ES2312222T3

ES2312222T3 - Tratamiento de la enfermedad de pompe.

Info

Publication number: ES2312222T3
Application number: ES99965162T
Authority: ES
Inventors: Johannes Brenardus Mathias Marie Van Bree; Edna Henriette Germaine Venneker; David P. Meeker
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1998-12-07
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2019-12-06
Also published as: CY2018020I1; EP1137762A1; JP2002531581A; ES2677343T3; CY2018020I2; EP1137762B1; US20100092449A1; EP2020438A1; KR20010101131A; JP2012224643A; JP2015134836A; US7655226B2; AU3113700A; DK1137762T3; CA2353522A1; NL300382I1; DK2020438T3; JP2017066160A; US20040081645A1; PT2020438T

Abstract

El uso de alfa glucosidasa ácida humana en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad de Pompe infantil, en el que la alfa glucosidasa ácida humana está en forma de 100 a 110 kD, en el que el medicamento es para administrarse intravenosamente, y en el que el tratamiento es para continuarse durante al menos 4 semanas.

Description

Tratamiento de la enfermedad de Pompe.

Remisión a solicitudes relacionadas

La presente solicitud obtiene prioridad del documento USSN 60/111291, presentado el 12/07/98, que se incorpora como referencia en su integridad para todos los fines. La presente solicitud está relacionada con el documento USSN 08/700.760, presentado el 29 de Julio de 1996, que obtiene prioridad del documento USSN 60/001.796, presentado el 2 de Agosto de 1995, ambos de los cuales se incorporan como referencia en su integridad para todos los fines.

Campo técnico

La presente invención reside en los campos de la genética recombinante y la medicina, y se dirige a terapia de sustitución de enzima de pacientes con enfermedad de Pompe.

Fundamento de la invención

Al igual que otras proteínas secretoras, las proteínas lisosómicas se sintetizan en el retículo endoplásmico y se transportan al aparato de Golgi. Sin embargo, a diferencia de muchas otras proteínas secretoras, las proteínas lisosómicas no están destinadas a secreción en fluidos extracelulares sino en un orgánulo intracelular. Dentro del Golgi, las proteínas lisosómicas experimentan un tratamiento especial para equiparlas para alcanzar su destino intracelular. Casi todas las proteínas lisosómicas experimentan una variedad de modificaciones post-traducción, incluyendo glicosilación y fosforilación mediante la posición 6' de un grupo manosa terminal. Los restos de manosa fosforilados se reconocen por receptores específicos en la superficie interna de la Red Trans Golgi. Las proteínas lisosómicas se unen mediante estos receptores, y se separan por ello de otras proteínas secretoras. A continuación, se estrangulan de la Red Trans Golgi pequeñas vesículas de transporte que contienen las proteínas unidas a receptor y se fija como objetivo su destino intracelular. Véase en general Kornfeld, Biochem. Soc. Trans. 18, 367-374 (1990).

Hay más de treinta enfermedades lisosómicas, cada una resultante de una deficiencia de una proteína lisosómica particular, usualmente como resultado de una mutación genética. Véase, por ejemplo, Cotran et al., Robbins Pathological Basis of Disease (4ª ed. 1989) (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines). La deficiencia de la proteína lisosómica produce habitualmente acumulación dañina de un metabolito. Por ejemplo, en los síndromes de Hurler, Hunter, Morquio y Sanfilippo, hay una acumulación de mucopolisacáridos; en los síndromes de Tay-Sachs, Gaucher, Krabbe, Niernam-Pick y Fabry, hay una acumulación de esfingolípidos; y en fucosidosis y manosidosis, hay una acumulación de esfingolípidos y fragmentos de glicoproteínas que contienen fucosa, y de oligosacáridos que contienen manosa, respectivamente.

La enfermedad de almacenamiento de glicógeno de tipo II (GSD II; enfermedad de Pompe; deficiencia de maltasa ácida) es causada por deficiencia de la enzima lisosómica \alpha-glucosidasa ácida (maltasa ácida). Se distinguen dos formas clínicas: comienzo temprano infantil y comienzo tardío, juvenil y adulto. La GSD II infantil tiene su comienzo poco después del nacimiento y se presenta con debilidad muscular progresiva y fallo cardíaco. Esta variante clínica es usualmente fatal dentro de los dos primeros años de vida. Los síntomas en el comienzo tardío en pacientes adultos y juveniles tienen lugar durante su vida, y están implicados sólo músculos esqueléticos. Los pacientes mueren eventualmente debido a insuficiencia respiratoria. Los pacientes pueden sobrevivir excepcionalmente durante más de seis décadas. Hay una buena correlación entre la gravedad de la enfermedad y la actividad de \alpha-glucosidasa ácida residual, siendo la actividad 10-20% de la normal en las formas de comienzo tardío y menos del 2% en comienzo temprano de la enfermedad (véase Hirschhorn, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (Scriver et al., reds., 7ª ed., McGraw-Hill, 1995), págs. 2443-2464).

Desde el descubrimiento de las deficiencias de enzimas lisosómicas como la causa principal de enfermedades de almacenamiento lisosómico (véase, por ejemplo, Hers, Biochem. J. 86, 11-16 (1963)), se han hecho intentos para tratar pacientes que tienen enfermedades de almacenamiento lisosómico por administración (intravenosa) de la enzima que falta, es decir, terapia de enzima. Estos experimentos con terapia de sustitución de enzima para la enfermedad de Pompe no tuvieron éxito. Se usaron \alpha-glucosidasa no humana de Aspergillus niger, dando reacciones inmunológicas, o una forma de la enzima que no es absorbida eficazmente por células (la forma de baja absorción, enzima madura de placenta humana; véase después). Además, la duración del tratamiento y/o la cantidad de enzima administrada fueron insuficientes (3-5). La producción de enzimas lisosómicas de fuentes naturales tales como orina humana y testículos de bovino es posible en teoría, pero da bajos rendimientos, y la enzima purificada no está necesariamente en una forma que pueda absorberse por tejidos de un paciente receptor.

A pesar de las incertidumbres y dificultades anteriores, la invención proporciona la fabricación de un medicamento para tratar pacientes con enfermedad de Pompe usando alfa glucosidasa ácida humana.

Sumario de la invención reivindicada

Se describen aquí métodos para tratar un paciente con enfermedad de Pompe. Tales métodos suponen administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de alfa glucosidasa ácida humana. La dosificación es preferiblemente al menos 10 mg/kg de peso corporal por semana. En algunos métodos, la dosificación es al menos 60 mg/kg de peso corporal por semana o al menos 120 mg/kg de peso corporal por semana. En algunos métodos, tales dosificaciones se administran en una sola ocasión por semana y en otros métodos en tres ocasiones por semana. En algunos métodos, el tratamiento se continúa durante al menos 24 semanas. La administración es preferiblemente intravenosa. La alfa glucosidasa ácida humana se obtiene preferiblemente en la leche de un mamífero transgénico no humano, y está preferible y principalmente en una forma de 110 kD.

Los métodos pueden usarse para tratar pacientes con enfermedad de Pompe infantil, juvenil o de adulto. En algunos métodos de tratamiento de la enfermedad de Pompe infantil, la eficacia es indicada porque la supervivencia de un paciente sea al menos un año de edad.

En algunos métodos, los niveles de alfa glucosidasa ácida humana se comprueban en el paciente acostado. Opcionalmente, puede administrarse una segunda dosificación de alfa glucosidasa ácida humana si el nivel de alfa-glucosidasa cae en el paciente por debajo de un valor umbral.

En algunos métodos, la alfa glucosidasa humana se administra intravenosamente y la proporción de administración aumenta durante el período de administración. En algunos métodos, la proporción de administración aumenta por al menos un factor de diez durante el período de administración. En algunos métodos, la proporción de administración aumenta por al menos un factor de diez durante un período de cinco horas. En algunos métodos, se administra al paciente una serie de al menos cuatro dosificaciones, cada dosificación con una concentración más alta que la dosificación previa. En algunos métodos, las dosificaciones son una primera dosificación de 0,03-0,3 mg/kg/h, una segunda dosificación de 0,3-12 mg/kg/h, una tercera dosificación de 1-30 mg/kg/h y una cuarta dosificación de 2-60 mg/kg/h. En algunos métodos, las dosificaciones son una primera dosificación de 0,1-1 mg/kg/h, una segunda dosificación de 1-4 mg/kg/h, una tercera dosificación de 3-10 mg/kg/h y una cuarta dosificación de 6-20 mg/kg/h. En algunos métodos, las dosificaciones son una primera dosificación de 0,25-4 mg/kg/h, una segunda dosificación de 0,9-1,4 mg/kg/h, una tercera dosificación de 3,6-5,7 mg/kg/h y una cuarta dosificación de 7,2-11,3 mg/kg/h. En algunos métodos, las dosificaciones son una primera dosificación de 0,3 mg/kg/h, una segunda dosificación de 1 mg/kg/h, una tercera dosificación de 4 mg/kg/h y una cuarta dosificación de 12 mg/kg/h. En algunos métodos, la primera, segunda, tercera y cuarta dosificaciones se administran cada una durante períodos de 15 minutos a 8 horas.

En algunos métodos, la primera, segunda, tercera y cuarta dosificaciones se administran durante períodos de 1 h, 1 h, 0,5 h y 3 h respectivamente.

También se describe aquí una composición farmacéutica que comprende alfa glucosidasa ácida humana, albúmina de suero humano y un azúcar en un tampón fisiológicamente aceptable en forma estéril. Algunas de tales composiciones comprenden alfa glucosidasa ácida humana, albúmina de suero humano y glucosa en tampón de fosfato sódico. Algunas composiciones comprenden alfa glucosidasa, manitol y sacarosa en una solución acuosa. En algunas composiciones, el azúcar comprende manitol y sacarosa y la concentración de manitol es 1-3% p/p de la solución acuosa y la concentración de sacarosa es 0,1 a 1% p/p de la solución acuosa. En algunas composiciones, la concentración de manitol es 2% p/p y la concentración de sacarosa es 0,5% p/p.

También se describe aquí una composición liofilizada producida liofilizando una composición farmacéutica que comprende glucosidasa ácida humana, manitol y sacarosa en solución acuosa. Tal composición puede prepararse liofilizando una primera composición que comprende alfa-glucosidasa ácida humana, manitol, sacarosa y una solución acuosa para producir una segunda composición; y reconstituyendo la composición liofilizada en solución salina para producir una tercera composición. En algunas de tales composiciones, la alfa-glucosidasa ácida humana está en en 5 mg/ml en ambas primera y tercera composición, el manitol está en 2 mg/ml en la primera composición, la sacarosa está en 0,5 mg/ml en la primera composición y la solución salina usada en la etapa de reconstitución es 0,9% p/p.

En base a la descripción contenida aquí, la presente invención proporciona el uso de alfa glucosidasa ácida humana en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad de Pompe infantil, en el que la alfa glucosidasa ácida humana está en la forma de 100 a 110 kD, en el que el medicamento es para administrarse intravenosamente, y en el que el tratamiento es para continuarse durante al menos 4 semanas. Esta invención y realizaciones preferidas de ella se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1: Un transgen que contiene cADN de \alpha-glucosidasa ácida. Los exones de \alphas1-caseína están representados por cajas sin rayar; el cADN de \alpha-glucosidasa está representado por una caja rayada. El intrón de \alphas1-caseína y las secuencias flanqueantes están representados por una línea gruesa. Una línea delgada representa el lugar de aceptor de IgG. El lugar de iniciación de la transcripción está marcado (I^{\rightarrow}), el lugar de iniciación de la traducción (ATG), el codón de detención (TAG) y el lugar de poliadenilación (pA).

Fig. 2 (paneles A, B, C): Tres transgenes que contienen ADN genómico de \alpha-glucosidasa ácida. Las áreas rayadas oscuras son secuencias de \alphas1 caseína, las cajas sin rayar representan exones de \alpha-glucosidasa ácida y la línea delgada entre las cajas sin rayar representa intrones de \alpha-glucosidasa. Otros símbolos son los mismos que en la Fig. 1.

