JP2022546587A

JP2022546587A - 生物製剤の捕捉及び精製のための方法

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Publication number: JP2022546587A
Application number: JP2022514655A
Authority: JP
Inventors: クマールダナセカラン，; クリスティンカロセリ，; ポールランジュバン，
Original assignee: アミカスセラピューティックスインコーポレイテッド
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-11-04
Also published as: MX2022002774A; CA3149955A1; CN114341333A; EP4025242A1; KR20220058587A; WO2021046443A1; AU2020343680A1; US20230220320A1; BR112022004000A2

Abstract

組換えタンパク質などの生物製剤の連続的な生成、捕捉及び精製のための方法が記載される。そのような生物製剤を含む医薬組成物並びに処置方法及びそのような生物製剤の使用も記載される。【選択図】図６

Description

本発明の原理及び実施形態は、概して、生物製剤、特に高含有量のマンノース－６－リン酸を有するリソソーム酵素の製造に関する。

ソソーム蓄積症は、リソソームと呼ばれる細胞内区画内のスフィンゴ糖脂質、グリコーゲン又はムコ多糖類などの分子基質の蓄積を特徴とする常染色体劣性遺伝疾患群である。これらの疾患を有する個体は、これらの基質の１つ以上の加水分解を触媒するのに欠陥がある酵素をコードする変異遺伝子を保有し、それらの物質は、リソソームに蓄積する。例えば、ポンペ病は、酸マルターゼ欠乏症又はＩＩ型糖源蓄積症としても知られ、いくつかのリソソーム蓄積症の１つである。リソソーム障害の他の例には、ゴーシェ病、ＧＭ１－ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ムコ多糖症、ハーラー症候群、ニーマン・ピックＡ及びＢ病並びにファブリー病が含まれる。ポンペ病は、神経筋疾患又は代謝性ミオパチーにも分類される。

ポンペ病は、４０，０００人の出生で約１人に発生すると推定されており、酵素リソソームα－グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）（一般に酸性α－グルコシダーゼとしても知られる）をコードするＧＡＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。酸性α－グルコシダーゼは、リソソーム内のグルコースへのその加水分解を触媒することにより、動物におけるグルコースの主要な貯蔵形態である分枝多糖、グリコーゲンの代謝に関与する。ポンペ病に罹患している個体は、不活性であるか、又は活性が低下した変異体である欠損酸性α－グルコシダーゼを産生するため、グリコーゲン分解は、ゆっくりと起こるか又は全く起こらず、グリコーゲンは、様々な組織、特に線条筋において、リソソームに蓄積し、進行性の筋力低下及び呼吸器不全を含む広範囲の臨床症状を生じる。心臓及び骨格筋などの組織が特に影響を受ける。

リソソーム蓄積症のための最近の治療選択肢としては、組換え酵素を用いた酵素補充療法（ＥＲＴ）が挙げられる。例えば、ポンペ病のための１つの治療選択肢としては、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）を用いたＥＲＴが挙げられる。従来のｒｈＧＡＡ生成物は、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．のアルグルコシダーゼアルファ、ミオザイム（登録商標）又はルミザイム（登録商標）の名称で知られている。ＥＲＴは、患者の生涯にわたって必要とされる慢性処置であり、静脈内注入によって置換酵素を投与することを含む。次いで、補充酵素は、循環中で輸送され、細胞内のリソソームに入り、そこで蓄積された基質（例えば、グリコーゲン）を分解するように作用し、内因性欠損突然変異酵素の欠損した活性を補い、そうして病気の症状を緩和する。乳児期発症ポンペ病患者では、アルグルコシダーゼアルファによる処置は、過去のコントロールと比較して生存率を有意に改善することが示されており、後期発症ポンペ病では、アルグルコシダーゼアルファは、プラセボと比較して、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）及び努力性肺活量（ＦＶＣ）の結果において、控えめに言っても統計的に有意な効果を有することが示されてきた。

しかしながら、大部分の対象は、アルグルコシダーゼアルファによる処置を受けている間、安定を維持するか又は悪化し続ける。アルグルコシダーゼアルファによるＥＲＴの明らかに最適下限の効果の理由は、不明であるが、根底にある筋肉病変の進行性の性質又は現在のＥＲＴの組織標的化の不十分さに部分的に起因する可能性がある。例えば、注入された酵素は、血漿のｐＨ（約ｐＨ７．４）を含む中性ｐＨで安定ではなく、循環中で不可逆的に不活性化され得る。さらに、注入されたアルグルコシダーゼアルファは、おそらくマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）残基による不十分なグリコシル化のため、重要な疾患関連筋肉での不十分な取り込みを示す。そのような残基は、細胞表面でカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合し、酵素が細胞内及びリソソーム内に入ることを可能にする。したがって、十分な量の活性酵素がリソソームに到達するように、高用量の酵素が効果的な処置のために必要とされる場合があり、これにより治療に費用がかかり、時間がかかる。

ｒｈＧＡＡには、７つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位がある。存在するＮ－結合型オリゴ糖（Ｎ－グリカン）のタイプでは、それぞれのグリコシル化部位が不均一であるため、ｒｈＧＡＡは、Ｍ６Ｐ受容体及び他の炭水化物受容体に対して様々な結合親和性を有するタンパク質とＮ－グリカンとの複合混合物からなる。１つのＭ６Ｐ基（モノ－Ｍ６Ｐ）を有するＮ－グリカンを有する高マンノースを含むｒｈＧＡＡは、低（約７，０００ｎＭ）親和性でＣＩＭＰＲに結合する一方、同じＮ－グリカン（ビス－Ｍ６Ｐ）上に２つのＭ６Ｐ基を含むｒｈＧＡＡは、高い（約２ｎＭ）親和性で結合する。非リン酸化、モノ－Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐグリカンの代表的な構造を図１Ａに示す。マンノース－６－Ｐ基を図１Ｂに示す。リソソーム内に入ると、ｒｈＧＡＡは、蓄積されたグリコーゲンを酵素的に分解することができる。しかしながら、従来のｒｈＧＡＡは、Ｍ６Ｐ及びビスＭ６Ｐを有するグリカンの総レベルが低く、したがって、標的筋細胞は、リソソームへのｒｈＧＡＡの送達が劣る結果となる。ｒｈＧＡＡの生産的薬物標的化を図２Ａに示す。これらの従来の生成物中のｒｈＧＡＡ分子の大部分は、リン酸化されたＮ－グリカンを有さず、それによりＣＩＭＰＲに対する親和性が欠如している。非リン酸化高マンノースグリカンは、ＥＲＴの非生産的クリアランスをもたらすマンノース受容体によっても除去され得る（図２Ｂ）。

ガラクトース及びシアル酸を含む他のタイプのＮ－グリカン、複合糖質もｒｈＧＡＡに存在する。複合Ｎ－グリカンは、リン酸化されていないため、それらは、ＣＩＭＰＲに対する親和性を有しない。しかし、暴露されたガラクトース残基を有する複合型Ｎ－グリカンは、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に対して中程度～高度の親和性を有し、ｒｈＧＡＡの迅速な非生産的クリアランスをもたらす（図２Ｂ）。

ミオザイム（登録商標）、ルミザイム（登録商標）又はアルグルコシダーゼアルファなどの従来のｒｈＧＡＡを作製するために使用される現在の製造方法は、細胞炭水化物の処理が本来複雑で操作が極めて困難であるため、Ｍ６Ｐ又はｂｉｓ－Ｍ６Ｐの含有量を有意に増加させなかった。したがって、ｒｈＧＡＡの新しい製造、捕捉及び精製方法など、ポンペ病の処置のための酵素補充療法のさらなる改善が求められている。

同様に、他のリソソーム酵素などのリソソームに標的化される他の組換えタンパク質もＣＩＭＰＲに結合する。しかしながら、リソソームを標的とする他の従来の組換えタンパク質を作製するために使用される現在の製造方法は、Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐの含有量が高い組換えタンパク質を提供しない。したがって、これらの他の組換えタンパク質の製造、捕捉及び精製方法でもさらなる改善が必要である。

本発明の１つの態様は、生物製剤を生成する方法に関する。この態様の様々な実施形態において、本方法は、バイオリアクター内において宿主細胞を培養することと、生物製剤含有流体（例えば、ろ液）を少なくとも２つの捕捉カラムに充填することとを含み、少なくとも２つの捕捉カラムは、総捕捉カラム容積を有し、バイオリアクター容積対総捕捉カラム容積の比率は、約５００：１～約１０：１の範囲、例えば約１００：１～約２０：１の比率である。この態様の様々な実施形態において、総捕捉カラム滞留時間（すなわち総捕捉カラム容積及び捕捉カラムを充填する体積流速の商）は、約０．５分～２００分、例えば約１０～７０分の範囲である。

１つ以上の実施形態において、本方法は、バイオリアクター内において、生物製剤を生成し、且つ任意選択により分泌する宿主細胞を培養することと；培地及び／又は細胞懸濁液をバイオリアクターから除去することと；培地及び／又は細胞懸濁液を処理して、生物製剤を含有するろ液を分離することと；ろ液を少なくとも２つの捕捉カラムに充填して、生物製剤を捕捉することと；第１の生物学的製剤を少なくとも２つの捕捉カラムから溶出することと；第１の生物学的製剤を１つ以上の精製カラムに充填することと；第２の生物学的製剤を１つ以上の精製カラムから溶出することとを含み、バイオリアクターは、バイオリアクター容積を有し、少なくとも２つの捕捉カラムは、総捕捉カラム容積を有し、バイオリアクター容積対総捕捉カラム容積の比率は、約５００：１～約１０：１の範囲、例えば約１００：１～約２０：１の比率である。代わりに、１つ以上の実施形態において、生物製剤は、分泌されず、細胞を溶解させた後に除去される。

１つ以上の実施形態において、生物製剤は、組換えタンパク質、ウイルス粒子又は抗体の１つ以上を含む。

１つ以上の実施形態において、組換えタンパク質は、宿主細胞によって生成される分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である。１つ以上の実施形態において、組換えタンパク質は、細胞及び／又は細胞器官からろ液中に分離される。１つ以上の実施形態において、ろ液は、ろ過又は遠心分離によって分離される。

１つ以上の実施形態において、少なくとも２つの捕捉カラムは、連続して充填されて、少なくとも２つの捕捉カラムへのろ液の連続的な充填を提供する。

１つ以上の実施形態において、ろ液は、約０．５～約１００カラム容積（ＣＶ）／時、例えば約１～約４０ＣＶ／時の範囲のろ液充填速度で少なくとも２つの捕捉カラムに充填される。

１つ以上の実施形態において、ろ液は、少なくとも２つの捕捉カラムに充填されて、各捕捉カラムについて４８時間未満、例えば２４時間未満の捕捉カラム充填時間を提供する。

１つ以上の実施形態において、生物製剤は、組換えヒトリソソームタンパク質を含む。

１つ以上の実施形態において、少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムを含む。１つ以上の実施形態において、少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つの親和性クロマトグラフィーカラムを含む。親和性クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡカラム及びプロテインＺカラムの１つ以上であり得る。１つ以上の実施形態において、少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムを含む。１つ以上の実施形態において、少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つの固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを含む。１つ以上の実施形態において、少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つのサイズ排除クロマトグラフィーカラムを含む。１つ以上の実施形態において、少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを含む。

１つ以上の実施形態において、１つ以上の精製カラムは、１つ以上のアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムを含む。１つ以上の実施形態において、１つ以上の精製カラムは、１つ以上の親和性クロマトグラフィーカラムを含む。親和性クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡカラム及びプロテインＺカラムの１つ以上であり得る。１つ以上の実施形態において、１つ以上の精製カラムは、１つ以上のカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムを含む。１つ以上の実施形態において、１つ以上の精製カラムは、１つ以上の固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを含む。１つ以上の実施形態において、１つ以上の精製カラムは、１つ以上のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを含む。１つ以上の実施形態において、１つ以上の精製カラムは、１つ以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを含む。１つ以上の実施形態において、１つ以上の精製カラムは、１つ以上の固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを含む。

１つ以上の実施形態において、第２の生物学的製剤は、バイオリアクターから培地及び／又は細胞懸濁液を除去してから４８時間以内に１つ以上の精製カラムから溶出される。

１つ以上の実施形態において、１つ以上の精製カラムは、総精製カラム容積を有し、及びバイオリアクター容積対総精製カラム容積の比率は、約５，０００：１～約５０：１の範囲である。

１つ以上の実施形態において、総捕捉カラム容積対総精製カラム容積の比率は、約２０：１～約１：１の範囲である。

本開示の別の態様は、組換えヒトリソソームタンパク質を製造する方法を記載する。いくつかの実施形態において、本方法は、バイオリアクター内において、組換えヒトリソソームタンパク質を生成する宿主細胞を培養することと、培地及び／又は細胞懸濁液をバイオリアクターから除去することと、培地及び／又は細胞懸濁液を処理して、リソソームタンパク質を含有するろ液を分離することと、ろ液を少なくとも２つのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムに充填して、リソソームタンパク質を捕捉することと、少なくとも２つのＡＥＸカラムから第１の生物学的製剤を溶出することと、第１の生物学的製剤を１つ以上の固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムに充填することと、１つ以上のＩＭＡＣカラムから第２の生物学的製剤を溶出することとを含み、バイオリアクターは、バイオリアクター容積を有し、少なくとも２つのＡＥＸカラムは、総ＡＥＸカラム容積を有し、バイオリアクター容積対総ＡＥＸカラム容積の比率は、約５００：１～約１０：１の範囲、例えば約１００：１～約２０：１の比率である。

１つ以上の実施形態において、リソソームタンパク質は、宿主細胞によって生成される分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である。いくつかの実施形態において、細胞内タンパク質は、細胞を溶解させて細胞溶解物を調製することによってろ液中に分離される。いくつかの実施形態において、細胞溶解物は、ろ過又は遠心分離によってろ液から分離される。

いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＡＥＸカラムは、組換えヒトリソソームタンパク質を製造するために、連続して充填されて、少なくとも２つのＡＥＸカラムへのろ液の連続的な充填を提供する。

１つ以上の実施形態において、ろ液は、約０．５～約１００カラム容積（ＣＶ）／時、例えば約１～約４０ＣＶ／時の範囲のろ液充填速度で少なくとも２つのＡＥＸカラムに充填される。

いくつかの実施形態において、ろ液は、少なくとも２つのＡＥＸカラムに充填されて、各ＡＥＸカラムについて４８時間未満、例えば２４時間未満のＡＥＸ充填時間を提供する。

いくつかの実施形態において、各ＡＥＸカラムは、５０Ｌ以下のカラム容積を有する。

１つ以上の実施形態において、第２の生物学的製剤は、バイオリアクターから培地及び／又は細胞懸濁液を除去してから４８時間以内に１つ以上のＩＭＡＣカラムから溶出される。

１つ以上の実施形態において、１つ以上のＩＭＡＣカラムは、総ＩＭＡＣカラム容積を有し、及びバイオリアクター容積対総ＩＭＡＣカラム容積の比率は、約５，０００：１～約５０：１の範囲である。

いくつかの実施形態において、総ＡＥＸカラム容積対総ＩＭＡＣカラム容積の比率は、約２０：１～約１：１の範囲である。

いくつかの実施形態において、各ＩＭＡＣカラムは、２０Ｌ以下のカラム容積を有する。

１つ以上の実施形態において、本方法は、第２の生物学的製剤を貯蔵することをさらに含む。１つ以上の実施形態において、第２の生物学的製剤は、２４時間～１０５日間の期間にわたって０℃～１０℃の温度で貯蔵される。１つ以上の実施形態において、第２の生物学的製剤は、最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又は１０５日間にわたって貯蔵される。１つ以上の実施形態において、第２の生物学的製剤は、１時間～３日間の期間にわたって１５℃～３０℃の温度で貯蔵される。

