ES2629853T3 - Péptidos de dirección lisosómica y usos de los mismos - Google Patents

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ES2629853T3 ES09743707.3T ES09743707T ES2629853T3 ES 2629853 T3 ES2629853 T3 ES 2629853T3 ES 09743707 T ES09743707 T ES 09743707T ES 2629853 T3 ES2629853 T3 ES 2629853T3
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Jonathan H. Lebowitz
John Maga
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Abstract

Una proteína de fusión terapéutica dirigida que comprende: una enzima lisosómica; y una muteína IGF-II que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 70 % idéntica a IGF-II humano maduro (SEQ ID NO: 1) y que comprende una mutación dentro de una región correspondiente a los aminoácidos 30-40 de la SEQ ID NO: 1 de modo que la mutación anula al menos un sitio de escisión con proteasa furina, en la que la muteína IGF-II (a) se une al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes de una manera independiente de manosa-6-fosfato; (b) es resistente a escisión por furina; y (c) tiene afinidad de unión disminuida por el receptor de insulina respecto a la afinidad del IGF-II humano de origen natural por el receptor de insulina.

Description

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DESCRIPCION
Peptidos de direccion lisosomica y usos de los mismos Antecedentes
Normalmente, las enzimas lisosomicas de mairnfero se sintetizan en el citosol y atraviesan el RE donde se glucosilan con un carbohidrato ligado a N de tipo manosa elevado. En el Golgi, el carbohidrato de alto contenido de manosa se modifica en protemas lisosomicas por la adicion de manosa-6-fosfato (M6P) que dirige estas protemas al lisosoma. Las protemas modificadas con M6P se suministran al lisosoma a traves de la interaccion con cualquiera de los dos receptores de M6P. La forma mas favorable de modificacion es cuando se anaden dos M6P a un carbohidrato de alto contenido de manosa.
Mas de 40 enfermedades de almacenamiento lisosomico (LSD) estan causadas, directa o indirectamente, por la ausencia de una o mas enzimas lisosomicas en el lisosoma. La terapia de remplazo enzimatico para LSD se esta persiguiendo activamente. La terapia generalmente requiere que se capten protemas LSD y se suministren a los lisosomas de una diversidad de tipos celulares de un modo dependiente de M6P. Una estrategia posible implica purificar una protema LSD y modificarla para que incorpore un resto de carbohidrato con M6P. Este material modificado puede captarse por las celulas de forma mas eficaz que las protemas LSD sin modificar debido a la interaccion con receptores de M6P sobre la superficie celular.
Los inventores de la presente solicitud han desarrollado previamente una tecnologfa de direccion basada en peptidos que permite un suministro mas eficaz de enzimas terapeuticas a los lisosomas. Esta tecnologfa patentada se llama Direccion Lisosomica Independiente de Glucosilacion (GILT) porque una marca peptfdica remplaza M6P como el resto de direccion a los lisosomas. Los detalles de la tecnologfa GILT se describen en las publicaciones de solicitud de Estados Unidos n.° 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 2005-0281805, 2005-0244400 y las publicaciones internacionales WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona composiciones mejoradas adicionales y metodos para la direccion lisosomica eficaz basada en la tecnologfa GILT. Entre otras cosas, la presente invencion proporciona metodos y composiciones para dirigir enzimas lisosomicas a los lisosomas usando peptidos de direccion lisosomica resistentes a furina. La presente invencion tambien proporciona metodos y composiciones para dirigir enzimas lisosomicas a los lisosomas usando un peptido de direccion lisosomica que tiene afinidad de union reducida o disminuida por el receptor de insulina. La presente invencion abarca el descubrimiento inesperado de que peptidos de direccion lisosomica resistentes a furina de acuerdo con la invencion tienen afinidad de union reducida por el receptor de insulina.
Por tanto, la presente invencion proporciona una protema de fusion terapeutica dirigida que comprende:
una enzima lisosomica; y
una mutema IGF-II que tiene una secuencia de aminoacidos al menos un 70 % identica a IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 1),
y que comprende una mutacion dentro de una region correspondiente a los aminoacidos 30-40 de la SEQ ID NO: 1 de modo que la mutacion anule al menos un sitio de escision por proteasa furina, donde la mutema IGF-II (a) se une al receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes humano de una manera independiente de manosa-6-fosfato; (b) es resistente a la escision con furina y (c) tiene afinidad de union disminuida por el receptor de insulina respecto a la afinidad de IGF-II humana de origen natural por el receptor de insulina.
Una mutema IGF-II adecuada para la invencion incluye una mutacion dentro de una region correspondiente a los aminoacidos 30-40 de la SEQ Id NO: 1. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II adecuada para la invencion incluye una mutacion dentro de una region correspondiente a los aminoacidos 30-40 de la SEQ ID NO: 1 de modo que la mutacion anula al menos un sitio de escision por proteasa furina. En algunas realizaciones, una mutacion adecuada es una sustitucion, delecion y/o insercion de aminoacido. En algunas realizaciones, la mutacion es una sustitucion de aminoacidos en una posicion correspondiente a Arg37 o Arg40 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la sustitucion de aminoacidos es una sustitucion de Lys o Ala.
En algunas realizaciones, una mutacion adecuada es una delecion o remplazo de restos de aminoacido correspondientes a las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 3139, 32-39, 34-37, 32-39, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40, 34-40 de la SEQ ID NO: 1 y combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, una mutema IGF-II de acuerdo con la invencion contiene adicionalmente una delecion o un remplazo de aminoacidos correspondientes a las posiciones 2-7 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II de acuerdo con la invencion incluye adicionalmente una delecion o un remplazo de aminoacidos correspondientes a las posiciones 1-7 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II de acuerdo
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con la invencion contiene adicionalmente una delecion o un remplazo de aminoacidos correspondientes a las posiciones 62-67 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II de acuerdo con la invencion contiene adicionalmente una sustitucion de aminoacidos en una posicion correspondiente a Tyr27, Leu43, o Ser26 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II de acuerdo con la invencion contiene al menos una sustitucion de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en Tyr27Leu, Leu43Val, Ser26Phe y combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II de acuerdo con la invencion contiene aminoacidos correspondientes a las posiciones 48-55 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II de acuerdo con la invencion contiene al menos tres aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en los aminoacidos correspondientes a las posiciones 8, 48, 49, 50, 54 y 55 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones una mutema IGF-II de la invencion contiene, en las posiciones correspondientes a las posiciones 54 y 55 de la SEQ ID NO: 1, aminoacidos cada uno de los cuales esta sin cargar a cargado negativamente a pH 7,4. En algunas realizaciones, la mutema IGF-II tiene afinidad de union disminuida por el receptor de IGF-I respecto a la afinidad de IGF-II humana de origen natural por el receptor de IGF-I.
En algunas realizaciones, una enzima lisosomica adecuada para la invencion es alfa-glucosidasa acida (GAA) humana o una variante funcional de la misma. En algunas realizaciones, una enzima lisosomica adecuada para la invencion incluye los aminoacidos 70-952 de GAA humana.
En algunas realizaciones, una protema de fusion terapeutica dirigida de la invencion incluye adicionalmente un espaciador entre la enzima lisosomica y la mutema IGF-II resistente a furina. En algunas realizaciones, el espaciador contiene una secuencia de aminoacidos Gly-Ala-Pro.
La presente invencion tambien proporciona acidos nucleicos que codifican la mutema IGF-II o la protema de fusion terapeutica dirigida como se describe en diversas realizaciones anteriormente. La presente invencion proporciona adicionalmente diversas celulas que contienen el acido nucleico de la invencion.
La presente invencion proporciona composiciones farmaceuticas adecuadas para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomico, que contiene una cantidad terapeuticamente eficaz de una protema de fusion terapeutica dirigida de la invencion. La invencion proporciona adicionalmente protemas de fusion terapeuticas dirigidas de la invencion para su uso en metodos de tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosomico, que comprenden administrar a un sujeto que necesita tratamiento una protema de fusion terapeutica dirigida de acuerdo con la invencion. En algunas realizaciones, la enfermedad de almacenamiento lisosomico es enfermedad de Pompe. En algunas realizaciones, la enfermedad de almacenamiento lisosomico es enfermedad de Fabry. En algunas realizaciones, la enfermedad de almacenamiento lisosomico es enfermedad de Gaucher.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo de produccion de una protema de fusion terapeutica dirigida, que incluye una etapa de cultivo de celulas de marnffero en un medio de cultivo celular, donde las celulas de mairnfero portan el acido nucleico de la invencion, en particular, como se describe en diversas realizaciones en este documento; y el cultivo se realiza en condiciones que permitan la expresion de la protema de fusion terapeutica dirigida.
En otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un metodo de produccion de una protema de fusion terapeutica dirigida, que incluye una etapa de cultivo de celulas deficientes de furina (por ejemplo, celulas de mamffero deficientes de furina) en un medio de cultivo celular, donde las celulas deficientes de furina portan un acido nucleico que codifica una protema de fusion que comprende una enzima lisosomica y una mutema IGF-II que tiene una secuencia de aminoacidos al menos un 70 % identica a IGF-II humana madura (SEQ ID NO: 1), donde la mutema IGF-II se une al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes de una manera independiente de manosa-6-fosfato; y donde el cultivo se realiza en condiciones que permiten la expresion de la protema de fusion terapeutica dirigida.
Otras caractensticas, objetivos y ventajas de la presente invencion seran evidentes en la descripcion detallada a continuacion. Debe entenderse, sin embargo, que la descripcion detallada, aunque indica realizaciones de la presente invencion, se da a modo de ilustracion solamente, no de limitacion. Diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invencion llegaran a ser evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripcion detallada.
Breve descripcion de los dibujos
Los dibujos son con motivos de ilustracion solamente, no para su limitacion.
La fig. 1 ilustra un mapa del extremo N-terminal de ZC-701. Dos restos de aminoacido en recuadro son sitios de eventos de escision. El primero es el sitio de la escision del peptido senal, el segundo es el sitio de escision con furina.
La fig. 2 ilustra un analisis SDS-PAGE ejemplar de ZC-701 despues de tratamiento con PNGasa F. El carril en la derecha se ha tratado adicionalmente con furina.
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Fig. 3 Izquierda: Ilustracion esquematica de mutantes ZC-701 ejemplares en que el sitio de escision con furina esta modificado. Centro: Analisis SDS-PAGE ejemplar de mutantes tratados con PNGasa despues de 3-7 d^as de cultivo celular. Derecha: Analisis SDS-PAGE ejemplar de mutantes tratados con PNGasa tratados con furina.
La fig. 4 ilustra los resultados de union al receptor de IGF-II competitivo ejemplar.
La fig. 5 ilustra los resultados de union al receptor de IGF-II competitivo ejemplar adicional.
La fig. 6 ilustra los resultados del ensayo de competicion con el receptor de insulina ejemplar.
La fig. 7 ilustra los resultados del ensayo de competicion con el receptor de IGF-I ejemplar.
La fig. 8 ilustra los resultados ejemplares de cierto ensayo de union al receptor de insulina.
La fig. 9 ilustra los resultados ejemplares de cierto ensayo de union al receptor de insulina.
La fig. 10 ilustra el analisis ejemplar de GAA marcada con GILT parcialmente purificada de transfecciones transitorias. Se transfectaron celulas HEK293 con las construcciones 1479, 1487 o ZC-701. Despues de la recoleccion, los sobrenadantes de cultivo se purificaron parcialmente por cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC). Todas las muestras se trataron con PNGasa antes de la electroforesis. Paneles de la izquierda: SDS- PAGE de protemas purificadas parcialmente. ZC-701 B12 purificada se muestra como control. Paneles de la derecha: Analisis de inmunotransferencia de las protemas purificadas parcialmente. Se uso el anticuerpo primario indicado. Los paneles inferiores se trataron adicionalmente con furina exogena. La protema codificada por la construccion 1487 es identica en secuencia a la codificada por la construccion 1461 (R37A). La protema codificada por la construccion 1479 es identica a la codificada por la construccion 1459 (R37K).
La fig. 11 ilustra los resultados ejemplares de captacion de la GAA marcada con GILT resistente a furina ejemplar en mioblastos de rata L6. Las Kcaptacion para la protema 1479, 1487, ZC-701 y ZC-701 purificada con 4,5 nM, 4,4 nM, 5.0 nM y 2,6 nM, respectivamente. La protema codificada por la construccion 1487 es identica en secuencia a la codificada por la construccion 1461 en la figura 3 (R37A). La protema codificada por la construccion 1479 es identica a la codificada por la construccion 1459 en la figura 3 (R37K).
Definiciones
Mejora: Como se usa en este documento, el termino "mejora" significa la prevencion, reduccion o paliacion de un estado, o la mejora del estado de un sujeto. Mejora incluye, aunque no requiere, recuperacion completa o prevencion completa de una afeccion patologica. En algunas realizaciones, mejora incluye la reduccion de materiales acumulados dentro de los lisosomas de tejidos enfermos relevantes.
Mute^na IGF-II resistente a furina: Como en este documento, la expresion "mutema IGF-II resistente a furina" se refiere a un peptido basado en IGF-II que contiene una secuencia alterada de aminoacidos que anula al menos un sitio de escision proteasa furina nativo o cambia una secuencia cerca o adyacente de un sitio de escision con proteasa furina nativo de modo que se evita, inhibe, reduce o ralentiza la escision con furina en comparacion con un peptido IGF-II humano de tipo silvestre. Como se usa en este documento, una mutema IGF-II resistente a furina tambien se menciona como una mutema IGF-II que es resistente a furina.
Sitio de escision con proteasa furina: Como se usa en este documento, la expresion "sitio de escision con proteasa furina" (tambien mencionado como "sitio de escision con furina" o "secuencia de escision con furina") se refiere a la secuencia de aminoacidos de un peptido o protema que sirve como secuencia de reconocimiento para la escision con proteasa enzimatica por furina o proteasas de tipo furina. Tfpicamente, un sitio de escision con proteasa furina tiene una secuencia consenso Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO: 2), X es cualquier aminoacido. El sitio de escision esta situado despues del resto de arginina (Arg) carboxiterminal en la secuencia. En algunas realizaciones, un sitio de escision con furina puede tener una secuencia consenso Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 3), X es cualquier aminoacido. El sitio de escision esta situado despues del resto de arginina (Arg) carboxiterminal en la secuencia.
