BR112019024125A2

BR112019024125A2 - Alfa-glicosidase ácida humana recombinante

Info

Publication number: BR112019024125A2
Application number: BR112019024125-6A
Authority: BR
Inventors: Do Hung; Gotschall Russell; Khanna Richie; Lun Yi; Char Hing; Tesler Sergey; Sunderland Wendy; Diloné Enrique
Original assignee: Amicus Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-05-15
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2020-06-02
Also published as: IL270530B2; KR20200004414A; AU2018270925A1; EP3624831A4; EP3624831A1; WO2018213340A1; US20210393747A1; EP4223310A3; PT3624831T; DK3624831T5; CL2019003251A1; HUE062504T2; TW201900208A; CN111356474A; IL310719A; IL270530A; ZA201907552B; IL270530B1; EP3624831B1; PL3624831T3

Abstract

são fornecidas uma a-glicosidase ácida recombinante e composição farmacêutica compreendendo uma a-glicosidase ácida recombinante, em que a a-glicosidase ácida recombinante é expressada em células de ovário de hamster chinês (cho) e compreende um conteúdo aumentado de unidades de n-glicano contendo um ou dois resíduos de manose-6-fosfato quando comparados a um conteúdo de unidades de n-glicano compreendendo um ou dois resíduos de manose-6-fosfato de alfa-alglicosidase. também são aqui fornecidos métodos de produção, purificação e formulação da a-glicosidase ácida recombinante ou composição farmacêutica para administração a um indivíduo e métodos de tratamento de uma doença ou distúrbio, tal como a doença de pompe, usando a a-glicosidase ácida recombinante ou composição farmacêutica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: ALFAGLICOSIDASE ÁCIDA HUMANA RECOMBINANTE REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provisório No. de Série U.S. 62/506.561 depositado em 15 de maio de 2017, Pedido Provisório No. de Série U.S. 62/506.569 depositado em 15 de maio de 2017, Pedido Provisório No. de Série U.S. 62/506.574 depositado em 15 de maio de 2017, Pedido Provisório No. de Série U.S. 62/564.083 depositado em 27 de setembro de 2017, Pedido Provisório No. de Série U.S. 62/567.334 depositado em 3 de outubro de 2017, Pedido Provisório No. de Série U.S. 62/618.021 depositado em 16 de janeiro de 2018, Pedido Provisório No. de Série U.S. 62/624.638, depositado em 31 de janeiro de 2018, e Pedido Provisório No. de Série U.S. 62/660.758, depositado em 20 de abril de 2018, para cada um dos quais é reivindicada prioridade e cada um é incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção envolve os campos da medicina, genética e bioquímica da glicoproteína recombinante e, especificamente, se refere a composições de a-glicosidase humana recombinante (rhGAA) que possuem um conteúdo total mais alto de N-glicanos contendo manose-6-fosfato que têm como alvo eficiente O CIMPR nas células e subsequentemente

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2/150 entrega rhGAA aos lisossomos, onde pode quebrar níveis anormalmente altos de glicogênio acumulado. O rhGAA da invenção exibe captação superior nas células musculares e entrega subsequente aos lisossomos em comparação com os produtos rhGAA convencionais e exibe outras propriedades farmacocinéticas que o tornam particularmente eficaz para a terapia de substituição enzimática de indivíduos com doença de Pompe.

[003] A presente invenção também fornece um método para o tratamento da doença de Pompe compreendendo a administração a um indivíduo de uma combinação de um rhGAA e uma chaperona farmacológica. Por exemplo, em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método para o tratamento da doença de Pompe compreendendo a administração a um indivíduo de uma combinação de rhGAA e miglustat. O rhGAA da invenção exibe uma eficácia surpreendente no tratamento e reversão da progressão da doença em indivíduos que sofrem da doença de Pompe. ANTECEDENTES

[004] A doença de Pompe é uma doença hereditária de armazenamento lisossômico que resulta de uma deficiência na atividade da α-glicosidase ácida (GAA). Uma pessoa com doença de Pompe não possui ou tem níveis reduzidos de a-glicosidase ácida (GAA), a enzima que decompõe glicogênio em glicose, principal fonte de energia para os músculos. Essa deficiência

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3/150 enzimática causa acúmulo excessivo de glicogênio nos lisossomos, que são organelas intracelulares contendo enzimas que normalmente quebram o glicogênio e outros detritos celulares ou produtos residuais. O acúmulo de glicogênio em certos tecidos de um indivíduo com doença de Pompe, especialmente músculos, prejudica a capacidade das células de funcionar normalmente. Na Doença de Pompe, o glicogênio não é adequadamente metabolizado e acumula-se progressivamente nos lisossomos, principalmente nas células musculares esqueléticas e, na forma inicial da doença, nas células cardíacas. O acúmulo de glicogênio danifica as células musculares e nervosas, bem como as de outros tecidos afetados.

[005] Tradicionalmente, dependendo da idade de início, a doença de Pompe é clinicamente reconhecida como uma forma infantil precoce ou como uma forma de início tardio. A idade de início tende a ser paralela à gravidade da mutação genética que causa a Doença de Pompe. As mutações genéticas mais graves causam perda completa da atividade do GAA e se manifestam como doença de início precoce durante a infância. Mutações genéticas que diminuem a atividade do GAA, mas não o eliminam completamente, estão associadas a formas da doença de Pompe com atraso no início e progressão. A doença de Pompe de início infantil manifesta-se logo após o nascimento e é caracterizada por fraqueza muscular, insuficiência

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4/150 respiratória e insuficiência cardíaca. Não tratado, geralmente é fatal dentro de dois anos. A doença de Pompe de início juvenil e adulta se manifesta mais tarde na vida e geralmente progride mais lentamente do que a doença de início infantil. Essa forma da doença, embora geralmente não afete o coração, também pode resultar em morte, devido ao enfraquecimento dos músculos esqueléticos e daqueles envolvidos na respiração.

[006] O tratamento não paliativo atual da doença de Pompe envolve terapia de reposição enzimática (TRE) usando GAA humano recombinante (rhGAA), conhecido como Lumizyme®, Myozyme® ou alglicosidase alfa. Essa terapia convencional de reposição enzimática procura tratar a doença de Pompe, substituindo o GAA ausente nos lisossomos, administrando rhGAA, restaurando assim a capacidade das células de decompor o glicogênio lisossômico. Lumizyme® e Myozyme® são formas convencionais de rhGAA produzidas ou comercializadas como produtos biológicos pela Genzyme e aprovadas pela US Food and Drug Administration, e são descritas por referência à Physician's Desk Reference (2014) (que é aqui incorporada por referência). Alglicosidase alfa é identificada como nome químico [199-arginina, 223-histidina]prepro-a-glicosidase (humana) ; fórmula molecular, C4758H7262N1274O1369S35; Número CAS 420794-05-0. Esses produtos são administrados a indivíduos com doença de Pompe, também conhecida como doença de

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5/150 armazenamento de glicogênio tipo II (GSD-II) ou doença por deficiência de maltase ácida.

[007] A captação celular de uma molécula de rhGAA é facilitada pelo carboidrato especializado, manose-6-fosfato (M6P), que se liga ao receptor independente de cátions da manose-6-fosfato (CIMPR) presente nas células-alvo, como as células musculares. Após a ligação, a molécula de rhGAA é absorvida pelas células alvo e subsequentemente transportada para os lisossomos dentro das células. A maioria dos produtos rhGAA convencionais, no entanto, carece de um alto conteúdo total de N-glicanos contendo mono-M6P e bis-M6P (ou seja, Nglicanos com um resíduo de M6P ou N-glicanos com dois resíduos de M6P, respectivamente), o que limita sua captação celular via CIMPR e liberação lisossômica, tornando a terapia de reposição enzimática convencional insuficientemente eficaz. Por exemplo, enquanto os produtos rhGAA convencionais em doses de 20 mg/kg ou mais melhoram alguns aspectos da doença de Pompe, eles não são capazes de adequadamente, entre outras coisas, (i) tratar a disfunção celular subjacente, (ii) restaurar a estrutura muscular, ou (iii) reduzir o glicogênio acumulado em muitos tecidos-alvo, como músculos esqueléticos, para reverter a progressão da doença. Além disso, doses mais altas podem impor encargos adicionais ao paciente, bem como profissionais médicos que o tratam, como prolongar o tempo de infusão necessário para

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6/150 administrar o rhGAA por via intravenosa. Continua a haver necessidade de melhorias adicionais na terapia de reposição enzimática para o tratamento da doença de Pompe, como o rhGAA com melhor captação de tecidos, atividade enzimática aprimorada, estabilidade aprimorada ou imunogenicidade reduzida.

[008] A glicosilação de GAA ou rhGAA pode ser enzimaticamente modificada in vitro pela fosfotransferase e enzimas reveladoras descritas por Canfield, et al., Patente U.S. No. 6.534.300, para gerar grupos M6P. A glicosilação enzimática não pode ser adequadamente controlada e pode produzir rhGAA com propriedades imunológicas e farmacológicas indesejáveis. O rhGAA modificado enzimaticamente pode conter apenas oligossacarideo de alta manose que pode ser potencialmente fosforilado enzimaticamente in vitro com uma fosfotransferase ou enzima reveladora e pode conter, em média, 5-6 grupos M6P por GAA. Os padrões de glicosilação produzidos pelo tratamento enzimático in vitro do GAA são problemáticos porque os resíduos de manose terminal adicionais, particularmente os resíduos de manose terminal não fosforilados, afetam negativamente a farmacocinética do rhGAA modificado. Quando um produto enzimaticamente modificado é administrado in vivo, esses grupos de manose aumentam a depuração não produtiva do GAA, aumentam a captação do GAA enzimaticamente

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7/150 modificado pelas células imunológicas e reduzem a eficácia terapêutica do rhGAA devido à menor quantidade de GAA atingindo os tecidos-alvo, como miócitos do músculo esquelético. Por exemplo, os resíduos terminais de manose não fosforilados são ligantes conhecidos para os receptores de manose no fígado e baço, o que leva à rápida depuração do rhGAA modificado enzimaticamente e ao direcionamento reduzido do rhGAA para o tecido alvo. Além disso, o padrão de glicosilação de GAA enzimaticamente modificado com Nglicanos de manose altos com resíduos de manose não fosforilados terminais se assemelha ao das glicoproteínas produzidas em leveduras e bolores, e aumenta o risco de desencadear respostas imunes ou alérgicas, tais como reações alérgicas severas com risco de vida (anafiláticas) ou reações de hipersensibilidade, ao rhGAA enzimaticamente modificado.

[009] Em vista dessas deficiências dos produtos rhGAA convencionais e dos métodos in vitro para fosforilar o rhGAA, os inventores procuraram diligentemente e identificaram maneiras de produzir rhGAA com um perfil N-glicano otimizado para maior biodistribuição e captação lisossômica e, assim, minimizar a liberação não produtiva do rhGAA uma vez administrado. A presente invenção fornece aos pacientes com Pompe estáveis ou em declínio uma terapia eficaz que reverte a progressão da doença no nível celular. Os inventores também relatam que o rhGAA da presente invenção reverte a progressão

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8/150 da doença - incluindo a eliminação mais eficiente do glicogênio lisossômico do que o atual padrão de tratamento e que os pacientes tratados com o rhGAA da presente invenção exibem melhorias surpreendentes e significativas na saúde, incluindo melhorias no força muscular, função motora e/ou função pulmonar e/ou incluindo uma reversão na progressão da doença, como demonstrado em vários resultados de eficácia (por exemplo, Exemplos 10 e 11) dos estudos clínicos.

SUMÁRIO

[010] A presente invenção se refere a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio como a doença de Pompe em um indivíduo, compreendendo a administração de uma população de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA).

[011] As moléculas de rhGAA aqui descritas podem ser expressas em células de ovário de hamster chinês (CHO) e compreendem sete sítios potenciais de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o perfil de N-glicosilação de uma população de moléculas de rhGAA como aqui descrito é determinado usando espectrometria de massa em cromatografia líquida-tandem (LC-MS/MS). Em algumas modalidades, as moléculas de rhGAA compreendem em média 3-4 resíduos de manose-6-fosfato (M6P). Em algumas modalidades, as moléculas de rhGAA compreendem em média cerca de pelo menos 0,5 mol de

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9/150 grupos N-glicano fosforilados (bis-M6P) por mol de rhGAA no primeiro sitio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, pelo menos 30% das moléculas das moléculas de rhGAA compreendem uma ou mais unidades de Nglicano contendo um ou dois resíduos de M6P. Em algumas modalidades, as moléculas de rhGAA compreendem, em média, de cerca de 0,5 mol a cerca de 7,0 mol de unidades de N-glicano contendo um ou dois resíduos de M6P por mol de rhGAA. Em algumas modalidades, as moléculas de rhGAA compreendem em média pelo menos 2,5 moles de resíduos de M6P por mole de rhGAA e pelo menos 4 moles de resíduos de ácido siálico por mole de rhGAA. Em algumas modalidades, as moléculas de rhGAA compreendendo uma média de 3-4 resíduos de M6P por molécula e uma média de pelo menos 0,5 mol de bis-M6P por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de N-glicosilação compreendem ainda uma média de cerca de 0,4 a cerca de 0,6 mol de Nglicanos monofosforilados (mono-M6P) por mol rhGAA no segundo sítio potencial de N-glicosilação, cerca de 0,4 a cerca de 0, 6 mol bis-M6P por mol rhGAA no quarto sítio potencial de N-glicosilação e cerca de 0,3 a cerca de 0,4 mol de mono-M6P por rhGAA mol no quarto sítio potencial de

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N-glicosilação. Em algumas modalidades, as moléculas de rhGAA compreendem ainda, em média, cerca de 4 mol a cerca de 7,3 mol de resíduos de ácido siálico por mol de rhGAA, incluindo cerca de 0,9 a cerca de 1,2 mol de ácido siálico por mol rhGAA no terceiro sítio potencial de N-glicosilação, cerca de 0,8 a cerca de 0,9 mol de ácido siálico por mol rhGAA no quinto sítio de N-glicosilação potencial e cerca de 1,5 a cerca de 4,2 mol de ácido siálico por mol rhGAA no sexto sítio de N-glicosilação potencial. Em algumas modalidades, a população de moléculas de RhGAA é formulada em uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica que compreende uma população de moléculas de rhGAA compreende ainda pelo menos um tampão selecionado do grupo que consiste em um citrato, um fosfato e uma combinação dos mesmos e pelo menos um excipiente selecionado do grupo que consiste em manitol, polissorbato 80, e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o pH da composição farmacêutica é de cerca de 5,0 a cerca de 7,0, cerca de 5,0 a cerca de 6,0 ou cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda água, um agente acidificante, um agente alcalinizante ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem um pH de 6,0 e compreende cerca de 5-50 mg/mL da população de moléculas de rhGAA, cerca de 10-100 mM de um tampão de citrato de sódio, cerca de 10-50 mg/mL de

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11/150 manitol, cerca de 0,1-1 mg/mL de polissorbato 80 e água e, opcionalmente, compreende um agente acidificante e/ou agente alcalinizante. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica tem um pH de 6,0 e compreende cerca de 15 mg/mL da população de moléculas de rhGAA, cerca de 25 mM de um tampão de citrato de sódio, cerca de 20 mg/mL de manitol, cerca de 0,5 mg/mL de polissorbato 80, e água, e opcionalmente compreende um agente acidificante e/ou agente alcalinizante.

[012] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada a uma dose de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg. Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada a uma dose de cerca de 20 mg/kg. Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada bimestralmente, mensalmente, duas vezes por semana, semanalmente, duas vezes por semana ou diariamente, por exemplo, duas vezes por semana. Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada por via intravenosa.

[013] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada simultaneamente ou sequencialmente com um chaperona farmacológica como miglustat (também referido como AT2221) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o miglustat ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via

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12/150 oral, por exemplo, em uma dose de cerca de 200 mg a cerca de 600 mg e, opcionalmente, cerca de 260 mg. Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada por via intravenosa a uma dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e o miglustat ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via oral a uma dose de cerca de 233 mg a cerca de 500 mg. Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada por via intravenosa a uma dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e o miglustat ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via oral a uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 200 mg. Em uma modalidade, a população de moléculas de rhGAA é administrada por via intravenosa a uma dose de cerca de 20 mg/kg e o miglustat ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via oral a uma dose de cerca de 260 mg. Em algumas modalidades, o miglustat ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado antes de (por exemplo, cerca de uma hora antes da administração da população de moléculas de rhGAA. Em pelo menos uma modalidade, o indivíduo jejua por pelo menos duas horas antes e pelo menos duas horas após a administração de miglustat ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

[014] Modalidades da invenção demonstram a eficácia do rhGAA aqui descrito para tratar e reverter a progressão da doença em um indivíduo com doença de Pompe.

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[015] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de reverter a progressão da doença em um indivíduo. Por exemplo, após o tratamento, um músculo ou fibra muscular no indivíduo exibe tamanho lisossômico reduzido e/ou uma resolução do acúmulo autofágico. Em algumas modalidades, após o tratamento, menos de 65% das fibras musculares analisadas no indivíduo apresentam acúmulo autofágico. Em algumas modalidades, após o tratamento, pelo menos 36% das fibras musculares analisadas no indivíduo têm aparência normal ou quase normal. Em algumas modalidades, o indivíduo experimentando uma reversão na progressão da doença após o tratamento é um paciente com ERT-switch, por exemplo, um paciente com ERT-switch que havia sido tratado anteriormente com alglicosidase alfa por pelo menos dois anos.

[016] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de reduzir o conteúdo de glicogênio em um músculo do indivíduo mais rapidamente do que a mesma dosagem de alglicosidase alfa. O rhGAA pode reduzir o conteúdo de glicogênio pelo menos cerca de 1,25, 1,5, 1,75, 2,0 ou 3,0 vezes mais rápido que a mesma dosagem de alglicosidase alfa. Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem mais capaz de reduzir o conteúdo de glicogênio em um músculo do indivíduo de forma mais eficaz do que a alglicosidase

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14/150 alfa administrada na mesma dosagem quando avaliada após uma, duas, três, quatro, cinco ou seis administrações. Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA reduz o conteúdo de glicogênio em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 50%, 75% ou 90% mais efetivamente do que a alglicosidase alfa administrada na mesma dosagem. Em algumas modalidades, após o tratamento, o indivíduo exibe níveis mais baixos do biomarcador de acumulação de glicogênio na urina tetrassacarídeo de hexose (Hex4). Em pelo menos uma modalidade, os níveis de Hex4 no indivíduo são reduzidos em pelo menos 30% seis meses após o tratamento em relação à linha de base. Por exemplo, um paciente ambulatorial ou não ambulatorial previamente tratado com terapia de reposição enzimática (um paciente com chave de ERT) pode exibir uma redução nos níveis de Hex4 de pelo menos 35% em seis meses após o tratamento em relação à linha de base. Em outro exemplo, um paciente ambulatorial que ainda não recebeu terapia de reposição enzimática (um paciente ingênuo da ERT) pode exibir uma redução nos níveis de Hex4 de pelo menos 45% em seis meses após o tratamento em relação à linha de base.

[017] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de melhorar a função motora no indivíduo. A melhoria da função motora pode ser medida por um teste de função motora, como um teste de caminhada de seis minutos (6MWT), um teste Timed up and go,

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15/150 um teste de subida de quatro degraus, um teste de caminhada de dez metros, um teste de gower, um teste gait-stair-gowerchair (GSGC) ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o indivíduo seis meses após o tratamento (quando comparado com a linha de base) mostra um aumento na distância de 6MWT de pelo menos 20 metros, uma diminuição do tempo de teste Timed up and go de pelo menos 1 segundo, uma diminuição no tempo de teste de subida de quatro degraus de pelo menos 0,6 segundos, uma diminuição do tempo de teste de caminhada de dez metros de pelo menos 0,7 segundos, uma redução do tempo de teste de gower de pelo menos 1 segundo e/ou uma diminuição da pontuação GCSC de pelo menos 1. Por exemplo, um paciente ambulatorial ERT-switch, seis meses após o tratamento (em comparação à linha de base), pode exibir um aumento de 6MWT de pelo menos 20 metros, uma diminuição do tempo de teste Timed up and go de pelo menos 1,5 segundos, uma diminuição do tempo de teste de subida de quatro degraus de pelo menos 0,6 segundos , e/ou uma diminuição do tempo de teste de gower de pelo menos 1 segundo. Em outro exemplo, um paciente ambulatorial sem terapia ERT, seis meses após o tratamento (comparado à linha de base), pode exibir um aumento na distância de 6MWT de pelo menos 40 metros, uma diminuição de tempo de teste Timed up and go de pelo menos 1 segundo, uma diminuição no tempo de teste de subida de quatro degraus de pelo menos 0, 6 segundos, uma diminuição no

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16/150 tempo de teste de caminhada de dez metros de pelo menos 0,7 segundos e/ou uma diminuição na pontuação no GSGC de pelo menos 1. Em algumas modalidades, um paciente com ERT-switch exibe uma melhoria em pelo menos um teste de função motora após o tratamento em relação ao resultado do teste de função motora do paciente após uma ERT anterior com alglicosidase alfa.

[018] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de melhorar a força da parte superior do corpo no indivíduo. Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada a um indivíduo ambulatorial e é ainda capaz de melhorar a força corporal inferior e/ou força corporal total no indivíduo.

[019] Em algumas modalidades, a melhoria na força da parte superior do corpo é medida usando um escore de força muscular manual. O escore de força muscular manual de um indivíduo pode melhorar em pelo menos 1 (para um paciente ERT-switch ambulatorial) ou pelo menos 5,5 (para um paciente ERT-switch não ambulatorial) seis meses após o tratamento em relação à linha de base. Em algumas modalidades, um paciente com ERT-switch exibe uma melhora na força da parte superior do corpo após o tratamento em relação à força da parte superior do corpo do paciente após uma ERT anterior com alglicosidase alfa.

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[020] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de melhorar a força da extremidade superior como medida por teste muscular quantitativo ou teste muscular manual da adução do ombro, no caso de abdução, flexão do cotovelo e/ou extensão do cotovelo. Por exemplo, aos seis meses após o tratamento em relação à linha de base, um paciente com ERT-switch não ambulatorial pode exibir uma melhora na adução do ombro de pelo menos 8 libras de força, uma melhora na abdução do ombro de pelo menos 1 libra de força, uma melhora no cotovelo flexão de pelo menos 2 libras de força e/ou uma melhoria na extensão do cotovelo de pelo menos 5 libras de força.

[021] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de melhorar a função pulmonar no indivíduo. A melhoria da função motora pode ser medida por um teste de função pulmonar, como um teste de capacidade vital forçada na posição vertical (sentada), um teste de pressão expiratória máxima (MEP), um teste de pressão inspiratória máxima (MIP) ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o indivíduo seis meses após o tratamento (quando comparado à linha de base) mostra uma melhora na FVC de pelo menos 4%, uma melhora na MEP de pelo menos 16 cmH20 e/ou uma melhora na MIP de pelo menos 0,3 cmH20. Por exemplo, um paciente ambulatorial de ERTswitch, seis meses após o tratamento (comparado à linha de

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18/150 base), pode exibir uma melhora na MEP de pelo menos 16 cmUO. Em outro exemplo, um paciente ambulatorial sem uso de ERT, seis meses após o tratamento (comparado ao basal), pode exibir uma melhora na FVC de pelo menos 4% e/ou uma melhora na MIP de pelo menos 11 cmípO. Em algumas modalidades, um paciente com ERT-switch exibe uma melhora em pelo menos um teste de função pulmonar após o tratamento em relação ao resultado do teste de função pulmonar do paciente após um ERT anterior com alglicosidase alfa.

[022] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de reduzir a fadiga no indivíduo, conforme medido de acordo com uma pontuação na escala de gravidade da fadiga (FSS) . Por exemplo, o indivíduo pode ser um paciente ERT-switch não ambulatorial e exibir uma diminuição na pontuação do FSS de pelo menos 3,5 a seis meses após o tratamento em relação à linha de base. Em outro exemplo, o indivíduo pode ser um paciente ERT-switch ambulatorial e exibir uma diminuição na pontuação do FSS de pelo menos 8 a seis meses após o tratamento em relação à linha de base. Em ainda outro exemplo, o indivíduo pode ser um paciente ambulatorial que não usa ERT e exibe uma diminuição na pontuação do FSS de pelo menos 5 a seis meses após o tratamento em relação à linha de base. Em algumas modalidades, um paciente com ERTswitch exibe uma pontuação FSS mais baixa após o tratamento

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19/150 em relação à pontuação FSS do paciente após uma ERT anterior com alglicosidase alfa.

[023] Em algumas modalidades, a população de moléculas de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de reduzir os níveis de pelo menos um biomarcador de lesão muscular, por exemplo creatina quinase (CK), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) ou um combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os níveis de CK do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 15% em relação à linha de base, os níveis de ALT do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 5% em relação à linha de base e/ou os níveis de AST em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 5% em relação à linha de base. Por exemplo, o indivíduo pode ser um paciente ERT-switch ambulatorial e exibir uma redução nos níveis de CK de pelo menos 15%, uma redução nos níveis de ALT de pelo menos 15% e/ou uma redução nos níveis de AST de pelo menos 10% seis meses após o tratamento em relação à linha de base. Em outro exemplo, o indivíduo pode ser um paciente ERT-switch não ambulatorial e exibir uma redução nos níveis de CK de pelo menos 20%, uma redução nos níveis de ALT de pelo menos 5% e/ou uma redução nos níveis de AST de pelo menos 5 % em seis meses após o tratamento em relação à linha de base. Em ainda outro exemplo, o indivíduo pode ser um paciente ambulatorial que não usa ERT e exibe uma

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20/150 redução nos níveis de CK de pelo menos 35%, uma redução nos níveis de ALT de pelo menos 35% e/ou uma redução nos níveis de AST de pelo menos 30% aos seis meses após o tratamento em relação à linha de base.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[024] A Figura IA mostra N-glicano de alta manose não fosforilado, um N-glicano mono-M6P e um N-glicano bis-M6P. A Figura 1B mostra a estrutura química do grupo M6P. Cada quadrado representa N-acetilglicosamina (GlcNAc), cada círculo representa manose e cada P representa fosfato.

[025] A Figura 2A descreve o direcionamento produtivo de rhGAA via N-glicanos portadores de M6P para atingir tecidos (por exemplo, tecidos musculares de indivíduos com Doença de Pompe). A Figura 2B descreve a depuração não produtiva do medicamento para tecidos não-alvo (por exemplo, fígado e baço) ou pela ligação de N-glicanos não M6P a tecidos nãoalvo .

[026] A Figura 3 é um diagrama esquemático de um processo exemplar para a fabricação, captura e purificação de uma proteína lisossômica recombinante.

[027] A Figura 4 mostra um construto de DNA para transformar células CHO com DNA que codifica rhGAA.

[028] A Figura 5 é um gráfico que mostra os resultados da cromatografia de afinidade CIMPR de ATB200 rhGAA com

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21/150 (Modalidade 2) e sem captura (Modalidade 1) em uma coluna de troca aniônica (AEX).

