JP2019172685A - ポンペ病の処置 - Google Patents

Abstract

【課題】ポンペ病の処置の方法を提供することを本発明の課題とする。【解決手段】上記課題は、ヒト酸性αグルコシダーゼを用いたポンペ病の処置の方法を提供することにより解決された。好ましい処置養生法は、患者に１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ体重より多く投与する工程を含む。投与は、好ましくは静脈内投与である。この方法は、乳児性、若年性または成人性ポンペ病を有する患者の処置のために用いられ得る。ヒト酸性αグルコシダーゼは、好ましくは、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁において得られ、そして好ましくは、主に１１０ｋＤの形態である。【選択図】なし

Description

（関連出願の引用）
本出願は、１９９８年１２月７日に出願された、ＵＳＳＮ６０／１１１２９１からの優
先権に由来し、これは、すべての目的のために、その全体において参考として援用されて
いる。本出願は、１９９６年７月２９日に出願された、ＵＳＳＮ０８／７００，７６０に
関連し、これは、１９９５年８月２日に出願された、ＵＳＳＮ６０／００１，７９６から
の優先権に由来し、これらの両方は、すべての目的のために、それらの全体において参考
として援用されている。

（技術分野）
本発明は、組換え遺伝学分野および医学分野に属し、そしてポンペ病を有する患者の酵
素置換治療に関する。

（発明の背景）
他の分泌タンパク質と同様に、リソソームタンパク質は、小胞体において合成され、そ
してゴルジ装置へ輸送される。しかし、たいていの他の分泌タンパク質と異なり、リソソ
ームタンパク質は、細胞外液へではなく、細胞内小器官へ分泌することになっている。ゴ
ルジ装置の内部において、リソソームタンパク質は特別なプロセシングを受けて、それら
の細胞内の行き先に到達するために必要なものを備える。ほとんどすべてのリソソームタ
ンパク質が、末端のマンノース基の６’位を介したグリコシル化およびリン酸化を含む、
種々の翻訳後修飾を受ける。リン酸化されたマンノース残基が、トランスゴルジ網の内部
の表面上で、特異的なレセプターによって認識される。リソソームタンパク質は、これら
のレセプターを介して結合し、そしてそれによって、他の分泌タンパク質から分離される
。その後、レセプターに結合したタンパク質を含む小さな輸送小胞が、トランスゴルジ網
からつみ取られ、そしてそれらの細胞内の行き先へと標的化される。一般に、非特許文献
１を参照のこと。

３０を超えるリソソーム疾患が通常、遺伝子変異の結果として存在し、その各々は、特
定のリソソームタンパク質の欠損に起因する。例えば、非特許文献２を参照のこと（すべ
ての目的のために、その全体において参考として援用される）。リソソームタンパク質に
おける欠損は、通常、代謝産物の有害な蓄積を生じる。例えば、フルラー症候群、ハンタ
ー症候群、モルキオ症候群およびサンフィリポ症候群において、ムコ多糖の蓄積が存在し
；テイ−サックス症候群、ゴシェ症候群、クラッベ症候群、ニーマン−ピック症候群およ
びファブリー症候群において、スフィンゴ脂質の蓄積が存在し；ならびに、フコース蓄積
症およびマンノシドーシスにおいて、それぞれ、フコース含有スフィンゴ脂質および糖タ
ンパク質フラグメントの蓄積、ならびにマンノース含有オリゴ糖類の蓄積が存在する。

ＩＩ型糖原病（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＩ
）（ＧＳＤ ＩＩ；ポンペ病；酸性マルターゼ欠損症）は、リソソーム酵素の酸性α−グ
ルコシダーゼ（酸性マルターゼ）の欠損によって引き起こされる。２つの臨床的形態が識
別される：早期発症（乳児性）および後期発症（若年性および成人性）。乳児性ＧＳＤ
ＩＩは、誕生直後にその発症を有し、そして進行性の筋肉虚弱および心不全を示す。この
臨床的改変（ｖａｒｉａｎｔｉｓ）は、通常、生涯の最初の２年以内に致命的である。成
人性患者および若年性患者の後期発症における症状は、生涯においてより遅く生じ、そし
て骨格筋のみが関与する。この患者は、最終的に、呼吸不全が原因で死亡する。患者は、
例外的に、６０年間を超えて生存し得る。疾患の重症度と、残留酸性α−グルコシダーゼ
活性との間には、十分な相関が存在し、この活性は、後期発症において、正常の１０〜２
０％であり、そしてこの疾患の初期発症形態において、２％未満である（非特許文献３を
参照のこと）。

リソソーム貯蔵疾患の主要な原因としての、リソソーム酵素欠損の発見以来（例えば、
非特許文献４を参照のこと）、リソソーム貯蔵疾患を有する患者を、失われている酵素の
（静脈内）投与（すなわち、酵素治療）によって、処置する試みがなされた。ポンペ病の
ための酵素置換治療を用いるこれらの実験は、成功していない。免疫学的反応を与えるＡ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来の非ヒトα−グルコシダーゼ、または細胞によっ
て効率的に取り込まれない酵素形態（ヒト胎盤由来の低取り込み形態の成熟酵素；以下を
参照のこと）のいずれかが用いられた。さらに、処置の持続期間および／または投与され
た酵素の量の両方が、不十分であった（３〜５）。天然の供給源（例えば、ヒトの尿およ
びウシの精巣）由来のリソソーム酵素の産生は、理論上は可能であるが、低い収率を与え
、そして精製された酵素は、必ずしもレシピエント患者の組織によって取り込まれ得る形
態というわけではない。

上記の不確実性および困難にもかかわらず、本発明は、ヒト酸性αグルコシダーゼを用
いて、ポンペ病の患者を処置する方法を提供する。

Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１８、３６７−３７４（１９９０） Ｃｏｔｒａｎら、Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ（第４版 １９８９） Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ、Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒら（編）、第７版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９９５）、２４４３−２４６４頁 Ｈｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８６、１１−１６（１９６３）

（請求の範囲に記載される発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ポンペ病を有する患者を処置する方法を提供する。こ
のような方法は、治療的に有効な量のヒト酸性αグルコシダーゼを、患者に投与する工程
を必然的に伴う。投薬量は、好ましくは、１週間当たり少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ体重で
ある。いくつかの方法において、投薬量は、１週間当たり少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ体重
であるか、または１週間当たり少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの方法
において、このような投薬量は、１週間当たり１回投与され、そして他の方法においては
、１週間当たり３回投与される。いくつかの方法において、処置は少なくとも２４週間続
けられる。投与は、好ましくは静脈内投与である。ヒト酸性αグルコシダーゼは、好まし
くは、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁において得られ、そして好ましくは、主
に１１０ｋＤの形態である。

この方法は、乳児性、若年性または成人性ポンペ病を有する患者の処置のために用いら
れ得る。乳児性ポンペ病を処置するいくつかの方法において、有効性が、少なくとも１歳
まで生存する患者によって示される。

いくつかの方法において、ヒト酸性αグルコシダーゼのレベルが、レシピエント（ｒｅ
ｃｕｏｕｅｂｔ）患者においてモニターされる。必要に応じて、ヒト酸性αグルコシダー
ゼの第二の投薬量が、α−グルコシダーゼのレベルが、患者において閾値未満に減少する
場合に、投与され得る。

いくつかの方法において、ヒトαグルコシダーゼが、静脈内に投与され、そして投与の
速度は、投与の時間の間に増加する。いくつかの方法において、投与の速度は、投与の時
間の間に、少なくとも１０倍増加する。いくつかの方法において、投与の速度は、５時間
の間以内に、少なくとも１０倍増加する。いくつかの方法において、患者は、一連の少な
くとも４つの投薬量を投与され、各々の投薬量は、以前の投薬量よりも強度が高い。いく
つかの方法において、投薬量は、第一の投薬量が０．０３〜３ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の
投薬量が０．３〜１２ｍｇ／ｋｇ／時間、第三の投薬量が１〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間、お
よび第四の投薬量が２〜６０ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、投薬量
は、第一の投薬量が０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が１〜４ｍｇ／ｋｇ／時
間、第三の投薬量が３〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が６〜２０ｍｇ／ｋ
ｇ／時間である。いくつかの方法において、投薬量は、第一の投薬量が０．２５〜４ｍｇ
／ｋｇ／時間、第二の投薬量が０．９〜１．４ｍｇ／ｋｇ／時間、第三の投薬量が３．６
〜５．７ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が７．２〜１１．３ｍｇ／ｋｇ／時間で
ある。いくつかの方法において、投薬量は、第一の投薬量が０．３ｍｇ／ｋｇ／時間、第
二の投薬量が１ｍｇ／ｋｇ／時間、第三の投薬量が４ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投
薬量が１２ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、第一、第二、第三および
第四の投薬量が、各々１５分〜８時間の間投与される。

いくつかの方法において、第一、第二、第三および第四の投薬量が、それぞれ、１時間
、１時間、０．５時間および３時間の間投与される。

別の局面において、本発明は、滅菌形態においてヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清
アルブミン、および糖を生理学的に受容可能な緩衝液中に含む薬学的組成物を提供する。
いくつかのこのような組成物は、ヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清アルブミン、およ
びグルコースをリン酸ナトリウム緩衝液中に含む。いくつかの組成物は、αグルコシダー
ゼ、マンニトールおよびスクロースを水溶液中に含む。いくつかの組成物において、糖は
、マンニトールおよびスクロースを含み、そしてマンニトールの濃度は、水溶液の１〜３
％ｗ／ｗであり、そしてスクロースの濃度は、水溶液の０．１〜１％ｗ／ｗである。いく
つかの組成物において、マンニトールの濃度は、２％ｗ／ｗであり、そしてスクロースの
濃度は、０．５％ｗ／ｗである。

本発明は、さらに、薬学的組成物（ヒト酸性グルコシダーゼ、マンニトールおよびスク
ロースを水溶液中に含む）を凍結乾燥することによって産生される、凍結乾燥された組成
物を提供する。このような組成物は、第一の組成物（ヒト酸性α−グルコシダーゼ、マン
ニトール、スクロースおよび水性溶液を含む）を凍結乾燥して、第二の組成物を産生し；
そして、生理食塩水中で凍結乾燥された組成物を再構成して、第三の組成物を産生するこ
とによって調製され得る。いくつかのこのような組成物において、ヒト酸性α−グルコシ
ダーゼは、第一の組成物および第三の組成物の両方において、５ｍｇ／ｍｌであり、マン
ニトールは、第一の組成物において、２ｍｇ／ｍｌであり、スクロースは、第一の組成物
において、０．５ｍｇ／ｍｌであり、そして再構成の工程において用いられる生理食塩水
は、０．９％ｗ／ｗである。

