TWI710570B - 用於治療代謝異常之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

提供治療患有葡萄糖代謝異常及/或體重異常之個體的方法及與其相關之組成物。

Description

用於治療代謝異常之組成物及方法 [以引用的方式併入作為文本檔案提供之序列表]
序列表係作為2015年7月22日創建且具有133KB大小之文本檔案「NGMB-139WO_SeqList.txt」隨本文提供。該文本檔案之內容係以全文引用之方式併入本文中。
[相關申請案之交叉引用]
本申請案主張2014年7月30日申請之美國臨時申請案序列號62/031,063及2015年7月23日申請之美國臨時申請案序列號62/195,908的優先權權益，該等申請案係以全文引用之方式併入本文中。
本發明尤其係關於適用於治療代謝相關病狀之多肽及其組成物。
肥胖之最常見原因為過度食物攝取伴隨有限 能量消耗及/或缺乏身體鍛煉。肥胖使罹患各種疾病之可能性增加，該等疾病為諸如糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠狀動脈病、睡眠呼吸中止、痛風、風濕病及關節炎。此外，死亡風險與肥胖直接相關，使得例如超過40的身體質量指數導致平均預期壽命減少10年以上。
當前藥理學治療形態包括靶向諸多受體類別 (例如CB1、5-HT2C及NPY)之食慾抑制劑；下視丘中之食慾迴路及飢餓素之分子作用的調節劑；及靶向脂肪脢之營養吸收抑制劑。不幸的是，當前形態中無一者顯示可有效地治療肥胖而不導致不利效應，一些不利效應可能非常嚴重。
高血糖水準刺激胰臟β細胞分泌胰島素。胰 島素又刺激葡萄糖進入肌肉及脂肪細胞中，導致糖原及甘油三酯之儲存以及蛋白質之合成。各種細胞類型上之胰島素受體之活化藉由增加葡萄糖攝取及利用以及藉由減少肝臟葡萄糖輸出而降低循環葡萄糖水準。此調節網路內之破環可導致糖尿病及相關病理症候群，其所影響的人口百分比較大且不斷增長。
患有葡萄糖代謝異常之患者可能受高血糖 症、高胰島素血症及/或葡萄糖不耐受困擾。通常與異常葡萄糖及/或胰島素水準相關之異常的實例為胰島素抗性，其中肝臟、脂肪及肌肉細胞喪失其響應正常血液胰島素水準之能力。
鑒於肥胖、糖尿病及相關代謝及非代謝異常 之流行及嚴重性，對在患者中調節例如食慾、葡萄糖及/或胰島素水準且增強對波動之葡萄糖水準之生物反應的治療形態仍感興趣。
已經將野生型GDF15，亦稱為MIC-1(巨噬細 胞抑制性細胞因子-1)，與體重調節相關聯(Tsai VW等人，PLoS One 2013；8(2)：e55174；US8,192,735)。
提供具有與成熟野生型人類GDF15(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列具有至少90%同一性之連續胺基酸序列的多肽。本發明之多肽涵蓋GDF15突變蛋白、經修飾之GDF15及經修飾之GDF15突變蛋白。亦提供此等多肽之組成物。本發明涵蓋本文中所描述之多肽及其組成物用於治療或預防體重相關之異常及/或葡萄糖代謝異常的用途。
如以上所指出，提供包括與SEQ ID NO：1之 胺基酸序列具有至少90%一致性之連續胺基酸序列的多肽。該連續胺基酸序列包括對SEQ ID NO：1中之相應胺基酸之以下成對取代中的至少一者：i)D5T/S及R21N；ii)R16N及H18T/S；iii)S23N及E25T/S；iv)L24N及D26T/S；v)S50N及F52T/S或F52N及A54T/S；vi)Q51N及R53T/S或R53N及A55T/S；vi)S64N及H66T/S；vii)L65N及R67T/S；viii)S82N及N84T/S；ix)K91N及D93T/S or D93N及G95T/S；x)T94N及V96T/S 或V96N及L98T/S；xi)S97N及Q99T/S；以及xii)A106N及D108T/S。
舉例而言，該連續胺基酸序列可包括對SEQ ID NO：1中之相應胺基酸之以下成對取代中的至少一者：i)D5T及R21N或D5S及R21N；ii)R16N及H18T或R16N及H18S；iii)S23N及E25T或S23N及E25S；iv)L24N及D26T或L24N及D26S；v)S50N及F52T；S50N及F52S；F52N及A54T；或F52N及A54S；vi)Q51N及R53T；Q51N及R53S；R53N及A55T；或R53N及A55S；vi)S64N及H66T或S64N及H66S；vii)L65N及R67T或L65N及R67S；viii)S82N及N84T或S82N及N84S；ix)K91N及D93T；K91N及D93S；D93N及G95T；或D93N及G95S；x)T94N及V96T；T94N及V96S；V96N及L98T；或V96N及L98S；xi)S97N及Q99T或S97N及Q99S；以及xii)A106N及D108T或A106N及D108S。
在某些實施例中，該多肽可包括對SEQ ID NO：1中之相應胺基酸之以下成對取代中的至少一者：D5T及R21N；S23N及E25T/S；R53N及A55T/S；S64N及H66T/S；K91N及D93T/S；D93N及G95T/S；S97N及Q99T/S；以及A106N及D108T/S。
在某些實施例中，該多肽可包括對SEQ ID NO：1中之相應胺基酸之以下成對取代中的至少一者：D5T及R21N；D5S及R21N；S23N及E25T；S23N及 E25S；R53N及A55T；R53N及A55S；S64N及H66T；S64N及H66S；K91N及D93T；K91N及D93S；D93N及G95T；D93N及G95S；S97N及Q99T；S97N及Q99S；A106N及D108T；以及A106N及D108S。
在某些實施例中，該多肽可包括對SEQ ID NO：1中之相應胺基酸之以下成對取代中的至少一者：D5T及R21N；S64N及H66T/S；K91N及D93T/S；D93N及G95T/S；以及S97N及Q99T/S。
在其他實施例中，該多肽可包括對SEQ ID NO：1中之相應胺基酸之以下成對取代中的至少一者：K91N及D93T或K91N及D93S；以及D93N及G95T或D93N及G95S。在其他實施例中，該多肽可包括對SEQ ID NO：1中之相應胺基酸之以下成對取代：K91N及D93T。
在例示性實施例中，該連續胺基酸序列可與 SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少95%同一性。
在其他實施例中，該連續胺基酸序列可為至 少98個胺基酸長，且可與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少90%同一性，其中該多肽之C末端胺基酸對應於SEQ ID NO：1中位置112上的異白胺酸。
在其他實施例中，該連續胺基酸序列可為至 少98個胺基酸長，且可與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少95%同一性，其中該多肽之C末端胺基酸對應於SEQ ID NO：1中之位置112上的異白胺酸。
本文中所揭示之例示性多肽包括至少98個胺 基酸長、與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少90%同一性且相對於SEQ ID NO：1具有胺基酸缺失的連續胺基酸序列。舉例而言，該等多肽相對於SEQ ID NO：1可具有N末端截短。該截短可為相對於SEQ ID NO：1之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個或更多個胺基酸，例如1至14個胺基酸、3至14個胺基酸、6至14個胺基酸或3至6個胺基酸。
在某些情況下，該連續胺基酸序列為至少98 個胺基酸長、與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少90%同一性，且不包括對應於SEQ ID NO：1之N末端上所存在之前三個胺基酸的前三個胺基酸，其中該C末端胺基酸對應於SEQ ID NO：1中之位置112上的異白胺酸。
在某些情況下，該連續胺基酸序列為至少98 個胺基酸長、與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少90%同一性，且不包括對應於SEQ ID NO：1之N末端上所存在之前六個胺基酸的前六個胺基酸，其中該C末端胺基酸對應於SEQ ID NO：1中之位置112上的異白胺酸。
在某些情況下，該連續胺基酸序列為至少98 個胺基酸長、與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少90%同一性，且不包括對應於SEQ ID NO：1之N末端上所存在之前十四個胺基酸的前十四個胺基酸，其中該C末端胺基酸對應於SEQ ID NO：1中之位置112上的異白胺酸。
在某些情況下，該多肽可包括N末端之信號 序列，諸如IgK信號序列。該信號序列可經由連接子與該多肽結合，該連接子可為可裂解連接子。
本文中亦提供自N末端至C末端連續包括以 下各物之融合蛋白質：異源多肽-[(G4S)]5-GDF15；異源多肽-[(G4S)]5-△N3-GDF15；或異源多肽-[(G4S)]5-△N6-GDF15。
在例示性實施例中，該異源多肽可為血清白 蛋白、麥芽糖結合蛋白或免疫球蛋白Fc多肽。該血清白蛋白可為人血清白蛋白、犬血清白蛋白或牛血清白蛋白。 該融合蛋白質可包括N末端之信號序列。該信號序列可為IgK信號序列。
本文中亦提供編碼上述多肽或融合蛋白質之 核酸分子。該核酸分子可操作地連接於可賦予編碼該多肽或該融合蛋白質之核酸分子之活體外或活體內表現的表現控制元件。亦涵蓋包括該核酸分子之載體。該載體可為病毒載體。
一些實施例包括表現上述多肽中之一或多種 的轉型細胞或宿主細胞。
在本發明之特定實施例中，對上述多肽中之 一或多種進行調配以產生醫藥組成物，其中該組成物亦包括一或多種醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。在某些實施例中，醫藥組成物亦包括至少一種附加預防劑或治療劑。
本發明之其他實施例包含特異性結合上述突 變蛋白多肽之一的抗體。在一些實施例中，該抗體包含獨立多肽中或單一多肽中所存在之輕鏈可變區及重鏈可變區。在某些實施例中，本發明之抗體結合該多肽之親和力為約107M-1至約1012M-1。在其他實施例中，該抗體包含同型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之重鏈恆定區。在其他實施例中，該抗體經可偵測地標記，而在其他實施例中，其為Fv、scFv、Fab、F(ab')2或Fab'。
本發明亦涵蓋包含共價連接之非多肽聚合物 (例如聚(乙二醇)聚合物)的抗體。在其他實施例中，該抗體包含選自脂質部分、脂肪酸部分、多糖部分及碳水化物部分之共價連接之部分。
在一些實施例中，該抗體為單鏈Fv(scFv)抗 體，且在其他實施例中，該scFv經多聚。
本發明之抗體可為但不限於單株抗體、多株 抗體或人類化抗體。
此外，本發明涵蓋包含如上所描述之抗體與 至少一種醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑之調配物的醫藥組成物。此種醫藥組成物亦可含有至少一種附加預防劑或治療劑。
本發明之某些實施例涵蓋含有以上所提及之 醫藥組成物之一及視情況存在之一或多種其他組分的無菌容器。舉例而言，但不具限制性，該無菌容器可為注射器。在其他實施例中，該無菌容器為套組之一個組件；該 套組亦可含有例如含有至少一種預防劑或治療劑之第二無菌容器。
本文中亦揭示製造上述多肽或融合蛋白質之 方法。該方法可包括對表現該多肽或該融合蛋白質之宿主細胞進行培養；及對所表現之多肽或融合蛋白質進行純化。
本發明亦涵蓋在個體(例如人類)中治療或預防 葡萄糖代謝異常之方法，該方法係藉由向該個體投與治療有效量之上述多肽或融合蛋白質。在一些方法中，該治療或預防引起該個體之血漿葡萄糖降低、該個體之血漿胰島素降低、該個體之體重及/或食物攝取減少或葡萄糖耐受性增加。在特定實施例中，該葡萄糖代謝異常為糖尿病。
亦揭示治療或預防個體之體重異常的方法。 該方法可包括向該個體投與本發明之多肽或融合蛋白質，其中該多肽或該融合蛋白質係以有效治療或預防該個體之體重異常之量投與。在一些方法中，該治療或預防引起個體之體重及/或食物攝取減少。
在一些實施例中，該個體肥胖及/或存在體重 異常。
儘管不限於任何特定投與途徑或給藥方案， 但在一些實施例中，該投與係藉由非經腸(例如皮下)注射。
圖1顯示本文中所揭示之GDF15突變蛋白之 胺基酸序列與野生型(WT)成熟人類GDF15之胺基酸序列的比對。
圖2顯示本文中所揭示之△N3-GDF15突變蛋 白之胺基酸序列與WT成熟人類GDF15之胺基酸序列的比對。△N3-hGDF15突變蛋白缺乏成熟hGDF15之N末端上所存在之前3個胺基酸(ARN)。
圖3描繪兩種融合蛋白質(構築體M1及 M2)，其自N末端至C末端連續包括：IgK信號序列(小寫字母)(IgK)-人血清白蛋白胺基酸(D25-L609)序列(HSA)-非可裂解(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3連接子[(G4S)]3(加下劃線)-成熟人類GDF15胺基酸序列(hGDF15)(加粗)。構築體M1(IgK-HSA-[(G4S)]3-hGDF15)含有全長成熟hGDF15，而構築體M2(IgK-HSA-[(G4S)]3-△N3-hGDF15)含有△N3-hGDF15，其中缺失對應於成熟hGDF15之N末端上的胺基酸的前3個胺基酸(ARN)。
圖4描繪構築體M1及M2自CHOK1SV GSKO穩定細胞株培養基之非還原型古瑪西染色SDS-PAGE表現凝膠。星號(*)表示M1中在自CHOK1SV分泌期間出現的剪切物質。對剪切位點之LC/MS鑑別引起設計穩定性提高構築體(M2)，其含有成熟hGDF15之N末端上的3個胺基酸截短(△ARN或△N3)。
圖5描繪含具有經由非可裂解[(G4S)]5連接子 (加下劃線)與成熟人GDF15胺基酸序列(加粗)之N末端融 合的IgK信號序列(小寫字母)的人血清白蛋白胺基酸(D25-L609)序列的兩種融合分子。構築體M3(IgK-HSA-[(G4S)]5-△N3-hGDF15)含有成熟hGDF15之N末端上的3個胺基酸截短(△ARN)；而構築體M4(IgK-HSA-[(G4S)]5-△N6-hGDF15)含有相對於成熟hGDF15之N末端的6個胺基酸截短(△ARNGDH)。
圖6描繪單次快速皮下投與媒劑、M1、M3 及M4融合分子(40nmol/kg)後對飲食誘導型肥胖(DIO)小鼠之食物攝取的效應。如圖中所指示，在劑量後24小時及劑量後7天測定食物攝取參數。在各組小鼠中，n=8且p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)係藉由在各規定時間點比較不同的劑量組與媒劑對照組的非配對T檢定來確定。
圖7描繪單次快速皮下投與媒劑、M1、M3 及M4融合分子(40nmol/kg)後對DIO小鼠之體重的效應。如圖中所指示，在劑量後24小時及劑量後7天相對於劑量前群組體重確定體重參數。在各組小鼠中，n=8且p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)係藉由在各規定時間點比較不同的劑量組與媒劑對照組的非配對T檢定來確定。
圖8A描繪藉由引入N連接之糖基化一致位點 而產生之單糖基化及二糖基化突變蛋白的胺基酸序列(M5至M21)。此等序列包括與成熟人GDF15胺基酸序列(加粗)之N末端融合的IgK信號序列(小寫字母)。圖8B描繪 編碼圖8A中所描繪之胺基酸序列的核酸序列。圖8C描繪△N3-M16之胺基酸序列及編碼△N3-M16之核酸序列。 圖8D描繪含有IgK信號序列之WT成熟人類GDF15胺基酸序列(IgK-WT-GDF15)的胺基酸序列及編碼IgK-WT-GDF15之核酸序列。
圖9提供圖8A中及針對△N3-M16所闡述之 各經工程改造之N糖基化人GDF15突變蛋白的分泌及二聚體形成之彙總以及相對溶解度之改良。
圖10描繪單次皮下投與媒劑(PBS)、 GDF15、M16、△N3-M16及M17多肽(1mg/kg(40nmol/Kg))後對飲食誘導型肥胖(DIO)小鼠之食物攝取的效應。
圖11描繪單次皮下投與媒劑(PBS)、 GDF15、M16、△N3-M16及M17多肽(1mg/kg(40nmol/Kg))後對DIO小鼠之體重的效應。
在進一步描述本發明之方法及組成物之前，應理解本發明不限於本文中所闡述之特定實施例，且亦應理解本文中所使用之術語僅出於描述特定實施例之目的，而不欲具有限制性。
在提供值之範圍的情況下，應理解，除非上下文另外清楚地指出，否則該範圍之上限與下限之間(直至下限單位的十分之一)的各居中值及該所阐述範圍內之 任何其他所阐述值或居中值涵蓋在本發明內。服從於所阐述範圍中之任何明確排除之界限，此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括在較小範圍中，且亦涵蓋在本發明內。 在所阐述範圍包括界限之一或兩者的情況下，排除彼等所包括之界限中之任一者或兩者的範圍亦包括在本發明中。 除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬領域者通常所理解相同的含義。
必須注意，如本文中及所附申請專利範圍中 所使用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一」及「該」包括複數參考物。因而，舉例而言，對「該突變多肽」之引用包括對一或多種突變多肽之引用等等。應進一步注意，可起草申請專利範圍以排除任何可選要素。因而，此陳述意欲充當結合陳述申請專利範圍要素來使用此種排他性術語(諸如「僅僅」、「僅」及類似術語)或使用「負」限制的前提條件。
提供本文中所論述之公開案僅僅由於其揭示內容在本申請之申請日期之前。在本文中不應理解為承認本發明由於先前發明而無權先於該公開案。此外，所提供之公開日期可能與實際公開日期不同，由此可能需要獨立地證實。
定義
術語「患者」或「個體」可互換用於指人類或非人類動物(例如哺乳動物)。
術語「治療」及其類似術語係指在已診斷出、觀測到及類似地發現疾病、病症或病狀或其症狀之後開始以便暫時地或永久地消除、減輕、抑制、緩解或改善困擾個體之疾病、病症或病狀之至少一個根本病因或與困擾個體之疾病、病症、病狀相關之至少一種症狀的動作過程(諸如投與藥劑，例如多肽或包含多肽之醫藥組成物)。 因而，治療包括抑制(亦即，阻遏疾病、病症或病狀或與其相關之臨床症狀的發展或進一步發展)活性疾病(例如，以便降低血流中之胰島素及/或葡萄糖之水準，增加葡萄糖耐受性以便使葡萄糖水準波動最小化，及/或以便防止由破環葡萄糖動態平衡所致的疾病)。
如本文中所使用之術語「需要治療」係指由醫師或其他照護者判斷個體需要或將受益於治療。此判斷係基於在醫師或照護者之專長領域中的多種因素而作出。
術語「預防」及類似術語係指一般在傾向於患有特定疾病、病症或病狀之個體的情形下，以暫時地或永久地預防、遏制、抑制或減輕個體罹患疾病、病症、病狀或其類似狀況之風險(如藉由例如不存在臨床症狀所確定)或延遲其發作之方式(例如在疾病、病症、病狀或其症狀發作之前)開始之動作過程(諸如投與藥劑，例如多肽或包含多肽之醫藥組成物)。在某些情況下，該術語亦係指減緩疾病、病症或病狀之進展，或抑制其進展至有害或非所需狀態。
如本文中所使用之術語「需要預防」係指由 醫師或其他照護者判斷個體需要或將受益於預防性照護。 此判斷係基於醫師或照護者之專長領域中的多種因素而作出。
片語「治療有效量」係指單獨或作為醫藥組成物之一部分且以單次劑量或作為一系列劑量之一部分投與個體之藥劑的量當投與患者時能夠對疾病、病症或病狀之任何症狀、態樣或特徵具有任何可偵測之積極效應。治療有效量可藉由量測相關生理學效應來確定。舉例而言，在高血糖病狀之情況下，可使用血糖之降低或減少或葡萄糖耐受性測試之改良來確定藥劑之量對治療該高血糖病狀是否有效。舉例而言，治療有效量為足以減少或降低空腹血漿葡萄糖(FPG)之任何水準(例如基線水準)的量，其中舉例而言，該量足以將大於200mg/dl之FPG水準減至小於200mg/dl，其中該量足以將介於175mg/dl與200mg/dl之間的FPG水準減至小於起始水準，其中該量足以將介於150mg/dl與175mg/dl之間的FPG水準減至小於起始水準，其中該量足以將介於125mg/dl與150mg/dl之間的FPG水準減至小於起始水準，以此類推(例如將FPG水準減至小於125mg/dl、小於120mg/dl、小於115mg/dl、小於110mg/dl等等)。在HbAIc水準之情況下，有效量為足以使水準減少或降低超過約10%至9%、超過約9%至8%、超過約8%至7%、超過約7%至6%、超過約6%至5%的量，以此類推。更特定言之，本發明涵蓋HbA1c水準減少或降低約0.1%、0.25%、0.4%、0.5%、 0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、1.5%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、33%、35%、40%、45%、50%或更多。可結合給藥方案及對個體病狀之診斷分析及類似因素來調節治療有效量。
片語「以足以實現某一變化之量」意謂在投與特定療法之前(例如基線水準)及之後所量測之指標水準之間存在可偵測之差異。指標包括任何客觀參數(例如葡萄糖或胰島素或食物攝取之水準)或主觀參數(例如個體對健康或食慾之感覺)。
如本文中所使用之片語「葡萄糖耐受性」係指當葡萄糖攝取波動時個體控制血漿葡萄糖及/或血漿胰島素水準之能力。舉例而言，葡萄糖耐受性涵蓋個體在約120分鐘內使血漿葡萄糖水準減至攝取葡萄糖之前所測定之水準的能力。
術語「糖尿病」係指涉及胰島素產生或利用不足之進行性碳水化合物代謝疾病，通常以高血糖及糖尿為特徵。術語「糖尿病前期」係指個體不具有在糖尿病中通常觀測到之特徵、症狀及類似狀態但具有若不加以治療則可能發展成糖尿病之特徵、症狀及類似狀態的狀態。此等狀況之存在可使用例如空腹血漿葡萄糖(FPG)測試或口服葡萄糖耐受性測試(OGTT)來確定。兩者通常皆需要個體在開始測試之前空腹至少8小時。在FPG測試中，在空腹結束之後量測個體之血液葡萄糖；一般而言，個體空腹隔夜且在早晨個體進食之前量測血液葡萄糖。健康個體 一般將具有介於約90與約100mg/dl之間的FPG濃度，患有「糖尿病前期」之個體一般將具有介於約100與約125mg/dl之間的FPG濃度，且患有「糖尿病」之個體一般將具有約126mg/dl以上的FPG水準。在OGTT中，在空腹之後且在飲用富葡萄糖飲料之後兩小時再次量測個體之血液葡萄糖。在消費富葡萄糖飲料之後兩小時，健康個體一般具有約140mg/dl以下之血液葡萄糖濃度，糖尿病前期個體一般具有約140至約199mg/dl之血液葡萄糖濃度，且糖尿病個體一般具有約200mg/dl或200mg/dl以上之血液葡萄糖濃度。儘管上述血糖值係關於人類個體，但在鼠類個體中差異性地定標為正常高血糖、適度高血糖及明顯高血糖健康鼠類個體在四小時空腹之後一般將具有介於約100與約150mg/dl之間的FPG濃度，患有「糖尿病前期」之鼠類個體一般將具有介於約175與約250mg/dl之間的FPG濃度，且患有「糖尿病」之鼠類個體一般將具有約250mg/dl以上的FPG濃度。
如本文中所使用之術語「胰島素抗性」係指正常量之胰島素不能產生正常生理或分子反應的病狀。在一些情況下，內源產生或外源投與之高於生理量之胰島素能夠完全或部分地克服胰島素抗性且產生生物反應。
術語「代謝症候群」係指包括但不限於高胰島素血症、異常葡萄糖耐受性、肥胖、脂肪再分佈於腹部或上體腔、高血壓、異常纖維蛋白溶解及以高甘油三酯、低高密度脂蛋白(HDL)-膽固醇及高小緻密低密度脂蛋白 (LDL)顆粒為特徵之血脂異常的相關特質分群。患有代謝症候群之個體處在發展2型糖尿病及/或其他病症(例如動脈粥樣硬化)之風險下。
片語「葡萄糖代謝異常」涵蓋以與相對於健康個體，個體葡萄糖水準升高及/或胰島素水準升高相關之臨床症狀或臨床症狀組合為特徵的任何異常。葡萄糖及/或胰島素水準升高可尤其體現於以下疾病、病症及病狀中：高血糖症、II型糖尿病、妊娠期糖尿病、I型糖尿病、胰島素抗性、葡萄糖耐受性不良、高胰島素血症、葡萄糖代謝不良、糖尿病前期、其他代謝異常(諸如代謝症候群，其亦稱為症候群X)及肥胖。本發明之多肽及其組成物可以用於例如達成及/或維持葡萄糖動態平衡，例如使血流中之葡萄糖水準減少及/或使胰島素水準減少至健康個體中所發現之範圍。
如本文中所使用之術語「高血糖」係指相對於健康個體，升高量之葡萄糖在個體之血漿中循環的病狀。高血糖可使用此項技術中已知的方法來診斷，包括量測如本文中所描述之空腹血糖水準。
如本文中所使用之術語「高胰島素血症」係指當伴隨血液葡萄糖水準升高或正常時存在升高水準之循環胰島素的病狀。高胰島素血症可由與以下各項相關之胰島素抗性造成：血脂異常，諸如高甘油三酯、高膽固醇、高低密度脂蛋白(LDL)及低高密度脂蛋白(HDL)；高尿酸水準；多囊卵巢症候群；II型糖尿病；及肥胖。高胰島素 血症可診斷為具有高於約2μU/mL之血漿胰島素水準。
如本文中所使用，片語「體重異常」係指與體重過度及/或食慾增強相關之病狀。使用各種參數來確定個體與參考健康個體相比是否過重，包括個體之年齡、身高、性別及健康狀態。舉例而言，個體可藉由評定個體之身體質量指數(BMI)而被視為過重或肥胖，該身體質量指數係藉由個體之體重(公斤)除以個體身高(米)之平方來計算。具有在約18.5至約24.9kg/m2範圍內之BMI的成人被視為具有正常體重；具有介於約25與約29.9kg/m2之間的BMI的成人被視為過重(肥胖前期)；且具有約30kg/m2或更高BMI之成人被視為肥胖。食慾增強往往促成過度體重。存在若干種與食慾增強相關之病狀，包括例如夜間進食症候群，其特徵在於往往與失眠相關之早晨厭食及傍晚貪食，但其可能與對下視丘之損傷有關。
術語「活性劑」係指例如刺激、增加、活化、促進、增強活化、致敏或上調一或多種藥劑之功能或活性的藥劑，例如用於治療或預防代謝異常之多肽。另外，活性劑包括藉由與本發明多肽相同之作用機制起作用(即，以類似於該多肽之方式調節與該多肽相同之信號傳導途徑的藥劑)且能夠引發與該多肽相當(或更大)之生物反應的藥劑。活性劑之實例包括促效劑，諸如小分子化合物。
術語「調節劑」總體上係指本發明多肽及活性劑。