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Fig. 3 (paneles A, B, C): Construcción de transgenes genómicos. Los exones de \alpha-glucosidasa están representados por cajas sin rayar; los intrones de \alpha-glucosidasa y las secuencias no traducidas están indicados por líneas delgadas. Las secuencias del vector pKUN están representadas por líneas gruesas.

Fig. 4: Detección de \alpha-glucosidasa ácida en leche de ratones transgénicos por transferencia Western

Definiciones

La expresión "identidad sustancial" u "homología sustancial" significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de aberturas por defecto, comparten al menos un 65 por ciento de identidad de secuencias, preferiblemente al menos 80 o 90 por ciento de identidad de secuencias, más preferiblemente al menos 95 por ciento de identidad de secuencias o más (por ejemplo, 99 por ciento de identidad de secuencias). Preferiblemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservadoras.

La expresión "sustancialmente pura" o "aislada" significa que una especie objeto se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Usualmente, la especie objeto es la especie predominante presente (es decir, en base molar es más abundante que cualquier otra especie individual de la composición), y preferiblemente una fracción purificada sustancialmente es una composición en la que la especie objeto comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 al 90 por ciento en peso de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. Más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición por métodos de detección convencionales) en la que la composición consiste esencialmente en derivados de una sola especie macromolecular.

Un segmento de ADN está enlazado operativamente cuando se pone en relación funcional con otro segmento de ADN. Por ejemplo, ADN para una secuencia señal está enlazado operativamente con ADN que codifica un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si estimula la transcripción de la secuencia. Generalmente, las secuencias de ADN que están enlazadas operativamente son contiguas, y en el caso de una secuencia señal tanto contigua como en fase de lectura. Sin embargo los potenciadores no necesitan ser contiguos con las secuencias de codificación cuya transcripción controlan. El enlace se consigue por ligación en lugares de restricción convenientes o en adaptadores o enlazadores insertados en su lugar.

Un segmento de ADN exógeno es uno extraño a la célula, u homólogo a un segmento de ADN de la célula pero en posición no natural en el genoma de la célula hospedante. Los segmentos de ADN exógenos se expresan para producir polipéptidos exógenos.

En un mamífero transgénico, todas, o sustancialmente todas, las células del linaje germinal y somático contienen un transgen introducido en el mamífero como un antepasado del mamífero en una fase embriónica temprana.

Descripción detallada

Se describen aquí mamíferos transgénicos no humanos que segregan una proteína lisosómica en su leche. La secreción se consigue por incorporación de un transgen que codifica una proteína lisosómica y secuencias reguladoras capaces de fijar como objetivo la expresión del gen en la glándula mamaria. El transgen se expresa, y el producto de expresión se modifica post-traducción dentro de la glándula mamaria, y se segrega después en la leche. La modificación post-traducción puede incluir etapas de glicosilación y fosforilación para producir una manosa-6 fosfato que contiene proteína lisosómica.

A. Genes lisosómicos

Se describen aquí mamíferos no humanos transgénicos que expresan segmentos de ADN que contienen cualquiera de los más de 30 genes conocidos que codifican enzimas lisosómicas y otros tipos de proteínas lisosómicas, incluyendo \alpha-glucosidasa, \alpha-L-iduronidasa, iduronato-sulfato sulfatasa, hexosaminidasa A y B, proteína activadora de gangliósido, arilsulfatasa A y B, iduronato sulfatasa, heparan N-sulfatasa, galacto-ceramidasa, \alpha-galactosilceramidasa A, esfingomielinasa, \alpha-fucosidasa, \alpha-manosidasa, aspartilglicosamina amida hidrolasa, lipasa ácida, N-acetil-\alpha-D-glucosamina-6-sulfato sulfatasa, \alpha y \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, \beta-manosidasa, ceramidasa, galacto-cere-brosidasa, \alpha-N-acetilgalactosaminidasa y proteína protectora y otras. También están incluidos mamíferos transgénicos que expresan variantes alélica, cognada e inducida de cualquiera de las secuencias génicas de proteínas lisosómicas conocidas. Tales variantes muestran usualmente identidad de secuencias sustancial a nivel de aminoácidos con genes de proteínas lisosómicas conocidas. Tales variantes se hibridan habitualmente con un gen conocido bajo condiciones rigurosas o reaccionan cruzadamente con anticuerpos a un polipéptido codificado por uno de los genes conocidos.

Están disponibles clones de ADN que contienen las secuencias genómicas o de cADN de muchos de los genes conocidos que codifican proteínas lisosómicas. (Scott et al., Am. J. Hum. Genet. 47, 802-807 (1990); Wilson et al., PNAS 87, 8531-8535 (1990); Stein et al., J. Biol. Chem. 264, 1252-1259 (1989); Ginns et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 123, 574-580 (1984); Hoefsloot et al., EMBO J. 7, 1697-1704 (1988); Hoefsloot et al., Biochem. J. 272, 473-479 (1990); Meyerowitz & Proia, PNAS 81, 5394-5398 (1984); Scriver et al., supra, parte 12, páginas 2427-2882 y referencias citadas en ellos)). Otros ejemplos de secuencias genómicas y de cADN están disponibles en GenBank. En la extensión en que se requieran secuencias clonadas adicionales de genes lisosómicos, pueden obtenerse de genotecas genómicas o de cADN (preferiblemente humanas) usando secuencias de ADN de proteínas lisosómicas conocidas o anticuerpos para proteínas lisosómicas conocidas como sondas.

B. Conformación de proteínas lisosómicas

Las proteínas lisosómicas recombinantes se elaboran preferiblemente para tener la misma o similar estructura que las proteínas lisosómicas de origen natural. Las proteínas lisosómicas son glicoproteínas que se sintetizan en ribosomas unidos al retículo endoplásmico (RER). Se introducen en este orgánulo guiadas co-traducciónalmente por un péptido señal N-terminal Ng et al., Current Opinion in Cell Biology 6, 510-516 (1994)). El procedimiento de glicosilación N-enlazado comienza en el RER con la transferencia en bloque del precursor oligosacárido con alto contenido de manosa Glc3Man9GlcNAc2 desde un vehículo dolicol. La modificación de la cadena de hidratos de carbono comienza en el RER y continúa en el aparato de Golgi con la eliminación de los tres restos de glucosa más exteriores por glicosidasas I y II. La fosforilación es un procedimiento de dos etapas en el que se acopla primero N-acetil-gluco-samina-1-fosfato a grupos manosa selectos por una transferasa específica para proteína lisosómica, y en segundo lugar, se escinde la N-acetil-gluco-samina por una diesterasa (Goldberg et al., Lysosomes: Their Role in Protein Breakdown (Academic Press Inc., Londres, 1987), págs 163-191). La escisión expone manosa 6-fosfato como marcador de reconocimiento y ligando para el receptor de manosa 6-fosfato que media en el transporte de muchas proteínas lisosómicas a los lisosomas (Kornfeld, Biochem. Soc. Trans. 18, 367-374 (1992)).

Además de la modificación de la cadena de hidratos de carbono, muchas proteínas lisosómicas experimentan tratamiento proteolítico, en el que el primer suceso es eliminación del péptido señal. El péptido señal de muchas proteínas lisosómicas se escinde después de la translocación por peptidasa señal, tras lo cual, las proteínas se hacen solubles. Hay una evidencia sugerente de que el péptido señal de \alpha-glucosidasa ácida se escinde después de que la enzima ha dejado el RER, pero antes de entrar en el lisosoma o la trayectoria secretora (Wisselaar et al., J. Biol. Chem. 268, 2223-2231 (1993)). El tratamiento proteolítico de \alpha-glucosidasa ácida es complejo e implica una serie de etapas además de la escisión del péptido señal, que tienen lugar en diversas localizaciones subcelulares. Los polipéptidos se escinden en ambos extremos terminales N y C, por lo que aumenta la actividad catalítica específica. Las principales especies reconocidas son una precursora de 110/100 kD, una intermedia de 95 kD y formas maduras de 76 y 70 kD. (Hasilik et al., J. Biol. Chem. 255, 4937-4945 (1980); Oude Elferink et al., Eur. J. Biochem. 139, 489-495 (1984); Reuser et al., J. Biol. Chem. 260, 8336-8341 (1985); Hoefsloot et al., EMBO J. 7, 1697-1704 (1988)). El tratamiento post-traducción de \alpha-glucosidasa ácida humana natural y de formas recombinantes de \alpha-glucosidasa ácida humana como se expresa en células de mamífero cultivadas como células COS, células BHK y células CHO es similar (Hoefsloot et al., (1990) supra; Wisselaar et al., (1993) supra.

El tratamiento auténtico para generar proteínas lisosómicas fosforiladas en la posición 6' del grupo manosa puede ensayarse midiendo la captación de un sustrato por células que llevan un receptor para manosa 6-fosfato. Los sustratos modificados correctamente se captan más rápido que los sustratos no modificados, y de una manera por la que la captación del sustrato modificado puede inhibirse competitivamente por adición de manosa 6-fosfato.

C. Diseño de transgenes

Se diseñan transgenes para fijar como objetivo la expresión de una proteína lisosómica recombinante en la glándula mamaria de un mamífero no humano transgénico que albergue el transgen. El método básico supone enlazar operativamente un segmento de ADN exógeno que codifica la proteína con una secuencia señal, un promotor y un potenciador. El segmento de ADN puede ser genómico, minigen (genómico con uno o más intrones omitidos), cADN, un fragmento de YAC, una quimera de dos genes de proteína lisosómica diferentes, o un híbrido de cualquiera de éstos. La inclusión de secuencias genómicas conduce generalmente a niveles de expresión más altos. Muy altos niveles de expresión podrían sobrecargar la capacidad de la glándula mamaria para realizar modificaciones post-traducción y la secreción de proteínas lisosómicas. Sin embargo, los datos presentados abajo indican que tiene lugar modificación post-traducción sustancial, incluyendo la formación de grupos manosa-6 fosfato, a pesar de un alto nivel de expresión en el intervalo de mg/ml. Modificación sustancial significa que al menos aproximadamente 10, 25, 50, 75 o 90% de las moléculas segregadas llevan al menos un grupo manosa 6-fosfato. Así, se prefieren generalmente construcciones genómicas o cADN híbrido-construcciones genómicas.

En construcciones genómicas, no es necesario conservar todas las secuencias intrónicas. Por ejemplo, pueden eliminarse algunas secuencias intrónicas para obtener un transgen más pequeño que facilite las manipulaciones de ADN y la microinyección subsiguiente. Véase Archibald et al., documento WO 90/05188 (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines). La eliminación de algunos intrones también es útil en algunos casos para reducir los niveles de expresión y asegurar por ello que la modificación post-traducción es sustancialmente completa. En otros casos, la exclusión de un intrón tal como el intrón uno de la secuencia genómica de \alpha-glucosidasa ácida conduce a una expresión más alta de la enzima madura. También es posible suprimir algunos o todos los exones no codificantes. En algunos transgenes, se mutan nucleótidos seleccionados en proteína lisosómica que codifican secuencias para eliminar lugares de división proteolítica.

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Puesto que el uso pretendido de proteínas lisosómicas producidas por mamíferos transgénicos es habitualmente administración a seres humanos, la especie de la que se obtiene el segmento de ADN que codifica una secuencia de proteína lisosómica es preferiblemente humana. Análogamente, si el uso pretendido fuera en terapia veterinaria (por ejemplo, en un caballo, perro o gato), es preferible que el segmento de ADN sea de la misma especie.

