JP4302877B2 - 新規な骨鉱化蛋白質、ｄｎａ、ベクター及び発現系 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、一般に哺乳類の骨形成原細胞並びに骨及び骨組織の形成に関する。特に本発明は、生体外及び生体内で骨鉱化の効力を促進する新規な蛋白質群及びこれらの蛋白質をコードする核酸に関する。本発明は更に、骨及び骨組織に関する様々な病理状態を処理する方法（例えば脊椎固定術、骨折修復及び骨粗鬆症の処理）を提供する。
２．背景技術
骨芽細胞は多能性間充織幹細胞から分化すると考えられている。骨芽細胞が成熟すると、骨を鉱化形成する細胞外基質が分泌される。この複雑な過程がどのように制御されているのかはよく理解されていないが、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）として知られる信号糖蛋白群が関与していると考えられている。これらの蛋白質は、胎芽の背側−腹側パターン形成、肢芽発達及び成体動物の骨折修復に関与することが示されている［Ｂ．Ｌ．Ｈｏｇａｎ、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：１５８０（１９９６）］。このβ超科型トランスフォーミング増殖因子分泌性蛋白質群は、分化の異なる段階にある様々な種類の細胞において様々な活性を有するが、これら密接に関連する分子間における生理活性の違いは明らかにされていない［Ｄ．Ｍ．Ｋｉｎｇｓｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１０：１６（１９９４）］。
【０００２】
異なるＢＭＰ信号蛋白質それぞれに特異な生理学的役割をよりよく理解するために、ラット頭蓋冠骨芽細胞分化の誘発について、ＢＭＰ−６の効能と、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４の効能とを比較した［Ｂｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３７：３４０１（１９９６）参照］。この研究には、分化の開始にＢＭＰ又はグルココルチコイドを必要とするラット胎児頭蓋冠の第一継代の培養（二次培養）を用いた。この膜性骨形成のモデルにおいて、グルココルチコイド（ＧＣ）又はＢＭＰによって、骨芽細胞特異的蛋白質であるオステオカルシンの分泌が可能な鉱化骨小結節の分化が開始される。この二次培養系は、自然分化を経た一次ラット骨芽細胞培養とは性質が異なる。この二次培養系においては、グルココルチコイドによって、１０倍量のＢＭＰ―６ ｍＲＮＡ及び蛋白質発現が誘発され、骨芽細胞分化が促進された［Ｂｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：２９２０（１９９７）］。
【０００３】
ＢＭＰ等の細胞外信号に加えて、細胞内信号又は調節分子が、新しい骨形成を導く一連の事象において役割を担っているようである。細胞内調節分子の主なものにＬＩＭ蛋白質があり、ＬＩＭ領域として知られる特徴的な構造パターンを有するためにそのような呼び名がある。ＬＩＭ領域は、２−アミノ酸スペーサーによって連結している２個の特異なジンクフィンガーによって構成される、システインに富んだ構造パターンである。ＬＩＭ領域のみを有する蛋白質もあるが、様々な機能領域を更に有する蛋白質もある。ＬＩＭ蛋白質は多種存在し、それには転写因子及び細胞骨格蛋白質が含まれる。ＬＩＭ領域の主要な役割は、ＬＩＭ領域と同一な又は異なるニ量体の形成を通じた、又は特異な蛋白質との結合による、蛋白質−蛋白質間相互作用の媒介であると思われる。
【０００４】
ＬＩＭ同型領域（ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）蛋白質、すなわちＬＩＭ領域と同型領域配列を有する蛋白質において、ＬＩＭ領域は負の調節因子として作用する。ＬＩＭ同型領域蛋白質は、細胞系統決定の制御や分化の調節に関与しているが、ＬＩＭのみの蛋白質も同様の機能を有する。ＬＩＭのみの蛋白質は、そのような蛋白質をコードする遺伝子の幾つかが腫瘍染色体転座に関与しているので、細胞増殖の制御にも影響を与えている。
【０００５】
ヒト及び他の哺乳類は、骨回復及び／又は再生の過程を必要とする疾患又は負傷をする可能性のある動物である。例えば、自然の骨修復機能を刺激することのできる新しい治療法が有れば、骨折の治療は改善され、これによって骨折の治癒にかかる時間が短縮される。他には例えば、骨粗鬆症などの全身性の骨疾患にかかった者は、全身にわたって新しい骨を形成する治療法が有れば恩恵を受けることができる。このような治療法によって、この種の疾患に特徴的な多量の骨成分損失に由来する骨折事故を避けることができる。
【０００６】
少なくともこれらの理由から、生体内での新しい骨形成の刺激に用いる目的で、ＢＭＰ等の細胞外因子が研究されてきた。ＢＭＰ及び他の細胞外信号分子について研究初期には大きな成果が得られたにもかかわらず、それらの使用には数多くの欠点が存在する。例えば、新しい骨形成には精製ＢＭＰの比較的大量な投与が必要であり、従ってそのような治療法には経費がかかる。更に、細胞外蛋白質は、宿主動物に導入されると分解されやすい。加えて、そうした蛋白質はたいていは免疫原となるので、投与した蛋白質に対する免疫応答を刺激する可能性がある。
【０００７】
このような事情から、細胞内信号分子を使用して新しい骨形成を誘発する治療法の実現が望まれる。遺伝子治療分野における進歩によって、骨形成過程の一部を構成する細胞内信号をコードする核酸断片を、骨形成前駆細胞（すなわち骨形成に関与する細胞）内に導入することが可能になった。骨形成に遺伝子治療を用いることによって、（１）費用が削減できる；（２）細胞内信号を長期間発現することができるので、細胞外因子を用いた治療法と比較して、より大きな効果が得られる；（３）細胞外信号による治療では信号の受容体数が限られていることで治療が制限されるがそれを回避できる；（４）局所的な骨形成が必要な部位に、トランスフェクトした潜在的骨形成細胞を直接投与することが可能になる；そして（５）全身性の骨形成が可能になり、骨粗鬆症や他の代謝骨疾患に対する治療法を提供することが可能になる、などの数多くの利点が提供される可能性がある。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、骨形成にいたる一連の事象の初期に関与する細胞内信号分子を用いた骨形成を誘導する新規な構成と方法を提供することによって、先行技術の欠点を克服することを目的とする。本出願者らは、刺激を加えたラット頭蓋冠骨芽細胞培養から単離したものを元にした配列を有する新規なＬＩＭ遺伝子である、１０−４／ＲＬＭＰ（配列番号１、配列番号２）を発見した。遺伝子をクローンし、配列決定し、生体外で骨鉱化効果を促進する能力についてアッセイを行った。蛋白質ＲＬＭＰは骨基質の鉱化に影響を与えただけでなく、細胞の骨芽系統への分化にも影響を与えた。例えば公知の他のサイトカインとは違って、ＢＭＰやＲＬＭＰは分泌性蛋白質ではないが、細胞内信号分子である。この特徴によって、細胞内信号増幅が提供されるという利点があるだけでなく、トランスフェクトした細胞の評価が容易に行えるという利点もある。これら蛋白質の使用は、より効果的で特異な生体内の用途にも適している。好ましい臨床用途としては、骨折、骨欠損、骨移植回復の促進及び骨粗鬆症の患者における正常な恒常性の促進が挙げられる。
【０００９】
本出願者らは更に、ヒト蛋白質（ヒトＬＭＰ−１）に相当するアミノ酸配列の遺伝子をクローンし、配列決定し、アミノ酸配列を推定した。ヒト蛋白質によって、生体外及び生体内での骨鉱化効果が促進されることが実証される。
【００１０】
加えて、本出願者らは、ＬＭＰ−１を切断した（短縮した）もの（ＨＬＭＰ−１ｓと称する）についても特徴付けを行った。この短縮版はｃＤＮＡクローン源のひとつにおける点突然変異（蛋白質を短縮する停止コドンを提供する）から得られたものである。短縮版（ＬＭＰ−１ｓ）は細胞培養内及び生体内で発現された場合十分に機能する。
【００１１】
本発明の更なる特徴及び利点は、下記に説明するが、これらの説明から明らかになるところもあるし、あるいは本発明の実施によって理解されるであろうところもある。本発明の目的及び他の利点は、ここに記載の説明及び請求項で特に指摘する方法及び構成によって実現及び達成される。
【００１２】
一つの特徴にあっては、本発明はあらゆるＬＩＭ鉱化蛋白質をコードする核酸配列を包含する単離核酸分子にして、配列番号２５の全長に相補的な核酸分子に標準条件下でハイブリダイズし、そして配列番号２６の全長に相補的な核酸分子に強度の緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子に関する。特異な特徴にあっては、単離核酸分子はＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ又はＲＬＭＰをコードする。加えて、本発明はこれらの核酸分子を包含するベクター、及びベクターを包含する宿主細胞も企図している。他の特異的な特徴にあっては、本発明は蛋白質自体に関する。
【００１３】
第二の特徴にあっては、本発明はＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ及びＲＬＭＰ等のＬＩＭ鉱化蛋白質に特異的な抗体に関する。一つの特異な特徴にあっては、抗体はポリクローナル抗体である。他の特異な特徴にあっては、抗体はモノクローナル抗体である。
【００１４】
第三の特徴にあっては、本発明は、ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸分子によって骨形成前駆細胞のトランスフェクトが行われる、骨形成誘発の方法に関する。一つの特異な特徴にあっては、単離核酸分子はベクター（プラスミド又はアデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス）内にある。トランスフェクションはエクスビボ（ex vivo）又は生体内で単離核酸分子を直接投与することで行われる。トランスフェクトした単離核酸分子はＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ又はＲＬＭＰをコードする。
【００１５】
更なる特徴にあっては、本発明は、ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸分子で骨形成前駆細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトした骨形成前駆細胞を基質と混合し、そしてその基質を脊椎に接触させることを含む脊椎固定の方法に関する。
【００１６】
更に他の特徴にあっては、本発明は、本発明のベクターで宿主細胞を安定的にトランスフェクトすることによって全身骨形成を誘発する方法に関する。
【００１７】
以下の一般的な記述及び詳細な記述は例証及び説明のためのものであり、請求項に記載の発明を更に説明することを企図していることが理解されよう。
【００１８】
略号及び定義
ＢＭＰ 骨形態形成蛋白質
ＨＬＭＰ−１ ヒトＬＭＰ−１。ヒトＬＩＭ蛋白質又はＨＬＭＰとも称する。
ＨＬＭＰ−１ｓ ヒトＬＭＰ−１短縮（切断）蛋白質
ＨＬＭＰＵ ヒトＬＩＭ蛋白質ユニーク領域
ＬＭＰ ＬＩＭ鉱化蛋白質
ＭＥＭ 最小必要培地
Ｔｒｍ トリアムシノロン
β−ＧｌｙＰ β−グリセリンリン酸
ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ末端の急速増幅
ＲＬＭＰ ラットＬＩＭ鉱化蛋白質。ＲＬＭＰ−１とも称する。
ＲＬＭＰＵ ラットＬＩＭ蛋白質ユニーク領域
ＲＮＡｓｉｎ ＲＮアーゼ阻害剤
ＲＯＢ ラット骨芽細胞
１０−４ ＲＬＭＰのｃＤＮＡ配列（配列番号２）を含有するクローン
ＵＴＲ 非翻訳領域
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規な哺乳類ＬＩＭ蛋白質（以下、ＬＩＭ鉱化蛋白質又はＬＭＰと称する）に関する。本発明は特に、ＨＬＭＰ又はＨＬＭＰ−１として知られるヒトＬＭＰに関する。本出願者らは、これらの蛋白質が生体外で育成される哺乳類細胞内の骨鉱化を促進することを発見した。哺乳類内で産生される場合には、ＬＭＰは生体内での骨形成も誘発する。
【００２０】
骨髄細胞、骨形成前駆細胞又は間充織幹細胞をＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸でエクスビボトランスフェクションし、次いでこのトランスフェクトされた細胞をドナーに移植することは、様々な骨関連疾患又は損傷の治療に適している。例えばこの方法を、長骨骨折修復の増強；体節欠陥部分における骨の形成；骨折治療用の代用骨移植片の提供；腫瘍再建術又は脊椎固定術の促進；及び臀部、椎骨又は手関節の骨粗鬆症などにおける、脆弱化骨又は骨粗鬆症骨の（注射による）局所的治療の提供に用いることができる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸を用いたトランスフェクションは、長骨の骨折修復を促進することを目的とする、トランスフェクトした骨髄細胞の経皮注射；長骨骨折における癒合の遅延又は非癒合の治療、あるいは脊椎固定における偽関節の治療；及び臀部又は膝関節の無血管壊死における新しい骨形成の誘発、においても有用である。
【００２１】
遺伝子治療のエクスビボに基づく方法に加えて、ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸配列を包含する組替えＤＮＡベクターによるトランスフェクトを、生体内で行うことができる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードするＤＮＡ断片を適当なウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター）に挿入し、得られるウイルス構造体を軟骨内性骨形成が望まれる体の部位に直接に注射することができる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰ配列を導入する直接的な経皮注射を用いることによって、（エクスビボでトランスフェクトするための）骨髄細胞の入手や新しい骨形成が必要とされる患者の部位へのそれらの移植を目的とした外科的な処理を行う必要なく、骨形成を刺激することが可能になる。Ａｌｄｅｎ他、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ Ｆｏｃｕｓ（１９９８）は、アデノウイルスベクター内にクローンしたＢＭＰ−２をコードするｃＤＮＡを用いた遺伝子治療における、直接注射法の有用性を実証している。
【００２２】
ＨＬＭＰをコードする核酸配列を包含する、裸のすなわちカプセル封入されていない組替えプラスミドを、適当な体部位に直接注射する生体内遺伝子治療を実施することが可能である。本発明のこの態様においては、上記したように、裸のプラスミドＤＮＡが適当な標的細胞によって取りこまれる又は内在化させられるとトランスフェクションが起こる。ウイルス構造体を用いた生体内遺伝子治療の場合のように、裸プラスミドＤＮＡを直接注射することによって、外科的処理が殆ど又は全く必要なくなるという利点が得られる。内皮細胞有糸分裂促進剤ＶＥＧＦ（血管内皮発育因子）をコードする裸プラスミドＤＮＡを用いた直接遺伝子治療は、ヒト患者における効果が実証されている［Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９７（１２）：１１１４−２３（１９９８）］。
【００２３】
ＬＭＰを骨形成原細胞内に導入するのにアデノウイルスベクターを用いることによって、ＬＭＰの一時的な発現が可能になる。トランスフェクトされる標的細胞のゲノム内にアデノウイルスが組み込まれないためにこのようなことが起こる。ＬＭＰの一時的発現、すなわちトランスフェクトされた標的細胞の寿命間に起こる発現は、本発明の目的を達成するのに十分である。しかしＬＭＰの安定した発現は、標的細胞のゲノムに組み込まれるベクターが導入媒体として用いられた時に可能となる。例えばレトロウイルスに基づくベクターが、この目的に適している。
【００２４】
ＬＭＰの安定した発現は、骨粗鬆症や骨形成不全症などの様々な全身性骨関連疾患の治療に特に有用である。本発明のこの態様にあっては、ＬＭＰをコードするヌクレオチド配列を標的細胞内に導入するために、標的細胞のゲノム内に組み込まれるベクターを用いることに加え、ＬＭＰ発現を調節性プロモーターの制御下におく。例えばテトラサイクリン等の外因性誘発剤と接触することによって起動するプロモーターが好ましい。この方法を利用して有効量の外因性誘発剤を投与することによって、全身性の新しい骨形成を刺激することができる。十分量の骨塊が形成されたのち、外因性誘発剤の投与を中止する。この工程は、例えば骨粗鬆症の治療後の経過など、骨塊の損失を補う必要に応じて、繰り返してもよい。
【００２５】
ＨＬＭＰに特異な抗体は、患者細胞における骨誘発性すなわち骨形成の潜在能力をアッセイする方法に用いるのに特に適している。この方法を用いて、骨回復の進行が遅くなる又は治癒の程度が低くなる可能性のある患者を同定することができる。更に、ＨＬＭＰ特異的抗体は、骨粗鬆症などの骨変性疾患における危険因子を同定するマーカーアッセイに用いるのに適している。
【００２６】
公知の及び従来の方法に従い、ＬＭＰをコードする核酸断片をクローン及び／又は発現ベクターなどの他の核酸配列に連結することによって、本発明の遺伝子を調製する。これらの組替えベクターを作成し分析するのに必要な方法、例えば制限エンドヌクレアーゼによる消化、クローニングプロトコル、突然変異誘発、オリゴヌクレオチドの有機合成及びＤＮＡ配列決定は、公知のものを用いることができる。ＤＮＡ配列決定には、デオキシターミネーター法を用いるのが好ましい。
【００２７】
組替えＤＮＡ法については多くの論文がある［Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）、Ｄａｖｉｓ他、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）、及びＡｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）］。これらの参考文献は、ここに参照して説明に代える。
【００２８】
ＤＮＡ又はｃＤＮＡのプライマー依存性増幅は、本発明における遺伝子の発現においてよく用いられる工程である。これは一般的にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。ＰＣＲについては米国特許第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓ他）や他の文献に記載がある。ＰＣＲの基本原理は、プライマー伸長のサイクルを繰り返すことによるＤＮＡ配列の指数関数的複製である。１個のプライマーの伸長産物が、別のプライマーとハイブリダイズすると、他の核酸分子合成用の鋳型となる。プライマー−鋳型複合体はＤＮＡポリメラーゼの基質として作用し、複製を行う際に、プライマーを伸長する。ＰＣＲに従来用いられている酵素は、サームス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。
【００２９】
このＰＣＲ法を基本とする様々な改変法が存在するが、本発明の組替えベクターを作成するのに必要な段階は、どのような方法を選択したとしても、当業者によって容易に行うことができる。例えば、１０−４／ＲＬＭＰの細胞発現を測定するために、ＲＮＡを抽出して標準的で公知の方法によって逆転写する。得られるｃＤＮＡを適当なｍＲＮＡ配列についてＰＣＲで分析する。
【００３０】
ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードする遺伝子は、組替え発現系における発現ベクター内で発現される。もちろん、作成される配列は元の配列又はその相補的配列と同じである必要はなく、ＤＮＡコードが縮退していても骨形成活性を有するＬＭＰを発現するものであれば、どのような配列であってもよい。保存的アミノ酸置換や、アミノ末端におけるメチオニン残基の出現などの他の改変を、用いることもできる。
【００３１】
宿主の発現系において活性を有するリボソーム結合部位を、キメラＬＭＰコード配列の５’末端に連結し、合成遺伝子を作成する。合成遺伝子は、適当に線型化されたプラスミドに連結することによって、様々な発現ベクターのいずれか一つに導入することができる。調節性プロモーター、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃプロモーターも、キメラコード配列の発現に適している。他に好ましい調節性プロモーターの例としては、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７及びλプロモーターが挙げられる。
【００３２】
ＬＭＰをコードするＤＮＡは、文献にある標準的な手順の一つ、例えばリン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気穿孔法、又は原形質体融合法によってレシピエント細胞にトランスフェクトされ、安定した形質転換体を形成する。特に下記の態様で実施されるリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。
【００３３】
細胞内に移転させる前に、Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ Ｄｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６（１９７３）の方法に従ってＤＮＡをリン酸カルシウムと共に共沈させる。４０〜５０μｇのＤＮＡの等画分の一つに、担体としてサケ精子又は子牛胸腺ＤＮＡを加えたものを、１００ｍｍディッシュに植えた０．５×１０6細胞に用いる。ＤＮＡを０．５ｍｌの２×ヘペス溶液（２８０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭヘペス及び１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．０）に混合し、等体積の２×ＣａＣｌ2（２５０ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．０）を添加する。３０〜４０分後に現れた白い顆粒沈殿を、細胞上に均等に滴下し、３７℃で４〜１６時間保温する。培地を除去し１５％グリセロールを含むＰＢＳで３分間、細胞にショックを与える。グリセロールを除去したのち、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコの最小必要培地（ＤＭＥＭ）に細胞を入れる。
【００３４】
ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｋｉｍｕｒａ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４９：３９４（１９７２）及びＳｏｍｐａｙｒａｃ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：７５７５（１９８１）参照］；電気穿孔法［Ｐｏｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：７１６１（１９８４）参照］；及び原形質体融合法［Ｓａｎｄｒｉ−Ｇｏｄｄｉｎ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：７４３（１９８１）参照］を用いても、ＤＮＡをトランスフェクトすることができる。
【００３５】
