ES2883158T3 - Composiciones y procedimientos de uso para el tratamiento de trastornos metabólicos - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido comprende uno de los siguientes pares de sustituciones de los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1: K91N y D93T/S o D93N y G95T/S; donde el polipéptido es adecuado para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad metabólica, una enfermedad asociada al metabolismo, un trastorno del peso corporal o un trastorno del metabolismo de la glucosa.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos de uso para el tratamiento de trastornos metabólicos
Incorporación por referencia del listado de secuencias proporcionado como un archivo de texto
Se proporciona un Listado de Secuencias adjunto como un archivo de texto, "NGMB-139WO_SeqList.txt" creado el 22 de julio de 2015 y con un tamaño de 133 KB.
Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio prioritario de la solicitud provisional de EE.UU. n. ° de serie 62/031,063, presentada el 30 de julio de 2014 y la solicitud provisional de EE. UU. n. ° de serie. 62/195,908 presentada el 23 de julio de 2015. Campo de la invención
La presente invención se refiere, entre otras cosas, a los polipéptidos y composiciones del mismo que son útiles en el tratamiento de afecciones relacionadas con el metabolismo.
Introducción
La obesidad es causada más comúnmente por la ingesta excesiva de alimentos junto con un gasto energético limitado y/o la falta de ejercicio físico. La obesidad aumenta la posibilidad de desarrollar varias enfermedades, tales como diabetes mellitus, hipertensión, aterosclerosis, enfermedad de las arterias coronarias, apnea del sueño, gota, reumatismo y artritis. Además, el riesgo de mortalidad se relaciona directamente con la obesidad, de modo que, por ejemplo, un índice de masa corporal de más de 40 resulta en una disminución promedio de la esperanza de vida de más de 10 años.
Las modalidades de tratamiento farmacológico actuales incluyen supresores del apetito dirigidos a clases de receptores (por ejemplo, CB1, 5-HT2C, y NPY); reguladores de los circuitos de apetito en el hipotálamo y las acciones moleculares de la grelina; e inhibidores de absorción de nutrientes dirigidos a lipasas. Desafortunadamente, ninguna de las modalidades actuales ha mostrado tratar de forma efectiva la obesidad sin provocar efectos adversos, algunos de los cuales pueden ser muy graves.
Los niveles altos de glucosa en la sangre estimulan la secreción de insulina por las células beta pancreáticas. La insulina, por su parte, estimula la entrada de la glucosa en los músculos y células adiposas, lo que lleva al almacenamiento de glicógeno y triglicéridos y a la síntesis de las proteínas. La activación de los receptores de insulina en varios tipos de células disminuye los niveles de glucosa en circulación al aumentar la absorción y utilización de la glucosa, y al reducir la salida de glucosa hepática. Las alteraciones dentro de esta red reguladora pueden resultar en diabetes y síndromes patológicos asociados que afectan a un amplio y creciente porcentaje de la población humana. Los pacientes que tienen un trastorno del metabolismo de la glucosa pueden sufrir hiperglucemia, hiperinsulinemia y/o intolerancia a la glucosa. Un ejemplo de un trastorno que generalmente está asociado con los niveles anormales de glucosa y/o insulina es la resistencia a la insulina, en la que las células hepáticas, grasas y musculares pierden su capacidad de responder a los niveles de insulina en sangre normales.
En vista de la prevalencia y la gravedad de la obesidad, la diabetes y los trastornos metabólicos y no metabólicos asociados, las modalidades de tratamiento que modulan, por ejemplo, los niveles de apetito, glucosa y/o insulina y mejoran la respuesta biológica a los niveles fluctuantes de glucosa en un paciente siguen siendo de interés.
El tipo salvaje GDF15, también conocido como MIC-1 (citocina-1 inhibidora de macrófagos) se ha relacionado con la regulación del peso corporal (Tsai VW, y col., PLoS One 2013; 8 (2): e55174; US8.192.735). El documento WO 2013/148117 describe variantes de GDF15 y su uso en el tratamiento de la obesidad, la diabetes y otros trastornos relacionados con el metabolismo.
RESUMEN
La invención se define mediante las reivindicaciones. Se proporcionan polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos del GDF15 humano de tipo salvaje maduro (SEQ ID NO: 1). Los polipéptidos de la presente descripción abarcan muteínas de GDF15, GDF15 modificado y muteínas de GDF15 modificado. También se proporcionan composiciones de estos polipéptidos. La presente descripción contempla el uso de los polipéptidos descritos en esta invención, y sus composiciones, para tratar o prevenir trastornos relacionados con el peso corporal y/o trastornos del metabolismo de la glucosa.
Como se indicó anteriormente, se proporciona un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 donde la secuencia de aminoácidos contigua incluye al menos uno de los siguientes pares de sustituciones de los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 1: K91N y D93T/S o D93N y G95T/S donde el polipéptido es adecuado para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad metabólica, una enfermedad asociada al metabolismo, un trastorno del peso corporal o un trastorno del metabolismo de la glucosa.
La secuencia de aminoácidos contigua puede incluir al menos uno de los siguientes pares de sustituciones de los aminoácidos correspondientes en la Se Q ID NO: 1: i) D5T and R21N o D5S y R21N; ii) R16N y H18T o R16N y H18S; iii) S23N y E25T o S23N y E25S; iv) L24N y D26T o L24N y D26S; v) S50N y F52T; S50N y F52S; F52N y A54T; o F52N y A54S; vi) Q51N y R53T; Q51N y R53S; R53N y A55T; o R53N y A55S; vi) S64N y H66T o S64N y H66S; vii) L65N y R67T o L65N y R67S; viii) S82N y N84T o S82N y N84S; ix) K91N y D93T; K91N y D93S; D93N y G95T; o D93N y G95S; x) T94N y V96T; T94N y V96S; V96N y L98T; o V96N y L98S; xi) S97N y Q99T o S97N y Q99S; y xii) A106N y D108T o A106N y D108S.
En ciertos casos, el polipéptido puede incluir al menos uno de los siguientes pares de sustituciones de los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1: D5T y R21N; S23N y E25T/S; R53N y A55T/S; S64N y H66T/S; K91N y D93T/S; D93N y G95T/S; S97N y Q99T/S; y A106N y D108T/S.
En ciertos casos, el polipéptido puede incluir al menos uno de los siguientes pares de sustituciones de los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1: D5T y R21N; D5S y R21N; S23N y E25T; S23N y E25S; R53N y A55T; R53N y A55S; S64N y H66T; S64N y H66S; K91N y D93T; K91N y D93S; D93N y G95T; D93N y G95S; S97N y Q99T; S97N y Q99S; A106N y D108T; y A106N y D108S.
En ciertos casos, el polipéptido puede incluir al menos uno de los siguientes pares de sustituciones de los correspondientes aminoácidos de SEQ ID NO: 1:D5T y R21N; S64N y H66T/S; K91N y D93T/S; D93N y G95T/S; y S97N y Q99T/S.
En algunas realizaciones, el polipéptido puede incluir al menos uno de los siguientes pares de sustituciones de los aminoácidos correspondientes en la Se Q ID NO: 1 K91N y D93T o K91N y D93S; y D93N y G95T o D93N y G95S. En otras realizaciones, el polipéptido puede incluir el siguiente par de sustituciones de los aminoácidos correspondientes en la SEQ iD NO: 1: K91N y D93T.
En realizaciones ejemplares, la secuencia de aminoácidos contigua puede ser al menos en un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos contigua puede tener al menos 98 aminoácidos de longitud y puede ser al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, donde el aminoácido del C-terminal del polipéptido corresponde a isoleucina en la posición 112 en la SEQ ID NO: 1.
En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos contigua puede tener al menos 98 aminoácidos de longitud y puede ser al menos en un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, donde el aminoácido del C-terminal del polipéptido corresponde a isoleucina en la posición 112 en la SEQ ID NO: 1.
Los polipéptidos ejemplares descritos en esta invención incluyen una secuencia de aminoácidos contigua que tiene al menos 98 aminoácidos de longitud, es al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y tienen eliminaciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, los polipéptidos pueden tener un truncamiento de N-terminal con respecto a la SEQ ID NO: 1. El truncamiento puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, 1-14 aminoácidos, 3-14 aminoácidos, 6-14 amino ácidos, o 3-6 aminoácidos.
En ciertos casos, la secuencia de aminoácidos contigua que es de al menos 98 aminoácidos de longitud, al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y no incluye los tres primeros aminoácidos que corresponden a los tres primeros aminoácidos presentes en el extremo N de la SEQ ID NO: 1, donde el aminoácido C-terminal corresponde a isoleucina en la posición 112 en la SEQ ID NO: 1.
En ciertos casos, la secuencia de aminoácidos contigua tiene al menos 98 aminoácidos de longitud, al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y no incluye los seis primeros aminoácidos que corresponden a los seis primeros aminoácidos presentes en el extremo N de la SEQ ID NO: 1, donde el aminoácido de C-terminal corresponde a isoleucina en la posición 112 en la SEQ ID NO: 1.
En ciertos casos, la secuencia de aminoácidos contigua tiene al menos 98 aminoácidos de longitud, al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 1, y no incluye los catorce primeros aminoácidos que corresponden a los catorce primeros aminoácidos presentes en el extremo N de la SEQ ID NO: 1, donde el aminoácido C-terminal corresponde a isoleucina en la posición 112 en la SEQ ID No: 1.
En ciertos casos, el polipéptido puede incluir una secuencia señal en el extremo N, tal como una secuencia señal de IgK. La secuencia señal puede conjugarse con el polipéptido mediante un enlazador, cuyo enlazador puede ser un enlazador escindible.
También se proporciona en esta invención una proteína de fusión que incluye de forma contigua desde el extremo N al extremo C: un polipéptido heterólogo -[(G4S)] 5-GDF15; un polipéptido heterólogo -[(G4S)] 5-AN3-GDF15; o un polipéptido heterólogo -[(G4S)] 5-AN6-GDFl5.
En realizaciones ejemplares, el polipéptido heterólogo puede ser albúmina de suero, proteína de unión a maltosa o polipéptido de inmunoglobulina Fc. La albúmina de suero puede ser albúmina de suero humano, albúmina de suero cino o albúmina de suero bovino. La proteína de fusión puede incluir una secuencia señal en el extremo N. La secuencia de señal puede ser una secuencia de señal IgK.
También se proporciona en esta invención una molécula de ácido nucleico que codifica los anteriores polipéptidos o proteínas de fusión descritos. La molécula de ácido nucleico puede estar operativamente unida a un elemento de control de expresión que confiere la expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido o la proteína de fusión in vitro o in vivo. También se contempla un vector que incluye la molécula de ácido nucleico. El vector puede ser un vector viral.
Algunas realizaciones incluyen células huésped o transformadas que expresan uno o más de los polipéptidos mencionados anteriormente.
En realizaciones particulares de la presente descripción, uno o más de los polipéptidos mencionados anteriormente se formulan para producir una composición farmacéutica, donde la composición incluye también uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica incluye también al menos un agente profiláctico o terapéutico adicional.
También se describe un anticuerpo que se une específicamente a uno de los polipéptidos de muteína mencionados anteriormente. En algunos casos, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada presentes en polipéptidos separados o en un único polipéptido. Un anticuerpo de la presente descripción se une al polipéptido con una afinidad de aproximadamente 107 M-1 a aproximadamente 10l2 M-1 en ciertos casos. En otros casos más, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En casos adicionales, el anticuerpo se marca de forma detectable, mientras que en otros casos es un Fv, scFv, Fab, F(ab') 2 o Fab'.
La presente descripción contempla también anticuerpos que comprenden un polímero no polipeptídico unido covalentemente (por ejemplo, un polímero de poli(etilenglicol)). En otros casos, el anticuerpo comprende un resto unido covalentemente seleccionado de un resto lípido, un resto de ácido graso, un resto de polisacárido y un resto de carbohidrato.
El anticuerpo es un anticuerpo monocatenario Fv (scFv) en algunos casos, y el scFv está multimerizado en otros. Los anticuerpos de la presente descripción pueden ser, entre otros, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o anticuerpos humanizados.
Además, la presente descripción contempla composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo como se describe anteriormente formulado con al menos un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas pueden contener también al menos un agente terapéutico o profiláctico adicional. Ciertas realizaciones de la presente descripción contemplan un recipiente estéril que contiene una de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente y, opcionalmente, uno o más componentes adicionales. A modo de ejemplo, pero de modo no limitativo, el recipiente estéril puede ser una jeringa. En otras realizaciones, el contenedor estéril es un componente de un kit; el kit también puede contener, por ejemplo, un segundo recipiente estéril que contiene al menos un agente profiláctico o terapéutico.
También se describe en esta invención un procedimiento para fabricar los polipéptidos o proteínas de fusión mencionados anteriormente. El procedimiento puede incluir el cultivo de una célula huésped que exprese el polipéptido o la proteína de fusión; y que purifique el polipéptido o la proteína de fusión expresados.
La presente descripción contempla también un procedimiento para tratar o prevenir un trastorno del metabolismo de la glucosa en un sujeto (por ejemplo, un ser humano) administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido o proteína de fusión mencionado anteriormente. En algunos procedimientos, el tratamiento o prevención resulta en una reducción en la glucosa en plasma en el sujeto, una reducción en la insulina en plasma en el sujeto, una reducción en el peso corporal y/o la ingesta de alimentos, o un aumento en la tolerancia a la glucosa en el sujeto. En realizaciones particulares, el trastorno del metabolismo de la glucosa es diabetes mellitus.
También se describe un procedimiento para tratar o prevenir un trastorno del peso corporal en un sujeto. El procedimiento puede incluir administrar al sujeto el polipéptido o la proteína de fusión de la presente descripción, donde el polipéptido o la proteína de fusión se administra en una cantidad efectiva para tratar o prevenir el trastorno del peso corporal en el sujeto. En algunos procedimientos, el tratamiento o prevención resulta en la reducción en el peso corporal y/o la ingesta de alimentos en el sujeto.
En algunas realizaciones, el sujeto es obeso y/o tiene un trastorno del peso corporal.
Aunque no se limita a ninguna vía particular de administración o régimen de dosificación, en algunas realizaciones la administración es por inyección parenteral (por ejemplo, subcutánea).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las muteínas de GDF15 descritas en esta invención con la secuencia de aminoácidos del GDF15 humano maduro de tipo salvaje (WT).
La figura 2 muestra un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las muteínas de AN3-GDF15 descritas en esta invención con la secuencia de aminoácidos de GDF15 humano maduro WT. Las muteínas de AN3-hGDF15 carecen de los primeros 3 aminoácidos (ARN) presentes en el extremo N del hGDF15 maduro.
La figura 3 representa dos proteínas de fusión (construcciones M1 y M2) que incluyen contiguamente desde el extremo N al extremo C: secuencia señal de IgK (minúsculas) (IgK) - secuencia de aminoácidos de albúmina de suero humana (D25-L609) (HSA) - un enlazador (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 no escindible [(G4S)] 3 (subrayado) -secuencia de aminoácidos GDF15 humana madura (hGDFl5) (negrita). La construcción M1 (IgK-HSA -[(G4S)] 3-hGDF15) contiene hGDF15 maduro de longitud completa, mientras que la construcción M2 (IgK-HSA -[(G4S)] 3­ AN3-hGDF15) contiene AN3-hGDF15 en el que se eliminan los primeros 3 aminoácidos (ARN) que corresponden a los aminoácidos en el extremo N del hGDF15 maduro.
La figura 4 representa un gel de expresión de SDS-PAGE teñido con coommassie no reducido de las construcciones M1 y M2 de los medios de la línea celular estable CHOK1SV GSKO. Los asteriscos (*) indican especies recortadas que ocurren en M1 durante la secreción de CHOK1SV. La identificación por LC/MS de los sitios del clip dio como resultado el diseño de una construcción de estabilidad mejorada (M2), que contiene un truncamiento de 3 aminoácidos (AARN o AN3) en el extremo N de hGDF15 maduro.
La figura 5 representa dos moléculas de fusión con una secuencia de aminoácidos de albúmina de suero humana (D25-L609) que tiene una secuencia señal de IgK (minúscula) fusionada al extremo N de la secuencia de aminoácidos GDF15 humana madura (negrita) a través de un enlazador de [(G4S)] 5 no escindible (subrayado). La construcción M3 (IgK-HSA -[(G4S)] 5-AN3-hGDF15) contiene un truncamiento de 3 aminoácidos (AARN) en el extremo N de hGDF15 maduro; mientras que la construcción M4 (IgK-HSA -[(G4S)] 5-AN6-hGDF15) contiene un truncamiento de 6 aminoácidos (AARNGDH) con respecto al extremo N del hGDFl5 maduro.
La figura 6 representa el efecto sobre la ingesta de alimentos en ratones obesos inducidos por la dieta (DIO) después de una única administración subcutánea aguda de vehículo, moléculas de fusión M1, M3 y M4 (40 nmol/kg). Como se indica en la figura, los parámetros de ingesta de alimentos se determinaron 24 horas después de la dosis y 7 días después de la dosis. En cada grupo de ratones, n = 8 y los valores de p (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001) se determinaron mediante una prueba T no asociada por pares comparando los diversos grupos de dosis con el grupo de control del vehículo en cada punto de tiempo especificado.
La figura 7 representa el efecto sobre el peso corporal en ratones DIO después de una única administración subcutánea aguda de vehículo, moléculas de fusión M1, M3 y M4 (40 nmol/kg). Como se indica en la figura, los parámetros de peso corporal se determinaron 24 horas después de la dosis y 7 días después de la dosis frente a los pesos del grupo antes de la dosis. En cada grupo de ratones, n = 8 y los valores de p (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001) se determinaron mediante una prueba T no asociada por pares comparando los diversos grupos de dosis con el grupo de control del vehículo en cada punto de tiempo especificado.
La figura 8A representa las secuencias de aminoácidos de muteínas monoglicosiladas y diglicosiladas producidas mediante la introducción de sitios consenso de glicosilación unidos a N (M5-M21). Estas secuencias incluyen una secuencia señal de IgK (minúscula) fusionada al extremo N de la secuencia de aminoácidos GDF15 humana madura (negrita). La figura 8B representa secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos representadas en la figura 8A. La figura 8C representa la secuencia de aminoácidos de AN3-M16 y la secuencia de ácido nucleico que codifica AN3-M16. La figura 8D representa la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de GDF15 humana madura en WT que contiene la secuencia señal de IgK (IgK-WT-GDF15) y la secuencia de ácido nucleico que codifica la IgK-WT-GDF15.
La figura 9 proporciona un resumen de la secreción y la formación de dímeros, junto con mejoras en la solubilidad relativa, para cada muteína de GDF15 humana N-glicosilada diseñada por ingeniería genética expuesta en la figura 8A y para AN3-M16.
La figura 10 representa el efecto sobre la ingesta de alimentos en ratones obesos inducidos por la dieta (DIO) después de una única administración subcutánea de vehículo (PBS), polipéptidos GDF15, M16, AN3-M16 y M17 (1 mg/kg (40 nmol/kg)).
La figura 11 representa el efecto sobre el peso corporal en ratones DIO después de una única administración subcutánea de vehículo (PBS), polipéptidos GDF15, M16, AN3-M16 y M17 (1 mg/kg (40 nmol/kg)).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Antes de que los procedimientos y las composiciones de la presente descripción se describan adicionalmente, se debe entender que la descripción no se limita a las realizaciones particulares expuestas en esta invención, y también se debe entender que la terminología utilizada en esta invención tiene el propósito de describir solo realizaciones particulares, y no pretende ser limitativa.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior y el inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, queda comprendido dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos menores pueden estar incluidos de forma independiente en los intervalos menores también comprendidos dentro de la invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención.
Cabe señalar que tal como se usa en esta invención y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "el polipéptido mutante" incluye la referencia a uno o más polipéptidos mutantes, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden ser redactadas de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esta declaración tiene la intención de servir como base antecedente para el uso de tal terminología exclusiva tal como "únicamente", "solo" y similares en relación con la mención de elementos de reivindicación, o el uso de una limitación "negativa".
Las publicaciones analizadas en esta invención se proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. No debe interpretarse que nada en esta invención constituya una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anteponer tal publicación por virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, lo que podría necesitar ser confirmado de manera independiente.
Definiciones
Los términos “paciente” o “sujeto” se usan de manera intercambiable para referirse a un humano o a un animal no humano (por ejemplo, un mamífero).
Los términos "tratar", "tratando", tratamiento "y similares se refieren a un curso de acción (tal como administrar un agente, por ejemplo, un polipéptido o una composición farmacéutica que comprende un polipéptido) iniciado después de que una enfermedad, trastorno o afección, o un síntoma de los mismos, haya sido diagnosticado, observado y similar para eliminar, reducir, suprimir, mitigar o mejorar, temporal o permanentemente, al menos una de las causas subyacentes de una enfermedad, trastorno o afección que afecta a un sujeto, o al menos uno de los síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o afección que afecta a un sujeto. Por lo tanto, el tratamiento incluye inhibir (es decir, detener el desarrollo o desarrollo adicional de la enfermedad, trastorno o afección o asociación de síntomas clínicos con los mismos) una enfermedad activa (por ejemplo, para disminuir el nivel de insulina y/o glucosa en el torrente sanguíneo, para aumentar la tolerancia a la glucosa para minimizar la fluctuación de los niveles de glucosa y/o para proteger contra las enfermedades causadas por la interrupción de la homeostasis de la glucosa).
El término "con necesidad de tratamiento", como se usa en esta invención, se refiere a un juicio emitido por un médico u otro cuidador de que un sujeto requiere o se beneficiará del tratamiento. Este juicio se basa en una variedad de factores que se encuentran en el ámbito de la experiencia del médico o cuidador.
Los términos "prevenir", "previniendo", "prevención" y similares se refieren a un curso de acción (tal como administrar un agente, por ejemplo, un polipéptido o una composición farmacéutica que comprende un polipéptido) iniciado de un modo (por ejemplo, antes de la aparición de una enfermedad, trastorno, afección o síntoma de los mismos) para prevenir, suprimir, inhibir o reducir, ya sea temporal o permanentemente, el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad, trastorno, afección o similar (según lo determinado, por ejemplo, por la ausencia de síntomas clínicos) o retrasar su aparición, generalmente en el contexto de un sujeto predispuesto a tener una enfermedad, trastorno o afección particular. En determinados casos, las expresiones también se refieren a ralentizar la evolución de la enfermedad, trastorno o afección, o inhibir la evolución de los mismos a un estado nocivo o de otro modo indeseado. El término "con necesidad de prevención", como se usa en esta invención, se refiere a un juicio emitido por un médico u otro cuidador de que un sujeto requiere o se beneficiará de la atención preventiva. Este juicio se basa en una variedad de factores que se encuentran en el ámbito de la experiencia de un médico o cuidador.
La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la administración de un agente a un sujeto, ya sea solo o como parte de una composición farmacéutica y en una sola dosis o como parte de una serie de dosis, en una cantidad que es capaz de tener un efecto positivo detectable sobre cualquier síntoma, aspecto o características de una enfermedad, trastorno o afección cuando se administra a un paciente. La cantidad terapéuticamente efectiva se puede determinar midiendo los efectos fisiológicos relevantes. Por ejemplo, en el caso de una afección hiperglucémica, una disminución o reducción de la glucosa en sangre o una mejora en la prueba de la tolerancia a la glucosa se puede utilizar para determinar si la cantidad de un agente es efectiva para tratar la afección hiperglucémica. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad suficiente para reducir o disminuir cualquier nivel (por ejemplo, un nivel de punto de referencia) de glucosa en plasma en ayunas (FPG, por sus siglas en inglés), donde por ejemplo, la cantidad es suficiente para reducir un nivel de FPG mayor que 200 mg/dl a menos de 200 mg/dl, donde la cantidad es suficiente para reducir un nivel de FPG entre 175 mg/dl y 200 mg/dl a menos del nivel de inicio, donde la cantidad es suficiente para reducir un nivel de FPG entre 150 mg/dl y 175 mg/dl a menos del nivel de inicio, donde la cantidad es suficiente para reducir un nivel de FPG entre 125 mg/dl y 150 mg/dl a menos del nivel de inicio, y así sucesivamente (por ejemplo, reducir los niveles de FPG a menos de 125 mg/dl, a menos de 120 mg/dl, a menos de 115 mg/dl, a menos de 110 mg/dl, etc.). En el caso de los niveles de HbAlc, la cantidad efectiva es una cantidad suficiente para reducir o disminuir los niveles en más de aproximadamente el 10 % al 9 %, en más de aproximadamente el 9 % al 8 %, en más de aproximadamente el 8% al 7 %, en más de aproximadamente el 7 % al 6 %, en más de aproximadamente el 6 % al 5 %, y así sucesivamente. Más particularmente, una reducción o disminución de los niveles de HbAlc en aproximadamente el 0,1 %, 0,25 %, 0,4 %, 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 1,5 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 33 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 % o más se contempla en la presente descripción. La cantidad terapéuticamente efectiva se puede ajustar en relación con el régimen de dosificación y el análisis de diagnóstico de la afección del sujeto y similares.
La frase "en una cantidad suficiente para efectuar un cambio" significa que hay una diferencia detectable entre un nivel de un indicador medido antes (por ejemplo, un nivel de punto de referencia) y después de la administración de una terapia particular. Los indicadores incluyen cualquier parámetro objetivo (por ejemplo, nivel de glucosa o insulina o ingesta de alimentos) o parámetro subjetivo (por ejemplo, la sensación de bienestar o apetito de un sujeto).
La frase "tolerancia a la glucosa", como se usa en esta invención, se refiere a la capacidad de un sujeto para controlar el nivel de glucosa en plasma y/o insulina en plasma cuando fluctúa la ingesta de glucosa. Por ejemplo, la tolerancia a la glucosa abarca la capacidad del sujeto para reducir, en aproximadamente 120 minutos, el nivel de glucosa en plasma de vuelta a un nivel determinado antes de la ingesta de glucosa.
Los términos "diabetes" y "diabético" se refieren a una enfermedad progresiva del metabolismo de carbohidratos que implica una producción o utilización inadecuada de insulina, caracterizada frecuentemente por hiperglucemia y glucosuria. Los términos "pre-diabetes" y "pre-diabético" se refieren a un estado donde un sujeto no tiene las características, síntomas y similares típicamente observados en la diabetes, pero tiene características, síntomas y similares que, si no se tratan, pueden evolucionar a diabetes. La presencia de estas afecciones se puede determinar utilizando, por ejemplo, la prueba de glucosa en plasma en ayunas (FPG) o la prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT, por sus siglas en inglés). Ambas usualmente requieren que un sujeto ayune durante al menos 8 horas antes de iniciar la prueba. En la prueba FPG, la glucosa en sangre de un sujeto se mide después del final del ayuno; generalmente, el sujeto ayuna durante la noche y la glucosa en sangre se mide por la mañana antes de que el sujeto coma. Un sujeto sano generalmente tendría una concentración de FPG entre aproximadamente 90 y aproximadamente 100 mg/dl, un sujeto con "pre-diabetes" generalmente tendría una concentración de FPG entre aproximadamente 100 y aproximadamente 125 mg/dl, y un sujeto con "diabetes" generalmente tendría un nivel de FPG superior a aproximadamente 126 mg/dl. En la OGTT, la glucosa en sangre de un sujeto se mide después del ayuno y de nuevo dos horas después de beber una bebida rica en glucosa. Dos horas después del consumo de la bebida rica en glucosa, un sujeto sano generalmente tiene una concentración de glucosa en sangre menor de aproximadamente 140 mg/dl, un sujeto pre-diabético generalmente tiene una concentración de glucosa en sangre de aproximadamente 140 a aproximadamente 199 mg/dl, y un sujeto diabético generalmente tiene una concentración de glucosa en sangre de aproximadamente 200 mg/dl o superior. Mientras que los valores glucémicos anteriormente mencionados pertenecen a sujetos humanos, la normoglucemia, hiperglucemia moderada e hiperglucemia aparente varían de forma diferente en los sujetos murinos. Un sujeto murino sano después de un ayuno de cuatro horas generalmente tendría una concentración de FPG entre aproximadamente 100 y aproximadamente 150 mg/dl, un sujeto murino con "pre-diabetes" generalmente tendría una concentración de FPG entre aproximadamente 175 y aproximadamente 250 mg/dl y un sujeto murino con "diabetes" generalmente tendría una concentración de FPG superior a aproximadamente 250 mg/dl.