Furina: Como se usa en este documento, el termino "furina" se refiere a cualquier proteasa que puede reconocer y escindir el sitio de escision con proteasa furina como se define en este documento, incluyendo furina o proteasa de tipo furina. Furina tambien se conoce como enzima de escision de aminoacido basico emparejado (PACE). La furina pertenece a la familia de proprotema convertasa de tipo subtilisina. El gen que codifica la furina se conocio como FUR (region en direccion 5' de FES).
Celulas deficientes de furina: Como se usa en este documento, la expresion "celulas deficientes de furina" se refiere a cualquier celula cuya actividad proteasa furina esta inhibida, reducida o eliminada. Las celulas deficientes de furina incluyen tanto celulas de mairnfero como celulas que no son de mairnfero que no producen furina o producen una cantidad reducida de furina o proteasa furina defectuosa.
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Direccion lisosomica independiente de glucosilacion. Como se usa en este documento, la expresion "direccion lisosomica independiente de glucosilacion" (tambien mencionada como "GILT") se refiere a direccion lisosomica que es independiente de manosa-6-fosfato.
Alfa-glucosidasa acida humana. Como se usa en este documento, la expresion "alfa-glucosidasa acida humana" (tambien mencionada como "GAA") se refiere a la forma de tipo silvestre precursora de GAA humana o una variante funcional que es capaz de reducir los niveles de glucogeno en lisosomas de mairnfero o que puede reducir o mejorar uno o mas smtomas de la enfermedad de Pompe.
Mejorar, aumentar o reducir. Como se usan en este documento, los terminos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medicion basal, tal como una medicion en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en ese documento, o una medicion en un individuo de control (o multiples individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito en ese documento. Un "individuo de control" es un individuo afectado con la misma forma de enfermedad de almacenamiento lisosomico (por ejemplo, la enfermedad de Pompe) que el individuo que se esta tratando, que es aproximadamente de la misma edad que el individuo que se esta tratando (para asegurar que las fases de la enfermedad en el individuo tratado y el individuo o individuos de control son comparables).
Individuo, sujeto, paciente. Como se usan en este documento, los terminos "individuo", "sujeto, o "paciente" se refieren a un ser humano o un sujeto marnffero no humano. El individuo (tambien mencionado como "paciente" o "sujeto") que se esta tratando es un individuo (feto, lactante, nino, adolescente o ser humano adulto) que padece una enfermedad de almacenamiento lisosomico, por ejemplo, enfermedad de Pompe (es decir, enfermedad de Pompe de aparicion infantil, juvenil o en el adulto) o que tiene el potencial de desarrollar una enfermedad de almacenamiento lisosomico (por ejemplo, enfermedad de Pompe).
Enfermedades de almacenamiento lisosomico. Como se usa en este documento, "enfermedades de almacenamiento lisosomico" se refiere a un grupo de trastornos geneticos que resultan de la deficiencia de al menos una de las enzimas (por ejemplo, hidrolasas acidas) que son necesarias para descomponer las macromoleculas en peptidos, aminoacidos, monosacaridos, acidos nucleicos y acidos grasos en los lisosomas. Como resultado, los individuos que padecen enfermedades de almacenamiento lisosomico tienen materiales acumulados en los lisosomas. Las enfermedades de almacenamiento lisosomico ejemplares se enumeran en la tabla 1.
Enzima lisosomica. Como se usa en este documento, la expresion "enzima lisosomica" se refiere a cualquier enzima que es capaz de reducir los materiales acumulados en lisosomas de marnffero o que puede rescatar o mejorar uno o mas smtomas de la enfermedad de almacenamiento lisosomico. Las enzimas lisosomicas adecuadas para la invencion incluyen enzimas lisosomicas tanto de tipo silvestre como modificadas y pueden producirse usando metodos recombinantes y sinteticos o purificarse de fuentes naturales. Las enzimas lisosomicas ejemplares se enumeran en la tabla 1.
Espaciador. Como se usa en este documento, el termino "espaciador" (tambien mencionado como "enlazador") se refiere a una secuencia peptfdica entre dos restos de protema en una protema de fusion. Un espaciador generalmente se disena para que sea flexible o para interponer una estructura, tal como una helice alfa, entre los dos restos de protema. Un espaciador puede ser relativamente corto tal como la secuencia Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO. 4) o Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO. 5), o puede ser mas largo tal como, por ejemplo, 10-25 aminoacidos de longitud.
Cantidad terapeuticamente eficaz. Como se usa en este documento, la expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una protema de fusion terapeutica dirigida que confiere un efecto terapeutico al sujeto tratado, a una relacion razonable de beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento medico. El efecto terapeutico puede ser objetivo (es decir, medible por algun ensayo o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto da una indicacion o siente un efecto). En particular, la "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una protema de fusion terapeutica o composicion eficaz para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afeccion deseada, o para mostrar un efecto terapeutico o preventivo detectable, tal como mejorando los smtomas asociados con la enfermedad, previniendo o retardando la aparicion de la enfermedad y/o tambien disminuyendo la gravedad o frecuencia de los smtomas de la enfermedad. Una cantidad terapeuticamente eficaz habitualmente se administra en un regimen de dosificacion que puede comprender multiples dosis unitarias. Para cualquier protema de fusion terapeutica particular, una cantidad terapeuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada en un regimen de dosificacion eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la via de administracion, en combinacion con otros agentes farmaceuticos. Ademas, la cantidad terapeuticamente eficaz espedfica (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una diversidad de factores, incluyendo el trastorno que se esta tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmaceutico espedfico empleado; la composicion espedfica empleada; la edad, peso corporal, salud general, genero y dieta del paciente; el tiempo de administracion; la via de administracion y/o la tasa de excrecion o metabolismo de la protema de fusion espedfica empleada; la duracion del tratamiento; y factores similares que son bien conocidos en las tecnicas medicas.
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Tratamiento: Como se usa en este documento, el termino "tratamiento" (tambien "tratar" o "tratando") se refiere a cualquiera administracion de una protema de fusion terapeutica que alivia, mejora, mitiga, inhibe, retrasa la aparicion de, reduce la gravedad de y/o reduce la incidencia parcial o completamente de uno o mas smtomas o caractensticas de una enfermedad, trastorno y/o afeccion particular. Dicho tratamiento puede ser de un sujeto que no muestra signos de la enfermedad, trastorno y/o afeccion relevante y/o de un sujeto que muestra solamente signos prematuros de la enfermedad, trastorno y/o afeccion. Como alternativa o adicionalmente, dicho tratamiento puede ser de un sujeto que muestra uno o mas signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o afeccion relevante. Por ejemplo, el tratamiento puede referirse a mejora del estado cardfaco (por ejemplo, aumento del volumen final diastolico y/o el volumen final sistolico, o reduccion, mejora o prevencion de la cardiomiopatfa progresiva que se encuentra tfpicamente en enfermedad de Pompe) o de la funcion pulmonar (por ejemplo, aumento en la capacidad vital de llorar sobre la capacidad basal, y/o normalizacion de la desaturacion de oxfgeno durante el llanto); mejora en el neurodesarrollo y/o las habilidades motoras (por ejemplo, aumento en el valor AIMS); reduccion de los niveles de glucogeno en tejido del individuo afectado por la enfermedad; o cualquier combinacion de estos efectos. En algunas realizaciones, el tratamiento incluye mejora de la eliminacion de glucogeno, particularmente en la reduccion o prevencion de la cardiomiopatfa asociada con la enfermedad de Pompe.
Los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Cualquier numero usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente se entiende cubriendo cualquier fluctuacion normal apreciada por un experto en la materia relevante.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona metodos y composiciones para dirigir enzimas lisosomicas basandose en la tecnologfa de direccion lisosomica independiente de glucosilacion (GILT). Entre otras cosas, la presente invencion proporciona mutemas IGF-II que son resistentes a furina y/o tienen afinidad de union reducida o disminuida por el receptor de insulina y protemas de fusion terapeuticas dirigidas que contienen una mutema IGF-II de la invencion. La presente invencion tambien proporciona metodos de preparacion y uso de las mismas.
Se describen en detalle diversos aspectos de la invencion en las siguientes secciones. El uso de las secciones no pretende limitar la invencion. Cada seccion puede aplicarse a cualquier aspecto de la invencion. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" salvo que se indique lo contrario.
Enzimas lisosomicas
Una enzima lisosomica adecuada para la invencion incluye cualquier enzima que sea capaz de reducir los materiales acumulados en lisosomas de mairnfero o que pueda rescatar o mejorar uno o mas smtomas de enfermedad de almacenamiento lisosomico. Las enzimas lisosomicas adecuadas incluyen enzimas lisosomicas tanto de tipo silvestre como modificadas y pueden producirse usando metodos recombinantes o sinteticos o pueden purificarse de fuentes naturales. Las enzimas lisosomicas ejemplares se enumeran en la tabla 1.
Tabla 1. Enfermedades de almacenamiento lisosomico y defectos enzimaticos asociados
A. Trastornos de glucogenosis
Nombre de la enfermedad
Defecto enzimatico Sustancia almacenada
Enfermedad de Pompe
Acido-a1,4-glucosidasa Oligosacaridos ligados a glucogeno a 1-4
B. Trastornos de glucolipidosis
Nombre de la enfermedad
Defecto enzimatico Sustancia almacenada
Gangliosidosis GM1
3-galactosidasa Gangliosidos GM1
Enfermedad de Tay-Sachs
3-hexosaminidasa A Gangliosidos GM2
Gangliosidosis GM2: variante AB
Protema activadora GM2 Gangliosidos GM2
Enfermedad de Sandhoff
3-hexosaminidasa Ay B Gangliosidos GM2
Enfermedad de Fabry
a-galactosidasa A Globosidos
Enfermedad Gaucher
Glucocerebrosidasa Glucosilceramida
Leucodistrofia metacromatica
Arilsulfatasa A Sulfatidos
Enfermedad de Krabbe
Galactosilceramidasa Galactocerebrosido
Niemann-Pick, tipos A y B
Acido esfingomielinasa Esfingomielina
Niemann-Pick, tipo C
Defecto de esterificacion del colesterol Esfingomielina
Niemann-Pick, tipo D
Desconocido Esfingomielina
Enfermedad de Farber
Acido ceramidasa Ceramida
Enfermedad de Wolman
Acido lipasa Esteres de colesterilo
C. Trastornos de mucopolisacarido
Nombre de la enfermedad
Defecto enzimatico Sustancia almacenada
Sindroma de Hurler (MPS IH)
a-L-iduronidasa Heparan y dermatan sulfatos
Smdrome de Scheie (MPS IS)
a-L-iduronidasa Heparan y dermatan sulfatos
Hurler-Scheie (MPS IH/S)
a-L-iduronidasa Heparan y dermatan sulfatos
Smdrome de Hunter (MPS II)
Iduronato sulfatasa Heparan y dermatan sulfatos
Sanfilippo A (MPS IIIA)
Heparan N-sulfatasa Heparan sulfato
Sanfilippo B (MPS IIIB)
a-N-acetilglucosaminidasa Heparan sulfato
Sanfilippo C (MPS IIIC)
Acetil-CoA-glucosammido acetiltransferasa Heparan sulfato
Sanfilippo D (MPS IIID)
N-acetilglucosamina-6-sulfatasa Heparan sulfato
Morquio A (MPS IVA)
Galactosamina-6-sulfatasa Queratan sulfato
Morquio B (MPS IVB)
p-galactosidasa Queratan sulfato
Maroteaux-Lamy (MPS VI)
Arilsulfatasa B Dermatan sulfato
Smdrome de Sly (MPS VII)
p-glucuronidasa
D. Trastornos de oligosacarido/glucoprotema
Nombre de la enfermedad
Defecto enzimatico Sustancia almacenada
a-manosidosis
a-manosidasa Manosa/oligosacaridos
p-manosidosis
p-manosidasa Manosa/oligosacaridos
Fucosidosis
a-L-fucosidasa Oligosacaridos de fucosilo
Aspartilglucosaminuria
N-aspartil-p-glucosaminidasa Aspartilglucosamina asparaginas
Sialidosis (Mucolipidosis I)
a-neuraminidasa Sialiloligosacaridos
Galactosialidosis (Smdrome de Goldberg)
Deficiencia de protema protectora lisosomica Sialiloligosacaridos
Enfermedad de Schindler
a-N-acetil-galactosaminidasa
E. Trastornos de transporte de enzimas lisosomicas
Nombre de la enfermedad
Defecto enzimatico Sustancia almacenada
Mucolipidosis II (Enfermedad de celulas i)
N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa Heparan sulfato
Mucolipidosis III (Pseudopolidistrofia de Hurler)
Igual que ML II
F. Trastornos del transporte de membrana lisosomica
Nombre de la enfermedad
Defecto enzimatico Sustancia almacenada
Cistinosis
Protema de transporte de cistina Cistina libre
Enfermedad de Salla
Protema de transporte de acido sialico Acido sialico y acido glucuronico libre
Enfermedad infantil de almacenamiento de acido sialico
Protema de transporte de acido sialico Acido sialico y acido glucuronico libre
G. Otros
Nombre de la enfermedad
Defecto enzimatico Sustancia almacenada
Enfermedad de Batten (Lipofuscinosis ceroide neuronal juvenil)
Desconocido Lipofuscinas
Lipofuscinosis ceroide neuronal infantil
Palmitoil-protema tioesterasa Lipofuscinas
Mucolipidosis IV
desconocido Gangliosidos y acido hialuronico
Prosaposina
Saposinas A, B, C o D
En algunas realizaciones, una enzima lisosomica adecuada para la invencion incluye una secuencia polipeptfdica que tiene un 50-100 %, incluyendo un 50, 55, 60, 65, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 5 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia
polinucleotfdica de origen natural de una enzima humana mostrada en la tabla 1, que codifica aun al mismo tiempo una protema que es capaz de reducir los materiales acumulados en lisosomas de mairnfero o que puede rescatar o mejorar uno o mas smtomas de enfermedad de almacenamiento lisosomico.