El promotor y el potenciador son de un gen que se exprese exclusiva o al menos preferentemente en la glándula mamaria (es decir, un gen específico para la glándula mamaria). Los genes preferidos como fuente de promotor y potenciador incluyen \beta-caseína, \kappa-caseína, \alphaS1-caseína, \alphaS2-caseína, \beta-lactoglobulina, proteína de ácido de suero y \alpha-lactalbúmina. El promotor y el potenciador se obtienen usualmente, pero no siempre, del mismo gen específico para la glándula mamaria. Este gen es a veces, pero no necesariamente, de la misma especie de mamífero que el mamífero en el que ha de expresarse el transgen. Pueden usarse también secuencias de regulación de expresión de otras especies tales como las de genes humanos. La secuencia señal debe ser capaz de dirigir la secreción de la proteína lisosómica desde la glándula mamaria. Pueden derivarse secuencias señal adecuadas de genes de mamífero que codifican una proteína segregada. Sorprendentemente, son adecuadas las secuencias señal naturales de proteínas lisosómicas, a pesar de que estas proteínas no se segregan normalmente sino que tienen fijado como objetivo un orgánulo intracelular. Además de tales secuencias señal, las fuentes preferidas de secuencias señal son la secuencia señal del mismo gen del que se obtienen el promotor y el potenciador. Opcionalmente, se incluyen en el transgen secuencias reguladoras adicionales para optimizar los niveles de expresión. Tales secuencias incluyen regiones flanqueantes 5', regiones transcritas pero no traducidas 5', secuencias intrónicas, regiones transcritas pero no traducidas 3', lugares de poliadenilación y regiones flanqueantes 3'. Tales secuencias se obtienen habitualmente del gen específico para la glándula mamaria del que se obtienen el promotor y el poternciador o del gen de la proteína lisosómica expresada. La inclusión de tales secuencias produce un medio genético que simula el de un gen específico para la glándula mamaria auténtico y/o el de un gen de proteína lisosómica auténtico. Este medio genético produce en algunos casos (por ejemplo, \alphaS1-caseína de bovino) mayor expresión del gen transcrito. Alternativamente, se obtienen regiones flanqueantes 3' y regiones no traducidas de otros genes heterólogos tales como el gen de \beta-globina o genes víricos. La inclusión de regiones no traducidas 3' y 5' de un gen de proteína lisosómica u otro gen heterólogo puede aumentar también la estabilidad del transcripto.

En algunos casos, se incluyen aproximadamente 0,5, 1, 5, 10, 15, 20 o 30 kb de secuencia flanqueante 5' de un gen específico mamario en combinación con aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20 o 30 kb de secuencia flanqueante 3' del gen de la proteína lisosómica expresada. Si la proteína se expresa desde una secuencia de cADN, es ventajoso incluir una secuencia intrónica entre el promotor y la secuencia de codificación. La secuencia intrónica es preferiblemente una secuencia híbrida formada de una porción 5' de una secuencia que intervenga del primer intrón de la región específica para glándula mamaria de la que se obtiene el promotor y una porción 3' de una secuencia que intervenga de una secuencia que intervenga de IgG o gen de proteína lisosómica, Véase DeBoer et al., socumento WO 91/08216 (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines).

Un transgen preferido para expresar una proteína lisosómica comprende un gen de proteína lisosómica híbrido de cADN-genómico enlazado 5' a un promotor de caseína y potenciador. El gen híbrido incluye la secuencia señal, la región de codificación y la región flanqueante 3' del gen de proteína lisosómica. Opcionalmente, el segmento de cADN incluye una secuencia intrónica entre la caseína 5' y la región no traducida del gen que codifica la proteína lisosómica. Por supuesto, el cADN correspondiente y segmentos genómicos pueden fusionarse también en otras localizaciones dentro del gen siempre que pueda expresarse una proteína contigua de la fusión resultante.

Otros transgenes preferidos tienen un segmento de proteína lisosómica genómico enlazado 5' a secuencias reguladoras de caseína. El segmento genómico es usualmente contiguo de la región no traducida 5' a la región flanqueante 3' del gen. Así, el segmento genómico incluye una porción de la secuencia no traducida 5' de la proteína lisosómica, la secuencia señal, intrones alternativos y exones de codificación, una región no traducida 3' y una región flanqueante 3'. El segmento genómico está enlazado mediante la región no traducida 5' a un fragmento de caseína que comprende un promotor y un potenciador y habitualmente una región no traducida 5'.

Está disponible información de secuencias de ADN para todos los genes específicos para glándula mamaria listados antes, en al menos uno y a menudo varios organismos. Véase, por ejemplo, Richards et al., J. Biol. Chem. 256, 526-532 (1981) (\alpha-lactalbúmina de rata); Campbell et al., Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984) (WAP de rata); Jones et al., J. Biol. Chem. 260, 7042-7050 (1985) (\beta-caseína de rata); Yu-Lee & Rosen, J. Biol. Chem. 258, 10794-10804 (1983) (\gamma-caseína de rata); Hall, Biochem. J. 242, 735-742 (1987) (\alpha-lactalbúmina humana); Stewart, Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984) (cADNs de \alphas1 y \kappa caseína de bovino); Gorodetsky et al., Gene 66, 87-96 (1988) (\beta caseína de bovino); Alexander et al., Eur. J. Biochem. 178, 395-401 (1988) (\kappa caseína de bovino); Brignon et al., FEBS Lett. 188, 48-55 (1977) (\alphaS2 caseína de bovino); Jamieson et al., Gene 61, 85-90 (1987), Ivanov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander et al., Nucleic Acids Res. 17, 6739 (1989) (\beta lactoglobulina de bovino); Vilotte et al., Biochimie 69, 609-620 (1987) (\alpha-lactalbúmina de bovino) (incorporaoas como referencia en su integridad para todos los fines). La estructura y función de los diversos genes de proteínas de la leche se examinan por Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098 (1993) (incorporada como referencia en su integridad para todos los fines). En la extensión en que podrían requerirse datos de secuencias adicionales, podrían clonarse fácilmente secuencias que flanquean las regiones ya obtenidas usando como sondas las secuencias existentes. Se obtienen de igual modo secuencias reguladoras específicas para glándula mamaria de diferentes organismos examinando genotecas de tales organismos usando secuencias de nucleótidos cognados conocidas, o anticuerpos para proteínas cognadas como sondas.

Se describen con más detalle estrategias generales y ejemplos de transgenes que emplean secuencias reguladoras de \alphaS1-caseína para fijar como objetivo la expresión de una proteína recombinante en la glándula mamaria en DeBoer et al., documentos WO 91/08216 y WO 93/25567 (incorporados aquí como referencia en su integridad para todos los fines). Se han descrito también ejemplos de transgenes que emplean secuencias reguladoras de otros genes específicos para glándula mamaria. Véase, por ejemplo, Simon et al., Bio/Technology 6, 179-183 (1988) y documento WO 88/00239 (1988) (secuencia reguladora de \beta-lactoglobulina para expresión en ovejas); Rosen, documento EP 279.582 y Lee et al., Nucleic Acids Res. 16, 1027-1041 (1988) (secuencia reguladora de \beta-caseína para expresión en ratones); Gordon, Biotechnology 5, 1183 (1987) (secuencia reguladora de WAP para expresión en ratones); documento WO 88/01648 y Eur. J. Biochem. 186, 43-48 (1989) (secuencia reguladora de \alpha-lactalbúmina para expresión en ratones) (incorporados como referencia en su integridad para todos los fines).

La expresión de proteínas lisosómicas en la leche a partir de transgenes puede ser influida por co-expresión o inactivación funcional (es decir, eliminación) de genes implicados en modificación post-traducción y fijación de objetivo de las proteínas lisosómicas. Los datos de los ejemplos indican que, sorprendentemente, las glándulas mamarias expresan ya enzimas modificantes en cantidades suficientes para obtener montaje y secreción de proteínas que contienen manosa 6-fosfato en altos niveles. Sin embargo, en algunos mamíferos transgénicos que expresan estas proteínas en altos niveles, es preferible a veces suplementar niveles endógenos de enzimas de tratamiento con enzima adicional resultante de expresión de transgenes. Tales transgenes se construyen empleando principios similares a los discutidos antes con la secuencia de codificación de la enzima de tratamiento que sustituye a la secuencia de codificación de la proteína lisosómica en el transgen. No es necesario generalmente que se segreguen enzimas de tratamiento post-traducción. Así, la secuencia de señal de secreción enlazada a la secuencia de codificación de la proteína lisosómica se sustituye con una secuencia señal que fija el objetivo de la enzima de tratamiento al retículo endoplásmico sin secreción. Por ejemplo, son adecuadas las secuencias señal asociadas naturalmente con estas enzimas.

D. Transgénesis

Los transgenes descritos antes se introducen en mamíferos no humanos. Son adecuados muchos mamíferos no humanos, incluyendo roedores tales como ratones y ratas, conejos, ovinos tales como ovejas y cabras, porcinos tales como cerdos y bovinos tales como ganado vacuno y búfalos. Los bovinos ofrecen la ventaja de grandes producciones de leche, mientras que los ratones ofrecen las ventajas de facilidad de transgénesis y crianza. Los conejos ofrecen un compromiso de estas ventajas. Un conejo puede producir 100 ml de leche por día con un contenido de proteína de aproximadamente el 14% (véase Buhler et al., Bio/Technology 8, 140 (1990)) (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines), y puede manipularse y criarse aún usando los mismos principios y con similar facilidad que los ratones. No se emplean típicamente mamíferos no vivíparos tales como equidna u ornitorrinco.

En algunos métodos de transgénesis, los transgenes se introducen en los pronúcleos de oocitos fertilizados. Para algunos animales, tales como ratones y conejos, la fertilización se realiza in vivo y los óvulos fertilizados se eliminan quirúrgicamente. En otros animales, particularmente bovinos, es preferible eliminar óvulos de animales vivos o de matadero y fertilizar los óvulos in vitro. Véase DeBoer et al., documento WO 91/08216. La fertilización in vitro permite introducir un transgen en células sustancialmente síncronas en una fase óptima del ciclo de células para integración (no más tarde de la fase S). Los transgenes se introducen habitualmente por microinyección. Véase el documento US 4.873.292. Los oocitos fertilizados se cultivan después in vitro hasta obtener un embrión de pre-implantación que contenga 16-150 células. La fase de un embrión de 16-32 células se describe como una mórula. Los embriones de pre-implantación que contienen más de 32 células se denominan blastocistos. Estos embriones muestran el desarrollo de un blastocelo, típicamente en la fase de 64 células. Los métodos para cultivar oocitos fertilizados hasta la fase de pre-implantación se describen por Gordon et al., Methods Enzymol. 101, 414 (1984); Hogan et al., Manipulation of the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, C.S.H.L. N.Y. (1986) (embrión de ratón); y Hammaer et al., Nature 315, 680 (1985) (embriones de conejo y de porcino); Gandolfi et al., J. Reprod. Fert. 81, 23-28 (1987); Rexroad et al., J. Anim. Sci. 66, 947-953 (1988) (embriones de ovino) y Eyestone et al., J. Reprod. Fert. 85, 715-720 (1989); Camous et al., J. Reprod. Fert. 72, 779-785 (1984); y Heyman et al., Theriogenology 27, 5968 (1987) (embriones de bovino) (incorporados como referencia en su integridad para todos los fines). A veces, los embriones pre-implantación se guardan congelados durante un período pendientes de implantación. Los embriones pre-implantación se transfieren al oviducto de una hembra pseudopreñada, produciendo el nacimiento de un animal transgénico o quimérico dependiendo de la fase de desarrollo en la que se integra el transgen. Los mamíferos quiméricos pueden criarse para formar animales transgénicos de linaje germinal verdadero.

Alternativamente, pueden introducirse transgenes en células estaminales embriónicas (ES). Estas células se obtienen de embriones de preimplantación cultivados in vitro. Bradley et al., Nature 309, 255-258 (1984) (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines). Pueden introducirse transgenes en tales células por electroporación o microinyección. Las células ES transformadas se combinan con blastocistos de un animal no humano. Las células ES colonizan el embrión y forman en algunos embriones el linaje germinal del animal quimérico resultante. Véase Jaenisch, Science, 240, 1468-1474 (1988) (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines). Alternativamente, pueden usarse células ES como fuente de núcleos para trasplante a un oocito fertilizado enucleado, dando lugar a un mamífero transgénico.