術語「調節」及類似術語係指藥劑(例如活性劑)直接或間接地增加一或多種多肽(或編碼其之核酸分子)功能或活性的能力；或藥劑產生與一或多種多肽相當之效應的能力。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換用於指任何長度之胺基酸的聚合形式，其可包括基因編碼及非基因編碼之胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生化之胺基酸，及具有經修飾之多肽骨架的多肽。該等術語包括融合蛋白質，包括但不限於具有異源胺基酸序列之融合蛋白質、具有異源及同源前導序列且有或無N末端甲硫胺酸殘基之融合蛋白質；經免疫標記之蛋白質；及其類似物。在特定實施例中，該等術語係指任何長度之胺基酸的多聚形式，該等胺基酸包括基因編碼胺基酸。在特定實施例中，該等術語係指任何長度之胺基酸的多聚形式，該等胺基酸包括與異源胺基酸序列融合之基因編碼胺基酸。在特定實施例中，該等術語係指視情況與異源序列融合的112個胺基酸長的胺基酸。在特定實施例中，視情況而定，當提及本文中所揭示及描述之蛋白質及分子時，術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」係指如本文中所定義之多肽。
應瞭解，在本發明全文中，根據單字母或三字母代碼參考胺基酸。為方便讀者，以下提供單字母及三字母胺基酸代碼：
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如本文中所使用，術語「變異體」涵蓋天然存在之變異體(例如同系物及等位基因變異體)及非天然存在之變異體(例如，經重組修飾)。天然存在之變異體包括同系物，亦即，在一個物種與另一物種之間分別在核苷酸或胺基酸序列方面不同的核酸及多肽。天然存在之變異體包括等位基因變異體，亦即在某一物種內之一個體與另一個體之間分別在核苷酸或胺基酸序列方面不同的核酸及多肽。非天然存在之變異體包括分別在核苷酸或胺基酸序列中包含變化之核酸及多肽，其中該序列變化係人工引入，例如，該變化係在實驗室或其他設施中由人類干預(「人工」)而產生。
術語「天然」或「野生型」在參考GDF15時係指天然存在之生物學活性GDF15，包括天然存在之生物學活性GDF15變異體。該術語包括112個胺基酸之人類GDF15成熟序列(SEQ ID NO：1)。
如本文中所使用之術語「突變蛋白」在廣義上指重組蛋白，亦即，在胺基酸序列中包含人工引入之變化，例如在實驗室或其他設施中藉由人類干預("人工")在胺基酸序列中產生之變化的多肽。此等多肽通常攜帶單個或多個胺基酸取代或缺失，且通常來源於已進行定點突變誘發或隨機突變誘發之選殖基因或來源於完全合成之基因。因而相對於參考多肽，例如相對於成熟人類GDF15(SEQ ID NO：1)，本發明之「GDF15突變蛋白」涵蓋例如胺基酸取代及/或胺基酸缺失(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個或更多個胺基酸之N末端截短)。
如本文中參考天然人類GDF15或GDF15突變蛋白所使用，術語「經修飾」、「修飾」及類似術語係指改變人類GDF15、天然存在之GDF15變異體或GDF15突變蛋白之性質的一或多個變化，其中該變化不改變GDF15之原生胺基酸序列。此種性質包括例如溶解度、循環半衰期、穩定性、清除率、免疫原性或致過敏性及可製造性(例如成本及效率)。「修飾」包括不改變GDF15多肽(天然或突變蛋白)本身之原生胺基酸序列的共價化學修飾。對人類GDF15、天然存在之GDF15變異體或GDF15突變蛋白可進行之變化包括但不限於聚乙二醇化(一或多個聚乙二醇(PEG)分子或其衍生物之共價連接)；糖基化(例如N-糖基化)、聚唾液酸化及羥乙基澱粉化；麥芽糖結合蛋白融合；白蛋白融合(例如HSA融合)；經由例如結合之脂 肪酸鏈的白蛋白結合(醯化)；Fc融合；及與PEG模擬物融合。一些特定實施例需要涉及聚乙二醇之修飾，其他特定實施例需要涉及白蛋白之修飾，且其他特定修飾需要涉及糖基化之修飾，或其組合。
術語「DNA」、「核酸」、「核酸分子」、「聚核苷酸」及類似術語在本文中可互換用於指任何長度之核苷酸(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物)的聚合形式。聚核苷酸之非限制性實例包括線性及環形核酸、信差RNA(mRNA)、互補DNA(cDNA)、重組聚核苷酸、載體、探針、引物及其類似物。
術語「探針」係指對應於相關基因或序列之DNA或RNA片段，其中該片段已經放射性標記(例如，藉由併入32P或35S)或一些其他可偵測分子，諸如生物素、地高辛(digoxygenin)或螢光素。由於具有互補序列之DNA或RNA延伸物將雜交，故可使用探針，例如，以標記含有相關基因之病毒斑、細菌群落或凝膠譜帶。探針可為選殖DNA，或其可為合成DNA股鏈；後者可用於藉由例如對蛋白質之一部分進行微量測序、推斷編碼該蛋白質之核酸序列、合成攜帶該序列之寡核苷酸、對該序列進行放射性標記及使用其作為探針來篩選cDNA庫或基因組庫而自分離之蛋白質獲得cDNA或基因組純系。
術語「異源」係指兩種組分由來源於不同來源之結構限定。舉例而言，在多肽之情形下，「異源」多肽可包括來源於不同的多肽的可操作地連接之胺基酸序列 (例如，第一組分包含重組多肽，而第二組分來源於天然GDF15多肽)。類似地，在編碼嵌合多肽之聚核苷酸的情形下，「異源」聚核苷酸可包括可來源於不同的基因的可操作地連接之核酸序列(例如，第一組分來自編碼根據本文中所揭示之一實施例之多肽的核酸，而第二組分來自編碼載體多肽之核酸)。其他例示性「異源」核酸包括包含包含編碼序列之核酸可操作地連接於來自不同於該編碼序列之基因來源(例如，以便在相關宿主細胞中表現，其可能屬於不同於該啟動子、該編碼序列或兩者之基因來源)的調節元件(例如啟動子)的表現構築體。舉例而言，可操作地連接於編碼GDF15多肽或其結構域之聚核苷酸的T7啟動子稱為異源核酸。在重組細胞之情形下，「異源」可指存在屬於不同於其所存在之宿主細胞的基因來源的核酸(或基因產物，諸如多肽)。
術語「可操作地連接」係指用於提供所要功能之分子間鍵聯。舉例而言，「可操作地連接」在核酸之情形下係指核酸序列之間的功能鍵聯。舉例而言，核酸表現控制序列(諸如啟動子、信號序列或轉錄因子結合位點陣列)可能可操作地連接於第二聚核苷酸，其中該表現控制序列影響第二聚核苷酸之轉錄及/或轉譯。在多肽之情形下，「可操作地連接」係指用於提供多肽之所描述活性的胺基酸序列(例如不同的結構域)間功能鍵聯。
如本文中所使用，在多肽結構之情形下，「N末端」(或「胺基末端」)及「C末端」(或「羧基末端」) 分別係指最終胺基及羧基端，而術語「N末端」及「C末端」分別係指在多肽之胺基酸序列中的相對位置接近N末端及C末端，且分別可包括N末端及C末端上之殘基。 「緊鄰N末端」或「緊鄰C末端」係指第一胺基酸殘基相對於第二胺基酸殘基之位置，其中該第一胺基酸殘基及該第二胺基酸殘基共價結合以提供連續胺基酸序列。
「來源於」在胺基酸序列或聚核苷酸序列之情形下(例如，「來源於」GDF15多肽之胺基酸序列)意欲指示該多肽或核酸具有基於參考多肽或核酸(例如，天然存在之GDF15多肽或GDF15編碼核酸)之序列，而不欲限制產生蛋白質或核酸之來源或方法。舉例而言，術語「來源於」包括參考胺基酸或DNA序列之同系物或變異體。
在多肽之情形下，術語「經分離」係指若天然存在則處在不同於其可天然存在之環境中的相關多肽。「經分離」意欲包括實質上富含相關多肽及/或相關多肽部分地或實質上經純化之樣品內的多肽。在多肽非天然存在之情況下，「經分離」指示該多肽已與藉由合成或重組手段產生其之環境分離。
「富含」意謂樣品經非天然處置(例如在實驗室中，例如由科學家或臨床醫師)，使得相關多肽以如下濃度存在：a)比起始樣品，諸如生物樣品(例如多肽天然存在或多肽在投藥後存在之樣品)中之多肽濃度高(例如高至少3倍、高至少4倍、高至少8倍、高至少64倍或更高)的濃度，或b)比產生多肽之環境(例如，如在細菌細胞中) 高的濃度。
「實質上純」指示組分(例如，多肽)組成組成物之總含量的約50%以上，且典型地大於總多肽含量之約60%。更典型地，「實質上純」係指總組成物之至少75%、至少85%、至少90%或更多為相關組分的組成物。 在一些情況下，該多肽將組成組成物之總含量之大於約90%或大於約95%。
術語「抗體」(Ab)及「免疫球蛋白」(Ig)係指具有相同結構特徵之糖蛋白。儘管抗體對特定抗原展現結合特異性，但免疫球蛋白包括抗體及缺乏抗原特異性之其他抗體樣分子。下文詳細描述抗體。
術語「單株抗體」係指獲自實質上同源之抗體群體的抗體，亦即，構成該群體之個別抗體為同一的，但可能存在微量的可能天然存在之突變。單克隆抗體具有高特異性，針對單一抗原位點。與可包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。
在抗體之情形下，術語「經分離」係指已與其天然環境之污染組分分離及/或自其中回收之抗體；此種污染組分包括可能干擾抗體之診斷或治療用途的材料，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶解物。
片語「保守胺基酸取代」係指對以下各組內之胺基酸殘基的取代：1)L、I、M、V、F；2)R、K；3)F、Y、H、W、R；4)G、A、T、S；5)Q、N；及6)D、 E。保守胺基酸取代可藉由以含具有類似酸度、鹼度、電荷、極性或側鏈尺寸之側鏈的胺基酸置換蛋白質中之胺基酸來保留蛋白質之活性。對取代、插入或缺失之指導可基於對來自不同物種之不同變異蛋白質之胺基酸序列的比對。
生長分化因子15(GDF15)
GDF15，亦稱為MIC-1(巨噬細胞抑制細胞因子-1)、PDF(前列腺分化因子)、PLAB(胎盤骨形态發生蛋白)、NAG-1(非類固醇消炎藥(NSAID)活化基因)、TGF-PL及PTGFB，為轉型生長因子β(TGF-β)超家族之成員。GDF15分泌為25kDa二硫連接之蛋白質，其合成為62kDa細胞內前驅蛋白，隨後由弗林蛋白酶樣蛋白酶裂解。[參見例如Fairlie等人，J.Leukoc.Biol 65：2-5(1999)]。GDF15 mRNA見於若干組織中，包括肝臟、腎臟、胰臟、結腸及胎盤，且肝臟中之GDF15表現在諸如肝臟、腎臟、心臟及肺之器官損傷期間可顯著上調。
GDF15前驅體為含有具有29個胺基酸之信號肽、具有167個胺基酸之前結構域及由弗林蛋白酶樣蛋白酶自前結構域切除之具有112個胺基酸之成熟結構域的具有308個胺基酸之多肽(NCBI參考序列NP_004855.2)。308個胺基酸之GDF15多肽稱為「全長」GDF15多肽；112個胺基酸之GDF15多肽(「全長」GDF15多肽之胺基酸197至308)為「成熟」GDF15多肽(SEQ ID NO：1)。除 非另外指示，否則術語「GDF15」係指112個胺基酸之成熟人類序列。另外，參考特定GDF15殘基之數字係指112個胺基酸之成熟序列(即，殘基1為Ala(A)，且殘基112為Ile(I)；參見SEQ ID NO：1)。值得注意的是，儘管GDF15前驅胺基酸序列預計三個切除位點，從而產生「成熟」人類GDF15之三種推定形式(亦即，110、112及115個胺基酸)，但112個胺基酸之成熟序列被視為正確的。
本發明之範圍包括來自其他哺乳動物物種之GDF15異種同源物及其經修飾形式及其用途，包括小鼠(NP_035949)、黑猩猩(XP_524157)、猩猩(XP_002828972)、恆河猴(EHH29815)、大貓熊(XP_002912774)、長臂猿(XP_003275874)、豚鼠(XP_003465238)、白鼬(AER98997)、奶牛(NP_001193227)、豬(NP_001167527)、狗(XP_541938)及鴨嘴獸(鴨嘴獸屬；AFV61279)。人類GDF15之成熟形式與小鼠異種同源物具有約67%胺基酸同一性。
為方便起見，下文所描述之經修飾之人類GDF15分子、GDF15變異體(例如突變蛋白)及經修飾之GDF15突變蛋白總體上稱為「多肽」。應注意，結合本發明之多肽及核酸分子對「人類」之任何引用均不欲限制多肽或核酸之獲得方式或來源，而是僅在其可能對應於天然存在之人類多肽或核酸分子之序列時參考該序列。在特定實施例中，該等經修飾之人類GDF15分子為N糖基化二聚體。在特定實施例中，該等經修飾之人類GDF15分子 為N糖基化同源二聚體。除人類多肽及編碼其之核酸分子以外，本發明亦涵蓋GDF15相關多肽及來自其他物種之相應核酸分子。
A.具有所要物理性質之多肽
本發明部分涵蓋包括與SEQ ID NO：1(112個胺基酸長之成熟人類GDF15)之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之連續胺基酸序列的多肽。相對於SEQ ID NO：1之胺基酸序列，該等多肽可包括一或多個胺基酸取代及/或缺失。在某些實施例中，相對於SEQ ID NO：1之胺基酸序列，除胺基酸取代以外，本發明之多肽亦可包括胺基酸缺失。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO：1之胺基酸序列，本發明之多肽可包括胺基酸缺失。
為方便及清楚起見，使用SEQ ID NO：1之胺基酸序列作為本文中所提供之多肽的參考序列。因此，在本文中參考SEQ ID NO：1對胺基酸殘基位置進行編號。以下提供SEQ ID NO：1之序列：ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
在一些實施例中，本發明之多肽可包括一、二、三或更多個胺基酸取代、添加或缺失從而在SEQ ID NO：1中不存在N連接之糖基化一致位點的位置上引入一 或多個此種位點。N連接之糖基化一致位點包括序列NXS/T，其中N為Asn；X為除脯胺酸以外之胺基酸；隨後為Ser(S)或Thr(T)。
本發明多肽之實例包括在SEQ ID NO：1之胺基酸序列中不存在糖基化一致位點(例如，N連接之糖基化一致位點)的胺基酸位置上具有一、二、三、四或更多個此種位點的多肽。
在某些實施例中，相對於SEQ ID NO：1，該多肽可包括胺基酸取代從而在取代位置上提供一個N連接之糖基化一致位點(例如，可藉由一個取代將SEQ ID NO：1中之NGD序列變成NGT/S；取代位置加下劃線)。在其他情況下，相對於SEQ ID NO：1，該多肽可包括兩個胺基酸取代從而在取代位置上提供一個N連接之糖基化一致位點(例如，可藉由兩個取代將SEQ ID NO：1中之KTD序列變成NTT/S；取代位置加下劃線)。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO：1，該多肽可包括三個胺基酸取代從而在取代位置上提供一個N連接之糖基化一致位點(例如，可藉由三個取代將SEQ ID NO：1中之GPG序列變成NTT/S；取代位置加下劃線)。
在某些實施例中，相對於SEQ ID NO：1，該多肽可包括一或多個胺基酸缺失從而在缺失位置上提供N連接之糖基化一致位點。舉例而言，SEQ ID NO：1中之NGDHCPLGPGRCCRLHT序列可藉由缺失胺基酸D至H(加下劃線)而得以改變，從而提供N連接之糖基化一致位 點：NGT。
在某些實施例中，相對於SEQ ID NO：1，該多肽可包括一或多個胺基酸添加從而在添加位置上提供N連接之糖基化一致位點。藉由添加一個胺基酸來引入N連接之糖基化一致位點的實例包括向SEQ ID NO：1中之序列LHT添加N，從而產生序列LNHT，其中NHT為N連接之糖基化一致位點。
如上所述，相對於SEQ ID NO：1，該多肽可包括一或多個取代且該等取代可編號為SEQ ID NO：1中相應胺基酸之位置。
在某些實施例中，該多肽可包括與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的連續胺基酸序列，其中相對於SEQ ID NO：1中之相應胺基酸，該連續胺基酸序列具有以下成對取代中的至少一種：
i)D5T及R21N或D5S及R21N；
ii)R16N及H18T或R16N及H18S；
iii)S23N及E25T或S23N及E25S；
iv)L24N及D26T或L24N及D26S；
v)S50N及F52T；S50N及F52S；F52N及A54T；或F52N及A54S；
vi)Q51N及R53T；Q51N及R53S；R53N及A55T；或R53N及A55S
vi)S64N及H66T或S64N及H66S；
vii)L65N及R67T或L65N及R67S；
viii)S82N及N84T或S82N及N84S；
ix)K91N及D93T；K91N及D93S；D93N及G95T；或D93N及G95S；
x)T94N及V96T；T94N及V96S；V96N及L98T；或V96N及L98S；
xi)S97N及Q99T或S97N及Q99S；以及
xii)A106N及D108T或A106N及D108S。
舉例而言，以上i)中之取代表示該多肽在對應於SEQ ID NO：1中之胺基酸位置5的胺基酸位置上具有酥胺酸(T)或絲胺酸(S)，其中在SEQ ID NO：1中，該胺基酸位置5上存在天冬醯胺(D)。以T或S取代位置5上之D可由D5T/S表示。相對於SEQ ID NO：1，多肽中之相應胺基酸之位置可藉由比對胺基酸序列來確定。
在某些實施例中，該多肽可包括在SEQ ID NO：1中不存在N糖基化一致序列之位置上提供單一N糖基化一致序列的兩個胺基酸取代(成對取代)。此種取代之實例包括R16N及H18T/S；K91N及D93T/S；T94N及V96T/S；及以上列出之其他取代。R16N及H18T/S表示該多肽在對應於SEQ ID NO：1之位置16的位置上具有N，其中在SEQ ID NO：1中存在R，且該多肽在對應於SEQ ID NO：1之位置18的位置上具有T或S，其中存在H。由於SEQ ID NO：1中之序列RXH(在位置16至18上)不包括N連接之糖基化一致序列的任何殘基，故成對 取代使得引入N連接之糖基化一致序列。
在替代實施例中，單一胺基酸取代可能足以提供N連接之糖基化一致序列，舉例而言，由於SEQ ID NO：1中存在序列NGD(在位置3至5上)，故以T或S對D進行單一取代分別產生序列NGT或NGS，兩者皆為N糖基化一致序列。
在某些情況下，可向野生型GDF15中引入多於一個N糖基化一致序列。舉例而言，野生型GDF15胺基酸序列可藉由取代及/或缺失以提供一、二、三、四或更多個N糖基化一致序列而經修飾。在某些實施例中，該多肽可包括112個連續胺基酸，其與SEQ ID NO：1之112個胺基酸序列具有至少90%之序列同一性，其中該112個連續胺基酸包括一、二、三、四或更多個N糖基化一致序列，諸如1-12、1-10、1-8、1-6、1-4、1-3或1-2個N糖基化一致序列。
具有兩個N糖基化一致序列之多肽的一個實例包括在位置5上(相對於SEQ ID NO：1)具有T/S且在位置21上(相對於SEQ ID NO：1)具有N的GDF15突變蛋白。
本發明之例示性多肽包括具有兩個或更多個N連接之糖基化一致序列的多肽。舉例而言，該多肽可包括以下成對取代中之兩個或更多個的組合：i)D5T及R21N或D5S及R21N；ii)R16N及H18T或R16N及H18S； iii)S23N及E25T或S23N及E25S；iv)L24N及D26T或L24N及D26S；v)S50N及F52T；S50N及F52S；或F52N及A54T；或F52N及A54S；vi)Q51N及R53T；Q51N及R53S；或R53N及A55T；或R53N及A55S；vi)S64N及H66T；或S64N及H66S；vii)L65N及R67T；或L65N及R67S；viii)S82N及N84T或S82N及N84S；ix)K91N及D93T；K91N及D93S；或D93N及G95T；或D93N及G95S；x)T94N及V96T；T94N及V96S；或V96N及L98T；或V96N及L98S；xi)S97N及Q99T；或S97N及Q99S；及xii)A106N及D108T或A106N及D108S。
在某些實施例中，該多肽可包括與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的連續胺基酸序列，其中相對於SEQ ID NO：1中之相應胺基酸，該連續胺基酸序列具有以下成對取代中的至少一種：i)D5T及R21N或D5S及R21N；ii)R16N及H18T或R16N及H18S；iii)S23N及E25T或S23N及E25S；iv)S50N及F52T；S50N及F52S；F52N及A54T；或 F52N及A54S；v)Q51N及R53T；Q51N及R53S；R53N及A55T；或R53N及A55S；vi)S64N及H66T；或S64N及H66S；vii)K91N及D93T；K91N及D93S；D93N及G95T；或D93N及G95S；viii)T94N及V96T；T94N及V96S；V96N及L98T；或V96N及L98S；ix)S97N及Q99T；或S97N及Q99S；以及x)A106N及D108T或A106N及D108S；其中該取代產生一個或多個具有序列NXS/T之N連接之糖基化一致位點，其中N為Asn；X為除脯胺酸以外的胺基酸；隨後為Ser(S)或Thr(T)，且此外其中一個或多個N連接之糖基化一致位點連接於N聚糖。在另一實施例中，該多肽形成二聚體。在另一實施例中，該多肽相對於SEQ ID NO：1具有N末端截短及/或C末端截短。相對於參考多肽，例如SEQ ID NO：1，該等截短可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多個胺基酸。在一特定實施例中，該多肽具有GDF15中前三個N末端殘基截短(△ARN或△N3)。在另一實施例中，該多肽在緩衝溶液中具有至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml之溶解度，例如 在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml範圍內之溶解度。在某些情況下，該多肽在緩衝溶液中具有至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml之溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml範圍內之溶解度。該緩衝液可為磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液或類似緩衝液或其組合。在某些情況下，該緩衝液可包括磷酸鹽緩衝鹽水。在某些情況下，該緩衝液可包括Tris、磷酸鉀及氯化鈉。在一些情況下，該緩衝液可包括Tris、磷酸鉀、氯化鈉及甲酸。舉例而言，該緩衝液可包括10mM至100mM Tris pH 7、1mM至50mM磷酸鉀、100mM至200mM氯化鈉及10mS/cm至30mS/cm甲酸。在其他實施例中，該多肽使血液葡萄糖水准、體重及/或食物攝取與投與該多肽之前相比降低至少10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%或90%。
在某些實施例中，該多肽可包括與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的連續胺基酸序列，其中相對於SEQ ID NO：1中之相應胺基酸，該連續胺基酸序列具有以下成對取代中的至少一種：i)D5T及R21N；ii)S23N及E25T；iii)F52N及A54T；iv)R53N及A55T；v)S64N及H66T；vi)K91N及D93T；vii)D93N及G95T；viii)S97N及Q99T；以及ix)A106N及D108T；其中該取代產生一個或多個具有序列NXS/T之N連接之糖基化一致位點，其中N為Asn；X為除脯胺酸以外的胺基酸；隨後為Ser(S)或Thr(T)，且此外其中一個或多個N連接之糖基化一致位點連接於N聚糖。在另一實施例中，該多肽形成二聚體。在另一實施例中，該多肽相對於SEQ ID NO：1具有N末端截短及/或C末端截短。相對於參考多肽，例如SEQ ID NO：1，該等截短可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多個胺基酸。在一特定實施例中，該多肽具有GDF15中前三個N末端殘基截短(△ARN或△N3)。在另一實施例中，該多肽在緩衝溶液中具有至少0.5mg/ml，例如至少1 mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml之溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml範圍內之溶解度。在某些情況下，該多肽在緩衝溶液中具有至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml之溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml範圍內之溶解度。該緩衝液可為磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液或類似緩衝液或其組合。在某些情況下，該緩衝液可包括磷酸鹽緩衝鹽水。在某些情況下，該緩衝液可包括Tris、磷酸鉀及氯化鈉。在一些情況下，該緩衝液可包括Tris、磷酸鉀、氯化鈉及甲酸。舉例而言，該緩衝液可包括10mM至100mM Tris pH 7、1mM至50mM磷酸鉀、100mM至200mM氯化鈉及10mS/cm至30mS/cm甲酸。在其他實施例中，該多肽使血液葡萄糖水准、體重及 /或食物攝取與投與該多肽之前相比降低至少10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%或90%。在特定實施例中，該多肽包含以下各項或基本上由其組成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：30。在特定實施例中，該多肽包含以下各項或基本上由其組成：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：100。在某些實施例中，該多肽可包括與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少95%同一性的連續胺基酸序列，其中相對於SEQ ID NO：1中之相應胺基酸，該連續胺基酸序列具有以下成對取代中的至少一種：i)D5T及R21N；ii)S64N及H66T；iii)K91N及D93T；iv)D93N及G95T；以及v)S97N及Q99T；其中該取代產生一個或多個具有序列NXS/T之N連接之糖基化一致位點，其中N為Asn；X為除脯胺酸以外的胺基酸；隨後為Ser(S)或Thr(T)，其中一個或多個N連接之糖基化一致位點連接於N聚糖；此外，其中該多肽形成二聚體；且此外，其中該多肽在緩衝溶液中具有至少1mg/ml之 溶解度。
