KR20080025373A - 1-데옥시노지리마이신 및 유도체를 이용한 폼페병의 치료방법 - Google Patents

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벤자민 무그라지
게리 리
시아오시앙 주
로버트 보이드
캄레시 쉐스
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아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 α-글루코시다제 효소를 1-데옥시노지리마이신 유도체인 특이적인 약학 샤페론과 접촉시킴으로써, 돌연변이 또는 야생형 α-글루코시다제 효소의 활성을 시험관내 및 생체내에서 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 1-데옥시노지리마이신 유도체인 소형 샤페론 분자 화합물의 투여에 의한 폼페 질환의 치료 방법을 제공한다. 1-데옥시노지리마이신 유도체는 N 또는 Cl 위치에서 치환된다. 대체 α-글루코시다제 유전자 또는 효소의 조합 요법도 제공한다.

Description

1-데옥시노지리마이신 및 유도체를 이용한 폼페병의 치료 방법{A METHOD FOR THE TREATMENT OF POMPE DISEASE USING 1-DEOXYNOJIRIMYCIN AND DERIVATIVES}
관련 출원
본 출원은 미국 가출원 번호 60/682,241(2005. 5. 17. 출원) 및 60/729,329(2005. 10. 21. 출원)를 우선권으로 하며, 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 예를 들어, N-부틸-1-데옥시노지리마이신(NB-DNJ)을 포함하는 1-데옥시노지리마이신(1-DNJ) 및 1-DNJ 유도체를 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함하는, α-글루코시다제 효소 활성을 증대시키는 방법 및 폼페병(Pompe disease) 치료 방법을 제공한다. 이들 화합물은 예기치 못하게 폼페병을 초래하는 효소인 산 α-글루코시다제를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다.
폼페병(Pompe Disease)
폼페병은 리소좀 축적병의 일종이다. 리소좀 축적병은 열성 가수분해효소로 인한 세포내 글리코스핑고리피드, 글리코겐 또는 뮤코다당류의 축적이 원인이 되어 발생하는 상염색체 열성 질환군이다. 리소좀 질환의 예는 고셰병(Gaucher disease)(Beutler et al., The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 8th ed. 2001 Scriver et al., ed. pp. 3635-3668, McGraw-Hill, New York), GM1-갱글리오사이드증(gangliosidosis)(id. at pp 3775-3810), 푸코시드축적증(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 1995. Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. and Valle, D., ed pp. 2529-2561, McGraw-Hill, New York), 뮤코다당질축적증(id. at pp 3421-3452), 폼페병(id. at pp. 3389-3420), 헐러-샤이에 증후군(Hurler-Scheie disease)(Weismann et al., Science. 1970; 169, 72-74), 니이만-픽(Niemann-Pick) A 및 B 질환(The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease 8th ed. 2001. Scriver et al. Ed., pp 3589-3610, McGraw-Hill, New York), 및 파브리병(Id. at pp. 3733-3774)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
폼페병은 산 α-글루코시다제(Gaa) 효소 결핍으로 인해 발생한다. Gaa는 에너지로 사용되는 당의 저장 형태인 글리코겐을 글루코스로 대사시킨다. 글리코겐의 축적은, 다양한 신체 조직, 특히 심장, 골격근, 간 및 신경계에 영향을 미치는 신체 전반에 걸친 진행성 근육병증을 초래하는 것으로 생각되고 있다. 신경질환 및 뇌졸중 국립연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)에 따르면, 폼페병은 약 1/40,000의 비율로 발병하는 것으로 추산된다.
폼페병은 유아기, 소아기, 및 성인기 발병의 세가지 형태로 존재한다. 유아기 발병이 가장 치명적이며, 근육긴장 약화, 허약, 간과 심장의 비대, 및 심근병증 을 포함하는 증상을 동반한다. 연하 곤란을 가져올 수 있고, 혀가 돌출되어 비대해질 수 있다. 대부분의 유아는 2살이 되기 전에 호흡기 또는 심장 합병증으로 사망한다. 소아기 발병 폼페병은 유년 초기 내지 말기에 처음으로 발병하며 동맥, 횡경막 및 하지 호흡근의 진행성 약화와 운동불내성을 동반한다. 대부분의 소아기 발병 폼페병 환자들은 20세 또는 30세를 넘기지 못한다. 성인기 발병 폼페병의 증상은 전신 근육 약화와 동맥, 하지 및 횡경막 호흡근의 소모를 포함한다. 일부 성인 환자는 주증상이나 운동제한이 없을 수 있다.
현재의 치료법
폼페병의 현 치료법은 심장 및 호흡기 증상의 치료를 포함한다. 잠재적인 유전적 결함에 대한 치료는 개선되어 있지 않다. 최근에, Gaa(Myozyme; Genzyme, Inc.) 효소 대체요법이 미국 F.D.A. 승인을 받았다. 그러나, 영아 폼페병 환자의 결손 Gaa를 대체하는 효소 대체요법을 이용한 임상적 평가에서는, 심장 및 골격 기능만을 중등도로 개선시켰다(Klinge et al., Neuropediatrics. 2005; 36(1): 6-11). 재조합 효소는 결합조직을 관통할 수 없기 때문에, 재조합 Gaa는 골격근병증 보다 심근병증을 해소하는데 더 효과적인 것으로 나타났다(Raben et al., MoI Ther. 2005; 11(1): 48-56). 재조합 Gaa를 이용하여 폼페병을 치료하는 방법이 미국 특허 6,537,785(Canfield)에 상세히 기재되어 있다.
효소 대체요법(ERT)의 주관건 중 하나는 주입된 효소의 급속한 분해에 대해 효소의 치료적 유효량을 달성하고 유지하는 것이다. 결과적으로, ERT는 다수의 고용량 주입을 필요로 하여, 비용과 시간에 있어서 비경제적이다. ERT 치료에는, 글 리코실화 천연 단백질은 얻지만, 적절히 접힌 단백질의 대규모 생성, 정제 및 저장의 어려움, 항-단백질 면역 반응의 생성, 및 단백질이 중추신경계 관련 질환에 영향을 미치기에 충분한 양으로 뇌혈관장벽을 통과하지 못하는 것과 같은 여러 가지 추가적인 문제점이 내재되어 있다. 또한, 재조합 효소는 신장과 같은 장기를 둘러싼 장벽을 관통하지 못하고, 결합 조직에 침투하지 못하기 때문에, 다수의 감염된 세포의 기능을 회복시키는데 효과적이지 못하다.
또한, 기능성 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 또는 기능성 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 인간 세포를 이용한 유전자 치료법이, 단백질 대체요법이 유익한 단백질 결손 및 다른 질환을 치료하는데 사용되고 있다. 이러한 접근법은 장래성이 있지만, 벡터의 분화 세포로 감염 또는 도입 불능, 표적 유전자의 낮은 발현, 및 유전자 송달 직후의 발현 조절(예컨대, 대부분의 바이러스 벡터는 세포가 효능을 위해 분화될 것을 요함)과 같은 기술적 어려움으로 한계가 있다.
효소 결핍을 치료하기 위한 비교적 최근의 제3의 접근법은 결핍 효소 단백질의 천연 기질을 감소시켜 관찰된 병리를 경감시키는 소분자 저해제의 사용을 포함한다. 이러한 "기질 제한(substrate deprivation)" 접근법은 당지질 축적을 포함하는 일부 리소좀 축적병의 치료법으로서 구체적으로 개시되어 있다(미국 특허 5,798,366, 6,291,657, 및 6,660,749 참조). 치료를 위해 사용되도록 제안된 소분자 저해제는, N-알킬-데옥시노지리마이신(N-알킬-DNJ) 유도체를 포함하며, 당지질 합성과 관련된 효소를 억제하여 결핍 효소에 의해 파괴될 필요가 있는 세포성 당지 질의 양을 감소시키는데 특효가 있는 것으로 보고되고 있다. 그러나, 이러한 접근법은, 당지질이 생물학적 기능에 필수적이어야 한다는 점에서 한계가 있고, 과도한 기질 제한(deprivation)은 부작용을 초래할 수 있다. 특히, 당지질은 뇌를 통하여 한 뉴런의 갱글리오사이드로부터 다른 뉴런의 갱글리오사이드로 신호를 전달하는데 사용된다. 당지질이 너무 적거나 너무 많을 경우, 신호를 전달하는 뉴런의 능력이 저해된다.
제4의 접근법으로서 특이적인 샤페론 전략은 추측건데 소포체(ER) 또는 다른 세포성 단백질 분해/처리 시스템에서의 분해로부터 돌연변이 단백질을 구제하는 것이다. 잘못 접힌 리소좀 효소를 포함하는 내인성 효소 단백질이 ER 품질 관리 장치(ER quality control machinery)에 의해 분해되는 것을 방지하는 치료 전략이 종래의 특허 및 공보에 개시되어 있다. 특정 구현예에서, 이 전략은 특정 리소좀 질환과 관련된 결핍 리소좀 효소에 특이적으로 결합하는 소분자 약리학적 샤페론을 이용한 것이다. 치료하지 않을 경우, 돌연변이 효소 단백질은 ER 내에서 불안정하고(Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815), 최종 산물로의 성장이 지연되며, 그 결과 ER 내에서 분해된다. 샤페론 전략은 ER 품질 관리 시스템에 의한 부당하거나 비정상적인 분해를 방지하기 위하여, 단백질 접힘을 촉진하고 돌연변이 단백질의 안정성을 개선시키는 화합물의 사용을 포함한다. 이러한 특이적 샤페론은 활성 부위-특이적 샤페론으로 고안되거나 특정 약리학적 샤페론으로 나타난다.
이러한 전략의 이면에 있는 원천 이론은 다음과 같다: 돌연변이 효소 단백질 은 ER에서 부적절하게 접히기 때문에(Ishii et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 1996; 220: 812-815), 효소 단백질은 정상적인 수송 경로(ER → 골지체 → 엔도좀 → 리소좀)가 지연되고 급속히 분해된다. 따라서, 돌연변이 단백질의 정상적인 접힘을 촉진하는 화합물이, 돌연변이 단백질에 대한 활성 부위-특이적 샤페론으로서의 역할을 수행하여 ER 품질 관리 시스템으로부터의 유연한 이탈을 촉진할 것이다. 일부 효소 저해제가 촉매중심을 점유하여 시험관내 효소 형태의 안정화를 도모하는 것으로 알려져 있다.
리소좀 축적병과 관련된 다수의 효소에 대해 특이적 약리학적 샤페론 전략이 미국 특허 번호 6,274,597, 6,583,158, 6,589,964, 6,599,919, 및 6,916,829(Fan et al.)에서 입증되었으며, 이 문헌들은 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 갈락토스의 소분자 유도체인 1-데옥시갈락토노지리마이신(DGJ)이, 돌연변이 파브리(Fabry) 효소 α-갈락토시다아제 A(α-Gal A; Gla)의 강력한 경쟁적 저해제로서, 중성 pH에서 인산 돌연변이 α-Gal A(R301Q)의 시험관내 안정성을 효과적으로 증진시키며, R301Q 또는 Q279E 돌연변이를 가진 파브리병 환자로부터 확인된 림프모구에서의 돌연변이 효소 활성을 강화시킨다. 또한, 돌연변이(R301Q) α-Gal A를 과발현하는 형질전환 마우스에 DGJ를 경구 투여할 경우, 주요 장기에서 효소 활성이 실질적으로 증가하였다(Fan et al., Nature Med. 1999; 5: 112-115). 미국 특허 번호 6,916,829에 기재된 이미노당(iminosugar), 이소파고민(IFG) 및 그의 유도체와 글루코세레브로시다아제에 특이적인 다른 화합물(2004. 11. 12. 출원되어 계류중인 미국 특허 출원 번호 10/988,428 및 10/988,427에 기재됨)을 이용하여, 고셰병(Gaucher) 환자 세포로부터 글루코세레브로시다아제(산 β-글루코시다제, Gba)를 구제하는 유사한 방법이 개시되어 있다. 전술된 미국 특허 6,583,158에, 1-데옥시노지리마이신(DNJ), α-호모노지리마이신, 및 카스타노스퍼민(castanospermine)을 포함하는, 폼페병 치료를 위해 Gaa를 구제하는 작용을 하는 것으로 기대되는 몇몇 소분자 화합물이 개시되어 있다.
본 발명은, 돌연변이 Gaa에 대해 효과적인 특정 약리학적 샤페론으로 확인된, N-부틸 DNJ와 같은 DNJ 유도체를 이용하여 얻어지는 예상치 못한 결과에 기초한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 1-데옥시노지리마이신(1) 또는 N-부틸 DNJ(5)와 같은 데옥시노지리마이신(DNJ) 유도체를 효소와 접촉하여, 세포내 α-글루코시다제(Gaa) 효소의 적절한 형태를 유도하거나 안정화시키는 방법을 제공한다. 바람직하게는, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성의 비율은 최대 Gaa 활성을 제공하는 DNJ 유도체 농도에서 적어도 1.5-배이다. 다른 구현예에서, Gaa 활성 증가율은 적어도 5-배이다.
한 구현예에서, DNJ 유도체는 하기 구조식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
Figure 112007090581802-PCT00001
상기 식에서,
R1은 H, 또는 1 - 12개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알콕시알킬 또는 아미노알킬, 또는 5 - 12개의 원환을 포함하는 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 알킬이고, 여기서 R1은 하나 이상의 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C(=O)N-(알킬)2로 선택적으로 치환되며;
R2는 H, 또는 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알킬아릴, 또는 알콕시알킬, 또는 5 - 12개의 탄소원자를 포함하는 아릴이고, 여기서 R2는 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3 또는 헤테로사이클환으로 선택적으로 치환되며;
R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
바람직하게는, DNJ 유도체가 1-데옥시노지리마이신 또는 α-호모노지리마이신이 아닌 경우, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성 비율은 세포내 최대 Gaa 활성을 제공하는 DNJ 유도체 농도에서 적어도 1.5-배이다.
다른 구현예에서, DNJ 유도체는 다음 구조식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
Figure 112007090581802-PCT00002
상기 식에서,
R1은 H, 또는 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C(=O)N-(알킬)2로 선택적으로 치환된, 1 - 12개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알콕시알킬 또는 아미노알킬이고;
R2는 H, 또는 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 또는 알콕시알킬이고;
R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
바람직하게는, DNJ 유도체가 1-데옥시노지리마이신 또는 α-호모노지리마이신이 아닌 경우, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성의 비율은 세포내 최대 Gaa 활성을 제공하는 DNJ 유도체 농도에서 적어도 1.5-배이다.
세포내 최대 Gaa 활성은 실시예에 기재된 시험관내 또는 세포내 방법으로 측정될 수 있으며, 임의의 DNJ 유도체에 대해, 임의의 예시된 분석법이 사용되어 이러한 활성 비율을 보여줄 수 있다.
특정 구현예에서, R1은 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3, 또는 -C(=O)N-(Me)2로 선택적으로 치환된, 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 또는 알콕시알킬이고; R2는 H이다. 다른 구현예에서, R1은 n-메틸, n-에틸, n-부틸, n-사이클로프로필 메틸, 또는 n-노닐이다. 또 다른 구현예에서, R1은 -OH, -COOH, CF3, OCF3, 또는 -C(O)N-(Me)2로 치환된 n-에틸 또는 n-부틸이다.
한 구현예에서, R1은
Figure 112007090581802-PCT00003
이다.
다른 구현예에서, R1은 H이고 R2는 -CF3 또는 헤테로사이클로 선택적으로 치환된, 에테르, 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐, 또는 아릴이다.
한 구현예에서, R2는 n-노닐기이다.
추가적 구현예에서, 화합물은 N-메틸-DNJ, N-부틸-DNJ, N-사이클로프로필메틸-DNJ, N-(2-(N,N-디메틸아미도)에틸옥시-DNJ, N-4-t-부틸옥시카르보닐-피페리디닐메틸-DNJ, N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ, N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ, N-(2-(2,2,2-트리플루오로에톡시)에틸-DNJ, N-2-메톡시에틸-DNJ, N-2-에톡시에틸-DNJ, N-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ, N-알파-시아노-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ, N-4-트리플루오로메톡시벤질-DNJ, N-4-n-펜톡시벤질-DNJ, 및 N-4-n-부톡시벤질-DNJ, 또는 Cl-노닐 DNJ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 화합물은 장내 Gaa를 저해하는 IC50 농도 또는 그 미만에서 리소좀 Gaa 활성을 증가시킨다.
한 구현예에서, Gaa 효소는 돌연변이 α-글루코시다제이다. 특정 구현예에서, 상기 돌연변이 α-글루코시다제는 D645E; D645H; R224W; S619R; R660H; T1064C; C2104T; D645N; L901Q; G219R; E262K; M408V; G309R; D645N; G448S; R672W; R672Q; P545L; C647W; G643R; M318T; E521K; W481R; L552P, G549R; R854X; V816I; 및 T927I 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, Gaa는 정제 또는 재조합 기능성 Gaa이다.
추가적 구현예에서, 접촉은 생체내 또는 시험관내에서 일어난다.
본 발명은 또한 N-부틸 DNJ와 같은 데옥시노지리마이신 유도체를 유효량으로 투여하여 폼페병을 치료하는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, DNJ 유도체는 하기 구조식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
Figure 112007090581802-PCT00004
상기 식에서,
R1은 H, 또는 1 - 12개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알콕시알킬 또는 아미노알킬, 또는 5 - 12개의 원환을 포함하는 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 알킬이고, 여기서 R1은 하나 이상의 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C(=O)N-(알킬)2로 선택적으로 치환되며;
R2는 H, 또는 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 또는 알콕시알킬, 또는 5 - 12개의 탄소원자를 포함하는 아릴이고, 여기서 R2는 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3 또는 헤테로사이클환으로 선택적으로 치환되며;
R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
바람직하게는, DNJ 유도체가 1-데옥시노지리마이신 또는 α-호모노지리마이신이 아닌 경우, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성 비율은 세포내 최대 Gaa 활성을 제공하는 DNJ 유도체 농도에서 적어도 1.5-배이다.
다른 구현예에서, DNJ 유도체는 다음 구조식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:
Figure 112007090581802-PCT00005
상기 식에서,
R1은 H, 또는 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C(=O)N-(알킬)2로 선택적으로 치환된, 1 - 12개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알콕시알킬 또는 아미노알킬이고;
R2는 H, 또는 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 또는 알콕시알킬이고;
R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
바람직하게는, DNJ 유도체가 1-데옥시노지리마이신 또는 α-호모노지리마이신이 아닌 경우, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성의 비율은 세포내 최대 Gaa 활성을 제공하는 DNJ 유도체 농도에서 적어도 1.5-배이다.
한 구현예에서, R1은 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3, 또는 -C(=O)N-(Me)2로 선택적으로 치환된, 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 또는 알콕시알킬이고; R2는 H이다. 특정 구현예에서, R1은 n-메틸, n-에틸, n-부틸, n-사이클로프로필 메틸, 또는 n-노닐이다. 다른 구현예에서, R1은 -OH, -COOH, CF3, OCF3, 또는 -C(O)N-(Me)2로 치환된 n-에틸 또는 n-부틸이다. 또 다른 구현예에서, R1은
Figure 112007090581802-PCT00006
이다.
다른 구현예에서, R1은 H이고 R2는 -CF3 또는 헤테로사이클로 선택적으로 치환된, 에테르, 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐, 또는 아릴이다. 또 다른 구현예에서, R2는 n-노닐기이다.
특정 구현예에서, 화합물은 N-메틸-DNJ, N-부틸-DNJ, N-사이클로프로필메틸-DNJ, N-(2-(N,N-디메틸아미도)에틸옥시-DNJ, N-4-t-부틸옥시카르보닐-피페리디닐메틸-DNJ, N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ, N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ, N-(2-(2,2,2-트리플루오로에톡시)에틸-DNJ, N-2-메톡시에틸-DNJ, N-2-에톡시에틸-DNJ, N-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ, N-알파-시아노-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ, N-4-트리플루오로메톡시벤질-DNJ, N-4-n-펜톡시벤질-DNJ, 및 N-4-n-부톡시벤질-DNJ, 또는 Cl-노닐 DNJ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 화합물은 장관 Gaa를 억제하는 IC50 농도 또는 그 미만에서 리소좀 Gaa 활성을 증가시킨다.
다른 구현예에서, 1-데옥시노지리마이신 유도체의 유효량은 1일당 약 1 mg 내지 300 mg이다. 대안적 구현예에서, 유효량은 1일당 약 5 mg 내지 150 mg이다. 다른 구현예에서, 유효량은 1일당 약 5 내지 75 mg이다.
한 구현예에서, 데옥시노지리마이신 유도체는 정제 또는 캡슐과 같은 경구투여 제형으로 투여된다.
다른 구현예에서, 데옥시노지리마이신 유도체는 Gaa 대체 효소와 조합하여 투여된다.
이 구현예에서, 데옥시노지리마이신 유도체 및 Gaa 대체 효소는 별개의 제형 또는 단일 제형으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 데옥시노지리마이신 유도체는 경구 투여 제형으로 투여되고, Gaa 대체 효소는 비경구 투여 제형으로 투여된다.
대안적 구현예에서, 데옥시노지리마이신 유도체는 유전자 치료법과 조합하여 투여된다.
한 구현예에서, 상기 치료법은 폼페병 병리를 경감시킨다.
특정 구현예에서, 폼페병 병리는 다음 중 적어도 하나를 특징으로 한다: 골격 조직 활성의 감소; 심근병증; 심장비대; 진행성 근육 약화; 근긴장저하; 대설증(macroglossia); 연하, 흡인 및/또는 섭취 곤란; 호흡부전; 간비대; 안면근의 이완; 무반사; 운동불내성; 운동성 호흡곤란; 기좌호흡(orthopnea); 수면 무호흡; 오전 두통; 기면; 척추전만증 및/또는 척추측만증; 깊은 힘줄 반사(deep tendon reflex) 감소; 하부요통; 및 운동발달 이정표에 부적격.
