JP2012224643A - ポンペ病の処置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】上記課題は、ヒト酸性αグルコシダーゼを用いたポンペ病の処置の方法を提供することにより解決された。好ましい処置養生法は、患者に1週間当たり10mg/kg体重より多く投与する工程を含む。投与は、好ましくは静脈内投与である。この方法は、乳児性、若年性または成人性ポンペ病を有する患者の処置のために用いられ得る。ヒト酸性αグルコシダーゼは、好ましくは、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁において得られ、そして好ましくは、主に110kDの形態である。
【選択図】なし
Description
本出願は、1998年12月7日に出願された、USSN60/111291からの優先権に由来し、これは、すべての目的のために、その全体において参考として援用されている。本出願は、1996年7月29日に出願された、USSN08/700,760に関連し、これは、1995年8月2日に出願された、USSN60/001,796からの優先権に由来し、これらの両方は、すべての目的のために、それらの全体において参考として援用されている。
本発明は、組換え遺伝学分野および医学分野に属し、そしてポンペ病を有する患者の酵素置換治療に関する。
他の分泌タンパク質と同様に、リソソームタンパク質は、小胞体において合成され、そしてゴルジ装置へ輸送される。しかし、たいていの他の分泌タンパク質と異なり、リソソームタンパク質は、細胞外液へではなく、細胞内小器官へ分泌することになっている。ゴルジ装置の内部において、リソソームタンパク質は特別なプロセシングを受けて、それらの細胞内の行き先に到達するために必要なものを備える。ほとんどすべてのリソソームタンパク質が、末端のマンノース基の6’位を介したグリコシル化およびリン酸化を含む、種々の翻訳後修飾を受ける。リン酸化されたマンノース残基が、トランスゴルジ網の内部の表面上で、特異的なレセプターによって認識される。リソソームタンパク質は、これらのレセプターを介して結合し、そしてそれによって、他の分泌タンパク質から分離される。その後、レセプターに結合したタンパク質を含む小さな輸送小胞が、トランスゴルジ網からつみ取られ、そしてそれらの細胞内の行き先へと標的化される。一般に、非特許文献1を参照のこと。
1つの局面において、本発明は、ポンペ病を有する患者を処置する方法を提供する。このような方法は、治療的に有効な量のヒト酸性αグルコシダーゼを、患者に投与する工程を必然的に伴う。投薬量は、好ましくは、1週間当たり少なくとも10mg/kg体重である。いくつかの方法において、投薬量は、1週間当たり少なくとも60mg/kg体重であるか、または1週間当たり少なくとも120mg/kg体重である。いくつかの方法において、このような投薬量は、1週間当たり1回投与され、そして他の方法においては、1週間当たり3回投与される。いくつかの方法において、処置は少なくとも24週間続けられる。投与は、好ましくは静脈内投与である。ヒト酸性αグルコシダーゼは、好ましくは、非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳汁において得られ、そして好ましくは、主に110kDの形態である。
(項目1) ポンペ病を有する患者を処置する方法であって、該方法が、治療的に有効な量のヒト酸性αグルコシダーゼを該患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目2) 前記患者に、1週間当たり少なくとも10mg/kg体重で投与される、項目1に記載の方法。
(項目3) 前記患者に、1週間当たり少なくとも60mg/kg体重で投与される、項目1に記載の方法。
(項目4) 前記患者に、1週間当たり少なくとも120mg/kg体重で投与される、項目1に記載の方法。
(項目5) 前記患者に、1週間当たり単一投薬量のα−グルコシダーゼが投与される、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
(項目6) 前記患者に、1週間当たり3投薬量のα−グルコシダーゼが投与される、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
(項目7) 前記量が、少なくとも24週の期間にわたって1週間当たりで投与される、項目1〜4のいずれかに記載の方法。
(項目8) 前記α−グルコシダーゼが、静脈内に投与される、項目1に記載の方法。
(項目9) 前記α−グルコシダーゼが、トランスジェニック哺乳動物の乳汁中に産生された、項目1に記載の方法。
(項目10) 前記患者が、乳児性ポンペ病を有する、項目1に記載の方法。
(項目11) 前記患者が、少なくとも1歳になるまで生存する、項目10に記載の方法。
(項目12) 前記患者が、若年性ポンペ病を有する、項目1に記載の方法。
(項目13) 前記患者が、成人性ポンペ病を有する、項目1に記載の方法。
(項目14) 前記α−グルコシダーゼが、主に110kD型である、項目1に記載の方法。
(項目15) 前記患者におけるヒト酸性αグルコシダーゼのレベルをモニタリングする工程をさらに包含する、項目1に記載の方法。
