KR20220146662A - 개선된 탄수화물을 가지는 고도로 강력한 산성 알파-글루코시다제 - Google Patents

개선된 탄수화물을 가지는 고도로 강력한 산성 알파-글루코시다제 Download PDF

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훙 도
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아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 적은 양의 비-인산화된 고 만노스 글리칸 및 복합 올리고사카라이드에서 적은 양의 말단 갈락토스와 함께, 종래 재조합 인간 알파 글루코시다제(rhGAA)에 비해 만노스-6-인산염(M6P) 또는 비스-M6P를 갖는 N-글리칸을 함유하는 보다 많은 양의 rhGAA로 이루어진 보다 최적화된 글리칸 조성물을 함유하는, CHO 세포로부터 유래된 rhGAA 조성물에 관한 것이다. 이러한 rhGAA를 함유하는 조성물 및 용법이 기술되어 있다.

Description

개선된 탄수화물을 가지는 고도로 강력한 산성 알파-글루코시다제{HIGHLY POTENT ACID ALPHA-GLUCOSIDASE WITH ENHANCED CARBOHYDRATES}
관련된 출원의 상호 참조
본 출원은 2014년 9월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/057,842호, 2014년 9월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/057,847호, 2015년 2월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/112,463호 및 2015년 3월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/135,345호에 대하여 우선권의 이익을 주장하며, 각각의 출원은 이의 전체 내용이 참조로써 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 의학, 유전학 및 재조합 당단백질 생화학의 분야를 포함하며, 특히 근육 세포에서 양이온-독립적인 6-인산염 수용체(CIMPR)를 효율적으로 표적화한 후에 재조합 인간 알파 글루코시다제(rhGAA)를 비정상적으로 높은 수준의 축적된 글리코겐을 분해할 수 있는 리소좀에 전달하는, 보다 높은 총 함량의 만노스 6-인산염-함유 글리칸을 갖는 rhGAA 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 rhGAA는 종래의 rhGAA 제품에 비해 우수한 근육 세포 표적화 및 리소좀으로의 후속전달을 나타내며, 폼페병을 가진 대상의 효소 대체 요법에 특히 효과적이도록 하는 다른 약물동태학적 특성을 나타낸다.
폼페병에 대한 기존의 효소 대체 요법은 만노스 6-인산염(M6P) 및 비스-M6P 함유 글리칸의 총 함량이 낮은 종래의 rhGAA 제품을 사용한다. 종래 제품은 루미자임(Lumizyme)®, 마이오자임(Myozyme)® 및 알글루코시다제 알파(Alglucosidase alfa)라는 명칭으로 공지되어 있다. "루미자임" 및 "마이오자임"은 젠자임(Genzyme) 사에 의해 생물학적 제제로서 생산되거나 판매되고, 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인된 종래 형태의 rhGAA이고, 참조문헌[Physician's Desk Reference (2014)](참조로써 본원에 포함됨) 또는 2014년 10월 1일자로 FDA에 의해 미국내 사용을 승인 받은 "루미자임®" 또는 "마이오자임®"이라는 명칭의 제품에 의해 기술된다. 알글루코시다제 알파는 화학명 [199-아르기닌,223-히스티딘]프리프로(prepro)-α-글루코시다제(인간); 분자식 C4758H7262N1274O1369S35; 카스넘버(CAS number) 420794-05-0로 식별된다. 이러한 제품은 글리코겐 저장 질환 유형 II(GSD-II) 또는 산성 말타제 결핍 질환으로도 공지된 폼페병을 가진 대상에 투여된다. 효소 대체 요법은 rhGAA를 투여하여 리소좀에서 사라진(missing) GAA를 대체함으로써 세포로 하여금 리소좀 글리코겐 분해능을 회복하도록 하여 폼페병을 치료하는 것을 목표로 한다.
폼페병은 산성 알파-글루코시다제(GAA) 활성이 결핍되어 야기되는 유전적인 리소좀 저장 질환이다. 폼페병을 가진 사람은 글리코겐을 분해하는 효소인 산성 알파-글루코시다제(GAA) 및 신체가 에너지원으로 사용하는 물질이 결핍되어 있거나 그 수준이 감소되어 있다. 이러한 효소 결핍은 통상적으로 글리코겐 및 기타 세포 잔해 또는 세포 폐기물을 분해하는 효소를 함유하는 세포내 세포 소기관인 리소좀에서 과잉의 글리코겐 축적을 야기한다. 폼페병을 가진 대상의 특정 조직, 특히 근육에서의 글리코겐 축적은 세포가 정상적으로 기능하는 능력을 손상시킨다. 폼페병에서 글리코겐은 제대로 대사되지 않고 특히 골격근 세포의 리소좀에, 그리고 영아 발병 형태에서는 심장근 세포의 리소좀에 점진적으로 축적된다. 글리코겐 축적은 근육 및 신경 세포뿐만 아니라 영향을 받는 다른 조직의 세포를 손상시킨다.
전통적으로, 발병 연령에 따라, 폼페병은 임상적으로 조기 영아형 또는 후기 발병형으로 알려져 있다. 발병 연령은 폼페병을 야기하는 유전적 돌연변이의 중증도와 유사한 경향이 있다. 가장 심각한 유전적 돌연변이는 영아기에 조기 발병으로 나타나는 것으로서 GAA 활성을 완전하게 상실시킨다. GAA 활성을 감소시키지만 완전하게 제거하지 않는 유전적 돌연변이는 지연된 발병 및 진행을 갖는 폼페병 형태와 관련있다. 영아 발병 폼페병은 출생 직후에 나타나며, 근육 약화, 호흡 부전 및 심부전을 특징으로 한다. 치료하지 않을 경우, 대부분 2년 이내에 치명적이다. 소아 및 성인 발병 폼페병은 생애 중 나중에 나타나며 일반적으로 영아 발병보다 천천히 진행된다. 이러한 형태의 질병은 일반적으로 심장에 영향을 미치지는 않지만 골격근 및 호흡과 관련된 근육이 약화되므로 역시 사망을 초래할 수 있다.
현재 폼페병의 비-완화적인 치료는 루미자임® 또는 마이오자임®과 같은 재조합 인간 GAA(rhGAA)를 사용하는 효소 대체 요법(ERT)을 포함한다. 이러한 rhGAA가 폼페병을 가진 대상에서 사라지거나 결핍된 GAA를 대체하거나 보충하기 위한 시도로서 투여된다. 그러나, 종래의 rhGAA 제품 중의 대부분의 rhGAA는 근육 조직을 표적화하지 않으므로, 투여된 후에 비-생산적으로 제거된다.
이러한 현상은, 종래의 rhGAA는 rhGAA 분자를 표적 근육 세포의 CIMPR에 표적화하고 이어서 rhGAA 분자를 세포의 리소좀내로 운송하는 M6P- 및 비스-M6P-함유 글리칸의 총 함량이 부족하기 때문에 일어난다. 효소 대체 요법에서 rhGAA의 이러한 세포 흡수는, 외인성 효소를 리소좀에 후속적으로 전달하기 위해 세포 표면에 존재하는 양이온-독립적인 만노스 6-인산염 수용체(CIMPR)에 결합하는, 특수화된 탄수화물인 만노스-6-인산염(M6P)에 의해 가능하게 된다.
rhGAA에는 7개의 잠재적인 N-연결 당화(N-linked glycosylation) 부위가 존재한다. 각각의 당화 부위는 N-연결 올리고사카라이드(N-글리칸) 유형에서 서로 다르게(heterogeneous) 존재하기 때문에, rhGAA는 M6P 수용체 및 다른 탄수화물 수용체에 대해 다양한 결합 친화도를 갖는 N-글리칸을 갖는 단백질의 복합 혼합물로 이루어져 있다. 하나의 M6P 기(모노-M6P)를 갖는 고(high) 만노스 N-글리칸을 함유하는 rhGAA는 CIMPR에 낮은 친화도(약 6,000 nM)로 결합하는 반면, 동일한 N-글리칸에 2개의 M6P 기(비스-M6P)를 함유하는 rhGAA는 높은 친화도(약 2 nM)로 결합한다. 비-인산화된 글리칸, 모노-M6P 글리칸 및 비스-M6P 글리칸의 대표적인 구조가 도 1a에 도시되어 있다. 만노스-6-P 기가 도 1b에 도시되어 있다. 리소좀 내부로 들어가면, rhGAA는 축적된 글리코겐을 효소적으로 분해할 수 있다. 그러나, 종래의 rhGAA는 M6P- 및 비스-M6P-함유 글리칸의 총 수준이 낮기 때문에 근육 세포를 불량하게 표적화하여 리소좀으로 rhGAA의 전달을 저하시킨다. 이러한 종래 제품 중의 대부분의 rhGAA 분자는 인산화된 N-글리칸을 가지고 있지 않으므로 CIMPR에 대한 친화도가 결여되어 있다. 비-인산화된 고 만노스 글리칸은 또한 만노스 수용체에 의해 제거될 수 있어 ERT의 비-생산적인 제거를 초래한다(도 2).
갈락토스 및 시알산을 함유하는 다른 유형의 N-글리칸인 복합 탄수화물 또한 rhGAA에 존재한다. 복합 N-글리칸은 인산화되지 않기 때문에 CIMPR에 대한 친화도가 없다. 그러나, 노출된 갈락토스 잔기를 갖는 복합형 N-글리칸은 간세포에서 비시알산당단백질(asialoglycoprotein) 수용체에 대해 중간 내지 높은 친화도를 가지며, 이는 신속한 rhGAA의 비-생산적인 제거를 초래한다(도 2).
GAA 또는 rhGAA의 당화는 캔필드(Canfield) 등의 미국특허 제6,534,300호에 의해 기술된 바와 같이 인산전이효소 및 노출(uncovering) 효소에 의해 시험관 내에서 효소적으로 변형되어 M6P 기를 생성할 수 있다. 효소적 당화는 적절하게 조절될 수 없으며, 바람직하지 않은 면역학적 및 약리학적 특성을 갖는 rhGAA를 생성한다. 효소적으로 변형된 rhGAA는 인산전이효소/노출 효소에 의해 시험관내에서 모두 잠재적으로 효소적으로 인산화될 수 있는 고-만노스 N-글리칸만을 함유할 수 있으며, 하나의 GAA 당 평균적으로 5 내지 6개의 M6P 기를 함유할 수 있다. 시험관내에서 GAA의 효소적 치료에 의해 생성된 당화 패턴은 추가적인 말단 만노스 잔기, 특히 비-인산화된 말단 만노스 잔기가 변형된 rhGAA의 약물동태학에 부정적인 영향을 미치기 때문에 문제가 있다. 이와 같은 효소적으로 변형된 산물이 체내에 투여되는 경우 이러한 만노스 기는 GAA의 비-생산적인 제거를 증가시키고, 면역 세포에 의한 효소적으로 변형된 GAA의 흡수를 증가시키며, 표적화된 조직, 예컨대 심장근 또는 골격근 세포에 도달하는 GAA가 적어지기 때문에 rhGAA의 치료 효과를 감소시킨다. 예컨대, 말단 비-인산화된 만노스 잔기는 간 및 비장에서의 만노스 수용체로 공지된 리간드이며, 효소적으로 변형된 rhGAA를 신속하게 제거하고 rhGAA의 표적 조직으로의 표적화를 감소시킨다. 또한, 말단 비-인산화된 만노스 잔기를 갖는 고 만노스 N-글리칸을 갖는 효소적으로 변형된 GAA의 당화 패턴은 효모, 곰팡이에서 생산된 당단백질상의 것 및, 효소적으로 변형된 rhGAA에 대해 생명을 위협하는 심각한 알러지성(아나필락시성) 또는 과민성 반응과 같은 촉발(trigerring) 면역 반응 또는 알러지 반응의 위험을 증가시키는 기능과 유사하다.
