ES2758827T3 - Formulaciones para enzimas lisosómicas - Google Patents
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Abstract
Un kit que comprende (a) una formulación farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Pompe, que comprende una alfa glucosidasa ácida y un poloxámero, y (b) instrucciones para la reconstitución y/o el uso de la formulación farmacéutica.
Description
DESCRIPCIÓN
Formulaciones para enzimas lisosómicas
Antecedentes
La ausencia de una o más enzimas lisosómicas en el lisosoma provocan, de forma directa o indirecta, más de cuarenta enfermedades de almacenamiento lisosómico (EAL). Se va en pos de forma activa de la terapia de reemplazo enzimático para las EAL. En general, la terapia necesita que las proteínas de las EAL se capten y suministren a los lisosomas en una diversidad de tipos celulares. Los inventores de la presente solicitud han desarrollado de forma previa una tecnología de dirección basada en péptidos, que permite la entrega más eficaz de enzimas terapéuticas a los lisosomas. Esta tecnología patentada se denomina Dirección Lisosómica Independiente de Glucosilación (DLIG). Los detalles de la tecnología DLIG se describen en las patentes de Estados Unidos n.° 7.396.811, 7.560.424, y 7.629.309; las solicitudes de publicación de Estados Unidos n.° 2003-0082176, 2004 0006008, 2003-0072761, 2005-0281805, 2005-0244400, y las publicaciones internacionales WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077.
Debido a que las proteínas utilizadas en la terapia de reemplazo enzimático son más grandes y más complejas que los fármacos orgánicos e inorgánicos tradicionales (es decir, poseen múltiples grupos funcionales además de estructuras tridimensionales complejas), la formulación, acondicionamiento y conservación de tales proteínas presentan problemas especiales.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona formulaciones mejoradas para las enzimas lisosómicas útiles para la terapia de reemplazo enzimático. Entre otras cosas, la presente invención proporciona formulaciones que conservan y potencian la estabilidad y/o la eficacia de una enzima lisosómica tal como la alfa glucosidasa ácida.
Se describe una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Pompe que comprende una alfa glucosidasa ácida y un poloxámero. En algunas realizaciones, el poloxámero adecuado para la invención es Pluronic® F-68. En algunas realizaciones, el poloxámero está en una concentración que varía entre aproximadamente el 0,001 % y aproximadamente el 0,2 %. En determinadas realizaciones, el poloxámero está en una concentración de aproximadamente el 0,1 %. En determinadas realizaciones, el poloxámero está en una concentración de aproximadamente el 0,05 %.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención incluye adicionalmente un agente tamponador. En algunas realizaciones, el agente tamponador se selecciona del grupo que consiste en histidina, acetato de sodio, citrato, fosfato, succinato, Tris y combinaciones de los mismos. En determinadas realizaciones, el agente tamponador está en una concentración que varía entre aproximadamente 25 mM y aproximadamente 50 mM.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención incluye adicionalmente un agente estabilizador. En algunas realizaciones, el agente estabilizador se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, arginina, sorbitol, manitol, glicina, trehalosa y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención incluye adicionalmente un modificador de la tonicidad. En algunas realizaciones, el modificador de la tonicidad se selecciona del grupo que consiste en glicina, sorbitol, sacarosa, manitol, cloruro de sodio, dextrosa, arginina y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención incluye un agente formador de volumen. En algunas realizaciones, el agente formador de volumen se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, manitol, glicina, cloruro de sodio, dextrano, trehalosa y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención tiene un pH que varía desde aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0. En determinadas realizaciones, un pH adecuado es de aproximadamente 6,0.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención está en una forma adecuada para la administración parenteral. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención está en una forma adecuada para la infusión intravenosa.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de acuerdo con la invención es una mezcla liofilizada. En algunas realizaciones, la alfa glucosidasa ácida en una formulación es una alfa glucosidasa ácida (AGA) de ser humano recombinante. En determinadas realizaciones, la AGA de ser humano recombinante se produce a partir de células CHO. En determinadas realizaciones, la AGA de ser humano recombinante tiene niveles de glucosilación
modificados (por ejemplo, aumentados o reducidos) en comparación con la AGA de ser humano de origen natural. En determinadas realizaciones, la AGA de ser humano recombinante contiene cantidades aumentadas de restos manosa-6-fosfato en comparación con la AGA de ser humano de origen natural. En algunas realizaciones, la AGA de ser humano recombinante contiene cantidades reducidas de restos manosa-6-fosfato en comparación con la AGA de ser humano de origen natural. En algunas realizaciones, la AGA de ser humano recombinante utilizada en una formulación está subglucosilada o desglucosilada.
En algunas realizaciones, la alfa glucosidasa ácida es una proteína de fusión que comprende a la AGA de ser humano o a una variante funcional de la misma. En algunas realizaciones, la proteína de fusión incluye adicionalmente un péptido de dirección lisosómica. En algunas realizaciones, el péptido de dirección lisosómica tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos el 70 % (por ejemplo, por lo menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 99 %) idéntica al IGF-II de ser humano maduro (SeQ ID NO: 1).
En algunas realizaciones, el péptido de dirección lisosómica es una muteína del IGF-II y comprende una mutación dentro de una región que corresponde a los aminoácidos 34-40 de la SEQ ID NO: 1, de forma que la mutación suprime por lo menos un sitio de escisión de la proteasa furina. En algunas realizaciones, el péptido de dirección lisosómica es una muteína del IGF-II que tiene afinidad de unión disminuida por el receptor de IGF-I con respecto a la afinidad del IGF-II de ser humano de origen natural por el receptor del IGF-I. En algunas realizaciones, el péptido de dirección lisosómica es una muteína del IGF-II que tiene afinidad de unión disminuida por el receptor de insulina, con respecto a la afinidad del IGF-II de ser humano de origen natural por el receptor de insulina.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos el 70 % (por ejemplo, por lo menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 99 %) idéntica a la SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una alfa glucosidasa ácida descrita en el presente documento en una formulación que contiene aproximadamente citrato de sodio 50 mM, manitol al 4 %, trehalosa al 1 %, y Pluronic F-68 al 0,1 %. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una alfa glucosidasa ácida descrita en el presente documento en una formulación que contiene aproximadamente citrato de sodio a 25 mM, manitol al 2 %, trehalosa al 0,5 %, y Pluronic F-68 al 0,05 %. En diversas realizaciones, una formulación de acuerdo con la invención está en una forma líquida. En diversas realizaciones, una formulación de acuerdo con la invención tiene un pH que varía aproximadamente entre 5-7 (por ejemplo, un pH de aproximadamente 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, o 7,0). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una mezcla liofilizada de una alfa glucosidasa ácida descrita en el presente documento, citrato de sodio, manitol, trehalosa, y Pluronic F-68.
Adicionalmente, se describen métodos para el tratamiento de la enfermedad de Pompe y de otras enfermedades de almacenamiento lisosómico, mediante la administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento a un sujeto que necesita tratamiento.
Como se utiliza en la presente solicitud, las expresiones “aproximadamente” y “de forma aproximada” se utilizan como equivalentes. Cualquiera de las cifras utilizadas en la presente solicitud, con o sin aproximadamente/de forma aproximada, tienen el propósito de cubrir cualquiera de las fluctuaciones normales que aprecia alguien con las habilidades habituales en la técnica pertinente. Por ejemplo, las fluctuaciones normales de un valor de interés pueden incluir una serie de valores que caen dentro del 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) de un valor de referencia establecido a menos que se establezca otra cosa o que sea evidente otra cosa a partir del contexto (excepto en donde tal número excediese el 100 % de un posible valor). Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa resultados ejemplares de estudios de exploración de tensioactivos. Los viales se muestran después de la agitación con y sin tensioactivos.
La Figura 2 ilustra cromatogramas de SE-HPLC ejemplares de muestras después de la agitación durante 4 horas a temperatura ambiente. La muestra agitada sin tensioactivo no se analizó debido a la precipitación.
La Figura 3 ilustra un ciclo de liofilización ejemplar utilizado para liofilizar diversas formulaciones.
La Figura 4 representa viales ejemplares que contienen la formulación después del secado.
La Figura 5 ilustra la calorimetría de selección diferencial de C6MT ejemplar.
La Figura 6 ilustra cromatogramas de SE-HPLC ejemplares de todas las formulaciones a "pre lio.", tiempo cero, y dos días de reconstitución. No tuvo lugar degradación detectable como resultado del procedimiento de
liofilización o del almacenamiento de dos días después de la reconstitución.
La Figura 7 ilustra cromatografías de SE-HPLC ejemplares para todas las formulaciones probadas después de 16 semanas de almacenamiento a 4 °C y a 25 °C.
La Figura 8 ilustra el SDS-PAGE ejemplar de todas las formulaciones probadas después de 16 semanas de almacenamiento a 4 °C y a 25 °C.
La Figura 9 ilustra el análisis de SDS-PAGE ejemplar de la reconstitución "pre lio.", tiempo cero, y dos días de reconstitución de las formulaciones probadas.
La Figura 10 ilustra la estabilidad ejemplar mediante SEC-HPLC (HPLC por cromatografía de exclusión por tamaño) de las tres formulaciones probadas almacenadas a (A) 4 °C, (B) 25 °C, y (C) 37 °C.
La Figura 11 ilustra la medición ejemplar de la concentración de las proteínas de la muestra mediante espectrofotometría de A280. Las concentraciones de proteínas de las muestras probadas fueron estables en el transcurso de 92 días del estudio. La concentración de proteína de la muestra se determinó mediante medición de la A280 utilizando un coeficiente de extinción de 1,59 cm-1 (mg/ml)’1.
La Figura 12 ilustra la medición ejemplar de la actividad enzimática de AGA mediante el ensayo de PNP. Definición de unidad: enzima necesaria para hidrolizar 1 nmol de para-nitrofenol alfa-glucósido (Sigma n.° N1377) en una hora a 37 °C en una reacción que contiene sustrato 10 mM y acetato de sodio 100 mM pH 4,2. Las reacciones de 50 pl se detuvieron con 300 pl de carbonato de sodio 100 mM. El sustrato hidrolizado se detectó a 405 nm y se comparó con una curva estándar de p-nitrofenol (Sigma n.° N7660).
La Figura 13 ilustra la medida ejemplar de la actividad de AGA de ZC-701-GMP1 mediante el ensayo PNP, en muestras que se sometieron a hasta 5 ciclos de congelación instantánea en nitrógeno líquido, seguido de descongelación en agua a temperatura ambiente.
La Figura 14 ilustra el SDS-PAGE reductor (+DTT) y no reductor (-DTT) ejemplar. Los carriles que contenían 10 pg de la muestra ZC-701 se separaron en geles prefabricados XT con Bis-Tris al 4-12 % (Bio Rad n.° 345 0124) en condiciones reductoras (DTT 100 mM) o en condiciones no reductoras (sin DTT) como describía el fabricante, a 200 voltios durante 50 minutos. Los geles se tiñeron con tinción de Imperial Protein (Pierce n.° 24615).
La Figura 15 ilustra análisis de estabilidad ejemplares. Las muestras se separaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño analítica. El porcentaje de ZC-701 presente como forma monomérica se determinó cargando 33 pg de ZC-701 en solución salina tamponada con fosfato pH 6,2 a temperatura ambiente a 0,25 ml/min en una columna TSKgel G2000 SWxl de 30 cm x 7,8 mm y una columna TSKgel G3000 SWxl de 30 cm x 7,8 mm conectadas en serie. El nivel de multimerización se definió como el % de fracción más grande que el monómero de ZC-701.
La Figura 16 ilustra la cuantificación ejemplar de las especies proteicas escindidas por furina mediante el análisis de PNGasa F / SDS-PAGE de diversas muestras.
La Figura 17 ilustra resultados ejemplares que indican la concentración de proteína de ZC-701 de un análisis de estabilidad ejemplar. Las concentraciones se determinaron mediante medición de A280 utilizando un coeficiente de extinción de 1,59 cirr1 (mg/ml)'1.
