiempo de proteína total GAA en plasma en sujetos humanos después de la dosificación de 5, 10 o 20 mg/kg de ATB200, 20 mg/kg de ATB200 y 130 mg de miglustat, o 20 mg/kg de ATB200 y 260 mg de miglustat.
La Figura 22C es un gráfico que muestra el AUC de proteína total GAA en plasma en sujetos humanos después de la dosificación de 20 mg/kg de ATB200, 20 mg/kg de ATB200 y 130 mg miglustat, o 20 mg/kg de ATB200 y 260 mg de miglustat.
La Figura 22D es un gráfico que muestra los perfiles de concentración frente al tiempo de proteína total GAA en plasma en dos sujetos humanos individuales después de la dosificación de 20 mg/kg de ATB200 y 260 mg de miglustat.
La Figura 23 es un gráfico que muestra los perfiles de concentración frente al tiempo de miglustat en plasma en sujetos humanos después de la dosificación de 130 mg o 260 mg de miglustat.
Las Figuras 24A-24D son gráficos que muestran cambios en los niveles de alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), creatina fosfocinasa (CPK) y hexosa tetrasacárido (Hex4) en pacientes humanos después de la administración de dosis ascendentes de ATB200 (5, 10 y 20 mg /kg) seguido de la coadministración de ATB200 (20 mg/kg) y miglustat (130 y 260 mg).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Sorprendentemente, se descubrió que, mediante una cuidadosa selección de amortiguadores y excipientes, se puede proporcionar una formulación para la proteína GAA recombinante ATB200 que muestra una estabilidad superior y puede someterse a los procedimientos asociados con la preparación, el almacenamiento, el transporte, la reconstitución y la administración de la formulación, al tiempo que se mantiene la actividad enzimática y la eficacia, pero minimizando la precipitación de la enzima. En consecuencia, un aspecto de la invención se refiere a una formulación que comprende rhGAA, un amortiguador, y al menos un excipiente. En una o más realizaciones, la rhGAA comprende ATB200. En algunas realizaciones, la formulación es una formulación líquida. A continuación, se dan detalles y diversas realizaciones con respecto a los diversos ingredientes de la formulación.
Definiciones
Los términos usados en esta memoria descriptiva generalmente tienen sus significados habituales en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico en el que se usa cada término. Ciertos términos se discuten a continuación, o en otra parte en la memoria descriptiva, para proporcionar una guía adicional al profesional en la descripción de las composiciones y métodos de la invención, y cómo prepararlos y usarlos.
En la presente memoria descriptiva, excepto cuando el contexto requiera lo contrario debido a un lenguaje expreso o una implicación necesaria, la palabra “comprende”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se usa en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de características expuestas, pero no para excluir la presencia o la adición de otras características en diversas realizaciones de la invención.
Como se usa aquí, el término “enfermedad de Pompe”, también conocida como deficiencia de maltasa ácida, enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II (GSDII), y glucogenosis tipo II, pretende referirse a un trastorno genético de almacenamiento lisosomal caracterizado por mutaciones en el gen GAA, que codifica la enzima aglucosidasa ácida humana. La expresión incluye, pero no se limita a, las formas de inicio temprano y tardío de la enfermedad, incluyendo, pero sin limitarse a, la enfermedad de Pompe infantil, juvenil y de inicio en adultos.
Como se usa aquí, la expresión “a-glucosidasa ácida” se refiere a una enzima lisosomal que hidroliza los enlaces a-1,4 entre las unidades de D-glucosa de glucógeno, maltosa, e isomaltosa. Los nombres alternativos incluyen, entre otros, a-glucosidasa lisosomal (EC:3.2.1.20); glucoamilasa; 1,4-a-D-glucano glucohidrolasa; amiloglucosidasa; gamma-amilasa, y exo-1,4-a-glucosidasa. La a-glucosidasa ácida humana está codificada por el gen GAA (National Centre for Biotechnology Information (NCBI) Gene ID 2548), que se ha cartografiado en el brazo largo del cromosoma 17 (ubicación 17q25.2-q25.3). La secuencia completa de aminoácidos de GAA de tipo salvaje se establece en SEQ ID NO: 1, como se describe en la patente US n° 8.592.362, y tiene el número de acceso de GenBank AHE24104.1 (GI:568760974).
Actualmente, se han identificado más de 500 mutaciones en el gen GAA humano, muchas de las cuales están asociadas con la enfermedad de Pompe. Las mutaciones que dan como resultado un plegamiento o procesamiento incorrectos de la enzima a-glucosidasa ácida incluyen T1064C (Leu355Pro) y C2104T (Arg702Cys). Además, las mutaciones de GAA que afectan a la maduración y al procesamiento de la enzima incluyen Leu405Pro y Met519Thr. El hexapéptido conservado WIDMNE en los restos de aminoácidos 516-521 es necesario para la actividad de la proteína a-glucosidasa ácida. Como se usa aquí, la abreviatura “GAA” se refiere a la enzima a-glucosidasa ácida, mientras que la abreviatura en cursiva “GAA” pretende referirse al gen humano que codifica la enzima a-glucosidasa ácida humana. Por tanto, la abreviatura “rhGAA” pretende referirse a la enzima a-glucosidasa ácida humana recombinante.
Como se usa aquí, la expresión “alglucosidasa alfa” pretende referirse a una a-glucosidasa ácida humana recombinante identificada como [199-arginina,223-histidina]prepro-a-glucosidasa (humana); Número de Registro del Chemical Abstract 420794-05-0. La alglucosidasa alfa está aprobada para su comercialización en los Estados Unidos de América por Genzyme, a partir de enero de 2016, como los productos Lumizyme® y Myozyme®.
Como se usa aquí, el término “ATB200” se refiere a una a-glucosidasa ácida humana recombinante descrita en la solicitud de patente PCT/US2015/05 3252, en tramitación junto con la presente.
Como se usa aquí, el término “glicano” pretende referirse a una cadena de polisacárido unida covalentemente a un resto de aminoácido en una proteína o polipéptido. Como se usa aquí, el término “N-glicano” o “glicano unido a N” se refiere a una cadena de polisacárido unida a un resto de aminoácido en una proteína o polipéptido a través de la unión covalente a un átomo de nitrógeno del resto de aminoácido. Por ejemplo, un N-glicano se puede unir covalentemente al átomo de nitrógeno de la cadena lateral de un resto de asparagina. Los glicanos pueden contener una o varias unidades de monosacárido, y las unidades de monosacárido pueden estar unidas covalentemente para formar una cadena lineal o una cadena ramificada. En al menos una realización, las unidades de N-glicano unidas a ATB200 pueden comprender una o más unidades de monosacárido, cada una seleccionada independientemente de N-acetilglucosamina, manosa, galactosa o ácido siálico. Las unidades de N-glicano en la proteína pueden determinarse mediante cualquier técnica analítica apropiada, tal como espectrometría de masas. En algunas realizaciones, las unidades de N-glicano pueden determinarse mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) usando un instrumento tal como el espectrómetro de masas Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro™, el espectrómetro de masas Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid™, o el espectrómetro de masas Waters Xevo® G2-XS QTof.
Como se usa aquí, el término “N-glicano rico en manosa” se refiere a un N-glicano que tiene una a seis o más unidades de manosa. En al menos una realización, una unidad de N-glicano rico en manosa puede contener una cadena de bis(N-acetilglucosamina) enlazada a un resto de asparagina, y enlazada además a una cadena de polimanosa ramificada. Como se usa aquí de manera intercambiable, el término “M6P” o “manosa-6-fosfato” se refiere a una unidad de manosa fosforilada en la posición 6; es decir, que tiene un grupo fosfato unido al grupo hidroxilo en la posición 6. En al menos una realización, una o más unidades de manosa de una o más unidades de N-glicano se fosforilan en la posición 6 para formar unidades de manosa-6-fosfato.
Como se usa aquí, la expresión “N-glicano complejo” se refiere a un N-glicano que contiene una o más unidades de galactosa y/o ácido siálico. En al menos una realización, un N-glicano complejo puede ser un N-glicano rico en manosa en el que una o más unidades de manosa están unidas además a una o más unidades de monosacárido, cada una seleccionada independientemente de N-acetilglucosamina, galactosa y ácido siálico.
Como se usa aquí, la “dosis terapéuticamente eficaz” y la “cantidad eficaz” pretenden hacer referencia a una cantidad de a-glucosidasa ácida que es suficiente para dar como resultado una respuesta terapéutica en un sujeto. Una respuesta terapéutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (por ejemplo, un médico) reconozca como una respuesta eficaz a la terapia, incluyendo cualesquiera marcadores clínicos sustitutos o los síntomas descritos aquí y conocidos en la técnica. Por tanto, en al menos una realización, una respuesta terapéutica puede ser una mejora o inhibición de uno o más síntomas o marcadores de la enfermedad de Pompe, tales como los conocidos en la técnica. Los síntomas o marcadores de la enfermedad de Pompe incluyen, entre otros, disminución de la actividad tisular de la a-glucosidasa ácida; cardiomiopatía; cardiomegalia; debilidad muscular progresiva, especialmente en el tronco o miembros inferiores; hipotonía profunda; macroglosia (y en algunos casos, protrusión de la lengua); dificultad para tragar, succionar y/o alimentarse; insuficiencia respiratoria; hepatomegalia (moderada); laxitud de los músculos faciales; arreflexia; intolerancia al ejercicio; disnea de esfuerzo; ortopnea; apnea del sueño; cefaleas matutinas; somnolencia; lordosis y/o escoliosis; disminución de los reflejos tendinosos profundos; lumbalgia; e incumplimiento de los hitos del desarrollo motor.
Como se usa aquí, la expresión “terapia de reemplazo de enzimas” o “ERT” pretende hacer referencia a la introducción de una enzima purificada no nativa en un individuo que tiene una deficiencia de dicha enzima. La proteína administrada se puede obtener de fuentes naturales o por expresión recombinante. La expresión también se refiere a la introducción de una enzima purificada en un individuo que requiere o se beneficia de la administración de una enzima purificada. En al menos una realización, dicho individuo padece insuficiencia enzimática. La enzima introducida puede ser una enzima recombinante purificada producida in vitro, o una proteína purificada a partir de tejido o fluido aislado, tal como, por ejemplo, placenta o leche animal, o de plantas.
Como se usa aquí, la expresión “farmacéuticamente aceptable” pretende referirse a entidades y composiciones moleculares que son fisiológicamente tolerables y que normalmente no producen reacciones adversas cuando se administran a un ser humano. Preferiblemente, como se usa aquí, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos.
Como se usa aquí, el término “excipiente” se refiere a una sustancia distinta de los ingredientes activos incluidos en una formulación, y generalmente es un material inactivo. El excipiente puede ayudar a transportar el fármaco activo al sitio en el que se pretende que el fármaco surta efecto, controlar la liberación del fármaco activo, o ayudar con la solubilización, o puede cumplir una variedad de otras funciones. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, agentes amortiguadores, tensioactivos, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes de carga, estabilizadores, modificadores de tonicidad, etc.
Como se usa aquí, el término “amortiguador” se refiere a una disolución que contiene tanto un ácido débil como su base débil conjugada, cuyo pH cambia solo ligeramente con la adición de un álcali o ácido. Como se explicará más adelante, en algunas realizaciones, el amortiguador usado en la formulación farmacéutica es un amortiguador de citrato y/o fosfato.
Como se usa aquí, los términos “sujeto” o “paciente” se refieren a un ser humano o a animal no humano. En al menos una realización, el sujeto es un mamífero. En al menos una realización, el sujeto es un ser humano.
Tal como se usan aquí, las expresiones “alrededor de” y “aproximadamente” se refieren a un grado de error aceptable para la cantidad medida, dada la naturaleza o precisión de las medidas. Por ejemplo, el grado de error se puede indicar mediante el número de cifras significativas proporcionadas para la medida, como se entiende en la técnica, e incluye, pero no se limita a, una variación de ±1 en la cifra significativa más precisa dada a conocer para la medida. Los grados de error ejemplares típicos están dentro del 20 por ciento (%), preferiblemente dentro del 10%, y más preferiblemente dentro del 5% de un valor dado o intervalo de valores. Alternativamente, y de forma particular en sistemas biológicos, los términos “alrededor de” y “aproximadamente” pueden significar valores que están dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro de 5 veces, y más preferiblemente dentro de 2 veces de un valor dado. Las cantidades numéricas proporcionadas aquí son aproximadas a menos que se indique lo contrario, lo que significa que el término “alrededor de” o “aproximadamente” se puede inferir cuando no se señala expresamente.
ATB200 rhGAA
La formulación comprende ATB200, que es una proteína GAA recombinante (rhGAA) adecuada para uso en la terapia de reemplazo de enzimas. A continuación, se proporcionan los detalles sobre la estructura y producción de ATB200, así como las variantes.
En al menos una realización, la ATB200 se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO), y comprende un mayor contenido de unidades de N-glicano que portan uno o más restos de manosa-6-fosfato en comparación con un contenido de unidades de N-glicano que portan uno o más restos de manosa-6-fosfato de alglucosidasa alfa. Hay siete sitios potenciales de glicosilación ligados a N en rhGAA. Dado que cada sitio de glicosilación es heterogéneo en el tipo de oligosacáridos unidos a N (N-glicanos) presentes, la rhGAA consiste en una mezcla compleja de proteínas con N-glicanos que tienen afinidades de unión variables por el receptor M6P y otros receptores de hidratos de carbono. La rhGAA que contiene N-glicanos ricos en manosa que tienen un grupo M6P (mono-M6P) se une a CIMPR con baja afinidad (-6.000 nM), mientras que la rhGAA que contiene dos grupos M6P en el mismo N-glicano (bis-M6P) se une con alta afinidad (~2 nM). Las estructuras representativas de los glicanos no fosforilados, mono-M6P, y bis-M6P, se muestran en la Figura 1A. El grupo manosa-6-P se muestra en la Figura 1B. Una vez dentro del lisosoma, la rhGAA puede degradar enzimáticamente el glucógeno acumulado. Sin embargo, las rhGAA convencionales tienen niveles totales bajos de glicanos que contienen M6P y bis-M6P, y por lo tanto se dirigen mal a las células musculares, lo que da como resultado un menor suministro de rhGAA a los lisosomas. En la Figura 2A se muestra el direccionamiento farmacológico productivo de rhGAA. La mayoría de las moléculas de rhGAA en estos productos convencionales no tienen N-glicanos fosforilados, por lo que carecen de afinidad por el CIMPR. Los glicanos ricos en manosa no fosforilados también pueden ser eliminados por el receptor de manosa, lo que da como resultado una eliminación no productiva de la ERT (Figura 2B).
El otro tipo de N-glicanos, los hidratos de carbono complejos, que contienen galactosa y ácidos siálicos, también están presentes en la rhGAA. Dado que los N-glicanos complejos no están fosforilados, no tienen afinidad por CIMPR. Sin embargo, los N-glicanos de tipo complejo con restos de galactosa expuestos tienen una afinidad de moderada a alta por el receptor de asialoglicoproteína en los hepatocitos hepáticos, lo que conduce a una eliminación rápida no productiva de rhGAA (Figura 2B).
En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida es una a-glucosidasa ácida humana recombinante denominada aquí ATB200, como se describe en la solicitud de patente internacional PCT/US2015/053252, en trámite junto con la presente. Se ha demostrado que ATB200 se une a los receptores de manosa-6-fosfato independientes de cationes (CIMPR) con alta afinidad (Kd ~ 2-4 nM) y es internalizada de manera eficiente por los fibroblastos de Pompe y los mioblastos del músculo esquelético (Kcaptación ~ 7-14 nM). ATB200 se caracterizó en vivo, y ha demostrado tener una vida media plasmática aparente más corta (t1/2 ~ 45 min) que la alglucosidasa alfa (t1/2 ~ 60 minutos).
En una o más realizaciones, la a-glucosidasa ácida humana recombinante tiene una secuencia de aminoácidos de GAA de tipo salvaje como se expone en SEQ ID NO: 2, que corresponde a los restos de aminoácidos 57-952, y es idéntica a la de GAA humana de tipo salvaje (WT) después del procesamiento proteolítico intracelular natural que elimina los 56 restos iniciales que comprenden el péptido señal y el péptido precursor. La secuencia de aminoácidos de ATB200 se ha verificado mediante digestión tríptica, seguida de cromatografía de líquidos/espectroscopia de masas, así como mediante secuenciación de aminoácidos. Por el contrario, la terapia de reemplazo de enzimas (ERT) de rhGAA estándar actual (los productos disponibles comercialmente que contienen alglucosidasa alfa son Myozyme® en la mayoría de los países, y Lumizyme® en los EE.UU., Genzyme, una compañía de Sanofi) difiere de WT GAA, y contiene 3 sustituciones de restos de aminoácidos: histidina cambió a arginina en la posición 199, arginina cambió a histidina en 223, y valina cambió a isoleucina en 780.
En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida humana recombinante sufre modificaciones postraduccionales y/o químicas en uno o más restos de aminoácidos en la proteína. Por ejemplo, los restos de metionina y triptófano pueden sufrir oxidación. Como otro ejemplo, los restos de asparagina pueden sufrir desamidación a ácido aspártico. Como otro ejemplo más, el ácido aspártico puede experimentar isomerización a ácido isoaspártico. En consecuencia, en algunas realizaciones, la enzima se expresa inicialmente con una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 2, y la enzima sufre una o más de estas modificaciones postraduccionales y/o químicas. Tales modificaciones también están dentro del alcance de la presente descripción.