在其他實施例中，該多肽在緩衝溶液中具有至少5mg/ml之溶解度。該緩衝液可為磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液或類似緩衝液或其組合。在某些情況下，該緩衝液可包括磷酸鹽緩衝鹽水。在某些情況下，該緩衝液可包括Tris、磷酸鉀及氯化鈉。在一些情況下，該緩衝液可包括Tris、磷酸鉀、氯化鈉及甲酸。舉例而言，該緩衝液可包括10mM至100mM Tris pH 7、1mM至50mM磷酸鉀、100mM至200mM氯化鈉及10mS/cm至30mS/cm甲酸。在其他實施例中，該多肽使血液葡萄糖水准、體重和/或食物攝取與投與該多肽之前相比降低至少10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%或90%。在另一實施例中，該多肽相對於SEQ ID NO：1具有N末端截短及/或C末端截短。相對於參考多肽，例如SEQ ID NO：1，該等截短可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多個胺基酸。在一特定實施例中，該多肽具有GDF15中前三個N末端殘基截短(△ARN或△N3)。在特定實施例中，該多肽包含以下各項或基本上由其組成：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：30。在特定實施例中，該多肽包含以下各項或基本上由其組成：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：100。
在某些實施例中，該多肽可包括與SEQ ID NO：1之112個胺基酸序列具有至少90%之序列同一性的112個連續胺基酸，其中該112個連續胺基酸包括上述成對取代中的一、二、三、四或更多種。
圖1描繪本發明涵蓋之例示性多肽(編號1至17)的胺基酸序列與野生型成熟人類GDF15(WT hGDF15；SEQ ID NO：1)之胺基酸序列的比對。在圖1中，描繪包括兩個N連接之糖基化一致位點的多肽(編號為1的突變體；SEQ ID NO：2)以及包括一個N連接之糖基化一致位點的多肽(編號為2至17的突變體；分別為SEQ ID NO：3至18)。
在某些實施例中，本發明涵蓋經修飾之GDF15 N糖基化二聚體，其中該二聚體包含彼此共價接合的本文中所揭示之兩個多肽。在特定實施例中，該兩個多肽各自包含選自以下的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：30，或相差至多5個胺基酸之胺基酸；其中該等多肽含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。在特定實施例中，該兩個多肽各自包含選自以下的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：30，或相差至多2個胺基酸之胺基酸；其中 該等多肽含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。在特定實施例中，該兩個多肽各自由選自以下的胺基酸序列組成：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：100，或相差至多5個胺基酸之胺基酸；其中該等多肽含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。在特定實施例中，該兩個多肽各自由選自以下的胺基酸序列組成：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：100，或相差至多2個胺基酸之胺基酸；其中該等多肽含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。在其他實施例中，該經修飾之GDF15 N糖基化二聚體為由鏈間二硫鍵接合之同源二聚體。在其他實施例中，該經修飾之GDF15 N糖基化二聚體為具有兩個如本文中所揭示之多肽的同源二聚體，各多肽包含相同之胺基酸序列，其中該等多肽含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。
本發明亦涵蓋作為上述多肽之活性片段(例如子序列)的多肽。活性片段或子序列之長度可為40個胺基酸至111個胺基酸，例如40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、98、106、109或直至111個胺基酸。
該多肽與參考序列相比在所定義長度之連續 胺基酸(例如「比較窗」)上具有所定義之序列同一性。用於比較之序列比較方法在此項技術中為熟知的。藉由以下方式進行用於比較之最佳序列比對，例如：藉由Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.2：482(1981)之局部同源性算法、藉由Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之同源性比對算法、藉由Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之相似性檢索法、藉由電腦實施此等算法(Wisconsin Genetics Software Package(Madison，Wis.)中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由手工比對及直觀檢查(參見例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編，1995年增刊))。
舉例而言，適合之多肽可包含與SEQ ID NO：1中之40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或直至112個胺基酸的連續延伸物具有至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。
本文中所揭示之多肽的例示性片段包括相對於SEQ ID NO：1具有胺基酸缺失的多肽。舉例而言，該等多肽相對於SEQ ID NO：1可具有N末端截短及/或C末端截短。相對於參考多肽，例如SEQ ID NO：1，該等截短可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多個胺基酸。在某些實施例中，相對於SEQ ID NO：1，相關多肽可包括引入N連接之糖基化一致序列(諸如本 文中所揭示者)的一或多個取代及N末端截短及/或C末端截短。
在某些實施例中，該多肽可為至少98個胺基酸長且與SEQ ID NO：1中98個胺基酸之相應延伸物具有至少90%之胺基酸序列同一性。此多肽可能缺乏SEQ ID NO：1之N末端上所存在的前三個至前十四個胺基酸(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸)，而保留SEQ ID NO：1之C末端上所存在的胺基酸。換言之，所缺失之胺基酸對應於SEQ ID NO：1之N末端胺基酸。
在某些實施例中，該GDF15突變蛋白可為至少106個胺基酸長且與SEQ ID NO：1中106個胺基酸之相應延伸物具有至少90%之胺基酸序列同一性。該GDF15突變蛋白可能缺乏SEQ ID NO：1之N末端上所存在的前六個胺基酸。
在某些實施例中，該多肽可為至少109個胺基酸長且與SEQ ID NO：1中109個胺基酸之相應延伸物具有至少90%之胺基酸序列同一性。該GDF15突變蛋白可能缺乏SEQ ID NO：1之N末端上所存在的前三個胺基酸。
本發明之例示性多肽描繪於圖2中。圖1中所描繪之例示性多肽(編號1至17)與WT hGDF15具有相同長度。圖2中所描繪之例示性多肽(編號18至34；SEQ ID NO：19-35)為109個胺基酸長，因為相對於WT hGDF15，其包括三個N末端胺基酸缺失(△N3)。然而，當係指胺基酸取代之位置時，所指示之殘基編號為對應於WT成熟hGDF15(WT；SEQ ID NO：1)中之位置的編號。 因而，該多肽之N末端上的胺基酸G被稱為殘基4，但其為多肽胺基酸序列中之第一胺基酸。
如上所述，相對於SEQ ID NO：1之序列，此等多肽片段可包括一或多個引入N糖基化一致序列之胺基酸取代，諸如本文中所揭示之一、二或更多個胺基酸取代。
如上文所指示且如下文更詳細描述，本發明之多肽可藉由例如以下方式而經修飾：聚乙二醇化(一或多個聚乙二醇(PEG)分子或其衍生物之共價連接)；糖基化(例如N-糖基化)；聚唾液酸化；白蛋白融合分子，其包含血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)、犬血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))；經由例如結合之脂肪酸鏈的白蛋白結合(醯化)；Fc融合；及與PEG模擬物融合。在某些實施例中，以位點特異性方式引入修飾。在其他實施例中，該等修飾包括連接子。該連接子可使修飾部分與該多肽結合。
在特定實施例，本發明涵蓋藉由與白蛋白結合對成熟人類GDF15及GDF15突變蛋白(諸如上述多肽)之修飾。在其他實施例中，本發明涵蓋經由N糖基化或O糖基化對多肽之修飾。下文進一步描述白蛋白及其多肽結合物(例如融合蛋白質)及糖基化多肽之特徵。
用於修飾及/或模擬GDF15功能之特定修飾
多肽可包括一或多個增強經調配以用於療法之蛋白質所需之性質(例如血清半衰期)、使得能夠產生用於偵測分析之抗體(例如抗原決定基標簽)、容易進行蛋白質純化的修飾。此種修飾包括但不限於聚乙二醇化(一或多個聚乙二醇(PEG)分子或其衍生物之共價連接)；糖基化(N連接及O連接)；聚唾液酸化；白蛋白融合；經由例如結合之脂肪酸鏈的白蛋白結合(醯化)；Fc融合蛋白質；及與PEG模擬物融合。
如本文中所闡述，本發明涵蓋包含成熟GDF15多肽(例如，成熟人類GDF15)或GDF15突變蛋白多肽(例如，成熟人類GDF15之突變蛋白)之融合分子，其中該成熟GDF15多肽或GDF15突變蛋白多肽包含至少一個不改變其胺基酸序列之修飾，且其中該修飾改良該多肽或該突變蛋白多肽之至少一種物理性質。在一個實施例中，該GDF15多肽或GDF15突變蛋白多肽修飾包含與血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HSA)、犬血清白蛋白或牛血清白蛋白(BSA))結合。在一些實施例中，該物理性質為溶解度。
在該融合分子包含與白蛋白結合之經修飾GDF15多肽或GDF15突變蛋白(諸如以上所揭示之多肽)的實施例中，相對於未結合之重組人類GDF15，該融合分子之溶解度一般得以改良。在某些實施例中，該融合分子 在pH 7.0之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中具有至少1mg/mL之溶解度。在其他實施例中，該融合分子具有至少2mg/mL、至少3mg/mL、至少4mg/mL或至少5mg/mL之溶解度。在其他實施例中，該融合分子在pH 7.0之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中具有至少6mg/mL、至少7mg/mL、至少8mg/mL、至少9mg/mL或至少10mg/mL之溶解度。在特定實施例中，該融合分子具有大於10mg/mL之溶解度。
聚乙二醇化：蛋白質治療劑之臨床效果往往受短血漿半衰期及對蛋白酶降解之敏感性限制。對各種治療蛋白質(例如非格司亭)之研究已顯示，該等困難可藉由各種修飾來克服，包括將該多肽序列結合或連接於多種非蛋白質聚合物中之任一種，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯(參見例如，典型地經由與蛋白質及非蛋白質聚合物(例如PEG)共價結合之連接部分)。該等PEG結合之生物分子已顯示具有臨床適用之性質，包括較佳物理及熱穩定性、針對酶促降解敏感性之保護、增加之溶解度、較長活體內循環半衰期及降低之清除率、降低之免疫原性及抗原性，及降低之毒性。
適合於與多肽序列結合之PEG一般在室溫下可溶於水，且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R為氫或諸如烷基或烷醇基之保護基，且其中n為整數1至1000。當R為保護基時，其一般具有1至8個碳。與多肽序列結合之PEG可為線性或分枝的。本發明涵蓋分枝 PEG衍生物「星形PEG」及多臂PEG。本發明中所使用之PEG之分子量不局限於任何特定範圍，但某些實施例具有介於500與20,000之間的分子量，而其他實施例具有介於4,000與10,000之間的分子量。
本發明亦涵蓋其中PEG具有不同的n值且因而各種不同的PEG以特定比率存在之結合物的組合物。 舉例而言，一些組成物包含其中n=1、2、3及4之結合物的混合物。在一些組成物中，n=1之結合物的百分比為18%至25%，n=2之結合物的百分比為50%至66%，n=3之結合物的百分比為12%至16%，且n=4之結合物的百分比為至多5%。該等組成物可藉由此項技術中已知的反應條件及純化方法來製造。舉例而言，可以使用陽離子交換層析來分離結合物，且隨後鑑別含有連接有例如所要數目之PEG之結合物的溶離份，加以純化使得不含未經修飾之蛋白質序列及連接有其他數目之PEG的結合物。
PEG可經由末端反應基團而結合於本發明之多肽。末端反應基團可介導一或多個多肽序列之自由胺基或羧基與聚乙二醇之間的鍵。末端反應基團可連接於離散長度之聚乙二醇間隔基。此等PEG間隔基增加試劑及結合物溶解度、與非PEG間隔基相比使毒性及免疫學效應最小化，且提供若干選項以容納PEG與多肽之間的特定交聯距離。具有反應基團之例示性PEG間隔基包括胺反應性聚乙二醇化交聯劑(例如雙(丁二醯亞胺基)五(乙二醇) BS(PEG)5))；巰基反應性聚乙二醇化交聯劑(1,11-雙順丁烯二醯亞胺基三乙二醇(BM(PEG)3))；雙管能聚乙二醇化交聯劑(NHS-PEGn-順丁烯二醯亞胺丁二醯亞胺基-([N-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基]-乙二醇)酯(SM(PEG)n；n=2至24)。PEG間隔基可結合於自由胺基。PEG間隔基包括N-羥基丁二醯亞胺聚乙二醇，其可藉由用N-羥基丁二醯亞胺活化聚乙二醇丁二酸酯來製備。可與自由胺基結合之另一經活化聚乙二醇為2,4-雙(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪，其可藉由使聚乙二醇單甲基醚與氰尿醯氯反應來製備。與自由羧基結合之經活化聚乙二醇包括聚乙二醇二胺。
一或多個本發明多肽序列與具有間隔基之PEG結合可藉由各種習知方法來進行。舉例而言，該結合反應可利用4：1至30：1之試劑與蛋白質莫耳比，在5至10之pH值下、4℃至室溫之溫度下在溶液中進行30分鐘至20小時。可選擇反應條件以指引反應朝向主要產生所要取代度。一般而言，低溫、低pH值(例如pH=5)及短反應時間傾向於減少所連接之PEG數目，而高溫、中性至高pH值(例如pH
Figure 104124401-A0202-12-0049-219
7)及較長反應時間傾向於增加所連接之PEG數目。此項技術中已知的各種手段均可用於終止反應。在一些實施例中，藉由對反應混合物進行酸化且在例如-20℃下冷凍來終止該反應。
本發明亦涵蓋使用PEG模擬物。已開發出保留PEG之屬性(例如提高血清半衰期)同時賦予若干其他有 利性質的重組PEG模擬物。舉例而言，可重組產生之能夠形成類似於PEG之延伸構形的簡單多肽鏈(包含例如Ala、Glu、Gly、Pro、Ser及Thr)已融合於相關肽或蛋白質藥物(例如Amunix' XTEN技術；Mountain View，CA)。 由此迴避製造過程中對附加結合步驟的需要。此外，已確立之分子生物學技術使得能夠控制多肽鏈之側鏈組成，從而允許優化免疫原性及製造性質。
糖基化：出於本發明之目的，「糖基化」在廣義上意指聚糖連接於蛋白質、脂質或其他有機分子之酶促過程。結合本發明使用術語「糖基化」一般欲意謂添加或缺失一或多個碳水化合物部分(藉由移除潛在糖基化位點或藉由化學及/或酶促手段缺失糖基化)及/或添加一或多個天然序列中可能存在或可能不存在之糖基化位點。另外，該片語包括天然蛋白質糖基化時之質變，包括所存在之各種碳水化合物部分之本質及比例的改變。
糖基化可顯著影響蛋白質之物理性質，且亦可在蛋白質穩定性、分泌及亞細胞定位中為重要的。實際上，本文中所描述之GDF15突變蛋白多肽之糖基化賦予其物理性質以有利改良。舉例而言，但不具限制性，可藉由糖基化改良GDF15突變蛋白之溶解度，且此種改良可為實質性的(參見實例)。本文中所描述之經糖基化之GDF15突變蛋白多肽與未經糖基化之野生型GDF15相比具有較高溶解度。在某些實施例中，本文中所揭示之經糖基化之GDF15突變蛋白在緩衝溶液中具有至少0.5 mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml之溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml範圍內之溶解度。在某些情況下，本文中所描述之經糖基化之GDF15突變蛋白在緩衝溶液中可具有至少0.5mg/ml，例如至少1mg/ml、至少2mg/ml、至少3mg/ml、至少4mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少20mg/ml或至少25mg/ml之溶解度，例如在0.5mg/ml至25mg/ml、0.5mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至25mg/ml、1mg/ml至20mg/ml、3mg/ml至25mg/ml、3mg/ml至20mg/ml、5mg/ml至25mg/ml、5mg/ml至20mg/ml或5mg/ml至18mg/ml範圍內之溶解度。該緩衝液可為磷酸鹽緩衝液、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、MOPS緩衝液、PIPES緩衝液或類似緩衝液或其組合。在某些情況下，該緩衝液可包括磷酸鹽緩衝鹽水。在某些情況下，該緩衝液可包括Tris、磷酸鉀及氯化鈉。在一些情況下，該緩衝液可包括Tris、磷酸鉀、氯化鈉及甲酸。舉例而言，該緩衝液可包括10mM至100mM Tris pH 7、1mM至50mM磷酸鉀、100mM至200mM氯化鈉及10mS/cm至30mS/cm甲 酸。
本文中所揭示之經糖基化之GDF15突變蛋白多肽優於野生型成熟GDF15多肽。此等經糖基化之GDF15突變蛋白多肽與野生型成熟GDF15多肽相比具有改良之特徵，包括但但不限於以下各項中之一項或多項：更大之細胞培養產率、經改良之二聚體形成、更大之溶解度及降低之免疫原性。此種經修飾之GDF15突變蛋白所展現之溶解度改良可例如使得能夠產生比未經糖基化之GDF15/GDF15突變蛋白更適合於醫藥投與之調配物。經糖基化之GDF15/GDF15突變蛋白多肽亦可展現經提高之穩定性。此外，多肽可改良一或多種醫藥動力學性質，諸如半衰期。
糖基化位點之添加可藉由改變如上所描述之胺基酸序列來實現。對多肽之改變可例如藉由一或多個絲胺酸或酥胺酸殘基(對於O連接之糖基化位點)或天冬醯胺殘基(對於N連接之糖基化位點)添加或取代來進行。N連接及O連接之寡糖及各類型中所發現之糖殘基的結構可能不同。兩者中通常發現之一種糖類型為N-乙醯神經胺酸(下文中稱為唾液酸)。唾液酸通常為N連接及O連接之寡糖之末端殘基，且藉由其負電荷，可賦予糖蛋白酸性性質。本發明之一特定實施例包括如上文所描述之N糖基化變異體之產生及使用。
增加多肽上之碳水化合物部分之數目的另一手段為藉由使糖苷化學或酶促偶合於多肽。
二氫葉酸還原酶(DHFR)缺乏型中國倉鼠卵巢(CHO)細胞為用於產生重組糖蛋白之常用宿主細胞。此等細胞不表現酶β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸轉移酶，且因此不向此等細胞中所產生之糖蛋白之N連接之寡糖添加呈α-2,6鍵聯形式之唾液酸。
聚唾液酸化：本發明亦涵蓋聚唾液酸化、肽與蛋白質之結合用於天然存在之生物可降解α-(2→8)連接之聚唾液酸(「PSA」)以便改良其穩定性及活體內醫藥動力學性質。PSA為高度親水性生物可降解無毒天然聚合物，從而賦予其在血液中之高表觀分子量，由此增加其血清半衰期。另外，多種肽及蛋白質治療劑之聚唾液酸化引起蛋白水解作用顯著減少，活體內活性得以保留且免疫原性及抗原性降低(參見例如G.Gregoriadis等人，Int.J.Pharmaceutics 300(1-2)：125-30)。如同用其他結合物(例如PEG)進行修飾，可利用各種位點特異性聚唾液酸化技術(參見例如T.Lindhout等人，PNAS 108(18)7397-7402(2011))。
融合蛋白質.本發明涵蓋野生型成熟GDF15(例如人類GDF15)之融合蛋白質以及本發明多肽(例如，經修飾之人類GDF15分子、人類GDF15之突變蛋白、經修飾之GDF15突變蛋白及類似物)之融合蛋白質。該等融合蛋白質一般由在其N末端或C末端與野生型GDF15多肽或本發明多肽結合之非GDF15多肽(例如，白蛋白(例如，HSA)或其片段：白蛋白結合域(ABD)；Fc多肽；麥 芽糖結合域(MBD)，其在本文中可稱為「融合搭配物」)構成。視情況，該融合搭配物可經由連接子多肽與野生型GDF15或多肽結合。該連接子多肽可視情況為可裂解連接子，例如酶可裂解連接子。融合搭配物之實例描述如下。
白蛋白融合：適合於結合之融合搭配物包括白蛋白，諸如人血清白蛋白(HSA)、犬血清白蛋白及牛血清白蛋白(BSA)。
成熟HSA為具有約20天之血清半衰期的585個胺基酸之多肽(約67kDa)，其主要負責維持膠體滲透血壓、血液pH值以及許多內源性及外源性配位體之輸送及分配。該蛋白質具有三個結構上同源之結構域(結構域I、結構域II及結構域III)，幾乎完全呈α-螺旋構形，且藉由17個二硫橋加以高度穩定。白蛋白之三個主要藥物結合區位於亞結構域IB、IIA及IIIA內之三個結構域中的每一個上。
白蛋白合成在肝臟中發生，由此產生短壽命之主要產物前白蛋白原。因而，全長HSA具有含18個胺基酸之信號肽，隨後為含6個胺基酸之原結構域；此含24個胺基酸殘基之肽可稱為前結構域原。可使用其內源性信號肽將HSA表現且分泌為前結構域原。或者，可使用與成熟HSA融合之IgK信號肽表現並分泌HSA。前白蛋白原在內質網管腔中在其胺基末端進行快速共轉譯裂解，以產生含609個胺基酸之穩定前驅多肽白蛋白原。白蛋白原隨後傳至高爾基體，其在此由弗林蛋白酶依賴性胺 基末端裂解轉化成含585個胺基酸之成熟白蛋白。除非另外闡述，否則「白蛋白」或「成熟白蛋白」係指HSA。
白蛋白之主要胺基酸序列、結構及功能在諸多物種中均為高度保守型，如同在白蛋白合成及分泌過程中。在例如食蟹獼猴、乳牛、狗、兔及大鼠中發現與HSA相當之白蛋白血清蛋白質。在非人類物種中，牛血清白蛋白(BSA)在結構上與HSA最相似。[參見例如Kosa等人，J Pharm Sci.96(11)：3117-24(2007年11月)]。本發明涵蓋得自非人類物種之白蛋白(包括但不限於以上所闡述之彼等)之用途，其係用於例如與GDF15多肽融合。在某些實施例中，該非人類物種為乳牛。在其他實施例中，該非人類物種為食蟹獼猴。
根據本發明，白蛋白可結合於藥物分子(例如，本文中所描述之多肽)之羧基末端、胺基末端、羧基與胺基末端兩者或內部(參見例如USP 5,876,969及USP 7,056,701)。此外，本發明涵蓋包含超過一個同源(例如，多個GDF15突變蛋白分子)或異源(例如，GDF15突變蛋白分子及不同的抗糖尿病劑)藥物分子的白蛋白融合蛋白質。
在本發明所涵蓋之HSA-多肽結合物中，可使用白蛋白之各種形式，諸如HSA變異體，諸如片段。該等形式一般具有一或多種所要白蛋白活性。在其他實施例中，本發明包括包含直接或間接與白蛋白、白蛋白片段及白蛋白變異體等融合之多肽藥物分子的融合蛋白質，其中 該融合蛋白質與未融合藥物分子相比具有更高血漿穩定性，及/或該融合蛋白質保留該未融合藥物分子之治療活性。在一些實施例中，該間接融合係藉由諸如肽連接子或其經修飾型式之連接子而實現。
HSA可經由連接子與本文中所描述之多肽結合以產生融合蛋白質。適合之連接子的實例描述於本文中。一些實施例涵蓋例如含四至三十個胺基酸之肽連接子。
在其中該融合蛋白質包含連接子之實施例中，該連接子可為非可裂解連接子。舉例而言，在一個實施例中，本發明描述一種融合分子，其中該HSA前驅物胺基酸序列或該成熟HSA經由非可裂解(G4S)3連接子與成熟人類GDF15或GDF15突變蛋白胺基酸序列之N末端融合。
在其中該融合蛋白質包含連接子之其他實施例中，該連接子可為可裂解連接子。舉例而言，本發明涵蓋一種融合分子，其中該HSA前驅物胺基酸序列或該成熟HSA胺基酸序列經由蛋白酶敏感性(G4S)2因子Xa可裂解連接子與如本文中所提供之成熟人類GDF15或GDF15突變蛋白胺基酸序列之N末端融合。
HSA可裂解連接子-成熟重組GDF15/GDF15突變蛋白分子之構築以及成熟重組GDF15/GDF15突變蛋白可裂解連接子-HSA融合分子之構築可用於促進對例如GDF15/GDF15突變蛋白之溶解度之評估及活體內效力之測定。在該等實施例中，可藉由細胞內裂解或藉由活體外 酶促裂解自HSA伴護蛋白中切除該GDF15/GDF15突變蛋白。在一些實施例中，切除係藉由使用任何活蛋白酶對可裂解連接子進行蛋白水解消化來實現。在其他實施例中，GDF15突變蛋白亦可經由構築與本文中所提供之多肽融合之信號肽而產生為非HSA融合物。
細胞內裂解可藉由例如弗林蛋白酶或半胱天冬酶以酶促方式進行。表現該融合蛋白質之宿主細胞可表現低水準之此等內源性酶，該等酶能夠在細胞內裂解該融合分子之一部分；因而，一些多肽在未與HSA結合之情況下自細胞中分泌，而一些多肽呈包含HSA之融合分子的形式分泌。本發明之實施例涵蓋各種弗林蛋白酶融合構築體之用途。舉例而言，可設計包含序列RGRR(SEQ ID NO：36)、RKRKKR(SEQ ID NO：37)、RKKR(SEQ ID NO：38)或RRRKKR(SEQ ID NO：39)之構築體。該等構築體可具有以下一般結構：Igk-HSA-(G4S)2-弗林蛋白酶序列-hGDF15。
本發明亦涵蓋細胞外裂解(即，離體裂解)，其中該等融合分子自細胞中分泌，經受純化，隨後裂解(例如，使用例如因子Xa蛋白水解敏感性連接子或腸激酶)。 應理解，該切除可使整個HSA-連接子複合物與多肽(例如，成熟GDF15或GDF15突變蛋白)或小於整個HSA-連接子複合物解離。
如上文所描述，白蛋白與一或多種本發明多肽之融合可例如藉由基因操縱，使得編碼HSA之DNA或 其片段與編碼一或多個多肽序列之DNA接合來達成。此後，可用呈例如適合之質體形式之經融合核苷酸序列來轉型或轉染適合之宿主，以便表現融合多肽。該表現可在活體外由例如原核或真核細胞實現，或在活體內由例如轉殖基因生物體實現。在本發明之一些實施例中，融合蛋白質之表現係在哺乳動物細胞株，例如CHO細胞株中進行。 轉型在本文中廣泛用於指由直接攝取、併入及表現來自其周圍且經由細胞膜吸收之外源性遺傳物質(外源性DNA)而引起之細胞基因變化。轉型在一些細菌種類中天然地發生，但其在其他細胞中亦可受人工手段影響。
