KR102404717B1 - Tgf-베타 슈퍼패밀리의 ab6 패밀리 디자이너 리간드 - Google Patents

Abstract

TGF-베타 패밀라 구성원에 의해 제공된 활성을 가진 비자연적으로 발생한 키메라 폴리펩티드가 개시되어있다. 일 실시예의 키메라 폴리펩티드는 작동 가능하게 연결된 부모 TGF-베타 단백질로부터 2개 이상의 도메인 또는 단편들을 포함하며, 그 결과 폴리펩티드는 TGF-베타 패밀리 구성원과 관련된 경로를 수정할 수 있는 능력을 가진다. 일 실시예에서, 상기 경로는 SMAD 또는 DAXX 경로이다.

Description

TGF-베타 슈퍼패밀리의 AB6 패밀리 디자이너 리간드

본 발명은 TGF-베타 활성을 가진 키메라 폴리펩티드, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 폴리펩티드를 생산하는 숙주 세포에 관한 것이다.

액티빈 및 골 형성 단백질들(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) 은 수많은 TGF-β 리간드라고도 불리는 리간드들의 형질전환 성장 인자-베타(Transforming Growth Factor-beta, TGF-β) 슈퍼패밀리의 구성원이다. TGF-β 리간드는 수많은 발달 과정 및 세포 과정에 널리 관여하기 때문에 큰 관심을 받고 있다.

TGF-β 리간드가 치료학적 도구로서 성공적으로 사용되기 위해, 몇 가지 장애물을 극복해야 한다. TGF-β의 특성들을 특이적으로 수정하고 변형시키는 것뿐만 아니라, 상당한 양의 리간드를 생성하는 것이 필요하다.

1. 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 도메인의 아미노산 잔기들을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 키메라 폴리펩티드로서, 상기 제1 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 X_1b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 1 내지 X_1aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 1 내지 X_1ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 1 내지 X_1ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 1 내지 X_1ae로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 제2 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_1b 내지 X_2b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_1aa 내지 X_2aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_1ab 내지 X_2ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_1ac 내지 X_2ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_1ae 내지 X_2ae로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제3 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_2b 내지 X_3b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_2aa 내지 X_3aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_2ab 내지 X_3ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_2ac 내지 X_3ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_2ae 내지 X_3ae로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제4 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_3b 내지 X_4b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_3aa 내지 X_4aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_3ab 내지 X_4ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_3ac 내지 X_4ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_3ae 내지 X_4ae로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제5 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_4b 내지 X_5b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_4aa 내지 X_5aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_4ab 내지 X_5ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_4ac 내지 X_5ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_4ae 내지 X_5ae으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 제6 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_5b 내지 X_6b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_5aa 내지 X_6aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_5ab 내지 X_6ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_5ac 내지 X_6ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_5ae 내지 X_6ae으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 X_1b-는 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52이고; X_2b는 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70이고; X_3b는 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 또는 88이고; X_4b는 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 또는 103이고; X_5b는 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 또는 115이고; X_6b는 130, 131 또는 132이고; X_1aa는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31이고; X_2aa는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51이고; X_3aa는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74이고; X_4aa는 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87이고; X_5aa는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100이고; X_6aa는 114, 115 또는 116이고; X_1ab는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31이고; X_2ab는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51이고; X_3ab는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74이고; X_4ab는 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 또는 86이고; X_5ab는 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99이고; X_6ab는 113, 114 또는 115이고; X_1ac는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31이고; X_2ac는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51이고; X_3ac는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74이고; X_4ac는 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87이고; X_5ac는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100이고; X_6ac는 114, 115 또는 116이고; X_1ae는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31이고; X_2ae는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51이고; X_3ae는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74이고; X_4ae는 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 85이고; X_5ae는 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 또는 98이고; X_6ae는 112, 113 또는 114이고; 상기 키메라 폴리펩티드는 하나 이상의 형질전환 성장 인자-베타(Transforming Growth Factor-beta, TGF-β) 슈퍼패밀리 구성원; 또는 하나 이상의 TGF-β 수용체와 결합할 수 있는, 키메라 폴리펩티드

2. 위 1에 있어서, 상기 폴리펩티드의 서열은 알고리즘 1n2n3n4n5n6n에 의해 기술되며, 상기 1n, 2n, 3n, 4n, 5n 및 6n은 각각 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 도메인을 나타내며; 상기 n은 a 또는 b이고, 상기 a는 서열번호 2의 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 나타내고; 상기 b는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래된 아미노산 서열을 나타내는, 키메라 폴리펩티드.

3. 위 2에 있어서, 상기 폴리펩티드의 서열은 알고리즘 1b2a3b4b5a6a에 의해 기술되는, 키메라 폴리펩티드.

4. 위 1에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 47을 포함하고; 상기 제2 도메인은 서열번호 4의 아미노산 잔기 28 내지 45를 포함하고; 상기 제3 도메인은 서열번호 2의 아미노산 잔기 66 내지 85를 포함하고; 상기 제4 도메인은 서열번호 2의 아미노산 잔기 86 내지 99를 포함하고; 상기 제5 도메인은 서열번호 4의 아미노산 잔기 84 내지 95를 포함하고; 상기 제6 도메인은 서열번호 4의 아미노산 잔기 96 내지 116을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.

5. 위 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 12에 기재된 서열을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.

6. 위 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 12에 기재된 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 키메라 폴리펩티드.

7. 위 1에 있어서, 상기 키메라 폴리펩티드는 상기 제1 도메인, 상기 제2 도메인, 상기 제3 도메인, 상기 제4 도메인, 상기 제5 도메인 및 상기 제6 도메인을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는, 키메라 폴리펩티드.

8. 위 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7의 키메라 폴리펩티드의 호모-다이머.

9. 위 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7의 키메라 폴리펩티드의 헤테로-다이머.

일 실시예의 키메라 폴리펩티드는 효율적으로 리폴딩될 수 있고, 고수율로 생산될 수 있다.

일 실시예의 키메라 폴리펩티드는 단독으로 또는 약학적으로 허용되는 담체와 조합되어 간 질환 치료에 사용될 수 있다.

일 실시예의 키메라 폴리펩티드는 단독으로 또는 약학적으로 허용되는 담체와 조합되어 골 또는 연골 질환 치료에 사용될 수 있다.

도 1은 TGF-베타 슈퍼패밀리에서 2개의 상이한 리간드들의 도메인을 이용하여 AB604와 같은 액티빈/BMP-6 키메라를 생성하기 위한 일 실시예에 사용된 전략을 나타낸다.
도 2는 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원들의 서열 비교를 나타낸다.
도 3은 BMP-2, 3, 6 및 7의 리폴딩 효율을 나타낸다.
도 4는 추정 교차 점들로 확인된 BMP-6와 액티빈의 서열 동일성을 갖는 부분을 나타낸 것이다.
도 5는 AB604의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 6은 봉입체 내에서 AB604가 모노머로 존재한다는 것을 나타내는 AB604의 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
도 7은 정제된 액티빈/BMP-6 키메라가 이황화결합된 다이머라는 것을 나타내는 환원 및 비환원 SDS-PAGE를 도시한다.
도 8은 AB604, BMP-2 및 BMP-6의 Smad-1 신호 활성의 비교를 나타낸다.
도 9는 AB604 및 AB204의 Smad-1 신호 활성의 비교를 나타낸다.
도 10은 AB604의 Smad-2 신호 활성을 나타낸다.
도 11은 BMP6에 의한 TGFβ1의 신호 활성의 억제를 나타낸다.
도 12는 TGFβ1 3.0 ng/ml의 존재 하에 BMP6에 의한 TGFβ1의 신호 활성의 억제를 나타낸 것이다.
도 13은 AB604에 의한 TGFβ1의 신호 활성의 억제를 나타낸 것이다.
도 14는 TGFβ1 3.0 ng/ml의 존재 하에 AB604에 의한 TGFβ1의 신호 활성의 억제를 나타낸 것이다.
도 15는 노긴(noggin)에 의한 BMP2, BMP6 또는 AB604 활성의 억제를 나타낸다.
도 16은 BMP6 및 AB604에 의한 헵시딘(hepcidin) 발현 조절의 비교를 나타낸 것이다.
도 17은 BMP6 및 AB604에 의한 헵시딘(hepcidin) 유전자 발현을 용량 의존성 프로파일의 비교를 나타낸다.
도 18은 AB604, TGFβ1 및 BMP6에 의한 SMAD1/5/8 인산화의 비교를 나타낸 것이다.
도 19는 AB604, TGFβ1 및 BMP6에 의한 SMAD2 인산화의 비교를 나타낸 것이다.

일 실시예는 TGF-베타 패밀리 구성원에 의해 제공된 활성을 가진 비자연적으로 발생한 키메라 폴리펩티드를 제공한다. 일 실시예의 키메라 폴리펩티드는 작동 가능하게 연결된 부모 TGF-베타 단백질로부터 2개 이상의 도메인 또는 단편들을 포함하며, 그 결과 폴리펩티드는 TGF-베타 패밀리 구성원과 관련된 경로를 수정할 수 있는 능력을 가진다. 일 실시예에서, 상기 경로는 SMAD 또는 DAXX(Death-associated protein 6) 경로이다.

본 발명의 일 실시예는 새로운 리간드(예를 들어, 디자이너 리간드)를 구성하기 위해 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드들의 상이한 도메인들을 선택하고 결합함으로써 합성될 수 있는 디자이너 TGF-베타 리간드를 제공한다. 이러한 신규 키메라 리간드는 자연적으로 존재하는 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드와는 완전히 다른 신규 단백질 서열 라이브러리를 보유한다. 이러한 접근은 주로 천연 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 사이에서 구조적 공통성의 인식에서 비롯된다. 모든 ~40 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드들은 단백질의 각 부분의 공통적인 특징들과 전반적으로 동일한 건축을 공유한다. TGF-베타 리간드들의 골격은 모든 슈퍼패밀리 구성원이 공유하는 (일반적으로) 6개 도메인으로 구분할 수 있다.

본 발명의 일 실시예는 적어도 두 개의 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 제공한다: 폴리펩티드의 제1 도메인은 제1 TGF-베타 패밀리 단백질과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 제2 도메인은 제2 TGF-베타 패밀리 단백질과 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 도메인들은 작동 가능하게 연결되어 있고, 제1 또는 제2 부모 TGF-베타 패밀리 단백질 중 적어도 하나의 활성을 가진다. 일 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 N-말단이 작동 가능하게 C-말단에 연결된 6개의 도메인들을 포함한다. 일 실시예에서, 제1 및 제2 TGF-베타 패밀리 단백질 각각은 구조적 유사성을 가지고, 각 도메인은 구조적 모티프가 일치한다. 일 실시예에서, 제1 TGF-베타 패밀리 단백질은 BMP-6이고, 제2 TGF-베타 패밀리 단백질은 액티빈(activin)이다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 BMP-6의 N-말단 도메인을 포함한다.

일 실시예에서, BMP-6, 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC 및 액티빈-βE의 도메인들은 표 1에 도시된 바와 같고, 상기 키메라 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단 방향으로 도메인 1-도메인 2-도메인 3-도메인 4-도메인 5-도메인 6의 순서를 가진다.

본 발명의 일 실시예는 서열번호 12에 기재된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 제공하고, 상기 폴리펩티드는 SMAD 또는 DAXX 경로를 조절한다.

본 발명의 일 실시예는 SMAD 또는 DAXX 조절 활성을 가진 키메라 폴리펩티드를 제공하기 위해 상이한 제2 TGF-베타 패밀리 단백질의 도메인과 작동 가능하게 연결된 제1 TGF-베타 패밀리 단백질의 도메인을 포함하는 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 제공한다. 일 실시예에서, 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 서열번호 12에 기재된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 포함하고, 상기 폴리펩티드는 SMAD 또는 DAXX 경로를 조절한다.

본 발명의 일 실시예는 일 실시예의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일 실시예에서, 폴리펩티드는 서열번호 11에 기재된 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는다. 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또한 재조합 세포와 함께 제공된다.

본 발명의 일 실시예는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 신규 리간드를 제공하며, 상기 각 리간드는 TGF-베타 슈퍼패밀리의 외래 또는 상이한 구성원의 6개 도메인 중 적어도 하나를 갖는 키메라 단백질이다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 단수 형태들은 문맥에서 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "도메인"에 대한 언급은 복수의 이러한 도메인들을 포함하고, "단백질"에 대한 언급은 하나 이상의 단백질들 등을 포함한다.

또한, 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미한다. 유사하게, "포함한다", "포함하다", "포함하는" 및 "포함"은 상호교환될 수 있고, 제한하려는 것은 아니다.

다양한 실시예들에 대한 설명에서 사용되는 용어 "포함하는"에 대해 당업자는 몇몇의 특정 예에서, 일 실시예가 "본질적으로 구성되는" 또는 "구성되는" 용어를 이용하여 대체되어 설명될 수 있음을 이해할 수 있다.

비록 본원에 기술된 것들과 동일하거나 유사한 방법들과 재료들이 개시된 방법 및 조성물의 실시에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및 재료들이 본원에 기술되어 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 개시물이 속한 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 이해될 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 따라서, 본 출원서 전반에 걸쳐 사용된 하기 용어들은 하기와 같은 의미를 가질 수 있다.

"아미노산"은 중심 탄소 원자(알파-탄소 원자)가 수소 원자, 카르복실산 그룹(카르복실산의 탄소 원자는 본원에서 "카르복실 탄소 원자"로 언급됨), 아미노 그룹(아미노 그룹의 질소 원자는 본원에서 "아미노 질소 원자"로 언급됨) 및 곁사슬 그룹인 R과 연결되는 구조를 갖는 분자이다. 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에 혼입되는 경우, 아미노산은 하나의 아미노산이 다른 아미노산과 연결되는 탈수 반응에서 아미노산 카르복실 그룹의 하나 이상의 원자들이 소실된다. 결과적으로, 단백질에 혼입될 때, 아미노산은 "아미노산 잔기"로 언급된다.

"단백질" 또는 "폴리펩티드"는 둘이 상의 개별 아미노산들(자연적으로 발생한 것이든 아니든)이 펩티드 결합을 통해 연결된 임의의 중합체를 지칭하며, 하나의 아미노산(또는 아미노산 잔기)의 알파-탄소에 연결된 카르복실산의 카르복실 탄소 원자가 인접 아미노산의 -탄소에 연결된 아미노 그룹의 아미노 질소 원자에 공유적으로 결합될 때, 생성된다. 용어 "단백질"은 "폴리펩티드" 및 "펩티드"(본원에서 때로는 상호교환적으로 사용될 수 있음)라는 용어의 의미를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 다중 폴리펩티드 소단위(예를 들어, DNA 중합효소 III, RNA 중합효소 II) 또는 다른 성분들(예를 들어, 텔로머라제에서 발생되는 RNA 분자)을 포함하는 단백질들은 본원에서 사용된 "단백질"의 의미를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 유사하게, 단백질 및 폴리펩티드의 단편 또한 본 발명의 범위에 속하며, "단백질"로서 본원에서 언급될 수 있다. 일 실시예의 일 측면에서, 폴리펩티드는 둘 이상의 부모 도메인의 키메라를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원은 임의의 종, 특히 소, 양, 돼지, 쥐, 말 및 사람을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 포유류의 TGF-베타 슈퍼패밀리(골 형성 인자들을 포함) 유전자 또는 단백질을 의미한다. "TGF-베타 슈퍼패밀리 폴리펩티드"는 임의의 종, 특히 소, 양, 돼지, 쥐, 말 및 사람을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 포유류 및 천연, 합성, 반합성 또는 재조합과 같이 임의의 공급원으로부터 얻어진 정제된 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 아미노산 서열을 의미한다.

주어진 단백질(예를 들어, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 쓰여질 때, 폴리펩티드의 "1차 구조")의 특정 아미노산 서열은 유전 정보, 일반적인 유전체 DNA(세포 소기관 DNA를 포함, 예를 들어, 미토콘드리아 또는 엽록체 DNA)에 의해 차례로 구체화되는 mRNA의 코딩 부분의 뉴클레오티드 서열에 의해 결정된다. 따라서, 유전자의 서열을 결정하는 것은 상응하는 폴리펩티드의 1차 서열 및 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 단백질의 보다 구체적인 역할 또는 활성의 예측에 도움을 준다.

"융합된", "작동 가능하게 연결된" 및 ""작동 가능하게 결합된"은 두 개의 별개의 도메인의 화학적 또는 물리적 결합을 광범위하게 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 상기 각 도메인은 독립적으로 생물학적 기능을 가진다. 이와 같이, 본 발명의 일 실시예는 TGF-베타 패밀리 활성 또는 폴리펩티드의 TGF-베타 패밀리의 리간드 특이성의 개선 또는 변화를 가진 폴리펩티드로서 기능하도록 서로 융합된 TGF-베타(예를 들어, BMP-6 또는 액티빈) 도메인을 제공한다. 일 실시예에서, 두 부모 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드의 도메인의 복수를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 연결되어, 부모 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 각 도메인인 동일 코딩 서열의 일부가 되며, 상기 폴리뉴클레오티드는 프레임 내에 존재하여, 폴리뉴클레오티드는 전사될 때 단일 mRNA를 코딩하고, 단일 mRNA는 번역될 때 단일 폴리펩티드인 도메인들의 복수를 포함한다. 일반적으로, 코딩 도메인은 직접적으로 또는 펩티드 링커에 의해 분리되고, 단일 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 "프레임 내" 연결될 것이다. 펩티드 링커 및 펩티드에 대한 다양한 코딩 서열들이 당업계에 공지되어 있다.

"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 뉴클레오티드의 중합 형태를 의미한다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오티드는 그것이 유래된 생물의 자연적으로 발생한 유전체에서 코딩 서열 중 어느 하나와 바로 인접하지 않은 서열과 바로 인접한(5' 말단에 하나 및 3' 말단에 하나) 서열을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 이 용어는 벡터; 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스; 또는 원핵 생물 또는 진핵생물의 유전체 DNA에 혼입되거나 다른 서열에 독립적인 별개의 분자(예를 들어, cDNA)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 일 실시예의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시뉴클레오티드 또는 각 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 본원에서 사용된 폴리뉴클레오티드는 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 및 이중 가닥 부분의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중 가닥 RNA, 단일 및 이중 가닥 부분의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로는 이중가닥 또는 단일 및 이중 가닥 부분의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 말한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 유전체 DNA 또는 RNA(생물체에 따름, 예를 들어, 바이러스의 RNA 유전체)뿐만 아니라 유전체 DNA에 의해 코딩되는 mRNA 및 cDNA를 포함한다.

"키메라" 또는 "키메라 단백질" 또는 "키메라 폴리펩티드"는 최소 2개의 다른 부모 단백질의 최소 2개의 도메인들의 결합을 말한다. 예를 들어, 키메라 BMP는 두 개의 다른 부모 BMP; 또는 BMP 및 TGF-베타 슈퍼패밀리의 다른 구성원(예를 들어, 액티빈), 또는 택일적으로 비관련 단백질로부터 최소 두 개의 도메인을 가질 것이다. 키메라 단백질은 또한 다른 종류의 생물들에 의해 발현되는 단백질 구조(동일 또는 상이한 구성원 단백질)의 "종간", "유전자간" 등의 융합일 수 있다. 일 실시예에서, 두 개의 도메인들은 연결되어 새로운 키메라 단백질을 생성할 수 있다. 다시 말해, 만약 전체 부모 중 어느 것과 동일한 서열을 가진다면, 단백질은 키메라가 되지 않을 수 있다. 예를 들어, 최종 키메라 또는 키메라 라이브러리의 생성을 유도하는 도메인의 부모들은 2, 3, 4, 5, 6 또는 10-20 이상의 부모가 있을 수 있다. 각 부모 단백질의 도메인은 매우 짧거나 매우 길수 있고, 도메인은 1부터 약 단백질 전체 길이의 인접 아미노산 길이의 범위를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 최소 길이는 5 아미노산이다. 일반적으로, 6개 도메인 중 하나이거나, 택일적으로 5개의 도메인이다(도 2 참조).

TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 6개 도메인들은 구성원 단백질 및/또는 다른 상동성 구성원 단백질에 대해 정렬된 1차 아미노산 서열의 구조적 건축에 기초하여 확인된다. 확인된 바와 같이, 구성원 단백질은 키메라 공정 동안 정렬된 본래의 TGF-베타 구성원 서열의 변화를 최소화 또는 택일적으로 보이듯이, 변화를 최대화하기 위해 유도된 도메인에 기초하여 일반적으로 6개의 별개의 도메인(택일적으로 5개의 구분된 도메인이 있더라도)으로 구분된다. 일반적으로, 도 2는 몇몇의 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원 각각의 정렬된 서열들과 겹치는 별개의 도메인의 상대적인 위치를 나타낸다. 수직선은 키메라의 생성에서 도메인 간의 교차에 대한 일반적인 위치를 나타낸다. 두 개의 도메인과 겹칠 수 있는 아미노산은 수직선의 어느 방향에서든 약 5개의 아미노산(또는 택일적으로 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산)의 추가 또는 제거되는 것으로 정의될 수 있다. 또한, 도 2는 키메라를 생성하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 접합부를 확인시켜주는 아미노산 박스형 세트를 나타낸다. J1 내지 J5 접합부는 교차점을 생성하기 위해 사용될 수 있는 TGF-베타 패밀리 단백질들을 가로지르는 일반적인 보전 위치이다.

