KR20210077790A - 액티빈/bmp7 키메라: 슈퍼-활성 sab704 및 sab715, 및 이들의 노긴-감작 변이체인 nab704, nab715 및 nab204 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TGF-베타 활성을 갖는 키메라 폴리펩타이드, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 및 개선되거나 신규한 생물학적 및 치료적 특성을 갖는 폴리펩타이드를 생산하기 위하 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

액티빈/BMP7 키메라: 슈퍼-활성 SAB704 및 SAB715, 및 이들의 노긴-감작 변이체인 NAB704, NAB715 및 NAB204

본 특허출원은 2018년 11월 15일에 미국 특허청에 제출된 미국 가출원 제62/767,707호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명은 생체 분자의 조작과 설계, 그리고 조작된 단백질과 핵산과 관련된 발명이다.

액티빈 및 골형성 단백질 (BMP)은 전환 성장 인자-베타 (TGF-베타) 슈퍼패밀리의 구성원이다. 다양한 발달과정 및 세포 신호 전달과정에서의 이들이 널리 존재(pervasiveness)하기 때문에 TGF-베타 리간드는 치료목적을 위해 사용될 수 있는 후보이다. TGF-베타 리간드를 가공하여, 이러한 생물학적 특성을 특이적으로 변형, 향상 및 변경시키는 것은 본 발명에서 나타내는 발견의 기초이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 각각 상이한 폴리펩타이드로부터 유래된 2개 이상의 펩타이드 분절을 포함하는 재조합 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드의 제 1 분절(segment)은 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질에 90 % 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고 및 제 2 펩타이드 분절은 제 2 TGF-베타 패밀리 단백질에 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것으로, 상기 두 분절은 작동가능하게 연결되고, 제 1 또는 제 2 부모 TGF-베타 패밀리 단백질(parental TGF-beta family protein) 중 적어도 둘 이상의 활성을 갖거나, 또는 새로운 in vivo 신호전달 활성 및 세포 특성의 활성을 갖는 것으로, 2 개 이상의 폴리펩타이드 분절은 N-말단에서 C-말단으로 작동가능하게 연결된 6개의 펩타이드 분절을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로(pathway)를 조절하는 것인, 재조합 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 총 6개의 분절을 포함하는 재조합 폴리펩타이드를 제공한다: 2 개 이상의 펩타이드 분절은 제 1 TGF-베타 패밀리 부모 단백질로부터 90 % 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 다른 펩타이드 분절은 제 2 TGF-베타 패밀리 부모 단백질로부터 90 % 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 여기서 이들 6 개의 분절은 분절 1, 2, 3, 4, 5, 6의 순서로 작동가능하게 연결되고, 생성된 폴리펩타이드 키메라는 TGF-베타 패밀리 단백질 중 하나 이상 또는 둘 모두의 활성을 향상시킨다.

본 발명의 일 구현예예 있어서, 상기 폴리펩타이드는 BMP-2로부터 유래한 N-말단 분절 1을 포함하는 것으로, 2 개 이상의 폴리펩타이드 분절은 N-말단에서 C- 말단으로 작동가능하게 연결되는 6개의 펩타이드 분절을 포함하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질은 BMP-2이고 및 상기 제 2 TGF-베타 패밀리 단백질은 액티빈 또는 다른 패밀리 구성원인 것으로, 각각의 분절은 상기 두 TGF-베타 패밀리 단백질의 공통(common) 분절의 구조적 모티프에 상응하는 것으로, 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로를 조절하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 BMP-7로부터 유래한 N-말단 분절 1을 포함하는 것으로, 2 개 이상의 폴리펩타이드 분절은 N-말단에서 C-말단으로 작동가능하게 연결되는 6 개의 펩타이드 분절을 포함하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질은 BMP-7 이고 및 상기 제 2 TGF-베타 패밀리 단백질은 액티빈 또는 다른 패밀리 구성원인 것으로, 여기서 각각의 분절은 상기 두 TGF-베타 패밀리 단백질의 공통(common) 분절의 구조적 모티프에 상응하는 것으로, 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로를 조절하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 BMP-7으로부터 유래한 분절 1, 3, 및 4 와 액티빈으로부터 유래한 분절 2, 5, 및 6이 SAB704를 제조하기 위해 작동가능하게 연결되는 것이고, 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로를 조절하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 BMP-7으로부터 유래한 분절 1, 3, 4, 및 5와 액티빈으로부터 유래한 분절 2 및 6이 SAB715를 제조하기 위해 작동가능하게 연결되는 것이고, 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로를 조절하는 것이다.

보다 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명은 새로운 리간드(“DA 키메라”)를 구축하기 위하여 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 상이한 서열 분절을 선별하고 결합함으로써 합성될 수 있는 설계-증강 TGF-베타 리간드(design-augmented (DA) TGF-beta ligand)를 제공한다. 이들 신규한 리간드는 자연적으로 존재하는 부모 리간드와 상이한 완전히 새로운 단백질 서열 라이브러리를 보유한다. 이러한 접근법은 근본적으로 자연 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 간에 구조 공통성(structural commonality)의 인식으로부터 비롯한다. 모든 ~40 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드는 상기 단백질의 각 영역에 대한 포괄적(generic) 특징을 갖는 동일한 전반적인 체계(overall architecture)를 공유한다. TGF-베타 리간드의 프레임워크(framework)는 모든 슈퍼패밀리 구성원이 공유하는 (일반적으로) 6가지 하위도메인(subdomain) (일명, 서열 분절; 도 1에서 6개의 상이한 색으로 표시됨)으로 분류될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 또한 제 2 상이한 TGF-베타 패밀리 단백질 분절(예를 들어 “B”로 표시되는 단백질)에 작동가능하게 연결되는 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질의 분절(예를 들어 “A”로 표시되는 단백질)을 포함하는 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩타이드를 위한 설계 원리를 제공하는 것으로, 여기서 상기 폴리펩타이드 키메라는 분절 1 - 분절 2 - 분절 3 - 분절 4 - 분절 5 - 분절 6의 순서를 가지며, 키메라의 각 분절은 A 또는 B의 해당 숫자의 분절으로부터 유도되는 것으로, 본 발명에 기재된 바와 같이 상이한 키메라를 생성하여, 상이한 SMAD-조절 활성을 제공한다 (Gray & Choe, 2019, “Design-augmented (DA) biologics: BMP Chimeras for bone and cartilage regeneration, Osteoarthritis and Cartilage, in press, DOI: doi.org/10.1016/j.joca.2019.09.004).

이들 키메라의 서열 경계(sequence boundaries)는 2009 년 2 월 24 일에 출원된 미국 가출원 제61/155,066호에서 유래하며. 액티빈 및 BMP-2 키메라(AB204 및 AB215 포함)는 이들의 부모 단백질과 비교했을때 슈퍼-활성 신호전달 능력을 가지고 있다(도면 2 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 SMAD-조절 활성을 갖는 키메라(chimeric) 폴리펩타이드를 제공하기 위하여 제 2 TGF-베타 패밀리 단백질의 분절에 작동가능하게 연결된 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질의 분절을 포함하는 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩타이드로서, 각각의 분절은 상기 두 TGF-베타 패밀리 단백질의 공통 분절의 구조적 모티프에 상응하는 것인, 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 청구항 제1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8항의 서열 변이체로서, 노긴 결합 능력을 조절하여 AB204로부터는 NAB204, SAB704로부터는 NAB704, 또는 SAB715로부터는 NAB715를 제조하기 위해 6개의 아미노산 길이의 노긴 민감자 서열이 상기 폴리펩타이드의 구조적으로 동등한 영역을 대체하는 것인, 서열 변이체를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 TGF-베타 슈퍼패밀리의 폴리펩타이드의 서열 변이체로서, 노긴-민감성-(NS-) 서열은 관련된 서브 패밀리 서열로부터 유래된 6 개 아미노산 길이의 노긴-감작 서열을 사용하여 도입되어 이러한 키메라 예로서 NS-액티빈(액티빈으로부터)과 같은 노긴-민감성 형태를 생성할 수 있으며, 또는 노긴-민감성-(NS-) 서열은 동일한 6 개 아미노산 길이의 노긴-감작 서열을 관련 서브 패밀리 서열에서 유래된 노긴-비민감-(NIS-) 서열로 대체하여 제거하여 이러한 키메라 예로서 BMP2로부터 NIS-BMP2를 생성할 수 있다.

본 발명은 구체적으로 3 개의 비 자연 발생 키메라를 제공하며, 각각은 그들의 부모 단백질, 액티빈 및 골 형성 단백질 7(BMP-7, 서열번호 6, 도 2)으로부터 유래된 단백질 서열을 갖는 6 개의 펩타이드 분절을 포함한다. SAB704 및 SAB715로 명명된 2 개의 키메라는 액티빈 및 BMP-7(각각 서열번호 9 및 11, 도 2)과 자연적으로 연관된 SMAD 경로를 조절하기 위해 분절 1, 2, 3, 4, 5, 6의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 작동가능하게 연결되어 있다.

NAB704 및 NAB715(각각 서열번호 10 및 12, 도 2)로 명명된 다른 2 개의 키메라는 각각 SAB704 및 SAB715의 서열 변이체이며, 이를 위해 SAB704 및 SAB715의 분절 6의 서열에서 5 개 이하의 아미노산 잔기가 각각 변화하였다. 결과적으로, NAB704 및 NAB715는 노긴-민감(Noggin-sensitive)이다. 노긴-민감이란 구체적으로 생물학적 기능을 위한 설계에 의해 생체 내에서 노긴(Noggin)에 물리적을 결합할 수 있고 노긴에 반응할 수 있다는 것을 의미한다. SAB704 및 SAB715는 노긴-비민감(Noggin-insensitive)이며, 설계에 의해 세포 신호전달 능력에 있어 슈퍼-활성이다. 추가적으로 본 발명은 또한 노긴-민감인 세 번째 DA 키메라 서열을 제공하며(identifies), 이는 미국 가출원 61/155,066호에서 유래한 AB204(도 2의 서열 번호 7)의 유사한 변이체로서 노긴-민감인 NAB204(도 2의 서열 번호 8)이다.

SAB704, SAB715, NAB204, NAB704, 및 NAB715의 기초 설계

본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드 키메라, SAB704는 액티빈 A("A")로부터 유래된 3개의 분절인 분절 2, 5, 및 6을 포함하고 BMP-7("B")로부터 유래된 3개의 분절인 분절 1, 3, 및 4를 포함하는 것으로, 이들 분절은 "1B2A3B4B5A6A"로 지칭되는 바와 같이 분절 1,2,3,4,5, 및 6의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 작동가능하게 연결되어 있다. SAB704의 서열 경계는 2009년 2월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/155,066호로부터 유래한다 (도 5).

또 다른 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드 키메라, SAB715는 액티빈 A("A")로부터 유래된 2개의 분절인 분절 2, 및 6을 포함하고 BMP-7("B")로부터 유래된 4개의 분절인 분절 1, 3, 4, 및 5를 포함하는 것으로, 이들 분절은 "1B2A3B4B5B6A"로 지칭되는 바와 같이 분절 1,2,3,4,5, 및 6의 순서로 N-말단에서 C-말단으로 작동가능하게 연결되어 있다. SAB715의 서열 경계는 2009년 2월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/155,066호로부터 유래한다.

또 다른 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드 키메라, NAB204는 AB204의 분절 6 내에서 6개의 잔기 부분을 대체하는 5개의 새로운 아미노산(IIKKDI에서 VVLKKY로 대체)을 갖는다. IIKKDI는 액티빈 A (서열번호 4에서 밑줄 부분, 도 2)로부터 유래하며, 반면에 VVLKKY는 BMP2로부터 유래한다(서열번호 5에서 밑줄 부분, 도 2). 분절 6 내의 이들 6개의 잔기 부분은 본원에서 "노긴-민감자(Noggin-sensitizer)"로 정의되고, 이의 단백질 서열은 BMP-2 및 BMP-7을 포함하는 모든 노긴-결합 BMP와 유사하다 (BMP7에서의 VILKKY, 서열 번호 7에서 밑줄 부분, 도 2). AB204에 도입된 이들 아미노산 변화는 AB204의 생물학적 특성을 변화시켜, NAB204(서열번호 8, 도 2)가 노긴에 결합할 수 있게 함으로써(도 4b) in vivo 노긴의 길항 작용에 기능적으로 민감해지게 되는 것이고, 본원에서는 "노긴-감작"로 정의된다. AB204의 단백질 서열은 2009년 2월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/155,066호로부터 유래한다.

또 다른 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드 키메라, NAB704는 SAB704의 노긴-민감자 서열을 대체하는 4개의 새로운 아미노산(IIKKDI에서 VILKKY로 대체)을 갖는다. 이들 아미노산 변화는 SAB704의 생물학적 특성을 변화시켜, NB704가 노긴에 결합할 수 있게 함으로써 in vivo 노긴의 길항 작용에 기능적으로 민감해지게 되는 것이다(도 4a).

또 다른 본 발명의 일 구현예에서, 폴리펩타이드 키메라, NAB715는 SAB715의 노긴-민감자 서열을 대체하는 4개의 새로운 아미노산(IIKKDI에서 VILKKY로)을 갖는다. 이들 아미노산 변화는 SAB715의 생물학적 특성을 변화시켜, NB715가 노긴에 결합할 수 있게 함으로써 in vivo 노긴의 길항 작용에 기능적으로 민감해지게 되는 것이다(도 4a).