본 발명은 또한 유효량의 데옥시노지리마이신 유도체를 투여하여 폼페병 증상을 완화 또는 감소시키는 방법을 제공한다.
한 구현예에서, 상기 증상은 다음 중 적어도 하나이다: 골격 조직 활성의 감소; 심근병증; 심장비대; 진행성 근육 약화; 근긴장저하; 대설증(macroglossia); 연하, 흡인 및/또는 섭취 곤란; 호흡부전; 간비대; 안면근의 이완; 무반사; 운동불내성; 운동성 호흡곤란; 기좌호흡(orthopnea); 수면 무호흡; 오전 두통; 기면; 척추전만증 및/또는 척추측만증; 깊은 힘줄 반사(deep tendon reflex) 감소; 하부요통; 및 운동발달 이정표에 부적격.
다른 구현예에서, 데옥시노지리마이신 유도체는 α-글루코시다제 대체 단백질 또는 유전자와 조합하여 투여된다.
본 발명은 DNJ 유도체, 상기 DNJ 유도체를 포함하는 조성물, 및 상기 DNJ 유도체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 포함한다. DNJ 유도체는 전술한 구조식을 가지며, 단 DNJ 유도체는 1-데옥시노지리마이신 또는 α- 호모노지리마이신이 아니다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 특이적 약리학적 샤페론으로서, 소분자 이미노당 DNJ 및 환 질소 또는 질소에 인접한 환 탄소에서 치환체를 가진 DNJ의 유도체를 이용한 돌연변이 Gaa의 구제 방법 및 폼페병의 치료방법을 제공한다. 이러한 분자는 불안정한 Gaa 변이 단백질에 결합하여 이 단백질이 안정한 분자 형태로 접혀질 수 있도록 유도할 수 있다. 그 결과, Gaa가 리소좀으로 진전하거나 트래픽킹하고 글리코겐에 대한 가수분해 활성을 가져서 이러한 질병과 연관된 근육 조직에서의 병리적 축척을 감소시킨다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 명세서의 문맥 내에서, 그리고 각 용어가 사용된 특정 문맥에서, 당해 분야에서 통용되는 통상의 의미를 가진다. 특정 용어는 아래에서 논의되거나, 본 발명의 구성 및 방법과 이를 어떻게 제조하고 사용하는 지를 설명할 때 실무자에게 추가적인 가이드를 주기 위하여 본 명세서 모든 곳에서 논의된다.
"폼페병"은 산 말타아제 결핍, 글리코겐 저장 질병 타입 II(GSDII), 및 글리코겐증 타입 II이라고 일컬어지기도 하는, 글리코겐을 대사하는 Gaa 유전자에서의 돌연변이로 특징지워지는 유전적 리소좀 저장 장애이다. 본 명세서에서 사용된 이러한 용어는 영아기, 소아기 및 성인기-발현형 질병을 포함한다.
"산 α-글루코시다제(Gaa)"는 글리코겐, 말토오스, 및 이소말토오스에 존재하는 알파-1,4- 및 알파-1,6-연결-D-글루코스 중합체를 가수분해하는 리소좀 효소이다. 또 다른 이름은 다음과 같다: 글루코아밀라아제; 1,4-α-D-글루칸 글루코하이드로라아제; 아밀로글루코시다제; 감마-아밀라아제; 및 엑소-l,4-α-글루코시다제, 및 감마-아밀라아제. 인간 Gaa 유전자는 염색체 17q25.2- 25.3에 맵핑되고 진뱅크 등록 번호 Y00839(각각 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2으로 나타남)으로 표시되는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 가진다. 70개 이상의 돌연변이가 폼페병과 연관되어 있다. Gaa 효소가 잘못접힘 또는 잘못가공된 돌연변이는 T1064C(35번 위치에 Leu이 Pro으로 치환) 및 C2104T(702 번 위치의 Arg이 Cys로 치환)을 포함한다(Montalvo et al, MoI Genet Metab. 2004; 81(3): 203-8). 또한, Hermans 등은(Human Mutation 2004; 23: 47-56) 이 효소의 성숙화 및 가공에 영향을 미치는 Gaa 돌연변이의 목록을 설명하였다. 이러한 돌연변이는 Leu405Pro 및 Met519Thr을 포함한다. 본 발명의 방법은 ER에서 α-글루코시다제의 불안정한 접힘을 초래하는 돌연변이에 유용할 것으로 예상된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "약리학적 샤페론," 또는 때때로 "특이적 약리학적 샤페론"("SPC")은 Gaa에 특이적으로 결합하는 분자를 말하고 한가지 이상의 다음의 효과를 가진다: (i) 단백질의 안정적인 분자 형태의 형성을 향상시키고; (ii) ER로부터 또다른 세포 위치, 바람직하게는 천연 세포 위치로 단백질의 적당한 트래피킹을 향상시켜서 단백질의 ER-연관 분해를 방지하며; (iii) 형태적으로 불안정한, 즉 잘못접힌 단백질의 응집을 방지하고; (iv) 적어도 부분적으로 단백질의 야생형 기능, 안정성, 및/또는 활성을 회복시키고/회복시키거나 향상시키며; (v) 세포 정박 Gaa의 표현형 또는 기능을 향상시킨다. 따라서, Gaa에 대한 약리학적 샤페론은 Gaa에 결합하여 Gaa의 적당한 접힘, 트래피킹(trafficking), 무응집 및 활성을 가지도록 Gaa에 결합하는 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 이러한 용어는 내인성 샤페론, 예를 들어 BiP을 말하는 것이 아니고, 또한 글리세롤, DMSO 또는 중수소화 물, 즉 화학적 샤페론과 같은, 다양한 단백질에 대한 비특이적 샤페론 활성을 증명하는 비특이적 제제를 말하는 것도 아니다(Welch et al, Cell Stress and chaperone 1996; l(2):109-l 15; Welch et al., Journal of Bioenergetics and Biomembranes 1997; 29(5):491-502; 미국 특허 번호 5,900,360; 미국 특허 번호 6,270,954; 및 미국 특허 번호 6,541,195 참조). 이 용어는 특이적 결합 분자, 즉, 활성 부위-특이적 샤페론 (ASSCs)를 포함하고, 이 분자는 효소, 저해제 또는 길항제 및 작용제의 활성부위에 결합한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적으로 결합"은 Gaa와 약리학적 샤페론의 상호작용, 특이적으로, 약리학적 샤페론과 접촉하는데 직접 참여하는 Gaa 아미노산 잔기와의 상호작용을 말한다. 약리학적 샤페론은 표적 단백질, 즉 Gaa에 특이적으로 결합하여 Gaa상에 샤페론 효과를 나타내지만 연관 또는 무관 단백질의 일반 그룹에는 영향을 미치지 않는다. 소정의 약리학적 샤페론과 상호작용하는 Gaa 아미노산 잔기는 단백질의 "활성부위내"이거나 아닐 수 있다. 후술하는 바와 같이, 아미노산 잔기 512-520번에서 보존된 헥사펩타이드 WiDMNE는 Gaa 단백질의 활성에서 요구된다(참고 서열로서 SEQ ID NO: 2을 사용함). 추가로, Trp516 및 Asp518이 Gaa의 촉매적 활성을 위해 필요하다(Hermans et al., J Biol. Chem. 1991; 266: 13507-12). 특이적 결합은 전형적인 결합 검정법 또는 구조적 연구, 즉 동시-결정화, NMR 등을 통하여 평가될 수 있다.
한 비제한적 구체예에서, 약리학적 샤페론은 Gaa의 저해제 또는 길항제이다. 또 다른 비제한적 구체예에서, 약리학적 샤페론은 Gaa의 작용제이다. 또 다른 구체예에서, 약리학적 샤페론은 혼합된 작용제/길항제이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "길항제"는 단백질에 결합하여 부분적으로 또는 완전하게 Gaa의 활성을 차단, 저해, 감소, 또는 중화시키는 분자를 말한다. 용어 "작용제"는 단백질에 결합하여 Gaa의 활성을 적어도 부분적으로 증가, 향상, 회복 또는 모방하는 분자를 말한다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 이러한 분자가 Gaa로 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Gaa 형태적 안정성을 향상시킨다" 또는 "Gaa 형태적 안정성을 증가시킨다"는 Gaa에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하지 않는 세포(바람직하게는 동일한 세포형 또는 동일한 세포, 예를 들어 초기에)에서의 Gaa의 양 또는 비율과 비교해 볼때, Gaa에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하는 세포에서의 기능적인 형태를 채택하는 Gaa의 양 또는 비율을 증가시키는 것을 말한다. 한 구현예에서, 세포는 형태적인 돌연변이 Gaa를 발현하지 않는다. 다른 구현예에서, 세포는 폴리펩타이드 즉, 형태적 돌연변이 Gaa를 코딩하는 돌연변이 Gaa 폴리뉴클레오타이드를 발현한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "트래피킹(trafficking)을 향상시킨다" 또는 "Gaa 트래피킹을 증가시킨다"는 Gaa에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하지 않는 세포(바람직하게는 동일한 세포형 또는 동일한 세포, 즉 초기에)에서의 Gaa의 수송 효율과 비교하여, Gaa에 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하는 세포에서의 리소좀으로 Gaa를 수송하는 효율을 증가시키는 것을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Gaa 활성을 향상시키다" 또는 "Gaa 활성을 증가시키다"는 Gaa에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하지 않는 세포(바람직하게는 동일한 세포형 또는 동일한 세포, 예를 들어 초기에)에서의 Gaa의 활성과 비교해 볼 때, Gaa에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하는 세포에서의 Gaa의 활성을 증가시키는 것을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Gaa 수준을 향상시키다" 또는 "Gaa 수준을 증가시키다"는 Gaa에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하지 않는 세포(바람직하게는 동일한 세포형 또는 동일한 세포, 예를 들어 초기에)에서의 Gaa의 수준과 비교해 볼 때, Gaa에 대하여 특이적인 약리학적 샤페론과 접촉하는 세포에서의 Gaa의 수준을 증가시키는 것을 말한다.
용어 "적당한 형태를 안정화시키다"는 야생형 Gaa 단백질의 형태와 기능적으로 동일한 변이된 Gaa 단백질의 형태를 유도하거나 안정화시키는 Gaa 약리학적 샤페론의 능력을 말한다. 용어 "기능적으로 동일한"은 형태(거의 모든 단백질이 생리학적인 상태의 어떤 형태적인 탄력성을 보임)에서의 미세한 변이인 경우에, 형태적인 탄력성이 (1) 단백질 응집, (2) ER-연관성 분해 경로을 통한 제거, (3) 단백질 기능의 손상, 예를 들어 Gaa 활성의 손상, 및/또는 (4) 세포내에 부적당한 수송, 예를 들어, 야생형 단백질의 정도보다 많게 또는 적게 리소좀으로 이동하지 않게 되는 것이다.
용어 "안정한 분자 형태"는 약리학적 샤페론에 의해 유도되는 단백질, 즉, Gaa의 형태로서, 세포내에서 적어도 부분적인 야생형 기능을 제공하는 것을 말한다. 예를 들어, 돌연변이 Gaa의 안정적인 분자 형태는 잘못접히고 분해되는 것 대신에 Gaa가 ER로부터 탈출하고 야생형 Gaa에 대하여 리소좀으로 트래피킹하는 것일 것이다. 또한, 변이된 Gaa의 안정적인 분자 형태는 완전하거나 부분적인 Gaa 활성, 예를 들어, 글리코겐, 말토오스, 및 이소말토오스에서의 α-1,4 및 α-1,6 연결 가수분해활성을 가질 수 있다. 그러나, 안정적인 분자 형태가 야생형 단백질의 모든 기능적인 속성을 가질 필요는 없다.
용어 "야생형 활성"은 세포내 Gaa의 정상적인 생리학적인 기능을 말한다. 예를 들어, Gaa 활성은 접힘 및 ER에서 리소좀으로의 트래피킹을 포함하고, 글리코겐, 말토오스, 및 이소말토오스에서 α-1,4- 및 α-1,6-연결된-D-글루코스 중합체를 가수분해시키는 수반 능력을 가진다.
용어 "야생형 Gaa"는 Gaa를 코딩하는 뉴클레오타이드(SEQ ID NO. 1) 서열 및 전술한 뉴클레오타이드 서열(인간 Gaa 진뱅크 등록 번호 Y00839)로 코딩된 폴리펩타이드(SEQ ID NO: 2) 서열 및 폴리펩타이드(전술한 폴리펩타이드 서열로서 동일한 기능적인 특성 및 결합 친화도를 가짐)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, ER에서 기능적인 형태를 이루고, 세포내에서 적당한 위치설정을 가지며, 야생형 활성(예를 들어 글리코겐의 가수분해)을 보여주는 능력을 가진, 정상적인 개인에서의 대립유전자 변이를 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "돌연변이 α-글루코시다제" 또는 "돌연변이 Gaa"는 변경된 α-글루코시다제 아미노산 서열이 되는 유전적 돌연변이를 함유하는, 유전자로부터 번역된 α-글루코시다제 폴리펩타이드를 말한다. 한 구현예에서, 돌연변이는 야생형 α-글루코시다제와 비교해 볼 때, ER에서 정상적으로 존재하는 조건하에서 천연의 형태를 가지지 않는 α-글루코시다제 단백질을 말하거나, 야생형 α-글루코시다제와 비교해 볼때 감소된 안정성 또는 활성을 보여주는 것을 말한다. 이러한 유형의 돌연변이는 "형태적 돌연변이"라고 말하고, 이러한 돌연변이를 가진 단백질은 "형태적 돌연변이"라고 말한다. 이러한 형태를 달성하지 못한 경우에 분해되거나 응집된 α-글루코시다제 단백질이 되어, 세포내에서 천연적 위치 또는 세포외 환경으로의 단백질 수송 시스템에서 정상 경로를 통하여 수송되지 않는다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 단백질의 덜 효과적인 발현, 예를 들어, 전사 효율, 스프라이싱 효율, mRNA 안정성 등에 영향을 미치는 돌연변이를 가지게 되는 α-글루코시다제를 코딩하는 유전자의 비코딩 부분에서 발생한다. 야생형뿐만 아니라 α-글루코시다제의 형태적 돌연변이 변이체의 발현수준을 향상시켜서, α-글루코시다제 약리학적 샤페론의 투여가 비효율적인 단백질 발현으로 인한 결함을 개선시킬 수 있다. 또한, ER에 축척될 수 있는 스프라이싱 돌연변이 또는 비센스 돌연변이로 인하여, 변이체에 결합하고 ER에 존재하도록 도와주는 샤페론의 능력이, 리소좀 하이드로라아제 활성의 회복 없이도, 폼페병 환자에서 일부 세포의 병리를 완화하여 증상을 향상시키기에 충분할 수 있다.
Gaa의 예시적 형태적 돌연변이는 다음을 포함한다: D645E(Lin et al., Zhonghua Min Guo Xiao Er Ke Yi Xue Hui Za ZhL 1996;37(2): 115-21); D645H(Lin et al, Biochem Biophys Res Commun. 1995 17;208(2):886-93); R224W, S619R, 및 R660H(New et al. Pediatr Neurol. 2003;29(4):284-7); T1064C 및 C2104T(Montalvo et al., MoI Genet Metab. 2004;81(3):203-8); D645N 및 L901Q(Kroos et al., Neuromuscul Disord. 2004;14(6):371-4); G219R, E262K, M408V(Fernandez-Hojas et al, Neuromuscul Disord. 2002; 12(2): 159-66); G309R(Kroos et al, Clin Genet. 1998;53(5):379-82); D645N, G448S, R672W, 및 R672Q(Huie et al, Biochem Biophys Res Commun. 1998; 27;244(3):921-7); P545L(Hermans et al. Hum MoI Genet. 1994;3(12):2213-8); C647W(Huie et al, Huie et al. Hum MoI Genet. 1994;3(7):1081-7); G643R(Hermans et al, Hum Mutat. 1993;2(4):268-73); M318T(Zhong et al, Am J Hum Genet. 1991;49(3):635-45); E521K(Hermans et al., Biochem Biophys Res Commun. 1991;179(2):919-26); W481R(Raben et al., Hum Mutat. 1999;13(l):83-4); 및 L552P 및 G549R(공개되지 않은 데이타).
스프라이싱 돌연변이는 IVS1AS, T>G, -13 및 IVS8+1 G>A를 포함한다.
추가적인 Gaa 돌연변이가 확인되어 당해 분야에서 공지되어 있다. 형태적 돌연변이는 당해 분야의 통상적인 당업자에 의하여 쉽게 확인될 수 있다.
따라서, 접힘이 손상된 돌연변이 및 Gaa의 트래피킹은 당해 분야에서 공지된 전형적인 검정법, 예를 들어 단백질이 골지체에 들어갔는지를 판단하기 위하여 글리코시다아제와 함께 또는 글리코시다아제 없이, 펄스-추적 대사 표지법 또는 세포내 Gaa 위치설정에 대한 형광 면역염색에 의하여 결정될 수 있다. 야생형 Gaa는 성숙된 Gaa의 76 kD 및 중간체 95 kD으로 변환되는 110 kD 전구체로 배출된다.
이와 같은 기능성은 상기 단백질의 기능성을 입증하는 것으로 공지된 방법에 의하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 4-α 메틸엄벨리페릴(methylumbelliferyl)-D-글루코피라노사이드와 같은 형광 기질을 사용하는 검정법이 Gaa 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 검정법은 당해 분야에서 공지되어 있다(예를 들어, 상기 Hermans et al.참조).
특정 시험이 생체내 실질적인 활성에 상응하거나 상응하지 않는 단백질의 속성을 평가할 수 있지만, 이 시험은 단백질 기능성의 적당한 대리물일 뿐이고 이러한 시험에서의 야생형 동태가 본 발명의 단백질 접힘 구제 또는 향상 기술을 뒷받침하는 증거를 보여준다. 본 발명에 따른 이와 같은 활성은 ER로부터 리소좀까지 기능적인 Gaa의 수송에 적당하다.
시험관내, 예컨대, 제형에서, 샤페론 화합물은 야생형 또는 돌연변이 단백질이 본래의 또는 적절한 형태로 유지되도록 보장할 수 있다. 이러한 효과는 (i) 단백질의 반감기 증가 (즉, ERT에 대해); (ii) 단백질 단위/양 당 고활성; 또는 (iii) 생체내 효능 증대 중 하나 이상을 통하여 실제로 나타날 수 있다. 이것은 발현 동안 ER 수율의 증가; 온도 상승에 따른 접힘이상에 대한 내성 증가; 또는 무질서유발제(chaotropic agent)의 존재를 통하거나, 유사한 수단에 의해 실험적으로 관찰될 수 있다.
용어 "내인성 발현" 및 "내인성으로 발현되는"은, 발현, 활성 또는 안정성을 저해하는 Gaa 핵산 또는 폴리펩티드의 돌연변이와 같은, Gaa 결핍, 과발현 또는 다른 결손과 관련된 질환 또는 질병, 예컨대, 폼페병을 앓거나 앓을 위험이 있는 개체에서 세포내 Gaa의 정상적인 생리적 발현을 의미한다. 이 용어는 또한 Gaa가 발현되는 것이 일반적인 세포 타입에서 Gaa의 발현을 의미하나, 건강한 개체에서 Gaa가 발현되지 않는 세포 또는 세포 타입, 예컨대, 암세포에서의 발현은 포함하지 않는다.
본 명세서에서 용어 "수송능"은 돌연변이 단백질이 소포체 외부에서 세포내 원래 위치, 즉 세포막으로 또는 세포외 환경으로 수송되는 능력을 의미한다.
효소의 "경쟁적 저해제"는, 기질과 거의 동일한 위치에서 효소에 결합하는, 효소 기질의 화학 구조 및 분자 형상과 구조적으로 유사한 화합물을 의미한다. 따라서, 저해제는 기질 분자와 동일한 활성 부위에서 경쟁하여, Km을 증가시킨다. 충분한 기질 분자가 저해제를 대체하는데 이용가능하다면, 다시 말해서, 경쟁적 저해제가 가역적으로 결합할 수 있다면, 통상 경쟁적 저해는 가역적이다. 따라서, 효소 저해량은 저해제 농도, 기질 농도 및 저해제와 기질의 활성 부위에 대한 상대적인 친화성에 따라 달라진다.
저해제가 활성 부위에서 떨어진 위치에 결합하여 효소의 형태를 변화시킴으로써, 기질이 더 이상 활성 부위에 결합할 수 없는 경우에는, 비전형적 경쟁적 저해가 일어난다. 비전형적 경쟁적 저해의 경우, 반대로 활성 부위에 기질이 결합하면 떨어진 위치에서 저해제의 결합을 방지한다. 이는 알로스테리(allosteric) 저해를 포함한다.
효소의 "선형 혼합형 저해제"는, 기질이 결합하도록 두지만 그 친화력을 감소시켜, Km이 증가하고 Vmax가 감소되도록 하는, 경쟁적 저해제의 일종이다.
"비경쟁적 저해제"는 효소와 강한 결합을 형성하는 화합물을 의미하는데, 비경쟁적 저해제는 과량의 기질 추가에 의해서도 대체되지 않을 수 있으며, 다시 말해서, 비경쟁적 저해제는 비가역적일 수 있다. 비경쟁적 저해제는 효소 또는 단백질의 활성 부위에, 또는 그와 인접하거나 떨어진 위치에서 결합할 수 있으며, 효소와 관련하여 Km에는 영향을 미치지 않으나, Vmax를 감소시킨다. 비경쟁적 저해란, 저해제가 효소-기질(ES) 복합체에만 결합하는 상태를 의미한다. 저해제가 결합할 때, 효소는 불활성화된다. 이 점에서, 기질 부재하에서 효소에 결합할 수 있는 비전형적 경쟁적 저해제와 다르다.
용어 "Vmax"는 효소 촉매 반응의 최대 초기속도, 즉, 포화된 기질 농도를 의미한다. 용어 "Km"은 1/2 Vmax를 달성하는데 필요한 기질 농도이다.
효소 "활성제"는 Gaa에 결합하고 효소적 반응 속도를 증가시키는 화합물이다.
