ES2950808T3

ES2950808T3 - Alfa-glucosidasa ácida humana recombinante

Info

Publication number: ES2950808T3
Application number: ES18802722T
Authority: ES
Inventors: Hung Do; Russell Gotschall; Richie Khanna; Yi Lun; Hing Char; Sergey Tesler; Wendy Sunderland; Enrique Dilone
Original assignee: Amicus Therapeutics Inc
Current assignee: Amicus Therapeutics Inc
Priority date: 2017-05-15
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2038-05-15
Also published as: IL270530B2; KR20200004414A; AU2018270925A1; EP3624831A4; EP3624831A1; WO2018213340A1; US20210393747A1; EP4223310A3; PT3624831T; DK3624831T5; CL2019003251A1; HUE062504T2; TW201900208A; BR112019024125A2; CN111356474A; IL310719A; IL270530A; ZA201907552B; IL270530B1; EP3624831B1

Abstract

Se proporcionan una α-glucosidasa ácida recombinante y una composición farmacéutica que comprende una α-glucosidasa ácida recombinante, en la que la α-glucosidasa ácida recombinante se expresa en células de ovario de hámster chino (CHO) y comprende un mayor contenido de unidades de N-glicano que llevan una o dos residuos de manosa-6-fosfato en comparación con un contenido de unidades de N-glicano que contienen uno o dos residuos de manosa-6-fosfato de alglucosidasa alfa. También se proporcionan en el presente documento métodos para producir, purificar y formular la α-glucosidasa ácida recombinante o la composición farmacéutica para su administración a un sujeto y métodos para tratar una enfermedad o trastorno tal como la enfermedad de Pompe usando la α-glucosidasa ácida o la composición farmacéutica recombinante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Alfa-glucosidasa ácida humana recombinante

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. N° de serie 62/506.561 presentada el 15 de mayo de 2017, la Solicitud Provisional de EE.UU. N° de serie 62/506.569 presentada el 15 de mayo de 2017, la Solicitud Provisional de EE.UU. N° de serie 62/506.574 presentada el 15 de mayo de 2017, la Solicitud provisional de EE.UU. N° de serie 62/564.083 presentada el 27 de septiembre de 2017, la Solicitud provisional de EE.UU. N° de serie 62/567.334 presentada el 3 de octubre de 2017, la Solicitud provisional de EE.UU. N° de serie 62/618.021 presentada el 16 de enero de 2018, la Solicitud provisional de EE.UU. N° de serie 62/624.638 presentada el 31 de enero de 2018 y la Solicitud Provisional de EE.UU. N° de serie 62/660.758 presentada el 20 de abril de 2018, a cada una de las cuales se les reivindica prioridad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención implica los campos de la medicina, la genética y la bioquímica de glicoproteínas recombinantes y, específicamente, se refiere a composiciones de a-glucosidasa humana recombinante (rhGAA, por sus siglas en inglés) que tienen un alto contenido total de N-glicanos portadores de manosa-6-fosfato que fijan de manera eficiente como objetivo CIMPR en las células y, posteriormente, suministran rhGAA a los lisosomas, en donde puede descomponer niveles anormalmente altos de glucógeno acumulado. La rhGAA de la invención exhibe una absorción superior en las células de la musculatura y el posterior suministro a los lisosomas en comparación con los productos de rhGAA convencionales y exhibe otras propiedades farmacocinéticas que la hacen particularmente eficaz para la terapia de reemplazo enzimática de sujetos que padecen la enfermedad de Pompe.

La presente divulgación también proporciona un método para tratar la enfermedad de Pompe, que comprende administrar a un individuo una combinación de una rhGAA y una chaperona farmacológica. Por ejemplo, en algunos ejemplos, la presente divulgación proporciona un método para tratar la enfermedad de Pompe, que comprende administrar a un individuo una combinación de rhGAA y miglustat. La rhGAA de la invención exhibe una eficacia sorprendente en el tratamiento y la reversión de la progresión de la enfermedad en sujetos que padecen la enfermedad de Pompe.

ANTECEDENTES

La enfermedad de Pompe es una enfermedad de almacenamiento lisosomal heredada que resulta de una deficiencia en la actividad de la a-glucosidasa ácida (GAA, por sus siglas en inglés). Una persona que padece la enfermedad de Pompe carece o tiene niveles reducidos de a-glucosidasa ácida (GAA), la enzima que descompone el glucógeno en glucosa, una fuente de energía principal para los músculos. Esta deficiencia enzimática provoca una acumulación excesiva de glucógeno en los lisosomas, que son orgánulos intracelulares que contienen enzimas que normalmente descomponen el glucógeno y otros desechos o productos de desecho celulares. La acumulación de glucógeno en determinados tejidos de un sujeto que padece la enfermedad de Pompe, especialmente en los músculos, deteriora la capacidad de las células de funcionar normalmente. En la enfermedad de Pompe, el glucógeno no se metaboliza adecuadamente y se acumula progresivamente en los lisosomas, especialmente en las células del músculo esquelético y, en la forma de aparición infantil de la enfermedad, en las células del músculo cardíaco. La acumulación de glucógeno daña las células musculares y nerviosas, así como las de otros tejidos afectados.

Tradicionalmente, dependiendo de la edad de inicio, la enfermedad de Pompe se reconoce clínicamente como una forma infantil temprana o como una forma de aparición tardía. La edad de la aparición tiende a ser paralela a la gravedad de la mutación genética que provoca la enfermedad de Pompe. Las mutaciones genéticas más graves provocan la pérdida completa de la actividad de GAA y se manifiestan como una enfermedad de aparición temprana durante la infancia. Las mutaciones genéticas que disminuyen la actividad de GAA pero no la eliminan por completo están asociadas con formas de la enfermedad de Pompe que tienen una aparición y una progresión retardadas. La enfermedad de Pompe de aparición infantil se manifiesta poco después del nacimiento y se caracteriza por debilidad muscular, insuficiencia respiratoria e insuficiencia cardíaca. Sin tratamiento, por lo general es fatal en el espacio de dos años. La enfermedad de Pompe de aparición juvenil y adulta se manifiesta más tarde en la vida y habitualmente progresa más lentamente que la enfermedad de aparición infantil. Esta forma de la enfermedad, si bien generalmente no afecta al corazón, también puede provocar la muerte debido al debilitamiento de los músculos esqueléticos y de los implicados en la respiración.

El tratamiento no paliativo actual de la enfermedad de Pompe implica la terapia de reemplazo enzimático (ERT, por sus siglas en inglés) utilizando GAA humana recombinante (rhGAA) conocida como Lumizyme®, Myozyme® o alglucosidasa alfa. Esta terapia de reemplazo enzimático convencional busca tratar la enfermedad de Pompe al reemplazar la GAA que falta en los lisosomas mediante la administración de rhGAA, restaurando así la capacidad de las células de descomponer el glucógeno lisosomal. "Lumizyme®" y "Myozyme®" son formas convencionales de rhGAA producidas o comercializadas como productos biológicos por Genzyme y aprobadas por la Food and Drug Administration de EE.UU., y se describen con referencia a Physician's Desk Reference (2014). La alglucosidasa alfa se identifica como nombre químico [199-arginina, 223-histidina]prepro-a-glucosidasa (humana); fórmula molecular, C4758H7262N1274O1369S35; número CAS 420794-05-0. Estos productos se administran a sujetos con la enfermedad de Pompe, también conocida como enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II (GSD-II, por sus siglas en inglés) o enfermedad por deficiencia de maltasa ácida.

La absorción celular de una molécula de rhGAA se ve facilitada por el hidrato de carbono especializado, manosa-6-fosfato (M6P), que se une al receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CIMPR, por sus siglas en inglés) presente en las células diana tales como las células musculares. Tras la unión, la molécula de rhGAA es captada por las células diana y posteriormente es transportada a los lisosomas dentro de las células. Sin embargo, la mayoría de los productos de rhGAA convencionales carecen de un alto contenido total de N-glicanos portadores de mono-M6P y bis-M6P (es decir, N-glicanos que portan un residuo de M6P o N-glicanos que portan dos residuos de M6P, respectivamente). lo que limita su captación celular a través del CIMPR y el suministro lisosomal, lo que hace que la terapia de reemplazo enzimático convencional sea insuficientemente eficaz. Por ejemplo, mientras que los productos convencionales de rhGAA a 20 mg/kg o dosis más altas mejoran algunos aspectos de la enfermedad de Pompe, no son capaces, entre otras cosas, de (i) tratar la disfunción celular subyacente, (ii) restaurar la estructura muscular o (iii) reducir el glucógeno acumulado en muchos tejidos diana, tales como los músculos esqueléticos, para revertir la progresión de la enfermedad. Además, las dosis más altas pueden imponer cargas adicionales al sujeto, así como a los profesionales médicos que tratan al sujeto tal como prolongar el tiempo de infusión necesario para administrar rhGAA por vía intravenosa. Sigue existiendo la necesidad de mejoras adicionales en la terapia de reemplazo enzimática para el tratamiento de la enfermedad de Pompe tal como rhGAA con captación tisular mejorada, actividad enzimática mejorada, estabilidad mejorada o inmunogenicidad reducida.

La glicosilación de GAA o rhGAA puede modificarse enzimáticamente in vitro mediante la fosfotransferasa y las enzimas de descubrimiento descritas por Canfield, et al., Patente de EE.UU. N° 6.534.300, para generar grupos M6P. La glicosilación enzimática no puede controlarse adecuadamente y puede producir rhGAA con propiedades inmunológicas y farmacológicas indeseables. La rhGAA modificada enzimáticamente puede contener solo oligosacáridos con alto contenido en manosa que podrían fosforilarse potencialmente de forma enzimática in vitro con una fosfotransferasa o enzima de descubrimiento y pueden contener en promedio 5-6 grupos M6P por cada GAA. Los patrones de glicosilación producidos por el tratamiento enzimático in vitro de GAA son problemáticos, porque los residuos de manosa terminal adicionales, en particular, los residuos de manosa terminal no fosforilados, afectan negativamente a la farmacocinética de la rhGAA modificada. Cuando un producto modificado enzimáticamente se administra in vivo, estos grupos de manosa aumentan el aclaramiento no productivo de GAA, aumentan la absorción de la GAA modificada enzimáticamente por las células inmunitarias y reducen la eficacia terapéutica de rhGAA debido a que menos GAA llega a los tejidos fijados como objetivo, tales como los miocitos del músculo esquelético. Por ejemplo, residuos terminales de manosa no fosforilados son ligandos conocidos para los receptores de manosa en el hígado y el bazo, lo que conduce a un aclaramiento rápido de la rhGAA modificada enzimáticamente y una fijación de objetivo reducida de la rhGAA al tejido diana. Además, el patrón de glicosilación de la GAA modificada enzimáticamente que tiene N-glicanos con alto contenido en manosa con residuos de manosa no fosforilados terminales se asemeja al de las glicoproteínas producidas en levaduras y mohos, y aumenta el riesgo de desencadenar respuestas inmunitarias o alérgicas, tales como reacciones alérgicas graves que ponen en peligro la vida (anafilácticas) o de hipersensibilidad a la rhGAA modificada enzimáticamente.

A la vista de estas deficiencias de los productos de rhGAA convencionales y los métodos in vitro para fosforilar rhGAA, los autores de la invención buscaron e identificaron diligentemente formas de producir rhGAA con un perfil optimizado de N-glicanos para una biodistribución potenciada y la captación lisosomal y, con ello, minimizar el aclaramiento no productivo de rhGAA una vez administrada. La presente invención proporciona a los pacientes con Pompe estables o en declive una terapia eficaz que revierta la progresión de la enfermedad a nivel celular. Los autores de la invención también informan que la rhGAA de la presente invención invierte la progresión de la enfermedad - incluyendo el aclaramiento del glucógeno lisosomal de manera más eficiente que el tratamiento estándar actual - y que los pacientes tratados con la rhGAA de la presente invención exhiben mejoras de salud sorprendentes y significativas, incluyendo mejoras en la fuerza muscular, función motora y/o función pulmonar, y/o incluyendo una reversión en la progresión de la enfermedad, como se demuestra en diversos resultados de eficacia (p. ej., Ejemplos 10 y 11) de los estudios clínicos.

El documento WO 2016/054231 describe una composición de alfa glucosidasa humana recombinante (rhGAA) derivada de células CHO que contiene una composición de glicanos más optimizada que consiste en una cantidad mayor de rhGAA que contiene N-glicanos que llevan manosa-6-fosfato (M6P) o bis-M6P mayor que las rhGAAs convencionales, junto con una baja cantidad de glicanos de alto contenido en manosa, no fosforilados, y una baja cantidad de galactosa terminal en oligosacáridos complejos. Se describen composiciones que contienen rhGAA y métodos de uso.

SUMARIO

La presente invención se recoge en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1A muestra un N-glicano no fosforilado, con alto contenido en mañosa, un N-glicano mono-M6P y un N-glicano bis-M6P. La Fig. 1B muestra la estructura química del grupo M6P. Cada uno de los cuadrados representa N-acetilglucosamina (GlcNAc), cada uno de los círculo representa manosa y cada una de las P representa fosfato.

La Fig. 2A describe la fijación productiva de objetivo de rhGAA a través de N-glicanos que portan M6P a tejidos diana (p. ej., tejidos musculares de sujetos con enfermedad de Pompe). La Fig. 2B describe el aclaramiento no productivo del fármaco a tejidos no diana (p. ej., hígado y bazo) o mediante la unión de N-glicanos no M6P a tejidos no diana.

La Fig.3 es un diagrama esquemático de un procedimiento ejemplar para la fabricación, captura y purificación de una proteína lisosomal recombinante.

La Fig. 4 muestra una construcción de ADN para transformar células CHO con ADN que codifica rhGAA

La Fig. 5 es un gráfico que muestra los resultados de la cromatografía de afinidad CIMPR de rhGAA ATB200 con (Realización 2) y sin (Realización 1) captura en una columna de intercambio aniónico (AEX).

Las Figs. 6A-6H muestran los resultados de un análisis de N-glicosilación específico del sitio de rhGAA ATB200, utilizando dos técnicas analíticas LC-MS/MS diferentes. La Fig. 6A muestra la ocupación del sitio de los siete sitios potenciales de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 6B muestra dos análisis del perfil de N-glicosilación del primer sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 6C muestra dos análisis del perfil de N-glicosilación del segundo sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 6D muestra dos análisis del perfil de N-glicosilación del tercer sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 6E muestra dos análisis del perfil de N-glicosilación del cuarto sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 6F muestra dos análisis del perfil de N-glicosilación del quinto sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 6G muestra dos análisis del perfil de N-glicosilación del sexto sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 6H resume el porcentaje relativo de especies mono-fosforiladas y bisfosforiladas para los potenciales sitios de N-glicosilación primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto.

La Fig. 7 es un gráfico que muestra los perfiles de elución con Polywax de Lumizyme® (alglucosidasa alfa, línea más delgada, eluyendo a la izquierda) y ATB200 (línea más gruesa, eluyendo a la derecha).

La Fig. 8 es una tabla que muestra un resumen de las estructuras de N-glicanos de Lumizyme® en comparación con tres preparaciones diferentes de rhGAA ATB200, identificadas como BP-rhGAA, ATB200-1 y ATB200-2.

Las Figs. 9A y 9B son gráficos que muestran los resultados de la cromatografía de afinidad CIMPR de Lumizyme® y Myozyme®, respectivamente.

La Fig. 10A es un gráfico que compara la afinidad de unión a CIMPR de rhGAA ATB200 (trazo izquierdo) con la de Lumizyme® (trazo derecho). La Fig. 10B es una tabla que compara el contenido de bis-M6P de Lumizyme® y rhGAA ATB200.

La Fig. 11A es un gráfico que compara la actividad de rhGAA ATB200 (trazo izquierdo) con la actividad de rhGAA Lumizyme® (trazo derecho) dentro de fibroblastos normales a diversas concentraciones de GAA. La Fig. 11B es un gráfico que compara la actividad de rhGAA ATB200 (trazo izquierdo) con la actividad de rhGAA Lumizyme® (trazo derecho) dentro de fibroblastos de un sujeto que padece la enfermedad de Pompe a diversas concentraciones de GAA. La Fig. 11C es una tabla que compara la Kcaptación de fibroblastos de sujetos normales y sujetos con enfermedad de Pompe.

La Fig. 12 muestra la estabilidad de ATB200 en tampones de pH ácido o neutro evaluados en un ensayo de termoestabilidad utilizando SYPRO Orange, ya que la fluorescencia del colorante aumenta cuando las proteínas se desnaturalizan.

La Fig. 13 muestra el contenido de glucógeno tisular de ratones WT o ratones Gaa KO tratados con un vehículo, alglucosidasa alfa o ATB200/AT2221, determinado utilizando digestión con amiloglucosidasa. Las barras representan la media ± EMT de 7 ratones/grupo. * p < 0,05 en comparación con alglucosidasa alfa en comparación múltiple utilizando el método de Dunnett bajo análisis ANOVA de una vía.

La Fig. 14 representa vesículas positivas para LAMP1 en fibras musculares de ratones Gaa KO tratados con un vehículo, alglucosidasa alfa, o ratones ATB200/AT2221 o WT. Las imágenes se tomaron de vastus lateralis y eran representativas de 7 ratones por grupo. Aumento = 200x (1000x en recuadros).

La Fig 15A muestra agregados positivos para LC3 en fibras musculares de ratones Gaa KO tratados con un vehículo, alglucosidasa alfa o ratones ATB200/AT2221 o WT. Las imágenes se tomaron de vastus lateralis y eran representativas de 7 ratones por grupo. Aumento = 400x. La Fig. 15B muestra un análisis de transferencia Western de la proteína LC3 II. Se cargó un total de 30 mg de proteína en cada una de las pistas.

La Fig 16 muestra la expresión de disferlina en fibras musculares de ratones Gaa KO tratados con un vehículo, alglucosidasa alfa o ratones ATB200/AT2221 o WT. Las imágenes se tomaron de vastus lateralis y eran representativas de 7 ratones por grupo. Aumento = 200x.

La Fig. 17 muestra la tinción co-inmunofluorescente de LAMP1 (verde) (véase, por ejemplo, "B") y LC3 (rojo) (véase, por ejemplo, "A") en fibras individuales aisladas del gastrocnemio blanco de ratones Gaa KO tratados con un vehículo, alglucosidasa alfa o ATB200. "C" representa el aclaramiento de restos autofágicos y la ausencia de lisosoma agrandado. Se examinó un mínimo de 30 fibras de cada uno de los animales.

La Fig. 18 representa la estabilización de ATB200 por AT2221 a 17 μM y 170 μM de AT2221, respectivamente, en comparación con ATB200 sola.

Las Figs. 19A y 19B muestran el diseño del estudio ATB200-02. Dosis baja = 130 mg. Dosis alta = 260 mg. En la Fig. 26A, "6MWT" = prueba de marcha de 6 minutos; "FVC" = capacidad vital forzada; "QOW" = cada dos semanas. "a" = se revisaron los datos de seguridad de 2 pacientes centinela de la Cohorte 1 en cada nivel de dosificación antes de administrar la dosis en las Cohortes 2 y 3; "b" = durante las fases 2 y 3, se administró AT2221 por vía oral antes del inicio de la infusión intravenosa de ATB200. Para todas las dosis, se infundió ATB200 por vía intravenosa durante 4 horas, "c" = los primeros 2 pacientes en las Cohortes 2 y 3 sirvieron como pacientes centinela para sus respectivas cohortes. La Fig. 19C resume las características iniciales de los pacientes inscritos en las Cohortes 1,2 y 3. "NA" = no aplicable. "SD" = desviación estándar. "a" = pacientes de la Cohorte 1 requerían haber recibido alglucosidasa alfa durante 2-6 años al inicio del estudio. LOPD = enfermedad de Pompe de aparición tardía.

La Fig. 20 representa los datos farmacocinéticos de AT2221. "AUC" = área bajo la curva; "CL/F" = aclaramiento plasmático ajustado para la biodisponibilidad oral de AT2221; "Cmax" = concentración máxima de fármaco; "CV" = coeficiente de variabilidad; "t1/2" = semivida; "tmax" = tiempo hasta la concentración máxima de fármaco; "Vz/F" = volumen de distribución aparente de la fase terminal ajustado para la biodisponibilidad oral de AT2221. "a" = media geométrica (% CV); "b" = mediana (mín-máx); "c" = media aritmética (% CV).

La Fig. 21 representa la proteína GAA total por el péptido distintivo T09 para las Cohortes 1 y 3. "AUC" = área bajo la curva; "CL^t" = aclaramiento total del cuerpo; "Cmax" = concentración máxima de fármaco; "CV" = coeficiente de variabilidad; "MD" = dosis múltiples; 'W = semivida; "tmax" = tiempo hasta la concentración máxima de fármaco; "Frel" = relación AUC de 20 mg/kg de ATB 200 sola y 10 mg/kg de ATB200 sola frente a 5 mg/kg de ATB200 sola, y 20 mg/kg de ATB200 dosis baja o dosis alta de AT2221 frente a 20 mg/kg de ATB200 sola. "a" = media geométrica (% CV); "b" = mediana (mín-máx); "c" = media aritmética (% CV); "d" = n = 11; "e" = n = 5. Dosis baja = 130 mg. Dosis alta = 260 mg.