固相におけるホスホルアミダイト化学法は、オリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシヌクレオチドを有機合成する方法として好ましい。加えて、他の多くの有機合成法を用いることも可能である。当業者は、本発明の特定の配列についてこれらの方法を容易に適用することが可能である。
【００３６】
本発明は更に、標準的な条件下で、本発明のＬＩＭ鉱化蛋白質をコードする核酸配列のいずれかにハイブリダイズする核酸分子を含む。「標準的ハイブリダイゼーション条件」はプローブの大きさ、核酸試薬のバックグラウンド及び濃度、並びにハイブリダイゼーションの種類（例えばインサイチューサザンブロット法又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション（ノーザンブロット法））に伴って異なる。「標準的ハイブリダイゼーション条件」は当分野の技術レベルの範疇にある。例えばＦｒｅｍｅａｕ他の米国特許第５，５８０，７７５号、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）、Ａｌｗｉｎｅ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：２２０（１９７９）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、ｐｐ７．１９−７．５０、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい（ここに参照して説明に代える）。
【００３７】
好ましい標準的なハイブリダイゼーション条件のひとつは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（１５０ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4［ｐＨ７．４］、１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、５×デンハート溶液（水１００ｇ中２０ｍｇのフィコール、２０ｍｇのポリビニルピロリドン及び２０ｍｇのＢＳＡを含む）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中に、４２℃で２時間プレハイブリダイズするブロットに関する。32Ｐ標識化ｃＤＮＡプローブを添加し、ハイブリダイゼーションを１４時間続けた。次いで、ブロットを２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いて２２℃で２０分にわたる洗浄を２回行い、次いで０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いて６５℃で１時間洗浄した。ブロットを乾燥し、増感スクリーンの存在下でＸ線フィルムに５日間露出した。
【００３８】
プローブとその標的配列が実質的に同一である場合、「強度の緊縮条件」下で、これらはハイブリダイズする。標準的ハイブリダイズ条件の場合のように、当業者は実質的に同一の配列のみがハイブリダイズする条件を設定することができる。
【００３９】
本発明の他の特徴は、核酸配列によってコードされる蛋白質を含有する。更に他の態様においては、本発明は抗ＬＭＰ抗体を用いたそのような蛋白質の同定に関する。この態様においては、細胞を溶解し蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによってウエスタンブロット用の蛋白質試料が調製される。蛋白質は電気ブロットによってニトロセルロースに転写される［Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７）参照］。フィルターを即席脱脂粉乳（１００ｍｌＰＢＳ中１ｇｍ）でブロックしたのち、抗ＬＭＰ抗体をフィルターに添加して室温で１時間保温する。フィルターをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で完全に洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−抗体複合体と共に室温で１時間保温する。フィルターを再度ＰＢＳで完全に洗浄したのち、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を添加して抗体バンドを同定する。
【００４０】
単一特異的抗体を本発明の試薬として用いることができ、特に、ＬＭＰの発現に関連した特異的な特徴について患者の細胞を分析するのに用いられる。ここでいう「単一特異的抗体」とは、ＬＭＰに対する単一結合特性を有する単抗体種又は複数抗体種のことを言う。ここで言う「単一結合」とは、（例えば上記したようにＬＭＰに関連する）特異な抗原又はエピトープに結合する抗体種の能力のことを言う。ＬＭＰに対する単一特異的抗体は、ＬＭＰに対して反応性を有する抗体を含む哺乳類抗血清から精製されるか、又はＬＭＰに対して反応性を有するモノクローナル抗体からＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−９７（１９７５）］の方法を用いて調製される。ＬＭＰ特異性抗体は例えばネズミ、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ又はウマなどの動物を、適当な濃度のＬＭＰ（及び免疫アジュバント）で免疫化することによって調製することができる。
【００４１】
この方法においては、前免疫血清を第一の免疫化に先だって採取する。各動物は約０．１〜１０００ｍｇのＬＭＰ（及び望ましい場合には許容される免疫アジュバント）を投与される。このような許容される免疫アジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、明礬沈殿、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）を含有する油乳濁液の水、及びｔＲＮＡアジュバントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。初期免疫は、好ましくは、フロイント完全アジュバントに含まれるＬＭＰを、複数部位に皮下注射（ＳＣ）、腹腔内注射（ＩＰ）のいずれか又はその両方によって導入することを含む。各動物から一定間隔で、好ましくは１週間ごとに採血し、抗体価を測定する。動物は初期免疫化に続いて追加注射を受けてもよいし受けなくてもよい。追加注射を受ける動物は一般に、フロイント不完全アジュバントに含まれる抗体を等量、同じ経路で投与される。追加注射は最大抗体価が得られるまで約３週間の間隔で投与される。各追加免疫化から約７日後に、又は１回の免疫化から約１週間ごとに、動物から採血して血清を回収し、画分を約−２０℃で貯蔵する。
【００４２】
ＬＭＰに対して反応性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスをＬＭＰで免疫化することによって調製する。マウスは、約０．１〜１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＬＭＰを含む約０．５ｍｌの緩衝液又は食塩水と等量の許容されるアジュバントとを混合したものをＩＰ又はＳＣ経路で投与することによって免疫化される（上記参照）。アジュバントとしてはフロイント完全アジュバントが好ましい。ネズミは第０日に初期免疫を受け、約３~３０週間静養させる。免疫化ネズミは、約０．１〜１０ｍｇのＬＭＰを含む緩衝溶液（例えばリン酸緩衝食塩水）を静脈注射（ＩＶ）経路で１回以上投与する追加免疫化をうける。抗体陽性ネズミから得たリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当分野で公知の標準法を用いて免疫化ネズミから脾臓を除去することによって得る。脾臓リンパ球と適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞とを、安定的なハイブリドーマが得られる条件下で混合することによってハイブリドーマ細胞を作成する。融合相手の例としては、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４；及びＳｐ２／０が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このうちＳｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、約３０〜５０％の濃度の、約１０００分子量のポリエチレングリコール中で融合される。融合ハイブリドーマ細胞は、公知の方法で補助ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンで育成することによって選択する。第１４、１８及び２１日あたりで上澄液を成長が陽性のウェルから回収し、ＬＭＰを抗体として用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）等のイムノアッセイによって、抗体産生についてのスクリーニングを行う。培養液をオクタロニー沈降アッセイで試験して、ｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞は、軟寒天法などによってクローンする［ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、“Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９７３）；Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）参照］。
【００４３】
モノクローナル抗体は、プリスタン−プライム化Ｂａｌｂ／ｃマウスに、一匹につきプライム化約４日後の約２×１０6〜６×１０6ハイブリドーマ細胞を約０．５ｍｌ注射することによって、生体内で産生することもできる。細胞移転の後約８〜１２日で腹水を回収し、モノクローナル抗体を公知の技術で精製する。
【００４４】
約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ内でハイブリドーマ細胞系を育成することによって抗ＬＭＰｍＡｂの生体外産生を行い、十分量の特異的ｍＡｂを得る。ｍＡｂを公知の技術で精製する。
【００４５】
腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体価は、様々な血清学的又は免疫学的アッセイによって決定する。それらの例として沈降法、受動的凝集、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。体液又は組織、及び細胞抽出物中のＬＭＰの存在を調べるのに、同様のアッセイが用いられる。
【００４６】
上記した単一特異的抗体を産生する方法を、ＬＭＰのポリペプチド断片、全長の新生ＬＭＰポリペプチド、又はその改変体、あるいはその対立形質に特異な抗体を産生するのに利用できることは、当業者には自明のことであろう。
【００４７】
ｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと称されるベクターに含まれる１０−４／ＲＬＭＰ試料（すなわち１０−４クローン／ＲＬＭＰを挿入したｐＲｃ／ＣＭＶ２ベクター）が、１９９７年７月２２日にＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、２０８５２メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ１２３０１）に寄託されている。培養番号は２０９１５３が割り当てられている。ＨＬＰＭ−１ｓを挿入したｐＨｉｓ−Ａベクター試料が１９９８年３月１９日にＡＴＣＣに寄託されている。培養番号は２０９６９８が割り当てられている。ブダペスト条約の取り決め下に扱われるこれらの寄託物は、少なくとも３０年間ＡＴＣＣに保持され、それらを開示する特許の権利賦与のもとに誰もが入手することができる。寄託物が入手しやすいとはいっても、政府の決定による特許権を軽んじて本発明を実施するライセンスが賦与されたとみなすべきでないことは理解されるべきである。
【００４８】
本発明の核酸、蛋白質又は抗体の評価において、酵素アッセイ、蛋白質精製及び従来の他の生物化学的方法が用いられる。ＤＮＡ及びＲＮＡはそれぞれサザンブロット法及びノーザンブロット法によって分析される。通常、分析される試料はゲル電気泳動によって寸法を分別される。ゲル中のＤＮＡ又はＲＮＡは、次いでニトロセルロース又はナイロン膜に転写される。ゲル中の試料パターンの複製であるブロットは、プローブとハイブリダイズされる。一般に、プローブは放射性同位元素、好ましくは32Ｐで標識付けされるが、当分野で公知の信号発生分子でプローブを標識付けすることもできる。次いで対象とする特異的なバンドを、オートラジオグラフィー等の検出系によって可視化することができる。
【００４９】
本発明の好ましい態様を例証する目的で、以下に実施例を述べるが、本発明を限定するものではない。これらの結果は本発明のＬＩＭ鉱化蛋白質、及びこれらの蛋白質をコードする単離核酸に、骨形成の誘発能又は促進能があることを立証している。
【００５０】
実施例１：頭蓋冠細胞培養
ラット骨芽細胞（ＲＯＢ）としても知られるラット頭蓋冠細胞を、分娩２０日前のラットから得た［Ｂｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３７（８）：３４０１−０７（１９９６）参照］。一次培養を密集するまで（７日間）培養し、トリプシン処理し、第一継代培養細胞として６ウェルプレート（１×１０5細胞／３５ｍｍウェル）に植えた。第０日に密集状態の継代培養細胞を、更に７日間培養した。第０日に始まって３〜４日ごとに層流フードの下で培養基を交換して処理（Ｔｒｍ及び／又はＢＭＰ）を行った。標準的な培養プロトコルは以下の通りである。第１〜７日、ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、±刺激；第８〜１４日、ＢＧＪｂ培養基、１０％ＦＢＳ、（鉱化を可能にする無機隣酸塩源としての）５ｍＭβ−ＧｌｙＰ。骨小結節形成及びオステオカルシン分泌の終点分析を第１４日に行った。研究した全てのＢＭＰについて得た投与応答曲線において範囲中央効果を示した系の試行実験に基づいて、ＢＭＰ投与量を５０ｎｇ／ｍｌとした。
【００５１】
実施例２：アンチセンス処理及び細胞培養
膜性骨形成の間の、ＬＭＰ−１の潜在的な機能的役割を調べるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成してＬＭＰ−１ｍＲＮＡ翻訳をブロックし、グルココルチコイドにより誘発され分化しつつある二次骨芽細胞培養を処理した。ＲＬＭＰ発現の阻害を、推定翻訳開始領域に渡る２５塩基対に相当する高度に特異的な（公知のラット配列に対して有意な相同性を有さない）アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３５）を用いて行った。対照培養としてオリゴヌクレオチドを加えないものとセンスオリゴヌクレオチドを加えたものを作成した。リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）の存在下（前保温）又は非存在下で実験を行った。以下簡単に述べると、２２μｇのセンス又はアンチセンスＲＬＭＰオリゴヌクレオチドをＭＥＭに室温で４５分間保温した。保温に続いて、更にＭＥＭか前保温したリポフェクタミン／ＭＥＭ（７％ｖ／ｖ；室温で４５分保温）のいずれかを添加してオリゴヌクレオチド濃度を０．２μＭとした。得られた混合物を室温で１５分間保温した。次いでオリゴヌクレオチド混合物を適当な培養基（すなわちＭＥＭ／アスコルビン酸塩／±Ｔｒｍ）に混合し、最終オリゴヌクレオチド濃度を０．１μＭとした。
【００５２】
細胞を適当なオリゴヌクレオチドの存在下又は非存在下に適当な培地（±刺激）で保温した。まずリポフェクタミンで保温した培養にリポフェクタミン及びオリゴヌクレオチドのいずれも含まない培養基で４時間保温（３７℃；５％ＣＯ2）したのち、培地補充した。全ての培養、特にオリゴヌクレオチドを加えた培養について、オリゴヌクレオチドレベルを保持するために２４時間ごとに培地補充した。
【００５３】
ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ−６オリゴヌクレオチドの効果と同様に、投与量に依存する形で、鉱化小結節形成及びオステオカルシン分泌を阻害した。
骨芽細胞分化におけるＬＭＰ−１アンチセンスブロックは、外因性ＢＭＰ−６の添加により回復できなかったが、一方ＢＭＰ−６アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害はＢＭＰ−６の添加により取り消された。この実験では骨芽細胞分化経路においてＢＭＰ−６よりＬＭＰ−１が上流に位置することも確認された。ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは更に一次ラット骨芽細胞培養において自然な骨芽細胞の分化を阻害した。
【００５４】
実施例３：鉱化骨小結節形成の定量化
実施例１及び２で調製したＲＯＢの培養を、７０％エタノールで一晩定着し、フォンコッサ銀染色で染色した。半自動コンピューター化ビデオイメージ分析システムを用いて、各ウェルの小結節数及び小結節面積の定量化を行った［Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３７（８）：３４０１−０７（１９９６）参照］。小結節値あたりの面積を計算するためにこれらの値を割った。この自動化工程の手動測定法に対する有効性は確認されており、０．９２の相関係数（ｐ＜０．０００００１）が実証されている。全てのデータは、各条件下のウェル５〜６個から計算した平均値±平均値の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表現される。各実験は異なる頭蓋冠調製物からの細胞を用いて少なくとも２度行われた。
【００５５】
実施例４：オステオカルシン分泌の定量化
本発明者らは実験室でラットオステオカルシンのＣ末端ノナペプチドに対する単一特異的ポリクローナル抗体（Ｐａｂ）を作成した。培養基中のオステオカルシンのレベルを、この抗体を利用した競合ラジオイムノアッセイを用いて測定した［Ｎａｎｅｓ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２７：５８８（１９９０）参照］。以下簡単に述べると、１μｇのノナペプチドをラクトペルオキシダーゼ法によって１ｍＣｉ125Ｉ−Ｎａでヨウ素処理した。２００μｌのアッセイ緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００１％チメロサール、０．０２５％ＢＳＡ）を含む試験管に、細胞培養から又はオステオカルシン基準（０〜１２０００ｆｍｏｌｅ）から取った培養基を、アッセイ緩衝液中１００μｌ／試験管の割合で加えた。次いでＰａｂ（１：４００００；１００μｌ）を加え、ヨウ素処理したペプチド（１２０００ｃｐｍ；１００μｌ）を加えた。非特異的結合について試験した試料は、同様に調製した（ただし抗体を含まないように調製した）。
【００５６】
結合及び遊離ＰＡｂを、７００μｌヤギ抗ウサギＩｇＧを添加して４℃で１８時間保温することによって分離した。試料を１２００ｒｐｍで４５分間遠心分離したのち、上澄を静かに別容器に移して沈殿物をγ線計数器で測定した。オステオカルシンの値はｆｍｏｌｅ／１００μｌの単位で測定し、次いで１００で割ることによってｐｍｏｌｅ／ｍｌ培養基（第三日）の単位に変換した。数値は各条件下のウェル５〜６個から３回計算した値の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表現された。各実験は異なる頭蓋冠調製物からの細胞を用いて少なくとも２度行われた。
【００５７】
実施例５：Ｔｍ及びＲＬＭＰが生体外での鉱化に与える効果
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、非刺激細胞培養系において骨小結節の形成全般に与える効果は、はっきりしていない。しかしＲＯＢがＴｍで刺激された場合には、ＲＬＭＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは小結節の鉱化を＞９５％の割合で阻害する。外因性のＢＭＰ−６をオリゴヌクレオチド処理した培養に添加したところ、ＲＬＭＰアンチセンス処理した小結節の鉱化は起こらなかった。
【００５８】
今まで長いことオステオカルシンといえば骨鉱化のことを意味し、オステオカルシンのレベルは小結節形成及び鉱化と関連があった。ＲＬＭＰアンチセンスオリゴヌクレオチドはオステオカルシン産生を有意に減少させるが、アンチセンス処理した培養における小結節の数は有意に変化しない。この場合、外因性のＢＭＰ−６を添加してもＲＬＭＰアンチセンス処理した培養におけるオステオカルシンの産生は１０〜１５％しか回復しなかった。これはＲＬＭＰの作用がＢＭＰ−６の下流で起こり、ＢＭＰ−６よりも特異的であることを示唆している。
【００５９】
実施例６：ＲＮＡの採取及び精製
２対のＲＯＢウェルからの細胞ＲＮＡ（実施例１及び２に従って６ウェル培養ディッシュ中に調製）を、４Ｍグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴ）溶液を用いて採取し、統計的に同じものを３つ作成した。以下簡単に述べると、培養上澄をウェルから吸引し、２対ウェルからの採取あたり０．６ｍｌのＧＩＴ溶液で覆った。ＧＩＴ溶液を添加したのち、プレートを５〜１０秒旋回させた（できるだけ均等に覆うようにした）。さらなる工程を行う前に、試料を−７０℃で最大７日間まで保存した。
【００６０】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、７．１９章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］の標準的方法を僅かに改変した方法を用いてＲＮＡを精製した。以下簡単に述べると、解凍した試料に６０μｌの２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０μｌのフェノール（水飽和）及び１５０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を添加した。渦巻攪拌ののち、試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分；４℃）にかけ、水性相を別の試験管に移し、６００μｌのイソプロパノールを添加してＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。
【００６１】
一晩の保温に次いで、試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分）にかけ、上澄を静かに吸引した。得られたペレットを４００μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、４０μｌの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）及び１．０ｍｌの無水エタノールを添加したのち−２０℃で一晩沈殿させた。細胞ＲＮＡを採取するために、試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分）にかけ、７０％エタノールで洗浄し、５〜１０分間空気乾燥し、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＲＮＡ濃度は分光光度計を用いて測定した光学濃度から計算した。