비록, 상대적으로 별개이지만, 도메인들은 특정 아미노산 서열 또는 원래의 서열의 어느 한 쪽 또는 양쪽 말단에의 치환, 삽입, 추가적인 아미노산, 또는 다른 변형을 허용할 수 있는 원래의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. "허용할 수 있는"은 원래 서열의 도메인에 비하여 각 도메인의 구조적 온전함이 유지되는 것을 의미한다. 예를 들어, TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 본원에 기술된 도메인은 확인된 바와 같이, 도메인의 어느 한 쪽 또는 양쪽 말단에 10, 5, 3, 2 또는 1 또는 바람직하게는 1개 이하의 아미노산에 의해 이동될 수 있다. 본 발명의 일 실시예는 적어도 TGF-베타 구성원의 하나의 도메인과 제2 TGF-베타 구성원의 제2 도메인과의 융합을 포함하는 키메라 단백질을 제공하며, 상기 제1 도메인은 제2 TGF-베타 구성원에게는 외래이다. 뼈대 골격으로서 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 단일 소단위의 5-6 도메인을 이용하여, 새로운 (디자이너) 서열은 자연에서 나타난 것과 동일한 순서로 다른 TGF-베타 리간드의 도메인들을 혼합함으로써 재조합적으로 연결될 수 있다. 이 조립은 몇몇 다른 표적 서열의 하나와 부분적으로 유사하나, 자연적으로 발생한 서열과는 분명히 다른 새로운 서열을 생성한다.

일 실시예에서, 단일 교차점은 두 부모의 아미노산 서열에 대해 정의된다. 교차 위치는 한 부모의 도메인이 중지되는 위치와 다음 부모의 도메인이 시작되는 위치를 정의한다. 따라서, 단순한 키메라는 교차 위치 이전의 도메인은 한 부모에 속하고, 교차 위치 이후의 도메인은 두 번째 부모에 속하는 하나의 교차 위치만 갖는다. 일 실시예에서, 키메라는 하나 이상의 교차 위치를 가진다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-30 또는 그 이상의 교자 위치이다. 일 실시예에서, 부모 가닥들은 1, 2, 3, 4 또는 5 교차 위치를 갖는 것으로 정의된다. 어떻게 이러한 교차 위치들이 명명되고 정의되는 지는 모두 이하에서 설명된다. 두 개의 교차 위치 및 두 개의 부모가 있는 일 실시예에서, 제1 부모로부터의 제1 인접 도메인, 제2 부모로부터의 제2 인접 도메인, 제1 부모로부터의 제3 인접 도메인이 뒤따를 것이다. 인접은 도메인을 방해하는 중요성이 없는 것을 의미한다. 이러한 인접 도메인은 인접 아미노산 서열을 생성하기 위해 연결된다. 예를 들어, BMP-6 야생형 부모 가닥 및 액티빈 야생형 부모 가닥으로부터 유래되며 5개의 교차를 갖는 액티빈/BMP-6 키메라는 BMP-6 또는 액티빈 중 어느 하나의 제1 도메인, 제1 도메인과 작동 가능하도록 연결되고, 제1 도메인의 구조적 모티프 하류를 포함하는 제1 도메인에 비해 반대편 부모 가닥의 제2 도메인, 제2 도메인과 작동 가능하도록 연결되고, 제2 도메인의 구조적 모티프 하류를 포함하는 제2 도메인에 비해 반대편 부모 가닥의 제3 도메인, 제3 도메인과 작동 가능하도록 연결되고, 제3 도메인의 구조적 모티프 하류를 포함하는 제3 도메인에 비해 반대편 부모 가닥의 제4 도메인, 제4 도메인과 작동 가능하도록 연결되고, 제4 도메인의 구조적 모티프 하류를 포함하는 제4 도메인에 비해 반대편 부모 가닥의 제5 도메인 및 제5 도메인과 작동 가능하도록 연결되고, 제5 도메인의 구조적 모티프 하류를 포함하는 제5 도메인에 비해 반대편 부모 가닥의 제6 도메인을 포함하며, 모두 하나의 인접 아미노산 사슬에 연결되어 있다.

당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 정확한 서열뿐만 아니라 변형 키메라도 존재한다. 다시 말해, 보존적 아미노산 치환이 키메라에 혼입될 수 있다(예를 들어, 약 1 내지 10 보존적 아미노산 치환으로부터). 따라서, 변형 키메라의 경우, 최종 키메라에 각 도메인의 100%가 존재해야 할 필요가 없다. 그 양은 추가적인 잔기 또는 잔기의 제거 또는 변경을 통해 변경될 수 있고, 용어 변형이 정의된 바에 따라 정의될 수 있다. 물론, 당업자에게 이해되는 바와 같이, 상기 논의는 아미노산 뿐만 아니라, 아미노산을 코딩하는 핵산에도 적용된다.

"보존적 아미노산 치환"은 유사한 곁사슬을 갖는 잔기의 상호교환성을 나타내며, 따라서 아미노산의 전형적으로 동일하거나 유사하게 정의된 분류의 아미노산으로 폴리펩티드 내 아미노산의 치환을 포함한다. 비제한적인 예시로서, 지방족 곁사슬을 가진 아미노산은 또다른 지방족 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신 및 메티오닌으로 치환될 수 있고; 수산기 곁사슬을 가진 아미노산은 또다른 수산기 곁사슬을 가진 아미노산, 예를 들어, 세린 및 트레오닌으로 치환되고; 방향족 곁사슬을 가진 아미노산은 또다른 방향족 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘으로 치환되고; 염기성 곁사슬을 가진 아미노산은 또다른 염기성 곁사승릉ㄹ 가진 아미노산, 예를 들어, 라이신, 알기닌 및 히스티딘으로 치환되고; 산성 곁사슬을 가진 아미노산은 또다른 산성 곁사슬을 가진 아미노산, 예를 들어, 아스파라트산 또는 글루탐산으로 치환되고; 소수성 또는 친수성 아미노산은 각각 또다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 치환된다.

"비보존적 치환"은 폴리펩티드 내 아미노산을 상당히 다른 곁사슬 특성을 가진 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 비보존적 치환은 정의된 군 내에서 라기보다는, 사이에서 아미노산을 사용할 수 있고, (a) 치환 영역에서 펩티드 골격의 구조(예를 들어, 글리신의 프롤린) (b) 전하 또는 소수성 또는 (c) 곁사슬의 부피에 영향을 준다. 비제한적인 예시로서, 예시적인 비보존적 치환은 염기성 또는 지방족 아미노산으로 치환된 산성 아미노산일 수 있고; 작은 아미노산으로부터 치환된 방향족 아미노산일 수 있고; 소수성 아미노산으로부터 치환된 친수성 아미노산일 수 있다.

"참조 서열"은 서열 비교의 기초로서 사용되는 정의된 서열을 의미한다. 참조 서열은 보다 큰 서열의 서브세트, 예를 들어, 유전자 또는 폴리펩티드 서열의 전체 길이의 도메인일 수 있다. 일반적으로, 참조 서열은 적어도 20 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 길이, 적어도 25 잔기의 길이, 적어도 50 잔기의 길이 또는 핵산 또는 폴리펩티드의 전체 길이일 수 있다. 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 각 (1) 두 서열 간에 유사한 서열(예를 들어, 완벽한 서열의 일부)을 포함할 수 있고, (2) 두 서열 간에 엇갈리는 서열을 더 포함할 수 있기 때문에, 두 개(또는 그 이상)의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 간의 서열 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부적인 부분을 확인하고 비교하기 위한 "비교 창문"을 통해 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 비교함으로써 수행된다.

"서열 동일성"은 두 아미노산 서열들이 비교의 창문을 통해 실질적으로 동일하다(예를 들어, 아미노산마다 아미노산 기준으로)는 것을 의미한다. 용어 "서열 유사성"은 동일한 생물물리학적 특성을 공유하는 유사한 아미노산을 의미한다. 용어 "서열 동일성의 백분율" 또는 "서열 유사성의 백분율"은 비교의 창문을 통해 두 개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하고, 매칭되는 위치의 수를 산출하기 위해 양 폴리펩티드 서열에서 동일한 잔기(또는 유사한 잔기)가 발생하는 위치의 수를 결정하고, 비교의 창문(예를 들어, 창문 크기)에서 매칭된 위치의 수를 전체 위치의 수로 나누고, 서열 동일성의 백분율(또는 서열 유사성의 백분율)을 산출하기 위해 결과에 100을 곱함으로써 계산된다. 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 서열 동일성 및 유사성은 단백질 서열에 기술된 것과 유사한 의미를 가지며, 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교의 창문을 통해 두 폴리뉴클레오티드 서열이 동일(뉴클레오티드마다 뉴클레오티드 기준으로)한 것을 지칭한다. 이와 같이, 폴리뉴클레오티드 서열 동일성의 백분율(또는, 예를 들어, 분석 알고리즘에 기초한 동의 치환(silent substitution) 또는 다른 치환에 대한 폴리뉴클레오티드 서열 유사성의 백분율) 또한 계산될 수 있다. 최대 일치성은 본원에 기술된 서열 알고리즘(또는 당업자에게 이용 가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 이용하거나 시각적 검사에 의해 결정될 수 있다.

폴리펩티드에 적용된 바와 같이, 용어 실질적인 동일성 또는 실질적인 유사성은 디폴트 갭 중량을 이용한 BLAST, GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의하거나 시각적인 검사에 의하는 것과 같이 최적으로 정렬되었을 때의 두 펩티드 서열이 서열 동일성 또는 서열 유사성을 공유하는 것을 의미한다. 유사하게, 2개의 핵산의 문맥에서 적용되는 바와 같이, 용어 실질적인 동일성 또는 실질적인 유사성은 디폴트 갭 중량(하기에 구체적으로 기술??)을 이용한 BLAST, GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의하거나 시각적인 검사에 의하는 것과 같이 최적으로 정렬되었을 때, 두 핵산 서열이 서열 동일성 또는 서열 유사성을 공유하는 것을 의미한다.

서열 동일성 또는 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 일 예시는 Pearson, W. R. & Lipman, D. J., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444에 기술된 FASTA 알고리즘이다. 또한, W. R. Pearson, (1996) Methods Enzymology 266:227-258에 기술되어 있다. 동일성 백분율 또는 유사성 백분율을 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTA 정렬에서 사용된 바람직한 변수는 최적화되었다, BL50 Matrix 15: 5, k-tuple=2; joining penalty=40, 최적화(optimization)=28; 갭 패널티(gap penalty) 12, 갭 길이 패널티(gap length penalty)=2; 및 폭(width)=16.

유용한 알고리즘의 또 다른 예시는 PILEUP이다. PILEUP은 관계 및 서열 동일성 백분율 또는 서열 유사성 백분율을 나타내기 위해 점진적이고 쌍방향적인 정렬을 이용한 관련된 서열들의 군으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 그것은 또한 정렬의 생성에 사용되는 군집 관계를 나타내는 나무 또는 덴도그램을 도시한다. PILEUP는 Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360의 점진적인 정렬 방법의 단순화를 이용한다. 사용된 방법은 Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989에 의해 설명된 방법과 유사하다. 이 프로그램은 300개의 서열, 각 최대 길이 5,000 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 정렬할 수 있다. 다중 정렬 과정은 두 개의 가장 유사한 서열의 쌍방향 정렬로 시작하여 2개의 정렬된 서열의 군집을 생성한다. 이 군집은 그 다음으로 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열의 군집과 정렬된다. 서열의 두 군집은 두 개별적인 서열의 쌍방 정렬의 단순한 연장에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 점진적이고 쌍방적인 정렬의 연속에 의해 달성된다. 이 프로그램은 서열 비교 영역에 대한 특정 서열 및 그들의 아미노산 또는 뉴클레오티드의 좌표를 지정하고, 프로그램 변수를 지정함으로써 구동된다. PILEUP를 이용하여, 참조 서열을 하기 변수들을 이용하여 서열 동일성 백분율(또는 서열 유사성 백분율) 관계를 결정하기 위해 다른 시험 서열과 비교한다: 디폴트 갭 중량 (default gap weight, 3.00), 디폴트 갭 길이 중량 (default gap length weight, 0.10) 및 가중된 말단 갭(weighted end gaps). PILEUP은 GCG 서열 분석 소프트웨어 패키지, 예를 들어, 버전 7.0 (Devereaux et al., (1984) Nuc. Acids Res. 12:387-395)으로부터 얻을 수 있다.

다중 DNA 및 아미노산 서열 정렬에 적합한 알고리즘의 또 다른 예시는 CLUSTALW 프로그램이다(Thompson, J. D. et al., (1994) Nuc. Acids Res. 22:4673-4680). CLUSTALW는 서열 군 간의 다중 쌍방 비교를 수행하고, 서열 동일성에 기초하여 다중 정렬로 조립한다. Gap open과 Gap extension penalties는 각각 10 및 0.05였다. 아미노산 정렬을 위해, BLOSUM 알고리즘이 단백질 중량 매트릭스로서 이용될 수 있다(Henikoff and Henikoff, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919).

예를 들어, 도 2는 TGF-베타 패밀리 구성원의 수를 정렬한 것을 나타낸다. 당업자는 보존되지 않은 아미노산뿐만 아니라 패밀리에 걸쳐 보존된 아미노산의 정렬로부터 용이하게 결정할 수 있다.

"기능적"은 예를 들어, 리간드 또는 유사한 분자에 결합하거나 특정 생물학적 기능(예를 들어, 근육 성장의 자극, 골 성장 등)을 촉진하는 능력에 의해 판단되는 것과 같이, 그 유형의 자연적으로 생성된 단백질의 본래의 생물학적 활성 또는 임의의 특정 바람직한 활성 중 어느 하나를 가진 폴리펩티드를 의미한다.

형질전환 성장 인자-베타(Transforming Growth Factor-beta, TGF-β) 슈퍼패밀리의 단백질은 매우 대다수의 인간 세포에서 발견되는 세포외 사이토카인으로 구성되어 있다. ~40인 TGF-β 슈퍼패밀리 리간드들은 TGF-β, 골 형성 단백질(Bone Morphogenetic Proteins, BMPs), 액티빈(activin) 및 인히빈(inhibin), 성장 및 분화 인자(Growth and Differentiation Factors, GDFs), 노달(Nodal), 물질 억제 뮐러(Mullerian Inhibiting Substance, MIS), 및 신경교세포주-유도 신경영양인자(Glial cell line-Derived Neurotrophic Factors, GDNFs)를 포함하는 보다 작은 패밀리들로 세분화될 수 있다. TGF-β 슈퍼패밀리 구성원은 다양한 범위의 세포 유형에서 발견되고, 골 형성 및 조직 수선에 대한 등/복부 패턴화 및 좌/우 축 결정을 포함하는 많은 기본적인 세포적 사건에서 중요한 역할을 한다. 보다 최근에는, 몇몇 TGF-β 리간드들이 줄기세포의 유지 또는 분화 지시에 관여하는 것으로 나타났다. 그들의 풍부함 때문에, TGF-β 리간드 신호의 조절은 골격 및 근육 이상으로부터 다양한 종양들까지의 광범위한 다른 질병들의 치료에 도움이 된다. 본원에서 제공된 예시적인 서열들이 이 패밀리 또는 단백질의 다양한 구성원에 대해 제공되지만, 당업자는 단어 검색 또는 서열 BLAST 검색에 의한 공용 데이터베이스를 이용하여 상동체 및 변이체를 용이하게 확인할 수 있다.

일반적으로 TGF-베타의 슈퍼패밀리(TGF-β1-β5) 뿐만 아니라, 분화 인자(예를 들어, Vg-1), 호르몬 액티빈(activin) 및 인히빈(inhibin), 물질 억제 뮐러(Mullerian Inhibiting Substance, MIS), 골 형성 및 형태발생 단백질(예를 들어, OP-1, OP-2, OP-3, 다른 BMPs), 성장적으로 조절되는 단백질(developmentally regulated protein) Vgr-1, 성장/분화 인자(Growth/Differentiation Factors 예를 들어, GDF-1, GDF-3, GDF-9 및 도르살린-1(dorsalin-1)) 등도 몇몇 서브패밀리로 인식된다. 예를 들어, Spam and Roberts (1990) in Peptide Growth Factors and Their Receptors, Spom and Roberts, eds., Springer-Verlag: Berlin pp. 419-472; Weeks and Melton (1987) Cell 51: 861-867; Padgett et al. (1987) Nature 325: 81-84; Mason et al. (1985) Nature 318: 659-663; Mason et al. (1987) Growth Factors 1: 77-88; Cate et al. (1986) Cell 45: 685-698; PCT/US90/05903; PCT/US91/07654; PCT/WO94/10202; U.S. Pat. Nos. 4,877,864; 5,141,905; 5,013,649; 5,116,738; 5,108,922; 5,106,748; and U.S. Pat. No. 5,155,058; Lyons et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4554-58; McPherron et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3444-3449; Basler et al. (1993) Cell 73: 687-702에서 확인할 수 있다.

TGF-베타 슈퍼패밀리의 형태발생 단백질은 포유류의 골 형성 단백질-1(osteogenic protein-1, OP-1, BMP-7로도 알려짐), 골 형성 단백질-2(osteogenic protein-2, OP-2, BMP-8로도 알려짐), 골 형성 단백질-3(osteogenic protein-3, 053), BMP-2 (BMP-2A 또는 CBMP-2A 및 초파리의 상동체 DPP라고도 알려짐), BMP-3, BMP-4 (BMP-2B 또는 CBMP-2B라고도 알려짐), BMP-5, BMP-6 및 그의 쥐의 상동체 Vgr-1, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, GDF3 (Vgr2라고도 알려짐), GDF-8, GDF-9, GDF-10, GDF-11, GDF-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, GDF-5 (CDMP-1 또는 MP52라고도 알려짐), GDF-6 (CDMP-2 또는 BMP13라고도 알려짐), GDF-7 (CDMP-3 또는 BMP-12라고도 알려짐), 개구리의 상동체 Vgl 및 NODAL, UNIVIN, SCREW, ADMP, NEURAL 등을 포함한다.

TGF-β 리간드는 단백질분해효소 절단 부위에 의해 연결된 N-말단 전구 도메인 및 C-말단 성숙 도메인으로 구성된 불활성 전구체 분자로서 합성된다. 활성화되기 위해서는, 일반적으로 퓨린과 같은 전환효소에 의해 전구 도메인으로부터 절단되어야만 한다. TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원들은 그들의 성숙 도메인에서 발견되는 보존된 구조적 건축 때문에 함께 분류된다. 일반적으로, 각 성숙 리간드 모노머는 7개의 시스테인을 포함하며, 그 중 6개는 '시스테인 매듭' 모티프에 배열된 3개의 내부 이황화 결합을 형성한다. '시스테인 매듭'으로부터 바깥쪽으로 뻗은 것은 2개의 굽은 손가락을 형성하는 4개의 베타 가닥이다. 마지막으로 남은 시스테인은 공유적으로 결합된 다이머를 생성하는 제2 리간드 모노머와 이황화결합을 형성한다. 다이머는 '시스테인 매듭'이 몸체 그리고 손가락들이 날개와 같이 뻗친 것이 전체적으로 나비와 같은 형태를 가진다. TGF-β 슈퍼패밀리에 대한 기능적 소단위는 다이머고, 그들은 생체 내에서 호모- 및 헤테로다이머로서 존재하는 것으로 보인다. GDF-9 및 BMP-15과 같은 몇몇 슈퍼패밀리 구성원들은 이황화결합을 형성하는 데 필요한 시스테인이 없더라도 안정한 다이머를 형성할 수 있다.