En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida humana recombinante tiene una secuencia de aminoácidos de GAA de tipo salvaje como se expone en SEQ ID NO: 1, como se describe en la patente US n° 8.592.362, y tiene el número de acceso de GenBank AHE24104.1 (GI:568760974). En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida humana recombinante es glucosidasa alfa, la enzima a-glucosidasa ácida humana codificada por el más predominante de nueve haplotipos observados del gen GAA.
En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida humana recombinante se expresa inicialmente con la secuencia de 952 aminoácidos de longitud completa de GAA de tipo salvaje como se expone en SEQ ID NO: 1, y la a-glucosidasa ácida humana recombinante experimenta procesamiento intracelular que elimina una porción de los aminoácidos, por ejemplo, los primeros 56 aminoácidos. Por consiguiente, la a-glucosidasa ácida humana recombinante segregada por la célula hospedante puede tener una secuencia de aminoácidos más corta que la a-glucosidasa ácida humana recombinante que se expresa inicialmente dentro de la célula. En al menos una realización, la proteína más corta puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, que solo difiere de SEQ ID NO: 1 en que se han eliminado los primeros 56 aminoácidos que comprenden el péptido señal y el péptido precursor, dando, así como resultado una proteína que tiene 896 aminoácidos. También son posibles otras variaciones en el número de aminoácidos, tal como tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más supresiones, sustituciones y /o inserciones con respecto a la secuencia de aminoácidos descrita por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el producto rhGAA incluye una mezcla de moléculas de a-glucosidasa ácida humana recombinante que tienen diferentes longitudes de aminoácidos.
En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida humana recombinante sufre modificaciones postraduccionales y/o químicas en uno o más restos de aminoácidos en la proteína. Por ejemplo, los restos de metionina y triptófano pueden sufrir oxidación. Como otro ejemplo, la glutamina N-terminal puede formar piroglutamato. Como otro ejemplo, los restos de asparagina pueden sufrir desamidación a ácido aspártico. Como otro ejemplo más, los restos de ácido aspártico puede experimentar isomerización a ácido isoaspártico. Como otro ejemplo más, los restos de cisteína no apareados en la proteína pueden formar enlaces de disulfuro con glutationa y/o cisteína libres. En consecuencia, en algunas realizaciones, la enzima se expresa inicialmente con una secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y la enzima sufre una o más de estas modificaciones postraduccionales y/o químicas. Tales modificaciones también están dentro del alcance de la presente descripción.
Preferiblemente, no más del 70, 65, 60, 55, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 o 5% del total de moléculas de a-glucosidasa ácida humana recombinante carecen de una unidad de N-glicano que porta una o más restos de manosa-6-fosfato, o carecen de la capacidad para unirse al receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CIMPR). Alternativamente, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%, <100% o más de las moléculas de aglucosidasa ácida humana recombinante comprenden al menos una unidad de N-glicano que porta uno o más restos de manosa-6-fosfato o tiene la capacidad de unirse a CIMPR.
Las moléculas de a-glucosidasa ácida humana recombinante pueden tener 1, 2, 3 o 4 grupos de manosa-6-fosfato (M6P) en sus glicanos. Por ejemplo, solo un N-glicano en una molécula de a-glucosidasa ácida humana recombinante puede portar M6P (monofosforilado), un único N-glicano puede portar dos grupos M6P (bisfosforilado), o dos N-glicanos diferentes en la misma molécula de a-glucosidasa ácida humana recombinante pueden portar cada uno grupos M6P individuales. Las moléculas de a-glucosidasa ácida humana recombinante también pueden tener N-glicanos que no porten grupos M6P. En otra realización, en promedio, los N-glicanos contienen más de 3 mol/mol de M6P y más de 4 mol/mol de ácido siálico, de modo que la a-glucosidasa ácida humana recombinante comprende en promedio al menos 3 moles de restos de manosa-6-fosfato por mol de a-glucosidasa ácida humana recombinante, y al menos 4 moles de ácido siálico por mol de a-glucosidasa ácida humana recombinante. En promedio, al menos alrededor del 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10% de los glicanos totales en la a-glucosidasa ácida humana recombinante puede estar en forma de un glicano mono-M6P; por ejemplo, alrededor del 6,25% de los glicanos totales pueden portar un solo grupo M6P, y, en promedio, al menos alrededor del 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0% de los glicanos totales en la aglucosidasa ácida humana recombinante están en forma de glicano bis-M6P, y, en promedio, menos del 25% de la aglucosidasa ácida humana recombinante total no contiene glicano fosforilado que se una a CIMPR.
La a-glucosidasa ácida humana recombinante puede tener un contenido promedio de N-glicanos que portan M6P que oscila de 0,5 a 7,0 mol/mol de a-glucosidasa ácida humana recombinante, o cualquier valor intermedio de subintervalo, incluyendo 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 o 7,0 mol/mol de a-glucosidasa ácida humana recombinante. La a-glucosidasa ácida humana recombinante puede fraccionarse para proporcionar preparaciones de a-glucosidasa ácida humana recombinante con diferentes números promedio de glicanos que portan M6P o bis-M6P, lo que permite así una mayor personalización de la a-glucosidasa ácida humana recombinante dirigida a los lisosomas en tejidos diana al seleccionar una fracción particular o al combinar selectivamente diferentes fracciones.
En algunas realizaciones, la a-glucosidasa ácida humana recombinante tendrá, en promedio, 2,0 a 8,0 moles de M6P por mol de a-glucosidasa ácida humana recombinante. Este intervalo incluye todos los valores intermedios y subintervalos, incluyendo 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0 mol de M6P/mol de a-glucosidasa ácida humana recombinante.
Hasta el 60% de los N-glicanos en la a-glucosidasa ácida humana recombinante pueden estar completamente sialilados, por ejemplo, hasta el 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o 60% de los N-glicanos pueden estar completamente sializados. En algunas realizaciones, de 4 a 20% de los N-glicanos totales están completamente sialilados. En otras realizaciones, no más del 5%, 10%, 20% o 30% de los N-glicanos en la a-glucosidasa ácida humana recombinante portan ácido siálico y un resto terminal de galactosa (Gal). Este intervalo incluye todos los valores intermedios y subintervalos, por ejemplo, del 7 al 30% de los N-glicanos totales en la a-glucosidasa ácida humana recombinante pueden portar ácido siálico y galactosa terminal. En aún otras realizaciones, no más del 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 o 20% de los N-glicanos en la a-glucosidasa ácida humana recombinante tienen una galactosa terminal solamente, y no contienen ácido siálico. Este intervalo incluye todos los valores intermedios y subintervalos; por ejemplo, del 8 al 19% de los N-glicanos totales en la a-glucosidasa ácida humana recombinante en la composición pueden portar galactosa terminal solamente, y no contener ácido siálico.
En otras realizaciones de la invención, 40, 45, 50, 55 a 60% de los N-glicanos totales en la a-glucosidasa ácida humana recombinante son N-glicanos de tipo complejo; o no más del 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% de los N-glicanos totales en la aglucosidasa ácida humana recombinante son N-glicanos de tipo híbrido; no más del 5, 10, o 15% de los N-glicanos de tipo ricos en manosa en la a-glucosidasa ácida humana recombinante no están fosforilados; al menos el 5% o el 10% de los N-glicanos de tipo ricos en manosa en la a-glucosidasa ácida humana recombinante están fosforilados mono-M6P; y/o al menos el 1 o el 2% de los N-glicanos de tipo ricos en manosa en la a-glucosidasa ácida humana recombinante están fosforilados bis-M6P. Estos valores incluyen todos los valores intermedios y subintervalos. Una aglucosidasa ácida humana recombinante puede cumplir uno o más de los intervalos de contenido descritos anteriormente.
En algunas realizaciones, la a-glucosidasa ácida humana recombinante tendrá, en promedio, 2,0 a 8,0 moles de restos de ácido siálico por mol de a-glucosidasa ácida humana recombinante. Este intervalo incluye todos los valores intermedios y subintervalos, incluyendo 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0 mol de restos/mol de a-glucosidasa ácida humana recombinante. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que la presencia de unidades de N-glicano que portan restos de ácido siálico puede evitar la eliminación no productiva de la a-glucosidasa ácida humana recombinante por parte de los receptores de asialoglicoproteína.
En una o más realizaciones, la rhGAA tiene M6P y/o unidades de ácido siálico en ciertos sitios de N-glicosilación de la proteína lisosomal humana recombinante. Por ejemplo, hay siete sitios potenciales de glicosilación ligados a N en rhGAA. Estos sitios potenciales de glicosilación están en las siguientes posiciones de SEQ ID NO: 2: N84, N177, N334, N414, N596, N826 y N869. De manera similar, para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 1, estos sitios potenciales de glicosilación están en las siguientes posiciones: N140, N233, N390, N470, N652, N882 y N925. Otras variantes de rhGAA pueden tener sitios de glicosilación similares, dependiendo de la ubicación de los restos de asparagina. Generalmente, las secuencias de ASN-X-SER o ASN-X-THR en la secuencia de aminoácidos de la proteína indican sitios potenciales de glicosilación, con la excepción de que X no puede ser HIS o PRO.
En diversas realizaciones, la rhGAA tiene un cierto perfil de N-glicosilación. En una o más realizaciones, al menos el 20% de la rhGAA se fosforila en el primer sitio de N-glicosilación (por ejemplo, N84 para SEQ ID NO: 2 y N140 para SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, al menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA se puede fosforilar en el primer sitio de N-glicosilación. Esta fosforilación puede ser el resultado de unidades mono-M6P y/o bis-M6P. En algunas realizaciones, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA porta una unidad mono-M6P en el primer sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA porta una unidad bis-M6P en el primer sitio de N-glicosilación.
En una o más realizaciones, al menos el 20% de la rhGAA se fosforila en el segundo sitio de N-glicosilación (por ejemplo, N177 para SEQ ID NO: 2 y N223 para SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, al menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA se puede fosforilar en el segundo sitio de N-glicosilación. Esta fosforilación puede ser el resultado de unidades mono-M6P y/o bis-M6P. En algunas realizaciones, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA porta una unidad mono-M6P en el segundo sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA porta una unidad bis-M6P en el segundo sitio de N-glicosilación. En una o más realizaciones, al menos el 5% de la rhGAA se fosforila en el tercer sitio de N-glicosilación (por ejemplo, N334 para SEQ ID NO: 2 y N390 para SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, menos del 5%, 10%, 15%, 20% o 25% de la rhGAA se fosforila en el tercer sitio de N-glicosilación. Por ejemplo, el tercer sitio de N-glicosilación puede tener como la especie principal una mezcla de glicanos ricos en manosa no fosforilados, glicanos complejos di-, tri- y tetraantenarios, y glicanos híbridos. En algunas realizaciones, al menos el 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% o 50% de la rhGAA está sialilada en el tercer sitio de N-glicosilación.
En una o más realizaciones, al menos el 20% de la rhGAA se fosforila en el cuarto sitio de N-glicosilación (por ejemplo, N414 para SEQ ID NO: 2 y N470 para SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, al menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA se puede fosforilar en el cuarto sitio de N-glicosilación. Esta fosforilación puede ser el resultado de unidades mono-M6P y/o bis-M6P. En algunas realizaciones, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA porta una unidad mono-M6P en el cuarto sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA porta una unidad bis-M6P en el cuarto sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos el 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% o 25% de la rhGAA está sialilada en el cuarto sitio de N-glicosilación.
En una o más realizaciones, al menos el 5% de la rhGAA se fosforila en el quinto sitio de N-glicosilación (por ejemplo, N596 para SEQ ID NO: 2 y N692 para SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, menos del 5%, 10%, 15%, 20% o 25% de la rhGAA se fosforila en el quinto sitio de N-glicosilación. Por ejemplo, el quinto sitio de N-glicosilación puede tener como la especie principal glicanos complejos diantenarios fucosilados. En algunas realizaciones, al menos 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA está sialilada en el quinto sitio de N-glicosilación.
En una o más realizaciones, al menos el 5% de la rhGAA se fosforila en el sexto sitio de N-glicosilación (por ejemplo, N826 para SEQ ID NO: 2 y N882 para SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, menos del 5%, 10%, 15%, 20% o 25% de la rhGAA se fosforila en el sexto sitio de N-glicosilación. Por ejemplo, el sexto sitio de N-glicosilación puede tener una mezcla de glicanos complejos di-, tri- y tetra-antenarios como la especie principal. En algunas realizaciones, al menos 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de la rhGAA está sialilada en el sexto sitio de N-glicosilación.
En una o más realizaciones, al menos el 5% de la rhGAA se fosforila en el séptimo sitio de N-glicosilación (por ejemplo, N869 para SEQ ID NO: 2 y N925 para SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, menos del 5%, 10%, 15%, 20% o 25% de la rhGAA se fosforila en el séptimo sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, menos del 40%, 45%, 50%, 55%, 60% o 65% de la rhGAA tiene algún glicano en el séptimo sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos el 30%, 35% o 40% de la rhGAA tiene un glicano en el séptimo sitio de N-glicosilación.
En diversas realizaciones, la rhGAA tiene un contenido medio de fucosa de 0-5 mol por mol de rhGAA, un contenido de GlcNAc de 10-30 mol por mol de rhGAA, un contenido de galactosa de 5-20 mol por mol de rhGAA, un contenido de manosa de 10-40 mol por mol de rhGAA, un contenido de M6P de 2-8 mol por mol de rhGAA, y un contenido de ácido siálico de 2-8 mol por mol de rhGAA. En diversas realizaciones, la rhGAA tiene un contenido medio de fucosa de 2-3 mol por mol de rhGAA, un contenido de GlcNAc de 20-25 mol por mol de rhGAA, un contenido de galactosa de 8-12 mol por mol de rhGAA, un contenido de manosa de 22-27 mol por mol de rhGAA, un contenido de M6P de 3-5 mol por mol de rhGAA, y un contenido de ácido siálico de 4-7 mol por mol de rhGAA.
La a-glucosidasa ácida humana recombinante se produce preferentemente por células de ovario de hámster chino (CHO), tal como la línea celular CHO GA-ATB200 o ATB200-001-X5-14, o por un subcultivo o derivado de tal cultivo de células CHO. Las construcciones de ADN, que expresan variantes alélicas de a-glucosidasa ácida u otras variantes de secuencias de aminoácidos de a-glucosidasa ácida, tales como aquellas que son al menos 90%, 95% o 99% idénticas a SEQ ID NO: 1, pueden construirse y expresarse en células CHO. Estas secuencias de aminoácidos de la a-glucosidasa ácida variantes pueden contener supresiones, sustituciones y/o inserciones con respecto a la SEQ ID NO: 1, tal como tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más supresiones, sustituciones y/o inserciones en la secuencia de aminoácidos descrita por SEQ ID NO: 1. Los expertos en la técnica pueden seleccionar vectores alternativos adecuados para transformar células CHO para la producción de tales construcciones de ADN.
Se pueden usar diversos algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y se pueden usar con, por ejemplo, la configuración predeterminada. Por ejemplo, se contemplan los polipéptidos que tienen al menos un 90%, 95% o 99% de identidad con los polipéptidos específicos descritos aquí y que preferiblemente exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótidos que codifican tales polipéptidos. A menos que se indique lo contrario, la puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de positivos de BLASTP, y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades de BLASTP. BLASTP “Identidades” muestra el número y la fracción de restos totales en los pares de secuencias de alta puntuación que son idénticos; y BLASTP “Positivos” muestra el número y la fracción de restos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud, o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con las secuencias de aminoácidos descritas aquí, se contemplan y están abarcadas por esta descripción. Las secuencias polinucleotídicas de polipéptidos similares se deducen usando el código genético, y se pueden obtener por medios convencionales, en particular mediante la traducción inversa de su secuencia de aminoácidos usando el código genético.
En algunas realizaciones, la a-glucosidasa ácida humana recombinante que tiene una capacidad superior para dirigirse contra los receptores de manosa-6-fosfato independientes de cationes (CIMPR) y los lisosomas celulares, así como los patrones de glicosilación que reducen su eliminación no productiva in vivo, se puede producir usando células de ovario de hámster chino (CHO). Estas células pueden ser inducidas para expresar a-glucosidasa ácida humana recombinante con niveles significativamente más altos de unidades de N-glicano que contienen uno o más restos de manosa-6-fosfato que los productos de a-glucosidasa ácida humana recombinante convencional, tal como la alglucosidasa alfa. La a-glucosidasa ácida humana recombinante producida por estas células, por ejemplo, como se ejemplifica con ATB200, tiene significativamente más restos de N-glicanos con manosa-6-fosfato (M6P) y bis-manosa-6-fosfato dirigidos contra las células musculares que la a-glucosidasa ácida convencional, tal como Lumizyme®. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que esta amplia glicosilación permite que la enzima ATB200 se absorba de manera más eficaz en las células diana, y por lo tanto se elimine de la circulación de manera más eficaz que otras aglucosidasas ácidas humanas recombinantes, tal como, por ejemplo, alglucosidasa alfa, que tiene un contenido mucho menor de M6P y bis-M6P. Se ha mostrado que ATB200 se une de manera eficiente a CIMPR, y es absorbida de manera eficiente por el músculo esquelético y el músculo cardíaco, y tiene un patrón de glicosilación que proporciona un perfil farmacocinético favorable y reduce la eliminación no productiva in vivo.