앞서 설명한 바와 같이, 루미자임®과 같은 종래의 rhGAA 제품은 낮은 수준의 모노-인산화된 글리칸 및 훨씬 더 낮은 비스-인산화된 글리칸을 갖는다. 폼페병 치료가 효과적이기 위해서는, rhGAA가 근육 세포의 리소좀으로 전달되어야 한다. 종래의 rhGAA 중의 낮은 총량의 모노-M6P 및 비스-M6P 표적화 기는 CIMPR을 통한 세포 흡수 및 리소좀 전달을 제한하므로 종래의 효소 대체 요법을 비효율적이게 한다. 예컨대, 종래 rhGAA 제품은 20 mg/kg 이상의 투여량으로 폼페병의 일부 양상을 개선하지만, 질환의 진행을 역전시키도록 다수의 표적 조직, 특히 골격근에 축적된 글리코겐을 적절하게 감소시킬 수 없다.
종래의 효소 대체 요법의 리소좀으로의 전달의 비효율성으로 인해, 이러한 치료법은 종종 GAA에 대한 면역 반응의 생성을 포함하여, 다른 문제점과 관련된다. 종래 rhGAA 중의 대부분의 GAA가 rhGAA를 근육 세포에 표적화하는 모노- 또는 비스-M6P를 함유하는 글리칸을 함유하지 않는다. 대상의 면역 체계가 이러한 과도한 비-인산화된 GAA에 노출되어 GAA를 인식하는 해로운 면역 반응을 생성할 수 있다. 표적 조직으로 유입되지 않고 리소좀에 전달되지 않는 비-인산화된 GAA에 대한 면역 반응 유도는, 투여된 rhGAA의 면역학적 불활성화로 인해 치료 실패의 위험을 증가시키고, rhGAA 치료에 대해 환자가 겪을 해로운 자가면역 또는 알러지 반응의 위험을 증가시킨다. 본 발명에 따른 rhGAA는 이러한 비-표적화되고 비-인산화된 rhGAA를 현저하게 적게 함유하므로 환자의 면역 체계가 이에 노출되는 것을 감소시킨다.
논리적으로, 보다 많은 투여량은 rhGAA를 정맥 투여하는데 요구되는 주입 시간을 길게 하는 것과 같이 대상을 치료하는 의료 전문가뿐만 아니라 대상에게 추가적인 부담을 준다. 이는 종래의 rhGAA가 근육 세포에서 CIMPR을 표적화하지 않는 비-인산화된 rhGAA를 보다 높은 함량으로 함유하기 때문이다. 근육 세포에서 CIMPR에 결합하지 않고 이후 리소좀에 유입되지 않는 rhGAA는 그곳에서 글리코겐을 효소적으로 분해하지 않는다. 종래의 rhGAA 및 본 발명에 따른 rhGAA가 동일한 투여량으로 투여되는 경우, 본 발명에 따른 조성물 내의 보다 많은 rhGAA가 근육 세포에서 CIMPR에 결합한 후 리소좀에 전달된다. 본 발명의 rhGAA는 동일하거나 보다 많은 rhGAA를 리소좀에 전달하면서 보다 적은 양의 rhGAA를 투여하는 선택사항을 의사에게 제공한다.
마이오자임®, 루미자임® 또는 알글루코시다제 알파와 같은 종래의 rhGAA를 제조하기 위해 사용되는 현재의 제조 공정은 M6P 또는 비스-M6P의 함량을 현저하게 증가시키지 않는데 그 이유는 세포의 탄수화물 처리가 원래 복잡하고 조작하기가 매우 어렵기 때문이다. 종래 rhGAA 제품의 이러한 단점의 관점에서, 본 발명자들은 rhGAA를 근육 세포에 효율적으로 표적화하고 이를 리소좀에 전달하고, 투여되면 비-생산적인 rhGAA의 제거를 최소화함으로써 보다 생산적으로 rhGAA를 근육 조직에 표적화하는 방법을 부지런히 찾고 규명하였다.
종래 형태의 rhGAA의 표적화 및 투여와 관련된 문제점 및 매우 우수하게 표적화된 형태의 rhGAA를 생산하는 것과 관련된 어려움에 대응하여, 본 발명자들은 종래의 rhGAA 조성물보다 높은 함량의 M6P- 및 비스-M6P 글리칸을 가지고 있으므로 근육 조직에서 CIMPR을 보다 효율적으로 표적화하고 이를 리소좀에 전달하는, rhGAA의 제조 방법을 조사하고 개발하였다. 또한, 본 발명의 rhGAA는 비-표적화된 조직에 의한 비-생산적인 rhGAA의 제거를 최소화하는, 우수하게 처리된 복합형 N-글리칸을 갖는다.
루미자임®과 같은 종래의 rhGAA 제품을 사용하는 현재의 효소 대체 요법과 관련된 문제점을 고려하여, 부지런한 연구 및 조사를 통해 본 발명자들은 근육 세포에서 CIMPR을 표적화한 후 rhGAA를 리소좀에 전달하는, 현저하게 보다 높은 총 함량의 모노-M6P 및 비스-M6P 글리칸을 갖는 CHO 세포에서 rhGAA를 생산하는 방법을 개발하였다.
또한, 이러한 방법으로 생산된 rhGAA는 폼페병을 가진 대상에 투여된 후 표적 조직 흡수를 증가시키고 비-생산적인 제거를 감소시키는 전체적인 당화 패턴에 의해 유리한 약물동태학적 특성을 갖는다. 본 발명자들은, ATB-200으로 명명된 rhGAA에 의해 예시되는 바와 같이, 본 발명의 rhGAA가 루미자임®과 같은 종래의 rhGAA에 비해 골격근 조직을 표적화하는데 있어 보다 강력하고 보다 효율적임을 보여준다. 도 2에 의해 설명되는 바와 같이, 본 발명에 따른 rhGAA는 폼페병을 가진 환자에서 근육 세포를 생산적으로 표적화하고 비-생산적인 rhGAA의 제거를 감소시키는 능력이 우수하다.
본 발명에 따른 우수한 rhGAA는 추가로 샤페론으로 완성 또는 조합될 수 있거나 근육 조직에서 CIMPR을 표적화하는 다른 기, 예컨대 이 수용체에 결합하는 IGF2 부분과 접합(conjugation)될 수 있다. 아래의 실시예는 ATB-200 rhGAA로 예시된 본 발명의 rhGAA가 종래의 rhGAA 제품인 루미자임®을 사용하는 기존의 요법에 비하여 골격근에서 현저하게 더 우수한 글리코겐 제거를 제공함으로써 효소 대체 요법에 대한 기존의 표준 치료법을 능가함을 보여준다.
본 출원서는 색상으로 도시된 도면을 하나 이상 포함한다.
도 1a는 비-인산화된 고 만노스 글리칸, 모노-M6P 글리칸 및 비스-M6P 글리칸을 나타낸다.
도 1b는 M6P 기의 화학적 구조를 나타낸다.
도 2a는 rhGAA가 M6P를 함유하는 글리칸을 통해 표적 조직(예컨대, 폼페병을 가진 대상의 근육 조직)을 생산적으로 표적화함을 보여준다.
도 2b는 비-표적 조직(예컨대, 간 및 비장)에 대한 또는 비-표적 조직에 대한 비-M6P 글리칸의 결합에 의한 비-생산적인 약물 제거를 나타낸다.
도 3a는 CIMPR 수용체(IGF2 수용체로도 공지되어 있음) 및 이 수용체의 도메인을 상세하게 나타낸다.
도 3b는 비스- 및 모노-M6P를 함유하는 글리칸의 CIMPR에 대한 결합 친화도(nM), 고 만노스형 글리칸의 만노스 수용체에 대한 결합 친화도 및 탈-시알화된 복합 글리칸의 비시알산당단백질 수용체에 대한 결합 친화도를 나타낸 표이다. M6P 및 비스-M6P를 함유하는 글리칸을 갖는 rhGAA는 근육 표적 세포에서 CIMPR에 생산적으로 결합할 수 있다. 고 만노스 글리칸 및 탈-시알화된 글리칸을 갖는 rhGAA는 상응하는 수용체를 갖는 비-표적화 세포에 비-생산적으로 결합할 수 있다.
도 4a 및 도 4b는 각각 루미자임® 및 마이오자임®의 CIMPR 친화 크로마토그래피의 결과를 보여준다. 점선은 M6P 용리 구배를 나타낸다. M6P에 의한 용리는 M6P-함유 글리칸을 통해 CIMPR에 결합된 GAA 분자를 대체시킨다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 루미자임® 중 78%의 GAA 활성이 M6P를 첨가하기 전에 용리되었다. 도 4b는 마이오자임® 중 73%의 GAA의 활성이 M6P를 첨가하기 전에 용리되었음을 보여준다. 루미자임® 또는 마이오자임 중의 각각 22% 또는 27%의 rhGAA만이 M6P에 의해 용리되었다. 이 도면들은 이와 같은 2종의 종래 rhGAA 제품 중의 대부분의 rhGAA가 표적 근육 조직에서 CIMPR을 표적화하는데 필요한 M6P를 함유하는 글리칸이 결여되었음을 보여준다.
도 5는 rhGAA를 암호화하는 DNA로 CHO 세포를 형질전환시키기 위한 DNA 작제물을 나타낸다. CHO 세포는 rhGAA를 암호화하는 DNA 작제물(서열번호 4)에 의해 형질전환되었다.
도 6a 및 도 6b는 마이오자임 및 ATB-200 rhGAA의 CIMPR 친화 크로마토그래피의 결과를 나타낸다. 도 6b로부터 명백한 바와 같이, ATB-200 rhGAA 중의 약 70%의 rhGAA가 M6P를 함유하였다.
도 7은 ATB-200 rhGAA 정제 구현예 1 및 구현예 2를 나타낸다.
도 8은 루미자임® ATB-200 rhGAA의 폴리왁스 용리 프로파일이다.
도 9는 루미자임®의 N-글리칸 구조를 BP-rhGAA, ATB200-1 및 ATB200-2로 확인된 3종의 상이한 ATB200 rhGAA 제제와 비교하여 요약한 것이다.
도 10a는 ATB-200 rhGAA의 CIMPR 결합 친화도(좌측 선)를 루미자임®의 CIMPR 결합 친화도(우측 선)와 비교한 것이다.
도 10b는 루미자임® 및 ATB-200 rhGAA의 비스-M6P 함량을 나타낸다.
도 11a는 다양한 GAA 농도에서 정상 섬유아세포 내에서 ATB-200 rhGAA 활성(좌측 선)을 루미자임® rhGAA 활성(우측 선)과 비교한 것이다.
도 11b는 다양한 GAA 농도에서 폼페병을 가진 대상의 섬유아세포 내에서 ATB-200 rhGAA 활성(좌측 선)을 루미자임® rhGAA 활성(우측 선)과 비교한 것이다.
도 11c는 정상인 대상과 폼페병을 가진 대상의 섬유아세포의 (K흡수)를 비교한 것이다.
도 12a는 비히클(음성 대조군), 20 mg/ml의 알글루코시다제 알파, 또는 5, 10 또는 20 mg/kg의 ATB-200 rhGAA와 접촉시킨 후 심장근에서 단백질에 대해 상대적인 글리코겐의 양을 나타낸다.
도 12b는 비히클(음성 대조군), 20 mg/ml의 루미자임®, 또는 5, 10 또는 20 mg/kg의 ATB-200 rhGAA와 접촉시킨 후 대퇴사두근에서 단백질에 대해 상대적인 글리코겐의 양을 나타낸다.
도 12c는 비히클(음성 대조군), 20 mg/ml의 루미자임®, 또는 5, 10 또는 20 mg/kg의 ATB-200 rhGAA와 접촉시킨 후 삼두근에서 단백질에 대해 상대적인 글리코겐의 양을 나타낸다. ATB-200 rhGAA는 음성 대조군 및 루미자임®에 비해 대퇴사두근 및 삼두근에서 현저한 글리코겐의 감소를 나타냈다.