Las Figs. 22A, 22B, 22C, 22D, 22E y 22F representan la proteína GAA total por cohorte. Dosis baja = 130 mg. Dosis alta = 260 mg. La Fig. 22^amuestra los perfiles de concentración-tiempo de proteína GAA total media para la Cohorte 1 (dosis única). La Fig. 22B muestra los perfiles de concentración-tiempo de proteína GAA total media para la Cohorte 1 (dosis múltiple). La Fig. 22C muestra los perfiles de concentración-tiempo de proteína GAA total media para la Cohorte 1 frente a la Cohorte 3 (dosis única). La Fig. 22D muestra los perfiles de concentración-tiempo de proteína GAA total media para la Cohorte 1 frente a la Cohorte 3 (dosis múltiple). La Fig. 22E muestra comparaciones de proteína GAA total con 20 mg/kg de ATB200 12 horas después de la dosis; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; ***p < 0,001. La Fig. 22F muestra comparaciones de proteína GAA total con 20 mg/kg de ATB200 24 horas después de la dosis; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; "ns" = no significativo.

La Fig. 23 muestra un análisis de varianza (ANOVA) para la proteína GAA total por el péptido distintivo T09. El área bajo la curva (AUC) se proporciona en μgh/mL; "CI" = intervalo de confianza.

La Fig. 24A muestra un resumen de los análisis y los datos provisionales disponibles de la prueba de la marcha de 6 minutos ("6MWT"), que muestra el cambio desde el inicio ("CFBL") en el mes 6, mes 9 y mes 12 para pacientes en la Cohorte 1 y la Cohorte 3.

La Fig. 24B representa datos de 6MWT para pacientes individuales de la Cohorte 1 y la Cohorte 3.

La Fig. 24C representa un resumen del análisis y los datos provisionales disponibles de otras pruebas de función motora: la prueba de función motora Levántate y Anda; la prueba de subida de 4 escalones; la prueba de marcha de diez metros (10M); Gowers; y la prueba de función motora marcha-escalera-gower-silla ("GSGC"), que muestra el cambio desde el inicio ("CFBL") en el mes 6, mes 9 y mes 12 para pacientes en la Cohorte 1 y la Cohorte 3. GSGC es un puntuación combinada calificada por el observador de cuatro evaluaciones de la función motora: marcha (caminar 10 metros), subir 4 escalones, Gowers (levantarse del suelo) y levantarse de una silla. Cada prueba se califica de 1 (normal) a 7 (no se puede realizar; puntuación máxima de 6 para la prueba de levantarse de la silla). Las puntuaciones totales oscilan entre 4 y 27. "a" = n = 9, valores perdidos no obtenidos debido a la negativa del paciente a realizar la prueba; "b" = la mediana del cambio desde el inicio fue -1,5, y 7/9 pacientes tuvieron una disminución; "c" = la mediana del cambio desde el inicio fue -0,8, y 4/5 pacientes tuvieron una disminución.

La Fig. 25 muestra un resumen de los análisis y los datos provisionales disponibles de la prueba de fuerza muscular (QMT), que muestra el cambio desde el inicio ("CFBL") en el mes mes 6 y mes 9 para pacientes en la Cohorte 2. QMT = prueba muscular cuantificada. Los valores mostrados representan kilogramos de fuerza para los lados derecho e izquierdo combinados. "a" = aducción del hombro no disponible para un sujeto; "b" = puntuación: (1) movimiento muscular visible, pero sin movimiento en la articulación; (2) movimiento en la articulación, pero no contra la gravedad; (3) movimiento contra la gravedad, pero no contra una resistencia adicional; (4) movimiento contra resistencia, pero menos de lo normal; (5) fuerza normal.

La Fig. 26A representa el resumen del análisis y los datos provisionales disponibles de las puntuaciones de la prueba muscular manual (MMT) en pacientes de la Cohorte 1. Las puntuaciones MMT se calcularon para la parte superior del cuerpo (puntuación máxima: 40), la parte inferior del cuerpo (puntuación máxima: 40) y el cuerpo total (puntuación máxima: 80). Se observaron aumentos en la fuerza de los músculos manuales en los pacientes de la Cohorte 1 en los meses 6, 9 y 12. "SD" = desviación estándar.

La Fig. 26B representa el resumen del análisis y los datos provisionales disponibles de las puntuaciones de la prueba muscular manual (MMT) en pacientes de la Cohorte 2. Las puntuaciones MMT se calcularon para la parte superior del cuerpo (puntuación máxima: 40). Se observaron aumentos en la fuerza de los músculos manuales en los pacientes de la Cohorte 2 en los meses 6 y 9. "SD" = desviación estándar. Los resultados de MMT fueron generalmente consistentes con los resultados de QMT (mostrados en la Fig. 28).

La Fig. 26C representa el resumen del análisis y los datos provisionales disponibles de las puntuaciones de la prueba muscular manual (MMT) en pacientes de la Cohorte 3. Las puntuaciones MMT se calcularon para la parte superior del cuerpo (puntuación máxima: 40), la parte inferior del cuerpo (puntuación máxima: 40) y el cuerpo total (puntuación máxima: 80). Se observaron aumentos en la fuerza de los músculos manuales en los pacientes de la Cohorte 3 en cada uno de los meses 6, 9 y 12. "SD" = desviación estándar.

La Fig. 27 muestra un resumen de los análisis y los datos provisionales disponibles de la capacidad vital forzada sentada ("FVC"), la presión inspiratoria máxima ("MIP") y la presión espiratoria máxima ("MEP"), que muestra el cambio desde el inicio ("CFBL") en el mes 6, el mes 9 y el mes 12 para pacientes en la Cohorte 1 y la Cohorte 3. "a" = FVC no disponible para un sujeto. MEP y MIP se midieron en cm de H₂O.

La Fig. 28 muestra un resumen del análisis y los datos provisionales disponibles de la Escala de gravedad de la fatiga ("FSS"), un cuestionario de auto-evaluación que consiste en nueve preguntas, cada una puntuada en una escala de 1 a 7. La puntuación total varía de 9 a 63, con valores más altos que representan un mayor nivel de fatiga debido al estado de la enfermedad. El valor normativo en la población sana es ~21. La Fig. 28 muestra el cambio desde el inicio ("CFBL") en el mes 6, el mes 9 y el mes 12 para los pacientes de la Cohorte 1, la Cohorte 2 y la Cohorte 3.

Las Figs. 29A-29C representan el cambio porcentual medio desde el inicio en marcadores de lesión del marcador (alanina aminotransferasa, aspartato aminotransferasa y creatina quinasa) en todas las cohortes de pacientes. La Fig. 29A representa datos de pacientes de la Cohorte 1 a lo largo de 58 semanas, la Fig. 29B representa datos de pacientes de la Cohorte 2 a lo largo de 24 semanas y la Fig. 29C representa datos de pacientes de la Cohorte 3 a lo largo de 36 semanas. La Fig. 29D representa el cambio porcentual medio desde el inicio en los marcadores de lesión muscular (CK = creatina quinasa) y el sustrato de la enfermedad (Hex4 = tetrasacárido de hexosa en orina) durante hasta 12 meses para pacientes en la Cohorte 1, la Cohorte 2 y la Cohorte 3. "BL" = inicio. "SE" = error típico. "WK" = semana. "M" = mes.

La Fig. 30 resume los datos de seguridad del estudio ATB200-02. "AE" = eventos adversos. "IAR" = reacción asociada a la infusión; "a" = informado a través del análisis de datos intermedios (máximo 20+ meses); "b" = Incluye dolor abdominal superior e inferior.

La Fig. 31 resume los datos de eficacia y seguridad disponibles del estudio ATB200-02.

Las Figs. 32A-32H muestran los resultados de un análisis de N-glicosilación específico del sitio de rhGAA ATB200, incluyendo un perfil de N-glicosilación para el séptimo sitio potencial de N-glicosilación, utilizando análisis LC-MS/MS de ATB200 digerida con proteasa. Las Figs. 32A-32H proporcionan datos promedio para diez lotes de ATB200 producidos a diferentes escalas.

La Fig. 32A muestra la ocupación del sitio promedia de los siete sitios potenciales de N-glicosilación para ATB200. Los sitios de N-glicosilación se proporcionan de acuerdo con SEQ ID NO: 1. CV = coeficiente de variación.

Las Figs. 32B-32H muestran los análisis de N-glicosilación específicos del sitio de los siete sitios potenciales de N-glicosilación para ATB200, con números de sitio proporcionados de acuerdo con SEQ ID NO: 5. Las barras representan el porcentaje máximo y mínimo de especies de N-glicanos identificados como un grupo particular de N-glicanos para los diez lotes de ATB200 analizados. La Fig. 32B muestra el perfil de N-glicosilación del primer sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 32C el perfil de N-glicosilación del segundo sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 32D muestra el perfil de N-glicosilación del tercer sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 32E muestra el perfil de N-glicosilación del cuarto sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 32F muestra el perfil de N-glicosilación del quinto sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 32G muestra el perfil de N-glicosilación del sexto sitio potencial de N-glicosilación para ATB200. La Fig. 32H muestra el perfil de N-glicosilación del séptimo sitio potencial de N-glicosilación para ATB200.

Las Figs. 33A-33B caracterizan y resumen adicionalmente el perfil de N-glicosilación de ATB200, como también se muestra en las Figs. 32A-32H. La Fig. 33A muestra el mapeo de glicanos del ácido 2-antranílico (2-AA) y el análisis LC/MS-MS de ATB200 y resume las especies de N-glicanos identificadas en ATB200 como un porcentaje de la fluorescencia total. Los datos del mapeo de glucanos 2-AA y el análisis LC-MS/MS también se representan en la Tabla 5. La Fig. 33B resume la ocupación promedio del sitio y el perfil promedio de N-glicanos, incluyendo la fosforilación total, la mono-fosforilación, la bis-fosforilación y la sialilación, para los siete sitios potenciales de N-glicosilación para ATB200. ND = no detectado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Antes de describir varias realizaciones ejemplares de la invención, debe entenderse que la invención no se limita a los detalles de construcción o etapas del procedimiento recogidos en la siguiente descripción. La invención es susceptible de otras realizaciones y de ser puesta en práctica o llevada a cabo de diversas maneras.

I. Definición

Las expresiones y los términos utilizados en esta memoria descriptiva tienen generalmente sus significados habituales en la técnica, dentro del contexto de esta invención y en el contexto específico en el que se utiliza cada término o expresión. Determinados términos y expresiones se discuten más adelante, o en otra parte de la memoria descriptiva, para proporcionar una orientación adicional al profesional en la descripción de las composiciones de la invención y cómo prepararlas y utilizarlas. Los artículos "un" y "una" se refieren a uno/una o más de uno/una (es decir, al menos a uno/una) del objeto gramatical del artículo. El término "o" significa y se utiliza indistintamente con el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no son limitativos. Se entenderá que cualquier intervalo descrito en esta memoria incluye los puntos finales y todos los valores entre los puntos finales. En la presente memoria descriptiva, excepto cuando el contexto requiera lo contrario debido a un lenguaje expreso o una implicación necesaria, la palabra "comprende", o variaciones tales como "que comprende" se utiliza en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de las características establecidas, pero sin excluir la presencia o la adición de características adicionales en diversas realizaciones de la invención.

El término "GAA" se refiere a la enzima a-glucosidasa ácida humana (GAA) que cataliza la hidrólisis de los enlaces glucosídicos a-1,4 y a-1,6 del glucógeno lisosomal, así como variantes de inserción, relacionales o de sustitución. de la secuencia de aminoácidos de GAA y fragmentos de una secuencia de GAA más larga que ejercen actividad enzimática. La a-glucosidasa ácida humana está codificada por el gen GAA (National Centre for Biotechnology Information (NCBI) Gene ID 2548), que se ha cartografiado en el brazo largo del cromosoma 17 (ubicación 17q25.2-q25.3). Una secuencia de ADN ejemplar que codifica GAA es NP 000143.2. Actualmente, se han identificado más de 500 mutaciones en el gen GAA humano, muchas de las cuales están asociadas con la enfermedad de Pompe. Las mutaciones que dan como resultado un plegamiento o procesamiento incorrectos de la enzima a-glucosidasa ácida incluyen T1064C (Leu355Pro) y C2104T (Arg702Cys). Además, las mutaciones de GAA que afectan a la maduración y al procesamiento de la enzima incluyen Leu405Pro y Met519Thr. El hexapéptido conservado WIDMNE en los restos de aminoácidos 516-521 es necesario para la actividad de la proteína a-glucosidasa ácida. Tal como se utiliza en esta memoria, la abreviatura "GAA" pretende referirse a la enzima a-glucosidasa ácida humana, mientras que la abreviatura en cursiva "GAA" pretende referirse al gen humano que codifica la enzima a-glucosidasa ácida humana. La abreviatura en cursiva "Gaa" se refiere a genes no humanos que codifican enzimas a-glucosidasa ácidas no humanas, incluyendo, pero no limitados a genes de rata o ratón, y la abreviatura "Gaa" pretende referirse a enzimas aglucosidasa ácida no humana.

El término "rhGAA" pretende referirse a la enzima a-glucosidasa ácida humana recombinante y se utiliza para distinguir la GAA endógena de la GAA sintética o recombinante (p. ej., GAA producida a partir de células CHO transformadas con ADN que codifica GAA). El término "rhGAA" abarca una población de moléculas de rhGAA individuales. En esta memoria se proporcionan características de la población de moléculas de rhGAA. La expresión "producto rhGAA convencional" se refiere a productos que contienen alglucosidasa alfa, tales como Lumizyme® o Myozyme®.

La expresión "genéticamente modificado" o "recombinante" se refiere a células, tales como células CHO, que expresan un producto génico particular, tal como rhGAA, después de la introducción de un ácido nucleico que comprende una secuencia codificante que codifica el producto génico, junto con elementos reguladores. que controlan la expresión de la secuencia codificante. La introducción del ácido nucleico se puede conseguir mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la fijación de objetivo de genes y la recombinación homóloga. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión también incluye células que han sido manipuladas para expresar o sobre-expresar un gen endógeno o un producto génico que dicha célula normalmente no expresa, p. ej., mediante tecnología de activación génica.

El término "purificado" tal como se utiliza en esta memoria se refiere a material que se ha aislado en condiciones que reducen o eliminan la presencia de materiales no relacionados, es decir, contaminantes, incluyendo materiales nativos a partir de los cuales se obtiene el material. Por ejemplo, una proteína purificada preferiblemente está sustancialmente libre de otras proteínas o ácidos nucleicos con los que está asociada en una célula; una molécula de ácido nucleico purificada está de preferencia sustancialmente libre de proteínas u otras moléculas de ácido nucleico no relacionadas con las que se puede encontrar dentro de una célula. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sustancialmente libre" se utiliza operativamente, en el contexto de las pruebas analíticas del material. Preferiblemente, el material purificado, sustancialmente libre de contaminantes, es al menos 95 % puro; más preferiblemente, al menos 97 % puro, y aún más preferiblemente al menos 99 % puro. La pureza se puede evaluar mediante cromatografía, electroforesis en gel, inmunoensayo, análisis de la composición, ensayo biológico, ensayo enzimático y otros métodos conocidos en la técnica. En una realización específica, purificado significa que el nivel de contaminantes está por debajo de un nivel aceptable para las autoridades reguladoras para la administración segura a un ser humano o un animal no humano. Proteínas recombinantes tales como rhGAA pueden aislarse o purificarse a partir de células CHO utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo separación cromatográfica por tamaño, cromatografía de afinidad o cromatografía de intercambio aniónico. En algunas realizaciones, la rhGAA se purifica mediante un método que comprende cromatografía de intercambio aniónico seguida de cromatografía de afinidad con metal inmovilizado, opcionalmente seguida de purificación utilizando una tercera columna de cromatografía.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “alglucosidasa alfa” pretende referirse a una a-glucosidasa ácida humana recombinante identificada como [199-arginina,223-histidina]prepro-a-glucosidasa (humana); Número de Registro del Chemical Abstract 420794-05-0. La alglucosidasa alfa está aprobada para su comercialización en los Estados Unidos por Genzyme, como los productos Lumizyme® y Myozyme®.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "ATB200" pretende referirse a una a-glucosidasa ácida humana recombinante descrita en la solicitud internacional PCT/US2015/053252.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término “glicano” pretende referirse a una cadena de polisacárido unida covalentemente a un resto de aminoácido en una proteína o polipéptido. Tal como se utiliza en esta memoria, el término “N-glicano” o “glicano unido a N” se refiere a una cadena de polisacárido unida a un resto de aminoácido en una proteína o polipéptido a través de la unión covalente a un átomo de nitrógeno del resto de aminoácido. Por ejemplo, un N-glicano se puede unir covalentemente al átomo de nitrógeno de la cadena lateral de un resto de asparagina. Los glicanos pueden contener una o varias unidades de monosacárido, y las unidades de monosacárido pueden estar unidas covalentemente para formar una cadena lineal o una cadena ramificada. Las unidades de N-glicano unidas a una rhGAA pueden comprender una o más unidades de monosacárido, cada una de ellas seleccionada independientemente de N-acetilglucosamina, manosa, galactosa, fucosa, manosa-6-fosfato o ácido siálico. Las unidades de N-glicano en la proteína pueden determinarse mediante cualquier técnica analítica apropiada, tal como espectrometría de masas. Las unidades de N-glicano unidas a una rhGAA se determinan mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) utilizando un instrumento como el espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Orbitrap Velos Pro™, el espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribid™ o el espectrómetro de masas Waters Xevo® G2-XS QTof.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "N-glicano con alto contenido en manosa" se refiere a un N-glicano que tiene de una a seis o más unidades de manosa. Una unidad de N-glicano con alto contenido en manosa puede contener una cadena de bis(N-acetilglucosamina) unida a un residuo de asparagina y unida adicionalmente a una cadena de polimanosa ramificada. Tal como se utiliza en esta memoria de manera indistinta, el término "M6P" o la expresión "manosa-6-fosfato" pretende referirse a una unidad de manosa fosforilada en la posición 6, es decir, que tiene un grupo fosfato unido al grupo hidroxilo en la posición 6. Una o más unidades de manosa de una o más unidades de N-glicano se fosforilan en la posición 6 para formar unidades de manosa-6-fosfato. El término "M6P" o la expresión "manosa-6-fosfato" se refiere tanto a un fosfodiéster de manosa que tiene N-acetilglucosamina (GlcNAc) como a un "casquete" en el grupo fosfato, así como a una unidad de manosa que tiene un grupo fosfato expuesto que carece del casquete de GlcNAc. En al menos una realización, los N-glicanos de una proteína pueden tener múltiples grupos M6P, teniendo al menos un grupo M6P un casquete de GIcNAc y al menos otro grupo M6P que carece de casquete de GIcNAc.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "N-glicano complejo" pretende referirse a un N-glicano que comprende tipos de sacáridos distintos de GlcNac y manosa, por ejemplo, una o más unidades de galactosa y/o ácido siálico. Un N-glicano complejo puede ser un N-glicano con alto contenido en manosa, en el que una o más unidades de manosa están unidas adicionalmente a una o más unidades de monosacárido, cada una de ellas seleccionada independientemente de N-acetilglucosamina, galactosa y ácido siálico. Tal como se utiliza en esta memoria, un "N-glicano híbrido" se refiere a un N-glicano que comprende al menos una rama con alto contenido en manosa y al menos una rama compleja. Estructuras representativas de los N-glicanos no fosforilados, mono-M6P y bis-M6P se muestran en la Fig. 1A. El grupo manosa-6-fosfato se muestra en la Fig. 1B.

Tal como se utiliza en esta memoria, "normalización" de lisosomas en un músculo se refiere al proceso de restaurar el músculo afectado a una morfología lisosomal de un músculo de tipo salvaje al reducir el tamaño y la cantidad de su glucógeno acumulado de modo que el músculo afectado se parezca sustancialmente a la morfología lisosomal normal, lo que en última instancia conduce a la progresión inversa de la enfermedad.

Tal como se utiliza en esta memoria, "reversión de la progresión de la enfermedad" significa, entre otras cosas, (i) reducir o eliminar adecuadamente la acumulación de glucógeno, (ii) reducir o eliminar la hinchazón y/o disfunción lisosomal y (iii) reducir o eliminar la acumulación de desechos de autofagia. La reversión de la progresión de la enfermedad puede manifestarse en un paciente ambulatorio con enfermedad de Pompe experimentado con ERT como dos o más de las siguientes "mejoras clínicas": (a) un aumento promedio en la distancia de prueba de marcha de seis minutos de al menos 20 metros, (b) una mejora promedio en la presión espiratoria máxima de al menos 16 cm de H₂O y (c) una disminución promedio en la puntuación de la escala de gravedad de la fatiga de al menos 7. La reversión de la progresión de la enfermedad puede manifestarse en un paciente con enfermedad de Pompe experimentado con ERT no ambulatorio como dos o más de las siguientes "mejoras clínicas": (a) una mejora promedio en la aducción del hombro de al menos 8 libras (3,6 kg) de fuerza, (b) una mejora promedio en la extensión del codo de al menos 5 libras (2,3 kg) de fuerza, y (c) una disminución promedio en puntuación en la escala de gravedad de la fatiga de al menos 3,5. La reversión de la progresión de la enfermedad puede manifestarse en un paciente con enfermedad de Pompe que no ha sido sometido a una ERT como dos o más de las siguientes "mejoras clínicas": (a) un aumento promedio en la distancia de prueba de marcha de seis minutos de al menos 40 metros, (b) una mejora promedio en la capacidad vital forzada en posición vertical (sentado) de al menos 4 %, (c) una mejora promedio en la presión inspiratoria máxima de al menos 11 cm de H₂O, y (d) una disminución promedio en la puntuación de la escala de gravedad de la fatiga de al menos 5.

