JPH07265079A - リガンド特異性を与える繊維芽細胞レセプター内のリガンド−結合決定領域 - Google Patents
リガンド特異性を与える繊維芽細胞レセプター内のリガンド−結合決定領域Info
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- JPH07265079A JPH07265079A JP4356203A JP35620392A JPH07265079A JP H07265079 A JPH07265079 A JP H07265079A JP 4356203 A JP4356203 A JP 4356203A JP 35620392 A JP35620392 A JP 35620392A JP H07265079 A JPH07265079 A JP H07265079A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 リガンド特異性を与える繊維芽細胞レセプタ
ー内のリガンド結合領域を有するポリペプチドなどが提
供される。 【構成】 繊維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ）
の細胞外部の部分内にある領域は、レセプターのリガン
ド特異性を与える。一つのこのようなリガンド特異性領
域（ＬＳＲ）はＦＧＦＲのイムノグロブリン様ドメイン
のＣ−末端領域に含まれ、他の一つは、第二イムノグロ
ブリン様ドメイン内にある。ＦＧＦＲからＬＳＲを動か
し、それを他のＦＧＦＲからの相当するＬＳＲで置き換
えることによって、挿入したＬＳＲにより決定された結
合の特異性によってリガンドを結合することができるキ
メラ蛋白質が得られる。
ー内のリガンド結合領域を有するポリペプチドなどが提
供される。 【構成】 繊維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦＲ）
の細胞外部の部分内にある領域は、レセプターのリガン
ド特異性を与える。一つのこのようなリガンド特異性領
域（ＬＳＲ）はＦＧＦＲのイムノグロブリン様ドメイン
のＣ−末端領域に含まれ、他の一つは、第二イムノグロ
ブリン様ドメイン内にある。ＦＧＦＲからＬＳＲを動か
し、それを他のＦＧＦＲからの相当するＬＳＲで置き換
えることによって、挿入したＬＳＲにより決定された結
合の特異性によってリガンドを結合することができるキ
メラ蛋白質が得られる。
Description
【０００１】
【発明の分野】本発明は繊維芽細胞増殖因子レセプター
（ＦＧＦＲ）の分野、さらに正確には、レセプターのリ
ガンド結合特性を与えるＦＧＦＲの細胞外の部分の領域
に関するものである。このようなレセプターのリガンド
結合特性性を与える領域は、“リガンド特異性領域（Ｌ
ＳＲ）”としてここに適用されるだろう。
（ＦＧＦＲ）の分野、さらに正確には、レセプターのリ
ガンド結合特性を与えるＦＧＦＲの細胞外の部分の領域
に関するものである。このようなレセプターのリガンド
結合特性性を与える領域は、“リガンド特異性領域（Ｌ
ＳＲ）”としてここに適用されるだろう。
【０００２】本発明はまた、他のＦＧＦＲのそれによっ
て移動され、置きかえられたＬＳＲの少なくとも一つを
もつＦＧＦＲの細胞外部分からなるキメラ蛋白質に関す
るものである。本発明に従って、このようなキメラ蛋白
質の結合特異性は、ＬＳＲによって決められることが見
出された。
て移動され、置きかえられたＬＳＲの少なくとも一つを
もつＦＧＦＲの細胞外部分からなるキメラ蛋白質に関す
るものである。本発明に従って、このようなキメラ蛋白
質の結合特異性は、ＬＳＲによって決められることが見
出された。
【０００３】本発明は、さらに、当該ＬＳＲとキメラ蛋
白質をコードするＤＮＡ分子、当該ＤＮＡからなるベク
ター、当該ベクターによって移入される細胞、及びそこ
からの組換え発現ベクターの生成物に関するものであ
る。
白質をコードするＤＮＡ分子、当該ＤＮＡからなるベク
ター、当該ベクターによって移入される細胞、及びそこ
からの組換え発現ベクターの生成物に関するものであ
る。
【０００４】
【先行技術】本発明に関連すると思われる従来の技術は
次のリストの通りである。 上記の論文に関係する記述は、以下リストの番号で示さ
れる。
次のリストの通りである。 上記の論文に関係する記述は、以下リストの番号で示さ
れる。
【０００５】
【発明の背景】レセプターへの細胞増殖因子の結合は、
非常に特異的な相互作用と、細胞と組織の型に特有の増
殖と分化を基礎にしてなりたっている。繊維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ）族は、細胞増殖の制御、胚成長、血管形
成と悪性軽質転換に関わる少なくとも７つの密接に関係
のあるポリペプチドからなっている。ＦＧＦｓは、間充
識、神経及び上皮起源の細胞に対し、変化に富んだ生物
学的活性を示す。少なくとも５つのＦＧＦレセプター
（ＦＧＦＲｓ）が最近同定されクローン化され
た１−９。すべてのＦＧＦＲｓがレセプターチロシンキ
ナーゼであり、それらは、リガンド結合へ活性化され
る、３つの細胞外イムノグロブリン様（Ｉｇ）ドメイン
と、細胞内触媒ドメインとして機能するスプリットキナ
ーゼから成る通常の基本構造を分担している。
非常に特異的な相互作用と、細胞と組織の型に特有の増
殖と分化を基礎にしてなりたっている。繊維芽細胞増殖
因子（ＦＧＦ）族は、細胞増殖の制御、胚成長、血管形
成と悪性軽質転換に関わる少なくとも７つの密接に関係
のあるポリペプチドからなっている。ＦＧＦｓは、間充
識、神経及び上皮起源の細胞に対し、変化に富んだ生物
学的活性を示す。少なくとも５つのＦＧＦレセプター
（ＦＧＦＲｓ）が最近同定されクローン化され
た１−９。すべてのＦＧＦＲｓがレセプターチロシンキ
ナーゼであり、それらは、リガンド結合へ活性化され
る、３つの細胞外イムノグロブリン様（Ｉｇ）ドメイン
と、細胞内触媒ドメインとして機能するスプリットキナ
ーゼから成る通常の基本構造を分担している。
【０００６】さらに、ＦＧＦＲｓは、たとえば酸性ＦＧ
Ｆ（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）及びｈｓｔ
／Ｋｆｇｆ（またはＦＧＦ４）が、マウス遺伝子ｂｅｋ
４によりエンコードされたＢｅｋまたはＦＧＦＲ２とし
て知られているｂＦＧＦＲに結合する能力がある、ある
程度の交差反応性を示唆する結合の側面をもっている。
しかしながら、ＦＧＦ族のメンバーである角化細胞増殖
因子（ＫＧＦ）は、これもまたマウス遺伝子ｂｅｋによ
りエンコードされた角化細胞増殖因子（ＫＧＦＲ）にだ
け結合する高度の特異性を示す。ＫＧＦＲは、ＫＧＦに
結合する能力のほかに、ａＦＧＦ及びＦＧＦ４にもまた
結合する能力があるが、ｂＦＧＦとは結合しない。マウ
ス遺伝子ｆｌｇによってエンコードされたほかのＦＧＦ
Ｒ、ＦＧＦＲ１はまた、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ及びＦＧＦ
４と結合する能力があり、ＫＧＦ４，１１，１２とは結
合できないのでＦＧＦＲ２に似ている。
Ｆ（ａＦＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）及びｈｓｔ
／Ｋｆｇｆ（またはＦＧＦ４）が、マウス遺伝子ｂｅｋ
４によりエンコードされたＢｅｋまたはＦＧＦＲ２とし
て知られているｂＦＧＦＲに結合する能力がある、ある
程度の交差反応性を示唆する結合の側面をもっている。
しかしながら、ＦＧＦ族のメンバーである角化細胞増殖
因子（ＫＧＦ）は、これもまたマウス遺伝子ｂｅｋによ
りエンコードされた角化細胞増殖因子（ＫＧＦＲ）にだ
け結合する高度の特異性を示す。ＫＧＦＲは、ＫＧＦに
結合する能力のほかに、ａＦＧＦ及びＦＧＦ４にもまた
結合する能力があるが、ｂＦＧＦとは結合しない。マウ
ス遺伝子ｆｌｇによってエンコードされたほかのＦＧＦ
Ｒ、ＦＧＦＲ１はまた、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ及びＦＧＦ
４と結合する能力があり、ＫＧＦ４，１１，１２とは結
合できないのでＦＧＦＲ２に似ている。
【０００７】今日まで、色々なＦＧＦＲｓのリガンドや
組織の特異性について、また色々なＦＧＦＲｓの間のリ
ガンド特異性の中に観察される上記のような変化につい
ても、正確な分子的原理に関すはっきりした証拠は見当
らない。本発明に従って、リガンド特異性に関する分子
的原理が解明され、リガンド特異性を与える領域が同定
された。このような領域の一つは、ＦＧＦＲの細胞外の
部分の第３イミノグロブリン様（Ｉｇ）ドメイン（以後
“Ｉｇ−ドメイン３”）の５０アミノ酸長Ｃ−末端半分
に含まれることが判明した。ほかのこのような領域は、
第二Ｉｇ−様ドメイン（以後“Ｉｇ−ドメイン２”）内
に位置することが見出された。
組織の特異性について、また色々なＦＧＦＲｓの間のリ
ガンド特異性の中に観察される上記のような変化につい
ても、正確な分子的原理に関すはっきりした証拠は見当
らない。本発明に従って、リガンド特異性に関する分子
的原理が解明され、リガンド特異性を与える領域が同定
された。このような領域の一つは、ＦＧＦＲの細胞外の
部分の第３イミノグロブリン様（Ｉｇ）ドメイン（以後
“Ｉｇ−ドメイン３”）の５０アミノ酸長Ｃ−末端半分
に含まれることが判明した。ほかのこのような領域は、
第二Ｉｇ−様ドメイン（以後“Ｉｇ−ドメイン２”）内
に位置することが見出された。
【０００８】
【発明の目的】本発明の目的は、ＦＧＦＲの細胞外部分
のリガンド特異性領域（ＬＳＲ）、すなわち、リガンド
−結合特異性を与える細胞外の部分の領域を与えること
にある。本発明の他の目的は、ＬＳＲが他のＦＧＦＲか
らの相当するＬＳＲによって置換されたある種のＦＧＦ
Ｒの細胞外部分から成る可溶性キメラ蛋白質を提供する
ことにある。本発明のさらに他の目的は、ＬＳＲまたは
当該キメラ蛋白質をエンコードするＤＮＡ分子を提供す
ることにある。さらに他の発明の目的は、次項以下に明
らかにされるだろう。
のリガンド特異性領域（ＬＳＲ）、すなわち、リガンド
−結合特異性を与える細胞外の部分の領域を与えること
にある。本発明の他の目的は、ＬＳＲが他のＦＧＦＲか
らの相当するＬＳＲによって置換されたある種のＦＧＦ
Ｒの細胞外部分から成る可溶性キメラ蛋白質を提供する
ことにある。本発明のさらに他の目的は、ＬＳＲまたは
当該キメラ蛋白質をエンコードするＤＮＡ分子を提供す
ることにある。さらに他の発明の目的は、次項以下に明
らかにされるだろう。
【０００９】
【発明の要約】本発明に従って、ＦＧＦＲのリガンド特
異性は、ここに云う“ＬＳＲ”（リガンド特異性領域）
のようなＦＧＦＲの細胞外部分にある２つの領域によっ
て与えられることが見出された。これらの領域の一つ
は、ＦＧＦＲの細胞外の部分のイムノグロブリン様ドメ
イン３（“Ｉｇ−ドメイン３”）のＣ−末端半分に位置
し、他の一つは、その第２イムノグロブリン様ドメイン
（“Ｉｇ−ドメイン２”）内に含まれていることが判明
した。リガンド結合特異性を与えない（“非−ＬＳ
Ｒ”）あるＦＧＦＲからのＦＧＦＲと、他のＦＧＦＲか
らのＬＳＲ（またはこのような多数の領域−ＬＳＲｓ）
の細胞外の部分からの領域で構成され、当該ＬＳＲの起
源であったＦＧＦＲのそれと似たような結合特異性をも
ったキメラ蛋白質が作られた。発明に従って、当該ＬＳ
Ｒｓをコードし、あるいはキメラ蛋白質をコードするＤ
ＮＡ分子が構築され、それらからなる発現ベクターが作
られ、これらのベクターによって細胞に移入され、そこ
から組換え発現生成物が得られた。
異性は、ここに云う“ＬＳＲ”（リガンド特異性領域）
のようなＦＧＦＲの細胞外部分にある２つの領域によっ
て与えられることが見出された。これらの領域の一つ
は、ＦＧＦＲの細胞外の部分のイムノグロブリン様ドメ
イン３（“Ｉｇ−ドメイン３”）のＣ−末端半分に位置
し、他の一つは、その第２イムノグロブリン様ドメイン
（“Ｉｇ−ドメイン２”）内に含まれていることが判明
した。リガンド結合特異性を与えない（“非−ＬＳ
Ｒ”）あるＦＧＦＲからのＦＧＦＲと、他のＦＧＦＲか
らのＬＳＲ（またはこのような多数の領域−ＬＳＲｓ）
の細胞外の部分からの領域で構成され、当該ＬＳＲの起
源であったＦＧＦＲのそれと似たような結合特異性をも
ったキメラ蛋白質が作られた。発明に従って、当該ＬＳ
Ｒｓをコードし、あるいはキメラ蛋白質をコードするＤ
ＮＡ分子が構築され、それらからなる発現ベクターが作
られ、これらのベクターによって細胞に移入され、そこ
から組換え発現生成物が得られた。
【００１０】第一の観点に従って、本発明は以下の項か
らなる基から選ばれたメンバーであるポリペプチドを与
える： （ａ） ＦＧＦＲの細胞外の部分からのリガンド特異性
領域（ＬＳＲ）のアミノ酸配列をもち、その領域が当該
ＦＧＦＲのリガンド結合特異性を与えるポリペプチド； （ｂ） 一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が添加さ
れ、置換または欠失されたポリペプチドが、当該ＬＳＲ
に代ってＦＧＦＲの細胞外の部分に挿入されて、当該Ｌ
ＳＲと同じリガンド結合特異性を当該ＦＧＦＲに与え
る、（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列をもつポリペ
プチド；そしてまた （ｃ） （ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるア
ミノ酸配列をもつ組換えポリペプチドまたは蛋白質。 上記のポリペプチドは、Ｉｇ−ドメイン３またはＩｇ−
ドメイン２のＣ−末端領域からのＬＳＲからなるだろ
う。
らなる基から選ばれたメンバーであるポリペプチドを与
える： （ａ） ＦＧＦＲの細胞外の部分からのリガンド特異性
領域（ＬＳＲ）のアミノ酸配列をもち、その領域が当該
ＦＧＦＲのリガンド結合特異性を与えるポリペプチド； （ｂ） 一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が添加さ
れ、置換または欠失されたポリペプチドが、当該ＬＳＲ
に代ってＦＧＦＲの細胞外の部分に挿入されて、当該Ｌ
ＳＲと同じリガンド結合特異性を当該ＦＧＦＲに与え
る、（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列をもつポリペ
プチド；そしてまた （ｃ） （ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるア
ミノ酸配列をもつ組換えポリペプチドまたは蛋白質。 上記のポリペプチドは、Ｉｇ−ドメイン３またはＩｇ−
ドメイン２のＣ−末端領域からのＬＳＲからなるだろ
う。
【００１１】熟練者であれば理解されるだろうが、必要
以上の実験を行うことなく、アミノ酸残基を添加し、置
換または欠失によってリガンド特異性を修正することな
くＬＳＲが修飾されるようなポリペプチドを作ることは
可能である。これはたとえば、制御された方法で、この
ようなＬＳＲをコードするｃＤＮＡを突然変異させ、突
然変異したｃＤＮＡをクローン化し、このクローンＤＮ
Ａの生成物をたとえばキメラ蛋白質（以下参照）の中に
挿入して、そのリガンド特異性の性質を検定することに
よって達成されるかも知れない。
以上の実験を行うことなく、アミノ酸残基を添加し、置
換または欠失によってリガンド特異性を修正することな
くＬＳＲが修飾されるようなポリペプチドを作ることは
可能である。これはたとえば、制御された方法で、この
ようなＬＳＲをコードするｃＤＮＡを突然変異させ、突
然変異したｃＤＮＡをクローン化し、このクローンＤＮ
Ａの生成物をたとえばキメラ蛋白質（以下参照）の中に
挿入して、そのリガンド特異性の性質を検定することに
よって達成されるかも知れない。
【００１２】第二の観点に従い、本発明は、第一蛋白質
から引き出した一つまたはそれ以上の第一領域と、第二
蛋白質から引き出した一つまたはそれ以上の第二領域か
らなり、当該第一及び第二領域はお互いに融合してお
り、次のように特徴づけられるキメラ蛋白質を与える： （ｉ） 当該一つまたはそれ以上の第一領域は以下のよ
うに構成される基から選ばれるお互いに独立したメンバ
ーである− （ａ） 第一ＦＧＦＲの細胞外の部分からの第一ＬＳＲ
のアミノ配列をもつポリペプチド鎖、そして（ｂ） 当
該第一ＬＳＲのリガンド特異的性質をもち、また一つま
たはそれ以上のアミノ酸残基が添加され、置換または欠
失した（ａ）におけるポリペプチドのアミノ酸配列をも
つポリペプチド鎖； （ｉｉ） 当該一つまたはそれ以上の第二領域は以下の
ように構成される基から選ばれるお互いに独立している
メンバーである− （ａ） 当該第二ＦＧＦＲのＬＳＲ領域をもたない（非
−ＬＳＲ）第二ＦＧＦＲの領域のアミノ酸配列をもつポ
リベプチド鎖、そして（ｂ） 当該一つまたはそれ以上
の第二領域の生物学的性質にも、あるいは当該第一ＬＳ
Ｒの結合特異性にも本質的には影響を及ぼすことなく、
一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換されまたは添
加された当該非−ＬＳＲのアミノ酸配列をもつポリペプ
チド鎖；その中で （ｉｉｉ） 当該キメラ蛋白質は、リガンドと結合する
能力があり、また、当該一つまたはそれ以上の第一領域
により与えられたリガンド結合特異性をもっている。
から引き出した一つまたはそれ以上の第一領域と、第二
蛋白質から引き出した一つまたはそれ以上の第二領域か
らなり、当該第一及び第二領域はお互いに融合してお
り、次のように特徴づけられるキメラ蛋白質を与える： （ｉ） 当該一つまたはそれ以上の第一領域は以下のよ
うに構成される基から選ばれるお互いに独立したメンバ
ーである− （ａ） 第一ＦＧＦＲの細胞外の部分からの第一ＬＳＲ
のアミノ配列をもつポリペプチド鎖、そして（ｂ） 当
