KR101558642B1

KR101558642B1 - Ｔｇｆ-베타 슈퍼패밀리의 설계자 리간드

Info

Publication number: KR101558642B1
Application number: KR1020117021911A
Authority: KR
Inventors: 서연 최; 조오지 알렌도르프; 마이크 이삭스
Original assignee: 솔크 인스티튜트 포 바이올로지칼 스터디즈; 재단법인 제이씨비 공동생물과학연구소
Priority date: 2009-02-24
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2015-10-12
Also published as: KR20110121642A; WO2010099219A3; JP2012518420A; EP2401293A4; US8952130B2; US20100221777A1; CA2752647A1; JP5841845B2; WO2010099219A2; US20150239950A1; EP2401293A2; EP2401293B1

Abstract

본 발명은 TGF-베타 활성을 갖는 키메라 폴리펩티드, 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 그리고 이들 폴리펩티드를 생산하는 호스트 세포에 관계한다.

Description

ＴＧＦ-베타 슈퍼패밀리의 설계자 리간드{DESIGNER LIGANDS OF TGF-BETA SUPERFAMILY}

관련된 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 35 U.S.C. §119 하에, 2009년 2월 24일 제출된 U.S. Provisional Application Serial No. 61/155,066에 우선권을 주장하고, 이의 내용은 본 발명에 참조로서 편입된다.

연방정부의 지원을 받은 연구에 관한 진술

본 발명은 National Institutes of Health 과제 번호 (grant number) HD013527로부터 연구 보조금에 의해 부분적으로 자금 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.

기술분야

본 발명은 생체분자 조작과 설계, 그리고 조작된 단백질과 핵산에 관계한다.

배경기술

액티빈 및 골형성 단백질 (BMP)은 훨씬 큰 전환 성장 인자 - 베타 (TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원이다. 다양한 발달 과정 및 세포 과정에서 편재 (pervasiveness)로 인하여, TGF-β 리간드는 많은 관심의 중심이었다. TGF-β 리간드가 치료 도구 (therapeutic tool)로서 성공적으로 이용되기 위하여, 여러 장애물이 극복되어야 한다. TGF-β 리간드의 특성을 특이적으로 변형 및 변경하고, 그리고 이들 리간드를 상당한 양으로 산출하는 능력이 요구된다.

요약

본 발명에서는 TGF-베타 패밀리의 단백질에 의해 제공되는 활성을 갖는 비-자연 발생 키메라 폴리펩티드를 제시한다. 본 발명의 키메라 폴리펩티드는 결과의 폴리펩티드가 TGF-베타 패밀리의 단백질과 연관된 경로를 조정할 수 있도록 작동가능하게 연결된 부모 TGF-베타 단백질로부터 2개 이상의 분절 (segment) 또는 단편 (fragment)을 포함한다. 한 구체예에서, 경로는 SMAD 또는 DAXX 경로이다.

한 구체예에서, 본 발명에서는 새로운 리간드 (설계자 리간드)를 작제하기 위하여 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 상이한 서열 분절을 선별하고 결합함으로써 합성될 수 있는 설계자 TGF-베타 리간드를 제시한다. 이들 신규한 리간드는 자연적으로 존재하는 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드와 상이한 완전히 새로운 단백질 서열 라이브러리를 보유한다. 이러한 접근법은 근본적으로, 자연 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 간에 구조 공통성 (structural commonality)의 인식으로부터 비롯한다. 모든 ~40 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드는 상기 단백질의 각 영역에 대한 포괄적 특징을 갖는 동일한 전반적인 체계를 공유한다. TGF-베타 리간드의 프레임워크 (framework)는 모든 슈퍼패밀리 구성원이 공유하는 (일반적으로) 6가지 하위도메인 (일명, 서열 분절; 도 19에서 6개의 상이한 색으로 표시됨)으로 분류될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명에서는 또한, 최소한 2개의 펩티드 분절을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제시하고, 상기 폴리펩티드의 첫 번째 분절은 첫 번째 TGF-베타 패밀리 단백질에 최소한 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 그리고 두 번째 분절은 두 번째 TGF-베타 패밀리 단백질에 최소한 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 여기서 이들 분절은 작동가능하게 연결되고 첫 번째 또는 두 번째 부모 TGF-베타 패밀리 단백질 중에서 최소한 하나의 활성을 갖는다. 한 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 BMP-2로부터 N-말단 분절을 포함한다. 다른 구체예에서, 최소한 2개의 펩티드 분절은 N- 내지 C-말단에 작동가능하게 연결된 6개 펩티드 분절을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 TGF-베타 패밀리 단백질 각각은 구조적 유사성을 갖고, 그리고 각각의 분절은 구조적 모티프 (structural motif)에 상응한다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 TGF-베타 패밀리 단백질은 BMP-2이고, 그리고 두 번째 TGF-베타 패밀리 단백질은 액티빈이다. 한 구체예에서, BMP-2 단백질의 분절은 BMP-2의 C-말단에 상응하는, 분절 1: 서열 번호 2의 아미노산 잔기 대략 1 내지 대략 x₁ ("1b"); 분절 2: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₁ 내지 대략 x₂ ("2b"); 분절 3: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₂ 내지 대략 x₃ ("3b"); 분절 4: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₃ 내지 대략 x₄ ("4b"); 분절 5: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₄ 내지 대략 x₅ ("5b"); 그리고 분절 6: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₅ 내지 대략 x₆ ("6b")을 포함하고; 그리고 여기서 x₁은 서열 번호 2의 잔기 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35이고; x₂는 서열 번호 2의 잔기 45, 46, 47, 또는 48이고; x₃은 서열 번호 2의 잔기 65, 66, 67, 또는 68이고; x₄는 서열 번호 2의 잔기 76, 77, 78, 79, 80, 81 또는 82이고; x₅는 서열 번호 2의 잔기 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94이고; 그리고 x₆은 서열 번호 2의 잔기 112, 113, 또는 114이고; 그리고

액티빈 단백질의 분절은 분절 1: 서열 번호 5의 아미노산 잔기 대략 1 내지 대략 x₁ ("1a"); 분절 2: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₁ 내지 대략 x₂ ("2a"); 분절 3: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₂ 내지 대략 x₃ ("3a"); 분절 4: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₃ 내지 대략 x₄ ("4a"); 분절 5: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₄ 내지 대략 x₅ ("5a"); 그리고 분절 6: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₅ 내지 대략 x₆ ("6a")을 포함하고; 그리고 여기서 x₁은 서열 번호 5의 잔기 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32이고; x₂는 서열 번호 5의 잔기 42, 43, 44, 또는 45이고; x₃은 서열 번호 5의 잔기 61, 62, 63, 또는 64이고; x₄는 서열 번호 5의 잔기 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84이고; x₅는 서열 번호 5의 잔기 90, 91, 92, 93, 94, 95 또는 96이고; 그리고 x₆은 서열 번호 5의 잔기 114, 115, 또는 116이고; 그리고

여기서 폴리펩티드는 분절 1-분절 2-분절 3-분절 4-분절 5-분절 6의 순서를 갖는다. 다른 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 1b2b3b4b5b6a; 1b2b3b4b5a6a; 1b2b3b4b5a6b; 1b2b3a4a5a6a; 1b2b3a4a5b6a; 1b2a3a4a5a6a; 1b2a3a4a5a6a L66V/V67I; 1b(1a_II)2a3a4a5a6a; 1b2a3a4a5a6b; 1b2a3a4a5b6b; 1b2a3a4a5b6a; 1b2a3b4b5b6a; 1b2a3b4b5a6a; 그리고 1b2a3b4b5a6b로 구성된 군에서 선택되는 분절의 서열을 포함한다.

본 발명에서는 또한, 서열 번호 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 1, 23, 25, 2, 29, 31, 33, 35, 37, 39 또는 41에 진술된 서열에 최소한 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제시하고, 여기서 상기 폴리펩티드는 SMAD 또는 DAXX 경로를 조정한다.

본 발명에서는 또한, SMAD 또는 DAXX 조정 활성을 갖는 키메라 폴리펩티드를 제공하기 위하여 두 번째 상이한 TGF-베타 패밀리 단백질의 분절에 작동가능하게 연결된 첫 번째 TGF-베타 패밀리 단백질의 분절을 포함하는 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 제시한다.

본 발명에서는 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다. 한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 그리고 40로 구성된 군에서 선택되는 서열에 최소한 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 재조합 세포와 함께, 이런 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 역시 제시된다.

대안적 구체예에서, 본 발명에서는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원에 대한 신규한 리간드를 제시하고, 여기서 상기 리간드는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 외래성 또는 상이한 구성원으로부터 6개 하위도메인 (subdomian) 중에서 최소한 하나를 보유하는 키메라 단백질이다.

본 발명에서는 첫 번째 TGF-베타 패밀리 구성원으로부터 첫 번째 도메인 (domain), J1에서 크로스오버 접점 (cross-over point)(예로써, 도 18 참조), 동일한 또는 두 번째 TGF-베타 패밀리 구성원으로부터 두 번째 도메인, J2에서 크로스오버 접점 (예로써, 도 18 참조), 동일한 또는 세 번째 TGF-베타 패밀리 구성원으로부터 세 번째 도메인, J3에서 크로스오버 접점 (예로써, 도 18 참조), 동일한 또는 네 번째 TGF-베타 패밀리 구성원으로부터 네 번째 도메인, J4에서 크로스오버 접점 (예로써, 도 18 참조), 동일한 또는 다섯 번째 TGF-베타 패밀리 구성원으로부터 다섯 번째 도메인, J5에서 크로스오버 접점 (예로써, 도 18 참조), 그리고 동일한 또는 여섯 번째 TGF-베타 패밀리 구성원으로부터 두 번째 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 키메라는 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 상이한 TGF-베타 패밀리 구성원으로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, J3에서 크로스오버는 선택적이다.

상세한 설명

본 명세서에서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 복수 지시물 (referent)을 포함한다. 가령, "도메인"에 대한 지시 (reference)는 복수의 이런 도메인을 포함하고, 그리고 "단백질"에 대한 지시 (reference)는 하나 이상의 단백질에 대한 지시를 포함한다.

또한, "또는"의 이용은 달리 명시되지 않으면, "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함한다," "포함하는" "보유한다," 그리고 "보유하는"은 동의어로서 이용되고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

게다가, 다양한 구체예의 설명이 용어 "포함하는"을 이용하는 경우에, 당업자는 일부 특정한 경우에, 구체예는 용어 "본질적으로 구성되는" 또는 "구성되는"을 이용하여 대안적으로 기술될 수 있음을 이해할 것이다.

비록 본 명세서에서 기술된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 것들이 이들 개시된 방법 및 조성물의 실시에 이용될 수 있긴 하지만, 이들 예시적인 방법 및 물질이 본 명세서에서 기술된다.

달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 이용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야에 평균의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 따라서 본 출원 전반에서 아래의 용어는 아래의 의미를 가질 것이다.

"아미노산"은 중심 탄소 원자 (알파-탄소 원자)가 수소 원자, 카르복실산 기 (이의 탄소 원자는 본 명세서에서, "카르복실 탄소 원자"로 지칭된다), 아미노 기 (이의 질소 원자는 본 명세서에서, "아미노 질소 원자"로 지칭된다), 그리고 측쇄 기, R에 연결되는 구조를 갖는 분자를 지칭한다. 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 내로 통합될 때, 아미노산은 하나의 아미노산을 다른 아미노산에 연결하는 탈수 반응 동안 아미노산 카르복실산 기의 하나 이상의 원자를 상실한다. 결과적으로, 단백질 내로 통합될 때, 아미노산은 "아미노산 잔기"로 지칭된다.

"단백질" 또는 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 2개 이상의 개별 아미노산 (자연 발생인지에 상관없이)의 임의의 중합체를 지칭하고, 그리고 아미노산 (또는 아미노산 잔기)의 알파-탄소에 결합된 카르복실산 기의 카르복실 탄소 원자가 인접 아미노산의 -탄소에 결합된 아미노 기의 아미노 질소 원자에 공유 결합될 때 발생한다. 용어 "단백질"은 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" (이들은 때때로, 본 명세서에서 동의어로서 이용될 수 있다)를 그 의미 내에 포함하는 것으로 이해된다. 이에 더하여, 복합 폴리펩티드 아단위 (가령, DNA 폴리메라아제 III, RNA 폴리메라아제 II) 또는 다른 성분 (가령, 텔로메라아제의 경우에서처럼 RNA 분자)을 포함하는 단백질 역시 본 명세서에서 "단백질"의 의미 내에 포함되는 것으로 이해될 것이다. 유사하게, 단백질 및 폴리펩티드의 단편 역시 본 발명의 범위 내에 있고 본 명세서에서, "단백질"로 지칭될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, 폴리펩티드는 2개 이상의 부모 펩티드 분절의 키메라를 포함한다.

본 명세서에서, TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원은 임의의 종, 특히 소, 양, 돼지, 뮤린, 말, 그리고 인간이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 포유동물 종의 TGF-베타 슈퍼패밀리 (골형성 인자 포함) 유전자 또는 단백질을 지칭한다. "TGF-베타 슈퍼패밀리 폴리펩티드"는 임의의 종, 특히 소, 양, 돼지, 뮤린, 말, 그리고 인간을 비롯한 포유동물 종으로부터, 그리고 자연, 합성, 반-합성, 또는 재조합인 지에 상관없이 임의의 출처로부터 획득된 정제된 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 아미노산 서열을 지칭한다.

"펩티드 분절"은 더욱 큰 폴리펩티드 또는 단백질의 일부 또는 단편을 지칭한다. 펩티드 분절은 비록 일부 경우에, 펩티드 분절이 폴리펩티드의 도메인에 상응하고, 상기 도메인이 자체적인 생물학적 활성을 갖긴 하지만, 그 자체가 기능적 활성을 가질 필요가 없다. 안정성-연관된 펩티드 분절은 이러한 펩티드 분절이 없는 관련된 폴리펩티드와 비교하여, 안정성, 기능, 또는 접힘을 증진하는 폴리펩티드에서 발견되는 펩티드 분절이다.

소정의 단백질의 특정 아미노산 서열 (즉, 아미노-말단에서부터 카르복시-말단으로 기록될 때 폴리펩티드의 "일차 구조")은 mRNA의 코딩 부분의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정되고, 이는 교대로, 유전 정보, 전형적으로 게놈 DNA (세포 소기관 DNA, 예를 들면, 미토콘드리아 또는 엽록체 DNA 포함)에 의해 특정된다. 따라서 유전자 서열의 결정은 상응하는 폴리펩티드의 일차 서열, 더욱 구체적으로, 상기 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 역할 또는 활성을 예측하는데 도움을 준다.

"융합된," "작동가능하게 연결된," 그리고 "작동가능하게 결합된"은 본 명세서에서, 동의어로서 이용되고, 그리고 다른 모든 점에서 상이한 2개의 도메인의 화학적 또는 물리적 결합을 폭넓게 지칭하고, 여기서 각각의 도메인은 독립적인 생물학적 기능을 갖는다. 따라서 본 발명에서는 서로 융합되는 TGF-베타 (가령, BMP 또는 액티빈) 도메인을 제시하고, 이들은 TGF-베타 패밀리 활성, 또는 TGF-베타 패밀리의 폴리펩티드의 리간드 특이성에서 향상 또는 변화를 갖는 폴리펩티드로서 기능한다. 한 구체예에서, 2개의 부모 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드로부터 복수의 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드는 그들이 동일한 코딩 서열의 일부가 되도록 연결되고, 각각의 도메인은 부모 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드로부터 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되고, 여기서 이들 폴리뉴클레오티드는 전사될 때 폴리뉴클레오티드가 번역될 때 복수의 도메인을 단일 폴리펩티드로서 포함하는 단일 mRNA을 인코딩하도록 인 프레임 (in-frame)으로 존재한다. 전형적으로, 코딩 도메인은 펩티드 링커에 의해 직접적으로 분리되고 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 경우에 "인-프레임"으로 연결될 것이다. 펩티드 링커 및 펩티드에 대한 다양한 코딩 서열은 당분야에 공지되어 있다.

"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오티드는 그 자신이 유래되는 생명체의 자연 발생 게놈에서 즉시 인접하는 코딩 서열 (5' 단부에서 코딩 서열 및 3' 단부에서 코딩 서열) 중에서 어느 한쪽과 즉시 인접하지 않는 서열을 포함한다. 이런 이유로, 상기 용어에는 예로써, 벡터; 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 통합되거나, 또는 다른 서열에 독립된 별개의 분자 (가령, cDNA)로서 존재하는 재조합 DNA가 포함된다. 본 발명의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 한쪽 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 본 명세서에서, 이들 폴리뉴클레오티드는 특히, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 그리고 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는, 더욱 전형적으로, 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 게놈 DNA 또는 RNA (생명체, 다시 말하면, 바이러스의 RNA 게놈에 따라서), 그리고 게놈 DNA에 의해 인코딩된 mRNA, 그리고 cDNA를 포괄한다.

"핵산 분절," "올리고뉴클레오티드 분절" 또는 "폴리뉴클레오티드 분절"은 더욱 큰 폴리뉴클레오티드 분자의 일부를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 분절은 단백질의 인코딩된 기능적 도메인에 상응할 필요가 없다; 하지만, 일부 경우에 상기 분절은 단백질의 기능적 도메인을 인코딩할 것이다. 폴리뉴클레오티드 분절은 대략 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이 (가령, 6-20, 20-50, 50-100, 100-200, 200-300, 300-400개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이)일 수 있다.

"키메라" 또는 "키메라 단백질" 또는 "키메라 폴리펩티드"는 최소한 2개의 상이한 부모 단백질의 최소한 2개의 분절의 조합을 지칭한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 분절은 실제로, 관련된 특정 서열이 그러한 것처럼 각각의 부모로부터 유래될 필요가 없고, 그리고 그 자체로 물리적 핵산일 필요가 없다. 가령, 키메라 BMP는 2개의 상이한 부모 BMP; 또는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 BMP 및 다른 구성원, 또는 대안으로, 관계없는 단백질로부터 최소한 2개의 분절을 보유할 것이다. 키메라 단백질은 또한, 상이한 종류의 생명체에 의해 발현되는 단백질 구조 (동일한 또는 상이한 구성원 단백질)의 "종간 (interspecies)", "유전자간 (intergenic)" 등의 융합일 수 있다. 한 구체예에서, 2개의 분절은 새로운 키메라 단백질을 산출하기 위하여 연결된다. 다시 말하면, 단백질은 전장 부모 중에서 어느 한쪽의 동일한 서열을 보유하면, 키메라가 아닐 것이다. 키메라 단백질은 2개의 상이한 부모 단백질로부터 2개 이상의 분절을 포함할 수 있다. 가령, 키메라의 최종 키메라 또는 라이브러리를 산출하기 위하여 이들 도메인이 유래될 수 있는 2, 3, 4, 5, 6 또는 10-20개, 또는 그 이상의 부모가 존재할 수 있다. 각 부모 단백질의 분절은 매우 짧거나 또는 매우 길 수 있고, 이들 분절은 상기 단백질의 1개 내지 대략 전장의 인접 아미노산 길이 범위에서 변동할 수 있다. 한 구체예에서, 최소 길이는 5개 아미노산이다. 일반적으로, 이러한 분절 또는 하위도메인은 6개 하위도메인, 대안으로 5개 하위도메인 중에서 하나이다 (도 18과 19 참조). TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 6개 분절은 구성원 단백질 및/또는 다른 상동성 구성원 단백질에 대하여 정렬된 일차 아미노산 서열의 구조 체계에 기초하여 확인된다. 확인된 바와 같이, 구성원 단백질은 일반적으로, 키메라 조작 동안 정렬된 고유 TGF-베타 구성원 서열에 대한 변형을 최소화하기 위하여, 또는 대안으로, 변형을 극대화하기 위하여 도출된 분절에 기초하여 6가지 상이한 섹션 (대안으로, 5가지 상이한 섹션)으로 분류된다. 일반적으로, 도 18에서는 여러 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원 각각의 정렬된 서열 위에서 중복되는 상이한 분절의 상대적 위치를 도시한다. 수직선은 키메라를 산출하기 위한 도메인 간에 크로스-오버를 위한 일반적인 위치를 표시한다. 2개의 도메인 위에서 중복될 수 있는 아미노산은 수직선의 어느 한쪽 방향으로 플러스 또는 마이너스 대략 5개 아미노산 (또는 대안으로, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산)인 것으로 정의될 수 있다. 또한, 도 18에서는 키메라를 산출하는데 이용될 수 있는 추가의 연접부 (junction)를 확인하는 일단의 아미노산이 도시되고, 이들 아미노산은 상자로 표시된다. J1-J5 연접부는 크로스-오버 접점을 산출하는데 이용될 수 있는 TGF-베타 패밀리 단백질 전역에서 일반적인 보존의 위치이다. 비록 상대적으로 상이하긴 하지만, 이들 분절은 본래 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 치환(들), 삽입(들), 추가의 아미노산(들), 또는 기타 변형에 순응하는 특정 아미노산 서열 또는 본래 아미노산 서열을 포함할 수 있다. "순응하는"은 각 분절의 구조 완전성 (structural integrity)이 본래 서열의 도메인과 비교하여 유지된다는 것을 의미한다. 가령, TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 본 명세서에서 기술된 분절은 확인된 분절의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에서 10, 5, 3, 2, 또는 1개, 또는 바람직하게는 단지 1개의 아미노산이 전위할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명에서는 TGF-베타 구성원으로부터 최소한 하나의 분절 및 두 번째 TGF-베타 구성원으로부터 두 번째 분절의 융합을 포함하는 키메라 단백질을 제시하고, 여기서 첫 번째 분절은 두 번째 TGF-베타 구성원에 외래성이다. TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 단일 아단위에서 5-6개 하위도메인 (분절)을 뼈대 프레임워크로서 이용하여, 새로운(설계자) 서열은 상이한 TGF-베타 리간드로부터 분절을 그들이 자연에서 출현하는 순서와 동일한 순서로 혼합함으로써 재조합 방식으로 연결될 수 있다. 이러한 집합은 여러 상이한 표적 서열 중에서 하나와 부분적으로 유사하지만 임의의 자연 발생 서열과 명백하게 상이한 새로운 서열을 산출한다.

한 구체예에서, 단일 크로스오버 접점은 2개의 부모에 대하여 규정된다. 크로스오버 위치는 한 부모의 아미노산 분절이 어디서 끝나고, 그리고 다음 부모의 아미노산 분절이 어디서 시작되는 지를 규정한다. 따라서 간단한 키메라는 단지 하나의 크로스오버 위치를 보유할 것이고, 여기서 상기 크로스오버 위치 이전의 분절은 첫 번째 부모에 속할 것이고, 그리고 크로스오버 위치 이후의 분절은 두 번째 부모에 속할 것이다. 한 구체예에서, 키메라는 하나 이상의 크로스오버 위치, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-30개, 또는 그 이상의 크로스오버 위치를 보유한다. 특정 구체예에서, 부모 가닥은 4 또는 5개의 크로스오버 위치를 보유하는 것으로 규정된다. 이들 크로스오버 위치가 어떻게 명명되고 규정되는 지는 하기에 논의된다. 2개의 크로스오버 위치 및 2개의 부모가 존재하는 구체예에서, 첫 번째 부모로부터 첫 번째 인접 분절, 그 이후에 두 번째 부모로부터 두 번째 인접 분절, 그 이후에 첫 번째 부모로부터 세 번째 인접 분절이 존재할 것이다. 인접은 분절을 파괴하는 유의미한 것이 존재하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 이들 인접 분절은 연결되어 인접 아미노산 서열을 형성한다. 가령, 2개의 크로스오버를 보유하는, BMP-2 야생형 부모 가닥 및 액티빈 야생형 부모 가닥으로부터 유래된 BMP-2/액티빈 키메라는 BMP-2 또는 액티빈 중에서 하나로부터 첫 번째 분절, 첫 번째 가닥에 작동가능하게 연결되고 첫 번째 가닥의 구조적 모티프 하류를 포함하는 첫 번째 분절과 비교하여 마주보는 부모 가닥으로부터 두 번째 분절, 그리고 두 번째 분절과 비교하여 마주보는 부모 가닥으로부터 및 두 번째 가닥에 작동가능하게 연결되고 두 번째 가닥의 구조적 모티프 하류를 포함하는 첫 번째 분절과 동일한 부모 가닥으로부터 세 번째 분절 가닥을 포함하고, 이들 모두 하나의 인접 아미노산 사슬에서 연결될 것이다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 정확한 서열뿐만 아니라 키메라의 변이체가 존재한다. 다시 말하면, 보존성 아미노산 치환 (가령, 대략 1-10개의 보존성 아미노산 치환)이 키메라 내로 통합될 수 있다. 따라서 변이체 키메라이면, 각 분절은 최종 키메라 내에 100% 존재할 필요가 없다. 추가의 잔기, 또는 잔기의 제거 또는 변경을 통하여 변경될 수 있는 양은 용어 변이체가 정의되는 바에 따라서 정의될 것이다. 물론, 당업자가 인지하는 바와 같이, 상기 논의는 아미노산뿐만 아니라 이들 아미노산을 인코딩하는 핵산에도 적용된다.

"보존성 아미노산 치환"은 유사한 측쇄를 보유하는 잔기의 교체가능성 (interchangeability)을 지칭하고, 따라서 전형적으로, 폴리펩티드 내에서 아미노산의 동일한 또는 유사한 정의된 부류 내에 아미노산으로의 치환을 수반한다. 실례로써, 그리고 제한 없이, 지방족 측쇄를 보유하는 아미노산은 다른 지방족 아미노산, 예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 그리고 메티오닌으로 치환될 수 있다; 히드록실 측쇄를 보유하는 아미노산은 히드록실 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를 들면, 세린 및 트레오닌으로 치환된다; 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산은 방향족 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 그리고 히스티딘으로 치환된다; 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산은 염기성 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를 들면, 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘으로 치환된다; 산성 측쇄를 보유하는 아미노산은 산성 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를 들면, 아스파르트산 또는 글루타민산으로 치환된다; 그리고 소수성 또는 친수성 아미노산은 각각, 다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 치환된다.

"비-보존성 치환"은 폴리펩티드 내에서 아미노산의 현저하게 상이한 측쇄 특성을 갖는 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 비-보존성 치환은 정의된 군 내에서보다는 이들 군 간에 아미노산을 이용할 수 있고, 그리고 (a) 치환 (가령, 글리신에 대하여 프롤린)의 부위에서 펩티드 골격의 구조, (b) 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 준다. 실례로써, 그리고 제한 없이, 예시적인 비-보존성 치환은 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환된 산성 아미노산; 작은 아미노산으로 치환된 방향족 아미노산; 그리고 소수성 아미노산으로 치환된 친수성 아미노산일 수 있다.

"참고 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 이용되는 정의된 서열을 지칭한다. 참고 서열은 더욱 큰 서열의 부분집합, 예를 들면, 전장 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 분절일 수 있다. 일반적으로, 참고 서열은 최소한 20개 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 길이, 최소한 25개 잔기 길이, 최소한 50개 잔기 길이, 또는 핵산 또는 폴리펩티드의 전장일 수 있다.

2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 각각, (1) 이들 두 서열 간에 유사한 서열 (즉, 완전한 서열의 일부분)을 포함하고, 그리고 (2) 이들 두 서열 간에 다른 서열을 더욱 포함할 수 있기 때문에, 2개 (또는 그 이상의) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이에 서열 비교는 전형적으로, 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위하여 "비교 윈도우" 위에서 이들 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 비교함으로써 수행된다.

"서열 동일성"은 2개의 아미노산 서열이 비교 윈도우 위에서 실질적으로 동일 (즉, 아미노산-아미노산 기초에서)하다는 것을 의미한다. 용어 "서열 유사성"은 동일한 생물물리학적 특징을 공유하는 유사한 아미노산을 지칭한다. 용어 "서열 동일성의 비율" 또는 "서열 유사성의 비율"은 비교 윈도우 위에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 잔기 (또는 유사한 잔기)가 양쪽 폴리펩티드 서열 내에서 발생하는 위치의 숫자를 결정하여 정합된 위치의 숫자를 산출하고, 비교 윈도우 내에서 위치의 총수 (즉, 윈도우 크기)로 정합된 위치의 숫자를 나눗셈하고, 그리고 획득된 결과를 100으로 곱셈하여 서열 동일성의 비율 (또는 서열 유사성의 비율)을 산출함으로써 계산된다. 폴리뉴클레오티드 서열에 관하여, 용어 서열 동일성 및 서열 유사성은 단백질 서열에 대하여 기술된 바와 필적하는 의미를 갖는데, 용어 "서열 동일성의 비율"은 2개의 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 윈도우 위에서 동일 (뉴클레오티드-뉴클레오티드 기초에서)하다는 것을 지시한다. 따라서 폴리뉴클레오티드 서열 동일성의 비율 (또는 분석 알고리즘에 기초하여, 예로써 침묵 치환 또는 기타 치환에 대한 폴리뉴클레오티드 서열 유사성의 비율) 역시 계산될 수 있다. 최대 상응도 (maximum correspondence)는 본 명세서에서 기술된 서열 알고리즘 (또는 당업자에게 가용한 다른 알고리즘) 중에서 한 가지를 이용함으로써, 또는 시각 검사에 의해 결정될 수 있다.

폴리펩티드에 적용될 때, 용어 실질적인 동일성 또는 실질적인 유사성은 예로써 디폴트 갭 가중치 (default gap weight)를 이용한 프로그램, BLAST, GAP 또는 BESTFIT에 의해, 또는 시각 검사에 의해 최적으로 정렬될 때, 2개의 펩티드 서열이 서열 동일성 또는 서열 유사성을 공유한다는 것을 의미한다. 유사하게, 2개 핵산의 맥락에서 적용될 때, 용어 실질적인 동일성 또는 실질적인 유사성은 예로써 디폴트 갭 가중치 (하기에 상세하게 기술됨)를 이용한 프로그램, BLAST, GAP 또는 BESTFIT에 의해, 또는 시각 검사에 의해 최적으로 정렬될 때, 2개의 핵산 서열이 서열 동일성 또는 서열 유사성을 공유한다는 것을 의미한다.

서열 동일성 또는 서열 유사성 비율을 결정하는데 적합한 알고리즘의 한 가지 실례는 FASTA 알고리즘인데, 이는 Pearson, W. R. & Lipman, D. J., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; 또한 W. R. Pearson, (1996) Methods Enzymology 266:227-258에서 설명된다. 동일성 비율 또는 유사성 비율을 계산하기 위하여 DNA 서열의 FASTA 정렬에 이용되는 바람직한 파라미터는 최적화된다: BL50 매트릭스 (matrix) 15: -5, k-tuple=2; 연결 페널티 (joining penalty)=40, 최적화 (optimization)=28; 갭 페널티 (gap penalty) -12, 갭 길이 페널티 (gap length penalty)=-2; 그리고 너비=16.

유용한 알고리즘의 다른 실례는 PILEUP이다. PILEUP은 상관관계 및 서열 동일성 비율 또는 서열 유사성 비율을 보여주는 점진적 쌍별 정렬을 이용하여, 일군의 관련된 서열로부터 복합 서열 정렬을 산출한다. 이는 또한, 이러한 정렬을 산출하는데 이용되는 집락화 상관관계 (clustering relationship)를 보이는 트리 (tree) 또는 덴드로그램 (dendogram)을 플롯팅 (plotting)한다. PILEUP는 Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360의 점진적 정렬 방법의 단순화 (simplification)를 이용한다. 이용되는 방법은 Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989에서 설명된 방법과 유사하다. 상기 프로그램은 최대 300개의 서열을 정렬할 수 있고, 각각의 최대 길이는 5,000개 뉴클레오티드 또는 아미노산이다. 이러한 복합 정렬 절차는 2개의 가장 유사한 서열의 쌍별 정렬로 시작되고, 2개의 정렬된 서열의 집락을 산출한다. 이러한 집락은 이후, 정렬된 서열의 그 다음 가장 관련된 서열 또는 집락에 정렬된다. 2개의 서열 집락은 2개의 개별 서열의 쌍별 정렬의 단순한 확장에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 점진적, 쌍별 정렬에 의해 달성된다. 상기 프로그램은 서열 비교의 영역에 대한 특정한 서열 및 그들의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정하고, 그리고 프로그램 파라미터를 지정함으로써 실행된다. PILEUP를 이용하여, 참고 서열은 아래의 파라미터: 디폴트 갭 가중치 (default gap weight) (3.00), 디폴트 갭 길이 가중치 (default gap length weight) (0.10), 그리고 가중된 최후 갭 (weighted end gap)을 이용하여, 서열 동일성 비율 (또는 서열 유사성 비율) 상관관계를 결정하기 위하여 다른 검사 서열에 비교된다. PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들면, version 7.0 (Devereaux et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:387-395)으로부터 획득될 수 있다.

복합 DNA 및 아미노산 서열 정렬에 적합한 알고리즘의 다른 실례는 CLUSTALW 프로그램 (Thompson, J. D. et al., (1994) Nuc. Acids Res. 22:4673-4680)이다. CLUSTALW는 서열의 군 간에 복합 쌍별 비교를 수행하고 서열 동일성에 기초하여 이들을 복합 정렬로 집합시킨다. 갭 열림 페널티 (Gap open penality) 및 갭 확장 페널티 (Gap extension penalty)는 각각, 10과 0.05이었다. 아미노산 정렬의 경우에, BLOSUM 알고리즘이 단백질 가중치 매트릭스로서 이용될 수 있다 (Henikoff and Henikoff, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919).

도 18에서는 예로써, 다수의 TGF-베타 패밀리 구성원의 정렬을 도시한다. 당업자는 이러한 정렬로부터, 패밀리 전역에서 보존되는 아미노산, 그리고 보존되지 않는 아미노산을 용이하게 결정할 수 있다.

"기능적"은 예로써, 리간드 또는 동계 (cognate) 분자에 결합하는 능력, 또는 특정 생물학적 기능을 유도하는 (가령, 근육 성장, 골 성장 등을 촉진하는) 능력에 의해 판단될 때, 동일 유형의 자연-발생 단백질의 고유 생물학적 활성, 또는 임의의 특정한 원하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.

전환 성장 인자 - 베타 (TGF-β) 슈퍼패밀리의 단백질은 매우 다양한 인간 세포에서 관찰되는 세포외 사이토킨으로 구성된다. ~40개인 TGF-β 슈퍼패밀리 리간드는 TGF-β, 골형성 단백질 (BMP), 액티빈과 인히빈, 성장과 분화 인자 (GDF), Nodal, 뮐러관 저해 물질 (Mullerian Inhibiting Substance, MIS), 그리고 아교세포주-유래된 신경영양성 인자 (GDNF)를 비롯한 더욱 작은 패밀리로 구분될 수 있다. TGF-β 슈퍼패밀리 구성원은 다양한 범위의 세포 유형에서 관찰되고, 그리고 등배 패턴화 (dorsal/ventral patterning) 및 좌우 축 결정 (left/right axis determination)에서부터 골 형성 및 조직 수복까지 많은 근본적 세포 현상에서 일정한 역할을 한다. 더욱 최근에, 여러 TGF-β 리간드는 줄기 세포의 유지에 관여하거나, 또는 줄기 세포의 분화를 주동하는 것으로 밝혀졌다. 편재 (pervasiveness)로 인하여, TGF-β 리간드 신호전달의 조절은 골격과 근육 비정상에서부터 다수의 신생물 현상 (neoplastic event)까지 넓은 범위의 상이한 질환의 치료에 희망적이다. 이러한 패밀리 또는 단백질의 다양한 구성원에 대한 예시적인 서열이 본 명세서에서 제시되긴 하지만, 당업자는 단어 검색 또는 서열 BLAST 검색에 의해 공개적으로 가용한 데이터베이스를 이용하여 동족체 (homolog) 및 변이체 (variant)를 용이하게 확인할 수 있다.

