CN113039199A

CN113039199A - 激活素/骨成型蛋白7嵌合体：超级活性sab704及sab715及作为它们的头蛋白-致敏变体的nab704、nab715及nab204

Info

Publication number: CN113039199A
Application number: CN201980075594.3A
Authority: CN
Inventors: 崔承贤; 尹小美
Original assignee: JOINT CENTER FOR BIOSCIENCES
Current assignee: OSR Holdings Ltd.
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2021-06-25
Also published as: EP3880695A4; US20210395322A1; WO2020101366A1; KR20210077790A; EP3880695A1

Abstract

本发明涉及具有转化生长因子(TGF)‑β活性的嵌合多肽、对多肽进行编码的核酸及用于生成具有得到改善或新生物学及治疗特性的多肽的宿主细胞。

Description

激活素/骨成型蛋白7嵌合体：超级活性SAB704及SAB715及作为它们的头蛋白-致敏变体的NAB704、NAB715及NAB204

技术领域

本申请要求于2018年11月15日提交且申请号为第62/767707号的美国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

本发明为与生物分子的操作和设计以及所操作的蛋白质和核酸相关的发明。

背景技术

激活素及骨成型蛋白(BMP)为转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员。他们广泛存在(pervasiveness)于各种发育过程及细胞信号传递过程中，因此，转化生长因子-β配体为能够以治疗目的使用的候选。可通过对转化生长因子-β配体进行加工来使这种生物学特性特异性变形、提高及变更，这是在本发明中示出的发现的基础。

发明内容

技术问题

根据本发明的一实施方式，本发明提供包含分别源自不同的多肽的两个以上的肽段的重组多肽，上述多肽的第一段(segment)包含与第一转化生长因子-β家族蛋白具有90％以上的同一性的序列，第二肽段包含与第二转化生长因子-β家族蛋白具有90％以上的同一性的序列，上述两个段可操作地连接，具有第一亲本转化生长因子-β家族蛋白或第二亲本转化生长因子-β家族蛋白(parental TGF-beta family protein)中的至少两种活性，或者具有新的体内(in vivo)信号传递活性及细胞特性的活性，两个以上的多肽段包含可操作地从N-末连接至C-末端的6个肽段，其中，上述多肽调节SMAD通路(pathway)。

在本发明的一实例中，本发明提供包含共6个段的重组多肽。两个以上的肽段包含与第一转化生长因子-β家族亲本蛋白具有90％以上的同一性的序列，另一肽段包含与第二转化生长因子-β家族亲本蛋白具有90％以上的同一性的序列，其中，这些6个段以段1、段2、段3、段4、段5、段6的顺序可操作地连接，所生成的多肽嵌合体提高转化生长因子-β家族蛋白中的一个以上或所有两个的活性。

在本发明的一实例中，上述多肽包含源自骨成型蛋白-2的N-末端段1，两个以上的多肽段包含可操作地从N-末端连接至C-末端的6个肽段。

在本发明的一实例中，上述第一转化生长因子-β家族蛋白为骨成型蛋白-2，上述第二转化生长因子-β家族蛋白为激活素或其他家族成员，各个段与上述两个转化生长因子-β家族蛋白的共同(common)段的结构基序相应，上述多肽调节SMAD通路。

在本发明的一实例中，上述多肽包含源自骨成型蛋白-7的N-末端段1，两个以上的多肽段包含可操作地从N-末端连接至C-末端的6个肽段。

在本发明的一实例中，上述第一转化生长因子-β家族蛋白为骨成型蛋白-7，上述第二转化生长因子-β家族蛋白为激活素或其他家族成员，其中，各个段与上述两个转化生长因子-β家族蛋白的共同段的结构基序相应，上述多肽调节SMAD通路。

在本发明的一实例中，在上述多肽中，源自骨成型蛋白-7的段1、段3及段4与源自激活素的段2、段5及段6可操作地连接来制备SAB704，上述多肽调节SMAD通路。

在本发明的一实例中，在上述多肽中，源自骨成型蛋白-7的段1、段3、段4及段5与源自激活素的段2及段6可操作地练级来制备SAB715，上述多肽调节SMAD通路。

在更优选的实例中，本发明提供如下的设计-增强转化生长因子-β配体(design-augmented(DA)TGF-beta ligand)，即，可通过筛选结合生长因子-β超家族配体的不同序列段并接合来合成，从而构建新的配体(“设计-增强嵌合体”)。这些新配体具有与天然存在的亲本配体不同的完全新的蛋白质序列文库。这种接近法主要来自天然转化生长因子-β超家族配体之间识别结构共性(structural commonality)。所有～40转化生长因子-β超家族配体共享具有对于上述蛋白质的各个区域的通用(generic)特征的相同的整体架构(overallarchitecture)。转化生长因子-β配体的骨架(framework)可分为所有超家族成员共享的(通常)6种子域(subdomain)(也称为序列段；在图1中以6个不同颜色表示)。

根据本发明的再一实施方式，本发明还提供包含可操作地连接至第二不同的转化生长因子-β家族蛋白段(例如，以“B”表示的蛋白质)的第一转化生长因子-β家族蛋白段(例如，以“A”表示的蛋白质)的用于嵌合转化生长因子-β家族多肽的设计原理，其中，上述多肽嵌合体具有段1-段2-段3-段4-段5-段6的顺序，嵌合体的各个段从A或B的相应数字的段衍生，如本发明中所记载，通过生成不同的嵌合体来提供不同的SMAD-调节活性(Gray&Choe,2019,“Design-augmented(DA)biologics:BMP Chimeras for bone and cartilageregeneration,Osteoarthritis and Cartilage,in press,DOI:doi.org/10.1016/j.joca.2019.09.004)。

这些嵌合体的序列边界(sequence boundaries)来自于2009年2月24日申请的美国临时申请第61/155066号。激活素及骨成型蛋白-2嵌合体(包含AB204及AB215)与它们的亲本蛋白质相比具有超级活性信号传递能力(参照图2)。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供嵌合转化生长因子-β家族多肽，包含与第二转化生长因子-β家族蛋白段能够操作地连接的第一转化生长因子-β家族蛋白段，以提供具有SMAD-调节活性的嵌合(chimeric)多肽，各个段与上述两个转化生长因子-β家族蛋白的共同段的结构基序相应。

根据本发明的还有一实施方式，本发明提供序列变体，上述序列变体为权利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的序列变体，为了通过调节头蛋白结合能力来利用AB204制备NAB204、利用SAB704制备NAB704或利用SAB715制备NAB715，6个氨基酸长度的头蛋白敏化剂序列取代上述多肽的结构上等同的区域。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供转化生长因子-β超家族的多肽的序列变体，使用源自相关的亚家族序列的6个氨基酸长度的头蛋白-致敏序列导入头蛋白-敏感性(NS-)-序列，作为这种嵌合体的例，可生成如头蛋白-敏感性-激活素(源自激活素)的头蛋白-敏感性形态，或者利用源自相关亚家族序列的头蛋白-非敏感(NIS-)-序列取代相同的6个氨基酸长度的头蛋白-致敏序列来去除头蛋白-敏感性-序列，作为这种嵌合体的例，可利用骨成型蛋白2生成头蛋白-非敏感-骨成型蛋白2。

具体地，本发明提供3个非天然生成的嵌合体，其分别包含具有源自亲本蛋白、激活素及骨成型蛋白7(BMP-7，SEQ ID NO:6，图2)的蛋白质序列的6个肽段。命名为SAB704及SAB715的2个嵌合体以段1、段2、段3、段4、段5、段6的顺序可操作地从N-末端连接至C-末端，从而调节与激活素及骨成型蛋白-7(分比为SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:11，图2)天然相关的SMAD通路。

命名为NAB704及NAB715(分别为SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:12，图2)的其他2个嵌合体分比为SAB704及SAB715的序列变体，为此，在SAB704及SAB715的段6的序列中，5个以下的氨基酸残基分别变化。结果，NAB704及NAB715为头蛋白-敏感性(Noggin-sensitive)。具体地，头蛋白-敏感性是指可通过用于生物学功能的设计在体内使头蛋白(Noggin)物理结合且与头蛋白进行反应。SAB704及SAB715为头蛋白-非敏感(Noggin-insensitive)，通过设计对于细胞信号传递能力具有超级活性。追加地，本发明还提供作为头蛋白-敏感性的第三个设计-增强嵌合体序列(identifies)，这为源自美国临时申请61/155066号的AB204(图2的SEQ ID NO:7)的类似的变体，为作为头蛋白-敏感性的NAB204(图2的SEQ ID NO:8)。

SAB704、SAB715、NAB204、NAB704及NAB715的基础设计

在本发明的一实例中，多肽嵌合体SAB704包含源自激活素A(“A”)的3个段的段2、段5及段6，包含源自骨成型蛋白-7(“B”)的3个段的段1、段3及段4，如称为“1B2A3B4B5A6A”，这些段以段1、段2、段3、段4、段5及段6的顺序可操作地从N-末端连接至C-末端。SAB704的序列边界源自于2009年2月24日申请的美国临时申请第61/155066号(图5)。

在本发明的再一实例中，多肽嵌合体SAB715包含源自激活素A(“A”)的2个段的段2及段6，包含源自骨成型蛋白-7(“B”)的4个段的段1、段3、段4及段5，如称为“1B2A3B4B5B6A”，这些段以段1、段2、段3、段4、段5及段6的顺序可操作地从N-末端连接至C-末端。SAB715的序列边界源自于2009年2月24日申请的美国临时申请第61/155066号。

在本发明的另一实例中，多肽嵌合体NAB204具有在AB204的段6内取代6个残基部分的5个新的氨基酸(在IIKKDI中被VVLKKY取代)。IIKKDI源自激活素A(SEQ ID NO:4的下划线部分，图2)，相反，VVLKKY源自骨成型蛋白2(SEQ ID NO:5的下划线部分，图2)。在本申请中，段6内的这些6个残基部分定义为“头蛋白-敏感性(Noggin-sensitizer)”，其蛋白质序列与包含骨成型蛋白-2及骨成型蛋白-7的所有头蛋白-结合骨成型蛋白类似(骨成型蛋白7中的VILKKY，SEQ ID NO:7中的下划线部分，图2)。引入至AB204的这些氨基酸变化改变AB204的生物学特性，来使NAB204(SEQ ID NO:8，图2)与头蛋白结合(图4b)，从而，对于体内头蛋白的拮抗作用具有功能敏感，在本申请中，定义为“头蛋白-致敏”。AB204的蛋白质序列源自于2009年2月24日申请的美国临时申请第61/155066号。

在本发明的还有一实例中，多肽嵌合体NAB704具有取代SAB704的头蛋白-敏感性序列的4个新的氨基酸(在IIKKDI中被VILKKY取代)。这些氨基酸变化改变SAB704的生物特性来使NB704与头蛋白结合，从而，对于体内头蛋白的拮抗作用具有功能敏感(图4a)。

在本发明的又一实例中，多肽嵌合体NAB715具有取代SAB715的头蛋白-敏感性序列的4个新的氨基酸(在IIKKDI中被VILKKY取代)。这些氨基酸变化改变SAB715的生物特性来使NB715与头蛋白结合，从而，对于体内头蛋白的拮抗作用具有功能敏感(图4a)。