[029] As Figuras 6A-6H mostram os resultados de uma análise de N-glicosilação específica do sítio de ATB200 rhGAA, usando duas técnicas analíticas diferentes de LCMS/MS. A Figura 6A mostra a ocupação do sítio dos sete locais potenciais de N-glicosilação para ATB200. A Figura 6B mostra duas análises do perfil de N-glicosilação do primeiro sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 6C mostra duas análises do perfil de N-glicosilação do segundo sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 6D mostra duas análises do perfil de N-glicosilação do terceiro sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 6E mostra duas análises do perfil de N-glicosilação do quarto sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 6F mostra duas análises do perfil de N-glicosilação do quinto sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 6G mostra duas análises do perfil de N-glicosilação do sexto sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 6H resume a porcentagem relativa de espécies monofosforiladas e bisfosforiladas para o primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto sítios potenciais de N-glicosilação.

[030] A Figura 7 é um gráfico que mostra os perfis de eluição Polywax de Lumizyme® (alglicosidase alfa, linha mais

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22/150 fina, eluindo para a esquerda) e ATB200 (linha mais espessa, eluindo para a direita).

[031] A Figura 8 é uma tabela que mostra um resumo das estruturas de N-glicano de Lumizyme® em comparação com três preparações diferentes de ATB200 rhGAA, identificadas como BP-rhGAA, ATB200-1 e ATB200-2.

[032] As Figuras 9A e 9B são gráficos que mostram os resultados da cromatografia de afinidade CIMPR de Lumizyme® e Myozyme®, respectivamente.

[033] A Figura 10A é um gráfico comparando a afinidade de ligação CIMPR do ATB200 rhGAA (traço esquerdo) com a do Lumizyme® (traço direito). A Figura 10B é uma tabela que compara o conteúdo de bis-M6P do Lumizyme® e ATB200 rhGAA.

[034] A Figura 11A é um gráfico comparando a atividade de rhGAA ATB200 (traço esquerdo) com a atividade de rhGAA Lumizyme® (traço direito) dentro de fibroblastos normais em várias concentrações de GAA. A Figura 11B é uma tabela comparando a atividade de rhGAA ATB200 (traço esquerdo) com a atividade de rhGAA Lumizyme® (traço direito) dentro de fibroblastos de um indivíduo com doença de Pompe em várias concentrações de GAA. A Figura 11C é uma tabela comparando o Kuptake de fibroblastos de indivíduos normais e indivíduos com Doença de Pompe.

[035] A Figura 12 mostra a estabilidade do ATB200 em tampões de pH ácidos ou neutros avaliados em um ensaio de

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23/150 termoestabilidade usando SYPRO Orange, pois a fluorescência do corante aumenta quando as proteínas desnaturam.

[036] A Figura 13 mostra o conteúdo de glicogênio no tecido de camundongos WT ou Gaa KO tratados com um carreador, alglicosidase alfa ou ATB200/AT2221, determinado usando digestão com amiloglicosidase. As barras representam a média ± SEM de 7 ratos/grupo. * p < 0,05 comparado à alglicosidase alfa em comparação múltipla usando o método de Dunnett sob análise ANOVA unidirecional.

[037] A Figura 14 representa vesículas positivas para LAMP1 em fibras musculares de camundongos Gaa KO tratados com um carreador, alglicosidase alfa ou ATB200/AT2221 ou WT. As imagens foram tiradas do vasto lateral e representavam 7 camundongos por grupo. Ampliação = 200x (l.OOOx em inserções).

[038] A Figura 15A mostra agregados positivos para LC3 nas fibras musculares de camundongos Gaa KO tratados com um carreador, alglicosidase alfa ou camundongos ATB200/AT2221 ou WT. As imagens foram tiradas do vasto lateral e representavam 7 camundongos por grupo. Ampliação = 400x. A Figura 15B mostra uma análise de transferência de Western da proteína LC3 II. Um total de 30 mg de proteína foi carregado em cada faixa.

[039] A Figura 16 mostra a expressão de Disferlina nas fibras musculares de camundongos Gaa KO tratados com um

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24/150 carreador, alglicosidase alfa, ou ATB200/AT2221 ou WT. As imagens foram tiradas do vasto lateral e representavam 7 camundongos por grupo. Ampliação = 200x.

[040] A Figura 17 mostra a coloração coimunofluorescente de LAMP1 (verde) (veja, por exemplo, B) e LC3 (vermelho) (veja, por exemplo, A) em fibras únicas isoladas do gastrocnêmio branco de camundongos Gaa KO tratados com um carreador, alglicosidase alfa ou ATB200. C representa a depuração de detritos autofágicos e a ausência de lisossomo aumentado. Um mínimo de 30 fibras foi examinado de cada animal.

[041] A Figura 18 mostra a estabilização do ATB200 por AT2221 a 17 μΜ e 170 μΜ AT2221, respectivamente, em comparação com ο ATB200 sozinho.

[042] As Figuras 19A e 19B mostram o desenho do estudo ATB200-02. Dose baixa = 130 mg. Dose alta = 260 mg. Na Figura 26A, 6MWT = teste de caminhada de 6 minutos; CVF = capacidade vital forçada; QOW = a cada duas semanas. A = os dados de segurança de 2 pacientes sentinelas da Coorte 1 foram revisados em cada nível de dose antes da dosagem nas Coortes 2 e 3; B = durante os estágios 2 e 3, ο AT2221 foi administrado por via oral antes do início da infusão intravenosa de ATB200. Para todas as doses, ο ATB200 foi administrado por via intravenosa por um período de 4 horas. C = os 2 primeiros pacientes das coortes 2 e 3 serviram

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25/150 como pacientes sentinelas para suas respectivas coortes. A Figura 19C resume as características da linha de base dos pacientes inscritos nas Coortes 1, 2 e 3. NA = não aplicável. SD = desvio padrão. A = Foi necessário que os pacientes da Coorte 1 estivessem em alglicosidase alfa por 2-6 anos no início do estudo. DPOC = doença de Pompe de início tardio.

[043] A Figura 20 representa dados farmacocinéticos para AT2221. AUC = área sob a curva; CL/F = depuração plasmática ajustada para biodisponibilidade oral AT2221; Cmax = concentração máxima do medicamento; CV = coeficiente de variabilidade; ti/2 = meia-vida; tmax = tempo até a concentração máxima do medicamento; Vz/F = volume aparente da fase terminal de distribuição ajustado para a biodisponibilidade oral AT2221. a = média geométrica (CV%); b = mediana (min-max); c = média aritmética (CV%).

[044] A Figura 21 representa a proteína GAA total pelo peptídeo de assinatura T09 para as coortes 1 e 3. AUC = área sob a curva; CL_T = depuração total do corpo; Cmax = concentração máxima do medicamento; CV = coeficiente de variabilidade; MD = doses múltiplas; ti/2 = meia-vida; tmax = tempo até a concentração máxima do medicamento; F_rei = Proporção AUC de 20 mg/kg de ATB 200 sozinho e 10 mg/kg de ATB200 sozinho versus 5 mg/kg de ATB200 sozinho e 20 mg/kg de ATB200 + dose baixa ou alta dose de AT2221 versus 20 mg/kg

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26/150 de ATB200 sozinho, a = média geométrica (CV%); b = mediana (min-max); c = média aritmética (CV%); d = n = 11; e = n = 5. Dose baixa = 130 mg. Dose alta = 260 mg.

[045] As Figuras 22A, 22B, 22C, 22D, 22E e 22F representam a proteína GAA total por coorte. Dose baixa = 130 mg. Dose alta = 260 mg. A Figura 22A mostra os perfis médios totais de concentração-tempo da proteína GAA para a Coorte 1 (dose única). A Figura 22B mostra os perfis médios totais de concentração-tempo da proteína GAA para a Coorte 1 (dose múltipla). A Figura 22C mostra os perfis médios totais de tempo de concentração da proteína GAA para a Coorte 1 versus a Coorte 3 (dose única) . A Figura 22D mostra os perfis médios totais de concentração-tempo da proteína GAA para a Coorte 1 versus a Coorte 3 (dose múltipla). A Figura 22E mostra comparações totais de proteína GAA com 20 mg/kg de ATB200 às 12 horas após a dose; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** p < 0,001. A Figura 22F mostra comparações totais de proteína GAA com 20 mg/kg de ATB200 às 24 horas após a dose; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; ns = não significativo.

[046] A Figura 23 mostra uma análise de variância (ANOVA) para a proteína GAA total pelo peptídeo de assinatura T09. A área sob a curva (AUG) é fornecida em pg-h/mL; Cl = intervalo de confiança.

[047] A Figura 24A mostra um resumo das análises e dados provisórios disponíveis do teste de caminhada de 6 minutos

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27/150 (6MWT), mostrando a alteração da linha de base (CFBL) nos meses 6, 9 e 12 para os pacientes da coorte 1 e Coorte 3 .

[048] A Figura 24B mostra dados de 6MWT para pacientes individuais das coortes 1 e 3.

[049] A Figura 24C mostra um resumo da análise e dados provisórios disponíveis de outros testes de função do motor: o teste de função do motor Timed up and Go; o teste de subida de 4 degraus; o teste de caminhada de 10 metros (10M); gower; e o teste de função motora gait-stair-gower-chair (GSGC) , mostrando a alteração da linha de base (CFBL) nos meses 6, 9 e 12 para os pacientes da Coorte 1 e da Coorte 3. 0 GSGC é um pontuação combinada avaliada por observador de quatro avaliações da função motora: marcha (caminhada de 10 metros), subida de 4 graus, torres (pé do chão) e elevação da cadeira. Cada teste é pontuado de 1 (normal) a 7 (não é possível realizar; pontuação máxima de 6 para subir do teste de cadeira) . A pontuação total varia de 4 a 27. a = n = 9, valores ausentes não obtidos devido à recusa do paciente em realizar o teste; b = mudança mediana da linha de base foi de -1,5 e 7/9 pacientes tiveram uma diminuição; c = alteração mediana da linha de base foi de -0,8 e 4/5 pacientes tiveram uma diminuição.

[050] A Figura 25 mostra um resumo da análise e os dados intermediários disponíveis do Muscle Strength Testing (QMT),

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28/150 mostrando a alteração da linha de base (CFBL) nos meses 6 e 9 para os pacientes da coorte 2. QMT = teste muscular quantificado. Os valores mostrados representam libras de força para os lados direito e esquerdo combinados, a = adução do ombro não disponível para um indivíduo; b = pontuação: (1) movimento muscular visível, mas nenhum movimento na articulação; (2) movimento na articulação, mas não contra a gravidade; (3) movimento contra a gravidade, mas não contra resistência adicional; (4) movimento contra resistência, mas menos que o normal; (5) força normal.

[051] A Figura 26A mostra um resumo da análise e os dados provisórios disponíveis das pontuações do teste muscular manual (MMT) em pacientes da Coorte 1. Os escores do MMT foram calculados para parte superior do corpo (pontuação máxima: 40), parte inferior do corpo (pontuação máxima: 40) e corpo total (pontuação máxima: 80) . Aumentos na força muscular manual foram observados nos pacientes da Coorte 1 nos meses 6, 9 e 12. SD = desvio padrão.

[052] A Figura 26B representa um resumo da análise e os dados intermediários disponíveis das pontuações do teste muscular manual (MMT) em pacientes da Coorte 2. Os escores do MMT foram calculados para a parte superior do corpo (pontuação máxima: 40). Aumentos na força muscular manual foram observados nos pacientes da Coorte 2 nos meses 6 e 9. SD = desvio padrão. Os resultados do MMT foram geralmente

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29/150 consistentes com os resultados do QMT (mostrado na Figura 28) .

[053] A Figura 26C mostra um resumo da análise e os dados provisórios disponíveis das pontuações do teste muscular manual (MMT) em pacientes da Coorte 3. Os escores do MMT foram calculados para parte superior do corpo (pontuação máxima: 40), parte inferior do corpo (pontuação máxima: 40) e corpo total (pontuação máxima: 80) . Aumentos na força muscular manual foram observados nos pacientes da Coorte 3 em cada um dos meses 6, 9 e 12. SD = desvio padrão.

[054] A Figura 27 mostra um resumo da análise e os dados provisórios disponíveis da capacidade vital forçada sentada (FVC), pressão inspiratória máxima (MIP) e pressão expiratória máxima (MEP), mostrando a alteração da linha de base (CFBL) no mês 6, 9 e 12 para os pacientes da Coorte 1 e da Coorte 3.a= FVC não disponível para um indivíduo. MEP e MIP foram medidos em cmH20.

[055] A Figura 28 mostra um resumo da análise e os dados provisórios disponíveis da Escala de Severidade de Fatiga (FSS), um questionário de autoavaliação composto por nove perguntas, cada uma com uma escala de 1 a 7. A pontuação total varia de 9 a 63, com valores mais altos representando maior nível de fadiga devido à condição da doença. O valor normativo na população saudável é de ~ 21. A Figura 28 mostra

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30/150 a alteração da linha de base (CFBL) no mês 6, mês 9 e 12 para os pacientes da Coorte 1, Coorte 2 e Coorte 3.

[056] As Figuras 29A a 29C representam a variação percentual média da linha de base nos marcadores da lesão do marcador (alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase e creatina quinase) em todas as coortes de pacientes. A Figura 29A mostra dados de pacientes da Coorte 1 por mais de 58 semanas, a Figura 29B mostra dados de pacientes da Coorte 2 por 24 semanas e a Figura 29C mostra dados de pacientes da Coorte 3 por 36 semanas. A Figura 29D mostra a variação percentual média da linha de base nos marcadores de lesão muscular (CK = creatina quinase) e substrato da doença (Hex4 = tetrassacarideo de hexose na urina) por até 12 meses para pacientes da Coorte 1, Coorte 2 e Coorte 3. BL = linha de base. SE = erro padrão. WK = semana. M = mês.

[057] A Figura 30 resume os dados de segurança do estudo ATB200-02. AE = eventos adversos. IAR = reação associada à infusão; a = Relatado por meio de análise intermediária de dados (máximo de 20 meses ou mais) ; b = inclui dor abdominal superior e inferior.

[058] A Figura 31 resume os dados de eficácia e segurança disponíveis no estudo ATB200-02.

[059] As Figuras 32A a 32H mostram os resultados de uma análise de N-glicosilação específica do sítio de ATB200

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31/150 rhGAA, incluindo um perfil de N-glicosilação para o sétimo potencial sítio de N-glicosilação, usando análise por LCMS/MS do ATB200 digerido com protease. As Figuras 32A a 32H fornecem dados médios para dez bateladas de ATB200 produzidos em diferentes escalas.

[060] A Figura 32A mostra a ocupação média do sítio dos sete locais potenciais de N-glicosilação para ATB200. Os locais de N-glicosilação são fornecidos de acordo com a SEQ ID NO: 1. CV = coeficiente de variação.

[061] As Figuras 32B a 32H mostram as análises de Nglicosilação específica do sítio de todos os sete potenciais locais de N-glicosilação do ATB200, com números de locais fornecidos de acordo com a SEQ ID NO: 5. As barras representam a porcentagem máxima e mínima de espécies de Nglicano identificadas como grupo N-glicano específico para os dez bateladas de ATB200 analisados. A Figura 32B mostra o perfil de N-glicosilação do primeiro sítio potencial de Nglicosilação para ATB200. A Figura 320 mostra o perfil de Nglicosilação do segundo sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 32D mostra o perfil de N-glicosilação do terceiro sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 32E mostra o perfil de N-glicosilação do quarto sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 32F mostra o perfil de N-glicosilação do quinto sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 32G mostra o perfil

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32/150 de N-glicosilação do sexto sítio potencial de N-glicosilação para ATB200. A Figura 32H mostra o perfil de N-glicosilação do sétimo sítio potencial de N-glicosilação para ATB200.

[062] As Figuras 33A a 33B caracterizam e resumem ainda o perfil de N-glicosilação de ATB200, como também mostrado nas Figuras 32A-32H. A Figura 33A mostra o mapeamento de glicano do ácido 2-antranílico (2-AA) e a análise LC/MS-MS do ATB200 e resume as espécies de N-glicano identificadas no ATB200 como uma porcentagem da fluorescência total. Os dados do mapeamento de glicano 2-AA e análise de LC-MS/MS também são mostrados na Tabela 5. A Figura 33B resume a ocupação média do sítio e o perfil médio de N-glicano, incluindo fosforilação total, monofosforilação, bisfosforilação e sialilação, para todos os sete locais potenciais de Nglicosilação do ATB200. ND = não detectado.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[063] Antes de descrever várias modalidades exemplares da invenção, deve ser entendido que a invenção não está limitada aos detalhes das etapas de construção ou processo estabelecidas na descrição a seguir. A invenção é capaz de outras modalidades e de ser praticada ou realizada de várias maneiras.

I. Definição

[064] Os termos utilizados nesta especificação geralmente têm seus significados comuns na técnica, dentro

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33/150 do contexto desta invenção e no contexto específico em que cada termo é usado. Certos termos são discutidos abaixo, ou em outra parte da especificação, para fornecer orientação adicional ao profissional na descrição das composições e métodos da invenção e como fazer e usá-los. Os artigos um e uma se referem a um ou mais de um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. O termo ou significa e é usado de forma intercambiável com o termo e/ou, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Neste pedido, o uso do singular inclui o plural, salvo indicação em contrário. Além disso, o uso do termo incluindo, bem como de outras formas, como inclui e incluído, não são limitativos. Qualquer intervalo aqui descrito será entendido como incluindo os pontos finais e todos os valores entre os pontos finais. Na presente especificação, exceto quando o contexto exigir de outra forma devido à linguagem expressa ou implicação necessária, a palavra compreende ou variações como compreendendo são usadas em um sentido inclusivo, isto é, para especificar a presença dos recursos declarados, mas não impedir a presença ou adição de outras características em várias modalidades da invenção.

[065] O termo GAA se refere à enzima a-glicosidase ácida humana (GAA) que catalisa a hidrólise das ligações a1,4- e a-1,6-glicosídica do glicogênio lisossômico, bem como a variantes de inserção, relacionais ou de substituição da

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34/150 sequência de aminoácidos GAA e fragmentos de uma sequência GAA mais longa que exercem atividade enzimática. A aglicosidase ácida humana é codificada pelo gene GAA (National Center for Biotechnology Information (NCBI), Gene ID 2548), que foi mapeado para o braço longo do cromossomo 17 (localização 17q25.2-q25.3). Uma sequência de DNA exemplar que codifica GAA é NP 000143.2, que é incorporada por referência. Atualmente, mais de 500 mutações foram identificadas no gene GAA humano, muitas das quais estão associadas à doença de Pompe. Mutações que resultam em dobras ou processamento incorreto da enzima α-glicosidase ácida incluem T1064C (Leu355Pro) e C2104T (Arg702Cys) . Além disso, as mutações de GAA que afetam a maturação e o processamento da enzima incluem Leu405Pro e Met519Thr. O hexapeptídeo conservado WIDMNE nos resíduos de aminoácidos 516-521 é necessário para a atividade da proteína α-glicosidase ácida. Como aqui utilizada, a abreviação GAA pretende se referir à enzima α-glicosidase ácida humana, enquanto a abreviatura em itálico GAA se refere ao gene humano que codifica a enzima α-glicosidase ácida humana. A abreviatura em itálico Gaa destina-se a se referir a genes não humanos que codificam para enzimas α-glicosidase não humanas, incluindo, mas não se limitando a genes de ratos ou camundongos, e a abreviação Gaa se refere a não-humanos enzimas ácidasglicosidase ácidas.

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[066] O termo rhGAA pretende se referir à enzima aglicosidase ácida humana recombinante e é usado para distinguir GAA endógeno de GAA sintético ou produzido recombinante (por exemplo, GAA produzido a partir de células CHO transformadas com DNA que codifica GAA). O termo rhGAA abrange uma população de moléculas de rhGAA individuais. As características da população de moléculas de rhGAA são fornecidas aqui. O termo produto rhGAA convencional se refere a produtos que contêm alglicosidase alfa, como Lumizyme® ou Myozyme®.

[067] O termo geneticamente modificado ou recombinante se refere a células, como células CHO, que expressam um produto genético específico, como rhGAA, após a introdução de um ácido nucleico compreendendo uma sequência de codificação que codifica o produto genético, juntamente com elementos reguladores que controlam a expressão da sequência de codificação. A introdução do ácido nucleico pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo direcionamento de genes e recombinação homóloga. Como aqui utilizado, o termo também inclui células que foram modificadas por engenharia para expressar ou superexpressar um gene ou produto genético endógeno que normalmente não é expresso por essa célula, por exemplo, pela tecnologia de ativação de genes.

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[068] O termo purificado, conforme usado aqui, se refere ao material que foi isolado sob condições que reduzem ou eliminam a presença de materiais não relacionados, isto é, contaminantes, incluindo materiais nativos dos quais o material é obtido. Por exemplo, uma proteína purificada é preferencialmente substancialmente livre de outras proteínas ou ácidos nucleicos aos quais está associada em uma célula; uma molécula de ácido nucleico purificada é preferencialmente substancialmente livre de proteínas ou outras moléculas de ácido nucleico não relacionadas com as quais pode ser encontrada dentro de uma célula. Como usados aqui, o termo substancialmente livre é usado operacionalmente, no contexto de testes analíticos do material. De preferência, o material purificado substancialmente livre de contaminantes é pelo menos 95% puro; mais preferencialmente, pelo menos 97% puro, e mais preferencialmente ainda pelo menos 99% puro. A pureza pode ser avaliada por cromatografia, eletroforese em gel, imuno ensaio, análise de composição, ensaio biológico, ensaio enzimático e outros métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade específica, purificado significa que o nível de contaminantes está abaixo de um nível aceitável pelas autoridades reguladoras para administração segura a um animal humano ou não humano. As proteínas recombinantes, tal como rhGAA, podem ser isoladas ou purificadas a partir de

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37/150 células CHO usando métodos conhecidos na técnica, incluindo separação por tamanho cromatográfico, cromatografia de afinidade ou cromatografia de troca aniônica. Em algumas modalidades, o rhGAA é purificado por um método compreendendo cromatografia de troca aniônica seguida por cromatografia de afinidade de metal imobilizada, opcionalmente seguida por purificação usando uma terceira coluna de cromatografia.

[069] Como usado aqui, o termo alglicosidase alfa se refere a uma α-glicosidase ácida humana recombinante identificada como [ 199-arginina, 223-histidina] prepro-aglicosidase (humana); Número de registro de resumos químicos 420794-05-0. A alglicosidase alfa é aprovada para comercialização nos Estados Unidos pela Genzyme, como os produtos Lumizyme® e Myozyme®.

[070] Como usado aqui, o termo ATB200 pretende se referir a uma α-glicosidase ácida humana recombinante descrita no Pedido Internacional PCT/US2015/053252, cuja divulgação é aqui incorporada por referência.

[071] Como usado aqui, o termo glicano pretende se referir a uma cadeia de polissacarídeos ligada covalentemente a um resíduo de aminoácido em uma proteína ou polipeptídeo. Como usado aqui, o termo N-glicano ou glicano ligado a N se refere a uma cadeia de polissacarídeos ligada a um resíduo de aminoácido em uma proteína ou polipeptídeo através da ligação covalente a um

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38/150 átomo de nitrogênio do resíduo de aminoácido. Por exemplo, um N-glicano pode ser ligado covalentemente ao átomo de nitrogênio da cadeia lateral de um resíduo de asparagina. Os glicanos podem conter uma ou várias unidades de monossacarídeos, e as unidades de monossacarídeos podem ser ligadas covalentemente para formar uma cadeia linear ou uma cadeia ramificada. Em pelo menos uma modalidade, as unidades de N-glicano anexadas a um rhGAA podem compreender uma ou mais unidades de monossacarídeos, cada uma selecionada independentemente dentre N-acetilglicosamina, manose, galactose, fucose, manose-6-fosfato ou ácido siálico. As unidades de N-glicano na proteína podem ser determinadas por qualquer técnica analítica apropriada, como espectrometria de massa. Em algumas modalidades, as unidades de N-glicano anexadas a um rhGAA são determinadas por espectrometria de massa em cromatografia líquida-tandem (LC-MS/MS) utilizando um instrumento como o espectrômetro de massa Thermo ScientificTM Orbitrap Velos Pro™, Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribid Espectrômetro de Massa™ ou Espectrômetro de Massa Waters Xevo® G2-XS QTof.

[072] Como aqui utilizado, o termo N-glicano de alta manose se refere a um N-glicano com uma a seis ou mais unidades de manose. Em algumas modalidades, uma unidade Nglicano de alta manose pode conter uma cadeia bis (Nacetilglicosamina) ligada a um resíduo de asparagina e ainda

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39/150 ligada a uma cadeia de poliamanose ramificada. Como usados aqui de forma intercambiável, o termo M6P ou manose-6fosfato se refere a uma unidade de manose fosforilada na posição 6, ou seja, com um grupo fosfato ligado ao grupo hidroxila na posição 6. Em algumas modalidades, uma ou mais unidades de manose de uma ou mais unidades de N-glicano são fosforiladas na posição 6 para formar unidades de manose-6fosfato. Em alguma modalidade, o termo M6P ou manose-6fosfato se refere a um fosfodiéster de manose com Nacetilglicosamina (GlcNAc) como um tampão no grupo fosfato, bem como uma unidade de manose com um fosfato exposto grupo sem o limite de GlcNAc. Em pelo menos uma modalidade, os N-glicanos de uma proteína podem ter vários grupos M6P, com pelo menos um grupo M6P tendo um tampão de GlcNAc e pelo menos um outro grupo M6P sem um tampão de GlcNAc.

[073] Como usado aqui, o termo complexo N-glicano pretende se referir a um N-glicano compreendendo outros tipos de sacarídeos que não GlcNac e manose, por exemplo, uma ou mais unidades de galactose e/ou ácido siálico. Em pelo menos uma modalidade, um N-glicano complexo pode ser um N-glicano de alta manose, no qual uma ou mais unidades de manose são ainda ligadas a uma ou mais unidades de monossacarídeos, cada uma selecionada independentemente a partir de Nacetilglicosamina, galactose e ácido siálico. Como usados

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40/150 aqui, um N-glicano híbrido pretende se referir a um Nglicano compreendendo pelo menos um ramo com alto teor de manose e pelo menos um ramo complexo. Estruturas representativas para N-glicanos não fosforilados, mono-M6P e bis-M6P são mostrados na Figura IA. O grupo manose-6fosfato é mostrado na Figura 1B.

[074] Como usado aqui, normalização de lisossomos em um músculo se refere ao processo de restaurar o músculo afetado a uma morfologia lisossômica de um músculo do tipo selvagem, reduzindo o tamanho e o número de seu glicogênio acumulado, de modo que o músculo afetado se assemelhe substancialmente à morfologia lisossômica normal, levando finalmente à reversão da progressão da doença.

[075] Como usado aqui, reversão da progressão da doença significa, entre outras coisas, (i) reduzir ou eliminar adequadamente o acúmulo de glicogênio, (ii) reduzir ou eliminar o inchaço e/ou disfunção lisossômica e (iii) reduzir ou eliminar o acúmulo de substâncias autofágicas detritos. A reversão da progressão da doença pode se manifestar em um paciente ambulatorial com doença de Pompe com experiência em ERT como duas ou mais das seguintes melhorias clínicas: (a) um aumento médio na distância do teste de caminhada de seis minutos de pelo menos 20 metros; melhora média na pressão expiratória máxima de pelo menos 16 cmH20 e (c) uma diminuição média na pontuação da escala de

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41/150 gravidade da fadiga de pelo menos 7. A reversão da progressão da doença pode se manifestar em um paciente com doença de Pompe não-ambulatorial com ERT como dois ou mais dos seguintes melhorias clínicas: (a) uma melhora média na adução do ombro de pelo menos 8 libras de força, (b) uma melhoria média na extensão do cotovelo de pelo menos 5 libras de força e (c) uma diminuição média na gravidade da fadiga pontuação na escala de pelo menos 3,5. A reversão da progressão da doença pode se manifestar em um paciente com doença de Pompe com ERT como duas ou mais das seguintes melhorias clínicas: (a) um aumento médio na distância do teste de caminhada de seis minutos de pelo menos 40 metros; (b) uma melhoria média na capacidade vertical forçada (sentada) de pelo menos 4%, (c) uma melhora média na pressão inspiratória máxima de pelo menos 11 cmíhO e (d) uma diminuição média no escore da escala de gravidade da fadiga de pelo menos 5.