該第一ＬＳＲのリガンド特異的性質をもち、また一つま
たはそれ以上のアミノ酸残基が添加され、置換または欠
失した（ａ）におけるポリペプチドのアミノ酸配列をも
つポリペプチド鎖； （ｉｉ） 当該一つまたはそれ以上の第二領域は以下の
ように構成される基から選ばれるお互いに独立している
メンバーである− （ａ） 当該第二ＦＧＦＲのＬＳＲ領域をもたない（非
−ＬＳＲ）第二ＦＧＦＲの領域のアミノ酸配列をもつポ
リベプチド鎖、そして（ｂ） 当該一つまたはそれ以上
の第二領域の生物学的性質にも、あるいは当該第一ＬＳ
Ｒの結合特異性にも本質的には影響を及ぼすことなく、
一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換されまたは添
加された当該非−ＬＳＲのアミノ酸配列をもつポリペプ
チド鎖；その中で （ｉｉｉ） 当該キメラ蛋白質は、リガンドと結合する
能力があり、また、当該一つまたはそれ以上の第一領域
により与えられたリガンド結合特異性をもっている。
【００１３】このようなキメラ蛋白質は、全部またはそ
のほんの一部が第二蛋白質からの非−ＬＳＲからなって
いるかも知れない。しかしながら、一般的には、キメラ
蛋白質は、そのＬＳＲが、一つまたはそれ以上のＦＧＦ
Ｒｓからの一つまたは両方の相当するＬＳＲｓによって
置換されたか、あるいはそのリガンド特異的性質に影響
を及ぼすことなく一つまたはそれ以上のアミノ酸が添加
されて、置換または欠失したＬＳＲｓによって置換され
た第二ＦＧＦＲの細胞外の部分でその主要な部分ができ
ていると思われる。
のほんの一部が第二蛋白質からの非−ＬＳＲからなって
いるかも知れない。しかしながら、一般的には、キメラ
蛋白質は、そのＬＳＲが、一つまたはそれ以上のＦＧＦ
Ｒｓからの一つまたは両方の相当するＬＳＲｓによって
置換されたか、あるいはそのリガンド特異的性質に影響
を及ぼすことなく一つまたはそれ以上のアミノ酸が添加
されて、置換または欠失したＬＳＲｓによって置換され
た第二ＦＧＦＲの細胞外の部分でその主要な部分ができ
ていると思われる。
【００１４】従って、本発明のキメラ蛋白質は、二つの
異なるＦＧＦＲｓからの融合領域、すなわち一つのＦＧ
ＦＲからくる一つまたは二つのＬＳＲｓと他のＦＧＦＲ
からくる非−ＬＳＲから成るかあるいは、複数のＦＧＦ
Ｒｓからの融合領域、たとえば一つのＦＧＦＲからくる
一つのＬＳＲ、他のＦＧＦＲからくる他のＬＳＲ、そし
て第三のＦＧＦＲからくる非−ＬＳＲ、あるいは複数の
ＦＧＦＲｓからくるかも知れないＦＧＦＲの非−ＬＳＲ
ｓから成るかも知れない。
異なるＦＧＦＲｓからの融合領域、すなわち一つのＦＧ
ＦＲからくる一つまたは二つのＬＳＲｓと他のＦＧＦＲ
からくる非−ＬＳＲから成るかあるいは、複数のＦＧＦ
Ｒｓからの融合領域、たとえば一つのＦＧＦＲからくる
一つのＬＳＲ、他のＦＧＦＲからくる他のＬＳＲ、そし
て第三のＦＧＦＲからくる非−ＬＳＲ、あるいは複数の
ＦＧＦＲｓからくるかも知れないＦＧＦＲの非−ＬＳＲ
ｓから成るかも知れない。
【００１５】第三の観点により、本発明は、上記のポリ
ペプチドまたはキメラ蛋白質をエンコードするＤＮＡ分
子を与える。本発明のＤＮＡ分子は、以下の項目からな
るグループから選ばれたメンバーのコーディング配列か
らなる； （ａ） その領域が当該ＦＧＦＲのリガンド結合特異性
を与えるＦＧＦＲの細胞外の部分からのリガンド特異性
領域（ＬＳＲ）をコードするヌクレオチド配列 （ｂ） コードしたポリペプチドが当該ＬＳＲの同じリ
ガンド特異的性質を保つ條件で、一つまたはそれ以上の
コドンが添加され、置換または欠失した（ａ）のヌクレ
オチド配列； （ｃ） （ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列からな
るポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列。
ペプチドまたはキメラ蛋白質をエンコードするＤＮＡ分
子を与える。本発明のＤＮＡ分子は、以下の項目からな
るグループから選ばれたメンバーのコーディング配列か
らなる； （ａ） その領域が当該ＦＧＦＲのリガンド結合特異性
を与えるＦＧＦＲの細胞外の部分からのリガンド特異性
領域（ＬＳＲ）をコードするヌクレオチド配列 （ｂ） コードしたポリペプチドが当該ＬＳＲの同じリ
ガンド特異的性質を保つ條件で、一つまたはそれ以上の
コドンが添加され、置換または欠失した（ａ）のヌクレ
オチド配列； （ｃ） （ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列からな
るポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列。
【００１６】本発明のＤＮＡ分子の特別な例は、キメラ
蛋白質をエンコードするもので、その場合ＤＮＡ分子
は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に加えて、
さらにほかのＦＧＦＲからの非−ＬＳＲから得たアミノ
酸配列をコードする一つまたはそれ以上の他の融合配列
からなっている。本発明はさらに、上記のＤＮＡ分子
と、当該発現ベクターにより移入された細胞からなる発
現ベクターを与える。
蛋白質をエンコードするもので、その場合ＤＮＡ分子
は、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列に加えて、
さらにほかのＦＧＦＲからの非−ＬＳＲから得たアミノ
酸配列をコードする一つまたはそれ以上の他の融合配列
からなっている。本発明はさらに、上記のＤＮＡ分子
と、当該発現ベクターにより移入された細胞からなる発
現ベクターを与える。
【００１７】さらにまた、本発明は、当該ベクターによ
り宿主細胞へ移入することと、移入された細胞から当該
ベクターの発現生成物を回収することからなる上記キメ
ラＦＧＦＲを作るための組換えＤＮＡ法を与える。若し
望むなら、特異性ＬＳＲに対抗する抗体が、特異性ＬＳ
Ｒを含むペプチドまたはキメラ蛋白質による動物の免疫
化、次にＦＧＦＲの色々な可溶性部分と色々な融合蛋白
質による抗体のスクリーニング、たとえば、特異性ＬＳ
Ｒまたはこれとは逆の他のＬＳＲからなるポリペプチド
またはキメラ蛋白質により特異性抗体が得られるまでの
スクリーニング、によって作られるかも知れない。
り宿主細胞へ移入することと、移入された細胞から当該
ベクターの発現生成物を回収することからなる上記キメ
ラＦＧＦＲを作るための組換えＤＮＡ法を与える。若し
望むなら、特異性ＬＳＲに対抗する抗体が、特異性ＬＳ
Ｒを含むペプチドまたはキメラ蛋白質による動物の免疫
化、次にＦＧＦＲの色々な可溶性部分と色々な融合蛋白
質による抗体のスクリーニング、たとえば、特異性ＬＳ
Ｒまたはこれとは逆の他のＬＳＲからなるポリペプチド
またはキメラ蛋白質により特異性抗体が得られるまでの
スクリーニング、によって作られるかも知れない。
【００１８】本発明に従い、マウスのＦＧＦＲ１、ＦＧ
ＦＲ２またＫＧＦＲ、そしてヒトＫ−Ｓａｍを含む多く
のＦＧＦＲｓによって実験を行った。これらのＦＧＦＲ
ｓは、ＬＳＲｓを含むことが見出され、一つのＦＧＦＲ
のＬＳＲを他のそれにより置換すると、結果として生ず
るキメラ蛋白質のリガンド結合特異性が変ることが分っ
た。しかしながら、以下に報告する実験は前記の四つの
ＫＧＦＲｓに限定されるけれども、本発明が単にこれら
４つのレセプターに限定されないことは熟練者には明ら
かであろう。逆に、本発明に従って得られた知識により
熟練者が、それから得たそれらの位置の知識に基づいて
他のＦＧＦＲｓ内のＬＳＲｓを発見し、このようなほか
のＦＧＦＲｓからのＬＳＲｓと非−ＬＳＲｓを用いてキ
メラ蛋白質を作ることは難かしいことではないだろう。
さらに、異なった哺乳動物（図４例参照）からの似たよ
うなＦＧＦＲｓ間の高い均一性に基づき、たとえば、一
つのＬＳＲをエンコードするｃＤＮＡをとり、厳密な標
準條件下でのハイブリッド形成試験の方法で、容易に他
の種からＬＳＲｓを得ることができるだろう。
ＦＲ２またＫＧＦＲ、そしてヒトＫ−Ｓａｍを含む多く
のＦＧＦＲｓによって実験を行った。これらのＦＧＦＲ
ｓは、ＬＳＲｓを含むことが見出され、一つのＦＧＦＲ
のＬＳＲを他のそれにより置換すると、結果として生ず
るキメラ蛋白質のリガンド結合特異性が変ることが分っ
た。しかしながら、以下に報告する実験は前記の四つの
ＫＧＦＲｓに限定されるけれども、本発明が単にこれら
４つのレセプターに限定されないことは熟練者には明ら
かであろう。逆に、本発明に従って得られた知識により
熟練者が、それから得たそれらの位置の知識に基づいて
他のＦＧＦＲｓ内のＬＳＲｓを発見し、このようなほか
のＦＧＦＲｓからのＬＳＲｓと非−ＬＳＲｓを用いてキ
メラ蛋白質を作ることは難かしいことではないだろう。
さらに、異なった哺乳動物（図４例参照）からの似たよ
うなＦＧＦＲｓ間の高い均一性に基づき、たとえば、一
つのＬＳＲをエンコードするｃＤＮＡをとり、厳密な標
準條件下でのハイブリッド形成試験の方法で、容易に他
の種からＬＳＲｓを得ることができるだろう。
【００１９】ＬＳＲ、特に“可変領域”として特に指定
されるＩｇ−ドメイン３のＣ−末端領域のそれと、特に
可変領域の一つまたは両方のＬＳＲｓが他のＦＧＦＲか
らの相当するＬＳＲによって置換されたＦＧＦＲの細胞
外の部分からなるキメラ蛋白質は、たとえばＦＧＦＲの
細胞による増加生成物が関係する各種の悪性物に対する
化学療法剤として、重要な医療上の用途の可能性をもっ
ているかも知れない。このようなＬＳＲとキメラ蛋白質
は、過剰に生成したＦＧＦＲのリガンドに競合的に結合
し、従って腫瘍細胞の激増を疎害するかも知れない。さ
らに、ＬＳＲまたはキメラ蛋白質からなるペプチドは、
またたとえば、培地内のリガンドの量を定量的に決定す
るような色々な診断利用の可能性があるかも知れない。
キメラ蛋白質は、色々なリガンド特異性の側面をもつよ
うにできているので上記の目的には特に有効である。
されるＩｇ−ドメイン３のＣ−末端領域のそれと、特に
可変領域の一つまたは両方のＬＳＲｓが他のＦＧＦＲか
らの相当するＬＳＲによって置換されたＦＧＦＲの細胞
外の部分からなるキメラ蛋白質は、たとえばＦＧＦＲの
細胞による増加生成物が関係する各種の悪性物に対する
化学療法剤として、重要な医療上の用途の可能性をもっ
ているかも知れない。このようなＬＳＲとキメラ蛋白質
は、過剰に生成したＦＧＦＲのリガンドに競合的に結合
し、従って腫瘍細胞の激増を疎害するかも知れない。さ
らに、ＬＳＲまたはキメラ蛋白質からなるペプチドは、
またたとえば、培地内のリガンドの量を定量的に決定す
るような色々な診断利用の可能性があるかも知れない。
キメラ蛋白質は、色々なリガンド特異性の側面をもつよ
うにできているので上記の目的には特に有効である。
【００２０】
【図の説明】図１は、マウスのＦＧＦＲ２（Ｂｅｋ）と
ＫＧＦＲの構造と配列の図式説明と、また例１に述べる
ような、それらの比較である。図２は、例１で述べるよ
うに、アルカリホスファターゼ発現ベクター（ＡＰｔａ
ｇ）中のＦＧＦＲ２とキメラＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２の構
造の図式説明である；図３は、例１に述べるように、マ
ウス皮膚ＲＮＡから得たＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列を示
す；図４は、例１に述べるように、（ｉ）マウスのＦＧ
ＦＲ２とＫＧＦＲ可変領域及び（ｉｉ）ヒトＫＧＦＲ可
変領域のアミノ酸配列を示す；図５は、例１に述べるよ
うに、分泌した可溶性ＦＧＦＲ２（ＢＡＰ）とＦＧＦＲ
２／ＫＧＦＲ（Ｋ−ＢＡＰ）レセプターのリガンド結合
能（ａ−酸性ＦＧＦ、ｂ−塩基性ＦＧＦそしてＫ−ＫＧ
Ｆ）の棒グラフ表示である。
ＫＧＦＲの構造と配列の図式説明と、また例１に述べる
ような、それらの比較である。図２は、例１で述べるよ
うに、アルカリホスファターゼ発現ベクター（ＡＰｔａ
ｇ）中のＦＧＦＲ２とキメラＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２の構
造の図式説明である；図３は、例１に述べるように、マ
ウス皮膚ＲＮＡから得たＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列を示
す；図４は、例１に述べるように、（ｉ）マウスのＦＧ
ＦＲ２とＫＧＦＲ可変領域及び（ｉｉ）ヒトＫＧＦＲ可
変領域のアミノ酸配列を示す；図５は、例１に述べるよ
うに、分泌した可溶性ＦＧＦＲ２（ＢＡＰ）とＦＧＦＲ
２／ＫＧＦＲ（Ｋ−ＢＡＰ）レセプターのリガンド結合
能（ａ−酸性ＦＧＦ、ｂ−塩基性ＦＧＦそしてＫ−ＫＧ
Ｆ）の棒グラフ表示である。
【００２１】図６Ａと６Ｂは、例１に述べるように、可
溶性ＦＧＦレセプターへのリガンド（ＦＧＦＲｓ）の結
合の競合的な結合解析のグラフ表示である。図７は、例
１で述べるように、非標識リガンド例（ｂ−塩基性ＦＧ
Ｆ、ａ−酸性ＦＧＦ、Ｋ−ＦＧＦ）の存在で、それらの
リガンドに対する、可溶性の分泌したＦＧＦＲ２（ＢＡ
Ｐ）とＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ（Ｋ−ＢＡＰ）レセプター
の間の競合的結合の結果を示す露出したＸ線フィルムの
表示である。図８は、例２に述べるように、レセプター
ＦＧＦＲ１とＫＧＦＲそしてキメラレセプターＦＧＦＲ
１／ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）とＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／
ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のエクトドメインのｃＤＮ
Ａの図式表示である。図９は、例２で述べるように、可
溶性の分泌したレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ及びキ
メラレセプターＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）とＦ
ＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のリガンド結
合能の棒−グラフ表示である。
溶性ＦＧＦレセプターへのリガンド（ＦＧＦＲｓ）の結
合の競合的な結合解析のグラフ表示である。図７は、例
１で述べるように、非標識リガンド例（ｂ−塩基性ＦＧ
Ｆ、ａ−酸性ＦＧＦ、Ｋ−ＦＧＦ）の存在で、それらの
リガンドに対する、可溶性の分泌したＦＧＦＲ２（ＢＡ
Ｐ）とＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ（Ｋ−ＢＡＰ）レセプター
の間の競合的結合の結果を示す露出したＸ線フィルムの
表示である。図８は、例２に述べるように、レセプター
ＦＧＦＲ１とＫＧＦＲそしてキメラレセプターＦＧＦＲ
１／ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）とＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／
ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のエクトドメインのｃＤＮ
Ａの図式表示である。図９は、例２で述べるように、可
溶性の分泌したレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ及びキ
メラレセプターＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）とＦ
ＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のリガンド結
合能の棒−グラフ表示である。
【００２２】図１０は、例２に述べるように、可溶性の
分泌したレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ、また可溶性
の分泌したキメラレセプターＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲへの
色々なＦＧＦｓの結合の置換分析結果のグラフ表示であ
る。図１１は、例２に述べるように、可溶性の分泌した
レセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ、また可溶性の分泌し
たキメラレセプターＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ
への色々なＦＧＦｓの結合の置換分析結果のグラフ表示
である。図１２は、例２に述べるように、色々なリガン
ド（ＦＧＦｓ）への、可溶性の分泌したＦＧＦＲ１とＫ
ＧＦＲレセプター及びキメラＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲとＦ
ＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲレセプターの間の架橋
の結果を示す露出Ｘ線フィルムの再生の数の表示であ
る。
分泌したレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ、また可溶性
の分泌したキメラレセプターＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲへの
色々なＦＧＦｓの結合の置換分析結果のグラフ表示であ
る。図１１は、例２に述べるように、可溶性の分泌した
レセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ、また可溶性の分泌し
たキメラレセプターＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ
への色々なＦＧＦｓの結合の置換分析結果のグラフ表示
である。図１２は、例２に述べるように、色々なリガン
ド（ＦＧＦｓ）への、可溶性の分泌したＦＧＦＲ１とＫ
ＧＦＲレセプター及びキメラＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲとＦ
ＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲレセプターの間の架橋
の結果を示す露出Ｘ線フィルムの再生の数の表示であ
る。
【００２３】次の限定しない例の中に、上記の図に関連
した発明の特異的な実施例が述べられている。例１ ＦＧＦリガンドとＦＧＦレセプターの２つの大きな族内
のリガンド特異性の疑問に着手するため２つの密接に関
係したＦＧＦレセプターの間の別々の領域を置換するた
めに遺伝子工学の技術を用いた。次の結果において、マ
ウスＢｅｋ（ＦＧＦＲ２）の第３イムノグロブリン様ド
メイン内の限られた５０アミノ酸長で可変の領域と、角
化細胞増殖因子レセプター（ＫＧＦＲ）は、独占的にそ
れらのリガンド結合特異性を決定することが示された。
さらに、続く結果から生ずるように、ＦＧＦレセプター
の第３イムノグロブリン様ドメインのカルボキシ末端半
分“可変領域”は、リガンド結合の主な決定因子であ
り、レセプターリガンド特異性を変えそして、レセプタ
ーの多様性を発生させる新らしい機構に含まれるように
思われる。
した発明の特異的な実施例が述べられている。例１ ＦＧＦリガンドとＦＧＦレセプターの２つの大きな族内
のリガンド特異性の疑問に着手するため２つの密接に関
係したＦＧＦレセプターの間の別々の領域を置換するた
めに遺伝子工学の技術を用いた。次の結果において、マ
ウスＢｅｋ（ＦＧＦＲ２）の第３イムノグロブリン様ド
メイン内の限られた５０アミノ酸長で可変の領域と、角
化細胞増殖因子レセプター（ＫＧＦＲ）は、独占的にそ
れらのリガンド結合特異性を決定することが示された。
さらに、続く結果から生ずるように、ＦＧＦレセプター
の第３イムノグロブリン様ドメインのカルボキシ末端半
分“可変領域”は、リガンド結合の主な決定因子であ
り、レセプターリガンド特異性を変えそして、レセプタ
ーの多様性を発生させる新らしい機構に含まれるように
思われる。
【００２４】ＦＧＦＲ２の結合特異性に対する第３Ｉｇ
ドメインの可変半分の寄与を調べるため、ＦＧＦＲ２と
ＫＧＦＲ間のキメラ分子を作った。図１に、マウスＦＧ
ＦＲ２とＫＧＦＲの構造と配列及びそれらの比較が図示
されている。二つのレセプターの全体の構造は、アミノ
酸配列と同じように示されている。名称：Ｄ１，Ｄ２及
びＤ３はＩｇ−様ドメインを表す；ＡＢは酸性箱を表
す；ＴＭはトランスメンブラン領域を表す；Ｋ１とＫ２
はチロシンキナーゼ領域を表す；ＩＫはインターキナー
ゼセグメントを表す；そしてＣＴはＣ−末端尾を表す。
一文字コードの形で示されるアミノ酸配列は、ＦＧＦＲ
２とＫＧＦＲの間では、Ｄ３に相違を描写している。定
常部の配列を含むＮ末端領域は、Ｃで表示され、可変配
列を含むＣ末端領域はνで表示されている。図１に示す
ように、ＦＧＦＲ２は典型的な３Ｉｇドメイン構造をも
っているが、ＫＧＦＲは第１Ｉｇドメインと保存酸性箱
６の両方を欠いている。さらに、制限可変配列（ν）
は、第３Ｉｇドメインの半分のカルボキシ−末端にあ
り、両レセプター間では、定常（ｃ）副ドメイン中では
１００％同一であるのに比較してわずか４８％しか配列
が同等でなかった。
ドメインの可変半分の寄与を調べるため、ＦＧＦＲ２と
ＫＧＦＲ間のキメラ分子を作った。図１に、マウスＦＧ
ＦＲ２とＫＧＦＲの構造と配列及びそれらの比較が図示
されている。二つのレセプターの全体の構造は、アミノ
酸配列と同じように示されている。名称：Ｄ１，Ｄ２及
びＤ３はＩｇ−様ドメインを表す；ＡＢは酸性箱を表
す；ＴＭはトランスメンブラン領域を表す；Ｋ１とＫ２
はチロシンキナーゼ領域を表す；ＩＫはインターキナー
ゼセグメントを表す；そしてＣＴはＣ−末端尾を表す。
一文字コードの形で示されるアミノ酸配列は、ＦＧＦＲ
２とＫＧＦＲの間では、Ｄ３に相違を描写している。定
常部の配列を含むＮ末端領域は、Ｃで表示され、可変配
列を含むＣ末端領域はνで表示されている。図１に示す
ように、ＦＧＦＲ２は典型的な３Ｉｇドメイン構造をも
っているが、ＫＧＦＲは第１Ｉｇドメインと保存酸性箱
６の両方を欠いている。さらに、制限可変配列（ν）
は、第３Ｉｇドメインの半分のカルボキシ−末端にあ
り、両レセプター間では、定常（ｃ）副ドメイン中では
１００％同一であるのに比較してわずか４８％しか配列
が同等でなかった。
【００２５】図２は、アルカリ性ホスファターゼ発現ベ
クター（ＡＰｔａｇ）１０，１１中のＦＧＦＲ２とキメ
ラＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２の構造を示す。ＡＰｔａｇ中の
ＦＧＦＲ２の細胞外の部分を作るため、ベクターｐＢＳ
（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭ）中のＦＧＦＲ２クローン
を、次に示すプライマーを用い、標準ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）法で処理した： １） ５′−ＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧＴＣＣＡＣＧＴＧ
Ｇ ＡＴＧ方向へ５０ｂｐ上流で開始される配列に相当し、
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいる。そして ２） ５′−ＴＣＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＧ
ＧＡＡＧＣＣＧＴ トランスメンブレン領域へ二つのコドン５′を終結する
配列に相当し、ＢｇＩＩＩ部位を含む。
クター（ＡＰｔａｇ）１０，１１中のＦＧＦＲ２とキメ
ラＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２の構造を示す。ＡＰｔａｇ中の
ＦＧＦＲ２の細胞外の部分を作るため、ベクターｐＢＳ
（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭ）中のＦＧＦＲ２クローン
を、次に示すプライマーを用い、標準ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）法で処理した： １） ５′−ＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＧＴＣＣＡＣＧＴＧ
Ｇ ＡＴＧ方向へ５０ｂｐ上流で開始される配列に相当し、
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含んでいる。そして ２） ５′−ＴＣＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＧ
ＧＡＡＧＣＣＧＴ トランスメンブレン領域へ二つのコドン５′を終結する
配列に相当し、ＢｇＩＩＩ部位を含む。
【００２６】反応混合液（１００μｌ）は、６７ｍＭト
リス塩酸、ｐＨ８．８，６．７ｍＭ塩化マグネシウム、
１６．６ｍＭ硫酸アンモニア、２５０ｍＭ ｄＮＴＰ、
０．１７ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．５ｎＭの
各プライマー及びＴａｑポリメラーゼ（プロメガ）の５
単位（ｕ）の溶液であった。９４°で１．５分、６５°
で１．５分そして７２°で４分の３０回転後、反応生成
物をフェノールとフェノール−クロロホルム（１：１）
で抽出し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを溶解し、
αＮＴＰとクレノウ酵素による部位充てん後ＰＢＳのＥ
ｃｏＲＶ部位にクローンさせた。Ｂｅｋの細胞外部領域
をエンコードするこのようなクローンからＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢｇＩＩＩ断片が分離され、ＡＰｔａｇベクターを
消費したＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇＩＩＩにクローンされ
た。
リス塩酸、ｐＨ８．８，６．７ｍＭ塩化マグネシウム、
１６．６ｍＭ硫酸アンモニア、２５０ｍＭ ｄＮＴＰ、
０．１７ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．５ｎＭの
各プライマー及びＴａｑポリメラーゼ（プロメガ）の５
単位（ｕ）の溶液であった。９４°で１．５分、６５°
で１．５分そして７２°で４分の３０回転後、反応生成
物をフェノールとフェノール−クロロホルム（１：１）
で抽出し、エタノールで沈澱させた。ＤＮＡを溶解し、
αＮＴＰとクレノウ酵素による部位充てん後ＰＢＳのＥ
ｃｏＲＶ部位にクローンさせた。Ｂｅｋの細胞外部領域
をエンコードするこのようなクローンからＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−ＢｇＩＩＩ断片が分離され、ＡＰｔａｇベクターを
消費したＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇＩＩＩにクローンされ
た。
【００２７】キメラＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２を作るため、
Ｄ３のＫＧＦＲ−ν領域に相当するｃＤＮＡが次のよう
にマウスの皮膚ＲＮＡからクローンされた：ｃＤＮＡ
は、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．１５中のＲＮＡ１０
μｇ、６ｍＭの塩化マグネシウム、１１０ｍＭ塩化カリ
ウム、１ｍＭジチオスライトル、２０μｇ／ｍｌ ＲＮ
Ａアシン、２５０Ｍ ｄＮＴＰ及びＡＭＶ逆転写酵素
（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）１０ｕを含む
１ｎＭプライマー２を４２°で１時間培養することによ
り、マウスの皮膚ＲＮＡから作られた。反応混合液（１
０μｌ）の半分を、プライマー２の０．５ｎＭと次のプ
ライマー３の０．５ｎＭをＰＣＲ緩衝液（上記参照）で
１００μｌに稀釈した。 ３） ５′−ＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＧＧ
ＧＧＡＴＡ
Ｄ３のＫＧＦＲ−ν領域に相当するｃＤＮＡが次のよう
にマウスの皮膚ＲＮＡからクローンされた：ｃＤＮＡ
は、５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．１５中のＲＮＡ１０
μｇ、６ｍＭの塩化マグネシウム、１１０ｍＭ塩化カリ
ウム、１ｍＭジチオスライトル、２０μｇ／ｍｌ ＲＮ
Ａアシン、２５０Ｍ ｄＮＴＰ及びＡＭＶ逆転写酵素
（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）１０ｕを含む
１ｎＭプライマー２を４２°で１時間培養することによ
り、マウスの皮膚ＲＮＡから作られた。反応混合液（１
０μｌ）の半分を、プライマー２の０．５ｎＭと次のプ
ライマー３の０．５ｎＭをＰＣＲ緩衝液（上記参照）で
１００μｌに稀釈した。 ３） ５′−ＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＣＧＧ
ＧＧＡＴＡ
【００２８】このプライマーは定常領域と、ＰｐｕＭ１
部位を含むＤ３のＫＧＦＲ可変領域が重なっている。Ｔ
ａｑポリメラーゼの５ｕを添加後、ＰＣＲは上述のよう
に３５サイクル行われた。ＤＮＡはクレノウ酵素とｄＮ
ＴＰで処理され、ＰＣＲ断片（２３０ｂｐ）はアガロー
スゲル上に電気泳動法で分離され、ｐＢＳのＥｃｏＲＶ
にクローンされ、ＤＮＡシークエンシングで分析され
た。マウス皮膚から得られたＤ３のこのＫＧＦＲ−ν領
域のＤＮＡ配列は図３に図示的に示してある。ＤＮＡ配
列決定は、標準連鎖終結法を用いて行れた。このクロー
ンからのＰｐｕＭＩ−ＢｇＩＩＩ断片、ＦＧＦＲ２（図
１参照）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｐｕＭＩ断片及びＡＰｔ
ａｑを消化したＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇＩＩＩは、図２に
描かれているキメラレセプターを作るためにすべて一緒
に連結させた。
部位を含むＤ３のＫＧＦＲ可変領域が重なっている。Ｔ
ａｑポリメラーゼの５ｕを添加後、ＰＣＲは上述のよう
に３５サイクル行われた。ＤＮＡはクレノウ酵素とｄＮ
ＴＰで処理され、ＰＣＲ断片（２３０ｂｐ）はアガロー
スゲル上に電気泳動法で分離され、ｐＢＳのＥｃｏＲＶ
にクローンされ、ＤＮＡシークエンシングで分析され
た。マウス皮膚から得られたＤ３のこのＫＧＦＲ−ν領
域のＤＮＡ配列は図３に図示的に示してある。ＤＮＡ配
列決定は、標準連鎖終結法を用いて行れた。このクロー
ンからのＰｐｕＭＩ−ＢｇＩＩＩ断片、ＦＧＦＲ２（図
１参照）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｐｕＭＩ断片及びＡＰｔ
ａｑを消化したＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇＩＩＩは、図２に
描かれているキメラレセプターを作るためにすべて一緒
に連結させた。
【００２９】そこで、ＦＧＦＲ２とＫＧＦＲ間にキメラ
分子を発生させる上記の方法は次のようにまとめられよ
う：マウスの皮膚ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを作るため
に、ＫＧＦＲの可変の半分に隣接する二つのオリゴヌク
レオチドを用い、図２に示すようにドメインの普通の半
分を重ね合わせ、ＰＣＲにより増幅した。分けられた制
限部位は、ｂｅｋ（ＦＧＦＲ２エンコーディング遺伝
子）可変セグメントを、得られたＰＣＲ生成物によって
置き換えるために用いられた。ＰＣＲ生成物とキメラ構
造の配列分析は、その領域６でのＫＧＦＲ配列との同一
性、図３に示されれように、可変セグメントの枠挿入で
確認された。
分子を発生させる上記の方法は次のようにまとめられよ
う：マウスの皮膚ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを作るため
に、ＫＧＦＲの可変の半分に隣接する二つのオリゴヌク
レオチドを用い、図２に示すようにドメインの普通の半
分を重ね合わせ、ＰＣＲにより増幅した。分けられた制
限部位は、ｂｅｋ（ＦＧＦＲ２エンコーディング遺伝
子）可変セグメントを、得られたＰＣＲ生成物によって
置き換えるために用いられた。ＰＣＲ生成物とキメラ構
造の配列分析は、その領域６でのＫＧＦＲ配列との同一
性、図３に示されれように、可変セグメントの枠挿入で
確認された。
【００３０】ＦＧＦＲ２とキメラレセプターのリガンド
−結合のプロフィルを独立に決定するため、分泌アルカ
リホスファターゼ（ＡＰ）融合蛋白質（図２参照）とし
てレセプターの細胞外の部分を発現するためにＡＰｔａ
ｇ発現ベクター１０，１１が用いられた。ＦＧＦＲ２−
ＡＰ（ＢＡＰともいう。簡略にＦ２−ＡＰ、今後可溶性
ＦＧＦＲ２またはＦ２と名づけられよう）と、キメラＫ
ＧＦＲ／ＦＧＦＲ２−ＡＰ（Ｋ−ＢＡＰまたはＫ−Ｆ２
−ＡＰと呼称、今後可溶性キメラＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ
またはＦ２／Ｋと名づけられよう）構造は両方共、ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞に移入され、クローンを分泌するレセプタ
ーが、移入された細胞培養のならし培地におけるＡＰ活
性を測定することによって選別された。
−結合のプロフィルを独立に決定するため、分泌アルカ
リホスファターゼ（ＡＰ）融合蛋白質（図２参照）とし
てレセプターの細胞外の部分を発現するためにＡＰｔａ
ｇ発現ベクター１０，１１が用いられた。ＦＧＦＲ２−
ＡＰ（ＢＡＰともいう。簡略にＦ２−ＡＰ、今後可溶性
ＦＧＦＲ２またはＦ２と名づけられよう）と、キメラＫ
ＧＦＲ／ＦＧＦＲ２−ＡＰ（Ｋ−ＢＡＰまたはＫ−Ｆ２
−ＡＰと呼称、今後可溶性キメラＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ
またはＦ２／Ｋと名づけられよう）構造は両方共、ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞に移入され、クローンを分泌するレセプタ
ーが、移入された細胞培養のならし培地におけるＡＰ活
性を測定することによって選別された。
【００３１】図５は、分泌した可溶性ＦＧＦＲ２とＦＧ
ＦＲ２／ＫＧＦＲのリガンド結合の状態を図式的に示し
ている。これらのリガンド結合能力は、ヘパリンセファ
ローズ−結合リガンド（ＦＧＦｓ）の、レセプターＡＰ
融合蛋白質への結合を利用し、そのリガンド結合を、共
役結合したビーズ上のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）
の測定で決定する分析を行って求められた。固定化され
たリガンドは、１μｇのヒト組換えＫＧＦ（Ａｍｇｅ
ｎ）、ヒト組換えｂＦＧＦ（武田、日本）またはヒト組
換えａＦＧＦ（Ｄｒ．Ｇ．Ｎｅｎｆｅｌｄ Ｗｅｉｚｍ
ａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから求めた）と３００μｌ