【００６２】
実施例７：逆転写−ＰＣＲ
加熱した総ＲＮＡ（５μｇを総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ中に６５℃で５分間）を、４μｌの５×ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２μｌのｄＮＴＰ、２μｌのｄＴ１７プライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）及び１μｌのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ユニット／μｌ）を含む試験管に添加した。試料を３７℃で１時間保温し、次いで９５℃で５分保温してＭＭＬＶ−ＲＴを不活化した。試料に８０μｌの水を加えて希釈した。
【００６３】
逆転写試料（５μｌ）を標準法を用いたＰＣＲにかけた（総量５０μｌ）。以下簡単に述べると、水、適量のＰＣＲ緩衝液（２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ、ハウスキーピング遺伝子）の正方向及び逆方向プライマー及び／又はＢＭＰ−６）、32Ｐ−ｄＣＴＰ及びＴａｑポリメラーゼを含む試験管に試料を添加した。プライマーを２２サイクル（９４℃で３０秒；５８℃で３０秒、７２℃で２０秒）にかけたが、特に注釈しない限りはサイクルを一定して行った。
【００６４】
実施例８：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び隣光イメージ分析によるＲＴ−ＰＣＲ産物の定量
ＲＴ−ＰＣＲ産物に５μｌ／試験管の量のローディング染料（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）を添加し、混合し、６５℃で１０分加熱し、遠心分離にかけた。１０μｌの各反応物を標準条件下でＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミド；１５Ｖ／ウェル；定電流）にかけた。ゲルをゲル保存緩衝液（１０％ｖ／ｖグリセロル、７％ｖ／ｖ酢酸、４０％ｖ／ｖメタノール、４３％脱イオン水）内に３０分保温し、真空内で８０℃で１〜２時間乾燥し、電子的に画質を向上させた隣光イメージシステムで６〜２４時間発色させた。可視化されたバンドを分析した。バンドあたりの数をグラフにプロットした。
【００６５】
実施例９：ディファレンシャル（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ディスプレーＰＣＲ
ＲＮＡをグルココルチコイド（Ｔｒｍ、１ｎＭ）で刺激した細胞から抽出した。加熱してＤＮアーゼで処理した総ＲＮＡ（５μｇを総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ中に６５℃で５分間）を実施例７で述べたように逆転写した［ただしＨ−Ｔ11Ｍ（配列番号４）をＭＭＬＶ―ＲＴプライマーとして用いた］。得られたｃＤＮＡを上記したようにＰＣＲで増幅した［ただしＨ―Ｔ11Ｇ（配列番号４）、Ｈ−ＡＰ−１０（配列番号５）（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社、テネシー州ナッシュビル）などの市販の様々なプライマーセットを用いた］。放射性同位元素標識化ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列決定ゲル上でゲル電気泳動にかけて分別した。電気泳動の後、得られたゲルを真空下で乾燥し、オートラジオグラフィーに一晩さらした。区別をつけて発現されたｃＤＮＡのバンドをゲルから切り出し、Ｃｏｎｎｅｒ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２７８（１９８３）］の方法を用いてＰＣＲで再増幅した。ＰＣＲ再増幅の産物をベクターＰＣＲ−ＩＩ（ＴＡクローニングキット；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）内にクローンした。
【００６６】
実施例１０：ＵＭＲ１０６ラット骨肉腫細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＵＭＲ１０６ライブラリー（２．５×１０10ｐｆｕ／ｍｌ）を５×１０4ｐｆｕ／ｍｌで寒天平板（ＬＢ底寒天）に植え、３７℃で一晩保温した。濾過膜を平板上に２分間載せた。濾過膜を取り除いて変性させ、洗浄し、乾燥してＵＶ架橋した。次いで濾過膜を前ハイブリダイゼーション緩衝液［２×ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）、５％ホルムアミド、１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ］内に４２℃で２時間保温した。２６０塩基対の放射性同位元素標識化プローブ（配列番号３；ランダムプライミングによる32Ｐ標識化）をハイブリダイゼーション混合物／濾過膜全体に添加し、４２℃で１８時間ハイブリダイズした。膜を室温で１回（１０分、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、５５℃で３回（１５分、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）洗浄した。
【００６７】
洗浄したのち、膜を上記したようにオートラジオグラフィーで分析した。正のクローンをプラークで精製した。この工程を第二の濾過膜についても４分間行い、見せかけの正のクローンを最小化した。プラーク精製したクローンをλＳＫ（−）ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）として回収した。クローンｃＤＮＡは下記のように配列決定した。
【００６８】
実施例１１：クローンの配列決定
クローンしたｃＤＮＡ挿入物を標準法によって配列決定した［Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）参照］。以下簡単に述べると、適当な濃度の終止混合物、鋳型及び反応混合物を適当なサイクルプロトコル（９５℃、３０秒；６８℃、３０秒；７２℃、６０秒；２５回）にかける。配列決定反応を終わらせるために停止混合物を添加する。９２℃で３分間加熱したのち、試料を変性６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル（２９：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド）に載せる。試料を６０ボルト定電流で約４時間電気泳動にかける。電気泳動の後、ゲルを真空下で乾燥してオートラジオグラフィーを行う。
【００６９】
オートラジオグラフを手動で分析した。得られた配列を国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＩＨ、メリーランド州ベセズダ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で保持されているデータベースについて、デフォルト値でＢＬＡＳＴｎプログラムを用いてスクリーンした。配列データに基づいて、新しい配列決定プライマーを調製し、遺伝子全体を配列決定するまで工程を繰り返した。全ての配列を両方向について最低３回確認した。
【００７０】
ヌクレオチド及びアミノ酸配列もＰＣＧＥＮＥソフトウェアー（ｖｅｒ．１６．０）を用いて分析した。ヌクレオチド配列について相同性のパーセントをＮＡＬＩＧＮプログラムによって計算した。計算にはパラメーターとして、非調和（ｎｏｎ−ｍａｔｃｈｉｎｇ）ヌクレオチドのウェイト＝１０；非調和ギャップのウェイト＝１０；考察の対象となるヌクレオチドの最大数＝５０；及び考察の対象となるヌクレオチドの最小数＝５０、を用いた。
【００７１】
アミノ酸配列については、ＰＡＬＩＧＮを用いて相同性パーセントを計算した。オープンギャップコスト（ｏｐｅｎ ｇａｐ ｃｏｓｔ）及びユニットギャップコスト（ｕｎｉｔ ｇａｐ ｃｏｓｔ）の両方について、値を１０とした。
【００７２】
実施例１２：ＲＬＭＰｃＤＮＡのクローニング
実施例９で述べたディファレンシャルディスプレーＰＣＲ増幅産物は、約２６０塩基対の主要バンドを含んでいた。この配列をラット骨肉腫（ＵＭＲ１０６）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。正のクローンをネスト状プライマー分析にかけ、全長ｃＤＮＡを増幅するのに必要なプライマー配列を得た（配列番号１１、１２、２９、３０及び３１）。後の研究のために選んだ正のクローンの一つをクローン１０−４と称した。
【００７３】
クローン１０−４の全長ｃＤＮＡの配列分析は、ネスト状プライマー分析で決定した。その結果、クローン１０−４はディファレンシャルディスプレーＰＣＲで同定された元の２６０塩基対断片を含んでいた。クローン１０−４（１６９６塩基対、配列番号２）は４５７アミノ酸（配列番号１）を有する蛋白質をコードする１３７１塩基対の開いた読み枠を含んでいる。終止コドンＴＧＡはヌクレオチド１４４４〜１４４６に見られる。ヌクレオチド１６７５〜１６８０のポリアデニレーション信号及びそれに隣接するポリ（Ａ）+末端は３’非コード領域に存在する。配列番号１のアミノ酸位置１１３〜１１６及び２５７〜２５９にそれぞれＡｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ及びＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒという２個の潜在的Ｎ−グリコシレーション部位が存在する。２個の潜在的ｃＡＭＰ依存及びｃＧＭＰ依存蛋白質キナーゼリン酸化部位Ｓｅｒ及びＴｈｒがそれぞれアミノ酸位置１９１及び３４９に見られた。５個の蛋白質キナーゼＣリン酸化部位Ｓｅｒ又はＴｈｒがアミノ酸位置３、１１５、１６６、２１９、４４２に見られた。１個の潜在的ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ−ループ）Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒがアミノ酸位置２７２〜２７９に見られた。
【００７４】
加えて、２個の高度に保存された推定ＬＩＭ領域がアミノ酸位置３４１〜３９１及び４００〜４５１に見られた。この新たに同定されたラットｃＤＮＡ中の推定ＬＩＭ領域は、他に公知のＬＩＭ蛋白質のＬＩＭ領域とかなりの相同性を示した。しかし、他のラットＬＩＭ蛋白質との全体的相同性は２５％未満であった。ＲＬＭＰ（１０−４とも称する）はヒトエニグマ（ｅｎｉｇｍａ）蛋白質（米国特許第５，５０４，１９２号参照）と７８．５％のアミノ酸相同性を有しているが、最も近いラット同族体ＣＬＰ−３６及びＲＩＴ−１８に対してそれぞれ僅か２４．５％及び２２．７％のアミノ酸相同性しか有していない。
【００７５】
実施例１３：ＲＬＭＰ発現のノーザンブロット分析
実施例１及び２で調製したＲＯＢからの３０μｇの総ＲＮＡを１％アガロース平面ゲル上のホルムアルデヒドゲル電気泳動にかけて寸法を分別し、ナイロン膜に浸透によりブロット転写した。ブロットに対して、ランダムプライミングで32Ｐ−ｄＣＴＰ標識化した全長１０−４ｃＤＮＡの６００塩基対ＥｃｏＲ１断片をプローブとして用いた。
【００７６】
ノーザンブロット分析の結果、ＲＬＭＰプローブとハイブリダイズした１．７ｋｂのｍＲＮＡ種が得られた。ＲＬＭＰｍＲＮＡはＢＭＰ−６に２４時間さらしたＲＯＢ中で約３．７倍に増加した。２４時間ＢＭＰ−２又はＢＭＰ−４で刺激したＲＯＢ中ではＲＭＬＰ発現の増加はみられなかった。
【００７７】
実施例１４：統計的方法
実験で得られた小結節／オステオカルシンの各結果について、５〜６ウェルから得られたデータを用いて平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を計算した。各パラメーターの最大値に正規化されたデータでグラフを作成し、小結節の個数、鉱化された領域及びオステオカルシンについて同時にグラフにすることが可能になる。
【００７８】
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ蛋白質アッセイ又はウエスタンブロット分析の各結果について、代表的な実験の３組用意した試料から得たデータを用いて、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を決定した。グラフを作成することによって、第０日又は負の対照に正規化されたデータが示され、上記対照値を数倍に増加したものとして表現される。
【００７９】
統計的有意性はボンフェロニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の事後多重比較修正を用いた分散の一方向分析を用いて評価した［Ｄ．Ｖ．Ｈｕｎｔｓｂｅｒｇｅｒ“Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ”Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｖａｒｉａｎｃｅ、Ｐ．Ｂｉｌｉｎｇｓｌｅｙ編、ｐｐ．２９８〜３３０、Ａｌｌｙｎ＆Ｂａｃｏｎ社、マサチューセッツ州ボストン（１９７７）及びＳｉｇｍａｓｔａｔ、Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州コルテマデラ］。有意性のαレベルはｐ＜０．０５として定義した。
【００８０】
実施例１５：ウエスタンブロット分析によるラットＬＩＭ鉱化蛋白質の検出
Ｅｎｇｌａｎｄ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ６２３：１７１（１９８０）及びＴｉｍｍｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４８６３（１９９３）の方法に従って、ポリクローナル抗体を調製した。
ヒーラ細胞をｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰでトランスフェクトした。Ｈａｉｒ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０：１（１９９６）の方法に従って蛋白質をトランスフェクトした細胞から採取した。天然ＲＬＭＰのウエスタンブロット分析をＴｏｗｂｉｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：４３５０（１９７９）に記載のされているように行った。
【００８１】
実施例１６：ラットＬＭＰユニーク体（ＲＬＭＰＵ）由来ヒトＰＣＲ産物の合成 ラットＬＭＰ−１ｃＤＮＡの配列に基づいて、正方向及び逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号１５及び１６）を合成し、ユニーク２２３塩基対の配列をラットＬＭＰ―１ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。同様なＰＣＲ産物をヒトＭＧ６３骨肉腫細胞ｃＤＮＡから同じＰＣＲプライマーを用いて単離した。
【００８２】
Ｔ−７５フラスコで培養したＭＧ６３骨肉腫細胞からＲＮＡを採取した。培養上澄を吸引によって除去し、フラスコに対あたり３．０ｍｌのＧＩＴを添加して覆い、５〜１０秒旋回させ、得られた溶液を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に移した（５本の試験管、０．６ｍｌ／試験管）。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第７章１９ページ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＢｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：２８２０−２８（１９９７）参照］の標準的方法を僅かに改変した方法を用いてＲＮＡを精製した。以下簡単に述べると、０．６ｍｌの試料に６０μｌの２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０μｌの水飽和フェノール及び１５０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を添加した。これら試薬を添加したのち、試料を渦巻攪拌し、遠心分離（１００００ｘｇ；２０分；４℃）にかけ、水性相を別の試験管に移した。、６００μｌのイソプロパノールを添加してＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分）にかけ、上澄を静かに吸引した。得られたペレットを４００μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、４０μｌの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）及び１．０ｍｌの無水エタノール中、−２０℃で一晩沈殿させた。試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分）にかけ、７０％エタノールで洗浄し、５〜１０分間空気乾燥し、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＲＮＡ濃度は光学濃度から計算した。
【００８３】
総ＲＮＡ（総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ中５μｇ）を６５℃で５分間加熱し、４μｌの５×ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２μｌのｄＮＴＰ、２μｌのｄＴ１７プライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）及び１μｌのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ユニット／μｌ）を含む試験管に添加した。反応物を３７℃で１時間保温し、次いで９５℃で５分保温してＭＭＬＶ−ＲＴを不活化した。試料に８０μｌの水を加えて希釈した。
【００８４】
転写試料（５μｌ）を標準法を用いたＰＣＲにかけた（総量５０μｌ）［Ｂｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：２８２０−２８（１９９７）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ＤＮＡｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５．３１−１章、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニュージャージー州トレントン（１９９０）参照］。以下簡単に述べると、水、適量のＰＣＲ緩衝液［２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ、正方向及び逆方向プライマー（ＲＬＭＰＵ用；配列番号１５及び１６）］、32Ｐ−ｄＣＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼを含む試験管に試料を添加した。プライマーは放射性バンド検出のため一定のサイクルに２２回かけ、スクリーニングプローブとして用いるＰＣＲ産物を増幅するためにサイクルに３３回かけた（９４℃、３０秒；５８℃、３０秒；７２℃、２０秒）。
【００８５】
アガロースゲル精製したＭＧ６３骨肉腫由来ＰＣＲ産物を配列決定した結果、ＲＬＭＰＵのＰＣＲ産物と９５％以上の相同性があることが判明した。この配列をＨＬＭＰユニーク領域（ＨＬＭＰＵ；配列番号６）と称した。
【００８６】
実施例１７：逆転写酵素由来ＭＧ６３ｃＤＮＡのスクリーニング
特異的プライマー（配列番号１６及び１７）を用いたＰＣＲを行って実施例７と同様にスクリーニングを行った。７１７塩基対のＭＧ６３ＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製して所与のプライマー（配列番号１２、１５、１６、１７、１８、２７及び２８）で配列決定した。配列は両方向について最低二回確認した。ＭＧ６３配列を整列させ全長ラットＬＭＰｃＤＮＡ配列に対向させ、ヒトＬＭＰｃＤＮＡ部分配列（配列番号７）を得た。
【００８７】
実施例１８：ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ノーザンブロット実験の結果に基づいて、ＬＭＰ−１が幾つかの異なる組織（例えばヒト心筋）において異なるレベルで発現することが判明した。従ってヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーを研究した。ライブラリーを５×１０4ｐｆｕ／ｍｌで寒天平板（ＬＢ底寒天）に植え、３７℃で一晩保温した。濾過膜を平板上に２分間載せた。濾過膜を取り除いて変性させ、洗浄し、乾燥してＵＶ架橋した。次いで濾過膜を前ハイブリダイゼーション緩衝液［２×ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）、５％ホルムアミド、１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ］内に４２℃で２時間保温した。２２３塩基対のＬＭＰに特異な放射性同位元素標識化プローブ（配列番号６；ランダムプライミングによる32Ｐ標識化）を添加し、４２℃で１８時間ハイブリダイズした。膜を室温で１回（１０分、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、５５℃で３回（１５分、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）洗浄した。正のプラーク精製を２回行った心臓ライブラリークローンをオートラジオグラフィーで同定し、市販製品のプロトコルに従ってλファージミドとして回収した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）。
【００８８】
正のクローンを制限酵素消化して様々な寸法のｃＤＮＡ挿入配列を得た。６００塩基対より長い挿入配列を配列決定により一次スクリーニングについて選択した。これらの挿入配列は、実施例１１に述べた標準的方法によって配列決定した。
【００８９】
一つのクローン（番号７）を、配列番号１１〜１４、１６及び２７に相当するプライマーを用いる自動配列決定分析にかけた。これらの方法によって得た配列は通常９７〜１００％の相同性を示した。クローン７（心臓ライブラリーから得たヒトＬＭＰ−１部分ｃＤＮＡ；配列番号８）は、転写領域においてラットＬＭＰｃＤＮＡ配列と８７％以上の相同性を示した。
【００９０】
実施例１９：全長ＬＭＰ−１ｃＤＮＡの決定
ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ配列とヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列のオーバーラップ領域を用いて、これら２つの配列を整列させ、１６４４塩基対の完全ヒトｃＤＮＡ配列を得た。ＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥソフトウェアー中のプログラム）を用いてこれら２つの配列を整列させた。２つの配列のオーバーラップ領域は、ＭＧ６３ｃＤＮＡ（配列番号７）のヌクレオチド６７２における１個のヌクレオチド置換を除いてはクローン番号７（配列番号８；対応するヌクレオチド５１６においてＧの代わりにＡを有する。）と完全な相同性を示す約３６０塩基対から成り立っていた。