[076] Uma vantagem do método de tratamento aqui divulgado em comparação com a administração de alglicosidase alfa é que os pacientes com Pompe tratados com o primeiro exibem melhora clínica prolongada. Por exemplo, melhorias podem ser observadas em dois a três anos a partir da administração do primeiro tratamento ou além, incluindo, por exemplo, quatro, cinco ou seis anos a partir da administração do primeiro tratamento. Por outro lado, após dois anos de

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42/150 terapia de reposição enzimática com o padrão de atendimento (por exemplo, alglicosidase alfa), os pacientes com doença de Pompe (i) mantêm seus ganhos em relação à linha de base antes do tratamento, mas não apresentam melhora perceptível além dos dois ou três anos marca ou (ii) experimentam um declínio gradual e perdem os ganhos alcançados dois ou três anos após o tratamento com o padrão de atendimento. Kuperus et al. 2017. Benefício a longo prazo da terapia de reposição enzimática na doença de Pompe: um estudo prospective de 5 anos. Neurologia. 89: 2365-2373. Por outro lado, o rhGAA descrito aqui limpa o glicogênio lisossômico com mais eficiência do que o padrão de atendimento e demonstrou provocar melhorias nos pacientes (por exemplo, ERT-switch ambulatorial, Coorte 1 do Estudo ATB200-02) que não deve melhorar após tomar uma terapia de reposição enzimática por pelo menos dois anos. Até o momento, espera-se que os dados clínicos usando o rhGAA ou a composição farmacêutica aqui descrita proporcionem uma melhoria contínua nos resultados dos pacientes, mesmo após dois anos após o tratamento. Assim, em algumas modalidades, um paciente tratado com o rhGAA ou composição farmacêutica descrita neste documento continua exibindo progresso em uma ou mais melhorias clínicas por mais de dois anos após o tratamento (por exemplo, experimenta ganhos adicionais além do ganho alcançado por ou nas duas marcas do ano).

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[077] Como usado aqui, reversão da patologia lisossômica significa depuração parcial ou completa de glicogênio que se acumulou na célula devido à falta de atividade ideal do GAA.

[078] Conforme usado aqui, capacidade vital forçada, ou FVC, é a quantidade de ar que pode ser exalada à força a partir dos pulmões de um indivíduo depois que o indivíduo respira mais profundamente possível.

[079] Conforme usado aqui, um teste de caminhada de seis minutos (6MWT) é um teste para medir a distância que um indivíduo é capaz de percorrer durante um total de seis minutos em uma superfície plana e dura. O teste é realizado com o indivíduo a caminhar o mais longe possível em seis minutos.

[080] Conforme usado aqui, um teste de caminhada de dez metros (10MWT) é um teste para medir o tempo que um indivíduo leva em sapatos para caminhar dez metros em uma superfície plana.

[081] Como usado aqui, o composto miglustat, também conhecido como N-butil-l-desoxinojirimicina ou NB-DNJ ou (2R, 3R, 4R, 5S) -1-butil-2-(hidroximetil)piperidina-3,4,5triol, é um composto com a seguinte fórmula química:

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[082] Uma formulação de miglustat é comercializada comercialmente sob o nome comercial de Zavesca® como monoterapia para a doença de Gaucher tipo 1. Em algumas modalidades, o miglustat é referido como AT2221.

[083] Como discutido abaixo, sais farmaceuticamente aceitáveis de miglustat também podem ser utilizados na presente invenção. Quando é utilizado um sal de miglustat, a dose do sal será ajustada de modo a que a dose de miglustat recebida pelo paciente seja equivalente à quantidade que teria sido recebida se a base livre de miglustat fosse utilizada.

[084] Como aqui utilizado, o composto duvoglustat, também conhecido como 1-desoxinojirimicina ou DNJ ou (2R, 3R, 4R, 5S) -2-(hidroximetil)piperidina-3,4,5-triol, é um composto com a seguinte fórmula química:

OH

OH

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[085] Conforme usado neste documento, o termo chaperona farmacológica ou algumas vezes simplesmente chaperona se refere a uma molécula que se liga especificamente à aglicosidase ácida e tem um ou mais dos seguintes efeitos:

• melhora a formação de uma conformação molecular estável da proteína;

• melhora o tráfego adequado da proteína do retículo endoplasmático para outro sítio celular, preferencialmente um sítio celular nativo, de modo a evitar a degradação da proteína associada ao retículo endoplasmático;

• evita a agregação de proteínas conformacionalmente instáveis ou mal dobradas;

• restaura e/ou melhora pelo menos a função parcial do tipo selvagem, estabilidade e/ou atividade da proteína; e/ou • melhora o fenótipo ou função da célula que abriga a α-glicosidase ácida.

[086] Assim, um chaperona farmacológica para a aglicosidase ácida é uma molécula que se liga à a-glicosidase ácida, resultando em dobragem, tráfego, não agregação e atividade apropriados da α-glicosidase ácida. Como aqui utilizado, este termo inclui, mas não está limitado a chaperonas específicos do sítio ativo (ASSCs) que se ligam no sítio ativo da enzima, inibidores ou antagonistas e agonistas. Em pelo menos uma modalidade, a chaperona farmacológica pode ser um inibidor ou antagonista da a

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46/150 glicosidase ácida. Como aqui utilizado, o termo antagonista se refere a qualquer molécula que se liga à aglicosidase ácida e bloqueia parcial ou completamente, inibe, reduz ou neutraliza uma atividade da a-glicosidase ácida. Em pelo menos uma modalidade, o chaperona farmacológica é miglustat. Outro exemplo não limitativo de uma chaperona farmacológica para a a-glicosidase ácida é o duvoglustat.

[087] Como usado aqui, o termo sítio ativo pretende se referir a uma região de uma proteína que está associada e necessária para uma atividade biológica específica da proteína. Em pelo menos uma modalidade, o sítio ativo pode ser um sítio que se liga a um substrato ou outro parceiro de ligação e contribui com os resíduos de aminoácidos que participam diretamente na produção e quebra de ligações químicas. Os locais ativos nesta invenção podem abranger locais catalíticos de enzimas, locais de ligação a antígenos de anticorpos, domínios de receptores de ligação a ligantes, domínios de ligação de reguladores ou domínios de ligação a receptores de proteínas segregadas. Os sítios ativos também podem incluir transativação, interação proteína-proteína ou domínios de ligação ao DNA de fatores de transcrição e reguladores.

[088] Conforme usado aqui, o termo AUC ou área sob a curva pretende se referir a um cálculo matemático para

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47/150 avaliar a exposição total do corpo ao longo do tempo a um determinado medicamento. Em um gráfico que mostra como a concentração no sangue de um medicamento administrado a um indivíduo muda com o tempo após a administração, a variável de concentração do medicamento está no eixo y e o tempo no eixo x. A área entre a curva de concentração da droga e o eixo x durante um intervalo de tempo designado é a AUG. As AUCs são usadas como um guia para horários de dosagem e para comparar a biodisponibilidade da disponibilidade de diferentes medicamentos no organismo.

[089] Como usado aqui, o termo Cmax pretende se referir à concentração plasmática máxima de um medicamento alcançada após a administração a um indivíduo.

[090] Conforme usado aqui, o termo volume de distribuição ou V se refere ao volume teórico que seria necessário para conter a quantidade total de um medicamento administrado na mesma concentração observada no plasma sanguíneo, e representa o grau em que um medicamento é distribuído no tecido corporal e não no plasma. Valores mais altos de V indicam um maior grau de distribuição do tecido. Volume central de distribuição ou Vc se refere ao volume de distribuição no sangue e tecidos altamente perfundidos pelo sangue. Volume periférico de distribuição ou V2 pretende se referir ao volume de distribuição dentro do tecido periférico.

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[091] Como usado aqui de forma intercambiável, o termo depuração, depuração sistêmica ou CL se refere ao volume de plasma que é completamente eliminado de um medicamento administrado por unidade de tempo. A depuração periférica se refere ao volume de tecido periférico que é limpo de um medicamento administrado por unidade de tempo.

[092] Como usado aqui, o termo farmaceuticamente aceitável pretende se referir a entidades e composições moleculares que são fisiologicamente toleráveis e geralmente não produzem reações indesejáveis quando administradas a um ser humano. De preferência, como aqui utilizado, o termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos EUA ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos. Como aqui utilizado, o termo carreador se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual um composto é administrado. Os carreadores farmacêuticos adequados são conhecidos na técnica e, em pelo menos uma modalidade, são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin, 18^a Edição, ou outras edições.

[093] O termo sal farmaceuticamente aceitável, conforme usado aqui, pretende significar um sal que é, dentro do escopo de um julgamento médico adequado, adequado para uso em contato com tecidos de humanos e animais inferiores,

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49/150 sem toxicidade, irritação, resposta alérgica e toxicidade indevida. semelhantes, proporcionais a uma relação benefício/risco razoável, geralmente solúvel em água ou em óleo ou dispersível e eficaz para o uso pretendido. O termo inclui sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis e sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis. As listas de sais adequados são encontradas em, por exemplo, S. M. Berge et al., J. Pharm. Sei., 1977, 66, pp. 1 -19, aqui incorporado por referência. O termo sal de adição de ácido aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, conforme aqui utilizado, pretende significar aqueles sais que retêm a eficácia e as propriedades biológicas das bases livres e que não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis, formados com ácidos inorgânicos. O termo sal de adição de base aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, conforme aqui utilizado, pretende significar aqueles sais que retêm a eficácia e as propriedades biológicas dos ácidos livres e que não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis, formados com bases inorgânicas.

[094] Como usados aqui, o termo tampão se refere a uma solução que contém um ácido fraco e sua base conjugada que ajuda a evitar alterações no pH.

[095] Como aqui utilizado, os termos dose terapeuticamente eficaz e quantidade eficaz destinam-se a se referir a uma quantidade de α-glicosidase ácida e/ou de

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50/150 miglustat e/ou de uma combinação dos mesmos, que é suficiente para resultar em uma resposta terapêutica em um indivíduo. Uma resposta terapêutica pode ser qualquer resposta que um usuário (por exemplo, um clínico) reconheça como uma resposta eficaz à terapia, incluindo quaisquer marcadores ou sintomas clínicos substitutos descritos aqui e conhecidos na técnica. Assim, em pelo menos uma modalidade, uma resposta terapêutica pode ser uma melhoria ou inibição de um ou mais sintomas ou marcadores da doença de Pompe, como os conhecidos na técnica. Os sintomas ou marcadores da doença de Pompe incluem, mas não estão limitados a, diminuição da atividade do tecido ácido α-glicosidase; cardiomiopatia; cardiomegalia; fraqueza muscular progressiva, especialmente no tronco ou membros inferiores; hipotonia profunda; macroglossia (e em alguns casos, protrusão da língua); dificuldade em engolir, sugar e/ou alimentar; insuficiência respiratória; hepatomegalia (moderada); frouxidão dos músculos faciais; areflexia; intolerância ao exercício; dispnéia por esforço; ortopneia; apneia do sono; dores de cabeça matinais; sonolência; lordose e/ou escoliose; reflexos tendinosos profundos diminuídos; dor na região lombar; e falha em cumprir os marcos motores do desenvolvimento. Deve-se notar que uma concentração de miglustat que tem um efeito inibitório sobre a a-glicosidase ácida pode constituir uma quantidade eficaz para os fins desta invenção devido à diluição (e consequente mudança na

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51/150 ligação devido à alteração no equilíbrio e no pH) , biodisponibilidade e metabolismo do miglustato após administração in vivo.

[096] A resposta terapêutica também pode incluir respostas moleculares, como acúmulo de glicogênio, proliferação lisossômica e formação de zonas autofágicas. As respostas terapêuticas podem ser avaliadas comparando respostas fisiológicas e moleculares de biópsias musculares antes e após o tratamento com um rhGAA aqui descrito. Por exemplo, a quantidade de glicogênio presente nas amostras de biópsia pode ser usada como um marcador para determinar a resposta terapêutica. Outro exemplo inclui biomarcadores como LAMP-1, LC3 e Disferlin, que podem ser usados como um indicador de disfunção de armazenamento lisossômico. Por exemplo, biópsias musculares coletadas antes e após o tratamento com um rhGAA aqui descrito podem ser coradas com um anticorpo que reconhece um dos biomarcadores.

[097] Como aqui utilizado, o termo terapia de reposição enzimática ou ERT pretende se referir à introdução de uma enzima purificada não nativa em um indivíduo com uma deficiência dessa enzima. A proteína administrada pode ser obtida de fontes naturais ou por expressão recombinante. O termo também se refere à introdução de uma enzima purificada em um indivíduo que requer ou se beneficia da administração de uma enzima purificada. Em pelo menos uma modalidade, esse

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52/150 indivíduo sofrem de insuficiência enzimática. A enzima introduzida pode ser uma enzima recombinante purificada produzida in vitro, ou uma proteína purificada a partir de tecido ou fluido isolado, como, por exemplo, placenta ou leite animal, ou de plantas.

[098] Como usado aqui, o termo terapia de combinação se refere a qualquer terapia em que duas ou mais terapias individuais são administradas simultaneamente ou sequencialmente. Em algumas modalidades, os resultados da terapia combinada são aprimorados em comparação com o efeito de cada terapia quando é realizada individualmente. O aprimoramento pode incluir qualquer melhoria do efeito das várias terapias que pode resultar em um resultado vantajoso em comparação com os resultados alcançados pelas terapias quando realizadas isoladamente. Efeito ou resultados aprimorados podem incluir um aprimoramento sinérgico, em que o efeito aprimorado é mais do que os efeitos aditivos de cada terapia quando realizada por si só; um aprimoramento aditivo, em que o efeito aprimorado é substancialmente igual ao efeito aditivo de cada terapia quando realizado por si só; ou menor que o efeito aditivo, em que o efeito aprimorado é menor que o efeito aditivo de cada terapia quando realizado por si só, mas ainda melhor que o efeito de cada terapia quando realizado por si só. O efeito aprimorado pode ser

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53/150 medido por qualquer meio conhecido na técnica, pelo qual a eficácia ou o resultado do tratamento possa ser medido.

[099] O termo simultaneamente, conforme usado neste documento, pretende significar ao mesmo tempo ou dentro de um período razoavelmente curto de tempo antes ou depois, como será entendido pelos especialistas na técnica. Por exemplo, se dois tratamentos são administrados simultaneamente, um tratamento pode ser administrado antes ou depois do outro tratamento, para permitir o tempo necessário para se preparar para o posterior dos dois tratamentos. Portanto, a administração simultânea de dois tratamentos inclui, mas não se limita a, um tratamento após o outro por cerca de 30 minutos ou menos, cerca de 30 minutos, 20 minutos ou menos, cerca de 20 minutos, cerca de 15 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 9 minutos , cerca de 8 minutos, cerca de 7 minutos, cerca de 6 minutos cerca de 5 minutos, cerca de 4 minutos, cerca de 3 minutos, cerca de 2 minutos, cerca de 1 minuto ou menos de 1 minuto.

[100] Doença de Pompe se refere a um LSD autossômico recessivo, caracterizado por atividade alfa-glicosidase ácida deficiente (GAA), que prejudica o metabolismo lisossômico do glicogênio. A deficiência enzimática leva ao acúmulo lisossômico de glicogênio e resulta em fraqueza progressiva dos músculos esqueléticos, função cardíaca reduzida, insuficiência respiratória e/ou comprometimento do

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SNC nos estágios finais da doença. Mutações genéticas no gene GAA resultam em menor expressão ou produzem formas mutantes da enzima com estabilidade alterada e/ou atividade biológica que levam à doença (veja em geral Hirschhorn R, 1995, Doença de Armazenamento de Glicogênio Tipo II: aGlicosidase ácida Deficiência (Maltase Ácida) , As Bases Metabólicas e Moleculares de Doenças Herdadas, Scriver et al., Eds., McGraw-Hill, Nova Iorque, 7^a ed., Páginas 24432464) . As três formas clínicas reconhecidas da Doença de Pompe (infantil, juvenil e adultos) estão correlacionadas com o nível de atividade residual da α-glicosidase (Reuser AJ et al., 1995, Glicogenose Tipo II (Deficiência de Maltase Ácida), Suplemento Muscular e Nervoso 3, S61-S69) . A doença de Pompe infantil (tipo I ou A) é mais comum e mais grave, caracterizada por falha no desenvolvimento, hipotonia generalizada, hipertrofia cardíaca e insuficiência cardiorrespiratória no segundo ano de vida. A doença de Pompe juvenil (tipo II ou B) é de gravidade intermediária e é caracterizada por predominância de sintomas musculares sem cardiomegalia. Os indivíduos com Pompe juvenil geralmente morrem antes de atingir os 20 anos de idade devido a insuficiência respiratória. A doença de Pompe em adultos (tipo III ou C) geralmente se apresenta como uma miopatia lentamente progressiva na adolescência ou até a sexta década (Felicia KJ et al. , 1995, Variabilidade clínica na

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55/150 deficiência de maltase ácida de início adulto: relatório de irmãos afetados e Review of the Literature, Medicine 74, 131-135). Em Pompe, foi demonstrado que a α-glicosidase é extensivamente modificada pós-traducionalmente por processamento de glicosilação, fosforilação e proteolítica. A conversão do precursor de 110 kilodalton (kDa) em formas maduras de 76 e 70 KDa por proteólise no lisossomo é necessária para uma catálise ótima de glicogênio. Conforme usados aqui, o termo Doença de Pompe se refere a todos os tipos de Doença de Pompe. As formulações e esquemas de dosagem divulgados neste pedido podem ser utilizados para tratar, por exemplo, Doença de Pompe Tipo I, Tipo II ou Tipo III.

[101] Um indivíduo ou paciente é preferencialmente um humano, embora outros mamíferos e animais não humanos com distúrbios envolvendo acúmulo de glicogênio também possam ser tratados. Um indivíduo pode ser um feto, um neonato, criança, jovem ou adulto com doença de Pompe ou outro distúrbio de armazenamento ou acumulação de glicogênio. Um exemplo de indivíduo que está sendo tratado é um indivíduo (feto, neonato, criança, adolescente, adolescente ou adulto humano) com GSD-II (por exemplo, GSD-II infantil, GSD-II juvenil ou GSD-II de início adulto). O indivíduo pode ter atividade residual do GAA ou nenhuma atividade mensurável. Por exemplo, o indivíduo com GSD-II pode ter atividade GAA

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56/150 inferior a cerca de 1% da atividade normal de GAA (infantil GSD-II), atividade GAA que é de cerca de 1-10% da atividade normal de GAA (juvenil GSD-II) ou atividade GAA que representa cerca de 10 a 40% da atividade normal do GAA (GSDII adulto). Em algumas modalidades, o indivíduo ou paciente é um paciente experimentado em ERT ou ERT-switch, referindo-se a um paciente com doença de Rompe que recebeu anteriormente terapia de reposição enzimática. Em algumas modalidades, o indivíduo ou paciente é um paciente ingênuo à ERT, referindo-se a um paciente com doença de Rompe que ainda não recebeu terapia de reposição enzimática. Em certas modalidades, o indivíduo ou paciente é ambulatorial (por exemplo, um paciente ambulatorial com comutador ERT ou um paciente ambulatorial ingênuo com ERT) . Em certas modalidades, o indivíduo ou paciente é não-ambulatorial (por exemplo, um paciente não-ambulatorial com ERT-switch). O status ambulatorial ou não ambulatorial pode ser determinado por um teste de caminhada de seis minutos (6MWT). Em algumas modalidades, um paciente ambulatorial é um paciente com doença de Rompe capaz de andar pelo menos 200 metros no 6MWT. Em algumas modalidades, um paciente não ambulatório é um paciente com doença de Rompe que é incapaz de andar sem assistência ou que está ligado à cadeira de rodas.

[102] Os termos tratar e tratamento, conforme usados aqui, se referem à melhoria de um ou mais sintomas associados

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57/150 à doença, prevenção ou atraso do aparecimento de um ou mais sintomas da doença e/ou diminuição da gravidade ou frequência de um ou mais sintomas da doença. Por exemplo, o tratamento pode se referir à melhora do estado cardíaco (por exemplo, aumento dos volumes diastólicos finais e/ou sistólicos finais, ou redução, melhoria ou prevenção da cardiomiopatia progressiva que normalmente é encontrada no GSD-II) ou da função pulmonar (por exemplo, aumento da capacidade vital de choro sobre a capacidade de linha de base e/ou normalização da dessaturação de oxigênio durante o choro); melhoria no neurodesenvolvimento e/ou habilidades motoras (por exemplo, aumento no escore AIMS); redução dos níveis de glicogênio no tecido do indivíduo afetado pela doença; ou qualquer combinação desses efeitos. Em uma modalidade preferida, o tratamento inclui melhoria do estado cardíaco, particularmente na redução ou prevenção de cardiomiopatia associada a GSD-II.

[103] Os termos melhorar, aumentar e reduzir, conforme usados aqui, indicam valores que são relativos a uma medida de linha de base, como uma medida no mesmo indivíduo antes do início do tratamento aqui descrito ou uma medida em um indivíduo de controle (ou múltiplos indivíduos de controle) na ausência do tratamento aqui descrito. Um indivíduo de controle é um indivíduo afetado pela mesma forma de GSD-II (início infantil, juvenil ou adulto) que o

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58/150 indivíduo que está sendo tratado, que tem aproximadamente a mesma idade que o indivíduo que está sendo tratado (para garantir que os estágios de a doença no indivíduo tratado e no (s) indivíduo (s) de controle são comparáveis).

[104] Conforme usados neste documento, os termos cerca de e aproximadamente destinam-se a se referir a um grau aceitável de erro para a quantidade medida, dada a natureza ou precisão das medições. Por exemplo, o grau de erro pode ser indicado pelo número de figuras significativas fornecidas para a medição, como é entendido na técnica, e inclui, mas não está limitado a uma variação de ± 1 na figura significativa mais precisa relatada para a medição. Graus exemplares de erro típicos estão dentro de 20% (%) , preferencialmente dentro de 10% e mais preferencialmente dentro de 5% de um dado valor ou intervalo de valores. As quantidades numéricas fornecidas neste documento são aproximadas, a menos que indicado de outra forma, o que significa que o termo cerca de ou aproximadamente pode ser inferido quando não expressamente indicado.

II. α-Glicosidase ácida humana Recombinante (rhGAA.)

[105] Em algumas modalidades, a α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) é uma enzima que possui uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 Em algumas

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59/150 modalidades, o rhGAA é codificado por uma sequência de nucleotídeos, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 2.

Tabela 1. Sequências de nucleotídeos e proteínas

SEQ ID NO:	Sequências
1	MGVRHPPCSHRLLAVCALVSLATAALLGHILLHDFLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGA SRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGA QMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLH FTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTVAPLF FADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLA LEDGGSAHGVFLLNSNAMDWLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSWQQYLDWGY PFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQWENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDG FRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKV WPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELEN PPYVPGWGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISR STFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVR WTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAG ETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPI EALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQP MALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQ LQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
2	cagttgggaaagctgaggttgtcgccggggccgcgggtggaggtcggggatgaggcagcaggtag gacagtgacctcggtgacgcgaaggaccccggccacctctaggttctcctcgtccgcccgttgtt cagcgagggaggctctgggcctgccgcagctgacggggaaactgaggcacggagcgggcctgtag gagctgtccaggccatctccaaccatgggagtgaggcacccgccctgctcccaccggctcctggc cgtctgcgccctcgtgtccttggcaaccgctgcactcctggggcacatcctactccatgatttcc tgctggttccccgagagctgagtggctcctccccagtcctggaggagactcacccagctcaccag cagggagccagcagaccagggccccgggatgcccaggcacaccccggccgtcccagagcagtgcc cacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccagg aacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatg gggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctc

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tgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctga ccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagct aacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactcta cagcgtggagttctccgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgc tgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctg ccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggac caggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcacc ctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgcc atggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgt ctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacc cgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgct atcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacga cctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccgg ccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagc agctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcac caacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttca ccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttc gacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcagaggctctgaggacggctgccc caacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcca ccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctg accgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctc ccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcct gggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtc ggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagct gggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtaca gcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccc cacctctacacactgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcct ggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgc tcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatgg tacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccg tgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacg tccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgc

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	cagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctg ggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggcca ggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcag aaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctc caacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagc agtttctcgtcagctggtgttagccgggcggagtgtgttagtctctccagagggaggctggttcc ccagggaagcagagcctgtgtgcgggcagcagctgtgtgcgggcctgggggttgcatgtgtcacc tggagctgggcactaaccattccaagccgccgcatcgcttgtttccacctcctgggccggggctc tggcccccaacgtgtctaggagagctttctccctagatcgcactgtgggccggggcctggagggc tgctctgtgttaataagattgtaaggtttgccctcctcacctgttgccggcatgcgggtagtatt agccacccccctccatctgttcccagcaccggagaagggggtgctcaggtggaggtgtggggtat gcacctgagctcctgcttcgcgcctgctgctctgccccaacgcgaccgcttcccggctgcccaga gggctggatgcctgccggtccccgagcaagcctgggaactcaggaaaattcacaggacttgggag attctaaatcttaagtgcaattattttaataaaaggggcatttggaatc
3	MGVRHPPCSHRLLAVCALVSLATAALLGHILLHDFLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGA SRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGA QMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLH FTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTVAPLF FADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLA LEDGGSAHGVFLLNSNAMDWLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSWQQYLDWGY PFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQWENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDG FRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKV WPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELEN PPYVPGWGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISR STFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVR WTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAG ETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPI EALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQP MALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQ LQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
4	MGVRHPPCSHRLLAVCALVSLATAALLGHILLHDFLLVPRELSGSSPVLEETHPAHQQGA SRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGA

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	QMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLH
	FTIKDPANRRYEVPLETPHVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVRRQLDGRVLLNTTVAPLF FADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLA LEDGGSAHGVFLLNSNAMDWLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSWQQYLDWGY PFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQWENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDG FRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKV WPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELEN PPYVPGWGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISR STFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVR WTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAG ETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPV EALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQP MALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQ LQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC
5	QQGASRPGPRDAQAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQG LQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETE NRLHFTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTV APLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHP FYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDWLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSWQQYLD WGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQWENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTF NKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPL IGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNN ELENPPYVPGWGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPF VISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEE LCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQA HVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQ TVPIEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTES RQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEG AGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC

[106] Em algumas modalidades, o rhGAA possui uma sequência de aminoácidos GAA do tipo selvagem, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, conforme descrito na Patente

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US No. 8.592.362 e tem o número de acesso ao GenBank AHE24104.1 (GI: 568760974). Em algumas modalidades, o rhGAA tem uma sequência de aminoácidos GAA do tipo selvagem, conforme codificada na SEQ ID NO: 2, a sequência de mRNA tendo o número de acesso ao GenBank Y00839.1. Em algumas modalidades, o rhGAA possui uma sequência de aminoácidos GAA do tipo selvagem, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o rhGAA tem uma seguência de aminoácidos GAA, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 4, e possui Número de acesso ao National Center for Biotechnology Information (NCBI) NP_000143.2. Em algumas modalidades, o rhGAA é a alglicosidase alfa, a enzima α-glicosidase do ácido humano codificada pelo mais predominante dos nove haplótipos observados do gene GAA.

