WO2004082704A1

WO2004082704A1 - 骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法

Info

Publication number: WO2004082704A1
Application number: PCT/JP2004/002887
Authority: WO
Inventors: Katsuo Sueishi; Yoshikazu Yonemitsu; Akihisa Yamashita; Akihiko Yoshimura; Mamoru Hasegawa
Original assignee: Dnavec Research Inc.
Priority date: 2003-03-19
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2004-09-30
Also published as: CA2519414A1; KR20050114241A; AU2004222418A1; JPWO2004082704A1; CN1787832A; EP1611900A1; US20070173466A1

Abstract

　本発明は、線維芽細胞増殖因子-2 (FGF2)−FGF受容体1−Ras−Raf−MAPキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する遺伝子を有するウイルスベクターを疾患部位に投与する工程を含む、骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法に関する。また本発明は、該ベクターを含む、骨破壊を伴う炎症性疾患の治療組成物に関する。ウイルスベクターの局所投与を介してFGF2のシグナル伝達を阻害することにより、炎症性骨破壊における炎症と骨破壊の両方を同時に抑制することに成功した。本発明は、これまで治療が困難であった関節リウマチ等の炎症性骨疾患に対する、疾患特異的かつ効果的な治療方法、および治療組成物を提供する。

Description

明細 ΐ 骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法技術分野

本発明は、線維芽細胞増殖因子 _2 (fibroblast growth factor- 2: FGF2) の機能制御、及びその細胞内信号伝達系の遮断により骨破壌を伴う炎症性疾患を治療する方法に関する。本発明の方法は、特に関節リウマチ（rheumatoid arthritis : RA) の治療に有用である。背景技術

これまでの世界的医学研究により RAに対する種々の治療戦略および疾患修飾性 f几リゥマチ斉！] (disease modifyttg anti rheumatoid drugs： DMARDs) 力さてきた。 RA治療に関する従来の主要な技術（RA治療戦略）を以下に列挙する。これらは RAに対する生物学的作用薬を用レ、た治療及ぴその治療戦略である。

①腫瘍壊死因子（tumor necrotic factor: TNF) 制御による治療法

可溶性 TNF受容体（Moreland, L. W. et al. , Ν. Engl. J. Med. 337: 141-147 (1 997) ; Bathon, J. M. et al. , N. Engl. J. Med. 343 : 1586-1593 (2000) ) または抗 TNF-ひ抗体 (Maini, R. N. et al. , Ann. Rheum. Dis. 58:156-160 (1999)； Lip sky, P. E. et al. , N. Engl. J. Med. 343: 1594—1602 (2000) ; Maini, R. N. et a 1. , Lancet 354: 1932—1939 (1999) ) を用いて TNF- の機能制御により RAを治療する抗サイトカイン療法である。

② インターロイキンー1 (interleukin- 1 : IL- 1) 制御による治療法

IL- 1レセプターアンタゴニストを用いて IL-1の機能制御により RAを治療する抗サイト力イン療法である（Cohen, S. et al. , Arthritis Rheum. 46: 614-624 (20 ③ IL- 6制御による治療法

抗 IL- 6受容体モノクローナル抗体を用いて IL- 6の機能制御により RAを治療する抗サイト力イン療法である（Nishimoto, N. et al. , Ann. Rheum. Dis. 59 : 121-1 27 (2000) ) 。

④ VEGF機能制御による治療法

可溶'性 VEGF受容体 (Miotla, J. et al. , Lab. Invest. , 80: 1195—205 (2000) ) または抗 VEGF抗体（Lu, J. et al.， J. Immunol. 164： 5922-7 (2000) ; Sone, H. et al. , Biochem. Biophys. Res. Coramun. 281： 562-8 (2001) ) を用いて VEGFの機能を阻害することによつて RAを治療する抗サイトカイン療法である。

し力し、これらの従来技術には幾つか問題点が存在する。主要な問題点としては、例えば最終的に骨関節破壌を免れることは困難であることが挙げられる。すなわち、従来の治療法及び薬剤では滑膜炎抑制に基づく自他覚症状の緩和という面にお！/ヽては治療効果が認められるものの、骨関節破壊の直接的抑制効果に乏しく、炎症抑制に起因すると考えられる骨破壊進展遅延作用を認めるのみで最終的に骨関節破壌を免れることは困難である。また、キメラ型中和抗体を用いた治療法においては、中和抗体に対するヒト抗キメラ抗体産生に伴う効果の減弱が認められ、臨床的にはメソトレキセートなどの免疫抑制剤との併用を余儀なくされる。更に、炎症性サイトカインを標的とした抗サイトカイン療法およぴ生物学的作用薬の全身投与法においては非罹患諸臓器に与える影響の面で種々の予期せぬ副作用を来たす可能性が十分考えられる。発明の開示