10 El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoacidos" con respecto a la secuencia de la enzima lisosomica se define como el porcentaje de restos de aminoacido en una secuencia candidata que son identicos a los restos de aminoacido en la secuencia de la enzima humana de origen natural, despues de alinear las secuencias e introducir
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huecos, si fuera necesario, para conseguir el maximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitucion conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineacion con fines de determinacion del porcentaje de identidad de secuencia de aminoacidos puede conseguirse de diversas maneras que pertenecen a las habilidades de la tecnica, por ejemplo, usando un software informatico disponible al publico tal como el software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la materia pueden determinar los parametros apropiados para medir la alineacion, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineacion maxima sobre la longitud completa de las secuencias que se esta comparando. Preferiblemente, se usa el software WU-BLAST-2 para determinar la identidad de secuencia de aminoacidos (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996);
http://blast.wustl/edulblast/README.html). WU-BLAsT-2 usa varios parametros de busqueda, la mayona de los cuales se configuran a los valores por defecto. Los parametros ajustables se configuran con los siguientes valores: tramo de solapamiento=1, fraccion de solapamiento=0,125, umbral mundial (T)=11. El valor HSP (S) y los parametros HSP S2 son valores dinamicos y se establecen por el propio programa, dependiendo de la composicion de la secuencia particular, sin embargo, los valores mmimos pueden ajustarse y se configuran como se indica anteriormente.
Enfermedad de Pompe
Una enfermedad de almacenamiento lisosomico ejemplar es la enfermedad de Pompe. La enfermedad de Pompe es un trastorno genetico poco comun causado por una deficiencia en la enzima alfa-glucosidasa acida (GAA), que es necesaria para descomponer el glucogeno, una forma almacenada de azucar usada para la energfa. La enfermedad de Pompe tambien se conoce como enfermedad de almacenamiento de glucogeno de tipo II, GSD II, enfermedad de almacenamiento de glucogeno de tipo II, glucogenosis de tipo II, deficiencia de maltasa acida, deficiencia de alfa- 1,4-glucosidasa, cardiomegalia glucogenica difusa y forma cardfaca de glucogenosis generalizada. La acumulacion del glucogeno causa debilidad muscular progresiva (miopatfa) en todo el organismo y afecta a diversos tejidos corporales, particularmente en el corazon, los musculos esqueleticos, el Idgado, el sistema respiratorio y nervioso.
Las manifestaciones clmicas que se presentan de la enfermedad de Pompe pueden variar ampliamente dependiendo de la edad de aparicion de la enfermedad y la actividad GAA residual. La actividad GAA residual se correlaciona tanto con la cantidad como con la distribucion tisular de la acumulacion de glucogeno, asf como la gravedad de la enfermedad. La enfermedad de Pompe de aparicion infantil menos del 1 % de la actividad GAA normal) es la forma mas grave y se caracteriza por hipotoma, debilidad muscular generalizada y cardiomiopatfa hipertrofica, y acumulacion masiva de glucogeno en el tejido cardfaco y otros tejidos musculares. Habitualmente se produce muerte al ano del nacimiento debido a insuficiencia cardiorrespiratoria. Hirschhorn et al. (2001) "Glycogen Storage Disease Type II: Acid Alpha-glucosidase (Acid Maltase) Deficiency," en Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 8.a ed., Nueva York: McGraw-Hill, 3389-3420. La enfermedad de Pompe de aparicion juvenil (un 1-10 % de actividad GAA normal) y de aparicion en el adulto (un 10-40 % de actividad gAa normal) es clmicamente mas heterogenea, con una variacion mayor en la edad de aparicion, la presentacion clmica y la progresion de la enfermedad. La enfermedad de Pompe de aparicion juvenil y en el adulto generalmente se caracteriza por ausencia de afectacion cardfaca grave, edad tardfa de aparicion y progresion mas lenta de la enfermedad, pero la afectacion final de musculos respiratorios o de las extremidades provoca morbilidad y mortalidad significativas. Aunque la esperanza de vida puede variar, la muerte generalmente se produce debido a insuficiencia respiratoria. Hirschhorn et al. (2001) "Glycogen Storage Disease Type II: Acid Alpha-glucosidase (Acid Maltase) Deficiency," en Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 8.a ed., Nueva York: McGraw-Hill, 3389-3420.
Una enzima GAA adecuada para tratar la enfermedad de Pompe incluye una GAA humana de tipo silvestre o un fragmento o variante de secuencia de la misma que retiene la capacidad de escindir los enlaces a1-4 en oligosacaridos lineales.
Terapia de remplazo enzimatico
La terapia de remplazo enzimatico (ERT) es una estrategia terapeutica para corregir una deficiencia enzimatica infundiendo la enzima ausente en el torrente sangumeo. Segun la sangre perfunde los tejidos del paciente, la enzima se capta por las celulas y se transporta al lisosoma, donde la enzima actua eliminando el material que se ha acumulado en los lisosomas debido a la deficiencia enzimatica. Para que la terapia de remplazo de enzimas lisosomicas sea eficaz, la enzima terapeutica debe suministrarse a los lisosomas en las celulas apropiadas en los tejidos donde se manifiesta el defecto de almacenamiento. Los agentes terapeuticos convencionales de remplazo de enzimas lisosomicas se suministran usando carbohidratos unidos de forma natural a la protema para acoplarse con receptores espedficos en la superficie de las celulas diana. Un receptor, el receptor de M6P independiente de cationes (CI-MPR), es particularmente util para dirigir enzimas lisosomicas de remplazo porque el CI-MPR esta presente en la superficie de la mayona de tipos celulares.
Las expresiones "receptor de manosa-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR)", "receptor de M6P/IGF-II", "receptor de CI-MPR/iGF-II", "receptor de IGF-II " o "receptor de IGF2", o abreviaturas de las mismas se usan de forma intercambiable en este documento, que hacen referencia al receptor celular que se une a M6P e IGF-II.
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Direccion lisosomica independiente de glucosilacion
Se ha desarrollado una tecnologfa de direccion lisosomica independiente de glucosilacion (GILT) para dirigir enzimas terapeuticas a los lisosomas. Espedficamente, la tecnolog^a GILT usa una marca peptidica en lugar de M6P para acoplarse con el CI-MPR para direccion lisosomica. Tfpicamente, una marca GILT es una protema, peptido u otro resto que se une al CI-MPR de una manera independiente de manosa-6-fosfato. De forma ventajosa, esta tecnologfa imita el mecanismo biologico normal para captar enzimas lisosomicas, aunque haciendolo de una manera independiente de manosa-6-fosfato.
Una marca GILT preferida se obtiene del factor II de crecimiento de tipo insulina humano (IGF-II). El IGF-II humano es un ligando de afinidad para el CI-MPR, que tambien se menciona como receptor de IGF-II. La union de las enzimas terapeuticas marcadas con GILT al receptor de M6P/IGF-II dirige la protema al lisosoma a traves de la ruta endodtica. Este metodo tiene numerosas ventajas sobre los metodos que implican la glucosilacion, incluyendo simplicidad y rentabilidad, porque una vez la protema se ha aislado no es necesario hace modificaciones adicionales.
Puede encontrarse una descripcion detallada de la tecnologfa GILT y la marcar GILT en las publicaciones de Estados Unidos n.° 20030082176, 20040006008, 20040005309, y 20050281805.
Marca GILT resistente a furina
Durante el curso del desarrollo de enzimas lisosomicas marcadas con GILT para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomico, ha llegado a ser evidente que la marca GILT derivada de IGF-II puede someterse a escision proteolftica por furina durante la produccion en celulas de mairnfero (vease la seccion de ejemplos). La proteasa furina tfpicamente reconoce y escinde un sitio de escision que tiene una secuencia consenso Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO: 2), X es cualquier aminoacido. El sitio de escision esta colocado despues del resto de arginina (Arg) carboxiterminal en la secuencia. En algunas realizaciones, un sitio de escision por furina tiene una secuencia consenso Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 3), X es cualquier aminoacido. El sitio de escision esta colocado despues del resto de arginina (Arg) carboxiterminal en la secuencia. Como se usa en este documento, el termino "furina" se refiere a cualquier proteasa que pueda reconocer y escindir el sitio de escision por proteasa furina como se define en este documento, incluyendo furina o proteasa de tipo furina. La furina tambien se conoce como enzima de escision de aminoacido basico emparejado (PACE). La furina pertenece a la familia de proprotema convertasa de tipo subtilisina que incluye PC3, una proteasa responsable de la maduracion de la proinsulina en celulas de los islotes pancreaticos. El gen que codifica la furina se conoce como FUR (region en direccion 5' de FES).
La secuencia peptfdica de IGF-II humana madura se muestra a continuacion.
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AYRPSETLCGGELVDTLOFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYC ATPAKSE (SEQ ID NO:l)
Como puede observarse, el IGF-II humano maduro contiene dos sitios potenciales de escision con furina solapantes entre los restos 30-40 (en negrita y subrayados). Las fechas indican dos posiciones potenciales de escision con furina.
Se han desarrollado marcas GILT modificadas que son resistentes a escision por furina y aun retienen la capacidad de unirse al CI-MPR de una manera independiente de manosa-6-fosfato. Espedficamente, las marcas GILT resistentes a furina pueden disenarse por mutacion de la secuencia de aminoacidos en uno o mas sitios de escision con furina de modo que la mutacion anule al menos un sitio de escision con furina. Por tanto, en algunas realizaciones, una marca GILT resistente a furina es una mutema IGF-II resistente a furina que contiene una mutacion que anula al menos un sitio de escision con proteasa furina o cambia una secuencia adyacente al sitio de escision con proteasa furina de modo que se evite, inhiba, reduzca o ralentice la escision con furina en comparacion con un peptido IGF-II de tipo silvestre (por ejemplo, IGF-II maduro humano de tipo silvestre). Tfpicamente, una mutacion adecuada no influye en la capacidad de la maca GILT resistente a furina de unirse al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes. En particular, una mutema IGF-II resistente a furina adecuada para la invencion se une al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes de una manera independiente
1 / R Q 1 n 11
de manosa-6-fosfato con una constante de disociacion de 10 M o menos (por ejemplo, 10,10,10 , 10 , o menos) a pH 7,4. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II resistente a furina contiene una mutacion dentro de una region correspondiente a los aminoacidos 30-40 (por ejemplo, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 32-39, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40, 34-40) de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutacion adecuada anula al menos un sitio de escision con proteasa furina. Una mutacion puede ser sustituciones, deleciones, inserciones de aminoacidos. Por ejemplo, un aminoacido cualquiera dentro de la region correspondiente a los restos 30-40 (por ejemplo, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 32-39, 33-39, 34-39, 35-39,
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En algunas realizaciones, una mutema IGF-II resistente a furina contiene sustituciones de aminoacidos en posiciones correspondientes a Arg37 o Arg40 de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una mutema IGF-II resistente a furina contiene una sustitucion de Lys o Ala en las posiciones Arg37 o Arg40. Otras sustituciones son posibles, incluyendo combinaciones de mutaciones de Lys y/o Ala en ambas posiciones 37 y 40, o sustituciones de aminoacidos diferentes de Lys o Ala.
En algunas realizaciones, la mutema IGF-II resistente a furina adecuada para la invencion puede codificar mutaciones adicionales. Por ejemplo, hasta un 30 % o mas de los restos de la SEQ ID NO: 1 puede cambiarse (por ejemplo, hasta un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 % o mas restos puede cambiarse). Por tanto, una mutema IGF-II resistente a furina adecuada para la invencion puede tener una secuencia de aminoacidos al menos un 70 %, incluyendo al menos un 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % identica a la SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la mutema IGF-II resistente a furina adecuada para la invencion se dirige espedficamente al CI-MPR. Son particularmente utiles mutaciones en el polipeptido de IGF-II que producen una protema que se une al CI-MPR con alta afinidad (por ejemplo, con una constante de disociacion de 10-7 M o menos a pH 7,4) mientras que se unen a otros receptores que se sabe que estan unidos a IGF-II con afinidad reducida respecto a IGF-II nativo. Por ejemplo, una mutema IGF-II resistente a furina adecuada para la invencion puede modificarse para que tenga afinidad de union disminuida por el receptor de IGF-I respecto a la afinidad del IGF-II humano de origen natural por el receptor de IGF-I. Por ejemplo, la sustitucion en IGF-II de los restos Tyr 27 con Leu, Leu 43 con Val o Ser 26 con Phe disminuye la afinidad de IGF-II por el receptor de IGF-I en 94, 56, y 4 veces respectivamente (Torres et al. (1995) J. Mol. Biol. 248(2):385-401). La delecion de los restos 1-7 de IGF-II humano produjo una disminucion de 30 veces en la afinidad por el receptor de IGF-I humano y un aumento concomitante de 12 veces en la afinidad por el receptor de IGF-II de rata (Hashimoto et al. (1995) J. Biol. Chem. 270(30):18013-8). La estructura por RMN de IgF-II muestra que Thr 7 esta localizada cerca de los restos 48 Phe y 50 Ser, asf como cerca del puente disulfuro 9 Cys-47 Cys. Se cree que la interaccion de Thr 7 con estos restos puede estabilizar el hexapeptido N-terminal flexible necesario para la union al receptor de IGF-I (Terasawa et al. (1994) EMBO J. 13(23)5590-7). Al mismo tiempo, esta interaccion puede modular la union al receptor de IGF-II. El truncamiento del extremo C-terminal de IGF-II (restos 62-67) tambien parece disminuir la afinidad de IGF-II por el receptor de IGF-I en 5 veces (Roth et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181(2):907-14).