Para la producción de animales transgénicos que contengan dos o más transgenes, los transgenes pueden introducirse simultáneamente usando el mismo procedimiento que para un transgen simple. Alternativamente, los transgenes pueden introducirse inicialmente en animales separados y combinarse después en el mismo genoma reproduciendo los animales. Alternativamente, se produce un primer animal transgénico que contenga uno de los transgenes. Se introduce después un segundo transgen en óvulos fertilizados o células estaminales embriónicas del animal. En algunas realizaciones, transgenes cuya longitud excedería de otro modo de aproximadamente 50 kb, se construyen como fragmentos solapantes. Tales fragmentos solapantes se introducen en un oocito fertilizado o célula estaminal embriónica simultáneamente y experimentan recombinación homóloga in vivo. Véase Kay et al., documento WO 92/03917 (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines).

E. Características de mamíferos transgénicos

Los mamíferos transgénicos incorporan al menos un transgen en su genoma como se ha descrito antes. El transgen fija el objetivo de expresión de un segmento de ADN que codifica una proteína lisosómica al menos principalmente en la glándula mamaria. Sorprendentemente, las glándulas mamarias son capaces de expresar proteínas requeridas para tratamiento de post-traducción auténtica incluyendo etapas de adición de oligosacáridos y fosforilación. El tratamiento por enzimas en la glándula mamaria produce la fosforilación de la posición 6' de grupos manosa.

Las proteínas lisosómicas pueden segregarse en altos niveles de al menos 10, 50, 100, 500, 1.000, 2.000, 5.000 o 10.000 \mug/ml. Sorprendentemente, los mamíferos transgénicos presentan una salud sustancialmente normal. La expresión secundaria de proteínas lisosómicas en tejidos distintos de la glándula mamaria no tiene lugar en extensión suficiente para causar efectos perjudiciales. Además, la proteína lisosómica exógena producida en la glándula mamaria se segrega con eficacia suficiente para que no se presente un problema significativo por depósitos que atasquen el aparato secretor.

La edad a la que los mamíferos transgénicos pueden comenzar a producir leche varía, por supuesto, con la naturaleza del animal. Para bovinos transgénicos, la edad es aproximadamente dos años y medio naturalmente o seis meses con estímulo hormonal, mientras que para ratones transgénicos la edad es aproximadamente 5-6 semanas. Por supuesto, sólo los miembros hembras de una especie son útiles para producir leche. Sin embargo, los machos transgénicos también son valiosos para reproducir descendientes hembras. El esperma de machos transgénicos puede guardarse congelado para fertilización in vitro subsiguiente y generación de vástagos hembras.

F. Recuperación de proteínas de la leche

Los mamíferos hembras adultos transgénicos producen leche que contiene altas concentraciones de proteína lisosómica exógena. La proteína puede purificarse de la leche, si se desea, en virtud de sus propiedades físicas y químicas distintivas, y procedimientos de purificación estándares tales como precipitación, intercambio iónico, exclusión molecular o cromatografía de afinidad. Véase, en general, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982).

La purificación de \alpha-glucosidasa ácida humana a partir de la leche puede realizarse desgrasando la leche transgénica por centrifugación y eliminación de la grasa, seguido por eliminación de caseínas por centrifugación a alta velocidad seguida por filtración terminal (es decir, filtración terminal usando tamaños de filtros que disminuyen sucesivamente) o filtración de flujo transversal, o eliminación de caseínas directamente por filtración de flujo transversal. La \alpha-glucosidasa ácida humana se purifica por cromatografía, incluyendo Q Sepharose FF (u otra matriz de intercambio aniónico), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), Sepharose de quelación de metales o lectinas acopladas a Sepharose (u otras matrices).

Puede usarse cromatografía de flujo transversal en Q Sepharose para purificar \alpha-glucosidasa ácida humana presente en suero o una fracción de suero filtrados como sigue: se equilibró una columna una columna de cromatografía de flujo transversal en Q Sepharose (QFF; Pharmacia) (columna XK-50 de Pharmacia, altura de lecho 15 cm; caudal 250 cm/h) en tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7,0 (tampón A); se carga la fracción de suero incubada S/D (aproximadamente 500 a 600 ml) y se lava la columna con 4-6 volúmenes de columna (cv) de tampón A (tampón de fosfato sódico 20 mM, pH 7,0). La fracción de \alpha-glucosidasa ácida humana se eluye de la columna QFF con 2-3 cv de tampón A, que contiene NaCl 100 mM.

La fracción que contiene \alpha-glucosidasa ácida humana de QFF Sepharose puede purificarse adicionalmente usando cromatografía de alta eficacia en Fenil Sepharose. Por ejemplo, se añade 1 vol. de sulfato amónico 1 M al eluato de \alpha-glucosidasa ácida humana de QFF Sepharose mientras se agita continuamente. Se hace después a temperatura ambiente cromatografía de columna de Fenil HP (Pharmacia) (columna XK-50 de Pharmacia, altura de lecho 15 cm; caudal 150 cm/h) equilibrando la columna en tampón de sulfato amónico 0,5 M, fosfato sódico 50 mM, pH 6,0 (tampón C), cargando el eluato de \alpha-glucosidasa ácida humana incubada con sulfato amónico 0,5 M (de Q FF Sepharose), lavando la columna con 2-4 cv de tampón C y eluyendo la \alpha-glucosidasa ácida humana de la columna de Fenil HP con 3-5 cv de tampón D (tampón de fosfato sódico 50 mM a pH 6,0). Serán evidentes para los expertos métodos alternativos y métodos adicionales para purificar adicionalmente \alpha-glucosidasa ácida humana. Por ejemplo, véase la Solicitud de Patente del Reino Unido 998 07464.4 (incorporada como referencia en su integridad para todos los fines).

G. Usos de proteínas lisosómicas recombinantes

Las proteínas lisosómicas recombinantes producidas según esta descripción encuentran uso en procedimientos terapéuticos de sustitución de enzima. Un paciente que tenga una deficiencia genética u otra que produzca una insuficiencia de enzima lisosómica funcional puede tratarse administrando al paciente enzima exógena. Los pacientes que necesiten tal tratamiento pueden identificarse a partir de síntomas (por ejemplo, los síntomas del síndrome de Hurler incluyen enanismo, nublado corneal, hepatoesplenomegalia, lesiones valvulares, lesiones de la arteria coronaria, deformidades del esqueleto, rigidez de articulaciones y retardo mental progresivo). Alternativamente, o adicionalmente, pueden diagnosticarse pacientes a partir de análisis bioquímico de una muestra de tejido para revelar una acumulación excesiva de un metabilito característico tratado por una enzima lisosómica particular o por ensayo de enzimas usando un sustrato artificial o natural para revelar deficiencia de actividad de una enzima lisosómica particular. Para muchas enfermedades, la diagnosis puede hacerse midiendo la deficiencia de enzima particular o por análisis de ADN antes de la aparición de síntomas o acumulación excesiva de metabolitos (Scriver et al., supra, capítulos sobre trastornos del almacenamiento lisosómico). Todas las enfermedades de almacenamiento lisosómico son hereditarias. Así, en descendencia de familias de las que se sabe que tienen miembros que padecen enfermedades lisosómicas, es aconsejable a veces comenzar el tratamiento profiláctico incluso antes de que pueda hacerse una diagnosis definitiva.

Composiciones farmacéuticas

En algunos métodos, las enzimas lisosómicas se administran en forma purificada junto con un vehículo farmacéutico como una composición farmacéutica. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y de la aplicación terapéutica. El vehículo farmacéutico puede ser cualquier sustancia no tóxica compatible adecuada para suministrar los polipéptidos al paciente. Pueden usarse como vehículo agua estéril, alcohol, grasas, ceras y sólidos inertes. Pueden incorporarse también a las composiciones farmacéuticas coadyuvantes, agentes de tamponación, agentes de dispersión y similares farmacéuticamente aceptables.

La concentración de la enzima en la composición farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente el 0,1% en peso, siendo habitualmente al menos aproximadamente 1% en peso, hasta tanto como el 20% en peso o más.

Para administración oral, el ingrediente activo puede administrarse en formas de dosificación sólidas, tales como cápsulas, pastillas y polvos, o en formas de dosificación líquidas, tales como elixires, jarabes y suspensiones. El(los) componente(s) activo(s) pueden encapsularse en cápsulas de gelatina junto con ingredientes inactivos y vehículos en polvo, tales como glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, almidón, celulosa o derivados de celulosa, estearato magnésico, ácido esteárico, sacarina sódica, talco, carbonato magnésico y similares. Los ejemplos de ingredientes inactivos adicionales que pueden añadirse para proporcionar color, sabor, estabilidad, capacidad de tamponación, dispersión deseables u otros aspectos deseables conocidos son óxido de hierro rojo, gel de sílice, laurilsulfato sódico, bióxido de titanio, tinta blanca comestible y similares. Pueden usarse diluyentes similares para hacer pastillas comprimidas. Pastillas y cápsulas pueden fabricarse como productos de liberación sostenida para proporcionar liberación continua de medicación durante un período de horas. Las pastillas comprimidas pueden revestirse con azúcar o revestirse con película para ocultar cualquier sabor desagradable y proteger la pastilla de la atmósfera, o revestirse entéricamente para desintegración selectiva en el tracto gastrointestinal. Las formas de dosificación líquida para administración oral pueden contener colorantes y saporíferos para aumentar la aceptación por el paciente.

Podría producirse una composición típica para infusión intravenosa para contener de 100 a 500 ml de NaCl al 0,9% o glucosa al 5% estériles suplementada con una solución de albúmina al 20% y de 100 a 500 mg de una enzima. Podría producirse una composición farmacéutica típica para inyección intramuscular para contener, por ejemplo, 1 ml de agua tamponada estéril y de 1 a 10 mg de la alfa glucosidasa purificada de la presente descripción. Los métodos para preparar composiciones administrables parenteralmente son muy conocidos en la técnica y se describen con mayor detalle en diversas fuentes, incluyendo, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15ª ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines).

Puede formularse AGLU en tampón de fosfato sódico 10 mM pH 7,0. Están presentes opcionalmente pequeñas cantidades de sulfato amónico (< 10 mM). La enzima se mantiene congelada típicamente a aproximadamente -70ºC, y se descongela antes de usar. Alternativamente, la enzima puede guardarse fría (por ejemplo, a aproximadamente 4ºC a 8ºC) en solución. En algunas realizaciones, las soluciones de AGLU comprenden un tampón (por ejemplo, tampones de fosfato sódico, fosfato potásico u otros fisiológicamente aceptables), un hidrato de carbono simple (por ejemplo, sacarosa, glucosa, maltosa, manitol o similares), proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humano) y/o tensioactivos (por ejemplo, polisorbato 80 (Tween-80), cremóforo-EL, cremóforo-R, labrófilo y similares.

También puede guardarse AGLU en forma liofilizada. Para liofilización, puede formularse AGLU en una solución que contenga manitol y sacarosa en un tampón de fosfato. La concentración de sacarosa debe ser suficiente para impedir agregación de AGLU por reconstitución. La concentración de manitol debe ser suficiente para reducir significativamente el tiempo necesario de otro modo para liofilización. Las concentraciones de manitol y sacarosa deben ser sin embargo insuficientes para causar una hipertonicidad inaceptable por reconstitución. Son adecuadas concentraciones de manitol y sacarosa de 1-3 mg/ml y 0,1-1,0 mg/ml respectivamente. Son concentraciones prefertidas 2 mg/ml de manitol y 0,5 mg/ml de sacarosa. AGLU está presente preferiblemente en 5 mg/ml antes de liofilización y después de reconstitución. Una solución preferida para reconstitución es solución salina preferiblemente al 0,9%.

Para AGLU purificada de leche de conejo, puede tolerarse una pequeña cantidad de impurezas (por ejemplo, hasta aproximadamente el 5%). Las impurezas posibles pueden estar presentes en forma de proteínas de suero de conejo. Otras impurezas posibles son análogos estructurales (por ejemplo, oligómeros y agregados) y truncamientos de AGLU. Las partidas actuales indican que la AGLU producida en ratones transgénicos tiene > 95% de pureza. Las mayores impurezas son proteínas de suero de conejo, aunque por electroforesis en gel, se ven también bandas de AGLU de diferentes pesos moleculares.