本発明は、 FGF2の機能を阻害、またはその細胞内信号伝達系を遮断することによる、骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法を提供する。また本発明は、 FGF2の機能を阻害、またはその細胞内信号伝達系を遮断する蛋白質をコードするベクターを含む、該疾患の治療組成物を提供する。 FGF2は細胞の分ィ匕おょぴ発生に重要な役割を果たす増殖因子である（Klansbrun ， M. , 1989， Prog. Growth Factor Res. 1 : 207—235 ; Mason, I. , 1994, Cell 78： 547-552 ; Bikfalvi, A. et al. , 1997, Endocr. Rev. 18 : 26-45)。 FGF2は FGF受容体（FGFR) を介して正常の発生過程おょぴ組織再生に重要な役割を果たしている他、癌増殖おょぴ炎症などにも関与する（Basilico, C. and Moscatelli, D, 199 2, Adv. Cancer Res. 59 : 115—165 ; Klein, S et al. , 1997, Experientia Suppl.

79 : 159-192 ; Jackson, J. et al. , 1997， FASEB J. 11： 457-465) ₀ また、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、表皮細胞などの細胞増殖を促進し、血管新生、骨'軟骨形成、および創傷治癒などにおける調節因子としても作用する（Marie, P. et al. , 2000, Joint Bone Spine 67 : 150 - 15b ; Boyce, B. et al.， 1999, Lab . Invest. 79： 83-94； Goldfarb, M. 1996, Cytokine Growth Factor Rev. 7 : 311— 325 ; Chikazu, D. et al.， 2000, J. Biol. Chem. 275 : 31444-31450； Yamashita, A. et al. , 2002, J. Immnol. 168 : 450—457 ; Collon— Osdoby, P. et al.， 2002， J. Bone Mineral Res. 17 : 1859—1871)。 FGF2は、 FGF 1 IIIb、 FGFR1 IIIc、 FGFR 2 IIIc、 FGFR3 IIIc、および FGFR4 に結合することが知られている (Ornitz et a 1.， 1996, J. Biol. Chem.， 271 : 15292-15297)。 FGF2が FGFRに結合すると、 FGFR のチロシンリン酸化活性により下流のシグナル分子がリン酸化され、 Ras、 Raf-1 、 MAPKK、 MAPKへとシグナルが伝達される。本発明者らは、このシグナル伝達を阻害する遺伝子を発現するベクターによりシグナル伝達を阻害する遺伝子治療を、炎症性骨疾患に対して適用することを考えた。

そこで本発明者らは、 FGF2の機能を阻害する分泌型 FGF受容体、並びに FGF2の細胞内信号伝達系を遮断する sprouty- 2および spredをコードするウィルスベクターを作製し、 RAモデルラットの疾患関節に投与する遺伝子治療を行なった。その結果、これらのうちいずれのベクターの投与においても関節の炎症が有意に抑制され、さらに該ベクターを投与した関節では、骨量の減少が緩和され、有意な治療効果を認めた。このように、 FGF2の機能阻害またはその細胞内信号伝達系を遮断する蛋白質を発現するベクターを骨疾患部位に局所投与することによって、疾患部位の炎症を抑えると同時に骨破壌も抑制し、症状を有意に改善することに成功した。 RAなどの骨破壊を伴う炎症性疾患においては、これまで効果的な治療方法がなかったが、本発明の方法に従った遺伝子治療により、患部の炎症と骨破壊を同時に抑制できる新しい治療が可能となった。ベクターを患部に局所投与すれば、全身投与における副作用を回避することができ、さらにベクターからのシグナル伝達阻害因子の発現により、長期間にわたって治療効果を持続することが可能である。