용어 "치료적 유효용량" 및 "유효량"은, 적절한 세포내 위치에서 이미 발현된 단백질을 억제하지 않거나(길항제의 경우), 또는 적절한 세포내 위치로부터 단백질의 리간드-매개 수용체 세포내이동을 유도하지 않으면서(효능제의 경우), ER 내(기능적 형태를 허용하면서) 단백질 가공(processing)을 증가시키고, 표적 단백질의 활성을 향상시켜 대상체에서 치료적 반응을 일으키기에 충분한 양을 의미한다. 치료적 반응이란, 사용자(예컨대, 임상의)에 의해 본 명세서에 기재되고 당해 분야에서 공지된 증상 및 임의의 대용 임상 마커를 포함하여, 치료에 대해 효과적인 반응으로서 인식될 수 있는 임의의 반응일 수 있다. 따라서, 치료적 반응은 당해 분야에서 공지된 질환 또는 질병, 예컨대, Gaa 활성 감소 및 진행적 근육 약화와 같은, 하나 이상의 질환 또는 질병 증상, 예컨대, 폼페병의 경감 또는 억제일 수 있다.
정제된 치료 단백질의 시험관내 생성, 수송 또는 저장 중에 저해되는 샤페론 화합물의 농도는, 생체내 투여에 따른 샤페론의 대사, 생체이용률, 및 희석(및 평행상수의 변화에 따른 결합위치의 변위)에 기인하여 본원 발명을 위한 "유효량"을 구성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
"반응자(responder)"는 하나 이상의 임상 증상의 개선, 경감 또는 예방, 또는 병인의 지시자인 하나 이상의 대용 임상 마커의 개선 또는 반전을 보여주는, 폼페병으로 진단되어 본원 발명의 방법에 따라 치료되는 개체이다. 폼페병의 증상 또는 마커는 Gaa 조직 활성 감소; 심근병증; 심장비대; 특히 동맥 또는 하지에서 진행성 근육 약화; 초중증 근긴장저하; 대설증(macroglossia)(일부 사례에서, 혀의 돌출); 연하, 흡인 및/또는 섭취 곤란; 호흡부전; 간비대(중등도); 안면근의 이완; 무반사; 운동불내성; 운동성 호흡곤란; 기좌호흡(orthopnea); 수면 무호흡; 오전 두통; 기면; 척추전만증 및/또는 척추측만증; 깊은 힘줄 반사(deep tendon reflex) 감소; 하부요통; 및 운동발달 이정표에 부적격을 포함하나, 이에 제한하는 것은 아니다.
용어 "효소 대체요법" 또는 "ERT"는 비천연의 정제 효소를 효소가 결핍된 개체에 도입하는 것을 의미한다. 투여된 단백질은 천연 원료로부터 수득하거나 재조합 발현(이하에서 더욱 상세히 기재됨)에 의해 수득할 수 있다. 또한, 상기 용어는 정제된 효소의 투여가 필요하거나 유익한, 예컨대, 효소 부족을 겪고 있는 개체에 정제된 효소를 도입하는 것을 의미한다. 도입된 효소는 시험관내에서 생산된 정제된 재조합 효소이거나, 태반 또는 동물의 우유와 같은 분리된 조직이나 액체, 또는 식물로부터 정제된 단백질일 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 인간에게 투여되어 부적당한 반응을 일으키지 않고 생리학적으로 허용할 수 있는 분자단위 및 조성물에 대해 사용된다. 바람직하게는, 본 명세서에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 공인된 약전에서 동물, 더욱 특히 인간에서 사용되는 것으로 기재된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 화합물이 투여될 때 사용되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 약제학적 담체는 물 및 오일과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수성 식염수와 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 바람직하게는 담체로서, 특히 주사제 용액으로 사용될 수 있다. 적절한 약제학적 담체는 "Remington's Pharmaceutical Sciences"(E. W. Martin, 18th Edition, or other editions)에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "정제된"은, 관련이 없는 물질, 즉, 오염원을 감소 또는 제거시킨 조건에서 분리된, Gaa 핵산 또는 폴리펩티드와 같은 물질에 대해서 사용된다. 예를 들어, 정제된 단백질은, 바람직하게는 세포내에서 연합된 다른 단백질 또는 핵산이 실질적으로 없는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "실질적으로 없는"은 물질의 분석 시험 환경에서 사용된다. 바람직하게는, 오염원이 실질적으로 없는 정제된 물질은 적어도 50% 순수; 더 바람직하게는, 적어도 90% 순수, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 순수하다. 순도는 통상의 수단, 예컨대, 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역분석법, 조성물 분석, 생물학적 분석법 및 당해 분야에서 공지된 다른 방법에 의해 측정될 수 있다.
용어 "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성질 또는 정확성의 측면에서 측정값에 대해 허용가능한 정도의 오차를 의미할 수 있다. 통상 예시적인 오차 범위는 주어진 값 또는 범위의 20 %, 바람직하게는 10%, 더욱 바람직하게는 5% 이내이다. 생물계에서 대안적이고 특이적으로, 용어 "약" 및 "대략"은 크기 순서에 따라, 바람직하게는 주어진 값의 5-배, 더욱 바람직하게는 2-배 이내의 값을 의미한다. 본 명세서에서 주어진 수치는 달리 언급하지 않는 한 대략적인 값이며, 이는 명백히 기재되지 않은 경우라도 용어 "약" 또는 "대략"이 추론될 수 있는 것을 의미한다.
화학적 정의
본 명세서에서 "알킬"은, 단일 결합에 의해 분자의 잔여부에 결합되고, 불포화기(unsaturation)를 포함하지 않고, 탄소 원자 및 수소 원자만으로 이루어진 선형 또는 분지형의 C1-C20 탄화수소기를 의미하며, 이러한 알킬기를 예시하면, 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸 (이소프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸 (t-부틸)을 들 수 있다. 상기 알킬로서는 C1-C8 알킬이 바람직하다.
또한, "알케닐"은, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 선형 또는 분지형형의 C2-C20 지방족 탄화수소기를 의미하며, 이러한 알케닐을 예시하면, 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐 (알릴), 이소-프로페닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐을 들 수 있다.
아울러, "사이클로알킬"이란, 불포화된 비(非)방향족 단일환(monocyclic) 또는 복수환(multicyclic)의 탄화수소환 시스템을 칭하며, 이러한 사이클로알킬을 예시하면, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실을 들 수 있다. 복수환의 사이클로알킬기를 예시하면, 퍼하이드로나프틸기(perhydronapththyl group), 아다만틸기(adamantyl group) 및 노르보르닐기가 브릿지된 환형 기(cyclic group) 또는 스피로바이사이클기(spirobicyclic group), 예컨대, 스피로(4,4)논-2-일을 들 수 있다.
또한, "사이클로알칼킬(cycloalkalkyl)"은, 상기 알킬기에 직접 결합된 사이클로알킬기로서, 사이클로프로필메틸, 사이클로부틸에틸, 사이클로펜틸에틸과 같은 안정한 구조체를 형성한다.
"알킬 에테르"는, 알킬 사슬에 일체화된 하나 이상의 산소를 가지는 알킬기 또는 사이클로알킬기를 의미하며, 이러한 알킬 에테르를 예시하면, 메틸 에틸 에테르, 디에틸 에테르, 테트라하이드로퓨란을 들 수 있다.
본 명세서에서 "알킬 아민"은, 하나 이상의 질소 원자를 가지는 알킬기 또는 사이클로알킬기를 의미하며, 이러한 알킬 아민을 예시하면, n-부틸 아민 및 테트라하이드로옥사진을 들 수 있다.
또한, "아릴"은, 약 6개 내지 14개의 탄소 원자를 가지는 방향족 라디칼을 의미하며, 이러한 아릴을 예시하면, 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 바이페닐(biphenyl)을 들 수 있다.
아울러, "아릴알킬"은, 상기 알킬기에 직접 결합된 아릴기를 의미하며, 이러한 아릴기를 예시하면, -CH2C6H5 및 -C2H4C6H5를 들 수 있다.
"헤테로사이클"이란, 복수 개의 탄소 원자와, 질소, 인, 산소 및 황으로 이루어진 군에서 선택되는 1개 내지 5개의 헤테로원자(heteroatom)로 이루어진 안정한 3원환 내지 15원환 라디칼을 의미한다. 본 발명의 목적을 고려할 때, 상기 헤테로사이클환 라디칼은 모노사이클환, 바이사이클환 또는 트리사이클환 시스템일 수 있고, 이들 환은 융합환, 브릿지된 환, 또는 스피로환 시스템일 수 있으며, 상기 헤테로사이클환 라디칼의 질소, 인, 탄소, 산소 또는 황 원자는 다양한 산화 상태로 선택적으로 산화될 수 있다. 아울러, 상기 질소 원자는 선택적으로 4급화(quaternization)될 수 있고, 상기 환 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다(즉, 헤테로방향족 또는 헤테로아릴 방향족). 이러한 헤테로사이클환 라디칼을 예시하면, 아제티디닐(azetidinyl), 아크리디닐(acridinyl), 벤조디옥솔릴(benzodioxolyl), 벤조디옥사닐(benzodioxanyl), 벤조퓨라닐(benzofurnyl), 카르바졸릴(carbazolyl), 신놀리닐(cinnolinyl), 디옥솔라닐(dioxolanyl), 인돌리지닐(indolizinyl), 나프티리디닐(naphthyridinyl), 퍼하이드로아제피닐(perhydroazepinyl), 페나지닐(phenazinyl), 페노티아지닐(phenothiazinyl), 페녹사지닐(phenoxazinyl), 프탈라지닐(phthalazinyl), 피리딜(pyridyl), 프테리디닐(pteridinyl), 퓨리닐(purinyl), 퀴나졸리닐(quinazolinyl), 퀴녹살리닐(quinoxalinyl), 퀴놀리닐(quinolinyl), 이소퀴놀리닐(isoquinolinyl), 테트라졸릴(tetrazoyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 테트라하이드로이소퀴놀릴(tetrahydroisoquinolyl), 피페리디닐(piperidinyl), 피페라지닐(piperazinyl), 2-옥소피페라지닐(2-oxopiperazinyl), 2-옥소피페리디닐(2-oxopiperidinyl), 2-옥소피롤리디닐(2-opyrrolidinyl), 2-옥소아제피닐(2-oxoazepinyl), 아제피닐(azepinyl), 피롤릴(pyrrolyl), 4-피페리도닐(4-piperidonyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 옥사졸릴(oxazolyl), 옥사졸리닐(oxazolinyl), 옥사솔리디닐(oxasolidinyl), 트리아졸릴(triazolyl), 인다닐(indanyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 이속사솔리디닐(isoxasolidinyl), 모르폴리닐(morpholinyl), 티아졸릴(thiazolyl), 티아졸리닐(thiazolinyl), 티아졸리디닐(thiazolidinyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 퀴누클리디닐(quinuclidinyl), 이소티아졸리디닐(isothiazolidinyl), 인돌릴(indolyl), 이소인돌릴(isoindolyl), 인돌리닐(indolinyl), 이소인돌리닐(isoindolinyl), 옥타하이드로인돌릴(octahydroindolyl), 옥타하이드로이소인돌릴(octahydroisoindolyl), 퀴놀릴(quinolyl), 이소퀴놀릴(isoquinolyl), 데카하이드로이소퀴놀릴(decahydroisoquinolyl), 벤즈이미다졸릴(benzimidazolyl), 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 벤조피라닐(benzopyranyl), 벤조티아졸릴(benzothiazolyl), 벤조옥사졸릴(benzooxazolyl), 퓨릴(furyl), 테트라하이드로퍼틸(tetrahydrofurtyl), 테트라하이드로피라닐(tetrahydropyranyl), 티에닐(thienyl), 벤조티에닐(benzothienyl), 티아모르폴리닐(thiamorpholinyl), 티아모르폴리닐 설폭사이드(thiamorpholinyl sulfoxide), 티아모르폴리닐 설폰(thiamorpholinyl sulfone), 디옥사포스폴라닐(dioxaphospholanyl), 옥사디아졸릴(oxadiazolyl), 크로마닐(chromanyl), 이소크로마닐(isochromanyl)을 들 수 있으나, 전술한 것으로 제한되지는 않는다.
상기 헤테로사이클환 라디칼은 임의의 헤테로 원자 또는 탄소 원자에서 주 구조체에 결합하여, 안정한 구조를 형성할 수 있다.
"헤테로아릴"은, 상기 환이 방향족인 헤테로사이클환을 일컫는다.
"헤테로아릴알킬"은, 알킬기에 직접 결합된 헤테로아릴환 라디칼을 의미한다. 상기 헤테로아릴알킬 라디칼은, 알킬기로부터 유래한 임의의 탄소 원자에서 주 구조체에 결합되어, 안정한 구조를 형성할 수 있다.
"헤테로사이클릴(heterocyclyl)"은, 전술한 헤테로사이클환 라디칼을 칭한다. 상기 헤테로사이클릴환 라디칼은 임의의 헤테로 원자 또는 탄소 원자에서 주 구조체에 결합되어, 안정한 구조를 형성할 수 있다.
"헤테로사이클릴알킬(heterocyclylalkyl)"은, 알킬기에 직접 결합된 헤테로사이클환 라디칼을 의미한다. 상기 헤테로사이클릴알킬 라디칼은 상기 알킬기의 탄소 원자에서 주 구조체에 결합되어, 안정한 구조를 형성할 수 있다.
"치환된 알킬", "치환된 알케닐", 치환된 알키닐", "치환된 사이클로알킬", "치환된 사이클로알칼킬", "치환된 사이클로알케닐", "치환된 아릴알킬", "치환된 아릴", "치환된 헤테로사이클환", "치환된 헤테로아릴환", "치환된 헤테로아릴알킬", 또는 "치환된 헤테로사이클릴알킬환"은, 서로 동일 또는 상이할 수 있는 하나 이상의 수소기, 하이드록시기, 할로겐기, 카르복시기, 시아노기, 아미노기, 니트로기, 옥소기(=0), 티오기(=S)로 치환되거나, 또는 알킬, 알콕시, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클환, -COORx, -C(O)Rx, -C(S)Rx, -C(0)NRxRy, -C(O)ONRxRy, -NRxCONRyRz, -N(Rx)SORy, -N(Rx)SO2Ry, -(=N-N(Rx)Ry), -NRxC(O)ORy, -NRxRy, -NRxC(0)Ry-, -NRxC(S)Ry, -NRxC(S)NRyRz, -SONRxRy-, -SO2NRxRy-, -ORx, -ORxC(O)NRyRz, -ORxC(O)ORy-, -OC(O)Rx, -OC(O)NRxRy, -RxNRyRz, -RxRyRz, -RxCF3, -RxNRyC(O)Rz, -RxORy, -RxC(O)ORy, -RxC(O)NRyRz, -RxC(O)Rx, -RxOC(O)Ry, -SRx, -SORx, -SO2Rx, -ONO2 (단, 각각의 기에서 Rx, Ry 및 Rz는 수소 원자, 치환 또는 비(非)치환된 알킬, 할로알킬, 치환 또는 비(非)치환된 아릴알킬, 치환 또는 비(非)치환된 아릴, 치환 또는 비(非)치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비(非)치환된 사이클로알칼킬, 치환 또는 비(非)치환된 헤테로사이클환, 치환 또는 비(非)치환된 헤테로사이클릴알킬, 치환 또는 비(非)치환된 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비(非)치환된 헤테로아릴알킬일 수 있음)로부터 선택되는 기들로 선택적으로 치환될 수 있다.
"할로겐"은, 플루오르, 염소, 브롬 및 요오드 라디칼을 칭한다.
DNJ 및 DNJ 유도체
1-데옥시노지리마이신(화합물 1 , DNJ; 1,5-이미노-1,5-디데옥시-D-글루시톨-CAS No. 19130-96-2)은 폼페병(Pompe disease)의 치료에 적절하다. DNJ는 분자식 C6H13NO4를 가지며, 분자량이 163.2이다. DNJ는, Schroder 등의 미국특허 4,806,650에 기재된 화합물로서, 하기 구조식 1로 표시된다:
Figure 112007090581802-PCT00007
(1).
본 발명에 바람직한 DNJ의 유도체는 하기 구조식 II로 표시될 수 있다:
Figure 112007090581802-PCT00008
(II).
상기 구조식에서, R1은 H; 또는 1개 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형의 알킬, 알케닐, 알킬에테르 또는 알킬 아민, 또는 5원 내지 12원환의 알킬아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴 알킬이며, 여기서, R1은, 하나 이상의 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, 또는 -C(=O)N-(알킬)2 (즉, -0-C(=0)N-(Me)2)으로 선택적으로 치환되고, R2는 H; 1개 내지 9개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐 또는 알킬에테르, 또는 5개 내지 12개의 탄소 원자를 가지는 아릴이며, 여기서, R2는 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3 또는 헤테로사이클환으로 선택적으로 치환되고, R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아님).
DNJ 유도체로서 바람직한 것을 예시하면, 1-12개의 탄소 원자를 가지는 N-알킬 유도체를 들 수 있다. 이들 유도체 중 더욱 바람직한 것은, 1-9개의 탄소 원자를 가지는 선형, 분지형 또는 환형 화합물이다. 이러한 화합물을 예시하면, 각각이 하기 구조식으로 표시되는 N-메틸-DNJ (2), N-에틸-DNJ (3), N-프로필-DNJ (4), N-부틸-DNJ (5), N-펜틸-DNJ (6), N-헥실-DNJ (7), N-헵틸-DNJ (8), N-옥틸-DNJ (9), N-노닐-DNJ (10), N-메틸사이클로프로필-DNJ (11) 및 N-메틸사이클로펜틸-DNJ (12)를 들 수 있지만, 전술한 것으로 제한되지는 않는다:
Figure 112007090581802-PCT00009
Figure 112007090581802-PCT00010
Figure 112007090581802-PCT00011
Figure 112007090581802-PCT00012
.
알킬 DNJ 유도체로서 바람직한 화합물은, N-메틸-1-데옥시노지리마이신(화합물 2, N-메틸 DNJ; N-메틸모라놀린, 1,5-(메틸이미노)-1,5-디데옥시-D-글루시톨)이며, 상기 화합물로서는 합성 글루코스 유사체 시판품(Toronto Research Chemicals에서 시판, Cat. Number M297000, CAS 69567-1-08)을 상업적으로 입수할 수 있다. N-메틸 DNJ는 간 내의 글리코겐-분지 제거 효소(glycogen-debranching enzyme)인 α-1,6-글루코시다제를 저해함으로써, 글리코겐 분해율을 저하시키고, α-l,4-글루코시다제를 블로킹(blocking)하여, 항(抗)고혈당 작용(antihyperglycemic action)을 나타낸다 (Arai M 등, Circulation. 1998 Apr 7;97(13):1290-7).
알킬 DNJ 유도체로서 바람직한 다른 화합물을 예시하면, N-노닐-데옥시노지리마이신(화합물 10, N-노닐 DNJ; 1,5-(노닐이미노)-1,5-디데옥시-D-글루시톨)을 들 수 있으며, 상기 화합물은 고셰병(Gaucher disease) (당지질 축적을 특징으로 하는 라이소좀 축적 질환)의 치료에 바람직한 합성 글루코스 유사체이다 (Sawkar AR 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 26;99(24): 15428-33).
아울러, -OH, -COOH, 또는 OCF3와 같은 치환체를 가지는 알킬 DNJ 유도체 역시 바람직한 화합물이다. 치환된 알킬 DNJ 유도체를 예시하면, 하기 구조식을 가지는 화합물을 들 수 있지만, 이들 화합물로 제한되지는 않는다:
Figure 112007090581802-PCT00013
.
또한, 바람직한 DNJ 유도체로서, N-2-하이드록시에틸-데옥시노지리마이신(화합물 13, N-에톡시 DNJ; 1,5-(2-하이드록시에틸이미노)-1,5-디데옥시-D-글루시톨; 미글리톨)이 있으며, 상기 화합물은 타입 2 당뇨병의 치료에 사용되는 합성 글루코스 유사체이다 (Drent 등, Diabetes Nutr Metab. 2002;15(3):152-9; de Luis Roman DA , Rev Clin Esp. 2004 Jan;204(1):32-4).
다른 바람직한 DNJ 유도체로서는, 5-N-카르복시펜틸-데옥시노지리마이신(화합물 14, 5-N-카르복시펜틸 DNJ; 1,5-(5-N-카르복시펜틸이미노)-1,5-디데옥시-D-글루시톨)이 있다. 이 합성 글루코스 유사체는 Bernotas RC 등, Biochem J. 1990 Sep 1;270(2):539-40에 기재된 합성 경로에 따라 합성될 수 있다.
다른 DNJ 유도체를 예시하면, 하기 각각의 구조식으로 표시되는 화합물과 같은 알킬 에테르 유도체를 들 수 있다:
Figure 112007090581802-PCT00014
Figure 112007090581802-PCT00015
.
다른 바람직한 화합물을 예시하면, 하기 각각의 구조식으로 표시되는 N-벤질 치환된 DNJ 유도체와 같은 유도체들을 들 수 있다:
Figure 112007090581802-PCT00016
Figure 112007090581802-PCT00017
.
또 다른 바람직한 화합물을 예시하면, 하기 각각의 구조식으로 표시되며, N-CH2-Ar 치환된 DNJ 유도체(단, Ar은 방향족 헤테로사이클임)를 들 수 있다:
Figure 112007090581802-PCT00018
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전술한 질소 치환된 DNJ 유도체 외에도, 상기 환의 질소와 이웃하는 C-1 탄소에 결합된 치환체를 가지는 DNJ 유도체 역시 본 발명의 바람직한 화합물이다. 이들 화합물을 예시하면, 하기 각각의 구조식으로 표시되는 화합물을 들 수 있으나, 이들 화합물로 제한되지는 않는다:
Figure 112007090581802-PCT00019
.
