JP2009161562A - ポンペ病の処置 - Google Patents

Abstract

【課題】ポンペ病の処置の方法を提供することを本発明の課題とする。
【解決手段】上記課題は、ヒト酸性αグルコシダーゼを用いたポンペ病の処置の方法を提供することにより解決された。好ましい処置養生法は、患者に１週間当たり１０ｍｇ／ｋｇ体重より多く投与する工程を含む。投与は、好ましくは静脈内投与である。この方法は、乳児性、若年性または成人性ポンペ病を有する患者の処置のために用いられ得る。ヒト酸性αグルコシダーゼは、好ましくは、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁において得られ、そして好ましくは、主に１１０ｋＤの形態である。
【選択図】なし

Description

（関連出願の引用）
本出願は、１９９８年１２月７日に出願された、ＵＳＳＮ６０／１１１２９１からの優先権に由来し、これは、すべての目的のために、その全体において参考として援用されている。本出願は、１９９６年７月２９日に出願された、ＵＳＳＮ０８／７００，７６０に関連し、これは、１９９５年８月２日に出願された、ＵＳＳＮ６０／００１，７９６からの優先権に由来し、これらの両方は、すべての目的のために、それらの全体において参考として援用されている。

（技術分野）
本発明は、組換え遺伝学分野および医学分野に属し、そしてポンペ病を有する患者の酵素置換治療に関する。

（発明の背景）
他の分泌タンパク質と同様に、リソソームタンパク質は、小胞体において合成され、そしてゴルジ装置へ輸送される。しかし、たいていの他の分泌タンパク質と異なり、リソソームタンパク質は、細胞外液へではなく、細胞内小器官へ分泌することになっている。ゴルジ装置の内部において、リソソームタンパク質は特別なプロセシングを受けて、それらの細胞内の行き先に到達するために必要なものを備える。ほとんどすべてのリソソームタンパク質が、末端のマンノース基の６’位を介したグリコシル化およびリン酸化を含む、種々の翻訳後修飾を受ける。リン酸化されたマンノース残基が、トランスゴルジ網の内部の表面上で、特異的なレセプターによって認識される。リソソームタンパク質は、これらのレセプターを介して結合し、そしてそれによって、他の分泌タンパク質から分離される。その後、レセプターに結合したタンパク質を含む小さな輸送小胞が、トランスゴルジ網からつみ取られ、そしてそれらの細胞内の行き先へと標的化される。一般に、非特許文献１を参照のこと。

３０を超えるリソソーム疾患が通常、遺伝子変異の結果として存在し、その各々は、特定のリソソームタンパク質の欠損に起因する。例えば、非特許文献２を参照のこと（すべての目的のために、その全体において参考として援用される）。リソソームタンパク質における欠損は、通常、代謝産物の有害な蓄積を生じる。例えば、フルラー症候群、ハンター症候群、モルキオ症候群およびサンフィリポ症候群において、ムコ多糖の蓄積が存在し；テイ−サックス症候群、ゴシェ症候群、クラッベ症候群、ニーマン−ピック症候群およびファブリー症候群において、スフィンゴ脂質の蓄積が存在し；ならびに、フコース蓄積症およびマンノシドーシスにおいて、それぞれ、フコース含有スフィンゴ脂質および糖タンパク質フラグメントの蓄積、ならびにマンノース含有オリゴ糖類の蓄積が存在する。

ＩＩ型糖原病（ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｔｙｐｅ ＩＩ）（ＧＳＤ ＩＩ；ポンペ病；酸性マルターゼ欠損症）は、リソソーム酵素の酸性α−グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）の欠損によって引き起こされる。２つの臨床的形態が識別される：早期発症（乳児性）および後期発症（若年性および成人性）。乳児性ＧＳＤ ＩＩは、誕生直後にその発症を有し、そして進行性の筋肉虚弱および心不全を示す。この臨床的改変（ｖａｒｉａｎｔｉｓ）は、通常、生涯の最初の２年以内に致命的である。成人性患者および若年性患者の後期発症における症状は、生涯においてより遅く生じ、そして骨格筋のみが関与する。この患者は、最終的に、呼吸不全が原因で死亡する。患者は、例外的に、６０年間を超えて生存し得る。疾患の重症度と、残留酸性α−グルコシダーゼ活性との間には、十分な相関が存在し、この活性は、後期発症において、正常の１０〜２０％であり、そしてこの疾患の初期発症形態において、２％未満である（非特許文献３を参照のこと）。

リソソーム貯蔵疾患の主要な原因としての、リソソーム酵素欠損の発見以来（例えば、非特許文献４を参照のこと）、リソソーム貯蔵疾患を有する患者を、失われている酵素の（静脈内）投与（すなわち、酵素治療）によって、処置する試みがなされた。ポンペ病のための酵素置換治療を用いるこれらの実験は、成功していない。免疫学的反応を与えるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来の非ヒトα−グルコシダーゼ、または細胞によって効率的に取り込まれない酵素形態（ヒト胎盤由来の低取り込み形態の成熟酵素；以下を参照のこと）のいずれかが用いられた。さらに、処置の持続期間および／または投与された酵素の量の両方が、不十分であった（３〜５）。天然の供給源（例えば、ヒトの尿およびウシの精巣）由来のリソソーム酵素の産生は、理論上は可能であるが、低い収率を与え、そして精製された酵素は、必ずしもレシピエント患者の組織によって取り込まれ得る形態というわけではない。

上記の不確実性および困難にもかかわらず、本発明は、ヒト酸性αグルコシダーゼを用いて、ポンペ病の患者を処置する方法を提供する。

Ｋｏｒｎｆｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１８、３６７−３７４（１９９０） Ｃｏｔｒａｎら、Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ（第４版 １９８９） Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ、Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｓｃｒｉｖｅｒら（編）、第７版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、１９９５）、２４４３−２４６４頁 Ｈｅｒｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８６、１１−１６（１９６３）

（請求の範囲に記載される発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ポンペ病を有する患者を処置する方法を提供する。このような方法は、治療的に有効な量のヒト酸性αグルコシダーゼを、患者に投与する工程を必然的に伴う。投薬量は、好ましくは、１週間当たり少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの方法において、投薬量は、１週間当たり少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または１週間当たり少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ体重である。いくつかの方法において、このような投薬量は、１週間当たり１回投与され、そして他の方法においては、１週間当たり３回投与される。いくつかの方法において、処置は少なくとも２４週間続けられる。投与は、好ましくは静脈内投与である。ヒト酸性αグルコシダーゼは、好ましくは、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁において得られ、そして好ましくは、主に１１０ｋＤの形態である。

この方法は、乳児性、若年性または成人性ポンペ病を有する患者の処置のために用いられ得る。乳児性ポンペ病を処置するいくつかの方法において、有効性が、少なくとも１歳まで生存する患者によって示される。

いくつかの方法において、ヒト酸性αグルコシダーゼのレベルが、レシピエント（ｒｅｃｕｏｕｅｂｔ）患者においてモニターされる。必要に応じて、ヒト酸性αグルコシダーゼの第二の投薬量が、α−グルコシダーゼのレベルが、患者において閾値未満に減少する場合に、投与され得る。

いくつかの方法において、ヒトαグルコシダーゼが、静脈内に投与され、そして投与の速度は、投与の時間の間に増加する。いくつかの方法において、投与の速度は、投与の時間の間に、少なくとも１０倍増加する。いくつかの方法において、投与の速度は、５時間の間以内に、少なくとも１０倍増加する。いくつかの方法において、患者は、一連の少なくとも４つの投薬量を投与され、各々の投薬量は、以前の投薬量よりも強度が高い。いくつかの方法において、投薬量は、第一の投薬量が０．０３〜３ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が０．３〜１２ｍｇ／ｋｇ／時間、第三の投薬量が１〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が２〜６０ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、投薬量は、第一の投薬量が０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が１〜４ｍｇ／ｋｇ／時間、第三の投薬量が３〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が６〜２０ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、投薬量は、第一の投薬量が０．２５〜４ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が０．９〜１．４ｍｇ／ｋｇ／時間、第三の投薬量が３．６〜５．７ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が７．２〜１１．３ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、投薬量は、第一の投薬量が０．３ｍｇ／ｋｇ／時間、第二の投薬量が１ｍｇ／ｋｇ／時間、第三の投薬量が４ｍｇ／ｋｇ／時間、および第四の投薬量が１２ｍｇ／ｋｇ／時間である。いくつかの方法において、第一、第二、第三および第四の投薬量が、各々１５分〜８時間の間投与される。

いくつかの方法において、第一、第二、第三および第四の投薬量が、それぞれ、１時間、１時間、０．５時間および３時間の間投与される。

別の局面において、本発明は、滅菌形態においてヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清アルブミン、および糖を生理学的に受容可能な緩衝液中に含む薬学的組成物を提供する。いくつかのこのような組成物は、ヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清アルブミン、およびグルコースをリン酸ナトリウム緩衝液中に含む。いくつかの組成物は、αグルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロースを水溶液中に含む。いくつかの組成物において、糖は、マンニトールおよびスクロースを含み、そしてマンニトールの濃度は、水溶液の１〜３％ｗ／ｗであり、そしてスクロースの濃度は、水溶液の０．１〜１％ｗ／ｗである。いくつかの組成物において、マンニトールの濃度は、２％ｗ／ｗであり、そしてスクロースの濃度は、０．５％ｗ／ｗである。

本発明は、さらに、薬学的組成物（ヒト酸性グルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロースを水溶液中に含む）を凍結乾燥することによって産生される、凍結乾燥された組成物を提供する。このような組成物は、第一の組成物（ヒト酸性α−グルコシダーゼ、マンニトール、スクロースおよび水性溶液を含む）を凍結乾燥して、第二の組成物を産生し；そして、生理食塩水中で凍結乾燥された組成物を再構成して、第三の組成物を産生することによって調製され得る。いくつかのこのような組成物において、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、第一の組成物および第三の組成物の両方において、５ｍｇ／ｍｌであり、マンニトールは、第一の組成物において、２ｍｇ／ｍｌであり、スクロースは、第一の組成物において、０．５ｍｇ／ｍｌであり、そして再構成の工程において用いられる生理食塩水は、０．９％ｗ／ｗである。