【００９１】
「Ｇ」置換のＭＧ６３骨肉腫ｃＤＮＡクローンを用い、ＳＥＱＩＮ（ＰＣＧＥＮＥの別のサブプログラム）によって、整列させた２つの配列を連結した。結果として得られる配列を配列番号９に示す。新規なヒト由来配列とラットＬＭＰ−１ｃＤＮＡとの整列は、ＮＡＬＩＧＮによって行った。全長ヒトＬＭＰ−１ｃＤＮＡ配列（配列番号９）はラットＬＭＰ−１ｃＤＮＡ配列の翻訳領域と８７．３％の相同性を示した。
【００９２】
実施例２０：ヒトＬＭＰ−１のアミノ酸配列の決定
ヒトＬＭＰ−１推定アミノ酸配列をＰＣＧＥＮＥサブプログラムＴＲＡＮＳＬを用いて決定した。配列番号９の開いた読み枠は４５７アミノ酸（配列番号１０）を包含する蛋白質をコードする。ＰＣＧＥＮＥサブプログラムＰａｌｉｇｎを用いたところ、ヒトＬＭＰ−１アミノ酸配列はラットＬＭＰ−１アミノ酸配列と９４．１％の相同性を示すことが判明した。
【００９３】
実施例２１：ヒトＬＭＰｃＤＮＡの５’末端非翻訳領域の決定
ＭＧ６３ ５’ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ末端５’急速増幅（５’ＲＡＣＥ）プロトコルに従って、ＭＧ６３総ＲＮＡのネスト状ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。この方法ではまず３’末端の２個所に変性ヌクレオチドを有するロック−ドッキングオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた第一のｃＤＮＡ鎖合成を行う［Ｃｈｅｎｃｈｉｋ他、ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓＸ：５（１９９５）；Ｂｏｒｓｏｎ他、ＰＣ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．２：１４４（１９９３）］。第二の鎖合成は、Ｇｕｂｌｅｒ他、Ｇｅｎｅ２５：２６３（１９８３）の方法に従って、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮアーゼＨ、及び大腸菌ＤＮＡリガーゼの混合物を用いて行う。ブラントエンドをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで作成したのち、２重鎖ｃＤＮＡを断片（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’）（配列番号１９）に連結させた。ＲＡＣＥに先だって、アダプター連結ｃＤＮＡをマラソンＲＡＣＥ反応に好適な濃度（１：５０）に希釈した。アダプター連結２重鎖ｃＤＮＡについてこれで特異的クローニングを行う準備ができた。
【００９４】
第１回目のＰＣＲはセンスプライマーとしてのアダプター特異的オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（ＡＰ１）（配列番号２０）及び実施例１６で述べたユニーク領域（ＨＬＭＰＵ）からの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を用いて行った。第２回目のＰＣＲはネスト状プライマーＧＳＰ１−ＨＬＭＰＵ（アンチセンス／逆方向プライマー）（配列番号２３）及びＧＳＰ２−ＨＬＭＰＵＦ（配列番号２４）（センス／正方向プライマー、実施例１６参照）を用いて行った。ＰＣＲは抗体媒介の、しかしそれ以外は標準のホットスタートプロトコルを利用する市販のキット（アドバンテージｃＤＮＡ ＰＣＲコアキット；ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州パロアルト）を用いて行った。ＭＧ６３ｃＤＮＡ用のＰＣＲは、初期加熱開始変性（９４℃、６０秒）を行い、次いで９４℃で３０秒；６０℃で３０秒；６８℃で４分；このサイクルを３０回繰り返した。第１回のＰＣＲ産物は約７５０塩基対であり、ネスト状ＰＣＲ産物は約２３０塩基対であった。第１回ＰＣＲ産物を線型化したｐＣＲ２．１ベクター（３．９Ｋｂ）内にクローンした。挿入配列をＭ１３正方向及び逆方向プライマー（配列番号１１及び１２）の両方を用いて配列決定した。
【００９５】
実施例２２：５’末端ＵＴＲを有する全長ヒトＬＭＰ−１ｃＤＮＡの決定
ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ５’−ＵＴＲ配列（配列番号２１）、ＭＧ６３ ７１７塩基対配列（実施例１７；配列番号８）、及びヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列（実施例１８）のオーバーラップ領域を整列させ、１７０４塩基対の新規なヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２２）を得た。整列はＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥ及びＯｍｉｇａ１．０；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を用いて行った。オーバーラップ配列は全７１７塩基対領域（実施例１７）とほぼ１００％の相同性を示した。整列配列の結合はＳＥＱＩＮを用いて行った。
【００９６】
実施例２３：ＬＩＭ蛋白質発現ベクターの作成
ｐＨＩＳ−５ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターを、実施例１７及び１８に記した配列を用いて作成した。７１７塩基対クローン（実施例１７；配列番号７）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶで消化した。小さな断片（〜２５０塩基対）をゲル精製した。クローン７（実施例１８；配列番号８）をＣｌａＩ及びＸｂａＩで消化し、１４００塩基対の断片をゲル精製した。単離した２５０塩基対及び１４００塩基対の制限断片を連結して〜１６５０塩基対の断片を作成した。
【００９７】
クローン７における１個のヌクレオチド置換（７１７塩基対ＰＣＲ配列及び元のラット配列と比較）によって、翻訳塩基対６７２における停止コドンができた。この停止コドンのため、切断（短縮）蛋白質がコードされることになった（従ってＬＭＰ−１ｓの呼び名がある）。この構造体を発現ベクター（配列番号３２）に用いた。５’末端にＵＴＲを有する全長ｃＤＮＡ（配列番号３３）を、配列番号３２と５’ＲＡＣＥ配列（配列番号２１）とを整列させて作成した。ＬＭＰ−１ｓのアミノ酸配列（配列番号３４）を２２３アミノ酸蛋白質として推定し、予想される分子量〜２３．７ｋＤにてウエスタンブロットを（実施例１５と同様に）行って確認した。
【００９８】
ｐＨｉｓ−ＡＴＧベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化した。線型化ｐＨｉｓ−ＡＴＧベクターを取りだし、１６５０塩基対の制限断片を連結させた。連結産物をクローニングして増幅した。ｐＨｉｓ−ＡＴＧ−ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（ＨＬＭＰ−１ｓを挿入したｐＨＩＳ−Ａとも称する）を標準法によって精製した。
【００９９】
実施例２４：ＬＭＰ発現ベクターを用いた生体外での骨小結節形成及び鉱化の誘発
ラット頭蓋冠細胞を実施例１による２次培養から単離して増殖させた。培養は実施例１で述べたように刺激を加えないか又はグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激を加えた。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）のトランスフェクションプロトコルを改変したものを用いて、３μｇ／ウェルの各ベクターを実施例２５の２次ラット頭蓋冠骨芽細胞培養にトランスフェクトした。
【０１００】
鉱化した小結節を実施例３に記したようにフォンコッサ染色で可視化した。ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現のみが生体外の骨小結節形成（〜２０３小結節／ウェル）を誘発した。小結節のレベルはＧＣの正の対照によって誘発されるレベル（〜４１２小結節／ウェル）の約５０％であった。他の正の対照はｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクター（〜１５２小結節／ウェル）及びｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ発現ベクター（〜２０６小結節／ウェル）という結果であった一方、負の対照はｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖ発現ベクター（〜２小結節／ウェル）及び非処理（ＮＴ）プレート（〜４小結節／ウェル）という結果であった。これらのデータはヒトｃＤＮＡが少なくともラットｃＤＮＡ程度には骨形成刺激を与えることを実証している。効果はＧＣ刺激を行った場合よりも少なかったが、これは発現ベクターの量が最適以下であったためと考えられる。
【０１０１】
実施例２５：生体外及び生体内でＬＭＰにより誘発される細胞分化
クローン１０−４中のラットＬＭＰｃＤＮＡ（実施例１２参照）を、ＮｏｔＩ及びＡｐａｌを用いて３７℃で一晩２重消化してベクターから切り出した。ベクターｐＣＭＶ２ＭＣＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）を同じ制限酵素で消化した。クローン１０−４からの線型ｃＤＮＡ断片及びｐＣＭＶ２の両方をゲル精製し、抽出し、そしてＴ４リガーゼで連結した。連結したＤＮＡをゲル精製し、抽出し、大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換して増幅した。正の寒天コロニーを選択し、ＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化し、制限消化物をゲル電気泳動で分析した。ストック培養は正のクローンで調製した。
【０１０２】
制限酵素としてＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いたことを除いては同様の方法で逆方向ベクターを調製した。これらの制限酵素を用いたことによって、クローン１０−４からのＬＭＰｃＤＮＡ断片がｐＲｃ／ＣＭＶ２内に逆方向（すなわち非翻訳の方向）に挿入された。得られた組替えベクターをｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと称した。
【０１０３】
適量のｐＣＭＶ１０−４［６０ｎＭ（３μｇ）の最終濃度が最適；この実験では０〜６００ｎＭ／ウェル（０〜３０μｇ／ウェル）の最終濃度が好ましい］を最小イーグル培地（ＭＥＭ）中に再懸濁して４５０μｌの最終体積として１０秒間渦巻攪拌した。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを添加（７．５μｌ／ｍｌ最終溶液）して、溶液を１０秒間渦巻攪拌し、室温で１０分保温した。保温の後、１０％ＦＢＳ（１ｍｌ／ウェル；６ｍｌ／プレート）を追加したＭＥＭを添加してピペットで混合した。
【０１０４】
得られた溶液を次いで洗浄されたＲＯＢ培養にピペットで移した（１ｍｌ／ウェル）。培養を５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中、３７℃で２時間保温した。それから後、細胞を殺菌ＰＢＳで静かに一回洗浄し、適当な正常保温培養基を添加した。
【０１０５】
得られた結果は、有意な骨小結節形成がｐＣＭＶ１０−４で誘発したラット細胞培養全てで起こったことを実証している。例えば、ｐＣＭＶ１０−４トランスフェクト細胞は４２９小結節／ウェルを産生した。Ｔｒｍにさらした正の対照培養は４６０小結節／ウェルを産生した。これに対し、未処理の負の対照は、１小結節／ウェルを産生した。同様に、培養をｐＣＭＶ１０−４（逆方向）でトランスフェクトした場合、小結節は産生されなかった。
【０１０６】
生体内での新たな骨形成を実証するために、生後４〜５週の正常なラット（ｍｕ／＋；劣性無胸腺症状態に関して異型接合）の後肢から骨髄を吸引した。吸引した骨髄細胞をαＭＥＭ中で洗浄し、遠心分離にかけ、０．８３％ＮＨ4Ｃｌを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）中にペレットを再懸濁してＲＢＣを溶解した。残った骨髄細胞をＭＥＭで3回洗浄し、３×１０6細胞あたり9μｇのｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ（正方向又は逆方向）で２時間トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＭＥＭで２回洗浄し、３×１０7細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０１０７】
無菌ピペットを用いて細胞懸濁液（１００μｌ）を無菌２×５ｍｍＩ型ウシコラーゲンディスク（Ｓｕｌｚｅｒ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ社、コロラド州ホイートリッジ）上に載せた。ディスクは外科手術で生後４〜５週の無胸腺症ラット（ｍｕ／ｍｕ）の頭蓋、胸、胴体又は脊柱に皮下移植した。３〜４週目に動物からディスク又は外科処理部位を切りだし、７０％エタノールで固定した。固定された試験片はラジオグラフィーによって分析し、ゴルドナートリクロームで染色された５μｍ厚の部分について非脱石灰処理による組織学的研究を行った。コラーゲンディスクの代わりに失活（グアニジン抽出）鉱物質除去骨基質（Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州シュローズベリー）を用いた実験も行った。
【０１０８】
ラジオグラフィーによって、ＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトされた骨髄細胞を含む元のコラーゲンディスクと同じ形態の、高レベルの鉱化骨形成が得られたことが判明した。負の対照（翻訳された蛋白質をコードしない、ＬＭＰ−１ｓ ｃＤＮＡが逆方向をむいたものでトランスフェクトした細胞）では鉱化骨形成は観察されず、担体の吸着は進行中のようであった。
【０１０９】
組織学的研究によって、ＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトした移植片中で新しい骨柱が骨芽細胞と整列していることが判明した。負の対照中で、担体の部分的再吸収にともなった骨は見られなかった。
【０１１０】
１８セット（９個の負の対照ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−ＲＥＶ及び９個の実験用ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ）の移植片について、無胸腺症のラット複数における腰部脊椎と胸部脊椎との相互移植を更に行った。この実験で得たラジオグラフィーは、脊椎動物間で０／９個の負の対照移植片が骨形成（脊椎固定）を示すことを実証している。ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓで処理した移植片は９個ともに、脊椎動物間での固形骨固定を示した。
【０１１１】
実施例２６：実施例２及び３で説明された配列からの、ｐＨＩＳ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの合成
７１７塩基対クローン（実施例１７）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社、マサチューセッツ州シティー）で消化した。小断片（〜２５０塩基対）をゲル精製した。クローン７（実施例１８）をＣｌａＩ及びＸｂａｌで消化した。１４００塩基対断片をその消化物からゲル精製した。単離した２５０塩基対及び１４００塩基対のｃＤＮＡ断片を、標準法によって連結し、〜１６５０塩基対の断片を作成した。ｐＨｉｓ−Ａベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化した。線型化したベクターを回収して１６５０塩基対のキメラｃＤＮＡ断片に連結した。連結した産物を標準法によってクローンし増幅した。ｐＨｉｓＡ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（ＨＬＭＰ−１ｓを挿入したベクターｐＨｉｓ−Ａとも称する）を上記したようにＡＴＣＣに寄託した。
【０１１２】
実施例２７：ｐＨｉｓ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターを用いた、生体外での骨小結節形成及び鉱化の誘発
ラット頭蓋冠細胞を実施例１による２次培養から単離して増殖させた。培養は実施例１で述べたように刺激を加えないか又はグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激を加えた。組替えｐＨｉｓ−ＡベクターＤＮＡを３μｇ／ウェルの量で用いて、実施例２５と同様に培養をトランスフェクトした。鉱化した小結節を実施例３に記したようにフォンコッサ染色で可視化した。
【０１１３】
ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現のみ（すなわちＧＣ刺激なし）が生体外の骨小結節形成（〜２０３小結節／ウェル）を誘発した。小結節のレベルはＧＣの正の対照によって誘発されるレベル（〜４１２小結節／ウェル）の約５０％であった。ｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクターでトランスフェクトした培養（〜１５２小結節／ウェル）及びｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ発現ベクターでトランスフェクトした培養（〜２０６小結節／ウェル）について、同様な結果が得られた。一方、負の対照はｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖ発現ベクター（〜２小結節／ウェル）及び非処理（ＮＴ）プレート（〜４小結節／ウェル）という結果であった。これらのデータはヒトＬＭＰ−１ｃＤＮＡが少なくともこのモデル系におけるラットＬＭＰ−１ｃＤＮＡ程度には骨形成刺激を与えることを実証している。効果はＧＣ刺激を行った場合よりも少なかったが、しかしある場合においては効果が比較可能であった。
【０１１４】
実施例２８：ＬＭＰによる可溶性骨形成刺激因子の分泌誘発
実施例２４に記したようにラット頭蓋冠骨芽細胞培養におけるＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１ｓの過剰発現は、負の対照において観察された小結節形成より有意に大きな形成を引き起こした。ＬＩＭ鉱化蛋白質の作用メカニズムを研究するために、調節された培養基を異なる時点で回収し、１０倍に濃縮し、無菌濾過し、新鮮な血清を含む培養基中で元の濃度に希釈し、トランスフェクトされていない細胞に４日間適用した。
【０１１５】
第４日目にＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトされた細胞から回収した調節培養基は、トランスフェクトされた細胞中でＲＬＭＰ−１が直接過剰発現されるのとほぼ同じくらい、小結節形成の誘発に効果的であった。逆方向のＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１でトランスフェクトされた細胞から回収した調節培養基は、小結節形成についてはっきりとした効果を示さなかった。又、第４日以前にＬＭＰ−１でトランスフェクトされた培養から得た調節培養基も、小結節形成を誘発しなかった。これらのデータは、ＬＭＰ−１の発現が可溶因子の合成及び／又は分泌を引き起こしており、トランスフェクションから４日目までは培養基中に有効量が産生されていなかったことを示唆している。
【０１１６】
ｒＬＭＰ−１の過剰発現の結果、培養基中へ骨形成刺激因子が分泌されたので、ウエスタンブロット分析を用いてＬＭＰ−１蛋白質が培養基中に存在するかどうかを調べた。ｒＬＭＰ−１蛋白質の存在を、ＬＭＰ−１に特異な抗体（ＱＤＰＤＥＥ）を用いて評価し、従来法によって検出した。ＬＭＰ−１蛋白質は培養の細胞層中のみに見られ、培養基中からは検出されなかった。
【０１１７】
骨形成誘発性可溶因子の部分精製を、２５％及び１００％硫酸アンモニウムによる標準的希釈と、ＤＥ−５２陰イオン交換バッチクロマトグラフィー（１００ｍＭ又は５００ｍＭ ＮａＣｌ）によって行った。全ての活性が高濃度の硫酸アンモニウムと高濃度のＮａＣｌを用いた画分に観察された。このように偏った結果は、１個の要因が培養基の調節を担っているという可能性に一致する。
【０１１８】
ここに引用した全ての文献は、参照して説明に代える。
【０１１９】
上記の明細書は、例証を目的とした実施例とともに本発明の原理を教示しているが、本開示を読んだ当業者にとっては、本発明の範囲から離れることなく形態及び詳細において様々な改変が可能であることを理解されるはずである。
【配列表】
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、一般に哺乳類の骨形成原細胞並びに骨及び骨組織の形成に関する。特に本発明は、生体外及び生体内で骨鉱化の効力を促進する新規な蛋白質群及びこれらの蛋白質をコードする核酸に関する。本発明は更に、骨及び骨組織に関する様々な病理状態を処理する方法（例えば脊椎固定術、骨折修復及び骨粗鬆症の処理）を提供する。
２．背景技術
骨芽細胞は多能性間充織幹細胞から分化すると考えられている。骨芽細胞が成熟すると、骨を鉱化形成する細胞外基質が分泌される。この複雑な過程がどのように制御されているのかはよく理解されていないが、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）として知られる信号糖蛋白群が関与していると考えられている。これらの蛋白質は、胎芽の背側−腹側パターン形成、肢芽発達及び成体動物の骨折修復に関与することが示されている［Ｂ．Ｌ．Ｈｏｇａｎ、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐ．１０：１５８０（１９９６）］。このβ超科型トランスフォーミング増殖因子分泌性蛋白質群は、分化の異なる段階にある様々な種類の細胞において様々な活性を有するが、これら密接に関連する分子間における生理活性の違いは明らかにされていない［Ｄ．Ｍ．Ｋｉｎｇｓｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１０：１６（１９９４）］。
【０００２】
異なるＢＭＰ信号蛋白質それぞれに特異な生理学的役割をよりよく理解するために、ラット頭蓋冠骨芽細胞分化の誘発について、ＢＭＰ−６の効能と、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−４の効能とを比較した［Ｂｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３７：３４０１（１９９６）参照］。この研究には、分化の開始にＢＭＰ又はグルココルチコイドを必要とするラット胎児頭蓋冠の第一継代の培養（二次培養）を用いた。この膜性骨形成のモデルにおいて、グルココルチコイド（ＧＣ）又はＢＭＰによって、骨芽細胞特異的蛋白質であるオステオカルシンの分泌が可能な鉱化骨小結節の分化が開始される。この二次培養系は、自然分化を経た一次ラット骨芽細胞培養とは性質が異なる。この二次培養系においては、グルココルチコイドによって、１０倍量のＢＭＰ―６ ｍＲＮＡ及び蛋白質発現が誘発され、骨芽細胞分化が促進された［Ｂｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：２９２０（１９９７）］。