상기 구조식에서, 선형 탄화수소 유사체를 예시하면, 1-12개의 탄소 원자를 들 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않으며, R을 예시하면, -OH, -COOH, -CF3, -OCF3, NHR, NHCOR'(단, R'는 알킬기임) 또는 방향족환 또는 헤테로사이클환으로 선택적으로 치환된 분지형 알킬, 사이클로알킬 또는 알킬을 들 수 있지만, 전술한 것으로 제한되지는 않는다.
Figure 112007090581802-PCT00020
Figure 112007090581802-PCT00021
.
상기 구조식에서, HET는 테트라하이드로퓨란, 피리딘, 퓨란(furan), 피롤, 이미다졸, 트리아졸, 테트라졸, 옥사졸, 티아졸 및 결합된 벤조-유사체 등과 같은 헤테로사이클기이고, Ar은 페닐 또는 치환된 페닐이다. 페닐 치환체는, 작용기 G (예컨대, CH3, Cl , F, 또는 CH2-O-CF3)이며, n은 0 내지 5의 정수이다.
DNJ 유도체의 합성
R1에서 치환체를 가지는 본 발명의 화합물은, 유럽특허 49858, WO 2005/063706, 미국특허 4,639,436; WO 2004/037373; WO 95/22975; 미국특허 5,399,567; 미국특허 5,310,745; Bols 등, Journal of Carbohydrate Chemistry 2004 23(4), 223-238, Sawker 등, Chemistry and Biology, 2005; 12, 1235-1244, Overkleef, Journal of Biological Chemistry. 2005; 273(41), 26522-26527; Tan 등, Journal of Biological Chemistry. 1991, 266(22), 14504-14510; Romaniouk 등, Glycobiology. 2004; 14(4), 301-310; Lesur, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 1997; 7(3), 355-360; 및 Yoshikuni, Agric. Biol. Chem 1998; 52(1), 121)에 기재된 방법, 및 이들 방법의 공지된 변형 방법에 따라, DNJ로부터 합성될 수 있다.
R2에서 치환체를 가지는 본 발명의 화합물은, Anzeveno 등, J. Org. Chem. 1989; 54(11), 2539; WO 00/56713; 미국특허 4,880,917; 유럽특허 0315017; 및 미국특허 5,051,407, 및 Boshagen 등, Angewante Chemie, Int. Ed. Engl. 1981; 20(9), 806-807에 기재된 방법, 보고된 추가적인 방법 및 이들 방법의 공지된 변형 방법(WO OO/56713, 미국특허 5,051,407, 및 유럽특허 0315017에 기재되어 있음)에 따라, DNJ로부터 합성될 수 있다. 이들 분자의 이들 분자의 또 다른 합성 방법에 대해서는, Davis의 Angewante Chemie, Int. Engl. 2003; 42, 3788-3792에 보고된 바 있다.
또한, 본 발명의 화합물은 테트라-OBn 글루코노락톤으로부터 합성될 수 있다. 이러한 합성 방법은, Perrine 등, J. Org. Chem. 1967; 32, 664; Matos, Lopes & Lopes, Synthesis, 1999; 4, 571; Rao & Perlin; Can. J. Chem. 1981; 59, 333; Hoos, Naughton and Vassella, Helv. Chim. Acta, 1993; 76, 1802, 및 Baxter & Reitz, J. Org. Chem. 1994; 59, 3175에 기재된 합성 방법에 따라 적용될 수 있다.
반(semi)합성 방법을 사용하여, 본 발명의 DNJ 유도체를 형성할 수도 있다. 이러한 효소에 의한 합성 방법에서는 글루코노박터 옥시단즈(Gluconobacter Oxydans)를 사용하며, 미국특허 4,266,025; 미국특허 5,695,969; 미국특허 4,246,345; 미국특허 4,806,650; 0430307; 및 Kinast & Schedel; Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 20, 805(1981)에 기재된 방법에 따라 적용할 수 있다.
본 발명에 바람직한 몇몇 화합물들은 구입이 가능하며, 예컨대, 1-데옥시노지리마이신 (Cat. No. D245000), 1-데옥시노지리마이신 하이드로클로라이드 (Cat. No. D245005), N-부틸-1-데옥시노지리마이신 (Cat. No. B691000, CAS[21011-90-0]), 미글리톨(Cat. No. M344200, CAS[72432-03-2]), N-메틸-1-데옥시노지리마이신(Cat. No. 297000, CAS[69567-1-8]), N-5-카르복시펜틸-1-데옥시노지리마이신(Cat. No. C181200), 및 N-(5-아다만탄-1-일-메톡시)-펜틸-1-데옥시노지리마이신(Cat. No. A21000)은 Toronto Research Chemicals로부터 구입 가능하며, α-호모노지리마이신(Cat. No. H1144, CAS 119557-99-2)은 TCI America로부터 입수 가능하다.
본 발명에 사용될 수 있는 화합물을 예시하면, DNJ, N-부틸 DNJ, N-(사이클로프로필)메틸 DNJ, N-2-(테트라하이드로퓨란)메틸 DNJ, N-2-옥소에틸 DNJ 트리플루오로에톡시 에테르/N-(2-(2,2,2-트리플루오로에톡시)에틸 DNJ, N-에틸옥시 DNJ 디메틸 카르바메이트/N-(2-(N,N-디메틸아미도)에틸옥시) DNJ, N-메틸-DNJ, 2-메톡시에틸 DNJ, 2-에톡시에틸 DNJ, 4-트리플루오로메틸-벤질 DNJ, α-시아노-4-트리플루오로메틸-벤질 DNJ, 4-펜톡시벤질 DNJ, 4-부톡시벤질 DNJ, 4-t-BOC-피페리디닐메틸 DNJ, α-C6-n-노닐-DNJ, 및 α-호모-DNJ를 들 수 있으나, 전술한 것으로 제한되지는 않는다. 표 1 및 표 2에는, ½ 최대 향상률(%)이 관찰되는 1 mM DNJ에 대한 이들 화합물의 향상률(%)이 기재되어 있다(실시예 2).
본 발명에 사용하기에 적절한 다른 화합물을 예시하면, N-노닐 DNJ (10); 미글리톨(13); N-5-카르복시-펜틸-1-DNJ (14); 메틸-2-벤조퓨라닐 DNJ (30); 메틸-2-벤조티아페닐 DNJ (31); α-C6-n-부틸-DNJ (33); 메틸-2-퓨라닐 DNJ (29); N-n-헥실 DNJ (7); N-에틸 DNJ (3); N-n-프로필 DNJ (4); N-n-펜틸 DNJ (6); 및 β-C6-벤질-DNJ (36); 2-(N-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)-N-메틸아미노)에틸)-DNJ (28); 및 N-2-(N-메틸-N-메틸렌디옥시페닐아미노)에틸-DNJ (37)를 들 수 있다.
활성 및 위치화 분석
Gaa의 증강된 활성, 안정성 및/또는 이동성은 예컨대 세포의 Gaa 폴리펩티드 증가를 측정함으로써, 리소좀으로의 트래피킹 증가를 결정함으로써, 또는 Gaa 활성 또는 안정성 증가를 결정함으로써, 결정할 수 있다. 이러한 각각을 분석하기 위한 비제한적인 예는 하기에 설명되어 있다.
Gaa의 세포내 발현 결정 LPL 단백질의 세포내 수준을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법으로는 웨스턴 블롯팅, 웨스턴 블롯팅 이후에 면역침강(IP 웨스턴) 또는 테깅된 LPL 단백질을 이용한 면역형광 방법이 있다.
Gaa 트래피킹 결정 생합성 경로를 통한 단백질 이동성을 분석하는 것은, 예컨대 35S-표지된 리포터 단백질을 글리코시다제와 함께 이용한 펄스-체이스(pulse-chase) 실험, 또는 바람직하기로는 이동중에 단백질 수정을 측정하기 위한 간접적인 또는 직접적인 면역형광법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법과 그외 다른 방법은 Current Protocols in Cell Biology 2001; John Wiley & Sons에 개시되어 있다. Gaa의 리소좀 트래피킹을 검출하기 위한 면역형광 실험의 예는 하기 실시예 3 및 4에 상세히 설명되어 있다.
단백질 트래피킹의 손상을 검출하기 위한 다른 방법도 당업계에 잘 알려져 있다. 예컨대, 골지체에서 N- 및/또는 O-당화된 단백질의 경우, 글리코시다제 처리 및 면역침강이 조합된 방사능 표지된 단백질을 이용한 펄스-체이스 대사성 표지를 이용하여 단백질이 골지체에서 충분히 당화되었는지, 또는 골지체로 이동하는 대신에 추가적인 당화를 위해 ER에서 유지되는지를, 결정할 수 있다.
가시적으로 세포내 위치화를 검출하기 위한 민감한 방법으로는 또한 형광 단백질 또는 형광 항체를 이용한 형광 현미경이 있다. 예로, 대상 LPL 단백질을 예컨대 그린 형광단백질(GFP), 시안 형광 단백질, 옐로우 형광 단백질 및 레드 형광 단백질로 테깅한 다음, 다중 색상의 저속 촬영 현미경 및 전자 현미경을 사용하여, 고정된 세포와 살아있는 세포에서 이들 단백질의 운명을 연구할 수 있다. 단백질 트래피킹에서 형광 이미징 사용에 대한 내용은 Watson et al., Adv Drug Deliv Rev 2005; 57(1):43-61을 참조한다. 세포내 단백질의 공동-위치화를 위한 공초점 현미경의 사용에 대한 내용은 Miyashita et al., Methods MoI Biol. 2004; 261 :399-410를 참조한다.
FCS(Fluorescence correlation spectroscopy)는 하나의 분자를 실시간으로 볼 수 있는 매우 민감하며 비침습적인 검출 방법이다(Vukojevic et al., Cell MoI Life Sci 2005; 62(5): 535-50). SPFI(single-particle fluorescence imaging)는 소형 형광 입자로 선택적으로 표지된 개별 분자를 가시화하기 위하여 매우 민감한 형광 물질을 이용한다(Cherry et al., Biochem Soc Trans 2003; 31(Pt 5): 1028-31). 살아있는 세포 이미징화에 대한 내용은 Hariguchi, Cell Struct Funct 2002; 27(5):333-4)를 참조한다.
또한 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 현미경을 이용하여 생리 조건하에서의 단백질 구조 및 위치화를 연구한다(Periasamy, JBiomed Opt 2001; 6(3): 287-91).
Gaa 활성 증가 측정 시험관내에서, Gaa 활성은 실시예 2에서와 같이 측정할 수 있다. Gaa 활성은 Okumiya et al., MoI Genet Metab. 2006 May;88(l):22-8에 개시된 바와 같이 혼성 림프구를 이용한 약리학적 샤페론을 처리한 후 생체내에서 측정할 수 있다. 이 방법은 리소좀의 산 알파-글루코피라노사이드 활성을 측정하기 위한 기질로서 글리코겐 및 4-메틸움벨리페릴-알파-d-글루코피라노사이드(4MU-알파Glc)를 사용하며, 관련없는 알파-글루코시다제(거의 알타제-글루코아밀라제)의 간섭을 없애기 위해 아카르보스를 혼성한다.
제형, 투여량 및 투여
일 예로, 샤페론 화합물은 단일요법으로서, 다른 투약 형태를 포함하지만 바람직하기로는 경구 투약 형태로(하기에 상세히 언급됨) 투여된다. 이러한 예에서, 투약 요법은 폼페 질환자의 혈장에 화합물을 일정하고 안정적인 수준으로 제공하는 것이어야 한다. 이는 분할 투약으로 매일 투여에 의해, 조절 방출성 제형으로, 또는 지속적인 방출형 제형의 이따금의 투여에 의해 획득할 수 있다. 샤페론 화합물의 제형, 투여량 및 투여 경로는 하기에 설명한다.
제형
본 발명의 일 예에서, 샤페론 화합물은 단일요법으로서 투여되며, 예컨대 정제 또는 캡슐제로 경구로, 또는 주사용 멸균 수용액의 액체로서, 또는 투여하기 전에 시험관내에서 효소 응집을 예방하기 위해 재구성하는 중에 또는 한 후 바로 대체 Gaa(하기 참조) 제형에 첨가되는 건조 동결건조한 분말을 포함하여, 임의 투여 경로에 적합한 형태일 수 있다.
샤페론 화합물이 경구 투여용으로 제형화되는 경우, 정제 또는 캡슐제를 결합제(예, 미리 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스), 충진제(예, 락토스, 미세결정 셀룰로스 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트); 윤활제(예, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카), 붕해제(예, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트), 또는 습윤제(예, 소듐 라우릴 설페이트)와 같이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 이용하여 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 정제는 당업계에 잘 알려져 있는 방법으로 코딩할 수 있다. 경구 투여용 액체 조제물은 예컨대, 용액, 시럽 또는 현탁액 형태를 취할 수 있으며, 또는 이는 사용하기 전에 물 또는 그외 적정 비히클로 구성하기 위한 건조 산물로서 존재할 수 있다. 이러한 액체 조제물은 현탁화제(예, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가된 식용 지방), 유화제(예, 렉시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별화된 식물성 오일), 및 보존제(예, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)과 같은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 이용하여 통상적인 방법에 의해 제조할 수도 있다. 또한, 조제물은 완충제 염, 향료, 색소 및 감미제를 적절히 포함할 수 있다. 경구 투여용 조제물은 활성 샤페론 화합물의 조절 방출을 제공하도록 적절히 제형화될 수도 있다.
ZAVESCA®는 본 발명의 방법에 사용되는 샤페론 화합물로서, 경질 젤라틴 캡슐로서 시판되고 있으며, 각각에는 100 mg의 DNJ, 소듐 전분 글리콜레이트, 포비돈(K30) 및 마그네슘 스테아레이트가 포함되어 있다. 캡슐 껍질은 젤라틴과 티타늄 디옥사이드가 함유되어 있다.
비경구/주사용으로 적합한 샤페론 화합물의 약학 제형은 일반적으로 멸균 수용액(수용성), 또는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조용 분산제 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에서, 제형은 멸균형이어야 하며, 주사가 용이한 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정적이어야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 방제되어야 한다. 담체는 용매, 물, 에탄올 폴리올(예, 글리세로르 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등)을 포함하는 분산 매질, 이들의 적정 혼합물 및 식물성 오일일 수 있다. 예컨대, 렉시틴과 같은 코팅제를 사용함으로써, 분산제의 경우에는 입자의 필요한 크기를 유지시킴으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용 방제는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 벤질 알코올, 소르브산 등으로 이룰 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예컨대 당 또는 소듐 클로라이드를 포함하는 것이 합리적일 것이다. 주사용 조성물의 장기 흡수는 흡수 지연제 조성물 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 이룰 수 있다.
멸균 주사액은 정제된 Gaa와 샤페론 화합물을 상기 여러가지 성분과 함께 적절한 용매중에 필요량으로 혼성하고, 이후 필터 또는 종결 멸균화에 의해 제조한다. 일반적으로, 분산제는 여러가지 멸균 활성 성분을 염기성 분산 매질과 그외 상기 나열된 필수 성분을 포함하는 멸균 비히클에 혼합하여, 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균 여과한 용액으로부터 활성 성분 분말과 임의의 부가적인 원하는 성분을 산출하는, 진공 건조 및 냉동 건조 기법이다.
제형은 부형제를 포함할 수 있다. 제형에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 부형제로는 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액, 아세테이트 완충액, 바이카보네이트 완충액과 같은 완충액, 아미노산, 유레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질; 혈청 알부민, 콜라겐 및 젤라틴과 같은 단백질; EDTA 또는 EGTA와 같은 염 및 소듐 클로라이드; 리포좀; 폴리비닐피롤리돈; 엑스트란, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤과 같은 당; 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜(예, PEG-4000, PEG-6000); 글리세롤; 글리신 또는 그외 아미노산; 및 지질이 있다. 제형에 사용가능한 완충액 시스템으로는 시트레이트, 아세테이트, 바이카보네이트 및 포스페이트 완충액이 있다. 포스페이트 완충액이 바람직한 예이다.
또한, 제형은 비이온성 세정제를 포함할 수 있다. 바람직하니 비이온성 세정제로는, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-1OO, 트리톤 X-114, Nonidet P-40, 옥틸 알파-글루코시드, 옥틸-베타-글루코시드, Brij 35, 플루로닉(Pluronic) 및 트윈 20이 있다.
투여
샤페론 화합물의 투여 경로는 (바람직하기로는) 경구 또는 정맥내, 피하, 동맥내, 복막내, 눈, 근육내, 볼, 직장, 질, 안와내, 뇌내, 진피내, 두개내, 척수내, 실내, 경막내, 강내(intracisternal), 관절낭내, 폐재, 비강내, 경점막, 경피 또는 흡입을 포함한 비경구일 수 있다.
샤페론 화합물의 상기 비경구 제형의 투여는 주기적인 조제물의 볼루스 주사일 수 있으며, 또는 외부(예, 정맥내 백) 또는 내부(예, 생분해성 임플란트) 저장체로부터 정맥내 또는 복막내 투여에 의해 투여할 수 있다. 예로, 미국 특허 4,407,957 및 5,798,113을 참조하며, 각각은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
폐내 전달 방법 및 장치는 예컨대, 미국 특허 5,654,007, 5,780,014, 및 5,814,607에 언급되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 그외 유용한 비경구 전달 시스템은, 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투성 펌프, 이식용 주입 시스템, 펌프 전달, 캡슐화된 세포 전달, 림포솜 전달, 바늘을 이용한 주사, 바늘을 이용하지 않는 주사, 분무기, 에오로졸라이저, 전기천공 및 경피 패치가 있다. 바늘을 이용하지 않는 주사 기구는 미국 특허 5,879,327; 5,520,639; 5,846,233 및 5,704,911에 언급되어 있으며, 본 명세서에 원용에 의해 포함된다. 전술한 제형 모두 이러한 방법으로 투여할 수 있다.
경피 주사는 자가 투여가능한 장점이 있지만, 정맥내 투여에 비해 혈장 반감기가 길어진다. 게다가, 재충진가능한 주사 펜 및 바늘이 없는 주사 기구와 같이, 환자 용이성을 위해 제작된 다양한 기구를 본 발명의 제형과 함께 사용할 수 있다.
투여량
내인성 돌연변이 Gaa를 모집(및/또는 투여된 정제 Gaa를 안정화하는, 하기 조합 요법 참조)하는데 유효한 샤페론 화합물의 유효량은, 당업자가 경우에 따라 결정할 수 있다. 반감기(t1/2), 혈장 최대 농도(Cmax), 혈장 최대 농도 시간(tmax), 곡선 면적으로 측정한 노출(AUC), 및 대체 단백질과 샤페론 화합물 둘다에 대한 조질 할당과 같은 약물 동태학 및 약동학 뿐만 아니라, 샤페론/대체 Gaa 결합(친화성 상수, 조합 및 해리 상수 및 결합가) 데이타를, 당업계에 공지된 통상의 방법으로 수득하여, 활성을 저해하지 않으면서 대체 단백질 안정화, 즉 치료 효과를 부여하는데 필요한 상용가능한 함량을 결정할 수 있다.
세포 배양 분석 또는 동물 실험 결과를 이용하여, 인간 및 인간을 제외한 동물에서의 치료적 투약 범위를 설정할 수 있다. 본 발명의 치료 방법에 사용되는 화합물의 투여량은 바람직하기로는 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50(테스트 집단의 50%에 유효한 농도)의 농도를 포함한, 순환성 농도 범위이다. 임의 치료에 사용되는 특정 투여량은 사용되는 특정 투약 형태, 이용되는 투여 경로 및 개체(예, 환자)의 상태 등과 같은 인자에 따라 상기 범위내에서 변경될 수 있다.
치료 유효량은 먼저 세포 배양 분석으로 추정하고 동물 모델에서 일반화하여 IC50을 포함하는 순환성 농도 범위를 달성할 수 있다. 화합물의 IC50 농도는 증상의 최대 저해의 50%를 이루는 농도이다(예, 세포 배양 분석으로 결정). 특정 개체, 예컨대 인간 환자에게 사용하기 위한 적절한 투여량은 이후 이러한 정보를 이용하여 보다 정확하게 결정할 수 있다.
혈장내 화합물의 측정은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 가스 크로마토그래피와 같은 기법에 의해 환자와 같은 개체에서 통상적으로 측정할 수 있다.
화합물의 독성 및 치료 효능은 예컨대 세포 배양 분석에서 표준적인 약학 과정에 의해, 또는 LD50 및 ED50을 결정하기 위한 실험 동물을 이용하여 결정할 수 있다. 매개변수 LD50 및 ED50은 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 각각은 개체의 50%를 치사시키는 화합물의 농도 및 개체의 50%에 치료적으로 유효한 농도이다. 독성과 치료 효과 사이의 투약 비는, 치료 지수라고 하며, 이는 LD50/ED50으로 표시할 수 있다. 치료 지수가 높은 샤페론 화합물이 바람직하다.
하나의 예시적인 투약 요법으로서, N-부틸-DNJ(ZAVESCA®)는 분할된 투약(1일 2-3회)으로 매일 100 내지 300 mg의 경구 투여량을 사용하여 고셰 질환 치료를 위해 투여된다. 100 mg을 투여 후, 고셰 환자에서의 Tmax는 2 내지 2.5시간이다. ZAVESCA의 반감기는 약 6 내지 7시간이며, 이는 매일 3번 투약한 후 1.5 내지 2일까지 안정적인 상태를 수득할 수 있을 것으로 예상된다. ZAVESCA®가 인간에서 대사된다는 증거는 없다.
Gaa의 최적 샤페론 활성에서, 당지질 합성 저해에 필요한 DNJ 유도체의 낮은 함량이 효과적일 것으로 예상된다. 예로, 5 내지 150 mg/day, 특히 5 - 75 mg/day의 투여량이 보다 높은 Gaa 증강 활성을 갖는 DNJ 유도체에게 바람직하다. 일부 DNJ 유도체들은 Gaa 증강 활성을 낮추기 때문에 조금 더 많이 필요할 수 있다.