El término "resistencia a la insulina" como se usa en esta invención se refiere a una afección donde una cantidad normal de insulina no puede producir una respuesta fisiológica o molecular normal. En algunos casos, una cantidad hiper-fisiológica de insulina, ya sea producida de forma endógena o administrada de forma exógena, es capaz de superar la resistencia a la insulina, en su totalidad o en parte, y producir una respuesta biológica.
El término "síndrome metabólico" se refiere a un grupo asociado de rasgos que incluye, entre otros, hiperinsulinemia, tolerancia anormal a la glucosa, obesidad, redistribución de la grasa en el compartimento abdominal o superior del cuerpo, hipertensión, disfibrinólisis y dislipidemia caracterizada por triglicéridos altos, colesterol de lipoproteínas de alta y baja densidad (HDL) y partículas altas, pequeñas y densas de lipoproteína de baja densidad (LDL). Los sujetos que tienen el síndrome metabólico están en riesgo de desarrollar diabetes de Tipo 2 y/u otros trastornos (por ejemplo, aterosclerosis).
La frase "trastorno del metabolismo de la glucosa" abarca cualquier trastorno caracterizado por un síntoma clínico o una combinación de síntomas clínicos que se asocia con un nivel elevado de glucosa y/o un nivel elevado de insulina en un sujeto en relación con un individuo sano. Los niveles elevados de glucosa y/o insulina pueden manifestarse en las siguientes enfermedades, trastornos y afecciones: hiperglucemia, diabetes tipo II, diabetes gestacional, diabetes tipo I, resistencia a la insulina, tolerancia alterada a la glucosa, hiperinsulinemia, metabolismo alterado de la glucosa, pre-diabetes, otros trastornos metabólicos (tales como el síndrome metabólico, que también se conoce como síndrome X) y la obesidad, entre otros. Los polipéptidos de la presente descripción, y las composiciones de los mismos, se pueden usar, por ejemplo, para lograr y/o mantener la homeostasis de glucosa, por ejemplo, para reducir el nivel de glucosa en el torrente sanguíneo y/o para reducir el nivel de insulina a un intervalo que se encuentra en un sujeto sano.
El término "hiperglucemia", como se usa en esta invención, se refiere a una afección en la que una cantidad elevada de glucosa circula en el plasma sanguíneo de un sujeto con respecto a un individuo sano. La hiperglucemia puede diagnosticarse usando procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo la medición de los niveles de glucosa en sangre en ayuno como se describe en esta invención.
El término "hiperinsulinemia", como se usa en esta invención, se refiere a una afección en la que hay niveles elevados de insulina circulante cuando, simultáneamente, los niveles de glucosa en sangre son elevados o normales. La hiperinsulinemia puede ser causada por la resistencia a la insulina que está asociada con la dislipidemia, tal como triglicéridos altos, colesterol alto, lipoproteína de baja densidad alta (LDL) y lipoproteína de alta densidad baja (HDL); niveles de ácido úrico altos; síndrome de ovario poliquístico; diabetes tipo II y obesidad. La hiperinsulinemia se puede diagnosticar como que tiene un nivel de insulina en plasma mayor de aproximadamente 2 pU/mL.
Como se usa en esta invención, la frase "trastorno del peso corporal" se refiere a afecciones asociadas con un peso corporal excesivo y/o apetito aumentado. Se utilizan varios parámetros para determinar si un sujeto tiene sobrepeso en comparación con un individuo sano de referencia, incluida la edad, la altura, el sexo y el estado de salud del sujeto. Por ejemplo, un sujeto puede considerarse con sobrepeso u obeso mediante la evaluación del índice de masa corporal (IMC) del sujeto, que se calcula dividiendo el peso de un sujeto en kilogramos por la altura del sujeto en metros cuadrados. Se considera que un adulto que tiene un IMC en el intervalo de —18,5 a ~24,9 kg/m2 tiene un peso normal; un adulto que tiene un IMC entre —25 y —29,9 kg/m2 puede considerarse con sobrepeso (pre-obeso); y un adulto que tiene un IMC de —30 kg/m2 o superior puede considerarse obeso. El apetito aumentado con frecuencia contribuye al peso corporal excesivo. Existen varias afecciones asociadas con el apetito aumentado, que incluyen, por ejemplo, el síndrome de alimentación nocturna, que se caracteriza por la anorexia matutina y la polifagia por la noche que se asocia con frecuencia con el insomnio, pero que puede estar relacionado con daño en el hipotálamo.
El término "activadores" se refiere a agentes que, por ejemplo, estimulan, aumentan, activan, facilitan, mejoran la activación, sensibilizan o regulan la función o actividad de uno o más agentes, por ejemplo, polipéptidos utilizados para tratar o prevenir un trastorno metabólico. Además, los activadores incluyen agentes que operan a través del mismo mecanismo de acción que los polipéptidos de la presente invención (es decir, agentes que modulan la misma vía de señalización que los polipéptidos de una manera análoga a la de los polipéptidos) y son capaces de suscitar una respuesta biológica que se compara con (o es mayor que) aquella de los polipéptidos. Los ejemplos de los activadores incluyen agonistas tales como compuestos de moléculas pequeñas.
El término "moduladores" se refiere colectivamente a los polipéptidos de la presente invención y los activadores.
Los términos "modular", "modulación" y similares se refieren a la capacidad de un agente (por ejemplo, un activador) para aumentar la función o actividad de uno o más polipéptidos (o las moléculas de ácido nucleico que los codifican), directa o indirectamente; o a la capacidad de un agente para producir un efecto comparable al de uno o más polipéptidos.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína", usados indistintamente en esta invención, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados genéticamente y codificados no genéticamente, aminoácidos modificados o derivados químicamente o bioquímicamente, y polipéptidos que tienen cadenas principales de polipéptidos modificados. El término incluye proteínas de fusión, que incluyen, pero sin limitación, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, proteínas de fusión con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin residuos de metionina en el extremo N; proteínas marcadas inmunológicamente; y similares. En realizaciones específicas, los términos se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud que incluyen aminoácidos codificados genéticamente. En realizaciones particulares, los términos se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud que incluye aminoácidos codificados genéticamente fusionados a una secuencia de aminoácidos heteróloga. En realizaciones particulares, los términos se refieren a un aminoácido de 112 aminoácidos de longitud, opcionalmente fusionado a una secuencia heteróloga. En realizaciones específicas, según proceda, cuando se hace referencia a las proteínas y moléculas de reveladas y descritas en esta invención, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se refieren a polipéptidos tal como se define en esta invención.
Se apreciará que a lo largo de esta descripción se hace referencia a aminoácidos según los códigos de una letra o tres letras. Para conveniencia del lector, los códigos de aminoácidos de una y tres letras se proporcionan a continuación:
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Como se usa en esta invención, el término "variante" abarca variantes de origen natural (por ejemplo, homólogos y variantes alélicas) y variantes de origen no natural (por ejemplo, modificadas de forma recombinante). Las variantes de origen natural incluyen homólogos, es decir, ácidos nucleicos y polipéptidos que difieren en secuencia de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, de una especie a otra. Las variantes de origen natural incluyen variantes alélicas, es decir, ácidos nucleicos y polipéptidos que difieren en secuencia de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, de un individuo a otro dentro de una especie. Las variantes de origen no natural incluyen ácidos nucleicos y polipéptidos que comprenden un cambio en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos, respectivamente, donde el cambio en la secuencia se introduce artificialmente, por ejemplo, el cambio se genera en el laboratorio u otra instalación por intervención humana ("mano del hombre").
El término "nativo" o "tipo salvaje", en referencia a GDF15, se refiere a GDF15 de origen natural biológicamente activo, que incluye variantes de GDF15 de origen natural biológicamente activo. El término incluye la secuencia madura de Gd F15 humana de 112 aminoácidos (SEQ ID NO: 1).
El término "muteínas" como se usa en esta invención se refiere ampliamente a proteínas recombinantes, es decir, un polipéptido que comprende un cambio introducido artificialmente en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, un cambio en la secuencia de aminoácidos generada en el laboratorio u otra instalación por intervención humana ("mano de hombre"). Estos polipéptidos usualmente portan sustituciones o eliminaciones de aminoácidos únicas o múltiples y se derivan frecuentemente de genes clonados que se sometieron a mutagénesis de sitio dirigido o aleatoria o de genes completamente sintéticos. Las "muteínas GDF15" de la presente descripción abarcan, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos y/o eliminaciones de aminoácidos (por ejemplo, truncamientos de N-terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13 o 14 o más aminoácidos) en relación con un polipéptido de referencia, por ejemplo, en relación con GDF15 humano maduro (SEQ ID NO: 1).
Como se usa en esta invención en referencia a GDF15 humano nativo o una muteína GDF15, los términos "modificado", "modificación" y similares se refieren a uno o más cambios que modifican una propiedad de GDF15 humano, una variante de GDF15 de origen natural, o una muteína GDF15, donde el cambio no altera la secuencia de aminoácidos primaria del GDF15. Tal propiedad incluye, por ejemplo, la solubilidad, vida media de circulación, estabilidad, depuración, inmunogenicidad o alergenicidad y capacidad de fabricación (por ejemplo, coste y eficacia). La "modificación" incluye una modificación química covalente que no altera la secuencia de aminoácidos primaria del polipéptido GDF15 (nativo o muteína) en sí. Los cambios en el GDF15 humano, una variante de GDF15 de origen natural o una muteína GDF15 que se puede llevar a cabo incluyen, entre otros, pegilación (unión covalente de una o más moléculas de polietilenglicol (PEG), o derivados de los mismos); glicosilación (por ejemplo, N-glicosilación), polisilación y hesilación; fusión de proteínas de unión a maltosa; fusión de albúmina (por ejemplo, fusión de HSA); albúmina que se une a través de, por ejemplo, una cadena de ácido graso conjugado (acilación); Fc-fusión; y fusión con un mimético de PEG. Algunas realizaciones particulares conllevan modificaciones que implican polietilenglicol, otras realizaciones particulares suponen modificaciones que implican albúmina, y aún otras modificaciones particulares conllevan modificaciones que implican glicosilación, o una combinación de las mismas.
Los términos "ADN", "ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "polinucleótido" y similares se usan indistintamente en esta invención para referirse a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Ejemplos no limitativos de polinucleótidos incluyen ácidos nucleicos lineales y circulares, ARN mensajero (ARNm), ADN complementario (ADNc), polinucleótidos recombinantes, vectores, sondas, cebadores y similares.
El término "sonda" se refiere a un fragmento de ADN o ARN correspondiente a un gen o secuencia de interés, donde el fragmento ha sido marcado radioactivamente (por ejemplo, incorporando 32P o 35S) o con alguna otra molécula detectable, tal como biotina, digoxigenina o fluoresceína. A medida que se hibridan extensiones de ADN o ARN con secuencias complementarias, puede usarse una sonda, por ejemplo, para etiquetar placas virales, colonias bacterianas o bandas en un gel que contienen el gen de interés. Una sonda puede ser ADN clonado o puede ser una hebra de ADN sintético; este último puede usarse para obtener un ADNc o clon genómico de una proteína aislada mediante, por ejemplo, una microsecuencia de una porción de la proteína, deduciendo la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína, sintetizando un oligonucleótido que porta esta secuencia, radioetiquetando la secuencia y usándola como una sonda para analizar una biblioteca de ADNc o una biblioteca genómica.
El término "heterólogo" se refiere a dos componentes que están definidos por estructuras derivadas de diferentes fuentes. Por ejemplo, en el contexto de un polipéptido, un polipéptido "heterólogo" puede incluir secuencias de aminoácidos unidas operativamente que se derivan de diferentes polipéptidos (por ejemplo, un primer componente que comprende un polipéptido recombinante y un segundo componente derivado de un polipéptido GDF15 nativo). De manera similar, en el contexto de un polinucleótido que codifica un polipéptido quimérico, un polinucleótido "heterólogo" puede incluir secuencias de ácido nucleico unidas operativamente que pueden derivarse de diferentes genes (por ejemplo, un primer componente de un ácido nucleico que codifica un polipéptido según una realización descrita en esta invención y un segundo componente de un ácido nucleico que codifica un polipéptido transportador). Otros ácidos nucleicos "heterólogos" ejemplares incluyen construcciones de expresión en las que un ácido nucleico que comprende una secuencia de codificación está operativamente unido a un elemento regulador (por ejemplo, un promotor) que es de un origen genético diferente del de la secuencia de codificación (por ejemplo, para proporcionar para la expresión en una célula huésped de interés, que puede ser de origen genético diferente que el promotor, la secuencia de codificación o ambas). Por ejemplo, se dice que un promotor T7 unido operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido GDF15 o dominio de este es un ácido nucleico heterólogo. En el contexto de las células recombinantes, "heterólogo" puede referirse a la presencia de un ácido nucleico (o producto génico, tal como un polipéptido) que es de un origen genético diferente al de la célula huésped en la que está presente.
El término "operativamente unido" se refiere al enlace entre moléculas para proporcionar una función deseada. Por ejemplo, "unido operativamente" en el contexto de ácidos nucleicos se refiere a un enlace funcional entre secuencias de ácido nucleico. A modo de ejemplo, una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, una secuencia de señal o una matriz de sitios de unión del factor de transcripción) puede estar unida de forma operativa a un segundo polinucleótido, donde la secuencia de control de expresión afecta a la transcripción y/o la traducción del segundo polinucleótido. En el contexto de un polipéptido, "unido operativamente" se refiere a un enlace funcional entre secuencias de aminoácidos (por ejemplo, diferentes dominios) para proporcionar una actividad descrita del polipéptido.
Como se usa en esta invención en el contexto de la estructura de un polipéptido, "extremo N" (o "extremo amino") y "extremo C" (o "extremo carboxilo") se refieren a los extremos carboxilo y amino de extremo polipéptido, respectivamente, mientras que los términos "N-terminal" y "C-terminal" se refieren a posiciones relativas en la secuencia de aminoácidos del polipéptido hacia el extremo N y el extremo C, respectivamente, y pueden incluir los residuos en el extremo N y el extremo C, respectivamente. "Inmediatamente N-terminal" o "inmediatamente C-terminal" se refiere a una posición de un primer residuo de aminoácido con respecto a un segundo residuo de aminoácido donde el primer y el segundo residuo de aminoácido están unidos covalentemente para proporcionar una secuencia de aminoácidos contigua.
"Derivado de", en el contexto de una secuencia de aminoácidos o una secuencia de polinucleótidos (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos "derivada de" un polipéptido GDF15), pretende indicar que el polipéptido o ácido nucleico tiene una secuencia que se basa en la de un polipéptido o ácido nucleico de referencia (por ejemplo, un polipéptido GDF15 de origen natural o un ácido nucleico de codificación de GDF15), y no pretende ser limitante en cuanto a la fuente o procedimiento en el que se produce la proteína o el ácido nucleico. A modo de ejemplo, el término "derivado de" incluye homólogos o variantes de aminoácidos de referencia o secuencias de ADN.
En el contexto de un polipéptido, el término "aislado" se refiere a un polipéptido de interés que, si es de origen natural, se encuentra en un entorno diferente de aquel en el que puede producirse de forma natural. Se entiende que "aislado" incluye polipéptidos que están dentro de muestras que están sustancialmente enriquecidas para el polipéptido de interés y/o en las que el polipéptido de interés está purificado parcial o sustancialmente. Cuando el polipéptido no se produce de forma natural, "aislado" indica que el polipéptido ha sido separado de un entorno en el que se hizo por medios sintéticos o recombinantes.
"Enriquecido" significa que una muestra se manipula de forma no natural (por ejemplo, en un laboratorio, por ejemplo, por un científico o un médico) de modo que un polipéptido de interés esté presente en a) una concentración mayor (por ejemplo, al menos 3- veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 64 veces mayor o más) que la concentración del polipéptido en la muestra inicial, tal como una muestra biológica (por ejemplo, una muestra en la que el polipéptido de produce de forma natural o en el que está presente después de la administración), o b) una concentración mayor que el entorno en el que se formó el polipéptido (por ejemplo, como en una célula bacteriana).
"Sustancialmente puro" indica que un componente (por ejemplo, un polipéptido) constituye más de aproximadamente el 50 % del contenido total de la composición, y típicamente más de aproximadamente el 60 % del contenido del polipéptido total. Más típicamente, "sustancialmente puro" se refiere a composiciones en las que al menos el 75 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o más de la composición total es el componente de interés. En algunos casos, el polipéptido constituirá más de aproximadamente el 90 %, o más de aproximadamente el 95 % del contenido total de la composición.
Los términos "anticuerpos" (Abs) e "inmunoglobuNnas" (Igs) se refieren a glicoproteínas que tienen las mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos exhiben especificidad de unión a un antígeno específico, las inmunoglobulinas incluyen ambos anticuerpos y otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno. Los anticuerpos se describen detalladamente a continuación.
El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y se dirigen contra un único sitio antigénico. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que pueden incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en el antígeno.
En el contexto de un anticuerpo, el término "aislado" se refiere a un anticuerpo que se ha separado y/o recuperado de componentes contaminantes de su entorno natural; tales componentes contaminantes incluyen materiales que pueden interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos.
La frase "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la sustitución de residuos de aminoácidos dentro de los siguientes grupos: 1) L, I, M, V, F; 2) R, K; 3) F, Y, H, W, R; 4) G, A, T, S; 5) Q, N; y 6) D, E. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden preservar la actividad de la proteína al reemplazar uno o más aminoácidos en la proteína con un aminoácido con una cadena lateral de acidez, basicidad, carga, polaridad o tamaño similar de la cadena lateral. La guía para las sustituciones, inserciones o eliminaciones puede basarse en alineaciones de secuencias de aminoácidos de diferentes proteínas variantes o proteínas de diferentes especies.
Factor de diferenciación de crecimiento 15 (GDF15)
GDF15, también conocido como MIC-1 (citocina-1 inhibidora de macrófagos), PDF (factor de diferenciación de próstata), PLAB (proteína morfogenética ósea de la placenta), NAG-1 (gen activado por antiinflamatorios no esteroideos (AINE)), TGF-PL, y PTGFB, es un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGF-p). El GDF15, que se sintetiza como una proteína precursora intracelular de 62 kDa que es escindida posteriormente por una proteasa similar a la furina, se secreta como una proteína unida a disulfuro de 25 kDa. (Véase, por ejemplo, Fairlie y col., J. Leukoc. Biol 65:2-5 (1999)). El ARNm del GDF15 se muestra en varios tejidos, que incluyen el hígado, riñón, páncreas, colon y placenta y la expresión de GDF15 en el hígado puede ser significativamente incrementada durante el daño de órganos tales como el hígado, riñones, corazón y pulmones. El precursor de GDF15 es un polipéptido de 308 aminoácidos (NCBI Ref. Seq.NP_004855.2) que contiene un péptido de señal de 29 aminoácidos, un pro-dominio de 167 aminoácidos y un dominio maduro de 112 aminoácidos que es eliminado del pro-dominio por proteasas de tipo furina. Un polipéptido GDF15 de 308 aminoácidos se denomina polipéptido GDF15 de "longitud completa"; un polipéptido GDF15 de 112 aminoácidos (197-308 aminoácidos de GDF15 de "longitud completa") es un polipéptido GDF15 "maduro" (SEQ ID NO: 1). A menos que se indique lo contrario, el término "GDF15" se refiere a la secuencia humana madura de 112 aminoácidos. Además, las referencias numéricas a residuos particulares de GDF15 se refieren a la secuencia madura de 112 aminoácidos (es decir, el residuo 1 es Ala (A) y el residuo 112 es Ile (I); véase la SEQ ID NO: 1). Cabe destacar que, mientras que la secuencia de aminoácidos precursora de GDF15 predice tres sitios de escisión, lo que resulta en tres formas putativas de GDF15 humano "maduro" (es decir, 110, 112 y 115 aminoácidos), la secuencia madura de 112 aminoácidos se acepta como correcta. El alcance de la presente descripción incluye ortólogos GDF15 y formas modificadas de los mismos, de otras especies de mamíferos, y su uso, incluido el ratón (NP_035949), chimpancé (XP_524157), orangután (XP_002828972), mono Rhesus (EHH29815), panda gigante (XP_002912774), gibón (XP_003275874), cobaya (XP_003465238), hurón (AER98997), vaca (NP_001193227), cerdo (NP_001167527), perro (XP_541938) y ornitorrinco (Ornithorhynchus anatinus; AFV61279). La forma madura de GDF15 humano tiene aproximadamente un 67 % de identidad de aminoácido con respecto al ortólogo de ratón.
Por conveniencia, las moléculas de GDF15 humano modificado, las variantes de GDF15 (por ejemplo, muteínas) y las muteínas GDF15 modificadas descritas a continuación se denominan colectivamente en lo sucesivo como el "Polipéptido(s)". Cabe señalar que cualquier referencia a "humano" en relación con los polipéptidos y las moléculas de ácido nucleico de la presente descripción no pretende ser limitante con respecto a la forma en que se obtiene el polipéptido o ácido nucleico o la fuente, sino más bien es solo con referencia a la secuencia, ya que puede corresponder a una secuencia de un polipéptido humano de origen natural o una molécula de ácido nucleico. En realizaciones particulares, las moléculas GDF15 humanas modificadas son dímeros N-glicosilados. En realizaciones específicas, las moléculas humanas modificadas GDF15 son homodímeros N-glicosilados. Además de los polipéptidos humanos y las moléculas de ácido nucleico que los codifican, la presente descripción contempla polipéptidos relacionados con GDF15 y las correspondientes moléculas de ácido nucleico de otras especies.
A. Polipéptidos que tienen propiedades físicas deseadas
La presente descripción contempla, en parte, polipéptidos que incluyen una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (GDF15 humano de 112 aminoácidos de longitud maduros). Los polipéptidos pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos y/o eliminaciones con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, además de las sustituciones de aminoácidos, los polipéptidos de la presente descripción también pueden incluir eliminaciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, los polipéptidos de la presente descripción pueden incluir eliminaciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Por conveniencia y claridad, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se utiliza como secuencia de referencia para los polipéptidos presentados en esta invención. Por lo tanto, las posiciones de residuos de aminoácidos se numeran en esta invención con referencia a la SEQ ID NO: 1. La secuencia de SEQ ID NO: 1 se presenta a continuación:
ARN GDHCPLGPGRCCRLHTVR AS LEDLGW AD W VLS PRE V Q VTMCIG ACPS Q
FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDC
HCI
En algunas realizaciones, los polipéptidos de la presente descripción pueden incluir una, dos, tres o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos que introducen uno o más sitios de consenso de glicosilación de enlace-N en una ubicación donde tal sitio no está presente en la SEQ ID NO: 1. El sitio de consenso de glicosilación de enlace­ N incluye la secuencia NXS/T, donde N es Asn; X es un aminoácido distinto de la prolina; seguido de Ser (S) o Thr (T).
Los ejemplos de polipéptidos de la presente descripción incluyen polipéptidos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más sitios de consenso de glicosilación (por ejemplo, sitios de consenso de glicosilación de enlace-N) en una ubicación de aminoácidos donde tal sitio no está presente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, el polipéptido puede incluir una sustitución de aminoácidos con respecto a SEQ ID NO: 1 que proporciona un sitio de consenso de glicosilación de enlace-N en la posición de la sustitución (por ejemplo, una secuencia NGD en SEQ ID NO: 1 puede cambiarse a NGT/S por una sustitución; posición de la sustitución subrayada). En otros casos, el polipéptido puede incluir dos sustituciones de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 1 que proporcionan un sitio de consenso de glicosilación de enlace-N en la posición de las sustituciones (por ejemplo, una secuencia KTD en SEQ ID NO: 1 puede cambiarse a NTT/S mediante dos sustituciones; posiciones de sustituciones subrayadas). En algunas realizaciones, el polipéptido puede incluir tres sustituciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID No : 1 que proporcionan un sitio de consenso de glicosilación de enlace-N en la posición de la sustitución (por ejemplo, una secuencia GPG en SEQ ID NO: 1 puede cambiarse a NTT/S mediante tres sustituciones; posición de sustituciones subrayada).
En ciertas realizaciones, el polipéptido puede incluir una o más eliminaciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1 que proporciona un sitio de consenso de glicosilación de enlace-N en la posición de la eliminación. Por ejemplo, una secuencia NGDHCPLGPGRCCRLHT en la SEQ ID NO: 1 puede cambiarse mediante la eliminación de los aminoácidos D a H (subrayado), proporcionando así un sitio de consenso de glicosilación de enlace-N: NGT.
En ciertas realizaciones, el polipéptido puede incluir una o más adiciones de aminoácidos en relación con la SEQ ID NO: 1 que proporciona un sitio de consenso de glicosilación de enlace-N en la(s) posición(es) de la(s) adición(es). Un ejemplo de introducción de un sitio de consenso de glicosilación de enlace-N mediante la adición de un aminoácido incluye añadir una N a una secuencia LHT en la SEQ ID NO: 1, generando así la secuencia LNHT, donde NHT es un sitio de consenso de glicosilación de enlace-N.
Como se señaló anteriormente, el polipéptido puede incluir una o más sustituciones en relación con la SEQ ID NO: 1 y las sustituciones pueden numerarse como la posición del aminoácido correspondiente en la SEQ ID NO: 1.
En ciertos casos, el polipéptido puede incluir una secuencia de aminoácidos contigua que sea al menos en un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, donde la secuencia de aminoácidos contigua tiene al menos uno de los siguientes pares de sustituciones con respecto a los aminoácidos correspondientes en SEQ ID NO: 1:
i. D5T y R21N o D5S y R21N;
ii. R16N y H18T o R16N y H18S;
iii.S23N y E25T o S23N y E25S;
iv. L24N y D26T o L24N y D26S;
v. S50N y F52T; S50N y F52S; F52N y A54T; o F52N y A54S;
vi. Q51N y R53T; Q51N y R53S; R53N y A55T; o R53N y A55S;
vi. S64N y H66T o S64N y H66S;
vii. L65N y R67T o L65N y R67S;
viii. S82N y N84T o S82N y N84S;
ix. K91N y D93T; K91N y D93S; D93N y G95T; o D93N y G95S;
x. T94N y V96T; T94N y V96S; V96N y L98T; o V96N y L98S;
xi. S97N y Q99T o S97N y Q99S; y
xii. A106N y D108T o A106N y D108S.
Por ejemplo, las sustituciones en i) anteriores, indican que el polipéptido tiene una treonina (T) o serina (S) en una posición de aminoácidos que corresponde a la posición de aminoácidos 5 en la SEQ ID NO: 1, donde en la SEQ ID NO: 1 un aspartato (D) está presente en la posición de aminoácidos 5. Una sustitución de una D en la posición 5 con una T o S puede ser indicada por D5T/S. La posición del aminoácido correspondiente en un polipéptido con respecto a la SEQ ID NO: 1 puede determinarse alineando las secuencias de aminoácidos.
