TW201925236A - 包含酶替代療法酶之融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本文提供包含酶替代療法酶及Fc區之融合蛋白，以及使用此類蛋白質來治療溶酶體貯積症之方法。本文亦提供運送藥劑穿過血腦障壁之方法。
Description
溶酶體貯積症(LSD)為相對罕見之遺傳性代謝疾病，其由溶酶體功能缺陷引起。LSD典型地由缺乏參與溶酶體中之代謝產物分解之單一酶引起。由缺乏酶活性引起之產物積累影響各種器官系統且會導致嚴重症狀及早亡。大部分LSD亦具有在進行性神經變性及嚴重認知損傷至癲癇、行為及精神病症範圍內之顯著神經組分。可使用LSD中缺乏之酶的重組形式來治療該病症，但此類療法對腦部可能幾乎沒有作用，此係歸因於難以遞送重組酶穿過血腦障壁(BBB)。
本文提供包含酶替代療法(ERT)酶之融合蛋白及使用該等融合蛋白來治療溶酶體貯積症(LSD)之方法。
在一些態樣中，本文提供一種蛋白質，其包含：(a)第一Fc多肽，其鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段；及(b)第二Fc多肽，其與第一Fc多肽形成Fc二聚體。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈可變區序列或其抗原結合部分。
在一些實施例中，ERT酶為艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、IDS變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：91、92、114、230及234中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：91、92、114、230及234
中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、SGSH變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為酸性神經鞘磷脂酶(ASM)、ASM變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為β-葡糖腦苷脂酶(GBA)、GBA變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽為融合多肽，其藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，多肽連接子為可撓性多肽連接子。在一些實施例中，可撓性多肽連接子為富含甘胺酸之連接子。在一些實施例中，富含甘胺酸之連接子為G4
S(SEQ ID NO：239)或(G4
S)2
(SEQ ID NO：240)。在一些實施例中，第一Fc多肽不藉由化學交聯劑鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段，例如融合多肽不包括非肽鍵或非多肽連接子。
在某些實施例中，融合多肽自N端至C端包含：ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段；多肽連接子；及第一Fc多肽。
在一些實施例中，第二Fc多肽鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，第二Fc多肽為融合多肽，其藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，多肽連接子為可撓性多肽連接子。在一些實施例中，可撓性多肽連接子為富含甘胺酸之連接子。在一些實施例中，富含甘胺酸之連接子為G4
S(SEQ ID NO：239)或(G4
S)2
(SEQ ID NO：240)。在一些實施例中，第二Fc多肽不藉由化學交聯劑鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段，例如融合多肽不包括非肽鍵或非多肽連接子。
在一些實施例中，第一Fc多肽之N端及/或第二Fc多肽之N端鍵聯至ERT酶。在一些實施例中，第一Fc多肽之N端鍵聯至一個ERT酶且第二Fc多肽之N端鍵聯至另一ERT酶。
在一些實施例中，第一Fc多肽之C端及/或第二Fc多肽之C端鍵聯至ERT酶。在一些實施例中，第一Fc多肽之C端鍵聯至一個ERT酶且第二Fc多肽之C端鍵聯至另一ERT酶。
在一些實施例中，第一Fc多肽之N端鍵聯至一個ERT酶且第二Fc多肽之C端鍵聯至另一ERT酶。在一些實施例中，第一Fc多肽之C端鍵聯至一個ERT酶且第二Fc多肽之N端鍵聯至另一ERT酶。
在一些實施例中，蛋白質包含單個ERT酶，且第一Fc多肽之N端或C端鍵聯至ERT酶。在一些實施例中，蛋白質包含兩個ERT酶(例如剛好兩個ERT酶)。在一些實施例中，蛋白質包含剛好一個或剛好兩個ERT酶、酶變異體或其催化活性片段。
在一些實施例中，第一Fc多肽為經修飾之Fc多肽及/或第二Fc多肽為經修飾之Fc多肽。
在一些實施例中，第一Fc多肽及第二Fc多肽各含有促進異二聚化
之修飾。在一些實施例中，Fc二聚體為Fc異二聚體。在一些實施例中，根據EU編號，Fc多肽中之一者具有T366W取代且另一Fc多肽具有T366S、L368A及Y407V取代。在一些實施例中，第一Fc多肽含有T366S、L368A及Y407V取代且第二Fc多肽含有T366W取代。在一些實施例中，第一Fc多肽鍵聯至ERT酶IDS且包含SEQ ID NO：117、232及236中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽含有T366W取代且第二Fc多肽含有T366S、L368A及Y407V取代。在一些實施例中，第一Fc多肽鍵聯至ERT酶IDS且包含SEQ ID NO：118、233及237中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含天然FcRn結合位點。在一些實施例中，第一Fc多肽及第二Fc多肽不具有效應功能。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包括降低效應功能之修飾。在一些實施例中，降低效應功能之修飾為根據EU編號在位置234之Ala及在位置235之Ala的取代。在一些實施例中，降低效應功能之修飾進一步包含根據EU編號在位置329之Gly的取代。在一些實施例中，第一Fc多肽鍵聯至ERT酶IDS且包含SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽鍵聯至ERT酶SGSH且包含SEQ ID NO：149、150、152及153中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽相對於天然Fc序列包含延長血清半衰期之胺基酸變化。在一些實施例中，胺基酸變化包含根據EU編號在位置252之Tyr、在位置254之Thr及在位置256之Glu的取代。或者，在其他實施例中，胺基酸變化包含根據EU編號在位置428之Leu及在位置434之Ser的取代。或者，在其他實施例中，胺基酸變化包含根據EU編號在位置434之Ser或Ala的取代。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽特異性結合於轉鐵
蛋白受體(TfR)。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含根據EU編號在選自由以下組成之群的位置的至少兩個取代：384、386、387、388、389、390、413、416及421。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含在該等位置之至少三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽進一步包含根據EU編號在包含380、391、392及415之位置的一個、兩個、三個或四個取代。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽進一步包含根據EU編號在包含414、424及426之位置的一個、兩個或三個取代。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含在位置388之Trp。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含在位置421之芳族胺基酸。在一些實施例中，在位置421之芳族胺基酸為Trp或Phe。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含至少一個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含11個如下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位
置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser，Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽具有與SEQ ID NO：34-38、58及60-90、151及156-229中之任一者之胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的CH3結構域。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO：156-229中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO：34-38、58及60-90、151及156-229中之任一者的EU索引位置380、384、386、387、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424及426之位置中的至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者處的殘基未缺失或取代。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO：157之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO：217之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列，且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：205及228中之任一者(例如SEQ ID NO：228)之胺基酸序列。在其他實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列，且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：169及229中之任一者(例如SEQ ID NO：229)之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：231之胺基酸序列，
且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：205及228中之任一者(例如SEQ ID NO：228)之胺基酸序列。在其他實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：231之胺基酸序列，且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：169及229中之任一者(例如SEQ ID NO：229)之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：235之胺基酸序列，且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：205及228中之任一者(例如SEQ ID NO：228)之胺基酸序列。在其他實施例中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO：235之胺基酸序列，且第二Fc多肽包含SEQ ID NO：169及229中之任一者(例如SEQ ID NO：229)之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽結合於TfR之頂端結構域。在一些實施例中，蛋白質結合於TfR不實質上抑制轉鐵蛋白結合於TfR。
在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽與對應野生型Fc多肽相比具有至少75%或至少80%、85%、90%、92%或95%之胺基酸序列一致性。在一些實施例中，對應野生型Fc多肽為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽。
在一些實施例中，ERT酶在腦中之攝入(例如使用適當動物模型，諸如本文所描述之彼等動物模型)比在不存在第一Fc多肽及/或第二Fc多肽之情況下的ERT酶攝入或在不存在對第一Fc多肽及/或第二Fc多肽之引起TfR結合的修飾之情況下的ERT酶攝入大。在一些實施例中，與在不存在第一Fc多肽及/或第二Fc多肽之情況下的ERT酶攝入相比或與在不存在對第一Fc多肽及/或第二Fc多肽之引起TfR結合的修飾之情況下的ERT酶攝入相比，ERT酶在腦中之攝入為至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在一些實施例中，第一Fc多肽未經修飾以結合於血腦障壁(BBB)受
體且第二Fc多肽經修飾以特異性結合於TfR。在一些實施例中，第一Fc多肽經修飾以特異性結合於TfR且第二Fc多肽未經修飾以結合於BBB受體。
在一些實施例中，蛋白質不包括免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈可變區序列或其抗原結合部分。
在一些態樣中，本文提供一種包含鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段之Fc多肽的多肽，其中Fc多肽含有促進其與另一Fc多肽異二聚化之一或多個修飾。
在一些實施例中，ERT酶為IDS、IDS變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：91、92、114、230及234中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：91、92、114、230及234中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為SGSH、SGSH變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為ASM、ASM變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為GBA、GBA變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，Fc多肽為融合多肽，其藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，多肽連接子為可撓性多肽連接子。在一些實施例中，可撓性多肽連接子為富含甘胺酸之連接子。在一些實施例中，富含甘胺酸之連接子為G4
S(SEQ ID NO：239)或(G4
S)2
(SEQ ID NO：240)。在一些實施例中，Fc多肽不藉由化學交聯劑鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段，例如融合多肽不包括非肽鍵或非多肽連接子。
在某些實施例中，融合多肽自N端至C端包含：ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段；多肽連接子；及第一Fc多肽。
在一些實施例中，根據EU編號，Fc多肽含有T366S、L368A及Y407V取代。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：115、117、231、232、235及236中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：149及150中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，Fc多肽含有T366W取代。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：118、233及237中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽包含SEQ ID NO：152-155中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，多肽進一步包含另一Fc多肽。在一些實施例中，另一Fc多肽含有T366W取代或含有T366S、L368A及Y407V取代且與ERT酶-Fc融合多肽形成Fc二聚體。
在一些實施例中，Fc多肽包含天然FcRn結合位點。在一些實施例中，Fc多肽不具有效應功能。在一些實施例中，Fc多肽包括降低效應功能之修飾。在一些實施例中，降低效應功能之修飾為根據EU編號在位置234之Ala及在位置235之Ala的取代。在一些實施例中，降低效應功能之修飾進一步包含根據EU編號在位置329之Gly的取代。
在一些實施例中，Fc多肽相對於天然Fc序列包含延長血清半衰期之
胺基酸變化。在一些實施例中，胺基酸變化包含根據EU編號在位置252之Tyr、在位置254之Thr及在位置256之Glu的取代。
在一些實施例中，Fc多肽特異性結合於TfR。
在一些實施例中，Fc多肽包含根據EU編號在選自由以下組成之群的位置的至少兩個取代：384、386、387、388、389、390、413、416及421。在一些實施例中，Fc多肽包含在該等位置之至少三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。
在一些實施例中，Fc多肽進一步包含根據EU編號在包含380、391、392及415之位置的一個、兩個、三個或四個取代。在一些實施例中，Fc多肽進一步包含根據EU編號在包含414、424及426之位置的一個、兩個或三個取代。
在一些實施例中，Fc多肽包含在位置388之Trp。在一些實施例中，Fc多肽包含在位置421之芳族胺基酸。在一些實施例中，在位置421之芳族胺基酸為Trp或Phe。
在一些實施例中，Fc多肽包含至少一個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，Fc多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，Fc多肽包含11個如下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388
為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，Fc多肽具有與SEQ ID NO：34-38、58及60-90中之任一者之胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的CH3結構域。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO：34-38、58及60-90中之任一者的EU索引位置380、384、386、387、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424及426之位置中的至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者處的殘基未缺失或取代。
在一些實施例中，Fc多肽結合於TfR之頂端結構域。在一些實施例中，蛋白質結合於TfR不實質上抑制轉鐵蛋白結合於TfR。
在一些實施例中，Fc多肽與對應野生型Fc多肽相比具有至少75%或至少80%、85%、90%、92%或95%之胺基酸序列一致性。在一些實施例中，對應野生型Fc多肽為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽。
在一些實施例中，Fc多肽不包括免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈可變區序列或其抗原結合部分。
在一些實施例中，本文提供一種包含編碼多肽之核酸序列的聚核苷酸，該多肽包含鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段之Fc多肽，其中Fc多肽含有促進其與另一Fc多肽異二聚化之一或多個修飾。在一些實施例中，本文提供一種包含該聚核苷酸之載體。在一些實施例中，本文提供一種包含該聚核苷酸或該載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞進一步包含含有編碼另一Fc多肽之核酸序列的聚核苷酸。在一些實施例中，本文提供一種製備本文所描述之多肽的方法，該方法包括在使得由聚核苷酸編碼之多肽表現的條件下培養宿主細胞。
在一些態樣中，本文提供一種蛋白質，其包含：
(a)第一多肽鏈，其包含特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽；(b)第二多肽鏈，其包含Fc多肽，其中第一及第二多肽鏈形成Fc二聚體；及(c)ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段，其鍵聯至(a)之經修飾之Fc多肽或(b)之Fc多肽。
在一些實施例中，ERT酶為IDS、IDS變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：91、92、114、230及234中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：91、92、114、230及234中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為SGSH、SGSH變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為ASM、ASM變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶為GBA、GBA變異體或其催化活性片段。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，ERT酶包含SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，ERT酶鍵聯至(a)之經修飾之Fc多肽。在一些實施例中，ERT酶鍵聯至(b)之Fc多肽。在一些實施例中，(b)之Fc多肽未經修飾以結合於BBB受體。在一些實施例中，(b)之Fc多肽為特異性結合於TfR之經修
飾之Fc多肽。
在一些實施例中，ERT酶藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯(例如融合)至(a)之經修飾之Fc多肽或(b)之Fc多肽以形成融合多肽。在一些實施例中，多肽連接子為可撓性多肽連接子。在一些實施例中，可撓性多肽連接子為富含甘胺酸之連接子。在一些實施例中，富含甘胺酸之連接子為G4
S(SEQ ID NO：239)或(G4
S)2
(SEQ ID NO：240)。在一些實施例中，ERT酶不藉由化學交聯劑鍵聯至(a)之經修飾之Fc多肽或(b)之Fc多肽，例如融合多肽不包括非肽鍵或非多肽連接子。
在一些實施例中，ERT酶鍵聯至(a)之經修飾之Fc多肽的N端或(b)之Fc多肽之N端。在一些實施例中，ERT酶鍵聯至(a)之經修飾之Fc多肽的C端或(b)之Fc多肽之C端。
在一些實施例中，蛋白質包含兩個ERT酶。在一些實施例中，一個ERT酶鍵聯至(a)之經修飾之Fc多肽且另一ERT酶鍵聯至(b)之Fc多肽。在一些實施例中，ERT酶均鍵聯至各別Fc多肽之N端或均鍵聯至C端。在一些實施例中，一個ERT酶鍵聯至(a)之經修飾之Fc多肽的N端且另一ERT酶鍵聯至(b)之Fc多肽之C端。在一些實施例中，一個ERT酶鍵聯至(a)之經修飾之Fc多肽的C端且另一ERT酶鍵聯至(b)之Fc多肽之N端。
在一些實施例中，(a)及(b)之Fc多肽各含有促進異二聚化之修飾。在一些實施例中，根據EU編號，Fc多肽中之一者具有T366W取代且另一Fc多肽具有T366S、L368A及Y407V取代。在一些實施例中，(a)之經修飾之Fc多肽含有T366W取代且(b)之Fc多肽含有T366S、L368A及Y407V取代。在一些實施例中，(b)之Fc多肽鍵聯至ERT酶IDS且包含SEQ ID NO：117、232及236中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，(a)之經修飾之Fc多肽含有T366S、L368A及Y407V取代且(b)之Fc多肽含有T366W取代。在一些實施例中，(b)
之Fc多肽鍵聯至ERT酶IDS且包含SEQ ID NO：118、233及237中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，(a)之經修飾之Fc多肽及/或(b)之Fc多肽包含天然FcRn結合位點。在一些實施例中，(a)之經修飾之Fc多肽及(b)之Fc多肽不具有效應功能。在一些實施例中，(a)之經修飾之Fc多肽及/或(b)之Fc多肽包括降低效應功能之修飾。在一些實施例中，降低效應功能之修飾為根據EU編號在位置234之Ala及在位置235之Ala的取代。在一些實施例中，降低效應功能之修飾進一步包含根據EU編號在位置329之Gly的取代。在一些實施例中，(b)之Fc多肽鍵聯至ERT酶IDS且包含SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，(b)之Fc多肽鍵聯至ERT酶SGSH且包含SEQ ID NO：149、150、152及153中之任一者之胺基酸序列。
在一些實施例中，(a)之經修飾之Fc多肽及/或(b)之Fc多肽相對於天然Fc序列包含延長血清半衰期之胺基酸變化。在一些實施例中，胺基酸變化包含根據EU編號在位置252之Tyr、在位置254之Thr及在位置256之Glu的取代。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含根據EU編號在選自由以下組成之群的位置的至少兩個取代：384、386、387、388、389、390、413、416及421。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在該等位置之至少三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含根據EU編號在包含380、391、392及415之位置的一個、兩個、三個或四個取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含根據EU編號在包含414、424及426之位置的一個、兩個或三個取代。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置388之Trp。在一些
實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置421之芳族胺基酸。在一些實施例中，在位置421之芳族胺基酸為Trp或Phe。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含至少一個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含11個如下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽具有與SEQ ID NO：34-38、58及60-90、151及156-229中之任一者之胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的CH3結構域。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：156-229中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO：34-38、58及60-90、151及156-229中之任一者之EU索引位置380、384、386、387、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424及426之位置中的至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者處的殘基未缺失或取代。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：157之胺基酸序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：169之胺基酸序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：181之胺基酸序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：193之胺基酸序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：217之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO：205及228中之任一者(例如SEQ ID NO：228)之胺基酸序列且第二多肽鏈包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列。在其他實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO：169及229中之任一者(例如SEQ ID NO：229)之胺基酸序列且第二多肽鏈包含SEQ ID NO：115之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO：205及228中之任一者(例如SEQ ID NO：228)之胺基酸序列且第二多肽鏈包含SEQ ID NO：231之胺基酸序列。在其他實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO：169及229中之任一者(例如SEQ ID NO：229)之胺基酸序列且第二多肽鏈包含SEQ ID NO：231之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO：205及228中之任一者(例如SEQ ID NO：228)之胺基酸序列且第二多肽鏈包含SEQ ID NO：235之胺基酸序列。在其他實施例中，第一多肽鏈包含SEQ ID NO：169及229中之任一者(例如SEQ ID NO：229)之胺基酸序列且第二多肽鏈包含SEQ ID NO：235之胺基酸序列。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽結合於TfR之頂端結構域。在一些實施例中，蛋白質結合於TfR不實質上抑制轉鐵蛋白結合於TfR。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與對應野生型Fc多肽相比具有
至少75%或至少80%、85%、90%、92%或95%之胺基酸序列一致性。在一些實施例中，對應野生型Fc多肽為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽。
在一些實施例中，ERT酶在腦中之攝入(例如使用適當動物模型，諸如本文所描述之彼等動物模型)比在不存在Fc多肽之情況下的ERT酶攝入或在不存在對Fc多肽之引起TfR結合的修飾之情況下的ERT酶攝入大。在一些實施例中，與在不存在Fc多肽之情況下的ERT酶攝入相比或與在不存在對Fc多肽之引起TfR結合的修飾之情況下的ERT酶攝入相比，ERT酶在腦中之攝入大至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50，55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在一些態樣中，本文提供一種治療LSD之方法，該方法包括向有需要之患者投與如上文所描述之蛋白質或多肽。在一些實施例中，該方法減少患者中之毒性代謝產物累積，例如減少患者腦及/或腦脊髓液(CSF)中之毒性代謝產物。
在相關態樣中，本文提供一種減少患有LSD之患者中之毒性代謝產物累積的方法，該方法包括向患者投與如上文所描述之蛋白質或多肽。在一些實施例中，該方法減少患者腦及/或CSF中之毒性代謝產物累積。
在一些實施例中，LSD為亨特症候群(Hunter syndrome)，且ERT酶為IDS。在一些實施例中，毒性代謝產物包含硫酸乙醯肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣。
在一些實施例中，LSD為聖菲利柏症候群A(Sanfilippo syndrome A)，且ERT酶為SGSH。在一些實施例中，毒性代謝產物包含硫酸乙醯肝素衍生之寡醣(例如六醣)。
在一些實施例中，LSD為尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)，且ERT酶為ASM。在一些實施例中，毒性代謝產物包含神經鞘磷脂。
在一些實施例中，LSD為高歇氏病(Gaucher's disease)或帕金森氏病(Parkinson's disease)，且ERT酶為GBA。在一些實施例中，毒性代謝產物包含葡糖基神經醯胺。
在一些實施例中，毒性代謝產物之總量與在不存在該蛋白質或多肽之情況下的毒性代謝產物總量相比降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。本文描述了用於量測ERT酶活性及受質累積之說明性分析。
在一些態樣中，本文提供一種包含如上文所描述之蛋白質或多肽及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
在一些態樣中，本文提供一種監測受質累積以評估IDS活性之方法，該方法包括：(a)將來自投與如上文所描述之蛋白質或多肽之個體的細胞或組織樣品中之細胞或流體樣品中之微泡破碎以使微泡裂開從而獲得欲分析之醣胺聚醣(GAG)溶液；(b)使用至少一種肝素酶(例如肝素酶I、肝素酶II及肝素酶III)及軟骨素酶B消化GAG溶液以獲得GAG衍生之二醣；(c)藉由質譜法(例如LC-MS/MS)分析GAG衍生之二醣；及(d)測定硫酸乙醯肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣的含量，其中與缺乏IDS活性之對照相比硫酸乙醯肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣的含量降低指示與對照相比樣品中之IDS活性增加。
在一些實施例中，將細胞或微泡破碎之步驟包括至少一個冷凍-解凍循環及/或至少一個超音處理步驟。在一些實施例中，細胞係來自組織樣品且該方法包括至少三個、四個或五個冷凍-解凍循環。在一些實施例中，個體為缺乏IDS活性之小鼠。在一些實施例中，個體為非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為患有亨特症候群之人類患者。
在一些實施例中，硫酸乙醯肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣的含量與缺乏IDS活性之對照中的硫酸乙醯肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣的含量相比降低至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在一些實施例中，對照為在投與蛋白質或多肽之前自個體獲得之相同組織類型細胞之細胞或組織樣品。在一些實施例中，對照為已知缺乏IDS活性之相同組織類型細胞之細胞或組織樣品。在一些實施例中，蛋白質或多肽使樣品中之IDS活性與對照中之IDS活性相比增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在其他態樣中，本文提供一種監測受質累積以評估SGSH活性之方法，該方法包括：(a)將來自投與如上文所描述之蛋白質或多肽之個體的細胞或組織樣品中之細胞或流體樣品中之微泡破碎以使微泡裂開從而獲得欲分析之醣胺聚醣(GAG)溶液；(b)用至少一種肝素酶消化GAG溶液以獲得GAG衍生之二醣；(c)藉由質譜法(例如LC-MS/MS)分析GAG衍生之二醣；及(d)測定硫酸乙醯肝素衍生之二醣之含量，其中與缺乏SGSH活性之對照相比硫酸乙醯肝素衍生之二醣的含量降低指示與對照相比樣品中之SGSH活性增加。
在一些實施例中，將細胞或微泡破碎之步驟包括至少一個冷凍-解凍循環及/或至少一個超音處理步驟。在一些實施例中，細胞係來自組織樣品且該方法包括至少三個、四個或五個冷凍-解凍循環。在一些實施例中，個體為缺乏SGSH活性之小鼠。在一些實施例中，個體為非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為患有聖菲利柏症候群A之人類患者。
在一些實施例中，硫酸乙醯肝素衍生之二醣的含量與缺乏SGSH活性之對照中的硫酸乙醯肝素衍生之二醣的含量相比降低至少約5%、10%、15%、