También se contempla que la gran glicosilación de ATB200 puede contribuir a una reducción de la inmunogenicidad de ATB200 en comparación con, por ejemplo, la alglucosidasa alfa. Como apreciarán los expertos en la técnica, la glicosilación de proteínas con azúcares de mamíferos conservados generalmente mejora la solubilidad del producto y disminuye la agregación y la inmunogenicidad del producto. La glicosilación altera indirectamente la inmunogenicidad de las proteínas al minimizar la agregación de proteínas y al proteger los epítopos de proteínas inmunogénicas del sistema inmunitario (Guidance for Industry - Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research, agosto 2014). Por lo tanto, en al menos una realización, la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante no induce anticuerpos antifármaco. En al menos una realización, la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante induce una menor incidencia de anticuerpos antifármaco en un sujeto que el nivel de anticuerpos antifármaco inducido por la administración de alglucosidasa alfa.
Como se describe en la solicitud de patente internacional PCT/US2015/053252, en trámite junto con la presente, se pueden usar células, tales como células CHO, para producir la rhGAA descrita en la misma, y esta rhGAA se puede usar en la presente invención. Ejemplos de una línea celular CHO de este tipo son GA-ATB200 o ATB200-001-X5-14, o un subcultivo de las mismas que produce una composición de rhGAA como se describe allí. Tales líneas de células CHO pueden contener múltiples copias de un gen, tal como 5, 10, 15 o 20 o más copias, de un polinucleótido que codifica GAA.
La rhGAA rica en M6P y bis-M6P, tal como la rhGAA ATB200, se puede producir mediante la transformación de células CHO con una construcción de ADN que codifica GAA. Si bien las células CHO se han usado previamente para producir rhGAA, no se apreció que las células CHO transformadas pudieran cultivarse y seleccionarse de una manera que produjeran rhGAA que tiene un alto contenido de glicanos M6P y bis-M6P que se dirigen contra CIMPR.
Sorprendentemente, se encontró que era posible transformar líneas de células CHO, seleccionar transformantes que producen rhGAA que tiene un alto contenido de glicanos que portan M6P o bis-M6P que se dirigen contra CIMPR, y expresar de manera estable esta rhGAA rica en M6P. Por lo tanto, los métodos para hacer estas líneas de células CHO también se describen en la solicitud de patente internacional PCT/US2015/053252, en trámite junto con la presente. Este método consiste en transformar una célula CHO con ADN que codifica GAA o una variante de GAA, seleccionar una célula CHO que integre de forma estable el ADN que codifica GAA en su o sus cromosomas y que exprese de forma estable g Aa , y seleccionar una célula CHO que exprese GAA que tenga un alto contenido de glicanos que portan M6P o bis-M6P, y, opcionalmente, seleccionar una célula CHO que tenga N-glicanos con alto contenido de ácido siálico y/o que tenga N-glicanos con un bajo contenido rico en manosa no fosforilada. Estas líneas celulares CHO pueden usarse para producir rhGAA y composiciones de rhGAA cultivando la línea celular CHO y recuperando dicha composición del cultivo de células CHO.
En una o más realizaciones, la ATB200 está presente en una cantidad que oscila de alrededor de 5 a alrededor de 50 mg/ml. En realizaciones adicionales, la ATB200 está presente en una cantidad que oscila de alrededor de 5, 8, 10 o 12 a alrededor de 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg/ml. En algunas realizaciones, la ATB200 está presente en una cantidad de alrededor de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 mg/ml. En realizaciones adicionales, la ATB200 está presente en una cantidad de alrededor de 15 mg/ml.
pH y amortiguador
El pH de la formulación puede oscilar de alrededor de 5,0 a alrededor de 7,0, o alrededor de 5,0 a alrededor de 6,0. En una o más realizaciones, el pH oscila de alrededor de 5,5 a alrededor de 6,0. En algunas realizaciones, la formulación tiene un pH de alrededor de 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4 o 6,5. En general, las cantidades de componentes que se indican producirán un pH en el intervalo de alrededor de 5,0 a alrededor de 6,0. Sin embargo, el pH se puede ajustar a un pH diana mediante el uso de ajustadores de pH (es decir, alcalinizantes y acidulantes), tales como hidróxido de sodio y/o ácido clorhídrico.
La formulación también comprende un amortiguador, que se selecciona del grupo que consiste en un citrato, un fosfato, y combinaciones de los mismos. Como se usa aquí, “amortiguador” se refiere a una disolución amortiguadora que contiene un ácido débil y su base conjugada, que ayuda a prevenir cambios en el pH. El citrato y/o el fosfato pueden ser un citrato de sodio o un fosfato de sodio. Otras sales incluyen sales de potasio y amonio. En una o más realizaciones, el amortiguador comprende un citrato. En otras realizaciones, el amortiguador comprende citrato de sodio (por ejemplo, una mezcla de citrato de sodio deshidratado y ácido cítrico monohidratado). En una o más realizaciones, las disoluciones amortiguadoras que comprenden un citrato pueden comprender citrato de sodio y ácido cítrico. En algunas realizaciones, están presentes tanto un amortiguador de citrato como de fosfato.
Excipientes
La formulación también comprende al menos un excipiente. Algunas realizaciones de la invención comprenden excipientes que ayudan con la tonicidad, actúan como agentes de carga, o actúan como estabilizadores. En una o más realizaciones, el al menos un excipiente se selecciona del grupo que consiste en manitol, polisorbato y combinaciones de los mismos.
En una o más realizaciones, el excipiente comprende un ingrediente que puede actuar como modificador de la tonicidad y/o agente de carga, particularmente manitol. Los agentes de tonicidad son componentes que ayudan a asegurar que la formulación tenga una presión osmótica similar o igual a la sangre humana. Los agentes de carga son ingredientes que añaden masa a las formulaciones (por ejemplo, liofilizados) y proporcionan una estructura adecuada a la torta.
En una o más realizaciones, la cantidad total de agente de tonicidad y/o de carga oscila en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 50 mg/ml. En otras realizaciones, la cantidad total de agente de tonicidad y/o de carga oscila en una cantidad de alrededor de 10, 11, 12, 13, 14 o 15 a alrededor de 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg/ml. En algunas realizaciones, el agente de tonicidad y/o de carga comprende manitol. En una o más realizaciones, el manitol está presente en una cantidad de alrededor de 10 a alrededor de 50 mg/ml. En realizaciones adicionales, el manitol está presente en una cantidad de alrededor de 10, 11, 12, 13, 14 o 15 a alrededor de 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg/ml. En aún otras realizaciones, el manitol está presente en una cantidad de alrededor de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mg/ml. En algunas realizaciones, el manitol es el único agente de tonicidad y/o de carga. Los ejemplos de otros agentes de tonicidad y/o de carga incluyen cloruro de sodio, sacarosa, y trehalosa.
En algunas realizaciones, el excipiente comprende un ingrediente que puede actuar como estabilizador, tal como polisorbato 80. Los estabilizadores son compuestos que pueden prevenir o minimizar la formación de agregados en las superficies interfaciales hidrófobas de aire-agua. En algunas realizaciones, el estabilizador es un tensioactivo. En una o más realizaciones, la cantidad total de estabilizador oscila de alrededor de 0,1 a alrededor de 1,0 mg/ml. En realizaciones adicionales, la cantidad total de estabilizador oscila de alrededor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 a alrededor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 mg/ml. En aún otras realizaciones, la cantidad total de estabilizador es alrededor de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 mg/ml. En algunas realizaciones, el polisorbato 80 es el único estabilizador. Por tanto, en una o más realizaciones, el polisorbato 80 oscila de alrededor de 0,1 a alrededor de 1,0 mg/ml. En realizaciones adicionales, el polisorbato 80 oscila de alrededor de 0,1,0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 a alrededor de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 mg/ml. En aún otras realizaciones, el polisorbato 80 es alrededor de 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 mg/ml.
En una o más realizaciones, puede ser deseable excluir ciertos compuestos de la formulación. Por ejemplo, al preparar una formulación para el tratamiento de una enfermedad dada, sería deseable excluir ciertos compuestos que agravarían la enfermedad subyacente. Como se discutió anteriormente, las personas con la enfermedad de Pompe tienen una capacidad reducida o nula para descomponer el glucógeno. Varios excipientes de uso común, tales como la sacarosa, la trehalosa y la glicina, pueden convertirse en glucosa en el cuerpo, lo que a su vez agravaría la enfermedad de Pompe. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la sacarosa, la trehalosa y/o la glicina se excluyen de la formulación. De manera similar, se pueden excluir ciertos componentes que no son los más adecuados para la formulación dados ciertos contextos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se pueden excluir los poloxámeros. Realizaciones ejemplares
En una o más realizaciones, la formulación comprende o consiste esencialmente en:
(a) ATB200 (por ejemplo, una a-glucosidasa ácida recombinante, en la que la a-glucosidasa ácida recombinante se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) y comprende un mayor contenido de unidades de N-glicano que portan uno o dos restos de manosa-6-fosfato en comparación con un contenido de unidades de N-glicano que portan uno o dos restos de manosa-6-fosfato de alglucosidasa alfa);
(b) al menos un amortiguador seleccionado del grupo que consiste en un citrato, un fosfato y combinaciones de los mismos;
(c) al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en manitol, polisorbato 80, y combinaciones de los mismos; y
en la que la formulación tiene un pH de alrededor de 5,0 a alrededor de 6,0 o 7,0.
En algunas realizaciones, la formulación comprende o consiste esencialmente en:
(a) ATB200 (por ejemplo, una a-glucosidasa ácida recombinante, en la que la a-glucosidasa ácida recombinante se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) y comprende un mayor contenido de unidades de N-glicano que portan uno o dos restos de manosa-6-fosfato en comparación con un contenido de unidades de N-glicano que portan uno o dos restos de manosa-6-fosfato de alglucosidasa alfa);
(b1) citrato de sodio;
(b2) ácido cítrico monohidratado;
(c1) manitol;
(c2) polisorbato 80;
(d) agua;
(e) opcionalmente, un agente acidulante; y
(f) opcionalmente, un agente alcalinizante,
en la que la formulación tiene un pH de alrededor de 5,0 a alrededor de 6,0 o 7,0. En otras realizaciones, el pH oscila de alrededor de 5,5 a alrededor de 6,0. En aún otras realizaciones, el pH es alrededor de 6,0.
En una realización específica, la formulación comprende:
(a) ATB200 (por ejemplo, una a-glucosidasa ácida recombinante, en la que la a-glucosidasa ácida recombinante se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) y comprende un mayor contenido de unidades de N-glicano que portan uno o dos restos de manosa-6-fosfato en comparación con un contenido de unidades de N-glicano que portan uno o dos restos de manosa-6-fosfato de alglucosidasa alfa), presente en una concentración de alrededor de 5-30 mg/ml o alrededor de 15 mg/ml;
(b) amortiguador de citrato de sodio, presente en una concentración de alrededor de 10-100 mM o alrededor de 25 mM;
(cl) manitol, presente en una concentración de alrededor de 10-50 mg/ml, o alrededor de 20 mg/ml;
(c2) polisorbato 80, presente en una concentración de alrededor de 0,1-1 mg/ml, o alrededor de 0,5 mg/ml; y (d) agua;
(e) opcionalmente, un agente acidulante; y
(f) opcionalmente, un agente alcalinizante,
en la que la formulación tiene un pH de alrededor de 5,0 a alrededor de 6,0 o 7,0. En otras realizaciones, el pH oscila de alrededor de 5,5 a alrededor de 6,0. En aún otras realizaciones, el pH es alrededor de 6,0.
Preparación de la formulación
Otro aspecto de la invención se refiere a los métodos para preparar las formulaciones descritas aquí. En una o más realizaciones, la formulación se puede preparar a partir de la disolución de enzima. Esta disolución se puede concentrar e intercambiar el amortiguador hasta la concentración diana y los amortiguadores según sea necesario usando métodos conocidos en la técnica. Entonces se pueden añadir componentes adicionales (por ejemplo, excipientes y ajustadores de pH). A continuación, la formulación se puede filtrar y colocar en un recipiente de almacenamiento y se puede almacenar.
En una o más realizaciones, el método para preparar cualquiera de las formulaciones farmacéuticas descritas aquí comprende: añadir al agua al menos un amortiguador, al menos un excipiente y a-glucosidasa ácida recombinante, para proporcionar una disolución; ajustar opcionalmente el pH de la disolución; y opcionalmente añadir agua adicional a la disolución. En realizaciones adicionales, el método comprende además filtrar la disolución. En aún otras realizaciones, el método comprende además almacenar la disolución.
A continuación, se da un procedimiento ejemplar, no limitativo, para la producción de una formulación como se describe aquí:
1. En un recipiente de fabricación adecuado, añada alrededor de 85-90% del volumen del lote de agua para inyección.
2. Añada y disuelva los excipientes y amortiguadores deseados (por ejemplo, citrato de sodio dihidratado, ácido cítrico monohidratado, polisorbato 80, manitol), y mezcle hasta que se disuelva.
3. Añada el principio activo ATB200, y mezcle.
4. Ajuste el pH al pH buscado (por ejemplo, 6 ± 0,1) según sea necesario con ajustadores (por ejemplo,) disolución de ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
5. Añada suficiente agua para inyección hasta el volumen final, y mezcle.
6. Filtre la disolución a través de un filtro estéril en un receptor estéril.
7. Llene asépticamente la disolución del medicamento en los viales, e inserte los tapones.
8. Tape todos los viales y guárdelos a 22-82C.
En una o más realizaciones, la formulación según se prepara estará en forma líquida. Es decir, la formulación comprende agua. Esta formulación líquida puede someterse a un procedimiento de liofilización (secado por congelación) para proporcionar una torta o un polvo. En consecuencia, otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente después de la liofilización. La mezcla liofilizada puede comprender la ATB200, el amortiguador seleccionado del grupo que consiste en un citrato, un fosfato, y combinaciones de los mismos, y al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en trehalosa, manitol, polisorbato 80, y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se pueden añadir otros ingredientes (por ejemplo, otros excipientes) a la mezcla liofilizada. La composición farmacéutica que comprende la formulación liofilizada se puede proporcionar en un vial, que luego se puede almacenar, transportar, reconstituir y/o administrar a un paciente.
Método de tratamiento y administración al paciente
Otro aspecto se refiere a un método de tratamiento de la enfermedad de Pompe, y/o al uso de las formulaciones descritas aquí para el tratamiento de la enfermedad de Pompe. La formulación se puede administrar tal como está preparada, o después de la liofilización y reconstitución. Así, en una o más realizaciones, el método comprende administrar a un paciente que lo necesite cualquiera de las formulaciones farmacéuticas descritas anteriormente. En otras realizaciones, el método comprende reconstituir la composición farmacéutica liofilizada, y administrar la composición farmacéutica reconstituida a un paciente que lo necesite. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica reconstituida tiene una composición similar o igual a la de la formulación farmacéutica antes de la liofilización y/o según se prepara. En cualquier caso, la formulación farmacéutica o la composición farmacéutica reconstituida pueden diluirse antes de la administración al paciente. En realizaciones adicionales, la formulación farmacéutica o la composición farmacéutica reconstituida se administra por vía intravenosa.
En una o más realizaciones, una composición para administración intravenosa es una disolución en amortiguador acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. En general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, tal como una ampolla o un sobre, que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua estéril de grado farmacéutico, disolución salina o dextrosa/agua. Cuando la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o disolución salina, de manera que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.
En otras realizaciones, la formulación farmacéutica o la composición farmacéutica reconstituida se administra mediante administración directa a un tejido diana, tal como el corazón o el músculo esquelético (por ejemplo, intramuscular), o el sistema nervioso (por ejemplo, inyección directa en el cerebro, intraventricularmente, intratecalmente). Si se desea, se puede usar más de una ruta al mismo tiempo.
La formulación farmacéutica o composición reconstituida se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz (por ejemplo, una cantidad de dosificación que, cuando se administra a intervalos regulares, es suficiente para tratar la enfermedad, tal como mejorando los síntomas asociados con la enfermedad, previniendo o retrasando la aparición de la enfermedad, y/o disminuyendo la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad). La cantidad que será terapéuticamente eficaz en el tratamiento de la enfermedad dependerá de la naturaleza y extensión de los efectos de la enfermedad, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida humana recombinante se administra por infusión intravenosa a una dosis de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg, tal como alrededor de 5 mg/kg a alrededor de 30 mg/kg, típicamente alrededor de 5 mg/kg a alrededor de 20 mg/kg. En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida humana recombinante se administra por infusión intravenosa a una dosis de alrededor de 5 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 25 mg/kg, alrededor de 30 mg/kg, alrededor de 35 mg/kg, alrededor de 40 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 60 mg/kg, alrededor de 70 mg/kg, alrededor de 80 mg/kg, alrededor de 90 mg/kg, o alrededor de 100 mg/kg. En al menos una realización, la a-glucosidasa ácida humana recombinante se administra por infusión intravenosa a una dosis de alrededor de 20 mg/kg. La dosis eficaz para un individuo en particular se puede variar (por ejemplo, aumentar o disminuir) con el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en momentos de enfermedad física o estrés, o si se presentan o aumentan los anticuerpos anti-a-glucosidasa ácida, o si los síntomas de la enfermedad empeoran, se puede aumentar la cantidad.
