TW201829770A

TW201829770A - 用於治療fabry氏病之重組α-半乳糖苷酶A

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Publication number: TW201829770A
Application number: TW107100945A
Authority: TW
Inventors: 羅素哥特沙爾
Original assignee: 美商阿米庫斯醫療股份有限公司
Priority date: 2017-01-10
Filing date: 2018-01-10
Publication date: 2018-08-16
Also published as: EP3568152A1; US20190358302A1; JP2020503900A; US20230158123A1; WO2018132471A1; US11357834B2

Abstract

描述了包含具有獨特碳水化合物特徵的α-半乳糖苷酶A之組成物，以及用於製造和純化此類酶之方法。還描述了藉由將此類酶給予至對其有需要的受試者來治療、預防和/或改善Fabry氏病之方法。還描述了包含米加司他與此類α-半乳糖苷酶A的組合之組成物。

Description

用於治療Fabry氏病之重組α-半乳糖苷酶A

本發明的原理和實施方式總體上涉及溶體儲積症，特別是用於治療Fabry氏病之重組α-半乳糖苷酶A。

Fabry氏病係一種進行性的X-性聯的先天性醣神經鞘脂質代謝缺陷，係由作為α-Gal A基因（Gla）突變的結果的在溶酶體酶α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）方面的缺乏造成的。儘管是X-性聯障礙，女性可能表現出不同程度的臨床表現。Fabry氏病係一罕見疾病，發生率估計在40,000分之一的男性發病至117,000分之一的一般人群發病。此外，存在著可能在診斷標準以下的Fabry氏病的遲發表型的變體，因為它們沒有呈現出典型的體征和症狀。這種情況以及Fabry氏病的新生兒篩查，表明Fabry氏病的實際發病率可能高於目前的估計。

如果不治療，Fabry氏患者的預期壽命減少，通常在四十歲或五十歲左右由於影響腎臟、心臟和/或中樞神經系統的血管疾病而死亡。酶缺乏導致底物，球形三醯神經醯胺（GL-3），在全身血管內皮和內臟組織中的細胞內累積。由於醣神經鞘脂質沈積，腎功能逐步衰退和氮質血症的發展通常在生命的三十歲至五十歲時發生，但是也可能早在二十歲就發生。腎損傷在半合子（男性）和雜合子（女性）患者中都有發現。

Fabry氏病引起的心臟病發生在大多數男性和許多女性中。早期的心臟所見包括左心室增大、心瓣膜受累以及傳導異常。二尖瓣閉鎖不全係典型存在於兒童或青少年中的最常見的瓣膜損傷。腦血管表現主要來自多病灶小血管受累並且可能包括血栓、暫時性腦缺血、基底動脈缺血和動脈瘤、癲癇發作、偏癱、偏身麻木、失語症、迷路病症或腦出血。腦血管表現的平均發作年齡為33.8歲。可能隨著年齡增長而表現出人格改變和精神病行為。

Fabry氏病常常伴隨皮膚症狀出現，最常見的是血管角質瘤（可以存在於身體任何區域的小丘疹）。血管角質瘤表現為暗紅色或紫色皮膚損傷，尺寸範圍上至幾釐米直徑。損傷通常出現在青春期或成年早期，並可隨年齡增加。其他皮膚和軟組織相關症狀包括肢端感覺異常、流汗異常（少汗和多汗）和淋巴水腫。皮膚血管損傷的出現和程度可能與全身性疾病的嚴重性相關。

除皮膚症狀以外，患者常常經歷神經病變，諸如四肢灼痛（肢端感覺異常–常常是手和腳）。患者也可能經歷疼痛危象，始於四肢疼痛，並向內輻射，這可能持續幾天。神經性疼痛係由軀體感覺神經系統損傷造成的疼痛。許多類型的感覺感受器受到影響，包括皮膚、上皮組織、骨骼肌、骨和關節、內臟器官和心血管系統中的感覺感受器。

目前認可的Fabry氏病的治療為酶替代療法（“ERT”）。當前可用於治療Fabry氏病的有兩種α-Gal A產品：阿加糖酶（agalsidase）α（Replagal®，希雷人基因治療公司（Shire Human Genetic Therapies））和阿加糖酶β（Fabrazyme®；賽諾菲健贊公司（Sanofi Genzyme Corporation））。這兩種形式的ERT旨在用於靜脈給予重組酶形式來補償患者不足的α-Gal A活性。雖然ERT在許多情況下是有效的，這種治療還是有限制的。例如，沒有證實這兩種α-Gal A產品能充分減少中風的風險，心肌對治療反應緩慢，並且GL-3從腎臟的一些細胞類型中的消除受到限制。

因此，仍然需要對治療Fabry氏病的進一步改進。尤其是，本發明包括優於現有ERT的改良重組人類α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A），以及一種用具有藥理學伴護蛋白的改良酶治療有需要的患者之方法。

本發明的一個方面涉及一種人類重組α-半乳糖苷酶A （rhα-Gal A）。

在這個方面的各種實施方式中，rhα-Gal A包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白質，其中該rhα-Gal A具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸（單-M6P）的總N-聯寡糖和至少12%為雙-甘露糖-6-磷酸（雙-M6P）的總N-聯寡糖。在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有至少25%的含唾液酸的總N-聯寡糖。在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有少於20%為中性聚醣的總N-聯寡糖。

在這個方面的各種實施方式中，該rhα-Gal A包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白質，其中該rhα-Gal A具有少於10%為中性聚醣的總N-聯寡糖。在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有至少50%的含唾液酸的總N-聯寡糖。在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有至少25%為單-M6P的總N-聯寡糖和至少6%為雙-M6P的總N-聯寡糖。

在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有以下中的一種或多種： a) 至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖； b) 至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖； c) 至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或 d) 至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。

在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有以下中的兩種、三種或四種： a) 至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖； b) 至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖； c) 至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或 d) 至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。

在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有至少7莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。

在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有至少22%的含兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖。

在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A具有至少14%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。

本發明的另一方面涉及一種生產包含rhα-Gal A的重組蛋白產物之方法。在這個方面的各種實施方式中，該方法包括在分泌rhα-Gal A的生物反應器中培養中國倉鼠卵巢（CHO）宿主細胞，其中該rhα-Gal A包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白質；從該生物反應器去除培養基；將該培養基過濾以提供濾液；將該濾液載入到陰離子交換層析（AEX）柱上，以捕獲該rhα-Gal A；並且從該AEX柱上洗提包含該rhα-Gal A的第一蛋白產物。在一個或多個實施方式中，該第一蛋白產物係中間蛋白產物，它在變成最終蛋白產物（例如，適合用作ERT）之前經受進一步的加工和/或純化。在其他實施方式中，該第一蛋白產物係最終蛋白產物。

本發明的另一個方面涉及藉由本文所述方法而製得的重組蛋白產物。

本發明的另一個方面涉及一種治療Fabry氏病之方法，其中向對此有此需要的患者給予如本文所述的rhα-Gal A或包含如本文所述的rhα-Gal A的重組蛋白產物。

本發明的另一個方面涉及一種治療Fabry氏病之方法，其中向對此有此需要的患者給予如本文所述的rhα-Gal A或包含如本文所述的rhα-Gal A的重組蛋白產物。本發明的另一個方面涉及一種藥物組成物，其包含藥學上可接受的載體和如本文所述的rhα-Gal A或包含如本文所述的rhα-Gal A的重組蛋白產物。在一個或多個實施方式中，該藥物組成物包含約0.5至約20 µM rhα-Gal A和約50至約20,000 µM米加司他（migalastat）或其鹽。在一個或多個實施方式中，該藥物組成物包含約1至約10 µM rhα-Gal A和約100至約10,000 µM米加司他或其鹽。在一個或多個實施方式中，該米加司他和rhα-Gal A係以米加司他與α-半乳糖苷酶A在約13,000 : 1與約50 : 1之間的莫耳比存在。

本發明的另一個方面涉及一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括給予如本文所述的藥物組成物。在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg的劑量給予。

在一個或多個實施方式中，在給予rhα-Gal A或含重組蛋白產物的藥物組成物4小時內將α-Gal A的藥理學伴護蛋白共給予至患者。在一個或多個實施方式中，該藥理學伴護蛋白包括米加司他或其鹽。

在一個或多個實施方式中，該藥理學伴護蛋白係口服給予，並且包含rhα-Gal A的藥物組成物係靜脈內給予。

在一個或多個實施方式中，該藥理學伴護蛋白與該rhα-Gal A共同配製。在一個或多個實施方式中，該米加司他或其鹽係以約1 mg/kg至約100 mg/kg的劑量給予。

在一個或多個實施方式中，包含rhα-Gal A（和視情況的伴護蛋白，諸如米加司他）的藥物組成物係每月一次至每週一次給予。在一個或多個實施方式中，該藥物組成物係每隔一週給予。

本發明的另一個方面涉及一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括將包含如本文所述的rhα-Gal A和視情況的伴護蛋白（諸如米加司他）的藥物組成物給予至對其有需要的患者。

在一個或多個實施方式中，在給予包含rhα-Gal A的藥物組成物的4小時內將α-Gal A的藥理學伴護蛋白共給予至患者。

在一個或多個實施方式中，該米加司他或其鹽係以約1 mg/kg至約100 mg/kg的劑量給予。

在一個或多個實施方式中，該藥物組成物係每月一次至每週一次給予。

在一個或多個實施方式中，該藥物組成物係每隔一週給予。

在一個或多個實施方式中，該給予係使細胞與結合至該藥理學伴護蛋白的rhα-Gal A接觸。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的心臟中。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的腎臟中。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的皮膚中。

在一個或多個實施方式中，該藥理學伴護蛋白係鹽酸米加司他。

本發明的另一個方面涉及一種提高溶酶體中的α-半乳糖苷酶-A蛋白在哺乳動物細胞中的活性水平之方法，該方法包括使該哺乳動物細胞與如本文所述的rhα-Gal A接觸，其中該rhα-Gal A視情況結合至藥理學伴護蛋白。該rhα-Gal A係以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg的劑量給予。

在一個或多個實施方式中，將藥理學伴護蛋白與rhα-Gal A共同配製。

在一個或多個實施方式中，該藥物組成物係每隔一週給予。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的心臟中。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的腎臟中。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的皮膚中。

在一個或多個實施方式中，該接觸係藉由給予該rhα-Gal A和該藥理學伴護蛋白進行。

在一個或多個實施方式中，該給予係全身給予該藥理學伴護蛋白和該rhα-Gal A兩者。

在一個或多個實施方式中，共給予該藥理學伴護蛋白和該rhα-Gal A兩者。

在一個或多個實施方式中，該藥理學伴護蛋白和該rhα-Gal A包含被配製為用於靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹膜內給予的組成物。

在一個或多個實施方式中，該組成物被配製為用於靜脈內給予。

在一個或多個實施方式中，該藥理學伴護蛋白係米加司他或其鹽。

在一個或多個實施方式中，該藥物組成物包含：約0.5至約20 µM rhα-Gal A；和約50至約20,000 µM米加司他或其鹽。

在一個或多個實施方式中，該藥物組成物包含：約1至約10 µM rhα-Gal A；和約100至約10,000 µM米加司他或其鹽。

在一個或多個實施方式中，米加司他或其鹽與α-半乳糖苷酶A的比率在約13,000 : 1與約50 : 1之間。

在一個或多個實施方式中，該細胞係在體外。

在一個或多個實施方式中，該細胞係人類細胞。

在一個或多個實施方式中，該細胞在受試者中。

在一個或多個實施方式中，該受試者係有需要的患者。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的心臟、腎臟或皮膚中。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的心臟中。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的腎臟中。

在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的皮膚中。

在一個或多個實施方式中，該受試者已經被診斷為患有Fabry氏病。

本發明的另一個方面涉及一種降低有需要的患者的器官中GL-3水平之方法，該方法包括向該患者給予一種組成物，該組成物包含治療有效量的（i）藥理學伴護蛋白和（ii）如本文所述的rhα-Gal A。

在一個或多個實施方式中，該給予係藉由共給予進行。

在一個或多個實施方式中，其中該組合被配製為用於靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹膜內給予。

在一個或多個實施方式中，其中該組成物被配製為用於靜脈內給予。

在一個或多個實施方式中，其中該藥理學伴護蛋白係米加司他或其鹽。

在一個或多個實施方式中，該器官係心臟、腎臟或皮膚。

在一個或多個實施方式中，該器官係心臟。

在一個或多個實施方式中，該器官係腎臟。

在一個或多個實施方式中，該器官係皮膚。

本發明的另一個方面涉及一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括使哺乳動物細胞與有效量的rhα-Gal A接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少GL-3。

在一個或多個實施方式中，該接觸係向受試者給予有效量的rhα-Gal A。

在一個或多個實施方式中，該細胞在受試者中。

在一個或多個實施方式中，該受試者係有需要的患者。

在一個或多個實施方式中，在心臟組織中測量到GL-3減少。

在一個或多個實施方式中，在腎臟組織中測量到GL-3減少。

在一個或多個實施方式中，在皮膚組織中測量到GL-3減少。

在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A結合至藥理學伴護蛋白。

在一個或多個實施方式中，米加司他或其鹽的劑量係以3 mg/kg的劑量給予。

在一個或多個實施方式中，米加司他或其鹽的劑量係以10 mg/kg的劑量給予。

在一個或多個實施方式中，米加司他或其鹽的劑量係以30 mg/kg的劑量給予。

在一個或多個實施方式中，米加司他或其鹽的劑量係以300 mg/kg的劑量給予。

在一個或多個實施方式中，將rhα-Gal A和藥理學伴護蛋白共給予。

在一個或多個實施方式中，將rhα-Gal A和藥理學伴護蛋白共同配製。

在一個或多個實施方式中，向Gla敲除小鼠給予1 mg/kg劑量的rhα-Gal A比給予至少1 mg/kg劑量的阿加糖酶β更大程度地減少GL-3。

在一個或多個實施方式中，向Gla敲除小鼠給予10 mg/kg劑量的rhα-Gal A比給予至少10 mg/kg劑量的阿加糖酶β更大程度地減少GL-3。

在一個或多個實施方式中，向Gla敲除小鼠給予該藥物組成物後GL-3的減少比給予阿加糖酶β後GL-3的減少多至少10%。

在一個或多個實施方式中，向Gla敲除小鼠給予該藥物組成物後GL-3的減少比給予阿加糖酶β後GL-3的減少多至少20%。

本發明的另一個方面涉及一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括使哺乳動物細胞與有效量的rhα-Gal A接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少血漿溶血性Gb-3。

在一個或多個實施方式中，該細胞在受試者中。

在一個或多個實施方式中，該受試者係有需要的患者。

在一個或多個實施方式中，在心臟組織中測量到血漿溶血性Gb-3減少。

在一個或多個實施方式中，在腎臟組織中測量到血漿溶血性Gb-3減少。

在一個或多個實施方式中，在皮膚組織中測量到血漿溶血性Gb-3減少。

在一個或多個實施方式中，向Gla敲除小鼠給予1 mg/kg劑量的rhα-Gal A比給予至少1 mg/kg劑量的阿加糖酶β更大程度地減少血漿溶血性Gb-3。

在一個或多個實施方式中，向Gla敲除小鼠給予10 mg/kg劑量的rhα-Gal A比給予至少劑量的阿加糖酶β更大程度地減少血漿溶血性Gb-3。在一個或多個實施方式中，向Gla敲除小鼠給予該藥物組成物後血漿溶血性Gb-3的減少比給予阿加糖酶β後血漿溶血性Gb-3的減少多至少10%。

在一個或多個實施方式中，向Gla敲除小鼠給予該藥物組成物後血漿溶血性Gb-3的減少比給予阿加糖酶β後血漿溶血性Gb-3的減少多至少20%。

本發明的另一個方面涉及一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括使哺乳動物細胞與有效量的rhα-Gal A接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少一種或多種底物。

在一個或多個實施方式中，該一種或多種底物包括GL-3或血漿溶血性Gb-3。

在一個或多個實施方式中，該一種或多種底物係GL-3。

在一個或多個實施方式中，該一種或多種底物係血漿溶血性Gb-3。

在描述本發明若干示例性實施方式之前，應當理解的是，本發明不限於以下描述中列出的構建或方法步驟的細節。本發明能夠具有其他實施方式，並且能夠以不同的方式被實踐或進行。

本發明的各個方面涉及新型重組人類α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A）。本發明的其他方面涉及藉由本文所述的方法而產生的重組蛋白，連同此類重組蛋白的藥物組成物、治療方法、以及用途。定義

在本發明的上下文中以及在每個術語使用的特定上下文中,在本說明書中使用的術語通常具有其在本領域中的一般含義。下文或本說明書的其他地方討論某些術語係為了給從業者提供額外指導。

在本說明書中，除非上下文需要，否則歸因於表達語言或必要的含義，詞語“包括（comprises）”，或變化形式如“包括（“comprises或comprising”）”係以包容性的意義使用，即用於指明所述特徵的存在，但是不排除在本發明的不同實施方式中存在或添加的其他特徵。

如本文所用，術語“Fabry氏病”（也稱為α-半乳糖苷酶A缺陷病；Anderson-Fabry氏病；瀰漫性軀幹血管角化瘤；彌漫性血管角質瘤；神經醯胺三己糖苷酶缺乏症；GLA缺乏症，和遺傳性異位沈積症）旨在指代遺傳溶體儲積症，特徵在於編碼人類α-半乳糖苷酶A的Gla基因發生突變。該術語包括嬰兒、青少年和成年患者經歷的該疾病的所有階段和形式。

如本文所用，術語“α-半乳糖苷酶A”（也稱為α-Gal A；α-半乳糖苷酶的E.C. 3.2.1.22家族）旨在指代在溶酶體中分解α-半乳糖苷的溶酶體酶。人類α-半乳糖苷酶係水解來自糖脂和糖蛋白的末端α-半乳糖基部分的同源二聚體糖蛋白。該酶主要水解神經醯胺三己糖苷，且可催化蜜二糖水解為半乳糖和葡萄糖。基因中的各種突變影響該酶的合成、加工和穩定性，該酶由於無法使α-D-半乳糖基糖脂部分進行分解代謝引起Fabry氏病。α-半乳糖苷酶A催化去除來自多糖、糖脂和糖肽的末端α-半乳糖殘基。Gla基因（國家生物技術資訊中心（NCBI）基因ID 2717）編碼人類α-半乳糖苷酶A，並且已經映射到X染色體長臂的位置22。如本文所用，縮寫“α-Gal A”旨在指代α-半乳糖苷酶A。斜體“Gla”旨在指代編碼人類α-Gal A的人類基因。縮寫rhα-Gal A旨在指代重組人類α-Gal A。當前在Fabry氏病患者中識別出超過400種突變。最常見的突變形式導致該酶中單個胺基酸發生變化。其他類型的突變包括缺失、插入、提前終止密碼子、移碼突變和剪接位點突變。

術語“阿加糖酶β”旨在指代健贊公司以名稱Fabrazyme®銷售的同源二聚體重組人類α-Gal A。Fabrazyme（阿加糖酶β）的分子量約為100 kDa，推薦劑量為1.0 mg/kg體重，每兩週以IV輸注來輸注。建議起始輸注速率不超過0.25 mg/min（15 mg/hr）。Fabry氏病患者中已經出現對Fabrazyme（阿加糖酶β）的輸液反應，其中有些較嚴重。輸液反應包括發燒、僵硬、胸部緊迫感、高血壓、低血壓、瘙癢、肌痛、呼吸困難、蕁麻疹、腹痛和頭痛。建議在輸液前給予患者退熱劑。

術語“阿加糖酶α”旨在指代希雷人基因治療公司以名稱Replagal®銷售的同源二聚體重組人類α-Gal A。Replagal（阿加糖酶α）係約100 kDa的同源二聚體，每個亞基含有398個胺基酸殘基，具有與野生型人類α-Gal A相同的胺基酸序列。Replagal的推薦劑量係0.2 mg/kg，每隔一週靜脈內輸注。

術語“rhα-Gal A”旨在指代如本文所述和如下文實例中例示的重組人類α-半乳糖苷酶A。

如本文中所使用，術語“聚醣”或“寡糖”旨在指代共價結合至蛋白質或多肽上的胺基酸殘基的多糖鏈。如本文所用，術語“N-聚醣”、“N-寡糖”、“N-聯聚醣”或“N-聯寡糖”旨在指代藉由共價結合至胺基酸殘基的氮原子而附接至蛋白質或多肽上的胺基酸殘基的多糖鏈。例如，N-聚醣可以共價結合至天冬醯胺殘基的側鏈氮原子上。聚醣可以包含一個或若干個單糖單元，並且該單糖單元可以共價連接以形成直鏈或支鏈。在至少一個實施方式中，附接至rhα-Gal A的N-聚醣單元可以包括每一獨立地選自N-乙醯葡糖胺、甘露糖、半乳糖或唾液酸的一個或多個單糖單元。蛋白質上的該N-聚醣單元可以藉由任何適當的分析技術（例如，質譜）來確定。在一些實施方式中，N-聚醣單元可以藉由液相層析-串聯質譜（LC-MS/MS），利用儀器，如賽默科技（Thermo Scientific）Orbitrap Velos Pro^TM 質譜儀、賽默科技Orbitrap Fusion Lumos Tribid^TM 質譜儀或沃特斯（Waters）Xevo® G2-XS QTof質譜儀來確定。