신호전달 과정을 시작하기 위해, TGF-β 다이머는 유형 I 및 유형 II로 불리는 두 세트의 수용체들을 모아야만 한다. 이러한 수용체들은 세개의 손가락 독소 주름, 단일 막 도메인 및 세포 내 키나아제 도메인으로 정렬되는 세포 외 도메인(extracellular domain, ECD)을 갖는 세린/트레오닌 키나아제이다. TGF-β 리간드는 다른 수용체 유형들에 대한 그들의 친화도를 더 선호하는 것으로 나타났다. BMP-2 및 GDF-5는 유형 I 수용체에 대해 높은 친화도를 갖는 반면에, 액티빈 및 노달(Nodal)은 유형 II 수용체에 대해 높은 친화도를 보인다. TGF-β 리간드에 두개의 높은 친화도를 가진 수용체들이 결합한 후, 두 개의 낮은 친화도를 가진 수용체들은 그 후에 결합하고 복합체에 결합할 수 있다. TGF-β 리간드에 네 개의 모든 수용체들이 결합하여 6-구성원 3원 복합체를 형성하면, 하류 신호전달 연속 단계가 시작된다. 구조적으로 활성인 유형 II 수용체들은 유형 I 수용체들을 인산화시켜, Smads라 불리는 세포 내 신호전달 분자들과 결합하고 인산화시킨다. Smads 분자들은 그 후, 핵으로 전이하고, 전사 조절자들과 직접적으로 상호작용할 수 있다. 다중 메커니즘들이 연속 단계들의 다른 단계에서 TGF-β 신호 전달을 밀접하게 조절하는 것에 이용된다: 노긴(Noggin), 폴리스타틴(follistatin) 및 인히빈을 포함하는 세포 외 길항제; BAMBI와 유사한 세포 내 키나아제 도메인이 없는 유사-수용체(pseudo-receptors); 또는 억제성 Smas와 같은 세포 내 분자들을 통한다.

TGF-β 슈퍼패밀리는 수용체들에 의해 리간드에 대해 높은 정도의 난잡성을 보인다. 40개 이상의 TGF-β 리간드들이 존재하는 반면에, 오직 12개의 수용체들(7개의 유형 I 및 5개의 유형 II)이 존재한다. 그러므로, 수용체들은 다수의 다른 리간드들과 상호작용할 수 있어야만 한다. 예를 들어, ActRII는 액티빈과 BMP-7과 높은 친화도로 결합하는 것으로 알려졌으나, BMP-2와는 매우 낮은 친화도로 결합한다. GDF-5에서, 그의 유형 I 선호도를 결정하는 단일 아미노산이 발견되었으나, BMP-3에서는 유형 II 수용체 친화도를 변화시킬 뿐만 아니라, 리간드에 기능을 부여하는 단일 점 돌연변이가 발견되었다. 일 실시예는 신규 수용체의 결합 특성을 가진 변형된 TGF-β 리간드를 생성하여, TGF-β 리간드 기능을 다양화시키는 방법뿐만 아니라 이러한 활성을 갖는 조성물을 제공한다.

일 실시예는 신규 리간드 구성을 이용함으로써 TGF-베타 신호전달 복합체를 입증한다. 합성된 키메라 호모- 또는 헤테로다이머의 리간드를 이용하여, 일 실시예는 TGF-베타 패밀리 단백질의 신호전달을 해부하는 데 이용되는 조성물을 제공한다. 나아가, 이러한 리간드를 이용하는 것은 각자로부터 마주보는 두 개의 유형 I 수용체 및 서로 마주보는 두 개의 유형 II 수용체를 구분하는 데 기여하는 방법을 허용한다. 일 실시예의 방법과 조성물은 리간드-수용체 친화도, 신호전달 활성 및 생물학적 활성 간의 상호관계를 입증한다. 일 실시예의 방법과 조성물은 TGF-베타 슈퍼패밀리 신호전달 복합체 조립의 메커니즘과 요구 조건들을 밝혀냈다. 또한, 키메라 리간드는 TGF-β 패밀리 단백질과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는 데 이용되는 신규 폴리펩티드를 제공한다.

일 실시예는 예를 들어, E. coli 또는 포유류의 발현 시스템을 이용하여 발현되고 리폴딩되는 능력을 가진 신규 키메라 TGF-β 리간드를 제조하는 방법 및 이용하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 이용된 TGF-베타 슈퍼패밀리에서 두개의 다른 리간드의 도메인들을 이용하여 AB604와 같은 액티빈/BMP-6 키메라를 생성하는 전략은 도 1에 요약되어 있다. 키메라는 특정 TGF-β 리간드의 신호전달 특성을 모방하거나 자연에서 볼 수 없었던 독특한 신호전달 특성을 보인다. 일 실시예에서, 액티빈-βA 및 BMP-6는 액티빈/BMP-6 키메라를 생성하는 원형으로 사용된다. 일 실시예의 액티빈/BMP-6 키메라는 액티빈/BMP-2(AB204)에 비해 Smad-1 신호전달 활성에서 7배 증가 및 리폴딩(refolding) 수율에서는 10배 증가를 나타낸다. 일 실시예의 액티빈/BMP-6 키메라의 이러한 우수한 특성은 BMP-2가 BMP 단백질들 사이에서 가장 높은 리폴딩 효율을 가진다고 믿어지며, 또한, BMP-2가 Allendorph et al. Biochemistry, 2007:12238-47 (도 3)에 기술된 바와 같이 BMP-6에 비해 더 높은 Smad-1 신호전달 활성을 나타낸다고 믿어졌던 것을 고려하면, 이전에 예상될 수 없었던 것이다.

일 실시예에서, 키메라의 도메인을 설계할 때 두 개의 요인이 고려되었다. 첫 째는 구조적 고려였다. 전반적인 TGF-β 모노머 주름이 6개의 도메인으로 자연적으로 나뉜다: 베타 가닥 1 및 2, 예비 나선 루프, 알파 나선 1 및 베타 가닥 3 및 4. 이러한 도메인들의 동정과 특성화는 실시예 4에 추가로 기술되었다. 일 실시예는 설계에서 이러한 천연 영역을 모방하기 위해 키메라 구조를 이용하였다. 따라서, 각 도메인들은 1, 2, 3, 4, 5 및 6으로 지칭될 수 있다. 두 번째 고려는 키메라 공정동안 정렬된 본래의 TGF-베타 구성원 서열의 변형을 최소화하는 것이었다. 그러므로, 2개의 단백질 서열 간의 서열 동일성을 갖는 이러한 영역은 추정 교차점으로 확인되었다. 이러한 영역들은 PCR 전략을 위한 DNA 서열의 중첩에 적합하고, 천연 서열의 변화를 최소화할 것이다. 도 4는 이러한 고려들의 서열과 구조를 도시한다. 영역들은 박스화되고, 그들의 도메인에 따라 번호가 매겨지고, 리간드 모노머로 지도화된다. 일 실시예에서 잔기 번호 매김은 BMP-6(서열번호 2)에 기초한다. 따라서, 일 실시예의 키메라 폴리펩티드를 생성할 때 교차점은 구조적 모티프의 변화 간에 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 도메인 서열과 조합하여 유사한 구조적 모티프를 확인함으로써 확인될 수 있다. 이러한 영역들(3 내지 20개 사이의 아미노산일 수 있음)의 교차점들은 안정화된 키메라를 제공하는 결과물인 키메라 폴리펩티드의 파괴를 최소화한다.

예를 들어, 알고리즘 1b2a3b4b5a6a를 포함하는 키메라 폴리펩티드는 각 도메인의 부모 가닥을 지칭하는 문자인 6개의 도메인을 지칭한다. 따라서, 예 "1b2a3b4b5a6a"에서, 도메인 1은 BMP-6에 대한 부모 가닥 "b"로부터, 도메인 2는 액티빈에 대한 부모 가닥 "a"로부터, 도메인 3은 BMP-6에 대한 부모 가닥 "b"로부터, 도메인 4는 BMP-6에 대한 부모 가닥 "b"로부터, 도메인 5는 액티빈에 대한 부모 가닥 "a"로부터 및 도메인 6은 액티빈에 대한 부모 가닥 "a"로부터 온 것이다.

일 실시예에서, BMP-6의 도메인과 제2 TGF-베타 패밀리 단백질 간의 교차는 구조적 유사성 및 서열이 유사하게 중첩되는 경우 발생할 수 있다. 도 4는 BMP-6와 액티빈 간의 중첩을 도시하며, 상기 교차는 잔기 D42-P52, G62-S65; T82-H85; K94-T100; 및 S106-D112(잔기 번호 매김은 BMP-6(서열번호 2)에 기초함)간에 발생될 수 있다. BMP-6 및 액티빈-βA의 서열 정렬은 도메인 1 내지 6의 경계를 부각시킨다. 액티빈은 두 개의 시스테인 사이에 형성된 추가 이황화결합을 갖는다.

교차 장소를 확인하기 위한 다른 방법들이 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드의 생성에 사용될 수 있다. 예를 들어, SCHEMA는 단백질의 구조적 완전성에 영향을 주지 않고 상동성 단백질의 단편과 재조합될 수 있는 지를 예측할 수 있는 컴퓨터 기반 방법이다(예를 들어, Meyer et al., (2003) Protein Sci., 12:1686-1693 참조). 높은 안정성을 가진 키메라는 서열 안정성 데이터의 선형 회귀를 이용하거나 접힌 단백질 대 접히지 않은 단백질의 MSA의 공통 분석에 의존함으로써 전반적인 안정성에 각 도메인의 추가적인 기여도를 결정함으로써 확인될 수 있다. SCHEMA 재조합은 내성있는 것들은 교환하면서 중요한 기능적 잔기들은 보존함으로써 키메라가 생물학적 기능을 보유하고, 높은 서열 다양성을 나타내는 것을 보장한다.

일 실시예에 나타난 바와 같이, 이러한 재조합된 기능적 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드가 생성될 때, 그들의 리간드 특이성은 개선될 수 있거나 생물학적 활성이 변화되거나 재조합되지 않은 부모 폴리펩티드에 비해 개선될 수 있음이 밝혀졌다. 활성/리간드 프로필의 차이 때문에, 이러한 조작된 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 리간드 특이적 활성화 및 억제에 대한 활성을 스크리닝하는 독창적인 기초를 제공하고, 신규 치료학적 폴리펩티드 및 연구 시약을 제공한다.

예를 들어, 일 실시예의 키메라에서, 도메인 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 하기 서열들로부터 선택될 수 있고, 상기 폴리펩티드는 구조(도메인 1-도메인 2-도메인 3-도메인 4-도메인 5-도메인 6)를 포함한다:

아미노산 (도메인 #)	부모의 서열번호	변수 정의
1-X1b (1)	2	X1b는 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ,51 또는 52
1-X1aa (1)	4	X1aa는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31
1-X1ab (1)	6	X1ab는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31
1-X1ac (1)	8	X1ac는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31
1-X1ae (1)	10	X1ae는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31
X1b-X2b (2)	2	X1b는 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ,51 또는 52X2b는 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70
X1aa-X2aa (2)	4	X1aa는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31X2aa는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51
X1ab-X2ab (2)	6	X1ab는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31X2ab는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51
X1ac-X2ac (2)	8	X1ac는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31X2ac는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51
X1ae-X2ae (2)	10	X1ae는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31X2ae는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51
X2b-X3b (3)	2	X2b는 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70X3b는 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 또는 88
X2aa-X3aa (3)	4	X2aa는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51X3aa는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74
X2ab-X3ab (3)	6	X2ab는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51X3ab는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74
X2ac-X3ac (3)	8	X2ac는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51X3ac는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74
X2ae-X3ae (3)	10	X2ae는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51X3ae는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74
X3b-X4b (4)	2	X3b는 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 또는 88X4b는 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 또는 103
X3aa-X4aa (4)	4	X3aa는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74X4aa는 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87
X3ab-X4ab (4)	6	X3ab는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74X4ab는 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 또는 86
X3ac-X4ac (4)	8	X3ac는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74X4ac는 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87
X3ae-X4ae (4)	10	X3ae는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74X4ae는 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 85
X4b-X5b (5)	2	X4b는 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 또는 103X5b는 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 또는 115
X4aa-X5aa (5)	4	X4aa는 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87X5aa는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100
X4ab-X5ab (5)	6	X4ab는 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 또는 86X5ab는 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99
X4ac-X5ac (5)	8	X4ac는 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87X5ac는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100
X4ae-X5ae (5)	10	X4ae는 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 85X5ae는 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 또는 98
X5b-X6b (6)	2	X5b는 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 또는 115X6b는 130, 131 또는 132
X5aa-X6aa (6)	4	X5aa는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100X6aa는 114, 115 또는 116

일부 실시예에서, 도메인 3은 도메인 2, 도메인 4 둘 중 하나 또는 도메인 2 및 4 모두와의 동일한 부모로부터 유래될 수 있다.

도 2에 요약된 바와 같이, 일부 실시예에서, 도메인 1 및 도메인 2 간의 J1(접합부 1)은 공통 서열 Z₁Z₂W을 포함하고, 상기 Z₁은 L, V, F 및 M 군으로부터 선택되고, Z₂는 G 또는 K이며, 상기 3 개의 아미노산 중 2개는 제1 도메인의 C-말단 또는 제2 도메인의 N-말단에서 발견된다. 일부 실시예에서, 도메인 2 및 도메인 3 간의 J2(접합부 2)는 공통서열 CZ₁G을 포함하고, 상기 Z₁은 H, S, A, L, I, E, K, Q 및 D 군으로부터 선택되고, 상기 3 개의 아미노산 중 2개는 제2 도메인의 C-말단 또는 제3 도메인의 N-말단에서 발견된다. 일부 실시예에서, 도메인 3 및 도메인 4 간의 J3(접합부 3)은 공통 서열 Z₁Z₂Z₃을 포함하고, 상기 Z₁은 T, S, P, G 및 I 군으로부터 선택되고, Z₂는 N, K, V, M, H 및 Y으로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z₃은 H, Y, S, T 및 P으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 3 개의 아미노산 중 2개는 제3 도메인의 C-말단 또는 제4 도메인의 N-말단에서 발견된다. 일부 실시예에서, 도메인 4 및 도메인 5 간의 J4(접합부 4)는 공통 서열 Z₁CZ₂을 포함하고, 상기 Z1은 C, S 및 V 군으로부터 선택되고, Z₂는 V, A, I 및 T으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 3 개의 아미노산 중 2개는 제4 도메인의 C-말단 또는 제5 도메인의 N-말단에서 발견된다. 일부 실시예에서, 도메인 5 및 도메인 6 간의 J5(접합부 5)는 공통 서열 Z₁Z₂Z₃을 포함하고, 상기 Z₁은 L, R 및 V 군으로부터 선택되고, Z₂는 T, Q, Y, F 및 M으로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z₃은 L, F, Y, K, I, Q, V 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 3 개의 아미노산 중 2개는 제5 도메인의 C-말단 또는 제6 도메인의 N-말단에서 발견된다.

본 발명의 일 실시예는 증가 또는 개선된 생물학적 활성(예를 들어, 비활성화에 대한 저항 등)을 가진 일 실시예의 키메라를 형성하기 위해 재조합될 수 있는 TGF-베타 패밀리 구성원 각각에 대한 하기 도메인들(표 2)을 제공한다.

	도메인 1	도메인 2	도메인 3	도메인 4	도메인 5	도메인 6
BMP-6(서열번호 2)	1-47	48-65	66-85	86-99	100-111	112-132
액티빈-βA(서열번호 4)	1-27	28-45	46-68	69-83	84-95	96-116
액티빈-βB(서열번호 6)	1-27	28-45	46-68	69-82	83-94	95-115
액티빈-βC(서열번호 8)	1-27	28-45	46-68	69-83	84-95	96-116
액티빈-βE(서열번호 10)	1-27	28-45	46-68	69-81	82-93	94-114

따라서, 본원의 다양한 실시예에 의해 예시된 바와 같이, 일 실시예는 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 제공하며, BMP-6(서열번호 2)인 상기 제1 TGF-베타 패밀리 단백질(예를 들어, 제1 부모 단백질)은 액티빈인 다른 제2 TGF-베타 패밀리 단백질(예를 들어, 제2 부모 단백질)과 재조합되어 키메라 폴리펩티드가 제공된다. (서열번호 1은 BMP-6 DNA의 DNA 서열을 나타낸다.)

일부 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 하나 이상의 BMP-6 단백질의 도메인을 포함하며, 상기 BMP-6의 도메인은 표 1에 나타난 바와 같으며, 이로써 도메인 1b2b3b4b5b6b을 포함하는 인접 폴리펩티드는 번역 개시 코돈(ATG)로부터 생성된 메티오닌 잔기에 따르는 야생형 BMP-6를 포함한다. 앞서 말한 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일성을 갖는 상동체 및 단백질 또한 본 발명에 의해 포함된다.

일부 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 하나 이상의 액티빈 단백질의 도메인을 포함하고, 상기 액티빈-βA(서열번호 4), 액티빈-βB(서열번호 6), 액티빈-βC(서열번호 8) 및 액티빈-βE(서열번호 10)의 도메인들은 표 1에 나타난 바와 같으며, 이로써 도메인 1a2a3a4a5a6a을 포함하는 인접 폴리펩티드는 야생형 성숙 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC 또는 액티빈-βE 단백질 또는 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC 및 액티빈-βE의 키메라를 포함한다. 앞서 말한 서열과 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일성을 갖는 상동체 및 단백질 또한 본 발명에 의해 포함된다. (서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 9는 각각 액티빈-βA, 액티빈-βB, 액티빈-βC 및 액티빈-βE의 DNA 서열을 나타낸다.)

다른 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 키메라 융합 폴리펩티드를 생성하기 위해 추가적인 이형 폴리펩티드가 융합될 수 있다. 이형 폴리펩티드는 예를 들어, 정제에 유용한 펩티드이거나 본 발명의 일 실시예의 다중 키메라 폴리펩티드의 올리고머화를 가능하게 하는 것일 수 있다. 이형체는 키메라 폴리펩티드에 화학적으로 결합될 수 있거나 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 프레임 내에서 작동 가능하게 연결될 수 있다.

일 실시예에서, 키메라 폴리펩티드의 아미노산 서열은 알고리즘 1n2n3n4n5n6n에 의해 기술되고, 상기 1n, 2n, 3n, 4n, 5n 및 6n은 각각 제1, 2, 3, 4, 5 및 6 도메인을 나타내며; 상기 n은 a 또는 b이고, 상기 a는 서열번호 2의 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 나타내고; 상기 b는 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래되는 아미노산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 키메라 폴리펩티드는 1a2b3b4b5b6b; 1a2b3b4b5b6a; 1a2b3b4b5a6a; 1a2b3b4b5a6b; 1a2b3b4a5a6a; 1a2b3b4a5b6b; 1a2b3b4a5a6b; 1a2b3b4a5b6a; 1a2b3a4a5a6a; 1a2b3a4a5a6b; 1a2b3a4a5b6b; 1a2b3a4a5b6a; 1a2b3a4b5b6b; 1a2b3a4b5b6a; 1a2b3a4b5a6a; 1a2b3a4b5a6b; 1a2a3a4a5a6a; 1a2a3a4a5a6b; 1a2a3a4a5b6b; 1a2a3a4a5b6a; 1a2a3a4b5b6b; 1a2a3a4b5b6a; 1a2a3a4b5a6b; 1a2a3a4b5a6a; 1a2a3b4b5b6b; 1a2a3b4b5b6a; 1a2a3b4b5a6a; 1a2a3b4b5a6b; 1a2a3b4a5a6a; 1a2a3b4a5b6a; 1a2a3b4a5b6b; 1a2a3b4a5a6b; 1b2b3b4b5b6b; 1b2b3b4b5b6a; 1b2b3b4b5a6a; 1b2b3b4b5a6b; 1b2b3b4a5a6a; 1b2b3b4a5b6b; 1b2b3b4a5a6b; 1b2b3b4a5b6a; 1b2b3a4a5a6a; 1b2b3a4a5a6b; 1b2b3a4a5b6b; 1b2b3a4a5b6a; 1b2b3a4b5b6b; 1b2b3a4b5b6a; 1b2b3a4b5a6a; 1b2b3a4b5a6b; 1b2a3a4a5a6a; 1b2a3a4a5a6b; 1b2a3a4a5b6b; 1b2a3a4a5b6a; 1b2a3a4b5b6b; 1b2a3a4b5b6a; 1b2a3a4b5a6b; 1b2a3a4b5a6a; 1b2a3b4b5b6b; 1b2a3b4b5b6a; 1b2a3b4b5a6a; 1b2a3b4b5a6b; 1b2a3b4a5a6a; 1b2a3b4a5b6a; 1b2a3b4a5b6b; 1b2a3b4a5a6b로 이루어진 군으로부터 선택되는 알고리즘에 의해 기술되는 서열을 포함할 수 있고, 상기 1b, 2b, 3b, 4b, 5b 및 6b는 각각 서열번호 2의 제1, 2, 3, 4, 5 및 6 분절이고, 상기 1a, 2a, 3a, 4a, 5a 및 6a는 각각 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제1, 2, 3, 4, 5 및 6 분절이다.

일 실시예에서, 키메라 폴리펩티드의 아미노산 서열은 알고리즘 1b2a3b4b5a6a에 의해 기술된다.