Una ventaja del método de tratamiento descrito en esta memoria en comparación con la administración de alglucosidasa alfa es que los pacientes de Pompe tratados con el primero exhiben una mejoría clínica prolongada. Por ejemplo, se pueden observar mejoras a los dos o tres años desde la administración del primer tratamiento o más, incluyendo, por ejemplo, cuatro, cinco o seis años desde la administración del primer tratamiento. Por el contrario, después de dos años de terapia de reemplazo enzimático con el estándar de atención médica (p. ej., alglucosidasa alfa), los pacientes con enfermedad de Pompe (i) mantienen sus ganancias desde el inicio antes del tratamiento, pero no exhiben una mejora perceptible más allá de la marca de dos o tres años o (ii) experimentan una disminución gradual y pierden cualquier ganancia lograda durante dos o tres años después del tratamiento con el estándar de atención médica. Kuperus et al. 2017. Long-term benefit of enzyme replacement therapy in Pompe disease: A 5-year prospective study. Neurology. 89:2365-2373. Por el contrario, la rhGAA descrita en esta memoria aclara el glucógeno lisosomal de manera más eficiente que la atención médica y se ha demostrado que provoca mejoras en los pacientes (p. ej., "cambio de ERT ambulatorio", Cohorte 1 del Estudio ATB200-02) que no se espera que mejore después de someterse a una terapia de reemplazo enzimático durante al menos dos años. Se espera que los datos clínicos hasta la fecha utilizando la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria proporcionen una mejora continua en los resultados de los pacientes incluso después de dos años después del tratamiento. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un paciente tratado con la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria continúa exhibiendo progreso en una o más mejoras clínicas durante más de dos años después del tratamiento (p. ej., experimenta ganancias adicionales más allá de la ganancia lograda por o en la marca de dos años).

Tal como se utiliza en esta memoria, "inversión de la patología lisosomal" significa aclaramiento parcial o completo de glucógeno que se había acumulado en la célula debido a la falta de actividad óptima de GAA.

Tal como se utiliza en esta memoria, la capacidad vital forzada, o "FVC", es la cantidad de aire que se puede exhalar a la fuerza desde los pulmones de un sujeto después de que el sujeto respire lo más profundamente posible.

Tal como se utiliza en esta memoria, una "prueba de marcha de seis minutos" (6MWT) es una prueba para medir la distancia que un individuo es capaz de caminar durante un total de seis minutos sobre una superficie dura y plana. La prueba se lleva a cabo haciendo que el individuo camine lo más lejos posible en seis minutos.

Tal como se utiliza en esta memoria, una "prueba de marcha de diez metros" (10MWT) es una prueba para medir el tiempo que le toma a un individuo con zapatos de marcha caminar diez metros sobre una superficie plana.

Tal como se utiliza en esta memoria, el compuesto miglustat, también conocido como N-butil-1-desoxinojirimicina o NB-DNJ o (2R,3R,4R,5S)-1-butil-2-(hidroximetil)piperidina-3,4,5-triol, es un compuesto que tiene la siguiente fórmula química:

Una formulación de miglustat se comercializa bajo el nombre comercial Zavesca® como monoterapia para la enfermedad de Gaucher tipo 1. En algunas realizaciones, a miglustat se le alude como AT2221.

Como se discute más adelante, en la presente invención también se pueden utilizar sales farmacéuticamente aceptables de miglustat. Cuando se utilice una sal de miglustat, la dosificación de la sal se ajustará de modo que la dosis de miglustat recibida por el paciente sea equivalente a la cantidad que habría recibido si se hubiera utilizado la base libre de miglustat.

Tal como se utiliza en esta memoria, el compuesto duvoglustat, también conocido como 1-desoxinojirimicina o DNJ o (2R,3R,4R,5S)-2-(hidroximetil)piperidina-3,4,5-triol, es un compuesto que tiene la siguiente fórmula química:

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "chaperona farmacológica" o, a veces, simplemente el término "chaperona" se refiere a una molécula que se une específicamente a a-glucosidasa ácida y tiene uno o más de los siguientes efectos:

• potencia la formación de una conformación molecular estable de la proteína;

• potencia el tráfico adecuado de la proteína desde el retículo endoplásmico a otra ubicación celular, preferiblemente una ubicación celular nativa, para evitar la degradación de la proteína asociada al retículo endoplásmico;

• previene la agregación de proteínas conformacionalmente inestables o plegadas erróneamente;

• restaura y/o potencia al menos parcialmente la función de tipo salvaje, la estabilidad y/o la actividad de la proteína; y/o

• mejora el fenotipo o la función de la célula que alberga la a-glucosidasa ácida.

Por lo tanto, una chaperona farmacológica para la a-glucosidasa ácida es una molécula que se une a la a-glucosidasa ácida, dando como resultado el plegamiento, el tráfico, la no agregación y la actividad adecuados de la a-glucosidasa ácida. Tal como se utiliza en esta memoria, este término incluye, pero no se limita a chaperonas específicas del sitio activo (ASSCs, por sus siglas en inglés) que se unen en el sitio activo de la enzima, inhibidores o antagonistas y agonistas. La chaperona farmacológica es un inhibidor o antagonista de la a-glucosidasa ácida. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "antagonista" pretende referirse a cualquier molécula que se une a la a-glucosidasa ácida y bloquea, inhibe, reduce o neutraliza, parcial o completamente, una actividad de a-glucosidasa ácida. La chaperona farmacológica es miglustat.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "sitio activo" pretende referirse a una región de una proteína que está asociada y es necesaria para una actividad biológica específica de la proteína. El sitio activo puede ser un sitio que se une a un sustrato u otro participante en la unión y contribuye con los residuos de aminoácidos que participan directamente en la formación y ruptura de enlaces químicos. Los sitios activos en esta invención pueden abarcar sitios catalíticos de enzimas, sitios de unión a antígenos de anticuerpos, dominios de unión a ligandos de receptores, dominios de unión de reguladores o dominios de unión a receptores de proteínas secretadas. Los sitios activos también pueden abarcar la transactivación, la interacción proteína-proteína o los dominios de unión al ADN de los factores y reguladores de la transcripción.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "AUC" o la expresión "área bajo la curva" se refiere a un cálculo matemático para evaluar la exposición total del cuerpo a lo largo del tiempo a un fármaco dado. En un gráfico que muestra cómo cambia la concentración en la sangre de un fármaco administrado a un sujeto con el tiempo después de la dosificación, la variable de concentración del fármaco se encuentra en el eje y y el tiempo se encuentra en el eje x. El área entre la curva de concentración del fármaco y el eje x para un intervalo de tiempo designado es el AUC. Las AUCs se utilizan como guía para los programas de dosificación y para comparar la biodisponibilidad de la disponibilidad de diferentes fármacos en el cuerpo.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "Cmáx" pretende referirse a la concentración plasmática máxima de un fármaco alcanzada después de la administración a un sujeto.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "volumen de distribución" o "V" pretende referirse al volumen teórico que sería necesario para contener la cantidad total de un fármaco administrado a la misma concentración que se observa en el plasma sanguíneo, y representa el grado en el que un fármaco se distribuye en el tejido corporal en lugar del plasma. Los valores más altos de V indican un mayor grado de distribución tisular. “Volumen de distribución central” o “Vc” pretende referirse al volumen de distribución dentro de la sangre y los tejidos altamente perfundidos por la sangre. “Volumen de distribución periférico” o “V2” pretende referirse al volumen de distribución dentro del tejido periférico.

Tal como se utiliza indistintamente en esta memoria, el término "aclaramiento", "aclaramiento sistémico" o "CL" se refiere al volumen de plasma que se aclara completamente de un fármaco administrado por unidad de tiempo. “Aclaramiento periférica” pretende referirse al volumen de tejido periférico que se aclara de un fármaco administrado por unidad de tiempo.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “farmacéuticamente aceptable” pretende referirse a entidades y composiciones moleculares que son fisiológicamente tolerables y que normalmente no producen reacciones adversas cuando se administran a un ser humano. Preferiblemente, tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en seres humanos. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "soporte" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra un compuesto. Soportes farmacéuticos adecuados son conocidos en la técnica y, en al menos una realización, se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin, 18a Edición u otras ediciones.

La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en esta memoria, pretende significar una sal que, dentro del alcance del buen juicio médico, es adecuada para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales inferiores sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica y similares, proporcionales a una relación beneficio/riesgo razonable, generalmente solubles o dispersables en agua o aceite, y eficaces para el uso pretendido. La expresión incluye sales por adición de ácidos farmacéuticamente aceptables y sales por adición de bases farmacéuticamente aceptables. Se encuentran listas de sales adecuadas en, por ejemplo, S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp. 1 -19. La expresión "sal por adición de ácidos farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en esta memoria, pretende significar aquellas sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de las bases libres y que no son indeseables biológicamente o de otro modo, formadas con ácidos inorgánicos. La expresión "sal por adición de bases farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en esta memoria, pretende significar aquellas sales que conservan la eficacia biológica y las propiedades de los ácidos libres y que no son indeseables biológicamente o de otro modo, formadas con bases inorgánicas.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "tampón" se refiere a una solución que contiene un ácido débil y su base conjugada que ayuda a prevenir cambios en el pH.

Tal como se utiliza en esta memoria, las expresiones "dosis terapéuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" pretenden referirse a una cantidad de a-glucosidasa ácida y/o de miglustat y/o de una combinación de los mismos, que es suficiente para dar como resultado una respuesta terapéutica. en un sujeto. Una respuesta terapéutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (por ejemplo, un médico) reconozca como una respuesta eficaz a la terapia, incluyendo cualesquiera marcadores clínicos sustitutos o los síntomas descritos aquí y conocidos en la técnica. Por tanto, en al menos una realización, una respuesta terapéutica puede ser una mejora o inhibición de uno o más síntomas o marcadores de la enfermedad de Pompe, tales como los conocidos en la técnica. Los síntomas o marcadores de la enfermedad de Pompe incluyen, entre otros, disminución de la actividad tisular de la a-glucosidasa ácida; cardiomiopatía; cardiomegalia; debilidad muscular progresiva, especialmente en el tronco o miembros inferiores; hipotonía profunda; macroglosia (y en algunos casos, protrusión de la lengua); dificultad para tragar, succionar y/o alimentarse; insuficiencia respiratoria; hepatomegalia (moderada); laxitud de los músculos faciales; arreflexia; intolerancia al ejercicio; disnea de esfuerzo; ortopnea; apnea del sueño; cefaleas matutinas; somnolencia; lordosis y/o escoliosis; disminución de los reflejos tendinosos profundos; lumbalgia; e incumplimiento de los hitos del desarrollo motor. Cabe señalar que una concentración de miglustat que tiene un efecto inhibidor sobre la a-glucosidasa ácida puede constituir una "cantidad eficaz" para los fines de esta invención debido a la dilución (y el consiguiente cambio en la unión debido al cambio en el equilibrio y el pH), biodisponibilidad y metabolismo de miglustat tras la administración in vivo.

La respuesta terapéutica también puede incluir respuestas moleculares tales como acumulación de glucógeno, proliferación lisosomal y formación de zonas autofágicas. Las respuestas terapéuticas pueden evaluarse comparando las respuestas fisiológicas y moleculares de las biopsias musculares antes y después del tratamiento con una rhGAA descrita en esta memoria. Por ejemplo, la cantidad de glucógeno presente en las muestras de biopsia puede utilizarse como un marcador para determinar la respuesta terapéutica. Otro ejemplo incluye biomarcadores tales como LAMP-1, LC3 y Disferlina, que pueden utilizarse como un indicador de la disfunción del almacenamiento lisosomal. Por ejemplo, las biopsias musculares recogidas antes y después del tratamiento con una rhGAA descrita en esta memoria pueden teñirse con un anticuerpo que reconozca uno de los biomarcadores.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión “terapia de reemplazo de enzimas” o “ERT” pretende referirse a la introducción de una enzima purificada no nativa en un individuo que tiene una deficiencia de dicha enzima. La proteína administrada se puede obtener de fuentes naturales o por expresión recombinante. La expresión también se refiere a la introducción de una enzima purificada en un individuo que requiere o se beneficia de la administración de una enzima purificada. En al menos una realización, dicho individuo padece insuficiencia enzimática. La enzima introducida puede ser una enzima recombinante purificada producida in vitro, o una proteína purificada a partir de tejido o fluido aislado, tal como, por ejemplo, placenta o leche animal, o de plantas.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "terapia de combinación" pretende referirse a cualquier terapia en la que se administran dos o más terapias individuales de forma concurrente o secuencial. Los resultados de la terapia de combinación mejoran en comparación con el efecto de cada terapia cuando se realiza individualmente. La potenciación puede incluir cualquier mejora del efecto de las diversas terapias que pueda dar como resultado un resultado ventajoso en comparación con los resultados logrados por las terapias cuando se realizan solas. El efecto o los resultados mejorados pueden incluir un potenciamiento sinérgico, en la que el efecto potenciado es más que los efectos aditivos de cada terapia cuando se realiza por sí misma; un potenciamiento aditivo, en la que el efecto potenciado es sustancialmente igual al efecto aditivo de cada terapia cuando se realiza por sí misma; o menor que el efecto aditivo, en donde el efecto potenciado es menor que el efecto aditivo de cada terapia cuando se realiza por sí misma, pero aún mejor que el efecto de cada terapia cuando se realiza por sí misma. El efecto potenciado puede medirse por cualquier medio conocido en la técnica mediante el cual pueda medirse la eficacia o el resultado del tratamiento.

El término "concurrentemente", tal como se utiliza en esta memoria, pretende significar al mismo tiempo o dentro de un período de tiempo razonablemente corto antes o después, como entenderán los expertos en la técnica. Por ejemplo, si se administran dos tratamientos al mismo tiempo, un tratamiento puede administrarse antes o después del otro tratamiento, para permitir el tiempo necesario para prepararse para el último de los dos tratamientos. Por lo tanto, la "administración concurrente" de dos tratamientos incluye, pero no se limita a un tratamiento que sigue al otro durante aproximadamente 30 minutos o menos, aproximadamente 30 minutos, 20 minutos o menos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 9 minutos. , aproximadamente 8 minutos, aproximadamente 7 minutos, aproximadamente 6 minutos aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 4 minutos, aproximadamente 3 minutos, aproximadamente 2 minutos, aproximadamente 1 minuto o menos de 1 minuto.

"Enfermedad de Pompe" se refiere a una LSD autosomal recesiva caracterizada por una actividad deficiente de alfa glucosidasa ácida (GAA) que altera el metabolismo del glucógeno lisosomal. La deficiencia de enzima conduce a la acumulación de glucógeno lisosomal y da como resultado debilidad muscular esquelética progresiva, función cardíaca reducida, insuficiencia respiratoria y/o deterioro del SNC en las últimas fases de la enfermedad. Las mutaciones genéticas en el gen GAA dan como resultado una expresión más baja o producen formas mutantes de la enzima con estabilidad alterada y/o actividad biológica que en última instancia conduce a la enfermedad (véase, en general, Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid a-Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver et al., eds., McGraw-Hill, Nueva York, 7a ed., páginas 2443-2464). Las tres formas clínicas reconocidas de la enfermedad de Pompe (infantil, juvenil y adulta) están correlacionadas con el nivel de actividad de a-glucosidasa residual (Reuser A J et al., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69). La enfermedad de Pompe infantil (tipo I o A) es la más frecuente y grave, y se caracteriza por retraso del crecimiento, hipotonía generalizada, hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardiorrespiratoria en el segundo año de vida. La enfermedad de Pompe juvenil (tipo II o B) es de gravedad intermedia y se caracteriza por un predominio de síntomas musculares sin cardiomegalia. Los individuos juveniles de Pompe fallecen habitualmente antes de cumplir los 20 años debido a una insuficiencia respiratoria. La enfermedad de Pompe del adulto (tipo III o C) se presenta a menudo como una miopatía lentamente progresiva en la adolescencia o hasta la sexta década (Felicia K J et al., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135). En Pompe, se ha demostrado que la a-glucosidasa se modifica extensamente después de la traducción mediante glicosilación, fosforilación y procesamiento proteolítico. La conversión del precursor de 110 kilodalton (kDa) en formas maduras de 76 y 70 KDa mediante proteólisis en el lisosoma es necesaria para una catálisis óptima de glucógeno. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "Enfermedad de Pompe" se refiere a todos los tipos de enfermedad de Pompe. Las formulaciones y los regímenes de dosificación descritos en esta solicitud pueden utilizarse para tratar, por ejemplo, la enfermedad de Pompe Tipo I, Tipo II o Tipo III.

Un "sujeto" o "paciente" es preferiblemente un ser humano, aunque también pueden tratarse otros mamíferos y animales no humanos que tengan trastornos que implican la acumulación de glucógeno. Un sujeto puede ser un feto, un neonato, un niño, un joven o un adulto con enfermedad de Pompe u otro trastorno de almacenamiento o acumulación de glucógeno. Un ejemplo de un individuo que recibe tratamiento es un individuo (feto, recién nacido, niño, juvenil, adolescente o humano adulto) que tiene GSD-II (p. ej., GSD-II infantil, GSD-II juvenil o GSD-II de aparición en la edad adulta). El individuo puede tener actividad GAA residual o ninguna actividad mensurable. Por ejemplo, el individuo que tiene GSD-II puede tener una actividad de GAA inferior al 1 % de la actividad de GAA normal (GSD-II infantil), actividad de GAA que es aproximadamente 1-10 % la actividad de GAA normal (GSD-II juvenil) o actividad de GAA que es aproximadamente 10-40 % la actividad normal de GAA (GSD-II adulto). En algunas realizaciones, el sujeto o paciente es un paciente "experimentado con ERT" o "cambio de ERT", que se refiere a un paciente con enfermedad de Pompe que ha recibido previamente terapia de reemplazo enzimático. En algunas realizaciones, el sujeto o paciente es un paciente "que no ha sido sometido a una ERT", que se refiere a un paciente con enfermedad de Pompe que no ha recibido previamente terapia de reemplazo enzimático. En determinadas realizaciones, el sujeto o paciente es ambulatorio (p. ej., un paciente con cambio de ERT ambulatorio o que no ha recibido ERT ambulatoria). En determinadas realizaciones, el sujeto o paciente es no ambulatorio (p. ej., un paciente con cambio de ERT no ambulatorio). El estado ambulatorio o no ambulatorio se puede determinar mediante una prueba de marcha de seis minutos (6MWT). En algunas realizaciones, un paciente ambulatorio es un paciente con enfermedad de Pompe que puede caminar al menos 200 metros en el 6MWT. En algunas realizaciones, un paciente no ambulatorio es un paciente con enfermedad de Pompe que es incapaz de caminar sin ayuda o que está en silla de ruedas.

Los términos "tratar" y "tratamiento", tal como se utilizan en esta memoria, se refieren a la mejora de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, la prevención o el retraso de la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad y/o la disminución de la gravedad o frecuencia de uno o más síntomas de la enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento puede referirse a la mejora del estado cardíaco (p. ej., aumento de los volúmenes tele-diastólico y/o telesistólico, o reducción, mejora o prevención de la miocardiopatía progresiva que se encuentra típicamente en GSD-II) o de la función pulmonar (p. ej., aumento de la capacidad vital de llanto por encima de la capacidad inicial y/o normalización de la desaturación de oxígeno durante el llanto); mejora en el neurodesarrollo y/o habilidades motoras (p. ej., aumento en la puntuación AIMS); reducción de los niveles de glucógeno en tejido del individuo afectado por la enfermedad; o cualquier combinación de estos efectos. En una realización preferida, el tratamiento incluye la mejora del estado cardíaco, particularmente en la reducción o prevención de la miocardiopatía asociada a GSD-II.

Los términos "mejorar", "aumentar" y "reducir", tal como se utilizan en esta memoria, indican valores que son relativos a una medición de referencia tal como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en esta memoria, o una medición en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito en esta memoria. Un individuo de control es un individuo afectado por la misma forma de GSD-II (ya sea de aparición infantil, juvenil o en la edad adulta) que el individuo en tratamiento, que tiene aproximadamente la misma edad que el individuo en tratamiento (para garantizar que las fases de la enfermedad en el individuo tratado y el o los individuos de control son equiparables).

Tal como se usan aquí, las expresiones “alrededor de” y “aproximadamente” se refieren a un grado de error aceptable para la cantidad medida, dada la naturaleza o precisión de las medidas. Por ejemplo, el grado de error se puede indicar mediante el número de cifras significativas proporcionadas para la medida, como se entiende en la técnica, e incluye, pero no se limita a, una variación de ±1 en la cifra significativa más precisa dada a conocer para la medida. Grados de error ejemplares típicos están dentro del 20 por ciento (%), preferiblemente dentro del 10 %, y más preferiblemente dentro del 5 % de un valor dado o intervalo de valores. Las cantidades numéricas proporcionadas aquí son aproximadas a menos que se indique lo contrario, lo que significa que el término “alrededor de” o “aproximadamente” se puede inferir cuando no se señala expresamente.

II. a-Glucosidasa Ácida Humana Recombinante (rhGAA)

En algunas realizaciones, la a-glucosidasa ácida humana recombinante (rhGAA) es una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos como se recoge en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, la rhGAA es codificada por una secuencia de nucleótidos como se recoge en SEQ ID NO: 2.