すなわち本発明は、 FGF2の機能阻害またはその細胞内信号伝達系の遮断により骨破壊を伴う炎症性疾患を治療する方法、およぴ該治療に用いる医薬組成物に関し、より具体的には、請求項の各項に記載の発明に関する。なお本発明は、請求項の各項に記載の発明の 1つまたは複数（または全部）の所望の組み合わせからなる発明も意図されている。すなわち本発明は、より具体的には、

( 1 ) 骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法であって、線維芽細胞増殖因子- 2 (FGF 2)一 FGF受容体 1一 Ras_Raf— MAPキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸をコードするべクタ一を投与する工程を含む方法、

( 2 ) ベクターがー本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルスベクターである、 ( 1 ) に記載の方法、

( 3 ) 一本鎖ネガティブ鎖 RNAゥィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、（2 ) に記載の方法、

( 4 ) 該シグナル伝達を阻害する蛋白質が、可溶性 FGF受容体、 sprouty- 2、およぴ spredからなる群より選択される、（1 ) から（3 ) のいずれかに記載の方法、

( 5 ) 該疾患が関節リウマチである、（1 ) から（4 ) のいずれかに記載の方法

( 6 ) 骨破壊を伴う炎症性疾患の治療組成物であって、線維芽細胞増殖因子- 2 (F GF2)一 FGF受容体 1一 Ras— Raf— MAPキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物、

( 7 ) ベクターが一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルスベクターである、（6 ) に記載の組成物、

( 8 ) 一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、（7 ) に記載の糸且成物、

( 9 ) 該シグナル伝達を阻害する蛋白質が、可溶性 FGF受容体、 sprouty- 2、および spredからなる群より選択される、 ( 6 ) から ( 8 ) のいずれかに記載の組成物

( 1 0 ) 該疾患が関節リウマチである、 ( 6 ) から ( 9 ) のいずれかに記載の組— 成物、に関する。本発明は、骨疾患における炎症と骨破壊の一元的治療に対して、 FGF2の機能制御、及ぴその細胞内信号伝達系の遮断により RAを治療する方法を提供する。つまり、本発明者らは、 FGF2—FGF受容体 l—Ras— Raf— MAPキナーゼ系を介した一連の FGF2シグナル伝達系の細胞外および/または細胞内における阻害を治療戦略として提供した。 FGF2シグナル伝達系を阻害する因子をコードするベクターを患部に投与することにより、患部の炎症と骨破壊とを同時に抑制することができる。 FGF2 はその受容体（FGFR) に結合すると二量体を形成し、チロシンの自己リン酸化が誘導され活性化される。活性化した FGFRチロシンキナーゼは Srcキナーゼ、ホスホリパーゼ (PLC γ ) 等の酵素の他、 Shc、 FGF receptor substrate 2 (FRS2) などのアダプター蛋白質のチロシンをリン酸化する。リン酸化された Sheおよび FRS2 は Grb2と結合し、 Sosを細胞膜へリクルートし、 Sosによって Rasが活性化される。活性型 Rasは Raf- 1キナーゼと結合し、 MAPKキナーゼを活性化、さらに MAPキナーゼが活性化される。 FRS2には SHP2というチロシンホスファターゼが結合する。 FGF2 一 FGF受容体 1— Ras— Raf— MAPキナーゼを介するシグナル伝達とは、上記に示した FGF2から MAPKに至るシグナル伝達である。このシグナル伝達の阻害とは、例えば F GF2から、 FGF受容体 1、 Ras、 Raf、および MAPキナーゼへと至るシグナル伝達の 1 つまたはそれ以上の所望のボイントを阻害することである。例えば FGF2、 FGF受容体 1、 Shc、 Grb2、 Sos、 FRS2、 SHP2、 Ras、 Raf、 MAPKK、および MAPKの活性（他のシグナル分子との相互作用またはリン酸化活性など）を阻害することであってよい。また、各シグナル分子の発現（転写、翻訳、または raRNA '蛋白質の安定性など）を阻害することであってよい。