由于序列的类似性，头蛋白-敏感性序列可包含在激活素/骨成型蛋白嵌合体的头蛋白-敏感性序列内与骨成型蛋白-2的VVLKKY或骨成型蛋白-7的VILKKY相同或保守地(conservatively)类似的5个以下的氨基酸取代(replacement)，由此，将激活素/骨成型蛋白嵌合体的头蛋白-敏感性序列成为头蛋白-敏感性或头蛋白-非敏感。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供对上述多肽进行编码的多核苷酸。

本发明还提供对本发明的多肽进行编码的多核苷酸。但是，在本实例中，本发明提供与头蛋白-敏感性的存在无关地与激活素/骨成型蛋白嵌合体的段组合(assembly)构成的序列至少具有90％、95％、98％、99％或其以上的同一性的相同的多肽序列。

在本发明的一实例中，上述多核苷酸包含源自可操作地连接的多个转化生长因子-β家族多核苷酸的序列，来对功能性嵌合多肽进行编码，上述功能性嵌合多肽具有包括通过上述配体的组合时间-依赖性混合(combinatorial time-dependent mix)使骨及软骨再生在内的SMAD-调节活性，从而调节体内细胞活性。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述多核苷酸的载体。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述载体的宿主细胞。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含上述多核苷酸的宿主细胞。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供嵌合转化生长因子-β多肽的生成方法，其包括：步骤(a)，排列两个以上的转化生长因子-β家族成员蛋白序列；步骤(b)，确认两个家族蛋白的6个结构相关的段；步骤(c)，在5个以上的连续氨基酸中确认包含在结构上与90％以上的序列同一性相关的末端中的段的两个转化生长因子-β蛋白的交叉点(pointsof cross-over)；以及步骤(d)，从骨成型蛋白到第二转化生长因子-β家族成员蛋白，生成至少包含段1的嵌合转化生长因子-β多肽，上述段在交叉点依次连接，作为一个这种嵌合体的例，生成1B2-骨成型蛋白7。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供通过上述多肽的生成方法生成的嵌合多肽。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供调节与SMAD通路相关的细胞增殖或活性的方法，其包括使上述多肽与细胞相接触的步骤。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供与骨、软骨、神经组织、心脏组织、骨骼肌或内分泌组织相关的疾病或病症的治疗方法，其包括使上述多肽与组织相接触的步骤。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供细胞增殖性疾病或病症的治疗方法，其包括使上述多肽与具有细胞增殖疾病或病症的细胞相接触的步骤。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于预防或治疗与骨、软骨、神经组织、心脏组织、骨骼肌或内分泌组织相关的疾病的药剂学组合物，其包含上述多肽。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于预防或治疗细胞增殖性病症的药剂学组合物，其包含上述多肽。

在追加实例中，本发明提供在于2009年2月24日申请的美国临时申请第61/155066号中，提供对于转化生长因子-β超家族的其他成员的新的配体地追加基础。其中，上述配体为从转化生长因子-β超家族的不同成员具有6个段的相同序列排列的嵌合蛋白。

附图说明

图1为示出转化生长因子-β超家族配体支架的单一亚基的6个段的带状图(ribbondiagram)。单一转化生长因子-β超家族配体由共价结合的两个亚基构成。两个亚基为在此视图中具有垂直(浅蓝色箭头)的轴的两次旋转对称。因此，左侧面板和右侧面板以常规旋转对称轴进行旋转，因此，示出亚基的相反方向。6个段从N-末端至C-末端顺序示出红色(段1)、蓝色(段2)、黄色(段3)、绿色(段4)、棕色(段5)及紫色(段6)。

图2示出在本发明中记载的转化生长因子-β家族的成员序列及各种嵌合体序列的结构/序列排列(alignment)。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3分别为在本发明中为了表达激活素A、骨成型蛋白2及1B2-骨成型蛋白7的细菌而合成设计的核苷酸序列。1B2-骨成型蛋白7为指与源自骨成型蛋白2的段2至段6组合的源自骨成型蛋白2的段1的嵌合体的序列。上述嵌合体在细菌容易表达，具有与骨成型蛋白7相同的功能。由于他们的本质，在SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:13中记述的氨基酸序列未变的情况下，可改变核苷酸序列。

SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6为用于表达细菌的人激活素A(黑色)、人骨成型蛋白2(红色)、人骨成型蛋白7(蓝色)的成熟区(mature region)的氨基酸序列。由于这种原因，在这些3个亲本分子中，均以蛋氨酸作为第一个氨基酸的开始。为了表示它们的来源，这些嵌合体的所有相关段以红色、蓝色、黑色区分。仅以说明的目的，所有6个段以“-”区分。SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8为作为设计-增强嵌合体的AB204及NAB204的氨基酸序列。NAB204包含源自骨成型蛋白2的6个氨基酸长度的头蛋白敏感性(用红色下划线表示)。SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10为作为设计-增强嵌合体的SAB704及NAB704的氨基酸序列。NAB704包含源自骨成型蛋白7的6个氨基酸长度的头蛋白敏感性(用蓝色下划线表示)。SEQ ID NO:11及SEQ ID NO:12为作为设计-增强嵌合体的SAB715及NAB715的氨基酸序列。NAB715包含源自骨成型蛋白7的6个氨基酸长度的头蛋白敏感性(用蓝色下划线表示)。SEQID NO:13为作为设计-增强嵌合体的1B2-骨成型蛋白7的氨基酸序列。1B2-骨成型蛋白7包含源自骨成型蛋白2的段1(红色)和源自骨成型蛋白7的段2(蓝色)。为了将细菌表达及重折叠，1B2-骨成型蛋白7取代骨成型蛋白7。

图3a示出作为设计-增强嵌合体的SAB704和SAB715及作为对照分子的它们的亲本分子的骨成型蛋白-7的细胞信号传递活性(图3a)。图3a示出SAB704尤其通过SAMD1介导信号传递途径在C2C12细胞示出大约增加30倍的信号传递活性(Allendorph et al.,2011Designer TGF-beta Superfamily Ligands with Diversified Functionality,PLOSOne,https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026402,(2011))。

图3b示出通过4个同化作用基因(ACAN，Aggrecan)的核糖核酸(RNA)诱导的相对水平，上述基因与软骨形成及软骨再生相关而周知。通过以1.0标准化的红色垂直线示出与各个面板有关的核糖核酸表达的背景水平。在利用这些设计-增强嵌合体及骨成型蛋白7处理后，在第4天、第8天、第11天通过相同的方法测定Smad-1荧光素酶信号传递活性。

图3c示出通过4个同化作用基因(COL2A1，Collagen 2A1)的核糖核酸诱导的相对水平，上述基因与软骨形成及软骨再生相关而周知。通过以1.0标准化的红色垂直线示出与各个面板有关的核糖核酸表达的背景水平。在利用这些设计-增强嵌合体及骨成型蛋白7处理后，在第4天、第8天、第11天通过相同的方法测定Smad-1荧光素酶信号传递活性。

图3d示出通过4个同化作用基因(SOX9)的核糖核酸诱导的相对水平，上述基因与软骨形成及软骨再生相关而周知。通过以1.0标准化的红色垂直线示出与各个面板有关的核糖核酸表达的背景水平。在利用这些设计-增强嵌合体及骨成型蛋白7处理后，在第4天、第8天、第11天通过相同的方法测定Smad-1荧光素酶信号传递活性。

图3e示出通过4个同化作用基因(SOX6)的核糖核酸诱导的相对水平，上述基因与软骨形成及软骨再生相关而周知。通过以1.0标准化的红色垂直线示出与各个面板有关的核糖核酸表达的背景水平。在利用这些设计-增强嵌合体及骨成型蛋白7处理后，在第4天、第8天、第11天通过相同的方法测定Smad-1荧光素酶信号传递活性。

图3f示出通过4个同化作用基因(MMP-13)的核糖核酸诱导的相对水平，上述基因与软骨形成及软骨再生相关而周知。通过以1.0标准化的红色垂直线示出与各个面板有关的核糖核酸表达的背景水平。在利用这些设计-增强嵌合体及骨成型蛋白7处理后，在第4天、第8天、第11天通过相同的方法测定Smad-1荧光素酶信号传递活性。

图3g示出通过4个同化作用基因(ADAMTS5)的核糖核酸诱导的相对水平，上述基因与软骨形成及软骨再生相关而周知。通过以1.0标准化的红色垂直线示出与各个面板有关的核糖核酸表达的背景水平。在利用这些设计-增强嵌合体及骨成型蛋白7处理后，在第4天、第8天、第11天通过相同的方法测定Smad-1荧光素酶信号传递活性。

图3h示出通过4个同化作用基因(COLX，Collagen X)的核糖核酸诱导的相对水平，上述基因与软骨形成及软骨再生相关而周知。通过以1.0标准化的红色垂直线示出与各个面板有关的核糖核酸表达的背景水平。在利用这些设计-增强嵌合体及骨成型蛋白7处理后，在第4天、第8天、第11天通过相同的方法测定Smad-1荧光素酶信号传递活性。

图3i示出通过4个同化作用基因(RUNX2)的核糖核酸诱导的相对水平，上述基因与软骨形成及软骨再生相关而周知。通过以1.0标准化的红色垂直线示出与各个面板有关的核糖核酸表达的背景水平。在利用这些设计-增强嵌合体及骨成型蛋白7处理后，在第4天、第8天、第11天通过相同的方法测定Smad-1荧光素酶信号传递活性。

图4a示出骨成型蛋白2、骨成型蛋白7、作为设计-增强嵌合体的AB204的头蛋白敏感性，这是在头蛋白不存在或存在下对于各个配体进行比较的结果。在头蛋白的不存在(白色)及存在(暗灰色)下测定Smad-1荧光素酶信号传递活性，在头蛋白存在的情况下，头蛋白与嵌合体以1∶1的摩尔比处理。

图4b示出在头蛋白存在的情况下的作为头蛋白-致敏嵌合体的NAB204与头蛋白之间的物理结合(红色)，在头蛋白存在的情况下，作为头蛋白-非敏感嵌合体的AB204混合物区别于不示出与头蛋白的结合。结果，在尺寸排阻色谱法分析中，右移示出头蛋白-NAB204复合物的洗脱时间(elution time)。将单独头蛋白作为参照示出(蓝色)，相比于NAB204-头蛋白复合物，头蛋白洗脱的较慢。结果，与比较骨成型蛋白2与AB204结果相同地，对于NAB204、NAB714及NAB715的头蛋白结合在头蛋白存在的情况下导致信号传递活性减少的结果。

图5为作为对于本发明的序列的参照，示出转化生长因子-β超家族配体之间的序列排列，为了说明序列及结构的相似性，将它们分为6个段，从而证明对于该超家族的设计-增强嵌合体的相似的设计基础。

具体实施方式

除非另行定义，在本申请中使用的所有技术及科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。因此，在本说明书全文中所使用的术语可具有如下的含义。

在本申请中使用的转化生长因子-β超家族成员指包括任意物种，尤其，包括牛、羊、猪、鼠、马以及人但并不局限于此的哺乳动物的物种的转化生长因子-β超家族(包括骨形成因子)基因或蛋白质。“转化生长因子-β超家族多肽”指从任意物种，尤其，包括牛、羊、猪、鼠、马以及人在内的哺乳动物的种，并且，与天然、合成、半-合成或重组无关地，从任意来源获取的纯化的转化生长因子-β超家族蛋白的氨基酸序列。