(項目16) 前記患者においてα−グルコシダーゼの前記レベルが閾値未満に低下した場合に、第2投薬量のヒト酸性αグルコシダーゼを投与する工程をさらに包含する、項目15に記載の方法。
(項目17) 前記ヒトαグルコシダーゼが静脈内に投与され、そして投与期間の間に投与速度が上昇する、項目1に記載の方法。
(項目18) 前記投与速度が、前記投与期間の間に少なくとも10倍上昇する、項目17に記載の方法。
(項目19) 前記投与速度が、5時間の間に少なくとも10倍上昇する、項目17に記載の方法。
(項目20) 前記患者に、一連の少なくとも4投薬量が投与され、各投薬量は前回の投薬量よりも高い強度である、項目17に記載の方法。
(項目21) 前記投薬量が、0.03〜3mg/kg/時間の第1投薬量、0.3〜12mg/kg/時間の第2投薬量、1〜30mg/kg/時間の第3投薬量および2〜60mg/kg/時間の第4投薬量である、項目20に記載の方法。
(項目22) 前記投薬量が、0.1〜1mg/kg/時間の第1投薬量、1〜4mg/kg/時間の第2投薬量、3〜10mg/kg/時間の第3投薬量および6〜20mg/kg/時間の第4投薬量である、項目21に記載の方法。
(項目23) 前記投薬量が、0.25〜4mg/kg/時間の第1投薬量、0.9〜1.4mg/kg/時間の第2投薬量、3.6〜5.7mg/kg/時間の第3投薬量および7.2〜11.3mg/kg/時間の第4投薬量である、項目22に記載の方法。
(項目24) 前記投薬量が、0.3mg/kg/時間の第1投薬量、1mg/kg/時間の第2投薬量、4mg/kg/時間の第3投薬量および12mg/kg/時間の第4投薬量である、項目23に記載の方法。
(項目25) 前記第1投薬量、前記第2投薬量、前記第3投薬量および前記第4投薬量が、15分間〜8時間の時間にわたって、各々投与される、項目20〜24のいずれかに記載の方法。
(項目26) 前記第1投薬量、前記第2投薬量、前記第3投薬量および前記第4投薬量が、それぞれ、1時間、1時間、0.5時間および3時間の時間にわたって投与される、項目20〜24のいずれかに記載の方法。
(項目27) 滅菌形態の、生理学的に受容可能な緩衝液中にヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清アルブミン、および糖を含む、薬学的組成物。
(項目28) リン酸ナトリウム緩衝液中にヒト酸性αグルコシダーゼ、ヒト血清アルブミン、およびグルコースを含む、項目27に記載の薬学的組成物。
(項目29) 水溶液中にαグルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロースを含む、薬学的組成物。
(項目30) 前記糖が、マンニトールおよびスクロースを含み、そしてマンニトールの濃度が前記水溶液の1〜3% w/wであり、そしてスクロースの濃度が前記水溶液の0.1〜1% w/wである、項目27に記載の薬学的組成物。
(項目31) マンニトールの濃度が2% w/wであり、そしてスクロースの濃度が0.5% w/wである、項目27に記載の薬学的組成物。
(項目32) 水溶液中にヒト酸性グルコシダーゼ、マンニトールおよびスクロースを含む薬学的組成物を凍結乾燥することによって産生される、凍結乾燥された組成物。
(項目33) 薬学的組成物であって、該組成物が、ヒト酸性α−グルコシダーゼ、マンニトール、スクロースおよび水溶液を含む第1組成物を凍結乾燥して第2組成物を産生する工程;ならびに、生理食塩水中で該凍結乾燥された組成物を再構成して第3組成物を産生する工程によって調製される、薬学的組成物。
(項目34) 前記ヒト酸性α−グルコシダーゼが、前記第1組成物および前記第3組成物の両方において5mg/mlであり、前記マンニトールが、前記第1組成物において2mg/mlであり、前記スクロースが、前記第1組成物において0.5mg/mlであり、そして前記再構成工程において使用される前記生理食塩水が、0.9% w/wである、項目33に記載の薬学的組成物。
用語「実質的な同一性」または「実質的な相同性」とは、デフォルトのギャップウエイトを用いて、例えばプログラムGAPまたはBESTFITによって、最適に整列される場合に、2つのペプチド配列が、少なくとも65パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも80または90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセントの配列同一性またはそれより高い配列同一性(例えば、99パーセントの配列同一性)を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
本発明は、リソソームタンパク質を、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳汁へ分泌する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。分泌は、リソソームタンパク質をコードする導入遺伝子、および乳腺に対してこの遺伝子の発現を標的化し得る調節配列の組み込みによって達成される。この導入遺伝子が発現され、そして、発現産物が乳腺中で翻訳後修飾され、次いで乳汁へ分泌される。翻訳後修飾は、グリコシル化およびリン酸化をして、マンノース−6リン酸を含むリソソームタンパク質を産生する工程を含み得る。