[107] Em algumas modalidades, o rhGAA é inicialmente expresso como tendo a sequência completa de 952 aminoácidos do GAA do tipo selvagem, conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, e o rhGAA sofre um processamento intracelular que remove uma porção dos aminoácidos, por exemplo, os primeiros 56 aminoácidos. Por conseguinte, o rhGAA que é secretado pela célula hospedeira pode ter uma sequência de aminoácidos mais curta que o rhGAA que é inicialmente expresso dentro da célula. Em uma modalidade, a proteína mais curta possui a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 5, que difere apenas da SEQ ID NO: 1, na medida em que os primeiros

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64/150 aminoácidos que compreendem o peptídeo sinal e o peptídeo precursor foram removidos, resultando assim em uma proteína possuindo 896 aminoácidos. Também são possíveis outras variações no número de aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais deleções, substituições e/ou inserções relativas à sequência de aminoácidos descrita pela SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o produto rhGAA inclui uma mistura de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante com diferentes comprimentos de aminoácidos.

[108] Em algumas modalidades, o rhGAA compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 95%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. Podem ser utilizados vários algoritmos de alinhamento e/ou programas para calcular a identidade entre duas sequências, incluindo FASTA ou BLAST, que estão disponíveis como parte do pacote de análise de sequência GCG (Universidade de Wisconsin, Madison, Wisconsin) e podem ser usadas com, por exemplo, configuração padrão. Por exemplo, são contemplados polipeptideos com pelo menos 90%, 95%, 98% ou 99% de identidade com polipeptideos específicos aqui descritos e preferencialmente exibindo substancialmente as mesmas funções, bem como polinucleotídeos que codificam esses polipeptideos. Salvo indicação em contrário, uma pontuação de similaridade será baseada no uso do BLOSUM62. Quando o

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BLASTP é usado, a similaridade percentual é baseada na pontuação positiva do BLASTP e a identidade da sequência percentual é baseada na pontuação das identidades do BLASTP. BLASTP Identidades mostra o número e a fração do total de resíduos nos pares de sequências de alta pontuação que são idênticos; e BLASTP Positivos mostra o número e a fração de resíduos para os quais as pontuações de alinhamento têm valores positivos e que são semelhantes entre si. As sequências de aminoácidos com esses graus de identidade ou semelhança ou qualquer grau intermediário de identidade de semelhança com as sequências de aminoácidos aqui divulgadas são contempladas e englobadas por esta divulgação. As sequências polinucleotídicas de polipeptídeos semelhantes são deduzidas usando o código genético e podem ser obtidas por meios convencionais, em particular por tradução reversa de sua sequência de aminoácidos usando o código genético.

[109] Em algumas modalidades, o rhGAA sofre modificações pós-traducionais e/ou químicas em um ou mais resíduos de aminoácidos na proteína. Por exemplo, resíduos de metionina e triptofano podem sofrer oxidação. Como outro exemplo, a glutamina N-terminal pode formar piro-glutamato. Como outro exemplo, os resíduos de asparagina podem sofrer desamidação com ácido aspártico. Como ainda outro exemplo, os resíduos de ácido aspártico podem sofrer isomerização do ácido isoaspártico. Como ainda outro exemplo, resíduos de cisteína

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66/150 não emparelhados na proteína podem formar ligações dissulfeto com glutationa livre e/ou cisteína. Por conseguinte, em algumas modalidades, a enzima é inicialmente expressa como tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 5 ou um aminoácido sequência codificada pela SEQ ID NO: 2 e a enzima sofre uma ou mais dessas modificações pós-traducionais e/ou químicas. Tais modificações também estão dentro do escopo da presente divulgação.

III. Glicosilação ligada a N de rhGAA

[110] Existem sete sítios potenciais de glicosilação ligada a N em uma única molécula de rhGAA. Esses locais potenciais de glicosilação estão nas seguintes posições da SEQ ID NO: 5: N84, N177, N334, N414, N596, N826 e N869. Da mesma forma, para a sequência completa de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, esses locais potenciais de glicosilação estão nas seguintes posições: N140, N233, N390, N470, N652, N882 e N925. Outras variantes do rhGAA podem ter locais de glicosilação semelhantes, dependendo da localização dos resíduos de asparagina. Geralmente, as sequências de Asn-XSer ou Asn-X-Thr na sequência de aminoácidos da proteína indicam potenciais locais de glicosilação, com a exceção de que X não pode ser His ou Pro.

[Ill] As moléculas de rhGAA aqui descritas podem ter, em média, 1, 2, 3 ou 4 grupos manose-6-fosfato (M6P) em seus N

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67/150 glicanos. Por exemplo, apenas um N-glicano em uma molécula de rhGAA pode conter M6P (monofosforilado ou mono-M6P), um único N-glicano pode suportar dois grupos M6P (bisfosforilado ou bis-M6P) ou dois N- glicanos na mesma molécula rhGAA podem cada um suportar grupos M6P únicos. Em algumas modalidades, as moléculas de rhGAA descritas aqui têm em média 3-4 grupos M6P em seus N-glicanos. As moléculas de aglicosidase ácida humana recombinante também podem ter Nglicanos sem grupos M6P. Noutra modalidade, em média, o rhGAA compreende mais de 2,5 mol M6P por mol rhGAA e maior que 4 mol de ácido siálico por mol rhGAA. Em algumas modalidades, em média, o rhGAA compreende cerca de 3-3,5 mol M6P por mol rhGAA. Em algumas modalidades, em média, o rhGAA compreende cerca de 4-5,4 mol de ácido siálico por mol de rhGAA. Em média, pelo menos cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10% ou 20% do total de N-glicanos no rhGAA podem estar na forma de um N-glicano mono-M6P, por exemplo , cerca de 6,25% do total de N-glicanos podem transportar um único grupo M6P e, em média, pelo menos 0,5, 1, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0% do total de N-glicanos no rhGAA estão na forma de um O bis-M6P N-glicano e, em média, menos de 25% do rhGAA total não contém ligação Nglicano fosforilada ao CIMPR. Em algumas modalidades, em média cerca de 10% a cerca de 14% do total de N-glicanos no rhGAA são monofosforilados. Em algumas modalidades, em média cerca de 7% a cerca de 25% do total de N-glicanos no rhGAA

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68/150 são bis-fosforilados. Em algumas modalidades, em média, o rhGAA compreende cerca de 1,3 mol de bis-M6P por mol de rhGAA.

[112] O rhGAA descrito neste documento pode ter um conteúdo médio de N glicanos que transportam M6P variando de 0,5 a 7,0 mol M6P por mol rhGAA ou qualquer valor intermediário ou subintervalo do mesmo, incluindo 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0 mol M6P por mol rhGAA. O rhGAA pode ser fracionado para fornecer preparações rhGAA com diferentes números médios de N-glicanos mono-M6P ou bis-M6P, permitindo assim uma personalização adicional do rhGAA direcionado para os lisossomos nos tecidos-alvo, selecionando uma fração especifica ou seletivamente combinando frações diferentes.

[113] Em algumas modalidades, até 60% dos N-glicanos no rhGAA podem ser totalmente sialilados, por exemplo, até 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou 60% dos N-glicanos podem ser totalmente sialilado. Em algumas modalidades, não mais de 50% dos Nglicanos no rhGAA são totalmente sialilados. Em algumas modalidades, de 4% a 20% do total de N-glicanos são totalmente sialilados. Em outras modalidades, não mais de 5%, 10%, 20% ou 30% de N-glicanos no rhGAA transportam ácido siálico e um resíduo de galactose terminal (Gal). Esse intervalo inclui todos os valores intermediários e subintervalos, por exemplo, 7% a 30% do total de N-glicanos

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69/150 no rhGAA podem transportar ácido siálico e galactose terminal. Em ainda outras modalidades, não mais de 5%, 10%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% dos N-glicanos no rhGAA têm apenas uma galactose terminal e não contêm siálico ácido. Esse intervalo inclui todos os valores intermediários e subintervalos, por exemplo, de 8% a 19% do total de Nglicanos no rhGAA na composição, podem ter apenas galactose terminal e não contêm ácido siálico.

[114] Em algumas modalidades, 40%, 45%, 50% ou 55% a 60% do total de N-glicanos no rhGAA são N-glicanos do tipo complexo; ou não mais de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6,% ou 7% do total de N-glicanos no rhGAA são N-glicanos do tipo híbrido; não mais de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% dos N-glicanos com alto teor de manose no rhGAA não são fosforilados; pelo menos 5% ou 10% dos N-glicanos com alto teor de manose no rhGAA são monofosforilados; e/ou pelo menos 1% ou 2% dos N-glicanos com alto teor de manose no rhGAA são bis-fosforilados. Esses valores incluem todos os valores intermediários e subintervalos. Um rhGAA pode atender a um ou mais dos intervalos de conteúdo descritos acima.

[115] Em algumas modalidades, o rhGAA pode suportar, em média, 2,0 a 8,0 moles de resíduos de ácido siálico por mole de rhGAA. Esse intervalo inclui todos os valores intermediários e suas sub-faixas, incluindo 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,0 resíduos

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70/150 de ácido siálico mol por mol rhGAA. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a presença de unidades de N-glicano contendo resíduos de ácido siálico pode impedir a liberação não produtiva do rhGAA pelos receptores de asialoglicoproteínas.

[116] Em uma ou mais modalidades, o rhGAA tem um certo perfil de N-glicosilação em certos locais potenciais de Nglicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA tem sete locais potenciais de N-glicosilação. Em algumas modalidades, pelo menos 20% do rhGAA é fosforilado no primeiro sítio potencial de N-glicosilação (por exemplo, N84 para SEQ ID NO: 5 e N140 para SEQ ID NO: 1). Por exemplo, pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% do rhGAA podem ser fosforilados no primeiro sítio potencial de N-glicosilação. Essa fosforilação pode ser o resultado de unidades mono-M6P e/ou bis-M6P. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90% ou 95% do rhGAA possui uma unidade mono-M6P no primeiro sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90% ou 95% do rhGAA possui uma unidade bis-M6P no primeiro sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 1,4 mol de M6P (mono-M6P e bis-M6P) por mol de rhGAA no primeiro sítio

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71/150 potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de pelo menos 0,5 mol de bis-M6P por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de Nglicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 0,25 mol de mono-M6P por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 0,2 mol a cerca de 0,3 mol de ácido siálico por mol rhGAA no primeiro sítio potencial de N-glicosilação. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma primeira ocupação potencial do sítio de N-glicosilação, como representado na Figura 6A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 6B. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma primeira ocupação potencial do sítio de Nglicosilação, como representado na Figura 32A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 32B ou Figura 33B.

[117] Em algumas modalidades, pelo menos 20% do rhGAA é fosforilado no segundo sítio potencial de N-glicosilação (por exemplo, N177 para a SEQ ID NO: 5 e N223 para a SEQ ID NO: 1) . Por exemplo, pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% do rhGAA pode ser fosforilado no segundo sítio de Nglicosilação. Essa fosforilação pode ser o resultado de unidades mono-M6P e/ou bis-M6P. Em algumas modalidades, pelo

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72/150 menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90% ou 95% do rhGAA possui uma unidade mono-M6P no segundo sítio de N-glicosilação. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90% ou 95% do rhGAA possui uma unidade bis-M6P no segundo sítio de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 0,5 mol de M6P (mono-M6P e bis-M6P) por mol de rhGAA no segundo sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende, em média, cerca de 0,4 a cerca de 0,6 mol de mono-M6P por mol de rhGAA no segundo sítio potencial de N-glicosilação. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma segunda ocupação potencial do sítio de N-glicosilação, como representado na Figura 6A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 6C. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma segunda ocupação potencial do sítio de Nglicosilação, como representado na Figura 32A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 32C ou Figura 33B.

[118] Em uma ou mais modalidades, pelo menos 5% do rhGAA é fosforilado no terceiro sítio potencial de N-glicosilação (por exemplo, N334 para a SEQ ID NO: 5 e N390 para a SEQ ID NO: 1). Em outras modalidades, menos de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% do rhGAA é fosforilado no terceiro sítio potencial de N

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73/150 glicosilação. Por exemplo, o terceiro sítio potencial de Nglicosilação pode ter uma mistura de N-glicanos de alta manose não fosforilados, N-glicanos do complexo di-, tri- e tetra-antenário e N-glicanos híbridos como espécies principais. Em algumas modalidades, pelo menos 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 50% do rhGAA são sialilados no terceiro potencial sítio de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 0,9 a cerca de 1,2 mol de ácido siálico por mol de rhGAA no terceiro sítio potencial de N-glicosilação. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma terceira ocupação potencial do sítio de N-glicosilação, como representado na Figura 6A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 6D. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma terceira ocupação potencial do sítio de Nglicosilação, como representado na Figura 32A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 32D ou na Figura 33B.

[119] Em algumas modalidades, pelo menos 20% do rhGAA é fosforilado no quarto sítio potencial de N-glicosilação (por exemplo, N414 para a SEQ ID NO: 5 e N470 para a SEQ ID NO: 1) . Por exemplo, pelo menos 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% do rhGAA pode ser fosforilado no quarto sítio potencial de Nglicosilação. Essa fosforilação pode ser o resultado de

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74/150 unidades mono-M6P e/ou bis-M6P. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90% ou 95% do rhGAA possui uma unidade mono-M6P no quarto sítio potencial de Nglicosilação. Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90% ou 95% do rhGAA possui uma unidade bis-M6P no quarto sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, pelo menos 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20% ou 25% do rhGAA é sialilado no quarto sítio potencial de Nglicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 1,4 mol de M6P (mono-M6P e bis-M6P) por mol de rhGAA no quarto sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende, em média, cerca de 0,4 a cerca de 0,6 mol de bis-M6P por mol de rhGAA no quarto sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 0,3 a cerca de 0,4 mol de mono-M6P por mol de rhGAA no quarto sítio potencial de Nglicosilação. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma quarta ocupação potencial do sítio de Nglicosilação, como representado na Figura 6A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 6E. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma quarta ocupação potencial do sítio de N-glicosilação, como representado na

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Figura 32A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 32E ou na Figura 33B.

[120] Em algumas modalidades, pelo menos 5% do rhGAA é fosforilado no quinto sítio potencial de N-glicosilação (por exemplo, N596 para a SEQ ID NO: 5 e N692 para a SEQ ID NO: 1). Em outras modalidades, menos de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% do rhGAA é fosforilado no quinto sítio potencial de Nglicosilação. Por exemplo, o quinto sítio potencial de glicosilação da N pode ter o complexo di-antennio fucosilado N-glicanos como a espécie principal. Em algumas modalidades, pelo menos 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% do rhGAA é sialilado no quinto sítio potencial de Nglicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 0,8 a cerca de 0,9 mol de ácido siálico por mol de rhGAA no quinto sítio potencial de N-glicosilação. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma quinta ocupação potencial do sítio de N-glicosilação, como representado na Figura 6A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 6F. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma quinta ocupação potencial do sítio de N-glicosilação, como representado na Figura 32A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 32F ou na Figura 33B.

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[121] Em algumas modalidades, pelo menos 5% do rhGAA é fosforilado no sexto sítio de N-glicosilação (por exemplo, N826 para a SEQ ID NO: 5 e N882 para a SEQ ID NO: 1) . Em outras modalidades, menos de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% do rhGAA é fosforilado no sexto sítio de N-glicosilação. Por exemplo, o sexto sítio de N-glicosilação pode ter uma mistura de complexos de di, tri- e tetra-antenário N-glicanos como espécies principais. Em algumas modalidades, pelo menos 3%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% do rhGAA são sialilados no sexto sítio de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 1,5 a cerca de 4,2 mol de ácido siálico por mol de rhGAA no sexto sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 0,9 mol de ácido siálico acetilado por mol rhGAA no sexto sítio potencial de Nglicosilação. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma sexta ocupação potencial do sítio de Nglicosilação, como representado na Figura 6A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 6G. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma sexta ocupação potencial do sítio de N-glicosilação, como representado na Figura 32A, e um perfil de N-glicosilação, como representado na Figura 32G ou Figura 33B.

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[122] Em algumas modalidades, pelo menos 5% do rhGAA é fosforilado no sétimo sítio potencial de N-glicosilação (por exemplo, N869 para a SEQ ID NO: 5 e N925 para a SEQ ID NO: 1). Em outras modalidades, menos de 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% do rhGAA é fosforilado no sétimo sítio potencial de Nglicosilação. Em algumas modalidades, menos de 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ou 65% do rhGAA possui qualquer N-glicano no sétimo sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, pelo menos 30%, 35% ou 40% do rhGAA possui um N-glicano no sétimo sítio potencial de N-glicosilação. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média cerca de 0,86 mol de ácido siálico por mol de rhGAA no sétimo sítio potencial de N-glicosilação. Pelo menos na modalidade, todos os N-glicanos identificados no sétimo sítio potencial de Nglicosilação são N-glicanos complexos. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende uma sétima ocupação potencial do sítio de N-glicosilação, como representado na Figura 6A ou conforme representado na Figura 32A e um perfil de Nglicosilação, conforme representado na Figura 32H ou Figura 33B.

[123] Em algumas modalidades, o rhGAA compreende em média 3-4 resíduos de M6P por molécula de rhGAA e cerca de 4 a cerca de 7,3 mol de ácido siálico por mol de rhGAA. Em algumas modalidades, o rhGAA compreende ainda, em média, pelo menos cerca de 0,5 mol de bis-M6P por mol rhGAA no

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78/150 primeiro sítio potencial de N-glicosilação, cerca de 0,4 a cerca de 0, 6 mol mono-M6P por mol rhGAA no segundo sítio potencial de N-glicosilação, cerca de 0,9 a cerca de 1,2 mol de ácido siálico por mol rhGAA no terceiro sítio potencial de N-glicosilação, cerca de 0,4 a cerca de 0,6 mol bis-M6P por mol rhGAA no quarto sítio potencial de N-glicosilação, cerca de 0,3 a cerca de 0,4 mol mono- M6P por mol rhGAA no quarto sítio potencial de N-glicosilação, cerca de 0,8 a cerca de 0,9 mol de ácido siálico por mol rhGAA no quinto sítio potencial de N-glicosilação e cerca de 1,5 a cerca de 4,2 mol de ácido siálico por mol rhGAA no sexto potencial N sítio de glicosilação. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende ainda em média cerca de 0,86 mol de ácido siálico por mol de rhGAA no sétimo sítio potencial de N-glicosilação. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende sete locais potenciais de N-glicosilação com perfis de ocupação e Nglicosilação, como representado nas Figuras 6A-6H. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA compreende sete locais potenciais de N-glicosilação com perfis de ocupação e Nglicosilação, como representado nas Figuras 32A-32H e Figuras 33A-33B.

[124] Os métodos de produção de rhGAA são divulgados no Pedido de Patente Provisória U.S. No. 62/057.842, depositado em 30 de setembro de 2014, cujo conteúdo inteiro é aqui incorporado por referência.

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[125] Uma vez dentro do lisossomo, o rhGAA pode degradar enzimaticamente o glicogênio acumulado. No entanto, os produtos rhGAA convencionais apresentam baixos níveis totais de N-glicanos mono-M6P- e bis-M6P e, portanto, têm como alvo as células musculares, resultando em entrega inferior de rhGAA aos lisossomos. A maioria das moléculas de rhGAA nesses produtos convencionais não possui N-glicanos fosforilados, desse modo faltando afinidade pelo CIMPR. Os N-glicanos com alto teor de manose não fosforilados também podem ser eliminados pelo receptor de manose, o que resulta na eliminação não produtiva da ERT (Figura 2B). Em contraste, como mostrado na Figura 2A, um rhGAA aqui descrito pode conter uma quantidade maior de N-glicanos contendo mono-M6P e bis-M6P, levando à captação produtiva de rhGAA em tecidos específicos, como músculos.

IV. Produção e purificação de rhGAA glicosilado ligado a N

[126] Como descrito no Pedido Internacional PCT/US2015/053252, cuja totalidade é incorporada aqui por referência, células, tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) , podem ser usadas para produzir o rhGAA aqui descrito. A expressão de rhGAA de M6P alto em células CHO é vantajosa sobre a modificação do perfil de glicano de um rhGAA pós-traducional, pelo menos em parte, porque apenas o primeiro pode ser convertido por degradação do glicano em

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80/150 uma forma de rhGAA com hidrólise ótima de glicogênio, aumentando assim a eficácia terapêutica.

[127] Em algumas modalidades, o rhGAA é de preferência produzido por uma ou mais linhagens de células CHO que são transformadas com um construto de DNA que codifica o rhGAA aqui descrito. Tais linhagens celulares CHO podem conter várias cópias de um gene, como 5, 10, 15 ou 20 ou mais cópias, de um polinucleotídeo que codifica GAA. Construtos de DNA, que expressam variantes alélicas da a-glicosidase ácida ou de outras sequências de aminoácidos de a-glicosidase ácida variante, tais como aquelas que são pelo menos 90%, 95%, 98% ou 99% idênticas às SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5, pode ser construído e expresso em células CHO. Os especialistas na técnica podem selecionar vetores alternativos adequados para transformar células CHO para produção de tais construtos de DNA.

[128] Os métodos para fazer essas linhagens de células CHO são descritos no Pedido Internacional PCT/US2015/053252, cuja totalidade é aqui incorporada por referência. Resumidamente, esses métodos envolvem a transformação de uma célula CHO com DNA que codifica GAA ou uma variante GAA, seleção de uma célula CHO que integra estavelmente o DNA que codifica GAA em seu(s) cromossomo(s) e que expressa estavelmente GAA e seleção de uma célula CHO que expressa GAA tendo um alto teor de N-glicanos portadores de mono-M6P

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81/150 ou bis-M6P e, opcionalmente, selecionando uma célula CHO com N-glicanos com alto teor de ácido siálico e/ou com N-glicanos com baixo teor de manose não fosforilado. As linhagens celulares CHO selecionadas podem ser usadas para produzir composições rhGAA e rhGAA cultivando a linhagem celular CHO e recuperando a referida composição da cultura de células CHO. Em algumas modalidades, um rhGAA produzido a partir das linhagens de células CHO selecionadas contém um alto conteúdo de N-glicanos contendo mono-M6P ou bis-M6P que têm como alvo o CIMPR. Em algumas modalidades, um rhGAA produzido como descrito aqui tem baixos níveis de N-glicanos complexos com galactose terminal. Em algumas modalidades, as linhagens de células CHO selecionadas são referidas como GA-ATB200 ou ATB200-X5-14. Em algumas modalidades, as linhagens de células CHO selecionadas abrangem uma subcultura ou derivado dessa cultura de células CHO. Em algumas modalidades, um rhGAA produzido a partir das linhagens celulares CHO selecionadas é referido como ATB200.

[129] Um rhGAA produzido como descrito aqui pode ser purificado pelos métodos descritos no Pedido Internacional PCT/US2017/024981 e no Pedido Provisório U.S. No. 62/506.569, ambos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Um processo exemplar para produzir, capturar e purificar um rhGAA produzido a partir de linhagens celulares CHO é mostrado na Figura 3.

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[130] Resumidamente, o biorreator 601 contém uma cultura de células, como células CHO, que expressam e secretam rhGAA no meio de cultura liquido circundante. O biorreator 601 pode ser qualquer biorreator apropriado para a cultura de células, como um biorreator de perfusão, batelada ou alimentado em batelada. O meio de cultura é removido do biorreator após um periodo de tempo suficiente para as células produzirem rhGAA. Essa remoção do meio pode ser continua para um biorreator de perfusão ou pode ser por bateladas para um reator por batelada ou alimentado por batelada. O meio pode ser filtrado pelo sistema de filtragem 603 para remover as células. O sistema de filtragem 603 pode ser qualquer sistema de filtragem adequado, incluindo um sistema de filtragem de fluxo tangencial alternado (ATE), um sistema de filtragem de fluxo tangencial (TFF) e/ou sistema de filtragem centrifuga. Em várias modalidades, o sistema de filtração utiliza um filtro com um tamanho de poro entre cerca de 10 nanômetros e cerca de 2 micrômetros.

[131] Após a filtração, o filtrado é carregado em um sistema de captura de proteínas 605. O sistema de captura de proteínas 605 pode incluir uma ou mais colunas de cromatografia. Se mais de uma coluna de cromatografia for usada, as colunas poderão ser colocadas em série para que a próxima coluna possa começar a carregar assim que a primeira coluna for carregada. Como alternativa, o processo de remoção

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83/150 de mídia pode ser interrompido durante o tempo em que as colunas são trocadas.

[132] Em várias modalidades, o sistema de captura de proteínas 605 inclui uma ou mais colunas de troca aniônica (AEX) para a captura direta do produto de rhGAA, particularmente rhGAA com um alto conteúdo de M6P. O rhGAA capturado pelo sistema de captura de proteína 605 é eluído da (s) coluna (s), alterando o pH e/ou o teor de sal na coluna. Condições exemplares para uma coluna AEX são fornecidas na Tabela 2.