분화 인자 (가령, Vg-1), 호르몬 액티빈과 인히빈, 뮐러관 저해 물질 (MIS), 골원성과 골형성 단백질 (가령, OP-1, OP-2, OP-3, 기타 BMP), 발달 조절된 단백질 Vgr-1, 성장/분화 인자 (가령, GDF-1, GDF-3, GDF-9 및 dorsalin-1) 등뿐만 아니라 TGF-베타 (TGF-β1-β5)의 슈퍼패밀리 내에 일반적으로 인정되는 여러 서브패밀리가 존재한다. 예로써, Spom and Roberts (1990) in Peptide Growth Factors and Their Receptors, Sporn and Roberts, eds., Springer-Verlag: Berlin pp. 419-472; Weeks and Melton (1987) Cell 51: 861-867; Padgett et al. (1987) Nature 325: 81-84; Mason et al. (1985) Nature 318: 659-663; Mason et al. (1987) Growth Factors 1: 77-88; Cate et al. (1986) Cell 45: 685-698; PCT/US90/05903; PCT/US91/07654; PCT/WO94/10202; U.S. Pat. Nos. 4,877,864; 5,141,905; 5,013,649; 5,116,738; 5,108,922; 5,106,748; 그리고 5,155,058; Lyons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4554-58; McPherron et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3444-3449; Basler et al.(1993) Cell 73: 687-702를 참조한다.

TGF-베타 슈퍼패밀리의 골형성 단백질에는 포유동물 골원성 단백질-1 (OP-1, 일명 BMP-7), 골원성 단백질-2 (OP-2, 일명 BMP-8), 골원성 단백질-3 (OP3), BMP-2 (일명, BMP-2A 또는 CBMP-2A, 그리고 초파리 동족체 DPP), BMP-3, BMP-4 (일명, BMP-2B 또는 CBMP-2B), BMP-5, BMP-6과 이의 뮤린 동족체 Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3 (일명, Vgr2), GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (일명, CDMP-1 또는 MP52), GDF-6 (일명, CDMP-2 또는 BMP13), GDF-7 (일명, CDMP-3 또는 BMP-12), 개구리 동족체 Vgl와 NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL 등이 포함된다.

많은 TGF-β 슈퍼패밀리 리간드와 관련된 연구에서 한 가지 중요한 장애물은 이들 단백질을 상당한 양으로 산출하는 능력 없음이었다. BMP-2가 시험관내에서 효율적으로 재접힘되는 것으로 알려져 있긴 하지만, 다른 TGF-β 리간드 (가령, 액티빈, Nodal, 그리고 BMP-7)는 동일한 재접힘 특성을 나타내지 않았다. 기능적 TGF-β 리간드를 획득하기 위하여 다른 발현 시스템이 가용하다. 액티빈은 예로써, 안정되게 형질감염된 세포주, 예를 들면, CHO 또는 일시적으로 형질감염된 세포주, 예를 들면, HEK293 세포를 이용하여 발현된다.

TGF-β 슈퍼패밀리의 최대 하위-패밀리는 BMP/GDF 패밀리인데, 이는 모든 공지된 리간드의 거의 절반을 차지한다. BMP/GDF 패밀리에서 많은 리간드는 BMP와 GDF 명칭 둘 모두를 공유한다, 가령, GDF-7은 BMP-12로도 지칭된다. BMP/GDF 패밀리는 최대 패밀리일 뿐만 아니라, 가장 폭넓게 조사된 패밀리이다. 가령, x-선 결정 구조는 단독으로, I형 수용체에 결합된, 또는 양쪽 수용체 유형에 결합된 삼원 복합체 (ternary complex)로서 BMP-2에 대하여 설명되었다. 부가적으로, BMP-2는 BMP-7과 함께, 일정한 골 손상에 대한 효과적인 치료제로서 이용되고 있다. BMP/GDF 패밀리와 관련된 최대량의 구조 및 치료 연구의 이유 중에서 한 가지는 이들 리간드를 화학적으로 재접힘하는 능력이었다. 실제로, BMP-2는 재접힘에서 가장 성공적인 TGF-β 리간드 중에서 하나인데, 최적화된 조건에서 출발 물질로부터 최대 63% 활성 이합체가 산출되는 것으로 보고되었다. 하지만, BMP-2의 특정한 아미노산이 다른 TGF-β 리간드 내로 통합될 수 있으면, 이는 그렇지 않으면 비-재접힘 리간드가 재접힘되도록 함으로써 TGF-β 슈퍼패밀리의 나머지 구성원이 더욱 효과적으로 조사될 수 있도록 할 것이다.

TGF-β 리간드는 프로테아제 절단 부위에 의해 연결된 N-말단 프로-도메인 및 C-말단 성숙 도메인으로 구성되는 비활성 전구체 분자로서 합성된다. 활성화되기 위하여, 성숙 도메인은 통상적으로 전환효소 (convertase), 예를 들면, 푸린 (furin)에 의해 프로-도메인으로부터 절단되어야 한다. TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원은 그들의 성숙 도메인 내에서 관찰되는 보존된 구조 체계로 인하여 함께 분류된다. 일반적으로, 각 성숙 리간드 단위체는 7개의 시스테인을 보유하고, 이들 중에서 6개는 '시스틴 결절 (cystine knot)' 모티프 내에 배열된 3개의 내부 이황화 결합 (intra-disulfide bond)을 형성한다. '시스틴 결절'로부터 4개의 베타 가닥이 뻗어나가 2개의 굽은 핑거를 발생시킨다. 마지막 남아있는 시스테인은 두 번째 리간드 단위체와 외부-이황화 결합을 형성하고 공유 연결된 이합체를 산출한다. 이러한 이합체는 '시스틴 결절'을 몸체로 하고 핑거가 날개처럼 뻗어나가는 전반적으로 나비의 외형을 갖는다. TGF-β 슈퍼패밀리에 대한 기능적 아단위는 상기 이합체이고, 그리고 이들은 생체내에서 동종-과 이종이합체 둘 모두로서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 일부 패밀리 구성원, 예를 들면, GDF-9와 BMP-15는 외부-이황화 결합을 형성하기 위하여 요구되는 시스테인이 부재하지만 여전히 안정된 이합체를 형성할 수 있다.

신호전달 과정을 개시하기 위하여, TGF-β 이합체는 I형과 II형으로 명명된 2가지 세트의 수용체를 동원해야 한다. 이들 수용체는 3-핑거 독소 접힘 (toxin fold)으로 정연된 세포외 도메인 (ECD), 단일 막통과 도메인, 그리고 대형 세포내 키나아제 도메인을 보유하는 세린/트레오닌 키나아제이다. TGF-β 리간드는 상이한 수용체 유형에 대한 그들의 친화성에서 선호 (preference)를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 액티빈 및 Nodal은 II형 수용체에 대한 높은 친화성을 나타내는 반면, BMP-2 및 GDF-5는 I형 수용체에 대한 더욱 높은 친화성을 갖는다. TGF-β 리간드에 2개의 높은 친화성 수용체의 결합 이후에, 2개의 더욱 낮은 친화성 수용체가 상기 복합체에 결합하고 합류할 수 있다. 4개의 수용체 모두 TGF-β 리간드에 결합하면, 6-구성원 삼원 복합체가 형성되고, 그리고 하류 신호전달 캐스케이드가 개시된다. 구조성으로 활성 II형 수용체는 I형 수용체를 인산화시키고, 이들은 차례로, Smad로 불리는 세포내 신호전달 분자에 결합하고 이들을 인산화시킨다. Smad 분자는 이후, 핵으로 전위 (translocation)할 수 있고, 그리고 전사 조절자와 직접적으로 상호작용한다. 이러한 캐스케이드의 상이한 단계에서 TGF-β 신호전달을 면밀히 조절하기 위하여 복합 기전이 이용된다: 노긴 (noggin), 폴리스타틴 (follistatin), 그리고 인히빈 (inhibin)을 비롯한 세포외 길항약; BAMBI와 유사한, 세포내 키나아제 도메인이 없는 슈도-수용체; 또는 세포내 분자, 예를 들면, 저해 Smad.

TGF-β 슈퍼패밀리는 이들 리간드에 대한 수용체에 의한 높은 정도의 무분별한 결합 (promiscuity)을 보인다. 40개 이상의 TGF-β 리간드가 존재하는 반면, 단지 12개의 수용체 (7개의 I형 및 5개의 II형)가 존재한다. 이런 이유로, 수용체는 다수의 상이한 리간드와 상호작용할 수 있어야 한다. 가령, ActRII는 높은 친화성으로 액티빈 및 BMP-7에 결합하는 것으로 알려져 있지만, 훨씬 낮은 친화성으로 BMP-2에 결합한다. GDF-5에서, 이의 I형 수용체 선호를 결정하는 단일 아미노산이 밝혀졌고, BMP-3에서 II형 수용체 친화성을 변경하고 상기 리간드에 기능을 부여하는 단일 점 돌연변이가 발견되었다. 본 발명에서는 신규한 수용체 결합 특성을 갖고, 따라서 TGF-β 리간드 기능이 다양화된 변형된 TGF-β 리간드, 그리고 이런 활성을 갖는 조성물을 산출하는 방법을 제시한다.

본 발명은 신규한 리간드 구조체를 이용함으로써 TGF-베타 신호전달 복합체를 설명한다. 합성된 키메라 동종- 또는 이종이합체성 리간드를 이용하여, 본 발명에서는 TGF-베타 패밀리 단백질의 신호전달을 분석하는데 이용되는 조성물을 제시한다. 더 나아가, 이런 리간드의 이용은 서로로부터 인터페이스에 위치하는 2개의 I형 수용체, 그리고 서로로부터 인터페이스에 위치하는 2개의 II형 수용체의 기여를 구별하는 방법을 가능하게 한다. 본 발명의 방법과 조성물은 리간드-수용체 친화성, 신호전달 활성, 그리고 생물학적 활성 사이에 상관을 증명한다. 본 발명의 방법과 조성물은 TGF-베타 슈퍼패밀리 신호전달 복합체 집합의 기전 및 필요 조건을 명백히 한다. 이에 더하여, 이들 키메라 리간드는 TGF-β 패밀리의 단백질과 연관된 질환과 장애를 치료하는데 이용되는 신규한 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명에서는 예로써, 대장균 (E. coli) 또는 포유동물 발현 시스템을 이용하여 발현되고 재접힘되는 능력을 갖는 신규한 키메라 TGF-β 리간드를 만드는 방법을 제시한다. 이들 키메라는 특정한 TGF-β 리간드의 신호전달 특징을 모방하거나, 또는 자연에서 관찰되지 않는 독특한 신호전달 특성을 나타낸다. 한 구체예에서, 본 발명에서는 BMP-2의 재접힘 효율 및 액티빈-βA의 신호전달 특성을 갖는 액티빈/BMP-2 키메라를 산출하기 위한 주형 (template)을 액티빈-βA 및 BMP-2를 이용한다; 하지만, 다수의 TGF-베타 단백질 패밀리 구성원이 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 키메라 설계 계획은 비자연적인 신호전달 특징 및 생물학적 활성을 갖는 추가의 TGF-베타 구성원 키메라 (가령, 액티빈/BMP-2) 리간드를 산출하였다. 이런 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 구조 연구에 가용한 TGF-β 리간드의 라이브러리를 확장하고 치료제로서 신규한 TGF-β 리간드의 개발을 용이하게 한다.

한 구체예에서, 본 발명에서는 독특한 신호전달 특성을 갖는 일련의 액티빈/BMP-2 키메라 리간드를 제공한다. 가령, 본 발명의 액티빈/BMP-2 리간드는 야생형 BMP-2의 재접힘 특징을 나타내면서, 액티빈-유사 신호전달 속성을 시험관내 및 생체내 연구 둘 모두에서 유지하였다. 게다가, 야생형 BMP-2보다 강력하고 BMP 길항약 노긴에 의해 저해되지 않는 '슈퍼' 리간드가 산출되었다. 본 발명에서는 또한, 상이한 TGF-β 리간드 폴리펩티드 분절에 작동가능하게 연결된 야생형 BMP-2mq의 N-말단을 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩티드를 제시한다. 본 발명에서는 야생형 BMP-2mq의 N-말단 부분이 기존의 비-재접힘 리간드를 재접힘가능 리간드로 전환시키는데 충분하다는 것을 증명한다. 이들 조사 결과는 액티빈 및 다른 TGF-β 리간드 모방체를 획득하기 위한 방법을 명백히 하고, 그리고 그들의 기능성을 다양화함으로써 TGF-β 리간드의 라이브러리를 확대하고 치료 목적의 비자연적인 리간드의 개발을 증진하는데 이러한 전략이 어떻게 이용될 수 있는 지를 지시한다.

BMP-2 및 자연 발생 변이체의 핵산 서열 및 폴리펩티드 서열은 공지되어 있다. 쥐 (Rattus sp.)로부터 야생형 BMP-2 핵산 서열 (서열 번호 1) 및 폴리펩티드 (서열 번호 2)가 제시된다. 잔기 1의 N-말단 위치에서 Met (Q)는 세균 개시 코돈 (ATG)의 번역에 기인한다. 더 나아가, 액티빈 역시 당분야에 공지되어 있다 (참조: 서열 번호 5). 본 발명에서는 BMP-2로부터 최소한 하나의 N-말단 도메인 및 다른 TGF-베타 패밀리 구성원으로부터 최소한 하나의 두 번째 도메인을 보유하는 다수의 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 제시하고, 여기서 이들 키메라 폴리펩티드는 야생형 부모 단백질과 상이한 활성을 보인다.

한 구체예에서, 키메라 분절의 설계를 꾀할 때, 2가지 인자가 고려되었다. 첫 번째는 구조적 고려이었다. 전체 TGF-β 단위체 접힘은 자연적으로 6개 섹션으로 분류된다: 베타 가닥 1과 2, 전나선 (pre-helix) 루프, 알파 나선 1, 그리고 베타 가닥 3과 4. 이들 하위도메인의 확인과 특성화는 실시예 4에서 더욱 기술된다. 본 발명에서는 이러한 설계에서 이들 자연 영역을 모방하는 키메라 구조를 이용하였다. 따라서 각 분절은 1, 2, 3, 4, 5, 그리고 6으로 표시될 수 있다. 두 번째 고려는 키메라 조작 동안 정렬된 고유 TGF-베타 구성원 서열에 변경을 최소화시키는 것이었다. 이런 이유로, 이들 두 단백질 서열 사이에 서열 동일성을 갖는 영역은 추정 크로스-오버 접점으로서 확인되었다. 이들 영역은 PCR 전략을 위한 DNA 서열 내에 중복에 적합하고 자연 서열에 대한 임의의 변화를 최소화시킬 것이다. 도 7에서는 이들 고려 대상의 서열 및 구조를 도시한다. 이들 영역은 상자로 표시되고 그들의 섹션에 따라서 넘버링 (numbering)되고, 그리고 리간드 단위체 상에 맵핑 (mapping)된다. 분절 경계로서 크로스-오버 접점에 이용될 수 있는 구역은 서열 범위로서 오렌지색으로 바림된다. 한 구체예에서 잔기 넘버링은 BMP-2 (서열 번호 2)에 기초된다. 따라서 본 발명의 키메라 폴리펩티드를 산출하기 위한 크로스-오버 접점은 상기 서열의 분절 내에서 구조적 모티프의 변화 간에 최소한 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성과 연합하여, 유사한 구조적 모티프들을 확인함으로써 확인될 수 있다. 이들 영역에서 크로스-오버 (3개 내지 20개 아미노산일 수 있다)는 결과의 키메라 폴리펩티드의 파괴를 최소화시켜 안정화된 키메라를 제공한다.

가령, 알고리즘 1b2b3b4b5b6a를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 6개 분절을 지시하고, 상기 문자는 각 분절의 부모 가닥을 지시한다. 따라서 실례 "1b2b3b4b5b6a"에서, 분절 1은 BMP-2mq에 대한 부모 가닥 "b"로부터 유래되고, 분절 2는 BMP-2mq에 대한 부모 가닥 "b"로부터 유래되고, 분절 3은 BMP-2mq에 대한 부모 가닥 "b"로부터 유래되고, 분절 4는 BMP-2mq에 대한 부모 가닥 "b"로부터 유래되고, 분절 5는 BMP-2mq에 대한 부모 가닥 "b"로부터 유래되고, 그리고 분절 6은 액티빈에 대한 부모 가닥 "a"로부터 유래된다.

한 구체예에서, BMP-2mq 및 두 번째 TGF-베타 패밀리 단백질의 분절 간에 크로스오버는 구조적 유사성 및 서열 유사성이 중복되는 경우에 발생할 수 있다. 도 7에서는 BMP-2mq 및 액티빈 사이에 이런 중복을 도시하고, 여기서 크로스오버는 대략 잔기 D25-P35, G45-P48; T65-N68; K76-T82; 그리고 S88-E94 (잔기 넘버링은 BMP-2 (서열 번호 2)에 기초된다) 사이에 발생될 수 있다. BMP-2 및 액티빈-βA의 서열 정렬은 분절 1 내지 6의 경계를 명백히 한다. 액티빈은 2개의 Cys 간에 형성된 추가의 이황화 결합을 보유한다. 적색 상자 (또는 아래쪽 서열에서 첫 번째 발림된 상자)는 AB2-008 내로 스와핑 (swapping)된 AB2-009의 2개 아미노산을 지시한다. 청색 상자 (아래쪽 선에서 두 번째 발림된 상자 L/Y)는 모든 키메라에 대한 BMP2의 분절 5에서 변화된 1개 아미노산을 지시한다. 명료함을 위하여, BMP-2의 분절 5는 YLD 대신에 YYD를 포함한다. 녹색 (KKQ-FFVSFKDI) 상자는 AB2-010를 만들기 위하여 AB2-008 내로 도입된 분절을 지시하고 AB2-010의 (1a_II)로서 표시된다.

도 18에서는 TGF-β 패밀리 또는 단백질의 추가의 구성원과 관련하여 이런 크로스오버 영역을 더욱 도시한다. 가령, 도 18과 관련하여, 당업자는 BMP-3 (서열 번호 43)이 110개의 아미노산을 포함한다는 것을 확인할 수 있다. 첫 번째 수직선은 크로스오버의 일반적인 영역을 설명하고 수직선의 어느 한쪽 측면에서 1-5개의 아미노산을 포함할 수 있다. 따라서 BMP-3으로부터 첫 번째 도메인은 아미노산 1 내지 대략 x₁을 포함할 수 있고, 여기서 x₁은 잔기 20-29에 상응하는 아미노산이다 (가령, x1은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29이다). 도 18에 더욱 도시된 바와 같이, "J1"은 서열 번호 43의 잔기 20-23에 상응한다. J1은 다양한 종에 걸쳐서 TGF-β 패밀리의 단백질 내에 보존된 연접부 영역을 지칭한다. 따라서 BMP-3의 첫 번째 도메인은 아미노산 1 내지 대략 x₁을 포함하고, 여기서 x₁은 V 또는 G이고, 그리고 두 번째 TGF-β 패밀리 구성원으로부터 그 다음 키메라 도메인은 G 또는 W로 시작할 것이다. 도 18을 주형으로서 이용하여, 당업자는 TGF-β 패밀리의 다양한 구성원에 대한 크로스-오버 영역 (또는 연접부 접점)을 용이하게 확인할 수 있다. 6개의 상이한 도메인을 보유하기 위하여 모든 키메라가 필요하지는 않다는 점에 주목하는 것이 중요하다. 가령, 연접부 3 (J3)에서 크로스오버는 반드시, 상이한 패밀리 구성원으로부터 단지 5개 이하의 도메인이 최종 키메라 내에 존재해야 하는 것은 아니다.

크로스오버 위치를 확인하는 다른 방법이 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드의 산출에 이용될 수 있다. 가령, SCHEMA는 상동성 단백질의 어떤 단편이 이들 단백질의 구조 완전성에 영향을 주지 않으면서 재조될 수 있는 지를 예측하는 컴퓨터 기초된 방법이다 (참조: Meyer et al., (2003) Protein Sci., 12:1686-1693). 더욱 높은 안정성을 갖는 키메라는 서열-안정성 데이터의 선형 회귀 (linear regression)의 이용에 의해, 또는 접힘된 단백질 대(對) 접힘되지 않은 단백질의 MSA의 컨센서스 분석에 대한 의존에 의해, 전체 안정성에 대한 각 분절의 부가적 기여를 결정함으로써 확인가능하다. SCHEMA 재조합은 이들 키메라가 생물학적 기능을 유지하고, 그리고 중요한 기능적 잔기를 보존하면서 관용성 잔기를 교체함으로써 높은 서열 다양성을 나타내도록 담보한다.

본 명세서에서 제시된 바와 같이, 이들 재조합된 기능적 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드가 산출될 때, 재조합되지 않은 부모 폴리펩티드와 비교하여, 그들의 리간드 특이성이 향상될 수 있거나, 또는 생물학적 활성이 변경되거나 향상될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 활성/리간드 프로필에서 차이로 인하여, 이들 조작된 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 리간드 특이적 활성화와 저해를 위한 활성물질을 스크리닝 (screening)하고, 그리고 신규한 치료 폴리펩티드 및 연구 시약을 제공하기 위한 독특한 기초를 제공한다.

가령, 본 발명의 키메라에서, 도메인 1, 2, 3, 4, 5, 그리고 6은 아래의 서열 (표 A)로부터 선택될 수 있고, 여기서 상기 폴리펩티드는 구조 (도메인 1-도메인 2-도메인 3-도메인 4-도메인 5-도메인 6)를 포함한다:

일부 구체예에서, 도메인 3은 도메인 2, 도메인 4, 또는 도메인 3과 4 둘 모두와 동일한 부모로부터 유래될 수 있다.

일부 구체예에서, 도메인 1과 도메인 2 사이에 J1 (연접부 1)은 컨센서스 서열 Z₁Z₂W를 포함하고, 여기서 Z₁은 L, V, F 및 M으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 Z₂는 G 또는 K이고, 여기서 이들 3개의 아미노산 중에서 2개는 첫 번째 도메인의 C-말단 또는 두 번째 도메인의 N-말단에서 관찰된다. 일부 구체예에서, 도메인 2와 도메인 3 사이에 J2 (연접부 2)는 컨센서스 서열 CZ₁G를 포함하고, 여기서 Z₁은 H, S, A, L, I, E, K, Q 및 D로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 이들 3개의 아미노산 중에서 2개는 두 번째 도메인의 C-말단 또는 세 번째 도메인의 N-말단에서 관찰된다. 일부 구체예에서, 도메인 3과 도메인 4 사이에 J3 (연접부 3)은 컨센서스 서열 Z₁Z₂Z₃을 포함하고, 여기서 Z₁은 T, S, P, G 및 I로 구성된 군에서 선택되고, Z₂는 N, K, V, M, H 및 Y로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 Z₃은 H, Y, S, T 및 P로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 이들 3개의 아미노산 중에서 2개는 세 번째 도메인의 C-말단 또는 네 번째 도메인의 N-말단에서 관찰된다. 일부 구체예에서, 도메인 4와 도메인 5 사이에 J4 (연접부 4)는 컨센서스 서열 Z₁CZ₂를 포함하고, 여기서 Z₁은 C, S 및 V 군에서 선택되고, 그리고 Z₂는 V, A, I 및 T로 구성된 군에서 선택되고, 여기서 이들 3개의 아미노산 중에서 2개는 네 번째 도메인의 C-말단 또는 다섯 번째 도메인의 N-말단에서 관찰된다. 일부 구체예에서, 도메인 5와 도메인 6 사이에 J5 (연접부 5)는 컨센서스 서열 Z₁Z₂Z₃을 포함하고, 여기서 Z₁은 L, R 및 V로 구성된 군에서 선택되고, Z₂는 T, Q, Y, F 및 M으로 구성된 군에서 선택되고, 그리고 Z₃은 L, F, Y, K, I, Q, V 및 T로 구성된 군에서 선택되고, 여기서

이들 3개의 아미노산 중에서 2개는 다섯 번째 도메인의 C-말단 또는 여섯 번째 도메인의 N-말단에서 관찰된다.

한 구체예에서, 본 발명에서는 증가된 또는 향상된 생물학적 활성 (가령, 비활성화에 대한 내성 등)을 갖는 본 발명의 키메라를 형성하기 위하여 재조합될 수 있는 각각의 TGF-베타 패밀리 구성원에 대한 아래의 도메인 (표 B)을 제시한다.

따라서 본 명세서에서 다양한 구체예에 의해 예시된 바와 같이, 본 발명에서는 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 제시하고, 여기서 첫 번째 TGF-베타 패밀리 단백질 (즉, 첫 번째 부모 단백질)은 키메라 폴리펩티드를 제공하기 위하여 두 번째 상이한 TGF-베타 패밀리 단백질과 재조합된다. 하기 표 2에서는 예시적인 본 발명의 키메라 폴리펩티드를 제시한다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는 BMP-2 단백질의 하나 이상의 도메인을 포함하고, 여기서 BMP-2 단백질의 이들 분절은 BMP-2의 C-말단에 상응하는, 분절 1: 서열 번호 2의 아미노산 잔기 대략 1 내지 대략 x₁ ("1b"); 분절 2: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₁ 내지 대략 x₂ ("2b"); 분절 3: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₂ 내지 대략 x₃ ("3b"); 분절 4: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₃ 내지 대략 x₄ ("4b"); 분절 5: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₄ 내지 대략 x₅ ("5b"); 그리고 분절 6: 서열 번호 2의 대략 아미노산 잔기 x₅ 내지 대략 x₆ ("6b")을 포함하고; 그리고 여기서 x₁은 서열 번호 2의 잔기 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35이고; x₂는 서열 번호 2의 잔기 45, 46, 47, 또는 48이고; x₃은 서열 번호 2의 잔기 65, 66, 67, 또는 68이고; x₄는 서열 번호 2의 잔기 76, 77, 78, 79, 80, 81 또는 82이고; x₅는 서열 번호 2의 잔기 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94이고; 그리고 x₆은 서열 번호 2의 잔기 112, 113, 또는 114이고, 따라서 분절 1b2b3b4b5b6b를 포함하는 연속 폴리펩티드는 번역 개시 코돈 (ATG) 이후에 야생형 BMP-2를 포함한다. 상기 서열에 대한 동족체 및 최소한 대략 80%, 90%, 95%, 98%, 그리고 99% 동일성을 갖는 단백질 역시 본 발명에 포함된다.

다른 구체예에서, 폴리펩티드는 액티빈 단백질의 하나 이상의 도메인을 포함하고, 여기서 액티빈 단백질의 분절은 액티빈의 C-말단에 상응하는, 분절 1: 서열 번호 5의 아미노산 잔기 대략 1 내지 대략 x₁ ("1a"); 분절 2: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₁ 내지 대략 x₂ ("2a"); 분절 3: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₂ 내지 대략 x₃ ("3a"); 분절 4: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₃ 내지 대략 x₄ ("4a"); 분절 5: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₄ 내지 대략 x₅ ("5a"); 그리고 분절 6: 서열 번호 5의 대략 아미노산 잔기 x₅ 내지 대략 x₆ ("6a")을 포함하고; 그리고 여기서 x₁은 서열 번호 5의 잔기 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32이고; x₂는 서열 번호 5의 잔기 42, 43, 44, 또는 45이고; x₃은 서열 번호 5의 잔기 61, 62, 63, 또는 64이고; x₄는 서열 번호 5의 잔기 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84이고; x₅는 서열 번호 5의 잔기 90, 91, 92, 93, 94, 95 또는 96이고; 그리고 x₆은 서열 번호 5의 잔기 114, 115, 또는 116이고, 따라서 분절 1a2a3a4a5a6a를 포함하는 연속 폴리펩티드는 야생형 성숙 액티빈 단백질을 포함한다. 상기 서열에 대한 동족체 및 최소한 대략 80%, 90%, 95%, 98%, 그리고 99% 동일성을 갖는 단백질 역시 본 발명에 포함된다.

일부 구체예에서, 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 1b2b3b4b5b6b; 1b2b3b4b5b6a; 1b2b3b4b5a6a; 1b2b3b4b5a6b; 1b2b3a4a5a6a; 1b2b3a4a5b6a; 1b2a3a4a5a6a; 1b2a3a4a5a6a L66V/V67I; 1b(1a_II)2a3a4a5a6a; 1b2a3a4a5a6b; 1b2a3a4a5b6b; 1b2a3a4a5b6a; 1b2a3b4b5b6a; 1b2a3b4b5a6a; 그리고 1b2a3b4b5a6b로 구성된 군에서 선택되는 키메라 분절 구조를 갖는다.

다른 구체예에서, 키메라 폴리펩티드는 키메라 융합 폴리펩티드를 산출하기 위하여 추가의 이종성 폴리펩티드에 융합될 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 예로써, 정제에 유용한, 또는 본 발명의 복합 키메라 폴리펩티드의 올리고머화 (oligomerization)를 허용하는 펩티드일 수 있다. 이종성 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드에 화학적으로 접합 (conjugation)되거나, 또는 키메라 폴리펩티드에 대한 코딩 서열과 인-프레임으로 작동가능하게 연결될 수 있다.

더욱 특정한 구체예에서, 폴리펩티드는 (a) 서열 번호 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 그리고 33로 구성된 군에서 선택되는 서열에 최소한 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 동일하고 BMP-2 활성을 갖는; (b) 서열 번호 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 그리고 33에 진술된 서열을 포함하는; (c) 서열 번호 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 그리고 32로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는; 또는 (d) 1b2b3b4b5b6b; 1b2b3b4b5b6a; 1b2b3b4b56a; 1b2b3b4b5a6b; 1b2b3b4a5a6a; 1b2b3b4a5b6b; 1b2b3b4a5a6b; 1b2b3b4a5b6a; 1b2b3a4a5a6a; 1b2b3a4a5a6b; 1b2b3a4a5b6b; 1b2b3a4a5b6a; 1b2b3a4b5b6b; 1b2b3a4b5b6a; 1b2b3a4b5a6a; 1b2b3a4b5a6b; 1b2a3a4a5a6a; 1b2a3a4a5a6b; 1b2a3a4a5b6b; 1b2a3a4a5b6a; 1b2a3a4b5b6b; 1b2a3a4b5b6a; 1b2a3a4b5a6b; 1b2a3a4b5a6a; 1b2a3b4b5b6b; 1b2a3b4b5b6a; 1b2a3b4b5a6a; 1b2a3b4b5a6b; 1b2a3b4a5a6a; 1b2a3b4a5b6a; 1b2a3b4a5b6b; 1b2a3b4a5a6b; 1b2a3a4a5a6a L66V/V67I; 그리고 1b(1a_II)2a3a4a5a6a로 구성된 군에서 선택되는 알고리즘에 의해 기술된 서열을 포함하는 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 BMP-2로부터 분절 및 BMP-7로부터 분절을 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩티드 (가령, 1b-BMP7 폴리펩티드; 예로써, 서열 번호 35 참조)를 제시한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 BMP-2로부터 분절 및 BMP-9로부터 분절을 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩티드 (가령, 1b-BMP9; 예로써, 서열 번호 37 참조)를 제시한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 BMP-2로부터 분절 및 GDF-7로부터 분절을 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩티드 (가령, 1b-GDF7; 예로써, 서열 번호 39 참조)를 제시한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에서는 BMP-2로부터 분절 및 GDF-8로부터 분절을 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩티드 (가령, 1b-GDF8; 예로써, 서열 번호 41 참조)를 제시한다. 본 발명의 키메라 폴리펩티드는 TGF-베타 단백질 패밀리 구성원 활성을 유지한다. 이런 활성은 하기에 기술된 바와 같은 다수의 방식으로 측정될 수 있다. 일부 구체예에서, 키메라 폴리펩티드는 BMP-2 활성을 갖지만, 노긴에 의해 저해되지 않는다.

일부 구체예에서, 키메라 폴리펩티드의 분절은 상기 분절이 유래된 부모 가닥에 100% 동일하다. 다른 구체예에서, 상기 분절은 부모 가닥에서 상응하는 분절에 최소한 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 가령, 상기 분절은 하나 이상의 보존성 아미노산 치환 (가령, 1-5개의 보존성 아미노산 치환)을 보유할 수 있다.

일부 구체예에서, 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 이러한 키메라 폴리펩티드가 산출되는 하나 이상의 부모 가닥과 비교하여 향상된 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 키메라 폴리펩티드의 생물학적 활성은 TGF-베타 활성에 대한 당분야에서 인정된 다수의 분석평가를 이용하여 측정될 수 있다. 이런 분석평가에는 BIAcore (표면 플라즈몬 공명); C₂C1₂ 루시페라아제 분석평가: Smad 1/5 리포터 시스템; HEK293 루시페라아제 분석평가: Smad 2/3 리포터 시스템; FSH (난포 자극 호르몬) 방출 분석평가: 쥐 뇌하수체 세포에서; BRE (BMP 반응 요소) 루시페라아제 분석평가: Smad 1/5 리포터 HEK 293 세포; Cripto 결합 분석평가: Crptio의 존재/부재에서 측정된 루시페라아제 반응; 인간 줄기 세포 분석평가: H9 세포의 유지 또는 분화; NMR 결합 연구; 미세 질량 배양 (Micro mass culture): 병아리 태아에서 측정된 골 형성; x-선 결정학: 리간드:수용체 복합체의 구조 결정; 고유 Gel: 리간드:수용체 복합체의 시각화; 크기 배제 크로마토그래피 (SEC): 리간드:수용체 복합체의 시각화; 속도 스캔 초원심분리: 리간드:수용체 복합체 형성의 시각화; 그리고 Seldi 질량 분석법: 리간드의 크기의 정확한 결정이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 명세서에서 기술된 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 다양한 형태, 예를 들면, 용해질 (lysate), 가공되지 않은 추출물, 또는 분리된 제조물로 제조될 수 있다.

일부 구체예에서, 분리된 키메라 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다. "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 상기 폴리펩티드 종류가 우세하게 존재하는 종류 (즉, 몰 또는 중량 기초에서, 이는 조성물 내에서 임의의 다른 개별 거대분자 종류보다 더욱 풍부하다)인 조성물을 지칭하고, 그리고 일반적으로, 목적 종류가 몰 또는 중량%로 존재하는 거대분자 종류의 최소한 대략 50%를 구성할 때 실질적으로 정제된 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물은 몰 또는 중량%로 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종류의 대략 60 % 또는 그 이상, 대략 70% 또는 그 이상, 대략 80% 또는 그 이상, 대략 90% 또는 그 이상, 대략 95% 또는 그 이상, 그리고 대략 98% 또는 그 이상을 구성할 것이다. 일부 구체예에서, 목적 종류는 본질적 균일성 (즉, 전통적인 검출 방법에 의해 오염 종류가 조성물 내에서 검출될 수 없다)으로 정제되고, 여기서 상기 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종류로 구성된다. 용매 종류, 소형 분자 (<500 달톤), 그리고 필수 이온 종류 (elemental ion species)는 거대분자 종류로 간주되지 않는다.

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 키메라의 구조를 변형함으로써 기능적 변이체를 만드는 것을 계획한다. 이런 변형은 예로써, 치료 효능, 또는 안정성 (가령, 탈체 반감기 및 생체내에서 단백질분해에 대한 내성, 향상된 안정성, 용해도, 생체이용효율, 또는 키메라 단백질의 생체분포 (biodistribution) 등)을 증강시키는 것을 목적으로 만들어질 수 있다. 가령, 무제한적 실례로써, 이들 유도체에는 예로써, 아세틸화, 카르복실화, 아실화, 당화, 페길화, 인산화, 파르네실화, 비오틴화, 리피데이션 (lipidation), 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화 (derivatization), 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 기타 단백질, 예를 들면, 유기 유도체화제 (organic derivatizing agent)에 결합 등에 의해 변형된 키메라가 포함된다. 다수의 화학적 변형은 특정한 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 신진대사 합성 (metabolic synthesis) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 부가적으로, 유도체는 하나 이상의 비-자연 아미노산, 예를 들면, 케톤-보유 측쇄, 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 폴리- 또는 모노-사카라이드, 그리고 인산염을 보유하는 것들을 포함할 수 있다. 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 기능성에 대한 이런 비-자연 아미노산 요소의 효과는 다른 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 변이체에 대하여 본 명세서에서 기술된 바와 같이 조사될 수 있다. 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질이 전구체 단백질의 미성숙 형태를 절단함으로써 세포 내에서 생산될 때, 번역후 가공 역시 상기 단백질의 정확한 접힘 및/또는 기능에 중요할 수 있다. 상이한 세포 (가령, CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 또는 HEK293)는 이런 번역후 활성을 위한 특정한 세포 기구 (cellular machinery) 및 특징적인 기전을 갖고, 그리고 정확한 번역후 변형 및 전구체 단백질의 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질로의 가공을 담보하도록 선택될 수 있다. 연관된 조작된 tRNA 신타아제 및 tRNA와 공동으로 시험관내 세포-없는 발현 시스템은 비-자연 아미노산을 도입하기 위하여 유전적으로 태그표식된 특정한 아미노산 위치에서 정확한 변형을 담보하는데 이용될 수 있다.