Las superficies de union para los receptores de IGF-I y M6P independiente de cationes estan en caras diferentes de IGF-II. Basandose en los datos estructurales y mutacionales, pueden construirse dominios de union a M6P independiente de cationes funcionales que son sustancialmente mas pequenos que IGF-II humano. Por ejemplo, los aminoacidos amino terminales (por ejemplo, 1-7 o 2-7) y/o los restos carboxiterminales 62-67 pueden delecionarse o remplazarse. Adicionalmente, los aminoacidos 29-40 pueden eliminarse o remplazarse probablemente sin alterar el plegamiento del resto del polipeptido o la union al receptor de M6P independiente de cationes. Por tanto, puede construirse un resto de direccion que incluya los aminoacidos 8-28 y 41-61. Estos tramos de aminoacidos quizas podnan unirse directamente o separados por un conector. Como alternativa, los aminoacidos 8-28 y 41-61 pueden proporcionarse en cadenas polipeptfdicas diferentes. Dominios comparables de insulina, que es homologa a IGF-II y tiene una estructura terciaria muy relacionada con la estructura de IGF-II, tienen suficiente informacion estructural para permitir un replegamiento apropiado en la estructura terciaria apropiada, incluso cuando estan presentes en cadenas polipeptfdicas diferentes (Wang et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 279-281). Por tanto, por ejemplo, los aminoacidos 8-28, o una variante de sustitucion conservativa de los mismos, podna fusionarse a una enzima lisosomica; la protema de fusion resultante podna mezclarse con los aminoacidos 41-61, o una variante de sustitucion conservativa de los mismos, y administrarse a un paciente.
IGF-II tambien puede modificarse para minimizar la union a protemas de union a IGF-II del suero (Baxter (2000) Am. J. Physiol Endocrinol Metab. 278(6):967-76) para evitar el secuestro de construcciones IGF-II/GILT. Varios estudios han localizado los restos en IGF-II necesarios para la union a protemas de union a IGF. Las construcciones con mutaciones en estos restos pueden explorarse para la retencion de la union de alta afinidad al receptor de M6P/IGF- II y para una afinidad reducida por protemas de union a IGF. Por ejemplo, se informa que el remplazo de Phe 26 de IGF-II con Ser reduce la afinidad de IGF-II por IGFBP-1 y 6 sin efecto sobre la union al receptor de M6P/IGF-II (Bach et al. (1993) J. Biol. Chem. 268(13):9246-54). Otras sustituciones, tales como Lys por Glu 9, tambien pueden ser ventajosas. Las mutaciones analogas, por separado o en combinacion, en una region de IGF-I que este altamente conservada con IGF-II producen disminuciones grandes en la union a IGF-BP (Magee et al. (1999) Biochemistry 38(48):15863-70).
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Una estrategia alternativa es identificar regiones mmimas de IGF-II que puedan unirse con alta afinidad al receptor de M6P/IGF-II. Los restos que se han implicado en la union de IGF-II al receptor de M6P/IGF-II se agrupan principalmente en una cara de IGF-II (Terasawa et al. (1994) EMBO J. 13(23):5590-7). Aunque la estructura terciaria de IGF-II normalmente se mantiene por tres enlaces disulfuro intramoleculares, puede disenarse un peptido que incorpora la secuencia de aminoacidos en la superficie de union al receptor de M6P/IGF-II de IGF-II para plegarse apropiadamente y tener actividad de union. Dicho peptido mmimo de union es un dominio de direccion lisosomica altamente preferido. Por ejemplo, un dominio de direccion lisosomica preferido es los aminoacidos 8-67 de IGF-II humano. Los peptidos disenados, basados en la region alrededor de los aminoacidos 48-55, que se une al receptor de M6P/IGF-II, tambien son dominios de direccion lisosomica deseables. Como alternativa, puede explorarse una biblioteca aleatoria de peptidos para la capacidad de unirse al receptor de M6P/IGF-II a traves de un ensayo de doble hforido de levaduras o a traves de un ensayo de tipo presentacion en fagos.
Afinidad de union por el receptor de insulina
Los inventores de la presente solicitud descubrieron inesperadamente que muchas mutemas IGF-II resistentes a furina descritas en este documento tienen afinidad de union reducida o disminuida por el receptor de insulina. Por tanto, en algunas realizaciones, una marca peptfdica adecuada para la invencion tiene afinidad de union reducida o disminuida por el receptor de insulina respecto a la afinidad del IGF-II humano de origen natural por el receptor de insulina. En algunas realizaciones, las marcas peptfdicas con afinidad de union reducida o disminuida por el receptor de insulina adecuadas para la invencion incluyen marcas peptfdicas que tienen una afinidad de union por el receptor de insulina que es mas de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 12 veces, 14 veces, 16 veces, 18 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces menor que la del IGF-II humano maduro de tipo silvestre. La afinidad de union por el receptor de insulina puede medirse usando diversos ensayos in vitro e in vivo conocidos en la tecnica. Los ensayos de union ejemplares se describen en la seccion de Ejemplos.
Mutagenesis
Las mutemas IGF-II pueden prepararse introduciendo cambios de nucleotidos apropiados en el ADN de IGF-II o por smtesis del polipeptido IGF-II deseado. Pueden hacerse variaciones en la secuencia de IGF-II, por ejemplo, usando cualquiera de las tecnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas expuestas, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitucion, delecion o insercion de uno o mas codones que codifican IGF-II que provoca un cambio en la secuencia de aminoacidos de IGF-II en comparacion con una secuencia de origen natural de IGF-II humano maduro. Las sustituciones de aminoacidos pueden ser el resultado de remplazar un aminoacido con otro aminoacido que tiene propiedades estructurales y/o qmmicas similares, tales como el remplazo de una leucina con una serina, es decir, remplazos conservativos de aminoacidos. Las sustituciones de aminoacidos tambien pueden ser el resultado de remplazar un aminoacido con otro aminoacido que tiene propiedades estructurales y/o qmmicas distintas, es decir, remplazos no conservativos de aminoacidos. Las inserciones o deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de 1 a 5 aminoacidos. La variacion permitida puede determinarse haciendo sistemicamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos en la secuencia y ensayando las variantes resultantes para la actividad en los ensayos in vivo o in vitro conocidos en la tecnica (tales como ensayos de union al CI-MPR o ensayos de escision con furina).
Tambien puede emplearse analisis de aminoacidos por exploracion para identificar uno o mas aminoacidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoacidos de exploracion preferidos estan los aminoacidos neutros relativamente pequenos. Dichos aminoacidos incluyen alanina, glicina, serina y cistema. La alanina es tfpicamente un aminoacido de exploracion preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral mas alla del carbono-p y es menos probable que altere la conformacion de cadena principal de la variante. La alanina tambien se prefiere tfpicamente porque es el aminoacido mas comun. Ademas, se encuentra frecuentemente en posiciones tanto enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitucion con alanina no produce cantidades adecuadas de variante, puede usarse un aminoacido esoterico.
Las variaciones pueden hacerse usando metodos conocidos en la tecnica tales como mutagenesis mediada por oligonucleotido (dirigida al sitio), exploracion con alanina y mutagenesis por PCR. La mutagenesis dirigida al sitio [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], la mutagenesis por casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], la mutagenesis por seleccion de restriccion [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras tecnicas conocidas pueden realizarse sobre el ADN clonado para producir mutemas IGF-II.
Espaciador
Una marca GILT resistente a furina puede fusionarse al extremo N-terminal o C-terminal de un polipeptido que codifica una enzima lisosomica. La marca GILT puede fusionarse directamente al polipeptido enzimatico lisosomico o puede separarse del polipeptido enzimatico lisosomico por un conector o un espaciador. Un conector o espaciador de aminoacidos generalmente se disena para que sea flexible o para interponer una estructura, tal como una helice- alfa, entre los dos restos proteicos. Un conector o espaciador puede ser relativamente corto, tal como la secuencia
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Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO: 4) o Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (SEQ ID NO: 5), o puede ser mas largo, tal como, por ejemplo, de 10-25 aminoacidos de longitud. El sitio de una union de fusion debe seleccionarse con cuidado para promover el plegamiento apropiado y la actividad de ambos companeros de fusion y para evitar la separacion prematura de una marca peptidica de un polipeptido GAA. En una realizacion preferida, la secuencia conectora es Gly-Ala-Pro (SEQ ID NO: 4).
Se describieron en detalle construcciones adicionales de protemas GAA marcadas con GILT que pueden usarse en los metodos y composiciones de la presente invencion en la publicacion de Estados Unidos n.° 2005 0244400.
Celulas
Puede utilizarse cualquier celula o tipo celular de mairnfero susceptible a cultivo celular, y a expresion de polipeptidos, de acuerdo con la presente invencion, tales como, por ejemplo, celulas de rinon embrionario humano (HEK) 293, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas renales de mono (COS), celulas HT1080, celulas C10, celulas HeLa, celulas renales de cna de hamster (BHK), celulas 3T3, celulas C127, celulas CV-1, celulas HaK, celulas NS/O y celulas L-929. Los ejemplos no limitantes de celulas de mamnfero que pueden usarse de acuerdo con la presente invencion incluyen, aunque sin limitacion, la lmea de mieloma de raton BALB/c (NSO/1, ECACC n.°: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Pafses Bajos)); la lmea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la lmea de rinon embrionario humano (293 o celulas 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); celulas renales de cna de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celulas de ovario de hamster chino +/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); celulas de sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243251 (1980)); celulas renales de mono (CV1 ATCC CCL 70); celulas renales de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); celulas de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); celulas renales caninas (MDCK, ATCC CCL 34); celulas hepaticas de rata bufalo (BRL 3A, AtCC CRL 1442); celulas pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); celulas hepaticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MMT 060562, ATCC CCL51); celulas TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una lmea de hepatoma humano (Hep G2). En algunas realizaciones la protema de fusion de la presente invencion se produce a partir de lmeas celulares CHO.
La protema de fusion de la invencion tambien puede expresarse en una diversidad de celulas hospedadoras que no son de mai^ero tales como, por ejemplo, de insecto ((por ejemplo, Sf-9, Sf-21, Hi5), de plantas (por ejemplo, Leguminosa, cereal, o tabaco), de levadura (por ejemplo, S. cerivisiae, P. pastoris), procariotas (por ejemplo, E. Coli, B. subtilis u otros Bacillus spp., Pseudomonas spp., Streptomyces spp), o de hongos.
En algunas realizaciones, una protema de fusion con o sin una marca GILT resistente a furina puede producirse en celulas deficientes de furina. Como se usa en este documento, la expresion "celulas deficientes de furina" se refiere a cualquier celula cuya actividad proteasa furina esta inhibida, reducida o eliminada. Las celulas deficientes de furina incluyen tanto celulas de mai^ero como celulas que no son de mai^ero que no producen furina o producen una cantidad reducida o proteasa furina defectuosa. Las celulas deficientes de furina ejemplares que son conocidas y estan disponibles para los expertos en la materia incluyen, aunque sin limitacion, celulas FD11 (Gordon et al. (1997) Infection and Immunity 65(8):3370 3375), y aquellas celulas mutantes descritas en Moebring y Moehring (1983) Infection and Immunity 41(3):998 1009. Como alternativa, una celula deficiente de furina puede obtenerse exponiendo las celulas de marnffero y que no son de mamffero descritas anteriormente a tratamiento de mutagenesis, por ejemplo, irradiacion, bromuro de etidio, uridina bromada (BrdU) y otros, preferiblemente mutagenesis qmmica, y mas preferiblemente mutagenesis con sulfonato de etilmetano, recuperando las celulas que sobreviven al tratamiento y seleccionando aquellas celulas que se encuentra que son resistentes a la toxicidad de la exotoxina A de Pseudomonas (vease, Moehring y Moehrin (1983) Infection and Immunity 41(3):998 1009).
Hipoglucosilacion
Las protemas terapeuticas dirigidas de la invencion pueden estar hipoglucosiladas es decir, una o mas estructuras de carbohidrato que estanan normalmente presentes en una protema humana de origen natural, preferiblemente se omite, elimina o modifica u oculta. Sin el deseo de limitarse a teona alguna, se contempla que una protema hipoglucosilada puede prolongar la semivida de la protema en un mai^ero. La hipoglucosilacion puede conseguirse de muchas maneras. En algunas realizaciones, la protema de fusion dirigida de la invencion puede producirse usando un peptido senal de secrecion para facilitar la secrecion de la protema de fusion. Por ejemplo, la protema de fusion puede producirse usando una peptida senal de IGF-II. En general, la protema de fusion producida usando un peptido senal de IGF-II tiene un nivel reducido de manosa-6-fosfato (M6P) sobre la superficie de la protema en comparacion con la enzima de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una protema puede estar completamente hipoglucosilada (como cuando se sintetiza en E. coli), parcialmente no glucosilada (como cuando se sintetiza en un sistema de marnffero despues de la alteracion de uno o mas sitios de glucosilacion por mutagenesis dirigida al sitio) o puede tener un patron de glucosilacion que no es de mamffero. Por ejemplo, las protemas de fusion hipoglucosiladas pueden generarse modificando, sustituyendo o eliminando uno o mas sitios de glucosilacion por mutagenesis dirigida al sitio. Por ejemplo, la GAA de tipo silvestre tfpicamente tiene siete sitios que coinciden con la secuencia de reconocimiento canonica para la glucosilacion ligada a N, Asn-Xaa-Thr/Ser (sEq ID NO: 7) (Xaa puede ser cualquier resto excepto Pro), concretamente, Asn-140, -233, -390, -470, -652, -882 y -925 (Hoefsloot et
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al., 1988; Martiniuk et al., 1990b). Puede cambiarse una o mas Asn en las posiciones descritas anteriores o puede eliminarse para generar GAA hipoglucosilada. En algunas realizaciones, puede cambiar Asn a Gln.
En algunas realizaciones, una protema de fusion terapeutica puede desglucosilarse despues de la smtesis. Por ejemplo, la desglucosilacion puede ser a traves de tratamientos qmmicos o enzimaticos, y puede dar lugar a desglucosilacion completa o, si se elimina solamente una parte de la estructura de carbohidrato, desglucosilacion parcial.