【０００３】
ＢＭＰ等の細胞外信号に加えて、細胞内信号又は調節分子が、新しい骨形成を導く一連の事象において役割を担っているようである。細胞内調節分子の主なものにＬＩＭ蛋白質があり、ＬＩＭ領域として知られる特徴的な構造パターンを有するためにそのような呼び名がある。ＬＩＭ領域は、２−アミノ酸スペーサーによって連結している２個の特異なジンクフィンガーによって構成される、システインに富んだ構造パターンである。ＬＩＭ領域のみを有する蛋白質もあるが、様々な機能領域を更に有する蛋白質もある。ＬＩＭ蛋白質は多種存在し、それには転写因子及び細胞骨格蛋白質が含まれる。ＬＩＭ領域の主要な役割は、ＬＩＭ領域と同一な又は異なるニ量体の形成を通じた、又は特異な蛋白質との結合による、蛋白質−蛋白質間相互作用の媒介であると思われる。
【０００４】
ＬＩＭ同型領域（ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ）蛋白質、すなわちＬＩＭ領域と同型領域配列を有する蛋白質において、ＬＩＭ領域は負の調節因子として作用する。ＬＩＭ同型領域蛋白質は、細胞系統決定の制御や分化の調節に関与しているが、ＬＩＭのみの蛋白質も同様の機能を有する。ＬＩＭのみの蛋白質は、そのような蛋白質をコードする遺伝子の幾つかが腫瘍染色体転座に関与しているので、細胞増殖の制御にも影響を与えている。
【０００５】
ヒト及び他の哺乳類は、骨回復及び／又は再生の過程を必要とする疾患又は負傷をする可能性のある動物である。例えば、自然の骨修復機能を刺激することのできる新しい治療法が有れば、骨折の治療は改善され、これによって骨折の治癒にかかる時間が短縮される。他には例えば、骨粗鬆症などの全身性の骨疾患にかかった者は、全身にわたって新しい骨を形成する治療法が有れば恩恵を受けることができる。このような治療法によって、この種の疾患に特徴的な多量の骨成分損失に由来する骨折事故を避けることができる。
【０００６】
少なくともこれらの理由から、生体内での新しい骨形成の刺激に用いる目的で、ＢＭＰ等の細胞外因子が研究されてきた。ＢＭＰ及び他の細胞外信号分子について研究初期には大きな成果が得られたにもかかわらず、それらの使用には数多くの欠点が存在する。例えば、新しい骨形成には精製ＢＭＰの比較的大量な投与が必要であり、従ってそのような治療法には経費がかかる。更に、細胞外蛋白質は、宿主動物に導入されると分解されやすい。加えて、そうした蛋白質はたいていは免疫原となるので、投与した蛋白質に対する免疫応答を刺激する可能性がある。
【０００７】
このような事情から、細胞内信号分子を使用して新しい骨形成を誘発する治療法の実現が望まれる。遺伝子治療分野における進歩によって、骨形成過程の一部を構成する細胞内信号をコードする核酸断片を、骨形成前駆細胞（すなわち骨形成に関与する細胞）内に導入することが可能になった。骨形成に遺伝子治療を用いることによって、（１）費用が削減できる；（２）細胞内信号を長期間発現することができるので、細胞外因子を用いた治療法と比較して、より大きな効果が得られる；（３）細胞外信号による治療では信号の受容体数が限られていることで治療が制限されるがそれを回避できる；（４）局所的な骨形成が必要な部位に、トランスフェクトした潜在的骨形成細胞を直接投与することが可能になる；そして（５）全身性の骨形成が可能になり、骨粗鬆症や他の代謝骨疾患に対する治療法を提供することが可能になる、などの数多くの利点が提供される可能性がある。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、骨形成にいたる一連の事象の初期に関与する細胞内信号分子を用いた骨形成を誘導する新規な構成と方法を提供することによって、先行技術の欠点を克服することを目的とする。本出願者らは、刺激を加えたラット頭蓋冠骨芽細胞培養から単離したものを元にした配列を有する新規なＬＩＭ遺伝子である、１０−４／ＲＬＭＰ（配列番号１、配列番号２）を発見した。遺伝子をクローンし、配列決定し、生体外で骨鉱化効果を促進する能力についてアッセイを行った。蛋白質ＲＬＭＰは骨基質の鉱化に影響を与えただけでなく、細胞の骨芽系統への分化にも影響を与えた。例えば公知の他のサイトカインとは違って、ＢＭＰやＲＬＭＰは分泌性蛋白質ではないが、細胞内信号分子である。この特徴によって、細胞内信号増幅が提供されるという利点があるだけでなく、トランスフェクトした細胞の評価が容易に行えるという利点もある。これら蛋白質の使用は、より効果的で特異な生体内の用途にも適している。好ましい臨床用途としては、骨折、骨欠損、骨移植回復の促進及び骨粗鬆症の患者における正常な恒常性の促進が挙げられる。
【０００９】
本出願者らは更に、ヒト蛋白質（ヒトＬＭＰ−１）に相当するアミノ酸配列の遺伝子をクローンし、配列決定し、アミノ酸配列を推定した。ヒト蛋白質によって、生体外及び生体内での骨鉱化効果が促進されることが実証される。
【００１０】
加えて、本出願者らは、ＬＭＰ−１を切断した（短縮した）もの（ＨＬＭＰ−１ｓと称する）についても特徴付けを行った。この短縮版はｃＤＮＡクローン源のひとつにおける点突然変異（蛋白質を短縮する停止コドンを提供する）から得られたものである。短縮版（ＬＭＰ−１ｓ）は細胞培養内及び生体内で発現された場合十分に機能する。
【００１１】
本発明の更なる特徴及び利点は、下記に説明するが、これらの説明から明らかになるところもあるし、あるいは本発明の実施によって理解されるであろうところもある。本発明の目的及び他の利点は、ここに記載の説明及び請求項で特に指摘する方法及び構成によって実現及び達成される。
【００１２】
一つの特徴にあっては、本発明はあらゆるＬＩＭ鉱化蛋白質をコードする核酸配列を包含する単離核酸分子にして、配列番号２５の全長に相補的な核酸分子に標準条件下でハイブリダイズし、そして配列番号２６の全長に相補的な核酸分子に強度の緊縮条件下でハイブリダイズする核酸分子に関する。特異な特徴にあっては、単離核酸分子はＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ又はＲＬＭＰをコードする。加えて、本発明はこれらの核酸分子を包含するベクター、及びベクターを包含する宿主細胞も企図している。他の特異的な特徴にあっては、本発明は蛋白質自体に関する。
【００１３】
第二の特徴にあっては、本発明はＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ及びＲＬＭＰ等のＬＩＭ鉱化蛋白質に特異的な抗体に関する。一つの特異な特徴にあっては、抗体はポリクローナル抗体である。他の特異な特徴にあっては、抗体はモノクローナル抗体である。
【００１４】
第三の特徴にあっては、本発明は、ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含する単離核酸分子によって骨形成前駆細胞のトランスフェクトが行われる、骨形成誘発の方法に関する。一つの特異な特徴にあっては、単離核酸分子はベクター（プラスミド又はアデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス）内にある。トランスフェクションはエクスビボ（ex vivo）又は生体内で単離核酸分子を直接投与することで行われる。トランスフェクトした単離核酸分子はＨＬＭＰ−１、ＨＬＭＰ−１ｓ又はＲＬＭＰをコードする。
【００１５】
更なる特徴にあっては、本発明は、ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を有する単離核酸分子で骨形成前駆細胞をトランスフェクトし、トランスフェクトした骨形成前駆細胞を基質と混合し、そしてその基質を脊椎に接触させることを含む脊椎固定の方法に関する。
【００１６】
更に他の特徴にあっては、本発明は、本発明のベクターで宿主細胞を安定的にトランスフェクトすることによって全身骨形成を誘発する方法に関する。
【００１７】
以下の一般的な記述及び詳細な記述は例証及び説明のためのものであり、請求項に記載の発明を更に説明することを企図していることが理解されよう。
【００１８】
略号及び定義
ＢＭＰ 骨形態形成蛋白質
ＨＬＭＰ−１ ヒトＬＭＰ−１。ヒトＬＩＭ蛋白質又はＨＬＭＰとも称する。
ＨＬＭＰ−１ｓ ヒトＬＭＰ−１短縮（切断）蛋白質
ＨＬＭＰＵ ヒトＬＩＭ蛋白質ユニーク領域
ＬＭＰ ＬＩＭ鉱化蛋白質
ＭＥＭ 最小必要培地
Ｔｒｍ トリアムシノロン
β−ＧｌｙＰ β−グリセリンリン酸
ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ末端の急速増幅
ＲＬＭＰ ラットＬＩＭ鉱化蛋白質。ＲＬＭＰ−１とも称する。
ＲＬＭＰＵ ラットＬＩＭ蛋白質ユニーク領域
ＲＮＡｓｉｎ ＲＮアーゼ阻害剤
ＲＯＢ ラット骨芽細胞
１０−４ ＲＬＭＰのｃＤＮＡ配列（配列番号２）を含有するクローン
ＵＴＲ 非翻訳領域
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規な哺乳類ＬＩＭ蛋白質（以下、ＬＩＭ鉱化蛋白質又はＬＭＰと称する）に関する。本発明は特に、ＨＬＭＰ又はＨＬＭＰ−１として知られるヒトＬＭＰに関する。本出願者らは、これらの蛋白質が生体外で育成される哺乳類細胞内の骨鉱化を促進することを発見した。哺乳類内で産生される場合には、ＬＭＰは生体内での骨形成も誘発する。
【００２０】
骨髄細胞、骨形成前駆細胞又は間充織幹細胞をＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸でエクスビボトランスフェクションし、次いでこのトランスフェクトされた細胞をドナーに移植することは、様々な骨関連疾患又は損傷の治療に適している。例えばこの方法を、長骨骨折修復の増強；体節欠陥部分における骨の形成；骨折治療用の代用骨移植片の提供；腫瘍再建術又は脊椎固定術の促進；及び臀部、椎骨又は手関節の骨粗鬆症などにおける、脆弱化骨又は骨粗鬆症骨の（注射による）局所的治療の提供に用いることができる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸を用いたトランスフェクションは、長骨の骨折修復を促進することを目的とする、トランスフェクトした骨髄細胞の経皮注射；長骨骨折における癒合の遅延又は非癒合の治療、あるいは脊椎固定における偽関節の治療；及び臀部又は膝関節の無血管壊死における新しい骨形成の誘発、においても有用である。
【００２１】
遺伝子治療のエクスビボに基づく方法に加えて、ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードする核酸配列を包含する組替えＤＮＡベクターによるトランスフェクトを、生体内で行うことができる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰをコードするＤＮＡ断片を適当なウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクター）に挿入し、得られるウイルス構造体を軟骨内性骨形成が望まれる体の部位に直接に注射することができる。ＬＭＰ又はＨＬＭＰ配列を導入する直接的な経皮注射を用いることによって、（エクスビボでトランスフェクトするための）骨髄細胞の入手や新しい骨形成が必要とされる患者の部位へのそれらの移植を目的とした外科的な処理を行う必要なく、骨形成を刺激することが可能になる。Ａｌｄｅｎ他、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ Ｆｏｃｕｓ（１９９８）は、アデノウイルスベクター内にクローンしたＢＭＰ−２をコードするｃＤＮＡを用いた遺伝子治療における、直接注射法の有用性を実証している。
【００２２】
ＨＬＭＰをコードする核酸配列を包含する、裸のすなわちカプセル封入されていない組替えプラスミドを、適当な体部位に直接注射する生体内遺伝子治療を実施することが可能である。本発明のこの態様においては、上記したように、裸のプラスミドＤＮＡが適当な標的細胞によって取りこまれる又は内在化させられるとトランスフェクションが起こる。ウイルス構造体を用いた生体内遺伝子治療の場合のように、裸プラスミドＤＮＡを直接注射することによって、外科的処理が殆ど又は全く必要なくなるという利点が得られる。内皮細胞有糸分裂促進剤ＶＥＧＦ（血管内皮発育因子）をコードする裸プラスミドＤＮＡを用いた直接遺伝子治療は、ヒト患者における効果が実証されている［Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９７（１２）：１１１４−２３（１９９８）］。
【００２３】
ＬＭＰを骨形成原細胞内に導入するのにアデノウイルスベクターを用いることによって、ＬＭＰの一時的な発現が可能になる。トランスフェクトされる標的細胞のゲノム内にアデノウイルスが組み込まれないためにこのようなことが起こる。ＬＭＰの一時的発現、すなわちトランスフェクトされた標的細胞の寿命間に起こる発現は、本発明の目的を達成するのに十分である。しかしＬＭＰの安定した発現は、標的細胞のゲノムに組み込まれるベクターが導入媒体として用いられた時に可能となる。例えばレトロウイルスに基づくベクターが、この目的に適している。
【００２４】
ＬＭＰの安定した発現は、骨粗鬆症や骨形成不全症などの様々な全身性骨関連疾患の治療に特に有用である。本発明のこの態様にあっては、ＬＭＰをコードするヌクレオチド配列を標的細胞内に導入するために、標的細胞のゲノム内に組み込まれるベクターを用いることに加え、ＬＭＰ発現を調節性プロモーターの制御下におく。例えばテトラサイクリン等の外因性誘発剤と接触することによって起動するプロモーターが好ましい。この方法を利用して有効量の外因性誘発剤を投与することによって、全身性の新しい骨形成を刺激することができる。十分量の骨塊が形成されたのち、外因性誘発剤の投与を中止する。この工程は、例えば骨粗鬆症の治療後の経過など、骨塊の損失を補う必要に応じて、繰り返してもよい。
【００２５】
ＨＬＭＰに特異な抗体は、患者細胞における骨誘発性すなわち骨形成の潜在能力をアッセイする方法に用いるのに特に適している。この方法を用いて、骨回復の進行が遅くなる又は治癒の程度が低くなる可能性のある患者を同定することができる。更に、ＨＬＭＰ特異的抗体は、骨粗鬆症などの骨変性疾患における危険因子を同定するマーカーアッセイに用いるのに適している。
【００２６】
公知の及び従来の方法に従い、ＬＭＰをコードする核酸断片をクローン及び／又は発現ベクターなどの他の核酸配列に連結することによって、本発明の遺伝子を調製する。これらの組替えベクターを作成し分析するのに必要な方法、例えば制限エンドヌクレアーゼによる消化、クローニングプロトコル、突然変異誘発、オリゴヌクレオチドの有機合成及びＤＮＡ配列決定は、公知のものを用いることができる。ＤＮＡ配列決定には、デオキシターミネーター法を用いるのが好ましい。
【００２７】
組替えＤＮＡ法については多くの論文がある［Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第２版（１９８８）、Ｄａｖｉｓ他、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）、及びＡｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）］。これらの参考文献は、ここに参照して説明に代える。
【００２８】
ＤＮＡ又はｃＤＮＡのプライマー依存性増幅は、本発明における遺伝子の発現においてよく用いられる工程である。これは一般的にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。ＰＣＲについては米国特許第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓ他）や他の文献に記載がある。ＰＣＲの基本原理は、プライマー伸長のサイクルを繰り返すことによるＤＮＡ配列の指数関数的複製である。１個のプライマーの伸長産物が、別のプライマーとハイブリダイズすると、他の核酸分子合成用の鋳型となる。プライマー−鋳型複合体はＤＮＡポリメラーゼの基質として作用し、複製を行う際に、プライマーを伸長する。ＰＣＲに従来用いられている酵素は、サームス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、又はＴａｑＤＮＡポリメラーゼである。
【００２９】
このＰＣＲ法を基本とする様々な改変法が存在するが、本発明の組替えベクターを作成するのに必要な段階は、どのような方法を選択したとしても、当業者によって容易に行うことができる。例えば、１０−４／ＲＬＭＰの細胞発現を測定するために、ＲＮＡを抽出して標準的で公知の方法によって逆転写する。得られるｃＤＮＡを適当なｍＲＮＡ配列についてＰＣＲで分析する。
【００３０】
ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードする遺伝子は、組替え発現系における発現ベクター内で発現される。もちろん、作成される配列は元の配列又はその相補的配列と同じである必要はなく、ＤＮＡコードが縮退していても骨形成活性を有するＬＭＰを発現するものであれば、どのような配列であってもよい。保存的アミノ酸置換や、アミノ末端におけるメチオニン残基の出現などの他の改変を、用いることもできる。
【００３１】
宿主の発現系において活性を有するリボソーム結合部位を、キメラＬＭＰコード配列の５’末端に連結し、合成遺伝子を作成する。合成遺伝子は、適当に線型化されたプラスミドに連結することによって、様々な発現ベクターのいずれか一つに導入することができる。調節性プロモーター、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃプロモーターも、キメラコード配列の発現に適している。他に好ましい調節性プロモーターの例としては、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７及びλプロモーターが挙げられる。
【００３２】
ＬＭＰをコードするＤＮＡは、文献にある標準的な手順の一つ、例えばリン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気穿孔法、又は原形質体融合法によってレシピエント細胞にトランスフェクトされ、安定した形質転換体を形成する。特に下記の態様で実施されるリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。
【００３３】
細胞内に移転させる前に、Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ Ｄｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６（１９７３）の方法に従ってＤＮＡをリン酸カルシウムと共に共沈させる。４０〜５０μｇのＤＮＡの等画分の一つに、担体としてサケ精子又は子牛胸腺ＤＮＡを加えたものを、１００ｍｍディッシュに植えた０．５×１０6細胞に用いる。ＤＮＡを０．５ｍｌの２×ヘペス溶液（２８０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭヘペス及び１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．０）に混合し、等体積の２×ＣａＣｌ2（２５０ｍＭ ＣａＣｌ2及び１０ｍＭヘペス、ｐＨ７．０）を添加する。３０〜４０分後に現れた白い顆粒沈殿を、細胞上に均等に滴下し、３７℃で４〜１６時間保温する。培地を除去し１５％グリセロールを含むＰＢＳで３分間、細胞にショックを与える。グリセロールを除去したのち、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコの最小必要培地（ＤＭＥＭ）に細胞を入れる。
【００３４】
ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｋｉｍｕｒａ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４９：３９４（１９７２）及びＳｏｍｐａｙｒａｃ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：７５７５（１９８１）参照］；電気穿孔法［Ｐｏｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：７１６１（１９８４）参照］；及び原形質体融合法［Ｓａｎｄｒｉ−Ｇｏｄｄｉｎ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：７４３（１９８１）参照］を用いても、ＤＮＡをトランスフェクトすることができる。
【００３５】
固相におけるホスホルアミダイト化学法は、オリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシヌクレオチドを有機合成する方法として好ましい。加えて、他の多くの有機合成法を用いることも可能である。当業者は、本発明の特定の配列についてこれらの方法を容易に適用することが可能である。
【００３６】
本発明は更に、標準的な条件下で、本発明のＬＩＭ鉱化蛋白質をコードする核酸配列のいずれかにハイブリダイズする核酸分子を含む。「標準的ハイブリダイゼーション条件」はプローブの大きさ、核酸試薬のバックグラウンド及び濃度、並びにハイブリダイゼーションの種類（例えばインサイチューサザンブロット法又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのハイブリダイゼーション（ノーザンブロット法））に伴って異なる。「標準的ハイブリダイゼーション条件」は当分野の技術レベルの範疇にある。例えばＦｒｅｍｅａｕ他の米国特許第５，５８０，７７５号、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５）、Ａｌｗｉｎｅ他、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：２２０（１９７９）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ第２版、ｐｐ７．１９−７．５０、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい（ここに参照して説明に代える）。
【００３７】
好ましい標準的なハイブリダイゼーション条件のひとつは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（１５０ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4［ｐＨ７．４］、１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］）、５×デンハート溶液（水１００ｇ中２０ｍｇのフィコール、２０ｍｇのポリビニルピロリドン及び２０ｍｇのＢＳＡを含む）、１０％硫酸デキストラン、１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中に、４２℃で２時間プレハイブリダイズするブロットに関する。32Ｐ標識化ｃＤＮＡプローブを添加し、ハイブリダイゼーションを１４時間続けた。次いで、ブロットを２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いて２２℃で２０分にわたる洗浄を２回行い、次いで０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを用いて６５℃で１時間洗浄した。ブロットを乾燥し、増感スクリーンの存在下でＸ線フィルムに５日間露出した。
【００３８】