En ciertas realizaciones, el polipéptido puede incluir dos sustituciones de aminoácidos (un par de sustituciones) que proporcionan una única secuencia de consenso de N-glicosilación en una posición donde una secuencia de consenso de N-glicosilación no está presente en la SEQ ID NO: 1. Los ejemplos de tales sustituciones incluyen R16N y H18T/S; K91N y D93T/S; T94N y V96T/S; y otros enumerados anteriormente. R16N y H18T/S indica que el polipéptido tiene una N en una posición que corresponde a la posición 16 de la SEQ ID NO: 1, donde en la SEQ ID NO: 1 una R está presente y el polipéptido tiene una T o S en una posición que corresponde a la posición 18 en la SEQ ID NO: 1, donde H está presente. Dado que la secuencia RXH (en la posición 16-18) en la SEQ ID NO: 1 no incluye ningún residuo para la secuencia de consenso de glicosilación de enlace-N, el par de sustituciones conduce a la introducción de la secuencia de consenso de glicosilación de enlace-N.
En realizaciones alternativas, una sola sustitución de aminoácido puede ser suficiente para proporcionar la secuencia de consenso de glicosilación de enlace-N, por ejemplo, ya que la secuencia NGD (en la posición 3-5) está presente en la SEQ ID NO: 1, una sola sustitución de D con T o S produce la secuencia NGT o NGS, respectivamente, que son ambas secuencias de consenso de N-glicosilación.
En ciertos casos, se puede introducir más de una secuencia de consenso de N-glicosilación en el GDF15 de tipo salvaje. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos GDF15 de tipo salvaje puede modificarse mediante sustituciones y/o eliminaciones para proporcionar una, dos, tres, cuatro o más secuencias de consenso de N-glicosilación. En ciertas realizaciones, el polipéptido puede incluir 112 aminoácidos contiguos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 90 % con respecto a la secuencia de 112 amino ácidos de la SEQ ID NO: 1, donde los 112 aminoácidos contiguos incluyen una, dos, tres, cuatro o más secuencias de consenso de N-glicosilación, tales como, 1-12, 1-10, 1­ 8, 1-6, 1-4, 1-3, o 1-2 secuencias de consenso de N-glicosilación.
Un ejemplo de un polipéptido con dos secuencias consenso de N-glicosilación incluye una muteína de GDF15 que tiene una T/S en la posición 5 (con respecto a la SEQ ID NO: 1) y N en la posición 21 (con respecto a la SEQ ID NO: 1).
Los polipéptidos ejemplares de la presente descripción incluyen aquellos que tienen dos o más secuencias consenso de glicosilación unidas a N. Por ejemplo, el polipéptido puede incluir una combinación de dos o más de los siguientes pares de sustituciones:
i) D5T y R21N o D5S y R21N;
ii) R16N y H18T o R16N y H18S;
iii) S23N y E25T o S23N y E25S;
iv) L24N y D26T o L24N y D26S;
v) S50N y F52T; S50N y F52S; F52N y A54T; o F52N y A54S;
vi) Q51N y R53T; Q51N y R53S; R53N y A55T; o R53N y A55S;
vi) S64N y H66T; o S64N y H66S;
vii) L65N y R67T; o L65N y R67S;
viii) S82N y N84T o S82N y N84S;
ix) K91N y D93T; K91N y D93S; D93N y G95T; o D93N y G95S;
x) T94N y V96T; T94N y V96S; V96N y L98T; o V96N y L98S;
xi) S97N y Q99T; o S97N y Q99S; y
xii) A106N y D108T o A106N y D108S.
En ciertos casos, el polipéptido puede incluir una secuencia de aminoácidos contigua que sea al menos en un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID. NO: 1, donde la secuencia de aminoácidos contigua tiene al menos uno de los siguientes pares de sustituciones con respecto a los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1:
i) D5T y R21N o D5S y R21N;ii) R16N y H18T o R16N y H18S;
iii) S23N y E25T o S23N y E25S;
iv) S50N y F52T; S50N y F52S; F52N y A54T; o F52N y A54S;
v) Q51N y R53T; Q51N y R53S; R53N y A55T; o R53N y A55S;
vi) S64N y H66T; o S64N y H66S;
vii) K91N y D93T; K91N y D93S; D93N y G95T; o D93N y G95S;
viii) T94N y V96T; T94N y V96S; V96N y L98T; o V96N y L98S;
ix) S97N y Q99T; o S97N y Q99S; y
.x) A106N y D108T o A106N y D108S;
donde la sustitución crea uno o más sitios consenso de glicosilación unidos a N que tienen la secuencia NXS/T, donde N es Asn; X es un aminoácido distinto de prolina; seguido de Ser (S) o Thr (T) y además donde uno o más sitios de consenso de glicosilación unidos a N están unidos a un N-glicano. En una realización adicional, el polipéptido forma un dímero. En una realización adicional, el polipéptido tiene truncamientos N-terminales y/o truncamientos C-terminales con respecto a la SEQ ID NO: 1. Los truncamientos pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más aminoácidos con respecto a un polipéptido de referencia, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. En una realización específica, el polipéptido tiene un truncamiento de los primeros tres residuos N-terminales en GDF15 (AARN o AN3). En una realización adicional, el polipéptido tiene una solubilidad de al menos 0,5 mg/ml, por ejemplo, al menos 1 mg/ml, al menos 2 mg/ml, al menos 3 mg/ml, al menos 4 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 20 mg/ml o al menos 25 mg/ml, por ejemplo, una solubilidad en el intervalo de 0,5 mg/ml a 25 mg/ml, 0,5 mg/ml a 20 mg/ml, 1 mg/ml a 25 mg/ml, 1 mg/ml a 20 mg/ml, 3 mg/ml a 25 mg/ml, 3 mg/ml a 20 mg/ml, 5 mg/ml a 25 mg/ml, 5 mg/ml a 20 mg/ml o 5 mg/ml a 18 mg/ml en una solución de tampón. En ciertos casos, el polipéptido tiene una solubilidad de al menos 0,5 mg/ml, por ejemplo, al menos 1 mg/ml, al menos 2 mg/ml, al menos 3 mg/ml, al menos 4 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 20 mg/ml o al menos 25 mg/ml, por ejemplo, una solubilidad en el intervalo de 0,5 mg/ml a 25 mg/ml, 0.5 mg/ml a 20 mg/ml, 1 mg/ml a 25 mg/ml, 1 mg/ml a 20 mg/ml, 3 mg/ml a 25 mg/ml, 3 mg/ml a 20 mg/ml, 5 mg/ml a 25 mg/ml, 5 mg/ml a 20 mg/ml o 5 mg/ml a 18 mg/ml en una solución de tampón. El tampón puede ser un tampón fosfato, tampón Tris, tampón HEPES, tampón MOPS, tampón PIPES o similar, o una combinación de los mismos. En ciertos casos, el tampón puede incluir solución salina tamponada con fosfato. En ciertos casos, el tampón puede incluir T ris, fosfato de potasio y cloruro de sodio. En algunos casos, el tampón puede incluir T ris, fosfato de potasio, cloruro de sodio y ácido fórmico. Por ejemplo, el tampón puede incluir Tris 10 mM-100 mM pH 7, fosfato de potasio 1 mM-50 mM, cloruro de sodio 100 mM-200 mM y ácido fórmico 10 mS/cm-30 mS/cm. En realizaciones adicionales, el polipéptido disminuye el nivel de glucosa en sangre, el peso corporal y/o la ingesta de alimentos en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con eso antes de la administración del polipéptido.
103 En ciertos casos, el polipéptido puede incluir una secuencia de aminoácidos contigua que sea al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia de aminoácidos contigua tiene al menos uno de los siguientes pares de sustituciones con respecto a los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1:
i) D5T y R21N;
ii) S23N y E25T;
iii) F52N y A54T;
iv) R53N y A55T;
v) S64N y H66T;
vi) K91N y D93T;
vii) D93N y G95T;
viii) S97N y Q99T; y
ix) A106N y D108T;
donde la sustitución crea uno o más sitios de consenso de glicosilación unidos a N que tienen la secuencia NXS/T, donde N es Asn; X es un aminoácido distinto de prolina; seguido de Ser (S) o Thr (T) y además en el que uno o más sitios de consenso de glicosilación unidos a N están unidos a un N-glicano. En una realización adicional, el polipéptido forma un dímero. En una realización adicional, el polipéptido tiene truncamientos N-terminales y/o truncamientos C-terminales con respecto a la SEQ ID NO: 1. Los truncamientos pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más aminoácidos con respecto a un polipéptido de referencia, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. En una realización específica, el polipéptido tiene un truncamiento de los primeros tres residuos N-terminales en GDF15 (AARN o AN3). En una realización adicional, el polipéptido tiene una solubilidad de al menos 0,5 mg/ml, por ejemplo, al menos 1 mg/ml, al menos 2 mg/ml, al menos 3 mg/ml, al menos 4 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 20 mg/ml o al menos 25 mg/ml, por ejemplo, una solubilidad en el intervalo de 0,5 mg/ml a 25 mg/ml, 0,5 mg/ml a 20 mg/ml, 1 mg/ml a 25 mg/ml, 1 mg/ml a 20 mg/ml, 3 mg/ml a 25 mg/ml, 3 mg/ml a 20 mg/ml, 5 mg/ml a 25 mg/ml, 5 mg/ml a 20 mg/ml o 5 mg/ml a 18 mg/ml en una solución de tampón. En ciertos casos, el polipéptido tiene una solubilidad de al menos 0,5 mg/ml, por ejemplo, al menos 1 mg/ml, al menos 2 mg/ml, al menos 3 mg/ml, al menos 4 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 20 mg/ml o al menos 25 mg/ml, por ejemplo, una solubilidad en el intervalo de 0,5 mg/ml a 25 mg/ml, 0.5 mg/ml a 20 mg/ml, 1 mg/ml a 25 mg/ml, 1 mg/ml a 20 mg/ml, 3 mg/ml a 25 mg/ml, 3 mg/ml a 20 mg/ml, 5 mg/ml a 25 mg/ml, 5 mg/ml a 20 mg/ml o 5 mg/ml a 18 mg/ml en una solución de tampón. El tampón puede ser un tampón fosfato, tampón Tris, tampón HEPES, tampón MOPS, tampón PIPES o similar, o una combinación de los mismos. En ciertos casos, el tampón puede incluir solución salina tamponada con fosfato. En ciertos casos, el tampón puede incluir T ris, fosfato de potasio y cloruro de sodio. En algunos casos, el tampón puede incluir T ris, fosfato de potasio, cloruro de sodio y ácido fórmico. Por ejemplo, el tampón puede incluir Tris 10 mM-100 mM pH 7, fosfato de potasio 1 mM-50 mM, cloruro de sodio 100 mM-200 mM y ácido fórmico 10 mS/cm-30 mS/cm. En realizaciones adicionales, el polipéptido disminuye el nivel de glucosa en sangre, el peso corporal y/o la ingesta de alimentos en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con el anterior a la administración del polipéptido. En casos específicos, el polipéptido comprende o consiste esencialmente en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID No : 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 30. En casos específicos, el polipéptido comprende o consiste esencialmente en: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 o SEQ ID NO: 100. En ciertos casos, el polipéptido puede incluir una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos en un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia de aminoácidos contigua tiene al menos uno de los siguientes pares de sustituciones con respecto a los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1:
i) D5T y R21N;
ii) S64N y H66T;
iii) K91N y D93T;
iv) D93N y G95T; y
v) S97N y Q99T; donde la sustitución crea uno o más sitios de consenso de glicosilación unidos a N que tienen la secuencia NXS/T, donde N es Asn; X es un aminoácido distinto de prolina; seguido de Ser (S) o Thr (T) donde uno o más sitios de consenso de glicosilación unidos a N están unidos a un N-glicano; donde además el polipéptido forma un dímero; y además donde el polipéptido tiene una solubilidad de al menos 1 mg/ml en una solución de tampón.
En realizaciones adicionales, el polipéptido tiene una solubilidad de al menos 5 mg/ml en una solución de tampón. El tampón puede ser un tampón fosfato, tampón Tris, tampón HEPES, tampón MOPS, tampón PIPES o similar, o una combinación de los mismos. En ciertos casos, el tampón puede incluir solución salina tamponada con fosfato. En ciertos casos, el tampón puede incluir Tris, fosfato de potasio y cloruro de sodio. En algunos casos, el tampón puede incluir Tris, fosfato de potasio, cloruro de sodio y ácido fórmico. Por ejemplo, el tampón puede incluir Tris 10 mM-100 mM pH 7, fosfato de potasio 1 mM-50 mM, cloruro de sodio 100 mM-200 mM y ácido fórmico 10 mS/cm-30 mS/cm. En realizaciones adicionales, el polipéptido disminuye el nivel de glucosa en sangre, el peso corporal y/o la ingesta de alimentos en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con el anterior a la administración del polipéptido. En una realización adicional, el polipéptido tiene truncamientos N-terminales y/o truncamientos C-terminales con respecto a la SEQ ID NO: 1. Los truncamientos pueden ser de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más aminoácidos con respecto a un polipéptido de referencia, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. En una realización específica, el polipéptido tiene un truncamiento de los primeros tres residuos N-terminales en GDF15 (AARN o AN3). En casos específicos, el polipéptido comprende o consiste esencialmente en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 30. En casos específicos, el polipéptido comprende o consiste esencialmente en: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 92, Se Q ID NO: 93, Se Q ID NO: 96 o SEQ ID NO: 100.
En ciertos casos, el polipéptido puede incluir 112 aminoácidos contiguos que tienen una identidad de secuencia de al menos el 90 % de la secuencia de 112 aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, donde los 112 aminoácidos contiguos incluyen uno, dos, tres, cuatro o más de los pares de sustituciones indicados anteriormente.
La figura 1 representa las secuencias de aminoácidos de polipéptidos ejemplares (numerados del 1 al 17) contemplados en la presente descripción alineados con la secuencia de aminoácidos del GDF15 humano maduro de tipo salvaje (WT hGDF15; SEC ID NO: 1). En la figura 1, los polipéptidos que incluyen dos sitios de consenso glicosilados unidos a N (mutante numerado 1; SEC ID NO: 2) así como polipéptidos que incluyen un sitio de consenso glicosilado unido a N (mutantes numerados 2-17; SEQ ID NOs: 3 a 18, respectivamente).
En ciertas realizaciones, la presente descripción contempla un dímero N-glicosilado de GDF15 modificado, en el que dicho dímero comprende dos polipéptidos descritos en esta invención unidos covalentemente entre sí. En casos particulares, los dos polipéptidos comprenden cada uno una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 30 o un aminoácido que difiere en hasta 5 aminoácidos; donde dichos polipéptidos contienen al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado. En casos específicos, los dos polipéptidos comprenden cada uno una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 30 o un aminoácido que difiere en hasta 2 aminoácidos; donde dichos polipéptidos contienen al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado. En casos particulares, los dos polipéptidos consisten cada uno en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO : 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 o SEQ ID NO: 100 o un aminoácido que difiere en hasta 5 aminoácidos; donde dichos polipéptidos contienen al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado. En casos particulares, los dos polipéptidos consisten cada uno en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO : 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 o SEQ ID NO: 100 o un aminoácido que difiere en hasta 2 aminoácidos; donde dichos polipéptidos contienen al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado. En otros casos, el dímero N-glicosilado de GDF15 modificado es un homodímero unido por un enlace disulfuro entre cadenas. En casos adicionales, el dímero GDF15 N-glicosilado modificado es un homodímero que tiene dos polipéptidos como se describe en esta invención, cada uno de los cuales comprende las mismas secuencias de aminoácidos, donde dichos polipéptidos contienen al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado.
La presente descripción contempla también polipéptidos que son fragmentos activos (por ejemplo, subsecuencias) de los polipéptidos descritos anteriormente. La longitud de fragmentos activos o subsecuencias pueden ser de 40 aminoácidos a 111 aminoácidos, por ejemplo, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 106, 109 o hasta 111 aminoácidos.
Los polipéptidos tienen una identidad de secuencia definida en comparación con una secuencia de referencia sobre una longitud definida de aminoácidos contiguos (por ejemplo, una "ventana de comparación"). Los procedimientos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del procedimiento de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Madison, Wis.), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Protocolos actuales en biología molecular (Ausubel y col., eds. suplemento 1995)).
Como ejemplo, un polipéptido adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 75 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 98 %, o al menos aproximadamente el 99 %, identidad de secuencia de aminoácidos con un tramo contiguo de 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o hasta 112 aminoácidos en la SEQ ID NO: 1.
Fragmentos ejemplares de los polipéptidos descritos en esta invención incluyen polipéptidos que tienen eliminaciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, los polipéptidos pueden tener truncamientos de N-terminal y/o truncamientos de C-terminal relativos a la s Eq ID NO: 1. Los truncamientos pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más aminoácidos con respecto a un polipéptido de referencia, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones, un polipéptido de interés puede incluir una o más sustituciones que introducen una secuencia de consenso de glicosilación de enlace-N, tales como la descrita en esta invención, y truncamientos de N-terminal y/o truncamientos de C-terminal relativos a la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, el polipéptido puede tener al menos 98 aminoácidos de longitud y tener una identidad de secuencia de aminoácido de al menos el 90 % a un tramo correspondiente de 98 aminoácidos en la SEQ ID NO: 1. Este polipéptido puede carecer de los tres primeros a los catorce primeros aminoácidos (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 aminoácidos) presentes en el extremo N de la SEQ ID NO: 1, al tiempo que conserva los aminoácidos presentes en el extremo C de la SEQ ID NO: 1. En otras palabras, el(los) aminoácido(s) eliminado(s) corresponden a los aminoácidos de N-terminal de la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, la muteína GDF15 puede tener al menos 106 aminoácidos de longitud y tener una identidad de secuencia de aminoácido de al menos el 90 % a un tramo correspondiente de 106 aminoácidos en la SEQ ID NO: 1. La muteína GDF15 puede carecer de los seis primeros aminoácidos presentes en el extremo N de la SEQ ID NO: 1.
En ciertas realizaciones, el polipéptido puede tener al menos 109 aminoácidos de longitud y tener una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 90 % a un tramo correspondiente de 109 aminoácidos en la SEQ ID NO: 1. La muteína GDF15 puede carecer de los primeros tres aminoácidos presentes en el extremo N de la SEQ ID NO: 1. Polipéptidos ejemplares de la presente descripción se representan en la figura 2. Los polipéptidos ejemplares (numerados del 1 al 17) representados en la figura 1 tienen la misma longitud que el WT hGDF15. Los polipéptidos ejemplares (numerados del 18 al 34; SEQ ID NO: 19-35) representados en la figura 2 tienen 109 aminoácidos de longitud ya que incluyen una eliminación de los tres aminoácidos del extremo N (AN3) con respecto al WT hGDF15. Sin embargo, cuando se refiere a la posición de las sustituciones de aminoácidos, el número de residuo indicado es el que corresponde a la posición en el WT hGDF15 maduro (WT; SEQ ID NO: 1). Por lo tanto, el aminoácido G en el extremo N del polipéptido puede ser denominado como residuo 4 aunque es el primer aminoácido en la secuencia de aminoácidos de polipéptido.
Como se señaló anteriormente, estos fragmentos de polipéptidos pueden incluir una o más sustituciones de aminoácidos que introducen una secuencia de consenso de N-glicosilación en relación con la secuencia de la SEQ ID NO: 1, tal como una, dos o más de las sustituciones de aminoácidos descritas en esta invención.
Como se indicó anteriormente y como se describe con más detalle a continuación, los polipéptidos de la presente descripción pueden modificarse mediante, por ejemplo, pegilación (unión covalente de una o más moléculas de polietilenglicol (PEG), o derivados de las mismas); glicosilación (por ejemplo, N-glicosilación); polisialilación; moléculas de fusión de albúmina que comprenden albúmina de suero (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), albúmina de suero de cino o albúmina de suero bovino (BSA)); albúmina que se une a través de, por ejemplo, una cadena de ácido graso conjugado (acilación); Fc-fusión; y fusión con un mimético de PEG. En ciertas realizaciones, las modificaciones se introducen de una manera específica del sitio. En otras realizaciones, las modificaciones incluyen un enlazador. El enlazador puede conjugar la porción modificadora al polipéptido.
En realizaciones particulares, la presente descripción contempla la modificación de muteínas GDF15 y GDF15 humanas maduras (tales como los polipéptidos descritos anteriormente) mediante conjugación con albúmina. En otras realizaciones, la presente descripción contempla la modificación de los polipéptidos mediante N-glicosilación u O-glicosilación. Las características de las albúminas y los conjugados de polipéptido de las mismas (por ejemplo, proteínas de fusión) y los polipéptidos glicosilados se describen adicionalmente más adelante.
Modificaciones particulares para modificar y/o imitar la función GDF15
Un polipéptido puede incluir una o más modificaciones que mejoran una propiedad deseable en una proteína formulada para terapia (p. ej., vida media del suero), que permiten la generación de anticuerpos para su uso en ensayos de detección (p. ej., etiquetas de epítopo), que proporcionan facilidad de purificación de proteínas, etc. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, pegilación (unión covalente de una o más moléculas de polietilenglicol (PEG), o derivados del mismo); glicosilación (unida a N y O); polisialilación; fusión de albúmina; unión de albúmina a través de una cadena de ácido graso conjugado (acilación); proteínas de fusión Fc; y fusión con un mimético de PEG. Como se establece en esta invención, la presente descripción contempla moléculas de fusión que comprenden polipéptido GDF15 maduro (por ejemplo, GDF15 humano maduro) o un polipéptido de muteína de GDF15 (por ejemplo, una muteína de GDF15 humano maduro), donde el polipéptido de GDF15 maduro o el polipéptido de muteína de GDF15 comprende al menos una modificación que no altera su secuencia de aminoácidos, y donde la modificación mejora al menos una propiedad física del polipéptido o del polipéptido de muteína. En una realización, el polipéptido GDF15 o la modificación del polipéptido de muteína GDF15 comprende la conjugación con albúmina de suero (por ejemplo, albúmina de suero humano (HSA), albúmina de suero cino o albúmina de suero bovino (BSA)). En algunas realizaciones, la propiedad física es la solubilidad.
En realizaciones en las que la molécula de fusión comprende un polipéptido GDF15 modificado o una muteína de GDF15 (tal como los polipéptidos descritos anteriormente), cualquiera de los cuales está conjugado con albúmina, la solubilidad de la molécula de fusión generalmente mejoró con respecto a GDF15 humano recombinante no conjugado. En ciertas realizaciones, la molécula de fusión tiene una solubilidad de al menos 1 mg/ml en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a pH 7.0. En otras realizaciones, la molécula de fusión tiene una solubilidad de al menos 2 mg/ml, al menos 3 mg/ml, al menos 4 mg/ml o al menos 5 mg/ml. En otras realizaciones, la molécula de fusión tiene una solubilidad de al menos 6 mg/ml en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a pH 7.0, al menos 7 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 9 mg/ml o a al menos 10 mg/ml. En realizaciones particulares, la molécula de fusión tiene una solubilidad de más de 10 mg/ml.
Pegilación: la eficacia clínica de las terapias proteicas a menudo se ve limitada por la vida media plasmática corta y la susceptibilidad a la degradación de las proteasas. Los estudios de varias proteínas terapéuticas (por ejemplo, filgrastim) han demostrado que tales dificultades pueden superarse mediante diversas modificaciones, incluida la conjugación o la unión de la secuencia polipeptídica a cualquiera de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemlo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol o polioxialquilenos (véase, por ejemplo, típicamente mediante un resto de unión unido covalentemente tanto a la proteína como al polímero no proteico, por ejemplo, un PEG). Se ha demostrado que tales biomoléculas conjugadas con PEG poseen propiedades clínicamente útiles, que incluyen mejor estabilidad física y térmica, protección contra la susceptibilidad a la degradación enzimática, mayor solubilidad, vida media circulante in vivo más prolongada y aclaramiento reducido, inmunogenicidad y antigenicidad reducidas y toxicidad reducida. Los PEG adecuados para la conjugación con una secuencia polipeptídica son generalmente solubles en agua a temperatura ambiente y tienen la fórmula general R (O-CH2-CH2) nO-R, donde R es hidrógeno o un grupo protector tal como un alquilo o un grupo alcanol, y donde n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es un grupo protector, generalmente tiene de 1 a 8 carbonos. El PEG conjugado con la secuencia polipeptídica puede ser lineal o ramificado. Los derivados de PEG ramificados, los "PEG en estrella" y los PEG de brazos múltiples se contemplan en la presente descripción. El peso molecular del PEG usado en la presente descripción no está restringido a ningún intervalo particular, pero ciertas realizaciones tienen un peso molecular entre 500 y 20.000 mientras que otras realizaciones tienen un peso molecular entre 4.000 y 10.000.
La presente descripción contempla también composiciones de conjugados en los que los PEG tienen diferentes valores de n y, por tanto, los diversos PEG diferentes están presentes en proporciones específicas. Por ejemplo, algunas composiciones comprenden una mezcla de conjugados donde n = 1, 2, 3 y 4. En algunas composiciones, el porcentaje de conjugados donde n = 1 es del 18-25 %, el porcentaje de conjugados donde n = 2 es del 50- 66 %, el porcentaje de conjugados donde n = 3 es del 12-16 % y el porcentaje de conjugados donde n = 4 es hasta el 5 %.
Tales composiciones se pueden producir mediante condiciones de reacción y procedimientos de purificación conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar cromatografía de intercambio catiónico para separar conjugados y, a continuación, se identifica una fracción que contiene el conjugado que tiene, por ejemplo, el número deseado de PEG unidos, purificado libre de secuencias de proteínas no modificadas y de conjugados que tienen otros números de PEG unidos.
El PEG puede unirse a un polipéptido de la presente descripción a través de un grupo reactivo terminal. El grupo reactivo terminal puede mediar un enlace entre los grupos amino o carboxilo libres de una o más de las secuencias polipeptídicas y polietilenglicol. El grupo reactivo terminal puede unirse a un espaciador de polietilenglicol de longitud discreta. Estos espaciadores de PEG aumentan la solubilidad del reactivo y del conjugado, minimizan los efectos tóxicos e inmunológicos en comparación con los espaciadores que no son de PEG y proporcionan varias opciones para acomodar distancias de reticulación específicas entre PEG y un polipéptido. Los espaciadores de PEG ejemplares con grupos reactivos incluyen reticulantes pegilados reactivos con amina (por ejemplo, bis (succinimidil) penta (etilenglicol) (BS (PEG) 5)); reticulantes pegilados reactivos con sulfhidrilo (1,11-bismaleimidotietilenglicol (BM (PEG) 3)); reticulantes pegilados bifuncionales (NHS-PEGn-Maleimida succinimidil - ([N-maleimidopropionamido] -etilenglicol) éster (SM (PEG) n); n = 2-24). El espaciador de PEG puede unirse al grupo amino libre. Los espaciadores de PEG incluyen polietilenglicol de N-hidroxisuccinilimida que se puede preparar activando el éster de ácido succínico de polietilenglicol con N-hidroxisuccinilimida. Otro polietilenglicol activado que puede unirse a un grupo amino libre es 2,4-bis(O-metoxipolietilenglicol)-6-cloro-s-triazina que puede prepararse haciendo reaccionar polietilenglicol monometiléter con cloruro cianúrico. El polietilenglicol activado que está unido al grupo carboxilo libre incluye polioxietilendiamina.