20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在一些實施例中，對照為在投與蛋白質或多肽之前自個體獲得之相同組織類型細胞之細胞或組織樣品。在一些實施例中，對照為已知缺乏SGSH活性之相同組織類型細胞之細胞或組織樣品。在一些實施例中，蛋白質或多肽使樣品中之SGSH活性與對照中之SGSH活性相比增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在其他態樣中，本文提供一種運送藥劑穿過哺乳動物之BBB的方法，該方法包括使BBB暴露於以約50nM至約250nM之親和力結合於TfR的蛋白質，其中蛋白質鍵聯至藥劑且運送鍵聯之藥劑穿過BBB。在一些實施例中，哺乳動物腦中之藥劑的最大濃度(Cmax
)有所提高。在一些實施例中，藥劑適用於治療LSD。
在其他態樣中，本文提供一種治療LSD之方法，該方法包括向哺乳動物投與以約50nM至約250nM之親和力結合於TfR的蛋白質，其中蛋白質鍵聯至用於治療LSD之藥劑，由此使哺乳動物之腦暴露於藥劑。在一些實施例中，與鍵聯至以較弱親和力結合於TfR之參考蛋白質的藥劑相比該蛋白質使腦中之藥劑的Cmax
有所提高。在一些實施例中，參考蛋白質以約600nM或更弱之親和力結合於TfR。
在一些實施例中，TfR為靈長類動物TfR。在一些實施例中，靈長類動物TfR為人類TfR。在一些實施例中，蛋白質結合於TfR頂端結構域。
在一些實施例中，蛋白質以約100nM至約200nM之親和力結合於TfR。在一些實施例中，蛋白質以約110nM至約150nM之親和力結合於TfR。
在一些實施例中，藥劑之治療有效濃度為可治療哺乳動物之LSD的一或多種症狀的濃度。在一些實施例中，藥劑為蛋白質替代治療劑。在一些實
施例中，藥劑或蛋白質替代治療劑為酶。
在一些實施例中，與酶鍵聯至參考蛋白質時相比，當酶鍵聯至該蛋白質時在更大程度上減少患有LSD之哺乳動物腦中之毒性代謝產物累積。在一些實施例中，酶為IDS且LSD為亨特症候群。在一些實施例中，毒性代謝產物包含硫酸肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣。在一些實施例中，酶為SGSH且LSD為聖菲利柏症候群A。在一些實施例中，酶為ASM且LSD為尼曼-皮克病。在一些實施例中，酶為GBA且LSD為高歇氏病。
在一些實施例中，藥劑包含抗體可變區。在一些實施例中，藥劑包含抗體片段。在一些實施例中，藥劑包含Fab或scFv。
在一些實施例中，蛋白質為含有能夠結合TfR之非天然結合位點的經修飾之Fc多肽。在一些實施例中，蛋白質包含特異性結合TfR之抗體可變區。
在一些實施例中，蛋白質包含抗體片段。在一些實施例中，蛋白質包含Fab或scFv。
在一些實施例中，鍵聯至藥劑之蛋白質係作為醫藥學上可接受之載劑的一部分而投與。
圖1顯示包含鍵聯至艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)之Fc多肽及結合於轉鐵蛋白受體(TfR)之經修飾之Fc多肽的IDS-Fc融合蛋白的純化及分析。
圖2顯示對圖1中分析之IDS-Fc融合蛋白的結合親和力分析的結果，證實融合蛋白結合於TfR。
圖3提供展示圖1中分析之IDS-Fc融合蛋白之活體外IDS活性的資料。
圖4提供證實缺乏IDS之敲出細胞之硫酸乙醯肝素衍生之二醣的含量如使用LC-MS/MS分析所評估有所增加，且IDS在IDS
敲出(KO)細胞中之表
現挽救敲出表型的資料。
圖5A表明包含相同TfR結合性Fc多肽(亦即，CH3C.35.21.17)之作為N端單酶或C端單酶的IDS-Fc融合蛋白使IDS
KO細胞中之硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素累積逆轉。圖5B表明N端單酶(「ETV：IDS 35.21.17」)具有與IDS類似之細胞功效。圖5C顯示在用IDS-Fc融合蛋白(「ETV：IDS」)或IDS處理之MPS II患者纖維母細胞中累積之S35
-硫酸鹽標記之蛋白質的劑量依賴性減少；n=8。圖5D顯示在存在或不存在5mM M6P之情況下用增加劑量之IDS-Fc融合蛋白(「ETV：IDS」)或IDS處理之MPS II患者纖維母細胞中S35
標記之蛋白質之M6PR依賴性清除的評估；n=3。圖5C-5D：「ETV：IDS」=ETV：IDS 35.23.2；圖式展示實驗重複之平均值±SEM。
圖6提供說明在小鼠中在來自給予媒劑之野生型(WT)小鼠或給予IDS或IDS-Fc融合蛋白(「ETV：IDS」)之IDS
KO小鼠之血清中硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素隨時間推移之含量的資料。「ETV：IDS」=ETV：IDS 35.21。
圖7提供說明以下情況下之資料：在施以40mg/kg IDS-Fc融合蛋白(「ETV：IDS」)或5.3mg/kg IDS之單次靜脈內注射後七天時評估在來自IDS
KO小鼠之外周組織中二醣D0SO、DOA0及D0a4之總體含量(稱為「總sGAG含量」)且與媒劑處理之IDS
KO及野生型小鼠相比較；IDS
KO組n=8且野生型組n=3。資料以平均值±SEM之形式顯示，p值：單因素ANOVA加上杜納多次比較測試(Dunnett multiple comparison test)；** p<0.01且**** p<0.0001。「ETV：IDS」=ETV：IDS 35.21。
圖8提供說明在外周投與IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21或缺乏賦予TfR結合之突變的對照IDS-Fc融合蛋白(「IDS：Fc」)之後人類TfR敲入(TfR ms/hu
KI)小鼠腦中之IDS-Fc融合蛋白濃度的資料。
圖9A提供說明在外周投與IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21.17.2或
ETV：IDS 35.23.2或缺乏賦予TfR結合之突變的對照IDS-Fc融合蛋白(「IDS：Fc」)之後TfR ms/hu
KI小鼠腦中之IDS-Fc融合蛋白濃度的資料。圖9B提供說明在單次靜脈內注射50mg/kg劑量之後TfR ms/hu
KI小鼠中之IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21或IDS：Fc之肝臟濃度的資料；n=4-5。圖式展示平均值±SEM。
圖10A-10C表明ETV：IDS使IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠之腦及外周組織中之GAG減少。如實例2中所描述為IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠投與40mg/kg ETV：IDS或14.2mg/kg IDS之單次靜脈內注射或四個週劑量。在單個劑量之後量測在IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠中在血清(圖10A)及組織(圖10B)中之IDS濃度。顯示在給藥後2h時時之組織PK；n=4。圖式展示平均值±SEM且p值：非配對t檢驗分析。圖10C顯示在單個劑量或多個劑量之ETV：IDS或IDS之後量測IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠之腦、CSF及外周組織中之二醣D0SO、DOA0及D0a4的含量(「總sGAG含量」)且與媒劑處理及野生型小鼠相比較；每個IDS
KO x TfR ms/hu
KI組n=8且野生型組n=5。圖式展示平均值±SEM且p值：單因素ANOVA加上杜納多次比較測試；** p<0.01，*** p0.001，且**** p0.0001。
圖11顯示包含鍵聯至兩個酸性神經鞘磷脂酶(ASM)酶之Fc區的ASM-Fc融合蛋白之純化及分析。
圖12提供展示圖11中分析之ASM-Fc融合蛋白的活體外ASM活性之資料。
圖13提供使用基於成像之分析表明如圖11中所分析之ASM-Fc融合蛋白減少ASM
KO細胞中之神經鞘磷脂累積的資料。
圖14提供使用基於LC-MS/MS之分析表明如圖11中所分析之ASM-Fc融合蛋白減少ASM
KO細胞中之神經鞘磷脂累積的資料。
圖15提供展示實例6中所描述之SGSH-Fc融合蛋白之活體外N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)活性的資料。
圖16提供證實缺乏SGSH之敲出(KO)細胞的硫酸乙醯肝素衍生之二醣的含量如使用LC-MS/MS分析所評估有所增加的資料。n=3-4個獨立細胞株；資料以平均值±s.e.m之形式顯示。
圖17提供說明圖15中分析之SGSH-Fc融合蛋白使SGSH
KO細胞中之硫酸乙醯肝素累積逆轉的資料。
圖18顯示經工程改造之TfR結合性多肽的hTfR親和力與在TfR ms/hu
KI小鼠中隨時間推移之腦暴露之間的關係。點表示在TfR ms/hu
KI小鼠中在單個50mg/kg劑量之後不同經工程改造之TfR結合性多肽親和力變異體的隨時間推移之累積腦暴露(AUC)。在給藥後之不同天數(在1-10天範圍內)時計算多肽之腦濃度(如藉由huIgG1所量測)。資料表示三個獨立研究之彙總，n=各研究每組4-5個小鼠。
圖19顯示經工程改造之TfR結合性多肽的hTfR親和力與在TfR ms/hu
KI小鼠中之最大腦濃度之間的關係。點表示在單個50mg/kg劑量之後在給藥後第1天量測的不同多肽親和力變異體之最大腦濃度。資料表示三個獨立研究之彙總，n=各研究每組4-5個小鼠。
圖20顯示經工程改造之TfR結合性多肽的hTfR親和力與在TfR ms/hu
KI小鼠中多肽腦濃度與血漿濃度之比率之間的關係。點表示在單個50mg/kg劑量之後在給藥後第1天量測的不同多肽親和力變異體之最大腦濃度與血漿濃度之比率。資料表示三個獨立研究之彙總，n=各研究每組4-5個小鼠。
圖21A及21B描繪在單次50mg/kg全身性注射抗BACE1_Ab153、CH3C35.21：Ab153、CH3C35.20：Ab153或CH3C35：Ab153多肽融合物之後，TfR ms/hu
敲入(KI)小鼠之血漿(圖21A)及腦溶解產物(圖21B)中之huIgG1濃度(平均值±SEM，n=每組5個)。
圖21C描繪在單次50mg/kg全身性注射抗BACE1_Ab153、
CH3C35.21：Ab153、CH3C35.20：Ab153或CH3C35：Ab153多肽融合物之後TfR ms/hu
KI小鼠之腦溶解產物中的內源性小鼠Aβ濃度(平均值±SEM，n=每組5個)。
圖21D描繪在單次50mg/kg全身性注射抗BACE1_Ab153、CH3C35.21：Ab153、CH3C35.20：Ab153或CH3C35：Ab153多肽融合物之後對在TfR ms/hu
KI小鼠之腦溶解產物中針對肌動蛋白校正之腦TfR蛋白質的西方墨點法(Western blot)定量(平均值±SEM，n=每組5個)。
本申請案主張於2017年10月2日申請之美國臨時專利申請案第62/566,898號、於2017年11月8日申請之美國臨時專利申請案第62/583,276號、於2018年2月5日申請之美國臨時專利申請案第62/626,365號、於2018年5月30日申請之美國臨時專利申請案第62/678,183號以及於2018年8月22日申請之美國臨時專利申請案第62/721,396號之優先權，該等臨時專利申請案之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
I. 引言
吾人已研發包括鍵聯至Fc多肽之酶替代療法(ERT)酶的融合蛋白。此等蛋白質可用於治療溶酶體貯積症(LSD)。在一些情況下，蛋白質包括二聚Fc多肽，其中Fc多肽單體中之一者鍵聯至ERT酶。Fc多肽可增加酶半衰期且在一些情況下，可經修飾以賦予蛋白質其他功能特性。本文亦描述促進ERT酶遞送穿過血腦障壁(BBB)之融合蛋白。此等蛋白質包含Fc多肽及經修飾之Fc多肽，其形成二聚體；以及鍵聯至Fc區及/或經修飾之Fc區的ERT酶。經修飾之Fc區可特異性結合於BBB受體，諸如轉鐵蛋白受體(TfR)。在一些實施例中，ERT酶為艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)或野生型IDS(例如野生型人類IDS)之催化活性變異體或片段。在其他實施例中，ERT酶為N-磺基葡糖胺磺基水解酶
(SGSH)、酸性神經鞘磷脂酶(ASM)、β-葡糖腦苷脂酶(GBA)，或野生型SGSH、ASM或GBA(例如野生型人類SGSH、ASM或GBA)之催化活性變異體或片段。
吾人亦研發了將鍵聯至TfR結合性多肽及蛋白質之治療劑運送穿過BBB以治療疾病的方法。吾人發現，運送治療劑穿過BBB所需之TfR結合親和力取決於治療劑之靶標，以及驅動在治療疾病中之功效的作用機制。特定而言，吾人發現，使用具有較強TfR親和力之多肽及蛋白質可產生較大之Cmax
，但清除較快。
對於一些療法，諸如可用於治療例如LSD之包括使用諸如IDS之ERT酶(例如用於治療亨特症候群)的蛋白質替代療法，以及其他療法，需要在給藥窗內達成治療劑之高腦Cmax
，因為較高之細胞外濃度又將驅動增加之細胞內蛋白質濃度。一旦遞送至細胞中，所遞送蛋白質之細胞內半衰期即持續與血漿滯留時間相比更長之時間。此外，具有高Cmax
可有益於酶替代，因為高酶濃度可驅動增加之由酶引起之受質周轉速率。為改良腦Cmax
，使用具有50-250nM之TfR親和力範圍的多肽及蛋白質為特別適用的。
II. 定義
如本文所用，除非內容另有清楚指示，否則單數形式「一個(種)(a/an)」及「該」包括複數指示物。因此，舉例而言，提及「一種多肽」可包括兩種或更多種此類分子及類似物。
如本文所用，術語「約」及「大約」，當用於修飾數值或範圍中指定之量時，表明該數值以及熟習此項技術者已知之與該值之合理偏差(例如±20%、±10%或±5%)在所敍述值之預期含義內。
「酶替代療法酶」或「ERT酶」係指溶酶體貯積症中缺乏之酶。「ERT酶變異體」係指野生型ERT酶或其片段之功能變異體，包括對偶及剪接變異體，其中例如當在相同條件下分析時，ERT酶變異體具有至少50%、至少55%、至
少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應野生型ERT酶或其片段之活性。ERT酶之「催化活性片段」係指全長ERT酶或其變異體之一部分，其中例如當在相同條件下分析時，催化活性片段具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應全長ERT酶或其變異體之活性。
如本文所用之「艾杜糖醛酸硫酸酯酶」、「艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶」或「IDS」係指艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(EC 3.1.6.13)，其為參與醣胺聚醣硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素之溶酶體降解的酶。IDS之缺乏與黏多醣貯積病II(亦稱為亨特症候群)相關。如本文中用作包含Fc多肽之蛋白質的組分的術語「IDS」為催化活性的且涵蓋野生型IDS或其片段之功能變異體，包括對偶及剪接變異體。人類IDS同種型I之序列為指定為規範序列之人類序列，可在UniProt條目P22304下獲得且由Xq28處之人類IDS基因編碼。全長序列以SEQ ID NO：91形式提供。如本文所用之「成熟」IDS序列係指缺乏天然存在之全長多肽鏈之信號及前肽序列的多肽鏈形式。成熟人類IDS多肽之胺基酸序列以SEQ ID NO：92形式提供，其對應於全長人類序列之胺基酸34-550。如本文所用之「截短」IDS序列係指天然存在之全長多肽鏈之催化活性片段。示例性截短人類IDS多肽之胺基酸序列以SEQ ID NO：114形式提供，其對應於全長人類序列之胺基酸26-550。人類IDS之結構已經充分表徵。說明性結構可在PDB登錄代碼5FQL下獲得。該結構亦描述於Nat.Comm.
8：15786 doi：10.1038/ncomms15786,2017中。亦已描述非人類靈長類動物IDS序列，包括黑猩猩(UniProt條目K7BKV4)及恆河猴(UniProt條目H9FTX2)。小鼠IDS序列可在UniProt條目Q08890下獲得。IDS變異體例如當在相同條件下分析時具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%
之對應野生型IDS或其片段之活性。催化活性IDS片段例如當在相同條件下分析時具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應全長IDS或其變異體之活性。
如本文所用之「磺基葡糖胺磺基水解酶」、「N-磺基葡糖胺磺基水解酶」或「SGSH」係指N-磺基葡糖胺磺基水解酶(EC 3.10.1.1)，其為參與硫酸乙醯肝素之溶酶體降解的酶。此基因中之突變與聖菲利柏症候群A相關，此為一種類型之溶酶體貯積症黏多醣貯積症III，其由硫酸乙醯肝素之降解受損引起。如本文用作包含Fc多肽之蛋白質的組分之術語「SGSH」為催化活性的且涵蓋野生型SGSH或其片段之功能變異體，包括對偶及剪接變異體。人類SGSH之序列可在UniProt條目P51688下獲得且由17q25.3處之人類SGSH基因編碼。全長序列以SEQ ID NO：119形式提供。如本文所用之「成熟」SGSH序列係指缺乏天然存在之全長多肽鏈之信號序列的多肽鏈形式。成熟人類SGSH多肽之胺基酸序列以SEQ ID NO：120形式提供，其對應於全長人類序列之胺基酸21-502。如本文所用之「截短」SGSH序列係指天然存在之全長多肽鏈之催化活性片段。人類SGSH之結構已經充分表徵。說明性結構可在PDB登錄代碼4MHX下獲得。亦已描述非人類靈長類動物SGSH序列，包括黑猩猩(UniProt條目K7C218)。小鼠SGSH序列可在UniProt條目Q9EQ08下獲得。SGSH變異體例如當在相同條件下分析時具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應野生型SGSH或其片段之活性。催化活性SGSH片段例如當在相同條件下分析時具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應全長SGSH或其變異體之活性。
如本文所用之「酸性神經鞘磷脂酶」、「神經鞘磷脂磷酸二酯酶」或「ASM」係指神經鞘磷脂磷酸二酯酶1(EC 3.1.4.12)，其為將神經鞘磷脂轉化
為神經醯胺之溶酶體酶。與ASM缺乏相關之疾病包括尼曼-皮克病(例如A型或B型)。如本文中用作包含Fc多肽之蛋白質的組分之術語「ASM」為催化活性的且涵蓋野生型ASM或其片段之功能變異體，包括對偶及剪接變異體。人類ASM同種型1之序列為指定為規範序列之人類序列，可在UniProt條目P17405下獲得且由11p15.4處之人類SMPD1基因編碼。全長序列以SEQ ID NO：121形式提供。如本文所用之「成熟」ASM序列係指缺乏天然存在之全長多肽鏈之信號序列的多肽鏈形式。成熟人類ASM多肽之胺基酸序列以SEQ ID NO：122形式提供，其對應於全長人類序列之胺基酸47-629。如本文所用之「截短」ASM序列係指天然存在之全長多肽鏈之催化活性片段。示例性截短人類ASM多肽之胺基酸序列以SEQ ID NO：123形式提供，其對應於全長人類序列之胺基酸47-620。人類ASM之結構已充分表徵。說明性結構可在PDB登錄代碼5I81下獲得。亦已描述非人類靈長類動物ASM序列，包括黑猩猩(UniProt條目H2Q319)。小鼠ASM序列可在UniProt條目Q04519下獲得。ASM變異體例如當在相同條件下分析時具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應野生型ASM或其片段之活性。催化活性ASM片段例如當在相同條件下分析時具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應全長ASM或其變異體之活性。
「β-葡糖腦苷脂酶」或「GBA」亦稱為葡糖基神經醯胺酶(EC 3.2.1.45)。如本文所用之該術語係指具有葡糖基神經醯胺酶活性且催化葡糖基神經醯胺分解為神經醯胺及葡萄糖之溶酶體酶。GBA之缺乏與高歇氏病及帕金森氏病相關。如本文中用作包含Fc多肽之蛋白質的組分之術語「GBA」為催化活性的且涵蓋野生型GBA或其片段之功能變異體，包括對偶及剪接變異體。人類GBA長同種型之序列經指定為規範序列，可在UniProt條目P04062-1下獲得且
由1q22處之人類GBA基因編碼。全長序列以SEQ ID NO：93形式提供。如本文所用之「成熟」GBA序列係指缺乏天然存在之全長多肽鏈之信號及前肽序列的多肽鏈形式。成熟人類GBA多肽之胺基酸序列以SEQ ID NO：94形式提供，其對應於全長人類序列之胺基酸40-536。如本文所用之「截短」GBA序列係指天然存在之全長多肽鏈之催化活性片段。人類GBA之結構已經充分表徵。可獲得GBA之近20種晶體結構。亦已描述非人類靈長類動物GBA序列，包括黑猩猩(UniProt條目Q9BDT0)及紅毛猩猩(UniProt條目Q5R8E3)。小鼠GBA序列可在UniProt條目P17439下獲得。GBA變異體例如當在相同條件下分析時具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應野生型GBA或其片段之活性。催化活性GBA片段例如當在相同條件下分析時具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之對應全長GBA或其變異體之活性。
如本文所用之「轉鐵蛋白受體」或「TfR」係指轉鐵蛋白受體蛋白1。人類轉鐵蛋白受體1多肽序列闡述於SEQ ID NO：96中。其他物種之轉鐵蛋白受體蛋白1序列亦為已知的(例如黑猩猩，登錄號XP_003310238.1；恆河猴，NP_001244232.1；狗，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；及雞，NP_990587.1)。術語「轉鐵蛋白受體」亦涵蓋示例性參考序列(例如人類序列)之對偶變異體，其由在轉鐵蛋白受體蛋白1染色體位點處之基因編碼。全長轉鐵蛋白受體蛋白包括短N端細胞內區、跨膜區及大細胞外結構域。細胞外結構域之特徵為三個結構域：蛋白酶樣結構域、螺旋狀結構域及頂端結構域。人類轉鐵蛋白受體1之頂端結構域序列闡述於SEQ ID NO：238中。
如本文所用之「融合蛋白」或「[ERT酶]-Fc融合蛋白」係指二聚蛋
白質，其包含鍵聯(例如融合)至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段之第一Fc多肽(亦即，「[ERT]-Fc融合多肽」)；及與第一Fc多肽形成Fc二聚體之第二Fc多肽。第二Fc多肽亦可鍵聯(例如融合)至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段。第一Fc多肽及/或第二Fc多肽可藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段。第一Fc多肽及/或第二Fc多肽可為經修飾之Fc多肽，其含有促進其與另一Fc多肽異二聚化之一或多個修飾。第一Fc多肽及/或第二Fc多肽可為經修飾之Fc多肽，其含有使其結合於轉鐵蛋白受體之一或多個修飾。第一Fc多肽及/或第二Fc多肽可為經修飾之Fc多肽，其含有降低效應功能之一或多個修飾。第一Fc多肽及/或第二Fc多肽可為經修飾之Fc多肽，其含有延長血清半衰期之一或多個修飾。
如本文所用之「融合多肽」或「[ERT酶]-Fc融合多肽」係指鍵聯(例如融合)至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段之Fc多肽。Fc多肽可藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段。Fc多肽可為經修飾之Fc多肽，其含有促進其與另一Fc多肽異二聚化之一或多個修飾。Fc多肽可為經修飾之Fc多肽，其含有使其結合於轉鐵蛋白受體之一或多個修飾。Fc多肽可為經修飾之Fc多肽，其含有降低效應功能之一或多個修飾。Fc多肽可為經修飾之Fc多肽，其含有延長血清半衰期之一或多個修飾。
如本文所用，術語「Fc多肽」係指天然存在之免疫球蛋白重鏈多肽之C端區，其以作為結構域之Ig摺疊為特徵。Fc多肽含有至少包括CH2結構域及/或CH3結構域之恆定區序列且可含有至少部分之鉸鏈區。一般而言，Fc多肽不含可變區。
「經修飾之Fc多肽」係指與野生型免疫球蛋白重鏈Fc多肽序列相比具有至少一個突變，例如取代、缺失或插入，但保留天然Fc多肽之總體Ig摺疊或結構的Fc多肽。
術語「FcRn」係指新生兒Fc受體。Fc多肽結合於FcRn降低Fc多肽之清除率且增加血清半衰期。人類FcRn蛋白為由尺寸為約50kDa且類似於主要組織相容性(MHC)I類蛋白之蛋白質及尺寸為約15kDa之β2-微球蛋白組成之異二聚體。
如本文所用，「FcRn結合位點」係指Fc多肽中結合於FcRn之區域。在人類IgG中，如使用EU索引編號之FcRn結合位點包括T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、T307、E380、M428、H433、N434、H435及Y436。此等位置對應於SEQ ID NO：1之位置20至26、77、150、198及203至206。
如本文所用，「天然FcRn結合位點」係指Fc多肽中結合於FcRn且具有與天然存在之Fc多肽中結合於FcRn之區域相同的胺基酸序列的區域。
如本文所用之術語「CH3結構域」及「CH2結構域」係指免疫球蛋白恆定區結構域多肽。出於本申請案之目的，CH3結構域多肽係指如根據EU編號自約位置341至約位置447之胺基酸區段，且CH2結構域多肽係指如根據EU編號流程自約位置231至約位置340之胺基酸區段且不包括鉸鏈區序列。CH2及CH3結構域多肽亦可根據IMGT(ImMunoGeneTics)編號方案進行編號，其中根據IMGT科學圖表編號(IMGT網站)，CH2結構域編號為1-110且CH3結構域編號為1-107。CH2及CH3結構域為免疫球蛋白Fc區之一部分。Fc區係指如根據EU編號流程編號自約位置231至約位置447之胺基酸區段，但如本文所用，可包括抗體鉸鏈區之至少一部分。說明性鉸鏈區序列為人類IgG1鉸鏈序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：95)。
關於CH3或CH2結構域之術語「野生型」、「天然」及「天然存在」在本文中用於指結構域具有自然界中存在之序列。
如本文所用，關於突變體多肽或突變體聚核苷酸之術語「突變體」可與「變異體」互換使用。關於給定野生型CH3或CH2結構域參考序列之變異
體可包括天然存在之對偶變異體。「非天然」存在之CH3或CH2結構域係指天然CH3結構域或CH2結構域聚核苷酸或多肽之在自然界中不存在於細胞中且藉由例如使用基因工程改造技術或誘變技術進行基因修飾所產生之變異體或突變體結構域。「變異體」包括相對於野生型包含至少一個胺基酸突變之任何結構域。突變可包括取代、插入及缺失。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸，以及以類似於天然存在之胺基酸之方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。
天然存在之胺基酸為彼等由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及隨後經修飾之彼等胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及O-磷酸絲胺酸。「胺基酸類似物」係指具有與天然存在之胺基酸相同的基礎化學結構(亦即結合於氫、羧基、胺基及R基團之α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽主鏈，但保留與天然存在之胺基酸相同之基礎化學結構。「胺基酸模擬物」係指結構不同於胺基酸之一般化學結構，但以類似於天然存在之胺基酸的方式起作用的化合物。
天然存在之α-胺基酸包括但不限於丙胺酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、苯丙胺酸(Phe)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、天冬醯胺(Asn)、脯胺酸(Pro)、麩醯胺(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)及其組合。天然存在之α-胺基酸之立體異構體包括但不限於D-丙胺酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬胺酸(D-Asp)、D-麩胺酸(D-Glu)、D-苯丙胺酸(D-Phe)、D-組胺酸(D-His)、D-異白胺酸(D-Ile)、D-精胺酸(D-Arg)、D-離胺酸(D-Lys)、D-白胺酸(D-Leu)、D-甲硫胺酸(D-Met)、D-天冬醯胺(D-Asn)、D-脯胺酸(D-Pro)、D-麩醯胺(D-Gln)、D-絲胺酸(D-Ser)、D-蘇胺酸(D-Thr)、D-纈胺
酸(D-Val)、D-色胺酸(D-Trp)、D-酪胺酸(D-Tyr)及其組合。
在本文中可藉由通常已知之三字母符號或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會建議之一字母符號提及胺基酸。
術語「多肽」及「肽」在本文中可互換地用於指單個鏈中之胺基酸殘基的聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學模擬物的胺基酸聚合物，以及天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。胺基酸聚合物可包含完全L-胺基酸、完全D-胺基酸或L及D胺基酸之混合物。
如本文所用之術語「蛋白質」係指多肽或單鏈多肽之二聚體(亦即，兩者)或多聚體(亦即，三者或更多者)。蛋白質之單鏈多肽可藉由共價鍵(例如二硫鍵)或非共價相互作用而連接。
術語「保守取代」、「保守突變」或「經保守修飾之變異體」係指使得胺基酸經可歸類為具有類似特徵之另一胺基酸取代的改變。以此方式定義之保守胺基酸組類別之實例可包括：「帶電荷/極性組」，包括Glu(麩胺酸或E)、Asp(天冬胺酸或D)、Asn(天冬醯胺或N)、Gln(麩醯胺或Q)、Lys(離胺酸或K)、Arg(精胺酸或R)及His(組胺酸或H)；「芳族組」，包括Phe(苯丙胺酸或F)、Tyr(酪胺酸或Y)、Trp(色胺酸或W)及(組胺酸或H)；及「脂族組」，包括Gly(甘胺酸或G)、Ala(丙胺酸或A)、Val(纈胺酸或V)、Leu(白胺酸或L)、Ile(異白胺酸或I)、Met(甲硫胺酸或M)、Ser(絲胺酸或S)、Thr(蘇胺酸或T)及Cys(半胱胺酸或C)。在各組內，亦可鑑定出亞組。舉例而言，帶電荷或極性胺基酸組可再劃分成包括以下之亞組：「帶正電荷之亞組」，包含Lys、Arg及His；「帶負電荷之亞組」，包含Glu及Asp；及「極性亞組」，包含Asn及Gln。在另一實例中，芳族或環狀組可再劃分成包括以下之亞組：「氮環亞組」，包含Pro、His及Trp；及「苯基亞組」，包含Phe及Tyr。在另一實例中，脂族組可
再劃分成例如以下之亞組：「脂族非極性亞組」，包含Val、Leu、Gly及Ala；及「脂族略帶極性之亞組」，包含Met、Ser、Thr及Cys。保守突變類別之實例包括以上亞組內胺基酸之胺基酸取代，諸如但不限於：Lys取代Arg或反之亦然，使得正電荷可維持；Glu取代Asp或反之亦然，使得負電荷可維持；Ser取代Thr或反之亦然，使得游離-OH可維持；及Gln取代Asn或反之亦然，使得游離-NH2
可維持。在一些實施例中，疏水性胺基酸取代例如活性位點中之天然存在之疏水性胺基酸以保留疏水性。
在兩個或更多個多肽序列之背景下術語「一致」或「一致性」百分比係指如使用序列比較算法或藉由手動比對及視覺檢查所量測，當在比較窗或指定區域上比較及比對以獲得最大對應性時，兩個或更多個序列或子序列相同或具有指定百分比之在指定區域上一致的胺基酸殘基，例如至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更大的一致性。
對於多肽之序列比較，典型地一個胺基酸序列充當參考序列，將候選序列與其比較。可使用熟習此項技術者可獲得之各種方法(例如視覺比對)或使用公共可獲得之軟體使用已知算法以達成最佳比對來進行比對。此類程式包括BLAST程式、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用於比對以達成最佳比對之參數可由熟習此項技術者確定。對於用於本申請案之目的的多肽序列之序列比較，使用用於比對兩個蛋白質序列之BLASTP算法標準蛋白質BLAST，且使用預設參數。
當在鑑定多肽序列中之給定胺基酸殘基的背景中使用術語「對應於」、「參考......確定」或「參考......編號」時，係指當將給定胺基酸序列與參考序列最佳比對及比較時指定參考序列之殘基位置。因此，舉例而言，當將經修飾之Fc多肽中之胺基酸殘基在與SEQ ID NO：1最佳比對時其與SEQ ID
NO：1中之胺基酸對齊時，該殘基「對應於」SEQ ID NO：1中之胺基酸。與參考序列比對之多肽不需要與參考序列長度相同。
如本文所用之「結合親和力」係指兩個分子(例如多肽上之單個結合位點及與其結合之靶標，例如轉鐵蛋白受體)之間的非共價相互作用之強度。因此，舉例而言，除非另外指出或由上下文來看為清楚的，否則該術語可指多肽與其靶標之間的1：1相互作用。結合親和力可藉由量測平衡解離常數(KD
)來定量，平衡解離常數係指解離速率常數(kd
，時間-1
)除以締合速率常數(ka
，時間-1
M-1
)。KD
可藉由量測複合物形成及解離之動力學來測定，例如使用表面電漿子共振(SPR)法，例如BiacoreTM
系統；動力學排除分析，諸如KinExA®
；及BioLayer干涉術(例如使用ForteBio®
Octet®
平台)。如本文所用，「結合親和力」不僅包括形式結合親和力，諸如反映多肽與其靶標之間的1：1相互作用的彼等形式結合親和力，而且包括可反映親合結合之計算KD
'要獲得之表觀親和力。
如本文所用，當提及如本文所描述之經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體時，術語「特異性結合」或「選擇性結合」於靶標，例如TfR，係指一種結合反應，藉由此結合反應經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體與結合於結構不同之靶標相比以更大親和力、更大親合力(avidity)及/或更大持久性結合於靶標。在典型實施例中，當在相同親和力分析條件下分析時，經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體對特定靶標(例如TfR)具有與不相關靶標相比至少5倍、10倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更大之親和力。如本文所用，術語「特異性結合特定靶標(例如TfR)」、「特異性結合於特定靶標(例如TfR)」或「對特定靶標(例如TfR)具特異性」可例如由一分子展現，該分子對與其結合之靶標具有例如10-4
M或更小(例如10-5
M、10-6
M、10-7
M、10-8
M、10-9
M、10-10
M、10-11
M或10-12
M)的平衡解離常數KD
。在一些實施例中，經工程改造之TfR結
合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體特異性結合於TfR上之抗原決定基，其在物種間為保守的(例如在物種間在結構上保守)，例如在非人類靈長類動物與人類物種之間為保守的(例如在非人類靈長類動物與人類物種之間在結構上保守)。在一些實施例中，經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體可排他地結合於人類TfR。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中的結構域，其衍生自生殖系可變(V)基因、多樣性(D)基因或連接(J)基因(且不衍生自恆定(Cμ及Cδ)基因區段)，且其給予抗體結合於抗原之特異性。典型地，抗體可變區包含穿插有三個高變「互補決定區」之四個保守「構架」區。
術語「抗原結合部分」及「抗原結合片段」在本文中可互換使用且係指抗體中保留經由可變區特異性結合於抗原之能力的一或多個片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab片段(由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段)、F(ab')2
片段(包含藉由位於鉸鏈區之二硫鍵鍵聯的兩個Fab片段的二價片段)、單鏈Fv(scFv)、二硫鍵聯之Fv(dsFv)、互補決定區(CDR)、VL(輕鏈可變區)及VH(重鏈可變區)。
術語「治療(treatment/treating)」及類似術語在本文中通常用於意謂獲得所需藥理學及/或生理作用。「治療(treating/treatment)」可指成功治療或改善溶酶體貯積症(例如亨特症候群、聖菲利柏症候群A、尼曼-皮克病、高歇氏病或帕金森氏病)之任何標誌，包括任何客觀或主觀參數，諸如消除、緩解、患者存活率提高、存活時間或存活率增加、症狀減少或使病症對患者而言更可忍受、變性或衰退速率減慢或改良患者之身體或精神健康。症狀之治療或改善可為基於客觀或主觀參數的。可將治療之效果與未接受治療之個體或個體集合或與同一患者在治療之前或在治療期間之不同時間相比較。
如本文中可互換使用之術語「個體(subject/individual)」及「患者」
係指哺乳動物，包括但不限於人類、非人類靈長類動物、囓齒動物(例如大鼠、小鼠及豚鼠)、兔、牛、豬、馬及其他哺乳動物物種。在一個實施例中，患者為人類。