プローブとその標的配列が実質的に同一である場合、「強度の緊縮条件」下で、これらはハイブリダイズする。標準的ハイブリダイズ条件の場合のように、当業者は実質的に同一の配列のみがハイブリダイズする条件を設定することができる。
【００３９】
本発明の他の特徴は、核酸配列によってコードされる蛋白質を含有する。更に他の態様においては、本発明は抗ＬＭＰ抗体を用いたそのような蛋白質の同定に関する。この態様においては、細胞を溶解し蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することによってウエスタンブロット用の蛋白質試料が調製される。蛋白質は電気ブロットによってニトロセルロースに転写される［Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８７）参照］。フィルターを即席脱脂粉乳（１００ｍｌＰＢＳ中１ｇｍ）でブロックしたのち、抗ＬＭＰ抗体をフィルターに添加して室温で１時間保温する。フィルターをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で完全に洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）−抗体複合体と共に室温で１時間保温する。フィルターを再度ＰＢＳで完全に洗浄したのち、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を添加して抗体バンドを同定する。
【００４０】
単一特異的抗体を本発明の試薬として用いることができ、特に、ＬＭＰの発現に関連した特異的な特徴について患者の細胞を分析するのに用いられる。ここでいう「単一特異的抗体」とは、ＬＭＰに対する単一結合特性を有する単抗体種又は複数抗体種のことを言う。ここで言う「単一結合」とは、（例えば上記したようにＬＭＰに関連する）特異な抗原又はエピトープに結合する抗体種の能力のことを言う。ＬＭＰに対する単一特異的抗体は、ＬＭＰに対して反応性を有する抗体を含む哺乳類抗血清から精製されるか、又はＬＭＰに対して反応性を有するモノクローナル抗体からＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−９７（１９７５）］の方法を用いて調製される。ＬＭＰ特異性抗体は例えばネズミ、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ又はウマなどの動物を、適当な濃度のＬＭＰ（及び免疫アジュバント）で免疫化することによって調製することができる。
【００４１】
この方法においては、前免疫血清を第一の免疫化に先だって採取する。各動物は約０．１〜１０００ｍｇのＬＭＰ（及び望ましい場合には許容される免疫アジュバント）を投与される。このような許容される免疫アジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、明礬沈殿、コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）を含有する油乳濁液の水、及びｔＲＮＡアジュバントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。初期免疫は、好ましくは、フロイント完全アジュバントに含まれるＬＭＰを、複数部位に皮下注射（ＳＣ）、腹腔内注射（ＩＰ）のいずれか又はその両方によって導入することを含む。各動物から一定間隔で、好ましくは１週間ごとに採血し、抗体価を測定する。動物は初期免疫化に続いて追加注射を受けてもよいし受けなくてもよい。追加注射を受ける動物は一般に、フロイント不完全アジュバントに含まれる抗体を等量、同じ経路で投与される。追加注射は最大抗体価が得られるまで約３週間の間隔で投与される。各追加免疫化から約７日後に、又は１回の免疫化から約１週間ごとに、動物から採血して血清を回収し、画分を約−２０℃で貯蔵する。
【００４２】
ＬＭＰに対して反応性を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃマウスをＬＭＰで免疫化することによって調製する。マウスは、約０．１〜１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＬＭＰを含む約０．５ｍｌの緩衝液又は食塩水と等量の許容されるアジュバントとを混合したものをＩＰ又はＳＣ経路で投与することによって免疫化される（上記参照）。アジュバントとしてはフロイント完全アジュバントが好ましい。ネズミは第０日に初期免疫を受け、約３~３０週間静養させる。免疫化ネズミは、約０．１〜１０ｍｇのＬＭＰを含む緩衝溶液（例えばリン酸緩衝食塩水）を静脈注射（ＩＶ）経路で１回以上投与する追加免疫化をうける。抗体陽性ネズミから得たリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当分野で公知の標準法を用いて免疫化ネズミから脾臓を除去することによって得る。脾臓リンパ球と適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞とを、安定的なハイブリドーマが得られる条件下で混合することによってハイブリドーマ細胞を作成する。融合相手の例としては、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４；及びＳｐ２／０が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このうちＳｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは、約３０〜５０％の濃度の、約１０００分子量のポリエチレングリコール中で融合される。融合ハイブリドーマ細胞は、公知の方法で補助ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンで育成することによって選択する。第１４、１８及び２１日あたりで上澄液を成長が陽性のウェルから回収し、ＬＭＰを抗体として用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）等のイムノアッセイによって、抗体産生についてのスクリーニングを行う。培養液をオクタロニー沈降アッセイで試験して、ｍＡｂのアイソタイプを決定する。抗体陽性ウェルから得たハイブリドーマ細胞は、軟寒天法などによってクローンする［ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、“Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９７３）；Ｈａｒｌｏｗ他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）参照］。
【００４３】
モノクローナル抗体は、プリスタン−プライム化Ｂａｌｂ／ｃマウスに、一匹につきプライム化約４日後の約２×１０6〜６×１０6ハイブリドーマ細胞を約０．５ｍｌ注射することによって、生体内で産生することもできる。細胞移転の後約８〜１２日で腹水を回収し、モノクローナル抗体を公知の技術で精製する。
【００４４】
約２％のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ内でハイブリドーマ細胞系を育成することによって抗ＬＭＰｍＡｂの生体外産生を行い、十分量の特異的ｍＡｂを得る。ｍＡｂを公知の技術で精製する。
【００４５】
腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体価は、様々な血清学的又は免疫学的アッセイによって決定する。それらの例として沈降法、受動的凝集、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。体液又は組織、及び細胞抽出物中のＬＭＰの存在を調べるのに、同様のアッセイが用いられる。
【００４６】
上記した単一特異的抗体を産生する方法を、ＬＭＰのポリペプチド断片、全長の新生ＬＭＰポリペプチド、又はその改変体、あるいはその対立形質に特異な抗体を産生するのに利用できることは、当業者には自明のことであろう。
【００４７】
ｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと称されるベクターに含まれる１０−４／ＲＬＭＰ試料（すなわち１０−４クローン／ＲＬＭＰを挿入したｐＲｃ／ＣＭＶ２ベクター）が、１９９７年７月２２日にＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、２０８５２メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ１２３０１）に寄託されている。培養番号は２０９１５３が割り当てられている。ＨＬＰＭ−１ｓを挿入したｐＨｉｓ−Ａベクター試料が１９９８年３月１９日にＡＴＣＣに寄託されている。培養番号は２０９６９８が割り当てられている。ブダペスト条約の取り決め下に扱われるこれらの寄託物は、少なくとも３０年間ＡＴＣＣに保持され、それらを開示する特許の権利賦与のもとに誰もが入手することができる。寄託物が入手しやすいとはいっても、政府の決定による特許権を軽んじて本発明を実施するライセンスが賦与されたとみなすべきでないことは理解されるべきである。
【００４８】
本発明の核酸、蛋白質又は抗体の評価において、酵素アッセイ、蛋白質精製及び従来の他の生物化学的方法が用いられる。ＤＮＡ及びＲＮＡはそれぞれサザンブロット法及びノーザンブロット法によって分析される。通常、分析される試料はゲル電気泳動によって寸法を分別される。ゲル中のＤＮＡ又はＲＮＡは、次いでニトロセルロース又はナイロン膜に転写される。ゲル中の試料パターンの複製であるブロットは、プローブとハイブリダイズされる。一般に、プローブは放射性同位元素、好ましくは32Ｐで標識付けされるが、当分野で公知の信号発生分子でプローブを標識付けすることもできる。次いで対象とする特異的なバンドを、オートラジオグラフィー等の検出系によって可視化することができる。
【００４９】
本発明の好ましい態様を例証する目的で、以下に実施例を述べるが、本発明を限定するものではない。これらの結果は本発明のＬＩＭ鉱化蛋白質、及びこれらの蛋白質をコードする単離核酸に、骨形成の誘発能又は促進能があることを立証している。
【００５０】
実施例１：頭蓋冠細胞培養
ラット骨芽細胞（ＲＯＢ）としても知られるラット頭蓋冠細胞を、分娩２０日前のラットから得た［Ｂｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３７（８）：３４０１−０７（１９９６）参照］。一次培養を密集するまで（７日間）培養し、トリプシン処理し、第一継代培養細胞として６ウェルプレート（１×１０5細胞／３５ｍｍウェル）に植えた。第０日に密集状態の継代培養細胞を、更に７日間培養した。第０日に始まって３〜４日ごとに層流フードの下で培養基を交換して処理（Ｔｒｍ及び／又はＢＭＰ）を行った。標準的な培養プロトコルは以下の通りである。第１〜７日、ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、±刺激；第８〜１４日、ＢＧＪｂ培養基、１０％ＦＢＳ、（鉱化を可能にする無機隣酸塩源としての）５ｍＭβ−ＧｌｙＰ。骨小結節形成及びオステオカルシン分泌の終点分析を第１４日に行った。研究した全てのＢＭＰについて得た投与応答曲線において範囲中央効果を示した系の試行実験に基づいて、ＢＭＰ投与量を５０ｎｇ／ｍｌとした。
【００５１】
実施例２：アンチセンス処理及び細胞培養
膜性骨形成の間の、ＬＭＰ−１の潜在的な機能的役割を調べるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを合成してＬＭＰ−１ｍＲＮＡ翻訳をブロックし、グルココルチコイドにより誘発され分化しつつある二次骨芽細胞培養を処理した。ＲＬＭＰ発現の阻害を、推定翻訳開始領域に渡る２５塩基対に相当する高度に特異的な（公知のラット配列に対して有意な相同性を有さない）アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号３５）を用いて行った。対照培養としてオリゴヌクレオチドを加えないものとセンスオリゴヌクレオチドを加えたものを作成した。リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）の存在下（前保温）又は非存在下で実験を行った。以下簡単に述べると、２２μｇのセンス又はアンチセンスＲＬＭＰオリゴヌクレオチドをＭＥＭに室温で４５分間保温した。保温に続いて、更にＭＥＭか前保温したリポフェクタミン／ＭＥＭ（７％ｖ／ｖ；室温で４５分保温）のいずれかを添加してオリゴヌクレオチド濃度を０．２μＭとした。得られた混合物を室温で１５分間保温した。次いでオリゴヌクレオチド混合物を適当な培養基（すなわちＭＥＭ／アスコルビン酸塩／±Ｔｒｍ）に混合し、最終オリゴヌクレオチド濃度を０．１μＭとした。
【００５２】
細胞を適当なオリゴヌクレオチドの存在下又は非存在下に適当な培地（±刺激）で保温した。まずリポフェクタミンで保温した培養にリポフェクタミン及びオリゴヌクレオチドのいずれも含まない培養基で４時間保温（３７℃；５％ＣＯ2）したのち、培地補充した。全ての培養、特にオリゴヌクレオチドを加えた培養について、オリゴヌクレオチドレベルを保持するために２４時間ごとに培地補充した。
【００５３】
ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＭＰ−６オリゴヌクレオチドの効果と同様に、投与量に依存する形で、鉱化小結節形成及びオステオカルシン分泌を阻害した。
骨芽細胞分化におけるＬＭＰ−１アンチセンスブロックは、外因性ＢＭＰ−６の添加により回復できなかったが、一方ＢＭＰ−６アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害はＢＭＰ−６の添加により取り消された。この実験では骨芽細胞分化経路においてＢＭＰ−６よりＬＭＰ−１が上流に位置することも確認された。ＬＭＰ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは更に一次ラット骨芽細胞培養において自然な骨芽細胞の分化を阻害した。
【００５４】
実施例３：鉱化骨小結節形成の定量化
実施例１及び２で調製したＲＯＢの培養を、７０％エタノールで一晩定着し、フォンコッサ銀染色で染色した。半自動コンピューター化ビデオイメージ分析システムを用いて、各ウェルの小結節数及び小結節面積の定量化を行った［Ｅｎｄ ｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３７（８）：３４０１−０７（１９９６）参照］。小結節値あたりの面積を計算するためにこれらの値を割った。この自動化工程の手動測定法に対する有効性は確認されており、０．９２の相関係数（ｐ＜０．０００００１）が実証されている。全てのデータは、各条件下のウェル５〜６個から計算した平均値±平均値の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）として表現される。各実験は異なる頭蓋冠調製物からの細胞を用いて少なくとも２度行われた。
【００５５】
実施例４：オステオカルシン分泌の定量化
本発明者らは実験室でラットオステオカルシンのＣ末端ノナペプチドに対する単一特異的ポリクローナル抗体（Ｐａｂ）を作成した。培養基中のオステオカルシンのレベルを、この抗体を利用した競合ラジオイムノアッセイを用いて測定した［Ｎａｎｅｓ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１２７：５８８（１９９０）参照］。以下簡単に述べると、１μｇのノナペプチドをラクトペルオキシダーゼ法によって１ｍＣｉ125Ｉ−Ｎａでヨウ素処理した。２００μｌのアッセイ緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００１％チメロサール、０．０２５％ＢＳＡ）を含む試験管に、細胞培養から又はオステオカルシン基準（０〜１２０００ｆｍｏｌｅ）から取った培養基を、アッセイ緩衝液中１００μｌ／試験管の割合で加えた。次いでＰａｂ（１：４００００；１００μｌ）を加え、ヨウ素処理したペプチド（１２０００ｃｐｍ；１００μｌ）を加えた。非特異的結合について試験した試料は、同様に調製した（ただし抗体を含まないように調製した）。
【００５６】
結合及び遊離ＰＡｂを、７００μｌヤギ抗ウサギＩｇＧを添加して４℃で１８時間保温することによって分離した。試料を１２００ｒｐｍで４５分間遠心分離したのち、上澄を静かに別容器に移して沈殿物をγ線計数器で測定した。オステオカルシンの値はｆｍｏｌｅ／１００μｌの単位で測定し、次いで１００で割ることによってｐｍｏｌｅ／ｍｌ培養基（第三日）の単位に変換した。数値は各条件下のウェル５〜６個から３回計算した値の平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表現された。各実験は異なる頭蓋冠調製物からの細胞を用いて少なくとも２度行われた。
【００５７】
実施例５：Ｔｍ及びＲＬＭＰが生体外での鉱化に与える効果
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドが、非刺激細胞培養系において骨小結節の形成全般に与える効果は、はっきりしていない。しかしＲＯＢがＴｍで刺激された場合には、ＲＬＭＰに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは小結節の鉱化を＞９５％の割合で阻害する。外因性のＢＭＰ−６をオリゴヌクレオチド処理した培養に添加したところ、ＲＬＭＰアンチセンス処理した小結節の鉱化は起こらなかった。
【００５８】
今まで長いことオステオカルシンといえば骨鉱化のことを意味し、オステオカルシンのレベルは小結節形成及び鉱化と関連があった。ＲＬＭＰアンチセンスオリゴヌクレオチドはオステオカルシン産生を有意に減少させるが、アンチセンス処理した培養における小結節の数は有意に変化しない。この場合、外因性のＢＭＰ−６を添加してもＲＬＭＰアンチセンス処理した培養におけるオステオカルシンの産生は１０〜１５％しか回復しなかった。これはＲＬＭＰの作用がＢＭＰ−６の下流で起こり、ＢＭＰ−６よりも特異的であることを示唆している。
【００５９】
実施例６：ＲＮＡの採取及び精製
２対のＲＯＢウェルからの細胞ＲＮＡ（実施例１及び２に従って６ウェル培養ディッシュ中に調製）を、４Ｍグアニジンイソチオシアネート（ＧＩＴ）溶液を用いて採取し、統計的に同じものを３つ作成した。以下簡単に述べると、培養上澄をウェルから吸引し、２対ウェルからの採取あたり０．６ｍｌのＧＩＴ溶液で覆った。ＧＩＴ溶液を添加したのち、プレートを５〜１０秒旋回させた（できるだけ均等に覆うようにした）。さらなる工程を行う前に、試料を−７０℃で最大７日間まで保存した。
【００６０】
Ｓａｍｂｒｏｏｋ他［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、７．１９章、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］の標準的方法を僅かに改変した方法を用いてＲＮＡを精製した。以下簡単に述べると、解凍した試料に６０μｌの２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０μｌのフェノール（水飽和）及び１５０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を添加した。渦巻攪拌ののち、試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分；４℃）にかけ、水性相を別の試験管に移し、６００μｌのイソプロパノールを添加してＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。
【００６１】
一晩の保温に次いで、試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分）にかけ、上澄を静かに吸引した。得られたペレットを４００μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、４０μｌの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）及び１．０ｍｌの無水エタノールを添加したのち−２０℃で一晩沈殿させた。細胞ＲＮＡを採取するために、試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分）にかけ、７０％エタノールで洗浄し、５〜１０分間空気乾燥し、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＲＮＡ濃度は分光光度計を用いて測定した光学濃度から計算した。
【００６２】
実施例７：逆転写−ＰＣＲ
加熱した総ＲＮＡ（５μｇを総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ中に６５℃で５分間）を、４μｌの５×ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２μｌのｄＮＴＰ、２μｌのｄＴ１７プライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）及び１μｌのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ユニット／μｌ）を含む試験管に添加した。試料を３７℃で１時間保温し、次いで９５℃で５分保温してＭＭＬＶ−ＲＴを不活化した。試料に８０μｌの水を加えて希釈した。
【００６３】
逆転写試料（５μｌ）を標準法を用いたＰＣＲにかけた（総量５０μｌ）。以下簡単に述べると、水、適量のＰＣＲ緩衝液（２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ、ハウスキーピング遺伝子）の正方向及び逆方向プライマー及び／又はＢＭＰ−６）、32Ｐ−ｄＣＴＰ及びＴａｑポリメラーゼを含む試験管に試料を添加した。プライマーを２２サイクル（９４℃で３０秒；５８℃で３０秒、７２℃で２０秒）にかけたが、特に注釈しない限りはサイクルを一定して行った。
【００６４】
実施例８：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及び隣光イメージ分析によるＲＴ−ＰＣＲ産物の定量
ＲＴ−ＰＣＲ産物に５μｌ／試験管の量のローディング染料（ｌｏａｄｉｎｇ ｄｙｅ）を添加し、混合し、６５℃で１０分加熱し、遠心分離にかけた。１０μｌの各反応物を標準条件下でＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミド；１５Ｖ／ウェル；定電流）にかけた。ゲルをゲル保存緩衝液（１０％ｖ／ｖグリセロル、７％ｖ／ｖ酢酸、４０％ｖ／ｖメタノール、４３％脱イオン水）内に３０分保温し、真空内で８０℃で１〜２時間乾燥し、電子的に画質を向上させた隣光イメージシステムで６〜２４時間発色させた。可視化されたバンドを分析した。バンドあたりの数をグラフにプロットした。
【００６５】
実施例９：ディファレンシャル（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）ディスプレーＰＣＲ