La Figura 18 ilustra resultados ejemplares que muestran la actividad enzimática de ZC-701 diluida en solución salina. Definición de unidad: enzima necesaria para hidrolizar 1 nmol de para-nitrofenol alfa-glucósido (Sigma n.° N1377) en una hora a 37 °C en una reacción que contenía sustrato 10 mM y acetato de sodio 100 mM pH 4,2. Las reacciones de 50 pl se detuvieron con 300 pl de carbonato de sodio 100 mM. Se detectó al sustrato hidrolizado a 405 nm y se comparó con una curva estándar de p-nitrofenol (Sigma n.° N7660).
La Figura 19 ilustra el análisis por SDS-PAGE ejemplar de ZC-701 diluida en solución salina. Los carriles que contenían 10 pg de muestra de ZC-701 se separaron en geles prefabricados XT con Bis-Tris al 4-12 % (Bio Rad n.° 345-0124) en condiciones reductoras (DTT 100 mM, gel superior) o condiciones no reductoras (sin DTT, gel inferior) como describía el fabricante a 200 voltios durante 50 minutos. Los geles se tiñeron con tinción de Imperial Protein (Pierce n.° 24615). Los carriles 1 y 2 contenían material de ZC-701 que no estaba diluido en solución salina. El material del carril 1 se almacenó a -80 °C y el material de carril 2 se almacenó a 4 °C.
Definiciones
Para que la presente invención sea comprendida más fácilmente, primero se definen determinados términos a continuación. A lo largo de toda la especificación se indican definiciones adicionales para los siguientes y otros
términos.
Agente formador de volumen: Como se utiliza en el presente documento, la expresión “agente formador de volumen” se refiere a un compuesto que añade masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada (por ejemplo, facilita la producción de una torta liofilizada esencialmente uniforme que mantiene una estructura de poro abierta). Los agentes formadores de volumen ejemplares incluyen manitol, glicina, cloruro de sodio, almidón hidroxietílico, lactosa, sacarosa, trehalosa, polietilenglicol y dextrano.
Receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR): Como se utiliza en el presente documento, la expresión "receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR)" se refiere a un receptor celular que se une a etiquetas de manosa-6-fosfato (M6P) sobre los precursores de la hidrolasa ácida en el aparato de Golgi que están destinadas al transporte al lisosoma. Además de a manosa-6-fosfatos, el CI-MPR también se une a otras proteínas que incluyen el IGF-II. También se conoce al CI-MPR como "receptor de M6P/IGF-II", "receptor de CI-MPR/IGF-II", "receptor de IGF-II" o "receptor de IGF2". Estas expresiones y abreviaturas de las mismas se utilizan en el presente documento indistintamente.
Diluyente: Como se utiliza en el presente documento el término “diluyente” se refiere a una sustancia de dilución farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, segura y no tóxica para la administración a un ser humano) útil para la preparación de una formulación reconstituida. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (ABPI), una solución de pH tamponado (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.
Terapia de reemplazo de enzimas (TRE): Como se utiliza en el presente documento, la expresión “terapia de reemplazo enzimático (TRE)” se refiere a cualquier estrategia terapéutica que corrija una deficiencia enzimática proporcionando la enzima faltante. En algunas realizaciones, la enzima faltante se proporciona por infusión en el torrente sanguíneo. A medida que la sangre perfunde los tejidos del paciente, las células captan la enzima y la transportan al lisosoma, en donde la enzima actúa para eliminar material que se ha acumulado en los lisosomas debido a la deficiencia enzimática. Normalmente, para que la terapia de reemplazo de enzimas lisosómicas sea eficaz, la enzima terapéutica se entrega a los lisosomas en las células y los tejidos apropiados donde se manifiesta el defecto de almacenamiento. En algunas realizaciones, el producto terapéutico de reemplazo enzimático lisosómico se entrega utilizando carbohidratos acoplados de forma natural a la proteína para involucrar a los receptores específicos sobre la superficie de las células diana. Un receptor, el receptor de M6P independiente de cationes (CI-MPR), es particularmente útil para dirigir las enzimas lisosómicas de reemplazo debido a que el CI-MPR está presente en la superficie de la mayoría de los tipos celulares. Tales terapias de reemplazo enzimático, y enzimas de reemplazo, se describen en las patentes de Estados Unidos números 7.371.366, 7.354.576, 7.067.127, 6.905.856, 6.861.242, 6.828.135, 6.800.472, 6.770.468, 6.670.165, 6.642.038, 6.569.661, 6.537.785, 6.534.300 y publicación de solicitudes de patente de Estados Unidos números 20080176285, 20080003626, 20060286087, 20050170449, 20050003486. En algunas realizaciones, los productos terapéuticos de reemplazo de enzimas lisosómicas se entregan de una manera independiente de glucosilación, en particular, de manera independiente de manosa-6-fosfato. Tal método de entrega también se conoce como dirección lisosómica independiente de glucosilación (DLIG). En algunas realizaciones, las enzimas de reemplazo contienen una etiqueta DLIG (por ejemplo, un péptido) que se une al CI-MPR de manera independiente de manosa-6-fosfato. Los detalles de la tecnología DLIG se describen en la patente de Estados Unidos n.° 7.396.811, las publicaciones de solicitudes de Estados Unidos n.° 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 2005-0281805, 2005-0244400, y las publicaciones internacionales WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077.
Dirección lisosómica independiente de glucosilación: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "dirección lisosómica independiente de glucosilación " (también denominada como “DLIG”) se refiere a la dirección lisosómica que es independiente de manosa-6-fosfato.
Alfa glucosidasa ácida de ser humano: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "alfa glucosidasa ácida de ser humano" (también denominada como "AGA") se refiere a la forma de tipo silvestre precursora de la AGA de ser humano o a una variante funcional que es capaz de reducir los niveles de glucógeno en los lisosomas de mamífero, o que puede rescatar o mejorar uno o más de los síntomas de la enfermedad de Pompe.
Mejorar, aumentar, o reducir: Como se utiliza en el presente documento, los términos "mejorar”, "aumentar" o "reducir”, o los equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición inicial, tal como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en el presente documento, o a una medición en un individuo de control (o en múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito en el presente documento. Un “individuo de control” es un individuo aquejado con la misma forma de enfermedad de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, enfermedad de Pompe) que el individuo que se está tratando, quien tiene aproximadamente la misma edad que el individuo que se está tratando (para asegurar que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y en el(los) individuo(s) de control son comparables).
Individuo, sujeto, paciente: Como se utiliza en el presente documento, los términos “sujeto”, “individuo” o “paciente” se refieren a un ser humano o a un sujeto mamífero que no sea ser humano. El individuo (también denominado
como “paciente” o “sujeto”) que se está tratando es un individuo (feto, lactante, niño, adolescente, o ser humano adulto) que padece una enfermedad de almacenamiento lisosómico, por ejemplo, enfermedad de Pompe (es decir, enfermedad de Pompe de inicio ya sea infantil, juvenil, o en el adulto) o que tenga el potencial de desarrollar una enfermedad de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, enfermedad de Pompe).
Lioprotector: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "lioprotector" se refiere a una molécula que previene o reduce la inestabilidad química y/o física de una proteína o de otra sustancia a lo largo de la liofilización y el almacenamiento posterior. Los lioprotectores ejemplares incluyen azúcares tales como sacarosa o trehalosa; un aminoácido tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaína; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes trihídricos o de azúcares superiores, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol, polietilenglicol, Pluronics y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, un lioprotector es un azúcar no reductor, tal como trehalosa o sacarosa.
Enfermedades de almacenamiento lisosómico: Como se utiliza en el presente documento, "enfermedades de almacenamiento lisosómico" se refiere a un grupo de trastornos genéticos que se producen por la deficiencia de por lo menos una de las enzimas (por ejemplo, hidrolasas ácidas) que se necesitan en los lisosomas para romper macromoléculas para producir péptidos, aminoácidos, monosacáridos, ácidos nucleicos y ácidos grasos. Como resultado, los individuos que padecen enfermedades de almacenamiento lisosómico tienen materiales acumulados en los lisosomas. Las enfermedades del almacenamiento lisosómico ejemplares se enumeran en la Tabla 1.
Enzima lisosómica: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "enzima lisosómica" se refiere a cualquier enzima que es capaz de reducir los materiales acumulados en los lisosomas de mamífero o que pueden rescatar o mejorar uno o más de los síntomas de la enfermedad de almacenamiento lisosómico. Las enzimas lisosómicas adecuadas para la invención incluyen enzimas lisosómicas de tipo silvestre o modificadas, y pueden producirse utilizando métodos recombinantes y sintéticos, o pueden purificarse a partir de fuentes naturales. Las enzimas lisosómicas ejemplares se enumeran en la Tabla 1.
Conservante: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "conservante" se refiere a un compuesto que se puede añadir al diluyente para reducir la acción bacteriana en la formulación reconstituida, facilitando así la producción de una formulación reconstituida de múltiples usos. Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilo amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en los que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, y m-cresol. En el presente documento el conservante más preferente es alcohol bencílico.
Espaciador: Como se utiliza en el presente documento, el término "espaciador" (también denominado "conector") se refiere a una secuencia peptídica entre dos residuos de proteína en una proteína de fusión. En general, un conector se diseña para ser flexible o para interponerse a una estructura, tal como una hélice alfa, entre los dos residuos de proteína. Un espaciador puede ser relativamente corto, tal como la secuencia Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO: 3) o Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 4), o puede ser más largo, tal como, por ejemplo, de 10-25 aminoácidos de longitud.
Esencialmente: Como se utiliza en el presente documento, el término "esencialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar el alcance o el grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las artes biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos casi nunca llegan a su finalización y/o se desarrollan hasta la exhaustividad o alcanzan o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término “esencialmente” se utiliza en el presente documento para capturar la pérdida potencial de exhaustividad inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.
Cantidad terapéuticamente eficaz: Como se utiliza en el presente documento, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz " se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima lisosómica) que confiere un efecto terapéutico sobre el sujeto tratado, en una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible mediante alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto proporciona una indicación de, o siente, un efecto). En particular, la “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima lisosómica) o composición eficaz, para tratar, mejorar, o prevenir una enfermedad o afección deseada, o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable, tal como mediante la mejora de los síntomas asociados con la enfermedad, que previene o retrasa la aparición de la enfermedad, y/o también disminuir la severidad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz habitualmente se administra en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, o de la combinación con otros agentes farmacéuticos. También, la cantidad terapéuticamente eficaz específica (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una diversidad de factores que incluyen el trastorno a tratar y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, la vía de administración, y/o la
velocidad de excreción o de metabolismo de la proteína específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como es bien conocido en las artes médicas.
Tratamiento: Como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" (también “tratar” o “que trata”) se refiere a cualquier administración de una proteína terapéutica (por ejemplo, una enzima lisosómica) que alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa la aparición de, reduce la gravedad de y/o reduce la incidencia de forma parcial o completa de uno o más de los síntomas o característica de una enfermedad, trastorno, y/o afección particular. Tal tratamiento puede ser de un sujeto que no muestra signos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante y/o de un sujeto que muestra solamente signos prematuros de la enfermedad, trastorno, y/o afección. Como alternativa o de forma adicional, tal tratamiento puede ser el de un sujeto que muestra uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afección relevante. Por ejemplo, tratamiento puede referirse a la mejora del estado cardiaco (por ejemplo, el aumento del volumen telediastólico y/o telesistólico, o la reducción, mejora o prevención de la cardiomiopatía progresiva que se encuentra normalmente en la enfermedad de Pompe) o de una función pulmonar (por ejemplo, aumento de la capacidad vital durante el llanto sobre la capacidad de la medida basal, y/o la normalización de la desaturación de oxígeno durante el llanto); mejora del neurodesarrollo y/o de las capacidades motoras (por ejemplo, aumento del valor en la AIMS: sigla del inglés: Abnormal Involuntary Movement Scale; escala de movimientos involuntarios anormales); reducción de los niveles de glucógeno en los tejidos del individuo afectado por la enfermedad; o cualquier combinación de estos efectos. En algunas realizaciones, el tratamiento incluye la mejora de la eliminación del glucógeno; en particular, la reducción o prevención de la cardiomiopatía asociada a la enfermedad de Pompe.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona, entre otras cosas, formulaciones para enzimas lisosómicas adecuadas para la terapia de reemplazo enzimático que conservan o potencian la estabilidad y/o eficacia de la proteína. En particular, las formulaciones que proporciona la presente invención reducen o eliminan la formación de agregados de alto peso molecular, la degradación de proteínas durante el secado por congelación, el almacenamiento, el transporte y la infusión.