術語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指對在人類或動物中使用而言在生物學或藥理學上相容之非活性醫藥成分，諸如但不限於緩衝劑、載劑或防腐劑。
如本文所用，藥劑之「治療量」、「治療有效量」或「治療有效濃度」為藥劑可治療個體(例如哺乳動物)中之疾病(例如LSD)跡象或症狀之量或濃度。
術語「投與」係指將藥劑、化合物或組合物遞送至所需生物作用位點之方法。此等方法包括但不限於表面遞送、非經腸遞送、靜脈內遞送、真皮內遞送、肌肉內遞送、鞘內遞送、經結腸遞送、經直腸遞送或腹膜內遞送。在一個實施例中，本文所描述之多肽係靜脈內投與。
III. 酶替代療法(ERT)酶
溶酶體貯積症(LSD)為以未消化或部分消化之大分子的累積為特徵之遺傳性代謝疾病，其最終產生細胞功能障礙及臨床異常。傳統地，已將LSD定義為溶酶體功能缺乏，通常根據累積之受質來歸類且包括鞘脂貯積病(sphingolipidose)、寡醣貯積病(oligosaccharidose)、黏脂貯積病(mucolipidose)、黏多醣貯積病、脂蛋白貯積症、神經元蠟樣脂褐質貯積病(neuronal ceroid lipofuscinose)及其他溶酶體貯積病。此等病症之類別最近已擴大為包括引起大分子(諸如溶酶體酶之正常轉譯後修飾所必需的蛋白質或對於適當溶酶體運輸而言重要的蛋白質)累積之其他蛋白質的缺乏或缺陷。
在一些態樣中，本文所描述之融合蛋白包含：(i)Fc多肽，其可含有修飾(例如促進異二聚化之一或多個修飾)或可為野生型Fc多肽；及ERT酶；及
(ii)Fc多肽，其可含有修飾(例如促進異二聚化之一或多個修飾)或可為野生型Fc多肽；及視情況存在之ERT酶。在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽可含有引起結合於血腦障壁(BBB)受體，例如轉鐵蛋白受體(TfR)之修飾。ERT酶可為LSD中缺乏之任何酶。併入融合蛋白之ERT酶為催化活性的，亦即，其保留LSD中缺乏之酶活性。在一些實施例中，ERT酶為艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)，其在亨特症候群中為缺乏的。在一些實施例中，ERT酶為N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)，其在聖菲利柏症候群中為缺乏的。在一些實施例中，ERT酶為酸性神經鞘磷脂酶(ASM)，其在尼曼-皮克病中為缺乏的。在一些實施例中，ERT酶為β-葡糖腦苷脂酶(GBA)，其在高歇氏病及帕金森氏病中為缺乏的。
在一些實施例中，包含ERT酶及視情況存在之結合於BBB受體的經修飾之Fc多肽(例如TfR結合性Fc多肽)的融合蛋白包含野生型IDS之催化活性片段或變異體。在一些實施例中，IDS酶為IDS蛋白質之變異體或催化活性片段，其包含SEQ ID NO：91、92、114、230及234中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，IDS酶之催化活性變異體或片段具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更大之野生型IDS酶活性。
在一些實施例中，包含ERT酶及視情況存在之結合於BBB受體的經修飾之Fc多肽(例如TfR結合性Fc多肽)的融合蛋白包含野生型SGSH之催化活性片段或變異體。在一些實施例中，SGSH酶為SGSH蛋白質之變異體或催化活性片段，其包含SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，SGSH酶之催化活性變異體或片段具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更大之野生型SGSH酶活性。
在一些實施例中，包含ERT酶及視情況存在之結合於BBB受體的經
修飾之Fc多肽(例如TfR結合性Fc多肽)的融合蛋白包含野生型ASM之催化活性片段或變異體。在一些實施例中，ASM酶為ASM蛋白質之變異體或催化活性片段，其包含SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，ASM酶之催化活性變異體或片段具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更大之野生型ASM酶活性。
在一些實施例中，包含ERT酶及視情況存在之結合於BBB受體的經修飾之Fc多肽(例如TfR結合性Fc多肽)的融合蛋白包含野生型GBA之催化活性片段或變異體。在一些實施例中，GBA酶為GBA蛋白質之變異體或催化活性片段，其包含SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，GBA酶之催化活性變異體或片段具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更大之野生型GBA酶活性。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中之ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)或其催化活性變異體或片段與其不連接至Fc多肽或TfR結合性Fc多肽時之活性相比保留其活性之至少25%。在一些實施例中，ERT酶或其催化活性變異體或片段與其不連接至Fc多肽或TfR結合性Fc多肽時之活性相比保留其活性之至少10%或至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在一些實施例中，ERT酶或其催化活性變異體或片段與其不連接至Fc多肽或TfR結合性Fc多肽時之活性相比保留其活性之至少80%、85%、90%或95%。在一些實施例中，融合至Fc多肽不降低ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)或其催化活性變異體或片段之活性。在一些實施例中，融合至TfR結合性Fc多肽不降低ERT酶之活性。
IV. 用於血腦障壁(BBB)受體結合之Fc多肽修飾
在一些態樣中，本文提供能夠運送穿過血腦障壁(BBB)之融合蛋白。此類蛋白質包含結合於BBB受體之經修飾之Fc多肽。BBB受體表現於BBB內皮以及其他細胞及組織類型上。在一些實施例中，BBB受體為轉鐵蛋白受體(TfR)。
在各種Fc修飾(包括引入結合於BBB受體(例如TfR)之經修飾之Fc多肽的彼等Fc修飾)中指定之胺基酸殘基在本文中係使用EU索引編號進行編號。任何Fc多肽(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)均可如本文所描述在一或多個位置具有修飾，例如胺基酸取代。
存在於本文所描述之融合蛋白中之經修飾(例如增強異二聚化及/或BBB受體結合)之Fc多肽可與天然Fc區序列或其片段(例如長度為至少50個胺基酸或至少100個胺基酸或更長之片段)具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，天然Fc胺基酸序列為SEQ ID NO：1之Fc區序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸1-110或與SEQ ID NO：1之胺基酸111-217或其片段(例如長度為至少50個胺基酸或至少100個胺基酸或更長之片段)具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，經修飾(例如增強異二聚化及/或BBB受體結合)之Fc多肽包含對應於天然Fc區胺基酸序列之至少50個胺基酸或至少60、65、70、75、80、85、90或95或更多個或至少100個或更多個胺基酸。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含對應於天然Fc區胺基酸序列(諸如SEQ ID NO：1)之至少25個連續胺基酸或至少30、35、40或45個連續胺基酸或50個連續胺基酸或至少60、65、70、75、80 85、90或95或更多個連續胺基酸或100或更多個連續胺基
酸。
在一些實施例中，經修飾以獲得BBB受體結合活性之結構域為人類Ig CH3結構域，諸如IgG1 CH3結構域。CH3結構域可屬於任何IgG亞型，亦即來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG1抗體之背景下，CH3結構域係指如根據EU編號流程編號自約位置341至約位置447之胺基酸區段。
在一些實施例中，經修飾以獲得BBB受體結合活性之結構域為人類Ig CH2結構域，諸如IgG CH2結構域。CH2結構域可屬於任何IgG亞型，亦即來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG1抗體之背景下，CH2結構域係指如根據EU編號流程編號自約位置231至約位置340之胺基酸區段。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的經修飾(例如BBB受體結合)之Fc多肽包含根據EU編號流程在包含266、267、268、269、270、271、295、297、298及299之胺基酸位置的至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，為至少四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的經修飾(例如BBB受體結合)之Fc多肽包含根據EU編號流程在包含274、276、283、285、286、287、288、289及290之胺基酸位置的至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，為至少四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的經修飾(例如BBB受體結合)之Fc多肽包含根據EU編號流程在包含268、269、270、271、272、292、293、294、296及300之胺基酸位置的至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，為至少四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的經修飾(例如BBB受體結合)之Fc多肽包含根據EU編號流程在包含272、274、276、322、324、326、329、330及331之胺基酸位置的至少一個、兩個或三個取代；且在
一些實施例中，為至少四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的經修飾(例如BBB受體結合)之Fc多肽包含根據EU編號流程在包含345、346、347、349、437、438、439及440之胺基酸位置的至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，為至少四個、五個、六個或七個取代。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的經修飾(例如BBB受體結合)之Fc多肽包含根據EU編號流程在胺基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416及421的至少一個、兩個或三個取代；且在一些實施例中，為至少四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。
FcRn結合位點
在某些態樣中，經修飾(例如BBB受體結合)之Fc多肽或存在於本文所描述之融合蛋白中且不特異性結合於BBB受體之之Fc多肽亦可包含FcRn結合位點。在一些實施例中，FcRn結合位點在Fc多肽或其片段內。
在一些實施例中，FcRn結合位點包含天然FcRn結合位點。在一些實施例中，FcRn結合位點相對於天然FcRn結合位點之胺基酸序列不包含胺基酸變化。在一些實施例中，天然FcRn結合位點為IgG結合位點，例如人類IgG結合位點。在一些實施例中，FcRn結合位點包含改變FcRn結合之修飾。
在一些實施例中，FcRn結合位點具有突變(例如經取代)之一或多個胺基酸殘基，其中突變增加血清半衰期或不實質上減少血清半衰期(亦即，當在相同條件下分析時與在突變位置具有野生型殘基之對應經修飾之Fc多肽相比使血清半衰期減少不超過25%)。在一些實施例中，FcRn結合位點具有根據EU編號流程在位置250-256、307、380、428及433-436經取代之一或多個胺基酸殘基。
在一些實施例中，使位於FcRn結合位點處或其附近之一或多個殘基
相對於天然人類IgG序列發生突變，以延長經修飾多肽之血清半衰期。在一些實施例中，將突變引入位置252、254及256中之一者、兩者或三者。在一些實施例中，突變為M252Y、S254T及T256E。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含突變M252Y、S254T及T256E。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含根據EU編號流程在位置T307、E380及N434中之一者、兩者或全部三者處的取代。在一些實施例中，突變為T307Q及N434A。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含突變T307A、E380A及N434A。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含根據EU編號流程在位置T250及M428之取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含突變T250Q及/或M428L。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含根據EU編號流程在位置M428及N434之取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含突變M428L及N434S。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含N434S或N434A突變。
V. 轉鐵蛋白受體結合性Fc多肽
本部分描述本文所描述之結合於轉鐵蛋白受體(TfR)且能夠運送穿過血腦障壁(BBB)的經修飾之Fc多肽的產生。
在CH3結構域中包含突變之TfR結合性Fc多肽
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽在CH3結構域中包含取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含人類IgCH3結構域，諸如IgG CH3結構域，其經修飾以獲得TfR結合活性。CH3結構域可屬於任何IgG亞型，亦即來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗體之背景下，CH3結構域係指如根據EU編號流程編號自約位置341至約位置447之胺基酸區段。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽結合於TfR之頂端結構域且可在不阻斷或以其他方式抑制轉鐵蛋白結合於TfR之情況下結合於TfR。在一些實施例中，轉鐵蛋白結合於TfR未實質上受到抑制。在一些
實施例中，轉鐵蛋白結合於TfR被抑制不到約50%(例如不到約45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%)。在一些實施例中，轉鐵蛋白結合於TfR被抑制不到約20%(例如不到約19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽包含根據EU編號流程在位置384、386、387、388、389、390、413、416及421之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。可在此等位置引入之說明性取代顯示於表4及5中。在一些實施例中，在位置388及/或421之胺基酸為芳族胺基酸，例如Trp、Phe或Tyr。在一些實施例中，在位置388之胺基酸為Trp。在一些實施例中，在位置421之芳族胺基酸為Trp或Phe。
在一些實施例中，至少一個如下位置經取代：在位置384之Leu、Tyr、Met或Val；在位置386之Leu、Thr、His或Pro；在位置387之Val、Pro或酸性胺基酸；在位置388之芳族胺基酸，例如Trp；在位置389之Val、Ser或Ala；在位置413之酸性胺基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置416之Thr或酸性胺基酸；或在位置421之Trp、Tyr、His或Phe。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽可包含保守取代，例如集合中之一或多個位置之指定胺基酸的相同電荷分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或尺寸分組及/或極性或非極性分組中之胺基酸。因此，舉例而言，Ile可存在於位置384、386及/或位置413處。在一些實施例中，在位置387、413及416中之一者、兩者或每一者之位置處的酸性胺基酸為Glu。在其他實施例中，在位置387、413及416中之一者、兩者或每一者處之酸性胺基酸為Asp。在一些實施例中，位置384、386、387、388、389、413、416及421中之兩者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者處具有如此段落中指定之胺基酸取代。
在一些實施例中，如前兩個段落中所描述經修飾之Fc多肽包含在位
置390之天然Asn。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置390之Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala或Asp。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含根據EU編號流程在包含380、391、392及415之位置的一個、兩個、三個或四個取代。在一些實施例中，Trp、Tyr、Leu或Gln可存在於位置380處。在一些實施例中，Ser、Thr、Gln或Phe可存在於位置391處。在一些實施例中，Gln、Phe或His可存在於位置392處。在一些實施例中，Glu可存在於位置415處。
在某些實施例中，經修飾之Fc多肽包含兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或十一個選自以下之位置：在位置380之Trp、Leu或Glu；在位置384之Tyr或Phe；在位置386之Thr；在位置387之Glu；在位置388之Trp；在位置389之Ser、Ala、Val或Asn；在位置390之Ser或Asn；在位置413之Thr或Ser；在位置415之Glu或Ser；在位置416之Glu；及/或在位置421之Phe。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含如下全部十一個位置：在位置380之Trp、Leu或Glu；在位置384之Tyr或Phe；在位置386之Thr；在位置387之Glu；在位置388之Trp；在位置389之Ser、Ala、Val或Asn；在位置390之Ser或Asn；在位置413之Thr或Ser；在位置415之Glu或Ser；在位置416之Glu；及/或在位置421之Phe。
在某些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置384之Leu或Met；在位置386之Leu、His或Pro；在位置387之Val；在位置388之Trp；在位置389之Val或Ala；在位置413之Pro；在位置416之Thr；及/或在位置421之Trp。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含在位置391之Ser、Thr、Gln或Phe。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含在位置380之Trp、Tyr、Leu或Gln及/或在位置392之Gln、Phe或His。在一些實施例中，Trp存在於位置380處及/或Gln存在於位置392處。在一些實施例中，經修飾之Fc多
肽不具有在位置380之Trp。
在其他實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置384之Tyr；在位置386之Thr；在位置387之Glu或Val；在位置388之Trp；在位置389之Ser；在位置413之Ser或Thr；在位置416之Glu；及/或在位置421之Phe。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置390之天然Asn。在某些實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含在位置380之Trp、Tyr、Leu或Gln；及/或在位置415之Glu。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含在位置380之Trp及/或在位置415之Glu。
在其他實施例中，經修飾之Fc多肽進一步包含根據EU編號流程在包含414、424及426之位置的一個、兩個或三個取代。在一些實施例中，位置414為Lys、Arg、Gly或Pro；位置424為Ser、Thr、Glu或Lys；及/或位置426為Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含以下取代中之一者或多者：根據EU編號流程在位置380之Trp；在位置386之Thr；在位置388之Trp；在位置389之Val；在位置413之Thr或Ser；在位置415之Glu；及/或在位置421之Phe。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：4-90、97-100及105-108中之任一者(例如SEQ ID NO：34-38、58及60-90)之胺基酸111-217具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：4-90、97-100及105-108中之任一者(例如SEQ ID NO：34-38、58及60-90)具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在SEQ ID NO：4-90、97-100及105-108中之任一者(例如SEQ ID NO：34-38、58及
60-90)之EU索引位置384-390及/或413-421的胺基酸。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在4-90、97-100及105-108中之任一者(例如SEQ ID NO：34-38、58及60-90)之EU索引位置380-390及/或413-421的胺基酸。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在SEQ ID NO：4-90、97-100及105-108中之任一者(例如SEQ ID NO：34-38、58及60-90)之EU索引位置380-392及/或413-426的胺基酸。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：4-90、97-100及105-108中之任一者(例如SEQ ID NO：34-38、58及60-90)具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，且進一步包含根據EU索引編號之如下位置中的至少五者、六者、七者、八者、九者、十者、十一者、十二者、十三者、十四者、十五者或十六者：在位置380之Trp、Tyr、Leu、Gln或Glu；在位置384之Leu、Tyr、Met或Val；在位置386之Leu、Thr、His或Pro；在位置387之Val、Pro或酸性胺基酸；在位置388之芳族胺基酸，例如Trp；在位置389之Val、Ser或Ala；在位置390之Ser或Asn；在位置391之Ser、Thr、Gln或Phe；在位置392之Gln、Phe或His；在位置413之酸性胺基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置414之Lys、Arg、Gly或Pro；在位置415之Glu或Ser；在位置416之Thr或酸性胺基酸；在位置421之Trp、Tyr、His或Phe；在位置424之Ser、Thr、Glu或Lys；及在位置426之Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：34-38、58及60-90中之任一者之胺基酸序列。在其他實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：34-38、58及60-90中之任一者之胺基酸序列，但其中一個、兩個或三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含其他突變，諸如以下第VI部分中所描述之突變，包括但不限於杵突變(例如如參考EU編號進行編號之
T366W)、臼突變(例如如參考EU編號進行編號之T366S、L368A及Y407V)、調節效應功能之突變(例如如參考EU編號進行編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))及/或增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)。作為例證，SEQ ID NO：156-229提供在CH3結構域中具有包含此等其他突變中之一者或多者之突變的經修飾之Fc多肽的非限制性實例(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2及CH3C.35.23)。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含杵突變(例如如參考EU編號進行編號之T366W)且與SEQ ID NO：156、168、180、192、204及216中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：156、168、180、192、204及216中之任一者之序列。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含杵突變(例如如參考EU編號進行編號之T366W)及調節效應功能之突變(例如如參考EU編號進行編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))，且與SEQ ID NO：157、158、169、170、181、182、193、194、205、206、217、218、228及229中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：157、158、169、170、181、182、193、194、205、206、217及218中之任一者之序列。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含杵突變(例如如參考EU編號進行編號之T366W)及增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)，且與SEQ ID NO：159、171、183、195、207及219中之
任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：159、171、183、195、207及219中之任一者之序列。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含杵突變(例如如參考EU編號進行編號之T366W)、調節效應功能之突變(例如如參考EU編號進行編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))及增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)，且與SEQ ID NO：160、161、172、173、184、185、196、197、208、209、220及221中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：160、161、172、173、184、185、196、197、208、209、220及221中之任一者之序列。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含臼突變(例如如參考EU編號進行編號之T366S、L368A及Y407V)且與SEQ ID NO：162、174、186、198、210及222中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：162、174、186、198、210及222中之任一者之序列。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含臼突變(例如如參考EU編號進行編號之T366S、L368A及Y407V)及調節效應功能之突變(例如如參考EU編號進行編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))，且與SEQ ID NO：163、164、175、176、187、188、199、200、211、212、223及224中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：163、164、175、176、187、188、199、200、211、212、223及224中之任一者之序列。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含臼突變(例如如參考EU編號進行編號之T366S、L368A及Y407V)及增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)，且與SEQ ID NO：165、177、189、201、213及225中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：165、177、189、201、213及225中之任一者之序列。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含臼突變(例如如參考EU編號進行編號之T366S、L368A及Y407V)、調節效應功能之突變(例如如參考EU編號進行編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))及增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)，且與SEQ ID NO：166、167、178、179、190、191、202、203、214、215、226及227中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：166、167、178、179、190、191、202、203、214、215、226及227中之任一者之序列。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽包含根據EU編號流程在位置345、346、347、349、437、438、439及440之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個取代。說明性經修飾之Fc多肽提供於SEQ ID NO：124-128中。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置437之Gly；在位置438之Phe；及/或在位置440之Asp。在一些實施例中，Glu存在於位置440處。在某些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在如下位置之至少一個取代：在位置345之Phe或Ile；在位置346之Asp、Glu、Gly、Ala或Lys；在位置347之Tyr、Met、Leu、Ile或Asp；在位置349之Thr或Ala；在位置437之Gly；
在位置438之Phe；在位置439之His、Tyr、Ser或Phe；或在位置440之Asp。在一些實施例中，位置345、346、347、349、437、438、439及440中之兩者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者處具有如此段落中所指定之取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽可包含保守取代，例如集合中之一或多個位置之指定胺基酸的相同電荷分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或尺寸分組及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：124-128中之任一者之胺基酸111-217具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：124-128具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：124-128中之任一者之胺基酸序列。在其他實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：124-128中之任一者之胺基酸序列，但其中一個、兩個或三個胺基酸經取代。
在CH2結構域中包含突變之TfR結合性Fc多肽
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽在CH2結構域中包含取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含人類Ig CH2結構域，諸如IgG CH2結構域，其經修飾以獲得TfR結合活性。CH2結構域可屬於任何IgG亞型，亦即，來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗體之背景下，CH2結構域係指如根據EU編號流程編號自約位置231至約位置340之胺基酸區段。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽結合於TfR之頂端結構域且可在不阻斷或以其他方式抑制轉鐵蛋白結合於TfR之情況下結合於TfR。在一些實施例中，轉鐵蛋白結合於TfR未實質上受到抑制。在一些實施例中，轉鐵蛋白結合於TfR被抑制不到約50%(例如不到約45%、40%、
35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%)。在一些實施例中，轉鐵蛋白結合於TfR被抑制不到約20%(例如不到約19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽包含根據EU編號流程在位置274、276、283、285、286、287、288及290之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。說明性經修飾之Fc多肽提供於SEQ ID NO：129-133中。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置287之Glu及/或在位置288之Trp。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在如下位置之至少一個取代：在位置274之Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn、Tyr或Trp；在位置276之Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；在位置283之Asp、Pro、Met、Leu、Ala、Asn或Phe；在位置285之Arg、Ser、Ala或Gly；在位置286之Tyr、Trp、Arg或Val；在位置287之Glu；在位置288之Trp或Tyr；在位置289之Gln、Tyr、His、Ile、Phe、Val或Asp；或在位置290之Leu、Trp、Arg、Asn、Tyr或Val。在一些實施例中，位置274、276、283、285、286、287、288及290中之兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或全部九者具有如此段落中所指定之取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽可包含保守取代，例如集合中之一或多個位置之指定胺基酸的相同電荷分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或尺寸分組及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置274之Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn或Tyr；在位置276之Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；在位置283之Asp、Pro、Met、Leu、Ala或Asn；在位置285之Arg、Ser或Ala；在位置286之Tyr、Trp、Arg或Val；在位置287之Glu；在位置288之Trp；在位置289之Gln、Tyr、His、Ile、Phe或Val；及/或在位置290之Leu、Trp、Arg、Asn或Tyr。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置285之Arg；在位置