本発明は、リソソーム酵素および以下を含む他の型のリソソームタンパク質をコードする30を超える公知の遺伝子のいずれかを含むDNAセグメントを発現する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する:α−グルコシダーゼ、α−L−イズロニダーゼ、イズロネート(iduronate)−硫酸スルファターゼ、ヘキソサミニダーゼ(hexosaminidase)AおよびヘキソサミニダーゼB、ガングリオシドアクチベータータンパク質、アリールスルファターゼAおよびアリールスルファターゼB、イズロネートスルファターゼ、ヘパランN−スルファターゼ、ガラクト−セラミダーゼ、α−ガラクトシルセラミダーゼA、スフィンゴミエリナーゼ、α−フコシダーゼ、α−マンノシダーゼ、アスパルチルグリコサミンアミド加水分解酵素、酸性リパーゼ、N−アセチル−α−D−グルコサミン−6−スルフェートスルファターゼ、α−ガラクトシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、セラミダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、および保護性タンパク質などを含む。公知のリソソームタンパク質の遺伝子配列のいずれかの対立遺伝子改変体、同族改変体および誘導された改変体を発現するトランスジェニック哺乳動物もまた、含まれる。このような改変体は、通常、アミノ酸レベルで、公知のリソソームタンパク質の遺伝子と、実質的な配列同一性を示す。このような改変体は、通常、ストリンジェントな条件下で、公知の遺伝子とハイブリダイズするか、または公知の遺伝子の1つによってコードされたポリペプチドに対する抗体と交差反応する。
組換えリソソームタンパク質は、好ましくは、天然に存在するリソソームタンパク質と同じかまたは類似の構造を有するようにプロセシングされる。リソソームタンパク質とは、小胞体(RER)に結合した、リボソーム上で合成される糖タンパク質である。リソソームタンパク質は、N末端シグナルペプチドにより導かれて、この細胞小器官に翻訳と同時に入る(Ngら、Current Opinion in Cell Biology
6,510−516(1994))。N結合型グリコシル化プロセスは、RERにおいてドリコールキャリアからの高マンノース型オリゴ糖の前駆体であるGlc3Man9GlcNAc2の一塊としての移動と共に開始する。糖鎖の修飾は、RERにおいて開始し、そしてグリコシダーゼIおよびグリコシダーゼIIによる、一番外側から3つのグルコース残基の除去を伴ってゴルジ装置において継続する。リン酸化とは、最初に、N−アセチル−グルコ−サミン−1−リン酸がリソソームタンパク質特異的トランスフェラーゼにより、選択されたマンノース基へと結合する工程、そして2番目に、N−アセチル−グルコ−サミンがジエステラーゼにより切断される工程(Goldbergら、Lysosomes:Their Role in Protein Breakdown(Academic Press Inc.,London,1987)163−191頁)の2工程の手順である。切断は、認識マーカーとして、そして大部分のリソソームタンパク質の、リソソームへのマンノース6−リン酸レセプター触媒輸送におけるリガンドとして、マンノース6−リン酸を露出させる。(Kornfeld,Biochem.Soc.Trans.18,367−374(1992))。
組換えリソソームタンパク質の発現を、導入遺伝子を保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳腺へと標的化するために、導入遺伝子が設計される。基本的なアプローチには、タンパク質をコードする外因性のDNAセグメントを、グナル配列、プロモーターおよびエンハンサーに作動可能に連結することが必要である。そのDNAセグメントは、ゲノム、ミニ遺伝子(1つ以上のイントロンが除外されたゲノム)、cDNA、YACフラグメント、2つの異なるリソソームタンパク質遺伝子のキメラ、またはこれらの任意のハイブリッドであり得る。ゲノム配列を含むことは、一般的に、より高レベルの発現を導く。非常に高レベルの発現は、乳腺が、リソソームタンパク質の翻訳後修飾および分泌を行う能力に負荷をかけ過ぎ得る。しかし、以下に示すデータは、mg/mlの範囲における高い発現レベルにもかかわらず、マンノース6−リン酸基の形成を含む、実質的な翻訳後修飾が生じることを示す。実質的な修飾とは、少なくとも約10、25、50、75または90%の分泌分子が、少なくとも1つのマンノース6−リン酸基を保有することを意味する。従って、ゲノム構築物またはハイブリッドcDNA−ゲノム構築物は、一般的に好ましい。