La conjugación de una o más de las secuencias polipeptídicas de la presente descripción con PEG que tiene un espaciador puede llevarse a cabo mediante varios procedimientos convencionales. Por ejemplo, la reacción de conjugación se puede llevar a cabo en solución a un pH de 5 a 10, a una temperatura de 4 °C a temperatura ambiente, durante 30 minutos a 20 horas, utilizando una relación molar de reactivo a proteína de 4:1 a 30:1. Las condiciones de reacción pueden seleccionarse para dirigir la reacción hacia la producción predominante de un grado de sustitución deseado. En general, la temperatura baja, el pH bajo (por ejemplo, pH = 5) y el tiempo de reacción corto tienden a disminuir el número de PEG adheridos, mientras que la temperatura alta, el pH neutro a alto (por ejemplo, pH > 7) y el tiempo de reacción más largo tienden a aumentar el número de PEG adjuntos. Pueden usarse varios medios conocidos en la técnica para terminar la reacción. En algunas realizaciones, la reacción se termina acidificando la mezcla de reacción y congelando a, por ejemplo, -20 °C.
La presente descripción contempla también el uso de miméticos de PEG. Se han desarrollado miméticos de PEG recombinantes que retienen los atributos de PEG (por ejemplo, vida media sérica mejorada) al mismo tiempo que confieren varias propiedades ventajosas adicionales. A modo de ejemplo, las cadenas polipeptídicas simples (que comprenden, por ejemplo, Ala, Glu, Gly, Pro, Ser y Thr) capaces de formar una conformación extendida similar a PEG pueden producirse recombinantemente ya fusionadas al fármaco peptídico o proteico de interés (por ejemplo, tecnología XTEN de Amunix; Mountain View, CA). Esto evita la necesidad de una etapa de conjugación adicional durante el procedimiento de fabricación. Además, las técnicas de biología molecular establecidas permiten el control de la composición de la cadena lateral de las cadenas polipeptídicas, lo que permite optimizar la inmunogenicidad y las propiedades de fabricación.
Glicosilación: Para los propósitos de la presente descripción, "glicosilación" se refiere en general al procedimiento enzimático que une los glicanos a proteínas, lípidos u otras moléculas orgánicas. El uso del término "glicosilación" en conjunción con la presente descripción generalmente pretende significar agregar o eliminar una o más porciones de carbohidratos (ya sea eliminando el sitio de glicosilación subyacente o eliminando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o agregando uno o más sitios de glicosilación que pueden o no estar presentes en la secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas naturales que implican un cambio en la naturaleza y en las proporciones de las diversas porciones de carbohidratos presentes.
La glicosilación puede afectar drásticamente a las propiedades físicas de las proteínas y también puede ser importante en la estabilidad de las proteínas, la secreción y la localización subcelular. De hecho, la glicosilación de los polipéptidos de muteína GDF15 descritos en esta invención imparten mejoras beneficiosas a sus propiedades físicas. A modo de ejemplo, pero sin limitación, la solubilidad de las muteínas GDF15 se puede mejorar mediante glicosilación, y tal mejora puede ser sustancial (véanse los ejemplos). Los polipéptidos de muteína de GDF15 glicosilados descritos en esta invención tienen una mayor solubilidad en comparación con el GDF15 de tipo salvaje, que no está glicosilado. En ciertas realizaciones, las muteínas de GDF15 glicosiladas descritas en esta invención tienen una solubilidad de al menos 0,5 mg/ml, por ejemplo, al menos 1 mg/ml, al menos 2 mg/ml, al menos 3 mg/ml, al menos 4 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 20 mg/ml o al menos 25 mg/ml, por ejemplo, una solubilidad en el intervalo de 0,5 mg/ml a 25 mg/ml, 0,5 mg/ml a 20 mg/ml, 1 mg/ml a 25 mg/ml, 1 mg/ml a 20 mg/ml, 3 mg/ml a 25 mg/ml, 3 mg/ml a 20 mg/ml, 5 mg/ml a 25 mg/ml, 5 mg/ml a 20 mg/ml o 5 mg/ml a 18 mg/ml en una solución de tampón. En ciertos casos, las muteínas de GDF15 glicosiladas descritas en esta invención pueden tener una solubilidad de al menos 0,5 mg/ml, por ejemplo, al menos 1 mg/ml, al menos 2 mg/ml, al menos 3 mg/ml, al menos 4 mg/ml ml, al menos 5 mg/ml, al menos 8 mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/ml, al menos 20 mg/ml o al menos 25 mg/ml, por ejemplo, una solubilidad en el intervalo de 0,5 mg/ml a 25 mg/ml, 0,5 mg/ml a 20 mg/ml, 1 mg/ml a 25 mg/ml, 1 mg/ml a 20 mg/ml, 3 mg/ml a 25 mg/ml, 3 mg/ml a 20 mg/ml, 5 mg/ml a 25 mg/ml, 5 mg/ml a 20 mg/ml o 5 mg/ml a 18 mg/ml en una solución de tampón. El tampón puede ser un tampón fosfato, tampón Tris, tampón HEPES, tampón MOPS, tampón PIPES o similar, o una combinación de los mismos. En ciertos casos, el tampón puede incluir solución salina tamponada con fosfato. En ciertos casos, el tampón puede incluir Tris, fosfato de potasio y cloruro de sodio. En algunos casos, el tampón puede incluir Tris, fosfato de potasio, cloruro de sodio y ácido fórmico. Por ejemplo, el tampón puede incluir Tris 10 mM-100 mM pH 7, fosfato de potasio 1 mM-50 mM, cloruro de sodio 100 mM-200 mM y ácido fórmico 10 mS/cm-30 mS/cm.
Los polipéptidos de muteína de GDF15 glicosilados descritos en esta invención son superiores al polipéptido de GDF15 maduro de tipo salvaje. Estos polipéptidos de muteína GDF15 glicosilados tienen una característica mejorada en comparación con el polipéptido GDF15 maduro de tipo salvaje que incluye, pero no se limita a, uno o más de: mayor rendimiento en cultivo celular, formación mejorada de dímeros, mayor solubilidad e inmunogenicidad reducida. La mejora en la solubilidad mostrada por tales muteínas GDF15 modificadas puede, por ejemplo, permitir la generación de formulaciones más adecuadas para la administración farmacéutica que las muteínas GDF15/GDF15 no glicosiladas. Los polipéptidos de muteína GDF15/GDF15 glicosiladas también pueden exhibir una estabilidad mejorada. Además, los polipéptidos pueden mejorar una o más propiedades farmacocinéticas, tales como la vida media.
La adición de sitios de glicosilación se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos como se describió anteriormente. La alteración del polipéptido se puede realizar también, por ejemplo, mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina (para los sitios de glicosilación de enlace-O) o residuos de asparagina (para los sitios de glicosilación de enlace-N). Las estructuras de oligosacáridos de enlace-N y de enlace­ O y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo pueden ser diferentes. Un tipo de azúcar que se encuentra comúnmente en ambos es el ácido N-acetilneuramínico (en adelante denominado ácido siálico). El ácido siálico es generalmente el residuo terminal de ambos oligosacáridos de enlace-N y de enlace-O y, en virtud de su carga negativa, puede conferir propiedades ácidas a la glicoproteína. Una realización particular de la presente descripción comprende la generación y uso de las variantes de N-glicosilación tal como se describe anteriormente.
Otro medio para aumentar el número de porciones de carbohidratos en el polipéptido es mediante acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido.
Las células de ovario de hámster chino (CHO) deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) son una célula huésped comúnmente utilizada para la producción de glicoproteínas recombinantes. Estas células no expresan la enzima betagalactosidasa alfa-2,6-sialiltransferasa y, por lo tanto, no agregan ácido siálico en el enlace de alfa-2,6 a los oligosacáridos de enlace-N de las glicoproteínas producidas en estas células.
Polisialilación: la presente descripción contempla también el uso de polisialilación, la conjugación de péptidos y proteínas con el ácido polisiálico enlazado a (2 ^ 8) biodegradable de origen natural ("PSA") con el fin de mejorar su estabilidad y farmacocinética in vivo. El PSA es un polímero natural biodegradable, no tóxico y altamente hidrófilo, lo que le confiere un alto peso molecular aparente en la sangre que aumenta su vida media en suero. Además, la polisialilación de una variedad de terapias de péptidos y proteínas ha conducido a una proteólisis notablemente reducida, retención de la actividad in vivo y reducción de la inmunogenicidad y antigenicidad (véase, por ejemplo, G. Gregoriadis y col., Int. J. Pharmaceutics 300 (1-2): 125-30). Al igual que con las modificaciones con otros conjugados (por ejemplo, PEG), están disponibles varias técnicas para la polisialilación específica de sitio (véase, por ejemplo, T. Lindhout y col., PNAS 108 (18) 7397-7402 (2011)).
Proteínas de fusión. La presente descripción contempla proteínas de fusión de GDF15 maduro de tipo salvaje (por ejemplo, GDF15 humano), así como proteínas de fusión de los polipéptidos de la presente descripción (por ejemplo, moléculas de GDF15 humano modificado, muteínas de GDF15 humano, muteínas de GDF15 modificado y similares). Tales proteínas de fusión generalmente están compuestas por un polipéptido que no es GDF15 (por ejemplo, albúmina (por ejemplo, HSA) o un fragmento de la misma: dominio de unión a albúmina (ABD); polipéptido Fc; dominio de unión a maltosa (MBD), que puede denominarse en esta invención como un "socio de fusión", conjugado con el polipéptido o polipéptido GDF15 de tipo salvaje de la presente descripción en su extremo N o extremo C. Opcionalmente, el socio de fusión puede conjugarse con el polipéptido o GDF15 de tipo salvaje a través de un polipéptido enlazador. El polipéptido enlazador puede ser opcionalmente un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador escindible enzimáticamente. Se describen a continuación ejemplos de socios de fusión.
Fusión de albúmina: el socio de fusión adecuado para la conjugación incluye albúmina tales como albúmina de suero humano (HSA), albúmina de suero cino y albúmina de suero bovino (BSA).
La HSA madura, un polipéptido de 585 aminoácidos (-67 kDa) que tiene una vida media en suero de -20 días, es principalmente responsable del mantenimiento de la presión sanguínea osmótica coloidal, el pH sanguíneo y el transporte y distribución de numerosos ligandos endógenos y exógenos. La proteína tiene tres dominios estructuralmente homólogos (dominios I, II y III), está casi en su totalidad en la conformación de hélice alfa y está altamente estabilizada por 17 puentes disulfuro. Las tres regiones primarias de albúmina de unión al fármaco están ubicadas en cada uno de los tres dominios dentro de los subdominios IB, IIA y IIIA.
La síntesis de albúmina tiene lugar en el hígado, que produce el producto primario preproalbúmina de vida corta. Por tanto, la HSA de longitud completa tiene un péptido señal de 18 aminoácidos seguido de un pro-dominio de 6 aminoácidos; este péptido de 24 residuos de aminoácidos puede denominarse pre-pro dominio. La HSA puede expresarse y secretarse usando su péptido señal endógeno como pre-pro-dominio. Alternativamente, la HSA puede expresarse y secretarse usando un péptido señal de IgK fusionado a una HSA madura. La preproalbúmina se escinde rápidamente co-traduccionalmente en el lumen del retículo endoplásmico en su extremo amino para producir el polipéptido precursor estable de 609 aminoácidos, proalbúmina. La proalbúmina pasa a continuación al aparato de Golgi, donde se convierte en albúmina madura de 585 aminoácidos mediante una escisión amino-terminal dependiente de furina. A menos que se indique lo contrario, "albúmina" o "albúmina madura" se refiere a HSA.
Las secuencias de aminoácidos primarias, la estructura y la función de las albúminas están muy conservadas en todas las especies, al igual que los procedimientos de síntesis y secreción de albúmina. Las proteínas séricas de albúmina comparables a la HSA se encuentran, por ejemplo, en monos cynomolgus, vacas, perros, conejos y ratas. De las especies no humanas, la albúmina de suero bovino (BSA) es la más similar estructuralmente a la HSA. [Véase, por ejemplo, Kosa y col., J Pharm Sci. 96 (11): 3117-24 (noviembre de 2007)]. La presente descripción contempla el uso de albúmina de especies no humanas, incluidas, pero sin limitarse a, las expuestas anteriormente, en, por ejemplo, la fusión con el polipéptido GDF15. En determinadas realizaciones, la especie no humana es una vaca. En otras realizaciones, la especie no humana es un mono cynomolgus.
Según la presente descripción, la albúmina se puede conjugar con una molécula de fármaco (por ejemplo, un polipéptido descrito en esta invención) en el extremo carboxilo terminal, el extremo amino terminal, tanto el carboxilo terminal como el amino terminal, o internamente (véase, por ejemplo, USP 5.876.969 y USP 7.056.701). Además, la presente descripción contempla proteínas de fusión de albúmina que comprenden más de una molécula de fármaco homóloga (por ejemplo, múltiples moléculas de muteína de GDF15) o heteróloga (por ejemplo, una molécula de muteína de GDF15 y un agente antidiabético distinto).
En los conjugados HSA-polipéptido contemplados por la presente descripción, se pueden usar varias formas de albúmina, tales como variantes de HSA, tales como fragmentos. Tales formas generalmente poseen una o más actividades de albúmina deseadas. En realizaciones adicionales, la presente descripción implica proteínas de fusión que comprenden una molécula de fármaco polipeptídico fusionada directa o indirectamente a albúmina, un fragmento de albúmina y variante de albúmina, etc., donde la proteína de fusión tiene una mayor estabilidad en plasma que la molécula de fármaco no fusionada y/o la proteína de fusión retiene la actividad terapéutica de la molécula de fármaco no fusionada. En algunas realizaciones, la fusión indirecta se efectúa mediante un enlazador, tal como un enlazador peptídico o una versión modificada del mismo.
La HSA puede conjugarse mediante un enlazador a un polipéptido descrito en esta invención para generar una proteína de fusión. En esta invención se describen ejemplos de enlazadores adecuados. Algunas realizaciones contemplan un enlazador peptídico de, por ejemplo, de cuatro a treinta aminoácidos.
En realizaciones en las que la proteína de fusión comprende un enlazador, el enlazador puede ser un enlazador no escindible. Por ejemplo, en una realización, la presente descripción describe una molécula de fusión en la que la secuencia de aminoácidos precursora de HSA o la HSA madura se fusiona con el extremo N del GDF15 humano maduro o una secuencia de aminoácidos de muteína de GDF15 a través de un enlazador no escindible (G4S)3. En otras realizaciones en las que la proteína de fusión comprende un enlazador, el enlazador puede ser un enlazador escindible. Por ejemplo, la descripción contempla una molécula de fusión en la que la secuencia de aminoácidos precursora de hSa o la secuencia de aminoácidos de HSA madura se fusiona con el extremo N del GDF15 humano maduro o una secuencia de aminoácidos de muteína de GDF15 como se proporciona en esta invención a través de un enlazador sensible a proteasas (G4S)2 escindible con factor Xa.
La construcción de moléculas de muteína GDF15/GDF15 recombinantes maduras de enlazador escindible con HSA, así como la construcción de moléculas de fusión de enlazador HSA escindible de muteína GDF15/GDF15 recombinantes maduras, pueden usarse para facilitar la evaluación de, por ejemplo, la solubilidad y la determinación de la eficacia in vivo de la muteína GDF15/GDF15. En tales realizaciones, la muteína GDF15/GDF15 puede escindirse del acompañante HSA mediante escisión intracelular o mediante escisión enzimática in vitro. En algunas realizaciones, la escisión se efectúa mediante digestión proteolítica del enlazador escindible usando cualquier proteasa viable. En otras realizaciones, las muteínas de GDF15 también se pueden generar como fusiones sin HSA mediante la construcción de un péptido señal fusionado a los polipéptidos proporcionados en esta invención.
La escisión intracelular se puede llevar a cabo enzimáticamente mediante, por ejemplo, furina o caspasa. Una célula huésped que expresa la proteína de fusión puede expresar un nivel bajo de estas enzimas endógenas, que son capaces de escindir una porción de las moléculas de fusión intracelularmente; por tanto, algunos de los polipéptidos se secretan de la célula sin conjugarse con HSA, mientras que algunos de los polipéptidos se secretan en forma de moléculas de fusión que comprenden HSA. Las realizaciones de la presente descripción contemplan el uso de diversas construcciones de fusión de furina. Por ejemplo, pueden diseñarse construcciones que comprendan la secuencia RGRR (SEQ ID NO: 36), RKRKKR (SEQ ID NO: 37), RKKR (SEQ ID NO: 38) o RRRKKR (SEQ ID NO: 39). Tales construcciones pueden tener la siguiente estructura general: Igk-HSA-(G4S)2-secuencia de furina-hGDF15.
La presente descripción contempla también la escisión extracelular (es decir, escisión ex-vivo) mediante la cual las moléculas de fusión se secretan de la célula, se someten a purificación y, a continuación, se escinden (por ejemplo, usando, por ejemplo, un factor Xa sensible a proteolíticos enlazador o una enteroquinasa). Se entiende que la escisión puede disociar todo el complejo HSA-enlazador del polipéptido (por ejemplo, muteína GDF15 o GDF15 madura), o menos que todo el complejo HSA-enlazador.
Como se describió anteriormente, la fusión de albúmina a uno o más polipéptidos de la presente descripción se puede lograr, por ejemplo, mediante manipulación genética, de modo que el ADN que codifica HSA, o un fragmento del mismo, se une al ADN que codifica para la una o más secuencias polipeptídicas. Posteriormente, un huésped adecuado puede transformarse o transfectarse con las secuencias de nucleótidos fusionadas en forma de, por ejemplo, un plásmido adecuado, para expresar un polipéptido de fusión. La expresión puede efectuarse in vitro a partir, por ejemplo, de células procariotas o eucariotas, o in vivo a partir, por ejemplo, de un organismo transgénico. En algunas realizaciones de la presente descripción, la expresión de la proteína de fusión se realiza en líneas celulares de mamíferos, por ejemplo, líneas celulares CHO. La transformación se usa ampliamente en esta invención para referirse a la alteración genética de una célula resultante de la captación, incorporación y expresión directas de material genético exógeno (ADN exógeno) de su entorno y captado a través de la(s) membrana(s) celular(es). La transformación ocurre naturalmente en algunas especies de bacterias, pero también puede verse afectada por medios artificiales en otras células.
Además, la propia albúmina se puede modificar para extender su vida media circulante. La fusión de la albúmina modificada con uno o más polipéptidos de la presente descripción se puede lograr mediante las técnicas de manipulación genética/recombinantes descritas anteriormente o mediante conjugación química; la molécula de fusión resultante tiene una vida media superior a la de las fusiones con albúmina no modificada (por ejemplo, véase el documento WO2011/051489).
Existen plataformas tecnológicas bien establecidas para la fusión genética y la conjugación química de polipéptidos (por ejemplo, los polipéptidos descritos en esta invención) y albúmina recombinante. A modo de ejemplo, la plataforma AlBUFUSe (r) flex (Novozymes Biopharma A/S; Dinamarca) se puede utilizar para efectuar la fusión genética de una o más moléculas de albúmina recombinante a uno o más polipéptidos, produciendo así un ADNc contiguo que codifica el(los) polipéptido(s) y la(s) albúmina(s) para generar una única proteína homogénea. La plataforma se puede utilizar, por ejemplo, con sistemas de expresión de huésped de levadura y de mamífero. A modo de ejemplo adicional, la plataforma RECOMBUMIN (r) Flex (Novozymes Biopharma A/S; Dinamarca) puede usarse para efectuar la conjugación química de los polipéptidos de la presente descripción con albúmina recombinante, sin ninguna derivatización adicional de la albúmina. Aunque la conjugación se puede realizar en varios residuos de aminoácidos (por ejemplo, lisina y tirosina), el tiol libre en Cys34 es una estrategia común debido a la especificidad del sitio que produce un producto final más homogéneo.
Estrategias alternativas de unión a albúmina: se han desarrollado varias estrategias de unión a albúmina como alternativas para la fusión directa, incluida la unión de albúmina a través de una cadena de ácido graso conjugado (acilación). Debido a que la albúmina sérica es una proteína de transporte de ácidos grasos, estos ligandos naturales con actividad de unión a la albúmina se han utilizado para prolongar la vida media de terapias con proteínas pequeñas. Por ejemplo, la insulina determir (LEVEMIR), un producto aprobado para la diabetes, comprende una cadena de miristilo conjugada con una insulina modificada genéticamente, lo que da como resultado un análogo de insulina de acción prolongada.
La presente descripción también contempla proteínas de fusión que comprenden una secuencia polipeptídica del dominio de unión a albúmina (ABD) y la secuencia de uno o más de los polipéptidos descritos en esta invención. Cualquier secuencia de polipéptido ABD descrita en esta invención o en la bibliografía puede ser un componente de las proteínas de fusión. Los componentes de las proteínas de fusión se pueden unir opcionalmente covalentemente a través de un enlazador, tal como los enlazadores descritos en esta invención. En algunas de las realizaciones de la presente descripción, las proteínas de fusión comprenden la secuencia del polipéptido ABD como un resto N-terminal y los polipéptidos descritos en esta invención como un resto C-terminal.
La presente descripción también contempla proteínas de fusión que comprenden un fragmento de un polipéptido que se une a la albúmina, cuyo fragmento retiene sustancialmente la unión a la albúmina; o un multímero de polipéptidos de unión a albúmina o sus fragmentos que comprenden al menos dos polipéptidos de unión a albúmina o sus fragmentos como unidades monoméricas.
Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que los polipéptidos descritos en esta invención se unen a la secuencia polipeptídica ABD, secuestrando de ese modo los polipéptidos en un sujeto que conduce a una mayor duración de la acción en el sujeto.
Para una discusión general de ABD y tecnologías relacionadas, véanse los documentos WO 2012/050923, WO 2012/050930, WO 2012/004384 y WO 2009/016043.
Proteínas de fusión con proteína de unión a maltosa o fragmentos de la misma: la presente descripción contempla también proteínas de fusión que comprenden una proteína de unión a maltosa (MBP), o un fragmento de la misma, y la secuencia de aminoácidos de uno o más de los polipéptidos descritos en esta invención. En algunas realizaciones, el fragmento de MBP comprende un dominio de unión a maltosa (MBD). Cualquier MBP, o fragmento de la misma, o secuencia polipeptídica de MBD descrita en esta invención o conocida en la técnica puede ser un componente de las proteínas de fusión de la presente descripción. Los componentes de las proteínas de fusión se pueden unir opcionalmente covalentemente a través de un enlazador, tal como los enlazadores descritos en esta invención. En algunas de las realizaciones de la presente descripción, las proteínas de fusión comprenden la MBP, o un fragmento de la misma, o la secuencia del polipéptido MBD como un resto N-terminal y los polipéptidos descritos en esta invención como un resto C-terminal.
La presente descripción contempla también proteínas de fusión que comprenden un fragmento de un polipéptido MBP o MBD, fragmento que retiene sustancialmente la actividad de unión a maltosa; o un multímero de polipéptidos de unión a maltosa, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, multímero de un MBD) que comprende al menos dos polipéptidos de unión a maltosa, o fragmentos de los mismos, como unidades monoméricas (por ejemplo, dos o más polipéptidos de MBD).
Para una discusión general de MBP y MBD y tecnologías relacionadas, véase, por ejemplo, Kapust y col. (1999) Protein Sci 8 (8):1668-74.
Proteínas de fusión Fc. La presente descripción contempla también proteínas de fusión que comprenden un polipéptido Fc o un fragmento del mismo, y la secuencia de aminoácidos de uno o más de los polipéptidos descritos en esta invención (por ejemplo, moléculas GDF15 humanas, moléculas GDF15 humanas modificadas, muteínas GDF15 y muteínas GDF15 modificadas). Cualquier secuencia de polipéptido Fc descrita en esta invención o conocida en la técnica puede ser un componente de las proteínas de fusión de la presente descripción. Los componentes de las proteínas de fusión pueden unirse opcionalmente de forma covalente a través de un enlazador, tal como aquellos enlazadores descritos en esta invención. En algunas de las realizaciones de la presente descripción, las proteínas de fusión comprenden la secuencia del polipéptido Fc como una porción del N-terminal y los polipéptidos descritos en esta invención como una porción del C-terminal.
La presente descripción contempla también socios de fusión de polipéptidos Fc, y proteínas de fusión que comprenden tales, donde el socio de fusión de polipéptidos Fc se modifica para ser un socio de un par Fc cargado. Un "socio de un par Fc cargado" se refiere a una (i) una secuencia de Fc "cargada negativamente" (opcionalmente sin la región bisagra) y que comprende una mutación de par cargado o (ii) una secuencia de Fc "cargada positivamente" (opcionalmente sin la región bisagra) y que comprende una mutación de par cargada. "Cargado positivamente" y "cargado negativamente" se utilizan en esta invención para facilitar la referencia para describir la naturaleza de las mutaciones de par cargado en las secuencias Fc, y no para indicar que la secuencia general o construcción necesariamente tiene una carga positiva o negativa. Las secuencias de aminoácidos de Fc cargadas adecuadas para su uso en construcciones de polipéptidos (por ejemplo, muteína GDF15, muteínas GDF15 modificadas) de la presente descripción se describen en, por ejemplo, el documento WO 2013/113008.
Los ejemplos de una Fc cargada positivamente ("Fc(+)") incluyen una Fc que comprende una mutación de ácido aspártico a lisina (E356K) y una mutación de ácido glutámico a lisina (D399K) de una secuencia de Fc que carece de la región bisagra. Los ejemplos de una Fc cargada negativamente ("Fc(-)") incluyen una Fc que comprende dos mutaciones de lisina a aspartato (K392D, K409D) en una secuencia de Fc que carece de la región bisagra. La lisina del C-terminal (K477) también se puede borrar opcionalmente. Cuando una proteína de fusión de polipéptidos Fc(+) (por ejemplo, la proteína de fusión de muteína Fc(+)GDF15) y una proteína de fusión de polipéptidos Fc(-) (por ejemplo, la proteína de fusión de muteína Fc(-)GDF15) se incuban juntos, los residuos de aspartato se asocian con los residuos de lisina a través de la fuerza electrostática, lo que facilita la formación de heterodímeros Fc entre las secuencias Fc(+) y Fc(-) de las proteínas de fusión de los polipéptidos GDF15.
La presente descripción contempla también construcciones designadas "hemi" o "hemiFc", que comprenden dos secuencias Fc unidas en tándem por un enlazador que conecta el extremo N de una primera secuencia de Fc con el extremo C de una segunda secuencia de Fc. En algunas realizaciones, un monómero comprende una secuencia de polipéptido (por ejemplo, un GDF15 modificado maduro o GDF15 de muteína) unida a la primera secuencia de Fc por un primer enlazador que conecta el extremo N de la secuencia GDF15 al extremo C de la primera secuencia de Fc, donde la primera secuencia de Fc está unida a la segunda secuencia de Fc por un segundo enlazador que conecta el extremo N de la primera secuencia de Fc con el extremo C de la segunda secuencia de Fc. La primera y la segunda secuencia de Fc también están asociadas por las regiones bisagra Fc. Dos de tales monómeros se asocian para formar un dímero en el que los monómeros están unidos a través de un enlace de disulfuro intercatenario entre las dos secuencias de polipéptidos. Para ejemplos de polipéptidos hemiFc adecuados para su uso con las muteínas GDF15 de la presente descripción, véase el documento w O 2013/113008.
La presente descripción contempla también proteínas de fusión que tienen un multímero de polipéptidos Fc, o fragmentos de los mismos, que incluyen un socio de un par Fc cargado (por ejemplo, multímero de un Fc).
Conjugación con otras moléculas: los componentes y moléculas adecuados adicionales para la conjugación incluyen, por ejemplo, tiroglobulina; toxoide tetánico; toxoide diftérico; poliaminoácidos tales como poli(D-lisina: ácido D-glutámico); polipéptidos VP6 de rotavirus; hemaglutinina del virus de la influenza, nucleoproteína del virus de la influenza; Hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH); y proteína central y antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; o cualquier combinación de los anteriores.