286之Tyr或Trp；在位置287之Glu；在位置288之Trp；及/或在位置290之Arg或Trp。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：129-133中之任一者之胺基酸1-110具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：129-133具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：129-133中之任一者之胺基酸序列。在其他實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：129-133中之任一者之胺基酸序列，但其中一個、兩個或三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽包含根據EU編號流程在位置266、267、268、269、270、271、295、297、298及299之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。說明性經修飾之Fc多肽提供於SEQ ID NO：134-138中。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置270之Pro、在位置295之Glu及/或在位置297之Tyr。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在如下位置之至少一個取代：在位置266之Pro、Phe、Ala、Met或Asp；在位置267之Gln、Pro、Arg、Lys、Ala、Ile、Leu、Glu、Asp或Tyr；在位置268之Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe、Trp或Leu；在位置269之Pro、Val、Ala、Thr或Asp；在位置270之Pro、Val或Phe；在位置271之Trp、Gln、Thr或Glu；在位置295之Glu、Val、Thr、Leu或Trp；在位置297之Tyr、His、Val或Asp；在位置298之Thr、His、Gln、Arg、Asn或Val；或在位置299之Tyr、Asn、Asp、Ser或Pro。在一些實施例中，位置266、267、268、269、270、271、295、297、298及299中之兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者或全部十者具有如此段落中所指定之取代。在一
些實施例中，經修飾之Fc多肽可包含保守取代，例如集合中之一或多個位置之指定胺基酸的相同電荷分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或尺寸分組及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置266之Pro、Phe或Ala；在位置267之Gln、Pro、Arg、Lys、Ala或Ile；在位置268之Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe或Trp；在位置269之Pro、Val或Ala；在位置270之Pro；在位置271之Trp或Gln；在位置295之Glu；在位置297之Tyr；在位置298之Thr、His或Gln；及/或在位置299之Tyr、Asn、Asp或Ser。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置266之Met；在位置267之Leu或Glu；在位置268之Trp；在位置269之Pro；在位置270之Val；在位置271之Thr；在位置295之Val或Thr；在位置197之His；在位置198之His、Arg或Asn；及/或在位置299之Pro。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置266之Asp；在位置267之Asp；在位置268之Leu；在位置269之Thr；在位置270之Phe；在位置271之Gln；在位置295之Val或Leu；在位置297之Val；在位置298之Thr；及/或在位置299之Pro。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：134-138中之任一者之胺基酸1-110具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：134-138具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：134-138中之任一者之胺基酸序列。在其他實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：134-138中之任一者之胺基酸序列，但其中一個、兩個或三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽包含根據EU編號流程在位置268、269、270、271、272、292、293、294及300之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。說明性經修飾之Fc多肽提供於SEQ ID NO：139-143中。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在如下位置之至少一個取代：在位置268之Val或Asp；在位置269之Pro、Met或Asp；在位置270之Pro或Trp；在位置271之Arg、Trp、Glu或Thr；在位置272之Met、Tyr或Trp；在位置292之Leu或Trp；在位置293之Thr、Val、Ile或Lys；在位置294之Ser、Lys、Ala或Leu；在位置296之His、Leu或Pro；或在位置300之Val或Trp。在一些實施例中，位置268、269、270、271、272、292、293、294及300中之兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者或全部十者具有如此段落中所指定之取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽可包含保守取代，例如集合中之一或多個位置之指定胺基酸的相同電荷分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或尺寸分組及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置268之Val；在位置269之Pro；在位置270之Pro；在位置271之Arg或Trp；在位置272之Met；在位置292之Leu；在位置293之Thr；在位置294之Ser；在位置296之His；及/或在位置300之Val。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置268之Asp；在位置269之Met或Asp；在位置270之Trp；在位置271之Glu或Thr；在位置272之Tyr或Trp；在位置292之Trp；在位置293之Val、Ile或Lys；在位置294之Lys、Ala或Leu；在位置296之Leu或Pro；及/或在位置300之Trp。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：139-143中之任一者之胺基酸1-110具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、
至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：139-143具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：139-143中之任一者之胺基酸序列。在其他實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：139-143中之任一者之胺基酸序列，但其中一個、兩個或三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽具有根據EU編號流程在位置272、274、276、322、324、326、329、330及331之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。說明性經修飾之Fc多肽提供於SEQ ID NO：144-148中。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置330之Trp。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在如下位置之至少一個取代：在位置272之Trp、Val、Ile或Ala；在位置274之Trp或Gly；在位置276之Tyr、Arg或Glu；在位置322之Ser、Arg或Gln；在位置324之Val、Ser或Phe；在位置326之Ile、Ser或Trp；在位置329之Trp、Thr、Ser、Arg或Asp；在位置330之Trp；或在位置331之Ser、Lys、Arg或Val。在一些實施例中，位置272、274、276、322、324、326、329、330及331中之兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或全部九者具有如此段落中所指定之取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽可包含保守取代，例如集合中之一或多個位置之指定胺基酸的相同電荷分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或尺寸分組及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個選自以下之位置：位置272為Trp、Val、Ile或Ala；位置274為Trp或Gly；位置276為Tyr、Arg或Glu；位置322為Ser、Arg或Gln；位置324為Val、Ser或Phe；位置326為Ile、Ser或Trp；位置329為Trp、Thr、
Ser、Arg或Asp；位置330為Trp；及位置331為Ser、Lys、Arg或Val。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含在位置272之Val或Ile；在位置274之Gly；在位置276之Arg；在位置322之Arg；在位置324之Ser；在位置326之Ser；在位置329之Thr、Ser或Arg；在位置330之Trp；及/或在位置331之Lys或Arg。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：144-148中之任一者之胺基酸1-110具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：144-148具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：144-148中之任一者之胺基酸序列。在其他實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：144-148中之任一者之胺基酸序列，但其中一個、兩個或三個胺基酸經取代。
VI. 其他Fc多肽突變
在一些態樣中，本文所描述之融合蛋白包含兩個Fc多肽，該兩個Fc多肽可各自包含經獨立選擇之修飾或可為野生型Fc多肽，例如人類IgG1 Fc多肽。在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽含有一或多個修飾，該一或多個修飾使其結合於血腦障壁(BBB)受體，例如轉鐵蛋白受體(TfR)。可引入一個或兩個Fc多肽中之其他突變之非限制性實例包括例如用於以下目的之突變：增加血清穩定性或血清半衰期、調節效應功能、影響糖基化、降低人類之免疫原性及/或提供Fc多肽之杵及臼異二聚化。
在一些實施例中，存在於融合蛋白中之Fc多肽獨立地與對應野生型Fc多肽(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、
89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之胺基酸序列一致性。
在一些實施例中，存在於融合蛋白中之Fc多肽包括杵及臼突變以促進異二聚體形成且阻止均二聚體形成。通常，修飾在第一多肽之界面處引入突起(「杵」)且在第二多肽之界面中引入對應空腔(「臼」)，使得突起可安置於空腔中以便促進異二聚體形成且因此阻止均二聚體形成。藉由將第一多肽界面之小胺基酸側鏈用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換來構築突起。藉由將大胺基酸側鏈用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換在第二多肽之界面中形成尺寸與突起一致或類似之補償性空腔。在一些實施例中，此類其他突變係位於Fc多肽中不對多肽結合於BBB受體(例如TfR)有負面影響之位置。
在杵及臼二聚化方法之一個說明性實施例中，存在於融合蛋白中之Fc多肽中之一者的位置366(根據EU編號流程編號)包含色胺酸替代天然蘇胺酸。二聚體中之另一Fc多肽具有在位置407之纈胺酸(根據EU編號流程編號)替代天然酪胺酸。另一Fc多肽可進一步包含如下取代，其中在位置366(根據EU編號流程編號)之天然蘇胺酸經絲胺酸取代且在位置368(根據EU編號流程編號)之天然白胺酸經丙胺酸取代。因此，本文所描述之融合蛋白的Fc多肽中之一者具有T366W杵突變且另一Fc多肽具有Y407V突變，其典型地伴隨T366S及L368A臼突變。
在一些實施例中，可引入用於增強血清半衰期之修飾。舉例而言，在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的一個或兩個Fc多肽可包含如根據EU編號流程編號在位置252之酪胺酸、在位置254之蘇胺酸及在位置256之麩胺酸。因此，一個或兩個Fc多肽可具有M252Y、S254T及T256E取代。或者，一個或兩個Fc多肽可具有如根據EU編號流程編號之M428L及N434S取代。或者，一個或兩個Fc多肽可具有N434S或N434A取代。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的一個或兩個Fc多肽可包含降低效應功能之修飾，亦即，具有降低之在結合於在介導效應功能之效應細胞上表現之Fc受體後誘導某些生物功能的能力。抗體效應功能之實例包括但不限於C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之噬菌作用(ADCP)、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。效應功能可隨抗體類別而變化。舉例而言，天然人類IgG1及IgG3抗體可在結合於免疫系統細胞上存在之適當Fc受體後引發ADCC及CDC活性；且天然人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4可在結合於免疫細胞上存在之適當Fc受體後引發ADCP功能。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的一個或兩個Fc多肽亦可經工程改造以含有用於異二聚化之其他修飾，例如對CH3-CH3界面內天然帶電荷之接觸殘基之靜電工程改造或疏水補丁修飾(hydrophobic patch modification)。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的一個或兩個Fc多肽可包括調節效應功能之其他修飾。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中的一個或兩個Fc多肽可包含降低或消除效應功能之修飾。說明性降低效應功能之Fc多肽突變包括但不限於在CH2結構域中例如根據EU編號流程在位置234及235之取代。舉例而言，在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽可包含在位置234及235之丙胺酸殘基。因此，一個或兩個Fc多肽可具有L234A及L235A(LALA)取代。
調節效應功能之其他Fc多肽突變包括但不限於以下情況：位置329可具有突變，其中脯胺酸經甘胺酸或精胺酸或足夠大以破壞在Fc之脯胺酸329與FcγRIII之色胺酸殘基Trp 87及Trp 110之間形成的Fc/Fcγ受體界面之胺基酸殘基取代。其他說明性取代包括根據EU編號流程之S228P、E233P、L235E、
N297A、N297D及P331S。亦可存在多重取代，例如根據EU編號流程，人類IgG1 Fc區之L234A及L235A；人類IgG1 Fc區之L234A、L235A及P329G；人類IgG4 Fc區之S228P及L235E；人類IgG1 Fc區之L234A及G237A；人類IgG1 Fc區之L234A、L235A及G237A；人類IgG2 Fc區之V234A及G237A；人類IgG4 Fc區之L235A、G237A及E318A；及人類IgG4 Fc區之S228P及L236E。在一些實施例中，一個或兩個Fc多肽可具有調節ADCC之一或多個胺基酸取代，例如根據EU編號流程在位置298、333及/或334之取代。
包含其他突變之說明性Fc多肽
作為非限制性實例，存在於本文所描述之融合蛋白中的一個或兩個Fc多肽可包含其他突變，包括杵突變(例如如根據EU編號流程編號之T366W)、臼突變(例如如根據EU編號流程編號之T366S、L368A及Y407V)、調節效應功能之突變(例如如根據EU編號流程編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))及/或增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)。
在一些實施例中，Fc多肽可具有杵突變(例如如根據EU編號流程編號之T366W)且與序列之中之任一者SEQ ID NO：1、4-90及124-148具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列的Fc多肽可經修飾以具有杵突變。
在一些實施例中，Fc多肽可具有杵突變(例如如根據EU編號流程編號之T366W)、調節效應功能之突變(例如如根據EU編號流程編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))，且與SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列的Fc
多肽可經修飾以具有杵突變及調節效應功能之突變。
在一些實施例中，Fc多肽可具有杵突變(例如如根據EU編號流程編號之T366W)、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)，且與SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列的Fc多肽可經修飾以具有杵突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變。
在一些實施例中，Fc多肽可具有杵突變(例如如根據EU編號流程編號之T366W)、調節效應功能之突變(例如如根據EU編號流程編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)，且與SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列的Fc多肽可經修飾以具有杵突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變。
在一些實施例中，Fc多肽可具有臼突變(例如如根據EU編號流程編號之T366S、L368A及Y407V)且與SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列的Fc多肽可經修飾以具有臼突變。
在一些實施例中，Fc多肽可具有臼突變(例如如根據EU編號流程編號之T366S、L368A及Y407V)、調節效應功能之突變(例如如根據EU編號流程
編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))，且與SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列的Fc多肽可經修飾以具有臼突變及調節效應功能之突變。
在一些實施例中，Fc多肽可具有臼突變(例如如根據EU編號流程編號之T366S、L368A及Y407V)、增加血清或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)，且與SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列的Fc多肽可經修飾以具有臼突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變。
在一些實施例中，Fc多肽可具有臼突變(例如如根據EU編號流程編號之T366S、L368A及Y407V)、調節效應功能之突變(例如如根據EU編號流程編號之L234A、L235A及/或P329G(例如L234A及L235A))、增加血清穩定性或血清半衰期之突變(例如(i)如參考EU編號進行編號之M252Y、S254T及T256E，或(ii)如根據EU編號流程編號之N434S加上或不加上M428L)，且與SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：1、4-90及124-148中之任一者之序列的Fc多肽可經修飾以具有臼突變、調節效應功能之突變及增加血清穩定性或血清半衰期之突變。
VII.包含ERT酶之說明性融合蛋白
在一些態樣中，本文所描述之融合蛋白包含第一Fc多肽，其鍵聯至酶替代療法(ERT)酶、ERT酶變異體或其催化活性片段；及第二Fc多肽，其與第一Fc多肽形成Fc二聚體。在一些實施例中，第一Fc多肽及/或第二Fc多肽
不包括免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈可變區序列或其抗原結合部分。在一些實施例中，ERT酶為IDS、SGSH、ASM或GBA。在一些實施例中，第一Fc多肽為經修飾之Fc多肽及/或第二Fc多肽為經修飾之Fc多肽。在一些實施例中，第二Fc多肽為經修飾之Fc多肽。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有促進其與另一Fc多肽之異二聚化的一或多個修飾。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有降低效應功能之一或多個修飾。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有延長血清半衰期之一或多個修飾。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽含有使其結合於血腦障壁(BBB)受體(例如轉鐵蛋白受體(TfR))之一或多個修飾。
在其他態樣中，本文所描述之融合蛋白包含第一多肽鏈，其包含特異性結合於BBB受體(例如TfR)之經修飾之Fc多肽；及第二多肽鏈，其包含與經修飾之Fc多肽二聚化以形成Fc二聚體之Fc多肽。ERT酶可鍵聯至第一或第二多肽鏈。在一些實施例中，ERT酶為IDS、SGSH、ASM或GBA。在一些實施例中，ERT酶鍵聯至第二多肽鏈。在一些實施例中，蛋白質包含兩個ERT酶，其各自鍵聯至多肽鏈中之一者。在一些實施例中，Fc多肽可為BBB受體結合性多肽，其特異性結合於與第一多肽鏈中之經修飾之Fc多肽相同的BBB受體。在一些實施例中，Fc多肽不特異性結合於BBB受體。
在一些實施例中，本文所描述之融合蛋白包含第一多肽鏈，其包含特異性結合於TfR之經修飾之Fc多肽；及第二多肽鏈，其包含Fc多肽，其中該經修飾之Fc多肽與該Fc多肽二聚化以形成Fc二聚體。在一些實施例中，ERT酶為IDS、SGSH、ASM或GBA。在一些實施例中，ERT酶鍵聯至第一多肽鏈。在一些實施例中，ERT酶鍵聯至第二多肽鏈。在一些實施例中，Fc多肽不特異性結合於BBB受體，例如TfR。
在一些實施例中，本文所描述之融合蛋白包含第一多肽鏈，其包含結合於TfR且包含T366W(杵)取代之經修飾之Fc多肽；及第二多肽鏈，其包含
含有T366S、L368A及Y407V(臼)取代之Fc多肽。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽進一步包含L234A及L235A(LALA)取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽進一步包含M252Y、S254T及T256E(YTE)取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽進一步包含L234A及L235A(LALA)取代及M252Y、S254T及T256E(YTE)取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽包含在位置234、235、252、254、256及366之人類IgG1野生型殘基。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含如關於SEQ ID NO：97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209及216-221中之任一者所指定之杵、LALA及YTE突變，且與各別序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性；或包含SEQ ID NO：97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209及216-221中之任一者之序列。在一些實施例中，Fc多肽包含如關於SEQ ID NO：101-104中之任一者所指定之臼、LALA及YTE突變且與各別序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性；或包含SEQ ID NO：101-104中之任一者之序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209及216-221中之任一者，且Fc多肽包含SEQ ID NO：101-104中之任一者。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽之N端包括IgG1鉸鏈區之一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：116、228及229中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性，或包含SEQ ID NO：116、228及229中之任一者之序列。
在一些實施例中，本文所描述之融合蛋白包含第一多肽鏈，其包含結合於TfR且包含T366S、L368A及Y407V(臼)取代之經修飾之Fc多肽；及第二多肽鏈，其包含含有T366W(杵)取代之Fc多肽。在一些實施例中，經修飾之
Fc多肽及/或Fc多肽進一步包含L234A及L235A(LALA)取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽進一步包含M252Y、S254T及T256E(YTE)取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽進一步包含L234A及L235A(LALA)取代及M252Y、S254T及T256E(YTE)取代。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽包含在位置234、235、252、254、256及366之人類IgG1野生型殘基。
在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含如關於SEQ ID NO：105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215及222-227中之任一者所指定之臼、LALA及YTE突變，且與各別序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性；或包含SEQ ID NO：105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215及222-227中之任一者之序列。在一些實施例中，Fc多肽包含如關於SEQ ID NO：109-112中之任一者所指定之杵、LALA及YTE突變且與各別序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性；或包含SEQ ID NO：109-112中之任一者之序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽包含SEQ ID NO：105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215及222-227中之任一者，且Fc多肽包含SEQ ID NO：109-112中之任一者。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽之N端包括IgG1鉸鏈區之一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中之ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)鍵聯至多肽鏈，該多肽鏈包含與SEQ ID NO：101-104中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO：101-104中之任一者之序列(例如呈融合多肽之形式)。在一些實施例中，ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)藉由諸如可撓性連接子之連接子鍵聯至Fc多肽及/或鉸鏈區或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。在一些實
施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：114、230及234中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之IDS序列，或包含SEQ ID NO：114、230及234中之任一者之序列。在一些實施例中，鍵聯至Fc多肽之IDS序列與SEQ ID NO：115、117、231、232、235及236中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性，或包含SEQ ID NO：115、117、231、232、235及236中之任一者之序列。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：120具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之SGSH序列，或包含SEQ ID NO：120之序列。在一些實施例中，鍵聯至Fc多肽之SGSH序列與SEQ ID NO：149及150中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性，或包含SEQ ID NO：149及150中之任一者之序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與SEQ ID NO：97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209及216-221中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之經修飾之Fc多肽，或包含SEQ ID NO：97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209及216-221中之任一者之序列。在一些實施例中，Fc多肽及/或經修飾之Fc多肽之N端包括IgG1鉸鏈區的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽與SEQ ID NO：116、228及229中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性，或包含SEQ ID NO：116、228及229中之任一者之序列。
在一些實施例中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，其包含SEQ ID NO：115之序列；及經修飾之Fc多肽，其包含SEQ ID NO：205及228中之任一者之序列。在其他實施例中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，其包含SEQ ID NO：115之序列；及經修飾之Fc多肽，其包含SEQ ID NO：169及229中之任一者之序列。
在一些實施例中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，其包含SEQ ID NO：231之序列；及經修飾之Fc多肽，其包含SEQ ID NO：205及228中之任一
者之序列。在其他實施例中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，其包含SEQ ID NO：231之序列；及經修飾之Fc多肽，其包含SEQ ID NO：169及229中之任一者之序列。
在一些實施例中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，其包含SEQ ID NO：235之序列；及經修飾之Fc多肽，其包含SEQ ID NO：205及228中之任一者之序列。在其他實施例中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，其包含SEQ ID NO：235之序列；及經修飾之Fc多肽，其包含SEQ ID NO：169及229中之任一者之序列。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中之ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)鍵聯至多肽鏈，該多肽鏈包含與SEQ ID NO：109-112中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO：109-112中之任一者之序列(例如呈融合多肽之形式)。在一些實施例中，ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)藉由諸如可撓性連接子之連接子鍵聯至Fc多肽，及/或鉸鏈區或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：114、230及234中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之IDS序列，或包含SEQ ID NO：114、230及234中之任一者之序列。在一些實施例中，鍵聯至Fc多肽之IDS序列與SEQ ID NO：118、233及237中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性，或包含SEQ ID NO：118、233及237中之任一者之序列。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：120具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之SGSH序列，或包含SEQ ID NO：120之序列。在一些實施例中，鍵聯至Fc多肽之SGSH序列與SEQ ID NO：152及153中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性，或包含SEQ ID NO：152及153中之任一者之序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與SEQ ID NO：105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、