本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） ポンペ病を有する患者を処置する方法であって、該方法が、治療的に有
効な量のヒト酸性αグルコシダーゼを該患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目２） 前記患者に、１週間当たり少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される
、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記患者に、１週間当たり少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される
、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記患者に、１週間当たり少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与され
る、項目１に記載の方法。
（項目５） 前記患者に、１週間当たり単一投薬量のα−グルコシダーゼが投与され
る、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６） 前記患者に、１週間当たり３投薬量のα−グルコシダーゼが投与される
、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目７） 前記量が、少なくとも２４週の期間にわたって１週間当たりで投与され
る、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目８） 前記α−グルコシダーゼが、静脈内に投与される、項目１に記載の方法
。
（項目９） 前記α−グルコシダーゼが、トランスジェニック哺乳動物の乳汁中に産
生された、項目１に記載の方法。
（項目１０） 前記患者が、乳児性ポンペ病を有する、項目１に記載の方法。
（項目１１） 前記患者が、少なくとも１歳になるまで生存する、項目１０に記載の
方法。
（項目１２） 前記患者が、若年性ポンペ病を有する、項目１に記載の方法。
（項目１３） 前記患者が、成人性ポンペ病を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４） 前記α−グルコシダーゼが、主に１１０ｋＤ型である、項目１に記載
の方法。
（項目１５） 前記患者におけるヒト酸性αグルコシダーゼのレベルをモニタリング
する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１６） 前記患者においてα−グルコシダーゼの前記レベルが閾値未満に低下
した場合に、第２投薬量のヒト酸性αグルコシダーゼを投与する工程をさらに包含する、
項目１５に記載の方法。
（項目１７） 前記ヒトαグルコシダーゼが静脈内に投与され、そして投与期間の間
に投与速度が上昇する、項目１に記載の方法。
（項目１８） 前記投与速度が、前記投与期間の間に少なくとも１０倍上昇する、項
目１７に記載の方法。
（項目１９） 前記投与速度が、５時間の間に少なくとも１０倍上昇する、項目１７
に記載の方法。
（項目２０） 前記患者に、一連の少なくとも４投薬量が投与され、各投薬量は前回
の投薬量よりも高い強度である、項目１７に記載の方法。
（項目２１） 前記投薬量が、０．０３〜３ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、０．３
〜１２ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、１〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量および２
〜６０ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、項目２０に記載の方法。
（項目２２） 前記投薬量が、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、１〜４ｍ
ｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、３〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量および６〜２０ｍ
ｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、項目２１に記載の方法。
（項目２３） 前記投薬量が、０．２５〜４ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、０．９
〜１．４ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、３．６〜５．７ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量
および７．２〜１１．３ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記投薬量が、０．３ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、１ｍｇ／ｋｇ
／時間の第２投薬量、４ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量および１２ｍｇ／ｋｇ／時間の第
４投薬量である、項目２３に記載の方法。
（項目２５） 前記第１投薬量、前記第２投薬量、前記第３投薬量および前記第４投
薬量が、１５分間〜８時間の時間にわたって、各々投与される、項目２０〜２４のいずれ
かに記載の方法。
（項目２６） 前記第１投薬量、前記第２投薬量、前記第３投薬量および前記第４投
薬量が、それぞれ、１時間、１時間、０．５時間および３時間の時間にわたって投与され
る、項目２０〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２７） 滅菌形態の、生理学的に受容可能な緩衝液中にヒト酸性αグルコシダ
ーゼ、ヒト血清アルブミン、および糖を含む、薬学的組成物。
（項目２８） リン酸ナトリウム緩衝液中にヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清ア
ルブミン、およびグルコースを含む、項目２７に記載の薬学的組成物。
（項目２９） 水溶液中にαグルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロースを含む
、薬学的組成物。
（項目３０） 前記糖が、マンニトールおよびスクロースを含み、そしてマンニトー
ルの濃度が前記水溶液の１〜３％ ｗ／ｗであり、そしてスクロースの濃度が前記水溶液
の０．１〜１％ ｗ／ｗである、項目２７に記載の薬学的組成物。
（項目３１） マンニトールの濃度が２％ ｗ／ｗであり、そしてスクロースの濃度
が０．５％ ｗ／ｗである、項目２７に記載の薬学的組成物。
（項目３２） 水溶液中にヒト酸性グルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロース
を含む薬学的組成物を凍結乾燥することによって産生される、凍結乾燥された組成物。
（項目３３） 薬学的組成物であって、該組成物が、ヒト酸性α−グルコシダーゼ、
マンニトール、スクロースおよび水溶液を含む第１組成物を凍結乾燥して第２組成物を産
生する工程；ならびに、生理食塩水中で該凍結乾燥された組成物を再構成して第３組成物
を産生する工程によって調製される、薬学的組成物。
（項目３４） 前記ヒト酸性α−グルコシダーゼが、前記第１組成物および前記第３
組成物の両方において５ｍｇ／ｍｌであり、前記マンニトールが、前記第１組成物におい
て２ｍｇ／ｍｌであり、前記スクロースが、前記第１組成物において０．５ｍｇ／ｍｌで
あり、そして前記再構成工程において使用される前記生理食塩水が、０．９％ ｗ／ｗで
ある、項目３３に記載の薬学的組成物。

酸性α−グルコシダーゼのｃＤＮＡを含む導入遺伝子。αｓ１−カゼインのエキソンが、白い四角によって表される；α−グルコシダーゼのｃＤＮＡが、陰を付けた四角によって表される。αｓ１−カゼインのイントロンおよび隣接配列が、太線によって表される。細線は、ＩｇＧのアクセプター部位を表す。転写開始部位は、（１^→）と記され、翻訳開始部位は、（ＡＴＧ）と記され、終始コドンは、（ＴＡＧ）と記され、そしてポリアデニル化部位は、（ｐＡ）と記される。 パネルＡ、Ｂ、Ｃ。酸性α−グルコシダーゼのゲノムＤＮＡを含む３つの導入遺伝子である。暗く陰を付けた領域は、αｓ１カゼイン配列であり、白い四角は、酸性α−グルコシダーゼのエキソンを表し、そして白い四角の間の細線は、α−グルコシダーゼのイントロンを表す。他の記号は、図１中の記号と同じである。 パネルＡ、Ｂ、Ｃ。ゲノム導入遺伝子の構築。α−グルコシダーゼのエキソンは、白い四角によって表される；α−グルコシダーゼのイントロンおよび非翻訳配列は、細線によって示される。ｐＫＵＮベクター配列は、太線によって表される。 ウエスタンブロッティングによる、トランスジェニックマウスの乳汁中の酸性α−グルコシダーゼの検出。

（定義）
用語「実質的な同一性」または「実質的な相同性」とは、デフォルトのギャップウエイ
トを用いて、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって、最適に整列される
場合に、２つのペプチド配列が、少なくとも６５パーセントの配列同一性、好ましくは少
なくとも８０または９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセ
ントの配列同一性またはそれより高い配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性
）を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸
置換によって異なる。

用語「実質的に純粋な」または「単離された」とは、目的の種が同定され、そしてその
天然の環境の成分から分離および／または回収されたことを意味する。通常、目的の種は
、存在する主な種であり（すなわち、モル規準で、組成物中の任意の他の個々の種よりも
豊富である）、そして好ましくは、実質的に精製された画分が、組成物であり、ここでこ
の目的の種が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル規準で）
を構成する。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種
を約８０〜９０重量パーセントを超えて含む。最も好ましくは、目的の種は、本質的に均
質（混入物種が、従来の検出方法によって、組成物中で検出され得ない）になるまで精製
され、ここで、この組成物は、単一の高分子種の誘導体から、本質的になる。

ＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントとの機能的な関係に置かれた場合に、作動
可能に連結されている。例えば、シグナル配列についてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌
に関係するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドをコードするＤＮＡに
作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を刺
激する場合に、その配列に作動可能に連結されている。一般的に、作動可能に連結された
ＤＮＡ配列は隣接しており、そして、シグナル配列の場合においては、隣接しており、か
つ読み取り相にある。しかし、エンハンサーは、転写を制御するコード配列と隣接する必
要はない。連結は、簡便な制限部位での連結、あるいはその代わりに挿入されたアダプタ
ーまたはリンカーでの連結によって達成される。

外因性のＤＮＡセグメントは、細胞に対して外来であるか、または細胞のＤＮＡセグメ
ントに対して相同であるが、宿主細胞ゲノム中で異常な位置にある、セグメントである。
外因性のＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを回収するために発現される。

トランスジェニック哺乳動物において、すべての、または実質的にすべての生殖系列細
胞および体細胞は、初期胚期で、哺乳動物または哺乳動物の祖先に導入された導入遺伝子
を含む。

（詳細な説明）
本発明は、リソソームタンパク質を、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁へ分泌
する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。分泌は、リソソームタンパク質を
コードする導入遺伝子、および乳腺に対してこの遺伝子の発現を標的化し得る調節配列の
組み込みによって達成される。この導入遺伝子が発現され、そして、発現産物が乳腺中で
翻訳後修飾され、次いで乳汁へ分泌される。翻訳後修飾は、グリコシル化およびリン酸化
をして、マンノース−６リン酸を含むリソソームタンパク質を産生する工程を含み得る。

（Ａ．リソソーム遺伝子）
本発明は、リソソーム酵素および以下を含む他の型のリソソームタンパク質をコードす
る３０を超える公知の遺伝子のいずれかを含むＤＮＡセグメントを発現する、トランスジ
ェニック非ヒト哺乳動物を提供する：α−グルコシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イ
ズロネート（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ）−硫酸スルファターゼ、ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘ
ｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）ＡおよびヘキソサミニダーゼＢ、ガングリオシドアクチベータ
ータンパク質、アリールスルファターゼＡおよびアリールスルファターゼＢ、イズロネー
トスルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガラクト−セラミダーゼ、α−ガラク
トシルセラミダーゼＡ、スフィンゴミエリナーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダー
ゼ、アスパルチルグリコサミンアミド加水分解酵素、酸性リパーゼ、Ｎ−アセチル−α−
Ｄ−グルコサミン−６−スルフェートスルファターゼ、α−ガラクトシダーゼおよびβ−
ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、セラミダーゼ、ガラク
トセレブロシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、および保護性タンパク質
などを含む。公知のリソソームタンパク質の遺伝子配列のいずれかの対立遺伝子改変体、
同族改変体および誘導された改変体を発現するトランスジェニック哺乳動物もまた、含ま
れる。このような改変体は、通常、アミノ酸レベルで、公知のリソソームタンパク質の遺
伝子と、実質的な配列同一性を示す。このような改変体は、通常、ストリンジェントな条
件下で、公知の遺伝子とハイブリダイズするか、または公知の遺伝子の１つによってコー
ドされたポリペプチドに対する抗体と交差反応する。

リソソームタンパク質をコードする公知の遺伝子のうちの多くのゲノムＤＮＡ配列また
はｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡクローンが、入手可能である（Ｓｃｏｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｈ
ｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４７、８０２−８０７（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、ＰＮＡＳ ８
７、８５３１−８５３５（１９９０）；Ｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４
、１２５２−１２５９（１９８９）；Ｇｉｎｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２３、５７４−５８０（１９８４）；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭ
ＢＯ Ｊ．７、１６９７−１７０４（１９８８）；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．２７２、４７３−４７９（１９９０）；ＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚおよびＰｒｏｉａ
、ＰＮＡＳ ８１、５３９４−５３９８（１９８４）；Ｓｃｒｉｖｅｒら、前出、第１２
部、２４２７−２８８２頁ならびにそこで引用された参考文献）。ゲノムＤＮＡ配列およ
びｃＤＮＡ配列の他の例は、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。さらなるクローン化さ
れたリソソーム遺伝子の配列が必要とされる範囲まで、公知のリソソームタンパク質のＤ
ＮＡ配列または、公知のリソソームタンパク質に対する抗体をプローブとして使用して、
ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー（好ましくは、ヒト）から得られ
得る。

（Ｂ．リソソームタンパク質のコンホメーション）
組換えリソソームタンパク質は、好ましくは、天然に存在するリソソームタンパク質と
同じかまたは類似の構造を有するようにプロセシングされる。リソソームタンパク質とは
、小胞体（ＲＥＲ）に結合した、リボソーム上で合成される糖タンパク質である。リソソ
ームタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドにより導かれて、この細胞小器官に翻訳と同
時に入る（Ｎｇら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
６，５１０−５１６（１９９４））。Ｎ結合型グリコシル化プロセスは、ＲＥＲにおい
てドリコールキャリアからの高マンノース型オリゴ糖の前駆体であるＧｌｃ３Ｍａｎ９Ｇ
ｌｃＮＡｃ２の一塊としての移動と共に開始する。糖鎖の修飾は、ＲＥＲにおいて開始し
、そしてグリコシダーゼＩおよびグリコシダーゼＩＩによる、一番外側から３つのグルコ
ース残基の除去を伴ってゴルジ装置において継続する。リン酸化とは、最初に、Ｎ−アセ
チル−グルコ−サミン−１−リン酸がリソソームタンパク質特異的トランスフェラーゼに
より、選択されたマンノース基へと結合する工程、そして２番目に、Ｎ−アセチル−グル
コ−サミンがジエステラーゼにより切断される工程（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｌｙｓｏｓｏ
ｍｅｓ：Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ（Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）１６３−１９１頁）の２工
程の手順である。切断は、認識マーカーとして、そして大部分のリソソームタンパク質の
、リソソームへのマンノース６−リン酸レセプター触媒輸送におけるリガンドとして、マ
ンノース６−リン酸を露出させる。（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒ
ａｎｓ．１８，３６７−３７４（１９９２））。

糖鎖の修飾に加えて、大部分のリソソームタンパク質は、タンパク質分解プロセシング
を受ける。このプロセシングの最初の事象は、シグナルペプチドの除去である。大部分の
リソソームタンパク質のシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼによるトランスロケ
ーション後に切断され、その後、そのタンパク質は可溶性になる。酸性α−グルコシダー
ゼのシグナルペプチドは、その酵素がＲＥＲを離れた後に切断されるが、その前に、リソ
ソームまたは分泌経路に入るという、示唆的な証拠がある（Ｗｉｓｓｅｌａａｒら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２２２３−２２３１（１９９３））。酸性α−グルコシダ
ーゼのタンパク質分解プロセシングは、複雑であり、そして細胞下の種々の位置で生じる
シグナルペプチドの切断に加えて、一連の工程を含む。ポリペプチドは、Ｎ末端およびＣ
末端の両方で切断され、それによって、比触媒活性が増加する。認識される主な種は、１
１０／１００ｋＤの前駆体、９５ｋＤの中間体ならびに７６ｋＤの成熟型および７０ｋＤ
の成熟型である（Ｈａｓｉｌｉｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，４９３７−４９
４５（１９８０）；Ｏｕｄｅ Ｅｌｆｅｒｉｎｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３
９，４８９−４９５（１９８４）；Ｒｅｕｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，
８３３６−８３４１（１９８５）；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．７，１６９７
−１７０４（１９８８））。天然のヒト酸性α−グルコシダーゼの翻訳後プロセシングと
ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞のような、培養された哺乳動物細胞において発
現されたような組換え型ヒト酸性α−グルコシダーゼの翻訳後プロセシングとは、類似す
る（Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（１９９０）前出；Ｗｉｓｓｅｌａａｒら（１９９３）前出）
。

マンノース基の６’位がリン酸化されたリソソームタンパク質を産生する真正のプロセ
シングは、マンノース６−リン酸に対するレセプターを保有する細胞による、基質の取り
込みを測定することによって試験され得る。正確に修飾された基質は、修飾されない基質
よりも早く取り込まれ、かつそれによって修飾された基質の取り込みが、マンノース６−
リン酸の添加により競合的に阻害され得るような様式で取り込まれる。