샤페론 화합물의 최적 농도는 그것의 활성, 조직 또는 순환계에서의 샤페론 화합물의 생체이용성과, 조직 또는 순환계에서 샤페론 화합물의 대사를 방지하지 않으면서, 조직 또는 순환계에서 생체내 재조합 단백질의 적절한 구조를 안정화 및 유도하는데 필요한 함량에 따라 결정될 것이다. 예컨대, 샤페론 화합물이 효소 저해제인 경우, 저해제의 농도는 효소에 대한 특이적인 샤페론의 순환성 IC50에 의해 결정할 수 있다. 화합물의 생체이용성 및 대사를 고려하여, 약 IC50의 농도 또는 IC50 보다 조금 높은 농도를, 예, 효소 활성을 증가시키거나 또는 투여된 효소의 장기적으로 효소 활성을 증가시키는데 필요한 저해제의 양을, 효소 활성에 대한 효과를 근간으로 평가할 수 있다. 예컨대, 알파-Gal a 효소에 대한 화합물 데옥시갈락토노지로마이신(DGJ)의 IC50은 0.04 μM이며, 이는 DGJ가 강력한 저해제임을 시사한다. 따라서, 알파-Gal의 세포내 농도는 투여되는 알파-Gal A 보다 훨씬 낮을 것이다.
효소 대체 요법과의 조합 요법
효소 대체 요법은 주입에 의해 야생형 또는 생물학적 기능 효소를 외인적으로 도입하여, 단백질 양을 증가시키는 것이다. 이러한 요법은 전술한 바를 참조하여 리소좀 축적증(lysosomal storage disorder)인 고셰 질환 및 파이브리 질환을 포함한 수많은 유전 질환에 대해 개발되었다. 야생형 효소는 재조합 세포 발현 시스템으로부터 정제된다(예, 포유류 세포 또는 곤충 세포는 Desnick 등의 미국 특허 5,580,757; Selden 등의 6,395,884 및 6,458,574; Calhoun 등의 6,461,609; Miyamura 등의 6,210,666; Selden 등의 6,083,725; Rasmussen 등의 6,451,600; Rasmussen 등의 5,236,838; 및 Ginns 등의 5,879,680), 인간 태반 또는 동물의 모유(미국 특허 6,188,045, Reuser et al.)). 주입 후, 외인성 효소는 비특이적인 또는 리셉터 특이적인 기전을 통해 조직에 흡수되는 것으로 생각되고 있다. 일반적으로, 흡수 효율은 높지 않으며, 외인성 단백질의 순환 시간은 짧다(Ioannu et al., Am. J. Hum. Genet. 2001; 68: 14-25). 게다가, 외인성 단백질은 불안정적이어서, 신속하게 세포내에서 분해될 수 있을 뿐만 아니라 후속 처리제와 잘못된 면역 반응을 일으킬 가능성이 있다.
폼페 질환의 효소 대체는 여러가지 그룹들, Klinge et al., Neuropediatrics, 2005; 36(1): 6-11; Klinge et al., Neuromuscul Disord. 2005; 15(1): 24-31; Van den Hout et al., J Inherit Metab Dis. 2001; 24(2): 266-74; 및 Amalfitano et al., Genet Med. 2001; 3(2): 132-8에서 언급되었지만, 성공에는 한계가 있었다. 인간에게 투여하기 위한 재조합 Gaa는 Van den Hout et al., Lancet. 2000; 56: 397-8에 언급되어 있다.
본 발명은 미스폴딩(misfolding)이 특징인 돌연변이 Gaa를 갖는 폼페 환자에서 단백질에 대하여 ASSC의 공동-투여에 의한, 정제된 단백질의 생체내 및 시험관내 제형 또는 조성물 안정성 증가로, 단백질의 대체 효과를 증가시킨다.
일 예로, 대체 Gaa 및 샤페론 화합물은 개별 조성물로 제형화된다. 일 예로, DNJ 유도체 샤페론 화합물 및 대체 Gaa는 동일한 경로, 예컨대 정맥내 주입, 또는 바람직하기로는 서로 다른 경로, 예컨대 대체 효소는 정맥내 주입으로 샤페론 화합물은 상기와 같이 경구 투여로 투여할 수 있다.
대체 Gaa는 샤페론 투여에 대한 전술한 임의 경로에 의해 투여되지만, 바람직하기로는 비경구 투여된다. 더 바람직하기로는, 투여는 주사용 멸균 용액으로, 정맥내 투여이다.
다른 예로, 샤페론 화합물 및 대체 Gaa는 단일 조성물로 제형화된다. 이러한 조성물은 저장 및 생체내 투여중에 효소의 안정성을 증가시켜, 따라서 단가를 낮추고 치료 효과를 증가시킨다. 제형은 바람직하기로는, 정맥내, 피하 및 복막내를 포함한 비경구 투여에 적합한 제형일 수 있으며, 경구, 비강내 또는 경피와 같은 다른 투여 경로에 적합한 제형도 포함된다.
투여 시기. 대체 Gaa 및 샤페론 화합물이 개별 제형인 경우에, 투여는 동시적일 수 있으며, 또는 샤페론 화합물은 Gaa 투여 전에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 예로, 대체 효소를 정맥 투여하는 경우, 샤페론 화합물은 0 내지 6시간 이후에 일정 기간동안 투여될 수 있다. 대안적으로 샤페론 화합물은 단백질에 0 내지 6시간 이전에 투여될 수 있다.
바람직한 예로, 샤페론 화합물 및 대체 단백질을 개별 투여하는 경우, 그리고, 샤페론 화합물의 순환성 반감기가 짧은 경우(예, 소형 분자), 샤페론 화합물의 일정한 순화 농도를 유지하기 위해, 매일과 같이 연속적으로 경구 투여할 수 있다. 이러한 일정한 농도는 환자에 무독한 것으로 결정된 것이며, 비저해성 치료 효과를 부여하기 위해 투여 기간 동안 타겟 대체 단백질과의 상호작용 측면에서 최적이다.
다른 예로, 샤페론 화합물은 대체 Gaa의 턴오버에 필요한 시간동안(이는 샤페론 화합물의 투여에 의해 연장됨) 투여된다.
대체 Gaa의 투여량 현 방법에 있어, 대체 효소의 농도는 체중 1 kg당 약 0.05-5.0 mg/kg이고, 전형적으로 매주 또는 2주마다 투여된다. 효소는 0.1 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 바람직하기로는 약 0.1 mg/kg 내지 약 2 mg/kg으로 투여할 수 있다. 예컨대, 파이브리 질환의 치료에 있어, 투여되는 재조합 알파-Gal의 투여량은 전형적으로 0.1-0.3 mg/kg이고, 매주 또는 이주일마다 투여된다. 단백질의 일정한 반복 투여는 환자의 일생동안 필수적이다. 피하 주사는 전신에 대한 약물 노출 시간을 더욱 길게 유지시킨다. 피하 투여량은 체중 1 kg당 알파-Gal A 0.1-5.0 mg이 바람직하며, 이주일마다 또는 매주 투여된다. 알파-Gal A는 또는 정맥내로, 예컨대 정맥내 볼루스 주사로, 느린 푸시 정맥내 주입 또는 연속적인 정맥내 주사에 의해 투여된다. 연속적인 정맥내 주입(예, 2-6시간)으로 혈액에서 특정 농도로 유지시킬 수 있다.
재조합 또는 정제된 Gaa의 유효량은, 폼페에서 타겟 조직인 골격근이 내피 및 세포간 조직에 의해 재조합 투여된 효소로부터 차폐되기 때문에 파이브리 또는 고셰 질환에서 필요한 양 보다 더 높을 것이다. 재조합 Gaa(Myozyme, Genzyme, Inc.)는 현재 폼페 치료제로 승인받았다. 현재, 유럽에서 듀크 대학이 Synpac, Inc.와 산학협력하여 추가적인 실험을 진행하고 있다. 유럽 그룹의 연구에서, 폼페 어린이 환자에게 토끼 모유로부터 재조합 인간 Gaa를 1주 당 15 및 20 mg/kg의 투여량으로 투여하기 시작하였고, 연구를 진행하는 동안에, 근육 조직 활성 수준을 모니터링하면서, 투여량을 일주일에 한번으로 40 mg/kg으로 증가시켰고, 정맥내 주입하였다. 연구는 36주간 144회의 주입으로 수행하였다(Van den Hout et al, Pediatrics. 2004; 113: 448-57). 후발성 폼페 환자 수 명에 대한 한차례의 시도에서, 토끼 모유 유래의 재조합 인간 Gaa를 5% 글루코스 및 0.1% 인간 혈청 알부민이 첨가된 염수내 1 내지 2 mg/ml 용액으로서 처음에는 매주 10 mg/kg의 투여량으로 시작으로 20 mg/kg으로 증가시키면서 정맥내 투여하였다(Winkel et al., Ann Neurol. 2004; 55: 495-502).
유전자 요법과의 조합 요법
미국에서는 아직까지 치료제가 승인되진 않았지만, 수많은 유전자 질환에 대한 유전자 요법(생체외 및 직접 전달)이 조사중에 있다. 또한, 본 발명은 폼페 질환에서 결함성 Gaa를 대체하기 위하여 유전자 요법과 조합한 샤페론 화합물의 사용을 포함한다. 이러한 조합은, 돌연변이된 효소의 접힘 및 프로세싱 강화 뿐만 아니라, 소형 분자 샤페론이 야생형 또는 구조적으로 안정적인 카운터파트의 접힘 및 프로세싱을 강화시키는 것으로 입증되었으므로, 치료적 Gaa의 생체내 발현 수준 증가에 의해 유전자 요법의 효과를 증가시킬 수 있을 것이다(예, 미국 특허 6,274,597, Fan et al., 실시예 3).
최근, Sun et al.(Mol Ther. 2005; 11(1): 57-65)은 폼페 질환의 면역결핍성 마우스 모델(Gaa knock-out/SCID mice)에 정맥내 주사하기 위하여, 인간 Gaa(hGaa; pseudotyped as AAV8(AAV2/8))를 코딩하는 아데노-부속 바이러스(AAV)를 사용하였다. AAV2/8 벡터를 투여한 후 24주동안 혈장내에서 hGa는 고농도로 유지되었다. 심장 및 골격근에서의 Gaa의 결핍증은 수컷 마우스에서 AAV2/8 벡터로 보정되었지만, 암컷 마우스에서는 심장에서만 보정되었다.
당업계에서 이용가능한 또는 이용가능하게 될 유전자 요법의 임의 방법을 사용하여 치료 유전자를 전달할 수 있다. 예는 하기에 개시되어 있다. 유전자 치료 방법에 대한 일반적인 설명으로, Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 1991, 3:87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32:573-596; Mulligan, Science. 1993, 260:926-932; and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993, 62:191- 217; May, TIBTECH 1993, 11:155-215를 참조한다. Ausubel et al.,(eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al.,(eds.), 1994, Current Protocols in Human 5 Genetics, John Wiley & Sons, NY; 및 Colosimo et al., Biotechniques 2000;29(2):314-8, 320-2, 324를 참조한다.
본 발명의 방법으로 투여되는 Gaa 유전자는 통상적인 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법으로 당업계의 기술 범위내에서 분리 및 정제할 수 있다. 예로, 타겟 단백질을 코딩하는 핵산은 문헌에 나타난 바와 같이 재조합 DNA 발현을 이용하여 분리할 수 있다. 예로, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II(D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J.EHiggins eds.(1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & SJ. Higgins, eds.(1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Lmmobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B.E Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)를 참조한다. 단백질을 코딩하는 핵산은 유전자가 생물학적으로 활성인 단백질을 코딩하는 길이로 절단된 것이거나 또는 전장일 수 있다.
Gaa 유전자를 동정 및 분리한 후, 이를 적절한 클로닝 벡터로 삽입할 수 있다. 유전자 요법에 적합한 벡터는, 아데노바이러스 아데노-부속 바이러스(AAV), 백시니아, 헤르페스바이러스, 베큘로바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스, 렌티바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터 및 그외 다양한 진핵 및 원핵 숙주에서의 발현에 대해 언급된 당업계에서 전형적으로 사용되는 재조합 비히클을 포함하며, 단순한 단백질 발현과 유전자 요법에 사용될 수 있다.
바람직한 예로, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터, 특히 아데노바이러스 벡터는 타겟 세포의 바이러스 감염 효율을 증가시키는, 양이온성 지질, 폴리-L-라이신(PLL) 및 디에틸아미노에틸덱스트란(DELAE-덱스트란)과 같은 양이온성 양친성 물질과 복합체를 이룰 수 있다(1997년 11월 20일자 PCT/US97/21496, 원용에 의해 본 명세서에 포함된). 본 발명에 사용하기에 바람직한 바이러스 벡터로는, 백시니아, 헤르페스바이러스 AAV 및 레트로바이러스로부터 유래된 벡터가 있다. 특히, 헤르페스바이러스, 특히 미국 특허 5,672,344에 개시된 것과 같은 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)가 신경 세포에 트랜스유전자 절단에 매우 유용하며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 미국 특허 5,139,941, 5,252,479 및 5,753,500와 PCT 공개공보 WO 97/09441에 개시된 것과 같은 AAV 벡터는, 벡터의 반복적인 투여를 위한 최소 요건을 만족시키면서 숙주 세포에 삽입되므로, 또한 사용가능하며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 유전자 요법에서의 바이러스 벡터에 대한 내용은, McConnell et al, Hum Gene Ther. 2004; 15(11): 1022-33; Mccarty et al, Annu Rev Genet. 2004; 38:819-45; Mah et al., Clin. Pharmacokinet. 2002; 41(12):901-l1; Scott et al., Neuromuscul. Disord. 2002;12 Suppl 1:S23-9을 참조한다. 또한, 미국 특허 5,670,488. Beck et al., Curr Gene Ther. 2004; 4(4): 457-67는 특히 심혈관 세포의 유전자 요법을 설명하고 있다.
전달되는 유전자의 코딩 서열은 발현 조절 서열, 예컨대 유전자의 직접 발현을 인가하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본원에서, 표현 "작동가능하게 연결된"은 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 종결부 및 그외 신호 서열과 같은 뉴클레오티드의 조절 및 작동 서열과의 폴리뉴클레오티드/유전자의 기능성의 상호관계를 의미한다. 예컨대, 핵산 서열의 프로모터로의 작동가능한 연결은 DNA의 전사가 프로모터를 특이적으로 인지하여 결합하는 RNA 중합효소에 의해 프로모터로부터 개시되도록 하는 폴리뉴클레오티드와 프로모터 사이에 물리적이며 기능적인 상호관계를 의미하며, 프로모터는 폴리뉴클레오티드로부터 RNA 전사를 인가한다.
일 특정 예에서, 벡터는 코딩 서열 및 그외 임의의 원하는 서열이 게놈에서 원하는 부위에 상동적인 재조합을 조작하는 부위에 측면으로, 게놈에 삽입된 핵산 분자로부터의 구조체의 발현을 제공하도록, 벡터가 사용된다(Roller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989, 86:8932-8935; Zijlstra et al., Nature. 1989, 342:435-438; U.S. Patent No. 6,244,113 to Zarling et al.; and U.S. Patent No. 6,200,812 to Pati et al.).
유전자 전달
환자에게 벡터 전달은 환자가 벡터 또는 전달 복합체에 직접 노출되는 직접적이거나, 또는 세포에 먼저 시험관내에서 벡터를 형질전환한 후 환자에게 이식하는 간접적일 수 있다. 이러한 두가지 방식은 각각 생체내 및 생체외 유전자 요법으로서 알려져 있다.
직접 전달. 특정 예에서, 벡터는 직접 생체내에 투여되며, 이것은 유기체의 세포로 들어가 유전자의 발현을 매개한다. 이는, 당업계에 공지된 및 전술한 수많은 임의 방법에 의해, 예컨대 적절한 발현 벡터의 일부분으로서 이를 구축한 다음 결함 또는 약독화된 레트로바이러스 또는 그외 바이러스 벡터를 이용한 감염에 의해(미국 특허 4,980,286), 또는 네이키드 DNA의 직접 주사에 의해, 또는 미세입자 총(microparticle bombardment)(예, 유전자 총, Biolistic, Dupont); 또는 지질이나 세포 표면 리셉터 또는 형질감염제로의 코팅, 바이오폴리머내 캡슐화(예, 폴리-β-l-64-N-아세틸글루코사민 폴리사카라이드, 미국 특허 5,635,493), 리포좀, 미세입자 또는 미세캡슐내 캡슐화를 이용하여; 핵으로 도입되는 것으로 알려진 펩티드 또는 다른 리간드와 연결된 것을 투여함으로써; 또는 리셉터 매개의 엔도사이토시스하는 리간드에 연결된 것을 투여함으로써(예, Wu and Wu, J Biol. Chem. 1987, 62:4429-4432) 등과 같이, 달성될 수 있다. 다른 예로, 핵산-리간드 복합체는 리간드가 엔도좀을 파괴하여 리소좀 분해를 방지하기 위한 융합형성 바이러스 펩티드 또는 예컨대 안테나페디아 유래의 치료 DNA를 세포에 이동시키는데 사용할 수 있는 양이온성 12-mer 펩티드를 포함하는 형태로, 만들 수 있다(Mi et al, MoI. Therapy. 2000, 2:339-47). 다른 예로, 핵산은 세포 특이적인 흡수 및 발현에 대해 특이적인 리셉터 타겟팅에 의해 생체내에서 타겟화될 수 있다(예, PCT 공개공보 WO 92/06180, WO 92/22635, WO 92/20316 및 WO 93/14188). 최근, 자기감염(magnetofection)이라고 하는 기법을 사용하여 벡터를 포유류에 전달하고 있다. 이러한 기법은 자기장의 영향하에 전달하기 위한 초상자성 나노입자를 벡터와 조합한다. 이러한 방법은 전달 시간을 단축시키고 벡터 효과를 증강시킨다(Scherer et al., Gene Therapy. 2002; 9:102-9). 추가적인 타겟팅 및 전달 방법은 하기에서 벡터 설명에 있다.
특정 예로, 핵산을 지질 담체를 이용하여 투여할 수 있다. 지질 담체는 네이키드 핵산(예, 플라스미드 DNA)과 조합되어, 세포 막을 통한 관통을 용이하게 할 수 있다. 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질을 이러한 목적으로 사용할 수 있다. 그러나, 이것은 일반적으로 음성 전하를 띄는 DNA와 더 잘 조합하는 것으로 입증되었으므로, 양이온성 지질이 바람직하다. 또한, 양이온성 지질은 플라스미드 DNA의 세포내 전달을 매개하는 것으로 알려져 있다(Feigner and Ringold, Nature. 1989; 337:387). 양이온성 지질-플라스미드 복합체의 마우스로의 정맥내 주사하면, 폐에서 DNA가 발현됨을 확인하였다(Brigham et al, Am. J. Med. Sci 1989; 298:278). 또한, Osaka et al., J. Pharm. ScL 1996; 85(6):612-618; San et al., Human Gene Therapy. 1993; 4:781-788; Senior et al., Biochemica et Biophysica Acta. 1991; 1070:173-179); Kabanov and Kabanov, Bioconjugate Chem. 1995; 6:7-20; Liu et al., Pharmaceut. Res. 1996; 13; Remy et al., Bioconjugate Chem. 1994; 5:647-654; Behr, J-P., Bioconjugate Chem. 1994; 5:382-389; Wyman et al., Biochem. 1997; 36:3008-3017; U.S. Patent No. 5,939,401 to Marshall et al; and U.S. Patent No. 6,331,524 to Scheule et al를 참조한다.
대표적인 양이온성 지질로는 예컨대, 미국 특허 5,283,185 및 5,767,099에 개시된 것을 포함하며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 바람직한 예에서, 양이온성 지질은 미국 특허 5,767,099에 개시된 N4-스페르민 콜리스테릴 카바메이트(GL-67)이다. 추가적으로 바람직한 지질 N4-스페르미딘 콜레스트릴 카바메이트(GL-53) 및 1-(N4-스페르민)-2,3-디라우릴글리세롤 카바메이트(GL-89)가 있다.
바람직하기로는, 바이러스 벡터의 생체내 투여에 있어, 적절한 면역억제 제를 바이러스 벡터 및 형질감염된 세포의 면역-불활성화를 방지하기 위해, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터와 함께 사용한다. 예컨대, 인터루킨-12(IL12), 인터페론-감마(IFN-γ) 또는 항-CD4 항체와 같은 면역억제 사이토카인을 투여하여, 바이러스 벡터에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 차단할 수 있다. 이런 점에서, 최소의 항원을 발현하도록 조작된 바이러스 벡터를 사용하는 것이 좋다.
간접 전달. 체세포는 전술한 임의 방법을 이용하여 야생형 단백질을 코딩하는 구조체로 생체외에서 조작할 수 있다. 이러한 방법은 Selden 등의 WO 93/09222에 개시되어 있다. 또한, 이러한 기법은 Payumo et al., Clin. Orthopaed. and Related Res. 2002; 403 S: S228-S242에 기재된, Cell Based Delivery's proprietary ImPACT 기법으로 사용된다. 이러한 유전자 치료 시스템에서, 체세포(예, 섬유모세포, 간세포 또는 내피 세포)를 환자에서 취하여 시험관내에서 배양한 다음, 원하는 특정화된 치료 유전자와 함께 형질도입하고, 환자에게 다시 도입한다. (개체 또는 조직으로부터 유래된 계대배양전에 조작된) 일차 세포와 (생체내로 도입하기 전에 시험관내에서 계대 배양한) 이차 세포 둘다와, 당업계에 공지된 불멸화 세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용가능한 체세포는 비제한적으로, 섬유모세포, 각질세포, 상피 세포, 내피 세포, 신경교 세포, 신경 세포, 혈액을 형성하는 요소, 근육세포, 배양할 수 있는 그외 체세포 및 체세포 전구체와 같은 체세포를 포함한다. 바람직한 예로, 세포는ㄹ 섬유모세포 또는 간엽 줄기 세포이다.