)(ヒトα−ラクトアルブミン);Stewart,Nucleic Acids Res.12,389(1984)(ウシαs1およびκカゼインのcDNAs);Gorodetskyら、Gene 66,87−96(1988)(ウシβカゼイン);Alexanderら、Eur.J.Biochem.178,395−401(1988)(ウシκカゼイン);Brignonら、FEBS Lett.188,48−55(1977)(ウシαS2カゼイン);Jamiesonら、Gene 61,85−90(1987),Ivanovら、Biol.Chem.Hoppe−Seyler 369,425−429(1988),Alexanderら、Nucleic Acids Res.17,6739(1989)(ウシβラクトグロブリン);Vilotteら、Biochimie 69,609−620(1987)(ウシα−ラクトアルブミン)を参照のこと(全ての目的のために、その全体において参考として援用される)。種々の乳タンパク質遺伝子の構造および機能は、MercierおよびVilotte,J.Dairy Sci.76,3079−3098(1993)(全ての目的のために、その全体において参考として援用される)に概説される。さらなる配列データが必要とされ得る範囲まで、すでに得られた領域に隣接する配列は、既存の配列をプローブとして使用して、容易にクローン化され得る。異なる生物由来の乳腺特異的調節配列は、同様に、公知の同族のヌクレオチド配列、または同族タンパク質に対する抗体をプローブとして使用して、そのような生物由来のライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
上記の導入遺伝子は、非ヒト哺乳動物中に導入される。ほとんどの非ヒト哺乳動物(げっし類(例えば、マウスおよびラット)ウサギ、ヒツジ類(例えば、ヒツジおよびヤギ)、ブタ類(例えば、ブタ)、ならびにウシ類(ウシおよびバッファロー)を含む)は適している。ウシ類は、大きな収量の乳汁という利点を提供し、一方、マウスは、トランスジェネシス(transgenesis)および育種の容易さという利点を提供する。ウサギは、これらの利点の折衷物を提供する。ウサギは、約14%のタンパク質含量を有する乳を、1日に100ml生産し得(Buhlerら、Bio/Technology 8,140(1990)(全ての目的のために、その全体において参考として援用される)を参照のこと)、そしてなお、マウスの場合と同じ原理および類似の設備を使用して操作され得、そして育種され得る。非胎生哺乳動物(例えば、ハリモグラまたはカモノハシ)は、代表的には使用されない。
Embryo:A Laboratory Manual,C.S.H.L.N.Y.(1986)(マウス胚);およびHammerら、Nature 315,680(1985)(ウサギ胚およびブタ胚);Gandolfiら、J.Reprod.Fert.81,23−28(1987);Rexroadら、J.Anim.Sci.66,947−953(1988)(ヒツジ胚)ならびにEyestoneら、J.Reprod.Fert.85,715−720(1989);Camousら、J.Reprod.Fert.72,779−785(1984);ならびにHeymanら、Theriogenology
27,5968(1987)(ウシ胚)(全ての目的のために、その全体において参考として援用される)により記載される。ときどき、着床前胚は、着床までの間、凍結して保存される。着床前胚は、偽妊娠雌の卵管に移され、導入遺伝子を組込んだ、発生段階に依存して、トランスジェニック動物またはキメラ動物が誕生する。キメラ哺乳動物を交配して、真の生殖系列トランスジェニック動物を形成し得る。
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、上記のように、それらのゲノム中の少なくとも1つの導入遺伝子を取り込む。導入遺伝子は、リソソームタンパク質をコードするDNAセグメントの発現を少なくとも主に乳腺に対して標的化する。驚くことに、その乳腺は、オリゴ糖の添加およびリン酸化の工程を含む、真正翻訳後プロセシングに必要とされるタンパク質を発現し得る。乳腺における酵素によるプロセシングは、マンノース基の6’位のリン酸化を生じる。
トランスジェニック成体雌哺乳動物は、高濃度の外因性リソソームタンパク質を含む乳を産生する。所望であるなら、そのタンパク質は、識別する物理的特性および化学的特性、ならびに標準的な精製手順(例えば、沈澱、イオン交換、分子排除またはアフィニティークロマトグラフィー)によって乳汁から精製され得る(一般的に、Scopes,Protein Purification(Springer−Verlag,N.Y.,1982)を参照のこと)。
end)な濾過(すなわち、フィルターの大きさを連続して小さくして使用することによるデッドエンドな濾過)または直交流濾過によるカゼインの除去、あるいは直交流濾過によるカゼインの直接的な除去によって実施され得る。ヒト酸性α−グルコシダーゼは、クロマトグラフィー(例えば、Q Sepharose FF(または他の陰イオン交換マトリックスを含む)、疎水的相互作用クロマトグラフィー(HIC)、金属キレートセファロースあるいはセファロースに結合したレクチン(または他のマトリックス))によって精製される。
HPカラムから溶出された)を溶出することにより、室温にて行われた。ヒト酸性α−グルコシダーゼをさらに精製するための代替的方法およびさらなる方法は、当業者には明らかである。例えば、英国特許出願998 07464.4(全ての目的のためにその全体が参考として援用される)を参照のこと。