（Ｃ．導入遺伝子の設計）
組換えリソソームタンパク質の発現を、導入遺伝子を保有するトランスジェニック非ヒ
ト哺乳動物の乳腺へと標的化するために、導入遺伝子が設計される。基本的なアプローチ
には、タンパク質をコードする外因性のＤＮＡセグメントを、グナル配列、プロモーター
およびエンハンサーに作動可能に連結することが必要である。そのＤＮＡセグメントは、
ゲノム、ミニ遺伝子（１つ以上のイントロンが除外されたゲノム）、ｃＤＮＡ、ＹＡＣフ
ラグメント、２つの異なるリソソームタンパク質遺伝子のキメラ、またはこれらの任意の
ハイブリッドであり得る。ゲノム配列を含むことは、一般的に、より高レベルの発現を導
く。非常に高レベルの発現は、乳腺が、リソソームタンパク質の翻訳後修飾および分泌を
行う能力に負荷をかけ過ぎ得る。しかし、以下に示すデータは、ｍｇ／ｍｌの範囲におけ
る高い発現レベルにもかかわらず、マンノース６−リン酸基の形成を含む、実質的な翻訳
後修飾が生じることを示す。実質的な修飾とは、少なくとも約１０、２５、５０、７５ま
たは９０％の分泌分子が、少なくとも１つのマンノース６−リン酸基を保有することを意
味する。従って、ゲノム構築物またはハイブリッドｃＤＮＡ−ゲノム構築物は、一般的に
好ましい。

ゲノムの構築において、全ての介在配列を保持する必要はない。例えば、いくつかの介
在配列は、ＤＮＡの操作および引き続く微量注入を容易にする、より小さい導入遺伝子を
得るために除去され得る（Ａｒｃｈｉｂａｌｄら、ＷＯ ９０／０５１８８（全ての目的
のために、その全体において参考として援用される）を参照のこと）。いくつかのイント
ロンの除去はまた、いくつかの例において、発現レベルを減らし、そしてそれによって翻
訳後修飾が実質的に完了することを確かめるために有用である。他の例において、イント
ロン（例えば、酸性α−グルコシダーゼのゲノム配列に由来するイントロン１）の除外は
、成熟酵素の、より高い発現を導く。いくつかのまたは全ての非コードエキソンを欠失さ
せることもまた、可能である。いくつかの導入遺伝子において、リソソームタンパク質コ
ード配列中の選択されたヌクレオチドは、タンパク質分解性切断部位を除去するために変
異される。

トランスジェニック哺乳動物により産生されるリソソームタンパク質の意図される用途
が、通常、ヒトへの投与であるので、リソソームタンパク質配列をコードするＤＮＡセグ
メントを得る種は、好ましくは、ヒトである。同様に、意図される用途が（例えば、ウマ
、イヌまたはネコに対する）獣医治療である場合、ＤＮＡセグメントが同じ種に由来する
ことが好ましい。

プロモーターおよびエンハンサーは、乳腺においてもっぱら発現するか、または少なく
とも優先的に発現する遺伝子（すなわち、乳腺特異的遺伝子）に由来する。プロモーター
およびエンハンサーの供給源として好ましい遺伝子としては、β−カゼイン、κ−カゼイ
ン、αＳ１−カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−ラクトグロブリン、乳清酸性タンパク質
およびα−ラクトアルブミンが挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーは、常にで
はないが、たいてい同じ乳腺特異的遺伝子から得られる。この遺伝子は、必ずではないが
、ときどき、導入遺伝子が発現されるべき哺乳動物と、同じ種の哺乳動物に由来する。他
の種由来の発現調節配列（例えば、ヒト遺伝子由来の発現調節配列）もまた、使用され得
る。このシグナル配列は、乳腺からのリソソームタンパク質の分泌を指向し得ねばならな
い。適切なシグナル配列は、分泌タンパク質をコードする哺乳動物遺伝子に由来し得る。
驚くことに、リソソームタンパク質は通常、分泌されず、細胞内の細胞小器官に標的にさ
れるにもかかわらず、これらのタンパク質の天然のシグナル配列は、適している。そのよ
うなシグナル配列に加えて、シグナル配列の好ましい供給源は、プロモーターおよびエン
ハンサーを得る遺伝子と、同じ遺伝子由来のシグナル配列である。必要に応じて、さらな
る調節配列が、発現レベルを最適化するために、導入遺伝子中に含まれる。そのような配
列としては、５’隣接領域、５’の転写されるが、翻訳されない領域、介在配列、３’の
転写されるが、翻訳されない領域、ポリアデニル化部位および３’隣接領域が挙げられる
。そのような配列は、通常、プロモーターおよびエンハンサーを得る、乳腺特異的遺伝子
、または発現されるリソソームタンパク質遺伝子からのいずれかから得られる。そのよう
な配列を含むことは、真正の乳腺特異的遺伝子の遺伝環境および／または真正のリソソー
ムタンパク質遺伝子の遺伝環境をシュミレーションする遺伝環境を生じる。この遺伝環境
は、いくつかの場合（例えば、ウシαＳ１−カゼイン）、転写された遺伝子の、より高い
発現を生じる。あるいは、３’隣接領域および非翻訳領域は、他の異種遺伝子（例えば、
β−グロビン遺伝子またはウイルスの遺伝子）から得られる。リソソームタンパク質遺伝
子または他の異種遺伝子由来の３’非翻訳領域および５’非翻訳領域を含むことはまた、
転写物の安定性を増加させ得る。

いくつかの実施形態において、乳腺特異的遺伝子由来の５’隣接配列の約０．５、１、
５、１０、１５、２０または３０ｋｂは、発現されるリソソームタンパク質遺伝子由来の
３’隣接配列の約１、５、１０、１５、２０または３０ｋｂと組み合せて含まれる。タン
パク質がｃＤＮＡ配列から発現される場合、プロモーターとコード配列との間に介在配列
を含むことは有利である。介在配列は、好ましくはプロモーターを得た乳腺特異的領域の
第１イントロン由来の介在配列の５’部分と、ＩｇＧ介在配列またはリソソームタンパク
質遺伝子の介在配列由来の３’部分とから形成されるハイブリッド配列である（ＤｅＢｏ
ｅｒら、ＷＯ ９１／０８２１６（全ての目的のために、その全体において参考として援
用される）を参照のこと）。

リソソームタンパク質を発現するための好ましい導入遺伝子は、カゼインプロモーター
およびカゼインエンハンサーの５’に結合したｃＤＮＡ−ゲノムハイブリッドリソソーム
タンパク質遺伝子を含む。このハイブリッド遺伝子としては、リソソームタンパク質遺伝
子由来のシグナル配列、コード領域および３’隣接領域が挙げられる。必要に応じて、ｃ
ＤＮＡセグメントは、５’カゼインとリソソームタンパク質をコードする遺伝子の非翻訳
領域との間に介在配列を含む。当然、得られる融合体から連続したタンパク質が発現され
得るのであれば、対応するｃＤＮＡおよびゲノムセグメントはまた、遺伝子中の他の位置
で融合され得る。

他の好ましい導入遺伝子は、カゼイン調節配列の５’に結合したゲノムリソソームタン
パク質セグメントを有する。このゲノムセグメントは通常、遺伝子の５’非翻訳領域から
３’隣接領域へと続く。従って、ゲノムセグメントにはリソソームタンパク質の５’非翻
訳配列の一部、シグナル配列、交互に続くイントロンおよびコードエキソン、３’非翻訳
領域ならびに３’隣接領域が挙げられる。ゲノムセグメントは、この５’非翻訳領域を介
して、プロモーターおよびエンハンサーならびに通常は、５’非翻訳領域を含むカゼイン
フラグメントに結合される。

ＤＮＡ配列情報は、少なくとも１種、そしてしばしば、様々な生物における上記に列挙
した全ての乳腺特異的遺伝子について利用可能である（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，５２６−５３２（１９８１）（ラットα−ラクトアルブ
ミン）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，８６８５−
８６９７（１９８４）（ラットＷＡＰ）；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
０，７０４２−７０５０（１９８５）（ラットβ−カゼイン）；Ｙｕ−ＬｅｅおよびＲｏ
ｓｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，１０７９４−１０８０４（１９８３）（ラッ
トγ−カゼイン）；Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４２，７３５-７４２（１９８７
）（ヒトα−ラクトアルブミン）；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１２，３８９（１９８４）（ウシαｓ１およびκカゼインのｃＤＮＡｓ）；Ｇｏｒｏ
ｄｅｔｓｋｙら、Ｇｅｎｅ ６６，８７−９６（１９８８）（ウシβカゼイン）；Ａｌｅ
ｘａｎｄｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８，３９５−４０１（１９８８）（
ウシκカゼイン）；Ｂｒｉｇｎｏｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１８８，４８−５５（１９
７７）（ウシαＳ２カゼイン）；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｇｅｎｅ ６１，８５−９０（１
９８７），Ｉｖａｎｏｖら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３６９，
４２５−４２９（１９８８），Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１７，６７３９（１９８９）（ウシβラクトグロブリン）；Ｖｉｌｏｔｔｅら、Ｂ
ｉｏｃｈｉｍｉｅ ６９，６０９−６２０（１９８７）（ウシα−ラクトアルブミン）を
参照のこと（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）。種々の乳
タンパク質遺伝子の構造および機能は、ＭｅｒｃｉｅｒおよびＶｉｌｏｔｔｅ，Ｊ．Ｄａ
ｉｒｙ Ｓｃｉ．７６，３０７９−３０９８（１９９３）（全ての目的のために、その全
体において参考として援用される）に概説される。さらなる配列データが必要とされ得る
範囲まで、すでに得られた領域に隣接する配列は、既存の配列をプローブとして使用して
、容易にクローン化され得る。異なる生物由来の乳腺特異的調節配列は、同様に、公知の
同族のヌクレオチド配列、または同族タンパク質に対する抗体をプローブとして使用して
、そのような生物由来のライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。

組換えタンパク質の発現を乳腺へと標的化するためにαＳ１−カゼイン調節配列を使用
する、一般的なストラテジー、および例示的な導入遺伝子は、ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ ９
１／０８２１６およびＷＯ９３／２５５６７（全ての目的のために、その全体において参
考として援用される）においてより詳細に記載される。他の乳腺特異的遺伝子由来の調節
配列を使用する導入遺伝子の例としてもまた、記載されている（例えば、Ｓｉｍｏｎら、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１７９−１８３（１９８８）およびＷＯ８８／００
２３９（１９８８）（ヒツジにおける発現のためのβ−ラクトグロブリン調節配列）；Ｒ
ｏｓｅｎ，ＥＰ ２７９，５８２およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．１６，１０２７−１０４１（１９８８）（発現のためのマウスにおけるβ−カゼイン調
節配列）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５，１１８３（１９８７）（発
現のためのマウスにおけるＷＡＰ調節配列）；ＷＯ８８／０１６４８（１９８８）および
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，４３−４８（１９８９）（発現のためのマウスに
おけるα−ラクトアルブミン調節配列）を参照のこと（全ての目的のために、その全体に
おいて参考として援用される））。

導入遺伝子からの乳汁におけるリソソームタンパク質の発現は、翻訳後修飾およびリソ
ソームタンパク質の標的化に関与する遺伝子の、同時発現または機能的不活性化（すなわ
ち、ノックアウト）により影響を受け得る。実施例におけるデータは、驚くことに、乳腺
は、高レベルでタンパク質を含むマンノース６−リン酸の集合および分泌を得るのに十分
な量で、すでに修飾酵素を発現することを示す。しかし、高レベルでこれらのタンパク質
を発現する、いくつかのトランスジェニック哺乳動物において、導入遺伝子発現から生じ
るさらなる酵素を用いて、プロセシング酵素の内因性のレベルを補うことが、ときどき好
ましい。そのような導入遺伝子は、プロセシング酵素コード配列について上記で議論され
た原理と類似の原理を使用し、リソソームタンパク質コード配列を、導入遺伝子において
置換して用いて構築される。翻訳後プロセシング酵素が分泌されることは、一般的には必
要ではない。従って、リソソームタンパク質コード配列に連結された分泌シグナル配列は
、分泌を伴わずにプロセシング酵素を小胞体へと標的化するシグナル配列で置換される。
例えば、これらの酵素に天然で結合しているシグナル配列が適している。

（Ｄ．トランスジェネシス）
上記の導入遺伝子は、非ヒト哺乳動物中に導入される。ほとんどの非ヒト哺乳動物（げ
っし類（例えば、マウスおよびラット）ウサギ、ヒツジ類（例えば、ヒツジおよびヤギ）
、ブタ類（例えば、ブタ）、ならびにウシ類（ウシおよびバッファロー）を含む）は適し
ている。ウシ類は、大きな収量の乳汁という利点を提供し、一方、マウスは、トランスジ
ェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）および育種の容易さという利点を提供する。ウサ
ギは、これらの利点の折衷物を提供する。ウサギは、約１４％のタンパク質含量を有する
乳を、１日に１００ｍｌ生産し得（Ｂｕｈｌｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８
，１４０（１９９０）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）
を参照のこと）、そしてなお、マウスの場合と同じ原理および類似の設備を使用して操作
され得、そして育種され得る。非胎生哺乳動物（例えば、ハリモグラまたはカモノハシ）
は、代表的には使用されない。