La cantidad terapéuticamente eficaz de a-glucosidasa ácida humana recombinante (o composición o medicamento que contiene a-glucosidasa ácida humana recombinante) se administra a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza y el alcance de los efectos de la enfermedad, y de forma continua. La administración a un “intervalo regular”, como se usa aquí, indica que la cantidad terapéuticamente eficaz se administra periódicamente (a diferencia de una dosis única). El intervalo se puede determinar mediante técnicas clínicas estándar. En realizaciones preferidas, la aglucosidasa ácida humana recombinante se administra mensualmente, bimensualmente; semanalmente; dos veces por semana; o diariamente. El intervalo de administración para un solo individuo no necesita ser un intervalo fijo, sino que puede variar con el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en momentos de enfermedad física o estrés, si se presentan o aumentan los anticuerpos anti-a-glucosidasa ácida humana recombinante, o si los síntomas de la enfermedad empeoran, el intervalo entre dosis se puede reducir.
En una o más realizaciones, la formulación farmacéutica o composición reconstituida se coadministra con una chaperona farmacológica, tal como la administración oral de la chaperona y la administración intravenosa de la formulación farmacéutica o composición reconstituida. En diversas realizaciones, la chaperona farmacológica es miglustat. En al menos una realización, el miglustat se administra a una dosis oral de alrededor de 200 mg a alrededor de 400 mg, o a una dosis oral de alrededor de 200 mg, alrededor de 250 mg, alrededor de 300 mg, alrededor de 350 mg o alrededor de 400 mg. En al menos una realización, el miglustat se administra a una dosis oral de alrededor de 233 mg a alrededor de 400 mg. En al menos una realización, el miglustat se administra a una dosis oral de alrededor de 250 a alrededor de 270 mg, o a una dosis oral de alrededor de 250 mg, alrededor de 255 mg, alrededor de 260 mg, alrededor de 265 mg o alrededor de 270 mg. En al menos una realización, el miglustat se administra como una dosis oral de alrededor de 260 mg.
En al menos una realización, el miglustat y la a-glucosidasa ácida humana recombinante se administran simultáneamente. En al menos una realización, el miglustat y la a-glucosidasa ácida humana recombinante se administran secuencialmente. En al menos una realización, el miglustat se administra antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra menos de tres horas antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra alrededor de dos horas antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra menos de dos horas antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra alrededor de 1,5 horas antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra alrededor de una hora antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra desde alrededor de 50 minutos hasta alrededor de 70 minutos antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra desde alrededor de 55 minutos hasta alrededor de 65 minutos antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra alrededor de 30 minutos antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra desde alrededor de 25 minutos hasta alrededor de 35 minutos antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante. En al menos una realización, el miglustat se administra desde alrededor de 27 minutos hasta alrededor de 33 minutos antes de la administración de la a-glucosidasa ácida humana recombinante.
Kit
Otro aspecto se refiere a los kits que comprenden las formulaciones farmacéuticas descritas aquí (incluso después de la liofilización). En una o más realizaciones, el kit comprende un recipiente (por ejemplo, vial, tubo, bolsa, etc.) que comprende las formulaciones farmacéuticas (ya sea antes o después de la liofilización) y las instrucciones para la reconstitución, dilución y administración.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1 DE ENZIMA: LIMITACIONES DE PRODUCTOS DE rhGAA MYOZYME® Y LUMIZYME® EXISTENTES
Para evaluar la capacidad de la rhGAA en Myozyme® y Lumizyme®, los únicos tratamientos actualmente aprobados para la enfermedad de Pompe, estas preparaciones de rhGAA se inyectaron en una columna CIMPR (que se une a rhGAA que tiene grupos M6P) y posteriormente se eluyeron con un gradiente de M6 libre. Las fracciones se recogieron en placas de 96 pocillos, y la actividad de GAA se analizó mediante el sustrato 4MU-a-glucosa. Las cantidades relativas de rhGAA unida y no unida se determinaron en base a la actividad de GAA, y se dieron a conocer como la fracción de enzima total.
Las Figuras 3A-B muestran los problemas asociados con los ERT convencionales (Myozyme® y Lumizyme®): el 73% de la rhGAA en Myozyme® (Figura 3B) y el 78% de la rhGAA en Lumizyme® (Figura 3A) no se unió al C iMp R; vea los picos más a la izquierda en cada figura. Solo el 27% de la rhGAA en Myozyme® y el 22% de la rhGAA en Lumizyme® contenía M6P, que puede ser productivo para dirigirlo al CIMPR en las células musculares.
Una dosis eficaz de Myozyme® y Lumizyme® corresponde a la cantidad de rhGAA que contiene M6P que se dirige al CIMPR en las células musculares. Sin embargo, la mayor parte de la rhGAA en estos dos productos convencionales no se dirige al receptor CIMPR en las células musculares diana. La administración de una rhGAA convencional, en la que la mayor parte de la rhGAA no está dirigida a las células musculares, aumenta el riesgo de reacción alérgica o de inducción de inmunidad a la rhGAA no dirigida.
EJEMPLO 2 DE ENZIMA: PREPARACIÓN DE CÉLULAS CHO QUE PRODUCEN rhGAA ATB200 QUE TIENE UN ALTO CONTENIDO DE N-GLICANOS QUE PORTAN MONO- O BIS-M6P
Las células CHO se transfectaron con ADN que expresa rhGAA, seguido de la selección de transformantes que producen rhGAA. En la Figura 4 se muestra una construcción de ADN para transformar células CHO con ADN que codifica rhGAA. Las células CHO se transfectaron con ADN que expresa rhGAA, seguido de la selección de transformantes que producen rhGAA.
Después de la transfección, las células DG44 CHO (DHFR-) que contenían un gen GAA integrado de forma estable se seleccionaron con medio deficiente en hipoxantina/timidina (-HT). Amplificación de
La expresión de GAA en estas células se indujo por tratamiento con metotrexato (MTX, 500 nM). Los grupos de células que expresaban grandes cantidades de GAA se identificaron mediante ensayos de actividad enzimática de GAA, y se usaron para establecer clones individuales que producían rhGAA. Se generaron clones individuales en placas de medios semisólidos, se seleccionaron mediante el sistema ClonePix, y se transfirieron a placas de 24 pocillos profundos. Se analizó la actividad de la enzima GAA en los clones individuales para identificar los clones que expresaban un alto nivel de GAA. Los medios acondicionados para determinar la actividad de GAA usaron un sustrato de 4-MU-a-Glucosidasa. Los clones que producían niveles más altos de GAA, medidos mediante ensayos de la enzima GAA, se evaluaron adicionalmente en cuanto a viabilidad, capacidad de crecimiento, productividad de GAA, estructura de N-glicanos, y expresión estable de proteínas. Usando este procedimiento, se aislaron líneas celulares CHO, incluyendo la línea celular CHO GA-ATB-200, que expresan rhGAA con N-glicanos mono-M6P o bis-M6P potenciados.
EJEMPLO 3 DE ENZIMA: CAPTURA Y PURIFICACIÓN DE rhGAA ATB200
Se produjeron múltiples lotes de rhGAA según la invención en matraces de agitación y en biorreactores de perfusión usando la línea celular CHO GA-ATB-200, y se midió la unión a CIMPR. Se observó una unión al receptor CIMPR similar (-70%) a la que se muestra en la Figura 5B y la Figura 6 para rhGAA ATB200 purificada procedente de diferentes lotes de producción, lo que indica que rhGAA ATB200 se puede producir de manera consistente. Como se muestra en las Figuras 3A-B y 5A-B, las rhGAA Myozyme® y Lumizyme® mostraron una unión significativamente menor a CIMPR que la rhGAA ATB200.
EJEMPLO 4 DE ENZIMA: COMPARACIÓN ANALÍTICA DE ATB200 CON LUMIZYME®
Se usó cromatografía de líquidos de intercambio aniónico débil (“WAX”) para fraccionar rhGAA ATB200 según el fosfato terminal. Los perfiles de elución se generaron eluyendo el ERT con una cantidad creciente de sal. Los perfiles se monitorizaron por UV (A280nm). rhGAA ATB200 se obtuvo de células CHO, y se purificó. Lumizyme® se obtuvo de una fuente comercial. Lumizyme® exhibió un pico elevado a la izquierda de su perfil de elución. rhGAA ATB200 exhibió cuatro picos prominentes, que eluyeron a la derecha de Lumizyme® (Figura 7). Esto confirma que rhGAA ATB200 se fosforiló en mayor medida que Lumizyme®, ya que esta evaluación es por carga terminal en lugar de afinidad por CIMPR.
EJEMPLO 5 DE ENZIMA: CARACTERIZACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS DE rhGAA ATB200
Los glicanos de rhGAA ATB200 purificada y de Lumizyme® se evaluaron por MALDI-TOF para determinar las estructuras de glicanos individuales encontradas en cada ERT (Figura 8). Se encontró que las muestras de ATB200 contenían cantidades más bajas de N-glicanos de tipo ricos en manosa no fosforilados que Lumizyme®. El mayor contenido de glicanos M6P en ATB200 que en Lumizyme® dirige rhGAA ATB200 a las células musculares con mayor eficacia. El alto porcentaje de estructuras monofosforiladas y bisfosforiladas, determinado por MALDI, concuerda con los perfiles de CIMPR, que ilustraron una unión significativamente mayor de ATB200 al receptor CIMPR. El análisis de N-glicanos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF confirmó que, en promedio, cada molécula de ATB200 contiene al menos una estructura de N-glicano bis-M6P natural. Este mayor contenido de N-glicano bis-M6P en rhGAA ATB200 se correlacionó directamente con la unión de alta afinidad a CIMPR en ensayos de unión en placas al receptor de M6P (KD alrededor de 2-4 nM) Figura 10A.
rhGAA ATB200 también se analizó en busca de perfiles de N-glicanos específicos del sitio usando dos técnicas analíticas LC-MS/MS diferentes. En el primer análisis, la proteína se desnaturalizó, se redujo, se alquiló, y se digirió antes del análisis mediante LC-MS/MS. Durante la desnaturalización y reducción de la proteína, se añadieron 200 gg de muestra de proteína, 5 gl de tris-HCl 1 mol/l (concentración final 50 mM), 75 gl de guanidina HCl 8 mol/l (concentración final 6 M), 1 gl de EDTA 0,5 mol/l (concentración final 5 mM), 2 gl de DTT 1 mol/l (concentración final 20 mM) y agua Milli-Q® a un tubo de 1,5 ml, para proporcionar un volumen total de 100 gl. La muestra se mezcló y se incubó a 56°C durante 30 minutos en un baño seco. Durante la alquilación, la muestra de proteína desnaturalizada y reducida se mezcló con 5 gl de yodoacetamida 1 mol/l (IAM, concentración final 50 mM), después se incubó a 10-30°C en la oscuridad durante 30 minutos. Después de la alquilación, se añadieron a la muestra 400 gl de acetona preenfriada, y la mezcla se congeló a -80°C de refrigeración durante 4 horas. A continuación, la muestra se centrifugó durante 5 min a 13000 rpm a 4°C, y se eliminó el sobrenadante. Se añadieron 400 gl de acetona preenfriada a los sedimentos, que entonces se centrifugaron durante 5 min a 13000 rpm a 4°C, y se eliminó el sobrenadante. A continuación, la muestra se secó al aire sobre hielo en la oscuridad para eliminar el residuo de acetona. Se añadieron a la muestra 40 gl de urea 8M y 160 gl de NH4HCO3100 mM, para disolver la proteína. Durante la digestión con tripsina, se añadieron 50 gg de la proteína con amortiguador de digestión de tripsina hasta un volumen final de 100 gl, y se añadieron 5 gl de tripsina 0,5 mg/ml (relación proteína a enzima de 20/1 p/p). La disolución se mezcló bien y se incubó durante la noche (16 ± 2 horas) a 37°C. Se añadieron 2,5 gl de TFA al 20% (concentración final 0,5%) para paralizar la reacción. A continuación, la muestra se analizó con el espectrómetro de masas Thermo Scientific Orbitrap Velos Pro™.
En el segundo análisis LC-MS/MS, la muestra de ATB200 se preparó de acuerdo con un procedimiento similar de desnaturalización, reducción, alquilación y digestión, excepto que se usó ácido yodoacético (IAA) como reactivo de alquilación en lugar de IAM, y entonces se analizó usando el espectrómetro de masas Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribid™.
Los resultados del primer y segundo análisis se muestran en las Figuras 9A-9H. En las Figuras 9A-9H, los resultados del primer análisis están representados por la barra izquierda (gris oscuro), y los resultados del segundo análisis están representados por la barra derecha (gris claro). En las Figuras 9B-9G, la nomenclatura de símbolos para la representación de glicanos está de acuerdo con Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., et al., Essentials of Glycobiology, 2a edición (2009).
Como puede verse en las Figuras 9A-9G, los dos análisis proporcionaron resultados similares, aunque hubo alguna variación entre los resultados. Esta variación puede deberse a una serie de factores, incluyendo el instrumento usado y la plenitud del análisis de los N-glicanos. Por ejemplo, si algunas especies de glicanos fosforilados no se identificaron y/o no se cuantificaron, entonces el número total de glicanos fosforilados puede estar subrepresentado, y el porcentaje de rhGAA que porta los glicanos fosforilados en ese sitio puede estar subrepresentado. Como otro ejemplo, si algunas especies de glicanos no fosforilados no se identificaron y/o no se cuantificaron, entonces el número total de glicanos no fosforilados puede estar subrepresentado, y el porcentaje de rhGAA que porta los glicanos fosforilados en ese sitio puede estar sobrerrepresentado. La Figura 9A muestra la ocupación de los sitios de N-glicosilación de ATB200. Como se puede ver en la Figura 9A, los sitios de N-glicosilación primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto están mayoritariamente ocupados, detectando ambos análisis alrededor del 90% y hasta alrededor del 100% de la enzima ATB200 que tiene un glicano detectado en cada sitio potencial. Sin embargo, el séptimo sitio potencial de N-glicosilación está glicosilado alrededor de la mitad de las veces.
La Figura 9B muestra el perfil de N-glicosilación del primer sitio, N84. Como se puede ver en la Figura 9B, la principal especie de glicano son los glicanos bis-M6P. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 75% de la ATB200 tenía un glicano bis-M6P en el primer sitio.
La Figura 9C muestra el perfil de N-glicosilación del segundo sitio, N177. Como se puede ver en la Figura 9C, las principales especies de glicanos son los glicanos mono-M6P y los glicanos ricos en manosa no fosforilados. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 40% de la ATB200 tenía un glicano mono-M6P en el segundo sitio.
La Figura 9D muestra el perfil de N-glicosilación del tercer sitio, N334. Como se puede ver en la Figura 9D, las principales especies de glicanos son glicanos ricos en manosa no fosforilados, glicanos complejos di-, tri- y tetraantenarios, y glicanos híbridos. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 20% de la ATB200 tenía un resto de ácido siálico en el tercer sitio.
La Figura 9E muestra el perfil de N-glicosilación del cuarto sitio, N414. Como se puede ver en la Figura 9E, las principales especies de glicanos son los glicanos bis-M6P y mono-MGP. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 40% de la ATB200 tenía un glicano bis-M6P en el cuarto sitio. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 25% de la ATB200 tenía un glicano mono-M6P en el cuarto sitio.
La Figura 9F muestra el perfil de N-glicosilación del quinto sitio, N596. Como se puede ver en la Figura 9F, las principales especies de glicanos son glicanos complejos diantenarios fucosilados. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 70% de la ATB200 tenía un resto de ácido siálico en el quinto sitio.
La Figura 9G muestra el perfil de N-glicosilación del sexto sitio, N826. Como se puede ver en la Figura 9G, las principales especies de glicanos son glicanos complejos di-, tri- y tetraantenarios. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 80% de la ATB200 tenía un resto de ácido siálico en el sexto sitio.
Un análisis de la glicosilación en el séptimo sitio, N869, mostró aproximadamente 40% de glicosilación, siendo los glicanos más comunes A4S3S3GF (12%), A5S3G2F (10%), A4S2G2F (8%) y A6S3G3F (8%).
La Figura 9H muestra un resumen de la fosforilación en cada uno de los siete sitios potenciales de N-glicosilación. Como puede verse en la Figura 9G, tanto el primer como el segundo análisis detectaron altos niveles de fosforilación en los sitios primero, segundo y cuarto. Ambos análisis detectaron que más del 80% de la ATB200 estaba mono- o difosforilada en el primer sitio, más del 40% de la ATB200 estaba monofosforilada en el segundo sitio, y más del 80% de la ATB200 estaba mono- o difosforilada en el cuarto sitio.
Se realizó otro análisis de glicanos de ATB200 de acuerdo con un método de cromatografía de líquidos de interacción hidrófila-detección fluorescente-espectrometría de masas (HILIC-FLD-MS).
Los resultados del análisis de HILIC-FLD-MS se proporcionan en la Tabla A a continuación. En la Tabla A, el primer número en el número de tres dígitos indica el número de ramificaciones en el glicano, el segundo número indica el número de unidades de fucosa central, y el tercer número indica el número de unidades de ácido siálico terminal.
Usando esta nomenclatura, “303” representa un glicano triantenario (los 3 primeros) con 0 núcleos de fucosa (el 2° 0) y 3 ácidos siálicos terminales (los 3 últimos), “212” representa un glicano biantenario con 1 núcleo fucosa y 2 ácidos siálicos terminales, “404” representa un glicano tetraantenario con 0 núcleos de fucosa y 4 ácidos siálicos terminales, etc.