“肽段”指更大的多肽地一部分或片段或者蛋白质的一部分或片段。尽管在一部分情况下，肽段与多肽的结构域相对应，上述结构域具有自身生物学活性，但是，其本身无需具有功能活性。相比于没有这种肽段的相关的多肽，稳定性-相关肽段为增进稳定性、功能或折叠的多肽中发现的肽段。

“融合的”、“可操作地连接”及“可操作地结合”在本申请中用作同义词，并且，在其他所有方面，广泛地指不同的两个结构域的化学或物理结合，其中，各个结构域具有单独的生物学功能。因此，在本发明中，提出相互融合的转化生长因子-β(鸡舍，骨成型蛋白或激活素)结构域，这些起到在转化生长因子-β家族活性或转化生长因子-β家族的多肽的配体特异性中具有改善或变化的多肽的功能。

“嵌合体”或“嵌合蛋白”或“嵌合多肽”指两个以上的不同的亲本蛋白的两个以上的段的组合。如普通技术人员所理解，段实际上无需如相关的特定序列分别源自亲本，并且，其本身无需为物理核酸。例如，骨成型蛋白嵌合体拥有两个不同的亲本骨成型蛋白；或转化生长因子-β超家族的骨成型蛋白及其他成员，或者作为代替技术方案，从无关的蛋白质拥有至少两个段。嵌合蛋白还可以为通过不同种的生命体表达的蛋白结构(相同或不同的成员蛋白)的“种间(interspecies)”、“基因间(intergenic)”等的融合。在优选的实例中，两个段为了计算新的嵌合蛋白而连接。换言之，若蛋白质拥有与全长亲本蛋白中的一侧相同的序列，则不是嵌合体。嵌合蛋白可从两个不同的亲本蛋白包含两个以上的段。例如，为了计算嵌合体的最终嵌合体或文库，可存在这些结构域来源的2个、3个、4个、5个、6个或10个～20个或其以上的亲本。各个亲本蛋白的段可非常短或非常长，这些段可在上述蛋白质的一个至约全长的相邻氨基酸长度范围内改变。在一实例中，最小长度为5个氨基酸。通常，这种段或子域为6个子域中的一种(参照图1和图2)。

转化生长因子-β超家族成员的“6个段”以对于成员蛋白和/或其他同源性成员蛋白(包括其他种的蛋白质)排列的一级氨基酸序列的结构体系为基础确认。如所确认，通常，为了使在嵌合体操作器件排列的对于固有转化生长因子-β成员序列的变形最小化，或者，作为代替技术方案，使变形最大化，成员蛋白以所导出的段为基础分为6种不同的部分(作为代替技术方案，5种不同的部分)。通常，图1及图2示出多个转化生长因子-β超家族成员各自的所排列的序列上重复的不同段的相对位置。尽管相对，这些段可在本来序列的一侧或两侧末端包含取代(substitution)、插入、追加的氨基酸或与其他变形顺应的特定氨基酸序列或本来氨基酸序列。“顺应的”是指各个段的结构完整性(structural integrity)与本来序列的结构域相比维持原样。例如，在本申请中记述的转化生长因子-β超家族成员的段中，如为了使段重组相邻而确认，在段的一侧或两侧末端中，5个、3个、2个或1个氨基酸可被移动(shift)，或优选地，仅1个氨基酸可被移动。

在一实例中，本发明的嵌合蛋白包含源自转化生长因子-β成员的一个以上的段和源自第二转化生长因子-β成员的第二段的融合，其中，第一段与第二转化生长因子-β成员无关。在转化生长因子-β超家族配体的单一亚基中，将5个～6个子域(段)用作支架骨架，新的(设计-增强嵌合体)序列将源自不同的转化生长因子-β配体的段以其天然出现的顺序相同的顺序混合来通过重组方式连接。这种组合在各种不同的靶序列中与一个部分相似，但是，计算与任意天然生成序列明确不同的新的序列。

如普通技术人员所理解，不仅存在正确的序列(exactsequences)，还存在嵌合体的“变体”。换言之，保守的氨基酸取代(例如，约1个～10个保守的氨基酸取代)可在嵌合体内生成。因此，若为变体嵌合体，则各个段100％不存在于最终嵌合体。根据术语变体的定义，来定义可通过追加地残基或者残基的去除或变更而变更的量。当然，如普通技术人员所理解，上述研讨不仅适用于氨基酸，还适用于对这些氨基酸进行编码的核酸。

“保守的”氨基酸取代指拥有类似的侧链的残基的可交替性(interchangeability)，因此，通常，伴随利用定义为多肽内的氨基酸相同或类似的分类的氨基酸的取代。作为实例，并且，无限制地，具有脂肪族侧链的氨基酸可被其他脂肪族氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及蛋氨酸取代；具有羟基侧链的氨基酸可被具有羟基侧链的其他氨基酸，如丝氨酸及苏氨酸取代；具有芳香族侧链的氨基酸可被具有芳香族侧链的其他氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸及组氨酸取代；具有碱性侧链的氨基酸被具有碱性侧链的其他氨基酸，如赖氨酸、精氨酸及组氨酸取代；具有酸性侧链的氨基酸被具有酸性侧链的其他氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸取代；以及疏水性或亲水性氨基酸分别被其他疏水性或亲水性氨基酸取代。

“非保守的”取代指被在多肽内氨基酸的显著不同的侧链特性的氨基酸取代。非保守的取代与所定义的组中相比可利用这些组之间的氨基酸，并且，影响(a)取代(例如，将甘氨酸取代为脯氨酸)位点中的肽主链的结构、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链的大小。作为实例，并且无限制地，例示性的非保守的取代可以为被碱性或脂肪族氨基酸取代的酸性氨基酸；被小氨基酸取代的芳香族氨基酸；以及被疏水性氨基酸取代的亲水性氨基酸。

“分离的多肽”指从天然伴随的其他污染物，如蛋白质、脂质及多核苷酸分离的多肽。上述术语包括(embrace)天然产生的多肽或利用表达系统(例如，宿主细胞或体外(invitro)合成)去除或纯化的多肽。

“实质上纯的”多肽指以上述多肽种类为主要成分(即，当以摩尔或重量为基础时，多肽种类与组合物内的任意其他个别大分子种类相比更丰富)的组合物，并且，通常，当以摩尔或重量百分比为基准，所目标的种类占大分子种类中的约50％以上时，实质上纯化的组合物。通常，实质上纯的多肽组合物以摩尔或重量百分比占在组合物中存在的所有大分子种的约90％或其以上、约95％或其以上、约98％或其以上。在一部分实例中，将目的种类基本均匀地(即，通过常规检测方法无法从组合物内检测污染种类)纯化，其中，上述组合物基本上由单一大分子种类构成。溶剂种类、小型分子(＜500道尔顿)及元素离子种类(elemental ion species)不被视作大分子种类。

“参考序列”指用作序列比较基础的序列。参考序列可以为较大序列的子集，如全长基因或多肽序列的段。通常，参考序列可以为至少20个核苷酸或氨基酸残基长度、至少25个残基长度、至少50个残基长度或者全长核酸或全长多肽。两个多核苷酸或多肽分别(1)包含上述两个序列之间类似的序列(即，完整序列的一部分)、(2)还包含上述两个序列之间不同的序列，因此，通常，两个(或两个以上的)多核苷酸或多肽之间的序列比较通过在“比较窗”上比较上述两个多核苷酸或多肽的序列来执行，从而确认并比较序列类似性的局部区域。

表1示出作为对于本发明的图5的序列的参照，转化生长因子-β超家族配体的成熟形态的序列。如图1的(b)部分所述的作为第一个氨基酸的Met位于其前的SEQ ID NO:5(骨成型蛋白2)、SEQ ID NO:6(骨成型蛋白7)及SEQ ID NO:4(激活素)，该表1的SEQ ID NO:14(骨成型蛋白2)、SEQ ID NO:19(骨成型蛋白7)、SEQ ID NO:35(激活素A)以重组表达的形态复制。

“序列同一性”是指两个氨基酸序列在比较窗上实质上相同(即以，氨基酸-氨基酸为基础)。术语“序列类似性”指共享相同生物物理特性的的类似的氨基酸。术语“序列同一性的比例”或“序列类似性的比例”通过下述方式计算，即，在比较窗上比较两个最优排列的序列，通过确定相同的残基(或类似的残基)在两侧多肽序列内生成的位置的数字来计算一致的位置的数字，在比较窗内，对所一致的位置的数字除以位置的总数(即，窗口大小)，并且，对所获取的结果乘以100来计算序列同一性的比例(或序列类似性的比例)。关于多核苷酸序列，术语序列同一性及序列类似性具有与对于蛋白质序列所记述的说明相似的含义，术语“序列同一性的比例”是指两个多核苷酸序列在比较窗上相同(以核苷酸-核苷酸为基础)。因此，还可计算多核苷酸序列同一性的比例(或者，以分析算法为基础，例如，对于沉默取代或其他取代的多核苷酸序列类似性的比例)。可利用在本申请中记述的序列算法(或者普通技术人员可利用的算法)中的一种或者通过目测来确定最大对应性(maximumcorrespondence)。

当适用于多肽时，术语实质性同一性或实质性类似性是指当通过利用默认间隙权重(default gap weight)的程序BLAST、GAP或BESTFIT，或者通过目视检查，两个肽序列最佳排列时，两个肽序列共享序列同一性或序列类似性。类似地，当适用于两个核酸的前后(context)时，术语实质性同一性或实质性类似性是指当通过利用默认间隙权重(在下文中详细记述)的程序BLAST、GAP或BESTFIT，或者通过目视检查，两个核酸序列最佳排列时，两个核酸序列共享序列同一性或序列类似性。

“功能性”指具有根据多肽类型的天然-生成蛋白质的固有生物学活性或者任意特定的所要的活性中的一种的多肽，这与如通过与配体或同源(cognate)分子结合的能力判断多肽相同。

“转化生长因子-β(TGF-beta)”超家族的蛋白质由在大部分人细胞中观察的细胞外细胞因子构成。40个以下的转化生长因子-β超家族配体可分为包括转化生长因子-β、骨成型蛋白(BMP)、激活素和抑制素、生长和分化因子(Growth and DifferentiationFactors，GDF)、节点(Nodal)、缪勒氏管抑制物质(Mullerian Inhibiting Substance，MIS)及胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在内的更小的家族。转化生长因子-β超家族成员在各种范围的细胞类型中观察到，并且，在包括用于骨形成及组织修复的背侧/腹侧模式化(dorsal/ventral patterning)及左右轴确定(left/right axis determination)的逐个基础细胞现象中起到规定作用。最近，经发现，各种转化生长因子-β配体参与干细胞的维持或直接参与干细胞的分化。它们广泛存在(pervasiveness)，因此，转化生长因子-β配体信号传递的调节可适用于从骨骼和肌肉异常到各种肿瘤事件(neoplastic event)为止的各种不同病症的治疗。在本申请中公开与这种家族或蛋白质的各种成员有关的例示性序列，普通技术人员可利用通过单词搜索或序列BLAST搜索而公开利用的数据库容易确认同源物(homolog)及变体(variant)。