Antes de la presente invención, la obstrucción del filtro resultante de la precipitación enzimática durante la infusión era un problema antiguo para las formulaciones existentes para determinadas enzimas lisosómicas (en particular, la a-glucosidasa (AGA) de ser humano recombinante). Se ha informado de que en ocasiones los filtros se bloqueaban múltiples veces durante una infusión. Este problema no solo provoca un gran inconveniente a los pacientes y los médicos, sino que también afecta a la eficacia terapéutica y la seguridad del paciente. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente de que el uso de un tipo particular de tensioactivo, el poloxámero, en una formulación, reduce de forma significativa o elimina la precipitación enzimática durante la infusión. Como se describe en la sección de Ejemplos, las formulaciones que contienen un poloxámero también estabilizan las enzimas lisosómicas durante la liofilización, la reconstitución, el almacenamiento y la infusión del paciente. Por lo tanto, la presente invención representa una mejora significativa en el campo de la terapia terapéutica enzimática.
En las siguientes secciones se describen en detalle diversos aspectos de la invención. El uso de las secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En la presente solicitud, el uso de "o" significa "y/o", a menos que se indique otra cosa.
Enzimas lisosómicas
La presente invención se puede utilizar para formular cualquier enzima lisosómica. Las enzimas lisosómicas adecuadas incluyen cualquier enzima que es capaz de reducir los materiales acumulados en los lisosomas de mamífero o que pueden rescatar o mejorar uno o más de los síntomas de la enfermedad de almacenamiento lisosómico. Las enzimas lisosómicas adecuadas incluyen enzimas lisosómicas de tipo silvestre o modificadas y se pueden producir utilizando métodos recombinantes o sintéticos, o purificarse a partir de fuentes naturales. Las enzimas lisosómicas ejemplares se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1. Enfermedades de almacenamiento lisosómico defectos enzimáticos asociados
continuación
Las secuencias de aminoácidos de las enzimas mostradas en la Tabla 1 son bien conocidas en la técnica y son fácilmente accesibles mediante la búsqueda en las bases de datos públicas tales como GenBank utilizando los nombres de las enzimas. En algunas realizaciones, también se puede utilizar la presente invención para formular enzimas modificadas a partir de las enzimas de origen natural que incluyen, pero sin limitación, cualquiera de las enzimas que tengan una secuencia por lo menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia de la correspondiente enzima de origen natural mostrada en la Tabla 1. En algunas realizaciones, una enzima adecuada puede ser un fragmento o una enzima de origen natural. En algunas realizaciones, una enzima adecuada puede ser una proteína de fusión que contiene una enzima de origen natural o un fragmento de la misma. En diversas realizaciones, una enzima modificada conserva la actividad enzimática de la enzima de origen natural correspondiente. Por ejemplo, una enzima AGA adecuada puede ser un fragmento de una AGA de ser humano de origen natural o una variante de secuencia de la misma que conserve la capacidad de escindir las uniones al-4 en oligosacáridos lineales.
"Porcentaje ( %) de identidad de secuencia de aminoácidos” con respecto a las secuencias de las enzimas lisosómicas se define como el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de la enzima de ser humano de origen natural, después del alineamiento de las secuencias y de la introducción de huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar cualquier sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento para fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede conseguir de diversos modos que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, utilizando programas informáticos de ordenador disponibles de forma pública tales como los programas informáticos BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para el alineamiento de medición, que incluyen cualquier algoritmo necesario para conseguir el máximo alineamiento a lo largo de la longitud completa de las secuencias a comparar. Preferentemente, el programa informático WU-BLAST-2 se utiliza para determinar la identidad de secuencia de aminoácidos (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se ajusta a los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se ajustan con los siguientes valores: tramo de solapamiento=1, fracción de solapamiento=0,125, umbral de palabra (T)=11. El valor HSP (S) y los parámetros HSP S2 son valores dinámicos y los establece el propio programa, dependiendo de la composición de la secuencia particular, sin embargo, los valores mínimos se pueden ajustar y se fijan como se indica anteriormente.
Enzimas lisosómicas etiquetadas con DLIG
En algunas realizaciones, para facilitar la dirección lisosómica se modifica una enzima adecuada. Por ejemplo, se puede fusionar una enzima adecuada a una etiqueta de Dirección Lisosómica Independiente de Glucosilación (DLIG), que dirige a la enzima a los lisosomas de una manera independiente de manosa-6-fosfato. Normalmente, una etiqueta DLIG es una proteína, péptido, u otro residuo que se une al CI-MPR, que también se denomina como receptor IGF-II, de una manera independiente de manosa-6-fosfato.
En algunas realizaciones, se obtiene una etiqueta DLIG a partir del factor de crecimiento similar a insulina de ser humano II (IGF-II). En algunas realizaciones, una etiqueta DLIG es un IGF-II de ser humano maduro de tipo silvestre o de origen natural (SEQ ID NO: 1).
IGF-II de ser humano madura (SEQ ID NO: 1) (los sitios de escisión de furina están en negrita y subrayados)
AYRPSETLCGGELVDTLOFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLET
YCATPAKSE
En algunas realizaciones, una etiqueta DLIG es un IGF-II de ser humano maduro modificado que contiene sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos. En algunas realizaciones, una etiqueta DLIG tiene una secuencia por lo menos el 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 99 % idéntica a la secuencia del IGF-II de ser humano maduro (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, una etiqueta DLIG es un fragmento del IGF-II de ser humano maduro. En realizaciones particulares, una etiqueta DLIG contiene los aminoácidos 8-67 del IGF-II de ser humano maduro (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, una etiqueta DLIG contiene una deleción N terminal, C terminal o interna. En realizaciones particulares, una etiqueta DLIG contiene una deleción de los aminoácidos 2-7 (A2-7) del IGF-II de ser humano maduro (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, una etiqueta DLIG es un péptido IGF-II de ser humano modificado que tiene disminuida la afinidad de unión por el receptor de IGF-I en comparación con IGF-II de ser humano de origen natural.
En algunas realizaciones, una etiqueta DLIG es una etiqueta peptídica resistente a furina. Normalmente la proteasa furina reconoce y escinde un sitio de escisión que tiene una secuencia consenso Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO: 5), X es cualquier aminoácido. El sitio de escisión está posicionado en la secuencia después del resto arginina (Arg) carboxilo terminal. En algunas realizaciones, un sitio de escisión de furina tiene una secuencia consenso Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 6), X es cualquier aminoácido. El sitio de escisión está posicionado en la secuencia
después del resto arginina (Arg) carboxilo terminal. Como se utiliza en el presente documento, el término “furina" se refiere a cualquier proteasa que pueda reconocer y escindir el sitio de escisión de la proteasa furina como se define en el presente documento, que incluye a la proteasa furina o similar a furina. La furina también es conocida como enzima de escisión de aminoácidos básicos emparejados (PACE: sigla del inglés: paired basic amino acid cleaving enzyme). La furina pertenece a la familia de la proproteína convertasa similar a subtilisina que incluye a PC3, una proteasa responsable de la maduración de la proinsulina en los islotes pancreáticos. El gen que codifica la furina se conoció como FUR (sigla del inglés: "FES Upstream Region", región cadena arriba FES).
Como se muestra en la SEQ ID NO: 1, el IGF-II de ser humano maduro contiene entre los restos 34-40 (en negrita y subrayado) dos sitios potenciales solapantes de escisión de furina.
En algunas realizaciones, una etiqueta DLIG adecuada es un péptido IGF-II modificado que es resistente a la escisión por furina y todavía conserva la capacidad de unirse al CI-MPR de una manera independiente de manosa-6-fosfato. En algunas realizaciones, las etiquetas DLIG resistentes a furina se pueden diseñar mutando la secuencia de aminoácidos en uno o más sitios de escisión de furina, de forma que la mutación suprima por lo menos un sitio de escisión de furina. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una etiqueta DLIG resistente a furina es una muteína de IGF-II resistente a furina que contiene una mutación que suprime por lo menos un sitio de escisión de la proteasa furina o cambia una secuencia adyacente al sitio de escisión de la proteasa furina de forma que se evita, inhibe, reduce o ralentiza la escisión de la furina, en comparación con un péptido IGF-II de tipo silvestre (por ejemplo, IGF-II maduro de ser humano de tipo silvestre). Normalmente, una mutación adecuada no afecta la capacidad de la etiqueta DLIG resistente a furina para unirse al receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes de ser humano. En particular, una muteína de IGF-II resistente a furina adecuada para la invención se une al receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes de ser humano de una manera independiente de manosa-6-fosfato con una constante de disociación de 10'7 M o menor (por ejemplo, 10'8, 10'9, 10'10, 10-11, o menor) a pH 7,4. En algunas realizaciones, una muteína de IGF-II resistente a furina contiene una mutación dentro de una región que corresponde a los aminoácidos 30-40 (por ejemplo, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 32-39, 33- 39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40, 34-40) de SeQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutación adecuada suprime por lo menos un sitio de escisión de la proteasa furina. Una mutación puede ser sustituciones, deleciones, inserciones de aminoácidos. Por ejemplo, cualquier aminoácido dentro de la región que corresponde a los restos 30 40 (por ejemplo, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 32-39, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40, 34- 40) de la SEQ ID NO: 1 puede sustituirse por cualquier otro aminoácido o delecionarse. Por ejemplo, las sustituciones en la posición 34 pueden afectar al reconocimiento de la furina del primer sitio de escisión. La inserción de uno o más aminoácidos adicionales dentro de cada sitio de reconocimiento puede suprimir uno o ambos sitios de escisión de la furina. La deleción de uno o más de los restos en las posiciones degeneradas también puede suprimir ambos sitios de escisión de la furina.
En algunas realizaciones, una muteína de IGF-II resistente a furina contiene sustituciones de aminoácidos en las posiciones que corresponden a Arg37 o Arg40 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una muteína de IGF-II resistente a furina contiene una sustitución Lys o Ala en las posiciones Arg37 o Arg40. Son posibles otras sustituciones, incluyendo combinaciones de mutaciones de Lys y/o Ala en las posiciones 37 y 40, o sustituciones de aminoácidos que no sean Lys o Ala.
Una etiqueta DLIG se puede fusionar al extremo N o al extremo C de un polipéptido que codifica una enzima lisosómica, o se puede insertar de forma interna. La etiqueta DLIG se puede fusionar de forma directa al polipéptido de la enzima lisosómica o se puede separar del polipéptido de la enzima lisosómica mediante un conector o un espaciador. Un conector o espaciador de aminoácidos en general se diseña para ser flexible o para interponerse en una estructura, tal como una hélice alfa, entre los dos residuos de proteína. Un conector o espaciador puede ser relativamente corto, tal como en la secuencia Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO: 3) o Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 4), o puede ser más largo, tal como, por ejemplo, de una longitud de 10-25 aminoácidos. El sitio de unión de la fusión debería seleccionarse con cuidado para promover el plegamiento y la actividad apropiados de los compañeros de fusión y para evitar la separación prematura de una etiqueta peptídica de un polipéptido AGA. En una realización preferente, la secuencia conectora es Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO: 3).
Se pueden encontrar la descripción detallada de la tecnología DLIG, etiquetas DLIG ejemplares y construcciones de enzimas lisosómicas etiquetadas con DLIG, en las patentes de Estados Unidos n.° 7.396.811, 7.560.424, y 7.629.309; las solicitudes de publicación de Estados Unidos n.° 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 20040005309, 2005-0281805, 2005-0244400, y las publicaciones internacionales WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077, WO/2009/137721.