Tabla A
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Según este análisis de HILIC-FLD-MS, se espera que la ATB200 evaluada tenga un contenido promedio de fucosa de 2-3 mol por mol de ATB200, un contenido de GlcNAc de 20-25 mol por mol de ATB200, un contenido de galactosa de 8-12 mol por mol de ATB200, un contenido de manosa de 22-27 mol por mol de ATB200, un contenido de M6P de 3­ 5 mol por mol de ATB200, y un contenido de ácido siálico de 4-7 mol de ATB200.
EJEMPLO 6 DE ENZIMA: CARACTERIZACIÓN DE LA AFINIDAD POR CIMPR DE ATB200
Además de tener un mayor porcentaje de rhGAA que puede unirse al CIMPR, es importante entender la calidad de esa interacción. La unión al receptor de Lumizyme® y rhGAA ATB200 se determinó usando un ensayo de unión en placa a CIMPR. Brevemente, para capturar GAA, se usaron placas recubiertas con CIMPR. Se aplicaron concentraciones variables de rhGAA al receptor inmovilizado, y la rhGAA no unida se eliminó por lavado. La cantidad de rhGAA restante se determinó mediante la actividad de GAA. Como se muestra en la Figura 10A, rhGAA ATB200 se unió a CIMPR significativamente mejor que Lumizyme®.
La Figura 10B muestra el contenido relativo de glicanos bis-M6P en Lumizyme®, un rhGAA convencional, y ATB200 según la invención. Para Lumizyme®, en promedio, solo el 10% de las moléculas tienen un glicano bisfosforilado. Compárese esto con ATB200, en la que, en promedio, cada molécula de rhGAA tiene al menos un glicano bisfosforilado.
EJEMPLO 7 DE ENZIMA: rhGAA ATB200 SE INTERNALIZÓ DE MANERA MÁS EFICIENTE POR FIBROBLASTOS QUE LUMIZYME®
La captación celular relativa de las rhGAA ATB200 y Lumizyme® se comparó usando líneas celulares de fibroblastos normales y de Pompe. Las comparaciones incluyeron 5-100 nM de rhGAA ATB200 según la invención con 10-500 nM de rhGAA convencional Lumizyme®. Después de 16 horas de incubación, la rhGAA externa se inactivó con TRIS base, y las células se lavaron 3 veces con PBS antes de la recolección. La GAA internalizada se midió por hidrólisis de 4MU-a-glucósido y se representó gráficamente con respecto a la proteína celular total, y los resultados aparecen en las Figuras 11A-B.
También se mostró que rhGAA ATB200 se internaliza de manera eficiente en las células (Figura 11A y 11B), respectivamente, muestran que rhGAA ATB200 se internaliza en células de fibroblastos tanto normales como de Pompe, y que se internaliza en mayor grado que la rhGAA convencional Lumizyme®. rhGAA ATB200 satura los receptores celulares a alrededor de 20 nM, mientras que se necesita alrededor de 250 nM de Lumizyme®. La constante de eficiencia de captación (Kcaptación) extrapolada a partir de estos resultados es 2-3 nm para ATB200 y 56 nM para Lumizyme®, como se muestra en la Figura 11C. Estos resultados sugieren que rhGAA ATB200 es un tratamiento bien dirigido contra la enfermedad de Pompe.
EJEMPLO 8 DE ENZIMA: REDUCCIÓN DE GLUCÓGENO EN RATONES CON DESACTIVACIÓN DEL GEN GAA
Las Figuras 12A a 12C muestran los efectos de la administración de alglucosidasa alfa (Lumizyme®) y ATB200 en el aclaramiento de glucógeno en ratones con desactivación del gen Gaa. Los animales recibieron dos administraciones en bolo IV (cada dos semanas); los tejidos se recogieron dos semanas después de la última dosis y se analizaron en cuanto a actividad de a-glucosidasa ácida y contenido de glucógeno.
Como se observa en las Figuras 12A a 12C, se encontró que ATB200 agota el glucógeno tisular de forma dependiente de la dosis en ratones con desactivación génica de la a-glucosidasa ácida (gaa). La dosis de 20 mg/kg de ATB200 eliminó consistentemente una mayor proporción de glucógeno almacenado en ratones con desactivación génica de gaa que los niveles de dosis de 5 y 10 mg/kg. Sin embargo, como se observa en las Figuras 12A a 12C, ATB200, administrada a 5 mg/kg, mostró una reducción similar de glucógeno en el corazón y músculos esqueléticos (cuádriceps y tríceps) de ratón que Lumizyme® administrada a 20 mg/kg, mientras que ATB200, a dosis de 10 y 20 mg/kg, mostró una reducción significativamente mayor de los niveles de glucógeno en los músculos esqueléticos que Lumizyme®.
La Figura 15 muestra los efectos de la administración de alglucosidasa alfa (Lumizyme®) y ATB200 sobre el aclaramiento de glucógeno en ratones con desactivación del gen Gaa. Ratones con desactivación génica de GAA de doce semanas se trataron con Lumizyme® o ATB200, 20 mg/kg IV cada dos semanas, 4 inyecciones. Los tejidos se recogieron 14 días después de la última dosis de enzima, para medir el glucógeno. La Figura 13 muestra la reducción relativa de glucógeno en el músculo esquelético cuádriceps y tríceps, proporcionando ATB200 una mayor reducción de glucógeno que Lumizyme®.
EJEMPLO 9 DE ENZIMA: FISIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA MUSCULAR EN RATONES CON DESACTIVACIÓN GÉNICA DE GAA
A los ratones con desactivación génica de Gaa se les administraron dos bolos intravenosos de a-glucosidasa ácida humana recombinante (alglucosidasa alfa o ATB200), a 20 mg/kg cada dos semanas. Los ratones de control se trataron solo con vehículo. Se recoge tejido del sóleo, cuádriceps y diafragma dos semanas después de la última dosis de a-glucosidasa ácida humana recombinante. El tejido del sóleo y del diafragma se analizó para determinar los niveles de glucógeno, mediante tinción con ácido peryódico - reactivo de Schiff (PAS), y para determinar la proliferación de lisosomas, midiendo los niveles del marcador de proteína de membrana asociada al lisosoma (LAMP1), que está aumentado en la enfermedad de Pompe. Secciones semidelgadas del músculo cuádriceps incrustadas en resina epoxi (Epon) se tiñeron con azul de metileno y se observaron mediante microscopía electrónica (1000x) para determinar la extensión de la presencia de vacuolas. Las muestras de músculo cuádriceps se analizaron inmunohistoquímicamente para determinar los niveles de los marcadores de autofagia, conjugado de cadena ligera 3 de proteína 1A/1B asociada a microtúbulos con fosfatidiletanolamina (LC3A II) y p62, el transportador de glucosa dependiente de insulina GLUT4, y el transportador de glucosa independiente de insulina GLUT1.
En un estudio similar, a los ratones con desactivación génica de Gaa se les administraron cuatro bolos intravenosos de a-glucosidasa ácida humana recombinante (alglucosidasa alfa o ATB200), a 20 mg/kg cada dos semanas. Los ratones de control se trataron solo con vehículo. Se cosechó tejido muscular cardíaco dos semanas después de la última dosis de a-glucosidasa ácida humana recombinante, y se analizó para determinar los niveles de glucógeno, mediante tinción con ácido peryódico - reactivo de Schiff (PAS), y para la proliferación de lisosomas, midiendo los niveles de LAMP1.
Como se observa en la Figura 14, la administración de ATB200 mostró una reducción en la proliferación de lisosomas en el corazón, el diafragma y el músculo esquelético (sóleo) en comparación con el tratamiento convencional con alglucosidasa alfa. Además, como se observa en la Figura 15, la administración de ATB200 mostró una reducción en los niveles de glucógeno punteados en el corazón y el músculo esquelético (sóleo) en comparación con el tratamiento convencional con alglucosidasa alfa.
Igualmente, como se observa en la Figura 16, ATB200 redujo significativamente el número de vacuolas en la fibra muscular en los cuádriceps de ratones con desactivación génica de Gaa en comparación con los ratones no tratados y los ratones tratados con alglucosidasa alfa. Como se observa en la Figura 17, los niveles tanto de LC3 II como de p62 aumentan en los ratones con desactivación génica de Gaa en comparación con los ratones de tipo salvaje. Además, los niveles del transportador de glucosa dependiente de insulina GLUT4 y del transportador de glucosa independiente de insulina GLUT1 aumentan en los ratones con desactivación génica de Gaa en comparación con los ratones de tipo salvaje. Los niveles elevados de GLUT4 y GLUT 1 asociados con la deficiencia de a-glucosidasa ácida pueden contribuir a una mayor captación de glucosa en las fibras musculares y una mayor síntesis de glucógeno tanto basalmente como después de la ingesta de alimentos.
EJEMPLO 10 DE ENZIMA: FUNCIÓN MUSCULAR EN RATONES CON DESACTIVACIÓN GÉNICA DE GAA
En estudios a más largo plazo de 12 administraciones quincenales, 20 mg/kg de ATB200 más 10 mg/kg de miglustat aumentaron progresivamente la fuerza muscular funcional en ratones con desactivación génica de Gaa desde la línea base, según lo medido tanto por la fuerza de agarre como por las pruebas de suspensión del alambre (Figuras 18A-18B). Se observó que los ratones tratados con alglucosidasa alfa (Lumizyme®), que recibieron la misma dosis de ERT (20 mg/kg), empeoran en condiciones idénticas durante la mayor parte del estudio (Figuras 18A-18B). Al igual que con el estudio a más corto plazo, ATB200/miglustat tuvo una eliminación de glucógeno sustancialmente mejor después de 3 meses (Figuras 19A-19C) y 6 meses (Figuras 19D-19G) de tratamiento que la alglucosidasa alfa. ATB200/miglustat también redujo la autofagia y la acumulación intracelular de LAMP1 y disferlina después de 3 meses de tratamiento (Figura 20), en comparación con la alglucosidasa alfa. En la Figura 18A, * indica estadísticamente significativo en comparación con Lumizyme® sola (p<0,05, prueba de la t bilateral). En las Figuras 19A-19G, * indica estadísticamente significativo en comparación con Lumizyme® sola (p<0,05, comparación múltiple usando el método de Dunnett bajo análisis de ANOVA unidireccional).
En conjunto, estos datos indican que ATB200/miglustat se dirigió de manera eficiente a los músculos para revertir la disfunción celular y mejorar la función muscular. Es importante destacar que las aparentes mejoras en la arquitectura muscular y la reducción de la autofagia y la acumulación intracelular de LAMP1 y disferlina pueden ser buenos sustitutos para mejorar la fisiología muscular, que se correlaciona con mejoras en la fuerza muscular funcional. Estos resultados sugieren que la monitorización de la autofagia y estas proteínas musculares clave puede ser un método racional y práctico para evaluar la eficacia de los tratamientos terapéuticos para la enfermedad de Pompe en ratones con desactivación génica de Gaa, que pueden resultar ser biomarcadores útiles de biopsias musculares en estudios clínicos.
La Figura 20 muestra que 6 meses de administración de ATB200, con o sin miglustat, redujeron la acumulación intracelular de distrofina en ratones con desactivación génica de Gaa. Hubo una mayor reducción de la acumulación de distrofina para ATB200 ± miglustat que con Lumizyme®.
EJEMPLO 1 DE FORMULACIÓN: pH Y AMORTIGUADOR
Métodos analíticos para ejemplos de formulación
Los análisis de los ejemplos descritos aquí con respecto al aspecto, pH, concentración de proteína, etc., se llevaron a cabo de acuerdo con los métodos siguientes, a menos que se especifique lo contrario.
Aspecto
El aspecto de las muestras, incluyendo la transparencia, el color, y las partículas visibles, se examinó bajo un fondo blanco y negro usando una caja de luz YB-2.
pH
El pH de la muestra se midió con un pH-metro SevenMulti™.
Concentración de proteína
La concentración de proteína se determinó mediante lecturas de UV280 usando un espectrofotómetro NanoDrop™ 2000. Todas las medidas se repitieron dos veces con 2,5 pl de muestra cada vez, y se tomó un promedio.
Cromatografía de líquidos de alta resolución con exclusión por tamaños (SEC-HPLC)
Para los ejemplos de pH y amortiguador, de congelación-descongelación, y de excipientes, la separación de los monómeros de proteínas y sus especies y fragmentos de alto peso molecular se llevó a cabo usando una columna TSKgel® G3000 SWXL (Tosoh Bioscience, 7,8 x 300 mm, 5 pm, 25°C) en un sistema HPLC Agilent 1260. La fase móvil consistió en fosfato de sodio 50 mM, cloruro de sodio 100 mM y citrato de sodio 20 mM (pH 6,0 ± 0,2). El sistema cromatográfico empleó un caudal de 1,0 ml/min, un volumen de inyección de 50 pl (típicamente 1 mg/ml), y un tiempo de ejecución de 20 min con un gradiente isocrático. Las señales se detectaron mediante un detector de UV a 280 nm (Referencia: 360 nm).
En el ejemplo de PS80, la separación de los monómeros de proteínas y sus especies y fragmentos de alto peso molecular se realizó utilizando una columna BioSep™- SEC-s3000 (Phenomenex, 7,8 x 300 mm, 5 pm, 25°C) en un sistema HPLC Agilent 1260. La fase móvil consistió en fosfato de sodio 50 mM y cloruro de sodio 100 mM (pH 6,2 ± 0,2). El sistema cromatográfico empleó un caudal de 1,15 ml/min, un volumen de inyección de 50 pl (típicamente 1 mg/ml), y un tiempo de ejecución de 25 min con un gradiente isocrático. Las señales se detectaron mediante un detector de UV a 280 nm.
SDS-PAGE (no reducida)
Los valores notificables son la pureza y el peso molecular de la proteína en SDS-PAGE no reductora. Las muestras se desnaturalizaron sin reducir en presencia de SDS en exceso, para lograr una carga negativa uniforme. En un campo eléctrico aplicado (165 V), estas especies recubiertas con SDS se separaron en función de su peso molecular aparente a través de gel de poliacrilamida. Las bandas separadas se detectaron mediante tinción con azul de Coomassie. Actividad enzimática de 4-MUG
10 pl de muestra se diluyó e hidrolizó (mediante GAA, 37°C durante 60 min) para generar el producto fluorescente 4-MU. Se añadieron 125 pl de glicina 1 M o NaOH 0,1 M, para detener la reacción.
Una serie de patrones de 4-MU se analizó con muestras para generar una curva de calibración patrón basada en la señal de fluorescencia. La conversión de RFU a la cantidad de 4-MU se logró mediante una comparación mediada por software con una curva patrón, que se sometió a regresión de acuerdo con un modelo de regresión logística de 4 parámetros. A continuación, la actividad de la enzima GAA (nmol de 4-MU liberada/h/ml de GAA) en la muestra se calculó basándose en la curva patrón de 4-MU.
Concentración enzimática de 4-MUG
10 pl de muestra y patrón de referencia de GAA se diluyeron e hidrolizaron (mediante GAA, 37°C durante 60 min) para generar el producto fluorescente 4-MU. Se añadieron 125 pl de NaOH 1 M, para detener la reacción.
Una serie de patrones de referencia de GAA se analizó con muestras para generar una curva de calibración patrón basada en la señal de fluorescencia. La conversión de RFU a la cantidad de 4-MU se logró mediante una comparación mediada por software con una curva patrón, que se sometió a regresión de acuerdo con un modelo de regresión logística de 4 parámetros. A continuación, la concentración de la enzima GAA (nmol de 4-MU liberada/h/ml de GAA) en la muestra se calculó basándose en la curva patrón de GAA.
Dispersión dinámica de la luz (DLS)
Se usó una micropipeta para transferir una alícuota de 40 pl de muestra sin diluir a una cubeta desechable de 40 pl. Se realizaron medidas por triplicado para cada muestra.
Partículas: HIAC
Se diluyeron 200 pl de cada muestra en 2000 pl con un amortiguador de referencia filtrado. La muestra se analizó tres veces, y se usaron 450 pl para cada ensayo. Se dio a conocer el número promedio de partículas de cada tamaño, 1 pm, 3 pm, 5 pm, 10 pm, y 25 pm por ml.
Calorimetría diferencial de barrido (DSC) MicroCal
La calorimetría de barrido diferencial (DSC) de células capilares se usa para medir la estabilidad térmica de las proteínas mediante la detección de la diferencia en la cantidad de calor necesaria para aumentar la temperatura de una muestra y la referencia en función de la temperatura. Específicamente, se usa para medir el punto medio de transición térmica (Tm), que es un indicador de la estabilidad relativa de la proteína en disolución.
Las muestras se diluyeron hasta alrededor de 1 mg/ml con amortiguador de referencia. Se añadió una alícuota de 400 pl de amortiguador de referencia en cada pocillo impar de una placa de 96 pocillos, mientras que se añadió una alícuota de 400 pl de cada muestra en el pocillo par correspondiente. La temperatura de escaneo oscila de 10°C a 110°C.
Calorimetría diferencial de barrido modulada (DSC)
La temperatura de transición vítrea (Tg’) y la temperatura eutéctica (Te) se evaluaron usando un calorímetro diferencial de barrido Netzsch (DSC 204 F1). Para el ensayo, se cargaron 15 pl de muestra en el disco de carga. En primer lugar, la temperatura se redujo de 20°C a -60°C a una velocidad de 10°C/min, y el valor de Te se obtuvo de la curva de enfriamiento durante esta etapa. En segundo lugar, la temperatura se aumentó de -60°C a 40°C a razón de 10°C/min, y se analizó el valor de Tg’ a partir de la curva de calentamiento.