１つ以上の実施形態において、本方法は、第２の生物学的製剤を第３のクロマトグラフィーカラムに充填することと；第３のクロマトグラフィーカラムから第３の生物学的製剤を溶出することとをさらに含む。１つ以上の実施形態において、第３のクロマトグラフィーカラムは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラム、親和性クロマトグラフィーカラム、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムから選択される。

１つ以上の実施形態において、ろ液は、交互接線流ろ過（ＡＴＦ）及び接線流ろ過（ＴＦＦ）の１つ以上から培地及び／又は細胞懸濁液をろ過することによって分離される。

１つ以上の実施形態において、本方法は、第１の生物学的製剤、第２の生物学的製剤及び第３の生物学的製剤の１つ以上においてウイルスを不活性化することをさらに含む。

１つ以上の実施形態において、本方法は、第２の生物学的製剤又は第３の生物学的製剤をろ過してろ過生成物を提供し、且つバイアルにろ過生成物を充填することをさらに含む。

１つ以上の実施形態において、本方法は、ろ過生成物を凍結乾燥することをさらに含む。

１つ以上の実施形態において、生物製剤は、ｒｈＧＡＡを含む。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

１つ以上の実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。１つ以上の実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００若しくはＡＴＢ－２００－００１－Ｘ５－１４又はその継代培養物を含む。

１つ以上の実施形態において、（ｉ）第１の生物学的製剤、又は第２の生物学的製剤、又は第３の生物学的製剤の少なくとも９０％は、ＣＩＭＰＲに結合し、及び／又は（ｉｉ）第１の生物学的製剤、又は第２の生物学的製剤、又は第３の生物学的製剤の少なくとも９０％は、モノ－Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐを保有するＮ－グリカンを含有する。

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、７つの潜在的なＮ－グリコシル化部位を含み、ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも５０％は、第１の部位に２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含み、ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも３０％は、第２の部位に１つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含み、ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも３０％は、第４の部位に２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含み、及びｒｈＧＡＡの分子の少なくとも２０％は、第４の部位に１つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む。

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡにおけるＮ－グリカンの４０％～６０％は、複合型Ｎ－グリカンであり；及びｒｈＧＡＡは、ｒｈＧＡＡの１モル当たり３．０～５．０モルのＭ６Ｐ残基を含む。

本発明の別の態様は、生物製剤を製造する方法に関する。この態様の様々な実施形態において、本方法は、バイオリアクター内において細胞を培養することと、生物製剤含有流体を少なくとも２つのＡＥＸカラムに充填することとを含み、少なくとも２つのＡＥＸカラムは、総ＡＥＸカラム容積を有し、バイオリアクター容積対総ＡＥＸカラム容積の比率は、約５００：１～約１０：１の範囲、例えば約１００：１～約２０：１の比率である。この態様の様々な実施形態において、総ＡＥＸカラム滞留時間（すなわち総ＡＥＸカラム容積及びＡＥＸカラムを充填する体積流速の商）は、約０．５分～２００分、例えば約１０～７０分の範囲である。

１つ以上の実施形態において、本方法は、バイオリアクター内において、組換えヒトリソソームタンパク質を分泌する宿主細胞を培養することと；バイオリアクターから培地を除去することと；培地をろ過してろ液を提供することと；ろ液を少なくとも２つのＡＥＸカラムに充填して、リソソームタンパク質を捕捉することと；少なくとも２つのＡＥＸカラムから第１のタンパク質生成物を溶出することと；第１のタンパク質生成物を１つ以上のＩＭＡＣカラムに充填することと；１つ以上のＩＭＡＣカラムから第２のタンパク質生成物を溶出することとを含み、バイオリアクターは、バイオリアクター容積を有し、少なくとも２つのＡＥＸカラムは、総ＡＥＸカラム容積を有し、バイオリアクター容積対総ＡＥＸカラム容積の比率は、約５００：１～約１０：１の範囲、例えば約１００：１～約２０：１の比率である。

１つ以上の実施形態において、少なくとも２つのＡＥＸカラムは、連続して充填されて、少なくとも２つのＡＥＸカラムへのろ液の連続的な充填を提供する。

１つ以上の実施形態において、ろ液は、約０．５～約１００ＣＶ／時、例えば約１～約４０ＣＶ／時の範囲のろ液充填速度で少なくとも２つのＡＥＸカラムに充填される。

１つ以上の実施形態において、ろ液は、少なくとも２つのＡＥＸカラムに充填されて、各ＡＥＸカラムについて４８時間未満、例えば２４時間未満のＡＥＸ充填時間を提供する。

１つ以上の実施形態において、各ＡＥＸカラムは、５０Ｌ以下のカラム容積を有する。

１つ以上の実施形態において、第２のタンパク質生成物は、バイオリアクターから培地を除去してから４８時間以内に１つ以上のＩＭＡＣカラムから溶出される。

１つ以上の実施形態において、総ＡＥＸカラム容積対総ＩＭＡＣカラム容積の比率は、約２０：１～約１：１の範囲である。

１つ以上の実施形態において、各ＩＭＡＣカラムは、２０Ｌ以下のカラム容積を有する。

１つ以上の実施形態において、本方法は、第２のタンパク質生成物を貯蔵することをさらに含む。１つ以上の実施形態において、第２のタンパク質生成物は、２４時間～１０５日間の期間にわたって０℃～１０℃の温度で貯蔵される。１つ以上の実施形態において、第２のタンパク質生成物は、最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又は１０５日間にわたって貯蔵される。１つ以上の実施形態において、第２のタンパク質生成物は、１時間～３日間の期間にわたって１５℃～３０℃の温度で貯蔵される。

１つ以上の実施形態において、本方法は、第２のタンパク質生成物を第３のクロマトグラフィーカラムに充填することと；第３のクロマトグラフィーカラムから第３のタンパク質生成物を溶出することとをさらに含む。１つ以上の実施形態において、第３のクロマトグラフィーカラムは、ＣＥＸカラム及びＳＥＣカラムから選択される。

１つ以上の実施形態において、培地のろ過は、ＡＴＦ及びＴＦＦから選択される。

１つ以上の実施形態において、本方法は、第１のタンパク質生成物、第２のタンパク質生成物及び第３のタンパク質生成物の１つ以上においてウイルスを不活性化することをさらに含む。

１つ以上の実施形態において、本方法は、第２のタンパク質生成物又は第３のタンパク質生成物をろ過してろ過生成物を提供し、且つろ過生成物をバイアルに充填することをさらに含む。

１つ以上の実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質は、ｒｈＧＡＡである。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。

１つ以上の実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞を含む。１つ以上の実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００若しくはＡＴＢ－２００－００１－Ｘ５－１４又はその継代培養物を含む。

１つ以上の実施形態において、（ｉ）第１のタンパク質生成物、又は第２のタンパク質生成物、又は第３のタンパク質生成物の少なくとも９０％は、ＣＩＭＰＲに結合し、及び／又は（ｉｉ）第１のタンパク質生成物、又は第２のタンパク質生成物、又は第３のタンパク質生成物の少なくとも９０％は、モノ－マンノース－６－リン酸（モノ－Ｍ６Ｐ）又はビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を保有するＮ－グリカンを含有する。

本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法のいずれかによって作製される生物学的製剤に関する。

本発明の別の態様は、生物学的製剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。

本発明のさらに別の態様は、リソソーム蓄積症を処置する方法であって、医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。

１つ以上の実施形態において、リソソーム蓄積症は、ポンペ病であり、及び生物学的製剤は、ｒｈＧＡＡである。１つ以上の実施形態において、患者は、ｒｈＧＡＡ生成物を含む医薬組成物の投与から４時間以内にα－グルコシダーゼの薬理学的シャペロンを共投与される。いくつかの実施形態において、薬理学的シャペロンは、１－デオキシノジリマイシン及びＮ－ブチル－デオキシノジリマイシンから選択される。いくつかの実施形態において、薬理学的シャペロンは、ｒｈＧＡＡ生成物と共製剤される。

様々な実施形態を以下に列挙する。以下に列挙される実施形態は、以下に列挙されるものだけでなく、本発明の範囲に従った他の適切な組み合わせで組み合わされ得ることが理解されるであろう。

本発明のさらなる特徴は、以下の本明細書及び添付図面から明らかになる。

非リン酸化高マンノースグリカン、モノ－Ｍ６Ｐグリカン及びビス－Ｍ６Ｐグリカンを示す。Ｍ６Ｐ基の化学構造を示す。標的組織（例えば、ポンペ病を有する対象の筋肉組織）に対するＭ６Ｐを有するグリカンを介したｒｈＧＡＡの生産的標的化を記載する。非標的組織（例えば、肝臓及び脾臓）への非生産的薬物クリアランス又は非標的組織への非Ｍ６Ｐグリカンの結合によって説明される。ＣＩＭＰＲ受容体（ＩＧＦ２受容体としても知られる）及びこの受容体のドメインをグラフで示す。ＣＩＭＰＲに対するビス－及びモノ－Ｍ６Ｐを有するグリカンの結合親和性（ナノモル）、高マンノース型グリカンのマンノース受容体への結合親和性及びアシアロ糖タンパク質受容体に対する脱シアル化複合グリカンの結合親和性を示す表である。Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンを有するＲｈＧＡＡは、筋肉上のＣＩＭＰＲに生産的に結合し得る。ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物で形質転換した。組換えタンパク質の製造、捕捉及び精製のための例示的な先行技術のプロセスの概略図である。本発明の１つ以上の実施形態に係る生物製剤の製造、捕捉及び精製のための例示的なプロセスの概略図である。生物製剤の製造、捕捉及び精製における例示的な第１の事象シーケンスを記載し、生物製剤を含有するろ液は、捕捉カラム１に充填される。生物製剤の製造、捕捉及び精製における例示的な第２の事象シーケンスを記載し、捕捉カラム１中の捕捉された生物製剤は、溶出され、精製カラムに充填される。このプロセス中、生物製剤を含有するろ液は、捕捉カラム２に充填される。生物製剤の製造、捕捉及び精製における例示的な第３の事象シーケンスを記載し、捕捉カラム２中の捕捉された生物製剤は、溶出され、精製カラムに充填される。このプロセス中、生物製剤を含有するろ液は、捕捉カラム１に充填される。生物製剤の製造、捕捉及び精製における例示的な第４の事象シーケンスを記載し、生物製剤は、精製カラムから溶出される。ｒｈＧＡＡの製造、捕捉及び精製における例示的な事象シーケンスを記載し、ＡＥＸカラムは、捕捉カラムとして使用され、ＩＭＡＣカラムは、精製カラムとして使用される。本発明の１つ以上の実施形態に係る生物製剤の製造、捕捉及び精製のための別の例示的なプロセスの概略図である。バッチ精製プロセスにおける２つのＡＥＸ捕捉カラムからの溶出プロファイルを示す。連続精製プロセスにおける２つのＡＥＸ捕捉カラムからの溶出プロファイルを示す。バッチ精製プロセスと連続精製プロセスとの間の、ＩＭＡＣ精製カラムからの溶出プロファイルの比較を示す。図１５からのバッチ精製プロセスと連続精製プロセスとの間の、ＩＭＡＣ精製カラムからの溶出プロファイルの拡大画像を示す。

本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明する前に、本発明は、以下の説明に記載された構成又はプロセスステップの詳細に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施又は実行されることが可能である。

本開示は、生物製剤を生成、捕捉及び精製する方法を記載する。１つ以上の実施形態において、生物製剤は、組換えタンパク質、ウイルス粒子又は抗体の１つ以上を含む。１つ以上の実施形態において、組換えタンパク質は、リソソームを標的とする。１つ以上の実施形態において、組換えタンパク質は、組換えヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ｒｈＧＡＡ）である。

１つ以上の実施形態において、組換えタンパク質は、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基において翻訳後及び／又は化学修飾を受ける。例えば、メチオニン及びトリプトファン残基は、酸化を受け得る。別の例として、Ｎ末端グルタミンは、ピログルタミン酸を形成することができる。別の例として、アスパラギン残基は、アスパラギン酸への脱アミド化を受け得る。さらに別の例として、アスパラギン酸残基は、イソアスパラギン酸への異性化を受け得る。さらに別の例として、タンパク質中の不対システイン残基は、遊離グルタチオン及び／又はシステインとジスルフィド結合を形成し得る。

ｒｈＧＡＡについて特に言及しているが、他の組換えタンパク質を生成、捕捉及び精製するために、本明細書に記載の方法及びシステムを使用することができることは、当業者に理解されるであろう。様々な実施形態において、他の組換えタンパク質は、リソソーム酵素α－ガラクトシダーゼＡを含むが、これに限定されないリソソームも標的とする。（例えば、遺伝子治療のための）抗体及びウイルス粒子などの他の生物学的製剤を生成、捕捉及び精製するために、本明細書に記載の方法及びシステムを使用することもできる。

ｒｈＧＡＡの生成のためのいくつかの現行の方法は、１メートルの直径×３０ｃｍの床高さの寸法（すなわちそれぞれＡＥＸカラム容積＝２３６Ｌ）を有するＡＥＸカラムなどの大きいＡＥＸカラムを用いる。これらの大きいＡＥＸカラムは、長い充填時間（例えば、９６時間）を有し、ＡＥＸ条件中のｒｈＧＡＡの低い安定性のため、ＡＥＸは、２℃～８℃の制御された温度の低温の部屋において行われる。次に、大きいＡＥＸカラムからの溶出液は、６０ｃｍの直径×２０ｃｍの床高さの寸法（すなわち各ＩＭＡＣカラム容積＝５６．５Ｌ）を有するＩＭＡＣカラムなどの大きいＩＭＡＣカラムにおいて手作業で充填される。大きいＡＥＸ及びＩＭＡＣカラムを含むこれらの製造システムは、いくつかの欠点も有する：大きい設備設置面積；低い生産性（１時間当たり樹脂の１リットル当たり生成される酵素）；高い操作者の関与（ヒューマンエラーのリスクを増加させる）；及びＡＥＸサイクルに何らかの不具合があるか又はＩＭＡＣにおける前方処理が遅延している場合の高い製品損失／不合格率。

しかしながら、比較的小型の製造システムは、以下の利点の１つ以上を提供し得ることが意外にも発見された：捕捉カラム（例えば、ＡＥＸ）充填時間を減少させ；低温の部屋での処理をなくし；設備設置面積を減少させ；生産性を向上させ；捕捉カラム（例えば、ＡＥＸ）から精製カラム（例えば、ＩＭＡＣ）への直接の処理により操作者の関与を減少させ；生物製剤捕捉（例えば、ＡＥＸ）サイクルに何らかの不具合がある場合の製品損失／不合格率を最小限に抑える。さらに、このシステムは、より小さいカラムサイズを使用し、これは、他のタンパク質からの最終生成物のより良好な分離を達成することを促進する。

したがって、本発明の様々な態様は、生物製剤（例えば、ｒｈＧＡＡなど、組換えヒトリソソームタンパク質を含む組換えタンパク質）の生成、捕捉及び精製のための新規な方法に関する。本発明の他の態様は、本明細書に記載された方法により生成された生物製剤（例えば、組換えタンパク質）並びに医薬組成物、処置方法及びそのような生物製剤（例えば、組換えタンパク質）の使用に関する。

定義
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明に関連して且つ各用語が使用される具体的な文脈において、当技術分野における通常の意味を有する。本発明の組成物及び方法並びにそれらを製造及び使用する方法を説明する上で、専門家に追加的な指針を提供するために、特定の用語については以下又は本明細書の他の箇所で説明する。

本明細書では、文言の説明又は必要な示唆のために、文脈が他に要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる」などの変形は、包括的な意味、すなわち述べられた特徴の存在を特定するために使用され、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在又は追加を排除するものではない。