FGF2—FGF受容体 1—Ras—Raf— MAPキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸としては、例えばこのシグナル伝達に関与する分子に対するアンチセンス核酸、 R 干渉（R Ai) 効果を有する RNA、リボザィム、または抗体などが挙げられる。アンチセンス核酸としては、シグナル分子をコードする遗伝子のセンス鎖の連続した 13ヌクレオチド以上、好ましくは 14ヌクレオチド以上、さらに好ましくは 15ヌクレオチド以上、さらに好ましくは 20ヌクレオチド以上に対するアンチセンス配列を含む核酸が挙げられる。例えば、初期転写配列中のェクソン一イントロン境界、イントロンーェクソン境界、翻訳開始コドンを含む領域、または成熟 mRNA中の蛋白質コード配列に対するァンチセンス配列を含む核酸などが好ましい。また、リボザィムとしては、標的遺伝子の mRNAを切断する RNA切断型リポザィムを利用できる。たとえば、ハンマーヘッド型リボザィム（Rossi et al . (1991) Pharmac. Ther. 50: 245-254) およびヘアピン型のリボザィム（Hampel et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18： 299—304, and U. S. Pat. No. 5, 254, 678) 力塩基配列特異的な切断作用を有することが知られている。これらのリボザィムは、ァンチセンス配列がハイブリダイズするポリヌクレオチドの特定の位置を、その触媒作用によって切断することができる。またシグナル伝達を阻害する抗体としては、シグナル分子の活性に重要なドメイン、例えばリン酸ィ匕部位または他のシグナル分子との相互作用部位に結合する抗体が用いられる。また、本発明においてさらに好ましい態様では、 FGF2— FGF受容体 1一 Ras— Raf —MAPキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質成分をベクターから発現させる。好ましい手段としては、大きく、 ①可溶性 FGF受容体遺伝子を用いたシグナル伝達の阻害、 ②細胞内シグナル伝達系（Ras-Raf- MAPキナーゼ系）を阻害する遺伝子を用いた阻害の二通りが挙げられる。発明の実施形態として具体的に以下に述べる。

1 . 可溶性 FGF受容体遺伝子を用いた遺伝子治療

現在までの諸家の研究により、滑膜組織においては FGF受容体 1から受容体 4が、破骨細胞においては受容体 1のみが発現していること、また、破骨細胞の分化およぴ生物学的機能発現において FGF受容体 1— MAPK (_Ρ42/ρ44ΜΑΡΚ) を介したシグナル伝達が重要であることが報告されている。本発明の好ましい態様では、ヒト可溶性 FGF受容体 (human soluble FGF receptor : hsFGFR) 遺伝子をベクターにより直接的に滑膜組織に導入する遺伝子治療法により FGF2を細胞外で機能阻害する。可溶性 FGF受容体とは、 FGF受容体の細胞外ドメィンにある FGF2結合ドメィンを含む蛋白質であって、細胞で発現させることにより細胞外に分泌される蛋白質である。分泌蛋白質をコードする核酸は、 FGF受容体遺伝子の膜貫通ドメィンおよび細胞内ドメインをコードする核酸を欠失させることにより得られる。細胞外に分泌された可溶性 FGF受容体は、 FGF2と結合し、 FGF2と内因性 FGFR - 1との結合と干渉することにより FGF2のシグナル伝達を阻害する。可溶' I4FGF受容体遺伝子を組み込んだべクターを骨破壊部位に投与することにより、炎症と骨破壊を抑制する顕著な効果が得られる。可溶性 FGF受容体としては、 FGF2と結合する FGF受容体の FGF2結合部位を含む分泌型蛋白質であればよく、天然の蛋白質おょぴ遺伝子組み換えにより人為的に作り出した蛋白質が含まれる。具体的には、例えば FGFRla Illb (Acce ssion NM_015850, NP— 056934， AAB19502, Isacchi, A. et al. , 1990， Nucleic A cids Res. 18 : 1906 ; Johnson, D. E. et al. , 1991， Mol. Cell. Biol. 11 : 4627-4 634) 、 FGFRlb (IIIb) (Accession NM_023106, NP_075594, AAB19502, Isacchi, A . et al.， 1990, Nucleic Acids Res. 18 : 1906; Johnson, D. E. et al. , 1991, M ol. Cell. Biol. 11 : 4627 - 4634) 、 FGFRla(IIIc) (Accession NM一 015850， NP一 056 934, AAB19502, Isacchi, A. et al. , 1990, Nucleic Acids Res. 18: 1906) 、 FG FRlb (IIIc) (Accession雇一 023106， NP— 075594, AAB19502, Isacchi, A. et al. , 1990， Nucleic Acids Res. 18 : 1906) 、 FGFR2 (IIIc) (Accession 022962, NP —075251, Johnson, D. E. et al. , 1991, Mol. Cell. Biol. 11 :4627-4634) 、 FGF R3 (IIIc) (Accession P22607, Keegan, K. et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sc