210-215及222-227中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性的經修飾之Fc多肽，或包含SEQ ID NO：105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215及222-227中之任一者之序列。在一些實施例中，Fc多肽及/或經修飾之Fc多肽之N端包括IgG1鉸鏈區的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中之ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)鍵聯至多肽鏈，該多肽鏈包含與SEQ ID NO：97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209及216-221中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性的經修飾之Fc多肽，或包含SEQ ID NO：97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209及216-221中之任一者之序列(例如呈融合多肽之形式)。在一些實施例中，ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)藉由諸如可撓性連接子之連接子鍵聯至經修飾之Fc多肽，及/或鉸鏈區或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：114、230及234中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之IDS序列，或包含SEQ ID NO：114、230及234中之任一者之序列。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：120具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之SGSH序列，或包含SEQ ID NO：120之序列。在一些實施例中，鍵聯至經修飾之Fc多肽之SGSH序列與SEQ ID NO：154及155中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性，或包含SEQ ID NO：154及155中之任一者之序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與SEQ ID NO：101-104、149及150中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之Fc多肽，或包含SEQ ID NO：101-104、149及150中之任一者之序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽之N端包括IgG1鉸鏈區之一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。
在一些實施例中，存在於本文所描述之融合蛋白中之ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)鍵聯至多肽鏈，該多肽鏈包含與SEQ ID NO：105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215及222-227中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性的經修飾之Fc多肽，或包含SEQ ID NO：105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215及222-227中之任一者之序列(例如呈融合多肽之形式)。在一些實施例中，ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)藉由諸如可撓性連接子之連接子鍵聯至經修飾之Fc多肽，及/或鉸鏈區或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：114、230及234中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之IDS序列，或包含SEQ ID NO：114、230及234中之任一者之序列。在一些實施例中，ERT酶包含與SEQ ID NO：120具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之SGSH序列，或包含SEQ ID NO：120之序列。在一些實施例中，融合蛋白包含與SEQ ID NO：109-112中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性之Fc多肽，或包含SEQ ID NO：109-112中之任一者之序列。在一些實施例中，融合蛋白包含鍵聯至Fc多肽之SGSH序列，其與SEQ ID NO：152及153中之任一者具有至少85%、至少90%或至少95%一致性，或包含SEQ ID NO：152及153中之任一者之序列。在一些實施例中，經修飾之Fc多肽及/或Fc多肽之N端包括IgG1鉸鏈區之一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。
VIII. 量測結合動力學、親和力、腦濃度及腦暴露
本文所描述之融合蛋白及其他組合物可具有廣泛範圍之結合親和力。舉例而言，在一些實施例中，蛋白質對血腦障壁(BBB)受體(例如轉鐵蛋白受體(TfR))具有在1pM至10μM之範圍內的親和力。在一些實施例中，對TfR之親和力在1nM至5μM或10nM至1μM範圍內。在一些實施例中，對TfR
之親和力在約50nM至約250nM範圍內。
在一些實施例中，TfR結合性多肽之親和力可以單價形式加以量測。在其他實施例中，親和力可以二價形式加以量測，例如作為包含多肽-Fab融合蛋白之二聚體。
用於分析結合親和力、結合動力學及交叉反應性以分析與BBB受體(例如TfR)之結合的方法為此項技術中已知的。此等方法包括但不限於固相結合分析(例如ELISA分析)、免疫沈澱、表面電漿子共振(例如BiacoreTM
(GE Healthcare,Piscataway,NJ))、動力學排除分析(例如KinExA®)、流式細胞術、螢光激活細胞分選(FACS)、BioLayer干涉術(例如Octet®(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))及西方墨點分析。在一些實施例中，使用ELISA來測定結合親和力及/或交叉反應性。進行ELISA分析之方法為此項技術中已知的且亦描述於以下實例部分中。在一些實施例中，使用表面電漿子共振(SPR)來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用動力學排除分析來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用BioLayer干涉術分析來測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。
測定結合親和力(例如對TfR)之方法的非限制性實例描述於以下實例13中，其中使用BiacoreTM
儀器藉由表面電漿子共振(SPR)來測定親和力。在此方法中，將相關經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體捕獲於感測器晶片上且在指定流速(例如30μL/min)及溫度(例如室溫)下將TfR之連續稀釋液注射至感測器晶片上。使用指定締合及解離時間(例如分別45及180秒)分析樣品，隨後進行感測器晶片再生。藉由將量測到之反應自對照(例如使用類似密度之不相關IgG)中扣除來校正結合反應，然後可藉由使用軟體擬合針對濃度之平衡反應來測定穩態親和力。
可例如使用人類轉鐵蛋白受體(hTfR)敲入小鼠模型來量測腦及/或血
漿中之經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽、TfR結合性抗體或藥劑(例如鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體)的濃度。此類模型可用於例如量測及/或比較最大腦濃度(Cmax
)及/或腦暴露，例如以確定Cmax
是否增加及/或腦暴露是否延長。下文在實例12中描述了人類頂端TfR(TfR ms/hu
)小鼠敲入模型之創建。為創建適合之模型，可使用CRISPR/Cas9系統來產生表現鼠Tfrc
基因內之人類Tfrc
頂端結構域的小鼠(例如其中活體內表現受內源性啟動子控制)。特定而言，可將Cas9、單一導向RNA及供體DNA(例如已關於在小鼠中之表現密碼子優化之人類頂端結構域編碼序列)引入小鼠胚胎中(例如藉由原核注射)。然後可將胚胎轉移至假妊娠雌性。可使來自接受胚胎之雌性的子代的首建雄性(founder male)與野生型雌性繁殖以產生F1雜合子小鼠。然後可隨後由培育F1代雜合子小鼠產生純合子小鼠。
對於經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽、TfR結合性抗體或藥劑(例如鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體)之腦及/或血漿濃度或暴露之評估，可向小鼠模型(例如TfR ms/hu
)投與經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽、TfR結合性抗體(例如鍵聯至藥劑)。可在適合之時間段之後自小鼠獲得血漿樣品，隨後用適合之溶液灌注血管系統。在灌注之後，可萃取腦(或其部分)且均質化並溶解。然後可使用一般熟習此項技術者將已知之標準方法測定血漿及/或腦溶解產物中之藥劑濃度。作為非限制性實例，可使用基於ELISA之分析，諸如以下實例3中所描述之基於ELISA之分析來量測濃度。簡單來說，可使用夾心ELISA來定量藥劑、經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體(例如在血漿或溶解產物中)之濃度。可以所需濃度(例如約3μg/mL)將捕獲抗體(例如抗Fc捕獲抗體)塗佈至板(例如384孔MaxiSorpTM
板)上。將板阻斷(例如用5% BSA)，然後與已經稀釋(例如1：1,000或1：10,000)之血漿一起孵育。接著，以所需濃度(例如約0.5μg/mL)添加
偵測抗體，隨後添加第二抗體，諸如抗山羊-HRP抗體。然後使板顯色(例如使用TMB受質)、停止反應(例如用硫酸)且在讀板儀(例如BioTek讀板儀)上量測在適當波長(例如450nm)下之吸光度。可使用適當之(例如4倍)稀釋系列產生標準曲線並使用諸如四參數羅吉斯回歸(four-parameter logistic regression)之算法進行擬合。
藉由向敲入小鼠模型投與一系列劑量，可產生標準曲線。藉由向敲入小鼠模型投與鍵聯至不同的經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體(例如具有不同TfR親和力)之藥劑或鍵聯至參考多肽或蛋白質(例如與相關多肽或蛋白質相比對TfR具有較弱親和力)之藥劑，可關於經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體對腦暴露於藥劑及/或藥劑在腦中之Cmax
值的影響進行比較。
IX. 鍵聯至Fc多肽之ERT酶
在一些實施例中，本文所描述之融合蛋白包含如本文所描述之兩個Fc多肽且Fc多肽中之一者或兩者可進一步包含部分或全部鉸鏈區。鉸鏈區可來自任何免疫球蛋白亞類或同型。說明性免疫球蛋白鉸鏈為IgG鉸鏈區，諸如IgG1鉸鏈區，例如人類IgG1鉸鏈胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：95)或其一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。在一些實施例中，鉸鏈區位於Fc多肽之N端區域。
在一些實施例中，Fc多肽藉由連接子(例如肽連接子)連接至ERT酶。在一些實施例中，Fc多肽藉由肽鍵或藉由肽連接子連接至ERT酶，例如為融合多肽。肽連接子可經組態使得其允許ERT酶相對於與其連接之Fc多肽發生轉動；及/或對由蛋白酶消化具抗性。肽連接子可含有天然胺基酸、非天然胺基酸或其組合。在一些實施例中，肽連接子可為可撓性連接子，例如含有諸如以下之胺基酸：Gly、Asn、Ser、Thr、Ala及類似胺基酸。此類連接子係使用已知
參數設計且可具有任何長度並含有任何數目之任何長度之重複單元(例如Gly及Ser殘基之重複單元)。舉例而言，連接子可具有重複，諸如兩個、三個、四個、五個或更多個Gly4
-Ser(SEQ ID NO：239)重複或單個Gly4
-Ser(SEQ ID NO：239)。在一些實施例中，肽連接子可包括蛋白酶裂解位點，例如其可由存在於中樞神經系統中之酶裂解。
在一些實施例中，ERT酶例如藉由Gly4
-Ser連接子(SEQ ID NO：239)或(Gly4
-Ser)2
連接子(SEQ ID NO：240)連接至Fc多肽之N端。在一些實施例中，Fc多肽可包含在N端之鉸鏈序列或部分鉸鏈序列，其連接至連接子或直接連接至ERT酶。
在一些實施例中，ERT酶例如藉由Gly4
-Ser連接子(SEQ ID NO：239)或(Gly4
-Ser)2
連接子(SEQ ID NO：240)連接至Fc多肽之C端。在一些實施例中，Fc多肽之C端直接連接至ERT酶。
在一些實施例中，ERT酶藉由化學交聯劑連接至Fc多肽。此類結合物可使用熟知化學交聯試劑及方案來產生。舉例而言，存在大量熟習此項技術者已知且適用於交聯多肽與相關藥劑之化學交聯劑。舉例而言，交聯劑為異雙官能交聯劑，其可用於逐步鍵聯分子。異雙官能交聯劑提供設計用於結合蛋白質之更具特異性之偶合方法的能力，由此減少不想要之副反應(諸如同源蛋白質聚合物)的出現。多種異雙官能交聯劑為此項技術中已知的，包括N-羥基丁二醯亞胺(NHS)或其水溶性類似物N-羥基磺基丁二醯亞胺(磺基-NHS)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺酯(MBS)；胺基苯甲酸N-丁二醯亞胺基(4-碘乙醯基)酯(SIAB)、4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸丁二醯亞胺酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)；4-丁二醯亞胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-丁二醯亞胺酯(SPDP)
及6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸]己酸丁二醯亞胺酯(LC-SPDP)。具有N-羥基丁二醯亞胺部分之彼等交聯劑可以N-羥基磺基丁二醯亞胺類似物之形式獲得，其通常具有更大之水溶性。此外，彼等在連接鏈內具有二硫鍵之交聯劑可替代地以烷基衍生物之形式合成，以便減少活體內連接子裂解之量。除異雙官能交聯劑之外，亦存在許多其他交聯劑，包括同雙官能及光反應性交聯劑。辛二酸二丁二醯亞胺酯(DSS)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)及庚二醯亞胺酸二甲酯(dimethylpimelimidate)。2HCl(DMP)為適用同雙官能交聯劑之實例，且雙[B-(4-疊氮基水楊基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)及N-丁二醯亞胺基-6(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸酯(SANPAH)為適用光反應性交聯劑之實例。
X. 蛋白質活性之評估
本文所描述之包含諸如IDS、SGSH、ASM或GBA之ERT酶的融合蛋白之活性可使用各種分析來評估，包括使用人工受質量測活體外活性之分析，諸如實例部分中所描述之彼等分析。用於量測活體外IDS活性之說明性方案提供於實例2中。用於量測活體外ASM活性之說明性方案提供於實例5中。用於量測活體外SGSH活性之說明性方案提供於實例7及8中。
在一些態樣中，藉由分析諸如細胞樣品、組織樣品或流體樣品(例如CSF或尿液)之樣品中因IDS缺乏而累積之醣胺聚醣(GAG)硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素的量來評估IDS活性。硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素之量係藉由用肝素酶及軟骨素酶消化存在於樣品中之GAG來測定。然後可藉由質譜法(例如LC-MS/MS)分析所得二醣。含有高水準之硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素累積之樣品中硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素衍生之二醣的量將增加。因此，二醣之含量與IDS酶活性成反比。
可對GAG累積之任何樣品，包括細胞樣品、組織樣品及流體樣品進行質譜法(例如LC-MS/MS)分析。可對此類樣品進行評估以監測例如在活體外投
與細胞或在一些實施例中在活體內投與個體之本文所描述的含有IDS之蛋白質的活性。個體可為動物，諸如囓齒動物，例如小鼠，或非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為人類患者，諸如患有亨特症候群且正經歷用IDS療法治療之患者，其中該分析用於監測患者中之IDS活性。在一些實施例中，人類患者正經歷用本文所描述之融合蛋白治療。
對於細胞樣品，諸如細胞或組織樣品，該分析包括將細胞破碎並使微泡裂開。將細胞破碎或使微泡裂開可藉由使用冷凍-解凍及/或超音處理來達成以獲得包含GAG之萃取物(例如細胞萃取物)。然後用肝素酶(例如本文所描述之任何肝素酶)及軟骨素酶對GAG進行處理，該等酶分解硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素GAG。在消化之後，獲得含有GAG二醣之上清液且藉由質譜法(例如LC-MS/MS)分析二醣產物。說明性方案提供於實例2中。
在一些實施例中，將要分析IDS活性之細胞樣品洗滌並冷凍。將細胞球粒在二醣消化緩衝液中超音處理。然後將來自經超音處理之樣品的所需量之總蛋白添加至包含肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III及軟骨素酶B之消化緩衝液中，其中後者對硫酸皮膚素具特異性。在例如在30℃下消化約3小時之後，用EDTA及煮沸將酶去活化。然後例如在16,000 x G下將樣品離心，且將上清液轉移至離心過濾器中並在約14,000 x G下離心。然後將二醣再懸浮於1：1 v/v比率之分析緩衝液：乙腈混合物中且例如如實例2中所描述藉由與電噴霧質譜法聯用之液相層析進一步分析。可基於與市售參考標準物相比之滯留時間來鑑定GAG衍生之二醣產物。說明性硫酸乙醯肝素衍生之二醣包括D0S0及D2S0(根據Lawrence等人，Nat.Methods
,5：291-292(2008)之命名法)。
在其他態樣中，藉由分析諸如細胞樣品或組織樣品之樣品中因SGSH缺乏而累積之硫酸乙醯肝素醣胺聚醣(GAG)之量來評估SGSH活性。藉由用肝素酶(例如本文所描述之任何肝素酶)消化存在於樣品中之GAG來測定硫酸乙醯肝
素之量。然後可藉由質譜法(例如LC-MS/MS)分析所得二醣。含有高水準之硫酸乙醯肝素累積的樣品中之硫酸乙醯肝素衍生之二醣的量將增加。因此，二醣之含量與SGSH酶活性成反比。
可對GAG累積之任何樣品，包括細胞樣品、組織樣品及流體樣品進行質譜法(例如LC-MS/MS)分析。可對此類樣品進行評估以監測例如在活體外投與細胞或在一些實施例中在活體內投與個體之本文所描述的含有SGSH之蛋白質的活性。個體可為動物，諸如囓齒動物，例如小鼠，或非人類靈長類動物。在一些實施例中，個體為人類患者，諸如患有聖菲利柏症候群A且正經歷用SGSH療法治療之患者，其中該分析用於監測患者中之SGSH活性。在一些實施例中，人類患者正經歷用本文所描述之融合蛋白治療。
對於細胞樣品，諸如細胞或組織樣品，該分析包括將細胞破碎及/或使微泡裂開。將細胞破碎或使微泡裂開可藉由使用冷凍-解凍及/或超音處理來達成以獲得包含GAG之萃取物(例如細胞萃取物)。然後用肝素酶(例如本文所描述之任何肝素酶)對GAG進行處理，肝素酶分解硫酸乙醯肝素GAG。在消化之後，獲得含有GAG二醣之上清液且藉由質譜法(例如LC-MS/MS)分析二醣產物。說明性方案提供於實例7中。
在一些實施例中，將要分析SGSH活性之細胞樣品洗滌並冷凍。將細胞球粒在二醣消化緩衝液中超音處理。然後將來自經超音處理之樣品的所需量之總蛋白添加至包含肝素酶I、肝素酶II及/或肝素酶III之消化緩衝液中。在例如在30℃下消化約3小時之後，用EDTA及煮沸將酶去活化。然後例如在16,000 x G下將樣品離心，且將上清液轉移至離心過濾器中並在約14,000 x G下離心。然後將二醣再懸浮於1：1 v/v比率之分析緩衝液：乙腈混合物中且例如如實例7中所描述藉由與電噴霧質譜法聯用之液相層析進一步分析。可基於與市售參考標準物相比之滯留時間來鑑定GAG衍生之二醣產物。說明性硫酸乙醯肝素
衍生之二醣包括D0S0及D2S0(根據Lawrence等人，Nat.Methods,
5：291-292(2008)之命名法)。
在一些實施例中，評估組織樣品。可使用如上文所描述之分析來評估組織樣品，除了典型地在超音處理步驟之前包括多個冷凍-解凍週期(例如2、3、4、5或更多個)以確保微泡裂開。
可藉由本文所描述之分析評估的樣品包括腦、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、血漿、血清、腦脊髓液(CSF)及尿液。在一些實施例中，可評估來自接受本文所描述之酶-Fc融合蛋白(例如IDS-Fc或SGSH-Fc融合蛋白)之患者的CSF樣品。
XI. 核酸、載體及宿主細胞
如本文所描述之融合蛋白中所含之多肽鏈係典型地使用重組方法來製備。因此，在一些態樣中，本發明提供分離之核酸，其所包含之核酸序列編碼包含如本文所描述之Fc多肽的多肽鏈中之任一者；及引入該等核酸之宿主細胞，其用於複製編碼多肽之核酸及/或表現多肽。在一些實施例中，宿主細胞為真核的，例如人類細胞。
在另一態樣中，提供包含編碼本文所描述之多肽鏈的核苷酸序列之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股或雙股的。在一些實施例中，聚核苷酸為DNA。在特定實施例中，聚核苷酸為cDNA。在一些實施例中，聚核苷酸為RNA。
在一些實施例中，聚核苷酸包括於核酸構築體內。在一些實施例中，構築體為可複製載體。在一些實施例中，載體係選自質粒、病毒載體、噬菌粒、酵母染色體載體及非附加型哺乳動物載體。
在一些實施例中，聚核苷酸可操作地連接至表現構築體中之一或多個調控核苷酸序列。在一系列實施例中，核酸表現構築體適合於用作表面表現文庫。在一些實施例中，該文庫適合於在酵母中之表面表現。在一些實施例中，
該文庫適合於在噬菌體中之表面表現。在另一系列實施例中，核酸表現構築體適合於使多肽在容許以毫克或克量分離多肽之系統中表現。在一些實施例中，系統為哺乳動物細胞表現系統。在一些實施例中，系統為酵母細胞表現系統。
用於製備重組多肽之表現媒劑包括質粒及其他載體。舉例而言，適合之載體包括以下類型之質粒：pBR322衍生之質粒、pEMBL衍生之質粒、pEX衍生之質粒、pBTac衍生之質粒及pUC衍生之質粒，其係用於在諸如大腸桿菌(E.coli
)之原核細胞中表現。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo及pHyg衍生之載體為適合於轉染真核細胞之哺乳動物表現載體之實例。或者，諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP衍生型及p205)之病毒衍生物可用於多肽在真核細胞中之瞬時表現。在一些實施例中，可能需要藉由使用桿狀病毒表現系統來表現重組多肽。此類桿狀病毒表現系統之實例包括pVL衍生之載體(諸如pVL1392、pVL1393及pVL941)、pAcUW衍生之載體(諸如pAcUW1)及pBlueBac衍生之載體。其他表現系統包括腺病毒、腺相關病毒及其他病毒表現系統。
載體可轉型至任何適合之宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞(例如細菌或酵母細胞)可適合於用作表面表現文庫。在一些細胞中，使載體在宿主細胞中表現以表現相對大量之多肽。此類宿主細胞包括哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及原核細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎臟(BHK)細胞、NS0細胞、Y0細胞、HEK293細胞、COS細胞、Vero細胞或HeLa細胞。
可將用編碼如本文所描述之一或多個Fc多肽鏈之表現載體轉染的宿主細胞在適當條件下培養以允許發生一或多種多肽之表現。多肽可為分泌的及自細胞混合物及含有多肽之培養基分離。或者，多肽可保留在細胞質中或膜級
分中且收穫細胞，溶解，且使用所需方法分離多肽。
XII.治療方法
本文所描述之鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體的融合蛋白或藥劑(例如治療劑)可治療性地用於治療LSD。在一些實施例中，使用包含IDS之鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體之融合蛋白或藥劑來治療患有亨特症候群之患者。在一些實施例中，使用包含SGSH之鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體之融合蛋白或藥劑來治療患有聖菲利柏症候群A之患者。在一些實施例中，使用包含ASM之鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體之融合蛋白或藥劑來治療患有尼曼-皮克病之患者。在一些實施例中，使用包含GBA之鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體之融合蛋白或藥劑來治療患有高歇氏疾病或帕金森氏病之患者。
本文所描述之包含ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)之融合蛋白係以治療有效量或劑量投與個體。說明性劑量包括約0.01mg/kg至約500mg/kg或約0.1mg/kg至約200mg/kg或約1mg/kg至約100mg/kg之日劑量範圍，或可使用約10mg/kg至約50mg/kg。在一些實施例中，蛋白質之酶活性為至少約500單位(U)/mg，約1,000U/mg，或至少約1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000U/mg。在一些實施例中，酶活性為至少約11,000U/mg，或至少約12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45000或50,000U/mg；或約500U/mg至約50,000U/mg範圍內之任何值。然而，劑量可根據若干因素而變化，包括所選投藥途徑、組合物之調配物、患者反應、病狀之嚴重程度、個體之重量及處方醫師之判斷。可根據個別患者之需要隨時間
推移增加或減小劑量。在一些實施例中，最初給予患者低劑量，然後劑量增加至患者可忍受之有效劑量。有效量之確定完全在熟習此項技術者之能力範圍內。
在各個實施例中，本文所描述之融合蛋白係非經腸投與。在一些實施例中，蛋白質係靜脈內投與。可藉由輸注例如歷經約10至約30分鐘之時間或歷經至少1小時、2小時或3小時之時間進行靜脈內投與。在一些實施例中，以靜脈內速注之形式投與蛋白質。亦可使用輸注及速注投與之組合。
在一些非經腸實施例中，鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體之融合蛋白或藥劑(例如治療劑)係腹膜內、皮下、皮內或肌肉內投與。在一些實施例中，鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體之蛋白質或藥劑係皮內或肌肉內投與。在一些實施例中，鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體之蛋白質或藥劑係鞘內投與，諸如藉由硬膜外投與或腦室內投與。
在其他實施例中，鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體之融合蛋白或藥劑(例如治療劑)可經口、藉由經肺投與、鼻內投與、眼內投與或藉由表面投與來投與。亦可採用經肺投與，例如通過使用吸入器或噴霧器及含有粉霧劑之調配物。
XIII. 蛋白質替代之方法
在其他態樣中，本文提供一種運送藥劑(例如適用於治療溶酶體貯積症(LSD)之藥劑)穿過哺乳動物之血腦障壁(BBB)的方法。在一些實施例中，該方法包括使BBB暴露於以約50nM至約250nM之親和力結合(例如特異性結合)於轉鐵蛋白受體(TfR)之多肽或蛋白質。在一些實施例中，多肽或蛋白質鍵聯至藥劑且運送鍵聯之藥劑穿過BBB。在一些實施例中，藥劑在哺乳動物腦中之最大濃度(Cmax
)有所提高(例如增加)。
在其他態樣中，本文提供一種治療LSD之方法。在一些實施例中，
該方法包括向哺乳動物投與以約50nM至約250nM之親和力結合(例如特異性結合)於TfR之多肽或蛋白質。在一些實施例中，多肽或蛋白質鍵聯至用於治療LSD之藥劑，由此使哺乳動物之腦暴露於藥劑。
在一些實施例中，多肽或蛋白質以約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250nM之親和力結合(例如特異性結合)於TfR。在一些實施例中，多肽或蛋白質以約100nM至約200nM或約110nM至約150nM之親和力結合於TfR。
在一些實施例中，多肽或蛋白質(例如鍵聯至藥劑)與鍵聯至以較弱親和力結合(例如特異性結合)於TfR之參考多肽或蛋白質的藥劑相比提高(例如增加)了藥劑在腦中之Cmax
。
在一些實施例中，藥劑在腦中之Cmax
與鍵聯至參考多肽或蛋白質(例如其以較弱親和力結合於TfR)的藥劑相比提高(例如增加)至少約1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.2倍、2.4倍、2.6倍、2.8倍、3倍、4倍、5倍或更多倍。
在一些實施例中，哺乳動物之腦暴露於治療有效濃度(例如足以治療LSD之一或多種跡象或症狀的濃度)之藥劑持續與鍵聯至參考多肽或蛋白質之藥劑相比較短之持續時間。在一些實施例中，腦暴露持續時間縮短至少約5%、10%、25%、40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%或98%。
在一些實施例中，藉由繪製腦暴露(例如腦中之藥劑濃度)隨時間之變化並計算曲線下面積(AUC)來定量腦暴露。AUC降低可表示腦暴露減少或縮短。在一些實施例中，腦暴露於藥劑(例如在治療有效濃度下)之持續時間縮短。
在一些實施例中，參考多肽或蛋白質以等於或弱於約250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM或600nM之親和力結合(例如特異性結合)於TfR。在一些實施例中，參考多肽或蛋白質以等於或弱於約600
nM之親和力結合於TfR。
在一些實施例中，哺乳動物為靈長類動物(例如人類)。在一些實施例中，人類為需要治療LSD之患者。在一些實施例中，患者具有LSD之一或多種跡象或症狀。
在一些實施例中，多肽或蛋白質結合(例如特異性結合)於靈長類動物TfR。在一些實施例中，靈長類動物TfR為人類TfR。在一些實施例中，多肽或蛋白質結合於TfR頂端結構域。
在一些實施例中，藥劑(例如治療劑)鍵聯至經工程改造之TfR結合性多肽。在一些實施例中，經工程改造之TfR結合性多肽包含CH3或CH2結構域，該等CH3或CH2結構域具有允許多肽特異性結合於TfR之修飾。本文中描述了適合之經工程改造之TfR結合性多肽的非限制性實例。在一些實施例中，藥劑鍵聯至描述於表4或表5中之經工程改造之TfR結合性多肽。在一些實施例中，藥劑鍵聯至選自由以下組成之群的經工程改造之TfR結合性多肽：CH3C.35.20.2、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.5、CH3C.35.21.17及CH3C.35.21.17.2。
在一些實施例中，藥劑(例如治療劑)鍵聯至TfR結合性肽。在一些實施例中，TfR結合性肽為短肽，長度為約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸。產生、篩選及鑑定適合之肽(亦即，以在所需範圍內之親和力結合於TfR之肽)的方法為此項技術中已知的。舉例而言，可使用交替使用多輪負選擇及正選擇之噬菌體展示策略來鑑定適合之肽。此策略描述於例如Lee等人，Eur.J.Biochem.,
268：2004-2012(2001)中，該文獻出於所有目的全文併入本文中。
在一些實施例中，藥劑(例如治療劑)鍵聯至TfR結合性抗體。適合之TfR結合性抗體之非限制性實例包括揭示於Thom
等人，Mol.Pharm.
,15(4)：1420-1431(2018)中之OX26抗TfR抗體(亦即，具有約76nM、108nM及
174nM之親和力)。在一些實施例中，藥劑鍵聯至包含特異性結合於TfR之抗體可變區的蛋白質。在一些情況下，蛋白質包含Fab或scFv。
在一些實施例中，藥劑(例如治療劑)為蛋白質(例如酶)。在一些實施例中，藥劑為蛋白質替代治療劑。在一些實施例中，藥劑為在哺乳動物中之細胞或組織(例如神經細胞或組織)中缺乏(例如低表現或不存在)的蛋白質或酶。在一些實施例中，藥劑為對哺乳動物中之正常健康細胞或組織(例如神經細胞或組織)而言為內源性的或在其中表現，但在針對LSD進行治療之哺乳動物中缺乏(例如在對應細胞或組織中)的蛋白質或酶。
在一些實施例中，蛋白質替代治療劑為酶。可使任何數目之藥劑(例如蛋白質替代治療劑，諸如酶)鍵聯至多肽或蛋白質(例如結合於TfR之多肽或蛋白質)以治療各種LSD。在一些實施例中，藥劑為酶，其在鍵聯至該多肽或蛋白質時與該酶鍵聯至參考多肽或蛋白質時相比在更大程度上減少毒性代謝產物在患有LSD之哺乳動物腦中之累積。在一些實施例中，酶為艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)且LSD為亨特症候群。在一些情況下，毒性代謝產物包含硫酸肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣。在一些實施例中，酶為N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)且LSD為聖菲利柏症候群。在一些實施例中，酶為酸性神經鞘磷脂酶(ASM)且LSD為尼曼-皮克病。在一些實施例中，酶為β-葡糖腦苷脂酶(GBA)且LSd為高歇氏病。
在一些實施例中，藥劑(例如治療劑)包含抗體可變區。在一些實施例中，藥劑包含抗體片段。在一些實施例中，藥劑包含Fab或scFv。在一些實施例中，藥劑不包含抗體可變區。在一些情況下，藥劑不包含抗β分泌酶1(BACE1)Fab。
其他實施例及連接子
多肽(例如如本文進一步描述之經修飾之CH3或CH2結構域多肽)可
連接至Fc區之另一結構域。在一些實施例中，經修飾之CH3結構域多肽典型地在CH2結構域之C末端連接至CH2結構域，該CH2結構域可為天然存在之CH2結構域或變異體CH2結構域。在一些實施例中，經修飾之CH2結構域多肽典型地在CH3結構域之N端連接至CH3結構域，該CH3結構域可為天然存在之CH3結構域或CH3變異體結構域。在一些實施例中，包含連接至CH3結構域之經修飾之CH2結構域的多肽或包含連接至CH2結構域之經修飾之CH3結構域的多肽進一步包含抗體之部分或全部鉸鏈區，由此產生一種形式，在該形式中經修飾之CH3結構域多肽或經修飾之CH2結構域多肽為具有部分或全部鉸鏈區之Fc區的一部分。鉸鏈區可來自任何免疫球蛋白亞類或同型。說明性免疫球蛋白鉸鏈為IgG鉸鏈區，諸如IgG1鉸鏈區，例如人類IgG1鉸鏈胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：95)。
在一些實施例中，經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體融合至適用於蛋白質純化之肽或蛋白質，例如聚組胺酸、抗原決定基標籤(例如FLAG、c-Myc、血球凝集素標籤及類似物)、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G或麥芽糖結合蛋白(MBP)。在一些情況下，與經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體融合之肽或蛋白質可包含蛋白酶裂解位點，諸如因子Xa或凝血酶之裂解位點。
在本發明之方法中，藥劑(例如治療劑)鍵聯至多肽或蛋白質(例如經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體)。連接子可為適合於將藥劑連接至多肽或蛋白質之任何連接子。在一些實施例中，鍵聯為酶可裂解的。在某些實施例中，鍵聯可由存在於中樞神經系統中之酶裂解。
在一些實施例中，連接子為肽連接子。肽連接子可經組態使得其允許藥劑(例如治療劑)及多肽或蛋白質相對於彼此轉動；及/或對由蛋白酶消化具抗性。在一些實施例中，連接子可為可撓性連接子，其例如含有諸如以下之胺
基酸：Gly、Asn、Ser、Thr、Ala及類似胺基酸。此類連接子係使用已知參數設計。舉例而言，連接子可具有重複，諸如Gly-Ser重複。