ＲＮＡをグルココルチコイド（Ｔｒｍ、１ｎＭ）で刺激した細胞から抽出した。加熱してＤＮアーゼで処理した総ＲＮＡ（５μｇを総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ中に６５℃で５分間）を実施例７で述べたように逆転写した［ただしＨ−Ｔ11Ｍ（配列番号４）をＭＭＬＶ―ＲＴプライマーとして用いた］。得られたｃＤＮＡを上記したようにＰＣＲで増幅した［ただしＨ―Ｔ11Ｇ（配列番号４）、Ｈ−ＡＰ−１０（配列番号５）（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社、テネシー州ナッシュビル）などの市販の様々なプライマーセットを用いた］。放射性同位元素標識化ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列決定ゲル上でゲル電気泳動にかけて分別した。電気泳動の後、得られたゲルを真空下で乾燥し、オートラジオグラフィーに一晩さらした。区別をつけて発現されたｃＤＮＡのバンドをゲルから切り出し、Ｃｏｎｎｅｒ他［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２７８（１９８３）］の方法を用いてＰＣＲで再増幅した。ＰＣＲ再増幅の産物をベクターＰＣＲ−ＩＩ（ＴＡクローニングキット；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）内にクローンした。
【００６６】
実施例１０：ＵＭＲ１０６ラット骨肉腫細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ＵＭＲ１０６ライブラリー（２．５×１０10ｐｆｕ／ｍｌ）を５×１０4ｐｆｕ／ｍｌで寒天平板（ＬＢ底寒天）に植え、３７℃で一晩保温した。濾過膜を平板上に２分間載せた。濾過膜を取り除いて変性させ、洗浄し、乾燥してＵＶ架橋した。次いで濾過膜を前ハイブリダイゼーション緩衝液［２×ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）、５％ホルムアミド、１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ］内に４２℃で２時間保温した。２６０塩基対の放射性同位元素標識化プローブ（配列番号３；ランダムプライミングによる32Ｐ標識化）をハイブリダイゼーション混合物／濾過膜全体に添加し、４２℃で１８時間ハイブリダイズした。膜を室温で１回（１０分、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、５５℃で３回（１５分、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）洗浄した。
【００６７】
洗浄したのち、膜を上記したようにオートラジオグラフィーで分析した。正のクローンをプラークで精製した。この工程を第二の濾過膜についても４分間行い、見せかけの正のクローンを最小化した。プラーク精製したクローンをλＳＫ（−）ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）として回収した。クローンｃＤＮＡは下記のように配列決定した。
【００６８】
実施例１１：クローンの配列決定
クローンしたｃＤＮＡ挿入物を標準法によって配列決定した［Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）参照］。以下簡単に述べると、適当な濃度の終止混合物、鋳型及び反応混合物を適当なサイクルプロトコル（９５℃、３０秒；６８℃、３０秒；７２℃、６０秒；２５回）にかける。配列決定反応を終わらせるために停止混合物を添加する。９２℃で３分間加熱したのち、試料を変性６％ポリアクリルアミド配列決定ゲル（２９：１ アクリルアミド：ビスアクリルアミド）に載せる。試料を６０ボルト定電流で約４時間電気泳動にかける。電気泳動の後、ゲルを真空下で乾燥してオートラジオグラフィーを行う。
【００６９】
オートラジオグラフを手動で分析した。得られた配列を国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＩＨ、メリーランド州ベセズダ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で保持されているデータベースについて、デフォルト値でＢＬＡＳＴｎプログラムを用いてスクリーンした。配列データに基づいて、新しい配列決定プライマーを調製し、遺伝子全体を配列決定するまで工程を繰り返した。全ての配列を両方向について最低３回確認した。
【００７０】
ヌクレオチド及びアミノ酸配列もＰＣＧＥＮＥソフトウェアー（ｖｅｒ．１６．０）を用いて分析した。ヌクレオチド配列について相同性のパーセントをＮＡＬＩＧＮプログラムによって計算した。計算にはパラメーターとして、非調和（ｎｏｎ−ｍａｔｃｈｉｎｇ）ヌクレオチドのウェイト＝１０；非調和ギャップのウェイト＝１０；考察の対象となるヌクレオチドの最大数＝５０；及び考察の対象となるヌクレオチドの最小数＝５０、を用いた。
【００７１】
アミノ酸配列については、ＰＡＬＩＧＮを用いて相同性パーセントを計算した。オープンギャップコスト（ｏｐｅｎ ｇａｐ ｃｏｓｔ）及びユニットギャップコスト（ｕｎｉｔ ｇａｐ ｃｏｓｔ）の両方について、値を１０とした。
【００７２】
実施例１２：ＲＬＭＰｃＤＮＡのクローニング
実施例９で述べたディファレンシャルディスプレーＰＣＲ増幅産物は、約２６０塩基対の主要バンドを含んでいた。この配列をラット骨肉腫（ＵＭＲ１０６）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。正のクローンをネスト状プライマー分析にかけ、全長ｃＤＮＡを増幅するのに必要なプライマー配列を得た（配列番号１１、１２、２９、３０及び３１）。後の研究のために選んだ正のクローンの一つをクローン１０−４と称した。
【００７３】
クローン１０−４の全長ｃＤＮＡの配列分析は、ネスト状プライマー分析で決定した。その結果、クローン１０−４はディファレンシャルディスプレーＰＣＲで同定された元の２６０塩基対断片を含んでいた。クローン１０−４（１６９６塩基対、配列番号２）は４５７アミノ酸（配列番号１）を有する蛋白質をコードする１３７１塩基対の開いた読み枠を含んでいる。終止コドンＴＧＡはヌクレオチド１４４４〜１４４６に見られる。ヌクレオチド１６７５〜１６８０のポリアデニレーション信号及びそれに隣接するポリ（Ａ）+末端は３’非コード領域に存在する。配列番号１のアミノ酸位置１１３〜１１６及び２５７〜２５９にそれぞれＡｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ及びＡｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒという２個の潜在的Ｎ−グリコシレーション部位が存在する。２個の潜在的ｃＡＭＰ依存及びｃＧＭＰ依存蛋白質キナーゼリン酸化部位Ｓｅｒ及びＴｈｒがそれぞれアミノ酸位置１９１及び３４９に見られた。５個の蛋白質キナーゼＣリン酸化部位Ｓｅｒ又はＴｈｒがアミノ酸位置３、１１５、１６６、２１９、４４２に見られた。１個の潜在的ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ−ループ）Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒがアミノ酸位置２７２〜２７９に見られた。
【００７４】
加えて、２個の高度に保存された推定ＬＩＭ領域がアミノ酸位置３４１〜３９１及び４００〜４５１に見られた。この新たに同定されたラットｃＤＮＡ中の推定ＬＩＭ領域は、他に公知のＬＩＭ蛋白質のＬＩＭ領域とかなりの相同性を示した。しかし、他のラットＬＩＭ蛋白質との全体的相同性は２５％未満であった。ＲＬＭＰ（１０−４とも称する）はヒトエニグマ（ｅｎｉｇｍａ）蛋白質（米国特許第５，５０４，１９２号参照）と７８．５％のアミノ酸相同性を有しているが、最も近いラット同族体ＣＬＰ−３６及びＲＩＴ−１８に対してそれぞれ僅か２４．５％及び２２．７％のアミノ酸相同性しか有していない。
【００７５】
実施例１３：ＲＬＭＰ発現のノーザンブロット分析
実施例１及び２で調製したＲＯＢからの３０μｇの総ＲＮＡを１％アガロース平面ゲル上のホルムアルデヒドゲル電気泳動にかけて寸法を分別し、ナイロン膜に浸透によりブロット転写した。ブロットに対して、ランダムプライミングで32Ｐ−ｄＣＴＰ標識化した全長１０−４ｃＤＮＡの６００塩基対ＥｃｏＲ１断片をプローブとして用いた。
【００７６】
ノーザンブロット分析の結果、ＲＬＭＰプローブとハイブリダイズした１．７ｋｂのｍＲＮＡ種が得られた。ＲＬＭＰｍＲＮＡはＢＭＰ−６に２４時間さらしたＲＯＢ中で約３．７倍に増加した。２４時間ＢＭＰ−２又はＢＭＰ−４で刺激したＲＯＢ中ではＲＭＬＰ発現の増加はみられなかった。
【００７７】
実施例１４：統計的方法
実験で得られた小結節／オステオカルシンの各結果について、５〜６ウェルから得られたデータを用いて平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を計算した。各パラメーターの最大値に正規化されたデータでグラフを作成し、小結節の個数、鉱化された領域及びオステオカルシンについて同時にグラフにすることが可能になる。
【００７８】
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ蛋白質アッセイ又はウエスタンブロット分析の各結果について、代表的な実験の３組用意した試料から得たデータを用いて、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を決定した。グラフを作成することによって、第０日又は負の対照に正規化されたデータが示され、上記対照値を数倍に増加したものとして表現される。
【００７９】
統計的有意性はボンフェロニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の事後多重比較修正を用いた分散の一方向分析を用いて評価した［Ｄ．Ｖ．Ｈｕｎｔｓｂｅｒｇｅｒ“Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｃｅ”Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｖａｒｉａｎｃｅ、Ｐ．Ｂｉｌｉｎｇｓｌｅｙ編、ｐｐ．２９８〜３３０、Ａｌｌｙｎ＆Ｂａｃｏｎ社、マサチューセッツ州ボストン（１９７７）及びＳｉｇｍａｓｔａｔ、Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カリフォルニア州コルテマデラ］。有意性のαレベルはｐ＜０．０５として定義した。
【００８０】
実施例１５：ウエスタンブロット分析によるラットＬＩＭ鉱化蛋白質の検出
Ｅｎｇｌａｎｄ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ６２３：１７１（１９８０）及びＴｉｍｍｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４８６３（１９９３）の方法に従って、ポリクローナル抗体を調製した。
ヒーラ細胞をｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰでトランスフェクトした。Ｈａｉｒ他、Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ２０：１（１９９６）の方法に従って蛋白質をトランスフェクトした細胞から採取した。天然ＲＬＭＰのウエスタンブロット分析をＴｏｗｂｉｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：４３５０（１９７９）に記載のされているように行った。
【００８１】
実施例１６：ラットＬＭＰユニーク体（ＲＬＭＰＵ）由来ヒトＰＣＲ産物の合成 ラットＬＭＰ−１ｃＤＮＡの配列に基づいて、正方向及び逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号１５及び１６）を合成し、ユニーク２２３塩基対の配列をラットＬＭＰ―１ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅した。同様なＰＣＲ産物をヒトＭＧ６３骨肉腫細胞ｃＤＮＡから同じＰＣＲプライマーを用いて単離した。
【００８２】
Ｔ−７５フラスコで培養したＭＧ６３骨肉腫細胞からＲＮＡを採取した。培養上澄を吸引によって除去し、フラスコに対あたり３．０ｍｌのＧＩＴを添加して覆い、５〜１０秒旋回させ、得られた溶液を１．５ｍｌエッペンドルフ試験管に移した（５本の試験管、０．６ｍｌ／試験管）。Ｓａｍｂｒｏｏｋ他［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第７章１９ページ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）及びＢｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：２８２０−２８（１９９７）参照］の標準的方法を僅かに改変した方法を用いてＲＮＡを精製した。以下簡単に述べると、０．６ｍｌの試料に６０μｌの２．０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、５５０μｌの水飽和フェノール及び１５０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を添加した。これら試薬を添加したのち、試料を渦巻攪拌し、遠心分離（１００００ｘｇ；２０分；４℃）にかけ、水性相を別の試験管に移した。、６００μｌのイソプロパノールを添加してＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分）にかけ、上澄を静かに吸引した。得られたペレットを４００μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁し、フェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、４０μｌの酢酸ナトリウム（３．０Ｍ；ｐＨ５．２）及び１．０ｍｌの無水エタノール中、−２０℃で一晩沈殿させた。試料を遠心分離（１００００ｘｇ；２０分）にかけ、７０％エタノールで洗浄し、５〜１０分間空気乾燥し、２０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＲＮＡ濃度は光学濃度から計算した。
【００８３】
総ＲＮＡ（総量１０．５μｌのＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ中５μｇ）を６５℃で５分間加熱し、４μｌの５×ＭＭＬＶ−ＲＴ緩衝液、２μｌのｄＮＴＰ、２μｌのｄＴ１７プライマー（１０ｐｍｏｌ／ｍｌ）、０．５μｌのＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ／ｍｌ）及び１μｌのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００ユニット／μｌ）を含む試験管に添加した。反応物を３７℃で１時間保温し、次いで９５℃で５分保温してＭＭＬＶ−ＲＴを不活化した。試料に８０μｌの水を加えて希釈した。
【００８４】
転写試料（５μｌ）を標準法を用いたＰＣＲにかけた（総量５０μｌ）［Ｂｏｄｅｎ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：２８２０−２８（１９９７）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ＤＮＡｓ ｂｙ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５．３１−１章、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニュージャージー州トレントン（１９９０）参照］。以下簡単に述べると、水、適量のＰＣＲ緩衝液［２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｄＮＴＰ、正方向及び逆方向プライマー（ＲＬＭＰＵ用；配列番号１５及び１６）］、32Ｐ−ｄＣＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼを含む試験管に試料を添加した。プライマーは放射性バンド検出のため一定のサイクルに２２回かけ、スクリーニングプローブとして用いるＰＣＲ産物を増幅するためにサイクルに３３回かけた（９４℃、３０秒；５８℃、３０秒；７２℃、２０秒）。
【００８５】
アガロースゲル精製したＭＧ６３骨肉腫由来ＰＣＲ産物を配列決定した結果、ＲＬＭＰＵのＰＣＲ産物と９５％以上の相同性があることが判明した。この配列をＨＬＭＰユニーク領域（ＨＬＭＰＵ；配列番号６）と称した。
【００８６】
実施例１７：逆転写酵素由来ＭＧ６３ｃＤＮＡのスクリーニング
特異的プライマー（配列番号１６及び１７）を用いたＰＣＲを行って実施例７と同様にスクリーニングを行った。７１７塩基対のＭＧ６３ＰＣＲ産物をアガロースゲルで精製して所与のプライマー（配列番号１２、１５、１６、１７、１８、２７及び２８）で配列決定した。配列は両方向について最低二回確認した。ＭＧ６３配列を整列させ全長ラットＬＭＰｃＤＮＡ配列に対向させ、ヒトＬＭＰｃＤＮＡ部分配列（配列番号７）を得た。
【００８７】
実施例１８：ヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
ノーザンブロット実験の結果に基づいて、ＬＭＰ−１が幾つかの異なる組織（例えばヒト心筋）において異なるレベルで発現することが判明した。従ってヒト心臓ｃＤＮＡライブラリーを研究した。ライブラリーを５×１０4ｐｆｕ／ｍｌで寒天平板（ＬＢ底寒天）に植え、３７℃で一晩保温した。濾過膜を平板上に２分間載せた。濾過膜を取り除いて変性させ、洗浄し、乾燥してＵＶ架橋した。次いで濾過膜を前ハイブリダイゼーション緩衝液［２×ＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．５）、５％ホルムアミド、１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ］内に４２℃で２時間保温した。２２３塩基対のＬＭＰに特異な放射性同位元素標識化プローブ（配列番号６；ランダムプライミングによる32Ｐ標識化）を添加し、４２℃で１８時間ハイブリダイズした。膜を室温で１回（１０分、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）、５５℃で３回（１５分、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）洗浄した。正のプラーク精製を２回行った心臓ライブラリークローンをオートラジオグラフィーで同定し、市販製品のプロトコルに従ってλファージミドとして回収した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）。
【００８８】
正のクローンを制限酵素消化して様々な寸法のｃＤＮＡ挿入配列を得た。６００塩基対より長い挿入配列を配列決定により一次スクリーニングについて選択した。これらの挿入配列は、実施例１１に述べた標準的方法によって配列決定した。
【００８９】
一つのクローン（番号７）を、配列番号１１〜１４、１６及び２７に相当するプライマーを用いる自動配列決定分析にかけた。これらの方法によって得た配列は通常９７〜１００％の相同性を示した。クローン７（心臓ライブラリーから得たヒトＬＭＰ−１部分ｃＤＮＡ；配列番号８）は、転写領域においてラットＬＭＰｃＤＮＡ配列と８７％以上の相同性を示した。
【００９０】
実施例１９：全長ＬＭＰ−１ｃＤＮＡの決定
ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ配列とヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列のオーバーラップ領域を用いて、これら２つの配列を整列させ、１６４４塩基対の完全ヒトｃＤＮＡ配列を得た。ＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥソフトウェアー中のプログラム）を用いてこれら２つの配列を整列させた。２つの配列のオーバーラップ領域は、ＭＧ６３ｃＤＮＡ（配列番号７）のヌクレオチド６７２における１個のヌクレオチド置換を除いてはクローン番号７（配列番号８；対応するヌクレオチド５１６においてＧの代わりにＡを有する。）と完全な相同性を示す約３６０塩基対から成り立っていた。
【００９１】
「Ｇ」置換のＭＧ６３骨肉腫ｃＤＮＡクローンを用い、ＳＥＱＩＮ（ＰＣＧＥＮＥの別のサブプログラム）によって、整列させた２つの配列を連結した。結果として得られる配列を配列番号９に示す。新規なヒト由来配列とラットＬＭＰ−１ｃＤＮＡとの整列は、ＮＡＬＩＧＮによって行った。全長ヒトＬＭＰ−１ｃＤＮＡ配列（配列番号９）はラットＬＭＰ−１ｃＤＮＡ配列の翻訳領域と８７．３％の相同性を示した。
【００９２】
実施例２０：ヒトＬＭＰ−１のアミノ酸配列の決定
ヒトＬＭＰ−１推定アミノ酸配列をＰＣＧＥＮＥサブプログラムＴＲＡＮＳＬを用いて決定した。配列番号９の開いた読み枠は４５７アミノ酸（配列番号１０）を包含する蛋白質をコードする。ＰＣＧＥＮＥサブプログラムＰａｌｉｇｎを用いたところ、ヒトＬＭＰ−１アミノ酸配列はラットＬＭＰ−１アミノ酸配列と９４．１％の相同性を示すことが判明した。
【００９３】
実施例２１：ヒトＬＭＰｃＤＮＡの５’末端非翻訳領域の決定
ＭＧ６３ ５’ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ末端５’急速増幅（５’ＲＡＣＥ）プロトコルに従って、ＭＧ６３総ＲＮＡのネスト状ＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。この方法ではまず３’末端の２個所に変性ヌクレオチドを有するロック−ドッキングオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた第一のｃＤＮＡ鎖合成を行う［Ｃｈｅｎｃｈｉｋ他、ＣＬＯＮＴＥＣＨｎｉｑｕｅｓＸ：５（１９９５）；Ｂｏｒｓｏｎ他、ＰＣ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．２：１４４（１９９３）］。第二の鎖合成は、Ｇｕｂｌｅｒ他、Ｇｅｎｅ２５：２６３（１９８３）の方法に従って、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮアーゼＨ、及び大腸菌ＤＮＡリガーゼの混合物を用いて行う。ブラントエンドをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで作成したのち、２重鎖ｃＤＮＡを断片（５’−ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴ−３’）（配列番号１９）に連結させた。ＲＡＣＥに先だって、アダプター連結ｃＤＮＡをマラソンＲＡＣＥ反応に好適な濃度（１：５０）に希釈した。アダプター連結２重鎖ｃＤＮＡについてこれで特異的クローニングを行う準備ができた。
【００９４】