도 13은 샤페론 AT2221의 존재하에 ATB-200 rhGAA의 안정성이 개선되었음을 나타낸다. 도 13a에서 첫 번째 좌측 선은 pH 7.4(혈액 pH)에서 다양한 온도에서의 풀린(unfolded) ATB-200 rhGAA 단백질의 백분율을 나타낸다. 마지막 우측 선은 pH 5.2(리소좀 pH)에서 다양한 온도에서의 풀린 ATB-200 rhGAA 단백질의 백분율을 나타낸다. 3개의 중간 선은 10 ㎍, 30 ㎍ 또는 100 ㎍의 AT2221 샤페론이 단백질 접힘(folding)에 미치는 영향을 나타낸다. 이러한 데이터는 대조군 샘플에 비해 AT2221이 혈액 pH에서 ATB-200 rhGAA의 풀림을 방지한다는 것을 보여준다. 중성 pH에서 AT2221에 의한 온도(Tm) 향상이 도 13b에 요약되어 있다.
도 14의 표는 루미자임® 및 AT2221로 치료, 또는 AT2221 샤페론이 없는 상태의 루미자임® 또는 ATB200 rhGAA 어느 하나의 대조군으로 치료에 비해 ATB-200 rhGAA와 샤페론 AT2221의 조합이 GAA 넉-아웃 마우스에서 현저하게 우수한 글리코겐 제거를 제공함을 보여준다.
도 15는 루미자임, ATB-200 rhGAA 또는 ATB-200 rhGAA와 다양한 농도의 AT2221 샤페론으로 치료한 후 대퇴사두근에서의 잔여 글리코겐을 나타낸다.
도 16은 ATB200 + 마이글루스타트(Miglustat)(AT2221)로 치료한 마우스에서 골격근 병리학적 개선이 ERT를 단독으로 치료한 마우스의 골격근 병리학적 개선을 능가했음을 나타낸다. 도 16a 및 도 16b는 종래의 rhGAA 또는 ATB-200 rhGAA와 마이글루스타트(AT-2221)로 치료한 GAA 넉아웃(KO) 마우스 근육 조직의 과요도산쉬프(PAS) 글리코겐 염색(도 16a) 및 전자현미경(EM)(도 16b)이다. 도 16c는 LAMP-1 마커로 리소좀 증식을 평가한 것이다. 도 16d는 유형 I 및 유형 II 근육 섬유를 확인한 것이다.
도 17은 ATB-200 + 마이글루스타트(AT2221)로 치료한 마우스의 골격근 병리학적 개선이 ERT를 단독으로 치료한 마우스의 골격근 병리학적 개선을 능가했음을 나타낸 것이다. 도 17a는 종래의 rhGAA 또는 ATB-200 rhGAA와 마이글루스타트(AT-2221)로 치료한 GAA 넉아웃 마우스 근육 조직의 PAS 글리코겐 염색을 나타낸 것이다. 도 17b는 LAMP-1 마커로 리소좀 증식을 평가한 것이다.
정의
본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 문맥 내에 그리고 각 용어가 사용된 특정 문맥에서 당해 분야에서의 통상적인 의미를 가진다. 특정 용어는 본 발명의 조성물 및 방법, 및 이의 생산 및 사용법을 설명하는데 있어서 실시자에게 추가적인 지침을 제공하기 위해 다음에서 또는 본 명세서의 임의 부분에서 논의된다.
용어 "GAA"는 리소좀 글리코겐의 α-1,4- 및 α-1,6-글루코시드 결합의 가수분해를 촉매작용하는 효소인 인간 산성 α-글루코시다제(GAA) 및, 효소 활성을 발휘하는 삽입, 관계 또는 치환 변이체의 GAA 아미노산 서열 및 보다 긴 GAA 서열 단편을 지칭한다. 용어 "rhGAA"는 내인성 GAA를 합성 또는 GAA를 암호화하는 DNA로 CHO 세포를 형질전환 시켜 생산된 것과 같은 재조합적으로 생산된 GAA와 구별하기 위해 사용된다. GAA를 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 참조로써 포함된 NP_000143.2(서열번호 4)이다. GAA 및 rhGAA는, 상이한 당화 패턴을 갖는 GAA 분자의 혼합물, 예컨대 이들의 글리칸에 모노-M6P 또는 비스-M6P 기를 함유하는 rhGAA 분자와 M6P 또는 비스-M6P를 함유하지 않는 GAA 분자의 혼합물을 함유하는 조성물 중에 존재할 수 있다. 또한, GAA 및 rhGAA는 샤페론과 같은 다른 화합물로 완성될 수 있거나, 접합체를 CIMPR에 표적화하고 이어서 이를 리소좀으로 전달하는 IGF2 모이어티에 결합되는 것과 같이 GAA 또는 rhGAA 접합체 내의 다른 모이어티에 결합될 수 있다.
"대상" 또는 "환자"는 바람직하게는 인간이지만, 글리코겐 축적을 수반하는 장애를 가진 기타 포유류 및 비-인간 동물도 또한 치료될 수 있다. 대상은 폼페병 또는 다른 글리코겐 저장 또는 축적 장애를 가진 태아, 신생아, 어린이, 소아 또는 성인일 수 있다. 치료되는 개체의 일례는 GSD-II(예컨대 영아 GSD-II, 소아 GSD-II 또는 성인-발병 GSD-II)를 가진 개체(태아, 신생아, 어린이, 소아, 청소년 또는 성인)이다. 개체는 잔여 GAA 활성을 가질 수 있거나 활성의 측정이 불가능할 수 있다. 예컨대, GSD-II를 가진 개체는 정상 GAA 활성의 약 1% 미만인 GAA 활성(영아 GSD-II), 정상 GAA 활성의 약 1 내지 10%인 GAA 활성(소아 GSD-II), 또는 정상 GAA 활성의 약 10 내지 40%인 GAA 활성(성인 GSD-II)을 가질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하다" 및 "치료"는 질병과 관련된 하나 이상의 증상 개선, 질병의 하나 이상의 증상의 발병의 예방 또는 지연, 및/또는 질병의 하나 이상의 증상의 중증도 또는 빈도의 감소를 지칭한다. 예컨대, 치료는 심장 상태 개선(예컨대, 확장-말기 및/또는 수축-말기 용적의 증가, 또는 GSD-II에서 전형적으로 발견되는 진행성 심근병증의 감소, 개선 또는 예방) 또는 폐 기능 개선(예컨대, 기저 폐활량에 대한 울음(crying) 폐활량의 증가, 및/또는 울음 중 산소 불포화도의 정상화); 신경발달 및/또는 운동 능력의 개선(예컨대, AIMS 점수 증가); 질병에 걸린 개체의 조직에서 글리코겐 수준의 감소; 또는 이러한 효과의 임의의 조합을 지칭할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 치료는 심장 상태의 개선, 특히 GSD-II와 관련된 심근병증의 감소 또는 예방에 있어서 개선을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "개선하다", "증가시키다" 또는 "감소시키다"는 본원에 기술된 치료의 개시 전에 동일한 개체에서의 측정값, 또는 본원에 기술된 치료가 부재한 하나의 대조군 개체(또는 다수의 대조군 개체)에서의 측정값과 같은 기준 측정값에 대해 상대적인 값을 나타낸다. 대조군 개체는 치료되는 개체와 동일한 형태의 GSD-II(유아, 소아 또는 성인-발병)에 걸려있는 개체로서, 치료되는 개체와 거의 동일한 연령이다(치료되는 개체 및 대조군 개체에서의 질병 단계가 비교가능함을 보장하기 위함임).
본원에 사용된 용어 "정제된"은 물질을 수득하게 된 천연 물질을 포함하여 관련이 없는 물질, 즉, 오염원의 존재를 감소 또는 제거시키는 조건하에 단리된 물질을 지칭한다. 예컨대, 정제된 단백질은 바람직하게는 세포 내에서 연관된 다른 단백질 또는 핵산을 실질적으로 함유하지 않고; 정제된 핵산 분자는 바람직하게는 세포 내에서 발견될 수 있는 단백질 또는 기타 관련되지 않은 핵산 분자를 실질적으로 함유하지 않는다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 함유하지 않은"은 물질의 분석 시험의 맥락에서 작업적(operationally)으로 사용된다. 바람직하게는, 오염원을 실질적으로 함유하지 않는 정제된 물질은 95% 이상 순수하고; 보다 바람직하게는 97% 이상 순수하고, 보다 더 바람직하게는 99% 이상 순수하다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역검정, 조성물 분석, 생물학적 검정, 효소 검정 및 기타 당해 분야에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서 "정제된"은 오염원의 수준이 인간 또는 비-인간 동물에게 안전하게 투여하기 위해 규제 당국에 의해 허용되는 수준 미만임을 의미한다. 재조합 단백질은 크로마토그래피적 크기 분리, 친화 크로마토그래피 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하여 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 CHO 세포로부터 단리되거나 정제될 수 있다.
용어 "유전적으로 변형된" 또는 "재조합의"는 유전자 산물을 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 핵산을 암호화 서열의 발현을 조절하는 조절 요소와 함께 도입한 후 특정 유전자 산물, 예컨대, rhGAA 또는 ATB-200 rhGAA를 발현하는 세포, 예컨대 CHO 세포를 지칭한다. 핵산 도입은 유전자 표적화 및 상동성 재조합을 포함하여 당해 분야에 공지된 임의의 방법으로 달성될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 본 용어는 또한 예컨대 유전자 활성화 기술에 의해 이러한 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 내인성 유전자 또는 유전자 산물을 발현 또는 과발현하도록 조작된 세포를 포함한다.
"폼페병"은 리소좀 글리코겐 대사를 저해하는 결여된 산성 알파 글루코시다제(GAA) 활성을 특징으로 하는 상염색체 열성 리소좀 저장 질환(LSD)이다. 효소 결핍은 리소좀 글리코겐 축적을 야기하고 진행성 골격근 약화, 감소된 심장 기능, 호흡기능 부전 및/또는 질병의 후기 단계에서의 CNS 손상을 야기한다. GAA 유전자에서 유전적 돌연변이는 보다 낮은 발현을 야기하거나, 변경된 안정성, 및/또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 형태의 효소를 생산하여 궁극적으로는 질병을 야기한다(일반적으로, 문헌[Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid α-Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver et al., eds., McGraw-Hill, New York, 7th ed., pages 2443-2464]을 참조). 3종의 알려진 폼페병의 임상학적 형태(유아, 소아 및 성인)는 잔여 α-글루코시다제의 활성 수준과 관련되어 있다(문헌 [(Reuser A J et al., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69)]). 영아 폼페병(유형 I 또는 A)은 가장 흔하고 가장 중증이며 생애 중 2년 이내에 성장 장애, 전신 근육긴장저하, 심장 비후, 및 심장호흡 부전을 특징으로 한다. 소아 폼페병(유형 II 또는 B)은 중증도가 중간이며 심장비대가 없는 근육 증상이 우세한 것을 특징으로 한다. 소아 폼페 개체는 보통 호흡 부전에 의해 20세가 되기 전에 사망한다. 성인 폼페병(유형 III 또는 C)은 종종 10대 또는 60대와 같이 늦게 서서히 진행되는 근육병으로서 존재한다(문헌[Felicia K J et al., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135]). 폼페에서, α-글루코시다제는 당화, 인산화 및 단백질 분해성 프로세스에 의해 번역 후 광범위하게 변형되는 것으로 밝혀졌다. 최적의 글리코겐 촉매작용을 위해서는 리소좀에서 110 킬로 달톤(kid)의 전구체가 단백질 분해에 의해 76 및 70 kid의 성숙한 형태로 전환되는 것이 필요하다. 본원에 사용된 용어 "폼페병"은 모든 유형의 폼페병을 지칭한다. 본원에 개시된 제형 및 투여 요법은, 예컨대 유형 I, 유형 II 또는 유형 III 폼페병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 비제한적인 구현예
루미자임® (알글루코시다제 알파; CAS 420794-05-0)으로 예시된 바와 같은 종래의 rhGAA에 비해 모노-만노스-6-인산염(M6P) 또는 비스-M6P를 가지는 N-글리칸을 함유하는 보다 많은 양의 rhGAA를 함유하는 CHO 세포로부터 rhGAA 조성물이 유래하였다. 본 발명에 따른 예시적인 rhGAA 조성물은 실시예에 기술된 ATB-200(종종 ATB-200, ATB-200 또는 CBP-rhGAA로 명명됨)이다. 본 발명의 rhGAA(ATB-200)는 CIMPR에 높은 친화도(K D 약 2 내지 4 nM)로 결합하고, 폼페 섬유아세포 및 골격근 근섬유에 의해 효율적으로 내재화(K 흡수 약 7 내지 14 nM)되는 것으로 밝혀졌다. ATB-200은 체내에서 특징 지어져 있으며, 기존의 rhGAA ERT(t1/2 약 60 분)에 비해 명백히 짧은 혈장 반감기(t1/2 약 45 분)를 갖는 것으로 밝혀졌다.