本発明により産生される組換えリソソームタンパク質は、酵素置換治療手順において用途を見出す。機能的リソソーム酵素の不全を生じる、遺伝的または他の欠損を有する患者は、この患者に外来性の酵素を投与することにより処置され得る。このような処置の必要な患者は、症状(例えば、小人症、角膜混濁、肝脾腫大症、弁病変、冠状動脈病変、骨格変形、関節硬直および進行性精神遅滞を含むフルラー症候群の症状)から同定され得る。あるいは、またはさらに、患者は、特定のリソソーム酵素によりプロセスされる特徴的な代謝物の過剰な蓄積を明らかにするため、組織サンプルの生化学的分析から診断され得るか、あるいは特定のなリソソーム酵素活性の欠損を明らかにするための、人工の基質または天然の基質を使用する酵素アッセイによって診断され得る。ほとんどの疾患について、診断は、症状の発症または代謝物の過剰な蓄積の前に、特定の酵素の欠損を測定することにより、またはDNA分析によりなされ得る(Scriverら、前出、lysosomal storage disordersの章)。リソソーム貯蓄症の全ては、遺伝性である。従って、リソソーム疾患に罹患したメンバーを有することが既知である家系由来の子孫において、最終診断がなされ得る前でも、予防的処置を開始することは、時として有利である。
いくつかの方法において、リソソーム酵素は、薬学的成物として薬学的キャリアと共に、精製された形態で投与される。この好ましい形態は、投与および治療的適用の意図される様式に依存する。この薬学的キャリアは、患者にポリペプチドを送達するために適切な任意の適合性の非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性固体が、キャリアとして使用され得る。薬学的に受容可能なアジュバント、緩衝化剤、分散剤などもまた、この薬学的組成物中へ組み込まれ得る。
white ink)などである。同様の希釈剤が、圧縮剤を作製するために使用され得る。錠剤およびカプセルの両方は、徐放生成物として製造されて、数時間にわたり薬物の持続的な放出を提供し得る。圧縮剤は、いかなる不快な味をも遮断するため、および大気からこの錠剤を保護するために、糖コーティングもしくはフィルムコーティングされ得るか、または胃腸管中での選択的な分解のために腸溶性コーティングされ得る。経口投与のための液体投薬形態は、患者の受け入れを増加するために、着色剤および香味料を含み得る。
本発明は、ポンペ病を処置する有効な方法を提供する。これらの方法は、触媒的に活性である形態での、および処置されている患者の組織、特に肝臓、心臓および筋肉(例えば、平滑筋、横紋筋および心筋)により取り込まれ得る形態での大量のヒト酸性α−グルコシダーゼの利用可能性を、一部前提とする。このようなヒト酸性α−グルコシダーゼは、例えば、実施例に記載されるトランスジェニック動物から提供される。α−グルコシダーゼは、好ましくは、主に(すなわち、>50%)約100kD〜110kDの前駆体形態である。(100kD〜110kDの前駆体の見かけの分子量または相対的移動性は、使用される分析の方法に依存して幾分変化し得るが、典型的には、95kDと120kDの範囲内である。)実施例において議論されるトランスジェニック動物中のヒト酸性α−グルコシダーゼでの首尾よい結果を考慮すると、細胞発現系から生じるようなヒトα−グルコシダーゼの他の供給源もまた使用され得ることが可能である。例えば、ヒト酸性α−グルコシダーゼを生成する代替的方法は、適切なプロモーターに作動可能に連結された、cDNAまたはゲノム構築物として、安定な真核生物細胞株(例えば、CHO)中に、酸性α−グルコシダーゼ遺伝子をトランスフェクトすることである。しかし、このようなアプローチによる臨床的な治療のために必要とされる、大量のヒト酸性α−グルコシダーゼを生成することは、より困難である。
トランスジェニック動物の乳汁中のリソソームタンパク質産物は、多くの他の用途を有する。例えば、他のα−アミラーゼと共通してα−グルコシダーゼは、デンプン、ビールおよび医薬品の生産において重要なツールである。VihinenおよびMantsala,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.24,329−401(1989)(全ての目的のためにその全体が参考として援用される)を参照のこと。リソソームタンパク質はまた、実験化学薬品または加工食品を生産するために有用である。例えば、酸性α−グルコシダーゼは、1,4α−糖質結合(glucidic bond)および1,6α−糖質結合を分解し、そして、マルトース、イソマルトース、デンプンおよびグリコーゲンのような、それらの結合を含む種々の炭水化物の分解に使用されて、グルコースを産生し得る。酸性α−グルコシダーゼはまた、腸マルターゼ不全または腸イソマルターゼ不全の患者に対する投与のために有用である。さもなくば消化されないマルトースの存在から生じる症状は、回避される。そのような適用において、この酵素は、乳汁からの事前の画分化なしで、そのような乳汁から誘導される加工食品(例えば、アイスクリームまたはチーズ)として、または薬学的組成物として投与され得る。精製された組換えリソソーム酵素はまた、組織サンプル中のこのような酵素の未知量のアッセイのための診断キットにおけるコントロールとして含まれるために有用である。