本明細書で使用される場合、用語「バイオリアクター容積」は、バイオリアクター内の作動容積（すなわち液体容積）を指す。バイオリアクター内の作動容積は、１００００リットル未満、５０００リットル未満、４０００リットル未満、３５００リットル未満、３０００リットル未満、２５００リットル未満、２０００リットル未満、１５００リットル未満、１０００リットル未満、５００リットル未満又は２５０リットル未満であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「捕捉カラム」は、バイオリアクターから生成される所望の生物学的生成物を捕捉するクロマトグラフィーカラムを指す。本開示は、少なくとも２つの捕捉カラムを使用する方法を記載する。様々な実施形態において、少なくとも２つの捕捉カラムは、連続して充填されて、少なくとも２つの捕捉カラムへのろ液の連続的な充填を提供する。

本明細書で使用される場合、用語「精製カラム」は、捕捉カラムにおいて捕捉された後、所望の生物学的生成物をさらに精製するために使用されるクロマトグラフィーカラムを指す。

本明細書で使用される場合、用語「カラム容積」は、クロマトグラフィーカラムの充填される床容積を指す。

本明細書で使用される場合、「総生物製剤捕捉カラム容積」、総ＡＥＸカラム容積などの用語「総．．．カラム容積」は、特定のタイプの全てのカラムの総合カラム容積を指す。

本明細書で使用される場合、用語「総．．．カラム滞留時間」は、特定のタイプの全てのカラムの総合カラム容積及びカラムを充填するために使用される体積流速の商を指す。

本明細書で使用される場合、用語「組換えＤＮＡ」は、複数の源（例えば、異なる生物）に由来する遺伝物質を組み合わせることによって人工的に形成されたＤＮＡを指す。

本明細書で使用される場合、用語１つ若しくは複数の「生物製剤」又は「生物学的製剤」は、生物系において生成される複合分子又は分子の混合物を指す。生物製剤は、組み換えＤＮＡ技術を用いて細胞ベースの系において生成されることが多い。生物製剤の例は、組換えタンパク質、ウイルス粒子及び抗体を含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、用語「組換えタンパク質」は、遺伝子の発現を支持する系においてクローニングされた組換えＤＮＡにおいて遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。１つ以上の実施形態において、組換えタンパク質は、宿主細胞において生成される分泌タンパク質又は細胞内タンパク質である。宿主細胞は、原核生物（例えば、細菌）細胞並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核細胞を含む任意の生物有機体から選択され得る。特に望ましい宿主細胞は、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを含む哺乳動物に由来する、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２及び初代線維芽細胞、肝細胞及び筋芽細胞などの細胞を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物種の中から選択される。細胞を提供する哺乳動物種の選択は、本発明の限定ではなく；哺乳動物細胞、すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞などのタイプでもない。

いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であり得る。分泌タンパク質は、ろ過又は遠心分離のいずれかによってろ液中に分離され得る。細胞内タンパク質は、まず、細胞を溶解させた後、ろ過又は遠心分離のいずれかによってろ液中に分離され得る。膜タンパク質は、細胞を溶解させ、超遠心分離法によって組換え含有膜を分離し、好適な洗浄剤を用いて膜タンパク質を可溶化し、超遠心分離法によってろ液を調製して、不溶性膜タンパク質を分離することによって分離され得る。洗浄剤は、性質がアニオン性、カチオン性又は両性であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「リソソームタンパク質」は、リソソーム酵素など、リソソームに標的化された任意のタンパク質を指す。リソソーム酵素及び関連する疾患の例は、以下の表１に示されるものを含むが、これらに限定されない。

１つ以上の実施形態において、リソソームタンパク質は、α－ガラクトシダーゼ（Ａ又はＢ）、β－ガラクトシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ（Ａ又はＢ）、ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼ（Ａ又はＢ）、β－グルコセレブロシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ、ホルミルグリシン生成酵素、イズロニダーゼ（例えば、α－Ｌ）、アセチル－ＣｏＡ：α－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、グリコサミノグリカンα－Ｌ－イズロノヒドロラーゼ、ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－α－Ｄ－グルコサミニダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、ガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、グリコサミノグリカンＮ－アセチルガラクトサミン４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼ、ヒアルロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）、ガングリオシドシアリダーゼ、ホスホトランスフェラーゼ、α－グルコシダーゼ、α－Ｄ－マンノシダーゼ、β－Ｄ－マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α－Ｌ－フコシダーゼ、バテニン、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ及び他のバッテン病関連タンパク質（例えば、神経セロイドリポフスチン症タンパク質６）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、α－ガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態において、酵素は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１及び２（それぞれＰＰＴ１及びＰＰＴ２）を含むパルミトイルタンパク質チオエステラーゼ（ＰＰＴ）である。いくつかの実施形態において、酵素は、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ１である。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、ＣＤＫＬ５欠損症、嚢胞性線維症、α－及びβ－サラセミア、鎌状赤血球貧血、マルファン症候群、脆弱性Ｘ症候群、ハンチントン病、ヘモクロマトーシス、先天性難聴（非症候群型）、テイ・サックス病、家族性高コレステロール血、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、スターガルト病、アッシャー症候群、先天性脈絡膜欠如、色覚異常、Ｘ連鎖性網膜分離症、血友病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖性慢性肉芽腫症、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ欠損症、劣性栄養障害性表皮水疱症、α１アンチトリプシン欠損症、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）、ヌーナン症候群、Ｘ連鎖性重症複合免疫不全症（Ｘ－ＳＣＩＤ）からなる群から選択される遺伝性疾患に関連している。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質は、ＣＤＫＬ５、コネキシン２６、ヘキソサミニダーゼＡ、ＬＤＬ受容体、ジストロフィン、ＣＦＴＲ、β－グロブリン、ＨＦＥ、ハンチントン、ＡＢＣＡ４、ミオシンＶＩＩＡ（ＭＹＯ７Ａ）、Ｒａｂエスコートタンパク質－１（ＲＥＰ１）、環状ヌクレオチド感受性チャネルβ３（ＣＮＧＢ３）、レチノスキシン１（ＲＳ１）、ヘモグロビンサブユニットβ（ＨＢＢ）、第ＩＸ因子、ＷＡＳ、シトクロムＢ－２４５ β鎖、ドーパ脱炭酸酵素（ＤＤＣ）、ＶＩＩ型コラーゲンα１鎖（ＣＯＬ７Ａ１）、セルピンファミリーＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、ＬＭＮＡ、ＰＴＰＮ１１、ＳＯＳ１、ＲＡＦ１、ＫＲＡＳ及びＩＬ２受容体γ遺伝子からなる群から選択される。

１つ以上の実施形態において、遺伝性疾患（例えば、リソソーム蓄積症）は、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、シスチン症、ファブリー病、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ポンペ病、テイ・サックス病、サンドホフ病、異染性白質ジストロフィー、ムコリピドーシスＩ型、ムコリピドーシスＩＩ型、ムコリピドーシスＩＩＩ型、ムコリピドーシスＩＶ型、ハーラー病、ハンター病、サンフィリッポ病Ａ型、サンフィリッポ病Ｂ型、サンフィリッポ病Ｃ型、サンフィリッポ病Ｄ型、モルキオ病Ａ型、モルキオ病Ｂ型、マロトー・ラミー病、スライ病、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ１型、ニーマン・ピック病Ｃ２型、シンドラー病Ｉ型及びシンドラー病ＩＩ型からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、リソソーム蓄積症は、アクチベーター欠損症、ＧＭ２－ガングリオシドーシス；ＧＭ２－ガングリオシドーシス、ＡＢ変異型；α－マンノシドーシス（２型、中等症型；３型、新生児期、重症型）；β－マンノシドーシス；リソソーム酸性リパーゼ欠損症；シスチン症（遅発性の若年又は思春期腎障害型；小児腎障害型）；シャナリン・ドルフマン症候群；ミオパチーを伴う中性脂質蓄積症；ＮＬＳＤＭ；ダノン病；ファブリー病；ファブリー病ＩＩ型、遅発型；ファーバー病；ファーバー脂肪性肉芽腫症；フコシドーシス；ガラクトシアリドーシス（ノイラミニダーゼ及びβ－ガラクトシダーゼの複合欠損症）；ゴーシェ病；ＩＩ型ゴーシェ病；ＩＩＩ型ゴーシェ病；ＩＩＩＣ型ゴーシェ病；ゴーシェ病、非定型、サポシンＣ欠損による；ＧＭ１－ガングリオシドーシス（遅発乳児型／若年型ＧＭ１－ガングリオシドーシス；成人型／慢性ＧＭ１－ガングリオシドーシス）；グロボイド細胞白質ジストロフィー、クラッベ病（遅発乳児型；若年型；成人型）；クラッベ病、非定型、サポシンＡ欠損による；異染性白質ジストロフィー（若年型；成人型）；部分的セレブロシドスルファターゼ欠損症；偽性アリールスルファターゼＡ欠損症；サポシンＢ欠損による異染性白質ジストロフィー；ムコ多糖症障害：ＭＰＳＩ、ハーラー症候群；ＭＰＳＩ、ハーラー・シェイ症候群；ＭＰＳＩ、シェイ症候群；ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群；ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群；サンフィリッポ症候群Ａ型／ＭＰＳＩＩＩＡ；サンフィリッポ症候群Ｂ型／ＭＰＳＩＩＩＢ；サンフィリッポ症候群Ｃ型／ＭＰＳＩＩＩＣ；サンフィリッポ症候群Ｄ型／ＭＰＳＩＩＩＤ；モルキオ症候群、Ａ型／ＭＰＳＩＶＡ；モルキオ症候群、Ｂ型／ＭＰＳＩＶＢ；ＭＰＳＩＸヒアルロニダーゼ欠損症；ＭＰＳＶＩマロトー・ラミー症候群；ＭＰＳＶＩＩスライ症候群；ムコリピドーシスＩ、シアリドーシスＩＩ型；Ｉ細胞病、ルロイ病（Ｌｅｒｏｙｄｉｓｅａｓｅ）、ムコリピドーシスＩＩ；偽性ハーラー病ポリジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩ型；ムコリピドーシスＩＩＩＣ／ＭＬＩＩＩＧＡＭＭＡ；ムコリピドーシスＩＶ型；多重スルファターゼ欠損症；ニーマン・ピック病（Ｂ型；Ｃ１型／慢性神経細胞障害型；Ｃ２型；Ｄ型／ノバスコシア型）；神経セロイドリポフスチン症：ＣＬＮ６病－非定型の遅発乳児型、遅発型変異型、早期若年型；バッテン・シュピールマイヤー・フォークト／若年型ＮＣＬ／ＣＬＮ３病；フィンランド変異型遅発乳児型ＣＬＮ５；ヤンスキー・ビールショースキー病／遅発乳児型ＣＬＮ２／ＴＰＰ１病；クーフス病／成人型ＮＣＬ／ＣＬＮ４病（Ｂ型）；北部型癲癇／変異型遅発乳児型ＣＬＮ８；サンタヴォリ・ハルティア病／乳児型ＣＬＮ１／ＰＰＴ病；ポンペ病（糖原病ＩＩ型）；遅発型ポンペ病；濃化異骨症；サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス；サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス；サンドホフ病／ＧＭ２ガングリオシドーシス；シンドラー病（ＩＩＩ型／中間型、可変的）；神崎病；サラ病；乳児型遊離シアル酸蓄積症（ＩＳＳＤ）；進行性ミオクローヌスてんかんを伴う脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡＰＭＥ）；テイ・サックス病／ＧＭ２ガングリオシドーシス；若年性テイ・サックス病；遅発型テイ・サックス病；クリスチャンソン症候群；ロウ眼脳腎症候群；シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、ＣＭＴ４Ｊ；ユニス・バロン症候群；両側性側頭後頭葉多小脳回（ＢＴＯＰ）；Ｘ連鎖性高カルシウム尿腎結石症、デント病１型；及びデント病２型、アデノシンデアミナーゼ欠損重症複合免疫不全症（ＡＤＡ－ＳＣＩＤ）及び神経セロイドリポフスチン症からなる群から選択される。

本明細書で使用される場合、用語「ポンペ病」は、酸マルターゼ欠乏症、ＩＩ型糖源蓄積症（ＧＳＤＩＩ）及びＩＩ型糖源病とも呼ばれ、ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードするＧＡＡ遺伝子の突然変異を特徴とする、遺伝的リソソーム蓄積症を指すことが意図される。この用語には、乳児期、若年期及び成人期発症のポンペ病が含まれるが、これらに限定されない、初期及び後期発症形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用される場合、用語「酸性α－グルコシダーゼ」は、グリコーゲン、マルトース及びイソマルトースのＤ－グルコース単位間のα－１，４結合を加水分解するリソソーム酵素を指すことが意図される。別の名称には、リソソームα－グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）；グルコアミラーゼ；１，４－α－Ｄ－グルカングルコヒドロラーゼ；アミログルコシダーゼ；ガンマ－アミラーゼ及びエキソ－１，４－α－グルコシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒト酸性α－グルコシダーゼは、１７番染色体の長腕（位置１７ｑ２５．２－ｑ２５．３）にマッピングされているＧＡＡ遺伝子（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｒｅｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ＧｅｎｅＩＤ２５４８）によってコードされている。５００を超える突然変異が現在ヒトＧＡＡ遺伝子において同定されており、その多くはポンペ病に関連している。酸性α－グルコシダーゼ酵素のミスフォールディング又は誤処理を生じる突然変異には、Ｔ１０６４Ｃ（Ｌｅｕ３５５Ｐｒｏ）及びＣ２１０４Ｔ（Ａｒｇ７０２Ｃｙｓ）が含まれる。さらに、酵素の成熟及び処理に影響を及ぼすＧＡＡ突然変異には、Ｌｅｕ４０５Ｐｒｏ及びＭｅｔ５１９Ｔｈｒが含まれる。酸性α－グルコシダーゼタンパク質の活性には、アミノ酸残基５１６～５２１で保存されたヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥが必要である。本明細書で使用される場合、略語「ＧＡＡ」は、酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図され、イタリック体の略語「ＧＡＡ」は、ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードするヒト遺伝子を指すことが意図される。イタリック体の略語「Ｇａａ」は、ラット又はマウス遺伝子を含むが、これらに限定されない、非ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードする非ヒト遺伝子を指すことが意図され、略語「Ｇａａ」は、非ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。したがって、略語「ｒｈＧＡＡ」は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「アルグルコシダーゼアルファ」は、［１９９－アルギニン、２２３－ヒスチジン］プレプロ－α－グルコシダーゼ（ヒト）；ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ登録番号４２０７９４－０５－０として同定された組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを指すことが意図される。アルグルコシダーゼアルファは、ルミザイム（登録商標）及びミオザイム（登録商標）として、２０１６年１月付けで米国におけるＧｅｎｚｙｍｅによる市販が承認されている。

本明細書で使用される場合、用語「ＡＴＢ２００」は、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書（現在、米国特許第１０，２０８，２９９号明細書として発行されている）に記載される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを指すことが意図され、その開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。組換えリソソームタンパク質（ＡＴＢ２００などのｒｈＧＡＡを含む）を製造する方法は、米国特許第１０，２２７，５７７号明細書に記載され、この文献も全体が参照により本明細書に組み込まれる。ｒｈＧＡＡを用いた製剤及び方法は、同時係属中の出願公開番号米国特許出願公開第２０１７／０３３３５３４号明細書及び米国特許出願公開第２０１８／０２２８８７７号明細書に記載され、これらの文献も全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、用語「グリカン」は、タンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸残基に共有結合した多糖類鎖を指すことが意図される。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－グリカン」又は「Ｎ－結合グリカン」は、アミノ酸残基の窒素原子に共有結合によってタンパク質又はポリペプチド上のアミノ酸残基に結合した多糖類鎖を指すことが意図される。例えば、Ｎ－グリカンは、アスパラギン残基の側鎖窒素原子に共有結合し得る。グリカンは、１個又は数個の単糖単位を含み得、単糖単位は共有結合して直鎖又は分枝鎖を形成し得る。少なくとも１つの実施形態において、ＡＴＢ２００に結合したＮ－グリカン単位は、Ｎ－アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトース又はシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位を含み得る。タンパク質上のＮ－グリカン単位は、質量分析などの任意の適切な分析技術によって決定し得る。いくつかの実施形態において、Ｎ－グリカン単位は、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＯｒｂｉｔｒａｐＶｅｌｏｓＰｒｏ（商標）質量分析計、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＯｒｂｉｔｒａｐＦｕｓｉｏｎＬｕｍｏｓＴｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計又はＷａｔｅｒｓＸｅｖｏ（登録商標）Ｇ２－ＸＳＱＴｏｆ質量分析計などの機器を利用する液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって決定され得る。