Por lo tanto, la presente descripción contempla la conjugación de uno o más componentes o moléculas adicionales en el extremo N y/o el extremo C de una secuencia de polipéptidos, tal como otra proteína (por ejemplo, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos heteróloga a la proteína sujeto) o una molécula portadora. Por lo tanto, una secuencia de polipéptidos ejemplar se puede proporcionar como un conjugado con otro componente o molécula. Una modificación de conjugado puede resultar en una secuencia polipeptídica que retiene actividad con una función o actividad adicional o complementaria de la segunda molécula. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica puede conjugarse con una molécula, por ejemplo, para facilitar la solubilidad, el almacenamiento, la vida media o estabilidad in vivo o en almacenamiento, la reducción de la inmunogenicidad, la liberación retardada o controlada in vivo, etc. Otras funciones o actividades incluyen un conjugado que reduce la toxicidad en relación con una secuencia polipeptídica no conjugada, un conjugado que se dirige a un tipo de célula u órgano de manera más eficaz que una secuencia polipeptídica no conjugada, o un fármaco para contrarrestar aún más las causas o efectos asociados con un trastorno o enfermedad como se establece en esta invención ( por ejemplo, diabetes).
Un polipéptido también puede conjugarse con macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas; polisacáridos, tales como sefarosa, agarosa, celulosa, perlas de celulosa; aminoácidos poliméricos tales como ácido poliglutámico, polilisina; copolímeros de aminoácidos; partículas de virus inactivadas; toxinas bacterianas inactivadas tales como toxoide de la difteria, tétanos, cólera, moléculas de leucotoxina; bacterias inactivadas; y células dendríticas. Tales formas conjugadas, si se desea, se pueden utilizar para producir anticuerpos contra un polipéptido de la presente descripción.
Componentes candidatos adicionales y moléculas para la conjugación incluyen aquellos adecuados para aislamiento o purificación. Los ejemplos no limitativos particulares incluyen las moléculas de unión, tales como biotina (par de unión específica biotina-avidina), un anticuerpo, un receptor, un ligando, una lectina, o moléculas que comprenden un soporte sólido, que incluye, por ejemplo, perlas de plástico o poliestireno, placas o perlas, perlas magnéticas, tiras reactivas y membranas.
Los procedimientos de purificación tales como la cromatografía de intercambio catiónico pueden usarse para separar conjugados por diferencia de carga, que separa efectivamente los conjugados en sus diversos pesos moleculares. Por ejemplo, la columna de intercambio catiónico puede cargarse y, a continuación, lavarse con acetato de sodio a -20 mM, pH ~4, y, a continuación, eluirse con un gradiente lineal de NaCl (0 M a 0,5 M) amortiguado a un pH de aproximadamente 3 a 5.5, por ejemplo, a pH -4.5. El contenido de las fracciones obtenidas por cromatografía de intercambio catiónico puede identificarse por peso molecular mediante el uso de procedimientos convencionales, por ejemplo, espectroscopia de masas, SDS-PAGE u otros procedimientos conocidos para separar entidades moleculares por peso molecular.
Otras modificaciones: la presente descripción contempla el uso de otras modificaciones, actualmente conocidas o desarrolladas en el futuro, de los polipéptidos para mejorar una o más propiedades. Uno de tales procedimientos para prolongar la vida media en circulación, aumentar la estabilidad, reducir la liberación o alterar la inmunogenicidad o alergenicidad de un polipéptido de la presente descripción implica la modificación de las secuencias polipeptídicas por hesilación, que utiliza derivados de hidroxietil almidón unidos a otras moléculas para modificar las características de la molécula. Varios aspectos de la hesilación se describen, por ejemplo, en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nos.
2007/0134197 y 2006/0258607.
La presente descripción contempla también moléculas de fusión que comprenden SUMO como etiqueta de fusión (LifeSensors, Inc.; Malvern, PA). La fusión de un polipéptido descrito en esta invención con SUMO puede transmitir varios efectos beneficiosos sobre el polipéptido, incluida la potenciación de la expresión, la mejora de la solubilidad y/o la asistencia en el desarrollo de procedimientos de purificación. Las proteasas SUMO reconocen la estructura terciaria de SUMO y escinden la proteína de fusión en el extremo C de SUMO, liberando así un polipéptido descrito en esta invención con el aminoácido N-terminal deseado.
Enlazadores: Cualquiera de los componentes y moléculas anteriores utilizados para modificar las secuencias polipeptídicas de la presente descripción se puede conjugar opcionalmente a través de un enlazador. Los enlazadores adecuados incluyen "enlazadores flexibles" que generalmente tienen una longitud suficiente para permitir cierto movimiento entre las secuencias de polipéptidos modificados y los componentes y moléculas unidos. Las moléculas enlazadoras pueden tener una longitud de aproximadamente 6-50 átomos. Las moléculas enlazadoras también pueden ser, por ejemplo, acetileno de arilo, oligómeros de etilenglicol que contienen 2-10 unidades de monómeros, diaminas, diácidos, aminoácidos o combinaciones de estos. Los enlazadores adecuados pueden seleccionarse fácilmente y pueden tener cualquier longitud adecuada, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50 aminoácidos.
Los enlazadores flexibles ejemplares incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina, polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GmSo)n, (GSGGS)n, (GmSoGm)n, (GmSoGmSoGm)n, (GSGGSm)n, (GSGSmG)n y (GGGSm)n, y sus combinaciones, donde m, n y o se seleccionan cada uno independientemente de un número entero de al menos 1 a 20, por ejemplo, 1-18, 2-16, 3-14, 4-12, 5-10, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) y otros enlazadores flexibles. Polímeros de glicina y glicina-serina están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como una conexión neutra entre los componentes. Los enlazadores flexibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a GGSG, GGSGG, GSGSG, GSGGG, GGGSG, y GSSSG.
Los enlazadores flexibles adicionales incluyen polímeros de glicina (G)n o polímeros de glicina-serina (por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n y (GGGGS)n, donde n=1 a 50, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30­ 50). Los enlazadores flexibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a GGGS (SEQ ID NO: 40), GGGGS (SEQ ID NO: 41), GGSG (SEQ ID NO: 42), GGSGG (SEQ ID NO: 43), GSGSG (SEQ ID NO: 44), GSGGG (SEQ ID NO: 45), GGGSG (SEQ ID NO: 46), y GSSSG (SEQ ID NO: 47). Un multímero (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 o 30-50) de estas secuencias enlazadoras puede estar unido entre sí para proporcionar enlazadores flexibles que puedan ser usados para conjugar una secuencia de aminoácidos heteróloga a los polipéptidos descritos en esta invención. Tal como se describe en esta invención, la secuencia de aminoácidos heteróloga puede ser una secuencia de señalización y/o un socio de fusión, tal como albúmina, secuencia de Fc y similares.
Ejemplos de enlazadores incluyen, por ejemplo, (GGGGS)n, donde n es un entero de 1 a aproximadamente 10 (por ejemplo, n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10); GGGSGGGSIEGR (SEQ ID NO: 48); GGGGG (SEQ ID NO: 49); EGGGS (SEQ ID NO: 50).
En algunos casos, el enlazador puede ser un enlazador escindible, por ejemplo, un enlazador enzimáticamente escindible. En otros casos, el enlazador puede ser un enlazador no escindible, por ejemplo, un enlazador que no se escinde enzimáticamente en condiciones fisiológicas normales in vivo.
Por ejemplo, un enlazador proteolíticamente escindible puede incluir un sitio de escisión de metaloproteinasa de matriz (MMP), por ejemplo, un sitio de escisión para una MMP seleccionada de colagenasa-1, -2, y -3 (MMP-1, -8, y -13), gelatinasa A y B (MMP-2 y -9), estromelisina 1,2, y 3 (MMP-3, 10, y -11), matrilisina (MMP-7), y metaloproteinasas de membrana (MT1-MMP y MT2-MMP). La secuencia de escisión de m Mp -9 es Pro-X-X-Hy (donde, X representa un residuo arbitrario; Hy, un residuo hidrófobo), (SEQ ID NO: 51), por ejemplo, Pro-X-X-Hy-(Ser/Thr) (SEQ ID NO: 52), por ejemplo, Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr-Ser (SEQ ID NO: 53) o Pro-Leu/Gln-Gly-Met-Thr (SEq ID n O: 54). Otro ejemplo de un sitio de escisión de proteasa es un sitio de escisión activador de plasminógeno, por ejemplo, un sitio de escisión activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) o un sitio de escisión de activador de plasminógeno tisular (tPA). Los ejemplos específicos de secuencias de escisión de uPA y tPA incluyen secuencias que comprenden Val-Gly-Arg. Otro ejemplo es un sitio de escisión de trombina, por ejemplo, CGLVPAGSGP (SEQ ID NO: 55). Los enlazadores adecuados adicionales que comprenden sitios de escisión de proteasas incluyen enlazadores que comprenden una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos: 1); SLLKSRMVPNFN (SEQ ID NO: 56) o SLLIARRMPNFN (SEQ ID NO: 57), escindida por catepsina B; SKLVQASASGVN (SEQ ID NO: 58) o SSYLKASDAPDN (SEQ ID NO: 59), escindida por una proteasa del virus Epstein-Barr; RPk Pq QFFGLMN (SEQ ID NO: 60) escindida por MMP-3 (estromelisina); SLRPLALWRSFN (SEQ ID NO: 61) escindida por MMP-7 (matrilisina); SPQGIAGQRNFN (SEQ ID NO: 62) escindida por MMP-9; DVDERDVRGFASFL SEQ ID No : 63) escindida por una MMP de tipo termolisina; SLPLGLWAPNFN (SEQ ID NO: 64) escindida por metaloproteinasa de matriz 2(MMP-2); SLLIFRSWANFN (SEQ ID NO: 65) escindida por catepsina L; SGVVIATVIVIT (SEQ ID NO: 66) escindida por catepsina D; SLGPQGiWg QFN (SEQ iD NO: 67) escindida por metaloproteinasa de matriz 1(MMP-1); KKSPGRVVGGSV (SEQ ID NO: 68) escindida por activador del plasminógeno de tipo urocinasa; PQGLLGAPGILG (SEQ ID NO: 69) escindida por metaloproteinasa de matriz de membrana de tipo 1 (MT-MMP); HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT (SEQ ID NO: 70) escindida por estromelisina 3 (o MMP-11), termolisina, colagenasa de fibroblastos y estromelisina-1; GPQGLAGQRGIV (SEQ ID NO: 71) escindida por metaloproteinasa de matriz 13 (colagenasa-3); GGSGQRGRKALE (SEQ ID NO: 72) escindida por activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA); SLSALLSSDIFN (SEQ ID NO: 73) escindida por antígeno específico de próstata humano; SLPRFKIIGGFN (SEQ ID NO: 74) escindida por calicreína (hK3); SLLGIAVPGNFN (SEQ ID NO: 75) escindida por elastasa de neutrófilos; y FFKNIVTPRTPP (SEQ ID NO: 76) escindida por calpaína (proteasa neutra activada por calcio).
La figura 3 representa la secuencia de aminoácidos de dos proteínas de fusión M1 (SEQ ID NO: 77) y M2 (SEQ ID NO: 78) contempladas en esta invención. La proteína de fusión M1 incluye contiguamente desde el extremo N al extremo C, la secuencia señal de IgK (minúscula) fusionada a la secuencia de aminoácidos HSA fusionada con un enlazador (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 (Subrayado) al estremo N de GDF15 humano maduro (en negrita). La proteína de fusión M2 incluye contiguamente desde el extremo N al extremo C, la secuencia señal de IgK (minúscula) fusionada a la secuencia de aminoácidos HSA fusionada con un enlazador (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3 (subrayado) al extremo N de GDF15 humano maduro (en negrita) que contiene una deleción de 3 aminoácidos (AARN).
La figura 5 representa la secuencia de aminoácidos de dos proteínas de fusión M3 (SEQ ID NO: 79) y M4 (SEQ ID NO: 80) contempladas en esta invención. La proteína de fusión M3 incluye contiguamente desde el extremo N al extremo C, la secuencia señal de IgK (minúscula) fusionada a la secuencia de aminoácidos HSA fusionada con un enlazador (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 5 (subrayado) al extremo N de la secuencia de aminoácidos de GDF15 humano maduro (en negrita) que contiene una deleción de 3 aminoácidos (indicada AARN o AN3). La proteína de fusión M4 incluye contiguamente desde el extremo N al extremo C, la secuencia señal de IgK (minúscula) fusionada a la secuencia de aminoácidos HSA fusionada con un enlazador (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 5 (subrayado) al extremo N de la secuencia de aminoácidos del GDF15 humano maduro (en negrita) que contiene un truncamiento de 6 aminoácidos (AARNGDH) con respecto al extremo N del hGDF15 maduro.
La presente invención contempla también secuencias de ácidos nucleicos recombinantes que codifican las secuencias, polipéptidos y dímeros descritos en esta invención. En ciertos casos, el ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos en un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %,
97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, donde la secuencia de aminoácidos contigua tiene al menos uno de los siguientes pares de sustituciones con respecto a los aminoácidos correspondientes en la SEQ ID NO: 1:
i) D5T y R21N o D5S y R21N;
ii) R16N y H18T o R16N y H18S;
iii) S23N y E25T o S23N y E25S;
iv) S50N y F52T; S50N y F52S; F52N y A54T; o F52N y A54S;
v) Q51N y R53T; Q51N y R53S; R53N y A55T; o R53N y A55S;
vi) S64N y H66T; o S64N y H66S;
vii) K91N y D93T; K91N y D93S; D93N y G95T; o D93N y G95S;
viii) T94N y V96T; T94N y V96S; V96N y L98T; o V96N y L98S;
ix) S97N y Q99T; o S97N y Q99S; y
x) A106N y D108T o A106N y D108S;
en el que la sustitución crea uno o más sitios consenso de glicosilación unidos a N que tienen la secuencia NXS/T, donde N es Asn; X es un aminoácido distinto de prolina; seguido de Ser (S) o Thr (T) y además en el que uno o más sitios de consenso de glicosilación unidos a N, cuando se expresan, están unidos a un N-glicano. En una realización adicional, el ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido que cuando se expresa forma un dímero. En una realización adicional, el ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido que tiene truncamientos N-terminales y/o truncamientos C-terminales con respecto a la SEQ ID NO: 1. Los truncamientos pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14 o más aminoácidos con respecto a un polipéptido de referencia, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. En una realización específica, el ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido que tiene un truncamiento de los primeros tres residuos N-terminales en GDF15 (AARN o AN3). En casos particulares, la presente descripción contempla moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ
ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 30 o un aminoácido que difiere en hasta 5 aminoácidos; en el que dicho polipéptido, cuando se expresa, contiene al menos un sitio de N-glicosilación que está
N-glicosilado. En casos específicos, la presente descripción contempla moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: SEQ ID NO: 2, SEQ
ID NO: 4, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
NO: 18 o SEQ ID NO: 30 o un aminoácido que difiere en hasta 2 aminoácidos; en el que dicho polipéptido, cuando se expresa, contiene al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado. En casos particulares, el ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre: SEQ ID NO:
81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:
96, SEQ ID NO: 97 o SEQ ID NO: 100 o un aminoácido que difiere en hasta 5 aminoácidos; en el que dicho polipéptido, cuando se expresa, contiene al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado. En casos particulares, el ácido nucleico recombinante codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre:
SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID. NO: 92, SEQ ID. NO: 93,
SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97 o SEQ ID NO: 100 o un aminoácido que difiere en hasta 2 aminoácidos; en el que dicho polipéptido, cuando se expresa, contiene al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado. La presente descripción contempla también un procedimiento para preparar un homodímero GDF15 N-glicosilado modificado que comprende la etapa de expresar el ácido nucleico recombinante anterior en una célula de mamífero, por ejemplo, una célula CHO. La presente descripción abarca también un homodímero N-glicosilado de GDF15 modificado elaborado mediante el procedimiento anterior.
Además de las secuencias de aminoácidos específicas y las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en esta invención, la descripción contempla también polipéptidos y ácidos nucleicos que tienen secuencias que son al menos en un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % idénticas en secuencia a los aminoácidos y ácidos nucleicos. Los términos "idéntica" o "identidad" porcentual, en el contexto de dos o más secuencias de polinucleótidos, o dos o más secuencias de aminoácidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (por ejemplo, al menos en un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % idénticos en una región especificada), cuando se comparan y se alinean para obtener la correspondencia máxima sobre una región designada. La descripción contempla específicamente polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que son al menos en un
80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % idéntica en la secuencia a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2-35 o 77-97.
Procedimientos de producción de polipéptidos
Se puede producir un polipéptido de la presente descripción por cualquier procedimiento adecuado, que incluye procedimientos recombinantes y no recombinantes (por ejemplo, síntesis química).
A. Síntesis química
Cuando se sintetiza químicamente un polipéptido, la síntesis puede llevarse a cabo mediante una fase líquida o una fase sólida. La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) permite la incorporación de modificaciones en la estructura principal de aminoácidos y/o péptidos/proteínas no naturales. Diversas formas de SPPS, tales como Fmoc y Boc, están disponibles para sintetizar polipéptidos de la presente descripción. Los detalles de la síntesis química son conocidos en la técnica (por ejemplo, Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med. Chem. 6:3-10 y Camarero JA y col. 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8).
La síntesis de péptidos en fase sólida se puede realizar como se describe a continuación. Las funciones a (Na) y cualquier cadena lateral reactiva están protegidas con grupos lábiles a los ácidos o lábiles a las bases. Los grupos protectores son estables en las condiciones para unir enlaces amida, pero se pueden escindir fácilmente sin dañar la cadena peptídica que se ha formado. Los grupos protectores adecuados para la función a-amino incluyen, entre otros, los siguientes: t-butiloxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z), o-clorobenciloxicarbonilo, bi-fenilisopropiloxicarbonilo, terc-amiloxicarbonilo (Amoc), a, a-dimetil-3,5-dimetoxi-benciloxicarbonilo, o-nitrosulfenilo, 2-ciano-t-butoxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxocilohex-1-ilideno)etilo (Dde) y similares.
Los grupos protectores de cadena lateral adecuados incluyen, pero no se limitan a: acetilo, alilo (All), aliloxicarbonilo (Alloc), bencilo (Bzl), benciloxicarbonilo (Z), t-butiloxicarbonilo (Boc), benciloximetilo (Bom), o-bromobenciloxicarbonilo, t-butilo (tBu), t-butildimetilsililo, 2-clorobencilo, 2-clorobenciloxicarbonilo (2-CIZ), 2,6-diclorobencilo, ciclohexilo, ciclopentilo, 1-(4,4-dimetil-2,6 -dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde), isopropilo, 4-metoxi-2,3-6-trimetilbencilsulfonilo (Mtr), 2,3,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc), pivalilo, tetrahidropiran-2-ilo, tosilo (Tos), 2,4,6-trimetoxibencilo, trimetilsililo y tritilo (Trt).
En la síntesis en fase sólida, el aminoácido C-terminal se acopla a un material de soporte adecuado. Los materiales de soporte adecuados son aquellos que son inertes frente a los reactivos y las condiciones de reacción para las reacciones de condensación y escisión escalonadas del procedimiento de síntesis y que no se disuelven en los medios de reacción que se utilizan. Ejemplos de materiales de soporte disponibles comercialmente incluyen copolímeros de estireno/divinilbenceno que se han modificado con grupos reactivos y/o polietilenglicol; copolímeros de estireno/divinilbenceno clorometilados; copolímeros de estireno/divinilbenceno hidroximetilados o aminometilados y similares. Se puede utilizar poliestireno (1 %) - divinilbenceno o TentaGel (r) derivatizado con alcohol 4­ benciloxibencílico (ancla de Wang) o cloruro de 2-clorotritilo si se pretende preparar el ácido peptídico. En el caso del péptido amida, se puede usar poliestireno (1 %) divinilbenceno o TentaGel (r) derivatizado con ácido 5-(4'-aminometil)-3', 5'-dimetoxifenoxi) valérico (ancla PAL) o el grupo p-(2,4-dimetoxifenil-amino metil)-fenoxi (ancla de amida de Rink). El enlace al soporte polimérico se puede lograr haciendo reaccionar el aminoácido protegido con Fmoc C-terminal con el material de soporte con la adición de un reactivo de activación en etanol, acetonitrilo, N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano, tetrahidrofurano, N-metilpirrolidona o disolventes similares a temperatura ambiente o temperaturas elevadas (por ejemplo, entre 40 °C y 60 °C) y con tiempos de reacción de, por ejemplo, 2 a 72 horas.
El acoplamiento del aminoácido protegido en Na (por ejemplo, el aminoácido Fmoc) al ancla PAL, Wang o Rink puede realizarse, por ejemplo, con la ayuda de reactivos de acoplamiento tales como N,N'-diciclohexilcarbodiimida. (DCC), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DlC) u otras carbodiimidas, 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio tetrafluoroborato (TBTU) u otras sales de uronio, o-acilo-ureas, benzotriazol-1-il-Tris-pirrolidino-fosfonio hexafluorofosfato (PyBOP) u otras sales de fosfonio, N-hidroxisuccinimidas, otras N-hidroxiimidas u oximas en presencia o también en ausencia de 1-hidroxibenzotriazol o 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, por ejemplo, con la ayuda de TBTU con adición de hidroxibenzotriazol (HOBt), con o sin la adición de una base tal como, por ejemplo, diisopropiletilamina (DIEA), trietilamina o N-metilmorfolina, por ejemplo, diisopropiletilamina con tiempos de reacción de 2 a 72 horas (por ejemplo, 3 horas en un exceso de 1,5 a 3 veces del aminoácido y el reactivo de acoplamiento, por ejemplo, en un exceso de 2 veces y a temperaturas entre aproximadamente 10 °C y 50 °C, por ejemplo, 25 °C en un disolvente tal como dimetilformamida, N-metilpirrolidona o diclorometano, por ejemplo dimetilformamida).
En lugar de los reactivos de acoplamiento, también es posible usar los ésteres activos (por ejemplo, pentafluorofenilo, p-nitrofenilo o similares), el anhídrido simétrico del Na-Fmoc-aminoácido, su cloruro de ácido o fluoruro de ácido bajo las condiciones descritas anteriormente.
El aminoácido protegido con Na (por ejemplo, el aminoácido Fmoc) se puede acoplar a la resina de 2-clorotritilo en diclorometano con la adición de DIEA con tiempos de reacción de 10 a 120 minutos, por ejemplo, 20 minutos, pero no es limitado al uso de este disolvente y esta base.
El acoplamiento sucesivo de los aminoácidos protegidos se puede llevar a cabo de acuerdo con procedimientos convencionales en la síntesis de péptidos, típicamente en un sintetizador de péptidos automático. Después de la escisión del grupo protector Na-Fmoc del aminoácido acoplado en la fase sólida mediante tratamiento con, por ejemplo, piperidina (10 % a 50 %) en dimetilformamida durante 5 a 20 minutos, por ejemplo, 2 x 2 minutos con piperidina al 50 % en DMF y 1 x 15 minutos con piperidina al 20 % en DMF, el siguiente aminoácido protegido en un exceso de 3 a 10 veces, por ejemplo, en un exceso de 10 veces, se acopla al aminoácido anterior en un disolvente polar no acuoso, inerte tal como diclorometano, DMF o mezclas de los dos y a temperaturas entre aproximadamente 10 °C y 50 °C, por ejemplo, a 25 °C. Los reactivos mencionados anteriormente para acoplar el primer aminoácido Na-Fmoc al ancla PAL, Wang o Rink son adecuados como reactivos de acoplamiento. También se pueden utilizar como alternativa ésteres activos del aminoácido protegido, o cloruros o fluoruros o anhídridos simétricos de los mismos.
Al final de la síntesis en fase sólida, el péptido se escinde del material de soporte mientras se escinden simultáneamente los grupos protectores de la cadena lateral. La escisión se puede llevar a cabo con ácido trifluoroacético u otros medios fuertemente ácidos con la adición del 5 %-20 % V/V de depuradores tales como dimetilsulfuro, etilmetilsulfuro, tioanisol, tiocresol, m-cresol, anisol etanoditiol, fenol o agua, por ejemplo, 15 % v/v dimetilsulfuro/etanoditiol/m-cresol 1:1:1, dentro de 0,5 a 3 horas, por ejemplo, 2 horas. Los péptidos con cadenas laterales totalmente protegidas se obtienen escindiendo el ancla 2-clorotritilo con ácido acético glacial/trifluoroetanol/diclorometano 2:2:6. El péptido protegido se puede purificar mediante cromatografía en gel de sílice. Si el péptido se une a la fase sólida mediante el ancla de Wang y si se pretende obtener un péptido con una alquilamidación C-terminal, la escisión se puede realizar mediante aminólisis con una alquilamina o fluoroalquilamina. La aminólisis se lleva a cabo a temperaturas entre aproximadamente -10 °C y 50 °C (por ejemplo, aproximadamente 25 °C) y tiempos de reacción entre aproximadamente 12 y 24 horas (por ejemplo, aproximadamente 18 horas). Además, el péptido se puede escindir del soporte mediante reesterificación, por ejemplo, con metanol.
La solución ácida que se obtiene se puede mezclar con una cantidad de 3 a 20 veces de éter frío o n-hexano, por ejemplo, un exceso de 10 veces de éter dietílico, para precipitar el péptido y, por lo tanto, separar los depuradores y grupos protectores escindidos que permanecen en el éter. Puede llevarse a cabo una purificación adicional volviendo a precipitar el péptido varias veces en ácido acético glacial. El precipitado que se obtiene puede recogerse en agua o terc-butanol o mezclas de los dos disolventes, por ejemplo, una mezcla 1:1 de terc-butanol/agua, y liofilizarse.
El péptido obtenido se puede purificar mediante varios procedimientos cromatográficos, que incluyen intercambio iónico sobre una resina débilmente básica en forma de acetato; cromatografía de adsorción hidrófoba sobre copolímeros de poliestireno/divinilbenceno no derivatizados (por ejemplo, Amberlite(r) XAD); cromatografía de adsorción sobre gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo, sobre carboximetilcelulosa; cromatografía de distribución, por ejemplo, en Sephadex(r) G-25; cromatografía de distribución en contracorriente; o cromatografía líquida de alta presión (HpLC), por ejemplo, HPLC de fase inversa en fases de octilo u octadecilsililsilica (ODS).
B. Producción recombinante
Cuando se produce un polipéptido mediante el uso de técnicas recombinantes, el polipéptido se puede producir como una proteína intracelular o como una proteína secretada, usando cualquier construcción adecuada y cualquier célula huésped adecuada, que puede ser una célula procariota o eucariota, tal como una bacteria (por ejemplo, E. coli) o una célula huésped de levadura, respectivamente. Otros ejemplos de células eucariotas que pueden utilizarse como células huésped incluyen células de insectos, células de mamíferos y/o células vegetales. Cuando se utilizan células huésped de mamífero que pueden incluir células humanas (por ejemplo, células HeLa, 293, H9 y Jurkat), células de ratones (por ejemplo, NIH3T3, células L y células C127), células de primates (por ejemplo, Cos 1, Cos 7 y CV1) y células de hámster (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO)). En realizaciones específicas, el polipéptido se produce en células CHO. En otras realizaciones, el polipéptido se produce en una célula de levadura y en realizaciones particulares puede ser una célula de levadura manipulada genéticamente para producir glicoproteínas con N-glicanos de tipo mamífero.