(実施例1:導入遺伝子の構築)
((a)cDNA構築物)
ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードするcDNAを含む発現ベクターの構築は、プラスミドp16,8hlf3(DeBoerら(1991)および(1993)、前出を参照のこと)を用いて開始した。このプラスミドは、ウシαS1−カゼイン調節配列を含む。この親プラスミドのラクトフェリンcDNA挿入物を、図1において示されるような発現カセットのClaI部位およびSalI部位において、ヒト酸性α−グルコシダーゼcDNA(Hoefslootら、EMBO J.7,1697〜1704(1988))と交換した。α−グルコシダーゼcDNAフラグメントの末端にこれらの適合可能な制限部位を得るために、ヒトα−グルコシダーゼをコードする完全なcDNAを含むプラスミドpSHAG2(同上)を、EcoRIおよびSphIを用いて消化して、そしてこの3.3kb cDNAフラグメントを、ベクターのヌクレオチド配列内の破壊されたClaI部位および新しく設計されたポリリンカー(HindIII ClaI EcoRI SphI XhoI EcoRI SfiI SfiI/SmaI NotI EcoRI*(*=破壊された部位))を有する、pKUN7ΔC(pKUNI誘導体)(Koningsら、Gene 46、269〜276(1986))中でサブクローン化した。生じたプラスミドpαgluCESXから、この3.3−kb cDNAフラグメントを、ClaIおよびXhoIにより切り出し得た。このフラグメントを、ClaI部位およびXhoI−適合可能なSalI部位で、図1において示される発現カセットに挿入した。結果として、発現プラスミドp16,8αgluは、図1において示されるようなウシαS1−カゼイン配列に隣接される、ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードするcDNA配列からなる。完全な発現カセットを含むこの27.3−kbフラグメントを、NotIを用いた切断により、切り出し得る(図1を参照のこと)。
構築物c8αgluex1は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子(Hoefslootら、Biochem,J.272,493〜497(1990))(その転写開始部位のちょうど下流のエキソン1において始まる)を含む(図2、パネルAを参照のこと)。従って、この構築物は、ヒト酸性αグルコシダーゼ遺伝子のほとんど完全な5’UTRをコードする。このフラグメントを、ウシαS1−カゼイン遺伝子のプロモーター配列に融合した。このαS1−カゼイン開始部位は、αS1−カゼイン/酸性α−グルコシダーゼ接合部の22bp上流に存在する。この構築物は、ヒト酸性α−グルコシダーゼポリアデニル化シグナル配列および3’隣接配列を有する。構築物c8αgluex2は、ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子のエキソン2における転写開始部位に即座に融合されるウシαS1カゼインプロモーターを含む(図2、パネルBを参照のこと)。従って、αS1−カゼイン転写開始部位およびα−グルコシダーゼ転写開始部位は、この構築物において22bp離れている。従って、α−グルコシダーゼ5’UTRを保存しない。この構築物はまた、図2、パネルBにおいて示されるようなヒト酸性α−グルコシダーゼポリアデニル化シグナル配列および3’隣接配列を含む。
ヒト酸性α−グルコシダーゼ遺伝子を含む3つの連続したBglIIフラグメントを、Hoefslootら(前出)によって単離した。これらのフラグメントを、カスタマイズされたポリリンカー(HindIII ClaI StuI
SstI BglII PvnI NcoI EcoRI SphI XhoI EcoRI* SmaI/SfiI NotI EcoRI*(*=破壊された部位))を有す
るpKUN8ΔC(pKUN7ΔC誘導体)のBglII部位中に連結した。この連結は、プラスミドp7.3αgluBES、p7.3αgluBSE、p8.5αgluBSE、p8.5αgluBES、p10αagluBSEおよびp10αgluBESを生成する、これらの2つの方向のフラグメントを生じた。
αグルコシダーゼ遺伝子の最初のエキソンにおけるSstI部位を、ウシαS1−カゼイン配列との融合のために選択したことから、p8.5αgluBSEを、BglIIを用いて消化し、その後、SstIを用いて部分消化した。エキソン1〜3を含むフラグメントを単離し、そしてpKUN8ΔCのBglII部位およびSstI部位に連結した。この生じたプラスミドを、以下のように命名した:p5’αgluex1(図3、パネルAを参照のこと)。