如本文中所使用，術語“高甘露糖N-聚醣”旨在指代具有一個至六個或更多個甘露糖單元的N-聚醣。在至少一個實施方式中，高甘露糖N-聚醣單元可以包含結合至天冬醯胺殘基並且進一步結合至分支的聚甘露糖鏈的一個雙(N-乙醯葡糖胺)鏈。如在本文可互換地使用，術語“M6P”或“甘露糖-6-磷酸鹽”旨在指代在位置6處磷酸化的甘露糖單元；即，具有與位置6處的羥基基團結合的磷酸基基團。在至少一個實施方式中，一個或多個N-聚醣單元的一個或多個甘露糖單元係在位置6處磷酸化以形成甘露糖-6-磷酸單元。在至少一個實施方式中，術語“M6P”或“甘露糖-6-磷酸”係指在磷酸基團上具有作為“帽”的N-乙醯葡糖胺（GlcNAc）的甘露糖磷酸二酯，連同具有缺少GlcNAc帽的暴露的磷酸基團的甘露糖單元。在至少一個實施方式中，蛋白質的N-聚醣可以具有多種M6P基團，其中至少一個M6P基團具有GlcNAc帽，並且至少另一個M6P基團缺少GlcNAc帽。

如本文中所使用，術語“複合N-聚醣”旨在指代包含一個或多個N-乙醯葡糖胺、N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、海藻糖和/或唾液酸單元的N-聚醣。在至少一個實施方式中，複合N-聚醣可以是高-甘露糖N-聚醣，其中一個或多個甘露糖單元進一步結合至各自獨立地選自N-乙醯葡糖胺、N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、海藻糖和唾液酸的一個或多個單糖單元。

如本文中所使用，化合物米加司他，也稱為1-去氧半乳糖野尻黴素（1-DGJ），(2R,3S,4R,5S0-2-(羥甲基)哌啶-3,4,5-三醇，並且是具有以下化學式的化合物：和米加司他游離鹼

如下討論，米加司他的藥學上可接受的鹽也可以用於本發明。如本文所用，術語“米加司他”旨在指代游離鹼和任何藥學上可接受的鹽（例如，如下所示的鹽酸米加司他）兩者。當使用米加司他的鹽時，調整該鹽的劑量，這樣使得由患者接受的米加司他的該劑量與使用米加司他游離鹼時接受的量係相當的。米加司他的藥學上可接受的鹽的一個實例係鹽酸米加司他：鹽酸米加司他

術語“米加司他”涵蓋米加司他游離鹼或其藥學上可接受的鹽，除非有相反的確切說明。

如本文中所使用，術語“藥理學伴護蛋白”或有時簡稱為術語“伴護蛋白”旨在指代特異性地結合α-Gal A並且具有以下作用中的一種或多種的分子：增強蛋白質的穩定分子構象的形成；增強蛋白質從內質網到另一個細胞位置，較佳的是天然細胞位置的適當運輸，以便於防止蛋白質的內質網-相關降解；防止構象不穩定或錯誤折疊的蛋白質的聚集；恢復和/或增強蛋白質的至少部分的野生型功能、穩定性和/或活性；和/或改善具有α-Gal A的細胞的表型或功能。因此，α-Gal A的藥理學伴護蛋白係結合至α-Gal A導致α-Gal A正確折疊、運輸、無聚集和活性的分子。如本文中所使用，這個術語包括但不限於結合酶、抑制劑或拮抗劑和激動劑的活性位點的活性位點特異性伴護蛋白（ASSC）。在至少一個實施方式中，藥理學伴護蛋白可以是α-Gal A的抑制劑或拮抗劑。如本文所用，術語“拮抗劑”旨在指代結合至α-Gal A並部分或完全阻斷、抑制、降低或中和α-Gal A的活性的任何分子。在至少一個實施方式中，該藥理學伴護蛋白係米加司他。α-Gal A的藥理學伴護蛋白的另一個非限制性實例係N-丁基去氧半乳糖野尻黴素（N-butyldeoxygalactonojirimycin）（NB-DGJ）或其鹽。

如本文中所使用，術語“活性位點”旨在指代與蛋白質的特定生物活性相關的並且是蛋白質的特定生物活性必需的蛋白質區域。在至少一個實施方式中，該活性位點可以是結合底物或其他結合配偶體的，並且有助於直接參與化學鍵的形成和斷裂的胺基酸殘基的位點。本發明的活性位點可以涵蓋酶的催化位點、抗體的抗原結合位點、受體的配位基結合結構域、調節物的結合結構域或分泌蛋白的受體結合結構域。活性位點還可以涵蓋反式激活、蛋白質-蛋白質交互作用或轉錄因子和調節物的DNA結合結構域。

如本文所用，術語“AUC”旨在指代評價人體隨著時間對一種給定藥物的總暴露的數學計算。在繪製給藥後血液中給予至受試者的藥物的濃度如何隨時間變化的圖中，藥物濃度變量於y軸上，並且時間位於x軸上。在一個指定的時間間隔之內，藥物濃度曲線和x軸之間的面積係AUC（“曲線下面積”）。AUC被用作給藥方案和比較身體內不同藥物的利用度的生體可用率的指導。

如本文所用，術語“C_max ”旨在指代藥物給予至受試者後達到的最大血漿濃度。

如本文所用，術語“t_max ”旨在指代藥物給予至受試者後達到最大血漿濃度的時間。

如本文所用，術語“t½”旨在指代末端消除半衰期。

如本文所用，術語“分佈容積”或“V”旨在指代容納以與血漿中觀察到的濃度相同的濃度給予的藥物總量所必需的理論容積，且代表藥物在身體組織而非血漿中的分佈程度。V值越高表明組織分佈程度越高。“中央分佈容積”或“V_c ”旨在指代血液和血液高度灌注的組織內的分佈容積。“外周分佈容積”或“V2”旨在指代外周組織內的分佈容積。

如本文中可互換使用的，術語“清除率”、“全身清除率”或“CL”旨在指代單位時間內完全清除給予的藥物的血漿體積。“外周清除率”旨在指代單位時間內清除給予的藥物的外周組織體積。

如本文中所使用，“治療有效劑量”和“有效量”旨在指代足夠導致受試者治療反應的α-半乳糖苷酶A和/或藥理學伴護蛋白（例如，米加司他或其鹽）和/或其組合的量。治療反應可以是使用者（例如，臨床醫生）將會識別為對治療的有效響應的任何反應，包括本文所述和本領域已知的任何替代性臨床標記物或症狀。因此，在至少一個實施方式中，治療反應可以是Fabry氏病的一個或多個症狀或標記物（例如本領域已知的那些）的改善或抑制。Fabry氏病的症狀或標記包括但不限於α-半乳糖苷酶A組織活性降低；角膜混濁、手腳灼燒感、皮膚瑕疵（紅紫色凸起病灶）、胃腸道問題、飲食後不久頻繁的排便、毛細血管擴張、疼痛攻擊、自主神經功能障礙、心絞痛、EKG變化、感覺異常、淋巴水腫、皮膚損傷、血管角質瘤、角膜混濁、高血壓、腎衰竭、肢端感覺異常、少汗、短暫性腦缺血發作、中風、肌無力、輕偏癱、眩暈、聽力喪失、耳鳴、眼球震顫、頭痛、單側共濟不能、共濟失調、腿腫脹、白內障、慢性氣流阻塞、呼吸困難、冠心病、心肌梗塞、心律不整、偶然腹瀉（episodic diarrhea）、噁心、嘔吐、蛋白尿。應當注意的是，出於本發明的目的，因為在體內給予時，米加司他的稀釋（以及由於平衡變化導致的結合隨之轉變）、生體可用率和代謝，對α-半乳糖苷酶A具有抑制作用的米加司他的濃度可以構成“有效量”。

如本文中所使用，術語“酶替代療法”或“ERT”旨在指代將非天然的、經純化的酶引入具有這種酶缺乏的個體中。給予的蛋白質可以從自然來源或藉由重組表現而獲得。該術語也指將經純化的酶引入個體，該個體在其他情況下需要或受益於給予的經純化的酶。在至少一個實施方式中，這樣的個體患有酶缺乏症。該引入的酶可以是在體外產生的經純化的重組酶，或從離體組織或體液例如像胎盤或動物奶，或從植物純化的蛋白質。

如本文中所使用，術語“聯合治療”旨在指代同時地或連續地給予兩種或更多種個體化治療的任何療法。在至少一個實施方式中，與單獨進行每種治療時的效果相比，聯合治療的結果係增強的。增強可以包括，與藉由單獨進行治療時所實現的結果相比，可以產生有利的結果的不同治療的效果的任何改進。增強的效果或結果可以包括協同增強，其中增強的效果高於單獨進行每種療法時的相加效果；相加的增強，其中增強的效果基本上等於單獨進行每種療法時的相加效果；或小於協同效果，其中增強的效果低於單獨進行每種療法時的相加效果，但是仍然好於單獨進行每種療法時的效果。增強的效果可以藉由本領域已知的可以測量的治療功效或結果的任何手段來測量。增強的效果可包括降低副作用的頻率或嚴重性，或治療劑的脫靶活性。

如本文中所使用，術語“藥學上可接受的”旨在指代當給予人類時，生理上可耐受的，並且通常不會產生不良反應的分子實體以及組成物。較佳的是，如本文所使用的，術語“藥學上可接受的”意指由聯邦或州政府的管理機構批准的或在美國藥典或用於動物（更特別地用於人）的其他公認的藥典中列出的。

如本文中所使用，術語“載體”旨在指代與化合物一起給予的稀釋劑、助劑、賦形劑、或運載體。適合的藥物載體係本領域已知的，並且在至少一個實施方式中，其描述於“Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明頓藥物科學]”，E. W.馬丁著，第18版，或其他版本。

如本文中所使用，術語“受試者”或“患者”旨在指代人類或非人類動物。在至少一個實施方式中，受試者係哺乳動物。在至少一個實施方式中，受試者係人類。

如本文中所使用，術語“抗藥物抗體”旨在指代特異性地結合給予至受試者的藥物並且作為向受試者給予藥物的體液免疫反應的至少一部分由受試者產生的抗體。在至少一個實施方式中，該藥物係治療性蛋白質藥物產品。抗藥物抗體在受試者中的存在可以引起範圍從輕微到嚴重的免疫反應，包括但不限於危機生命的免疫反應，包括但不限於過敏反應、細胞介素釋放綜合症、以及介導關鍵功能的內源性蛋白質的交叉反應中和。另外或可替代地，抗藥物抗體在受試者中的存在可以降低該藥物的功效。

如本文中所使用，術語“中和抗體”旨在指代用於中和藥物功能的抗藥物抗體。在至少一個實施方式中，該治療性蛋白質藥物產品係在受試者中表現減少或缺失的內源性蛋白質的對應物。在至少一個實施方式中，該中和抗體可以用於中和內源性蛋白質的功能。藥物功能的抗體中和包括結合至酶活性位點以阻止酶促活性或結合至該酶以將其移出血流和/或將該酶靶向無治療性的路徑。

如本文中所使用，術語“約”和“大約”旨在指代對於給定測量的性質或精度的測量的量而言可接受程度的誤差。例如，如本領域中所理解的，誤差的程度可以由為測量提供的有效數字的數值來指示，並且包括但不限於對於測量所報告的最精確的有效數字中±1的變化。典型的示例性誤差程度係在給定值或值範圍的20%（%）內，較佳的是在10%內，並且更較佳的是在5%內。可替代地，並且特別是在生物系統中，術語“約”和“大約”可以意指係在給定值的一個數量級內，較佳的是在5倍以內，並且更較佳的是在2倍以內的值。除非另有說明，本文給出的數字量係近似的，意味著當沒有明確說明時，可以推斷出術語“約”或“大約”。

如熟習該項技術者將理解的，如本文中使用的術語“同時地”旨在意指同時或在之前或之後的相當短的時間內。例如，如果用彼此同時給予兩種治療，一種治療可以在另一種治療之前或之後給予，以允許為兩種治療的後者做準備所需要的時間。因此，兩種治療的“同時給予”包括但不限於一種治療在另一種治療之後20分鐘或更短，約20分鐘、約15分鐘、約10分鐘、約5分鐘、約2分鐘、約1分鐘或比1分鐘更短。重組人類α - 半乳糖苷酶 A

本發明的各種實施方式涉及具有獨特碳水化合物特徵的重組人類α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A）。溶酶體酶替代療法總體上依賴將該酶結合至陽離子獨立性甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）。具體地，特定碳水化合物具有針對CIMPR，最特別的是M6P和尤其是雙-M6P的親和性。CIMPR結合在細胞表面上時，酶內化並運輸到溶酶體。溶酶體係底物累積的主要位點，且最終是酶降解該底物所需的位點。

rhα-Gal A同源二聚體的每條鏈上有四個潛在的N-聯糖基化位點，其中三個通常被糖基化。由於每個糖基化位點在存在的N-聯寡糖（N-聚醣）的類型中是異質的，所以rhα-Gal A由具有N-聚醣的蛋白的複合混合物組成，該等N-聚醣對碳水化合物受體具有不同結合親和力。包含具有一個M6P基團（單-M6P）的高甘露糖N-聚醣的rhα-Gal A以低（約7,000 nM）親和力結合至CIMPR，而在相同N-聚醣上包含兩個M6P基團（雙-M6P）的rhα-Gal A以高（約2 nM）親和力來結合。非磷酸化的、單-M6P、和雙-M6P聚醣的代表性結構如圖1A所示。圖1B示出M6P基團。圖2A中示出生產性藥物靶向。

不具有磷酸化N-聚醣的重組蛋白質缺少對CIMPR的親和力。非磷酸化的高甘露糖聚醣還可以被甘露糖受體清除，導致ERT的非生產性清除（圖2B）。

rhα-Gal A上還存在其他類型的N-聚醣，包含半乳糖和唾液酸的複合碳水化合物。因為複合N-聚醣未磷酸化，所以它們不具有針對CIMPR的親和力。具有暴露的半乳糖殘基的複合型N-聚醣對肝臟肝細胞上的脫唾液酸糖蛋白受體具有中度至高度親和力，這導致rhα-Gal A的快速非生產性清除（圖2B）。脫唾液酸糖蛋白受體和甘露糖受體在肝細胞中高度表現，且從循環中去除具有暴露的半乳糖和甘露糖（等等）的蛋白。一種避免酶藉由脫唾液酸糖蛋白受體吸收的非生產性路徑的方式係阻斷具有唾液酸的末端位點。具有末端唾液酸的蛋白質不經歷這個非生產性去除路徑，並因此可以靶向CIMPR。

由於將常規酶替代療法遞送至溶酶體的效率低，此類療法通常伴隨著問題，包括產生對rhα-Gal A的免疫反應。給予現有ERT報導的最嚴重且最常見的不良反應係輸液反應。輸液反應可以包括：心動過速、高血壓、喉發緊、胸痛/胸部緊迫感、呼吸困難、發燒、發冷/寒顫、腹痛、瘙癢、蕁麻疹、噁心、嘔吐、唇或耳水腫和皮疹。

大多數接受Fabrazyme（阿加糖酶β）的患者形成IgG抗體，一些患者形成對重組酶具有特異性的IgE或皮試反應。為改善輸液反應，對一些患者用對乙醯胺基酚和/或抗組胺劑或類固醇預先治療。另一種控制輸液反應的策略係增加輸液時間。

雖然不同N-聯碳水化合物賦予ERT期望的特徵，但糖基化位點數量有限。因此，ERT的設計不單純是添加期望的碳水化合物，因為選擇了一種特徵或一類碳水化合物可能要以另一種特徵為代價。因此，研發新型ERT存在許多困難。本文所述的rhα-Gal A酶係在ERT選擇、表現和純化期間小心監測聚醣圖譜的結果，以確保經由甘露糖和脫唾液酸糖蛋白受體的脫靶清除率最小化且藉由CIMPR以最大生產性高親和力靶向溶酶體。

藉由勤奮研究和充分實驗，諸位發明人已經平衡了許多蛋白質特徵，以使得rhα-Gal A的非生產性清除最小化，並有效地將rhα-Gal A靶向溶酶體。在已經應用到本文所述rhα-Gal A的特徵中的是：高蛋白質產量、磷酸化、複合型聚醣的末端唾液酸加帽、低含量的中性聚醣、高酶活性和在血液中的穩定性。

在至少一個實施方式中，該rhα-Gal A在中國倉鼠卵巢（CHO）細胞中表現，並且相比於帶有Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme（阿加糖酶β）中的一個或多個M6P殘基的N-聚醣單元的含量時，該rhα-Gal A包含含量增加的帶有一個或多個M6P殘基的N-聚醣單元。已經顯示，如本文所述的rhα-Gal A以高親和力（K_D 約3 nM）結合CIMPR。如本文所述的rhα-Gal A在體內表徵，且顯示具有比Fabrazyme（阿加糖酶β）（t^1/2 約7.8 min）更長的表觀血漿半衰期（t^1/2 約13.2 min）。

在至少一個實施方式中，該rhα-Gal A具有低水平的中性聚醣（例如1.5%-6%）和高水平的雙-磷酸化寡糖（例如7%-14%）。在至少另一個實施方式中，該rhα-Gal A具有極高水平的單-磷酸化寡糖（例如大於25%）和極高水平的雙-磷酸化寡糖（例如大於12%）。該rhα-Gal A還可以具有極高水平的含唾液酸的寡糖（例如大於50%）。在該等和其他實施方式中，ERT具有最小的藉由甘露糖和脫唾液酸糖蛋白受體的非生產性脫靶清除率，同時最大化藉由CIMPR的對溶酶體的生產性高親和力靶向。

在至少一個實施方式中，該rhα-Gal A係同源二聚體。在至少一個實施方式中，該rhα-Gal A最初被表現為具有如SEQ ID NO: 1中所列野生型α-Gal A的全長429個胺基酸序列，並與GenBank登錄號NP_00160.1相關聯。全長rhα-Gal A經歷細胞內處理，去除一部分胺基酸，例如前31個胺基酸。因此，由宿主細胞生產並分泌的rhα-Gal A可以具有比最初表現在細胞內的rhα-Gal A更短的胺基酸序列。在至少一個實施方式中，該更短的蛋白質可以具有在SEQ ID NO: 2中所示的胺基酸序列，其與SEQ ID NO: 1不同僅在於已經去除了包括信號肽的前31個胺基酸，因此產生具有398個胺基酸的蛋白質。在另一個實施方式中，每條鏈在去除信號肽之前是大約49 kDa，且在去除信號肽後是大約45 kDa，未考慮額外的聚醣重量。胺基酸數目的其他變化也是可能的，如相對由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2描述的胺基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。在一些實施方式中，該rhα-Gal A產物包括具有不同胺基酸長度的rhα-Gal A分子的混合物。

在至少一個實施方式中，同源二聚體具有796個胺基酸，分子量大約為91 kDa，未考慮額外的聚醣重量。 SEQ ID NO: 1 Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu SEQ ID NO: 2 Leu Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu SEQ ID NO: 3 ATGCAGCTGAGGAATCCCGAGCTCCACCTGGGCTGTGCTCTGGCTCTGCGGTTCCTGGCCCTCGTGTCCTGGGACATCCCTGGCGCTAGGGCCCTCGATAACGGACTGGCCCGGACCCCCACAATGGGATGGCTCCACTGGGAAAGGTTCATGTGCAATCTGGACTGTCAGGAGGAACCCGACTCCTGCATCAGCGAAAAGCTCTTCATGGAGATGGCCGAGCTGATGGTGAGCGAGGGCTGGAAGGACGCCGGCTACGAGTATCTGTGCATCGATGACTGCTGGATGGCCCCTCAAAGGGACTCCGAAGGCAGGCTGCAGGCTGATCCCCAAAGGTTTCCCCACGGAATCCGGCAGCTCGCCAACTACGTGCATTCCAAGGGCCTCAAGCTCGGCATCTACGCCGACGTGGGCAACAAAACATGCGCCGGATTCCCCGGCAGCTTCGGCTACTACGACATCGACGCCCAGACATTCGCTGATTGGGGAGTGGACCTGCTGAAGTTCGACGGCTGTTACTGCGATTCCCTGGAAAACCTGGCCGACGGCTACAAACACATGTCCCTCGCCCTGAACCGGACAGGCAGGTCCATCGTGTACAGCTGCGAGTGGCCCCTGTACATGTGGCCTTTCCAGAAGCCCAACTACACAGAGATCAGGCAGTACTGCAACCACTGGAGGAACTTCGCTGACATCGACGACTCCTGGAAGAGCATCAAGAGCATCCTGGACTGGACCAGCTTCAACCAGGAGAGGATCGTGGACGTGGCTGGACCCGGAGGCTGGAACGACCCCGATATGCTGGTGATTGGCAACTTCGGACTGAGCTGGAACCAGCAGGTGACCCAGATGGCCCTGTGGGCCATTATGGCCGCTCCCCTGTTCATGTCCAACGACCTGAGGCACATCAGCCCCCAGGCCAAGGCTCTGCTGCAGGACAAGGATGTGATCGCCATCAACCAGGACCCCCTGGGCAAGCAGGGCTACCAGCTGAGGCAAGGAGATAACTTCGAGGTGTGGGAGAGGCCCCTGTCCGGACTGGCTTGGGCCGTGGCCATGATCAATCGGCAGGAGATCGGCGGACCCCGGTCCTACACCATTGCTGTGGCCAGCCTGGGAAAAGGAGTCGCCTGCAACCCCGCCTGCTTCATTACCCAGCTGCTCCCCGTGAAGCGGAAGCTGGGCTTCTATGAGTGGACCAGCAGGCTGAGGTCCCATATCAATCCTACCGGCACCGTCCTCCTCCAGCTCGAGAATACCATGCAGATGAGCCTCAAGGATCTGCTGTGA