일 실시예에서, 상기 제1 도메인은 서열번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 47을 포함하고; 상기 제2 도메인은 서열번호 4의 아미노산 잔기 28 내지 45를 포함하고; 상기 제3 도메인은 서열번호 2의 아미노산 잔기 66 내지 85를 포함하고; 상기 제4 도메인은 서열번호 2의 아미노산 잔기 86 내지 99를 포함하고; 상기 제5 도메인은 서열번호 4의 아미노산 잔기 84 내지 95를 포함하고; 상기 제6 도메인은 서열번호 4의 아미노산 잔기 96 내지 116을 포함한다.

일 실시예에서, 키메라 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 12에 기재된 서열을 포함한다.

일 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 서열번호 12에 기재된 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는다.

일 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 상기 제1 도메인, 상기 제2 도메인, 상기 제3 도메인, 상기 제4 도메인, 상기 제5 도메인 및 상기 제6 도메인을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다.

일 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 호모-다이머를 형성할 수 있다.

일 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 헤테로-다이머를 형성할 수 있다.

일부 실시예에서, 키메라 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인은 각 도메인이 유래된 부모 가닥과 100% 동일하다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 도메인은 부모 가닥과 상응하는 도메인과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 도메인은 하나 이상의 보존적 아미노산 치환(예를 들어, 1-5 보존적 아미노산 치환)을 가질 수 있다.

일부 실시예에서, 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드가 생성되는 하나 이상의 부모 가닥에 비해 개선된 활성을 가질 수 있다. 일 실시예의 키메라 폴리펩티드의 생물학적 활성은 TGF-베타 활성에 대한 당업계에 인식된 임의의 수의 분석법을 이용하여 측정될 수 있다. 이러한 분석법은 BIAcore (표면 플라즈몬 공명, Surface Plasmon Resonance); C₂C1₂ 루시페라아제 분석(C₂C1₂ luciferase assay): Smad 1/5 리포터 시스템(Smad 1/5 reporter system); HEK293 루시페라아제 분석(HEK293 luciferase assay): Smad 2/3 리포터 시스템(Smad 2/3 reporter system); 쥐 뇌하수체 세포에서의 FSH 방출 분석(FSH (여포 자극 호르몬, Follicle Stimulating Hormone) release assay: in rat pituitary cells); BRE 루시페라아제 분석(BRE (BMP 결정 요소, BMP Response Element) luciferase assay): Smad 1/5 리포터 HEK 293 세포(Smad 1/5 reporter HEK 293 cells); Cripto 결합 분석(Cripto binding assay): Crptio의 존재/부재 하에서 측정된 루시페라아제 반응(Luciferase response measured in presence/absence of Crptio); 인간 줄기 세포 분석(Human Stem Cell assay): H9 세포의 유지 또는 분화(Maintenance or Differentiation of H9 cells); NMR 결합 분석(NMR binding Studies); 마이크로 질량 배양(Micro mass culture): 닭 배아에서의 측정된 골 형성(Bone formation measured in Chick embryos); X-선 결정학(X-ray Crystallography): 리간드:수용체 복합체의 구조 결정(Determine Structure of ligand:receptor complexes); 네이티브 겔(Native Gel): 리간드:수용체 복합체의 시각화(Visualization of ligand:receptor complexes); 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography (SEC)): 리간드:수용체 복합체의 시각화(Visualization of ligand:receptor complexes); 속도 측정 초원심분리(Velocity Scan Ultracentrifugation): 리간드:수용체 복합체 형성의 시각화(Visualize ligand:receptor complex formation); 및 Seldi 질량 분석(Seldi mass Spectrometry): 리간드의 정확한 사이즈 측정(Accurately determine size of ligands)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기술된 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드는 용해물, 조추출물 또는 분리된 제제와 같은 다양한 형태로 제조될 수 있다.

일부 실시예에서, 분리된 키메라 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물이다. "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 폴리펩티드 종이 우세하게 존재하는 종(예를 들어, 몰 또는 중량 기준으로 조성물에서 어느 다른 개별 거대분자 종보다도 풍부한 것)이고, 일반적으로 대상 종이 적어도 몰 또는 중량%에 의해 존재하는 거대분자 종의 약 50%를 포함할 때, 실질적으로 조성물로 정제되는 것인 조성물을 의미한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 폴리펩티드 조성물은 조성물 내 몰 또는 중량%로 존재하는 약 60% 또는 그 이상, 약 70% 또는 그 이상, 약 80% 또는 그 이상, 약 90% 또는 그 이상, 약 95% 또는 그 이상 및 약 98% 또는 그 이상의 모든 거대 분자 종을 포함할 것이다. 일부 실시예에서, 대상 종은 필수적인 동종성으로 정제되며(예를 들어, 오염 종들은 조성물 내에서 통상적인 검출 방법에 의해 검출될 수 없음), 상기 조성물은 필수적으로 단일 거대분자 종으로 구성된다. 용매 종, 작은 분자(<500 Dalton) 및 원소 이온 종들은 거대분자 종으로 간주되지 않는다.

일 실시예는 키메라의 구조를 변형시킴으로써 기능적 변이체를 제조하는 것을 고려한다. 예를 들어, 이러한 변형은 치료학적 효능 또는 안정성을 증진시키는 것(예를 들어, 키메라 단백질의 생체 내 저장 수명 및 생체 내 단백질 분해에 대한 내성, 안정성, 용해성, 생체적합성 또는 생체분포의 개선 등)과 같은 목적을 위해 이루어질 수 있다. 비제한적인 예시로서, 유도체는 예를 들어, 아세틸화, 카르복실화, 아실화, 당화, 페길화(pegylation), 인산화, 파르네실화, 바이오틴일화, 지질화, 아미드화, 공지된 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백질 분해성 절단, 세포성 리간드 또는 유기 유도체화 제제와 같은 다른 단백질과의 연결 등에 의해 변형된 키메라를 포함한다. 다수의 화학적 변형 중 임의의 것이 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 대사 합성 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다. 추가적으로, 유도체는 케톤을 포함한 곁사슬, 폴리에틸렌글리콜, 지질, 다당류 또는 단당류 및 인산염을 가진 아미노산과 같이 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 기능성에 대한 이러한 비천연 아미노산 요소의 효과는 다른 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 변이체에 대해 본원에 기술된 바에 의해 시험될 수 있다. 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질이 전구체 단백질의 초기 형태의 절단함으로써 생산될 때, 번역 후 과정이 또한 단백질의 정확한 접힘 및/또는 기능에 중요할 수 있다. 다른 세포들(CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 또는 HEK293 같이)은 이러한 번역 후 활성을 위한 특정 세포 기계 및 특징적인 기작을 가지며, 전구체 단백질의 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질로의 정확한 번역 후 변형 및 가공을 보장하기 위해 선택될 수 있다. 시험관 내 무세포 발현 시스템 및 그와 관련된 가공된 tRNA 합성효소 및 tRNA와의 조합이 비천연 아미노산을 도입하기 위해 유전적으로 표지된 특정 아미노산 위치에 정확한 변형을 보장하기 위해 이용될 수 있다.

예를 들어, 변형된 키메라 또한 아미노산 치환, 삭제 또는 추가에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 류신의 이소류신 또는 발린으로의 분리된 치환, 아스파라트산의 글루탐산으로의 분리된 치환, 트레오닌의 세린으로의 분리된 치환 또는 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산(예를 들어, 보존적 돌연변이)로의 유사한 치환은 생성된 분자의 생물학적 활성에 대해 큰 영향을 미치지 않을 것이다. 보존적 치환은 패밀리의 아미노산, 그의 곁사슬과 관련된 아미노산 내에서 일어난다.

일 실시예는 키메라 서열의 단백질 분해성 절단 부위에서의 돌연변이를 만들어 해당 부위의 단백질 분해성 절단에 덜 민감하게 만드는 것을 고려한다. 컴퓨터 분석(상업적으로 이용가능한 소프트웨어, 예를 들어, MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.를 이용한)은 단백질 분해성 절단 부위를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 당업자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 기술된 돌연변이, 변이체 또는 변형의 대부분은 핵산 수준에서 또는 일부 경우에는, 번역 후 변형 또는 화학적 합성에 의해 이루어질 수 있다. 이러한 기술들은 당업계에 잘 알려져 있다.

일 실시예는 키메라의 당화를 변형시키기 위해 키메라 서열의 특정 돌연변이를 고려한다. 이러한 돌연변이는 O-연결 또는 N-연결된 당화 부위와 같은 하나 이상의 당화 부위의 도입 또는 제거를 위해 선택될 수 있다. 아스파라긴이 연결된 당화 인식 부위는 일반적으로 정확한 세포의 당화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 아스파라긴-X-트레오닌("X"는 임의의 아미노산)인 트리펩티드 서열을 포함한다. 변형은 야생형 폴리펩티드(O-연결된 당화 부위에 대해)의 서열에 대해 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 첨가하거나 추가하여 이루어질 수도 있다. 당화 인식 부위의 첫 번째 또는 세 번째 아미노산 위치의 하나 또는 둘의 다양한 아미노산의 치환 또는 제거(및/또는 두 번째 위치의 아미노산 제거)는 변형된 트리펩티드 서열에 비당화를 야기시킨다. 탄수화물 부분의 수를 증가시키는 또 다른 방법은 폴리펩티드에 글리코시드를 화학적 또는 효소적으로 결합시키는 것이다. 사용된 결합 방식에 따라, 당이 (a) 알기닌 및 히스티딘; (b) 자유 카르복실 그룹; (c) 시스테인의 것과 같은 자유 메르캅토(sulfhydryl) 그룹; (d) 세린, 트레오닌 또는 수산화프롤린의 것과 같은 자유 수산기 그룹; (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것과 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 것과 같은 아미드 그룹에 부착될 수 있다. 1987.9.11.에 발행된 WO 87/05330 및 Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306에 기술된 이러한 방법들은 본원에 참조로서 인용되었다. 키메라에 존재하는 하나 이상의 탄수화물 부분의 제거는 화학적 및/또는 효소적으로 달성될 수 있다. 화학적 탈당화는, 예를 들어, 트리플루오로메탄술폰산 화합물 또는 이와 동등한 화합물에 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 이러한 처리는 아미노산 서열은 손상되지 않게 두는 반면에 연결된 당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분 또는 모든 당이 절단된다. 화학적 탈당화는 Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131에 추가로 기술되어 있다. 폴리펩티드의 탄수화물 부분의 효소적 절단은 Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350에 기재된 다양한 엔도-(endo-) 및 엑소-글리코시다아제(exo-glycosidase)를 이용하여 달성될 수 있다. 포유류, 효모, 곤충 및 식물 세포가 펩티드의 아미노산 서열에 의해 영향받을 수 있는 상이한 당화 패턴이 모두 도입될 수 있기 때문에, 펩티드의 핵산 및/또는 아미노산 서열은 이용된 발현 시스템의 유형에 따라 적절하게 조절될 수 있다.

일부 실시예에서, 키메라 폴리펩티드는 어레이(array) 형태일 수 있다. 폴리펩티드는 가용성 형태, 예를 들어, 마이크로티트레 플레이트(microtitre plate)의 웰(well)의 용액이거나 기판 상에 고정될 수 있다. 기판은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리플루오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시 및 폴리아크릴아미드와 같은 유기 중합체뿐만 아니라 이들의 공중합체 및 그래프트(graft)로 구성될 수 있는 고체 기판 또는 다공성 기판(예를 들어, 막)일 수 있다. 또한, 고체 지지대는 유리, 실리카, 조절 공극 유리(controlled pore glass, CPG), 역상 실리카 또는 금 또는 백금과 같은 금속과 같은 무기성일 수 있다. 기판의 형태는 구슬, 구, 입자, 과립, 겔, 막 또는 표면의 형태일 수 있다. 표면은 평면, 실질적으로 평면 또는 비평면일 수 있다. 고체 지지대는 다공성 또는 비다공성일 수 있고, 팽창 또는 비팽창 특성을 가질 수 있다. 고체 지지대는 웰(well), 오목한 것(depression) 또는 다른 용기(container)의 형태, 그릇(vessel), 특징 또는 위치로 구성될 수 있다. 복수의 지지대는 다양한 위치의 어레이 상에 구성될 수 있고, 시약의 로봇식 전달을 위해 또는 검출 방법 및/또는 기구에 의해 고려될 수 있다.

또한, 일 실시예는 본원에 개시된 키메라 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클로에티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 폴리뉴클레오티드를 생성하기 위해 유전자 발현을 조절하는 하나 이상의 이형의 조절 또는 제어 서열과 작동 가능토록 연결될 수 있다. 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 구조물은 폴리펩티드를 발현하도록 숙주 세포에 적절하게 도입될 수 있다. 일 실시에의 다양한 도메인 또는 전체 키메라를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 내 아미노산과 관련된 다양한 코돈에 기초하여 과도한 노력없이 결정될 수 있다. 또한, 일 실시예는 TGF-β 패밀리 구성원의 예시적 서열을 제공한다. 본원에 제공된 서열로부터 도메인 또는 키메라의 서열의 유도는 당업자에게 용이하게 수행된다. 본원의 TGF-베타 패밀리 단백질의 특정 서열 및 키메라 폴리펩티드의 상세한 설명(예를 들어, 키메라 도메인의 도메인 구조)에 관한 지식이 주어지면, 가공된 키메라의 핵산 서열은 당업자에게 명백할 것이다. 폴리펩티드의 아미노산 서열의 지식과 결합된 다양한 아미노산에 상응하는 코돈에 대한 지식은 당업자가 일 실시예의 폴리펩티드를 코딩하는 상이한 폴리뉴클레오티드를 생성할 수 있도록 한다. 따라서, 일 실시예는 가능한 코돈 선택들에 기초하여 조합의 선택에 의해 만들어진 폴리뉴클레오티드의 각각 및 매 가능한 변이를 고려하며, 이러한 모든 변이는 본원에 기술된 임의의 폴리펩티드에 대해 구체적으로 개시된 것으로 간주되어야 한다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 본원에 기술된 폴리펩티드를 코딩하지만, 키메라 또는 부모 TGF-베타 패밀리 폴리펩티드를 코딩하는 참조 폴리뉴클레오티드와 뉴클레오티드 수준에서 약 80% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 85% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 90% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 91% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 92% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 93% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 94% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 95% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 96% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 97% 또는 그 이상의 서열 동일성, 약 98% 또는 그 이상의 서열 동일성 또는 약 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

일부 실시예에서, 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 다양한 방법으로 조작될 수 있다. 벡터에 삽입하기 전에 분리된 폴리뉴클레오티드의 조작은 발현 벡터에 따라 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드 및 핵산 서열을 변형시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2007에 안내가 되어 있다.

일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 발현에 대한 조절 서열에 작동 가능하도록 연결된다. 일부 실시예에서, 조절 서열은 숙주 세포에 상동 또는 이형 세포 외 또는 세포 내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 얻어질 수 있는 적절한 프로모터 서열일 수 있다.

또한, 일부 실시예에서, 조절 서열은 전사를 종결 시키기 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 서열인 적절한 전사 종결 서열일 수 있다. 종결 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단에 작동 가능하도록 연결된다. 선택되는 숙주 세포에서 기능적인 임의의 종결자가 이용될 수 있다.

또한, 일부 실시예에서, 조절 서열은 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역인 적절한 리더 서열일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 작동 가능하도록 연결된다. 선택되는 숙주 세포에서 기능적인 임의의 리더 서열이 이용될 수 있다.

또한, 일부 실시예에서, 조절 서열은 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 코딩하는 신호 펩티드 코딩 영역일 수 있고, 세포의 분비 경로로 코딩된 폴리펩티드를 도입한다. 핵산 서열의 코딩 서열의 5' 말단은 분비된 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 영역의 도메인과 번역 판독 프레임 내 자연적으로 연결된 신호 펩티드 코딩 영역을 본질적으로 포함할 수 있다. 택일적으로, 코딩 서열의 5' 말단은 코딩 서열 외의 신호 펩티드 코딩 영역을 포함할 수 있다. 외래 신호 펩티드 코딩 서열은 코딩 서열이 신호 펩티드 코딩 영역을 자연적으로 포함하지 않는 경우에 필요할 수 있다.

또한, 일 실시예는 그들이 도입되는 숙주의 유형에 따라 본원에 기술된 키메라 TGF-베타 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 프로모터 및 종결자, 복제 기점 등과 같은 하나 이상의 발현 조절 영역을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 발현 벡터의 생성에 있어서, 코딩 서열은 벡터 내 위치하고, 코딩 서열은 발현에 대한 적절한 조절 서열과 작동 가능하도록 연결된다.

재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 공정에 편리하게 적용될 수 있고, 폴리뉴클레오티드의 발현을 초래할 수 있는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포 또는 시험관 내 무세포 반응 혼합물과 벡터의 양립성에 좌우될 것이다. 벡터는 선형 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있다.

발현 벡터는 자율적으로 복제되는 벡터, 예를 들어, 염색체적 복제와 독립적인 복제인 염색체 외 독립체로서 존재하는 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 염색체 외 요소, 소염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가 복제를 보장하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 택일적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때, 유전체에 통합되고, 통합되는 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 숙주 세포의 유전체 또는 트랜스포존(transposon)에 도입되는 전체 DNA를 함께 포함하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드가 사용될 수 있다.

일부 실시예에서, 발현 벡터는 형질전환된 세포의 용이한 선택을 위해 하나 이상의 선택 가능한 마커들을 포함한다. 선택 가능한 마커는 살생물제 또는 바이러스성 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구체에 대한 원영양체(prototrophy to auxotrophs) 등의 산물을 제공하는 유전자이다.

일 실시예는 키메라 TGF-베타 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 이 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내 융합 폴리펩티드의 발현을 위한 하나 이상의 조절 서열과 작동 가능하도록 연결된다. 일 실시예의 발현 벡터에 의해 코딩된 융합 폴리펩티드를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 기술된 숙주 세포에 대한 적절한 배양 배지 및 성장 조건은 당업계에 잘 알려져 있다.

발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포 내 키메라의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예의 키메라는 E.coli, 곤충 세포(예를 들어, 바큐로바이러스 발현 시스템), 효모 세포, 미세조류, 식물세포 또는 포유류 세포와 같은 세균성 또는 원핵 세포뿐만 아니라 시험관 내 무세포 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 일부 적절한 숙주 세포는 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 내 추가로 논의된다.

논의된 발현 시스템의 일 예는 E.coli 발현 시스템이지만, 당업자라면, 이러한 단백질들을 쉽게 수많은 다른 발현 시스템으로부터 복제하고, 발현시킬 수 있다. 상기 이점은 단백질이 유래되는 유기체(이 경우에는 H. sapiens)에서 볼 수 있는 번역 후 변형, 세균성 발현에 필요한 출발 메티오닌 없는 리간드의 발현 및 비천연 아미노산의 손쉬운 결합 또는 추가적인 화학적 변형의 달성을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 원핵 생물은 그람음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어, E.coli와 같은 장내세균와 같은 진정세균을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. E.coli K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); E. coli X1776 (ATCC 31,537); E. coli 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)와 같은 다양한 E.coli 균주들이 공적으로 이용가능하다. 원핵 생물 이외에, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물들은 VEGF-E를 코딩하는 벡터(VEGF-E-encoding vector)에 대한 복제 또는 발현 숙주로서 적합하다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 일반적으로 사용되는 하부의 진핵 숙주 미생물이다.

키메라의 발현에 대해 적합한 숙주 세포는 단세포 및 다세포 생물로부터 유래된다. 무척추 세포의 예시는 식물 세포뿐만 아니라 초파리 S2 및 나방 Sf9와 같은 곤충 세포를 포함한다. 식물 발현 시스템은 또한 변형된 단백질을 성공적으로 발현하는 데 사용된다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예시는 중국 햄스터 난소(CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예시는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 주(현탁액 배양에서 성장을 위해 서브클론된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); 중국 햄스터 난소 세포/ DHFR(CHO, Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); 쥐 세르톨리(sertoli) 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 및 쥐 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51)를 포함한다. 적절한 숙주 세포의 선택은 당업계의 기술 범위에 있는 것으로 간주된다.

다른 단백질 발현 시스템은 바큐로바이러스 발현 시스템, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에 제한되지 않는 효모 발현 시스템을 이용한 인간 배아 신장(human embryonic kidney, HEK) 293 세포, 곤충 세포주(스포도프테라 프루기페르다, Spodoptera frugiperda) 및 수많은 미세조류 균주를 포함한다. 유전자 변형 동물들은 정확하게 변형된 단백질을 발현하는데 이용될 수 있다. 본질적으로, 동물들은 소에서 추출한 우유와 같이 쉽게 배양된 액체 또는 조직에서 원하는 단백질을 대량으로 발현할 수 있는 살아있는 '생물반응기'가 된다. 세균 또는 밀 배아 세포 용해물 중 하나를 이용한 시험관 내 무세포 시스템이 사용될 수 있다. 무세포 발현 시스템은 높은 효율 및 우수한 특이성을 가진 다양한 범위의 비천연 아미노산 또는 에피토프 표지를 삽입할 수 있게 한다.