转化生长因子-β配体被合称为非活性前体分子，上述非活性前体分子由通过蛋白酶切割位点连接的N-末端前结构域及C-末端成熟结构域构成。通常，为了活性化，成熟结构域通过转化酶(convertase)，如弗林蛋白酶(furin)从前结构域中切割。转化生长因子-β超家族的成员由于在它们的成熟结构域内观察到的所保守的结构体系被分类在一起。通常，各个成熟配体单体包含7个半胱氨酸，其中，6个形成在“胱氨酸结(cystine knot)”基序内排列的3个内部二硫键(intra-disulfide bond)。从“胱氨酸结”延伸4个β链来形成2个弯曲的指形。最后剩余的半胱氨酸与第二个配体单体形成外部二硫键，生成共价连接的二聚体。在这种二聚体中，以“胱氨酸结”为主题，且指形如吃放延伸，整体上呈蝴蝶形状。对于转化生长因子-β超家族的功能性亚基为上述二聚体，并且，它们在体内以同二聚体和异二聚体存在。一部分家族成员，如生长和分化因子-9和骨成型蛋白-15中虽不具有为了形成外部二硫键而需要的半胱氨酸，但，可依然形成稳定的二聚体。

为了公开信号传递过程，转化生长因子-β二聚体需具有命名为I型和II型的两组受体。这些受体为具有以3-指毒素折叠(toxin fold)排列的细胞外结构域(ECD)、单个跨膜结构域及大的细胞内激酶结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶。转化生长因子-β配体在对于不同受体类型的它们的亲和性中示出偏好(preference)。激活素及节点示出对于II型受体的高亲和性，相反，骨成型蛋白-2及生长和分化因子-5对于I型受体具有更高的亲和性。转化生长因子-β配体与两个高亲和性受体结合后，两个低亲和性受体与上述复合物结合。若4个受体均与转化生长因子-β配体结合，则形成6-成员三元复合物(6-member ternarycomplex)，并且，公开下游信号传递级联(cascade)。本质上，活性II型受体使I型受体磷酸化，之后，I型受体使称为Smad的细胞内信号传递分子结合并使其磷酸化。之后，Smad分子可向核易位(translocation)，并且，直接与转录调节因子相互作用。在这种级联的多个步骤中，为了紧密调节转化生长因子-β信号传递，利用符合机制：包括头蛋白(noggin)、卵泡抑素(follistatin)及抑制素(inhibin)在内的细胞外拮抗剂；与BAMBI类似且没有细胞内激酶结构域的伪受体；或者如抑制性Smad的细胞内分子。

转化生长因子-β超家族配体示出对于他们的配体的通过受体的高程度的不规则结合(promiscuity)。存在40个以上的转化生长因子-β配体，相反，仅存在12个受体(7个I型及5个II型)。因此，受体可与多个不同的配体相互作用。例如，ActRII以高亲和性与激活素及骨成型蛋白-7结合而周知，但是，以更低的亲和性与骨成型蛋白-2结合。可理解对于配体∶受体的亲和力及特异性的结构细节通过何种方式调节及在整体信号传递过程(fate)中它们所具有的意义。在生长和分化因子-5中，发现用于确定其的I型受体偏好的单一氨基酸，在骨成型蛋白-3中，发现变更II型受体亲和性且向上述配体赋予功能的单点突变。本发明具有新的受体结合特性，由此，提供具有各种转化生长因子-β配体功能的修饰的转化生长因子-β配体及具有这种活性的组合物的制备方法。

本发明提供具有利用大肠杆菌(E.coli)或哺乳动物表达系统表达且重折叠(refolded)的能力的新嵌合转化生长因子-β配体及这些配体的制备方法。上述嵌合体模仿特定转化生长因子-β配体的信号传递特征或示出在天然未观察到的独特的信号传递特性。在一实例中，在本发明中，为了计算具有骨成型蛋白-2的重折叠效率及激活素-βA的信号传递特性的激活素/骨成型蛋白-2嵌合体，利用激活素-βA及骨成型蛋白-2作为模板(template)，但是，可理解的是，可利用任意其他转化生长因子-β蛋白质家族成员。

本发明的嵌合体设计方案(scheme)计算具有非天然信号传递特征及生物学活性的追加转化生长因子-β成员嵌合体(例如，激活素/骨成型蛋白-2)配体。并且，本发明说明，为了生成“头蛋白-致敏(Noggin-sensitized)”配体，可向骨成型蛋白-2或骨成型蛋白-7的小的头蛋白-敏感性部分掺入靶嵌合体。这种嵌合转化生长因子-β家族多肽发明可扩展能够用于功能研究的转化生长因子-β配体的文库，且容易研发新转化生长因子-β配体作为治疗剂。

骨成型蛋白-2及天然生成变体的核酸序列及多肽序列已公知。提供野生型骨成型蛋白-2核酸序列(SEQ ID NO:2)。在残基1的N-末端位置中，Met(Q)的由细菌的起始密码子(ATG)的翻译引起的。并且，激活素也在本领域公知(SEQ ID NO:1)。本发明提供如下的方法，即，为了表达嵌合体的相同的多肽序列的细菌，可通过密码子-最优化的多核苷酸序列生成嵌合体的细菌的方法。本发明还提供与ATG的起始密码子一同源自在Met之后包含骨成型蛋白-2或骨成型蛋白-7的1个以上的N-末端段1及活素的其他转化生长因子-β的两个以上的段(段2及段6)，在此生成的嵌合多肽提出与它们的亲本蛋白不同高的活性(display)。

在本发明的一实例中，当设计嵌合体段时，考虑两种因素。第一为结构上的考虑。整个转化生长因子-β单体折叠自然分为6个部分：β链1和β链2、前螺旋(pre-helix)环、α螺旋1及β链3和β链4。第二考虑因素为，在这种段边界(boundaries)中，使对于嵌合体的变更最小化，使区域对于聚合酶链式反应(PCR)战略的脱氧核糖核酸(DNA)序列的重复，使对于天然序列的所有变化最小化。图2示出这些考虑对象的序列及结构。嵌合体的段边界源自美国临时申请第61/155066号。

例如，包含算法1B2B3B4B5B6A的嵌合多肽指示1至6的6个段，上述文字通过“A”或“B”指示各个段的亲本链。因此，在实施例“1B2B3B4B5B6A”中，段1源自分别与AB215或SAB715嵌合体相对应的对于骨成型蛋白-2或骨成型蛋白-7的亲本链“B”，段2源自对于激活素的亲本链“A”，段3源自亲本链“B”，段4源自亲本链“B”，段5源自亲本链“B”，以及段6源自亲本链“A”。

经发现，如在本说明书中所公开，当制备这些重组的功能性嵌合转化生长因子-β家族多肽时，相比于未重组的亲本多肽，可提高它们的配体特异性，或者变更或提高生物学活性。由于活性/配体谱(profiles)差异，这些所操作的嵌合转化生长因子-β家族多肽筛选用于配体特异性活性化和抑制的活性物质，并且，提供用于提供新的治疗多肽及研究试剂的特殊的基础。

在本发明的再一实例中，本发明提供嵌合转化生长因子-β多肽，其包含源自骨成型蛋白2的段1，之后，包含源自骨成型蛋白-7的段2值段6(例如，1B2-骨成型蛋白-7多肽，参照SEQ ID NO:3)。这些嵌合体1B2-骨成型蛋白-7提出骨成型蛋白-7的转化生长因子-β蛋白活性。

在本发明的另一实例中，嵌合多肽的段可与源自上述段的亲本链100％相同。在本发明的一实例中，上述段可包含与亲本链中的相应段具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％或者其以上的同一性的氨基酸序列。例如，上述段可包含一个以上的保守的氨基酸取代(假设，1个～5个保守的氨基酸取代)。

在本发明的一实例中，可利用对于转化生长因子-β活性的在本领域得到认可的多个分析评价测定本发明的嵌合体的生物学活性。在这种分析评价包括：BIAcore(表面等离子共振)；C2C12荧光素酶分析评价；Smad 1/5报告系统；HEK293荧光素酶分析评价；Smad 2/3报告系统；FSH(促卵泡激素)释放分析评价；在大鼠垂体细胞中，BRE(骨成型蛋白反应因素)荧光素酶分析评价；Smad 1/5报告HEK 293细胞；Cripto结合分析评价；在Crptio的存在/不存在的情况下测定的荧光素酶反应；人干细胞分析评价；软骨再生分析评价；体外的软骨颗粒培养；NMR结合研究；大鼠及其他动物中的骨及软骨形成测定；配体∶受体复合物的视觉化；尺寸排阻色谱法(SEC)；用于配体∶受体复合物形成的视觉化的速度稻苗超离心分离；以及用于准确地确定配体大小的Seldi重量分析法，但并不限定于此。

并且，例如，修饰的嵌合体可通过氨基酸取代、缺失或附加制备。例如，可合理地预期利用异亮氨酸或缬氨酸孤立替换亮氨酸、利用谷氨酸盐孤立替换(isolatedreplacement)天冬氨酸盐、利用丝氨酸孤立替换苏氨酸，或者利用结构上相关的氨基酸(假设，保守的突变)类似交替氨基酸对于结果分子的生物学活性没有其他影响。保守的交替在与侧链相关的氨基酸的家族内发生。

在特定实例中，本发明考虑以使嵌合体序列的蛋白分解切割位点对于蛋白分解切割的敏感性降低的方式进行突变(contemplates)。计算机分析(使用可商购的软件，如MacVector、Omega、PCGene、Molecular Simulation，Inc.)可用于确认蛋白分解切割位点。如普通技术人员所理解，这些所记述的突变、变体或修饰中的大部分可通过核酸水平(或者，在一部分情况下，通过翻译后的变形或化学合成)制备。这些记述在本领域周知。

在特定实例中，本发明为了变更嵌合体的糖基化(glycosylation)，考虑嵌合体序列的特定突变。这种突变可为了引入或去除一个以上的糖基化位点，如O-连接或N-连接的糖基化位点而选择。天冬酰胺-连接的糖基化识别位点通常包含三肽序列、天冬酰胺-X-苏氨酸(其中，“X”为任意氨基酸)，它们被适当的细胞糖基化酶特异性识别。修饰也可通过向野生型多肽的序列附加一个以上的丝氨酸或苏氨酸残基或者通过一个以上的丝氨酸或苏氨酸残基的取代(O-连接的糖基化位点的情况)制备。在糖基化识别位点的第一或第三氨基酸位置中，一侧或两侧的各种氨基酸取代或缺失(和/或第二位置中的氨基酸缺失)导致修饰的三肽序列的非-糖基化。增加碳水化合物部分的数量的其他方法为多肽与糖苷的化学或酶促偶联。

本发明还提供对在本申请中公开的嵌合多肽地一部分进行编码的多核苷酸。多核苷酸可进行密码子优化(codon-optimized)，为了生成可在特定表达宿主表达多肽的重组多核苷酸，能够可操作得连接在控制基因表达的一个以上的异源调节序列或控制序列。包含对嵌合多肽进行编码的多核苷酸的表达构建体可引入至适当的宿主细胞内，来表达上述嵌合多肽。

若考虑与转化生长因子-β家族的蛋白质的特定序列有关的知识及与本申请中的嵌合多肽有关的特定说明(例如，嵌合体结构域的段结构)，则普通技术人员可明确理解所操作的嵌合体地核酸序列。与这些多肽的氨基酸序列有关的知识和与各种氨基酸相应的密码子相关知识可使普通技术人员制备对本发明的多肽进行编码的不同多核苷酸。因此，本发明考虑可通过尽可能以密码子选择为基础选择组合来制备的多核苷酸地各个可能的变化，并且，对于在本申请记述的任意多肽，这些所有变化被视作明确公开。