在至少一個實施方式中，該rhα-Gal A在蛋白質的一個或多個胺基酸殘基處經歷翻譯後修飾和/或化學修飾。例如，甲硫胺酸和色胺酸殘基可以經歷氧化反應。作為另一個實例，N-末端穀胺醯胺可以形成焦穀胺酸。作為另一個實例，天冬醯胺殘基可以經歷脫醯胺作用以形成天冬胺酸。作為又另一個實例，天冬胺酸殘基可以經歷異構化作用以形成異天冬胺酸。作為又另一個實例，蛋白質中未配對的半胱胺酸殘基可以與游離谷胱甘肽和/或半胱胺酸形成二硫鍵。因此，在一些實施方式中，該酶初始表現為具有如在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2中所示或如由SEQ ID NO: 3編碼的胺基酸序列，並且該酶經歷該等翻譯後修飾和/或化學修飾中的一個或多個。此類修飾也在本揭露的範圍內。

在各種實施方式中，該rhα-Gal A係與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2至少90%、95%、98%、99%或99.5%一致的變體。該等變體α-半乳糖苷酶A胺基酸序列相對SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2可以包含缺失、取代和/或插入，如相對由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2描述的胺基酸序列，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。

還考慮編碼Gla和此類變體人Gla的多核苷酸序列，並且可以用於重組表現根據本發明的rhα-Gal A。

該rhα-Gal A較佳的是由CHO細胞產生。可以在CHO細胞中構建並表現可表現α-半乳糖苷酶A的等位變體或其他變體α-半乳糖苷酶胺基酸序列（諸如與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2至少90%、95%、98%、99%或99.5%一致的那些）的DNA構建體。該等變體α-半乳糖苷酶A胺基酸序列相對SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2可以包含缺失、取代和/或插入，如相對由SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2描述的胺基酸序列，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個缺失、取代和/或插入。該等DNA構建體與SEQ ID NO: 3可以是至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99.5%一致的。熟習該項技術者可以選擇適合於轉化CHO細胞用於產生此類變體α-半乳糖苷酶胺基酸序列的替代載體。

可以使用不同比對演算法和/或程序來計算兩個序列之間的一致性，包括可用作GCG序列分析包（威斯康辛大學，麥迪森市，威斯康辛州）的一部分的FASTA或BLAST，並且可以與例如，默認設置一起使用。例如，考慮與本文所述的特定多肽具有至少90%、95%、98%或99%一致性，並且較佳的是表現出基本相同功能的多肽，連同編碼此類多肽的多核苷酸。除非另有說明，相似性分數將基於BLOSUM62的使用。當使用BLASTP時，相似性百分比係基於BLASTP陽性得分，並且序列一致性百分比係基於BLASTP一致性得分。BLASTP“一致性”示出一致的高得分序列對中總殘基的數目和分數；且BLASTP“陽性”示出比對得分具有正值且彼此相似的殘基的數目和分數。本揭露考慮和涵蓋具有與本文揭露的胺基酸序列具有該等程度的一致性或相似性或任何中間程度的一致性或相似性的胺基酸序列。使用遺傳密碼推導出的相似多肽的多核苷酸序列，並且可以藉由常規手段（具體地藉由使用遺傳密碼來逆轉錄其胺基酸序列）獲得。

較佳的是，總rhα-Gal A分子中的不超過70%、65%、60%、55%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%缺少帶有一個或多個M6P殘基的N-聚醣單元或缺少結合至CIMPR的能力。可替代地，30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、＜100%或更多的rhα-Gal A分子包括帶有一個或多個M6P殘基的至少一個N-聚醣單元，或具有結合CIMPR的能力。

rhα-Gal A分子在它們的聚醣上可以具有1、2、3、4、5或6個M6P基團/亞基或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個M6P基團/同源二聚體。例如，在rhα-Gal A分子上的唯一一個N-聚醣可以帶有M6P（單-磷酸化的），單個N-聚醣可以帶有兩個M6P基團（雙-磷酸化的），或在相同rhα-Gal A分子上的兩個不同的N-聚醣可以各自帶有單個M6P基團。rhα-Gal A分子還可以具有不帶有M6P基團的N-聚醣。在另一個實施方式中，平均來說，N-聚醣包含大於2 mol/mol的M6P和大於4 mol/mol唾液酸，這樣使得rhα-Gal A包括平均至少2莫耳的M6P殘基/莫耳的rhα-Gal A，以及至少4莫耳的唾液酸/莫耳的rhα-Gal A同源二聚體。平均地，rhα-Gal A上總聚醣的至少約3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%、30%或35%可以呈單-M6P聚醣形式，且平均地，rhα-Gal A上總聚醣的至少約0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%係呈雙-M6P聚醣形式，且平均地，rhα-Gal A上總聚醣的少於約75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%或25%不含結合至CIMPR的磷酸化聚醣。

rhα-Gal A可以具有的攜帶M6P的N聚醣的平均含量在0.5至6.0 mol/mol rhα-Gal A同源二聚體的範圍內或子範圍的任何中間值，包括0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0 mol/mol rhα-Gal A同源二聚體。可以將該rhα-Gal A分級以提供具有不同平均數量的帶有單-M6P或帶有雙-M6P的聚醣的rhα-Gal A製劑，從而藉由選擇特定級分或藉由選擇性地組合不同級分來允許進一步定製靶向靶組織中溶酶體的rhα-Gal A。

可以將在rhα-Gal A上高達60%的N-聚醣完全唾液酸化，例如，可以將高達10%、20%、30%、40%、50%或60%的N-聚醣完全唾液酸化。在一些實施方式中，從4%至20%的總N-聚醣被完全地唾液酸化。在其他實施方式中，在rhα-Gal A上不超過5%、10%、15%、20%、25%或30%的N-聚醣攜帶唾液酸和末端半乳糖殘基（Gal）。這一範圍包括所有的中間值和子範圍，例如，在該rhα-Gal A上7%至30%的總N-聚醣可以攜帶唾液酸和末端半乳糖。在又其他實施方式中，在rhα-Gal A上不超過5%、10%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的N-聚醣僅具有末端半乳糖並且不包含唾液酸。這一範圍包括所有的中間值和子範圍，例如，在組成物中rhα-Gal A上從8%至19%的總N-聚醣可以僅具有末端半乳糖，並且不包含唾液酸。

在本發明的其他實施方式中，在rhα-Gal A上40%、45%、50%、55%或60%的總N聚醣係複合型N-聚醣；或在rhα-Gal A上不超過1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的總N-聚醣係雜合型N-聚醣；在rhα-Gal A上不超過5%、10%或15%的高甘露糖型N-聚醣係非磷酸化的；在rhα-Gal A上至少5%、10%、15%、20%、25%、30%或35%的高甘露糖型N-聚醣係單-M6P磷酸化的；和/或在rhα-Gal A上至少1%、2%、3%、4%、5%、6%或7%的高甘露糖型N-聚醣係雙-M6P磷酸化的。該等值包括所有的中間值和子範圍。rhα-Gal A可以滿足上述描述的一個或多個含量範圍。

在一個或多個實施方式中，rhα-Gal A將平均攜帶2.0至9.0莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A。這個範圍包括所有中間值和子範圍，包括2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0 mol殘基/mol rhα-Gal A同源二聚體。不受理論的約束，認為帶有唾液酸殘基的N-聚醣單元的存在可以防止藉由脫唾液酸糖蛋白受體對rhα-Gal A的非生產性清除。

在一個或多個實施方式中，在rhα-Gal A上至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%或25%的總N-聚醣包含單個唾液酸殘基。

在一個或多個實施方式中，在rhα-Gal A上至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%的總N-聚醣包含兩個唾液酸殘基。該等值包括所有的中間值和子範圍。

在一個或多個實施方式中，在rhα-Gal A上至少30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%的總N-聚醣包含一個或兩個唾液酸殘基。該等值包括所有的中間值和子範圍。

在一個或多個實施方式中，在rhα-Gal A上至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%的總N-聚醣包含三個唾液酸殘基。在一個或多個實施方式中，在rhα-Gal A上少於30%、25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%或10%的總N-聚醣包含三個唾液酸殘基。該等值包括所有的中間值和子範圍。

在一個或多個實施方式中，在rhα-Gal A上至少0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%或5%的總N-聚醣包含四個唾液酸殘基。在一個或多個實施方式中，在rhα-Gal A上少於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4.5%、4%、3.5%、3%、2.5%、2%、1.5%、1%或0.5%的總N-聚醣包含四個唾液酸殘基。該等值包括所有的中間值和子範圍。

在一個或多個實施方式中，在rhα-Gal A上少於2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%或25%的總N-聚醣係中性聚醣。

在一個或多個實施方式中，該rhα-Gal A在重組人類溶酶體蛋白的某些N-糖基化位點上具有M6P和/或唾液酸單元。例如，rhα-Gal A的兩個相同亞基中每一個上都有三個N-聯糖基化位點。有四個對應於SEQ ID NO: 1的以下位置的潛在糖基化位點：Asn-139、Asn-192、Asn-215和Asn-408。類似地，對於SEQ ID NO: 2的成熟肽，該等潛在糖基化位點在以下位置：Asn-108、Asn-161、Asn-184和Asn-377。通常，只有前三個位點被糖基化。取決於天冬醯胺殘基的位置，rhα-Gal A的其他變體可以具有相似的糖基化位點。通常，除了X不能是HIS或PRO以外，在蛋白質胺基酸序列中的ASN-X-SER或ASN-X-THR序列指示潛在的糖基化位點。

諸位發明人已經發現，可以使用CHO細胞產生rhα-Gal A，該rhα-Gal A具有靶向CIMPR和細胞溶酶體的優異能力以及降低其體內非生產性清除的糖基化模式。該等細胞可以表現rhα-Gal A，該rhα-Gal A具有的帶有一個或多個M6P殘基的N-聚醣單元的水平比常規重組人類α-半乳糖苷酶A產物（如Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme（阿加糖酶β））顯著更高。由該等細胞產生的rhα-Gal A（例如，如下文實例中所例示）具有比常規α-半乳糖苷酶A，諸如Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme（阿加糖酶β）顯著更多的M6P和雙-M6P N-聚醣殘基和/或顯著更多的唾液酸 N-聚醣殘基和/或顯著更少的中性N-聚醣。不受理論的約束，認為這種獨特的糖基化允許rhα-Gal A酶被更有效地吸收到靶細胞中並且因此比其他重組人類α-半乳糖苷酶A分子（例如像Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme（阿加糖酶β），其具有低得多的M6P和雙-M6P含量和/或更高含量的中性聚醣）更有效地從循環中被清除。已經示出如本文所述的rhα-Gal A有效地結合CIMPR，並且被腎臟和心肌有效吸收，並且具有提供有利的藥物動力學曲線並且減少體內非生產性清除的糖基化模式。

還考慮了與例如Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme（阿加糖酶β）相比，如本文所述的rhα-Gal A的獨特糖基化可促成rhα-Gal A的免疫原性下降。如熟習該項技術者將理解的，用保守的哺乳動物糖對蛋白質的糖基化通常增強產物溶解度，並且減少產物的聚集和免疫原性。糖基化藉由最小化蛋白質聚集連同藉由從免疫系統中遮罩免疫原性蛋白質表位來間接改變蛋白質免疫原性（工業指導 - 治療性蛋白質產品的免疫原性評估（Guidance for Industry-Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products），美國衛生和人類服務部，食品與藥品管理局，藥物評價和研究中心，生物製劑評估和研究中心，2014年8月）。因此，在至少一個實施方式中，該rhα-Gal A的給予不會誘導抗藥物抗體。在至少一個實施方式中，相比藉由給予Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme（阿加糖酶β）誘導的抗藥物抗體水平，該rhα-Gal A的給予引起受試者中抗藥物抗體更低的發生率。產生用於生產 rh α -Gal A 的細胞系之方法

具有高含量單-M6P、高含量雙-M6P、高含量唾液酸和/或低含量中性聚醣的rhα-Gal A可以藉由用編碼Gla的DNA構建體轉化宿主細胞來產生。合適的宿主細胞包括哺乳動物細胞，例如CHO細胞，諸如CHO-DG44細胞、CHO-K1細胞和CHO-DXB11細胞。雖然先前已經使用CHO細胞製造重組人類α-半乳糖苷酶A，但應理解，轉化的CHO細胞可以以產生具有高含量單-M6P、雙-M6P和含唾液酸的聚醣和/或具有低含量中性聚醣的重組酶的方式產生和培養。

適合的用於轉染宿主細胞的載體可以包括與SEQ ID NO: 3至少80%、85%、90%、95%、98%、99%、99.5%或100%一致的DNA構建體。替代性DNA構建體也可以用於產生與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2至少90%、95%、98%、99%、99.5%或100%一致的胺基酸序列。示例性載體包括但不限於質粒。這種（些）載體可以包括其他序列，諸如啟動子序列和/或編碼選擇基因的序列。啟動子序列包括但不限於猿猴病毒40（SV40）和人類巨細胞病毒（CMV）啟動子基因。選擇基因包括但不限於吉歐黴素（Zeocin）抗性基因、胺苄西林（ampicillin）抗性基因、殺稻瘟菌素（blasticidin）S-抗性基因和二氫葉酸還原酶基因。其他啟動子序列和選擇基因係本領域中已知的。也可以將多個載體用在轉染，例如雙載體轉染中。

可以在宿主細胞中進行多次轉染，以提供供評價的獨立池。可以評價該等池的具體特性，諸如細胞培養活力、rhα-Gal A表現和/或聚醣含量，諸如單-M6P、雙-M6P、唾液酸和/或中性聚醣含量。可以在整個培養過程中諸如轉染後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20天等評價該等特性。

可以選擇具有期望特性的池產生殖株，且可以根據類似標準進一步評價該等殖株（例如細胞培養活力，rhα-Gal A表現和/或聚醣含量）。所選擇的殖株也可以在其他條件下，以不同規模（例如旋轉管或生物反應器規模），或在培養期間的不同時間點評價。

產生表現載體、產生細胞系和產生重組細胞系的方法係常規的，且遍及本領域均有描述。例如，此類方法描述於美國專利申請公開號US 2016/0264953中，將該文獻藉由引用以其全文併入本文，且下文複製其中某些部分。

表現載體

本文還提供了含有編碼本發明的重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列（例如，cDNA）的表現載體。例如，該表現載體可以包含編碼與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2至少90%一致（例如，至少90%、92%、94%、96%、98%、99%或100%一致）的重組人類α-半乳糖苷酶A-蛋白的序列（例如，cDNA）。除了該序列，表現載體可以包含可操作地連接至編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列（例如，cDNA）的5’末端的啟動子（和視情況一種或多種增強子序列）。該等表現載體可以包含編碼人類CD52蛋白的肽的序列（TTG為起始密碼子，可操作地連接至編碼重組蛋白的序列（例如，cDNA）的5’末端）和編碼聚（A）識別位點的序列（可操作地連接至編碼重組蛋白的序列（例如，cDNA）的3’末端）。該等表現載體可以包含編碼哺乳動物選擇標記（例如，人類或狗合成酶蛋白）序列（例如，cDNA）和可操作地連接至編碼該哺乳動物選擇標記的序列（例如，cDNA）的5'末端的啟動子序列，和視情況SV40早現內含子序列和聚（A）信號序列（兩者可操作地連接至編碼該哺乳動物選擇標記的序列（例如，cDNA）的3'末端）。表現載體可以包括以下中的一種或多種（例如，兩種或三種）：可操作地連接至編碼原核生物選擇基因（例如，胺苄西林抗性基因）的序列的5'末端的原核生物啟動子序列、原核生物複製起點序列和真核生物複製起點序列。

可操作地連接至編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列（例如，cDNA）的啟動子序列（和視情況一種或多種增強子序列）包括：猿猴病毒40（SV 40）早現啟動子、核糖體蛋白21（rpS21）啟動子、倉鼠β-肌動蛋白啟動子、巨細胞病毒（CMV）啟動子（例如，CMV立即早現啟動子（參見，例如，Teschendorf等人，Anticancer Res.[抗癌研究] 22:3325-3330, 2002）、泛激素C （UBC）啟動子、延長因子1-a（EFlA）啟動子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PCK）啟動子、來自小鼠CMV的IE2啟動子/增強子區域（參見，例如，Chatellard等人，Biotechnol. Bioeng. [生物技術與生物工程] 96: 106-117, 2007）和雞β-肌動蛋白啟動子。可用於本文所述任一表現載體中的人類基因啟動子的其他非限制性實例描述在哺乳動物啟動子資料庫（Mammalian Promoter Database）（維斯拓研究院（Wistar Institute）網址mrpombdb.wister.upenn.edu）中。可用於表現載體中的哺乳動物啟動子序列的其他實例係本領域中已知的。可以用於表現質粒中的啟動子和增強子的一個非限制性實例係具有CMV增強子的雞β-肌動蛋白啟動子（本領域中稱為CAGG啟動子）。本文提供的表現載體可以包括可操作地連接至編碼人類重組α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列（例如，cDNA）的5'末端的rpS21啟動子、倉鼠β-肌動蛋白啟動子或SV 40早現啟動子序列，編碼人類CD52蛋白的肽的序列（TTG為起始密碼子，可操作地連接至編碼人類重組α-半乳糖苷酶-A蛋白的核酸（例如，cDNA）（例如，編碼本文所述的人類重組α-半乳糖苷酶-A蛋白的任一核酸）的5'末端），和可操作地連接至編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的核酸序列的3'末端的含聚（A）識別位點的序列。

聚（A）識別位點序列的非限制性實例係牛生長激素聚（A）識別位點。人類聚（A）識別位點的結構特徵描述在Nunes等人，EMBO J [歐洲分子生物學雜誌] 29:1523-1536, 2010中。其他聚（A）識別位點係本領域內所熟知的。

在一些實例中，該表現載體包含倉鼠β-肌動蛋白啟動子和編碼人類CD52蛋白的序列（TTG為起始密碼子，可操作地連接至編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列（例如，cDNA）的5'末端），和可操作地連接至編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列（例如，cDNA）的3'末端的SV 40早現內含子和聚（A）識別序列。

一些表現載體可以包含編碼哺乳動物選擇基因的序列。哺乳動物選擇基因的非限制性實例包括：二氫葉酸還原酶基因、潮黴素（hydromycin）抗性基因、新黴素（neomycin）抗性基因、殺稻瘟菌素抗性基因、吉歐黴素抗性基因、穀胺醯胺合成酶基因、二氫葉酸抗性基因和次黃嘌呤-鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶基因。編碼該等哺乳動物選擇基因的序列的實例係本領域中已知的。編碼哺乳動物選擇基因的序列的5'末端可操作地連接至啟動子（例如，本文所述或本領域中已知的任何示例性啟動子）。

一些表現載體（例如，本文所述的任何表現載體）可以包含哺乳動物複製起點序列和/或原核生物複製起點序列。哺乳動物複製起點序列係本領域中已知的（例如，Todorovic等人，Front. Biosci.[生物科學里程碑]4:D859-D568, 1999；Aladjem, Front. Biosci.[生物科學里程碑] 9:2540-2547, 2004；Hamlin, Bioessays[生物測定]14:651-659, 1992）。原核生物複製起點序列也是本領域中已知的（例如，Marczynski等人，Curr. Opin. Genet. Dev.[遺傳學與發育學新觀點]3:775-782, 1993）。

載體的非限制性實例係質粒。本文提供的質粒的非限制性實例示出在圖3中。

表現載體可以是病毒載體。病毒載體的非限制性實例包括腺病毒載體、皰疹病毒載體、桿狀病毒載體和逆轉錄病毒載體。表現載體也可以是質粒或粘粒。

宿主細胞

本文還提供包含編碼本文所述重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的宿主細胞。該序列可操作地連接至啟動子序列（例如，本文所述任何示例性啟動子序列或本領域內已知的任何病毒或哺乳動物啟動子序列）。例如，編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列和可操作地連接至編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5'末端的啟動子序列的序列可以整合在宿主細胞的染色體中。在其他實例中，編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列和可操作地連接至編碼重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的序列的5'末端的啟動子序列存在於宿主細胞內的表現載體（例如，本文所述的任何表現載體）中。