トランスジェネシスのいくつかの方法において、導入遺伝子は、受精した卵母細胞の前
核中に導入される。いくつかの動物（例えば、マウスおよびウサギ）については、受精は
インビボで実施され、そして受精した卵は外科的に取り出される。他の動物（特にウシ類
）においては、生きている動物または屠殺動物から卵細胞を取り出し、そしてインビトロ
で卵を受精させることが好ましい（ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ９１／０８２１６を参照のこと
）。インビトロの受精は、導入遺伝子は、組込むために最適な細胞周期の段階（Ｓ期より
遅くない）で、実質的に同調した細胞中に導入されることを可能にする。導入遺伝子は、
通常、微量注入法によって導入される（ＵＳ ４，８７３，２９２を参照のこと）。次い
で、受精した卵母は、約１６〜１５０細胞を含む着床前胚が得られるまで、インビトロで
培養される。１６〜３２細胞期の胚は、桑実胚として記載される。３２を越える細胞を含
む着床前胚は、胚盤胞と呼ばれる。これらの胚は、代表的に、６４細胞期で割腔の発生を
示す。受精した卵母細胞を着床前段階まで培養するための方法は、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１，４１４（１９８４）；Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐ
ｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｎ．Ｙ．（１９８６）（マウス胚）；およびＨａｍｍ
ｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５，６８０（１９８５）（ウサギ胚およびブタ胚）；Ｇａｎ
ｄｏｌｆｉら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１，２３−２８（１９８７）；Ｒｅｘｒ
ｏａｄら、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６，９４７−９５３（１９８８）（ヒツジ胚）なら
びにＥｙｅｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８５，７１５−７２０（１９８
９）；Ｃａｍｏｕｓら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．７２，７７９−７８５（１９８４
）；ならびにＨｅｙｍａｎら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７，５９６８（１９８
７）（ウシ胚）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）により
記載される。ときどき、着床前胚は、着床までの間、凍結して保存される。着床前胚は、
偽妊娠雌の卵管に移され、導入遺伝子を組込んだ、発生段階に依存して、トランスジェニ
ック動物またはキメラ動物が誕生する。キメラ哺乳動物を交配して、真の生殖系列トラン
スジェニック動物を形成し得る。

あるいは、導入遺伝子は、胚幹細胞（ＥＳ）中に導入され得る。これらの細胞は、イン
ビトロで培養された、着床前の胚から得られる（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３０
９，２５５−２５８（１９８４）（全ての目的のために、その全体において参考として援
用される））。導入遺伝子は、エレクトロポレーションまたは微量注入法によって、その
ような細胞中に導入され得る。形質転換されたＥＳ細胞は、非ヒト動物由来の胚盤胞と結
合される。ＥＳ細胞は、その胚にコロニーをつくり、そしていくつかの胚では、生じるキ
メラ動物の生殖系列を形成する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１４６８
−１４７４（１９８８）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される
）を参照のこと）。あるいは、ＥＳ細胞は、除核された受精卵母細胞中に移植し、トラン
スジェニック哺乳動物を発生させるための、核の供給源として使用され得る。

２つ以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の産生については、その導入遺伝
子は、単一の導入遺伝子の場合と同じ手順を使用して、同時に導入され得る。あるいは、
導入遺伝子は、最初に別々の動物中に導入され得、次いで、これらの動物を交配すること
により、同じゲノム中に組み合わされ得る。あるいは、導入遺伝子の一方を含む第１のト
ランスジェニック動物が、産生される。次いで、２番目の導入遺伝子は、その動物由来の
受精卵中または胚幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態において、長さが他の点で
は約５０ｋｂを超える導入遺伝子は、重複フラグメントとして構築される。そのような重
複フラグメントは、受精卵母細胞中または胚幹細胞中に同時に導入され、そしてインビボ
において相同組換えを受ける（Ｋａｙら、ＷＯ ９２／０３９１７（全ての目的のために
、その全体において参考として援用される）を参照のこと）。

（Ｅ．トランスジェニック哺乳動物の特徴）
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、上記のように、それらのゲノム中の少なくと
も１つの導入遺伝子を取り込む。導入遺伝子は、リソソームタンパク質をコードするＤＮ
Ａセグメントの発現を少なくとも主に乳腺に対して標的化する。驚くことに、その乳腺は
、オリゴ糖の添加およびリン酸化の工程を含む、真正翻訳後プロセシングに必要とされる
タンパク質を発現し得る。乳腺における酵素によるプロセシングは、マンノース基の６’
位のリン酸化を生じる。

リソソームタンパク質は、少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００、２００
０、５０００または１０，０００μｇ／ｍｌという高レベルで分泌され得る。驚くことに
、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、実質的に正常な健康を現わす。乳腺以外の組
織におけるリソソームタンパク質の二次発現は、有毒な効果を引き起こすのに十分な程度
までは生じない。さらに、乳腺において産生される外因性のリソソームタンパク質は、分
泌装置を詰まらせる堆着により存在する、有意な問題が示されない、十分な効率性で分泌
される。

当然、トランスジェニック哺乳動物が乳汁を産生し始め得る年は、動物の性質に伴って
異なる。トランスジェニックウシについては、その年齢は、通常、約２歳半またはホルモ
ンの刺激を用いて６ヶ月であり、一方、トランスジェニックマウスについては、その年齢
は、約５〜６週間である。当然、種の雌のメンバーのみが、乳汁を産生するために有用で
ある。しかし、トランスジェニック雄はまた、雌の子孫を育種するために有用である。ト
ランスジェニック雄由来の精子は、続いてインビトロにおける受精および雌の子孫の産生
のために冷凍保存され得る。

（Ｆ．乳汁からのタンパク質の回収）
トランスジェニック成体雌哺乳動物は、高濃度の外因性リソソームタンパク質を含む乳
を産生する。所望であるなら、そのタンパク質は、識別する物理的特性および化学的特性
、ならびに標準的な精製手順（例えば、沈澱、イオン交換、分子排除またはアフィニティ
ークロマトグラフィー）によって乳汁から精製され得る（一般的に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，
１９８２）を参照のこと）。

乳汁からのヒト酸性α−グルコシダーゼの精製は、遠心分離および脂肪の除去によるト
ランスジェニック乳汁の脱脂、続いて高速遠心分離、続いてのデッドエンド（ｄｅａｄ-
ｅｎｄ）な濾過（すなわち、フィルターの大きさを連続して小さくして使用することによ
るデッドエンドな濾過）または直交流濾過によるカゼインの除去、あるいは直交流濾過に
よるカゼインの直接的な除去によって実施され得る。ヒト酸性α−グルコシダーゼは、ク
ロマトグラフィー（例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（または他の陰イオン交換マ
トリックスを含む）、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属キレートセフ
ァロースあるいはセファロースに結合したレクチン（または他のマトリックス））によっ
て精製される。

Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィーは、以下のように、
濾過した乳清または乳清画分中に存在するヒト酸性α−グルコシダーゼを精製するために
使用され得る：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＱＦＦ；Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、１５ｃｍベッド高
；２５０ｃｍ／時間流速）のカラムを、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０
）（緩衝液Ａ）中で平衡化し；Ｓ／Ｄ−インキュベートした乳清画分（約５００〜約６０
０ｍｌ）を充填し、そしてこのカラムを、４〜６カラム容量（ｃｖ）の緩衝液Ａ（２０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０））で洗浄する。ヒト酸性α−グルコシダーゼ
画分は、１００ｍＭのＮａＣｌを含む２〜３ｃｖの緩衝液Ａを用いて、このＱＦＦカラム
から溶出される。

このＱＦＦ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのヒト酸性α−グルコシダーゼ含有画分は、Ｐｈｅｎ
ｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｆｏｒｍａｎｃｅクロマトグラフィーを使用
して、さらに精製され得る。例えば、１容量の１Ｍの硫酸アンモニウムを、持続的に攪拌
しながら、ＱＦＦ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのヒト酸性α−グルコシダーゼ溶出物に添加する
。次いで、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムクロマトグラフィー（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、１５ｃｍベッド高；１５０ｃｍ／時間流速）は、０
．５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ｃ）（ｐＨ６．
０）中でカラムを平衡化し、（ＱＦＦ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから）０．５Ｍの硫酸アンモ
ニウム−インキュベートしたヒト酸性α−グルコシダーゼ溶出物を充填し、２〜４ｃｖの
緩衝液Ｃでこのカラムを洗浄し、そしてヒト酸性α−グルコシダーゼ（これは、３〜５ｃ
ｖの緩衝液Ｄ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＰｈｅｎｙｌ
ＨＰカラムから溶出された）を溶出することにより、室温にて行われた。ヒト酸性α−
グルコシダーゼをさらに精製するための代替的方法およびさらなる方法は、当業者には明
らかである。例えば、英国特許出願９９８ ０７４６４．４（全ての目的のためにその全
体が参考として援用される）を参照のこと。

（Ｇ．組換えリソソームタンパク質の用途）
本発明により産生される組換えリソソームタンパク質は、酵素置換治療手順において用
途を見出す。機能的リソソーム酵素の不全を生じる、遺伝的または他の欠損を有する患者
は、この患者に外来性の酵素を投与することにより処置され得る。このような処置の必要
な患者は、症状（例えば、小人症、角膜混濁、肝脾腫大症、弁病変、冠状動脈病変、骨格
変形、関節硬直および進行性精神遅滞を含むフルラー症候群の症状）から同定され得る。
あるいは、またはさらに、患者は、特定のリソソーム酵素によりプロセスされる特徴的な
代謝物の過剰な蓄積を明らかにするため、組織サンプルの生化学的分析から診断され得る
か、あるいは特定のなリソソーム酵素活性の欠損を明らかにするための、人工の基質また
は天然の基質を使用する酵素アッセイによって診断され得る。ほとんどの疾患について、
診断は、症状の発症または代謝物の過剰な蓄積の前に、特定の酵素の欠損を測定すること
により、またはＤＮＡ分析によりなされ得る（Ｓｃｒｉｖｅｒら、前出、ｌｙｓｏｓｏｍ
ａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの章）。リソソーム貯蓄症の全ては、遺伝性
である。従って、リソソーム疾患に罹患したメンバーを有することが既知である家系由来
の子孫において、最終診断がなされ得る前でも、予防的処置を開始することは、時として
有利である。

（薬学的組成物）
いくつかの方法において、リソソーム酵素は、薬学的成物として薬学的キャリアと共に
、精製された形態で投与される。この好ましい形態は、投与および治療的適用の意図され
る様式に依存する。この薬学的キャリアは、患者にポリペプチドを送達するために適切な
任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活
性固体が、キャリアとして使用され得る。薬学的に受容可能なアジュバント、緩衝化剤、
分散剤などもまた、この薬学的組成物中へ組み込まれ得る。

薬学的組成物中の酵素の濃度は、広範に変化し得る（すなわち、約０．１重量％未満（
通常は、少なくとも約１重量％）から、２０重量％以上程度まで）。

経口投与のために、活性成分は、カプセル、錠剤および粉末のような固形投薬形態、ま
たはエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態で投与され得る。活性成分
は、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたは
セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、
タルク、炭酸マグネシウムなどのような不活性成分および粉末キャリアと共に、ゼラチン
カプセル中にカプセル化され得る。所望の色、味、安定性、緩衝能、分散または他の公知
の所望の特徴を提供するために添加され得る、さらなる不活性成分の例は、赤色酸化鉄、
シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタニウム、食用白インク（ｅｄｉｂｌｅ
ｗｈｉｔｅ ｉｎｋ）などである。同様の希釈剤が、圧縮剤を作製するために使用され
得る。錠剤およびカプセルの両方は、徐放生成物として製造されて、数時間にわたり薬物
の持続的な放出を提供し得る。圧縮剤は、いかなる不快な味をも遮断するため、および大
気からこの錠剤を保護するために、糖コーティングもしくはフィルムコーティングされ得
るか、または胃腸管中での選択的な分解のために腸溶性コーティングされ得る。経口投与
のための液体投薬形態は、患者の受け入れを増加するために、着色剤および香味料を含み
得る。

静脈内注入のための代表的な組成物は、２０％アルブミン溶液および１００ｍｇ〜５０
０ｍｇの酵素を必要に応じて補充した、１００〜５００ｍｌの滅菌した０．９％のＮａＣ
ｌまたは５％のグルコースを含むように調合され得る。筋肉内注射のための代表的な薬学
的組成物は、例えば、１ｍｌの滅菌緩衝水および１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明の精製された
αグルコシダーゼをむように調合される。非経口的に投与可能な組成物を調製するための
方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏ
ｎ，ＰＡ，１９８０）（全ての目的のためにその全体において参考として援用される）を
含む種々の供給源において、より詳細に記載される。