1. U. S. A. 88 : 1095 - 1099) 、 FGFR4 (Accession AAB25788, Ron, D. et al. , 1993 ， J. Biol. Chem. 268 : 5388-5394) の細胞外ドメインを含む分泌型蛋白質が挙げられる。特に好ましくは、スプライシングバリアントとして自然界に存在し、なおかつ FGF-2の天然のインヒビターとしての作用を有する FGFR1 IIIa、およびヒト線維芽細胞増殖因子受容体分泌型 (human fibroblast growth factor receptor ( FGFr) secreted form) などが挙げられる。例えば FGFr分泌型遺伝子の塩基配列（配列番号： 1 ) は Accession number M34188、アミノ酸配列（配列番号： 2 ) は pr otein ID AAA35839に示されている（Johnson, D. E. et al. , Mol. Cell. Biol. 1 0 (9) , 4728-4736 (1990) ) 。

2 . 細胞内シグナル伝達系の阻害による治療

sprouty- 2およぴ sprouty関連 Rasシグナル抑制因子である spredは Rasに結合し、 Rafのリン酸化と活性化を妨害して MAPキナーゼの活性ィ匕を抑制することで FGF受容体と上皮増殖因子（epidermal growth factor: EGF) 受容体の生理作用を調節している。この sprouty-2または spred遺伝子を遺伝子治療により滑膜組織および/または周囲の骨格筋に導入、局所で発現させることにより FGF2分子を介した滑膜炎症ならぴに破骨細胞性骨吸収を抑制し治療効果を発揮する。 sprouty 2 [Homo sap iens] の塩基配列（配列番号： 3 ) およびアミノ酸配列（配列番号： 4 ) は Acces sion number NM— 005842および NP— 005833に、 Spred- 2 [Mus musculus] の塩基配列 (配列番号： 5 ) およびアミノ酸配列（配列番号： 6 ) は Access ion number AB06 3496および BAB62849、ヒ Spred—2«Accession number ■— 181784および NP— 86144 9 に示されている (Hacohen, N. et al. , Cell 92 (2)， 253-263 (1998) ; Gl ienk e, J. et al. , Mech. Dev. 96 (1)， 91-99 (2000) ; Lira, J. et al. , J. Biol. C hem. 275 (42) , 32837-32845 (2000)； Wong, E. S. et al:， J. Biol. Chem. 276 (8) , 5866-5875 (2001)； Yusoff, P. et al. , J. Biol. Chem. 277 (5)， 3195-32 01 (2002)； Egan, J. E. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9)， 6041— 6046 (2002)； Wakioka, T. et al. , Nature 412 (6847) , 647—651 (2001) ) 。また、 Ras/Raf/MEK/MAPKを介した FGFシグナル伝達系のアンタゴニストとして作用する Sef (.similar expression to fgf genes) を用いること X)できる (Furthauer M ， et al. , Nat. Cell Biol" 2002, 4 (2) : 170 - 4) 。また、 fgf8、 fgf3、 sprouty4 なども利用し得る。