將核酸（例如，本文所述的任何核酸或表現載體）引入細胞（例如，哺乳動物宿主細胞）係本領域內已知的。例如，可利用微脂粒感染、電穿孔、磷酸鈣介導的轉染、病毒（例如，逆轉錄病毒）轉導、DEAE葡聚醣-介導的細胞轉染、樹狀聚合物介導的轉染、聲致穿孔、光學轉染、刺穿轉染、水力遞送、磁轉染或彈道轉染將核酸引入細胞。

宿主細胞可以是任何類型的哺乳動物細胞。例如，宿主細胞可以是細胞系，例如，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞（例如，CHO DG44細胞、CHO-Kls細胞、C02.31殖株細胞、A14.13殖株細胞、C02.57殖株細胞和F05.43殖株細胞）、Sp2.0、骨髓瘤細胞（例如，NS/0）、B-細胞、雜交瘤細胞、T-細胞、人胚腎（HEK）細胞（例如，HEK 293E和HEK 293F）、非洲綠猴腎上皮細胞（Vero）或馬-達二氏（Madin-Darby）犬（可卡犬）腎上皮細胞（MDCK）。可利用本文所述方法培養的其他哺乳動物細胞係本領域內已知的。宿主細胞可以是例如上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、腎細胞、肺細胞、T-細胞、骨髓瘤細胞或B-細胞。一些宿主細胞可以在懸浮細胞培養物或貼壁細胞培養物中生長。

產生哺乳動物細胞系之方法

本文還提供產生可用於糖蛋白的重組表現的哺乳動物細胞系之方法。

還提供了產生可用於糖蛋白（例如，本文所述或本領域內已知的任何重組蛋白）的重組表現的哺乳動物細胞系之方法，該方法包括：（a）連續培養後從培養物產生單細胞亞殖株培養物，並選擇具有可接受轉染效率、細胞在無血清培養基中生長和重組蛋白表現的亞殖株培養物（例如，選擇與其他測試的亞殖株培養物相比具有最佳轉染效率、細胞生長和重組蛋白表現的亞殖株培養物）；（c）從（a）中選擇的亞殖株培養物產生單細胞亞殖株培養物；和（d）選擇（b）中產生的單細胞亞殖株培養物，該培養物具有可接受的轉染效率、細胞密度峰值（例如，無血清培養基中的細胞密度峰值）、生長特性（例如，無血清培養基中的生長）、容積生產率（VPR）和重組蛋白表現，其中（c）中所選擇的亞殖株（例如，與其他測試的亞殖株培養物相比，具有最佳轉染效率、細胞密度峰值、生長特性、VPR和重組蛋白表現的亞殖株培養物）可以用於糖蛋白的重組表現。

本文還提供了藉由本文所述的任何方法生產的哺乳動物細胞或哺乳動物細胞系。可用於本文所述的任何方法的血清依賴性永生化細胞系的非限制性實例包括中國倉鼠卵巢（CHO）細胞、骨髓瘤細胞、B-細胞、雜交瘤細胞、T-細胞、人胚腎（HEK）細胞、非洲綠猴腎上皮細胞（Vero）細胞和馬-達二氏犬（可卡犬）腎上皮細胞（MDCK）細胞。可用於本文所述任何方法的其他血清依賴性永生化細胞系係本領域中已知的。例如，血清依賴性永生細胞系可以是表皮細胞系、內皮細胞系、淋巴細胞系、腎細胞系、肺細胞系、T細胞系、骨髓瘤細胞系或B-細胞系。在一些實例中，血清依賴性永生細胞系懸浮生長。在其他實例中，血清依賴性永生細胞系在貼壁細胞培養物中生長。

在一些實例中，血清依賴性永生細胞系並不內源性表現二氫葉酸還原酶。選擇的亞殖株（該等方法中選擇的第一或第二亞殖株）可以懸浮生長。

用於培養永生化哺乳動物細胞系的方法係本領域內已知的。用於測定轉染效率、無血清培養基中的細胞生長、重組蛋白表現、細胞密度峰值（例如，活細胞密度峰值）、細胞生長特性、容積生產率和產生的重組蛋白的糖基化特徵圖係本領域內所熟知的。例如，可以藉由檢測轉染到細胞中的表現質粒中的報導基因的表現水平（例如，這種報導基因的表現可以利用螢光輔助細胞分選來檢測）測定轉染效率。例如，可以例如藉由利用特異性地結合至重組蛋白的抗體檢測組織培養基中或細胞內存在的重組蛋白的水平來測定重組蛋白表現。例如，可以藉由隨時間測量細胞培養物中的細胞密度（例如，活細胞密度）（例如，用血球計或其他可商購的自動細胞計數器）評估細胞密度峰值和細胞生長。可以用本領域內已知的方法，藉由隨時間評估細胞培養基或細胞內存在的重組蛋白水平測定細胞的容積生產率。例如，可以利用本說明書中實例部分描述的任何方法（例如，2-鄰胺基苯甲酸（anthilic acid acid）（AA）-衍生化和HPLC-螢光檢測）測定由細胞生產的重組糖蛋白的糖基化特徵圖。

如本領域中所熟知的，由本文所述方法生產的哺乳動物細胞系可以儲存在低溫（例如，低於-20ºC、低於-30ºC、低於-40ºC、低於-50ºC、低於-60ºC、低於-70ºC或低於-80ºC）下供將來使用。用於製備儲存在低溫下的哺乳動物細胞系原液的方法描述在例如Hewitt, Methods Mal. Biol.[分子生物學方法] 640:83-105, 2010和Phelan, Curr. Protoc. Hum. Genet.[當前人類遺傳學指南] 附錄3：3G, 2006）中。在一些實例中，未將由本文所述方法產生的哺乳動物細胞系暴露至含血清和/或含血清培養基（例如，儲存之前和/或儲存之後）。在一些實例中，由本文所述方法產生的哺乳動物細胞系只在無動物源性組分（ADC）的培養基中培養。在一些實例中，由本文所述方法產生的哺乳動物細胞系只在無血清、無蛋白的化學限定生長培養基中培養。

生產重組糖蛋白之方法

本文還提供生產重組糖蛋白（例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或本領域內已知的任何重組糖蛋白）的方法。該等方法包括提供由本文所述任何方法產生的哺乳動物細胞，將包含編碼糖蛋白（例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白和本領域內已知的任何其他糖蛋白）的序列的核酸（例如，表現載體）引入該細胞中，在足以生產糖蛋白的條件下在無血清培養基中培養該細胞，並從細胞或生長培養基收穫糖蛋白。還提供了由本文所述的任何方法產生的重組糖蛋白（例如，重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白）。

在一些情況下，包含編碼糖蛋白的序列的核酸係表現載體（例如，本文所述的任何表現載體）。在其他實例中，將包含編碼糖蛋白的序列的核酸整合到哺乳動物細胞的染色體中。

在一些實例中，利用生物反應器進行培養。該生物反應器可以具有例如約1 L至約10,000 L之間（例如，約1 L至約50 L之間、約50 L至約500 L之間、約500 L至約1000 L之間、500 L至約5000 L之間、約500 L至約10,000 L之間、約5000 L至約10,000 L之間、約1 L與約10 ,000 L之間、約I L與約8,000 L之間、約1 L與約6,000 L之間、約1 L與約5,000 L之間、約100 L與約5,000 L之間、約10 L與約100 L之間、約10 L與約4,000 L之間、約10 L與約3,000 L之間、約10 L 與約2,000 L之間、或約10 L與約1,000 L之間）的體積。生物反應器中存在的液體培養基的量可以是例如約0.5 L至約5,000 L之間（例如，約0.5 L至約25 L之間、約25 L至約250 L之間、約250 L至約500 L之間、250 L至約2500 L之間、約250 L至約5,000 L之間、約2500 L至約5,000 L之間、約0.5 L與約5,000 L之間、約0.5 L與約4,000 L之間、約0.5 L與約3,000 L之間、在約0.5 L與約2,500 L之間、約50 L與約2,500 L之間、約5 L與約50 L之間、約5 L與約2,000 L之間、約5 L與約1,500 L之間、約5 L與約1,000 L之間、或約5 L與約500 L之間）。可以例如用分批補料生物反應器或灌注生物反應器培養細胞。可以藉由分批補料培養或灌注培養進行培養（例如，在生物反應器中）。

本文所述的任何生物反應器的內表面係本領域內已知的，一個或多個用於將O₂ 、CO₂ 和N₂ 鼓入液體培養基中的埠，和用於攪拌液體培養基的攪拌機構。生物反應器可以在控制的濕化氣氛下（例如，在大於20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的濕度或100%濕度下）孵育細胞培養物。生物反應器還可以配備能夠從生物反應器移除一定體積液體培養基的機械裝置，和視情況的該機械裝置內的過濾器（例如，交替切向流（ATF）或切向流過濾（TFF）系統），該過濾器在將液體培養基移出生物反應器的過程中從液體培養基移除細胞。培養可以包括將生物反應器中的液體培養基暴露到如下氣氛中：包括至多或約15% CO₂ （例如，至多或約14% CO₂ 、12% CO₂ 、10% CO₂ 、8% CO₂ 、6% CO₂ 、5% CO₂ 、4% CO₂ 、3% CO₂ 、2% CO₂ 或至多或約1% CO₂ ）。

可以在約31ºC至約40ºC的溫度下進行培養。熟練的從業者將知道，可以例如每小時或每天在培養期間在一個或多個特定時間點改變溫度。例如，可以在生物反應器中初次接種哺乳動物細胞後約一天、兩天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天、十四天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天或約二十天或更多天改變或偏移（例如，增加或降低）溫度。例如，溫度可以向上偏移（例如，改變至多或約0.1ºC、0.2ºC、0.3ºC、0.4ºC、0.5ºC、0.6ºC、0.7ºC、0.8ºC、0.9ºC、1.0ºC、1.5ºC、2.0ºC、2.5ºC、3.0ºC、3.5ºC、4.0ºC、4.5ºC、5.0ºC、5.5ºC、6.0ºC、6.5ºC、7.0ºC、7.5ºC、8.0ºC、8.5ºC、9.0ºC、9.5ºC、10ºC、11ºC、12ºC、13ºC、14ºC、15ºC、16ºC、17ºC、18ºC、19ºC、或至多或約20ºC）。例如，溫度可以向下偏移（例如，改變大於0.05ºC或約0.1ºC、0.2ºC、0.3ºC、0.4ºC、0.5ºC、0.6ºC、0.7ºC、0.8ºC、0.9、1.0ºC、1.5ºC、2.0ºC、2.5ºC、3.0ºC、3.5ºC、4.0ºC、4.5ºC、5.0ºC、5.5ºC、6.0ºC、6.5ºC、7.0ºC、7.5ºC、8.0ºC、8.5ºC、9.0ºC、9.5ºC、10ºC、11ºC、12ºC、13ºC、14ºC、15ºC、16ºC、17ºC、18ºC、19ºC、或至多或約20ºC）。可以用無蛋白、無血清、化學限定培養基進行培養。此類培養基的非限制性實例係本領域內已知的且可商購獲得。有用的培養基的非限制性實例包括例如，CD CHO、Opti CHO和Forti CHO（全部可從紐約格蘭德艾蘭的生命技術公司（Life Technologies）獲得）、Hycell CHO培養基（麻塞諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.））、Ex-cell CD CHO融合培養基（密蘇里州聖路易斯的西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich Co.））和PowerCHO培養基（瑞士巴塞爾的龍沙集團（Lonza Group, Ltd.））。

哺乳動物細胞可以是本文所述的任何哺乳動物細胞。例如，哺乳動物細胞可以是CHO細胞。哺乳動物細胞可以是不內源性表現二氫葉酸還原酶的細胞（例如，不內源性表現二氫葉酸還原酶的CHO細胞）。

重組糖蛋白可以是酶（例如，人類α-半乳糖苷酶-A蛋白或本領域內已知的任何其他糖蛋白）。在一些實例中，核酸（例如，表現載體）包括與SEQ ID NO: 1至少90%（例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）一致的序列。核酸（例如，表現載體）可以包含可操作地連接至編碼糖蛋白的核酸的5'末端的啟動子序列、編碼人類CD52蛋白的肽的序列（TTG為起始密碼子，可操作地連接至編碼糖蛋白的核酸的5'末端）和編碼可操作地連接至編碼糖蛋白的核酸的3'末端的聚（A）識別位點的序列。例如，啟動子序列可以選自由下各項組成之群組：倉鼠rpS21啟動子、倉鼠β-肌動蛋白啟動子和SV 40早現啟動子。編碼聚（A）識別位點的序列可以是SV 40早現聚（A）識別序列。在一些實例中，啟動子序列可以是倉鼠β-肌動蛋白啟動子，且聚（A）識別序列係SV 40早現聚（A）識別序列。在一些實例中，核酸還包括編碼人類或狗穀胺醯胺合成酶的序列（例如，其中編碼人類或狗穀胺醯胺合成酶的核酸的5'末端可操作地連接至SV 40早現啟動子，且該編碼人類或狗穀胺醯胺合成酶的核酸的3'末端可操作地連接至SV 40早現內含子和聚（A）信號序列）。在一些實例中，該核酸還包含編碼二氫葉酸還原酶（DHFR）（例如，人類或小鼠DHFR）的序列（例如，其中編碼二氫葉酸還原酶的核酸的5'末端可操作地連接至SV 40早現啟動子，且該編碼二氫葉酸還原酶的核酸的3'末端可操作地連接至SV 40早現內含子和聚聚（A）信號序列）。

可用灌注生物反應器進行培養。灌注培養係本領域內熟知的，且包括從生物反應器移除第一體積的第一液體培養基（例如，包含任何濃度的哺乳動物細胞，例如，第一體積的基本上不含細胞的第一液體培養基），並向該第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。移除和添加可以同時或按順序或兩者的組合進行。另外，移除和添加可以連續（例如，以在任何給定時間段內（例如，在24小時期間，在約1小時至約24小時的增量時間段內，或在超過24小時的增量時間段內）移除並替換該生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.1%至800%之間（例如，在1%與700%之間，在1%與600%之間，在1%與500%之間，在1%與400%之間，在1%與350%之間，在1%與300%之間，在1%與250%之間，在1%與100%之間，在100%與200%之間，在5%與150%之間，在10%與50%之間，在15%與40%之間，在8%與80%之間，和在4%與30%之間）的體積的速率）或定期（例如，每三天一次，每隔一天一次，一天一次，一天兩次，一天三次，一天四次或一天五次）或它們的任何組合進行。當定期進行時，移除或替換的體積（例如，在約24小時期間，在約1小時至約24小時的增量時間段內，或在超過24小時的增量時間段內）可以例如在該生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.1%至800%之間（例如，在1%與700%之間，在1%與600%之間，在1%與500%之間，在1%與400%之間，在1%與300%之間，在1%與200%之間，在1%與100%之間，在100%與200%之間，在5%與150%之間，在10%與50%之間，在15%與40%之間，在8%與80%之間，和在4%與30%之間）。移除的第一液體培養基的第一體積和添加的第二液體培養基的第二體積在一些情況下可以在整個或部分培養期內，在每24小時時期（或，可替代地，約1小時至約24小時的增量時間段或超過24小時的增量時間段）內保持大致相同。如本領域中已知的，移除第一體積的第一液體培養基的速率（體積/單位時間）和添加第二體積的第二液體培養基的速率（體積/單位時間）可以不同。移除第一體積的第一液體培養基的速率（體積/單位時間）和添加第二體積的第二液體培養基的速率（體積/單位時間）可以大致相同或可以不同。

可替代地，移除和添加的體積可以在培養期間每24小時期間內（或可替代地，在1小時與約24小時之間的增量時間段或超過24小時的增量時間段）變化（例如，逐漸增加）。例如，在培養期內每24小時時期內（或可替代地，在約1小時與超過24小時之間的增量時間段或超過24小時的增量時間段）移除的第一液體培養基的體積和添加的第二液體培養基的體積可以在培養期間內從生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.5%至約20%之間的體積增加（例如，逐漸或藉由交錯增量）至生物反應器體積或第一液體培養基體積的約25%至約150%。

熟練的從業者將理解，第一液體培養基和第二液體培養基可以是同類培養基（例如，無血清或無血清、無蛋白化學限定培養基）。在其他情況下，第一液體培養基和第二液體培養基可以是不同的。

第一體積的第一液體培養基可以例如使用機械系統和/或藉由滲出或重力使該體積流過無菌膜，該無菌膜具有排除該體積中存在的哺乳動物細胞的分子量截留。第二體積的第二液體培養基可以以自動方式（例如，藉由灌注泵）添加至第一液體培養基。在一些情況下，在將哺乳動物細胞接種在生物反應器至少1小時內（例如，在2小時內，在3小時內，在4小時內，在5小時內，在6小時內，在7小時內，在8小時內，在9小時內，在10小時內，在12小時內，在14小時內，在16小時內，在18小時內，在24小時內，在36小時內，在48小時內，在72小時內，在96小時內或在96小時之後）不移除第一體積的第一液體培養基（例如，第一體積的基本上不含哺乳動物細胞的第一液體培養基）和向該第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。

可替代地或除此之外，可用分批補料生物反應器進行培養。此類培養係本領域內已知的，且包括在大部分培養時間內向第一液體培養基添加（例如，定期或連續添加）第二體積的第二液體培養基。添加第二液體培養基可以連續（例如，以在任何給定時間段內（例如，在24小時期間，在約1小時至約24小時的增量時間段內，或在超過24小時的增量時間段內）添加該生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.1%至300%之間（例如，在1%與250%之間，在1%與100%之間，在100%與200%之間，在5%與150%之間，在10%與50%之間，在15%與40%之間，在8%與80%之間，和在4%與30%之間）的體積的速率）或定期（例如，每三天一次，每隔一天一次，一天一次，一天兩次，一天三次，一天四次或一天五次）或它們的任何組合進行。當定期進行時，添加的體積（例如，在約24小時時期內，在約1小時至約24小時的增量時間段內，或在超過24小時的增量時間段內）可以例如在該生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.1%至300%之間（例如，在1%與200%之間，在1%與100%之間，在100%與200%之間，在5%與150%之間，在10%與50%之間，在15%與40%之間，在8%與80%之間，和在4%與30%之間）。添加的第二液體培養基的第二體積在一些情況下可以在整個或部分培養期內，在每24小時時期（或，可替代地，約1小時至約24小時的增量時間段或超過24小時的增量時間段）內保持大致相同。如本領域中已知的，添加第二體積的第二液體培養基的速率（體積/單位時間）在整個或部分培養期間內可以變化。例如，添加的第二液體培養基的體積可以在培養期間每24小時期間內（或可替代地，在1小時與約24小時之間的增量時間段或超過24小時的增量時間段）變化（例如，逐漸增加）。例如，在培養期間內每24小時時期內（或可替代地，在約1小時與超過24小時之間的增量時間段或超過24小時的增量時間段）添加的第二液體培養基的體積可以在培養期間內從生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.5%至約20%之間的體積增加（例如，逐漸或藉由交錯增量）至生物反應器體積或第一液體培養基體積的約25%至約150%。添加第二體積的第二液體培養基的速率（體積/單位時間）在整個或部分培養期間內可以大致相同。

熟練的從業者將理解，第一液體培養基和第二液體培養基可以是同類培養基（例如，無蛋白培養基或無血清、無蛋白化學限定培養基）。在其他情況下，第一液體培養基的類型可以不同於第二液體培養基。第二液體培養基的體積可以以自動方式（例如，藉由灌注泵）添加至第一液體培養基。

在一些情況下，在將哺乳動物細胞接種在生物反應器至少1小時後但不超過7天后（例如，在給生物反應器接種哺乳動物細胞後至少2小時、3小時內、4小時內、5小時內、6小時內、7小時內、8小時內、9小時內、10小時內、12小時內、14小時內、16小時內、18小時內、24小時內、36小時內、48小時內、72小時內、96小時內、或96小時後，但不超過7天）才向第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。分批補料培養中的細胞培養基通常在培養期結束時收穫，然而，分批補料培養中的細胞培養基也可以在培養期期間的一個或多個時間點收穫。

熟練從業者將理解，本文所述的各種培養參數（例如，生物反應器、體積、替換培養體積的速率或頻率、攪拌、溫度、培養基和/或CO2濃度）中的任一個可以在實施該等方法時以任何組合使用。

可以實施分離重組糖蛋白的額外步驟。如本領域中所熟知的，此類方法根據糖蛋白的物理特性和活性而不同。例如，當設計分離重組糖蛋白（例如，來自培養基或來自細胞）的步驟時，應考慮參數（諸如糖蛋白的結合特異性（例如，底物或抗原結合活性）、淨電荷和/或尺寸）。可以使用一種或多種以下任何方法分離重組糖蛋白（例如，用本文所述的任何方法生產的重組糖蛋白）：親和柱層析、離子（例如，陽離子或陰離子）交換柱層析、尺寸排除柱層析、反相柱層析、過濾和沈澱。分離重組人類α-半乳糖苷酶-A蛋白的非限制性方法描述在實例中。