のヘパリン−セファローズスラリー（ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）の培養によって作られた。室温で３０分振とう後、
ビーズを０．５Ｍ塩化ナトリウムで３回洗浄し、０．０
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム（ＰＢＳ）中に懸濁した（１：１）。レセプター結合
分析のため、３０μｌのリガンド−ヘパリンサファロー
ズビーズを用い、全ＡＰ活性へ標準化した、融合ＦＧＦ
Ｒ２分泌細胞またはＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ分泌細胞由来
の培地の１０μｌから１５μｌで培養した。室温で３０
分振とう後、ビーズを０．５Ｍ塩化ナトリウムで３回、
１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０で１回洗浄し、内因性
細胞のＡＰを不活性化するため６５°で１０分培養し
た。ビーズは、１．０Ｍのジエタノールアミン（ｐＨ
９．８）、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＬ−
ホモアルギニン、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミ
ン（Ｓｉｇｍａ）及び１２ｍＭｐ−ニトロフェニルホス
フェートと共に１５分培養後、４０５ｎｍの吸収を測定
することにより、ＡＰとして分析された。ＦＧＦＲ２と
ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲは、それぞれ、ＦＧＦＲ２とＦＧ
ＦＲ２／ＫＧＦＲを移入された細胞から引き出された、
分泌したレセプターに相当する。図５のａ，ｂ，ｋは、
それぞれ、ヘパリン−セファローズ結合の酸性ＦＧＦ、
塩基性ＦＧＦ及びＫＧＦを表している。
ＦＲ２／ＫＧＦＲのリガンド結合の状態を図式的に示し
ている。これらのリガンド結合能力は、ヘパリンセファ
ローズ−結合リガンド（ＦＧＦｓ）の、レセプターＡＰ
融合蛋白質への結合を利用し、そのリガンド結合を、共
役結合したビーズ上のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）
の測定で決定する分析を行って求められた。固定化され
たリガンドは、１μｇのヒト組換えＫＧＦ（Ａｍｇｅ
ｎ）、ヒト組換えｂＦＧＦ（武田、日本）またはヒト組
換えａＦＧＦ（Ｄｒ．Ｇ．Ｎｅｎｆｅｌｄ Ｗｅｉｚｍ
ａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから求めた）と３００μｌ
のヘパリン−セファローズスラリー（ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）の培養によって作られた。室温で３０分振とう後、
ビーズを０．５Ｍ塩化ナトリウムで３回洗浄し、０．０
１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウ
ム（ＰＢＳ）中に懸濁した（１：１）。レセプター結合
分析のため、３０μｌのリガンド−ヘパリンサファロー
ズビーズを用い、全ＡＰ活性へ標準化した、融合ＦＧＦ
Ｒ２分泌細胞またはＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ分泌細胞由来
の培地の１０μｌから１５μｌで培養した。室温で３０
分振とう後、ビーズを０．５Ｍ塩化ナトリウムで３回、
１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０で１回洗浄し、内因性
細胞のＡＰを不活性化するため６５°で１０分培養し
た。ビーズは、１．０Ｍのジエタノールアミン（ｐＨ
９．８）、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭＬ−
ホモアルギニン、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミ
ン（Ｓｉｇｍａ）及び１２ｍＭｐ−ニトロフェニルホス
フェートと共に１５分培養後、４０５ｎｍの吸収を測定
することにより、ＡＰとして分析された。ＦＧＦＲ２と
ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲは、それぞれ、ＦＧＦＲ２とＦＧ
ＦＲ２／ＫＧＦＲを移入された細胞から引き出された、
分泌したレセプターに相当する。図５のａ，ｂ，ｋは、
それぞれ、ヘパリン−セファローズ結合の酸性ＦＧＦ、
塩基性ＦＧＦ及びＫＧＦを表している。
【００３２】図５に示されるように、可溶性ＦＧＦＲ２
は、そのリガンド結合と特異性を保持している、すなわ
ち可溶性ＦＧＦＲ２は、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦそしてまた
ｈＳｔ／Ｋｆｇｆ（今後用いられる時ＦＧＦ４と呼ばれ
る、結果は示されない）と結合するがＫＧＦとは結合し
ないことが見出され、ｂｅｋまたはｆｌｇ ４のどちらか
を過剰発現する細胞に関する試験と一致している。しか
しながら、ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラは、親のＦＧＦ
Ｒ２と比較して、異なった結合の形をもち、ｂＦＧＦと
の結合能力をなくし、ＫＧＦとは完全に結合する能力を
得た。ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲの獲得した結合能力は、細
胞ＫＧＦＲについて報告されたそれと非常に良く似てい
る。
は、そのリガンド結合と特異性を保持している、すなわ
ち可溶性ＦＧＦＲ２は、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦそしてまた
ｈＳｔ／Ｋｆｇｆ（今後用いられる時ＦＧＦ４と呼ばれ
る、結果は示されない）と結合するがＫＧＦとは結合し
ないことが見出され、ｂｅｋまたはｆｌｇ ４のどちらか
を過剰発現する細胞に関する試験と一致している。しか
しながら、ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラは、親のＦＧＦ
Ｒ２と比較して、異なった結合の形をもち、ｂＦＧＦと
の結合能力をなくし、ＫＧＦとは完全に結合する能力を
得た。ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲの獲得した結合能力は、細
胞ＫＧＦＲについて報告されたそれと非常に良く似てい
る。
【００３３】三つのリガンドによるＦＧＦＲ２及びＦＧ
ＦＲ２／ＫＧＦＲの置換結合分析は、ヘパリンの存在下
で、レセプター結合−リガンドを分離するため固定化さ
れた抗−ＡＰ抗体を用いて行れた。先に述べたｂＦＧＦ
の絶対的なヘパリン依存結合と一致して、ヘパリンのな
い状態では、リガンドはどれもＦＧＦレセプターとは結
合しなかった。
ＦＲ２／ＫＧＦＲの置換結合分析は、ヘパリンの存在下
で、レセプター結合−リガンドを分離するため固定化さ
れた抗−ＡＰ抗体を用いて行れた。先に述べたｂＦＧＦ
の絶対的なヘパリン依存結合と一致して、ヘパリンのな
い状態では、リガンドはどれもＦＧＦレセプターとは結
合しなかった。
【００３４】６Ａ図は、競合的な結合分析における、可
溶性ＦＧＦＲ２レセプターに対するａＦＧＦ、ｂＦＧＦ
及びＫＧＦの結合をグラフで示している。反応混合液
（２００μｌ）は、非標識リガンドの量を増加させなが
ら２ｎｇの１２５Ｉ−標識ｂＦＧＦ、０．２μｇヘパリ
ン（Ｈｅｐａｒ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｏｈｉｏ）０．２
％ＢＳＡ、２５ｍＭヘペス、ｐＨ７．４そして細胞分泌
ＢＡＰからの１００μｌのならし培地を含んでいた。室
温で３０分培養後、ウサギ抗−ヒト胎盤ＡＰ抗体に予め
結合した１５μｌのアガロース−蛋白質Ａを添加し、反
応混合液を室温で３０分振とうした。ビーズをＨＮＴＧ
（２０ｍＭヘペスｐＨ７．５ １５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１％トリトンｘ−１００及び１０％グリセロル）で
２回洗浄し、また非−特異性結合リガンドを除くため
０．５Ｍ塩化ナトリウムで１回洗浄し、またビーズと結
合した放射能をγ−カウンターで計測した。
溶性ＦＧＦＲ２レセプターに対するａＦＧＦ、ｂＦＧＦ
及びＫＧＦの結合をグラフで示している。反応混合液
（２００μｌ）は、非標識リガンドの量を増加させなが
ら２ｎｇの１２５Ｉ−標識ｂＦＧＦ、０．２μｇヘパリ
ン（Ｈｅｐａｒ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｏｈｉｏ）０．２
％ＢＳＡ、２５ｍＭヘペス、ｐＨ７．４そして細胞分泌
ＢＡＰからの１００μｌのならし培地を含んでいた。室
温で３０分培養後、ウサギ抗−ヒト胎盤ＡＰ抗体に予め
結合した１５μｌのアガロース−蛋白質Ａを添加し、反
応混合液を室温で３０分振とうした。ビーズをＨＮＴＧ
（２０ｍＭヘペスｐＨ７．５ １５０ｍＭ塩化ナトリウ
ム、１％トリトンｘ−１００及び１０％グリセロル）で
２回洗浄し、また非−特異性結合リガンドを除くため
０．５Ｍ塩化ナトリウムで１回洗浄し、またビーズと結
合した放射能をγ−カウンターで計測した。
【００３５】６Ｂ図は、競合的結合分析におけるαＦＧ
Ｆ，ｂＦＧＦ及びＫＧＦの、可溶性ＦＧＦＲ２／ＫＧＦ
Ｒレセプターの結合のグラフ図であり、分析條件は、標
識リガンドが１２５Ｉ−ＫＧＦの時を除いて前記の通り
であり、ならし培地は、細胞が分泌するＦＧＦＲ２／Ｋ
ＧＦＲからのものであった。上記の１２５Ｉ−標識リガ
ンドは両方共、その沃度化は２μｇのリガンドについて
ラクトパーオキシダーゼ法で行い、ヘパリン−セファロ
ーズで精製した。色々な標識リガンドの比放射能は１５
０，０００−２５０，０００ｃｐｍ／ｎｇの間であっ
た。かくて、図６Ａと６Ｂに示される結果は、可溶性レ
セプターＦＧＦＲ２はａＦＧＦとｂＦＧＦとそれぞれ、
７ｎＭと９ｎＭの解離定数で結合し、ＫＧＦとは結合し
ないことである。さらに、ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲレセプ
ターは、ａＦＧＦとＫＧＦとそれぞれ８ｎＭと５ｎＭの
解離定数で結合し、同じ実験條件下では、ｂＦＧＦとの
結合は検出されない。ＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ２／ＫＧＦ
Ｒは共に、ａＦＧＦがＦＧＦＲ２及びＫＧＦＲ発現細胞
と結合する能力と似たような親和性でａＦＧＦと結合す
る。上記の競合結合実験は、キメラレセプターのユニー
クなリガンド像を確認したばかりでなく、さらに、ａＦ
ＧＦ、ｂＦＧＦ及びＫＧＦのすべてが同じリガンド結合
部位で競合することを示唆している。ＦＧＦＲ２または
ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲに対する異なったリガンドの親和
性は、それぞれの内在性膜レセプター６について報告さ
れている値より１０から３０倍低い。
Ｆ，ｂＦＧＦ及びＫＧＦの、可溶性ＦＧＦＲ２／ＫＧＦ
Ｒレセプターの結合のグラフ図であり、分析條件は、標
識リガンドが１２５Ｉ−ＫＧＦの時を除いて前記の通り
であり、ならし培地は、細胞が分泌するＦＧＦＲ２／Ｋ
ＧＦＲからのものであった。上記の１２５Ｉ−標識リガ
ンドは両方共、その沃度化は２μｇのリガンドについて
ラクトパーオキシダーゼ法で行い、ヘパリン−セファロ
ーズで精製した。色々な標識リガンドの比放射能は１５
０，０００−２５０，０００ｃｐｍ／ｎｇの間であっ
た。かくて、図６Ａと６Ｂに示される結果は、可溶性レ
セプターＦＧＦＲ２はａＦＧＦとｂＦＧＦとそれぞれ、
７ｎＭと９ｎＭの解離定数で結合し、ＫＧＦとは結合し
ないことである。さらに、ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲレセプ
ターは、ａＦＧＦとＫＧＦとそれぞれ８ｎＭと５ｎＭの
解離定数で結合し、同じ実験條件下では、ｂＦＧＦとの
結合は検出されない。ＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ２／ＫＧＦ
Ｒは共に、ａＦＧＦがＦＧＦＲ２及びＫＧＦＲ発現細胞
と結合する能力と似たような親和性でａＦＧＦと結合す
る。上記の競合結合実験は、キメラレセプターのユニー
クなリガンド像を確認したばかりでなく、さらに、ａＦ
ＧＦ、ｂＦＧＦ及びＫＧＦのすべてが同じリガンド結合
部位で競合することを示唆している。ＦＧＦＲ２または
ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲに対する異なったリガンドの親和
性は、それぞれの内在性膜レセプター６について報告さ
れている値より１０から３０倍低い。
【００３６】３つのリガンドの親及びキメラレセプター
に対する化学的架橋はさらに、リガンド特異性に対する
可変セグメントの排他的な貢献を明らかにした。図７
は、可溶性分泌ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲの
ＦＧＦｓに対する架橋の結果を示す。ＦＧＦＲ２または
ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ（１００μｌ）を分泌する融合紬
胞からのならし培地は１μｇ／ｍｌのヘパリンの存在下
で１２５Ｉ−ＫＧＦ、１２５Ｉ−ａＦＧＦまたは１２５
Ｉ−ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）のどれかと反応した。
そして１００倍のコールド（非標識）リガンドの存在、
非存在下で、アガロース−蛋白質Ａ−抗ＡＰによる免疫
沈降がそれに続いた。洗浄後、ビーズは化学架橋を効果
的にするためにＰＢＳ中０．１５ｍＭのジサクシニリミ
ジルサブレート（ＤＳＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）の０．４ｍｌ
中に懸濁した。室温で３０分後ビーズを回転し、架橋反
応を終止するため１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５中の
１５０ｍＭグリシンの１ｍｌ中に懸濁した。５分後ビー
ズをＰＢＳで洗い、試料緩衝液中で５分間煮沸し、蛋白
質を６％ゲルのポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｐ
ＡＧＥ）によって分析した。走査後ゲルを乾燥し、Ｘ線
フィルムに１６時間さらした。露出したＸ線フィルムの
再生は図７に示され、この中で競合的リガンドはｂ，ｃ
及びｋで、それぞれｂＦＧＦ、ａＦＧＦ及びＫＧＦを表
している。
に対する化学的架橋はさらに、リガンド特異性に対する
可変セグメントの排他的な貢献を明らかにした。図７
は、可溶性分泌ＦＧＦＲ２及びＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲの
ＦＧＦｓに対する架橋の結果を示す。ＦＧＦＲ２または
ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ（１００μｌ）を分泌する融合紬
胞からのならし培地は１μｇ／ｍｌのヘパリンの存在下
で１２５Ｉ−ＫＧＦ、１２５Ｉ−ａＦＧＦまたは１２５
Ｉ−ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）のどれかと反応した。
そして１００倍のコールド（非標識）リガンドの存在、
非存在下で、アガロース−蛋白質Ａ−抗ＡＰによる免疫
沈降がそれに続いた。洗浄後、ビーズは化学架橋を効果
的にするためにＰＢＳ中０．１５ｍＭのジサクシニリミ
ジルサブレート（ＤＳＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）の０．４ｍｌ
中に懸濁した。室温で３０分後ビーズを回転し、架橋反
応を終止するため１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５中の
１５０ｍＭグリシンの１ｍｌ中に懸濁した。５分後ビー
ズをＰＢＳで洗い、試料緩衝液中で５分間煮沸し、蛋白
質を６％ゲルのポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｐ
ＡＧＥ）によって分析した。走査後ゲルを乾燥し、Ｘ線
フィルムに１６時間さらした。露出したＸ線フィルムの
再生は図７に示され、この中で競合的リガンドはｂ，ｃ
及びｋで、それぞれｂＦＧＦ、ａＦＧＦ及びＫＧＦを表
している。
【００３７】図７に示される結果から、ＦＧＦＲ２／Ｋ
ＧＦＲはＫＧＦに架橋し、この架橋は過剰のＫＧＦまた
は、ａＦＧＦで疎害されるがｂＦＧＦではされない。Ｆ
ＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲはそれぞれ、ＫＧ
ＦまたはｂＦＧＦに架橋しなかった。ＦＧＦＲ１（Ｆｌ
ｇ遺伝子産物）とＦＧＦＲ２（Ｂｅｋ遺伝子産物）は、
二つまたは三つのＩｇドメインの形で自然に存在し、同
じようによくｂＦＧＦ”と結合するけれども、ＫＧＦＲ
はただ二つのＩｇドメインの形しか今日まで発見されな
いことは興味深い。今日までの利用できる技術に基ずい
て、第１Ｉｇドメインは、ＫＧＦの、そのレセプターへ
の結合に特に支配的な負の影響を与えるのかも知れない
ことを認めない訳にはいなかった。キメラＦＧＦＲ２／
ＫＧＦＲがアミノ末端Ｉｇドメインを含み、一方ＫＧＦ
Ｒのリガンド結合能が識別されないことを示す事実から
その可能性は除外される。従って、ドメイン３のＣ−末
端半分で置換５０アミノ酸長の可変領域がレセプターリ
ガンド特異性を決定すると結論される。Ｉｇドメイン３
のアミノ酸配列比較に基づけば、ヒト胃腫瘍における増