서열의 유사성으로 인해, 노긴-민감자 서열은 액티빈/BMP 키메라의 노긴-민감자 서열 내에서 BMP-2의 VVLKKY 또는 BMP-7의 VILKKY와 동일하거나 보존적으로(conservatively) 유사한 5 개 이하의 아미노산 치환(replacement)을 포함할 수 있으며, 이를 통해 액티빈/BMP 키메라 노긴-민감자 서열을 노긴-민감 또는 노긴-비민감으로 만든다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 그러나, 본 구현예에서, 본 발명은 노긴-민감자의 존재에 관계없이 액티빈/BMP 키메라의 분절 어셈블리(assembly)로 구성된 서열과 적어도 90 %, 95 %, 98%, 99 % 또는 그 이상의 동일성을 갖는 동일한 폴리펩타이드 서열을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 in vivo 세포 활성을 조절하기 위해 이들 리간드의 조합 시간-의존적 혼합(combinatorial time-dependent mix)에 의한 골 및 연골 재생을 비롯한, SMAD-조절 활성을 갖는 기능적 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하도록 작동가능하게 연결된 복수의 TGF-베타 패밀리 폴리뉴클레오타이드로부터의 서열을 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩타이드를 생산하는 방법을 제공한다:

(a) 2 개 이상의 TGF-베타 패밀리 구성원 단백질 서열을 정렬하는 단계;

(b) 2개의 패밀리 단백질의 6개의 구조적으로 관련된 분절을 확인하는 단계;

(c) 5개 이상의 연속 아미노산에 걸쳐 90 % 이상의 서열 동일성과 구조적으로 관련된 말단에서의 분절을 포함하는 2 개의 TGF-베타 단백질의 교차점(points of cross-over)을 확인하는 단계; 및

(d) BMP로부터 제 2 TGF-베타 패밀리 구성원 단백질로 적어도 분절 1을 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩타이드를 생산하는 단계로서, 상기 분절은 교차점(points of cross-over)에서 순차적으로 연결되어 하나의 이러한 키메라 예로 1B2-BMP7을 생성하는 것인, 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로부터 생산된 키메라 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 SMAD 경로와 연관된 세포 증식 또는 활성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드와 조직을 접촉시키는 단계를 포함하는 골, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 골격근 또는 내분비 조직과 연관된 질병 또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드와 세포 증식 질병 또는 질환을 갖는 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식성 질병 또는 질환의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 골, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 골격근 또는 내분비 조직과 연관된 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 포함하는 세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

추가 구현예에서, 본 발명은 2009년 2월 24일에 출원한 미국 가출원 제61/155,066호 하에서 TGF-베타 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 대한 신규한 리간드에 대한 추가 기반을 제공한다. 여기서 상기 리간드는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 상이한 구성원으로부터 6개의 분절의 동일한 서열 정렬을 갖는 키메라 단백질이다.

도 1은 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 스카폴드의 단일 서브유니트의 6개의 분절을 리본 다이어그램(ribbon diagram)으로 나타낸 것이다. 단일 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드는 공유 결합된 두 개의 서브유니트로 구성된다. 두 개의 서브유니트는 본 시점에서 수직인(밝은-파란 화살표) 축을 갖는 2회 회전 대칭이다. 따라서 왼쪽-패널과 오른쪽-패널은 일반회전대칭축으로 회전하기 때문에 서브유니트의 반대 방향을 보여준다. 6개 분절은 N-말단에서 C-말단 순서로 빨강 (분절 1), 파랑 (분절 2), 노랑 (분절 3), 초록 (분절 4), 갈색(분절 5) 및 보라(분절 6)으로 나타난다.
도 2는 본 발명에 기재된 TGF-베타 패밀리의 구성원 서열 및 다양한 키메라 서열의 구조/서열 정렬(alignment)을 나타낸다. 서열 번호 1, 2 및 3은 각각 본 발명에서 액티빈 A, BMP2 및 1B2-BMP7의 박테리아 발현을 위해 합성 설계된 뉴클레오타이드 서열이다. 1B2-BMP7은 BMP2로부터 유래된 분절 2 내지 분절 6과 조합된 BMP2로부터 유래된 분절1의 키메라를 지칭하는 서열이다. 상기 키메라는 박테리아에서 쉽게 발현되며 BMP7과는 동일한 기능을 갖는다. 이들의 본질에 의해, 서열번호 4 내지 13에서 기술된 아미노산 서열이 변하지 않는 선에서 이들 뉴클레오타이드 서열은 변할 수 있다.
서열 번호 4, 5, 및 6은 박테리아 발현에 사용되는 인간 액티빈 A (검정색), 인간 BMP2(붉은색), 인간 BMP7(푸른색)의 성숙 영역(mature region)의 아미노산 서열이다. 이러한 이유로, 이들 3개의 부모 분자는 모두 첫 번째 아미노산이 메티오닌으로 시작한다. 이들 키메라의 모든 관련 분절은 그들의 유래를 표시하기 위해 붉은색, 푸른색, 검정색으로 구분된다. 모든 6 개의 분절은 설명 목적으로만 "-"으로 구분된다. 서열번호 7 및 8은 DA 키메라인 AB204 및 NAB204의 아미노산 서열이다. NAB204는 BMP2로부터 유래한 6 개의 아미노산 길이인 노긴 민감자를 함유한다(붉은색으로 밑줄로 표시). 서열번호 9 및 10은 DA 키메라인 SAB704 및 NAB704의 아미노산 서열이다. NAB704는 BMP7으로부터 유래한 6 개의 아미노산 길이인 노긴 민감자를 함유한다(푸른색으로 밑줄로 표시). 서열번호 11 및 12는 DA 키메라인 SAB715 및 NAB715의 아미노산 서열이다. NAB715는 BMP7으로부터 유래한 6 개의 아미노산 길이인 노긴 민감자를 함유한다(푸른색으로 밑줄로 표시). 서열번호 13은 DA 키메라인 1B2-BMP7의 아미노산 서열이다. 1B2-BMP7은 BMP2로부터의 분절 1(붉은색)과 BMP7으로부터 유래한 분절 2(푸른색)를 함유한다. 1B2-BMP7은 박테리아 발현 및 리폴딩을 위하여 BMP7을 대체한다.
도 3a는 DA 키메라인 SAB704와 SAB715 및 대조 분자로서 이들의 부모 분자인 BMP-7의 세포 신호전달 활성을 나타낸다(도 3a). 도 3(a)는 SAB704가 특히 SAMD1 매개 신호 전달 경로에 의해 C2C12 세포에서 대략 30 배 증가된 신호 전달 활성을 보이는 것을 나타낸다 (Allendorph et al., 2011 Designer TGF-beta Superfamily Ligands with Diversified Functionality, PLOS One, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026402, (2011)).
도 3b는 4 개의 동화 작용 유전자(ACAN, Aggrecan)에 의한 RNA 유도의 상대적은 수준을 나타내며, 상기 유전자는 연골 형성 및 연골 재생과 연관된 것으로 알려져 있다. 각 패널에 대한 RNA 발현의 배경 수준은 1.0로 정규화된 붉은 수직선으로 나타내었다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 이들 DA 키메라 및 BMP7로의 처치 후에 4일, 8일, 11일에서 같은 방법으로 측정되었다.
도 3c는 4 개의 동화 작용 유전자(COL2A1, Collagen 2A1)에 의한 RNA 유도의 상대적은 수준을 나타내며, 상기 유전자는 연골 형성 및 연골 재생과 연관된 것으로 알려져 있다. 각 패널에 대한 RNA 발현의 배경 수준은 1.0로 정규화된 붉은 수직선으로 나타내었다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 이들 DA 키메라 및 BMP7로의 처치 후에 4일, 8일, 11일에서 같은 방법으로 측정되었다.
도 3d는 4 개의 동화 작용 유전자(SOX9)에 의한 RNA 유도의 상대적은 수준을 나타내며, 상기 유전자는 연골 형성 및 연골 재생과 연관된 것으로 알려져 있다. 각 패널에 대한 RNA 발현의 배경 수준은 1.0로 정규화된 붉은 수직선으로 나타내었다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 이들 DA 키메라 및 BMP7로의 처치 후에 4일, 8일, 11일에서 같은 방법으로 측정되었다.
도 3e는 4 개의 동화 작용 유전자(SOX6)에 의한 RNA 유도의 상대적은 수준을 나타내며, 상기 유전자는 연골 형성 및 연골 재생과 연관된 것으로 알려져 있다. 각 패널에 대한 RNA 발현의 배경 수준은 1.0로 정규화된 붉은 수직선으로 나타내었다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 이들 DA 키메라 및 BMP7로의 처치 후에 4일, 8일, 11일에서 같은 방법으로 측정되었다.
도 3f는 4 개의 동화 작용 유전자(MMP-13)에 의한 RNA 유도의 상대적은 수준을 나타내며, 상기 유전자는 연골 형성 및 연골 재생과 연관된 것으로 알려져 있다. 각 패널에 대한 RNA 발현의 배경 수준은 1.0로 정규화된 붉은 수직선으로 나타내었다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 이들 DA 키메라 및 BMP7로의 처치 후에 4일, 8일, 11일에서 같은 방법으로 측정되었다.
도 3g는 4 개의 동화 작용 유전자(ADAMTS5)에 의한 RNA 유도의 상대적은 수준을 나타내며, 상기 유전자는 연골 형성 및 연골 재생과 연관된 것으로 알려져 있다. 각 패널에 대한 RNA 발현의 배경 수준은 1.0로 정규화된 붉은 수직선으로 나타내었다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 이들 DA 키메라 및 BMP7로의 처치 후에 4일, 8일, 11일에서 같은 방법으로 측정되었다.
도 3h는 4 개의 동화 작용 유전자(COLX, Collagen X)에 의한 RNA 유도의 상대적은 수준을 나타내며, 상기 유전자는 연골 형성 및 연골 재생과 연관된 것으로 알려져 있다. 각 패널에 대한 RNA 발현의 배경 수준은 1.0로 정규화된 붉은 수직선으로 나타내었다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 이들 DA 키메라 및 BMP7로의 처치 후에 4일, 8일, 11일에서 같은 방법으로 측정되었다.
도 3i는 4 개의 동화 작용 유전자(RUNX2)에 의한 RNA 유도의 상대적은 수준을 나타내며, 상기 유전자는 연골 형성 및 연골 재생과 연관된 것으로 알려져 있다. 각 패널에 대한 RNA 발현의 배경 수준은 1.0로 정규화된 붉은 수직선으로 나타내었다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 이들 DA 키메라 및 BMP7로의 처치 후에 4일, 8일, 11일에서 같은 방법으로 측정되었다.
도 4a는 BMP2, BMP7, DA 키메라인 AB204의 노긴 민감성을 나타내고, 이는 노긴의 부재 또는 존재 하에 각 리간드에 대해 비교한 결과이다. Smad-1 루시퍼라제 신호전달 활성은 노긴의 부재(흰색) 및 존재(어두운 회색)에서 측정되며, 노긴이 존재하는 경우 노긴은 키메라와 1:1의 몰비로 처리된다.
도 4b는 노긴의 존재하에 노긴-감작 키메라인 NAB204와 노긴 사이의 물리적 결합을 나타내는 것으로(붉은색), 노긴의 존재 하에 노긴-비민감 키메라인 AB204 혼합물은 노긴과 결합을 나타내지 않는 것과 비교된다. 이 결과는 크기 배제 크로마토그래피 분석에서 노긴-NAB204 복합체의 용출 시간(elution time)은 우편향으로 나타난다. 노긴 단독은 참조로서 나타내며(푸른색), 노긴은 NAB204-노긴 복합체와 비교했을 때 약간 늦게 용출된다. 결과적으로, NAB204, NAB714, 및 NAB715에 대한 노긴 결합은 BMP2와 AB204 결과를 비교한 것과 마찬가지로 노긴의 존재하에 신호 전달 활성이 감소된 결과를 가져다준다.
도 5는 본 발명의 서열에 대한 참조로서 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 사이의 서열정렬을 나타낸 것으로, 서열 및 구조의 유사성을 설명하기 위해 이들을 6개의 분절로 나누어, 이 수퍼 패밀리에 대한 DA 키메라의 유사한 설계 기반을 입증한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명들이 속한 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해될 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어들은 하기와 같은 의미를 가질 수 있다.

본원에서 사용된, TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원은 임의의 종, 특히 소, 양, 돼지, 쥐, 말, 그리고 인간이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 포유동물 종의 TGF-베타 슈퍼패밀리 (골형성 인자 포함) 유전자 또는 단백질을 지칭한다. "TGF-베타 슈퍼패밀리 폴리펩타이드"는 임의의 종, 특히 소, 양, 돼지, 쥐, 말, 그리고 인간을 비롯한 포유동물 종으로부터, 그리고 자연, 합성, 반-합성, 또는 재조합인지에 상관없이 임의의 출처로부터 획득한 정제된 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 아미노산 서열을 지칭한다

"펩타이드 분절"은 더욱 큰 폴리펩타이드의 일부 또는 단편, 또는 단백질의 일부 또는 단편을 지칭한다. 펩타이드 분절은 비록 일부 경우에, 펩타이드 분절이 폴리펩타이드의 도메인에 해당하고, 상기 도메인이 자체적인 생물학적 활성을 갖긴 하지만, 그 자체가 기능적 활성을 가질 필요가 없다. 안정성-연관 펩타이드 분절은 이러한 펩타이드 분절이 없는 관련된 폴리 펩타이드와 비교하여, 안정성, 기능, 또는 접힘을 증진하는 폴리펩타이드에서 발견되는 펩타이드 분절이다.