Sef (simi lar expression to fgf genes) (IL17RLM, FLJ35755, IL- 17RDとも称す）遺伝子の塩基配列は、 Accession number NM_017563の 523から 2307番目、 Sef のアミノ酸配列は、 NP_060033に例示されている（Clark, H. F. , et al. , Genome R es. 13 (10) , 2265-2270 (2003)； Yang, R. B. , et al. , J. Biol. Chem. 278 (35) ， 33232-33238 (2003)； Kovalenko, D. , et al. , J. Biol. Chem. 278 (16) , 1408 7-14091 (2003)； Furthauer, M.， et al. , Nat. Cell Biol. (2) , 170 - 174 (200 2)； Tsang, M. , et al. , Nat. Cell Biol. 4 (2)， 165 - 169 (2002) ) 。 FGF8 (fibr oblast growth factor 8) 遺伝子の塩基配列は、 Accession number匪—033165の 2 37から 782番目、 FGF8 (成熟蛋白質）のアミノ酸配列は、 NP_149355の 23から 204番目に例示されている（Gnanapragasam, V· J. , et al. , Br. J. Cancer 88, 1432-14 38 (2003) ; Gnanapragasam, V. J. , et al. , Oncogene 21， 5069-5080 (2002)； Tan aka, S. , et al.， Dig. Dis. Sci. 46, 1016—1021 (2001)； Ghosh, A. K.， et al.， Cell Growth Differ. 7, 1425-1434 (1996) ) 。 FGF3 (fibroblast growth factor 3) 遺伝子の塩基配列は、 Accession number藤— 005247の 543から 1208番目、 FGF3 (成熟蛋白質）のアミノ酸配列は、 NP_005238の 18から 239番目に例示されている (Kong, M. , et al. , J. Biol. Chem. 277 (18) , 15962 - 15970 (2002)； Galdemard , C.， et al.， J. Biol. Chem. 275 (23) , 17364—17373 (2000)； Thompson, L. M. , et al.， Genomics 11 (4)， 1133-1142 (1991) ) 。 sprouty4 (spry4とも称される) 遺伝子の塩基配列は、 Accession number ■— 030964の 188から 1153番目、 sprouty 4のアミノ酸配列は、 NP_112226に例示されている（Sasaki, A.， et al. , Nat. Cel 1 Biol. 5 (5) , 427-432 (2003)； Leeksma, 0. C.， et al. , Eur. J. Biochem. 269

(10) , 2546-2556 (2002) ) 。

また、上記した可溶性 FGFR、および FGFRの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質は、天然のアミノ酸を改変された蛋白質、例えば自然界に存在するバリアントおよび他の哺乳動物のカウンターパートを用いることができる。具体的には、天然の可溶性 FGFRまたは FGFRの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質のアミノ酸配列において 1または複数のァミノ酸が置換、欠失、および/または付加したァミノ酸配列を含む蛋白質、天然の可溶性 FGFRまたは FGFRの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質と 7 0%以上、好ましくは 75%以上、より好ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の同一性を有するァミノ配列を含む蛋白質、ならびに天然の可溶性 FGFRまたは FGFRの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質のコード領域の一部または全部を含む核酸とストリンジヱントな条件でハイブリダィズする核酸がコードする蛋白質であって、 FGF2—FGF受容体 1一 R as— Raf— MAPキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質は本発明において好適に用いることができる。例えば可溶性 FGFRであれば、 FGF2と結合する活性を有している分泌蛋白質であるかぎり所望の変異を有していてもよい。また sprouty 2または Spredの変異体であれば、 Rafのリン酸化を阻害する活性を持つものであるかぎり本発明において利用することができる。

アミノ酸の置換、欠失、および/または付加においては、改変されるアミノ酸数は、通常 15以内、好ましくは 11以内、より好ましくは 9以内、より好ましくは 7以内、より好ましくは 5以内である。特にアミノ酸を保存的に置換した蛋白質は活十生が維持されやすい。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグリシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン）、非極性アミノ酸（例えばァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエエ^^ァラエン、メチォニン、トリブトファン）、 ]3分岐アミノ酸（例えばスレオニン、ノリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。ァミノ酸配列の同一性は、例えば BLASTPプログラム (Altschul, S. F. et al. , 1990, J . Mol. Biol. 215： 403-410) を用いて決定することができる。具体的には blastp プログラムを用いることができる。例えば NCBI (National Center for Biothchno logy Information) の BLASTのゥ工ブベージにおいて Low complexityを含むフィノレターは全て OFFにして、デフオルトのパラメ一タを用いて検索を行う (Altschul, S. F. et al. (1993) Nature Genet. 3 : 266—272 ; Madden, T. L. et al. (1996) Me th. Enzymol. 266 : 131—141 ; Altschul, S. F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402； Zhang, J. & Madden, T.し. (1997) Genome Res. 7 : 649-656) 。例えば 2つの配列の比較を行う blast2sequencesプログラム (Tatiana A et al. ( 1999) FEMS Microbiol Lett. 174 : 247-250) により、 2配列のァライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に极い、例えば天然の可溶性 FGFRまたは FGFRの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質のァミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。また、ハイブリダィゼーシヨンにおレ、ては、天然の可溶性 FGFRまたは FGFRの細胞内シグナル伝達の阻害蛋白質のコード配列を含む核酸、またはハイプリダイズの対象とする核酸のどちらかからプローブを調製し、それが他方の核酸にハイプリダイズするかを検出することにより同定することができる。ストリンジヱントなハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5 X SSC、 7% (W/V) SDS、 100 /z g/ml 変性サケ精子 DNA、液（1 Xデンハルト溶液は 0. 2%ポリビニールピロリドン、 0. 2%牛血清アルブミン、および 0. 2%フイコールを含む）を含む溶液中、 48°C、好ましくは 50°C、より好ましくは 52°Cでハイブリダイゼーションを行い、その後ハイブリダイゼーションと同じ温度、より好ましくは 60°C、さらにこの好ましくは 65°C、最も好ましくは 6 8°Cで 2 X SSC中、好ましくは 1 X SSC中、より好ましくは 0. 5 X SSC中、より好ましくは 0. 1 X SSC中で、振蘯しながら 2時間洗浄する条件である。