rhGAA의 아미노산 서열은 서열번호 1, 3 또는 4로 기재된 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 95% 또는 99% 이상 동일할 수 있거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 결실, 치환 또는 부가를 함유할 수 있다. ATB-200 rhGAA에서와 같이, 본 발명의 GAA 또는 rhGAA의 일부 구현예에서, GAA 또는 rhGAA는 서열번호 1 또는 3과 같은 야생형 GAA 아미노산 서열을 포함할 것이다. 또 다른 비제한적인 구현예에서, rhGAA는 야생형 GAA에 존재하는 아미노산 잔기의 서브세트(subset)를 포함하며, 이때, 서브세트는 기질 결합 및/또는 기질 감소에 대한 활성 부위를 형성하는 야생형 GAA의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, rhGAA는 인간 효소 산성 α-글루코시다제(GAA)인 글루코시다제 알파이며, 이 유전자의 9개의 관찰된 일배체형 중에서 가장 우세한 것에 의해 암호화된다. ATB-200 rhGAA를 포함하여 본 발명의 rhGAA는, 예컨대 등록 번호(accession number) AHE24104.1(GI:568760974)(서열번호 1)로 주어지고 미국특허 제8,592,362호에 의해 참조로써 포함된 인간 알파 글루코시다제의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 NP_000143.2(서열번호 4)와 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, GAA의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 서열번호 3으로 주어져 있다. 이러한 아미노산 서열의 변이체는 또한 아래의 GAA 아미노산 서열에 대해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 이상의 아미노산 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. GAA 및 이와 같은 변이체 인간 GAA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열도 또한 고려되고, 본 발명에 따른 rhGAA를 재조합적으로 발현하기 위해 사용될 수 있다.
GCG 서열 분석 패키지(위스콘신 대학교, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)의 일부로서 입수가능한 FASTA 또는 BLAST를 포함하는 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 프로그램이 2개 서열 사이의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있고, 예컨대 기본 설정으로 사용될 수 있다. 예컨대, 본원에 기술된 특정 폴리펩티드와 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 동일하고 바람직하게는 실질적으로 동일한 기능을 나타내는 폴리펩티드뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 고려된다. 달리 명시되지 않는 한, 유사성 점수는 BLOSUM62의 사용을 기준으로 할 것이다. BLASTP가 사용될 경우, 퍼센트 유사성은 BLASTP 양수 점수를 기준으로 하고, 퍼센트 서열 동일성은 BLASTP 동일성 점수를 기준으로 한다. BLASTP "동일성"은 높은 점수의 동일한 서열 쌍에서 총 잔기의 수 및 분율을 나타내고; BLASTP "양수"는 정렬 점수가 양수 값을 갖고 서로 유사한 잔기의 수 및 분율을 나타낸다. 본원에 개시된 아미노산 서열에 대하여 이러한 정도의 동일성 또는 유사성을 갖거나, 임의의 중간 정도의 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열이 고려되고 본 개시에 포함된다. 유사한 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드 서열이 유전자 암호를 사용하여 추론되며, 통상적인 방법, 특히 유전자 암호를 사용하여 이의 아미노산 서열을 역으로 번역함으로써 수득될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 조성물 중의 70, 65, 60, 55, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 또는 5% 이하의 총 rhGAA가 M6P 또는 비스-M6P를 함유하는 N-글리칸이 결여되어 있거나, 양이온 독립적인 만노스-6-인산염 수용체(CIMPR)에 대한 결합 능력이 결여되어 있다. 다르게는, 본 조성물 중의 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99% 또는 100% 미만 또는 초과의 rhGAA는 M6P 및/또는 비스-M6P를 함유하는 N-글리칸을 하나 이상 포함하거나 CIMPR에 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명의 rhGAA 조성물 중의 rhGAA 분자는 이의 글리칸상에 1, 2, 3 또는 4개의 M6P 기를 함유할 수 있다. 예컨대, rhGAA 분자상에 오직 하나의 N-글리칸은 M6P를 함유할 수 있거나(모노-인산화된), 단일 N-글리칸은 2개의 M6P 기를 가질 수 있거나(비스-인산화된), 동일한 rhGAA 분자상의 2개의 상이한 N-글리칸은 단일 M6P 기를 함유할 수 있다. 또한, rhGAA 조성물 중의 rhGAA 분자는 M6P 기를 함유하지 않는 N-글리칸을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 평균적으로 N-글리칸은 3 mol/mol 초과의 M6P 및 4 mol/mol 초과의 시알산을 함유한다. 평균적으로 rhGAA 상의 총 글리칸의 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10% 이상이 모노-M6P 글리칸의 형태일 수 있으며, 예컨대 총 글리칸의 약 6.25%가 단일 M6P 기를 함유할 수 있고, 평균적으로 rhGAA 상의 총 글리칸의 약 0.5, 1, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0% 이상이 비스-M6P 글리칸의 형태이고, 평균적으로 본 발명의 총 rhGAA의 25% 미만이 CIMPR에 결합하는 인산화된 글리칸을 함유하지 않는다.
본 발명에 따른 rhGAA 조성물은 0.5 내지 7.0 mol M6P/mol rhGAA, 또는 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0 mol M6P/mol의 rhGAA를 포함하는 하위 범위의 임의의 중간 값의 M6P를 함유하는 평균 함량의 N-글리칸을 가질 수 있다. 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명의 rhGAA는 분획화되어 rhGAA상에 상이한 평균 개수의 M6P-함유 또는 비스-M6P-함유 글리칸을 갖는 rhGAA 조성물을 제공할 수 있으므로, 특정 분획을 선택하거나 선택적으로 상이한 분획을 조합함으로써 표적 조직에서 리소좀을 표적화하는 rhGAA를 추가로 맞춤화할 수 있다.
rhGAA상의 60% 이하의 N-글리칸이 완전히 시알화될 수 있으며, 예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 60% 이하의 N-글리칸이 완전히 시알화될 수 있다. 일부 구현예에서, rhGAA 조성물 중의 총 N-글리칸의 4 내지 20%가 완전히 시알화된다.
다른 구현예에서, rhGAA상의 5%, 10%, 20% 또는 30% 이하의 N-글리칸이 시알산 및 말단 Gal을 함유한다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하며, 예컨대, 본 조성물 중의 rhGAA 상의 총 N-글리칸의 7 내지 30%가 시알산 및 말단 Gal을 함유할 수 있다.
또 다른 구현예에서, rhGAA상의 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20% 이하의 N-글리칸이 말단 Gal만을 가지며 시알산은 함유하지 않는다. 이러한 범위는 모든 중간 값 및 하위범위를 포함하며, 예컨대, 조성물 중의 rhGAA 상의 총 N-글리칸의 8 내지 19%가 말단 Gal만을 가질 수 있으며 시알산은 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 조성물 중의 rhGAA 상의 총 N-글리칸의 40, 45, 50, 55 또는 60%가 복합형 N-글리칸이고; 조성물 중의 rhGAA상의 총 N-글리칸의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7% 이하가 혼성(hybrid)형 N-글리칸이고; 조성물 중의 rhGAA 상의 고 만노스형 N-글리칸의 5, 10 또는 15% 이하가 인산화되지 않고; 조성물 중의 rhGAA 상의 고 만노스형 N-글리칸의 5% 또는 10% 이상이 모노-M6P 인산화되어 있고/있거나; 조성물 중의 rhGAA 상의 고 만노스형 N-글리칸의 1 또는 2% 이상이 비스-M6P 인산화되어 있다. 이러한 값은 모든 중간 값 및 하위범위를 포함한다. 본 발명에 따른 rhGAA 조성물은 위에 기술된 하나 이상의 함량 범위를 만족할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rhGAA 조성물은 rhGAA 1몰 당 평균 2.0 내지 8.0개의 시알산 잔기를 함유할 것이다. 이러한 범위는 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0 잔기/mol rhGAA를 포함하여 모든 중간 값 및 하위 범위를 포함한다. 시알산 잔기는 비시알산당단백질 수용체에 의한 비-생산적인 제거를 방지할 수 있다.
본 발명의 rhGAA 조성물은 바람직하게는 CHO 세포, 예컨대 CHO 세포주 GA-ATB-200, 또는 이러한 CHO 세포 배양의 계대배양 또는 유도체에 의해 생산된다. 서열번호 1과 90%, 95% 또는 99% 이상 동일한 것과 같은 대립유전자 변이체 GAA 또는 다른 변이체 GAA 아미노산 서열을 발현하는 DNA 작제물이 CHO 세포에서 제작되고 발현될 수 있다. 당업자는 이러한 DNA 작제물의 생산을 위해 CHO 세포를 형질전환시키기에 적합한 대안적인 벡터를 선택할 수 있다.
본 발명자들은 CIMPR 및 세포질 리소좀을 표적화하는 우수한 능력뿐만 아니라 체내에서 이의 비-생산적인 제거를 감소시키는 당화 패턴을 갖는 rhGAA를 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포를 사용하여 생산할 수 있음을 발견하였다. 이러한 세포는 종래의 rhGAA 제품보다 현저히 더 높은 수준의 총 M6P 및 비스-M6P를 갖는 rhGAA를 발현하도록 유도될 수 있다. 예컨대, 실시예에 기술된 rhGAA ATB-200으로 예시된 바와 같이 이러한 세포에 의해 생산된 재조합 인간 GAA는, 루미자임®과 같은 종래의 GAA보다 현저히 더 많은 근육 세포-표적화 M6P 및 비스-M6P 기를 가지며, CIMPR에 효율적으로 결합하고 골격근 및 심장근에 의해 효율적으로 흡수될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이는 체내에서 유리한 약물동태학적 프로파일을 제공하고 비-생산적인 제거를 감소시키는 당화 패턴을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 rhGAA는 폼페병 또는 GAA 결핍과 관련된 다른 증상의 치료를 위한 약제학적 조성물로 제형화되거나 제제의 제조에 사용될 수 있다. 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 제형화될 수 있다. 담체 및 조성물은 멸균될 수 있고 이와는 달리 투여 방식에 적합할 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 물, 염 용액(예컨대, NaCl), 염수, 완충된 염수, 알콜, 글리세롤, 에탄올, 아라비아 고무, 식물유, 벤질 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물, 예컨대 락토스, 아밀로스 또는 전분, 당, 예컨대 만니톨, 수크로스, 또는 기타 덱스트로스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 지방산 에스터, 하이드록시메틸셀룰로스, 폴리피닐 피롤리돈 등 및 이들의 조합을 포함한다. 원하는 경우, 약제학 제제는 활성 화합물과 유해하게 반응하지 않는 보조제, 예컨대 계면활성제, 예컨대 폴리솔베이트 80과 같은 폴리솔베이트, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향료 및/또는 방향족 물질 등과 함께 혼합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여에 적합한 수용성 담체가 사용된다.
원하는 경우, 조성물 또는 약제는 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 서방형 제형 또는 분말일 수 있다. 또한, 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세리드와 같은 담체와 함께 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 나트륨 사카라이드, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, rhGAA는 정맥내 주입으로 투여된다.