本明細書で使用される場合、用語「高マンノースＮ－グリカン」は、１～６個又はそれを超えるマンノース単位を有するＮ－グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、高マンノースＮ－グリカン単位は、アスパラギン残基に結合したビス（Ｎ－アセチルグルコサミン）鎖を含有し、さらに分枝状ポリマンノース鎖に結合し得る。本明細書で交換可能に使用される場合、用語「Ｍ６Ｐ」又は「マンノース－６－リン酸」は、６位がリン酸化された、すなわち６位のヒドロキシル基に結合したリン酸基を有する、マンノース単位を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、１つ以上のＮ－グリカン単位の１つ以上のマンノース単位が６位でリン酸化されて、マンノース－６－リン酸単位を形成する。少なくとも１つの実施形態において、用語「Ｍ６Ｐ」又は「マンノース－６－リン酸」は、リン酸基上に「キャップ」としてＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するマンノースホスホジエステル及びＧｌｃＮＡｃキャップを欠く露出したリン酸基を有するマンノース単位の両方を指す。少なくとも１つの実施形態において、タンパク質のＮ－グリカンは、ＧｌｃＮＡｃキャップを有する少なくとも１つのＭ６Ｐ基及びＧｌｃＮＡｃキャップを欠く少なくとも１つの他のＭ６Ｐ基を有する複数のＭ６Ｐ基を有し得る。

本明細書で使用される場合、用語「複合Ｎ－グリカン」は、１つ以上のガラクトース及び／又はシアル酸単位を含むＮ－グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、複合Ｎ－グリカンは、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース及びシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位に、１つ又はマンノース単位がさらに結合した高マンノースＮ－グリカンであり得る。

本明細書で使用される場合、Ｎ－ブチル－１－デオキシノジリマイシンＮＢ－ＤＮＪ又は（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－１－ブチル－２－（ヒドロキシメチル）ピペリジン－３，４，５－トリオールとしても知られる化合物ミグルスタットは、以下の化学式を有する。

ミグルスタットの１つの製剤は、１型ゴーシェ病の単剤治療として、商品名Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）で市販されている。

後述するように、ミグルスタットの薬学的に許容される塩も本発明において使用し得る。ミグルスタットの塩を使用する場合、塩の用量は、患者が受けたミグルスタットの用量がミグルスタットの遊離塩基が使用された場合に受けるであろう用量に等しくなるように調整される。

本明細書で使用される場合、１－デオキシノジリマイシン又はＤＮＪ又は（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）ピペリジン－３，４，５－トリオールとしても知られる化合物ドゥボグルスタットは、以下の化学式を有する。

ドゥボグルスタットの塩を使用する場合、塩の用量は、患者が受けたドゥボグルスタットの用量がドゥボグルスタットの遊離塩基が使用された場合に受けるであろう用量に等しくなるように調整される。

本明細書で使用される場合、用語「薬理学的シャペロン」又は場合により単に用語「シャペロン」は、タンパク質（例えば、天然タンパク質又は組換えタンパク質）に特異的に結合し、以下の効果の１つ以上を有する分子を指すことが意図される。
・タンパク質の安定した分子立体構造の形成を促進する；
・タンパク質の小胞体関連分解を防止するために、小胞体から別の細胞位置、好ましくは天然の細胞位置へのタンパク質の適切な輸送を促進する；
・構造的に不安定なタンパク質又はミスフォールドタンパク質の凝集を防止する；
・タンパク質の少なくとも一部の野生型機能、安定性及び／又は活性を回復及び／又は向上させる；及び／又は
・タンパク質を有する細胞の表現型又は機能を改善する。

したがって、薬理学的シャペロンは、リソソームタンパク質を含む。例えば、酸性α－グルコシダーゼのシャペロンは、酸性α－グルコシダーゼに結合する分子であり、酸性α－グルコシダーゼの適切なフォールディング、輸送、非凝集及び活性をもたらす。本明細書で使用される場合、この用語は、酵素の活性部位に結合する活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）、阻害剤又はアンタゴニスト及びアゴニストを含むが、これらに限定されるものではない。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンは、酸性α－グルコシダーゼの阻害剤又はアンタゴニストであり得る。本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、酸性α－グルコシダーゼに結合し、酸性α－グルコシダーゼの活性を部分的又は完全に遮断、阻害、低減又は中和する任意の分子を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンはミグルスタットである。別の非限定的な酸性α－グルコシダーゼの薬理学的シャペロンは、ドゥボグルスタットである。

本明細書で使用される場合、用語「活性部位」は、タンパク質の特異的な生物学的活性に関連し、且つ必要である、タンパク質の領域を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、活性部位は、基質又は他の結合パートナーに結合し、化学結合の形成及び切断に直接関与するアミノ酸残基に寄与する部位であり得る。

本明細書で使用される場合、「治療有効用量」及び「有効量」は、対象において治療応答を生じる、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）及び／又はシャペロン及び／又はその組み合わせの量を指すことが意図される。治療応答は、本明細書に記載され、且つ当技術分野で公知である、任意の代理臨床マーカー又は症状を含む、ユーザ（例えば、臨床医）が治療に対する有効な応答として認識する任意の応答であり得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、治療応答は、当技術分野で公知のものなどのポンペ病の１つ以上の症状又はマーカーの改善又は抑制であり得る。ポンペ病の症状又はマーカーとしては、心筋症、心臓肥大、特に体幹又は下肢における進行性筋力低下、重度の低血圧、巨舌（及び場合により舌の突出）、嚥下、吸い込み及び／又は摂食の困難、呼吸不全、肝腫（中度）、顔面筋肉の弛緩、反射消失、運動不耐性、労作性呼吸困難、起座呼吸、睡眠時無呼吸、朝の頭痛、傾眠、脊柱前弯及び／又は脊柱側弯症、深部腱反射の減少、腰痛、発達的運動マイルストーンの不達成が挙げられるが、これらに限定されるものではない。酸性α－グルコシダーゼに対する阻害効果を有するシャペロン（例えば、ミグルスタット）の濃度は、希釈（及び結果として平衡の変化による結合の変化）、バイオアベイラビリティ及びインビボ投与時のシャペロンの代謝のために、本発明の目的にとって「有効量」を構成し得ることに留意すべきである。

本明細書で使用される場合、用語「酵素補充療法」又は「ＥＲＴ」は、非天然の精製酵素を、そのような酵素の欠乏を有する個体に導入することを指すことが意図される。投与されるタンパク質は、天然源から又は組換え発現により得ることができる。この用語は、他の点で精製酵素の投与を必要とするか、又は精製酵素の投与から恩恵を受ける個体における精製酵素の導入も指す。少なくとも１つの実施形態において、そのような個体は酵素不全を患っている。導入された酵素は、インビトロで産生された精製組換え酵素又は例えば胎盤若しくは動物の乳などの単離された組織又は液体或いは植物から精製されたタンパク質であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「併用治療」は、２つ以上の個々の治療が同時に又は連続して投与される任意の治療を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、併用治療の結果は、個々に行われる場合の各治療の効果と比較して、強化される。強化は、単独で実施した場合の治療によって達成された結果と比較して有利な結果をもたらし得る、様々な治療の効果の任意の改善を含み得る。強化された効果又は結果には、強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果よりも大きい、相乗的強化；強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果と実質的に等しい、相加的強化；又は強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果よりも低いが、単独で行われた場合の各治療の効果より優れている、相乗効果未満が含まれ得る。強化された効果は、処置効果又は結果を測定し得る当技術分野で公知の任意の手段によって測定し得る。

本明細書で使用される場合、用語「ウイルス粒子」は、カプシドとして知られているタンパク質コートによって囲まれる遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含むことが意図される。ウイルス粒子の例は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス及びアデノウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。１つ以上の実施形態において、ウイルス粒子は、組換えタンパク質をコードする組換えＤＮＡを含む。１つ以上の実施形態において、ウイルス粒子は、発現を増加させ、且つ／又はベクターを安定させるためのさらなる要素、例えばプロモーター（例えば、ハイブリッドＣＢＡプロモーター（ＣＢｈ）及びヒトシナプシン１プロモーター（ｈＳｙｎ１））、ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐｏｌｙＡ））、安定化要素（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後制御要素（ＷＰＲＥ））及び／又はＳＶ４０イントロンを含む。１つ以上の実施形態において、ベクターは、ゲノム中の所望の部位において相同的組み換えを促進し、それにより所望のタンパク質の発現を提供する領域によって隣接されるポリヌクレオチド配列を含み得る（ＫｏｌｌｅｒａｎｄＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：８９３２－８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａｅｔａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４２：４３５－４３８；Ｚａｒｌｉｎｇｅｔａｌ．に付与された米国特許第６，２４４，１１３号明細書；及びＰａｔｉｅｔａｌ．に付与された米国特許第６，２００，８１２号明細書を参照されたい）。

本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリンを指し、免疫グロブリンは、天然及び／又は組換え免疫グロブリンを含む。天然免疫グロブリンの供給源は、ヒト、家畜及び農用動物及び実験動物、動物園の動物、スポーツ用動物又はペット、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルを含む哺乳動物であり得る。供給源は、天然に又は人工的に、免疫原性応答を誘導するように特異的抗原に曝されて、抗体産生をもたらし得る。代わりに、組換え免疫グロブリンは、好適な宿主細胞でも生成され得る。

本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、生理学的に許容され、ヒトに投与される場合に典型的には有害な反応を生じない、分子実体及び組成物を指すことが意図される。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、連邦又は州政府の規制当局によって承認されているか、又は米国薬局方又は動物、特にヒトにおける使用のための他の一般に認められている薬局方に列挙されることを意味する。

本明細書で使用される場合、用語「担体」は、化合物と投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又は溶媒を指すことが意図される。適切な薬学的担体は、当技術分野で公知であり、少なくとも１つの実施形態において、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ”第１８版又は他の版に記載されている。

本明細書で使用される場合、用語「対象」又は「患者」は、ヒト又は非ヒト動物を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、対象は哺乳動物である。少なくとも１つの実施形態において、対象はヒトである。

本明細書で使用される場合、用語「抗薬物抗体」は、対象に投与される薬物及び対象への薬物の投与に対する体液性免疫応答の少なくとも一部として対象により生成される薬物に、特異的に結合する抗体を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、薬物は、治療用タンパク質薬物製品である。対象における抗薬物抗体の存在は、軽度から重度の範囲の免疫応答を起こす可能性があり、これは、アナフィラキシー、サイトカイン放出症候群及び重要な機能を媒介する内因性タンパク質の交差反応性中和を含むが、これらに限定されない、生命を脅かす免疫応答を含むが、これに限定されるものではない。さらに又は代わりに、対象における抗薬物抗体の存在は、薬物の有効性を低下させ得る。

本明細書で使用される場合、用語「中和抗体」は、薬物の機能を中和するように作用する抗薬物抗体を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、治療用タンパク質薬物製品は、発現が対象において低減又は欠損している内在性タンパク質の対応物である。少なくとも１つの実施形態において、中和抗体は、内因性タンパク質の機能を中和するように作用し得る。

本明細書で使用される場合、用語「約」及び「およそ」は、測定の性質又は精度を考慮して、測定された量に対する許容可能な程度の誤差を指すことが意図される。例えば、誤差の程度は、当技術分野で理解されているように、測定に関して提供された有効数字の数によって示すことができ、測定に関して報告された最も正確な有効数字の±１の変化を含むが、これに限定されるものではない。典型的な例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。代わりに、特に生物系において、用語「約」及び「およそ」は、所与の値の１桁倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書に記載の数値は、他に明記しない限りおよそのものであり、用語「約」又は「およそ」は、明示的に記載されていない場合に推測できることを意味する。

用語「同時に」は、本明細書で使用される場合、当業者に理解されるように、同じ時間又は前後の合理的な短い時間以内を意味することが意図される。例えば、２つの処置が互いに同時に投与される場合、２つの処置のうちの後の処置の準備に必要な時間を許容するために、１つの処置は他の処置の前又は後に投与し得る。したがって、２つの処置の「同時投与」は、１つの処置が２０分以下、約２０分、約１５分、約１０分、約５分、約２分、約１分又は１分未満で他の処置に続くことを含むが、これに限定されるものではない。

用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書で使用される場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがなくヒト及び下等動物の組織との接触に使用するのに適切であり、合理的な利益／危険比に応じ、一般に水溶性又は油溶性又は分散性であり、それらの意図された用途に有効である塩を意味することが意図される。この用語は、薬学的に許容される酸付加塩及び薬学的に許容される塩基付加塩を含む。適切な塩のリストは、例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｉｒｇｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，ｐｐ．１－１９に見出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。

用語「薬学的に許容される酸付加塩」は、本明細書で使用される場合、遊離塩基の生物学的有効性及び性質を保持し、生物学的に又は他の点で望ましくないものではない、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸などを含むが、これらに限定されない無機酸及び酢酸、トリフルオロ酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、ジグルコン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリセロリン酸、ヘミスルフィック酸、ヘキサン酸、ギ酸、フマル酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）、乳酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メシチレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、２－ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、フェニル酢酸、３－フェニルプロピオン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ウンデカン酸などを含むが、これらに限定されない有機酸で形成される塩を意味することが意図される。

ＡＴＢ２００ｒｈＧＡＡ
少なくとも１つの実施形態において、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡなどの組換えタンパク質）は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファなどの従来の組換えタンパク質の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む。少なくとも１つの実施形態において、酸性α－グルコシダーゼは、米国特許第１０，２０８，２９９号明細書に記載されるような、本明細書でＡＴＢ２００と称される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼである。ＡＴＢ２００は、高親和性（Ｋ_Ｄ～２～４ｎＭ）でカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合し、ポンペ線維芽細胞及び骨格筋芽細胞（Ｋ_取り込み～７～１４ｎＭ）によって効率的に内在化されることが示されている。ＡＴＢ２００はインビボで特徴付けられ、アルグルコシダーゼアルファ（ｔ_１／２～６０分）よりも短い見かけの血漿半減期（ｔ_１／２～４５分）を有することが示された。

少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する酵素である。

少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、米国特許第８，５９２，３６２号明細書に記載されるような、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨＥ２４１０４．１（ＧＩ：５６８７６０９７４）を有する。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、ＧＡＡ遺伝子の９つの観察されたハプロタイプの最も優勢なものによってコードされるヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素である、グルコシダーゼアルファである。

少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡの全長９５２アミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、アミノ酸の一部、例えば最初の５６アミノ酸を除去する細胞内プロセシングを受ける。したがって、宿主細胞によって分泌される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、細胞内で最初に発現される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼよりも短いアミノ酸配列を有し得る。少なくとも１つの実施形態において、より短いタンパク質は、シグナルペプチド及び前駆体ペプチドを含む最初の５６アミノ酸が除去され、したがって８９６個のアミノ酸を有するタンパク質が得られる点でのみ配列番号１と異なる、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し得る。配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超える欠失、置換及び／又は挿入を有するなど、アミノ酸の数における他の変更も可能である。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡ生成物は、異なるアミノ酸長を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子の混合物を含む。