在各個實施例中，藥劑(例如治療劑)鍵聯至多肽或蛋白質(例如經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體)可使用熟知化學交聯試劑及方案來達成。舉例而言，存在大量熟習此項技術者已知且適用於交聯多肽或蛋白質與相關藥劑之化學交聯劑。舉例而言，交聯劑為異雙官能交聯劑，其可用於逐步鍵聯分子。異雙官能交聯劑提供設計用於結合蛋白質之更具特異性之偶合方法的能力，由此減少不想要之副反應(諸如同源蛋白質聚合物)的出現。
藥劑(例如治療劑)可鍵聯至多肽或蛋白質(例如經工程改造之TfR結合性多肽、TfR結合性肽或TfR結合性抗體)之N端或C端區域，或附接至多肽或蛋白質之任何區域，只要藥劑不妨礙多肽或蛋白質結合於轉鐵蛋白受體即可。
XIV. 醫藥組合物及套組
在其他態樣中，提供包含本文所描述之融合蛋白的醫藥組合物及套組。
醫藥組合物
可在熟習此項技術者已知之大量醫藥製備及調配手冊中找到關於製備供在本發明中使用之調配物的指導。
在一些實施例中，醫藥組合物包含如本文所描述之融合蛋白且進一步包含一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑包括任何溶劑、分散介質或包衣，其為生理學上相容的且不妨礙或以其他方式抑制活性劑之活性。
在一些實施例中，載劑適合用於靜脈內、鞘內、經眼、腦室內、肌肉內、經口、腹膜內、經皮膚、表面或皮下投與。醫藥學上可接受之載劑可含
有一或多種生理學上可接受之化合物，其起到例如穩定組合物或增加或減少多肽吸收之作用。生理學上可接受之化合物可包括例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或麩胱甘肽；螯合劑、低分子量蛋白質、減少活性劑之清除或水解的組合物或賦形劑或其他穩定劑及/或緩衝劑。其他醫藥學上可接受之載劑及其調配物亦為在此項技術中可獲得的。
本文所描述之醫藥組合物可例如藉助於習知混合、溶解、造粒、糖衣丸製備、乳化、囊封、包埋或凍乾製程來製造。以下方法及賦形劑為示例性的。
對於經口投與，可藉由將本文所描述之融合蛋白與此項技術中熟知之醫藥學上可接受之載劑組合來調配如本文所描述之融合蛋白。此類載劑使融合蛋白能夠調配成錠劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、乳液、親脂性及親水性懸浮液、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及類似物供由所要治療之患者經口攝取。用於經口使用之醫藥製劑可如下獲得：將融合蛋白與固體賦形劑混合，視情況研磨所得混合物，且在添加適合之助劑(若需要)之後加工顆粒混合物以獲得錠劑或糖衣丸核心。適合之賦形劑包括例如填料，諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素製劑，諸如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基-纖維素、羧甲基纖維素鈉及/或聚乙烯吡咯啶酮。若需要，則可添加崩解劑，諸如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉。
如上文所揭示，如本文所描述之融合蛋白可經調配用於藉由注射(例如藉由快速注射或連續輸注)進行非經腸投與。為進行注射，可如下將融合蛋白調配成製劑，將其在水性或非水溶劑(諸如植物油或其他類似油、合成脂肪族酸甘油酯、高碳脂肪酸之酯或丙二醇)中溶解、懸浮或乳化；且若需要，則使用習知添加劑，諸如增溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑。在一些
實施例中，可將融合蛋白在水溶液中加以調配，該等水溶液為諸如生理學相容之緩衝液，其非限制性實例包括漢克斯氏溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)及生理鹽水緩衝液。用於注射之調配物可以單位劑型形式與所添加之防腐劑一起存在於例如安瓿或多劑量容器中。組合物可呈諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液的形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。
在一些實施例中，將如本文所描述之融合蛋白例如在含有活性劑之固體疏水性聚合物之半滲透基質中製備成用於以持續釋放、控制釋放、延長釋放、限時釋放或延遲釋放調配物形式進行遞送。已確定各種類型之持續釋放材料且為熟習此項技術者所熟知。延長釋放調配物包括薄膜包衣錠劑、多顆粒或球粒系統、使用親水性或親脂性材料之基質技術及使用成孔賦形劑之蠟基錠劑。通常，持續釋放調配物可使用天然存在或合成之聚合物來製備，例如聚合乙烯基吡咯啶酮，諸如聚乙烯吡咯啶酮；羧基乙烯基親水聚合物；疏水性及/或親水性水狀膠體，諸如甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素及羥丙基甲基纖維素；及羧基聚亞甲基(carboxypolymethylene)。
典型地，用於活體內投與之醫藥組合物為無菌的。滅菌可根據此項技術中已知之方法來實現，例如熱滅菌、蒸氣滅菌、無菌過濾或輻射。
本文所描述之醫藥組合物之劑量及所需藥物濃度可視所設想之特定用途而變化。適合之劑量亦描述於以上第XII部分中。
套組
在一些實施例中，提供一種用於治療LSD(例如亨特症候群、聖菲利柏症候群A、尼曼-皮克病、高歇氏病或帕金森氏病)之套組，其包含如本文所描述之融合蛋白。
在一些實施例中，套組進一步包含一或多種其他治療劑。舉例而言，
在一些實施例中，套組包含如本文所描述之融合蛋白且進一步包含用於治療LSD之神經症狀的一或多種其他治療劑。在一些實施例中，套組進一步包含說明材料，其含有關於實踐本文所描述之方法的指導(亦即，方案)(例如關於使用套組穿過血腦障壁投與包含ERT酶之融合蛋白的說明書)。雖然說明材料典型地包含書面或印刷材料，但其不限於書面或印刷材料。本發明涵蓋能夠儲存此類說明書且使其與最終用戶通信之任何介質。此類介質包括但不限於，電子存儲介質(例如磁盤、磁帶、盒式磁帶、晶片)、光學介質(例如CD-ROM)及類似介質。此類介質可包括提供此類說明材料之網際網路站點網址。
XV.實例
將通過特定實例更詳細地描述本發明。以下實例僅出於說明目的而提供，且不旨在以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將容易識別多個非關鍵參數，其可經改變或修改以得到基本上相同之結果。已努力確保關於所用數字(例如量、溫度等)之準確性，但可能存在一些實驗誤差及偏差。除非另外指出，否則本發明之實踐將在此項技術之技術範圍內採用蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。此類技術在文獻中有充分解釋。另外，對熟習此項技術者而言應顯而易見的是，如適用於某些文庫之用於工程改造之方法亦可適用於本文所描述之其他文庫。
設計及選殖
將IDS-Fc融合蛋白設計成含有(i)融合多肽，其中成熟人類IDS酶融合至包括Fc區之人類IgG1片段(「IDS-Fc融合多肽」)，及(ii)經修飾之人類IgG1片段，其在Fc區中含有賦予轉鐵蛋白受體(TfR)結合之突變(「經修飾之Fc多肽」)。特定而言，形成IDS-Fc融合多肽，其中IDS片段融合至人類IgG1 Fc區之N端或C端。在一些情況下，將連接子放置於IDS與IgG1片段之間以緩解兩
個片段之間的任何空間位阻。在所有構築體中，將來自κ鏈V-III之信號肽，胺基酸1-20(UniProtKB ID-P01661)插入融合物之上游以促進分泌，且將IDS截短至由胺基酸S26-P550(UniProtKB ID-P22304)組成。所用人類IgG1 Fc區之片段對應於UniProtKB ID P01857中之序列的胺基酸D104-K330(位置221-447，EU編號，其包括鉸鏈之10個胺基酸(位置221-230))。在一些實施例中，將衍生自人類IgG1殘基D104-K330但缺乏IDS融合之第二Fc多肽用IDS-Fc融合多肽共轉染以產生含有一個IDS酶之異二聚融合蛋白(「單酶」)。在一些構築體中，IgG1片段含有其他突變以促進兩個Fc區之異二聚化。類似地設計並構築缺乏賦予TfR結合之突變的對照IDS-Fc融合蛋白，差異在於此等蛋白質缺乏賦予TfR結合之突變。作為另一對照，吾人生成了含有C端六組胺酸標籤(SEQ ID NO：241)以促進偵測及純化之IDS(胺基酸S26-P550)。
實例中所用之TfR結合IDS-Fc融合蛋白為由IDS-Fc融合多肽及結合於TfR之經修飾之Fc多肽形成的二聚體。對於IDS酶鍵聯至Fc區N端之二聚體，IDS-Fc融合多肽可具有SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之序列。在此等序列中，IDS序列加下劃線且在位置59(加雙下劃線)所含之半胱胺酸經修飾為甲醯甘胺酸。IDS藉由GGGGS連接子(SEQ ID NO：239)連接至Fc多肽。在Fc多肽之N端包括IgG1鉸鏈區之一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。CH2結構域序列自SEQ ID NO：115、231及235之位置541起始。
實例中所用之IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21為由具有SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之序列的IDS-Fc融合多肽及結合於TfR且具有SEQ ID NO：116之序列的經修飾之Fc多肽形成的二聚體。頭10個胺基酸為IgG1鉸鏈區之一部分。CH2結構域序列自SEQ ID NO：116之位置11起始。
實例中所用之IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21.17.2為由具有SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之序列的IDS-Fc融合多肽及結合於TfR且具有
SEQ ID NO：228之序列的經修飾之Fc多肽形成的二聚體。頭10個胺基酸為IgG1鉸鏈區之一部分。CH2結構域序列自SEQ ID NO：228之位置11起始。
實例中所用之IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.23.2為由具有SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之序列的IDS-Fc融合多肽及結合於TfR且具有SEQ ID NO：229之序列的經修飾之Fc多肽形成的二聚體。頭10個胺基酸為IgG1鉸鏈區之一部分。CH2結構域序列自SEQ ID NO：229之位置11起始。
實例中所用之IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21.17為由具有SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之序列的IDS-Fc融合多肽及結合於TfR且具有SEQ ID NO：151之序列的經修飾之Fc多肽形成的二聚體。經修飾之Fc多肽之N端可包括IgG1鉸鏈區之一部分(例如SEQ ID NO：113)。
重組蛋白表現及純化
為表現融合至Fc區之重組IDS酶，使用ExpifectamineTM
CHO轉染套組根據製造商之說明書(Thermo Fisher Scientific)用相關DNA構築體對ExpiCHO細胞(Thermo Fisher Scientific)進行轉染。使細胞在迴轉式振盪器(Infors HT Multitron)中在37℃，6% CO2
及120rpm下在ExpiCHOTM
表現培養基中生長。簡單地說，在每毫升6x106
個細胞之密度下用每毫升培養體積0.8μg之DNA質粒對對數生長之ExpiCHOTM
細胞進行轉染。在轉染之後，使細胞回到37℃且在轉染後18-22h時為經轉染之培養物補充如所指示之饋料。在轉染後120h時藉由在3,500rpm下離心20min收穫經轉染之細胞培養物上清液。將澄清上清液過濾(0.22μM膜)並儲存在4℃下。在進行微小修改之情況下如上文所描述進行抗原決定基標記之IDS酶(用作對照)之表現。簡單地說，使具有C端六組胺酸標籤(SEQ ID NO：241)之IDS酶在ExpiCHO細胞中表現。
A親和層析自細胞培養物上清液純化具有(或不具有)賦予TfR結合之經工程改造之Fc區的IDS-Fc融合蛋白。將上清液加載至HiTrap MabSelect
SuRe蛋白質A親和管柱(GE Healthcare Life Sciences，使用Akta Pure系統)上。然後將管柱用>20管柱體積(CV)之PBS洗滌。將結合之蛋白質使用含有150mM NaCl之100mM檸檬酸鹽/NaOH緩衝液pH 3.0溶離。在溶離之後，即刻使用1M精胺酸-670mM丁二酸鹽緩衝液pH 5.0(1：5稀釋)將級分中和。藉由還原及非還原性SDS-PAGE評估溶離級分中IDS-Fc融合蛋白之均質性。
為純化六組胺酸標記(SEQ ID NO：241)之IDS酶，將經轉染之上清液用含有100mM NaCl之15L 20mM HEPES pH 7.4澈底滲析隔夜。使經滲析之上清液結合於HisTrap管柱(GE Healthcare Life Sciences，使用Akta Pure系統)。在結合之後，將管柱用20 CV之PBS洗滌。將結合之蛋白質使用含有500mM咪唑之PBS溶離。藉由還原及非還原性SDS-PAGE評估溶離級分中IDS酶之均質性。將含有IDS酶之彙集級分於50mM Tris pH 7.5中1：10稀釋並使用高效能Q瓊脂糖凝膠(GE Healthcare)進一步純化。在結合之後，將管柱用10 CV之50mM Tris pH 7.5洗滌。使用達至50mM Tris pH 7.5及0.5M NaCl之線性梯度將結合之蛋白質溶離並收集於1 CV級分中。藉由非還原性SDS-PAGE評估級分純度。如圖1中所示，純化產生均質IDS-Fc融合蛋白及六組胺酸標記(SEQ ID NO：241)之IDS酶。
具有經工程改造之TfR結合位點的IDS-Fc融合蛋白結合於人類TfR
為確定具有經工程改造之TfR結合的IDS-Fc融合蛋白是否影響經修飾之Fc結構域與人類TfR相互作用之能力，使用BiacoreTM
表面電漿子共振分析評估此蛋白質對人類TfR之親和力。將BiacoreTM
系列S CM5感測器晶片用抗人類Fab(來自GE Healthcare之人類Fab捕獲套組)固定。將5μg/mL之IDS-Fc融合蛋白捕獲於各液體池(flow cell)上持續1分鐘且以30μL/min之流速注射人類頂端結構域TfR之連續3倍稀釋液。在3分鐘締合及3分鐘解離之情況下分析各樣
品。在每次注射之後，使用10mM甘胺酸-HCl(pH 2.1)使晶片再生。藉由自捕獲以類似密度之不相關IgG的液體池扣除RU來校正結合反應。使用BiacoreTM
T200評估軟體v3.1藉由針對濃度對平衡狀態下之反應進行擬合來獲得穩態親和力。如圖2中所示，BiacoreTM
分析證實具有工程改造至Fc區之TfR結合位點的IDS-Fc融合蛋白結合於人類TfR。BiacoreTM
分析亦證實IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21以~200nM之親和力結合於人類TfR。
具有經工程改造之TfR結合位點的IDS-Fc融合蛋白在活體外、細胞中及活體內具活性
評估經工程改造之TfR結合性IDS-Fc融合蛋白的活體外及細胞活性以證實IDS在融合至人類IgG片段時維持其酶活性。使用人工受質使用兩步螢光酶分析量測活體外活性。特定而言，將20μL之1mM 4-甲基傘形酮基a-L-哌喃艾杜糖醛酸2-硫酸二鈉鹽受質(Carbosynth Limited，#EM03201)在分析緩衝液(100mM乙酸鈉，10mM乙酸鉛，0.05% Triton X-100，pH 5.0)中稀釋並與10μL之0.2nM IDS混合。將第一反應物在37℃下孵育4h並使用60μL之0.2M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液，pH 5.0終止反應。然後在存在來自用人類α-艾杜糖醛酸酶(IDUA)瞬時轉染之HEK 293T細胞的15μg細胞溶解產物之情況下進行第二反應，在37℃下孵育16h，並以添加100μL之0.5M碳酸鈉緩衝液，pH 10.5來停止反應。然後量測反應溶液之螢光(在365nm下激發且在450nm下發射)。藉由線性回歸對4-甲基傘形酮標準曲線進行擬合以計算產物之量且經驗證為不到10%之總受質裂解。藉由用產物之量除以反應時間及IDS之莫耳量來計算特定活性(每奈莫耳IDS每分鐘之產物奈莫耳數)。
活體外酶活性分析證實IDS-Fc融合蛋白為活性的且表明Fc區融合至IDS不妨礙酶活性(圖3)。
使用CRISPR/CAS9產生IDS
敲出(KO)細胞以提供用於測試經工程
改造之IDS-Fc融合蛋白之細胞活性的細胞系統。將HEK 293T細胞(ATCC)用含有靶向人類IDS中之外顯子1之後半部分的嚮導序列的CRISPR/CAS9 pCas-Guide-EF1a-GFP載體(Origene)轉染。在根據製造商說明書使用Guide-it突變偵測套組(Clontech)之後針對IDS之基因組序列內插入缺失之存在對單個細胞純系進行分析。為鑑定IDS
KO細胞，使用上文所描述之活體外IDS酶分析對插入缺失陽性純系細胞溶解產物進行分析。簡單來說，使用12.5、25、50及100μg細胞溶解產物如先前所描述在乙酸鉛分析緩衝液pH 5.0(100mM乙酸鈉，10mM乙酸鉛，0.02%疊氮化鈉)中進行活體外活性分析(Vozyni等人，J.Inherit.Metab.Dis
.,24：675-80(2001))。藉由將10μL經校正之細胞溶解產物(於水中)與1mM受質在20μL乙酸鉛緩衝液中組合來起始反應。將第一反應物在37℃下孵育4h並使用60μL之0.2M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液，pH 5.0終止反應。然後以添加來自用人類α-艾杜糖醛酸酶(IDUA)瞬時轉染之HEK 293T細胞的10μg/10μL細胞溶解產物進行第二反應並使其在37℃下進行24h，並以添加100μL之0.5M碳酸鈉緩衝液，pH 10.3來停止反應。然後量測反應溶液之螢光(在365nm下激發且在450nm下發射)。將在HEK 293T CRISPR純系中之IDS活性與用作分析標準物之重組IDS、HEK野生型(WT)溶解產物及過表現IDS之HEK細胞溶解產物相比較。在mini-Topo(ThermoFisher)選殖之後對酶活性水準類似於背景信號之純系進行序列驗證並確認為KO純系。後續細胞分析使用三個獨特的且經驗證之IDS
KO純系及三個獨立批次之WT HEK 293T細胞。
為測試裸IDS酶或IDS-Fc融合蛋白之細胞活性，開展基於LC-MS/MS之醣體學分析，從而允許監測受質累積(硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素)之量作為IDS活性之指示。在將IDS或IDS-Fc融合蛋白添加至細胞培養基之前及之後量測IDS
KO細胞中之受質累積。簡單來說，將細胞用PBS洗滌三次，使其集結成粒並冷凍。將細胞球粒在二醣消化緩衝液(111mM NH4
OAc，11mM
CaOAc，pH 7.0)中超音處理。使用BCA分析(Pierce)量測蛋白質濃度。將總蛋白(100μg)與2mM DTT、1.25 mIU肝素酶I(Galen)、1.25 mIU肝素酶II(Galen)、1.25 mIU肝素酶III(Galen)及6.25 mIU軟骨素酶B(Galen)一起添加至100μL消化緩衝液中。在30℃下三小時之後硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素消化完成，此後將20ng之內部標準物(4UA-2S-GlcNCOEt-6S HD009[Galen])添加至各樣品中。藉由添加6μL之250mM EDTA將酶去活化且將樣品在95℃下煮沸10分鐘。然後將樣品在室溫下在16,000 x G下離心5分鐘。將上清液轉移至Amicon Ultra 30KD離心過濾器(Millipore)中並在14,000 x G下離心15分鐘。將二醣濃縮在流出物(flow through)中並再懸浮於[1：1，v/v]分析緩衝液：乙腈之混合物中，然後將其轉移至質譜分析小瓶用於進一步分析。
藉由與電噴霧質譜法(Sciex 6500+ QTRAP,Sciex,Framingham,MA,USA)聯用之液相層析(Shimadzu Nexera X2系統，Shimadzu Scientific Instrument,Columbia,MD,USA)對由硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素之酶消化所產生之二醣進行分析。對於各分析，使用0.4mL/min之流速及50℃之管柱溫度，將10μL之樣品注射在ACQUITY UPLC BEH醯胺1.7μm，2.1×150mm管柱(Waters Corporation,Milford,Massachusetts,USA)上。移動相A由水加上10mM甲酸銨及0.1%甲酸組成。移動相B由乙腈加上0.1%甲酸組成。如下對梯度進行程式化：0.0-1.0min為85% B，1.0-5.0min自85% B至50% B，5.0-6.0min 50% B至85% B，在85% B下保持6-8.0min。應用以下設定以陰離子模式進行電噴霧電離：氣簾氣體(curtain gas)，30；碰撞氣體設定為中等；離子噴霧電壓，-4500；溫度，450；離子源氣體1，50；離子源氣體2，60。使用Analyst 1.6.3(Sciex)以多反應監測模式(MRM)進行資料採集，停留時間為25(毫秒)。碰撞能量，-30；去簇電位，-80；入口電位，-10；碰撞室出口電位，-10。使用以下MRM瞬態(transition)以[M--H]-之形式偵測GAG：m/z
378.1之D0A0>87.0；m/z
378.1之D0a0>175.0；m/z
416.1之D0S0>138.0；m/z
458.1之D0a4>300.0；m/z
458.1之D0A6、D2A0、D0a6、D2a0>97.0；m/z
496.0之D0S6、D2S0>416.1；m/z
538.0之D2a4、D2a6、D0a10、D2A6>458.0；m/z
575.95之D0S6>97.0；m/z
472.0(碎片離子)之4UA-2S-GlcNCOEt-6S>97.0用作內部標準物(I.S.)。基於滯留時間及與市售參考標準物(Iduron Ltd,Manchester,UK)匹配之MRM瞬態來鑑定GAG。使用MultiQuant 3.0.2(Sciex)藉由與I.S.之面積比進行定量。針對總蛋白量對GAG進行校正。使用BCA分析(Pierce)量測蛋白質濃度。
與對照細胞株相比，在IDS
KO細胞中觀察到如由在硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素消化之後所觀測到之二醣量反映之顯著受質累積，此影響可以向細胞中添加重組IDS來挽救(圖4)。此證實基於之LC-MS/MS分析可用於評估IDS及IDS-Fc融合蛋白之細胞活性。
使用此分析，證實了將細胞用包含相同TfR結合性Fc多肽(亦即，CH3C.35.21.17)之呈N端單酶(亦即，ETV：IDS 35.21.17)或C端單酶形式之IDS-Fc融合蛋白進行處理使硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素衍生之二醣的含量降回在野生型細胞中觀察到之水準(圖5A)。此外，N端單酶之活性類似於IDS(圖5B)。總之，此等資料證實IDS-Fc融合蛋白維持酶活性且可減少IDS
KO細胞中之受質累積。
亦如先前所描述使用35
S脈衝追蹤分析在來自MPS II患者及健康對照之纖維母細胞中檢驗IDS-Fc融合蛋白之細胞活性，其中35
S整合至新合成之GAG中(Lu等人，Bioconjugate Chemistry
,21：151-156(2010))。MPS II患者纖維母細胞缺乏可偵測之IDS活性，從而導致約10倍之受質累積及2.5倍之35
S信號累積(圖5C)。類似於IDS
KO細胞，諸如ETV：IDS 35.23.2之IDS-Fc融合蛋白在MPS II患者衍生之細胞中高度有效，關於減少S35
標記之蛋白質的累積展示低皮莫耳細胞EC50
(圖5C)。此外，證實諸如ETV：IDS 35.23.2之IDS-Fc融合蛋白之
細胞活性為M6PR依賴性的，因為過量之M6P抑制所處理之MPS II患者纖維母細胞中35
S標記之蛋白質的清除(圖5D)總起來說，此等資料證實在IDS-Fc融合蛋白模式中IDS之M6PR依賴性運輸及細胞活性可得以維持。
為量測活體內硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素衍生之二醣，將基於LC-MS/MS之醣體學分析加以調適用於組織及流體之分析。簡單來說，收集所有組織及流體，然後即刻冷凍並儲存在-80℃下。對樣品進行5個冷凍-解凍循環並如上文所描述進行加工用於細胞分析。與雄性野生型同窩對照相比，在所分析之來自雄性IDS
KO小鼠的所有組織及流體中觀察到硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素衍生之二醣的顯著累積(表1)。使用此分析來進行活體內融合蛋白之功效研究。IDS
KO小鼠係獲自Jackson Laboratories(JAX品系024744)。
使用此方法，評估來自給予媒劑之野生型(WT)小鼠及給予IDS或IDS-Fc融合蛋白(亦即，ETV：IDS 35.21)之IDS
KO小鼠的血清中的硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素衍生之二醣的含量。給藥之前的基線量測展現與WT小鼠相比在來自IDS
KO小鼠之血清中硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素衍生之二醣的顯著累積。在給予IDS-Fc融合蛋白之後，在IDS
KO血清中硫酸乙醯肝素及硫酸皮膚素衍生之二醣的含量顯著降低，顯示與在來自給予IDS之IDS
KO小鼠之血清中
所觀察類似的降低(圖6)。此等資料證實IDS-Fc融合蛋白在活體內為活性的且可減少IDS
KO小鼠中之受質累積。基於此等資料，在單個劑量之IDS-Fc融合蛋白之後七天時評估在IDS
KO小鼠之組織中的分佈及藥效動力學(PD)反應。為IDS
KO小鼠靜脈內投與40mg/kg之IDS-Fc融合蛋白或5.3mg/kg之IDS(25%莫耳當量劑量)作為陽性對照，且評估GAG含量。在給藥後兩小時時確認兩種分子在外周組織中之分佈。在給予IDS-Fc融合蛋白之後七天時在IDS
KO小鼠之肝臟、脾臟及肺臟中觀測到顯著受質減少(圖7)。
為確定TfR結合性IDS-Fc融合蛋白是否與對照IDS-Fc融合蛋白相比顯示改良之腦遞送，給予人類TfR敲入(TfR ms/hu
KI)小鼠50mg/kg之TfR結合性IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21或缺乏賦予TfR結合之突變的對照IDS-Fc融合蛋白(「IDS：Fc」)，且在給藥後4小時時使用以下實例3中所描述之基於夾心ELISA之分析量測腦中的IDS-Fc融合蛋白濃度。如國際專利公開案第WO 2018/152285號中所描述使用CRISPR/Cas9技術表現鼠Tfrc
基因內之人類Tfrc
頂端結構域來產生TfR ms/hu
KI小鼠；所得嵌合TfR在內源性啟動子之控制下在活體內表現。與對照IDS-Fc融合蛋白相比，在腦中偵測到顯著更高含量之IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21，ETV：IDS 35.21之平均腦濃度為23.7nM(圖8)。使用TfR ms/hu
KI小鼠評估兩種其他TfR結合性IDS-Fc融合蛋白ETV：IDS 35.21.17.2及ETV：IDS 35.23.2之腦攝入。給予TfR ms/hu
KI小鼠50mg/kg之ETV：IDS 35.21.17.2、ETV：IDS 35.23.2或對照IDS-Fc融合蛋白(「IDS：Fc」)，且在給藥後2小時及8小時時使用基於夾心ELISA之分析量測腦中的IDS-Fc融合蛋白濃度。在給藥後2小時時，相對於對照IDS-Fc融合蛋白，投與TfR結合性IDS-Fc融合蛋白使得腦攝入增加5倍，且在8小時時，使得腦濃度增加10-20倍(圖9A)。ETV：IDS 35.21與IDS：Fc兩者之血清PK及完整融合蛋白在肝臟中之累積為等效的(圖9B)，表明IDS部分主要決定血漿清除之分佈期。剩餘之TfR結合性IDS-Fc
融合蛋白之腦含量升高八小時，隨外周清除而稍微降低。總之，此等資料證實TfR結合性IDS-Fc融合蛋白與TfR之相互作用大體維持外周分佈，同時顯著改良腦暴露。
ETV：IDS之靜脈內投與使腦中之GAG減少
為檢驗在上文所描述且根據實例1製備之TfR結合性IDS-Fc融合蛋白(在本文中稱為ETV：IDS)的情況下所觀測到改良之腦暴露是否產生對應之腦中所累積受質的減少，產生具有敲入鼠TfR之人類TfR頂端結構域的IDS缺陷型小鼠模型(在本文中稱為IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠)。簡單來說，使TfR ms/hu
KI雄性小鼠與雌性IDS雜合子小鼠繁殖以在TfR ms/hu
KI純合子背景中產生IDS
KO小鼠。此研究中所用之所有小鼠均為雄性且收容在12小時明-暗週期下，隨意獲取食物(LabDiet JL照射6F)及水。
為IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠靜脈內投與單個或四個週活性等效劑量之ETV：IDS或IDS(每公斤每分鐘747μmol產物或分別40mg/kg及14.2mg/kg)，且評估藥物動力學及藥效動力學反應。特定而言，使用一次(n=8)或每週一次持續4週(n=8)靜脈內注射(i.v.)鹽水、IDS(每公斤體重14.2mg)或ETV：IDS(每公斤體重40mg)之2月齡IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠測定外周投與ETV：IDS對IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠中之腦及組織GAG的影響。將一次(n=5)或每週一次持續4週(n=5)靜脈內注射鹽水之2月齡同窩TfR ms/hu
KI小鼠用作對照。對於給予IDS或ETV：IDS之動物，在各個時間點藉由下頜下放血收集壽命內血清樣品。在單個劑量後7天時或最後之4週劑量之後7天時將所有動物處死。對尿液、血清、CSF、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟、心臟及右半腦進行解剖並在乾冰上快速冷凍。
在單個劑量之後，如使用以下實例3中所描述之用於偵測IDS濃度的基於ELISA之分析所評估，ETV：IDS展現與IDS類似之血清清除型態，從而提供對酶主要影響外周清除之額外支持(圖10A)。在給藥後兩小時時與IDS相比
ETV：IDS之腦含量顯著增加，平均濃度分別為8.4及1.6nM，且與IDS相比ETV：IDS之肝臟及脾臟含量顯著升高(圖10B)。
為確定ETV：IDS是否降低腦中之受質含量，如實例2中所描述評估在單個劑量或四個週劑量之酶之後在IDS
KO x TfR ms/hu
KI小鼠中的GAG含量。在早期時間點IDS輕微地降低腦GAG含量，但在處理四週之後對於顯著降低GAG為無效的(圖10C)。然而，ETV：IDS在單個劑量之後使腦GAG含量降低約58%且在處理四週之後降低71%(圖10C)。此導致在單個劑量之後CSF GAG伴隨地減少約75%，此在給藥四週之後得以維持(圖10C)。兩種分子在一週之後均有效降低肝臟及脾臟中之GAG含量，且在重複給藥之情況下反應得以維持(圖10C)，證實TfR結合不負面地影響此等組織中之藥效動力學反應。總之，此等資料證實ETV：IDS顯著增加酶之腦暴露且使外周與CNS中之受質累積大大減少。
此實例描述小鼠血漿中經工程改造之IDS-Fc融合蛋白的藥物動力學(PK)表徵。
為測定TfR結合性IDS-Fc融合蛋白之血漿半衰期及清除率，經由尾部靜脈注射給予7-8週齡雄性C57BL/6小鼠10mg/kg之兩種IDS-Fc融合蛋白分子(N端單酶及C端單酶)。使用基於ELISA之分析量測歷經24小時之時間保留在血漿中的IDS-Fc融合蛋白之濃度。簡單來說，使用夾心ELISA定量小鼠血漿中之IDS-Fc融合蛋白濃度。將抗Fc捕獲抗體(Abcam #ab124055)以3μg/mL塗佈至384孔MaxiSorpTM
板(Thermo Scientific #464718)上。將板用5% BSA阻斷，然後與1：1,000或1：10,000稀釋之血漿一起孵育。接著，以0.5μg/mL添加多株抗IDS偵測抗體(R&D Systems #AF2449)，隨後添加抗山羊HRP抗體。使用TMB受質使板顯色，用硫酸停止反應，且在BioTek讀板儀上量測在450nm下之吸光
度標準曲線為4倍稀釋系列中之200-0.1ng/mL之個別構築體且使用四參數羅吉斯回歸進行擬合
使用此分析，證實IDS-Fc融合蛋白之終末血漿半衰期為7.7-10h(表2)。在活體內在IDS-Fc融合蛋白情況下未觀察到未預期PK傾向。
設計及選殖
將ASM-Fc融合蛋白設計成成熟人類ASM酶融合至包括Fc區之人類IgG1片段之融合多肽(「ASM-Fc融合多肽」)的二聚體。在一些實施例中，ASM-Fc融合多肽包含含有賦予轉鐵蛋白受體(TfR)結合之突變的經修飾之Fc區。特定而言，形成ASM片段融合至人類IgG1 Fc區N端之ASM-Fc融合多肽。在一些情況下，將連接子放置於ASM與IgG1片段之間以緩解兩個片段之間的任何空間位阻。在所有構築體中，天然ASM信號序列胺基酸1-46(UniProtKB ID-P17405)被移除且經來自κ鏈V-III之分泌信號胺基酸1-20(UniProtKB ID-P01661)置換，以改良ASM之分泌。另外，在融合蛋白中，將ASM在其C端截短，於胺基酸Q620處結束，以防止ASM與人類IgG1 Fc區域之間任何不想要之裂解。然後將人類IgG1 Fc區之片段(UniProtKB ID-P01857)與ASM之C端自胺基酸E99起始放置於框內，在位置103之半胱胺酸突變為絲胺酸。在一些實施例中，IgG1片段含有用於促進兩個Fc區異二聚化之其他突變。另外，產生含有一個或兩個ASM分子之ASM-Fc融合蛋白。作為對照，將ASM-六組胺
酸(SEQ ID NO：241)融合蛋白設計成由經截短以移除C端半胱胺酸且促進酶活化之ASM胺基酸1-628及C端融合之六組胺酸標籤(SEQ ID NO：241)組成。
重組蛋白表現及純化
為表現融合至Fc區之重組ASM酶，將ExpiCHO-S細胞(Thermo Fisher)在每毫升6x106
個細胞之密度下用Expifectamine CHO/質粒DNA複合物根據製造商之說明書(Thermo Fisher Scientific)進行轉染。在轉染之後，將細胞在迴轉式振盪器(Infors HT Multitron)中在32℃加上6-8% CO2
之濕潤氛圍下孵育。在轉染後第一天，將Expifectamine增強子及Expifectamine饋料添加至培養物中。在48-72小時表現時間之後藉由離心收穫培養基上清液。為澄清之上清液補充不含EDTA之蛋白酶抑制劑(Roche)並儲存在-80℃下。
對於ASM-Fc融合蛋白純化，為澄清之培養基上清液補充200μM乙酸鋅(Sigma Aldrich)。將上清液加載於HiTrap MabSelect SuRe蛋白質A親和管柱(GE Healthcare Life Sciences)上並用200mM精胺酸及137mM丁二酸鹽緩衝液pH 5.0(精胺酸-丁二酸鹽緩衝液)洗滌。將融合蛋白在補充有200μM乙酸鋅之100mM QB檸檬酸鹽緩衝液pH 3.0中溶離。在溶離之後，即刻添加精胺酸-丁二酸鹽緩衝液以調節pH值。藉由在Superdex 200 increase 10/300 GL管柱(GE Healthcare Life Sciences)上之尺寸排阻層析(SEC)將蛋白質聚集物與ASM-Fc融合蛋白分離。使SEC移動相保持在補充有200μM乙酸鋅之精胺酸-丁二酸鹽pH 5.0緩衝液中。所有層析步驟使用Akta Pure系統或Akta Avant系統(GE Healthcare Life Sciences)進行。藉由非還原性SDS-PAGE評估級分純度。如圖11中所示，純化產生均質ASM-Fc融合蛋白。
ASM-Fc融合蛋白在活體外及細胞中為活性的
為證實ASM在融合至人類IgG重鏈時維持其酶活性，評估ASM-Fc
融合蛋白之活體外及細胞活性。使用神經鞘磷脂之合成生色類似物量測重組ASM酶或重組ASM-Fc融合蛋白之活體外活性。特定而言，將2.5mM 2-(N-十六醯基胺基)-4-硝基苯基磷酸膽鹼(EMD Millipore)與0.75nM ASM在100mM乙酸鈉緩衝液(pH 5.3；在100μL反應體積中之最終濃度)中混合。將反應物在37℃下孵育16h且以添加相等體積之0.2M NaOH來停止反應。然後在410nm下量測反應溶液之吸光度。藉由線性回歸對對硝基酚標準曲線進行擬合以計算產物之量且經驗證為不到10%之總受質裂解。藉由用產物之量除以反應時間及ASM之莫耳量來計算特定活性(每奈莫耳ASM每分鐘之產物奈莫耳數)。活體外酶活性分析證實ASM-Fc融合蛋白為活性的且表明Fc區融合至ASM不妨礙其酶活性(圖12)。
使用CRISPR/CAS9產生ASM