本発明は、例えば以下を提供する。
（項目１） ポンペ病を有する患者を処置する方法であって、該方法が、治療的に有効な量のヒト酸性αグルコシダーゼを該患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目２） 前記患者に、１週間当たり少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される、項目１に記載の方法。
（項目３） 前記患者に、１週間当たり少なくとも６０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される、項目１に記載の方法。
（項目４） 前記患者に、１週間当たり少なくとも１２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与される、項目１に記載の方法。
（項目５） 前記患者に、１週間当たり単一投薬量のα−グルコシダーゼが投与される、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６） 前記患者に、１週間当たり３投薬量のα−グルコシダーゼが投与される、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目７） 前記量が、少なくとも２４週の期間にわたって１週間当たりで投与される、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目８） 前記α−グルコシダーゼが、静脈内に投与される、項目１に記載の方法。
（項目９） 前記α−グルコシダーゼが、トランスジェニック哺乳動物の乳汁中に産生された、項目１に記載の方法。
（項目１０） 前記患者が、乳児性ポンペ病を有する、項目１に記載の方法。
（項目１１） 前記患者が、少なくとも１歳になるまで生存する、項目１０に記載の方法。
（項目１２） 前記患者が、若年性ポンペ病を有する、項目１に記載の方法。
（項目１３） 前記患者が、成人性ポンペ病を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４） 前記α−グルコシダーゼが、主に１１０ｋＤ型である、項目１に記載の方法。
（項目１５） 前記患者におけるヒト酸性αグルコシダーゼのレベルをモニタリングする工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１６） 前記患者においてα−グルコシダーゼの前記レベルが閾値未満に低下した場合に、第２投薬量のヒト酸性αグルコシダーゼを投与する工程をさらに包含する、項目１５に記載の方法。
（項目１７） 前記ヒトαグルコシダーゼが静脈内に投与され、そして投与期間の間に投与速度が上昇する、項目１に記載の方法。
（項目１８） 前記投与速度が、前記投与期間の間に少なくとも１０倍上昇する、項目１７に記載の方法。
（項目１９） 前記投与速度が、５時間の間に少なくとも１０倍上昇する、項目１７に記載の方法。
（項目２０） 前記患者に、一連の少なくとも４投薬量が投与され、各投薬量は前回の投薬量よりも高い強度である、項目１７に記載の方法。
（項目２１） 前記投薬量が、０．０３〜３ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、０．３〜１２ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、１〜３０ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量および２〜６０ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、項目２０に記載の方法。
（項目２２） 前記投薬量が、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、１〜４ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、３〜１０ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量および６〜２０ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、項目２１に記載の方法。
（項目２３） 前記投薬量が、０．２５〜４ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、０．９〜１．４ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、３．６〜５．７ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量および７．２〜１１．３ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記投薬量が、０．３ｍｇ／ｋｇ／時間の第１投薬量、１ｍｇ／ｋｇ／時間の第２投薬量、４ｍｇ／ｋｇ／時間の第３投薬量および１２ｍｇ／ｋｇ／時間の第４投薬量である、項目２３に記載の方法。
（項目２５） 前記第１投薬量、前記第２投薬量、前記第３投薬量および前記第４投薬量が、１５分間〜８時間の時間にわたって、各々投与される、項目２０〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２６） 前記第１投薬量、前記第２投薬量、前記第３投薬量および前記第４投薬量が、それぞれ、１時間、１時間、０．５時間および３時間の時間にわたって投与される、項目２０〜２４のいずれかに記載の方法。
（項目２７） 滅菌形態の、生理学的に受容可能な緩衝液中にヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清アルブミン、および糖を含む、薬学的組成物。
（項目２８） リン酸ナトリウム緩衝液中にヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清アルブミン、およびグルコースを含む、項目２７に記載の薬学的組成物。
（項目２９） 水溶液中にαグルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロースを含む、薬学的組成物。
（項目３０） 前記糖が、マンニトールおよびスクロースを含み、そしてマンニトールの濃度が前記水溶液の１〜３％ ｗ／ｗであり、そしてスクロースの濃度が前記水溶液の０．１〜１％ ｗ／ｗである、項目２７に記載の薬学的組成物。
（項目３１） マンニトールの濃度が２％ ｗ／ｗであり、そしてスクロースの濃度が０．５％ ｗ／ｗである、項目２７に記載の薬学的組成物。
（項目３２） 水溶液中にヒト酸性グルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロースを含む薬学的組成物を凍結乾燥することによって産生される、凍結乾燥された組成物。
（項目３３） 薬学的組成物であって、該組成物が、ヒト酸性α−グルコシダーゼ、マンニトール、スクロースおよび水溶液を含む第１組成物を凍結乾燥して第２組成物を産生する工程；ならびに、生理食塩水中で該凍結乾燥された組成物を再構成して第３組成物を産生する工程によって調製される、薬学的組成物。
（項目３４） 前記ヒト酸性α−グルコシダーゼが、前記第１組成物および前記第３組成物の両方において５ｍｇ／ｍｌであり、前記マンニトールが、前記第１組成物において２ｍｇ／ｍｌであり、前記スクロースが、前記第１組成物において０．５ｍｇ／ｍｌであり、そして前記再構成工程において使用される前記生理食塩水が、０．９％ ｗ／ｗである、項目３３に記載の薬学的組成物。

酸性α−グルコシダーゼのｃＤＮＡを含む導入遺伝子。αｓ１−カゼインのエキソンが、白い四角によって表される；α−グルコシダーゼのｃＤＮＡが、陰を付けた四角によって表される。αｓ１−カゼインのイントロンおよび隣接配列が、太線によって表される。細線は、ＩｇＧのアクセプター部位を表す。転写開始部位は、（１^→）と記され、翻訳開始部位は、（ＡＴＧ）と記され、終始コドンは、（ＴＡＧ）と記され、そしてポリアデニル化部位は、（ｐＡ）と記される。 パネルＡ、Ｂ、Ｃ。酸性α−グルコシダーゼのゲノムＤＮＡを含む３つの導入遺伝子である。暗く陰を付けた領域は、αｓ１カゼイン配列であり、白い四角は、酸性α−グルコシダーゼのエキソンを表し、そして白い四角の間の細線は、α−グルコシダーゼのイントロンを表す。他の記号は、図１中の記号と同じである。 パネルＡ、Ｂ、Ｃ。ゲノム導入遺伝子の構築。α−グルコシダーゼのエキソンは、白い四角によって表される；α−グルコシダーゼのイントロンおよび非翻訳配列は、細線によって示される。ｐＫＵＮベクター配列は、太線によって表される。 ウエスタンブロッティングによる、トランスジェニックマウスの乳汁中の酸性α−グルコシダーゼの検出。

（定義）
用語「実質的な同一性」または「実質的な相同性」とは、デフォルトのギャップウエイトを用いて、例えばプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって、最適に整列される場合に、２つのペプチド配列が、少なくとも６５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８０または９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより高い配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。

用語「実質的に純粋な」または「単離された」とは、目的の種が同定され、そしてその天然の環境の成分から分離および／または回収されたことを意味する。通常、目的の種は、存在する主な種であり（すなわち、モル規準で、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）、そして好ましくは、実質的に精製された画分が、組成物であり、ここでこの目的の種が、存在するすべての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル規準で）を構成する。一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種を約８０〜９０重量パーセントを超えて含む。最も好ましくは、目的の種は、本質的に均質（混入物種が、従来の検出方法によって、組成物中で検出され得ない）になるまで精製され、ここで、この組成物は、単一の高分子種の誘導体から、本質的になる。

ＤＮＡセグメントは、別のＤＮＡセグメントとの機能的な関係に置かれた場合に、作動可能に連結されている。例えば、シグナル配列についてのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現される場合に、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写を刺激する場合に、その配列に作動可能に連結されている。一般的に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、そして、シグナル配列の場合においては、隣接しており、かつ読み取り相にある。しかし、エンハンサーは、転写を制御するコード配列と隣接する必要はない。連結は、簡便な制限部位での連結、あるいはその代わりに挿入されたアダプターまたはリンカーでの連結によって達成される。

外因性のＤＮＡセグメントは、細胞に対して外来であるか、または細胞のＤＮＡセグメントに対して相同であるが、宿主細胞ゲノム中で異常な位置にある、セグメントである。外因性のＤＮＡセグメントは、外因性ポリペプチドを回収するために発現される。

トランスジェニック哺乳動物において、すべての、または実質的にすべての生殖系列細胞および体細胞は、初期胚期で、哺乳動物または哺乳動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む。

（詳細な説明）
本発明は、リソソームタンパク質を、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁へ分泌する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。分泌は、リソソームタンパク質をコードする導入遺伝子、および乳腺に対してこの遺伝子の発現を標的化し得る調節配列の組み込みによって達成される。この導入遺伝子が発現され、そして、発現産物が乳腺中で翻訳後修飾され、次いで乳汁へ分泌される。翻訳後修飾は、グリコシル化およびリン酸化をして、マンノース−６リン酸を含むリソソームタンパク質を産生する工程を含み得る。

（Ａ．リソソーム遺伝子）
本発明は、リソソーム酵素および以下を含む他の型のリソソームタンパク質をコードする３０を超える公知の遺伝子のいずれかを含むＤＮＡセグメントを発現する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する：α−グルコシダーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロネート（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ）−硫酸スルファターゼ、ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）ＡおよびヘキソサミニダーゼＢ、ガングリオシドアクチベータータンパク質、アリールスルファターゼＡおよびアリールスルファターゼＢ、イズロネートスルファターゼ、ヘパランＮ−スルファターゼ、ガラクト−セラミダーゼ、α−ガラクトシルセラミダーゼＡ、スフィンゴミエリナーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、アスパルチルグリコサミンアミド加水分解酵素、酸性リパーゼ、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン−６−スルフェートスルファターゼ、α−ガラクトシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、および保護性タンパク質などを含む。公知のリソソームタンパク質の遺伝子配列のいずれかの対立遺伝子改変体、同族改変体および誘導された改変体を発現するトランスジェニック哺乳動物もまた、含まれる。このような改変体は、通常、アミノ酸レベルで、公知のリソソームタンパク質の遺伝子と、実質的な配列同一性を示す。このような改変体は、通常、ストリンジェントな条件下で、公知の遺伝子とハイブリダイズするか、または公知の遺伝子の１つによってコードされたポリペプチドに対する抗体と交差反応する。

リソソームタンパク質をコードする公知の遺伝子のうちの多くのゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡクローンが、入手可能である（Ｓｃｏｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４７、８０２−８０７（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、ＰＮＡＳ ８７、８５３１−８５３５（１９９０）；Ｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、１２５２−１２５９（１９８９）；Ｇｉｎｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２３、５７４−５８０（１９８４）；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．７、１６９７−１７０４（１９８８）；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７２、４７３−４７９（１９９０）；ＭｅｙｅｒｏｗｉｔｚおよびＰｒｏｉａ、ＰＮＡＳ ８１、５３９４−５３９８（１９８４）；Ｓｃｒｉｖｅｒら、前出、第１２部、２４２７−２８８２頁ならびにそこで引用された参考文献）。ゲノムＤＮＡ配列およびｃＤＮＡ配列の他の例は、ＧｅｎＢａｎｋから入手可能である。さらなるクローン化されたリソソーム遺伝子の配列が必要とされる範囲まで、公知のリソソームタンパク質のＤＮＡ配列または、公知のリソソームタンパク質に対する抗体をプローブとして使用して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー（好ましくは、ヒト）から得られ得る。

（Ｂ．リソソームタンパク質のコンホメーション）
組換えリソソームタンパク質は、好ましくは、天然に存在するリソソームタンパク質と同じかまたは類似の構造を有するようにプロセシングされる。リソソームタンパク質とは、小胞体（ＲＥＲ）に結合した、リボソーム上で合成される糖タンパク質である。リソソームタンパク質は、Ｎ末端シグナルペプチドにより導かれて、この細胞小器官に翻訳と同時に入る（Ｎｇら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ６，５１０−５１６（１９９４））。Ｎ結合型グリコシル化プロセスは、ＲＥＲにおいてドリコールキャリアからの高マンノース型オリゴ糖の前駆体であるＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２の一塊としての移動と共に開始する。糖鎖の修飾は、ＲＥＲにおいて開始し、そしてグリコシダーゼＩおよびグリコシダーゼＩＩによる、一番外側から３つのグルコース残基の除去を伴ってゴルジ装置において継続する。リン酸化とは、最初に、Ｎ−アセチル−グルコ−サミン−１−リン酸がリソソームタンパク質特異的トランスフェラーゼにより、選択されたマンノース基へと結合する工程、そして２番目に、Ｎ−アセチル−グルコ−サミンがジエステラーゼにより切断される工程（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ：Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）１６３−１９１頁）の２工程の手順である。切断は、認識マーカーとして、そして大部分のリソソームタンパク質の、リソソームへのマンノース６−リン酸レセプター触媒輸送におけるリガンドとして、マンノース６−リン酸を露出させる。（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１８，３６７−３７４（１９９２））。

糖鎖の修飾に加えて、大部分のリソソームタンパク質は、タンパク質分解プロセシングを受ける。このプロセシングの最初の事象は、シグナルペプチドの除去である。大部分のリソソームタンパク質のシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼによるトランスロケーション後に切断され、その後、そのタンパク質は可溶性になる。酸性α−グルコシダーゼのシグナルペプチドは、その酵素がＲＥＲを離れた後に切断されるが、その前に、リソソームまたは分泌経路に入るという、示唆的な証拠がある（Ｗｉｓｓｅｌａａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２２２３−２２３１（１９９３））。酸性α−グルコシダーゼのタンパク質分解プロセシングは、複雑であり、そして細胞下の種々の位置で生じるシグナルペプチドの切断に加えて、一連の工程を含む。ポリペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端の両方で切断され、それによって、比触媒活性が増加する。認識される主な種は、１１０／１００ｋＤの前駆体、９５ｋＤの中間体ならびに７６ｋＤの成熟型および７０ｋＤの成熟型である（Ｈａｓｉｌｉｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，４９３７−４９４５（１９８０）；Ｏｕｄｅ Ｅｌｆｅｒｉｎｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３９，４８９−４９５（１９８４）；Ｒｅｕｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，８３３６−８３４１（１９８５）；Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．７，１６９７−１７０４（１９８８））。天然のヒト酸性α−グルコシダーゼの翻訳後プロセシングとＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞のような、培養された哺乳動物細胞において発現されたような組換え型ヒト酸性α−グルコシダーゼの翻訳後プロセシングとは、類似する（Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（１９９０）前出；Ｗｉｓｓｅｌａａｒら（１９９３）前出）。

マンノース基の６’位がリン酸化されたリソソームタンパク質を産生する真正のプロセシングは、マンノース６−リン酸に対するレセプターを保有する細胞による、基質の取り込みを測定することによって試験され得る。正確に修飾された基質は、修飾されない基質よりも早く取り込まれ、かつそれによって修飾された基質の取り込みが、マンノース６−リン酸の添加により競合的に阻害され得るような様式で取り込まれる。