上記のシグナル伝達を阻害する核酸または蛋白質の遺伝子を組み込むベクタ一としては、ウィルスベクター、およびプラスミドベクター等の naked DNA (裸の DN A) など所望のベタター系を用いることができるが、ウィルスベクターが特に好適である。ウィルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、単純へルぺスウィルスベクター、レトロウイルスベクタ一、レンチウイノレスベクター、セムリキ森林ウィルスベクター、シンドビスウイルスべクタ一、ワクシニアウィルスベクタ一、フオウルボックスウイノレスべクタ一、センダイウィルスベクターなどが挙げられる。これらのウィルスベクターは、遺伝子工学的に組み換えウィルスベクターとして調製することができる。

「組み換え」ウィルスベクターとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウィルスベクターまたはそれを増幅して得られるウィルスベクターである。なお、組み換えポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドの両端が自然の状態と同じようには配置していないポリヌクレオチドを言う。より具体的には、例えば人為的にポリヌクレオチド鎖が繋ぎ替えられたり、あるいは新たに生成されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み換え方法により生成させることができる。

組み換えウィルスベクターは当業者に周知の方法に従って調製することができる。例えば、遺伝子治療などに最も普通に利用されるアデノウイルスベクターの作製は、斎藤らの方法および他（Miyakeら、 1996、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 、 93巻、 1320- 24頁； Kanegaeら、 1996、 Acta Paediatr. Jpn、 38巻、 182 - 188頁；鐘ケ江ら、バイオマニュアルシリーズ 4 -遺伝子導入と発現'解析法、 1994、 43-58 頁、羊土社；鐘ケ江ら、 1994、細胞工学、 13巻、 8号、 757- 763頁）に従って製造することができる。また、例えばレトロウイルスベクター（脇本ら、 1995、蛋白質核酸酵素、 40巻、 2508- 2513頁）、およびアデノ随伴ウィルスベクター（玉寄ら、 1995、蛋白質核酸酵素、 40卷、 2532- 2538頁）なども、公知の方法により調製することができる。哺乳動物に遺伝子導入可能なその他のウィルスベクターを製造するための詳細は、組換えワクシニアウィルスを製造する方法としては、特表平 6 - 502069、特公平 6 - 95937、特公平 6- 71429が知られている。組換えパピローマウィルスを製造する方法としては特公平 6 - 34727、特表平 6- 505626が知られている。組換えアデノ随伴ウィルスを製造する方法としては、特開平 5 - 308975が知られている。組換えアデノウィルスを製造する方法としては、特表平 6 - 508039が知られている。