本文所述的方法可另外包括將分離的重組糖蛋白配製到藥學上可接受的賦形劑或緩衝劑中（例如，以便給予至受試者）。該等方法還可包括無菌過濾、病毒滅活、UV照射和/或冷凍乾燥和/或它們的任何組合。生產、捕獲和純化 rh α -Gal A

典型的細胞製造方法從使來自主細胞庫的冷凍保存細胞的復蘇開始。在小體積小瓶中解凍細胞，並逐漸引入較大體積的培養容器中，以實現種子生物反應器的接種。然後將種子反應器中的擴增細胞群引入生產生物反應器中，治療性蛋白將在裡面表現。

有許多種反應器，反應器的選擇基於以下因素憑經驗決定：諸如最佳細胞生長、活力、蛋白產量和維持治療蛋白的關鍵質量屬性。分批、分批補料、分批重新補料或間歇收穫和灌注係當前最常用的反應器。

分批培養係封閉系統，其中在開始生產時添加培養基和細胞，然後不添加任何其他東西培養，直到停止生產運行。細胞生長分四階段進行：停滯期、指數生長期、穩定期和死亡期。

在分批補料細胞培養期間，當已耗盡細胞培養組分時，添加進料溶液。進料溶液含有濃縮形式的胺基酸、維生素和痕量元素。因此，使用分批補料培養，培養體積隨後續每次添加進料溶液而增加。

當培養營養物已經耗盡且細胞進入穩定期時，分批重新補料或間歇收穫培養移除一部分細胞培養物（包括細胞）。這種收穫方法可用於不穩定蛋白，因為該收穫可以頻繁進行，諸如每2-4天。

培養中的細胞在指數期期間具有高能量需求，並迅速將葡萄糖轉化為乳酸。高乳酸含量對細胞生長和生產率有害。因此，必須密切控制乳酸，以確保產物質量。用半乳糖或甘露糖替代葡萄糖可以緩解乳酸堆積，因為該等糖的代謝更緩慢。影響生長動力學、細胞活力和蛋白質生產的其他培養參數係pH、溫度和溶解氧。

在初始細胞擴增後，在灌注細胞培養中，藉由添加新鮮培養基，同時移除含蛋白產物的已用培養基將細胞維持在穩定狀態。採用灌注培養的情況下，細胞密度可以高於分批培養的細胞密度，因為連續補充培養基。使細胞留在培養物中，同時移除含產物的已用培養基。定期移除一些含細胞的培養基，將細胞密度維持在生產性範圍內。灌注培養也與連續加工相容。

生物藥物生產不產生一種均一的蛋白，而係一系列不同同種型，這反應了生物過程的複雜性。可以出現蛋白變化，包括糖基化、磷酸化、硫酸化、醯胺化、氧化、加合物形成、焦谷胺酸形成和異構化。胺基酸變異可以來自基因突變、胺基酸錯摻、修剪以及N-和C-末端異質性。結構變異可以包括錯誤折疊、聚集和二硫化物加擾（disulfide scrambling）。

製造期間引入的雜質也可以影響蛋白穩定性、毒性和功效。這類雜質包括宿主細胞蛋白、DNA、培養基元素和病毒組分。

被設計成從細胞分泌的蛋白質的信號序列在藉由內質網移位時被信號肽酶裂解。信號序列的裂解差異可產生蛋白變體。N-末端谷胺酸或穀胺醯胺可以環化形成焦穀胺酸。這產生封閉蛋白，這可能對它們的生物功能有影響或沒影響。

蛋白上展現的兩種主要的糖基化類型係N-聯和O-聯糖基化。如上所述，α-半乳糖苷酶A的單體亞基上有四個潛在N-聯糖基化位點，其中三個通常被糖基化。共有序列ASN-X-SER/THR上發生糖基化，其中X係不同於組胺酸或脯胺酸的任何胺基酸。細胞系大大影響摻入糖基化位點的糖類型以及培養條件和蛋白的下游加工。

半胱胺酸係具有相對反應性的胺基酸，且未配對的半胱胺酸可以與細胞、培養基中的其他巰基基團反應或導致形成亞基內或亞基間鍵，這係成問題的。

由於蛋白酶、糖苷酶和磷酸酶的作用不受控制，蛋白也可以被降解，或具有不良的產物特徵。

在各種實施方式中，將包含一個或多個陰離子交換（AEX）柱的蛋白捕獲系統用於rhα-Gal A，特別是具有高M6P含量、高唾液酸含量和低中性聚醣含量的rhα-Gal A的直接產物捕獲。雖然不希望受任何具體理論的束縛，認為使用AEX層析捕獲來自經過濾的培養基中的rhα-Gal A可確保所捕獲的重組蛋白產物具有更高的M6P含量和更高的唾液酸含量，這歸因於具有一個或多個M6P基團和/或唾液酸基團的重組蛋白的更多的負電荷。其結果係，非磷酸化的重組蛋白和宿主細胞雜質不結合樹脂柱連同高度磷酸化的重組蛋白，並且將該非磷酸化的重組蛋白和宿主細胞雜質穿過該柱。因此，該AEX層析可以用於豐富該蛋白產物（即，選擇具有更多M6P的蛋白質分子）的M6P含量，這歸因於包含M6P的蛋白質對於AEX樹脂的高親和力。類似地，該AEX層析可以用於富集該蛋白產物（即，選擇具有更多唾液酸的蛋白質分子）的唾液酸含量，這歸因於包含唾液酸的蛋白質對於AEX樹脂的親和力。

此外，雖然不希望受任何具體理論的束縛，還認為藉由使用AEX層析的重組蛋白的直接產物捕獲可確保將具有高M6P含量的重組蛋白從包含蛋白酶和其他酶的培養基中去除，該等蛋白酶和其他酶可以降解該蛋白質和/或將該蛋白質脫磷酸。其結果係，該高質量的產物被保留。

強力結合至AEX柱證實期望的三種產物特徵：磷酸化酶、充分唾液酸化的酶和具有低中性聚醣含量的酶。在生理pH下，磷酸化和唾液酸化賦予負電荷，且促進結合至AEX柱。具有單-M6P和/或雙-M6P的酶將結合CIMPR，進而將酶靶向至溶酶體（酶作用位點）。已經充分唾液酸化的重組酶在血液中也展現出較大的半衰期。這係因為脫唾液酸糖蛋白受體（大部分位於肝細胞上）結合蛋白上暴露的半乳糖殘基，並從循環去除該蛋白。末端糖殘基上的唾液酸阻斷這種基於半乳糖的去除機制。

如果具有此類特徵的分子存在於細胞培養上清液中，AEX柱上的純化選擇具有低中性聚醣含量的磷酸化/唾液酸化酶。結合至CIMPR可以藉由將酶製劑結合至固定CIMPR，隨後用濃度漸增的M6P洗提來評估。

因此，本發明的一個或多個實施方式涉及具有指定水平的表面單-M6P和/或雙-M6P和/或唾液酸和/或低含量中性聚醣的重組α-Gal A，諸如藉由本文所述的方法生產的rhα-Gal A。藉由此類方法生產的rhα-Gal A可以具有本文所述的任何特徵。

同樣，相對於起初存在於細胞上清液中的酶分子而言，可利用本文所述的層析技術富集酶分子的單-M6P和/或雙-M6P和/或唾液酸含量。如上所述，可使用AEX柱選擇具有高的磷酸化含量、高的唾液酸含量和低的中性聚醣含量的酶分子。可使用其他柱（如CIMPR柱）選擇性地結合具有高的單-M6P和雙-M6P含量的酶。因此，即使宿主細胞起初表現聚醣含量類似於常規重組人類α-半乳糖苷酶A產品（諸如Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme（阿加糖酶β））的酶分子，可在產物捕獲和純化期間用AEX和CIMPR柱富集最終重組蛋白產物中酶分子的單-M6P和/或雙-M6P和/或唾液酸含量和/或降低中性聚醣含量，這係相對於起初存在於細胞上清液中的酶分子而言。藥理學伴護蛋白

鹽酸（HCl）米加司他係充當α-Gal A的藥理學伴護蛋白的低分子量亞胺糖。它係末端半乳糖基團的類似物，從底物球形三醯神經醯胺（GL-3）裂解而來。藥理學伴護蛋白被設計成結合並穩定預期蛋白靶標，以在從該蛋白解離前幫助恢復適當的細胞內運輸，從而允許該蛋白如預期在溶酶體中一樣發揮作用。因此，鹽酸米加司他係α-Gal A的強效可逆競爭性抑制劑。它結合至α-Gal A的突變體和野生型形式，穩定該酶，從而允許正確折疊的蛋白質藉由內質網，以適當地運輸至溶酶體。

血液的相對中性pH為用於酶替代療法中的適應溶酶體的酶呈現惡劣環境，因為ERT在溶酶體的酸性環境中更穩定。因此，一部分給予的ERT變性，變成引發針對該蛋白的免疫反應的抗原。最低程度上說，變性的酶藉由非有效途徑從血流中清除。米加司他結合至血流中的野生型α-Gal A ERT，產生活性更大且更多藉由CIMPR吸收到溶酶體中的穩定酶。溶酶體中累積的底物的低pH和高濃度有利於鹽酸米加司他解離，從而允許α-Gal A結合並分解GL-3。

【在一個或多個實施方式中，rhα-Gal A與藥理學伴護蛋白（諸如米加司他）共同配製。

在一個或多個實施方式中，共同配製組成物包含濃度在約0.05與約100 µM之間，或在約0.1與約75 µM之間，或在約0.2與約50 µM之間，或在約0.3與約40 µM之間，或在約0.4與約30 µM之間，或在約0.5與約20 µM之間，或在約0.6與約15 µM之間，或在約0.7與約10 µM之間，或在約0.8與約9 µM之間，或在約0.9與約8 µM之間，或在約1與約7 µM之間，或在約2與約6 µM之間，或在約3與約5 µM之間的α-Gal A。上述濃度中間的濃度和範圍也預期成為本申請的一部分。

在一個或多個實施方式中，共同配製組成物包含濃度為約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5或15 µM的α-Gal A。

在一個或多個實施方式中，共同配製組成物包含濃度在約0.0025與約5 mg/ml之間，或在約0.005與約4.5 mg/ml之間，或在約0.025與約4 mg/ml之間，或在約0.05與約3.5 mg/ml之間，或在約0.25與約3 mg/ml之間，或在約0.5與約2.5 mg/ml之間，或在約0.75與約2 mg/ml之間，或在約1與約1.5 mg/ml之間的α-Gal A。上述濃度中間的濃度和範圍也預期成為本申請的一部分。

在一個或多個實施方式中，共同配製組成物包含濃度在約10與約25,000 µM之間，或在約50與約20,000 µM之間，或在約100與約15,000 µM之間，或在約150與約10,000 µM之間，或在約200與約5,000 µM之間，或在約250與約1,500 µM之間，或在約300與約1,000 µM之間，或在約350與約550 µM之間，或在約400與約500 µM之間的米加司他或其鹽。上述濃度中間的濃度和範圍也預期成為本申請的一部分。

在一個或多個實施方式中，共同配製組成物包含濃度在約0.002與約5 mg/ml之間，或在約0.005與約4.5 mg/ml之間，或在約0.02與約4 mg/ml之間，或在約0.05與約3.5 mg/ml之間，或在約0.2與約3 mg/ml之間，或在約0.5與約2.5 mg/ml之間，或在約1與約2 mg/ml之間的米加司他或其鹽。上述濃度中間的濃度和範圍也預期成為本申請的一部分。

在一個或多個實施方式中，共同配製組成物包含濃度為約50；100；150；200；250；300；350；400；450；500；550；600；650；700；750；800；850；900；950；1,000；2,000；3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；9,000；10,000；11,000；12,000；13,000；14,000；15,000；16,000；17,000；18,000；19,000或20,000 µM的米加司他或其鹽。

在一個或多個實施方式中，α-Gal A酶和米加司他（或其鹽）組合產生米加司他與α-Gal A酶的莫耳比在約10 : 1與約20,000 : 1之間；或在約20 : 1與約15,000 : 1之間；或在約50 : 1與約10,000 : 1之間；或在約100 : 1與約5,000 : 1之間；或在約150 : 1與約1,000 : 1之間；或在約200 : 1與約500 : 1之間；或在約250 : 1與約450 : 1之間；或在約300 : 1與約400 : 1之間的共同配製物。上述莫耳比中間的莫耳比和範圍也預期成為本申請的一部分。治療方法

本發明提供一種治療有需要的患者的Fabry氏病之方法，該方法包括rhα-Gal A，其中rhα-Gal A在CHO細胞中表現，且包含含量與Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme （阿加糖酶β）的帶有一個或兩個M6P殘基的N-聚醣單元的含量相比增加的帶有一個或兩個M6P殘基的N-聚醣單元和/或實質上較低含量的中性聚醣。已經將生產rhα-Gal A的細胞系、表現條件和純化方法全部小心地挑選、評價和檢查，以使得具有糖基化蛋白的潛在益處最大化，該糖基化蛋白使得非生產性靶向最小化並使得在靶細胞中的生產性吸收最大化。

本發明還提供一種治療有需要的患者的Fabry氏病之方法，該方法包括向該患者給予藥理學伴護蛋白（諸如米加司他或其藥學上可接受的鹽）與rhα-Gal A的組合，其中該rhα-Gal A在CHO細胞中表現，且包含含量與Replagal（阿加糖酶α）或Fabrazyme（阿加糖酶β）的帶有一個或兩個M6P殘基的N-聚醣單元的含量相比增加的帶有一個或兩個M6P殘基的N-聚醣單元和實質上較低含量的中性聚醣。在另一方面中，本發明提供米加司他和rhα-Gal A的組合用於治療對其有需要的患者的Fabry氏病的用途。

本發明還提供了一種降低有需要的患者中的GL-3水平之方法，該方法包括向該患者給予含治療有效量的rhα-Gal A，視情況與藥理學伴護蛋白組合的組成物。在一個或多個實施方式中，該器官係心臟、腎臟或皮膚。

本發明還提供了一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括使哺乳動物細胞與有效量的rhα-Gal A（視情況與藥理學伴護蛋白組合）接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少GL-3。在一個或多個實施方式中，該接觸係向受試者給予有效量的rhα-Gal A。

本發明還提供了一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括使哺乳動物細胞與有效量的rhα-Gal A（視情況與藥理學伴護蛋白組合）接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少血漿溶血性Gb-3。在一個或多個實施方式中，該接觸係向受試者給予有效量的rhα-Gal A。

本發明還提供了一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括向患者給予有效量的rhα-Gal A（視情況與藥理學伴護蛋白組合）接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少一種或多種底物。在一個或多個實施方式中，該接觸係向受試者給予有效量的rhα-Gal A。在一個或多個實施方式中，該底物包含GL-3和/或血漿溶血性Gb-3。

本發明還提供了一種提高哺乳動物細胞中溶酶體中α-半乳糖苷酶-A蛋白的活性水平之方法，該方法包括使該哺乳動物細胞與rhα-Gal A（視情況與藥理學伴護蛋白組合）接觸。在一個或多個實施方式中，該接觸係藉由給予該rhα-Gal A和視情況的藥理學伴護蛋白進行。在一個或多個實施方式中，該細胞係在體外。

在以上任何方法中，該細胞可以在受試者中。在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的心臟中。在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的腎臟中。在一個或多個實施方式中，該細胞位於受試者的皮膚中。在至少一個實施方式中，該藥理學伴護蛋白（例如米加司他或其鹽）係口服給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約100 mg至約400 mg的口服劑量，或以約100 mg、約150 mg、約200 mg、約250 mg或約300 mg的口服劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約233 mg至約400 mg的口服劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約250至約270 mg的口服劑量或以約250 mg、約255 mg、約260 mg、約265 mg或約270 mg的口服劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約260 mg的口服劑量給予。

在至少一個實施方式中，將藥理學伴護蛋白（例如米加司他或其鹽）全身給予，如靜脈內給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約100 mg至約400 mg的靜脈內劑量，或以約100 mg、約123 mg、約150 mg、約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg或約400 mg的靜脈內劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約233 mg至約400 mg的靜脈內劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約250至約270 mg的靜脈內劑量，或以約250 mg、約255 mg、約260 mg、約265 mg或約270 mg的靜脈內劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約260 mg的靜脈內劑量給予。在至少一個實施方式中，米加司他或其鹽以約0.3 mg/kg至約300 mg/kg的靜脈內劑量，或以約1 mg/kg至約100 mg/kg的靜脈內劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約1 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/ kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg或約100 mg/kg的靜脈內劑量給予。

在至少一個實施方式中，將藥理學伴護蛋白（例如米加司他或其鹽）皮下給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約100 mg至約400 mg的皮下劑量，或以約100 mg、約123 mg、約150 mg、約200 mg、約250 mg、約300 mg、約350 mg或約400 mg的皮下劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約233 mg至約400 mg的皮下劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約250至約270 mg的皮下劑量，或以約250 mg、約255 mg、約260 mg、約265 mg或約270 mg的皮下劑量給予。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽以約260 mg的皮下劑量給予。

熟習該項技術者將理解，在約100 mg至400 mg的範圍或其中任何更小範圍中的米加司他的口服劑量可以適用於平均體重為約70 kg的成年患者。對於體重顯著低於約70kg的患者，包括但不限於嬰兒、兒童或體重不足的成人，醫生可以認為更小的劑量係適合的。因此，在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽按從約25 mg至約200 mg的口服劑量給予，或按以下口服劑量給予：約50 mg、約75 mg、約100 mg、125 mg、約150 mg、約175 mg或約200 mg。在至少一個實施方式中，將米加司他或其鹽按從約65 mg至約195 mg口服劑量給予，或按以下口服劑量給予：約65 mg、約130 mg 或約195 mg。

可以根據常規程序將rhα-Gal A配製為適合向人類給予的藥物組成物。例如，在較佳的實施方式中，用於靜脈內給予的組成物係在無菌等滲水緩衝液中的溶液。必要時，該組成物還可以包括增溶劑和局部麻醉劑以緩解注射部位的疼痛。通常，成分以單位劑量形式分開或混合在一起提供，例如，作為在氣密容器中的乾燥凍乾粉或無水濃縮物，氣密容器如指明活性劑的量的安瓿或小藥囊。在藉由輸注給予組成物時，可以用包含無菌藥用級的水、鹽水或右旋糖/水的輸液瓶進行分配。在藉由注射給予組成物時，可以提供無菌注射用水或鹽水的安瓿，這樣使得可以在給予前將該等成分混合。

藉由適當的途徑給予rhα-Gal A（或包含rhα-Gal A的組成物或藥物）。在一個或多個實施方式中，rhα-Gal A係全身給予。在一個實施方式中，rhα-Gal A係靜脈內給予。在其他實施方式中，藉由直接給予至靶組織（如至心臟或骨骼肌（例如，肌內））或神經系統（例如，直接注射到腦中；腦室內；鞘內）來給予rhα-Gal A。如果需要，可以同時使用多於一個途徑。

將rhα-Gal A（或包含rhα-Gal A的組成物或藥物）以治療有效量給予（例如，當以規律間隔給予時，足以治療疾病的劑量，例如藉由減輕與疾病相關的症狀、預防或延遲疾病的發作、和/或降低疾病的症狀的嚴重性或頻率實現的）。在治療疾病中治療有效的量將取決於疾病影響的性質和程度，並且可以藉由標準臨床技術來確定。另外，可以視情況採用體外或體內測定來幫助鑒定最佳劑量範圍。待採用的確切劑量還取決於給予途徑和疾病的嚴重程度，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況來決定。可以從源自體外或動物模型測試系統的劑量-反應曲線外推有效劑量。在至少一個實施方式中，將rhα-Gal A藉由靜脈內輸注以約0.1 mg/kg至約30 mg/kg，通常約0.5 mg/kg至約10 mg/kg的劑量給予。在至少一個實施方式中，將rhα-Gal A藉由靜脈內輸注以約0.5 mg/kg、約1.0 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2.0 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg或約10 mg/kg的劑量給予。對具體個體的有效劑量可以是隨著時間變化的（例如，增加的或減少的），這取決於該個體的需要。例如，在生理疾病或軀體應激的時候，或如果抗-α-半乳糖苷酶A抗體存在或增加，或如果疾病症狀惡化，該量可以增加以對抗效果下降，或減少以減少輸液反應引起的併發症。

以規律的間隔給予治療有效量的rhα-Gal A（或包含rhα-Gal A的組成物或藥物），這取決於疾病影響的性質和程度，以及持續進行的基礎。如本文中所使用，以“規律的間隔”給予表示，將該治療有效量定期地給予（如區別於一次性劑量）。該間隔可以藉由標準臨床技術來確定。在較佳的實施方式中，將rhα-Gal A每月；每兩月；每週；每週兩次；或每天給予。可替代地，將rhα-Gal A借助醫療裝置給予，該裝置藉由任何相容途徑接近連續或連續地給予。單個個體的給予間隔不需要是固定的間隔，但是可以是隨時間變化的，其取決於該個體的需要。例如，在生理疾病或軀體應激的時候，如果抗-重組人類半乳糖苷酶A抗體存在或增加，或如果疾病症狀惡化，可以減小劑量之間的間隔或減小以提高功效或減少輸液反應。在一些實施方式中，將0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、10、15、20或30 mg酶/kg體重的治療有效量以每週兩次、每週一次或每隔一週，伴有或不伴有伴護蛋白來給予。

rhα-Gal A可以製備用於以後使用，如在單位劑量小瓶或注射器中，或在用於靜脈給予的瓶或袋或醫療裝置中。包含rhα-Gal A的套組（kit）連同視情況的賦形劑或其他活性成分，如伴護蛋白或或其他藥物，可以封裝在包裝材料中，並且附有用於重構、稀釋或定量給藥以用於治療對其有需要的受試者（如患有Fabry氏病的患者）的說明書。