Las soluciones de infusión deben prepararse asépticamente en una campana de flujo de aire laminar. La cantidad apropiada de AGLU debe retirarse del congelador y descongelarse a temperatura ambiente. Pueden prepararse soluciones de infusión en botellas de infusión de vidrio mezclando la cantidad apropiada de solución de producto terminado de AGLU con una cantidad adecuada de una solución que contiene albúmina de suero humano (HSA) y glucosa. Las concentraciones finales pueden ser 1% de HSA y 4% de glucosa para dosis de 25-200 mg y 1% de HSA y 4% de glucosa para dosis de 400-800 mg. HSA y AGLU pueden filtrarse con un filtro de jeringa de 0,2 \mum antes de transferir a la botella de infusión que contiene 5% de glucosa. Alternativamente, puede reconstituirse AGLU en solución salina, preferiblemente 0,9% para infusión. Las soluciones de AGLU para infusión se han mostrado estables durante hasta 7 horas a temperatura ambiente. Por tanto, la solución de AGLU se infunde preferiblemente dentro de siete horas desde la preparación.

Métodos terapéuticos

Se describen aquí métodos eficaces para tratar la enfermedad de Pompe. Estos métodos se basan en parte en la disponibilidad de grandes cantidades de alfa glucosidasa ácida humana en una forma que sea activa catalíticamente y en una forma que pueda absorberse por tejidos, particularmente hígado, corazón y músculo (por ejemplo, músculo liso, músculo estriado y músculo cardíaco) de un paciente tratado. Tal alfa-glucosidasa ácida humana se proporciona a partir de, por ejemplo, los animales transgénicos descritos en los Ejemplos. La alfa-glucosidasa está preferiblemente y de modo principal (es decir, > 50%) en la forma precursora de aproximadamente 100-110 kD. (El peso molecular aparente o movilidad relativa del precursor de 100-110 kD puede variar algo dependiendo del método de análisis usado, pero está típicamente en el intervalo de 95 kD a 120 kD). Dados los resultados con éxito con alfa-glucosidasa ácida humana en los animales transgénicos discutidos en los Ejemplos, es posible que puedan usarse también otras fuentes de alfa-glucosidasa humana, tales como las resultantes de sistemas de expresión celular. Por ejemplo, una manera alternativa para producir \alpha-glucosidasa ácida humana es transfectar el gen de \alpha-glucosidasa ácida en un linaje de células eucariotas estable (por ejemplo, CHO) como un cADN o una construcción genómica enlazada operativamente a un promotor adecuado. Sin embargo, es más laborioso producir las grandes cantidades de alfa glucosidasa ácida humana necesarias para terapia clínica por tal método.

Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se administran usualmente intravenosamente. También es posible en algunas circunstancias administración intradérmica, intramuscular u oral. Las composiciones pueden administrarse para tratamiento profiláctico de individuos que padezcan, o estén en riesgo de, una enfermedad de deficiencia de enzima lisosómica. Para aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un paciente que padezca una enfermedad establecida en una cantidad suficiente para reducir la concentración de metabolito acumulado y/o para prevenir o detener una acumulación adicional de metabolito. Para individuos con riesgo de enfermedad de deficiencia de enzima lisosómica, las composiciones farmacéuticas se administran profilácticamente en una cantidad suficiente para prevenir o inhibir la acumulación de metabolito. Una cantidad adecuada para conseguir esto se define como una dosis eficaz "terapéutica" o "profilácticamente". Tales dosificaciones eficaces dependerán de la gravedad del estado y del estado general de salud del paciente.

En los presentes métodos, se administra habitualmente alfa glucosidasa ácida humana en una dosificación de 10 mg/kg de peso corporal del paciente o más por semana a un paciente. A menudo, las dosificaciones son mayores de 10 mg/kg por semana. Los regímenes de dosificación pueden variar de 10 mg/kg por semana a al menos 1.000 mg/kg por semana. Son regímenes de dosificación típicos 10 mg/kg por semana, 15 mg/kg por semana, 20 mg/kg por semana, 25 mg/kg por semana, 30 mg/kg por semana, 35 mg/kg por semana, 40 mg/kg por semana, 45 mg/kg por semana, 60 mg/kg por semana, 80 mg/kg por semana y 120 mg/kg por semana. En regímenes preferidos, se administran 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg o 40 mg/kg una vez, dos veces o tres veces por semana. El tratamiento se continúa típicamente durante al menos 4 semanas, a veces 24 semanas y algunas veces durante la vida del paciente. El tratamiento se administra preferiblemente i.v. Opcionalmente, se comprueban después del tratamiento los niveles de alfa-glucosidasa humana (por ejemplo, en el plasma o músculo) y se administra una dosificación adicional cuando los niveles detectados caen sustancialmente por debajo (por ejemplo, menos del 20%) de los valores en personas normales.

En algunos métodos, se administra alfa glucosidasa ácida humana en una dosis inicialmente "alta" (es decir, una "dosis de carga"), seguida por administración de dosis más bajas (es decir, una "dosis de mantenimiento"). Un ejemplo de una dosis de carga es al menos aproximadamente 40 mg/kg de peso corporal del paciente 1 a 3 veces por semana (por ejemplo, durante 1, 2 o 3 semanas). Un ejemplo de dosis de mantenimiento es de al menos aproximadamente 5 a al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal del paciente, o más, tal como 20 mg/kg por semana, 30 mg/kg por semana, 40 mg/kg por semana.

En algunos métodos, se administra una dosificación en proporción creciente durante el período de dosificación. Esto puede conseguirse aumentando el caudal de infusión intravenosa o usando un gradiente de concentración creciente de alfa-glucosidasa administrada con caudal constante. La administración de esta manera reduce el riesgo de reacción inmunógena. En algunas dosificaciones, la proporción de administración medida en unidades de alfa glucosa por unidad de tiempo aumenta por al menos un factor de diez. Típicamente, la infusión intravenosa tiene lugar durante un período de varias horas (por ejemplo, 1-10 horas y preferiblemente 2-8 horas, más preferiblemente 3-6 horas) y el caudal de infusión se aumenta a intervalos durante el período de administración.

En la siguiente tabla 1 se muestran dosificaciones adecuadas (todas en mg/kg/h) para infusión en proporciones crecientes. La primera columna de la tabla indica períodos de tiempo en el programa de dosificación. Por ejemplo, la referencia 0-1 h se refiere a la primera hora de la dosificación. La quinta columna de la tabla muestra el intervalo de dosis que pueden usarse en cada período de tiempo. La cuarta columna muestra un intervalo incluido más estrecho de dosificaciones preferidas. La tercera columna indica los valores superior e inferior de dosificaciones administradas en una prueba clínica ejemplo. La segunda columna muestra dosificaciones particularmente preferidas, representando éstas la media del intervalo mostrado en la tercera columna de la tabla 1.

TABLA 1

1

Los métodos son eficaces en pacientes con enfermedad de Pompe de comienzo temprano (infantil) y comienzo tardío (juvenil y adulto). En pacientes con la forma infantil de la enfermedad de Pompe, los síntomas se evidencian en los 4 primeros meses de vida. En mayor medida, se advierten primero mal desarrollo motor y fallo para crecer. Por examen clínico, hay hipotonia generalizada con agotamiento muscular, ritmo respiratorio aumentado con retracciones esternales, agrandamiento moderado del hígado y protrusión de la lengua. El examen por ultrasonidos del corazón muestra una cardiomiopatía hipertrófica progresiva, conduciendo eventualmente a insuficiente producción cardíaca. El ECG se caracteriza por desviación del eje izquierdo acusada, un corto intervalo de PR, grandes complejos de QRS, ondas T invertidas y depresión de ST. La enfermedad muestra un transcurso progresivo rápidamente conduciendo a fallo cardiorrespiratorio en el primer año de vida. Por examen histológico en la autopsia, se observa almacenamiento de glicógeno lisosómico en diversos tejidos, y es más pronunciado en el corazón y el músculo esquelético. El tratamiento con alfa glucosidasa ácida humana en los presentes métodos produce una prolongación de la vida de tales pacientes (por ejemplo, más de 1, 2, 5 años hasta una duración de vida normal). El tratamiento puede producir también eliminación o reducción de características clínicas y bioquímicas de la enfermedad de Pompe como se ha discutido antes. El tratamiento se administra poco después del nacimiento, o antenatalmente si los padres saben que llevan alelos de alfa glucosidasa variantes que ponen en riesgo su progenie.

Los pacientes con la forma de adulto de comienzo tardío de la enfermedad de Pompe pueden no experimentar síntomas en las dos primeras décadas de vida. En este subtipo clínico, están implicados principalmente músculos esqueléticos con predilección de los del ceñidor de miembros, el tronco y el diafragma. La dificultad para subir escaleras es a menudo la queja inicial. El deterioro respiratorio varía considerablemente. Puede dominar el cuadro clínico o no experimentarse por el paciente hasta tarde en su vida. Muchos de tales pacientes mueren por insuficiencia respiratoria. En pacientes con el subtipo juvenil, los síntomas se evidencian habitualmente en la primera década de vida. Como en la enfermedad de Pompe de adultos, la debilidad del músculo esquelético es el problema principal; pueden verse cardiomegalia, hepatomegalia y macroglosia, pero son raros. En muchos casos, se necesita finalmente soporte ventilador nocturno. Las infecciones pulmonares en combinación con desgaste de los músculos respiratorios son amenazadores para la vida y se hacen mayormente fatales antes de la tercera década. El tratamiento con los presentes métodos prolonga la vida de pacientes con enfermedad de Pompe juvenil de comienzo tardío o de adulto hasta una duración de vida normal. El tratamiento elimina también o reduce significativamente los síntomas clínicos y bioquímicos de la enfermedad.

Otros usos

Las proteínas lisosómicas producidas en la leche de animales transgénicos tienen un cierto número de otros usos. Por ejemplo, la \alpha-glucosidasa, en común con otras \alpha-amilasas, es una herramienta importante en la producción de almidón, cerveza y productos farmacéuticos. Véase Vihinen & Mantsala, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24, 329-401 (1989) (incorporado como referencia en su integridad para todos los fines). Las proteínas lisosómicas también son útiles para producir compuestos químicos de laboratorio o productos de alimentación. Por ejemplo, \alpha-glucosidasa ácida degrada enlaces 1,4 y 1,6 \alpha-glucídicos y puede usarse para degradación de diversos hidratos de carbono que contengan estos enlaces, tales como maltosa, isomaltosa, almidón y glicógeno, para producir glucosa. La \alpha-glucosidasa ácida también es útil para administración a pacientes con una deficiencia intestinal de maltasa o isomaltasa. Se evitan los síntomas resultantes de otro modo de la presencia de maltosa no digerida. En tales aplicaciones, la enzima puede administrarse sin fraccionamiento previo de la leche, como un producto de alimentación derivado de tal leche (por ejemplo, helado o queso) o como una composición farmacéutica. Las enzimas lisosómicas recombinantes purificadas también son útiles para inclusión como testigos en juegos de diagnóstico para ensayo de cantidades desconocidas de tales enzimas en muestras de tejido.

Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de transgenes (a) Construcción de cADN

La construcción de un vector de expresión que contiene cADN que codifica \alpha-glucosidasa ácida humana comenzó con el plásmido p16,8hlf3 (véase DeBoer et al. (1991) & (1993), supra). Este plásmido incluye secuencias reguladoras de \alphaS1-caseína de bovino. El inserto de cADN de lactoferrina del plásmido progenitor se intercambió por el cADN de \alpha-glucosidasa ácida humana (Hoefsloot et al., EMBO J. 7, 1697-1704 (1988)) en el lugar de ClaI y el lugar de SalI de la cassette de expresión como se muestra en la Fig. 1. Para obtener los lugares de restricción compatibles en los extremos del fragmento de cADN de \alpha-glucosidasa, se digirió con EcoRI y SphI el plásmido pSHAG2 (id.) que contiene el cADN completo que codifica \alpha-glucosidasa humana, y el fragmento de cADN de 3,3 kb se subclonó en pKUN7\DeltaC, un derivado de pKUN1 (Konings et al., Gene 46, 269-276 (1986)), con un lugar de ClaI destruido dentro de las secuencias de nucleótidos del vector y con un polienlazador diseñado recientemente: HindIII ClaI EcoRI SphI XhoI EcoRI SfiI/SmaI NotI EcoRI* (* = lugar destruido). Del plásmido resultante pagluCESX, podía quitarse el fragmento de cADN de 3,3 kb por ClaI y XhoI. Este fragmento se insertó en la cassette de expresión mostrada en la Fig. 1 en el lugar de ClaI y el lugar de SalI compatible con XhoI. Como resultado, el plásmido de expresión p16,8\alphaglu consiste en la secuencia de cADN que codifica \alpha-glucosidasa ácida humana flanqueada por secuencias de \alphaS1-caseína de bovino como se muestra en la Fig. 1. El fragmento de 27,3 kb que contiene la cassette de expresión completa puede escindirse por escisión con NotI (véase Fig. 1).

(b) Construcciones genómicas

La construcción c8\alphagluex1 contiene el gen de \alpha-glucosidasa ácida humana (Hoefsloot et al., Biochem. J. 272, 493-497 (1990)); partiendo en el exón 1 inmediatamente aguas abajo de su lugar de iniciación de la transcripción (véase Fig. 2, panel A). Por tanto, la construcción codifica casi un 5' UTR completo del gen de \alpha-glucosidasa ácida humana. Este fragmento se fusionó con las secuencias de promotor del gen de \alphaS1-caseína de bovino. El lugar de iniciación de \alphaS1-caseína está presente 22 pb aguas arriba de la unión \alphaS1-caseína/ \alpha-glucosidasa ácida. La construcción tiene la señal de poliadenilación de \alpha-glucosidasa ácida humana y secuencias flanqueantes 3'. La construcción c8\alphagluex2 contiene el promotor de \alphaS1-caseína de bovino fusionado inmediatamente con el lugar de iniciación de la traducción en el exón 2 del gen de \alpha-glucosidasa ácida humana (véase Fig. 2, panel B). Así, el lugar de iniciación de la transcripción de \alphaS1-caseína y el lugar de iniciación de la traducción de \alpha-glucosidasa están separados 22 pb en esta construcción. Por tanto, no se preserva 5' UTR de \alpha-glucosidasa. Esta construcción contiene también la señal de poliadenilación de \alpha-glucosidasa ácida humana y secuencias flanqueantes 3' como se muestra en la Fig. 2, panel B.

La construcción c8,8\alphagluex2-20 difiere de la construcción c8\alphagluex2 sólo en la región 3'. Se usó un lugar de SphI en el exón 20 para fusionar la secuencia 3' de \alphaS1-caseína de bovino con la construcción de \alpha-glucosidasa ácida humana. La señal de poliadenilación está situada en esta secuencia de \alphaS1-caseína 3' (Figura 2, panel C).

Métodos para construcción de construcciones genómicas

Se aislaron tres fragmentos de BglII contiguos que contenían el gen de \alpha-glucosidasa ácida humana por Hoefsloot et al., supra. Estos fragmentos se ligaron en el lugar de BglII de pKUN8\DeltaC, un derivado de pKUN7\DeltaC con nun polienlazador adaptado: HindIII ClaI StuI BglII Pvn1 NcoI EcoRI SphI XhoI EcoRI* SmaI/SfiI NotI EcoRI* (* = lugar destruido). Esta ligación produjo dos orientaciones de los fragmentos generando los plásmidos p7.3\alphagluBES, p7.3\alphagluBSE, p8.5\alphagluBSE, p8.5\alphagluBES, p10\alphaagluBSE y p10\alphagluBES.

Puesto que los lugares de NotI únicos en los extremos de la cassette de expresión se usan seguidamente para el aislamiento de los fragmentos usados para microinyección, ha de destruirse el lugar de NotI intragénico en el intrón 17 de \alpha-glucosidasa ácida humana. Por tanto, se digirió p10\alphagluBES con ClaI y XhoI; se aisló el fragmento que contenía el extremo de \alpha-glucosidasa 3'. Este fragmento se insertó en los lugares de ClaI y XhoI de pKUN10\DeltaC, produciendo p10\alphaglu\DeltaNV. Previamente se obtuvo pKUN10\DeltaC (es decir, un derivado de pKUN8\DeltaC) digiriendo pKUN8\DeltaC con NotI, llenando los extremos adherentes con Klenow y, a continuación, reasociando el plásmido por ligación con extremos romos. Finalmente, se digirió p10\alphaglu\DeltaNV con NotI. Estos extremos adherentes se llenaron también con Klenow y se ligó el fragmento, produciendo el plásmido p10\alphaglu\DeltaNotI.

Construcción de c8\alphagluexI

Puesto que el lugar de SstI en el primer exón del gen de \alpha-glucosidasa se escogió para la fusión con la secuencia de \alphaS1-caseína de bovino, se digirió p8.5\alphagluBSE con BglII seguido por una digestión parcial con SstI. Se aisló el fragmento que contenía los exones 1-3 y se ligó a los lugars de BglII y SstI de pKUN8\DeltaC. El plásmido resultante se denominó p5'\alphagluex1 (véase Fig. 3, panel A).

La siguiente etapa (Fig. 3, panel B) fue la ligación de la parte 3' a p5'\alphagluex1. Primero, se digirió p10\alphaglu\DeltaN con BglII y BamHI. Este fragmento que contenía los exones 16-20 se aisló. Segundo, se digirió p5'\alphagluex1 con BglII y para impedir la auto-ligación, se trató con fosforilasa (BAP) para desfosforilar los extremos adherentes de BglII. Puesto que los extremos adherentes de BamHI son compatibles con los extremos adherentes de BglII, estos extremos se ligan entre sí. Se seleccionó el plásmido resultante, es decir, p5'3'\alphagluex1. Este plásmido tiene un lugar de BglII único disponible para la etapa de construcción final (véase Fig. 3, paneles B y C).

La parte intermedia del gen de \alpha-glucosidasa se insertó en la última construcción. Para esta etapa, se digirió p7.3\alphagluBSE con BglII, se aisló el fragmento de 8,5 kb y se ligó al plásmido p5'3'\alphagluex1 digerido con BglII y desfosforilado. El plásmido resultante es p\alphagluex1 (Fig. 3, panel C).

Las secuencias de promotor de \alphaS1-caseína de bovino se incorporaron en la siguiente etapa mediante una ligación que implicaba tres fragmentos. El vector cósmido pWE15 se digirió con NotI y se desfosforiló. El promotor de \alphaS1-caseína de bovino se aisló como un fragmento de NotI-ClaI de 8 kb (véase de Boer et al. 1991, supra). El fragmento de \alpha-glucosidasa ácida humana se aisló de p\alphagluex1 usando las mismas enzimas. Estos tres fragmentos se ligaron y empaquetaron usando el juego Stratagene GigapackII en células hospedantes de E. coli 1046. El cósmido resultante c8\alphagluex1 se propagó en la cepa de E. coli DH5\alpha. El vector se linealizó con NotI antes de microinyección.

Construcción de c8\alphagluex2 y c8.8\alphagluex2-20

La construcción de los otros dos plásmidos de expresión (Fig. 2, paneles B y C) siguió una estrategia similar a la de c8\alphagluex1. El plásmido p5'\alphagluStuI se derivó de p8,5\alphagluBSE por digestión del plásmido con StuI, seguida por auto-ligación del fragmento aislado que contenía los exones 2-3 más las secuencias del vector. El plásmido p5'\alphagluStuI se digirió con PglII seguida por una digestión parcial del fragmento lineal con NcoI, produciendo varios fragmentos. El fragmento de 2,4 kb, que contenía los exones 2 y 3, se aisló y ligó a los lugares de NcoI y BglII del vector pKUN12\DeltaC, produciendo p5'\alphagluex2. Nótese que pKUN12\DeltaC es un derivado de pKUN8\DeltaC que contiene el polienlazador ClaI NcoI BglII HindIII EcoRI SphI XhoI SmaI/SfiI NotI.

El plásmido p10\alphaglu\DeltaNotI se digirió con BgIII y HindIII. El fragmento que contenía los exones 16-20 se aisló y ligó en p5'\alphagluex2 digerido con BglIII y HindIII. El plásmido resultante fue p5'3'\alphagluex2. El fragmento intermedio en p5'3'\alphagluex2 se insertó como para p\alphagluex1. Para esto, se digirió p7.3\alphaglu con BglII. El fragmento se aisló y ligó al p5'3'\alphagluex2 digerido con BglII y desfosforilado. El plásmido resultante, p\alphagluex2, se usó en la construcción de c8\alphagluex-20 y c8,8\alphagluex2-20 (Fig. 2, paneles B y C).

Para la construcción del tercer plásmido de expresión c8,8\alphagluex2-20 (Fig. 2, panel C), se suprimió la región flanqueante 3' de \alpha-glucosidasa. Para conseguir esto, se digirió p\alphagluex2 con SphI. El fragmento que contenía los exones 2-20 se aisló y auto-ligó, produciendo p\alphagluex2-20. A continuación, el fragmento que contenía la región flanqueante 3' del gen de \alphaS1-caseína de bovino se aisló de p16,8\alphaglu por digestión con SphI y NotI. Este fragmento se insertó en p\alphagluex2-20 usando el lugar de SphI y el lugar de NotI en la secuencia del polienlazador, produciendo p\alphagluex2-20-3\alphaS1.

La etapa final en la generación de c8,8\alphagluex2-20 fue la ligación de tres fragmentos como en la etapa final en la construcción que condujo a c8\alphagluex1. Puesto que el lugar de ClaI en p\alphagluex2-20-3'\alphaS1 y p\alphagluex2 parecía ser indivisible debido a metilación, los plásmidos tenían que propagarse en la cepa de E. coli DAM(-) ECO343. El p\alphagluex2-20-3'\alphaS1 aislado de esa cepa se digirió con ClaI y NotI. El fragmento que contenía los exones 2-20 más la región flanqueante 3' de \alphaS1-caseína se purificaron de las secuencias del vector. Este fragmento, un fragmento de NotI-ClaI de 8 kb que contenía el promotor de \alphaS1 de bovino (véase DeBoer (1991) & (1993), supra) y pWE15 digerido con NotI y desfosforilado se ligaron y empaquetaron. El cósmido resultante es c8,8\alphagluex2-20.

El cósmido c8\alphagluex2 (Fig. 2, panel B) se construyó mediante un par de diferentes etapas. Primero, se digirió el cósmido c8,8\alphagluex2-20 con SalI y NotI. Se aisló el fragmento de 10,5 kb que contenía el promotor de \alphaS1 y los exones 2-6 parte del gen de \alpha-glucosidasa ácida. Segundo, se digirió el plásmido p\alphagluex2 con SalI y NotI para obtener el fragmento que contiene la parte 3' del gen de \alpha-glucosidasa ácida. Finalmente, el vector cósmido pWE15 se digirió con NotI y se desfosforiló. Estos tres fragmentos se ligaron y empaquetaron. El cósmido resultante es c8\alphagluex2.

Ejemplo 2 Transgénesis

El cADN y las construcciones genómicas se linealizaron con NotI y se inyectaron en el pronúcleo de oocitos de ratón fertilizados que se implantaron después en el útero de madres adoptivas ratones pseudopreñadas. Se analizó en la prole la inserción del cADN de \alpha-glucosidasa humana o la construcción del gen de ADN genómica por transferencia Southern de ADN aislado de colas cortadas. Se seleccionaron ratones transgénicos y se criaron.

Las construcciones genómicas linealizadas con NotI se inyectaron también en el pronúcleo de oocitos de conejo fertilizados, que se implantaron en el útero de madres adoptivas conejas pseudopreñadas. Se analizó en la prole la inserción del cADN de alfa-glucosidasa por transferencia Southern. Se seleccionaron conejos transgénicos y se criaron.