此外，白蛋白本身可經修飾以延長其循環半衰期。經修飾之白蛋白與一或多種本發明多肽之融合可藉由如上文所描述之基因操縱/重組技術或藉由化學結合來獲得；所得融合分子所具有的半衰期超過與未經修飾之白蛋白之融合物的半衰期。(參見例如WO2011/051489)。
對於多肽(例如，本文中所描述之多肽)與重組白蛋白之基因融合及化學結合存在充分確立之技術平臺。 舉例而言，可使用ALBUFUSE® flex平臺(Novozymes Biopharma A/S；Denmark)來實現一或多種重組白蛋白分子與一或多種多肽之基因融合，從而產生編碼多肽及白蛋白之連續cDNA以產生單一同源蛋白質。該平臺可用於例如酵母及哺乳動物宿主表現系統。進一步舉例而言，可使用RECOMBUMIN® Flex平臺(Novozymes Biopharma A/S；Denmark)在不對白蛋白進行任何進一步衍生化之情 況下實現本發明多肽與重組白蛋白之化學結合。雖然可在若干胺基酸殘基(例如離胺酸及酪胺酸)上進行結合，但Cys34上之自由硫醇由於位點特異性而成為常用策略，從而產生更均質之最終產物。
替代白蛋白結合策略：已開發若干白蛋白結合策略作為直接融合之替代方案，包括經由結合脂肪酸鏈(醯化)之白蛋白結合。由於血清白蛋白為脂肪酸之轉運蛋白，故此等具有白蛋白結合活性之天然配位體已用於小蛋白質治療劑之半衰期延長。舉例而言，已批准用於糖尿病之產品胰島素地特密爾(LEVEMIR)包含與經基因修飾之胰島素結合，從而產生長效胰島素類似物之肉豆蔻基鏈。
本發明亦涵蓋包含白蛋白結合域(ABD)多肽序列及一或多種本文中所描述之多肽之序列的融合蛋白質。 本文中或文獻中所描述之任何ABD多肽序列均可為融合蛋白質之組分。融合蛋白質之組分可視情況經由連接子(諸如本文中所描述之彼等連接子)共價鍵結。在一些本發明實施例中，融合蛋白質包含作為N末端部分之ABD多肽序列及作為C末端部分之本文中所描述之多肽。
本發明亦涵蓋包含白蛋白結合多肽之片段的融合蛋白質，該片段實質上保持白蛋白結合；或白蛋白結合多肽或其片段之多聚體，該多聚體包含至少兩個白蛋白結合多肽或其片段作為單體單元。
不希望受任何理論束縛，據信本文中所描述之多肽結合ABD多肽序列，從而與個體中之多肽螯合， 從而引起在個體中之作用持續時間增加。
關於ABD及相關技術之一般論述，參見WO 2012/050923、WO 2012/050930、WO 2012/004384及WO 2009/016043。
與麥芽糖結合蛋白或其片段之融合蛋白質：本發明亦涵蓋包含麥芽糖結合蛋白(MBP)或其片段及一或多種本文中所描述之多肽之胺基酸序列的融合蛋白質。在一些實施例中，該MBP片段包含麥芽糖結合域(MBD)。本文中所描述或此項技術中已知的任何MBP或其片段或MBD多肽序列均可為本發明之融合蛋白質的組分。融合蛋白質之組分可視情況經由連接子(諸如本文中所描述之彼等連接子)共價鍵結。在一些本發明實施例中，融合蛋白質包含作為N末端部分之MBP或其片段或MBD多肽序列及作為C末端部分之本文中所描述之多肽。
本發明亦涵蓋包含MBP或MBD多肽之片段的融合蛋白質，該片段實質上保留麥芽糖結合活性；或麥芽糖結合多肽之多聚體或其片段(例如，MBD之多聚體)，其包含至少兩個麥芽糖結合多肽或其片段作為單體單元(例如兩個或更多個MBD多肽)。
關於MBP及MBD及相關技術之一般論述，參見例如Kapust等人，(1999)Protein Sci8(8)：1668-74。
Fc融合蛋白質. 本發明亦涵蓋包含Fc多肽或其片段及一或多種本文中所描述之多肽(例如，人類GDF15分子、經修飾之人類GDF15分子、GDF15突變蛋 白及經修飾之GDF15突變蛋白)之融合蛋白質。本文中所描述或此項技術中已知的任何Fc多肽序列均可為本發明之融合蛋白質的組分。融合蛋白質之組分可視情況經由連接子(諸如本文中所描述之彼等連接子)共價鍵結。在一些本發明實施例中，融合蛋白質包含作為N末端部分之Fc多肽序列及作為C末端部分之本文中所描述之多肽。
本發明亦涵蓋Fc多肽融合搭配物及包含其之融合蛋白質，其中該Fc多肽融合搭配物經修飾以成為帶電Fc配對之一個搭配物。「帶電Fc配對之搭配物」係指(i)(視情況缺乏絞鏈區)且包含帶電配對突變之「帶負電」Fc序列或(ii)(視情況缺乏絞鏈區)且包含帶電配對突變之「帶正電」Fc序列。為便於參考，「帶正電」及「帶負電」在本文中用於描述Fc序列中之電荷配對突變之本質，而非指示整個序列或構築體必需具有正電荷或負電荷。適用於本發明之多肽構築體(例如，GDF15突變蛋白、經修飾之GDF15突變蛋白)的帶電Fc胺基酸序列描述於例如WO 2013/113008中。
帶正電Fc(「Fc(+)」)之實例包括包含缺乏絞鏈區之Fc序列之天冬胺酸-離胺酸突變(E356K)及麩胺酸-離胺酸突變(D399K)的Fc。帶負電Fc(「Fc(-)」)之實例包括在Fc序列中缺乏絞鏈區且包含兩個離胺酸-天冬胺酸突變(K392D、K409D)的Fc。亦可視情況缺失C末端離胺酸(K477)。當Fc(+)多肽融合蛋白質(例如Fc(+)GDF15突變蛋白融合蛋白質)與Fc(-)多肽融合蛋白質(例如Fc(- )GDF15突變蛋白融合蛋白質)一起培育時，天冬胺酸殘基與離胺酸殘基藉由靜電力締合，從而促進在GDF15多肽融合蛋白質之Fc(+)序列與Fc(-)序列之間形成Fc異源二聚體。
本發明亦涵蓋命名為「半」或「半Fc」構築體之構築體，其包含由將第一Fc序列之N末端連接於第二Fc序列之C末端的連接子串聯接合的兩個Fc序列。在一些實施例中，單體包含藉由將GDF15序列之N末端連接於第一Fc序列之C末端的連接子與第一Fc序列連接之多肽(例如，經修飾之成熟GDF15或突變蛋白GDF15)序列，其中該第一Fc序列藉由將第一Fc序列之N末端連接於第二Fc序列之C末端的第二連接子連接於第二Fc序列。該第一Fc序列及該第二序列亦藉由Fc絞鏈區締合。 兩個此種單體締合形成二聚物，其中該等單體係經由兩個多肽序列之間的鏈間二硫鍵連接。關於適合於與本發明之GDF15突變蛋白一起使用的半Fc多肽的實例，參見WO 2013/113008。
本發明亦涵蓋具有Fc多肽或其片段之多聚體的融合蛋白質，包括帶電Fc配對之搭配物(例如，Fc多聚體)。
與其他分子之結合：其他適用於結合之組分及分子包括例如甲狀腺球蛋白；破傷風類毒素；白喉類毒素；聚胺基酸，諸如聚(D-離胺酸：D-麩胺酸)；輪狀病毒之VP6多肽；流感病毒血球凝集素、流感病毒核蛋白；鑰孔 蟲戚血藍蛋白(KLH)；及B型肝炎病毒核心蛋白及表面抗原；或前述各項之任何組合。
因而，本發明涵蓋一或多種其他組分或分子在多肽序列之N及/或C末端，諸如另一蛋白質(例如，具有與標的蛋白質異源之胺基酸序列的蛋白質)或載體分子之結合。因而，可提供呈與另一組分或分子之結合物形式的例示性多肽序列。
結合物修飾可產生保留具有附加或互補功能之活性或第二分子之活性的多肽序列。舉例而言，多肽序列可與分子結合，例如以促進溶解、儲存、活體內或儲架半衰期或穩定性、降低免疫原性、延遲或控制活體內釋放等。其他功能或活性包括相對於未結合多肽序列降低毒性之結合物、比未結合多肽序列更有效地靶向一種類型細胞或器官的結合物或進一步對抗與如本文中所闡述之病症或疾病(例如，糖尿病)相關之原因或效應的藥物。
多肽亦可與大型緩慢代謝大分子結合，諸如蛋白質；聚糖，諸如瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠粒；聚合胺基酸，諸如聚麩胺酸、聚離胺酸；胺基酸共聚物；未活化病毒顆粒；不活化細菌毒素，諸如得自白喉、破傷風、霍亂、白細胞毒素分子之類毒素；不活化細菌；及樹枝狀細胞。該等結合形式在需要時可用於產生針對本發明多肽之抗體。
用於結合之其他候選組分及分子包括適用於分離或純化者。特定非限制性實例包括結合分子，諸如生 物素(生物素-抗生物素特異性結合配對)、抗體、受體、配位體、凝集素，或包含固體載體之分子，包括例如塑膠或聚苯乙烯珠粒、板或珠粒、磁性珠粒、測試條及膜。
諸如陽離子交換層析之純化方法可用於藉由電荷差異來分離結合物，由此將結合物有效地分離成其各種分子量。舉例而言，可裝載陽離子交換管柱且隨後用約20mM乙酸鈉pH~4洗滌，且隨後用在pH~3至5.5下，例如，在pH~4.5下經緩衝之線性(0M至0.5M)NaCl梯度溶離。由陽離子交換層析獲得之溶離份的內含物可使用習知方法藉由分子量鑑別，例如質譜、SDS-PAGE或用於藉由分子量分離分子實體的其他已知方法。
其他修飾：本發明涵蓋當前已知或將要開發之用於改良一或多種性質之其他多肽修飾之使用。一種用於延長本發明多肽之循環半衰期、增加穩定性、降低清除率或改變免疫原性或過敏原性的此種方法包括藉由羥乙基澱粉化修飾多肽序列，其利用與其他分子連接之羥乙基澱粉衍生物以便修飾分子之特徵。各種羥乙基澱粉化態樣描述於例如美國專利申請案第2007/0134197號及第2006/0258607號中。
本發明亦涵蓋包含SUMO作為融合標簽之融合分子(LifeSensors,Inc.；Malvern，PA)。本文中所描述之多肽與SUMO之融合可向該多肽傳輸若干有益效應，包括增強表現、改良溶解度及/或輔助純化方法之開發。SUMO蛋白酶識別SUMO之三級結構且在SUMO之C末 端使該融合蛋白質裂解，從而釋放本文中所描述之具有所要N末端胺基酸之多肽。
連接子：用於修飾本發明之多肽序列的任何前述組分及分子均可視情況經由連接子結合。適合之連接子包括一般具有足夠長度以允許經修飾之多肽序列與所連接之組分及分子之間存在一些移動的「撓性連接子」。該等連接子分子可為約6至50個原子長。該等連接子分子亦可為例如芳基乙炔、含2至10個單體單元之乙二醇寡聚物、二胺、二酸、胺基酸或其組合。適合之連接子可容易地選擇且可以具有任何適合之長度，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50個胺基酸。
例示性可撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、甘胺酸-絲胺酸聚合物(例如(GmSo)n、(GSGGS)n、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n、(GSGGSm)n、(GSGSmG)n及(GGGSm)n及其組合，其中m、n及o各自獨立地選自至少1至20之整數，例如1-18、2-16、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)及其他可撓性連接子。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物相對未經結構化，且因此可充當組分之間的中性繫鏈。例示性可撓性連接子包括但不限於GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG及GSSSG。
其他可撓性連接子包括甘胺酸聚合物(G)n或甘胺酸-絲胺酸聚合物(例如，(GS)n、(GSGGS)n、(GGGS)n 及(GGGGS)n，其中n=1至50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50)。例示性可撓性連接子包括但不限於GGGS(SEQ ID NO：40)、GGGGS(SEQ ID NO：41)、GGSG(SEQ ID NO：42)、GGSGG(SEQ ID NO：43)、GSGSG(SEQ ID NO：44)、GSGGG(SEQ ID NO：45)、GGGSG(SEQ ID NO：46)及GSSSG(SEQ ID NO：47)。此等連接子序列之多聚體(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可連接在一起以提供可用於使異源胺基酸序列與本文中所揭示之多肽結合的可撓性連接子。如本文中所描述，該異源胺基酸序列可為信號序列及/或融合搭配物，諸如白蛋白、Fc序列及類似物。
連接子之實例包括例如(GGGGS)n，其中n為1至約10之整數(例如，n=1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)；GGGSGGGSIEGR(SEQ ID NO：48)；GGGGG(SEQ ID NO：49)；EGGGS(SEQ ID NO：50)。
在一些情況下，該連接子可為可裂解連接子，例如酶促可裂解連接子。在其他情況下，該連接子可為非可裂解連接子，例如，在正常生理條件下不會發生活體內酶促裂解之連接子。
舉例而言，蛋白水解可裂解連接子可包括基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點，例如，選自膠原蛋白酶-1、膠原蛋白酶-2及膠原蛋白酶-3(MMP-1、MMP-8及MMP-13)、明膠酶A及明膠酶B(MMP-2及MMP-9)、基質溶素1 、基質溶素2及基質溶素3(MMP-3、MMP-10及MMP-11)、基質溶解蛋白(MMP-7)及膜金屬蛋白酶(MT1-MMP及MT2-MMP)之MMP裂解位點。MMP-9之裂解序列為Pro-X-X-Hy(其中X表示任意殘基；Hy為疏水性殘基)(SEQ ID NO：51)，例如Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr)(SEQ ID NO：52)，例如Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser(SEQ ID NO：53)或Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr(SEQ ID NO：54)。蛋白酶裂解位點之另一實例為胞漿素原活化因子裂解位點，例如尿激酶型胞漿素原活化因子(uPA)或組織胞漿素原活化因子(tPA)裂解位點。uPA及tPA之裂解序列之特定實例包括包含Val-Gly-Arg之序列。另一實例為凝血酶裂解位點，例如CGLVPAGSGP(SEQ ID NO：55)。包含蛋白酶裂解位點之其他適合連接子包括包含以下胺基酸序列中之一或多者的連接子：1)SLLKSRMVPNFN(SEQ ID NO：56)或SLLIARRMPNFN(SEQ ID NO：57)，由組織蛋白酶B裂解；SKLVQASASGVN(SEQ ID NO：58)或SSYLKASDAPDN(SEQ ID NO：59)，由EB病毒蛋白酶裂解；RPKPQQFFGLMN(SEQ ID NO：60)，由MMP-3(基質溶素)裂解；SLRPLALWRSFN(SEQ ID NO：61)，由MMP-7(基質溶解蛋白)裂解；SPQGIAGQRNFN(SEQ ID NO：62)，由MMP-9裂解；DVDERDVRGFASFL(SEQ ID NO：63)，由嗜熱菌蛋白酶樣MMP裂解；SLPLGLWAPNFN(SEQ ID NO：64)，由基質金屬蛋白酶2(MMP-2)裂解；SLLIFRSWANFN(SEQ ID NO：65)，由組織蛋白酶L裂解 ；SGVVIATVIVIT(SEQ ID NO：66)，由組織蛋白酶D裂解；SLGPQGIWGQFN(SEQ ID NO：67)，由基質金屬蛋白酶1(MMP-1)裂解；KKSPGRVVGGSV(SEQ ID NO：68)，由尿激酶型胞漿素原活化因子裂解；PQGLLGAPGILG(SEQ ID NO：69)，由膜1型基質金屬蛋白酶(MT-MMP)裂解；HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT(SEQ ID NO：70)，由基質溶素3(對於MMP-11)、嗜熱菌蛋白酶、纖維母細胞膠原蛋白酶及基質溶素-1裂解；GPQGLAGQRGIV(SEQ ID NO：71)，由基質金屬蛋白酶13(膠原蛋白酶-3)裂解；GGSGQRGRKALE(SEQ ID NO：72)，由組織型胞漿素原活化因子(tPA)裂解；SLSALLSSDIFN(SEQ ID NO：73)，由人類前列腺特異性抗原裂解；SLPRFKIIGGFN(SEQ ID NO：74)，由血管舒緩素(hK3)裂解；SLLGIAVPGNFN(SEQ ID NO：75)，由嗜中性球彈性蛋白酶裂解；及FFKNIVTPRTPP(SEQ ID NO：76)，由鈣蛋白酶(鈣活化中性蛋白酶)裂解。
圖3描繪本文中所涵蓋之兩種融合蛋白質M1(SEQ ID NO：77)及M2(SEQ ID NO：78)之胺基酸序列。融合蛋白質M1自N末端至C末端連續包括與HSA胺基酸序列融合之IgK信號序列(小寫字母)利用(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3連接子(加下劃線)融合於成熟人類GDF15(加粗)之N末端。融合蛋白質M2自N末端至C末端連續包括與HSA胺基酸序列融合之IgK信號序列(小寫字母)利用(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3連接子(加下劃線)融合於含3個胺 基酸(△ARN)缺失之成熟人類GDF15(加粗)之N末端。
圖5描繪本文中所涵蓋之兩種融合蛋白質M3(SEQ ID NO：79)及M4(SEQ ID NO：80)之胺基酸序列。 融合蛋白質M3自N末端至C末端連續包括與HSA胺基酸序列融合之IgK信號序列(小寫字母)利用(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)5連接子(加下劃線)融合於含3個胺基酸缺失(表示為△ARN或△N3)之成熟人類GDF15(加粗)胺基酸序列之N末端。融合蛋白質M4自N末端至C末端連續包括與HSA胺基酸序列融合之IgK信號序列(小寫字母)利用(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)5連接子(加下劃線)融合於相對於成熟hGDF15之N末端含6個胺基酸截短(△ARNGDH)之成熟人類GDF15(加粗)胺基酸序列之N末端。
本發明亦涵蓋編碼本文中所描述之序列、多肽及二聚體的重組核酸序列。在某些實施例中，該重組核酸所編碼之多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的連續胺基酸序列，其中相對於SEQ ID NO：1中之相應胺基酸，該連續胺基酸序列具有以下成對取代中的至少一種：i)D5T及R21N或D5S及R21N；ii)R16N及H18T或R16N及H18S；iii)S23N及E25T或S23N及E25S；iv)S50N及F52T；S50N及F52S；F52N及A54T；或F52N及A54S； v)Q51N及R53T；Q51N及R53S；R53N及A55T；或R53N及A55S；vi)S64N及H66T；或S64N及H66S；vii)K91N及D93T；K91N及D93S；D93N及G95T；或D93N及G95S；viii)T94N及V96T；T94N及V96S；V96N及L98T；或V96N及L98S；ix)S97N及Q99T；或S97N及Q99S；以及x)A106N及D108T或A106N及D108S；其中該取代產生一個或多個具有序列NXS/T之N連接之糖基化一致位點，其中N為Asn；X為除脯胺酸以外的胺基酸；隨後為Ser(S)或Thr(T)，且此外其中一個或多個N連接之糖基化一致位點在得以表現時連接於N聚糖。在另一實施例中，該重組核酸編碼在得以表現時形成二聚體的多肽，該多肽。在另一實施例中，該重組核酸編碼相對於SEQ ID NO：1具有N末端截短及/或C末端截短的多肽。相對於參考多肽，例如SEQ ID NO：1，該等截短可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多個胺基酸。在一特定實施例中，該重組核酸編碼具有GDF15中之前三個N末端殘基截短(△ARN或△N3)的多肽。在特定實施例中，本發明涵蓋編碼包含選自以下之胺基酸序列的多肽的重組核酸分子：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：30，或相差至多5個胺基酸之胺基酸；其中該多肽在得以表現時含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。在特定實施例中，本發明涵蓋編碼包含選自以下之胺基酸序列的多肽的重組核酸分子：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：30，或相差至多2個胺基酸之胺基酸；其中該多肽在得以表現時含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。在特定實施例中，該重組核酸編碼包含選自以下之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：100，或相差至多5個胺基酸之胺基酸；其中該多肽在得以表現時含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。在特定實施例中，該重組核酸編碼包含選自以下之胺基酸序列的多肽：SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97或SEQ ID NO：100，或相差至多2個胺基酸之胺基酸；其中該多肽在得以表現時含有至少一個經N糖基化之N糖基化位點。本發明亦涵蓋一種製造經修飾之GDF15 N糖基化同源二聚體的方法，該方法包括在哺乳動物細胞，例如CHO細胞中表現前述重組核酸的步驟。本發明亦涵蓋藉 由前述方法製造的經修飾之GDF15 N糖基化同源二聚體。
除本文中所提供之特定胺基酸序列及核酸序列以外，本發明亦涵蓋具有在序列中與該等胺基酸及核酸存在至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致性之序列的多肽及核酸。術語「一致」或「一致性」百分比在兩個或更多個聚核苷酸序列或兩個或更多個胺基酸序列之內容中係指當在指定區域上比較並比對最大對應性時，兩個或更多個序列或子序列為相同的或所具有之規定百分比之胺基酸殘基或核苷酸為相同的(例如，在規定區域上至少80%、至少85%、至少90%或至少95%一致)。特定言之，本發明涵蓋具有在序列中與SEQ ID NO：2-35或77-97之胺基酸序列存在至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列的多肽。
產生多肽之方法
本發明之多肽可藉由任何適合之方法來產生，包括重組及非重組方法(例如化學合成)。
A.化學合成
在化學合成多肽之情況下，該合成可經由液相或固相來進行。固相肽合成(SPPS)允許併人非天然胺基酸及/或肽/蛋白質骨架修飾。SPPS之各種形式，諸如 Fmoc及Boc，可用於合成本發明之多肽。化學合成之詳情在此項技術中為已知的(例如，Ganesan A.2006 Mini Rev.Med.Chem.6：3-10；及Camarero J.A.等人，2005 Protein Pept Lett.12：723-8)。
可如下文所描述進行固相肽合成。用酸不穩定或鹼不穩定基團保護α官能基(Nα)及任何反應性側鏈。 該等保護基在用於連接醯胺鍵之條件下為穩定的，但可在不削弱該已形成之肽鏈的情況下容易地裂解。適用於α胺基官能基之保護基包括但不限於以下：第三丁氧基羰基(Boc)、苯甲氧基羰基(Z)、鄰氯苯甲氧基羰基、聯苯異丙氧基羰基、第三戊氧基羰基(Amoc)、α,α-二甲基-3,5-二甲氧-苯甲氧基羰基、鄰硝基碸烯基、2-氰基-第三丁氧基羰基、9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)、1-(4,4-二甲基-2,6-二側氧基環己-1-亞基)乙基(Dde)及類似基團。
適合之側鏈保護基包括但不限於：乙醯基、烯丙基(All)、烯丙氧基羰基(Alloc)、苯甲基(Bzl)、苯甲氧基羰基(Z)、第三丁氧基羰基(Boc)、苯甲氧基甲基(Bom)、鄰溴苯甲氧基羰基、第三丁基(tBu)、第三丁基二甲基矽烷基、2-氯苯甲基、2-氯苯甲氧基羰基(2-CIZ)、2,6-二氯苯甲基、環己基、環戊基、1-(4,4-二甲基-2,6-二側氧基環己-1-亞基)乙基(Dde)、異丙基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯甲基磺醯基(Mtr)、2,3,5,7,8-五甲基色烷-6-磺醯基(Pmc)、新戊醯基、四氫哌喃-2-基、甲苯磺醯基(Tos)、2,4,6-三甲氧基苯甲基、三甲基甲矽烷基及三苯甲基 (Trt)。
在固相合成中，C末端胺基酸與適合之載體材料偶合。適合之載體材料為對用於合成過程之逐步縮合及裂解反應之試劑及反應條件呈惰性且不溶解於所使用之反應介質中的材料。市售載體材料之實例包括已經反應基團及/或聚乙二醇修飾之苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；氯甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；羥甲基化或胺基甲基化苯乙烯/二乙烯基苯共聚物；及類似物。若意欲製備肽酸，則可使用聚苯乙烯(1%)-二乙烯基苯或經4-苯甲氧基苯甲醇(Wang氏錨定子)或2-氯三苯甲氯衍生化之TentaGel®。在肽醯胺之情況下，可使用聚苯乙烯(1%)二乙烯基苯或經5-(4'-胺基甲基)-3',5'-二甲氧基苯氧基)戊酸(PAL-anchor)或對(2,4-二甲氧基苯基-胺基甲基)苯氧基衍生化之TentaGel®(Rink醯胺錨定子)。
與聚合載體之鍵聯可藉由在室溫或高溫(例如介於40℃與60℃之間)下且在例如2至72小時之反應時間下在添加含活化試劑之乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、二氯甲烷、四氫呋喃、N-甲基吡咯啶酮或類似溶劑的情況下使C末端經Fmoc保護之胺基酸與載體材料反應來達成。
經Nα保護之胺基酸(例如Fmoc胺基酸)與PAL、Wang或Rink錨定子之偶合可例如在以下情況下進行：在諸如N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIC)或其他碳化二亞胺、2-(1H-苯并三唑 -1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)或其他脲鎓鹽、鄰醯基脲、苯并三唑-1-基-叁-吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)或其他鏻鹽、N-羥基丁二醯亞胺、其他N-羥基醯亞胺或肟之偶合試劑輔助下，存在或不存在1-羥基苯并三唑或1-羥基-7-氮雜苯并三唑，例如在TBTU輔助下、在添加羥基苯並三唑(HOBt)之情況下、在添加或不添加諸如二異丙基乙胺(DIEA)、三乙胺或N-甲基嗎啉之鹼(例如二異丙基乙胺)的情況下；反應時間為2至72小時(例如，在胺基酸及偶合試劑呈1.5至3倍過量(例如2倍過量)時為3小時)；且反應溫度介於約10℃與50℃之間，例如25℃；在諸如二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯啶酮或二氯甲烷之溶劑(例如，二甲基甲醯胺)中。