"융합된," "작동가능하게 연결된," 그리고 "작동가능하게 결합된"은 본 원에서, 동의어로서 이용되고, 그리고 다른 모든 점에서 상이한 2개의 도메인의 화학적 또는 물리적 결합을 폭넓게 지칭하고, 여기서 각각의 도메인은 독립적인 생물학적 기능을 갖는다. 따라서 본 발명에서는 서로 융합되는 TGF-베타 (가령, BMP 또는 액티빈) 도메인을 제시하고, 이들은 TGF-베타 패밀리 활성, 또는 TGF-베타 패밀리의 폴리펩타이드의 리간드 특이성에서 향상 또는 변화를 갖는 폴리펩타이드로서 기능한다.

"키메라" 또는 "키메라 단백질" 또는 "키메라 폴리펩타이드"는 2개 이상의 상이한 부모 단백질의 2개 이상의 분절의 조합을 지칭한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 분절은 실제로, 관련된 특정 서열이 그러한 것처럼 부모로부터 각각 유래될 필요가 없고, 그리고 그 자체로 물리적 핵산일 필요가 없다. 예를 들어, BMP 키메라는 2개의 상이한 부모 BMP; 또는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 BMP 및 다른 구성원, 또는 대안으로 관계없는 단백질로부터 최소한 2개의 분절을 보유할 것이다. 키메라 단백질은 또한, 상이한 종류의 생명체에 의해 발현되는 단백질 구조 (동일한 또는 상이한 구성원 단백질)의 "종간 (interspecies)", "유전자간 (intergenic)" 등의 융합일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 2개의 분절은 새로운 키메라 단백질을 산출하기 위하여 연결된다. 다시 말하면, 단백질은 전장 부모 단백질 중에서 어느 한쪽과 동일한 서열을 보유하면, 키메라가 아닐 것이다. 키메라 단백질은 2개의 상이한 부모 단백질로부터 2개 이상의 분절을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라의 최종 키메라 또는 라이브러리를 산출하기 위하여 이들 도메인이 유래될 수 있는 2, 3, 4, 5, 6 또는 10-20개, 또는 그 이상의 부모가 존재할 수 있다. 각 부모 단백질의 분절은 매우 짧거나 또는 매우 길 수 있고, 이들 분절은 상기 단백질의 1개 내지 대략 전장의 인접 아미노산 길이 범위에서 변동할 수 있다. 한 구현예에서, 최소 길이는 5개 아미노산이다. 일반적으로, 이러한 분절 또는 하위도메인은 6개 하위도메인 중에서 하나이다 (도 1과 2 참조).

TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 "6개 분절"은 구성원 단백질 및/또는 다른 상동성 구성원 단백질(다른 종의 단백질 포함)에 대하여 정렬된 일차 아미노산 서열의 구조 체계에 기초하여 확인된다. 확인된 바와 같이, 구성원 단백질은 일반적으로, 키메라 조작 동안 정렬된 고유 TGF-베타 구성원 서열에 대한 변형을 최소화하기 위하여, 또는 대안으로, 변형을 극대화하기 위하여 도출된 분절에 기초하여 6가지 상이한 섹션 (대안으로, 5가지 상이한 섹션)으로 분류된다. 일반적으로, 도 1 및 도 2에서는 여러 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원 각각의 정렬된 서열 위에서 중복되는 상이한 분절의 상대적 위치를 도시한다. 비록 상대적으로 상이하긴 하지만, 이들 분절은 본래 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 치환(substitution), 삽입, 추가의 아미노산, 또는 기타 변형에 순응하는 특정 아미노산 서열 또는 본래 아미노산 서열을 포함할 수 있다. "순응하는"은 각 분절의 구조 완전성 (structural integrity)이 본래 서열의 도메인과 비교하여 그대로 유지된다는 것을 의미한다. 예를들어, 본원에서 기술된 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 분절은 분절을 재조합적으로 인접시키기 위해 확인된 바와 같이 분절의 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에서 5, 3, 2, 또는 1개, 또는 바람직하게는 단지 1개의 아미노산이 전위(shift)될 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명의 키메라 단백질은 TGF-베타 구성원으로부터 유래된 1개 이상의 분절과 제 2 TGF-베타 구성원으로부터 유래된 제 2 분절의 융합을 포함하며, 여기서 제 1 분절은 제 2 TGF-베타 구성원과 관계가 없다. TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 단일 서브유니트에서 5-6개 하위도메인 (분절)을 스카폴드 프레임워크로서 이용하여, 새로운(DA 키메라) 서열은 상이한 TGF-베타 리간드로부터 유래된 분절을 그들이 자연에서 출현하는 순서와 동일한 순서로 혼합함으로써 재조합 방식으로 연결될 수 있다. 이러한 어셈블리는 여러 상이한 표적 서열 중에서 어느 하나와 부분적으로 유사하지만 임의의 자연 발생 서열과 명백하게 상이한 새로운 서열을 산출한다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 정확한 서열(exact sequences)뿐만 아니라 키메라의 "변이체"가 존재한다. 다시 말하면, 보존적 아미노산 치환 (예를들어, 대략 1-10개의 보존적 아미노산 치환)이 키메라 내에서 발생할 수 있다. 따라서 변이체 키메라이면, 각 분절 100 %가 최종 키메라에 존재하지 않는다. 추가의 잔기, 또는 잔기의 제거 또는 변경을 통하여 변경될 수 있는 양은 용어 변이체가 정의되는 바에 따라서 정의될 것이다. 물론, 당업자가 인지하는 바와 같이, 상기 논의는 아미노산뿐만 아니라 이들 아미노산을 인코딩하는 핵산에도 적용된다.

"보존적" 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 보유하는 잔기의 교체가능성 (interchangeability)을 지칭하고, 따라서 전형적으로, 폴리펩타이드 내에서 아미노산이 동일하거나 또는 유사한것으로 정의된 분류의 아미노산으로의 치환을 수반한다. 실례로써, 그리고 제한없이, 지방족 측쇄를 보유하는 아미노산은 다른 지방족 아미노산, 예를들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 그리고 메티오닌으로 치환될 수 있으며; 히드록실 측쇄를 보유하는 아미노산은 히드록실 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를들어, 세린 및 트레오닌으로 치환되며; 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산은 방향족 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 그리고 히스티딘으로 치환되며; 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산은 염기성 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를들어, 리신, 아르기닌, 그리고 히스티딘으로 치환되며; 산성 측쇄를 보유하는 아미노산은 산성 측쇄를 보유하는 다른 아미노산, 예를들어, 아스파르트산 또는 글루타민산으로 치환되며; 및 소수성 또는 친수성 아미노산은 각각, 다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 치환된다.

"비-보존적" 치환은 폴리펩타이드 내에서 아미노산의 현저하게 상이한 측쇄 특성을 갖는 아미노산으로의 치환을 지칭한다. 비-보존적 치환은 정의된 그룹 내에서 보다는 이들 그룹 사이의 아미노산을 이용할 수 있고, 그리고 (a) 치환 (예를들어, 글리신을 프롤린으로) 부위에서의 펩타이드 골격의 구조, (b) 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 준다. 실례로써, 그리고 제한 없이, 예시적인 비-보존적 치환은 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환된 산성 아미노산; 작은 아미노산으로 치환된 방향족 아미노산; 그리고 소수성 아미노산으로 치환된 친수성 아미노산일 수 있다.

"분리된 폴리펩타이드"는 자연적으로 수반되는 다른 오염물, 예를들어 단백질, 지질 및 폴리뉴클레오타이드로부터 분리된 폴리펩타이드를 지칭한다. 상기 용어는 자연발생 또는 발현 시스템(예를들어, 숙주 세포 또는 in vitro 합성)으로부터 제거되거나 정제된 폴리펩타이드를 포괄한다(embrace).

"실질적으로 순수한" 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드 종류가 우세하게 존재하는(즉, 몰 또는 중량에 기초했을 때, 폴리펩타이드 종류가 조성물 내에서 임의의 다른 개별 거대분자 종류보다 더욱 풍부하다) 조성물을 지칭하고, 그리고 일반적으로, 몰 또는 중량%를 기준으로 목표로 하는 종류가 거대분자 종류 중에서 약 50 % 이상을 구성할 때 실질적으로 정제된 조성물이다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드 조성물은 몰 또는 중량%로 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 90 % 또는 그 이상, 약 95% 또는 그 이상, 약 98% 또는 그 이상을 구성할 것이다. 일부 구현예에서, 목적 종류는 본질적 균일하게(즉, 전통적인 검출 방법에 의해 오염 종류가 조성물 내에서 검출될 수 없다) 정제되고, 여기서 상기 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종류로 구성된다. 용매 종, 소형 분자 (<500 달톤), 및 필수 이온 종(elemental ion species)은 거대분자 종류로 간주되지 않는다.

"참조 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 이용되는 서열을 지칭한다. 참조 서열은 더욱 큰 서열의 부분 집합, 예를 들어, 전장 유전자 또는 폴리펩타이드 서열의 분절일 수 있다. 일반적으로, 참조 서열은 최소한 20개 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 길이, 최소한 25개 잔기 길이, 최소한 50개 잔기 길이, 또는 전장 핵산 또는 전장 폴리펩타이드일 수 있다. 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 각각, (1) 이들 두 서열 간에 유사한 서열 (즉, 완전한 서열의 일부분)을 포함하고 (2) 이들 두 서열 간에 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있기 때문에, 2개 (또는 그 이상의) 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 사이에 서열 비교는 일반적으로 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위하여 "비교 윈도우" 위에서 이들 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 서열을 비교함으로써 수행된다.

표 1은 본 발명의 도 5의 서열에 대한 참조로서 TGF-베타 수퍼 패밀리 리간드의 성숙한 형태의 서열을 보여준다. 이 표 1의 서열 번호 14 (BMP2), 서열 번호 19 (BMP7), 서열 번호 35 (액티빈 A)는 도 1 (b)에 기술된 바와 같이 첫 번째 아미노산으로서 Met가 앞에 오는 서열 번호 5 (BMP2), 서열 번호 6 (BMP7) 및 서열 번호 4 (액티빈)와 같이 재조합 발현된 형태로 재현된다.