변형된 키메라는 또한, 예로써 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 생산될 수 있다. 가령, 이소류신 또는 발린으로 류신의 고립된 교체, 글루타민산염으로 아스파르트산염의 고립된 교체, 세린으로 트레오닌의 고립된 교체, 또는 구조적으로 관련된 아미노산 (가령, 보존성 돌연변이)으로 아미노산의 유사한 교체가 결과의 분자의 생물학적 활성에 별다른 영향을 주지 않을 것으로 예상하는 것은 합리적이다. 보존성 교체는 측쇄에서 관련되는 아미노산의 패밀리 내에서 발생하는 것들이다.

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 키메라 서열의 단백질분해 절단 부위를 단백질분해 절단에 덜 민감하도록 돌연변이를 만드는 것을 계획한다. 컴퓨터 분석 (상업적으로 가용한 소프트웨어, 예를 들면, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.를 이용)이 단백질분해 절단 부위를 확인하는데 이용될 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이들 기술된 돌연변이, 변이체 또는 변형 중에서 대부분은 핵산 수준에서, 또는 일부 경우에, 번역후 변형 또는 화학적 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이런 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 키메라의 당화를 변경하기 위하여 키메라 서열의 특정한 돌연변이를 계획한다. 이런 돌연변이는 하나 이상의 당화 부위, 예를 들면, O-연결된 또는 N-연결된 당화 부위를 도입하거나 제거하기 위하여 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결된 당화 인식 부위는 일반적으로, 트리펩티드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 "X"는 임의의 아미노산)을 포함하고, 이들은 적절한 세포 당화 효소에 의해 특이적으로 인식된다. 변형은 또한, 야생형 폴리펩티드의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 치환 (O-연결된 당화 부위의 경우에)에 의해 만들어질 수 있다. 당화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실 (및/또는 두 번째 위치에서 아미노산 결실)은 변형된 트리펩티드 서열에서 비-당화를 결과한다. 탄수화물 모이어티의 숫자를 증가시키는 다른 수단은 폴리펩티드에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링이다. 이용된 커플링 양식에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌과 히스티딘; (b) 유리 카르복실 기; (c) 유리 설피드릴 기, 예를 들면, 시스테인의 유리 설피드릴 기; (d) 유리 히드록실 기, 예를 들면, 세린, 트레오닌, 또는 히드록시프롤린의 유리 히드록실 기; (e) 방향족 잔기, 예를 들면, 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판의 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일자 공개된 WO 87/05330, 그리고 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에서 기술되고, 이들은 본 발명에 참조로서 편입된다. 키메라 상에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 및/또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는 예로써, 화합물 트리플루오르메탄설폰산, 또는 등가의 화합물에 노출을 수반할 수 있다. 이러한 처리는 연결 당 (linking sugar) (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 당의 대부분 또는 완전한 제거를 유발하지만 아미노산 서열을 본래대로 남겨둔다. 화학적 탈당화는 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 및 Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에서 더욱 설명된다. 폴리펩티드 상에서 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에 의해 설명된 바와 같이, 다양한 엔도와 엑소-글리코시다아제의 이용에 의해 달성될 수 있다. 프로펩티드의 핵산 및/또는 아미노산 서열은 이용된 발현 시스템의 유형에 따라 적절하게 조정될 수 있는데, 그 이유는 포유동물, 효모, 곤충 및 식물 세포 모두 상기 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향을 받을 수 있는 상이한 당화 패턴을 도입할 수 있기 때문이다.

일부 구체예에서, 키메라 폴리펩티드는 어레이의 형태로 존재할 수 있다. 폴리펩티드는 가용성 형태, 예를 들면, 마이크로역가 평판의 웰에서 용액으로 존재하거나, 또는 기질 상에 고정될 수 있다. 기질은 유기 중합체, 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플루오르에틸렌, 폴리에틸렌옥시, 폴리아크릴아미드, 그리고 이들의 공중합체와 이식편으로 구성될 수 있는 고형 기질 또는 다공성 기질 (가령, 막)일 수 있다. 고형 지지체는 또한, 무기, 예를 들면, 유리, 실리카, 다공성 유리 구슬 (controlled pore glass, CPG), 역상 실리카 또는 금속, 예를 들면, 금 또는 백금일 수 있다. 기질의 윤곽은 구슬, 구체, 입자, 과립, 겔, 막 또는 표면의 형태일 수 있다. 표면은 평면, 실질적으로 평면, 또는 비-평면일 수 있다. 고형 지지체는 다공성 또는 비-다공성일 수 있고, 그리고 팽창 또는 비-팽창 특징을 가질 수 있다. 고형 지지체는 정 (well), 구렁 (depression), 또는 기타 그릇, 용기, 지형, 또는 위치의 형태로 형성될 수 있다. 복수의 지지체는 시약의 로봇 전달을 위하여, 또는 검출 방법 및/또는 기구에 의해 어드레스 가능한 어레이 상의 다양한 위치에서 형성될 수 있다.

본 발명에서는 또한, 본 명세서에서 개시된 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다. 이들 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 산출하기 위하여, 유전자 발현을 제어하는 하나 이상의 이종성 조절 또는 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 키메라 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구조체는 상기 폴리펩티드를 발현하기 위하여 적절한 호스트 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 다양한 도메인 또는 완전한 키메라를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 내에서 아미노산과 연관된 다양한 코돈에 기초하여, 과도한 노력 없이 결정될 수 있다. 더 나아가, 본 발명에서는 TGF-β 패밀리 구성원의 예시적인 서열을 제시한다. 본 명세서에서 제시된 서열로부터 도메인 또는 키메라 서열의 도출은 당업자에 의해 용이하게 수행된다. TGF-베타 패밀리의 단백질의 특정 서열에 관한 지식, 그리고 본 명세서에서 키메라 폴리펩티드에 관한 특정한 설명 (가령, 키메라 도메인의 분절 구조)을 고려하면, 조작된 키메라의 핵산 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 이들 폴리펩티드의 아미노산 서열에 관한 지식과 함께 다양한 아미노산에 상응하는 코돈에 관한 지식은 당업자가 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 상이한 폴리뉴클레오티드를 만드는 것을 가능하게 한다. 따라서 본 발명에서는 가능한 코돈 선택에 기초하여 조합을 선택함으로써 만들어질 수 있는 폴리뉴클레오티드의 각각의 가능한 변이를 계획하고, 그리고 이와 같은 모든 변이는 본 명세서에서 기술된 임의의 폴리펩티드에 대하여 명확하게 개시된 것으로 간주된다.

일부 구체예에서, 이들 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드를 인코딩하지만, 키메라 또는 부모 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 인코딩하는 참고 폴리뉴클레오티드에 대하여 뉴클레오티드 수준에서 대략 80% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 85% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 90% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 91% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 92% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 93% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 94% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 95% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 96% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 97% 또는 그 이상의 서열 동일성, 대략 98% 또는 그 이상의 서열 동일성, 또는 대략 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 구체예에서, 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위하여 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 벡터 내로 삽입에 앞서 분리된 폴리뉴클레오티드의 조작은 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 변경하는 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다. 보도(補導)는 Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; 그리고 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2007에서 제공된다.

일부 구체예에서, 이들 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현을 위한 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 제어 서열은 호스트 세포에 상동성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자로부터 획득될 수 있는 적절한 인핸서 서열일 수 있다.

일부 구체예에서, 제어 서열은 또한, 전사를 종결시키기 위하여 호스트 세포에 의해 인식되는 서열인 적절한 전사 종결부위 서열일 수 있다. 종결부위 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택되는 호스트 세포 내에서 기능적인 임의의 종결부위가 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 제어 서열은 또한, 호스트 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비-번역 영역인 적절한 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동가능하게 연결된다. 선택되는 호스트 세포 내에서 기능적인 임의의 리더 서열이 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 제어 서열은 또한, 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하고 인코딩된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로 내로 지향시키는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있다. 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 단부는 번역 해독틀 내에서, 분비된 폴리펩티드를 인코딩하는 코딩 영역의 분절과 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 선천적으로 포함할 수 있다. 대안으로, 코딩 서열의 5' 단부는 이러한 코딩 서열에 외래인 신호 펩티드 코딩 영역을 포함할 수 있다. 외래 신호 펩티드-코딩 영역은 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 영역을 자연적으로 포함하지 않는 경우에 요구될 수 있다.

더 나아가, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 키메라 TGF-베타 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 그들이 도입되는 호스트의 유형에 따른 하나 이상의 발현 조절 영역, 예를 들면, 인핸서와 종결부위, 복제 기원 등을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관계한다. 발현 벡터를 산출할 때, 코딩 서열은 이러한 코딩 서열이 발현을 위한 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 벡터 내에 위치된다. 재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편의하게 종속될 수 있고 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 유도할 수 있는 임의의 벡터 (가령, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로, 벡터 및 이러한 벡터가 도입되는 호스트 세포 또는 시험관내 세포-없는 반응 혼합물의 양립성 (compatibility)에 좌우될 것이다. 이들 벡터는 선형 또는 닫힌 원형 플라스미드일 수 있다.

발현 벡터는 자기 복제 벡터, 다시 말하면, 염색체외 실체 (extrachromosomal entity)로서 존재하는 벡터일 수 있고, 이의 복제는 염색체 복제에 독립적이고, 예로써 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체 (minichromosome), 또는 인공 염색체가 포함된다. 벡터는 자기-복제를 담보하기 위한 임의의 수단을 포함할 수 있다. 대안으로, 벡터는 호스트 세포 내로 도입될 때, 게놈 내로 통합되고, 이후 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 게다가, 호스트 세포의 게놈 내로 도입되는 전체 DNA, 또는 트랜스포손 (transposon)을 함께 포함하는 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드가 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터는 형질전환된 세포의 용이한 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 선별가능 마커를 포함한다. 선별가능 마커는 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구균주 (auxotroph)에 원영양성 (prototrophy) 등을 제공하는 산물의 유전자이다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 키메라 TGF-베타 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 호스트 세포를 제시하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 호스트 세포 내에서 융합 폴리펩티드의 발현을 위한 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 발현 벡터에 의해 인코딩되는 융합 폴리펩티드를 발현하는데 이용되는 호스트 세포는 당분야에 널리 공지되어 있다. 앞서 기술된 호스트 세포에 적합한 배양 배지 및 성장 조건은 당분야에 공지되어 있다.

발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포 내에서 키메라의 발현 목적으로 설계될 수 있다. 가령, 본 발명의 키메라는 세균 또는 원핵생물 세포, 예를 들면, 대장균 (E. coli), 곤충 세포 (가령, 배큘로 발현 시스템), 효모 세포, 미세조류 (microalgae), 식물 세포 또는 포유동물 세포, 그리고 시험관내 세포-없는 발현 시스템 내에서 발현될 수 있다. 일부 적절한 호스트 세포는 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)에서 더욱 설명된다.

설명된 발현 시스템 중에서 한 가지 실례가 대장균 (E. coli) 발현 시스템이긴 하지만, 이들 단백질은 다수의 다른 발현 시스템 내로 용이하게 클로닝되고 이들 시스템으로부터 발현될 수 있다. 이점에는 단백질이 유래되는 생명체 (본 발명의 경우에, 호모 사피엔스 (H. sapiens))에서 관찰되는 바와 같은 번역후 변형 달성, 세균 발현에 요구되는 출발 메티오닌이 없는 리간드의 발현, 그리고 비-자연 아미노산 또는 추가의 화학적 변형의 용이한 통합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적절한 원핵생물에는 진정세균 (eubacteria), 예를 들면, 그람-음성 또는 그람-양성 생명체, 예를 들면, 엔테로박터 (Enterobacteriaceae), 예를 들면, 대장균 (E. coli)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다양한 대장균 (E. coli) 균주, 예를 들면, 대장균 (E. coli) K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 대장균 (E. coli) X1776 (ATCC 31,537); 대장균 (E. coli) 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 가용하다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예를 들면, 섬유상 진균류 또는 효모가 VEGF-E-인코딩 벡터에 대한 클로닝 또는 발현 호스트로서 적합하다. 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 이용되는 하등 진핵 호스트 미생물이다.

키메라의 발현에 적합한 호스트 세포는 단세포 및 다세포 생명체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례에는 곤충 세포, 예를 들면, 초파리 (Drosophila) S2 및 나방 (Spodoptera) Sf9, 그리고 식물 세포가 포함된다. 식물 발현 시스템 역시 변형된 단백질을 발현하는데 성공적으로 이용되고 있다. 유용한 포유동물 호스트 세포주의 실례에는 중국 햄스터 난소 (CHO) 및 COS 세포가 포함된다. 더욱 구체적인 실례에는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 태아 신장 세포주 (현탁 배양에서 성장을 위하여 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 생쥐 버팀 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 그리고 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 적절한 호스트 세포의 선택은 당분야의 평균적인 지식 내에 있는 것으로 간주된다.

대안적 단백질 발현 시스템에는 인간 태아 신장 (HEK) 293 세포, 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하는 곤충 세포주 (S. frugiperda), 피키아 파스토리스 (P. pastoris) 및 사카로미세스 세레비시아 (S. cerevisiae)에 국한되지 않는 효모 발현 시스템, 그리고 다수의 미세조류 계통이 포함된다.

정확하게 변형된 단백질을 발현하기 위하여 유전자도입 동물이 이용될 수 있다. 본질적으로, 이들 동물은 쉽게 수확되는 유체 또는 조직, 예를 들면, 소로부터 우유 내에서 원하는 단백질을 다량 발현할 수 있는 살아있는 '생물반응기 (bioreactor)'가 될 수 있다. 세균 또는 맥아 (wheat germ) 세포 용해질을 이용한 세포-없는 시험관내 발현 시스템이 이용될 수 있다. 세포-없는 발현 시스템은 더욱 높은 효율 및 더욱 큰 특이성을 갖는 넓은 범위의 비-자연 아미노산 또는 에피토프 태그를 삽입하는 것을 가능하게 할 것이다.

세균 벡터의 실례에는 pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 그리고 pRIT5 (Pharmacia)가 포함된다. 효모 사카로미세스 세레비시아 (S. cerevisiae)에서 발현을 위한 벡터의 실례에는 pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. 6:229 (1987)), pMFa (Kurjan and Herskowitz, Cell 30:933 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54:113 (1987)), 그리고 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)가 포함된다. 배양된 곤충 세포 (가령, Sf9 세포) 내에서 단백질을 생산하기 위한 핵산의 발현에 가용한 배큘로바이러스 벡터에는 pAc 시리즈 (Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3:2156 (1983)) 및 pVL 시리즈 (Lucklow and Summers Virology 170:31 (1989))가 포함된다.

포유동물 발현 벡터의 실례에는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, PBPV, pMSG, PSVL (Pharmacia), pCDM8 (Seed, Nature 329:840 (1987)) 및 pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6:187 (1987))가 포함된다. 포유동물 세포에 이용될 때, 발현 벡터의 제어 기능은 종종, 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 가령, 통상적으로 이용되는 인핸서는 폴리오마바이러스, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 유인원 바이러스 40으로부터 유래된다.

바이러스 벡터는 세포 내에서, 그리고 살아있는 동물 개체 내에서 매우 다양한 유전자 전달 적용에 이용되고 있다. 이용될 수 있는 바이러스 벡터에는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 폭스바이러스, 알파바이러스, 배큘로바이러스, 우두 바이러스, 포진 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 아데노바이러스, 제미니바이러스 (geminivirus), 그리고 칼리모바이러스 (caulimovirus) 벡터가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 비-바이러스 벡터에는 플라스미드, 리포좀, 하전된 지질 (cytofectin), 핵산-단백질 복합체, 그리고 생물중합체가 포함된다. 목적되는 핵산에 더하여, 벡터는 핵산 전이 결과 (특정 조직으로 전달, 발현의 지속 등)를 선별하고, 측정하고, 그리고 모니터링하는데 유용한 하나 이상의 조절 영역, 및/또는 선별가능 마커 역시 포함할 수 있다.

본 발명의 키메라는 당분야에 널리 공지된 방법을 이용함으로써 만들어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 재조합 기술, 예를 들면, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; 그리고 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2007에서 설명된 재조합 기술에 의해 합성될 수 있다. 이들 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 증폭을 위한 프라이머 역시 공지된 합성 방법에 따른, 예로써 Beaucage et al., (1981) Tet Lett 22:1859-69에서 설명된 포스포라미디트 (phosphoramidite) 방법, 또는 Matthes et al., (1984) EMBO J. 3:801-05에서 설명된 방법을 이용한 표준 고형-상 방법에 의해 제조될 수 있다, 가령, 이것은 전형적으로, 자동화된 합성 방법으로 실행된다. 이에 더하여, 자동화된 펩티드 합성장치는 상업적으로 가용하다 (가령, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600).

한 구체예에서, 본 발명은 넓은 키메라 라이브러리의 구축을 가속화시키는 방법에 관계한다. 따라서 본 발명에서는 RASCH (RAndom Segmental Chimera)로 명명된 재조합 전략을 제시한다 (도 17 참조). 이것은 주형 서열 (하나의 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원으로부터 첫 번째 가닥) 및 소수의 표적 서열 (하나 이상의 대체 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원으로부터 두 번째 (세 번째, 네 번째, 다섯 번째, 여섯 번째) 가닥)을 이용하고, 이의 하위도메인은 연결된다. 주형 DNA 서열은 표적 서열의 효과적인 커플링을 증진하는데 이용되고, 그리고 일단 하위도메인이 연결되면 분해된다. 키메라 서열을 산출하기 위한 유전자 작제 이후에, 새로운 리간드는 기능적 이합체로 화학적으로 재접힘된다. 이러한 이합체화 과정은 자연 기원 및 설계자 기원 둘 모두의 2개의 상이한 서열을 혼합하고 이합체화함으로써 최종 서열의 추가적인 다양화를 가능하게 한다. 이런 이유로, RASCH 방법은 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 대략 40개 자연 단백질 서열을 임의의 자연-발생 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 서열로부터 각각 상이한 수 만개 또는 그 이상의 변이체 서열로 다양화하는데 이용될 수 있다.

호스트 세포 내에서 발현된 조작된 폴리펩티드는 특히, 리소자임 처리, 초음파 처리, 여과, 염석 (salting-out), 초원심분리, 크로마토그래피, 그리고 친화성 분리 (가령, 기질 결합된 항체)를 비롯한 단백질 정제를 위한 한 가지 이상의 널리 공지된 기술을 이용하여 이들 세포 및/또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

폴리펩티드의 분리를 위한 크로마토그래피 기술에는 특히, 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 그리고 친화성 크로마토그래피가 포함된다. 특정 효소를 정제하기 위한 조건은 부분적으로, 알짜 전하 (net charge), 소수성, 친수성, 분자량, 분자 외형 등과 같은 인자에 좌우될 것이고, 그리고 당업자에게 자명할 것이다.

활성을 결정하는 분석평가는 당분야에 널리 공지되어 있다. 본 발명은 키메라 단백질의 생물학적 활성을 조사하는 분석평가, 더욱 바람직하게는, 임상적 활성을 조사하는 분석평가에 관계한다. 이런 활성에는 증강된 작동성 또는 길항성 TGF-베타 활성, 연합된 또는 신규한 생물학적 활성 등이 포함될 수 있다.

일정한 구체예에서, TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 작동약 (agonist)을 포함하는 본 발명의 키메라 단백질은 상이한 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 길항약 (antagonist)을 포함할 수 있다.

어떤 단백질 발현, 수확, 그리고, 접힘 방법이 이용되는 지에 상관없이, 본 발명의 일정한 키메라 단백질은 미리-선택된 수용체에 우선적으로 결합할 수 있고, 그리고 널리 공지되고 당분야에서 상세하게 보고된 표준 방법, 예를 들면, 리간드/수용체 결합 분석평가를 이용하여 확인될 수 있다 (참조: Legerski gl al. (1992) Bio h??_Biophys. Res. Comm. 183: 672679; Frakar et al. (1978) Biochem. Bio12-hys. Res. Comm 80:849-857; Chio et el. (1990) Nature 343: 266-269; Dahlman et al. (1988) Biochem 27: 1813-1817; Strader et el. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13572-13578; 그리고 DDowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992).

전형적으로, 리간드/수용체 결합 분석평가에서, 미리-선택된 수용체에 대한 공지된 정량가능 친화성을 갖는 목적되는 고유 또는 부모 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원은 검출가능 모이어티, 예를 들면, 방사성 라벨, 발색성 (chromogenic) 라벨, 또는 형광 (fluorogenic) 라벨로 표지된다. 정제된 수용체, 수용체 결합 도메인 단편, 또는 표면 상에서 목적 수용체를 발현하는 세포의 분취량 (aliquot)은 다양한 농도의 표지되지 않은 키메라 단백질의 존재에서, 표지된 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원과 함께 배양된다. 후보 키메라 단백질의 상대적인 결합 친화성은 표지된 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 수용체와의 결합을 저해하는 키메라 단백질의 능력을 정량함으로써 측정될 수 있다. 분석평가를 실행할 때, 고정된 농도의 수용체 및 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원이 표지되지 않은 키메라 단백질의 존재와 부재에서 배양된다. 민감성은 표지된 주형 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원을 첨가하기에 앞서, 수용체를 키메라 단백질과 함께 미리 배양함으로써 증가될 수 있다. 표지된 경쟁자가 첨가된 이후, 적절한 경쟁자 결합을 위한 충분한 시간이 허용되고, 이후 유리 및 결합된 표지된 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원이 서로 분리되고, 그리고 한쪽 또는 다른 쪽이 측정된다. 스크리닝 절차의 실행에 유용한 라벨에는 방사성 라벨, 발색성 라벨, 분광성 라벨, 예를 들면, Haughland (1994) "Handbook of Fluorescent and Research Chemicals," 5 ed. by Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.에서 설명된 것들, 또는 화학발광 또는 형광 기질과 병용되는 높은 전환 속도 (turnover rate)를 갖는 접합된 효소, 다시 말하면, 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타아제, 또는 갈락토시다아제가 포함된다. 결과의 키메라 단백질 구조체의 생물학적 활성, 다시 말하면, 작동약 또는 길항약 특성은 차후에, 임의의 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 생물학적 활성을 측정하기 위하여 개발된 전통적인 생체내 및 시험관내 분석평가를 이용하여 특성화될 수 있다. 하지만, 이용되는 분석평가의 유형은 바람직하게는, 키메라 단백질이 기초되는 TGF-a 슈퍼패밀리 구성원에 좌우되는 것으로 생각된다. 가령, 자연 발생 BMP-2 단백질에 기초된 키메라 구조체는 하기에 더욱 상세하게 기술된, BMP-2 활성을 측정하기 위하여 현재까지 개발된 임의의 생물학적 분석평가를 이용하여 평가될 수 있다.

본 발명의 키메라 단백질 사이에 다합체의 존재는 환원제 (reducing agent), 예를 들면, DTT의 부재에서 표준 SDS-PAGE에 의해, 또는 HPLC (가령, C18 reverse phase HPLC)에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 본 발명의 다합체성 단백질은 단위체성 아단위보다 비례적으로 더욱 큰 겉보기 분자량 (apparent molecular weight), 예를 들면, 대략 14-18 kDa의 겉보기 분자량을 갖는 단위체성 아단위와 비교하여 이합체의 경우에 대략 28-36 kDa 범위의 겉보기 분자량을 가질 수 있다. 다합체성 단백질은 상업적으로 가용한 분자량 표준에 비교에 의해, 전기영동 겔 상에서 용이하게 시각화될 수 있다. 이합체성 단백질은 또한, 단위체성 대응물에서와 상이한 시점에서, C18 RP HPLC (45-50% 아세토니트릴: 0.1% TFA)로부터 용리한다.

두 번째 분석평가는 수산화인회석에 결합하는 능력에 의해 이합체 (가령, OP-1 이합체)의 존재를 평가한다. 최적으로-접힘된 이합체는 pH7, 10 mM 인산염, 6M 요소, 그리고 0.142M NaCl에서 수산화인회석 칼럼 웰에 결합하고 (이합체는 0.25 M NaCl에서 용리한다), 반면 단위체는 이들 농도에서 실질적으로 결합하지 않는다 (단위체는 0.1M NaCl에서 용리한다). 세 번째 분석평가는 트립신 또는 펩신 절단에 대한 상기 단백질의 내성에 의한 이합체의 존재를 평가한다. 접힘된 이합체성 종은 양쪽 효소, 특히 성숙 단백질의 N-말단의 작은 부분만을 절단하는 트립신에 실질적으로 내성이고, 처리되지 않은 이합체보다 크기에서 약간 작은 생물학적 활성 이합체성 종이 남겨진다 (아미노산 내에 각 단위체는 트립신 절단 이후에 더욱 작다). 대조적으로, 단위체 및 오접힘딘 이합체는 실질적으로 분해된다. 이러한 분석평가에서, 단백질은 표준 조건을 이용한 효소 절단, 예를 들면, 표준 완충액, 예를 들면, 50 mM Tris 완충액 (pH 8, 4 M 요소, 100 mM NaCl, 0.3% Tween-80 및 20 mM 메틸아민 포함)에서 절단에 종속된다. 절단은 37℃에서 16시간 동안 발생하도록 허용되고, 그리고 산물은 임의의 적절한 수단, 바람직하게는, SDS PAGE에 의해 가시화된다. 본 발명의 키메라 단백질, 예를 들면, BMP로부터 하나 이상의 분절을 보유하는 키메라 단백질의 생물학적 활성은 WO00/20607에서 설명된 바와 같은 다수의 수단에 의해 평가될 수 있다. 가령, 연골내 골 형성을 유도하는 단백질의 능력은 충분히 특성화된 쥐 피하 골 분석평가를 이용하여 평가될 수 있다. 이러한 분석평가에서, 골 형성은 조직 구조 (histology)에 의해, 그리고 알칼리성 포스파타아제 및/또는 오스테오칼신 생산에 의해 측정된다. 이에 더하여, 높은 특이적 골 형성 활성을 갖는 골원성 단백질, 예를 들면, OP-1, BMP-2, BMR4, BMP-5 및 BMP-6 역시 시험관내 쥐 조골세포 또는 골육종 세포-기초된 분석평가에서 알칼리성 포스파타아제 활성을 유도한다. 이런 분석평가는 당분야에서 충분히 설명된다 (참조: Sabokdar of al. (1994) Bone and Mineral 27:57-67.; Knutsen et al. (1993) Biochem Biophvs Res. Commun 194:1352-1358; 그리고 Maliakal et al. (1994) Growth Factors 1:227-234).

대조적으로, 낮은 특이적 골 형성 활성을 갖는 골원성 단백질, 예를 들면, CDMP-1 및 CDMP-2는 예로써, 세포 기초된 조골세포 분석평가에서 알칼리성 포스파타아제 활성을 유도하지 못한다. 따라서 이러한 분석평가는 B1b9 돌연변이체의 생물학적 활성을 평가하기 위한 손쉬운 방법을 제공한다. 가령, CDMP-1, CDMP-2 및 CMDP-3 모두 비록 BMP-2, BW-4, BV-5, BMP-6 또는 OP-1보다 낮은 비활성 (specific activity)활성을 갖긴 하지만 골 형성을 유도하는데 적격이다. 반면에, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BPylP-6 및 OP-1 모두 비록 CDMP-1, CDMP-2 또는 CDMP-3보다 낮은 비활성을 갖긴 하지만, 관절 연골 형성을 유도할 수 있다. 따라서 세포-기초된 분석평가에서 알칼리성 포스파타아제 활성을 유도하는데 적격인 키메라 단백질이 되도록 본 명세서에서 기술된 바와 같이 설계된, CDMP로부터 하나 이상의 분절을 보유하는 키메라 단백질은 쥐 동물 생물분석평가에서 더욱 높은 특이적인 골 형성 활성을 나타낼 것으로 예상된다.

키메라 단백질의 생물학적 활성은 또한, 상피 세포 성장을 저해하는 단백질의 능력에 의해 손쉽게 평가될 수 있다. 유용하고 충분히 특성화된 시험관내 분석평가는 밍크 폐 세포 또는 흑색종 세포를 이용한다 (WO00/20607 참조). TGF-베타 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 대한 기타 분석평가는 기존 문헌에서 충분히 설명되고 과도한 실험 없이 실행될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 호스트, 바람직하게는, 인간에서 골격근량 (skeletal muscle mass)을 제어하고 유지하기 위한 방법 및 작용제를 제시한다. 이런 이유로, TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질, 예를 들면, GDF-8의 근육-관련된 기능에 영향을 줄 것으로 예상되는 본 발명의 키메라 단백질은 골격근량을 조정하는 능력을 확증하기 위하여, 완전한 세포 또는 조직에서 시험관내에서 또는 생체내에서 조사될 수 있다. GDF-8 (일명, 미오스타틴)은 골격근 성장의 음성적인 조절자이다. GDF-8 녹아웃 (knockout) 생쥐는 정상 생쥐의 대략 2배의 골격근량을 갖는다. 골 모델링에 대한 증가된 근육량의 효과는 예로써, 암컷 GDF-8 녹아웃 생쥐의 대퇴부에서 골 무기물 함량 (BMC) 및 골 무기물 밀도 (BMD)를 검사함으로써 조사될 수 있다. 전체 대퇴골 BMC와 BMD를 측정하기 위하여 이중 에너지 엑스레이 흡수법 (dual-energy X-ray absorptiometry, DEXA) 농도계측 (densitometry)이 이용될 수 있고, 그리고 조직의 횡단면으로부터 BMC와 BMD를 계산하기 위하여 PQCT 농도계측이 이용될 수 있다. Hamrick, Anat Rec. 2003 May; 272A(1):388-91. 당분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 키메라 단백질이 GDF-8 녹아웃 생쥐 내로 도입될 수 있고, 그리고 유사한 분석평가가 골격근량 및 골 밀도에 대한 키메라 단백질의 효과를 결정하는데 이용될 수 있다.

뒤시엔느형 근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy, DMD)의 mdx 생쥐 모형에서 영양실조 표현형 (dystrophic phenotype) 역시 본 발명의 키메라 단백질의 생물학적 활성을 조사하는데 이용될 수 있다. 3개월 동안 차단 항체 (blocking antibody)의 복막내 주사를 이용함으로써 내생성 미오스타틴의 차단은 근육 퇴화 (muscle degeneration) 및 혈청 크레아틴 키나아제의 농도에서 현저한 감소와 함께, mdx 생쥐 근육에서 체중, 근육량, 근육 크기 및 절대 근력 (absolute muscle strength)의 증가를 유발하는 것으로 보고되었다. Bogdanovich et al., Nature. 2002 Nov. 28; 420(6914):418-21. 본 발명의 키메라 단백질이 내생성 GDF-8 활성을 강화 또는 저해하는 지를 결정하기 위하여 유사한 연구가 이용될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 신경발생 (neurogenesis)을 조정하기 위한 방법 및 작용제를 제시한다. 가령, GDF-11은 선조 (progenitor)에서 p27(Kip1) 및 가역성 세포 주기 정지 (cell cycle arrest)를 유도함으로써 후각 상피 (olfactory epithelium) 신경발생을 시험관내에서 저해하는 것으로 알려져 있다. Wu et al. Neuron. 2003 Jan. 23; 37(2):197-207. 신경발생에 대한 본 발명의 키메라 단백질의 효과는 유사하게 조사될 수 있다. 게다가, 신경발생에 대한 GDF-11의 효과에 대한 본 발명의 키메라 단백질의 효과 역시 Wu et al. Id에서 설명된 바와 같이, 유사한 분석평가를 이용하여 조사될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 골 형성을 촉진하고 골량을 증가시키기 위한 방법 및 작용제를 제시한다. 이런 이유로, TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질, 예를 들면, BMP-2, BMP-3, GDF-10, BMP-4, BMP-7, 또는 BMP-8의 골-관련된 기능에 영향을 줄 것으로 예상되는 본 발명의 키메라 단백질은 골 또는 연골 성장을 조정하는 능력을 확증하기 위하여, 완전한 세포 또는 조직에서 시험관내에서 또는 생체내에서 조사될 수 있다. 당분야에 공지된 다양한 방법이 이러한 목적에 이용될 수 있다. 가령, BMP-3은 Msx2의 BMP2-매개된 유도를 저해하고 골전구세포 (osteoprogenitor)의 조골세포로의 BMP2-매개된 분화를 차단한다. 따라서 골 또는 연골 성장에 대한 본 발명의 키메라 단백질, 바람직하게는, BMP-2 또는 BMP-3으로부터 분절을 포함하는 키메라 단백질의 효과는 예로써, 세포 기초된 분석평가에서 Msx2의 유도 또는 골전구세포의 조골세포로의 분화를 측정함으로써 BMP-2의 골원성 활성에 대한 그들의 효과에 의해 결정될 수 있다 (참조: Daluiski et al., Nat. Genet. 2001, 27(1):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9). 유사하게, 본 발명의 키메라 단백질, 바람직하게는, BMP-2 또는 BMP-3으로부터 분절을 포함하는 키메라 단백질은 골원성 또는 항-골원성 활성, 또는 BMP-2-매개된 골생성에 대한 작동성 또는 길항성 효과에 대하여 조사될 수 있다.

세포-기초된 분석평가의 다른 실례에는 중간엽 선조 및 조골세포에서 본 발명의 키메라 및 검사 화합물의 골원성 또는 항-골원성 활성을 분석하는 것이 포함된다. 가령, 본 발명의 키메라 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 다능성 중간엽 선조 C3H10T1/2 세포, 전조골성 C2C12 세포, 그리고 조골성 TE-85 세포를 감염시키기 위하여 작제되었다. 이후, 골원성 활성은 알칼리성 포스파타아제, 오스테오칼신, 그리고 매트릭스 무기화의 유도를 측정함으로써 결정된다 (참조: Cheng et al., J Bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(8):1544-52).

더 나아가, 본 발명에서는 골 또는 연골 성장을 측정하는 생체내 분석평가를 계획한다. 가령, Namkung-Matthai et al., Gene, 28:80-86 (2001)에서는 쥐 골다공증성 모형을 설명하는데, 여기서 골절후 초기 단계 동안 골 수복이 조사된다. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999) 역시 쥐 골다공증성 모형을 설명하는데, 여기서 골절후 후기 단계 동안 골 수복이 조사된다. 이들 참고문헌은 골다공증성 골절에 관한 연구를 위한 쥐 모형의 개시에 대하여 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 일정한 측면에서, 본 발명은 당분야에 공지된 골절 치유 분석평가를 이용한다. 이들 분석평가에는 예로써, 골절을 유발하고, 그리고 골절의 정도 및 수복 과정을 측정하는 실험적 프로토콜에 관한 개시에 대하여 본 발명에 순전히 참조로서 편입되는 U.S. Pat. No. 6,521,750에서 설명된 골절 기술, 조직학적 분석, 그리고 생역학적 분석이 포함된다.

본 발명의 스크리닝 분석평가는 본 발명의 키메라 단백질 및 이들의 변이체뿐만 아니라, 이들의 키메라 단백질 또는 그들의 변이체 자신의 작동약과 길항약을 비롯한 임의의 검사 화합물에 적용되는 것으로 이해된다. 게다가, 이들 스크리닝 분석평가는 약물 표적 검증 및 품질 관리 목적에 유용하다.