조성물 또는 약제는 인간에게 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로서 통상적인 절차에 따라 제형화될 수 있다. 예컨대, 바람직한 구현예에서, 정맥내 투여용 조성물은 멸균의 등장성 수성 완충액의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위한 국소 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분들은 개별적으로 또는 단위 투여량으로 함께 혼합되어, 예컨대 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰와 같은 기밀된 용기내의 건조 동결된 분말 또는 무수 농축물로서 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균된 약제학적인 등급의 물, 염수 또는 덱스트로스/물을 함유하는 주입 병과 함께 제공될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 염수 앰플이 제공될 수 있다.
rhGAA는 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유래된 것과 같은 유리 아미노 기로 형성된 것, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제이철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것과 같은 유리 카복실 기로 형성된 것을 포함한다.
rhGAA(또는 GAA 함유 조성물 또는 약제)는 적절한 경로로 투여된다. 일 구현예에서, GAA는 정맥내로 투여된다. 다른 구현예에서, GAA는 표적 조직, 예컨대 심장근 또는 골격근에(예컨대, 근육내로), 또는 신경계에(예컨대, 뇌내에 직접 주사; 뇌실내로; 척추강내로) 직접 투여된다. 원하는 경우, 하나 초과의 경로가 동시에 사용될 수 있다.
rhGAA(또는 GAA 함유 조성물 또는 약제)는 치료학적 유효량(예컨대, 규칙적인 간격으로 투여되는 경우, 앞서 기재한 바와 같이 질환과 관련된 증상을 개선, 질환의 발병을 예방 또는 지연, 및/또는 또한 질환의 증상의 중증도 또는 빈도를 감소시키는 것과 같이 질환을 치료하는데 충분할 정도의 투여량)으로 투여된다. 질환의 치료에 있어 치료학적 유효량은 질병의 효과의 성질 및 정도에 따라 달라질 것이며, 표준적인 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적의 투여량 범위를 확인하는데 도움이 되도록, 시험관내 또는 체내 검정법이 임의적으로 사용될 수 있다. 이용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 질환의 심각성에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 치료학적 유효량은 개체의 체중 1 kg 당 20 mg 이하의 효소, 바람직하게는 약 1 내지 10 mg 효소/kg 체중, 및 보다 더 바람직하게는 약 10 mg 효소/kg 체중 또는 약 5 mg 효소/kg 체중이다. 특정 개체에 유효한 투여량은 개체의 요구에 따라 시간의 경과에 따라 변할 수 있다(예컨대, 증가 또는 감소). 예컨대, 신체적인 질병 또는 스트레스 중에, 또는 항-GAA 항체가 생기거나 증가하는 경우, 또는 질환의 증상이 악화되는 경우, 그 양은 증가될 수 있다.
치료학적 유효량의 GAA(또는 GAA 함유 조성물 또는 약제)는 질병의 영향의 성질 및 정도에 따라, 그리고 지속적으로 규칙적인 간격으로 투여된다. 본원에 사용된 "규칙적인 간격"으로 투여는 치료학적 유효량이 주기적으로 투여됨을 나타낸다(1회 투여와 구별됨). 간격은 표준적인 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 구현예에서, GAA는 매월, 격월, 매주, 격주 또는 매일 투여된다. 단일 개체의 투여 간격은 고정된 간격일 필요는 없지만, 개체의 필요에 따라, 시간의 경과에 따라 변할 수 있다. 예컨대, 신체적인 질병 또는 스트레스 중에, 항-GAA 항체가 생기거나 증가하는 경우, 또는 질환의 증상이 악화되는 경우, 투여 사이의 간격은 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 5, 10, 20, 50, 100 또는 200 mg 효소/kg 체중의 치료학적 유효량이 주 2회, 매주 또는 격주로 샤페론과 함께 또는 샤페론 없이 투여된다.
본 발명의 GAA 또는 rhGAA는 나중 사용을 위해 예컨대 단위 투여량 바이알 또는 주사기로, 또는 정맥내 투여를 위한 병 또는 백(bag)으로 제조될 수 있다. GAA 또는 rhGAA 및 임의적인 부형제 또는 기타 활성 성분, 예컨대 샤페론 또는 기타 약물을 함유하는 키트가 포장 재료에 포함될 수 있고, 폼페병을 가진 환자와 같이 치료가 필요한 대상을 치료하기 위한 재구성(reconstitution), 희석 또는 투여 지침이 수반될 수 있다.
GAA(또는 GAA 함유 조성물 또는 약제)는 단독으로 또는 샤페론과 같은 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 모노-M6P 또는 비스-M6P를 가진 상이한 당화 정도의 rhGAA가 투여될 수 있거나, 상이한 정도의 M6P 또는 비스-M6P 당화를 갖는 rhGAA의 조합이 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 rhGAA 조성물은 AT-2220 또는 AT-2221과 같은 샤페론과 함께 복합화되거나 혼합될 것이다. 종종 "약리학적 샤페론"으로 지칭되는 샤페론은 rhGAA와 함께 복합화되거나 병용투여되는 경우 이의 약물동태학 및 기타 약리학적 특성을 변형시키는 화합물이다. 본원에 예시된 대표적인 샤페론은 AT2221(마이글루스타트, N-부틸-디옥시노지리마이신) 및 AT2220(두보글루스타트 HCl, 1-디옥시노지리마이신)을 포함한다. 이러한 복합화 또는 혼합은, 예컨대 개별적인 투여량의 rhGAA 및 샤페론이 투여되는 경우 체외 또는 체내에서 발생할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 활성 rhGAA, 이의 분획물 또는 유도체를 CIMPR 및 이어서 세포질 리소좀으로 표적화하는 것은 이를 두보글루스타트-HCl(AT2220, 디옥시노지리마이신, AT2220) 또는 마이글루스타트(AT2221, N-부틸-디옥시노지리마이신)과 함께 조합시킴으로써 개선될 수 있다. 아래의 실시예는, 우수하게 표적화된 본 발명의 rhGAA를 샤페론과 조합하여 투여한 GAA-넉아웃 마우스의 주요 골격근에서 글리코겐 기질이 현저하게 감소했음을 보여준다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 rhGAA를 생산하는 CHO 세포 또는 이의 유도체 또는 다른 균등물에 관한 것이다. 이러한 CHO 세포주의 일례는 본원에 기술된 바와 같은 rhGAA 조성물을 생산하는 GA-ATB-200 또는 이의 계대배양물이다. 이러한 CHO 세포주는 GAA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 유전자의 다수의 복제물, 예컨대 5, 10, 15 또는 20개 이상의 복제물을 함유할 수 있다.
ATB-200 rhGAA와 같이 본 발명의 고 M6P 및 비스-M6P rhGAA는 GAA를 암호화하는 DNA 작제물로 CHO 세포(중국 햄스터 난소 세포)를 형질전환시킴으로써 생산될 수 있다. CHO 세포가 이전에 rhGAA의 제조에 사용되었지만, 형질전환된 CHO 세포가 CIMPR을 표적화하는 M6P 및 비스-M6P 글리칸을 높은 함량으로 갖는 rhGAA를 생산하도록 배양되고 선별될 수 있다는 것이 인정되지 않았다.
놀랍게도, 본 발명자들은 CHO 세포주를 형질전환시키고, CIMPR을 표적화하는 M6P 또는 비스-M6P를 함유하는 높은 함량의 글리칸을 함유하는 rhGAA를 생산하는 형질전환체를 선별하고, 이러한 고-M6P rhGAA를 안정적으로 발현시키는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 관련된 양태는 이러한 CHO 세포주를 제작하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 GAA 또는 GAA 변이체를 암호화하는 DNA로 CHO 세포를 형질전환시키고, GAA를 암호화하는 DNA가 이의 염색체내에 안정적으로 통합되어 GAA를 안정적으로 발현하는 CHO 세포를 선별하고, M6P 또는 비스-M6P를 함유하는 높은 함량의 글리칸을 갖는 GAA를 발현하는 CHO 세포를 선별하고, 임의적으로 높은 시알산 함량을 갖는 N-글리칸 및/또는 낮은 비-인산화된 고-만노스 함량을 갖는 N-글리칸을 갖는 CHO 세포를 선별하는 것을 포함한다.
이러한 CHO 세포주는 CHO 세포주를 배양하고 CHO 세포 배양물로부터 rhGAA 조성물을 회수함으로써 본 발명에 따른 rhGAA 및 rhGAA 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 rhGAA 조성물 또는 이의 분획물 또는 유도체는 rhGAA 조성물을 투여함으로써 불충분한 리소좀 GAA와 관련된 증상, 장애 또는 질환을 가진 대상을 치료하는 데에 유리하게 사용된다. 치료가 필요한 대상은 글리코겐 저장 질환 유형 II(폼페병)뿐만 아니라 rhGAA의 투여로부터 이익을 얻는 다른 증상, 장애 또는 질환을 가진 대상을 포함한다.
아래의 실시예는 본 발명의 rhGAA(ATB-200)가 종래의 rhGAA 제품보다 현저하게 낮은 투여량으로 투여된 경우, 골격근 세포에 의해 흡수되고, CIMPR에 결합하고, 글리코겐을 골격근 세포로부터 효과적으로 제거함을 보여준다. GAA-넉아웃 마우스에 ATB-200을 격주로 정맥내 투여함으로써 골격근 근섬유에서 75% 이하의 글리코겐 감소가 달성되었다. 이러한 감소는 동일한 투여량의 루미자임®에 의해 제공된 감소를 초과하며, 이는 M6P 및 비스-M6P를 함유하는 증가된 함량의 N-글리칸을 갖는 본 발명의 rhGAA가 글리코겐 기질을 우수하게 감소시킴을 보여준다. 개선된 표적화로 인해, 본 발명의 rhGAA 조성물의 약력학 및 약물동태학은 루미자임® 또는 마이오자임®과 같은 종래의 rhGAA 제품보다 낮은 투여량으로 투여될 수 있다.