他の2つの発現プラスミドの構築(図2、パネルBおよびパネルC)は、c8αgluex1の構築と類似のストラテジーに従った。このプラスミドp5’αgluStuIを、p8,5αgluBSEから、StuIを用いたこのプラスミドの消化、それに続く、エキソン2〜3およびこのベクター配列を含む、単離されたフラグメントの自己連結により誘導した。プラスミドp5’αgluStuIを、PglIIを用いて消化し、それに続いて、NcoIを用いてこの線状フラグメントを部分消化して、いくつかのフラグメントを生じた。エキソン2および3を含む2.4kbフラグメントを単離し、そしてベクターpKUN12ΔCのNcoI部位およびBglIIに連結し、p5’αgluex2を生じた。pKUN12ΔCが、ポリリンカー(ClaI NcoI BglII HindIII EcoRI SphI XhoI SmaI/SfiI NotI)を含むpKUN8ΔCの誘導体であることに留意すること。
cDNA構築物およびゲノム構築物を、NotIを用いて線状化して、そして受精マウス卵母細胞の前核に注入し、次いで、この卵母細胞を、偽妊娠マウスの養母の子宮の中に移植した。この子孫を、クリップテイル(clipped tail)から単離されたDNAのサザンブロットによって、ヒトα−グルコシダーゼcDNA遺伝子構築物またはゲノムDNA遺伝子構築物の挿入について分析した。トランスジェニックマウスを選択し、そして育種した。
トランスジェニックマウスおよび非トランスジェニックコントロールからの乳汁をウェスタンブロットによって分析した。このプローブは、ヒト酸性α−グルコシダーゼに対して特異的な(すなわち、マウス酵素には結合しない)マウス抗体であった。導入遺伝子1672および1673は、乳汁中にヒト酸性αグルコシダーゼの発現を示した(図4)。100〜110kDおよび76kDにおける大きいバンドおよび小さいバンドが、α−グルコシダーゼについて予測されるものとして観察された。非トランスジェニックマウス由来の乳汁中に、バンドは観察されなかった。
Aセファロースの1:1懸濁液を加え、そしてその乳汁を穏やかな振とうで、一晩、4度に置いた。次いで、Con Aセファロースビーズを、遠心分離によって収集し、そしてCon A緩衝液を用いて5回、100mMの代わりに1M
NaClを含むCon A緩衝液を用いて3回、100mMの代わりに0.5M NaClを含むCon A緩衝液を用いて1回洗浄し、そして次いで、0.5M NaClおよび0.1Mメチル−α−D−マンノピラノシドを含むCon
A緩衝液を用いてバッチ形式で抽出した。抽出されたサンプル中の酸性α−グルコシダーゼ活性を、人工の4−メチル−ウンベリフェリル−α−D−グルコピラノシド基質を用いて測定した(上記を参照のこと)。酸性α−グルコシダーゼ活性を含む画分をプールし、濃縮し、20mMの酢酸Na、pH4.5および25mM NaClからなるSephadex緩衝液に対して透析し、そしてSephadexTM200カラムにアプライした。このカラムに、同じ緩衝液を流し(run)、そして画分を酸性α−グルコシダーゼ活性およびタンパク質含量についてアッセイした。酸性α−グルコシダーゼ活性に富み、そして実質的に他のタンパク質を含まない画分を、プールし、そして濃縮した。記載されるような方法は、Reuserら、Exp.Cell Res.155:178〜179(1984)によって公開された方法と基本的に同じである。この方法のいくつかの改変は、緩衝液系の正確な組成およびpH、ならびに精製工程の数およびカラム材料における選択に関して可能である。
Ploegら、Ped.Res.24:90−94(1988))。
最近、ポンペ病についてのノックアウトマウスモデルが、利用可能になった(25)。このモデルは、マウスα−グルコシダーゼ遺伝子の標的化された破壊によって産生された。グリコゲン含有リソソームが、肝臓、心臓および骨格筋において、誕生後すぐに検出された。明白な臨床症状は、比較的遅い年齢(>9ヶ月)でのみ明らかになるが、心臓は代表的に拡大し、そして心電図は異常である。
6日間隔で、単回または複数回の注射を、尾静脈を介してKOマウスに投与した。最後の酵素の投与の2日後に、その動物を殺し、そして器官をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を用いて灌流した。組織ホモジェネートを、GLU酵素活性アッセイおよび組織グリコゲン含量のために作製し、そして種々の器官の薄切片を、リソソームグリコゲン含量の蓄積を(電子顕微鏡を介して)可視化するために作製した。内部移行されたAGLUの局在をまた、ヒト胎盤成熟α−グルコシダーゼに対するウサギポリクローナル抗体を用いて決定した。
長期実験において、酵素を、1週間に1回、25週までの期間、2または3匹のKOマウスの群の尾静脈に注射した。最初の用量は、2mg/マウス(68mg/kg)、続いて12週間に渡って0.5mg/マウス(17mg/kg)であった。マウスの2つの群においては、さらに4週またはさらに11週のいずれかで、マウス当たり2mgの処置が続いた。注射を、マウスが、6〜7月齢のときに開始した。この齢のとき、KOモデルにおいて明確な組織病理学を行った。最後の酵素投与の2日後に、動物を殺し、そして器官をリン酸緩衝化生理食塩水を用いて灌流した。組織ホモジネートを、AGLU酵素活性アッセイおよび組織グリコーゲン含量のために作製し、そして種々の器官の切片を、リソソームのグリコーゲン蓄積を(光学顕微鏡を介して)可視化するために作製した。