幅遺伝子、Ｋ−ＳＡＭがヒトＦＧＦＲ相同染色体をエン
コードすることは、よく起りうることかも知れない。ヒ
トｆｌｇ１２のｈ４−変種の同じ領域における配列の可
変性は、二者択一のエクソンのこのような機構が、同様
に、ＦＧＦＲ族の他のメンバーにも存在するかも知れな
いことを示唆している。
ＧＦＲはＫＧＦに架橋し、この架橋は過剰のＫＧＦまた
は、ａＦＧＦで疎害されるがｂＦＧＦではされない。Ｆ
ＧＦＲ２またはＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲはそれぞれ、ＫＧ
ＦまたはｂＦＧＦに架橋しなかった。ＦＧＦＲ１（Ｆｌ
ｇ遺伝子産物）とＦＧＦＲ２（Ｂｅｋ遺伝子産物）は、
二つまたは三つのＩｇドメインの形で自然に存在し、同
じようによくｂＦＧＦ”と結合するけれども、ＫＧＦＲ
はただ二つのＩｇドメインの形しか今日まで発見されな
いことは興味深い。今日までの利用できる技術に基ずい
て、第１Ｉｇドメインは、ＫＧＦの、そのレセプターへ
の結合に特に支配的な負の影響を与えるのかも知れない
ことを認めない訳にはいなかった。キメラＦＧＦＲ２／
ＫＧＦＲがアミノ末端Ｉｇドメインを含み、一方ＫＧＦ
Ｒのリガンド結合能が識別されないことを示す事実から
その可能性は除外される。従って、ドメイン３のＣ−末
端半分で置換５０アミノ酸長の可変領域がレセプターリ
ガンド特異性を決定すると結論される。Ｉｇドメイン３
のアミノ酸配列比較に基づけば、ヒト胃腫瘍における増
幅遺伝子、Ｋ−ＳＡＭがヒトＦＧＦＲ相同染色体をエン
コードすることは、よく起りうることかも知れない。ヒ
トｆｌｇ１２のｈ４−変種の同じ領域における配列の可
変性は、二者択一のエクソンのこのような機構が、同様
に、ＦＧＦＲ族の他のメンバーにも存在するかも知れな
いことを示唆している。
【００３８】Ｉｇドメイン３の可変部分は、本解析によ
れば、ＫＧＦの結合に必要な相互作用の大部分に貢献し
ている。ＦＧＦＲ２とＫＧＦＲ（図１）間の配列におけ
る相違は、二つのセグメントに割り当てることができ
る。１つ（Ｃ−末端）はＩｇν領域の相補性決定領域３
（ＣＤＲ３）であり、もう一方は部分的にＣＤＲ２に相
当する。これは、ＦＧＦのレセプターへの結合が、抗原
抗体間の相互作用に似て、ドメインのＩｇ−様枠から突
き出ている二つまたはそれ以上のポリペプチドのループ
との相互作用によることを暗に意味している。これらの
構造的相似性は、ＦＧＦＲ−リガンドの将来の模型やレ
セプター拮抗剤のデザインについて重要な意味をもつだ
ろう。
れば、ＫＧＦの結合に必要な相互作用の大部分に貢献し
ている。ＦＧＦＲ２とＫＧＦＲ（図１）間の配列におけ
る相違は、二つのセグメントに割り当てることができ
る。１つ（Ｃ−末端）はＩｇν領域の相補性決定領域３
（ＣＤＲ３）であり、もう一方は部分的にＣＤＲ２に相
当する。これは、ＦＧＦのレセプターへの結合が、抗原
抗体間の相互作用に似て、ドメインのＩｇ−様枠から突
き出ている二つまたはそれ以上のポリペプチドのループ
との相互作用によることを暗に意味している。これらの
構造的相似性は、ＦＧＦＲ−リガンドの将来の模型やレ
セプター拮抗剤のデザインについて重要な意味をもつだ
ろう。
【００３９】マウスレセプターから得たデータに基づ
き、ヒトが対応するものも試験されるだろう。これらの
結果に基づいて、上記のＫ−Ｓａｍ、ヒトの胃癌におけ
る増幅遺伝子はヒトＫＧＦレセプターとしての條件を満
たすことが確認された。マウスＫＧＦＲとＫ−Ｓａｍの
確認された可変領域の配列比較（４図参照）から、ほと
んど完全な配列の一致とその領域における単一アミノ酸
置換がわかってきた。
き、ヒトが対応するものも試験されるだろう。これらの
結果に基づいて、上記のＫ−Ｓａｍ、ヒトの胃癌におけ
る増幅遺伝子はヒトＫＧＦレセプターとしての條件を満
たすことが確認された。マウスＫＧＦＲとＫ−Ｓａｍの
確認された可変領域の配列比較（４図参照）から、ほと
んど完全な配列の一致とその領域における単一アミノ酸
置換がわかってきた。
【００４０】例２ ＦＧＦＲ２とＦＧＦＲ２は同じような親和力４，１１で
ａＦＧＦとｂＦＧＦに結合する。そこで、ＦＧＦＲ１遺
伝子内のＩｇドメイン３のＣ−末端半分の可変エクソン
に非常に相同しているＫＧＦＲ可変エクソンの生成物も
またこのレセプターにＫＧＦ結合を与えるかどうかの疑
問を追求するため上記（例１）のレセプターキメラの方
法を用いた。次の結果の中に、ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキ
メラ（ＫＧＦＲが可変領域を示す）はａＦＧＦとＦＧＦ
４に対する高い結合親和性を保持し、ｂＦＧＦとの結合
能力を失い、意外にもＫＧＦと結合する部分的な能力を
もったことが示されている。ＫＧＦの高度の結合親和性
は、ＦＧＦＲ１のドメイン２が、ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ
２／ＫＧＦＲキメラを作るためにＦＧＦＲ２から得た相
同領域によって置き換えられた時にだけ、獲得された。
ａＦＧＦとｂＦＧＦに結合する。そこで、ＦＧＦＲ１遺
伝子内のＩｇドメイン３のＣ−末端半分の可変エクソン
に非常に相同しているＫＧＦＲ可変エクソンの生成物も
またこのレセプターにＫＧＦ結合を与えるかどうかの疑
問を追求するため上記（例１）のレセプターキメラの方
法を用いた。次の結果の中に、ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキ
メラ（ＫＧＦＲが可変領域を示す）はａＦＧＦとＦＧＦ
４に対する高い結合親和性を保持し、ｂＦＧＦとの結合
能力を失い、意外にもＫＧＦと結合する部分的な能力を
もったことが示されている。ＫＧＦの高度の結合親和性
は、ＦＧＦＲ１のドメイン２が、ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ
２／ＫＧＦＲキメラを作るためにＦＧＦＲ２から得た相
同領域によって置き換えられた時にだけ、獲得された。
【００４１】こうして、上記（例１）ＦＧＦＲ２／ＫＧ
ＦＲキメラとＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキメラは両方共、同
じようにａＦＧＦとＦＧＦ４への結合親和性を保ち、ｂ
ＦＧＦに対する結合能力を失った。これはＩｇドメイン
３のＣ−末端半分の配列がｂＦＧＦに対する主な結合要
因を決定するが、同時にこの配列がａＦＧＦとＦＧＦ４
の結合に対して重要なものではないことを示している。
しかしながら、ＫＧＦ結合に関しては、ＫＧＦへの高い
親和性を与えるＫＧＦＲからのＩｇドメイン３のＣ−末
端半分の配列が、ＦＧＦＲ２へ挿入される時（例１）に
示された全能力とは対照的に、ＦＧＦＲ１に挿入される
場合には不十分なことは、ＫＧＦ結合の高い親和性を支
えるためＦＧＦＲ以外の領域からの関与が必要なことを
示唆している。
ＦＲキメラとＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキメラは両方共、同
じようにａＦＧＦとＦＧＦ４への結合親和性を保ち、ｂ
ＦＧＦに対する結合能力を失った。これはＩｇドメイン
３のＣ−末端半分の配列がｂＦＧＦに対する主な結合要
因を決定するが、同時にこの配列がａＦＧＦとＦＧＦ４
の結合に対して重要なものではないことを示している。
しかしながら、ＫＧＦ結合に関しては、ＫＧＦへの高い
親和性を与えるＫＧＦＲからのＩｇドメイン３のＣ−末
端半分の配列が、ＦＧＦＲ２へ挿入される時（例１）に
示された全能力とは対照的に、ＦＧＦＲ１に挿入される
場合には不十分なことは、ＫＧＦ結合の高い親和性を支
えるためＦＧＦＲ以外の領域からの関与が必要なことを
示唆している。
【００４２】ＦＧＦＲ１とＦＧＦＲ２は、それらのエク
トドメイン配列の中の多様な位置に相違があるので、ド
メイン３またはドメイン２のＮ末端半分における相違
が、上記のＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲとＦＧＦＲ２／ＫＧＦ
Ｒキメラに対するＫＧＦの結合の違いの原因になること
はあり得ることであり、このことは、上記ＦＧＦＲ１／
ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラが高い親和性でＫＧＦと結
合する能力があることによって支持される。ＦＧＦＲ１
／ＫＧＦＲとＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラ
間の相違は、ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲとして保持されるド
メイン３のＣ末端半分の配列の中にはないが、むしろ、
ＦＧＦＲ１配列がＦＧＦＲ２配列で置き換えられたドメ
イン２の配列の中にある。
トドメイン配列の中の多様な位置に相違があるので、ド
メイン３またはドメイン２のＮ末端半分における相違
が、上記のＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲとＦＧＦＲ２／ＫＧＦ
Ｒキメラに対するＫＧＦの結合の違いの原因になること
はあり得ることであり、このことは、上記ＦＧＦＲ１／
ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラが高い親和性でＫＧＦと結
合する能力があることによって支持される。ＦＧＦＲ１
／ＫＧＦＲとＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラ
間の相違は、ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲとして保持されるド
メイン３のＣ末端半分の配列の中にはないが、むしろ、
ＦＧＦＲ１配列がＦＧＦＲ２配列で置き換えられたドメ
イン２の配列の中にある。
【００４３】従って、Ｉｇドメイン１の欠失が、結合特
異性または親和性１１，１２を換えないことが示された
事実を考慮すると、ＦＧＦＲｓのドメイン２とドメイン
３の両方から隣接していない領域がＦＧＦＲｓのリガン
ド結合特異性を定める主要な要因に関係している。図８
にＦ１／Ｋと名づけたＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキメラを作
るために、例１に述べたＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラ製
造と同じ方法を次のように用いた：ＦＧＦＲ１をエンコ
ードするマウスｆｌｇクローン（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＴＭ）を、次のプライマーを用いてＰＣＲ（２５）サイ
クルで処理した： ４） ５′−ＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＡ
ＴＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧ ＡＴＧへ４０ｂｐ上流で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を
含む配列に相当する、そして ５） ５′−ＧＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴ
ＡＡＧＧＣ アミノ酸３４４−３５１をエンコードするＦＧＦＲ１蛋
白質中の配列に相当する。
異性または親和性１１，１２を換えないことが示された
事実を考慮すると、ＦＧＦＲｓのドメイン２とドメイン
３の両方から隣接していない領域がＦＧＦＲｓのリガン
ド結合特異性を定める主要な要因に関係している。図８
にＦ１／Ｋと名づけたＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキメラを作
るために、例１に述べたＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラ製
造と同じ方法を次のように用いた：ＦＧＦＲ１をエンコ
ードするマウスｆｌｇクローン（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＴＭ）を、次のプライマーを用いてＰＣＲ（２５）サイ
クルで処理した： ４） ５′−ＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＡ
ＴＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧ ＡＴＧへ４０ｂｐ上流で始まり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を
含む配列に相当する、そして ５） ５′−ＧＴＣＴＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴ
ＡＡＧＧＣ アミノ酸３４４−３５１をエンコードするＦＧＦＲ１蛋
白質中の配列に相当する。
【００４４】第二プライマーは、ヌクレオチド１０４２
（Ｉｌｅ３４８をＶａｌに変える）にＴ／Ｃ置換（上記
下線部）を含み、ＫＧＦＲｃＤＮＡ（例１参照）内のＰ
ｐｕＭＩ部位と相同した位置にＰｐｕｍＩ部位を発生さ
せる。反応混合液（１００μｌ）は、６７ｍＭトリス塩
酸ｐＨ８．８，６．７ｍＭ塩化マグネシウム、１６．６
ｍＭ硫酸アンモニウム、２５０ｍＭ ｄＮＴＰ，０．１
７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，各プライマー０．５ｍＭ及び５
ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。
９４℃で１．５分、６５℃で１．５分及び７２℃で４分
の３０サイクル後、反応生成物をフエノール及びフエノ
ールクロロホルム（１：１）で抽出しエタノールで沈澱
させた。ＤＮＡを溶解し、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｐｕｍＩ
で消化後、１ｋｂ断片は、例１で述べたようにｐＢＳベ
クター中にすでにクローンされたＦＧＦＲ２配列のＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＰｐｕｍＩ断片を置換するために用いられ
た。結果としてできたキメラＦＧＦＲＩ／ＫＧＦＲエク
トドメインは、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇＩＩＩを用いてｐ
ＢＳベクターから切り取られ、例１で述べたように、Ａ
Ｐ−融合蛋白質として発現されるように、ＡＰｔａｇの
同じ位置にサブクローンされた。キメラ分子もまたＭ１
３ｍｐ１９にサブクローンされ標準連鎖終結法でＤＮＡ
配列決定がなされた。ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲとＦＧＦＲ
２間のキメラを作るために、ＦＧＦＲ１から得た第二Ｉ
ｇ様ドメインが、次の様に（図８参照）ＦＧＦＲ２のド
メイン２によって置き換えられた。ＦＧＦＲ１からのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片、ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキ
メラ（図８のＲ１／Ｋ）からのＡａｔＩＩ−ＢｇＩＩＩ
断片及びＦＧＦＲ２（下記参照）からＰＣＲによって得
られたＳｐｈＩ−ＡａｔＩＩ断片が、４点結合で、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＢｇＩＩＩにより予め消化されたＡＰｔａ
ｇベクターに共に連結された。次にＸＬ１ブルーバクテ
リアがこのベクターによってトランスフェクトされ、上
の三つの断片に正のクローンがＤＮＡシークエンシング
によって構造解析された。
（Ｉｌｅ３４８をＶａｌに変える）にＴ／Ｃ置換（上記
下線部）を含み、ＫＧＦＲｃＤＮＡ（例１参照）内のＰ
ｐｕＭＩ部位と相同した位置にＰｐｕｍＩ部位を発生さ
せる。反応混合液（１００μｌ）は、６７ｍＭトリス塩
酸ｐＨ８．８，６．７ｍＭ塩化マグネシウム、１６．６
ｍＭ硫酸アンモニウム、２５０ｍＭ ｄＮＴＰ，０．１
７ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ，各プライマー０．５ｍＭ及び５
ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。
９４℃で１．５分、６５℃で１．５分及び７２℃で４分
の３０サイクル後、反応生成物をフエノール及びフエノ
ールクロロホルム（１：１）で抽出しエタノールで沈澱
させた。ＤＮＡを溶解し、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｐｕｍＩ
で消化後、１ｋｂ断片は、例１で述べたようにｐＢＳベ
クター中にすでにクローンされたＦＧＦＲ２配列のＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＰｐｕｍＩ断片を置換するために用いられ
た。結果としてできたキメラＦＧＦＲＩ／ＫＧＦＲエク
トドメインは、ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇＩＩＩを用いてｐ
ＢＳベクターから切り取られ、例１で述べたように、Ａ
Ｐ−融合蛋白質として発現されるように、ＡＰｔａｇの
同じ位置にサブクローンされた。キメラ分子もまたＭ１
３ｍｐ１９にサブクローンされ標準連鎖終結法でＤＮＡ
配列決定がなされた。ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲとＦＧＦＲ
２間のキメラを作るために、ＦＧＦＲ１から得た第二Ｉ
ｇ様ドメインが、次の様に（図８参照）ＦＧＦＲ２のド