在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）和rhα-Gal A同時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）和rhα-Gal A連續給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前小於三小時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前約兩小時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前小於兩小時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前約1.5小時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前一小時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前約50分鐘至約70分鐘給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前約55分鐘至約65分鐘給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前約30分鐘給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前約25分鐘至約35分鐘給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前約27分鐘至約33分鐘給予。

在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A的同時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前或之後20分鐘內給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前或之後15分鐘內給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前或之後10分鐘內給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之前或之後5分鐘內給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）和rhα-Gal A共同配製。

在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之後給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之後至多2小時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之後約30分鐘給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之後約一小時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之後約1.5小時給予。在至少一個實施方式中，將米加司他（或其鹽）在給予rhα-Gal A之後約2小時給予。

本發明的另一方面提供了在有需要的患者中用於Fabry氏病的聯合治療的套組。該套組包括以下各項：包含米加司他的藥學上可接受的劑型，包含rhα-Gal A的藥學上可接受的劑型，以及用於將包含米加司他的藥學上可接受的劑型和包含rhα-Gal A的藥學上可接受的劑型給予至對其有需要的患者的說明書。在至少一個實施方式中，包含米加司他的藥學上可接受的劑型係如本文所描述的口服劑型，包括但不限於片劑或膠囊。在至少一個實施方式中，包含rhα-Gal A的藥學上可接受的劑型係如本文所述的適合注射的無菌溶液。在至少一個實施方式中，用於給予該等劑型的說明書包括如本文所述的，在藉由靜脈內輸注包含rhα-Gal A的藥學上可接受的劑型之前口服給予包含米加司他的藥學上可接受的劑型的說明書。

不受理論束縛，認為米加司他充當該rhα-Gal A的藥物伴護蛋白，並且結合其活性位點。已發現米加司他降低了rhα-Gal A的未折疊，並且穩定了rhα-Gal A的活性構象，防止在中性pH下變性和不可逆失活，潛在地允許其在循環條件中存在足夠長以到達組織，並且被組織吸收。然而，米加司他與rhα-Gal A活性位點的結合，藉由防止天然底物GL-3接近該活性位點還可以導致rhα-Gal A酶活性的抑制。認為當在本文所描述的條件下將米加司他和rhα-Gal A給予患者時，血漿和組織內的米加司他和rhα-Gal A的濃度使得rhα-Gal A穩定，直到它可以被吸收到組織中，並且靶向溶酶體，但是由於米加司他的快速清除，在溶酶體中由rhα-Gal A對GL-3的水解沒有因米加司他的存在而受到過度抑制，並且該酶保留治療有用的足夠活性。

可以組合上述所有實施方式。這包括在涉及以下的具體實施方式中：藥理學伴護蛋白，例如米加司他的性質；和其特異性活性位點；藥理學分子伴護蛋白（例如，米加司他）的劑量、給予途徑和包括載體性質的藥物組成物的類型以及可商購組成物的用途；藥物，例如治療性蛋白藥物產品的性質，該藥物可以是受試者中活性降低或不存在的內源性蛋白的對應物，適合地是rhα-Gal A，例如如下的rhα-Gal A：其在CHO細胞中表現且包含含量與Replagal （阿加糖酶α）和/或Fabrazyme （阿加糖酶β）的帶有一個或多個M6P殘基的N-聚醣單元的含量相比增加的N-聚醣單元和/或含有與Replagal（阿加糖酶α）和/或Fabrazyme （阿加糖酶β）相比更少的中性聚醣的rhα-Gal A；且適合地具有如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2中所列或由SEQ ID NO: 3編碼的胺基酸序列。 rhα-Gal A上N-聚醣單元的數量和類型，例如附接至該rhα-Gal A的N-乙醯葡糖胺、N-乙醯半乳糖胺、半乳糖、海藻糖、唾液酸或由該等的組合形成的複合N-聚醣）； rhα-Gal A上形成單-M6P和/或雙-M6P的甘露糖單元的磷酸化程度；替代酶（rhα-Gal A）的劑量和給予途徑（例如，靜脈內給予，尤其是靜脈內輸注，或直接給予至靶組織）以及包括載體的配製物的類型和治療有效量；藥理學伴護蛋白（例如米加司他）和rhα-Gal A的給藥間隔；治療反應的性質和聯合治療的結果（例如，如與單獨進行的每種治療的效果相比，增強的結果）；給予聯合治療的時間安排，例如同時給予米加司他和rhα-Gal A或順序給予，例如其中米加司他（或其鹽）係在rhα-Gal A之前或在rhα-Gal A之後或在給予rhα-Gal A之前或之後的某一時間內給予；和所治療的患者的性質（例如，哺乳動物，例如人）以及個體所患有的病症（例如，酶不足）。

可以將以上清單中的任何實施方式與清單中的一個或多個其他實施方式進行組合。實例實例 1 ：製備生產具有高含量帶有單 -M6P 、雙 -M6P 和 / 或唾液酸的 N- 聚醣的 rh α -Gal A 的 CHO 細胞殖株

將編碼野生型人類α-半乳糖苷酶A（α-Gal A）的DNA選殖到雙載體表現系統中，以轉染到懸浮CHO-K1細胞中。兩個用於用編碼rhα-Gal A的DNA（例如SEQ ID NO: 3）轉化CHO細胞的載體示出在圖3中。

為了轉染，用FspI使每個載體線性化，FspI在Amp抗性基因內切割。用酚氯仿萃取來純化消化的DNA，並在NanoDrop（賽默科技，ND2000）上量化。將線性DNA進行編碼序列確認和轉染。

在轉染之前24小時，將CHO Kl宿主細胞以7 x 10⁵ 個細胞/ml在培養基M1（CD CHO + 4 mM穀胺醯胺 + 1% HT補充物）中傳代。在轉染之日，獲取宿主細胞培養物樣品並計數。

在轉染期間，用預先在水浴（36.5ºC）中溫熱約30 min的培養基M1將宿主細胞培養物稀釋至10 x 10⁵ 個細胞/ml，並將5 ml稀釋細胞添加至50 ml旋轉管，並保持在Kuhner孵化器（36.5ºC，85%濕度，6% CO₂ ，225 RPM）中。

將12 μg每種載體（圖3）添加到50 ml旋轉管中的776 μl OptiPro^TM SFM中。將24 μl FreeStyle^TM MAX試劑添加到第二50 ml旋轉管中的776 μl OptiPro^TM SFM中。將DNA-OptiPro SFM混合物添加到FreeStyle MAX-OptiPro SFM混合物中，同時輕輕混合，並在室溫下孵育10分鐘。

從Kuhner孵化器移除稀釋的宿主細胞培養物，並將667 μl DNA-Freestyle Max混合物添加到宿主細胞培養物中。在Kuhner孵化器（36.5ºC，85%濕度，6% CO₂ ，225 RPM）中孵育轉染的細胞培養物6小時。將5 ml新鮮M1培養基添加到轉染的細胞培養物中。

用以上程序總共進行六次獨立轉染。

轉染後四十八小時，以1-1.6 x 10⁶ 個細胞/ml的細胞密度將來自每次轉染的細胞在三個96孔板中以3000-4000個細胞/100 μL/孔的鋪板密度鋪板在選擇培養基M2（培養基M1 + 9 μg/ml殺稻瘟菌素 + 400 μg/ml吉歐黴素）中。在CO₂ 孵化器（36.5ºC，6% CO₂ ）中孵育96孔板。

鋪板後三天或四天，將120 μl新鮮選擇培養基M2添加到96孔板的每個孔中。在接下來的2-3週，每3或4天用等體積的新鮮培養基替換150 μl細胞上清液。

為確定六個穩定CHO池中哪個將提供最佳的產物屬性，比較該等池的細胞培養活力、rhα-Gal A的表現和與CIMPR的結合。鋪板後約16-18天，當大多數孔達到＞70% 匯合度，在表現分析之前24小時用等體積的新鮮選擇培養基M2替換150 μl細胞上清液。

在試驗性培養物中擴增細胞池，以研究長時間段內的活力。選擇每次轉染的前9個具有最高酶活性的小池，並從96-孔板擴增到24-孔板，到6-孔板，並放入旋轉管中，以用選擇培養基M2進行批量重新補料篩選。使小瓶在小池擴增期間冷凍（低溫保存培養基：90% M1 + 10% DMSO）。將冷凍小瓶放在-80ºC冷凍機中的低溫箱冷凍容器中過夜，並儲存在液氮槽中。

當回收T9池時，將N-1細胞培養物藉由1 : 5稀釋在新鮮生產培養基M3（CDM4 + 4mM 穀胺醯胺 + 1% HT補充物）中接種以在旋轉管中獲得3.8-5.7 x 10⁵ 個細胞/ml的接種密度（第0天），以進行分批重新補料培養。將池批量重新補料培養物（20 ml）在Kuhner振動器（35ºC，85%濕度，6% CO₂ 和225 RPM）中孵育。從第3天開始，使細胞離心沈降（300 RPM，5 min，25ºC），並用新鮮培養基交換80%上清液。當活細胞密度大於20 x 10⁶ 個細胞/ml時，根據生長情況棄去一定量細胞，以在第二天達到25 x 10⁶ 與30 x 10⁶ 個細胞/ml之間的目標活細胞密度。在第20天藉由離心（3000 RPM，10 min，4ºC）收穫池批量重新補料培養物。在培養的18天期間，每個細胞池的活力大於90%，且活細胞密度係約20-30 x 10⁶ 個細胞/ml。（圖4）。

分別藉由4-甲基傘形酮基（methylumbelliferyl）-α-D-半乳糖苷酶測定（4MU）和結合至具有固定陽離子獨立甘露糖-6-磷酸受體（CIMPR）的柱評估rhα-Gal A的表現和與CIMPR的結合。圖5示出池號2在至少16天的細胞培養中都維持最高水平的rhα-Gal A表現（藉由酶活性測量）。

期望的產物屬性係與CIMPR的高度結合。結合至CIMPR提供了將酶吸收在溶酶體中的途徑，溶酶體代表累積底物的大儲庫。藉由將來自每個池的細胞上清液施加到CIMPR柱評估該酶作為體內結合至正確受體以內化的候選物的能力（圖6A-6F）。將第15至17天池化的培養上清液載入到固定的CIMPR親和柱上。使濃度從0增加到1 mM，然後進一步增加至5 mM的游離M6P藉由柱，以洗提結合的酶。對於細胞池而言，CIMPR結合的程度範圍為從37%到52%（藉由活性測量）。池1和4具有最高的CIMPR結合，為52%，池2略微更少為51%。因此，該等池在培養期間的相同時間點具有比其他池更有利的CIMPR結合特徵。

在基於96孔板的CIMPR結合分析中進一步評價上清液的結合情況。總之，將來自各個時間點的上清液以1 : 100、1 : 1,000和l : 10,000稀釋在CIMPR結合緩衝液中，然後添加至塗布CIMPR受體的孔。在37ºC下孵育1小時後，洗掉未結合的酶，並在4MU酶活性測定中測量結合的酶。將活性轉化為結合的酶的納克數，並針對稀釋繪製計算值的曲線。在6個池中，池1和4示出最佳（與Fabrazyme相比）和最一致的結合。

基於酶活性數據和CIMPR結合結果，池1和4被選擇為最好的池，以進行進一步的殖株篩選。

使池1和4解凍，並傳代培養一週。在鋪板之日，新製備鋪板培養基，並以0.6個細胞/30微升/孔的細胞密度將兩個池鋪板在384孔板中。在鋪板之日（D0）、鋪板後一天（D1）和兩天（D2）拍攝所有板的圖片，以供將來選殖性（clonality）驗證。鋪板一週後，將15微升M2培養基補充到所有384孔板的每個孔中。

鋪板後十天，再次仔細查看所有板，以觀察殖株回收。基於匯合度將回收的細胞從384孔板轉移到96孔板。鋪板後約15天，當大多數孔達到＞70% 匯合度，在表現分析前24小時用等體積的新鮮選擇培養基M4（CD CHO+ 4mM 穀胺醯胺 + 1% HT補充物 + 4 μg/mL殺稻瘟菌素 + 200 μg/mL吉歐黴素）替換150 μl細胞上清液。對於表現水平高的孔來說，取出D0、D1和D2的圖片並評價選殖性。來自D0-D2的具有1-2-4細胞階段的殖株被視為源自單一細胞。將具有最高表現水平和良好選殖性的來自池1的22個殖株和來自池4的37個殖株擴增，以進行進一步評價。在這個階段，在細胞系開發中，表現水平範圍為7至23 μg/mL。

考慮池篩選階段期間來自池4的殖株的總體較高的表現和池4的更佳產物質量，用CIMPR結合測定來篩選來自池1具有最高表現水平的前10個殖株和來自池4的前26個殖株。首先分析36個殖株的酶活性。滴定後，在CIMPR結合測定中測試兩種濃度的酶（每小時釋放50和100納莫耳4MU/微升）。

選擇具有高生產率和/或高CIMPR結合的殖株進行進一步評價。選擇來自池1的四個殖株和來自池4的八個殖株，在旋轉管中進行分批重新補料評價。

將殖株從96-孔板擴增到24-孔板，再擴增至6-孔板，並放入旋轉管，用含有選擇壓力的培養基M4進行分批重新補料篩選。使小瓶在殖株擴增期間冷凍（低溫保存培養基：90% M1 + 10% DMSO）。將冷凍小瓶放在-80ºC冷凍機中的低溫箱冷凍容器中過夜，並儲存在液氮槽中。

當回收從孔板擴增到旋轉管的殖株時，將N-1細胞培養物藉由1 : 4-1 : 5稀釋在新鮮生產培養基M3中接種以在旋轉管中獲得4.0-5.3 x 10⁵ 個細胞/ml的接種密度（第0天）以進行分批重新補料培養。將殖株批量重新補料培養物（20 ml）在Kuhner振動器（35ºC，85%濕度，6% CO₂ 和225 RPM）中孵育。從第3天開始，使細胞離心沈降（300 RPM，5 min，25ºC），並用新鮮M3培養基交換80%上清液。當活細胞密度大於20 x 10⁶ 個細胞/ml時，根據生長速率棄去一定量細胞，以在第二天達到25 x 10⁶ 與30 x 10⁶ 個細胞/ml之間的目標活細胞密度。當活力降到20%之下或在第14天藉由離心（3000 RPM，10 min，4ºC）收穫池批量重新補料培養物。

從第6天（D6）開始每天測量來自收穫的培養物的上清液的酶生產。用D6和D9樣品在滴定至每小時50和100納莫耳釋放的4-MU/微升後進行CIMPR結合分析。基於旋轉管研究中的生長特徵、酶生產率和CIMPR結合，選擇幾種殖株進行進一步評價。

基於細胞生長表現、酶生產和CIMPR結合能力，從10個最好的殖株選擇4個最好的殖株01-003、04-002、04-018和04-023。使用生物反應器研究和其他旋轉管研究進一步評價殖株，並將殖株01-003和04-023選擇為來自池1和4的最好殖株，以進行進一步開發。實例 2 ： rh α -Gal A 的 CIMPR 親和力的表徵

組α-半乳糖苷酶A體外結合CIMPR柱的能力係重組酶體內結合受體並靶向溶酶體的能力的指示。藉由灌注培養生產兩種rhα-Gal A殖株（殖株01-003和殖株04-023），並藉由使每種酶藉由固定的CIMPR親和柱測定結合（圖7），如上所述。圖7A-7C示出90%的Fabrazyme（阿加糖酶β）結合至CIMPR柱，80%的rhα-Gal A（01-003）和96%的rhα-Gal A （04-023）結合CIMPR柱。圖7D-7F示出可以如何改變表現和純化來產生針對CIMPR柱具有較高結合親和力的分子。實例 3 ：用米加司他穩定 rh α -Gal A

研究米加司他穩定rhα-Gal A的能力。如圖8和表1中所見，已發現米加司他降低了rhα-Gal A的未折疊，並且穩定了rhα-Gal A的活性構象，防止在中性pH下變性和不可逆失活，潛在地允許其在循環條件下存在足夠長以到達組織，並且被組織吸收。表1：Sypro Orange熱穩定性實例 4 ：藉由液相層析對 rh α -Gal A 殖株進行寡糖表徵

α-Gal A的糖基化特徵圖對血清半衰期和溶酶體靶向極為重要，進而對ERT的功效有大的影響。Replagal（阿加糖酶α）和Fabrazyme（阿加糖酶β）的每個單體有三個位點被糖基化。每個α-Gal A分子上的每個糖基化位點具有各類聚醣，可以得到α-Gal A分子的極其異質性混合物。圖10提供不同rhα-Gal A ERT治療上發現的總聚醣的寡糖特徵圖。

分析由兩種殖株產生的酶的聚醣特徵圖，以詳細闡述可以影響臨床功效的體外和體內特徵。藉由肽N-糖苷酶F（PNG酶）在標準變性和還原條件下從每種α-Gal A的蛋白樣品去除聚醣。在SDS-PAGE上評估去糖基化程度，蛋白質在去糖基化時顯示向較低的表觀分子量的轉變（圖9）。從蛋白主鏈釋放聚醣後，聚醣與鄰胺基苯甲酸反應形成2-鄰胺基苯甲酸衍生物，然後在胺基柱上藉由正相層析分離。

胺基柱上的正相液相層析係對於比較所有聚醣形式的相對豐度有價值的技術。保留時間受到電荷密度和總體寡糖尺寸的影響。在15-30分鐘之間洗提的聚醣係由高甘露糖寡糖和脫唾液酸-複合寡糖組成的中性聚醣。

圖10代表兩類指定為01-003和04-023的rhα-Gal A蛋白的分析。圖10A-F中比較來自不同ERT的純化聚醣，以測定每種ERT上發現的聚醣結構。

含有由高甘露糖寡糖和脫唾液酸-複合寡糖組成的中性聚醣的蛋白藉由甘露糖受體或脫唾液酸糖蛋白受體從循環中快速清除。因此，有益的是在重組人類α-Gal A上具有最少高甘露糖和脫唾液酸-複合寡糖。

另一種可能的聚醣類型係磷酸化寡糖。該等聚醣對於藉由CIMPR將ERT遞送到溶酶體很關鍵。磷酸化聚醣可以含有一個M6P殘基（單-M6P）或兩個M6P殘基（雙-M6P）。雙-磷酸化聚醣係較佳的，因為與單磷酸化聚醣相比，它對CIMPR的親和力高約3,000倍。單-磷酸化聚醣用藍色星星表示，而雙-磷酸化聚醣在110與120分鐘之間洗提。單-磷酸化聚醣可以藉由不完全磷酸化或製造期間因細胞死亡釋放到條件培養基的酸性磷酸酶進行去磷酸化而形成。

圖10A示出來自Fabrazyme（阿加糖酶β）的聚醣。中性聚醣（洗提15–30 min）占總聚醣的約13%，且雙-磷酸化聚醣（洗提110-120 min）占總聚醣的約9%。存在大量單-磷酸化聚醣，表明部分磷酸化或大量磷酸酶降解。

圖10B示出來自Fabry ERT rhα-Gal A 04-023（由細胞系04-023生產）的聚醣。中性聚醣占總聚醣的約33%，且雙-磷酸化聚醣高於（11%）Fabrazyme。

圖10C示出來自Fabry ERT rhα-Gal A 01-003（由細胞系01-003生產）的聚醣。存在極少量中性聚醣（6%），表明藉由甘露糖和脫唾液酸糖蛋白受體的清除減少。然而，這個製劑含有極少量雙-磷酸化聚醣（6%），這可以潛在地對藉由血流的溶酶體遞送具有負面影響。

圖10D-10F示出可以如何改變表現和純化來產生同時具有低水平中性聚醣（1.5%-5%）和高水平雙磷酸化寡糖（9%-14%）的分子。藉由仔細地監測在選擇ERT、表現和純化期間的聚醣圖譜，可以改變rhα-Gal A產物特徵來使得藉由甘露糖和脫唾液酸糖蛋白受體的脫靶清除最小化，同時使得藉由CIMPR以生產性高親和力靶向溶酶體最大化。

圖11提供來自10A-10F的用於ERT的聚醣分佈的匯總。

下表2-4中提供Replagal（阿加糖酶α）、Fabrazyme（阿加糖酶β）、rhα-Gal A 04-023和rhα-Gal A 01-003的聚醣的詳細比較。表2提供單糖分析的匯總，表3提供聚醣“家族”的匯總，且表4提供聚醣結構的匯總。表2 表3 1 2AA標記聚醣的HPLC分析得到的聚醣值 2 LC/MS/MS方法得到的聚醣值表4 1 2AA標記聚醣的HPLC分析得到的聚醣值 2 LC/MS/MS方法得到的聚醣值