이는 글리코겐을 심장근, 평활근 또는 횡문근으로부터 분해, 감소 또는 제거하는데 사용될 수 있다. 치료 대상의 골격근 또는 횡문근의 예는, 새끼벌림근(발), 새끼벌림근(손), 엄지벌림근, 짧은엄지벌림근, 긴엄지벌림근, 짧은모음근, 엄지모음근(adductor halluces), 긴모음근, 큰모음근, 엄지모음근(adductor pollicis), 팔꿈치근, 팔꿈관절근, 무릎관절근, 모뿔덮개근, 아리요다니쿠스(aryjordanicus), 이개근, 위팔두갈래근, 넙다리두갈래근, 위팔근, 위팔노근, 볼근, 망울해면체근, 아래인두수축근, 중간인두수축근, 위인두수축근, 부리위팔근, 눈썹주름근, 고환올림근, 환상 갑상근, 음낭근, 깊은 횡회음근, 삼각근, 입꼬리내림근, 아래입술내림근, 가로막근, 턱두힘살근, 턱두힘살근(앞쪽), 척주세움근-가시근, 척추세움근-엉덩갈비근, 척추세움근-가장긴근, 짧은노쪽손목폄근, 긴노쪽손목폄근, 자쪽손목폄근, 새끼폄근(손), 손가락폄근(손), 짧은발가락폄근(발), 긴발가락폄근(발), 긴엄지폄근, 집게폄근, 짧은엄지폄근, 긴엄지폄근, 외복사근, 노쪽손목굽힘근, 자쪽손목굽힘근, 짧은새끼굽힘근(발), 짧은새끼굽힘근(손), 짧은발가락굽힘근, 긴발가락굽힘근(발), 깊은손가락굽힘근, 얕은손가락굽힘근, 짧은엄지굽힘근(flexor hallucis brevis), 긴엄지굽힘근(flexor hallucis longus), 짧은엄지굽힘근(flexor pollicis brevis), 긴엄지굽힘근(flexor pollicis longus), 전두근, 장딴지근, 아래쌍둥근, 위쌍둥근, 턱끝혀근, 턱끝목뿔근, 큰볼기근, 중간볼기근, 작은볼기근, 두덩정강근, 목뿔혀근, 엉덩근, 아래빗근, 아래곧은근, 가시아래근, 외늑간근, 최내늑간근, 내늑간근, 내복사근, 손등뼈사이근, 발등뼈사이근, 손바닥뼈사이근, 발바닥뼈사이근, 가시사이근, 가로돌기사이근, 혀내재근, 궁둥해면체근, 가쪽반지모뿔근, 가쪽날개근, 가쪽곧은근, 넓은등근, 입꼬리올림근, 항문올림근-꼬리근, 항문올림근-엉덩꼬리근, 항문올림근-두덩꼬리근, 항문올림근- 두덩곧창자근, 항문올림근-두덩질근, 위입술올림근, 위입술올림근, 위입술콧방울올림근, 눈꺼풀올림근, 어깨올림근, 입천장올림근, 갈비올림근, 머리긴근, 목긴근, 발 충양근(4), 손 충양근, 교근, 안쪽날개근, 안쪽곧은근, 턱끝근, 목젖근, 턱목뿔근, 비근, 빗모뿔근, 아래머리빗근, 위머리빗근, 바깥폐쇄근, 속폐쇄근(A), 속폐쇄근(B), 어깨목뿔근, 새끼맞섬근(손), 엄지맞섬근, 눈둘레근, 입둘레근, 입천장혀근, 입천장인두근, 짧은손바닥근, 긴손바닥근, 두덩근, 큰가슴근, 작은가슴근, 짧은종아리근, 긴종아리근, 셋째종아리근, 궁둥구멍근(A), 궁둥구멍근(B), 장딴지빗근, 넓은목근, 오금근, 뒤반지모뿔근, 눈살근, 네모엎침근, 원엎침근, 큰허리근, 작은허리근, 배세모근, 넙다리네모근, 허리네모근, 발바닥네모근, 배곧은근, 앞머리곧은근, 가쪽머리곧은근, 큰뒤머리곧은근, 작은머리뒤곧은근, 넙다리곧은근, 큰마름근, 작은마름근, 입꼬리당김근, 귀관인두근, 넙다리빗근, 앞목갈비근, 중간목갈비근, 작은목갈비근, 뒤목갈비근, 반막근, 반힘줄근, 앞톱니근, 아래뒤톱니근, 위뒤톱니근, 가자미근, 항문조임근, 요도조임근, 머리널판근, 목널판근, 등자근, 목빗근, 복장목뿔근, 복장방패근, 붓혀근, 붓목뿔근, 붓목뿔근(앞쪽), 붓인두근, 빗장밑근, 갈비밑근, 어깨밑근, 얕은샅가로근, 회음근, 위빗근, 위곧은근, 뒤침근, 가시위근, 관자근, 관자마루근, 넙다리근막긴장근, 고막긴장근, 입천장긴장근, 큰원근, 작은원근, 방패모뿔근과 성대근, 방패덮개근, 방패목뿔근, 앞정강근, 뒤정강근, 가로모뿔근, 가로돌기가시근-뭇갈래근, 가로돌기가시근-돌림근, 가로돌기가시근-반가시근, 배가로근, 가슴가로근, 등세모근, 삼두근, 중간넓은근, 가쪽넓은근, 안쪽넓은근, 큰광대근, 및 작은광대근으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 근육을 포함한다.
또한, 본 발명의 GAA 조성물은 유형 1(느린 연축) 근섬유 또는 유형 2(빠른 연축) 근섬유, 또는 이러한 근섬유에 글리코겐이 축적되어 있는 대상에 투여되거나 이를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 유형 1의 느린 연축, 또는 "적색" 근육은 모세혈관에 밀집되어 있고 미토콘드리아 및 미오글로빈이 풍부하여 근육 조직이 특유의 붉은 색을 띠게 한다. 이는 지방 또는 탄수화물을 연료로 사용하여 보다 많은 산소를 운반할 수 있고 호기성 활동을 유지할 수 있다. 느린 연축 섬유는 장기간 동안 수축하지만 힘은 거의 없다. 유형 2의 빠른 연축 근육은 수축 속도 및 생성되는 힘 모두 다양한 3종의 주요 아형(IIa, IIx 및 IIb)을 가진다. 빠른 연축 섬유는 빠르고 강력하게 수축하지만 피로는 매우 신속하게 일어나므로, 근수축이 고통스러워지기 전 혐기성의 폭발적인(burst) 활동이 짧게만 지속된다. 빠른 연축 섬유는 근력에 가장 많이 기여하고 질량이 증가할 가능성이 보다 크다. 유형 IIb는 미토콘드리아 및 미오글로빈에서 가장 밀도가 낮은 혐기성의 당분해성 "백색" 근육이다. 소형동물(예컨대, 설치류)에서, 이는 주요 빠른 근육 유형이며, 이들 살에 창백한 색을 띠게 한다.
본 발명의 rhGAA 조성물, 이의 분획물 또는 유도체는, 예컨대 정맥내(IV) 주입에 의해 전신적으로 투여될 수 있거나, 목적하는 부위내로, 예컨대 심장근 또는 골격근내로, 예컨대 사두근, 삼두근 또는 가로막근에 직접 투여될 수 있다. 이는 근세포, 특정 근육 조직, 근육 또는 근육 군에 투여될 수 있다. 예컨대, 이러한 치료는 rhGAA 조성물을 대상의 사두근 또는 삼두근 또는 가로막근에 근육내로 직접 투여할 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명의 rhGAA 조성물, 이의 분획물 또는 유도체는 rhGAA 투여의 약물동태학을 개선하기 위해 AT-2220(두보글루스타트　 HCl, 1-디옥시노지리마이신) 또는 AT-2221(마이글루스타트, N-부틸-디옥시노지리마이신) 및 이의 염과 같은 샤페론과 복합화되거나 혼합될 수 있다. rhGAA와 샤페론은 함께 또는 개별적으로 투여될 수 있다. 동시에 투여된 경우, 조성물 중의 GAA는 샤페론과 함께 사전충진(preload)될 수 있다. 다르게는, GAA와 샤페론은 동시에 또는 다른 시간에 개별적으로 투여될 수 있다.
AT2221의 대표적인 투여량은 0.25 내지 400 mg/kg, 바람직하게는 0.5 내지 200 mg/kg, 가장 바람직하게는 2 내지 50 mg/kg이다. AT2221의 특정 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 및 50 mg/kg을 포함한다. 이러한 투여량은 ATB-200 rhGAA와 같은 rhGAA와 rhGAA에 대한 AT2221의 몰 비 15:1 내지 150:1로 조합될 수 있다. 특정 비율은 15:1, 20:1, 25:1, 50:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 100:1, 125:1 및 150:1을 포함한다. rhGAA와 AT2221은 이러한 양 또는 몰 비로 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 병용투여될 수 있다. 위의 범위는 범위 끝점 사이의 모든 중간 하위범위 및 중간 값, 예컨대 모든 정수 값을 포함한다.
AT2220의 대표적인 투여량은 0.1 내지 120 mg/kg, 바람직하게는 0.25 내지 60, 가장 바람직하게는 0.6 내지 15 mg/kg이다. AT2220의 특정 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 및 30 mg/kg을 포함한다. 이러한 투여량은 ATB-200 rhGAA와 같은 rhGAA와 rhGAA에 대한 AT2220의 몰 비 15:1 내지 150:1로 조합될 수 있다. 특정 비율은 15:1, 20:1, 25:1, 50:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 100:1, 125:1 및 150:1을 포함한다. rhGAA와 AT2220은 이러한 양 또는 몰 비로 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 병용투여될 수 있다. 위의 범위는 범위 끝점 사이의 모든 중간 하위범위 및 중간값, 예컨대 모든 정수 값을 포함한다.
또한, 본 발명의 rhGAA 조성물, 이의 분획물 또는 유도체는 조직, 근육, 근섬유, 근세포, 리소좀, 세포소기관, 세포 구획(cellular compartment) 또는 세포질에서 글리코겐을 대사하거나, 분해하거나, 제거하거나 다른 방식으로 감소시키기 위해 사용될 수 있다. rhGAA 조성물을 대상에 투여함에 있어서, 임의적으로 샤페론 또는 rhGAA에 대한 면역 반응을 감소시키는 약물과 함께 투여될 수 있다.
이의 용법의 다른 구현예에서, 본 발명의 rhGAA는, rhGAA, 이의 분획물 또는 유도체를 세포, 조직 또는 이러한 조절이 필요한 대상에게 임의적으로 샤페론과 조합하거나 임의적으로 또 다른 표적화 모이어티와의 접합체로서 투여함으로써 세포에서 리소좀 증식, 자가포식작용 또는 외포작용을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 자가포식작용은 세포로 하여금 글리코겐 또는 기타 불필요하거나 장애가 있는 세포 성분을 리소좀 작용을 통해 분해하도록 하는 이화작용 메커니즘이다. 또한, 이러한 방법은 치료가 필요한 대상에 GAA 조성물을 전신적으로 또는 국소적으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
루미자임® 및 마이오자임에 비해 모노-M6P 및 비스-M6P가 풍부하고 이의 당화 패턴에 의해 부여된 유리한 약물동태학적 특성을 가진 본 발명에 따른 rhGAA는 또한 복합 탄수화물 분해가 필요한 다른 증상, 예컨대 rhGAA에 의해 분해된 글리코겐 또는 기타 탄수화물이 리소좀 또는 세포의 다른 부분, 예컨대 rhGAA가 접근할 수 있는 세포질 내에 축적된 기타 장애, 예컨대 글리코겐 저장 질환 III을 치료하는데 사용될 수 있다. 이는 또한 비치료적인 목적, 예컨대, 전분 및 글리코겐과 같은 복합 탄수화물을 이의 단량체로 분해할 필요가 있는 식품, 음료, 화학물질 및 약제품의 생산에 사용될 수 있다.
실시예
다음의 비제한적인 실시예가 본 발명의 양태를 예시한다.
섹션 I: ATB-200 rhGAA 및 이의 특성
종래 마이오자임 ® 및 루미자임 ® rhGAA 제품의 한계
현재 폼페병 치료를 위해 유일하게 승인된 치료제인 마이오자임® 및 루미자임® 중의 rhGAA 능력을 평가하기 위해, 이러한 rhGAA 제제를 CIMPR 컬럼상에 주사하고(이는 M6P 기를 가진 rhGAA에 결합함), 이어서 유리 M6 구배로 용리시켰다. 분획물을 96-웰 플레이트에 수집하고 GAA 활성을 4MU-α-글루코스 기질로 검정하였다. 결합 및 비결합된 rhGAA의 상대적인 양을 GAA 활성에 기초하여 판단하고 총 효소 중의 분율로서 보고하였다.
도 5는 종래 ERT(마이오자임® 및 루미자임®)와 관련된 문제점을 설명한다: 마이오자임® 중의 73%의 rhGAA(도 5b) 및 루미자임® 중의 78%의 rhGAA(도 5a)가 CIMPR에 결합하지 않았다(각 도면의 가장 왼쪽 피크를 참조). 오직 마이오자임® 중의 27%의 rhGAA 및 루미자임® 중의 22%의 rhGAA만이 근육 세포에서 이를 CIMPR로 생산적으로 표적화할 수 있는 M6P를 함유하였다(생산적인 약물 표적화 및 비-생산적인 약물 제거를 설명하는 도 2를 참조).
마이오자임® 및 루미자임®의 유효량은 근육 세포에서 CIMPR을 표적화하는 M6P를 함유하는 rhGAA의 양에 상응한다. 그러나, 이러한 2종의 종래 제품 중의 대부분의 rhGAA는 표적 근육 세포에서 CIMPR 수용체를 표적화하지 않는다. 대부분의 rhGAA가 근육 세포를 표적화하지 않는 종래의 rhGAA의 투여는 비-표적화된 rhGAA에 대한 알러지 반응 또는 면역 유도에 대한 위험을 증가시킨다.