メイン２によって置き換えられた。ＦＧＦＲ１からのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩ断片、ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキ
メラ（図８のＲ１／Ｋ）からのＡａｔＩＩ−ＢｇＩＩＩ
断片及びＦＧＦＲ２（下記参照）からＰＣＲによって得
られたＳｐｈＩ−ＡａｔＩＩ断片が、４点結合で、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩとＢｇＩＩＩにより予め消化されたＡＰｔａ
ｇベクターに共に連結された。次にＸＬ１ブルーバクテ
リアがこのベクターによってトランスフェクトされ、上
の三つの断片に正のクローンがＤＮＡシークエンシング
によって構造解析された。
【００４５】上のＳｐｈＩ−ＡａｔＩＩ断片は、次のプ
ライマーを用い、ＡＰｔａｇ内のＦＧＦＲ２のＰＣＲに
よって発生した。 ６） ５′−ＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＣ
Ｃ ＦＧＦＲ２のヌクレオチド１１４４−１１６３に相当
し、Ｓｐｈ１部位をもっている、そして ７） ５′−ＣＣＧＴＴＣＡＡＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧ
ＴＧ， ＦＧＦＲ２のヌクレオチド１１８７−１４０７に相補的
で、ＡａｔＩＩ部位をもっている。
ライマーを用い、ＡＰｔａｇ内のＦＧＦＲ２のＰＣＲに
よって発生した。 ６） ５′−ＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＣＣ
Ｃ ＦＧＦＲ２のヌクレオチド１１４４−１１６３に相当
し、Ｓｐｈ１部位をもっている、そして ７） ５′−ＣＣＧＴＴＣＡＡＣＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧ
ＴＧ， ＦＧＦＲ２のヌクレオチド１１８７−１４０７に相補的
で、ＡａｔＩＩ部位をもっている。
【００４６】上記の制限部位は、相当するエンコードし
たアミノ酸を変えることなく、ヌクレオチド（上記の下
線部分）を置換することによって導入された。ＰＣＲ生
成物はＳｐｈＩとＡａｔＩＩによって消化され、上述の
４−点連結部に含まれた。このように組立てられたキメ
ラレセプターは、図８（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）に図式的に示
されている。呼称：Ｄ１，Ｄ２及びＤ３はＩｇ−様ドメ
インを意味し；ＡＢは酸性ボックス；ＳＰはシグナルペ
プチド；またＣとＤはそれぞれ、Ｉｇドメイン３の定常
と可変領域を意味する。ＰｐｕｍＩ部位は、可変領域の
開始を表す。ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇＩＩＩは、ＡＰｔａ
ｇＩベクター中のクローニング部位であり、例１に述べ
た方法で、ＦＧＦＲ１，ＫＧＦＲ，ＦＧＦＲ１／ＫＧＦ
Ｒ及びＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲのためにＡＰ
−融合蛋白質エンコーディングクローンを作るのに用い
られた。
たアミノ酸を変えることなく、ヌクレオチド（上記の下
線部分）を置換することによって導入された。ＰＣＲ生
成物はＳｐｈＩとＡａｔＩＩによって消化され、上述の
４−点連結部に含まれた。このように組立てられたキメ
ラレセプターは、図８（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）に図式的に示
されている。呼称：Ｄ１，Ｄ２及びＤ３はＩｇ−様ドメ
インを意味し；ＡＢは酸性ボックス；ＳＰはシグナルペ
プチド；またＣとＤはそれぞれ、Ｉｇドメイン３の定常
と可変領域を意味する。ＰｐｕｍＩ部位は、可変領域の
開始を表す。ＨｉｎｄＩＩＩとＢｇＩＩＩは、ＡＰｔａ
ｇＩベクター中のクローニング部位であり、例１に述べ
た方法で、ＦＧＦＲ１，ＫＧＦＲ，ＦＧＦＲ１／ＫＧＦ
Ｒ及びＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲのためにＡＰ
−融合蛋白質エンコーディングクローンを作るのに用い
られた。
【００４７】ＡＰ−レセプターまたはＡＰ−キメラレセ
プター融合生成物をエンコードする上記の組換えＡＰｔ
ａｇの組立てにつづいて、移入の選択マーカーとしての
ｐＳＶ２ｎｅｏと共に、ＭＩＨ３Ｔ３細胞が、それぞれ
のＡＰｔａｇ組換えベクターの燐酸カルシウム沈降によ
って移入された。その結果のＧ４１８−抵抗細胞ライン
分泌ＡＰ活性は、選択されさらに分析された。レセプタ
ーまたはキメラレセプターを分泌する能力のある細胞ラ
イン、移入細胞培養のならし培地中におけるＡＰ活性の
測定によって選別された。選ばれた細胞ラインは次にク
ローン化され、分泌した可溶性レセプターとキメラレセ
プターのリガンド結合能を分析するために用いられた。
プター融合生成物をエンコードする上記の組換えＡＰｔ
ａｇの組立てにつづいて、移入の選択マーカーとしての
ｐＳＶ２ｎｅｏと共に、ＭＩＨ３Ｔ３細胞が、それぞれ
のＡＰｔａｇ組換えベクターの燐酸カルシウム沈降によ
って移入された。その結果のＧ４１８−抵抗細胞ライン
分泌ＡＰ活性は、選択されさらに分析された。レセプタ
ーまたはキメラレセプターを分泌する能力のある細胞ラ
イン、移入細胞培養のならし培地中におけるＡＰ活性の
測定によって選別された。選ばれた細胞ラインは次にク
ローン化され、分泌した可溶性レセプターとキメラレセ
プターのリガンド結合能を分析するために用いられた。
【００４８】分泌した可溶性レセプターとキメラレセプ
ターのリガンド結合能を分析するため、ヘパリン−セフ
ァローズ結合リガンドが用いられ、レセプター−アルカ
リホスファターゼ（ＡＰ）融合蛋白質を結合させ、共役
結合ビーズ上のＡＰ活性によってその程度を測定した。
３００μｌのヘパリン−セファローズスラリー（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）と１μｇのヒト組換えＫＧＦ（Ａｍｇｅ
ｎ）、ヒト組換えｂＦＧＦ（武田、日本）、ヒト組換え
ＦＧＦ４（Ｐｅｐｒｏ−Ｔｅｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡから得
た）、あるいはヒトａＦＧＦ（Ｄｒ．Ｇ．Ｎｅｕｆｅｌ
ｄ，Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｅｈｏ
ｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）の何れかと共に培養して固定リ
ガンドが作られた。室温で３０分振とう後、ビーズを
０．５Ｍ塩化ナトリウム液で３回洗浄し、０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（Ｐ
ＢＳ）中で懸濁（１：１）させた。レセプターリガンド
結合能分析のため、１５μｌのリガンド−結合ヘパリン
−セファローズビーズは、融合細胞分泌ＦＧＦＲＩ、Ｋ
ＧＦＲ，ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲまたはＦＧＦＲ１／ＦＧ
ＦＲ２／ＫＧＦＲから得てそれらのＡＰ活性を標準化し
た、ならし培地（１００−１５０μｌ）と共に培養し
た。室温で３０分振とう後、ビーズを０．５Ｍ塩化ナト
リウムで３回、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０で１回
洗浄し、内因性細胞ＡＰを不活性化するため６５℃で１
０分培養した。０．１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．
８），０．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｌ−ホ
モアルギニン、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍ
ａ）及び１２ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェートで
１５分培養後ビーズは４０５ｎｍの吸収を測定してＡＰ
活性について分析された。ＡＰ活性は、固定リガンドへ
のレセプターの結合の範囲の分析として役立てられた。
ターのリガンド結合能を分析するため、ヘパリン−セフ
ァローズ結合リガンドが用いられ、レセプター−アルカ
リホスファターゼ（ＡＰ）融合蛋白質を結合させ、共役
結合ビーズ上のＡＰ活性によってその程度を測定した。
３００μｌのヘパリン−セファローズスラリー（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）と１μｇのヒト組換えＫＧＦ（Ａｍｇｅ
ｎ）、ヒト組換えｂＦＧＦ（武田、日本）、ヒト組換え
ＦＧＦ４（Ｐｅｐｒｏ−Ｔｅｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡから得
た）、あるいはヒトａＦＧＦ（Ｄｒ．Ｇ．Ｎｅｕｆｅｌ
ｄ，Ｗｅｉｚｍａｎｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｅｈｏ
ｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）の何れかと共に培養して固定リ
ガンドが作られた。室温で３０分振とう後、ビーズを
０．５Ｍ塩化ナトリウム液で３回洗浄し、０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．４、０．１５Ｍ塩化ナトリウム（Ｐ
ＢＳ）中で懸濁（１：１）させた。レセプターリガンド
結合能分析のため、１５μｌのリガンド−結合ヘパリン
−セファローズビーズは、融合細胞分泌ＦＧＦＲＩ、Ｋ
ＧＦＲ，ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲまたはＦＧＦＲ１／ＦＧ
ＦＲ２／ＫＧＦＲから得てそれらのＡＰ活性を標準化し
た、ならし培地（１００−１５０μｌ）と共に培養し
た。室温で３０分振とう後、ビーズを０．５Ｍ塩化ナト
リウムで３回、１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０で１回
洗浄し、内因性細胞ＡＰを不活性化するため６５℃で１
０分培養した。０．１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．
８），０．５ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ Ｌ−ホ
モアルギニン、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍ
ａ）及び１２ｍＭ ｐ−ニトロフェニルホスフェートで
１５分培養後ビーズは４０５ｎｍの吸収を測定してＡＰ
活性について分析された。ＡＰ活性は、固定リガンドへ
のレセプターの結合の範囲の分析として役立てられた。
【００４９】図９に上記の分析結果が棒グラフで示さ
れ、その中でａ，ｂ，ｈ及びｋは、それぞれ、ヘパリン
−セファローズ結合ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ４及び
ＫＧＦを表している；また、Ｆ１／ＫとＦ１／Ｆ２／Ｋ
は上記のキメラレセプターを表している。これらの結果
から、可溶性分泌キメラレセプターＦＧＦＲＩ／ＫＧＦ
Ｒは、ａＦＧＦとＦＧＦ４に対して、両方の親レセプタ
ーＦＧＦＲ１とＫＧＦＲと同じ程度の高い結合親和力を
基本的に保持していることは明らかである。しかしなが
ら、キメラＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲレセプターは、例１に
述べたＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラの場合と同様に、ｂ
ＦＧＦとの結合能力を失ったが、しかし、ＦＧＦＲ２／
ＫＧＦＲキメラの場合のように意外にもＫＧＦと結合す
る同じ能力は獲得されなかった。最上の時に、ＦＧＦＲ
Ｉ／ＫＧＦＲキメラは弱いＫＧＦ結合能力を得た。対照
的に、他のキメラＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ
は、高いＫＧＦ結合能力を獲得し、全体として、このキ
メラは、ＫＧＦＲと似たようなリガンド結合能を保有し
た。
れ、その中でａ，ｂ，ｈ及びｋは、それぞれ、ヘパリン
−セファローズ結合ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ４及び
ＫＧＦを表している；また、Ｆ１／ＫとＦ１／Ｆ２／Ｋ
は上記のキメラレセプターを表している。これらの結果
から、可溶性分泌キメラレセプターＦＧＦＲＩ／ＫＧＦ
Ｒは、ａＦＧＦとＦＧＦ４に対して、両方の親レセプタ
ーＦＧＦＲ１とＫＧＦＲと同じ程度の高い結合親和力を
基本的に保持していることは明らかである。しかしなが
ら、キメラＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲレセプターは、例１に
述べたＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラの場合と同様に、ｂ
ＦＧＦとの結合能力を失ったが、しかし、ＦＧＦＲ２／
ＫＧＦＲキメラの場合のように意外にもＫＧＦと結合す
る同じ能力は獲得されなかった。最上の時に、ＦＧＦＲ
Ｉ／ＫＧＦＲキメラは弱いＫＧＦ結合能力を得た。対照
的に、他のキメラＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ
は、高いＫＧＦ結合能力を獲得し、全体として、このキ
メラは、ＫＧＦＲと似たようなリガンド結合能を保有し
た。
【００５０】上の結果から、ＦＧＦＲ２またはＫＧＦＲ
のＩｇドメイン２と、ＫＧＦＲのＩｇドメイン３のＣ末
端半分の両方ともＦＧＦＲ１に高いＫＧＦ結合能力を与
えるために獲得されていると結論できる。上記可溶性レ
セプターとキメラレセプターは、また、置換または競合
結合分析方法で、それらの結合親和力と特異性が解析さ
れた。ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ４およびＫＧＦの可
溶性レセプターへの結合は、標識したＦＧＦ４またはＫ
ＧＦの非標識ＦＧＦｓの置換によって分析された。反応
混合液（２００μｌ）は、非標識リガンドの量を増加さ
せながら、〔１２５Ｉ〕ＦＧＦ４かまたは〔１２５Ｉ〕
ＫＧＦの０．４ｎｇ，２μｇヘパリン（Ｈｅｐａｒ，Ｆ
ｒａｎｋｌｉｎ，ＯＨ），０．２％ＢＳＡ，２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４そしてＦＧＦＲＩ，ＫＧＦＲ，
ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲまたはＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／
ＫＧＦＲのどれかを分泌する細胞からの標準化されたな
らし培地１００μｌを含んでいた。室温で３０分培養
後、ウサギ抗−ヒト胎盤性ＡＰ抗体へ予め結合した１５
μｌのセファローズ−蛋白質Ａを加え、反応混合液を３
０分室温で振とうした。ビーズをＨＮＴＧ（２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ塩化ナトリウム、
１％トリトンＸ−１００及び１０％グリセロル）で洗
い、非特異性結合リガンドを除くため０．５Ｍ塩化ナト
リウムで１回洗いまたビーズに結合した放射能はγ−カ
ウンターで計測した。
のＩｇドメイン２と、ＫＧＦＲのＩｇドメイン３のＣ末
端半分の両方ともＦＧＦＲ１に高いＫＧＦ結合能力を与
えるために獲得されていると結論できる。上記可溶性レ
セプターとキメラレセプターは、また、置換または競合
結合分析方法で、それらの結合親和力と特異性が解析さ
れた。ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧＦ４およびＫＧＦの可
溶性レセプターへの結合は、標識したＦＧＦ４またはＫ
ＧＦの非標識ＦＧＦｓの置換によって分析された。反応
混合液（２００μｌ）は、非標識リガンドの量を増加さ
せながら、〔１２５Ｉ〕ＦＧＦ４かまたは〔１２５Ｉ〕
ＫＧＦの０．４ｎｇ，２μｇヘパリン（Ｈｅｐａｒ，Ｆ
ｒａｎｋｌｉｎ，ＯＨ），０．２％ＢＳＡ，２５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４そしてＦＧＦＲＩ，ＫＧＦＲ，
ＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲまたはＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／
ＫＧＦＲのどれかを分泌する細胞からの標準化されたな
らし培地１００μｌを含んでいた。室温で３０分培養
後、ウサギ抗−ヒト胎盤性ＡＰ抗体へ予め結合した１５
μｌのセファローズ−蛋白質Ａを加え、反応混合液を３
０分室温で振とうした。ビーズをＨＮＴＧ（２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ塩化ナトリウム、
１％トリトンＸ−１００及び１０％グリセロル）で洗
い、非特異性結合リガンドを除くため０．５Ｍ塩化ナト
リウムで１回洗いまたビーズに結合した放射能はγ−カ
ウンターで計測した。
【００５１】上記の置換結合分析の結果は、図１０と１
１にグラフで記載してある。図１１は、可溶性レセプタ
ーＦＧＦＲＩとＫＧＦＲ及び可溶性キメラレセプターＦ