Tabla 1. Secuencias de Nucleótidos y Secuencias de Proteínas

En algunas realizaciones, la rhGAA tiene una secuencia de aminoácidos de GAA de tipo salvaje como se recoge en SEQ ID NO: 1, como se describe en la Patente de EE.UU. N° 8.592.362, y tiene el número de acceso de GenBank AHE24104.1 (GI:568760974). En algunas realizaciones, la rhGAA tiene una secuencia de aminoácidos de GAA de tipo salvaje como es codificada en SEQ ID NO: 2, la secuencia de ARNm tiene el número de acceso de GenBank Y00839.1. En algunas realizaciones, la rhGAA tiene una secuencia de aminoácidos de GAA de tipo salvaje como se recoge en SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la rhGAA tiene una secuencia de aminoácidos de GAA como se recoge en SEQ ID NO: 4, y tiene número de acceso del National Center for Biotechnology Information (NCBI) NP_000143.2. En algunas realizaciones, la rhGAA es alglucosidasa alfa, la enzima a-glucosidasa ácida humana es codificada por el más predominante de los nueve haplotipos observados del gen GAA.

En algunas realizaciones, la rhGAA se expresa inicialmente con la secuencia de 952 aminoácidos de longitud completa de la GAA de tipo salvaje como se recoge en SEQ ID NO: 1, y la rhGAA se somete a un procesamiento intracelular que elimina una parte de los aminoácidos, p. ej., los primeros 56 aminoácidos. Por consiguiente, la rhGAA secretada por la célula huésped puede tener una secuencia de aminoácidos más corta que la rhGAA que se expresa inicialmente dentro de la célula. En una realización, la proteína más corta tiene la secuencia de aminoácidos recogida en SEQ ID NO: 5, que solo difiere de SEQ ID NO: 1 en que se han eliminado los primeros 56 aminoácidos que comprenden el péptido señal y el péptido precursor, dando así como resultado una proteína que tiene 896 aminoácidos. También son posibles otras variaciones en el número de aminoácidos, tales como que tienen 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más deleciones, sustituciones y/o inserciones relativas a la secuencia de aminoácidos descrita por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el producto rhGAA incluye una mezcla de moléculas de aglucosidasa ácida humana recombinante que tienen diferentes longitudes de aminoácidos.

En algunas realizaciones, la rhGAA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5. Se pueden utilizar diversos algoritmos y/o programas de alineamiento para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y se pueden usar con, por ejemplo, la configuración predeterminada. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen al menos un 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad con los polipéptidos específicos descritos en esta memoria y que preferiblemente exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótidos que codifican polipéptidos de este tipo. A menos que se indique lo contrario, la puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación de positivos de BLASTP, y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidades de BLASTP. BLASTP “Identidades” muestra el número y la fracción de restos totales en los pares de secuencias de alta puntuación que son idénticos; y BLASTP “Positivos” muestra el número y la fracción de restos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud, o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con las secuencias de aminoácidos descritas aquí, se contemplan y están abarcadas por esta descripción. Las secuencias polinucleotídicas de polipéptidos similares se deducen usando el código genético, y se pueden obtener por medios convencionales, en particular mediante la traducción inversa de su secuencia de aminoácidos usando el código genético.

En algunas realizaciones, la rhGAA sufre modificaciones post-traduccionales y/o químicas en uno o más residuos de aminoácidos en la proteína. Por ejemplo, los restos de metionina y triptófano pueden sufrir oxidación. Como otro ejemplo, la glutamina N-terminal puede formar piroglutamato. Como otro ejemplo, los restos de asparagina pueden sufrir desamidación a ácido aspártico. Como otro ejemplo más, los restos de ácido aspártico puede experimentar isomerización a ácido isoaspártico. Como otro ejemplo más, los restos de cisteína no apareados en la proteína pueden formar enlaces de disulfuro con glutationa y/o cisteína libres. Por consiguiente,en algunas realizaciones, la enzima se expresa inicialmente con una secuencia de aminoácidos como se recoge en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NO: 2 y la enzima sufre una o más de estas modificaciones post-traduccionales y/o químicas. Modificaciones de este tipo también están dentro del alcance de la presente divulgación.

III. Glicosilación ligada a N de rhGAA

Existen siete sitios potenciales de glicosilación ligados a N en una sola molécula de rhGAA. Estos sitios potenciales de glicosilación están en las siguientes posiciones de SEQ ID NO: 5: N84, N177, N334, N414, N596, N826 y N869. De manera similar, para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de SEQ ID NO: 1, estos sitios potenciales de glicosilación están en las siguientes posiciones: N140, N233, N390, N470, N652, N882 y N925. Otras variantes de rhGAA pueden tener sitios de glicosilación similares, dependiendo de la ubicación de los restos de asparagina. Generalmente, las secuencias de Asn-X-Ser o Asn-X-Thr en la secuencia de aminoácidos de la proteína indican sitios potenciales de glicosilación, con la excepción de que X no puede ser His o Pro.

Las moléculas de rhGAA descritas en esta memoria pueden tener, en promedio, 1,2, 3 o 4 grupos manosa-6-fosfato (M6P) en sus N-glicanos. Por ejemplo, solo un N-glicano en una molécula de rhGAA puede portar M6P (monofosforilado o mono-M6P), un solo N-glicano puede portar dos grupos M6P (bis-fosforilados o bis-M6P) o dos N-glicanos diferentes en la misma molécula de rhGAA pueden portar cada uno grupos M6P individuales. En la presente invención, las moléculas de rhGAA descritas en esta memoria tienen en promedio 3-4 grupos M6P en sus N-glicanos. Moléculas de a-glucosidasa ácida humana recombinante también pueden tener N-glicanos que no porten grupos M6P. En otra realización, en promedio, la rhGAA comprende más de 2,5 moles de M6P por mol de rhGAA y más de 4 moles de ácido siálico por mol de rhGAA. En algunas realizaciones, en promedio, la rhGAA comprende aproximadamente 3-3,5 moles de M6P por mol de rhGAA. En algunas realizaciones, en promedio, la rhGAA comprende aproximadamente 4-5,4 moles de por mol de rhGAA. En promedio, al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 % o 20 % de los N-glicanos totales en la rhGAA pueden estar en forma de un N-glicano mono-M6P, por ejemplo, aproximadamente 6,25 % del total de N-glicanos puede llevar un solo grupo M6P y, en promedio, al menos aproximadamente 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0 % del total de N-glicanos en la rhGAA están en forma de un N-glicano bis-M6P y, en promedio, menos del 25 % de la rhGAA total no contiene N-glicano fosforilado que se una a CIMPR. En algunas realizaciones, en promedio aproximadamente 10 % a aproximadamente 14 % de los N-glicanos totales en la rhGAA están monofosforilados. En algunas realizaciones, en promedio aproximadamente 7 % a aproximadamente 25 % de los N-glicanos totales en la rhGAA están bis-fosforilados. En algunas realizaciones, en promedio, la rhGAA comprende aproximadamente 1,3 moles de M6P por mol de rhGAA.

La rhGAA descrita en esta memoria puede tener un contenido promedio de N-glicanos que llevan M6P que varía de 0,5 a 7,0 moles de M6P por mol de rhGAA o cualquier valor intermedio o sub-intervalo que incluya 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 o 7,0 moles de M6P por mol de rhGAA. La rhGAA se puede fraccionar para proporcionar preparaciones de rhGAA con diferentes cantidades promedio de N-glicanos que portan mono-M6P o bis-M6P, lo que permite una personalización adicional de la fijación de objetivo de la rhGAA a los lisosomas en los tejidos diana seleccionando una fracción particular o combinando selectivamente diferentes fracciones.

En algunas realizaciones, hasta el 60 % de los N-glicanos en la rhGAA pueden estar completamente sialilados, por ejemplo, hasta el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o 60 % de los N-glicanos pueden estar totalmente sialilados. En algunas realizaciones, no más del 50 % de los N-glicanos en la rhGAA están completamente sialilados. En algunas realizaciones, del 4 % al 20 % de los N-glicanos totales están completamente sialilados. En otras realizaciones, no más del 5 %, 10 %, 20 % o 30 % de los N-glicanos en la rhGAA llevan ácido siálico y un residuo terminal de galactosa (Gal). Este intervalo incluye todos los valores intermedios y subintervalos, por ejemplo, del 7 % al 30 % de los N-glicanos totales en la rhGAA pueden llevar ácido siálico y galactosa terminal. En aún otras realizaciones, no más del 5 %, 10 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % o 20 % de los N-glicanos en la rhGAA tienen una galactosa terminal solamente y no contienen ácido siálico. Este intervalo incluye todos los valores intermedios y subintervalos, por ejemplo, del 8 % al 19 % de los N-glicanos totales en la rhGAA en la composición pueden tener solo galactosa terminal y no contener ácido siálico.

En algunas realizaciones, el 40 %, 45 %, 50 % o 55 % a 60 % de los N-glicanos totales en la rhGAA son N-glicanos de tipo complejo; o no más del 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 % o 7 % de los N-glicanos totales en la rhGAA son N-glicanos de tipo híbrido; no más del 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % de los N-glicanos de tipo de alto contenido en manosa en la rhGAA no están fosforilados; al menos el 5 % o el 10 % de los N-glicanos de tipo de alto contenido en manosa en la rhGAA están mono-fosforilados; y/o al menos el 1% o el 2% de los N-glicanos de tipo de alto contenido en manosa en la rhGAA están bis-fosforilados. Estos valores incluyen todos los valores intermedios y subintervalos. Una rhGAA puede cumplir con uno o más de los intervalos de contenido arriba descritos.

En algunas realizaciones, la rhGAA puede contener, en promedio, 2,0 a 8,0 moles de residuos de ácido siálico por mol de rhGAA. Este intervalo incluye todos los valores intermedios y subintervalos de los mismos, incluyendo 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0 moles de residuos de ácido siálico por mol de rhGAA. Sin estar ligados por la teoría, se cree que la presencia de unidades de N-glicano que portan residuos de ácido siálico puede evitar el aclaramiento no productivo de la rhGAA por parte de los receptores de asialoglicoproteína.

La rhGAA tiene un determinado perfil de N-glicosilación en determinados sitios potenciales de N-glicosilación. La rhGAA tiene siete sitios potenciales de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos el 20 % de la rhGAA se fosforila en el primer sitio potencial de N-glicosilación (p. ej., N84 para SEQ ID NO: 5 y N140 para SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, al menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA puede fosforilarse en el primer sitio potencial de N-glicosilación. Esta fosforilación puede ser el resultado de unidades mono-M6P y/o bis-M6P. En algunas realizaciones, al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA porta una unidad de mono-M6P en el primer sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA porta una unidad de bis-M6P en el primer sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 1,4 moles de M6P (mono-M6P y bis-M6P) por mol de rhGAA en el primer sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente al menos 0,5 moles de bis-M6P por mol de rhGAA en el primer sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,25 moles de mono-M6P por mol de rhGAA en el primer sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,2 moles a aproximadamente 0,3 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el primer sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, la rhGAA comprende una primera ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6B. En al menos una realización, la rhGAA comprende una primera ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32B o la Fig. 33B.

En algunas realizaciones, al menos el 20 % de la rhGAA está fosforilada en el segundo sitio potencial de N-glicosilación (p. ej., N177 para SEQ ID NO: 5 y N223 para SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, al menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA puede estar fosforilada en el segundo sitio de N-glicosilación. Esta fosforilación puede ser el resultado de unidades mono-M6P y/o bis-M6P. En algunas realizaciones, al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA porta una unidad de mono-M6P en el segundo sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA porta una unidad de bis-M6P en el segundo sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,5 moles de M6P (mono-M6P y bis-M6P) por mol de rhGAA en el segundo sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 moles de mono-M6P por mol de rhGAA en el segundo sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, la rhGAA comprende una segunda ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6C. En al menos una realización, la rhGAA comprende una segunda ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32C o la Fig. 33B.

En algunas realizaciones, al menos el 5 % de la rhGAA está fosforilada en el tercer sitio potencial de N-glicosilación (p. ej., N334 para SEQ ID NO: 5 y N390 para SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, menos del 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % de la rhGAA está fosforilada en el tercer sitio potencial de N-glicosilación. Por ejemplo, el tercer sitio potencial de N-glicosilación puede tener una mezcla de N-glicanos con alto contenido en manosa no fosforilados, N-glicanos complejos di-, tri- y tetra-antenarios y N-glicanos híbridos como especies principales. En algunas realizaciones, al menos 3 %, 5 %, 8 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % de la rhGAA está sialilada en el tercer sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,2 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el tercer sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, la rhGAA comprende una tercera ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6D. En al menos una realización, la rhGAA comprende una tercera ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32D o la Fig. 33B.

En algunas realizaciones, al menos el 20 % de la rhGAA está fosforilada en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación (p. ej., N414 para SEQ ID NO: 5 y N470 para SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, al menos 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA puede fosforilarse en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación. Esta fosforilación puede ser el resultado de unidades mono-M6P y/o bis-M6P. En algunas realizaciones, al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA porta una unidad de mono-M6P en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA porta una unidad de bis-M6P en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos 3 %, 5 %, 8 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % de la rhGAA está sialilada en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 1,4 moles de M6P (mono-M6P y bis-M6P) por mol de rhGAA en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 moles de bis-M6P por mol de rhGAA en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,4 moles de mono-M6P por mol de rhGAA en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, la rhGAA comprende una cuarta ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6E. En al menos una realización, la rhGAA comprende una cuarta ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32E o la Fig. 33B.

En algunas realizaciones, al menos el 5 % de la rhGAA está fosforilada en el quinto sitio potencial de N-glicosilación (p. ej., N596 para SEQ ID NO: 5 y N692 para SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, menos del 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % de la rhGAA está fosforilada en el quinto sitio potencial de N-glicosilación. Por ejemplo, el quinto sitio potencial de N-glicosilación puede tener N-glicanos del complejo diantenario fucosilados como la especie principal. En algunas realizaciones, al menos 3 %, 5 %, 8 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA está sialilada en el quinto sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,8 a aproximadamente 0,9 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el quinto sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, la rhGAA comprende una quinta ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6F. En al menos una realización, la rhGAA comprende una quinta ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32F o la Fig. 33B.

En algunas realizaciones, al menos el 5 % de la rhGAA está fosforilada en el sexto sitio potencial de N-glicosilación (p. ej., N826 para SEQ ID NO: 5 y N882 para SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, menos del 5%, 10%, 15%, 20% o 25% de la rhGAA se fosforila en el sexto sitio de N-glicosilación. Por ejemplo, el sexto sitio potencial de N-glicosilación puede tener una mezcla de N-glicanos complejos di-, tri- y tetra-antenarios como la especie principal. En algunas realizaciones, al menos 3 %, 5 %, 8 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de la rhGAA está sialilada en el sexto sitio de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4,2 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el sexto sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,9 moles de ácido siálico acetilado por mol de rhGAA en el sexto sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, la rhGAA comprende una sexta ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6G. En al menos una realización, la rhGAA comprende una sexta ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32G o la Fig. 33B.

En algunas realizaciones, al menos el 5 % de la rhGAA está fosforilada en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación (p. ej., N869 para SEQ ID NO: 5 y N925 para SEQ ID NO: 1). En otras realizaciones, menos del 5 %, 10 %, 15 %, 20 % o 25 % de la rhGAA está fosforilada en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación. En otras realizaciones, menos del 40 %, 45 %, 50 %, 55%, 60 % o 65 % de la rhGAA tiene un N-glicano en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, al menos 30 %, 35 % o 40 % de la rhGAA tiene un N-glicano en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación. En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio aproximadamente 0,86 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, todos los N-glicanos identificados en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación son N-glicanos complejos. En al menos una realización, la rhGAA comprende una séptima ocupación potencial del sitio de N-glicosilación como se representa en la Fig. 6A o como se representa en la Fig. 32A y un perfil de N-glicosilación como se representa en la Fig. 32H o la Fig. 33B.

En algunas realizaciones, la rhGAA comprende en promedio 3-4 residuos de M6P por molécula de rhGAA y aproximadamente 4 a aproximadamente 7,3 moles de ácido siálico por mol de rhGAA En algunas realizaciones, la rhGAA comprende, además, en promedio al menos aproximadamente 0,5 moles de bis-M6P por mol de rhGAA en el primer sitio potencial de N-glicosilación, aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 moles de mono-M6P por mol de rhGAA en el segundo sitio potencial de N-glicosilación, aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,2 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el tercer sitio potencial de N-glicosilación, aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 moles de bis-M6P por mol de rhGAA en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación, aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,4 moles de mono- M6P por mol de rhGAA en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación, aproximadamente 0,8 a aproximadamente 0,9 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el quinto sitio potencial de N-glicosilación y de 1,5 a 4,2 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el sexto sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, la rhGAA comprende, además, en promedio aproximadamente 0,86 moles de ácido siálico por mol de rhGAA en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación. En al menos una realización, la rhGAA comprende siete sitios potenciales de N-glicosilación con perfiles de ocupación y N-glicosilación como se representa en las Figs.

6A-6H. En al menos una realización, la rhGAA comprende siete sitios potenciales de N-glicosilación con perfiles de ocupación y N-glicosilación como se representa en las Figs. 32A-32H y las Figs. 33A-33B.

Los métodos para producir rhGAA se describen en la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. N° 62/057.842, presentada el 30 de septiembre de 2014.

Una vez dentro del lisosoma, la rhGAA puede degradar enzimáticamente el glucógeno acumulado. Sin embargo, los productos convencionales de rhGAA tienen niveles totales bajos de N-glicanos que portan mono-M6P y bis-M6P y, por lo tanto, fijan mal como objetivo células musculares, resultando en un suministro inferior de rhGAA a los lisosomas. La mayoría de las moléculas de rhGAA en estos productos convencionales no tienen N-glicanos fosforilados, por lo que carecen de afinidad por el CIMPR. Los N-glicanos con alto contenido en manosa no fosforilados también pueden ser aclarados por el receptor de manosa, lo que da como resultado un aclaramiento no productivo de la ERT (Fig. 2B). Por el contrario, como se muestra en la Fig. 2A, una rhGAA descrita en esta memoria puede contener una mayor cantidad de N-glicanos portadores de mono-M6P y bis-M6P, lo que conduce a una captación productiva de rhGAA en tejidos específicos tales como el músculo.

IV. Producción y Purificación de rhGAA Glicosilada ligada a N

Como se describe en la Solicitud Internacional PCT/US2015/053252, se pueden utilizar células tales como células de ovario de hámster chino (CHO) para producir la rhGAA descrita en la misma. Expresar rhGAA de alto contenido en M6P en células CHO es ventajoso frente a la modificación del perfil de glicano de una rhGAA post-traduccionalmente, al menos en parte, porque solo el primero puede convertirse por degradación de glicano en una forma de rhGAA con hidrólisis de glicógeno óptima, potenciando así la eficacia terapéutica.

La rhGAA es producida por una o más líneas de células CHO que se transforman con una construcción de ADN que codifica la rhGAA descrita en ella. Líneas de células CHO de este tipo pueden contener múltiples copias de un gen, tal como 5, 10, 15 o 20 o más copias, de un polinucleótido que codifica GAA. Construcciones de ADN, que expresan variantes alélicas de a-glucosidasa ácida u otra variante de secuencias de aminoácidos de a-glucosidasa ácida tales como aquellas que son al menos 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idénticas a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5, pueden construirse y expresarse en células CHO. Los expertos en la técnica pueden seleccionar vectores alternativos adecuados para transformar células CHO para la producción de construcciones de ADN de este tipo.

Métodos para producir líneas de células CHO de este tipo se describen en la Solicitud Internacional PCT/US2015/053252. Brevemente, estos métodos implican la transformación de una célula CHO con ADN que codifica GAA o una variante de GAA, la selección de una célula CHO que integre de forma estable el ADN que codifica GAA en su(s) cromosoma(s) y que exprese de forma estable GAA y la selección de una célula CHO que exprese GAA que tenga un alto contenido en N-glicanos con mono-M6P o bis-M6P y, opcionalmente, la selección de una célula CHO que tenga N-glicanos con alto contenido en ácido siálico y/o N-glicanos con bajo contenido en manosa no fosforilada. Las líneas de células CHO seleccionadas pueden utilizarse para producir rhGAA y composiciones de rhGAA cultivando la línea de células CHO y recuperando dicha composición del cultivo de células CHO. En algunas realizaciones, una rhGAA producida a partir de las líneas de células CHO seleccionadas contiene un alto contenido en N-glicanos que portan mono-M6P o bis-M6P que fijan como objetivo a CIMPR. En algunas realizaciones, una rhGAA producida como se describe en esta memoria tiene niveles bajos de N-glicanos complejos con galactosa terminal. En algunas realizaciones, a las líneas de células CHO seleccionadas se las alude como GA-ATB200 o ATB200-X5-14. En algunas realizaciones, las líneas de células CHO seleccionadas abarcan un subcultivo o derivado de un cultivo de células CHO de este tipo. En algunas realizaciones, a una rhGAA producida a partir de líneas de células CHO seleccionadas se la alude como ATB200.

Una rhGAA producida como se describe en esta memoria puede purificarse mediante los siguientes métodos descritos en la Solicitud Internacional PCT/US2017/024981 y en la Solicitud Provisional de EE.UU. N° 62/506.569. En la Fig. 3 se muestra un procedimiento ejemplar para producir, capturar y purificar una rhGAA producida a partir de líneas de células CHO.