다른 구체예에서, 본 발명은 키메라 단백질의 활성을 조정할 수 있는 화합물을 확인하기 위한 본 발명의 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 용도에 관계한다. 이러한 스크리닝을 통하여 확인된 화합물은 시험관내에서 검사 조직 또는 세포 (가령, 골/연골 성장 또는 근육 세포 성장)를 조정하는 능력을 평가하기 위하여 조직 (가령, 골 및/또는 연골) 또는 세포 (가령, 근육 세포)에서 조사될 수 있다. 선택적으로, 이들 화합물은 생체내에서 예로써, 골/연골 성장 또는 근육 제어와 유지를 조정하는 능력을 평가하기 위하여 동물 모형에서 더욱 조사될 수 있다.

다양한 분석평가 형식이 충분하지만, 본 발명에 비추어 본 명세서에서 명시되지 않은 것들 역시 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명의 검사 화합물 (작용제)은 임의의 조합 화학적 방법에 의해 산출될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 화합물은 생체내에서 또는 시험관내에서 합성된 자연 발생 생체분자일 수 있다. 골 또는 연골 성장의 조절제 (modulator)로서 기능하는 능력에 대하여 조사되는 화합물 (작용제)은 예로써, 세균, 효모, 식물 또는 기타 생명체에서 생산되거나 (가령, 자연 산물), 화학적으로 생산되거나 (가령, 펩티드모방체를 비롯한 소형 분자), 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 검사 화합물에는 비-펩티딜 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드모방체, 당, 호르몬, 그리고 핵산 분자가 포함된다. 특정 구체예에서, 검사 작용제는 대략 2,000 달톤 (dalton) 이하의 분자량을 갖는 소형 유기 분자이다.

본 발명의 검사 화합물은 단일의 구별된 실체로서 제공되거나, 또는 예로써, 조합 화학 (combinatorial chemistry)에 의해 만들어진 더욱 복잡한 라이브러리로 제공될 수 있다. 이들 라이브러리는 예로써, 알코올, 알킬 할로겐 화합물, 아민, 아미드, 에스테르, 알데히드, 에테르 및 다른 부류의 유기 화합물을 포함할 수 있다. 검사 시스템에 검사 화합물의 제공은 특히 최초 스크리닝 단계에서 분리된 형태로 또는 화합물의 혼합물로서 존재할 수 있다. 선택적으로, 이들 화합물은 다른 화합물로 선택적으로 유도체화되고, 그리고 이들 화합물의 분리를 용이하게 하는 유도체화기를 보유할 수 있다. 유도체화기의 무제한적 실례에는 비오틴, 플루오레세인, 디곡시제닌, 녹색 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자성 구슬, 글루타티온 S 전이효소, 광활성가능 가교링커 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.

화합물 및 자연 추출물의 라이브러리를 조사하는 많은 약물 스크리닝 프로그램에서, 소정의 기간 동안 조사된 화합물의 숫자를 극대화시키기 위하여 고처리량 분석평가가 바람직하다. 정제된 또는 반-정제된 단백질로 유래될 수 있는 것과 같은 세포-없는 시스템에서 실행되는 분석평가는 종종, "일차" 스크린으로서 선호되는데, 그 이유는 이들이 검사 화합물에 의해 매개되는 분자 표적에서 변경의 신속한 발생 및 상대적으로 용이한 검출을 가능하게 하도록 산출될 수 있기 때문이다. 게다가, 검사 화합물의 세포 독성 효과 또는 생체이용효율은 시험관내 시스템에서 일반적으로 무시될 수 있고, 그 대신에 이러한 분석평가는 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 이의 결합 단백질 (가령, 키메라 단백질 자체 또는 TGF-베타 수용체 단백질 또는 이의 단편) 사이에 결합 친화성의 변경에서 명백하게 나타나는 바와 같이 분자 표적에 대한 약물의 효과에 일차적으로 집중된다.

단지 예로써, 본 발명의 예시적인 스크리닝 분석평가에서, 목적 화합물은 통상적으로, 분석평가의 목적에 적합한 TGF-베타 수용체 단백질 또는 이의 단편에 결합할 수 있는 분리되고 정제된 키메라 단백질과 접촉된다. 이후, 본 발명의 키메라 단백질 및 TGF-베타 수용체 단백질을 포함하는 혼합물에 검사 화합물을 포함하는 조성물이 첨가된다. 키메라 단백질 수용체 복합체의 검출 및 정량은 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 이의 결합 단백질, 예를 들면, TGF-베타 수용체 또는 이의 단편 사이에 복합체 형성을 저해하는 (또는 강화시키는) 화합물의 효능을 결정하기 위한 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 다양한 농도의 검사 화합물을 이용하여 획득된 데이터로부터 산출하고 용량 반응 곡선을 산출함으로써 평가될 수 있다. 게다가, 비교를 위한 기준선 (baseline)을 제공하기 위한 대조 분석평가 역시 실행될 수 있다. 가령, 대조 분석평가에서, 분리되고 정제된 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질이 TGF-베타 수용체 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 조성물 (세포-없는 또는 세포-기초된)에 첨가되고, 그리고 키메라 단백질-수용체 복합체의 형성이 검사 화합물의 부재에서 정량된다. 일반적으로, 반응물이 혼합되는 순서는 변할 수 있고, 그리고 동시에 혼합될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 게다가, 정제된 단백질 대신에, 적절한 세포-없는 분석평가 시스템을 제공하기 위하여 세포 추출물 및 용해질이 이용될 수 있다. 대안으로, 표면 상에서 TGF-베타 수용체 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포가 일정한 분석평가에 이용될 수 있다.

본 발명의 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 이의 결합 단백질 사이에 복합체 형성은 다양한 기술에 의해 검출될 수 있다. 가령, 복합체 형성의 조정은 예로써, 면역분석평가에 의해, 또는 크로마토그래피 검출에 의해, 검출가능하게 표지된 단백질, 예를 들면, 방사성표지된 (가령, 32 P, 35 S, 14 C 또는 3 H), 형광 표지된 (가령, FITC), 또는 효소 표지된 키메라 단백질 또는 이의 결합 단백질을 이용하여 정량될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명에서는 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 이의 결합 단백질 (가령, TGF-베타 수용체 단백질 또는 이의 단편) 사이에 상호작용의 정도를 직접적으로 또는 간접적으로 측정하는데 형광 편광 분석평가 및 형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석평가의 용도를 계획한다. 게다가, 다른 검출 양식, 예를 들면, 광도파 (optical waveguide)에 기초된 것들 (PCT Publication WO 96/26432 및 U.S. Pat. No. 5,677,196), 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 표면 전하 센서 (surface charge sensor), 그리고 표면력 센서 (surface force sensor)가 본 발명의 많은 구체예에 적합하다.

게다가, 본 발명에서는 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 이의 결합 단백질 (가령, TGF-베타 수용체 단백질 또는 이의 단편) 사이에 상호작용을 교란시키거나 강화시키는 작용제를 확인하기 위한 "이중 하이브리드 분석평가"로 알려져 있는 상호작용 트랩 (trap) 분석평가의 용도를 계획한다. 예로써, U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; 그리고 Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696을 참조한다.

본 발명의 키메라 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체, 세포 및 기타 시약은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 매우 다양한 용도를 갖는다. 가령, 대표적인 구체예에서, 이들 시약은 무기화, 골 형성, 그리고 골 손실의 과정을 조사하기 위하여 시험관내에서 또는 생체내에서 (가령, 동물 모형에서) 이용될 수 있다. 게다가, "녹인 (knock in)" 및 "녹아웃 (knock out)" 동물이 질환의 동물 모형으로서, 또는 키메라 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 상호작용하는 화합물에 대한 스크리닝 도구 (하기에 더욱 논의됨)로서 이용될 수 있다. 세포 또는 개체에 이러한 폴리뉴클레오티드를 전달하기 위하여 임의의 적절한 벡터가 이용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 전달 벡터의 선택은 표적 호스트의 연령과 종, 시험관내 대(對) 생체내 전달, 요망되는 발현의 수준과 지속성, 의도된 목적 (가령, 치료 또는 스크리닝을 위한), 표적 세포 또는 기관, 전달 경로, 분리된 폴리뉴클레오티드의 크기, 안전 우려 등을 비롯한 당분야에 공지된 다수의 인자에 기초하여 수행될 수 있다.

본 발명의 키메라 폴리펩티드는 생체내를 비롯한 다양한 생물학적 시스템에서 이용을 위하여 조제될 수 있다. 단독으로 또는 다른 활성제와 공동으로 키메라를 투여하기 위하여 임의의 다양한 공지된 방법이 이용될 수 있다. 가령, 시간의 흐름에서 주사 또는 점진적인 주입에 의해 비경구 투여될 수 있다. 이들 작용제(들)는 경구, 직장, 협측 (가령, 설하), 질, 비경구 (가령, 피하, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 및 평활근을 비롯한 근육내, 피내, 정맥내, 복막내), 국소 (즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면), 비내, 경피, 관절내, 수막공간내, 강내 (intracavity), 흡입 투여, 문맥내 (intraportal) 전달에 의한 간에 투여, 그리고 직접 기관 주사 (가령, 간 내로, 중추신경계에 전달을 위한 뇌 내로, 췌장 내로)와 같은 수단에 의해 투여될 수 있다. 임의의 소정의 경우에 가장 적합한 경로는 치료되는 장애의 성질과 심각도 및 이용되는 특정 화합물의 성질에 좌우될 것이다.

본 발명에서는 또한, 본 발명의 키메라 단백질 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 제조물을 제시한다. 제약학적 제조물은 개체, 바람직하게는 인간에서 조직의 성장을 증진하거나, 또는 조직의 손실을 감소시키거나 예방하는데 이용될 수 있다. 표적화된 조직은 예로써, 골, 연골, 골격근, 심장 근육 및/또는 뉴런 조직일 수 있다.

다른 측면에서, 키메라 TGF-베타 폴리펩티드는 단독으로 또는 투여를 위한 다른 작용제 (가령, 로션, 크림, 스프레이, 겔, 또는 연고로서)와 공동으로 조제될 수 있다. 이것은 독성을 감소시키거나, 또는 생체이용효율을 증가시키기 위하여 리포좀으로 조제될 수 있다. 다른 전달 방법에는 미소구체 (microsphere) 또는 프로티노이드 (proteinoid)의 캡슐화 (encapsulation)를 수반하는 경구 방법, 에어로졸 전달 (가령, 폐로), 또는 경피 전달 (가령, 이온삼투요법 (iontophoresis) 또는 경피 전기천공 (transdermal electroporation)에 의해)이 포함된다. 다른 투여 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

키메라 TGF-베타 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 비경구 투여를 위한 제조물에는 무균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 그리고 에멀젼이 포함된다. 비-수성 용매의 실례는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 (가령, 올리브 오일), 그리고 주사가능 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레산염이다. 수성 담체의 실례에는 물, 염수, 완충된 매체, 알코올성/수성 용액, 그리고 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 운반제의 실례에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스와 염화나트륨, 링거 주사액, 그리고 고정유 (fixed oil)가 포함된다. 정맥내 운반제에는 유체와 영양소 보충제, 전해질 보충제 (가령, 링거 덱스트로스에 기초된 것들) 등이 포함된다. 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들면, 기타 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 비활성 가스 등 역시 포함될 수 있다.

본 발명에서는 TGF-베타 단백질 패밀리 구성원에 의해 조정될 수 있는 다양한 질환과 장애를 치료하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 단독으로 또는 다른 작용제와 공동으로 키메라 TGF-베타 폴리펩티드의 치료 효과량을 이런 질환을 앓고 있거나 이런 질환에 걸릴 위험이 있는 개체에 접촉시키거나 투여하는 단계를 포함한다.

치료 효과량은 이러한 질환 또는 장애와 연관된 개체의 증상을 감소시킬 만큼 충분한 양으로서 측정될 수 있다. 전형적으로, 개체는 질환 또는 장애의 증상을 최소한 50%, 90% 또는 100% 감소시킬 만큼 충분한 치료 조성물의 양으로 치료된다. 일반적으로, 최적 용량은 질환, 그리고 개체의 체중, 연령, 비만, 성별, 그리고 증상의 정도와 같은 인자에 좌우될 것이다. 가령, 골 형태형성에 대하여, 선택적으로, 용량은 재구성에 이용되는 매트릭스의 유형 및 조성물 내에서 화합물의 유형에 따라 변할 수 있다. 최종 조성물에 다른 공지된 성장 인자의 첨가 역시 용량에 영향을 줄 수 있다. 진행은 골 성장 및/또는 수복의 주기적인 평가, 예를 들면, X-선, 조직형태학적 결정 (histomorphometric determination), 그리고 테트라사이클린 표지화 (tetracycline labeling)에 의해 모니터링될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 적절한 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 적절한 용량은 0.5 내지 40 ㎎/체중 ㎏, 예를 들면, 1 내지 8 ㎎/체중 ㎏이다.

앞서 언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은 추가적인 (가령, 키메라 TGF-베타 폴리펩티드에 더하여) 치료제 (가령, TNF의 저해물질, 항생제 등)의 이용을 포함할 수 있다. 키메라 TGF-베타 폴리펩티드, 다른 치료제(들), 및/또는 항생제(들)는 동시에 투여될 수 있지만, 순차적으로 투여될 수도 있다.

본 발명에 따른 키메라를 포함하는 제약학적 조성물은 담체, 부형제, 그리고 첨가제 또는 보조제를 이용한, 개체에 투여하기 적합한 형태일 수 있다. 빈번하게 이용되는 담체 또는 보조제에는 탄산마그네슘, 이산화티타늄, 락토오스, 만니톨 및 기타 당, 활석, 우유 단백질, 젤라틴, 전분, 비타민, 셀룰로오스 및 이의 유도체, 동물성 및 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 용매, 예를 들면, 무균수, 알코올, 글리세롤 및 다가 알코올이 포함된다. 정맥내 운반제에는 유체 및 영양소 보충제가 포함된다. 보존제에는 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 그리고 비활성 가스가 포함된다. 다른 제약학적으로 허용되는 담체에는 예로써, 본 발명에 참조로서 편입되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975), 그리고 The National Formulary XIV., 14th ed., Washington: American Pharmaceutical Association (1975)에서 설명된 바와 같이, 수성 용액, 염을 비롯한 비-독성 부형제, 보존제, 완충액 등이 포함된다. 제약학적 조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 당분야의 일과적인 기술에 따라 조정된다 (참조: Goodman and Gilman's, The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.)).

본 발명에 따른 제약학적 조성물은 국부 또는 전신 투여될 수 있다. "치료 효과량"은 질환 또는 장애와 연관된 증상을 예방, 치료 또는 최소한 부분적으로 정지시키거나, 또는 세포 성장, 증식 또는 분화를 증진하는데 필요한 본 발명에 따른 작용제의 양이다. 이러한 용도에 효과적인 양은 당연히, 질환 또는 장애의 심각도, 원하는 효과, 그리고 개체의 체중 및 전반적인 상태에 좌우될 것이다. 전형적으로, 시험관내에서 이용되는 용량은 제약학적 조성물의 in situ 투여에 유용한 양에 관한 유익한 보도(補導)를 제공할 수 있고, 그리고 감염 치료를 위한 효과적인 용량을 결정하기 위하여 동물 모형이 이용될 수 있다. 다양한 고려 대상은 예로써, Langer, Science, 249: 1527, (1990); Gilman et al. (eds.) (1990)에서 설명되고, 이들 각각은 본 발명에 참조로서 편입된다. 제약학적으로 활성 화합물의 용량은 당분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다 (참조: Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.); Remington, The Science & Practice of Pharmacy, (Lippincott Williams & Wilkins; Twenty first Edition)). 임의의 특정 화합물의 치료 효과량은 화합물마다, 그리고 환자마다 다소간 변할 것이고, 그리고 환자의 상태 및 전달 경로에 좌우될 것이다. 일반적인 제안으로서, 대략 0.1 내지 대략 100 ㎎/㎏의 용량이 치료 효능을 갖는데, 모든 중량은 염이 이용되는 경우를 비롯하여, 화합물의 중량에 기초하여 계산된다. 더욱 높은 수준에서 독성 우려는 정맥내 용량을 더욱 낮은 수준, 예를 들면, 최대 대략 10 내지 대략 20 ㎎/㎏으로 제한할 수 있는데, 모든 중량은 염이 이용되는 경우를 비롯하여, 화합물의 중량에 기초하여 계산된다. 대략 10 ㎎/㎏ 내지 대략 50 ㎎/㎏의 용량이 경구 투여에 이용될 수 있다. 전형적으로, 대략 0.5 ㎎/㎏ 내지 15 ㎎/㎏의 용량이 근육내 주사에 이용될 수 있다. 특정한 용량은 대략 1 μmol/㎏ 내지 50 μmol/㎏, 그리고 더욱 특정하게는, 정맥내 또는 경구 투여의 경우에, 각각 최대 대략 22 μmol/㎏ 및 최대 33 μmol/㎏이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 치료 효과를 달성하기 위하여 다양한 시간 간격 (가령, 매시, 매일, 매주, 매월 등)에서, 1회 이상 투여 (가령, 2회, 3회, 4회, 또는 그 이상의 투여)가 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 키메라는 수의 및 의학 적용에서 이용될 수 있다. 적절한 개체에는 조류와 포유동물 둘 모두 포함되고, 포유동물이 선호된다. 본 명세서에서, 용어 "조류 (avian)"에는 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조, 그리고 꿩이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 명세서에서, 용어 "포유동물"에는 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개, 토끼 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 인간 개체에는 신생아, 영유아, 청소년, 그리고 성인이 포함된다. 다른 구체예에서, 개체는 골 질환의 동물 모형이다.

본 명세서에서, "치료 효과량의 투여"는 본 발명의 제약학적 조성물이 의도된 치료 기능을 수행할 수 있도록 상기 조성물을 개체에 제공하거나 적용하는 방법을 포함하는 것으로 의도된다.

제약학적 조성물은 편의한 방식으로, 예를 들면, 주사 (피하, 정맥내 등), 경구 투여, 흡입, 경피 적용, 또는 직장 투여에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라서, 제약학적 조성물은 이러한 제약학적 조성물을 효소, 산, 그리고 상기 제약학적 조성물을 비활성화시킬 수 있는 기타 자연 조건의 작용으로부터 보호하는 물질로 코팅될 수 있다. 제약학적 조성물은 또한, 비경구 또는 복막내 투여될 수 있다. 또한, 분산액이 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 그리고 이들의 혼합물에서, 그리고 오일에서 제조될 수 있다. 보관과 이용의 통상적인 조건 하에, 이들 제조물은 미생물의 성장을 예방하는 보존제를 포함할 수 있다.

주입가능 용도에 적합한 제약학적 조성물에는 무균 수성 용액 (물 용해성인 경우에) 또는 분산액, 그리고 무균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말이 포함된다. 모든 경우에, 조성물은 무균이어야 하고, 그리고 용이하게 주사될 수 있을 만큼 유동적이어야 한다. 담체는 예로써, 물, 에탄올, 폴리올 (가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 그리고 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 그리고 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매체일 수 있다. 적절한 유동성 (fluidity)은 예로써, 코팅, 예를 들면, 레시틴 (lecithin)의 이용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방은 다양한 항생제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 전형적으로 등장성제 (isotonic agent), 예를 들면, 당, 다가알코올, 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 조성물 내에 포함될 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 (aluminum monostearate) 및 젤라틴 (gelatin)을 포함함으로써 달성될 수 있다.

무균 주사가능 용액은 필요한 양의 제약학적 조성물을 적절한 용매 내에서, 필요에 따라 앞서 열거된 성분 중에서 한 가지 또는 이들의 조합과 혼합하고, 그 이후에 멸균 여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 제약학적 조성물을, 염기성 분산 매체 및 앞서 열거된 것들로부터 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 운반제 내로 혼합함으로써 제조된다.

제약학적 조성물은 예로써, 비활성 희석제 또는 동화가능 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 제약학적 조성물 및 다른 성분은 또한, 경성 또는 연성 껍질 젤라틴 캡슐 내에 내포되거나, 정제로 압축되거나, 또는 개체의 식이 내로 직접적으로 혼합될 수 있다. 경구 치료 투여를 위하여, 제약학적 조성물은 부형제와 혼합되고, 그리고 섭취가능 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 이용될 수 있다. 이런 조성물 및 제조물은 중량으로 최소한 1%의 활성 화합물을 포함해야 한다. 이들 조성물 및 제조물의 백분율은 당연히, 변할 수 있고, 그리고 편의하게, 단위 (unit)의 중량의 대략 5% 내지 대략 80%일 수 있다.

정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 또한, 아래를 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들면, 트래거캔스 검, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면, 인산이칼슘; 붕해제, 예를 들면, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트; 그리고 감미료, 예를 들면, 수크로오스, 락토오스 또는 사카린, 또는 풍미제, 예를 들면, 페퍼민트, 윈터그린 (wintergreen) 오일, 또는 체리 향. 단위 제형 (dosage unit form)이 캡슐일 때, 이것은 상기 유형의 물질 이외에, 액상 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 존재하거나, 또는 투약 단위 (dosage unit)의 물리적 형태를 달리 변경하기 위하여 존재할 수 있다. 가령, 정제, 알약, 또는 캡슐은 셸락 (shellac), 당, 또는 둘 모두로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 본 발명의 작용제, 감미료로서 수크로오스, 보존제로서 메틸과 프로필파라벤, 염료, 그리고 향, 예를 들면, 체리 또는 오렌지 향을 포함할 수 있다. 당연히, 임의의 단위 제형을 제조하는데 이용되는 임의의 물질은 제약학적으로 순수하고 이용된 양에서 실질적으로-비독성/생물적합성이어야 한다. 이에 더하여, 제약학적 조성물은 서방 제조물 및 조제 내로 통합될 수 있다.

따라서 "제약학적으로 허용되는 담체"는 용매, 분산 매체, 코팅, 항생제와 항진균제, 등장성제, 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 제약학적 활성 물질에 대한 이런 매체와 작용제의 이용은 당분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 전통적인 매체 또는 작용제가 제약학적 조성물과 양립하지 않는 경우를 제외하고, 치료 조성물 및 치료 방법에서 이의 용도가 계획된다. 보충 활성 화합물 역시 조성물 내로 혼합될 수 있다.

일정한 구체예에서, 본 발명의 치료 방법은 조성물을 이식물 또는 장치로서 국소, 전신 또는 국부 투여하는 단계를 포함한다. 투여될 때, 본 명세서에서 기술된 치료 조성물은 일반적으로, 발열원-없는 생리학적으로 허용되는 형태로 존재한다. 게다가, 조성물은 골, 연골 또는 조직 손상의 부위로 전달을 위하여, 바람직하게는 캡슐화되거나, 또는 점성 형태로 주사될 수 있다. 국소 투여는 상처 치유 및 조직 수복에 적합할 수 있다. 본 발명의 키메라 이외에 치료적으로 유용한 작용제 역시 본 명세서에서 기술된 방법에서 선택적으로, 앞서 기술된 바와 같이 조성물 내에 포함되거나, 대안으로 또는 부가적으로, 이들 키메라와 동시에 투여되거나, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 가령, 바람직하게는, 골 및/또는 연골 형성을 위하여, 조성물은 골 및/또는 연골 손상의 부위에 BMP 키메라 또는 다른 치료 화합물을 전달할 수 있고, 발달하는 골과 연골을 위한 구조물을 제공하고, 그리고 최적으로, 체내로 재흡수될 수 있는 매트릭스를 포함할 것이다. 가령, 매트릭스는 BMP 키메라의 느린 방출을 제공할 수 있다. 이런 매트릭스는 다른 이식된 의료적 적용을 위하여 현재 이용되고 있는 물질로 형성될 수 있다.

매트릭스 물질의 선택은 생물적합성 (biocompatibility), 생물분해성 (biodegradability), 기계적 특성, 미용학적 외관 및 인터페이스 특성에 기초된다. 본 발명의 조성물의 특정한 적용은 적절한 조제 (formulation)를 규정할 것이다. 이들 조성물에 대한 잠재적 매트릭스는 생물분해성이고 화학적으로 규정된 황산칼슘, 트리칼슘 인산염, 수산화인회석, 폴리락트산 및 폴리무수물일 수 있다. 다른 잠재적 물질은 생물분해성이고 생물학적으로 충분히 규정된 물질, 가령 골 또는 피부 콜라겐이다. 추가의 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 다른 잠재적 매트릭스는 비-생물분해성이고 화학적으로 규정된 물질, 예를 들면, 소결 수산화인회석, 생물활성유리, 알루미네이트, 또는 기타 세라믹이다. 매트릭스는 상기한 유형의 물질의 임의의 조합, 예를 들면, 폴리락트산 및 수산화인회석 또는 콜라겐 및 트리칼슘 인산염으로 구성될 수 있다. 바이오세라믹 (bioceramic)은 칼슘-알루미네이트-인산염에서와 같은 구성 및 처리에서 구멍 크기, 입자 크기, 입자 외형, 그리고 생물분해성을 변화시키기 위하여 변경될 수 있다.

본 명세서에서 개시된 일정한 조성물은 피부 또는 점막에 국소 투여될 수 있다. 국소 조제는 피부 또는 각질층 (stratum corneum) 침투 증강제로서 효과적인 것으로 알려져 있는 하나 이상의 다양한 작용제를 더욱 포함할 수 있다. 이들의 실례는 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 프로필렌 글리콜, 메틸 또는 이소프로필 알코올, 디메틸 설폭시드, 그리고 아존 (azone)이다. 조제를 미용학적으로 허용가능하도록 만들기 위하여 추가의 작용제가 더욱 포함될 수 있다. 이들의 실례는 지방, 왁스, 오일, 염료, 방향제, 보존제, 안정화제, 그리고 표면 활성제이다. 각질용해제 (keratolytic agent), 예를 들면, 당분야에 공지된 것들 역시 포함될 수 있다. 실례는 살리실산 (salicylic acid) 및 황이다.

투여의 용이성 및 용량의 균등을 위하여 비경구 조성물을 단위 제형으로 조제하는 것이 특히 바람직하다. 본 명세서에서, "단위 제형"은 치료되는 개체에 대한 단위 용량 (unitary dosage)으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭한다; 미리 결정된 양의 제약학적 조성물을 포함하는 각 단위는 필요한 제약학적 담체와 공동으로 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된다. 본 발명의 단위 제형에 대한 명세는 제약학적 조성물의 특징 및 달성되는 특정한 치료 효과에 관련된다.

주요한 제약학적 조성물은 허용되는 투약 단위에서 편의하고 효과적인 투여를 위한 효과량으로, 적절한 제약학적으로 허용되는 담체와 혼합된다. 보충 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우에, 용량은 이들 성분의 통상적인 용량 및 투여 방식을 참고하여 결정된다.

키메라를 치료제로서 이용할 때 과제중의 하나는 단백질을 효과적으로 전달하는 능력이다. 본 발명의 키메라는 여러 상이한 방법에 의해 전달될 수 있다. 혈류 내에서, 대부분의 TGF-β 리간드의 반감기 (half-life)는 분 (minute)의 차수 (order)에 있다. 너무 빨리 분해되는 리간드를 보충하기 위하여, TGF-β 리간드를 수반하는 현재의 요법은 이들 단백질을 매우 높은 용량으로 이용한다. 대안으로, 이들 리간드의 안정성 또는 서방 특성을 향상시키는데 도움을 주는, 이들 리간드 또는 전달 시스템을 직접적으로 변경하는 여러 수단이 가용하다.

(1) 단백질의 직접적인 변형에는 변형의 한 가지 통상적인 형태로서 페길화 (PEGylation)가 포함된다. 이러한 방법에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 용해도 증가, 단백질분해에 대한 내성, 그리고 감소된 면역원성 (immunogenicity)에 의해 안정성을 향상시키는 목적으로 단백질에 공유 부착된다.

(2) 단백질 표면 상에서 잔기의 합리적 변형. 전반적인 단백질 기능을 변화시키지 않으면서 정전 불안정성 (electrostatic instability)을 향상시킴으로써, 분자의 전반적인 안정성이 향상될 수 있다. 연속 정전 모형 (continuum electrostatic model)을 이용하여, 불안정성의 원인이 되는 잔기는 위치가 결정되고, 이후 더욱 우호적인 잔기로 돌연변이될 수 있는 지가 분석될 수 있다.

(3) 리간드를 단백질의 일부 또는 다른 단백질에 융합하는 것은 단백질 안정성 및 용해도를 증가시키는 또 다른 기술이다. 항체 불변 단편 (Fc)은 안정성 및 용해도를 향상시키기 위하여 이용되는 통상적인 융합 상대이다.

(4) 리포좀의 용도는 단백질 전달 운반제로서 이용될 수 있다. 리포좀은 자기 집합하여 구체를 형성하는 다수의 인지질 (phospholipid)로 구성된다. 목적 단백질은 이중층 내부에 캡슐화되고 외부 환경으로부터 보호된다. 인지질 조성은 리포좀의 정확한 특성에 영향을 주고, 그리고 다수의 원하는 조건 하에 단백질을 방출하도록 맞춤될 수 있다. 중합체/리포좀 복합 시스템 역시 전달 시스템으로서 이용이 가능하다. 이론적으로, 이러한 유형의 시스템은 단백질 전달을 향상시키기 위하여 각 시스템의 이점을 합동시킨다.

(5) 리포좀과 유사하게, 중합체는 단백질 약물 전달 시스템으로서 이용될 수 있다. 이들 중합체는 통상적으로, 높은 수분 함량으로 인하여 하이드로겔 (hydrogel)로 불리는 매트릭스를 만드는데 이용된다. 상기 겔을 이용하는 이점은 이것이 단백질을 단백질분해로부터 보호할 뿐만 아니라 장기간, 지속된 방출을 가능하게 하기 때문이다. 리포좀에서처럼, 겔을 만드는데 이용되는 중합체가 이의 특성에 영향을 준다. 하이드로겔을 만드는데 이용되는 물질에 대한 2가지 포괄적인 분류가 존재한다: 자연 및 비자연 중합체. 자연 중합체를 이용하여 하이드로겔을 산출하는데 이용되는 통상의 물질에는 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알기네이트, 키토산, 그리고 덱스트란이 포함된다. 하이드로겔을 만드는데 이용되는 합성 중합체에는 폴리(산화에틸렌), 폴리(아크릴산), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(비닐 알코올), 그리고 폴리포스파젠 (polyphosphazene)이 포함된다.

(6) 자연 또는 비자연 중합체의 이용 없이, 상이한 종류의 하이드로겔이 산출될 수 있다. 생물활성 유리, 또는 제로겔 (Xerogel)인 것으로 간주되는 이러한 물질은 목적 단백질을 흡수할 수 있는 실리카 및 인산칼슘 층으로부터 산출된다 (도 8 참조). 제로겔 (Xerogel)은 단백질의 서방 시간을 수주까지 증가시킨다. 도 1에서는 MTT 분석평가에 의해 조골세포 세포주 MC3T3을 이용한 세포 생존능 분석평가로부터 결과를 도시하고, 이는 제로겔 물질이 조사된 배양 배지에서 30 ㎎/㎖의 최대 농도까지 비-독성이라는 것을 증명한다.

본 발명의 키메라는 단독으로 또는 제약학적으로 허용되는 담체와 공동으로, 다수의 질환과 장애를 치료하거나, 또는 세포 또는 조직 활성을 조정하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 키메라 폴리펩티드는 TGF-베타 활성의 조정이 치료 이익을 제공하는 다수의 질환 또는 장애를 치료하는데 이용될 수 있다. 가령, 본 발명의 키메라는 골다공증, 연골 질환 또는 치주 질환을 앓는 개체에서 이용될 수 있다. 키메라는 골 및/또는 연골 형성을 증진하고, 골 손실/밀도 또는 탈무기화 (demineralization)를 저해하고, 골 침전을 촉진하는 등에 이용될 수 있다. 대안으로, 키메라는 과도한 골 밀도 및 성장을 저해하는데 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 키메라는 내분비 질환과 장애, 부갑상샘항진증 (hyperparathyroidism), 쿠싱병 (Cushing's disease), 흡수불량 (malabsorption), 신세뇨관성 산증 (renal tubular acidosis), 또는 갑상샘항진증 (thyrotoxicosis)의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 키메라는 또한, 성적 발달의 치료 또는 조정, 뇌하수체 호르몬 생산, 그리고 골과 연골의 창출에 이용될 수 있다. 키메라는 또한, 세포 증식성 질환과 장애, 염증과 연관된 세포 성장과 분화, 알레르기, 자가면역 질환, 감염성 질환, 그리고 종양의 치료에 이용될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명의 키메라는 신경근 질환, 예를 들면, 근이영양증 (muscular dystrophy) 및 근육 위축 (muscle atrophy), 울혈성 폐쇄성 폐 질환 (congestive obstructive pulmonary disease), 근육 소모 증후군 (muscle wasting syndrome), 비만, 또는 예로써, 2형 당뇨병을 비롯한 기타 신진대사 질환의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 키메라는 골격근의 점진적인 약화와 악화를 비롯한 근육 조직의 비정상적인 양, 발달 또는 신진대사 활성으로 특징되는 퇴행성 근육 질환에 이용될 수 있다. 근육 질환과 장애의 실례에는 근육 소모 질환, 악액질 (cachexia), 식욕부진 (anorexia), AIDS 소모 증후군, 근이영양증, 뒤시엔느형 근이영양증 (Duchenne Muscular Dystrophy, DMD), 베커형 근이영양증 (Becker Muscular Dystrophy, BMD), 근육긴장성 장애 (Myotonic Dystrophy, MMD) (일명, Steinert's Disease), 안인두성(眼咽頭性) 근이영양증 (Oculopharyngeal Muscular Dystrophy, OPMD), 에머리-드레이푸스형 근이영양증 (Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy, EDMD), 지대형 근이영양증 (Limb-Girdle Muscular Dystrophy, LGMD), 안면견갑 상완성 근이영양증 (Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy, FSH 또는 FSHD) (일명, Landouzy-Dejerine), 선천성 근이영양증 (Congenital Muscular Dystrophy, CMD), 그리고 원위성 근이영양증 (Distal Muscular Dystrophy, DD)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 키메라는 알츠하이머병 (Alzheimer's Disease, AD), 파킨슨씨병 (Parkinson's Disease, PD), 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 헌팅턴병 (Huntington's disease, HD), 기타 신경근 질환 (neuromuscular disease), 운동 뉴런 질환 (motor neuron disease), 신경근 연접부 (neuromuscular junction)의 질환, 및/또는 염증성 근병증 (inflammatory myopathy)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 증상을 예방, 치료 또는 경감시키기 위한 방법 및 조성물에 이용될 수 있다.

개체는 염증, 알레르기, 자가면역 질환, 감염 질환 및/또는 종양을 유발할 수 있는, 비정상적인 세포 성장 및 분화와 연관된 질환을 앓을 수 있다. 개체는 심장 질환, 예를 들면, 과도한 심근세포 (cardiomyocyte) 증식 또는 성장과 연관된 질환, 또는 심근세포 성장 또는 증식을 촉진하는 것이 바람직한 질환을 앓을 수 있다. 본 발명의 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질은 TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원의 작동약 또는 길항약에 의한 치료에 순응하는 본질적으로 임의의 질환의 치료 목적으로 설계될 수 있다.

아래의 실시예는 더욱 상세하게 설명하기 위한 것으로 의도되지만, 상세한 설명 또는 첨부된 특허청구범위에 한정되지 않는다.