TGF-베타 리간드	단백질 서열
BMP-2	qakhkqrkrlkssckrhplyvdfsdvgwndwivappgyhafychgecpfpladhlnstnhaivqtlvnsvnskipkaccvptelsaismlyldenekvvlknyqdmvvegcgcr(서열목록 14)
BMP-3 (오스테오제닌)	qwieprncarrylkvdfadigwsewiispksfdayycsgacqfpmpkslkpsnhatiqsivravgvvpgipepccvpekmsslsilffdenknvvlkvypnmtvescacr(서열목록 15)
BMP-4(BMP-2b)	spkhhsqrarkknkncrrhslyvdfsdvgwndwivappgyqafychgdcpfpladhlnstnhaivqtlvnsvnssipkaccvptelsaismlyldeydkvvlknyqemvvegcgcr(서열목록 16)
BMP-5	AAnqnrnkssshqdssrmssvgdyntseqkqackkhelyvsfrdlgwqdwiiapegyaafycdgecsfplnahmnatnhaivqtlvhlmfpdhvpkpccaptklnaisvlyfddssnvilkkyrnmvvrscgch(서열목록 17)
BMP-6(Vgr-1)	qqsrnrstqsqdvarvssasdynsselktacrkhelyvsfqdlgwqdwiiapkgyaanycdgecsfplnahmnatnhaivqtlvhlmnpeyvpkpccaptklnaisvlyfddnsnvilkkyrnmvvracgch(서열목록 18)
BMP-7(OP-1)	stgskqrsqnrsktpknqealrmanvaensssdqrqackkhelyvsfrdlgwqdwiiapegyaayycegecafplnsymnatnhaivqtlvhfinpetvpkpccaptqlnaisvlyfddssnvilkkyrnmvvracgch(서열목록 19)
BMP-8(OP-2)	avrplrrrqpkksnelpqanrlpgifddvhgshgrqvcrrhelyvsfqdlgwldwviapqgysayycegecsfpldscmnatnhailqslvhlmkpnavpkaccaptklsatsvlyydssnnvilrkhrnmvvkacgch(서열목록 20)
BMP-9(GDF-2)	sagagshcqktslrvnfedigwdswiiapkeyeayeckggcffpladdvtptkhaivqtlvhlkfptkvgkaccvptklspisvlykddmgvptlkyhyegmsvaecgcr(서열목록 21)
BMP-10	nakgnyckrtplyidfkeigwdswiiappgyeayecrgvcnyplaehltptkhaiiqalvhlknsqkaskaccvptklepisilyldkgvvtykfkyegmavsecgcr(서열목록 22)
BMP-15(GDF-9b)	qadgisaevtassskhsgpennqcslhpfqisfrqlgwdhwiiappfytpnyckgtclrvlrdglnspnhaiiqnlinqlvdqsvprpscvpykyvpisvlmieangsilykeyegmiaesctcr(서열목록 23)
GDF-1	daepvlgggpggacrarrlyvsfrevgwhrwviaprgflanycqgqcalpvalsgsggppalnhavlralmhaaapgaadlpccvparlspisvlffdnsdnvvlrqyedmvvdecgc(서열목록 24)
GDF-3(Vgr-2)	aaipvpklscknlchrhqlfinfrdlgwhkwiiapkgfmanychgecpfsltislnssnyafmqalmhavdpeipqavciptklspismlyqdnndnvilrhyedmvvdecgcg(서열목록 25)
GDF-5(BMP-14)	aplatrqgkrpsknlkarcsrkalhvnfkdmgwddwiiapleyeafhceglcefplrshleptnhaviqtlmnsmdpestpptccvptrlspisilfidsannvvykqyedmvvescgcr(서열목록 26)
GDF-6(BMP-13)	tafasrhgkrhgkksrlrcskkplhvnfkelgwddwiiapleyeayhcegvcdfplrshleptnhaiiqtlmnsmdpgstppsccvptkltpisilyidagnnvvykqyedmvvescgcr(서열목록 27)
GDF-7(BMP-12)	talagtrtsqgsgggagrghgrrgrsrcsrkplhvdfkelgwddwiiapldyeayhceglcdfplrshleptnhaiiqtllnsmapdaapasccvparlspisilyidaannvvykqyedmvveacgcr(서열목록 28)
GDF-8(미오스타틴)	dfgldcdehstesrccrypltvdfeafgwdwiiapkrykanycsgecefvflqkyphthlvhqanprgsagpcctptkmspinmlyfngkeqiiygkipamvvdrcgcs(서열목록 29)
GDF-9	gqetvsselkkplgpasfnlseyfrqfllpqnecelhdfrlsfsqlkwdnwivaphrynpryckgdcpravghrygspvhtmvqniiyekldssvprpscvpakysplsvltiepdgsiaykeyedmiatkctcr(서열목록 30)
GDF-10(BMP-3b)	ktmqkarrkqwdeprvcsrrylkvdfadigwnewiispksfdayycagacefpmpkivrp61snhatiqsivravgiipgipepccvpdkmnslgvlfldenrnvvlkvypnmsvdtcacr (서열목록 31)
GDF-11(BMP-11)	nlgldcdehssesrccrypltvdfeafgwdwiiapkrykanycsgqceymfmqkyphthlvqqanprgsagpcctptkmspinmlyfndkqqiiygkipgmvvdrcgcs(서열목록 32)
GDF-15	arngddcplgpgrccrlhtvrasledlgwadwvlsprevqvtmcigacpsqfraanmhaqiktslhrlkpdtepapccvpasynpmvliqktdtgvslqtyddllakdchci(서열목록 33)
노달	HHLPDRSQLCRKVKFQVDFNLIGWGSWIIYPKQYNAYRCEGECPNPVGEEFHPTNHAYIQSLLKRYQPHRVPSTCCAPVKTKPLSMLYVDNGRVLLDHHKDMIVEECGCL(서열목록 34)
액티빈-bA	glecdgkvnicckkqffvsfkdigwndwiiapsgyhanycegecpshiagtsgsslsfhstvinhyrmrghspfanlksccvptklrpmsmlyyddgqniikkdiqnmiveecgcs(서열목록 35)
액티빈-bB	glecdgrtnlccrqqffidfrligwndwiiaptgyygnycegscpaylagvpgsassfhtavvnqyrmrglnpgtvnscciptklstmsmlyfddeynivkrdvpnmiveecgca(서열목록 36)
액티빈-bC	gidcqggsrmccrqeffvdfreigwhdwiiqpegyamnfcigqcplhiagmpgiaasfhtavlnllkantaagttgggsccvptarrplsllyydrdsnivktdipdmvveacgcs(서열목록 37)
액티빈-bE	tptcepatplccrrdhyvdfqelgwrdwilqpegyqlnycsgqcpphlagspgiaasfhsavfsllkannpwpastsccvptarrplsllyldhngnvvktdvpdmvveacgcs(서열목록 38)
인히빈-a	stplmswpwspsalrllqrppeepaahanchrvalnisfqelgwerwivyppsfifhychggcglhippnlslpvpgapptpaqpysllpgaqpccaalpgtmrplhvrttsdggysfkyetvpnlltqhcaci(서열목록 39)
TGF-b1	aldtnycfssteknccvrqlyidfrkdlgwkwihepkgyhanfclgpcpyiwsldtqyskvlalynqhnpgasaapccvpqaleplpivyyvgrkpkveqlsnmivrsckcs(서열목록 40)
TGF-b2	aldaaycfrnvqdncclrplyidfkrdlgwkwihepkgynanfcagacpylwssdtqhsrvlslyntinpeasaspccvsqdlepltilyyigktpkieqlsnmivksckcs(서열목록 41)
TGF-b3	aldtnycfrnleenccvrplyidfrqdlgwkwvhepkgyyanfcsgpcpylrsadtthstvlglyntlnpeasaspccvpqdlepltilyyvgrtpkveqlsnmvvksckcs(서열목록 42)

"서열 동일성"은 2개의 아미노산 서열이 비교 윈도우 위에서 실질적으로 동일 (즉, 아미노산-아미노산 기초에서)하다는 것을 의미한다. 용어 "서열 유사성"은 동일한 생물물리학적 특징을 공유하는 유사한 아미노산을 지칭한다. 용어 "서열 동일성의 비율" 또는 "서열 유사성의 비율"은 비교 윈도우 위에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동일한 잔기 (또는 유사한 잔기)가 양쪽 폴리펩타이드 서열 내에서 발생하는 위치의 숫자를 결정하여 일치된 위치의 숫자를 산출하고, 일치된 위치의 숫자를 비교 윈도우 내에서 위치의 총수 (즉, 윈도우 크기)로 나눗셈하고, 그리고 획득된 결과를 100으로 곱셈하여 서열 동일성의 비율 (또는 서열 유사성의 비율)을 산출함으로써 계산된다. 폴리뉴클레오타이드 서열에 관하여, 용어 서열 동일성 및 서열 유사성은 단백질 서열에 대하여 기술된 바와 비슷한 의미를 갖는데, 용어 "서열 동일성의 비율"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열이 비교 윈도우 위에서 동일 (뉴클레오타이드-뉴클레오타이드 기초에서)하다는 것을 의미한다. 따라서 폴리뉴클레오타이드 서열 동일성의 비율 (또는 분석 알고리즘에 기초하여, 예로써 침묵 치환 또는 기타 치환에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열 유사성의 비율) 역시 계산될 수 있다. 최대 상응도 (maximum correspondence)는 본원에서 기술된 서열 알고리즘 (또는 당업자에게 이용 가능한 다른 알고리즘) 중에서 한가지를 이용함으로써, 또는 시각 검사에 의해 결정될 수 있다.

폴리펩타이드에 적용될 때, 용어 실질적인 동일성 또는 실질적인 유사성은 디폴트 갭 가중치 (default gap weight)를 이용한 프로그램, BLAST, GAP 또는 BESTFIT에 의해, 또는 시각 검사에 의해 2 개의 펩타이드 서열이 최적으로 정렬될 때, 2개의 펩타이드 서열이 서열 동일성 또는 서열 유사성을 공유한다는 것을 의미한다. 유사하게, 2개 핵산의 문맥(context)에서 적용될 때, 용어 실질적인 동일성 또는 실질적인 유사성은 디폴트 갭 가중치 (하기에 상세하게 기술됨)를 이용한 프로그램, BLAST, GAP 또는 BESTFIT에 의해, 또는 시각 검사에 의해 2 개의 핵산 서열이 최적으로 정렬될 때, 2개의 핵산 서열이 서열 동일성 또는 서열 유사성을 공유한다는 것을 의미한다.

"기능적"은 폴리펩타이드 유형에 따른 자연-발생 단백질의 고유 생물학적 활성, 또는 임의의 특정한 원하는 활성 중 어느 하나를 갖는 폴리펩타이드를 지칭하며, 이는 예를 들어, 폴리펩타이드가 리간드 또는 동족 (cognate) 분자에 결합하는 능력에 의해 판단되는 바와 같다.

"전환 성장 인자-베타" (TGF-베타) 슈퍼패밀리의 단백질은 매우 다양한 인간 세포에서 관찰되는 세포외 사이토킨으로 구성된다. 40개 이하인 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드는 TGF-베타, 골형성 단백질 (BMP), 액티빈과 인히빈, 성장과 분화 인자 (Growth and Differentiation Factors, GDF), 노달(Nodal), 뮐러관 저해 물질 (Mullerian Inhibiting Substance, MIS), 그리고 아교세포주-유래 신경영양성 인자 (GDNF)를 비롯한 더욱 작은 패밀리로 구분될 수 있다. TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원은 다양한 범위의 세포 유형에서 관찰되고, 그리고 부터 골 형성 및 조직 수복을 위한 등배 패턴화 (dorsal/ventral patterning) 및 좌우 축 결정 (left/right axis determination)을 포함하는 많은 기초적인 세포 현상에서 일정한 역할을 한다. 더욱 최근에, 여러 TGF-베타 리간드는 줄기 세포의 유지에 관여하거나, 또는 줄기 세포의 분화에 직접적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 널리 존재하기(pervasiveness)때문에, TGF-베타 리간드 신호전달의 조절은 골격과 근육 비정상에서부터 다수의 신생물 현상 (neoplastic event)까지 넓은 범위의 상이한 질환의 치료에 적용가능하다. 이러한 패밀리 또는 단백질의 다양한 구성원에 대한 예시적인 서열이 본원에서 제시되긴 하지만, 당업자는 단어 검색 또는 서열 BLAST 검색에 의해 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 이용하여 동족체 (homolog) 및 변이체(variant)를 용이하게 확인할 수 있다.

TGF-베타 리간드는 프로테아제 절단 부위에 의해 연결된 N-말단 프로-도메인 및 C-말단 성숙 도메인으로 구성되는 비활성 전구체 분자로 합성된다. 활성화되기 위하여, 성숙 도메인은 통상적으로 전환효소 (convertase), 예를 들어, 푸린(furin)에 의해 프로-도메인으로부터 절단되어야 한다. TGF-베타 슈퍼패밀리의 구성원은 그들의 성숙 도메인 내에서 관찰되는 보존된 구조 체계로 인하여 함께 분류된다. 일반적으로, 각 성숙 리간드 단위체는 7개의 시스테인을 보유하고, 이들 중에서 6개는 '시스틴 결절 (cystine knot)' 모티프 내에 배열된 3개의 내부 이황화 결합(intra-disulfide bond)을 형성한다. '시스틴 결절'로부터 4개의 베타 가닥이 뻗어나가 2개의 굽은 핑거를 발생시킨다. 마지막 남아있는 시스테인은 두 번째 리간드 단위체와 외부-이황화 결합을 형성하고 공유 연결된 이합체를 산출한다. 이러한 이합체는 '시스틴 결절'을 몸체로 하고 핑거가 날개처럼 뻗어나가 전체적으로 보면 나비의 형상을 갖는다. TGF-베타 슈퍼패밀리에 대한 기능적 서브유니트는 상기 이합체이고, 그리고 이들은 생체 내에서 동종이합체와 이종이합체 둘 모두로서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 일부 패밀리 구성원, 예를 들어, GDF-9와 BMP-15는 외부-이황화 결합을 형성하기 위하여 요구되는 시스테인이 존재하지 않지만 여전히 안정된 이합체를 형성할 수 있다.

신호전달 과정을 개시하기 위하여, TGF-베타 이합체는 I형과 II형으로 명명된 2가지 세트의 수용체를 동원해야 한다. 이들 수용체는 3-핑거 독소 접힘 (toxin fold)으로 정렬된 세포외 도메인 (ECD), 단일 막통과 도메인, 그리고 대형 세포내 키나아제 도메인을 보유하는 세린/트레오닌 키나아제이다. TGF-베타 리간드는 상이한 수용체 유형에 대한 그들의 친화성에서 선호(preference)를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 액티빈 및 노달은 II형 수용체에 대한 높은 친화성을 나타내는 반면, BMP-2 및 GDF-5는 I형 수용체에 대한 더욱 높은 친화성을 갖는다. TGF-베타 리간드와 2개의 높은 친화성 수용체의 결합 이후에, 2개의 더욱 낮은 친화성 수용체가 상기 복합체에 결합하고 합류할 수 있다. 4개의 수용체 모두 TGF-베타 리간드에 결합하면, 6-구성원 삼원 복합체(6-member ternary complex)가 형성되고, 그리고 하류 신호전달 캐스케이드(cascade)가 개시된다. 본질적으로 활성 II형 수용체는 I형 수용체를 인산화시키고, 그 다음에 I형 수용체는 Smad로 불리는 세포내 신호전달 분자에 결합하고 이들을 인산화시킨다. Smad 분자는 이후, 핵으로 전위 (translocation)할 수 있고, 그리고 전사 조절자와 직접적으로 상호작용한다. 이러한 캐스케이드의 여러 단계에서 TGF-베타 신호전달을 면밀히 조절하기 위하여 복합 기전은 이용된다: 노긴 (noggin), 폴리스타틴(follistatin), 그리고 인히빈 (inhibin)을 비롯한 세포외 길항제; BAMBI와 유사한, 세포내 키나아제 도메인이 없는 슈도-수용체; 또는 억제성 Smad 같은 세포내 분자.

TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드는 이들 리간드에 대한 수용체에 의한 높은 정도의 불규칙한 결합(promiscuity)을 보인다. 40개 이상의 TGF-베타 리간드가 존재하는 반면, 단지 12개의 수용체 (7개의 I형 및 5개의 II형)가 존재한다. 따라서, 수용체는 다수의 상이한 리간드와 상호작용할 수 있어야 한다. 예를 들어, ActRII는 높은 친화성으로 액티빈 및 BMP-7에 결합하는 것으로 알려져 있지만, 훨씬 낮은 친화성으로 BMP-2에 결합한다. 리간드:수용체의 친화도 및 특이성에 대한 구조적 세부사항이 어떤 방식으로 조절되는지 및 전체 신호 전달 과정(fate)에서 이들이 가지는 의미가 이해된다. GDF-5에서, 이의 I형 수용체 선호를 결정하는 단일 아미노산이 밝혀졌고, BMP-3에서 II형 수용체 친화성을 변경하고 상기 리간드에 기능을 부여하는 단일 점 돌연변이가 발견되었다. 본 발명은 신규한 수용체 결합 특성을 갖고, 그에 따라 다양한 TGF-베타 리간드 기능을 갖는 변형된 TGF-베타 리간드, 그리고 이런 활성을 갖는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 대장균 (E. coli) 또는 포유동물 발현 시스템을 이용하여 발현되고 재접힘되는(refolded) 능력을 갖는 신규한 키메라 TGF-베타 리간드 및 이들 리간드를 제조하는 방법을 제공한다. 이들 키메라는 특정한 TGF-베타 리간드의 신호전달 특징을 모방하거나, 또는 자연에서 관찰되지 않는 독특한 신호전달 특성을 나타낸다. 한 구현예에서, 본 발명은 BMP-2의 재접힘 효율 및 액티빈-βA의 신호전달 특성을 갖는 액티빈/BMP-2 키메라를 산출하기 위해 주형(template)으로서 액티빈-βA 및 BMP-2를 이용한다; 하지만, 임의의 다른 TGF-베타 단백질 패밀리 구성원이 이용될 수 있는 것은 이해할 수 있다.

본 발명의 키메라 설계 도식(scheme)은 비자연적인 신호전달 특징 및 생물학적 활성을 갖는 추가의 TGF-베타 구성원 키메라 (예를 들어, 액티빈/BMP-2) 리간드를 산출하였다. 또한, 본 발명은 '노긴-감작(Noggin-sensitized)'리간드를 생성하기 위해 BMP-2 또는 BMP-7의 작은 노긴-민감자 섹션이 표적 키메라에 통합될 필요가 있음을 설명한다. 이런 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩타이드 발명은 기능적 연구에 이용 가능한 TGF-베타 리간드의 라이브러리를 확장하고 치료제로서 신규한 TGF-베타 리간드의 개발을 용이하게 한다.

BMP-2 및 자연 발생 변이체의 핵산 서열 및 폴리펩타이드 서열은 공지되어 있다. 야생형 BMP-2 핵산 서열 (서열 번호 2)이 제공된다. 잔기 1의 N-말단 위치에서 Met(Q)은 세균의 개시 코돈(ATG)의 번역에 기인한다. 또한, 액티빈 역시 당분야에 공지되어 있다 (서열 번호 1). 본 발명은 키메라의 동일한 폴리펩타이드 서열의 박테리아 발현을 위해 코돈-최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용하여 키메라의 박테리아 생산을 가능하게 하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 ATG의 개시 코돈과 함께 Met 다음에 BMP-2 또는 BMP-7의 1개 이상의 N-말단 분절 1 및 액티빈을 포함하는 또다른 TGF-베타 패밀로부터 유래하는 2 개 이상의 분절(분절 2 및 6)을 제공하며, 여기서 생성된 키메라 폴리펩타이드는 그들의 부모 단백질과 상이한 활성을 제시한다(display).

본 발명의 일 구현예에서, 키메라 분절을 설계할 때, 2가지 요소가 고려되었다. 첫 번째는 구조적 고려이다. 전체 TGF-베타 단위체 접힘은 자연적으로 6개 섹션으로 분류된다: 베타 가닥 1과 2, 전나선 (pre-helix) 루프, 알파 나선 1, 그리고 베타 가닥 3과 4. 두 번째 고려는 이러한 분절 경계(boundaries)에서 키메라에 대한 변경을 최소화하여 영역이 PCR 전략에 대한 DNA 서열의 중복에 적합하고 자연 서열에 대한 모든 변화를 최소화하는 것이다. 도 2에서는 이들 고려 대상의 서열 및 구조를 나타낸다. 키메라의 분절 경계는 미국 가출원 제61/155,066호로부터 유래한다.

예를 들어, 알고리즘 1B2B3B4B5B6A를 포함하는 키메라 폴리펩타이드는 1 내지 6인 6개의 분절을 지시하고, 상기 문자는 "A" 또는 "B"로서 각 분절의 부모 가닥을 지시한다. 따라서, 실시예 "1B2B3B4B5B6A"에서, 분절 1은 각각 AB215 또는 SAB715 키메라에 해당하는 BMP-2 또는 BMP-7에 대한 부모 가닥 "B"로부터 유래하며, 분절 2는 액티빈에 대한 부모 가닥 "A"로부터 유래하며, 분절 3은 부모 가닥 "B"로부터 유래하며, 분절 4는 부모 가닥 "B"로부터 유래하며, 분절 5는 부모 가닥 "B"로부터 유래하며, 및 분절 6은 부모 가닥 "A"로부터 유래한다.

본 명세서에서 제시된 바와 같이, 이들 재조합된 기능적 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩타이드가 제조될 때, 재조합되지 않은 부모 폴리펩타이드와 비교하여, 그들의 리간드 특이성이 향상될 수 있거나, 또는 생물학적 활성이 변경되거나 향상될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 활성/리간드 프로필(profiles)에서 차이로 인하여, 이들 조작된 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩타이드는 리간드 특이적 활성화와 저해를 위한 활성물질을 스크리닝하고, 그리고 신규한 치료 폴리펩타이드 및 연구 시약을 제공하기 위한 특별한 기반을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명은 BMP2에서 유래하는 분절 1 다음으로, BMP-7에서 유래하는 분절 2 내지 6을 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩타이드를 제공한다(예를 들어, 1B2-BMP-7 폴리펩타이드, 서열 번호 3 참조). 이들 키메라 1B2-BMP-7은 BMP-7의 TGF-베타 단백질 활성을 제시한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 키메라 폴리펩타이드의 분절은 상기 분절이 유래된 부모 가닥에 100% 동일할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 분절은 부모 가닥에서 상응하는 분절에 최소한 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 분절은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환 (가령, 1-5개의 보존적 아미노산 치환)을 포함 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 키메라의 생물학적 활성은 TGF-베타 활성에 대한 당분야에서 인정된 다수의 분석평가를 이용하여 측정될 수 있다. 이런 분석평가에는 BIAcore (표면 플라즈몬 공명); C2C12 루시페라아제 분석평가; Smad 1/5 리포터 시스템; HEK293 루시페라아제 분석평가; Smad 2/3 리포터 시스템; FSH (난포 자극 호르몬) 방출 분석평가: 쥐 뇌하수체 세포에서; BRE (BMP 반응 요소) 루시페라아제 분석평가: Smad 1/5 리포터 HEK 293 세포; Cripto 결합 분석평가: Crptio의 존재/부재에서 측정된 루시페라아제 반응; 인간 줄기 세포 분석평가: 연골 재생 분석평가, 생체 외에서의 연골 펠릿 배양; NMR 결합 연구; 쥐 및 다른 동물에서의 골 및 연골 형성 측정; 리간드:수용체 복합체의 시각화; 크기 배제 크로마토그래피(SEC); 리간드:수용체 복합체 형성의 시각화를 위한 속도 스캔 초원심분리; 및 리간드 크기의 정확한 결정을 위한 Seldi 질량 분석법이 포함되지만 이들에 한정되지는 않는다.

변형된 키메라는 또한, 예로써 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 이소류신 또는 발린으로 류신의 고립된 교체, 글루타민산염으로 아스파르트산염의 고립된 교체(isolated replacement), 세린으로 트레오닌의 고립된 교체, 또는 구조적으로 관련된 아미노산 (가령, 보존적 돌연변이)으로 아미노산의 유사한 교체가 결과 분자의 생물학적 활성에 별다른 영향을 주지 않을 것으로 예상하는 것은 합리적이다. 보존적 교체는 측쇄에서 관련되는 아미노산의 패밀리 내에서 발생하는 것들이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 키메라 서열의 단백질 분해 절단 부위를 단백질 분해 절단에 덜 민감하도록 돌연변이를 만드는 것을 고려한다(contemplates). 컴퓨터 분석 (상업적으로 이용 가능한 소프트웨어, 예를 들면, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.를 이용)은 단백질 분해 절단 부위를 확인하는데 이용될 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 이들 기술된 돌연변이, 변이체 또는 변형 중에서 대부분은 핵산 수준에서(또는 일부 경우에 번역 후 변형 또는 화학적 합성에 의해) 만들어질 수 있다. 이런 기술은 당분야에 널리 공지되어 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 키메라의 당화(glycosylation)를 변경하기 위하여 키메라 서열의 특정한 돌연변이를 고려한다. 이런 돌연변이는 하나 이상의 당화 부위, 예를 들면, O-연결된 또는 N-연결된 당화 부위를 도입하거나 제거하기 위하여 선택될 수 있다. 아스파라긴-연결된 당화 인식 부위는 일반적으로, 트리펩타이드 서열, 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 "X"는 임의의 아미노산)을 포함하고, 이들은 적절한 세포 당화 효소에 의해 특이적으로 인식된다. 변형은 또한, 야생형 폴리펩타이드의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기에 의한 치환 (O-연결된 당화 부위의 경우에)에 의해 만들어질 수 있다. 당화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽에서 다양한 아미노산 치환 또는 결실(및/또는 두 번째 위치에서 아미노산 결실)은 변형된 트리펩타이드 서열에서 비-당화를 초래한다. 탄수화물 모이어티의 숫자를 증가시키는 다른 수단은 폴리펩타이드에 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링이다.

본 발명은 또한 본원에서 개시한 키메라 폴리펩타이드의 일부를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 코돈 최적화(codon-optimized) 될 수 있으며, 특정 발현 숙주에서 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 생성하기 위해 유전자 발현을 제어하는 하나 이상의 이종성 조절 서열 또는 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 구조체는 상기 키메라 폴리펩타이드를 발현하기 위하여 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

TGF-베타 패밀리의 단백질의 특정 서열에 관한 지식, 그리고 본원에서의 키메라 폴리펩타이드에 관한 특정한 설명(예를 들어, 키메라 도메인의 분절 구조)을 고려하면, 조작된 키메라의 핵산 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 이들 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 관한 지식과 함께 다양한 아미노산에 상응하는 코돈에 관한 지식은 당업자가 본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 상이한 폴리뉴클레오타이드를 만드는 것을 가능하게 한다. 따라서 본 발명에서는 가능한 코돈 선택에 기초하여 조합을 선택함으로써 만들어질 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 각각의 가능한 변화를 고려하고, 그리고 이와 같은 모든 변화는 본원에서 기술된 임의의 폴리펩타이드에 대하여 명확하게 개시된 것으로 간주된다.

논의된 발현 시스템 중에서 한 가지 예는 대장균 (E. coli) 발현 시스템이긴 하지만, 이들 단백질은 다수의 다른 발현 시스템 내로 용이하게 클로닝되고 이들 시스템으로부터 발현될 수 있다. 이점으로 단백질이 유래되는 생명체 (본 발명의 경우에, 호모 사피엔스 (H. sapiens))에서 관찰되는 바와 같은 번역후 변형 달성, 세균 발현에 요구되는 출발 메티오닌이 없는 리간드의 발현, 그리고 비-자연 아미노산 또는 추가의 화학적 변형의 용이한 통합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적절한 원핵생물에는 진정세균 (eubacteria), 예를 들면, 그람-음성 또는 그람-양성 생명체, 예를 들면, 엔테로박터 (Enterobacteriaceae), 예를 들면, 대장균 (E. coli)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다양한 대장균 (E. coli) 균주, 예를 들면, 대장균 (E. coli) K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 대장균 (E. coli) X1776 (ATCC 31,537); 대장균 (E. coli) 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 이용가능하다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예를 들면, 섬유상 진균류 또는 효모가 VEGF-E-인코딩 벡터에 대한 클로닝 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 이용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다.

본 발명의 키메라의 발현에 적합한 숙주 세포는 단세포 및 다세포 생명체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 곤충 세포, 예를 들면, 초파리 (Drosophila) S2 및 나방 (Spodoptera) Sf9, 그리고 식물 세포가 포함된다. 식물 발현 시스템 역시 변형된 단백질을 발현하는데 성공적으로 이용되고 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 중국 햄스터 난소 (CHO) 및 COS 세포가 포함된다. 더욱 구체적인 예에는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 태아 신장 세포주 (현탁 배양에서 성장을 위하여 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 생쥐 세르톨리 세포(sertoli cell) (TM4, Mather, Biol.Reprod., 23:243-251 (1980)); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 그리고 생쥐 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 적절한 숙주 세포의 선택은 당분야의 평균적인 지식 내에 있는 것으로 간주된다.