Una variedad de sistemas de vector huésped adecuados para la expresión de un polipéptido se pueden emplear según procedimientos estándar conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989 Protocolos actuales en biología molecular, Cold Spring Harbor Press, Nueva York ; y Ausubel y col. 1995 Protocolos actuales en biología molecular, eds. Wiley and Sons. Los procedimientos para la introducción de material genético dentro de las células huésped incluyen, por ejemplo, los procedimientos de transformación, electroporación, conjugación, fosfato de calcio y similares. El procedimiento para transferir puede seleccionarse de tal forma que proporcione una expresión estable del ácido nucleico codificante de polipéptido introducido. El ácido nucleico codificante de polipéptido puede proporcionarse como un elemento episomal hereditario (por ejemplo, un plásmido) o integrarse de forma genómica. Se encuentran disponibles a nivel comercial diversos vectores adecuados para utilizar en la producción de un polipéptido de interés.
Los vectores pueden proporcionar mantenimiento extracromosómico en una célula huésped o pueden proporcionar integración en el genoma de la célula huésped. El vector de expresión proporciona secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, y puede proporcionar una expresión inducible o constitutiva donde la región codificante se encuentra unida de forma operativa bajo el control transcripcional de la región de inicio transcripcional y una región de terminación transcripcional y traduccional. En general, las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden incluir, de forma no limitativa, secuencias promotoras, sitios de unión ribosómicos, secuencias de inicio y detención transcripcionales, secuencias de inicios y detención traduccionales y secuencias potenciadoras o de activación. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles y pueden ser un promotor constitutivo fuerte (por ejemplo, T7).
Las construcciones de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes ubicados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de interés. Un marcador seleccionable operativo en el huésped de expresión puede estar presente para facilitar la selección de células que contienen el vector. Además, las construcciones de expresión pueden incluir elementos adicionales. Por ejemplo, el vector de expresión puede tener uno o dos sistemas de replicación, que le permiten, de esta manera, mantenerse en organismos, por ejemplo, en células de mamífero o insecto para la expresión y en un huésped procariota para la clonación y amplificación. Además, la construcción de expresión puede contener un gen marcador seleccionable para permitir la selección de células huésped transformadas. Los genes seleccionables son ampliamente conocidos en la técnica y variarán dependiendo de la célula huésped utilizada.
El aislamiento y la purificación de una proteína puede llevarse a cabo según procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una proteína se puede aislar a partir de un lisado de células modificadas genéticamente para expresar la proteína constitutivamente y/o después de la inducción; o de una mezcla de reacción sintética, mediante purificación por inmunoafinidad, que implica generalmente poner en contacto la muestra con un anticuerpo de anti-proteína, lavado para eliminar material no-específicamente unido, y eluyendo la proteína unida específicamente. Esta proteína aislada puede ser purificada adicionalmente mediante diálisis y otros procedimientos empleados normalmente en los procedimientos de purificación de proteínas. En una realización, la proteína puede aislarse usando procedimientos de cromatografía de quelato metálico. Las proteínas pueden contener modificaciones para facilitar el aislamiento.
Los polipéptidos pueden prepararse de forma sustancialmente pura o aislada (por ejemplo, libre de otros polipéptidos). Los polipéptidos pueden estar presentes en una composición que está enriquecida para los polipéptidos con respecto a otros componentes que pueden estar presentes (por ejemplo, otros polipéptidos u otros componentes de la célula huésped). Por ejemplo, se puede proporcionar un polipéptido purificado de modo que el polipéptido esté presente en una composición que esté sustancialmente libre de otras proteínas expresadas, por ejemplo, menos del 90 %, menos del 60 %, menos del 50 %, menos del 40 %, menos del 30 %, menos del 20 %, menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % de la composición está constituido por otras proteínas expresadas.
Anticuerpos
La presente descripción proporciona anticuerpos, que incluyen anticuerpos aislados que se unen específicamente a un polipéptido o proteína de fusión de la presente descripción. El término "anticuerpo" abarca anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de unión de anticuerpos que incluyen Fab y F(ab)'2, siempre que unan específicamente un polipéptido o proteína de fusión de la presente descripción. La unidad estructural básica del anticuerpo completo comprende un tetrámero, y cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. En cambio, la porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante que es la principal responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como kappa y lambda, mientras que las cadenas pesadas humanas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Los fragmentos de unión se producen por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, y anticuerpos de cadena única.
Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo, el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, e incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Todas las cadenas de anticuerpos presentan la misma estructura general de regiones marco relativamente conservadas (FR) unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones marco, permitiendo la unión a un epítope específico. Desde el N-terminal al C-terminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
Un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión y, excepto en los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son los mismos. Un anticuerpo biespecífico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de unión diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se pueden producir mediante una variedad de procedimientos que incluyen la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab'.
Como se expuso anteriormente, los fragmentos de unión pueden producirse por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. La digestión de anticuerpos con la enzima papaína resulta en dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, también conocidos como fragmentos "Fab", y un fragmento "Fc" que no tiene actividad de unión a antígeno. La digestión de anticuerpos con la enzima pepsina resulta en un fragmento F(ab')2 en el que los dos brazos de la molécula de anticuerpo permanecen unidos y comprenden sitios de unión de dos antígenos. El fragmento F(ab')2 tiene la capacidad de reticular antígeno.
Como se usa en esta invención, el término "Fab" se refiere a un fragmento de un anticuerpo que comprende regiones VH y VL, así como el dominio constante de la cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada.
Cuando se usa en esta invención, el término "Fv" se refiere al fragmento mínimo de un anticuerpo que retiene tanto el reconocimiento de antígeno como los sitios de unión a antígeno. En una especie Fv de cadena doble, esta región incluye un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en una asociación no covalente. En una especie Fv de cadena única, un dominio variable de cadena ligera y uno de cadena pesada pueden unirse covalentemente por un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligera y pesada puedan asociarse en una estructura "dimérica" análoga a aquella en una especie Fv de cadena doble. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Mientras que las seis CDR, , confieren colectivamente especificidad de unión de antígeno al anticuerpo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir un antígeno.
Cuando se usa en esta invención, el término "regiones de determinación de complementariedad" o "CDR" se refiere a partes de receptores inmunológicos que entran en contacto con un ligando específico y determinan su especificidad. El término "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende generalmente residuos de aminoácidos de una CDR y/o esos residuos de un "bucle hipervariable".
Como se usa en esta invención, el término "epítopo" se refiere a sitios de unión para anticuerpos en antígenos proteicos. Los determinantes epitópicos comprenden generalmente agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como cadenas laterales de azúcar o aminoácidos, así como características estructurales tridimensionales específicas y de carga. Se dice que un anticuerpo se une a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 pM, < 100 nM, o < 10 nM. Una constante de equilibrio aumentada ("Kd") significa que hay menos afinidad entre el epítopo y el anticuerpo, mientras que una constante de equilibrio disminuida significa que hay más afinidad entre el epítopo y el anticuerpo. Un anticuerpo con una Kd de "no más de" una cierta cantidad significa que el anticuerpo se unirá al epítopo con la Kd dada o con más fuerza. Mientras que Kd describe las características de unión de un epítopo y un anticuerpo, la "potencia" describe la efectividad del propio anticuerpo para una función del anticuerpo. No hay necesariamente una correlación entre una constante de equilibrio y potencia; así, por ejemplo, una Kd relativamente baja no significa automáticamente una alta potencia.
El término "se une selectivamente" en referencia a un anticuerpo no significa que el anticuerpo solo se une a una sola sustancia, sino que la Kd del anticuerpo a una primera sustancia es menor que la Kd del anticuerpo a una segunda sustancia. Un anticuerpo que se une exclusivamente a un epítopo solo se une a ese epítopo único.
Cuando se administran a humanos, los anticuerpos que contienen regiones variables y/o constantes de roedores (es decir, murinas o ratas) en ocasiones se asocian, por ejemplo, con una eliminación rápida del cuerpo o la generación de una respuesta inmune del cuerpo contra el anticuerpo. Con el fin de evitar la utilización de anticuerpos derivados de roedores, se pueden generar anticuerpos completamente humanos por medio de la introducción de la función de anticuerpos humanos en un roedor, de manera que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos. A menos que se identifique específicamente en esta invención, los anticuerpos "humanos" y "completamente humanos" se pueden usar indistintamente. El término "completamente humano" puede ser útil al distinguir anticuerpos que son solo parcialmente humanos de aquellos que son total o completamente humanos. El experto en la materia conoce varios procedimientos para generar anticuerpos completamente humanos.
Con el fin de abordar las posibles respuestas de anticuerpos antirratón humanos, se pueden utilizar anticuerpos quiméricos o de otro modo humanizados. Los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable murina y, como tales, pueden observarse respuestas del anticuerpo antiquimérico humano en algunos pacientes. Por lo tanto, es ventajoso proporcionar anticuerpos completamente humanos contra enzimas multiméricas con el fin de evitar posibles respuestas de un anticuerpo antirratón humano o de un anticuerpo antiquimérico humano.
Los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden prepararse, por ejemplo, mediante la generación de líneas celulares de hibridoma mediante técnicas conocidas por el experto en la materia. Otros procedimientos de preparación implican el uso de secuencias que codifican anticuerpos particulares para la transformación de una célula huésped de mamífero adecuada, tal como una célula CHO. La transformación podría realizarse mediante cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, envasar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o vector) o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica. Los procedimientos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del o los polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN dentro de los núcleos. Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión son ampliamente conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, células CHO, células HeLa y células de carcinoma hepatocelular humano.
Los anticuerpos se pueden usar para detectar un polipéptido de la presente descripción. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse como un diagnóstico al detectar el nivel de uno o más polipéptidos de la presente descripción en un sujeto y comparar el nivel detectado con respecto a un nivel de control estándar o con respecto a un nivel de punto de referencia en un sujeto determinado anteriormente (por ejemplo, antes de cualquier enfermedad).
Otra realización de la presente descripción implica el uso de uno o más anticuerpos de dominio humano (dAb). Los dAb son las unidades de unión funcionales más pequeñas de los anticuerpos humanos (IgG) y tienen características favorables de estabilidad y solubilidad. La tecnología implica un dAb conjugado con HSA (formando así un "AlbudAb"; véanse, por ejemplo, los documentos EP1517921B, WO2005/118642 y WO2006/051288) y una molécula de interés (por ejemplo, una secuencia polipeptídica de la presente descripción). Los AlbudAbs son a menudo más pequeños y más fáciles de fabricar en sistemas de expresión microbiana, tal como bacterias o levaduras, que las tecnologías actuales utilizadas para extender la vida media sérica de los polipéptidos. Como la HSA tiene una vida media de aproximadamente tres semanas, la molécula conjugada resultante mejora la vida media de la molécula de interés. El uso de la tecnología dAb también puede mejorar la eficacia de la molécula de interés.
Usos terapéuticos y profilácticos
La presente descripción proporciona procedimientos para tratar o prevenir enfermedades metabólicas y metabólicas asociadas, tales como la obesidad y otros trastornos del peso corporal, hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa y trastornos del metabolismo de la glucosa, mediante la administración de los polipéptidos, o composiciones de los mismos, como se describe en esta invención. Tales procedimientos también pueden tener un efecto ventajoso en uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o afección al, por ejemplo, disminuir la gravedad o la frecuencia de un síntoma. En realizaciones específicas, la presente descripción proporciona procedimientos para tratar un trastorno del metabolismo de la glucosa o del peso corporal mediante la administración de polipéptidos, dímeros N-glicosilados o composiciones de los mismos. En una realización particular, los procedimientos de la presente descripción para reducir la ingesta de alimentos o disminuir el peso corporal mediante la administración de los polipéptidos, dímeros N-glicosilados o composiciones de los mismos. La presente descripción proporciona además un uso de las secuencias anteriores, polipéptidos, dímeros N-glicosilados o composiciones de los mismos en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada entre enfermedades metabólicas y asociadas con el metabolismo, tales como obesidad y otros trastornos del peso corporal, hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa y trastornos del metabolismo de la glucosa. La presente descripción proporciona además un uso de las secuencias anteriores, polipéptidos, dímeros N-glicosilados o composiciones de los mismos en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un trastorno del metabolismo de la glucosa o del peso corporal. La presente descripción proporciona además un uso de las secuencias anteriores, polipéptidos, dímeros N-glicosilados o composiciones de los mismos en la fabricación de un medicamento para su uso en la reducción de la ingesta de alimentos o el peso corporal.
Con el fin de determinar si un sujeto puede ser candidato para el tratamiento o la prevención de un trastorno del peso corporal (por ejemplo, obesidad) mediante los procedimientos proporcionados en esta invención, se evaluarán parámetros tales como, entre otros, la etiología y el alcance de la afección del sujeto (por ejemplo, cómo se compara el sujeto con sobrepeso con el individuo sano de referencia). Por ejemplo, un adulto que tiene un IMC entre -25 y -29,9 kg/m2 puede considerarse sobrepeso (pre-obeso), mientras que un adulto con un IMC de -30 kg/m2 o más puede considerarse obeso. Como se trata en esta invención, los polipéptidos de la presente invención pueden efectuar la supresión del apetito, por ejemplo, disminuir el apetito que conduce a una reducción en el peso corporal.
Con el fin de determinar si un sujeto puede ser candidato para el tratamiento o la prevención de hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa y/o trastornos de la glucosa mediante los procedimientos proporcionados en esta invención, pueden utilizarse diversos procedimientos de diagnóstico conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen aquellos descritos en otra parte en esta invención (por ejemplo, evaluación de la glucosa en plasma en ayunas (FPG) y la prueba de tolerancia a la glucosa oral (oGTT)).
Los polipéptidos y las proteínas de fusión proporcionados en esta invención cuando se administran a un sujeto para tratar o prevenir enfermedades metabólicas y asociadas con el metabolismo, tales como obesidad y otros trastornos del peso corporal, hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, trastornos del metabolismo de la glucosa pueden conducir a una reducción en el nivel de glucosa en sangre, una reducción en el peso corporal y/o una reducción en la ingesta de alimentos.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos y las proteínas de fusión contemplados en esta invención pueden disminuir el nivel de glucosa en sangre, el peso corporal y/o la ingesta de alimentos en al menos un 5 % en comparación con la ausencia de administración de los polipéptidos o las proteínas de fusión. Por ejemplo, los polipéptidos y las proteínas de fusión contemplados en esta invención pueden disminuir el nivel de glucosa en sangre, el peso corporal y/o la ingesta de alimentos en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % en comparación con los anteriores al inicio del tratamiento o prevención.
Composiciones farmacéuticas
Los polipéptidos de la presente descripción pueden estar en forma de composiciones adecuadas para la administración a un sujeto. En general, tales composiciones son "composiciones farmacéuticas" que comprenden uno o más polipéptidos y uno o más diluyentes, vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables. En ciertas realizaciones, los polipéptidos están presentes en una cantidad terapéuticamente efectiva. Las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar en los procedimientos de la presente descripción; por lo tanto, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar ex vivo o in vivo a un sujeto para practicar los procedimientos y usos terapéuticos y profilácticos descritos en esta invención.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden formularse para que sean compatibles con el procedimiento o la vía de administración previstos; vías de administración ejemplares se exponen en esta invención. Además, las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar en combinación con otros agentes o compuestos activos terapéuticamente (por ejemplo, agentes de disminución de la glucosa) tal como se describe en esta invención para tratar o prevenir las enfermedades, trastornos y afecciones tal como se contemplan en la presente descripción.
Las composiciones farmacéuticas comprenden típicamente una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los polipéptidos contemplados por la presente descripción y uno o más agentes de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables. Los diluyentes, portadores o excipientes farmacéutica y fisiológicamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico y bisulfato sódico), conservantes (por ejemplo, alcohol bencílico, parabenos de metilo, etilo o n-propilo, p-hidroxibenzoato), agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes de dispersión, disolventes, rellenos, agentes de carga, detergentes, amortiguadores, vehículos, diluyentes y/o adyuvantes. Por ejemplo, un vehículo adecuado puede ser una solución salina fisiológica o solución salina amortiguada de citrato, complementada posiblemente con otros materiales comunes en las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral. Otros ejemplos de vehículos adicionales son una solución salina neutra amortiguada o una solución salina mezclada con albúmina de suero. Los expertos en la materia reconocerán rápidamente una variedad de amortiguadores que se podrían utilizan en composiciones farmacéuticas y formas de dosificación. Los amortiguadores incluyen típicamente, pero no se limitan a, ácidos débiles farmacéuticamente aceptables, bases débiles o mezclas de estos. Como ejemplo, los componentes amortiguadores pueden ser materiales solubles en agua tales como ácido fosfórico, ácidos tartáricos, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido acético, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido glutámico y sales de estos. Los agentes amortiguadores aceptables incluyen, por ejemplo, un amortiguador Tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal de sodio de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) y ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS).
Una vez que se haya formulado una composición farmacéutica, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, polvo sólido, deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones se pueden almacenar, ya sea en una forma lista para ser utilizada, una forma liofilizada que requiere reconstitución antes de ser utilizada, una forma líquida que requiere dilución antes de ser utilizada u otra forma aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se proporciona en un recipiente de un solo uso (por ejemplo, un vial, ampolla, jeringa o autoinyector de un solo uso (similar a, por ejemplo, un EpiPen®)), mientras que en otras realizaciones se proporciona un recipiente multiuso (por ejemplo, un vial multiuso). Se puede usar cualquier aparato de administración de fármacos para administrar los polipéptidos, incluidos los implantes (por ejemplo, bombas implantables) y los sistemas de catéteres, ambos bien conocidos por el experto en la materia. Las inyecciones de depósito, que generalmente se administran por vía subcutánea o intramuscular, también se pueden utilizar para liberar los polipéptidos descritos en esta invención durante un período de tiempo definido. Las inyecciones de depósito usualmente son a base de aceite o sólidos y generalmente comprenden al menos uno de los componentes de la formulación establecida en esta invención. Un experto en la materia está familiarizado con las formulaciones y usos posibles de inyecciones de depósito.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una suspensión acuosa u oleagenosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede formular según la técnica conocida con agentes de suspensión y agentes humectantes o dispersantes adecuados mencionados en esta invención. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, una solución en 1,3-butanodiol. Los diluyentes, disolventes y medio de dispersión aceptables que se pueden emplear incluyen agua, solución de Ringer, solución de cloruro de sodio isotónico, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS), etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. Además, se emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como un disolvente o medio de suspensión. Con este propósito, se puede emplear cualquier aceite no volátil insípido, inclusive mono o diglicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables también se pueden utilizar ácidos grasos tales como el ácido oleico. La absorción prolongada de formulaciones inyectables particulares se puede lograr al incluir un agente de retraso de la absorción (por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina).
Las composiciones farmacéuticas que contienen el ingrediente activo (por ejemplo, polipéptidos de la presente descripción) pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como comprimidos, cápsulas, píldoras, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes, soluciones, microperlas o elixires. Las composiciones farmacéuticas previstas para uso oral se pueden preparar según cualquier procedimiento conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes tales como, por ejemplo, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservantes para proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables. Los comprimidos, cápsulas y similares contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio, agentes desintegrantes y de granulación, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico, agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina, o acacia y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Los comprimidos, cápsulas y similares adecuados para la administración por vía oral pueden no recubrirse o recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y de ese modo proporcionar una acción sostenida. Por ejemplo, se puede emplear un material de retardo de tiempo tal como el monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. También se pueden recubrir mediante técnicas conocidas en la materia para formar comprimidos terapéuticos osmóticos para la liberación controlada. Los agentes adicionales incluyen partículas biodegradables o biocompatibles o una sustancia polimérica tal como poliésteres, ácidos de poliamina, hidrogel, polivinilpirrolidona, polianhídridos, ácido poliglicólico, etilenvinilacetato, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina, o lactida/copolímeros de glicólido, copolímeros de polilactida/glicólido, copolímero de etilenvinilacetato para controlar la administración de una composición administrada. Por ejemplo, el agente oral se puede atrapar en microcápsulas preparadas mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, mediante el uso de microcápsulas de gelatina o hidroximetilcelulosa o microcápsulas de poli(metilmetacrolato), respectivamente, en un sistema de administración de fármacos coloidales. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, microperlas y sistemas a base de lípidos, que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mezcladas y liposomas. Los procedimientos para preparar liposomas se describen en, por ejemplo, los documentos de patente de EE.UU. n. ° 4.235.871, 4.501.728, y 4.837.028. Los procedimientos para la preparación de las formulaciones mencionadas anteriormente serán evidentes para los expertos en la materia.
Las formulaciones para uso oral pueden presentarse también como cápsulas de gelatina duras donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio, caolín o celulosa microcristalina, o como cápsulas de gelatina blandas donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de maní, parafina líquida o aceite de oliva.
Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de los mismos. Tales excipientes pueden ser agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia, y agentes dispersantes o humectantes, por ejemplo un fosfátido de origen natural (por ejemplo, lecitina), o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos (por ejemplo, polioxietilenestearato), o productos de condensación de óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga (por ejemplo, heptadecaetileno oxicetanol), o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol (por ejemplo, monooleato de polioxietileno sorbitol), o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol (por ejemplo, monooleato de polietileno sorbitán). Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes.
Las suspensiones de aceite pueden formularse suspendiendo el ingrediente activo en un aceite vegetal, por ejemplo, el aceite de cacahuete (arachis), el aceite de oliva, el aceite de sésamo o el aceite de coco, o en un aceite mineral tal como la parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo, cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden agregar agentes edulcorantes tales como los establecidos anteriormente, y agentes saborizantes, para proporcionar una preparación oral agradable al paladar.
Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservantes. Los agentes dispersantes o humectantes y los agentes de suspensión adecuados se ejemplifican en esta invención.
Las composiciones farmacéuticas de la presente descripción también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo, aceite de oliva o aceite de cacahuete (arachis), un aceite mineral, por ejemplo, parafina líquida o mezclas de estos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo, goma acacia o goma tragacanto; fosfátidos de origen natural, por ejemplo, semillas de soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos; anhídridos de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán; y productos de condensación de los ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo, monooleato de polioxietileno sorbitán.
Las formulaciones también pueden incluir vehículos para proteger la composición contra la degradación o eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, liposomas, hidrogeles, profármacos y sistemas de administración microencapsulados. Por ejemplo, se puede emplear un material de retardo de tiempo tal como monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo solos, o en combinación con una cera.
La presente descripción contempla la administración de los polipéptidos en forma de supositorios para la administración rectal del fármaco. Los supositorios se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperaturas normales, pero líquido a temperatura rectal y, por lo tanto, se disuelve en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen, pero no se limitan a, manteca de cacao y polietilenglicoles. Los polipéptidos contemplados por la presente descripción pueden estar en forma de cualquier otra composición farmacéutica adecuada (por ejemplo, aerosoles para uso nasal o por inhalación) actualmente conocida o desarrollada en el futuro.
La concentración de un polipéptido o fragmento del mismo en una formulación puede variar ampliamente (por ejemplo, de menos de aproximadamente el 0,1 %, usualmente a o al menos aproximadamente el 2 % a hasta el 20 % al 50 % o más en peso) y usualmente se seleccionarán principalmente en función de los volúmenes de fluido, las viscosidades y los factores basados en el paciente según el modo particular de administración seleccionado.
En esta invención se contempla el uso de la tecnología de administración en depósito de Nano Precision Medical (Nano Precision Medical; Emeryville, CA). La tecnología utiliza una membrana de nanotubos de titanio que produce velocidad de liberación de orden cero de macromoléculas, tales como terapéuticos de proteínas y péptidos. La membrana biocompatible se aloja en un pequeño implante subcutáneo que proporciona la administración de macromoléculas terapéuticas a velocidad constante a largo plazo (por ejemplo, hasta un año). La tecnología actualmente está siendo evaluada para la administración de agonistas GLP-1 para el tratamiento de diabetes de tipo II. En ciertas realizaciones, los polipéptidos descritos en esta invención pueden ser una formulación con una membrana. Por ejemplo, el polipéptido puede estar impregnado en la membrana o rodeado por la membrana. La membrana puede tener forma de disco, tubo o esfera. En determinadas realizaciones, el tubo puede ser un nanotubo o la esfera puede ser una nanoesfera.
En algunas realizaciones, los polipéptidos descritos en esta invención pueden administrarse a un sujeto usando un sistema de administración corporal que puede fijarse al paciente y puede administrar una dosis predeterminada del polipéptido al paciente. Los sistemas de administración corporal ejemplares incluyen parches o bombas. En ciertos casos, se pueden usar sistemas de administración corporal tales como los inyectores corporales usados para administrar Neulasta (r) para administrar los polipéptidos descritos en esta invención. En otras realizaciones, se pueden usar bombas osmóticas, tales como bombas osmóticas implantables (por ejemplo, bomba DUROS (r) o bomba osmótica ALZET (r)) para administrar un polipéptido descrito en esta invención a un paciente.
Vías de administración
La presente descripción contempla la administración de los polipéptidos descritos, y sus composiciones, de cualquier manera apropiada. Las vías de administración adecuadas incluyen la vía parenteral (por ejemplo, intramuscular, intravenosa, subcutánea (por ejemplo, inyección o implante), intraperitoneal, intracisternal, intraarticular, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal) e intracerebroventricular), oral, nasal, vaginal, sublingual, intraocular, rectal, tópica (por ejemplo, transdérmica), sublingual e inhalación.
Las inyecciones de depósito, que generalmente se administran por vía subcutánea o intramuscular, también se pueden utilizar para liberar los polipéptidos descritos en esta invención durante un período de tiempo definido. Las inyecciones de depósito usualmente son a base de aceite o sólidos y generalmente comprenden al menos uno de los componentes de la formulación establecida en esta invención. Un experto en la materia está familiarizado con las formulaciones y usos posibles de inyecciones de depósito.
Con respecto a los anticuerpos, en una realización ejemplar, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente descripción se almacena a 10 mg/ml en solución salina acuosa isotónica estéril para inyección a 4 °C y se diluye en 100 ml o 200 ml de cloruro de sodio al 0,9 % para inyección antes de la administración al sujeto. El anticuerpo se administra mediante infusión intravenosa durante el curso de 1 hora a una dosis de entre 0,2 y 10 mg/kg. En otras realizaciones, el anticuerpo se administra mediante infusión intravenosa durante un período de entre 15 minutos y 2 horas. En aun otras realizaciones, el procedimiento de administración es mediante inyección de bolo subcutánea.
La presente descripción contempla procedimientos donde el polipéptido o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente descripción se administran a un sujeto al menos dos veces al día, al menos una vez al día, al menos una vez cada 48 horas, al menos una vez cada 72 horas, al menos una vez a la semana, al menos una vez cada 2 semanas, al menos una vez al mes, al menos una vez cada dos meses o al menos una vez cada tres meses o con menor frecuencia.
Terapia de combinación
La presente descripción contempla el uso de los polipéptidos en combinación con uno o más agentes terapéuticos activos u otras modalidades profilácticas o terapéuticas. En tal terapia de combinación, los diversos agentes activos tienen frecuentemente diferentes mecanismos de acción. Tal terapia de combinación puede ser especialmente ventajosa al permitir una reducción de la dosis de uno o más de los agentes, reduciendo o eliminando de este modo los efectos adversos asociados con uno o más de los agentes; además, tal terapia de combinación puede tener un efecto profiláctico o terapéutico sinérgico en la enfermedad, trastorno o afección subyacente.
Como se usa en esta invención, "combinación" pretende incluir terapias que pueden administrarse por separado, por ejemplo, formuladas por separado para una administración separada (por ejemplo, como se puede proporcionar en un kit), y terapias que pueden administrarse juntas en una sola formulación (es decir, una "co-formulación").
En ciertas realizaciones, los polipéptidos se administran o aplican secuencialmente, por ejemplo, cuando un agente se administra antes que uno o más agentes. En otras realizaciones, los polipéptidos se administran simultáneamente, por ejemplo, cuando dos o más agentes se administran aproximadamente o al mismo tiempo; los dos o más agentes pueden estar presentes en dos o más formulaciones separadas o combinarse en una sola formulación (es decir, una co-formulación). Independientemente de si los dos o más agentes se administran de forma secuencial o simultánea, se considera que son administrados en combinación para los fines de la presente descripción.