세균성 벡터의 예시는 pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 및 pRIT5 (Pharmacia)을 포함한다. 효모 S. cerevisiae 내 발현을 위한 벡터의 예시는 pYepSec1 (Baldari et al., EMBO J. 6:229 (1987)), pMFa (Kurjan and Herskowitz, Cell 30:933 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54:113 (1987)) 및 pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)을 포함한다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 내 단백질을 생산하기 위한 핵산의 발현에 이용가능한 바큐로바이러스 벡터는 pAc 시리즈 (Smith et al., Mol. Cell. Biol. 3:2156 (1983)) 및 pVL 시리즈 (Lucklow and Summers Virology 170:31 (1989))를 포함한다.

포유류의 발현 벡터의 예시는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, PBPV, pMSG, PSVL (Pharmacia), pCDM8 (Seed, Nature 329:840 (1987)) 및 pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6:187 (1987))을 포함한다. 포유류의 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 조절 기능은 가끔 바이러스성 조절 인자에 의해 제공된다. 예를 들어, 일반적으로 이용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된다.

바이러스성 벡터는 살아있는 동물 대상뿐만 아니라 세포에서 매우 다양한 유전자 전달 적용에 사용되어 왔다. 바이러스성 벡터는 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus), 수두바이러스(poxvirus), 알파바이러스(alphavirus), 바큐로바이러스(baculovirus), 우두 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr virus), 아데노바이러스, 제미니바이러스(geminivirus) 및 칼리모바이러스(caulimovirus) 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비바이러스성 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질(시토펙틴(cytofectin)), 핵산-단백질 복합체 및 생고분자를 포함한다. 목표 핵산 이외에 벡터는 또한, 핵산 전이 결과(특정 조직에의 전달, 발현 지속 시간 등)를 선택하고, 측정하고, 관찰하기에 유용한 하나 이상의 조절 영역 및/또는 선택가능한 마커를 포함할 수 있다.

일 실시예의 키메라는 당업계에 공지된 방법을 이용해 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2007에 제공된 것과 같은 재조합 기술에 의해 합성될 수 있다. 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 증폭을 위한 프라이머들 또한, 공지된 합성 방법에 따라, 예를 들어, Beaucage et al., (1981) Tet Lett 22:1859-69에 기술된 포스포라미다이트(phosphoramidite) 방법 또는 Matthes et al., (1984) EMBO J. 3:801-05에 기술된 방법을 사용하여, 예를 들어, 전형적으로 자동화된 합성 방법으로 실시되기 때문에 표준 고상 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 자동화된 펩티드 합성자들이 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600).

일 실시예는 대형 키메라 라이브러리의 구축을 가속화하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 일 실시예는 RASCH(RAndom Segmental CHimera)라 불리는 재조합 전략을 제공한다. RASCH는 도메인들이 연결된 원형 서열(하나의 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원으로부터의 제1 가닥) 및 소수의 표적 서열(하나 이상의 대체 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원으로부터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6) 가닥)을 이용한다. 원형 DNA 서열은 표적 서열의 효율적인 결합을 촉진시키는 데 사용되며, 일단 도메인이 연결되면 분해된다. 키메라 서열을 생성하기 위한 유전자 구축 후, 새로운 리간드들이 화학적으로 리폴딩되어 기능적 다이머가 된다. 이러한 다이머화 공정은 천연 및 디자이너 기원 모두의 두 개의 다른 서열의 혼합 및 다이머화함으로써 최종 서열의 추가적인 다양성을 허용한다. 그러므로, RASCH 방법은 약 40 개의 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드의 천연 단백질 서열을 임의의 자연적으로 발생한 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 서열로부터 각 구분되는 만 개 또는 그 이상의 변이체 서열로 다양화하는 데 사용될 수 있다.

숙주 세포에서 발현되는 조작된 폴리펩티드는 리소자임 처리, 초음파, 여과, 염석, 초원심분리, 크로마토그래피 및 친화도 분리(예를 들어, 항체에 결합된 기질), 기타 다른 것들을 포함하는 단백질 정제를 위한 임의의 하나 이상의 공지 기술을 이용하여 세포 및 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

폴리펩티드를 분리하기 위한 크로마토그래피 기술은 역상 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 및 친화도 크로마토그래피, 기타 다른 것들을 포함한다. 특정 효소를 정제하기 위한 조건은 부분적으로 순 전하, 소수성, 친수성, 분자량, 분자 모양 등과 같은 요인들에 따르며, 당업자에게는 명백할 것이다.

활성을 결정하기 위한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다. 일 실시예는 키메라 단백질의 생물학적 활성을 시험하기 위한 분석, 보다 바람직하게는 임상적 활성을 시험하기 위한 분석에 관한 것이다. 이러한 활성은 증진된 작용적 또는 길항적 TGF-베타 활성, 결합된 또는 신규 생물학적 활성 등을 포함할 수 있다.

특정 실시예에서, TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 작용제를 포함하는 일 실시예의 키메라 단백질은 다른 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 길항제를 포함한다.

단백질 발현, 수확 및 접힘 방법론이 사용되는 것과 상관없이, 특정 키메라 단백질의 일부는 우선적으로 미리 선택된 수용체에 결합할 수 있고, 잘 알려지고 당업계에서 완전히 문서화된 표준 방법론, 예를 들어, 리간드/수용체 결합 분석을 이용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, Legerski gl al. (1992) Bio h_Biophys. Res. Comm. 183: 672679; Frakar et al. (1978) Biochem. Bio12-hys. Res. Comm 80:849-857; Chio et el. (1990) Nature 343: 266-269; Dahlman et al. (1988) Biochem 27: 1813-1817; Strader et el. (1989) J. Biol. Chem. 264: 13572-13578; 및 DDowd et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992를 참조할 수 있다.

전형적으로, 리간드/수용체 결합 분석에서, 미리 선택된 수용체에 대한 알려지고 정량가능한 친화도를 가지며, 목표의 본래 또는 부모 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원은 검출 가능한 부분, 예를 들어, 방사성표지, 발색 표지 또는 형광 표지와 함께 표지된다. 정제된 수용체의 부분 표본, 수용체 결합 도메인 단편 또는 그들의 표면에 목표 수용체를 발현하는 세포들은 비표지된 키메라 단백질의 다양한 농도 존재 하에서 표지된 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원과 함께 배양되었다. 후보 키메라 단백질의 상대적인 결합 친화도는 수용체와 함께 표지된 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 결합을 억제하는 키메라 단백질의 능력을 정량함으로써 측정될 수 있다. 분석의 시행에 있어서, 수용체 및 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 고정된 농도가 비표지된 키메라 단백질의 존재 및 부재 하에서 배양된다. 민감도는 표지된 원형 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원을 첨가하기 전에 키메라 단백질과 함께 수용체를 예비 배양함으로써 증가될 수 있다. 표지된 경쟁자가 첨가된 후, 적절한 경쟁자 결합에 충분한 시간이 허용되고, 그 후 자유 및 결합된 표지된 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원은 서로 분리되고, 둘 중 하나가 측정된다. 스크리닝 과정의 실시에 있어서 유용한 표지는 방사선 표지, 발색 표지, Inc., Eugene, Oreg.의 분자프로브에 의해 Haughland (1994) "Handbook of Fluorescent and Research Chemicals," 5 ed.에 개시된 것과 같은 분광학적 표지 또는 화학 발광 또는 형광 기질과 조합되어 사용되는 높은 전환율을 갖는 결합 효소, 예를 들어, 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 또는 갈락토시다아제(galactosidase)를 포함한다. 생물학적 활성, 즉 생성된 키메라 단백질 구조물의 작용제 또는 길항제 성질은 그 후에 임의의 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원의 생물학적 활성을 측정하기 위해 개발된 통상적인 생체 내 및 시험관 내 분석을 이용하여 특성화될 수 있다. 그러나, 사용된 분석의 유형은 바람직하게는 키메라 단백질이 기초한 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원에 의존한다는 것이 이해된다.

대상 키메라 단백질 사이에 다량체의 존재는 DTT와 같은 환원제의 부재 하에서 표준 SDS-PAGE에 의하거나 HPLC(예를 들어, C18 역상 HPLC)에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 일 실시예의 다량체 단백질은 모노머 소단위에 비례하여, 예를 들어, 약 14-18 kDa의 겉보기 분자량을 가질 수 있는 모노머 소단위에 비하여 다이머에 대해 약 28-36 kDa 범위 내에서, 큰 겉보기 분자량을 가질 수 있다. 다량체 단백질은 겔 전기영동 상에서 상업적으로 이용가능한 분자량 표준과 비교함으로써 쉽게 시각화될 수 있다. 또한, 다이머 단백질은 그의 모노머 대응물과 다른 시점에서 C18 RP HPLC (45-50% 아세토나이트릴:0.1% TFA)로부터 용리된다.

두 번째 분석은 다이머(예를 들어, OP-1 다이머)의 존재를 그의 수산화인회석(hydroxyapatite)과의 결합 능력에 의해 평가한다. 최적으로 접힌 다이머는 pH7, 10 mM 인산염, 6M 요소 및 0.142M NaCl (다이머는 0.25 M NaCl에서 용리됨)에서 실질적으로 그 농도(모노머는 0.1M NaCl에서 용리됨)에서 결합하지 않는 모노머에 비해 수산화인회석 컬럼과 잘 결합한다. 세 번째 분석은 다이머의 존재를 트립신 또는 펩신 소화에 내성을 가진 단백질에 의해 평가한다. 접힌 다이머 종은 효소, 특히 성숙 단백질의 N-말단의 작은 부분만을 절단하는 효소인 트립신에 실질적으로 내성을 가지며, 처리되지 않은 다이머(트립신 절단 후, 더 작은 아미노산의 각 모노머)에 비해 크기가 약간 작은 생물학적으로 활성인 다이머 종만을 남긴다. 대조적으로, 모노머 및 잘못 접힌 다이머는 실질적으로 분해된다. 분석에서, 단백질은 표준 조건, 예를 들어, pH 8, 4 M 요소, 100 mM NaCl, 0.3% Tween-80 및 20 mM 메틸아민을 포함하는 50 mM Tris 완충액과 같은 표준 완충액 내에서의 소화를 이용한 효소 소화의 대상이다. 소화는 37℃에서 16시간동안 일어나게 되고, 생성물은 임의의 적절한 수단, 바람직하게 SDS PAGE에 의해 시각화된다.

대상 키메라 단백질, 예를 들어, BMP로부터의 하나 이상의 도메인을 갖는 키메라 단백질의 생물학적 활성은 WO00/20607에 기술된 여러 수단 중 임의의 것에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 연골 내 골 형성을 유도하는 단백질의 능력은 잘 특성화된 쥐 피하 골 분석을 이용하여 평가될 수 있다. 분석에서 골 형성은 조직학뿐만 아니라 알칼리 포스파타아제 및/또는 오스테오칼신(osteocalcin) 생성에 의해 측정될 수 있다. 또한, BMP-2, BMR4, BMP-5 및 BMP-6과 같은 높은 특이적 골 형성 활성을 가진 골형성 단백질 또한 시험관 내 쥐 조골세포 또는 골육종 세포 기반 분석에서 알칼리 포스파타아제 활성을 유도한다. 이러한 분석은 당업계에 잘 기재되어 있다. 예를 들어, Sabokdar of al. (1994) Bone and Mineral 27:57-67.; Knutsen et al. (1993) Biochem Biophvs Res. Commun 194:1352-1358; 및 Maliakal et al. (1994) Growth Factors 1:227-234)을 참조할 수 있다.

대조적으로, CDMP-1 및 CDMP-2와 같은 낮은 특이적 골 형성 활성을 가진 골형성 단백질은, 예를 들어, 세포 기반 조골세포 분석에서 알칼리 포스파타아제 활성을 유도하지 않는다. 예를 들어, CDMP-1, CDMP-2 및 CMDP-3 모두 비록 BMP-2, BW-4, BV-5, BMP-6 또는 OP-1보다 낮은 특이적 활성을 가졌지만, 골 형성 유도하는 능력이 있다. 반대로, BMP-2, BMP-4, BMP-5, BPylP-6 및 OP-1 모두 비록 CDMP-1, CDMP-2 또는 CDMP-3보다 낮은 특이적 활성을 가졌지만, 관절 연골 형성을 유도할 수 있다. 따라서, 세포 기반 분석에서 알칼리 포스파타아제 활성을 유도하는 능력을 가진 키메라 단백질로서 본원에 설계되고 기술된 CDMP의 하나 이상의 도메인을 갖는 키메라 단백질은 쥐 동물 생물검정에서 보다 높은 특이적 골 형성 활성을 나타낼 것으로 기대된다.

키메라 단백질의 생물학적 활성 또한, 상피 세포 성장을 억제하는 단백질의 능력에 의해 쉽게 평가될 수 있다. 유용하고, 잘 특성화된 시험관 내 분석은 밍크 폐 세포 또는 흑색종 세포를 이용한다. WO00/20607를 참조할 수 있다. TGF-베타 슈퍼패밀리의 다른 구성원에 대한 다른 분석은 문헌에 잘 기재되어 있고, 과도한 실험없이 수행될 수 있다.

일 실시예는 숙주, 바람직하게는 인간 내 골격근 질량을 조절하고 유지하기 위한 방법 및 제제를 제공한다. 그러므로, 예를 들어, GDF-8과 같은 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 근육 관련 기능에 영향을 줄 것으로 기대되는 일 실시예의 임의의 키메라 단백질은 골격근 질량을 조절하는 그들의 능력을 확인하기 위해 전체 세포 또는 조직 내, 시험관 내 또는 생체 내에서 시험될 수 있다. GDF-8(미오스타틴(myostatin)으로도 알려진)은 골격근 성장의 음성 조절자이다. GDF-8을 넉아웃(knockout)시킨 쥐는 골격근 질량을 정상 쥐의 약 두 배를 갖는다. 골 모델링에서 증가된 골격근 질량의 효과는 예를 들어, 암컷의 GDF-8을 넉아웃시킨 쥐의 대퇴골에서 골 미네랄 함량(bone mineral content, BMC) 및 골 미네랄 밀도(bone mineral density, BMD)를 검사함으로써 조사될 수 있다. 이중 에너지 X-선 흡수계측법(Dual-energy X-ray absorptiometry, DEXA) 검사는 대퇴골 전체의 BMC 및 BMD를 측정하는 데 사용될 수 있고, PQCT 검사는 조직의 단면에서 BMC 및 BMD를 계산하는 데 사용될 수 있다. Hamrick, Anat Rec. 2003 May; 272A(1):388-91.처럼 당 분야에 알려진 바와 같이, 일 실시예의 키메라 단백질은 GDF-8을 넉아웃시킨 쥐에 도입될 수 있고, 유사한 분석이 골격근 질량 및 골밀도에 대한 키메라 단백질의 효과를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

뒤시엔느 근위축증(Duchenne muscular dystrophy, DMD)의 mdx 쥐 모델 내 영양실조 표현형 또한, 일 실시예의 키메라 단백질의 생물학적 활성을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 3개월 간 차단성 항체의 복강 내 주사를 이용한 내인성 미오스탄틴의 차단은 mdx 쥐 근육에서 근육 변성 및 혈청 크레아틴 키나아제의 농도의 상당한 감소와 함께 체중, 근질량, 근육 크기 및 비정상적인 근력을 증가시켰음이 보고되었다. Bogdanovich et al., Nature. 2002 Nov. 28; 420(6914):418-21.처럼 유사한 연구가 일 실시예의 키메라 단백질이 내인성 GDF-8 활성을 증가시키는지 억제시키는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있다.

일 실시예는 신경발생을 조절하기 위한 방법 및 제제를 제공한다. 예를 들어, GDF-11은 전구세포에서 p27(Kip1) 및 가역적 세포 주기 정지를 유도함으로써 시험관 내 후각 상피 신경 발생을 억제하는 것으로 알려져 있다. Wu et al. Neuron. 2003 Jan. 23; 37(2):197-207.처럼, 신경 발생에 대한 일 실시예의 키메라 단백질의 효과는 유사하게 시험될 수 있다. 또한, 신경 발생에 대한 GDF-11의 효과에 대한 일 실시예의 키메라 단백질의 효과 또한 Wu et al. Id에 기술된 것과 유사한 분석법을 이용해 시험될 수 있다.

일 실시예는 골 형성 자극 및 골 질량 증가를 위한 방법 및 제제를 제공한다. 그러므로, 예를 들어, BMP-2, BMP-3, GDF-10, BMP-4, BMP-7 또는 BMP-8와 같은 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 골관련 기능에 영향을 미칠 것으로 기대되는 일 실시예의 임의의 키메라 단백질은 그들의 골 또는 연골 성장을 조절하는 능력을 확인하기 위해 세포 전체 또는 조직 내, 시험관 내 또는 생체 내에서 시험될 수 있다. 당업계에 알려진 다양한 방법들이 본 목적을 위해 이용될 수 있다.

예를 들어, BMP-3는 BMP2-매개 Msx2의 유도를 억제하고, BMP2-매개 골간세포(osteoprogenitor)의 조골세포로의 분화를 차단한다. 따라서, 바람직하게는 BMP-2 또는 BMP-3로부터의 도메인을 포함하는 것인 대상 키메라 단백질의 골 또는 연골 성장에 대한 효과는 BMP-2의 골형성 활성에 대한 그들의 효과에 의해, 예를 들어, Msx2의 유도 또는 세포 기반 분석에서 골간세포의 조골세포로의 분화를 측정함으로써 결정될 수 있다(예를 들어, Daluiski et al., Nat. Genet. 2001, 27(1):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9를 참조할 수 있음). 유사하게, 바람직하게는 BMP-2 또는 BMP-3로부터의 도메인을 포함하는 것인 대상 키메라 단백질은 그의 골형성 또는 항골형성 활성 또는 그의 BMP-2 매개 골 형성에 대한 작용 또는 길항 효과에 대해 시험될 수 있다.

세포 기반 분석의 또 다른 예시는 중간엽 전구세포(mesenchymal progenitor) 및 조골세포에서 대상 키메라 및 시험 화합물의 골형성 또는 항골형성 활성의 분석을 포함한다. 예를 들어, 대상 키메라 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스는 다능성 중간엽 전구세포 C3H10T1/2, 전구조골세포 C2C12 및 조골세포 TE-85를 감염시키도록 구성되었다. 그 후, 골 형성 활성은 알칼리 포스파타아제, 오스테오칼신 및 기질의 미네랄화(matrix mineralization)의 유도를 측정함으로써 결정된다(예를 들어, Cheng et al., J bone Joint Surg Am. 2003, 85-A(8):1544-52 참조).

또한, 일 실시예는 골 또는 연골 성장을 측정하기 위한 생체 내 분석을 고려한다. 예를 들어, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001)는 쥐 골다공증 모델에서 골절 후 초기의 골 수선에 대한 연구를 개시한다. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999) 또한, 쥐 골다공증 모델에서 골절 후 후기의 골 수선에 대한 연구를 개시한다. 이러한 참조 문헌들은 골다공증성 골절에 대한 연구를 위한 쥐 모델의 그들의 개시를 위해 그 전체가 본원에 참조로서 포함되어 있다. 특정 측면에서, 일 실시예는 당업계에 알려진 골절 치유 분석법을 사용한다. 이러한 분석법은 예를 들어, 골절의 정도의 측정뿐만 아니라 원인, 수선 과정에 대한 실험적인 계획서의 개시를 위해 그 전체가 참조로서 포함되어 있는 U.S. Pat. No. 6,521,750에 기술된 골절 기술, 조직학 분석 및 생체역학적 분석을 포함한다.

일 실시예의 스크리닝 분석은 대상 키메라 단백질 및 그의 변이체 뿐만 아니라 키메라 단백질 또는 그의 변이체 자체의 작용제 및 길항제를 포함하는 임의의 시험 화합물들에 적용되는 것으로 이해된다. 또한, 이러한 스크리닝 분석은 약물 표적 검증 및 품질 관리 목적에 유용하다.

일 실시예는 대상 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 키메라 단백질의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 용도에 관한 것이다. 이 스크리닝을 통해 동정된 화합물은 시험관 내에서 시험 조직이나 세포(예를 들어, 골/연골 성장 또는 근세포 성장)를 조절하는 그들의 능력을 평가하기 위해 조직(예를 들어, 골 및/또는 연골) 또는 세포(예를 들어, 근세포) 내에서 시험될 수 있다. 선택적으로, 이러한 화합물들은 예를 들어, 생체 내 골/연골 성장 또는 근육 조절 및 유지를 조절하는 그들의 능력을 평가하기 위해 동물 모델에서 추가적으로 평가될 수 있다.