En algunas realizaciones, la glucosilacion de una enzima lisosomica se modifica, por ejemplo, por oxidacion y reduccion, para reducir la eliminacion de la protema terapeutica de la sangre. Por ejemplo, puede desglucosilarse una enzima lisosomica por tratamiento con peryodato. En particular, el tratamiento con peryodato y un agente reductor tal como borohidruro sodico es eficaz para modificar la estructura de carbohidrato de la mayona de las glucoprotemas. El tratamiento con peryodato oxida dioles vecinales, escindiendo el enlace carbono-carbono y remplazando los grupos hidroxilo con grupos aldetndo; el borohidruro reduce los aldetndos en hidroxilos. Por ejemplo, a concentracion 1 mM, el peryodato oxida exclusivamente los grupos de acido sialico y a o por encima de 10 mM todos los dioles vecinales disponibles se convierten en aldehfdos (Hermanson, G.T. 1996, Bioconjugate techniques. Academic press). Una vez formados, los grupos aldehfdos son altamente reactivos y pueden formar enlaces de bases de Schiff con grupos amino primarios en la protema, produciendo enlaces intramoleculares. Por lo tanto, los grupos aldehfdo formados tienen que reducirse en grupos alcohol. Un agente reductor habitualmente usado es NaBH4 y la reaccion se ejecuta mejor en condiciones alcalinas. Muchos restos de azucar, incluyendo dioles vecinales, por lo tanto, se escinden por este tratamiento. No obstante, aunque este tratamiento convierte los carbohidratos cmlicos en carbohidratos lineales, no elimina completamente el carbohidrato, minimizando los riesgos de exposicion de sitios polipeptfdicos potencialmente sensibles a proteasa o antigenicos.
Grubb, J.H., et al. (Grubb et al., 2008, PNAS 105:2616) informan del tratamiento de p-glucuronidasa humana con metaperyodato sodico seguido por reduccion con borohidruro sodico. La beta-glucuronidasa modificada retema un 90 % de la actividad, pero perdfa la actividad de captacion del receptor tanto dependiente de manosa como dependiente de manosa-6-fosfato. La condicion de pH alcalino usada en la reduccion debido al reactivo de borohidruro sodico como se describe por Grubb et al., no es adecuada para todas las enzimas lisosomicas, muchas de las cuales son inestables en condiciones alcalinas.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, se usa cianoborohidruro sodico como agente reductor. Aunque la tasa de reduccion de los aldehfdos por cianoborohidruro es insignificante a pH neutro, y superiores, la tasa de reaccion llega a ser rapida a pH acido (Borch, et al. 1971, JACS 93:2897). Por ejemplo, pueden usarse regfmenes que usan metaperyodato sodico y cianoborohidruro a pH 3,5-4.
Por ejemplo, el tratamiento de GAA o alfa-galactosidasa A, las enzimas deficientes en las enfermedades de Pompe y Fabry respectivamente, con peryodato y cianoborohidruro a pH 5,6 produjo una buena recuperacion de la actividad enzimatica. La enzima se incubo con una mezcla de volumen igual que contema metaperyodato sodico 20 mM y cianoborohidruro sodico 40 mM en acetato de Na 0,1 M, pH 5,6 durante 60 min en hielo. El peryodato sin reaccionar se inactivo con glicerol (concentracion final al 10 %) durante 15 min en hielo. Las protemas se intercambiaron finalmente en solucion salina tamponada con fosfato, pH 6,2 por diafiltracion usando dispositivos de filtro de centrifugacion Amicon. Otros agentes reductores, por ejemplo, borano de dimetilamina, tambien pueden ser utiles para reducir los aldehfdos generados por oxidacion con metaperyodato sodico de glucoprotemas tales como GAA en condiciones acidas.
Por tanto, en algunas realizaciones, la reduccion de GAA tratada con metaperyodato sodico implica el uso de cianoborohidruro sodico a pH acido de pH 3,0 a pH 6. Las condiciones optimas para la modificacion qrnmica pueden determinarse facilmente usando dos ensayos: perdida de union a ConA sepharose y captacion disminuida en macrofagos J774E.
Por ejemplo, la capacidad de la p-glucuronidasa modificada con peryodato/borohidruro de unirse a ConA sepharose se comparo con la de p-glucuronidasa no tratada. Las enzimas se incubaron con 50 pl de perlas ConA en Tris-HCl 20 mM, pH 6,8, NaCl 0,5 M durante 15 min a temperatura ambiente. Las perlas se centrifugaron a velocidad maxima durante 15 s. El sobrenadante (flujo directo) se extrajo cuidadosamente, se ensayo para la actividad GUS y se analizo por SDS/PAGE. Cuando se trato GUS exactamente como se presenta en Grubb et al., se perdio un 60 % de la actividad de union a ConA y estaba presente GUS sin unir solamente en el flujo directo de la muestra tratada con peryodato y posteriormente reducida con borohidruro sodico.
Administracion de protemas terapeuticas
De acuerdo con la invencion, una protema terapeutica de la invencion tfpicamente se administra al individuo en solitario, o en composiciones y medicamentos que comprenden la protema terapeutica (por ejemplo, en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad), como se describe en este documento. Las composiciones pueden formularse con un vehmulo o excipiente fisiologicamente aceptable para preparar una
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composicion farmaceutica. El vehmulo y la composicion pueden ser esteriles. La formulacion debe adecuarse al modo de administracion.
Los vehmulos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, aunque sin limitacion, agua, soluciones salinas (por ejemplo, NaCl), solucion salina, solucion salina tamponada, alcoholes, glicerol, etanol, goma arabiga, aceites vegetales, alcoholes bendlicos, polietilenglicoles , gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidon, azucares tales como manitol, sacarosa u otros, dextrosa, estearato de magnesio, talco, acido silfcico, parafina viscosa, aceite esencial, esteres de acidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., as^ como combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmaceuticas pueden mezclase, si se desea, con agentes auxiliares (por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectante, emulsionantes, sales para influir en la presion osmotica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromaticas y similares) que no reaccionan de forma perjudicial con los compuestos activos o impiden su actividad. En una realizacion preferida, se usa un vehmulo soluble en agua adecuado para administracion intravenosa.
La composicion o medicamento, si se desea, tambien puede contener cantidades mmimas de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes del pH. La composicion puede ser una solucion lfquida, suspension, emulsion, comprimido, pfldora, capsula, formulacion de liberacion sostenida o polvo. La composicion tambien puede formularse como un supositorio, con aglutinantes tradicionales y veldculos tales como trigliceridos. La formulacion oral puede incluir veldculos convencionales tales como calidades farmaceuticas de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.
La composicion o medicamento puede formularse de acuerdo con los procedimientos rutinarios como una composicion farmaceutica adaptada para su administracion a seres humanos. Por ejemplo, en una realizacion preferida, una composicion para administracion intravenosa tfpicamente es una solucion en tampon acuoso isotonico esteril. Cuando es necesario, la composicion tambien puede incluir una agente solubilizante y un anestesico local para aliviar el dolor en el sitio de la inyeccion. Generalmente, los ingredientes se suministran por separado o mezclados juntos en una forma monodosis, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un recipiente cerrado hermeticamente tal como una ampolla o sobrecito, que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composicion tiene que administrarse por infusion, puede distribuirse con un frasco de infusion que contiene agua esteril de calidad farmaceutica, solucion salina o dextrosa/agua. Cuando la composicion se administra por inyeccion, puede proporcionarse una ampolla de agua esteril para inyeccion o solucion salina de modo que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administracion.
La protema terapeutica puede formularse como formas neutras o salinas. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres tales como los derivados de acido clorddrico, fosforico, acetico, oxalico, tartarico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de hidroxido de sodio, potasio, amonio, calcio, ferrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procama, etc.
Una protema terapeutica (o una composicion o medicamento que contiene una protema terapeutica) se administra por cualquier via apropiada. En una realizacion preferida, una protema terapeutica se administra por via intravenosa. En otras realizaciones, una protema terapeutica se administra por administracion directa a un tejido diana, tal como el corazon o el musculo (por ejemplo, intramuscular) o sistema nervioso (por ejemplo, inyeccion directa en el cerebro; por via intraventricular; por via intratecal). Como alternativa, una protema terapeutica (o una composicion o medicamento que contiene una protema terapeutica) puede administrarse por via parenteral, por via transdermica o por via transmucosa (por ejemplo, por via oral o por via nasal). Puede usarse de forma simultanea mas de una via, si se desea.
Una protema terapeutica (o una composicion o medicamento que contiene una protema terapeutica) puede administrarse en solitario o junto con otros agentes, tales como antihistaminas (por ejemplo, difenhidramina) o inmunosupresores u otros agentes inmunoterapeuticos que contrarrestan los anticuerpos antienzima lisosomica marcada con GILT. La expresion "junto con" indica que el agente se administra antes de, o aproximadamente al mismo tiempo que o despues de la protema terapeutica (o una composicion o medicamento que contiene la protema terapeutica). Por ejemplo, el agente puede mezclarse en una composicion que contiene la protema terapeutica y de ese modo se administra de forma contemporanea con la protema terapeutica; como alternativa, el agente puede administrase de forma contemporanea, sin mezcla (por ejemplo, por suministro "combinado" del agente en la via intravenosa por la cual tambien se administra la protema terapeutica, o viceversa). En otro ejemplo, el agente puede administrarse por separado (por ejemplo, sin mezclarse), pero en un corto marco de tiempo (por ejemplo, en 24 horas) de administracion de la protema terapeutica.
La protema terapeutica (o composicion o medicamento que contiene la protema terapeutica) se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz (es decir, una cantidad de dosificacion que, cuando se administra a intervalos regulares, es suficiente para tratar la enfermedad, tal como mejorando los smtomas asociados con la enfermedad, previniendo o retardando la aparicion de la enfermedad y/o tambien disminuyendo la gravedad o frecuencia de los smtomas de la enfermedad, como se describe anteriormente). La dosis que sera terapeuticamente eficaz para el tratamiento de la enfermedad dependera de la naturaleza y grado de los efectos de la enfermedad, y se puede determinar por tecnicas clmicas convencionales. Ademas, pueden emplearse opcionalmente ensayos in vitro o in
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vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificacion optimos usando metodos conocidos en la tecnica. La dosis precisa a emplear tambien dependera de la via de administracion y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse de acuerdo con los criterios de un facultativo y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a dosis derivadas de sistemas de ensayo in vitro o de modelo animal. La cantidad de dosificacion terapeuticamente eficaz puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,1-1 mg/kg, aproximadamente 1-5 mg/kg, aproximadamente 5-20 mg/kg, aproximadamente 20-50 mg/kg, o 20-100 mg/kg. La dosis eficaz para un individuo particular puede variarse (por ejemplo, aumentarse o disminuirse) en el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en momentos de enfermedad ffsica o estres, o si empeora los smtomas de la enfermedad, la cantidad de dosificacion puede aumentarse.
La cantidad terapeuticamente eficaz de la protema terapeutica (o composicion o medicamente que contiene la protema terapeutica) se administra a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza y grado de los efectos de la enfermedad, y en una base continua. La administracion a un "intervalo", como se usa en este documento, indica que la cantidad terapeuticamente eficaz se administra periodicamente (que se distingue de una dosis de una vez). El intervalo puede determinarse por tecnicas clmicas convencionales. En algunas realizaciones, la protema terapeutica se administra bimensualmente, mensualmente, dos veces al mes, cada tres semanas, bisemanalmente, semanalmente, dos veces a la semana, tres veces a la semana o diariamente. El intervalo de administracion para un unico individuo no tiene que ser un intervalo fijo, sino que puede variarse en el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en momentos de enfermedad ffsica o estres, o si empeoran los smtomas de la enfermedad, el intervalo entre dosis puede disminuirse.
Como se usa en este documento el termino "bimensualmente" significa administracion una vez en dos meses (es decir, una vez cada dos meses); el termino "mensualmente" significa administracion una vez al mes; el termino "cada tres semanas" significa administracion una vez en tres semanas (es decir, una vez cada tres semana); el termino "bisemanalmente" significa administracion una vez en dos semanas (es decir, una vez cada dos semanas); el termino "semanalmente" significa administracion una vez a la semana; y el termino "diariamente" significa administracion una vez al dfa.
La invencion se refiere adicionalmente a una composicion farmaceutica que comprende una protema terapeutica, como se describe en este documento en un recipiente (por ejemplo, un vial, frasco, bolsa para administracion intravenosa, jeringa, etc.) con una etiqueta que contiene instrucciones para la administracion de la composicion para el tratamiento de la enfermedad de Pompe, tal como por los metodos descritos en este documento.
La invencion se describira adicionalmente y mas espedficamente por los siguientes ejemplos. Los ejemplos, sin embargo, se incluyen con fines de ilustracion, no de limitacion.
Ejemplos
Ejemplo 1: Escision con furina de marca GILT basada en IGF-II
ZC-701 se ha desarrollado para el tratamiento de la enfermedad de Pompe. ZC-701 es una protema quimerica que contiene una marca GILT basada en IGF-II N-terminal fusionada con un espaciador de tres aminoacidos a los restos 70-952 de la a-glucosidasa acida humana (hGAA). Espedficamente, ZC-701 incluye los aminoacidos 1 y 8-67 de IGF-II humano (es decir, A2-7 de IGF-II humano maduro), la secuencia espaciadora Gly-Ala-Pro, y los aminoacidos 70-952 de GAA humana. La secuencia de aminoacidos de longitud completa se muestra a continuacion. La secuencia espaciadora esta en negrita. La secuencia N-terminal a la secuencia espaciadora refleja los aminoacidos 1 y 8-67 de IGF-II humano y la secuencia C-terminal a la secuencia espaciadora refleja los aminoacidos 70-952 de gAa humana. Los dos sitios potenciales de escision con furina solapantes dentro de la secuencia de marca IGF-II esta en negrita, y subrayada. Las flechas indican las dos posiciones potenciales de escision con furina.