Los polipéptidos de la presente descripción se pueden usar en combinación con otros agentes útiles en el tratamiento, prevención, supresión o mejora de las enfermedades, trastornos o afecciones establecidos en esta invención, incluidos los que normalmente se administran a sujetos que padecen obesidad, trastorno alimentario, hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa y otros trastornos del metabolismo de la glucosa.
La presente descripción contempla la terapia de combinación con numerosos agentes (y clases de los mismos), que incluyen 1) insulina, miméticos de insulina y agentes que implican la estimulación de la secreción de insulina, incluidas sulfonilureas (por ejemplo, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, tolbutamida, gliburida, glimepirida, glipizida) y meglitinidas (por ejemplo, mitiglinida, repaglinida (PRANDIN) y nateglinida (STARLIX)); 2) biguanidas (por ejemplo, metformina (GLUCOPHAGE)) y sus sales farmacéuticamente aceptables, en particular, hidrocloruro de metformina, y sus formulaciones de liberación prolongada, tal como Glumetza™, Fortamet™ y GlucophageXR™) y otros agentes que actúan promoviendo la utilización de glucosa, reduciendo la producción de glucosa hepática y/o disminuyendo la producción de glucosa intestinal; 3) inhibidores de la alfa-glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, voglibosa y miglitol) y otros agentes que ralentizan la digestión de carbohidratos y, en consecuencia, la absorción intestinal y reducen la hiperglucemia postprandial; 4) tiazolidinedionas (por ejemplo, rosiglitazona (AVANDIA), troglitazona (REZULIN), pioglitazona (ACTOS), glipizida, balaglitazona, rivoglitazona, netoglitazona, AMG 131, MBX2044, mitoglitazona, lobeglitazona, IDR-105, troglitazona, englitazona, ciglitazona, adaglitazona, darglitazona que mejora la acción de la insulina (por ejemplo, mediante la sensibilización a la insulina) incluyendo insulina y miméticos de la insulina (por ejemplo, insulina degludec, insulina glargina, insulina lispro, insulina detemir, insulina glulisina y formulaciones inhalables de cada uno), promoviendo así la utilización de glucosa en los tejidos periféricos; 5) péptidos similares al glucagón, incluidos los inhibidores de DPP-IV (por ejemplo, alogliptina, omarigliptina, linagliptina, vildagliptina (GALVUS) y sitagliptina (JANUVIA)) y péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) y agonistas y análogos de GLP-1 (por ejemplo, exenatida (BYETTA e ITCA 650 (una bomba osmótica insertada por vía subcutánea que administra un análogo de exenatida durante un período de 12 meses; Intarcia, Boston, mA)) y agonistas del receptor GLP-1 (por ejemplo, dulaglutida, semaglutida, albiglutida, exenatida, liraglutida, lixisenatida, taspoglutida, CJC-1131 y BIM-51077, incluidas sus formulaciones intranasales, transdérmicas y una vez a la semana); 6) y análogos resistentes a DPP-IV (miméticos incretina), agonistas gamma PPAR, agonistas alfa PPAR tales como derivados del ácido fenofíbrico (por ejemplo, gemfibrozilo, clofibrato, ciprofibrato, fenofibrato, bezafibrato), agonistas PPAR de doble acción (por ejemplo, ZYH2, ZYH1, GFT505, chiglitazar, muraglitazar, aleglitazar, sodelglitazar y naveglitazar), agonistas de PPAr de acción panorámica, inhibidores de PTP1B (por ejemplo, ISIS-113715 y TTP814), inhibidores de SGLT (por ejemplo, ASP1941, SGLT-3, empagliflozin, dapagliflozin, dapagliflozin, canagliflozin , BI-10773, PF-04971729, remogloflozina, TS-071, tofogliflozina, ipragliflozina y LX-4211), secretagogos de insulina, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (por ejemplo, alacepril, benazepril, captopril, ceronapril, cilazapril, delapril, enalapril, enalaprilat, fosinopril, imidapril, lisinopril, moveltipril, perindopril, quinapril, ramipril, spirapril, temocapril o trandolapril), antagonistas de los receptores de angiotensina II (por ejemplo, losartán, es decir, COZAAR®, valsartán, candesartán, olmesartán, telmesartán y cualquiera de estos fármacos utilizados en combinación con hidroclorotiazida tal como HYZAAR®) u otros fármacos antihipertensivos tales como LCZ 696, agonistas de RXR, inhibidores de la glucógeno sintasa quinasa 3, inmunomoduladores, simpaticolíticos, beta bloqueadores adrenérgicos (por ejemplo, propranolol, atenolol, bisoprolol, carvedilol , metoprolol o tartato de metoprolol), fármacos bloqueantes alfa adrenérgicos (por ejemplo, doxazocina, prazocina o alfa metildopa) agonistas alfa adrenérgicos centrales, vasodilatadores periféricos (por ejemplo, hidralazina); agonistas del receptor adrenérgico beta-3, inhibidores de 11beta-HSD1, inhibidores de endopeptidasa neutra (por ejemplo, tiorfano y fosforamidón), antagonistas de la aldosterona, inhibidores de la aldosterona sintasa, inhibidores de la renina (por ejemplo, derivados de urea de di y tripéptidos (véase el documento de patente de EE.UU. n. ° 5.116.835), aminoácidos y derivados (patentes de EE.UU. 5.095.119 y 5.104.869), cadenas de aminoácidos unidas por enlaces no peptídicos (patente de EE.UU. 5.114.937), derivados de di y tri-péptidos (patente de EE.UU. 5.106.835), peptidil amino dioles (patentes de EE.UU. 5.063.208 y 4.845.079) y peptidil beta-aminoacil aminodiol carbamatos (patente de EE.UU. 5.089.471); también, una variedad de otros análogos de péptidos como se describe a continuación patentes de EE.UU. 5.071.837; 5.064.965; 5.063.207; 5.036.054; 5.036.053; 5.034.512 y 4.894.437, e inhibidores de renina de molécula pequeña (incluyendo diol sulfonamidas y sulfinilos) (patente de EE.Uu .5.098.924), derivados de N-morfolino (patente de EE.UU. 5.055.466), alcoholes N-heterocíclicos (patente de EE.UU. 4.885.292) y pirolimidazolonas (patente de EE.UU. 5.075.451); también, derivados de pepstatina (patente de EE.UU. 4.980.283) y derivados de fluoro y cloro de péptidos que contienen estatona (patente de EE.UU. 5.066.643), enalkrein, RO 42-5892, A 65317, CP 80794, ES 1005, ES 8891, SQ 34017, aliskiren (2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(2-carbamoil-2-metilpropil) -5-amino-4-hidroxi-2,7-diisopropil-8-[4-metoxi-3-(3-metoxipropoxi) -fenil] -octanamid hemifumarato) SPP600, SPp630 y SPP635), antagonistas del receptor de endotelina, inhibidores de la fosfodiesterasa-5 (por ejemplo, sildenafil, tadalafil y vardenafil), vasodilatadores, bloqueadores de los canales de calcio (por ejemplo, amlodipino, nifedipino, veraparmilo, diltiazem, gallopamilo, niludipino, nimodipinas, nicardipino), activadores de los canales de potasio (por ejemplo, nicorandil, pinacidil, cromakalim, minoxidil, aprilkalim, loprazolam), agentes reductores de lípidos, por ejemplo, inhibidores de la HMG-CoA reductasa tales como simvastatina y lovastatina, que se comercializan como ZOCOR® y MEVACOR® en forma de profármacos de lactona y funcionan como inhibidores después de la administración, y sales farmacéuticamente aceptables de inhibidores de la reductasa HMG-CoA de ácido de anillo abierto dihidroxi tales como la atorvastatina (particularmente la sal de calcio vendida en LIPITOR®), rosuvastatina (particularmente la sal de calcio vendida en CRESTOR®), pravastatina (particularmente la sal de sodio vendida en PRAVACHOL®), cerivastatina y fluvastatina (particularmente la sal de sodio vendida en LESCOL®); un inhibidor de la absorción de colesterol tal como ezetimiba (ZETIA®) y ezetimiba en combinación con cualquier otro agente de reducción de lípidos tal como los inhibidores de la HMG-CoA reductasa mencionados anteriormente y particularmente con simvastatina (VYTORIN®) o con atorvastatina cálcica; fármacos que aumentan el HDL, (por ejemplo, agonistas de los receptores de niacina y ácido nicotínico, y versiones de liberación prolongada o controlada de los mismos, y/o con un inhibidor de la HMG-CoA reductasa; agonistas del receptor de niacina tales como acipimox y acifran, así como agonistas parciales del receptor de niacina; antagonistas del receptor de glucagón (por ejemplo, MK-3577, MK-0893, LY-2409021 y KT6-971); agentes secuestrantes de ácidos biliares (por ejemplo, colestilan, colestimida, clorhidrato de colesevalam, colestipol, colestiramina y derivados de dialquilaminoalquilo de un dextrano reticulado), acilo CoA: inhibidores de colesterol aciltransferasa (por ejemplo, avasimibe); agentes destinados a su uso en afecciones inflamatorias, tales como aspirina, fármacos antiinflamatorios no esteroideos o AINE, glucocorticoides e inhibidores selectivos de la ciclooxigenasa-2 o COX-2; activadores de glucoquinasa (GKA) (por ejemplo, AZD6370); inhibidores de la 11p-hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo 1 (por ejemplo, como los descritos en la patente de EE.UU. n. ° 6.730.690, y LY-2523199); inhibidores de CETp (por ejemplo, anacetrapib, evacetrapib y torcetrapib); inhibidores de la fructosa 1,6-bisfosfatasa (por ejemplo, tal como los descritos en las patentes de EE.UU. n. ° 6.054.587; 6.110.903; 6.284.748; 6.399.782; y 6.489.476); inhibidores de acetil CoA carboxilasa-1 o 2 (ACC1 o ACC2); inhibidores de PCSK9; agonistas parciales de GPR-40; moduladores de SCD; inhibidores de la ácido graso sintasa; amilina y análogos de amilina (por ejemplo, pramlintida); incluyendo formas de sal farmacéuticamente aceptables de los agentes activos anteriores donde sea químicamente posible.
Además, la presente descripción contempla la terapia de combinación con agentes y procedimientos para promover la pérdida de peso, tales como agentes que estimulan el metabolismo o disminuyen el apetito, y dietas y/o regímenes de ejercicio modificados para promover la pérdida de peso.
Los polipéptidos de la presente descripción pueden usarse en combinación con uno o más agentes de cualquier manera apropiada bajo las circunstancias. En una realización, el tratamiento con al menos un agente activo y al menos un polipéptido de la presente descripción se mantiene durante un período de tiempo. En otra realización, el tratamiento con el al menos un agente activo se reduce o interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), mientras que el tratamiento con un polipéptido(s) de la presente descripción se mantiene a un régimen de dosificación constante. En una realización adicional, el tratamiento con al menos un agente activo se reduce o se interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), mientras que el tratamiento con el(los) polipéptido(s) de la presente descripción se reduce (por ejemplo, dosis más baja, dosificación menos frecuente o régimen de tratamiento más corto). En otra realización más, el tratamiento con al menos un agente activo se reduce o interrumpe (por ejemplo, cuando el sujeto está estable), y el tratamiento con el polipéptido(s) de la presente descripción aumenta (por ejemplo, dosis más alta, dosificación más frecuente o régimen de tratamiento más prolongado). En otra realización más, el tratamiento con al menos un agente activo se mantiene y el tratamiento con el(los) polipéptido(s) de la presente descripción se reduce o interrumpe (por ejemplo, dosis más baja, dosificación menos frecuente o régimen de tratamiento más corto). En otra realización más, el tratamiento con al menos un agente activo y el tratamiento con el(los) polipéptido(s) de la presente descripción se reduce o interrumpe (por ejemplo, dosis más baja, dosificación menos frecuente o régimen de tratamiento más corto).
Dosificación
Los polipéptidos de la presente descripción pueden administrarse a un sujeto en una cantidad que depende, por ejemplo, del objetivo de la administración (por ejemplo, el grado de resolución deseado); la edad, peso, sexo y estado físico y de salud del sujeto que se va a tratar; la naturaleza del polipéptido y/o la formulación que se administra; la vía de administración; y la naturaleza de la enfermedad, trastorno, afección o síntoma de la misma (por ejemplo, la gravedad de la desregulación de glucosa/insulina y la etapa del trastorno). El régimen de dosificación también puede tener en consideración la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto adverso asociado con el o los agentes que se administran. Las cantidades de dosificación y regímenes de dosificación eficaces pueden determinarse fácilmente, por ejemplo, a partir de ensayos de seguridad y aumento de dosis, estudios in vivo (por ejemplo, modelos animales) y otros procedimientos conocidos por el experto en la materia.
En general, los parámetros de dosificación dictan que la cantidad de dosificación sea menor que una cantidad que podría ser irreversiblemente tóxica para el sujeto (es decir, la dosis máxima tolerada, "MTD") y no menor que la cantidad requerida para producir un efecto medible en el sujeto. Tales cantidades se determinan, por ejemplo, por los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos asociados con la absorción, distribución, metabolismo y excreción ("ADME"), teniendo en cuenta la vía de administración y otros factores.
Una dosis efectiva (ED) es la dosis o cantidad de un agente que produce una respuesta terapéutica o efecto deseado en alguna fracción de los sujetos que la toman. La "dosis efectiva media" o ED50 de un agente es la dosis o cantidad de un agente que produce una respuesta terapéutica o efecto deseado en el 50 % de la población a la que se administra. Aunque la ED50 se usa comúnmente como una medida de expectativa razonable del efecto de un agente, no es necesariamente la dosis que un clínico pueda considerar apropiada teniendo en cuenta todos los factores relevantes. Por lo tanto, en algunas situaciones la cantidad efectiva es más que la ED50 calculada, en otras situaciones la cantidad efectiva es menor que la ED50 calculada, y en aun otras situaciones la cantidad efectiva es la misma que la ED50 calculada.
Además, una dosis efectiva de los polipéptidos de la presente descripción puede ser una cantidad que, cuando se administra en una o más dosis a un sujeto, produce un resultado deseado en relación con un sujeto sano. Por ejemplo, una dosis efectiva puede ser una que, cuando se administra a un sujeto que tiene glucosa en plasma y/o insulina elevada en plasma, alcanza una reducción deseada con relación a aquella de un sujeto sano en al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, o más del 80 %. Un nivel de dosificación apropiado generalmente será de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal del paciente por día, que puede administrarse en dosis únicas o múltiples. En algunas realizaciones, el nivel de dosificación será aproximadamente de 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg por día y en otras realizaciones aproximadamente de 0,05 a aproximadamente 10 mg/kg por día. Un nivel de dosificación adecuado puede ser aproximadamente de 0,01 a 25 mg/kg por día, aproximadamente de 0,05 a 10 mg/kg por día o aproximadamente de 0,1 a 5 mg/kg por día. Dentro de este intervalo, la dosificación puede ser de 0,005 a 0,05, 0,05 a 0,5 o 0,5 a 5,0 mg/kg por día.
Para la administración de un agente oral, las composiciones se pueden proporcionar en forma de comprimidos, cápsulas y similares que contienen de 1,0 a 1.000 miligramos del ingrediente activo, particularmente 1,0, 3,0, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 50,0, 75,0, 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0, 400,0, 500,0, 600,0, 750,0, 800,0, 900,0 y 1000,0 miligramos del ingrediente activo. El(los) polipéptido(s) puede(n) administrarse en un régimen de, por ejemplo, 1 a 4 veces por día, y con frecuencia una o dos veces por día.
La dosificación del(de los) polipéptido(s) de la presente descripción puede repetirse a una frecuencia apropiada, que puede estar en el intervalo de una vez al día a una vez cada tres meses, dependiendo de la farmacocinética del polipéptido (por ejemplo, vida media) y la respuesta farmacodinámica (por ejemplo, la duración del efecto terapéutico del polipéptido). En algunas realizaciones, la dosificación se repite con frecuencia entre una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes. En otras realizaciones, el polipéptido se administra aproximadamente una vez al mes.
En ciertas realizaciones, la dosificación del polipéptido descrito está contenida en una "forma de dosificación unitaria". La frase "forma de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un polipéptido de la presente descripción, ya sea solo o en combinación con uno o más agentes adicionales, suficientes para producir el efecto deseado. Se comprenderá que los parámetros de una forma de dosificación unitaria dependerán del agente particular y el efecto que se desee lograr.
Kits
La presente descripción contempla también kits que comprenden los polipéptidos descritos y sus composiciones farmacéuticas. Los kits tienen generalmente la forma de una estructura física que aloja varios componentes, como se describe a continuación, y pueden utilizarse, por ejemplo, para practicar los procedimientos descritos anteriormente (por ejemplo, administración de un polipéptido a un sujeto que necesita reducción de peso).
Un kit puede incluir uno o más de los polipéptidos descritos en esta invención (proporcionados, por ejemplo, en un recipiente estéril), que puede estar en forma de una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. El(los) polipéptido(s) se pueden proporcionar en una forma que esté lista para su uso o en una forma que requiera, por ejemplo, reconstitución o dilución antes de la administración. Cuando el(los) polipéptido(s) está(n) en una forma que necesita ser reconstituida por un usuario, el kit también puede incluir amortiguadores, excipientes farmacéuticamente aceptables y similares, envasados con o por separado del(de los) polipéptido(s). Cuando se contempla la terapia de combinación, el kit puede contener los varios agentes de forma separada o pueden estar ya combinados en el kit. Cada componente del kit puede estar incluido dentro de un recipiente individual y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de un solo paquete. Se puede designar un kit de la presente descripción para las condiciones necesarias para mantener de forma apropiada los componentes alojados allí dentro (por ejemplo, refrigeración o congelamiento).
Un kit puede contener una etiqueta o un prospecto que incluya información de identificación de los componentes que contiene e instrucciones para su uso (por ejemplo, parámetros de dosificación, farmacología clínica del ingrediente o ingredientes activos, incluido el mecanismo de acción, farmacocinética y farmacodinámica, efectos adversos, contraindicaciones, etc.). Las etiquetas o prospectos pueden incluir información del fabricante tal como el número de lote y fechas de caducidad. La etiqueta o prospecto puede, por ejemplo, integrarse en la estructura física que aloja los componentes, contenidos por separado dentro de la estructura física, o fijados a un componente del kit (por ejemplo, una ampolla, tubo o vial). Las instrucciones de ejemplo incluyen aquellas para reducir o disminuir la glucosa en sangre, el tratamiento de hiperglucemia, tratamiento de la diabetes, etc., con los moduladores descritos y las composiciones farmacéuticas de estos.
Las etiquetas o los prospectos pueden incluir adicionalmente, o incorporarse a, un medio legible por ordenador, tal como un disco (por ejemplo, disco duro, tarjeta, disco de memoria), disco óptico tal como CD- o DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, cinta magnética, o un medio de almacenamiento eléctrico tal como RAM y ROM o híbridos de estos tal como medios de almacenamiento magnético/óptico, medios FLASH o tarjetas de memoria. En algunas realizaciones, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se proporcionan los medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, por ejemplo, a través de Internet.
EXPERIMENTACIÓN
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a aquellos expertos habituales en la materia una divulgación y descripción completas sobre cómo preparar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales.
A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura se encuentra en grados Celsius (°C) y la presión es igual o cercana a la atmosférica. Se utilizan abreviaturas estándar, incluidas las siguientes: bp = par(es) de base; kb = kilobase(s); pl = picolitro(s); s o seg = segundo(s); min = minuto(s); h o hr = hora(s); aa = aminoácido(s); kb = kilobase(s); nt = nucleótido(s); ng = nanogramo; |jg = microgramo; mg = miligramo; g = gramo; kg = kilogramo; dl o dL = decilitro; pl o jL = microlitro; ml o mL = mililitro; 1 o L = litro; jM = micromolar; mM = milimolar; M = molar; kDa = kilodalton; i.m. = intramuscular(ly); i.p. = intraperitoneal(ly); s.c. = subcutáneo(mente); bid = dos veces al día; HPLC = cromatografía líquida de alto rendimiento; BW = peso corporal; U = unidad; ns = no estadísticamente significativo; PG = glucosa en plasma en ayunas; FPI = insulina en plasma en ayunas; ITT = prueba de tolerancia a la insulina; PTT = prueba de tolerancia al piruvato; oGTT = prueba oral de tolerancia a la glucosa; GSIS = secreción de insulina estimulada por glucosa; PBS = solución salina amortiguada con fosfato; PCR = reacción en cadena de la polimerasa; NHS = N-hidroxisuccinimida; DMEM = Modificación de Dulbeco del medio de Eagle; GC = copia del genoma; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético. Materiales y procedimientos
Los siguientes procedimientos y materiales se utilizaron en los siguientes ejemplos:
Animales. Los ratones C57BL/6J machos obesos inducidos por la dieta (DIO) (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) se mantuvieron con una dieta alta en grasas (D12492, Research Diets, Inc, New Brunswick, NJ) que contenía 60 kcal% de grasa, 20 kcal% de proteínas y 20 kcal% de carbohidratos durante 12-20 semanas. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de cuidado y uso de animales institucional NGM. Los ratones DIO C57BL/6J ofrecen un modelo humano de obesidad, donde la obesidad se basa en la ingesta excesiva de calorías. Los ratonesC57BL/6J son propensos a la obesidad en los que se observa un aumento de peso pronunciado, así como la hiperinsulinemia y, en ocasiones, la hiperglucemia. La cepa es la cepa de ratón más comúnmente utilizada para modelar la obesidad inducida por la dieta ( Nilsson C., y col., Acta Pharmacológica Sínica (2012) 33: 173-181 ).
Secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos. El número de acceso de GenBank BC000529.2 establece el ADNc de ORF que codifica variantes de GDF15 humano, y el número de acceso de GenBank NP_004855.2 establece la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc. El ADNc para la albúmina de suero de Homo sapiens se adquirió de Origene (SC319937), número de acceso de GeneBank n M_000477.3, NP_000468).
Un elemento de Kozak y una secuencia de péptido de señal de IgK humana:
(5'CACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTC CGAGGTGCCAGATGT3 ') (SEQ ID NO: 98) se insertó en el vector pTT5 (Consejo Nacional de Investigación de Canadá) entre el sitio PmeI y EcoRI. Para crear la construcción hIgK-GDF15, el ADN de GDF15 se amplificó mediante PCR utilizando el cebador directo: 5'-CTCCGAGGTGCCAGATGTGCGCGCAACGGGGACCACTGTCCGCTCGGG 3' (SEQ ID NO: 102) y el cebador inverso: 5'-CCTCGAGCGGCCGCTAGCTCATATGCAGTGGCAGTCTTTGGCTAACAA 3' (SEQ ID NO: 99) y la mezcla de PCR Sapphire (Clontech). El producto de PCR se purificó en gel (kit de extracción de gel Qiagen) y se clonó en pTT5-hIgK (linealizado con AgeI/HindIII) usando In-Fusion (Clontech). Para crear la construcción hIgK-HSA-enlazador-GDF15, el enlazador HSA y GDF15 se amplificaron por PCR individualmente usando cebadores apropiados. Después de la purificación en gel, los dos fragmentos de PCR y el vector pTT5 linealizado se ensamblaron usando Gibson Assembly Master Mix. Las células estelares o NEB 5a se transformaron con reacciones de clonación In-Fusion y Gibson, respectivamente,se transformaron con reacciones In-Fusion y Gibson respectivamente, se colocaron en placas de agar LB que contenían carbenicilina y se incubaron durante la noche a 37 °C. Las colonias individuales se recogieron y se analizaron por secuenciación. El ADN de las colonias positivas se purificó (DNA-Maxi-prep, Qiagen), se confirmó completamente la secuencia y se usó para transfectar células de mamífero para la expresión de proteínas recombinantes.
Para crear muteínas específicas, mutagénesis dirigida al sitio se realizó con el kit QuikChange Lightning (Agilent) y cebadores apropiados.
Expresión transitoria. Todas las muteínas de GDF15 fueron transfectadas transitoriamente en células Expi 293F (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Las células se subcultivaron rutinariamente en medio de expresión Expi (Invitrogen) y se mantuvieron como cultivos en suspensión en matraces de agitación de diferentes tamaños. Típicamente, las células se subcultivaron a una densidad celular de 5e5 células viables/ml y se cultivaron durante 3 días antes del subcultivo. Los matraces se mantuvieron en una incubadora de CO2 humidificada (mantenidos a nivel a 37 °C y 5 % de CO2). Las células se mantuvieron en plataformas de agitador de New Brunswick (New Brunswick Scientific Company, Edison, NJ) a una velocidad de agitación de 120 RPM.
Las transfecciones se realizaron cuando la densidad celular del cultivo alcanzó 2,5e6 células viables/ml con una viabilidad mayor del 95 %. Típicamente, para una transfección de 50 ml, se inocularon 2,5e6 células/mL x 50 mL de células en un matraz agitador de 250 mL en un volumen de cultivo de 42,5 mL. 50 |jg de ADN plasmídico que consiste en el vector de expresión que contiene el gen de interés se diluyó primero en 2,5 mL de medio de suero reducido OPTI-MEM (Invitrogen). Al mismo tiempo, el reactivo de transfección Expifectamine (Invitrogen), 2,67 veces el volumen (de la cantidad de ADN plasmídico) también se diluyó en 2,5 mL de medio de suero reducido OPTI-MEM. Después de una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente, el reactivo de transfección diluido se añadió lentamente al ADN plasmídico diluido para formar complejos competentes de transfección. Después de un período de incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 5 mL del complejo de transfección al cultivo celular de 42,5 mL. Las células transfectadas se colocaron, a continuación, en la incubadora de CO2 humidificada en un agitador orbital mantenido a 120 RPM. Veinticuatro horas después de la transfección, el cultivo transfectado se alimentó con 250 j l de solución potenciadora 1 (Invitrogen) y 2,5 ml de solución potenciadora 2 (Invitrogen). El cultivo se reemplazó, a continuación, en la incubadora de CO2 humidificada en un agitador orbital. De 6-7 días después de la transfección, los cultivos se cosecharon por centrifugación a 3000 RPM durante 30 minutos antes de filtrarse a través de un filtro de 0,2 jm (Nalgene). Las muestras se analizaron, a continuación, en un gel teñido con Commassie para determinar la expresión.
Expresión de células CHO estable. Las muteínas de GDF15 se expresaron de forma estable a partir del sistema GS Xceed (tm) con la línea celular huésped CHOK1SV GS-KO que se basa en el sistema de expresión bien establecido de Lonza para las células CHOK1SV. El sistema GS Xceed permite generar líneas celulares de alta expresión que son adecuadas para la fabricación de cGMP. El sistema incluye células huésped CHOK1SV GS-KO almacenadas en cGMP, vectores de expresión GS, protocolos completos para cultivo celular, transfección, selección y cribado de líneas celulares y procedimientos de producción v8 (medios y alimentos). En el desarrollo de líneas celulares para muteínas GDF15, se siguieron las recomendaciones sugeridas por el fabricante con el fin de establecer líneas celulares no clonadas en primer lugar. A continuación, las líneas celulares no clonadas se sometieron a clonación por dilución limitada para aislar clones de células individuales de alta expresión.