可以從表2-4中看出，rhα-Gal A 01-003和rhα-Gal A 04-023具有與Replagal（阿加糖酶α）和Fabrazyme（阿加糖酶β）有結構差異的某些區別性特徵。例如，rhα-Gal A 04-023具有極高雙-M6P含量，超過14%的聚醣帶有雙-M6P。rhα-Gal A 04-023還具有高水平的單-M6P，超過30%的聚醣係單-M6P（高甘露糖）。rhα-Gal A 04-023還具有超過35%的帶有唾液酸的聚醣。表5

經測試並示出在上表2-5中的rhα-Gal A 01-003具有高雙-M6P（＞ 14%）、高單-M6P（＞ 25%）和高唾液酸（＞ 50%）和低中性聚醣（＜ 7%）。測試的rhα-Gal A 01-003具有高含量M6P（＞3 mol/mol）和唾液酸殘基（＞5 mol/mol）/rhα-Gal A蛋白。

特定的糖基化特徵的該等組合提供獨特的rhα-Gal A酶，平衡磷酸化、唾液酸化和中性聚醣含量，從而提供可以具有比可商購的酶增強的靶向和更少非生產性清除的新型酶。實例 5 ： rh α -Gal A 和米加司他組合的藥物動力學

比較rhα-Gal A 01-003和rhα-Gal A 04-023的藥物動力學曲線以及與米加司他組合的效果（圖12）。藉由靜脈內彈丸式（bolus）注射將與或不與3 mg/kg米加司他共同配製的酶（1 mg/kg）給予至Gla KO小鼠。Fabry氏病的Gla敲除（KO）小鼠模型示出與Fabry氏病患者中疾病的病理生理過程高水平的類似。在輸注5、15和30分鐘後以及輸注1、2和24小時後評估血漿酶活性。表6中示出處理組。表6

圖12示出rhα-Gal A 01-003和rhα-Gal A 04-023的藥物動力學。rhα-Gal A 04-023與Fabrazyme（阿加糖酶β）相比具有較低的藥物動力學曲線，而rhα-Gal A 01-003在2小時內示出更高的AUC，表明與其他酶相比總體上更多地暴露至這種酶。藉由與米加司他共同配製，rhα-Gal A 01-003在血漿中的12活性也得到增強。類似地，因存在米加司他，rhα-Gal A 04-023在血漿中的活性增加。

表7示出Gla KO小鼠中Fabrazyme（阿加糖酶β）、rhα-Gal A 01-003和rhα-Gal A 04-023各自的半衰期和曲線下面積（AUC）。在24小時時用酶活性測定評估組織吸收重組酶的水平。表7

圖13A示出01-003在心臟組織中24小時後的酶活性與Fabrazyme（阿加糖酶β）相似，而rhα-Gal A 04-023的活性略微更低。rhα-Gal A 01-003和rhα-Gal A 04-023在心臟中24小時後的活性都因存在米加司他而增加。納入品系匹配野生型小鼠中發現的酶活性水平作為比較。有趣的是，彈丸式輸注重組酶後，24小時後的活性水平比野生型心臟組織中見到的高。圖13B示出所有三種酶在腎臟中24小時後的酶活性相似，且rhα-Gal A 01-003和rhα-Gal A 04-023的活性都因存在米加司他而增加，rhα-Gal A 01-003達到野生型水平。圖13C示出測試的所有三種酶在皮膚組織中24小時後的活性相似，且未顯現因存在米加司他而受到影響。實例 6 ： rh α -Gal A 變體的單次給予功效比較

在Gla KO小鼠中評估rhα-Gal A 01-003和rhα-Gal A 04-023減少血漿溶血性-Gb3和組織GL-3的能力。還評估將該等酶與米加司他組合為共同配製物時對底物減少的影響。給予小鼠1 mg/kg酶的劑量，連同或不連同米加司他，並在給予酶七天后評估血漿溶血性-Gb3和組織GL-3 （心臟、腎臟和皮膚）（表8）。表8

圖14A示出給予酶七天后在Gla KO小鼠心臟中的組織酶活性。在心臟中，給予rhα-Gal A 01-003七天后產生與給予Fabrazyme（阿加糖酶β）相似的酶活性，而將米加司他添加至rhα-Gal A 01-003顯著增加酶活性水平。七天后所有三種酶在腎臟中產生相似活性（圖14B）。將米加司他添加至rhα-Gal A 01-003顯著增加腎臟中的酶水平，如同將劑量增加至3 mg/kg一樣（rhα-Gal A 04-023的較高劑量）。在皮膚中，七天后，rhα-Gal A 04-023和Fabrazyme（阿加糖酶β）的酶活性水平相似，但具有或不具有米加司他的rhα-Gal A 01-003更高（圖14C）。增加rhα-Gal A 04-023的劑量在七天后在皮膚中產生更高水平的酶活性（圖15C）。藉由將米加司他添加至rhα-Gal A 04-023或藉由將劑量增加至3 mg/kg觀察到更高的酶水平（圖14D）。

除了評估組織中酶活性以外，測定給予七天后底物的減少程度。在心臟組織中，與1 mg/mg Fabrazyme（阿加糖酶β）相比，納入米加司他顯著增強GL-3的減少（rhα-Gal A 01-003和rhα-Gal A 04-023），如同將劑量從1 mg/kg增加至3 mg/kg一樣（rhα-Gal A 04-023）（圖15A）。在腎臟中（圖15B），所有酶處理導致GL-3相似地減少，除了3 mg/kg rhα-Gal A 04-023的較高劑量，其增強了底物減少。

在皮膚中（圖15C），rhα-Gal A 04-023與米加司他共同配製導致GL-3減少，這顯著低於只有Fabrazyme（阿加糖酶β）的情況。當與只有Fabrazyme（1 mg/kg）的情況下相比時，3 mg/kg的劑量在皮膚中導致顯著更低水平的GL-3。rhα-Gal A 01-003（1 mg/kg）與米加司他共同配製導致溶血性-Gb3減少，這顯著低於只有Fabrazyme（1 mg/kg）的情況。rhα-Gal A 04-023的劑量（3 mg/kg）導致比只有Fabrazyme（1 mg/kg）顯著更低水平的血漿溶血性-Gb3（圖16D）。

在這個實例6中，rhα-Gal A 01-003在Gla KO小鼠中的半衰期約為14分鐘，相比之下，對於Fabrazyme（阿加糖酶β）而言約為8分鐘，並且對於rhα-Gal A 04-023為4分鐘，而添加米加司他提高兩種rhα-Gal A殖株的暴露。

基於藥物動力學和功效數據，選擇rhα-Gal A 01-003作進一步開發。實例 7 ：生產 rh α -Gal A 的變型

兩個不同的研究比較藉由不同方法生產的rhα-Gal A的藥物動力學。向Gla KO小鼠（n = 5-7/組）給予單次IV彈丸式注射1 mg/kg Fabrazyme或藉由不同方法生產的rhα-Gal A 01-003。如藉由α-Gal A活性測量測定在5、15、30、60和120 min連續采血收集的血漿和藥物動力學。圖16A-16B和表9和10中提供Fabrazyme和rhα-Gal A 01-003的藥物動力學特性。圖16A和表9中示出的rhα-Gal A對應圖10C中示出的製劑，且圖16B和表10中示出的rhα-Gal A對應圖10F中示出的製劑。表9 表10 T½^a 用上部λz 5 min和下部λz 30 min測定

從圖16A和表9中可以看出，根據第一方法生產的rhα-Gal A 01-003具有比Fabrazyme顯著更長的半衰期。從圖16B和表10中可以看出，第二方法產生rhα-Gal A 01-003，它具有與Fabrazyme相似的表觀半衰期。然而，認為，這種半衰期的減少係因為吸收到細胞中增加，這係因為M6P含量增加，而不是非生產性清除增加。如圖10C和10F中所示，兩種rhα-Gal A製劑都具有低含量中性聚醣（圖左邊的峰），且圖10F中的rhα-Gal A製劑具有比圖10C中rhα-Gal A製劑更高的雙-M6P含量（圖右邊的峰）。因此，該等研究示出，即使ERT的半衰期相似也不一定證明ERT產物相似，因為ERT可因為靶向或藉由非生產性清除而清除。

藉由改變製造方法生產的rhα-Gal A 01-003能夠減少心臟和腎臟中的α-Gal A底物，且藉由與米加司他共同配製而增強（圖17A和17B）。向Gla KO小鼠IV給予1 mg/kg酶，並在給予一週後測量GL-3。與只有Fabrazyme（阿加糖酶β）或只有rhα-Gal A 01-003的情況下相比，與米加司他共同配製導致底物更大程度的減少。實例 8 ：具有和不具有米加司他的各種劑量的 rh α -Gal A 的藥物動力學

將具有和不具有米加司他的各種劑量的rhα-Gal A 01-003的藥物動力學與Fabrazyme進行比較。藉由單次彈丸式輸注，在與或不與米加司他共同配製的情況下將酶給予Gla KO小鼠（n = 5；總共40隻；約6個月大）。表11中示出處理組。表11

在5 min、15 min、30 min、1 hr和2 hr時進行連續下頜下取血，獲得血漿。在24小時時進行驗屍，並收集血漿和組織。

圖18A-18F示出與和不與米加司他共同配製的各種劑量的rhα-Gal A、以及兩種劑量的Fabrazyme的藥物動力學。下表12示出相同處理組的各自半衰期。圖18A和18B示出所有處理組的藥物動力學。圖18C聚焦1 mg/kg酶劑量的Fabrazyme、僅rhα-Gal A以及rhα-Gal A加3 mg/kg米加司他。圖18D聚焦3 mg/kg酶劑量的僅rhα-Gal A以及rhα-Gal A加10 mg/kg米加司他。圖18E聚焦10 mg/kg酶劑量的Fabrazyme和rhα-Gal A。圖18F聚焦僅Fabrazyme和僅rhα-Gal A在不同酶劑量下的藥物動力學。表12 注意：Prism GraphPad中以單相衰減的半衰期，無加權

從表12和圖18A-18F中可以看出，每種酶的半衰期隨著劑量增加而增加。rhα-Gal A具有劑量依賴性和非線性藥物動力學。在相同劑量下，rhα-Gal A示出比Fabrazyme更長的半衰期。米加司他與rhα-Gal A的共同配製也實質上增加循環中酶活性的半衰期，在與米加司他共同配製後，rhα-Gal A的循環半衰期增加高達2.3倍。實例 9 ： Gla KO 小鼠中的重複給予功效研究

比較具有和不具有米加司他的rhα-Gal A 01-003以及Fabrazyme的功效。藉由彈丸式輸注，在與或不與3 mg/kg米加司他共同配製的情況下將酶給予至Gla KO小鼠。向約16週大的雄性Gla KO小鼠（n = 8；總共72隻）每兩週IV給予，給予兩次。表13中示出處理組，且圖19A-19D和20A-20C中示出結果。表13

從圖19A（心臟）和圖19B（腎臟）中可以看到，僅rhα-Gal A和僅Fabrazyme示出良好的劑量反應：10 mg/kg Fabrazyme ＞ 3 mg/kg rhα-Gal A ＞ 1 mg/kg rhα-Gal A = 1 mg/kg Fabrazyme。與1 mg/kg Fabrazyme相比，1 mg/kg rhα-Gal A + 3或10 mg/kg米加司他的共同配製物顯著降低GL-3水平。與10 mg/kg Fabrazyme相比，3 mg/kg rhα-Gal A與3或10 mg/kg米加司他共同配製實現相似或甚至略微更好的GL-3減少，與10 mg/kg米加司他的共同配製物顯現得到最佳結果。

從圖19C（皮膚）和圖19D（血漿溶血性-GB3）可以看出，僅rhα-Gal A和僅Fabrazyme示出良好的劑量反應：10 mg/kg Fabrazyme ＞ 3 mg/kg rhα-Gal A ＞ 1 mg/kg rhα-Gal A ≈ 1 mg/kg Fabrazyme。在1 mg/kg rhα-Gal A組中，存在高可變性（可能有一個異常值）。總體上，對心臟和腎臟的觀察結果相似。1 mg/kg rhα-Gal A + 3或10 mg/kg米加司他的共同配製物示出比1 mg/kg Fabrazyme顯著更低的GL-3水平。與10 mg/kg Fabrazyme相比，3 mg/kg rhα-Gal A與3或10 mg/kg米加司他共同配製實現相似或甚至略微更好的GL-3減少，與10 mg/kg米加司他的共同配製物顯現得到最佳結果。實例 10 ：各種劑量的 rh α -Gal A 的單次給予功效比較

比較具有和不具有米加司他的rhα-Gal A 01-003以及Fabrazyme的功效。藉由單次彈丸式輸注，在與或不與米加司他共同配製的情況下將酶給予至Gla KO小鼠。向約18週大的雄性Gla KO小鼠（7隻/組）進行單次彈丸式IV給予，並在給予7天后驗屍。表14中示出處理組，並且圖21A-21D和表15-18中示出結果。表14 表15 表16 表17 表18

從圖21A-21D和表15-18中可以看出，rhα-Gal A 1 mg/kg + 米加司他3 mg/kg的共同配製物比1 mg/kg劑量的Fabrazyme更大程度地減少底物（GL-3和溶血性Gb-3），且rhα-Gal A 3 mg/kg + 米加司他10 mg/kg的共同配製物與較高劑量10 mg/kg的Fabrazyme係可比的。rhα-Gal A 10 mg/kg與米加司他的共同配製物實現與較高劑量25 mg/kg的Fabrazyme相似的功效，rhα-Gal A 10 mg/kg + 米加司他30 mg/kg的共同配製物總體上最大程度地減少底物。10 mg/kg的rhα-Gal A劑量比同等劑量10 mg/kg的Fabrazyme更大程度地減少底物，並且與米加司他共同配製進一步增強了底物減少。實例 11 ：靜脈內給予米加司他劑量遞增來評價安全性、耐受性和藥物動力學

健康志願者藉由IV給予途徑接受鹽酸米加司他來評價安全性、耐受性和藥物動力學。進行另一項研究來測定與在健康志願者中IV給予一定劑量的鹽酸米加司他相比，口服膠囊劑量後米加司他的絕對生體可用率。預期表徵IV給予單獨的米加司他後的PK行為可允許更精確地預測鹽酸米加司他在與rhα-Gal A共同配製時的建議劑量。添加絕對生體可用率臂來測定150 mg口服劑量相對於以IV輸注給予的150 mg劑量的暴露比。這樣研究係為了確定口服跨到IV是否是可能的並提供用於與rhα-Gal A共給予和/或共同配製的IV鹽酸米加司他的精確劑量確定。表19中提供主要和次要目標和終點的清單。表19

研究類型：這個1期研究係由2個設計組成的單中心研究。根據隨機化、雙盲、安慰劑對照、單一遞增劑量（SAD）IV研究設計進行定群1、2和3，以評價IV給予鹽酸米加司他或IV給予安慰劑給健康受試者的安全性、耐受性和PK。群組4係開放標籤、隨機化雙向交叉臂，經設計用於評估口服給予鹽酸米加司他相對於IV給予鹽酸米加司他到健康受試者的絕對生體可用率。在所有群組中，IV輸注鹽酸米加司他（或安慰劑，如果可行）的持續時間係2小時（± 10 min），恒定速率為125 mL/h。

群組1、2、3：群組1、2和3中的受試者接受IV給予的單一遞增劑量的鹽酸米加司他。將七名受試者納入每個群組（5名受試者隨機接受鹽酸米加司他，且2名受試者隨機接受安慰劑）。將群組1、2和3的給藥錯開，以允許在進入下一組之前檢查安全性和耐受性。因此，群組1、2和3各自分成2個子組：A組（2名受試者隨機接受鹽酸米加司他，且1名受試者隨機接受安慰劑）和B組（3名受試者隨機接受鹽酸米加司他，且1名受試者隨機接受安慰劑）。B組中的受試者在A組完成給藥後給藥。群組3A 31天后給藥的群組3B除外，因為要對群組3A的出現數據進行中期PK檢查。此外，對於A組受試者，開始輸注時間錯開60分鐘，且B組受試者錯開30分鐘（參見圖22）。

*在所有群組中，向B組中受試者給藥始於A組給藥的第二天。群組3A 31天后給藥的群組3B除外，因為要對群組3A進行中期PK檢查。

群組4：添加開放標籤交叉臂（群組4）來評估口服給予150 mg鹽酸米加司他膠囊相對於IV輸注2小時150 mg鹽酸米加司他的絕對生體可用率。群組4由2個相繼處理期組成，7天沖刷期在研究藥物給予之間（圖23）。群組4納入10名受試者，他們全部接受活性藥物（不給予安慰劑）。使群組4隨機化，使得5名受試者接受口服配製物，並且5名受試者在1期接受IV配製物，隨後在2期期間接受替代性配製物。 *在1期期間，進行第1天到第3天的評估。**沖刷期係7天。***在2期期間，受試者重複第1天到第3天評估。

劑量遞增：在評估每個先前劑量的安全性和耐受性後，選擇這個遞增設計來小心增加劑量。IV給予單一遞增劑量的鹽酸米加司他包括0.3 mg/kg的開始劑量（群組1）、1.0 mg/kg的中等劑量（群組2）和在群組中的任何時間允許的最高劑量，這基於緊急安全性、耐受性和PK數據，最大允許劑量高達13.0 mg/kg。按照CSP修正案3.1（參見附錄16.1.1和章節9.8.1），估計這項研究（群組3）的最高劑量不超過以下極限：口服給予1250 mg鹽酸米加司他的最大暴露（AUC）116 h.μg/mL（115,931 h•ng/mL）。

給予的處理：在所有群組中，IV輸注鹽酸米加司他（或安慰劑，如果可行）的持續時間係2小時（± 10 min），恒定速率為125 mL/h。使納入群組1、2和3中的受試者隨機接受以下劑量的鹽酸米加司他（n = 5）或安慰劑（n = 2）中的一種：

群組1（0.3 mg/kg IV）：鹽酸米加司他（n = 5）或安慰劑（n = 2）

群組2（1.0 mg/kg IV）：鹽酸米加司他（n = 5）或安慰劑（n = 2）

群組3（10.0 mg/kg IV）：鹽酸米加司他（n = 5）或安慰劑（n = 2）。群組4：1期：150 mg鹽酸米加司他膠囊（n = 5）或藉由IV輸注150 mg鹽酸米加司他（n = 5）。2期：150 mg鹽酸米加司他膠囊（n = 5）或藉由IV輸注150 mg鹽酸米加司他（n = 5）

用於輸注的鹽酸米加司他係50 mg/ml，且安慰劑係0.9%氯化鈉。口服鹽酸米加司他作為150 mg明膠片劑給予。

研究中劑量的選擇：基於IV給藥後的預計人類PK、非臨床的安全界限和目標治療米加司他暴露來選擇當前的單劑量水平獲得功效。基於大安全界限選擇起始的單次IV輸注0.3 mg/kg鹽酸米加司他給人類（表20）。同樣，人類中鹽酸米加司他10 mg/kg劑量得到先前人類口服米加司他暴露和臨床前安全界限的支持（表21）。基於質量平衡研究，米加司他的回收性高，表明米加司他吸收性良好，然而，約20%至25%可以代表未吸收的藥物。這樣，預期預測的暴露在IV給藥後高多達1.25倍，解釋了口服給藥後可能未吸收的藥物。表20 表21

在健康志願者和Fabry氏病患者中進行的先前臨床研究中，口服給予150 mg鹽酸米加司他膠囊的耐受性良好。此外，在1期研究中單劑量給予多達2000 mg鹽酸米加司他給健康志願者的耐受性良好。口服給予已經證實對1250 mg鹽酸米加司他的線性暴露。在23名Fabry氏病患者中進行的2a期研究證明，在共給予單次口服給予150 mg鹽酸米加司他與0.2、0.5和1.0 mg/kg阿加糖酶後，活性α-Gal A到皮膚中的組織吸收得到改進。此外，已經在2期和3期研究中以單一療法程序每隔一天安全地將口服150 mg鹽酸米加司他給予至具有易感型突變的Fabry氏病患者。

群組1、2和3（SAD）：以0.3至10 mg/kg的範圍內的劑量單次2小時IV輸注鹽酸米加司他後，米加司他通常在輸注結束時（對應於開始輸注2 h後）達到血漿濃度最大算數平均值。在增加鹽酸米加司他的IV劑量後，米加司他血漿濃度平均值-時間曲線顯示血漿濃度明顯的劑量依賴性增加。達到最大值後，米加司他濃度迅速降低，直到給藥12 h後。在高劑量水平（0.3 mg/kg和10 mg/kg）下，米加司他濃度起初快速下降，隨後以明顯雙相方式更平緩下降（圖24A和24B分別以線性和對數尺度示出藥物動力學）。組合的單獨米加司他血漿濃度-時間曲線示出單獨的PK曲線在測試的IV劑量範圍上示出最小的個體間差異。