ＡＧＬＵは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で処方され得る。少
量の硫酸アンモニウムは、必要に応じて存在（＜１０ｍＭ）する。酵素は、代表的には約
−７０℃にて凍結保存され、使用前に解凍される。あるいは、この酵素は、溶液中で（例
えば、約４℃〜８℃にて）冷却保存され得る。いくつかの実施形態においてＡＧＬＵ溶液
は、緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムまたは他の生理学的に受容可能
な緩衝液）、単純な炭水化物（例えば、スクロース、グルコース、マルトース、マンニト
ールなど）、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、および／または界面活性剤（
例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、クレモフォア（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ
ｅ）−ＥＬ，クレモフォア（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）−Ｒ，ラブロフィル（ｌａｂｒｏｆ
ｉｌ）など）を含む。

ＡＧＬＵはまた、凍結乾燥形態で保存され得る。凍結乾燥のために、ＡＧＬＵは、リン
酸緩衝液中にマンニトールおよびスクロースを含む溶液中で処方され得るべきである。ス
クロースの濃度は、再構成に際してＡＧＬＵの凝集を妨げるために十分である。マンニト
ールの濃度は、さもなくば凍結乾燥のために必要とされる時間を顕著に減少するために十
分であるべきである。しかし、マンニトールおよびスクロースの濃度は、再構成に際して
受容されない高浸透圧性を引き起こすに不十分であるべきである。それぞれ１ｍｇ／ｍｌ
〜３ｍｇ／ｍｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのマンニトールおよびスクロ
ースの濃度が、適切である。好ましい濃度は、２ｍｇ／ｍｌのマンニトールおよび０．５
ｍｇ／ｍｌのスクロースである。ＡＧＬＵは、凍結乾燥前および再構成後に、好ましくは
、５ｍｇ／ｍｌである。好ましく０．９％での生理食塩水は、再構成のために好ましい溶
液である。

ウサギの乳汁から精製されるＡＧＬＵについて、少量の不純物（例えば、約５％まで）
は容認され得る。可能性のある不純物は、ウサギの乳清タンパク質の形態で存在し得る。
他の可能性のある不純物は、ＡＧＬＵの構造的アナログ（例えば、オリゴマーおよび凝集
体）および切断物である。現在のバッチは、トランスジェニックウサギにおいて産生され
るＡＧＬＵが９５％より高く純粋であることを示す。最も大きな不純物はウサギの乳清タ
ンパク質であるが、ゲル電気泳動に際して、異なる分子量のＡＧＬＵバンドもまた見られ
る。

注入溶液は、層流空気流フード中で無菌的に調製されるべきである。適切な量のＡＧＬ
Ｕは、フリーザーから取り出され、室温にて解凍されるべきである。注入溶液は、ヒト血
清アルブミン（ＨＳＡ）およびグルコースを含む、適切な量の溶液と適切な量のＡＧＬＵ
最終産物溶液を混合することにより、ガラス注入ボトル中で調製され得る。最終濃度は、
２５ｍｇ〜２００ｍｇの用量に対して１％のＨＳＡおよび４％のグルコース、そして４０
０ｍｇ〜８００ｍｇの用量に対して１％のＨＳＡおよび４％のグルコースであり得る。Ｈ
ＳＡおよびＡＧＬＵは、５％グルコースを含む注入ボトルに移す前に、０．２μｍのシリ
ンジフィルターを用いて濾過され得る。あるいは、ＡＧＬＵは、生理食塩水溶液（注入の
ために、好ましくは０．９％）中で再構成され得る。注入のためのＡＧＬＵの溶液は、室
温にて７時間まで安定であることが示されている。従って、このＡＧＬＵ溶液は、好まし
くは調製７時間以内に注入される。

（治療方法）
本発明は、ポンペ病を処置する有効な方法を提供する。これらの方法は、触媒的に活性
である形態での、および処置されている患者の組織、特に肝臓、心臓および筋肉（例えば
、平滑筋、横紋筋および心筋）により取り込まれ得る形態での大量のヒト酸性α−グルコ
シダーゼの利用可能性を、一部前提とする。このようなヒト酸性α−グルコシダーゼは、
例えば、実施例に記載されるトランスジェニック動物から提供される。α−グルコシダー
ゼは、好ましくは、主に（すなわち、＞５０％）約１００ｋＤ〜１１０ｋＤの前駆体形態
である。（１００ｋＤ〜１１０ｋＤの前駆体の見かけの分子量または相対的移動性は、使
用される分析の方法に依存して幾分変化し得るが、典型的には、９５ｋＤと１２０ｋＤの
範囲内である。）実施例において議論されるトランスジェニック動物中のヒト酸性α−グ
ルコシダーゼでの首尾よい結果を考慮すると、細胞発現系から生じるようなヒトα−グル
コシダーゼの他の供給源もまた使用され得ることが可能である。例えば、ヒト酸性α−グ
ルコシダーゼを生成する代替的方法は、適切なプロモーターに作動可能に連結された、ｃ
ＤＮＡまたはゲノム構築物として、安定な真核生物細胞株（例えば、ＣＨＯ）中に、酸性
α−グルコシダーゼ遺伝子をトランスフェクトすることである。しかし、このようなアプ
ローチによる臨床的な治療のために必要とされる、大量のヒト酸性α−グルコシダーゼを
生成することは、より困難である。

本発明の薬学的組成物は、通常、静脈内に投与される。皮内、筋肉内または経口投与は
また、いくつかの場合において可能である。この組成物は、リソソーム酵素欠損疾患を患
っている、またはその危険のある個体の予防的な処置のために投与され得る。治療的適用
について、薬学的組成物は、蓄積された代謝物の濃度を減少させるため、および／または
代謝物のさらなる蓄積を予防もしくは防止するために十分な量で、確立された疾患に罹患
している患者に投与される。リソソーム酵素欠損疾患の危険のある個体に対して、この薬
学的組成物は、代謝物の蓄積を予防または阻害するいずれかのために十分な量で、予防的
に投与される。このことを達成するために適切な量は、「治療的有効量」または「予防的
有効量」として定義される。このような有効量は、状態の重症度および患者の健康状態の
全身性状態に依存する。

この方法において、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、通常、患者に対して一週間あたり
患者体重に対して１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、投与される。しばしば、用量は、一週間
あたり１０ｍｇ／ｋｇを超える。投薬レジメンは、一週間あたり１０ｍｇ／ｋｇ〜一週間
あたり少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。代表的な投薬レジメンは、一週
間あたり１０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり１５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり２０ｍｇ／ｋｇ、
一週間あたり２５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり３０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり３５ｍｇ／ｋ
ｇ、一週間あたり４０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり４５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり６０ｍｇ
／ｋｇ、一週間あたり８０ｍｇ／ｋｇおよび一週間あたり１２０ｍｇ／ｋｇである。好ま
しいレジメンにおいては、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ
／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇが、毎週１回、２回または３回投与される。処置は、少なく
とも４週間、時として２４週間、そして時として患者の生涯にわたり、代表的に続けられ
る。処置は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される。必要に応じて、ヒトα−グル
コシダーゼのレベルは、処置後にモニターされ（例えば、血漿または筋肉において）、そ
して検出されるレベルが、実質的に正常なヒトにおける値未満（例えば、２０％未満）に
低下した場合、さらなる用量が投与される。

いくつかの方法において、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、初めは「高」用量（すなわ
ち、「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」）で投与され、続いて低用量（すなわち
、「維持用量」）で投与される。負荷用量の例は、週（例えば、１、２または３週間）あ
たり１〜３回、患者体重に対して少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇである。維持用量の例は、
周あたり患者体重に対して少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ〜少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇであ
り、またはそれ以上（例えば、一週間あたり２０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり３０ｍｇ／ｋ
ｇ、一週間あたり４０ｍｇ／ｋｇ）である。

いくつかの方法において、用量は、投薬期間中に増加速度で投与される。このようなこ
とは、静脈内注入の流速を増加することにより、または一定の速度で投与される漸増する
濃度のα−グルコシダーゼの勾配を使用することにより達成され得る。この様式での投与
は、免疫原性反応の危険性を減少させる。いくつかの用量において、単位時間あたりのα
−グルコシダーゼの単位において測定される投与速度は、少なくとも１０の係数により増
加する。代表的に、静脈内注入は、数時間の期間（例えば、１〜１０時間、および好まし
くは２〜８時間、より好ましくは３〜６時間）にわたり行われ、そして注入速度は、投与
の期間中に間隔をおいて増加される。

増加速度での注入についての適切な用量（全ては、ｍｇ／ｋｇ／時間）は、以下の表１
に示される。この表の第１欄は、投薬スケジュールにおける時間を示す。例えば、０〜１
時間への参照は、投薬の最初の時間を言及する。表の第５欄は、それぞれの時間で使用さ
れ得る用量の範囲を示す。第４欄は、好ましい投薬量の制限された内包範囲を示す。第３
欄は、例示的な臨床的試行において投与される投薬量のより高い値とより低い値を示す。
第２欄は、特に好ましい投薬量を示し、それらは、表１の第３欄に示される範囲の平均を
示す。

この方法は、早発性（幼児性）ポンペ病および遅発性（若年性および成人性）ポンペ病
の両方を有する患者に対して有効である。ポンペ病の幼児性形態を有する患者において、
症状は、生涯の最初の４ヶ月において明らかになる。大半において、貧弱な運動発達およ
び成長不全が、最初に認められる。臨床試験に際して、筋肉消耗、胸骨退縮を伴う増加し
た呼吸速度、肝臓の中程度の膨大および舌の突出を伴う全身性緊張低下が存在する。心臓
の超音波試験は、進行性の肥大型心筋症を示し、最終的に不十分な心拍出量を誘導する。
ＥＣＧは、顕著な左軸偏位、短いＰＲ間隔、大きなＱＲＳ複合体、反転Ｔ波、およびＳＴ
低下により特徴付けられる。この疾患は、生涯の最初の年において心臓性呼吸不全を誘導
する、急速な進行経過を示す。剖検での組織学的な試験に際して、リソソームのグリコー
ゲン蓄積が、種々の組織において観察され、心臓および骨格筋において最も明白である。
本発明の方法におけるてヒト酸性α−グルコシダーゼを用いる処置は、そのような患者の
寿命の延長を生じる（例えば、１、２、５年を超えて、正常な寿命まで）。処置はまた、
上で議論したように、ポンペ病の臨床学的特徴および生化学的特徴の除去または減少を生
じ得る。処置は、生後直ぐに、またはこの患者が、それらの子孫を危険におかせる変異し
たα−グルコシダーゼ対立遺伝子を保有することが既知である場合は、出生前に投与され
る。

ポンペ病の遅発性の成人性形態を有する患者は、生涯の最初の二十年において、症状を
経験しないかもしれない。この臨床学的なサブタイプにおいて、主に骨格筋が、肢帯、体
幹および横隔膜のそれらの偏好に関連する。階段を登る際の困難は、しばしば最初の病訴
である。呼吸障害は、かなり変化する。これは、臨床的容体を支配し得るか、またはこれ
は、患者によっては、晩年になるまで経験されない。ほとんどのそのような患者は、呼吸
不全のために死亡する。若年性サブタイプを有する患者において、症状は、通常、生涯の
最初の１０年で明らかとなる。成人性ポンペ病の場合、骨格筋衰弱が、主な問題であり；
心臓肥大、肝腫大および巨舌症が見られ得るが、稀である。多くの場合、毎晩の人工呼吸
器支持が、最終的に必要とされる。呼吸筋の萎縮を併発する肺感染は、生命を脅かし、大
半において、３０年の年数前には致死的になる。本発明の方法を用いた処置は、遅延性の
若年性ポンペ病患者または成人性ポンペ病患者の寿命を正常な寿命まで延長する。処置は
また、疾患の臨床的症状および生化学的症状を除去または顕著に減少する。

（他の用途）
トランスジェニック動物の乳汁中のリソソームタンパク質産物は、多くの他の用途を有
する。例えば、他のα−アミラーゼと共通してα−グルコシダーゼは、デンプン、ビール
および医薬品の生産において重要なツールである。ＶｉｈｉｎｅｎおよびＭａｎｔｓａｌ
ａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４，３２９−４０１（１
９８９）（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照のこと。リソソ
ームタンパク質はまた、実験化学薬品または加工食品を生産するために有用である。例え
ば、酸性α−グルコシダーゼは、１，４α−糖質結合（ｇｌｕｃｉｄｉｃ ｂｏｎｄ）お
よび１，６α−糖質結合を分解し、そして、マルトース、イソマルトース、デンプンおよ
びグリコーゲンのような、それらの結合を含む種々の炭水化物の分解に使用されて、グル
コースを産生し得る。酸性α−グルコシダーゼはまた、腸マルターゼ不全または腸イソマ
ルターゼ不全の患者に対する投与のために有用である。さもなくば消化されないマルトー
スの存在から生じる症状は、回避される。そのような適用において、この酵素は、乳汁か
らの事前の画分化なしで、そのような乳汁から誘導される加工食品（例えば、アイスクリ
ームまたはチーズ）として、または薬学的組成物として投与され得る。精製された組換え
リソソーム酵素はまた、組織サンプル中のこのような酵素の未知量のアッセイのための診
断キットにおけるコントロールとして含まれるために有用である。