외인성 유전자와 선택적으로 선별 마커를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 핵산 구조체는 외인성 유전자를 일차 또는 이차 수여 세포내에서 발현시키기에 필수적인 추가적인 서열과 함께 사용하여, 코딩된 산물이 생산되는 일차 또는 이차 세포로 전달된다. 이러한 구조체로는, 레트로바이러스, 헤르페스, 아데노바이러스, 아데노바이러스 부속, mumps 및 폴리오바이러스 벡터와 같은 감염성 벡터를 포함하며, 이러한 목적으로 사용할 수 있다.
경피 전달은 특히 각질세포, 멜라노사이트 및 수지상 세포를 포함한 상피 세포 타입을 이용하여 간접적으로 전달하는데 적합하다(Pfutzner et al., Expert Opin. Investig. Drugs. 2000; 9:2069-83).
간엽 줄기 세포(MSC)는 골수에서 생산되는 비-혈액 생성 줄기 세포이다. MSC는 특수화된 비-혈액 조직으로 분화 및 증식될 수 있다. 레트로바이러스로 형질감염된 줄기 세포는 자기-갱신 능력으로 인해 요법에 좋은 후보물질이다. 이러한 능력은 유전자 요법의 반복적인 투여를 방지한다. 다른 이점은, 주입된 줄기 세포가 타겟 장기에 도달하여 분화된다면, 이는 장기에서 손상된 또는 기형의 세포를 대체할 수 있다는 것이다.
시험관내 안정성
저장 수명동안에 약학 제형의 안정성을 보장하는 것은 중요한 과제이다. 이는 단백질 약제를 개발하기 전에, 활성 성분의 고유 또는 잠재적인 불안정성을 조사하여 해결하여야 한다. 단백질 및 펩티드 치료제의 불안정성은 화학적 불안정성 또는 물리적인 불안정성으로 나뉜다. 화학적 불안정성의 예는 가수분해, 산화 및 탈아미드화이다. 물리적 불안정성의 예는 응집, 침전 및 표면 흡착이다. 또한, 단백질은 pH, 온도, 전단응력, 동결/해동 스트레스 및 이들 스트레스의 조합과 같은 스트레스를 겪을 수 있다.
가장 심각한 제형의 문제점 중 하나는 생활성을 소실시키는 제품 응집이다. 부형제 첨가는 이러한 과정을 서행시킬 수 있지만 완벽하게 이를 방지하진 못할 수 있다. 활성 소실은 물리적 분석에 의해 검출할 수 있거나 검출할 수 없을 수 있으며, 생물분석 또는 효능 분석에서 큰(흔히 15-20%) 변이 계수로 표시되지만 이는 실제 소실 정도를 측정하기 어렵다.
투여되는 대체 효소의 안정화 뿐만 아니라, 샤페론 화합물의 존재는 약학 제형을 약 pH 7.0-7.5의 중성에서 보관가능하게 한다. 이는 정상적으로 안정성을 유지하기 위해 보다 낮은 pH에서 보관되어야 하는 효소에게 유리하다. 예컨대, Gaa를 포함하여 리소좀 효소는 낮은 pH(예, 5.0 또는 미만)에서 안정적인 구조를 유지한다. 그러나, 대체 효소를 낮은 pH에 장기간 보관하며, 효소 및/또는 제형의 분해를 촉진시킬 수 있다. 안정성 샤페론 화합물의 첨가는 산에서의 대체 단백질을 보관할 필요성을 경감시킬 수 있다.
특허 또는 특허출원은 적어도 하나의 컬러 도면을 포함하고 있다. 컬러 도면이 있는 특허 또는 특허출원 공보의 사본은 필수 비용의 지불과 요청에 의해 제공될 것이다.
도 1. 도 1은 폼페병 세포주 PM-11에서의 산 α-글루코시다제 활성상의 1-DNJ, NB-DNJ 및 N-(사이클로프로필)메틸 DNJ 이미도당 유도체의 효과를 나타낸다.
도 2A-D. 도 2는 다양한 농도의 DNJ 및 NB-DNJ로 2주 동안 처리한 정상 C57BL6 마우스의 뇌(2A), 간장(2B), 비복근(2C), 및 혀(2D)에서의 Gaa 상승을 보여준다.
도 3A-D. 도 3은 다양한 농도의 DNJ 및 NB-DNJ로 2주 동안 처리한 정상 C5BL6 마우스의 신장(3A), 횡경막(3B), 심장(3C), 및 비장근(3D)에서의 Gaa 상승을 보여준다.
도 4A-D. 도 4는 다양한 농도의 DNJ 및 NB-DNJ로 4주 동안 처리한 정상 C57BL6 마우스의 뇌(4A), 간장(4B), 비복근(4C), 및 혀(4D)에서의 Gaa 상승을 보여준다.
도 5A-D. 도 5는 다양한 농도의 DNJ 및 NB-DNJ로 4주 동안 처리한 정상 C57BL6 마우스의 신장(5A), 횡경막(5B), 심장(5C), 및 비장근(5D)에서의 Gaa 상승을 보여준다.
도 6A-H. 도 6은 야생형(6C) 및 폼페 PM8(6A 및 6F) 섬유모세포에서의 Gaa 면역염색을 보여준다. 이 도면은 또한 야생형(6D) 및 폼페 PM8 섬유모세포(6B 및 6E)에서 리소좀 마커 LAMP-I에 대한 리소좀 염색을 보여준다. 야생형(6H) 및 PM8(6G) 섬유모세포에 대한 Gaa 및 LAMP-I 염색의 중첩이 또한 보여진다.
도 7A-F. 도 7은 PM9 폼페 섬유모세포에서의 Gaa(7B 및 D) 및 LAMP-I(7E)에 대한 면역형광 염색을 보여준다. Gaa 및 LAMP-I 염색의 중첩이 또한 보여진다(7 A, 7C 및 7F).
도 8. 도 8은 DNJ 또는 NB-DNJ로 처리한 Gaa, LAMP-I, 및 Gaa/L AMP-I 이중 염색 PM11 폼페 세포주를 나타내고 있다.
본 발명은 하기 실시예로 추가적으로 설명한다. 이러한 실시예들은 단지 예시에 불과하며 어떠한 방식으로도 본 발명 또는 예시된 것의 범위 및 의미를 한정하는 것은 아니다. 이와같이, 본 발명은 하기 바람직한 특정 예로 한정되지 않는다. 실제, 본 명세서에 따라 본 발명에 대한 수많은 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것이지만, 본 발명의 사상 및 범위에서 이탈되지 않는 범위로 행해질 수 있다. 본 발명은 따라서 청구항에 부여된 등가의 전체 범위로 첨부된 청구항 측면으로만 한정된다.
실시예 1: DNJ 및 유도체의 합성
테트라-O-벤질-1-데옥시노지리마이신[통상적인 이미노슈가(iminosugar)의 제조 방법-1]
Figure 112007090581802-PCT00022
건조 CH2Cl2 (75 mL)와 DMSO (4.4 mL, 0.124 mol)의 용액을 아르곤 분위기 하에 둔 다음, -78℃로 냉각시켰다. 그런 다음, 온도를 -78℃로 유지시키면서, 건조 CH2Cl2 (50 mL)와 트리플루오로아세트산 무수물(6.1 mL, 0.088 mol)의 용액을 서 서히 첨가하였다. 첨가 반응을 완료한 후, 얻어진 반응물을 30분간 더 교반하였다. 교반 후, CH2Cl2와 2,3,4,6-테트라-O-벤질글루시톨 (5.4 g, 10 mmol)의 용액을 적하 첨가하였다. 이렇게 하여 얻어진 반응물을 -78℃에서 90분간 교반한 후, CH2Cl2 (50 mL) 중에서 트리에틸아민(11.2 mL, 0.08 mol)을 첨가하여, 급랭(quenching)하였다. 그런 다음, 상기 반응물의 온도를 0℃로 승온(warming)한 후, 회전 증발기를 이용하여, 농축시켰다. 그 잔사를 MeOH (75 mL)로 희석시킨 다음, MeOH (10.0 mL, 20.0 mmol)와 2M NH3의 용액을 첨가한 후, 포름산(0.77 mL, 20.0 mmol), 3Å의 분자 체(molecular sieve), 끝으로 NaCNBH3 (1.57 g, 25.0 mmol)를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 회전 증발기를 이용하여, 상기 용매를 증발시켰다. 잔사를 EtOAc에 용해한 다음, 10% Na2CO3로 세척한 후, Na2SO4로 건조하였다. 건조된 물질을 여과한 후, 상기 용매를 증발시킨 다음, 얻어진 생성물을 플래시 크로마토그래피(헥산 중에서의 20-40% EtOAc 단계 구배)에 의해 정제함으로써, 2,3,4,6-테트라벤질-1-데옥시노지리마이신을 얻었다.
1-데옥시노지리마이신 하이드로클로라이드 (화합물 1)
Figure 112007090581802-PCT00023
EtOH (100 mL)와 2,3,4,6-테트라벤질-1-데옥시노지리마이신(5.0 g, 9.5 mmol)의 용액을, 2-PrOH (3.0 mL, 15.0 mmol) 중의 5N HCl과 함께 교반한 다음, 회 전 증발기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 그 잔사를 EtOH 중에 용해한 후, 다시 회전 증발기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 그 잔사를 EtOH(150 mL)에 용해한 다음, 0.5 g의 Pd(OH)2의 존재 하에, 실온에서 하룻밤 동안 수소화하였다(50 psi). 여과에 의해 상기 촉매를 제거한 다음, 필터 케이크를 EtOH/H2O로 세정하고, 최종적으로 EtOH로 세정하였다. 이렇게 하여 얻어진 여액을 회전 증발기 상에서 증발시킨 다음, EtOH와 함께 공동 증발(co-evaporation)시켜, 백색의 고체를 얻었다. 얻어진 고체를 EtOH로 혼화(trituration)한 다음, 여과하여, 백색의 고체를 수득하였다. 그런 다음, EtOH/H2O로부터 재결정화함으로써, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. MP 212-215℃, MH+= 164.
N-(2-하이드록시에틸)-1-데옥시노지리마이신 디메틸 카르바메이트 (화합물 15)
Figure 112007090581802-PCT00024
N-(2-하이드록시에틸)-테트라-O-벤질-1-데옥시노지리마이신 디메틸 카르바메이트(0.63 g, 0.99 mmol)를 50 ml의 메탄올에 용해한 다음, 130 마이크로리터의 농축 염산(1.6 mmol), 및 촉매로서 20% 팔라듐 하이드록사이드(0.2 g, 0.3 mmol)를 사용하여 처리하였다. 이렇게 하여 얻어진 불균질 반응 혼합물을 수소 분위기 하 에 두고, 15시간 동안 교반하였다. 셀라이트를 통한 여과에 의해 상기 촉매를 제거한 다음, 메탄올을 더 사용하여, 세정하였다. 그 여액을 회전 증발기에 의해 농축시킨 다음, 얻어진 미정제 생성물(crude product)을, 클로로포름:메탄올(4:1)을 용출 용매로 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그런 다음, 회전 증발기를 사용하여, 적절한 분획을 농축한 후, 동결 건조함으로써, N-(2-하이드록시에틸)-1-데옥시노지리마이신 디메틸 카르바메이트 유도체(V, 화합물 14)를 얻었다 (MS= 279.4, M+H).
N-(2-(2,2,2-트리플루오로에톡시에틸)-1-데옥시노지리마이신(화합물 19)
Figure 112007090581802-PCT00025
트리플루오로에틸 에테르 중간 생성물(IX) (0.40 g, 0.62 mmol)를 150 ml의 메탄올에 용해한 다음, 130 마이크로리터의 농축 염산(1.6 mmol) 및 20% 팔라듐 하이드록사이드(0.2 g, 0.3 mmol)를 사용하여 처리하였다. 이렇게 하여 얻어진 불균질 반응 혼합물을 수소 분위기 하에 둔 다음, Parr 셰이커를 사용하여, 40 psi로 가압하였다. 32시간 후, 셀라이트에 의해 여과하여 상기 촉매를 제거한 다음, 메탄올을 더 사용하여 세정하였다. 그 여액을 회전 증발기로 농축한 후, 얻어진 미정제 생성물을, 클로로포름:메탄올(4:1)을 용출 용매로 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그런 다음, 회전 증발기를 사용하여, 적절한 분획을 농축한 후, 동결 건조함으로써, 황색 폼(foam) 형태의 N-(2-(2,2,2-트리플루오로에톡시에틸)-1-데옥시노지리마이신을 얻었다 (MS = 290.2, M+H).
N-(메톡시에틸)DNJ (화합물 20)
Figure 112007090581802-PCT00026
NH3 대신에 2-메톡시에틸 아민을 사용한 것을 제외하고는, 전술한 통상적인 이미노슈가 제조 방법-1을 이용하여, 표제 화합물을 얻었다. MS (ES+): 222 [M+l].
N-(에톡시에틸)DNJ (화합물 21)
Figure 112007090581802-PCT00027
NH3 대신에 2-에톡시에틸 아민을 사용한 것을 제외하고는, 전술한 통상적인 이미노슈가 제조 방법-1을 이용하여, 표제 화합물을 얻었다. MS (ES+): 258 [M+Na].
N-R-(-)-테트라하이드로퓨라닐메틸-1-데옥시노지리마이신 (화합물 17)
Figure 112007090581802-PCT00028
60℃로 승온하는 한편, 60 psi의 수소 분위기 하에, 에탄올 중의 팔라듐 하이드록사이드를 사용하여, 테트라하이드로퓨라닐메틸-테트라-O-벤질-1-데옥시노지리마이신으로부터 벤질을 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 미정제 생성물을, 클로로포름:메탄올:암모늄 하이드록사이드(80:20:2)의 혼합물을 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 백색 폼 형태의, 표제 화합물의 유리 염기(free base)를 얻었다. 그런 다음, 정제된 유리 염기를, 2-프로판올 내 1.0 당량의 무수 염산으로 처리하여, 하이드로클로라이드염으로 전환하였다. 회전 증발기를 사용하여, 상기 용매를 제거함으로써, 백색 고체 형태의 원하는 하이드로클로라이드염을 얻었다 (MS = 248.2, M+H).
N-S-(+)-테트라하이드로퓨라닐메틸-1-데옥시노지리마이신 (화합물 18)
Figure 112007090581802-PCT00029
60℃로 승온하는 한편, 60 psi의 수소 분위기 하에, 메탄올 중의 팔라듐 하이드록사이드를 사용하여, N-S-(+)-테트라하이드로퓨라닐메틸-테트라-O-벤질-1-데 옥시노지리마이신으로부터 벤질을 제거하였다. 이렇게 하여 얻어진 미정제 생성물을, 클로로포름:메탄올:암모늄 하이드록사이드(80:20:2)의 혼합물을 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 백색 폼 형태의 표제 화합물을 얻었다 (MS = 248.2, M+H).
N-에틸-DNJ (화합물 3) [통상적인 이미노슈가 제조 방법-2]
Figure 112007090581802-PCT00030
1-DNJ (1.O g, 6.1 mmol), 메탄올(60 mL), 탈이온화수(3.0 mL), 아세트알데히드(6.2 g, 141 mmol) 및 Pd 블랙(50 mg)의 혼합물을 신속하게 교반한 다음, 60 psi 압력의 H2 분위기 하, 20-22℃에서 20시간 동안 수소화하였다. 그런 다음, Celite-545의 상(bed)를 통해 여과함으로써 상기 촉매를 제거하였다. 그 여액을, 회전 증발기를 사용하여 증발시켰다. 얻어진 비휘발성 잔사를 플래시 실리카겔 칼럼에 적용하여, 메틸렌 클로라이드: 메탄올: 29% 및 농축 NH4OH (70:30:5)로 이루어진 혼합물을 사용하여 용출시켰다. 적절한 분획을 수집하여, 합한 다음, 회전식 증발기로 용매를 증발시켰다. 그런 다음, 동결 건조시킴으로써, 분리된 원하는 생성물을 얻었다. MP 168.3-169.6℃, m/z 192 (ES, [M+H]+).
N-프로필-DNJ (화합물 4)
Figure 112007090581802-PCT00031
1-DNJ (1.O g, 6.1 mmol), 메탄올(6O mL), 탈이온화수(10.0 mL), 프로피온알데히드(8.1, 139 mmol) 및 Pd black (100 mg)의 혼합물을 교반한 후, 전술한 N-에틸-DNJ의 제조에서와 유사한 조건 하에 처리하였다. 이렇게 하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. MP: 56.6-57.2℃, m/z 206 (ES, [M+H]+).
N-펜틸-DNJ (화합물 6)
Figure 112007090581802-PCT00032
1-DNJ (1.O g, 6.1 mmol), 메탄올(10O mL), 탈이온화수(10.0 mL), 발레르알데히드(valeraldehyde) (4.22 g, 49 mmol) 및 Pd 블랙(lOO mg)의 혼합물을 신속하게 교반한 다음, 전술한 N-에틸-DNJ의 제조에서와 유사한 조건 하에 처리하였다. 이렇게 하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. MP 70-71℃, m/z 234 (ES, [M+H]+).
N-헥실-DNJ (화합물 7)
Figure 112007090581802-PCT00033
1-DNJ (1.O g, 6.1 mmol), 메탄올(100 mL), 탈이온화수(3.0 mL), 헥사날(4.3 g, 42.9 mmol) 및 Pd 블랙(50 mg)의 혼합물을 신속하게 교반한 다음, 전술한 N-에틸-DNJ의 제조에서와 유사한 조건 하에 처리하였다. 이렇게 하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. MP 64.4-65.6℃, m/z 248 (ES, [M+H]+).
N-헵틸-DNJ (화합물 8)
Figure 112007090581802-PCT00034
1-DNJ-HCl (1.0 g, 5.0 mmol), 메탄올(100 mL), 헵트알데히드(heptaldehyde)(4.9 g, 42.9 mmol) 및 Pd 블랙(50 mg)의 혼합물을 신속하게 교반한 다음, 전술한 N-에틸-DNJ의 제조에서와 유사한 조건 하에 처리하였다. 이렇게 하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. MP 107-108℃, m/z 262 (ES, [M+H]+).
N-옥틸-DNJ (화합물 9)
Figure 112007090581802-PCT00035
1-DNJ-HCl (1.0 g, 5.0 mmol), 메탄올(100 mL), 옥틸 알데히드(4.9 g, 42.9 mmol) 및 Pd 블랙(50 mg)의 혼합물을 신속하게 교반한 다음, 전술한 N-에틸-DNJ의 제조에서와 유사한 조건 하에 처리하였다. 이렇게 하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. MP 193-195℃, m/z 276 (ES, [M+H]+).
N-((벤조퓨란-2-일)메틸)데옥시노지리마이신 (화합물 30)
Figure 112007090581802-PCT00036
EtOH (3O mL)와 데옥시노지리마이신 하이드로클로라이드(0.5 g, 2.5 mmol)의 현탁액을, 벤조퓨란-2-카르복스알데히드(0.55 g, 3.75 mmol), HOAc (0.15 mL, 3.75 mmol) 및 소듐 시아노보로하이드라이드(0.23 g, 3.75 mmol)로 처리하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 24-36시간 동안 교반하였다. 회전식 증발기를 사용하여, 상기 용매를 증발시킨 다음, 그 잔사를 9/1의 혼합비로 혼합된 MeOH/NH4OH의 혼합 용매에 용해한 후, 실리카 상에서 상기 용매를 증발시켰다. 그런 다음, 얻어진 물질을 CHCl3 내에서 0 내지 20% (9/1 MeOH/NH4OH) 구배의 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 적절한 분획을 합하고, 상기 용매를 증발시킴으로써, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. mp 169-175℃. MH+ = 294.
N-((벤조티오펜-3-일)메틸)데옥시노지리마이신 (화합물 31)
Figure 112007090581802-PCT00037
벤조퓨란-2-카르복스알데히드 대신에 벤조티오펜-3-카르복스알데히드를 사용한 것을 제외하고는, 전술한 화합물의 제조 방법을 이용하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. mp 145-149℃. MH+= 310.
N-((퓨란-2-일)메틸)데옥시노지리마이신 (화합물 29)
Figure 112007090581802-PCT00038
벤조퓨란-2-카르복스알데히드 대신에 퓨르퓨랄(furfural)을 사용한 것을 제외하고는, 전술한 화합물의 제조 방법을 이용하여, 무색 오일 형태의 표제 화합물을 얻었다. MH+= 244.
N-((1,4-벤조디옥산-6-일)메틸)데옥시노지리마이신 (화합물 28)
Figure 112007090581802-PCT00039
벤조퓨란-2-카르복스알데히드 대신에 1,4-벤조디옥산-6-카르복스알데히드를 사용한 것을 제외하고는, 전술한 화합물의 제조 방법을 이용하여, 비정질 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다. MH+= 312.
N-사이클로프로필메틸-1-데옥시노지리마이신 (화합물 11)
[통상적인 이미노슈가 제조 방법-3]
Figure 112007090581802-PCT00040
1-데옥시노지리마이신(Toronto Research Chemicals, Cat. No. D245000, 3.O g, 18.4 mmol)을 300 ml의 무수 메탄올에 용해한 다음, 사이클로프로판 카르복스알데히드(Aldrich, 2.5 ml, 33.1 mmol)와 합하였다. 그런 다음, 3 옹스트롬의 분자 체(6.0 g)를 첨가하고, 얻어진 혼합물을 15분간 교반하였다. 교반된 물질에 MP-시아노보로하이드라이드(Argonaut Technologies, 19.2 g, 46.0 mmol)를 첨가한 다음, 빙초산(1.1 ml, 18.4 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물의 온도를 45℃로 48시간 동안 승온하였다. 얻어진 용액을 회전 증발기로 농축시키고, 얻어진 미정제 생성물을, 혼합비 5:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10/1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 3:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10/1) 혼합 용매를, 끝으로 혼합비 1:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10/1) 혼합 용매를 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 그런 다음, 회전 증발기를 이용하여, 적절한 분획을 농축함으로써, 백색 폼 형태의 표제 화합물을 분리하였다 (MS = 218.8, M+H).