（Ｃ．導入遺伝子の設計）
組換えリソソームタンパク質の発現を、導入遺伝子を保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳腺へと標的化するために、導入遺伝子が設計される。基本的なアプローチには、タンパク質をコードする外因性のＤＮＡセグメントを、グナル配列、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結することが必要である。そのＤＮＡセグメントは、ゲノム、ミニ遺伝子（１つ以上のイントロンが除外されたゲノム）、ｃＤＮＡ、ＹＡＣフラグメント、２つの異なるリソソームタンパク質遺伝子のキメラ、またはこれらの任意のハイブリッドであり得る。ゲノム配列を含むことは、一般的に、より高レベルの発現を導く。非常に高レベルの発現は、乳腺が、リソソームタンパク質の翻訳後修飾および分泌を行う能力に負荷をかけ過ぎ得る。しかし、以下に示すデータは、ｍｇ／ｍｌの範囲における高い発現レベルにもかかわらず、マンノース６−リン酸基の形成を含む、実質的な翻訳後修飾が生じることを示す。実質的な修飾とは、少なくとも約１０、２５、５０、７５または９０％の分泌分子が、少なくとも１つのマンノース６−リン酸基を保有することを意味する。従って、ゲノム構築物またはハイブリッドｃＤＮＡ−ゲノム構築物は、一般的に好ましい。

ゲノムの構築において、全ての介在配列を保持する必要はない。例えば、いくつかの介在配列は、ＤＮＡの操作および引き続く微量注入を容易にする、より小さい導入遺伝子を得るために除去され得る（Ａｒｃｈｉｂａｌｄら、ＷＯ ９０／０５１８８（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）を参照のこと）。いくつかのイントロンの除去はまた、いくつかの例において、発現レベルを減らし、そしてそれによって翻訳後修飾が実質的に完了することを確かめるために有用である。他の例において、イントロン（例えば、酸性α−グルコシダーゼのゲノム配列に由来するイントロン１）の除外は、成熟酵素の、より高い発現を導く。いくつかのまたは全ての非コードエキソンを欠失させることもまた、可能である。いくつかの導入遺伝子において、リソソームタンパク質コード配列中の選択されたヌクレオチドは、タンパク質分解性切断部位を除去するために変異される。

トランスジェニック哺乳動物により産生されるリソソームタンパク質の意図される用途が、通常、ヒトへの投与であるので、リソソームタンパク質配列をコードするＤＮＡセグメントを得る種は、好ましくは、ヒトである。同様に、意図される用途が（例えば、ウマ、イヌまたはネコに対する）獣医治療である場合、ＤＮＡセグメントが同じ種に由来することが好ましい。

プロモーターおよびエンハンサーは、乳腺においてもっぱら発現するか、または少なくとも優先的に発現する遺伝子（すなわち、乳腺特異的遺伝子）に由来する。プロモーターおよびエンハンサーの供給源として好ましい遺伝子としては、β−カゼイン、κ−カゼイン、αＳ１−カゼイン、αＳ２−カゼイン、β−ラクトグロブリン、乳清酸性タンパク質およびα−ラクトアルブミンが挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーは、常にではないが、たいてい同じ乳腺特異的遺伝子から得られる。この遺伝子は、必ずではないが、ときどき、導入遺伝子が発現されるべき哺乳動物と、同じ種の哺乳動物に由来する。他の種由来の発現調節配列（例えば、ヒト遺伝子由来の発現調節配列）もまた、使用され得る。このシグナル配列は、乳腺からのリソソームタンパク質の分泌を指向し得ねばならない。適切なシグナル配列は、分泌タンパク質をコードする哺乳動物遺伝子に由来し得る。驚くことに、リソソームタンパク質は通常、分泌されず、細胞内の細胞小器官に標的にされるにもかかわらず、これらのタンパク質の天然のシグナル配列は、適している。そのようなシグナル配列に加えて、シグナル配列の好ましい供給源は、プロモーターおよびエンハンサーを得る遺伝子と、同じ遺伝子由来のシグナル配列である。必要に応じて、さらなる調節配列が、発現レベルを最適化するために、導入遺伝子中に含まれる。そのような配列としては、５’隣接領域、５’の転写されるが、翻訳されない領域、介在配列、３’の転写されるが、翻訳されない領域、ポリアデニル化部位および３’隣接領域が挙げられる。そのような配列は、通常、プロモーターおよびエンハンサーを得る、乳腺特異的遺伝子、または発現されるリソソームタンパク質遺伝子からのいずれかから得られる。そのような配列を含むことは、真正の乳腺特異的遺伝子の遺伝環境および／または真正のリソソームタンパク質遺伝子の遺伝環境をシュミレーションする遺伝環境を生じる。この遺伝環境は、いくつかの場合（例えば、ウシαＳ１−カゼイン）、転写された遺伝子の、より高い発現を生じる。あるいは、３’隣接領域および非翻訳領域は、他の異種遺伝子（例えば、β−グロビン遺伝子またはウイルスの遺伝子）から得られる。リソソームタンパク質遺伝子または他の異種遺伝子由来の３’非翻訳領域および５’非翻訳領域を含むことはまた、転写物の安定性を増加させ得る。

いくつかの実施形態において、乳腺特異的遺伝子由来の５’隣接配列の約０．５、１、５、１０、１５、２０または３０ｋｂは、発現されるリソソームタンパク質遺伝子由来の３’隣接配列の約１、５、１０、１５、２０または３０ｋｂと組み合せて含まれる。タンパク質がｃＤＮＡ配列から発現される場合、プロモーターとコード配列との間に介在配列を含むことは有利である。介在配列は、好ましくはプロモーターを得た乳腺特異的領域の第１イントロン由来の介在配列の５’部分と、ＩｇＧ介在配列またはリソソームタンパク質遺伝子の介在配列由来の３’部分とから形成されるハイブリッド配列である（ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ ９１／０８２１６（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）を参照のこと）。

リソソームタンパク質を発現するための好ましい導入遺伝子は、カゼインプロモーターおよびカゼインエンハンサーの５’に結合したｃＤＮＡ−ゲノムハイブリッドリソソームタンパク質遺伝子を含む。このハイブリッド遺伝子としては、リソソームタンパク質遺伝子由来のシグナル配列、コード領域および３’隣接領域が挙げられる。必要に応じて、ｃＤＮＡセグメントは、５’カゼインとリソソームタンパク質をコードする遺伝子の非翻訳領域との間に介在配列を含む。当然、得られる融合体から連続したタンパク質が発現され得るのであれば、対応するｃＤＮＡおよびゲノムセグメントはまた、遺伝子中の他の位置で融合され得る。

他の好ましい導入遺伝子は、カゼイン調節配列の５’に結合したゲノムリソソームタンパク質セグメントを有する。このゲノムセグメントは通常、遺伝子の５’非翻訳領域から３’隣接領域へと続く。従って、ゲノムセグメントにはリソソームタンパク質の５’非翻訳配列の一部、シグナル配列、交互に続くイントロンおよびコードエキソン、３’非翻訳領域ならびに３’隣接領域が挙げられる。ゲノムセグメントは、この５’非翻訳領域を介して、プロモーターおよびエンハンサーならびに通常は、５’非翻訳領域を含むカゼインフラグメントに結合される。

ＤＮＡ配列情報は、少なくとも１種、そしてしばしば、様々な生物における上記に列挙した全ての乳腺特異的遺伝子について利用可能である（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，５２６−５３２（１９８１）（ラットα−ラクトアルブミン）；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，８６８５−８６９７（１９８４）（ラットＷＡＰ）；Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，７０４２−７０５０（１９８５）（ラットβ−カゼイン）；Ｙｕ−ＬｅｅおよびＲｏｓｅｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８，１０７９４−１０８０４（１９８３）（ラットγ−カゼイン）；Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４２，７３５-７４２（１９８７）（ヒトα−ラクトアルブミン）；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，３８９（１９８４）（ウシαｓ１およびκカゼインのｃＤＮＡｓ）；Ｇｏｒｏｄｅｔｓｋｙら、Ｇｅｎｅ ６６，８７−９６（１９８８）（ウシβカゼイン）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８，３９５−４０１（１９８８）（ウシκカゼイン）；Ｂｒｉｇｎｏｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１８８，４８−５５（１９７７）（ウシαＳ２カゼイン）；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｇｅｎｅ ６１，８５−９０（１９８７），Ｉｖａｎｏｖら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３６９，４２５−４２９（１９８８），Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，６７３９（１９８９）（ウシβラクトグロブリン）；Ｖｉｌｏｔｔｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ６９，６０９−６２０（１９８７）（ウシα−ラクトアルブミン）を参照のこと（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）。種々の乳タンパク質遺伝子の構造および機能は、ＭｅｒｃｉｅｒおよびＶｉｌｏｔｔｅ，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．７６，３０７９−３０９８（１９９３）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）に概説される。さらなる配列データが必要とされ得る範囲まで、すでに得られた領域に隣接する配列は、既存の配列をプローブとして使用して、容易にクローン化され得る。異なる生物由来の乳腺特異的調節配列は、同様に、公知の同族のヌクレオチド配列、または同族タンパク質に対する抗体をプローブとして使用して、そのような生物由来のライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。

組換えタンパク質の発現を乳腺へと標的化するためにαＳ１−カゼイン調節配列を使用する、一般的なストラテジー、および例示的な導入遺伝子は、ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ ９１／０８２１６およびＷＯ９３／２５５６７（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）においてより詳細に記載される。他の乳腺特異的遺伝子由来の調節配列を使用する導入遺伝子の例としてもまた、記載されている（例えば、Ｓｉｍｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，１７９−１８３（１９８８）およびＷＯ８８／００２３９（１９８８）（ヒツジにおける発現のためのβ−ラクトグロブリン調節配列）；Ｒｏｓｅｎ，ＥＰ ２７９，５８２およびＬｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，１０２７−１０４１（１９８８）（発現のためのマウスにおけるβ−カゼイン調節配列）；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５，１１８３（１９８７）（発現のためのマウスにおけるＷＡＰ調節配列）；ＷＯ８８／０１６４８（１９８８）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８６，４３−４８（１９８９）（発現のためのマウスにおけるα−ラクトアルブミン調節配列）を参照のこと（全ての目的のために、その全体において参考として援用される））。

導入遺伝子からの乳汁におけるリソソームタンパク質の発現は、翻訳後修飾およびリソソームタンパク質の標的化に関与する遺伝子の、同時発現または機能的不活性化（すなわち、ノックアウト）により影響を受け得る。実施例におけるデータは、驚くことに、乳腺は、高レベルでタンパク質を含むマンノース６−リン酸の集合および分泌を得るのに十分な量で、すでに修飾酵素を発現することを示す。しかし、高レベルでこれらのタンパク質を発現する、いくつかのトランスジェニック哺乳動物において、導入遺伝子発現から生じるさらなる酵素を用いて、プロセシング酵素の内因性のレベルを補うことが、ときどき好ましい。そのような導入遺伝子は、プロセシング酵素コード配列について上記で議論された原理と類似の原理を使用し、リソソームタンパク質コード配列を、導入遺伝子において置換して用いて構築される。翻訳後プロセシング酵素が分泌されることは、一般的には必要ではない。従って、リソソームタンパク質コード配列に連結された分泌シグナル配列は、分泌を伴わずにプロセシング酵素を小胞体へと標的化するシグナル配列で置換される。例えば、これらの酵素に天然で結合しているシグナル配列が適している。

（Ｄ．トランスジェネシス）
上記の導入遺伝子は、非ヒト哺乳動物中に導入される。ほとんどの非ヒト哺乳動物（げっし類（例えば、マウスおよびラット）ウサギ、ヒツジ類（例えば、ヒツジおよびヤギ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ならびにウシ類（ウシおよびバッファロー）を含む）は適している。ウシ類は、大きな収量の乳汁という利点を提供し、一方、マウスは、トランスジェネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ）および育種の容易さという利点を提供する。ウサギは、これらの利点の折衷物を提供する。ウサギは、約１４％のタンパク質含量を有する乳を、１日に１００ｍｌ生産し得（Ｂｕｈｌｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８，１４０（１９９０）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）を参照のこと）、そしてなお、マウスの場合と同じ原理および類似の設備を使用して操作され得、そして育種され得る。非胎生哺乳動物（例えば、ハリモグラまたはカモノハシ）は、代表的には使用されない。