（実施例）
（実施例１：導入遺伝子の構築）
（（ａ）ｃＤＮＡ構築物）
ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築は、プラ
スミドｐ１６，８ｈｌｆ３（ＤｅＢｏｅｒら（１９９１）および（１９９３）、前出を参
照のこと）を用いて開始した。このプラスミドは、ウシαＳ１−カゼイン調節配列を含む
。この親プラスミドのラクトフェリンｃＤＮＡ挿入物を、図１において示されるような発
現カセットのＣｌａＩ部位およびＳａｌＩ部位において、ヒト酸性α−グルコシダーゼｃ
ＤＮＡ（Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．７，１６９７〜１７０４（１９８８））
と交換した。α−グルコシダーゼｃＤＮＡフラグメントの末端にこれらの適合可能な制限
部位を得るために、ヒトα−グルコシダーゼをコードする完全なｃＤＮＡを含むプラスミ
ドｐＳＨＡＧ２（同上）を、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いて消化して、そしてこの３
．３ｋｂ ｃＤＮＡフラグメントを、ベクターのヌクレオチド配列内の破壊されたＣｌａ
Ｉ部位および新しく設計されたポリリンカー（ＨｉｎｄＩＩＩ ＣｌａＩ ＥｃｏＲＩ
ＳｐｈＩ ＸｈｏＩ ＥｃｏＲＩ ＳｆｉＩ ＳｆｉＩ／ＳｍａＩ ＮｏｔＩ ＥｃｏＲ
Ｉ^*（^*＝破壊された部位））を有する、ｐＫＵＮ７ΔＣ（ｐＫＵＮＩ誘導体）（Ｋｏｎｉ
ｎｇｓら、Ｇｅｎｅ ４６、２６９〜２７６（１９８６））中でサブクローン化した。生
じたプラスミドｐαｇｌｕＣＥＳＸから、この３．３−ｋｂ ｃＤＮＡフラグメントを、
ＣｌａＩおよびＸｈｏＩにより切り出し得た。このフラグメントを、ＣｌａＩ部位および
ＸｈｏＩ−適合可能なＳａｌＩ部位で、図１において示される発現カセットに挿入した。
結果として、発現プラスミドｐ１６，８αｇｌｕは、図１において示されるようなウシα
Ｓ１−カゼイン配列に隣接される、ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードするｃＤＮＡ配
列からなる。完全な発現カセットを含むこの２７．３−ｋｂフラグメントを、ＮｏｔＩを
用いた切断により、切り出し得る（図１を参照のこと）。

（（ｂ）ゲノム構築物）
構築物ｃ８αｇｌｕｅｘ１は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子（Ｈｏｅｆｓｌｏｏ
ｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．２７２，４９３〜４９７（１９９０））（その転写開始部位
のちょうど下流のエキソン１において始まる）を含む（図２、パネルＡを参照のこと）。
従って、この構築物は、ヒト酸性αグルコシダーゼ遺伝子のほとんど完全な５’ＵＴＲを
コードする。このフラグメントを、ウシαＳ１−カゼイン遺伝子のプロモーター配列に融
合した。このαＳ１−カゼイン開始部位は、αＳ１−カゼイン／酸性α−グルコシダーゼ
接合部の２２ｂｐ上流に存在する。この構築物は、ヒト酸性α−グルコシダーゼポリアデ
ニル化シグナル配列および３’隣接配列を有する。構築物ｃ８αｇｌｕｅｘ２は、ヒト酸
性α−グルコシダーゼ遺伝子のエキソン２における転写開始部位に即座に融合されるウシ
αＳ１カゼインプロモーターを含む（図２、パネルＢを参照のこと）。従って、αＳ１−
カゼイン転写開始部位およびα−グルコシダーゼ転写開始部位は、この構築物において２
２ｂｐ離れている。従って、α−グルコシダーゼ５’ＵＴＲを保存しない。この構築物は
また、図２、パネルＢにおいて示されるようなヒト酸性α−グルコシダーゼポリアデニル
化シグナル配列および３’隣接配列を含む。

構築物ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０は、３’領域においてのみ、構築物ｃ８αｇｌｕ
ｅｘ２と異なる。エキソン２０におけるＳｐｈＩ部位を、ウシαＳ１−カゼイン３’配列
をヒト酸性α−グルコシダーゼ構築物と融合するために用いた。このポリアデニル化シグ
ナルは、この３’αＳ１−カゼイン配列中に位置する（図２、パネルＣ）。

構築物ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０は、３’領域においてのみ、構築物ｃ８αｇｌｕ
ｅｘ２と異なる。エキソン２０におけるＳｐｈＩ部位を、ウシαＳ１−カゼイン３’配列
をヒト酸性α−グルコシダーゼ構築物と融合するために用いた。このポリアデニル化シグ
ナルは、この３’αＳ１−カゼイン配列中に位置する（図２、パネルＣ）。

（ゲノム構築物の構築の方法）
ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子を含む３つの連続したＢｇｌＩＩフラグメントを、
Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（前出）によって単離した。これらのフラグメントを、カスタマイ
ズされたポリリンカー（ＨｉｎｄＩＩＩ ＣｌａＩ ＳｔｕＩ ＳｓｔＩ ＢｇｌＩＩ
ＰｖｎＩ ＮｃｏＩ ＥｃｏＲＩ ＳｐｈＩ ＸｈｏＩ ＥｃｏＲＩ^* ＳｍａＩ／Ｓｆ
ｉＩ ＮｏｔＩ ＥｃｏＲＩ^*（^*＝破壊された部位））を有するｐＫＵＮ８ΔＣ（ｐＫＵ
Ｎ７ΔＣ誘導体）のＢｇｌＩＩ部位中に連結した。この連結は、プラスミドｐ７．３αｇ
ｌｕＢＥＳ、ｐ７．３αｇｌｕＢＳＥ、ｐ８．５αｇｌｕＢＳＥ、ｐ８．５αｇｌｕＢＥ
Ｓ、ｐ１０αａｇｌｕＢＳＥおよびｐ１０αｇｌｕＢＥＳを生成する、これらの２つの方
向のフラグメントを生じた。

発現カセットの末端の独特なＮｏｔＩ−部位が、マイクロインジェクションに使用され
るフラグメントの単離のために後で使用されることから、ヒト酸性α−グルコシダーゼの
イントロン１７における遺伝子内ＮｏｔＩ部位を、破壊しなければならなかった。従って
、ｐ１０αｇｌｕＢＥＳを、ＣｌａＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し；３’α−グルコシ
ダーゼの末端を含むフラグメントを単離した。このフラグメントを、ｐＫＵＮ１０ΔＣの
ＣｌａＩ部位およびＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐ１０αｇｌｕΔＮＶを生じた。前もって、
ｐＫＵＮ１０ΔＣ（すなわち、ｐＫＵＮ８ΔＣの誘導体）を、ＮｏｔＩを用いてｐＫＵＮ
８ΔＣを消化し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて粘着末端を充填し、そして続いて、平滑末端連結
によりこのプラスミドをアニーリングすることによって得た。最終的に、ｐ１０αｇｌｕ
ΔＮＶを、ＮｏｔＩを用いて消化した。これらの粘着末端をまた、Ｋｌｅｎｏｗで充填し
て、そしてこのフラグメントを連結し、プラスミドｐ１０αｇｌｕΔＮｏｔＩを生じた。

（ｃ８αｇｌｕｅｘ１の構築）
αグルコシダーゼ遺伝子の最初のエキソンにおけるＳｓｔＩ部位を、ウシαＳ１−カゼ
イン配列との融合のために選択したことから、ｐ８．５αｇｌｕＢＳＥを、ＢｇｌＩＩを
用いて消化し、その後、ＳｓｔＩを用いて部分消化した。エキソン１〜３を含むフラグメ
ントを単離し、そしてｐＫＵＮ８ΔＣのＢｇｌＩＩ部位およびＳｓｔＩ部位に連結した。
この生じたプラスミドを、以下のように命名した：ｐ５’αｇｌｕｅｘ１（図３、パネル
Ａを参照のこと）。

次の工程（図３、パネルＢ）は、３’部分のｐ５’αｇｌｕｅｘ１への連結であった。
第１に、ｐ１０αｇｌｕΔＮをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。エキソン
１６〜２０を含むこのフラグメントを、単離した。第２に、ｐ５’αｇｌｕｅｘ１を、Ｂ
ｇｌＩＩを用いて消化し、そして自己連結を防ぐために、および粘着ＢｇｌＩＩ末端を脱
リン酸化するために、ホスホリラーゼ（ＢＡＰ）を用いて処理した。ＢａｍＨＩ粘着末端
は、ＢｇｌＩＩ粘着末端と適合可能であるから、これらの末端は互いに連結する。この生
じたプラスミド（すなわち、ｐ５’３’αｇｌｕｅｘ１）を、選択した。このプラスミド
は、最終の構築工程のために利用可能な独特なＢｇｌＩＩ部位を有する（図３、パネルＢ
およびパネルＣ）。

αグルコシダーゼ遺伝子の中間部分を、その後の構築物に挿入した。この工程のために
、ｐ７．３αｇｌｕＢＳＥをＢｇｌＩＩを用いて消化し、８．５−ｋｂフラグメントを単
離し、そしてＢｇｌＩＩ−消化および脱リン酸化されたｐ５’３’αｇｌｕｅｘ１プラス
ミドに連結した。この生じたプラスミドが、ｐαｇｌｕｅｘ１である（図３、パネルＣ）
。

このウシαＳ１カゼインプロモーター配列を、３つのフラグメントを含む連結を介して
次の工程において組み込んだ。ｐＷＥ１５コスミドベクターを、ＮｏｔＩを用いて消化し
、そして脱リン酸化した。ウシαＳ１−カゼインプロモーターを、８ Ｒｂ ＮｏｔＩ−
ＣｌａＩフラグメントとして単離した（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９９１、（前出）を参照の
こと）。ヒト酸性α−グルコシダーゼフラグメントを、同じ酵素を用いてｐαｇｌｕｅｘ
１から単離した。これらの３つのフラグメントを、連結して、そして１０４６ Ｅ．ｃｏ
ｌｉ宿主細胞において、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＧｉｇａｐａｃｋＩＩキットを用いてパ
ッケージングした。この生じたコスミドｃ８αｇｌｕｅｘ１を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α
中で、増殖させた。このベクターを、マイクロインジェクションの前にＮｏｔＩを用いて
線状化した。

（ｃ８αｇｌｕｅｘ２およびｃ８．８αｇｌｕｅｘ２−２０の構築）
他の２つの発現プラスミドの構築（図２、パネルＢおよびパネルＣ）は、ｃ８αｇｌｕ
ｅｘ１の構築と類似のストラテジーに従った。このプラスミドｐ５’αｇｌｕＳｔｕＩを
、ｐ８，５αｇｌｕＢＳＥから、ＳｔｕＩを用いたこのプラスミドの消化、それに続く、
エキソン２〜３およびこのベクター配列を含む、単離されたフラグメントの自己連結によ
り誘導した。プラスミドｐ５’αｇｌｕＳｔｕＩを、ＰｇｌＩＩを用いて消化し、それに
続いて、ＮｃｏＩを用いてこの線状フラグメントを部分消化して、いくつかのフラグメン
トを生じた。エキソン２および３を含む２．４ｋｂフラグメントを単離し、そしてベクタ
ーｐＫＵＮ１２ΔＣのＮｃｏＩ部位およびＢｇｌＩＩに連結し、ｐ５’αｇｌｕｅｘ２を
生じた。ｐＫＵＮ１２ΔＣが、ポリリンカー（ＣｌａＩ ＮｃｏＩ ＢｇｌＩＩ Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ ＥｃｏＲＩ ＳｐｈＩ ＸｈｏＩ ＳｍａＩ／ＳｆｉＩ ＮｏｔＩ）を含むｐ
ＫＵＮ８ΔＣの誘導体であることに留意すること。

プラスミドｐ１０αｇｌｕΔＮｏｔＩを、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消
化した。このエキソン１６〜２０を含むフラグメントを単離し、そしてＢｇｌＩＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化されたｐ５’αｇｌｕｅｘ２中に連結した。この生じたプラ
スミドが、ｐ５’３’αｇｌｕｅｘ２であった。ｐ５’３’αｇｌｕｅｘ２における中間
のフラグメントを、ｐαｇｌｕｅｘ１についてのように挿入した。このために、ｐ７．３
αｇｌｕを、ＢｇｌＩＩを用いて消化した。このフラグメントを単離し、そしてＢｇｌＩ
Ｉ−消化および脱リン酸化されたｐ５’３’αｇｌｕｅｘ２に連結した。この生じたプラ
スミド、ｐαｇｌｕｅｘ２を、ｃ８αｇｌｕｅｘ−２０およびｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−
２０の構築において使用した（図２、パネルＢおよびパネルＣ）。

第３の発現プラスミドｃ８，８α ｇｌｕｅｘ２−２０の構築のために（図２、パネル
Ｃ）、α−グルコシダーゼの３’隣接領域を欠失した。これを達成するために、ｐαｇｌ
ｕｅｘ２を、ＳｐｈＩを用いて消化した。このエキソン２−２０を含むフラグメントを単
離し、そして自己連結して、ｐαｇｌｕｅｘ２−２０を生じた。その後に、ウシαｓ１−
カゼイン遺伝子の３’隣接領域を含むフラグメントを、ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩを用いた
消化により、ｐ１６，８αｇｌｕから単離した。このフラグメントを、ポリリンカー配列
におけるＳｐｈＩ部位およびＮｏｔＩ部位を用いて、ｐαｇｌｕｅｘ２−２０に挿入し、
ｐαｇｌｕｅｘ２−２０−３αＳ１を生じた。