4-트리플루오로메틸(벤질)-DNJ (화합물 23) 및 알파-시아노-4-트리플루오로메틸(벤질)-DNJ (화합물 24)
Figure 112007090581802-PCT00041
통상적인 이미노슈가 제조 방법-3을 이용하여, 1-데옥시노지리마이신(300 mg, 1.839 mmol), 4-트리플루오로메틸벤즈알데히드(Aldrich, 576.2 mg, 3.309 mmol), MP-시아노보로하이드라이드(Argonaut Technologies, 1.92 g, 4.596 mmol), 및 아세트산(110.4 mg, 1.839 mmol)을 합한 다음, 전술한 통상적인 합성 과정에서와 같이 교반하였다. 얻어진 물질을, 제일 먼저 클로로포름을, 그 다음에는 혼합비 10:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 8:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 6:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 4:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 백색 고체 형태의 4-트리플루오로메틸(벤질)-DNJ(MS= 322, M+H), 및 백색 고체 형태의 알파-시아노-4-트리플루오로메틸(벤질)-DNJ(MS= 347, M+H)을 얻었다.
4-트리플루오로메톡시(벤질)-DNJ (화합물 25)
Figure 112007090581802-PCT00042
통상적인 이미노슈가 제조 방법-3을 이용하여, 1-데옥시노지리마이신(300 mg, 1.839 mmol), 4-트리플루오로메톡시벤즈알데히드(Aldrich, 629.2 mg, 3.309 mmol), MP-시아노보로하이드라이드(Argonaut Technologies, 1.92 g, 4.596 mmol) 및 아세트산(110.4 mg, 1.839 mmol)을 합한 다음, 전술한 통상적인 합성 과정에서와 같이 교반하였다. 얻어진 물질을, 제일 먼저 클로로포름을, 그 다음에는 혼합비 10:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 8:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 6:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 4:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다(MS = 338, M+H, MP 101-103℃).
4-n-부톡시(벤질)-DNJ (화합물 27)
Figure 112007090581802-PCT00043
통상적인 이미노슈가 제조 방법-3을 이용하여, 1-데옥시노지리마이신(1.0 g, 6.1 mmol), 4-부톡시벤즈알데히드(Aldrich, 2.0 g 11.2 mmol), MP-시아노보로하이드라이드(Argonaut Technologies, 6.4 g, 15.3 mmol) 및 아세트산(0.37 ml, 6.4 mmol)을 합한 다음, 전술한 통상적인 합성 과정에서와 같이 교반하였다. 얻어진 물질을, 제일 먼저 클로로포름을, 그 다음에는 혼합비 10:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 8:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 6:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 4:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다(MP 153-155℃).
4-n-펜톡시(벤질)-DNJ (화합물 26)
Figure 112007090581802-PCT00044
통상적인 이미노슈가 제조 방법-3을 이용하여, 1-데옥시노지리마이신(1.0 g, 6.1 mmol), 4-부톡시벤즈알데히드(Alfa Aesar, 2.2 g 11.2 mmol), MP-시아노보로하이드라이드(Argonaut Technologies, 6.4 g, 15.3 mmol) 및 아세트산(0.37 ml, 6.4 mmol)을 합한 다음, 전술한 통상적인 합성 과정에서와 같이 교반하였다. 얻어진 물질을, 제일 먼저 클로로포름을, 그 다음에는 혼합비 10:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 8:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 6:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 4:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 백색 고체 형태의 표제 화합물을 얻었다(MS=340, M+H; MP 155-157℃).
N-(1-(tert-부톡시카르보닐)-4-피페리디닐메틸)-1-데옥시노지리마이신 (화합물 16)
Figure 112007090581802-PCT00045
통상적인 이미노슈가 제조 방법-3을 이용하여, 1-데옥시노지리마이신(500 mg, 3.064 mmol), 1-(tert-부톡시카르보닐)-4-피페리딘카르복스알데히드(CNH Technologies, 1.18 g, 5.516 mmol), MP-시아노보로하이드라이드(Argonaut Technologies, 3.19 g, 4.596 mmol) 및 아세트산(184 mg, 3.064 mmol)을 합한 다음, 전술한 통상적인 합성 과정에서와 같이 교반하였다. 얻어진 물질을, 제일 먼저 클로로포름을, 그 다음에는 혼합비 10:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 회백색(off-white) 고체 형태의 N-(1-(tert-부톡시카르보닐)-4-피페리디닐메틸)-1-데옥시노지리마이신을 얻었다(MS=361, M+H, MP 46-50℃).
N-사이클로펜틸메틸-1-데옥시노지리마이신 (화합물 12)
Figure 112007090581802-PCT00046
통상적인 이미노슈가 제조 방법-3을 이용하여, 1-데옥시노지리마이신(500 mg, 3.064 mmol), 사이클로펜탄카르복스알데히드(Aldrich, 541 mg, 5.516 mmol), MP-시아노보로하이드라이드(Argonaut Technologies, 3.19 g, 7.661 mmol) 및 아세트산(184 mg, 3.064 mmol)을 합한 다음, 전술한 통상적인 합성 과정에서와 같이 교반하였다. 얻어진 물질을, 제일 먼저 클로로포름을, 그 다음에는 혼합비 8:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를, 그 다음에는 혼합비 4:1의 클로로포름:메탄올/암모늄 하이드록사이드(10:1) 혼합 용매를 용출 용매로서 사용하는 플래시 실리카겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 점성이 있는 황갈색 오일 형태의 N-사이클로펜틸메틸-1-데옥시노지리마이신을 얻었다 (MS=246, M+H).
C-1-α-노닐-1-데옥시노지리마이신 및 C-1-β-노닐-1-데옥시노지리마이신 (화합물 32)[통상적인 이미노슈가 제조 방법-4]
Figure 112007090581802-PCT00047
본 실시예에서는 Boshagen, Geiger 및 Junge에 의한 절차와 유사한 절차를 사용하였다(Angewante Chemie, Int. Ed. Engl., 20(9), 806-807(1981). Marcuccio의 방법(WO 00/56713)에 따라, 1-α-시아노-1-데옥시노지리마이신(1.0 g, 5.3 mmol)을 제조한 다음, 헥사메틸디실라잔(11 mL)에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액을 이미다졸(156.3 mg, 2.5 mmol)로 처리한 다음, 아르곤 분위기 하, 60℃의 온도에서 5시간 동안 가열하였다. 얻어진 혼합물을 여과하여, 상기 고체 물질을 제거한 다음, 그 여액을 55-6O℃의 온도에서 회전 증발기로 농축하였다. 그 잔사를 건조 THF (5O mL)에 용해한 다음, 15-2O℃에서 n-노닐마그네슘브로마이드의 용액(에테르 중 1 M, 31.9 mmol, 38 mL)을 첨가하였다. 이렇게 하여 얻어진 혼합물을 실온으로 승온한 다음, 5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 아이스 배쓰(ice-bath)에서 냉각시킨 다음, 1N HCl (3O mL)과 함께 3시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 상기 혼합물에 2N NaOH를 첨가하여, 상기 혼합물의 pH를 8.0으로 조정하였다. 유기층을 제거한 다음, 수상(aqueous phase)을 동결 건조하였다. 그 잔사를 메탄올(5O mL)에 용해한 후, 여과하여, 상기 고체 물질을 제거하였다. 그 여액을 진공 건조하여 증발시켰다. 증발 후에 얻어진 잔사를, 메틸렌 클로라이드:메탄올:29% NH4OH (85:15:1.5)의 혼합 용매를 사용하는 실리카겔 컬럼 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. β-이성질체를 포함하는 적절한 분획(Rf 0.5)을 합한 다음, 회전 증발기를 사용하여 상기 용매를 증발시킨 후, 동결 건조함으로써, C-1-β-노닐-DNJ를 얻었다 (MS =m/z 290).
C1-α-부틸-DNJ (화합물 33)
Figure 112007090581802-PCT00048
통상적인 이미노슈가 제조 방법-4를 이용하여, 1-α-시아노-1-데옥시노지리마이신(2.O g, 9.5 mmol)을 C-1-α-부틸-DNJ로 전환하였다. 얻어진 생성물을, 메틸렌 클로라이드:메탄올:29% NH4OH(혼합비=85:15:1.5)의 혼합 용매를 사용하는 실리 카겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. α-이성질체를 포함하는 적절한 분획(Rf 0.3)을 합한 다음, 증발에 의해 용매를 제거한 후, 동결 건조함으로써, 표제 화합물을 얻었다(MS = m/z 220).
C1-α-벤질-DNJ (화합물 35)
Figure 112007090581802-PCT00049
통상적인 이미노슈가 제조 방법-4를 이용하여, 테트라-(O-트리메틸실릴)-1-α-시아노-1-데옥시노지리마이신(2.O g, 9.448 mmol)을 제조하였다. 이렇게 하여 얻어진 보호된 화합물을 건조 THF (2O mL)에 용해한 다음, 벤질마그네슘브로마이드(THF 중 2.0 M, 2O mL)를 적하 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 교반한 다음, 45℃에서 하룻밤 동안 가열하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각하고, 2N HCl (3O mL)을 첨가한 후, 얻어진 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 회전 증발기를 이용하여, 상기 용매를 증발시킨 다음, 잔사를 29% NH4OH 용액으로 처리하여, 상기 산을 중화시켰다. 상기 용액을 에테르(2×2O mL)로 세정한 다음, 수상을 분리하여, 동결 건조시켰다. 얻어진 고체를, 메틸렌 클로라이드:메탄올:29% NH4OH 혼합 용매(혼합비=80:20:4)와 함께 교반한 다음, 여과한 후, 그 여액을 회전식 증발기로 증발시켰다. 그 잔사를, 메틸렌 클로라이드:메탄올:29% NH4OH 혼합 용매(혼합비=80:20:4)를 사용하는 실리카겔 칼럼 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하였다. α-이성질체 를 포함하는 적절한 분획(Rf 0.3)을 합하여, 회전 증발기로 용매를 증발시킨 다음, 동결 건조하여, 표제 화합물을 얻었다 (MP = 73-74℃, MS = m/z 254).
1H-NMR, 300 MHz (D2O) 2.28 (m, 2H), 2.55 (ddd, IH, J=2.8, 5.6,10Hz), 2.99 (m, 2H), 3.06 (dd, 1H, J=2.8, 13.6Hz), 3.11(m, 1H), 3.22 (dd, 1H, J=7.6, 11.2Hz), 3.56(dd, 1H, J=3.2,11.6Hz), and 7.2 (m, 5H).
실시예 2: DNJ 및 DNJ 유사체를 이용한 Gaa의 증강
하기 실험은 당지질 합성에 관여하는 효소에 대한 공지된 저해제인 DNJ와 DNJ 유사체인 N-부틸-DNJ가 당지질 합성을 저해하지 않으면서 돌연변이 Gaa에 결합하여 활성을 증강시킬 수 있다는 것을 입증한다.
방법
세포 배양 및 접종. PM11(P545L), PM8 및 PM12(둘다 일부 결함이 있음), 섬유모세포주를 증강 실험에 사용하였다. 이들 세포는 폼페 환자로부터 분리한 섬유모세포이다. 세포를 멸균한 블랙 클리어 바닥의 96웰 코스터 플레이트내 180 ㎕의 배지에, 웰당 5000개로 접종하고, 37℃, 5% 이산화탄소 조건으로 약 3-6시간 인큐베이션하였다. 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM으로 배지를 구성하였다.
약물 처리. 모든 테스트 화합물은 1:1 DMSO:H2O에 스톡 농도 100 mM로 용해시켰다. 다른 멸균한 블랙 클리어 바닥의 코스터 플레이트를 이용하여 세포의 연속 희석을 하기와 같이 수행하였다:
1. 20 ㎕의 1 : 1 DMSO:H20 와 180 ㎕의 배지를 줄 3-11 및 1, 열 E-H에 배지중의 5% DMSO, 5% H2O의 농도에 첨가하였다.
2. 20 ㎕의 100 mM DNJ 및 180 ㎕의 배지를 줄 1, 열 A-D에 1O mM DNJ 농도로 첨가하였다.
3. 30 ㎕의 각 10O mM의 테스트 스톡 용액을 줄 2에 270 ㎕의 배지와 함께 적당한 웰에 10 mM 농도로 첨가하였다.
4. 줄 1을 멀티-채널 파이펫으로 상하 혼합하였다.
5. 줄 2를 상기와 같이 혼합하고, 100 ㎕을 줄 2번에서 3번으로 이동시켰다. 3번 줄을 상기와 같이 혼합하고, 100 ㎕을 3배수 연속 희석물을 만들기 위해 11(줄 12는 좌측 블랭크)를 통해 각 줄 4번으로 연속 이동시켰다.
4. 표 1에 따라 연속 희석 플레이트에서 20 ㎕을 이동시켯다.
5. 플레이트는 투약 일과 같은 1일에 6일간 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 인큐베이션하였다.
효소 활성 분석. 세포는 200 ㎕의 dPBS로 2번 세정하고, 시트레이트-포스페이트 완충액(30 mM 소듐 시트레이트, 40 mM 소듐 포스페이트 다이베이직, pH 4.0) 중에 70 ㎕의 기질(2.11 mM 3 mM 4-MU-α-D-glu)과 2.5 % DMSO를 줄 1-12에 첨가하였다. 3시간동안 37℃에서 5% 이산화탄소하에서 인큐베이션한 다음, 정지 완충액(0.4 M 글리신 pH 10.8) 70 ㎕을 줄 1-12에 첨가하였다. Victor2 멀티라벨 카운터- Wallac 형광 플레이트 판독기에서 플레이트를 판독하고, F460 nm에서 여기 355 nm 및 방출 460 nm에서 웰당 1초의 판독 시간으로 b를 결정하였다. 현탁물내 단백질 1 μg 당 효소 활성은 가수분해된 기질의 함량과 직접적으로 비례되어 따라서 용해물내 Gaa 활성 정도인 방출된 형광량으로부터 계산하였다. 증강 비율은 화합물의 첨가없이 Gaa 활성으로 나눈 DNJ 유도체 존재시의 Gaa 활성이다.
결과
DNJ, NB-DNJ 및 N-(사이클로프로필)메틸 DNJ. 도 1에 나타낸 바와 같이, DNJ(1), N-부틸-DNJ(5) 및 N-(사이클로프로필)메틸 DNJ(11)은 PM11 세포주에서 무처리 대조군 세포에 비해 Gaa 활성의 농도 의존적인 증가를 보였다. 최고 농도의 DNJ 1 mM은 Gaa 활성을 무처리 세포에 비해 약 7.8배 증가시킨다(데이타 미기재).
DNJ 및 NB-DNJ 역시 PM12 세포주에서 50 μM 농도에서 Gaa 활성을 현저하게 증가(2배 이상)시켰다. DNJ에 의한 PM8 세포주에서의 Gaa 활성 증가는 관찰되지 않았다(데이타 미기재). DNJ 및 NB-DNJ에 의한 Gaa 증강은 농도 의존적이며, 안정 수준(plateau) 이전에 3.0-100 μM 범위에서 증강되었다(데이타 미기재).
그외 DNJ 유사체. 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, DNJ 유도체들, N-메틸-DNJ, N-(2-(N,N-디메틸아미도)에틸옥시-DNJ(15), N-4-t-부틸옥시카르보닐-피페리디닐메틸-DNJ(16), N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ(17), N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ(18), N-(2-(2,2,2-트리플루오로에톡시)에틸-DNJ(19), N-2-메톡시에틸-DNJ(20), N-2-에톡시에틸-DNJ(21), N-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ(23), N-알파-시아노-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ(24), N-4-트리플루오로메톡시벤질-DNJ(25), N-4-n-펜톡시벤질-DNJ(26) 및 N-4-n-부톡시벤질-DNJ(27)을 PM11에서 Gaa 활성을 현저하게 증가시켰다. N-메틸 DNJ 및 N-카복시펜틸 DNJ를 이용한 Gaa 활성 증가는 약 3-100 μM에서 농도 의존적이었다(데이타 미기재).
% Emax는 1 mM DNJ의 존재시에 관찰되는 증가에 대한, 실험 화합물의 최대 증가%이다. 이는 GraphPad Prism version 3.02을 이용하여 분석한 이론적인 비선형 회귀 곡선의 정점으로서 계산한다. 증가는 1 mM DNJ의 존재시에 평균적인 최대 카운트와 화합물 부재시의 최소 평균 카운트로 일반화한, 다중 형광물질 카운트의 평균으로서 정의된다. 형광 카운트는 백그라운드를 뺀다. 백그라운드는 세포 존재시의 평균 카운트에서 세포 부재시의 값을 뺀 것이다. EC5O(μM)은 Emax 50%를 수득하는 화합물의 농도이다.
특정 기전에 제한없이, DNJ 및 DNJ 유사체는 ER에서 돌연변이 Gaa에 결합하여 돌연변이된 단백질의 적절한 접힘을 유도하여, 효소가 ER에서 나와 어느 정도의 효소 활성을 나타낼 수 있는 리소좀으로 이동가능하게 한다.
표 1: 1-데옥시노지리미신의 N-알킬 유도체
Figure 112007090581802-PCT00050
Figure 112007090581802-PCT00051
Figure 112007090581802-PCT00052
표 2: C-치환을 가진 1- 데옥시노지리미신의 유도체
Figure 112007090581802-PCT00053
실시예 3: DNJ 및 DNJ 유도체 처리시 Gaa의 생체내 활성
약물 투여. 본 실시예는 마우스에서의 DNJ 유도체 효과에 대한 정보를 제공한다. DNJ 유도체 테스트 화합물을 마우스에 0, 1 mg/kg/day; 10 mg/kg/day; 및 100 mg/kg/day로 투여하고, 실험을 개시한지 2 및 4주 후에 장기 및 혈장을 수거하였다. 그룹당 20마리의 수컷 마우스 C57BL6(25 g)을 사용하였다. 약물은 식수에 넣었고, 물 섭치를 매일 모니터링하였다.
대조군(0 mg/kg/day)의 경우, 마우스에 매일 식수(약물 무첨가)를 먹였고, 2 그룹으로 나누었다. 10마리는 처리 2주일 후에 안락사시키고, 혈액을 하행 대동맥 또는 대정맥에서 채혈하고, 조직을 적출하여 검시하였다. 처리 4주 후에, 나머지 10마리를 안락사시켜, 동일한 평가를 수행하였다.
첫번째 테스트 그룹에서는, 마우스 20마리에 1 mg/kg-day 투여 목표로 식수로 매일 먹였다(25 g의 마우스가 매일 5 mL/day로 마시는 것으로 가정하였을때 식수내 농도는 0.025 mg/5 ml 또는 5 ㎍/ml 이어야 함). 대조군과 유사하게, 처리한 지 2주일 후에 마우스 10마리를 안락사시키고 평가하였다. 처리 4주일 후에, 나머지 10마리를 안락사시키고 평가하였다.
테스트 화합물 10 mg/kg-day을 목표로, 마우스 20마리에게 매일 식수(화합물 농도 50 ㎍/ml으로 추정)를 먹이고, 상기 그룹에 대해 언급한 바와 같이 테스트하기 위해 2 그룹으로 나누었다.
테스트 화합물 투여량 100 mg/kg-day을 목표로, 마우스 20마리에게 매일 식수(화합물 농도 500 ㎍/ml으로 추정)를 먹이고, 상기 그룹에 대해 언급한 바와 같이 테스트하기 위해 2 그룹으로 나누었다.
혈액 샘플을 리튬 헤파린으로 넣고 혈장을 스핀하였다. 채혈 후, 심장, 간, 비복근, 비장근, 혀, 신장 및 뇌를 적출하여 바이얼에 넣었다. 바이얼은 급속 냉동을 위해 드라이 아이스에 넣었다. 다음으로, 조직과 혈장에서 Gaa 및 글리코겐의 조직 수준을 분석하였다.
조직 준비. 일부 조직을 적출하여 500 ㎕의 세포용혈 완충액(20 mM 소듐 시트레이트 및 40 mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트, pH 4.0, 0.1% 트리톤 X-100 포함)에 넣었다. 얼마간 마이크로호모게나이저로 조직을 동질화하고, 10,000 rpt에서 10분간 4℃에서 원심분리하였다. 상층액을 새로운 튜브로 이동시켜 효소 분석에 사용하였다.
조직 효소 분석. (96웰 플레이트내) 상층액 2.5 ㎕에 17.5 ㎕의 반응 완충액(시트레이트 포스페이트 완충액, 트리톤 무 첨가) 및 50 ㎕의 4-메틸 움벨리페론(4-MU)-표지된 기질인 알파-글루코피라노시드 또는 표지된 음성 대조군인 베타- 글루코피라노시드 및 알파-갈락카토피라노시드를 넣었다. 플레이트는 37℃에서 한시간 인큐베이션한 다음, 70 ㎕의 정지 완충액(0.4 M 글리신-NaOH, pH 10.6)을 넣었다. Gaa의 활성은 웰당 1초 판독 시간으로 355 nm 여기에 의한 460 nm에서 흡광을 측정하여 결정하였다(Victor2 multilabel counter- Wallac). 효소 활성은 첨가된 세포용혈물 ㎕ 내 함량으로 일반화하였고, 세포용혈물 ㎕ 당 효소 활성을 추정하였다. 증강율은 화합물 부재시의 활성을 넘어선 화합물의 활성이다.
결과
도 2A-D 및 3A-D으로 입증된 바와 같이, Gaa 농도는 뇌, 간, 비복근, 혀(도 2A-D) 및 신장, 횡격막, 심장 및 비장근(도 3A-D)에 DNJ 및 N-부틸-DNJ를 처리한지 2달 후에 증가하였다. 그 결과는 선형 추세에서 유의하였다. DNJ의 경우, 뇌, 비복근, 혀, 신장, 횡격막, 심장 및 비장근(선형 추세에서 유의함)에서 증가는 농도 의존적이었다. N-부틸-DNJ의 경우, 뇌, 간, 비복근, 혀 및 신장에서 농도 의존적으로 증가하였다.