분석 형식의 다양성은 충분할 것이고, 본 발명에 비추어, 본원에 명백하게 기술되지 않은 것이라도 당업자에 의해 이해될 것이다. 본원에 기재된 바와 같이, 일 실시예의 시험 화합물(제제)는 임의의 조합 화학 방법에 의해 생성될 수 있다. 택일적으로, 대상 화합물은 생체 내 또는 시험관 내에서 합성된 자연적으로 발생한 생체분자일 수 있다. 골 또는 연골 성장의 조절자로서 작용하는 그들의 능력에 대해 시험되는 화합물(제제)은 예를 들어, 세균, 효모, 식물 또는 다른 생물(예를 들어, 천연물)에 의해 생산될 수 있고, 화학적으로 합성될 수 있고(예를 들어, 펩티도미메틱(peptidomimetic)을 포함하는 소분자) 또는 재조합적으로 생산될 수 있다. 일 실시예에 의해 고려되는 시험 화합물은 비펩티드 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 당, 호르몬 및 핵산 분자를 포함한다. 특정 실시예에서, 시험 제제는 약 2,000 달톤보다 적은 분자량을 갖는 작은 유기 분자이다.

일 실시예의 시험 화합물은 단일, 별개의 독립체로서 제공될 수 있고, 조합 화학에 의해 제조되는 것과 같이 매우 복잡한 라이브러리에 제공될 수 있다. 예를 들어, 이러한 라이브러리는 알코올, 알킬 할리드, 아민, 아미드, 에스터, 알데하이드, 에터 및 다른 부류의 유기 화합물들을 포함한다. 시험 화합물의 시험 시스템으로의 제시는 분리된 형태 또는 화합물들의 혼합물로서 특히 초기 스크리닝 단계에서 가능하다. 선택적으로, 화합물들은 임의로 다른 화합물로 유도체화될 수 있고, 화합물의 분리를 촉진하는 유도체화 그룹을 가질 수 있다. 유도체화 그룹의 비제한적인 예시는 비오틴(biotin), 플루오레세인(fluorescein), 디곡시제닌(digoxygenin), 녹색 형광 단백질, 동위원소, 폴리히스티딘, 자성 입자(magnetic bead), 글루타티온 S 전이효소(glutathione S transferase), 광활성가능한 가교제(photoactivatible crosslinker) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

화합물 및 천연 추출물의 시험 라이브러리인 수많은 약물 스크리닝 프로그램에서, 주어진 시간 안에 조사된 화합물의 수를 최대화하기 위해서는 높은 처리량 분석이 바람직하다. 정제되거나 반정제된 단백질로부터 유래될 수 있는 것과 같은 무세포 시스템에서 수행되는 분석은 신속한 개발 및 시험 화합물에 의해 매개되는 분자 표적에서 변형의 상대적으로 쉬운 감지를 가능하게 하기 위해 생성될 수 있다는 점에서 "첫 번째" 스크린으로서 종종 선호된다. 또한, 시험 화합물의 세포 독성 또는 생체적합성의 효과는 일반적으로 시험관 내 시스템, 분석에서는 무시될 수 있고, 대신에 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 그의 결합 단백질(예를 들어, 키메라 단백질 자체 또는 TGF-베타 수용체 단백질 또는 그들의 단편)간의 결합 친화도의 변형에서 나타날 수 있는 분자 표적에 대한 약물의 효과에 주로 집중한다.

단순하게 설명하기 위해, 일 실시예의 예시적인 스크리닝 분석에서, 목표 화합물을 분석의 의도에 대해 적절하도록 TGF-베타 수용체 단백질 또는 그들의 단편들에 통상적으로 결합할 수 있는 분리되고 정제된 키메라 단백질과 함께 접촉시킨다. 그 후, 대상 키메라 단백질 및 TGF-베타 수용체 단백질을 포함하는 혼합물에 시험 화합물이 포함된 조성물을 첨가한다. 키메라 단백질 수용체 복합체의 검출 및 정량화는 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 그의 결합 단백질, 예를 들어, TGF-베타 수용체 또는 그들의 단편들 간의 복합체 형성의 억제(또는 증가)에 화합물의 효능을 계산하는 수단을 제공한다. 화합물의 효능은 시험 화합물의 다양한 농도를 이용하여 얻어진 데이터로부터의 투여량 반응 곡선을 생성함으로써 평가될 수 있다. 더욱이, 조절 분석은 또한, 비교를 위한 기준선을 제공하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 조절 분석에서 분리되고 정제된 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질은 TGF-베타 수용체 단백질 또는 그들의 단편을 포함하는 조성물(무세포 또는 세포 기반)에 첨가되고, 키메라 단백질-수용체 복합체의 형성은 시험 화합물의 부재 하에 정량된다. 일반적으로, 반응물이 혼합될 수 있는 순서는 다양할 수 있고, 동시에 혼합될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 정제된 단백질 대신에 세포 추출물 또는 용해물이 적절한 무세포 분석 시스템을 만드는 데 사용될 수 있다. 택일적으로, TGF-베타 수용체 단백질 또는 그들의 단편을 그들의 표면에서 발현하는 세포는 특정 분석법에서 사용될 수 있다.

대상 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 그의 결합 단백질 간의 복합체 형성은 다양한 기술에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 복합체의 형성의 조절은 예를 들어, 방사선 표지된(예를 들어, 32P, 35S, 14C 또는 3H), 형광 표지된(예를 들어, FITC) 또는 효소적으로 표지된 키메라 단백질 또는 그의 결합단백질을 이용하여 면역분석법 또는 크로마토그래피 검출에 의해 정량될 수 있다.

일 실시예는 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질 및 그의 결합 단백질(예를 들어, TGF-베타 수용체 단백질 또는 그들의 단편)간의 상호작용의 정도를 직접 또는 간접적으로 측정함에 있어서, 형광 편광 분석(fluorescence polarization assay), 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 분석의 이용을 고려한다. 또한, 광도 파로(optical waveguide, PCT Publication WO 96/26432 and U.S. Pat. No. 5,677,196), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR), 표면 전하 센서(surface charge sensor) 및 표면력 센서(surface force sensor)에 기초한 것과 같은 다른 검출 방식들은 본 발명의 많은 실시예에서 호환된다.

또한, 일 실시예는 키메라 TGF-베타 슈퍼패밀라 단백질 및 그의 결합 단백질(예를 들어, TGF-베타 수용체 단백질 또는 그들의 단편)간의 상호작용을 방해 또는 증가시키는 제제를 동정하기 위한 "두 혼성체 분석(two hybrid assay)"이라고도 알려진 상호작용 트랩 분석(interaction trap assay)의 이용을 고려한다. 예를 들어, U.S. Pat. No. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; 및 Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696)를 참조할 수 있다.

일 실시예의 키메라 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체, 세포 및 다른 시약은 시험관 내 및 생체 내 모두에서 매우 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어, 대표적인 실시예에서, 이러한 시약들은 미네랄화, 골 형성 및 골 손실의 과정을 연구하기 위해 시험관 내 또는 생체 내(예를 들어, 동물 모델 내)에서 사용될 수 있다. 또한, "넉인(knock in)" 및 "넉아웃(knock out)" 동물들은 질병 동물 모델로서 또는 키메라 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 상호작용하는 화합물을 스크리닝하는 도구(하기에 더 논의됨)로서 사용될 수 있다. 임의의 적합한 벡터가 폴리뉴클레오티드를 세포 또는 대상에 전달하는 데 사용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 전달 벡터의 선택은 표적 숙주의 연령 및 종, 생체 내 대 시험관 내 전달, 목적 발현의 수준과 지속성, 의도된 목적(예를 들어, 치료용 또는 스크리닝용), 표적 세포 또는 기관, 전달의 경로, 분리된 폴리뉴클레오티드의 크기, 안전성 문제 등을 포함하는 당업계에 알려진 여러 요인에 기초하여 이루어질 수 있다.

일 실시예의 키메라 폴리펩티드는 생체 내를 포함하는 다양한 생물학적 시스템에서 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 임의의 다양한 당업계에 공지된 방법을 키메라 단독 또는 다른 활성제와 조합하여 투여하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 투여는 주사 또는 시간에 따라 점진적인 주입에 의해 비경구적일 수 있다. 제제는 경구, 직장, 구강(예를 들어, 혀 밑), 질, 비경구(예를 들어, 피하, 골격근, 심근, 횡격막근 및 평활근을 포함하는 근육 내, 피내, 정맥내, 복강내), 국부(예를 들어, 기도 표면을 포함하는 피부 및 점막 표면 모두), 비강내, 경피, 관절내, 척수강내 및 흡입 투여, 직접적인 기관 주사(예를 들어, 간으로, 중추신경계로의 전달을 위한 뇌로, 췌장으로)뿐만 아니라 내문 전달에 의한 간으로의 투여와 같은 수단에 의해 투여될 수 있다. 임의의 주어진 경우에 있어서 가장 적절한 경로는 치료되는 상태의 성질 및 중증도 및 사용되는 특정 화합물의 성질에 따라 달라질 것이다.

일 실시예는 또한, 대상 키메라 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 제제를 제공한다. 약학적 제제는 조직의 성장을 촉진 또는 대상, 바람직하게는 인간의 조직의 손실의 감소 또는 방지하기 위해 사용될 수 있다. 목표 조직은 예를 들어, 골, 연골, 골격근, 심근 및/또는 신경 조직일 수 있다.

또 다른 측면에서, 키메라 TGF-베타 폴리펩티드는 단독으로 또는 투여를 위한 다른 제제들(예를 들어, 로션, 크림, 스프레이, 겔 또는 연고)과 조합되어 제제화될 수 있다. 독성을 감소시키거나 생체적합성을 증가시키기 위해 리포솜으로 제제화할 수 있다. 전달을 위한 다른 방법들은 미소구체(microsphere) 또는 프로테노이드(proteinoid) 내에서의 캡슐화, 에어로졸 전달(예를 들어, 폐로) 또는 경피 전달(예를 들어, 이온토포레시스(iontophoresis) 또는 경피 전기천공법(transdermal electroporation)에 의해)을 포함하는 경구 방법을 포함한다. 다른 투여 방법들이 당업자에게 알려질 것이다.

키메라 TGF-베타 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기름(예를 들어, 올리브유) 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스터이다. 수성 담체의 예시는 물, 염수 및 완충 배지, 알코올성/수성 용액 및 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구용 운송 수단의 예시는 염화나트륨 수용액, Ringer의 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 젖산화된 Ringer 및 고정유를 포함한다. 정맥 주사용 운송 수단은 액체 및 영양 보충제, 전해질 보충제(Ringer의 덱스트로오스에 기초한 것과 같은) 등을 포함한다. 방부제 및 다른 항균제, 항산화제, 킬레이트제, 불활성 가스 등과 같은 다른 첨가제들 또한 포함될 수 있다.

일 실시예는 TGF-베타 단백질 패밀리 구성원에 의해 조절될 수 있는 다양한 질병이나 장애를 제공하며, 상기 질병이나 장애는 키메라 TGF-베타 폴리펩티드의 치료학적 유효량을 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 이러한 장애를 가지거나 가질 위험이 있는 대상에게 접촉시키거나 투여하는 것을 포함한다.

치료학적 유효량은 대상의 질병이나 장애에 관련된 증상을 감소시키기에 충분한 양으로서 측정될 수 있다. 전형적으로, 대상은 질병 또는 장애의 증상을 적어도 50%, 90% 또는 100% 완화시키기 위해 충분한 치료학적 조성물의 양으로 치료된다. 일반적으로, 최적 투여량은 대상의 체중, 연령, 체중, 성별 및 증상의 정도와 같은 요인 및 장애에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 골 형태발생과 관련하여, 투여량은 재구성에 사용된 기질의 유형 및 조성물 내 화합물의 유형에 따라 선택적으로 달라질 수 있다. 또한, 다른 공지된 성장 인자의 최종 조성물에의 첨가는 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 진행과정이 골 성장 및/또는 수선의 주기적 평가, 예를 들어, X-선, 조직형태학적 결정 및 테트라사이클린 표지에 의해 모니터링될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 적절한 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, 전형적으로, 적절한 양은 0.01 내지 40 mg/kg 체중이다.

이전에 언급한 바와 같이, 일 실시예의 조성물 및 방법은 추가적인(키메라 TGF-베타 폴리펩티드에 추가하여) 치료학적 제제(예를 들면, TNF의 억제자, 항생제 등)의 사용을 포함할 수 있다. 키메라 TGF-베타 폴리펩티드, 다른 치료학적 제제 및/또는 항생제는 동시에 투여될 수 있지만, 순차적으로 투여될 수도 있다.

일 실시예에 따라 키메라를 포함하는 약학적 조성물은 담체, 부형제 및 첨가제 또는 보조제를 이용하여 대상에게 투여하기에 적합한 형태일 수 있다. 자주 사용되는 담체 또는 보조제는 탄산마그네슘, 이산화티탄, 락토오스, 만니톨 및 다른 당, 탈크, 우유 단백질, 젤라틴, 전분, 비타민, 셀룰로오스 및 그의 유도체, 동물성 및 식물성 기름, 폴리에틸렌 글리콜 및 증류수, 알코올, 글리세롤 및 다가 알코올과 같은 용매를 포함한다. 정맥 주사용 운송 수단은 액체와 영양 보충제를 포함한다. 방부제는 항생제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 기체를 포함한다. 다른 약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 그 내용이 본원에 참조로서 포함되는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975) 및 The National Formulary XIV., 14th ed., Washington: American Pharmaceutical Association (1975)에 기술된 수용액, 비독성 부형제, 염분이 포함된 것, 방부제, 완충제 등을 포함한다. 약학적 조성물의 PH와 다양한 성분들의 정확한 농도는 당업계의 통상적인 기술에 따라 조절된다. Goodman and Gilman's, The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.)를 참조할 수 있다.

일 실시에에 따른 약학적 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. "치료학적 유효량"은 질병 또는 장애에 관련된 증상을 예방, 치료, 또는 적어도 부분적으로 정지시키거나 세포 성장, 증식 또는 분화를 촉진시키는 데 필요한 일 실시예에 따른 제제의 양이다. 이 사용에 대한 효과적인 양은 물론, 질병, 장애 또는 원하는 효과의 정도에 따라 달라질 것이고, 대상의 체중 및 일반적인 상태에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 시험관 내 사용된 투여량은 약학적 조성물의 발생부위에의 투여에 유용한 양에 대한 유용한 지침을 제공할 수 있고, 동물 모델은 질병 또는 장애의 치료에 유효량을 결정하는데 이용될 수 있다. 다양한 고려사항들이 예를 들어, Langer, Science, 249: 1527, (1990); Gilman et al. (eds.) (1990)에 기재되어 있고, 각 문헌들은 본원에 참조로서 인용되어 있다. 약학적으로 활성 화합물의 투여량은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있고, Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa.); Remington, The Science & Practice of Pharmacy, (Lippincott Williams & Wilkins; Twenty first Edition)를 참조할 수 있다. 임의의 특정 화합물의 치료학적 유효량은 화합물마다 및 환자마다 다양할 것이고, 환자의 상태 및 전달 경로에 따라 달라질 것이다. 일반적인 명제로서, 약 0.1 내지 약 100 mg/kg의 투여량은 치료학적 효능을 가질 것이고, 모든 중량은 염이 사용되는 경우를 포함하는 화합물의 중량에 기초하여 계산된다. 높은 수준에서의 독성 우려는 약 10 내지 약 20 mg/kg과 같이 낮은 수준의 정맥 내 투여량을 제한할 수 있고, 모든 중량은 염이 사용되는 경우를 포함하는 화합물의 중량에 기초하여 계산된다. 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 투여량은 경구 투여에 사용될 수 있다. 전형적으로 약 0.5 mg/kg 내지 15 mg/kg의 투여량은 근육 내 주사에 사용될 수 있다. 특정 투여량인 화합물의 약 1 μmol/kg 내지 50 μmol/kg이고, 특히 약 22 μmol/kg 및 33 μmol/kg이 각각 정맥내 또는 경구 투여용이다.

일 실시예에서, 1회 이상의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 투여)는 치료학적 효과를 달성하기 위해 여러 시간 간격(예를 들어, 매시간, 매일, 매주, 매월 등)에 대해 사용될 수 있다.

일 실시예의 조성물 및 키메라는 수의학 및 의학 분야에서 사용된다. 적합한 대상은 조류와 포유류 모두를 포함하나, 포유류가 선호된다. 본원에서 사용된 용어 "조류"는 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에 사용된 용어 "포유류"는 인간, 소, 양, 염소, 고양이, 개, 토끼 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 인간 대상은 신생아, 유아, 청소년 및 성인을 포함한다. 다른 실시예에서, 대상은 간질환 또는 골 및 연골 질환의 동물 모델이다.

본원에서 사용된 "치료학적 유효량의 투여"는 조성물이 그의 의도된 치료학적 기능을 수행할 수 있게 하는 대상에게 일 실시예의 약학적 조성물을 투여하거나 적용하는 방법을 포함하는 것으로 의도된다.

약학적 조성물은 주사(피하, 정맥내 등), 경구 투여, 흡입, 경피 투여 또는 직장 투여에 의하는 것과 같이 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 약학적 조성물은 약학적 조성물을 불활성화할 수 있는 효소, 산 및 다른 천연 조건의 작용으로부터 약학적 조성물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다. 약학적 조성물은 또한, 비경구적으로 또는 복강내 투여될 수 있다. 분산액은 또한, 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 혼합물 및 기름에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 방지하는 방부제를 포함할 수 있다.

주사가능한 사용에 적합한 약학적 조성물은 멸균 주사가능한 용액 또는 분산제의 즉석 제조용 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산제 및 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 무균이어야 하고, 주사가능하기 쉽도록 존재하기 위해 액체여야 한다. 담체는 에를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 그들의 적절한 혼합물 및 식물성 기름을 포함하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 분산제의 경우에 있어서, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살(thimerosal) 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 조성물에 등장성 제제, 예를 들어, 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알코올 또는 염화나트륨을 포함하는 것은 전형적일 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 스테아린산 알루미늄(aluminum monostearate) 및 젤라틴을 포함시킴으로써 초래될 수 있다.

멸균 주사가능용 용액은 약학적 조성물의 필요한 양을 적절한 용매에 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합물과 혼합하고, 필요에 따라 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로 분산제는 약학적 조성물을 염기성 분산매 및 상기 나열된 것들 중 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 운송수단에 혼합함으로써 제조될 수 있다.

약학적 조성물은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화할 수 있는 먹을 수 있는 담체와 함께 경구적으로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물과 다른 성분들은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 포함되거나, 정제로 압축하거나 개인 식단에 직접적으로 포함시킬 수 있다. 경구용 치료학적 투여를 위해, 약학적 조성물은 부형제와 혼입될 수 있고, 섭취가능한 정제, 버칼정(buccal tablet), 트로키(troche), 캡슐, 엘릭서(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 적어도 1%의 활성 화합물의 중량을 포함해야 한다. 물론, 조성물 및 제제의 백분율은 다양할 수 있고, 편리하게 단위 중량의 약 5% 내지 약 80% 사이일 수 있다.

정제, 트로키, 알약, 캡슐 등은 또한 하기의 것들을 포함할 수 있다: 그라가칸트 검(gum gragacanth), 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 인산이칼슘(dicalcium phosphate)과 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제; 및 수크로오스, 락토오스 또는 사카린(saccharin)과 같은 감미제 또는 페퍼민트, 노루발유(oil of wintergreen) 또는 체리 향료와 같은 향미제. 투여 단위 제형이 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 이외에 액상 담체를 포함할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제 또는 단위 투여의 물리적 형태를 변형시키는 것으로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 셸락(shellac), 당 또는 둘 다로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭서는 제제, 감미제로서 수크로오스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리 또는 오렌지 향료과 같은 향미제를 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 제형을 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약학적으로 순수해야 하고, 사용된 양에 있어서 실질적으로 비독성/생체적합성이어야 한다. 또한, 약학적 조성물은 서방성 제제 또는 제형에 혼입될 수 있다.

따라서, "약학적으로 허용되는 담체"는 용매, 분산매, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적으로 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 약학적 조성물과 양립할 수 없는 것을 제외하고는, 치료학적 조성물 및 치료 방법에서 그들의 사용이 고려된다. 또한, 보충적 활성 화합물들이 조성물에 포함될 수 있다.

특정 실시예에서, 치료학적 방법은 임플란트 또는 장치로서 국소적으로, 전신적으로 또는 국부적으로 투여하는 것을 포함한다. 투여될 때, 일 실시예에 기술된 치료학적 조성물은 일반적으로 발열물질이 없고, 생리학적으로 허용되는 형태이다. 또한, 조성물은 바람직하게는 골, 연골 또는 조직 손상 부위에 전달을 위한 점성 형태로 캡슐화되거나 주사될 수 있다. 국부 투여는 상처 치유 및 조직 수선에 적합할 수 있다. 일 실시예의 키메라 이외의 치료학적으로 유용한 제제는 또한 선택적으로 상기 기술된 조성물에 포함될 수 있고, 택일적으로 또는 추가적으로 본원에 기술된 방법에서 키메라와 함께 동시적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 골 및/또는 연골 형성을 위해 바람직하게 조성물은 골 및/또는 연골 손상 부위에 BMP 키메라 또는 다른 치료학적 조성물의 전달, 골 및 연골의 발생시기 위해 구조의 제공이 가능하며, 최적으로 신체에 재흡수가 가능한 기질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기질은 BMP 키메라의 느린 방출을 제공할 수 있다. 이러한 기질들은 다른 이식된 의학 용도에서 현재 사용되는 물질들로 형성될 수 있다.