Enzimas con glucosilación modificada
En algunas realizaciones, se puede utilizar la presente invención para formular enzimas lisosómicas con patrones de glucosilación modificados. En algunas realizaciones, las enzimas con patrones de glucosilación modificados están altamente fosforiladas. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “enzimas lisosómicas altamente fosforiladas” se refiere a enzimas lisosómicas que contienen un alto nivel de fosforilación en comparación con el de una enzima de origen natural. En algunas realizaciones, las enzimas lisosómicas altamente fosforiladas que
contienen un nivel de fosforilación que no podría obtenerse solamente mediante el aislamiento de la enzima, se tratan con GlcNAc-fosfotransferasa y fosfodiéster-a-GlcNAcasa. En algunas realizaciones, "enzimas lisosómicas altamente fosforiladas” significa una enzima lisosómica que contiene desde aproximadamente el 6 % a aproximadamente el 100 % de oligosacáridos bis fosforilados. En algunas realizaciones, una enzima lisosómica altamente fosforilada es una AGA de ser humano altamente fosforilada. En algunas realizaciones, una AGA de ser humano altamente fosforilada contiene cantidades aumentadas de restos manosa-6-fosfato (M6P) por molécula, en comparación con una AGA de ser humano de origen natural. En algunas realizaciones, una AGA de ser humano altamente fosforilada puede contener, en promedio, por lo menos 2, 3, 4, 5, o 6 restos M6P por molécula. Se describen ejemplos de AGA de ser humano altamente fosforilada y de otras enzimas lisosómicas, en las patentes de Estados Unidos n.° 7.371.366, 7.135.322, 7.067.127, 6.905.856, 6.861.242, 6.828.135, 6.800.472, 6.770.468, 6.670.165, 6.642.038, 6.537.785, y 6.534.300. En algunas realizaciones, las enzimas lisosómicas altamente fosforiladas se producen mediante líneas celulares deficientes en acidificación endosómica (por ejemplo, grupo de complementación END3 obtenido de CHO-K1). Se describen ejemplos adicionales en el documento WO/2005/077093.
En algunas realizaciones, la presente invención se puede utilizar para formular enzimas lisosómicas subglucosiladas. Como se utiliza en el presente documento, "enzimas lisosómicas subglucosiladas" se refiere a una enzima en la que una o más de las estructuras de carbohidratos (por ejemplo, restos M6P) que normalmente estarían presentes en una enzima de origen natural se han omitido, eliminado, modificado, o enmascarado. Normalmente, las enzimas lisosómicas subglucosiladas tienen semivida in vivo extendida. Las enzimas lisosómicas subglucosiladas se pueden producir en un hospedador (por ejemplo, bacteria o levadura) que no glucosila proteínas como lo hacen las células de mamífero convencionales (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO)). Por ejemplo, las proteínas que produce la célula hospedadora pueden carecer de restos manosa, fucosa, y/o N-acetilglucosamina terminales, los cuales reconoce el receptor de manosa, o pueden estar completamente subglicosilados. En algunas realizaciones, las enzimas lisosómicas subglucosiladas se pueden producir en células de mamífero o en otros hospedadores, pero se las trata de forma química o enzimática para eliminar uno o más restos de carbohidratos (por ejemplo, uno o más restos M6P) o para modificar o enmascarar uno o más restos de carbohidratos. Tales enzimas tratadas de forma química o enzimática también se denominan enzimas lisosómicas desglucosiladas. En algunas realizaciones, se eliminan uno o más sitios de glucosilación potenciales mediante mutación del ácido nucleico que codifica una enzima lisosómica, reduciendo de este modo la glucosilación de la enzima cuando se sintetiza en una célula de mamífero o en otra célula que glucosila proteínas. En algunas realizaciones, las enzimas lisosómicas se pueden producir utilizando un péptido señal secretor (por ejemplo, un péptido señal del IGF-II) de forma tal que los niveles de glucosilación de las enzimas se reducen y/o modifican. Los ejemplos de enzimas lisosómicas subglucosiladas o desglucosiladas se describen en la patente de Estados Unidos n.° 7.629.309 y en las publicaciones de Estados Unidos 20090041741 y 20040248262.
Producción de enzima
Las enzimas adecuadas para la presente invención se pueden producir en cualesquier célula de mamífero o tipo celular susceptibles de cultivo celular y de expresión de polipéptidos, tales como, por ejemplo, células 293 de riñón embrionario de ser humano (HEK), de ovario de hámster chino (CHO), de riñón de mono (COS), HT1080, C10, HeLa, de riñón de hámster lactante (BHK), 3T3, C127, CV-1, HaK, Ns/O, y L-929. Los ejemplos no limitantes específicos incluyen, pero sin limitación, la línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/1, ECACC n.° 85110503); retinoblastos de ser humano (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea CV1de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario de ser humano (células 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células de riñón de hámster lactante (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (c Ho , Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma de cuello uterino de ser humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón de perro (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata parda (BRL 3A, a Tc C CRL 1442); células de pulmón de ser humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado de ser humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mater et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma de ser humano (Hep G2). En algunas realizaciones, las enzimas se producen en células c Ho . En algunas realizaciones, las enzimas se producen en células obtenidas de CHO tales como líneas celulares deficientes en acidificación endosómica (por ejemplo, grupo de complementación END3 obtenido de C'1-10-K.1).
Las enzimas también se pueden expresar en una diversidad de células hospedadoras que no son de mamífero tales como, por ejemplo, de insecto, (por ejemplo, Sf-9, Sf-21, Hi5), vegetales (por ejemplo, Leguminosa, cereal, o tabaco), de levadura (por ejemplo, S. cerivisae, P. pastoris), procariotas (por ejemplo, E. coli, B. subtilis y otros Bacillus spp., Pseudomonas spp., Streptomyces spp.), o de hongos.
En algunas realizaciones, se puede producir en células deficientes en furina una proteína lisosómica con o sin una etiqueta DLIG resistente a furina. Como se utiliza en el presente documento, la expresión "células deficientes en furina" se refiere a cualquiera de las células cuya actividad de furina proteasa está inhibida, reducida o eliminada.
Las células deficientes en furina incluyen a células de mamífero y que no son de mamífero que no producen furina o producen cantidades reducidas o proteasa furina defectuosa. Las células deficientes en furina ejemplares que se conocen y están disponibles para el experto incluyen, pero sin limitación, las células FD11 (Gordon et al. (1997) Infection and Immunity 65 (8): 33703375), y las células mutantes descritas en Moehring y Moehring (1983) Infection and Immunity 41 (3): 998 1009. Como alternativa, se puede obtener una célula deficiente en furina exponiendo a tratamiento de mutagénesis a las células de mamífero y que no son de mamífero descritas anteriormente, por ejemplo, irradiación, bromuro de etidio, bromouridina (BrdU) y otros, preferentemente mutagénesis química, y más preferente mutagénesis por metanosulfonato de etilo, recuperando las células que sobreviven al tratamiento y seleccionando las células que se encuentran como resistentes a la toxicidad de la exotoxina A de Pseudomonas (véase Moehring y Moehring (1983) Infection and Immunity 41 (3): 9981009).
En otras realizaciones, mamíferos que no son ser humano transgénicos han mostrado producir en su leche enzimas lisosómicas. Tales mamíferos que no son ser humanos transgénicos pueden incluir ratones, conejos, cabras, ovejas, porcinos o bovinos. Véanse las patentes de Estados Unidos n.° 6.118.045 y 7.351.410.
Formulaciones para enzimas lisosómicas
La presente invención proporciona formulaciones de enzimas lisosómicas que conservan o potencian la estabilidad y/o eficacia de las proteínas. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona formulaciones de liofilización para enzimas lisosómicas. La liofilización, o secado por congelación, es una técnica empleada comúnmente para conservar proteínas, que sirve para eliminar agua de la preparación de proteína de interés. La liofilización es un procedimiento mediante el cual primero se congela el material a desecar y después se elimina el hielo o el disolvente congelado mediante sublimación en un entorno al vacío. La presente invención sirve para proteger a las enzimas de los estreses por congelación y deshidratación y conservar o potenciar la estabilidad de la proteína durante el secado por congelación, y/o conservar o mejorar la estabilidad del producto liofilizado durante el almacenamiento.
Debido a las variaciones en la temperatura y la presión a través del procedimiento de liofilización, se necesita una elección apropiada de excipientes o de otros componentes tales como estabilizadores, agentes tamponadores, agentes formadores de volumen, y tensioactivos para evitar la degradación de la enzima (por ejemplo, agregación, desamidación, y/u oxidación de proteínas) durante el secado por congelación y el almacenamiento.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona formulaciones en una forma líquida. Las formulaciones líquidas de la presente invención incluyen, formulaciones de preliofilización, formulaciones reconstituidas (por ejemplo, formulaciones reconstituidas a partir de polvos liofilizados), y formulaciones líquidas adecuadas para el almacenamiento prolongado en un estado líquido o congelado.
Las formulaciones de acuerdo con la presente invención pueden contener uno o más componentes descritos a continuación
Concentración de enzima
Las formulaciones de acuerdo con la invención pueden contener una enzima lisosómica a diversas concentraciones. En algunas realizaciones, las formulaciones de acuerdo con la invención pueden contener una enzima lisosómica (por ejemplo, AGA de ser humano recombinante) en una concentración en el intervalo desde aproximadamente 0,1 mg/ml a 100 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 0,1 mg/ml a 80 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 60 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 50 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 40 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 30 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 20 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 60 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 50 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 40 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 30 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 20 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 15 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 10 mg/ml, aproximadamente 0,1 mg/ml a 5 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a 10 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a 20 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a 40 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml a 100 mg/ml, aproximadamente 5 mg/ml a 50 mg/ml, o aproximadamente 5 mg/ml a 25 mg/ml). En algunas realizaciones, las formulaciones de acuerdo con la invención pueden contener una enzima lisosómica (por ejemplo, AGA de ser humano recombinante) en una concentración de aproximadamente 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, o 100 mg/ml.
Tensioactivos
En algunas realizaciones, las formulaciones de acuerdo con la presente invención contienen un tensioactivo. En particular, las formulaciones que proporciona la presente invención contienen como tensioactivo un poloxámero. Normalmente, los poloxámeros son copolímeros tribloque no iónicos. Los poloxámeros normalmente tienen una estructura anfífila que consta de un bloque hidrófobo central entre dos bloques hidrófilos. En general, el bloque hidrófobo central es polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) ("PPO") y los dos bloques hidrófilos son polioxietileno (poli(óxido de etileno)) ("PEO"). Se muestra como sigue una estructura general para un poloxámero ejemplar:
Se conoce también a los poloxámeros por el nombre comercial Pluronics® (fabricado por BASF). Los poloxámeros/Pluronics® están disponibles en diversas calidades que difieren en los pesos moleculares, las proporciones de bloques hidrófilos con respecto a los hidrófobos y las formas físicas, (es decir líquido, copos/sólidos o concentrado). Los productos de poloxámeros/Pluronics® ejemplares adecuados para la presente invención se muestran en la Tabla 2 a continuación.
T l 2 li l x m r Pl r ni m i i n ími
En algunas realizaciones, un poloxámero adecuado para la presente invención es Pluronic® F-68.
Se puede incluir un poloxámero en una formulación de la invención a diversas concentraciones. En algunas realizaciones, un poloxámero está presente en una concentración que varía aproximadamente entre el 0,001 % y el 1 % (por ejemplo, entre el 0,001 % y el 0,8 %, entre el 0,001 % y el 0,6 %, entre el 0,001 % y el 0,5 %, entre el 0,001 % y el 0,4 %, entre el 0,001 % y el 0,3 %, entre el 0,001 % y el 0,2 %, entre el 0,001 % y el 0,1 %, entre el 0,01 % y el 1 %, entre el 0,01 % y el 0,5 %, entre el 0,01 % y el 0,4 %, entre el 0,01 % y el 0,3 %, entre el 0,01 % y el 0,2 %, o entre el 0,01 % y el 0,1 %) en peso. En algunas realizaciones, está presente un poloxámero en una concentración de aproximadamente el 0,001 %, 0,01 %, 0,02 %, 0,04 %, 0,06 %, 0,08 %, 0,1 %, 0,12 %, 0,14 %, 0,16 %, 0,18 %, 0,2 %, 0,25 %, 0,3 %, 0,35 %, 0,4 %, 0,45 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, o 1,0 % en peso.