도면의 간단한 설명
도 1A-B에서는 BMP2/BMP6 샘플 특성화를 도시한다. 패널 A: SDS-PAGE에서 BMP2/BMP6 샘플. 레인 1에서 비-환원된 BMP2/BMP6 샘플, 레인 2에서 분자량 마커, 그리고 레인 3에서 환원된 BMP2/BMP6 샘플. 패널 B: BMP2, BMP6, 그리고 BMP2/BMP6 리간드의 별개의 샘플로부터 SELDI-TOF-MS 오버레이 결과.
도 2에서는 야생형 리간드를 이용한 C₂C1₂ 전세포 Smad1-의존성 리포터 분석평가를 도시한다. 짙은 검은색 막대는 오차를 나타낸다.
도 3에서는 5일후, 병아리 사지싹 중간엽 세포 미세 배양 연골형성 분석평가 의 시각화를 도시한다. 위쪽 패널은 인자 없음 및 세포외 길항약 노긴 (Noggin)을 포함하는 배양액을 도시한다. 이들 현미경사진에서 막대는 1mm를 표시한다. 두 번째 내지 네 번째 패널은 각각, 리간드 BMP2, BMP6, 그리고 BMP2/BMP6을 포함하는 배양액을 도시한다.
도 4에서는 3일후, 병아리 사지싹 중간엽 세포 미세 배양 연골형성 분석평가의 정량을 도시한다. 상이한 농도에서 특정된 성장 인자의 첨가가 지시된다.
도 5에서는 Smad1 리포터 유전자의 활성화를 나타내는 돌연변이 BMP2/BMP6 이종이합체를 도시한다. 샘플 a는 인자 없음 (배경)을 포함하고, 그리고 샘플 b는 활성 수용체 부위가 없는 BMP2 동종이합체를 포함한다. 모든 양은 완전 활성 BMP2/BMP6 이종이합체 (리포터 유전자의 100% 활성화)인 샘플 c에 표준화된다.
도 6에서는 특정된 리간드를 보유하는 리간드-수용체 복합체로 포화된 이후에 남아있는 II형 수용체 ECD의 양을 나타내는 고유-PAGE를 도시한다.
도 7에서는 키메라 설계 전략을 위한 구조/서열 정렬을 도시한다.
도 8에서는 제로겔 (Xerogel) 물질 (최저 농도, 녹색, 0.3 ㎍/㎕; 중간 농도, 적색, 3 ㎍/㎕; 높은 농도, 청색, 30 ㎍/㎕)의 존재에서 세포 생존능을 도시하는 그래프를 제공한다.
도 9에서는 인간 FGF2의 부재 또는 존재에서 상이한 농도의 AB2-008을 이용하여, mCIVA에서 배양된 H9 hES 세포를 도시한다.
도 10에서는 (A) 첨가된 리간드 없음, (B) 재조합 BMP2 (30 ng/㎖), (B) AB2-004 (30 ng/㎖), (C) AB2-011 (30 ng/㎖), 그리고 (D) AB2-015 (30 ng/㎖)로 Von Kossa 염색에 의해 시각화된 무기화 (mineralization)를 도시한다.
도 11에서는 AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010의 신호전달 활성을 도시한다. (A) AB2-008 대(對) 액티빈-βA, (B) AB2-009 대(對) 액티빈-βA, (C) AB2-010 대(對) 액티빈-βA, 그리고 (D) 액티빈-βA와 비교하여 상대적 신호전달 강도.
도 12에서는 액티빈-βA 및 BMP2와 비교하여, AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010에 의한 인산화를 도시한다. 액티빈-βA, AB2-008, 그리고 AB2-009는 SMAD2의 인산화의 필적하는 수준을 보이는 반면, BMP2는 SMAD1의 인산화를 특이적으로 나타낸다.
도 13에서는 액티빈-βA, AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010에 의한 FSH 방출을 도시한다. (A) 인히빈 없는 용량 의존성 FSH 자극, 그리고 (B) 인히빈으로 감소된 방출.
도 14에서는 액티빈-βA 및 AB2-008에 의한 보조-수용체 결합을 도시한다. HEK 세포에서 Cripto의 존재와 부재에서 (A) 액티빈-βA, 그리고 (B) AB2-008로 Smad-2-루시페라아제 활성.
도 15에서는 Smad-1 경로에 의한 AB2-011, AB2-012, 그리고 AB2-015의 신호전달 활성을 도시한다. (A) AB2-004 대(對) BMP2, (B) AB2-011 대(對) BMP2, (C) AB2-012 대(對) BMP2, 그리고 (D) AB2-015 대(對) BMP2, 이들 모두 C2C12 세포로 Smad-1 루시페라아제 분석평가를 이용하여, 배양 배지에서 3-30 ng/㎖의 농도 범위에 있다.
도 16에서는 BMP2, AB2-004, AB2-011, AB2-012, 그리고 AB2-015의 노긴 민감성을 도시한다. Smad-1 루시페라아제 신호전달 활성은 노긴의 존재 (밝은 회색) 및 부재 (어두운 회색)에서 측정된다.
도 17은 RASCH 방법의 개략적 설명이다.
도 18에서는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 여러 구성원의 서열의 정렬을 도시하고, 상대적인 분절이 각 구성원에 대하여 정의된다.
도 19에서는 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 뼈대의 단일 아단위에서 6개의 하위도메인 (단편)을 도시한다.

실시예

실시예 1

TGF-β 키메라의 산출. 이들 신규한 TGF-β 리간드를 산출하기 위하여, 변형된 방향적 진화 (modified directed evolution) 접근법이 이용되었다. 전형적으로, 이러한 기술은 상동성 유전자의 서열을 혼합하거나, 또는 무작위 돌연변이를 삽입하고, 이후 원하는 리간드 특성에 대하여 스크리닝 (screening)함으로써 10³개이상의 다수의 무작위 단백질 서열을 만드는 것을 수반한다. 일단의 실험에서, 골격 리간드로 명명된 효율적으로 재접힘되는 것으로 밝혀진 서열은 표적 리간드를 모방하기 위하여 요망되는 신호전달 특성을 갖는 두 번째 리간드 서열과 결합되었다. 구조 근거된 접근법 (structure guided approach)을 이용하여, 여러 TGF-β 리간드 결정 구조가 분석되고 6가지 상이한 섹션으로 분류되었다. 이들 섹션은 상기 리간드의 아래의 영역을 거의 포함한다: 섹션 1, N-말단 및 베타 가닥 1; 섹션 2, 베타 가닥 2; 섹션 3, 전나선 루프; 섹션 4, 알파 나선; 섹션 5, 베타 가닥 3; 그리고 섹션 6, 베타 가닥 4 및 C-말단. 이러한 프로토콜을 이용하여, 재조합에 선택되는 각 세트의 TGF-β 리간드에 대하여 64가지 상이한 리간드 조합이 가능하다. 2개 이상의 부모 사슬이 상이한 서브패밀리 (가령, BMP/GDF 대(對) TGFbeta)로부터 유래될 때, 그들의 신호전달 기전 간에 차이는 섹션 3과 4가 분리되면 포착될 수 없다. 설계 원리 (design principle)로서 폭넓게 적용될 수 있기 위하여, 이는 또한, 2개의 구조 분절, 섹션 3과 4를 유지하는 설계의 일부이고 부모 유전자 중에서 어느 한쪽의 한 섹션으로 처리될 수 있다 (섹션 3*4로 지칭됨).

이러한 전략은 액티빈-βA를 표적 리간드로서, 그리고 BMP-2를 골격 리간드로서 이용하여 액티빈/BMP-2 키메라를 만듦으로써 실행되었다. 액티빈-βA는 생물학적으로 매우 흥미롭기 때문에, 표적 리간드로서 선택되었다. BMP-2는 출발 변성된 봉입체로부터 우수한 효율, >10% 이합체 수율로 재접힘되는 것으로 밝혀졌고, 그리고 이들 이합체가 시험관내와 생체내 실험 둘 모두에서 활동적인 것으로 밝혀졌기 때문에, 골격 리간드로서 선택되었다. 다양한 섹션을 설계하기 위하여, 이들 리간드 사이에 서열 동일성의 영역을 찾아내기 위한 BMP-2와 액티빈-βA의 서열 정렬이 수행되었다 (도 7). 이들 영역은 상이한 섹션에 대한 경계로서 이용되었다. PCR 동안 이들 올리고뉴클레오티드에 대한 중복 영역으로서 이들 서열 부분을 이용함으로써, 변화가 BMP-2 또는 액티빈-βA 서열 내로 도입되지 않을 것이다. 서열 정렬은 이후, 6가지 섹션을 궁극적으로 결정하기 위하여 이전에 해석된 BMP-2와 액티빈-βA 구조로부터 데이터와 공동으로 이용되었다 (도 7a-c). 이들 서열 간에 동일성의 영역으로 제한으로 인하여, 이들 섹션은 이상적인 것으로부터 약간 변경되어져야 했다. 특히, 전나선 루프 및 대부분의 α-나선은 한 섹션 내로 합동되는 반면, 베타 가닥 3의 시작 부분까지 나머지 α-나선은 상이한 섹션 내로 배치되었다 (도 7b와 c). 부가적으로, 이러한 클로닝 전략 (cloning strategy)이 성공되도록 하기 위하여 3-점 돌연변이 (점 돌연변이)가 삽입되었다. 섹션 3의 단부에서, BMP-2 서열은 TLVN인 반면, 액티빈-βA 서열은 TVIN이다 (도 7a). 이들 잔기 차이가 보존성이기 때문에, BMP-2로부터 류신과 발린이 상응하는 액티빈-βA 서열 내로 도입되었다. 세 번째 돌연변이는 섹션 5의 단부에서 발견된다. 여기서, BMP-2 서열은 LYLD인 반면, 동등한 액티빈-βA 서열은 LYYD이다 (도 7a). 이러한 잔기 차이가 앞선 2개보다 덜 보존성이기 때문에, 액티빈-βA로부터 티로신이 상응하는 BMP-2 서열 내로 삽입되었다.

액티빈-βA의 N-말단은 2개의 추가 시스테인을 보유하고 (도 7a), 이들은 4번째 내부 이황화 결합 (intra-disulfide bond)을 형성한다. 재접힘 과정을 복잡하게 만드는 이러한 여분의 이황화 결합의 가능성을 제거하기 위하여, 이들 잔기를 보유하는 섹션은 액티빈-βA 키메라 설계의 섹션 1로부터 제거되었다.

액티빈/BMP-2 키메라의 경우에, 인간 BMP-2와 인간 액티빈-βA의 성숙 도메인은 초기에 6가지 섹션 각각으로 분류되고, 그리고 각 섹션에 대하여 프라이머가 설계되었다. BMP-2의 경우에, 이들 프라이머는 아래의 단백질 서열을 코딩한다: 섹션 1, QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWND; 섹션 2, WIVAPPGYHAFYCHGECP; 섹션 3, FPLADHLNSTNHAIVQTLVN; 섹션 4, SVNSKIPKACCVP; 섹션 5, TELSAISMLYYD; 섹션 6, ENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR. 액티빈-βA의 경우에, 이들 프라이머는 아래의 단백질 서열을 코딩한다: 섹션 1, RGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDW; 섹션 2, WIIAPSGYHANYCEGECP; 섹션 3, SHIAGTSGSSLSFHSTLVN; 섹션 4, HYRMRGHSPFANLKSCCVP; 섹션 5, TKLRPMSMLYYD; 섹션 6, DGQNIIKKDIQNMIVEECGCS. 다양한 섹션을 함께 혼합하여 전장 키메라를 산출하기 위하여, 중복 PCR 전략이 이용되었다. 1b 키메라를 산출하기 위하여, BMP-2 서열 QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDII를 표적 유전자 내로 삽입하는데 2개의 올리고가 이용되었다. 모든 구조체에 대한 외부 프라이머는 pET21a 발현 벡터 내로 클로닝을 위하여 5' NdeI 부위 및 3' XhoI 부위를 통합하도록 작제되었다. 이들 원하는 단백질 서열은 DNA 염기서열분석에 의해 확증되었다.

이들 키메라는 그들이 보유하는 섹션에 따라 표지화되었다. 가령, 1b2b3b4a5a6b, 여기서 b'는 섹션이 BMP-2로부터 유래된다는 것을 나타내고, 그리고 a'는 섹션이 액티빈-βA로부터 유래된다는 것을 나타낸다. 이들 키메라는 또한, 임의의 기능적 분석평가가 맹검 방식 (blind manner)으로 실행될 수 있도록 하기 위하여, A/B2-020과 같은 속기 숫자 명칭이 제공된다. 표 1에서는 다양한 키메라 중에서 일부를 설명한다:

단백질 발현 및 정제. 액티빈/BMP-2, 1b 키메라, 그리고 BMP-2_ma 키메라는 전형적인 대장균 (E. coli) 발현 시스템을 이용하여 발현되었고, 그리고 32개의 키메라 모두 봉입체 분획물에서 관찰되었다. 발현된 봉입체는 분리되고, 정제되고, 그리고 재접힘되었다. 재접힘된 리간드는 Hi-trap 헤파린 칼럼 (GE Healthcare) 및 역상 크로마토그래피 (reversed phase chromatography) (GraceVydac)를 이용하여 정제되었다. 이들 리간드는 동결 건조되고, 그리고 모든 세포 기초된 분석평가의 경우에 4mM HCl, pH 1에서 또는 모든 생물물리학적 분석평가의 경우에 10mM Na 아세테이트, pH 4에서 재-현탁되었다. 액티빈-βA는 안정되게 형질감염된 CHO 세포주에서 발현되고 당분야에 공지된 기술을 이용하여 정제되었다. 노긴은 앞서 기술된 프로토콜에 기초하여 발현되고 정제되었다.

액티빈/BMP-2 키메라 봉입체는 환원된 SDS-PAGE 겔 상에서 단일 띠로서 관찰되고 ~13 kDa의 예측된 크기에서 발견되었다 (도 1a). 재접힘을 표준화시키기 위하여, 모든 액티빈/BMP-2 키메라는 100㎖ 부피에서 50㎎/ℓ의 농도로 재접힘되었다. 농도는 이전의 성공적인 BMP-2, BMP-3, 그리고 GDF-5 재접힘에 기초하여 선택되었다. 부피는 2% 또는 그 이상의 이합체 수율이 생물물리학적 활성 분석평가를 위한 충분한 단백질을 산출하지만 다수의 샘플로 관리될 수 있을 만큼 충분히 낮도록 선택되었다. 재접힘 이후에, 액티빈/BMP-2 샘플은 헤파린 칼럼으로부터 용리후 원하는 산물인 순수한 이합체의 형성에 대하여 분석되었다 (도 1b와 c). 놀랍게도, 32개의 액티빈/BMP-2 샘플 모두 일부 이합체의 존재를 보였고, 그리고 이들 키메라는 그들의 재접힘 효율 (이합체 수율)에 기초하여 위치되고 불량 (<1%, -)에서부터 야생형 (>10%, +++)까지 4가지 범주로 분류되었다 (표 2). '성공적인' 키메라로서 분류되기 위하여, 리간드는 5% 또는 그 이상의 재접힘 효율을 확보해야 했다. 이러한 효율은 50㎎/ℓ 농도에서 표준 1L 재접힘으로부터 2.5㎎/ℓ의 이합체성 단백질을 산출할 것이고, 그리고 많은 양이 요구되는 실험, 예를 들면, x-선 결정학에 적합한 것으로 간주될 것이다. 재접힘 효율이 계산될 때, 32개의 액티빈/BMP-2 키메라 중에서 24개 (75%)가 이러한 기준을 충족하였다 (표 2, 보충, ++ 또는 +++).

성공적인 리간드로서 간주되기 위하여, 이들 액티빈/BMP-2 키메라는 재접힘될 뿐만 아니라 신호전달 특징을 나타내야 한다. 이들 특성을 조사하기 위하여, 모든 액티빈/BMP-2 키메라는 재접힘 효율에 상관없이, 초기에 액티빈 활성 분석평가에 종속되었다. 액티빈-유사 신호전달 특징은 Smad-2/3 활성화에 민감한 전세포 루시페라아제 리포터 분석평가를 이용하여 조사되었다 (하기에 기술된 바와 같음). 액티빈-βA는 Smad-2/3 경로를 통하여 신호하고 상기 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있고, 따라서 임의의 액티빈/BMP-2 키메라가 액티빈-βA 기능성을 모방하면, 이들은 유사한 방식으로 신호할 것이다. 32개의 키메라 중에서 단지 1b2a3a4a5a6a (AB2-008)만 액티빈-유사 방식으로 신호하였다. AB2-008은 액티빈-βA에서와 유사한 용량 의존성 방식으로 루시페라아제 리포터를 활성화시킨다. AB2-008 키메라의 효능이 결정될 때, EC₅₀은 64.5 pM인 것으로 계산되었다. 이러한 값은 28.8 pM의 EC₅₀을 갖는 액티빈-βA보다 ~2배 낮다. 루시페라아제 결과가 Smad-2 활성화에 대한 직접적인 반응인 지를 확증하기 위하여, 포스포-Smad-2가 AB2-008의 존재에서 조사되었다. 액티빈-βA에서와 유사하게, AB2-008의 추가는 포스포-Smad-2 수준에서 증가를 증진한다. 예상된 바와 같이, 액티빈-βA와 함께 AB2-008은 포스포-Smad-1 생산을 촉진하지 않는데, 이는 단지 특정한 신호전달 경로의 활성화를 지시한다. 흥미롭게도, AB2-008은 >10% 이합체 수율로 BMP-2_ma 재접힘 효율을 나타낸다 (표 2).

AB2-008이 완전한 액티빈-βA 기능성을 갖는 지를 충분히 조사하기 위하여, 추가의 생물물리학적 분석평가가 실행되었다. Cripto는 많은 TGF-β 리간드에 대한 공지된 보조-수용체이고 넓은 범위의 반응을 유도한다. 가령, Cripto의 존재는 적절한 Nodal 신호전달에 요구되는 반면, Cripto는 TGF-β1 및 액티빈 신호전달에 대항한다. 이런 이유로, Smad-2/3 루시페라아제 분석평가를 이용하여, 액티빈-βA 및 AB2-008 신호전달은 Cripto의 존재 또는 부재에서 모니터링되었다. Cripto의 존재에서, 액티빈-βA 신호전달은 액티빈-βA 단독과 비교하여 ~43% 감소한다. AB2-008 키메라는 Cripto가 분석평가에 추가될 때, 신호전달에서 ~38%의 유사한 감소를 보였다. 이러한 결과는 AB2-008 키메라가 액티빈 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있고, 또한 다른 공지된 액티빈 결합 상대와 상호작용하는 능력을 가짐으로써 충분히 기능하는 액티빈 모방체임을 확증한다.

AB2-008의 결과에 기초하여, 이들 키메라의 효능이 야생형 액티빈-βA 수준까지 증가될 수 있는 지를 알아보기 위하여, 2개의 추가 액티빈/BMP-2 키메라가 산출되었다. 1b2a3a4a5a6a L66V/V67I (AB2-009)로 명명된 첫 번째 키메라는 키메라 내로 발린 및 이소-류신을 도입하였다. 이들 잔기는 액티빈-βA의 야생형 서열에서 발견되고, 그리고 실험적 설계 강제 (experimental design constraint)로 인하여 상응하는 BMP-2 잔기로 초기에 돌연변이되었다 (도 7a). 1b(1a_II)2a3a4a5a6a (AB2-010)로 명명된 두 번째 키메라는 1b 섹션의 두 번째 절반을 액티빈으로부터 상응하는 서열로 대체한다 (도 7a). 이로 인하여, 상기 키메라 구조체 내에 BMP-2로부터 성분으로서 첫 구조적으로 보존된 시스테인, Leu-66, 그리고 Val-67을 선행하는 단지 13개의 N-말단 잔기만 남게 된다. AB2-008 내로 추가의 액티빈 잔기의 도입은 이의 기능적 특징 (즉, 효능)을 향상시킬 것으로 예측된다. AB2-009 및 AB2-010은 다른 액티빈/BMP-2 키메라에 대하여 앞서 기술된 바와 같이 발현되고 재접힘되었다. 예상치 않게, 이들 새로운 키메라 둘 모두 AB2-008과 비교하여 감소된 재접힘 효율을 나타냈다. AB2-009 및 AB2-010은 AB2-009 및 AB2-010의 경우에 각각, >10% 이합체 수율에서 ~4% 및 ~3%로 감소를 보였다 (표 2). 11개 잔기 섹션이 돌연변이된 AB2-010의 경우에는 이러한 결과가 놀라운 것이 아닐 수도 있지만, AB2-009에서 급격한 감소는 예상되지 못하였다. L66V와 V67I 돌연변이 둘 모두 돌연변이된 잔기의 측쇄 간에 단지 하나의 탄소 차이를 보유하는 매우 보존성 변화이다.

재접힘 이후에, 이들 새로운 키메라는 상기 AB2-008에서와 동일한 Smad-2/3 루시페라아제 분석평가에 적용되었다. AB2-009는 용량 의존성 방식으로 리포터를 활성화시키고 79.4 pM의 EC₅₀으로 AB2-008에 필적하는 활성을 나타냈다. 하지만, AB2-010 역시 상기 리포터를 활성화시키지만, 198.6 pM, 또는 AB2-008보다 ~3-배 약하고 액티빈-βA보다 ~7-배 약한 EC₅₀으로 활성에서 현저한 감소를 보였다. AB2-008에서처럼, AB2-009와 AB2-0010 둘 모두 Smad-2 인산화를 나타냈다. AB2-009 및 AB2-010이 루시페라아제 분석평가에서 AB2-008로부터 증강된 신호전달 특징을 나타내지 않았기 때문에, 이들은 Cripto 결합 분석평가에 종속되지 않았다.

이러한 Smad-2/3 루시페라아제, Smad-2 인산화, 그리고 Cripto 리포터 분석평가가 AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010이 액티빈 경로를 통하여 신호하고 액티빈-βA에서와 매우 유사하게 기능한다는 것을 지시하긴 하지만, 이들 분석평가는 시험관내 환경에서만 기능을 나타낸다. 이런 이유로, 이들 액티빈/BMP-2 키메라가 액티빈-βA에서와 유사한 생물학적 반응을 유도한다는 것을 증명하기 위하여, 생리학적으로 더욱 적절한 실험이 요구된다. 적절한 액티빈 기능을 조사하는데 이용되는 한 가지 고전적인 방법은 난포 자극 호르몬 (FSH) 방출 분석평가이다. 쥐 뇌하수체 전엽 세포는 생체내 및 시험관내 실험 둘 모두에서 액티빈의 존재에 응하여 FSH를 방출하는 것으로 알려져 있다. 이런 이유로, 쥐 뇌하수체 전엽 세포는 증가하는 양의 액티빈-βA 또는 액티빈/BMP-2 키메라에 노출되고, 그리고 FSH 방출이 방사면역측정법에 의해 측정되었다. 3가지 액티빈/BMP-2 키메라 모두 액티빈-βA에서와 유사하게, FSH 방출에서 용량 의존성 방출을 나타냈다. 이들 키메라에 의해 촉진된 FSH 방출의 양은 증가하는 양의 인히빈의 존재에서 감소되었다. 이러한 FSH 방출 분석평가는 시험관내 분석평가 결과와 합동되면, AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010이 완전한 액티빈-βA 기능적 특징을 갖는다는 것을 확증한다.

이들 키메라는 또한, 추가의 신호전달 특성을 점검하기 위하여 조사되었다. BMP-2는 일정한 골 치료를 위한 치료제로서 이미 이용되고 있고, 그리고 변경된 BMP-2 기능을 갖는 키메라를 확보하는 것은 유익할 수 있다. 임의의 액티빈/BMP-2 키메라가 독특한 신호전달 특징을 나타내는 지를 조사하기 위하여, 액티빈-βA 기능적 분석평가에 대한 유사한 실험이 실행되었다. 여기서, 공지된 BMP-2 신호전달 경로인 Smad-1/5 활성화에 민감한 전세포 루시페라아제 리포터 분석평가가 Smad-2/3 활성화에 민감한 리포터 대신에 이용되었다. 용량 의존성 방식으로 루시페라아제 반응의 모니터링에서, 다수의 액티빈/BMP-2 키메라가 흥미로운 속성을 나타낸다. 이들 액티빈/BMP-2 키메라는 확인되고 3가지 군으로 분류되었다: 상향 조절된 또는 '슈퍼' BMP-2 활성을 갖는 것들; BMP-2 길항약인 노긴에 무감각한 것들; 또는 '슈퍼' BMP-2 활성을 갖고 노긴에 무감각한 것들. 액티빈/BMP-2 키메라 1b2a3b4b5a6a (AB2-004), 1b2b3b4b5a6a (AB2-011), 1b2b3b4b5b6a (AB2-012), 그리고 1b2a3b4b5b6a (AB2-015) 모두 증강된 BMP-2 활성을 갖고 노긴에 무감각한 범주에 속한다. Smad-1 루시페라아제 분석평가에서, 이들 리간드는 10x 적은 단백질 (즉, 10-배 높은 활성)을 이용하여 BMP-2_wt에서와 동일한 수준에서 리포터를 활성화시킨다. 1b2b3b4b5a6b (AB2-013)는 상향 조절된 BMP-2 활성의 범주로 분류된다. 상기 키메라는 AB2-004,-011,-012,-015에서와 동일한 활성의 10-배 증가를 보이긴 하지만, BMP-2_wt에서와 유사하게 노긴의 추가 시에 신호가 배경 수준까지 감소되었다. 키메라, 1b2a3b4b5a6b (AB2-014)는 정상적인 BMP-2 신호전달을 갖지만 무감각한 리간드의 최종 범주에 속한다. AB2-014는 루시페라아제 리포터를 BMP-2_wt에서와 동일한 수준으로 활성화시키지만 이의 신호는 노긴의 추가에 의해 차단될 수 없다. AB2-008은 또한, Smad-2 경로의 활성화에 더하여 Smad-1 경로를 활성화시키는 지를 알아보기 위하여 조사되었다. AB2-008은 1㎍/㎖의 수준까지, Smad-1 활성화를 전혀 나타내지 않았다. 이러한 결과는 AB2-008이 특정한 액티빈 모방체이고 비-특이적인 신호전달 특징을 나타내지 않는다는 것을 확증한다.

효율적으로 재접힘되고 액티빈-유사 신호전달 특징을 갖는 AB2-008 키메라의 성공으로, 1b 섹션은 그렇지 않으면 비-재접힘 TGF-β 리간드의 재접힘을 향상시키는 일반적인 도구로서 조사되었다. 앞서 언급된 바와 같이, 1b 섹션은 30 a.a. 길이이고 BMP-2의 N-말단, 그리고 핑거 1의 첫 번째 베타 가닥을 형성하는 잔기를 포함한다 (도 7a). BMP-2/BMPRIa/ActRII의 삼원 구조의 분석에 기초하여, 섹션 1b에서 발견되는 대부분의 잔기는 I형 또는 II형 수용체와의 접촉을 형성하지 않는다. 실제로, I형 수용체와의 접촉을 산출하는 극소수 잔기, Val-26, Gly-27, 그리고 Trp-28 중에서, 트립토판은 전체 TGF-β 슈퍼패밀리에서 불변하는 반면, Gly-27은 골격 상호작용에 관계하고, 그리고 발린은 전체 TGF-β 슈퍼패밀리에서 이 위치에서 주로 비-극성 아미노산이다. 이에 기초하여, 1b 영역은 리간드-수용체 친화성과 특이성에 결정적으로 기여하는 것은 아니지만, 화학적 재접힘 과정 동안 적절한 이황화 결합 형성에 매우 유익할 수도 있다. 이런 이유로, 1b 섹션은 추가의 TGF-β 리간드 BMP-7, BMP-9, 그리고 GDF-8 내로 클로닝되었다. 액티빈/BMP-2 키메라에서처럼, 1b 키메라는 대장균 (E. coli) 발현 시스템에서 발현되고, 그리고 봉입체는 높은 순도로 분리되었다.

C2C12 세포에서 Smad-1 루시페라아제 분석평가. Smad1-의존성 루시페라아제 분석평가는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 실행되었다. 간단히 말하면, C2C12 근아세포 세포는 L-글루타민 및 항생제로 보충된 Dulbecco's minimum essential medium (DMEM) + 5% FBS에서 배양된다. 루시페라아제 리포터 분석평가를 위하여, 세포는 트립신처리되고, PBS로 2회 세척되고, 그리고 DMEM + 0.1% FBS를 포함하는 48-웰 평판 내로 도말되었다. 24시간후, 세포는 제조업체의 지시에 따라 Fugene6 (Roche)을 이용함으로써 Smad 결합 부위를 보유하는 -1147Id1-루시페라아제 구조체 (Id1-Luc), Smad1 발현 구조체, 그리고 CAGGS-LacZ 플라스미드로 형질감염되고, 그리고 세포는 증가하는 양의 BMP-2_ma로 촉진되거나, 또는 다양한 액티빈/BMP-2 키메라가 형질감염후 24시간 시점에 첨가되었다. 루시페라아제 활성은 리간드로 자극후 24시간 시점에 측정되고, 그리고 이들 값은 베타-갈락토시다아제 활성을 이용함으로써 형질감염 효율에 대하여 표준화되었다. 루시페라아제 리포터의 활성은 Smad 결합 도메인이 없는 -927Id1-루시페라아제 (Id1-Luc mut)를 이용함으로써 획득되는 대조 값 (control value)과 비교하여 배수적-유도 (fold-induction)로 표시된다. 이들 리간드의 Smad1 신호전달을 약화시키는 노긴의 능력을 조사하기 위하여, 루시페라아제 분석평가는 이러한 분석평가에 지정된 용량의 노긴이 포함된 점을 제외하고, 앞서 기술된 바와 같이 반복되었다.

HEK293 세포에서 Smad-2 루시페라아제 분석평가. HEK293T세포는 폴리리신으로 코팅된 24-웰 평판 내로 150,000개 세포/웰의 밀도로 접종되었다. 24시간후, 세포는 하룻밤동안, 제조업체의 권고에 따라 Perfectin® 형질감염시약 (GenLantis)을 이용하여, A3 룩스 (Lux) (25 ng) 및 β-갈락토시다아제(25 ng) 리포터 플라스미드의 혼합물, 전사 인자 FAST2 (50ng), 그리고 빈 pCDNA3 벡터 (400 ng)로 형질감염되었다. 이후, 이들 세포는 16-24시간 동안 증가하는 용량의 액티빈- βA 또는 액티빈/BMP-2 키메라로 처리되었다. 이들 세포는 얼음같이 차가운 용해 완충액 (1 mM 디티오트레이톨을 포함하는 25 mM 글리실글리신,4 nM EGTA, 15 mM MgSO₄에서 1% Triton X-100)에서 수확되고, 그리고 표준 방법을 이용하여 루시페라아제 및 β-갈락토시다아제 활성에 대하여 평가되었다. 공지된 TGF-β 보조-수용체에 결합하는 액티빈/BMP-2 키메라의 능력을 평가하기 위하여, HEK293T 세포는 16-24시간 동안 형질감염된 Cripto의 존재 또는 부재에서 증가하는 용량의 액티빈-βA 또는 액티빈/BMP-2 키메라로 처리되었다 (생쥐 Cripto 구조체는 Malcolm Whitman(Department of Cell Biology, Harvard Medical School, Boston,MA)로부터 우호적으로 증여받았다). 활성은 이후, 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다.

쥐 내측 뇌하수체 세포로부터 난포 자극 호르몬 (FSH) 방출. 이러한 분석평가는 당분야에서 기존에 보고된 바와 같이 실행되었다. 간단히 말하면, 여러 동물로부터 수컷 Sprague-Dawley 쥐 내측 뇌하수체로부터 새로 분리된 세포는 합동되고, 그리고 2% 우태아 혈청 및 적절한 성장 인자로 보충된 βPJ 배지에서 50,000 세포/웰의 밀도로 96-웰 평판 내로 접종되었다. 24시간후, 세포는 증가하는 용량의 액티빈-βA 또는 액티빈/BMP-2 키메라 (0-40 nM)로 처리되었다. 72시간후, 배지는 수확되고, 그리고 분비된 FSH의 농도는 방사면역측정법에 의해 결정되었다.

표면 플라즈몬 공명 (BIAcore) 친화성 연구. BMPRIa, ActRII, 그리고 ActRIIb에 대한 리간드의 친화성은 Biacore 3000 (GE Healthcare)을 이용함으로써 모니터링되고, 그리고 데이터는 BIAevaluation 소프트웨어 ver. 4.1 (GE Healthcare)을 이용함으로써 분석되었다. 일차 아민 커플링 (primary amine coupling)을 이용하여, 수용체 ECD는 CM5 칩 상에 고정되었다. 이들 수용체는 5 ㎕/min의 유속 및 10 mM Na 아세테이트, pH 4.0에서 20 μM의 농도로, 10분 동안 유동 세포 2-4 상에 독립적으로 고정되었다. 유동 세포 1은 음성 대조 (negative control)로서, 고정된 단백질이 없는 공백으로 남겨졌다. 실험은 20 mM Tris-HCl pH 7.9, 250 mM NaCl, 0.36% 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 (CHAPS), 그리고 0.005% Tween-20에서 50 ㎕/min의 유속으로 실행되었다. 반응속도 분석을 위하여 샘플당 최소 5가지 농도 + 제로 농도가 시험되고, 그리고 데이터는 물질 전달로 글로벌 1:1 랑뮈에 결합을 이용함으로써 피팅 (fitting)되었다.

실시예 2

BMP 이종이합체 리간드의 합성. BMP2-BMPRIa-ActRIIb의 결정 구조는 각 수용체 분자가 세포외에서 결합되지 않고 4개의 상이한 리간드-수용체 인터페이스 (인터페이스)를 보유한다는 것을 보여준다. 이는 이종이합체가 2개의 상이한 I형 인터페이스 및 2개의 상이한 II형 인터페이스를 보유한다는 것을 암시하였다. 이들 BMP 리간드의 기능적 측면 및 기타 측면을 특성화하기 위하여, 재조합 이종이합체가 합성되었다. 상기 단백질의 순도는 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 검증되었다. 도 1a에서는 SDS-PAGE에서 비-환원 조건 하에 단일 띠 (레인 1)로서, 그리고 환원 조건 하에 2개의 상이한 띠 (레인 3)로서 BMP2/BMP6 이종이합체의 이동을 도시한다. 이들 2개의 상이한 띠는 BMP2/BMP6 이종이합체의 2개의 상이한 단위체 종 (각각, 대략 13 및 15 kDa)에 상관한다. 이러한 증거는 표면-증강된 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석 (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS) 데이터로 더욱 뒷받침된다. BMP2와 BMP6 동종이합체 및 BMP2/BMP6 이종이합체의 3개의 별개의 정제된 샘플이 SELDI-TOF-MS에서 평가되었다. 도 1b에서 증명되는 바와 같이, 이들 3개의 샘플은 각각, 다른 오염 종 (contaminating species)이 없는 그들의 예측된 질량에 상응한다. 이들 분석평가는 순수한 BMP2/BMP6 이종이합체가 산출된다는 지시한다.

시험관내에서 BMP 이종이합체 활성.

BMP2/BMP6 이종이합체 및 I형과 II형 TGF-베타 수용체 ECD 사이에 상호작용을 평가하기 위하여, 시험관내 친화성을 측정하는데 표면 플라즈몬 공명이 이용되었다. TGF-베타 수용체는 칩에 고정되고, 그리고 TGF-베타 리간드는 상호작용을 모니터링하는 동안 표면 위에서 유동되었다. 표 3에서는 조사된 리간드 및 I형과 II형 수용체 ECD에 대한 변하는 친화성을 요약한다. BMP2/BMP6 이종이합체의 경우에, 이것은 각각의 BMP2와 BMP6 단위체 아단위로부터 더욱 큰 친화성을 채용한다. 보이는 바와 같이, BMP2/BMP6 이종이합체는 I형 수용체에 대하여, BMP2 동종이합체에서와 유사한 친화성을 갖는다. 하지만, BMP2 아단위로부터 II형 수용체 ECD 친화성을 채용하는 대신에, BMP2/BMP6 이종이합체는 II형 수용체에 대하여, BMP6 동종이합체에서와 유사한 친화성을 갖는다. 이는 II형 수용체 ECD에 대한 높은 친화성이 BMP6 단위체 아단위에 의해 기여되는 반면, I형 수용체 ECD에 대한 높은 친화성이 BMP2 단위체 아단위에 의해 기여된다는 것을 지시한다.