고 함량의 모노- 또는 비스-M6P-함유 N-글리칸을 갖는 ATB-200 rhGAA를 생산하는 CHO 세포의 제조
rh-GAA를 발현하는 DNA로 CHO 세포를 형질감염시킨 후 rhGAA를 생산하는 형질전환체를 선별하였다. rh-GAA를 암호화하는 DNA로 CHO 세포를 형질전환시키기 위한 DNA 작제물이 도 5에 나타나 있다. rh-GAA를 발현하는 DNA로 CHO 세포를 형질감염시킨 후 rhGAA를 생산하는 형질전환체를 선별하였다.
형질감염시킨 후에, 안정적으로 통합된 GAA 유전자를 함유하는 DG44 CHO (DHFR-) 세포를 하이포잔틴/티미딘 결핍(-HT) 배지로 선별하였다. 메토트렉세이트(MTX, 500 nM)로 처리하여 이러한 세포에서 GAA 발현 증폭을 유도시켰다. 많은 양의 GAA를 발현하는 세포 풀(pool)을 GAA 효소 활성 검정법으로 확인하고, rhGAA를 생산하는 개별적인 클론으로 확립하는데 사용하였다. 개별적인 클론을 반고체 배지 플레이트상에서 생산하고, 클론픽스(ClonePix) 시스템으로 피킹(picking)하고, 24-딥 웰 플레이트로 옮겼다. 개별적인 클론을 GAA 효소 활성에 대해 검정하여 GAA를 높은 수준으로 발현하는 클론을 확인하였다. GAA 활성을 판단하기 위한 조건화된 배지는 4-MU-α-글루코시다제 기질을 사용하였다. GAA 효소 검정법에 의해 측정한 바와 같이 보다 높은 수준의 GAA를 생산하는 클론을 생존력, 성장능, GAA 생산성, N-글리칸 구조 및 안정한 단백질 발현에 대해 추가로 평가하였다. 향상된 모노-M6P 또는 비스-M6P N-글리칸을 갖는 rhGAA를 발현하는, CHO 세포주 GA-ATB-200을 포함하는 CHO 세포주를 이러한 방법을 사용하여 단리하였다.
rhGAA ATB-200 rhGAA의 정제
본 발명에 따른 rhGAA의 다수의 배치를 CHO 세포주 GA-ATB-200을 사용하여 진탕 플라스크 및 관류 생물반응기에서 생산하고 CIMPR 결합을 측정하였다. 도 6b 및 도 7에 나타난 것과 유사한 CIMPR 수용체 결합(약 70%)이 상이한 생산 배치로부터 정제된 ATB-200 rhGAA에 대해 관찰되었고, 이는 ATB-200 rhGAA가 일관되게 생산될 수 있음을 나타낸다. 도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 마이오자임® 및 루미자임® rhGAA는 ATB-200 rhGAA에 비해 현저히 낮은 CIMPR 결합을 나타냈다.
ATB-200과 루미자임의 분석 비교
ATB-200 rhGAA를 말단 인산염에 따라 분획화하기 위해 약한 음이온 교환("WAX") 액체 크로마토그래피를 사용하였다. 용리 프로파일을 염의 양을 증가시켜 ERT를 용리함으로써 생성하였다. 이 프로파일을 UV(A280nm)로 모니터링하였다. ATB-200 rhGAA를 CHO 세포로부터 수득하고 정제하였다. 루미자임®을 상업적인 공급원으로부터 수득하였다. 루미자임®은 이의 용리 프로파일의 좌측상에 높은 피크를 나타냈다. ATB-200 rhGAA은 루미자임®의 오른쪽으로 용리되는 4개의 현저한 피크를 나타냈다(도 8). 이는 ATB-200 rhGAA가 루미자임®보다 많은 정도로 인산화되었음을 확인시켜주는데, 그 이유는 이러한 평가가 CIMPR 친화도가 아닌 말단 전하에 의한 것이기 때문이다.
ATB-200 rhGAA의 올리고사카라이드 특성분석
정제된 ATB-200 rhGAA 및 루미자임® 글리칸을 말디-토프(MALDI-TOF)로 평가하여 각 ERT에서 발견된 개별적인 글리칸의 구조를 판단하였다(도 9). ATB-200 샘플은 루미자임®보다 약간 적은 양의 비-인산화된 고-만노스형 N-글리칸을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 루미자임에서에 비해 ATB-200에서 보다 높은 함량의 M6P 글리칸이 ATB-200 rhGAA를 근육 세포로 보다 효율적으로 표적화한다. 말디에 의해 판단된 높은 백분율의 모노-인산화된 구조 및 비스-인산화된 구조는 CIMPR 수용체에 대한 ATB-200의 현저하게 많은 결합을 설명하는 CIMPR 프로파일과 일치한다. 말디-토프 질량 분석법을 통한 N-글리칸 분석으로 평균적으로 각 ATB200 분자가 하나 이상의 천연 비스-M6P N-글리칸 구조를 함유함을 확인하였다. 이와 같이 ATB-200 rhGAA에서 보다 높은 비스-M6P N-글리칸 함량은 M6P 수용체 플레이트 결합 검정에서 CIMPR에 대한 고친화도 결합(KD 약 2 내지 4 nM)과 직접적으로 연관성이 있었다(도 10a).
ATB-200의 CIMPR 친화도 특성분석
CIMPR에 결합할 수 있는 rhGAA의 백분율을 높이는 것 외에, 이의 상호작용의 질에 대해 이해하는 것이 중요하다. 루미자임® 및 ATB200 rhGAA 수용체 결합을 CIMPR 플레이트 결합 검정법을 사용하여 판단하였다. 요컨대, GAA를 포획하기 위해 CIMPR이 코팅된 플레이트를 사용하였다. 다양한 농도의 rhGAA를 고정화된 수용체에 도포하고, 결합하지 않은 rhGAA를 씻어냈다. 남아있는 rhGAA의 양을 GAA 활성으로 판단하였다. 도 10a에 도시된 바와 같이, 루미자임에 비해 ATB-200 rhGAA가 CIMPR에 현저하게 보다 잘 결합하였다.
도 10b는 종래의 rhGAA인 루미자임 및 본 발명에 따른 ATB-200 중의 비스-M6P 글리칸의 상대적인 함량을 보여준다. 루미자임®은 평균적으로 10%의 분자만이 비스-인산화된 글리칸을 갖는다. 이를 평균적으로 모든 rhGAA 분자에 하나 이상의 비스-인산화된 글리칸을 갖는 ATB-200과 비교하도록 한다.
ATB-200 rhGAA는 루미자임보다 섬유아세포에 의해 보다 효율적으로 내재화되었음
ATB-200 및 루미자임® rhGAA의 상대적인 세포 흡수를 정상 및 폼페 섬유아세포 세포주를 사용하여 비교하였다. 5 내지 100 nM의 본 발명에 따른 ATB-200 rhGAA를 10 내지 500 nM의 종래의 rhGAA 루미자임®과 비교하였다. 16시간 동안 배양시킨 후에, 외부 rhGAA를 트리스(TRIS) 염기로 불활성화시키고 회수하기 전에 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 내재화된 GAA를 4MU-α-글루코시드 가수분해로 측정하고 총 세포 단백질에 대해 상대적인 그래프로 나타내고 이의 결과를 도 11에 나타냈다.
또한, ATB-200 rhGAA는 세포내에 효율적으로 내재화되는 것으로 밝혀졌다(도 11a 및 도 11b 각각은 ATB-200 rhGAA가 정상 및 폼페 섬유아세포 모두에 내재화되고, 종래의 루미자임® rhGAA보다 큰 정도로 내재화됨을 보여준다). ATB-200 rhGAA는 세포 수용체를 약 20 nM로 포화시키는 반면, 약 250 nM의 루미자임®이 요구된다. 이러한 결과로부터 외삽된 흡수 효율 상수(K흡수)는 도 11c에 도시된 바와 같이 ATB-200의 경우 2 내지 3 nM이고, 루미자임®의 경우 56 nM이다. 이러한 결과는 ATB-200 rhGAA가 폼페병에 우수하게 표적화된 치료제임을 시사한다.
섹션 II: 전임상 연구
GAA 넉아웃 마우스의 골격근에서 글리코겐 제거에 있어 우수한 당화를 갖는 ATB-200 rhGAA는 ERT 표준 치료보다 현저하게 더 우수하였음
앞서 언급한 바와 같이, 재조합 인간 GAA(rhGAA)를 사용하는 효소 대체 요법(ERT)은 폼페병에 대해 유일하게 승인된 치료법이다. 이러한 ERT는 세포 흡수 및 세포 표면의 양이온-독립적인 M6P 수용체(CIMPR)를 통한 리소좀으로의 후속적 전달을 위해 특화된 탄수화물인 만노스 6-인산염(M6P)을 필요로 한다. 그러나, 현재의 rhGAA ERT는 적은 양의 M6P를 함유하여 질병과 관련된 조직에서 약물 표적화 및 효능을 제한한다. 본 발명자들은, 개선된 약물 표적화를 위해 종래의 rhGAA보다 우수한 당화 및 높은 M6P 함량, 특히 고친화성 비스-M6P N-글리칸 구조를 갖는 rhGAA(ATB-200 rhGAA로 명명됨)를 생산하는 생산 세포주 및 제조공정을 개발하였다. ATB-200 rhGAA는 CIMPR에 높은 친화도(KD 약 2 내지 4 nM)로 결합하고, 폼페 섬유아세포 및 골격근 근섬유에 효율적으로 내재화되었다(K흡수 약 7 내지 14 nM).
ATB-200 rhGAA는 골격근에서 루미자임®보다 글리코겐을 현저하게 더 우수하게 제거한다. GAA 넉아웃 마우스에서 글리코겐 제거에 대한 루미자임® 및 ATB-200 rhGAA의 투여 효과를 평가하였다. 동물에 2회의 정맥 볼루스 주사로 투여하였다(격주로); 마지막 투여 후 2주 후에 조직을 회수하고 GAA 활성 및 글리코겐 함량을 분석하였다(도 12). ATB-200 rhGAA 및 루미자임® rhGAA가 심장에서 글리코겐 제거에 있어 동등하게 효과적이었다(도 12a). 도 12b 및 도 12c에 나타난 바와 같이, 골격근에서 글리코겐 감소를 위한 5 mg/kg의 ATB-200 rhGAA는 20 mg/kg의 루미자임® rhGAA와 동등했고; 골격근에서 글리코겐 제거를 위한 10 및 20 mg/kg 투여량의 ATB-200은 루미자임®보다 현저히 우수하였다.
ATB-200 rhGAA와 AT2221의 병용투여에 대한 이론적 근거(차트(CHART) 기술)
샤페론은 rhGAA ERT에 결합하여 이를 안정화시키고, 활성 효소가 조직 내로 흡수되는 것을 증가시키고, 내약성을 향상시키고, 잠재적으로 면역원성을 완화시킨다. 앞서 보여준 바와 같이, 악조건 하에 ERT의 단백질 안정성이 차트(CHARTTM)를 사용하여 실질적으로 개선되었다. 차트(CHRT): 샤페론-진보된 대체 요법(chaperone-advanced replacement therapy). 참조로써 포함된 http://_www.amicusrx.com/chaperone.aspx(2015년 9월 22일 마지막 접속함)를 참조한다. 도 13a 및 도 13b에 나타난 바와 같이, ATB-200의 안정성이 AT2221(마이글루스타트, N-부틸-디옥시노지리마이신)에 의해 현저히 향상되었다. rhGAA 단백질 접힘을 중성(pH 7.4 - 혈장 환경) 또는 산성(pH 5.2 - 리소좀 환경) 완충액에서 열 변성에 의해 37℃에서 모니터링하였다. 중성의 pH 완충액에서 24시간에 걸쳐 AT2220이 rhGAA 단백질을 안정화시켰다.