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AALCGGELVDTLOFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPA
KSEGAPAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQ
MGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHF
TIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTVAPLFFA
DQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALE
DGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGY
PFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQWENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFN
KDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPL
IGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCP
NNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGT
RPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLG
NTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLY
TLFHQ AHVAGET VARPLFLEFPKDS S T WT VDFIQLL W GEALLITP VLQ AGKAE VT G YFPL
GTWYDLQTVPIEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPG
LTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNEL
VRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQYLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFL
VSWC (SEQ ID NO: 8)
Durante el curso de desarrollo de ZC-701, ha llegado a ser evidente que la marca GILT derivada de IGF-II en una fraccion de las moleculas ZC-701 esta sometida a escision proteolttica por furina durante la produccion en celulas CHO. El analisis N-terminal del lote de ZC-701 10-2-F45-54 revelo la presencia de dos secuencias N-terminal. Una se conformo al extremo N-terminal predicho de ZC-701 que indica la presencia de la proteina ZC-701 predicha. La otra secuencia N-terminal se alineaba con la secuencia dentro de la parte de marca de ZC-701, que indica la presencia de un derivado de ZC-701 coherente con una escision endoproteolitica en el resto del aminoacido 34 de ZC-701. Basandose en las relaciones molares estimadas de los dos extremos N-terminales, se descubrio que este lote de ZC-701 tenia una relacion de aproximadamente 1:1 de especies intactas y escindidas.
Tras recibir este resultado, cada uno de los otros lotes de ZC-701 se sometio a secuenciacion N-terminal. Todos los lotes presentaban los mismos extremos N-terminales con las especies escindidas variando de un 20-50 % del compuesto total. Un lote, que previamente ha demostrado tener baja actividad de captacion, presentaba un conjunto de extremos N-terminales indicativos de proteolisis adicional. Se concluyo que el evento proteolitico responsable de la segunda especie en todos los lotes de ZC-701 se perpetraba por furina o una proteasa de tipo furina.
La figura 1 muestra un mapa del extremo amino terminal de ZC-701. Los dos restos de aminoacidos en un recuadro son los sitios de los extremos N-terminales identificados en todos los lotes de ZC-701. El primero de los extremos N- terminales es el sitio de escision del peptido senal, que produce el extremo N-terminal predicho de ZC-701. El segundo resto en un recuadro es el sitio de un evento de escision proteolitica indeseado. La secuencia de aminoacidos proximal al sitio de escision es Arg-Arg-Ser-Arg (SEQ ID NO: 9). Esto coincide con el sitio de escision canonico de una proteasa presente en celulas CHO llamada furina, que escinde despues de Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO: 10). La furina es un miembro de una familia de convertasas de prohormonas que incluye PC3, una proteasa responsable de la maduracion de proinsulina en celulas de los islotes pancreaticos. De hecho, el sitio de escision de PC3 en la proinsulina esta conservado y es identico al sitio en que la furina escinde la marca IGF-II.
ZC-701 escindido con furina difiere en su peso molecular de ZC-701 intacto en aproximadamente 3000 Dalton, que representa menos de un 3 % de diferencia en el peso molecular. Debido a la heterogeneidad del oligosacarido en la proteina, la presencia de ZC-701 escindido no se detecto previamente por SDS-PAGE. Sin embargo, si ZC-701 se desglucosila primero por tratamiento con peptido N-glucosidasa F (PNGasa F), entonces la proteina escindida puede resolverse de ZC-701 intacto por SDS-PAgE.
Como se muestra en la figura 2, el carril 1 del gel de SDS-PAGE muestra el patron electroforetico de ZC-701 purificado desglucosilado. Son evidentes dos bandas. Se cree que la banda superior es ZC-701 intacto y se cree que la banda inferior es ZC-701 escindido con furina. Para demostrar que la banda inferior es de hecho ZC-701 escindido con furina, primero se trataron las mismas proteinas cargadas en el carril 1 con furina y despues se cargaron en el carril 2. Como se muestra en la figura 2, todas las proteinas en el carril 1 comigran con la banda inferior en el carril 1, lo que indica que la banda inferior es de hecho ZC-701 escindido con furina.
Se ha estimado la proportion de ZC-701 que se ha escindido con furina en varios lotes de ZC-701 por cuantificacion de la intensidad de banda en SDS-PAGE y por cuantificacion de aminoacidos liberados en experimentos de
secuenciacion N-terminal. Como se analiza anteriormente, la fraccion de ZC-701 escindido ha variado de un 20 % a un 50 % en diferentes lotes.
Ejemplo 2: Proteinas de fusion dirigidas que contienen una marca GILT basada en IGF-II resistente a furina 5
Se puede hacer un diseno respecto al problema de escision con furina alterando la secuencia de aminoacidos de IGF-II de modo que la alteracion de aminoacidos anule al menos un sitio de escision con furina. Se genero una serie de versiones mutantes de ZC-701 y se ensayo para la resistencia a escision por furina. Las versiones mutantes ejemplares de ZC-701 se generaron como se describe a continuacion.
10
ZC-701
El casete GILTA2-7-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y NotI del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7-GAA70-952 (plasmido p701). Los sitios de restriccion para la clonacion estan
15 en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGA ATCCC AAT GGGGAAGT CGAT GCTGGTGCTT C
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG
CCGT GT GAGCCGT CGC AGCCGT GGC AT CGTT GAGGAGT GCT GTTTCCGC AGCT GT GA
CCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgca
caccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcaccca
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gatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacc
tcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaacc
gggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtg
ttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacat
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cacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaa
tggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctg
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cactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctg
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ggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccct
20
gcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagtt
ccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaagg
ccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctg
cagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggc
tgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagg
gtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcct
ggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcg
tggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtc
tcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO: 11)
Construccion 1459
El casete GILTA2-7/K37-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7/K37-GAA70-952 (plasmido p1459). Los sitios de restriccion para la clonacion 5 estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7/K37 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7/K37 contiene una sustitucion de Arg a Lys en el aminoacido 37 de la secuencia de IGF-II humano (mayuscula negrita).
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGAATC CC AAT GGGGAAGTCGAT GCT GGT GCTTC TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG CCGTGTGAGCAAGCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGA CCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgca caccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcaccca ggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcc cacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttctt ccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcg ctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggt gatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacc tcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaacc gggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtg ttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacat cttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttc cacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaa tggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctg caccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagg gtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttca ccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacg agccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttgggggga ccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatc 0 gcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggc
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gtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgc
ggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccct
gcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagtt
ccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaagg
ccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctg
cagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggc
tgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagg
gtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcct
ggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcg
tggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtc
tcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO: 12)
Construccion 1460 15
El casete GILTA2-7/K40-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7/K40-GAA70-952 (plasmido p1460). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7/K40 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en 20 direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7/K40 contiene una sustitucion de Arg a Lys en el aminoacido 40 de la secuencia de IGF-II humano (mayuscula negrita).
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG
CCGTGTGAGCCGTCGCAGCAAGGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGA
CCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgca
caccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcaccca
ggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcc
cacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttctt
ccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcg
ctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggt
gatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacc
tcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaacc
gggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtg
ttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacat
cttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttc
cacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaa
tggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctg
caccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagg
gtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttca
ccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacg
agccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttgggggga
ccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatc
gcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggc
cactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctg
gtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgc
ggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccct
gcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagtt
ccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaagg
ccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctg
cagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggc
tgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagg
gtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcct
ggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcg
tggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtc
tcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO: 13)
5 Construccion 1461
El casete GILTA2-7/A37-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7/A37-GAA70-952 (plasmido p1461). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa 10 el gen GAA y la marca GILTA2-7/A37 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7/A37 contiene una sustitucion de Arg a Ala en el aminoacido 37 de la secuencia de IGF-II humano (mayuscula negrita).
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG
CCGTGTGAGCGCTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGA
CCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgca
caccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcaccca
ggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcc
cacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttctt
ccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcg
ctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggt
gatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacc
tcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaacc
gggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtg
ttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacat
cttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttc
cacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaa
tggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctg
caccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagg
gtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttca
ccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacg
agccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttgggggga
ccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatc
gcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggc
cactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctg
gtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgc
ggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccct
gcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagtt
ccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaagg
ccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctg
cagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggc
tgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagg
gtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcct
ggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcg
tggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtc
tcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO: 14)
5 Construccion 1463
El casete GILTA2-7/A40-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7/A40-GAA70-952 (plasmido p1463). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa 10 el gen GAA y la marca GILTA2-7/A40 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7/A40 contiene una sustitucion de Arg a Ala en el aminoacido 40 de la secuencia de IGF2 humano (mayuscula negrita).
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG
CCGTGTGAGCCGTCGC AGCGCTGGC AT CGTTGAGGAGT GCT GTTT CCGC AGCT GT G A
CCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgca
caccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcaccca
ggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcc
cacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttctt
ccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcg
ctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggt
gatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacc
tcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaacc
gggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtg
ttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacat
cttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttc
cacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaa
tggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctg
caccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagg
gtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttca
ccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacg
agccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttgggggga
ccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatc
gcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggc
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gtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgc
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gcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagtt
ccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaagg
ccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctg
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ggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcg
tggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtc
tcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO: 15)
5 Construccion 1479
El casete GILTA2-7M1/K37-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7M1/K37-GAA70-952 (plasmido p1479). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7M1/K37 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7M1/K37 contiene una sustitucion de Arg a Lys en el aminoacido 37 de la secuencia de IGF-II humano (mayuscula negrita).
ggtaccaagcttgccAT GGGAAT CCC AAT GGGC A AGTCGAT GCT GGT GCT GCTC ACCTTCTT
GGCCTTTGCCTCGTGCTGCATTGCCGCTCTGTGCGGCGGGGAACTGGTGGACACCCT
CCAATTCGTCTGTGGGGACCGGGGCTTCTACTTCAGCAGACCCGCAAGCCGTGTGAG
TAAGCGCAGCCGTGGCATTGTTGAGGAGTGCTGTTTTCGCAGCTGTGACCTGGCTCT
CCTGGAGACGTACTGCGCTACCCCCGCCAAGTCTGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtc
ccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcga
ggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctacc
ccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacat
cctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcc
cttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccg
gcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcg
cagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcg
cccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaac
agcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggccc
agagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccg
ctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacct
ggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcg
gccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggagg
ggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccaca
gccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaact
tcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcg
gcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacag
ggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgg
gggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccg
acgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaa
cagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgca
ctcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggact
ctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgact
ggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgt
gagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatca
tccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggc
ccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaata
acacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcg
ccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatg
ggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO: 16)
5 Construccion 1487
El casete GILTA2-7M1/A37-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7M1/A37-GAA70-952 (plasmido p1487). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7M1/A37 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7M1/A37 contiene una sustitucion de Arg a Ala en el aminoacido 37 de la secuencia de IGF-II humano (mayuscula negrita).
ggtaccaagcttgccATGGGAATCCCAATGGGCAAGTCGATGCTGGTGCTGCTCACCTTCTT
GGCCTTTGCCTCGTGCTGCATTGCCGCTCTGTGCGGCGGGGAACTGGTGGACACCCT
CCAATTCGTCTGTGGGGACCGGGGCTTCTACTTCAGCAGACCCGCAAGCCGTGTGAG
TGCTCGCAGCCGTGGCATTGTTGAGGAGTGCTGTTTTCGCAGCTGTGACCTGGCTCT
CCTGGAGACGTACTGCGCTACCCCCGCCAAGTCTGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtc
ccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcga
ggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctacc
ccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacat
cctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcc
cttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccg
gcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcg
cagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcg
cccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaac
agcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggccc
agagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccg
ctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacct
ggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcg
gccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggagg
ggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccaca
gccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaact
tcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcg
gcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacag
ggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgg
gggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccg
acgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaa
cagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgca
ctcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggact
ctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgact
ggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgt
gagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatca
tccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggc
ccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaata
acacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcg
ccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatg
ggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:17)
5 Como se muestra en la figura 3, tres mutantes ejemplares (es decir, construcciones 1459, 1460 y 1461) en que la alanina o la lisina se ha sustituido por uno de los restos de arginina canonicos se expresaron sin escision detectable por furina. Tambien se muestra en la figura 3 (panel de la derecha), la construccion 1461 que contiene una sustitucion R37A que es adicionalmente resistente a adicion de furina exogena.