대안적 단백질 발현 시스템에는 인간 태아 신장 (HEK) 293 세포, 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하는 곤충 세포주 (S. frugiperda), 피키아 파스토리스 (P. pastoris) 및 사카로미세스 세레비시아 (S. cerevisiae)에 국한되지 않는 효모 발현 시스템, 그리고 다수의 미세조류 계통이 포함된다. 정확하게 변형된 단백질을 발현하기 위하여 형질전환 동물이 이용될 수 있다. 본질적으로, 이들 동물은 쉽게 수확되는 유체 또는 조직, 예를 들면, 소에서 얻는 우유 내에 원하는 단백질을 다량 발현할 수 있는 살아있는 '생물반응기 (bioreactor)'가 될 수 있다. 세균 또는 맥아 (wheat germ) 세포 용해질을 이용한 세포-없는 in vitro 발현 시스템이 이용될 수 있다. 세포-없는 발현 시스템은 더욱 높은 효율 및 더욱 큰 특이성을 갖는 넓은 범위의 비-자연 아미노산 또는 에피토프 태그를 삽입하는 것을 가능하게 할 것이다.

특정 양태에서, 본 발명은 연골 및 골 형성을 촉진하고 그 양을 증가시키기 위한 방법 및 작용제를 제공한다. 따라서, TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질, 예를 들면, BMP-2, BMP-3, GDF-10, BMP-4, BMP-7, 또는 BMP-8의 골-관련된 기능에 영향을 줄 것으로 예상되는 본 발명의 키메라 단백질은 골 또는 연골 성장을 조정하는 능력을 확증하기 위하여, 완전한 세포 또는 조직에서 in vitro에서 또는 생체 내에서 조사될 수 있다. 당분야에 공지된 다양한 방법이 이러한 목적에 이용될 수 있다. 따라서 골 또는 연골 성장에 대한 대상 키메라 단백질, 바람직하게는, BMP-2 또는 BMP-3으로부터의 분절을 포함하는 키메라 단백질의 효과는 골 형성 및 연골 형성 활성에 미치는 영향을 통해 결정될 수 있으며, 그 예로는 세포 기반 분석방법에서 ACAN (양성), Col2A1 (양성), MMP13 (음성), ADAMTS-5 (음성), 및 ColX (음성)을 포함하는 연골 형성의 양성 또는 음성 분화 마커 유전자, 또는 Msx2의 유도를 측정하는 것이 있다(see also, e.g., Daluiski et al., Nat. Genet. 2001, 27(1):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9).

본 발명의 스크리닝 분석평가는 대상 키메라 단백질 및 이들의 변이체뿐만 아니라, 이들의 키메라 단백질 또는 그들의 변이체의 활성물질(agonist)과 길항제(antagonist)을 비롯한 임의의 검사 화합물에 적용되는 것으로 이해된다. 게다가, 이들 스크리닝 분석평가는 약물 표적 검증 및 품질 관리 목적에 유용하다.

본 발명의 키메라는 in vitro 및 생체 내 다양한 생물학적 시스템에서의 이용을 위하여 조제될 수 있다. 단독으로 또는 다른 활성제와 공동으로 키메라를 투여하기 위하여 임의의 다양한 공지된 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 투여는 시간에 따라 조직영역으로 점진적으로 주입되거나 또는 주사에 의해 비경구 투여될 수 있다. 이들 작용제는 경구, 직장, 구강(buccal) (가령, 설하), 질, 비경구 (예를 들어, 피하, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 및 평활근을 포함하는 근육내, 피내, 정맥내, 복막내), 국소(topical) (즉, 피부 및 기도 표면을 비롯한 점막 표면), 비내, 경피, 관절내, 수막 공간내, 강내 (intracavity), 흡입 투여, 문맥내 (intraportal) 전달에 의한 간에 투여, 그리고 직접 기관 주사(예를 들어, 간 내로, 중추신경계에 전달을 위한 뇌 내로, 췌장 내로)와 같은 수단에 의해 투여될 수 있다. 임의의 경우에 가장 적합한 경로는 치료되는 장애의 성질과 심각도 및 이용되는 특정 화합물의 성질에 좌우될 것이다

본 발명은 또한 대상 키메라 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제조물을 제공한다. 약제학적 제조물은 대상, 바람직하게는 인간에서 조직의 성장을 증진하거나, 또는 조직의 손실을 감소시키거나 예방하는데 이용될 수 있다. 표적화된 조직은 예로써, 골, 연골, 골격근, 심장 근육 및/또는 신경 조직일 수 있다.

다른 양태에서, 키메라는 단독으로 또는 투여를 위한 다른 작용제 (가령, 로션, 크림, 스프레이, 겔, 또는 연고로서)와 공동으로 조제될 수 있다. 이것은 독성을 감소시키거나, 또는 생체이용효율을 증가시키기 위하여 리포좀으로 조제될 수 있다. 다른 전달 방법에는 미소구체 (microsphere) 또는 프로티노이드 (proteinoid)의 캡슐화 (encapsulation)를 수반하는 경구 방법, 에어로졸 전달 (예를 들어, 폐로), 또는 경피 전달(예를 들어, 이온삼투요법 (iontophoresis) 또는 경피 전기천공 (transdermal electroporation)에 의해)이 포함된다. 다른 투여 방법은 당업자에게 명백할 것이다.

실시예

실시예 1

TGF-베타 키메라의 제조. 설계 원리 (design principle)로서 폭넓게 적용될 수 있기 위하여, 이는 또한, 2개의 구조 분절, 섹션3과 4를 유지하는 설계의 일부이고 부모 유전자 중에서 어느 한쪽의 한 섹션으로 처리될 수 있다 (섹션 3*4로지칭됨). 이러한 전략은 액티빈-βA를 표적 리간드로서, 그리고 BMP-2를 골격 리간드로서 이용하여 액티빈/BMP-2 키메라를 만듦으로써 수행하였다. 이 발명은 2009년 2월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/155,066호에서 이미 제출되었고, 심사받았으며 공개되었다.

액티빈/BMP-2 키메라의 경우에, 인간 BMP-2와 인간 액티빈-βA의 성숙 도메인은 초기에 6개의 분절로 각각 분류되고, 그리고 각 분절에 대하여 프라이머가 설계되었다. BMP-2의 경우에, 아래 6개의 분절을 코딩하는 프라이머가 설계되었다. 분절 6 내의 6-잔기-길이 노긴-민감자 서열은 밑줄로 표시하였다.

분절 1, QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWND;

분절 2, WIVAPPGYHAFYCHGECP;

분절 3, FPLADHLNSTNHAIVQTLVN;

분절 4, SVNSKIPKACCVP;

분절 5, TELSAISMLYYD;

분절 6, ENEK VVLKNY QDMVVEGCGCR.

액티빈-βA의 경우에, 아래 6개의 분절을 코딩하는 프라이머가 설계되었다. 분절 6 내의 6-잔기-길이 노긴-민감자 서열은 밑줄로 표시하였다.

분절 1, RGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDW;

분절 2, WIIAPSGYHANYCEGECP;

분절 3, SHIAGTSGSSLSFHSTLVN;

분절 4, HYRMRGHSPFANLKSCCVP;

분절 5, TKLRPMSMLYYD;

분절 6, DGQN IIKKDI QNMIVEECGCS.

전장 키메라를 산출하고, Met에 대한 개시 코돈 ATG 이후로 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 순서로 작동가능하게 연결된 BMP-2 및 액티빈 βA의 다양한 분절을 혼합하기 위해 중복되는 PCR 전략(overlapping PCR strategy)을 사용하였다.

액티빈/BMP-7 키메라의 경우에, 인간 BMP-7과 인간 액티빈-βA의 성숙 도메인은 초기에 6개의 분절로 각각 분류되고, 그리고 각 분절에 대하여 프라이머가 설계되었다. BMP-7의 경우에, 아래 6개의 단백질 서열을 코딩하는 프라이머가 설계되었다. 분절 6 내의 6-잔기-길이 노긴-민감자 서열은 밑줄로 표시하였다.

분절 1, MSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQD

분절 2, WIIAPEGYAAYYCEGECA;

분절 3, GPLNSYMNATNHAIVQTLVH;

분절 4, FINPETVPKPCCAP;

분절 5, TQLNAISVLYFD;

분절 6, DSSN VILKKY RNMVVRACGCH.

액티민-베타A의 경우에, 아래 6개의 분절을 코딩하는 프라이머가 설계되었다. 분절 6 내의 6-잔기-길이 노긴 민감자 서열은 밑줄로 표시하였다.

분절 1, RGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDW;

분절 2, WIIAPSGYHANYCEGECP;

분절 3, SHIAGTSGSSLSFHSTLVN;

분절 4, HYRMRGHSPFANLKSCCVP;

분절 5, TKLRPMSMLYYD;

분절 6, DGQN IIKKDI QNMIVEECGCS.

전장 키메라를 산출하고, Met에 대한 개시 코돈 ATG 이후로 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 순서로 작동가능하게 연결된 BMP-7 및 액티빈 βA의 다양한 분절을 혼합하기 위해 중복되는 PCR 전략(overlapping PCR strategy)을 사용하였다.

BMP-7의 1B2 키메라, 1B2-BMP-7를 산출하기위해, 2개의 올리고를 사용하여 BMP-2 분절 1에 이어서 아미노산 II(밑줄로 표시됨), QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWND II , 를 표적유전자에 삽입하였다. 2개의 아미노산, II는 편리한 제한 효소 부위를 생성하기 위해 첨가되었다. 모든 구조체에 대한 외부 프라이머는 pET21a 발현 벡터 내로 클로닝을 위하여 5' NdeI 부위 및 3' XhoI 부위를 통합하도록 제작되었다. 도 2는 1B2-BMP-7를 하기와 같이 설명하고 있으며, 1B2 분절의 N- 말단 추가를 사용하여 1B2-NAB704 및 1B2-AB704 및 1B2-NAB715를 포함한 다양한 키메라 및 그 변이체의 기반을 설정한다. 다만, 분절 1의 C-말단에 삽입되는 이들 2 개의 아미노산은 1B2-BMP7을 제조하는데 요구되지는 않는다. 두 서열은 모두 동일하게 작동한다.

분절 1, QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWND II ; (BMP-2)

분절 2, WIIAPEGYAAYYCEGECA; (BMP-7)

분절 3, GPLNSYMNATNHAIVQTLVH; (BMP-7)

분절 4, FINPETVPKPCCAP (BMP-7)

분절 5, TQLNAISVLYFD (BMP-7)

분절 6, DSSNVILKKYRNMVVRACGCH (BMP-7)

단백질 발현 및 정제. 액티빈/BMP-2 키메라, 액티빈/BMP-7 키메라, 액티빈- βA, 1B 키메라, 및 이들의 노긴-감작 변이체는 전형적인 대장균 (E. coli) 발현 시스템을 이용하여 발현되었고, 그리고 키메라는 봉입체 분획물(inclusion body fractions)에서 관찰되었다. 발현된 봉입체는 분리되고, 정제되고, 그리고 재접힘되었다. 재접힘된 리간드는 Hi-trap 헤파린 칼럼 (GE Healthcare) 및 역상 크로마토그래피 (reversed phase chromatography) (GraceVydac)를 이용하여 정제되었다. 이들 리간드는 동결 건조되고, 그리고 모든 세포 기초된 분석평가의 경우에 4mM HCl, pH 1에서 또는 모든 생물물리학적 분석평가의 경우에 10mM Na 아세테이트, pH 4에서 재-현탁되었다. 이들 중 일부는 안정적으로 형질 전환된 CHO 세포주에서 발현되었고 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 정제되었다. 노긴은 앞서 기술된 프로토콜에 기초하여 발현되고 정제되었다.

C2C12 세포에서 Smad-1 루시페라아제 분석평가. Smad1-의존성 루시페라아제 분석평가는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 수행되었다. 간단히 말하면, C2C12 근원세포 세포는 L-글루타민 및 항생제로 보충된 Dulbecco's minimum essential medium (DMEM) + 5% FBS에서 배양된다. 루시페라아제 리포터 분석평가를 위하여, 세포는 트립신 처리되고, PBS로 2회 세척되고, 그리고 DMEM + 0.1% FBS를 포함하는 48-웰 플레이트 내로 도말되었다. 루시페라아제 활성은 리간드로 자극후 24시간 후에 측정되고, 그리고 이들 값은 베타-갈락토시다아제 활성을 이용함으로써 형질전환 효율에 대하여 표준화되었다. 루시페라아제 리포터의 활성은 Smad 결합 도메인이 없는 -927Id1-루시페라아제 (Id1-Luc mut)를 이용함으로써 획득되는 대조 값 (control value)과 비교하여 배수적-유도 (fold-induction)로 표시된다. 이들 리간드의 Smad1 신호전달을 약화시키는 노긴의 능력을 조사하기 위하여, 루시페라아제 분석평가를 상기 기술된 바와 같이 반복하고, 설정된 용량의 Noggin을 분석에 포함시켰다. 도 3은 SAB704가 각각 15.6 nM 및 423.1 nM의 ED50을 기준으로 자연 BMP-7보다 약 30 배 더 높은 신호 전달 능력을 가지고 있음을 나타낸다. 도 4 (a)는 도 4 (b) 내지 4(i)에 도시된 ADAMTS5, COLX 및 MMP13을 포함하는 비대 유전자(hypertrophic gene)를 감소시키거나, 아그레칸(aggrecan) 및 COL2A1을 포함하는 연골-촉진 유전자 발현을 증가시킴으로써 이들 활성이 SAB704의 향상된 RNA-유도 활성과 관련됨을 나타낸다.