ＧＦＲＩ／ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）、の、ａＦＧＦ，ｂＦ
ＧＦ，ＦＧＦ４及びＫＧＦに対する結合特異性と親和性
を示す。図１０のパネルＡ，Ｂ及びＣは、非標識ａＦＧ
Ｆ（Ａ），ｂＦＧＦ（Ｂ）及びＦＧＦ４（Ｃ）を用い、
１２５Ｉ−ＦＧＦ４のＦＧＦＲ１とＦ１／Ｋに対する結
合の置換分析の結果を示す。パネルＤには、非標識ＫＧ
Ｆを用い、１２５Ｉ−ＫＧＦのＫＧＦＲとＦ１／Ｋキメ
ラに対する結合の置換分析の結果が示されている。図１
１は、可溶性レセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ及び加溶
性キメラレセプターＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ
（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のそれぞれリガンドａＦＧＦ，ｂＦ
ＧＦ，ＦＧＦ４及びＫＧＦに対する結合特異性と親和性
を示す。図１１のパネルＡ，Ｂ及びＣは、非標識ａＦＧ
Ｆ（Ａ），ｂＦＧＦ（Ｂ）およびＦＧＦ４（Ｃ）を用
い、１２５Ｉ−ＦＧＦ４のＦＧＦＲＩ及びＦ１／Ｆ２／
Ｋキメラに対する結合の置換分析結果を示す。パネルＤ
は、非標識ＫＧＦを用い、１２５Ｉ−ＫＧＦのＫＧＦＲ
及びＦ１／Ｆ２／Ｋキメラに対する結合の置換分析結果
を示す。
１にグラフで記載してある。図１１は、可溶性レセプタ
ーＦＧＦＲＩとＫＧＦＲ及び可溶性キメラレセプターＦ
ＧＦＲＩ／ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）、の、ａＦＧＦ，ｂＦ
ＧＦ，ＦＧＦ４及びＫＧＦに対する結合特異性と親和性
を示す。図１０のパネルＡ，Ｂ及びＣは、非標識ａＦＧ
Ｆ（Ａ），ｂＦＧＦ（Ｂ）及びＦＧＦ４（Ｃ）を用い、
１２５Ｉ−ＦＧＦ４のＦＧＦＲ１とＦ１／Ｋに対する結
合の置換分析の結果を示す。パネルＤには、非標識ＫＧ
Ｆを用い、１２５Ｉ−ＫＧＦのＫＧＦＲとＦ１／Ｋキメ
ラに対する結合の置換分析の結果が示されている。図１
１は、可溶性レセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ及び加溶
性キメラレセプターＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ
（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のそれぞれリガンドａＦＧＦ，ｂＦ
ＧＦ，ＦＧＦ４及びＫＧＦに対する結合特異性と親和性
を示す。図１１のパネルＡ，Ｂ及びＣは、非標識ａＦＧ
Ｆ（Ａ），ｂＦＧＦ（Ｂ）およびＦＧＦ４（Ｃ）を用
い、１２５Ｉ−ＦＧＦ４のＦＧＦＲＩ及びＦ１／Ｆ２／
Ｋキメラに対する結合の置換分析結果を示す。パネルＤ
は、非標識ＫＧＦを用い、１２５Ｉ−ＫＧＦのＫＧＦＲ
及びＦ１／Ｆ２／Ｋキメラに対する結合の置換分析結果
を示す。
【００５２】図１０，１１に記載した結果と以下の表１
にまとめた結果は、ａＦＧＦのＦＧＦＲ１への、またＦ
１／Ｋキメラへの親和性は非常に似ているのに対し、ｂ
ＦＧＦは試験濃度では、Ｆ１／Ｋキメラとは有意に結合
しないことを示している。さらに、ＫＧＦは、ＫＧＦＲ
に比較してＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキメラへの親和性は約
１５倍低く（ＩＣ５０は、それぞれ、３２ｎｇ／ｍｌに
比較して５００ｎｇ／ｍｌ）、これに反し、ＫＧＦのＦ
ＧＦＲＩへの結合は測定できなかった。
にまとめた結果は、ａＦＧＦのＦＧＦＲ１への、またＦ
１／Ｋキメラへの親和性は非常に似ているのに対し、ｂ
ＦＧＦは試験濃度では、Ｆ１／Ｋキメラとは有意に結合
しないことを示している。さらに、ＫＧＦは、ＫＧＦＲ
に比較してＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲキメラへの親和性は約
１５倍低く（ＩＣ５０は、それぞれ、３２ｎｇ／ｍｌに
比較して５００ｎｇ／ｍｌ）、これに反し、ＫＧＦのＦ
ＧＦＲＩへの結合は測定できなかった。
【表１】
【００５３】置換によってｂＦＧＦのＦＧＦＲＩとＦＧ
ＦＲ２の両方への結合をなくしているので（例１参
照）、これらの結果は、ＦＧＦＲＩのＣ末端半分の配列
が、ｂＦＧＦの高い親和結合にとって不可欠なことを示
唆している。しかしながら、ＫＧＦＲからのＩｇドメイ
ン３のＣ末端半分は、同種のＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメ
ラ（例１参照）内でそうであるように、ＫＧＦと高い親
和結合をもつＦＧＦＲＩに完全に与える程十分ではな
い。逆に、ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラ
（Ｉｇドメイン１及びＦＧＦＲ１からのＩｇドメイン３
のＮ−末端半分；ＦＧＦＲ２またはＫＧＦＲからのＩｇ
ドメイン２；そしてＫＧＦＲからのＩｇドメイン３のＣ
−末端半分を含む）はａＦＧＦとＦＧＦ４と高い親和性
で結合し、Ｆ１／Ｋキメラと同じように、ｂＦＧＦとは
低い結合親和性を示し、またＫＧＦＲ（図１１と表１）
のそれと同じ程度にＫＧＦとは高い結合親和性がある。
これらの結果は、また、上の結果（図５）、すなわち、
Ｉｇドメイン２とＫＧＦＲのＩｇドメイン３のＣ末端半
分の両方とも、ＫＧＦをめざすＦＧＦＲＩへ高い結合親
和性を与えるために必要とされることを確証している。
ＦＲ２の両方への結合をなくしているので（例１参
照）、これらの結果は、ＦＧＦＲＩのＣ末端半分の配列
が、ｂＦＧＦの高い親和結合にとって不可欠なことを示
唆している。しかしながら、ＫＧＦＲからのＩｇドメイ
ン３のＣ末端半分は、同種のＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメ
ラ（例１参照）内でそうであるように、ＫＧＦと高い親
和結合をもつＦＧＦＲＩに完全に与える程十分ではな
い。逆に、ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲキメラ
（Ｉｇドメイン１及びＦＧＦＲ１からのＩｇドメイン３
のＮ−末端半分；ＦＧＦＲ２またはＫＧＦＲからのＩｇ
ドメイン２；そしてＫＧＦＲからのＩｇドメイン３のＣ
−末端半分を含む）はａＦＧＦとＦＧＦ４と高い親和性
で結合し、Ｆ１／Ｋキメラと同じように、ｂＦＧＦとは
低い結合親和性を示し、またＫＧＦＲ（図１１と表１）
のそれと同じ程度にＫＧＦとは高い結合親和性がある。
これらの結果は、また、上の結果（図５）、すなわち、
Ｉｇドメイン２とＫＧＦＲのＩｇドメイン３のＣ末端半
分の両方とも、ＫＧＦをめざすＦＧＦＲＩへ高い結合親
和性を与えるために必要とされることを確証している。
【００５４】追加試験として、上記の分泌した可溶性レ
セプターとキメラレセプターはまた、可溶性分泌レセプ
ターとＦＧＦｓの化学的架橋の方法によって、色々のリ
ガンドとの結合親和性に関して分析された。ＦＧＦＲ
Ｉ，ＫＧＦＲ，ＦＧＦＲＩ／ＫＧＦＲまたはＦＧＦＲ１
／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ、を分泌する集密的細胞からの
ならし培地とＡＰ活性（１００μｌ）について標準化
し、１０μｇ／ｍｌのヘパリンの存在でまた１００倍過
剰の非標識リガンドの存在または非存在下で、〔１２５
Ｉ〕ＫＧＦ，〔１２５Ｉ〕ａＦＧＦ，〔１２５Ｉ〕ｂＦ
ＧＦまたは〔１２５Ｉ〕ＦＧＦ４（１０ｎｇ／ｍｌ）と
反応させ、つづてい、セファローズ−蛋白質Ａ結合−抗
−ＡＰで免疫沈降試験を行った。洗浄後、ビーズとＰＢ
Ｓ中の０．４ｍｌの０．１５ｍＭジサクシニリミジルサ
ベレート（ＤＳＳ，Ｐｉｅｃｅ）中に３０分室温で懸濁
してリガンドのレセプターへの架橋を効果的にし、次に
回転し、架橋反応を終結させるため１０ｍＭトリス−塩
酸ｐＨ７．５中１５０ｍＭグリシンの１ｍｌ中で再懸濁
させた。５分後ビーズをＰＢＳで洗い、試料緩衝液中で
５分間煮沸し、蛋白質を６％ゲルでＰＡＧＥによって分
析した。走査後、ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに１６時
間露出した。
セプターとキメラレセプターはまた、可溶性分泌レセプ
ターとＦＧＦｓの化学的架橋の方法によって、色々のリ
ガンドとの結合親和性に関して分析された。ＦＧＦＲ
Ｉ，ＫＧＦＲ，ＦＧＦＲＩ／ＫＧＦＲまたはＦＧＦＲ１
／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ、を分泌する集密的細胞からの
ならし培地とＡＰ活性（１００μｌ）について標準化
し、１０μｇ／ｍｌのヘパリンの存在でまた１００倍過
剰の非標識リガンドの存在または非存在下で、〔１２５
Ｉ〕ＫＧＦ，〔１２５Ｉ〕ａＦＧＦ，〔１２５Ｉ〕ｂＦ
ＧＦまたは〔１２５Ｉ〕ＦＧＦ４（１０ｎｇ／ｍｌ）と
反応させ、つづてい、セファローズ−蛋白質Ａ結合−抗
−ＡＰで免疫沈降試験を行った。洗浄後、ビーズとＰＢ
Ｓ中の０．４ｍｌの０．１５ｍＭジサクシニリミジルサ
ベレート（ＤＳＳ，Ｐｉｅｃｅ）中に３０分室温で懸濁
してリガンドのレセプターへの架橋を効果的にし、次に
回転し、架橋反応を終結させるため１０ｍＭトリス−塩
酸ｐＨ７．５中１５０ｍＭグリシンの１ｍｌ中で再懸濁
させた。５分後ビーズをＰＢＳで洗い、試料緩衝液中で
５分間煮沸し、蛋白質を６％ゲルでＰＡＧＥによって分
析した。走査後、ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに１６時
間露出した。
【００５５】上記の色々のＦＧＦＲｓとキメラＦＧＦＲ
ｓの、化学架橋親和標識分析からの露出Ｘ線の再生が図
１２に示されている。図１２のパネルＩは、可溶性レセ
プターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲの結果を示し、パネルＩＩ
には、可溶性キメラレセプターＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲと
ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ、（それぞれ、Ｆ１
／ＫとＦ１／Ｆ２／Ｋ）についての結果が示されてい
る。パネルＩ，ＩＩともに、ａ，ｂ，ｈ及びｋは、それ
ぞれ１２５Ｉ−標識リガンドａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧ
Ｆ４及びＫＧＦを意味し、一方、そこに関連して“ｘ
ｓ′リガンド”及び“−”または“＋”サインは、１０
０倍過剰の同じ非標識リガンドの存在（＋），非存在
（−）を意味している。両パネル共に左側の数字は分子
量マーカー（ＫＤａ標示分子量）の同一條件同一ゲル上
の移動の相対的位置を示す。
ｓの、化学架橋親和標識分析からの露出Ｘ線の再生が図
１２に示されている。図１２のパネルＩは、可溶性レセ
プターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲの結果を示し、パネルＩＩ
には、可溶性キメラレセプターＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲと
ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ、（それぞれ、Ｆ１
／ＫとＦ１／Ｆ２／Ｋ）についての結果が示されてい
る。パネルＩ，ＩＩともに、ａ，ｂ，ｈ及びｋは、それ
ぞれ１２５Ｉ−標識リガンドａＦＧＦ，ｂＦＧＦ，ＦＧ
Ｆ４及びＫＧＦを意味し、一方、そこに関連して“ｘ
ｓ′リガンド”及び“−”または“＋”サインは、１０
０倍過剰の同じ非標識リガンドの存在（＋），非存在
（−）を意味している。両パネル共に左側の数字は分子
量マーカー（ＫＤａ標示分子量）の同一條件同一ゲル上
の移動の相対的位置を示す。
【００５６】図１２の結果は、レセプター結合リガンド
はモノマーと、レセプターリガンドコンプレックスのダ
イマー型との二つの主なバンドとして泳動することを表
している。Ｆ１／ＫキメラはａＦＧＦまたはＦＧＦ４で
強く標識されていた。ＫＧＦでの標識物は、著るしく弱
く、ある二量体のレセプターの状態に結合しているよう
に見えた。親レセプターＦＧＦＲ１はＫＧＦによって全
く標識されず、定性的定量的リガンド結合能と一致した
（上記参照）。これに反してキメラレセプターＦ１／Ｆ
２／ＫはＫＧＦにより、高い標識化を示し、非標識ＫＧ
Ｆにより特異的に疎害された。これらの結果は完全に、
結合データ（図１０ａ１１）及びリガンド結合図（図
９）と一致する。
はモノマーと、レセプターリガンドコンプレックスのダ
イマー型との二つの主なバンドとして泳動することを表
している。Ｆ１／ＫキメラはａＦＧＦまたはＦＧＦ４で
強く標識されていた。ＫＧＦでの標識物は、著るしく弱
く、ある二量体のレセプターの状態に結合しているよう
に見えた。親レセプターＦＧＦＲ１はＫＧＦによって全
く標識されず、定性的定量的リガンド結合能と一致した
（上記参照）。これに反してキメラレセプターＦ１／Ｆ
２／ＫはＫＧＦにより、高い標識化を示し、非標識ＫＧ
Ｆにより特異的に疎害された。これらの結果は完全に、
結合データ（図１０ａ１１）及びリガンド結合図（図
９）と一致する。
【００５７】そこで、三つの独立した方法による結果
は、キメラＦ１／Ｆ２／ＫはＫＧＦの高い結合親和性を
獲得し、この結合親和性は、ＦＧＦＲ２またはＫＧＦＲ
起源のドメンイ２、及びＫＧＦＲ起源のドメイン３のＣ
−末端の中にある配列決定因子により決定されることを
示している。例１，２及びそれらに伴う図に示されるす
べてを考慮して、次のようにまとめられる。ＦＧＦレセ
プターの細胞外ドメインは三つのイムノグロブリン様ド
メインとして機能しており、その中膜に閉じこめられて
いる二つはＦＧＦの高い親和結合性のために必要なすべ
ての要素を含んでいる。これまでに示した結果は、ドメ
イン３の中の可変配列は、ＦＧＦ族の異なったメンバー
の高い親和結合性に異なった影響を与えることができ
る。現在の結果はまた、リガンド一結合性に関係するド
メイン２とドメイン３に含まれる多様な非近接要因は、
ＦＧＦＲＳの結合特異性のみであることを示している。
は、キメラＦ１／Ｆ２／ＫはＫＧＦの高い結合親和性を
獲得し、この結合親和性は、ＦＧＦＲ２またはＫＧＦＲ
起源のドメンイ２、及びＫＧＦＲ起源のドメイン３のＣ
−末端の中にある配列決定因子により決定されることを
示している。例１，２及びそれらに伴う図に示されるす
べてを考慮して、次のようにまとめられる。ＦＧＦレセ
プターの細胞外ドメインは三つのイムノグロブリン様ド
メインとして機能しており、その中膜に閉じこめられて
いる二つはＦＧＦの高い親和結合性のために必要なすべ
ての要素を含んでいる。これまでに示した結果は、ドメ
イン３の中の可変配列は、ＦＧＦ族の異なったメンバー
の高い親和結合性に異なった影響を与えることができ
る。現在の結果はまた、リガンド一結合性に関係するド
メイン２とドメイン３に含まれる多様な非近接要因は、
ＦＧＦＲＳの結合特異性のみであることを示している。
【００５８】上記の発見に基づき、異なったリガンド結
合特異性をもった多くのキメラレセプターを組み立てる
ことができる。さらに、Ｉｇ−ドメイン３及び／または
ドメイン２の可変配列内にミューテーションを挿入する
ことにより色々なレセプターの結合活性を調節すること
が可能であろう。これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＧＦｓ
の分裂促進及び形質転換活性の両方の特異的な抑制因子
として、将来の遺伝子医療のために用いられる優性負の
ミューテーションの構築の基礎として役立てることがで
きる。本発明はまた、たとえばＦＧＦＲ刺戟径路の競合
疎害剤としてＢＳＲ由来ポリペプチドの使用のように、
ｉｎ ｖｉｔｒｏにもｉｎ ｖｉｖｏにも、生長因子−
レセプター相互作用を調節するための新らしい医療剤の
開発の基礎として資することができる。
合特異性をもった多くのキメラレセプターを組み立てる
ことができる。さらに、Ｉｇ−ドメイン３及び／または
ドメイン２の可変配列内にミューテーションを挿入する
ことにより色々なレセプターの結合活性を調節すること
が可能であろう。これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＧＦｓ
の分裂促進及び形質転換活性の両方の特異的な抑制因子
として、将来の遺伝子医療のために用いられる優性負の
ミューテーションの構築の基礎として役立てることがで
きる。本発明はまた、たとえばＦＧＦＲ刺戟径路の競合
疎害剤としてＢＳＲ由来ポリペプチドの使用のように、
ｉｎ ｖｉｔｒｏにもｉｎ ｖｉｖｏにも、生長因子−
レセプター相互作用を調節するための新らしい医療剤の
開発の基礎として資することができる。
【図１】図１は、マウスのＦＧＦＲ２（Ｂｅｋ）とＫＧ
ＦＲの構造と配列の図式説明と、また例１に述べるよう
な、それらの比較である。
ＦＲの構造と配列の図式説明と、また例１に述べるよう
な、それらの比較である。
【図２】図２は、例１で述べるように、アルカリホスフ
ァターゼ発現ベクター（ＡＰｔａｇ）中のＦＧＦＲ２と
キメラＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２の構造の図式説明である。
ァターゼ発現ベクター（ＡＰｔａｇ）中のＦＧＦＲ２と
キメラＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２の構造の図式説明である。
【図３】図３は、例１に述べるように、マウス皮膚ＲＮ
Ａから得たＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列を示す；