M6P
El M6P se liberó de la muestra por hidrólisis (TFA 4 M, 100°C, 4 h), y se secó mediante un evaporador centrífugo de vacío. El M6P seco y el patrón de referencia se suspendieron en agua purificada antes del análisis. Se usó una columna analítica CarboPac PA10 BioLCTM (4 mm x 250 mm, 3,5 pm, 100 Á, 30°C) y una columna CarboPac PA10 BioLCGuard (4 mm x 50 mm, 3,5 pm, 100 Á, 30°C). La fase móvil consistió en la fase A (NaOH 100 mM) y la fase B (NaOAc 1 M, NaOH 100 mM). El sistema cromatográfico empleó un caudal de 1 ml/min, un volumen de inyección de 25 pl, y un tiempo de ejecución de 30 min con un gradiente. Las señales se detectaron mediante una detección amperométrica pulsada. El contenido de M6P en la muestra se calculó en base a la curva patrón.
Ácido siálico
Los ácidos siálicos se liberaron de las moléculas del fármaco por hidrólisis (HAc 2 M, 802C, 2 h) y después marcando con DMB todas las muestras y la disolución patrón mezclada (50°C, 17 ± 0,5 h en la oscuridad) antes de separarlos usando una columna Zorbax Eclipse Plus C18 (Agilent, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 pm, 45°C) en el sistema HPLC Agilent 1260. La fase móvil consistió en la fase A (9% ACN, 7% MeOH) y la fase B (100% ACN). El sistema cromatográfico empleó un caudal de 0,5 ml/min, un volumen de inyección de 20 pl, y un tiempo de ejecución de 20 min con un gradiente. Las señales se detectaron mediante un detector de fluorescencia (Aex=373 nm, Aem=448 nm). El contenido de Neu5Gc y Neu5Ac en la muestra se calculó en base a una curva patrón.
Se prepararon diez formulaciones de amortiguador con un pH que oscilaba de 4,0 a 8,0, que contenían fosfato de sodio 25 mM o citrato de sodio 25 mM, con o sin NaCl 50 mM, como se muestra en la Tabla 1. La concentración enzimática de ATB2004-MUG fue 1 mg/ml.
Tabla 1 Composiciones de formulación:
Figure imgf000025_0001
Preparación de la muestra
El material usado en el estudio de evaluación del pH y amortiguador es como se describe en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2 Información de la materia prima del estudio de evaluación del pH y amortiguador:
Figure imgf000025_0002
Se prepararon amortiguador de fosfato de sodio 25 mM que contiene NaCl 50 mM a pH 4,0 (P40), 5,0 (P50), 6,0 (P60), 7,0 (P70) y 8,0 (P80), amortiguador de fosfato de sodio 25 mM a pH 6,0 (P60 sin NaCl), y amortiguador de citrato de sodio 25 mM que contenía NaCl 50 mM a pH 5,0 (C50), 5,5 (C55), 6,0 (C60) y 6,5 (C65). Para pH 4,0, se usó HCl, para ajustar el pH en el amortiguador de fosfato de sodio (pH 4,0).
La disolución de enzima ATB200 se concentró en primer lugar usando dispositivos centrífugos de ultrafiltración en condiciones de 15°C y 3500 rpm durante 40 min. Después de eso, la disolución enzimática concentrada se intercambió de amortiguador en los tres amortiguadores diferentes descritos anteriormente mediante dos rondas de ultrafiltración a 15°C y 3500 rpm durante 50 min y 55 min. Las disoluciones enzimáticas con amortiguador intercambiado se analizaron posteriormente para determinar la concentración de proteína y la concentración de enzima 4-MUG.
Finalmente, se añadió el volumen apropiado de cada amortiguador para ajustar la concentración final de enzima ATB200 a 1,0 mg/ml. La concentración final de ATB200 se confirmó mediante la absorbancia de UV_A280 y la concentración de enzima 4-MUG.
Las disoluciones se filtraron asépticamente con un filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 gm.
Cada formulación se llenó asépticamente en viales de vidrio de 2 ml en una campana de bioseguridad, con un volumen de llenado de 500 gl ~ 1000 gl según el requisito de cantidad de muestra de los ensayos analíticos. Los viales se taparon, y entonces se sellaron por presión inmediatamente después del llenado.
Evaluación de las muestras
Los viales de cada formulación se almacenaron a 5°C y 40°C durante un máximo de 8 semanas, y se agitaron a 25°C a 100 rpm en un agitador orbital durante un máximo de 5 días (véase la Tabla 3). Las formulaciones se muestrearon inicialmente (T0), 5 días (5D), 2 semanas (2S), 4 semanas (4S) y 8 semanas (8S), como se describe en la Tabla 3, para los ensayos de aspecto, pH, concentración de UV, concentración enzimática de 4-MUG, SEC, HIAC, DLS, actividad enzimática de 4-MUG, y DSC.
Tabla 3 Parámetros de estudio en el estudio de evaluación del amortiguador y pH de ATB200:
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Resultados
Resultados de estabilidad térmica - MicroCal DSC
Los resultados de las medidas de estabilidad térmica se muestran a continuación en la Tabla 4:
Tabla 4:
Figure imgf000026_0002
Una mayor Tmcomienzo indica una mejor estabilidad térmica de la proteína en la formulación particular. En consecuencia, las formulaciones que exhibieron la mayor estabilidad térmica fueron P50, C55, C50, P60 sin NaCl, P60 y C60. Estos resultados indican que la enzima ATB200 tiene mejor estabilidad térmica en amortiguador ácido débil que en condiciones básicas.
Aspecto - Agitación
Los resultados del aspecto del estudio de agitación se muestran a continuación en la Tabla 5:
Tabla 5:
Figure imgf000027_0001
Como se puede ver en la tabla, después de 5 días de agitación, P60 sin NaCl, C50, C55, C60 y C65 se mantuvieron incoloros, transparentes, y libres de partículas visibles, pero se observaron partículas visibles en P40, P50, P60, P70 y P80. Estos datos muestran que el amortiguador de citrato de sodio estabilizó la formulación mejor que el amortiguador de fosfato de sodio después de la agitación.
pH
Los resultados de las medidas de pH se muestran a continuación en la Tabla 6:
Tabla 6:
Figure imgf000027_0002
Como se observa a partir de los datos, tanto los amortiguadores de fosfato como los de citrato con NaCI 50 mM en un intervalo de pH de 5,0 a 6,5 pudieron mantener el pH designado en todo momento. Durante el intercambio de amortiguador, el ajuste de la concentración, el almacenamiento durante 8 semanas a 5°C y 40°C, y la agitación, no hubo cambios significativos en el pH de las muestras.
Por el contrario, el pH disminuyó en P60 sin NaCl tras 8 semanas de almacenamiento tanto a 5°C como a 40°C, y el pH aumentó en P40 tras el intercambio de amortiguador y 8 semanas de almacenamiento a ambas temperaturas. Sin embargo, la agitación no condujo a ningún cambio de pH tanto en P40 como en P60 sin NaCl.
Concentración de proteína
Los resultados de las medidas de concentración de proteína se muestran a continuación en la Tabla 7:
Tabla 7:
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El almacenamiento durante 8 semanas a 5°C y la agitación durante 5 días no afectaron la concentración de proteína. No se observó ninguna variación significativa entre todas las formulaciones.
Por el contrario, durante el almacenamiento a 40°C, la concentración de proteína aumentó ligeramente en P50, P60, P60 sin NaCl, C60 y C65, disminuyó ligeramente en C50, y se mantuvo en P40, P70, P80, C55. Debido a la formación de partículas visibles en muestras a 40°C, las muestras a 40°C/8 semanas se volvieron a analizar tras centrifugar a 12000 rpm durante 1 minuto. Los resultados mostraron una caída en la concentración de proteína después de la centrifugación en las muestras que contenían partículas, lo que indicó que las partículas presentes en las muestras tenían un impacto en la adsorción a 280 nm.
Concentración enzimática de 4-MUG
Los resultados de las medidas de concentración enzimática de 4-MUG se muestran a continuación en la Tabla 8:
Tabla 8:
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Después del intercambio de amortiguador, la concentración enzimática de 4-MUG de P80 cayó inmediatamente hasta 0,27 mg/ml. Esto indicó que un pH de 8,0 afectó significativamente a la actividad enzimática. Después de 2 semanas de almacenamiento tanto a 5°C como a 40°C, la concentración enzimática cayó a cero. Excepto para P80, después de 8 semanas de almacenamiento a 5°C, las concentraciones enzimáticas de la mayoría de las formulaciones se mantuvieron estables, y cayeron un poco en P40.
Por el contrario, el almacenamiento a 40°C afectó obviamente a la concentración enzimática. Después de 2 semanas, la concentración enzimática desapareció en P70, disminuyó drásticamente en P40 y C65, y disminuyó obviamente en P50. Después de 4 semanas, la concentración enzimática continuó disminuyendo. Finalmente, después de 8 semanas, las concentraciones enzimáticas fueron cercanas a cero en P40 y C65, cayeron hasta 0,33 mg/ml en amortiguadores de pH 5,0 (P50 y C50), y hasta 0,5-0,7 mg/ml en amortiguadores de pH 5,5 ~ 6,0 (P60, P60 sin NaCl, C55 y C60). Entre ellos, P60 sin NaCl tuvo finalmente la mayor concentración enzimática (0,73 mg/ml). Los resultados indican que la concentración de enzima se conservó más con respecto a la concentración enzimática de 4-MUG en el intervalo de pH 5,5 ~ 6,0, pero no hubo una diferencia significativa entre el amortiguador de fosfato de sodio y el amortiguador de citrato de sodio.
Durante el estudio de agitación, excepto para P80, la concentración enzimática no cambió significativamente.
Actividad enzimática de 4-MUG
Los resultados de las medidas de actividad enzimática de 4-MUG se muestran a continuación en la Tabla 9:
Tabla 9:
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La tendencia del cambio de actividad de la enzima 4-MUG fue paralela a la de la concentración enzimática de 4-MUG.
P80 mostró la peor estabilidad en la actividad de la enzima 4-MUG en las condiciones de ensayo. La actividad enzimática de P80 tuvo una disminución de alrededor del 70% tras el intercambio de amortiguador. Posteriormente, la actividad enzimática se perdió casi totalmente después de 2 semanas de almacenamiento a 5°C y 40°C. La condición básica afectó significativamente la actividad enzimática.
Después de 8 semanas de almacenamiento a 52C, la actividad enzimática de PS80 se perdió casi por completo; se encontró una disminución del 20% en P40; y no se observó ningún cambio significativo en otras formulaciones. Por el contrario, el almacenamiento a 40°C condujo a una disminución evidente de la actividad enzimática en todas las formulaciones. Después de 2 semanas, la actividad enzimática se perdió casi por completo en P70, disminuyó drásticamente en P40 y C65, y obviamente disminuyó en P50. La actividad enzimática continuó disminuyendo en diferentes grados desde las 2 semanas hasta las 4 semanas. Al final del estudio, la actividad enzimática se perdió casi por completo en C65, cayó a 211,5 U/l en P40, a ~ 1550 U/l en P50 y C50, y a 2500 ~ 3000 U/l en C60, P60 y C55. Entre las formulaciones, P60 sin NaCl mantuvo la mayor actividad, con 3549,7 U/l.
Según los resultados de los ensayos de la actividad de la enzima 4-MUG, la enzima se estabilizó más a un pH en el intervalo de pH 5,5 ~ 6,0, pero no se observó distinción entre el amortiguador de fosfato de sodio y el amortiguador de citrato de sodio.
Pureza: SEC-HPLC
Los resultados de las medidas de SEC se muestran a continuación en la Tabla 10:
Tabla 10:
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Después del intercambio de amortiguador, la pureza SEC de algunas de las formulaciones disminuyó significativamente en comparación con el material de partida (monómero SEC: 98,9%). En P80, la pureza SEC cayó hasta 44,9%, y se formó un 54,5% de agregados; en P40 hubo una disminución del 4,9% en el porcentaje de monómero en comparación con el DS anterior al intercambio, con más fragmentos de LMW formados que moléculas de HMW (4,7% frente a 1,3%); en P70 se encontró una ligera disminución (1,2%) en el porcentaje de monómero, correspondiente a un aumento en los agregados; en P60 sin NaCl, hubo una disminución del 2,3% en el porcentaje de monómero.
Después de 8 semanas de almacenamiento a 5°C, la pureza SEC de las formulaciones P60, P60 sin NaCl, y C65 se mantuvo bien, pero la pureza SEC de las otras formulaciones disminuyó significativamente en comparación con T0. En P40, la pureza SEC cayó drásticamente hasta el 74,3% (T0: 94,0%) y se formó un 23,4% de fragmentos LMW; en P50 y C50, hubo una ligera disminución (5~7%) en el monómero, y un aumento (5~7%) en los fragmentos LMW. En P80, se encontró una disminución del 18,2%, que se trasladó principalmente a la agregación (14,8%). En cuanto a P70, hubo una disminución del 10,7% en el monómero, y un aumento del 9,2% en los fragmentos de HMW. En C55, hubo un ligero cambio en el porcentaje de monómero, HMW y LMW.
El almacenamiento a 40°C condujo a un cambio drástico en el porcentaje de monómero en todas las formulaciones. En P70 y P80, el monómero SEC cayó a 0~0,5% tras 2 semanas, y en C65 quedó un 22,4%, y en su mayoría se convirtieron en agregados después de 8 semanas. En P40, P50 y C50, hubo una caída significativa (50-90%) en el monómero, atribuida principalmente a la formación de fragmentos de LMW. En P60, P60 sin NaCl, y C60, después de 8 semanas, el porcentaje de monómero SEC disminuyó hasta 80,8%, 83,6% y 77,5%, respectivamente.
Los resultados de la SEC indicaron que el pH 6,0 se comportó mejor para la estabilidad de ATB200, y no se encontraron diferencias significativas entre el amortiguador de fosfato de sodio y el amortiguador de citrato de sodio. Además, la ausencia de cloruro de sodio en las formulaciones no afectó la estabilidad de ATB200.
Durante el estudio de agitación, la pureza SEC disminuyó ligeramente en P60 y P60 sin NaCl. En P40, P50, P70, P80, C50, C60 y C65 hubo una disminución evidente en el porcentaje de monómero.
Polidispersidad: DLS
Los resultados de las medidas de DLS se muestran a continuación en la Tabla 11:
Tabla 11:
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Los datos de DLS reflejaron el radio hidrodinámico de las moléculas de proteína y la polidispersidad de las partículas. Se observó opalescencia en algunas muestras, por lo que se utilizó DLS para analizar las partículas subvisibles. El resultado de DLS fue generalmente consistente con la indicación del aspecto.
Durante el almacenamiento a 5°C durante 8 semanas, tanto el radio hidrodinámico de las moléculas de proteína como el índice de polidispersidad (PDI) fueron estables y comparables en P60, P70, P80, P60 sin NaCl, y C60. El radio hidrodinámico pasó de alrededor de 10 nm a unos pocos cientos de nm en las otras cinco formulaciones, especialmente en P40 después de 8 semanas.
Durante el almacenamiento a 402C durante 8 semanas, hubo un cambio drástico en el radio hidrodinámico y PDI en todas las formulaciones. Sin embargo, debido a los perfiles complejos de los agregados, es difícil comparar esas formulaciones en función del resultado.
En el estudio de agitación, el radio hidrodinámico y el PDI de P80 tuvieron un aumento espectacular; en P40, P50 y C50, el radio hidrodinámico y el PDI tuvieron un ligero aumento; en P60, P70, P60 sin NaCl, C55, C60 y C65 no se observaron cambios significativos.
Según todos los datos de DLS anteriores, P60, P70, P60 sin NaCl, C55, C60 y C65 fueron mejores que P40, P50, P80 y C50.
Partículas: HIAC
Los resultados de las medidas de HIAC del estudio de agitación se muestran a continuación en la Tabla 12:
Tabla 12:
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Durante el estudio de agitación, P70 tuvo un aumento significativo en el número de partículas después de agitar a 25°C durante 5 días, y todas las demás formulaciones tenían números de partículas comparables.
Sumario
En general, P60 y C60 se destacaron como las formulaciones más estables en comparación con las demás. Por lo tanto, se concluyó que ATB200 era más estable en un intervalo de 5,0 a 6,0. Sin embargo, no se pudo hacer ninguna distinción entre el amortiguador de fosfato y el de citrato. Además, la ausencia de cloruro de sodio en la formulación no mostró un impacto significativo en la estabilidad de ATB200.
EJEMPLO 2 DE FORMULACIÓN: CONGELACIÓN-DESCONGELACIÓN
Se evaluó la estabilidad de tres formulaciones durante el procedimiento de congelación-descongelación. Las tres formulaciones se resumen a continuación en la Tabla 13 siguiente. La concentración diana de la enzima ATB200 fue 5 mg/ml.
Tabla 13:
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Preparación de la muestra
El amortiguador de ATB200 DS se intercambió en los 3 amortiguadores de formulación usando un casete de diálisis (20000 MWCO). Las diálisis se realizaron a 5°C con agitación suave, cada una usando tres intercambios de amortiguador, una vez cada 6~10 horas.