在所讨论的表达系统中的一种例为大肠杆菌(E.coli)表达系统，这些蛋白质可容易克隆带多个表达系统内并通过这些系统表达。优点包括但不限于，如在蛋白质所源自的生命体(本发明的情况下，为智人(H.sapiens))中观察到的，翻译后修饰实现，没有细菌表达所需的起始蛋氨酸的配体的表达，以及容易掺入非天然氨基酸或追加的化学修饰。适当的原核生物包括但不限于真细菌(eubacteria)，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生命体，如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如大肠杆菌。可公开利用各种大肠杆菌菌株，如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31446)、大肠杆菌X1776(ATCC 31537)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC27325)及K5 772(ATCC 53635)。除原核生物外，真核微生物，如纤维状真菌类或酵母也适合用作对于VEGF-E-编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为通常利用的低等真核宿主微生物。

适合表达本发明的嵌合体的宿主细胞源自单细胞及多细胞生命体。无脊椎动物的例包括昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)S2及灰翅夜蛾(Spodoptera)Sf9以及植物细胞。植物表达系统也成功用于表达所修饰的蛋白质。有用的哺乳动物宿主细胞株的例包括中国仓鼠卵巢(CHO)及COS细胞。作为更具体的例，包括利用SV40转化的猴肾CV1细胞株(COS-7，ATCCCRL 1651)、人胚胎肾细胞株(在悬浮培养中，为了生长而亚克隆的293或293细胞，Grahamet al.,J.Gen Virol.,36:59(1977))、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub andChasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))、小鼠睾丸支持细胞(sertoli cell)(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251(1980))、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)以及小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)。适当的宿主细胞的选择视作在本领域的技术范围内。

代替蛋白质表达系统包括并不局限于人胚胎肾(HEK)293细胞、利用杆状病毒表达系统的昆虫细胞株(S.frugiperda)、毕赤酵母(P.pastoris)及酿酒酵母(S.cerevisiae)的酵母表达系统，并且，包括多个微藻株。为了表达准确修饰的蛋白质，可利用转化动物。本质上，这些动物可以为可在容易收获的液体或组织，如从牛中获取的牛乳内大量表达所要的蛋白质的“生物反应器(bioreactor)”。可使用利用细菌或麦芽(wheat germ)细胞裂解物的无细胞-体外表达系统。无细胞-表达系统可使具有更高效率及更大特异性的宽范围的非-天然氨基酸或附加表位插入。

在特定实施方式中，本发明提供促进软骨及骨形成且用于增加其量的方法及作用剂。因此，在经预测，影响转化生长因子-β超家族蛋白，如骨成型蛋白-2、骨成型蛋白-3、生长和分化因子-10、骨成型蛋白-4、骨成型蛋白-7或骨成型蛋白-8的骨-相关功能的本发明的嵌合蛋白中，为了确认调整骨或软骨生长的能力，可在体内或体外，在完整的细胞或组织中进行测试。在本领域公知的各种方法可用于这种目的。因此，对于骨或软骨生长的对象嵌合蛋白，优选地，包含源自骨成型蛋白-2或骨成型蛋白-3的段的嵌合蛋白的效果可通过对于骨形成及软骨形成活性的影响确认，作为其例，在基于细胞的分析方法中，具有测定包含ACAN(阳性)、Col2A1(阳性)、MMP13(阴性)、ADAMTS-5(阴性)及ColX(阴性)的软骨形成的阳性或阴性分化标记基因或Msx2的诱导(see also,e.g.,Daluiski et al.,Nat.Genet.2001,27(1):84-8；Hino et al.,Front Biosci.2004,9:1520-9)。

需理解的是，本发明的筛选分析评价不仅适用于对象嵌合蛋白及它们的变体，还适用于包括它们的嵌合蛋白或其变体的活性物质(agonist)和拮抗剂(antagonist)在内的任意检查化合物。而且，这些筛选分析评价有用于药物靶标验证及质量管理目的。

本发明的嵌合体可以为了在体外及体内各种生物系统中利用而制备。为了单独给药嵌合体或与其他活性剂一同给药嵌合体，可利用任意的公知方法。例如，可根据时间向组织区域逐渐注入或通过注射非口服给药。上述作用剂可通过如口服、直肠、口腔(buccal)(假设，舌下)、引导、非口服(例如，皮下、包括骨骼肌、心肌、隔膜肌及平滑肌的肌内、皮内、静脉内、腹膜内)、局部(topical)(即，包括皮肤即气道表面的黏膜表面)、鼻内、经皮、关节内、鞘内、腔内(intracavity)、吸入给药、通过门静脉内(intraportal)传递向gang给药以及直接器官注射(例如，向肝内注射、向脑内注射来向中枢神经系统传递、向胰腺内注射)的方法给药。在任意情况下，最适合的途径受到所治疗的障碍的性质和严重程度及所利用的特定化合物的性质的影响。

本发明还提供包含对象嵌合蛋白及药剂学上可接受的载体的药剂学组合物。药剂学组合物可用于增进对象，优选为在人中的组织的生长或用于减少或预防组织的损失。例如，靶向的组织可以为骨、软骨、骨骼肌、心肌和/或神经组织。

在另一实施方式中，嵌合体可与用于单独给药或一同给药的其他作用剂(假设，乳剂、霜剂、喷雾剂、凝胶剂或软膏剂)一同制备。为了减少毒性或增加生物体利用效率，进而可制备为脂质体。作为另一传递方法，包括伴随微球体(microsphere)或类蛋白(proteinoid)的胶囊化(encapsulation)的口服方法、气雾剂传递(例如，向肺)、或经皮传递(例如，通过离子渗透疗法(iontophoresis)或经皮电穿孔(transdermalelectroporation))。普通技术人员可明确掌握其他给药方法。

实施例

实施例1

制备转化生长因子-β嵌合体。为了广泛地用作设计原理(designprinciple)，这还为保持两个结构段、部分3和部分4的设计的一部分，可利用亲本基因中的一侧的一部分处理(称为部分3*4)。这种战略通过下述方式执行，即，将激活素-βA用作靶配体，并且，将骨成型蛋白-2用作主链配体，由此，制备激活素/骨成型蛋白-2嵌合体。该发明已在于2009年2月24日申请的美国临时申请第61/155066号中提出并授权公开。

在激活素/骨成型蛋白-2嵌合体的情况下，人骨成型蛋白-2和人激活素-βA的成熟结构域分别预先分为6个段，并且，对于各个段设计引物。在骨成型蛋白-2的情况下，设计对下述6个段进行编码的引物。通过下划线表示段6中的6-残基-长度头蛋白-敏感性序列。

段1，QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWND；

段2，WIVAPPGYHAFYCHGECP；

段3，FPLADHLNSTNHAIVQTLVN；

段4，SVNSKIPKACCVP；

段5，TELSAISMLYYD；

段6，ENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR。

在激活素-βA的情况下，设计对下述6个段进行编码的引物。通过下划线表示段6中的6-残基-长度头蛋白-敏感性序列。

段1，RGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDW；

段2，WIIAPSGYHANYCEGECP；

段3，SHIAGTSGSSLSFHSTLVN；

段4，HYRMRGHSPFANLKSCCVP；

段5，TKLRPMSMLYYD；

段6，DGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。

使用重复的聚合酶链式反应战略(overlapping PCR strategy)，由此，计算全长嵌合体，在对于Met的起始密码子ATG之后，混合以1、2、3、4、5及6的顺序可操作地连接的骨成型蛋白-2及激活素βA的各种段。

在激活素/骨成型蛋白-7嵌合体的情况下，人骨成型蛋白-7和人激活素-βA的成熟结构域分别预先分为6个段，并且，对于各个段设计引物。在骨成型蛋白-7的情况下，设计对下述6个蛋白质序列进行编码的引物。通过下划线表示段6中的6-残基-长度头蛋白-敏感性序列。

段1，MSTGSKQRSQNRSKTPKNQEALRMANVAENSSSDQRQACKKHELYVSFRDLGWQD；

段2，WIIAPEGYAAYYCEGECA；

段3，GPLNSYMNATNHAIVQTLVH；

段4，FINPETVPKPCCAP；

段5，TQLNAISVLYFD；

段6，DSSNVILKKYRNMVVRACGCH。

在激活素-βA的情况下，设计对下述6个段进行编码的引物。通过下划线表示段6中的6-残基-长度头蛋白敏化剂序列。

段1，RGLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDW；

段2，WIIAPSGYHANYCEGECP；

段3，SHIAGTSGSSLSFHSTLVN；

段4，HYRMRGHSPFANLKSCCVP；

段5，TKLRPMSMLYYD；

段6，DGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。

使用重复的聚合酶链式反应战略，由此，计算全长嵌合体，在对于Met的起始密码子ATG之后，混合以1、2、3、4、5及6的顺序可操作地连接的骨成型蛋白-7及激活素βA的各种段。

为了计算骨成型蛋白-7的1B2嵌合体、1B2-骨成型蛋白-7，通过使用两个寡核苷酸，在骨成型蛋白-2段1之后将氨基酸II(通过下划线表示)QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDII插入值靶基因。两个氨基酸II为了生成便利的限制酶位点而添加。为了克隆到pET21a表达载体内，对于所有构建体的外部引物以掺入5'NdeI位点及3'XhoI位点的方式制备。在图2中，1B2-骨成型蛋白-7的说明如下，追加使用1B2段的N-末端，来设定包含1B2-NAB704及1B2-AB704及1B2-NAB715的各种嵌合体及其变体的基础。但是，插入值段1的C-末端的这些两个氨基酸不是制备1B2-骨成型蛋白7时所必需的。两个序列均相同地操作。

段1，QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDII；(骨成型蛋白-2)

段2，WIIAPEGYAAYYCEGECA；(骨成型蛋白-7)

段3，GPLNSYMNATNHAIVQTLVH；(骨成型蛋白-7)

段4，FINPETVPKPCCAP；(骨成型蛋白-7)

段5，TQLNAISVLYFD；(骨成型蛋白-7)

段6，DSSNVILKKYRNMVVRACGCH。(骨成型蛋白-7)

蛋白质表达及纯化。利用常规大肠杆菌表达系统表达激活素/骨成型蛋白-2嵌合体、激活素/骨成型蛋白-7嵌合体、激活素-βA、1B嵌合体及它们的头蛋白-致敏变体，并且，在包涵体分馏物(inclusionbody fractions)中观察到嵌合体。所表达的包涵体被分离、纯化及重折叠。重折叠的配体利用Hi-trap肝素柱(GE Healthcare)及反相色谱(reversedphase chromatography)(GraceVydac)纯化。这些配体冻结干燥，并且，在所有基于细胞的分析评价的情况下，在4mM的HCl、pH值为1中再悬浮，或者在所有生物物理学分析评价的情况下，在10mM的乙酸钠(Na acetate)、pH值为4中再悬浮。其中，一部分在稳定地转化的CHO细胞株中表达，通过本领域公知的技术纯化。头蛋白以在上文中记述的方案为基础表达并纯化。