Agentes tamponadores
En algunas realizaciones, una formulación de la presente invención incluye una agente tamponador. Normalmente, las formulaciones de acuerdo con la invención es una solución de pH tamponado a un pH que varía desde aproximadamente 4-8 (por ejemplo, aproximadamente 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,2, 6,4, 6,5, 6,6, 6,8, 7,0, 7,5, u 8,0) y, en algunas realizaciones, desde aproximadamente 5-7. Los agentes tamponadores ejemplares adecuados para la invención incluyen, pero sin limitación, histidina, fosfato, tris(hidroximetil)aminometano ("Tris"), citrato, acetato, acetato de sodio, fosfato, succinato y otros ácidos orgánicos. Un agente tamponador puede estar presente en diversas concentraciones, que dependen, por ejemplo, del tampón y de la isotonicidad de la formulación deseada (por ejemplo, de la formulación reconstituida). En algunas realizaciones, un agente tamponador está presente en una concentración que varía entre aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, o entre aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 15 mM a aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM, o entre aproximadamente 25 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, un agente tamponador adecuado está presente en una concentración de aproximadamente 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 mM.
Agentes estabilizadores
En algunas realizaciones, las formulaciones de acuerdo con la invención pueden contener un agente estabilizador para proteger a la enzima. Un agente estabilizador también se denomina como un lioprotector. Normalmente, un agente estabilizador adecuado puede ser sacarosa, rafinosa, sorbitol, manitol, trehalosa, glicina, arginina, metionina o combinaciones de los mismos. En general, la cantidad de agente estabilizador o lioprotector en una formulación preliofilizada es tal que, después de la reconstitución, la formulación resultante será isotónica. Sin embargo, también pueden ser adecuadas las formulaciones reconstituidas hipertónicas. Además, la cantidad de lioprotector no debe ser demasiado baja de forma que después de la liofilización se produzca una cantidad inaceptable de degradación/agregación de la enzima. Cuando el lioprotector sea un azúcar (tal como sacarosa o trehalosa), las concentraciones del lioprotector ejemplares en la formulación preliofilizada pueden variar entre aproximadamente 10 mM a aproximadamente 400 mM (por ejemplo, desde aproximadamente 30 mM a aproximadamente 300 mM, y desde aproximadamente 50 mM a aproximadamente 100 mM), o como alternativa, desde el 0,5 % al 15 % (por ejemplo, desde el 1 % al 10 %, desde el 5 % al 15 %, desde el 5 % al 10 %) en peso. En algunas realizaciones, la proporción de la cantidad de masa del agente estabilizador y de la enzima es de aproximadamente 1:1. En otras realizaciones, la proporción de la cantidad de masa del agente estabilizador y de la enzima puede ser de aproximadamente 0,1:1, 0,2:1, 0,5:1, 2:1, 5:1, 10:1, o 20:1.
Agentes formadores de volumen
En algunas realizaciones, las formulaciones de acuerdo con la presente invención pueden incluir adicionalmente uno o más agentes formadores de volumen. Un “agente formador de volumen” es un compuesto que añade masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física de la torta liofilizada. Por ejemplo, un agente formador de volumen puede mejorar el aspecto de la torta liofilizada (por ejemplo, torta liofilizada esencialmente uniforme). Los agentes formadores de volumen adecuados incluyen, pero sin limitación, cloruro de sodio, lactosa, manitol, glicina, sacarosa, dextrano, trehalosa, almidón hidroxietílico, o combinaciones de los mismos. Las concentraciones ejemplares de los agentes formadores de volumen son desde aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 % (por ejemplo, 1,0 %, 1,5 %, 2,0 %, 2,5 %, 3,0 %, 3,5 %, 4,0 %, 4,5 %, 5,0 %, 5,5 %, 6,0 %, 6,5 %, 7,0 %, 7,5 %, 8,0 %, 8,5 %, 9,0 %, 9,5 %, y 10,0 %) en peso.
Tonicidad
En algunas realizaciones, las formulaciones de acuerdo con la presente invención contienen un agente de tonicidad para mantener isotónicas a las formulaciones de preliofilización o a las formulaciones reconstituidas. Normalmente, por “isotónico” se refiere a que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre de ser humano. Las formulaciones isotónicas en general tendrán una presión osmótica desde aproximadamente 240 mOsm/kg a aproximadamente 350 mOsm/kg. La isotonicidad se puede medir utilizando, por ejemplo, un osmómetro tipo de presión de vapor o de punto de congelación. Los agentes de isotonicidad ejemplares incluyen, pero sin limitación, glicina, sorbitol, manitol, cloruro de sodio, sacarosa, dextrosa, arginina y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los agentes de tonicidad adecuados pueden estar presentes en formulaciones preliofilizadas en una concentración desde aproximadamente el 0,01 - 5 % (por ejemplo, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 1,0, 1,25, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 4,0 o 5,0 %) en peso.
Se pueden incluir en una formulación de acuerdo con la presente invención, siempre y cuando no afecten de forma adversa las características deseadas de la formulación, otros vehículos, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables tales como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, pero sin limitación, agentes tamponadores adicionales; conservantes; codisolventes; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tales como EDTA; complejos metálicos (por ejemplo, complejos Zn-proteína); polímeros biodegradables tales como poliésteres; y/o contraiones formadores de sales tales como sodio.
Las formulaciones descritas en el presente documento pueden contener más de una proteína como sea apropiado para una indicación particular tratada, preferentemente aquellas con actividades complementarias que no afectan de forma adversa a la otra proteína.
Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo deben estar estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de, o a continuación de, la liofilización y la reconstitución.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona formulaciones “estables” para las enzimas lisosómicas descritas en el presente documento. Como se utiliza en el presente documento, una formulación “estable” es una en la que la enzima que contiene esencialmente conserva su estabilidad e integridad física y química durante la liofilización, almacenamiento, transporte e infusión. Como resultado, las formulaciones que la presente invención proporciona reducen o eliminan la formación de agregados de alto peso molecular, la degradación de proteínas durante el secado por congelación, el almacenamiento, el transporte y la infusión. En realizaciones particulares, una formulación estable que proporciona la presente invención reduce o elimina la precipitación de enzima durante el secado por congelación, almacenamiento, transporte e infusión. La precipitación de enzima se puede determinar por examen visual. Además, para medir la estabilidad de la enzima se pueden utilizar diversas técnicas analíticas para la medición de la estabilidad de proteínas. Véase, Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad se puede medir después del almacenamiento a una temperatura seleccionada (por ejemplo, 0 °C, 5 °C, 25 °C (temperatura ambiente), 30 °C, 40 °C) durante un periodo de tiempo seleccionado (por ejemplo, 2 semanas, 1 mes, 1,5 meses, 2 meses, 3, meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, etc.). Para la exploración rápida, la formulación se puede mantener a 40 °C desde 2 semanas hasta 1 mes, en cuyo tiempo se mide la estabilidad. Cuando la formulación es para almacenarse a 2-8 °C, en general la formulación debería ser estable a 25 °C (es decir, a temperatura ambiente) o 40 °C durante por lo menos 1 mes y/o estable a 2-8 °C durante por lo menos 3 meses, 6 meses, 1 año o 2 años. Cuando la formulación es para almacenarse a 30 °C, en general la formulación debería ser estable durante por lo menos 3 meses, 6 meses, 1 año o 2 años a 30 °C y/o estable a 40 °C durante por lo menos 2 semanas, 1 mes, 3 meses o 6 meses. En algunas realizaciones, el grado de agregación después de la liofilización y el almacenamiento se puede utilizar como un indicador de estabilidad de la proteína. Como se utiliza en el presente documento, la expresión “agregados de alto peso molecular ("APM")" se refiere a una asociación de por lo menos dos monómeros de proteína. Para los fines de la presente invención, un monómero se refiere a la unidad individual de cualquier forma biológicamente activa de la proteína de interés. La asociación puede
ser covalente, no covalente, de disulfuro, entrecruzamiento no reducible, o mediante otro mecanismo.
Por ejemplo, una formulación “estable” puede ser una en la que menos de aproximadamente el 10 % (por ejemplo, menos del 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %) y preferentemente menos de aproximadamente el 5 % (por ejemplo, menos del 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %) de la proteína está presente en la formulación como un agregado (también denominado como especies de alto peso molecular ("APM")). En algunas realizaciones, se puede medir la estabilidad mediante un aumento en la formación de agregados después de la liofilización y el almacenamiento de la formulación liofilizada. Por ejemplo, una formulación liofilizada “estable” puede ser una en la que el aumento de agregado en la formulación liofilizada es menor de aproximadamente el 5 % (por ejemplo, menor del 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %) y preferente menor de aproximadamente el 3 % (por ejemplo, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 %, 0,1 %), cuando la formulación liofilizada se almacena a 25 °C (es decir, a temperatura ambiente) o a 40 °C durante por lo menos 2 semanas, 1 mes, 3 meses o 6 meses, o a 2-8 °C durante por lo menos 3 meses, 6 meses, 1 año o 2 años. Las especies agregadas o de APM se pueden analizar utilizando métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC), HPLC de intercambio de cationes (CEX-HPLC), difracción de rayos X (XRD), calorimetría diferencial de barrido modulada (mDSC), HPLC de fase inversa (RP-HPLC), dispersión de luz multiángulo (MALS), fluorescencia, absorción ultravioleta, nefelometría, electroforesis capilar (EC), SDS-PAGE, y combinaciones de los mismos.
Kits
La presente invención también proporciona kits que contienen reactivos o formulaciones de acuerdo con la presente invención. En algunas realizaciones, un kit de acuerdo con la invención puede incluir un recipiente que contiene la mezcla liofilizada de una enzima lisosómica (por ejemplo, AGA de ser humano) y proporcionar instrucciones para su reconstitución y/o uso. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales (por ejemplo, viales de dos cámaras), bolsas (por ejemplo, bolsas iv), jeringas (tales como jeringas de dos cámaras) y tubos de ensayo. El recipiente puede estar formado de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene a la formulación liofilizada y la etiqueta sobre, o en asociación con el recipiente puede indicar instrucciones para la reconstitución y/o utilización. Por ejemplo, la etiqueta puede indicar que la formulación liofilizada se reconstituye hasta las concentraciones de proteína como se describe anteriormente. La etiqueta puede indicar adicionalmente que la formulación es útil para o se destina a, por ejemplo, administración intravenosa como un bolo o mediante infusión continua a lo largo de un periodo de tiempo, mediante las vías intramuscular, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, o intratecal. Un kit adecuado puede incluir adicionalmente un segundo recipiente que contenga un diluyente adecuado (por ejemplo, ABPI). Después de la mezcla del diluyente y la formulación liofilizada, la concentración de proteína final en la formulación reconstituida en general será de por lo menos aproximadamente 1 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, o 100 mg/ml).
Ejemplos
Ejemplo 1: exploración de tensioactivo
Los experimentos en este ejemplo se diseñaron como parte del estudio de preformulación para examinar la estabilidad de ZC-701 en diversas condiciones de formulación que incluyen pH, modificador de tonicidad, y tensioactivo.
ZC-701 es una proteína de fusión que contiene una etiqueta DLIG obtenida del IGF-II de ser humano (IGF-II A2-7) fusionado al extremo N de un fragmento de la AGA de ser humano (aminoácidos 70-952 de la AGA de ser humano). Hay un espaciador de tres aminoácidos (GAP) entre la etiqueta DLIG y el fragmento de AGA. La secuencia de aminoácidos de ZC-701 se muestra en la SEQ ID NO: 2.
ALCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPA
KSEGAPAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGA
QMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETEN
RLHFTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTT
VAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYG
SHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSV
VQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDL
DYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEG
LRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWI
DMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNL
YGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEI
LQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFS
EPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQL
LWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPIEALGSLPPPPAAPREPA1HSEG
QWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFW
DDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQ
VLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC (SEQ ID NO:2)
En este ejemplo, se examinaron los siguientes parámetros de formulación: (1) pH: 4,0, 5,0, 6,0, y 6,2; (2) Tampones: tampón acetato de sodio (pH 3,0-5,0) y tampón fosfato de sodio (pH 7,0-8,0), todos a una concentración de 10 mM; (3) Modificadores de tonicidad: cloruro de sodio (NaCl) 100 mM, cloruro de sodio (NaCl) 150 mM, sorbitol al 3,5 %, y sorbitol al 5,0 %; (4) Estabilizador: arginina 100 mM, EDTA 0,1 mM; (5) Tensioactivos: polisorbato 20, polisorbato 80, y Pluronic F-68; y (6) Concentraciones de producto: 5 y 15 mg/ml.
El volumen de llenado se fijó en aproximadamente 0,5 ml. En el presente estudio todos los candidatos de formulación se formularon mediante diálisis frente a cada formulación candidata.