Tabela 2. Condições exemplares para uma coluna AEX

Procedimento	Tampão	Quociente de vazão (cm/h)	Volume (CV)	Temperatura (°C)
Sanitização pré-usada	0,1-10 M NaOH	< 25-2500	> 1-3 (> 10- 120 min)	15 - 25
Pré-Equilíbrio	20-2000 mM tampão fosfato (PB), pH 6,9-7,3	< 25-2500	> 1-5	15 - 25
Equilíbrio	4-400 mM PB, pH 6,9-7,3	< 25-2500	> 1-5	2-15
Carga	NA	< 10-1000	NA	2-15
Lavagem 1	4-400 mM PB, pH 6,9-7,3	< 25-2500	> 2-10	2-15
Lavagem 2	4-400 mM PB, pH 6,9-7,3	< 25-2500	> 2-10	15 - 25
Eluição	4-400 mM PB, 202000 mM NaCl, pH 6,1-6,5	< 25-2500	NA	15 - 25
Faixa	4-400 mM PB, 0,1-10 M NaCl, pH 6,1-6,5	< 25-2500	> 1-5	15 - 25
Sanitização pós-uso	0,1-10 M NaOH	< 25-2500	> 1-3	15 - 25

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			(> 10120 min)
Armazenamento	0,01-1,0 M NaOH	< 25-2500	> 1-5	15 - 25

[133] O rhGAA eluído pode ser submetido a etapas adicionais de purificação e/ou etapas de garantia de qualidade. Por exemplo, o rhGAA eluído pode ser indivíduo a uma etapa de eliminação de vírus 607. Essa eliminação de vírus 607 pode incluir uma ou mais de uma eliminação de pH baixo, uma eliminação de detergente ou outra técnica conhecida na técnica. O rhGAA da etapa de eliminação do vírus 607 pode ser introduzido em um segundo sistema de cromatografia 609 para purificar ainda mais o produto rhGAA. Alternativamente, o rhGAA eluído do sistema de captura de proteínas 605 pode ser alimentado diretamente ao segundo sistema de cromatografia 609. Em várias modalidades, o segundo sistema de cromatografia 609 inclui uma ou mais colunas de cromatografia de afinidade por metal imobilizada (IMAC) para remoção adicional de impurezas. Condições exemplares para uma coluna IMAC são fornecidas na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3. Condições exemplares para uma coluna IMAC

Procedimento	Tampão	Quociente de vazão (cm/h)	Vol(CV)
Enxágue	4-400 mM PB, pH 6,3-6,7	< 25-2500	> 1-5
Sanitização pré-uso	0,01-1,0 M NaOH	< 25-2500	> 1-3 (10 - 30 min)

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Equilíbrio	4-400 mM PB, pH 6,5	< 25-2500	> 1-5
Lavagem com WFI	Água para injeção (WFI)	< 25-2500	> 1-3
Quelante	Acetato de cobre 0,011,0 M	< 25-2500	> 1-5
Lavagem com WFI	WFI	< 25-2500	> 2-10
Lavagem com tampão ácido	Acetato de sódio 2-200 mM, NaCI 0,05-5 M, pH 3,5-4,5	< 25-2500	> 2-10
Equilíbrio	4-400 mM PB, pH 6,3-6,7	< 25-2500	> 1-5
Corrida em branco com buffer de eluição	4-400 mM PB, 15-1500 mM Glycine, pH 6,1-6,5	< 25-2500	> 2-20
Equilíbrio	4-400 mM PB, pH 6,3-6,7	< 25-2500	> 1-5
Carga	NA	< 25-2500	> 1-5
Lavageml	4-400 mM PB, pH 6,3-6,7	< 25-2500	> 2-10
Lavagemí	4-400 mM PB, 0,1-10 M NaCI, 5-30% propylene glycol, pH 6,3-6,7	< 25-2500	> 2-10
Lavagem3	4-400 mM PB, pH 6,3-6,7	< 25-2500	> 2-10
Eluição	PB 4-400 mM, Glicina 151500 mM, pH 6,1-6,5	< 25-2500	NA
Faixa	PB 4-400 mM, imidazol 50-5000 mM, pH 6,3-6,7	< 25-2500	> 1-5
Sanitização pós-uso	0,01-1M NaOH	< 25-2500	> 1-3 (10 - 30 min)
Enxágue	4-400 mM PB, pH 6,3-6,7	< 25-2500	> 1-5
Armazenamento	5-30% de etanol	< 25-2500	> 1-5

[134] Após o rhGAA ser carregado no segundo sistema de cromatografia 609, a proteína recombinante é eluída da(s) coluna(s). O rhGAA eluído pode ser indivíduo a uma etapa de eliminação de vírus 611. Tal como acontece com a eliminação de vírus 607, a eliminação de vírus 611 pode incluir uma ou mais de uma eliminação de pH baixo, uma eliminação de detergente ou outra técnica conhecida na técnica. Em algumas modalidades, apenas uma das mortes por vírus 607 ou 611 é

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86/150 usada, ou as mortes por vírus são realizadas no mesmo estágio no processo de purificação.

[135] O rhGAA da etapa de eliminação do vírus 611 pode ser introduzido em um terceiro sistema de cromatografia 613 para purificar ainda mais o produto proteico recombinante. Alternativamente, a proteína recombinante eluída do segundo sistema de cromatografia 609 pode ser alimentada diretamente ao terceiro sistema de cromatografia 613. Em várias modalidades, o terceiro sistema de cromatografia 613 inclui uma ou mais colunas de cromatografia de troca catiônica (CEX) e/ou cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para posterior remoção de impurezas. O produto rhGAA é então eluído a partir do terceiro sistema de cromatografia 613. Condições exemplares para uma coluna CEX são fornecidas na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4. Condições exemplares para uma coluna CEX

Procedimento	Tampão	Quociente de vazão (cm/h)	Vol (CV)
Sanitização pré-usada	0,1-10 M NaOH	< 25-2500	> 1-3 (> 10-120 min)
Equilíbrio	Citrato de sódio 2-200 mM, pH 4,0-5,0	< 30-3000	> 2-10
Carga	NA	< 30-3000	NA
Lavagem	Citrato de sódio 2-200 mM, pH 4,0-5,0	< 30-3000	> 2-10
Eluição	Citrato de sódio 2-200 mM, NaCl 15-1500 mM, pH 4,0-5,0	< 30-3000	> 2-10
Faixa	Citrato de sódio 2-200 mM, NaCl 0,1-10 M, pH 4,0-5,0	< 30-3000	> 1-5

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Sanitização pós-uso	0,1-10 M NaOH	< 25-2500	> 1-3 (> 10-120 min)
Arma z e name nto	0,01-1,0 M NaOH	< 30-3000	> 1-5

[136] O produto rhGAA também pode ser submetido a processamento adicional. Por exemplo, outro sistema de filtragem 615 pode ser usado para remover vírus. Em algumas modalidades, essa filtragem pode utilizar filtros com tamanhos de poro entre 5 e 50 pm. Outro processamento do produto pode incluir uma etapa de ajuste do produto 617, na qual o produto proteico recombinante pode ser esterilizado, filtrado, concentrado, armazenado e/ou ter componentes adicionais a serem adicionados para a formulação do produto final.

[137] Como usado aqui, o termo ATB200 se refere a um rhGAA com um alto conteúdo de N-glicanos contendo mono-M6P e bis-M6P, que é produzido a partir de uma linhagem de células GA-ATB200 e purificado usando os métodos aqui descritos.

V. Composição Farmacêutica

[138] Em várias modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o rhGAA aqui descrito, isoladamente ou em combinação com outros agentes terapêuticos, e/ou um carreador farmaceuticamente aceitável.

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[139] Em uma ou mais modalidades, uma composição farmacêutica aqui descrita compreende um sal farmaceuticamente aceitável.

[140] Em algumas modalidades, o sal farmaceuticamente aceitável usado aqui é um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável. O sal de adição de ácido aceitável sob o ponto de vista farmacêutico pode incluir, mas não está limitado a, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfâmico, ácido nítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes e ácidos orgânicos, incluindo mas não limitado a ácido acético, trifluoroacético ácido, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzenossulfônico, ácido benzoico, ácido butírico, ácido canfórico, ácido canforsulfônico, ácido cinâmico, ácido cítrico, ácido cítrico, ácido diglucônico, ácido etanossulfônico, ácido glutâmico, ácido glicólico, ácido glicerofosfórico, ácido hemissulfônico, ácido hexanóico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido 2hidroxietanossulfônico (ácido isetiônico), ácido lático, ácido hidroxmaleico, ácido málico, ácido malônico, ácido mandélico, ácido mesitilenosulfônico, ácido metanossulfônico, ácido naftalenossulfônico, ácido nicotínico, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido oxálico, ácido pamoico, ácido pectínico, ácido fenilacético, ácido 3fenilpropiônico, ácido piválico, ácido propiônico, ácido

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89/150 pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfanílico, ácido tartárico, ácido ptoluenossulfônico, ácido undecanóico e similares.

[141] Em algumas modalidades, o sal farmaceuticamente aceitável usado aqui é um sal de adição de base farmaceuticamente aceitável. O sal de adição de base farmaceuticamente aceitável pode incluir, mas não está limitado a, amônia ou hidróxido, carbonato ou bicarbonate de amônio ou um cátion metálico, como sódio, potássio, lítio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e similares. Os sais derivados de bases não tóxicas orgânicas aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem, entre outros, sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, compostos de aminas quaternárias, aminas substituídas, incluindo aminas substituídas naturalmente, aminas cíclicas e resinas básicas de troca iônica, como Metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, isopropilamina, tripropilamina, tributilamina, etanolamina, dietanolamina, 2dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, hidrabamina, colina, betaína, etilamina, colina, beta-amina, etilamina, etilamina, etilamina, metilamina, etilamina, etilamina, tributilamina, tributilamina, etanolamina, etanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol,

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90/150 diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, hidrabamina, colina, beta-amina, colina, beta-amina, etilamina, colina, beta-amina, etilamina, colina, betaamina, etilamina, colina, beta-amina, etilamina, etilamina, etilamina, etilamina, etilamina metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, compostos de tetrametilamônio, compostos de tetraetilamônio, piridina, N, N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, dibenzilamina, N, fenil-fenilamina, N, N'-dibenziletilenodiamina, resinas de poliamina e similares.

[142] Em algumas modalidades, o rhGAA ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser formulado como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é uma solução em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico sítio para aliviar a dor no sítio da injeção. Os ingredientes da composição farmacêutica podem ser fornecidos separadamente ou misturados na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em um recipiente hermeticamente fechado, como uma ampola ou saqueta, indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, ela pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água estéril de

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91/150 grau farmacêutico, solução salina ou dextrose/água. Em algumas modalidades, a infusão pode ocorrer em um hospital ou clínica. Em algumas modalidades, a infusão pode ocorrer fora do ambiente hospitalar ou clínico, por exemplo, na residência de um indivíduo. Onde a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[143] Em algumas modalidades, o rhGAA ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo pode ser formulado para administração oral. As composições administráveis por via oral podem ser formuladas na forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, soluções ou suspensões, géis, xaropes, lavagens bucais ou pó seco para reconstituição com água ou outro carreador adequado antes do uso, opcionalmente com agentes aromatizantes e corantes para aplicações de liberação imediata, retardada, modificada, sustentada, pulsada ou controlada. Composições sólidas, como comprimidos, cápsulas, drágeas, pastilhas, pílulas, bolus, pó, pastas, grânulos, balas, drageias ou preparações de prémistura também podem ser usadas. As composições sólidas e líquidas para uso oral podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Tais composições também podem conter um ou mais carreadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem estar na forma sólida

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92/150 ou líquida. Os comprimidos ou cápsulas podem ser preparados por meios convencionais com excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, incluindo, entre outros, agentes aglutinantes, cargas, lubrificantes, desintegrantes ou agentes umectantes. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados são conhecidos na técnica e incluem, entre outros, amido pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona, povidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropil etilcelulose (HPEC), hidroxipropil etilcelulose (HPEC), hidroxipropil etilcelulose (HPEC), hidroxipropil celulose (HPC), sacarose, gelatina, acácia, lactose, microcristalina celulose, hidrogenofosfato de cálcio, estearato de magnésio, ácido esteárico, amilato de gliceril, talco, silica, milho, amido de batata ou tapioca, amido glicolato de sódio, lauril sulfato de sódio, citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato dibásico de cálcio, glicina croscarmelose sódica e complexo silicatos. Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica.

[144] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica aqui descrita pode ser formulada de acordo com o Pedido Internacional PCT/US2017/024982 e o Pedido Provisório dos EUA No. 62/506.574, ambos aqui incorporados por referência na sua totalidade. Por exemplo, em algumas modalidades, o pH de uma composição farmacêutica aqui descrita é de cerca de 5,0 a cerca de 7,0 ou cerca de 5,0 a

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93/150 cerca de 6,0. Em algumas modalidades, o pH varia de cerca de 5,5 a cerca de 6,0. Em algumas modalidades, o pH da composição farmacêutica é 6,0. Em algumas modalidades, o pH pode ser ajustado para um pH alvo usando ajustadores de pH (por exemplo, agentes alcalinizantes e agentes acidificantes), como hidróxido de sódio e/ou ácido clorídrico.

[145] A composição farmacêutica aqui descrita pode compreender um sistema tampão, como um sistema de citrato, um sistema de fosfato e uma combinação dos mesmos. O citrato e/ou fosfato pode ser um citrato de sódio ou fosfato de sódio. Outros sais incluem sais de potássio e amônio. Em uma ou mais modalidades, o tampão compreende um citrato. Em outras modalidades, o tampão compreende citrato de sódio (por exemplo, uma mistura de citrato de sódio desidratado e ácido cítrico monohidratado). Em uma ou mais modalidades, soluções tampão compreendendo um citrato podem compreender citrato de sódio e ácido cítrico. Em algumas modalidades, estão presentes um tampão de citrato e fosfato.

[146] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica aqui descrita compreende pelo menos um excipiente. O excipiente pode funcionar como um agente de tonicidade, agente de volume e/ou estabilizador. Os agentes de tonicidade são componentes que ajudam a garantir que a formulação tenha uma pressão osmótica semelhante ou igual ao

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94/150 sangue humano. Os agentes de volume são ingredientes que adicionam massa às formulações (por exemplo, liofilizadas) e fornecem uma estrutura adequada ao bolo. Estabilizadores são compostos que podem impedir ou minimizar a formação de agregados nas superfícies interfaciais hidrofóbicas ar-água. Um excipiente pode funcionar como agente de tonicidade e agente de volume ao mesmo tempo. Por exemplo, o manitol pode funcionar como um agente de tonicidade e também fornecer benefícios como um agente de volume.

[147] Exemplos de agentes de tonicidade incluem cloreto de sódio, manitol, sacarose e trealose. Em algumas modalidades, o agente de tonicidade compreende manitol. Em algumas modalidades, a quantidade total de agente (s) de tonicidade varia em uma quantidade de cerca de 10 mg/mL a cerca de 50 mg/mL. Em outras modalidades, a quantidade total de agente (s) de tonicidade varia em uma quantidade de cerca de 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mg/mL a cerca de 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 mg/mL.

[148] Em algumas modalidades, o excipiente compreende um estabilizador. Em algumas modalidades, o estabilizador é um surfactante. Em algumas modalidades, o estabilizador é o polissorbato 80. Em uma ou mais modalidades, a quantidade total de estabilizador varia de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 1,0 mg/mL. Em outras modalidades, a quantidade total de estabilizador varia de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ou 0,5

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95/150 mg/mL a cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 mg/mL. Em ainda outras modalidades, a quantidade total de estabilizador é de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 mg/mL.

[149] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende (a) um rhGAA (como ATB200), (b) pelo menos um tampão selecionado do grupo que consiste em um citrato, um fosfato e uma combinação dos mesmos e (c) pelo menos um excipiente selecionado do grupo que consiste em manitol, polissorbato 80 e uma combinação dos mesmos, e tem um pH de (i) de cerca de 5,0 a cerca de 6,0 ou (ii) de cerca de 5,0 a cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda água. Em algumas modalidades, a composição pode ainda compreender um agente acidificante e/ou agente alcalinizante.

[150] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende (a) um rhGAA (como ATB200) a uma concentração de cerca de 5-50 mg/mL, cerca de 5-30 mg/mL ou cerca de 15 mg/mL, (b) citrato de sódio tampão a uma concentração de cerca de 10-100 mM ou cerca de 25 mM, (c) manitol a uma concentração de cerca de 10-50 mg/mL, ou cerca de 20 mg/mL, (d) polissorbato 80, presente a uma concentração de cerca de 0,1-1 mg/mL, cerca de 0,2-0,5 mg/mL, ou cerca de 0,5 mg/mL, e (e) água e tem um pH de cerca de 6,0. Em pelo menos uma modalidade, a composição farmacêutica compreende (a) 15

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96/150 mg/mL de rhGAA (como ATB200) (b) tampão de citrato de sódio 25 mM, (c) 20 mg/mL de manitol (d) 0,5 mg/mL de polissorbato 80, e (e) água e tern um pH de cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a composição pode ainda compreender um agente acidificante e/ou agente alcalinizante.

[151] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreendendo rhGAA é diluída antes da administração a um indivíduo em necessidade.

[152] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica aqui descrita compreende uma chaperona. Em algumas modalidades, a chaperona é miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Noutra modalidade, a chaperona é duvoglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[153] Em algumas modalidades, um rhGAA aqui descrito é formulado em uma composição farmacêutica, enquanto um chaperona como o miglustat é formulado em outra composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreendendo miglustat é baseada em uma formulação disponível comercialmente como Zavesca® (Actelion Pharmaceuticals).

[154] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica aqui descrita pode sofrer processo de liofilização (liofilização) para fornecer um bolo ou pó. Por conseguinte, outro aspecto da invenção se refere a uma composição

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97/150 farmacêutica após liofilização. A mistura liofilizada pode compreender o rhGAA aqui descrito (por exemplo, ATB200), tampão selecionado do grupo que consiste em um citrato, um fosfato e suas combinações e pelo menos um excipiente selecionado do grupo que consiste em trealose, manitol, polissorbato 80, e uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, outros ingredientes (por exemplo, outros excipientes) podem ser adicionados à mistura liofilizada. A composição farmacêutica compreendendo a formulação liofilizada pode ser fornecida frasco, que pode ser armazenado, transportado, reconstituído e/ou administrado a um paciente.

VI. Métodos de tratamento

A. Tratamento de Doenças

[155] Outro aspecto da invenção se refere a um método de tratamento de uma doença ou distúrbio relacionado à desregulação do armazenamento de glicogênio pela administração da rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita. Em algumas modalidades, a doença é a doença de Pompe (também conhecida como deficiência de maltase ácida (AMD) e doença de armazenamento de glicogênio tipo II (GSD II)). Em algumas modalidades, o rhGAA é ATB200. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende ATB200.

[156] A rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita é administrada por uma via apropriada. Em uma modalidade, a

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98/150 rhGAA ou composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Em outras modalidades, a rhGAA ou composição farmacêutica é administrada por administração direta a um tecido alvo, como coração ou músculo esquelético (por exemplo, intramuscular) ou sistema nervoso (por exemplo, injeção direta no cérebro; intraventricularmente; intratecalmente). Em algumas modalidades, a rhGAA ou composição farmacêutica é administrada por via oral. Mais de uma rota pode ser usada simultaneamente, se desejado.

[157] Em algumas modalidades, os efeitos terapêuticos do rhGAA ou da composição farmacêutica aqui descritos podem ser avaliados com base em um ou mais dos seguintes critérios: (1) status cardíaco (por exemplo, aumento dos volumes diastólico final e/ou sistólico final, ou redução, melhoria ou prevenção da cardiomiopatia progressiva geralmente encontrada no GSD-II), (2) função pulmonar (por exemplo, aumento da capacidade vital de choro sobre a capacidade basal e/ou normalização da dessaturação de oxigênio durante o choro), (3) desenvolvimento neurológico e/ou habilidades motoras (por exemplo, aumento no escore AIMS) e (4) redução dos níveis de glicogênio no tecido do indivíduo afetado pela doença.

[158] Em algumas modalidades, o status cardíaco de um indivíduo é melhorado em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de

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99/150 uma ou mais dosagens da rhGAA ou composição farmacêutica descrita aqui, em comparação com o de um indivíduo tratado com um carreador ou o de um indivíduo antes do tratamento. O status cardíaco de um indivíduo pode ser avaliado medindose os volumes diastólico final e/ou sistólico final e/ou avaliando clinicamente a cardiomiopatia. Em algumas modalidades, a função pulmonar de um indivíduo é melhorada em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de uma ou mais dosagens de ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200 , em comparação com o de um indivíduo tratado com um carreador ou o de um indivíduo antes do tratamento. Em certas modalidades, a melhoria é alcançada após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais da administração (ou qualquer período de tempo intermediário). Em certas modalidades, ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200 melhora a função pulmonar de um indivíduo após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais da administração (ou qualquer período intermediário).

[159] Em algumas modalidades, a função pulmonar de um indivíduo é melhorada em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de uma ou mais dosagens da rhGAA ou composição farmacêutica descrita aqui, em comparação com o de um indivíduo tratado com um carreador ou o de um indivíduo antes do tratamento.

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A função pulmonar de um indivíduo pode ser avaliada pela capacidade vital de choro sobre a capacidade basal e/ou normalização da dessaturação de oxigênio durante o choro. Em algumas modalidades, a função pulmonar de um indivíduo é melhorada em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de uma ou mais dosagens de ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200 , em comparação com o de um indivíduo tratado com um carreador ou o de um indivíduo antes do tratamento. Em certas modalidades, a melhoria é alcançada após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais da administração (ou qualquer período de tempo intermediário). Em certas modalidades, ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200 melhora a função pulmonar de um indivíduo após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais da administração (ou qualquer período intermediário).

[160] Em algumas modalidades, o neurodesenvolvimento e/ou habilidades motoras de um indivíduo são aprimorados em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de uma ou mais dosagens do rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita, em comparação com a de um indivíduo tratado com um carreador ou com o de um indivíduo antes do tratamento. O neurodesenvolvimento e/ou habilidades motoras de um

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101/150 indivíduo podem ser avaliados através da determinação de uma pontuação no AIMS. O AIMS é uma escala ancorada de 12 itens administrada e pontuada pelo médico (ver Rush JA Jr., Manual de Medidas Psiquiátricas, American Psychiatric Association, 2000, 166-168) . Os itens de 1 a 10 são classificados em uma escala ancorada de 5 pontos. Os itens del a 4 avaliam os movimentos orofaciais. Os itens de 5 a 7 tratam de discinesia truncal e de extremidade. Os itens de 8 a 10 lidam com a gravidade global, conforme julgado pelo examinador, e a conscientização do paciente sobre os movimentos e a angústia associados a eles. Os itens 11-12 são perguntas de sim/não com relação a problemas com dentes e/ou dentaduras (esses problemas podem levar a um diagnóstico equivocado de discinesia). Em algumas modalidades, o neurodesenvolvimento e/ou habilidades motoras de um indivíduo são aprimorados em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de uma ou mais dosagens de ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200, em comparação com a de um indivíduo tratado com um carreador ou o de um indivíduo antes do tratamento. Em certas modalidades, a melhoria é alcançada após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais da administração (ou qualquer período de tempo intermediário). Em certas modalidades, ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200 melhora o neurodesenvolvimento e/ou habilidades

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102/150 motoras de um indivíduo após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais da administração (ou qualquer período intermediário).

[161] Em algumas modalidades, o nível de glicogênio de um determinado tecido de um indivíduo é reduzido em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de uma ou mais dosagens do rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita, em comparação com a de um indivíduo tratado com um carreador ou com o de um indivíduo antes do tratamento. Em algumas modalidades, o tecido é um músculo como quadriceps, triceps e gastrocnêmio. O nível de glicogênio de um tecido pode ser analisado usando métodos conhecidos na técnica. A determinação dos níveis de glicogênio é bem conhecida com base na digestão da amiloglicosidase e é descrita em publicações como: Amalfitano et ai. (1999), Correção sistêmica da doença de armazenamento de glicogênio do distúrbio muscular tipo ii após o direcionamento hepático de um vetor de adenovirus modificado que codifica a ácido-alfaglicosidase humana, Proc Natl Acad Sei USA, 96: 8861-8866. Em algumas modalidades, o nível de glicogênio no músculo de um indivíduo é reduzido em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de uma ou mais dosagens de ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200, em comparação com o de um indivíduo

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103/150 tratado com um carreador ou com o de um indivíduo antes do tratamento. Em certas modalidades, a redução é alcançada após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais da administração (ou qualquer período de tempo intermediário). Em certas modalidades, ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200 reduz o nível de glicogênio no músculo de um indivíduo após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais após a administração (ou qualquer período intermediário).

B. Biomarcadores

[162] Os biomarcadores do acúmulo de glicogênio em uma fibra muscular de um indivíduo, como o tetrassacarídeo hexose hexagonal (Hex4), podem ser usados para avaliar e comparar os efeitos terapêuticos da terapia de reposição enzimática em um indivíduo com doença de Pompe. Em algumas modalidades, o efeito terapêutico do rhGAA ou de uma composição farmacêutica compreendendo rhGAA na acumulação de glicogênio é avaliado medindo os níveis de Hex4 em um indivíduo.

[163] Biomarcadores de lesão ou dano muscular, como creatina quinase (CK), alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) podem ser usados para avaliar e comparar os efeitos terapêuticos da terapia de reposição enzimática em indivíduos com doença de Pompe. Em algumas modalidades, o efeito terapêutico do rhGAA ou de uma composição farmacêutica compreendendo rhGAA no dano muscular

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104/150 é avaliado medindo os níveis de CK, ALT e/ou AST em um indivíduo. Em pelo menos uma modalidade, o efeito terapêutico do rhGAA ou de uma composição farmacêutica compreendendo rhGAA no dano muscular é avaliado medindo os níveis de CK em um indivíduo.

[164] Biomarcadores como LAMP-1, LC3 e Dysferlin também podem ser utilizados para avaliar e comparar os efeitos terapêuticos do rhGAA ou da composição farmacêutica aqui descrita. Na doença de Pompe, a falha do GAA em hidrolisar o glicogênio lisossômico leva ao acúmulo anormal de grandes lisossomos preenchidos com glicogênio em alguns tecidos. (Raben et al. , JBC 273: 19086-19092, 1998.) Estudos em um modelo de camundongo da doença de Pompe mostraram que os lisossomos aumentados no músculo esquelético não podem explicar adequadamente a redução no desempenho mecânico e que a presença de grandes inclusões contendo miofibrilas degradadas (ou seja, acúmulo autofágico) contribui para o comprometimento da função muscular. (Raben et al. , Human Mol Genet 17: 3897-3908, 2008.) Os relatórios também sugerem que o fluxo de autofagia prejudicado está associado a um resultado terapêutico ruim em pacientes com Pompe. (Nascimbeni et al., Neuropatologia e Neurobiologia Aplicada doi: 10.1111/nan. 12214, 2015; Fukuda et al. , Mol Ther 14: 831-839, 2006.) Além disso, a doença de Pompe de início tardio é prevalente em membros não classificados, distrofias

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105/150 musculares da cintura (LGMDs) (Preisler et al. , Mol Genet Metab 110: 287-289, 2013), que é um grupo de doenças neuromusculares geneticamente heterogêneas com mais de 30 subtipos geneticamente definidos de gravidade variável. O exame IHC revelou presença sarcoplasmática substancialmente elevada de disferlin nas fibras musculares esqueléticas de camundongos Gaa KO.

[165] Vários métodos conhecidos podem ser usados para medir o nível de expressão gênica e/ou o nível de proteína desses biomarcadores. Por exemplo, uma amostra de um indivíduo tratado com rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita pode ser obtida, como biópsia de tecidos, em particular músculo. Em algumas modalidades, a amostra é uma biópsia de músculo em um indivíduo. Em algumas modalidades, o músculo é selecionado dentre quadriceps, triceps e gastrocnêmio. A amostra obtida de um indivíduo pode ser corada com um ou mais anticorpos ou outros agentes de detecção que detectam esses biomarcadores ou podem ser identificados e quantificados por espectrometria de massa. As amostras podem também ou, alternativamente, ser processadas para detectar a presença de ácidos nucleicos, como mRNAs, que codificam os biomarcadores através de, por exemplo, métodos RT-qPCR.

[166] Em algumas modalidades, o nível de expressão gênica e/ou o nível de proteína de um ou mais biomarcadores

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106/150 é medido em uma biópsia muscular obtida de um indivíduo antes e após o tratamento com o rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita. Em algumas modalidades, o nível de expressão gênica e/ou nível de proteína de um ou mais biomarcadores é medido em uma biópsia muscular obtida de um indivíduo tratado com um carreador. Em algumas modalidades, o nível de expressão gênica e/ou nível de proteína de um ou mais biomarcadores é reduzido em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de um ou mais dosagens da rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita, em comparação com a de um indivíduo tratado com um carreador ou com o de um indivíduo antes do tratamento. Em algumas modalidades, o nível de expressão gênica e/ou nível de proteína de um ou mais biomarcadores é reduzido em 10%, 20%, 30%, 40% ou 50% (ou qualquer porcentagem intermediária) após a administração de um ou mais dosagens de ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200, em comparação com a de um indivíduo tratado com um carreador ou a de um indivíduo antes do tratamento. Em certas modalidades, a redução é alcançada após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais da administração (ou qualquer período de tempo intermediário). Em certas modalidades, ATB200 ou composição farmacêutica compreendendo ATB200 reduz o nível de expressão gênica e/ou proteína de um ou mais biomarcadores após 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 1 mês, 2 meses ou mais

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107/150 da administração (ou qualquer período de tempo intermediário).