第１回目のＰＣＲはセンスプライマーとしてのアダプター特異的オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（ＡＰ１）（配列番号２０）及び実施例１６で述べたユニーク領域（ＨＬＭＰＵ）からの遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を用いて行った。第２回目のＰＣＲはネスト状プライマーＧＳＰ１−ＨＬＭＰＵ（アンチセンス／逆方向プライマー）（配列番号２３）及びＧＳＰ２−ＨＬＭＰＵＦ（配列番号２４）（センス／正方向プライマー、実施例１６参照）を用いて行った。ＰＣＲは抗体媒介の、しかしそれ以外は標準のホットスタートプロトコルを利用する市販のキット（アドバンテージｃＤＮＡ ＰＣＲコアキット；ＣｌｏｎｅＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフォルニア州パロアルト）を用いて行った。ＭＧ６３ｃＤＮＡ用のＰＣＲは、初期加熱開始変性（９４℃、６０秒）を行い、次いで９４℃で３０秒；６０℃で３０秒；６８℃で４分；このサイクルを３０回繰り返した。第１回のＰＣＲ産物は約７５０塩基対であり、ネスト状ＰＣＲ産物は約２３０塩基対であった。第１回ＰＣＲ産物を線型化したｐＣＲ２．１ベクター（３．９Ｋｂ）内にクローンした。挿入配列をＭ１３正方向及び逆方向プライマー（配列番号１１及び１２）の両方を用いて配列決定した。
【００９５】
実施例２２：５’末端ＵＴＲを有する全長ヒトＬＭＰ−１ｃＤＮＡの決定
ＭＧ６３ヒト骨肉腫細胞ｃＤＮＡ５’−ＵＴＲ配列（配列番号２１）、ＭＧ６３ ７１７塩基対配列（実施例１７；配列番号８）、及びヒト心臓ｃＤＮＡクローン７配列（実施例１８）のオーバーラップ領域を整列させ、１７０４塩基対の新規なヒトｃＤＮＡ配列（配列番号２２）を得た。整列はＮＡＬＩＧＮ（ＰＣＧＥＮＥ及びＯｍｉｇａ１．０；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社）を用いて行った。オーバーラップ配列は全７１７塩基対領域（実施例１７）とほぼ１００％の相同性を示した。整列配列の結合はＳＥＱＩＮを用いて行った。
【００９６】
実施例２３：ＬＩＭ蛋白質発現ベクターの作成
ｐＨＩＳ−５ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターを、実施例１７及び１８に記した配列を用いて作成した。７１７塩基対クローン（実施例１７；配列番号７）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶで消化した。小さな断片（〜２５０塩基対）をゲル精製した。クローン７（実施例１８；配列番号８）をＣｌａＩ及びＸｂａＩで消化し、１４００塩基対の断片をゲル精製した。単離した２５０塩基対及び１４００塩基対の制限断片を連結して〜１６５０塩基対の断片を作成した。
【００９７】
クローン７における１個のヌクレオチド置換（７１７塩基対ＰＣＲ配列及び元のラット配列と比較）によって、翻訳塩基対６７２における停止コドンができた。この停止コドンのため、切断（短縮）蛋白質がコードされることになった（従ってＬＭＰ−１ｓの呼び名がある）。この構造体を発現ベクター（配列番号３２）に用いた。５’末端にＵＴＲを有する全長ｃＤＮＡ（配列番号３３）を、配列番号３２と５’ＲＡＣＥ配列（配列番号２１）とを整列させて作成した。ＬＭＰ−１ｓのアミノ酸配列（配列番号３４）を２２３アミノ酸蛋白質として推定し、予想される分子量〜２３．７ｋＤにてウエスタンブロットを（実施例１５と同様に）行って確認した。
【００９８】
ｐＨｉｓ−ＡＴＧベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化した。線型化ｐＨｉｓ−ＡＴＧベクターを取りだし、１６５０塩基対の制限断片を連結させた。連結産物をクローニングして増幅した。ｐＨｉｓ−ＡＴＧ−ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（ＨＬＭＰ−１ｓを挿入したｐＨＩＳ−Ａとも称する）を標準法によって精製した。
【００９９】
実施例２４：ＬＭＰ発現ベクターを用いた生体外での骨小結節形成及び鉱化の誘発
ラット頭蓋冠細胞を実施例１による２次培養から単離して増殖させた。培養は実施例１で述べたように刺激を加えないか又はグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激を加えた。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）のトランスフェクションプロトコルを改変したものを用いて、３μｇ／ウェルの各ベクターを実施例２５の２次ラット頭蓋冠骨芽細胞培養にトランスフェクトした。
【０１００】
鉱化した小結節を実施例３に記したようにフォンコッサ染色で可視化した。ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現のみが生体外の骨小結節形成（〜２０３小結節／ウェル）を誘発した。小結節のレベルはＧＣの正の対照によって誘発されるレベル（〜４１２小結節／ウェル）の約５０％であった。他の正の対照はｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクター（〜１５２小結節／ウェル）及びｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ発現ベクター（〜２０６小結節／ウェル）という結果であった一方、負の対照はｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖ発現ベクター（〜２小結節／ウェル）及び非処理（ＮＴ）プレート（〜４小結節／ウェル）という結果であった。これらのデータはヒトｃＤＮＡが少なくともラットｃＤＮＡ程度には骨形成刺激を与えることを実証している。効果はＧＣ刺激を行った場合よりも少なかったが、これは発現ベクターの量が最適以下であったためと考えられる。
【０１０１】
実施例２５：生体外及び生体内でＬＭＰにより誘発される細胞分化
クローン１０−４中のラットＬＭＰｃＤＮＡ（実施例１２参照）を、ＮｏｔＩ及びＡｐａｌを用いて３７℃で一晩２重消化してベクターから切り出した。ベクターｐＣＭＶ２ＭＣＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）を同じ制限酵素で消化した。クローン１０−４からの線型ｃＤＮＡ断片及びｐＣＭＶ２の両方をゲル精製し、抽出し、そしてＴ４リガーゼで連結した。連結したＤＮＡをゲル精製し、抽出し、大腸菌ＪＭ１０９細胞を形質転換して増幅した。正の寒天コロニーを選択し、ＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化し、制限消化物をゲル電気泳動で分析した。ストック培養は正のクローンで調製した。
【０１０２】
制限酵素としてＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いたことを除いては同様の方法で逆方向ベクターを調製した。これらの制限酵素を用いたことによって、クローン１０−４からのＬＭＰｃＤＮＡ断片がｐＲｃ／ＣＭＶ２内に逆方向（すなわち非翻訳の方向）に挿入された。得られた組替えベクターをｐＣＭＶ２／ＲＬＭＰと称した。
【０１０３】
適量のｐＣＭＶ１０−４［６０ｎＭ（３μｇ）の最終濃度が最適；この実験では０〜６００ｎＭ／ウェル（０〜３０μｇ／ウェル）の最終濃度が好ましい］を最小イーグル培地（ＭＥＭ）中に再懸濁して４５０μｌの最終体積として１０秒間渦巻攪拌した。Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを添加（７．５μｌ／ｍｌ最終溶液）して、溶液を１０秒間渦巻攪拌し、室温で１０分保温した。保温の後、１０％ＦＢＳ（１ｍｌ／ウェル；６ｍｌ／プレート）を追加したＭＥＭを添加してピペットで混合した。
【０１０４】
得られた溶液を次いで洗浄されたＲＯＢ培養にピペットで移した（１ｍｌ／ウェル）。培養を５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中、３７℃で２時間保温した。それから後、細胞を殺菌ＰＢＳで静かに一回洗浄し、適当な正常保温培養基を添加した。
【０１０５】
得られた結果は、有意な骨小結節形成がｐＣＭＶ１０−４で誘発したラット細胞培養全てで起こったことを実証している。例えば、ｐＣＭＶ１０−４トランスフェクト細胞は４２９小結節／ウェルを産生した。Ｔｒｍにさらした正の対照培養は４６０小結節／ウェルを産生した。これに対し、未処理の負の対照は、１小結節／ウェルを産生した。同様に、培養をｐＣＭＶ１０−４（逆方向）でトランスフェクトした場合、小結節は産生されなかった。
【０１０６】
生体内での新たな骨形成を実証するために、生後４〜５週の正常なラット（ｍｕ／＋；劣性無胸腺症状態に関して異型接合）の後肢から骨髄を吸引した。吸引した骨髄細胞をαＭＥＭ中で洗浄し、遠心分離にかけ、０．８３％ＮＨ4Ｃｌを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）中にペレットを再懸濁してＲＢＣを溶解した。残った骨髄細胞をＭＥＭで3回洗浄し、３×１０6細胞あたり9μｇのｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ（正方向又は逆方向）で２時間トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＭＥＭで２回洗浄し、３×１０7細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。
【０１０７】
無菌ピペットを用いて細胞懸濁液（１００μｌ）を無菌２×５ｍｍＩ型ウシコラーゲンディスク（Ｓｕｌｚｅｒ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ社、コロラド州ホイートリッジ）上に載せた。ディスクは外科手術で生後４〜５週の無胸腺症ラット（ｍｕ／ｍｕ）の頭蓋、胸、胴体又は脊柱に皮下移植した。３〜４週目に動物からディスク又は外科処理部位を切りだし、７０％エタノールで固定した。固定された試験片はラジオグラフィーによって分析し、ゴルドナートリクロームで染色された５μｍ厚の部分について非脱石灰処理による組織学的研究を行った。コラーゲンディスクの代わりに失活（グアニジン抽出）鉱物質除去骨基質（Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ社、ニュージャージー州シュローズベリー）を用いた実験も行った。
【０１０８】
ラジオグラフィーによって、ＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトされた骨髄細胞を含む元のコラーゲンディスクと同じ形態の、高レベルの鉱化骨形成が得られたことが判明した。負の対照（翻訳された蛋白質をコードしない、ＬＭＰ−１ｓ ｃＤＮＡが逆方向をむいたものでトランスフェクトした細胞）では鉱化骨形成は観察されず、担体の吸着は進行中のようであった。
【０１０９】
組織学的研究によって、ＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトした移植片中で新しい骨柱が骨芽細胞と整列していることが判明した。負の対照中で、担体の部分的再吸収にともなった骨は見られなかった。
【０１１０】
１８セット（９個の負の対照ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−ＲＥＶ及び９個の実験用ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓ）の移植片について、無胸腺症のラット複数における腰部脊椎と胸部脊椎との相互移植を更に行った。この実験で得たラジオグラフィーは、脊椎動物間で０／９個の負の対照移植片が骨形成（脊椎固定）を示すことを実証している。ｐＣＭＶ−ＬＭＰ−１ｓで処理した移植片は９個ともに、脊椎動物間での固形骨固定を示した。
【０１１１】
実施例２６：実施例２及び３で説明された配列からの、ｐＨＩＳ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターの合成
７１７塩基対クローン（実施例１７）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社、マサチューセッツ州シティー）で消化した。小断片（〜２５０塩基対）をゲル精製した。クローン７（実施例１８）をＣｌａＩ及びＸｂａｌで消化した。１４００塩基対断片をその消化物からゲル精製した。単離した２５０塩基対及び１４００塩基対のｃＤＮＡ断片を、標準法によって連結し、〜１６５０塩基対の断片を作成した。ｐＨｉｓ−Ａベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社）をＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩで消化した。線型化したベクターを回収して１６５０塩基対のキメラｃＤＮＡ断片に連結した。連結した産物を標準法によってクローンし増幅した。ｐＨｉｓＡ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクター（ＨＬＭＰ−１ｓを挿入したベクターｐＨｉｓ−Ａとも称する）を上記したようにＡＴＣＣに寄託した。
【０１１２】
実施例２７：ｐＨｉｓ−５’ＡＴＧ ＬＭＰ−１ｓ発現ベクターを用いた、生体外での骨小結節形成及び鉱化の誘発
ラット頭蓋冠細胞を実施例１による２次培養から単離して増殖させた。培養は実施例１で述べたように刺激を加えないか又はグルココルチコイド（ＧＣ）で刺激を加えた。組替えｐＨｉｓ−ＡベクターＤＮＡを３μｇ／ウェルの量で用いて、実施例２５と同様に培養をトランスフェクトした。鉱化した小結節を実施例３に記したようにフォンコッサ染色で可視化した。
【０１１３】
ヒトＬＭＰ−１ｓ遺伝子産物の過剰発現のみ（すなわちＧＣ刺激なし）が生体外の骨小結節形成（〜２０３小結節／ウェル）を誘発した。小結節のレベルはＧＣの正の対照によって誘発されるレベル（〜４１２小結節／ウェル）の約５０％であった。ｐＨｉｓＡ−ＬＭＰ−Ｒａｔ発現ベクターでトランスフェクトした培養（〜１５２小結節／ウェル）及びｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｆｗｄ発現ベクターでトランスフェクトした培養（〜２０６小結節／ウェル）について、同様な結果が得られた。一方、負の対照はｐＣＭＶ２／ＬＭＰ−Ｒａｔ−Ｒｅｖ発現ベクター（〜２小結節／ウェル）及び非処理（ＮＴ）プレート（〜４小結節／ウェル）という結果であった。これらのデータはヒトＬＭＰ−１ｃＤＮＡが少なくともこのモデル系におけるラットＬＭＰ−１ｃＤＮＡ程度には骨形成刺激を与えることを実証している。効果はＧＣ刺激を行った場合よりも少なかったが、しかしある場合においては効果が比較可能であった。
【０１１４】
実施例２８：ＬＭＰによる可溶性骨形成刺激因子の分泌誘発
実施例２４に記したようにラット頭蓋冠骨芽細胞培養におけるＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１ｓの過剰発現は、負の対照において観察された小結節形成より有意に大きな形成を引き起こした。ＬＩＭ鉱化蛋白質の作用メカニズムを研究するために、調節された培養基を異なる時点で回収し、１０倍に濃縮し、無菌濾過し、新鮮な血清を含む培養基中で元の濃度に希釈し、トランスフェクトされていない細胞に４日間適用した。
【０１１５】
第４日目にＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１ｓでトランスフェクトされた細胞から回収した調節培養基は、トランスフェクトされた細胞中でＲＬＭＰ−１が直接過剰発現されるのとほぼ同じくらい、小結節形成の誘発に効果的であった。逆方向のＲＬＭＰ−１又はＨＬＭＰ−１でトランスフェクトされた細胞から回収した調節培養基は、小結節形成についてはっきりとした効果を示さなかった。又、第４日以前にＬＭＰ−１でトランスフェクトされた培養から得た調節培養基も、小結節形成を誘発しなかった。これらのデータは、ＬＭＰ−１の発現が可溶因子の合成及び／又は分泌を引き起こしており、トランスフェクションから４日目までは培養基中に有効量が産生されていなかったことを示唆している。
【０１１６】
ｒＬＭＰ−１の過剰発現の結果、培養基中へ骨形成刺激因子が分泌されたので、ウエスタンブロット分析を用いてＬＭＰ−１蛋白質が培養基中に存在するかどうかを調べた。ｒＬＭＰ−１蛋白質の存在を、ＬＭＰ−１に特異な抗体（ＱＤＰＤＥＥ）を用いて評価し、従来法によって検出した。ＬＭＰ−１蛋白質は培養の細胞層中のみに見られ、培養基中からは検出されなかった。
【０１１７】
骨形成誘発性可溶因子の部分精製を、２５％及び１００％硫酸アンモニウムによる標準的希釈と、ＤＥ−５２陰イオン交換バッチクロマトグラフィー（１００ｍＭ又は５００ｍＭ ＮａＣｌ）によって行った。全ての活性が高濃度の硫酸アンモニウムと高濃度のＮａＣｌを用いた画分に観察された。このように偏った結果は、１個の要因が培養基の調節を担っているという可能性に一致する。
【０１１８】
ここに引用した全ての文献は、参照して説明に代える。
【０１１９】
上記の明細書は、例証を目的とした実施例とともに本発明の原理を教示しているが、本開示を読んだ当業者にとっては、本発明の範囲から離れることなく形態及び詳細において様々な改変が可能であることを理解されるはずである。
【配列表】
Claims (40)
- 骨鉱化促進機能を示すヒト蛋白質（以下「ヒトＬＭＰ蛋白質」という。）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であり、配列番号２２又は３３を含む単離された核酸分子。
- 配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒトＬＭＰ蛋白質（以下「ＨＬＭＰ−１ｓ」という。）をコードする、配列番号３３を含む請求項１に記載の核酸分子。
- 配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトＬＭＰ蛋白質（以下「ＨＬＭＰ−１」という。）をコードする、配列番号２２を含む請求項１に記載の核酸分子。
- 配列番号２２又は３３を含む単離された核酸分子にコードされるヒトＬＭＰ蛋白質。
- 配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の蛋白質。
- 配列番号２を含む単離された核酸分子であり、ラットＬＭＰ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- 配列番号２を含む単離された核酸分子にコードされるラットＬＭＰ蛋白質。
- 請求項１、２、３及び６のいずれかに記載の単離された核酸分子を包含するベクター。
- 請求項８に記載のベクターを包含する宿主細胞であり、原核細胞、酵母菌及び哺乳類細胞からなる群より選ばれる宿主細胞。
- 更に検出用の標識を包含する、請求項１、２、３及び６のいずれかに記載の核酸分子。
- 骨鉱化を促進するヒト蛋白質（以下「ＬＩＭ鉱化蛋白質」という。）であり、配列番号１０及び配列番号３４の群より選ばれるアミノ酸配列を含む蛋白質。
- 配列番号１のアミノ酸配列を含むラットＬＩＭ鉱化蛋白質。
- 配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒトＬＩＭ鉱化蛋白質に特異的に反応するモノクローナル抗体。
- ヒトＬＩＭ鉱化蛋白質がＨＬＭＰ−１（配列番号１０）である、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
- ヒトＬＩＭ鉱化蛋白質がＨＬＭＰ−１ｓ（配列番号３４）である、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
- 配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒトＬＩＭ鉱化蛋白質に特異的に反応するポリクローナル抗体。
- ヒトＬＩＭ鉱化蛋白質がＨＬＭＰ−１（配列番号１０）である、請求項１６に記載のポリクローナル抗体。
- ヒトＬＩＭ鉱化蛋白質がＨＬＭＰ−１ｓ（配列番号３４）である、請求項１６に記載のポリクローナル抗体。
- ラットＬＩＭ鉱化蛋白質（配列番号１）に特異的に反応するモノクローナル抗体。
- ラットＬＩＭ鉱化蛋白質（配列番号１）に特異的に反応するポリクローナル抗体。
- 請求項１、２、３及び６のいずれかに記載のＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子でトランスフェクトされた骨形成前駆細胞を含有する骨形成誘発用組成物。
- 単離した核酸分子がベクター内にある、請求項２１に記載の組成物。
- ベクターが発現ベクターである、請求項２２に記載の組成物。
- ベクターがプラスミドである、請求項２３に記載の組成物。
- ベクターがウイルスである、請求項２３に記載の組成物。
- ウイルスがアデノウイルスである、請求項２５に記載の組成物。
- ウイルスがレトロウイルスである、請求項２５に記載の組成物。
- 骨形成前駆細胞がエクスビボでトランスフェクトされる、請求項２１に記載の組成物。
- ＬＩＭ鉱化蛋白質がＨＬＭＰ−１（配列番号１０）である、請求項２１に記載の組成物。
- ＬＩＭ鉱化蛋白質がＨＬＭＰ−１ｓ（配列番号３４）である、請求項２１に記載の組成物。
- ＬＩＭ鉱化蛋白質が骨鉱化促進機能を有し、配列番号１を含む蛋白質（以下「ＲＬＭＰ」という。）である、請求項２１に記載の組成物。
- 請求項１、２、３及び６のいずれかに記載のＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子でトランスフェクトされた骨形成前駆細胞と混合される、脊椎との接触用基質を含有する脊椎固定用組成物であって、
ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列の発現によって基質中の鉱化骨形成が誘発される組成物。 - ＬＩＭ鉱化蛋白質が、ＨＬＭＰ−１（配列番号１０）、ＨＬＭＰ−１ｓ（配列番号３４）及びＲＬＭＰ（配列番号１）で表される蛋白質からなる群より選択される、請求項３２に記載の組成物。
- 全身性骨形成が必要な哺乳類宿主中で全身性骨形成を誘発する組成物であり、
（ａ）ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列の発現を誘発するのに有効な外因性の制御物質、並びに
（ｂ）骨形成前駆細胞中で安定的に維持される、請求項８記載のベクターでトランスフェクトされた骨形成前駆細胞であり、該ベクターはＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列及び、調節可能なプロモーターを含有し、該調節可能なプロモーターは外因性の制御化合物に応答し、ＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするヌクレオチド配列の発現を制御する細胞、
を含有する組成物。 - ＬＩＭ鉱化蛋白質が、ＨＬＭＰ−１（配列番号１０）、ＨＬＭＰ−１ｓ（配列番号３４）及びＲＬＭＰ（配列番号１）で表される蛋白質からなる群より選択される、請求項３４に記載の組成物。
- 生理学的条件下でＬＩＭ鉱化蛋白質をコードするｍＲＮＡと結合する能力を示すアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有し、ＬＩＭ鉱化蛋白質の発現を阻害する組成物であり、上記アンチセンスヌクレオチドが配列番号３５のヌクレオチド配列を含む組成物。
- 配列番号２２又は３３を含む単離された核酸分子であり、ヒトＬＭＰ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- 配列番号２２又は３３である単離された核酸分子であり、ヒトＬＭＰ蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
- 単離された核酸分子が、プラスミド及びウイルスからなる群より選ばれるベクター内にある、請求項２８に記載の組成物。
- ベクターが、筋肉組織に直接投与されるためのプラスミドである、請求項３９に記載の組成物。
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