Ejemplo 3 Análisis de \alpha-glucosidasa ácida en la leche de ratones transgénicos

Se analizó por transferencia Western la leche de ratones transgénicos y de testigos no transgénicos. La sonda fue anticuerpo de ratón específico para \alpha-glucosidasa ácida humana (es decir, no se une a la enzima de ratón). Los transgenes 1672 y 1673 mostraron expresión de \alpha-glucosidasa ácida humana en leche (Fig. 4). Se observaron como era de esperar para \alpha-glucosidasa bandas principales y pequeñas a 100-110 kD y 76 kD. En la leche de ratones no transgénicos, no se observaron bandas.

La actividad de \alpha-glucosidasa ácida humana se midió con el sustrato artificial 4-metilumbeliferil-\alpha-D-glucopiranósido en la leche de linajes de ratones transgénicos (véase Galiaard, Genetic Metabolic Disease, Early Diagnosis and Prenatal Analysis, Elservier/North Holland, Amsterdam, págs. 809-827 (1980)). Los ratones que contenían la construcción de cADN (Fig. 1) variaron de 0,2 a 2 \mumoles/ml por hora. Los linajes de ratones que contenían la construcción genómica (Fig. 2, panel A) expresaron en niveles de 10 a 610 \mumoles/ml por hora. Estos valores son equivalentes a una producción de 1,3 a 11,3 mg/l (construcción de cADN) y 0,05 a 3,3 g/l (construcción genómica) en base a una actividad específica estimada de la enzima recombinante de 180 \mumoles/mg (Van der Ploeg et al., J. Neurol. 235:392-396 (1988)).

La \alpha-glucosidasa ácida recombinante se aisló de la leche de ratones transgénicos por cromatografía secuencial de leche en ConA-Sepharose® y Sephadex® G200. Se diluyeron 7 ml de leche hasta 10 ml con 3 ml de tampón de Con A, consistente en fosfato sódico 10 mM, pH 6,6 y NaCl 100 mM. Se añadió después una suspensión 1:1 de Con A sepharose en tampón de Con A y se dejó la leche durante la noche a 4ºC con sacudidas suaves. Se recogieron después las perlas de Con A sepharose por centrifugación y se lavaron 5 veces con tampón de Con A, 3 veces con tampón de Con A que contenía NaCl 1 M en lugar de 100 mM y una vez con tampón de Con A que contenía NaCl 0,5 M en lugar de 100 mM, y se eluyeron después por lotes con tampón de Con A que contenía NaCl 0,5 M y metil-\alpha-D-manopiranósido 0,1 M. La actividad de \alpha-glucosidasa ácida en las muestras eluídas se midió usando el sustrato artificial de 4-metil-umbeliferil-\alpha-D-glicopiranósido (véase antes). Las fracciones que contenían actividad de \alpha-glucosidasa ácida se agruparon, concentraron y dializaron frente a tampón de Sephadex consistente en acetato de Na 20 mM, pH 4,5 y NaCl 25 mM, y se aplicaron a una columna de Sephadex® 200. Esta columna se hizo funcionar con el mismo tampón, y se ensayó en las fracciones la actividad de \alpha-glucosidasa ácida y el contenido de proteína. Las fracciones ricas en actividad de \alpha-glucosidasa ácida y prácticamente exentas de otras proteínas se agruparon y concentraron. El método como se ha descrito es esencialmente el mismo que el publicado por Reuser et al., Exp. Cell Res. 155:178-179 (1984). Son posibles varias modificaciones del método considerando la composición exacta y el pH de los sistemas de tampón y la elección de las etapas de purificación en número y en material de columna.

Se ensayó después fosforilación en la \alpha-glucosidasa ácida purificada de la leche administrando la enzima a fibroblastos cultivados de pacientes con GSD II (deficientes en \alpha-glucosidasa ácida endógena). En este ensayo, proteínas que contienen manosa 6-fosfato se unen por receptores de manosa 6-fosfato en la superficie celular de fibroblastos y se internalizan a continuación. La unión se inhibe por manosa 6-fosfato libre (Reuser et al., Exp. Cell Res. 155:178-189 (1984)). En un ensayo típico para la fosforilación de \alpha-glucosidasa ácida aislada de la leche de ratones transgénicos, la \alpha-glucosidasa ácida se añadió a 10^{4}-10^{6} fibroblastos en 500 \mul de medio de cultivo (Ham F10, suministrado con 10% de suero de becerro fetal y Pipes 3 mM) en una cantidad suficiente para metabolizar 1 \mumol de 4-metil-umbeliferil-\alpha-D-glucopiranósido por hora durante un período de tiempo de 20 horas. El experimento se realizó con o sin manosa 6-fosfato 5 mM como competidor, esencialmente como se describe por Reuser et al., supra (1984). En estas condiciones, la \alpha-glucosidasa ácida de los fibroblastos del paciente se restablece al nivel medido en fibroblastos de individuos sanos. El restablecimiento de la actividad de \alpha-glucosidasa ácida endógena por \alpha-glucosidasa ácida aislada de leche de ratones fue tan eficaz como el restablecimiento por \alpha-glucosidasa ácida purificada de testículos de bovino, orina humana y medio de células CHO transfectadas. El restablecimiento por \alpha-glucosidasa de leche se inhibió por manosa 6-fosfato 5 mM como se observó para \alpha-glucosidasa de otras fuentes. (Reuser et al., supra; Van der Ploeg et al., (1988), supra; Van der Ploeg et al., Ped. Res. 24:90-94 (1988)).

Como una demostración adicional de la autenticidad de \alpha-glucosidasa producida en la leche, se demostró que la secuencia de aminoácidos N-terminal de la \alpha-glucosidasa recombinante producida en la leche de ratones era la misma que la del precursor de \alpha-glucosidasa de orina humana, como se publicó por Hoefsloot et al., EMBO J. 7:1697-1704 (1988), que empieza con AHPGRP.

Ejemplo 4 Prueba animal de alfa-glucosidasa

Recientemente, se ha dispuesto un modelo de ratón de eliminación para la enfermedad de Pompe (25). Este modelo se generó por rompimiento con objetivo fijado del gen de alfa-glucosidasa de ratón. Se detectan lisosomas que contienen glicógeno poco después del nacimiento en el hígado, corazón y músculo esquelético. Sólo se evidencian síntomas clínicos abiertos a una edad relativamente tardía (> 9 meses), pero el corazón está típicamente agrandado y el electrocardiograma es anormal.

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Se han realizado experimentos usando el modelo de ratón de eliminación (KO) con el fin de estudiar el efecto in vivo de AGLU purificada de leche de conejo transgénico. La enzima recombinante en estos experimentos se purificó de leche de los conejos transgénicos esencialmente como se ha descrito antes para purificación a partir de ratones transgénicos.

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1. Estudios a corto plazo en modelo de ratón de KO

Se administraron inyecciones simples o múltiples con un intervalo de 6 días a ratones de KO en la vena de la cola. Dos días después de la última administración de enzima se sacrificaron los animales y los órganos se sometieron a perfusión con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se hicieron homogenados de tejidos para ensayos de actividad de enzima GLU y contenido de glicógeno de tejidos, y se hicieron secciones ultradelgadas de diversos órganos para visualizar la acumulación (mediante microscopía electrónica) del contenido de glicógeno lisosómico. También se determinó la localización de AGLU internalizada usando anticuerpos policlonales de conejo contra \alpha-glucosidasa madura de placenta humana.

Los resultados mostraron que dosis simples de 0,7 y 1,7 mg de AGLU (experimentos C y A respectivamente) se absorbieron eficazmente in vivo en diversos órganos de grupos de dos ratones de eliminación cuando se inyectaron intravenosamente. El experimento A mostró también que no había diferencias en la absorción y distribución de AGLU purificada de dos fuentes de leche de conejo independientes.

Se vieron aumentos de la actividad de AGLU en órganos tales como el hígado, bazo, corazón y músculo esquelético, pero no en el cerebro. Dos días después de una inyección simple de 1,7 mg de AGLU a dos animales de KO, se obtuvieron niveles próximos a, o mucho más altos que, los niveles de actividad de alfa-glucosidasa endógena observados en órganos de dos ratones testigo normales inyectados con PBS o dos ratones de KO heterocigóticos (experimento A). De los órganos ensayados, el hígado y el bazo son, cuantitativamente, los principales órganos implicados en absorción, pero también el corazón y los músculos pectoral y femoral absorbieron cantidades significativas de enzima. La ausencia de un aumento significativo en tejido del cerebro sugiere que AGLU no pasa la barrera sangre-cerebro. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Cuando se inyectaron dos ratones de KO 4 veces cada 6 días (experimento B), se observó una disminución notable del glicógeno celular total en el corazón y el hígado. No se observaron efectos en los tejidos de los músculos esqueléticos con respecto a glicógeno total. Sin embargo, en general la absorción de AGLU en estos tejidos fue más baja que en los otros tejidos ensayados.

La microscopía electrónica de transmisión de los ratones de KO inyectados 4 veces indicó una disminución notable del glicógeno lisosómico en células del hígado y células de músculo cardíaco. Los efectos observados en tejido del corazón son localizados, porque en algunas áreas del corazón no se observó disminución del glicógeno lisosómico después de estas administraciones a corto plazo.

El análisis de transferencia Western usando anticuerpos policlonales de conejo contra alfa-glucosidasa madura de placenta humana indicó un tratamiento completo de la AGLU inyectada hacia la enzima madura en todos los órganos ensayados, sugiriendo fuertemente absorción en tejidos objetivo, y localización y tratamiento lisosómicos. No se observaron efectos tóxicos en ninguno de los tres experimentos.

La coloración inmunohistoquímica de AGLU fue evidente en lisosomas de hepatocitos usando un anticuerpo policlonal de conejo contra alfa-glucosidasa humana. La presencia de AGLU en el corazón y los tejidos esqueléticos es más difícil de visualizar con esta técnica, debido aparentemente a la absorción más baja.

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2. Experimentos a largo plazo con el modelo de ratón de KO

En experimentos a plazo más largo, se inyectó enzima en la vena de la cola de grupos de dos o tres ratones de KO, una vez por semana durante períodos de hasta 25 semanas. La dosis inicial fue 2 mg (68 mg/kg) seguida por 0,5 mg (17 mg/kg)/ratón durante 12 semanas. En dos grupos de ratones, esto se siguió por 4 u 11 semanas de tratamiento adicionales de 2 mg/ratón. Las inyecciones comenzaron cuando los ratones tenían 6-7 meses de edad. A esta edad, se había desarrollado en el modelo de KO una histopatología clara. Dos días después de la última administración de enzima, se sacrificaron los animales y se perfusionaron los órganos con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se hicieron homogenados de tejidos para ensayos de actividad de enzima AGLU y contenido de glicógeno en tejidos, y se hicieron secciones de diversos órganos para visualizar (mediante microscopía óptica) la acumulación de glicógeno lisosómico.

Los resultados mostraron que ratones tratados 13 semanas con 0,5 mg/ratón (Grupo A, 3 animales/Grupo) tenían un aumento de actividad en el hígado y el bazo y niveles disminuidos de glicógeno en el hígado y quizás en el corazón. Un animal mostró actividad aumentada en músculos, aunque no hubo una disminución significativa de glicógeno en músculo.

Los ratones que se trataron 14 semanas con 0,5 mg/ratón seguido por 4 semanas con 2 mg/ratón (Grupo B, 3 animales/Grupo) mostraron resultados similares a los tratados durante sólo 13 semanas, excepto que se midió una actividad aumentada en el corazón y músculos esqueléticos y se vieron también disminuciones de niveles de glicógeno en el bazo.

Los ratones que se trataron 14 semanas con 0,5 mg/ratón seguido por 11 semanas con 2 mg/ratón (Grupo C, 2 animales/Grupo) mostraron resultados similares a los otros dos grupos, excepto que los ratones tratados mostraron disminuciones claras de los niveles de glicógeno en el hígado, bazo, corazón y músculo esquelético. No podía detectarse actividad, incluso con la dosis más alta, en el cerebro.