기질 물질의 선택은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 외관 및 계면 특성에 기초할 수 있다. 대상 조성물의 특정 용도는 적절한 제형을 정의할 것이다. 조성물을 위한 잠재적 기질들은 생분해성이고, 화학적으로 정의된 황산칼슘, 인산 삼칼슘, 수산화인회석, 폴리유산(polylactic acid) 및 폴리무수물(polyanhydride)일 수 있다. 다른 잠재적 물질들은 생분해성이고, 골 또는 피부 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 정의되어 있다. 추가 기질들은 순수한 단백질 또는 세포 외 기질 성분들로 구성된다. 다른 잠재적 기질들은 비생분해성이고, 소결 수산화인회석, 생체 유리, 알루미늄산염 또는 다른 세라믹들과 같이 화학적으로 잘 정의되어 있다. 기질들은 폴리유산 및 수산화 인회석 또는 콜라겐 및 인산 삼칼슘과 같은 물질의 전술한 유형의 임의의 조합으로 구성될 수 있다. 생체용 세라믹은 칼슘-알루미늄산-인산염 및 공극 크기, 입자 크기, 입자 형태 및 생분해성을 변형시키는 공정 내에서와 같이 조성물 내에서 변형될 수 있고, 이 가해질 수 있다.

본원에 개시된 특정 조성물은 국부적으로 피부 또는 점막에 적용될 수 있다. 국부 제형은 피부 또는 각질층 침투 증진제로서 효과적인 것으로 알려진 하나 이상의 매우 다양한 제제들을 더 포함할 수 있다. 이러한 것들의 예시로서 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, 다이메틸아세트아미드, 다이메틸포름아미드, 프로필렌 글리콜, 메틸 또는 이소프로필 알코올, 다이메틸 설폭사이드 및 아존(azone)이 있다. 제형을 화장용으로 허용되는 제형으로 만들기 위해 추가적인 제제가 더 포함될 수 있다. 이러한 것들의 예시로서 지방, 왁스, 기름, 염료, 향료, 방부제, 안정제 및 계면활성제가 있다. 당업계에 공지된 것과 같은 각질용해제 또한 포함될 수 있다. 예시로서 살리실산 및 황이 있다.

투여의 용이성 및 투여량의 일정함을 위해 단위 투여에서 비경구용 조성물을 제형화하는 것이 특히 바람직하다. 본원에서 사용된 "투여 단위 제형"은 치료되는 개체에 대한 단일 투여량으로서 적절한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다; 약학적 조성물의 미리 결정된 양을 포함하는 각 단위는 필요한 약학적 담체와 관련하여 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된다. 일 실시예의 투여 단위 제형에 대한 설명은 약학적 조성물의 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료학적 효과와 관련이 있다.

주요 약학적 조성물은 허용가능한 투여 단위에서 적합한 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 유효량의 편리하고 효과적인 투여를 위해 배합된다. 보충적 활성 성분을 포함하는 조성물의 경우, 투여량은 통상적인 투여량 및 상기 성분의 투여 방식을 참조하여 결정된다.

치료제로서 키메라를 사용하는 것에 따르는 어려움 중 하나는 단백질을 효과적으로 전달하는 능력이다. 일 실시예의 키메라는 여러가지 다른 방법으로 전달될 수 있다. 혈류에서, 대부분의 TGF-β 리간드의 반감기는 분 단위이다. 이렇게 빨리 분해되는 리간드를 보충하기 위한 현재의 TGF-β 리간드를 포함하는 치료법은 매우 높은 투여량의 단백질을 사용한다. 택일적으로, 리간드 또는 전달 시스템을 직접적으로 변형하는 몇 가지 수단들이 리간드의 안정성 또는 서방성을 개선시키는데 도움이 되도록 이용가능하다.

(1) 단백질의 직접적인 변형은 변형의 일반적인 형태 중 하나로서 페길화(PEGylation)를 포함한다. 이 방법에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 용해도, 단백질 분해에 대한 저항성 및 감소된 면역원성을 증가시킴으로써 안정성을 개선하기 위해 단백질에 공유적으로 부착된다.

(2) 단백질 표면 위의 잔기의 합리적인 변형. 전체 단백질 기능의 변화없이 어떠한 정전기적 불안정성을 개선함으로써, 분자의 전반적인 안정성이 개선될 수 있다. 연속체 정전기적 모델을 이용하여 불안정성에 기여하는 잔기를 찾아낼 수 있고, 그 후 그것이 보다 유리한 잔기로 변이될 수 있는 지를 분석할 수 있다.

(3) 리간드를 또 다른 단백질 또는 단백질의 일부에 융합시키는 것은 단백질 안정성 및 용해도를 증가시키는 또다른 기술이다. 항체 불변 부위(antibody constant fragment, Fc)는 안정성 및 용해도를 개선시키는데 사용되는 일반적인 융합 파트너이다.

(4) 리포솜의 이용은 단백질 운송수단으로서 사용될 수 있다. 리소폼들은 구를 형성하기 위해 자가조립되는 여러가지 다른 인지질로 구성되어 있다. 목표 단백질은 외부 환경으로부터 보호하는 이중층 내부에 캡슐화된다. 인지질 조성물은 리포솜의 정확한 성질에 영향을 미치고, 원하는 여러 조건 하에서 단백질을 방출할 수 있다. 폴리머/리포솜 복합 시스템은 또한 전달 시스템으로서 사용되는 것에 이용가능하다. 이상적으로, 시스템의 이 유형은 단백질 전달을 개선시키기 위한 각 시스템의 이점을 결합한다.

(5) 리포솜과 유사하게, 폴리머는 단백질 약물 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 폴리머는 물질의 높은 물 함량 때문에 일반적으로 하이드로겔(hydrogel)이라 불리는 기질을 만드는 데 사용된다. 겔을 사용하는 이점은 장기간, 서방성뿐만 아니라 단백질 분해로부터 단백질을 보호하는 것이다. 리포솜과 마찬가지로, 겔을 만드는 데 사용되는 폴리머는 그의 특성에 영향을 미친다. 하이드로겔을 만드는데 사용되는 물질에 대해 두 가지 일반적인 분류가 있다: 천연 및 비천연 폴리머. 천연 폴리머를 사용하는 하이드로겔을 생성하는 데 사용되는 일반적인 물질은 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 히알루론산, 알긴산염, 키토산 및 덱스트란을 포함한다. 하이드로겔을 만드는 데 사용되는 합성 폴리머는 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(아크릴산), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(비닐 알코올) 및 폴리포스파젠을 포함한다.

(6) 다른 종류의 하이드로겔이 천연 또는 비천연 중 하나의 폴리머의 사용없이 생성될 수 있다. 생체활성 유리 또는 크세로겔(Xerogel)로 간주되는, 이 물질은 목표 단백질의 흡수능이 있는 실리카 및 인산 칼슘 층으로부터 생성된다. 크세로겔은 단백질의 서방성 지속시간을 몇 주를 증가시킨다. MTT 분석에 의한 조골세포주 MC3T3을 이용한 세포 생존력 분석의 결과는 크세로겔 물질이 우리가 실험한 배양 배지에서 30 mg/ml의 최고 농도까지 비독성임을 나타낸다.

일 실시예의 키메라 폴리펩티드는 단독 또는 조합하여 간 질환(비알코올성 지방간, 간 섬유증, 간염을 포함하지만, 이에 제한되지는 않음) 또는 골 및 연골 질환(골다공증, 치주질환, 관절 연골에 부상과 같은 연골 장애 및 연골 손상, 골관절염(osteoarthritis), 늑연골염(costochondritis), 허니아형성(herniation), 연골 형성 부전증(achondroplasia), 재발성 다발 연골염(relapsing polychondritis), 양성 또는 암이 아닌 종양, 또는 악성 또는 암성 종양을 포함하지만, 이에 제한되지는 않음)으로부터 고통받는 대상을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 실시예의 키메라는 골 및/또는 연골 형성, 골 손실/밀도 또는 미네랄 소실의 억제, 골 침착의 증진 등을 촉진하는 데 사용될 수 있다. 택일적으로, 일 실시예의 키메라는 과도한 골 밀도 및 성장을 억제하는 데 사용될 수 있다.

실시예

실시예 1

디자이너 리간드의 생성을 위한 도메인(빌딩 블록(Building Blocks))의 설명

키메라를 생성하기 위해 첫 번째 단계는 각 도메인에 대한 경계를 만드는 위치를 결정하는 것이었다. 키메라 라이브러리는 두 개의 서열 소스로서 액티빈-βA 및 BMP-6를 이용하여 구축되었다. 액티빈/BMP-6(AB) 키메라를 만들기 위해 도메인에 대한 컷오프(cut-off) 영역(접합부)을 설계하기 위해 단백질 서열 정렬과 조합된 구조 유도 접근법이 사용되었다. 처음에는, 액티빈-βA (Harrington et al., 2006) 및 BMP-6 (Allendorph et al., 2007)의 3차원 결정 구조가 구조적으로 검사되었다. 이 분석으로부터 리간드는 느슨하게 6개의 개별 도메인으로 나뉘었다(도메인 1 내지 6에 대한 도 4 참조). 접합부의 결합의 결과로서 각 단백질 서열의 임의의 서열 변화를 최소화하기 위해 두 리간드의 단백질 서열 정렬 후 정확한 도메인 접합부가 궁극적으로 결정되었다. 또한, 도메인 경계는 수용체 결합 부위로부터 떨어진 구조적 영역에 위치하도록 선택되었다.

접합부에 대한 자세한 설명: 도메인 1 및 2 사이(접합부 1): 도메인 1 및 도메인 2의 경계에 초점을 두어, 우리는 BMP-6 및 액티빈-βA 사이에 매우 보존된 10-잔기 영역을 발견하였다. 실제로, 10개 잔기 중 8개는 동일하고, 다른 2개는 매우 보존적인 차이이다. 이 영역은 손가락 1의 끝부분에 위치하고, 리간드에 따라, 각 수용체 유형에 제한된 접촉을 만들거나 만들기 위해 예측된다. BMP-2/BMPRIa/ActRII의 삼원성 결정 구조(Allendorph et al., 2006)에 기초하여, 오직 Val-26, Gly-27 및 Trp-28 (BMP-2 번호 매김)이 유형 I 수용체와의 접촉을 일으킨다. 이 3개의 잔기 중, 오직 Val-26이 리간드들 사이에서 다르지만, 액티빈-βA 및 BMP-6 내 상응하는 잔기가 각각 Ile-23 및 Leu-43이기 때문에, 매우 보존적인 변화이다. 이 영역 내 잔기는 매우 유사하고 수용체 결합과 관련되지 않기 때문에, 도메인 1 및 2에 대한 좋은 경계 지점을 만든다.

도메인 2 및 3 사이 (접합부 2): 도메인 2 및 3 사이에 경계 영역으로 이동하면, 우리의 경계 컷오프를 위한 또 따른 좋은 영역이 찾아질 수 있다. 여기에는 6개의 잔기 중 4개가 동일한 액티빈-βA 및 BMP-6 사이의 6개 잔기의 매우 보존된 영역이 존재한다. 리간드가 적절하게 접혀지면, 이 영역은 시스테인 매듭 내 참여한 모든 시스테인과 함께 다이머의 중앙에 위치한다. 이것은 여기 잔기가 리간드의 표면으로부터 묻히고, 어떠한 리간드-수용체 상호작용에 참여하지 않기 때문에 유리하다.

도메인 4 및 5 사이 (접합부 4): 도메인 2/3 경계와 유사하게, 도메인 4/5 경계는 컷오프를 위한 훌륭한 장소에 위치해 있다. 여기에서 우리는 6개의 잔기 중 4개의 동일한 잔기를 가진 액티빈-βA 및 BMP-6 사이에 매우 보존된 6개 잔기 영역을 찾았고, 이 영역은 또한, 리간드 다이머의 중앙에 묻혀있다. 2개의 시스테인 잔기는 모두 시스테인 매듭뿐만 아니라 모노머간 이황화결합에 참여한다. 또한, 이 위치는 이 영역 내 잔기가 수용체 결합 상호작용에의 참여하는 것을 방지한다.

도메인 5 및 6 사이 (접합부 5): BMP-6 및 액티빈-βA 키메라의 설계를 확장하기 위해, 다른 경계 영역들이 TGF-β 슈퍼패밀리의 모든 구성원을 이용하여 RASCH 구조를 생성하는 것을 촉진하기 위해 선택된다. 구조적 건축을 공유하는 것과 함께, TGF-β 슈퍼패밀리 리간드는 매우 보존된 그들의 단백질 서열 내 특정 영역을 갖는 것으로 보인다. 흥미롭게도, 이러한 영역들은 BMP-2 및 액티빈-βA 키메라를 제조하기 위해 선택된 경계 영역과 일치한다. 예를 들어, 4 및 5의 경계 영역에서, 대부분의 리간드는 경계 도메인을 정의하는 4개의 잔기 중 3개를 공유한다. 이러한 높은 정도의 유사도는 수용체 결합 부위로부터 분리된 이러한 영역과 결합되어 새로운 기능을 가진 디자이너 리간드의 라이브러리를 생성하기 위한 보편적인 전략으로서 RASCH를 나타낸다.

도메인 3 및 4 사이 (접합부 3): 도메인 3 및 4 사이의 경계는 리간드-수용체 조립 메커니즘 실질적으로 다를 수 있는 상이한 서브패밀리 간의 구조적 다양성의 대상이 된다. 특정 실시예에서, 도메인 3 및 4는 구조적 완전성을 보전하기 위해 두 도메인이 그들의 통상적인 부모 가닥으로부터 유래될 수 있도록 하나의 분절 조각으로서 다뤄질 수 있다.

모든 TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드 사이의 구조적 유사성은 분자 인식과 같은 특정 기능을 수행하는 것으로 알려진 관련 도메인의 서열을 교환(교체)함으로써 키메라 단백질의 설계에 대한 합리적인 기반을 형성한다. 항체 사슬 또는 보다 구체적으로는 항체 단편(Fab)의 단백질 공정은 에피토프 결합 특이성의 역할을 책임지는 2개의 사슬 각각으로부터 3개씩인 6개의 가변 고리인 경쇄 및 중쇄 서열의 핵심 구조상에 지어진 구조적 뼈대는 대표적인 예시가 될 것이다. 비슷한 맥락에서, TGF-베타 슈퍼패밀리 리간드는 그들의 구조적 뼈대를 나비 같은 건축으로서 공유한다. 항체의 가변 고리 영역과 기능적으로 동등한 도메인의 서열 일부는 하나의 리간드로부터 또 다른 리간드로의 인식 특이성을 전이하기 위해 '이식'될 수 있다. 우리의 설계 원리는 전술한 '서열 이식에 의한 기능적 전이'로부터 구별된다. 새로운 키메라 라이브러리는 각 접합부에 의해 정의되는 각 도메인의 구조적 타당성에 기초하여 생성된다. 본 개시물의 키메라를 생성하는 데 사용되는 TGF-베타 패밀리 구성원의 다양한 도메인 간의 접합부는 키메라 라이브러리의 유용한 빌딩 블록(building block)을 제공한다. 이러한 이유로, 접합부 3은 광범위하게 적용될 수 없음에 반해 접합부 1, 2, 4 및 5는 모든 TGF-베타 슈퍼패밀리 구성원에 광범위하게 적용될 수 있는 것으로 잘 정의 되어 있다. 접합부 3의 키메라 설계에의 적용은 표적 서열에 따라 달라진다. 이 접근법은 접힐 수 있는 이러한 단백질 생성물을 생성하는 기회를 최대화하고, 그로 인한 기능적 특성화가 이어질 것이다.

실시예 2

TGF-β 키메라의 생성

이러한 신규 TGF-β 리간드를 생성하기 위해, 수정된 직접적 진화 접근법이 이용되었다. 전형적으로, 이 기술은 상동성 유전자의 서열을 혼합하거나 무작위 돌연변이를 삽입한 다음 원하는 리간드 특성을 스크리닝함으로써 10³보다 많은 숫자의 무작위 단백질 서열을 만드는 것을 포함한다. 구조 유도 접근법을 이용하여, 몇몇의 TGF-β 리간드 결정 구조가 분석되고, 6개의 개별 도메인으로 나뉘었다. 이러한 도메인들은 리간드의 하기의 영역을 대략적으로 포함한다: 도메인 1, N-말단 및 베타 가닥 1; 도메인 2, 베타 가닥 2; 도메인 3, 예비 나선 루프; 도메인 4, 알파 나선; 도메인 5, 베타 가닥 3; 및 도메인 6, 베타 나선 4 및 C-말단. 이 계획을 이용하여, 재조합되기 위해 선택된 TGF-β 리간드들의 각 세트에 대해 64개의 상이한 리간드 조합들이 가능하다. 두 개 이상의 부모 사슬이 서로 다른 서브패밀리(예를 들어, BMP/GDF v.s. TGF베타)로부터인 경우, 만약 도메인 3 및 4가 분리되면 그들의 신호전달 메커니즘 간의 차이는 포착되지 않을 수 있다. 설계 원리로서 광범위하게 적용가능하기 위해서는 부모 유전자 중 각각의 하나의 도메인(도메인 3*4로서 언급됨)으로서 취급될 수 있는 도메인 3 및 4인 두 구조적 도메인을 유지하는 것이 또한, 설계의 일부이다.

이 전략은 목표 리간드로서 선택된 액티빈-βA가 TGF-β 유형 II 수용체에 높은 친화도를 가지기 때문에, 액티빈/BMP-6 키메라를 제조함으로써 구현될 수 있다. 생물학적으로 매우 흥미로운 BMP-6가 선택되었다. 다양한 도메인을 설계하기 위해, BMP-6 및 액티빈-βA의 서열 정렬이 리간드 사이의 서열 동일성의 영역을 찾아내기 위해 수행되었다(도 4). 이러한 영역들은 상이한 도메인들에 대한 경계로서 사용되었다. PCR 동안 서열의 이러한 부분들을 올리고뉴클레오티드에 대한 중첩 영역으로서 사용함으로써, 변화가 BMP-6 또는 액티빈-βA 서열 중 하나에 도입되지 않을 것이다. 그 후, 서열 정렬은 궁극적으로 6개 도메인을 결정하기 위해 이전에 풀어낸 BMP-6 및 액티빈-βA 구조 데이터와 함께 사용되었다(도 4a 내지 c). 서열 사이의 동일성 영역에 대한 제한 때문에, 도메인들은 이상적으로 약간씩 이동되어야 했다. 특히, 베타 가닥 3의 시작에 대한 잔여 α-나선이 다른 도메인들에 위치하는 반면, 예비 나선 고리 및 대다수의 α-나선이 하나의 도메인과 결합된다(도 4b 및 c).

키메라는 그들이 포함된 도메인에 따라 표지되었다. 예를 들어, 1b2b3b4a5a6b에서, b들은 BMP-6로부터 얻어진 도메인을 나타내고, a들은 액티빈-βA로부터 유래된 도메인을 나타낸다.

AB604 (서열번호 12)로 설계된 하나의 액티빈/BMP-6의 키메라는 도 5에 나타내었다. (서열번호 11은 AB604의 DNA 서열을 나타낸다.)

실시예 3

단백질 발현 및 정제

액티빈/BMP-6 키메라는 E. coli BL21(DE3)를 이용한 전형적인 E. coli 발현 시스템을 이용하여 발현되었고, 키메라는 봉입체 부분에서 발견되었다. 발현된 봉입체는 분리되고, 정제되고, 리폴딩되었다. 리폴딩된 리간드는 역상 크로마토그래피(GraceVydac)에 의해 정제되었다. 리간드를 동결건조시켰고, 모든 세포 기반 분석에서의 사용을 위해 1 mM HCl에 재현탁 시키거나 모든 생물물리학적 분석을 위해 10 mM Na acetate, pH 4에 재현탁되었다. 액티빈-βA는 안정적으로 세포감염된 CHO 세포주에서 발현되었고, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 정제되었다.