少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基において翻訳後及び／又は化学修飾を受ける。例えば、メチオニン及びトリプトファン残基は酸化を受け得る。別の例として、Ｎ末端グルタミンはピログルタミン酸を形成することができる。別の例として、アスパラギン残基は、アスパラギン酸への脱アミノ化を受け得る。さらに別の例として、アスパラギン酸残基はイソアスパラギン酸への異性化を受け得る。さらに別の例として、タンパク質中の不対システイン残基は、遊離グルタチオン及び／又はシステインとジスルフィド結合を形成し得る。したがって、いくつかの実施形態において、酵素は、配列番号１又は配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、酵素はこれらの翻訳後及び／又は化学修飾の１つ以上を受ける。そのような改変形態も本開示の範囲内である。

ＧＡＡ及びそのような変異体ヒトＧＡＡをコードするポリヌクレオチド配列も企図され、本発明によるｒｈＧＡＡを組換え発現するために使用され得る。

好ましくは、全組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）分子の７０、６５、６０、５５、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０又は５％以下は、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を欠くか、又はカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合する能力が欠如している。代わりに、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）分子の３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％、＜１００％以上は、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有する少なくとも１つのＮ－グリカン単位を含むか、又はＣＩＭＰＲに結合する能力を有する。

組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）分子は、そのグリカン上に１、２、３又は４個のマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）基を有し得る。例えば、組換えタンパク質分子における１つのＮ－グリカンのみがＭ６Ｐ（モノ－リン酸化）を有し得るか、単一のＮ－グリカンが２つのＭ６Ｐ基（ビス－リン酸化）を有し得るか、又は同じ組換えタンパク質分子における２つの異なるＮ－グリカンがそれぞれ単一のＭ６Ｐ基を有し得る。組換えタンパク質分子は、Ｍ６Ｐ基を有しないＮ－グリカンも有し得る。別の実施形態において、Ｎ－グリカンは、平均して３モル／モルを超えるＭ６Ｐ及び４モル／モルを超えるシアル酸を含み、その結果、タンパク質は、平均して組換えタンパク質１モル当たり少なくとも３モルのマンノース－６－リン酸残基及び組換えタンパク質１モル当たり少なくとも４モルのシアル酸を含む。平均して組換えタンパク質における総グリカンの少なくとも約３、４、５、６、７、８、９又は１０％は、モノ－Ｍ６Ｐグリカンの形態であり得、例えば総グリカンの約６．２５％が単一のＭ６Ｐ基を有し得、平均して組換えタンパク質における総グリカンの少なくとも約０．５、１、１．５、２．０、２．５、３．０％がビス－Ｍ６Ｐグリカンの形態であり、平均して総組換えタンパク質の２５％未満は、ＣＩＭＰＲに結合するリン酸化グリカンを含まない。

組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、０．５～７．０モル／モル組換えリソソームタンパク質の範囲又は０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５又は７．０モル／モル組換えリソソームタンパク質を含む部分範囲の任意の中間値のＭ６Ｐを担持するＮ－グリカンの平均含有量を有し得る。組換えリソソームタンパク質を分画して、異なる平均数のＭ６Ｐ含有又はビス－Ｍ６Ｐ含有グリカンを有する組換えリソソームタンパク質調製物を提供することができ、これにより、特定の画分を選択するか又は選択的に異なる画分を組み合わせることにより、標的組織のリソソームへ標的化する組換えリソソームタンパク質のさらなるカスタマイズが可能となる。

いくつかの実施形態において、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）１モル当たり平均して２．０～８．０モルのＭ６Ｐを有する。この範囲には、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５及び８．０モルＭ６Ｐ／モル組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）を含む、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。

組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）におけるＮ－グリカンの最大６０％が完全にシアリル化され得、例えばＮ－グリカンの最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又は６０％が完全にシアリル化され得る。いくつかの実施形態において、全Ｎ－グリカンの４～２０％が完全にシアリル化されている。他の実施形態において、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）におけるＮ－グリカンの５％、１０％、２０％又は３０％以下がシアル酸及び末端ガラクトース残基（Ｇａｌ）を有する。この範囲には、全ての中間値及び部分範囲が含まれ、例えば組換えタンパク質における全Ｎ－グリカンの７～３０％がシアル酸及び末端ガラクトースを運ぶことができる。さらに他の実施形態において、組換えタンパク質におけるＮ－グリカンの５、１０、１５、１６、１７、１８、１９又は２０％以下が末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない。この範囲には、全ての中間値及び部分範囲が含まれ、例えば組成物中の組換えタンパク質における全Ｎ－グリカンの８～１９％が末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない場合がある。

本発明の他の実施形態において、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における総Ｎ－グリカンの４０、４５、５０、５５～６０％が複合型Ｎ－グリカンであり；又は組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における総Ｎ－グリカンの１、２、３、４、５、６、７％以下がハイブリッド型Ｎ－グリカンであり；組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における高マンノース型Ｎ－グリカンの５、１０又は１５％以下が非リン酸化されており；組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における高マンノース型Ｎ－グリカンの少なくとも５％又は１０％がリン酸化されたモノ－Ｍ６Ｐであり；及び／又は組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における高マンノース型Ｎ－グリカンの少なくとも１又は２％がリン酸化されたビス－Ｍ６Ｐである。これらの値には、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、上記の１つ以上の含有量範囲を満たし得る。

いくつかの実施形態において、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）１モル当たり平均して２．０～８．０モルのシアル酸残基を有する。この範囲には、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５及び８．０モル残基／モル組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）を含む、全ての中間値及び部分範囲が含まれる。理論に拘束されるものではないが、シアル酸残基を有するＮ－グリカン単位の存在は、アシアロ糖タンパク質受容体による組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）の非生産的クリアランスを防止し得ると考えられる。

１つ以上の実施形態において、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、組換えタンパク質の一定のＮ－グリコシル化部位にＭ６Ｐ及び／又はシアル酸単位を有する。例えば、上記のように、ｒｈＧＡＡには７つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位がある。これらの潜在的なグリコシル化部位は、配列番号２の次の位置に存在する：Ｎ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６及びＮ８６９。同様に、配列番号１の全長アミノ酸配列に関して、これらの潜在的なグリコシル化部位は、以下の位置に存在する：Ｎ１４０、Ｎ２３３、Ｎ３９０、Ｎ４７０、Ｎ６５２、Ｎ８８２及びＮ９２５。ｒｈＧＡＡの他の変異体は、アスパラギン残基の位置に応じて、同様のグリコシル化部位を有し得る。一般に、タンパク質アミノ酸配列におけるＡＳＮ－Ｘ－ＳＥＲ又はＡＳＮ－Ｘ－ＴＨＲの配列は、潜在的なグリコシル化部位を示すが、例外として、ＸはＨＩＳ又はＰＲＯではあり得ない。

様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、特定のＮ－グリコシル化プロファイルを有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第１のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８４及び配列番号１のＮ１４０）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％が第１のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐ及び／又はビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、第１のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、第１のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第２のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ１７７及び配列番号１のＮ２２３）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％が第２のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐ及び／又はビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、第２のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、第２のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第３のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ３３４及び配列番号１のＮ３９０）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％又は２５％未満が第３のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第３のＮ－グリコシル化部位は、非リン酸化高マンノースグリカン、ジ－、トリ－及びテトラ－アンテナリ複合グリカン並びに主要な種としてのハイブリッドグリカンの混合物を有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％が第３のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第４のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ４１４及び配列番号１のＮ４７０）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％が第４のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐ及び／又はビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、第４のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％は、第４のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％又は２５％が第４のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第５のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ５９６及び配列番号１のＮ６９２）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％又は２５％未満が第５のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第５のＮ－グリコシル化部位は、主要な種として、フコシル化されたジ－アンテナリ複合グリカンを有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％が第５のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第６のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８２６及び配列番号１のＮ８８２）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％又は２５％未満が第６のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第６のＮ－グリコシル化部位は、主要な種として、ジ－、トリ－及びテトラ－アンテナリ複合グリカンの混合物を有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％が第６のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。

１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第７のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８６９及び配列番号１のＮ９２５）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％又は２５％未満が第７のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％％未満が第７のＮ－グリコシル化部位に任意のグリカンを有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３０％、３５％又は４０％が第７のＮ－グリコシル化部位にグリカンを有する。

様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、モルｒｈＧＡＡ当たり０～５モルの平均フコース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり１０～３０モルのＧｌｃＮＡｃ含量、モルｒｈＧＡＡ当たり５～２０モルのガラクトース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり１０～４０モルのマンノース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２～８モルのＭ６Ｐ含有量及びモルｒｈＧＡＡ当たり２～８モルのシアル酸含有量を有する。様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、モルｒｈＧＡＡ当たり２～３モルの平均フコース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２０～２５モルのＧｌｃＮＡｃ含量、モルｒｈＧＡＡ当たり８～１２モルのガラクトース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２２～２７モルのマンノース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり３～５モルのＭ６Ｐ含有量及びモルｒｈＧＡＡ当たり４～７モルのシアル酸含有量を有する。

組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００若しくはＡＴＢ－２００－００１－Ｘ５－１４などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はそのようなＣＨＯ細胞培養物の継代培養物若しくは誘導体により好ましく産生される。配列番号１又は配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％同一であるものなど、酸性α－グルコシダーゼ又は他の変異体酸性α－グルコシダーゼアミノ酸配列の対立遺伝子変異体を発現するＤＮＡ構築物を構築し、ＣＨＯ細胞で発現させることができる。これらの変異体酸性α－グルコシダーゼアミノ酸配列は、例えば、配列番号１又は配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超える欠失、置換及び／又は挿入を有するなど、配列番号１に対して欠失、置換及び／又は挿入を含有し得る。当業者は、そのようなＤＮＡ構築物の産生のためのＣＨＯ細胞の形質転換に適した代替的ベクターを選択し得る。

ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として利用可能なＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴを含む、２つの配列間の同一性を計算するために、様々なアライメントアルゴリズム及び／又はプログラムを使用することができ、例えばデフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載され、好ましくは実質的に同じ機能を示す特定のポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有するポリペプチド並びにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。別段の指示がない限り、類似度スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性割合はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一の高スコア配列対における総残基の数及び割合を示す；及びＢＬＡＳＴＰの「陽性」は、整列スコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数及び割合を示す。これらの同一性又は類似性の程度又は本明細書に開示されるアミノ酸配列との類似性の任意の中程度の同一性を有するアミノ酸配列が企図され、この開示によって包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを使用して推定され、従来の手段、特に遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。

米国特許第１０，２０８，２９９号明細書に記載されるように、カチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）及び細胞リソソームを標的とする優れた能力を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ並びにインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して産生することができる。これらの細胞は、アルグルコシダーゼアルファなどの従来の組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ製品よりも、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有する有意に高いレベルのＮ－グリカン単位を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを発現するように誘導し得る。これらの細胞によって生成される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、例えば、ＡＴＢ２００によって例示されるように、ルミザイム（登録商標）などの従来の酸性α－グルコシダーゼよりも、有意に多くの筋肉細胞標的化マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）及びビス－マンノース－６－リン酸Ｎ－グリカン残基を有する。理論に拘束されるものではないが、この広範なグリコシル化により、ＡＴＢ２００酵素がより効果的に標的細胞に取り込まれることができ、したがって、例えばはるかに低いＭ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐ含有量を有するアルグルコシダーゼアルファなど、他の組換えヒト酸性α－グルコシダーゼよりも効率的に循環から除去され得ると考えられる。ＡＴＢ２００は、ＣＩＭＰＲに効率的に結合し、骨格筋及び心筋によって効率的に取り込まれ、好ましい薬物動態プロファイルを提供しインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンを有することが示されている。

ＡＴＢ２００の広範なグリコシル化は、例えば、アルグルコシダーゼアルファと比較して、ＡＴＢ２００の免疫原性の低下に寄与し得ることも企図される。当業者によって理解されるように、保存された哺乳動物糖によるタンパク質のグリコシル化は、一般に、生成物の溶解性を高め、生成物の凝集及び免疫原性を減少させる。グリコシル化は、タンパク質の凝集を最小限にし、免疫系からタンパク質免疫原性エピトープを遮断することにより、タンパク質免疫原性を間接的に変化させる（ＧｕｉｄａｎｃｅｆｏｒＩｎｄｕｓｔｒｙ－ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｆｏｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｒｕｇＥｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ，ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃｓＥｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｇｕｓｔ２０１４）。したがって、少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与は、抗薬物抗体を誘導しない。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与は、アルグルコシダーゼアルファの投与によって誘導される抗薬物抗体のレベルよりも対象における抗薬物抗体の発生率を低下させる。

米国特許第１０，２０８，２９９号明細書に記載されるように、ＣＨＯ細胞などの細胞を使用して同文献に記載されるｒｈＧＡＡを生成することができ、このｒｈＧＡＡは、本発明で使用され得る。そのようなＣＨＯ細胞株の例は、ＧＡ－ＡＴＢ－２００若しくはＡＴＢ－２００－００１－Ｘ５－１４又はそれに記載されるようなｒｈＧＡＡ組成物を産生するその継代培養物である。そのようなＣＨＯ細胞株は、ＧＡＡをコードする１ポリヌクレオチドにつき５、１０、１５、２０又はそれを超えるコピーなどの遺伝子の複数のコピーを含有し得る。

ＡＴＢ２００ｒｈＧＡＡなどの高Ｍ６Ｐ及びビス－Ｍ６ＰｒｈＧＡＡは、ＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物でＣＨＯ細胞を形質転換することによって産生され得る。ＣＨＯ細胞は以前にｒｈＧＡＡを作製するために使用されていたが、形質転換ＣＨＯ細胞は、ＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐ及びビス－Ｍ６Ｐグリカンの高い含有量を有するｒｈＧＡＡを産生するように培養及び選択できたことは認められなかった。

驚くべきことに、ＣＨＯ細胞株を形質転換し、ＣＩＭＰＲを標的化するＭ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンの高含有量を含有するｒｈＧＡＡを生成する形質転換体を選択し、この高Ｍ６ＰｒｈＧＡＡを安定に発現させることが可能であることが見出された。したがって、これらのＣＨＯ細胞株を作製する方法は、米国特許第１０，２０８，２９９号明細書にも記載されている。この方法は、ＣＨＯ細胞をＧＡＡ又はＧＡＡ変異体をコードするＤＮＡで形質転換することと、ＧＡＡをコードするＤＮＡをその染色体に安定に組み込み、安定にＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択することと、Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンの高い含有量を有するＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択することと、任意選択により、高いシアル酸含有量を有する及び／又は低い非リン酸化高マンノース含有量を有するＮ－グリカンを有するＣＨＯ細胞を選択することとを含む。

これらのＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ細胞株を培養し、前記組成物をＣＨＯ細胞の培養物から回収することにより、ｒｈＧＡＡ及びｒｈＧＡＡ組成物を生産するために使用され得る。

生物製剤の生成、捕捉及び精製
本発明の様々な実施形態は、生物製剤（例えば、ｒｈＧＡＡなどの組換えヒトリソソームタンパク質を含む組換えタンパク質、抗体及びウイルス粒子）の生成及び／又は捕捉及び／又は精製のための方法に関する。生物製剤を生成、捕捉及び精製するための例示的な先行技術のプロセス６００が図５に示される。本発明の１つ以上の実施形態に係る生物製剤を生成、捕捉及び精製するための例示的なプロセスが図６及び７に示される。図６は、２つの捕捉カラム（例えば、ＡＥＸカラム）及び１つの精製カラム（例えば、ＩＭＡＣカラム）を有する構造を示す一方、図７は、２つの捕捉カラム（例えば、ＡＥＸカラム）及び２つの精製カラム（例えば、ＩＭＡＣカラム）を有する構造を示す。