在C2C12细胞中评价Smad-1荧光素酶分析评价。通过本领域公知的技术执行Smad1-依赖性荧光素酶分析评价。简而言之，C2C12成肌细胞在补充L-谷氨酰胺及抗生素的杜尔贝克的最低基本介质(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)+5％的胎牛血清(FBS)中培养。为了分析评价荧光素酶报告基因，对细胞进行胰蛋白酶处理，利用磷酸盐缓冲液清洗2次，并且，向包含DMEM+0.1％的胎牛血清的48-孔板内涂抹。利用配体刺激后的24小时后测定荧光素酶活性，并且，这些值通过利用β-半乳糖苷酶活性来对于转化效率标准化。相对于利用没有Smad结合结构域的-927Id1-荧光素酶(Id1-Luc mut)获取的对照值(control value)，荧光素酶报告基因的活性以双重诱导(fold-induction)表示。为了研究弱化这些配体的Smad1信号传递的头蛋白的能力，如在上文中所记述，反复荧光素酶分析评价，并将所设定的容量的头蛋白包含在分析中。图3示出SAB704分别以15.6nM及423.1nM的ED50为基准具有比天然骨成型蛋白-7高约30倍的信号传递能力。图4a示出，在图4b至图4i中所示，减少包含ADAMTS5、COLX及MMP13的肥厚基因(hypertrophic gene)，或增加包含聚集蛋白聚糖(aggrecan)及COL2A1的软骨-促进基因表达，由此，这些活性与SAB704的得到提高的核糖核酸-诱导活性相关。

在HEK293细胞中评价Smad-2荧光素酶分析评价。HEK293T细胞以150000个细胞/孔的密度接种在涂敷有聚赖氨酸涂敷的24-孔板内。24小时后，细胞在一夜的时间内根据制造商的建议利用Perfectin转化试剂(GenLantis)转化为A3 Lux(25ng)及β-半乳糖苷酶(25ng)报告基因质粒的混合物、转录因子FAST2(50ng)及空pCDNA3载体(400ng)。之后，利用增加剂量的激活素-βA或激活素/骨成型蛋白-2嵌合体处理这些细胞16小时～24小时。从利用冰冷却的溶解缓冲液(包含1mM的二硫苏糖醇的25mM的双甘氨肽、4nM的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、15mM的MgSO₄中的1％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100))获取这些细胞，并且，利用标准方法评价荧光素酶及β-半乳糖苷酶活性。为了评价与公知的转化生长因子-β辅助-受体结合的嵌合体的能力，利用增加的剂量的激活素-βA或激活素/骨成型蛋白-7嵌合体处理HEK293T细胞。通过上文中所记述的方法测定活性。

AB204、SAB704及SAB715的头蛋白非敏感性。头蛋白直接与配体结合并抑制信号传递活性，使得上述配体无法与用于信号传递的自身的受体结合。相对于在头蛋白的存在下被阻隔至背景水平的骨成型蛋白-2，AB204、SAB704及SAB715的高信号传递不被头蛋白抑制。图4示出头蛋白-敏感性骨成型蛋白2、头蛋白-敏感性骨成型蛋白7、头蛋白-非敏感AB204或头蛋白-非敏感SAB704或者SAB8715的细胞活性。图4b为了说明相比于未与头蛋白结合的AB204，与头蛋白物理结合的NAB204而示出NAB204的尺寸排阻色谱法结果。这种物理结合提供对于AB204、SAB704及SAB715的信号传递活性的头蛋白-非敏感性的直接说明。这种特性可通过包括骨及软骨再生在内的它们之间的时间依赖性组合混合特别有效地调节体内细胞信号传递能力。

<110> 生物科技联合中心

<120> 激活素／骨成型蛋白7嵌合体：超级活性SAB704及SAB715及作为它们的头蛋白-致敏变体的NAB704、NAB715及NAB204

<130> PP190068

<150> US 62/767,707

<151> 2018-11-15

<160> 42

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 激活素 A

<400> 1

atgcaagcca aacacaaaca gcggaagcgt cttaagtcca gctgcaaaag gcaccctttg 60

tatgtggact tcagtgatgt ggggtggaat gactggatca ttgctccctc tggctatcat 120

gccaactact gcgacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180

catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240

gtcccgacca agctgagacc catgtccatg ttgtactatg atgatggtca aaacatcatc 300

aaaaaggaca ttcagaacat gatcgtggag gagtgtgggt gctca 345

<210> 2

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白2

<400> 2

atgcaagcca aacacaaaca gcggaagcgt cttaagtcca gctgcaaaag gcaccctttg 60

tatgtggact tcagtgatgt ggggtggaat gactggatca ttgctccctc tggctatcat 120

gccaactact gcgacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180

catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240

gtcccgacca agctgagacc catgtccatg ttgtactatg atgatggtca aaacatcatc 300

aaaaaggaca ttcagaacat gatcgtggag gagtgtgggt gctca 345

<210> 3

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B2-骨成型蛋白-7

<400> 3

atgcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60

tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggatta tcgcgcctga aggctacgcc 120

gcctactact gtgaggggga gtgtgccttc cctctgaact cctacatgaa cgccaccaac 180

cacgccatcg tgcagacgct ggtccacttc atcaacccgg aaacggtgcc caagccctgc 240

tgtgcgccca cgcagctcaa tgccatctcc gtcctctact tcgatgacag ctccaacgtc 300

atcctgaaga aatacagaaa catggtggtc cgggcctgtg gctgccac 348

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 激活素 A

<400> 4

Met Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln

1 5 10 15

Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala

20 25 30

Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His

35 40 45

Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile

50 55 60

Asn His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser

65 70 75 80

Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp

85 90 95

Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu

100 105 110

Glu Cys Gly Cys Ser

115

<210> 5

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白 2

<400> 5

Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys

1 5 10 15

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp

20 25 30

Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys

35 40 45

Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val

50 55 60

Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys

65 70 75 80

Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn

85 90 95

Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys

100 105 110

Gly Cys Arg

115

<210> 6

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白 7

<400> 6

Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser

20 25 30

Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe

35 40 45

Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala

50 55 60

Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met

65 70 75 80

Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn

85 90 95

Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala

100 105 110

Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys

115 120 125

Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His

130 135 140

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB204

<400> 7

Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys

1 5 10 15

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp

20 25 30

Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys

35 40 45

Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val

50 55 60

Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys

65 70 75 80

Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly

85 90 95

Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys

100 105 110

Gly Cys Ser

115

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NAB204

<400> 8

Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys

1 5 10 15

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp

20 25 30

Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys

35 40 45

Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val

50 55 60

Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys

65 70 75 80

Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly

85 90 95

Gln Asn Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys

100 105 110

Gly Cys Ser

115

<210> 9

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SAB704

<400> 9

Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser

20 25 30

Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe

35 40 45

Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His

50 55 60

Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met

65 70 75 80

Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn

85 90 95

Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro

100 105 110

Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp

115 120 125

Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser

130 135 140

<210> 10

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NAB704

<400> 10

Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser

20 25 30

Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe

35 40 45

Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His

50 55 60

Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met

65 70 75 80

Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn

85 90 95

Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Arg Pro

100 105 110

Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp Gly Gln Asn Val Ile Leu Lys Lys

115 120 125

Tyr Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser

130 135 140

<210> 11

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SAB715

<400> 11

Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser

20 25 30

Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe

35 40 45

Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His

50 55 60

Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met

65 70 75 80

Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn

85 90 95

Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala

100 105 110

Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp

115 120 125

Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser

130 135 140

<210> 12

<211> 140

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NAB715

<400> 12

Met Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro

1 5 10 15

Lys Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser

20 25 30

Ser Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe

35 40 45

Arg Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His

50 55 60

Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met

65 70 75 80

Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn

85 90 95

Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala

100 105 110

Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Gly Gln Asn Val Ile Leu Lys Asn

115 120 125

Tyr Gln Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Ser

130 135 140

<210> 13

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 1B2骨成型蛋白7

<400> 13

Met Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys

1 5 10 15

Arg His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp

20 25 30

Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys

35 40 45

Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val

50 55 60

Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys

65 70 75 80

Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp

85 90 95

Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala

100 105 110

Cys Gly Cys His

115

<210> 14

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-2

<400> 14

Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg

1 5 10 15

His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile

20 25 30

Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro

35 40 45

Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln

50 55 60

Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val

65 70 75 80

Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu

85 90 95

Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly

100 105 110

Cys Arg

<210> 15

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-3 (成骨素)

<400> 15

Gln Trp Ile Glu Pro Arg Asn Cys Ala Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp

1 5 10 15

Phe Ala Asp Ile Gly Trp Ser Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe

20 25 30

Asp Ala Tyr Tyr Cys Ser Gly Ala Cys Gln Phe Pro Met Pro Lys Ser

35 40 45

Leu Lys Pro Ser Asn His Ala Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val

50 55 60

Gly Val Val Pro Gly Ile Pro Glu Pro Cys Cys Val Pro Glu Lys Met

65 70 75 80

Ser Ser Leu Ser Ile Leu Phe Phe Asp Glu Asn Lys Asn Val Val Leu

85 90 95

Lys Val Tyr Pro Asn Met Thr Val Glu Ser Cys Ala Cys Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-4(骨成型蛋白-2b)

<400> 16

Ser Pro Lys His His Ser Gln Arg Ala Arg Lys Lys Asn Lys Asn Cys

1 5 10 15

Arg Arg His Ser Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp

20 25 30

Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly Tyr Gln Ala Phe Tyr Cys His Gly Asp

35 40 45

Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile

50 55 60

Val Gln Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Ser Ile Pro Lys Ala Cys

65 70 75 80

Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu

85 90 95

Tyr Asp Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Glu Met Val Val Glu Gly

100 105 110

Cys Gly Cys Arg

115

<210> 17

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-5

<400> 17

Ala Ala Asn Gln Asn Arg Asn Lys Ser Ser Ser His Gln Asp Ser Ser

1 5 10 15

Arg Met Ser Ser Val Gly Asp Tyr Asn Thr Ser Glu Gln Lys Gln Ala

20 25 30

Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg Asp Leu Gly Trp Gln

35 40 45

Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Phe Tyr Cys Asp Gly

50 55 60

Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala

65 70 75 80

Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Met Phe Pro Asp His Val Pro Lys

85 90 95

Pro Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe

100 105 110

Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val

115 120 125

Arg Ser Cys Gly Cys His

130

<210> 18

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-6(Vgr-1)

<400> 18

Gln Gln Ser Arg Asn Arg Ser Thr Gln Ser Gln Asp Val Ala Arg Val

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ser Asp Tyr Asn Ser Ser Glu Leu Lys Thr Ala Cys Arg

20 25 30

Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp

35 40 45

Ile Ile Ala Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Asn Tyr Cys Asp Gly Glu Cys

50 55 60

Ser Phe Pro Leu Asn Ala His Met Asn Ala Thr Asn His Ala Ile Val

65 70 75 80

Gln Thr Leu Val His Leu Met Asn Pro Glu Tyr Val Pro Lys Pro Cys

85 90 95

Cys Ala Pro Thr Lys Leu Asn Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp

100 105 110

Asn Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn Met Val Val Arg Ala

115 120 125

Cys Gly Cys His

130

<210> 19

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-7(OP-1)

<400> 19

Ser Thr Gly Ser Lys Gln Arg Ser Gln Asn Arg Ser Lys Thr Pro Lys

1 5 10 15

Asn Gln Glu Ala Leu Arg Met Ala Asn Val Ala Glu Asn Ser Ser Ser

20 25 30

Asp Gln Arg Gln Ala Cys Lys Lys His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Arg