BMP2/BMP6 이종이합체의 수용체 ECD 친화성이 신호전달 활성과 상관하는 지를 조사하기 위하여, 루시페라아제 리포터 분석평가가 이용되었다. C2C12 생쥐 근아세포 세포주를 이용하여, BMP 리간드는 Smad1 의존성 리포터 유전자를 활성화시키는 능력에 대하여 정량적으로 조사되었다. BMP2, BMP6 및 BMP2/BMP6 모두 용량-의존성 리포터 활성화를 보였다. BMP2/BMP6 이종이합체 리간드는 BMP2 또는 BMP6 동종이합체 대응물보다 리포터 유전자의 훨씬 큰 활성화를 보였다 (도 2). 리포터 유전자를 동등한 수준으로 활성화시키기 위하여, BMP2와 BMP6 동종이합체와 비교하여 각각, 최대 22-배와 400-배 적은 BMP2/BMP6이 필요하였다. BMP2/BMP6 이종이합체가 I형과 II형 수용체 ECD 둘 모두에 높은 친화성을 갖는 점을 고려하면, 이들 결과는 수용체에 대한 증가된 친화성이 세포내 신호전달 활성의 수준과 상관한다는 것을 암시한다.

BMP2/BMP6 이종이합체의 활성을 더욱 특성화하기 위하여, 미세 배양 (micromass culture) 동안 병아리 사지싹 중간엽 세포 (chick limb bud mesenchyme cell)를 이용한 탈체 분석평가가 이용되었다. 일차 배양된 사지싹 중간엽 세포는 BMP-의존성 방식으로 연골형성을 겪고, 그리고 이러한 시스템은 생물하적 과정에서 동종 및 이종이합체의 특성화를 가능하게 한다. 도 3에서는 형성이 BMP에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있는 연골형성 마디 (chondrogenic nodule)의 염색의 현미경사진 이미지를 도시한다. 연골형성의 정도는 연골형성 마디에 결합된 염료를 측정함으로써 정량된다. 리포터 분석평가에서와 유사하게, 상이한 BMP 리간드에 의한 사지싹 중간엽 세포의 연골형성의 용량-의존성 활성화. 이러한 분석평가의 독특한 측면은 BMP6이 BMP2보다 약간 높은 활성을 갖는 반면, Smad-1-의존성 리포터 활성화에서 이의 활성이 BMP2의 활성보다 훨씬 낮았다는 점이다. 이것은 아마도, II형 수용체-개시된 별개의 신호전달, 예를 들면, p38 경로를 수반한다. 이러한 시스템에서 연골형성을 활성화시키는 BMP2/BMP6 이종이합체의 더욱 큰 활성이 관찰되었다. BMP2/BMP6은 10-배 농도에서 BMP2와 BMP6 동종이합체의 유사한 수준까지 연골형성을 활성화시켰다. 이들 이종이합체 리간드는 또한, 동일한 농도에서 더욱 높은 최대 반응을 유도한다. 이러한 분석평가는 더욱 높은 신호전달 활성에 대한 더욱 높은 리간드-수용체 친화성의 상관을 가능하게 할 뿐만 아니라 이러한 관찰을 생물학적 활성에서 증가까지 확장한다.

리간드-수용체-ECD 친화성, 시험관내 및 탈체 분석평가의 데이터는 기능적 비대칭 BMP2/BMP6 이합체가 산출되었다는 것을 증명하였다. BMP2/BMP6 이종이합체의 비대칭 성격은 리간드의 특정한 TGF-베타 수용체 부위의 조작을 가능하게 한다. 도 5에서는 앞서 기술된 바와 동일한 시스템을 이용한, BMP2/BMP6 이종이합체의 특정한 돌연변이유발, 그리고 Smad1 의존성 리포터 유전자를 활성화시키는 상이한 돌연변이체의 능력의 정량을 도시한다 (모든 인자는 1nM 농도로 존재한다). 정량된 값은 돌연변이유발이 없는 BMP2/BMP6 야생형 이종이합체와 비교하여 배수적 활성화 백분율로서 표시된다 (리포터 유전자의 100% 활성화에 표준화됨). 2개의 I형 수용체 인터페이스 중에서 단지 하나에 대한 점 돌연변이를 보유하고 2개의 II형 수용체 인터페이스가 본래대로인 BMP2/BMP6 이종이합체 리간드 (도 5, 샘플 d와 e)는 비록 BMP2/BMP6 야생형 이종이합체와 비교하여 20 내지 80%이긴 하지만, 리포터 유전자를 활성화시킬 수 있다. 대조적으로, 2개의 II형 수용체 인터페이스 중에서 단지 하나에 대한 점 돌연변이를 보유하고 2개의 I형 수용체 인터페이스가 본래대로인 BMP2/BMP6 이종이합체 (도 5, 샘플 f)는 리포터 유전자를 활성화시킬 수 없다. 2개의 I형 수용체 및 II형 수용체 인터페이스 중에서 각각 하나를 파괴할 수 있는 점 돌연변이를 보유하는 BMP2/BMP6 이종이합체 리간드 (도 5, 샘플 g와 h)는 리포터 유전자를 활성화시킬 수 없다. 이들 결과는 2개의 II형 부위가 신호전달 활성에 요구되는 반면, 단지 하나의 I형 부위가 신호전달에 충분한다는 것을 증명한다. 하나의 I형 부위 돌연변이를 보유하는 2개의 리간드 (도 5에서 d와 e) 간에 신호전달 활성의 차이는 Smad1 활성화가 I형 부위 및 I형 수용체의 친화성과 직접적으로 상관한다는 것을 예증한다 (표 3).

비-신호전달 BMP2/BMP6 이종이합체 돌연변이체를 이용한 진전된 연구에서, 수용체 ECD에 결합하는 리간드의 능력이 평가되었다. 단지 하나의 활성 II형 수용체 부위를 보유하는 리간드 (도 5, 샘플 f)는 리포터 유전자를 활성화시키지 못하지만, 고유-PAGE 조건 하에 II형 수용체 ECD에 여전히 결합할 수 있다. 도 6에서는 수용체 ECD가 리간드의 존재와 부재 둘 모두에서 고유-PAGE 상에서 이동되는 II형 수용체 ECD 포화 분석평가를 도시한다. 5 ㎍의 II형 수용체 ECD 및 인자 없음의 레인을 2개의 활성 II형 수용체 결합 부위를 보유하는 리간드의 레인과 비교할 때, 띠의 강도가 9.0-배 감소하는데, 이는 수용체 ECD가 리간드-수용체 복합체에 통합되었다는 것을 지시한다. 이것은 단독 실행된 3 ㎍ 수용체 ECD의 강도를 비교할 때, 리간드-수용체 복합체 내로 통합된 수용체 ECD의 대략 절반을 나타낸다. 다음 레인에서, 단지 하나의 활성 II형 수용체 부위를 보유하는 리간드는 2개의 활성 II형 수용체 부위를 보유하는 리간드와 비교하여, 띠 강도에서 3.3-배 증가를 보인다. 마지막 레인에서, 활성 II형 수용체 부위를 보유하지 않는 리간드는 하나의 활성 II형 수용체 부위를 보유하는 리간드와 비교하여 띠 강도에서 1.8-배 증가를 보인다. 예상된 바와 같이, 하나의 활성 II형 수용체 부위를 보유하는 BMP2/BMP6 리간드는 2개의 활성 II형 수용체 부위를 보유하는 리간드 및 활성 II형 수용체 부위를 보유하지 않는 리간드 사이에 속한다. 돌연변이된 BMP2/BMP6 이종이합체 상에서 단일 본래 II형 수용체 인터페이스는 하나의 II형 TGF-베타 수용체 ECD에 여전히 결합할 수 있는데, 이는 상기 세포외 신호전달 복합체가 집합될 수 있음을 지시한다. 돌연변이된 리간드의 신호할 수 없음은 세포 표면에서 신호전달 복합체 집합으로부터 하류에 더욱 의존한다. 이러한 분석평가는 리간드-수용체 복합체 형성의 독립성 결합 모형에 대한 증거를 제공하고, 여기서 단일 수용체 ECD가 리간드 상에서 다른 3개의 수용체 부위의 친화성 또는 기능성에 상관없이 상기 리간드 상에서 4개의 수용체 부위 중에서 하나에 결합할 수 있다.

재조합 BMP 이종이합체의 분석으로부터 결과는 정제된 동질 이종이합체 샘플이 합성될 수 있음을 증명한다 (도 1). 상기 데이터는 재조합 BMP 이종이합체가 대장균 (E. coli)에서 봉입체로서 발현되고, 재접힘되고, 그리고 측정가능 수준으로 정제될 수 있음을 더욱 증명한다. 표면 플라즈몬 공명 친화성 연구로부터 획득된 데이터 (표 3)는 BMP 이종이합체가 BMP 동종이합체보다 생체내에서 및 시험관내에서 더욱 강력하다는 것을 증명한다. 동종이합체 대응물과 비교하여, BMP2/BMP6 이종이합체는 각각의 공유 연결된 단위체 아단위로부터 더욱 높은 친화성 수용체 부위를 보유한다. BMP2/BMP6 이종이합체는 BMP2 동종이합체에 필적하는 높은 친화성 I형 수용체 부위, 그리고 BMP6 동종이합체에 필적하는 높은 친화성 II형 수용체 부위를 보유한다. 이들 동종이합체 리간드 이차 수용체 부위 각각은 그들의 일차 수용체 부위와 비교하여, 개별 수용체에 대하여 더욱 낮은 친화성을 갖는다. 이러한 이종이합체 리간드-수용체 친화성 데이터는 최초로, 동종이합체 대응물과 비교하여 높은 효능 TGF-베타 이종이합체 리간드의 기전에 대한 명백한 증거를 제공한다. I형과 II형 수용체 ECD 둘 모두에 대한 높은 친화성으로, TGF-베타 신호전달 복합체는 더욱 용이하게 집합되고 세포 표면에서 집합된 상태로 존속할 수 있다. 이러한 BMP 이종이합체의 증가된 친화성은 전세포 리포터 분석평가에서 증가된 신호전달에 직접적으로 상관한다 (도 2). 부가적으로, 중간엽 세포 분석평가로부터 탈체 데이터 (도 3과 4)는 동종이합체 대응물보다 더욱 낮은 농도에서 및 더욱 높은 최대로 반응을 유도할 수 있는 BMP2/BMP6 이종이합체의 능력을 증명한다. 이러한 데이터는 증가된 리간드-수용체 친화성, 신호전달 활성, 그리고 생물학적 활성 사이에 상관을 직접적으로 뒷받침한다.

BMP 이종이합체의 높은 신호전달 활성이 전세포 리포터 시스템에서 용이하게 달성되긴 했지만 (도 2), TGF-베타 신호전달 복합체의 요구 및 활성화의 기전을 설명하는 것은 훨씬 어려웠다. 단지 하나의 I형 수용체 부위 및 2개의 II형 수용체 부위를 보유하는 BMP 이종이합체 구조체는 비록 완전 기능적 BMP 이종이합체와 비교하여 정도가 덜하긴 하지만, 리포터 유전자를 여전히 활성화시킬 수 있었다 (도 5). 하지만, 2개의 I형 수용체 부위 및 단지 하나의 II형 수용체 부위를 보유하는 BMP 이종이합체 구조체는 리포터 유전자를 활성화시키는데 실패하였다 (도 5). 리간드 상에서 요구되는 활성 I형과 II형 수용체 부위의 숫자 간에 이러한 불일치는 용이하게 설명될 수 없다. 고유-PAGE 조건 하에 복합체 형성을 증명하는 데이터 (도 6)는 II형 수용체 ECD가 단지 하나의 활성 II형 수용체 인터페이스를 보유하는 돌연변이된 이종이합체에 결합할 수 있다는 것을 예증한다. 이것은 문제점이 세포 표면에서 리간드 및 수용체 ECD 사이에 신호전달 복합체 형성에 있지 않다는 것을 지시한다. 단지 하나의 II형 수용체를 보유하는 복합체는 하나의 I형 수용체를 보유하는 복합체만큼 용이하게 형성되지만, 단지 하나의 II형 수용체를 보유하는 복합체는 하류 신호전달을 개시하지 못한다.

상기 데이터는 II형 수용체 키나아제가 그 자체보다는 상대 II형 수용체를 인산화시키고, 그리고 이런 "교차-인산화 (cross-phosphorylation)"가 자가인산화 (autophosphorylation)의 분자 성질 (molecular nature)이라는 것을 암시한다. 대안으로, 비록 ECD가 서로를 결합시키지 못하지만, 2개의 II형 수용체 간에 세포내 키나아제 도메인의 물리적 결합 (physical association)이 "자기 인산화"에 요구된다. 신호전달 캐스케이드의 이러한 최초 단계는 하나의 II형 수용체의 부재에서 발생할 수 없고, 따라서 신호가 전달되지 않는다. 단지 하나의 I형 수용체가 존재하는 활성 신호전달 복합체를 형성하는 일부 돌연변이 BMP 이종이합체 리간드의 능력 (도 5)은 이러한 신호전달 복합체 내에 2개의 II형 수용체 키나아제가 이합체화되고, 자가인산화되고, 이후 단일 I형 수용체 키나아제를 인산전달 (transphosphorylation)할 수 있기 때문에 발생한다. I형 수용체 키나아제의 이합체는 요구되지 않는데, 그 이유는 상기 키나아제 도메인이 II형 수용체 키나아제의 자가인산화된 이합체에 의해 간단하게 인산전달되기 때문이다.

상기 개시는 세포 표면에서 신호전달 복합체 형성을 위한 진정 독립성 리간드-수용체 ECD 결합 모형을 보여준다. 앞서 언급된 바와 같이, 단지 하나의 활성 II형 수용체 부위를 보유하는 돌연변이된 BMP2/BMP6 이종이합체 리간드는 단일 II형 수용체 ECD에 여전히 결합할 수 있다 (도 6). 이러한 증거는 리간드의 4개의 개별 수용체 부위의 친화성 또는 기능성에 상관없이, 형성되는 신호전달 복합체의 능력을 주장하는 근거를 제공한다. 리간드 상에서 각 수용체 부위가 이러한 독립성 방식으로 결합할 수 있으면, TGF-베타 신호전달 복합체 형성에 복잡성 (complexity)의 다른 층이 추가된다. 리간드 및 이종이합체로 인하여 가능한 많은 기능적 리간드를 인코딩하는 대략 40개의 유전자로, 복잡한 신호전달 기전이 존재할 것임에 틀림없다. 12개의 수용체를 통해서만 신호하는 능력으로, 이러한 리간드 주동된 신호전달 기전은 상이한 수용체에 대한 리간드의 개별 수용체 부위의 친화성에 의존할 것임에 틀림없다. 이는 리간드 상에서 4개의 수용체 부위 각각이 수용체를 신호전달 복합체 내로 동원하기 위하여 독립적으로 기능하는 경우에만 가능하다. 동일한 12개의 수용체를 통하여 상이한 생물학적 기능을 유도하기 위하여, 리간드 상에서 4개의 수용체 부위 각각의 독립적인 개별 친화성이 생물학적 반응을 조율하는데 핵심 인자이다. 이러한 관점에서, 특정한 리간드 (동종이합체 또는 이종이합체)의 역할은 상이한 친화성을 갖는 상이한 세트의 I형과 II형 수용체를 집합시키는 것이고, 이들은 교대로, 상이한 수준의 신호전달 및 TGF-b 신호전달의 복잡성을 발생시킨다.

높은 시험관내 및 탈체 활성을 갖는 신규한 BMP2/BMP6 구조체의 측정가능 산출은 많은 함의를 갖는다. 이러한 분자는 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드-수용체 신호전달 복합체의 집합을 결정하고 리간드-수용체 친화성, 신호전달 활성, 그리고 생물학적 활성 사이에 직접적인 상관을 증명하기 위한 기초로서 기능하였다. 리간드 및 수용체 사이에 친화성에서 차이는 결정적이고, 그리고 이러한 비대칭 이종이합체 리간드 신호전달은 TGF-베타 분자의 생물학적 활성에 복잡성을 더욱 추가한다. BMP 이종이합체로 연구는 각각의 리간드-수용체 상호작용이 TGF-베타 슈퍼패밀리의 활성에 어떻게 기여하는 지를 예증한다.

이종이합체의 산출. 인간 BMP2 (잔기 1-110) 및 인간 BMP6 (잔기 1-132)의 성숙 도메인은 대장균 (E. coli)에서 봉입체로서 발현되었다. 이들 야생형 리간드 서열에 대한 돌연변이는 리간드-수용체 인터페이스를 파괴하는 기존에 공개된 발견물에 기초되었다 (Keller et al., 2004; Kirsch et al., 2000). 발현된 봉입체는 분리되고, 정제되고, 그리고 재접힘되었다. 재접힘된 BMP2와 BMP6 동종이합체, 그리고 BMP2/BMP6 이종이합체는 HiTrap 헤파린 칼럼 (GE Healthcare) 및 역상 크로마토그래피 (GraceVydac)를 이용하여 정제되었다. 이들 리간드는 동결 건조되고 10mM 나트륨 아세테이트 pH 4.0에서 재-현탁되었다. 인간 BMPRIa (잔기 1-129) 및 생쥐 ActRIIb (잔기 1-98)의 ECD는 대장균 (E. coli)에서 티오레독신 (thioredoxin) 융합 단백질로서 발현되었다. 생쥐 ActRII-ECD (잔기 1-102)는 피키아 파스토리스 (P. pastoris) 발현 시스템으로부터 발현되고 정제되었다.

표면 플라즈몬 공명 (BIAcore) 친화성 연구. BMPRIa, ActRII, 그리고 ActRIIb에 대한 리간드의 친화성은 Biacore 3000 (GE Healthcare)을 이용함으로써 모니터링되고, 그리고 데이터는 BIAevaluation 소프트웨어 ver. 4.1 (GE Healthcare)을 이용함으로써 분석되었다. 일차 아민 커플링 (primary amine coupling)을 이용하여, 수용체 ECD는 CM5 칩 상에 고정되었다. 이들 수용체는 5 ㎕/min의 유속 및 10 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0에서 20 μM의 농도로, 10분 동안 유동 세포 2-4 상에 독립적으로 고정되었다. 유동 세포 1은 음성 대조 (negative control)로서, 고정된 단백질이 없는 공백으로 남겨졌다. 실험은 20 mM Tris-HCl pH 7.9, 250 mM NaCl, 0.36% 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 (CHAPS), 그리고 0.005% Tween-20에서 50 ㎕/min의 유속으로 실행되었다. 반응속도 분석을 위하여 샘플당 최소 5가지 농도 + 제로 농도가 시험되고, 그리고 데이터는 물질 전달로 글로벌 1:1 랑뮈에 결합을 이용함으로써 피팅 (fitting)되었다.

루시페라아제 리포터 분석평가. Smad1-의존성 루시페라아제 분석평가가 실행되었다. 간단히 말하면, C2C12 세포는 L-글루타민 및 항생제로 보충된 Dulbecco's minimum essential medium (DMEM) + 5% FBS에서 배양된다. 루시페라아제 리포터 분석평가를 위하여, 세포는 트립신처리되고, PBS로 2회 세척되고, 그리고 DMEM + 0.1% FBS를 포함하는 48-웰 평판 내로 도말되었다. 24시간후, 세포는 제조업체의 지시에 따라 Fugene6 (Roche)을 이용함으로써 Smad 결합 부위를 보유하는 -1147Id1-루시페라아제 구조체 (Id1-Luc) (Nakashima et al., 2001), Smad1 발현 구조체, 그리고 CAGGS-LacZ 플라스미드로 형질감염되었다. 루시페라아제 활성은 리간드로 자극후 24시간 시점에 측정되고, 그리고 이들 값은 베타-갈락토시다아제 활성을 이용함으로써 형질감염 효율에 대하여 표준화되었다. 루시페라아제 리포터의 활성은 Smad 결합 도메인이 없는 -927Id1-루시페라아제 (Id1-Luc mut)를 이용함으로써 획득되는 대조 값 (control value)과 비교하여 배수적-유도 (fold-induction)로 표시된다.

병아리 사지싹 Micromass 분석평가. Hamburger-Hamilton 23-24기 (Hamburger and Hamilton, 1951)에서 병아리 태아는 Ca2+와 Mg2+를 포함하는 Hanks 용액에 수집되고, 그리고 사지싹의 원위 1/3 부분이 절개되었다. 외배엽 시트 (ectodermal sheet)는 얼음 위에서 30분 동안 트립신처리 (trypsinization) (Ca2+와 Mg2+를 포함하는 Hanks 용액에서 0.5%)에 의해 제거되고, 이후 중간엽 조직은 회수되고 37℃에서 15분 동안 Ca²⁺와 Mg²⁺-없는 Hanks 용액에서 배양되었다. 이들 중간엽 세포는 1% FBS를 포함하는 OptiMEM 배지 (Invitrogen)에서 피펫팅 (pipetting)에 의해 단일 세포로 분리되었다. 배양액은 4 x 10⁵개 세포/웰로 96-웰 평판 내로 접종되었다. 1시간후, 각 리간드를 포함하는 배지가 첨가되었다. 리간드를 포함하는 새로운 배지가 매일 교체되고, 그리고 세포는 기존 문헌 (Wada et al., 2003)에서 설명된 바와 같이, 연골 마디를 시각화시키는 Alcian blue 염색 및 연골형성의 정량에 의해 연골형성에 대하여 분석되었다.

고유-PAGE 리간드-수용체 ECD 복합체 형성.

단독으로, 그리고 BMP2/BMP6, 단일 활성 II형 수용체 인터페이스를 보유하는 BMP2/BMP6, 또는 활성 II형 수용체 인터페이스를 보유하지 않는 BMP2 10 ㎍과 함께 5 ㎍의 정제된 ActRII-ECD는 50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 700 mM NaCl, 그리고 1.8% CHAPS에서 고유-PAGE 겔에 적하되었다. Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad) 염색된 겔은 NIH ImageJ 소프트웨어 (Abramoff et al., 2004)에서 "Integrated Density" 기능을 이용하여 분석되었다.

실시예 3

(1) AB2-008을 이용하여 줄기 세포 배지의 개발 (Valera et al. , 2010). 영양세포 (feeder) 없는 조건에서 인간 태아 줄기 세포 (hESC)의 배양은 다능성 (pluripotency)을 유지하기 위하여 복잡한 조제 배지 (formulation media)의 이용을 필요로 한다. 유감스럽게도, 상업용 배지는 매우 고가인데, 그 이유는 배지에 필요한 이들 성장 인자가 포유동물 세포에서 생산되기 어렵기 때문이다. 인간 태아 줄기 (hES) 세포를 배양하고, 그리고 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포를 도출하고 배양하기 위한 새로운 배지 (CIVA 배지 또는 mCIVA)를 유도하기 위하여 mTeSR1 조제가 이용되었다 (도 2 참조). CIVA 배지는 액티빈-A와 유사한 활성을 갖는 새로운 키메라 단백질인 AB2-008 대신에 mTeSR1에서 TGFβ1을 이용한다. 이러한 배지에서 매트리겔 코팅 (matrigel coating) 상에 배양된 hES 세포는 핵상 비정상 (karyotypic abnormality) 없이 20회 이상의 계대배양 (passage) 동안 다능성 형태를 유지한다. 이들 세포는 또한, 다능성 마커 TRA-1-60과 SSEA-4에 대하여 양성이고, 그리고 BMP-2 처리에 응하여 분화한다. 이러한 배지에서 배양된 iPS 세포 역시 다능성의 형태학적 특징 및 다능성 마커의 발현을 유지한다. 이러한 새로운 CIVA 배지는 또한, 인간 포피 섬유아세포로부터 iPS 세포를 도출하는 데에도 적합하다. CIVA 배지는 hES 세포에 대한 다른 상업적 배지의 바람직한 모든 특성을 갖지만 현재 가용한 배지보다 훨씬 적은 비용으로 조제될 수 있다. 도 2. H9 hES 세포주를 이용한 mCIVA 조제의 개발.

도 9에서는 인간 FGF2의 부재 또는 존재에서 상이한 농도의 AB2-008을 이용하여 mCIVA에서 배양된 H9 hES 세포를 도시한다. A. 3회 계대배양 (1 ng/㎖, AB2-008; FGF2 없음)후 분화된 H9 세포. B. 3회 계대배양 (10 ng/㎖, AB2-008; FGF2 없음)후 분화된 H9 세포. C. 11회 계대배양 (100 ng/㎖, AB2-008; FGF2 없음)후 분화된 H9 세포. D. 12회 계대배양 (1 ng/㎖, AB2-008; 100 ng/㎖, FGF2)후 분화된 H9 세포. E. 13회 계대배양 (10 ng/㎖, AB2-008; 100 ng/㎖, FGF2)후 H9 세포. F. 9회 계대배양 (100 ng/㎖, AB2-008; 100 ng/㎖, FGF2)후 분화된 H9 세포. 분화된 세포는 화살표로 표시된다.

(2) AB2-004, AB2-011, AB2-015의 무기화 데이터 (Yoon et al. , 2010).

Ca 침전에 의한 세포외 무기화에 대한 뼈 생성 전구세포 (pre-osteoblast) 세포주 (MC3T3-E1)의 진전을 모니터링하기 위하여 Von Kossa 염색이 이용되었다. AB2-004 및 AB2-011은 거의 10배 또는 그 이상의 강도로 염색의 극적인 증가를 보인다. AB2-015는 7일 기간을 지나서 최대 증가를 보인다 (데이터 제시되지 않음). 대조 군 (A)은 감지가능한 무기화를 나타내지 않는 반면, 대조 리간드 (BMP2)는 도 10의 B 열에 도시된 바와 같이 Ca 유출과 침전의 완만한 증가를 보인다.

(3) AB2-004에 의한 성체 쥐 재생 (협력으로). 성체 쥐의 P3 발가락이 절단되었다. 아가로즈 겔 비드 내에 배어든 BMP2 또는 AB2-004가 수술 부위에 첨가되었다. 골 재생 (regrowth)이 모니터링되었다. BMP2-처리된 조직은 골 회복을 나타내지 않는다. AB2-004-처리된 발가락은 완전한 회복을 나타낸다.

(4) AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010에 의한 Smad2-기초된 신호전달 (루시페라아제) 분석평가 (Allendorph et al. , 2010). AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010은 액티빈-βA에서와 거의 구별되지 않는 방식으로 Smad2 경로를 활성화시킨다. 이들 키메라에 대한 효능은 액티빈-βA와 비교하여, 5 내지 20-배 감소된다 (도 11 참조).

(5) AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010에 의한 포스포-Smad-2 분석평가. 액티빈-βA는 Smad-2를 특이적으로 인산화시키고 Smad-1을 특이적으로 인산화시키지 못한다. 이것은 BMP-2와 대조되는데, 여기서 Smad-1의 특이적인 인산화가 관찰되고 Smad-2의 특이적이 인산화는 관찰되지 않는다. AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010은 액티빈-βA와 동일한 Smad-2 인산화 패턴을 나타낸다. 이것은 3개의 리간드 모두 액티빈-βA에서와 유사한 방식으로 액티빈-βA 신호전달 경로를 촉진한다는 것을 확증한다 (도 11 참조).

(6) AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010에 의한 난포 자극 호르몬 방출. 액티빈-βA는 쥐 내측 뇌하수체 세포에 첨가될 때, 난포 자극 호르몬 (FSH)의 용량 의존성 방출을 유발한다. FSH의 액티빈-βA 유도된 방출은 길항약 인히빈의 첨가에 의해 차단될 수 있다. 액티빈-βA에서와 유사하게, AB2-008, AB2-009, 그리고 AB2-010은 FSH의 방출을 유발하고, 그리고 이러한 자극은 인히빈의 존재에서 감소된다.

(7) AB2-008에 의한 Cripto와의 보조-수용체 결합. Cripto의 첨가는 액티빈-βA 및 AB2-008 신호전달 둘 모두를 필적하는 수준으로 감소시킨다. 이들 데이터는 AB2-008이 액티빈-βA보조-수용체인 Cripto에 결합하는 능력을 갖는다는 것을 지시하고, 이는 AB2-008 및 액티빈-βA 사이에 기능적 유사성을 확증한다.

(8) AB2-008 및 액티빈-βA 수용체 친화성

AB2-008은 ActRII에 대한 높은 친화성을 갖고 BMPRIa에 대한 친화성이 없는 액티빈-βA에서와 유사한 수용체 결합 프로필을 나타낸다. 게다가, 이들 2개의 리간드는 거의 동일한 결합 친화성을 갖는다. AB2-008은 액티빈-βA보다 ~1.7 약하다.

(9) Smad-1 경로에 의한 AB2-011, AB2-012, 그리고 AB2-015의 신호전달 활성. AB2-004, AB2-011, AB2-012, 그리고 AB2-015는 BMP-2보다 훨씬 강력하게 Smad-1 경로를 활성화시킨다. 이러한 활성화는 BMP-2보다 3 내지 8-배 높다 (도 14).

(10) AB2-004, AB2-011, AB2-012, 그리고 AB2-015의 수용체 결합 친화성. AB2-004, AB2-011, AB2-012, 그리고 AB2-015는 ActRII에 대하여 액티빈-βA에서와 유사한 결합 친화성을 보인다. 이것은 BMP-2가 동일한 수용체에 대하여 갖는 결합 친화성보다 ~100배 높다. AB 키메라에 대한 I형 수용체 결합은 거의 BMP-2 수준 (AB2-004)에서부터 액티빈-βA 수준 (AB2-015의 경우에, BMPRIa에 대한 결합 없음)까지 변동한다.

(11) AB2-004, AB2-011, AB2-012, 그리고 AB2-015의 노긴 무감각. 노긴은 리간드와 직접적으로 복합되고, 그리고 상기 리간드가 신호전달을 위한 그 자신의 수용체에 결합할 수 없도록 만듦으로써 신호전달 활성을 억제한다. 노긴의 존재에서 거의 배경 수준까지 차단되는 BMP-2와 대조적으로, AB2-004, AB2-011, 그리고 AB2-015의 더욱 높은 신호전달은 노긴에 의해 저해되지 않는다. AB2-012는 노긴 저해에 부분적으로 무감각한데, 노긴이 첨가되면 신호전달이 ~50% 감소된다 (도 15). 이러한 특성으로 인하여, 이들은 골 재생을 비롯한 그들의 생체내 세포 신호전달 능력에서 특히 강력하다.

(12) 생산 효율

(13) BMP2 / BMP6 이종이합체의 수용체 결합 친화성 ( Isaacs et al . , 2010). BMP2/BMP6 이종이합체는 I형 수용체 BMPRIa에 대하여 BMP2의 결합 특징, 그리고 II형 수용체 ActRIIb에 대하여 BMP6의 결합 특징을 갖는다. 상기 이종이합체 리간드에 의한 각 수용체 유형에 대한 높은 친화성의 유지는 신호전달 활성에서, 동종이합체성 대응물, BMP2와 BMP6 동종이합체보다 BMP2/BMP6 이종이합체를 더욱 강하게 만든다 (표 7).

(14) BMP2/BMP6 이종이합체의 SMAD-1 신호전달 활성. BMP2/BMP6 이종이합체는 BMP2 또는 BMP6 단독보다 훨씬 강한 활성을 갖는다. BMP2/BMP6은 BMP2 또는 BMP6 단독보다 최소한 1 크기 자릿수 높은 EC50을 갖는다. 게다가, BMP2/BMP6에 의해 달성되는 최대 반응은 BMP2와 BMP6 단독에 의해 달성되는 최대 신호의 조합보다 크다.

(15) BMP2/BMP6 이종이합체에 대한 병아리 사지싹 미세 분석평가. BMP2/BMP6은 BMP2 또는 BMP6 동종이합체보다 더욱 강력하게 연골형성을 유도한다. 병아리 사지싹 중간엽 세포 미세 배양 연골형성 분석평가에서, 3일후 BMP2/BMP6은 BMP2 또는 BMP6보다 더욱 낮은 농도에서 및 더욱 높은 수준으로 연골형성을 유도하는 것으로 관찰된다.

실시예 4

설계자 리간드를 산출하기 위한 하위도메인 (빌딩 블록)에 관한 설명. 키메라를 산출하기 위하여, 첫 번째 단계는 각 분절에 대하여 어디서 경계를 만들지를 결정하는 것이었다. 키메라 라이브러리는 액티빈-βA 및 BMP-2를 2가지 서열 공급원으로서 이용하여 작제되었다. 액티빈/BMP-2 (AB) 키메라를 만들기 위한 섹션에 대한 컷-오프 (cut-off) 영역 (연접부 (junction))을 설계하기 위하여, 단백질 서열 정렬과 연합된 구조 근거된 접근법 (structure guided approach)이 이용되었다. 초기에, 액티빈-βA (Harrington et al., 2006) 및 BMP-2 (Allendorph et al., 2006)의 3-차원 결정 구조가 구조적으로 조사되었다. 이러한 분석으로부터, 이들 리간드는 6가지 상이한 섹션으로 느슨하게 분류되었다 (분절 1 내지 6에 대하여 도 7 참조). 정확한 분절 연접부는 상기 연접부를 연결한 결과로서 어느 한쪽 단백질 서열의 임의의 서열 변화를 최소화시키기 위하여, 이들 2개의 리간드의 단백질 서열 정렬 이후에 궁극적으로 결정되었다. 게다가, 이들 분절 경계 (segmental boundary)는 수용체 결합 부위로부터 멀리 떨어진 구조 영역 내에 위치하도록 선택되었다.

연접부에 관한 상세한 설명: 분절 1과 2 (연접부 1) 사이: 분절 1 및 분절 2의 경계에 집중하여, BMP-2 및 액티빈-βA 사이에 고도로 보존되는 10-잔기 영역이 발견되었다. 실제로, 이들 10개의 잔기 중에서 8개는 동일하고, 그리고 나머지 2개는 고도로 보존성 차이이다. 이러한 구역은 핑거 1의 끝 영역에 위치하고, 그리고 리간드에 따라서, 어느 한쪽 수용체 유형과 접촉하거나, 또는 제한된 접촉을 할 것으로 예측된다. BMP-2/BMPRIa/ActRII의 3원 결정 구조 (Allendorph et al., 2006)에 기초하여, 단지 Val-26, Gly-27, 그리고 Trp-28 (BMP-2 numbering)만 I형 수용체와 접촉을 산출한다. 이들 3개의 잔기 중에서, 단지 Val-26만 리간드 간에 상이하지만 고도로 보존성 변화인데, 그 이유는 액티빈-βA에서 상응하는 잔기가 Ile-23이기 때문이다. 이러한 영역에서 이들 잔기가 매우 유사하고 수용체 결합에 관여하지 않기 때문에, 이것은 분절 1과 2에 대한 우수한 경계 접점에 이바지한다.

분절 2와 3 (연접부 2) 사이: 분절 2와 3 사이에 경계 영역으로 이동하여, 경계 컷-오프를 위한 다른 우수한 구역이 발견될 수 있다. 여기서, 액티빈-βA 및 BMP-2 사이에 동일한 4-잔기 서열이 존재한다. 이들 리간드가 적절하게 접힘될 때, 이러한 영역은 이합체의 중심에 위치하고, 양쪽 시스테인이 시스틴 결절 (cystine knot)에 참여한다. 이것은 유리한데, 그 이유는 여기서 이들 잔기가 리간드의 표면으로부터 묻히고 임의의 리간드-수용체 상호작용에 참여하지 않기 때문이다.

분절 4와 5 (연접부 4) 사이: 분절 2/3 경계에서와 유사하게, 분절 4/5 경계는 컷-오프를 위한 우수한 위치에 놓여진다. 여기서, 서열 동일성의 5-잔기 영역이 발견되고, 그리고 분절 2/3 경계에서처럼, 이러한 영역은 리간드 이합체의 중심에서 묻힌다. 2개의 시스테인 잔기는 단위체간 이황화 결합뿐만 아니라 시스틴 결절에도 참여한다. 이번에도, 상기 위치는 이러한 영액 내에 잔기가 수용체 결합 상호작용에 참여하는 것을 예방한다.