作為偶合試劑之替代，亦有可能在上述條件下使用活性酯(例如五氟苯基、對硝基苯基或類似基團)、Nα-Fmoc-胺基酸之對稱酸酐、其酸氯化物或酸氟化物。
經Nα保護之胺基酸(例如Fmoc胺基酸)可在二氯甲烷中在添加DIEA之情況下在10至120分鐘(例如20分鐘)之反應時間下與2-氯三苯甲基樹脂偶合，但不限於使用此溶劑及此鹼。
經保護之胺基酸之相繼偶合可根據習知方法在肽合成器，典型地在自動化肽合成器中進行。在藉由用例如含哌啶(10%至50%)之二甲基甲醯胺處理5至20分鐘(例如，用含50%哌啶之DMF處理2×2分鐘及用含20%哌啶之DMF處理1×15分鐘)使固相上之偶合胺基酸之Nα- Fmoc保護基裂解之後，下一個經保護之胺基酸以3至10倍過量，例如以10倍過量在諸如二氯甲烷、DMF或該兩者之混合物的惰性非水性極性溶劑中且在介於約10℃與50℃之間的溫度下(例如在25℃下)與前述胺基酸偶合。先前提及之用於使第一Nα-Fmoc胺基酸與PAL、Wang或Rink錨定子偶合之試劑適合作為偶合試劑。經保護之胺基酸或其氯化物或氟化物或對稱酸酐之活性酯亦可用作替代物。
在固相合成結束時，該肽自載體材料中裂解，而同時使側鏈保護基裂解。裂解可利用三氟乙酸或其他強酸性介質酸性介質在添加5%至20%V/V諸如二甲基硫醚、乙基甲基硫醚、硫代苯甲醚、硫代甲酚、甲酚、苯甲醚乙二硫醇、苯酚或水之清除劑(例如，15%v/v二甲基硫醚/乙二硫醇/間甲酚1：1：1)的情況下在0.5至3小時內(例如2小時)進行。具有經完全保護之側鏈的肽係藉由用冰醋酸/三氟乙醇/二氯甲烷2：2：6使2-氯三苯甲基錨定子裂解而獲得。經保護之肽可藉由矽膠層析加以純化。若該肽經由Wang錨定子連接於固相且若意欲獲得具有C末端烷基醯胺化之肽，則裂解可藉由利用烷基胺或氟烷基胺之胺解來進行。胺解係在介於約-10℃與50℃之間的溫度(例如，約25℃)及介於約12與24小時之間的反應時間(例如，約18小時)下進行。另外，肽可藉由再酯化，例如用甲醇自載體裂解。
所獲得之酸性溶液可與3至20倍量之冷醚或 正己烷(例如，10倍過量之乙醚)混合，以便使肽沈澱且因此分離保留於醚中之清除劑及已裂解之保護基。可藉由使肽自冰醋酸中再沈澱若干次來進行進一步純化。所獲得之沈澱物可溶解於水或第三丁醇或該兩種溶劑之混合物(例如，第三丁醇/水之1：1混合物)中並冷凍乾燥。
所獲得之肽可藉由各種層析方法加以純化，包括在呈乙酸酯形式之弱鹼性樹脂上離子交換；在未經衍生化之聚苯乙烯/二乙烯基苯共聚物(例如，Amberlite® XAD)上之疏水性吸附層析；矽膠上之吸附層析；離子交換層析，例如在羧甲基纖維素上；分配層析，例如，在Sephadex® G-25上；逆流分配層析；或高壓液相層析(HPLC)，例如在辛基或十八烷基矽烷基矽膠(ODS)相上之逆相HPLC。
B.重組產生
在使用重組技術產生多肽之情況下，多肽可使用任何適合之構築體及任何適合之宿主細胞分別產生為細胞內蛋白質或分泌蛋白質，該宿主細胞可為原核或真核細胞，諸如細菌(例如，大腸桿菌)或酵母宿主細胞。可用作宿主細胞之真核細胞之其他實例包括昆蟲細胞、哺乳動物細胞及/或植物細胞。在使用哺乳動物宿主細胞之情況下，其可包括人類細胞(例如，HeLa、293、H9及Jurkat細胞)；小鼠細胞(例如，NIH3T3、L細胞及C127細胞)；靈長類動物細胞(例如，Cos 1、Cos 7及CV1)及倉鼠細胞 (例如，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)。在特定實施例中，該多肽係在CHO細胞中產生。在其他實施例中，該多肽係在酵母細胞中產生，且在特定實施例中，可為經基因工程改造以產生具有類哺乳動物N聚糖之糖蛋白的酵母細胞。
可根據此項技術中已知的標準程序採用適合於表現多肽之多種宿主-載體系統。參見例如Sambrook等人，1989 Current Protocols in Molecular Biology Cold Spring Harbor Press,New York；及Ausubel等人，1995 Current Protocols in Molecular Biology,Wiley and Sons編。用於將遺傳物質引入宿主細胞中之方法包括例如轉型、電穿孔、結合、磷酸鈣法及類似方法。可選擇用於轉移之方法以便提供所引入之多肽編碼核酸之穩定表現。多肽編碼核酸可提供為可繼承附加體元件(例如質體)，或可經基因組併入。用於產生相關多肽之多種適當載體可購自市面。
載體可提供宿主細胞中之染色體外維持或可提供併入宿主細胞基因組中。表現載體提供轉錄及轉譯調節序列，且可提供可誘導或組成性表現，其中編碼區在轉錄起始區及轉錄與轉譯終止區之轉錄控制下可操作地連接。一般而言，轉錄與轉譯調節序列可包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始與終止序列、轉譯起始與終止序列及增強子或活化子序列。啟動子可為組成性或可誘導性的，且可為強組成性啟動子(例如T7)。
表現構築體一般具有位於啟動子序列附近以 插入編碼相關蛋白質之核酸序列的便利限制位點。表現宿主中可存在可操作之可選標記物以促進對含有該載體之細胞之選擇。此外，表現構築體可包括其他要素。舉例而言，表現載體可具有一或兩個複製系統，因而允許其維持於生物體中，例如在用於表現之哺乳動物或昆蟲細胞中及在用於選殖及擴增之原核宿主中。另外，表現構築體可含有可選標記基因以允許選擇經轉型之宿主細胞。可選基因在此項技術中為熟知的且將隨所使用之宿主細胞而變化。
蛋白質之分離及純化可根據此項技術中已知的方法來實現。舉例而言，可藉由免疫親和力純化自經基因修飾以組成性表現蛋白質之細胞溶解物中及/或在誘導後，或自合成反應混合物中分離蛋白質，該免疫親和力純化一般包括使樣品與抗蛋白質抗體接觸，洗滌以移除非特異性結合之物質，及溶離特異性結合之蛋白質。可藉由透滲析及蛋白質純化方法中正常採用之其他方法進一步純化經分離之蛋白質。在一個實施例中，可使用金屬螯合物層析法來分離蛋白質。蛋白質可含有修飾以促進分離。
可製備呈實質上純或經分離形式之多肽(例如，不含其他多肽)。該等多肽可存在於相對於可能存在之其他組分(例如，其他多肽或其他宿主細胞組分)富含該多肽之組成物中。舉例而言，可提供經純化之多肽，使得該多肽存在於實質上不含其他經表現之蛋白質的組成物中，例如，該組成物之小於90%、小於60%、小於50%、小於40%、小於30%、小於20%、小於10%、小於5%或 小於1%由其他所表現之蛋白質組成。
抗體
本發明提供抗體，包括特異性結合本發明之多肽或融合蛋白質的經分離抗體。術語「抗體」涵蓋完整單株抗體、多株抗體、由至少兩種完整抗體形成之多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體結合片段，包括Fab及F(ab)'2，條件為其特異性結合本發明之多肽或融合蛋白質。基本完整抗體結構單元包含四聚體，且各四聚體由兩對相同之多肽鏈組成，各對具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50至70kDa)。各鏈之胺基末端部分包括含約100至110或更多個胺基酸且主要負責抗原識別之可變區。相反，各鏈之羧基末端部分定義主要負責效應功能之恆定區。人類輕鏈分類為κ及λ，而人類重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，且分別將抗體之同型定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE、藉由重組DNA技術或藉由對完整抗體之酶促或化學裂解來產生結合片段。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv及單鏈抗體。
各重鏈在一端具有可變域(VH)，隨後為許多個恆定域。各輕鏈在一端具有可變域(VL)且在其另一端具有恆定域；該輕鏈之該恆定域與該重鏈之第一恆定域對準，且該輕鏈可變域與該重鏈之該可變域對準。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由含約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中該重鏈亦包括含約10個或更多個胺基 酸之「D」區。該等抗體鏈均展現含由三個高變區(亦稱為「互補決定區」或「CDR」)接合之相對保守型架構區(FR)的相同一般結構。藉由該架構區使各對之兩個鏈之CDR對準，從而使得能夠結合特定抗原決定基。自N末端至C末端，輕鏈及重鏈均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。
完整抗體具有兩個結合位點，且除了在雙功能或雙特異性抗體中，該兩個結合位點相同。雙特異性或雙功能抗體為具有兩個不同的重/輕鏈對及兩個不同的結合位點的人造混合抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法產生，包括融合雜交瘤或連接Fab'片段。
如以上所闡述，可藉由完整抗體之酶促或化學裂解來產生結合片段。用酶木瓜蛋白酶消化抗體產生兩種相同的抗原結合片段，亦稱為「Fab」片段及不具有抗原結合活性之「Fc」片段。用酶胃蛋白酶消化抗體產生F(ab')2片段，其中抗體分子之兩個臂仍連接且包含雙抗原結合位點。F(ab')2片段具有使抗原交聯之能力。
如本文中所使用，術語「Fab」係指包含VH及VL區以及輕鏈之恆定域及重鏈之CH1域的抗體片段。
當用於本文中時，術語「Fv」係指抗體中保留抗原識別位點及抗原結合位點之最小片段。在雙鏈Fv種類中，此區域包括一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域呈非共價締合形式之二聚體。在單鏈Fv種類中，一個重鏈可變域與一個輕鏈可變域可藉由可撓性肽連接子共價連 接，使得該輕鏈及該重鏈可以類似於雙鏈Fv種類中之結構的「二聚」結構締合。在此構形中，各可變域之三個CDR相互作用以定義VH-VL二聚體之表面上的抗原結合位點。儘管該六個CDR總體上賦予抗體以抗原結合特異性，但即使單可變域(或僅包含三個CDR之Fv中之抗原特異性部分)亦具有識別及結合抗原之能力。
當用於本文中時，術語「互補決定區」或「CDR」係指免疫受體中與特定配位體接觸且決定其特異性之部分。
術語「高變區」係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區一般包含來自CDR之胺基酸殘基及/或來自「高變環」之彼等殘基。
如本文中所使用，術語「抗原決定基」係指蛋白質抗原上之抗體結合位點。抗原決定基決定子通常包含諸如胺基酸或糖側鏈之分子的化學活性表面分組以及特定三維結構及電荷特徵。據稱當解離常數
Figure 104124401-A0202-12-0082-220
1μM、
Figure 104124401-A0202-12-0082-222
100nM或
Figure 104124401-A0202-12-0082-223
10nM時，抗體結合抗原。增加之平衡常數(「K D 」)意謂抗原決定基與抗體之間存在較弱親和力，而降低之平衡常數意謂抗原決定基與抗體之間存在更大親和力。具有「不超過」某一量之K D 的抗體意謂該抗體將以指定K D 或更強地結合抗原決定基。K D 描述抗原決定基及抗體之結合特徵，而「效力」描述抗體本身對抗體功能之效用。平衡常數與效力之間未必存在相關性；因而，舉例而言，相對較低之K D 不自動地意謂高效力。
術語「選擇性結合」在參考抗體時不意謂該抗體僅結合單一物質，而是該抗體對第一物質之K D 小於該抗體對第二物質之K D 。排他性結合抗原決定基之抗體僅結合該單一抗原決定基。
當投與人類時，含有齧齒動物(亦即，鼠類或大鼠)可變區及/或恆定區之抗體有時與例如自體內快速清除或身體對該抗體產生免疫反應相關。為了避免利用齧齒動物衍生抗體，可藉由向齧齒動物中引入人類抗體功能，使得該齧齒動物產生完全人類抗體來產生完全人類抗體。 除非本文中明確鑑別，否則「人類」抗體與「完全人類」抗體可互換使用。當辨別僅部分人類抗體與完全人類抗體時，術語「完全人類」可適用。熟習此項技術者瞭解產生完全人類抗體的各種方法。
為了解決可能之人類抗小鼠抗體反應，可利用嵌合或者人類化抗體。嵌合抗體具有人類恆定區及鼠類可變區，且因而，可在一些患者中觀測到人類抗嵌合抗體反應。因此，宜提供針對多聚酶之完全人類抗體，以避免可能之人類抗小鼠抗體或人類抗嵌合抗體反應。
可例如藉由以熟習此項技術者已知的技術產生雜交瘤細胞株來製備完全人類單株抗體。其他製備方法包括使用編碼特定抗體之序列用於對諸如CHO細胞之適合哺乳動物宿主細胞進行轉型。轉型可藉由用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法，例如將聚核苷酸封裝於病毒(或病毒載體)中且用該病毒(或載體)或藉由此項技 術中已知的轉染程序來轉導宿主細胞。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中為熟知的，且包括聚葡萄糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、聚核苷酸囊封於脂質體中及直接微量注射DNA於細胞核中。可用作表現宿主之哺乳動物細胞株在此項技術中為熟知的，且包括但不限於CHO細胞、HeLa細胞及人類肝細胞癌細胞。
抗體可用於偵測本發明之多肽。舉例而言，抗體可藉由偵測個體中之一或多種本發明多肽之水準及比較偵測水準與標準對照水準或先前(例如，在任何疾患之前)測定之個體基線水準而用作診斷劑。
本發明之另一實施例需要使用一或多種人類結構域抗體(dAb)。dAb為人類抗體之最小功能結合單元(IgG)且具有良好穩定性及溶解度特徵。該技術需要與HSA(從而形成「AlbudAb」；參見例如EP1517921B、WO2005/118642及WO2006/051288)及相關分子(例如，本發明之多肽序列)結合之dAb。與用於延長多肽之血清半衰期的當前技術相比，AlbudAb通常較小且較容易在諸如細菌或酵母之微生物表現系統中製造。由於HSA具有約三週之半衰期，故所得共軛分子改良相關分子之半衰期。使用dAb技術亦可增強相關分子之效力。
治療性及預防性用途
本發明提供用於治療或預防諸如肥胖及其他 體重異常、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐受及葡萄糖代謝異常之代謝及代謝相關疾病之方法，該方法係藉由投與如本文中所描述之多肽或其組成物。該等方法亦可藉由例如降低症狀之嚴重程度或頻率而對與疾病、病症或病狀相關之一或多種症狀具有有利效應。在特定實施例中，本發明提供藉由投與該多肽、經N糖基化之二聚體或其組合物來治療葡萄糖代謝或體重異常的方法。在特定實施例中，本發明提供藉由投與該多肽、經N糖基化之二聚體或其組合物來減少食物攝取或降低體重的方法。本發明進一步提供前述序列、多肽、經N糖基化之二聚體或其組合物的用途，其係用於製造用以治療選自以下之病狀的藥劑：代謝及代謝相關病症，諸如肥胖及其他體重異常、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐受及葡萄糖代謝異常。本發明進一步提供前述序列、多肽、經N糖基化之二聚體或其組合物之用途，其係用於製造用以治療葡萄糖代謝或體重異常之藥劑。本發明進一步提供前述序列、多肽、經N糖基化之二聚體或其組合物之用途，其係用於製造用以減少食物攝取或體重之藥劑。
為了確定個體是否可為藉由本文中所提供之方法治療或預防體重異常(例如肥胖)之候選者，將評估諸如但不限於病因學及個體病狀程度(例如該個體與參考健康個體相比之過重程度)之參數。舉例而言，BMI介於約25與約29.9kg/m2之間的成人可被視為過重(肥胖前期)，而BMI為約30kg/m2或更高的成人可被視為肥胖。如本 文中所論述，本發明之多肽可實現食慾抑制，例如降低食慾，從而引起體重減少。
為了確定個體是否可為藉由本文中所提供之方法治療或預防高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐受及/或葡萄糖異常之候選者，可利用此項技術中已知的各種診斷方法。該等方法包括本文中其他部分(例如空腹血漿葡萄糖(FPG)評估及口服葡萄糖耐受性測試(oGTT))所描述之方法。
本文中所提供之多肽及融合蛋白質當投與個體以治療或預防諸如肥胖及其他體重異常、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐受、葡萄糖代謝異常之代謝及代謝相關疾病時可引起血液葡萄糖水準降低、體重減少及/或食物攝取減少。
在某些實施例中，本文中所涵蓋之多肽及融合蛋白質可使血液葡萄糖水準、體重及/或食物攝取與不存在投與多肽或融合蛋白質時相比降低至少5%。舉例而言，本文中所涵蓋之多肽及融合蛋白質可使血液葡萄糖水準、體重及/或食物攝取與開始治療或預防之前相比降低至少10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%或90%。
醫藥組成物
本發明之多肽可呈適合於投與個體之組成物形式。一般而言，該等組成物為包含一或多種多肽及一或多種醫藥學上可接受或生理學上可接受之稀釋劑、載劑或 賦形劑的「醫藥組成物」。在某些實施例中，該多肽係以治療有效量存在。醫藥組成物可用於本發明之方法中；因而，舉例而言，醫藥組成物可離體或活體內投與個體以實施本文中所描述之治療性及預防性方法及用途。
本發明之醫藥組成物可經調配以便與預定投藥方法或途徑相容；例示性投藥途徑闡述於本文中。此外，醫藥組成物可與如本文中所描述之其他治療活性劑或化合物(例如，葡萄糖降低劑)組合使用，以便治療或預防如本發明所如涵蓋之疾病、病症及病狀。
醫藥組成物典型地包含治療有效量之至少一種本發明所涵蓋之多肽及一或多種醫藥學上及生理學上可接受之調配劑。適合之醫藥學上可接受或生理學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑包括但不限於抗氧化劑(例如，抗壞血酸及硫酸氫鈉)、防腐劑(例如，苯甲醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯)、乳化劑、懸浮劑、分散劑、溶劑、填充劑、增積劑、清潔劑、緩衝劑、媒劑、稀釋劑及/或佐劑。舉例而言，適合之媒劑可為可能補充有用於非經腸投與之醫藥組成物中常用的其他材料的生理鹽水溶液或檸檬酸鹽緩衝生理鹽水。 與血清白蛋白混合之中性緩衝生理鹽水或生理鹽水為其他例示性媒劑。熟習此項技術者將容易地識別可用於醫藥組成物及劑型中的多種緩衝液。典型緩衝液包括但不限於醫藥學上可接受之弱酸、弱鹼或其混合物。舉例而言，緩衝液組分可為水溶性材料，諸如磷酸、酒石酸、乳酸、丁二 酸、檸檬酸、乙酸、抗壞血酸、天冬胺酸、麩胺酸及其鹽。可接受之緩衝劑包括例如Tris緩衝液、N-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸鈉鹽(MES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)及N-參[羥基甲基]甲基-3-胺基丙磺酸(TAPS)。
在醫藥組成物已經調配之後，其可作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或脫水或凍乾粉末儲存在無菌小瓶中。該等調配物可以即用形式、需要在使用前復原之凍乾形式、需要在使用前稀釋之液體形式或其他可接受形式儲存。在一些實施例中，該醫藥組成物提供於單次使用容器(例如單次使用小瓶、安瓿、注射器或自動注射器(類似於例如EpiPen®))中，而在其他實施例中提供多次使用容器(例如多次使用小瓶)。任何藥物遞送裝置均可用於遞送多肽，包括植入物(例如，可植入型泵)及導管系統，兩者對於熟習此項技術者均為熟知的。一般經皮下或肌肉內投與之儲庫式注射劑亦可用於在所限定之時間段內釋放本文中所揭示之多肽。儲庫式注射劑通常基於固體或油，且一般包含至少一種本文中所闡述之調配組分。熟習此項技術者應熟習可能之調配物及儲庫式注射劑之用途。
醫藥組成物可呈無菌可注射水性或油質懸浮液形式。此懸浮液可根據已知技術使用本文中所提及之彼等適合之分散劑或潤濕劑及懸浮劑加以調配。無菌可注射製劑亦可為處於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無 菌可注射溶液或懸浮液，例如處於1,3-丁二醇中之溶液。 可採用之可接受稀釋劑、溶劑及分散介質包括水、林格氏溶液、等滲氯化鈉溶液、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇)及其適合之混合物。另外，無菌固定油類慣用作溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和固定油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。此外，諸如油酸之脂肪酸得以用於製備可注射劑。延長特定可注射調配物之吸收可藉由包括延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁或明膠)來達成。
含有活性成分(例如，本發明之多肽)之醫藥組成物可呈適合於經口使用之形式，例如，呈錠劑、膠囊劑、喉錠、口含錠、水性或油性懸浮液、可分散粉劑或顆粒劑、乳液、硬膠囊或軟膠囊或糖漿、溶液、微珠或酏劑。意欲經口使用之醫藥組成物可根據此項技術中已知的用於製造醫藥組成物的任何方法製備，且該等組成物可含有一或多種藥劑，諸如甜味劑、調味劑、著色劑及防腐劑，以提供醫藥學上美觀且可口之製劑。錠劑、膠囊劑及類似物含有活性成分與適合於製造錠劑之醫藥學上可接受之無毒賦形劑的混合物。此等賦形劑可為例如稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、磷酸鈣或磷酸鈉；粒化及崩解劑，例如玉米澱粉或海藻酸；黏合劑，例如澱粉、明膠或阿拉伯膠；及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
適合於經口投與之錠劑、膠囊劑及類似物可 能未經塗佈或藉由已知技術加以塗佈以延遲該胃腸道中之崩解及吸收且從而提供持續作用。舉例而言，可採用諸如單硬脂酸甘油酯或雙硬脂酸甘油酯之時間延遲材料。其亦可藉由此項技術中已知的技術加以塗佈以形成滲透性治療錠劑以用於控制釋放。其他藥劑包括生物可降解或生物相容性顆粒或聚合物，諸如聚酯、聚胺酸、水凝膠、聚乙烯基吡咯啶酮、聚酸酐、聚乙醇酸、乙烯-乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素、硫酸魚精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚丙交酯/乙交酯共聚物或乙烯乙酸乙烯酯共聚物，以控制所投與之組成物的遞送。舉例而言，經口藥劑可分別藉由使用羥甲基纖維素或明膠微膠囊或聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，藉由團聚技術或藉由界面聚合而俘獲於微膠囊中，或俘獲於膠態藥物遞送系統中。膠態分散系統包括大分子複合物、奈米膠囊劑、微球體、微珠及基於脂質之系統，包括水包油乳液、膠束、混合型膠束及脂質體。製備脂質體之方法描述於例如美國專利第4,235,871號、第4,501,728號及第4,837,028號中。用於製備以上提及之調配物的方法對於熟習此項技術者將顯而易見。
用於經口使用之調配物亦可作為硬明膠膠囊存在，其中該活性成分與惰性固體稀釋劑混合，例如碳酸鈣、磷酸鈣、高嶺土或微晶纖維素；或作為軟明膠膠囊存在，其中該活性成分與水或油介質混合，例如花生油、液體石蠟或橄欖油。
水性懸浮液含有活性物質與適合於其製造之賦形劑的混合物。該等賦形劑可為懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯基吡咯啶酮、黃蓍樹膠及阿拉伯樹膠；分散或潤濕劑，例如天然存在之磷脂(例如卵磷脂)或氧化乙烯與脂肪酸之縮合產物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)或氧化乙烯與長鏈脂族醇之縮合產物(例如十七氧乙烯鯨蠟醇)或氧化乙烯與來源於脂肪酸及己糖醇之偏酯的縮合產物(例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯)或氧化乙烯與來源於脂肪酸及己糖醇酐之偏酯的縮合產物(例如，聚乙烯山梨醇酐單油酸酯)。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑。
油性懸浮液可藉由使活性成分懸浮於植物油(例如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(諸如液體石蠟)中來調配。油性懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、固體石蠟或鯨蠟醇。可添加甜味劑(諸如以上所闡述之彼等甜味劑)及調味劑以提供可口之經口製劑。
適合於藉由添加水來製備水性懸浮液之可分散粉劑及顆粒劑提供活性成分與分散或潤濕劑、懸浮劑及一或多種防腐劑之混合物。適合之分散或潤濕劑及懸浮劑例示於本文中。
本發明之醫藥組成物亦可呈水包油乳液形式。油相可為植物油(例如橄欖油或花生油)或礦物油(例如液體石蠟)或此等之混合物。適合之乳化劑可為天然存在之樹膠，例如阿拉伯樹膠或黃蓍樹膠；天然存在之磷脂， 例如大豆、卵磷脂及來源於脂肪酸之酯或偏酯；己糖醇酐，例如山梨醇酐單油酸酯；及偏酯與氧化乙烯之縮合產物，例如聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯。
調配物亦可包括載劑以防止組成物快速降解或自體內消除，諸如控制釋放調配物，包括植入物、脂質體、水凝膠、前藥及微囊封遞送系統。舉例而言，可採用時間延遲材料，諸如單獨或與蠟組合之單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。
本發明涵蓋投與呈用於經直腸投與藥物之栓劑形式之多肽。栓劑可藉由將藥物與在常溫下為固體但在直腸溫度下為液體且因此將在直腸中熔融以釋放藥物之適合無刺激性賦形劑來製備。該等包括但不限於可可脂及聚乙二醇。
本發明所涵蓋之多肽可呈目前已知的或將要開發的任何其他適合之醫藥組成物形式(例如，用於經鼻或吸入使用之噴霧)。
調配物中之多肽或其片段之濃度可廣泛變化(例如，以重量計小於約0.1%，通常為或至少約2%至多達20%至50%或更多)，且通常將主要基於流體體積、黏性及基於個體之因素，根據例如所選特定投藥模式加以選擇。