Los resultados de los animales tratados y no tratados en cada Grupo (medias de Grupo) se resumen en la Tabla 3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Además, se observó una mejora muy convincente del estado histopatológico en los ratones del Grupo C (tratados durante las primeras 14 semanas con 0,5 mg/ratón, seguido por 11 semanas con 2 mg/ratón). Se demostró una inversión clara de la patología en diversos tejidos, tales como el corazón y el músculo pectoral.

Se ha indicado que la enfermedad de Pompe no tiene lugar cuando la actividad de \alpha-glucosidasa residual es > 20% del valor testigo medio (14). Los datos obtenidos con el modelo de ratón de KO indican que estos niveles son obtenibles muy bien usando enzima precursora recombinante.

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Ejemplo 5 Prueba clínica humana

Se ha realizado un estudio de fase 1 simple (AGLU1101-01) en 15 voluntarios masculinos sanos. Las dosis de AGLU variaron de 25 a 800 mg, administrados por infusión intravenosa a voluntarios adultos masculinos sanos. Se excluyeron del estudio sujetos con una historia de alergias e hipersensibilidades. Los sujetos se distribuyeron aleatoriamente en grupos de dosis de 5, y cada Grupo de dosis recibió AGLU (4 sujetos) o placebo (1 sujeto) en cada nivel de dosis. Todos los sujetos recibieron dos dosis de fármaco de estudio, que se administraron separadas dos semanas. El régimen de dosis fue como sigue:

: A

: 25 mg: Grupo 1, período de tratamiento 1

: B

: 50 mg: Grupo 1, período de tratamiento 2

: C

: 100 mg: Grupo 2, período de tratamiento 1

: D

: 200 mg: Grupo3, período de tratamiento 1

: E

: 400 mg: Grupo 2, período de tratamiento 2

: F

: 800 mg: Grupo 3, período de tratamiento 2

: P

: placebo (1 sujeto por Grupo y período de tratamiento)

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Se administró a los sujetos AGLU o placebo como una infusión el Día 1 de cada período de tratamiento. Las infusiones se administraron durante un período de 30 minutos y se mantuvo a los sujetos en una posición semi-recostada durante al menos 2 horas después de cesar la infusión.

Se registraron sucesos adversos inmediatamente antes del comienzo de la infusión, a los 30 minutos (fin de la infusión) y a las 3, 12, 24, 36 y 48 horas posteriores, así como los Días 5 y 8 (primer período) y los días 5, 8 y 15 (segundo período). Se comprobaron también regularmente durante todo el período de tratamiento signos vitales, ECG y exámenes físicos.

Se tomaron muestras de sangre para un intervalo estándar de ensayos clínicos de laboratorio y análisis farmacocinéticos. Se recogió la orina de los sujetos y se realizó un intervalo estándar de análisis de laboratorio (incluyendo determinación de AGLU).

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(a) Seguridad de laboratorio y sucesos adversos

No hubo cambios significativos clínicamente en parámetros de laboratorio, signos clínicos y mediciones de ECG en ningún sujeto en cualquier Grupo de dosis. Los resultados de comprobación de sucesos adversos en todos los sujetos con todas las dosis se resumen en la Tabla 4.

TABLA 4 Relatos de sucesos adversos

5

Se realiza un ensayo clínico de la seguridad y eficacia de \alpha-glucosidasa recombinante como terapia de sustitución de enzimas en pacientes infantiles y juveniles con enfermedad de almacenamiento de glicógeno Tipo II. Se reclutan cuatro pacientes infantiles y tres pacientes juveniles. Se administra a los infantiles una dosis de partida de 15-20 mg/kg titulada hasta 40 mg/kg y se administra a los juveniles 10 mg/kg. Los pacientes se tratan durante 24 semanas.

\newpage

Se evalúan los pacientes mediante los siguientes parámetros.

\text{*}: Relato de sucesos adversos estándares incluyendo sucesos adversos sospechados

\text{*}: Parámetros de laboratorio incluyendo hematología, química clínica y detección de anticuerpos

\text{*}: Actividad de \alpha-glucosidasa en músculo

\text{*}: Histopatología muscular

\text{*}: ECG de 12 registros

\text{*}: Estado clínico incluyendo examen neurológico

\text{*}: Parámetros PK no paramétricos

\text{*}: Intervenciones para salvar la vida

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Se evaluaron en los pacientes infantiles los siguientes parámetros adicionales

\text{*}: Espesor de la pared ventricular posterior izquierda e índice de masa ventricular

\text{*}: Desarrollo neuromotor

\text{*}: Supervivencia

\text{*}: Contenido de glicógeno en el músculo

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Se evaluaron en los pacientes juveniles los siguientes parámetros adicionales

\text{*}: Función pulmonar

\text{*}: Ensayos temporizados de fuerza muscular y función muscular

\text{*}: Escala de 9 asuntos PEDI/Rotterdam

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Se someten después los mismos pacientes a dosificaciones adicionales de alfa glucosidasa, recibiendo los infantiles 15, 20, 30 o 40 mg/kg y los juveniles 10 mg/kg durante un período adicional de 24 semanas, y se evalúan por los parámetros indicados antes.

Se realiza una prueba clínica de fase II adicional en ocho pacientes de < 6 meses de edad en 2 meses después de la diagnosis con una dosificación de 40 mg/kg. Se tratan los pacientes durante 24 semanas y se evalúan mediante los siguientes criterios:

Parámetros de seguridad

Datos de seguridad de laboratorio

Registro de sucesos adversos

Parámetro de eficacia primaria: supervivencia sin intervenciones para salvar la vida (es decir, ventilación mecánica > 24 horas) 6 meses después de la diagnosis en combinación con función motora normal o retrasada suavemente (BSID II).

Eficacia secundaria: Cambios del desarrollo neuromotor; cambios del espesor de pared ventricular posterior izquierda e índice de masa ventricular izquierda; cambios de la actividad de \alpha-glucosidasa ácida del músculo esquelético y contenido de glicógeno.

La eficacia puede mostrarse por una supervivencia del 50% a los 6 meses post-diagnosis sin intervenciones para salvar la vida en el grupo de \alpha-glucosidasa en comparación con una supervivencia del 10% en el grupo testigo histórico en combinación con una BSID II clasificada como normal o retrasada suavemente.

Se realiza una prueba clínica adicional en pacientes juveniles. Los pacientes tienen > 1 año y < 35 años de edad con comienzo juvenil de GSD tipo IIb. Se administra a los pacientes 10 mg/kg o 20 mg/kg durante un período de tratamiento de venticuatro horas.

Se comprueba el tratamiento mediante los siguientes parámetros.

Parámetros de seguridad.: Datos de seguridad de laboratorio

\quad: Registro de sucesos adversos

Eficacia primaria: Parámetros de función pulmonar (por ejemplo, FVC, tiempo en ventilador)

\quad: Fuerza muscular

Eficacia secundaria: Parámetros de intervenciones para salvar la vida:

\quad: Calidad de vida

\quad: Actividad de \alpha-glucosidasa de músculo esquelético

Objetivo cuantitativo: Mejora relativa del 20% en parámetros de eficacia primaria sobre la línea de base

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Todas las mediciones cuantitativas relativas a eficacia son preferiblemente significativas estadísticamente con relación a testigos contemporáneos o históricos, preferiblemente con p < 0,05.

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Ejemplo 6 Formulaciones farmacéuticas

Se formula alfa-glucosidasa como sigue: 5 mg/ml de \alpha-Glu, fosfato sódico 15 mM, pH 6,5, 2% (p/p) de manitol y 0,5% (p/p) de sacarosa. Se llena con la formulación anterior hasta un volumen final de 10,5 ml un vial de tubo y se liofiliza. Para ensayo, liberación y uso clínico, se reconstituye cada vial con 10,3 ml* de solución salina estéril (0,9%) para inyección (USP o equivalente) para producir 10,5 ml de solución de \alpha-Glu de 5 mg/ml que puede administrarse directamente o diluirse seguidamente con solución salina estéril hasta una concentración de dosis objetivo específica para el paciente. La carga de 10,5 ml (52,5 mg de alfa glucosidasa total en el vial) incluye el sobrante recomendado USP, que permite la extracción y suministro (o transferencia) de 10 ml (50 mg). El manitol sirve como agente de carga adecuado que acorta el ciclo de liofilización (con relación a sacarosa sola). La sacarosa sirve como crio/lipoprotector, produciendo un aumento no significativo de agregación tras la reconstitución. La reconstitución de las formulaciones de manitol (sólo) ha producido repetidamente un ligero aumento de agregación. Tras la liofilización, la calidad de la torta era aceptable y los tiempos de reconstitución subsiguientes se redujeron significativamente. Se prefiere solución salina a HSA/dextrosa para solución de infusión. Cuando se usa solución salina en combinación con liofilización en 2% de manitol/0,5% de sacarosa, la solución tiene una tonicidad aceptable para administración intravenosa. Los viales liofilizados que contenían el 2% de manitol/0,5% de sacarosa se reconstituyeron con 0,9% de solución salina estéril (para inyección) para producir 5 mg/ml de \alpha-Glu.

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Ejemplo 7 Programa de infusión

La solución se administra mediante la cánula intravenosa residente. Se comprueban estrechamente los pacientes durante el período de infusión y se efectúa una intervención clínica apropiada en caso de un suceso adverso o un suceso adverso sospechado. Se permite para cada infusión una ventana de 48 horas. Un programa de infusión en el que la proporción de infusión aumenta con el tiempo reduce o elimina sucesos adversos.

Las infusiones para infantiles pueden administrarse según el siguiente programa:

\bullet: 5 cm^{3}/h durante 60 minutos

\bullet: 10 cm^{3}/h durante 60 minutos

\bullet: \geq 40 cm^{3}/h durante 30 minutos

\bullet: \geq 80 cm^{3}/h durante el resto de la infusión

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Las infusiones para juveniles pueden administrarse según el siguiente programa:

\bullet: 0,5 cm^{3}/kg/h durante 60 minutos

\bullet: 1 cm^{3}/kg/h durante 60 minutos

\bullet: 5 cm^{3}/kg/h durante 30 minutos

\bullet: 7,5 cm^{3}/kg/h durante el resto de la infusión

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Aunque se ha descrito la invención anterior con algún detalle con fines de claridad y comprensión, estará claro para un experto en la técnica de una lectura de esta descripción que pueden hacerse diversos cambios de forma y detalle sin alejarse del alcance verdadero de la invención. Todas las publicaciones y documentos de patentes citados en esta solicitud se incorporan como referencia en su integridad para todos los fines en la misma extensión en que cada publicación o documento de patente individual lo indicara así individualmente.

Claims

1. El uso de alfa glucosidasa ácida humana en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad de Pompe infantil, en el que la alfa glucosidasa ácida humana está en forma de 100 a 110 kD, en el que el medicamento es para administrarse intravenosamente, y en el que el tratamiento es para continuarse durante al menos 4 semanas.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que la alfa glucosidasa ácida humana tiene un peso molecular de 110 kD.

3. El uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento está adaptado para proporcionar al menos 10 mg/kg de alfa glucosidasa ácida humana por semana.

4. El uso de la reivindicación 1, en el que el medicamento está adaptado para proporcionar 20 mg/kg de alfa glucosidasa ácida humana por semana.

5. El uso de la reivindicación 1, en el que el niño a tratar sobrevive hasta tener al menos un año de edad.

6. El uso de la reivindicación 1, en el que la proporción de administración del medicamento ha de aumentarse durante el período de administración.

7. El uso de la reivindicación 1, en el que la administración del medicamento ha de continuarse durante al menos 24 semanas.

8. El uso de la reivindicación 1, en el que las dosis del medicamento han de administrarse una vez a la semana.

9. El uso de la reivindicación 1, en el que las dosis del medicamento han de administrarse tres veces a la semana.