ｃ８，８ｇｌｕｅｘ２−２０を生成するこの最終工程は、ｃ８αｇｌｕｅｘ１を導く構
築における最終工程のような、３つのフラグメントの連結であった。ｐαｇｌｕｅｘ２−
２０−３’αＳ１およびｐαｇｌｕｅｘ２におけるＣｌａＩ部位が、メチル化のために切
断可能でないようであったことから、プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＡＭ（−）株ＥＣ
Ｏ３４３において増殖しなければならなかった。その株から単離されたｐαｇｌｕｅｘ２
−２０−３’αＳ１を、ＣｌａＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。エキソン２〜２０お
よび３’αカゼイン隣接領域を含むフラグメントを、ベクター配列から精製した。このフ
ラグメント（ウシαｓ１プロモーター（ＤｅＢｏｅｒ（１９９１）および（１９９３）、
前出を参照のこと）を含む８ｋｂ ＮｏｔＩ−ＣｌａＩフラグメント）およびＮｏｔＩ−
消化、脱リン酸化されたｐＷＥ１５を連結し、そしてパッケージングした。この生じたコ
スミドが、ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０である。

コスミドｃ８αｇｌｕｅｘ２（図２、パネルＢ）を、２つの異なる工程を介して構築し
た。第１に、コスミドｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用い
て消化した。αＳ１−プロモーターおよび酸性α−グルコシダーゼ遺伝子のエキソン２〜
６の部分を含む１０．５ｋｂフラグメントを、単離した。第２に、プラスミドｐαｇｌｕ
ｅｘ２を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、酸性αグルコシダーゼ遺伝子の３’
部分を含むフラグメントを得た。最後に、コスミドベクターｐＷＥ１５を、ＮｏｔＩを用
いて消化して、脱リン酸化した。これらの３つのフラグメントを、連結して、そしてパッ
ケージングした。この生じたコスミドが、ｃ８αｇｌｕｅｘ２である。

（実施例２：トランスジェネシス）
ｃＤＮＡ構築物およびゲノム構築物を、ＮｏｔＩを用いて線状化して、そして受精マウ
ス卵母細胞の前核に注入し、次いで、この卵母細胞を、偽妊娠マウスの養母の子宮の中に
移植した。この子孫を、クリップテイル（ｃｌｉｐｐｅｄ ｔａｉｌ）から単離されたＤ
ＮＡのサザンブロットによって、ヒトα−グルコシダーゼｃＤＮＡ遺伝子構築物またはゲ
ノムＤＮＡ遺伝子構築物の挿入について分析した。トランスジェニックマウスを選択し、
そして育種した。

ＮｏｔＩを用いて線状化されたゲノム構築物をまた、受精ウサギ卵母細胞の前核に注入
し、これを偽妊娠ウサギの養母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）の子宮に移植した。この
子孫を、α−グルコシダーゼＤＮＡの挿入について、サザンブロットにより分析した。ト
ランスジェニックウサギを、選択し、そして育成した。

（実施例３：トランスジェニックマウスの乳汁中の酸性α−グルコシダーゼの分析）
トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックコントロールからの乳汁をウェ
スタンブロットによって分析した。このプローブは、ヒト酸性α−グルコシダーゼに対し
て特異的な（すなわち、マウス酵素には結合しない）マウス抗体であった。導入遺伝子１
６７２および１６７３は、乳汁中にヒト酸性αグルコシダーゼの発現を示した（図４）。
１００〜１１０ｋＤおよび７６ｋＤにおける大きいバンドおよび小さいバンドが、α−グ
ルコシダーゼについて予測されるものとして観察された。非トランスジェニックマウス由
来の乳汁中に、バンドは観察されなかった。

ヒト酸性α−グルコシダーゼの活性を、トランスジェニックマウス系統の乳汁中の人工
基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを用いて測定した（Ｇａｌ
ｉａａｒｄ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｅａｒｌｙ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎ
ｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、８０９〜８２７頁（１９８０）を参照
のこと）。このｃＤＮＡ構築物（図１）を含むマウスは、１時間あたり０．２μｍｏｌ／
ｍｌ〜２μｍｏｌ／ｍｌで変化する。このゲノム構築物（図２、パネルＡ）を含むマウス
系統は、１時間あたり１０μｍｏｌ／ｍｌ〜６１０μｍｏｌ／ｍｌまでのレベルで発現し
た。これらの図は、１８０μｍｏｌ／ｍｇの組換え酵素の推定される比活性（Ｖａｎ ｄ
ｅｒ Ｐｌｏｅｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２３５：３９２〜３９６（１９８８））に基づ
いて、１．３ｍｇ／ｌ〜１１．３ｍｇ／ｌまでの産生（ｃＤＮＡ構築物）および０．０５
ｇ／ｌ〜３．３ｇ／ｌの産生（ゲノム構築物）と同等である。

この組換え酸性α−グルコシダーゼを、ＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TMおよびＳｅｐ
ｈａｄｅｘ^TMＧ２００上での乳汁の連続クロマトグラフィーにより、トランスジェニック
マウスの乳汁から単離した。７ｍｌの乳汁を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．６お
よび１００ｍＭ ＮａＣｌからなる３ｍｌのＣｏｎ Ａ緩衝液を用いて、１０ｍｌに希釈
した。次いで、Ｃｏｎ Ａ緩衝液中のＣｏｎ Ａセファロースの１：１懸濁液を加え、そ
してその乳汁を穏やかな振とうで、一晩、４度に置いた。次いで、Ｃｏｎ Ａセファロー
スビーズを、遠心分離によって収集し、そしてＣｏｎ Ａ緩衝液を用いて５回、１００ｍ
Ｍの代わりに１Ｍ ＮａＣｌを含むＣｏｎ Ａ緩衝液を用いて３回、１００ｍＭの代わり
に０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＣｏｎ Ａ緩衝液を用いて１回洗浄し、そして次いで、０．
５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含むＣｏｎ Ａ緩衝
液を用いてバッチ形式で抽出した。抽出されたサンプル中の酸性α−グルコシダーゼ活性
を、人工の４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド基質を用いて測定
した（上記を参照のこと）。酸性α−グルコシダーゼ活性を含む画分をプールし、濃縮し
、２０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５および２５ｍＭ ＮａＣｌからなるＳｅｐｈａｄｅｘ
緩衝液に対して透析し、そしてＳｅｐｈａｄｅｘ^TM２００カラムにアプライした。このカ
ラムに、同じ緩衝液を流し（ｒｕｎ）、そして画分を酸性α−グルコシダーゼ活性および
タンパク質含量についてアッセイした。酸性α−グルコシダーゼ活性に富み、そして実質
的に他のタンパク質を含まない画分を、プールし、そして濃縮した。記載されるような方
法は、Ｒｅｕｓｅｒら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５５：１７８〜１７９（１９８４
）によって公開された方法と基本的に同じである。この方法のいくつかの改変は、緩衝液
系の正確な組成およびｐＨ、ならびに精製工程の数およびカラム材料における選択に関し
て可能である。

次いで、乳汁から精製された酸性α−グルコシダーゼを、ＧＳＤ ＩＩ（内因性の酸性
α−グルコシダーゼにおける欠陥）を有する患者由来の培養された線維芽細胞に対してこ
の酵素を投与することにより、リン酸化について試験した。この試験において、マンノー
ス６−ホスフェート含有タンパク質が、線維芽細胞の細胞表面上のマンノース６−ホスフ
ェートレセプターに結合され、そしてその後、内部移行される。この結合は、遊離マンノ
ース６−ホスフェートにより阻害される（Ｒｅｕｓｅｒら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．
１５５：１７８−１８９（１９８４））。トランスジェニックマウスの乳汁から単離され
た酸性α−グルコシダーゼのリン酸化についての代表的な試験において、この酸性α−グ
ルコシダーゼを、２０時間の間で、１時間あたり１μｍｏｌの４−メチル−ウンベリフェ
リル−α−Ｄ−グルコピラノシドを代謝するのに十分な量で、５００μｌ培養培地（１０
％ウシ胎仔血清および３ｍＭ Ｐｉｐｅｓを供給されたＨａｍ Ｆ１０）中の１０４〜１
０６の線維芽細胞に添加した。この実験を、本質的に、Ｒｅｕｓｅｒら、（前出）（１９
８４）により記載されるように、競合因子として５ｍＭマンノース６−ホスフェートを用
いて、または用いないで行った。これらの条件下で、患者の線維芽細胞の酸性α−グルコ
シダーゼは、健康な個体由来の線維芽細胞において測定されるレベルに回復した。マウス
乳汁から単離された酸性α−グルコシダーゼによる内因性の酸性α−グルコシダーゼ活性
の回復は、ウシ精巣、ヒト尿およびトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培地から精製さ
れた酸性α−グルコシダーゼによる回復と同様に有効であった。乳汁由来のα−グルコシ
ダーゼによる回復は、他の供給源由来のα−グルコシダーゼについて観察されるように、
５ｍＭマンノース６−ホスフェートにより阻害された（Ｒｅｕｓｅｒら、前出；Ｖａｎ
ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇら、（１９８８）、前出；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇら、Ｐｅｄ．
Ｒｅｓ．２４：９０−９４（１９８８））。

この乳汁において産生されるα−グルコシダーゼの確実性のさらなる実証として、マウ
スの乳汁において産生される組換えα−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列が、Ｈｏｅ
ｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．７：１６９７−１７０４（１９８８）によって公開され
たように、ＡＨＰＧＲＰで開始するヒト尿由来のα−グルコシダーゼの前駆体のＮ末端ア
ミノ酸と同様であると示された。

（実施例４：α−グルコシダーゼの動物試行）
最近、ポンペ病についてのノックアウトマウスモデルが、利用可能になった（２５）。
このモデルは、マウスα−グルコシダーゼ遺伝子の標的化された破壊によって産生された
。グリコゲン含有リソソームが、肝臓、心臓および骨格筋において、誕生後すぐに検出さ
れた。明白な臨床症状は、比較的遅い年齢（＞９ヶ月）でのみ明らかになるが、心臓は代
表的に拡大し、そして心電図は異常である。

実験を、トランスジェニックウサギの乳汁から精製されたＡＧＬＵのインビボでの効果
を研究するため、ノックアウト（ＫＯ）マウスモデルを用いて実行した。これらの実験に
おける組換え酵素を、基本的にトランスジェニックマウスからの精製について上記される
ように、トランスジェニックウサギの乳汁から精製した。

（１．ＫＯマウスモデルにおける短期の研究）
６日間隔で、単回または複数回の注射を、尾静脈を介してＫＯマウスに投与した。最後
の酵素の投与の２日後に、その動物を殺し、そして器官をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）を用いて灌流した。組織ホモジェネートを、ＧＬＵ酵素活性アッセイおよび組織グリ
コゲン含量のために作製し、そして種々の器官の薄切片を、リソソームグリコゲン含量の
蓄積を（電子顕微鏡を介して）可視化するために作製した。内部移行されたＡＧＬＵの局
在をまた、ヒト胎盤成熟α−グルコシダーゼに対するウサギポリクローナル抗体を用いて
決定した。

この結果は、０．７ｍｇのＡＧＬＵおよび１．７ｍｇのＡＧＬＵの単回用量（それぞれ
実験ＣおよびＡ）が、静脈内に注入した場合、２つのノックアウトマウスの群の種々の器
官において、インビボで効率的に取り込まれることを示した。実験Ａはまた、２つの独立
したウサギ乳汁供給源から精製したＡＧＬＵの取り込みおよび分布には違いがないことを
示した。

ＡＧＬＵ活性における増加は、肝臓、脾臓、心臓、および骨格筋のような器官において
見られたが、脳においては見られなかった。２つのＫＯ動物に対する１．７ｍｇのＡＧＬ
Ｕの単回注射の２日後に、２つのＰＢＳ注射した正常コントロールマウスまたは２つの異
種ＫＯマウスの器官において観察される内因性のα−グルコシダーゼ活性レベルに近いか
またはずっと高いレベルを、観察した（実験Ａ）。試験された器官のうち、肝臓および脾
臓は、定量的に、取り込みに関わる主要な器官であるが、心筋および胸筋ならびに大腿筋
もまた、有意な量の酵素を取り込む。脳組織における有意な増加の欠如は、ＡＧＬＵが血
液脳関門を通過しないことを示唆する。この結果を、表２において要約する。

２匹のＫＯマウスに、６日毎に４回注射（実験Ｂ）し、全細胞グリコーゲンの顕著な減
少を、心臓および肝臓の両方において観察した。骨格筋組織における全グリコーゲンに関
する効果は、観察されなかった。しかし、一般的に、これらの組織におけるＡＧＬＵの取
込みは、試験された他の組織よりもより低かった。