KO細胞以提供用於測試ASM-Fc融合蛋白之細胞活性的細胞系統。將HEK 293T細胞(ATCC)用含有靶向人類SMPD1中之外顯子2之後半部分的嚮導序列的CRISPR/CAS9 pCas-Guide-EF1a-GFP載體(Origene)轉染。在根據製造商之說明書使用Guide-it突變偵測套組(Clontech)之後針對ASM之基因組序列內插入缺失之存在對單個細胞純系進行分析。使用ASM生色受質2-N-十六醯基胺基-4-硝基苯基磷酸膽鹼(EMD Millipore)對插入缺失陽性純系細胞溶解產物進行活體外ASM酶分析。簡單來說，使用12.5、25、50及100μg細胞溶解產物在100mM乙酸鈉緩衝液(pH 5.3)中進行活體外活性分析。藉由添加2.5mM受質來起始反應且在20小時之後以添加0.2M NaOH來停止反應。將在HEK293T CRISPR純系中之ASM活性與用作分析標準物之重組ASM、HEK野生型(WT)溶解產物及過表現ASM之HEK細胞溶解產物相比較。在mini-Topo(Thermo Fisher Scientific)選殖之後對酶活性水準類似於背景信號之純系進行序列驗證並確認為KO純系。後續細胞分析使用三個獨特的且經驗證之ASM
KO純系及三個獨立批次之WT HEK293T細胞。
為測試裸ASM酶或ASM-Fc融合蛋白之細胞活性，使兩種細胞分析物顯色，從而允許監測在ASM
KO細胞中之在基線處及在用ASM或ASM-Fc融合物處理之後的受質累積(神經鞘磷脂)量。首先，開展基於成像之分析以監測ASM
KO細胞中BODIPY結合之C5-神經鞘磷脂累積的量。簡單來說，將HEK293T WT及ASM
KO細胞在補充有10% FBS之DMEM(Gibco)中以低密度塗鋪至PDL塗佈之96孔板(Perkin Elmer)上。在塗鋪後四小時時，將重組ASM酶、ASM-Fc融合蛋白或對照緩衝液添加至各孔中且在37℃下孵育48小時。移除培養基，替換為含有1μM BODIPY-C5-神經鞘磷脂(Thermo Fisher Scientific)之新鮮培養基，且在37℃下孵育16小時。然後將細胞用PBS洗滌，用4%多聚甲醛固定，且用核(DAPI,Thermo Fisher)及胞質(遠紅外cell mask，Thermo Fisher Scientific)染色進行染色。在使用63X物鏡之Opera Phenix共焦顯微鏡(Perkin Elmer)上獲得圖像，每個孔多個視野且每種條件三個重複的孔。使用Harmony軟體(Perkin Elmer)進行圖像分析，其偵測並分析每個細胞之BODIPY-C5-神經鞘磷脂的平均總強度、斑點數目及斑點強度。然後將此等每個細胞之值平均為每個孔之值，其用於分析基因型及/或處理對BODIPY-C5-神經鞘磷脂之累積的影響。與對照細胞株相比在ASM
KO細胞中觀察到顯著BODIPY-C5-神經鞘磷脂累積，此影響可以添加重組ASM酶及ASM-Fc融合蛋白來挽救(圖13)。
為進一步證實ASM-Fc融合蛋白在細胞中維持其活性，開展基於LC-MS/MS之分析以監測ASM
KO細胞中之內源性神經鞘磷脂累積。培養HEK293T WT及ASM
KO細胞並用如上文所描述之酶處理。在塗鋪後68小時時，在存在或不存在ASM或ASM-Fc融合蛋白處理之情況下，將細胞用PBS充分洗滌，且用摻加有適當內部標準物之水：甲醇[1：1，v/v]混合物萃取脂質。使用甲基-第三丁基醚(MTBE)萃取脂質，渦旋，並在10,000×g及4℃下離心10min。然後將含有脂質之上部MTBE級分在柔和的氮氣流下蒸發至乾燥。將脂質再懸
浮於異丙醇：乙腈：水[2：1：1，v/v/v]之混合物中，然後轉移至質譜分析小瓶中用於進一步分析。
藉由與電噴霧質譜法(Sciex 6500+ QTRAP,Sciex,Framingham,MA,USA)聯用之液相層析(Shimadzu Nexera X2系統，Shimadzu Scientific Instrument,Columbia,MD,USA)進行脂質分析。對於各分析，在55℃下使用0.25mL/min之流速將5μL之樣品注射於BEH C18 1.7μm，2.1×100mm管柱(Waters Corporation,Milford,Massachusetts,USA)上。移動相A由60：40乙腈/水(v/v)加上10mM甲酸銨+0.1%甲酸組成。移動相B由90：10異丙醇/乙腈(v/v)加上10mM甲酸銨+0.1%甲酸組成。如下對梯度進行程式化：0.0-8.0min自45% B至99% B，8.0-10.0min為99% B，10.0-10.1min達至45% B，且10.1-12.0min為45% B。應用以下設定以陽離子模式進行電噴霧電離：氣簾氣體，20；碰撞氣體設定為中等；離子噴霧電壓，5200；溫度，250；離子源氣體1，50；離子源氣體2，60。使用Analyst 1.6(Sciex)以多反應監測模式(MRM)進行資料採集。碰撞能量，40；去簇電位，80；入口電位，10；碰撞室出口電位，12.5。使用以下MRM瞬態以[M-H2O+H]+
之形式偵測神經醯胺(Cer)：m/z 538.5之Cer d18：1/16：0>264.3；m/z 566.6之Cer d18：1/18：0>264.3；m/z 594.6之Cer d18：1/20：0>264.3；m/z 622.6之Cer d18：1/22：0>264.3；m/z 650.6之Cer d18：1/24：0>264.3；m/z 648.6之Cer d18：1/24：1>264.3；m/z
552.4之Cer d18：1/17：0>264.3用作內部標準物。使用以下MRM瞬態以[M+H]+
之形式偵測神經鞘磷脂(SM)：m/z 703.7之SM d18：1/16：0>184.1；m/z 731.7之SM d18：1/18：0>184.1；m/z 759.7之SM d18：1/20：0>184.1；m/z 787.7之SM d18：1/22：0>184.1；m/z 815.7之SM d18：1/24：0>184.1；m/z 813.7之SM d18：1/24：1>184.1；m/z 738.7之SM d18：1/18：1(d9)>184.1用作內部標準物。基於滯留時間及市售參考標準物(Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL,USA)之MRM特性來鑑定脂質。使用MultiQuant 3.02(Sciex)
進行定量。針對總蛋白量對脂質進行校正。使用BCA分析(Pierce)量測蛋白質濃度。LC-MS/MS分析證實ASM-Fc融合蛋白可使ASM
KO細胞中之內源性神經鞘磷脂的含量降回在野生型細胞中所觀察到之水準(圖14)。另外，在兩個分析中在減少神經鞘磷脂方面ASM-Fc融合蛋白與裸ASM酶一樣有效(表3)。
總之，此等資料證實ASM-Fc融合蛋白保留其活性且可挽救ASM缺陷型細胞中之受質累積。
設計及選殖
將SGSH-Fc融合蛋白設計成含有(i)融合多肽，其中成熟人類SGSH酶融合至包括Fc區之人類IgG1片段(「SGSH-Fc融合多肽」)，及(ii)經修飾之人類IgG1片段，其在Fc區中含有賦予轉鐵蛋白受體(TfR)結合之突變(「經修飾之Fc多肽」)。特定而言，形成SGSH-Fc融合多肽，其中SGSH片段融合至人類IgG1 Fc區之N端或C端。在一些情況下，將連接子放置於SGSH與IgG1片段之間以緩解兩個片段之間的任何空間位阻。在所有構築體中，將來自κ鏈V-III之信號肽，胺基酸1-20(UniProtKB ID-P01661)插入融合物之上游以促進分泌，且將SGSH截短至由胺基酸R21-L502(UniProtKB ID-P51688)組成。所用人類IgG1 Fc區之片段對應於UniProtKB ID P01857中之序列的胺基酸D104-K330(位置221-447，EU編號，其包括鉸鏈之10個胺基酸(位置221-230))。在一些實施例中，將衍生自人類IgG1殘基D104-K330且在Fc區中含有賦予TfR結合之突變但缺乏SGSH融合之第二Fc多肽與SGSH-Fc融合多肽共轉染，以產生具有一
個SGSH酶之異二聚融合蛋白(「單酶」)。在其他實施例中，將衍生自人類IgG1殘基D104-K330且在Fc區中含有賦予TfR結合之突變且融合至SGSH之第二Fc多肽與SGSH-Fc融合多肽共轉染，以產生具有兩個SGSH酶之異二聚融合蛋白(「雙酶」)。在一些構築體中，IgG1片段含有其他突變以促進兩個Fc區之異二聚化。類似地設計並構築缺乏賦予TfR結合之突變的對照SGSH-Fc融合蛋白。作為另一對照，產生具有C端六組胺酸標籤(SEQ ID NO：241)以促進偵測及純化之SGSH(胺基酸R21-L502)。
實例中所用之包含TfR結合之SGSH-Fc融合蛋白為由SGSH-Fc融合多肽及結合於TfR之經修飾之Fc多肽形成的二聚體，其中經修飾之Fc多肽缺乏SGSH融合(「單酶」)或融合至第二SGSH分子(「雙酶」)。
包含融合至具有臼及LALA突變之IgG1 Fc多肽序列N端之成熟人類SGSH序列的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO：149之序列。SGSH酶藉由GGGGS連接子(SEQ ID NO：239)連接至Fc多肽且Fc多肽之N端包括IgG1鉸鏈區之一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO：113)。
包含融合至具有臼及LALA突變之IgG1 Fc多肽序列C端之成熟人類SGSH序列的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO：150之序列。SGSH酶藉由GGGGS連接子(SEQ ID NO：239)連接至Fc多肽且Fc多肽之N端可包括IgG1鉸鏈區之一部分(例如SEQ ID NO：113)。
包含具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.21.17(SEQ ID NO：58)之序列的結合於TfR之經修飾之Fc多肽具有SEQ ID NO：151之序列。經修飾之Fc多肽之N端可包括IgG1鉸鏈區之一部分(例如SEQ ID NO：113)。
在SEQ ID NO：149與151之間形成在Fc多肽之N端含有單個SGSH分子之「N端單酶」。在SEQ ID NO：150與151之間形成在Fc多肽之C端含有單個SGSH分子之「C端單酶」。
包含融合至具有杵及LALA突變之純系CH3C.35.21.17(SEQ ID NO：58)之序列N端之成熟人類SGSH序列的結合於TfR之經修飾之Fc多肽具有SEQ ID NO：154之序列。SGSH酶藉由GGGGS連接子(SEQ ID NO：239)連接至經修飾之Fc多肽且經修飾之Fc多肽之N端可包括IgG1鉸鏈區之一部分(例如SEQ ID NO：113)。
在SEQ ID NO：149與154之間形成含有在Fc多肽N端之第一SGSH分子及在經修飾之Fc多肽N端之第二SGSH分子的「N端雙酶」。
重組蛋白表現及純化
為表現融合至Fc區之重組SGSH酶，使用ExpifectamineTM
CHO轉染套組根據製造商之說明書(Thermo Fisher Scientific)用相關DNA構築體對ExpiCHO細胞(Thermo Fisher Scientific)進行轉染。使細胞在迴轉式振盪器(Infors HT Multitron)中在37℃，6% CO2
及120rpm下在ExpiCHOTM
表現培養基中生長。簡單地說，用每毫升培養體積0.8μg之DNA質粒在每毫升6x106
個細胞之密度下對對數生長之ExpiCHOTM
細胞進行轉染。在轉染之後，使細胞回到37℃且在轉染後18-22h時為經轉染之培養物補充如所指示之饋料。在轉染後120h時藉由在3,500rpm下離心20min收穫經轉染之細胞培養物上清液。將澄清上清液過濾(0.22μM膜)並儲存在4℃下。在進行微小修改之情況下如上文所描述進行抗原決定基標記之SGSH酶(用作對照)之表現。簡單地說，使具有C端六組胺酸標籤(SEQ ID NO：241)之SGSH酶在ExpiCHO細胞中表現。
A親和層析將具有(或不具有)賦予TfR結合之經工程改造之Fc區的SGSH-Fc融合蛋白自細胞培養物上清液純化。將上清液加載至HiTrap MabSelect SuRe蛋白質A親和管柱(GE Healthcare Life Sciences，使用Akta Pure系統)上。然後將管柱用>20管柱體積(CV)之PBS洗滌。將結合之蛋白質使用含有150mM NaCl之100mM檸檬酸鹽/NaOH緩衝液pH 3.0溶離。在溶離之後，即刻使用1M
精胺酸-670mM丁二酸鹽緩衝液pH 5.0(1：5稀釋)將級分中和。藉由還原及非還原性SDS-PAGE評估溶離級分中SGSH-Fc融合蛋白之均質性。
為純化六組胺酸標記(SEQ ID NO：241)之SGSH，將經轉染之上清液用含有100mM NaCl之15L 20mM HEPES pH 7.4澈底滲析隔夜，且在純化之前將20mM咪唑添加至經滲析之上清液中。使經滲析之上清液結合於HisTrap管柱(GE Healthcare Life Sciences，使用Akta Pure系統)。在結合之後，將管柱用20 CV之PBS洗滌。將結合之蛋白質使用含有500mM咪唑之PBS溶離。藉由還原及非還原性SDS-PAGE評估溶離級分中SGSH酶之均質性。可將含有SGSH之彙集級分於50mM Tris pH 7.5中1：10稀釋並使用高效能Q瓊脂糖凝膠(GE Healthcare)進一步純化。在結合之後，將管柱用10 CV之50mM Tris pH 7.5洗滌。使用達至50mM Tris pH 7.5及0.5M NaCl之線性梯度將結合之蛋白質溶離並收集於1 CV級分中。藉由非還原性SDS-PAGE評估級分純度。純化產生均質SGSH-Fc融合蛋白及六組胺酸標記(SEQ ID NO：241)之SGSH。
具有經工程改造之TfR結合位點的SGSH-Fc融合蛋白結合於人類TfR
為確定具有經工程改造之TfR結合的SGSH-Fc融合蛋白是否影響經修飾之Fc結構域與人類TfR相互作用之能力，可使用BiacoreTM
表面電漿子共振分析評估此蛋白質對人類TfR之親和力。將BiacoreTM
系列S CM5感測器晶片用抗人類Fab(來自GE Healthcare之人類Fab捕獲套組)固定。將5μg/mL之IDS-Fc融合蛋白捕獲於各液體池上持續1分鐘且以30μL/min之流速注射人類頂端結構域TfR之連續3倍稀釋液。在3分鐘締合及3分鐘解離之情況下分析各樣品。在每次注射之後，使用10mM甘胺酸-HCl(pH 2.1)使晶片再生。藉由自捕獲類似密度之不相關IgG之液體池扣除RU來校正結合反應。藉由使用BiacoreTM
T200評估軟體v3.1針對濃度對平衡狀態下之反應進行擬合來獲得穩態親和力。
BiacoreTM
分析證實具有工程改造至Fc區中之TfR結合位點的SGSH-Fc融合蛋白結合於人類TfR。
具有經工程改造之TfR結合位點的SGSH-Fc融合蛋白在活體外及細胞中為活性的
評估經工程改造之TfR結合性SGSH-Fc融合蛋白的活體外及細胞活性以證實SGSH在融合至人類IgG片段時維持其酶活性。使用人工受質使用兩步螢光酶分析來量測重組SGSH之活體外活性。特定而言，將於分析緩衝液(0.03M乙酸鈉，0.12M NaCl，pH 6.5)中稀釋之20μL 1mM 4-甲基傘形酮基2-去氧-2-磺胺基-a-D-哌喃葡糖苷鈉鹽受質(Carbosynth Limited，#EM06602)與10μL之40nM SGSH混合。將第一反應物在37℃下孵育17h，然後用10μL之0.2M磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液，pH 6.7終止反應。接著，藉由添加10μL(0.5U)之酵母α-葡糖苷酶(Sigma，#G0660-750UN)起始第二反應，在37℃下孵育24h，且以添加100μL之0.5M碳酸鈉緩衝液，pH 10.3停止反應。然後量測反應溶液之螢光(在365nm下激發且在450nm下發射)。藉由線性回歸對4-甲基傘形酮標準曲線進行擬合以計算產物之量且經驗證為不到10%之總受質裂解。藉由用產物之量除以反應時間及SGSH莫耳量來計算特定活性(每皮莫耳SGSH每分鐘之產物法莫耳數)。
活體外酶活性分析證實SGSH-Fc融合蛋白為活性的且表明Fc區融合至SGSH不妨礙酶活性(圖15)。
使用CRISPR/CAS9產生SGSH敲出(KO)細胞以提供用於測試經工程改造之SGSH-Fc多肽之細胞活性的細胞系統。用含有靶向人類SGSH中產生甲醯甘胺酸之反應性半胱胺酸位點上游之外顯子2的嚮導序列的CRISPR/CAS9 pCas-Guide-EF1a-GFP載體(Origene)轉染HEK 293T細胞(ATCC)。為鑑定SGSH
KO細胞，使單個細胞純系生長且對細胞溶解產物進行上文所描述之活體外
SGSH酶分析。簡單來說，使用12.5、25、50及100μg細胞溶解產物在乙酸鉛分析緩衝液pH 5.0(100mM乙酸鈉，10mM乙酸鉛)中進行活體外活性分析。藉由將20μL經校正之細胞溶解產物(於水中)與1mM受質在10μL乙酸鉛緩衝液(3X)中組合來起始反應且在37℃下孵育十七小時。藉由添加70μL 4x檸檬酸鹽磷酸鹽緩衝液pH 6.7加上0.5 UNAGLU(Sigma)來停止此第一反應。反應在37℃下進行24小時且然後藉由添加100μL 0.5M碳酸鈉pH 10.3來停止反應。將HEK293T CRISPR純系中之SGSH活性與用作分析標準物之重組SGSH(R&D)、HEK野生型(WT)溶解產物及過表現SGSH之HEK細胞溶解產物相比較。在mini-Topo(ThermoFisher)選殖之後對酶活性水準類似於背景信號之純系進行序列驗證並確認為KO純系。後續細胞分析使用三個獨特的且經驗證之SGSH
KO純系及三個獨立批次之WT HEK293T細胞。
為測試裸SGSH酶或SGSH-Fc融合蛋白之細胞活性，開展基於LC-MS/MS之醣體學分析，從而允許監測受質累積(硫酸乙醯肝素)之量作為SGSH活性之指示。量測SGSH
KO細胞及WT HEK293T細胞中之受質累積。將SGSH
KO細胞及WT HEK293T細胞培養24小時，且將細胞用PBS洗滌三次，使其集結成粒並冷凍。將細胞球粒在二醣消化緩衝液(111mM NH4
Oac，11mM CaOAc，pH 7.0)中超音處理。使用BCA分析(Pierce)量測蛋白質濃度。將總蛋白(100μg)與2mM DTT、1.25 mIU肝素酶I(Galen)、1.25 mIU肝素酶II(Galen)及1.25 mIU肝素酶III(Galen)一起添加至100μL消化緩衝液中。在30℃下三小時之後硫酸乙醯肝素消化完成，此後將20ng之內部標準物(4UA-2S-GlcNCOEt-6S HD009[Galen])添加至各樣品中。藉由添加6μL之250mM EDTA將酶去活化且將樣品在95℃下煮沸10分鐘。然後將樣品在室溫下在16,000 x G下離心5分鐘。將上清液轉移至Amicon Ultra 30KD離心過濾器(Millipore)中並在14,000 x G下離心15分鐘。將二醣濃縮在流出物中並再懸浮於[1：1，v/v]分析緩衝液：乙腈之
混合物中，然後將其轉移至質譜分析小瓶用於進一步分析。
藉由與電噴霧質譜法(Sciex 6500+ QTRAP,Sciex,Framingham,MA,USA)聯用之液相層析(Shimadzu Nexera X2系統，Shimadzu Scientific Instrument,Columbia,MD,USA)進行GAG分析。對於各分析，使用0.4mL/min之流速及50℃之管柱溫度，將10μL之樣品注射在ACQUITY UPLC BEH醯胺1.7μm，2.1×150mm管柱(Waters Corporation,Milford,Massachusetts,USA)上。移動相A由水加上10mM甲酸銨及0.1%甲酸組成。移動相B由乙腈加上0.1%甲酸組成。如下對梯度進行程式化：0.0-1.0min為85% B，1.0-5.0min自85% B至50% B，5.0-6.0min 50% B至85% B，在85% B下保持6-8.0min。應用以下設定以陰離子模式進行電噴霧電離：氣簾氣體，30；碰撞氣體設定為中等；離子噴霧電壓，-4500；溫度，450；離子源氣體1，50；離子源氣體2，60。使用Analyst 1.6.3(Sciex)以多反應監測模式(MRM)進行資料採集，停留時間為25(毫秒)。碰撞能量，-30；去簇電位，-80；入口電位，-10；碰撞室出口電位，-10。使用以下MRM瞬態以[M--H]-之形式偵測GAG：m/z 378.1之D0A0>87.0；m/z 378.1之D0a0>175.0；m/z 416.1之D0S0>138.0；m/z 458.1之D0a4>300.0；m/z 458.1之D0A6、D2A0、D0a6、D2a0>97.0；m/z 496.0之D0S6、D2S0>416.1；m/z 538.0之D2a4、D2a6、D0a10、D2A6>458.0；m/z 575.95之D0S6>97.0；m/z 472.0(碎片離子)之4UA-2S-GlcNCOEt-6S>97.0用作內部標準物(I.S.)。基於滯留時間及與市售參考標準物(Iduron Ltd,Manchester,UK)匹配之MRM瞬態來鑑定GAG。使用MultiQuant 3.0.2(Sciex)藉由與I.S.之面積比進行定量。針對總蛋白量對GAG進行校正。使用BCA分析(Pierce)量測蛋白質濃度。
與對照細胞株相比，在SGSH
KO細胞中觀察到如由在硫酸乙醯肝素消化之後所觀測到之二醣量反映的顯著受質累積(圖16)。使用基於LC-MS/MS之醣體學分析，證實用TfR結合性SGSH-Fc融合蛋白處理細胞使硫酸乙醯肝素
衍生之二醣的含量降回在野生型細胞中所觀察到之水準(圖17)。總之，此等資料證實SGSH-Fc融合蛋白維持酶活性且可減少SGSH
KO細胞中之受質累積。
此實例提供SGSH-Fc融合蛋白之替代活體外活性分析。該分析係由Karpova等人，J.Inherit.Metab.Dis
.,19：278-285(1996)改編而來。
標準反應混合物由於米氏巴比妥鈉乙酸鹽緩衝液(Michaelis' barbital sodium acetate buffer)，pH 6.5(29mmol/L巴比妥鈉，29mmol/L乙酸鈉，0.68%(w/v)NaCl，0.02%(w/v)疊氮化鈉；用HCl調節至pH 6.5)中之10-15μg蛋白質及20μL MU-α-GlcNS(分別5或10mmol/L)組成且將反應混合物在37℃下孵育17h。MU-α-GlcNS可購自Moscerdam Substrates。在第一次孵育之後，添加含有0.02%疊氮化鈉之6μl經兩次濃縮之麥基而文氏磷酸鹽/檸檬酸鹽緩衝液(McIlvain's phosphate/citrate buffer)，pH 6.7及於水中之10μl(0.1U)酵母a-葡糖苷酶(Sigma)且在37℃下進行24h之第二次孵育。在用寬膠帶氣密密封從而將蒸發限制為<15%之96孔板中在37℃下進行長時間孵育(17-24h)。接著，添加200μL 0.5mol/L Na2
CO3
/NaHCO3
，pH 10.7，且在Fluoroskan(Titertek)螢光計上量測所釋放之4-甲基傘形酮(MU)的螢光。如先前所描述測定蛋白質(van Diggelen等人，Clin.Chim.Acta
.,187：131-139(1990))。
此實例描述為賦予轉鐵蛋白受體(TfR)結合且運送穿過血腦障壁(BBB)而對Fc多肽之修飾。
除非另外指出，否則本部分中胺基酸殘基之位置係基於對人類IgG1野生型Fc區之EU索引編號來編號。
在位置384、386、387、388、389、390、413、416及421包含修飾之Fc多肽(CH3C純系)的產生及表徵
如下文所描述產生含有Fc區之酵母文庫，該等Fc區具有引入包括胺基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416及421之位置中的修飾。結合於TfR之說明性純系顯示於表4及5中。
在再兩輪分選之後，對單個純系進行測序且鑑定出四個獨特序列。此等序列具有在位置388之保守Trp，且全部具有在位置421之芳族殘基(亦即，Trp、Tyr或His)。在其他位置存在極大之多樣性。
使選自該文庫之四個純系以在CHO或293細胞中表現為與Fab片段之Fc融合物，且藉由蛋白質A及尺寸排阻層析純化，然後在存在或不存在holo-Tf之情況下藉由ELISA針對與人類TfR結合進行篩檢。該等純系全部結合於人類TfR且結合不因添加過量(5μM)holo-Tf而受影響。亦針對與內源性表現人類TfR之293F細胞之結合對純系進行測試。純系結合於293F細胞，不過總體結合實質上弱於高親和力陽性對照。
接著，使用純系CH3C.3作為測試純系測試純系是否可內化於TfR表現細胞中。使附著之HEK 293細胞在96孔板中生長至約80%匯合，移除培養基，且以1μM之濃度添加樣品：純系CH3C.3、抗TfR基準陽性對照抗體(Ab204)、抗BACE1基準陰性對照抗體(Ab107)及人類IgG同型對照(獲自Jackson Immunoresearch)。將細胞在37℃及8% CO2
濃度下孵育30分鐘，然後洗滌，用0.1% TritonTM
X-100透性化，並用抗人類-IgG-Alexa Fluor®
488第二抗體染色。在再洗滌之後，使細胞在高通量螢光顯微鏡(亦即，Opera PhenixTM
系統)下成像，且定量每一細胞之斑點數目。在1μM下，純系CH3C.3顯示與陽性抗TfR對照類似之內化傾向，而陰性對照未顯示內化。
純系之進一步工程改造
使用軟隨機化法(soft randomization approach)產生其他文庫以改良初始命中物(hit)對人類TfR之親和力，其中基於原始四個命中物中之每一者產生
DNA寡核苷酸以引入軟誘變(soft mutagenesis)。鑑定結合TfR之其他純系並加以選擇。所選純系屬於兩個一般序列組。組1純系(亦即，純系CH3C.18、CH3C.21、CH3C.25及CH3C.34)具有在位置384之半保守Leu、在位置386之Leu或His、分別在位置387及389之保守及半保守Val及分別在位置413、416及421之半保守P-T-W基元。組2純系具有在位置384之保守Tyr、在位置386-390之基元TXWSX及分別在位置413、416及421之保守基元S/T-E-F。將純系CH3C.18及CH3C.35用於其他研究作為各序列組之代表性成員。
抗原決定基定位
為確定經工程改造之Fc區是否結合於TfR之頂端結構域，使TfR頂端結構域在噬菌體之表面表現。為適當摺疊且展示頂端結構域，必須將環中之一者截短且需要將序列環形排列。將純系CH3C.18及CH3C.35塗佈於ELISA板上且進行噬菌體ELISA方案。簡單來說，在洗滌並用1% PBSA阻斷之後，添加噬菌體展示物之稀釋液並在室溫下孵育1小時。隨後將板洗滌且添加抗M13-HRP，且在再洗滌之後用TMB受質使板顯色並用2N H2
SO4
中止反應。在此分析中純系CH3C.18與CH3C.35兩者均結合於頂端結構域。
互補位定位
為理解Fc結構域中哪些殘基對TfR結合而言最重要，形成一系列突變體純系CH3C.18及純系CH3C.35 Fc區，其中各突變體在TfR結合登記者中有單個位置突變回野生型。使所得變異體重組表現為Fc-Fab融合物且針對與人類或犬TfR結合進行測試。對於純系CH3C.35，位置388及421對結合而言為重要的；此等位置中之任一者恢復為野生型均完全消除與人類TfR的結合。
成熟純系之結合表徵
如上文所描述，在存在塗佈於板上之人類或犬TfR之情況下用經純化之Fc-Fab融合變異體進行結合ELISA。來自純系CH3C.18成熟文庫之變異體
純系CH3C.3.2-1、純系CH3C.3.2-5及純系CH3C.3.2-19以大致相等之EC50
值結合人類及犬TfR，而親本純系CH3C.18及CH3C.35相較於犬TfR與人類TfR具有大於10倍之更佳結合。
接著，測試經修飾之Fc多肽是否內化於人類及猴細胞中。使用上文所描述之方案，測試在人類HEK 293細胞及恆河猴LLC-MK2細胞中之內化。與純系CH3C.35相比，類似地結合人類及犬TfR之變異體純系CH3C.3.2-5及CH3C.3.2-19在LLC-MK2細胞中具有顯著改良之內化。
純系之其他工程改造
對其他親和力成熟純系CH3C.18及CH3C.35之其他工程改造涉及向通過直接相互作用、第二殼相互作用(second-shell interaction)或結構穩定化增強結合之位置添加其他突變。此係經由產生「NNK行走(NNK walk)」或「NNK補丁(NNK patch)」文庫及由其選擇來達成。NNK行走文庫涉及形成靠近互補位之殘基的逐個NNK突變。藉由查看Fc結合於FcγRI之結構(PDB ID：4W4O)，將靠近原始修飾位置之44個殘基鑑定為詢問候選殘基。特定而言，靶向以下殘基進行NNK誘變：K248、R255、Q342、R344、E345、Q347、T359、K360、N361、Q362、S364、K370、E380、E382、S383、G385、Y391、K392、T393、D399、S400、D401、S403、K409、L410、T411、V412、K414、S415、Q418、Q419、G420、V422、F423、S424、S426、Q438、S440、S442、L443、S444、P4458、G446及K447。使用孔克爾誘變(Kunkel mutagenesis)產生44單點NNK文庫，且將產物彙集並如上文關於其他酵母文庫所描述經由電穿孔引入酵母。
此等迷你文庫(其中之每一者具有一個突變位置，從而產生20個變異體)之組合產生小文庫，針對引起較高親和力結合之任何位置使用酵母表面展示對該小文庫加以選擇。使用TfR頂端結構域蛋白質如上文所描述進行選擇。在三輪分選之後，對來自富集酵母文庫之純系進行測序，且鑑定出若干「熱點」
位置，在該等位置中某些點突變顯著改良與頂端結構域蛋白質之結合。對於純系CH3C.35，此等突變包括E380(突變為Trp、Tyr、Leu或Gln)及S415(突變為Glu)。純系CH3C.35單一及組合突變體之序列闡述於SEQ ID NO：27-38中。用於純系CH3C.18，此等突變包括E380(突變為Trp、Tyr或Leu)及K392(突變為Gln、Phe或His)。純系CH3C.18單一突變體之序列闡述於SEQ ID NO：21-26中。
用於改良純系CH3C.35親和力之其他成熟文庫
如關於先前之酵母文庫所描述產生用於鑑定來自NNK行走文庫之突變組合同時添加在此等位置周邊之若干其他位置的另一文庫。在此文庫中，YxTEWSS(SEQ ID NO：242)及TxxExxxxF基元保持恆定，且六個位置為完全隨機化的：E380、K392、K414、S415、S424及S426。包括位置E380及S415，因為其為NNK行走文庫中之「熱點」。包括位置K392、S424及S426，因為其構成可定位結合區之核心的一部分，同時選擇K414，此係歸因於其鄰近位置415。
僅使用犬TfR頂端結構域如先前所描述對此文庫進行分選。在五輪之後對富集彙集物進行測序，且所鑑定之獨特純系之經修飾區域的序列闡述於SEQ ID NO：42-59中。
設計接下來之文庫以進一步探索在主要結合互補位中可接受之多樣性。用NNK密碼子將原始位置(384、386、387、388、389、390、413、416及421)中之每一者加上兩個熱點(380及415)個別地隨機化以產生一系列基於酵母之單位置飽和誘變文庫。此外，將各位置個別地恢復為野生型殘基，且使此等個別純系展示於酵母上。應注意，位置380、389、390及415為在恢復為野生型殘基後保留與TfR之實質性結合的僅有位置(對於413恢復為野生型觀測到一定程度殘留但極大程度減弱之結合)。
將單位置NNK文庫針對人類TfR頂端結構域分選三輪以收集最先前
之約5%之結合者，然後自各文庫對至少16個純系進行測序。結果指示在純系CH3C.35之背景下，在各位置在不顯著降低與人類TfR之結合的情況下可忍受什麼胺基酸。彙總如下：位置380：Trp、Leu或Glu；位置384：Tyr或Phe；位置386：僅Thr；位置387：僅Glu；位置388：僅Trp；位置389：Ser、Ala或Val(雖然野生型Asn殘基似乎保留一些結合，但其在文庫分選之後不出現)；位置390：Ser或Asn；位置413：Thr或Ser；位置415：Glu或Ser；位置416：僅Glu；及位置421：僅Phe。
以上殘基當作為單一變化或以組合形式取代至純系CH3C.35中時呈現保留與TfR頂端結構域結合之互補位多樣性。在此等位置具有突變之純系包括表5中所示之彼等純系，且此等純系之CH3結構域的序列闡述於SEQ ID NO：34-38、58及60-90中。
產生在Fc區中在替代位點，例如在以下位置具有修飾之結合於轉鐵蛋白受體(TfR)的其他經修飾之Fc多肽：位置274、276、283、285、286、287、288及290(CH2A2純系)；位置266、267、268、269、270、271、295、297、298及299(CH2C純系)；
位置268、269、270、271、272、292、293、294及300(CH2D純系)；位置272、274、276、322、324、326、329、330及331(CH2E3純系)；或位置345、346、347、349、437、438、439及440(CH3B純系)。
結合於TfR之說明性CH3B純系闡述於SEQ ID NO：124-128中。結合於TfR之說明性CH2A2純系闡述於SEQ ID NO：129-133中。結合於TfR之說明性CH2C純系闡述於SEQ ID NO：134-138中。結合於TfR之說明性CH2D純系闡述於SEQ ID NO：139-143中。結合於TfR之說明性CH2E3純系闡述於SEQ ID NO：144-148中。
噬菌體展示文庫之產生
合成編碼野生型人類Fc序列之DNA模板並併入噬菌粒載體中。噬菌粒載體含有ompA或pelB前導序列、融合至c-Myc及6xHis(SEQ ID NO：241)抗原決定基標籤之Fc插入物及在M13外殼蛋白pIII之後的琥珀(amber)終止密碼子。
產生在用於修飾之所需位置含有「NNK」三密碼子的引物，其中N為任何DNA鹼基(亦即，A、C、G或T)且K為G或T。或者，使用用於「軟」隨機化之引物，其中將對應於70%野生型鹼基及10%其他三種鹼基中之每一者之鹼基混合物用於各隨機化位置。藉由進行對應於隨機化區域之Fc區片段的PCR擴增來產生文庫，然後使用含有Sfi
I限制位點之末端引物進行組裝，然後用Sfi
I消化並連結至噬菌粒載體中。或者，使用引物來進行孔克爾誘變。將連結產物或孔克爾產物轉型至菌株TG1(獲自Lucigen®
)之電轉感受態大腸桿菌細胞中。在回收及生長隔夜之後使大腸桿菌細胞感染M13K07輔助噬菌體，此後將文庫噬菌體用5% PEG/NaCl沈澱，再懸浮於含15%甘油之PBS中，並冷凍直至使用。典型文庫尺寸在約109
至約1011
個轉型體範圍內。經由pIII融合之Fc與
不附著於pIII之可溶性Fc(後者係因pIII前之琥珀終止密碼子而產生)之間的配對使Fc-二聚體展示於噬菌體上。
酵母展示文庫之產生
合成編碼野生型人類Fc序列之DNA模板並併入酵母展示載體中。對於CH2及CH3文庫，使Fc多肽展示於Aga2p細胞壁蛋白質上。兩種載體均含有具有Kex2裂解序列之前原前導肽(prepro leader peptide)及融合至Fc末端之c-Myc抗原決定基標籤。
使用類似於關於噬菌體文庫所描述之彼等方法的方法來組裝酵母展示文庫，除了使用含有對載體同源之末端的引物來進行片段擴增。用經線性化之載體及經組裝之文庫插入物對新製備之電轉感受態酵母(亦即，菌株EBY100)進行電穿孔。電穿孔方法將為熟習此項技術者已知的。在選擇性SD-CAA培養基中回收之後，使酵母生長至匯合並分裂兩次，然後藉由轉移至SG-CAA培養基誘導蛋白質表現。典型文庫尺寸在約107
至約109
個轉型體範圍內。藉由鄰近展示之Fc單體之配對形成Fc-二聚體。
噬菌體選擇之一般方法
噬菌體方法係由Phage Display：A Laboratory Manual(Barbas,2001)改編而來。自此參考文獻可獲得其他方案細節。
板分選法
在4℃下將抗原塗佈於MaxiSorp®
微量滴定板上(典型地1-10μg/mL)隔夜。將噬菌體文庫添加至各孔中並孵育隔夜以便結合。將微量滴定孔用含有0.05% Tween®
20(PBST)之PBS澈底洗滌且藉由將孔在酸(典型地為50mM HCl加上500mM KCl，或100mM甘胺酸，pH 2.7)存在下孵育30分鐘將結合之噬菌體溶離。將溶離之噬菌體用1M Tris(pH 8)中和並使用TG1細胞及M13/KO7輔助噬菌體擴增，且在37℃下在含有50μg/mL羧苄西林(carbenacillin)及50
ug/mL卡那黴素(Kanamycin)之2YT培養基中生長隔夜。將自含有靶標之孔溶離的噬菌體之效價與自不含靶標之孔中回收的噬菌體之效價相比較以評估富集。藉由隨後減少結合期間之孵育時間及增加洗滌時間及洗滌次數來增加選擇嚴格性。
珠粒分選法
NHS-PEG4-生物素(獲自PierceTM
)通過游離胺將抗原生物素化。對於生物素化反應，在PBS中使用3倍至5倍莫耳過量之生物素試劑。用Tris中止反應，隨後在PBS中澈底滲析。將經生物素化之抗原固定於鏈黴親和素塗佈之磁性珠粒(亦即，獲自Thermo Fisher之M280-鏈黴親和素珠粒)上。將噬菌體展示文庫與抗原塗佈之珠粒在室溫下一起孵育1小時。然後移除未結合之噬菌體且用PBST洗滌珠粒。藉由在存在含有500mM KCl之50mM HCl(或0.1M甘胺酸，pH 2.7)之情況下孵育30分鐘將結合之噬菌體溶離，然後如上文關於板分選所描述進行中和及增殖。
在三至五輪淘選之後，藉由使Fc在噬菌體上表現或在大腸桿菌周質中可溶性表現來篩選單個純系。此類表現方法將為熟習此項技術者已知的。使個別噬菌體上清液或周質萃取物暴露於塗有抗原或陰性對照之經阻斷之ELISA板，並隨後對於周質萃取物使用HRP結合之山羊抗Fc(獲自Jackson Immunoresearch)或對於噬菌體使用抗M13(GE Healthcare)進行偵測，然後用TMB試劑(獲自Thermo Fisher)顯色。將OD450
值大於約5倍於背景之孔視為陽性純系並測序，此後使一些純系作為可溶性Fc片段或以融合至Fab片段之形式表現。
酵母選擇之一般方法
珠粒分選(磁性輔助細胞分選(MACS))法
類似於Ackerman等人，Biotechnol.Prog.