本文中涵蓋對Nano Precision Medical之儲庫式遞送技術(Nano Precision Medical；Emeryville，CA)之使用。該技術利用產生大分子(諸如蛋白質及肽治療劑)之零級釋放率的二氧化鈦奈米管膜。將生物相容性膜容納於 提供治療大分子之長期(例如直至一年)恆定速率遞送的小皮下植入物中。當前正評估該技術用於遞送GLP-1促效劑以便治療II型糖尿病。在某些實施例中，本文中所揭示之多肽可為含膜之調配物。舉例而言，多肽可滲入該膜中且由該膜圍繞。該膜可呈圓盤形、管形或球形。在某些實施例中，該管可為奈米管，或該球可為奈米球。
在一些實施例中，本文中所描述之多肽可藉由使用可附接于患者且可向該患者遞送預定劑量之多肽的佩戴型遞送系統投與個體。例示性佩戴型遞送系統包括貼片或泵。在某些情況下，諸如用於遞送Neulasta®之佩戴型注射器之佩戴型遞送系統可用于投與本文中所揭示之多肽。在其他實施例中，可使用諸如可植入滲透泵(例如DUROS®泵或ALZET®滲透泵)之滲透泵向患者遞送本文中所描述之多肽。
投與途徑
本發明涵蓋以任何適當方式投與所揭示之多肽及其組成物。適合之投與途徑包括非經腸(例如，肌肉內、靜脈內、皮下(例如注射或植入)、腹膜內、腦池內、關節內、腹膜內、腦內(實質內)及腦室內)、經口、經鼻、經陰道、經舌下、經眼內、經直腸、經局部(例如，經皮)、經舌下及吸入。
一般經皮下或肌肉內投與之儲庫式注射劑亦可用於在所限定之時間段內釋放本文中所揭示之多肽。儲 庫式注射劑通常基於固體或油，且一般包含至少一種本文中所闡述之調配組分。熟習此項技術者應熟習可能之調配物及儲庫式注射劑之用途。
關於抗體，在一例示性實施例中，本發明之抗體或抗體片段以10mg/ml注射用無菌等滲生理鹽水溶液形式儲存在4℃下，且在投與個體之前稀釋於100ml或200ml注射用0.9%氯化鈉中。抗體係以介於0.2與10mg/kg之間的劑量經1小時之過程藉由靜脈內輸注投與。在其他實施例中，抗體係在15分鐘與2小時之間的週期內藉由靜脈內輸注投與。在其他實施例中，投與程序為經由皮下推注。
本發明涵蓋其中本發明之多肽或抗體或抗體片段每日至少兩次、每日至少一次、每48小時至少一次、每72小時至少一次、每週至少一次、每2週至少一次、每月至少一次、每2個月至少一次或每3個月至少一次或以更低頻率投與個體的方法。
組合療法
本發明涵蓋多肽與一或多種活性治療劑或其他預防或治療模態組合使用。在此種組合療法中，各種活性劑通常具有不同的作用機制。此種組合療法可因允許減少一或多種藥劑之劑量，從而減少或消除與一或多種藥劑相關之不利效應而尤其有利；此外，此種組合療法可對潛在疾病、病症或病狀具有協同治療或預防效應。
如本文中所使用，「組合」意在包括可單獨投與之療法，例如，單獨調配以用於單獨投與(例如，如可提供於套組中)，及可於單一調配物中一起投與之療法(亦即，「共調配」)。
在某些實施例中，依序投與或施用多肽，例如，投與一種藥劑，隨後投與一或多種其他藥劑。在其他實施例中，同時投與該等多肽，例如，其中同時或大約同時投與兩種或更多種藥劑；該兩種或更多種藥劑可存在於兩種或更多種單獨調配物中或組合於單一調配物(亦即，共調配物)中。不考慮該兩種或更多種藥劑是依序或是同時投與，其被視為出於本發明之目的組合投與。
本發明之多肽可與適用於治療、預防、抑制或改善本文中所闡述之疾病、病症或病症的其他藥劑組合使用，包括正常投與罹患肥胖、進食障礙、高血糖症、高胰島素血症、葡萄糖不耐受及其他葡萄糖代謝異常之個體的藥劑。
本發明涵蓋與許多藥劑(及其類別)之組合療法，包括1)胰島素、胰島素模擬物及需要刺激胰島素分泌之藥劑，包括磺醯脲(例如氯磺丙脲、甲磺氮脲、醋磺環已脲、甲磺丁脲、格列本脲、格列美脲、格列甲嗪)及美格替奈(例如米格列奈、瑞格列奈(PRANDIN)及那格列奈(STARLIX))；2)雙胍(例如二甲雙胍(GLUCOPHAGE)及其醫藥學上可接受之鹽，特定言之，二甲雙胍鹽酸鹽，及其延長釋放調配物，諸如GlumetzaTM、FortametTM及 GlucophageXRTM)及藉由促進葡萄糖利用、減少肝臟葡萄糖產生及/或減少腸葡萄糖輸出而起作用之其他藥劑；3)α-葡糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖、伏格列波糖及米格列醇)及減緩碳水化合物消化且因此減緩自腸管吸收並且減輕飯後高血糖之其他藥劑；4)增強胰島素作用(例如，藉由胰島素敏感化)，包括胰島素及胰島素模擬物(例如，德穀胰島素、甘精胰島素、離脯胰島素、地特胰島素、離麩胰島素及各自之可吸入調配物)，因而促進周圍組織中之葡萄糖利用的噻唑啶二酮(例如羅格列酮(AVANDIA)、曲格列酮(REZULIN)、吡格列酮(ACTOS)、格列甲嗪、巴格列酮、來格列酮、奈格列酮、AMG 131、MBX2044、米格列酮、洛格列酮、IDR-105、曲格列酮、恩格列酮、噻格列酮、阿格列酮、達格列酮；5)類升糖素肽，包括DPP-IV抑制劑(例如阿格列汀、奧格列汀、利格列汀、維達列汀(GALVUS)及西他列汀(JANUVIA))及類升糖素肽-1(GLP-1)及GLP-1促效劑及類似物(例如，艾塞那肽(BYETTA及ITCA 650(插入皮下之滲透泵，其在12個月之週期內遞送艾塞那肽；Intarcia，Boston，MA))及GLP-1受體促效劑(例如，杜拉魯肽、索馬魯肽、阿必魯肽、艾塞那肽、利拉魯肽、利西那肽、他司魯肽、CJC-1131及BIM-51077，包括其鼻內、經皮及每週一次調配物)；及6)抗DPP-IV類似物(腸促胰島素模擬物)、PPARγ促效劑、諸如非諾貝酸衍生物(例如，吉非羅齊、氯貝丁酯、環丙貝特、非諾貝特、苯紮貝特)之PPARα促效劑、雙作用 PPAR促效劑(例如，ZYH2、ZYH1、GFT505、西格列紮、莫格列紮、阿格列紮、索格列紮及那格列紮)、全作用PPAR促效劑、PTP1B抑制劑(例如，ISIS-113715及TTP814)、SGLT抑制劑(例如，ASP1941、SGLT-3、艾格列淨、達帕格列淨、卡格列淨、BI-10773、PF-04971729、瑞格列淨、TS-071、托格列淨、伊格列淨及LX-4211)、胰島素促分泌劑、血管收縮素轉化酶抑制劑(例如阿拉普利、貝那普利、卡托普利、西羅普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、咪達普利、賴諾普利、莫維普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、替莫普利或群多普利)、血管收縮素II受體拮抗劑(例如，洛沙坦，即，COZAAR®、纈沙坦、坎地沙坦、奧美沙坦、替米沙坦及此等藥物中之任一者與諸如HYZAAR®之氫氯噻嗪組合使用)或其他抗高血壓藥物(諸如LCZ 696)、RXR促效劑、糖原合成激酶-3抑制劑、免疫調節劑、交感神經阻斷劑、β-腎上腺素激導性阻斷藥(例如，普萘洛爾、阿替洛爾、比索洛爾、卡維洛爾、美托洛爾或酒石酸美托洛爾)、α腎上腺素激導性阻斷藥(例如，多沙唑嗪、呱唑嗪或α甲基多巴)、中樞α腎上腺素激導性促效劑、周圍血管舒張劑(例如胼苯噠嗪)、β-3腎上腺素激導性受體促效劑、11β-HSD1抑制劑及中性內肽酶抑制劑(例如，塞奧芬及磷酸阿米酮)、醛固酮拮抗劑、醛固酮合成酶抑制劑、腎素抑制劑(例如，二肽及三肽之脲衍生物(參見美國專利號5,116,835)、胺基酸和衍生物 (美國專利5,095,119及5,104,869)、由非肽鍵連接之胺基酸鏈(美國專利5,114,937)、二肽及三肽衍生物(美國專利5,106,835)、肽基胺基二醇(美國專利5,063,208及4,845,079)及肽基β-胺基醯基胺基二醇胺基甲酸酯(美國專利5,089,471)；以及如以下美國專利5,071,837、5,064,965、5,063,207、5,036,054、5,036,053、5,034,512及4,894,437中所揭示之多種其他肽類似物，及小分子腎素抑制劑(包括二醇磺醯胺及亞磺醯(美國專利5,098,924)、N-嗎啉基衍生物(美國專利5,055,466)、N-雜環醇(美國專利4,885,292)及吡咯並咪唑酮(美國專利5,075,451)；以及胃蛋白酶抑制劑衍生物(美國專利4,980,283)及含斯達酮(statone)之肽的氟代及氯代衍生物(美國專利5,066,643)、依那吉倉、RO 42-5892、A 65317、CP 80794、ES 1005、ES 8891、SQ 34017、阿利吉侖(2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(2-胺基甲醯基-2-甲基丙基)-5-胺基-4-羥基-2,7-二異丙基-8-[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)-苯基]-辛醯胺半富馬酸酯)SPP600、SPP630及SPP635)、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶-5抑制劑(例如西地那非、他達拉非及伐地那非)、血管舒張劑、鈣通道阻斷劑(例如，胺氯地平、硝苯地平、維拉帕米、地爾硫卓、加洛帕米、尼魯地平、尼莫地平、尼卡地平)、鉀通道活化劑(例如，尼可地爾、吡那地爾、克羅卡林、米諾地爾、阿吡卡林、洛普唑侖)、降脂劑(例如，HMG-CoA還原酶抑制劑，諸如以內酯前藥形式作為ZOCOR®及 MEVACOR®出售且在投與後充當抑制劑之辛伐他汀及洛伐他汀，及二羥基開環酸HMG-CoA還原酶抑制劑之醫藥學上可接受之鹽，諸如阿托伐他汀(尤其以LIPITOR®形式出售之鈣鹽)、羅蘇伐他汀(尤其以CRESTOR®形式出售之鈣鹽)、帕伐他汀(尤其以PRAVACHOL®形式出售之鈉鹽)、西立伐他汀及氟伐他汀(尤其以LESCOL®形式出售之鈉鹽))；膽固醇吸收抑制劑，諸如怡妥錠(ZETIA®)及怡妥錠與任何其他降脂劑，諸如上述HMG-CoA還原酶抑制劑且尤其與辛伐他汀(VYTORIN®)或與阿托伐他汀鈣之組合；HDL升高藥(例如菸鹼酸及菸鹼酸受體促效劑)及其延長釋放或控制釋放型式，及/或HMG-CoA還原酶抑制劑；菸鹼酸受體促效劑，諸如阿西莫司及阿昔呋喃，以及菸鹼酸受體部分促效劑；升糖素受體拮抗劑(例如，MK-3577、MK-0893、LY-2409021及KT6-971)；膽酸螯合劑(例如，考來替蘭、考來替胺、考來維侖鹽酸鹽、考來替泊、消膽胺及交聯葡聚糖之二烷基胺基烷基衍生物)、醯基CoA：膽固醇醯基轉移酶抑制劑(例如阿伐麥布)；意欲用於發炎性病狀之藥劑，諸如阿司匹靈、非類固醇消炎藥或NSAID、糖皮質激素及選擇性環加氧酶-2或COX-2抑制劑；葡糖激酶活化劑(GKA)(例如AZD6370)；11β-羥基固醇脫氫酶1型抑制劑(例如，諸如美國專利號6,730,690中所揭示者及LY-2523199)；CETP抑制劑(例如安塞曲匹、依塞曲匹及托塞曲匹)；果糖1,6-二磷酸酶抑制劑(例如，諸如美國專利號6,054,587、6,110,903、6,284,748、 6,399,782及6,489,476中所揭示者)；乙醯CoA羧化酶-1或乙醯CoA羧化酶-2抑制劑(ACC1或ACC2)；PCSK9抑制劑；GPR-40部分促效劑；SCD調節劑；脂肪酸合成酶抑制劑；支鏈澱粉及支鏈澱粉類似物(例如普蘭林肽)；包括上述活性劑之化學式可能之醫藥學上可接受之鹽形式。
此外，本發明涵蓋含用於促進體重損失之藥劑及方法的組合療法，諸如刺激代謝或減少食慾之藥劑，及改變飲食及/或鍛煉方案以促進體重損失。
本發明之多肽可與一或多種其他藥劑以在該等情形下適當之任何方式組合使用。在一個實施例中，在一段時間內維持用至少一種活性劑及至少一種本發明多肽治療。在另一實施例中，減少或停止用至少一種活性劑治療(例如，當個體穩定時)，同時以恆定給藥方案維持用本發明多肽治療。在另一實施例中，減少或停止用至少一種活性劑治療(例如，當個體穩定時)，同時減少用本發明多肽治療(例如，較低劑量、較低給藥頻率或較短治療方案)。在另一實施例中，減少或停止用至少一種活性劑治療(例如，及個體穩定時)，且增加用本發明多肽治療(例如，較高劑量、較高給藥頻率或較久治療方案)。在另一實施例中，維持用至少一種活性劑治療，且減少或停止用本發明多肽治療(例如，較低劑量、較低給藥頻率或較短治療方案)。在另一實施例中，減少或停止用至少一種活性劑治療及用本發明多肽治療(例如，較低劑量、較低給藥頻率或較短治療方案)。
給藥
本發明多肽可投與個體之量視例如以下因素而定：投與目標(例如，所要解決程度)；欲治療個體之年齡、體重、性別及健康及物理狀態；所施用之多肽及/或調配物之本質；投與途徑；及疾病、病症、病狀或其症狀之本質(例如，葡萄糖/胰島素失調之嚴重程度及病症階段)。給藥方案亦可考慮與所投與之藥劑相關之任何不利作用之存在、本質及程度。可根據例如安全性及劑量升級試驗、活體內研究(例如，動物模型)及熟習此項技術者已知的其他方法容易地確定有效劑量之量及給藥方案。
一般而言，給藥參數決定劑量之量小於可能對個體造成不可逆之毒性的量(亦即，最大耐受劑量，「MTD」)且不小於對個體產生可量測之效應所需的量。該等量係由例如與、分佈、代謝及排泄(「ADME」)相關之醫藥動力學及藥效學參數，考慮投與途徑及其他因素而決定。
有效劑量(ED)為藥劑在一定分數之服用其之個體中產生治療反應或所要效應之劑量或量。藥劑之「中值有效劑量」或ED50為藥劑在其所投與之群體之50%中產生治療反應或所要效應之劑量或量。儘管ED50通常用作藥劑效應之合理預期值之量度，但臨床醫師可能認為適當之劑量未必考慮到所有相關因素。因而，在一些情形中，有效量大於計算ED50，在其他情形中，有效量小於 計算ED50，且在其他情形中，有效量與計算ED50相同。
另外，本發明多肽之有效劑量可為當以一或多個劑量投與個體時相對於健康個體產生所要結果的量。 舉例而言，有效劑量可為當投與具有升高之血漿葡萄糖及/或血漿胰島素之個體時相對於健康個體達成至少約10%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或多於80%之所要降低。
適當劑量水準一般將為每天約0.001至100mg/kg患者體重，此可以單個或多個劑量投與。在一些實施例中，劑量水準將為每天約0.01至約25mg/kg，且在其他實施例中為每天約0.05至約10mg/kg。適合之劑量水準可為每天約0.01至約25mg/kg、每天約0.05至10mg/kg或每天約0.1至5mg/kg。在此範圍內，該劑量可為每天0.005至0.05、0.05至0.5或0.5至5.0mg/kg。
為了投與經口藥劑，該等組成物可以含1.0至1000毫克活性成分，尤其1.0、3.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0及1000.0毫克活性成分之錠劑、膠囊劑及類似形式提供。多肽可按例如每天1至4次及通常每天一次或兩次之方案投與。
本發明多肽之劑量可以適當頻率重複，該頻 率可在每天一次至每三個月一次之範圍內，視多肽之藥物動力學性質(例如半衰期)及藥效學反應(例如多肽之治療效應之持續時間)而定。在一些實施例中，通常在每週一次與每3個月一次之間重複給藥。在其他實施例中，大約每個月一次投與多肽。
在某些實施例中，所揭示之多肽的劑量容納於「單位劑型」中。片語「單位劑型」係指物理上離散之單元，各單元含有預定量之單獨或與一或多種其他藥劑組合之本發明多肽，從而足以產生所要效應。應瞭解，單位劑型之參數將視特定藥劑及欲達成之效應而定。
套組
本發明亦涵蓋包含所揭示之多肽及其醫藥組成物的套組。該等套組一般呈容納各種組分之物理結構形式，如下文所描述，且可用於例如實施以上所描述之方法(例如，向需要體重減輕之個體投與多肽)。
套組可包括一或多種本文中所揭示之多肽(提供於例如無菌容器中)，其可呈適合於投與個體之醫藥組成物形式。多肽可以即用形式或以需要在投與前復原或稀釋之形式提供。當多肽呈需要由使用者復原之形式時，該套組亦可包括與多肽一起或分開包裝之緩衝劑、醫藥學上可接受之賦形劑及類似物。當預期組合療法時，該套組可含有若干分開或可能已組合於套組中之藥劑。該套組之各組分可囊封於個別容器內，且所有不同的容器均可處在單 一包裝內。本發明之套組可設計用於必需適當維持容納於其中之組分的狀況(例如冷藏或冷凍)。
套組可含有包括關於其中組分之鑑別資訊及關於其使用之說明(例如，給藥參數、活性成分之臨床藥理學(包括作用機制)、醫藥動力學及藥效學、不利效應、禁忌等)的標簽或包裝插頁。標簽或插頁可包括製造商資訊，諸如批號及過期日期。標簽或包裝插頁可例如併入容納組分之物理結構中，分開容納於該物理結構內或附著於該套組之組件(例如安瓿、管或小瓶)。例示性說明包括關於用所揭示之調節劑及其醫藥組成物減少或降低血液葡萄糖、治療高血糖症、治療糖尿病等之說明。
標簽或插頁可另外包括或併入電腦可讀媒體，諸如磁碟(例如，硬碟、插卡、記憶磁碟)、光碟(諸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3、磁帶或電存儲媒體，諸如RAM及ROM)或此等媒體之混合形式，諸如磁性/光學儲存媒體、FLASH媒體或記憶型插卡。在一些實施例中，實際說明不存在於套組中，而是提供用於自遠程來源(例如，經由網際網路)獲得說明之手段。
實驗
發佈以下實例以向熟習此項技術者提供如何製造及使用本發明之完整揭示及描述，而不欲限制被諸位發明者視作其發明之範疇，其亦不欲表示以下實驗為所有實驗或僅進行之實驗。已試圖確保關於所使用之數字(例 如，量、溫度等)的準確度，但應考慮一些實驗誤差及偏差。
除非另外指示，否則份數為重量份數，分子量為重量平均分子量，溫度為攝氏度(℃)，且壓力為或接近大氣壓。使用標準縮寫，包括以下各項：bp=鹼基對；kb=千鹼基；pl=皮升；s或sec=秒；min=分鐘；h或hr=小時；aa=胺基酸；kb=千鹼基；nt=核苷酸；ng=奈克；μg=微克；mg=毫克；g=公克；kg=公斤；dl或dL=分升；μl或μL=微升；ml或mL=毫升；l或L=公升；μM=微莫耳；mM=毫莫耳；M=莫耳；kDa=千道爾頓；i.m.=肌肉內；i.p.=腹膜內；s.c.=皮下；bid=每日兩次；HPLC=高效液相層析；BW=體重；U=單位；ns=統計上不顯著；PG=空腹血漿葡萄糖；FPI=空腹血漿胰島素；ITT=胰島素耐受性測試；PTT=丙酮酸鹽耐受性測試；oGTT=經口葡萄糖耐受性測試；GSIS=葡萄糖刺激之胰島素分泌；PBS=磷酸鹽緩衝生理鹽水；PCR=聚合酶鏈反應；NHS=N-羥基丁二醯亞胺；DMEM=杜爾貝科氏改良伊格爾培養基；GC=基因組複本；EDTA=乙二胺四乙酸。
材料及方法
以下方法及材料用於以下實例中：動物。使飲食誘導型肥胖(DIO)雄性C57BL/6J小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)維持含有 60kcal%脂肪、20kcal%蛋白質及20kcal%碳水化合物之高脂肪飲食(D12492，Research Diets,Inc.，New Brunswick，NJ)持續12至20週。所有動物研究均經NGM學會動物照護與使用委員會(NGM Institutional Animal Care and Use Committee)批准。DIO C57BL/6J小鼠提供肥胖之類人模型，其中肥胖係基於過量卡路里攝取。C57BL/6J小鼠易於肥胖，其中觀測到顯著體重增加以及高胰島素血症及有時高血糖症。此品系為最常用於模仿飲食誘導之肥胖的小鼠品系。(Nilsson C.等人，Acta Pharmacologica Sinica(2012)33：173-181)。
核酸及胺基酸序列。GenBank登記號BC000529.2闡述編碼人類GDF15變異體之ORF之cDNA，且GenBank登記號NP_004855.2闡述由該cDNA編碼之胺基酸序列。智人血清白蛋白cDNA係購自Origene(SC319937)，GeneBank登記號NM_000477.3、NP_000468)。
將Kozak元件及人類IgK信號肽序列(5'CACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCCAGATGT3')(SEQ ID NO：98)插入pTT5載體(National Research Council Canada)中之PmeI與EcoRI位點之間。儘管兩個限制位點均被消除，但產生AgeI位點以便進行進一步同框選殖。為了產生hIgK-GDF15構築體，使用以下各物藉由PCR來擴增GDF15 DNA：正向引子：5'-CTCCGAGGTGCCAGATGTGCGCGC AACGGGGACCACTGTCCGCTCGGG 3'(SEQ ID NO：102)及反向引子：5'-CCTCGAGCGGCCGCTAGCTCATATGCAGTGGCAGTCTTTGGCTAACAA 3'(SEQ ID NO：99)及Sapphire PCR混合物(Clontech)。對PCR產物進行凝膠純化(Qiagen Gel Extraction套組)，且使用In-Fusion(Clontech)選殖於pTT5-hIgK(用AgeI/HindIII加以線性化)中。為了產生hIgK-HSA-連接子-GDF15構築體，使用適當引子，藉由PCR個別地擴增HSA-連接子及GDF15。在凝膠純化之後，使用Gibson Assembly Master Mix來組裝兩個PCR片段及線性化pTT5載體。分別用In-Fusion及Gibson反應轉型Stellar或NEB 5α細胞，接種於含卡本西林之LB-瓊脂板上且在37℃下培育隔夜。揀選單一群落且藉由測序加以分析。純化得自陽性群落之DNA(DNA-Maxi-prep，Qiagen)，確定全長序列且用於轉染哺乳動物細胞以便進行重組蛋白質表現。
為了產生特定突變蛋白，用QuikChange Lightning套組(Agilent)及適當引子進行定點突變誘發。
瞬時表現。將所有GDF15突變蛋白均瞬時轉染於Expi 293F細胞(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)中。將細胞以常規方式次選殖於Expi表現培養基(Invitrogen)中，且維持為尺寸可變之搖瓶中之懸浮液培養物。典型地，細胞係以5e5個活細胞/毫升之細胞密度進行次選殖且在次選殖之前生長3天。將燒瓶維持在濕潤CO2培育器中，該培育器維持在37℃及5%CO2水準下。 將細胞維持在120RPM之攪拌速率下之New Brunswick振盪器平臺(New Brunswick Scientific Company，Edison，NJ)上。
當培養物之細胞密度達到2.5e6個活細胞/毫升且活力大於95%時進行轉染。典型地，對於50ml轉染，將2.5e6個細胞/毫升×50ml細胞接種於250ml搖瓶中，培養物體積為42.5ml。將由含相關基因之表現載體組成之50μg質體DNA首先稀釋於2.5ml OPTI-MEM減血清培養基(Invitrogen)中。同時，將(質體DNA量之)2.67倍體積之Expifectamine轉染試劑(Invitrogen)亦稀釋於2.5ml OPTI-MEM減血清培養基中。在室溫下培育5分鐘之後，將經稀釋之轉染試劑緩慢添加至經稀釋之質體DNA中以形成勝任轉染之複合物。在室溫下經20分鐘之培育期之後，將5ml轉染複合物添加至42.5ml細胞培養物中。隨後將經轉染之細胞置於濕潤CO2培育器中維持在120RPM下之軌道式振盪器上。轉染後二十四小時，對經轉染之培養物饋入250μl增強子1溶液(Invitrogen)及2.5ml增強子2溶液(Invitrogen)。隨後將培養物再置於濕潤CO2培育器中之軌道式振盪器上。轉染後6至7天，藉由在3000RPM下離心30min，隨後經由0.2μm過濾器(Nalgene)過濾來收集細胞。隨後在考馬斯藍染色凝膠上分析樣品之表現。
穩定CHO細胞表現. 由基於Lonza之確立CHOK1SV細胞表現系統之含CHOK1SV GS-KO宿主細胞 株之GS XceedTM System穩定表現GDF15突變蛋白。GS Xceed System使得能夠產生適合於cGMP製造之高表現細胞株。該系統包括cGMP庫存CHOK1SV GS-KO宿主細胞、GS表現載體、針對細胞培養、轉染、選擇及細胞株篩選之完整方案及v8產生方法(培養基及饋料)。在開發針對GDF15突變蛋白之細胞株時，遵循製造商提議之推薦方案以首先建立未選殖之細胞株。隨後使未選殖細胞株經受限制稀釋選殖以分離高表現單細胞純系。
GDF15重組蛋白之純化. 使用藍色瓊脂糖凝膠親和力俘獲或離子變化俘獲自培養基中純化出HSA-GDF15融合物。在兩種情況下，使用有助於實現最佳溶離及與宿主細胞蛋白質雜質分離之適當鹽梯度/pH值條件來溶離HSA-GDF15融合物。隨後使用GE Healthcare Superdex 200(26/60)管柱，使用1×PBS作為運作緩衝液進一步純化所有HSA-GDF15融合物。進一步表徵經純化之融合物且用LC/MS(Agilent 6500系列Q-TOF)證實序列，經由凝膠過濾HPLC(Agilent 1200-HPLC)及SDS-PAGE凝膠(非還原型及還原型)以考馬斯藍及/或銀染色證實單分散性。對於活體內實驗，對皮下注射而言，證實內毒素小於5EU/mg。
使用離子交換俘獲自培養基中純化出GDF15糖基化突變蛋白。在所有情況下，使用有助於實現最佳溶離及與宿主細胞蛋白質雜質分離之適當鹽梯度/pH值條件來溶離GDF15突變蛋白。隨後在pH 8.0下使用硫酸銨之 降低線性梯度，使用GE HiTrap Phenyl HP進一步純化所有GDF15突變蛋白。經由非還原型SDS-PAGE凝膠上之凝膠位移，基於純度及糖基化性質評估並彙集溶離份。隨後進一步表徵各GDF15突變蛋白之最終彙集物且用LC/MS(Agilent 6500系列Q-TOF)證實序列/聚糖(+/- PNGase F，NEB目錄號P0704S)，經由凝膠過濾HPLC(Agilent 1200-HPLC)及SDS-PAGE凝膠(非還原型及還原型)以考馬斯藍及/或銀染色證實單分散性。所有GDF15突變蛋白均在10mM乙酸鈉pH 4.0中調配。
對人類GDF15突變蛋白之溶解度評估.使突變蛋白透析至0.01%(v/v)甲酸(pH 2.0)中，且使用由再生硝化纖維10,000 NMWL(UFC901096)組成之Amicon Ultra Centrifugal Filters加以濃縮，在一些情況下大於10mg/mL。使用在280nm波長下之吸光率及Beer定律(消光係數=14400，分子量=12,287Da)來測定各突變蛋白之起始濃度。隨後將各突變蛋白2倍連續稀釋回0.01%甲酸中且將90μL各稀釋添加至96孔板中。將10μL 10×PBS(含0.5M Tris pH 7.0)添加至各孔且證實pH值為7。在室溫下隨振盪培育隔夜之後，在370nm下量測混濁度。開始發生混濁之反曲點被視為各突變蛋白之最大溶解度。將突變蛋白視其溶解度水準而分類為五組之一：<0.2mg/mL=+；
Figure 104124401-A0202-12-0110-224
0.2mg/mL=++；
Figure 104124401-A0202-12-0110-225
0.5mg/mL=+++；
Figure 104124401-A0202-12-0110-226