図５～１３において、矢印は、生物製剤（例えば、ｒｈＧＡＡなどの組換えヒトリソソームタンパク質）を含有する様々な液相の移動方向を示す。バイオリアクター６０１は、生物製剤（例えば、ｒｈＧＡＡ）を生成する、ＣＨＯ細胞などの細胞の培養物を含有する。生物製剤は、組換えタンパク質、抗体及びウイルス粒子を含む。組換えタンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質であり得る。バイオリアクター６０１は、灌流、バッチ又は流加式培養バイオリアクターなど、細胞を培養するための任意の適切なバイオリアクターであり得る。様々な実施形態において、バイオリアクターは、約１Ｌ～約２０，０００Ｌの容積を有する。例示的なバイオリアクターの容積は、約１Ｌ、約１０Ｌ、約２０Ｌ、約３０Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約１５０Ｌ、約２００Ｌ、約２５０Ｌ、約３００Ｌ、約３５０Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、約２，５００Ｌ、約３，０００Ｌ、約３，５００Ｌ、約４，０００Ｌ、約５，０００Ｌ、約６，０００Ｌ、約７，０００Ｌ、約８，０００Ｌ、約９，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約１５，０００Ｌ及び約２０，０００Ｌを含む。

図５～１３に示されるように、培地及び／又は細胞懸濁液は、バイオリアクターから除去され得る。このような除去は、かん流バイオリアクターでは連続的であり得るか、又はバッチ若しくはフェッドバッチ反応器ではバッチ式であり得る。培地及び／又は細胞懸濁液は、細胞懸濁液処理システム６０３によって生物製剤を含有するろ液を分離するように処理される。１つ以上の実施形態において、細胞懸濁液処理システムは、細胞溶解、ろ過、遠心分離及び膜可溶化の１つ以上のステップを含む。いくつかの実施形態において、生物製剤は、分泌組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において、培地から除去された細胞は、バイオリアクターに再導入され、分泌組換えタンパク質を含む培地がさらに処理され得る。ある実施形態において、細胞懸濁液処理システム６０３は、ろ過システムを含む。ろ過システムは、交互接線流ろ過（ＡＴＦ）システム、接線流ろ過（ＴＦＦ）システム、遠心ろ過システムなどを含む、任意の適切なろ過システムであり得る。様々な実施形態において、ろ過システムは、約１０ナノメートル～約２マイクロメートルの孔サイズを有するフィルターを利用する。典型的なフィルター孔サイズは、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、約１μｍ、約１．５μｍ及び約２μｍを含む。

様々な実施形態において、培地及び／又は細胞懸濁液除去速度は、約１Ｌ／日～約２０，０００Ｌ／日である。例示的な培地及び／又は細胞懸濁液除去速度は、約１Ｌ／日、約１０Ｌ／日、約２０Ｌ／日、約３０Ｌ／日、約４０Ｌ／日、約５０Ｌ／日、約６０Ｌ／日、約７０Ｌ日、約８０Ｌ／日、約９０Ｌ／日、約１００Ｌ／日、約１５０Ｌ／日、約２００Ｌ／日、約２５０Ｌ／日、約３００Ｌ／日、約３５０Ｌ／日、約４００Ｌ／日、約５００Ｌ／日、約６００Ｌ／日、約７００Ｌ／日、約８００Ｌ／日、約９００Ｌ／日、約１，０００Ｌ／日、約１，５００Ｌ／日、約２，０００Ｌ／日、約２，５００Ｌ／日、約３，０００Ｌ／日、約３，５００Ｌ／日、約４，０００Ｌ／日、約５，０００Ｌ／日、約６，０００Ｌ／日、約７，０００Ｌ／日、約８，０００Ｌ日、約９，０００Ｌ／日、約１０，０００Ｌ／日、約１５，０００Ｌ／日及び約２０，０００Ｌ／日である。代わりに、培地除及び／又は細胞懸濁液去速度は、約０．１～約３リアクター容積／日など、バイオリアクター容積の関数として表すことができる。例示的な培地及び／又は細胞懸濁液除去速度は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約２、約２．５及び約３リアクター容積を含む。

連続又は流加処理の場合、新鮮な培地がバイオリアクターに供給される速度は、約１Ｌ／日～約２０，０００Ｌ／日であり得る。例示的な培地導入速度は、約１Ｌ／日、約１０Ｌ／日、約２０Ｌ／日、約３０Ｌ／日、約４０Ｌ／日、約５０Ｌ／日、約６０Ｌ／日、約７０Ｌ日、約８０Ｌ／日、約９０Ｌ／日、約１００Ｌ／日、約１５０Ｌ／日、約２００Ｌ／日、約２５０Ｌ／日、約３００Ｌ／日、約３５０Ｌ／日、約４００Ｌ／日、約５００Ｌ／日、約６００Ｌ／日、約７００Ｌ／日、約８００Ｌ／日、約９００Ｌ／日、約１，０００Ｌ／日、約１，５００Ｌ／日、約２，０００Ｌ／日、約２，５００Ｌ／日、約３，０００Ｌ／日、約３，５００Ｌ／日、約４，０００Ｌ／日、約５，０００Ｌ／日、約６，０００Ｌ／日、約７，０００Ｌ／日、約８，０００Ｌ日、約９，０００Ｌ／日、約１０，０００Ｌ／日、約１５，０００Ｌ／日及び約２０，０００Ｌ／日である。代わりに、培地導入速度は、約０．１～約３リアクター容積／日など、バイオリアクター容積の関数として表すことができる。例示的な培地導入速度は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約２、約２．５及び約３リアクター容積を含む。

細胞懸濁液処理システムによって処理された後、収集されたろ液は、捕捉システム６０５に充填される。捕捉システム６０５は、１つ以上のクロマトグラフィーカラムを含み得る。

図６において、捕捉システム６０５は、２つの捕捉カラム６０５ａ及び６０５ｂを含む。図１３は、２つのクロマトグラフィーシステムを示し、各システムは、単一の捕捉カラムを含み、すなわち、捕捉カラム６０５ａは、１つのクロマトグラフィーシステムの部分であり、捕捉カラム６０５ｂは、別個であるが、同一のクロマトグラフィーシステムの部分である。図６及び１２の両方において、捕捉カラムは、捕捉カラム６０５ａの流水は、捕捉６０５ｂに流れないように平行になっている。むしろ、捕捉カラム６０５ａが充填されたら、弁６０４は、ろ液の流れを、捕捉カラム６０５ａの代わりに第２の捕捉カラム６０５ｂに向け直す。１つ以上の実施形態において、捕捉カラム６０５ａ及び６０５ｂの充填は、カラム間で行き来して循環して、バイオリアクターから捕捉カラムへの培地の連続的な充填を提供する。３つ以上の捕捉カラムが使用される場合、カラムは、連続して又は異なる順序で充填され得る。

図７～１０は、生物製剤の連続精製のために連続して作動する２つの捕捉カラム、捕捉カラム１及び捕捉カラム２及び精製カラムを表す。図７において、捕捉カラム１に、生物製剤を含有するろ液が充填される。図８において、捕捉された生物製剤は、捕捉カラム１から溶出され、精製カラムに充填されると同時に、ろ液は、捕捉カラム２に充填される。図９において、捕捉された生物製剤は、捕捉カラム２から溶出され、精製カラムに充填されると同時に、ろ液は、捕捉カラム１に充填される。図１０において、精製された生物製剤は、精製カラムから溶出される。

様々な実施形態において、捕捉システム６０５は、生物製剤の直接の生成物捕捉のために１つ以上の捕捉カラム（例えば、ＡＥＸ）を含む。いくつかの実施形態において、捕捉カラムは、ＡＥＸカラムであり、生物製剤は、分泌組換えタンパク質、特に高いＭ６Ｐ含量を有するリソソームタンパク質である。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ろ過された培地から組換えタンパク質を捕捉するためにＡＥＸクロマトグラフィーを使用すると、１つ以上のＭ６Ｐ基を有する組換えタンパク質のより多くの負電荷のために、捕捉された組換えタンパク質生成物がより高いＭ６Ｐ含量を有することが保証されると考えられる。その結果、非リン酸化組換えタンパク質及び宿主細胞不純物は、カラム樹脂及び高リン酸化組換えタンパク質に結合せず、非リン酸化組換えタンパク質及び宿主細胞不純物はカラムを通過する。したがって、ＡＥＸクロマトグラフィーは、ＡＥＸ樹脂に対するＭ６Ｐ含有タンパク質の高い親和性により、タンパク質生成物のＭ６Ｐ含有量を富化する（すなわちより多くのＭ６Ｐを有するタンパク質を選択する）ために使用することができる。

いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＡＥＸクロマトグラフィーを使用した組換えタンパク質の直接的生成物捕捉により、プロテアーゼ並びにタンパク質を分解し及び／又はタンパク質を脱リン酸化することができる他の酵素、を含む培地から高Ｍ６Ｐ含有量を有する組換えタンパク質が確実に除去されると考えられる。その結果、高品質の生成物が保存される。

適切なＡＥＸクロマトグラフィーカラムは、負に荷電したタンパク質などの負に帯電した分子に結合する化学的官能基を有する。例示的な官能基には、第１級、第２級、第３級及び第４級アンモニウム又はアミン基が含まれるが、これらに限定されない。これらの官能基は、膜（例えば、セルロース膜）又は通常のクロマトグラフィー樹脂に結合し得る。例示的なカラム媒体には、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＰ、ＣＭ、Ｑ及びＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ媒体が含まれる。

対象とする生物製剤（例えば、組換えタンパク質）に応じて、他の捕捉カラムも使用され得る。例えば、ＣＥＸ、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及び／又はＩＭＡＣカラムも捕捉カラムとして使用され得る。他の捕捉カラムは、生物製剤に特異的な抗体を含むものも含む。いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーカラムは、抗体を捕捉するために使用され得る。いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーカラムは、ウイルス粒子を捕捉するために使用され得る。いくつかの実施形態において、親和性クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡカラム及びプロテインＺカラムを含む。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、捕捉カラムとして使用され得る。

捕捉カラム（例えば、ＡＥＸカラム）の容積は、０．１Ｌ～１，０００Ｌなどの任意の適切な容積であり得る。例示的なカラム容積は、約０．１Ｌ、約０．２Ｌ、約０．３Ｌ、約０．４Ｌ、約０．５Ｌ、約０．６Ｌ、約０．７Ｌ、約０．８Ｌ、約０．９Ｌ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約２０Ｌ、約３０Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約１５０Ｌ、約２００Ｌ、約２５０Ｌ、約３００Ｌ、約３５０Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ及び約１，０００Ｌを含む。

１つ以上の実施形態において、捕捉カラム（例えば、ＡＥＸカラム）は、バイオリアクターサイズ及び／又は捕捉カラムに充填されるろ液の流速と比較して比較的小さい。１つ以上の実施形態において、バイオリアクター容積対総捕捉カラム容積の比率は、約５００：１～約１０：１の範囲である。例示的な比率は、約５００：１、約４５０：１、約４００：１、約３５０：１、約３００：１、約２５０：１、約２００：１、約１５０：１、約１００：１、約９０：１、約８０：１、約７０：１、約６０：１、約５０：１、約４０：１、約３０：１、約２０：１及び約１０：１を含む。

１つ以上の実施形態において、総捕捉カラム滞留時間（例えば、総ＡＥＸカラム滞留時間）は、０．５分～２００分の範囲である。例示的な総捕捉カラム滞留時間は、０．５分、１分、１．５分、２分、２．５分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、７５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１１０分、１２０分、１３０分、１４０分、１５０分、１６０分、１７０分、１８０分、１９０分及び２００分を含む。

１つ以上の実施形態において、ろ液は、約０．５～約１００ＣＶ／時の範囲のろ液充填速度で少なくとも２つの捕捉カラムに充填される。例示的なろ液充填速度は、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５及び約１００ＣＶ／時を含む。

１つ以上の実施形態において、ろ液は、約１０～約１０，０００ｍＬ／分の範囲のろ液充填速度で少なくとも２つの捕捉カラムに充填される。例示的なろ液充填速度は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１，０００、約１，１００、約１，２００、約１，３００、約１，４００、約１，５００、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約３，５００、約４，０００、約４，５００、約５，０００、約６，０００、約７，０００、約８，０００、約９，０００及び約１０，０００ｍＬ／分を含む。

ＡＥＸカラムのための例示的な条件を以下の表２に示す。

ろ液を含有する生物製剤が捕捉システム６０５に充填された後、生物製剤は、カラム中のｐＨ及び／又は塩含有量を変化させることによってカラムから溶出される。

溶出した生物製剤は、さらなる精製ステップ及び／又は品質保証ステップに供され得る。例えば、図５に示されるように、溶出した生物製剤は、ウイルス死滅ステップ６０７に供され得る。このようなウイルス死滅６０７は、低ｐＨ死滅、洗浄剤死滅又は当技術分野において公知の他の技術の１つ以上を含み得る。１つ以上の実施形態において、生物製剤は、他の望ましくないウイルスより堅固なウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ）である。このような実施形態において、ウイルス死滅ステップは、望ましくないウイルスを選択的に死滅させるようにさらに行われ得る。

図５に示されるステップのいずれかは、ウイルス死滅、さらなるクロマトグラフィーシステム、さらなるろ過、最終生成物調整などを含むが、これらに限定されない、図６及び７に示されるシステムにも適用され得る。

ウイルス死滅ステップ６０７からの生物学的製剤を第２のクロマトグラフィーシステム６０９に導入して、生物学的製剤をさらに精製することができる。代わりに、捕捉システム６０５から溶出した生物製剤は、第２のクロマトグラフィーシステム６０９に直接供給することができる。様々な実施形態において、第２のクロマトグラフィーシステム６０９は、１つ以上の精製カラムを含む。いくつかの実施形態において、精製カラムは、不純物のさらなる除去のためのＩＭＡＣカラムを含む。例示的な金属イオンは、コバルト、ニッケル、銅、鉄、亜鉛又はガリウムを含む。いくつかの実施形態において、精製カラムは、不純物のさらなる除去のためのＡＥＸカラムを含む。いくつかの実施形態において、精製カラムは、不純物のさらなる除去のためのＣＥＸカラムを含む。いくつかの実施形態において、精製カラムは、不純物のさらなる除去のための親和性カラム（例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＺカラム）を含む。いくつかの実施形態において、精製カラムは、不純物のさらなる除去のためのサイズ排除カラムを含む。いくつかの実施形態において、精製カラムは、不純物のさらなる除去のための疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを含む。

第２のクロマトグラフィーカラム（例えば、ＩＭＡＣカラム）の容積は、０．１Ｌ～１００Ｌなどの任意の適切な容積であり得る。例示的なカラム容積は、約０．０１Ｌ、約０．０２Ｌ、約０．０３Ｌ、約０．０４Ｌ、約０．０５Ｌ、約０．０６Ｌ、約０．０７Ｌ、約０．０８Ｌ、約０．０９Ｌ、約０．１Ｌ、約０．２Ｌ、約０．３Ｌ、約０．４Ｌ、約０．５Ｌ、約０．６Ｌ、約０．７Ｌ、約０．８Ｌ、約０．９Ｌ、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約２．５Ｌ、約３Ｌ、約３．５Ｌ、約４Ｌ、約４．５Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１５Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ、約３０Ｌ、約３５Ｌ、約４０Ｌ及び約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ及び約１００Ｌを含む。

１つ以上の実施形態において、捕捉カラムからの溶出液は、約１０～約３０，０００ｍＬ／分の範囲の充填速度で１つ以上の精製カラムに充填される。例示的な精製カラム充填速度は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、約９５０、約１，０００、約１，１００、約１，２００、約１，３００、約１，４００、約１，５００、約２，０００、約２，５００、約３，０００、約３，５００、約４，０００、約４，５００、約５，０００、約６，０００、約７，０００、約８，０００、約９，０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００及び約３０，００ｍＬ／分を含む。

１つ以上の実施形態において、バイオリアクター容積対総精製カラム容積の比率は、約５，０００：１～約５０：１の範囲である。例示的な比率は、約５，０００：１、約４，５００：１、約４，０００：１、約３，５００：１、約３，０００：１、約２，５００：１、約２，０００：１、約１，５００：１、約１，０００：１、約９００：１、約８００：１、約７００：１、約６００：１、約５００：１、約４００：１、約３００：１、約２００：１、約１５０：１、約１００：１、約９０：１、約８０：１、約７０：１、約６０：１及び約５０：１を含む。