Purificación de la proteína recombinante GDF15. Las fusiones HSA-GDF15 se purificaron a partir de medios de cultivo utilizando captura por afinidad de azul sefarosa o captura por cambio de iones. En ambos casos, las fusiones HSA-GDF15 se eluyeron usando un gradiente de condiciones adecuadas de sal/pH conducentes a una elución y separación óptimas de las impurezas de la proteína de la célula huésped. A continuación, todas las fusiones HSA-GDF15 se purificaron adicionalmente usando una columna GE Healthcare Superdex 200 (26/60) usando 1X PBS como tampón de ejecución. Las fusiones purificadas se caracterizaron adicionalmente y la secuencia se confirmó con LC/MS (Agilent 6500-series Q-TOF), la monodispersidad se confirmó mediante filtración en gel-HPLC (Agilent 1200-HPLC) y gel SDS-PAGE (no reducido y reducido) con coomassie y/o tinción de plata. Para los experimentos in vivo, se confirmó que la endotoxina era inferior a 5EU/mg para inyección subcutánea.
Las muteínas de glicosilación de GDF15 se purificaron a partir de medios de cultivo utilizando la captura de intercambio iónico. En todos los casos, las luteínas de GDF15 se eluyeron usando un gradiente de sal/pH apropiado para una elución y separación óptimas de las impurezas de proteínas de la célula huésped. Todas las muteínas de GDF15 se purificaron, a continuación, mediante el uso de GE HiTrap Phenyl HP con un pH 8.0 usando un gradiente lineal decreciente de sulfato de amonio. Las fracciones se evaluaron y se agruparon con base en la pureza y las propiedades de glicosilación mediante cambio de gel en geles de SDS-PAGE no reducidos. Los grupos finales de cada muteína de GDF15 se caracterizaron adicionalmente y se confirmó la secuencia/glicano (+/- PNGasa F, NEB Cat. # P0704S) con LC/MS (Agilent 6500-series Q-TOF), la monodispersidad se confirmó mediante filtración en gel-HPLC (Agilent 1200-HPLC) y gel SDS-PAGE (no reducido y reducido) con tinción de coommassie y/o plata. Todas las muteínas de GDF15 se formularon en acetato de sodio 10 mM pH 4.0.
Evaluación de la solubilidad de muteínas de GDF15 humanas. Las muteínas se dializaron en ácido fórmico al 0,01 % (v/v) (pH 2.0) y se concentraron usando filtros ultracentrífugos Amicon compuestos de nitrocelulosa regenerada 10.000 NMWL (UFC901096), en algunos casos superiores a 10 mg/ml. La concentración inicial para cada muteína se determinó usando absorbancia a una longitud de onda de 280 nm y la ley de Beer (coeficiente de extinción = 14400, peso molecular = 12.287 Da). A continuación, cada muteína se diluyó en serie 2 veces de nuevo en ácido fórmico al 0,01 % y se añadieron 90 pl de cada dilución a una placa de 96 pocillos. Se añadieron 10 pl de PBS 10X (que contenía Tris 0,5 M pH 7.0) a cada pocillo y se confirmó que el pH era 7. Después de la incubación a temperatura ambiente durante la noche con agitación, se midió la turbidez a 370 nm. El punto de inflexión en el que comienza a producirse la turbidez se acepta como la solubilidad máxima de cada muteína. Las muteínas se clasificaron en uno de cinco grupos dependiendo de su nivel de solubilidad: <0,2 mg/ml = ; > 0,2 mg/ml = +; > 0,5 mg/ml = ++; > 1,0 mg/ml = +++; > 5,0 mg/ml = ++++.
Ejemplo 1: Ingeniería de una molécula de fusión HSA-GDF15 estabilizada
La expresión de la construcción M1 presentó desafíos de producción en una línea celular estable CHOK1SV GSKO (figura 4). Se observó un recorte significativo de la molécula de fusión dimérica HSA-GDF15 en el medio de cultivo celular. Las especies recortadas se aislaron usando cromatografía de intercambio iónico y/o interacción hidrófoba y/o filtración en gel para producir una fuente de especies enriquecidas para una caracterización adicional. Tras el análisis LC/MS en un Q-TOF Agilent serie 6500, los sitios de recorte fueron evidentes en el extremo C de la fusión HSA, el enlazador y en el extremo N de GDF15. Las especies principales de la construcción M1 se identificaron como sigue (enlazador = subrayado, GDF15 = negrita):
Especie 1 (SEQ ID NO:103):
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CVADES AENCDKSU [TLPGDKLCTV ATI ,RET YGEMADCCAKQEPI' RNECFLQI ] KD DNP
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Especie 2 (SEQ ID NO:104):
DAHKSEVAf IRFKDI ( TIENJ K A l.VLIAFAQYLQQCPEEDl IVKLVXEVTJ ÍFAKT
C V ADESAENCDKSLJ l J’L l í iDKLCT V ATLRLT Y (!L M A lX ( ’AK^EPERNECI'LQlJKDDNP NIPRl.-VRPE VDVMCTAl-'l IDNI¡] ¡TI LKKYLYEIARRl IPYFYAPl ¡IJ .l PAKRYKAAF'J'l ¡ÍÍC QAADKAACUPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASI.QKFGERAFKAWAVARI,SQRI i'KA
r’l ;AEVSKLVTDITKV]rTTit:CHODIJ.i;CADDRAI>LAKYlCENQDSlSSKLKECCEKPLr.r KSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSV VIJFRI-AKTYETTÍ.EKCCAAADPMECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCEErEQLGEYK FQNAlXVRYTKKVFQVSTnLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMFCAinYLSVVLNQL {;:VLHEKTPVSDR.VTK(,r rl’KSLVNRRIK,I'$A[.EVDHrl YVPKHENAHJ’KJ’EHADK TLKI-KE RQIKKQTAL VELVKHKPKA1KEQLKAVMDDI AAFVEKOCKADDKFl'CFAEEGKKLVA ASQAALG
Especie 3 (SEQ ID NO:105):
DAHKSEVAHRFKDIX ¡ I ENFKALVLIAFAQYLQQa >1 ¡EDI IVK LVNEVTi PAO
C VA DES AENCDKSLI [TLPGDKLCT V ATLRET YGEMADCC A KQEPERNECFLQI ] KD DNP NLPRLVRPI i VDVMCT A FHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELJ H !AKRYKA AFTECC QAADKAACUPKLDEERDBGKASSAKQRLKCASLQKFGERAi KAWAVARÍ SQRfPKA
i :i ai .vsk i v j i>] t k v [ m iccH c in r i.e c a d d r a d la k y ic en q d st ssk l k t x x ’f k p l t i:
KSRCIAE VE N DEMPADLPSLA ADFVI iSKD VCKN YAEA KD VFl _GMl ■ L YEYARRH PD YS V VLLLRLAK fYmiFKCCAAADPMECYAKVFDEI'KPLVEEFQNLIKQflCELEEyLÜEYK PQNALLVRYTKKVFQVSTPTr.VEVSRNTXiKVGííKX’CEÍHPEAKRMPCAEDYLSVVT.NQT-CVLl \ 1 lKTPVS].1 KVTKt Ti l 1SLVNRRPClISALEVDhTYVPKJil NAETETEHADICTLSEKE
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Se observa que la especie 3 incluye la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humano maduro y un (primer) aminoácido de la secuencia enlazadora. A las especies 1 y 2 les faltan los últimos ocho aminoácidos y el último aminoácido en el extremo C de la secuencia de aminoácidos de la albúmina de suero humana madura.
Especie 4 (SEQ ID NO: 106):
DAHKSHVAflRFKDI X¡liENFKALVLlAFAQYLXJQC]íl3EDl IVKLVNEVTIX'AKT
CVA DES AEM’DKSLH TLPGDKLCT VA'I’Í RETYGEMADCCAKQEPERNEO'LQHKDDNP NIPRÍ.VR] >1 - VI) V MC J ’AFHl )NKE1FLKKYLY HIARRHI> YKY API.[.] II AK R Y K A A [ PECC QAADKAACI í PKEDHERDBGKASSAKQRLKCASEQKFGERAFKAWAVARLSQREPKA HFAHVSK] VTDÍ I KVI flEOCf IGDI J*X)ADDRADLAKYTCLNQDSISSKLKPX X’KKPÍ.IF
KSI J( ’LAEVENDEMPADI J’SLAADFVESKDVCKNYA IÍAKDVFI XjMJ LYEYARRHPDYSV VIJJ.RLAKTYI ■: m EKCCAAA DPMI '.('YAK VFI> I U K P f ,V I EPQNI. IKQN CnI 11.1 - I :QL .GE YK FQNA]XWYlKKVPQVSlFILVEVSRNir¡KV(;SKÜCKHPEAKRIVlPCAEDYLSVV].lSrQL
CVLI IHKTPVSDRVTKÍXnTKSLVNRRPCF8ALEVDKTYVPKEKNAK] I I El IADKTLSHKK RQIKKQTAT VI I ,VKI1KPKATK1 - Qr.KAVMDDEAAFVEKCCKADDKI■:J TI A1.1 ■ f ¡ KK1 VA ASOAALGIX iGGGSGí H i( iSfifK K ¡SA R
Especie 5 (SEQ ID NO: 107):
D AHKSI !VAHRFKDI ,£ i I il ¡NFKAL VLIAFAQYI XJQCPPEDl tVKLVNEVl J iFAK* 1 CVADESAENCDKSUITLPGDKLCTVATLRETYGEMADOCAKQEP^RMCCFLQHKDDNP NLPRLVH l1!:VDVMCTAFHDNEETFLKKYLYIÍIARRHPYFYAPI ¡Lí I -FAICRYKÁ AFTEOC QAADKAAC’I J,PKEDEERDEGKASSAKQRLKCASEQKFOERAEKAWAVARLSQRFI,KA
i :i AI .VSKI V'l DLTKVII I i :» XZHÍlDIi,ECADDRADL.AKYICl NQixsiSSKLKTX’CEKPLI i:
KSHC.11A k VKNDKMP ADLPSLA A DE V ES KDVCKNY A EA KD VFI XIMFEYKYARRHPDYSV
VI XLRLAK rYEri LEKOCAAADPNECYAKVFDEl KPLVEEPQNLIKQMCELEEQUjEYK
FQN AU .VRYTKKVFQV STPTL VE VSRNT XrKVGS KX’CKHPEAKRMPC AED YLS VVT ,NQT -C VI.111 ¡KTPV S DRVTKCCTESLVN RRFCFSAI J^VDE'l YVPKEINAETETFHADICT LSLKE
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Para minimizar y corregir el problema de recorte observado cerca de la región enlazadora de la molécula de fusión, se diseñó una construcción M2 equivalente a la construcción M1, sin embargo, con un truncamiento de los primeros tres residuos N-terminales en GDF15 (AARN o AN3) (figura 3). La construcción M2 estabilizada resultante cuando se expresó en una línea celular estable CHOK1SV GSKO, mostró problemas de recorte mínimos como se observó para M1 cuando se compararon los medios acondicionados para cada construcción expresada. La figura 4 demuestra el recorte significativo observado para M1 y la estabilidad de la construcción M2.
Sobre la base de la mejora de la estabilidad observada para la construcción M2, se logró la ingeniería adicional para lograr una longitud óptima del enlazador y un potencial de recorte. Se logró la longitud optimizada del enlazador de [(G4S)] 5 y se acopló con deleciones N-terminales de GDF15 de 3 residuos (M3 - AARN o AN3) o 6 residuos (M4 -Aa RnGd H o AN6) (véase la figura 5).
Ejemplo 2: Efectos de la HSA de estabilidad mejorada -GDF15 sobre el peso corporal y la ingesta de alimentos en el modelo de ratón DIO
Los efectos de una molécula de fusión administrada por vía subcutánea que tiene HSA fusionada a GDF15 humano recombinante sobre el peso corporal y la ingesta de alimentos se evaluaron durante un período de 7 días. Brevemente, las proteínas M1 (figura 3), M3 y m4 (figura 5) se administraron semanalmente en dosis de 4 nmol/kg y12 nmol/kg como una sola inyección en bolo subcutánea (10 mL/kg) a ratones DIO con peso aproximado de 38g-40 g. Después de la administración de control del vehículo o la fusión de proteínas, el peso corporal y la ingesta de alimentos se controlaron 24 horas y 7 días después de la dosis para controlar la eficacia. Los resultados obtenidos para los ratones DIO a los que se les administró una dosis de 40 nmol/kg se presentan en las figuras 6 y 7.
Como se muestra en la figura 6, la administración de las proteínas de fusión a una dosis de 40 nmol/kg (4 nmol/kg y 12 nmol/kg no mostrados) dio como resultado una mejora significativa en la reducción de la ingesta de alimentos. En cada grupo de ratones, n = 8 y los valores p (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001, ns = no significativo) se determinaron mediante la prueba T de Student para datos no apareados comparando las ingestas de alimentos en las diversas concentraciones al grupo de control del vehículo en cada punto de tiempo especificado.
Con referencia a la figura 6, 24 horas (1 día) después de la administración de las proteínas de fusión frente al control del vehículo dieron como resultado las siguientes reducciones de la ingesta de alimentos (Vehículo = 2,8 g /- 0,13 g): grupo de dosis de 4 nmol/kg (M1 = 1,9 g /- 0,25 g, **; M3 = 1,8 g /- 0,18 g, ***; M4 = 1,8 g /- 0,10 g, ***), grupo de dosis de 12 nmol/kg (M1 = 1,5 g /- 0,19 g, ***; M3 = 1,9 g /- 0,16 g, ***; M4 = 1,7 g /- 0,12 g, ***) y grupo de dosis de 40 nmol/kg (M1 = 1,3 g /- 0,11 g, ***; M3 = 1,8 g /- 0,06 g, ***; M4 = 1,5 g /- 0,15 g, ***). 7 días después de la administración de las moléculas de fusión frente al control del vehículo dieron como resultado las siguientes reducciones de reducción de la ingesta de alimentos (vehículo = 2,7 g /- 0,09 g): grupo de dosis de 4 nmol/kg (M1 = 2,0 /- 0,18 g, **; M3 = 2,5g /- 0,08g, ns; M4 = 2,5g /- 0,09g, ns), grupo de dosis 12nmol/kg (M1 = 2,0g /- 0,20g, **; M3 = 2,2g /- 0,17 g, *; M4 = 2,4 g /- 0,28 g, ns) y grupo de dosis de 40 nmol/kg (M1 = 1,7 g /- 0,14 g, ***; M3 = 2,4 g /- 0,25 g, ns ; M4 = 2,2 g /- 0,24 g, ns).
Como se muestra en la figura 7, la administración de las moléculas de fusión a una dosis de 40 nmol/kg (4 nmol/kg y 12 nmol/kg no mostrados) dio como resultado una reducción significativa del peso corporal. En cada grupo de ratones, n = 8 y los valores p (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001, ns = no significativo) se determinaron mediante la prueba T de Student para datos no apareados comparando la ingesta de alimentos en las diversas concentraciones al grupo de control del vehículo en cada punto de tiempo especificado.
Con referencia a la figura 7, en el momento de la dosificación (día = 0) antes de la administración de las moléculas de fusión frente al control del vehículo, se registraron los siguientes pesos corporales (vehículo = 39,0 g /- 0,92 g): grupo de dosis de 4 nmol/kg (M1 = 39,2g /- 0,66g; M3 = 39,4g /- 0,91g; M4 = 39,3g /- 0,77g), grupo de dosis 12nmol/kg (M1 = 39,4g /- 0,78g; M3 = 39,3 g /- 1,09 g; M4 = 39,3 g /- 0,81 g) y grupo de dosis de 40 nmol/kg (M1 = 39,2 g /-0,64 g; M3 = 39,2 g /- 0,68 g; M4 = 38,9 g /- 0,60 g).24 horas (Día = 1) después de la administración de las moléculas de fusión frente al control del vehículo, se registraron los siguientes pesos corporales (% de disminución = diferencia Delta frente al peso del grupo de dosis antes de la administración). Vehículo = 0,3 g /- 0,11 g, 0,6 %), grupo de dosis de 4 nmol/kg (M1 = -0,6 g /- 0,21 g, -1,5 %, ***; M3 = -0,6 g /- 0,17 g, -1,6 %, ***; M4 = -0,9 g /- 0,13 g, -2,4 %, ***), grupo de dosis de 12 nmol/kg (M1 = -0,9 g /- 0,11 g, -2,3 % , ***; M3 = -0,7 g /- 0,18 g, -1,6 %, ***; M4 = -0,6 g /- 0,16 g, -1,7 %, ***) y grupo de dosis de 40 nmol/kg (M1 = -1,0 g /- 0,14 g, -2,5 %, ***; M3 = -0,6 g /- 0,09 g, -1,5 %, ***; M4 = -0,8 g /- 0,22 g, -2,1 %, ***). 7 días después de la administración de las moléculas de fusión frente al control del vehículo, se registraron los siguientes pesos corporales (% de disminución = diferencia delta frente al peso del grupo de dosis antes de la administración). Vehículo = 1,2 g /- 0,25 g, 3,1 %), grupo de dosis de 4 nmol/kg (M1 = -1,3 g /- 0,30 g, -3,3 %, ***; M3 = -1,1g /- 0,32 g, - 2,8 %, ***; M4 = -2,0g /- 0,29g, -5,0%, ***), grupo de dosis 12nmol/kg (M1 = -1,8g /- 0,34g, - 4,7 % , ***; M3 = -1,4 g /- 0,43 g, -3,6 %, ***; M4 = -1,5 g /- 0,32 g, -3,7 %, ***) y grupo de dosis de 40 nmol/kg (M1 = -2,6 g /- 0,28 g, -6,7 %, ***; M3 = -2,1 g /- 0,28 g, -5,4 %, ***; M4 = -2,6 g /- 0,31 g, -6,7 %, ***).
Los datos de las figuras 6 y 7 demuestran que las fusiones de HSA con optimización del enlazador y truncamientos N-terminales de GDF15 son activas, y que tales moléculas de fusión representan un enfoque viable para potenciar ciertas propiedades beneficiosas de las moléculas de GDF15.
Ejemplo 3: Muteínas GDF15 humanas con propiedades físicas mejoradas
Los datos expuestos en el Ejemplo 3 abordan las limitaciones de solubilidad asociadas con las hidrofobicidades e hidrofilicidades de la superficie inherentes al GDF15 humano maduro. Además, se evaluó el efecto sobre la solubilidad de la introducción de sitios de consenso de glicosilación unidos a N a lo largo de la secuencia de GDF15 humano maduro. Para facilitar la evaluación de las características de expresión; las propiedades de glicosilación y la solubilidad de muteínas GDF15 humanas recombinantes maduras, todas se construyeron como muteínas maduras fusionadas con una secuencia de péptido señal de IgK y se representan en la figura 8A. Se generaron 17 muteínas GDF15 (indicadas M5-M21; SEQ ID NO: 81-97, respectivamente). Para M16, se generó una versión N-terminal eliminada: muteína AN3-M16 y se determinó su solubilidad. La muteína M5 contiene dos sitios de consenso de glicosilación unidos a N introducidos sustituyendo la D en la posición 5 en el GDF15 wt (SEQ ID NO: 1) con T y sustituyendo la R en la posición 21 en el GDF15 wt (SEQ ID NO: 1) con T y sustituyendo el R en la posición 21 en el GDF15 wt (SEQ ID NO: 1) con N. En las muteínas M6-M21, se introdujo un sitio consenso de glicosilación unido a N (véase la figura 8A). Se observa que aunque las muteínas incluyen una secuencia señal de IgK en el extremo N con el fin de hacer referencia a la posición de la sustitución, los residuos se numeran como la posición del residuo correspondiente en la SEQ ID NO: 1. Así, por ejemplo, aunque T está presente en la posición 27 en la muteína M5, se denomina posición 5, ya que la posición del residuo D correspondiente en la SEQ ID NO: 1 es 5.
Se realizaron evaluaciones de solubilidad en muteínas (en ácido fórmico al 0,01 %) mediante un pico de PBS 10X Tris 0,5 M pH 7.0, un tampón riguroso para el que se pueden evaluar las mejoras en la solubilidad de una muteína en relación con GDF15 humano maduro.
La evaluación de la solubilidad se determinó basándose en la absorbancia a 280 nm usando la ley de Beer calculada usando el coeficiente de extinción (GDF15 humano maduro = 14.400/monómero) y el peso molecular (GDF15 humano maduro = 12.278Da/monómero).
Antes de evaluar la solubilidad, se evaluó la secreción de cada una de las muteínas de N-glicano manipuladas expuestas en la figura 8A y la muteína AN3-M16 tanto para la secreción como un homodímero de GDF15 plegado en medios de cultivo de tejido de mamíferos como para la ocupación del sitio de N-glicano. Como se expone en la figura 9, catorce de las dieciocho muteínas glicosiladas se secretaron como homodímeros de GDF15 plegados, mientras que M8, M10, M14 y M15 no dieron como resultado la formación de dímeros y se expresaron como agregados. Las catorce muteínas de glicosilación expresadas que secretaban como homodímeros se evaluaron a continuación mediante LC/MS y desplazamiento de gel SDS-PAGE para determinar la ocupación de grupos N-Glicano en el sitio consenso después de la purificación del medio acondicionado. En los catorce casos, las muteínas expresadas contenían un alto grado de ocupación y se analizó un subconjunto para mejorar las propiedades físicas tales como la solubilidad.
Se controlaron las muteínas de GDF15 de N-glicano manipuladas que fueron secretadas como homodímeros y poseían una alta ocupación de glicanos dentro del sitio de consenso para detectar mejoras en la solubilidad en relación con el GDF15 humano maduro. El punto de inflexión en el que comienza a producirse la turbidez se acepta como la solubilidad máxima de cada muteína. Las muteínas se clasificaron en uno de cinco grupos dependiendo de su nivel de solubilidad: <0,2 mg/ml = ; > 0,2 mg/ml = +; > 0,5 mg/ml = ++; > 1,0 mg/ml = +++; > 5,0 mg/ml = ++++. Cada una de las muteínas de N-glicano GDF15 que se evaluó exhibió una solubilidad mejorada en comparación con GDF15: M5: +++, M7: ++, M11: ++, M12: ++, M13: ++ humano maduro , M16: ++++, AN3-M16: ++++, M17: ++++, M20: +++, M21: ++.
Ejemplo 4: Efecto de las muteínas M16, AN3-M16 y M17 sobre la ingesta de alimentos en un modelo de ratón DIO Se evaluó el efecto de las glicomuteínas administradas por vía subcutánea sobre la ingesta de alimentos. Glicomuteína M16 (SEQ ID NO: 92) y M17 (SEQ ID NO: 93) se describen en el Ejemplo 3 anterior. También se evaluó la glicomuteína designada como N3-M16. La secuencia para la glicomuteína AN3-M16 se proporciona a continuación:
mdmrvpaqllgll] lwlrgarcG D11C PLG PGRCCRLHTVRASLEDLQWADWVLS PRE V QVTMCIG ACPSQFRAANMHAQIKTSLH RLKPDT VPAPCC V P AS YNPM VLIQNTTTG VS L QTYDDLLAKDCHC1 (SEQ ID NO: 100)
Se observa que los polipéptidos administrados a los ratones no incluyen la secuencia señal de IgK (mdmrvpaqllgllllwlrgarc, SEQ iD NO: 101) ya que la secuencia señal de IgK se escinde del polipéptido secretado por una peptidasa señal expresada por las células (293 células).
Con referencia a la figura 10, la administración subcutánea de una dosis única de 1,0 mg/kg (40 nmol/kg) de vehículo de PBS, GDF15 humano maduro o una muteína de N-glicano se administró a ratones DIO macho de 17 semanas de edad (n = 9). Se controló la ingesta de alimentos (gramos/animal) durante un período de 24 horas después de la administración subcutánea. Los valores de p se determinaron mediante una prueba T de Student no apareada relativa a un grupo de control de vehículo (PBS).
Como se muestra en la figura 10, la administración de las glicomuteínas dio como resultado una reducción en la ingesta de alimentos. En cada grupo de ratones, los valores p (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001) se determinaron mediante la prueba T de Student no apareada comparando la ingesta de alimentos con el grupo de control del vehículo. El GDF15 de tipo salvaje también redujo la ingesta de alimentos.
Ejemplo 5: Efecto de las muteínas M16, AN3-M16 y M17 sobre el peso corporal en un modelo de ratón DIO Se evaluó el efecto de las glicomuteínas administradas por vía subcutánea sobre el peso corporal. La administración subcutánea de una dosis única de 1,0 mg/kg (40 nmol/kg) de vehículo de PBS, GDF15 humano maduro o una muteína de N-glicano (M16, M17 y AN3-M16) se administró a ratones DIO macho de 17 semanas (n = 9). Se controló el peso corporal durante un período de 24 horas después de la administración subcutánea. Los valores de p se determinaron mediante una prueba T de Student no apareada relativa a un grupo de control de vehículo (PBS).
La administración de las glicomuteínas dio como resultado una reducción del peso corporal (figura 11). En cada grupo de ratones, los valores p (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001) se determinaron mediante la prueba T no de Student apareada comparando la ingesta de alimentos con el grupo de control del vehículo. El GDF15 de tipo salvaje también redujo el peso corporal.

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos contigua que es al menos en un 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, donde el polipéptido comprende uno de los siguientes pares de sustituciones de los aminoácidos correspondientes en la SEQ Id NO: 1:
K91N y D93T/S o D93N y G95T/S;
donde el polipéptido es adecuado para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad metabólica, una enfermedad asociada al metabolismo, un trastorno del peso corporal o un trastorno del metabolismo de la glucosa.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos contigua es al menos en un 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
3. El polipéptido de la reivindicación 1, donde la secuencia de aminoácidos contigua es al menos en un 97 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
4. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polipéptido carece de los primeros tres aminoácidos presentes en el extremo N de la SEQ ID NO: 1.
5. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 30.
6. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el polipéptido está fusionado a un polipéptido heterólogo.
7. El polipéptido de la reivindicación 6, donde el polipéptido heterólogo es albúmina de suero, proteína de unión a maltosa o polipéptido Fc de inmunoglobulina, y donde el polipéptido heterólogo está conjugado con el extremo N del polipéptido o el extremo C del polipéptido.
8. Un dímero que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. El dímero de la reivindicación 8, que es (a) un homodímero y/o (b) N-glicosilado.
10. El dímero de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, que es un dímero GDF15 N-glicosilado modificado, que es un homodímero que tiene dos polipéptidos que comprenden cada uno las mismas secuencias de aminoácidos, donde los polipéptidos contienen al menos un sitio de N-glicosilación que está N-glicosilado.
11. El dímero de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde dicho dímero comprende dos polipéptidos, cada uno de los cuales consta de la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 30.
12. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el dímero de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
13. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12, donde la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a un elemento de control de la expresión que confiere la expresión de la molécula de ácido nucleico in vitro o in vivo.
14. El vector de la reivindicación 13, donde el vector comprende un vector viral.
15. Una célula huésped que expresa el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el dímero de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
16. Una composición farmacéutica, que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el dímero de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
17. Un recipiente estéril que comprende la composición farmacéutica de la reivindicación 16.
18. El recipiente estéril de la reivindicación 17, donde el recipiente estéril es una jeringa.
19. Un procedimiento de preparación del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el dímero de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, comprendiendo el procedimiento:
cultivar una célula huésped que exprese el polipéptido o dímero; y
purificar el polipéptido o dímero expresado.
20. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 el dímero de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, o la composición farmacéutica de la reivindicación 16, para su uso en un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad metabólica, una enfermedad metabólica asociada, un trastorno de peso o un trastorno del metabolismo de la glucosa en un sujeto.
21. El polipéptido, dímero o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 20, donde el trastorno del metabolismo de la glucosa es diabetes mellitus, hiperglucemia, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa o síndrome metabólico.
22. El polipéptido, dímero o composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, donde el sujeto es un ser humano.
23. El polipéptido, dímero o composición farmacéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, donde el sujeto es obeso.
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