1.0mg/mL=++++；
Figure 104124401-A0202-12-0110-227
5.0mg/mL=+++++。
實例1：經穩定之HSA-GDF15融合分子之工程改造
構築體M1之表現顯示在CHOK1SV GSKO穩定細胞株中之產生挑戰(圖4)。在細胞培養基中觀測到HSA-GDF15二聚融合分子之顯著剪接。使用離子交換及/或疏水性相互作用層析及/或凝膠過濾來分離經剪接物質，以產生經富集物質來源以供進一步表徵。在Agilent 6500系列Q-TOF上進行LC/MS分析之後，HSA融合物之C末端、連接子及GDF15之N末端中顯而易見剪接位點。來自構築體M1之主要物質鑑別如下(連接子=加下劃線，GDF15=加粗)：物質1(SEQ ID NO：103)：
Figure 104124401-A0202-12-0111-2
Figure 104124401-A0202-12-0112-3
物質2(SEQ ID NO：104)：
Figure 104124401-A0202-12-0112-4
物質3(SEQ ID NO：105)：
Figure 104124401-A0202-12-0112-6
Figure 104124401-A0202-12-0113-7
應注意，物質3包括成熟人血清白蛋白胺基酸序列及連接子序列之一(第一)個胺基酸。物質1及2錯失成熟人血清白蛋白胺基酸序列之最後八個胺基酸及C末端的最後一個胺基酸。
物質4(SEQ ID NO：106)：
Figure 104124401-A0202-12-0113-8
Figure 104124401-A0202-12-0114-232
物質5(SEQ ID NO：107)：
Figure 104124401-A0202-12-0114-10
為了最小化並修正在融合分子之連接子區域附近觀測到之剪接問題，設計等效於構築體M1之構築體M2，然而截除GDF15中之前三個N末端殘基(△ARN或△N3)(圖3)。所得經穩定之M2構築體在表現於CHOK1SV GSKO穩定細胞株中時顯示極小剪接問題，如在針對各經表現之構築體比較改良培養基時針對M1所觀測。圖4顯示針對M1所觀測之顯著剪接及構築體M2之穩定性。
基於針對構築體M2所觀測之穩定性增強，達成進一步工程改造以獲得最佳連接子長度及剪接潛力。達成[(G4S)]5之經優化連接子長度且與3個殘基(M3-△ARN或△N3)或6個殘基(M4-△ARNGDH或△N6)之GDF15 N末端缺失偶合(參見圖5)。
實例2：穩定性提高之HSA-GDF15融合分子在DIO小鼠模型中對體重及食物攝取之效應
在7天週期內評估經皮下投與之具有與重組人類GDF15融合之重組HSA的融合分子對體重及食物攝取之效應。簡言之，以4nmol/kg、12nmol/kg及40nmol/kg之劑量，以單次皮下推注(10mL/kg)形式向稱重約38g至40g之DIO小鼠投與融合蛋白質M1(圖3)、M3及M4(圖5)。在投與媒劑對照或融合蛋白質之後，在給藥後24小時及7天監測體重及食物攝取以監測效力。針對投與40nmol/kg劑量之DIO小鼠所獲得之結果呈現 於圖6及圖7中。
如圖6中所描繪，以40nmol/kg(4nmol/kg及12nmol/kg未圖示)之劑量投與融合蛋白質顯著改良食物攝取減少。在各組小鼠中，n=8且p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；ns=不顯著)係藉由在各規定時間點比較各種濃度下之食物攝取與媒劑對照組的史都登氏非配對T檢定來確定。
參考圖6，投與融合蛋白質相對於媒劑對照後24小時(1天)產生以下食物攝取減少(媒劑=2.8g +/- 0.13g)：4nmol/kg劑量組(M1=1.9g +/- 0.25g，**；M3=1.8g +/- 0.18g，***；M4=1.8g +/- 0.10g，***)、12nmol/kg劑量組(M1=1.5g +/- 0.19g，***；M3=1.9g +/- 0.16g，***；M4=1.7g +/- 0.12g，***)及40nmol/kg劑量組(M1=1.3g +/- 0.11g，***；M3=1.8g +/- 0.06g，***；M4=1.5g +/- 0.15g，***)。投與融合分子相對於媒劑對照後7天產生以下食物攝取減少(媒劑=2.7g +/- 0.09g)：4nmol/kg劑量組(M1=2.0 +/- 0.18g，**；M3=2.5g +/- 0.08g，ns；M4=2.5g +/- 0.09g，ns)、12nmol/kg劑量組(M1=2.0g +/- 0.20g，**；M3=2.2g +/- 0.17g，*；M4=2.4g +/- 0.28g，ns)及40nmol/kg劑量組(M1=1.7g +/- 0.14g，***；M3=2.4g +/- 0.25g，ns；M4=2.2g +/- 0.24g，ns)。
如圖7中所描繪，以40nmol/kg(4nmol/kg及12nmol/kg未圖示)之劑量投與融合分子顯著減少體 重。在各組小鼠中，n=8且p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；ns=不顯著)係藉由在各規定時間點比較各種濃度下之食物攝取與媒劑對照組的史都登氏非配對T檢定來確定。
參考圖7，在投與融合分子相對於媒劑對照之前的給藥時間(天數=0)，記錄以下體重(媒劑=39.0g +/- 0.92g)：4nmol/kg劑量組(M1=39.2g +/- 0.66g；M3=39.4g +/- 0.91g；M4=39.3g +/- 0.77g)、12nmol/kg劑量組(M1=39.4g +/- 0.78g；M3=39.3g +/- 1.09g；M4=39.3g +/- 0.81g)及40nmol/kg劑量組(M1=39.2g +/- 0.64g；M3=39.2g +/- 0.68g；M4=38.9g +/-0.60g)。 投與融合分子相對於媒劑對照後24小時(天數=1)，記錄以下體重(降低%=△差異相對於投與劑量前之群組體重)。媒劑=+0.3g +/- 0.11g，+0.6%)，4nmol/kg劑量組(M1=-0.6g +/- 0.21g，-1.5%，***；M3=-0.6g +/- 0.17g，-1.6%，***；M4=-0.9g +/- 0.13g，-2.4%，***)、12nmol/kg劑量組(M1=-0.9g +/- 0.11g，-2.3%，***；M3=-0.7g +/- 0.18g，-1.6%，***；M4=-0.6g +/- 0.16g，-1.7%，***)及40nmol/kg劑量組(M1=-1.0g +/- 0.14g，-2.5%，***；M3=-0.6g +/- 0.09g，-1.5%，***；M4=-0.8g +/-0.22g，-2.1%，***)。投與融合分子相對於媒劑對照後7天，記錄以下體重(降低%=△差異相對於投與劑量前之群組體重)。媒劑=+1.2g +/- 0.25g，+3.1%)、4nmol/kg劑量組(M1=-1.3g +/- 0.30g，-3.3%， ***；M3=-1.1g +/- 0.32g，-2.8%，***；M4=-2.0g +/- 0.29g，-5.0%，***)、12nmol/kg劑量組(M1=-1.8g +/- 0.34g，-4.7%，***；M3=-1.4g +/- 0.43g，-3.6%，***；M4=-1.5g +/- 0.32g，-3.7%，***)及40nmol/kg劑量組(M1=-2.6g +/- 0.28g，-6.7%，***；M3=-2.1g +/- 0.28g，-5.4%，***；M4=-2.6g +/-0.31g，-6.7%，***)。
圖6及圖7中之資料顯示具有GDF15之連接子優化及N末端截短之HSA融合物具有活性，且該等融合分子代表一種用於增強GDF15分子之某些有益性質的可行方法。
實例3：具有經改良之物理性質的人類GDF15突變蛋白
實例3中所闡述之資料解決與成熟人類GDF15所固有之表面疏水性及親水性相關的溶解度限制。另外，評估沿成熟人類GDF15之序列引入N連接之糖基化一致位點對溶解度之效應。為了有助於評估成熟重組人類GDF15突變蛋白之表現特徵、糖基化性質及溶解度，均構築為與IgK信號肽序列融合之成熟突變蛋白且描繪於圖8A中。產生17種GDF15突變蛋白(表示為M5至M21；分別為SEQ ID NO：81-97)。對於M16，N末端缺失型式：產生△N3-M16突變蛋白且測定其溶解度。M5突變蛋白含有藉由以T取代wt GDF15(SEQ ID NO：1)中位置5上的D及藉由以N取代wt GDF15(SEQ ID NO：1)中 位置21上的R而引入的兩個N連接之糖基化一致位點。在突變蛋白M6至M21中，引入一個N連接之糖基化一致位點(參見圖8A)。應注意，儘管出於參考取代位置之目的，突變蛋白在N末端包括IgK信號序列，但該等殘基係編號為SEQ ID NO：1中之相應殘基之位置。因而，舉例而言，儘管T存在於M5突變蛋白中之位置27上，但其被稱為位置5，因為相應D殘基在SEQ ID NO：1中之位置為5。
經由快速傾入10×PBS+0.5M Tris pH 7.0(可評估突變蛋白相對於成熟人類GDF15之溶解度改良的嚴格緩衝液)中對突變蛋白(於0.01%甲酸中)進行溶解度評估。
溶解度評估係基於使用Beer定律，使用消光係數(成熟人類GDF15=14,400/單體)及分子量(成熟人類GDF15=12,278Da/單體)計算之在280nm下之吸光率來確定。
在評估溶解度之前，各經工程改造之N-聚糖突變蛋白闡述於圖8A中且評估△N3-M16突變蛋白呈摺疊型GDF15同源二聚體形式向哺乳動物組織培養基中分泌及N聚糖位點佔用率。如圖9中所闡述，十八種糖基化突變蛋白中有十四種分泌為摺疊型GDF15同源二聚體，而M8、M10、M14及M15不形成二聚體且表現為聚集物。隨後藉由LC/MS及SDS-PAGE凝膠位移評估分泌為同源二聚體之所有十四種經表現之糖基化突變蛋白，以確定自 改良培養基中純化出之後N-聚糖基團在一致位點上之佔用率。在所有十四種情況下，經表現之突變蛋白含有高度佔用率，且分析亞組對諸如溶解度之物理性質的改良。
監測分泌為同源二聚體且在一致位點內具有高聚糖佔用率的經工程改造之N-聚糖GDF15突變蛋白相對於成熟人類GDF15對溶解度之改良。開始發生混濁之反曲點被視為各突變蛋白之最大溶解度。將突變蛋白視其溶解度水準而分類為五組之一：<0.2mg/mL=+；
Figure 104124401-A0202-12-0120-228
0.2mg/mL=++；
Figure 104124401-A0202-12-0120-229
0.5mg/mL=+++；
Figure 104124401-A0202-12-0120-230
1.0mg/mL=++++；
Figure 104124401-A0202-12-0120-231
5.0mg/mL=+++++。所評估之各N-聚糖GDF15突變蛋白與成熟人類GDF15相比展現改良之溶解度：M5：++++，M7：+++，M11：+++，M12：+++，M13：++++，M16：+++++，△N3-M16：+++++，M17：+++++，M20：++++，M21：+++。
實例4：M16、△N3-M16及M17突變蛋白在DIO小鼠模型中對食物攝取之效應
評估經皮下投與糖基突變蛋白對食物攝取之效應。以上實例3中描述糖基突變蛋白M16(SEQ ID NO：92)及M17(SEQ ID NO：93)。亦評估命名為△N3-M16之糖基突變蛋白。△N3-M16糖基突變蛋白之序列提供如下：
Figure 104124401-A0202-12-0120-11
Figure 104124401-A0202-12-0121-12
(SEQ ID NO：100)
應注意，投與小鼠之多肽不包括IgK信號序列(mdmrvpaqllgllllwlrgarc，SEQ ID NO：101)，因為IgK信號序列因由細胞(293細胞)表現之信號肽酶而裂解脫離所分泌之多肽。
參見圖10，將經皮下投與單次1.0mg/kg(40nmol/Kg)劑量之PBS媒劑、成熟人類GDF15或N-聚糖突變蛋白給與17週齡雄性DIO小鼠(n=9)。監測經皮下投與後24小時週期內之食物攝取(公克/動物)。藉由非配對史都登T檢驗來確定相對於媒劑(PBS)對照組之P值。
如圖10中所描繪，投與糖基突變蛋白引起食物攝取減少。在各組小鼠中，p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)係藉由比較食物攝取與媒劑對照組之史都登氏非配對T檢驗來確定。野生型GDF15亦減少食物攝取。
實例5：M16、△N3-M16及M17突變蛋白在DIO小鼠模型中對體重之效應
評估經皮下投與之糖基突變蛋白對體重之效應。將經皮下投與單次1.0mg/kg(40nmol/Kg)劑量之PBS媒劑、成熟人類GDF15或N-聚糖突變蛋白(M16、M17及△N3-M16)給與17周齡雄性DIO小鼠(n=9)。監測經皮下投與後24小時週期內之體重。藉由非配對史都登T檢驗來確定相對於媒劑(PBS)對照組之P值。
投與糖基突變蛋白引起體重減少(圖11)。在各組小鼠中，p值(*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001)係藉由比較食物攝取與媒劑對照組之史都登氏非配對T檢驗來確定。野生型GDF15亦減少體重。
本發明之特定實施例描述於本文中，包括發明者已知的用於進行本發明之最佳模式。在閱讀前述描述後，此項技術中之工作人員可顯而易見所揭示之實施例的變化形式，且預期熟習此項技術者在適當時可採用該等變化形式。因此，如適用法規所允許，意欲以不同於如本文中所明確描述之方式來實施本發明，且本發明包括所附申請專利範圍中所闡述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文中另外指示或者上下文明確相抵觸，否則本發明涵蓋上述要素之所有可能變化形式之任何組合。
本說明書中所引用之所有公開案、專利申請案、登錄號及其他參考文獻均以引用之方式併入本文中，如同各個別公開案或專利申請案明確地且個別地以引用之方式併入。
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<210> 1
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Figure 104124401-A0305-02-0125-1
Figure 104124401-A0305-02-0126-2
<210> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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Figure 104124401-A0202-12-0128-22
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成多肽序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Figure 104124401-A0202-12-0135-37
Figure 104124401-A0202-12-0136-38
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 16
Figure 104124401-A0202-12-0136-39
Figure 104124401-A0202-12-0137-40
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 17
Figure 104124401-A0202-12-0137-41
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 18
Figure 104124401-A0202-12-0138-42
<210> 19
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 19
Figure 104124401-A0202-12-0139-43
<210> 20
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 20
Figure 104124401-A0202-12-0139-44
Figure 104124401-A0202-12-0140-45
<210> 21
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 21
Figure 104124401-A0202-12-0140-46
Figure 104124401-A0202-12-0141-47
<210> 22
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 22
Figure 104124401-A0202-12-0141-48
Figure 104124401-A0202-12-0142-49
<210> 23
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 23
Figure 104124401-A0202-12-0142-50
Figure 104124401-A0202-12-0143-51
<210> 24
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 24
Figure 104124401-A0202-12-0143-52
Figure 104124401-A0202-12-0144-53
<210> 25
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 25
Figure 104124401-A0202-12-0144-54
<210> 26
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 26
Figure 104124401-A0202-12-0145-55
<210> 27
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 27
Figure 104124401-A0202-12-0146-57
<210> 28
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 28
Figure 104124401-A0202-12-0146-58
Figure 104124401-A0202-12-0147-60
<210> 29
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 29
Figure 104124401-A0202-12-0147-61
Figure 104124401-A0202-12-0148-62
<210> 30
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 30
Figure 104124401-A0202-12-0148-63
Figure 104124401-A0202-12-0149-64
<210> 31
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 31
Figure 104124401-A0202-12-0149-65
Figure 104124401-A0202-12-0150-66
<210> 32
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 32
Figure 104124401-A0202-12-0150-67
<210> 33
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 33
Figure 104124401-A0202-12-0151-68
<210> 34
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 34
Figure 104124401-A0202-12-0152-69
<210> 35
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 35
Figure 104124401-A0202-12-0152-70
Figure 104124401-A0202-12-0153-71
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 36
Figure 104124401-A0202-12-0153-72
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 37
Figure 104124401-A0202-12-0154-73
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 38
Figure 104124401-A0202-12-0154-74
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 39
Figure 104124401-A0202-12-0154-75
<210> 40
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 40
Figure 104124401-A0202-12-0155-76
<210> 41
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 41
Figure 104124401-A0202-12-0155-77
<210> 42
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 42
Figure 104124401-A0202-12-0155-78
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 43
Figure 104124401-A0202-12-0156-79
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 44
Figure 104124401-A0202-12-0156-80
<210> 45
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 45
Figure 104124401-A0202-12-0156-81
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 46
Figure 104124401-A0202-12-0156-82
Figure 104124401-A0202-12-0157-83
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 47
Figure 104124401-A0202-12-0157-84
<210> 48
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 48
Figure 104124401-A0202-12-0157-85
<210> 49
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 49
Figure 104124401-A0202-12-0157-86
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 50
Figure 104124401-A0202-12-0158-87
<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> 此位置上之胺基酸可為任何胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 此位置上之胺基酸可為任何疏水性胺基酸
<400> 51
Figure 104124401-A0202-12-0158-88
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> 此位置上之胺基酸可為任何胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 此位置上之胺基酸可為任何疏水性胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> 此位置上之胺基酸可為Ser或Thr
<400> 52
Figure 104124401-A0202-12-0159-89
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 此位置上之胺基酸可為Leu或Gln
<400> 53
Figure 104124401-A0202-12-0159-90
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 此位置上之胺基酸可為Leu或Gln
<400> 54
Figure 104124401-A0202-12-0160-91
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 55
Figure 104124401-A0202-12-0160-92
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 56
Figure 104124401-A0202-12-0161-93
<210> 57
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 57
Figure 104124401-A0202-12-0161-94
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 58
Figure 104124401-A0202-12-0161-95
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 59
Figure 104124401-A0202-12-0162-96
<210> 60
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 60
Figure 104124401-A0202-12-0162-97