トランスジェネシスのいくつかの方法において、導入遺伝子は、受精した卵母細胞の前核中に導入される。いくつかの動物（例えば、マウスおよびウサギ）については、受精はインビボで実施され、そして受精した卵は外科的に取り出される。他の動物（特にウシ類）においては、生きている動物または屠殺動物から卵細胞を取り出し、そしてインビトロで卵を受精させることが好ましい（ＤｅＢｏｅｒら、ＷＯ９１／０８２１６を参照のこと）。インビトロの受精は、導入遺伝子は、組込むために最適な細胞周期の段階（Ｓ期より遅くない）で、実質的に同調した細胞中に導入されることを可能にする。導入遺伝子は、通常、微量注入法によって導入される（ＵＳ ４，８７３，２９２を参照のこと）。次いで、受精した卵母は、約１６〜１５０細胞を含む着床前胚が得られるまで、インビトロで培養される。１６〜３２細胞期の胚は、桑実胚として記載される。３２を越える細胞を含む着床前胚は、胚盤胞と呼ばれる。これらの胚は、代表的に、６４細胞期で割腔の発生を示す。受精した卵母細胞を着床前段階まで培養するための方法は、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１，４１４（１９８４）；Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ
Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｎ．Ｙ．（１９８６）（マウス胚）；およびＨａｍｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５，６８０（１９８５）（ウサギ胚およびブタ胚）；Ｇａｎｄｏｌｆｉら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１，２３−２８（１９８７）；Ｒｅｘｒｏａｄら、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６，９４７−９５３（１９８８）（ヒツジ胚）ならびにＥｙｅｓｔｏｎｅら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８５，７１５−７２０（１９８９）；Ｃａｍｏｕｓら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．７２，７７９−７８５（１９８４）；ならびにＨｅｙｍａｎら、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ
２７，５９６８（１９８７）（ウシ胚）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）により記載される。ときどき、着床前胚は、着床までの間、凍結して保存される。着床前胚は、偽妊娠雌の卵管に移され、導入遺伝子を組込んだ、発生段階に依存して、トランスジェニック動物またはキメラ動物が誕生する。キメラ哺乳動物を交配して、真の生殖系列トランスジェニック動物を形成し得る。

あるいは、導入遺伝子は、胚幹細胞（ＥＳ）中に導入され得る。これらの細胞は、インビトロで培養された、着床前の胚から得られる（Ｂｒａｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ３０９，２５５−２５８（１９８４）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される））。導入遺伝子は、エレクトロポレーションまたは微量注入法によって、そのような細胞中に導入され得る。形質転換されたＥＳ細胞は、非ヒト動物由来の胚盤胞と結合される。ＥＳ細胞は、その胚にコロニーをつくり、そしていくつかの胚では、生じるキメラ動物の生殖系列を形成する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１４６８−１４７４（１９８８）（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）を参照のこと）。あるいは、ＥＳ細胞は、除核された受精卵母細胞中に移植し、トランスジェニック哺乳動物を発生させるための、核の供給源として使用され得る。

２つ以上の導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の産生については、その導入遺伝子は、単一の導入遺伝子の場合と同じ手順を使用して、同時に導入され得る。あるいは、導入遺伝子は、最初に別々の動物中に導入され得、次いで、これらの動物を交配することにより、同じゲノム中に組み合わされ得る。あるいは、導入遺伝子の一方を含む第１のトランスジェニック動物が、産生される。次いで、２番目の導入遺伝子は、その動物由来の受精卵中または胚幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態において、長さが他の点では約５０ｋｂを超える導入遺伝子は、重複フラグメントとして構築される。そのような重複フラグメントは、受精卵母細胞中または胚幹細胞中に同時に導入され、そしてインビボにおいて相同組換えを受ける（Ｋａｙら、ＷＯ ９２／０３９１７（全ての目的のために、その全体において参考として援用される）を参照のこと）。

（Ｅ．トランスジェニック哺乳動物の特徴）
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、上記のように、それらのゲノム中の少なくとも１つの導入遺伝子を取り込む。導入遺伝子は、リソソームタンパク質をコードするＤＮＡセグメントの発現を少なくとも主に乳腺に対して標的化する。驚くことに、その乳腺は、オリゴ糖の添加およびリン酸化の工程を含む、真正翻訳後プロセシングに必要とされるタンパク質を発現し得る。乳腺における酵素によるプロセシングは、マンノース基の６’位のリン酸化を生じる。

リソソームタンパク質は、少なくとも１０、５０、１００、５００、１０００、２０００、５０００または１０，０００μｇ／ｍｌという高レベルで分泌され得る。驚くことに、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、実質的に正常な健康を現わす。乳腺以外の組織におけるリソソームタンパク質の二次発現は、有毒な効果を引き起こすのに十分な程度までは生じない。さらに、乳腺において産生される外因性のリソソームタンパク質は、分泌装置を詰まらせる堆着により存在する、有意な問題が示されない、十分な効率性で分泌される。

当然、トランスジェニック哺乳動物が乳汁を産生し始め得る年は、動物の性質に伴って異なる。トランスジェニックウシについては、その年齢は、通常、約２歳半またはホルモンの刺激を用いて６ヶ月であり、一方、トランスジェニックマウスについては、その年齢は、約５〜６週間である。当然、種の雌のメンバーのみが、乳汁を産生するために有用である。しかし、トランスジェニック雄はまた、雌の子孫を育種するために有用である。トランスジェニック雄由来の精子は、続いてインビトロにおける受精および雌の子孫の産生のために冷凍保存され得る。

（Ｆ．乳汁からのタンパク質の回収）
トランスジェニック成体雌哺乳動物は、高濃度の外因性リソソームタンパク質を含む乳を産生する。所望であるなら、そのタンパク質は、識別する物理的特性および化学的特性、ならびに標準的な精製手順（例えば、沈澱、イオン交換、分子排除またはアフィニティークロマトグラフィー）によって乳汁から精製され得る（一般的に、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）を参照のこと）。

乳汁からのヒト酸性α−グルコシダーゼの精製は、遠心分離および脂肪の除去によるトランスジェニック乳汁の脱脂、続いて高速遠心分離、続いてのデッドエンド（ｄｅａｄ-ｅｎｄ）な濾過（すなわち、フィルターの大きさを連続して小さくして使用することによるデッドエンドな濾過）または直交流濾過によるカゼインの除去、あるいは直交流濾過によるカゼインの直接的な除去によって実施され得る。ヒト酸性α−グルコシダーゼは、クロマトグラフィー（例えば、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（または他の陰イオン交換マトリックスを含む）、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、金属キレートセファロースあるいはセファロースに結合したレクチン（または他のマトリックス））によって精製される。

Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィーは、以下のように、濾過した乳清または乳清画分中に存在するヒト酸性α−グルコシダーゼを精製するために使用され得る：Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＱＦＦ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、１５ｃｍベッド高；２５０ｃｍ／時間流速）のカラムを、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０）（緩衝液Ａ）中で平衡化し；Ｓ／Ｄ−インキュベートした乳清画分（約５００〜約６００ｍｌ）を充填し、そしてこのカラムを、４〜６カラム容量（ｃｖ）の緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．０））で洗浄する。ヒト酸性α−グルコシダーゼ画分は、１００ｍＭのＮａＣｌを含む２〜３ｃｖの緩衝液Ａを用いて、このＱＦＦカラムから溶出される。

このＱＦＦ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのヒト酸性α−グルコシダーゼ含有画分は、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｈｉｇｈ Ｐｅｆｏｒｍａｎｃｅクロマトグラフィーを使用して、さらに精製され得る。例えば、１容量の１Ｍの硫酸アンモニウムを、持続的に攪拌しながら、ＱＦＦ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅのヒト酸性α−グルコシダーゼ溶出物に添加する。次いで、Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＸＫ−５０カラム、１５ｃｍベッド高；１５０ｃｍ／時間流速）は、０．５Ｍの硫酸アンモニウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（緩衝液Ｃ）（ｐＨ６．０）中でカラムを平衡化し、（ＱＦＦ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅから）０．５Ｍの硫酸アンモニウム−インキュベートしたヒト酸性α−グルコシダーゼ溶出物を充填し、２〜４ｃｖの緩衝液Ｃでこのカラムを洗浄し、そしてヒト酸性α−グルコシダーゼ（これは、３〜５ｃｖの緩衝液Ｄ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いてＰｈｅｎｙｌ ＨＰカラムから溶出された）を溶出することにより、室温にて行われた。ヒト酸性α−グルコシダーゼをさらに精製するための代替的方法およびさらなる方法は、当業者には明らかである。例えば、英国特許出願９９８ ０７４６４．４（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照のこと。

（Ｇ．組換えリソソームタンパク質の用途）
本発明により産生される組換えリソソームタンパク質は、酵素置換治療手順において用途を見出す。機能的リソソーム酵素の不全を生じる、遺伝的または他の欠損を有する患者は、この患者に外来性の酵素を投与することにより処置され得る。このような処置の必要な患者は、症状（例えば、小人症、角膜混濁、肝脾腫大症、弁病変、冠状動脈病変、骨格変形、関節硬直および進行性精神遅滞を含むフルラー症候群の症状）から同定され得る。あるいは、またはさらに、患者は、特定のリソソーム酵素によりプロセスされる特徴的な代謝物の過剰な蓄積を明らかにするため、組織サンプルの生化学的分析から診断され得るか、あるいは特定のなリソソーム酵素活性の欠損を明らかにするための、人工の基質または天然の基質を使用する酵素アッセイによって診断され得る。ほとんどの疾患について、診断は、症状の発症または代謝物の過剰な蓄積の前に、特定の酵素の欠損を測定することにより、またはＤＮＡ分析によりなされ得る（Ｓｃｒｉｖｅｒら、前出、ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｓｔｏｒａｇｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓの章）。リソソーム貯蓄症の全ては、遺伝性である。従って、リソソーム疾患に罹患したメンバーを有することが既知である家系由来の子孫において、最終診断がなされ得る前でも、予防的処置を開始することは、時として有利である。

（薬学的組成物）
いくつかの方法において、リソソーム酵素は、薬学的成物として薬学的キャリアと共に、精製された形態で投与される。この好ましい形態は、投与および治療的適用の意図される様式に依存する。この薬学的キャリアは、患者にポリペプチドを送達するために適切な任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性固体が、キャリアとして使用され得る。薬学的に受容可能なアジュバント、緩衝化剤、分散剤などもまた、この薬学的組成物中へ組み込まれ得る。

薬学的組成物中の酵素の濃度は、広範に変化し得る（すなわち、約０．１重量％未満（通常は、少なくとも約１重量％）から、２０重量％以上程度まで）。

経口投与のために、活性成分は、カプセル、錠剤および粉末のような固形投薬形態、またはエリキシル、シロップおよび懸濁液のような液体投薬形態で投与され得る。活性成分は、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムなどのような不活性成分および粉末キャリアと共に、ゼラチンカプセル中にカプセル化され得る。所望の色、味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の所望の特徴を提供するために添加され得る、さらなる不活性成分の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタニウム、食用白インク（ｅｄｉｂｌｅ ｗｈｉｔｅ ｉｎｋ）などである。同様の希釈剤が、圧縮剤を作製するために使用され得る。錠剤およびカプセルの両方は、徐放生成物として製造されて、数時間にわたり薬物の持続的な放出を提供し得る。圧縮剤は、いかなる不快な味をも遮断するため、および大気からこの錠剤を保護するために、糖コーティングもしくはフィルムコーティングされ得るか、または胃腸管中での選択的な分解のために腸溶性コーティングされ得る。経口投与のための液体投薬形態は、患者の受け入れを増加するために、着色剤および香味料を含み得る。

静脈内注入のための代表的な組成物は、２０％アルブミン溶液および１００ｍｇ〜５００ｍｇの酵素を必要に応じて補充した、１００〜５００ｍｌの滅菌した０．９％のＮａＣｌまたは５％のグルコースを含むように調合され得る。筋肉内注射のための代表的な薬学的組成物は、例えば、１ｍｌの滅菌緩衝水および１ｍｇ〜１０ｍｇの本発明の精製されたαグルコシダーゼをむように調合される。非経口的に投与可能な組成物を調製するための方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０）（全ての目的のためにその全体において参考として援用される）を含む種々の供給源において、より詳細に記載される。

ＡＧＬＵは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で処方され得る。少量の硫酸アンモニウムは、必要に応じて存在（＜１０ｍＭ）する。酵素は、代表的には約−７０℃にて凍結保存され、使用前に解凍される。あるいは、この酵素は、溶液中で（例えば、約４℃〜８℃にて）冷却保存され得る。いくつかの実施形態においてＡＧＬＵ溶液は、緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムまたは他の生理学的に受容可能な緩衝液）、単純な炭水化物（例えば、スクロース、グルコース、マルトース、マンニトールなど）、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、および／または界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）、クレモフォア（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）−ＥＬ，クレモフォア（ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ）−Ｒ，ラブロフィル（ｌａｂｒｏｆｉｌ）など）を含む。