처리한 지 4주일 후에, Gaa 활성 증가는 뇌, 간, 비복근 및 혀(도 4A-D) 및 신장, 횡격막, 심장 밀 비장근(도 5A-D)에서 DNJ 처리 이후에 관찰되었다. N-부틸 DNJ에 대한 결과는 증가가 관찰되지 않은 횡격막, 심장 및 비장근을 제외하고는 유사하엿다. 뇌, 비복근, 혀, 신장(DNJ만), 횡격막(DNJ만), 심장(DNJ만) 및 비장근(DNJ만)에서 증가는 농도 의존적인 것으로 보였다.
이러한 결과는, 특이적인 약학 샤페론이 생체내에서 돌연변이되지 않은 Gaa의 활성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4: DNJ 유사체 노출 또는 무노출시 Gaa의 축적 및 위치화
본 실험에서는, 잔류 Gaa 활성을 거의 보이지 않는 폼페 환자로부터 유래된 세포주 4종을 천연형 섬유모세포와, Gaa 축적 및 위치화에 대해 비교하였다.
방법
세포주. PM8, PM9, PM11 및 PM12 세포주를 평가하였다. PM8은 일부 잔류 Gaa 활성에서 스플라이싱 결함을 가지고 있으며(IVSlAS, T> G, -13); PM9는 하나의 대립유전자에 넌센스 돌연변이(R854X)를 그리고 다른 쪽에 3개의 미스센스 돌연변이(D645E, V816I, 및 T927I)를 가지고 있고 잔류 Gaa 활성은 본래 없으며(<1%); PM11은 하나의 미스센스 돌연변이(P545L)를 포함하며 일부 잔류 Gaa 활성을 가지고 있다. 또한, PM12는 스플라이싱에 결함(IVS8+G>A/M519V)이 있다.
면역형광 및 현미경 세포는 글라스 커버슬립상에서 NB-DNJ와 함께 5일간 배양하였다. 세포는 15분간 3.7% 파라포름알데하이드로 고정하고, 5분간 0.5% 사포닌으로 투과화한 다음, 토끼 항-인간 Gaa(gift from Barry Byrne) 및/또는 마우스 단일클론 항-LAMP1(BD Pharmingen, catalog # 555798)의 1:300 희석물로 한 시간 동안 실온에서 표지하였다. 이차 항체인, AlexaFluor 488가 접합된 염소 항-토끼 IgG와 AlexaFluor 594(Molecular Probes) 접합된 염소-항-마우스 IgG를 1:500 희석으로 첨가한 다음 실온에서 한 시간 인큐베이션하였다. 커버슬립을 10 ㎕의 Vectashield을 사용하여 슬라이드 상에 장착하고 급속 건조 네일 폴리쉬로 실링(sealing)하고 9Oi Nikon C1 공초점 현미경으로 검경하였다.
결과
PM8. 잔류 Gaa 활성이 거의 없음에도 불구하고, PM8 세포는 LAMP-1 및 Gaa 세포질 염색 증가를 보였으며, 야생형 섬유모세포와 비교되는 다른 염색 패턴을 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, NB-DNJ로 처리된 야생형 섬유모세포는 LAMP-1 및 Gaa 둘다에 대해 반점형의 염색 패턴을 보였으며(도 6C-D), 이는 리소좀에 공동-위치됨을 의미한다. 이와는 반대로, PM8 섬유모세포에서는 염색이 LAMP-1 및 Gaa 둘다 세포질에서 강하였다(도 6A-B 및 6E-F). 컨플루언트 야생형 섬유모세포에서의 LAMP-1과 Gaa의 중첩은, 리소좀에 공동-위치됨을 나타내었지만(도 6H), 컨플루언트 PB8 섬유모세포에서의 중첩은 LAMP-1 및 Gaa의 세포질 과다를 나타낸다(도 6G). 상기 결과는, 리소좀 형성에 결함 가능성이 있으며, 또는 비정상적으로 형성된 엔도좀/리소좀 구조(어그레좀)의 대규모 응집체가 존재함을 시사한다.
PM9. PM9 섬유모세포는 또한 세포질의 과잉의 Gaa(도 7B 및 7D) 및 LAMP-1(도 7E) 염색(도 7B)을 보였다. 중첩은 어그레좀와 유사한 Gaa 응집체 형성을 보인다(도 7A, 7C 및 7F, 화살표 및 인레이(inlay)는 어그레좀을 나타냄). DNJ 유사체 처리는 리소좀에 Gaa 위치화를 복원시키고 어그레좀 형성을 감소시킬 것이다. DNJ 유사체 처리시, Gaa의 적절한 리소좀 위치화를 복원시키고 세포질의 어그레좀의 존재를 감소시킬 것이다.
PM11. PM11 섬유모세포는 Gaa 활성 감소를 보인다. NB-DNJ(50 μM) 및 DNJ(100 μM)로 처리하면, PM11 세포는 리소좀 마커인 LAMP-1을 이용한 공동-표지에 의해 분석된 바와 같이 리소좀에서 Gaa의 표지 강도 증가를 보이며, 이는 이동성 복원을 시사한다(도 8). 무처리 PM11 섬유모세포는 일부 Gaa 염색을 나타내며, LAMP-1과 공동-위치화를 약간 보인다.
게다가, PM11 세포 결함이 리소좀 효소(Gaa)의 리소좀으로의 트래피킹임을 확인하기 위하여, 야생형 섬유모세포 및 PM11 세포를 초기 및 후기 엔도좀 마커인 EEA1 및 M6PR로 각각 염색하였다. 야생형 섬유모세포 및 폼페 PM11 섬유모세포 사이에 초기 및 후기 엔도좀에 대한 위치화 패턴에서는 차이가 없었다(데이타 미기재).
PM12. Gaa 염색 강도의 유의한 증가가 또한 NB-DNJ로 처리한 PM12 섬유모세포에서 관찰되었다(데이타 미기재).
고찰
본 실시예는 본 발명의 약학 샤페론이 Gaa 합성시에 불안정하게 되어 ER로 배출되지 못하게 하는 돌연변이 이외의(및 뿐만 아니라) 다른 Gaa 돌연변이를 가지고 있는 세포의 표현형을 복원시킬 수 있음을 입증한다. 이는, ER에서 리소좀으로의 돌연변이 Gaa의 트래피킹 향상이 심지어 리소좀에서 Gaa 하이드롤라제 활성을 복원시키지 않으면서도 근육과 같은 조직에서 폼페 질환의 일부 병리 작용을 개선시키는데 충분할 수 있다는 가설을 뒷받침한다. 글리코겐의 턴오버는 폼페 질환에서 환자 표현형을 개선시키는데 충분하지 않다는 것이 명백하다. 따라서, 트래피킹 개선이 폼페 병리상태를 개선시킬 수 있는 이유에 대한 하나의 가설은, Gaa 활성 결핍이 세포에서 글루코스 결핍증을 초래하고, 이것이 (글루코스의 신속한 분비를 위해 세포질 글리코겐을 이용하기 위하여) 자식작용 반응(autophagic response)을 촉발하거나 영속시킬 수 있다는 것이다. 이러한 자식작용 반응은 엔조솜의 트 래피킹 경로를 통한 트래피킹을 악화시켜, 막 안정화 단백질의 잘못된 트래피킹을 초래하고, 결국 근육 섬유의 파괴를 초래할 수 있다.
샤페론 요법은 Gaa 활성 획득, 글루코스 결핍증 개선 및 글루코스 결핍증에 의해 유도된 자식 반응을 개선할 수 있으며, 궁극적으로 추가적인 근육 손상을 예방하기 위해 막 안정화 단백질의 트래피킹을 복원시킬 수 있다.
실시예 5: 장의 Gaa에 대한 DNJ 유도체의 효과: 카운터스크리닝
이상적이고 특이적인 약학 샤페론은 저해 농도 이하에서 리소좀 Gaa를 증가시키지만 장의 Gaa를 저해하지 않을 것이다. 따라서, 장의 Gaa 활성을 pH 7.0의 마우스 장에서 추출한 조 추출물에서 평가하였다. 또한, DNJ 및 NB-DNJ와 같은 화합물이 장의 Gaa에 저해 효과를 나타내는지를 결정하기 위해, 장의 Gaa 효소 저해 분석을 확립하였다.
방법
조직 준비. C57BK6 마우스의 장으로부터 조 추출물을 전술한 바와 같이 준비하였다. 상층액을 새로운 튜브로 이동시켜 효소 분석에 사용하였다.
결과
DNJ는 장의 Gaa에 대한 보다 강력한 저해제이며, IC50은 1 μM이고, NB-DNJ의 IC5O 저해 수치는 21 μM이다(데이타 미기재).
실시예 6: 폼페 환자에 DNJ 유도체 처리
상기 결과를 토대로, 본 발명의 DNJ 및 DNJ 유사체를 폼페 환자에게 처리하 면 근육 조직내 글리코겐의 병적인 축적을 감소시켜, 따라서 질병 상태를 개선시킬 수 있을 것이다. 현재 폼페 질환에 대한 유일한 치료제로 승인받은 ERT는 골격근내 글리코겐의 축적 감소에는 효과가 없으며, 재조합 효소는 근육 조직으로 침투할 수 없기 때문에, 이 방법이 당업계에서 오랜기간 염원을 해결하는 방법이다.
방법
폼페 집단. 유아기, 소아기, 및 성인기-발현형의 폼페 질환으로 진단받은 환자를 모집하여 무작위 이중 맹검으로 경구 투여한 DNJ 유도체의 다중-투여 및 표지 개방 실험(open-label trial)을 수행하였다. 상기 실험에 참여하기 위해서는, 환자는 하기 사항중 한가지 이상에 해당되어야 한다: a) 단층 심초음파검사로 결정한 좌심실 질량 지수(LVMI)로 한정되는 심근증; b) 침습적 또는 비침습적 인공 호흡기의 필요성, 비침습적 호흡기는 기관내 관을 사용하지 않고 적용되는 모든 인공 호흡기 형태임; 또는 c) 덴버 발달 검사(Denver Developmental Screening Test)에서 동년배 정상인의 90%에 해당되는 대근육 운동을 행하지 못하는 것으로 정의되는, 중증 운동 지연(DDST-2; Hallioglo et al, Pediatr Int. 2001; 43(4):400-4).
약물 투여. 24주동안 하루에 2번 DNJ 또는 DNJ 유도체 50 또는 100 mg을 환자 10명으로 이루어진 2 그룹에게 제공한다. 이는 고셰 질환에서 글리코스핑고리피드의 기질 제한을 보이는 함량 보다 낮다.
종말점. 임상 효과는 자발적인 호흡에 의한 생존성, 좌심실 질량 지수, 운동 발단 및 골격근 기능, 예컨대 덴버 발달 건사 및 알베르타 유아 동작 척도(Piper et al., Motor Assessment of the Developing Infant. Philadelphia, PA, W.B. Saunders Co., 1994), 베일리의 영유아 발달 검사 II(BSIDII; Bayley et al., Bayley Scores of Infant Development. 2nd Ed., San Antonio, TX: Harcourt Brace & Co. 1993), 뿐만 아니라, 근육 생검의 조직 및 생화학적 분석, 즉 PAS(periodic acid-Schiff)-양성 염색 및 효소 활성 분석을 이용한 처리 및 무처리 환자에서의 글리코겐 수준 결정, 및 환자로부터 수득한 섬유모세포에서의 Gaa 활성 측정으로 평가한다. 임상 측정은 4, 12 및 24주에 분석하는 근육 생검을 제외하고는, 2주마다 평가한다.
결과
DNJ 유도체 처리는 일부 증상 완화 및 근육 조직의 글리코겐 수치 감소에 의해 폼페 질환 치료에 유효할 것이다. 예로, 12주 이내에 근육의 Gaa 활성 증가가 관찰될 것이며, 근육내 글리코겐의 축적은 감소될 것으로 예상된다. 또한, LVMI가 감소되고 호흡기 증상도 개선될 것으로 예상된다. 마지막으로, 특히 어린 환자에서의 운동 발달 진행 및 근육 긴장도를 개선시킬 것이다.
결론
본 발명의 방법은 유일한 폼페 질환 치료제인 ERT에서 예상할 수 없었던 이점을 제공한다. 소형 분자 샤페론의 투여, 바람직하기로는 경구 투여는 비용면에서 효율적이며, ERT가 투과할 수 없는 조직, 즉 뇌에서 효소 구제를 허용한다. 또한, 샤페론 화합물 및 대체 단백질과의 조합 요법은 주입 횟수 및/또는 필수 재조합 또는 정제 효소의 양을 낮추어, 단가를 낮추고 환자에게 유익함을 제공할 수 있다. 마지막으로, 본 발명의 샤페론 화합물과 조합하는 대체 Gaa 제형은 재조합 효 소를 안정화시키고 응집 및/또는 분해를 예방할 수 있어, 따라서 효소의 저장 수면을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 구체적인 예로 그 범위가 한정되는 것은 아니다. 실제, 당업자라면 본 명세서에 개시된 바 이외에도 전술한 상세한 설명 및 도면으로부터 본 발명에 대한 여러가지 변형이 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위내에 포함된다.
특허, 특허 출원, 공개공보, 제품 설명서, 등록 번호 및 프로토콜이 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되어 있으며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
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Figure 112007090581802-PCT00055
Figure 112007090581802-PCT00056
Figure 112007090581802-PCT00057
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Figure 112007090581802-PCT00059
Figure 112007090581802-PCT00060

Claims (38)

  1. 세포에서 α-글루코시다제 활성을 증가시키는 방법으로,
    상기 방법은 α-글루코시다제 효소에 하기 식으로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 유효량의 1-데옥시노지리마이신(deoxynojirimycin, DNJ) 유도체를 접촉시키는 단계를 포함하며,
    상기 DNJ 유도체는 1-데옥시노지리마이신 또는 α-호모노지리마이신이 아닌 것을 특징으로 하는, 세포에서 α-글루코시다제 활성을 증가시키는 방법:
    Figure 112007090581802-PCT00061
    상기 식에서,
    R1은 H, 또는 1 - 12개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알콕시알킬 또는 아미노알킬, 또는 5 - 12개의 원환을 포함하는 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 알킬이고, 여기서 R1은 하나 이상의 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C(=O)N-(알킬)2로 선택적으로 치환되며;
    R2는 H, 또는 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알킬아릴, 또는 알콕시알킬, 또는 5 - 12개의 탄소원자를 포함 하는 아릴이고, 여기서 R2는 선택적으로 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3 또는 헤테로사이클환으로 치환되며;
    R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
  2. 세포에서 α-글루코시다제 활성을 증가시키는 방법으로,
    상기 방법은 α-글루코시다제 효소에 하기 식으로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 유효량의 1-데옥시노지리마이신(deoxynojirimycin, DNJ) 유도체를 접촉시키는 단계를 포함하며,
    상기 DNJ 유도체는 1-데옥시노지리마이신 또는 α-호모노지리마이신이 아닌 것을 특징으로 하는, 세포에서 α-글루코시다제 활성을 증가시키는 방법:
    Figure 112007090581802-PCT00062
    상기 식에서,
    R1은 H, 또는 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C(=O)N-(알킬)2로 선택적으로 치환된 1 - 12개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알콕시알킬 또는 아미노알킬이고;
    R2는 H, 또는 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이 클로알킬, 또는 알콕시알킬이고;
    R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
  3. 제 1항에 있어서, R1은 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3, 또는 -C(=O)N-(Me)2로 선택적으로 치환된, 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 또는 알콕시알킬이고; 및 R2는 H인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, R1은 n-메틸, n-에틸, n-부틸, n-사이클로프로필 메틸, 또는 n-노닐인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3항에 있어서, R1은 -OH, -COOH, CF3, OCF3, 또는 -C(O)N-(Me)2로 치환된 n-에틸 또는 n-부틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, R1은
    Figure 112007090581802-PCT00063
    인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, R1은 H이고; 및 R2는 -CF3 또는 헤테로사이클로 선택적으로 치환된, 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐, 아릴 또는 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, R2는 n-노닐기인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 N-메틸-DNJ, N-부틸-DNJ, N-사이클로프로필메틸-DNJ, N-(2-(N,N-디메틸아미도)에틸옥시-DNJ, N-4-t-부틸옥시카르보닐-피페리디닐메틸-DNJ, N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ, N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ, N-(2-(2,2,2-트리플루오로에톡시)에틸-DNJ, N-2-메톡시에틸-DNJ, N-2-에톡시에틸-DNJ, N-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ, N-알파-시아노-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ, N-4-트리플루오로메톡시벤질-DNJ, N-4-n-펜톡시벤질-DNJ, 및 N-4-n-부톡시벤질-DNJ, 또는 Cl-노닐 DNJ로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 화합물은 N-부틸-데옥시노지리마이신인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성 증가는 세포에서 최대 Gaa 활성을 제공하는 DNJ 유도체 농도에서 적어도 1.5-배인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성 증가는 세포에서 최대 Gaa 활성을 제공하는 DNJ 유도체 농도에서 적어도 5-배인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 장의 Gaa를 저해하는 IC50 농도 또는 그 미만에서 리소좀의 Gaa 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 α-글루코시다제 효소는 돌연변이 α-글루코시다제인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 돌연변이 α-글루코시다제는 D645E; D645H; R224W; S619R; R660H; T1064C; C2104T; D645N; L901Q; G219R; E262K; M408V; G309R; D645N; G448S; R672W; R672Q; P545L; C647W; G643R; M318T; E521K; W481R; L552P, G549R; R854X; V816I; T927I 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 α-글루코시다제 효소는 정제 또는 재조합 기능성 α-글루코시다제 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 접촉은 생체내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 접촉은 시험관내에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 필요로하는 개체에서 폼페 질환을 치료하는 방법으로,
    상기 방법은 하기 식으로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 유효량의 1-데옥시노지리마이신(deoxynojirimycin, DNJ) 유도체를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 DNJ 유도체는 1-데옥시노지리마이신 또는 α-호모노지리마이신이 아닌 것을 특징으로 하는, 폼페 질환을 치료하는 방법:
    Figure 112007090581802-PCT00064
    상기 식에서,
    R1은 H, 또는 1 - 12개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이 클로알킬, 알케닐, 알콕시알킬 또는 아미노알킬, 또는 5 - 12개의 원환을 포함하는 아릴, 알킬아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로아릴 알킬이고, 여기서 R1은 하나 이상의 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C(=O)N-(알킬)2로 선택적으로 치환되며;
    R2는 H, 또는 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 알킬아릴, 또는 알콕시알킬, 또는 5 - 12개의 탄소원자를 포함하는 아릴이고, 여기서 R2는 선택적으로 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3 또는 헤테로사이클환으로 치환되며;
    R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
  20. 필요로하는 개체에서 폼페 질환을 치료하는 방법으로,
    상기 방법은 하기 식으로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 유효량의 1-데옥시노지리마이신(deoxynojirimycin, DNJ) 유도체를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 DNJ 유도체는 1-데옥시노지리마이신 또는 α-호모노지리마이신이 아닌 것을 특징으로 하는, 폼페 질환을 치료하는 방법::
    Figure 112007090581802-PCT00065
    상기 식에서,
    R1은 H, 또는 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF3, -OCF3, -O-C(=O)N-(알킬)2로 선택적으로 치환된 1 - 12개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알콕시알킬 또는 아미노알킬이고;
    R2는 H, 또는 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 또는 알콕시알킬이고;
    R1 및 R2 중 적어도 하나는 H가 아니다.
  21. 제 19항에 있어서, R1은 -OH, -COOH, -CF3, -OCF3, 또는 -C(=O)N-(Me)2로 선택적으로 치환된, 1 - 9개의 탄소원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 또는 알콕시알킬이고; 및 R2는 H인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, R1은 n-메틸, n-에틸, n-부틸, n-사이클로프로필 메틸, 또는 n-노닐인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, R1은 -OH, -COOH, CF3, OCF3, 또는 -C(O)N-(Me)2로 치환된 n-에틸 또는 n-부틸인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 21항에 있어서, R1은
    Figure 112007090581802-PCT00066
    인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19항에 있어서, R1은 H이고; R2는 -CF3 또는 헤테로사이클로 선택적으로 치환된, 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐, 아릴 또는 에테르인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, R2는 n-노닐기인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 19항에 있어서, 상기 화합물은 N-메틸-DNJ, N-부틸-DNJ, N-사이클로프로필메틸-DNJ, N-(2-(N,N-디메틸아미도)에틸옥시-DNJ, N-4-t-부틸옥시카르보닐-피페리디닐메틸-DNJ, N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ, N-2-R-테트라하이드로퓨라닐메틸-DNJ, N-(2-(2,2,2-트리플루오로에톡시)에틸-DNJ, N-2-메톡시에틸-DNJ, N-2-에톡시에틸-DNJ, N-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ, N-알파-시아노-4-트리플루오로메틸벤질-DNJ, N-4-트리플루오로메톡시벤질-DNJ, N-4-n-펜톡시벤질-DNJ, 및 N-4-n-부톡시벤질-DNJ, 또는 Cl-노닐 DNJ로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 화합물은 N-부틸-데옥시노지리마이신인 것을 특징으 로 하는 방법.
  29. 제 19항에 있어서, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성 증가는 적어도 1.5-배인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, DNJ 유도체 부재하의 Gaa 활성에 대한 DNJ 유도체 존재하의 Gaa 활성 증가는 적어도 5-배인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 19항에 있어서, 상기 화합물은 장의 Gaa를 저해하는 IC50 농도 또는 그 미만에서 리소좀의 Gaa 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 19항에 있어서, 상기 유효량은 약 1 mg/day 내지 약 300 mg/day인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 유효량은 약 5 mg/day 내지 약 150 mg/day인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 유효량은 약 5 mg/day 내지 약 75 mg/day인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 19항에 있어서, 상기 1-데옥시노지리마이신 유도체는 경구 투약 형태로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 경구 투약 형태는 정제 또는 캡슐제인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 19항에 있어서, 상기 1-데옥시노지리마이신 유도체는 α-글루코시다제 효소와 조합 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 19항에 있어서, 상기 α-글루코시다제는 대체 α-글루코시다제 유전자와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
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