Ａから得たＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列を示す；
【図４】図４は、例１に述べるように、（ｉ）マウスの
ＦＧＦＲ２とＫＧＦＲ可変領域及び（ｉｉ）ヒトＫＧＦ
Ｒ可変領域のアミノ酸配列を示す；
ＦＧＦＲ２とＫＧＦＲ可変領域及び（ｉｉ）ヒトＫＧＦ
Ｒ可変領域のアミノ酸配列を示す；
【図５】図５は、例１に述べるように、分泌した可溶性
ＦＧＦＲ２（ＢＡＰ）とＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ（Ｋ−Ｂ
ＡＰ）レセプターのリガンド結合能（ａ−酸性ＦＧＦ、
ｂ−塩基性ＦＧＦそしてＫ−ＫＧＦ）の棒グラフ表示で
ある。
ＦＧＦＲ２（ＢＡＰ）とＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ（Ｋ−Ｂ
ＡＰ）レセプターのリガンド結合能（ａ−酸性ＦＧＦ、
ｂ−塩基性ＦＧＦそしてＫ−ＫＧＦ）の棒グラフ表示で
ある。
【図６】図６Ａと６Ｂは、例１に述べるように、可溶性
ＦＧＦレセプターへのリガンド（ＦＧＦＲｓ）の結合の
競合的な結合解析のグラフ表示である。
ＦＧＦレセプターへのリガンド（ＦＧＦＲｓ）の結合の
競合的な結合解析のグラフ表示である。
【図７】図７は、例１で述べるように、非標識リガンド
例（ｂ−塩基性ＦＧＦ、ａ−酸性ＦＧＦ、Ｋ−ＦＧＦ）
の存在で、それらのリガンドに対する、可溶性の分泌し
たＦＧＦＲ２（ＢＡＰ）とＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ（Ｋ−
ＢＡＰ）レセプターの間の競合的結合の結果を示す露出
したＸ線フィルムの表示である。
例（ｂ−塩基性ＦＧＦ、ａ−酸性ＦＧＦ、Ｋ−ＦＧＦ）
の存在で、それらのリガンドに対する、可溶性の分泌し
たＦＧＦＲ２（ＢＡＰ）とＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲ（Ｋ−
ＢＡＰ）レセプターの間の競合的結合の結果を示す露出
したＸ線フィルムの表示である。
【図８】図８は、例２に述べるように、レセプターＦＧ
ＦＲ１とＫＧＦＲそしてキメラレセプターＦＧＦＲ１／
ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）とＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧ
ＦＲ（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のエクトドメインのｃＤＮＡの
図式表示である。
ＦＲ１とＫＧＦＲそしてキメラレセプターＦＧＦＲ１／
ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）とＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧ
ＦＲ（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のエクトドメインのｃＤＮＡの
図式表示である。
【図９】図９は、例２で述べるように、可溶性の分泌し
たレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ及びキメラレセプタ
ーＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）とＦＧＦＲ１／Ｆ
ＧＦＲ２（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のリガンド結合能の棒−グ
ラフ表示である。
たレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ及びキメラレセプタ
ーＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲ（Ｆ１／Ｋ）とＦＧＦＲ１／Ｆ
ＧＦＲ２（Ｆ１／Ｆ２／Ｋ）のリガンド結合能の棒−グ
ラフ表示である。
【図１０】図１０は、例２に述べるように、可溶性の分
泌したレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ、また可溶性の
分泌したキメラレセプターＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲへの色
々なＦＧＦｓの結合の置換分析結果のグラフ表示であ
る。
泌したレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ、また可溶性の
分泌したキメラレセプターＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲへの色
々なＦＧＦｓの結合の置換分析結果のグラフ表示であ
る。
【図１１】図１１は、例２に述べるように、可溶性の分
泌したレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ、また可溶性の
分泌したキメラレセプターＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／Ｋ
ＧＦＲへの色々なＦＧＦｓの結合の置換分析結果のグラ
フ表示である。
泌したレセプターＦＧＦＲ１とＫＧＦＲ、また可溶性の
分泌したキメラレセプターＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／Ｋ
ＧＦＲへの色々なＦＧＦｓの結合の置換分析結果のグラ
フ表示である。
【図１２】図１２は、例２に述べるように、色々なリガ
ンド（ＦＧＦｓ）への、可溶性の分泌したＦＧＦＲ１と
ＫＧＦＲレセプター及びキメラＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲと
ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲレセプターの間の架
橋の結果を示す露出Ｘ線フィルムの再生の数の表示であ
る。
ンド（ＦＧＦｓ）への、可溶性の分泌したＦＧＦＲ１と
ＫＧＦＲレセプター及びキメラＦＧＦＲ１／ＫＧＦＲと
ＦＧＦＲ１／ＦＧＦＲ２／ＫＧＦＲレセプターの間の架
橋の結果を示す露出Ｘ線フィルムの再生の数の表示であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (21)
- 【請求項１】 （ａ） ＦＧＦＲの細胞外の部分からの
リガンド特異性領域（ＬＳＲ）のアミノ酸配列をもち、
その領域が当該ＦＧＦＲのリガンド結合特異性を与え
る、ポリペプチド； （ｂ） 一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が与えら
れ、置換されまたは欠失されたポリペプチドが、当該Ｌ
ＳＲの代りにＦＧＦＲの細胞外の部分に挿入されて当該
ＬＳＲと同じリガンド結合特異性を当該ＦＧＦＲに与え
る、（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列をもつポリペ
ブチド；そして （ｃ） （ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるア
ミノ酸配列をもつ組換えポリペプチドまたは蛋白質から
なるグループから選ばれたメンバーであるポリペプチ
ド。 - 【請求項２】 ＦＧＦＲのイムノグロブリン様ドメイン
３のＣ−末端領域に当該ＬＳＲが含まれる、（ａ），
（ｂ），（ｃ）の下に限定される特許請求の範囲第１項
記載のポリペプチド。 - 【請求項３】 当該ＬＳＲは、マウスＦＧＦＲ１、マウ
スＦＧＦＲ２、マウスＫＧＦＲ、ヒトＫ−Ｓａｍ、そし
て前記に相同する他の哺乳動物からのＦＧＦＲｓからな
るグループから選ばれたＦＧＦＲの当該Ｃ−末端領域に
含まれる特許請求の範囲第２項記載のポリペプチド。 - 【請求項４】 当該ＬＳＲは、図１，３または４または
他の哺乳動物からの相同配列に描かれるアミノ酸配列に
含まれる特許請求の範囲第３項記載のポリペプチド。 - 【請求項５】 当該ＬＳＲは、ＦＧＦＲのイムノグロブ
リン様ドメイン２に含まれる特許請求の範囲第１項記載
のポリペプチド。 - 【請求項６】 当該ＬＳＲは、マウスＦＧＦＲ１、ＦＧ
ＦＲ２及びＫＧＦＲそして前記に相同する他の哺乳動物
からのＦＧＦＲｓからなるグループから選ばれるＦＧＦ
Ｒの当該ドメイン２に含まれる特許請求の範囲第５項記
載のポリペプチド。 - 【請求項７】 第一蛋白質から得られる一つまたはそれ
以上の第一領域と第二蛋白質から得られる一つまたはそ
れ以上の第二領域からなり、当該第一及び第二領域はお
互いに融合しており、蛋白質は、以下のような特性をも
つキメラ蛋白質： （ｉ） 当該一つまたはそれ以上の第一領域は各々独立
に、以下の項目からなるグループから選ばれるメンバー
である− （ａ） 第一繊維芽細胞増殖因子レセプター（ＦＧＦ
Ｒ）の細胞外の部分からのリガンド特異性領域（ＬＳ
Ｒ）のアミノ酸配列をもち、その領域は、当該ＦＧＦＲ
のリガンド結合特異性を与えるポリペプチド鎖 （ｂ） 当該ＬＳＲのリガンド特異的性質をもち、一つ
またはそれ以上のアミノ酸残基が加えられ、置換されま
たは欠失を生じた（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列
をもつポリペプチド鎖。 （ｉｉ） 当該一つまたはそれ以上の第二領域は各々独
立に、以下の項目からなるグループから選ばれるメンバ
ーである− （ａ） 当該第二ＦＧＦＲのＬＳＲ（非−ＬＳＲ）では
ない第二ＦＧＦＲの領域のアミノ酸配列をもつポリペプ
チド鎖。 （ｂ） 一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換さ
れ、添加され、当該第二領域の生物学的性質も、あるい
は当該ＬＳＲの結合特異性も本質的に影響されない当該
非−ＬＳＲのアミノ酸配列をもつポリペプチド鎖、そし
て （ｉｉｉ） 当該キメラ蛋白質は、リガンドを結合する
能力をもち、当該一つまたはそれ以上の第一領域によっ
て与えられたリガンド結合特異性をもっている。 - 【請求項８】 当該第一及び第二ＦＧＦＲは、マウスＦ
ＧＦＲ１、マウスＦＧＦＲ２、マウスＫＧＦＲ、ヒトＫ
−Ｓａｍ、そして他の哺乳動物からの相同ＦＧＦＲｓか
らなるグループから選ばれる特許請求の範囲第７項記載
のキメラ蛋白質。 - 【請求項９】 イムノグロブリン様ドメイン３のＣ−末
端領域にあるＬＳＲが他のＦＧＦＲからの相当するＬＳ
Ｒによって置換されたあるＦＧＦＲの細胞外の部分から
なる特許請求の範囲第７項記載のキメラ蛋白質。 - 【請求項１０】 当該ＬＳＲは、図１，２または４また
は他の哺乳動物からの相同配列に描かれるアミノ酸配列
に含まれる特許請求の範囲第９項記載のキメラ蛋白質。 - 【請求項１１】 イムノグロブリン様ドメイン２からの
ＬＳＲとイムノグロブリン様ドメイン３のＣ−末端から
のＬＳＲが、他のＦＧＦＲからの相当するＬＳＲｓによ
って置換され、その二つのＬＳＲｓは両方とも同じまた
は異なる他のＦＧＦＲから来ている特許請求の範囲第７
項記載のキメラ蛋白質 - 【請求項１２】 以下の項からなるグループから選ばれ
るメンバーであるコーディング配列からなるＤＮＡ分
子： （ａ） ＦＧＦＲの細胞外の部分からリガンド特異性領
域（ＬＳＲ）をコードし、その領域は当該ＦＧＦＲのリ
ガンド結合特異性を与えているヌクレオチド配列； （ｂ） もしもコードしたポリペプチドが当該ＬＳＲの
リガンド特異性を保持するならば、一つまたはそれ以上
のコドンが添加され、置換されまたは欠失された（ａ）
のヌクレオチド配列；そして （ｃ） ポリペプチドをコードし、（ａ）または（ｂ）
の配列からなる組換えヌクレオチド配列 - 【請求項１３】 当該ＬＳＲはＦＧＦＲのイムノグロブ
リンドメイン３のＣ−末端領域に含まれる（ａ）；
（ｂ）または（ｃ）の下に限定される特許請求の範囲第
１２項記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１４】 当該ＬＳＲは、マウスＦＧＦＲＩ、マ
ウスＦＧＦＲ２、マウスＫＧＦＲ、ヒトＫ−Ｓａｍ、そ
して他の哺乳動物からの相同ＦＧＦＲからなるグループ
から選ばれるＦＧＦＲから得られる特許請求の範囲第１
３項記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１５】 当該ＬＳＲは、図１，２，及び４に描
かれたアミノ酸配列または他の哺乳動物からの相同アミ
ノ酸配列に含まれる特許請求の範囲第１４項記載のＤＮ
Ａ。 - 【請求項１６】 当該ＬＳＲはＦＧＦＲのイムノグロブ
リン様ドメイン２に含まれる（ａ），（ｂ）または
（ｃ）の下に限定される特許請求の範囲第１２項記載の
ＤＮＡ分子。 - 【請求項１７】 当該ＬＳＲは、マウスＦＧＦＲ１、マ
ウスＦＧＦＲ２マウスＫＧＦＲそして他の哺乳動物から
の相同ＦＧＦＲからなるグループから選ばれるＦＧＦＲ
から得られる特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ分
子。 - 【請求項１８】 第一ＦＧＦＲから引き出したリガンド
特異性領域（ＬＳＲ）及び第二ＦＧＦＲから引き出した
非−ＬＳＲからなるキメラ蛋白質をコードする特許請求
の範囲第１２項記載のＤＮＡ分子。 - 【請求項１９】 特許請求の範囲第１２項のＤＮＡ分子
からなる発現ベクター。 - 【請求項２０】 特許請求の範囲第１９項のベクターに
より導入された細胞。 - 【請求項２１】 特許請求の範囲第２０項の細胞の発現
生成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL100219A IL100219A0 (en) | 1991-12-02 | 1991-12-02 | Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity |
| IL100219 | 1991-12-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07265079A true JPH07265079A (ja) | 1995-10-17 |
Family
ID=11063129
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4356203A Pending JPH07265079A (ja) | 1991-12-02 | 1992-12-02 | リガンド特異性を与える繊維芽細胞レセプター内のリガンド−結合決定領域 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0545343A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07265079A (ja) |
| AU (1) | AU2960792A (ja) |
| CA (1) | CA2083778A1 (ja) |
| IL (1) | IL100219A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ245220A (ja) |
| ZA (1) | ZA929100B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004082704A1 (ja) * | 2003-03-19 | 2004-09-30 | Dnavec Research Inc. | 骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法 |
| JP2011529705A (ja) * | 2008-08-04 | 2011-12-15 | ファイブ プライム セラピューティックス インコーポレイテッド | Ｆｇｆｒ細胞外ドメイン酸性領域突然変異タンパク質 |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL128380A0 (en) * | 1999-02-04 | 2000-01-31 | Yeda Res & Dev | A method of screening for agonists and antagonists of FGFR |
| US6656728B1 (en) | 1999-02-08 | 2003-12-02 | Chiron Corporation | Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion |
| EP1910542B1 (en) | 2005-07-22 | 2009-12-02 | Five Prime Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins |
| JOP20190083A1 (ar) | 2008-06-04 | 2017-06-16 | Amgen Inc | بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها |
| CN102625811B (zh) | 2008-10-10 | 2016-09-21 | 安姆根有限公司 | Fgf21突变体及其用途 |
| SG174904A1 (en) | 2009-03-25 | 2011-11-28 | Genentech Inc | Anti-fgfr3 antibodies and methods using same |
| UY32607A (es) | 2009-05-05 | 2010-12-31 | Amgen Inc | Mutantes de fgf21 y usos del mismo |
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