ＡＧＬＵはまた、凍結乾燥形態で保存され得る。凍結乾燥のために、ＡＧＬＵは、リン酸緩衝液中にマンニトールおよびスクロースを含む溶液中で処方され得るべきである。スクロースの濃度は、再構成に際してＡＧＬＵの凝集を妨げるために十分である。マンニトールの濃度は、さもなくば凍結乾燥のために必要とされる時間を顕著に減少するために十分であるべきである。しかし、マンニトールおよびスクロースの濃度は、再構成に際して受容されない高浸透圧性を引き起こすに不十分であるべきである。それぞれ１ｍｇ／ｍｌ〜３ｍｇ／ｍｌおよび０．１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのマンニトールおよびスクロースの濃度が、適切である。好ましい濃度は、２ｍｇ／ｍｌのマンニトールおよび０．５ｍｇ／ｍｌのスクロースである。ＡＧＬＵは、凍結乾燥前および再構成後に、好ましくは、５ｍｇ／ｍｌである。好ましく０．９％での生理食塩水は、再構成のために好ましい溶液である。

ウサギの乳汁から精製されるＡＧＬＵについて、少量の不純物（例えば、約５％まで）は容認され得る。可能性のある不純物は、ウサギの乳清タンパク質の形態で存在し得る。他の可能性のある不純物は、ＡＧＬＵの構造的アナログ（例えば、オリゴマーおよび凝集体）および切断物である。現在のバッチは、トランスジェニックウサギにおいて産生されるＡＧＬＵが９５％より高く純粋であることを示す。最も大きな不純物はウサギの乳清タンパク質であるが、ゲル電気泳動に際して、異なる分子量のＡＧＬＵバンドもまた見られる。

注入溶液は、層流空気流フード中で無菌的に調製されるべきである。適切な量のＡＧＬＵは、フリーザーから取り出され、室温にて解凍されるべきである。注入溶液は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびグルコースを含む、適切な量の溶液と適切な量のＡＧＬＵ最終産物溶液を混合することにより、ガラス注入ボトル中で調製され得る。最終濃度は、２５ｍｇ〜２００ｍｇの用量に対して１％のＨＳＡおよび４％のグルコース、そして４００ｍｇ〜８００ｍｇの用量に対して１％のＨＳＡおよび４％のグルコースであり得る。ＨＳＡおよびＡＧＬＵは、５％グルコースを含む注入ボトルに移す前に、０．２μｍのシリンジフィルターを用いて濾過され得る。あるいは、ＡＧＬＵは、生理食塩水溶液（注入のために、好ましくは０．９％）中で再構成され得る。注入のためのＡＧＬＵの溶液は、室温にて７時間まで安定であることが示されている。従って、このＡＧＬＵ溶液は、好ましくは調製７時間以内に注入される。

（治療方法）
本発明は、ポンペ病を処置する有効な方法を提供する。これらの方法は、触媒的に活性である形態での、および処置されている患者の組織、特に肝臓、心臓および筋肉（例えば、平滑筋、横紋筋および心筋）により取り込まれ得る形態での大量のヒト酸性α−グルコシダーゼの利用可能性を、一部前提とする。このようなヒト酸性α−グルコシダーゼは、例えば、実施例に記載されるトランスジェニック動物から提供される。α−グルコシダーゼは、好ましくは、主に（すなわち、＞５０％）約１００ｋＤ〜１１０ｋＤの前駆体形態である。（１００ｋＤ〜１１０ｋＤの前駆体の見かけの分子量または相対的移動性は、使用される分析の方法に依存して幾分変化し得るが、典型的には、９５ｋＤと１２０ｋＤの範囲内である。）実施例において議論されるトランスジェニック動物中のヒト酸性α−グルコシダーゼでの首尾よい結果を考慮すると、細胞発現系から生じるようなヒトα−グルコシダーゼの他の供給源もまた使用され得ることが可能である。例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼを生成する代替的方法は、適切なプロモーターに作動可能に連結された、ｃＤＮＡまたはゲノム構築物として、安定な真核生物細胞株（例えば、ＣＨＯ）中に、酸性α−グルコシダーゼ遺伝子をトランスフェクトすることである。しかし、このようなアプローチによる臨床的な治療のために必要とされる、大量のヒト酸性α−グルコシダーゼを生成することは、より困難である。

本発明の薬学的組成物は、通常、静脈内に投与される。皮内、筋肉内または経口投与はまた、いくつかの場合において可能である。この組成物は、リソソーム酵素欠損疾患を患っている、またはその危険のある個体の予防的な処置のために投与され得る。治療的適用について、薬学的組成物は、蓄積された代謝物の濃度を減少させるため、および／または代謝物のさらなる蓄積を予防もしくは防止するために十分な量で、確立された疾患に罹患している患者に投与される。リソソーム酵素欠損疾患の危険のある個体に対して、この薬学的組成物は、代謝物の蓄積を予防または阻害するいずれかのために十分な量で、予防的に投与される。このことを達成するために適切な量は、「治療的有効量」または「予防的有効量」として定義される。このような有効量は、状態の重症度および患者の健康状態の全身性状態に依存する。

この方法において、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、通常、患者に対して一週間あたり患者体重に対して１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、投与される。しばしば、用量は、一週間あたり１０ｍｇ／ｋｇを超える。投薬レジメンは、一週間あたり１０ｍｇ／ｋｇ〜一週間あたり少なくとも１０００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。代表的な投薬レジメンは、一週間あたり１０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり１５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり２０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり２５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり３０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり３５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり４０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり４５ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり６０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり８０ｍｇ／ｋｇおよび一週間あたり１２０ｍｇ／ｋｇである。好ましいレジメンにおいては、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇまたは４０ｍｇ／ｋｇが、毎週１回、２回または３回投与される。処置は、少なくとも４週間、時として２４週間、そして時として患者の生涯にわたり、代表的に続けられる。処置は、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）に投与される。必要に応じて、ヒトα−グルコシダーゼのレベルは、処置後にモニターされ（例えば、血漿または筋肉において）、そして検出されるレベルが、実質的に正常なヒトにおける値未満（例えば、２０％未満）に低下した場合、さらなる用量が投与される。

いくつかの方法において、ヒト酸性α−グルコシダーゼは、初めは「高」用量（すなわち、「負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｏｓｅ）」）で投与され、続いて低用量（すなわち、「維持用量」）で投与される。負荷用量の例は、週（例えば、１、２または３週間）あたり１〜３回、患者体重に対して少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇである。維持用量の例は、周あたり患者体重に対して少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ〜少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇであり、またはそれ以上（例えば、一週間あたり２０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり３０ｍｇ／ｋｇ、一週間あたり４０ｍｇ／ｋｇ）である。

いくつかの方法において、用量は、投薬期間中に増加速度で投与される。このようなことは、静脈内注入の流速を増加することにより、または一定の速度で投与される漸増する濃度のα−グルコシダーゼの勾配を使用することにより達成され得る。この様式での投与は、免疫原性反応の危険性を減少させる。いくつかの用量において、単位時間あたりのα−グルコシダーゼの単位において測定される投与速度は、少なくとも１０の係数により増加する。代表的に、静脈内注入は、数時間の期間（例えば、１〜１０時間、および好ましくは２〜８時間、より好ましくは３〜６時間）にわたり行われ、そして注入速度は、投与の期間中に間隔をおいて増加される。

増加速度での注入についての適切な用量（全ては、ｍｇ／ｋｇ／時間）は、以下の表１に示される。この表の第１欄は、投薬スケジュールにおける時間を示す。例えば、０〜１時間への参照は、投薬の最初の時間を言及する。表の第５欄は、それぞれの時間で使用され得る用量の範囲を示す。第４欄は、好ましい投薬量の制限された内包範囲を示す。第３欄は、例示的な臨床的試行において投与される投薬量のより高い値とより低い値を示す。第２欄は、特に好ましい投薬量を示し、それらは、表１の第３欄に示される範囲の平均を示す。

この方法は、早発性（幼児性）ポンペ病および遅発性（若年性および成人性）ポンペ病の両方を有する患者に対して有効である。ポンペ病の幼児性形態を有する患者において、症状は、生涯の最初の４ヶ月において明らかになる。大半において、貧弱な運動発達および成長不全が、最初に認められる。臨床試験に際して、筋肉消耗、胸骨退縮を伴う増加した呼吸速度、肝臓の中程度の膨大および舌の突出を伴う全身性緊張低下が存在する。心臓の超音波試験は、進行性の肥大型心筋症を示し、最終的に不十分な心拍出量を誘導する。ＥＣＧは、顕著な左軸偏位、短いＰＲ間隔、大きなＱＲＳ複合体、反転Ｔ波、およびＳＴ低下により特徴付けられる。この疾患は、生涯の最初の年において心臓性呼吸不全を誘導する、急速な進行経過を示す。剖検での組織学的な試験に際して、リソソームのグリコーゲン蓄積が、種々の組織において観察され、心臓および骨格筋において最も明白である。本発明の方法におけるてヒト酸性α−グルコシダーゼを用いる処置は、そのような患者の寿命の延長を生じる（例えば、１、２、５年を超えて、正常な寿命まで）。処置はまた、上で議論したように、ポンペ病の臨床学的特徴および生化学的特徴の除去または減少を生じ得る。処置は、生後直ぐに、またはこの患者が、それらの子孫を危険におかせる変異したα−グルコシダーゼ対立遺伝子を保有することが既知である場合は、出生前に投与される。

ポンペ病の遅発性の成人性形態を有する患者は、生涯の最初の二十年において、症状を経験しないかもしれない。この臨床学的なサブタイプにおいて、主に骨格筋が、肢帯、体幹および横隔膜のそれらの偏好に関連する。階段を登る際の困難は、しばしば最初の病訴である。呼吸障害は、かなり変化する。これは、臨床的容体を支配し得るか、またはこれは、患者によっては、晩年になるまで経験されない。ほとんどのそのような患者は、呼吸不全のために死亡する。若年性サブタイプを有する患者において、症状は、通常、生涯の最初の１０年で明らかとなる。成人性ポンペ病の場合、骨格筋衰弱が、主な問題であり；心臓肥大、肝腫大および巨舌症が見られ得るが、稀である。多くの場合、毎晩の人工呼吸器支持が、最終的に必要とされる。呼吸筋の萎縮を併発する肺感染は、生命を脅かし、大半において、３０年の年数前には致死的になる。本発明の方法を用いた処置は、遅延性の若年性ポンペ病患者または成人性ポンペ病患者の寿命を正常な寿命まで延長する。処置はまた、疾患の臨床的症状および生化学的症状を除去または顕著に減少する。

（他の用途）
トランスジェニック動物の乳汁中のリソソームタンパク質産物は、多くの他の用途を有する。例えば、他のα−アミラーゼと共通してα−グルコシダーゼは、デンプン、ビールおよび医薬品の生産において重要なツールである。ＶｉｈｉｎｅｎおよびＭａｎｔｓａｌａ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４，３２９−４０１（１９８９）（全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照のこと。リソソームタンパク質はまた、実験化学薬品または加工食品を生産するために有用である。例えば、酸性α−グルコシダーゼは、１，４α−糖質結合（ｇｌｕｃｉｄｉｃ ｂｏｎｄ）および１，６α−糖質結合を分解し、そして、マルトース、イソマルトース、デンプンおよびグリコーゲンのような、それらの結合を含む種々の炭水化物の分解に使用されて、グルコースを産生し得る。酸性α−グルコシダーゼはまた、腸マルターゼ不全または腸イソマルターゼ不全の患者に対する投与のために有用である。さもなくば消化されないマルトースの存在から生じる症状は、回避される。そのような適用において、この酵素は、乳汁からの事前の画分化なしで、そのような乳汁から誘導される加工食品（例えば、アイスクリームまたはチーズ）として、または薬学的組成物として投与され得る。精製された組換えリソソーム酵素はまた、組織サンプル中のこのような酵素の未知量のアッセイのための診断キットにおけるコントロールとして含まれるために有用である。