마이오자임 ® 과 AT2221(마이글루스타트)의 병용투여와 ATB-200 rhGAA와 마이글루스타트의 병용투여 비교
12주령의 GAA 넉아웃 마우스를 루미자임® 또는 ATB-200으로, 20 mg/kg의 격주로 4회 정맥주사하여 처리하고; 지시된 대로 rhGAA를 투여하기 30분 전에 10 mg/kg의 마이글루스타트를 경구로 병용투여하였다. 글리코겐을 측정하기 위해 마지막 효소 투여 후 14일에 조직을 수집하였다. 도 14는 대퇴사두근 및 삼두근 골격근에서 글리코겐의 상대적인 감소를 나타낸다.
약리학적 샤페론 AT2221(마이글루스타트)와 병용투여된 ATB-200 rhGAA에 의한 조직 글리코겐 감소
약리학적 샤페론과 ATB-200 rhGAA의 조합이 체내에서 글리코겐 제거를 향상시킴이 밝혀졌다. GAA 넉아웃 마우스에 20 mg/kg의 rhGAA를 격주로 2회 정맥 볼루스 주사로 투여하였다. rhGAA를 투여하기 30분 전에 약리학적 샤페론 AT2221을 0, 1, 2 및 10 mg/kg의 투여량으로 경구투여하였다. 마지막 ERT 투여 후 2주 후에 조직을 회수하고 GAA 활성, 글리코겐 함량 세포 특이적인 글리코겐 및 리소좀 증식에 대해 분석하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, ATB200+샤페론 AT2221이 투여된 동물은 대퇴사두근에서 향상된 글리코겐 제거를 보였다. ATB-200 rhGAA(20 mg/kg)가 동일한 투여량의 루미자임®보다 더 많이 글리코겐을 감소시켰으며, ATB-200 rhGAA가 10 mg/kg의 AT2220과 조합되었을 경우 근육에서 글리코겐이 정상 수준에 가까이 이르렀다.
도 16a 및 도 16b에 나타난 바와 같이, 제한적인 글리코겐 감소(풍부한 점 모양의 PAS 신호로 나타남)를 나타내는 종래의 rhGAA와는 달리, 단독의 ATB-200 rhGAA는 PAS 신호의 현저한 감소를 나타냈다. 10 mg/kg의 마이글루스타트와 병용투여하는 것은 기질에서 추가의 실질적인 감소를 가져왔다. 투과전자현미경(TEM)은 리소좀에서 대부분의 글리코겐이 점 모양의 PAS 신호에 상응하는, 막에 결합된 전자-밀집된 물질로서 존재함을 나타냈다. ATB-200 rhGAA와 마이글루스타트의 병용투여는 기질-함유 리소좀의 수, 크기 및 밀도를 감소시키며, 이는 ATB-200 rhGAA가 근육 세포로의 표적화된 전달 및 리소좀으로의 후속적 전달을 시사한다.
위에 제시된 연구(격주로 2회 정맥 볼루스 주사)에서, 조직을 LAMP 1 마커를 사용하여 리소좀 증식을 위해 처리하였으며, 상향 조절(up-regulation)은 폼페병의 또 다른 특징이다. LAMP: 리소좀-관련된 막 단백질(lysosome-associated membrane protein). 위에 제시된 연구(격주로 2회 정맥 볼루스 주사)에서, 인접한 절편에서 LAMP 1 염색 및 인접한 절편에서 유형 I 섬유 특이적인 항체(NOQ7.5.4D)에 대해, 가자미근(soleus) 조직을 처리하였다(도 16c 및 도 16d). ATB-200 rhGAA은 종래 rhGAA보다 LAMP 1이 보다 실질적으로 감소하여, 야생형 동물에서 나타나는 수준으로 감소하였다(도 16c).
또한, 효과가 유형 I 섬유(느린 연축, 별표로 표시됨)에 대부분 제한되어있는 rhGAA와는 달리, ATB-200 rhGAA는 또한 유형 II(빠른 연축) 섬유(적색 화살표 머리) 분획에서도 상당한 LAMP1 신호 감소를 가져왔다(도 16d). 중요하게도, 마이글루스트와 병용투여는 대부분의 유형 II 섬유에서 LAMP 1 증식의 ATB-200-매개된 감소를 추가로 향상시켰다(도 16c 및 도 16d). 결과적으로, LAMP1 신호 수준에서 현저한 섬유 유형별-특이적인 차이는 나타나지 않았다. 유사한 결론이 대퇴사두근 및 가로막근에서 나타났다(데이터 미제시).
별도의 유사하게 고안된 연구에서, ATB-200 ± AT2221의 효과를 4회의 격주 간격의 정맥 볼루스 주사로 보다 장기간에 걸쳐 시험하였다. 심장에서, 심근세포에서 주요 글리코겐 저장은 rhGAA 또는 ATB-200 중 어느 하나를 반복 투여함으로써 야생형 동물에서 나타나는 수준까지 용이하게 제거되었다(도 17a). 그러나, 심장 평활근 세포에서 기질은 바람직하게는 ATB-200 rhGAA에 의해 제거된 것으로 보이며, 이는 rhGAA에 비해 ATB-200이 잠재적으로 더 넓게 생체 분포됨을 시사한다(별표는 심혈관의 내관(lumen)을 나타낸다). 중요하게도, 마이글루스타트와 병용투여는 LAMP 1 증식의 ATB-200-매개된 감소를 추가로 향상시켰다.
이러한 결과는 ATB-200 rhGAA의 N-글리칸에 보다 높은 수준의 M6P 및 비스-M6P를 가지는 ATB-200 rhGAA가 골격근에서 CIMPR을 효과적으로 표적화함을 보여준다. 또한, ATB-200 rhGAA는 체내에서 비-생산적 제거를 최소화하는 우수하게-처리된 복합형 N-글리칸을 가지고, 이의 체내 사용에 유리한 약물동태학적인 특성을 가지고, 체내에서 주요 근육 조직으로 우수하게 표적화 한다. 이는 또한 근육 조직에서 글리코겐 감소에 있어 ATB-200 rhGAA가 종래 표준 치료인 루미자임보다 우수함을 보여주고, ATB-200 rhGAA와 샤페론 AT2221과의 조합이 표적 조직에서 글리코겐 제거를 추가로 향상시키고 근육 병리학을 개선시킴을 보여준다.
SEQUENCE LISTING <110> AMICUS THERAPEUTICS GOTSCHALL, Russell DO, Hung <120> HIGHLY POTENT MODIFIED ACID ALPHA-GLUCOSIDASE WITH ENHANCED CARBOHYDRATES <130> 442420WO <150> US 62/135,345 <151> 2015-03-19 <150> US 62/112,643 <151> 2015-02-05 <150> US 62/057,847 <151> 2014-09-30 <150> US 62/057,842 <151> 2014-09-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 952 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(952) <223> Sequence 4 from patent US 8592362GenBank: AHE24104.1 <400> 1 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 30 His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val 35 40 45 Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly 50 55 60 Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr 65 70 75 80 Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly 290 295 300 Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met 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Gly 930 935 940 Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 945 950 <210> 2 <211> 3624 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (220)..(3078) <223> H.sapiens GAA mRNA for lysosomal alpha-glucosidase (acid maltase); GenBank: Y00839.1 <400> 2 cagttgggaa agctgaggtt gtcgccgggg ccgcgggtgg aggtcgggga tgaggcagca 60 ggtaggacag tgacctcggt gacgcgaagg accccggcca cctctaggtt ctcctcgtcc 120 gcccgttgtt cagcgaggga ggctctgggc ctgccgcagc tgacggggaa actgaggcac 180 ggagcgggcc tgtaggagct gtccaggcca tctccaacc atg gga gtg agg cac 234 Met Gly Val Arg His 1 5 ccg ccc tgc tcc cac cgg ctc ctg gcc gtc tgc gcc ctc gtg tcc ttg 282 Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys Ala Leu Val Ser Leu 10 15 20 gca acc gct gca ctc ctg ggg cac atc cta ctc cat gat ttc ctg ctg 330 Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu 25 30 35 gtt ccc cga gag ctg agt ggc tcc tcc cca gtc ctg gag gag act cac 378 Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His 40 45 50 cca gct cac cag cag gga gcc agc aga cca ggg ccc cgg gat gcc cag 426 Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln 55 60 65 gca cac ccc ggc cgt ccc aga gca gtg ccc aca cag tgc gac gtc ccc 474 Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro 70 75 80 85 ccc aac agc cgc ttc gat tgc gcc cct gac aag gcc atc acc cag gaa 522 Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu 90 95 100 cag tgc gag gcc cgc ggc tgc tgc tac atc cct gca aag cag ggg ctg 570 Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu 105 110 115 cag gga gcc cag atg ggg cag ccc tgg tgc ttc ttc cca ccc agc tac 618 Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr 120 125 130 ccc agc tac aag ctg gag aac ctg agc tcc tct gaa atg ggc tac acg 666 Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr 135 140 145 gcc acc ctg acc cgt acc acc ccc acc ttc ttc ccc aag gac atc ctg 714 Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu 150 155 160 165 acc ctg cgg ctg gac gtg atg 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ctg ttg atg gga gag cag ttt ctc gtc 3066 Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val 935 940 945 agc tgg tgt tag ccgggcggag tgtgttagtc tctccagagg gaggctggtt 3118 Ser Trp Cys 950 ccccagggaa gcagagcctg tgtgcgggca gcagctgtgt gcgggcctgg gggttgcatg 3178 tgtcacctgg agctgggcac taaccattcc aagccgccgc atcgcttgtt tccacctcct 3238 gggccggggc tctggccccc aacgtgtcta ggagagcttt ctccctagat cgcactgtgg 3298 gccggggcct ggagggctgc tctgtgttaa taagattgta aggtttgccc tcctcacctg 3358 ttgccggcat gcgggtagta ttagccaccc ccctccatct gttcccagca ccggagaagg 3418 gggtgctcag gtggaggtgt ggggtatgca cctgagctcc tgcttcgcgc ctgctgctct 3478 gccccaacgc gaccgcttcc cggctgccca gagggctgga tgcctgccgg tccccgagca 3538 agcctgggaa ctcaggaaaa ttcacaggac ttgggagatt ctaaatctta agtgcaatta 3598 ttttaataaa aggggcattt ggaatc 3624 <210> 3 <211> 952 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu 20 25 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Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys 85 90 95 Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro 100 105 110 Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser 130 135 140 Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe 145 150 155 160 Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu 180 185 190 Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu 195 200 205 Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg 210 215 220 Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe 225 230 235 240 Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr 245 250 255 Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser 260 265 270 Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly 275 280 285 Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly 290 295 300 Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val 305 310 315 320 Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile 325 330 335 Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln 340 345 350 Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly 355 360 365 Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr 370 375 380 Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val 385 390 395 400 Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe 405 410 415 Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His 420 425 430 Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser 435 440 445 Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg 450 455 460 Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val 465 470 475 480 Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu 485 490 495 Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe 500 505 510 Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly 515 520 525 Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val 530 535 540 Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser 545 550 555 560 Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly 565 570 575 Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly 580 585 590 Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg 595 600 605 Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu 610 615 620 Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro 625 630 635 640 Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu 645 650 655 Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg 660 665 670 Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser 675 680 685 Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala 690 695 700 Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly 705 710 715 720 Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser 725 730 735 Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile 740 745 750 Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro 755 760 765 Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly 770 775 780 Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser 785 790 795 800 Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val 805 810 815 His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr 820 825 830 Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr 835 840 845 Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser 850 855 860 Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala 865 870 875 880 Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly 885 890 895 Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala 900 905 910 Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr 915 920 925 Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly 930 935 940 Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys 945 950

Claims (1)

  1. 루미자임®(알글루코시다제 알파; CAS 420794-05-0)으로 예시되는 바와 같은 종래의 rhGAA에 비해 모노-만노스-6-인산염(M6P) 또는 비스-M6P를 갖는 N-글리칸을 함유하는 rhGAA를 보다 많은 양으로 함유하는, CHO 세포로부터 유래된 rhGAA 조성물을 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 폼페병의 치료를 필요로 하는 대상에서 폼페병을 치료하는 방법.
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