Las formulaciones se probaron bajo las condiciones de estrés enumeradas en la Tabla 3.
Tabla 3. Condiciones de estrés eem lares
Para analizar los productos de degradación principales generados bajo los estreses, se utilizaron los ensayos indicadores de estabilidad SE-HPLC, RP-HPLC y SDS-PAGE.
Normalmente, el producto precipita cuando se introduce estrés por agitación. Como se describe a continuación, se observó que la adición en la formulación de Pluronic® F-68 como tensioactivo estabilizó el producto frente al estrés por agitación. Brevemente, el producto se sometió a agitación constante durante hasta 4 horas para comprender la estabilidad del producto bajo estrés por agitación y/o de corte. Se utilizó para este estudio el producto en la formulación a granel actual de fosfato de sodio 10 mM, NaCl 145,15 mM, KCl 2,33 mM, fosfato de potasio 2 mM, pH 7,2, lote CZ-701-B20-10 10,06 mg/ml. La Figura 1 proporciona una imagen de los viales del estudio de exploración de tensioactivos. La mezcla agitada sin tensioactivo (control ) precipitó, lo que sugiere que el producto precipita bajo estrés por agitación. La adición de cada uno de los tensioactivos probados, es decir, polisorbato 20 al 0,01 %, polisorbato 80 al 0,01 %, o Pluronic® F-68 (poloxámero 188) al 0,1 %, protegió al producto frente a la precipitación inducida por agitación. Basándose en el análisis por SE-HPLC (Figura 2), Pluronic® F-68 también previno la formación de cualquier agregado soluble.
A base del estudio de estrés por agitación con diversos tensioactivos, se seleccionó Pluronic F-68 como el tensioactivo para los estudios de formulación adicionales. Las formulaciones precisas probadas en este estudio se enumeran en la Tabla 4.
T l 4 F rm l i n m l r r n i i n r
Las formulaciones se expusieron a diversas condiciones de estrés (Tabla 3). Se observó que, por ejemplo, en condiciones iónicas, en ausencia de arginina, el producto fue sensible al estrés por congelación/descongelación. Como otro ejemplo, a pH 6 el producto fue sensible al estrés por luz UV. Cuando se incubó a 40 °C en el estudio de estabilidad acelerada, precipitaron todas las formulaciones excepto acetato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 %, Pluronic® F-68 al 0,1 %, pH 4,0. A temperaturas más bajas, 4 °C y -20 °C, la formulación acetato de sodio 10 mM, sorbitol al 5 %, Pluronic F-68 al 0,1 %, pH 4,0, fue la única formulación que no produjo agregados, como se caracterizó mediante SE-HPLC. Los resultados obtenidos a partir de este estudio sugieren que las formulaciones estables incluyen Pluronic® F-68 al 0,1 % a pH 4 con un modificador de la tonicidad no iónico.
Ejemplo 2. Formulación liofilizada para ZC-701
Los experimentos en este ejemplo se diseñaron para optimizar las formulaciones de liofilización para ZC-701. En particular, estos estudios proporcionan información acerca del efecto de la formulación sobre la estabilidad del producto. Por ejemplo, a través del estudio de degradación forzada con candidatos de formulación seleccionados, se abordaron los siguientes objetivos: (1) comprender los estreses a los que el producto es susceptible; (2) identificar los productos de degradación; (3) confirmar los ensayos de indicación de la estabilidad; y (4) comprender las condiciones de la formulación estable.
ZC-701 se formuló en diversas lioformulaciones basadas en citrato y fosfato. Se examinaron los siguientes parámetros de formulación: (1) Tampones: citrato (pH 6,0), o fosfato/citrato (pH 6,0); (2) Agentes formadores de volumen: glicina al 2 %, o manitol al 4 %. En todas las formulaciones probadas se utilizaron los siguientes parámetros: (3) Volumen de llenado: 0,5 ml; (4) pH: 6,0; (5) Tensioactivo: poloxámero 188; y (6) estabilizador: trehalosa al 1 %.
En este estudio todos los candidatos de formulación se formularon dializando frente a cada formulación candidata y las formulaciones ejemplares se muestran en la Tabla 5.
T l F rm l i n m l r Z - 1
Normalmente, un ciclo de liofilización se puede elegir a base de la integridad de la torta, alta temperatura de transición vítrea, contenido de humedad óptimo (< 1 %), reconstitución fácil y completa, y mínimo dolor asociado a la inyección (para una dosis de 1 mg), utilizando los siguientes ensayos: aspecto visual, pH, contenido de humedad (protocolo de integridad de biosolución), FTIR para análisis estructural (protocolo de integridad de biosolución), osmolalidad (protocolo de integridad de biosolución), calorimetría de barrido diferencial (protocolo de integridad de biosolución), SE-HPLC, SDS-PAGE.
Las formulaciones ejemplares (Tabla 5) se liofilizaron en viales de vidrio borosilicato de Tipo I con tapones de goma recubiertos con Flurotec®, con un volumen de llenado de 0,5 ml. Para secar las formulaciones se utilizó el ciclo de liofilización como se muestra en la Figura 3. Después del secado se formaron tortas firmes de buen aspecto (Figura 4). Sin embargo, el contenido de humedad fue mayor del 1 % en las tres formulaciones (Tabla 6). Esto puede deberse a la alta concentración de citrato en las formulaciones. La optimización de ciclo de liofilización debería reducir el contenido de humedad.
Tabla 6. Análisis de humedad resultados de osmolalidad
Se realizó la calorimetría de barrido diferencial de C6MT. La presencia de citrato en las formulaciones parecía enmascarar cualquiera de las señales de fusión eutéctica que podrían haberse producido a alrededor de -15 °C en el ensayo. Los intentos de desvitrificación mediante calentamiento de las muestras hasta - 15 °C desde -50 °C, enfriando otra vez a -50 °C y calentando a 4 °C, no mostraron diferencia en el flujo de calor (Figura 5). La temperatura de transición vítrea a -38 °C no pareció provocar ningún colapso de la torta después de la liofilización. Estudios de estrés
Para analizar los productos de degradación principales generados bajo los estreses, se utilizaron en este estudio los ensayos indicadores de estabilidad HPLC de exclusión por tamaño (SE-HPLC) y electroforesis en gel de poliacrilamida - dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Para la exclusión por tamaño (SE-HPLC), la fase móvil: solución salina tamponada con fosfato (p Bs ) 0,1 M, pH 7,2 NaCl 0,15 M; columna: Ts K-GEL G2000SWXL 300 X 7,8 mm ID de TOSOh Bioscience; caudal: 0,5 ml/min; carga de muestra: 50 pg/inyección. Para la electroforesis en gel de poliacrilamida - dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), tipo de gel: gel BisTris al 4-12 % NuPAGE Novex; tampón de desarrollo: tampón de desarrollo MOPS SDS 1X; reactivo de tinción: SimplyBlue SafeStain, Invitrogen; volumen de carga: 12 pl de estándar de PM Mark 12TM, Invitrogen; carga de muestra: 10 pg.
ZC-701 mostró muy poca degradación global a lo largo del periodo de tiempo de 16 semanas como se determinó mediante SE-HPLC (Figuras 6 y 7). Después de 16 semanas de almacenamiento a 4 °C y 25 °C, y de comparar con un estándar de referencia congelado, las formulaciones no mostraron cambio cuando se analizaron mediante SDS
PAGE (Figura 8). No se observó cambio significativo cuando las formulaciones reconstituidas se almacenaron durante dos días a 4 °C (Figura 9). Como se describe anteriormente, los contenidos inicial y final de humedad fueron alto debido al uso de citrato en el tampón de formulación (Tabla 6). La elección de citrato también dio como resultado la alta osmolalidad (Tabla 6). Los perfiles de estabilidad para cada una de las formulaciones probadas se ilustran en la Figura 10.
Como se muestra a continuación en la Tabla 8, los estudios de estabilidad indicaron que, en las formulaciones liofilizadas, la formulación que contenía citrato 50 mM a pH 6,0, glicina al 2 %, trehalosa al 1 %, y Poloxámero 188 al 0,1 % fue ligeramente más estable que las otras dos condiciones después del almacenamiento a 4 °C y 25 °C. El SDS-PAGE no sugirió ninguna diferencia apreciable entre las formulaciones. No se observó degradación apreciable en esta formulación después de 16 semanas de almacenamiento a 4 °C y 25 °C. Las diferencias entre las tres formulaciones son pequeñas.
T l m ri l r l ili l n i f rm l i n m l r
continuación
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Ejemplo 3. Estabilidad de ZC-701
La estabilidad de ZC-701A se examinó a lo largo del transcurso de un estudio de tres meses. El artículo de prueba liofilizado ZC-701-GMP1 en el tampón de formulación actual (citrato 50 mM, manitol al 4 %, trehalosa al 1 % y Pluronic F-68 al 0,1 %, pH 6,0) se comparó con la muestra de control ZC-701-B18-10 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 6,2. Las muestras se incubaron a 4 °C, a temperatura ambiente, y a -80 °C durante hasta 92 días. La estabilidad de ZC-701 se evaluó en términos de concentración de proteína, actividad enzimática de AGA, pureza del monómero, y unión al receptor CI-MPR.
ZC-701-GMP1 fue estable en el tampón de formulación a 4 °C y a -80 °C durante los tres meses de estudio completos. ZC-701-B18-10 en PBS pH 6,2 fue también estable excepto por un aumento en la multimerización del compuesto, que se produjo a 4 °C. En tres meses a 4 °C la cantidad de multímero de ZC-701-B18-10 aumentó desde <1 % hasta por encima del 25 %. Por el contrario, la cantidad de ZC-701-GMP1 multimérica se mantuvo a <1 % durante el estudio completo. Esto demuestra que el tampón de formulación actual proporciona estabilidad del compuesto mejorada en comparación con PBS pH 6,2.
Brevemente, material de ZC-701-GMP1 del lote 106A12-017782 del fármaco a granel GMP se liofilizó en una ejecución de diseño del ciclo de liofilización de llenado/acabado en Altea (ejecución de diseño 4ER-067). Se reconstituyeron viales de ZC-701-GMP1 que contenían 35 mg de ZC-701 en tampón de formulación con 6,8 ml de
agua, se prepararon alícuotas, y se almacenaron a 4 °C, a temperatura ambiente (TA), o a -80 °C. La muestra de control ZC-701-B18-10 formulada en PBS pH 6,2, se descongeló del almacenamiento a -80 °C.
Las muestras a TA se analizaron en el día 0 y en el día 1. Se analizaron otras mezclas en los días 0, 1, 7, 28 y 92. Los análisis incluyeron la determinación de la concentración de proteína por espectrometría A280, análisis de actividad enzimática de PNP de AGA, análisis de SDS-PAGE reductor y no reductor, análisis de cromatografía por exclusión de tamaño, análisis de PNGasa F / SDS-PAGE, y unión al receptor mediante un ensayo de unión competitiva al receptor de IGF-II. También se controló la actividad enzimática en un experimento de congelación/descongelación.
Determinación de la concentración de proteína
Como se muestra en la Figura 11 y en la Tabla 9, las concentraciones de proteína de todas las muestras fueron estables a lo largo de los 92 días del transcurso del estudio. La concentración de proteína de la muestra se determinó por medición A280 utilizando un coeficiente de extensión de 1,59 cirr1 (mg/ml)’1.
T l M i i n m l r l n nr i n r ín l m r r r m rí A280
Actividad enzimática de AGA
Como se muestra en la Figura 12 y en la Tabla 10, que muestran resultados de los análisis de la actividad enzimática de PNP de AGA, las muestras fueron estables a lo largo de los 92 días del transcurso del estudio. Definición de unidad: enzima necesaria para hidrolizar 1 nmol de para-nitrofenol alfa-glucósido (Sigma n.° N1377) en una hora a 37 °C en una reacción que contiene sustrato 10 mM y acetato de sodio 100 mM pH 4,2. Las reacciones de 50 |jl se detuvieron con 300 j l de carbonato de sodio 100 mM. Se detectó el sustrato hidrolizado a 405 nm y se comparó con una curva estándar de p-nitrofenol (Sigma n.° N7660). Para producir la actividad enzimática específica las unidades de PNP se dividieron por las concentraciones de proteína mostradas en la Tabla 9.