（実施例）
（実施例１：導入遺伝子の構築）
（（ａ）ｃＤＮＡ構築物）
ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの構築は、プラスミドｐ１６，８ｈｌｆ３（ＤｅＢｏｅｒら（１９９１）および（１９９３）、前出を参照のこと）を用いて開始した。このプラスミドは、ウシαＳ１−カゼイン調節配列を含む。この親プラスミドのラクトフェリンｃＤＮＡ挿入物を、図１において示されるような発現カセットのＣｌａＩ部位およびＳａｌＩ部位において、ヒト酸性α−グルコシダーゼｃＤＮＡ（Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．７，１６９７〜１７０４（１９８８））と交換した。α−グルコシダーゼｃＤＮＡフラグメントの末端にこれらの適合可能な制限部位を得るために、ヒトα−グルコシダーゼをコードする完全なｃＤＮＡを含むプラスミドｐＳＨＡＧ２（同上）を、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いて消化して、そしてこの３．３ｋｂ ｃＤＮＡフラグメントを、ベクターのヌクレオチド配列内の破壊されたＣｌａＩ部位および新しく設計されたポリリンカー（ＨｉｎｄＩＩＩ ＣｌａＩ ＥｃｏＲＩ ＳｐｈＩ ＸｈｏＩ ＥｃｏＲＩ ＳｆｉＩ ＳｆｉＩ／ＳｍａＩ ＮｏｔＩ ＥｃｏＲＩ^*（^*＝破壊された部位））を有する、ｐＫＵＮ７ΔＣ（ｐＫＵＮＩ誘導体）（Ｋｏｎｉｎｇｓら、Ｇｅｎｅ ４６、２６９〜２７６（１９８６））中でサブクローン化した。生じたプラスミドｐαｇｌｕＣＥＳＸから、この３．３−ｋｂ ｃＤＮＡフラグメントを、ＣｌａＩおよびＸｈｏＩにより切り出し得た。このフラグメントを、ＣｌａＩ部位およびＸｈｏＩ−適合可能なＳａｌＩ部位で、図１において示される発現カセットに挿入した。結果として、発現プラスミドｐ１６，８αｇｌｕは、図１において示されるようなウシαＳ１−カゼイン配列に隣接される、ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードするｃＤＮＡ配列からなる。完全な発現カセットを含むこの２７．３−ｋｂフラグメントを、ＮｏｔＩを用いた切断により、切り出し得る（図１を参照のこと）。

（（ｂ）ゲノム構築物）
構築物ｃ８αｇｌｕｅｘ１は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子（Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．２７２，４９３〜４９７（１９９０））（その転写開始部位のちょうど下流のエキソン１において始まる）を含む（図２、パネルＡを参照のこと）。従って、この構築物は、ヒト酸性αグルコシダーゼ遺伝子のほとんど完全な５’ＵＴＲをコードする。このフラグメントを、ウシαＳ１−カゼイン遺伝子のプロモーター配列に融合した。このαＳ１−カゼイン開始部位は、αＳ１−カゼイン／酸性α−グルコシダーゼ接合部の２２ｂｐ上流に存在する。この構築物は、ヒト酸性α−グルコシダーゼポリアデニル化シグナル配列および３’隣接配列を有する。構築物ｃ８αｇｌｕｅｘ２は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子のエキソン２における転写開始部位に即座に融合されるウシαＳ１カゼインプロモーターを含む（図２、パネルＢを参照のこと）。従って、αＳ１−カゼイン転写開始部位およびα−グルコシダーゼ転写開始部位は、この構築物において２２ｂｐ離れている。従って、α−グルコシダーゼ５’ＵＴＲを保存しない。この構築物はまた、図２、パネルＢにおいて示されるようなヒト酸性α−グルコシダーゼポリアデニル化シグナル配列および３’隣接配列を含む。

構築物ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０は、３’領域においてのみ、構築物ｃ８αｇｌｕｅｘ２と異なる。エキソン２０におけるＳｐｈＩ部位を、ウシαＳ１−カゼイン３’配列をヒト酸性α−グルコシダーゼ構築物と融合するために用いた。このポリアデニル化シグナルは、この３’αＳ１−カゼイン配列中に位置する（図２、パネルＣ）。

構築物ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０は、３’領域においてのみ、構築物ｃ８αｇｌｕｅｘ２と異なる。エキソン２０におけるＳｐｈＩ部位を、ウシαＳ１−カゼイン３’配列をヒト酸性α−グルコシダーゼ構築物と融合するために用いた。このポリアデニル化シグナルは、この３’αＳ１−カゼイン配列中に位置する（図２、パネルＣ）。

（ゲノム構築物の構築の方法）
ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子を含む３つの連続したＢｇｌＩＩフラグメントを、Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら（前出）によって単離した。これらのフラグメントを、カスタマイズされたポリリンカー（ＨｉｎｄＩＩＩ ＣｌａＩ ＳｔｕＩ
ＳｓｔＩ ＢｇｌＩＩ ＰｖｎＩ ＮｃｏＩ ＥｃｏＲＩ ＳｐｈＩ ＸｈｏＩ ＥｃｏＲＩ^* ＳｍａＩ／ＳｆｉＩ ＮｏｔＩ ＥｃｏＲＩ^*（^*＝破壊された部位））を有するｐＫＵＮ８ΔＣ（ｐＫＵＮ７ΔＣ誘導体）のＢｇｌＩＩ部位中に連結した。この連結は、プラスミドｐ７．３αｇｌｕＢＥＳ、ｐ７．３αｇｌｕＢＳＥ、ｐ８．５αｇｌｕＢＳＥ、ｐ８．５αｇｌｕＢＥＳ、ｐ１０αａｇｌｕＢＳＥおよびｐ１０αｇｌｕＢＥＳを生成する、これらの２つの方向のフラグメントを生じた。

発現カセットの末端の独特なＮｏｔＩ−部位が、マイクロインジェクションに使用されるフラグメントの単離のために後で使用されることから、ヒト酸性α−グルコシダーゼのイントロン１７における遺伝子内ＮｏｔＩ部位を、破壊しなければならなかった。従って、ｐ１０αｇｌｕＢＥＳを、ＣｌａＩおよびＸｈｏＩを用いて消化し；３’α−グルコシダーゼの末端を含むフラグメントを単離した。このフラグメントを、ｐＫＵＮ１０ΔＣのＣｌａＩ部位およびＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐ１０αｇｌｕΔＮＶを生じた。前もって、ｐＫＵＮ１０ΔＣ（すなわち、ｐＫＵＮ８ΔＣの誘導体）を、ＮｏｔＩを用いてｐＫＵＮ８ΔＣを消化し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて粘着末端を充填し、そして続いて、平滑末端連結によりこのプラスミドをアニーリングすることによって得た。最終的に、ｐ１０αｇｌｕΔＮＶを、ＮｏｔＩを用いて消化した。これらの粘着末端をまた、Ｋｌｅｎｏｗで充填して、そしてこのフラグメントを連結し、プラスミドｐ１０αｇｌｕΔＮｏｔＩを生じた。

（ｃ８αｇｌｕｅｘ１の構築）
αグルコシダーゼ遺伝子の最初のエキソンにおけるＳｓｔＩ部位を、ウシαＳ１−カゼイン配列との融合のために選択したことから、ｐ８．５αｇｌｕＢＳＥを、ＢｇｌＩＩを用いて消化し、その後、ＳｓｔＩを用いて部分消化した。エキソン１〜３を含むフラグメントを単離し、そしてｐＫＵＮ８ΔＣのＢｇｌＩＩ部位およびＳｓｔＩ部位に連結した。この生じたプラスミドを、以下のように命名した：ｐ５’αｇｌｕｅｘ１（図３、パネルＡを参照のこと）。

次の工程（図３、パネルＢ）は、３’部分のｐ５’αｇｌｕｅｘ１への連結であった。第１に、ｐ１０αｇｌｕΔＮをＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化した。エキソン１６〜２０を含むこのフラグメントを、単離した。第２に、ｐ５’αｇｌｕｅｘ１を、ＢｇｌＩＩを用いて消化し、そして自己連結を防ぐために、および粘着ＢｇｌＩＩ末端を脱リン酸化するために、ホスホリラーゼ（ＢＡＰ）を用いて処理した。ＢａｍＨＩ粘着末端は、ＢｇｌＩＩ粘着末端と適合可能であるから、これらの末端は互いに連結する。この生じたプラスミド（すなわち、ｐ５’３’αｇｌｕｅｘ１）を、選択した。このプラスミドは、最終の構築工程のために利用可能な独特なＢｇｌＩＩ部位を有する（図３、パネルＢおよびパネルＣ）。

αグルコシダーゼ遺伝子の中間部分を、その後の構築物に挿入した。この工程のために、ｐ７．３αｇｌｕＢＳＥをＢｇｌＩＩを用いて消化し、８．５−ｋｂフラグメントを単離し、そしてＢｇｌＩＩ−消化および脱リン酸化されたｐ５’３’αｇｌｕｅｘ１プラスミドに連結した。この生じたプラスミドが、ｐαｇｌｕｅｘ１である（図３、パネルＣ）。

このウシαＳ１カゼインプロモーター配列を、３つのフラグメントを含む連結を介して次の工程において組み込んだ。ｐＷＥ１５コスミドベクターを、ＮｏｔＩを用いて消化し、そして脱リン酸化した。ウシαＳ１−カゼインプロモーターを、８ Ｒｂ ＮｏｔＩ−ＣｌａＩフラグメントとして単離した（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９９１、（前出）を参照のこと）。ヒト酸性α−グルコシダーゼフラグメントを、同じ酵素を用いてｐαｇｌｕｅｘ１から単離した。これらの３つのフラグメントを、連結して、そして１０４６ Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＧｉｇａｐａｃｋＩＩキットを用いてパッケージングした。この生じたコスミドｃ８αｇｌｕｅｘ１を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α中で、増殖させた。このベクターを、マイクロインジェクションの前にＮｏｔＩを用いて線状化した。

（ｃ８αｇｌｕｅｘ２およびｃ８．８αｇｌｕｅｘ２−２０の構築）
他の２つの発現プラスミドの構築（図２、パネルＢおよびパネルＣ）は、ｃ８αｇｌｕｅｘ１の構築と類似のストラテジーに従った。このプラスミドｐ５’αｇｌｕＳｔｕＩを、ｐ８，５αｇｌｕＢＳＥから、ＳｔｕＩを用いたこのプラスミドの消化、それに続く、エキソン２〜３およびこのベクター配列を含む、単離されたフラグメントの自己連結により誘導した。プラスミドｐ５’αｇｌｕＳｔｕＩを、ＰｇｌＩＩを用いて消化し、それに続いて、ＮｃｏＩを用いてこの線状フラグメントを部分消化して、いくつかのフラグメントを生じた。エキソン２および３を含む２．４ｋｂフラグメントを単離し、そしてベクターｐＫＵＮ１２ΔＣのＮｃｏＩ部位およびＢｇｌＩＩに連結し、ｐ５’αｇｌｕｅｘ２を生じた。ｐＫＵＮ１２ΔＣが、ポリリンカー（ＣｌａＩ ＮｃｏＩ ＢｇｌＩＩ ＨｉｎｄＩＩＩ ＥｃｏＲＩ ＳｐｈＩ ＸｈｏＩ ＳｍａＩ／ＳｆｉＩ ＮｏｔＩ）を含むｐＫＵＮ８ΔＣの誘導体であることに留意すること。

プラスミドｐ１０αｇｌｕΔＮｏｔＩを、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化した。このエキソン１６〜２０を含むフラグメントを単離し、そしてＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化されたｐ５’αｇｌｕｅｘ２中に連結した。この生じたプラスミドが、ｐ５’３’αｇｌｕｅｘ２であった。ｐ５’３’αｇｌｕｅｘ２における中間のフラグメントを、ｐαｇｌｕｅｘ１についてのように挿入した。このために、ｐ７．３αｇｌｕを、ＢｇｌＩＩを用いて消化した。このフラグメントを単離し、そしてＢｇｌＩＩ−消化および脱リン酸化されたｐ５’３’αｇｌｕｅｘ２に連結した。この生じたプラスミド、ｐαｇｌｕｅｘ２を、ｃ８αｇｌｕｅｘ−２０およびｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０の構築において使用した（図２、パネルＢおよびパネルＣ）。

第３の発現プラスミドｃ８，８α ｇｌｕｅｘ２−２０の構築のために（図２、パネルＣ）、α−グルコシダーゼの３’隣接領域を欠失した。これを達成するために、ｐαｇｌｕｅｘ２を、ＳｐｈＩを用いて消化した。このエキソン２−２０を含むフラグメントを単離し、そして自己連結して、ｐαｇｌｕｅｘ２−２０を生じた。その後に、ウシαｓ１−カゼイン遺伝子の３’隣接領域を含むフラグメントを、ＳｐｈＩおよびＮｏｔＩを用いた消化により、ｐ１６，８αｇｌｕから単離した。このフラグメントを、ポリリンカー配列におけるＳｐｈＩ部位およびＮｏｔＩ部位を用いて、ｐαｇｌｕｅｘ２−２０に挿入し、ｐαｇｌｕｅｘ２−２０−３αＳ１を生じた。