10 Construccion 1726
El casete GILTA2-7A30-39-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A30-39-GAA70-952 (plasmido p1726). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia
15 subrayada) separa el gen GAA y la marca Gilts30-39 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A30-39 contiene una deletion de los restos de aminoacido 30-39 (Arg-Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGAATC CC AAT GGGGAAGT CGAT GCT GGT GCTT C
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCCGTGGCATCGT
TGAGGAGTGCTGTTT CCGC AGCTGT GACCT GGCCCT CCT GGAGACGT ACT GT GCTAC
CCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccc
cccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagca
ggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctga
aatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagact
gagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcacc
gtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgac
ggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcc
cctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccc
tttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccct
gcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggac
gttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggt
ggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaa
caaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatca
gcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgct
gattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagtt
ccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaat
gagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctcc
acacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatt
tgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctc
ctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggag
ctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagct
tcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcc
cacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtgg
ggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgca
gacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtg
acgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacaga
gtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagag
cctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccag
tgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctc
caacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctaga
gcttgctagcggccgc (SEQ ID NO: 18)
Construccion 1749
5 El casete GILTA2-7A31-39-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A31-39-GAA70-952 (plasmido p1749). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A31-39 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A31-39 contiene una deletion de los 10 restos de aminoacido 31-39 (Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGA ATCCC AAT GGGGAAGT CGAT GCTGGT GCTT C
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCGTGGCAT
CGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGC
TACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcaetgcccacacagtgcgacgt
cccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaa
agcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcc
tctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatgg
agactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgg
gcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaac
acgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacct
cagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggt
ctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagcc
gagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagta
cctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcaccc
gccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttc
acgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcct
gccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggcc
agccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtgg
ctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgcccc
aacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagttt
ctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacg
cccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagct
cgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctca
gaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccg
tacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccac
caggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagct
cctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacga
cctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcag
tgggtgacgctgeeggceeeeetggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacateateeeeetgcagggccctggcctcacaacc
acagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatgga
gagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtg
accagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccc
tgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttag
tctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:19)
Construccion 1746
5 El casete GILTA2-7A32-39-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A32-39-GAA70-952 (plasmido p1746). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A32-39 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A32-39 contiene una delecion de los 10 restos de aminoacido 32-39 (Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGA ATCCCAAT GGGGAAGT CGAT GCTGGT GCTT C
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCCGTGG
CATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTG
TGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgc
gacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccc
tgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctga
gctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgat
gatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacag
ccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgct
gaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagc
acctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacg
ggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgca
gccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagca
gtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatca
cccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggaggga
cttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtgga
tcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccg
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gtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggt gttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:20)
5 Construccion 1747
El casete GILTA2-7A33-39-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A33-39-GAA70-952 (plasmido p1747). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A33-39 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala de GAA. El casete GILTA2-7A33-39 contiene una delecion de los restos de aminoacido 33-39 (Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCACG
TGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTA
CTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtecccacaca
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tccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaac
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ctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgcc
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ctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtc
ctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtg
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5 Construccion 1758
El casete GILTA2-7A34-39-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A34-39-GAA70-952 (plasmido p1758). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A34-39 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A34-39 contiene una delecion de los restos de aminoacido 34-39 (Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGAAT C CC AAT GGGGA AGT CGATGCTGGTGCTT C
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG
CCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGAC
GTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgccc
acacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgct
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tggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgc
gtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggcc
gcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcc
tcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcg
aacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatg
tggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgt
ggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctcca
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ggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctcca
acggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtca
gctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:22)
5 Construccion 1750
El casete GILTA2-7A35-39-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A35-39-GAA70-952 (plasmido p1750). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A35-39 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A35-39 contiene una deletion de los restos de aminoacido 35-39 (Val-Ser-Arg-Arg-Ser) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG
CCGTCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGA
GACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcag
tgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcgg
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gctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctg
cggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccaettcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagacc
ccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggac
ggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcaca
ggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccgg
tgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatg
gatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaaga
gcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactc
ctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatgga
ctcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctaca
tgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatca
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gggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctct
gaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtg
cctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaa
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tctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctgga
ctgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttcccct
tgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatc
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tcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:23)
5 Construccion 1748
El casete GILTA2-7A36-39-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A36-39-GAA70-952 (plasmido p1748). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A36-39 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A36-39 contiene una delecion de los restos de aminoacido 36-39 (Ser-Arg-Arg-Ser) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGA AT C CC AAT GGGGAAGTCGAT GCTGGT GCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG
CCGTGTGCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCT
GGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccag
agcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcc
cgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccag
ctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctg
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cgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagca
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ggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggac
tacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccg
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gttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccc
tggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatc
aggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaa
ccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggc
gctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacggggg
acgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgt
ctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacag
cctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcc
tcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactcta
gcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactgg
ctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgag
ccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccc
cctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccga
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gatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgcccc
agcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggag
agcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:24)
5 Construccion 1751
El casete GILTA2-7A29-40-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A29-40-GAA70-952 (plasmido p1751). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A29-40 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A29-40 contiene una deletion de los restos de aminoacido 29-40 (Ser-Arg-Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGA ATC CC A AT GGGG AAGT CGAT GCT GGT GCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCGGCATCGTTGAGGA
GTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGC
CAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagc
cgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgca
gggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggcta
cacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccg
cctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccact
ctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgc
ccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgct
cagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacct
ggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgccctta
gctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgg
gatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtgga
gaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaagga
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gggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattggg
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caggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctgg
agaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacacta
caacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctc
ccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgc
cagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgt
gcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcga
gccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcg
cgggggagaccgtggeeeggecectotteetggagttccccaaggactctagcaectggactgtggaccaceagetcctgtggggggag
gccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtg
ccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgc
cggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgc
cagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaa
gtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgaggga
gctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttca
cctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
gcggccgc (SEQ ID NO:25)
5 Construccion 1752
El casete GILTA2-7A30-40-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A30-40-GAA70-952 (plasmido p1752). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A30-40 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A30-40 contiene una deletion de los restos de aminoacido 30-40 (Arg-Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGGA AT C CC AAT GGGGAAGT CGATGCT GGT GCTT C
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCGGCATCGTTGA
GGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCC
CGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaa
cagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggc
tgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgg gctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgaga accgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtcc ccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtg gcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctg atgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttct acctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcc cttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttg tgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggt ggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaa ggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagca gctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgatt gggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccat gaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgag ctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacac actacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtga tctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccg tgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtg tgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagc gagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgt cgcgggggagaccgtggeecggcccetetteetggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtgggggg aggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacgg tgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctg ccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccg ccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctgga agtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgaggg agctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttc acctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgct 5 agcggccgc (SEQ ID NO:26)
Construccion 1753
El casete GILTA2-7A31-40-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el
10 vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A31-40-GAA70-952 (plasmido p1753). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A31-40 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A31-40 contiene una deletion de los restos de aminoacido 31-40 (Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaAT GGG AATCCCAAT GGGGAAGT CGAT GCTGGTGCTT C
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGGGCATCGT
TGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTAC
CCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccc
cccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagca
ggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctga
aatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagact
gagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcacc
gtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgac
ggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcc
cctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccc
tttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccct
gcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggac
gttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggt
ggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaa
caaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatca
gcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgct
gattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagtt
ccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaat
gagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctcc
acacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatt
tgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctc
ctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggag
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tcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcc
cacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtgg
ggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgca
gacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtg
acgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacaga
gtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagag
cctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccag
tgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctc
caacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctaga
gcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:27)
Construccion 1754
5 El casete GILTA2-7A32-40-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A32-40-GAA70-952 (plasmido p1754). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A32-40 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A32-40 contiene una delecion de los 10 restos de aminoacido 32-40 (Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGGCAT
CGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGC
TACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgt
cccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaa
agcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcc
tctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatgg
agactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgg
gcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaac
acgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacct
cagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggt
ctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagcc
gagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagta
cctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcaccc
gccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttc
acgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcct
gccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggcc
agccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtgg
ctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgcccc
aacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagttt
ctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacg
cccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagct
cgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctca
gaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccg
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caggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagct
cctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacga
cctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcag
tgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaacc
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gagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtg
accagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccc
tgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttag
tctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:28)
Construccion 1755
5 El casete GILTA2-7A33-40-GAA70-952 a continuation se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A33-40-GAA70-952 (plasmido p1755). Los sitios de restriction para la donation estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A33-40 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direction 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A33-40 contiene una deletion de los 10 restos de aminoacido 33-40 (Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAGG
CATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTG
TGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgc
gacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccc
tgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctga
gctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgat
gatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacag
ccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgct
gaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagc
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cttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtgga
tcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccg
gccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatg
gtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctg
ccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccacc
agtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcggggga
cacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagc
agctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacac
ctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccagga
gccgtaeagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgtt
ccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccacc
agctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggt
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gtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggt
gtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggt gttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:29)
5 Construccion 1756
El casete GILTA2-7A34-40-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7A34-40-GAA70-952 (plasmido p1756). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7A34-40 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7A34-40 contiene una delecion de los restos de aminoacido 34-40 (Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg) de la secuencia IGF-II humano.
ggtaccagctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTC
TCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGT
GGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAG
CGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTA
CTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtecccacaca
gtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctaca
tccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaac
ctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacg
tgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtcc
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ctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgcc
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ctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtc
ctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtg
cagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccg
ctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccgga
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gtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacga
gaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggagg
acatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggac
ggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccag
ccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgg
gggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgg
gagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggca
acacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgcccca
ggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgc
tgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggacc
accagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacat
ggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgag
gggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcct
cacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggac
gatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggt
acgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacg
gtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctg
gtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:30)
5 Construccion 1763
El casete GILTA2-7M1/L27A37-GAA70-952 a continuacion se clono usando los sitios Asp718 y Notl del casete y el vector pCEP4 para producir pCEP-GILTA2-7M1/L27A37-GAA70-952 (plasmido p1763). Los sitios de restriccion para la clonacion estan en minuscula y negrita. La secuencia de aminoacidos espaciadora Gly, Ala, Pro (secuencia 10 subrayada) separa el gen GAA y la marca GILTA2-7M1/L27A37 (secuencia en mayuscula). El espaciador y la marca estan situados en direccion 5' del resto Ala70 de GAA. El casete GILTA2-7M1/L27A37 contiene las sustituciones Y27L y R37A en la secuencia de IGF-II humano. La secuencia de ADN del casete GILT difiere de la secuencia de ADN humano en cada 6.° codon.
ggtaccaagcttgccATGGGAATCCCAATGGGCAAGTCGATGCTGGTGCTGCTCACCTTCTT
GGCCTTTGCCTCGTGCTGCATTGCCGCTCTGTGCGGCGGGGAACTGGTGGACACCCT
CCAATTCGTCTGTGGGGACCGGGGCTTCCTGTTCAGCAGACCCGCAAGCCGTGTGAG
TGCTCGCAGCCGTGGCATTGTTGAGGAGTGCTGTTTTCGCAGCTGTGACCTGGCTCT
CCTGGAGACGTACTGCGCTACCCCCGCCAAGTCTGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtc
ccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcga
ggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctacc
ccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacat
cctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcc
cttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccg
gcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcg
cagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcg
cccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaac
agcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggccc
agagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccg
ctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacct
ggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcg
gccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggagg
ggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccaca
gccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaact
tcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcg
gcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacag
ggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgg
gggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccg
acgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaa
cagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgca
ctcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggact
ctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgact
ggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgt
gagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatca
tccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggc
ccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaata
acacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcg
ccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatg
ggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgctagcggccgc (SEQ ID NO:31)
5 Ejemplo 3: Expresion y purificacion de enzimas GAA marcadas con GILT Cultivo tisular
Los plasmidos de GAA marcados con GILT se transfectaron cada uno en celulas FreeStyle 293-F en suspension 10 como se describe por el fabricante (Invitrogen). En resumen, las celulas se cultivaron en medio Opti-MEM I (Invitrogen) en matraces de agitacion de policarbonato en un agitador orbital a 37 °C y CO2 al 8 %. Las celulas se ajustaron hasta una concentracion de 1x1o6 celulas/ml, despues se transfectaron con una relacion 1:1:1 de ml de celulas:jg de ADN:|jl de 293 fectin. Se recogieron alicuotas del cultivo 5-7 dias despues de la transfeccion y se centrifugaron a 5.000 x g durante 5 minutos. Los sobrenadantes se almacenaron congelados a -80 °C.
15
Purificacion y concentracion de protenas
El material de partida fue sobrenadante de cultivo celular de mamifero, como se describe anteriormente, descongelado de su almacenamiento a -80 °C. Se anadio acido citrico hasta alcanzar pH 6,0, despues se anadio 20 sulfato de amonio hasta alcanzar una concentracion final de 1 M. El material se paso a traves de un filtro Supor- Mach de 0,2 jm (Nalgene).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El material filtrado se cargo en una columna de fenil-Sepharose™ 6 Low-Sub Fast-Flow (GE Healthcare) preparada con tampon de carga HIC (citrato 50 mM pH 6,0, AmSO41 M). La columna se lavo con 10 volumenes de columna de tampon de lavado HIC (citrato 50 mM pH 6,0, AmSO4 0,8 M), y se eluyo con 5 volumenes de columna de tampon de elucion HIC (citrato 50 mM pH 6,0). Las muestras de cada pico de elucion se combinaron y se intercambio el tampon a solucion salina tamponada con fosfato (NaCl 145,15 mM, KCl 2,33 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM, pH 6,2) usando concentradores de centrifugacion centricon (Amicon) y columnas de desalado Bio-Spin-6 (Bio-Rad).
Actividad enzimatica
La expresion de GAA se determino por un ensayo enzimatico de para-nitrofenol (PNP). La enzima GAA se incubo en 50 |jl de mezcla de reaccion que contema acetato sodico 100 mM pH 4,2 y sustrato de a-glucosido de para-nitrofenol (PNP) 10 mM (Sigma N1377). Las reacciones se incubaron a 37 °C durante 20 minutos y se detuvieron con 300 jl de carbonato sodico 100 mM. Se midio la absorbancia a 405 nm en placas de microtitulacion de 96 pocillos y se compararon con curvas patron derivadas de p-nitrofenol (Sigma N7660). 1 unidad PNP de GAA se define como 1 nM de PNP hidrolizado/hora.