Brevemente, el biorreactor 601 contiene un cultivo de células, tal como células CHO, que expresan y secretan rhGAA en los medios de cultivo líquidos del entorno. El biorreactor 601 puede ser cualquier biorreactor apropiado para cultivar las células, tal como un biorreactor de perfusión, discontinuo o alimentado por lotes. El medio de cultivo se retira del biorreactor después de un período de tiempo suficiente para que las células produzcan rhGAA. Una retirada de medios de este tipo puede ser continua para un biorreactor de perfusión o puede ser discontinua para un reactor discontinuo o alimentado por lotes. Los medios pueden filtrarse mediante el sistema de filtración 603 para eliminar células. El sistema de filtración 603 puede ser cualquier sistema de filtración adecuado, incluyendo un sistema de filtración de flujo tangencial (ATF, por sus siglas en inglés) alterno, un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) y/o un sistema de filtración centrífuga. En diversas realizaciones, el sistema de filtración utiliza un filtro que tiene un tamaño de poros entre aproximadamente 10 nanómetros y aproximadamente 2 micrómetros.

Después de la filtración, el filtrado se carga en un sistema de captura de proteínas 605. El sistema de captura de proteínas 605 puede incluir una o más columnas de cromatografía. Si se utiliza más de una columna de cromatografía, entonces las columnas se pueden colocar en serie para que la siguiente columna pueda comenzar a cargarse una vez que se carga la primera columna. Alternativamente, el proceso de eliminación de medios se puede detener durante el tiempo que se cambian las columnas. Alternativamente, el procedimiento de eliminación de medios se puede detener durante el tiempo que se cambian las columnas.

En diversas realizaciones, el sistema de captura de proteínas 605 incluye una o más columnas de intercambio aniónico (AEX) para la captura directa de productos de rhGAA, particularmente rhGAA que tiene un alto contenido de M6P. La rhGAA capturada por el sistema de captura de proteínas 605 se eluye de la(s) columna(s) cambiando el pH y/o el contenido de sal en la columna. Condiciones ejemplares para una columna AEX se proporcionan en la Tabla 2

Tabla 2. Condiciones ejemplares para una columna AEX

La rhGAA eluida puede someterse a etapas de purificación y/o etapas de control de calidad adicionales. Por ejemplo, la rhGAA eluida puede someterse a una etapa de exterminio de virus 607. Un exterminio de virus 607 de este tipo puede incluir una o más de un exterminio por pH bajo, un exterminio por detergente u otra técnica conocida en la técnica. La rhGAA de la etapa de exterminio de virus 607 puede introducirse en un segundo sistema de cromatografía 609 para purificar adicionalmente el producto de rhGAA. Alternativamente, la rhGAA eluida del sistema de captura de proteínas 605 puede alimentarse directamente al segundo sistema de cromatografía 609. En diversas realizaciones, el segundo sistema de cromatografía 609 incluye una o más columnas de cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC, por sus siglas en inglés) para la eliminación adicional de impurezas. Condiciones ejemplares para una columna IMAC se proporcionan en la Tabla 3 que figura a continuación.

Tabla 3. Condiciones ejemplares para una columna IMAC

Después de cargar la rhGAA en el segundo sistema de cromatografía 609, la proteína recombinante se eluye de la(s) columna(s). La rhGAA eluida puede someterse a una etapa de exterminio de virus 611. Como con el exterminio de virus 607, el exterminio de virus 611 puede incluir una o más de un exterminio por pH bajo, un exterminio por detergente u otra técnica conocida en la técnica. En algunas realizaciones, solo se utiliza un exterminio de virus 607 o 611, o los exterminios de virus se realizan en la misma etapa en el proceso de purificación.

La rhGAA de la etapa de exterminio de virus 611 puede introducirse en un tercer sistema de cromatografía 613 para purificar adicionalmente el producto de proteína recombinante. Alternativamente, la proteína recombinante eluida del segundo sistema de cromatografía 609 puede alimentarse directamente al tercer sistema de cromatografía 613. En diversas realizaciones, el tercer sistema de cromatografía 613 incluye una o más columnas de cromatografía incluye una o más columnas de cromatografía de intercambio catiónico (CEX) y/o cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para una eliminación adicional de impurezas. El producto rhGAA luego se eluye del tercer sistema de cromatografía 613. Condiciones ejemplares para una columna CEX se proporcionan en la Tabla 4 que figura a continuación.

Tabla 4. Condiciones ejemplares para una columna CEX

El producto de rhGAA también puede someterse a un procesamiento adicional. Por ejemplo, se puede utilizar otro sistema de filtración 615 para eliminar virus. En algunas realizaciones, una filtración de este tipo puede utilizar filtros con tamaños de poro entre 5 y 50 μm. Otro procesamiento del producto puede incluir una etapa de ajuste del producto 617, en la que el producto de proteína recombinante puede esterilizarse, filtrarse, concentrarse, almacenarse y/o tener componentes adicionales para añadir a la formulación del producto final.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "ATB200" se refiere a una rhGAA con un alto contenido en N-glicanos que portan mono-M6P y bis-M6P, que se produce a partir de una línea de células GA-ATB200 y se purifica utilizando los métodos descritos en esta memoria.

V. Composición Farmacéutica

En diversas realizaciones, se proporciona una composición farmacéutica que comprende la rhGAA descrita en esta memoria, ya sea sola o en combinación con otros agentes terapéuticos y/o un soporte farmacéuticamente aceptable.

En una o más realizaciones, una composición farmacéutica descrita en esta memoria comprende una sal farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, la sal farmacéuticamente aceptable utilizada en esta memoria es una sal por adición de ácidos farmacéuticamente aceptable. La sal por adición de ácidos farmacéuticamente aceptable puede incluir, pero no se limita a ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfámico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos incluyendo, pero no limitados a ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido butírico, ácido canfórico, ácido canforsulfónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido diglucónico, ácido etanosulfónico, ácido glutámico, ácido glicólico, ácido glicerofosfórico, ácido hemisúlfico, ácido hexanoico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido 2-hidroxietanosulfónico (ácido isetiónico), ácido láctico, ácido hidroximaleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido mesitilenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido naftalenosulfónico, ácido nicotínico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido oxálico, ácido pamoico, ácido pectínico, ácido fenilacético, ácido 3-fenilpropiónico, ácido piválico, ácido propiónico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfanílico, ácido tartárico, ácido ptoluenosulfónico, ácido undecanoico y similares.

En algunas realizaciones, la sal farmacéuticamente aceptable utilizada en esta memoria es una sal por adición de bases farmacéuticamente aceptable. La sal por adición de bases farmacéuticamente aceptable puede incluir, pero no se limita a amoníaco o el hidróxido, carbonato o bicarbonato de amonio o un catión metálico, tal como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, compuestos de aminas cuaternarias, aminas sustituidas, incluyendo aminas sustituidas que se producen de forma natural, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, isopropilamina, tripropilamina, tributilamina, etanolamina, dietanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, compuestos de tetrametilamonio, compuestos de tetraetilamonio, piridina, N,N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, dibencilamina, N,N-dibencilfenetilamina, 1-efenamina, N,N'-dibenciletilendiamina, resinas de poliamina y similares.

En algunas realizaciones, la rhGAA o una de sal farmacéuticamente aceptable de la misma puede formularse como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es un tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. Los ingredientes de la composición farmacéutica pueden suministrarse por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo seco liofilizado o un concentrado sin agua en un recipiente herméticamente sellado, tal como una ampolla o un sobre, indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición deba administrarse por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contenga agua estéril de calidad farmacéutica, solución salina o dextrosa/agua. En algunas realizaciones, la infusión puede ocurrir en un hospital o una clínica. En algunas realizaciones, la infusión puede ocurrir fuera del entorno hospitalario o clínico, por ejemplo, en la residencia de un sujeto. Cuando la composición se administre mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se mezclen antes de la administración.

En algunas realizaciones, la rhGAA o una de sal farmacéuticamente aceptable de la misma puede formularse para la administración oral. Composiciones administrables por vía oral pueden formularse en forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluciones o suspensiones, geles, jarabes, colutorios o un polvo seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso, opcionalmente con agentes saborizantes y colorantes. para aplicaciones de liberación inmediata, retardada, modificada, sostenida, pulsada o controlada. También se pueden utilizar composiciones sólidas, tales como comprimidos, cápsulas, pastillas, píldoras, bolos, polvo, pastas, gránulos, balas, grageas o preparaciones de premezcla. Las composiciones sólidas y líquidas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Composiciones de este tipo también pueden contener uno o más soportes y excipientes farmacéuticamente aceptables que pueden estar en forma sólida o líquida. Los comprimidos o las cápsulas se pueden preparar por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo, pero no limitados a agentes aglutinantes, cargas, lubricantes, desintegrantes o agentes humectantes. Excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a almidón pregelatinizado, polivinilpirrolidona, povidona, hidroxipropil metilcelulosa (HPMC), hidroxipropil etilcelulosa (HPEC), hidroxipropil celulosa (HPC), sacarosa, gelatina, acacia, lactosa, celulosa microcristalina, hidrógeno-fosfato de calcio, estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo, talco, sílice, almidón de maíz, patata o tapioca, glicolato de almidón de sodio, lauril sulfato de sodio, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, glicina croscarmelosa de sodio y silicatos complejos. Los comprimidos se pueden recubrir mediante métodos bien conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica descrita en esta memoria puede formularse de acuerdo con la Solicitud Internacional PCT/US2017/024982 y la Solicitud Provisional de EE.UU. N° 62/506.574. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el pH de una composición farmacéutica descrita en esta memoria es de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0 o de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, el pH de la composición farmacéutica es 6,0. En algunas realizaciones, el pH puede ajustarse a un pH diana utilizando ajustadores de pH (p. ej., agentes alcalinizantes y agentes acidificantes) tales como hidróxido de sodio y/o ácido clorhídrico.

La composición farmacéutica descrita en esta memoria puede comprender un sistema tampón tal como un sistema citrato, un sistema fosfato y una combinación de los mismos. El citrato y/o el fosfato pueden ser un citrato de sodio o un fosfato de sodio. Otras sales incluyen sales de potasio y amonio. En una o más realizaciones, el tampón comprende un citrato. En realizaciones adicionales, el tampón comprende citrato de sodio (p. ej., una mezcla de citrato de sodio deshidrato y ácido cítrico monohidrato). En una o más realizaciones, las disoluciones tampón que comprenden un citrato pueden comprender citrato de sodio y ácido cítrico. En algunas realizaciones, están presentes tanto un tampón citrato como fosfato.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica descrita en esta memoria comprende al menos un excipiente. El excipiente puede funcionar como agente de tonicidad, agente conferidor de consistencia y/o estabilizador. Los agentes de tonicidad son componentes que ayudan a asegurar que la formulación tenga una presión osmótica similar o igual a la sangre humana. Los agentes de carga son ingredientes que añaden masa a las formulaciones (por ejemplo, liofilizados) y proporcionan una estructura adecuada a la torta. Los estabilizadores son compuestos que pueden prevenir o minimizar la formación de agregados en las superficies interfaciales hidrófobas de aire-agua. El excipiente puede funcionar como agente de tonicidad y agente conferidor de consistencia al mismo tiempo. Por ejemplo, manitol puede funcionar como agente de tonicidad y también proporcionar beneficios como agente conferidor de consistencia.

Ejemplos de agentes de tonicidad incluyen cloruro sódico, manitol, sacarosa y trehalosa. En algunas realizaciones, el agente de tonicidad comprende manitol. En algunas realizaciones, la cantidad total de agente(s) de tonicidad varía en una cantidad de aproximadamente 10 mg/mL a aproximadamente 50 mg/mL. En realizaciones adicionales, la cantidad total de agente(s) de tonicidad varía en una cantidad de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14 o 15 mg/mL a aproximadamente 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mg/mL.

En algunas realizaciones, el excipiente comprende un estabilizador. En algunas realizaciones, el estabilizador es un tensioactivo. En algunas realizaciones, el estabilizador es polisorbato 80. En una o más realizaciones, la cantidad total de estabilizador varía de aproximadamente 0,1 mg/mL a aproximadamente 1,0 mg/mL. En realizaciones adicionales, la cantidad total de estabilizador varía de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 mg/mL a aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 mg/mL. Aún en realizaciones adicionales, la cantidad total de estabilizador es de aproximadamente 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1,0 mg/mL.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende (a) una rhGAA (tal como ATB200), (b) al menos un tampón seleccionado del grupo que consiste en un citrato, un fosfato y una combinación de los mismos, y (c) al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en manitol, polisorbato 80 y una combinación de los mismos, y tiene un pH de (i) de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, o (ii) de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0. En algunas realizaciones, la composición comprende, además, agua. En algunas realizaciones, la composición puede comprender, además, un agente acidificante y/o un agente alcalinizante.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende (a) una rhGAA (tal como ATB200) a una concentración de aproximadamente 5-50 mg/mL, aproximadamente 5-30 mg/mL o aproximadamente 15 mg/mL, (b) tampón citrato de sodio a una concentración de aproximadamente 10-100 mM o aproximadamente 25 mM, (c) manitol a una concentración de aproximadamente 10-50 mg/mL, o aproximadamente 20 mg/mL, (d) polisorbato 80, presente a una concentración de aproximadamente 0,1-1 mg/mL, aproximadamente 0,2-0,5 mg/mL o aproximadamente 0,5 mg/mL, y (e) agua, y tiene un pH de aproximadamente 6,0. En al menos una realización, la composición farmacéutica comprende (a) 15 mg/mL de rhGAA (tal como ATB200), (b) tampón de citrato de sodio 25 mM, (c) 20 mg/mL de manitol (d) 0,5 mg/mL de polisorbato 80 y (e) agua, y tiene un pH de aproximadamente 6,0. En algunas realizaciones, la composición puede comprender, además, un agente acidificante y/o un agente alcalinizante.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende rhGAA se diluye antes de la administración a un sujeto que lo necesite.

En algunas realizaciones, una composición farmacéutica descrita en esta memoria comprende una chaperona. En algunas realizaciones, la chaperona es miglustat o una de sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otra realización, la chaperona es duvoglustat o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En algunas realizaciones, una rhGAA descrita en esta memoria se formula en una composición farmacéutica, mientras que una chaperona tal como miglustat se formula en otra composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende miglustat se basa en una formulación disponible comercialmente como Zavesca® (Actelion Pharmaceuticals).

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica descrita en esta memoria puede someterse a un proceso de liofilización (secado por congelación) para proporcionar una torta o un polvo. Por consiguiente, otro aspecto de la invención pertenece a una composición farmacéutica después de la liofilización. La mezcla liofilizada puede comprender la rhGAA descrita en esta memoria (p. ej., ATB200), tampón seleccionado del grupo que consiste en un citrato, un fosfato y combinaciones de los mismos, y al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en trehalosa, manitol, polisorbato 80, y una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, se pueden añadir otros ingredientes (por ejemplo, otros excipientes) a la mezcla liofilizada. La composición farmacéutica que comprende la formulación liofilizada se puede proporcionar en un vial, que luego se puede almacenar, transportar, reconstituir y/o administrar a un paciente.

VI. Métodos de Tratamiento

A. Tratamiento de Enfermedades

Otro aspecto de la divulgación pertenece a un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con la desregulación del almacenamiento de glucógeno mediante la administración de la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria. En algunos ejemplos, la enfermedad es la enfermedad de Pompe (también conocida como deficiencia de maltasa ácida (AMD, por sus siglas en inglés) y enfermedad de almacenamiento de glucógeno tipo II (GSD II, por sus siglas en inglés)). En algunas realizaciones, la rhGAA es ATB200. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende ATB200.

La rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria se administra por una vía apropiada. La rhGAA o composición farmacéutica se administra por vía intravenosa en la presente invención.

En algunas realizaciones, los efectos terapéuticos de la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria pueden evaluarse en base a uno o más de los siguientes criterios: (1) estado cardíaco (p. ej., aumento de los volúmenes al final de la diástole y/o al final de la sístole, o reducción, mejora o prevención de la miocardiopatía progresiva que se encuentra típicamente en GSD-II), (2) función pulmonar (p. ej., aumento de la capacidad vital de llanto sobre la capacidad inicial y/o normalización de la desaturación de oxígeno durante el llanto), (3) neurodesarrollo y/o habilidades motoras (p. ej., aumento en la puntuación AIMS), y (4) reducción de los niveles de glucógeno en el tejido del individuo afectado por la enfermedad.

En algunas realizaciones, el estado cardíaco de un sujeto mejora en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de la rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. El estado cardíaco de un sujeto puede evaluarse midiendo los volúmenes tele-diastólico y/o tele-sistólico y/o evaluando clínicamente la miocardiopatía. En algunas realizaciones, la función pulmonar de un sujeto mejora en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de ATB200 o composición farmacéutica que comprende ATB200, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. En determinadas realizaciones, la mejora se logra después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio). En determinadas realizaciones, ATB200 o la composición farmacéutica que comprende ATB200 mejora la función pulmonar de un sujeto después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio).

En algunas realizaciones, la función pulmonar de un sujeto mejora en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de la rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. La función pulmonar de un sujeto puede evaluarse mediante la capacidad vital de llanto sobre la capacidad de referencia y/o la normalización de la desaturación de oxígeno durante el llanto. En algunas realizaciones, la función pulmonar de un sujeto mejora en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de ATB200 o composición farmacéutica que comprende ATB200, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. En determinadas realizaciones, la mejora se logra después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio). En determinadas realizaciones, ATB200 o la composición farmacéutica que comprende ATB200 mejora la función pulmonar de un sujeto después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio).

En algunas realizaciones, el neurodesarrollo y/o las habilidades motoras de un sujeto mejoran en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de la rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. El neurodesarrollo y/o las habilidades motoras de un sujeto pueden evaluarse determinando una puntuación AIMS. El AIMS es una escala anclada de 12 puntos que es administrada y puntuada por un médico (véase Rush JA Jr., Handbook of Psychiatric Measures, American Psychiatric Association, 2000, 166 168). Los puntos 1-10 se clasifican en una escala anclada de 5 puntos. Los puntos 1-4 evalúan los movimientos orofaciales. Los puntos 5-7 tratan sobre la discinesia de las extremidades y del tronco. Los puntos 8-10 se ocupan de la gravedad global según lo juzgado por el examinador, y la conciencia del paciente de los movimientos y la angustia asociada con ellos. Los puntos 11-12 son preguntas de sí/no relacionadas con problemas con dientes y/o dentaduras postizas (problemas de este tipo pueden llevar a un diagnóstico erróneo de discinesia). En algunas realizaciones, el neurodesarrollo y/o las habilidades motoras de un sujeto mejoran en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de ATB200 o composición farmacéutica que comprende ATB200, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. En determinadas realizaciones, la mejora se logra después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio). En determinadas realizaciones, ATB200 o la composición farmacéutica que comprende ATB200 mejora el neurodesarrollo y/o las habilidades motoras de un sujeto después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio).

En algunas realizaciones, el nivel de glucógeno de un determinado tejido de un sujeto se reduce en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de la rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. En alguna realización, el tejido es músculo tal como cuádriceps, tríceps y gastrocnemio. El nivel de glucógeno de un tejido se puede analizar utilizando métodos conocidos en la técnica. La determinación de los niveles de glucógeno es bien conocida en base a la digestión con amiloglucosidasa, y está descrita en publicaciones tales como: Amalfitano et al. (1999), "Systemic correction of the muscle disorder glycogen storage disease type ii after hepatic targeting of a modified adenovirus vector encoding human acid-alphaglucosidase," Proc Natl Acad Sci USA, 96:8861-8866. En algunas realizaciones, el nivel de glucógeno de un sujeto se reduce en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de ATB200 o composición farmacéutica que comprende ATB200, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. En determinadas realizaciones, la reducción se logra después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio). En determinadas realizaciones, ATB200 o la composición farmacéutica que comprende ATB200 reduce el nivel de glucógeno en el músculo de un sujeto después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio).

B. Biomarcadores

Los biomarcadores de acumulación de glucógeno en una fibra muscular en un sujeto tal como tetrasacárido de hexosa (Hex4) en la orina, pueden utilizarse para evaluar y comparar los efectos terapéuticos de la terapia de reemplazo enzimático en un sujeto con enfermedad de Pompe. En algunas realizaciones, el efecto terapéutico de la rhGAA o una composición farmacéutica que comprende rhGAA sobre la acumulación de glucógeno se evalúa midiendo los niveles de Hex4 en un sujeto.

Los biomarcadores de lesión o daño muscular, tales como creatina quinasa (CK), alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), pueden utilizarse para evaluar y comparar los efectos terapéuticos de la terapia de reemplazo enzimático en un sujeto con enfermedad de Pompe. En algunas realizaciones, el efecto terapéutico de la rhGAA o una composición farmacéutica que comprende rhGAA sobre el daño muscular se evalúa midiendo los niveles de CK, ALT y/o AST en un sujeto. En al menos una realización, el efecto terapéutico de la rhGAA o una composición farmacéutica que comprende rhGAA sobre el daño muscular se evalúa midiendo los niveles de CK en un sujeto.