C. Dosagens de rhGAA

[167] A formulação farmacêutica ou composição reconstituída é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz (por exemplo, uma quantidade de dosagem que, quando administrada em intervalos regulares, é suficiente para tratar a doença, como melhorando os sintomas associados à doença, prevenindo ou retardando o aparecimento de doença e/ou diminuição da gravidade ou frequência dos sintomas da doença). A quantidade que é terapeuticamente eficaz no tratamento da doença pode depender da natureza e extensão dos efeitos da doença e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro ou in vivo podem opcionalmente ser empregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais. Em pelo menos uma modalidade, um rhGAA aqui descrito ou composição farmacêutica compreendendo o rhGAA é administrado a uma dose de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, como cerca de 5 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, tipicamente cerca de 5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Em pelo menos uma modalidade, a rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita é administrada a uma dose de cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de15 mg/kg, cerca de 20 mg/kg, cerca de 25 mg/kg, cerca de30 mg/kg, cerca de 35 mg/kg, cerca de 40 mg/kg, cerca de50

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108/150 mg/kg, cerca de 50 mg/kg, cerca de 60 mg/kg, cerca de 70 mg/kg, cerca de 80 mg/kg, cerca de 90 mg/kg, ou cerca de 100 mg/kg. Em algumas modalidades, o rhGAA é administrado na dose de 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg, 75 mg/kg ou 100 mg/kg. Em pelo menos uma modalidade, o rhGAA ou composição farmacêutica é administrado a uma dose de cerca de 20 mg/kg. Em algumas modalidades, a rhGAA ou composição farmacêutica é administrada simultaneamente ou sequencialmente com um chaperona farmacológica. Em algumas modalidades, o chaperona farmacológica é miglustat. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado como uma dose oral de cerca de 260 mg. A dose eficaz para um indivíduo em particular pode ser variada (por exemplo, aumentada ou diminuída) ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo. Por exemplo, em tempos de doença física ou estresse, ou se anticorpos anti-a-glicosidase presentes ou aumentam, ou se os sintomas da doença piorarem, a quantidade pode ser aumentada.

[168] Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz da rhGAA ou composição farmacêutica descrita aqui é menor que a dos produtos rhGAA convencionais. Por exemplo, se a dose terapeuticamente eficaz de um produto rhGAA convencional for 20 mg/kg, a dose do rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita necessária para produzir os mesmos ou melhores efeitos terapêuticos que o produto rhGAA

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109/150 convencional pode ser menor que 20 mg /kg. Os efeitos terapêuticos podem ser avaliados com base em um ou mais critérios discutidos acima (por exemplo, status cardíaco, nível de glicogênio ou expressão de biomarcadores). Em algumas modalidades, a dose terapeuticamente eficaz da rhGAA ou composição farmacêutica descrita aqui é pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais abaixo do que os produtos rhGAA convencionais.

[169] Em algumas modalidades, o efeito terapêutico do rhGAA ou da composição farmacêutica aqui descrita compreende uma melhoria na função motora, uma melhora na força muscular (parte superior do corpo, parte inferior do corpo ou corpo total), uma melhoria na função pulmonar, diminuição da fadiga, níveis reduzidos de pelo menos um biomarcador de lesão muscular, níveis reduzidos de pelo menos um biomarcador de acúmulo de glicogênio ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o efeito terapêutico do rhGAA ou composição farmacêutica descrita neste documento compreende uma reversão da patologia lisossômica em uma fibra muscular, uma redução mais rápida e/ou mais eficaz no conteúdo de glicogênio em uma fibra muscular, um aumento no teste de caminhada de seis minutos distância, uma diminuição no tempo de teste de aceleração e desaceleração, uma diminuição no tempo de teste de subida em quatro escadas, uma diminuição no tempo de teste de caminhada de dez metros, uma diminuição

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110/150 na pontuação da marcha na cadeira da torre, um aumento na força da extremidade superior , uma melhora na adução do ombro, uma melhora na abdução do ombro, uma melhora na flexão do cotovelo, uma melhoria na extensão do cotovelo, uma melhoria na força da parte superior do corpo, uma melhoria na força da parte inferior do corpo, uma melhoria na força total do corpo, uma melhoria na posição vertical (vital) capacidade vital forçada, uma melhora na pressão expiratória máxima, uma melhora na pressão inspiratória máxima, uma diminuição no escore da escala de gravidade da fadiga, uma redução no tetrasacchar de hexose na urina níveis ide, uma redução nos níveis de creatina quinase, uma redução nos níveis de alanina aminotransferase, uma redução nos níveis de asparato aminotransferase ou qualquer combinação dos mesmos.

[170] Em algumas modalidades, a rhGAA ou composição farmacêutica descrita aqui alcança os efeitos terapêuticos desejados mais rapidamente do que os produtos rhGAA convencionais quando administrados na mesma dose. Os efeitos terapêuticos podem ser avaliados com base em um ou mais critérios discutidos acima (por exemplo, status cardíaco, nível de glicogênio ou expressão de biomarcadores). Por exemplo, se uma dose única de um produto rhGAA convencional diminui os níveis de glicogênio no tecido de um indivíduo tratado em 10% em uma semana, o mesmo grau de redução pode

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111/150 ser alcançado em menos de uma semana quando a mesma dose do rhGAA ou produto farmacêutico a composição aqui descrita é administrada. Em algumas modalidades, guando administrado na mesma dose, o rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita pode alcançar os efeitos terapêuticos desejados pelo menos cerca de 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 3, 0 ou mais rápido que os produtos rhGAA convencionais.

[171] Em algumas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de rhGAA (ou composição ou medicamento compreendendo rhGAA) é administrada mais de uma vez. Em algumas modalidades, a rhGAA ou composição farmacêutica descrita aqui é administrada em intervalos regulares, dependendo da natureza e extensão dos efeitos da doença, e de forma contínua. A administração em um intervalo regular, como aqui utilizado, indica que a quantidade terapeuticamente eficaz é administrada periodicamente (em oposição a uma dose única). O intervalo pode ser determinado por técnicas clínicas padrão. Em certas modalidades, o rhGAA é administrado bimestralmente, mensalmente, duas vezes por semana, semanalmente, duas vezes por semana ou diariamente. Em algumas modalidades, o rhGAA é administrado por via intravenosa duas vezes por semana, semanalmente ou a cada duas semanas. O intervalo de administração para um único indivíduo não precisa ser um intervalo fixo, mas pode variar ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo.

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Por exemplo, em tempos de doença física ou estresse, se anticorpos anti-rhGAA se tornarem presentes ou aumentarem, ou se os sintomas da doença piorarem, o intervalo entre as doses poderá ser diminuído.

[172] Em algumas modalidades, quando usado na mesma dose, o rhGAA ou composição farmacêutica como aqui descrito pode ser administrado com menos frequência que os produtos rhGAA convencionais e ainda capaz de produzir os mesmos ou melhores efeitos terapêuticos que os produtos rhGAA convencionais. Por exemplo, se um produto rhGAA convencional for administrado a 20 mg/kg por semana, o rhGAA ou a composição farmacêutica descrita aqui pode produzir os mesmos ou melhores efeitos terapêuticos que o produto rhGAA convencional quando administrado a 20 mg/kg, mesmo que o rhGAA ou composição farmacêutica é administrada com menos frequência, por exemplo, quinzenalmente ou mensalmente. Os efeitos terapêuticos podem ser avaliados com base em um ou mais critérios discutidos acima (por exemplo, status cardíaco, nível de glicogênio ou expressão de biomarcadores) . Em algumas modalidades, um intervalo entre duas doses do rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita é maior que o dos produtos rhGAA convencionais. Em algumas modalidades, o intervalo entre duas doses da rhGAA ou composição farmacêutica é pelo menos cerca de 1,25, 1,5,

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1,75, 2,0, 3,0 ou mais maior que o dos produtos rhGAA convencionais.

[173] Em algumas modalidades, sob a mesma condição de tratamento (por exemplo, a mesma dose administrada no mesmo intervalo), a rhGAA ou composição farmacêutica descrita aqui fornece efeitos terapêuticos em um grau superior ao fornecido pelos produtos rhGAA convencionais. Os efeitos terapêuticos podem ser avaliados com base em um ou mais critérios discutidos acima (por exemplo, status cardíaco, nível de glicogênio ou expressão de biomarcadores) . Por exemplo, quando comparado a um produto rhGAA convencional administrado a 20 mg/kg por semana, o rhGAA ou composição farmacêutica administrada a 20 mg/kg por semana pode reduzir os níveis de glicogênio no tecido de um indivíduo tratado em um grau mais alto. Em algumas modalidades, quando administrado sob a mesma condição de tratamento, o rhGAA ou composição farmacêutica descrita neste documento fornece efeitos terapêuticos que são pelo menos cerca de 1,25, 1,5, 1,75, 2,0, 3,0 ou mais do que os dos produtos rhGAA convencionais.

D. Terapia combinada

[174] Em uma ou mais modalidades, o rhGAA ou composição farmacêutica compreendendo o rhGAA aqui descrito é administrado simultaneamente ou sequencialmente com um chaperona farmacológica. Em algumas modalidades, a rhGAA ou

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114/150 composição farmacêutica é administrada por uma via diferente em comparação com a chaperona farmacológica. Por exemplo, uma chaperona farmacológica pode ser administrada por via oral enquanto a rhGAA ou composição farmacêutica é administrada por via intravenosa.

[175] Em várias modalidades, a chaperona farmacológica é miglustat. Em algumas modalidades, o miglustat é administrado em uma dose oral de cerca de 50 mg a cerca de 600 mg. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado em uma dose oral de cerca de 200 mg a cerca de 600 mg, ou em uma dose oral de cerca de 200 mg, cerca de 250 mg, cerca de 250 mg, cerca de 300 mg, cerca de 300 mg, cerca de 350 mg, cerca de 400 mg, cerca de 450 mg, cerca de 500 mg, cerca de 550 mg ou cerca de 600 mg. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado em uma dose oral de cerca de 233 mg a cerca de 500 mg. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado a uma dose oral de cerca de 250 a cerca de 270 mg, ou a uma dose oral de cerca de 250 mg, cerca de 255 mg, cerca de 260 mg, cerca de 260 mg, cerca de 2 65 mg ou cerca de 27 0 mg. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado como uma dose oral de cerca de 260 mg.

[176] Será entendido pelos especialistas na técnica que uma dose oral de miglustat na faixa de cerca de 200 mg a 600 mg ou qualquer faixa menor com a mesma pode ser adequada

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115/150 para um paciente adulto, dependendo do seu peso corporal.

Por exemplo, para pacientes com um peso corporal significativamente menor que cerca de 70 kg, incluindo, entre outros, bebês, crianças ou adultos com baixo peso, uma dose menor pode ser considerada adequada por um médico. Portanto, em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado como uma dose oral de cerca de 50 mg a cerca de 200 mg, ou como uma dose oral de cerca de 50 mg, cerca de 75 mg, cerca de 100 mg, 125 mg, cerca de 150 mg, cerca de 175 mg ou cerca de 200 mg. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado como uma dose oral de cerca de 65 mg a cerca de 195 mg, ou como uma dose oral de cerca de 65 mg, cerca de 130 mg ou cerca de 195 mg.

[177] Em algumas modalidades, o rhGAA é administrado por via intravenosa a uma dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e o miglustat é administrado por via oral a uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 600 mg. Em algumas modalidades, o rhGAA é administrado por via intravenosa a uma dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e o miglustat é administrado por via oral a uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 200 mg. Em algumas modalidades, o rhGAA é administrado por via intravenosa a uma dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e o miglustat é administrado por via oral a uma dose de cerca de 200 mg a cerca de 600 mg. Em algumas modalidades, o rhGAA é administrado por via

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116/150 intravenosa a uma dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e o miglustat é administrado por via oral a uma dose de cerca de 233 mg a cerca de 500 mg. Em uma modalidade, o rhGAA é administrado por via intravenosa a uma dose de cerca de 20 mg/kg e o miglustat é administrado por via oral a uma dose de cerca de 260 mg.

[178] Em algumas modalidades, o miglustat e o rhGAA são administrados simultaneamente. Por exemplo, o miglustat pode ser administrado dentro de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 minuto (s) antes ou após a administração do rhGAA. Em algumas modalidades, o miglustat é administrado dentro de 5, 4, 3, 2 ou 1 minuto (s) antes ou após a administração do rhGAA.

[179] Em algumas modalidades, o miglustat e o rhGAA são administrados sequencialmente. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado antes da administração do rhGAA. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado menos de três horas antes da administração do rhGAA. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado cerca de duas horas antes da administração do rhGAA. Por exemplo, o miglustat pode ser administrado cerca de 1,5 horas, cerca de 1 hora, cerca de 50 minutos, cerca de 30 minutos ou cerca de 20 minutos antes da administração do rhGAA. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado cerca de uma hora antes da administração do rhGAA.

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[180] Em algumas modalidades, o miglustat é administrado após a administração do rhGAA. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado dentro de três horas após a administração do rhGAA. Em pelo menos uma modalidade, o miglustat é administrado dentro de duas horas após a administração do rhGAA. Por exemplo, o miglustat pode ser administrado dentro de cerca de 1,5 horas, cerca de 1 hora, cerca de 50 minutos, cerca de 30 minutos ou cerca de 20 minutos após a administração do rhGAA.

[181] Em algumas modalidades, o indivíduo jejua por pelo menos duas horas antes e pelo menos duas horas após a administração do miglustat.

E. Kit

[182] Outro aspecto da invenção se refere a kits compreendendo o rhGAA ou composição farmacêutica aqui descrita. Em uma ou mais modalidades, o kit compreende um recipiente (por exemplo, frasco, tubo, bolsa, etc.) compreendendo o rhGAA ou composição farmacêutica (antes ou depois da liofilização) e instruções para reconstituição, diluição e administração.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação de células CHO produzindo rhGAA com um alto teor de N-glicanos contendo mono- ou bis-M6P.

[183] As células DG44 CHO (DHFR-) foram transfectadas com um construto de DNA que expressa rhGAA. O construto de

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DNA é mostrada na Figura 4. Após a transfecção, as células CHO contendo um gene GAA estavelmente integrado foram selecionadas com meio deficiente em hipoxantina/timidina (HT) . A expressão de GAA nessas células foi induzida por tratamento com metotrexato (MTX, 500 nM).

[184] Os conjuntos de células que expressavam grandes quantidades de GAA foram identificados por ensaios de atividade enzimática de GAA e foram usados para estabelecer clones individuais que produzem rhGAA. Os clones individuais foram gerados em placas semi-sólidas, colhidos pelo sistema ClonePix, e foram transferidos para placas com 24 poços de profundidade. Os clones individuais foram testados quanto à atividade da enzima GAA para identificar clones que expressam um alto nível de GAA. O meio condicionado para determinar a atividade do GAA utilizou um substrato de 4-MU-aglicosidase. Os clones que produzem níveis mais altos de GAA, medidos por ensaios enzimáticos de GAA, foram ainda avaliados quanto à viabilidade, capacidade de crescimento, produtividade de GAA, estrutura de N-glicano e expressão estável de proteínas. As linhagens celulares CHO, incluindo a linhagem celular CHO GA-ATB200, expressando rhGAA com Nglicanos mono-M6P ou bis-M6P aprimorados, foram isoladas usando este procedimento.

Exemplo 2: Purificação de rhGAA

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[185] Várias bateladas do rhGAA de acordo com a invenção foram produzidos em frascos de agitação e em biorreatores de perfusão usando a linhagem celular CHO GA-ATB200, cujo produto é referido como ATB200. Foi utilizada cromatografia líquida de troca aniônica fraca (WAX) fracionar ο ATB200 rhGAA de acordo com o fosfato terminal e o ácido siálico. Os perfis de eluição foram gerados eluindo o ERT com uma quantidade crescente de sal. Os perfis foram monitorados por UV (A280nm). Perfis semelhantes de ligação ao receptor CIMPR (pelo menos ~ 70%) foram observados para ο ATB200 rhGAA purificado de diferentes bateladas de produção (Figura 5), indicando que ο ATB200 rhGAA pode ser produzido de forma consistente.

Exemplo 3: Caracterização de oligossacarideos de ATB200 rhGAA

[186] Ο ATB200 rhGAA foi analisado para perfis de Nglicano específicos do sítio usando diferentes técnicas analíticas de LC-MS/MS. Os resultados dos dois primeiros métodos de LC-MS/MS são mostrados nas Figuras 6A-6H. Os resultados de um terceiro método LC-MS/MS com mapeamento de 2-AA glicano são mostrados nas Figuras 32A-32H, Figura 33A33B e Tabela 5.

[187] Na primeira análise por LC-MS/MS, a proteína foi desnaturada, reduzida, alquilada e digerida antes da análise por LC-MS/MS. Durante a desnaturação e redução de proteínas,

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200 pg de amostra de proteína, 5 pL de 1 mol/L tris-HCl (concentração final 50 mM) , 75 pL de 8 mol/L guanidina HC1 (concentração final 6 M) , 1 pL de 0,5 mol/L EDTA (concentração final 5 mM), 2 pL de 1 mol/L DTT (concentração final 20 mM) e água Milli-Q® foram adicionados a um tubo de 1,5 mL para fornecer um volume total de 100 pL. A amostra foi misturada e incubada a 56 ° C por 30 minutos em banho seco. Durante a alquilação, a amostra de proteína desnaturada e reduzida foi misturada com 5 pL de iodoacetamida 1 mol/L (IAM, concentração final 50 mM) , depois incubada a 10-30 ° C no escuro por 30 minutos. Após a alquilação, foram adicionados à amostra 400 pL de acetona pré-resfriada e a mistura foi congelada a -80 ° C por 4 horas de refrigeração. A amostra foi então centrifugada por 5 min a 13000 rpm a 4 ° C e o sobrenadante foi removido. Foram adicionados 400 pL de acetona pré-resfriada aos sedimentos, que foram centrifugados por 5 min a 13000 rpm a 4 ° C e o sobrenadante foi removido. A amostra foi então seca ao ar em gelo no escuro para remover o resíduo de acetona. Quarenta microlitros de uréia 8M e 160 pL de NH4HCO3 100 mM foram adicionados à amostra para dissolver a proteína. Durante a digestão com tripsina, 50 pg da proteína foram adicionados com tampão de digestão com tripsina a um volume final de 100 pL e 5 pL de 0,5 mg/mL de tripsina (razão proteína/enzima de 20/1 w/w) . A solução foi bem misturada e incubada durante a

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121/150 noite (16 ± 2 horas) a 37 °C. Foram adicionados dois microlitros e meio de TFA a 20% (concentração final de 0,5%) para extinguir a reação. A amostra foi então analisada usando o espectrômetro de massas Thermo ScientificTM Orbitrap Velos Pro™.

[188] Na segunda análise de LC-MS/MS, a amostra ATB200 foi preparada de acordo com um procedimento semelhante de desnaturação, redução, alquilação e digestão, exceto que o ácido iodoacético (IAA) foi usado como reagente de alquilação em vez de IAM e depois analisado usando espectrômetro de massa Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribid™

[189] Os resultados da primeira e segunda análises são mostrados nas Figuras 6A-6H. Nas Figuras 6A-6H, os resultados da primeira análise são representados pela barra esquerda (cinza escuro) e os resultados da segunda análise são representados pela barra direita (cinza claro) . A nomenclatura de símbolo para a representação de glicano está de acordo com Varki, A., Cummings, R.D., Esko J.D., et al., Essentials of Glycobiology, 2nd edition (2009).

[190] Como pode ser visto nas Figuras 6A-6H, as duas análises forneceram resultados semelhantes, embora houvesse alguma variação entre os resultados. Essa variação pode ser devida a vários fatores, incluindo o instrumento usado e a integridade da análise de N-glicano. Por exemplo, se algumas espécies de N-glicanos fosforilados não foram identificadas

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122/150 e/ou não quantificadas, o número total de N-glicanos fosforilados pode estar sub-representado, e a porcentagem de rhGAA contendo os N-glicanos fosforilados nesse sítio pode estar sub-representada. Como outro exemplo, se algumas espécies de N-glicanos não fosforilados não foram identificadas e/ou não quantificadas, então o número total de N-glicanos não fosforilados pode estar sub-representado, e a porcentagem de rhGAA contendo os N-glicanos fosforilados nesse sítio pode estar sobre-representado.

[191] A Figura 6A mostra a ocupação do sítio de Nglicosilação do ATB200. Como pode ser visto na Figura 6A, os primeiro, segundo, terceiro, quarto, quinto e sexto locais de N-glicosilação estão ocupados principalmente, com ambas as análises detectando em torno de ou mais de 90% e até cerca de 100% da enzima ATB200 tendo um N-glicano detectado em cada sítio potencial de N-glicosilação. No entanto, o sétimo sítio potencial de N-glicosilação é N-glicosilado cerca de metade do tempo.

[192] A Figura 6B mostra o perfil de N-glicosilação do primeiro sítio potencial de N-glicosilação, N84. Como pode ser visto na Figura 6B, as principais espécies de N-glicano são os N-glicanos bis-M6P. Tanto a primeira quanto a segunda análises detectaram mais de 75% do ATB200 com bis-M6P no primeiro sítio, correspondendo a uma média de cerca de 0,8 mol de bis-M6P por mol de ATB200 no primeiro sítio.

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[193] A Figura 6C mostra o perfil de N-glicosilação do segundo sítio potencial de N-glicosilação, N177. Como pode ser visto na Figura 6C, as principais espécies de N-glicano são N-glicanos mono-M6P e N-glicanos de manose alta não fosforilados. As primeiras e segunda análises detectaram mais de 40% do ATB200 com mono-M6P no segundo sítio, correspondendo a uma média de cerca de 0,4 a cerca de 0,6 mol de mono-M6P por mol de ATB200 no segundo sítio.

[194] A Figura 6D mostra o perfil de N-glicosilação do terceiro sítio potencial de N-glicosilação, N334. Como pode ser visto na Figura 6D, as principais espécies de N-glicano são N-glicanos de manose alta não fosforilados, N-glicanos do complexo di-, tri- e tetra-antenário e N-glicanos híbridos. As primeiras e segunda análises detectaram mais de 20% do ATB200 com um resíduo de ácido siálico no terceiro sítio, correspondendo a uma média de cerca de 0,9 a cerca de 1,2 mol de ácido siálico por mol de ATB200 no terceiro sítio.

[195] A Figura 6E mostra o perfil de N-glicosilação do quarto sítio potencial de N-glicosilação, N414. Como pode ser visto na Figura 6E, as principais espécies de N-glicano são bis-M6P e N-glicanos mono-M6P. As primeiras e segunda análises detectaram mais de 40% do ATB200 com bis-M6P no quarto sítio, correspondendo a uma média de cerca de 0,4 a cerca de 0, 6 mol de bis-M6P por mol de ATB200 no quarto sítio. As primeiras e segunda análises também detectaram

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124/150 mais de 25% do ATB200 com mono-M6P no quarto sítio, correspondendo a uma média de cerca de 0,3 a cerca de 0,4 mol de mono-M6P por mol de ATB200 no quarto sítio.

[196] A Figura 6F mostra o perfil de N-glicosilação do quinto sítio potencial de N-glicosilação, N596. Como pode ser visto na Figura 6F, as principais espécies de N-glicano são os N-glicanos do complexo di-antenário fucosilado. A primeira e a segunda análises detectaram mais de 70% do ATB200 com um resíduo de ácido siálico no quinto sítio, correspondendo a uma média de cerca de 0,8 a cerca de 0,9 mol de ácido siálico por mol de ATB200 no quinto sítio.

[197] A Figura 6G mostra o perfil de N-glicosilação do sexto sítio potencial de N-glicosilação, N826. Como pode ser visto na Figura 6G, as principais espécies de N-glicano são os N-glicanos do complexo di, tri- e tetra-antenário. Tanto a primeira quanto a segunda análises detectaram mais de 80% do ATB200 com um resíduo de ácido siálico no sexto sítio, correspondendo a uma média de cerca de 1,5 a cerca de 1,8 mol de ácido siálico por mol de ATB200 no sexto sítio.

[198] Uma análise da N-glicosilação no sétimo sítio, N869, mostrou aproximadamente 40% de N-glicosilação, com os N-glicanos mais comuns sendo A4S3S3GF (12%), A5S3G2F (10%), A4S2G2F (8%) e A6S3G3F (8%).

[199] A Figura 6H mostra um resumo da fosforilação em cada um dos sete locais potenciais de N-glicosilação. Como

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125/150 pode ser visto na Figura 6H, a primeira e a segunda análises detectaram altos níveis de fosforilação no primeiro, segundo e quarto locais potenciais de N-glicosilação. Ambas as análises detectaram que mais de 80% do ATB200 foi mono- ou bis-fosforilado no primeiro sítio, mais de 40% do ATB200 foi monofosforilado no segundo sítio e mais de 80% do ATB200 foi mono- ou bis-fosforilado no quarto sítio.

[200] Outra análise de N-glicosilação do ATB200 foi realizada de acordo com um método de LC-MS/MS, conforme descrito abaixo. Esta análise produziu um perfil médio de Nglicosilação em dez bateladas de ATB200 (Figuras 32A-32H, Figuras 33A-33B).

[201] Os glicanos ligados a N do ATB200 foram liberados enzimaticamente com PNGase-F e marcados com ácido 2antranílico (2-AA). Os N-glicanos marcados com 2-AA foram posteriormente processados por extração em fase sólida (SPE) para remover o excesso de sais e outros contaminantes. Os 2AA N-glicanos purificados foram dissolvidos em acetonitrila/água (20/80; v/v) e 10 microgramas foram carregados em uma coluna analítica de amino-polímero (apHeraTM, Supelco) para cromatografia líquida de alta eficiência com detecção de fluorescência (Análise por HPLCFLD) e espectrometria de massa de alta resolução (HRMS).

[202] A separação cromatográfica líquida (LC) foi realizada em condições de fase normal em um modo de eluição

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126/150 gradiente com a fase móvel A (ácido acético a 2% em acetonitrila) e fase móvel B (ácido acético a 5%; ácido acético a 5%; acetato de amônio 20 milimolar em água ajustado para pH 4,3 com hidróxido de amônio). A composição inicial da fase móvel foi de 70% A/30% B. Para a detecção de fluorescência, os parâmetros para o detector (RF-20Axs, Shimadzu) foram Excitação (Ex) : 320 nm; Emissão (Em) : 420 nm. A análise HRMS foi realizada usando um espectrômetro de massa Quadrupole Time of Flight (Sciex X500B QTOF) operando no modo Aquisição de Dados Independente (IDA). Os arquivos de dados adquiridos foram convertidos em arquivos mzML usando o MSConvert do ProteoWizard e, em seguida, o software GRITS Toolbox 1.2 Morning Blend (UGA) foi utilizado para pesquisa de banco de dados de glicano e anotação subsequente de Nglicanos identificados. Os N-glicanos foram identificados usando massas monoisotópicas precursoras (m/z) e produto iônico m/z. Os ions experimentais do produto e os padrões de fragmentação foram confirmados in silico usando o aplicativo GlycoWorkbench 2.