ｃ８，８ｇｌｕｅｘ２−２０を生成するこの最終工程は、ｃ８αｇｌｕｅｘ１を導く構築における最終工程のような、３つのフラグメントの連結であった。ｐαｇｌｕｅｘ２−２０−３’αＳ１およびｐαｇｌｕｅｘ２におけるＣｌａＩ部位が、メチル化のために切断可能でないようであったことから、プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＡＭ（−）株ＥＣＯ３４３において増殖しなければならなかった。その株から単離されたｐαｇｌｕｅｘ２−２０−３’αＳ１を、ＣｌａＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。エキソン２〜２０および３’αカゼイン隣接領域を含むフラグメントを、ベクター配列から精製した。このフラグメント（ウシαｓ１プロモーター（ＤｅＢｏｅｒ（１９９１）および（１９９３）、前出を参照のこと）を含む８ｋｂ ＮｏｔＩ−ＣｌａＩフラグメント）およびＮｏｔＩ−消化、脱リン酸化されたｐＷＥ１５を連結し、そしてパッケージングした。この生じたコスミドが、ｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０である。

コスミドｃ８αｇｌｕｅｘ２（図２、パネルＢ）を、２つの異なる工程を介して構築した。第１に、コスミドｃ８，８αｇｌｕｅｘ２−２０を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて消化した。αＳ１−プロモーターおよび酸性α−グルコシダーゼ遺伝子のエキソン２〜６の部分を含む１０．５ｋｂフラグメントを、単離した。第２に、プラスミドｐαｇｌｕｅｘ２を、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、酸性αグルコシダーゼ遺伝子の３’部分を含むフラグメントを得た。最後に、コスミドベクターｐＷＥ１５を、ＮｏｔＩを用いて消化して、脱リン酸化した。これらの３つのフラグメントを、連結して、そしてパッケージングした。この生じたコスミドが、ｃ８αｇｌｕｅｘ２である。

（実施例２：トランスジェネシス）
ｃＤＮＡ構築物およびゲノム構築物を、ＮｏｔＩを用いて線状化して、そして受精マウス卵母細胞の前核に注入し、次いで、この卵母細胞を、偽妊娠マウスの養母の子宮の中に移植した。この子孫を、クリップテイル（ｃｌｉｐｐｅｄ ｔａｉｌ）から単離されたＤＮＡのサザンブロットによって、ヒトα−グルコシダーゼｃＤＮＡ遺伝子構築物またはゲノムＤＮＡ遺伝子構築物の挿入について分析した。トランスジェニックマウスを選択し、そして育種した。

ＮｏｔＩを用いて線状化されたゲノム構築物をまた、受精ウサギ卵母細胞の前核に注入し、これを偽妊娠ウサギの養母（ｆｏｓｔｅｒ ｍｏｔｈｅｒ）の子宮に移植した。この子孫を、α−グルコシダーゼＤＮＡの挿入について、サザンブロットにより分析した。トランスジェニックウサギを、選択し、そして育成した。

（実施例３：トランスジェニックマウスの乳汁中の酸性α−グルコシダーゼの分析）
トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックコントロールからの乳汁をウェスタンブロットによって分析した。このプローブは、ヒト酸性α−グルコシダーゼに対して特異的な（すなわち、マウス酵素には結合しない）マウス抗体であった。導入遺伝子１６７２および１６７３は、乳汁中にヒト酸性αグルコシダーゼの発現を示した（図４）。１００〜１１０ｋＤおよび７６ｋＤにおける大きいバンドおよび小さいバンドが、α−グルコシダーゼについて予測されるものとして観察された。非トランスジェニックマウス由来の乳汁中に、バンドは観察されなかった。

ヒト酸性α−グルコシダーゼの活性を、トランスジェニックマウス系統の乳汁中の人工基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを用いて測定した（Ｇａｌｉａａｒｄ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｅａｒｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｅｎａｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、８０９〜８２７頁（１９８０）を参照のこと）。このｃＤＮＡ構築物（図１）を含むマウスは、１時間あたり０．２μｍｏｌ／ｍｌ〜２μｍｏｌ／ｍｌで変化する。このゲノム構築物（図２、パネルＡ）を含むマウス系統は、１時間あたり１０μｍｏｌ／ｍｌ〜６１０μｍｏｌ／ｍｌまでのレベルで発現した。これらの図は、１８０μｍｏｌ／ｍｇの組換え酵素の推定される比活性（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．２３５：３９２〜３９６（１９８８））に基づいて、１．３ｍｇ／ｌ〜１１．３ｍｇ／ｌまでの産生（ｃＤＮＡ構築物）および０．０５ｇ／ｌ〜３．３ｇ／ｌの産生（ゲノム構築物）と同等である。

この組換え酸性α−グルコシダーゼを、ＣｏｎＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^TMおよびＳｅｐｈａｄｅｘ^TMＧ２００上での乳汁の連続クロマトグラフィーにより、トランスジェニックマウスの乳汁から単離した。７ｍｌの乳汁を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．６および１００ｍＭ ＮａＣｌからなる３ｍｌのＣｏｎ Ａ緩衝液を用いて、１０ｍｌに希釈した。次いで、Ｃｏｎ Ａ緩衝液中のＣｏｎ
Ａセファロースの１：１懸濁液を加え、そしてその乳汁を穏やかな振とうで、一晩、４度に置いた。次いで、Ｃｏｎ Ａセファロースビーズを、遠心分離によって収集し、そしてＣｏｎ Ａ緩衝液を用いて５回、１００ｍＭの代わりに１Ｍ
ＮａＣｌを含むＣｏｎ Ａ緩衝液を用いて３回、１００ｍＭの代わりに０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＣｏｎ Ａ緩衝液を用いて１回洗浄し、そして次いで、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．１Ｍメチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを含むＣｏｎ
Ａ緩衝液を用いてバッチ形式で抽出した。抽出されたサンプル中の酸性α−グルコシダーゼ活性を、人工の４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシド基質を用いて測定した（上記を参照のこと）。酸性α−グルコシダーゼ活性を含む画分をプールし、濃縮し、２０ｍＭの酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５および２５ｍＭ ＮａＣｌからなるＳｅｐｈａｄｅｘ緩衝液に対して透析し、そしてＳｅｐｈａｄｅｘ^TM２００カラムにアプライした。このカラムに、同じ緩衝液を流し（ｒｕｎ）、そして画分を酸性α−グルコシダーゼ活性およびタンパク質含量についてアッセイした。酸性α−グルコシダーゼ活性に富み、そして実質的に他のタンパク質を含まない画分を、プールし、そして濃縮した。記載されるような方法は、Ｒｅｕｓｅｒら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５５：１７８〜１７９（１９８４）によって公開された方法と基本的に同じである。この方法のいくつかの改変は、緩衝液系の正確な組成およびｐＨ、ならびに精製工程の数およびカラム材料における選択に関して可能である。

次いで、乳汁から精製された酸性α−グルコシダーゼを、ＧＳＤ ＩＩ（内因性の酸性α−グルコシダーゼにおける欠陥）を有する患者由来の培養された線維芽細胞に対してこの酵素を投与することにより、リン酸化について試験した。この試験において、マンノース６−ホスフェート含有タンパク質が、線維芽細胞の細胞表面上のマンノース６−ホスフェートレセプターに結合され、そしてその後、内部移行される。この結合は、遊離マンノース６−ホスフェートにより阻害される（Ｒｅｕｓｅｒら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１５５：１７８−１８９（１９８４））。トランスジェニックマウスの乳汁から単離された酸性α−グルコシダーゼのリン酸化についての代表的な試験において、この酸性α−グルコシダーゼを、２０時間の間で、１時間あたり１μｍｏｌの４−メチル−ウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを代謝するのに十分な量で、５００μｌ培養培地（１０％ウシ胎仔血清および３ｍＭ Ｐｉｐｅｓを供給されたＨａｍ Ｆ１０）中の１０４〜１０６の線維芽細胞に添加した。この実験を、本質的に、Ｒｅｕｓｅｒら、（前出）（１９８４）により記載されるように、競合因子として５ｍＭマンノース６−ホスフェートを用いて、または用いないで行った。これらの条件下で、患者の線維芽細胞の酸性α−グルコシダーゼは、健康な個体由来の線維芽細胞において測定されるレベルに回復した。マウス乳汁から単離された酸性α−グルコシダーゼによる内因性の酸性α−グルコシダーゼ活性の回復は、ウシ精巣、ヒト尿およびトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培地から精製された酸性α−グルコシダーゼによる回復と同様に有効であった。乳汁由来のα−グルコシダーゼによる回復は、他の供給源由来のα−グルコシダーゼについて観察されるように、５ｍＭマンノース６−ホスフェートにより阻害された（Ｒｅｕｓｅｒら、前出；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｌｏｅｇら、（１９８８）、前出；Ｖａｎ ｄｅｒ
Ｐｌｏｅｇら、Ｐｅｄ．Ｒｅｓ．２４：９０−９４（１９８８））。

この乳汁において産生されるα−グルコシダーゼの確実性のさらなる実証として、マウスの乳汁において産生される組換えα−グルコシダーゼのＮ末端アミノ酸配列が、Ｈｏｅｆｓｌｏｏｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．７：１６９７−１７０４（１９８８）によって公開されたように、ＡＨＰＧＲＰで開始するヒト尿由来のα−グルコシダーゼの前駆体のＮ末端アミノ酸と同様であると示された。

（実施例４：α−グルコシダーゼの動物試行）
最近、ポンペ病についてのノックアウトマウスモデルが、利用可能になった（２５）。このモデルは、マウスα−グルコシダーゼ遺伝子の標的化された破壊によって産生された。グリコゲン含有リソソームが、肝臓、心臓および骨格筋において、誕生後すぐに検出された。明白な臨床症状は、比較的遅い年齢（＞９ヶ月）でのみ明らかになるが、心臓は代表的に拡大し、そして心電図は異常である。

実験を、トランスジェニックウサギの乳汁から精製されたＡＧＬＵのインビボでの効果を研究するため、ノックアウト（ＫＯ）マウスモデルを用いて実行した。これらの実験における組換え酵素を、基本的にトランスジェニックマウスからの精製について上記されるように、トランスジェニックウサギの乳汁から精製した。

（１．ＫＯマウスモデルにおける短期の研究）
６日間隔で、単回または複数回の注射を、尾静脈を介してＫＯマウスに投与した。最後の酵素の投与の２日後に、その動物を殺し、そして器官をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて灌流した。組織ホモジェネートを、ＧＬＵ酵素活性アッセイおよび組織グリコゲン含量のために作製し、そして種々の器官の薄切片を、リソソームグリコゲン含量の蓄積を（電子顕微鏡を介して）可視化するために作製した。内部移行されたＡＧＬＵの局在をまた、ヒト胎盤成熟α−グルコシダーゼに対するウサギポリクローナル抗体を用いて決定した。

この結果は、０．７ｍｇのＡＧＬＵおよび１．７ｍｇのＡＧＬＵの単回用量（それぞれ実験ＣおよびＡ）が、静脈内に注入した場合、２つのノックアウトマウスの群の種々の器官において、インビボで効率的に取り込まれることを示した。実験Ａはまた、２つの独立したウサギ乳汁供給源から精製したＡＧＬＵの取り込みおよび分布には違いがないことを示した。

ＡＧＬＵ活性における増加は、肝臓、脾臓、心臓、および骨格筋のような器官において見られたが、脳においては見られなかった。２つのＫＯ動物に対する１．７ｍｇのＡＧＬＵの単回注射の２日後に、２つのＰＢＳ注射した正常コントロールマウスまたは２つの異種ＫＯマウスの器官において観察される内因性のα−グルコシダーゼ活性レベルに近いかまたはずっと高いレベルを、観察した（実験Ａ）。試験された器官のうち、肝臓および脾臓は、定量的に、取り込みに関わる主要な器官であるが、心筋および胸筋ならびに大腿筋もまた、有意な量の酵素を取り込む。脳組織における有意な増加の欠如は、ＡＧＬＵが血液脳関門を通過しないことを示唆する。この結果を、表２において要約する。

２匹のＫＯマウスに、６日毎に４回注射（実験Ｂ）し、全細胞グリコーゲンの顕著な減少を、心臓および肝臓の両方において観察した。骨格筋組織における全グリコーゲンに関する効果は、観察されなかった。しかし、一般的に、これらの組織におけるＡＧＬＵの取込みは、試験された他の組織よりもより低かった。

４回注射されたＫＯマウスの透過型電子顕微鏡は、肝細胞および心筋細胞の両方におけるリソソームのグリコーゲンの顕著な減少を示した。心臓のいくつかの領域では、リソソームのグリコーゲンの減少が、これらの短期間の投与の後に観察されなかったので、心臓組織において観察された効果は、局在していた。