Biomarcadores tales como LAMP-1, LC3 y Disferlina también se pueden utilizar para evaluar y comparar los efectos terapéuticos de la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria. En la enfermedad de Pompe, la incapacidad de GAA para hidrolizar el glucógeno lisosomal conduce a la acumulación anormal de grandes lisosomas llenos de glucógeno en algunos tejidos. (Raben et al., JBC 273: 19086-19092, 1998.) Estudios en un modelo de ratón de la enfermedad de Pompe han demostrado que los lisosomas agrandados en el músculo esquelético no pueden explicar adecuadamente la reducción del rendimiento mecánico y que la presencia de grandes inclusiones que contiene miofibrillas degradadas (es decir, acumulación autofágica) contribuye al deterioro de la función muscular. (Raben et al., Human Mol Genet 17: 3897-3908, 2008.) Informes también sugieren que el flujo de autofagia deteriorado está asociado con un resultado terapéutico deficiente en pacientes con Pompe. (Nascimbeni et al., Neuropathology and Applied Neurobiology doi: 10.1111/nan. 12214, 2015; Fukuda et al., Mol Ther 14: 831-839, 2006.) Además, la enfermedad de Pompe de aparición tardía prevalece en miembros no clasificados. distrofias musculares de la cintura (LGMDs, por sus siglas en inglés) (Preisler et al., Mol Genet Metab 110: 287-289, 2013), que es un grupo de enfermedades neuromusculares genéticamente heterogéneas con más de 30 subtipos definidos genéticamente de gravedad variable. El examen IHC reveló una presencia sarcoplásmica sustancialmente elevada de disferlina en las fibras musculares esqueléticas de ratones Gaa KO.

Se pueden utilizar diversos métodos conocidos para medir el nivel de expresión génica y/o el nivel de proteínas de biomarcadores de este tipo. Por ejemplo, se puede obtener una muestra de un sujeto tratado con la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria, tal como una biopsia de tejidos, en particular de músculo. En algunas realizaciones, la muestra es una biopsia de músculo en un sujeto. En algunas realizaciones, el músculo se selecciona de cuádriceps, tríceps y gastrocnemio. La muestra obtenida de un sujeto puede teñirse con uno o más anticuerpos u otros agentes de detección que detecten biomarcadores de este tipo o identificarse y cuantificarse mediante espectrometría de masas. Las muestras también o alternativamente pueden procesarse para detectar la presencia de ácidos nucleicos, tales como ARNm, que codifican los biomarcadores mediante, p. ej., métodos de RT-qPCR.

En algunas realizaciones, el nivel de expresión génica y/o el nivel de proteínas de uno o más biomarcadores se mide en una biopsia muscular obtenida de un individuo antes y después del tratamiento con la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria. En algunas realizaciones, el nivel de expresión génica y/o el nivel de proteínas de uno o más biomarcadores se mide en una biopsia muscular obtenida de un individuo tratado con un vehículo. En algunas realizaciones, el nivel de expresión génica y/o el nivel de proteínas de uno o más biomarcadores se reduce en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de la rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. En algunas realizaciones, el nivel de expresión génica y/o el nivel de proteínas de uno o más biomarcadores se reduce en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % (o cualquier porcentaje intermedio) después de la administración de una o más dosis de ATB200 o composición farmacéutica que comprende ATB200, en comparación con la de un sujeto tratado con un vehículo o la de un sujeto antes del tratamiento. En determinadas realizaciones, la reducción se logra después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio). En determinadas realizaciones, ATB200 o la composición farmacéutica que comprende ATB200 reduce el nivel de expresión génica y/o el nivel de proteínas de uno o más biomarcadores después de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mes, 2 meses o más desde la administración (o cualquier período de tiempo intermedio).

C. Dosificación de rhGAA

La formulación farmacéutica o composición reconstituida se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz (p. ej., una cantidad de dosificación que, cuando se administra a intervalos regulares, es suficiente para tratar la enfermedad, tal como mejorando los síntomas asociados con la enfermedad, previniendo o retrasando la aparición de la enfermedad y/o disminuyendo la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad). La cantidad que es terapéuticamente eficaz en el tratamiento de la enfermedad puede depender de la naturaleza y extensión de los efectos de la enfermedad, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándares. Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar intervalos de dosificación óptimos. En al menos una realización, una rhGAA descrita en esta memoria o una composición farmacéutica que comprende la rhGAA se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, tal como aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, típicamente aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg. En al menos una realización, la rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria se administra a una dosis de aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 90 mg /kg o aproximadamente 100 mg/kg. En algunas realizaciones, la rhGAA se administra a una dosis de 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg o 100 mg/kg. En al menos una realización, la rhGAA o la composición farmacéutica se administra a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg. En algunas realizaciones, la rhGAA o la composición farmacéutica se administran concurrente o secuencialmente con una chaperona farmacológica. En algunas realizaciones, la chaperona farmacológica es miglustat. En al menos una realización, el miglustat se administra como una dosis oral de aproximadamente 260 mg. La dosis eficaz para un individuo en particular se puede variar (p. ej., aumentar o disminuir) con el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en momentos de enfermedad física o estrés, o si se presentan o aumentan los anticuerpos anti-aglucosidasa ácida, o si los síntomas de la enfermedad empeoran, se puede aumentar la cantidad.

En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz de la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria es menor que la de los productos de rhGAA convencionales. Por ejemplo, si la dosis terapéuticamente eficaz de un producto de rhGAA convencional es de 20 mg/kg, la dosis de rhGAA o de la composición farmacéutica descrita en esta memoria necesaria para producir los mismos efectos terapéuticos que el producto de rhGAA convencional, o incluso mejores, puede ser inferior a 20 mg/kg. Los efectos terapéuticos pueden evaluarse en base a uno o más criterios arriba comentados (p. ej., estado cardíaco, nivel de glucógeno o expresión de biomarcadores). En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz de la rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria es de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90%, o más, inferior al de los productos rhGAA convencionales.

En algunas realizaciones, el efecto terapéutico de la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria comprende una mejora en la función motora, una mejora en la fuerza muscular (parte superior del cuerpo, parte inferior del cuerpo o cuerpo total), una mejora en la función pulmonar, disminución de la fatiga, niveles reducidos de al menos un biomarcador de lesión muscular, niveles reducidos de al menos un biomarcador de acumulación de glucógeno, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el efecto terapéutico de la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria comprende una reversión de la patología lisosomal en una fibra muscular, una reducción más rápida y/o más eficaz en el contenido de glucógeno en una fibra muscular, un aumento de la distancia en la prueba de marcha de seis minutos, una disminución en el tiempo de la prueba de time up and go, una disminución en el tiempo de la prueba de subida de cuatro escalones, una disminución en el tiempo de la prueba de marcha de diez metros, una disminución en la puntuación de marcha-escalera-Gower-silla, un aumento en la fuerza de las extremidades superiores, una mejora en la abducción de hombro, una mejora en la flexión del codo, una mejora en la extensión del codo, una mejora en la fuerza de la parte superior del cuerpo, una mejora en la fuerza de la parte inferior del cuerpo, una mejora en la fuerza corporal total, una mejora en la capacidad vital forzada en posición vertical (sentado), una mejora en la presión espiratoria máxima, una mejora en la presión inspiratoria máxima, una disminución en la puntuación de la escala de gravedad de la fatiga, una reducción en los niveles de hexosa tetrasacárido en orina, una reducción en los niveles de creatina quinasa, una reducción en los niveles de alanina aminotransferasa, una reducción en los niveles de asparato aminotransferasa, o cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria logra los efectos terapéuticos deseados más rápidamente que los productos de rhGAA convencionales cuando se administran a la misma dosis. Los efectos terapéuticos pueden evaluarse en base a uno o más criterios arriba comentados (p. ej., estado cardíaco, nivel de glucógeno o expresión de biomarcadores). Por ejemplo, si una sola dosis de un producto convencional de rhGAA reduce los niveles de glucógeno en el tejido de un individuo tratado en un 10 % en una semana, se puede lograr el mismo grado de reducción en menos de una semana cuando se administra la misma dosis de la rhGAA o composición farmacéutica descrita en esta memoria. En algunas realizaciones, cuando se administra a la misma dosis, la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria puede lograr los efectos terapéuticos deseados al menos aproximadamente 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 3,0 o más rápidamente que los productos de rhGAA convencionales.

En algunas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de rhGAA (o composición o medicamento que comprende rhGAA) se administra más de una vez. En algunas realizaciones, la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria se administra a intervalos regulares dependiendo de la naturaleza y el alcance de los efectos de la enfermedad, y de forma continua. La administración a un “intervalo regular”, como se usa aquí, indica que la cantidad terapéuticamente eficaz se administra periódicamente (a diferencia de una dosis única). El intervalo se puede determinar mediante técnicas clínicas estándares. En determinadas realizaciones, la rhGAA se administra bimensual, mensual, quincenal, semanal, dos veces por semana o diariamente. En algunas realizaciones, la rhGAA se administra por vía intravenosa dos veces por semana, semanalmente o cada dos semanas. El intervalo de administración para un solo individuo no necesita ser un intervalo fijo, sino que puede variar con el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en momentos de enfermedad física o estrés, si se presentan o aumentan los anticuerpos anti-rhGAA, o si los síntomas de la enfermedad empeoran, se puede reducir el intervalo entre dosis.

En algunas realizaciones, cuando se utiliza a la misma dosis, la rhGAA o la composición farmacéutica como se describe en esta memoria se puede administrar con menos frecuencia que los productos de rhGAA convencionales y, sin embargo, es capaz de producir los mismos o mejores efectos terapéuticos que los productos de rhGAA convencionales. Por ejemplo, si un producto de rhGAA convencional se administra a 20 mg/kg semanalmente, la rhGAA o la composición farmacéutica como se describe en esta memoria puede producir los mismos o mejores efectos terapéuticos que el producto de rhGAA convencional cuando se administra a 20 mg/kg, incluso a pesar de que la rhGAA o la composición farmacéutica se administra con menos frecuencia, p. ej., cada dos semanas o cada mes. Los efectos terapéuticos pueden evaluarse en base a uno o más criterios arriba comentados (p. ej., estado cardíaco, nivel de glucógeno o expresión de biomarcadores). En algunas realizaciones, el intervalo entre dos dosis de la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria es más largo que el de los productos de rhGAA convencionales. En algunas realizaciones, el intervalo entre dos dosis de rhGAA o composición farmacéutica es al menos aproximadamente 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 3,0 o más largo que el de los productos de rhGAA convencionales.

En algunas realizaciones, bajo la misma condición de tratamiento (p. ej., la misma dosis administrada en el mismo intervalo), la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria proporciona efectos terapéuticos en un grado superior al proporcionado por los productos de rhGAA convencionales. Los efectos terapéuticos pueden evaluarse en base a uno o más criterios arriba comentados (p. ej., estado cardíaco, nivel de glucógeno o expresión de biomarcadores). Por ejemplo, cuando se compara con un producto de rhGAA convencional administrado a 20 mg/kg semanalmente, la rhGAA o la composición farmacéutica administradas a 20 mg/kg semanalmente pueden reducir en un grado mayor los niveles de glucógeno en el tejido de un individuo tratado. En algunas realizaciones, cuando se administra bajo la misma condición de tratamiento, la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria proporciona efectos terapéuticos que son al menos aproximadamente 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 3,0 o más mayores que los productos de rhGAA convencionales.

D. Terapia de Combinación

En la invención, la rhGAA o la composición farmacéutica que comprende la rhGAA descrita en esta memoria se administra de forma concurrente o secuencial con una chaperona farmacológica. La chaperona farmacológica se administra por vía oral mientras que la rhGAA o la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa.

En la invención, la chaperona farmacológica es miglustat y se administra a una dosis oral de aproximadamente 260 mg.

En la presente invención, la rhGAA se administra por vía intravenosa a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg y el miglustat se administra por vía oral a una dosis de aproximadamente 260 mg.

En algunas realizaciones, miglustat y rhGAA se administran de forma concurrente. Por ejemplo, el miglustat puede administrarse dentro de los 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 minuto(s) antes o después de la administración de la rhGAA. En algunas realizaciones, el miglustat se administra dentro de los 5, 4, 3, 2 o 1 minutos antes o después de la administración de la rhGAA.

En algunas realizaciones, el miglustat y la rhGAA se administran de forma secuencial. En al menos una realización, el miglustat se administra antes de la administración de la rhGAA. En al menos una realización, el miglustat se administra menos de tres horas antes de la administración de la rhGAA. En al menos una realización, el miglustat se administra aproximadamente dos horas antes de la administración de la rhGAA. Por ejemplo, el miglustat puede administrarse aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 20 minutos antes de la administración de la rhGAA. En al menos una realización, el miglustat se administra aproximadamente una hora antes de la administración de la rhGAA.

En al menos una realización, el miglustat se administra después de la administración de la rhGAA. En al menos una realización, el miglustat se administra en el espacio de tres horas después de la administración de la rhGAA. En al menos una realización, el miglustat se administra en el espacio de dos horas después de la administración de la rhGAA. Por ejemplo, el miglustat puede administrarse en el espacio de aproximadamente 1,5 horas, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 50 minutos, aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 20 minutos después de la administración de la rhGAA.

En algunas realizaciones, el sujeto ayuna durante al menos dos horas antes y al menos dos horas después de la administración de miglustat.

E. Kit

Otro aspecto de la divulgación pertenece a kits que comprenden la rhGAA o la composición farmacéutica descrita en esta memoria. En uno o más ejemplos, el kit comprende un recipiente (p. ej., vial, tubo, bolsa, etc.) que comprende la rhGAA o la composición farmacéutica (ya sea antes o después de la liofilización) e instrucciones para la reconstitución, dilución y administración.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación de Células CHO que producen rhGAA con un alto contenido en N-glicanos portadores de mono- o bis-M6P.

Células DG44 CHO (DHFR-) se transfectaron con una construcción de ADN que expresa rhGAA. La construcción de ADN se muestra en la Fig. 4. Después de la transfección, las células CHO que contenían un gen GAA integrado de forma estable se seleccionaron con medio deficiente en hipoxantina/timidina (-HT). La expresión de GAA en estas células se indujo por tratamiento con metotrexato (MTX, 500 nM).

Los grupos de células que expresaban grandes cantidades de GAA se identificaron mediante ensayos de actividad enzimática de GAA, y se usaron para establecer clones individuales que producían rhGAA. Se generaron clones individuales en placas de medios semisólidos, se seleccionaron mediante el sistema ClonePix, y se transfirieron a placas de 24 pocillos profundos. Se analizó la actividad de la enzima GAA en los clones individuales para identificar los clones que expresaban un alto nivel de GAA. Los medios acondicionados para determinar la actividad de GAA utilizaron un sustrato de 4-MU-a-Glucosidasa. Los clones que producían niveles más altos de GAA, medidos mediante ensayos de la enzima GAA, se evaluaron adicionalmente en cuanto a viabilidad, capacidad de crecimiento, productividad de GAA, estructura de N-glicanos, y expresión estable de proteínas. Utilizando este procedimiento, se aislaron líneas celulares CHO, incluyendo la línea celular CHO GA-ATB200, que expresan rhGAA con N-glicanos mono-M6P o bis-M6P potenciados.

Ejemplo 2: Purificación de rhGAA

Se produjeron múltiples lotes de la rhGAA de acuerdo con la invención en matraces de agitación y en biorreactores de perfusión utilizando la línea de células CHO GA-ATB200, a cuyo producto se le alude como "ATB200". Se utilizó cromatografía líquida de intercambio aniónico débil ("WAX") para fraccionar rhGAA ATB200 de acuerdo con el fosfato terminal y ácido siálico. Los perfiles de elución se generaron eluyendo el ERT con una cantidad creciente de sal. Los perfiles se monitorizaron por UV (A280nm). Se observaron perfiles similares de unión al receptor CIMPR (al menos -70 %) para rhGAA ATB200 purificada de diferentes lotes de producción (Fig. 5), lo que indica que rhGAA ATB200 se puede producir de manera uniforme.

Ejemplo 3: Caracterización de oligosacáridos de rhGAA ATB200

Se analizó rhGAA ATB200 para perfiles de N-glicanos específicos del sitio utilizando diferentes técnicas analíticas de LC-MS/MS. Los resultados de los dos primeros métodos LC-MS/MS se muestran en las Figs. 6A-6H. Los resultados de un tercer método LC-MS/MS con mapeo de glicanos 2-AA se muestran en las Figs. 32A-32H, Fig. 33A-33B y la Tabla 5.

En el primer análisis LC-MS/MS, la proteína se desnaturalizó, redujo, alquiló y digirió antes del análisis LC-MS/MS. Durante la desnaturalización y reducción de proteínas, 200 μg de muestra de proteína, 5 μL de 1 mol/L de tris-HCl (concentración final 50 mM), 75 μL de 8 mol/L de guanidina HCl (concentración final 6 M), 1 μL de 0,5 mol /L de EDTA (concentración final 5 mM), 2 μL de 1 mol/L de DTT (concentración final 20 mM) y agua Milli-Q® se añadieron a un tubo de 1,5 mL para proporcionar un volumen total de 100 μL. La muestra se mezcló y se incubó a 56 °C durante 30 minutos en un baño seco. Durante la alquilación, la muestra de proteína desnaturalizada y reducida se mezcló con 5 μL de 1 mol/L de yodoacetamida (IAM, concentración final 50 mM) y luego se incubó a 10-30 °C en la oscuridad durante 30 minutos. Después de la alquilación, se añadieron a la muestra 400 μL de acetona pre-enfriada, y la mezcla se congeló a -80 °C de refrigeración durante 4 horas. A continuación, la muestra se centrifugó durante 5 min a 13000 rpm a 4 °C, y se eliminó el sobrenadante. Se añadieron 400 μL de acetona pre-enfriada a los sedimentos, que entonces se centrifugaron durante 5 min a 13000 rpm a 4 °C, y se eliminó el sobrenadante. A continuación, la muestra se secó al aire sobre hielo en la oscuridad para eliminar el residuo de acetona. Se añadieron a la muestra cuarenta microlitros de urea 8 M y 160 μL de NH4HCO3100 mM para disolver la proteína. Durante la digestión con tripsina, se añadieron 50 μg de la proteína con tampón de digestión de tripsina hasta un volumen final de 100 μL, y se añadieron 5 μL de 0,5 mg/mL de tripsina (relación proteína a enzima de 20/1 p/p). La solución se mezcló bien y se incubó durante la noche (16 ± 2 horas) a 37 °C. Se añadieron dos microlitros y medio de TFA al 20 % (concentración final del 0,5 %) para extinguir la reacción. A continuación, la muestra se analizó utilizando el espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Orbitrap Velos Pro™

En el segundo análisis LC-MS/MS, la muestra ATB200 se preparó de acuerdo con un procedimiento similar de desnaturalización, reducción, alquilación y digestión, excepto que se utilizó ácido yodoacético (IAA, por sus siglas en inglés) como reactivo de alquilación en lugar de IAM, y luego se analizó utilizando el espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribid™.

Los resultados del primer y segundo análisis se muestran en las Figs. 6A-6H. En las Figs. 6A-6H, los resultados del primer análisis están representados por la barra izquierda (gris oscuro) y los resultados del segundo análisis están representados por la barra derecha (gris claro). La nomenclatura de símbolos para la representación de glicanos está de acuerdo con Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., et al., Essentials of Glycobiology, 2a edición (2009).

Como puede verse en las Figs. 6A-6H, los dos análisis proporcionaron resultados similares, aunque hubo alguna variación entre los resultados. Esta variación puede deberse a una serie de factores, incluyendo el instrumento utilizado y la plenitud del análisis de los N-glicanos. Por ejemplo, si algunas especies de N-glicanos fosforilados no se identificaron y/o cuantificaron, entonces el número total de N-glicanos fosforilados puede estar sub-representado, y el porcentaje de rhGAA que porta los N-glicanos fosforilados en ese sitio puede estar sub-representado. Como otro ejemplo, si algunas especies de N-glicanos no fosforilados no se identificaron y/o cuantificaron, entonces el número total de N-glicanos no fosforilados puede estar sub-representado, y el porcentaje de rhGAA que porta los N-glicanos fosforilados en ese sitio puede estar sobre-representado.

La Fig. 6A muestra la ocupación del sitio de N-glicosilación de ATB200. Como se puede ver en la Fig. 6A, los sitios de N-glicosilación primero, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto están mayormente ocupados, detectando ambos análisis alrededor o más del 90 % y hasta aproximadamente 100 % de la enzima ATB200 que tiene un N-glicano detectado en cada sitio potencial de N-glicosilación. Sin embargo, el séptimo sitio potencial de N-glicosilación está N-glicosilado aproximadamente la mitad del tiempo.

La Fig. 6B muestra el perfil de N-glicosilación del primer sitio potencial de N-glicosilación, N84. Como se puede ver en la Fig. 6B, la principal especie de N-glicanos son los N-glicanos de bis-M6P. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 75 % de la ATB200 tenía bis-M6P en el primer sitio, lo que corresponde a un promedio de aproximadamente 0,8 moles de bis-M6P por mol de ATB200 en el primer sitio.

La Fig. 6C el perfil de N-glicosilación del segundo sitio potencial de N-glicosilación, N177. Como se puede ver en la Fig. 6C, las principales especies de N-glicanos son los N-glicanos mono-M6P y los N-glicanos de alto contenido en manosa no fosforilados. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 40 % de ATB200 tenía mono-M6P en el segundo sitio, lo que corresponde a un promedio de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 moles de mono-M6P por mol de ATB200 en el segundo sitio.