Después de cada diálisis, se añadió el volumen adecuado de amortiguador de formulación para ajustar la concentración de UV final a 5 mg/ml. Las disoluciones se filtraron entonces asépticamente con un filtro de PES de 0,22 pm. Cada formulación se llenó entonces asépticamente en viales de vidrio de 2 ml en una campana de bioseguridad, con un volumen de llenado de 500 pl ~ 1000 pl según el requisito de cantidad de muestra de los ensayos analíticos. Los viales se taparon, y entonces se sellaron por presión inmediatamente después del llenado.
Antes de la congelación-descongelación, se tomaron viales para cada formulación, y los viales de muestra restantes se sometieron a los ciclos de congelación-descongelación diseñados. Los viales de muestra después de la congelación y descongelación se tomaron en puntos de muestreo predefinidos.
Evaluación de las muestras
Se evaluaron tres procedimientos de congelación-descongelación, como se indica a continuación:
Procedimiento 1: congelación y descongelación no controlada. Las muestras se congelaron en un congelador a -80°C, y se descongelaron en una cámara a 25°C.
Procedimiento 2: congelación controlada y descongelación no controlada. Las muestras se colocaron en un recipiente Frosty, y se congelaron en un congelador a -80°C. El recipiente Frosty usó isopropanol para lograr una velocidad de congelación controlada a 1°C/min. El recipiente Frosty se colocó en una cámara a 25°C para descongelar las muestras. La velocidad de aumento de la temperatura fue aproximadamente 1°C/min.
Procedimiento 3: congelación y descongelación controladas. Se usó un liofilizador para congelar y descongelar las muestras. La temperatura de la muestra más baja alcanzada durante la congelación fue -47°C. La temperatura de la muestra se llevó hasta 25°C. La tasa de cambio de temperatura tanto para la congelación como para la descongelación se controló a alrededor de 0,5°C/min. Los resultados se confirmaron repitiendo el experimento.
Se realizaron cinco o tres ciclos de congelación-descongelación usando cada procedimiento. Se realizaron los siguientes ensayos para las muestras antes y después de la congelación y descongelación: aspecto, concentración (UV y enzimática), y SEC-HPLC. En la Tabla 14, a continuación, se da un resumen de los parámetros del ensayo: Tabla 14:
Figure imgf000036_0002
Resultados
Aspecto - 1a Ronda
Los resultados de la primera ronda de medidas del aspecto se muestran a continuación en las Tablas 15A y 15B:
Tabla 15A:
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Tabla 15B:
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A T0 (antes de la congelación-descongelación), todas las formulaciones parecían ser incoloras, ligeramente opalescente y libres de partículas visibles, usando como referencia los amortiguadores de formulación correspondientes.
Después de 5 ciclos de congelación-descongelación rápida (procedimiento 1), todas las formulaciones parecían contener más partículas visibles en comparación con su T0. CP60 contenía la menor cantidad de partículas entre los tres después de 5 C/D.
Después de 5 ciclos de congelación-descongelación lenta (procedimiento 2), todas las formulaciones parecían contener más partículas visibles que T0, mientras que menos que las tratadas por el procedimiento 1. Se observaron menos partículas en las muestras de CP60 después de 5 ciclos de C/D que en las muestras de P60 y C60 tras 1 ciclo de C/D.
Después de 3 ciclos de congelación-descongelación lenta (procedimiento 3), todas las formulaciones parecían tener más partículas visibles que T0. No hubo diferencia entre las tres formulaciones.
Apariencia - 2a Ronda
Los resultados de la segunda ronda de medidas del aspecto se muestran a continuación en las Tablas 23:
Tabla 16:
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En la segunda ronda del estudio de congelación-descongelación lenta (procedimiento 3), se realizaron más ciclos de C/D que en la primera ronda. Apareció una gran cantidad de partículas visibles en P60 después de 5 C/D en comparación con T0, mientras que se observó una pequeña cantidad de partículas tanto en C60 como en CP60. Concentración y actividad enzimática de 4-MUG
Los resultados de las medidas de actividad y concentración enzimática de 4-MUG se muestran a continuación en la Tabla 17 (procedimientos 1-2 y primera ronda del procedimiento 3) y la Tabla 18 (segunda ronda del procedimiento 3):
Tabla 17:
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Tabla 18:
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Después de 5 ciclos de congelación-descongelación rápida (procedimiento 1), se observó una ligera disminución en la concentración enzimática de 4-MUG en P60 en comparación con la muestra T0, mientras que no se observó una diferencia significativa en C60 y CP60.
Después de 5 ciclos de congelación-descongelación lenta usando un recipiente Frosty (procedimiento 2), no se observó una diferencia significativa en comparación con las muestras T0, en ninguna de las 3 formulaciones.
Después de 3 ciclos de congelación-descongelación lenta usando un liofilizador (procedimiento 3), hubo una clara disminución de la concentración enzimática tanto en P60 como en CP60, pero ningún cambio significativo en C60, en comparación con T0. La congelación-descongelación con el procedimiento 3 se repitió con 5 ciclos, y se observó la misma tendencia. La concentración enzimática de las muestras de P60 cayó un 18,8% después de 1 ciclo de C/D, y empeoró después de 3 ciclos (disminuyó en un 53,1%) y 5 ciclos (disminuyó en un 68,9%). En CP60, la concentración enzimática comenzó a caer después de 3 ciclos, y finalmente disminuyó al mismo nivel que P60 después de 5 ciclos. En C60, casi no hubo cambios después de 5 ciclos de congelación-descongelación lenta.
Los resultados de la concentración enzimática de 4-MUG mostraron que la velocidad de congelación/calentamiento, el número de ciclos de C/D, y el tipo de amortiguador podrían afectar la estabilidad del ATB200. El sistema amortiguador de citrato (C60) proporcionó un buen efecto estabilizador, independientemente del procedimiento de congelación-descongelación usado.
La tendencia del cambio de actividad de la enzima 4-MUG fue la misma que la de la concentración enzimática de 4-MUG.
Durante el estudio de congelación-descongelación rápida (procedimiento 1), se produjo una ligera disminución en la actividad enzimática en P60 después de 5 ciclos, no se observaron cambios significativos en C60 y CP60.
No se observó ningún cambio claro en ninguna muestra durante el estudio de congelación-descongelación lenta con un cambio de temperatura de 1 °C/min (procedimiento 2).
En el estudio de congelación-descongelación lenta con un liofilizador (procedimiento 3), la actividad enzimática en P60 tuvo una disminución evidente, y en CP60 tuvo una disminución leve. Sin embargo, casi no hubo cambios en C60. Durante la segunda ronda del estudio de congelación-descongelación lenta del procedimiento 3, la actividad enzimática de P60 disminuyó un 19,1% después de 1 ciclo, un 54,1% después de 3 ciclos, y un 71,2% después de 5 ciclos. En CP60, la actividad de la enzima comenzó a disminuir después de 3 ciclos, cayó hasta un nivel similar al de P60 después de 5 ciclos. Hubo un cambio insignificante en C60 después de 5 ciclos.
Pureza: SEC-HPLC
Los resultados de las medidas de pureza se muestran a continuación en la Tabla 20 (procedimientos 1-2 y primera ronda del procedimiento 3) y la Tabla 21 (segunda ronda del procedimiento 3):
Tabla 20:
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Tabla 21:
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No se detectó ningún cambio en el porcentaje de monómero SEC en ninguna muestra después de hasta 5 ciclos de C/D rápida (procedimiento 1) o C/D lenta (procedimiento 2).
En el primer estudio de C/D lenta (procedimiento 3), las muestras de P60 mostraron una disminución obvia del porcentaje de monómero SEC (principalmente debido a la formación de especies HMW) después de 3 ciclos. Y no ocurrió ningún cambio claro en C60 y CP60. En el estudio de C/D lenta del segundo procedimiento 3 (0,5°C/min), el monómero en las muestras P60 comenzó a disminuir después de 1 ciclo, y finalmente cayó un 68,1% después de 5 ciclos. Y en CP60, el porcentaje de monómero empezó a caer después de 3 ciclos, pero mucho menos que en P60; sin embargo, alcanzó el mismo nivel que en P60 después de 5 ciclos. No hubo cambios en el porcentaje de monómero en C60 después de hasta 5 ciclos.
Los resultados de pureza SEC fueron consistentes con el comportamiento en la concentración y actividad enzimática, lo que confirma que la velocidad de congelación/calentamiento, el número de ciclos de C/D, y el tipo de amortiguador pueden afectar la estabilidad de ATB200 durante el procedimiento de congelación y descongelación. Los amortiguadores que contenían fosfato de sodio no protegieron tan bien a ATB200 durante los ciclos de congelación y descongelación, según los resultados de la SEC.
Sumario
ATB200 formulada en amortiguador de citrato (C60) resistió mejor múltiples ciclos de congelación y descongelación que los otros dos amortiguadores (P60 y CP60). Independientemente del procedimiento de congelación y descongelación, ATB200 se mantuvo estable en amortiguador de citrato.
EJEMPLO 3 DE FORMULACIÓN: EXCIPIENTE
Se prepararon ocho formulaciones (E1 -8) con diversos excipientes. La concentración de enzima ATB200 en el estudio de evaluación de excipientes fue 5 mg/ml. Se seleccionaron tres amortiguadores, dos estabilizadores y un tensioactivo para evaluar la estabilidad de la proteína en las formulaciones descritas en la Tabla 22 a continuación.
Tabla 22:
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Preparación de la muestra
Se prepararon por separado amortiguador de fosfato de sodio 25 mM que contenía NaCI 50 mM a pH 6,0, amortiguador de citrato de sodio 25 mM que contenía NaCl 50 mM a pH 6,0, y amortiguador de combinación de fosfato-citrato de sodio 25 mM que contenía NaCl 50 mM a pH 6,0. La disolución de enzima ATB200 se intercambió en los tres amortiguadores usando un casete de diálisis. Las diálisis se realizaron a 5°C con agitación suave, cada una con 3 cambios de amortiguador, una vez cada 6~10 horas.
Después de la diálisis, se añadió trehalosa, manitol o PS80 al dializado, para preparar las formulaciones que se enumeran en la Tabla 22. Finalmente, se añadió el volumen apropiado de amortiguadores de formulación para ajustar la concentración final de ATB200 a 5 mg/ml. Las disoluciones se filtraron asépticamente con un filtro de PES de 0,22 gm.
Cada formulación se llenó asépticamente en viales de vidrio de 2 ml en una campana de bioseguridad, con un volumen de llenado de alrededor de 1 ml. Los viales se taparon, y entonces se sellaron por presión inmediatamente después del llenado.
Evaluación de las muestras
Las formulaciones E1-8 se evaluaron en 4 condiciones diferentes. Los viales de cada formulación se almacenaron a 5°C durante 12 semanas (12 W) y a 40°C durante 8 semanas (8 W), se congelaron y descongelaron (0,52C/min) durante 5 ciclos, y se agitaron a 100 rpm durante 5 días a 25°C. El plan de muestreo y análisis se describe en la Tabla 23. Las muestras se analizaron inicialmente (T0), 2 semanas (2W), 4 semanas (4W), 8 semanas (8W) y 12 semanas (12W).
Tabla 23:
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Resultados
Aspecto
Los resultados del aspecto para las medidas del estudio de congelación y descongelación se muestran a continuación en la Tabla 24 (usando refrigerador) y la Tabla 25 (usando liofilizador):
Tabla 24:
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Figure imgf000041_0001
Tabla 25:
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Durante el estudio de congelación-descongelación, las partículas visibles aumentaron ligeramente con el aumento de los ciclos de congelación-descongelación en F5 y F6, que no contenían PS80. No se observó diferencia en otras formulaciones.
Sumario
Las formulaciones sin PS80 (F5 y F6) no se comportaron tan bien como las formulaciones con PS80 en el estudio de congelación y descongelación, como lo demuestra la formación de partículas visibles después de múltiples ciclos de congelación y descongelación.
EJEMPLO 4 DE FORMULACIÓN: HEMOLISIS EN SANGRE HUMANA COMPLETA
Se preparó una serie de diluciones de sangre (1:2, 1:3, 1:4, 1:5 y 1:10) de un donante humano en disolución salina. Cuando se mezcló con agua desionizada, la dilución que dio como resultado una OD a 540 nm entre 0,8 y 1,2 se usó en el ensayo, y se denomina sustrato de sangre. Se evaluaron cuatro tipos de muestras: el artículo de ensayo, el placebo, el control positivo y el control negativo. El artículo de ensayo presentaba rhGAA ATB200 en una formulación con citrato de sodio 25 mM, manitol al 2% y polisorbato 80 al 0,05% a un pH de 6,0. El placebo fue el mismo que el artículo de ensayo, excepto que no había rhGAA ATB200. El artículo de control positivo era agua estéril para inyección, y tenía un pH de 5. El artículo de control negativo era disolución salina (0,9 NaCl), y tenía un pH de 5.
El artículo de ensayo (ATB200) a 300, 600 y 1000 pg/ml con disolución salina, el placebo con disolución salina, el control negativo (disolución salina) y el control positivo (agua) se mezclaron con el sustrato de sangre del donante humano. Las muestras se incubaron sin agitación durante 1 hora a 37°C. Después de la incubación, los tubos se centrifugaron durante 10 minutos a aproximadamente 100 x g a temperatura ambiente. La cantidad de hemoglobina en el sobrenadante de cada muestra se analizó espectrofotométricamente a 540 nm.
El porcentaje de hemólisis para el artículo de ensayo se determinó mediante la fórmula:
% de hemolisis = Abs. TA/placebo con sangre - Abs. de disolución salina con sangre - Abs. de TA/placebo Abs.de agua con sangre - Abs. de disolución salina con sangre
El porcentaje de hemolisis del agua más la sangre es 100%. La disolución salina fue el control negativo. La hemolisis menor o igual a 10% se consideró insignificante. Se calculó el porcentaje de hemólisis para cada concentración del artículo de ensayo y para el placebo.
La Tabla 26, a continuación, muestra los resultados de las muestras ensayadas.
Tabla 26:
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La incubación del sustrato de sangre humana con las tres muestras de placebo, diluidas en disolución salina en la misma relación que las tres dosis del artículo de ensayo, no provocó ninguna hemólisis significativa de la sangre humana. El porcentaje de hemólisis para las muestras diluidas con placebo se calculó en -1,3, -1,3, y 0,9%, respectivamente. La incubación del sustrato de sangre humana con ATB200 a 300, 600 y 1000 pg/ml no provocó ninguna hemólisis significativa de la sangre humana. El porcentaje de hemólisis para las muestras del artículo de ensayo se calculó en -0,1, -1,5% y -1,5%, respectivamente.
En conclusión, la formulación de ATB200 fue compatible con la sangre humana en todas las diluciones.
EJEMPLO 5 DE FORMULACIÓN: FLOCULACIÓN EN PLASMA Y SUERO HUMANOS
Las disoluciones de dosificación del artículo de ensayo (3 concentraciones) y el placebo (3 concentraciones) se mezclaron con volúmenes iguales de plasma humano y suero de un donante. El artículo de ensayo presentaba rhGAA ATB200 en una formulación con citrato de sodio 25 mM, manitol al 2% y polisorbato 80 al 0,05% a un pH de 6,0. El placebo fue el mismo que el artículo de ensayo, excepto que no había rhGAA ATB200.
Se mezcló un ml de cada dosis de artículo de ensayo o placebo con un volumen igual de plasma, suero y disolución salina. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los tubos se examinaron macroscópica y microscópicamente en busca de precipitación o coagulación. Una alícuota de cada tubo se centrifugó a 14.000 rpm en una microcentrífuga durante 10 minutos. Cada tubo se examinó para determinar la presencia o ausencia de un pelete. La precipitación/coagulación y los peletes se puntuaron de la siguiente manera:
0 = negativa
1 = muy poca precipitación o pelete
2 = precipitación o pelete mínimos
3 = precipitación o pelete moderados
4 = precipitación o pelete importantes
La Tabla 27, a continuación, muestra los resultados de las muestras ensayadas.
Figure imgf000044_0001
No se observó precipitación macroscópica o microscópicamente en el plasma o suero humano cuando se mezcló con cada concentración de ATB200. No se observó precipitación en las muestras de placebo. Cuando se centrifugaron todas las muestras de placebo o ATB200, no se observaron peletes.
En base a los resultados de este estudio, se encontró que la formulación de ATB200 es compatible con plasma y suero humanos hasta una concentración final de 1000 pg/ml inclusive.
EJEMPLO: DATOS FARMACOCINÉTICOS Y DE SEGURIDAD DE LA A-GLUCOSIDASA ÁCIDA RECOMBINANTE ATB200 COADMINISTRADA CON MIGLUSTAT EN PACIENTES CON ENFERMEDAD DE POMPE CON EXPERIENCIA EN ERT Y NO TRATADOS CON ERT PREVIAMENTE
Este estudio se diseñó para evaluar principalmente la seguridad, la tolerabilidad y la farmacocinética (PK) de ATB200 coadministrada con miglustat. Un modelo traslacional PK/farmacodinámico (PD) de un ratón con desactivación génica de Gaa predijo que una combinación de 20 mg/kg de ATB200 con una dosis alta (por ejemplo, 260 mg) de miglustat en seres humanos proporcionaría una reducción óptima del glucógeno.
En la siguiente descripción, “dosis alta” de miglustat se refiere a una dosis de alrededor de 260 mg, y “dosis baja” de miglustat se refiere a una dosis de alrededor de 130 mg.
El objetivo fue evaluar los datos farmacocinéticos preliminares de proteína GAA total, ATB200, y miglustat, y los marcadores de seguridad de 10 pacientes en este estudio de fase 1/2.