AB604로서 설계된 액티빈/BMP-6 키메라의 하나는 도 5에 나타내었다. 봉입체 내 AB604 단백질은 환원된 SDS-PAGE 겔 상에서 단일 밴드로 나타났고, AB604가 봉입체 내에서 모노머로 존재한다는 것을 뜻하는 약 15 kDa(도 6; "R"로 표지된 레인(lane))의 예측된 크기로서 발견되었다. AB604를 50 mg/L, 100 mg/L 또는 200 mg/L의 농도로 600 mL 부피로 리폴딩되었다. 리폴딩 후, 단일 밴드들이 비환원 SDS-PAGE 겔 상에서 나타났고, AB604가 성공적인 리폴딩 후에 다이머로서 존재한다는 것을 의미하는 약 30 kDa(도 6; "NR"로 표지된 레인)의 예측된 크기로서 발견되었다. 농도는 이전에 성공적으로 BMP-2 및 AB204 리폴딩에 기초하여 선택되었다.

리폴딩 후에, 액티빈/BMP-6 키메라는 Vydac C4 컬럼(10x250mm)과 함께 Agilent HPLC 시스템을 이용하여 정제되었다. 정제된 액티빈/BMP-6 키메라는 환원된 또는 비환원된 SDS-PAGE 겔 상에서 이황화결합된 다이머로서 확인되었다(도 7).

AB604는 AB204(액티빈/BMP-2 키메라의 하나)보다 높은 수율을 나타냈다. 리폴딩 단계는 생산동안 액티빈/BMP 키메라 단백질의 전반적인 수율을 결정하는 중요한 단계이다. 따라서, 수율은 리폴딩 부피의 1L에서 성공적으로 리폴딩된 단백질의 양으로서 계산되었다. AB604의 수율은 AB204의 수율보다 10배 높은 50 mg/L이다(표 3).

	AB604	AB204
리폴딩 부피	600 mL	200 L
리폴딩 후 회복된 단백질의 양	120 mg	50 g
정제된 양	30 mg	1 g
수율(기초: 1L 재접힘 부피)	50 mg/L	5 mg/L

실시예 4

Smad-1 신호전달 활성

성공적인 리간드로 간주되기 위해, 액티빈/BMP-6 키메라는 리폴딩 가능해야 할 뿐만 아니라 신호전달 특성을 나타낼 필요가 있다. 이러한 특성을 시험하기 위해, 리폴딩 효율에 관계없이 액티빈/BMP-6 키메라는 초기에 신호전달 활성 분석의 대상이 되었다. BMP 유사 신호전달 특성은 Smad-1 신호전달 활성(하기에 설명함)에 민감한 전체 세포 루시페라아제 리포터 분석을 이용하여 시험되었다. BMP-2는 BMP-6에 비하여 높은 Smad-1 신호전달 활성을 나타낸다는 것이 이전에 밝혀졌다(도 3). AB604는 BMP-6에 비해 높은 활성을 나타냈고, 놀랍게도 심지어 BMP-2보다도 높은 활성을 나타냈다(도 8).

또한, AB604의 Smad-1 신호전달 활성은 EC₅₀ 값에서 AB204의 값보다 7배 더 강력하였다(도 9).

C2C12 세포에서의 Smad-1 루시페라아제 분석이 하기와 같이 수행되었다. Smad1-의존성 루시페라아제 분석은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 수행되었다. 간단히 말해, C2C12 근섬유 세포가 L-글루타민 및 항생제가 보충된 Dulbecco의 최소 필수 배지 (DMEM)+10% FBS에서 배양되었다. 루시페라아제 리포터 분석에서, pvhemf이 트립신으로 처리되었고, PBS로 2회 세척되었고, 1.0% FBS를 포함하는 OptiMEM과 함께 96-웰 플레이트에 플레이팅되었다. 그 후, 세포들은 제조자의 지시에 따라 Fugene6 (Roche)을 이용함으로써 Smad 결합 부위(Id1-Luc), Smad1 발현 구조체 및 CAGGS-LacZ 플라스미드를 포함하는 1147Id1-루시페라아제 구조체로 세포감염되었고, 세포들은 세포감염 24시간 후에 첨가된 BMP-6, BMP-2 또는 액티빈/BMP-6 키메라의 증가되는 양(0.4 ng/ml, 1.2 ng/ml, 3.7 ng/ml, 11 ng/ml, 33 ng/ml, 100 ng/ml, 333 ng/ml, 1,000 ng/ml, 3,333 ng/ml 및 10,000 ng/ml)과 함께 자극되었다. 루시페라아제 활성은 리간드와 함께 자극 후 16시간 뒤에 측정되었고, 그 값은 베타-갈락토시다아제 활성을 이용함로써 세포감염 효율을 위해 표준화되었다.

실시예 5

Smad-2 신호전달 활성

액티빈/BMP6 키메라 또한 액티빈 A의 서열을 포함하기 때문에, 액티빈/BMP-6 키메라의 액티빈 유사 신호전달 특성은 Smad-2 신호전달 활성(하기에 설명됨)에 민감한 전체 세포 루시페라아제 리포터 분석을 이용하여 시험되었다. TGFβ1은 Smad-2 신호전달 활성을 갖는 것으로 잘 알려져 있기 때문에, TGFβ1을 양성 대조군으로 사용하였다. AB604는 Smad-2 신호전달 경로에서 거의 아무런 신호전달 활성을 나타내지 않지만, TGFβ1는 예측된 바와 같이 그의 활성을 나타내었다(도 10). 요약하면, 액티빈 A 및 BMP6의 서열로 구성된 액티빈/BMP6 키메라의 하나인 AB604는 BMP6로부터의 신호전달 특성을 승계하였지만, 액티빈 A로부터의 것은 그러지 않았다.

HEK293T 세포에서의 Smad-2 루시페라아제 분석이 하기와 같이 수행되었다. Smad2-의존성 루시페라아제 분석은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 수행되었다. 요약하면, HEK293T 세포는 L-글루타민과 항생제가 보충된 Dulbecco의 최소 필수 배지 (DMEM)+10% FBS에서 배양되었다. 루시페라아제 리포터 분석에서, 세포들은 트립신으로 처리되었고, PBS로 2회 세척되었고, 1.0% FBS를 포함하는 OptiMEM과 함께 96-웰 플레이트에 플레이팅되었다. 그 후, 세포들은 제조자의 지시에 따라 Fugene6 (Roche)을 이용하여 활성화 반응 요소(activing response elements, ARE)의 3회, FAST2 발현 구조체 및 베타-갈락토시다아제 발현 플라스미드를 포함하는 A3 Lux 구조체로 세포감염되었고, 세포들은 세포감염 24시간 후에 첨가된 리간드의 증가되는 양(예를 들어, AB604의 0.01 ng/ml, 0.1 ng/ml, 1.0 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml 또는 TGFβ1의 0.0005 ng/ml, 0.005 ng/ml, 0.05 ng/ml, 0.5 ng/ml, 5 ng/ml, 50 ng/ml, 및 500 ng/ml)과 함께 자극되었다. 루시페라아제 활성은 리간드와 함께 자극 후 16시간 뒤에 측정되었고, 그 값은 베타-갈락토시다아제 활성을 이용함로써 세포감염 효율을 위해 표준화되었다.

실시예 6

TGFβ 신호전달의 억제

AB604는 루시페라아제 리포터 분석에 의해 관찰된 바와 같이 HEK293T 세포에서 BMP6보다 더 강력하게 TGFβ1의 신호전달 활성을 억제시키는 것으로 나타났다. TGFβ1-반응성 A3 프로모터가 다양한 농도에서 BMP6 또는 AB604의 존재 또는 부재 하에 HEK293T 세포에서 TGFβ1에 의해 활성화되었을 때, TGFβ1에 의한 최대로 달성가능한 신호전달 활성이 BMP6 또는 AB604의 존재에 의해 용량의존적인 방식으로 억제되었다(도 11 내지 도 14). 이런 억제성 효과는 BMP6에 의한 것보다 AB604에 의한 것이 더 두드러졌다. 예를 들어, 도 12 및 도 14는 각각 BMP6 및 AB604에 의한 TGFβ1-매개 루시페라아제 활성의 용량의존적 감소를 나타낸다. AB604는 이미 1 ng/ml에서 TGFβ1 활성의 통계적으로 유의한 감소를 보인 반면(도 12), BMP6는 100 ng/ml에서 그러하였다(도 14).

실시예 7

노긴(Noggin) 민감도

BMP2 신호전달은 BMP2에 결합하고 세포막 위에서 그의 동족 수용체와 결합하는 것으로부터 방지하는 천연 길항제 노긴에 의해 조절된다. BMP6는 노긴에 의해 약하게 억제되는 것으로 알려져 있다. C2C12 세포에서 BMP 반응성 루시페라아제 리포터 분석이 AB604가 노긴에 민감한지 아닌지 확인하는 데 사용되었다. C2C12 세포는 Id1-luc, Smad1 및 β-갈락토시다아제로 일시적으로 세포감염시킨 후, 표시된 몰 비율의 보충된 노긴과 함께 다양한 농도에서 BMP2, BMP6 또는 AB604로 처리하였다. 모든 BMP2, BMP6 또는 AB604는 루시페라아제 활성의 용량의존성 증가를 나타내었으나(도 15), 노긴에 의한 활성의 억제는 BMP2에서만 관찰되었다(도 15A). BMP6 또는 AB604의 활성은 노긴에 의해 유의미하게 영향을 받지 않았고, BMP6 및 AB604 모두의 노긴에 무감각함을 암시하였다.

실시예 8

헵시딘(hepcidin) 유전자 발현의 활성화

BMP6는 간세포에서 헵시딘의 발현을 조절한다. 헵시딘은 세포막에서 페로포틴(ferroportin, FPN) 분해의 그의 작용에 의한 전신 및 간의 철 항상성의 주 조절자, 세포막에서의 철 유출 수송자로서 알려져 있다. 헵시딘 유전자 발현을 유도하는 것에 있어서 BMP6 및 AB604의 효과는 Hep3B 및 HepG2 세포에서 시험되었다. BMP6 및 AB604 모두 대조군에 비해 Hep3B 세포 및 HepG2 세포 모두에서 헵시딘의 mRNA 수준을 유의미하게 증가시켰다. 더욱이, 헵시딘의 mRNA 수준의 증가는 BMP6 처리된 대조군 보다 AB604 처리된 세포에서 유의미하게 더 컸다(도 16). 헵시딘 유전자 발현의 용량의존성 프로필은 BMP6의 것에 비해 AB604의 더 높은 능력을 나타냈고, BMP6 및 AB604의 EC50 값은 3배 차이를 나타냈다(BMP6에 대해 12.89 ng/ml, AB604에 대해 4.42 ng/ml)(도 17).

실시예 9

SMAD 단백질의 인산화

TGFβ 슈퍼패밀리 리간드의 신호전달은 세포질 내의 SMAD 단백질을 포함한다. 예를 들어, BMP6는 SMAD1/5/8 및 액티빈 A를 인산화시키거나 TGFβ1은 SMAD2/3를 인산화시킨다. SMAD1/5/8는 SMAD1, SMAD5 또는 SMAD8를 나타내며, SMAD2/3는 SMAD2 또는 SMAD3를 나타낸다. 일단 인산화되면, SMAD1/5/8 또는 SMAD2/3와 같은 이러한 수용체 SMADs (R-SMAD)는 Co-SMAD 또는 SMAD4와 복합체를 형성하고, 특정 표적 유전자의 발현을 조절하기 위해 실질적으로 핵으로 이동한다. 어떤 SMAD 단백질이 AB604에 의해 인산화되었는 지는 세 개의 다른 세포주에서의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다; C2C12, HEK293T 및 HepG2. 세포들은 TGFβ1, BMP6 또는 AB604로 30분 또는 60분간 처리되었고, 그 후 phospho-SMAD1/5/8 또는 phospho-SMAD2 수준은 웨스턴 블롯에 의해 시각화 되었다. AB604 처리는 모든 세 개의 세포주에서 SMAD1/5/8의 강한 인산화를 유도하였다. BMP6는 AB604에 비해 C2C12 또는 HEK293T 세포에서 SMAD1/5/8의 덜 현저한 인산화를 보였고, HepG2 세포에서 SMAD1/5/8를 거의 인산화하지 않았다. TGFβ1 또한, C2C12 세포에서 어느 정도의 인산화를 보였으나, 다른 세포주에서는 그러지 못 했다. 종합하면, AB604는 가장 유의미한 수준의 SMAD1/5/8 인산화를 유발하였다(도 18). 다른 한편으로, SMAD2 인산화는 TGFβ1에 의해 모든 3개의 세포주에서 강했다. 흥미롭게도, AB604 또한 오직 HEK293T 세포에서만 SMAD2를 인산화시킬 수 있었다(도 19).

<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE joint Center for Biosciences <120> AB6 FAMILY DESIGNER LIGANDS OF TGF-BETA SUPERFAMILY <130> 18P11025 <150> US 62/343,326 <151> 2016-05-31 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 396 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caacagagtc gtaatcgctc tacccagtcc caggacgtgg cgcgggtctc cagtgcttca 60 gattacaaca gcagtgaatt gaaaacagcc tgcaggaagc atgagctgta tgtgagtttc 120 caagacctgg gatggcagga ctggatcatt gcacccaagg gctatgctgc caattactgt 180 gatggagaat gctccttccc actcaacgca cacatgaatg caaccaacca cgcgattgtg 240 cagaccttgg ttcaccttat gaaccccgag tatgtcccca aaccgtgctg tgcgccaact 300 aagctaaatg ccatctcggt tctttacttt gatgacaact ccaatgtcat tctgaaaaaa 360 tacaggaata tggttgtaag agcttgtgga tgccac 396 <210> 2 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Gln Ser Arg Asn Arg Ser Thr Gln Ser Gln Asp Val Ala Arg Val 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg 20 25 30 Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp 35 40 45 Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys 50 55 60 Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val 65 70 75 80 Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys 85 90 95 Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp 100 105 110 Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala 115 120 125 Cys Gly Cys His 130 <210> 3 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggcttggagt gtgatggcaa ggtcaacatc tgctgtaaga aacagttctt tgtcagtttc 60 aaggacatcg gctggaatga ctggatcatt gctccctctg gctatcatgc caactactgc 120 gagggtgagt gcccgagcca tatagcaggc acgtccgggt cctcactgtc cttccactca 180 acagtcatca accactaccg catgcggggc catagcccct ttgccaacct caaatcgtgc 240 tgtgtgccca ccaagctgag acccatgtcc atgttgtact atgatgatgg tcaaaacatc 300 atcaaaaagg acattcagaa catgatcgtg gaggagtgtg ggtgctca 348 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe 1 5 10 15 Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile 35 40 45 Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn 50 55 60 His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp 85 90 95 Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu 100 105 110 Cys Gly Cys Ser 115 <210> 5 <211> 345 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggcctggagt gcgatggccg gaccaacctc tgttgcaggc aacagttctt cattgacttc 60 cgcctcatcg gctggaacga ctggatcata gcacccaccg gctactacgg caactactgt 120 gagggcagct gcccagccta cctggcaggg gtccccggct ctgcctcctc cttccacacg 180 gctgtggtga accagtaccg catgcggggt ctgaaccccg gcacggtgaa ctcctgctgc 240 attcccacca agctgagcac catgtccatg ctgtacttcg atgatgagta caacatcgtc 300 aagcgggacg tgcccaacat gattgtggag gagtgcggct gcgcc 345 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Leu Glu Cys Asp Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe 1 5 10 15 Phe Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro 20 25 30 Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu 35 40 45 Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn 50 55 60 Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys 65 70 75 80 Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu 85 90 95 Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys 100 105 110 Gly Cys Ala 115 <210> 7 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggcatcgact gccaaggagg gtccaggatg tgctgtcgac aagagttttt tgtggacttc 60 cgtgagattg gctggcacga ctggatcatc cagcctgagg gctacgccat gaacttctgc 120 atagggcagt gcccactaca catagcaggc atgcctggta ttgctgcctc ctttcacact 180 gcagtgctca atcttctcaa ggccaacaca gctgcaggca ccactggagg gggctcatgc 240 tgtgtaccca cggcccggcg ccccctgtct ctgctctatt atgacaggga cagcaacatt 300 gtcaagactg acatacctga catggtagta gaggcctgtg ggtgcagt 348 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Ile Asp Cys Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe 1 5 10 15 Phe Val Asp Phe Arg Glu Ile Gly Trp His Asp Trp Ile Ile Gln Pro 20 25 30 Glu Gly Tyr Ala Met Asn Phe Cys Ile Gly Gln Cys Pro Leu His Ile 35 40 45 Ala Gly Met Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn 50 55 60 Leu Leu Lys Ala Asn Thr Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ser Cys 65 70 75 80 Cys Val Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg 85 90 95 Asp Ser Asn Ile Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala 100 105 110 Cys Gly Cys Ser 115 <210> 9 <211> 342 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 acccccacct gtgagcctgc gaccccctta tgttgcaggc gagaccatta cgtagacttc 60 caggaactgg gatggcggga ctggatactg cagcccgagg ggtaccagct gaattactgc 120 agtgggcagt gccctcccca cctggctggc agcccaggca ttgctgcctc tttccattct 180 gccgtcttca gcctcctcaa agccaacaat ccttggcctg ccagtacctc ctgttgtgtc 240 cctactgccc gaaggcccct ctctctcctc tacctggatc ataatggcaa tgtggtcaag 300 acggatgtgc cagatatggt ggtggaggcc 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tatgtcccca aaccgtgctg tgcgccaacc 300 aaactgcgtc cgatgtccat gctgtattac gatgacggcc agaacatcat caaaaaagat 360 atccaaaaca tgatcgtcga agaatgcggt tgtagc 396 <210> 12 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AB604 Polypeptide <400> 12 Gln Gln Ser Arg Asn Arg Ser Thr Gln Ser Gln Asp Val Ala Arg Val 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg 20 25 30 Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp 35 40 45 Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys 50 55 60 Pro Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val 65 70 75 80 Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys 85 90 95 Cys Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp 100 105 110 Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu 115 120 125 Cys Gly Cys Ser 130

Claims (9)

1. 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 도메인의 아미노산 잔기들을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 키메라 폴리펩티드로서,
   상기
   제1 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 1 내지 X_1b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 1 내지 X_1aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 1 내지 X_1ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 1 내지 X_1ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 1 내지 X_1ae로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   제2 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_1b 내지 X_2b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_1aa 내지 X_2aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_1ab 내지 X_2ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_1ac 내지 X_2ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_1ae 내지 X_2ae로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   제3 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_2b 내지 X_3b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_2aa 내지 X_3aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_2ab 내지 X_3ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_2ac 내지 X_3ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_2ae 내지 X_3ae로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   제4 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_3b 내지 X_4b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_3aa 내지 X_4aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_3ab 내지 X_4ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_3ac 내지 X_4ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_3ae 내지 X_4ae로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   제5 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_4b 내지 X_5b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_4aa 내지 X_5aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_4ab 내지 X_5ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_4ac 내지 X_5ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_4ae 내지 X_5ae으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   제6 도메인의 아미노산 잔기들은 서열번호 2의 아미노산 잔기 X_5b 내지 X_6b, 서열번호 4의 아미노산 잔기 X_5aa 내지 X_6aa, 서열번호 6의 아미노산 잔기 X_5ab 내지 X_6ab, 서열번호 8의 아미노산 잔기 X_5ac 내지 X_6ac 및 서열번호 10의 아미노산 잔기 X_5ae 내지 X_6ae으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
   상기
   X_1b-는 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 52이고;
   X_2b는 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 또는 70이고;
   X_3b는 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 또는 88이고;
   X_4b는 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 또는 103이고;
   X_5b는 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 또는 115이고;
   X_6b는 130, 131 또는 132이고;
   X_1aa는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31이고;
   X_2aa는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51이고;
   X_3aa는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74이고;
   X_4aa는 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87이고;
   X_5aa는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100이고;
   X_6aa는 114, 115 또는 116이고;
   X_1ab는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31이고;
   X_2ab는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51이고;
   X_3ab는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74이고;
   X_4ab는 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85 또는 86이고;
   X_5ab는 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99이고;
   X_6ab는 113, 114 또는 115이고;
   X_1ac는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31이고;
   X_2ac는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51이고;
   X_3ac는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74이고;
   X_4ac는 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 또는 87이고;
   X_5ac는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100이고;
   X_6ac는 114, 115 또는 116이고;
   X_1ae는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31이고;
   X_2ae는 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 또는 51이고;
   X_3ae는 55, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 또는 74이고;
   X_4ae는 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 또는 85이고;
   X_5ae는 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 또는 98이고;
   X_6ae는 112, 113 또는 114이고;
   상기 키메라 폴리펩티드는 하나 이상의 형질전환 성장 인자-베타(Transforming Growth Factor-beta, TGF-β) 슈퍼패밀리 구성원; 또는 하나 이상의 TGF-β 수용체와 결합할 수 있고,
   상기 폴리펩티드는 서열번호 12에 기재된 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는, 키메라 폴리펩티드.
   
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5. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 12에 기재된 서열을 포함하는, 키메라 폴리펩티드.
   
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