La Fig. 6D muestra el perfil de N-glicosilación del tercer sitio potencial de N-glicosilación, N334. Como se puede ver en la Fig. 6D, las principales especies de N-glicanos son N-glicanos con alto contenido en manosa no fosforilados, N-glicanos complejos di-, tri- y tetra-antenarios y N-glicanos híbridos. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 20 % de la ATB200 tenía un residuo de ácido siálico en el tercer sitio, lo que corresponde a un promedio de aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,2 moles de ácido siálico por mol de ATB200 en el tercer sitio.

La Fig. 6E muestra el perfil de N-glicosilación del cuarto sitio potencial de N-glicosilación, N414. Como puede verse en la Fig. 6E, las principales especies de N-glicanos son los N-glicanos bis-M6P y mono-M6P. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 40 % de la ATB200 tenía bis-M6P en el cuarto sitio, lo que corresponde a un promedio de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 moles de bis-M6P por mol de ATB200 en el cuarto sitio. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 25 % de la ATB200 tenía mono-M6P en el cuarto sitio, lo que corresponde a un promedio de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,4 moles de mono-M6P por mol de ATB200 en el cuarto sitio.

La Fig. 6F muestra el perfil de N-glicosilación del quinto sitio potencial de N-glicosilación, N596. Como puede verse en la Fig. 6F, las principales especies de N-glicanos son los N-glicanos del complejo diantenario fucosilado. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 70 % de la ATB200 tenía un residuo de ácido siálico en el quinto sitio, lo que corresponde a un promedio de aproximadamente 0,8 a aproximadamente 0,9 moles de ácido siálico por mol de ATB200 en el quinto sitio.

La Fig. 6G muestra el perfil de N-glicosilación del sexto sitio potencial de N-glicosilación, N826. Como puede verse en la Fig. 6G, las principales especies de N-glicanos son los N-glicanos del complejo di-, tri- y tetra-antenario. Tanto el primer como el segundo análisis detectaron que más del 80 % de la ATB200 tenía un residuo de ácido siálico en el sexto sitio, lo que corresponde a un promedio de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 1,8 moles de ácido siálico por mol de ATB200 en el sexto sitio.

Un análisis de la N-glicosilación en el séptimo sitio, N869, mostró aproximadamente un 40 % de N-glicosilación, siendo los N-glicanos más comunes A4S3S3GF (12 %), A5S3G2F (10 %), A4S2G2F (8 %) y A6S3G3F (8 %).

La Fig. 6H muestra un resumen de la fosforilación en cada uno de los siete sitios potenciales de N-glicosilación. Como puede verse en la Fig. 6H, tanto el primer como el segundo análisis detectaron altos niveles de fosforilación en los sitios de N-glicosilación potenciales primero, segundo y cuarto. Ambos análisis detectaron que más del 80 % de la ATB200 estaba monofosforilada o bisfosforilada en el primer sitio, más del 40 % de la ATB200 estaba monofosforilada en el segundo sitio y más del 80 % de la ATB200 estaba monofosforilada o bisfosforilada en el cuarto sitio.

Se realizó otro análisis de N-glicosilación de ATB200 de acuerdo con un método LC-MS/MS como se describe más adelante. Este análisis proporcionó un perfil promedio de N-glicosilación sobre diez lotes de ATB200 (Figs. 32A-32H, Figs. 33A-33B).

Los glicanos ligados a N de ATB200 se liberaron enzimáticamente con PNGase-F y se marcaron con ácido 2-antranílico (2-AA). Los N-glicanos marcados con 2-AA se procesaron adicionalmente mediante extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en inglés) para eliminar el exceso de sales y otros contaminantes. Los N-glicanos 2-AA purificados se disolvieron en acetonitrilo/agua (20/80; v/v) y se cargaron 10 microgramos en una columna analítica de amino-polímero (apHera™, Supelco) para cromatografía líquida de alta resolución con detección de fluorescencia. (HPLC-FLD, por sus siglas en inglés) y análisis de espectrometría de masas de alta resolución (HRMS, por sus siglas en inglés).

La separación por cromatografía líquida (LC, por sus siglas en inglés) se realizó en condiciones normales de fase en un modo de elución en gradiente con fase móvil A (ácido acético al 2 % en acetonitrilo) y fase móvil B (ácido acético al 5 %; acetato de amonio 20 milimolar en agua ajustado a pH 4,3 con hidróxido de amonio). La composición inicial de la fase móvil fue 70 % de A/30 % de B. Para la detección de fluorescencia, los parámetros para el detector (RF-20Axs, Shimadzu) fueron Excitación (Ex): 320 nm; Emisión (Em):420 nm. El análisis HRMS se llevó a cabo utilizando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo (Sciex X500B QTOF) que funciona en modo de adquisición de datos independiente (IDA, por sus siglas en inglés). Los archivos de datos adquiridos se convirtieron en archivos mzML utilizando MSConvert de ProteoWizard, y luego se utilizó el software GRITS Toolbox 1.2 Morning Blend (UGA) para la búsqueda en la base de datos de glicanos y la posterior anotación de los N-glicanos identificados. Los N-glicanos se identificaron utilizando tanto masas monoisotópicas precursoras (m/z) como iones producto m/z. Los iones del producto experimental y los patrones de fragmentación se confirmaron in-silico utilizando la aplicación GlycoWorkbench 2.

Para determinar la cuantificación relativa de los glicanos ligados a N de ATB200, los datos adquiridos del experimento HPLC-FLD-QTOF MS/MS se procesaron de la siguiente manera. Se integraron todos los picos de N-glicano en el cromatograma FLD, y a cada pico se le asignó un porcentaje del área total de todos los picos en el cromatograma FLD. La señal fluorescente, expresada como área de pico, es una medida cuantitativa de la cantidad de cada N-glicano en la muestra (Fig. 33A). Sin embargo, en la mayoría de los casos, múltiples especies de N-glicanos estaban contenidas en el mismo pico de FLD. Por lo tanto, también se requirieron los datos del espectrómetro de masas para obtener la cuantificación relativa de cada una de las especies de N-glicano (Tabla 5). La señal de intensidad de iones para cada uno de los N-glicanos se "extrajo" de los datos para crear un pico cromatográfico denominado cromatograma de iones extraídos (XIC, por sus siglas en inglés). El XIC se alineó con el pico cromatográfico FLD y fue específico de solo una especie de N-glicano. A continuación, se integró el pico XIC creado a partir de la señal de intensidad de iones y este área de pico es una medida cuantitativa relativa de la cantidad de glicano presente. Tanto las áreas de los picos FLD como las áreas de los picos XIC del espectrómetro de masas se utilizaron para permitir la cuantificación relativa de todas las especies de glicanos ligados a N de ATB200 notificadas en esta memoria.

Los resultados de este análisis LC-MS/MS se proporcionan en la Tabla 5 que figura más adelante. La nomenclatura de símbolos para la representación de glicanos está de acuerdo con Wopereis W, et al. 2006. Abnormal glycosylation with hypersialylated O-glycans in patients with Sialuria. Biochimica et Biophysica Acta. 1762:598-607; Gornik O, et al.

2007. Changes of serum glycans during sepsis and acute pancreatitis. Glycobiology. 17:1321-1332 https://doi.org/10.1093/glycob/cwm106; Kattla JJ, et al. 2011. Biologic protein glycosylation. En: Murray Moo-Young (ed.), Comprehensive Biotechnology, Segunda Edición, 3:467-486; Tharmalingam-Jaikaran T, et al. N-glycan profiling of bovine follicular fluid at key dominant follicle developmental stages. 2014. Reproduction. 148:569-580; Clerc F, et al. Human plasma protein N-glycosylation. 2015. Glycoconj J. DOI 10.1007/s10719-015-9626-2; y Blackler RJ, et al. 2016 Single-chain antibody-fragment M6P-1 possesses a mannose 6-phosphate monosaccharide-specific binding pocket that distinguishes N-glycan phosphorylation in a branch-specific manner. Glycobiology. 26-2:181-192.

Tabla 5: Tipo y Prevalencia de Oligosacáridos identificados en ATB200 basado en el mapeo de glicanos 2-AA y la identificación LC-MS/MS

Basado en este análisis de 2-AA y LC-MS/MS, y como se resume adicionalmente en la Fig. 33C, la ATB200 testada tiene un contenido promedio de M6P de 3-5 moles por mol de ATB200 (que representa tanto mono-M6P como bis-M6P) y contenido de ácido siálico de 4-7 moles por mol de ATB200.

Como se muestra en las Figs. 32A-32H y se resume en la Fig. 33B, el primer sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 tiene un contenido promedio en M6P de aproximadamente 1,4 moles de M6P/mol de ATB200, lo que representa un contenido promedio de mono-M6P de aproximadamente 0,25 moles de mono-M6P/mol de ATB200 y un contenido promedio de bis-M6P de aproximadamente 0,56 moles de bis-M6P/mol de ATB200; el segundo sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 tiene un contenido promedio de M6P de aproximadamente 0,5 moles de M6P/mol de ATB200, siendo las especies de N-glicanos fosforilados primarios los N-glicanos mono-M6P; el tercer sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 tiene un contenido medio de ácido siálico de aproximadamente 1 mol de ácido siálico/mol de ATB200; el cuarto sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 tiene un contenido promedio de M6P de aproximadamente 1,4 moles de M6P/mol de ATB200, lo que representa un contenido promedio de mono-M6P de aproximadamente 0,35 moles de mono-M6P/mol de ATB200 y un contenido promedio de bis-M6P de aproximadamente 0,52 moles de bis-M6P/mol de ATB200; el quinto sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 tiene un contenido promedio de ácido siálico de aproximadamente 0,86 moles de ácido siálico/mol de ATB200; el sexto sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 tiene un contenido promedio de ácido siálico de aproximadamente 4,2 moles de ácido siálico/mol de ATB200; y el séptimo sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 tiene un contenido promedio de ácido siálico de aproximadamente 0,86 moles de ácido siálico/mol de ATB200.

También de acuerdo con esta técnica analítica de 2-AA y LC-MS/MS, un promedio de aproximadamente 65 % de los N-glicanos en el primer sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 son N-glicanos con alto contenido en manosa, aproximadamente 89 % de los N-glicanos en el segundo sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 son N-glicanos con alto contenido en manosa, más de la mitad de los N-glicanos en el tercer sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 están sialilados (con casi el 20 % completamente sialilados) y aproximadamente 85 % de los N-glicanos en el tercer sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 son N-glicanos complejos, aproximadamente 84 % de los N-glicanos en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 son N-glicanos con alto contenido en manosa, aproximadamente 70 % de los N-glicanos en el quinto sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 están sialilados (con aproximadamente un 26 % completamente sialilados) y aproximadamente el 100 % de los N-glicanos en el quinto sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 son N-glicanos complejos, aproximadamente 85 % de los N-glicanos en el sexto sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 están sialilados (con casi el 27 % completamente sialilados) y aproximadamente 98 % de los N-glicanos en el sexto sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 son N- glicanos complejos y aproximadamente 87 % de los N-glicanos en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 están sialilados (con casi el 8 % completamente sialilados) y aproximadamente 100 % de los N-glicanos en el séptimo sitio potencial de N-glicosilación de ATB200 son N-glicanos complejos.

Ejemplo 4: Comparación Analítica de ATB200 y Myozyme®/Lumizyme®

ATB200 y Lumizyme® purificados se evaluaron mediante MALDI-TOF para determinar las estructuras de N-glicanos individuales encontradas en cada ERT. Lumizyme® se obtuvo de una fuente comercial. Como se muestra en la Fig. 7, ATB200 exhibió cuatro picos prominentes que eluyeron a la derecha de Lumizyme®. Esto confirma que ATB200 se fosforiló en mayor medida que Lumizyme®, ya que esta evaluación es por carga terminal en lugar de afinidad CIMPR. Como se resume en la Fig. 8, se encontró que las muestras de ATB200 contenían cantidades más bajas de N-glicanos de tipo de alto contenido en manosa no fosforilados que Lumizyme®.

Para evaluar la capacidad de los rhGAAs convencionales en Myozyme® y Lumizyme® para interactuar con el CIMPR, las dos preparaciones de rhGAA convencionales se inyectaron en una columna de afinidad CIMPR (que se une a rhGAA que tiene grupos M6P) y se recogió el flujo. El material unido se eluyó con un gradiente M6 libre. Las fracciones se recogieron en una placa de 96 pocillos y la actividad de GAA se analizó mediante sustrato 4MU-a-glucosidasa. Las cantidades relativas de rhGAA no unida (flujo continuo) y unido (M6P eluido) se determinaron en función de la actividad de GAA y se informaron como la fracción de la enzima total. Las Figs. 9A y 9B muestran el perfil de unión de rhGAA en Myozyme® and Lumizyme®: 73 % de la rhGAA en Myozyme® (Fig. 9B) y 78 % de la rhGAA en Lumizyme® (Fig. 9A) no se unieron al CI^mP^r. De hecho, solo el 27 % de la rhGAA en Myozyme® y el 22 % de la rhGAA en Lumizyme® contenían M6P que puede ser productivo para fijarlo como objetivo al CIMPR en las células musculares. Por el contrario, como se muestra en la Fig. 5, bajo las mismas condiciones, se encontró que más del 70 % de la rhGAA en ATB200 se unía al CIMPR.

Además de tener un mayor porcentaje de rhGAA que puede unirse al CIMPR, es importante entender la calidad de esa interacción. La unión del receptor Lumizyme® y ATB200 se determinó utilizando un ensayo de unión en placa CIMPR. Brevemente, para capturar GAA, se utilizaron placas recubiertas con CIMPR. Se aplicaron concentraciones variables de rhGAA al receptor inmovilizado, y la rhGAA no unida se eliminó por lavado. La cantidad de rhGAA restante se determinó mediante la actividad de GAA. Como se muestra en la Fig. 10A, ATB200 se unió a CIMPR significativamente mejor que Lumizyme®. La Fig. 10B muestra el contenido relativo de N-glicanos bis-M6P en Lumizyme® (un producto rhGAA convencional) y ATB200 de acuerdo con la invención. Para Lumizyme®, en promedio, solo el 10 % de las moléculas tienen un N-glicano bisfosforilado. Por el contrario, en promedio, cada una de las moléculas de rhGAA en ATB200 tiene al menos un N-glucano bis-fosforilado.

En general, el contenido más alto de N-glicanos M6P en ATB200 que en Lumizyme® indica que la porción más alta de moléculas rhGAA en ATB200 puede fijar como objetivo células musculares. Como se muestra arriba, el alto porcentaje de estructuras monofosforiladas y bisfosforiladas determinado por MALDI concuerda con los perfiles CIMPR que ilustraron una unión significativamente mayor de ATB200 al receptor CIMPR. El análisis de N-glicanos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF confirmó que, en promedio, cada molécula de ATB200 contiene al menos una estructura de N-glicano bis-M6P natural. Este mayor contenido de N-glicano bis-M6P en ATB200 se correlacionó directamente con la unión de alta afinidad a CIMPR en los ensayos de unión a la placa del receptor M6P (K^daproximadamente 2-4 nM).

La captación celular relativa de las rhGAA ATB200 y Lumizyme® se comparó utilizando líneas celulares de fibroblastos normales y de Pompe. Las comparaciones incluyeron 5-100 nM de ATB200 de acuerdo con la invención con 10-500 nM del producto rhGAA convencional Lumizyme®. Después de 16 horas de incubación, la rhGAA externa se inactivó con TRIS base, y las células se lavaron 3 veces con PBS antes de la recolección. GAA internalizada se midió por hidrólisis de 4MU-a-glucósido y se representó gráficamente en relación con la proteína celular total y los resultados aparecen en las Figs. 11A-11C.

También se demostró que ATB200 se internaliza eficientemente en las células. Como se representa en las Figs. 11A-11B, ATB200 se internaliza en células de fibroblastos tanto normales como de Pompe y se internaliza en mayor grado que el producto rhGAA convencional Lumizyme®. ATB200 satura los receptores celulares a aproximadamente 20 nM, mientras que se necesitan aproximadamente 250 nM de Lumizyme® para saturar los receptores celulares. La constante de eficiencia de captación (Kcaptación) extrapolada a partir de estos resultados es de 2-3 nm para ATB200 y de 56 nM para Lumizyme®, como se muestra en la Fig. 11C. Estos resultados sugieren que ATB200 es un tratamiento bien fijado como objetivo para la enfermedad de Pompe.

Ejemplo 5: ATB200 y Chaperona Farmacológica

La estabilidad de ATB200 en tampones de pH ácido o neutro se evaluó en un ensayo de termoestabilidad utilizando SYPRO Orange, ya que la fluorescencia del colorante aumenta cuando las proteínas se desnaturalizan. Como se muestra en la Fig. 12, la adición de AT2221 estabilizó ATB200 a pH 7,4 de una forma dependiente de la concentración, equiparable a la estabilidad de ATB200 a pH 5,2, una condición que imita el entorno ácido del lisosoma. Como se resume en la Tabla 6, la adición de AT2221 aumentó la temperatura de fusión (Tm) de ATB200 en casi 10 °C.

Tabla 6. Estabilidad de ATB200 en Combinación con AT2221

Ejemplo 6: Co-administración de ATB200 y AT2221 en ratones Gaa KO

Los efectos terapéuticos de ATB200 y AT2221 se evaluaron y compararon con los de Alglucosidasa alfa en ratones Gaa KO. Para el estudio, se utilizaron ratones machos Gaa KO (de 3 a 4 meses de edad) y de tipo salvaje (WT) de la misma edad. La alglucosidasa alfa se administró a través de una inyección intravenosa (IV) en bolo en la vena de la cola. En el régimen de co-administración, AT2221 se administró por sonda oral (PO) 30 minutos antes de la inyección IV de ATB200. El tratamiento se dio quincenalmente. Los ratones tratados se sacrificaron después de 14 días desde la última administración y se recogieron varios tejidos para su posterior análisis. La Tabla 7 resume el diseño del estudio:

Tabla 7. Diseño del Estudio de Co-administración

El contenido de glucógeno tisular en las muestras de tejido se determinó utilizando digestión con amiloglucosidasa, como se comentó arriba. Como se muestra en la Fig. 13, una combinación de 20 mg/kg de ATB200 y 10 mg/kg de AT2221 disminuyó significativamente el contenido de glucógeno en cuatro tejidos diferentes (cuádriceps, tríceps, gastrocnemio y corazón) en comparación con la misma dosis de alglucosidasa alfa.

También se analizaron muestras de tejido para cambios en biomarcadores siguiendo los métodos comentados en: Khanna R, et al. (2012), "The pharmacological chaperone AT2220 increases recombinant human acid a-glucosidase uptake and glycogen reduction in a mouse model of Pompe disease," Plos One 7(7): e40776; y Khanna, R et al. (2014), "The Pharmacological Chaperone AT2220 Increases the Specific Activity and Lysosomal Delivery of Mutant Acid a-Glucosidase, and Promotes Glycogen Reduction in a Transgenic Mouse Model of Pompe Disease," PLoS ONE 9(7): e102092. Como se muestra en la Fig. 14, se observó un profundo aumento y agrandamiento de vesículas LAMP1-positivas en fibras musculares de animales Gaa KO en comparación con WT, indicativo de una proliferación lisosomal. La co-administración de ATB200 / AT2221 condujo a más fibras con un nivel de LAMP1 normalizado, mientras que las vesículas LAMP1-positivas restantes también redujeron su tamaño (recuadros).

De manera similar, los agregados LC₃-positivos intensos en las fibras musculares de ratones Gaa KO no tratados significan la presencia de zonas autofágicas y acumulación de autofagia. Los agregados LC₃-positivos (rojo) se redujeron preferentemente en los ratones tratados con la co-administración de ATB200 / AT2221 en comparación con los ratones tratados con alglucosidasa alfa (Fig. 15A). Se hizo una observación similar cuando se evaluó la expresión de LC3 utilizando la transferencia Western. Como se muestra en la Fig. 15B, la mayoría de los animales tratados con ATB200 / AT2221 mostraron una disminución significativa en los niveles de LC3 II, la forma lipidada que está asociada con los autofagosomas, lo que sugiere un flujo de autofagia mejorado. En comparación, el efecto de la alglucosidasa alfa sobre la autofagia fue modesto.

También se evaluó la disferlina, una proteína implicada en la reparación de membranas y cuya deficiencia/trafico erróneo se asocia con un cierto número de distrofias musculares. Como se muestra en la Fig. 16, la disferlina (marrón) se acumuló en gran medida en el sarcoplasma de los ratones Gaa KO. En comparación con la alglucosidasa alfa, ATB200 / AT2221 fue capaz de restaurar la disferlina al sarcolema en un mayor número de fibras musculares.

Estos datos son consistentes con las mejoras a nivel celular demostradas en pacientes humanos con enfermedad de Pompe tratados con ATB200 y miglustat (p. ej., los pacientes exhiben niveles reducidos de biomarcadores de acumulación de glucógeno y lesión muscular), lo que conduce no solo a un tratamiento eficaz de la enfermedad de Pompe, sino también a una reversión en la progresión de la enfermedad. Los datos clínicos en pacientes humanos con enfermedad de Pompe se resumen en los Ejemplos 8-13 que figuran más adelante.

Ejemplo 7: Análisis de Fibra Única

Como se muestra en la Fig. 17, la mayoría de los ratones tratados con vehículo mostraron lisosomas muy agrandados (verde) (véase, por ejemplo, "B") y la presencia de acumulación autofágica masiva (rojo) (véase, por ejemplo, "A"). Los ratones tratados con Myozyme® no mostraron diferencia significativa alguna en comparación con los ratones tratados con vehículo. Por el contrario, la mayoría de las fibras aisladas de ratones tratados con ATB200 mostraron un tamaño de lisosoma drásticamente reducido (véase, por ejemplo, "C"). Además, el área con acumulación autofágica también se redujo en varios grados (véase, por ejemplo, "C"). Como resultado, una porción significativa de las fibras musculares analizadas (36-60 %) de los ratones tratados con ATB200 parecían normales o casi normales. La Tabla 8 que figura a continuación resume el análisis de fibra única mostrado en la Fig. 17.