HEK293 세포에서 Smad-2 루시페라아제 분석평가. HEK293T 세포는 폴리리신으로 코팅된 24-웰 플레이트 내로 150,000 개 세포/웰의 밀도로 접종되었다. 24시간후, 세포는 하룻밤 동안, 제조업체의 권고에 따라 Perfectin 형질전환 시약(GenLantis)을 이용하여, A3 룩스 (Lux) (25 ng) 및 베타-갈락토시다아제(25 ng) 리포터 플라스미드의 혼합물, 전사 인자 FAST2 (50 ng), 그리고 빈 pCDNA3 벡터 (400 ng)로 형질전환되었다. 이후, 이들 세포는 16-24시간 동안 증가하는 용량의 액티빈-βA 또는 액티빈/BMP-2 키메라로 처리되었다. 이들 세포는 얼음으로 냉각된 용해 완충액 (1 mM 디티오트레이톨을 포함하는 25 mM 글리실글리신, 4 nM EGTA, 15 mM MgSO₄에서 1% Triton X-100)에서 수확되고, 그리고 표준 방법을 이용하여 루시페라아제 및 베타-갈락토시다아제 활성에 대하여 평가되었다. 공지된 TGF-베타 보조-수용체에 결합하는 키메라의 능력을 평가하기 위하여, HEK293T 세포는 증가하는 용량의 액티빈-βA 또는 액티빈/BMP-7 키메라로 처리되었다. 활성은 이후 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다.

AB204, SAB704, 및 SAB715의 노긴 비 민감성. 노긴은 리간드와 직접적으로 결합하고, 상기 리간드가 신호전달을 위한 그 자신의 수용체에 결합할 수 없도록 만듦으로써 신호전달 활성을 억제한다. 노긴의 존재에서 거의 배경 수준까지 차단되는 BMP-2과는 대조적으로, AB204, SAB704, 및 SAB715의 높은 신호 전달은 노긴에 의해 저해되지 않는다. 도 4는 노긴-민감 BMP2, 노긴-민감 BMP7, 노긴-비민감 AB204 또는 노긴-비민감 SAB704, 또는 SAB8715의 세포 활성을 나타낸다. 도 4(b)는 노긴에 대해 결합하지 않는 AB204와 비교하여 노긴에 대한 NAB204의 물리적 결합을 설명하기 위해 NAB204의 크기 배제 크로마토그래피 결과를 나타낸다. 이러한 물리적 결합은 AB204, SAB704, 및 SAB715의 신호전달 활성의 노긴-비민감성에 대한 직접적인 설명을 제공한다. 이러한 특성은 골 및 연골 재생을 비롯한 그들 사이의 시간 의존적 조합 혼합에 의해 in vivo 세포 신호 전달 능력을 조절하는데 특히 강력하다.

<110> JOINT CENTER FOR BIOSCIENCES <120> ACTIVIN/BMP7 CHIMERAS: SUPER-ACTIVE SAB704 and SAB715, and their respective NOGGIN-SENSITIZED variants, NAB704 and NAB715; and NAB204 <130> PP190068 <150> US 62/767,707 <151> 2018-11-15 <160> 42 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin A <400> 1 atgcaagcca aacacaaaca gcggaagcgt cttaagtcca gctgcaaaag gcaccctttg 60 tatgtggact tcagtgatgt ggggtggaat gactggatca ttgctccctc tggctatcat 120 gccaactact gcgacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180 catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240 gtcccgacca agctgagacc catgtccatg ttgtactatg atgatggtca aaacatcatc 300 aaaaaggaca ttcagaacat gatcgtggag gagtgtgggt gctca 345 <210> 2 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP2 <400> 2 atgcaagcca aacacaaaca gcggaagcgt cttaagtcca gctgcaaaag gcaccctttg 60 tatgtggact tcagtgatgt ggggtggaat gactggatca ttgctccctc tggctatcat 120 gccaactact gcgacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180 catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240 gtcccgacca agctgagacc catgtccatg ttgtactatg atgatggtca aaacatcatc 300 aaaaaggaca ttcagaacat gatcgtggag gagtgtgggt gctca 345 <210> 3 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1B2-BMP-7 <400> 3 atgcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60 tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggatta tcgcgcctga aggctacgcc 120 gcctactact gtgaggggga gtgtgccttc cctctgaact cctacatgaa cgccaccaac 180 cacgccatcg tgcagacgct ggtccacttc atcaacccgg aaacggtgcc caagccctgc 240 tgtgcgccca cgcagctcaa tgccatctcc gtcctctact tcgatgacag ctccaacgtc 300 atcctgaaga aatacagaaa catggtggtc cgggcctgtg gctgccac 348 <210> 4 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin A <400> 4 Met Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln 1 5 10 15 Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala 20 25 30 Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His 35 40 45 Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile 50 55 60 Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser 65 70 75 80 Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp 85 90 95 Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu 100 105 110 Glu Cys Gly Cys Ser 115 <210> 5 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP 2 <400> 5 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn 85 90 95 Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys 100 105 110 Gly Cys Arg 115 <210> 6 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP 7 <400> 6 Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro 1 5 10 15 Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser 20 25 30 Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe 35 40 45 Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala 50 55 60 Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met 65 70 75 80 Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn 85 90 95 Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala 100 105 110 Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys 115 120 125 Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135 140 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB204 <400> 7 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ser 115 <210> 8 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NAB204 <400> 8 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 35 40 45 Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys 65 70 75 80 Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly 85 90 95 Gln Asn Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ser 115 <210> 9 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SAB704 <400> 9 Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro 1 5 10 15 Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser 20 25 30 Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe 35 40 45 Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His 50 55 60 Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met 65 70 75 80 Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn 85 90 95 Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro 100 105 110 Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp 115 120 125 Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 130 135 140 <210> 10 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NAB704 <400> 10 Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro 1 5 10 15 Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser 20 25 30 Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe 35 40 45 Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His 50 55 60 Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met 65 70 75 80 Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn 85 90 95 Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro 100 105 110 Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Val Ile Leu Lys Lys 115 120 125 Tyr Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 130 135 140 <210> 11 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SAB715 <400> 11 Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro 1 5 10 15 Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser 20 25 30 Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe 35 40 45 Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His 50 55 60 Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met 65 70 75 80 Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn 85 90 95 Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala 100 105 110 Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp 115 120 125 Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 130 135 140 <210> 12 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NAB715 <400> 12 Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro 1 5 10 15 Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser 20 25 30 Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe 35 40 45 Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His 50 55 60 Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met 65 70 75 80 Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn 85 90 95 Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala 100 105 110 Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Gly Gln Asn Val Ile Leu Lys Asn 115 120 125 Tyr Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser 130 135 140 <210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1B2BMP7 <400> 13 Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys 1 5 10 15 Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp 20 25 30 Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 35 40 45 Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val 50 55 60 Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys 65 70 75 80 Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp 85 90 95 Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala 100 105 110 Cys Gly Cys His 115 <210> 14 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-2 <400> 14 Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg 1 5 10 15 His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile 20 25 30 Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 35 40 45 Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln 50 55 60 Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val 65 70 75 80 Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu 85 90 95 Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly 100 105 110 Cys Arg <210> 15 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-3 (osteogenin) <400> 15 Gln Trp Ile Glu Pro Arg Asn Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp 1 5 10 15 Phe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe 20 25 30 Asp Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gln Phe Pro Met Pro Lys Ser 35 40 45 Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val 50 55 60 Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Glu Lys Met 65 70 75 80 Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys Asn Val Val Leu 85 90 95 Lys Val Tyr Pro Asn Met Thr Val Glu Ser Cys Ala Cys Arg 100 105 110 <210> 16 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-4(BMP-2b) <400> 16 Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp 20 25 30 Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp 35 40 45 Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile 50 55 60 Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu 85 90 95 Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu Gly 100 105 110 Cys Gly Cys Arg 115 <210> 17 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-5 <400> 17 Ala Ala Asn Gln Asn Arg Asn Lys Ser Ser Ser His Gln Asp Ser Ser 1 5 10 15 Arg Met Ser Ser Val Gly Asp Tyr Asn Thr Ser Glu Gln Lys Gln Ala 20 25 30 Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln 35 40 45 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Asp Gly 50 55 60 Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala 65 70 75 80 Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Phe Pro Asp His Val Pro Lys 85 90 95 Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe 100 105 110 Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val 115 120 125 Arg Ser Cys Gly Cys His 130 <210> 18 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-6(Vgr-1) <400> 18 Gln Gln Ser Arg Asn Arg Ser Thr Gln Ser Gln Asp Val Ala Arg Val 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg 20 25 30 Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp 35 40 45 Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 50 55 60 Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val 65 70 75 80 Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys 85 90 95 Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp 100 105 110 Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala 115 120 125 Cys Gly Cys His 130 <210> 19 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-7(OP-1) <400> 19 Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys 1 5 10 15 Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser 20 25 30 Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala 50 55 60 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro 85 90 95 Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 20 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-8(OP-2) <400> 20 Ala Val Arg Pro Leu Arg Arg Arg Gln Pro Lys Lys Ser Asn Glu Leu 1 5 10 15 Pro Gln Ala Asn Arg Leu Pro Gly Ile Phe Asp Asp Val His Gly Ser 20 25 30 His Gly Arg Gln Val Cys Arg Arg His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln 35 40 45 Asp Leu Gly Trp Leu Asp Trp Val Ile Ala Pro Gln Gly Tyr Ser Ala 50 55 60 Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asp Ser Cys Met Asn 65 70 75 80 Ala Thr Asn His Ala Ile Leu Gln Ser Leu Val His Leu Met Lys Pro 85 90 95 Asn Ala Val Pro Lys Ala Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Ser Ala Thr 100 105 110 Ser Val Leu Tyr Tyr Asp Ser Ser Asn Asn Val Ile Leu Arg Lys His 115 120 125 Arg Asn Met Val Val Lys Ala Cys Gly Cys His 130 135 <210> 21 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-9(GDF-2) <400> 21 Ser Ala Gly Ala Gly Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn 1 5 10 15 Phe Glu Asp Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr 20 25 30 Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp 35 40 45 Val Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Lys 50 55 60 Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser 65 70 75 80 Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp Met Gly Val Pro Thr Leu Lys 85 90 95 Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala Glu Cys Gly Cys Arg 100 105 110 <210> 22 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-10 <400> 22 Asn Ala Lys Gly Asn Tyr Cys Lys Arg Thr Pro Leu Tyr Ile Asp Phe 1 5 10 15 Lys Glu Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Pro Gly Tyr Glu 20 25 30 Ala Tyr Glu Cys Arg Gly Val Cys Asn Tyr Pro Leu Ala Glu His Leu 35 40 45 Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Ile Gln Ala Leu Val His Leu Lys Asn 50 55 60 Ser Gln Lys Ala Ser Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro 65 70 75 80 Ile Ser Ile Leu Tyr Leu Asp Lys Gly Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys 85 90 95 Tyr Glu Gly Met Ala Val Ser Glu Cys Gly Cys Arg 100 105 <210> 23 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP-15(GDF-9b) <400> 23 Gln Ala Asp Gly Ile Ser Ala Glu Val Thr Ala Ser Ser Ser Lys His 1 5 10 15 Ser Gly Pro Glu Asn Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Ile Ser 20 25 30 Phe Arg Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro Pro Phe Tyr 35 40 45 Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Thr Cys Leu Arg Val Leu Arg Asp Gly 50 55 60 Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Ile Asn Gln Leu 65 70 75 80 Val Asp Gln Ser Val Pro Arg Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Val 85 90 95 Pro Ile Ser Val Leu Met Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile Leu Tyr Lys 100 105 110 Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Glu Ser Cys Thr Cys Arg 115 120 125 <210> 24 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-1 <400> 24 Asp Ala Glu Pro Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Ala Cys Arg Ala 1 5 10 15 Arg Arg Leu Tyr Val Ser Phe Arg Glu Val Gly Trp His Arg Trp Val 20 25 30 Ile Ala Pro Arg Gly Phe Leu Ala Asn Tyr Cys Gln Gly Gln Cys Ala 35 40 45 Leu Pro Val Ala Leu Ser Gly Ser Gly Gly Pro Pro Ala Leu Asn His 50 55 60 Ala Val Leu Arg Ala Leu Met His Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala Asp 65 70 75 80 Leu Pro Cys Cys Val Pro Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Phe 85 90 95 Phe Asp Asn Ser Asp Asn Val Val Leu Arg Gln Tyr Glu Asp Met Val 100 105 110 Val Asp Glu Cys Gly Cys 115 <210> 25 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-3(Vgr-2) <400> 25 Ala Ala Ile Pro Val Pro Lys Leu Ser Cys Lys Asn Leu Cys His Arg 1 5 10 15 His Gln Leu Phe Ile Asn Phe Arg Asp Leu Gly Trp His Lys Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Gly Phe Met Ala Asn Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro 35 40 45 Phe Ser Leu Thr Ile Ser Leu Asn Ser Ser Asn Tyr Ala Phe Met Gln 50 55 60 Ala Leu Met His Ala Val Asp Pro Glu Ile Pro Gln Ala Val Cys Ile 65 70 75 80 Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Met Leu Tyr Gln Asp Asn Asn Asp 85 90 95 Asn Val Ile Leu Arg His Tyr Glu Asp Met Val Val Asp Glu Cys Gly 100 105 110 Cys Gly <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-5(BMP-14) <400> 26 Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys 1 5 10 15 Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly 20 25 30 Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys 35 40 45 Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60 His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr 65 70 75 80 Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu 85 90 95 Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met 100 105 110 Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 27 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-6(BMP-13) <400> 27 Thr Ala Phe Ala Ser Arg His Gly Lys Arg His Gly Lys Lys Ser Arg 1 5 10 15 Leu Arg Cys Ser Lys Lys Pro Leu His Val Asn Phe Lys Glu Leu Gly 20 25 30 Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Tyr His Cys 35 40 45 Glu Gly Val Cys Asp Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60 His Ala Ile Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Gly Ser Thr 65 70 75 80 Pro Pro Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Thr Pro Ile Ser Ile Leu 85 90 95 Tyr Ile Asp Ala Gly Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met 100 105 110 Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 28 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-7(BMP-12) <400> 28 Thr Ala Leu Ala Gly Thr Arg Thr Ser Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ala 1 5 10 15 Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys Pro 20 25 30 Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala 35 40 45 Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys Asp Phe Pro 50 55 60 Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile Gln Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys Cys Val Pro 85 90 95 Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asn Asn 100 105 110 Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys 115 120 125 Arg <210> 29 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-8(Myostatin) <400> 29 Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45 Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 30 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-9 <400> 30 Gly Gln Glu Thr Val Ser Ser Glu Leu Lys Lys Pro Leu Gly Pro Ala 1 5 10 15 Ser Phe Asn Leu Ser Glu Tyr Phe Arg Gln Phe Leu Leu Pro Gln Asn 20 25 30 Glu Cys Glu Leu His Asp Phe Arg Leu Ser Phe Ser Gln Leu Lys Trp 35 40 45 Asp Asn Trp Ile Val Ala Pro His Arg Tyr Asn Pro Arg Tyr Cys Lys 50 55 60 Gly Asp Cys Pro Arg Ala Val Gly His Arg Tyr Gly Ser Pro Val His 65 70 75 80 Thr Met Val Gln Asn Ile Ile Tyr Glu Lys Leu Asp Ser Ser Val Pro 85 90 95 Arg Pro Ser Cys Val Pro Ala Lys Tyr Ser Pro Leu Ser Val Leu Thr 100 105 110 Ile Glu Pro Asp Gly Ser Ile Ala Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile 115 120 125 Ala Thr Lys Cys Thr Cys Arg 130 135 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-10(BMP-3b) <400> 31 Lys Thr Met Gln Lys Ala Arg Arg Lys Gln Trp Asp Glu Pro Arg Val 1 5 10 15 Cys Ser Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Asn 20 25 30 Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr Cys Ala Gly 35 40 45 Ala Cys Glu Phe Pro Met Pro Lys Ile Val Arg Pro Ser Asn His Ala 50 55 60 Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Ile Ile Pro Gly Ile Pro 65 70 75 80 Glu Pro Cys Cys Val Pro Asp Lys Met Asn Ser Leu Gly Val Leu Phe 85 90 95 Leu Asp Glu Asn Arg Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro Asn Met Ser 100 105 110 Val Asp Thr Cys Ala Cys Arg 115 <210> 32 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-11(BMP-11) <400> 32 Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys 1 5 10 15 Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu 35 40 45 Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala 50 55 60 Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80 Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly 85 90 95 Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 33 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GDF-15 <400> 33 Ala Arg Asn Gly Asp Asp Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Glu Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 <210> 34 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nodal <400> 34 His His Leu Pro Asp Arg Ser Gln Leu Cys Arg Lys Val Lys Phe Gln 1 5 10 15 Val Asp Phe Asn Leu Ile Gly Trp Gly Ser Trp Ile Ile Tyr Pro Lys 20 25 30 Gln Tyr Asn Ala Tyr Arg Cys Glu Gly Glu Cys Pro Asn Pro Val Gly 35 40 45 Glu Glu Phe His Pro Thr Asn His Ala Tyr Ile Gln Ser Leu Leu Lys 50 55 60 Arg Tyr Gln Pro His Arg Val Pro Ser Thr Cys Cys Ala Pro Val Lys 65 70 75 80 Thr Lys Pro Leu Ser Met Leu Tyr Val Asp Asn Gly Arg Val Leu Leu 85 90 95 Asp His His Lys Asp Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Leu 100 105 110 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin-bA <400> 35 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe 1 5 10 15 Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile 35 40 45 Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn 50 55 60 His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95 Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu 100 105 110 Cys Gly Cys Ser 115 <210> 36 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin-bB <400> 36 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe 1 5 10 15 Phe Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu 35 40 45 Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn 50 55 60 Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys 65 70 75 80 Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu 85 90 95 Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ala 115 <210> 37 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin-bC <400> 37 Gly Ile Asp Cys Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe 1 5 10 15 Phe Val Asp Phe Arg Glu Ile Gly Trp His Asp Trp Ile Ile Gln Pro 20 25 30 Glu Gly Tyr Ala Met Asn Phe Cys Ile Gly Gln Cys Pro Leu His Ile 35 40 45 Ala Gly Met Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn 50 55 60 Leu Leu Lys Ala Asn Thr Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ser Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg 85 90 95 Asp Ser Asn Ile Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala 100 105 110 Cys Gly Cys Ser 115 <210> 38 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Activin-bE <400> 38 Thr Pro Thr Cys Glu Pro Ala Thr Pro Leu Cys Cys Arg Arg Asp His 1 5 10 15 Tyr Val Asp Phe Gln Glu Leu Gly Trp Arg Asp Trp Ile Leu Gln Pro 20 25 30 Glu Gly Tyr Gln Leu Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Pro Pro His Leu 35 40 45 Ala Gly Ser Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Ser Ala Val Phe Ser 50 55 60 Leu Leu Lys Ala Asn Asn Pro Trp Pro Ala Ser Thr Ser Cys Cys Val 65 70 75 80 Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Asp His Asn Gly 85 90 95 Asn Val Val Lys Thr Asp Val Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly 100 105 110 Cys Ser <210> 39 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Inhibin-a <400> 39 Ser Thr Pro Leu Met Ser Trp Pro Trp Ser Pro Ser Ala Leu Arg Leu 1 5 10 15 Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala His Ala Asn Cys His Arg 20 25 30 Val Ala Leu Asn Ile Ser Phe Gln Glu Leu Gly Trp Glu Arg Trp Ile 35 40 45 Val Tyr Pro Pro Ser Phe Ile Phe His Tyr Cys His Gly Gly Cys Gly 50 55 60 Leu His Ile Pro Pro Asn Leu Ser Leu Pro Val Pro Gly Ala Pro Pro 65 70 75 80 Thr Pro Ala Gln Pro Tyr Ser Leu Leu Pro Gly Ala Gln Pro Cys Cys 85 90 95 Ala Ala Leu Pro Gly Thr Met Arg Pro Leu His Val Arg Thr Thr Ser 100 105 110 Asp Gly Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Leu Leu Thr 115 120 125 Gln His Cys Ala Cys Ile 130 <210> 40 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b1 <400> 40 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu 50 55 60 Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 41 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b2 <400> 41 Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys 1 5 10 15 Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser 65 70 75 80 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro 85 90 95 Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110 <210> 42 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF-b3 <400> 42 Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys 1 5 10 15 Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp 20 25 30 Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys 35 40 45 Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu 50 55 60 Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro 85 90 95 Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser 100 105 110