[203] Para determinar a quantificação relativa de glicanos ligados a N do ATB200, os dados adquiridos da experiência HPLC-FLD-QTOF MS/MS foram processados da seguinte forma. Todos os picos de N-glicano no cromatograma FLD foram integrados e a cada pico foi atribuída uma porcentagem da área total de todos os picos no cromatograma

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FLD. O sinal fluorescente, expresso como uma área de pico, é uma medida quantitativa da quantidade de cada N-glicano na amostra (Figura 33A) . No entanto, na maioria dos casos, várias espécies de N-glicano estavam contidas no mesmo pico de FLD. Portanto, os dados do espectrômetro de massa também foram necessários para obter a quantificação relativa de cada espécie de N-glicano (Tabela 5). 0 sinal de intensidade de ions para cada N-glicano foi extraído dos dados para criar um pico cromatográfico chamado cromatograma de ions extraído (XIC) . O XIC estava alinhado com o pico cromatográf ico da FLD e era específico para apenas uma espécie de N-glicano. O pico XIC criado a partir do sinal de intensidade de ions foi então integrado e essa área de pico é uma medida quantitativa relativa da quantidade de glicano presente. As áreas de pico da FLD e as áreas do pico do espectrômetro de massa XIC foram usadas para permitir a quantificação relativa de todas as espécies de glicano ligada ao N do ATB200 aqui relatadas.

[204] Os resultados desta análise de LC-MS/MS são fornecidos na Tabela 5 abaixo. A nomenclatura de símbolo para representação de glicano está de acordo com Wopereis W, et ai. 2006. Glicosilação anormal com O-glicanos hipersialilados em pacientes com sialúria. Biochimica e Biophysica Acta. 1762: 598-607; Gornik O, et ai. 2007. Alterações dos glicanos séricos durante sepse e pancreatite

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128/150 aguda. Glicobiologia. 17: 1321-1332 https://doi.org/10.1093/glycob/cwml06; Kattla JJ, et al.

2011. Glicosilação de proteínas biológicas. In: Murray MooYoung (ed.), Comprehensive Biotechnology, Second Edition, 3: 467-486; Tharmalingam-Jaikaran T, et al. Perfil de N-glicano do fluido folicular bovino nos principais estágios de desenvolvimento dos foliculos dominantes. 2014. Reprodução.

148: 569-580; Clerc F. et al. N-glicosilação da proteína plasmática humana. 2015. Glycoconj J. DOI 10.1007/sl0719015-9626-2; e Blackler RJ, et al. 2016. 0 fragmento de anticorpo de cadeia única M6P-1 possui uma bolsa de ligação específica ao monossacarídeo manose 6-fosfato que distingue a fosforilação do N-glicano de uma maneira específica do ramo. Glicobiologia. 26-2: 181-192.

Tabela 5: Tipo e prevalência de oligossacarídeos identificados no ATB200 com base no mapeamento de glicano 2AA e identificação de LC-MS/MS

Manose alta N-glicanos	% Total	Complexo N-glicanos	% Total	Complexo N-glicanos	% Total	Complexo N-glicanos	% Total
2P-M7	11.39	FA2G2S1	3.89	A3G3S1+1AC	0.65	FA2G2S1 + 1AC	0.29
P-M7	7.97	FA2G2S2	3.42	A3G2S2+1AC	0.64	A4G3	0.29
M6	6.89	A2G2S2	3.32	A1G1S1	0.63	A4G4+3KDN	0.29
P-M6	3.42	FA2G2	2.77	A4G3S1	0.61	A4G4S3	0.28
M5	2.06	FA4G4S3	2.26	FA3G3	0.61	FA5G4	0.24
P-M5	1.67	A2G2S1	2.25	A1G1	0.6	A4G3S2	0.21
2P-M8	1.27	FA3G3S1	2.12	FA2G2S2 + 1AC	0.57	FA1	0.21
P-M8	1.17	A3G3S2	1.8	A3G2S1	0.57	FA4G4	0.21
BP-M6	0.9	FA2G1	1.66	A3G2S1	0.56	A3G1	0.21

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M7	0.81	A2G2	1.46	A2G2S2+1AC	0.5	FA4G3S2	0.21
BP-M7	0.69	FA3G3S1	1.42	FA3G2	0.45	FA3G2S2	0.21
M4	0.14	A4G4S1	1.28	A3G3+3KDN	0.45	Al	0.2
BP2-M5	0.04	FA3G3S2	1.25	A4G3S1	0.45	A4G2	0.19
BP2-M6	0.01	FA4G4(1LN) S3	1.1	A2G1S1	0.41	FA4G3	0.19
Híbrido N-glicanos	% Total	FA4G4S1	1.08	A3G2	0.4	FA3	0.18
FA1P-M6	2.16	A3G3	1.08	FA4G4S1+LN	0.4	A1G1S1	0.18
M5A1G1S1	1.56	FA4G4S4	1.07	FA3G2S1	0.39	A4G1S1	0.16
FP-M6A1G1S1	0.42	FA3G3S3	1.04	FA2	0.38	FA1G1	0.15
A1M5	0.36	FA4G4S2	0.94	FA4G4S2+LN	0.38	FA3G1	0.14
A1G1M5	0.32	A2G1	0.94	A3G2S2	0.37	FA5G4S2	0.12
P-M6A1G1S1	0.17	FA2G1S1	0.94	A2	0.34	A3G1S1	0.11
Sumário	Total	A4G4	0.91	FA4G4(2LN)S3	0.33	A3	0.11
Manose alta N-glicanos	38%	FA1G1S1	0.91	FA2G2Sgl	0.32	FA3G3S3 + 1AC	0.1
Híbrido N-glicanos	5%	FA2G2S2+2A c	0.76	FA4G4(1LN)S4	0.31	A2G2S1+1AC	0.09
Complexo N-glicanos	57%	A4G4S2	0.69	A3G3S3	0.29	FA3G1S1	0.06

[205] Com base nesta análise de 2-AA e LC-MS/MS, e conforme resumido na Figura 33C, ο ATB200 testado possui um conteúdo médio de M6P de 3-5 mol por mol de ATB200 (representando tanto o mono-M6P quanto o bis- M6P) e teor de ácido siálico de 4-7 mol por mol de ATB200.

[206] Como mostrado nas Figuras 32A-32H e resumido na

Figura 33B, o primeiro sítio potencial de glicosilação em N do ATB200 possui um conteúdo médio de M6P de cerca de 1,4 mol M6P/mol ATB200, representando um conteúdo médio de monoM6P de cerca de 0,25 mol de mono-M6P/mol ATB200 e um teor

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130/150 médio de bis-M6P de cerca de 0,56 mol de bis-M6P/mol de ATB200; o segundo sitio potencial de glicosilação em N do ATB200 possui um conteúdo médio de M6P de cerca de 0,5 mol M6P/mol de ATB200, com as espécies primárias de N-glicano fosforiladas sendo N-glicanos mono-M6P; o terceiro sitio potencial de glicosilação em N do ATB200 possui um teor médio de ácido siálico de cerca de 1 mol de ácido siálico/mol de ATB200; o quarto sitio potencial de glicosilação de N do ATB200 possui um teor médio de M6P de cerca de 1,4 mol M6P/mol ATB200, representando um teor médio de mono-M6P de cerca de 0,35 mol mono-M6P/mol de ATB200 e um teor médio de bis-M6P de cerca de 0,52 mol de bis-M6P/mol de ATB200; o quinto sitio potencial de N-glicosilação do ATB200 possui um teor médio de ácido siálico de cerca de 0,86 mol de ácido siálico/mol de ATB200; o sexto sitio potencial de glicosilação de N do ATB200 possui um teor médio de ácido siálico de cerca de 4,2 mol de ácido siálico/mol de ATB200; e o sétimo sitio potencial de N-glicosilação de ATB200 possui um teor médio de ácido siálico de cerca de 0,86 mol de ácido siálico/pol ATB200.

[207] Também de acordo com esta técnica analítica 2-AA e LC-MS/MS, uma média de cerca de 65% dos N-glicanos no primeiro sítio potencial de N-glicosilação do ATB200 são Nglicanos com alta concentração de manose, cerca de 89% dos N-glicanos no segundo sítio potencial de N-glicosilação do

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ATB200 são N-glicanos com alta manose, mais da metade dos Nglicanos no terceiro sitio potencial de N-glicosilação do ATB200 são sialilados (com quase 20% totalmente sialilado) e cerca de 85% dos N-glicanos no terceiro sitio potencial de N-glicosilação do ATB200 são N-glicanos complexos, cerca de 84% dos N-glicanos no quarto sitio potencial de Nglicosilação do ATB200 são N-glicanos com alta manose, cerca de 70% dos os N-glicanos no quinto sitio potencial de glicosilação em N do ATB200 são sialilados (com cerca de 26% totalmente sialilado) e cerca de 100% dos N-glicanos no quinto sitio potencial em N-glicosilação do ATB200 são complexos N-glicanos 85% dos N-glicanos no sexto sitio potencial de N-glicosilação do ATB200 são sialilados (com quase 27% de sialilada) e cerca de 98% dos N-glicanos no sexto sitio potencial de glicosilação em N do ATB200 são complexos N-glicanos e cerca de 87% dos N-glicanos no sétimo sitio potencial em N-glicosilação do ATB200 são sialilados ( com quase 8% totalmente sialilado) e cerca de 100% dos Nglicanos no sétimo sitio potencial de N-glicosilação do ATB200 são N-glicanos complexos.

Exemplo 4: Comparação analítica de ATB200 e Myo zyme®/Lumi zyme®

[208] Ο ATB200 purificado e os N-glicanos Lumizyme® foram avaliados por MALDI-TOF para determinar as estruturas individuais de N-glicano encontradas em cada ERT. Lumizyme®

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132/150 foi obtido de uma fonte comercial. Como mostrado na Figura 7, ο ATB200 exibiu quatro picos proeminentes eluindo à direita do Lumizyme®. Isso confirma que ο ATB200 foi fosforilado em maior extensão do que o Lumizyme®, uma vez que essa avaliação é feita por carga terminal e não por afinidade CIMPR. Conforme resumido na Figura 8, verificouse que as amostras de ATB200 contêm quantidades mais baixas de N-glicanos do tipo high-manose não fosforilados do que o Lumizyme®.

[209] Para avaliar a capacidade dos rhGAAs convencionais em Myozyme® e Lumizyme® de interagir com o CIMPR, as duas preparações convencionais de rhGAA foram injetadas em uma coluna de afinidade CIMPR (que liga rhGAA com grupos M6P) e o fluxo coletado. O material ligado foi eluído com um gradiente M6 livre. As frações foram coletadas em placas de 96 poços e a atividade GAA foi testada pelo substrato 4MUα-glicosidase. As quantidades relativas de rhGAA não ligado (fluxo através) e ligado (eluído por M6P) foram determinadas com base na atividade de GAA e relatadas como a fração da enzima total. As Figuras 9A e 9B mostram o perfil de ligação dos rhGAAs no Myozyme® e Lumizyme®: 73% do rhGAA no Myozyme® (Figura 9B) e 7 8% do rhGAA no Lumizyme® (Figura 9A) não se ligam ao CIMPR. De fato, apenas 27% do rhGAA no Myozyme® e 22% do rhGAA no Lumizyme® continham M6P que pode ser produtivo para direcioná-lo ao CIMPR nas células musculares.

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Por outro lado, como mostrado na Figura 5, sob a mesma condição, verificou-se que mais de 70% do rhGAA no ATB200 se ligava ao CIMPR.

[210] Além de ter uma porcentagem maior de rhGAA que pode se ligar ao CIMPR, é importante entender a qualidade dessa interação. A ligação do receptor Lumizyme® e ATB200 foi determinada usando um ensaio de ligação à placa CIMPR. Resumidamente, placas revestidas com CIMPR foram usadas para capturar GAA. Várias concentrações de rhGAA foram aplicadas ao receptor imobilizado e o rhGAA não ligado foi lavado. A quantidade de rhGAA restante foi determinada pela atividade GAA. Como mostrado na Figura 10A, ο ATB200 se ligou ao CIMPR significativamente melhor que o Lumizyme®. A Figura 10B mostra o conteúdo relativo de N-glicanos bis-M6P em Lumizyme® (um produto rhGAA convencional) e ATB200 de acordo com a invenção. Para o Lumizyme®, existem em média apenas 10% de moléculas com um N-glicano bis-fosforilado. Por outro lado, em média, cada molécula de rhGAA no ATB200 possui pelo menos um N-glicano bis-fosforilado.

[211] No geral, o maior conteúdo de N-glicanos M6P no ATB200 do que no Lumizyme® indica que a porção mais alta de moléculas de rhGAA no ATB200 pode atingir células musculares. Como mostrado acima, a alta porcentagem de estruturas monofosforiladas e bisfosforiladas determinadas por MALDI concorda com os perfis CIMPR que ilustraram uma ligação

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134/150 significativamente maior de ATB200 ao receptor CIMPR. A análise de N-glicano via espectrometria de massa MALDI-TOF confirmou que, em média, cada molécula ATB200 contém pelo menos uma estrutura natural de N-glicano de bis-M6P. Este conteúdo mais alto de bis-M6P N-glicano no ATB200 correlacionou-se diretamente com a ligação de alta afinidade ao CIMPR nos ensaios de ligação à placa receptora M6P (Kd cerca de 2-4 nM).

[212] A captação celular relativa de ATB200 e Lumizyme® rhGAA foi comparada usando linhagens celulares normais e de fibroblasto de Pompe. As comparações envolveram 5-100 nM de ATB200 de acordo com a invenção com 10-500 nM de produto rhGAA convencional Lumizyme®. Após 16 horas de incubação, rhGAA externo foi inativado com base TRIS e as células foram lavadas três vezes com PBS antes da colheita. GAA internalizado medido por hidrólise de 4MU-a-glucósido e foi representado graficamente em relação à proteína celular total e os resultados aparecem nas Figuras 11A-11C.

[213] Ο ATB200 também demonstrou ser eficientemente internalizado nas células. Como representado nas Figuras 11A-11B, ATB200 é internalizado em células de fibroblastos normais e de Pompe e é internalizado em maior grau do que o produto rhGAA convencional Lumizyme®. Ο ATB200 satura os receptores celulares em cerca de 20 nM, enquanto cerca de 250 nM de Lumizyme® são necessários para saturar os

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135/150 receptores celulares. A constante de eficiência de absorção (Kuptake) extrapolada a partir desses resultados é de 2-3 nm para ATB200 e 56 nM para Lumizyme®, como mostrado na Figura 11C. Esses resultados sugerem que ο ATB200 é um tratamento bem direcionado para a doença de Pompe.

Exemplo 5: ATB200 e chaperona farmacológica

[214] A estabilidade do ATB200 em tampões de pH ácidos ou neutros foi avaliada em um ensaio de termoestabilidade usando SYPRO Orange, pois a fluorescência do corante aumenta quando as proteínas desnaturam. Como mostrado na Figura 12, a adição de AT2221 estabilizou ο ATB200 a pH 7,4 de maneira dependente da concentração, comparável à estabilidade do ATB200 a pH 5,2, uma condição que imita o ambiente ácido do lisossomo. Conforme resumido na Tabela 6, a adição de AT2221 aumentou a temperatura de fusão (Tm) do ATB200 em quase 10°C.

Tabela 6. Estabilidade do ATB200 em combinação com AT2221

Condição de teste	Tm (°C)
pH 7.4	56.2
pH 7.4 + 10 μΜ AT2221	61.6
pH 7.4 + 30 μΜ AT2221	62.9
pH 7.4 + 100 μΜ AT2221	66.0
pH 5.2	67.3

Exemplo 6: Co-administração de ATB200 e AT2221 em ratos

Gaa KO

[215] Os efeitos terapêuticos do ATB200 e AT2221 foram avaliados e comparados com os da Alglicosidase alfa em camundongos Gaa KO. Para o estudo, foram utilizados

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136/150 camundongos Gaa KO machos (com 3 a 4 meses de idade) e tipo selvagem (WT) de mesma idade. A alglicosidase alfa foi administrada por injeção intravenosa (IV) de veia da cauda do bolus. No regime de co-administração, AT2221 foi administrado por gavagem oral (PO) 30 minutos antes da injeção IV de ATB200. O tratamento foi administrado quinzenalmente. Os ratos tratados foram sacrificados após 14 dias da última administração e vários tecidos foram coletados para análise posterior. A Tabela 7 resume o desenho do estudo:

Tabela 7. Projeto do estudo de co-administração

Genótipo	Tratamento	Dosagem de Medicamentos por Administração (quinzenal)	Número de Administração
Gaa KO	Carreador	N/A	6
Gaa KO	Alglicosidase alfa	20 mg/kg	6
Gaa KO	ATB200/AT2221	20 mg/kg (ATB200) 10 mg/kg (AT2221)	6
WT (Sve 129)	Não tratado	N/A	N/A

[216] O teor de glicogênio no tecido nas amostras de tecidos foi determinado usando digestão com amiloglicosidase, como discutido acima. Como mostrado na Figura 13, uma combinação de 20 mg/kg de ATB200 e 10 mg/kg de AT2221 diminuiu significativamente o conteúdo de glicogênio em quatro tecidos diferentes (quadriceps, triceps, gastrocnêmio e coração) em comparação com a mesma dosagem de alglicosidase alfa.

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[217] As amostras de tecido também foram analisadas quanto a alterações de biomarcadores seguindo os métodos discutidos em: Khanna R, et al. (2012), A chaperona farmacológica AT2220 aumenta a captação de a-glicosidase ácida humana recombinante e a redução de glicogênio em um modelo de camundongo da doença de Pompe, Pios One 7 (7) : e40776; e Khanna, R et al. (2014), O chaperone farmacológico AT2220 aumenta a atividade específica e a entrega lisossômica da α-glicosidase de ácido mutante e promove a redução de glicogênio em um modelo de camundongo transgênico da doença de Pompe, PLoS ONE 9 (7): el02092. Como mostrado na Figura 14, foi observado um aumento profundo e aumento das vesículas positivas para LAMP1 nas fibras musculares de animais Gaa KO em comparação com o TP, indicativo de proliferação lisossômica. A administração concomitante de ATB200/AT2221 levou a mais fibras com o nível normal de LAMP1, enquanto as demais vesículas positivas para LAMP1 também reduziram em tamanho (inserções).

[218] Da mesma forma, agregados intensos de LC3positivos nas fibras musculares de camundongos Gaa KO não tratados significam a presença de zonas autofágicas e acúmulo de autofagia. Os agregados positivos para LC3 (vermelho) foram preferencialmente reduzidos em camundongos tratados com a administração concomitante de ATB200/AT2221 em comparação com camundongos tratados com alglicosidase alfa

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138/150 (Figura 15A) . Uma observação semelhante foi feita quando a expressão de LC3 foi avaliada usando western blot. Como mostrado na Figura 15B, a maioria dos animais tratados com ATB200/AT2221 mostrou uma diminuição significativa nos níveis de LC3 II, a forma lipidada que está associada aos autofagossomos, sugerindo um melhor fluxo de autofagia. Em comparação, o efeito da alglicosidase alfa na autofagia foi modesto.

[219] Também foi avaliada a disferlin, uma proteína envolvida no reparo da membrana e cuja deficiência/abuso está associada a uma série de distrofias musculares. Como mostrado na Figura 16, a disferlin (marrom) estava fortemente acumulada no sarcoplasma de camundongos Gaa KO. Comparado à alglicosidase alfa, ο ATB200/AT2221 foi capaz de restaurar o disferlin no sarcolema em um número maior de fibras musculares.

[220] Esses dados são consistentes com as melhorias no nível celular demonstradas em pacientes com doença de Pompe humana tratados com ATB200 e miglustat (por exemplo, os pacientes exibem níveis reduzidos de biomarcadores de acúmulo de glicogênio e lesão muscular), levando não apenas ao tratamento eficaz da doença de Pompe, mas também uma reversão na progressão da doença. Os dados clínicos em pacientes com doença de Pompe humana estão resumidos nos Exemplos 8-13, abaixo.

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Exemplo 7: Análise de fibra única

[221] Como mostrado na Figura 17, a maioria dos camundongos tratados com carreador apresentou lisossomos aumentados (verde) (veja, por exemplo, B) e a presença de acúmulo autofágico maciço (vermelho) (veja, por exemplo, A). Os camundongos tratados com Myozyme® não apresentaram diferença significativa em comparação aos camundongos tratados com carreador. Por outro lado, a maioria das fibras isoladas de camundongos tratados com ATB200 apresentou tamanho de lisossomo significativamente reduzido (veja, por exemplo, C) . Além disso, a área com acúmulo autofágico também foi reduzida em vários graus (ver, por exemplo, C). Como resultado, uma porção significativa das fibras musculares analisadas (36-60%) de camundongos tratados com ATB200 pareceu normal ou quase normal. A Tabela 8 abaixo resume a análise de fibra única mostrada na Figura 17.

Tabela 8. Análise de fibra única

Tratamento	Animal analisado	Número total de fibras analisadas (n)	Ampliação do Lisossomo	Fibras com acúmulo de autofagia	Fibras com aparência normal ou quase normal
WT	2	65	-	-	100%
Carreador	2	65	+	>90%	<10%
Al glicosidase alfa	4	150	+	>90%	<10%
ATB200	5	188	Diminuição dramática do tamanho na maioria das fibras	40-64%*	36-60%

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140/150 * Isso incluiu fibras com vários graus de redução no acúmulo autofágico. No geral, a extensão do acúmulo foi menor no grupo tratado com ATB200 em comparação ao grupo tratado com Carreador ou alglicosidase alfa.

[222] No geral, os dados indicam que ο ATB200, com seu maior conteúdo de M6P, sozinho e ainda mais estabilizado pelo chaperona farmacológica AT2221 no pH neutro do sangue, é mais eficiente no direcionamento de tecidos e no tráfego lisossômico em comparação à alglicosidase alfa quando administrada a Camundongos Gaa KO, consistentes com a estabilização do ATB200 por AT2221, como mostrado na Figura 18. Como resultado, a administração de ATB200 e a coadministração de ATB200/AT2221 foram mais eficazes que a alglicosidase alfa na correção de algumas patologias relevantes para a doença, como acúmulo de glicogênio, proliferação lisossômica e formação de zonas autofágicas. Devido a esses efeitos terapêuticos positivos, a administração de ATB200 e ATB200/AT2221 demonstrou melhorar a chance de recuperação das fibras musculares devido a danos e até reverter os danos, eliminando o glicogênio acumulado na célula devido à falta de atividade ótima do GAA. Tal como no Exemplo 6, estes dados também são consistentes com melhorias ao nível celular demonstradas em pacientes com doença de Pompe humana que levam ao tratamento eficaz da doença de Pompe e à reversão na progressão da doença após a

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141/150 administração de ATB200 e miglustat. Os dados clínicos em pacientes com doença de Pompe humana estão resumidos nos Exemplos 8-13, abaixo.

Exemplo 8: Teste ATB200-02: um estudo em humanos de ATB200/AT2221 em pacientes com doença de Pompe

[223] Estudos pré-clínicos foram conduzidos em camundongos knockout para Gaa para avaliar a farmacocinética (PK) e a eficiência da redução de glicogênio em doses variáveis da terapia de reposição enzimática ATB200 (ERT) e de chaperona AT2221. Estes dados foram utilizados para estimar as doses comparáveis de chaperona de AT2221 em humanos. O estudo ATB200-02 (NCT02675465) foi então concebido como um estudo de fase fixa de dose fixa, ascendente, em primeiro lugar no ser humano, fase 1/2 para avaliar a segurança, tolerabilidade, farmacocinética (DP) e eficácia de ATB200 coadministrado com AT2221 em pacientes com doença de Pompe. As Figuras 19A-19B apresentam o desenho do estudo ATB200-02. Os pacientes ambulatoriais que receberam anteriormente terapia de reposição enzimática com alglicosidase alfa são referidos como pacientes ambulatoriais com ERT-switch (ou ambulatórios com ERTswitch) ou pacientes da Coorte 1. Os pacientes não ambulatoriais que receberam anteriormente a terapia de reposição enzimática com alglicosidase alfa são referidos como pacientes com ERT-switch não-ambulatorial (ou não

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142/150 ambulatorial com ERT-switch) ou pacientes da Coorte 2. Os pacientes ambulatoriais que não receberam anteriormente terapia de reposição enzimática com alglicosidase alfa são referidos como pacientes ingênuos à ERT (ou ambulatoriais ingênuos à ERT) ou pacientes da Coorte 3.

[224] Dezesseis locais clínicos em cinco países participaram do estudo ATB200-02. O estudo empregou os seguintes critérios de inclusão chave: homens e mulheres com idades entre 18 e 65 anos diagnosticados com doença de Pompe com base na deficiência documentada da atividade da enzima GAA ou por fenotipagem do GAA e que receberam terapia de reposição enzimática com alglicosidase alfa por 2-6 anos (ou> 2 anos para a Coorte 2) antes do início do estudo (Coorte 1). Os indivíduos elegíveis eram aqueles que atualmente recebem alglicosidase alfa em uma frequência a cada duas semanas e que completaram as duas últimas infusões sem um evento adverso relacionado à droga (EA), resultando em interrupção da dose (Coortes 1 e 2). Os indivíduos tinham que poder andar entre 200 e 500 metros no teste de caminhada de 6 minutos (6MWT) (coortes 1 e 3), ter uma capacidade vital forçada vertical (CVF) de 30 a 80% do valor normal previsto (coortes 1 e 3) ou estar em cadeira de rodas e incapaz de andar sem ajuda (Coorte 2). Os protocolos para o teste 6MWT e FVC podem ser encontrados, por exemplo, em Lachman e Schoser, Journal of Rare Diseases, 2013, 8: 160, e em Bittner

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143/150 e Singh, The 6 Minute Walk Test, Cardiology Advisor, 2013. Figura 19C fornece as características da linha de base para 20 indivíduos. Segurança, tolerabilidade e biomarcadores foram avaliados para as coortes 1, 2 e 3. As seguintes avaliações funcionais foram avaliadas para as coortes 1 e 3: 6MWT, outros testes de função motora (testes de tempo e gaitstair-gower-chair (GSGC)), teste muscular manual e função pulmonar (CVF, pressão inspiratória máxima (PIM)/pressão expiratória máxima (PEM)). Protocolos para os testes de tempo e GSGC podem ser encontrados, por exemplo, em Lachman e Schoser, Journal of Rare Diseases, 2013, 8: 160. Para a Coorte 2, as avaliações funcionais incluíram testes de força muscular.

Exemplo 9: Resultados provisórios de PK da avaliação ATB200-02

[225] Um resumo dos dados farmacocinéticos do AT2221 é fornecido na Figura 20. As concentrações totais de proteína GAA no plasma para ATB200 a 5 mg/kg, 10 mg/kg e 20 mg/kg foram determinadas pela quantificação validada de rhGAA por LC-MS/MS peptídeo (s) específico (s) de assinatura (s) T09 (primário) e T50 (confirmatório) para 11 pacientes da Coorte 1 que concluíram os Estágios 1 e 2, bem como para cinco pacientes da Coorte 2 que concluíram o estudo PK no Estágio 3. Para o Estágio 1, amostras de sangue para a concentração total de proteína GAA no plasma foram coletadas antes do

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144/150 inicio da infusão de ATB200 e 1, 2, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a infusão de ATB200. início da infusão. Para os estágios 2 e 3, as amostras de sangue para a concentração total de proteína GAA no plasma foram coletadas antes do início da infusão e às 1, 2, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 6, 8, 10, 12 e 24 hora(s) após o início da perfusão.