１つ以上の実施形態において、総捕捉カラム容積対総精製カラム容積の比率は、約２０：１～約１：１の範囲である。例示的な比率は、約２０：１、約１５：１、約１０：１、約９：１、約８：１、約７：１、約６：１、約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．９：１、約１．８：１、約１．７：１、約１．６：１、約１．５：１、約１．４：１、約１．３：１、約１．２：１、約１．１：１及び約１：１を含む。

ＩＭＡＣカラムのための例示的な条件を以下の表３に示す。

ろ液を含有する生物製剤が第２のクロマトグラフィーシステム６０９に充填された後、生物製剤がカラムから溶出される。図５に示すように、溶出した生物製剤は、ウイルス死滅ステップ６１１に供され得る。ウイルス死滅６０７の場合と同様に、ウイルス死滅６１１は、低ｐＨ死滅、洗浄剤死滅又は当技術分野で公知の他の技術の１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルス死滅６０７又は６１１の１つのみが使用されるか、又は複数のウイルス死滅が精製方法において同じ段階で行われる。

１つ以上の実施形態において、第２のクロマトグラフィーシステム６０９からの溶出液は、貯蔵され得る。例えば、ＡＴＢ２００などのｒｈＧＡＡは、ＩＭＡＣ溶出液中で特に安定し得る。１つ以上の実施形態において、第２のクロマトグラフィーシステムからの溶出液（例えば、ＩＭＡＣ溶出液）は、２４時間～１０５日間の期間にわたって０℃～１０℃の温度で貯蔵される。１つ以上の実施形態において、第２のクロマトグラフィーシステムからの溶出液は、最大で１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又は１０５日間にわたって貯蔵される。１つ以上の実施形態において、第２のクロマトグラフィーシステムからの溶出液は、１時間～３日間の期間にわたって１５℃～３０℃の温度で貯蔵される。

図５に示されるように、ウイルス死滅ステップ６１１からの生物学的製剤を第３のクロマトグラフィーシステム６１３に導入して、生物学的製剤をさらに精製することができる。代わりに、第２のクロマトグラフィーシステム６０９からの溶出した生物製剤は、第３のクロマトグラフィーシステム６１３に直接供給することができる。様々な実施形態において、第３のクロマトグラフィーシステム６１３は、不純物のさらなる除去のための１つ以上のＡＥＸカラム、ＣＥＸカラム、サイズ排除カラム、親和性カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム及び／又はＳＥＣカラムを含む。次に、生物学的製剤は、第３のクロマトグラフィーシステム６１３から溶出される。

第３のクロマトグラフィーカラム（例えば、ＣＥＸ又はＳＥＣカラム）の容積は、０．１Ｌ～２００Ｌなどの任意の適切な容積であり得る。例示的なカラム容積は、約０．０１Ｌ、約０．０２Ｌ、約０．０３Ｌ、約０．０４Ｌ、約０．０５Ｌ、約０．０６Ｌ、約０．０７Ｌ、約０．０８Ｌ、約０．０９Ｌ、約０．１Ｌ、約０．２Ｌ、約０．３Ｌ、約０．４Ｌ、約０．５Ｌ、約０．６Ｌ、約０．７Ｌ、約０．８Ｌ、約０．９Ｌ、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約２．５Ｌ、約３Ｌ、約３．５Ｌ、約４Ｌ、約４．５Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１５Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ、約３０Ｌ、約３５Ｌ、約４０Ｌ及び約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約１５０Ｌ及び約２００Ｌを含む。

ＣＥＸカラムのための例示的な条件を以下の表４に示す。

生物学的製剤は、さらなる処理にも供され得る。例えば、ウイルスを除去するために別のろ過システム６１５を用い得る。いくつかの実施形態において、そのようなろ過は、５ｎｍ～５０μｍの孔径を有するフィルターを利用することができる。他の生成物処理には、生物学的製剤が滅菌、ろ過、濃縮、貯蔵され、且つ／又は最終生成物の製剤に添加するためのさらなる成分を有し得る、生成物調整ステップ６１７が含まれ得る。例えば、生物学的製剤は、２～１０倍の因数で濃縮することができる。この最終生成物は、バイアルを充填するために使用することができ、将来の使用のために凍結乾燥され得る。

生物製剤の投与
生物製剤又はその薬学的に許容される塩は、ヒトへの投与に適合した医薬組成物として通常の手順に従って製剤化し得る。例えば、好ましい実施形態において、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化剤及び注射部位において痛みを和らげるための局所麻酔剤も含み得る。一般に、成分は、別個に供給されるか又は単位剤形中で一緒に混合されて、又は例えば活性物質の量を示すアンプル又はサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、医薬グレードの滅菌水、生理食塩水又はデキストロース／水を含有する注入ボトルで分注し得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルが提供され得る。

いくつかの実施形態では、生物製剤（例えば、組換えタンパク質（ｒｈＧＡＡなど）（又は生物製剤を含有する組成物若しくは医薬）は、適切な経路で投与される。一実施形態において、生物製剤は、静脈内投与される。他の実施形態において、生物製剤（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、心臓若しくは骨格筋（例えば、筋肉内）又は神経系（例えば、脳への直接注射；脳室内；髄腔内）などの標的組織への直接投与によって投与される。必要に応じて、複数の経路を同時に使用できる。

生物製剤（例えば、組換えタンパク質（ｒｈＧＡＡなど）（又は生物製剤を含有する組成物若しくは医薬）は、治療有効量（例えば、定期的に投与された場合、疾患に関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防又は遅延させること及び／又は疾患の症状の重症度又は頻度を軽減することなどにより、疾患を処置するのに十分な投与量）で投与される。疾患の処置における治療上有効量は、性質及び疾患の影響の程度に依存し、標準的な臨床技術によって決定し得る。さらに、インビトロアッセイ又はインビボアッセイを、任意選択により、最適な投与量範囲の同定を促進するために使用し得る。使用される正確な用量は、投与経路及び疾患の重症度にも依存し、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から外挿し得る。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、生物製剤は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ又は約１００ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。特定の個体の有効用量は、個体の必要性に応じて、経時的に変化させる（例えば、増加又は減少させる）ことができる。例えば、身体疾患若しくはストレスを有するとき、又は抗酸性α－グルコシダーゼ抗体が存在するようになったか若しくは増加する場合、又は疾患の症状が悪化する場合、その量を増加することができる。

組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（又は組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含有する組成物又は医薬）の治療有効量は、性質及び疾患の影響の程度に依存して定期的及び継続的に投与される。本明細書で使用される場合、「定期的」な投与は、治療有効量が周期的に投与されることを示す（１回投与とは区別される）。間隔は、標準的な臨床技術によって決定することができる。好ましい実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは毎月、隔月；毎週；毎週２回；又は毎日投与される。単一の個体に対する投与間隔は、一定間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて、経時的に変化させることができる。例えば、身体疾患若しくはストレスを有するとき、抗組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ抗体が存在するようになったか若しくは増加する場合又は疾患の症状が悪化する場合、投与の間隔を減少させることができる。いくつかの実施形態において、治療有効量の５，１０，２０，５０，１００又は２００ｍｇ酵素／ｋｇ体重を、シャペロンを伴い又は伴わず、週に２回、毎週又は隔週投与する。

生物製剤（例えば、組換えタンパク質（ｒｈＧＡＡなど）は、単位用量のバイアル若しくはシリンジ中又は静脈内投与のための瓶若しくは袋の中など、後の使用のために調製され得る。生物製剤（例えば、組換えタンパク質（ｒｈＧＡＡなど）及び任意選択の賦形剤又はシャペロン若しくは他の薬物などの他の活性成分を含むキットは、包装材料に封入され、再構成、希釈又はポンペ病に罹患している患者などの処置を必要とする対象を処置する投与のための説明書を伴い得る。

ｒｈＧＡＡと薬理学的シャペロンの併用治療
様々な実施形態において、本明細書に記載の方法によって生成されたｒｈＧＡＡ（例えば、ＡＴＢ２００）は、ミグルスタット又はドゥボグルスタットなどの薬理学的シャペロンとの併用治療において使用することができる。

少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロン（例えば、ミグルスタット）は、経口投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２００～約４００ｍｇの経口用量又は約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ若しくは約４００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２３３ｍｇ～約４００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２５０～約２７０ｍｇの経口用量又は約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇ若しくは約２７０ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２６０ｍｇの経口用量として投与される。

平均体重が約７０ｋｇの成人患者の場合、約２００ｍｇ～４００ｍｇの範囲又は任意のそれより小さい範囲のミグルスタットの経口用量が適し得ることが当業者に理解されるであろう。乳児、小児又は低体重の成人を含むが、これらに限定されない、体重が約７０ｋｇよりも著しく低い患者については、より少ない用量が適切であると医師によって考えられ得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約５０ｍｇ～約２００ｍｇの経口用量又は約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ又は約２００ｍｇの経口用量として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約６５ｍｇ～約１９５ｍｇの経口用量又は約６５ｍｇ、約１３０ｍｇ若しくは約１９５ｍｇの経口用量として投与される。

少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、経口投与に適した薬学的に許容される剤形として投与され、これは、即時放出、遅延放出、変形放出、持続放出、パルス放出又は制御放出用途のための、錠剤、カプセル、胚珠、エリキシル、溶液又は懸濁液、ゲル、シロップ、口腔洗浄剤又は使用前に水又は他の適切な溶媒で再構成するための乾燥粉末、任意選択により香味剤及び着色剤を含むが、これらに限定されるものではない。錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ピル、ボーラス、粉末、ペースト、顆粒、弾丸状、糖衣錠又はプレミックス調製物などの固体組成物も使用できる。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは錠剤として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットはカプセルとして投与される。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約５０ｍｇ～約３００ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約６５ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約１３０ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約２６０ｍｇのミグルスタットを含有する。剤形が約６５ｍｇのミグルスタットを含む場合、ミグルスタットは、４剤形の投与量又は２６０ｍｇのミグルスタットの総投与量として投与され得ることが企図される。しかしながら、乳児、小児又は成人低体重を含むが、これに限定されない平均成人体重の７０ｋｇよりも有意に低い体重を有する患者の場合、ミグルスタットは１剤形（総用量６５ｍｇのミグルスタット）、２剤形（総投与量１３０ｍｇのミグルスタット）又は３剤形（総投与量１９５ｍｇのミグルスタット）の投与量として投与され得る。

経口使用のための固体及び液体組成物は、当技術分野で周知の方法に従って調製し得る。そのような組成物は、固体又は液体形態であり得る１つ以上の薬学的に許容される担体及び賦形剤も含み得る。錠剤又はカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤又は湿潤剤を含むが、これらに限定されない、薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製し得る。適切な薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野で公知であり、アルファ化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、タルク、シリカ、トウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、グリシンクロスカルメロースナトリウム及びケイ酸塩複合体を含むが、これらに限定されるものではない。錠剤は、当技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットはＺａｖｅｓｃａ（登録商標）（ＡｃｔｅｌｉｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として市販されている製剤として投与される。

少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタット及び組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタット及び組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、連続的に投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前にミグルスタットを投与する。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前３時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前の２時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約１．５時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約１時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約５０分～約７０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約５５分～約６５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約３０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２５分～約３５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２７分～約３３分前に投与される。

少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与と同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前又は投与後２０分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前又は投与後１５分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前又は投与後１０分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前又は投与後５分以内に投与される。

少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後２時間までに投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後約３０分で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後約１時間で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後約１．５時間で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後約２時間で投与される。

本発明の別の態様は、それを必要とする患者におけるポンペ病の併用治療のためのキットを提供する。キットは、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形、本明細書で定義される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形及びミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形及び組換え酸性α－グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形を、それを必要とする患者に投与するための説明書を含む。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形は、錠剤又はカプセルを含むが、これに限定されない、本明細書に記載される経口剤形である。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形は、本明細書に記載の注射に適した滅菌溶液である。少なくとも１つの実施形態において、剤形を投与するための説明書は、本明細書に記載されるように、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形を静脈内注入によって投与する前に、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形を投与するための説明書を含む。

理論に拘束されるものではないが、ミグルスタットは組換えヒト酸性α－グルコシダーゼＡＴＢ２００の薬理学的シャペロンとして作用し、その活性部位に結合すると考えられている。例えば、ミグルスタットは、アンフォールドＡＴＢ２００タンパク質の割合を減少させ、ＡＴＢ２００の活性立体構造を安定化さし、血漿の中性ｐＨでの変性及び不可逆的な不活性化を防止し、循環中で組織に到達して取り込まれるのに十分な長さの生存条件を許容することが見出された。しかしながら、ミグルスタットのＡＴＢ２００の活性部位への結合はまた、天然基質であるグリコーゲンが活性部位にアクセスすることを防止することにより、ＡＴＢ２００の酵素活性の阻害をもたらし得る。ミグルスタット及び組換えヒト酸性α－グルコシダーゼが本明細書に記載の条件下で患者に投与される場合、血漿及び組織内のミグルスタット及びＡＴＢ２００の濃度は、ＡＴＢ２００が組織に取り込まれ、リソソームを標的化するまで安定化される程度であるが、ミグルスタットのクリアランスが迅速であるために、リソソーム内のＡＴＢ２００によるグリコーゲンの加水分解は、ミグルスタットの存在によって過度に阻害されず、酵素は治療的に有用な十分な活性を保持すると考えられる。

上記の全ての実施形態を組み合わせ得る。これは、以下に関する特定の実施形態を含む。
・薬理学的シャペロン、例えばミグルスタットの性質；及びそれが特異的である活性部位；
・投与量、薬理学的シャペロン（例えば、ミグルスタット）の投与経路及び担体の性質及び市販の組成物の使用を含む医薬組成物のタイプ；
・薬の性質、例えば対象において発現が低下又は欠損している内因性タンパク質の対応物であり得る、治療用タンパク質薬物製品、好適には、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、１つ以上のアルグルコシダーゼのアルファマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較した場合、増加した含有量の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ；及び好適には、配列番号１又は配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するもの；
・組換えタンパク質に結合したＮ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸又はこれらの組み合わせから形成された複合Ｎ－グリカンなど、組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）上のＮ－グリカン単位の数及びタイプ；
・マンノース－６－リン酸及び／又はビス－マンノース－６－リン酸を形成する組換えタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）上のマンノース単位のリン酸化の程度；
・補充酵素（例えば、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ）の投与量及び投与経路（例えば、静脈内投与、特に静脈内注入又は標的組織への直接投与）及び担体及び治療有効量を含む製剤のタイプ；
・薬理学的シャペロン（ミグルスタット）及び組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与間隔；
・治療応答の性質及び併用治療の結果（例えば、個々に行われる各治療の効果と比較して強化された結果）；
・併用治療の投与タイミング、例えばミグルスタット及び組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの同時投与又は逐次投与、例えばミグルスタットが組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの前、又は組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの後、又は投与前又は投与後の一定時間内に投与される場合；及び
・処置患者の性質（例えば、ヒトなどの哺乳動物）及び個体が罹患している病状（例えば、酵素不全）。

上記リストの任意の実施形態は、リストの他の実施形態の１つ以上と組み合わせることができる。

本発明のさらなる特徴は、例として、本発明の原理を説明する以下の非限定的な実施例から明らかになる。

実施例１：高含有量のモノ－又はビス－Ｍ６Ｐ含有Ｎ－グリカンを有するＡＴＢ２００ｒｈＧＡＡを産生するＣＨＯ細胞の調製
ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を図４に示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。