４回注射されたＫＯマウスの透過型電子顕微鏡は、肝細胞および心筋細胞の両方におけ
るリソソームのグリコーゲンの顕著な減少を示した。心臓のいくつかの領域では、リソソ
ームのグリコーゲンの減少が、これらの短期間の投与の後に観察されなかったので、心臓
組織において観察された効果は、局在していた。

ヒト胎盤成熟α−グルコシダーゼに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタ
ンブロット分析は、試験された全ての器官の成熟酵素に対して注射されたＡＧＬＵ完全な
プロセシングを示した。このことは標的組織への取込み、ならびにリソソームへの局在お
よびプロセシングを強く示唆している。毒性効果は、３回の実験のいずれおいて観察され
なかった。

ＡＧＬＵの免疫組織化学的染色は、ヒトα−グルコシダーゼに対するポリクローナルウ
サギ抗体を用いた肝実質細胞のリソソームにおいて明白であった。心臓および骨格組織に
おけるＡＧＬＵの存在は、より低い取込みのために明らかに、この技術を用いた可視化に
はより困難である。

（２．ＫＯマウスモデルを用いた長期実験）
長期実験において、酵素を、１週間に１回、２５週までの期間、２または３匹のＫＯマ
ウスの群の尾静脈に注射した。最初の用量は、２ｍｇ／マウス（６８ｍｇ／ｋｇ）、続い
て１２週間に渡って０．５ｍｇ／マウス（１７ｍｇ／ｋｇ）であった。マウスの２つの群
においては、さらに４週またはさらに１１週のいずれかで、マウス当たり２ｍｇの処置が
続いた。注射を、マウスが、６〜７月齢のときに開始した。この齢のとき、ＫＯモデルに
おいて明確な組織病理学を行った。最後の酵素投与の２日後に、動物を殺し、そして器官
をリン酸緩衝化生理食塩水を用いて灌流した。組織ホモジネートを、ＡＧＬＵ酵素活性ア
ッセイおよび組織グリコーゲン含量のために作製し、そして種々の器官の切片を、リソソ
ームのグリコーゲン蓄積を（光学顕微鏡を介して）可視化するために作製した。

結果は、０．５ｍｇ／マウスで１３週間処理したマウス（群Ａ、３動物／群）が、肝臓
および脾臓における活性の上昇ならびに肝臓およびおそらく心臓においてグリコーゲンレ
ベルの減少を有することを示した。１匹の動物は、筋肉における顕著なグリコーゲンの減
少がなかったが、筋肉において上昇した活性を示した。

０．５ｍｇ／マウスで１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで４週間処置したマウス（群Ｂ
、３動物／群）は、上昇した活性が心臓および骨格筋において測定され、そしてグリコー
ゲンレベルの減少が脾臓でもまた見られたことを除いて、１３週間のみ処置されたマウス
と同様の結果を示した。

０．５ｍｇ／マウスで１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで１１週間処置したマウス（群
Ｃ、２動物／群）は、処置したマウスが、肝臓、脾臓、心臓および骨格筋のグリコーゲン
レベルにおいて明確な減少を示したことを除いて、他の２群と同様の結果を示した。脳に
おいては、最も高い用量であっても、活性化を検出し得なかった。

各群（群の平均）における処置した動物および処置していない動物の結果を、表３に要
約する。

さらに、組織病理学的な症状における非常に確証的な改良を、群Ｃのマウス（０．５ｍ
ｇ／マウスで最初の１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで１１週間の処置）で観察した。病
理学の明らかな逆転が、種々の組織（例えば、心臓および胸筋）において示された。

残留したリソソームのα−グルコシダーゼ活性が、平均コントロール値（１４）の２０
％より大きい場合、ポンペ病は起こらないと報告されている。ＫＯマウスのモデルを用い
て得られたデータは、これらのレベルが、組換え前駆体酵素を用いて非常に十分達成可能
であることを示す。

（実施例５：ヒト臨床試験）
単一（ｓｉｎｇｌｅ）フェーズＩ研究（ＡＧＬＵ１１０１−０１）を、１５人の健康な
男性ボランティアにおいて実施した。ＡＧＬＵの用量は、２５〜８００ｍｇの範囲で、静
脈内注入によって健康な男性成人ボランティアに投与した。アレルギーおよび過敏症の病
歴を有する被験体は、本研究から除外した。被験体を、５つの用量群に無作為化し、そし
てＡＧＬＵを受ける各用量群（４被験体）または各用量レベルのプラセボ（１被験体）に
無作為化した。全ての被験体は、２用量の研究薬物を受け、これは、２週間をおいて投与
した。用量のレジメンは以下の通りである：
Ａ
２５ｍｇ：群１、処置期間１
Ｂ
５０ｍｇ：群１、処置期間２
Ｃ
１００ｍｇ：群２、処置期間１
Ｄ
２００ｍｇ：群３、処置期間１
Ｅ
４００ｍｇ：群２、処置期間２
Ｆ
８００ｍｇ：群３、処置期間２
Ｐ
プラセボ（１群および処置期間当たり１被験体）。

被験体に、各処置期間の１日目に、注入としてＡＧＬＵまたはプラセボを投与した。注
入は、３０分間の時間にわたって投与し、そして被験体を、注入の中止後少なくとも２時
間の間、半横臥の位置に保持した。

有害事象を、注入開始の直前、３０分（注入の最後）に、ならびにその後３、１２、２
４、３６および４８時間に、その後ならびに５および８日目（第１期間）、ならびに５、
８および１５日目（第２期間）に記録した。生命徴候、ＥＣＧおよび身体的な診察もまた
、処置期間を通して定期的にモニターした。

血液サンプルを、標準的な範囲の臨床的な実験室試験および薬物動態分析のために採取
した。被験体の尿を収集し、そして標準的な範囲の実験室分析を行った（ＡＧＬＵの決定
を含む）。

（ａ）実験室安全性および有害事象
任意の用量群の任意の被験体において、実験室パラメーター、臨床的徴候およびＥＣＧ
測定の臨床的に有意な変化はなかった。全ての用量の全ての被験体でモニタリングした有
害事象の結果を、表４に要約する。

ＩＩ型糖原病を有する乳児患者および若年患者の酵素置換療法としての組換え酸性α−
グルコシダーゼの安全性および効果に関する試験を実施した。４人の乳児患者および３人
の若年患者を募集した。乳児に、滴定された１５〜２０ｍｇ／ｋｇの開始用量〜４０ｍｇ
／ｋｇを投与し、そして若年者には１０ｍｇ／ｋｇを投与する。患者を、２４週間処置す
る。

患者を以下のパラメーターによって評価した。

・疑わしい有害事象を含む、報告された標準的な有害事象
・血液学、臨床化学および抗体検出を含む実験室パラメーター
・筋におけるα−グルコシダーゼ活性
・筋組織病理学
・１２−リードＥＣＧ（１２−ｌｅａｄ ＥＣＧ）
・神経学的検査を含む臨床状態
・ノンパラメトリックなＰＫパラメーター
・救命（ｌｉｆｅ ｓａｖｉｎｇ）の介入
幼児患者は、以下のさらなるパラメーターについて評価する。

・左後部の心室壁の厚さおよび左心室質量インデックス（ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ）
・神経筋の発達
・生存
・筋内のクリゴーゲン含量
若年患者を、以下のさらなるパラメーターについて評価する。

・肺機能
・筋の強度／回数試験および筋機能
・ＰＥＤＩ／Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ ９−アイテムスケール（ｉｔｅｍ ｓｃａｌｅ）
次に、同じ患者をαグルコシダーゼのさらなる投与に供し、乳児は１５、２０、３０また
は４０ｍｇ／ｋｇを受け、そして若年者には、２４週間のさらなる期間に対して１０ｍｇ
／ｋｇを用いかつ上記に示したパラメーターによって評価した。

さらなるフェーズＩＩ臨床試験を、齢が６ヶ月未満の８人の患者に、診断後の２ヶ月以
内の投薬量が４０ｍｇ／ｋｇで実施する。患者を２４週間の間処置し、次の診断基準によ
って評価する：
安全性パラメーター
実験室安全性データ
記録した有害事象
初期効果パラメーター：正常または穏和な遅延性の運動機能（ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔ
ｉｏｎ）を組合せた診断後６ヶ月の、救命の介入（すなわち、２４時間より長い機械的人
工呼吸器）無しでの生存（ＢＳＩＤ ＩＩ）。

第２次効果：神経筋発達における変化；左後部の心室壁の厚さおよび左心室質量インデ
ックスにおける変化；骨格筋酸性α−グルコシダーゼ活性およびグリコーゲン含量におけ
る変化。

効果は、正常遅延または穏和な遅延として分類されたＢＳＩＤ ＩＩと組合せた背景（
ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）コントロール群における１０％の生存に比較した場合、α−グル
コシダーゼ群中へ救命の介入無しに診断後６ヶ月において５０％の生存であることによっ
て示され得る。

さらなる臨床試験を若年患者に実施した。患者は、年齢が１歳より大きくかつ３５歳未
満であり、ＩＩｂ型ＧＳＤの若年発症を有する。患者に、２４週間の処置期間の間、１０
ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで投与した。処置は、以下のパラメーターによってモニ
ターした。
安全性パラメーター 実験室安全性データ
記録した有害事象
初期効果 肺機能パラメーター（例えば、ＦＶＣ、人工呼吸器上の時間）
筋強度
第２次効果 救命の介入パラメーター
生活の質
骨格筋酸性α−グルコシダーゼ活性
定量的目標 ベースラインを超えた初期効果パラメーターにおける２０％の相対的改善
効果に関する全ての定量的測定は、好ましくは、同時発生するコントロールまたは背景の
コントロールに対して統計学的に顕著であり、好ましくは、ｐが０．０５未満である。

（実施例６ 薬学的処方物）
α−グルコシダーゼを以下のように処方した：５ｍｇ／ｍｌ □−Ｇｌｕ、１５ｍＭ
リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｗ）マンニトール、および０．５％（ｗ／ｗ
）スクロース。上記の処方物を最終体積１０．５ｍｌに満たして２０ｃｃチュービングバ
イアルに入れ、そして凍結乾燥した。放出および臨床使用の試験に関しては、注射のため
に各バイアルを１０．３ｍｌの滅菌生理食塩水（０．９％）を用いて再構築し（ＵＳＰま
たは当量）、１０．５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌ □−Ｇｌｕ溶液を生じ、これを、直接投与し
得るか、または患者特異的な標的用量濃度に滅菌生理食塩水を用いて引き続いて希釈し得
る。１０．５ｍｌ一服（バイアル中に総αグルコシダーゼが５２．５ｍｇ）は、ＵＳＰが
推奨する過剰量を含み、これは１０ｍｌ（５０ｍｇ）の抽出および送達（または、移動）
を可能にする。マンニトールは、適切なバルキング薬剤として機能を果たし、（スクロー
ス単独と比較して）凍結乾燥サイクルを短くする。スクロースは、クリオ／リオプロテク
タント（ｃｒｙｏ／ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として機能を果たし、再構築後の凝集
の有意な上昇を生じない。マンニトール（単独）処方物の再構築は、繰り返して、凝集の
わずかな上昇を生じた。凍結乾燥後、ケーキクオリティ（ｃａｋｅ ｑｕａｌｉｔｙ）は
、受容可能であり、そして引き続く再構築の回数は、有意に減少した。注入溶液のために
、ＨＳＡ／デキストロースのよりも、生理食塩水が好ましい。生理食塩水が、２％マンニ
トール／０．５％スクロース中での凍結乾燥と組合せて使用される場合、溶液は、静脈投
与に関して受容可能な張度を有する。２％マンニトール／０．５％スクロース処方物を含
む凍結乾燥されたバイアルを、０．９％の滅菌生理食塩水（注射のための）を用いて再構
築し、５ｍｇ／ｍｌ □−Ｇｌｕを生じる。

（実施例７：注入スケジュール）
溶液を、留置の静脈カミューレを介して投与する。患者を、注入期間中、近接にモニタ
ーし、そして、有害事象または有害事象と疑われる事象において適切な臨床的介入をとる
。４８時間のウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を、各注入に関して可能にする。注入の比率を
回数と共に増加させた注入スケジュールによって、有害事象を減少または排除する。

乳児に対する注入を、以下のスケジュールに従って投与し得る：
・６０分間、５ｃｃ／時間
・６０分間、１０ｃｃ／時間
・３０分間、４０ｃｃ／時間 以上
・残りの注入の間、８０ｃｃ／時間 以上。

若年者に対する注入を、以下のスケジュールに従って投与し得る：
・６０分間、０．５ｃｃ／ｋｇ／時間
・６０分間、１ｃｃ／ｋｇ／時間
・３０分間、５ｃｃ／ｋｇ／時間
・残りの注入の間、７．５ｃｃ／ｋｇ／時間。

前述の発明は、明確さおよび理解の目的のために、いくぶん詳細に記載してきたが、形
式および詳細における種々の変化が、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得る
ということは、この開示を読むことより当業者には明らかである。本出願に引用される全
ての刊行物および特許文書は、あたかも各個々の刊行物または特許文書がそのように個々
に示される程度まで、全ての目的に関してその全体が参考として援用される。

Claims (1)

1. 本願明細書に記載された発明。