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 61
Figure 104124401-A0202-12-0162-98
<210> 62
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 62
Figure 104124401-A0202-12-0162-99
<210> 63
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 63
Figure 104124401-A0202-12-0163-100
<210> 64
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 64
Figure 104124401-A0202-12-0163-101
<210> 65
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 65
Figure 104124401-A0202-12-0163-102
<210> 66
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 66
Figure 104124401-A0202-12-0164-103
<210> 67
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 67
Figure 104124401-A0202-12-0164-104
<210> 68
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 68
Figure 104124401-A0202-12-0164-105
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 69
Figure 104124401-A0202-12-0165-106
<210> 70
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 70
Figure 104124401-A0202-12-0165-107
<210> 71
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 71
Figure 104124401-A0202-12-0165-108
<210> 72
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 72
Figure 104124401-A0202-12-0166-109
<210> 73
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 73
Figure 104124401-A0202-12-0166-110
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 74
Figure 104124401-A0202-12-0166-111
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 75
Figure 104124401-A0202-12-0167-112
<210> 76
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 76
Figure 104124401-A0202-12-0167-113
<210> 77
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 77
Figure 104124401-A0202-12-0167-114
Figure 104124401-A0202-12-0168-115
Figure 104124401-A0202-12-0169-116
Figure 104124401-A0202-12-0170-117
Figure 104124401-A0202-12-0171-118
<210> 78
<211> 731
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 78
Figure 104124401-A0202-12-0172-119
Figure 104124401-A0202-12-0173-120
Figure 104124401-A0202-12-0174-121
Figure 104124401-A0202-12-0175-122
Figure 104124401-A0202-12-0176-123
<210> 79
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 79
Figure 104124401-A0202-12-0176-124
Figure 104124401-A0202-12-0177-125
Figure 104124401-A0202-12-0178-126
Figure 104124401-A0202-12-0179-127
Figure 104124401-A0202-12-0180-128
<210> 80
<211> 738
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 80
Figure 104124401-A0202-12-0181-129
Figure 104124401-A0202-12-0182-130
Figure 104124401-A0202-12-0183-131
Figure 104124401-A0202-12-0184-132
Figure 104124401-A0202-12-0185-133
<210> 81
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 81
Figure 104124401-A0202-12-0185-134
Figure 104124401-A0202-12-0186-135
<210> 82
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 82
Figure 104124401-A0202-12-0186-136
Figure 104124401-A0202-12-0187-137
<210> 83
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 83
Figure 104124401-A0202-12-0187-138
Figure 104124401-A0202-12-0188-139
<210> 84
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 84
Figure 104124401-A0202-12-0188-140
Figure 104124401-A0202-12-0189-141
<210> 85
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 85
Figure 104124401-A0202-12-0189-143
Figure 104124401-A0202-12-0190-144
<210> 86
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 86
Figure 104124401-A0202-12-0190-145
Figure 104124401-A0202-12-0191-146
<210> 87
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 87
Figure 104124401-A0202-12-0191-147
Figure 104124401-A0202-12-0192-149
<210> 88
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 88
Figure 104124401-A0202-12-0192-150
Figure 104124401-A0202-12-0193-151
<210> 89
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 89
Figure 104124401-A0202-12-0194-152
<210> 90
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 90
Figure 104124401-A0202-12-0195-153
<210> 91
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 91
Figure 104124401-A0202-12-0196-154
<210> 92
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 92
Figure 104124401-A0202-12-0197-155
<210> 93
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 93
Figure 104124401-A0202-12-0198-156
<210> 94
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 94
Figure 104124401-A0202-12-0199-157
<210> 95
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 95
Figure 104124401-A0202-12-0200-158
Figure 104124401-A0202-12-0201-159
<210> 96
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 96
Figure 104124401-A0202-12-0201-160
Figure 104124401-A0202-12-0202-161
<210> 97
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 97
Figure 104124401-A0202-12-0202-162
Figure 104124401-A0202-12-0203-163
<210> 98
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸序列
<400> 98
Figure 104124401-A0202-12-0203-164
<210> 99
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸序列
<400> 99
Figure 104124401-A0202-12-0203-165
<210> 100
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 100
Figure 104124401-A0202-12-0204-166
<210> 101
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽序列
<400> 101
Figure 104124401-A0202-12-0205-167
<210> 102
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸序列
<400> 102
Figure 104124401-A0202-12-0205-168
<210> 103
<211> 577
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 103
Figure 104124401-A0202-12-0205-169
Figure 104124401-A0202-12-0206-170
Figure 104124401-A0202-12-0207-171
Figure 104124401-A0202-12-0208-172
Figure 104124401-A0202-12-0209-173
<210> 104
<211> 584
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 104
Figure 104124401-A0202-12-0209-174
Figure 104124401-A0202-12-0210-175
Figure 104124401-A0202-12-0211-176
Figure 104124401-A0202-12-0212-177
<210> 105
<211> 586
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 105
Figure 104124401-A0202-12-0212-178
Figure 104124401-A0202-12-0213-179
Figure 104124401-A0202-12-0214-180
Figure 104124401-A0202-12-0215-181
Figure 104124401-A0202-12-0216-182
<210> 106
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 106
Figure 104124401-A0202-12-0216-183
Figure 104124401-A0202-12-0217-184
Figure 104124401-A0202-12-0218-185
Figure 104124401-A0202-12-0219-186
<210> 107
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 107
Figure 104124401-A0202-12-0220-187
Figure 104124401-A0202-12-0221-188
Figure 104124401-A0202-12-0222-189
Figure 104124401-A0202-12-0223-190
<210> 108
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
Figure 104124401-A0202-12-0223-191
Figure 104124401-A0202-12-0224-192
<210> 109
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
Figure 104124401-A0202-12-0224-193
<210> 110
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 110
Figure 104124401-A0202-12-0224-194
Figure 104124401-A0202-12-0225-195
<210> 111
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
Figure 104124401-A0202-12-0225-196
<210> 112
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
Figure 104124401-A0202-12-0226-197
<210> 113
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
Figure 104124401-A0202-12-0226-198
<210> 114
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
Figure 104124401-A0202-12-0227-199
<210> 115
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 115
Figure 104124401-A0202-12-0227-200
<210> 116
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 116
Figure 104124401-A0202-12-0228-201
<210> 117
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
Figure 104124401-A0202-12-0228-203
Figure 104124401-A0202-12-0229-205
<210> 118
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 118
Figure 104124401-A0202-12-0229-206
<210> 119
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
Figure 104124401-A0202-12-0229-207
Figure 104124401-A0202-12-0230-208
<210> 120
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
Figure 104124401-A0202-12-0230-209
<210> 121
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
Figure 104124401-A0202-12-0230-210
Figure 104124401-A0202-12-0231-211
<210> 122
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 122
Figure 104124401-A0202-12-0231-212
<210> 123
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
Figure 104124401-A0202-12-0232-213
<210> 124
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
Figure 104124401-A0202-12-0232-214
<210> 125
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
Figure 104124401-A0202-12-0233-215
<210> 126
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 126
Figure 104124401-A0202-12-0233-216
Figure 104124401-A0202-12-0234-217
<210> 127
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
Figure 104124401-A0202-12-0234-218

Claims (38)

  1. 一種二聚體，其包含2個共價接合之多肽，其中該2個多肽各自包含如下所示之胺基酸序列中一者：i)SEQ ID NO：13；ii)SEQ ID NO：14；iii)SEQ ID NO：30；或iv)SEQ ID NO：31。
  2. 如申請專利範圍第1項之二聚體，其中該2個多肽各自包含如SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項之二聚體，其中該2個多肽各自包含如SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1項之二聚體，其中該2個多肽各自包含如SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第1項之二聚體，其中該2個多肽各自包含如SEQ ID NO：31所示之胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之二聚體，其中該2個多肽之至少一者與異源多肽融合，且其中該異源多肽與該等多肽之該至少一者之N端或C端共軛。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之二聚體，其中該2個多肽各自與異源多肽融合。
  8. 如申請專利範圍第6項之二聚體，其中該異源多肽為人血清白蛋白、食蟹獼猴血清白蛋白或牛血清白蛋白。
  9. 如申請專利範圍第6項之二聚體，其中該異源多肽為人免疫球蛋白Fc多肽。
  10. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之二聚體，其中該二聚體經N-糖基化。
  11. 如申請專利範圍第10項之二聚體，其中該二聚體為同源二聚體，其中該2個多肽包含相同之胺基酸序列。
  12. 一種N-糖基化二聚體，其包含2個彼此共價接合之多肽，其中該2個多肽各自包含如SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列。
  13. 一種N-糖基化二聚體，其包含2個彼此共價接合之多肽，其中該2個多肽各自係由如SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列組成。
  14. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至13項中任一項之二聚體及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。
  15. 一種醫藥組成物，其包含N-糖基化二聚體及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑，該N-糖基化二聚體包含2個彼此共價接合之多肽，其中該2個多肽各自包含如SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列。
  16. 一種醫藥組成物，其包含N-糖基化二聚體及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑，該N-糖基化二聚體包含2個彼此共價接合之多肽，其中該2個多肽各自係由如SEQ ID NO：30所示之胺基酸序列組成。
  17. 一種核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1至13項中任一項之二聚體的多肽。
  18. 一種載體，其包含如申請專利範圍第17項之核酸 分子。
  19. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第17項之核酸分子或如申請專利範圍第18項之載體。
  20. 一種無菌容器，其包含如申請專利範圍第14至16項中任一項之醫藥組成物。
  21. 如申請專利範圍第20項之無菌容器，其中該無菌容器為注射器。
  22. 一種套組，其包含如申請專利範圍第21項之無菌容器。
  23. 一種製造如申請專利範圍第1項之二聚體的方法，該方法包含：培養如申請專利範圍第19項之宿主細胞以表現多肽，該多肽包含如下所示之胺基酸序列中一者：i)SEQ ID NO：13；ii)SEQ ID NO：14；iii)SEQ ID NO：30；或iv)SEQ ID NO：31；及純化所表現之二聚體。
  24. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之二聚體或如申請專利範圍第14至16項中任一項之醫藥組成物於製備藥物或套組之用途，該藥物或套組係用於治療哺乳動物個體之肥胖。
  25. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之二聚體或如申請專利範圍第14至16項中任一項之醫藥組成物 於製備藥物或套組之用途，該藥物或套組係用於治療哺乳動物個體之葡萄糖代謝異常。
  26. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該葡萄糖代謝異常係高血糖症。
  27. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該葡萄糖代謝異常係代謝症候群。
  28. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該葡萄糖代謝異常係糖尿病、高胰島素血症或葡萄糖不耐受。
  29. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之二聚體或如申請專利範圍第14至16項中任一項之醫藥組成物於製備藥物或套組之用途，該藥物或套組係用於治療哺乳動物個體之代謝疾病或代謝相關疾病。
  30. 一種如申請專利範圍第1至13項中任一項之二聚體或如申請專利範圍第14至16項中任一項之醫藥組成物於製備藥物或套組之用途，該藥物或套組係用於治療哺乳動物個體之體重異常。
  31. 如申請專利範圍第24或26項之用途，其中該治療包含減少該個體之食物攝取。
  32. 如申請專利範圍第24或26項之用途，其中該個體為人且該治療包含減少該個體之體重。
  33. 如申請專利範圍第24或26項之用途，其中該個體為人且該治療包含降低該個體之血糖。
  34. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該個體罹患糖尿病。
  35. 如申請專利範圍第24、25、29及30項中任一項之用途，其中該個體為人。
  36. 如申請專利範圍第35項之用途，其中該個體肥胖。
  37. 如申請專利範圍第24、25、29及30項中任一項之用途，其中該藥物或套組之該二聚體或醫藥組成物係藉由非經腸注射投與。
  38. 如申請專利範圍第37項之用途，其中該非經腸注射為經皮下。
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