トランスフェクション後、安定的に組み込まれたＧＡＡ遺伝子を含むＤＧ４４ＣＨＯ（ＤＨＦＲ－）細胞をヒポキサンチン／チミジン欠損（－ＨＴ）培地で選択した。

これらの細胞におけるＧＡＡ発現の増幅は、メトトレキサート処理（ＭＴＸ、５００ｎＭ）によって誘導された。大量のＧＡＡを発現する細胞プールはＧＡＡ酵素活性アッセイによって同定され、ｒｈＧＡＡを産生する個々のクローンを確立するために使用された。個々のクローンを半固体培地プレート上で生成し、ＣｌｏｎｅＰｉｘシステムにより採取し、２４ディープウェルプレートに移した。個々のクローンをＧＡＡ酵素活性についてアッセイして、高レベルのＧＡＡを発現するクローンを同定した。ＧＡＡ活性を決定するための条件培地は、４－ＭＵ－α－グルコシダーゼ基質を用いた。ＧＡＡ酵素アッセイによって測定される、より高レベルのＧＡＡを産生するクローンを生存能力、成長能力、ＧＡＡ生産性、Ｎ－グリカン構造及び安定なタンパク質発現についてさらに評価した。強化されたモノ－Ｍ６Ｐ又はビス－Ｍ６ＰＮ－グリカンを有するｒｈＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００を含むＣＨＯ細胞株を、この手順を用いて単離した。

実施例２：ＡＴＢ２００ｒｈＧＡＡの捕捉及び精製のための概念実証計画
ＡＴＢ２００ｒｈＧＡＡを発現する細胞をバイオリアクター内で培養する。細胞培地を除去し、ろ過し、後の使用のために凍結する。次に、解凍した収集物を含むバルク容器をバッチモードで使用して、カラム容積１５．７ｍＬ（１ｃｍの直径×２０ｃｍの床高さ）をそれぞれ有する２つのＡＥＸカラムを充填する。ＡＥＸカラムを１．５７ｍＬ／分の流速で充填する。総ＡＥＸカラム滞留時間（すなわち総ＡＥＸカラム容積及びＡＥＸカラムを充填する体積流速の商）は、２０分である。

連続プロセスを以下のプロトコルに従って実行した。
・２つのシーケンスを実行する（対照条件と同じ試験数に等しい）
・各ＡＥＸ溶出液は、ＩＭＡＣカラム上で連続して処理される。
ｉ．シーケンス１
１．ＡＥＸ１を充填する→ＳＴＰによりＡＥＸ１溶出液をＩＭＡＣに送る→ＩＭＡＣ溶出液（ＩＭＡＣａ）を収集する
２．ＡＥＸ２を充填する→ＳＴＰによりＡＥＸ２溶出液をＩＭＡＣに送る→ＩＭＡＣ溶出液（ＩＭＡＣｂ）を収集する
ｉｉ．シーケンス２
１．ＡＥＸ１を充填する→ＳＴＰによりＡＥＸ１溶出液をＩＭＡＣに送る→ＩＭＡＣ溶出液（ＩＭＡＣａ）を収集する
２．ＡＥＸ２を充填する→ＳＴＰによりＡＥＸ２溶出液をＩＭＡＣに送る→ＩＭＡＣ溶出液（ＩＭＡＣｂ）を収集する

また、バッチプロセスを以下のプロトコルに従って対照として実行した。
・４つの試験を実行する（各ＡＥＸカラム：ＡＥＸ１、ＡＥＸ２において２つの試験）
・各ＡＥＸ溶出液が収集され、ＩＭＡＣカラム上で処理される。
ｉ．対照試験１＝ＡＥＸ１を充填する→ＡＥＸ１溶出液を収集する→ＡＥＸ１溶出液をＩＭＡＣに充填する→ＩＭＡＣ溶出液を収集する
ｉｉ．対照試験２＝ＡＥＸ２を充填する→ＡＥＸ２溶出液を収集する→ＡＥＸ２溶出液をＩＭＡＣに充填する→ＩＭＡＣ溶出液を収集する
ｉｉｉ．対照試験３＝ＡＥＸ１を充填する→ＡＥＸ１溶出液を収集する→ＡＥＸ１溶出液をＩＭＡＣに充填する→ＩＭＡＣ溶出液を収集する
ｉｖ．対照試験４＝ＡＥＸ２を充填する→ＡＥＸ２溶出液を収集する→ＡＥＸ２溶出液をＩＭＡＣに充填する→ＩＭＡＣ溶出液を収集する

各ＡＥＸカラムのためのプロセス条件を以下の表５に示す。

対照プロセス及び連続プロセスについての溶出プロファイルは、それぞれ図１３及び１４に示される。

次に、ＡＥＸ溶出液を、３．９ｍＬのカラム容積（１ｃｍの直径×５ｃｍの床高さ）を有する単一のＩＭＡＣカラムに充填する。ＩＭＡＣカラムを０．６５ｍＬ／分の流速で充填する。総ＡＥＸカラム容積対ＩＭＡＣカラム容積の比率は、約８：１である。バッチ精製プロセス及び連続精製プロセスの両方についての溶出プロファイルを記録し、これは、図１５及び１６に示される。ＩＭＡＣカラムのためのプロセス条件を以下の表６に示す。

この実施例に係る連続プロセスに従って生成されるｒｈＧＡＡは、対照（前のバッチモード）プロセスに従って生成されるｒｈＧＡＡと同等であり、したがってこの実施例２において連続プロセスを用いた製品品質の低下を示さない。しかしながら、この実施例２の連続プロセスを実施する提案された設備設置面積は、設備設置面積の４～５倍の減少をもたらすと推定される。

バッチ精製及び連続精製からの最終生成物を分析した。データは、表７～９に列挙される。

実施例３：ＡＴＢ２００ｒｈＧＡＡの捕捉及び精製のための商業規模プラント
ＡＴＢ２００ｒｈＧＡＡを発現する細胞を大きいバイオリアクター（例えば、５００～２，０００Ｌ）内で培養する。細胞培地を連続して除去し、ろ過し、５～２５Ｌのカラム容積をそれぞれ有する２つのＡＥＸカラムに充填する。ＡＥＸカラムを、図６に示される捕捉カラムとして配置する。バイオリアクター容積対総ＡＥＸカラム容積の比率は、約１００：１～約２０：１の範囲である。ＡＥＸ溶出液をＩＭＡＣカラムに直接充填する。ＩＭＡＣカラム容積は、１～１０Ｌであり、総ＡＥＸカラム容積対ＩＭＡＣカラム容積の比率は、２：１～１０：１である。図１１は、ｒｈＧＡＡを精製する際のＡＥＸカラム及びＩＭＡＣカラムについての例示的な動作シーケンスを表す。

本明細書に記載の実施形態は、本発明の組成物及び方法を例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に全体として一致し、当業者に容易に明らかである様々な改変形態及び変更形態が含まれることが意図される。添付の特許請求の範囲は、実施例に記載された特定の実施形態によって限定されるべきではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。

特許、特許出願、刊行物、製品説明、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号及びプロトコルは、本出願を通して引用され、これらの開示は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

生物製剤を製造する方法であって、
バイオリアクター内において、生物製剤を生成し、且つ任意選択により前記生物製剤を分泌する宿主細胞を培養することと；
培地及び／又は細胞懸濁液を前記バイオリアクターから除去することと；
前記培地及び／又は細胞懸濁液を処理して、前記生物製剤を含有するろ液を分離することと；
前記ろ液を少なくとも２つの捕捉カラムに充填して、前記生物製剤を捕捉することと；
第１の生物学的製剤を前記少なくとも２つの捕捉カラムから溶出することと；
前記第１の生物学的製剤を１つ以上の精製カラムに充填することと；
第２の生物学的製剤を前記１つ以上の精製カラムから溶出することと
を含み、前記バイオリアクターは、バイオリアクター容積を有し、前記少なくとも２つの捕捉カラムは、総捕捉カラム容積を有し、前記バイオリアクター容積対前記総捕捉カラム容積の比率は、約５００：１～約１０：１の範囲である、方法。
前記生物製剤は、組換えタンパク質、ウイルス粒子又は抗体の１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
前記組換えタンパク質は、前記宿主細胞によって生成される分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である、請求項２に記載の方法。
前記組換えタンパク質は、細胞及び細胞器官から前記ろ液中に分離される、請求項３に記載の方法。
前記ろ液は、ろ過又は遠心分離によって分離される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも２つの捕捉カラムは、連続して充填されて、前記少なくとも２つの捕捉カラムへの前記ろ液の連続的な充填を提供する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
前記ろ液は、約０．５～約１００カラム容積（ＣＶ）／時の範囲のろ液充填速度で前記少なくとも２つの捕捉カラムに充填される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
前記ろ液は、前記少なくとも２つの捕捉カラムに充填されて、各捕捉カラムについて４８時間未満の捕捉カラム充填時間を提供する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記生物製剤は、組換えヒトリソソームタンパク質を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つの親和性クロマトグラフィーカラムを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記親和性クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡカラム及びプロテインＺカラムの１つ以上を含む、請求項１１に記載の方法。
前記少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つの固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つのサイズ排除クロマトグラフィーカラムを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも２つの捕捉カラムは、少なくとも２つの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上の精製カラムは、１つ以上のアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムを含む、請求項１～９又は１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上の精製カラムは、１つ以上の親和性クロマトグラフィーカラムを含む、請求項１～１０又は１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記親和性クロマトグラフィーカラムは、プロテインＡカラム及びプロテインＺカラムの１つ以上を含む、請求項１８に記載の方法。
前記１つ以上の精製カラムは、１つ以上のカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムを含む、請求項１～１２又は１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上の精製カラムは、１つ以上の固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを含む、請求項１～１３又は１５若しくは１６のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上の精製カラムは、１つ以上のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを含む、請求項１～１４又は１６のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上の精製カラムは、１つ以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の生物学的製剤は、前記バイオリアクターから前記培地及び／又は細胞懸濁液を除去してから４８時間以内に前記１つ以上の精製カラムから溶出される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上の精製カラムは、総精製カラム容積を有し、及び前記バイオリアクター容積対前記総精製カラム容積の比率は、約５，０００：１～約５０：１の範囲である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
前記総捕捉カラム容積対前記総精製カラム容積の比率は、約２０：１～約１：１の範囲である、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
組換えヒトリソソームタンパク質を製造する方法であって、
バイオリアクター内において、組換えヒトリソソームタンパク質を生成し、且つ任意選択により前記組換えヒトリソソームタンパク質を分泌する宿主細胞を培養することと；
培地及び／又は細胞懸濁液を前記バイオリアクターから除去することと；
前記培地及び／又は細胞懸濁液を処理して、前記リソソームタンパク質を含有するろ液を分離することと；
前記ろ液を少なくとも２つのアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムに充填して、前記リソソームタンパク質を捕捉することと；
前記少なくとも２つのＡＥＸカラムから第１の生物学的製剤を溶出することと；
前記第１の生物学的製剤を１つ以上の固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムに充填することと；
前記１つ以上のＩＭＡＣカラムから第２の生物学的製剤を溶出することと
を含み、前記バイオリアクターは、バイオリアクター容積を有し、前記少なくとも２つのＡＥＸカラムは、総ＡＥＸカラム容積を有し、前記バイオリアクター容積対前記総ＡＥＸカラム容積の比率は、約５００：１～約１０：１の範囲である、方法。
前記リソソームタンパク質は、前記宿主細胞によって生成される分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞内タンパク質である、請求項２７に記載の方法。
前記細胞内タンパク質は、前記細胞を溶解させて細胞溶解物を調製することによって前記ろ液中に分離される、請求項２８に記載の方法。
前記細胞溶解物は、ろ過又は遠心分離によって前記ろ液から分離される、請求項２８又は２９に記載の方法。
前記少なくとも２つのＡＥＸカラムは、連続して充填されて、前記少なくとも２つのＡＥＸカラムへの前記ろ液の連続的な充填を提供する、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。
前記ろ液は、約０．５～約１００カラム容積（ＣＶ）／時の範囲のろ液充填速度で前記少なくとも２つのＡＥＸカラムに充填される、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
前記ろ液は、前記少なくとも２つのＡＥＸカラムに充填されて、各ＡＥＸカラムについて４８時間未満のＡＥＸ充填時間を提供する、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。
各ＡＥＸカラムは、５０Ｌ以下のカラム容積を有する、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の生物学的製剤は、前記バイオリアクターから前記培地及び／又は細胞懸濁液を除去してから４８時間以内に前記１つ以上のＩＭＡＣカラムから溶出される、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
前記１つ以上のＩＭＡＣカラムは、総ＩＭＡＣカラム容積を有し、及び前記バイオリアクター容積対前記総ＩＭＡＣカラム容積の比率は、約５，０００：１～約５０：１の範囲である、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の方法。
前記総ＡＥＸカラム容積対前記総ＩＭＡＣカラム容積の比率は、約２０：１～約１：１の範囲である、請求項２７～３６のいずれか一項に記載の方法。
各ＩＭＡＣカラムは、２０Ｌ以下のカラム容積を有する、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の生物学的製剤を貯蔵することをさらに含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の生物学的製剤は、２４時間～１０５日間の期間にわたって０℃～１０℃の温度で貯蔵される、請求項３９に記載の方法。
前記第２の生物学的製剤は、１時間～３日間の期間にわたって１５℃～３０℃の温度で貯蔵される、請求項４０に記載の方法。
前記第２の生物学的製剤を第３のクロマトグラフィーカラムに充填することと；
前記第３のクロマトグラフィーカラムから第３の生物学的製剤を溶出することと
をさらに含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
前記第３のクロマトグラフィーカラムは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラム、親和性クロマトグラフィーカラム、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムから選択される、請求項４２に記載の方法。
前記ろ液は、交互接線流ろ過（ＡＴＦ）及び接線流ろ過（ＴＦＦ）の１つ以上から前記培地及び／又は細胞懸濁液をろ過することによって分離される、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
前記第１の生物学的製剤、前記第２の生物学的製剤及び前記第３の生物学的製剤の１つ以上においてウイルスを不活性化することをさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の生物学的製剤又は前記第３の生物学的製剤をろ過してろ過生成物を提供し、且つバイアルに前記ろ過生成物を充填することをさらに含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
前記ろ過生成物を凍結乾燥することをさらに含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
前記生物製剤は、組換えヒトα－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）を含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒｈＧＡＡは、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４８に記載の方法。
前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００若しくはＡＴＢ－２００－００１－Ｘ５－１４又はその継代培養物を含む、請求項５０に記載の方法。
（ｉ）前記第１の生物学的製剤、又は前記第２の生物学的製剤、又は前記第３の生物学的製剤の少なくとも９０％は、カチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合するか、又は
（ｉｉ）前記第１の生物学的製剤、又は前記第２の生物学的製剤、又は前記第３の生物学的製剤の少なくとも９０％は、モノ－マンノース－６－リン酸（モノ－Ｍ６Ｐ）又はビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を保有するＮ－グリカンを含有する、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
前記ｒｈＧＡＡは、７つの潜在的なＮ－グルコシル化部位を含み、前記ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも５０％は、第１の部位に２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含み、前記ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも３０％は、第２の部位に１つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含み、前記ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも３０％は、第４の部位に２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含み、及び前記ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも２０％は、第４の部位に１つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、請求項４８～５２のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法によって製造される生物学的製剤。
請求項５４に記載の生物学的製剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
リソソーム蓄積症を処置する方法であって、請求項５５に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
前記リソソーム蓄積症は、ポンペ病であり、及び前記生物学的製剤は、ｒｈＧＡＡである、請求項５６に記載の方法。
前記患者は、前記ｒｈＧＡＡ生成物を含む前記医薬組成物の投与から４時間以内にα－グルコシダーゼの薬理学的シャペロンを共投与される、請求項５７に記載の方法。
前記薬理学的シャペロンは、１－デオキシノジリマイシン及びＮ－ブチル－デオキシノジリマイシンから選択される、請求項５８に記載の方法。
前記薬理学的シャペロンは、前記ｒｈＧＡＡ生成物と共製剤される、請求項５９に記載の方法。