분절 5와 6 (연접부 5) 사이: BMP-2 및 액티빈-βA 키메라의 설계를 확장하기 위하여, TGF-β 슈퍼패밀리의 모든 구성원을 이용한 RASCH 구조체의 산출을 용이하게 하는 다른 경계 영역이 선택되었다. TGF-β 슈퍼패밀리 리간드는 구조적 체계 (structural architecture)를 공유할 뿐만 아니라, 그들의 단백질 서열 내에 고도로 보존되는 일정한 영역을 보유하는 것으로 보인다. 흥미롭게도, 이들 영역은 BMP-2 및 액티빈-βA 키메라를 만들기 위하여 선택된 경계 영역과 일치한다. 가령, 4와 5의 경계 영역에서, 대부분의 리간드는 경계 도메인을 규정하는 4개의 잔기 중에서 3개를 공유한다. 수용체 결합 부위로부터 분리되는 이들 영역과 결부된 이런 높은 유사성은 새로운 기능성을 갖는 설계자 리간드의 라이브러리를 산출하기 위한 보편적 전략으로서 RASCH를 지시한다.

분절 3과 4 (연접부 3) 사이: 분절 3과 4 사이에 경계는 상이한 서브패밀리 간에 구조적 가변 (structural variability)에 종속되고, 여기서 리간드-수용체 집합 기전은 실질적으로 상이할 수 있다. 이와 관련하여, 분절 3과 4는 2개의 분절이 그들의 구조적 일체성 (structural 완전성)을 보존하기 위하여 공통의 부모 가닥으로 유래되도록 하나의 분절 조각으로서 처리될 수 있다.

모든 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 간에 구조적 유사성은 일정한 기능성, 예를 들면, 분자 인식 (molecular recognition)을 수행하는 것으로 알려져 있는 서열의 관련된 분절을 교체 (스와핑)함으로써 키메라 단백질을 설계하기 위한 합리적 기초를 형성한다. 항체 사슬, 또는 더욱 구체적으로, 항체 단편 (Fab)의 단백질 조작은 가장 중요한 실례인데, 여기서 기본적 구조 뼈대가 경쇄 및 중쇄 서열의 중심 체계 (core architecture) 상에 구축되고, 이들 서열의 경우에 2개의 사슬 각각으로부터 3개씩 6개의 가변 루프가 에피토프-결합 특이성의 역할을 주도한다. 유사한 기질 (vein)에서, TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드는 나비-유사 체계로서 그들의 구조 프레임워크 (structural framework)를 공유한다. 항체의 가변 루프 영역에 기능적으로 동등한 서열 분절의 부분(들)은 이후, 한 리간드에서 다른 리간드로 인식 특이성을 전달하기 위하여 '이식'될 수 있다. 본 발명의 설계 원리는 전술한 '서열 이식에 의한 기능적 전달'로부터 그 자신을 구별한다. 새로운 키메라 라이브러리는 각 연접부에 의해 규정된 바와 같은 각 하위도메인의 구조 가능성 (structural feasibility)의 기초에서 산출된다. 본 발명의 키메라를 산출하는데 이용된 TGF-베타 패밀리 구성원의 다양한 도메인 간에 연접부는 키메라 라이브러리의 유용한 빌딩 블록을 제공한다. 이러한 추론에 의해, 연접부 1, 2, 4, 그리고 5는 모든 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원에 폭넓게 적용될 수 있을 만큼 충분히 규정되는 반면, 연접부 3은 폭넓게 적용되지 못한다. 키메라 설계에서 연접부 3의 적용은 표적 서열에 좌우되고, 이러한 경우에 하위도메인 분절 3과 4는 키메라 라이브러리를 설계할 때, 하나의 분절로서 처리될 수 있다. 이러한 접근법은 접힘가능한 이와 같은 단백질 산물을 생산하는 가능성을 극대화시키고, 이들 산물에 대한 기능적 특성화는 하기에 제시된다.

SEQUENCE LISTING <110> The Salk Institute for Biological Studies joint Center for Biosciences Choe, Senyon Allendorph, George Isaacs, Mike <120> DESIGNER LIGANDS OF TGF-BETA SUPERFAMILY <130> 00024-006WO1 <140> Not yet known <141> 2010-02-24 <150> US 61/155,066 <151> 2009-02-24 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-2 polynucleotide coding sequence <220> <221> CDS <222> (4)..(345) <400> 1 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc 144 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 cct ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt 192 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt 240 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 gtc ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ctg tac ctt gac gag aat 288 Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn 80 85 90 95 gaa aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg gtt gtg gag ggt tgt 336 Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110 ggg tgt cgc 345 Gly Cys Arg <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 1 5 10 15 His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile 20 25 30 Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 35 40 45 Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln 50 55 60 Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val 65 70 75 80 Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu 85 90 95 Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly 100 105 110 Cys Arg <210> 3 <211> 1281 <212> DNA <213> Homo Sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1281) <400> 3 atg ccc ttg ctt tgg ctg aga gga ttt ctg ttg gca agt tgc tgg att 48 Met Pro Leu Leu Trp Leu Arg Gly Phe Leu Leu Ala Ser Cys Trp Ile 1 5 10 15 ata gtg agg agt tcc ccc acc cca gga tcc gag ggg cac agc gcg gcc 96 Ile Val Arg Ser Ser Pro Thr Pro Gly Ser Glu Gly His Ser Ala Ala 20 25 30 ccc gac tgt ccg tcc tgt gcg ctg gcc gcc ctc cca aag gat gta ccc 144 Pro Asp Cys Pro Ser Cys Ala Leu Ala Ala Leu Pro Lys Asp Val Pro 35 40 45 aac tct cag cca gag atg gtg gag gcc gtc aag aag cac att tta aac 192 Asn Ser Gln Pro Glu Met Val Glu Ala Val Lys Lys His Ile Leu Asn 50 55 60 atg ctg cac ttg aag aag aga ccc gat gtc acc cag ccg gta ccc aag 240 Met Leu His Leu Lys Lys Arg Pro Asp Val Thr Gln Pro Val Pro Lys 65 70 75 80 gcg gcg ctt ctg aac gcg atc aga aag ctt cat gtg ggc aaa gtc ggg 288 Ala Ala Leu Leu Asn Ala Ile Arg Lys Leu His Val Gly Lys Val Gly 85 90 95 gag aac ggg tat gtg gag ata gag gat gac att gga agg agg gca gaa 336 Glu Asn Gly Tyr Val Glu Ile Glu Asp Asp Ile Gly Arg Arg Ala Glu 100 105 110 atg aat gaa ctt atg gag cag acc tcg gag atc atc acg ttt gcc gag 384 Met Asn Glu Leu Met Glu Gln Thr Ser Glu Ile Ile Thr Phe Ala Glu 115 120 125 tca gga aca gcc agg aag acg ctg cac ttc gag att tcc aag gaa ggc 432 Ser Gly Thr Ala Arg Lys Thr Leu His Phe Glu Ile Ser Lys Glu Gly 130 135 140 agt gac ctg tca gtg gtg gag cgt gca gaa gtc tgg ctc ttc cta aaa 480 Ser Asp Leu Ser Val Val Glu Arg Ala Glu Val Trp Leu Phe Leu Lys 145 150 155 160 gtc ccc aag gcc aac agg acc agg acc aaa gtc acc atc cgc ctc ttc 528 Val Pro Lys Ala Asn Arg Thr Arg Thr Lys Val Thr Ile Arg Leu Phe 165 170 175 cag cag cag aag cac ccg cag ggc agc ttg gac aca ggg gaa gag gcc 576 Gln Gln Gln Lys His Pro Gln Gly Ser Leu Asp Thr Gly Glu Glu Ala 180 185 190 gag gaa gtg ggc tta aag ggg gag agg agt gaa ctg ttg ctc tct gaa 624 Glu Glu Val Gly Leu Lys Gly Glu Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ser Glu 195 200 205 aaa gta gta gac gct cgg aag agc acc tgg cat gtc ttc cct gtc tcc 672 Lys Val Val Asp Ala Arg Lys Ser Thr Trp His Val Phe Pro Val Ser 210 215 220 agc agc atc cag cgg ttg ctg gac cag ggc aag agc tcc ctg gac gtt 720 Ser Ser Ile Gln Arg Leu Leu Asp Gln Gly Lys Ser Ser Leu Asp Val 225 230 235 240 cgg att gcc tgt gag cag tgc cag gag agt ggc gcc agc ttg gtt ctc 768 Arg Ile Ala Cys Glu Gln Cys Gln Glu Ser Gly Ala Ser Leu Val Leu 245 250 255 ctg ggc aag aag aag aag aaa gaa gag gag ggg gaa ggg aaa aag aag 816 Leu Gly Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Lys Lys 260 265 270 ggc gga ggt gaa ggt ggg gca gga gca gat gag gaa aag gag cag tcg 864 Gly Gly Gly Glu Gly Gly Ala Gly Ala Asp Glu Glu Lys Glu Gln Ser 275 280 285 cac aga cct ttc ctc atg ctg cag gcc cgg cag tct gaa gac cac cct 912 His Arg Pro Phe Leu Met Leu Gln Ala Arg Gln Ser Glu Asp His Pro 290 295 300 cat cgc cgg cgt cgg cgg ggc ttg gag tgt gat ggc aag gtc aac atc 960 His Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile 305 310 315 320 tgc tgt aag aaa cag ttc ttt gtc agt ttc aag gac atc ggc tgg aat 1008 Cys Cys Lys Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn 325 330 335 gac tgg atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag ggt 1056 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly 340 345 350 gag tgc ccg agc cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc 1104 Glu Cys Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe 355 360 365 cac tca aca gtc atc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt 1152 His Ser Thr Val Ile Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe 370 375 380 gcc aac ctc aaa tcg tgc tgt gtg ccc acc aag ctg aga ccc atg tcc 1200 Ala Asn Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser 385 390 395 400 atg ttg tac tat gat gat ggt caa aac atc atc aaa aag gac att cag 1248 Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln 405 410 415 aac atg atc gtg gag gag tgt ggg tgc tca tag 1281 Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 420 425 <210> 4 <211> 426 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 4 Met Pro Leu Leu Trp Leu Arg Gly Phe Leu Leu Ala Ser Cys Trp Ile 1 5 10 15 Ile Val Arg Ser Ser Pro Thr Pro Gly Ser Glu Gly His Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Asp Cys Pro Ser Cys Ala Leu Ala Ala Leu Pro Lys Asp Val Pro 35 40 45 Asn Ser Gln Pro Glu Met Val Glu Ala Val Lys Lys His Ile Leu Asn 50 55 60 Met Leu His Leu Lys Lys Arg Pro Asp Val Thr Gln Pro Val Pro Lys 65 70 75 80 Ala Ala Leu Leu Asn Ala Ile Arg Lys Leu His Val Gly Lys Val Gly 85 90 95 Glu Asn Gly Tyr Val Glu Ile Glu Asp Asp Ile Gly Arg Arg Ala Glu 100 105 110 Met Asn Glu Leu Met Glu Gln Thr Ser Glu Ile Ile Thr Phe Ala Glu 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Arg Lys Thr Leu His Phe Glu Ile Ser Lys Glu Gly 130 135 140 Ser Asp Leu Ser Val Val Glu Arg Ala Glu Val Trp Leu Phe Leu Lys 145 150 155 160 Val Pro Lys Ala Asn Arg Thr Arg Thr Lys Val Thr Ile Arg Leu Phe 165 170 175 Gln Gln Gln Lys His Pro Gln Gly Ser Leu Asp Thr Gly Glu Glu Ala 180 185 190 Glu Glu Val Gly Leu Lys Gly Glu Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ser Glu 195 200 205 Lys Val Val Asp Ala Arg Lys Ser Thr Trp His Val Phe Pro Val Ser 210 215 220 Ser Ser Ile Gln Arg Leu Leu Asp Gln Gly Lys Ser Ser Leu Asp Val 225 230 235 240 Arg Ile Ala Cys Glu Gln Cys Gln Glu Ser Gly Ala Ser Leu Val Leu 245 250 255 Leu Gly Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Lys Lys 260 265 270 Gly Gly Gly Glu Gly Gly Ala Gly Ala Asp Glu Glu Lys Glu Gln Ser 275 280 285 His Arg Pro Phe Leu Met Leu Gln Ala Arg Gln Ser Glu Asp His Pro 290 295 300 His Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile 305 310 315 320 Cys Cys Lys Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn 325 330 335 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly 340 345 350 Glu Cys Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe 355 360 365 His Ser Thr Val Ile Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe 370 375 380 Ala Asn Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser 385 390 395 400 Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln 405 410 415 Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 420 425 <210> 5 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature activin polypeptide homo sapiens <400> 5 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe 1 5 10 15 Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile 35 40 45 Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn 50 55 60 His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95 Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu 100 105 110 Cys Gly Cys Ser 115 <210> 6 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 6 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc 144 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 cct ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt 192 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt 240 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 gtc ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ttg tac tat gat gat ggt 288 Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 cga aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg atc gtg gag gag tgt 336 Arg Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 ggg tgc tca 345 Gly Cys Ser 115 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Arg Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ser 115 <210> 8 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <400> 8 atg caa gcc aaa cac caa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Gln Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc 144 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 cct ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt 192 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt 240 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 gtc ccg acc aag ctg aga ccc tcc atg ttg tac tat gat gat ggt caa 288 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln 85 90 95 aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg atc gtg gag gag tgt ggg 336 Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly 100 105 110 tgc tca 342 Cys Ser <210> 9 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Met Gln Ala Lys His Gln Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln 85 90 95 Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly 100 105 110 Cys Ser <210> 10 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 10 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc 144 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 cct ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt 192 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt 240 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 gtc ccg acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg tac tat gat gag aat 288 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Glu Asn 85 90 95 gaa aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg gtt gtg gag ggt tgt 336 Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110 ggg tgt cgc 345 Gly Cys Arg 115 <210> 11 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Glu Asn 85 90 95 Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110 Gly Cys Arg 115 <210> 12 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 12 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc 144 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 cct tct cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cac tca 192 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 acg ttg gtc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac 240 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 ctc aaa tcg tgc tgt gtc ccg acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg 288 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu 85 90 95 tac tat gat gat ggt caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg 336 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 atc gtg gag gag tgt ggg tgc tca 360 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu 85 90 95 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 14 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 14 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc 144 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 cct tct cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc tta cac tca 192 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Leu His Ser 50 55 60 acg ttg gtc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac 240 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 ctc aaa tcg tgc tgt gtc ccg aca gag ctc agt gct atc tcg atg ttg 288 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 85 90 95 tac tat gat gat ggt caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg 336 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 atc gtg gag gag tgt ggg tgc tca 360 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Leu His Ser 50 55 60 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 85 90 95 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 16 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag gga gaa tgc 144 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 cct tcc cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cat tca 192 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 acg ttg gtc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac 240 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 ctc aaa tcg tgc tgt gtc ccg acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg 288 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu 85 90 95 tac tat gat gat ggt caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg 336 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 atc gtg gag gag tgt ggg tgc tca 360 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu 85 90 95 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 18 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 18 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag gga gaa tgc 144 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 cct tcc cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cat tca 192 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 acg gtg atc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac 240 Thr Val Ile Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 ctc aaa tcg tgc tgt gtc ccg acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg 288 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu 85 90 95 tac tat gat gat ggt caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg 336 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 atc gtg gag gag tgt ggg tgc tca 360 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 19 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 Thr Val Ile Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu 85 90 95 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 20 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 20 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aaa cag ttc ttt gtc agt ttc aag gac atc ggg tgg aat gac tgg atc 96 Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile 20 25 30 att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag gga gaa tgc cct 144 Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro 35 40 45 tcc cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cat tca acg 192 Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr 50 55 60 ttg gtc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac ctc 240 Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu 65 70 75 80 aaa tcg tgc tgt gtc ccg acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg tac 288 Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr 85 90 95 tat gat gat ggt caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg atc 336 Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile 100 105 110 gtg gag gag tgt ggg tgc tca 357 Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro 35 40 45 Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr 50 55 60 Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu 65 70 75 80 Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr 85 90 95 Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile 100 105 110 Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 <210> 22 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 22 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag gga gaa tgc 144 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 cct tct cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cac tca 192 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 acg ttg gtc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac 240 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 ctc aaa tcg tgc tgt gtc ccg acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg 288 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu 85 90 95 tac ctt gac gag aat gaa aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg 336 Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met 100 105 110 gtt gtg gag ggt tgt ggg tgt cgc 360 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu 85 90 95 Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met 100 105 110 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 24 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 24 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag gga gaa tgc 144 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 cct tct cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cac tca 192 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 acg ttg gtc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac 240 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 ctc aaa tcg tgc tgt gtc ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ttg 288 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 85 90 95 tac ctt gac gag aat gaa aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg 336 Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met 100 105 110 gtt gtg gag ggt tgt ggg tgt cgc 360 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 85 90 95 Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met 100 105 110 Val Val Glu Gly Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 26 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 26 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag gga gaa tgc 144 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 cct tct cat ata gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cac tca 192 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 acg ttg gtc aac cac tac cgc atg cgg ggc cat agc ccc ttt gcc aac 240 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 ctc aaa tcg tgc tgt gtc ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ttg 288 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 85 90 95 tac tat gat gat ggt caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg 336 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 atc gtg gag gag tgt ggg tgc tca 360 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 27 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser 50 55 60 Thr Leu Val Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn 65 70 75 80 Leu Lys Ser Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu 85 90 95 Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met 100 105 110 Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 115 120 <210> 28 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 28 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gac gga gaa tgc 144 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 35 40 45 cct ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt 192 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt 240 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 gtc ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ttg tac tat gat gat ggt 288 Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg atc gtg gag gag tgt 336 Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 ggg tgc tca 345 Gly Cys Ser 115 <210> 29 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ser 115 <210> 30 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 30 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aag cgt ctt aag tcc agc tgc aaa 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 agg cac cct ttg tat gtg gac ttc agt gat gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gac gga gaa tgc 144 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 35 40 45 cct ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt 192 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt 240 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 gtc ccg acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg tac tat gat gat ggt 288 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg atc gtg gag gag tgt 336 Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 ggg tgc tca 345 Gly Cys Ser 115 <210> 31 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ser 115 <210> 32 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 32 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 atc att gct ccc tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gac gga gaa tgc 144 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 35 40 45 cct ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt 192 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt 240 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 gtc ccg acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg tac ctt gac gag aat 288 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn 85 90 95 gaa aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg gtt gtg gag ggt tgt 336 Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110 ggg tgt cgc 345 Gly Cys Arg 115 <210> 33 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn 85 90 95 Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110 Gly Cys Arg 115 <210> 34 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 34 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att atc gcg cct gaa ggc tac gcc gcc tac tac tgt gag ggg gag tgt 144 Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 gcc ttc cct ctg aac tcc tac atg aac gcc acc aac cac gcc atc gtg 192 Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 cag acg ctg gtc cac ttc atc aac ccg gaa acg gtg ccc aag ccc tgc 240 Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys 65 70 75 80 tgt gcg ccc acg cag ctc aat gcc atc tcc gtc ctc tac ttc gat gac 288 Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp 85 90 95 agc tcc aac gtc atc ctg aag aaa tac aga aac atg gtg gtc cgg gcc 336 Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala 100 105 110 tgt ggc tgc cac 348 Cys Gly Cys His 115 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys 65 70 75 80 Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp 85 90 95 Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala 100 105 110 Cys Gly Cys His 115 <210> 36 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(351) <400> 36 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att att gcc cca aaa gag tac gag gca tac gag tgt aag ggc ggc tgt 144 Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys 35 40 45 ttc ttt ccg ctg gcc gac gat gtc acc ccg acc aag cac gca att gtc 192 Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp Val Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val 50 55 60 caa acc tta gtg cac ctg aag ttc cca acg aaa gtg ggt aag gca tgt 240 Gln Thr Leu Val His Leu Lys Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys 65 70 75 80 tgt gtg cca acc aag tta tct cca att agc gtg ctg tat aag gat gat 288 Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp 85 90 95 atg ggc gtg ccg acg tta aag tat cat tac gag ggc atg agc gtc gca 336 Met Gly Val Pro Thr Leu Lys Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala 100 105 110 gag tgt ggc tgc cgc 351 Glu Cys Gly Cys Arg 115 <210> 37 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys 35 40 45 Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp Val Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val His Leu Lys Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp 85 90 95 Met Gly Val Pro Thr Leu Lys Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala 100 105 110 Glu Cys Gly Cys Arg 115 <210> 38 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 38 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att atc gcg ccg ctg gac tac gag gcg tac cac tgc gag ggc cta tgc 144 Ile Ile Ala Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys 35 40 45 gat ttt cct ctg cgt tcg cac ctc gaa ccc acc aac cat gcc atc att 192 Asp Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile 50 55 60 cag acg ttg gtc aac tcc atg gca cca gac gcg gcg ccg gcc tcc tgc 240 Gln Thr Leu Val Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys 65 70 75 80 tgt gtc ccg gcg cgc ctc agc ccc atc agc atc ttg tac tat gat gcc 288 Cys Val Pro Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Tyr Asp Ala 85 90 95 gcc aac aac gtt gtc tac aag caa tac gag gac atg gtg gtg gag gcc 336 Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala 100 105 110 tgt ggg tgt cgc 348 Cys Gly Cys Arg 115 <210> 39 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys 35 40 45 Asp Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Tyr Asp Ala 85 90 95 Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala 100 105 110 Cys Gly Cys Arg 115 <210> 40 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric polypeptide <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 40 atg caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag 48 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 aga cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg 96 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 att att gca ccc aaa aga tat aag gcc aat tac tgc tct gga gag tgt 144 Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys 35 40 45 gaa ttt gta ttt tta caa aaa tac cct cac act cat ctt gtg cac caa 192 Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln 50 55 60 gca aac ccc aga ggt tca gca ggc ccc tgc tgt act ccc aca aag atg 240 Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met 65 70 75 80 tct cca atc aat atg cta tat ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat 288 Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr 85 90 95 ggg aaa att cca gcc atg gta gta gat cgc tgt ggg tgc tca 330 Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 110 <210> 41 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys 35 40 45 Glu Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln 50 55 60 Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met 65 70 75 80 Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr 85 90 95 Gly Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 110 <210> 42 <211> 330 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 42 cag tgg att gaa cct cgg aat tgc gcc agg aga tac ctc aag gta gac 48 Gln Trp Ile Glu Pro Arg Asn Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp 1 5 10 15 ttt gca gat att ggc tgg agt gaa tgg att atc tcc ccc aag tcc ttt 96 Phe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe 20 25 30 gat gcc tat tat tgc tct gga gca tgc cag ttc ccc atg cca aag tct 144 Asp Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gln Phe Pro Met Pro Lys Ser 35 40 45 ttg aag cca tca aat cat gct acc atc cag agt ata gtg aga gct gtg 192 Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val 50 55 60 ggg gtc gtt cct ggg att cct gag cct tgc tgt gta cca gaa aag atg 240 Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Glu Lys Met 65 70 75 80 tcc tca ctc agt att tta ttc ttt gat gaa aat aag aat gta gtg ctt 288 Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys Asn Val Val Leu 85 90 95 aaa gta tac cct aac atg aca gta gag tct tgc gct tgc aga 330 Lys Val Tyr Pro Asn Met Thr Val Glu Ser Cys Ala Cys Arg 100 105 110 <210> 43 <211> 110 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 43 Gln Trp Ile Glu Pro Arg Asn Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp 1 5 10 15 Phe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe 20 25 30 Asp Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gln Phe Pro Met Pro Lys Ser 35 40 45 Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val 50 55 60 Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Glu Lys Met 65 70 75 80 Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys Asn Val Val Leu 85 90 95 Lys Val Tyr Pro Asn Met Thr Val Glu Ser Cys Ala Cys Arg 100 105 110 <210> 44 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 44 agc cct aag cat cac tca cag cgg gcc agg aag aag aat aag aac tgc 48 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 cgg cgc cac tcg ctc tat gtg gac ttc agc gat gtg ggc tgg aat gac 96 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 tgg att gtg gcc cca cca ggc tac cag gcc ttc tac tgc cat ggg gac 144 Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp 35 40 45 tgc ccc ttt cca ctg gct gac cac ctc aac tca acc aac cat gcc att 192 Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 gtg cag acc ctg gtc aat tct gtc aat tcc agt atc ccc aaa gcc tgt 240 Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys 65 70 75 80 tgt gtg ccc act gaa ctg agt gcc atc tcc atg ctg tac ctg gat gag 288 Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu 85 90 95 tat gat aag gtg gta ctg aaa aat tat cag gag atg gta gta gag gga 336 Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu Gly 100 105 110 tgt ggg tgc cgc 348 Cys Gly Cys Arg 115 <210> 45 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp 35 40 45 Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu 85 90 95 Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu Gly 100 105 110 Cys Gly Cys Arg 115 <210> 46 <211> 414 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(414) <400> 46 gca gcc aac aaa cga aaa aat caa aac cgc aat aaa tcc agc tct cat 48 Ala Ala Asn Lys Arg Lys Asn Gln Asn Arg Asn Lys Ser Ser Ser His 1 5 10 15 cag gac tcc tcc aga atg tcc agt gtt gga gat tat aac aca agt gag 96 Gln Asp Ser Ser Arg Met Ser Ser Val Gly Asp Tyr Asn Thr Ser Glu 20 25 30 caa aaa caa gcc tgt aag aag cac gaa ctc tat gtg agc ttc cgg gat 144 Gln Lys Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp 35 40 45 ctg gga tgg cag gac tgg att ata gca cca gaa gga tac gct gca ttt 192 Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe 50 55 60 tat tgt gat gga gaa tgt tct ttt cca ctt aac gcc cat atg aat gcc 240 Tyr Cys Asp Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala 65 70 75 80 acc aac cac gct ata gtt cag act ctg gtt cat ctg atg ttt cct gac 288 Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Phe Pro Asp 85 90 95 cac gta cca aag cct tgt tgt gct cca acc aaa tta aat gcc atc tct 336 His Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser 100 105 110 gtt ctg tac ttt gat gac agc tcc aat gtc att ttg aaa aaa tat aga 384 Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg 115 120 125 aat atg gta gta cgc tca tgt ggc tgc cac 414 Asn Met Val Val Arg Ser Cys Gly Cys His 130 135 <210> 47 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ala Ala Asn Lys Arg Lys Asn Gln Asn Arg Asn Lys Ser Ser Ser His 1 5 10 15 Gln Asp Ser Ser Arg Met Ser Ser Val Gly Asp Tyr Asn Thr Ser Glu 20 25 30 Gln Lys Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp 35 40 45 Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe 50 55 60 Tyr Cys Asp Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala 65 70 75 80 Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Phe Pro Asp 85 90 95 His Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser 100 105 110 Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg 115 120 125 Asn Met Val Val Arg Ser Cys Gly Cys His 130 135 <210> 48 <211> 396 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(396) <400> 48 caa cag agt cgt aat cgc tct acc cag tcc cag gac gtg gcg cgg gtc 48 Gln Gln Ser Arg Asn Arg Ser Thr Gln Ser Gln Asp Val Ala Arg Val 1 5 10 15 tcc agt gct tca gat tac aac agc agt gaa ttg aaa aca gcc tgc agg 96 Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg 20 25 30 aag cat gag ctg tat gtg agt ttc caa gac ctg gga tgg cag gac tgg 144 Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp 35 40 45 atc att gca ccc aag ggc tat gct gcc aat tac tgt gat gga gaa tgc 192 Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 50 55 60 tcc ttc cca ctc aac gca cac atg aat gca acc aac cac gcg att gtg 240 Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val 65 70 75 80 cag acc ttg gtt cac ctt atg aac ccc gag tat gtc ccc aaa ccg tgc 288 Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys 85 90 95 tgt gcg cca act aag cta aat gcc atc tcg gtt ctt tac ttt gat gac 336 Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp 100 105 110 aac tcc aat gtc att ctg aaa aaa tac agg aat atg gtt gta aga gct 384 Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala 115 120 125 tgt gga tgc cac 396 Cys Gly Cys His 130 <210> 49 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Gln Gln Ser Arg Asn Arg Ser Thr Gln Ser Gln Asp Val Ala Arg Val 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg 20 25 30 Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp 35 40 45 Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 50 55 60 Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val 65 70 75 80 Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys 85 90 95 Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp 100 105 110 Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala 115 120 125 Cys Gly Cys His 130 <210> 50 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(417) <400> 50 tcc acg ggg agc aaa cag cgc agc cag aac cgc tcc aag acg ccc aag 48 Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys 1 5 10 15 aac cag gaa gcc ctg cgg atg gcc aac gtg gca gag aac agc agc agc 96 Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser 20 25 30 gac cag agg cag gcc tgt aag aag cac gag ctg tat gtc agc ttc cga 144 Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg 35 40 45 gac ctg ggc tgg cag gac tgg atc atc gcg cct gaa ggc tac gcc gcc 192 Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 tac tac tgt gag ggg gag tgt gcc ttc cct ctg aac tcc tac atg aac 240 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn 65 70 75 80 gcc acc aac cac gcc atc gtg cag acg ctg gtc cac ttc atc aac ccg 288 Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro 85 90 95 gaa acg gtg ccc aag ccc tgc tgt gcg ccc acg cag ctc aat gcc atc 336 Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile 100 105 110 tcc gtc ctc tac ttc gat gac agc tcc aac gtc atc ctg aag aaa tac 384 Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr 115 120 125 aga aac atg gtg gtc cgg gcc tgt ggc tgc cac 417 Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 51 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys 1 5 10 15 Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro 85 90 95 Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 52 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(417) <400> 52 gca gtg agg cca ctg agg agg agg cag ccg aag aaa agc aac gag ctg 48 Ala Val Arg Pro Leu Arg Arg Arg Gln Pro Lys Lys Ser Asn Glu Leu 1 5 10 15 ccg cag gcc aac cga ctc cca ggg atc ttt gat gac gtc cac ggc tcc 96 Pro Gln Ala Asn Arg Leu Pro Gly Ile Phe Asp Asp Val His Gly Ser 20 25 30 cac ggc cgg cag gtc tgc cgt cgg cac gag ctc tac gtc agc ttc cag 144 His Gly Arg Gln Val Cys Arg Arg His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln 35 40 45 gac ctc ggc tgg ctg gac tgg gtc atc gct ccc caa ggc tac tcg gcc 192 Asp Leu Gly Trp Leu Asp Trp Val Ile Ala Pro Gln Gly Tyr Ser Ala 50 55 60 tat tac tgt gag ggg gag tgc tcc ttc cca ctg gac tcc tgc atg aat 240 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asp Ser Cys Met Asn 65 70 75 80 gcc acc aac cac gcc atc ctg cag tcc ctg gtg cac ctg atg atg cca 288 Ala Thr Asn His Ala Ile Leu Gln Ser Leu Val His Leu Met Met Pro 85 90 95 gac gca gtc ccc aag gcg tgc tgt gca ccc acc aag ctg agc gcc acc 336 Asp Ala Val Pro Lys Ala Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Ser Ala Thr 100 105 110 tct gtg ctc tac tat gac agc agc aac aat gtc atc ctg cgc aag cac 384 Ser Val Leu Tyr Tyr Asp Ser Ser Asn Asn Val Ile Leu Arg Lys His 115 120 125 cgc aac atg gtg gtc aag gcc tgc ggc tgc cac 417 Arg Asn Met Val Val Lys Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 53 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Ala Val Arg Pro Leu Arg Arg Arg Gln Pro Lys Lys Ser Asn Glu Leu 1 5 10 15 Pro Gln Ala Asn Arg Leu Pro Gly Ile Phe Asp Asp Val His Gly Ser 20 25 30 His Gly Arg Gln Val Cys Arg Arg His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Leu Asp Trp Val Ile Ala Pro Gln Gly Tyr Ser Ala 50 55 60 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asp Ser Cys Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Leu Gln Ser Leu Val His Leu Met Met Pro 85 90 95 Asp Ala Val Pro Lys Ala Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Ser Ala Thr 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Tyr Asp Ser Ser Asn Asn Val Ile Leu Arg Lys His 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Lys Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 54 <211> 333 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(333) <400> 54 agc gcc ggg gct ggc agc cac tgt caa aag acc tcc ctg cgg gta aac 48 Ser Ala Gly Ala Gly Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn 1 5 10 15 ttc gag gac atc ggc tgg gac agc tgg atc att gca ccc aag gag tat 96 Phe Glu Asp Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr 20 25 30 gaa gcc tac gag tgt aag ggc ggc tgc ttc ttc ccc ttg gct gac gat 144 Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp 35 40 45 gtg acg ccg acg aaa cac gct atc gtg cag acc ctg gtg cat ctc aag 192 Val Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Lys 50 55 60 ttc ccc aca aag gtg ggc aag gcc tgc tgt gtg ccc acc aaa ctg agc 240 Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80 ccc atc tcc gtc ctc tac aag gat gac atg ggg gtg ccc acc ctc aag 288 Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp Met Gly Val Pro Thr Leu Lys 85 90 95 tac cat tac gag ggc atg agc gtg gca gag tgt ggg tgc agg tag 333 Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala Glu Cys Gly Cys Arg 100 105 110 <210> 55 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ser Ala Gly Ala Gly Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn 1 5 10 15 Phe Glu Asp Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr 20 25 30 Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp 35 40 45 Val Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Lys 50 55 60 Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80 Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp Met Gly Val Pro Thr Leu Lys 85 90 95 Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala Glu Cys Gly Cys Arg 100 105 110 <210> 56 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 56 aac gcc aaa gga aac tac tgt aag agg acc ccg ctc tac atc gac ttc 48 Asn Ala Lys Gly Asn Tyr Cys Lys Arg Thr Pro Leu Tyr Ile Asp Phe 1 5 10 15 aag gag att ggg tgg gac tcc tgg atc atc gct ccg cct gga tac gaa 96 Lys Glu Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Pro Gly Tyr Glu 20 25 30 gcc tat gaa tgc cgt ggt gtt tgt aac tac ccc ctg gca gag cat ctc 144 Ala Tyr Glu Cys Arg Gly Val Cys Asn Tyr Pro Leu Ala Glu His Leu 35 40 45 aca ccc aca aag cat gca att atc cag gcc ttg gtc cac ctc aag aat 192 Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Ile Gln Ala Leu Val His Leu Lys Asn 50 55 60 tcc cag aaa gct tcc aaa gcc tgc tgt gtg ccc aca aag cta gag ccc 240 Ser Gln Lys Ala Ser Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro 65 70 75 80 atc tcc atc ctc tat tta gac aaa ggc gtc gtc acc tac aag ttt aaa 288 Ile Ser Ile Leu Tyr Leu Asp Lys Gly Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys 85 90 95 tac gaa ggc atg gcc gtc tcc gaa tgt ggc tgt aga 324 Tyr Glu Gly Met Ala Val Ser Glu Cys Gly Cys Arg 100 105 <210> 57 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Asn Ala Lys Gly Asn Tyr Cys Lys Arg Thr Pro Leu Tyr Ile Asp Phe 1 5 10 15 Lys Glu Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Pro Gly Tyr Glu 20 25 30 Ala Tyr Glu Cys Arg Gly Val Cys Asn Tyr Pro Leu Ala Glu His Leu 35 40 45 Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Ile Gln Ala Leu Val His Leu Lys Asn 50 55 60 Ser Gln Lys Ala Ser Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro 65 70 75 80 Ile Ser Ile Leu Tyr Leu Asp Lys Gly Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys 85 90 95 Tyr Glu Gly Met Ala Val Ser Glu Cys Gly Cys Arg 100 105 <210> 58 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(375) <400> 58 caa gca gat ggt atc tca gct gag gtt act gcc tct tcc tca aaa cat 48 Gln Ala Asp Gly Ile Ser Ala Glu Val Thr Ala Ser Ser Ser Lys His 1 5 10 15 agc ggg cct gaa aat aac cag tgt tcc ctc cac cct ttc caa atc agc 96 Ser Gly Pro Glu Asn Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Ile Ser 20 25 30 ttc cgc cag ctg ggt tgg gat cac tgg atc att gct ccc cct ttc tac 144 Phe Arg Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro Pro Phe Tyr 35 40 45 acc cca aac tac tgt aaa gga act tgt ctc cga gta cta cgc gat ggt 192 Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Thr Cys Leu Arg Val Leu Arg Asp Gly 50 55 60 ctc aat tcc ccc aat cac gcc att att cag aac ctt atc aat cag ttg 240 Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Ile Asn Gln Leu 65 70 75 80 gtg gac cag agt gtc ccc cgg ccc tcc tgt gtc ccg tat aag tat gtt 288 Val Asp Gln Ser Val Pro Arg Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Val 85 90 95 cca att agt gtc ctt atg att gag gca aat ggg agt att ttg tac aag 336 Pro Ile Ser Val Leu Met Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile Leu Tyr Lys 100 105 110 gag tat gag ggt atg att gct gag tct tgt aca tgc aga 375 Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Glu Ser Cys Thr Cys Arg 115 120 125 <210> 59 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gln Ala Asp Gly Ile Ser Ala Glu Val Thr Ala Ser Ser Ser Lys His 1 5 10 15 Ser Gly Pro Glu Asn Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Ile Ser 20 25 30 Phe Arg Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro Pro Phe Tyr 35 40 45 Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Thr Cys Leu Arg Val Leu Arg Asp Gly 50 55 60 Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Ile Asn Gln Leu 65 70 75 80 Val Asp Gln Ser Val Pro Arg Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Val 85 90 95 Pro Ile Ser Val Leu Met Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile Leu Tyr Lys 100 105 110 Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Glu Ser Cys Thr Cys Arg 115 120 125 <210> 60 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 60 gac gcc gaa ccc gtg ttg ggc ggc ggc ccc ggg ggc gct tgt cgc gcg 48 Asp Ala Glu Pro Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Ala Cys Arg Ala 1 5 10 15 cgg cgg ctg tac gtg agc ttc cgc gag gtg ggc tgg cac cgc tgg gtc 96 Arg Arg Leu Tyr Val Ser Phe Arg Glu Val Gly Trp His Arg Trp Val 20 25 30 atc gcg ccg cgc ggc ttc ctg gcc aac tac tgc cag ggt cag tgc gcg 144 Ile Ala Pro Arg Gly Phe Leu Ala Asn Tyr Cys Gln Gly Gln Cys Ala 35 40 45 ctg ccc gtc gcg ctg tcg ggg tcc ggg ggg ccg ccg gcg ctc aac cac 192 Leu Pro Val Ala Leu Ser Gly Ser Gly Gly Pro Pro Ala Leu Asn His 50 55 60 gct gtg ctg cgc gcg ctc atg cac gcg gcc gcc ccg gga gcc gcc gac 240 Ala Val Leu Arg Ala Leu Met His Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala Asp 65 70 75 80 ctg ccc tgc tgc gtg ccc gcg cgc ctg tcg ccc atc tcc gtg ctc ttc 288 Leu Pro Cys Cys Val Pro Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Phe 85 90 95 ttt gac aac agc gac aac gtg gtg ctg cgg cag tat gag gac atg gtg 336 Phe Asp Asn Ser Asp Asn Val Val Leu Arg Gln Tyr Glu Asp Met Val 100 105 110 gtg gac gag tgc ggc tgc cgc 357 Val Asp Glu Cys Gly Cys Arg 115 <210> 61 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Asp Ala Glu Pro Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Ala Cys Arg Ala 1 5 10 15 Arg Arg Leu Tyr Val Ser Phe Arg Glu Val Gly Trp His Arg Trp Val 20 25 30 Ile Ala Pro Arg Gly Phe Leu Ala Asn Tyr Cys Gln Gly Gln Cys Ala 35 40 45 Leu Pro Val Ala Leu Ser Gly Ser Gly Gly Pro Pro Ala Leu Asn His 50 55 60 Ala Val Leu Arg Ala Leu Met His Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala Asp 65 70 75 80 Leu Pro Cys Cys Val Pro Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Phe 85 90 95 Phe Asp Asn Ser Asp Asn Val Val Leu Arg Gln Tyr Glu Asp Met Val 100 105 110 Val Asp Glu Cys Gly Cys Arg 115 <210> 62 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <400> 62 gca gcc atc cct gtc ccc aag ctt tct tgt aag aac ctc tgc cac cgt 48 Ala Ala Ile Pro Val Pro Lys Leu Ser Cys Lys Asn Leu Cys His Arg 1 5 10 15 cac cag cta ttc att aac ttc cgg gac ctg ggt tgg cac aag tgg atc 96 His Gln Leu Phe Ile Asn Phe Arg Asp Leu Gly Trp His Lys Trp Ile 20 25 30 att gcc ccc aag ggg ttc atg gca aat tac tgc cat gga gag tgt ccc 144 Ile Ala Pro Lys Gly Phe Met Ala Asn Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 35 40 45 ttc tca ctg acc atc tct ctc aac agc tcc aat tat gct ttc atg caa 192 Phe Ser Leu Thr Ile Ser Leu Asn Ser Ser Asn Tyr Ala Phe Met Gln 50 55 60 gcc ctg atg cat gcc gtt gac cca gag atc ccc cag gct gtg tgt atc 240 Ala Leu Met His Ala Val Asp Pro Glu Ile Pro Gln Ala Val Cys Ile 65 70 75 80 ccc acc aag ctg tct ccc att tcc atg ctc tac cag gac aat aat gac 288 Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Met Leu Tyr Gln Asp Asn Asn Asp 85 90 95 aat gtc att cta cga cat tat gaa gac atg gta gtc gat gaa tgt ggg 336 Asn Val Ile Leu Arg His Tyr Glu Asp Met Val Val Asp Glu Cys Gly 100 105 110 tgt ggg 342 Cys Gly <210> 63 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ala Ala Ile Pro Val Pro Lys Leu Ser Cys Lys Asn Leu Cys His Arg 1 5 10 15 His Gln Leu Phe Ile Asn Phe Arg Asp Leu Gly Trp His Lys Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Gly Phe Met Ala Asn Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 35 40 45 Phe Ser Leu Thr Ile Ser Leu Asn Ser Ser Asn Tyr Ala Phe Met Gln 50 55 60 Ala Leu Met His Ala Val Asp Pro Glu Ile Pro Gln Ala Val Cys Ile 65 70 75 80 Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Met Leu Tyr Gln Asp Asn Asn Asp 85 90 95 Asn Val Ile Leu Arg His Tyr Glu Asp Met Val Val Asp Glu Cys Gly 100 105 110 Cys Gly <210> 64 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 64 gcc cca ctg gcc act cgc cag ggc aag cga ccc agc aag aac ctt aag 48 Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys 1 5 10 15 gct cgc tgc agt cgg aag gca ctg cat gtc aac ttc aag gac atg ggc 96 Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly 20 25 30 tgg gac gac tgg atc atc gca ccc ctt gag tac gag gct ttc cac tgc 144 Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys 35 40 45 gag ggg ctg tgc gag ttc cca ttg cgc tcc cac ctg gag ccc acg aat 192 Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60 cat gca gtc atc cag acc ctg atg aac tcc atg gac ccc gag tcc aca 240 His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr 65 70 75 80 cca ccc acc tgc tgt gtg ccc acg cgg ctg agt ccc atc agc atc ctc 288 Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu 85 90 95 ttc att gac tct gcc aac aac gtg gtg tat aag cag tat gag gac atg 336 Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met 100 105 110 gtc gtg gag tcg tgt ggc tgc agg 360 Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 65 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys 1 5 10 15 Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly 20 25 30 Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys 35 40 45 Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60 His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr 65 70 75 80 Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu 85 90 95 Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met 100 105 110 Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 66 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 66 acg gcc ttc gcc agt cgc cat ggc aag cgg cac ggc aag aag tcc agg 48 Thr Ala Phe Ala Ser Arg His Gly Lys Arg His Gly Lys Lys Ser Arg 1 5 10 15 cta cgc tgc agc aag aag ccc ctg cac gtg aac ttc aag gag ctg ggc 96 Leu Arg Cys Ser Lys Lys Pro Leu His Val Asn Phe Lys Glu Leu Gly 20 25 30 tgg gac gac tgg att atc gcg ccc ctg gag tac gag gcc tat cac tgc 144 Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Tyr His Cys 35 40 45 gag ggt gta tgc gac ttc ccg ctg cgc tcg cac ctg gag ccc acc aac 192 Glu Gly Val Cys Asp Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60 cac gcc atc atc cag acg ctg atg aac tcc atg gac ccc ggc tcc acc 240 His Ala Ile Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Gly Ser Thr 65 70 75 80 ccg ccc agc tgc tgc gtg ccc acc aaa ttg act ccc atc agc att cta 288 Pro Pro Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Thr Pro Ile Ser Ile Leu 85 90 95 tac atc gac gcg ggc aat aat gtg gtc tac aag cag tac gag gac atg 336 Tyr Ile Asp Ala Gly Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met 100 105 110 gtg gtg gag tcg tgc ggc tgc agg 360 Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 67 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Thr Ala Phe Ala Ser Arg His Gly Lys Arg His Gly Lys Lys Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Cys Ser Lys Lys Pro Leu His Val Asn Phe Lys Glu Leu Gly 20 25 30 Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Tyr His Cys 35 40 45 Glu Gly Val Cys Asp Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60 His Ala Ile Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Gly Ser Thr 65 70 75 80 Pro Pro Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Thr Pro Ile Ser Ile Leu 85 90 95 Tyr Ile Asp Ala Gly Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met 100 105 110 Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 68 <211> 387 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(387) <400> 68 acg gcg ttg gcc ggg acg cgg aca tcg cag ggc agc ggc ggg ggc gcg 48 Thr Ala Leu Ala Gly Thr Arg Thr Ser Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 10 15 ggc cgg ggc cac ggg cgc agg ggc cgg agc cgc tgc agc cgc aag ccg 96 Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys Pro 20 25 30 ttg cac gtg gac ttc aag gag ctc ggc tgg gac gac tgg atc atc gcg 144 Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala 35 40 45 ccg ctg gac tac gag gcg tac cac tgc gag ggc ctt tgc gac ttc cct 192 Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys Asp Phe Pro 50 55 60 ttg cgt tcg cac ctc gag ccc acc aac cat gcc atc att cag acg ctg 240 Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile Gln Thr Leu 65 70 75 80 ctc aac tcc atg gca cca gac gcg gcg ccg gcc tcc tgc tgt gtg cca 288 Leu Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys Cys Val Pro 85 90 95 gcg cgc ctc agc ccc atc agc atc ctc tac atc gac gcc gcc aac aac 336 Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asn Asn 100 105 110 gtt gtc tac aag caa tac gag gac atg gtg gtg gag gcc tgc ggc tgc 384 Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys 115 120 125 agg 387 Arg <210> 69 <211> 129 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Thr Ala Leu Ala Gly Thr Arg Thr Ser Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 10 15 Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys Pro 20 25 30 Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala 35 40 45 Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys Asp Phe Pro 50 55 60 Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile Gln Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys Cys Val Pro 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asn Asn 100 105 110 Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys 115 120 125 Arg <210> 70 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 70 gat ttt ggt ctt gac tgt gat gag cac tca aca gaa tca cga tgc tgt 48 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 cgt tac cct cta act gtg gat ttt gaa gct ttt gga tgg gat tgg att 96 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 atc gct cct aaa aga tat aag gcc aat tac tgc tct gga gag tgt gaa 144 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 ttt gta ttt tta caa aaa tat cct cat act cat ctg gta cac caa gca 192 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 aac ccc aga ggt tca gca ggc cct tgc tgt act ccc aca aag atg tct 240 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 cca att aat atg cta tat ttt aat ggc aaa gaa caa ata ata tat ggg 288 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 aaa att cca gcg atg gta gta gac cgc tgt ggg tgc tca 327 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 71 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 72 <211> 405 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <400> 72 ggt cag gaa act gtc agt tct gaa ttg aag aag ccc ttg ggc cca gct 48 Gly Gln Glu Thr Val Ser Ser Glu Leu Lys Lys Pro Leu Gly Pro Ala 1 5 10 15 tcc ttc aat ctg agt gaa tac ttc aga caa ttt ctt ctt ccc caa aat 96 Ser Phe Asn Leu Ser Glu Tyr Phe Arg Gln Phe Leu Leu Pro Gln Asn 20 25 30 gag tgt gag ctc cat gac ttt aga ctt agc ttt agt cag ctg aag tgg 144 Glu Cys Glu Leu His Asp Phe Arg Leu Ser Phe Ser Gln Leu Lys Trp 35 40 45 gac aac tgg att gtg gct ccg cac agg tac aac cct cga tac tgt aaa 192 Asp Asn Trp Ile Val Ala Pro His Arg Tyr Asn Pro Arg Tyr Cys Lys 50 55 60 ggg gac tgt cca agg gca gtt gga cat cgg tat ggc tct cca gtt cac 240 Gly Asp Cys Pro Arg Ala Val Gly His Arg Tyr Gly Ser Pro Val His 65 70 75 80 acc atg gta cag aac atc atc tat gag aag ctg gac tcc tca gtg cca 288 Thr Met Val Gln Asn Ile Ile Tyr Glu Lys Leu Asp Ser Ser Val Pro 85 90 95 aga ccg tca tgt gta cct gcc aaa tac agc ccc ttg agt gtt ttg acc 336 Arg Pro Ser Cys Val Pro Ala Lys Tyr Ser Pro Leu Ser Val Leu Thr 100 105 110 att gag ccc gat ggc tca att gcc tat aaa gag tac gaa gat atg ata 384 Ile Glu Pro Asp Gly Ser Ile Ala Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile 115 120 125 gct aca aag tgc acc tgt cgt 405 Ala Thr Lys Cys Thr Cys Arg 130 135 <210> 73 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gly Gln Glu Thr Val Ser Ser Glu Leu Lys Lys Pro Leu Gly Pro Ala 1 5 10 15 Ser Phe Asn Leu Ser Glu Tyr Phe Arg Gln Phe Leu Leu Pro Gln Asn 20 25 30 Glu Cys Glu Leu His Asp Phe Arg Leu Ser Phe Ser Gln Leu Lys Trp 35 40 45 Asp Asn Trp Ile Val Ala Pro His Arg Tyr Asn Pro Arg Tyr Cys Lys 50 55 60 Gly Asp Cys Pro Arg Ala Val Gly His Arg Tyr Gly Ser Pro Val His 65 70 75 80 Thr Met Val Gln Asn Ile Ile Tyr Glu Lys Leu Asp Ser Ser Val Pro 85 90 95 Arg Pro Ser Cys Val Pro Ala Lys Tyr Ser Pro Leu Ser Val Leu Thr 100 105 110 Ile Glu Pro Asp Gly Ser Ile Ala Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile 115 120 125 Ala Thr Lys Cys Thr Cys Arg 130 135 <210> 74 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 74 aag acg atg cag aaa gcc cgg agg aag cag tgg gat gag ccg agg gtg 48 Lys Thr Met Gln Lys Ala Arg Arg Lys Gln Trp Asp Glu Pro Arg Val 1 5 10 15 tgc tcc cgg agg tac ctg aag gtg gac ttc gca gac atc ggc tgg aat 96 Cys Ser Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Asn 20 25 30 gaa tgg ata atc tca ccg aaa tct ttt gat gcc tac tac tgc gcg gga 144 Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr Cys Ala Gly 35 40 45 gca tgt gag ttc ccc atg cct aag atc gtt cgt cca tcc aac cat gcc 192 Ala Cys Glu Phe Pro Met Pro Lys Ile Val Arg Pro Ser Asn His Ala 50 55 60 acc atc cag agc att gtc agg gct gtg ggc atc atc cct ggc atc cca 240 Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Ile Ile Pro Gly Ile Pro 65 70 75 80 gag ccc tgc tgt gtt ccc gat aag atg aac tcc ctt ggg gtc ctc ttc 288 Glu Pro Cys Cys Val Pro Asp Lys Met Asn Ser Leu Gly Val Leu Phe 85 90 95 ctg gat gag aat cgg aat gtg gtt ctg aag gtg tac ccc aac atg tcc 336 Leu Asp Glu Asn Arg Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro Asn Met Ser 100 105 110 gtg gac acc tgt gcc tgc cgg tga 360 Val Asp Thr Cys Ala Cys Arg 115 <210> 75 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Lys Thr Met Gln Lys Ala Arg Arg Lys Gln Trp Asp Glu Pro Arg Val 1 5 10 15 Cys Ser Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Asn 20 25 30 Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr Cys Ala Gly 35 40 45 Ala Cys Glu Phe Pro Met Pro Lys Ile Val Arg Pro Ser Asn His Ala 50 55 60 Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Ile Ile Pro Gly Ile Pro 65 70 75 80 Glu Pro Cys Cys Val Pro Asp Lys Met Asn Ser Leu Gly Val Leu Phe 85 90 95 Leu Asp Glu Asn Arg Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro Asn Met Ser 100 105 110 Val Asp Thr Cys Ala Cys Arg 115 <210> 76 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 76 aac ctg ggt ctg gac tgc gac gag cac tca agc gag tcc cgc tgc tgc 48 Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 cga tat ccc ctc aca gtg gac ttt gag gct ttc ggc tgg gac tgg atc 96 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 atc gca cct aag cgc tac aag gcc aac tac tgc tcc ggc cag tgc gag 144 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu 35 40 45 tac atg ttc atg caa aaa tat ccg cat acc cat ttg gtg cag cag gcc 192 Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala 50 55 60 aat cca aga ggc tct gct ggg ccc tgt tgt acc ccc acc aag atg tcc 240 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 cca atc aac atg ctc tac ttc aat gac aag cag cag att atc tac ggc 288 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 aag atc cct ggc atg gtg gtg gat cgc tgt ggc tgc tct 327 Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 77 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu 35 40 45 Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 78 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 78 gcg cgc aac ggg gac cac tgt ccg ctc ggg ccc ggg cgt tgc tgc cgt 48 Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 ctg cac acg gtc cgc gcg tcg ctg gaa gac ctg ggc tgg gcc gat tgg 96 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 gtg ctg tcg cca cgg gag gtg caa gtg acc atg tgc atc ggc gcg tgc 144 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 ccg agc cag ttc cgg gcg gca aac atg cac gcg cag atc aag acg agc 192 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 ctg cac cgc ctg aag ccc gac acg gtg cca gcg ccc tgc tgc gtg ccc 240 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 gcc agc tac aat ccc atg gtg ctc att caa aag acc gac acc ggg gtg 288 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 tcg ctc cag acc tat gat gac ttg tta gcc aaa gac tgc cac tgc ata 336 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 <210> 79 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 <210> 80 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <400> 80 cat cac ttg cca gac aga agt caa ctg tgt cgg aag gtc aag ttc cag 48 His His Leu Pro Asp Arg Ser Gln Leu Cys Arg Lys Val Lys Phe Gln 1 5 10 15 gtg gac ttc aac ctg atc gga tgg ggc tcc tgg atc atc tac ccc aag 96 Val Asp Phe Asn Leu Ile Gly Trp Gly Ser Trp Ile Ile Tyr Pro Lys 20 25 30 cag tac aac gcc tat cgc tgt gag ggc gag tgt cct aat cct gtt ggg 144 Gln Tyr Asn Ala Tyr Arg Cys Glu Gly Glu Cys Pro Asn Pro Val Gly 35 40 45 gag gag ttt cat ccg acc aac cat gca tac atc cag agt ctg ctg aaa 192 Glu Glu Phe His Pro Thr Asn His Ala Tyr Ile Gln Ser Leu Leu Lys 50 55 60 cgt tac cag ccc cac cga gtc cct tcc act tgt tgt gcc cca gtg aag 240 Arg Tyr Gln Pro His Arg Val Pro Ser Thr Cys Cys Ala Pro Val Lys 65 70 75 80 acc aag ccg ctg agc atg ctg tat gtg gat aat ggc aga gtg ctc cta 288 Thr Lys Pro Leu Ser Met Leu Tyr Val Asp Asn Gly Arg Val Leu Leu 85 90 95 gat cac cat aaa gac atg atc gtg gaa gaa tgt ggg tgc ctc 330 Asp His His Lys Asp Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Leu 100 105 110 <210> 81 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 His His Leu Pro Asp Arg Ser Gln Leu Cys Arg Lys Val Lys Phe Gln 1 5 10 15 Val Asp Phe Asn Leu Ile Gly Trp Gly Ser Trp Ile Ile Tyr Pro Lys 20 25 30 Gln Tyr Asn Ala Tyr Arg Cys Glu Gly Glu Cys Pro Asn Pro Val Gly 35 40 45 Glu Glu Phe His Pro Thr Asn His Ala Tyr Ile Gln Ser Leu Leu Lys 50 55 60 Arg Tyr Gln Pro His Arg Val Pro Ser Thr Cys Cys Ala Pro Val Lys 65 70 75 80 Thr Lys Pro Leu Ser Met Leu Tyr Val Asp Asn Gly Arg Val Leu Leu 85 90 95 Asp His His Lys Asp Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Leu 100 105 110 <210> 82 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 82 ggc ctg gag tgc gac ggc aag gtc aac atc tgc tgt aag aaa cag ttc 48 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe 1 5 10 15 ttt gtc agt ttc aag gac atc ggc tgg aat gac tgg atc att gct ccc 96 Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 tct ggc tat cat gcc aac tac tgc gag ggt gag tgc ccg agc cat ata 144 Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile 35 40 45 gca ggc acg tcc ggg tcc tca ctg tcc ttc cac tca aca gtc atc aac 192 Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn 50 55 60 cac tac gca tgc ggc cat agc ccc ttt gcc aac ctc aaa tcg tgc tgt 240 His Tyr Ala Cys Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys Cys 65 70 75 80 gtg ccc acc aag ctg aga ccc atg tcc atg ttg tac tat gat gat ggt 288 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 caa aac atc atc aaa aag gac att cag aac atg atc gtg gag gag tgc 336 Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 ggg tgc tcc 345 Gly Cys Ser 115 <210> 83 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe 1 5 10 15 Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile 35 40 45 Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn 50 55 60 His Tyr Ala Cys Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ser 115 <210> 84 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(345) <400> 84 ggc ctg gag tgc gat ggc cgg acc aac ctc tgt tgc agg caa cag ttc 48 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe 1 5 10 15 ttc att gac ttc cgc ctc atc ggc tgg aac gac tgg atc ata gca ccc 96 Phe Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 acc ggc tac tac ggc aac tac tgt gag ggc agc tgc cca gcc tac ctg 144 Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu 35 40 45 gca ggg gtc ccc ggc tct gcc tcc tcc ttc cac acg gct gtg gtg aac 192 Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn 50 55 60 cag tac cgc atg cgg ggt ctg aac ccc ggc acg gtg aac tcc tgc tgc 240 Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys 65 70 75 80 att ccc acc aag ctg agc acc atg tcc atg ctg tac ttc gat gat gag 288 Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu 85 90 95 tac aac atc gtc aag cgg gac gtg ccc aac atg att gtg gag gag tgc 336 Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 ggc tgc gcc 345 Gly Cys Ala 115 <210> 85 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe 1 5 10 15 Phe Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu 35 40 45 Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn 50 55 60 Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys 65 70 75 80 Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu 85 90 95 Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ala 115 <210> 86 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(348) <400> 86 ggc atc gac tgc caa gga ggg tcc agg atg tgc tgt cga caa gag ttt 48 Gly Ile Asp Cys Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe 1 5 10 15 ttt gtg gac ttc cgt gag att ggc tgg cac gac tgg atc atc cag cct 96 Phe Val Asp Phe Arg Glu Ile Gly Trp His Asp Trp Ile Ile Gln Pro 20 25 30 gag ggc tac gcc atg aac ttc tgc ata ggg cag tgc cca cta cac ata 144 Glu Gly Tyr Ala Met Asn Phe Cys Ile Gly Gln Cys Pro Leu His Ile 35 40 45 gca ggc atg cct ggt att gct gcc tcc ttt cac act gca gtg ctc aat 192 Ala Gly Met Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn 50 55 60 ctt ctc aag gcc aac aca gct gca ggc acc act gga ggg ggc tca tgc 240 Leu Leu Lys Ala Asn Thr Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ser Cys 65 70 75 80 tgt gta ccc acg gcc cgg cgc ccc ctg tct ctg ctc tat tat gac agg 288 Cys Val Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg 85 90 95 gac agc aac att gtc aag act gac ata cct gac atg gta gta gag gcc 336 Asp Ser Asn Ile Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala 100 105 110 tgt ggg tgc agt 348 Cys Gly Cys Ser 115 <210> 87 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gly Ile Asp Cys Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe 1 5 10 15 Phe Val Asp Phe Arg Glu Ile Gly Trp His Asp Trp Ile Ile Gln Pro 20 25 30 Glu Gly Tyr Ala Met Asn Phe Cys Ile Gly Gln Cys Pro Leu His Ile 35 40 45 Ala Gly Met Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn 50 55 60 Leu Leu Lys Ala Asn Thr Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ser Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg 85 90 95 Asp Ser Asn Ile Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala 100 105 110 Cys Gly Cys Ser 115 <210> 88 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(342) <400> 88 acc ccc acc tgt gag cct gcg acc ccc tta tgt tgc agg cga gac cat 48 Thr Pro Thr Cys Glu Pro Ala Thr Pro Leu Cys Cys Arg Arg Asp His 1 5 10 15 tac gta gac ttc cag gaa ctg gga tgg cgg gac tgg ata ctg cag ccc 96 Tyr Val Asp Phe Gln Glu Leu Gly Trp Arg Asp Trp Ile Leu Gln Pro 20 25 30 gag ggg tac cag ctg aat tac tgc agt ggg cag tgc cct ccc cac ctg 144 Glu Gly Tyr Gln Leu Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Pro Pro His Leu 35 40 45 gct ggc agc cca ggc att gct gcc tct ttc cat tct gcc gtc ttc agc 192 Ala Gly Ser Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Ser Ala Val Phe Ser 50 55 60 ctc ctc aaa gcc aac aat cct tgg cct gcc agt acc tcc tgt tgt gtc 240 Leu Leu Lys Ala Asn Asn Pro Trp Pro Ala Ser Thr Ser Cys Cys Val 65 70 75 80 cct act gcc cga agg ccc ctc tct ctc ctc tac ctg gat cat aat ggc 288 Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Asp His Asn Gly 85 90 95 aat gtg gtc aag acg gat gtg cca gat atg gtg gtg gag gcc tgt ggc 336 Asn Val Val Lys Thr Asp Val Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly 100 105 110 tgc agc 342 Cys Ser <210> 89 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Thr Pro Thr Cys Glu Pro Ala Thr Pro Leu Cys Cys Arg Arg Asp His 1 5 10 15 Tyr Val Asp Phe Gln Glu Leu Gly Trp Arg Asp Trp Ile Leu Gln Pro 20 25 30 Glu Gly Tyr Gln Leu Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Pro Pro His Leu 35 40 45 Ala Gly Ser Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Ser Ala Val Phe Ser 50 55 60 Leu Leu Lys Ala Asn Asn Pro Trp Pro Ala Ser Thr Ser Cys Cys Val 65 70 75 80 Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Asp His Asn Gly 85 90 95 Asn Val Val Lys Thr Asp Val Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly 100 105 110 Cys Ser <210> 90 <211> 402 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(402) <400> 90 tca act ccc ctg atg tcc tgg cct tgg tct ccc tct gct ctg cgc ctg 48 Ser Thr Pro Leu Met Ser Trp Pro Trp Ser Pro Ser Ala Leu Arg Leu 1 5 10 15 ctg cag agg cct ccg gag gaa ccg gct gcc cat gcc aac tgc cac aga 96 Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala His Ala Asn Cys His Arg 20 25 30 gta gca ctg aac atc tcc ttc cag gag ctg ggc tgg gaa cgg tgg atc 144 Val Ala Leu Asn Ile Ser Phe Gln Glu Leu Gly Trp Glu Arg Trp Ile 35 40 45 gtg tac cct ccc agt ttc atc ttc cac tac tgt cat ggt ggt tgt ggg 192 Val Tyr Pro Pro Ser Phe Ile Phe His Tyr Cys His Gly Gly Cys Gly 50 55 60 ctg cac atc cca cca aac ctg tcc ctt cca gtc cct ggg gct ccc cct 240 Leu His Ile Pro Pro Asn Leu Ser Leu Pro Val Pro Gly Ala Pro Pro 65 70 75 80 acc cca gcc cag ccc tac tcc ttg ctg cca ggg gcc cag ccc tgc tgt 288 Thr Pro Ala Gln Pro Tyr Ser Leu Leu Pro Gly Ala Gln Pro Cys Cys 85 90 95 gct gct ctc cca ggg acc atg agg ccc cta cat gtc cgc acc acc tcg 336 Ala Ala Leu Pro Gly Thr Met Arg Pro Leu His Val Arg Thr Thr Ser 100 105 110 gat gga ggt tac tct ttc aag tat gag aca gtg ccc aac ctt ctc acg 384 Asp Gly Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Leu Leu Thr 115 120 125 cag cac tgt gct tgt atc 402 Gln His Cys Ala Cys Ile 130 <210> 91 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Ser Thr Pro Leu Met Ser Trp Pro Trp Ser Pro Ser Ala Leu Arg Leu 1 5 10 15 Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala His Ala Asn Cys His Arg 20 25 30 Val Ala Leu Asn Ile Ser Phe Gln Glu Leu Gly Trp Glu Arg Trp Ile 35 40 45 Val Tyr Pro Pro Ser Phe Ile Phe His Tyr Cys His Gly Gly Cys Gly 50 55 60 Leu His Ile Pro Pro Asn Leu Ser Leu Pro Val Pro Gly Ala Pro Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Gln Pro Tyr Ser Leu Leu Pro Gly Ala Gln Pro Cys Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Pro Gly Thr Met Arg Pro Leu His Val Arg Thr Thr Ser 100 105 110 Asp Gly Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Leu Leu Thr 115 120 125 Gln His Cys Ala Cys Ile 130 <210> 92 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 92 gcc ctg gac acc aac tat tgc ttc agc tcc acg gag aag aac tgc tgc 48 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15 gtg cgg cag ctg tac att gac ttc cgc aag gac ctc ggc tgg aag tgg 96 Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 atc cac gag ccc aag ggc tac cat gcc aac ttc tgc ctc ggg ccc tgc 144 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45 ccc tac att tgg agc ctg gac acg cag tac agc aag gtc ctg gcc ctg 192 Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 tac aac cag cat aac ccg ggc gcc tcg gcg gcg ccg tgc tgc gtg ccg 240 Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 cag gcg ctg gag ccg ctg ccc atc gtg tac tac gtg ggc cgc aag ccc 288 Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 aag gtg gag cag ctg tcc aac atg atc gtg cgc tcc tgc aag tgc agc 336 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 93 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 94 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 94 gct ttg gat gcg gcc tat tgc ttt aga aat gtg cag gat aat tgc tgc 48 Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys 1 5 10 15 cta cgt cca ctt tac att gat ttc aag agg gat cta ggg tgg aaa tgg 96 Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 ata cac gaa ccc aaa ggg tac aat gcc aac ttc tgt gct gga gca tgc 144 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45 ccg tat tta tgg agt tca gac act cag cac agc agg gtc ctg agc tta 192 Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60 tat aat acc ata aat cca gaa gca tct gct tct cct tgc tgc gtg tcc 240 Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 65 70 75 80 caa gat tta gaa cct cta acc att ctc tac tac att ggc aaa aca ccc 288 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro 85 90 95 aag att gaa cag ctt tct aat atg att gta aag tct tgc aaa tgc agc 336 Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 95 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys 1 5 10 15 Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 65 70 75 80 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro 85 90 95 Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 96 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <400> 96 gct ttg gac acc aat tac tgc ttc cgc aac ttg gag gag aac tgc tgt 48 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 1 5 10 15 gtg cgc ccc ctc tac att gac ttc cga cag gat ctg ggc tgg aag tgg 96 Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 gtc cat gaa cct aag ggc tac tat gcc aac ttc tgc tca ggc cct tgc 144 Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 cca tac ctc cgc agt gca gac aca acc cac agc acg gtg ctg gga ctg 192 Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 tac aac act ctg aac cct gaa gca tct gcc tcg cct tgc tgc gtg ccc 240 Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 cag gac ctg gag ccc ctg acc atc ctg tac tat gtt ggg agg acc ccc 288 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 aaa gtg gag cag ctc tcc aac atg gtg gtg aag tct tgt aaa tgt agc 336 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 97 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110