35 40 45

Asp Leu Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala

50 55 60

Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ala Phe Pro Leu Asn Ser Tyr Met Asn

65 70 75 80

Ala Thr Asn His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Phe Ile Asn Pro

85 90 95

Glu Thr Val Pro Lys Pro Cys Cys Ala Pro Thr Gln Leu Asn Ala Ile

100 105 110

Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr

115 120 125

Arg Asn Met Val Val Arg Ala Cys Gly Cys His

130 135

<210> 20

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-8(OP-2)

<400> 20

Ala Val Arg Pro Leu Arg Arg Arg Gln Pro Lys Lys Ser Asn Glu Leu

1 5 10 15

Pro Gln Ala Asn Arg Leu Pro Gly Ile Phe Asp Asp Val His Gly Ser

20 25 30

His Gly Arg Gln Val Cys Arg Arg His Glu Leu Tyr Val Ser Phe Gln

35 40 45

Asp Leu Gly Trp Leu Asp Trp Val Ile Ala Pro Gln Gly Tyr Ser Ala

50 55 60

Tyr Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Ser Phe Pro Leu Asp Ser Cys Met Asn

65 70 75 80

Ala Thr Asn His Ala Ile Leu Gln Ser Leu Val His Leu Met Lys Pro

85 90 95

Asn Ala Val Pro Lys Ala Cys Cys Ala Pro Thr Lys Leu Ser Ala Thr

100 105 110

Ser Val Leu Tyr Tyr Asp Ser Ser Asn Asn Val Ile Leu Arg Lys His

115 120 125

Arg Asn Met Val Val Lys Ala Cys Gly Cys His

130 135

<210> 21

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-9(生长和分化因子-2)

<400> 21

Ser Ala Gly Ala Gly Ser His Cys Gln Lys Thr Ser Leu Arg Val Asn

1 5 10 15

Phe Glu Asp Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Lys Glu Tyr

20 25 30

Glu Ala Tyr Glu Cys Lys Gly Gly Cys Phe Phe Pro Leu Ala Asp Asp

35 40 45

Val Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Val Gln Thr Leu Val His Leu Lys

50 55 60

Phe Pro Thr Lys Val Gly Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Ser

65 70 75 80

Pro Ile Ser Val Leu Tyr Lys Asp Asp Met Gly Val Pro Thr Leu Lys

85 90 95

Tyr His Tyr Glu Gly Met Ser Val Ala Glu Cys Gly Cys Arg

100 105 110

<210> 22

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-10

<400> 22

Asn Ala Lys Gly Asn Tyr Cys Lys Arg Thr Pro Leu Tyr Ile Asp Phe

1 5 10 15

Lys Glu Ile Gly Trp Asp Ser Trp Ile Ile Ala Pro Pro Gly Tyr Glu

20 25 30

Ala Tyr Glu Cys Arg Gly Val Cys Asn Tyr Pro Leu Ala Glu His Leu

35 40 45

Thr Pro Thr Lys His Ala Ile Ile Gln Ala Leu Val His Leu Lys Asn

50 55 60

Ser Gln Lys Ala Ser Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Glu Pro

65 70 75 80

Ile Ser Ile Leu Tyr Leu Asp Lys Gly Val Val Thr Tyr Lys Phe Lys

85 90 95

Tyr Glu Gly Met Ala Val Ser Glu Cys Gly Cys Arg

100 105

<210> 23

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 骨成型蛋白-15(生长和分化因子-9b)

<400> 23

Gln Ala Asp Gly Ile Ser Ala Glu Val Thr Ala Ser Ser Ser Lys His

1 5 10 15

Ser Gly Pro Glu Asn Asn Gln Cys Ser Leu His Pro Phe Gln Ile Ser

20 25 30

Phe Arg Gln Leu Gly Trp Asp His Trp Ile Ile Ala Pro Pro Phe Tyr

35 40 45

Thr Pro Asn Tyr Cys Lys Gly Thr Cys Leu Arg Val Leu Arg Asp Gly

50 55 60

Leu Asn Ser Pro Asn His Ala Ile Ile Gln Asn Leu Ile Asn Gln Leu

65 70 75 80

Val Asp Gln Ser Val Pro Arg Pro Ser Cys Val Pro Tyr Lys Tyr Val

85 90 95

Pro Ile Ser Val Leu Met Ile Glu Ala Asn Gly Ser Ile Leu Tyr Lys

100 105 110

Glu Tyr Glu Gly Met Ile Ala Glu Ser Cys Thr Cys Arg

115 120 125

<210> 24

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-1

<400> 24

Asp Ala Glu Pro Val Leu Gly Gly Gly Pro Gly Gly Ala Cys Arg Ala

1 5 10 15

Arg Arg Leu Tyr Val Ser Phe Arg Glu Val Gly Trp His Arg Trp Val

20 25 30

Ile Ala Pro Arg Gly Phe Leu Ala Asn Tyr Cys Gln Gly Gln Cys Ala

35 40 45

Leu Pro Val Ala Leu Ser Gly Ser Gly Gly Pro Pro Ala Leu Asn His

50 55 60

Ala Val Leu Arg Ala Leu Met His Ala Ala Ala Pro Gly Ala Ala Asp

65 70 75 80

Leu Pro Cys Cys Val Pro Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Val Leu Phe

85 90 95

Phe Asp Asn Ser Asp Asn Val Val Leu Arg Gln Tyr Glu Asp Met Val

100 105 110

Val Asp Glu Cys Gly Cys

115

<210> 25

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-3(Vgr-2)

<400> 25

Ala Ala Ile Pro Val Pro Lys Leu Ser Cys Lys Asn Leu Cys His Arg

1 5 10 15

His Gln Leu Phe Ile Asn Phe Arg Asp Leu Gly Trp His Lys Trp Ile

20 25 30

Ile Ala Pro Lys Gly Phe Met Ala Asn Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro

35 40 45

Phe Ser Leu Thr Ile Ser Leu Asn Ser Ser Asn Tyr Ala Phe Met Gln

50 55 60

Ala Leu Met His Ala Val Asp Pro Glu Ile Pro Gln Ala Val Cys Ile

65 70 75 80

Pro Thr Lys Leu Ser Pro Ile Ser Met Leu Tyr Gln Asp Asn Asn Asp

85 90 95

Asn Val Ile Leu Arg His Tyr Glu Asp Met Val Val Asp Glu Cys Gly

100 105 110

Cys Gly

<210> 26

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-5(骨成型蛋白-14)

<400> 26

Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys

1 5 10 15

Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly

20 25 30

Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys

35 40 45

Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn

50 55 60

His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr

65 70 75 80

Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu

85 90 95

Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met

100 105 110

Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg

115 120

<210> 27

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-6(骨成型蛋白-13)

<400> 27

Thr Ala Phe Ala Ser Arg His Gly Lys Arg His Gly Lys Lys Ser Arg

1 5 10 15

Leu Arg Cys Ser Lys Lys Pro Leu His Val Asn Phe Lys Glu Leu Gly

20 25 30

Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Tyr His Cys

35 40 45

Glu Gly Val Cys Asp Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn

50 55 60

His Ala Ile Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Gly Ser Thr

65 70 75 80

Pro Pro Ser Cys Cys Val Pro Thr Lys Leu Thr Pro Ile Ser Ile Leu

85 90 95

Tyr Ile Asp Ala Gly Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met

100 105 110

Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg

115 120

<210> 28

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-7(骨成型蛋白-12)

<400> 28

Thr Ala Leu Ala Gly Thr Arg Thr Ser Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ala

1 5 10 15

Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys Pro

20 25 30

Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala

35 40 45

Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys Asp Phe Pro

50 55 60

Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile Gln Thr Leu

65 70 75 80

Leu Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys Cys Val Pro

85 90 95

Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asn Asn

100 105 110

Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys

115 120 125

Arg

<210> 29

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-8（肌生长抑制素）

<400> 29

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys

1 5 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile

20 25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu

35 40 45

Phe Val Phe Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gln Ala

50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser

65 70 75 80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln Ile Ile Tyr Gly

85 90 95

Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

100 105

<210> 30

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-9

<400> 30

Gly Gln Glu Thr Val Ser Ser Glu Leu Lys Lys Pro Leu Gly Pro Ala

1 5 10 15

Ser Phe Asn Leu Ser Glu Tyr Phe Arg Gln Phe Leu Leu Pro Gln Asn

20 25 30

Glu Cys Glu Leu His Asp Phe Arg Leu Ser Phe Ser Gln Leu Lys Trp

35 40 45

Asp Asn Trp Ile Val Ala Pro His Arg Tyr Asn Pro Arg Tyr Cys Lys

50 55 60

Gly Asp Cys Pro Arg Ala Val Gly His Arg Tyr Gly Ser Pro Val His

65 70 75 80

Thr Met Val Gln Asn Ile Ile Tyr Glu Lys Leu Asp Ser Ser Val Pro

85 90 95

Arg Pro Ser Cys Val Pro Ala Lys Tyr Ser Pro Leu Ser Val Leu Thr

100 105 110

Ile Glu Pro Asp Gly Ser Ile Ala Tyr Lys Glu Tyr Glu Asp Met Ile

115 120 125

Ala Thr Lys Cys Thr Cys Arg

130 135

<210> 31

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-10(骨成型蛋白-3b)

<400> 31

Lys Thr Met Gln Lys Ala Arg Arg Lys Gln Trp Asp Glu Pro Arg Val

1 5 10 15

Cys Ser Arg Arg Tyr Leu Lys Val Asp Phe Ala Asp Ile Gly Trp Asn

20 25 30

Glu Trp Ile Ile Ser Pro Lys Ser Phe Asp Ala Tyr Tyr Cys Ala Gly

35 40 45

Ala Cys Glu Phe Pro Met Pro Lys Ile Val Arg Pro Ser Asn His Ala

50 55 60

Thr Ile Gln Ser Ile Val Arg Ala Val Gly Ile Ile Pro Gly Ile Pro

65 70 75 80

Glu Pro Cys Cys Val Pro Asp Lys Met Asn Ser Leu Gly Val Leu Phe

85 90 95

Leu Asp Glu Asn Arg Asn Val Val Leu Lys Val Tyr Pro Asn Met Ser

100 105 110

Val Asp Thr Cys Ala Cys Arg

115

<210> 32

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-11(骨成型蛋白-11)

<400> 32

Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys

1 5 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile

20 25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Glu

35 40 45

Tyr Met Phe Met Gln Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gln Gln Ala

50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser

65 70 75 80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gln Gln Ile Ile Tyr Gly

85 90 95

Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser

100 105

<210> 33

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 生长和分化因子-15

<400> 33

Ala Arg Asn Gly Asp Asp Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg

1 5 10 15

Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp

20 25 30

Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser

50 55 60

Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Glu Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val

85 90 95

Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

100 105 110

<210> 34

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 节点

<400> 34

His His Leu Pro Asp Arg Ser Gln Leu Cys Arg Lys Val Lys Phe Gln

1 5 10 15

Val Asp Phe Asn Leu Ile Gly Trp Gly Ser Trp Ile Ile Tyr Pro Lys

20 25 30

Gln Tyr Asn Ala Tyr Arg Cys Glu Gly Glu Cys Pro Asn Pro Val Gly

35 40 45

Glu Glu Phe His Pro Thr Asn His Ala Tyr Ile Gln Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Arg Tyr Gln Pro His Arg Val Pro Ser Thr Cys Cys Ala Pro Val Lys