[226] Também foram realizadas análises de ATK21 PK para 11 pacientes da Coorte 1 que concluíram os Estágios 1 e 2, bem como para cinco pacientes da Coorte 2 que concluíram o estudo de farmacocinética no estágio 3. Foram coletadas amostras de sangue para as concentrações plasmáticas de AT2221 imediatamente antes de AT2221 administração oral (tempo 0) e às 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 9, 11 e 25 horas após a administração oral de AT2221. O plasma AT2221 foi determinado por um ensaio LC-MS/MS validado.

[227] Como mostrado na Figura 21, os níveis de ATB200 aumentaram de maneira proporcional ligeiramente superior à dose quando administrados isoladamente. A administração concomitante de ATB200 a 20 mg/kg com uma dose alta única (260 mg) de AT2221 aumentou a área total de exposição às proteínas GAA sob a curva (AUC) em aproximadamente 17%, em comparação com ο ATB200 a 20 mg/kg administrado isoladamente (Figura 21, Figura 22C) . A administração concomitante de ATB200 a 20 mg/kg com várias doses altas (260 mg) de AT2221 aumentou a área total de exposição às proteínas GAA sob a

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145/150 curva (AUG) em aproximadamente 29%, em comparação com o ATB200 a 20 mg/kg administrado isoladamente (Figura 21, Figura 22D). Aumentos na meia-vida da distribuição e na AUC24h parcial foram observados na escala logarítmica, durante a fase de eliminação terminal (Figura 21, Figura 22A, Figura 22B). Como mostrado na Figura 21, a meia-vida de distribuição (fase a) aumentou 40%, consistente com o efeito estabilizador de altas doses de AT2221 no ATB200 no plasma. O aumento na meia-vida de distribuição foi acompanhado por um aumento na AUC parcial do tempo para a concentração plasmática máxima até 24 horas após a dose em 42,2% (Figura 21, Figura 22B). Evidências adicionais da estabilização do ATB200 pelo AT2221 foram observadas nas comparações de 12 e 24 horas após a dose de AT2221 de baixa e alta dose versus ATB200 isoladamente (Figuras 22E e 22F) . Não houve diferença estatisticamente significante na exposição total à proteína GAA plasmática entre os pacientes ingênuos com ERT (Coorte 3) e com comutadores ERT (Coorte 1) (Figura 23). A disposição PK do peptídeo de assinatura T50 não diferiu da do peptídeo de assinatura T09 (razão AUC: 1,00) .

Exemplo 10: Resultados provisórios de eficácia do teste ATB200-02

[228] Como mostrado nas Figuras 24A e 24B, o 6MWT melhorou para pacientes ambulatoriais com ERT-switch e pacientes ingênuos com ERT no mês 6, com benefício contínuo

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146/150 observado no mês 12. O 6MWT aumentou em 7/10, 8/10 e 8/8 pacientes com ERT nos meses 6, 9 e 12, respectivamente. O 6MWT aumentou em 5/5, 5/5 e 2/2 de pacientes ingênuos de ERT nos meses 6, 9 e 12, respectivamente.

[229] Como mostrado nas Figura 24C, Figura 26A e Figura 26C, as melhorias nos testes de função motora e força muscular manual, juntamente com o 6MWT, foram consistentes com uma melhoria geral da função muscular, tanto para pacientes com ERT-switch quanto para pacientes com ERT. 12 meses.

[230] Como mostrado nas Figura 25 e Figura 26B, foram observados aumentos consistentes e substanciais na força da extremidade superior em todos os pacientes com ERT-switch não ambulatório no mês 6 e no mês 9.

[231] Como mostrado na Figura 27, a FVC foi estável ou aumentou em 5/9, 6/9 e 3/7 pacientes com ERT-switch nos meses 6, 9 e 12, respectivamente, e a FVC foi estável ou aumentou em 5/5, 5/5 e 2/2 pacientes não tratados com ERT nos meses 6, 9 e 12, respectivamente. Também como mostrado na Figura 27, a pressão inspiratória máxima (MIP) foi estável e a pressão expiratória máxima (MEP) aumentou em pacientes ambulatoriais com ERT-switch, enquanto a MIP aumentou e a MEP foi estável em pacientes que não receberam ERT.

[232] A Escala de Gravidade da Fadiga (FSS) é um questionário de auto-avaliação composto por nove perguntas,

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147/150 cada uma com uma escala de 1 a 7. A pontuação total varia de 9 a 63, com valores mais altos representando maior nível de fadiga devido à condição da doença. O valor normativo na população saudável é de aproximadamente 21 (Grace J et al. Parkinsonism Relat Disord. 2007; 13: 443-445) . Como mostrado na Figura 28, todas as coortes foram impactadas significativamente pela fadiga na linha de base e todas as coortes demonstraram uma melhora em seu FSS após receber ATB200/AT2221.

Exemplo 11: Resultados provisórios do teste ATB200-02: marcadores de lesão muscular

[233] Os seguintes marcadores de dano muscular foram avaliados: enzima creatina quinase (CK), alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST). Os resultados disponíveis após nove meses do ensaio clínico são relatados nas Figuras 29A-29C (dados de no máximo 58 semanas, 24 semanas e 36 semanas para as coortes 1, 2 e 3, respectivamente; valores mais baixos de n refletem que alguns dados não puderam ser analisados ou ainda não foram analisados). As reduções médias da linha de base observadas nesses respectivos momentos foram de aproximadamente 30-35% para os pacientes ambulatoriais com ERT-switch (n = 9), 520% para os pacientes não ambulatoriais com ERT-switch (n = 4) e 40-55 % para os pacientes ingênuos da ERT (n = 5) . Os resultados para a enzima CK disponível após doze meses do

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148/150 ensaio clínico são relatados na Figura 29D (dados de no máximo 12 meses para as coortes 1, 2 e 3; valores mais baixos de n refletem que alguns dados não puderam ser analisados ou ainda não foram analisados).

[234] O tetrassacárido de hexose na urina (Hex4) foi avaliado como um marcador da acumulação de glicogênio. Os resultados para o Hex4 disponíveis após doze meses do ensaio clínico são relatados na Figura 29D (dados de no máximo 12 meses para as coortes 1, 2 e 3; valores mais baixos de n refletem que alguns dados não puderam ser analisados ou ainda não foram analisados).

Exemplo 12: Resultados provisórios de segurança do teste ATB200-02

[235] A maior duração do tratamento foi superior a 20 meses. Os eventos adversos (EAs) foram geralmente leves e transitórios, com uma taxa muito baixa de reações associadas à infusão (menos de 1%) após mais de 400 infusões totais nas três coortes. Essas incidências foram controladas por prémedicação padrão.

[236] Os EAs mais comuns relatados como relacionados ao tratamento em até 72 semanas foram náusea (3/20), tremor (3/20), dor de cabeça (3/20), fadiga (3/20), diarréia (2/20), espasmo muscular (2/20) e inchaço das articulações (2/20) .

[237] Os EAs mais comuns relatados como relacionados ao tratamento em mais de 20 meses foram dor abdominal (incluindo

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149/150 dor abdominal superior e inferior) (8/20), diarréia (8/20), nasofaringite (6/20), náusea (5/20), dor de cabeça (5/20) e infecção do trato respiratório superior (5/20) (figura 30). Foi relatado um EA grave, que não estava relacionado ao medicamento do estudo (hospitalização por infecção do trato respiratório inferior). Nenhum paciente interrompeu o estudo devido a um EA.

[238] Houve três incidentes de reações associadas à infusão (IARs) em mais de 550 infusões, que foram controladas pela pré-medicação padrão. Ocorreu um evento de IAR (descoloração da pele) em um paciente com ERT-switch não ambulatório (Coorte 2). Dois eventos de IAR (prurido localizado, eritema e sensação de queimação) ocorreram em um paciente ingênuo de TRE (Coorte 3) (Figura 30).

Exemplo 13: Resumo e conclusões dos resultados provisórios do estudo ATB200-02

[239] Conforme resumido na Figura 31, há concordância nos dados provisórios do estudo ATB200-02, mostrando melhorias paralelas significativas e inesperadas nos marcadores de lesão muscular e acúmulo de substrato, testes de função muscular (testes cronometrados e resistência), força muscular manual e estabilização e/ou melhoria nos testes de função respiratória nas diferentes coortes. A função muscular melhorou em 16/18 e 10/10 pacientes nos meses 6 e 9, respectivamente. Os aumentos na distância do 6MWT

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150/150 foram consistentes e duráveis em pacientes ambulatoriais e que não usam a terapia anti-ERT até o 12° mês, assim como as melhorias em outros testes de função motora em pacientes ambulatoriais e que não tomam terapia com ERT. As medidas qualitativas e quantitativas mostraram aumentos na força da extremidade superior em pacientes com ERT-switch não ambulatório nos 6 e 9 meses. A FVC, a MIR e a MEP foram geralmente estáveis em pacientes com ERT-switch e aumentaram em pacientes ingênuos com ERT. Uma melhora no escore de fadiga foi observada em todas as coortes. Os níveis de biomarcadores (por exemplo, níveis de CK e Hex4) diminuíram em todas as coortes e ATB200/AT2221 foi geralmente bem tolerado.

[240] Assim, o impacto multidimensional da terapia sugere que o regime combinado de ATB200/AT2221 tem potencial para ser uma opção de tratamento importante para pacientes com doença de Pompe. Estes resultados clínicos suportam os resultados dos estudos de análise de fibra única descritos no Exemplo 7, que demonstram que o tratamento é eficaz para eliminar a patologia das fibras musculares. Um estudo mais aprofundado do ensaio clínico está em andamento.

Claims

1. Método de tratamento da doença de Pompe em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma população de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO);

em que as moléculas de rhGAA compreendem sete sítios potenciais de N-glicosilação;

em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, de 3 a 4 resíduos de manose-6-fosfato (M6P);

em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, pelo menos cerca de 0,5 mol de bis-manose-6-fosfato (bisM6P) por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de Nglicosilação, conforme determinado pelo uso de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem (LCMS /MS) ; e em que a população de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de reverter a progressão da doença no indivíduo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a reversão da progressão da doença inclui a redução do tamanho lisossômico em um músculo do indivíduo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou

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2/22 reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a reversão da progressão da doença inclui a resolução do acúmulo autofágico em um músculo do indivíduo.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que menos de 65% das fibras musculares analisadas no indivíduo apresentam acúmulo autofágico após o tratamento.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente com ERT-switch.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o paciente com ERT-switch havia sido tratado anteriormente com alfa-alglicosidase por pelo menos dois anos.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos 36% das fibras musculares analisadas no indivíduo têm aparência normal ou quase normal após o tratamento.

8. Método de tratamento da doença de Pompe em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma população de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO);

em que as moléculas de rhGAA compreendem sete sítios

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3/22 potenciais de N-glicosilação;

em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, pelo menos cerca de 0,5 mol de bis-manose-6-fosfato (bisM6P) por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de Nglicosilação, conforme determinado por LC-MS/MS; e em que o conteúdo de glicogênio em um músculo do indivíduo após o tratamento é reduzido mais rapidamente do que quando a alfa-alglicosidase é administrada na mesma dosagem.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o conteúdo de glicogênio em um músculo do indivíduo após o tratamento é reduzido a uma taxa que é pelo menos cerca de 1,25, 1,5, 1,75, 2,0 ou 3,0 vezes mais rápida que a taxa quando a alfa-alglicosidase é administrada na mesma dosagem.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o conteúdo de glicogênio em um músculo do indivíduo após o tratamento é reduzido mais efetivamente do que quando a alfaalglicosidase é administrada na mesma dosagem, quando avaliada após uma, duas, três, quatro, cinco, ou seis administrações.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,

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4/22 caracterizado pelo fato de que o conteúdo de glicogênio em um músculo do indivíduo após o tratamento é reduzido em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 50%, 75% ou 90% mais efetivamente do que quando a alfa-alglicosidase é administrada na mesma dosagem.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o conteúdo de glicogênio é avaliado após seis administrações.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo exibe níveis reduzidos de tetrassacarideo de hexose na urina após o tratamento.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que os níveis de tetrassacarideo de hexose na urina seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 30% em comparação com a linha de base.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente com ERT-switch ambulatorial ou um paciente com ERT-switch não ambulatorial, e em que os níveis do indivíduo de tetrassacarideo de hexose na urina seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 35% em comparação com a linha de base.

16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo em um paciente

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5/22 ambulatorial que não usa ERT e os níveis de tetrassacarídeo de hexose na urina do indivíduo seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 45% em comparação com a linha de base.

17. Método de tratamento da doença de Pompe em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma população de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO);

em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, pelo menos cerca de 0,5 mol de bis-manose-6-fosfato (bisM6P) por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de Nglicosilação, conforme determinado por LC-MS/MS; e em que a população de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de melhorar a função motora no indivíduo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a função motora aprimorada no indivíduo é medida por pelo menos um teste de função motora selecionado do grupo que consiste em um teste de caminhada de seis minutos (6MWT), um teste timed up and go, um teste

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6/22 de subida de quatro lances de escadas, um teste de caminhada de dez metros, um teste Gower, um teste gait-stair-gowerchair (GSGC) e combinações dos mesmos.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que, em comparação com a linha de base, a distância de 6MWT do indivíduo em seis meses após o tratamento é aumentada em pelo menos 20 metros, o tempo do teste timed up and go do indivíduo em seis meses após ο tratamento é diminuído em pelo menos 1 segundo, o tempo do teste de subida de quatro lances de escadas do indivíduo em seis meses após o tratamento é diminuído em pelo menos 0,6 segundos, o tempo do teste de caminhada de dez metros do indivíduo em seis meses após o tratamento é diminuído em pelo menos 0,7 segundos, o tempo do teste de Gower do indivíduo em seis meses após o tratamento é diminuído em pelo menos 1 segundo, ou a pontuação GSGC do indivíduo seis meses após o tratamento é diminuída em pelo menos 1.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial com ERT-switch e em que, em comparação com a linha de base, a distância de 6MWT do indivíduo seis meses após o tratamento é aumentada em pelo menos 20 metros, o tempo do teste timed up and go do indivíduo em seis meses após o tratamento é diminuído em pelo menos 1,5 segundo, o tempo do teste de subida de quatro lances de escadas do

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7/22 indivíduo em seis meses após o tratamento é diminuído em pelo menos 0, 6 segundos, ou o tempo do teste de Gower do indivíduo em seis meses após o tratamento é diminuído em pelo menos 1 segundo.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial que não usa ERT e, em comparação com a linha de base, a distância de 6MWT do indivíduo em seis meses após o tratamento é aumentada em pelo menos 40 metros, o tempo do teste timed up and go do indivíduo em seis meses após ο tratamento é diminuído pelo menos 1 segundo, o tempo do teste de subida de quatro lances de escadas do indivíduo em seis meses após o tratamento é diminuído pelo menos 0,6 segundos, o tempo do teste de caminhada de dez metros do indivíduo em seis meses após o tratamento é diminuído em pelo menos 0,7 segundos, ou a pontuação GSGC do indivíduo seis meses após o tratamento é diminuída em pelo menos 1.

22. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu anteriormente a terapia de reposição enzimática da alfaalglicosidase, em que o indivíduo exibe uma melhora em pelo menos um teste de função motora após tratamento com a população de rhGAA em comparação com o resultado do teste de função motora do indivíduo após a terapia de reposição enzimática com alfa-alglicosidase anterior.

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23. Método de tratamento da doença de Pompe em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma população de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO);

em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, pelo menos 0,5 mol de bis-manose-6-fosfato (bis-M6P) por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de N-glicosilação, conforme determinado por LC-MS/MS; e em que a população de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de melhorar a força da parte superior do corpo no indivíduo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a força superior do corpo melhorada no indivíduo é medida por uma pontuação de força muscular manual.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial com ERT-switch e, seis meses após o tratamento, exibe uma melhora na pontuação de força muscular manual da

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9/22 parte superior do corpo de pelo menos 1 em comparação com a linha de base.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente com ERT-switch não ambulatorial e, seis meses após o tratamento, exibe uma melhora na pontuação de força muscular manual da parte superior do corpo de pelo menos 5,5 em comparação com a linha de base.

27. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a força melhorada da parte superior do corpo no indivíduo é força melhorada da extremidade superior, em que a força da extremidade superior é medida por testes musculares quantitativos ou testes musculares manuais de pelo menos um grupo muscular da extremidade superior selecionado do grupo que consiste em adução do ombro, abdução do ombro, flexão do cotovelo, e extensão do cotovelo.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente com ERT-switch não ambulatorial e em que, em comparação com a linha de base, a adução do ombro do indivíduo seis meses após o tratamento é melhorada em pelo menos 3,63 kg (8 libras de força), a abdução do ombro do indivíduo seis meses após o tratamento é melhorada em pelo menos 0,45 kg (1 libra de força), a flexão do cotovelo do indivíduo em seis meses após

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10/22 o tratamento é melhorada em pelo menos 0,90 kg (2 libras de força), ou a extensão do cotovelo do indivíduo em seis meses após o tratamento é aprimorada em pelo menos 2,27 kg (5 libras de força).

29. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é ambulatorial e exibe ainda uma força corporal inferior melhorada e/ou força corporal total após o tratamento.

30. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu anteriormente a terapia de reposição enzimática com alfaalglicosidase, em que o indivíduo exibe uma melhora na força da parte superior do corpo após o tratamento com a população de rhGAA em comparação com a força da parte superior do corpo do indivíduo após a terapia de substituição enzimática de alfa-alglicosidase anterior.

31. Método de tratamento da doença de Pompe em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma população de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO);

em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, de

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3 a 4 resíduos de manose-6-fosfato (M6P);

em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, pelo menos 0,5 mol de bis-manose-6-fosfato (bis-M6P) por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de N-glicosilação, conforme determinado por LC-MS/MS; e em que a população de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de melhorar a função pulmonar no indivíduo.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a função pulmonar melhorada no indivíduo é medida por pelo menos um teste de função pulmonar selecionado do grupo que consiste em um teste de capacidade vital forçada na vertical (FVC), um teste de pressão expiratória máxima (MEP), um teste de pressão inspiratória máxima (MIP) e combinações dos mesmos.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que, em comparação com a linha de base, a FVC do indivíduo em seis meses após o tratamento é melhorada em pelo menos 4%, a MEP do indivíduo em seis meses após o tratamento é aprimorada em pelo menos 16 cmíUO ou a MIP do indivíduo seis meses após o tratamento é melhorada em pelo menos 0,3 cmíUO.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial com ERT-swicth e em que, comparado à linha de base, o MEP do indivíduo seis meses após o tratamento é

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12/22 melhorado em pelo menos 16 cmíUO.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial que não usa ERT e, em comparação com a linha de base, a FVC do indivíduo seis meses após o tratamento é melhorada em pelo menos 4% ou a MIP do indivíduo seis meses após o tratamento é melhorada em pelo menos 11 cmíUO.

36. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu anteriormente terapia de reposição enzimática com alfaalglicosidase, em que o indivíduo exibe uma melhora em pelo menos um teste de função pulmonar após o tratamento com a população de rhGAA em comparação com o resultado do teste de função pulmonar do indivíduo após a terapia de reposição enzimática com alfa-alglicosidase anterior.

37. Método para tratar a doença de Pompe em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma população de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO);

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13/22 em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, pelo menos 0,5 mol de bis-manose-6-fosfato (bis-M6P) por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de N-glicosilação, conforme determinado por LC-MS/MS; e em que a população de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de reduzir a fadiga no indivíduo, conforme medido de acordo com uma pontuação na escala de gravidade da fadiga (FSS).

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a pontuação FSS do indivíduo seis meses após o tratamento é reduzida em pelo menos 3,5 em comparação com a linha de base.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente de ERT-switch não ambulatorial.

40. Método, de acordo com a reivindicação 37 ou reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial com ERT-switch e em que a pontuação FSS do indivíduo seis meses após o tratamento é reduzida em pelo menos 8 em comparação com a linha de base.

41. Método, de acordo com a reivindicação 37 ou reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial que não usa ERT e em que a pontuação FSS do indivíduo seis meses após o tratamento diminui em pelo menos 5 em comparação com a linha de base.

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42. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o indivíduo recebeu anteriormente a terapia de reposição enzimática com alfaalglicosidase, em que o indivíduo possui uma pontuação FSS mais baixa após o tratamento com a população de rhGAA em comparação com a pontuação FSS do indivíduo após a terapia anterior com reposição enzimática com alfa-alglicosidase.

43. Método de tratamento da doença de Pompe em um indivíduo em necessidade do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma população de moléculas de α-glicosidase ácida humana recombinante (rhGAA) a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO);

em que as moléculas de rhGAA compreendem, em média, pelo menos 0,5 mol de bis-manose-6-fosfato (bis-M6P) por mol de rhGAA no primeiro sítio potencial de N-glicosilação, conforme determinado por LC-MS/MS; e em que a população de rhGAA é administrada em uma dosagem capaz de reduzir os níveis de pelo menos um biomarcador de lesão muscular selecionado no grupo que consiste em creatina quinase, alanina aminotransferase

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15/22 (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e combinações dos mesmos .

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que pelo menos um biomarcador de lesão muscular é creatina quinase.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que, em comparação com a linha de base, os níveis de creatina quinase do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 15%, os níveis de ALT do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 5% ou os níveis de AST do indivíduo seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 5%.

46. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial com ERT-swicth e em que, em comparação com a linha de base, os níveis de creatina quinase do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 15%, os níveis de ALT do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 15% ou os níveis de AST do indivíduo seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 10%.

47. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente com ERT-switch não ambulatorial e em que, em comparação com a

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16/22 linha de base, os níveis de creatina quinase do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 20%, os níveis de ALT do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 5% ou os níveis de AST do indivíduo seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 5%.

48. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um paciente ambulatorial que não usa ERT e em que, em comparação com a linha de base, os níveis de creatina quinase do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 35%, os níveis de ALT do indivíduo em seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 35% ou os níveis de AST do indivíduo seis meses após o tratamento são reduzidos em pelo menos 30%.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 48, caracterizado pelo fato de que a população de moléculas de rhGAA é administrada a uma dose de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 49, caracterizado pelo fato de que a população de moléculas de rhGAA é administrada a uma dose de cerca de 20 mg/kg.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 50, caracterizado pelo fato de que a

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17/22 população de moléculas de rhGAA é administrada bimestralmente, mensalmente, a cada duas semanas, semanalmente, duas vezes por semana ou diariamente.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a população de moléculas de rhGAA é administrada a cada duas semanas.

53. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 52, caracterizado pelo fato de que a população de moléculas de rhGAA é administrada por via intravenosa.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 53, caracterizado pelo fato de que a população de moléculas de rhGAA é administrada simultaneamente ou sequencialmente com uma chaperona farmacológica.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a chaperona farmacológica é miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via oral.

57. Método, de acordo com a reivindicação 55 ou reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado

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18/22 a uma dose de cerca de 200 mg a cerca de 600 mg.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado a uma dose de cerca de 260 mg.

59. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a população de moléculas de rhGAA é administrada por via intravenosa a uma dose de cerca de 5 mg/kg a cerca de 20 mg/kg e o miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via oral a uma dose de cerca de 233 mg a cerca de 500 mg.

60. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via oral a uma dose de cerca de 50 mg a cerca de 200 mg.

61. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a população de moléculas de rhGAA é administrada por via intravenosa a uma dose de cerca de 20 mg/kg e o miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado por via oral a uma dose de cerca de 260 mg.

62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 55 a 61, caracterizado pelo fato de que o miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado antes da administração do rhGAA.

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63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é administrado cerca de uma hora antes da administração do rhGAA.

64. Método, de acordo com a reivindicação 62 ou reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o indivíduo jejua por pelo menos duas horas antes e pelo menos duas horas após a administração de miglustat ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 64, caracterizado pelo fato de que as moléculas de rhGAA compreendem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 65, caracterizado pelo fato de que as moléculas de rhGAA compreendem uma sequência de aminoácidos idêntica à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 66, caracterizado pelo fato de que pelo menos 30% das moléculas de rhGAA compreendem uma ou mais unidades de N-glicano contendo um resíduo de manose-6fosfato (mono-M6P) ou bis-M6P, conforme determinado usando LC-MS/MS.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 67, caracterizado pelo fato de que as

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20/22 moléculas de rhGAA compreendem em média de cerca de 0,5 mol a cerca de 7,0 mol de mono-M6P ou bis-M6P por mol de rhGAA, conforme determinado por LC-MS/MS.

69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 68, caracterizado pelo fato de que as moléculas de rhGAA compreendem em média pelo menos 2,5 mol de M6P por mol de rhGAA e pelo menos 4 mol de ácido siálico por mol de rhGAA, conforme determinado por LC-MS/MS.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 69, caracterizado pelo fato de que, por mol de rhGAA, as moléculas de rhGAA compreendem em média:

(a) de cerca de 0,4 a cerca de 0,6 mol de mono-M6P no segundo sítio potencial de N-glicosilação;

(b) de cerca de 0,4 a cerca de 0,6 mol de bis-M6P no quarto sítio potencial de N-glicosilação; e (c) de cerca de 0,3 a cerca de 0,4 mol de mono-M6P no quarto sítio potencial de N-glicosilação;

em que (a) - (c) são determinados usando LC-MS/MS.

71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que, por mol de rhGAA, as moléculas de rhGAA compreendem ainda cerca de 4 mol a cerca de 7,3 mol de ácido siálico; e em que, por mol de rhGAA, as moléculas de rhGAA compreendem em média:

(a) de cerca de 0,9 a cerca de 1,2 mol de ácido siálico

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21/22 no terceiro sitio potencial de N-glicosilação;

(b) de cerca de 0,8 a cerca de 0,9 mol de ácido siálico no quinto sitio potencial de N-glicosilação; e (c) de cerca de 1,5 a cerca de 4,2 mol de ácido siálico no sexto sitio potencial de N-glicosilação;

em que (a) - (c) são determinados usando LC-MS/MS.

72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 71, caracterizado pelo fato de que a população de moléculas de rhGAA é formulada em uma composição farmacêutica.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende ainda pelo menos um tampão selecionado do grupo que consiste em um citrato, um fosfato e uma combinação dos mesmos, e pelo menos um excipiente selecionado do grupo que consiste em manitol, polissorbato 80, e uma combinação dos mesmos; em que a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,0.

75. Método, de acordo com a reivindicação 73 ou reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica compreende ainda água, um agente acidificante, um agente alcalinizante, ou uma combinação dos mesmos.

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76. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que, na composição farmacêutica, a população de moléculas de rhGAA está presente a uma concentração de cerca de 5 a 50 mg/mL, pelo menos um tampão é um tampão de citrato de sódio presente a uma concentração de cerca de 10 a 100 mM, pelo menos um excipiente é manitol presente em uma concentração de cerca de 10 a 50 mg/mL e polissorbato 80 presente em uma concentração de cerca de 0,1 a 1 mg/mL, e a composição farmacêutica compreende ainda água e opcionalmente compreende um agente de acidificação e/ou um agente alcalinizante; em que a composição farmacêutica tem um pH de cerca de 6,0.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que, na composição farmacêutica, a população de moléculas de rhGAA está presente a uma concentração de cerca de 15 mg/mL, o tampão citrato de sódio está presente a uma concentração de cerca de 25 mM, o manitol está presente a uma concentração de cerca de 20 mg/mL, e o polissorbato 80 está presente a uma concentração de cerca de 0,5 mg/mL.