Claims

다음을 포함하는 아미노산 서열에 100% 서열 동일성을 갖는 재조합 TGF-β 리간드 폴리펩티드:
서열 번호:2의 아미노산 잔기 1 내지 32 ("1b")를 포함하는 아미노산 잔기의 첫 번째 분절;
서열 번호:5의 아미노산 잔기 30 내지 45 ("2a")를 포함하는 아미노산 잔기의 두 번째 분절;
서열 번호:5의 아미노산 잔기 46 내지 x₁ ("3a"), 또는 서열 번호:2의 아미노산 잔기 x₂ 내지 x₃ ("3b")을 포함하는 아미노산 잔기의 세 번째 분절, 여기서:
x₁은 서열 번호:5의 잔기 61, 62, 63, 또는 64이고,
x₂는 서열 번호:2의 잔기 45, 46, 47, 또는 48이고, 그리고
x₃은 서열 번호:2의 잔기 65, 66, 67, 또는 68이고; 그리고
서열 번호:5의 아미노산 잔기 x₄ 내지 x₅ ("4a") 또는 서열 번호:2의 아미노산 잔기 x₆ 내지 x₇ ("4b")을 포함하는 아미노산 잔기의 네 번째 분절, 여기서:
세 번째 분절이 3b를 포함하면 x₄는 서열 번호: 5의 x₁이고, 또는 세 번째 분절이 3a를 포함하면 x₄는 서열 번호: 5의 x₁+1이고,
x₅는 서열 번호:5의 잔기 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84이고,
세 번째 분절이 3a를 포함하면 x₆은 서열 번호: 2의 x₃이고, 또는 세 번째 분절이 3b를 포함하면 x₆은 서열 번호: 2의 x₃+1이고,
x₇은 서열 번호:2의 잔기 76, 77, 78, 79, 80, 81 또는 82이고, 그리고;
서열 번호:5의 아미노산 잔기 x₈ 내지 x₉ ("5a") 또는 서열 번호:2의 아미노산 잔기 x₁₀ 내지 x₁₁ ("5b")을 포함하는 아미노산 잔기의 다섯 번째 분절, 여기서:
네 번째 분절이 4b를 포함하면 x₈은 서열 번호: 5의 x₅이고, 또는 네 번째 분절이 4a를 포함하면 x₈은 서열 번호: 5의 x₅+1이고,
x₉는 서열 번호:5의 잔기 90, 91, 92, 93, 94, 95 또는 96이고,
네 번째 분절이 4a를 포함하면 x₁₀은 서열 번호: 2의 x₇이고, 또는 네 번째 분절이 4b를 포함하면 x₁₀은 서열 번호: 2의 x₇+1이고,
x₁₁은 서열 번호:2의 잔기 88, 89, 90, 91, 92, 93, 또는 94이고, 그리고
서열 번호:5의 아미노산 잔기 x₁₂ 내지 x₁₃ ("6a") 또는 서열 번호:2의 아미노산 잔기 x₁₄ 내지 x₁₅ ("6b")를 포함하는 여섯 번째 분절, 여기서:
다섯 번째 분절이 5b를 포함하면 x₁₂는 서열 번호: 5의 x₉이고, 또는 다섯 번째 분절이 5a를 포함하면 x₁₂는 서열 번호: 5의 x₉+1이고,
x₁₃은 서열 번호:5의 잔기 114, 115, 또는 116이고,
다섯 번째 분절이 5a를 포함하면 x₁₄는 서열 번호: 2의 x₁₁이고, 또는 다섯 번째 분절이 5b를 포함하면 x₁₄는 서열 번호: 2의 x₁₁+1이고,
x₁₅는 서열 번호:2의 잔기 112, 113, 또는 114이고;
여기서 재조합 TGF-β 리간드 폴리펩티드는 SMAD 경로와 연관된 세포 증식 또는 활성을 활성화시킨다.
삭제
삭제
삭제
폴리펩티드는 서열 번호: 17, 19, 23, 25, 27, 29, 31, 그리고 33으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하며, SMAD 경로와 연관된 세포 증식 또는 활성을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 재조합 TGF-β 리간드 폴리펩티드.
청구항 5에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 31에서 진술된 바와 같은 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 TGF-β 리간드 폴리펩티드.
청구항 5에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 17에서 진술된 바와 같은 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 TGF-β 리간드 폴리펩티드.
청구항 5에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 29에서 진술된 바와 같은 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 TGF-β 리간드 폴리펩티드.
삭제
삭제
삭제
삭제
서열 번호: 16, 18, 22, 24, 26, 28, 30, 그리고 32로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 30에서 진술된 바와 같은 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 16에서 진술된 바와 같은 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 13에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 번호: 28에서 진술된 바와 같은 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제