群組4：口服給予150 mg鹽酸米加司他後，米加司他在給藥後0.25 h至0.5 h內出現在血漿中（0.25 h係第一給藥後取樣時間點）。米加司他通常在口服給藥後2 h與4 h之間達到血漿濃度最大算數平均值。對於大多數受試者，觀察到單一峰血漿濃度；受試者022除外，口服給藥後，在1.5 h是初始峰濃度，隨後在4 h是第二且更高的峰濃度。對於受試者030，在口服給藥後1 h與1.5 h之間觀察到相似的平臺期，隨後在給藥後3 h是峰濃度。IV給予150 mg鹽酸米加司他後，米加司他在輸注結束時（對應開始輸注2 h後）達到米加司他血漿濃度最大算數平均值，這類似於SAD數據。IV給藥後的血漿濃度最大算數平均值比口服給予鹽酸米加司他後高約2倍。達到最大值後，對於口服和IV給予鹽酸米加司他，米加司他濃度迅速下降，隨後以明顯雙相方式更平緩下降（圖25A和25B分別以線性和對數尺度示出藥物動力學）。

組合的單獨的米加司他血漿濃度-時間曲線在口服給予150 mg鹽酸米加司他後的單獨PK曲線比IV給予150 mg鹽酸米加司他後示出更大的個體間差異。PK曲線在150 mg IV劑量後的個體間差異比0.3至10 mg/kg IV劑量範圍後顯現也更顯著，這可能與150 mg口服劑量後吸收和清除的速率和程度的個體間差異有關，或是因為150 mg IV劑量沒有針對個別受試者體重進行校正。

無

從以下書面描述和附圖中，本發明的其他特徵將變得清楚，其中：

圖1A示出非磷酸化高甘露糖聚醣、單-M6P聚醣、和雙-M6P聚醣；

圖1B示出M6P基團之化學結構；

圖2A示出rhα-Gal A藉由帶有M6P的聚醣生產性地靶向靶組織；

圖2B示出了對非靶組織（例如，肝臟和脾）或藉由非M6P聚醣與非靶組織的結合的非生產性藥物清除；

圖3示出用於轉染懸浮CHO-K1培養物的雙表現載體；

圖4示出來自用表現rhα-Gal A的質粒轉化的CHO細胞池之活細胞密度；

圖5示出每個細胞池隨時間產生的酶活性程度；

圖6示出在第15-17天時每個細胞池培養上清液中CIMPR結合rhα-Gal A之程度；

圖7示出不同細胞系和不同生長條件的Fabrazyme®和rhα-Gal A之CIMPR曲線；

圖8示出rhα-Gal A在米加司他的存在下之熱穩定性增加；

圖9示出藉由SDS-PAGE分析的由PNG酶去除糖基化之程度；

圖10示出不同細胞系和不同生長條件的Fabrazyme®和rhα-Gal A之聚醣分析；

圖11示出不同細胞系和不同生長條件的Fabrazyme®和rhα-Gal A之聚醣比較；

圖12示出Fabrazyme®和兩個rhα-Gal A殖株在存在和不存在米加司他的情況下之藥物動力學；

圖13示出單次給予具有和不具有米加司他的各種ERT一天后Gla KO小鼠心臟（13A）、腎臟（13B）和皮膚（13C）中之α-Gal A活性；

圖14示出單次給予具有和不具有米加司他的各種ERT七天后Gla KO小鼠心臟（14A）、腎臟（14B）、皮膚（14C）和肝臟（14D）中之α-Gal A活性；

圖15示出單次給予具有和不具有米加司他的各種ERT後Gla KO小鼠心臟（15A）、腎臟（15B）、和皮膚（15C）和血漿溶血性-Gb3（15D）中之GL-3水平；

圖16A和16B示出Fabrazyme®和藉由不同方法生產的rhα-Gal A之藥物動力學；

圖17示出單次給予具有和不具有米加司他的各種ERT後Gla KO小鼠心臟（17A）和腎臟（17B）中之GL-3水平；

圖18示出Fabrazyme®和rhα-Gal A在不同劑量下在具有和不具有米加司他的情況下之藥物動力學；

圖19示出重複給予具有和不具有米加司他的各種ERT後Gla KO小鼠心臟（19A）、腎臟（19B）、和皮膚（19C）和血漿溶血性-Gb3（19D）中之GL-3水平；

圖20示出重複給予具有和不具有米加司他的各種ERT後Gla KO小鼠心臟（20A）、腎臟（20B）和皮膚（120C）中之α-Gal A活性；

圖21示出單次給予具有和不具有米加司他的各種ERT後Gla KO小鼠心臟（21A）、腎臟（21B）、皮膚（21C）和血漿溶血性-Gb3（21D）中之GL-3水平；

圖22示出研究在人類受試者中靜脈內給予米加司他之單劑量群組設計；

圖23示出研究在人類受試者中靜脈內和口服給予米加司他之群組交叉設計；

圖24示出在人類受試者中靜脈內給予米加司他之藥物動力學曲線；以及

圖25示出靜脈內和口服給予米加司他的藥物動力學曲線之比較。

國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無

國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims

一種人類重組α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A），其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白質，其中該蛋白質具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖和至少12%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第1項所述之rhα-Gal A，其中該rhα-Gal A具有至少30%含唾液酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第1或2項所述之rhα-Gal A，其中該rhα-Gal A具有少於20%為中性聚醣的總N-聯寡糖。
一種人類重組α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A），其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白質，其中該蛋白質具有少於10%為中性聚醣的總N-聯寡糖，並且該蛋白質具有以下中的一種或多種：至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第4項所述之rhα-Gal A，其中該rhα-Gal A具有以下中的兩種或更多種：至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第4或5項所述之rhα-Gal A，其中該rhα-Gal A具有至少50%的含唾液酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第4-6項中任一項所述之rhα-Gal A，其中該rhα-Gal A具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖和至少6%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第4-7項中任一項所述之rhα-Gal A，其中該rhα-Gal A具有至少7莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第4-8項中任一項所述之rhα-Gal A，其中該rhα-Gal A具有至少22%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第4-9項中任一項所述之rhα-Gal A，其中該rhα-Gal A具有至少14%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
一種生產包含重組人類α-Gal A（rhα-Gal A）的重組蛋白產物之方法，該方法包括：在分泌rhα-Gal A的生物反應器中培養中國倉鼠卵巢（CHO）宿主細胞，其中該rhα-Gal A包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白質；從該生物反應器去除培養基；將該等培養基過濾以提供濾液；將該濾液載入到陰離子交換層析（AEX）柱上，以捕獲該rhα-Gal A；並且從該AEX柱上洗提包含該rhα-Gal A的第一蛋白產物。
一種藉由如申請專利範圍第11項所述之方法製得的重組蛋白產物。
一種藥物組成物，其包含藥學上可接受的載體和如申請專利範圍第1-10項中任一項所述之rhα-Gal A或如申請專利範圍第12項所述之重組蛋白產物。
如申請專利範圍第13項所述之藥物組成物，其進一步包含α-Gal A的藥理學伴護蛋白。
如申請專利範圍第14項所述之藥物組成物，其中該藥理學伴護蛋白係米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第15項所述之藥物組成物，其中該藥理學伴護蛋白係鹽酸米加司他。
如申請專利範圍第15項所述之藥物組成物，其中該藥物組成物包含：約0.5至約20 µM rhα-Gal A；和約50至約20,000 µM米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第17項所述之藥物組成物，其中該藥理學伴護蛋白係鹽酸米加司他。
如申請專利範圍第15項所述之藥物組成物，其中該藥物組成物包含：約1至約10 µM rhα-Gal A；及約100至約10,000 µM米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第19項所述之藥物組成物，其中該藥理學伴護蛋白係鹽酸米加司他。
如申請專利範圍第17或19項所述之藥物組成物，其中該米加司他或其鹽和rhα-Gal A係以米加司他或其鹽與α-半乳糖苷酶A在約13,000 : 1與約50 : 1之間的莫耳比存在。
如申請專利範圍第21項所述之藥物組成物，其中該藥理學伴護蛋白係鹽酸米加司他。
如申請專利範圍第13-22項中任一項所述之藥物組成物，其中該組成物被配製為用於靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹膜內給予。
一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括將包含以下的藥物組成物給予至對其有需要的患者： a) 人類重組α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A），其包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白質，其中該蛋白質具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖和至少12%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖；及 b) 藥理學伴護蛋白。
如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少30%的含唾液酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第24或25項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有少於20%為中性聚醣的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第24-26項中任一項所述之方法，其中該蛋白質具有少於10%為中性聚醣的總N-聯寡糖，並且該蛋白質具有以下中的一種或多種：至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第27項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有以下中的兩種或更多種：至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第27或28項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少50%的含唾液酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第24-29項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖和至少6%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第24-30項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少7莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第24-31項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少22%含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第24-32項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少14%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第24-33項中任一項所述之方法，其中將該rhα-Gal A以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第24-34項中任一項所述之方法，其中將該藥理學伴護蛋白與該rhα-Gal A共同配製。
如申請專利範圍第24-35項中任一項所述之方法，其中在給予包含rhα-Gal A的該藥物組成物的4小時內，將α-Gal A的藥理學伴護蛋白共給予至該患者。
如申請專利範圍第24-36項中任一項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白係口服給予，並且包含rhα-Gal A的藥物組成物係靜脈內給予。
如申請專利範圍第24-37項中任一項所述之方法，其中將該米加司他或其鹽以約1 mg/kg至約100 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第24-38項中任一項所述之方法，其中該藥物組成物係每月一次至每週一次給予。
如申請專利範圍第24-39項中任一項所述之方法，其中該藥物組成物係每隔一週給予。
如申請專利範圍第24-41項中任一項所述之方法，其中該給予係使細胞與結合至該藥理學伴護蛋白的該rhα-Gal A接觸。
如申請專利範圍第42項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的心臟中。
如申請專利範圍第42項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的腎臟中。
如申請專利範圍第42項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的皮膚中。
如申請專利範圍第27-45項中任一項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白係鹽酸米加司他。
一種提高溶酶體中的α-半乳糖苷酶-A蛋白在哺乳動物細胞中的活性水平之方法，該方法包括使該哺乳動物細胞與人類重組α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A）接觸，該人類重組α-半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白，其中該蛋白具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖和至少12%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖；其中該rhα-Gal A結合至藥理學伴護蛋白。
如申請專利範圍第47項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少30%的含唾液酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第47或48項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有少於20%為中性聚醣的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第47-49項中任一項所述之方法，其中該蛋白質具有少於10%為中性聚醣的總N-聯寡糖，並且該蛋白質具有以下中的一種或多種：至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第50項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有以下中的兩種或更多種：至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第47-51項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少50%含唾液酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第47-52項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖和至少6%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第47-53項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少7莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第47-54項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少22%含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第47-55項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少14%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第47-56項中任一項所述之方法，其中將該rhα-Gal A以約0.5 mg/kg至約10 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第47-57項中任一項所述之方法，其中將該藥理學伴護蛋白與該rhα-Gal A共同配製。
如申請專利範圍第47-58項中任一項所述之方法，其中在給予包含rhα-Gal A的該藥物組成物的4小時內，將α-Gal A的藥理學伴護蛋白共給予至該患者。
如申請專利範圍第47-59項中任一項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白係口服給予，並且包含rhα-Gal A的藥物組成物係靜脈內給予。
如申請專利範圍第47-60項中任一項所述之方法，其中將該米加司他或其鹽以約1 mg/kg至約100 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第47-61項中任一項所述之方法，其中該藥物組成物係每月一次至每週一次給予。
如申請專利範圍第47-62項中任一項所述之方法，其中該藥物組成物係每隔一週給予。
如申請專利範圍第47-63項中任一項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的心臟中。
如申請專利範圍第47-63項中任一項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的腎臟中。
如申請專利範圍第47-63項中任一項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的皮膚中。
如申請專利範圍第47-66項所述之方法，其中該接觸係藉由給予該rhα-Gal A和該藥理學伴護蛋白進行。
如申請專利範圍第67項所述之方法，該給予係全身給予該藥理學伴護蛋白和該rhα-Gal A兩者。
如申請專利範圍第67項所述之方法，共給予該藥理學伴護蛋白和該rhα-Gal A兩者。
如申請專利範圍第69項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白和該rhα-Gal A包含被配製為用於靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹膜內給予的組成物。
如申請專利範圍第71項所述之方法，其中該組成物被配製為用於靜脈內給予。
如申請專利範圍第47-71項中任一項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白係米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第47-72項中任一項所述之方法，其中該藥物組成物包含：約0.5至約20 µM rhα-Gal A；及約50至約20,000 µM米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第47-72項中任一項所述之方法，其中該藥物組成物包含：約1至約10 µM rhα-Gal A；及約100至約10,000 µM米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第73或74項所述之方法，其中米加司他或其鹽與α-半乳糖苷酶A的比率在約13,000 : 1與約50 : 1之間。
如申請專利範圍第47-75項所述之方法，其中該細胞係在體外。
如申請專利範圍第47-75項所述之方法，其中該細胞係人類細胞。
如申請專利範圍第47-75項中任一項所述之方法，其中該細胞係在受試者中。
如申請專利範圍第78項所述之方法，其中該受試者係有需要的患者。
如申請專利範圍第79項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的心臟、腎臟或皮膚中。
如申請專利範圍第79項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的心臟中。
如申請專利範圍第79項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的腎臟中。
如申請專利範圍第79項所述之方法，其中該細胞位於該受試者的皮膚中。
如申請專利範圍第79-83項中任一項所述之方法，其中該受試者已被診斷為患有Fabry氏病。
一種降低有需要的患者的器官中球形三醯神經醯胺（GL-3）水平之方法，該方法包括向該患者給予一種組成物，該組成物包含治療有效量的（i）藥理學伴護蛋白和（ii）人類重組α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A），該人類重組α-半乳糖苷酶A包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性的蛋白質，其中該蛋白質具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖和至少12%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第85項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少30%的含唾液酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第85或86項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有少於20%為中性聚醣的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第85-87項中任一項所述之方法，其中該蛋白質具有少於10%為中性聚醣的總N-聯寡糖，並且該蛋白質具有以下中的一種或多種：至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第88項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有以下中的兩種或更多種：至少17%的含有單個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少20%的含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；至少40%的含有一個或兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖；或至少6莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第88或89項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少50%的含唾液酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第88-90項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少25%為單-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖和至少6%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第88-91項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少7莫耳唾液酸殘基/莫耳rhα-Gal A同源二聚體。
如申請專利範圍第88-92項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少22%含有兩個唾液酸殘基的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第88-93項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A具有至少14%為雙-甘露糖-6-磷酸的總N-聯寡糖。
如申請專利範圍第85項所述之方法，其中該給予係藉由共給予進行。
如申請專利範圍第85-95項中任一項所述之方法，該給予係全身給予該藥理學伴護蛋白和該rhα-Gal A兩者。
如申請專利範圍第85-96項中任一項所述之方法，其中該組成物被配製為用於靜脈內、動脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹膜內給予。
如申請專利範圍第97項所述之方法，其中該組成物被配製為用於靜脈內給予。
如申請專利範圍第85-98項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白係米加司他或其鹽。 100. 如申請專利範圍第99項所述之方法，其中該藥物組成物包含：約0.5至約20 µM rhα-Gal A；和約50至約20,000 µM米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第99項所述之方法，其中該藥物組成物包含：約1至約10 µM rhα-Gal A；和約100至約10,000 µM米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第99-101項中任一項所述之方法，其中米加司他或其鹽與α-半乳糖苷酶A的比率在約13,000 : 1與約50 : 1之間。
如申請專利範圍第85-102項所述之方法，其中該器官係心臟、腎臟或皮膚。
如申請專利範圍第103項所述之方法，其中該器官係心臟。
如申請專利範圍第103項所述之方法，其中該器官係腎臟。
如申請專利範圍第103項所述之方法，其中該器官係皮膚。
如申請專利範圍第85-106項中任一項所述之方法，其中該受試者已被診斷為患有Fabry氏病。
一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括使哺乳動物細胞與有效量的重組人類α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A）接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少球形三醯神經醯胺（GL-3）。
如申請專利範圍第108項所述之方法，其中該接觸係向受試者給予有效量的該rhα-Gal A。
如申請專利範圍第108或109項所述之方法，其中該細胞係在受試者中。
如申請專利範圍第110項所述之方法，其中該受試者係有需要的患者。
如申請專利範圍第108-111項中任一項所述之方法，其中在心臟組織中測量到GL-3減少。
如申請專利範圍第108-111項中任一項所述之方法，其中在腎臟組織中測量到GL-3減少。
如申請專利範圍第108-111項中任一項所述之方法，其中在皮膚組織中測量到GL-3減少。
如申請專利範圍第108-114項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A結合至藥理學伴護蛋白。
如申請專利範圍第115項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白係米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第116項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以3 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第116項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以10 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第116項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以30 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第116項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以300 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第115-120項中任一項所述之方法，其中將該rhα-Gal A和該藥理學伴護蛋白共給予。
如申請專利範圍第115-120項中任一項所述之方法，其中將該rhα-Gal A和該藥理學伴護蛋白共同配製。
如申請專利範圍第108-122項中任一項所述之方法，其中向Gla敲除小鼠給予1 mg/kg劑量的rhα-Gal A比給予至少1 mg/kg劑量的阿加糖酶β更大程度地減少GL-3。
如申請專利範圍第108-122項中任一項所述之方法，其中向Gla敲除小鼠給予10 mg/kg劑量的rhα-Gal A比給予至少10 mg/kg劑量的阿加糖酶β更大程度地減少GL-3。
如申請專利範圍第108-124項中任一項所述之方法，其中向Gla敲除小鼠給予該藥物組成物後GL-3的減少比給予阿加糖酶β後GL-3的減少多至少10%。
如申請專利範圍第108-124項中任一項所述之方法，其中向Gla敲除小鼠給予該藥物組成物後GL-3的減少比給予阿加糖酶β後GL-3的減少多至少20%。
一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括使哺乳動物細胞與有效量的重組人類α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A）接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少血漿溶血性Gb-3。
如申請專利範圍第127項所述之方法，其中該接觸係向受試者給予有效量的該rhα-Gal A。
如申請專利範圍第127或128項所述之方法，其中該細胞係在受試者中。
如申請專利範圍第129項所述之方法，其中該受試者係有需要的患者。
如申請專利範圍第127-130項中任一項所述之方法，其中在心臟組織中測量到血漿溶血性Gb-3減少。
如申請專利範圍第127-130項中任一項所述之方法，其中在腎臟組織中測量到血漿溶血性Gb-3減少。
如申請專利範圍第127-130項中任一項所述之方法，其中在皮膚組織中測量到血漿溶血性Gb-3減少。
如申請專利範圍第127-133項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A結合至藥理學伴護蛋白。
如申請專利範圍第134項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白係米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第134項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以3 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第134項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以10 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第134項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以30 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第134項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以300 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第135-139項中任一項所述之方法，其中將該rhα-Gal A和該藥理學伴護蛋白共給予。
如申請專利範圍第135-139項中任一項所述之方法，其中將該rhα-Gal A和該藥理學伴護蛋白共同配製。
如申請專利範圍第127-141項中任一項所述之方法，其中向Gla敲除小鼠給予1 mg/kg劑量的rhα-Gal A比給予至少1 mg/kg劑量的阿加糖酶β更大程度地減少血漿溶血性Gb-3。
如申請專利範圍第127-141項中任一項所述之方法，其中向Gla敲除小鼠給予10 mg/kg劑量的rhα-Gal A比給予至少10 mg/kg劑量的阿加糖酶β更大程度地減少血漿溶血性Gb-3。
如申請專利範圍第127-141項中任一項所述之方法，其中向Gla敲除小鼠給予該藥物組成物後血漿溶血性Gb-3的減少比給予阿加糖酶β後血漿溶血性Gb-3的減少多至少10%。
如申請專利範圍第127-141項中任一項所述之方法，其中向Gla敲除小鼠給予該藥物組成物後血漿溶血性Gb-3的減少比給予阿加糖酶β後血漿溶血性Gb-3的減少多至少20%。
一種治療Fabry氏病之方法，該方法包括使哺乳動物細胞與有效量的重組人類α-半乳糖苷酶A（rhα-Gal A)接觸，其中使該細胞與該rhα-Gal A接觸比與阿加糖酶β接觸更大程度地減少一種或多種底物。
如申請專利範圍第146項所述之方法，其中該一種或多種底物包括GL-3或血漿溶血性Gb-3。
如申請專利範圍第147項所述之方法，其中該一種或多種底物係GL-3。
如申請專利範圍第147項所述之方法，其中該一種或多種底物係血漿溶血性Gb-3。
如申請專利範圍第146-149項中任一項所述之方法，其中該rhα-Gal A結合至藥理學伴護蛋白。
如申請專利範圍第150項所述之方法，其中該藥理學伴護蛋白係米加司他或其鹽。
如申請專利範圍第151項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以3 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第151項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以10 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第151項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以30 mg/kg的劑量給予。
如申請專利範圍第151項所述之方法，其中米加司他或其鹽的劑量係以300 mg/kg的劑量給予。