単一(single)フェーズI研究(AGLU1101−01)を、15人の健康な男性ボランティアにおいて実施した。AGLUの用量は、25〜800mgの範囲で、静脈内注入によって健康な男性成人ボランティアに投与した。アレルギーおよび過敏症の病歴を有する被験体は、本研究から除外した。被験体を、5つの用量群に無作為化し、そしてAGLUを受ける各用量群(4被験体)または各用量レベルのプラセボ(1被験体)に無作為化した。全ての被験体は、2用量の研究薬物を受け、これは、2週間をおいて投与した。用量のレジメンは以下の通りである:
A
25mg:群1、処置期間1
B
50mg:群1、処置期間2
C
100mg:群2、処置期間1
D
200mg:群3、処置期間1
E
400mg:群2、処置期間2
F
800mg:群3、処置期間2
P
プラセボ(1群および処置期間当たり1被験体)。
任意の用量群の任意の被験体において、実験室パラメーター、臨床的徴候およびECG測定の臨床的に有意な変化はなかった。全ての用量の全ての被験体でモニタリングした有害事象の結果を、表4に要約する。
・血液学、臨床化学および抗体検出を含む実験室パラメーター
・筋におけるα−グルコシダーゼ活性
・筋組織病理学
・12−リードECG(12−lead ECG)
・神経学的検査を含む臨床状態
・ノンパラメトリックなPKパラメーター
・救命(life saving)の介入
幼児患者は、以下のさらなるパラメーターについて評価する。
・神経筋の発達
・生存
・筋内のクリゴーゲン含量
若年患者を、以下のさらなるパラメーターについて評価する。
・筋の強度/回数試験および筋機能
・PEDI/Rotterdam 9−アイテムスケール(item scale)
次に、同じ患者をαグルコシダーゼのさらなる投与に供し、乳児は15、20、30または40mg/kgを受け、そして若年者には、24週間のさらなる期間に対して10mg/kgを用いかつ上記に示したパラメーターによって評価した。
安全性パラメーター
実験室安全性データ
記録した有害事象
初期効果パラメーター:正常または穏和な遅延性の運動機能(motor function)を組合せた診断後6ヶ月の、救命の介入(すなわち、24時間より長い機械的人工呼吸器)無しでの生存(BSID II)。
安全性パラメーター 実験室安全性データ
記録した有害事象
初期効果 肺機能パラメーター(例えば、FVC、人工呼吸器上の時間)
筋強度
第2次効果 救命の介入パラメーター
生活の質
骨格筋酸性α−グルコシダーゼ活性
定量的目標 ベースラインを超えた初期効果パラメーターにおける20%の相対的改善
効果に関する全ての定量的測定は、好ましくは、同時発生するコントロールまたは背景のコントロールに対して統計学的に顕著であり、好ましくは、pが0.05未満である。
α−グルコシダーゼを以下のように処方した:5mg/ml □−Glu、15mM リン酸ナトリウム、pH6.5、2%(w/w)マンニトール、および0.5%(w/w)スクロース。上記の処方物を最終体積10.5mlに満たして20ccチュービングバイアルに入れ、そして凍結乾燥した。放出および臨床使用の試験に関しては、注射のために各バイアルを10.3mlの滅菌生理食塩水(0.9%)を用いて再構築し(USPまたは当量)、10.5mlの5mg/ml □−Glu溶液を生じ、これを、直接投与し得るか、または患者特異的な標的用量濃度に滅菌生理食塩水を用いて引き続いて希釈し得る。10.5ml一服(バイアル中に総αグルコシダーゼが52.5mg)は、USPが推奨する過剰量を含み、これは10ml(50mg)の抽出および送達(または、移動)を可能にする。マンニトールは、適切なバルキング薬剤として機能を果たし、(スクロース単独と比較して)凍結乾燥サイクルを短くする。スクロースは、クリオ/リオプロテクタント(cryo/lyoprotectant)として機能を果たし、再構築後の凝集の有意な上昇を生じない。マンニトール(単独)処方物の再構築は、繰り返して、凝集のわずかな上昇を生じた。凍結乾燥後、ケーキクオリティ(cake quality)は、受容可能であり、そして引き続く再構築の回数は、有意に減少した。注入溶液のために、HSA/デキストロースのよりも、生理食塩水が好ましい。生理食塩水が、2%マンニトール/0.5%スクロース中での凍結乾燥と組合せて使用される場合、溶液は、静脈投与に関して受容可能な張度を有する。2%マンニトール/0.5%スクロース処方物を含む凍結乾燥されたバイアルを、0.9%の滅菌生理食塩水(注射のための)を用いて再構築し、5mg/ml □−Gluを生じる。
溶液を、留置の静脈カミューレを介して投与する。患者を、注入期間中、近接にモニターし、そして、有害事象または有害事象と疑われる事象において適切な臨床的介入をとる。48時間のウインドウ(window)を、各注入に関して可能にする。注入の比率を回数と共に増加させた注入スケジュールによって、有害事象を減少または排除する。
・60分間、5cc/時間
・60分間、10cc/時間
・30分間、40cc/時間 以上
・残りの注入の間、80cc/時間 以上。
・60分間、0.5cc/kg/時間
・60分間、1cc/kg/時間
・30分間、5cc/kg/時間
・残りの注入の間、7.5cc/kg/時間。
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- 本願明細書に記載された発明。
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