Este es un estudio abierto, de secuencia fija, de dosis ascendente, primero en humanos, de fase 1/2, para evaluar la seguridad, tolerabilidad, PK, PD y eficacia de las infusiones intravenosas de ATB200 co-administrada con miglustat oral en adultos con enfermedad de Pompe (Figura 21). Se evaluaron los resultados medios de la farmacocinética de la proteína GAA total y de miglustat de los primeros 8 pacientes de la cohorte 1 hasta la visita 9 y los primeros 2 pacientes de la cohorte 3. aSe revisaron los datos de seguridad de 2 pacientes centinela de la Cohorte 1 en cada nivel de dosis antes de administrar la dosis en las Cohortes 2 y 3. bDurante las Etapas 2 y 3, miglustat se administró por vía oral antes del inicio de la infusión intravenosa de ATB200. Para todas las dosis, ATB200 se infundió por vía intravenosa durante 4 horas. cLos primeros 2 pacientes en las Cohortes 2 y 3 sirvieron como pacientes centinela para sus respectivas cohortes.
Criterios clave de inclusión:
• Hombres y mujeres de 18 a 65 años de edad que se diagnosticaron con la enfermedad de Pompe en base a una deficiencia documentada de la actividad de la enzima GAA o por genotipado de GAA
• Recibió ERT con alglucosidasa alfa durante 2-6 años (o >2 años para la Cohorte 2) antes del inicio del ensayo (Cohorte 1) •
• Actualmente recibe alglucosidasa alfa con una frecuencia de cada dos semanas, y completó las últimas 2 infusiones sin un evento adverso relacionado con el medicamento que provoque la interrupción de la dosis (Cohortes 1 y 2)
• Debe poder caminar entre 200 y 500 metros en la prueba de marcha de 6 minutos (Cohortes 1 y 3)
• La capacidad vital forzada en posición vertical debe ser del 30% al 80% del valor normal previsto (Cohortes 1 y 3)
• Debe estar en silla de ruedas y no poder caminar sin ayuda (Cohorte 2)
Análisis PK:
• Se recogieron muestras de sangre para la concentración de la proteína GAA total en plasma y actividad.
• Etapa 1: antes del inicio de la infusión de ATB200 y 1,2, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 10, 12 y 24 horas después del inicio de la infusión
• Etapas 2 y 3: 1,2, 3, 4, 4,5, 5, 6, 7, 9, 11, 13 y 25 horas después de la administración oral de miglustat
• Se tomaron muestras de sangre para determinar las concentraciones plasmáticas de miglustat justo antes de la administración oral de miglustat (tiempo 0), y 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 9, 11 y 25 horas después de la administración oral de miglustat. El miglustat plasmático se determina mediante un ensayo de LC-MS/MS validado
• Las concentraciones de proteína GAA total en plasma para ATB200 5, 10 y 20 mg/kg se determinaron mediante una cuantificación por LC-MS/MS validada de péptido o péptidos “firma” específicos de rhGAA
Se completó un análisis preliminar en 8 pacientes en la Cohorte 1, que completaron las Etapas 1 y 2, y 2 pacientes en la Cohorte 3, que comenzaron la Etapa 3
• Los pacientes con cambio inicial de ERT son representativos de la población con enfermedad de Pompe, con una media de 5,02 años en ERT (Tabla 28)
TABLA 28: Características de la línea base
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Tiempo en ERT (Lumizyme®/Myozyme®), años, media 5,02 (1,20) N/A (STDV)
Edad, años, media (intervalo) 47,7 (8,19) 33,0 (12,73) Sexo, H/M, % 80/20 0/100
6 MWT, metros, media (STDV) 398,4 (95,92) 432,1 (67,81) FVC en posición vertical, % medio, predicho (STDV) 51,9 (13,84) 51,0 (26,87) 6 MWT = prueba de marcha de 6 minutos; FVC = capacidad vital forzada; N/A = no disponible; STDV = desviación estándar.
an = 10 de la Cohorte 1 (cambio de ERT ambulatorio) mediante análisis de datos de ínterin; n = 2 de la Cohorte 3 (sin tratamiento previo).
Proteína GAA total
Cuando se administra sola, ATB200 aumenta de una manera proporcional ligeramente mayor que la dosis (Tabla 29 y Figuras 22A-22D). La variabilidad parece aumentar con la dosis de miglustat (Figura 22C). La coadministración de ATB200 20 mg/kg con la dosis alta de miglustat (260 mg) aumentó la exposición a la proteína GAA total (AUC) en aproximadamente un 25% con respecto a ATB200 sola a 20 mg/kg. La vida media de distribución (fase a) aumentó en un 45%, lo que sugiere que la dosis alta de miglustat estabiliza ATB200 en plasma. Un aumento en la vida media de la distribución se acompaña de un aumento en la AUC desde el tiempo hasta la concentración plasmática máxima hasta aproximadamente 12 horas después de la dosis. Los aumentos en AUC y vida media se pueden observar en la escala logarítmica, durante la fase de eliminación terminal (Figura 22B). ATB200 demostró un volumen de distribución relativamente alto. La disposición de la proteína GAA total en plasma parece similar entre los pacientes sin tratamiento previo con ERT (Cohorte 3) y los pacientes con experiencia con ERT (Cohorte 1) (Figuras 22A y 22D).
TABLA 29: Proteína GAA total
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1 5 mg/kg sola01 61 3,8 215 218 1,9 1,1 2,1 4,62
(18,1) (3,0-4,0) (16,7) (16,4) (16,7) (10,2) (16,9) (12,7) 1 10 mg/kg sola0 144 4,0 578 584 1,6 1,3 1,59 3,87
(16,6) (3,5-4,0) (20,3) (20,4) (46,1) (10,5) (25,4) (16,5) 1 20 mg/kg sola0 345 4,0 1508 1512 2,1 1,5 1,22 3,52
(10,1) (3,5-4,0) (14,5) (14,4) (29,7) (6,5) (21,7) (12,4) 1 ATB20020 mg/kg 334 4,0 1694 1701 2,4 1,8 1,09 3,76 miglustat baja SD0 (16-2) (3,5-4,0) (17,7) (17,5) (16,6) (10,2) (22,9) (13,3) 1 ATB20020 mg/kg 353 4,0 1804 1808 2,5 1,9 1,02 3,73 miglustat baja MD0 (13,7) (3,5-5,0) (15,7) (15,8) (8,1) (21,8) (21,4) (12,3) 1 ATB20020 mg/kg 349 4,0 1878 1886 2,7 2,3 0,98 3,74 miglustat alta SDe (13,9) (3,5-4,0) (17,5) (17,5) (13,1) (18,9) (26,5) (12,3) 1 ATB20020 mg/kg 356 4,0 1886 1901 2,5 2,1 0,98 3,6 miglustat alta MD0 (20,2) (3,5-4,0) (21,3) (21,7) (20,5) (16,1) (27,3) (18,7)
Figure imgf000047_0001
3 ATB20020 mg/kg 291 4,3 1597 1600 2,4 2 0,69 2,61 miglustat alta MDf (21,6) (4,0-4,5) (34,8) (34,9) (5,4) (14,5) (28,9) (17,3) 3 ATB20020 mg/kg 330 4,0 1672 1676 2,6 1,9 0,66 2,33 miglustat alta MDf (27,5) (4,0-4,0) (32,7) (32,6) (8,7) (9,0) (26,6) (23,2) AUC = área bajo la curva; CLj = eliminación total del cuerpo; Cmax = concentración de fármaco máxima; CV = coeficiente de variabilidad; MD = múltiples dosis; SD = una sola dosis; t1/2 = vida media; tmax = tiempo hasta la concentración de fármaco máxima; Vss = volumen de distribución aparente en estado estacionario.
aMedia geométrica (CV %).
bMediana (mín-máx).
cMedia aritmética (CV %.)
dn = 8.
en = 7.
fn = 2.
PK de miglustat
Miglustat demostró una cinética proporcional a la dosis (Tabla 30 y Figura 23). El miglustat plasmático parece similar entre dosis únicas y múltiples.
TABLA 30: Sumario de la PK de miglustat
Figure imgf000047_0002
Baja SD 1486 (29,9) 3,5 (1,5-3,5) 11.807 (25,6) 12.565 (26,8) 5,6 (11,7) 10,6 (23) 85,8 (23,4) Baja MD 1518 (27,6) 3,0 (1,5-3,5) 12.254 (26,4) 13.094 (28,3) 5,9 (32,1) 10,2 (23,9) 86,7 (43,9) Alta SD 3059 (36,1) 3,5 (1,5-5) 23.999 (35) 25.859 (34,4) 5,7 (29,9) 10,6 (33) 86,3 (45,7) Alta MD 3569 (25,5) 3,0 (1,0-4,0) 24.970 (24,1) 25.972 (23) 5,3 (15,6) 10,3 (26,4) 81 (41,8) Vz = volumen de distribución aparente en estado terminal.
aMedia geométrica (CV %).
bMediana (mín-máx).
cMedia aritmética (CV %).
Farmacodinámica
Para la visita número 11 en pacientes experimentados con ERT de la Cohorte 1 (Figuras 24A y 24B):
• La alanina aminotransferasa (ALT) disminuyó en 5 de 8 pacientes; 4/4 pacientes con niveles basales elevados normalizados
• La aspartato aminotransferasa (AST) disminuyó en 6 de 8 pacientes; 3/4 pacientes con niveles basales elevados normalizados
• La creatina fosfocinasa (CPK) disminuyó en 6 de 8 pacientes; 2/6 pacientes con niveles basales elevados normalizados
• Los niveles del tetrasacárido de glucosa en orina (HEX4) disminuyeron en 8 de 8 pacientes
En la semana 4, los niveles de los 4 biomarcadores disminuyeron en los 2 pacientes de la cohorte sin tratamiento previo (Cohorte 3) (Figuras 24C y 24D).
En las Figuras 24A-24D, los datos se representan como media ± error estándar.
Seguridad
• No se informaron eventos adversos graves (AE) o reacciones asociadas a la infusión después de más de 155 infusiones totales en todos los pacientes
• Los AE que surgen por el tratamiento, notificados en 11/13 (84%) pacientes, fueron generalmente leves y transitorios.
• AE relacionados con el tratamiento dados a conocer en 7/13 (53%) pacientes: náuseas (n=1), fatiga (n=1), cefalea (n=1), temblor (n=2), acné (n=1), taquicardia (n=1), e hipotensión (n=1).
Conclusiones
• ATB200 sola y en combinación con miglustat ha sido segura y bien tolerada, sin reacciones asociadas a la infusión hasta la fecha.
ATB200 sola mostró aumentos en la exposición mayores que los proporcionales a la dosis, que aumentaron aún más con miglustat, lo que sugiere un efecto estabilizador de la chaperona en ATB200.
• Después de cambiar del estándar de atención a ATB200/miglustat, los pacientes generalmente mostraron una mejora en los biomarcadores de daño muscular, y muchos pacientes demostraron una normalización en la semana 18.
• Los 2 pacientes iniciales sin tratamiento previo tratados con ATB200/miglustat demostraron una reducción robusta en todos los biomarcadores de daño muscular
SECUENCIAS
[0250]
SEQ ID NO: 1
Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys
Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His lie Leu Leu
His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val
Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly
Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr
G ln C y s A s p V a l P r o P r o A s n S e r A r g P h e A s p C y s A la P r o A s p L y s Ala lie Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr lie Pro
Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser
Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe
Pro Lys Asp lie Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr lie Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu
Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val lie Val His Arg
Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr
lie Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser
Trp Thr Arg lie Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly
Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly
Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly lie
Leu Asp Val Tyr lie Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln
Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly
Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala lie Thr
Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr
Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu
Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met lie Val Asp Pro Ala lie
Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu
Arg Arg Gly Val Phe lie Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu lie Gly
Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val
Pro Phe Asp Gly Met Trp lie Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe lie
Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr lie Cys
Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu
Tyr Gly Leu Thr Glu Ala lie Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala
Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val lie Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His
Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu
Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu lie Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly
Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser
Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser
Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg
Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val
Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp
Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu
Leu lie Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr
Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro lie Glu Ala
Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala lie
His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr lie
Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr lie lie Pro Leu Gln Gly Pro Gly
Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala
Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val lie Phe
Leu Ala Arg Asn Asn Thr lie Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser
Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala
Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe
Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp lie Cys Val Ser Leu Leu
Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys
SEQ ID NO: 2
Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro
Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser
Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala lie Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr lie Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala
Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr
Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu
Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp lie Leu Thr Leu Arg
Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr lie Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu
Pro Phe Gly Val lie Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu
Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu
Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr lie Thr Gly Leu Ala Glu His Leu
Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg lie Thr Leu Trp Asn
Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro
Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu
Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu
Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly lie Leu Asp Val Tyr lie Phe Leu Gly
Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr
Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp
Gly Tyr Ser Ser Thr Ala lie Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr
Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr
Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg
Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met lie Val Asp Pro Ala lie Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe lie Thr Asn Glu
Thr Gly Gln Pro Leu lie Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe
Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp lie Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe lie Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn
Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr
Leu Gln Ala Ala Thr lie Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr
His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala lie Ala Ser
His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val lie Ser
Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu lie
Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln
Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met
Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr
Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu
Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln
Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu lie Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly
Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu
Gln Thr Val Pro lie Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala
Ala Pro Arg Glu Pro Ala lie His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu
Pro Ala Pro Leu Asp Thr lie Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr lie lie Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu
Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val lie Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr lie Val Asn Glu
Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly
Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp
lie Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación farmacéutica, que comprende:
(a) una población de moléculas de a-glucosidasa ácida humana recombinante (rhGAA), en la que las moléculas de rhGAA se expresan en células de ovario de hámster chino (CHO), y en la que las moléculas de rhGAA comprenden al menos 3 moles de restos de manosa-6-fosfato (M6P) y al menos 4 mol de restos de ácido siálico, por mol de rhGAA;
(b) un amortiguador de citrato; y
(c) al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en manitol, polisorbato 80, y combinaciones de los mismos,
en la que la formulación tiene un pH de 5,0 a 7,0.
2. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, en la que el 40%-60% de los N-glicanos en las moléculas de rhGAA son N-glicanos de tipo complejo.
3. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la rhGAA está presente en una concentración de 5 mg/ml a 50 mg/ml, opcionalmente 15 mg/ml.
4. La formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la formulación tiene un pH de 5,5 a 7,0, opcionalmente de 6,0.
5. La formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en la que el amortiguador de citrato comprende una sal de potasio, sodio o amonio.
6. La formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el manitol está presente en una concentración de 10 mg/ml a 50 mg/ml, y/o el polisorbato 80 está presente en una concentración de 0,2 mg/ml a 0,5 mg/ml; y en la que, preferiblemente, el manitol está presente en una concentración de 20 mg/ml, y el polisorbato 80 está presente en una concentración de 0,5 mg/ml.
7. La formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, que comprende además un agente alcalinizante y/o
un agente acidulante,
en la que el agente alcalinizante y el agente acidulante están presentes en cantidades suficientes para mantener la formulación farmacéutica a un pH de 5,0 a 6,0.
8. La formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que las moléculas de rhGAA comprenden sitios potenciales de N-glicosilación primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto y séptimo en los aminoácidos correspondientes a N84, N177, N334, N414, N596, N826 y N869 de SEQ iD NO: 2, respectivamente, y en la que:
(a) al menos 50% de las moléculas de rhGAA comprenden una unidad de N-glicano que porta bis-M6P en el primer sitio potencial de N-glicosilación;
(b) al menos 30% de las moléculas de rhGAA comprenden una unidad de N-glicano que porta mono-M6P en el segundo sitio potencial de N-glicosilación; o
(c) al menos 30% de las moléculas de rhGAA comprenden una unidad de N-glicano que porta bis-M6P en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación; o
(d) al menos 20% de las moléculas de rhGAA comprenden una unidad de N-glicano que porta mono-M6P en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación.
9. La formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que la formulación farmacéutica consiste esencialmente en:
(a) la población de moléculas de rhGAA;
(b) citrato de sodio;
(c) ácido cítrico monohidratado;
(d) manitol;
(e) polisorbato 80;
(f) agua;
(g) opcionalmente, un agente acidulante; y
(h) opcionalmente, un agente alcalinizante,
en la que la formulación tiene un pH de 5,0 a 6,0, y en la que, opcionalmente: la población de moléculas de rhGAA está presente a una concentración de 15 mg/ml, el amortiguador de citrato de sodio está presente a una concentración de 25 mM, el manitol está presente a una concentración de 20 mg/ml, y el polisorbato 80 está presente a una concentración de 0,5 mg/ml.
10. Una composición farmacéutica que comprende la formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, en la que la formulación farmacéutica está liofilizada.
11. Una formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe en un paciente que lo necesite, en la que la formulación farmacéutica se diluye opcionalmente antes de la administración al paciente.
12. Una composición farmacéutica según la reivindicación 10 para uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe en un paciente que lo necesite, en la que la composición farmacéutica se reconstituye antes de la administración al paciente.
13. Un método para preparar la formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, comprendiendo el método:
(a) preparar una disolución que comprende el amortiguador de citrato, el al menos un excipiente, y la población de moléculas de rhGAA;
(b) opcionalmente, ajustar el pH de la disolución;
(c) opcionalmente añadir agua adicional a la disolución;
(d) opcionalmente filtrar la disolución; y
(e) opcionalmente almacenar la disolución.
14. Un método para preparar la composición farmacéutica de la reivindicación 10, comprendiendo el método liofilizar la formulación farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
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