,25(3)：774(2009)中所描述進
行MACS及FACS選擇。將鏈黴親和素磁性珠粒(例如來自ThermoFisher之M-280鏈黴親和素珠粒)用經生物素化之抗原標記並與酵母一起孵育(典型地5-10x文庫多樣性)。移除未結合之酵母，洗滌珠粒，且使結合之酵母在選擇性培養基中生長並誘導後續各輪選擇。
螢光激活細胞分選(FACS)法
將酵母用抗c-Myc抗體標記以監測表現及經生物素化之抗原(濃度視各輪分選而變化)。在一些實驗中，將抗原與鏈黴親和素-Alexa Fluor®
647預混合以增強相互作用之親合力。在其他實驗中，在結合且用鏈黴親和素-Alexa Fluor®
647洗滌之後偵測到生物素化之抗原。使用FACS Aria III細胞分選器對結合情況下之單線態酵母進行分選。使分選之酵母在選擇性培養基中生長，然後誘導後續各輪選擇。
在達成富集酵母群體之後，將酵母塗鋪於SD-CAA瓊脂板上且使單個菌落生長並誘導表現，然後如上文所描述進行標記以測定其結合於靶標之傾向。隨後針對結合抗原對陽性單個純系進行測序，此後一些純系作為可溶性Fc片段或以融合至Fab片段之形式表現。
篩選之一般方法
藉由ELISA篩選
自淘選輸出端選擇純系並使其在96孔深孔板之個別孔中生長。使用自動誘導培養基(獲自EMD Millipore)誘導純系之周質表現或使其感染輔助噬菌體以使個別Fc變異體於噬菌體上發生噬菌體展示。典型地以0.5mg/mL用抗原塗佈ELISA板隔夜，然後用1% BSA阻斷，然後添加噬菌體或周質萃取物。在1小時孵育並洗去未結合之蛋白質之後，添加HRP結合之第二抗體(亦即，對於可溶性Fc或噬菌體展示之Fc分別為抗Fc或抗M13)並孵育30分鐘。再次將板洗滌，然後用TMB試劑顯色並用2N硫酸中止反應。使用讀板儀(BioTek®
)定量
在450nm下之吸光度且在適當時使用Prism軟體繪製結合曲線。在一些分析中，在結合步驟期間典型地以顯著莫耳過量添加可溶性轉鐵蛋白或其他競爭物。
藉由流式細胞術篩選
將Fc變異體多肽(表現於噬菌體上、周質萃取物中或作為與Fab片段之融合物可溶性表現)添加至96孔V形底板中之孔中(在PBS+1%BSA(PBSA)中每孔約100,000個細胞)，並在4℃下孵育1小時。隨後將板離心並移除培養基，然後將細胞用PBSA洗滌一次。將細胞再懸浮於含有第二抗體(典型地為山羊抗人類-IgG-Alexa Fluor®
647(獲自Thermo Fisher))之PBSA中。在30分鐘之後，將板離心並移除培養基，將細胞用PBSA洗滌1-2次，然後將板在流式細胞儀(亦即，FACSCantoTM
II流式細胞儀)上讀取。使用FlowJo軟體計算各條件下之中值螢光值且用Prism軟體繪製結合曲線。
此實例描述TfR結合性多肽對轉鐵蛋白受體(TfR)之親和力與所得之腦對鍵聯至TfR結合性多肽之治療劑的暴露之間的關係。
圖18表明當治療劑鍵聯至對TfR具有相對更強之親和力的多肽時，腦對治療劑之暴露(如藉由測定腦濃度相較於時間之曲線下面積(AUC)所評估)縮短。特定而言，當治療劑鍵聯至對TfR具有比約250nM更強之親和力的多肽時，腦暴露實質上縮短。
如圖19中所示，當治療劑鍵聯至對TfR具有相對更強之親和力的多肽時，在腦中觀測到更高之最大濃度(Cmax
)。特定而言，當TfR結合性多肽具有比約250nM更強之親和力時，腦Cmax
值顯著更高。
圖20顯示當鍵聯至對TfR具有一系列親和力之多肽時腦Cmax
與治療劑之血漿濃度的比率。
方法
TfR
ms/hu
KI之產生
產生敲入/敲出小鼠之方法已公佈於文獻中且為熟習此項技術者熟知的。概括地說，使用CRISPR/Cas9技術產生TfR ms/hu
KI小鼠以表現鼠Tfrc
基因內之人類Tfrc
頂端結構域；使所得嵌合TfR在內源性啟動子之控制下在活體內表現。如以全文引用之方式併入本文中之國際專利公開案第WO 2018/152285號中所描述，使用C57Bl6小鼠經由原核微量注射至單細胞胚胎中，隨後胚胎移植至假妊娠雌性中來產生人類頂端TfR小鼠品系之敲入。特定而言，將Cas9、單一嚮導RNA及供體DNA引入胚胎中。供體DNA包含人類頂端結構域編碼序列，其已針對在小鼠中表現經密碼子優化。頂端結構域編碼序列側接左側及右側同源臂。將供體序列設計成使得頂端結構域插入第四小鼠外顯子之後，且在3’端緊密側接第九小鼠外顯子。可使來自接受胚胎之雌性的子代的首建雄性(founder male)與野生型雌性繁殖以產生F1雜合子小鼠。然後由培育F1代雜合子小鼠產生純合子小鼠。
小鼠PK/PD
對於PK/PD評估，經由尾部靜脈注射以50mg/kg為TfR ms/hu
KI小鼠一次性全身給藥。在灌注之前，經由心臟穿刺將血液收集於EDTA血漿管中並在14,000rpm下離心5分鐘。然後分離血漿用於後續PK/PD分析。在灌注之後萃取腦並分離半腦用於在10倍組織重量之含1% NP-40之PBS(對於PK)或5M GuHCl(對於PD)中均質化。
使用通用人類IgG分析(MSD人類IgG套組#K150JLD)遵循製造商之說明書定量小鼠血漿及腦溶解產物中之經工程改造之TfR結合性多肽的濃度。簡單來說，將預塗板用MSD阻斷劑A阻斷30分鐘。使用Hamilton Nimbus液體處理器將血漿樣品1：10,000稀釋並一式兩份添加至經阻斷之板。將腦樣品在1% NP-40溶解緩衝液中均質化且將溶解產物1：10稀釋用於PK分析。亦在相同板上
分析給藥溶液以確認恰當劑量。使用四參數羅吉斯回歸擬合標準曲線(0.78-200ng/mL IgG)。
使用BiacoreTM
T200儀器藉由表面電漿子共振來測定純系變異體對重組TfR頂端結構域之親和力。將BiacoreTM
系列SCM5感測器晶片用抗人類Fab(來自GE Healthcare之人類Fab捕獲套組)固定。將5μg/mL之IDS-Fc融合蛋白捕獲於各液體池上持續1分鐘且以30μL/min之流速注射人類或犬頂端結構域之連續3倍稀釋液。在45秒締合及3分鐘解離之情況下分析各樣品。在每次注射之後，使用10mM甘胺酸-HCl(pH 2.1)使晶片再生。藉由自捕獲類似密度之不相關IgG之液體池扣除RU來校正結合反應。使用BiacoreTM
T200評估軟體v3.1藉由針對濃度對平衡狀態下之反應進行擬合來獲得穩態親和力。
為測定純系變異體對重組TfR胞外域(ECD)之親和力，將BiacoreTM
系列S CM5感測器晶片用鏈黴親和素固定。將經生物素化之人類或犬TfR ECD捕獲於各液體池上持續1分鐘並在室溫下以30μL/min之流速注射純系變異體之連續3倍稀釋液。在45秒締合及3分鐘解離之情況下分析各樣品。藉由自不含類似密度之TfR ECD之液體池扣除RU來校正結合反應。使用BiacoreTM
T200評估軟體v3.1藉由針對濃度對平衡狀態下之反應進行擬合來獲得穩態親和力。
結合親和力概括於表6中。藉由穩態擬合獲得親和力。
為評估TfR結合親和力對PK及腦攝入之影響，產生抗BACE1 Ab153及TfR結合性多肽融合物(CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153、CH3C.35：Ab153融合物)，其如藉由BiacoreTM
所量測對頂端人類TfR之結合親和力不同。CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153、CH3C.35：Ab153融合物對人類TfR之結合親和力分別為100nM、170nM及620nM。以50mg/kg為TfR ms/hu
敲入小鼠全身性投與Ab153或多肽-Fab融合物，且在給藥後1、3及7天時評估血漿PK及腦PKPD。如上文所描述進行腦及血漿PKPD分析。歸因於TfR在外周組織上之表現，與單獨Ab153相比，CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物在血漿中展現更快之清除，此與靶標介導之清除一致且指示活體內TfR結合(圖21A)。給人深刻印象地，與Ab153相比，CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物之腦濃度顯著增加，在給藥後1天時與在此相同時間點Ab153之僅約3nM相比，達成超過30nM之最大腦濃度(圖21B)。CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物之腦暴露增加在小鼠腦中產生與給予Ab153之小鼠中的
Aβ含量相比低約55-60%之內源性小鼠Aβ含量(圖21C)。在腦中保持較低之腦Aβ含量同時剩餘之CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物之濃度升高，且當到第7天減少暴露時回至類似於Ab153處理之小鼠的水準。腦暴露隨時間推移減少與CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物之外周暴露減少相關聯，從而提供清楚之活體內PK/PD關係(比較圖21A與21C)。另外，在此單個高劑量後Ab153處理及多肽-Fab融合物處理之小鼠的總腦TfR含量類似，指示多肽-Fab融合物之腦暴露增加對腦中之TfR表現無顯著影響(圖21D)。
在有差異之情況下，表格(例如表5)中描述之各純系之胺基酸取代指示該純系在登記位置對存在於序列表中所闡述之序列中之胺基酸的胺基酸取代。
應瞭解，本文所描述之實例及實施例僅用於說明性目的，且將向熟習此項技術者建議根據其進行之各種修改或變化，且該等修改或變化應包括在本申請案之精神及權限以及隨附申請專利範圍之範疇內。本文引用之序列登錄號之序列以引用之方式併入本文中。
<110> 美商戴納立製藥公司
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成之多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 225
<210> 226
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 226
<210> 227
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成之多肽
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<210> 228
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 228
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<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
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<212> PRT
<213> 智人
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<210> 231
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 231
<210> 232
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 232
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<400> 233
<210> 234
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> 甲醯甘胺酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> 甲醯甘胺酸
<400> 235
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<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> 甲醯甘胺酸
<400> 236
<210> 237
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> 甲醯甘胺酸
<400> 237
<210> 238
<211> 181
<212> PRT
<213> 智人
<400> 238
<210> 239
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 239
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之肽
<400> 240
<210> 241
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成之6xHi標籤
<400> 241
<210> 242
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知序列
<220>
<223> 未知序列之描述：基元序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何胺基酸
<400> 242
Claims (142)
- 一種蛋白質，其包含：(a)第一Fc多肽，其鍵聯至酶替代療法(ERT)酶、ERT酶變異體或其催化活性片段；及(b)第二Fc多肽，其與該第一Fc多肽形成Fc二聚體，其中，該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈可變區序列或其抗原結合部分。
- 如申請專利範圍第1項之蛋白質，其中該ERT酶為艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、IDS變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第2項之蛋白質，其中該ERT酶包含與SEQ ID NO：91、92、114、230及234中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第3項之蛋白質，其中該ERT酶包含SEQ ID NO：91、92、114、230及234中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之蛋白質，其中該ERT酶為N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、SGSH變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第5項之蛋白質，其中該ERT酶包含與SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第6項之蛋白質，其中該ERT酶包含SEQ ID NO：119及120中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之蛋白質，其中該ERT酶為酸性神經鞘磷脂酶(ASM)、ASM變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第8項之蛋白質，其中該ERT酶包含與SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第9項之蛋白質，其中該ERT酶包含SEQ ID NO：121、122及123中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項之蛋白質，其中該ERT酶為β-葡糖腦苷脂酶(GBA)、GBA變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第11項之蛋白質，其中該ERT酶包含與SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%或95%一致性的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第12項之蛋白質，其中該ERT酶包含SEQ ID NO：93及94中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽為融合多肽，其藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯至該ERT酶、該ERT酶變異體或其該催化活性片段。
- 如申請專利範圍第14項之蛋白質，其中該多肽連接子為可撓性多肽連接子。
- 如申請專利範圍第15項之蛋白質，其中該可撓性多肽連接子為富含甘胺酸之連接子。
- 如申請專利範圍第16項之蛋白質，其中該富含甘胺酸之連接子為G4 S(SEQ ID NO：239)或(G4 S)2 (SEQ ID NO：240)。
- 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之蛋白質，其中該第二Fc多肽鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第18項之蛋白質，其中該第二Fc多肽為融合多肽，其藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯至該ERT酶、該ERT酶變異體或其 該催化活性片段。
- 如申請專利範圍第18項或第19項之蛋白質，其中該第一Fc多肽之N端及/或該第二Fc多肽之N端鍵聯至該ERT酶。
- 如申請專利範圍第20項之蛋白質，其中該第一Fc多肽之N端鍵聯至一個ERT酶且該第二Fc多肽之N端鍵聯至另一ERT酶。
- 如申請專利範圍第18項或第19項之蛋白質，其中該第一Fc多肽之C端及/或該第二Fc多肽之C端鍵聯至該ERT酶。
- 如申請專利範圍第22項之蛋白質，其中該第一Fc多肽之C端鍵聯至一個ERT酶且該第二Fc多肽之C端鍵聯至另一ERT酶。
- 如申請專利範圍第18項或第19項之蛋白質，其中該第一Fc多肽之N端鍵聯至一個ERT酶且該第二Fc多肽之C端鍵聯至另一ERT酶。
- 如申請專利範圍第18項或第19項之蛋白質，其中該第一Fc多肽之C端鍵聯至一個ERT酶且該第二Fc多肽之N端鍵聯至另一ERT酶。
- 如申請專利範圍第1項至第17項中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含單個ERT酶，且其中該第一Fc多肽之N端或C端鍵聯至該ERT酶。
- 如申請專利範圍第18項至第25項中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含兩個ERT酶。
- 如申請專利範圍第14項至第17項中任一項之蛋白質，其中該融合多肽自N端至C端包含：該ERT酶、該ERT酶變異體或其該催化活性片段；該多肽連接子；及該第一Fc多肽。
- 如申請專利範圍第1項至第28項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽為經修飾之Fc多肽及/或該第二Fc多肽為經修飾之Fc多肽。
- 如申請專利範圍第29項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及該第二 Fc多肽各含有促進異二聚化之修飾。
- 如申請專利範圍第30項之蛋白質，其中該Fc二聚體為Fc異二聚體。
- 如申請專利範圍第30項或第31項之蛋白質，其中根據EU編號，該等Fc多肽中的一者具有T366W取代且另一Fc多肽具有T366S、L368A及Y407V取代。
- 如申請專利範圍第32項之蛋白質，其中該第一Fc多肽含有T366S、L368A及Y407V取代且該第二Fc多肽含有T366W取代。
- 如申請專利範圍第33項之蛋白質，其中該第一Fc多肽鍵聯至該ERT酶且包含SEQ ID NO：117、232及236中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第32項之蛋白質，其中該第一Fc多肽含有T366W取代且該第二Fc多肽含有T366S、L368A及Y407V取代。
- 如申請專利範圍第35項之蛋白質，其中該第一Fc多肽鍵聯至該ERT酶且包含SEQ ID NO：118、233及237中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第29項至第36項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含天然FcRn結合位點。
- 如申請專利範圍第29項至第37項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及該第二Fc多肽不具有效應功能。
- 如申請專利範圍第29項至第37項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包括降低效應功能之修飾。
- 如申請專利範圍第39項之蛋白質，其中該降低效應功能之修飾為根據EU編號在位置234之Ala及在位置235之Ala的取代。
- 如申請專利範圍第40項之蛋白質，其中該第一Fc多肽鍵聯至該ERT酶且包含SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第40項之蛋白質，其中該第一Fc多肽鍵聯至該ERT酶且包含SEQ ID NO：149、150、152及153中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第29項至第42項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽相對於天然Fc序列包含延長血清半衰期之胺基酸變化。
- 如申請專利範圍第43項之蛋白質，其中該等胺基酸變化包含根據EU編號在位置252之Tyr、在位置254之Thr及在位置256之Glu的取代。
- 如申請專利範圍第43項之蛋白質，其中該等胺基酸變化包含根據EU編號在位置428之Leu及在位置434之Ser的取代。
- 如申請專利範圍第43項之蛋白質，其中該等胺基酸變化包含根據EU編號在位置434之Ser或Ala的取代。
- 如申請專利範圍第29項至第46項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽特異性結合於轉鐵蛋白受體(TfR)。
- 如申請專利範圍第47項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含根據EU編號在選自由以下組成之群的位置的至少兩個取代：384、386、387、388、389、390、413、416及421。
- 如申請專利範圍第48項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含在該等位置之至少三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個取代。
- 如申請專利範圍第48項或第49項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽進一步包含根據EU編號在包含380、391、392及415之位置的一個、兩個、三個或四個取代。
- 如申請專利範圍第48項至第50項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽進一步包含根據EU編號在包含414、424及 426之位置的一個、兩個或三個取代。
- 如申請專利範圍第48項至第51項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含在位置388之Trp。
- 如申請專利範圍第48項至第52項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含在位置421之芳族胺基酸。
- 如申請專利範圍第53項之蛋白質，其中在位置421之該芳族胺基酸為Trp或Phe。
- 如申請專利範圍第48項至第54項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含至少一個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
- 如申請專利範圍第55項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個選自以下之位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
- 如申請專利範圍第56項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含如下11個位置：位置380為Trp、Leu或Glu；位置384為Tyr或Phe；位置386為Thr；位置387為Glu；位置388為Trp；位置389為Ser、Ala、Val或Asn；位置390為Ser或Asn；位置413為Thr或Ser；位置415為Glu或Ser；位置416為Glu；及位置421為Phe。
- 如申請專利範圍第56項或第57項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽具有與SEQ ID NO：34-38、58、60-90、151及156-229中之任一者之胺基酸111-217具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的CH3結構域。
- 如申請專利範圍第58項之蛋白質，其中在對應於SEQ ID NO：34-38、58、60-90、151及156-229中之任一者的EU索引位置380、384、386、387、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424及426之位置中的至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者處的殘基未缺失或取代。
- 如申請專利範圍第58項或第59項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：156-229中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第60項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：157、169、181、193、205及217中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第60項之蛋白質，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之胺基酸序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：205及228中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第60項之蛋白質，其中該第一Fc多肽包含SEQ ID NO：115、231及235中之任一者之胺基酸序列，且該第二Fc多肽包含SEQ ID NO：169及229中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第47項至第63項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽結合於該TfR之頂端結構域。
- 如申請專利範圍第47項至第64項中任一項之蛋白質，其中該蛋白質與該TfR之該結合不實質上抑制轉鐵蛋白結合於該TfR。
- 如申請專利範圍第47項至第65項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽與對應野生型Fc多肽相比具有至少75%或至少80%、85%、90%、92%或95%之胺基酸序列一致性。
- 如申請專利範圍第66項之蛋白質，其中該對應野生型Fc多肽為人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽。
- 如申請專利範圍第47項至第67項中任一項之蛋白質，其中與在不存在該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽之情況下該ERT酶的攝入相比或與在不存在對該第一Fc多肽及/或該第二Fc多肽之引起TfR結合的修飾的情況下該ERT酶的攝入相比，該ERT酶在腦中之攝入為至少十倍。
- 如申請專利範圍第1項至第68項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽未經修飾以結合於血腦障壁(BBB)受體且該第二Fc多肽經修飾以特異性結合於TfR。
- 如申請專利範圍第1項至第68項中任一項之蛋白質，其中該第一Fc多肽經修飾以特異性結合於TfR且該第二Fc多肽未經修飾以結合於BBB受體。
- 如申請專利範圍第1項至第70項中任一項之蛋白質，其中該蛋白質不包括免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈可變區序列或其抗原結合部分。
- 一種包含鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段之Fc多肽的多肽，其中該Fc多肽含有促進其與另一Fc多肽異二聚化之一或多個修飾。
- 如申請專利範圍第72項之多肽，其中該ERT酶為艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、IDS變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第72項之多肽，其中該ERT酶為N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、SGSH變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第72項之多肽，其中該ERT酶為酸性神經鞘磷脂酶(ASM)、ASM變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第72項之多肽，其中該ERT酶為β-葡糖腦苷脂酶(GBA)、GBA變異體或其催化活性片段。
- 如申請專利範圍第72項至第76項中任一項之多肽，其中該Fc多肽為融合多肽，其藉由肽鍵或藉由多肽連接子鍵聯至該ERT酶、該ERT酶變異體或其該催化活性片段。
- 如申請專利範圍第77項之多肽，其中該融合多肽自N端至C端包含：該ERT酶、該ERT酶變異體或其該催化活性片段；該多肽連接子；及該第一Fc多肽。
- 如申請專利範圍第72項至第78項中任一項之多肽，其中根據EU編號，該Fc多肽含有T366S、L368A及Y407V取代。
- 如申請專利範圍第79項之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：115、117、231、232、235及236中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第79項之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：149及150中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第72項至第78項中任一項之多肽，其中該Fc多肽含有T366W取代。
- 如申請專利範圍第82項之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：118、233及237中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第82項之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：152-155中之任一者之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第72項至第84項中任一項之多肽，其中該多肽進一步包含另一Fc多肽。
- 一種聚核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第72項至第84項中任一項之多肽的核酸序列。
- 一種載體，其包含如申請專利範圍第86項之聚核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第86項之聚核苷酸或如申請專利範圍第87項之載體。
- 如申請專利範圍第88項之宿主細胞，其進一步包含含有編碼該另一Fc多肽之核酸序列的聚核苷酸。
- 一種製備包含Fc多肽之多肽的方法，該Fc多肽鍵聯至ERT酶、ERT酶變異體或其催化活性片段，該方法包括在使由如申請專利範圍第86項之聚核苷酸編碼之多肽表現的條件下培養宿主細胞。
- 一種治療溶酶體貯積症(LSD)之方法，該方法包括向有需要之患者投與如申請專利範圍第1項至第71項中任一項之蛋白質或如申請專利範圍第72項至第85項中任一項之多肽。
- 一種減少患有LSD之患者中毒性代謝產物之累積的方法，該方法包括向該患者投與如申請專利範圍第1項至第71項中任一項之蛋白質或如申請專利範圍第72項至第85項中任一項之多肽。
- 如申請專利範圍第91項或第92項之方法，其中該LSD為亨特症候群(Hunter syndrome)，且該ERT酶為IDS。
- 如申請專利範圍第93項之方法，其中該毒性代謝產物包含硫酸肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣。
- 如申請專利範圍第91項或第92項之方法，其中該LSD為聖菲利柏症候群A(Sanfilippo syndrome A)，且該ERT酶為SGSH。
- 如申請專利範圍第95項之方法，其中該毒性代謝產物包含硫酸乙醯肝素衍生之寡醣。
- 如申請專利範圍第91項或第92項之方法，其中該LSD為尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)，且該ERT酶為ASM。
- 如申請專利範圍第97項之方法，其中該毒性代謝產物包含神經鞘磷脂。
- 如申請專利範圍第91項或第92項之方法，其中該LSD為高歇氏病(Gaucher's disease)或帕金森氏病(Parkinson's disease)，且該ERT酶為GBA。
- 如申請專利範圍第99項之方法，其中該毒性代謝產物包含葡糖基神經醯胺。
- 一種醫藥組合物，其包含如申請專利範圍第1項至第71項中任一項之蛋白質或如申請專利範圍第72項至第85項中任一項之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種監測受質累積以評估IDS活性之方法，該方法包括：(a)將來自投與如申請專利範圍第2項至第4項、第14項至第41項及第43項至第71項中任一項之蛋白質或如申請專利範圍第72項至第73項、第77項至第80項、第82項至第83項及第85項中任一項之多肽的個體之細胞或組織樣品中之細胞破碎以使微泡裂開從而獲得欲分析的醣胺聚醣(GAG)溶液；(b)用至少一種肝素酶及軟骨素酶B消化該GAG溶液以獲得GAG衍生之二醣；(c)藉由質譜法分析該等GAG衍生之二醣；及(d)測定硫酸乙醯肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣的含量，其中與缺乏IDS活性之對照相比硫酸乙醯肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣的含量降低指示與該對照相比該樣品中之IDS活性增加。
- 如申請專利範圍第102項之方法，其中破碎細胞之步驟包括至少一個冷凍-解凍循環及至少一個超音處理步驟。
- 如申請專利範圍第103項之方法，其中該等細胞係來自組織樣品且該方法包括至少三個、四個或五個冷凍-解凍循環。
- 如申請專利範圍第102項至第104項中任一項之方法，其中該個體為缺乏IDS活性之小鼠。
- 如申請專利範圍第102項至第104項中任一項之方法，其中該個體為非人類靈長類動物。
- 如申請專利範圍第102項至第104項中任一項之方法，其中該個體為患有亨特症候群之人類患者。
- 一種監測受質累積以評估SGSH活性之方法，該方法包括：(a)將來自投與如申請專利範圍第5項至第7項、第14項至第33項、第35項、第37項至第40項及第42項至第71項中任一項之蛋白質或如申請專利範圍第72項、第74項、第77項至第79項、第81項至第82項及第84項至第85項中任一項之多肽的個體之細胞或組織樣品中之細胞破碎以使微泡裂開從而獲得欲分析的醣胺聚醣(GAG)溶液；(b)用至少一種肝素酶消化該GAG溶液以獲得GAG衍生之二醣；(c)藉由質譜法分析該等GAG衍生之二醣；及(d)測定硫酸乙醯肝素衍生之二醣之含量，其中與缺乏SGSH活性之對照相比硫酸乙醯肝素衍生之二醣的含量降低指示與該對照相比該樣品中之SGSH活性增加。
- 如申請專利範圍第108項之方法，其中破碎細胞之步驟包括至少一個冷凍-解凍循環及至少一個超音處理步驟。
- 如申請專利範圍第109項之方法，其中該等細胞係來自組織樣品 且該方法包括至少三個、四個或五個冷凍-解凍循環。
- 如申請專利範圍第108項至第110項中任一項之方法，其中該個體為缺乏SGSH活性之小鼠。
- 如申請專利範圍第108項至第110項中任一項之方法，其中該個體為非人類靈長類動物。
- 如申請專利範圍第108項至第110項中任一項之方法，其中該個體為患有聖菲利柏症候群A之人類患者。
- 一種運送藥劑穿過哺乳動物之BBB的方法，其包括使該BBB暴露於以約50nM至約250nM之親和力結合於TfR之蛋白質，其中該蛋白質鍵聯至該藥劑且運送該鍵聯之藥劑穿過該BBB。
- 如申請專利範圍第114項之方法，其中該哺乳動物腦中該藥劑之最大濃度(Cmax )有所提高。
- 如申請專利範圍第114項或第115項之方法，其中該藥劑適用於治療LSD。
- 一種治療LSD之方法，其包括向哺乳動物投與以約50nM至約250nM之親和力結合於TfR之蛋白質，其中該蛋白質鍵聯至用於治療該LSD之藥劑，由此使該哺乳動物之腦暴露於該藥劑。
- 如申請專利範圍第114項至第117項中任一項之方法，其中該蛋白質使該藥劑在該腦中之Cmax 與鍵聯至以較弱親和力結合於該TfR之參考蛋白質的藥劑相比有所提高。
- 如申請專利範圍第114項至第118項中任一項之方法，其中該蛋白質使在治療有效濃度下該藥劑在該哺乳動物中之Cmax 與鍵聯至以較弱親和力結合於該TfR之參考蛋白質的藥劑相比有所提高。
- 如申請專利範圍第118項至第119項中任一項之方法，其中該參 考蛋白質以約600nM或更弱之親和力結合於該TfR。
- 如申請專利範圍第114項至第120項中任一項之方法，其中該TfR為靈長類動物TfR。
- 如申請專利範圍第121項之方法，其中該靈長類動物TfR為人類TfR。
- 如申請專利範圍第114項至第122項中任一項之方法，其中該蛋白質結合於該TfR頂端結構域。
- 如申請專利範圍第114項至第123項中任一項之方法，其中該蛋白質以約100nM至約200nM之親和力結合於該TfR。
- 如申請專利範圍第114項至第124項中任一項之方法，其中該蛋白質以約110nM至約150nM之親和力結合於該TfR。
- 如申請專利範圍第119項至第125項中任一項之方法，其中該藥劑之該治療有效濃度為治療該哺乳動物中之LSD的一或多種症狀的濃度。
- 如申請專利範圍第114項至第126項中任一項之方法，其中該藥劑為蛋白質替代治療劑。
- 如申請專利範圍第114項至第127項中任一項之方法，其中該藥劑或蛋白質替代治療劑為酶。
- 如申請專利範圍第128項之方法，其中當該酶鍵聯至該蛋白質時與該酶鍵聯至該參考蛋白質時相比在更大程度上減少患有該LSD之該哺乳動物腦中毒性代謝產物的累積。
- 如申請專利範圍第128項或第129項之方法，其中該酶為IDS且該LSD為亨特症候群。
- 如申請專利範圍第130項之方法，其中該毒性代謝產物包含硫酸肝素衍生之二醣及/或硫酸皮膚素衍生之二醣。
- 如申請專利範圍第128項或第129項之方法，其中該酶為SGSH且該LSD為聖菲利柏症候群A。
- 如申請專利範圍第128項或第129項之方法，其中該酶為ASM且該LSD為尼曼-皮克病。
- 如申請專利範圍第128項或第129項之方法，其中該酶為GBA且該LSD為高歇氏病。
- 如申請專利範圍第114項至第126項中任一項之方法，其中該藥劑包含抗體可變區。
- 如申請專利範圍第135項之方法，其中該藥劑包含抗體片段。
- 如申請專利範圍第136項之方法，其中該藥劑包含Fab或scFv。
- 如申請專利範圍第114項至第137項中任一項之方法，其中該蛋白質為經修飾之Fc多肽，其含有能夠結合TfR之非天然結合位點。
- 如申請專利範圍第114項至第137項中任一項之方法，其中該蛋白質包含特異性結合TfR之抗體可變區。
- 如申請專利範圍第139項之方法，其中該蛋白質包含抗體片段。
- 如申請專利範圍第140項之方法，其中該蛋白質包含Fab或scFv。
- 如申請專利範圍第114項至第141項中任一項之方法，其中鍵聯至該藥劑之該蛋白質係作為醫藥學上可接受之載劑的一部分而投與。
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