T l 1 M i i n m l r l i i nzim i A A r n P P
Como se describe anteriormente, se controló la actividad enzimática de AGA en muestras de congelación/ descongelación. La actividad de AGA de ZC-701 GMP1 se midió mediante ensayo de PNP en las muestras que se sometieron a hasta 5 ciclos de congelación instantánea en nitrógeno líquido, seguido de descongelación en agua a temperatura ambiente. Como se muestra en la Figura 13, el compuesto es resistente a 5 congelaciones/descongelaciones.
Análisis de SDS-PAGE
Como se muestra en la Figura 14, las muestras de ZC-701-GMP1 almacenadas a 4 °C y a -80 °C fueron prácticamente indistinguibles mediante SDS-PAGE a lo largo del transcurso de 92 días. Las muestras de ZC-701-B18-10 a -80 °C también fueron estables, sin embargo, las muestras a 4 °C presentaron a lo largo del tiempo un aumento del multímero de alto peso molecular de ZC-701.
Análisis por cromatografía de exclusión por tamaño
Como se muestra en la Figura 15 y en la Tabla 11, el análisis por SEC (sigla del inglés size exclusion chromatography, cromatografía por exclusión por tamaño) mostró que la fracción del compuesto ZC-701 presente como forma monomérica fue constante durante el estudio con la excepción de ZC-701-B18-10 incubada a 4 °C. A lo largo del transcurso de tres meses, aproximadamente el 25 % de esta muestra se convirtió en la forma multimérica de alto peso molecular. El porcentaje de ZC-701 presente como una forma monomérica se determinó cargando 33 |jg de ZC-701 en solución salina tamponada con fosfato pH 6,2 a temperatura ambiente a 0,25 ml/min en una columna TSKgel G2000 SWxl de 30 cm x 7,8 mm y una columna TSKgel G3000 SWxl de 30 cm x 7,8 mm conectadas en serie. El nivel de multimerización se define como la fracción % que es más grande que el monómero ZC-701.
Tabla 11. L m r ili r r n m i n r m r fí x l i n r m ño analítica
Análisis de PNGasa F / SDS-PAGE
Normalmente, aproximadamente el 20-30 % de las moléculas de ZC-701 se escinden mediante furina durante la producción en cultivo tisular. La enzima furina escinde el esqueleto polipeptídico de la molécula de ZC-701, pero las dos porciones resultantes de la proteína permanecen asociadas a través de uniones disulfuro, manteniendo la funcionalidad de la proteína. Los métodos de análisis por PNasa F /SDS-PAGE pueden resolver y cuantificar las siguientes tres especies de proteína: Intacta: moléculas de ZC-701 que la furina no ha escindido; Escindida: moléculas de ZC-701 con un esqueleto que ha escindido la furina, pero que conservan ambas porciones de la molécula escindida a través de uniones disulfuro, y también conservan funcionalidad completa; y Truncada: moléculas de ZC-701 que ha escindido la furina y han perdido la proteína N terminal de la molécula. En general la proteína truncada no es funcional.
Para el tratamiento de PNGasa F, se diluyeron 2 jg de la proteína de muestra en tampón PNGasa 1X (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, SDS al 0,1 %) y se desnaturalizaron a 95 °C durante cinco minutos. Se añadió Triton X-100 al 0,75 % seguido de 1 j l de PNGasa F (New England Biolabs n°. P0704). Las muestras se incubaron a 37 °C durante una noche. Después, las mezclas se separaron por SDS-PAGE en geles Bis-Tris al 4-12 % (Bio-Rad) a 200 voltios durante 120 minutos en presencia o ausencia de DTT 100 mM. Los geles se trataron con tinción de Imperial Blue, como describía el fabricante (Pierce). La cantidad de cada una de las especies de proteína se cuantificó utilizando el programa informático UN-SCAN-IT (Silk Scientific).
Los resultados del análisis de PNGasa F / SDS-PAGE sobre las muestras de estabilidad se muestran en la Figura 16. Las cantidades de las especies proteicas intacta y escindida permanecen relativamente constantes para todas las muestras. A lo largo del estudio de tres meses la cantidad de ZC-701 inactiva truncada es insignificante. Análisis de unión competitiva al receptor de IGF-II
La afinidad de las muestras de ZC-701 por el receptor de IGF-II (IGF-IIR) se examinó en experimentos de unión competitiva realizados en un formato de placa de 96 pocillos. Se recubrió IGF-IIR en tampón de recubrimiento (tampón carbonato 0,05 M, pH 9,6) a una concentración de 0,5 jg/pocillo, a temperatura ambiente durante una noche en placas blancas Reacti-bind (Pierce, n.° de cat. 437111). Las placas se lavaron con tampón de lavado (solución salina tamponada con fosfato más Tween-20 al 0,05 %), después se bloquearon durante 1 hora en tampón de bloqueo Super (Pierce, n.° de cat. 37516). Después de otro lavado de la placa, se añadió a los pocillos ligando IGF-II biotinilado (Cell Sciences) 8 nM. Junto con el ligando IGF-II biotinilado, los pocillos también contenían diluciones en serie de las muestras de proteína ZC-701 o ligando IGF-II no biotinilado, para actuar como inhibidores de unión para el ligando IGF-II biotinilado. Después de una incubación de dos horas con balanceo, las placas se lavaron e IGF-II biotinilada unida se detectó con una incubación de estreptavidina-HRP (R&D, n.° de cat. 890803, dilución 1:200 en tampón de bloqueo, 30 minutos), seguida de una incubación con sustrato quimioluminiscente Super Elisa Pico (Pierce, n.° de cat. 37070, 5 minutos). La señal quimioluminiscente se midió a 425 nm, y se
calcularon para cada muestra los valores de la CI50.
La Tabla 12 muestra los valores de las CI50 para las muestras de estabilidad en el ensayo de unión competitiva de IGF-II. Las variaciones diarias del ensayo son evidentes a partir de los valores de la muestra de control de IGF-II no biotinilada. No se observó para las muestras un aumento general de los valores de la CI50, lo que indica que las muestras conservaron la actividad de unión al receptor IGF-II.
Tabla 12. Determinación de los valores de las CI50 para las muestras de estabilidad mediante un ensayo de unión
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Tomados juntos, estos datos demuestran que ZC-701-GMP1 reconstituida en tampón de formulación en una concentración de 4,5 mg/ml, es estable en solución a 4 °C y a -80 °C durante por lo menos 92 días. ZC-701-GMP1 es también estable durante 24 horas a temperatura ambiente. ZC-701-B18-10 en PBS pH 6,2 también fue estable excepto por un aumento en la multimerización del compuesto, que se produjo a 4 °C. En tres meses a 4 °C, la cantidad de multímero de ZC-701-B18-10 aumentó desde <1 % hasta por encima del 25 %. Por el contrario, la cantidad de ZC-701-GMP1 multimérica se mantuvo a <1 % durante el estudio completo. Esto demuestra que el tampón de formulación actual proporciona estabilidad del compuesto mejorada en comparación con PBS pH 6,2. Ejemplo 4. La estabilidad de ZC-701 en solución salina
La estabilidad de ZC-701 en solución salina se midió en condiciones que imitaban la preparación del compuesto para la infusión del paciente. Se añadieron 6,8 ml de agua a un vial de ZC-701-GMP1 liofilizada (Vial 3, n.° de Lot. 1-FIN-0692, formulada en citrato 50 mM, pH 6,0, manitol al 4 %, trehalosa al 1 %, y pluronic F-68 al 0,1 %). La concentración de proteína del material de ZC-701 reconstituido se determinó que era de 4,7 mg/ml mediante medición A280 (coeficiente de extinción = 1,59 cirr1 (mg/ml)'1). El material se diluyó a 2 mg/ml o a 4 mg/ml a temperatura ambiente en solución salina al 0,9 % (NaCl 9 g/l en agua), después se incubó a temperatura ambiente (~21 °C) durante hasta 24 horas. Al final de los puntos de tiempo 0, 1, 2, 4, 8, 21 y 24 horas, las alícuotas se retiraron y se almacenaron en hielo. El análisis incluyó la determinación de la concentración de proteína mediante espectrometría A280, ensayo enzimático de PNP de AGA, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y SDS-PAGE.
Determinación de la concentración de proteína
Se centrifugaron alícuotas de cada punto de tiempo a 4 °C a 15.000 g, durante un minuto y se examinó la presencia de precipitado de forma visual. No se observó precipitación de la muestra en ningún momento durante el estudio. La concentración de proteína de muestra se determinó por medición de A280 utilizando un coeficiente de extinción de 1,59 cm-1 (mg/ml)-1 (Figura 17). La concentración de proteína fue estable a lo largo del transcurso de 24 horas. Actividad enzimática de AGA
Los ensayos enzimáticos de PNP de AGA se realizaron sobre todas las muestras de los puntos de tiempo (Figura 18). Para los fines de este ensayo, una (1) unidad enzimática se define como la enzima necesaria para hidrolizar 1 nmol de para-nitrofenol alfa-glucósido (Sigma n.° N1377) en una hora a 37 °C, en una reacción que contiene sustrato 10 mM y acetato de sodio 100 mM pH 4,2. Las reacciones de 50 pl se detuvieron con 300 pl de carbonato de sodio 100 mM. El sustrato hidrolizado se detectó a 405 nm y se comparó con una curva estándar de p-nitrofenol (Sigma n.° N7660). Como se muestra en la Figura 18, la actividad enzimática de ZC-701 diluida en solución salina fue estable a lo largo del transcurso de 24 horas.
Análisis por cromatografía de exclusión por tamaño
También se analizaron las muestras de los puntos de tiempo 0, 2, 4 y 21 horas por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Tabla 13). Brevemente, el porcentaje de ZC-701 presente en una forma monomérica se determinó cargando 33 |jg de ZC-701 en solución salina tamponada con fosfato pH 7,2 a temperatura ambiente, a 0,2 ml/min en una columna TSKgel G2000 SWxl de 30 cm x 7,8 mm y una columna TSKgel G3000 SWxl de 30 cm x 7,8 mm conectadas en serie. El nivel de multimerización se definió como el % de fracción más grande que el monómero de ZC-701. Como se muestra de la Tabla 11, los niveles de monómero de las muestras fueron estables a lo largo del transcurso de 21 horas.
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Análisis por SDS-PAGE
Se analizaron las muestras de los puntos de tiempo 0, 8, 21 y 24 horas mediante SDS-PAGE reductor y no reductor (Figura 19). Las muestras diluidas en solución salina para hasta 24 horas fueron indistinguibles de las muestras de control.
Los experimentos anteriores muestran que ZC-701 formulada a aproximadamente 5 mg/ml en citrato 50 mM, pH 6,0, manitol al 4 %, trehalosa al 1 %, y Pluronic® F-68 al 0,1 % produce un compuesto que es estable durante hasta 24 horas cuando se diluye en solución salina a concentraciones de 2 mg/ml o de 4 mg/ml. Esta dilución en solución salina mimetiza las condiciones adecuadas para la preparación de ZC-701 para la infusión del paciente.
Ejemplo 5. Datos analíticos para la formulación de ZC-701
Después del almacenamiento durante 12 meses a 2-8 °C, se analizó ZC-701 (n.° lot. 1-FIN-0692) liofilizada del tampón de formulación (citrato 50 mM, manitol al 4 %, trehalosa al 1 % y Pluronic® F-68 al 0,1 %, pH 6,0). Como se muestra a continuación en la Tabla 14, los productos se analizaron a base de su aspecto, disolución, pH, contenido de humedad, pureza, potencia, y fuerza. Los atributos del producto para el almacenamiento a 2-8 °C estaban dentro de un intervalo aceptable y fueron similares a los atributos del producto en el momento de su producción.
T l 14 m ri l n líi Z - 1 m l r
Equivalentes
Lo anterior ha sido una descripción de determinadas realizaciones no limitantes de la invención. Los expertos en la materia reconocerán, o podrán determinar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden hacer diversos cambios y modificaciones en la presente descripción sin apartarse del espíritu o alcance de la presente invención, como se define en las siguientes reivindicaciones.