Claims (22)

1. 2개 이상의 펩타이드 분절을 포함하고 함유하는 재조합 폴리펩타이드로서,
   상기 폴리펩타이드의 제 1 분절(segment)은 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질에 90 % 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하고 및 제 2 펩타이드 분절은 제 2 TGF-베타 패밀리 단백질에 90% 이상의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것으로, 상기 두 분절은 작동가능하게 연결되고, 제 1 또는 제 2 부모 TGF-베타 패밀리 단백질(parental TGF-beta family protein) 중 적어도 둘 이상의 활성을 갖거나, 또는 새로운 in vivo 신호전달 활성 및 세포 특성의 활성을 갖는 것으로, 2 개 이상의 폴리펩타이드 분절은 N-말단에서 C-말단으로 작동가능하게 연결된 6개의 펩타이드 분절을 포함하고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로(pathway)를 조절하는 것인, 재조합 폴리펩타이드.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 BMP-2로부터 유래한 N-말단 분절 1을 포함하는 것으로, 2 개 이상의 폴리펩타이드 분절은 N-말단에서 C-말단으로 작동가능하게 연결되는 6개의 펩타이드 분절을 포함하는 것인, 재조합 폴리펩타이드.
   
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질은 BMP-2이고 및 상기 제 2 TGF-베타 패밀리 단백질은 액티빈 또는 다른 패밀리 구성원인 것으로, 각각의 분절은 상기 두 TGF-베타 패밀리 단백질의 공통(common) 분절의 구조적 모티프에 상응하는 것으로, 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로를 조절하는 것인, 재조합 폴리펩타이드.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 BMP-7로부터 유래한 N-말단 분절 1을 포함하는 것으로, 2 개 이상의 폴리펩타이드 분절은 N-말단에서 C-말단으로 작동가능하게 연결되는 6 개의 펩타이드 분절을 포함하는 것인, 재조합 폴리펩타이드.
   
5. 제 1 항 및 제 4 항에 있어서, 상기 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질은 BMP-7 이고 및 상기 제 2 TGF-베타 패밀리 단백질은 액티빈 또는 다른 패밀리 구성원인 것으로, 각각의 분절은 상기 두 TGF-베타 패밀리 단백질의 공통(common) 분절의 구조적 모티프에 상응하는 것으로, 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로를 조절하는 것인, 재조합 폴리펩타이드.
   
6. 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 BMP-7으로부터 유래한 분절 1, 3, 및 4 와 액티빈으로부터 유래한 분절 2, 5, 및 6은 SAB704를 제조하기 위해 작동가능하게 연결되는 것이고, 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로를 조절하는 것인, 재조합 폴리펩타이드.
   
7. 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 BMP-7으로부터 유래한 분절 1, 3, 4, 및 5와 액티빈으로부터 유래한 분절 2 및 6은 SAB715를 제조하기 위해 작동가능하게 연결되는 것이고, 상기 폴리펩타이드는 SMAD 경로를 조절하는 것인, 재조합 폴리펩타이드.
   
8. SMAD-조절 활성을 갖는 키메라(chimeric) 폴리펩타이드를 제공하기 위하여 제 2 TGF-베타 패밀리 단백질의 분절에 작동가능하게 연결된 제 1 TGF-베타 패밀리 단백질의 분절을 포함하는 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩타이드로서, 각각의 분절은 상기 두 TGF-베타 패밀리 단백질의 공통 분절의 구조적 모티프에 상응하는 것인, 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩타이드.
   
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드의 서열 변이체로서, 노긴 결합 능력을 조절하여 AB204로부터는 NAB204, SAB704로부터는 NAB704, 또는 SAB715로부터는 NAB715를 제조하기 위해 6개의 아미노산 길이의 노긴 민감자 서열이 상기 폴리펩타이드의 구조적으로 동등한 영역을 대체하는 것인, 서열 변이체.
   
10. TGF-베타 슈퍼패밀리의 폴리펩타이드의 서열 변이체로서, 노긴-민감성-(NS-) 서열은 관련된 서브 패밀리 서열로부터 유래된 6 개 아미노산 길이의 노긴-감작 서열을 사용하여 도입되어 이러한 키메라 예로서 NS-액티빈(액티빈으로부터)과 같은 노긴-민감성 형태를 생성할 수 있으며, 또는 노긴-민감성-(NS-) 서열은 동일한 6 개 아미노산 길이의 노긴-감작 서열을 관련 서브 패밀리 서열에서 유래된 노긴-비민감-(NIS-) 서열로 대체하여 제거하여 이러한 키메라 예로서 BMP2로부터 NIS-BMP2를 생성할 수 있는, 서열 변이체.
    
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide).
    
12. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 in vivo 세포 활성을 조절하기 위해 이들 리간드의 조합 시간-의존적 혼합(combinatorial time-dependent mix)에 의한 골 및 연골 재생을 비롯한, SMAD-조절 활성을 갖는 기능적 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하도록 작동가능하게 연결된 복수의 TGF-베타 패밀리 폴리뉴클레오타이드로부터의 서열을 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
    
13. 제 11 항 또는 제 12 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
    
14. 제 13 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
    
15. 제 11 항, 제 12 항 또는 제 13 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
    
16. 다음의 단계를 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
    (a) 2 개 이상의 TGF-베타 패밀리 구성원 단백질 서열을 정렬하는 단계;
    (b) 2개의 패밀리 단백질의 6개의 구조적으로 관련된 분절을 확인하는 단계;
    (c) 5개 이상의 연속 아미노산에 걸쳐 90 % 이상의 서열 동일성과 구조적으로 관련된 말단에서의 분절을 포함하는 2 개의 TGF-베타 단백질의 교차점(points of cross-over)을 확인하는 단계; 및
    (d) BMP로부터 제 2 TGF-베타 패밀리 구성원 단백질로 적어도 분절 1을 포함하는 키메라 TGF-베타 폴리펩타이드를 생산하는 단계로서, 상기 분절은 교차점(points of cross-over)에서 순차적으로 연결되어 하나의 이러한 키메라 예로 1B2-BMP7을 생성하는 것인, 단계.
    
17. 제 16 항의 방법으로부터 생산된 키메라 폴리펩타이드.
    
18. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 SMAD 경로와 연관된 세포 증식 또는 활성을 조절하는 방법.
    
19. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드와 조직을 접촉시키는 단계를 포함하는 골, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 골격근 또는 내분비 조직과 연관된 질병 또는 질환을 치료하는 방법.
    
20. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드와 세포 증식 질병 또는 질환을 갖는 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 증식성 질병 또는 질환의 치료 방법.
    
21. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 골, 연골, 신경 조직, 심장 조직, 골격근 또는 내분비 조직과 연관된 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
    
22. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 포함하는 세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
    

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