Tabla 8. Análisis de Fibra Única

En general, los datos indican que ATB200, con su mayor contenido de M6P, tanto sola como estabilizada por la chaperona farmacológica AT2221 al pH neutro de la sangre, es más eficiente en la fijación como objetivo de tejidos y el tráfico lisosomal en comparación con la alglucosidasa alfa cuando se administra a ratones Gaa KO, consistente con la estabilización de ATB200 por AT2221 como se muestra en la Fig. 18. Como resultado, la administración de ATB200 y la co-administración de ATB200/AT2221 fue más eficaz que la alglucosidasa alfa para corregir algunas de las patologías relevantes para la enfermedad, tales como la acumulación de glucógeno, la proliferación lisosomal y la formación de zonas autofágicas. Debido a estos efectos terapéuticos positivos, se ha demostrado que la co administración de ATB200 y ATB200/AT2221 mejora la posibilidad de que la fibra muscular se recupere del daño e incluso revierta el daño mediante el aclaramiento del glucógeno que se había acumulado en la célula debido a la falta de actividad óptima de GAA. Al igual que con el Ejemplo 6, estos datos también son consistentes con las mejoras a nivel celular demostradas en pacientes humanos con enfermedad de Pompe que conducen tanto a un tratamiento eficaz de la enfermedad de Pompe como a una reversión en la progresión de la enfermedad tras la administración de ATB200 y miglustat. Los datos clínicos en pacientes humanos con enfermedad de Pompe se resumen en los Ejemplos 8-13 que figuran a continuación.

Ejemplo 8: El Ensayo ATB200-02: un estudio en seres humanos de ATB200/AT2221 en pacientes con enfermedad de Pompe

Se realizaron estudios preclínicos en ratones inactivados para Gaa para evaluar la farmacocinética (PK) y la eficiencia de la reducción de glucógeno en dosis variables de terapia de reemplazo enzimático (ERT) ATB200 y chaperona AT2221. Estos datos se utilizaron para estimar las dosis equiparables de chaperona AT2221 en seres humanos. El estudio ATB200-02 (NCT02675465) se diseñó como un estudio abierto de secuencia fija, dosis ascendente, primero en seres humanos, fase 1/2 para evaluar la seguridad, tolerabilidad, PK, farmacodinámica (PD) y eficacia de ATB200 co-administrada con AT2221 en pacientes con enfermedad de Pompe. Las Figs. 19A-19B presentan el diseño del estudio ATB200-02. Pacientes ambulatorios que han recibido previamente terapia de reemplazo enzimático con alglucosidasa alfa se denominan pacientes ambulatorios con cambio de ERT (o ambulatorios con cambio de ERT) o pacientes de la Cohorte 1. Pacientes no ambulatorios que han recibido previamente terapia de reemplazo enzimático con alglucosidasa alfa se denominan pacientes no ambulatorios con cambio de ERT (o no ambulatorios con cambio de ERT) o pacientes de la Cohorte 2. Pacientes ambulatorios que no han recibido previamente terapia de reemplazo enzimático con alglucosidasa alfa se denominan pacientes que no han sido sometidos a una ERT (o ambulatorios que no han sido sometidos a una ERT) o pacientes de la Cohorte 3.

Dieciséis sitios clínicos en cinco países participaron en el estudio ATB200-02. El estudio empleó los siguientes criterios de inclusión clave: hombres y mujeres de 18 a 65 años de edad que fueron diagnosticados con la enfermedad de Pompe en base a una deficiencia documentada de actividad enzimática GAA o por fenotipado GAA, y que habían recibido terapia de reemplazo enzimático con alglucosidasa alfa durante 2-6 años (o > 2 años para la Cohorte 2) antes del inicio del ensayo (Cohorte 1). Los sujetos elegibles eran aquellos que actualmente recibían alglucosidasa alfa con una frecuencia de cada dos semanas y que habían completado las últimas 2 infusiones sin un evento adverso (AE) relacionado con el fármaco que resultara en la interrupción de la dosis (Cohortes 1 y 2). Los sujetos debían ser capaces de caminar entre 200 y 500 metros en la prueba de marcha de 6 minutos (6MWT) (Cohortes 1 y 3), tener una capacidad vital forzada (FVC) en posición vertical de 30-80 % del valor normal predicho (Cohortes 1 y 3), o estar en silla de ruedas y no poder caminar sin ayuda (Cohorte 2). Los protocolos para la prueba 6MWT y FVC se pueden encontrar, por ejemplo, en Lachman y Schoser, Journal of Rare Diseases, 2013, 8:160, y en Bittner y Singh, The 6 Minute Walk Test, Cardiology Advisor, 2013. Fig. 19C proporciona las características de referencia para 20 sujetos. Se evaluaron la seguridad, la tolerabilidad y los biomarcadores para las Cohortes 1,2 y 3. Se evaluaron las siguientes evaluaciones funcionales para las Cohortes 1 y 3: 6MWT, otras pruebas de función motora (pruebas de tiempo y marcha-escalera-Gower-silla (GSGC)), prueba muscular manual y función pulmonar (FVC, presión inspiratoria máxima (MIP)/presión espiratoria máxima (MEP)). Los protocolos para las pruebas de tiempo y las pruebas GSGC se pueden encontrar, por ejemplo, en Lachman y Schoser, Journal of Rare Diseases, 2013, 8:160. Para la Cohorte 2, las evaluaciones funcionales incluyeron pruebas de fuerza muscular.

Ejemplo 9: Resultados PK provisionales del Ensayo ATB200-02

En la Fig.20 se proporciona un resumen de los datos farmacocinéticos para AT2221. Las concentraciones de proteína GAA total en plasma para ATB200 a 5 mg/kg, 10 mg/kg y 20 mg/kg se determinaron mediante la cuantificación validada de LC-MS/MS de rhGAA -péptido(s) "firma" específico(s) T09 (primario) y T50 (confirmatorio) para 11 pacientes de la Cohorte 1 que completaron las Fases 1 y 2, así como para cinco pacientes de la Cohorte 2 que completaron el estudio PK en la Fase 3. Para la Fase 1, se recogieron muestras de sangre para la concentración de proteína GAA total en plasma antes del inicio de la infusión de ATB200 y 1,2, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 10, 12 y 24 hora(s) después de la inicio de la infusión. Para la Fase 2 y la Fase 3, se recogieron muestras de sangre para la concentración de proteína GAA total en plasma antes del inicio de la infusión y 1,2, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 10, 12 y 24 hora(s) después de la inicio de la infusión.

También se realizaron análisis PK de AT2221 para 11 pacientes de la Cohorte 1 que completaron las Fases 1 y 2, así como para cinco pacientes de la Cohorte 2 que completaron el estudio PK en la Fase 3. Se tomaron muestras de sangre para determinar las concentraciones plasmáticas de AT2221 justo antes de la administración oral de AT2221 (tiempo 0) y 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 9, 11 y 25 hora(s) después de la administración oral de AT2221. AT2221 en plasma se determinó mediante un ensayo LC-MS/MS validado.

Como se muestra en la Fig. 21, los niveles de ATB200 aumentaron de una manera ligeramente mayor que la dosis proporcional cuando se administró sola. La co-administración de ATB200 a 20 mg/kg con una dosis alta única (260 mg) de AT2221 aumentó el área bajo la curva (AUC) de exposición a la proteína GAA total en aproximadamente un 17 %, en comparación con ATB200 a 20 mg/kg administrado sola (Fig. 21, Fig. 22C). La co-administración de ATB200 a 20 mg/kg con múltiples dosis altas (260 mg) de AT2221 aumentó el área bajo la curva (AUC) de exposición a la proteína GAA total en aproximadamente un 29 %, en comparación con ATB200 a 20 mg/kg administrado sola (Fig. 21, Fig. 22D). Se observaron aumentos en la semivida de distribución y AUC-24h parcial en la escala logarítmica, durante la fase de eliminación terminal (Fig. 21, Fig. 22A, Fig. 22B). Como se muestra en la Fig. 21, la semivida de distribución (fase a) aumentó en un 40 %, en consonancia con el efecto estabilizador de la dosis alta de AT2221 sobre ATB200 en plasma. El aumento en la semivida de distribución estuvo acompañado por un aumento en el AUC parcial desde el tiempo hasta la concentración plasmática máxima hasta 24 horas post-dosis en un 42,2 % (Fig. 21, Fig. 22B). Se observó evidencia adicional de estabilización de ATB200 por AT2221 en comparaciones de 12 y 24 horas post-dosis de AT2221 en dosis baja y alta frente a ATB200 sola (Figs. 22E y 22F). No hubo una diferencia estadísticamente significativa en la exposición total a la proteína GAA en plasma entre los pacientes que no han sido sometidos a una ERT (Cohorte 3) y los pacientes con cambio de ERT (Cohorte 1) (Fig. 23). La disposición PK del péptido distintivo T50 no difirió de la del péptido distintivo T09 (relación AUC: 1,00).

Ejemplo 10: Resultados Provisionales de Eficacia del Ensayo ATB200-02

Como se muestra en las Figs. 24A y 24B, 6MWT mejoró para pacientes ambulatorios con cambio de ERT y pacientes que no han sido sometidos a una ERT en el mes 6 con un beneficio continuo observado hasta el mes 12. 6MWT aumentó en 7/10, 8/10 y 8/8 pacientes con cambio de ERT en los meses 6 ,9 y 12, respectivamente. 6MWT aumentó en 5/5, 5/5 y 2/2 pacientes que no han sido sometidos a una ERT en los meses 6 ,9 y 12, respectivamente.

Como se muestra en la Fig. 24C, la Fig. 26A y la Fig. 26C, las mejoras en las pruebas de función motora y la fuerza muscular manual, junto con 6MWT, fueron consistentes con una mejora general en la función muscular tanto para los pacientes con cambio de ERT como para los que no han sido sometidos a una ERT a lo largo de 12 meses.

Como se muestra en la Fig. 25 y la Fig. 26B, se observaron aumentos consistentes y sustanciales en la fuerza de las extremidades superiores en todos los pacientes no ambulatorios con cambio de ERT en el mes 6 y el mes 9.

Como se muestra en la Fig. 27, la FVC se mantuvo estable o aumentó en 5/9, 6/9 y 3/7 pacientes con cambio de ERT en los meses 6, 9 y 12, respectivamente y la FVC se mantuvo estable o aumentó en 5/5, 5/5 y 2/2 pacientes que no han sido sometidos a una ERT en los meses 6, 9 y 12, respectivamente. También como se muestra en la Fig. 27, la presión inspiratoria máxima (MIP) se mantuvo estable y la presión espiratoria máxima (MEP) aumentó en pacientes ambulatorios con cambio de ERT, mientras que la MIP aumentó y la MEP se mantuvo estable en pacientes que no han sido sometidos a una ERT.

La Escala de gravedad de la fatiga (''FSS'') es un cuestionario de auto-evaluación que consiste en nueve preguntas, cada una puntuada en una escala de 1 a 7. La puntuación total varía de 9 a 63, con valores más altos que representan un mayor nivel de fatiga debido al estado de la enfermedad. El valor normativo en población sana es de aproximadamente 21 (Grace J et al. Parkinsonism Relat Disord. 2007;13:443-445). Como se muestra en la Fig. 28, todas las cohortes se vieron significativamente afectadas por la fatiga al inicio del estudio, y todas las cohortes demostraron una mejora en su FSS después de recibir ATB200/AT2221.

Ejemplo 11: Resultados Provisionales Del Ensayo ATB200-02: Marcadores de la Lesión Muscular

Se evaluaron los siguientes marcadores de daño muscular: enzima creatina quinasa (CK), alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST). Los resultados disponibles después de nueve meses del ensayo clínico se muestran en las Figs. 29A-29C (datos de un máximo de 58 semanas, 24 semanas y 36 semanas para las Cohortes 1, 2 y 3, respectivamente; los valores de n más bajos reflejan que algunos datos no pudieron analizarse o aún no se analizaron). Las reducciones medias desde el inicio observadas en estos momentos respectivos fueron de aproximadamente 30-35 % para los pacientes con cambio de ERT ambulatorio (n = 9), 5-20 % para los pacientes con cambio de ERT no ambulatorio (n = 4) y 40-55 % para los pacientes que no han sido sometidos a una ERT (n = 5). Los resultados para la enzima CK disponibles después de doce meses del ensayo clínico se muestran en la Fig. 29D (datos de un máximo de 12 meses para las Cohortes 1, 2 y 3; los valores de n más bajos reflejan que algunos datos no pudieron analizarse o aún no se analizaron).

El tetrasacárido de hexosa en orina (Hex4) se evaluó como un marcador de la acumulación de glucógeno. Los resultados para Hex4 disponibles después de doce meses del ensayo clínico se muestran en la Fig. 29D (datos de un máximo de 12 meses para las Cohortes 1, 2 y 3; los valores de n más bajos reflejan que algunos datos no pudieron analizarse o aún no se analizaron).

Ejemplo 12: Resultados Provisionales de Seguridad del Ensayo ATB200-02

La duración más larga del tratamiento fue de más de 20 meses. Los eventos adversos (AEs) fueron generalmente leves y transitorios, con una tasa muy baja de reacciones asociadas a la infusión (menos del 1 %) después de más de 400 infusiones en total en las tres Cohortes. Estas incidencias fueron controladas por premedicación estándar.

Los AEs más comunes reseñados como relacionados con el tratamiento hasta las 72 semanas fueron náuseas (3/20), temblor (3/20), dolor de cabeza (3/20), fatiga (3/20), diarrea (2/20), espasmo muscular (2/20) e inflamación de las articulaciones (2/20).

Los AEs más comunes reseñados como relacionados con el tratamiento hasta los 20 meses o más fueron dolor abdominal (incluyendo dolor abdominal superior e inferior) (8/20), diarrea (8/20), nasofaringitis (6/20), náuseas (5/20), dolor de cabeza (5/20) e infección del tracto respiratorio superior (5/20) (Fig. 30). Se notificó un AE grave, que no estaba relacionado con el fármaco del estudio (hospitalización por infección del tracto respiratorio inferior). Ningún paciente abandonó el estudio debido a un AE.

Hubo tres incidentes de reacciones asociadas a la infusión (IARs, por sus siglas en inglés) en más de 550 infusiones, que se controlaron con premedicación estándar. Se produjo un evento de IAR (decoloración de la piel) en un paciente con cambio de ERT no ambulatorio (Cohorte 2). Dos eventos IAR (prurito localizado, eritema y sensación de ardor) ocurrieron en un paciente que no ha sido sometido a una ERT (Cohorte 3) (Fig. 30).

Ejemplo 13: Resumen y Conclusiones de los Resultados Provisionales del Ensayo ATB200-02

Como se resume en la Fig. 31, existe concordancia en los datos provisionales del ensayo ATB200-02 que muestran mejoras paralelas significativas e inesperadas en los marcadores de lesión muscular y acumulación de sustrato, pruebas de función muscular (pruebas cronometradas y resistencia), fuerza muscular manual y estabilización y/o mejora en las pruebas de función respiratoria en las diferentes cohortes. La función muscular mejoró en 16/18 y 10/10 pacientes a los 6 y 9 meses, respectivamente. Los aumentos en la distancia de 6MWT fueron consistentes y duraderos en pacientes ambulatorios con cambio de ERT y pacientes que no han sido sometido a una ERT hasta el mes 12, al igual que las mejoras en otras pruebas de función motora en pacientes ambulatorios con cambio de ERT y que no han sido sometidos a una ERT. Medidas cualitativas y cuantitativas mostraron aumentos en la fuerza de las extremidades superiores en pacientes no ambulatorios con cambio de ERT a los 6 y 9 meses. FVC, MIP y MEP generalmente se mantuvieron estables en pacientes con cambio de ERT y aumentaron en pacientes que no han sido sometidos a una ERT. Se observó una mejora en la puntuación de fatiga en todas las cohortes. Los niveles de biomarcadores (p. ej., niveles de CK y Hex4) disminuyeron en todas las cohortes y, en general, ATB200/AT2221 fue bien tolerada.

Por lo tanto, el impacto multidimensional de la terapia sugiere que el régimen combinado de ATB200/AT2221 tiene el potencial de ser una opción de tratamiento importante para pacientes con enfermedad de Pompe. Estos resultados clínicos respaldan los resultados de los estudios de análisis de fibras individuales descritos en el Ejemplo 7, que demuestran que el tratamiento es eficaz para aclarar la patología de las fibras musculares. El estudio adicional del ensayo clínico está en curso.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una población de moléculas de a-glucosidasa ácida humana recombinante (rhGAA) para uso en el tratamiento de la enfermedad de Pompe en un sujeto que lo necesite, en donde las moléculas de rhGAA se producen a partir de células de ovario de hámster chino (CHO);

en donde las moléculas de rhGAA comprenden siete sitios potenciales de N-glicosilación;

en donde las moléculas de rhGAA en promedio comprenden 3-4 residuos de manosa-6-fosfato (M6P);

en donde las moléculas de rhGAA en promedio comprenden al menos aproximadamente 0,5 moles de bis-manosa-6-fosfato (bis-M6P) por mol de rhGAA en el primer sitio potencial de N-glicosilación según se determina utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS);

en donde la población de moléculas de rhGAA se administra concurrentemente o secuencialmente con una chaperona farmacológica, y en donde la chaperona farmacológica es miglustat o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde la población de moléculas de rhGAA se administra por vía intravenosa a una dosis de aproximadamente 20 mg/kg y el miglustat o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra por vía oral a una dosis de aproximadamente 260 mg; y en donde

(i) el sujeto es un paciente con cambio de ERT y, en comparación con el valor de referencia, la función pulmonar del sujeto, medida mediante una prueba de capacidad vital forzada (FVC) en posición vertical, es estable o mejora seis meses después del tratamiento; y/o

(ii) el sujeto es un paciente de cambio de ERT ambulatorio y, en comparación con el valor de referencia, los niveles de creatina quinasa del sujeto seis meses después del tratamiento se reducen al menos un 15 %; y/o

(iii) el sujeto es un paciente de cambio de ERT ambulatorio y, en comparación con el valor de referencia, los niveles de creatina quinasa del sujeto seis meses después del tratamiento se reducen al menos un 20 %; y/o

(iv) el sujeto es un paciente de cambio de ERT ambulatorio y, en comparación con el valor de referencia, los niveles de tetrasacárido de hexosa en la orina del sujeto seis meses después del tratamiento se reducen al menos un 35 %.

2. La composición para uso de la reivindicación 1, en donde el miglustat o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra antes de la administración de la rhGAA.

3. La composición para uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las moléculas de rhGAA comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 95 % a SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:5.

4. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las moléculas de rhGAA comprenden en promedio de aproximadamente 0,5 moles a aproximadamente 7,0 moles de mono-M6P o bis-M6P por mol de rhGAA, según se determina utilizando LC-MS/MS.

5. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las moléculas de rhGAA comprenden en promedio al menos 2,5 moles de M6P por mol de rhGAA y al menos 4 moles de ácido siálico por mol de rhGAA, según se determina utilizando LC-MS/MS.

6. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde, por mol de rhGAA, las moléculas de rhGAA comprenden en promedio:

(a) aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 moles de mono-M6P en el segundo sitio potencial de N-glicosilación; (b) aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 moles de bis-M6P en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación; y (c) aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,4 moles de mono-M6P en el cuarto sitio potencial de N-glicosilación; en donde (a)-(c) se determinan utilizando LC-MS/MS.

7. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde, por mol de rhGAA, las moléculas de rhGAA comprenden, además, aproximadamente 4 moles a aproximadamente 7,3 moles de ácido siálico; y en donde, por mol de rhGAA, las moléculas de rhGAA comprenden en promedio:

(a) aproximadamente 0,9 a aproximadamente 1,2 moles de ácido siálico en el tercer sitio potencial de N-glicosilación; (b) aproximadamente 0,8 a aproximadamente 0,9 moles de ácido siálico en el quinto sitio potencial de N-glicosilación; y

(c) aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4,2 moles de de ácido siálico en el sexto sitio potencial de N-glicosilación; en donde (a)-(c) se determinan utilizando LC-MS/MS.

8. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la población de moléculas de rhGAA se formula en una composición farmacéutica, y en donde la composición farmacéutica comprende, además, al menos un tampón seleccionado del grupo que consiste en un citrato, un fosfato y una combinación de los mismos, y al menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en manitol, polisorbato 80 y una combinación de los mismos; en donde la composición farmacéutica tiene un pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 7,0.

9. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde, en la composición farmacéutica, la población de moléculas de rhGAA está presente en una concentración de aproximadamente 5-50 mg/mL, el al menos un tampón es un tampón citrato de sodio presente en una concentración de aproximadamente 10-100 mM, el al menos un excipiente es manitol presente en una concentración de aproximadamente 10-50 mg/mL y polisorbato 80 presente en una concentración de aproximadamente 0,1-1 mg/mL, y la composición farmacéutica comprende, además, agua y, opcionalmente, comprende un agente acidificante y/o un agente alcalinizante; en donde la composición farmacéutica tiene un pH de aproximadamente 6,0.