ヒト胎盤成熟α−グルコシダーゼに対するウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット分析は、試験された全ての器官の成熟酵素に対して注射されたＡＧＬＵ完全なプロセシングを示した。このことは標的組織への取込み、ならびにリソソームへの局在およびプロセシングを強く示唆している。毒性効果は、３回の実験のいずれおいて観察されなかった。

ＡＧＬＵの免疫組織化学的染色は、ヒトα−グルコシダーゼに対するポリクローナルウサギ抗体を用いた肝実質細胞のリソソームにおいて明白であった。心臓および骨格組織におけるＡＧＬＵの存在は、より低い取込みのために明らかに、この技術を用いた可視化にはより困難である。

（２．ＫＯマウスモデルを用いた長期実験）
長期実験において、酵素を、１週間に１回、２５週までの期間、２または３匹のＫＯマウスの群の尾静脈に注射した。最初の用量は、２ｍｇ／マウス（６８ｍｇ／ｋｇ）、続いて１２週間に渡って０．５ｍｇ／マウス（１７ｍｇ／ｋｇ）であった。マウスの２つの群においては、さらに４週またはさらに１１週のいずれかで、マウス当たり２ｍｇの処置が続いた。注射を、マウスが、６〜７月齢のときに開始した。この齢のとき、ＫＯモデルにおいて明確な組織病理学を行った。最後の酵素投与の２日後に、動物を殺し、そして器官をリン酸緩衝化生理食塩水を用いて灌流した。組織ホモジネートを、ＡＧＬＵ酵素活性アッセイおよび組織グリコーゲン含量のために作製し、そして種々の器官の切片を、リソソームのグリコーゲン蓄積を（光学顕微鏡を介して）可視化するために作製した。

結果は、０．５ｍｇ／マウスで１３週間処理したマウス（群Ａ、３動物／群）が、肝臓および脾臓における活性の上昇ならびに肝臓およびおそらく心臓においてグリコーゲンレベルの減少を有することを示した。１匹の動物は、筋肉における顕著なグリコーゲンの減少がなかったが、筋肉において上昇した活性を示した。

０．５ｍｇ／マウスで１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで４週間処置したマウス（群Ｂ、３動物／群）は、上昇した活性が心臓および骨格筋において測定され、そしてグリコーゲンレベルの減少が脾臓でもまた見られたことを除いて、１３週間のみ処置されたマウスと同様の結果を示した。

０．５ｍｇ／マウスで１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで１１週間処置したマウス（群Ｃ、２動物／群）は、処置したマウスが、肝臓、脾臓、心臓および骨格筋のグリコーゲンレベルにおいて明確な減少を示したことを除いて、他の２群と同様の結果を示した。脳においては、最も高い用量であっても、活性化を検出し得なかった。

各群（群の平均）における処置した動物および処置していない動物の結果を、表３に要約する。

さらに、組織病理学的な症状における非常に確証的な改良を、群Ｃのマウス（０．５ｍｇ／マウスで最初の１４週間、続いて２ｍｇ／マウスで１１週間の処置）で観察した。病理学の明らかな逆転が、種々の組織（例えば、心臓および胸筋）において示された。

残留したリソソームのα−グルコシダーゼ活性が、平均コントロール値（１４）の２０％より大きい場合、ポンペ病は起こらないと報告されている。ＫＯマウスのモデルを用いて得られたデータは、これらのレベルが、組換え前駆体酵素を用いて非常に十分達成可能であることを示す。

（実施例５：ヒト臨床試験）
単一（ｓｉｎｇｌｅ）フェーズＩ研究（ＡＧＬＵ１１０１−０１）を、１５人の健康な男性ボランティアにおいて実施した。ＡＧＬＵの用量は、２５〜８００ｍｇの範囲で、静脈内注入によって健康な男性成人ボランティアに投与した。アレルギーおよび過敏症の病歴を有する被験体は、本研究から除外した。被験体を、５つの用量群に無作為化し、そしてＡＧＬＵを受ける各用量群（４被験体）または各用量レベルのプラセボ（１被験体）に無作為化した。全ての被験体は、２用量の研究薬物を受け、これは、２週間をおいて投与した。用量のレジメンは以下の通りである：
Ａ
２５ｍｇ：群１、処置期間１
Ｂ
５０ｍｇ：群１、処置期間２
Ｃ
１００ｍｇ：群２、処置期間１
Ｄ
２００ｍｇ：群３、処置期間１
Ｅ
４００ｍｇ：群２、処置期間２
Ｆ
８００ｍｇ：群３、処置期間２
Ｐ
プラセボ（１群および処置期間当たり１被験体）。

被験体に、各処置期間の１日目に、注入としてＡＧＬＵまたはプラセボを投与した。注入は、３０分間の時間にわたって投与し、そして被験体を、注入の中止後少なくとも２時間の間、半横臥の位置に保持した。

有害事象を、注入開始の直前、３０分（注入の最後）に、ならびにその後３、１２、２４、３６および４８時間に、その後ならびに５および８日目（第１期間）、ならびに５、８および１５日目（第２期間）に記録した。生命徴候、ＥＣＧおよび身体的な診察もまた、処置期間を通して定期的にモニターした。

血液サンプルを、標準的な範囲の臨床的な実験室試験および薬物動態分析のために採取した。被験体の尿を収集し、そして標準的な範囲の実験室分析を行った（ＡＧＬＵの決定を含む）。

（ａ）実験室安全性および有害事象
任意の用量群の任意の被験体において、実験室パラメーター、臨床的徴候およびＥＣＧ測定の臨床的に有意な変化はなかった。全ての用量の全ての被験体でモニタリングした有害事象の結果を、表４に要約する。

ＩＩ型糖原病を有する乳児患者および若年患者の酵素置換療法としての組換え酸性α−グルコシダーゼの安全性および効果に関する試験を実施した。４人の乳児患者および３人の若年患者を募集した。乳児に、滴定された１５〜２０ｍｇ／ｋｇの開始用量〜４０ｍｇ／ｋｇを投与し、そして若年者には１０ｍｇ／ｋｇを投与する。患者を、２４週間処置する。

患者を以下のパラメーターによって評価した。

・疑わしい有害事象を含む、報告された標準的な有害事象
・血液学、臨床化学および抗体検出を含む実験室パラメーター
・筋におけるα−グルコシダーゼ活性
・筋組織病理学
・１２−リードＥＣＧ（１２−ｌｅａｄ ＥＣＧ）
・神経学的検査を含む臨床状態
・ノンパラメトリックなＰＫパラメーター
・救命（ｌｉｆｅ ｓａｖｉｎｇ）の介入
幼児患者は、以下のさらなるパラメーターについて評価する。

・左後部の心室壁の厚さおよび左心室質量インデックス（ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ）
・神経筋の発達
・生存
・筋内のクリゴーゲン含量
若年患者を、以下のさらなるパラメーターについて評価する。

・肺機能
・筋の強度／回数試験および筋機能
・ＰＥＤＩ／Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ ９−アイテムスケール（ｉｔｅｍ ｓｃａｌｅ）
次に、同じ患者をαグルコシダーゼのさらなる投与に供し、乳児は１５、２０、３０または４０ｍｇ／ｋｇを受け、そして若年者には、２４週間のさらなる期間に対して１０ｍｇ／ｋｇを用いかつ上記に示したパラメーターによって評価した。

さらなるフェーズＩＩ臨床試験を、齢が６ヶ月未満の８人の患者に、診断後の２ヶ月以内の投薬量が４０ｍｇ／ｋｇで実施する。患者を２４週間の間処置し、次の診断基準によって評価する：
安全性パラメーター
実験室安全性データ
記録した有害事象
初期効果パラメーター：正常または穏和な遅延性の運動機能（ｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を組合せた診断後６ヶ月の、救命の介入（すなわち、２４時間より長い機械的人工呼吸器）無しでの生存（ＢＳＩＤ ＩＩ）。

第２次効果：神経筋発達における変化；左後部の心室壁の厚さおよび左心室質量インデックスにおける変化；骨格筋酸性α−グルコシダーゼ活性およびグリコーゲン含量における変化。

効果は、正常遅延または穏和な遅延として分類されたＢＳＩＤ ＩＩと組合せた背景（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）コントロール群における１０％の生存に比較した場合、α−グルコシダーゼ群中へ救命の介入無しに診断後６ヶ月において５０％の生存であることによって示され得る。

さらなる臨床試験を若年患者に実施した。患者は、年齢が１歳より大きくかつ３５歳未満であり、ＩＩｂ型ＧＳＤの若年発症を有する。患者に、２４週間の処置期間の間、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇで投与した。処置は、以下のパラメーターによってモニターした。
安全性パラメーター 実験室安全性データ
記録した有害事象
初期効果 肺機能パラメーター（例えば、ＦＶＣ、人工呼吸器上の時間）
筋強度
第２次効果 救命の介入パラメーター
生活の質
骨格筋酸性α−グルコシダーゼ活性
定量的目標 ベースラインを超えた初期効果パラメーターにおける２０％の相対的改善
効果に関する全ての定量的測定は、好ましくは、同時発生するコントロールまたは背景のコントロールに対して統計学的に顕著であり、好ましくは、ｐが０．０５未満である。

（実施例６ 薬学的処方物）
α−グルコシダーゼを以下のように処方した：５ｍｇ／ｍｌ □−Ｇｌｕ、１５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、２％（ｗ／ｗ）マンニトール、および０．５％（ｗ／ｗ）スクロース。上記の処方物を最終体積１０．５ｍｌに満たして２０ｃｃチュービングバイアルに入れ、そして凍結乾燥した。放出および臨床使用の試験に関しては、注射のために各バイアルを１０．３ｍｌの滅菌生理食塩水（０．９％）を用いて再構築し（ＵＳＰまたは当量）、１０．５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌ □−Ｇｌｕ溶液を生じ、これを、直接投与し得るか、または患者特異的な標的用量濃度に滅菌生理食塩水を用いて引き続いて希釈し得る。１０．５ｍｌ一服（バイアル中に総αグルコシダーゼが５２．５ｍｇ）は、ＵＳＰが推奨する過剰量を含み、これは１０ｍｌ（５０ｍｇ）の抽出および送達（または、移動）を可能にする。マンニトールは、適切なバルキング薬剤として機能を果たし、（スクロース単独と比較して）凍結乾燥サイクルを短くする。スクロースは、クリオ／リオプロテクタント（ｃｒｙｏ／ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）として機能を果たし、再構築後の凝集の有意な上昇を生じない。マンニトール（単独）処方物の再構築は、繰り返して、凝集のわずかな上昇を生じた。凍結乾燥後、ケーキクオリティ（ｃａｋｅ ｑｕａｌｉｔｙ）は、受容可能であり、そして引き続く再構築の回数は、有意に減少した。注入溶液のために、ＨＳＡ／デキストロースのよりも、生理食塩水が好ましい。生理食塩水が、２％マンニトール／０．５％スクロース中での凍結乾燥と組合せて使用される場合、溶液は、静脈投与に関して受容可能な張度を有する。２％マンニトール／０．５％スクロース処方物を含む凍結乾燥されたバイアルを、０．９％の滅菌生理食塩水（注射のための）を用いて再構築し、５ｍｇ／ｍｌ □−Ｇｌｕを生じる。

（実施例７：注入スケジュール）
溶液を、留置の静脈カミューレを介して投与する。患者を、注入期間中、近接にモニターし、そして、有害事象または有害事象と疑われる事象において適切な臨床的介入をとる。４８時間のウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を、各注入に関して可能にする。注入の比率を回数と共に増加させた注入スケジュールによって、有害事象を減少または排除する。

乳児に対する注入を、以下のスケジュールに従って投与し得る：
・６０分間、５ｃｃ／時間
・６０分間、１０ｃｃ／時間
・３０分間、４０ｃｃ／時間 以上
・残りの注入の間、８０ｃｃ／時間 以上。

若年者に対する注入を、以下のスケジュールに従って投与し得る：
・６０分間、０．５ｃｃ／ｋｇ／時間
・６０分間、１ｃｃ／ｋｇ／時間
・３０分間、５ｃｃ／ｋｇ／時間
・残りの注入の間、７．５ｃｃ／ｋｇ／時間。

前述の発明は、明確さおよび理解の目的のために、いくぶん詳細に記載してきたが、形式および詳細における種々の変化が、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得るということは、この開示を読むことより当業者には明らかである。本出願に引用される全ての刊行物および特許文書は、あたかも各個々の刊行物または特許文書がそのように個々に示される程度まで、全ての目的に関してその全体が参考として援用される。

Claims (1)

1. 治療的に有効な量のヒト酸性αグルコシダーゼ