Ejemplo 4: Ensayos competitivos de union a receptor
Se examino la afinidad de protemas marcadas con GILT por el receptor de IGF2 (IGF2R), el receptor IGF1 (IGF1R) y el receptor de insulina (IR) en experimentos competitivos de union realizados en un formato de placa de 96 pocillos. Los receptores se recubrieron a temperatura ambiente durante una noche sobre placas blancas Reacti-bind (Pierce, n.° Cat. 437111) en tampon de recubrimiento (tampon carbonato 0,05 M, pH 9,6) a una concentracion de 0,5 jg/pocillos (IGF2R) o 1 jg/pocillo (IGF1R, IR). Las placas se lavaron con tampon de lavado (solucion salina tamponada con fosfato mas Tween-20 al 0,05 %), despues se bloquearon en tampon de bloqueo Super (Pierce, n.° Cat. 37516) durante 1 hora. Despues de otro lavado de la placa, se anadieron ligandos biotinilados (Cell Sciences) a los pocillos; los pocillos de IGF2R recibieron IGF2-biotina 8 nM, los pocillos de IGF1R recibieron IGF1 -biotina 30 mM y los pocillos de IR recibieron insulina-biotina 20 nM. Junto con los ligandos biotinilados, los pocillos tambien conteman diluciones en serie de las muestras de protema GAA marcada con GILT o ligandos de control no biotinilados que actuan como inhibidores de union para los ligandos biotinilados. Despues de una incubacion con balanceo de 2 horas, las placas se lavaron y los ligandos biotinilados unidos se detectaron con una incubacion con estreptavidina-HRP (R&D, n.° Cat. 890803, dilucion 1:200 en tampon de bloqueo, 30 minutos), seguido por una incubacion con sustrato quimioluminiscente Super Elisa Pico (Pierce, n.° Cat. 37070, 5 minutos). La senal quimioluminiscente se midio a 425 nm.
El porcentaje de ligando biotinilado unido se calculo para cada concentracion de competidor en el ensayo de competicion de union a IGF2R y se determinaron los valores de CI50 (figura 4). La protema 1752 con una delecion de los restos 30-40 de IGF2 presentaba un valor de CI50 similar a ZC-701 marcado con GILT (figura 4), lo que indica que la delecion de estos restos en la region del bucle de IGF2 no parece afectar a la union a IGF2R. La protema 1751 con una delecion de los restos 29-40 de IGF2 presentaba un valor mayor de CI50 (figura 4), lo que indica que no compite tambien por la union al IGF2R.
En una placa de ensayo de IGF2R diferente, la comparacion de ZC-701 y la protema 1763 produjo valores de CI50 que difenan en un 35 % (vease la figura 5).
En un ensayo que mide la competicion de la union de insulina biotinilada a insulina unida a placa, las protemas 1751 y 1752 no fueron tan eficaces como inhibidores en comparacion con 701 o IGF-II (vease la figura 6). Esto indica que las protemas 1751 y 1752, con deleciones en la region de bucle correspondiente a los aminoacidos 30-40 de la mara GILT, teman una afinidad reducida por el receptor de insulina en comparacion con la marca GILT intacta en 701 o IGF-II.
En un ensayo que mide la competicion de la union de IGF-I biotinilado a IGF1R unido a placa, la protema 1763 no fue tan eficaz como inhibidor en comparacion con 701, IGF-II o IGF-I (vease la figura 7). Esto indica que la protema 1763, con las mutaciones A2-7, Y27L y R37A en la marca GILT, tema una afinidad reducida por el receptor de IGF1 en comparacion con ZC-701 o IGF-II.
Ejemplo 4. Ensayo adicional de union al receptor de insulina
La protema ZC-1487 se ensayo para su afinidad de union por el receptor de insulana. La protema ZC-1487 contiene el casete GILTD2-7M1/A37 que contiene una sustitucion de Arg a Ala en el aminoacido 37 de la secuencia de IGF2 humano y es resistente a proteolisis por furina. Se analizaron dos lotes diferentes de esta protema purificada de celulas CHO, ZC-1487-B26 y ZC-1487-B28 en un ensayo que mide la competicion de la union de insulina biotinilada con insulina unida a placa.
Se realizo un ensayo de union al receptor de insulina por competicion de insulina, IGF-II, ZC710B20 y ZC1487B26 o ZC-1487-B28 con la union de insulina biotinilada al receptor de insulina (insulina-R).
Espedficamente, se recubrieron placas Reacti-Bind™ blancas con insulina-R a una concentracion 1 ug/pocillo/100 ul (38,4 nM). Las placas recubiertas se incubaron durante una noche a temperatura ambiente, despues se lavaron 3X con tampon de lavado (300 ul/pocillo). Las placas despues se bloquearon con tampon de bloqueo (300 ul/pocillo) durante 1 hora. Las etapas de lavado se repitieron y se extrajo cualquier resto de solucion en las placas.
5
La insulina biotinilada se mezclo a 20 nM con diferentes concentraciones de insulina, IGF-II, ZC701B20, B26 y B28 por diluciones en serie (las concentraciones finales se muestran en la tabla 2). Se anadieron 100 ul de insulina diluida, IGF-II, ZC710B20, ZC1487B26, y ZC1487B28 en insulina-biotina 20 nM en las placas recubiertas y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas despues se lavaron 3 con tampon de 10 lavado. Se anadieron 100 ul de solucion de trabajo de estreptavidina-HRP (50 ul de estreptavidina-HRP en l0 ml de tampon de bloqueo) a las placas y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron 100 ul de solucion de trabajo Elisa-Pico que contema sustrato quimioluminiscente Elisa-Pico y se midio la quimioluminiscencia a 425 nm. Los resultados ejemplares se muestran en la tabla 2, figura 8 y figura 9. Ambos lotes de ZC-1487 no fueron tan eficaces como inhibidores en comparacion con ZC-701 o el control de insulina. Como 15 puede observarse a partir de la tabla 2 y la figura 8, el peptido resistente a furina ZC-1487B26 se une al receptor de insulina con una avidez mas de 10 veces inferior que ZC-701 y mas de 20 veces menor que IGF-II de tipo silvestre.
Esto indica que la protema 1487 tema una afinidad reducida por el receptor de insulina en comparacion con la mara GILT en ZC-701.
20

Claims (26)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Una protema de fusion terapeutica dirigida que comprende:
    una enzima lisosomica; y
    una mutema IGF-II que tiene una secuencia de aminoacidos al menos un 70 % identica a IGF-II humano maduro (SEQ ID NO: 1) y que comprende una mutacion dentro de una region correspondiente a los aminoacidos 30-40 de la SEQ ID NO: 1 de modo que la mutacion anula al menos un sitio de escision con proteasa furina,
    en la que la mutema IGF-II (a) se une al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes de una manera independiente de manosa-6-fosfato; (b) es resistente a escision por furina; y (c) tiene afinidad de union disminuida por el receptor de insulina respecto a la afinidad del IGF-II humano de origen natural por el receptor de insulina.
  2. 2. La protema de fusion terapeutica dirigida de la reivindicacion 1, en la que la mutema IGF-II comprende una delecion de los aminoacidos 30-40 de la SEQ ID NO: 1.
  3. 3. La protema de fusion terapeutica dirigida de la reivindicacion 1, en la que la mutacion es una sustitucion de aminoacido en una posicion correspondiente a Arg37 de la SEQ ID NO: 1, opcionalmente en la que la sustitucion de aminoacido es una sustitucion de Lys o Ala.
  4. 4. La protema de fusion terapeutica dirigida de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la enzima lisosomica se selecciona de: a1,4-glucosidasa acida; p-galactosidasa; p-hexosaminidasa A; p- hexosaminidasa B; a-galactosidasa A; glucocerebrosidasa; arilsulfatasa A; galactosilceramidasa; esfingomielinasa acida; ceramidasa acida; lipasa acida; a-L-iduronidasa; iduronato sulfatasa; heparan N-sulfatasa; a-N- acetilglucosaminidasa; acetil-CoA-glucosammido acetiltransferasa; N-acetilglucosamina-6-sulfatasa; galactosamina- 6-sulfatasa; p-galactosidasa; arilsulfatasa B; p-glucuronidasa; a-manosidasa; p-manosidasa; a-L-fucosidasa; N- aspartil-p-glucosaminidasa; a-neuraminidasa; protema protectora lisosomica; a-N-acetil-galactosaminidasa; N- acetilglucosamina-1-fosfotransferasa; y palmitoil-protema tioesterasa.
  5. 5. La protema de fusion terapeutica dirigida de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la mutema IGF-II comprende:
    (a) una delecion o un remplazo de los aminoacidos correspondientes a las posiciones 2-7 de la SEQ ID NO: 1; y/o
    (b) una delecion o un remplazo de los aminoacidos correspondientes a las posiciones 1-7 de la SEQ ID NO: 1; y/o
    (c) una delecion o un remplazo de los aminoacidos correspondientes a las posiciones 62-67 de la SEQ ID NO: 1; y/o
    (d) una sustitucion de aminoacidos en una posicion correspondiente a Tyr27, Leu43 o Ser26 de la SEQ ID NO: 1, opcionalmente seleccionada del grupo que consiste en Tyr27Leu, Leu43Val, Ser26Phe y combinaciones de las mismas; y/o
    (e) aminoacidos correspondientes a las posiciones 48-55 de la SEQ ID NO: 1; y/o
    (f) al menos tres aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en los aminoacidos correspondientes a las posiciones 8, 48, 49, 50, 54 y 55 de la SEQ ID NO: 1; y/o
    (g) en las posiciones correspondientes a las posiciones 54 y 55 de la SEQ ID NO: 1, estando cada uno de dichos aminoacidos sin carga o con carga negativa a pH 7,4.
  6. 6. La protema de fusion terapeutica dirigida de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la mutema IGF-II tiene afinidad de union disminuida por el receptor de IGF-I respecto a la afinidad de IGF-II humano de origen natural por el receptor de IGF-I.
  7. 7. La protema de fusion terapeutica dirigida de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la enzima lisosomica es alfa-glucosidasa acida (GAA) humana o una variante funcional de la misma, opcionalmente en la que la enzima lisosomica comprende los aminoacidos 70-952 de GAA humana.
  8. 8. La protema de fusion terapeutica dirigida de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la protema de fusion terapeutica dirigida comprende adicionalmente un espaciador entre la enzima lisosomica y la mutema IGF-II, opcionalmente en la que el espaciador comprende una secuencia de aminoacidos Gly-Ala-Pro.
  9. 9. Un acido nucleico que codifica la protema de fusion terapeutica dirigida de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  10. 10. Una celula que contiene el acido nucleico de la reivindicacion 9.
  11. 11. Una composicion farmaceutica adecuada para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomico, que comprende una protema de fusion terapeutica dirigida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
  12. 12. La protema de fusion terapeutica dirigida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en un 5 metodo de tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosomico.
  13. 13. La protema de fusion terapeutica dirigida para su uso de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que la enfermedad de almacenamiento lisosomico se selecciona de: enfermedad de Pompe; enfermedad de Wolman; y Sanfilippo B (MPS IIIB).
    10
  14. 14. Un metodo de produccion de una protema de fusion terapeutica dirigida, que comprende una etapa de: cultivo de celulas de mairnfero en un medio de cultivo celular, en el que las celulas de mamffero portan el acido nucleico de la reivindicacion 9; y el cultivo se realiza en condiciones que permiten la expresion de la protema de fusion terapeutica dirigida.
    15
  15. 15. Un metodo de produccion de una protema de fusion terapeutica dirigida de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende una etapa de: cultivo de celulas deficientes de furina en un medio de cultivo celular, en el que las celulas deficientes de furina portan un acido nucleico que codifica una protema de fusion de las reivindicaciones 1 a 8 y en el que el cultivo se realiza en condiciones que permiten la expresion de la protema de fusion terapeutica
    20 dirigida.
    5
    imagen1
    Figura 1. Mapa del extremo N-terminal de ZC-701. Los dos restos de aminoacido en recuadro en rojo son sitios de eventos de escision. El primero es el sitio de escision del peptido senal, el segundo es el sitio de una escision con furina.
    Furina: _ 4.
    Figura 2. SDS-PAGE de ZC-701 despues del tratamiento con PNGasa F. El carril en la derecha se ha tratado adicionalmente con furina.
    FIGURA 2
    5
    imagen2
    Figura 3. Izquierda. Esquema de mutantes ZC-701 en que el sitio de escision con furina esta modificado. Centro. Analisis de SDS-PAGE de mutantes tratados con PNGasa despues de 3-7 dfas de cultivo celular. Derecha. Analisis de SDS-PAGE de mutantes tratados con PNGasa tratados con furina.
    imagen3
    Inhibicion de la union de IGF2-biotina a IGF2R
    1752
    40
    100
    1000
    Concentracion de competidor (nM)
    Competidor
    IGF2
    ZC-701
    1752
    1751
    CI50
    57,7
    106,0
    65,3
    FIGURA 4
    Inhibicion de IGF2-biotina a IGF2R
    imagen4
    Concentracion de competidor (nM)
    Competidor
    IGF2 ZC-701 1763
    CIso
    7,7 135,4 207,9
    FIGURA5
    imagen5
    Ensayo de competicion del receptor de insulina
    1400,0
  16. 1200.0
  17. 1000.0
    IGF2
    800,0
    701
    1751
    600,0
    *••1752
    400,0
    200,0
    100
    1000
    10000
    Concentracion de competidor (nM)
    FIGURA 6
    Ensayo de competidor de IGF1R
  18. 450.0
  19. 400.0
  20. 350.0
  21. 300.0
  22. 250.0
  23. 200.0
  24. 150.0
  25. 100.0
    50,0
    0,0
    imagen6
    imagen7
    IGF1 IGF2 701 1763
    Concentracion de competidor (nM)
    FIGURA7
    Intensidad de quimioluminiscencia (unidades)
    imagen8
    FIGURA 8
    imagen9
    Inn
    bicion
    de
    bioti
    union
    insu
    ina
    na
    nsu
    04292009
    120
    100
    Insul
    ina
    100
    1000
    Concentracion de competidor nM
    ZC-1487-B26
    ZC-1487-B28
    ZC-701-GMP1
    nsu ina
    CI50
  26. 40.5
    607
    F GURA 9
    imagen10
    ^>>>>^
    250
    150
    Furina «»
    250
    150
    + Furina «»
    Tincion
    PAb
    MAb
    MAb
    con Coomassie
    anti- GF2
    anti-GAA
    anti- GF2
    (Ambas bandas) (Banda superior)
    FIGURA 10
    Actividad de captacion de GAA (unidades/mg)
    FIGURA 11
    imagen11
    Concentracion de GAA (nM)
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