En los artículos de las reivindicaciones tales como “un”, “una”, y “el/la/los/las”, pueden significar uno o más que uno a menos que se indique otra cosa o sea evidente otra cosa a partir del contexto. Las reivindicaciones o las descripciones que incluyan “o” entre uno o más miembros de un grupo, se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, son empleados en, o son de otra forma relevantes para un producto o procedimiento dado, a menos que se indique lo contrario o sea evidente otra cosa a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en, o de otra forma es relevante para un producto o procedimiento dado. La invención también incluye realizaciones en las que más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o de otra forma son relevantes para un producto o procedimiento dado. Además, debe comprenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones, y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, clausulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones o de las partes relevantes de la descripción se introducen en otra reivindicación. Por ejemplo, cualquier reivindicación que es dependiente de otra reivindicación puede modificarse para incluir una o más limitaciones encontradas en cualquier otra reivindicación que sea dependiente de la misma reivindicación de base. Además, cuando las reivindicaciones detallan una composición, debe comprenderse que se incluyen los métodos de uso de la composición para cualquiera de los fines divulgados en el presente documento, y están incluidos los métodos para preparar la composición de acuerdo con cualquiera de los métodos de preparación divulgados en el presente documento u otros métodos conocidos en la técnica, a menos que se indique otra cosa o que fuese evidente para un experto en la materia que pueda presentarse una contradicción o inconsistencia. Además, la invención abarca composiciones hechas de acuerdo con cualquiera de los métodos para preparar composiciones descritos en el presente documento.
En donde los elementos se presenten como listados, por ejemplo, en el formato de grupo Markush, debe comprenderse que también se divulga cada subgrupo de los elementos, y cualquier elemento se puede eliminar del grupo. Debe también indicarse que la expresión “que comprende” pretende ser abierta y permite la inclusión de elementos o etapas adicionales. Debería comprenderse que, en general, en donde la invención, o aspectos de la invención, hagan referencia como que comprenden elementos, características, etapas, etc. particulares, determinadas realizaciones de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, tales elementos, características, etapas, etc. Para fines de simplicidad, esas realizaciones no se han indicado de forma específica in haec verba en el presente documento. Por lo tanto, para cada realización de la invención que comprenda uno o más elementos, características, etapas, etc., la invención también proporciona realizaciones que consisten o consisten esencialmente en esos elementos, características, etapas, etc.
Cuando se proporcionen intervalos, se incluyen criterios de valoración. Además, debe comprenderse que a menos que se indique otra cosa o que sea evidente otra cosa a partir del contexto y/o de la comprensión de un experto en la materia, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor específico dentro de los intervalos establecidos en las distintas realizaciones de la invención, hasta el décimo de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. También debe comprenderse que a menos que se indique otra cosa o que sea evidente otra cosa a partir del contexto y/o de la comprensión de un experto en la materia, los valores expresados como intervalos pueden asumir cualquier subintervalo dentro del intervalo dado, en el que los criterios de valoración del subintervalo se expresan en el mismo grado de precisión que el décimo de la unidad del límite inferior del intervalo.
Además, debe comprenderse que cualquier realización particular de la presente invención puede excluirse explícitamente de una cualquiera o más de las reivindicaciones. Cualquier realización, elemento, característica, aplicación, o aspecto de las composiciones y/o métodos de la invención, se pueden excluir de una cualquiera o más de las reivindicaciones. Para fines de brevedad, todas las realizaciones en las que uno o más elementos, características, fines, o aspectos se excluyan, no está indicado de forma explícita en el presente documento.
La invención también proporciona los siguientes aspectos y realizaciones:
1. Una composición farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Pompe que comprende una alfa glucosidasa ácida y un poloxámero.
2. La composición farmacéutica de 1, en la que el poloxámero es Pluronic® F-68.
3. La composición farmacéutica de 1 o 2, en la que el poloxámero está en una concentración que varía entre el 0,001 % y el 0,2 %.
4. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que el poloxámero está en una concentración del 0,1 %.
5. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que el poloxámero está en una concentración del 0,05 %.
6. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, que comprende adicionalmente un agente tamponador.
7. La composición farmacéutica de 5, en la que el agente tamponador se selecciona del grupo que consiste en histidina, acetato de sodio, citrato, fosfato, succinato, Tris y combinaciones de los mismos.
8. La composición farmacéutica de 5 o 6, en la que el agente tamponador está a una concentración que varía entre aproximadamente 25 mM y 50 mM.
9. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, que comprende adicionalmente un agente estabilizador.
10. La composición farmacéutica de 8, en la que el agente estabilizador se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, arginina, sorbitol, manitol, glicina, trehalosa y combinaciones de los mismos.
11. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, que comprende adicionalmente un modificador de la tonicidad.
12. La composición farmacéutica de 10, en la que el modificador de la tonicidad se selecciona del grupo que consiste en glicina, sorbitol, sacarosa, manitol, cloruro de sodio, dextrosa, arginina y combinaciones de los mismos.
13. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los anteriores, que comprende adicionalmente un agente formador de volumen.
14. La composición farmacéutica de 12, en la que el agente formador de volumen se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, manitol, glicina, cloruro de sodio, dextrano, trehalosa y combinaciones de los mismos. 15. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que la composición tiene un pH que varía de aproximadamente 4,0 a 7,0.
16. La composición farmacéutica de 14, en la que el pH es de aproximadamente 6,0.
17. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que la composición farmacéutica está en una forma adecuada para administración parenteral.
18. La composición farmacéutica de uno cualquiera de 1-16, en la que la composición farmacéutica es una mezcla liofilizada.
19. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que la alfa glucosidasa ácida es una alfa glucosidasa ácida (AGA) de ser humano recombinante.
20. La composición farmacéutica de 19, en la que la AGA de ser humano recombinante se produce a partir de células CHO.
21. La composición farmacéutica de 19, en la que la AGA de ser humano recombinante tiene niveles de glucosilación modificados en comparación con la a Ga de ser humano de origen natural.
22. La composición farmacéutica de 21, en la que la AGA de ser humano recombinante contiene un aumento de manosa-6-fosfatos en comparación con la AGA de ser humano de origen natural.
23. La composición farmacéutica de uno cualquiera de los puntos precedentes, en la que la alfa glucosidasa ácida es una proteína de fusión que comprende AGA humana o una variante funcional de la misma.
24. La composición farmacéutica de 23, en la que la proteína de fusión comprende adicionalmente un péptido de dirección lisosómica.
25. La composición farmacéutica de 24, en la que el péptido de dirección lisosómica tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 70 % idéntica a IGF-II de ser humano maduro (SEQ ID NO: 1).
26. La composición farmacéutica de 25, en la que el péptido de dirección lisosómica es una muteína de IGF-II y comprende una mutación dentro de una región que corresponde a los aminoácidos 34-40 de la SEQ ID NO: 1, de modo que la mutación suprime al menos un sitio de escisión de la proteasa furina.
27. La composición farmacéutica de 25, en la que el péptido de dirección lisosómica es una muteína de IGF-II que tiene una afinidad de unión disminuida por el receptor de IGF-I, con respecto a la afinidad del IGF-II de ser humano de origen natural por el receptor de IGF-I.
28. La composición farmacéutica de 25, en la que el péptido de dirección lisosómica es una muteína de IGF-II que tiene una afinidad de unión disminuida por el receptor de insulina, con respecto a la afinidad del IGF-II de ser humano de origen natural por el receptor de insulina.
29. La composición farmacéutica de 25, en la que la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
30. Una composición farmacéutica que comprende una alfa glucosidasa ácida en una formulación que contiene, aproximadamente, citrato de sodio 50 mM, manitol al 4 %, trehalosa al 1 % y Pluronic® F-68 al 0,1 %, a un pH de aproximadamente 6,0.
31. Una composición farmacéutica que comprende una mezcla liofilizada de alfa glucosidasa ácida, citrato de sodio, manitol, trehalosa y Pluronic® F-68.
32. La composición farmacéutica de 27 o 28, en la que la alfa glucosidasa ácida es una alfa glucosidasa ácida (AGA) de ser humano recombinante.
33. La composición farmacéutica de 32, en la que la AGA de ser humano recombinante se produce a partir de células CHO.
34. La composición farmacéutica de 32, en la que la AGA de ser humano recombinante tiene niveles de glucosilación modificados, en comparación con la AGA de ser humano de origen natural.
35. La composición farmacéutica de 32, en la que la AGA de ser humano recombinante contiene un aumento de 6-manosa fosfatos en comparación con la AGA de ser humano de origen natural.
36. La composición farmacéutica de 30 o 31, en la que la alfa glucosidasa ácida es una proteína de fusión que comprende AGA humana o una variante funcional de la misma
37. La composición farmacéutica de 36, en la que la proteína de fusión comprende adicionalmente un péptido de dirección lisosómica.
38. La composición farmacéutica de 37, en la que el péptido de direccionamiento lisosómico tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 70 % idéntica al IGF-II de ser humano maduro (SEQ ID NO: 1).
39. La composición farmacéutica de 38, en la que el péptido de dirección lisosómica es una muteína de IGF-II y comprende una mutación dentro de una región que corresponde a los aminoácidos 34-40 de la SEQ ID NO: 1, de
Claims (15)
1. Un kit que comprende (a) una formulación farmacéutica para el tratamiento de la enfermedad de Pompe, que comprende una alfa glucosidasa ácida y un poloxámero, y (b) instrucciones para la reconstitución y/o el uso de la formulación farmacéutica.
2. El kit de la reivindicación 1, en el que la formulación farmacéutica comprende adicionalmente un agente tamponador, opcionalmente seleccionado de histidina, fosfato, tris(hidroximetil)aminometano, citrato, acetato, acetato de sodio, succinato, otros ácidos orgánicos y combinaciones de los mismos.
3. El kit de la reivindicación 1 o 2, en el que la formulación farmacéutica comprende adicionalmente un agente formador de volumen, opcionalmente seleccionado de cloruro de sodio, lactosa, manitol, glicina, sacarosa, dextrano, trehalosa, almidón hidroxietílico y combinaciones de los mismos.
4. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la formulación farmacéutica comprende adicionalmente un agente estabilizante, opcionalmente seleccionado de sacarosa, rafinosa, sorbitol, manitol, trehalosa, glicina, arginina, metionina y combinaciones de los mismos.
5. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la formulación farmacéutica comprende adicionalmente un agente de tonicidad, opcionalmente seleccionado de glicina, sorbitol, manitol, cloruro de sodio, sacarosa, dextrosa, arginina y una combinación de los mismos.
6. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la alfa glucosidasa ácida es una alfa glucosidasa ácida (AGA) de ser humano recombinante.
7. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la alfa glucosidasa ácida es una proteína de fusión que comprende AGA humana o una variante funcional de la misma.
8. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la proteína de fusión comprende adicionalmente un péptido de dirección lisosómica, opcionalmente un péptido de dirección lisosómica que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 70 % idéntica al IGF-II de ser humano maduro (SEQ ID NO: 1), opcionalmente en el que el péptido de dirección lisosómica es una muteína de IGF-II que:
(a) comprende una mutación dentro de una región que corresponde a los aminoácidos 34-40 de la SEQ ID NO: 1, de modo que la mutación suprime al menos un sitio de escisión de la proteasa furina; y/o
(b) tiene una afinidad de unión disminuida por el receptor de IGF-I con respecto a la afinidad del IGF-II de ser humano de origen natural por el receptor de IGF-I; y/o
(c) tiene una afinidad de unión disminuida por el receptor de insulina con respecto a la afinidad del IGF-II de ser humano de origen natural por el receptor de insulina.
9. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en el que la proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
10. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el poloxámero es Pluronic® F-68.
11. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la formulación farmacéutica comprende una mezcla liofilizada de la alfa glucosidasa ácida.
12. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la mezcla liofilizada comprende adicionalmente citrato de sodio, manitol, trehalosa y Pluronic® F-68.
13. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende adicionalmente un diluyente, opcionalmente seleccionado de agua estéril, agua bacteriostática para inyección (ABPI), una solución de pH tamponado, solución salina estéril, solución de Ringer y solución de dextrosa.
14. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, que comprende instrucciones para una formulación reconstituida que tiene una concentración de proteína de al menos aproximadamente 1 mg/ml.
15. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende instrucciones para administrar la formulación farmacéutica por una vía seleccionada de intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraarticular, intrasinovial e intratecal.
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