65 70 75 80

Thr Lys Pro Leu Ser Met Leu Tyr Val Asp Asn Gly Arg Val Leu Leu

85 90 95

Asp His His Lys Asp Met Ile Val Glu Glu Cys Gly Cys Leu

100 105 110

<210> 35

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 激活素-bA

<400> 35

Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile Cys Cys Lys Lys Gln Phe

1 5 10 15

Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly Glu Cys Pro Ser His Ile

35 40 45

Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu Ser Phe His Ser Thr Val Ile Asn

50 55 60

His Tyr Arg Met Arg Gly His Ser Pro Phe Ala Asn Leu Lys Ser Cys

65 70 75 80

Cys Val Pro Thr Lys Leu Arg Pro Met Ser Met Leu Tyr Tyr Asp Asp

85 90 95

Gly Gln Asn Ile Ile Lys Lys Asp Ile Gln Asn Met Ile Val Glu Glu

100 105 110

Cys Gly Cys Ser

115

<210> 36

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 激活素-bB

<400> 36

Gly Leu Glu Cys Asp Gly Arg Thr Asn Leu Cys Cys Arg Gln Gln Phe

1 5 10 15

Phe Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro

20 25 30

Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu

35 40 45

Ala Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn

50 55 60

Gln Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys

65 70 75 80

Ile Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu

85 90 95

Tyr Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys

100 105 110

Gly Cys Ala

115

<210> 37

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 激活素-bC

<400> 37

Gly Ile Asp Cys Gln Gly Gly Ser Arg Met Cys Cys Arg Gln Glu Phe

1 5 10 15

Phe Val Asp Phe Arg Glu Ile Gly Trp His Asp Trp Ile Ile Gln Pro

20 25 30

Glu Gly Tyr Ala Met Asn Phe Cys Ile Gly Gln Cys Pro Leu His Ile

35 40 45

Ala Gly Met Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Thr Ala Val Leu Asn

50 55 60

Leu Leu Lys Ala Asn Thr Ala Ala Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ser Cys

65 70 75 80

Cys Val Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Tyr Asp Arg

85 90 95

Asp Ser Asn Ile Val Lys Thr Asp Ile Pro Asp Met Val Val Glu Ala

100 105 110

Cys Gly Cys Ser

115

<210> 38

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 激活素-bE

<400> 38

Thr Pro Thr Cys Glu Pro Ala Thr Pro Leu Cys Cys Arg Arg Asp His

1 5 10 15

Tyr Val Asp Phe Gln Glu Leu Gly Trp Arg Asp Trp Ile Leu Gln Pro

20 25 30

Glu Gly Tyr Gln Leu Asn Tyr Cys Ser Gly Gln Cys Pro Pro His Leu

35 40 45

Ala Gly Ser Pro Gly Ile Ala Ala Ser Phe His Ser Ala Val Phe Ser

50 55 60

Leu Leu Lys Ala Asn Asn Pro Trp Pro Ala Ser Thr Ser Cys Cys Val

65 70 75 80

Pro Thr Ala Arg Arg Pro Leu Ser Leu Leu Tyr Leu Asp His Asn Gly

85 90 95

Asn Val Val Lys Thr Asp Val Pro Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly

100 105 110

Cys Ser

<210> 39

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抑制素-a

<400> 39

Ser Thr Pro Leu Met Ser Trp Pro Trp Ser Pro Ser Ala Leu Arg Leu

1 5 10 15

Leu Gln Arg Pro Pro Glu Glu Pro Ala Ala His Ala Asn Cys His Arg

20 25 30

Val Ala Leu Asn Ile Ser Phe Gln Glu Leu Gly Trp Glu Arg Trp Ile

35 40 45

Val Tyr Pro Pro Ser Phe Ile Phe His Tyr Cys His Gly Gly Cys Gly

50 55 60

Leu His Ile Pro Pro Asn Leu Ser Leu Pro Val Pro Gly Ala Pro Pro

65 70 75 80

Thr Pro Ala Gln Pro Tyr Ser Leu Leu Pro Gly Ala Gln Pro Cys Cys

85 90 95

Ala Ala Leu Pro Gly Thr Met Arg Pro Leu His Val Arg Thr Thr Ser

100 105 110

Asp Gly Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn Leu Leu Thr

115 120 125

Gln His Cys Ala Cys Ile

130

<210> 40

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 转化生长因子-b1

<400> 40

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser Thr Glu Lys Asn Cys Cys

1 5 10 15

Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys

35 40 45

Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu

50 55 60

Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala Ala Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys Pro

85 90 95

Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Arg Ser Cys Lys Cys Ser

100 105 110

<210> 41

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 转化生长因子-b2

<400> 41

Ala Leu Asp Ala Ala Tyr Cys Phe Arg Asn Val Gln Asp Asn Cys Cys

1 5 10 15

Leu Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 30

Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly Ala Cys

35 40 45

Pro Tyr Leu Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu

50 55 60

Tyr Asn Thr Ile Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Ser

65 70 75 80

Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr Pro

85 90 95

Lys Ile Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser

100 105 110

<210> 42

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 转化生长因子-b3

<400> 42

Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Arg Asn Leu Glu Glu Asn Cys Cys

1 5 10 15

Val Arg Pro Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp

20 25 30

Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly Pro Cys

35 40 45

Pro Tyr Leu Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu

50 55 60

Tyr Asn Thr Leu Asn Pro Glu Ala Ser Ala Ser Pro Cys Cys Val Pro

65 70 75 80

Gln Asp Leu Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr Pro

85 90 95

Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Val Val Lys Ser Cys Lys Cys Ser

100 105 110

Claims

1.一种重组多肽，包含并含有两个以上的肽段，其特征在于，上述多肽的第一段包含与第一转化生长因子-β家族蛋白具有90％以上的同一性的序列，第二肽段包含与第二转化生长因子-β家族蛋白具有90％以上的同一性的序列，上述两个段能够操作地连接，具有第一亲本转化生长因子-β家族蛋白或第二亲本转化生长因子-β家族蛋白中的至少两种活性，或者具有新的体内信号传递活性及细胞特性的活性，两个以上的多肽段包含能够操作地从N-末端连接至C-末端的6个肽段，其中，上述多肽调节SMAD通路。

2.根据权利要求1所述的重组多肽，其特征在于，上述多肽包含源自骨成型蛋白-2的N-末端段1，两个以上的多肽段包含能够操作地从N-末端连接至C-末端的6个肽段。

3.根据权利要求1或2所述的重组多肽，其特征在于，上述第一转化生长因子-β家族蛋白为骨成型蛋白-2，上述第二转化生长因子-β家族蛋白为激活素或其他家族成员，各个段与上述两个转化生长因子-β家族蛋白的共同段的结构基序相应，上述多肽调节SMAD通路。

4.根据权利要求1所述的重组多肽，其特征在于，上述多肽包含源自骨成型蛋白-7的N-末端段1，两个以上的多肽段包含能够操作地从N-末端连接至C-末端的6个肽段。

5.根据权利要求1及4所述的重组多肽，其特征在于，上述第一转化生长因子-β家族蛋白为骨成型蛋白-7，上述第二转化生长因子-β家族蛋白为激活素或其他家族成员，各个段与上述两个转化生长因子-β家族蛋白的共同段的结构基序相应，上述多肽调节SMAD通路。

6.根据权利要求1、4或5所述的重组多肽，其特征在于，源自上述骨成型蛋白-7的段1、段3及段4与源自激活素的段2、段5及段6能够操作地连接来制备SAB704，上述多肽调节SMAD通路。

7.根据权利要求1、4或5所述的重组多肽，其特征在于，源自上述骨成型蛋白-7的段1、段3、段4及段5与源自激活素的段2及段6能够操作地连接来制备SAB715，上述多肽调节SMAD通路。

8.一种嵌合转化生长因子-β家族多肽，其特征在于，包含与第二转化生长因子-β家族蛋白段能够操作地连接的第一转化生长因子-β家族蛋白段，以提供具有SMAD-调节活性的嵌合多肽，各个段与上述两个转化生长因子-β家族蛋白的共同段的结构基序相应。

9.一种序列变体，为权利要求1至8中任一项所述的多肽的序列变体，其特征在于，为了通过调节头蛋白结合能力来利用AB204制备NAB204、利用SAB704制备NAB704或利用SAB715制备NAB715，6个氨基酸长度的头蛋白敏化剂序列取代上述多肽的结构上等同的区域。

10.一种序列变体，为转化生长因子-β超家族的多肽的序列变体，其特征在于，使用源自相关的亚家族序列的6个氨基酸长度的头蛋白-致敏序列导入头蛋白-敏感性-序列，作为这种嵌合体的例，可生成如源自激活素的头蛋白-敏感性-激活素的头蛋白-敏感性形态，或者利用源自相关亚家族序列的头蛋白-非敏感-序列取代相同的6个氨基酸长度的头蛋白-致敏序列来去除头蛋白-敏感性-序列，作为这种嵌合体的例，可利用骨成型蛋白2生成头蛋白-非敏感-骨成型蛋白2。

11.一种多核苷酸，其特征在于，对权利要求1至10中任一项所述的多肽进行编码。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，上述多核苷酸包含源自能够操作地连接的多个转化生长因子-β家族多核苷酸的序列，来对功能性嵌合多肽进行编码，上述功能性嵌合多肽具有包括通过上述配体的组合时间-依赖性混合使骨及软骨再生在内的SMAD-调节活性，从而调节体内细胞活性。

13.一种载体，其特征在于，包含权利要求11或12所述的多核苷酸。

14.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求13所述的载体。

15.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求11、12或13所述的多核苷酸。

16.一种嵌合转化生长因子-β多肽的生成方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，排列两个以上的转化生长因子-β家族成员蛋白序列；

步骤(b)，确认两个家族蛋白的6个结构上相关的段；

步骤(c)，在5个以上的连续氨基酸中确认包含在结构上与90％以上的序列同一性相关的末端中的段的两个转化生长因子-β蛋白的交叉点；以及

步骤(d)，从骨成型蛋白到第二转化生长因子-β家族成员蛋白，生成至少包含段1的嵌合转化生长因子-β多肽，上述段在交叉点依次连接，作为一个这种嵌合体的例，生成1B2-骨成型蛋白7。

17.一种嵌合多肽，其特征在于，通过权利要求16所述的方法生成。

18.一种调节与SMAD通路相关的细胞增殖或活性的方法，其特征在于，包括使权利要求1至10中任一项所述的多肽与细胞相接触的步骤。

19.一种与骨、软骨、神经组织、心脏组织、骨骼肌或内分泌组织相关的疾病或病症的治疗方法，其特征在于，包括使权利要求1至10中任一项所述的多肽与组织相接触的步骤。

20.一种细胞增殖性疾病或病症的治疗方法，其特征在于，包括使权利要求1至10中任一项所述的多肽与具有细胞增殖疾病或病症的细胞相接触的步骤。

21.一种用于预防或治疗与骨、软骨、神经组织、心脏组织、骨骼肌或内分泌组织相关的疾病的药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求1至10中任一项所述的多肽。

22.一种用于预防或治疗细胞增殖性病症的药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求1至10中任一项所述的多肽。