ウィルスベクターの中でも、本発明において特に好適なベタターは一本鎖ネガティブ鎖腿ウィルスベクターである。一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルスベクターとは、一本鎖のネガティブ鎖 [すなわち（-)鎖] RNAをゲノムに有するウィルスまたはその誘導体であって、遺伝子を宿主細胞に導入するベクター（担体）を言う。一本鎖ネガティブ鎖賺ウィルスとしは、パラミクソウィルス (Paramyxovirida e ; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等 - s' む) 、フプドウイノレス (Rhabdoviridae ; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ep hemerovirus属等を含む）、フィロウィルス（Firoviridae) 、オルトミクソウイルス (Ortnomyxoviriaae； Infuluenza virus A, B， C, ぉょぴ Thogoto- like vir uses等を含む) 、プニャウイルス (Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Na irovirus, およぴ Phlebovirus属等を含む）、ァレナウィルス（Arenaviridae) などの科に属するウィルスが含まれる。特に好ましくは、パラミクソウィルス科のウィルスベクター（本明細書においてこれをパラミクソウィルスべクターと言う）が用いられる。本発明者らは、 FGF2シグナルの阻害因子をコードするパラミクソウィルスベクターの投与が、骨破壊性関節炎の炎症おょぴ骨量の減少の両方を顕著に低下させることを実証した。パラミクソウィルスベクターは染色体非組み込み型の RNAウィルスベクターであり、外来遺伝子を一定期間、非常に高いレべルで発現させる特性を持つ。このようなベクターの特性が、本発明の方法における骨破壊性炎症疾患の治療にとって特に好ましい作用を及ぼしたと考えられる。本発明に用いられ得るパラミクソウィルスとしては、例えばパラミクソウィルス科 {Par amy xo viridae) のセンダイウイノレス (Sendai virus) 、ニュー力ッスノレ病ウイルス (Newcastle disease virus; 、おたふくぜゥイノレス (Mumps virus ) 、麻诊ウィルス (Measles virus) 、 RSウィルス (Respiratory syncytial viru s) 、牛疫ウイノレス (rinderpest virus) 、ジステンノーウイノレス (distemper vi rus) 、サルパラインフルェンザウイルス (SV5) 、ヒトパラインフルエンザウイルス 1, 2, 3型等が挙げられる。本発明においてパラミクソウィルスは、好ましくはパラミクソウィルス亜科 (Paramyxovirinae) (レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およびモービリウィルス属を含む）に属するウィルス、より好ましくはレスピロウィルス属 (Respirovirus) (パラミクソウイノレス属 (Paramyxovirus ) とも言う) に属するウィルスまたはその誘導体である。本発明に用いられ得るレスピロウィルス属ウィルスとしては、例えばヒトパラインフルェンザゥィルス 1型 (HPIV-1) 、ヒトパラインフルエンザウイルス 3型 (HPIV-3) 、ゥシパラインフルェンザウィルス 3型 (BPIV-3) 、センダイウイノレス（Sendai virus；マウスパラインフルエンザウイルス 1型とも呼ばれる）、およびサルパラインフルェンザウィルス 10型（SPIV- 10) などが含まれる。本発明においてパラミクソウィルスは

、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などであり得る。 DI粒子 (J. Virol. 68, 8413-8417 (1994) ) 等の不完全ウィルスまたは合成したオリゴヌクレオチド等も、ウィルスベクターを製造するための材料として使用することができる。

組み換えネガティブ鎖 RNAウィルスベクターは、ウィルスゲノムをコードする DN Aに適当な転写プロモーターを連結した組み換え DNAを構築し、これを試験管内または細胞内で転写させ、ネガティブ鎖 RNAウィルスの L、 P、および NPタンパク質の共存下で R Pを再構成させ、この RNPを含むウィルス粒子を形成させることにより生成させることができる。具体的には、通常、（a ) ネガティブ鎖 RNAゥイノレスに由来するネガティブ鎖一本鎖 RNAまたはその相補鎖（ポジティブ鎖）をコードするベクター DNAを、 NP、 P、および L蛋白質を発現する細胞（ヘルパー細胞）で転写させ、（b ) 該細胞を培養し、その培養上清からウィルス粒子を回収することにより調製することができる。ベクター DNAから転写された R Aは NP、 L、および Pタンパク質と RNP複合体を形成し、さらにェンべロープ蛋白質を含む外殻に包まれたゥィルス粒子が形成する。ウイルスべクタ一 DNAからのウイルスの再構成は公知の方法に従つて行うことができる (Hasan, M. K. et al. , J. Gen. Virol. 78： 2813- 2820, 1997、 Kato, A. et al. , 1997， EMBO J. 16： 578—587 ; Yu, D. et al. , 19 97, Genes Cells 2 : 457-466；国際公開 97/16539号；国際公開 97/16538号； Durbi n, A. P. et al. , 1997, Virology 235 : 323 - 332 ; Whelan, S. P. et al. , 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 8388—8392 ; Schnell. M. J. et al. , 1994， E MB0 J. 13 : 4195-4203； Radecke, F. et al. , 1995, EMBO J. 14： 5773—5784; La wson, N. D. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92： 4477—4481 ; Garcin, D. et al. , 1995， EMBO J. 14： 6087—6094 ; Kato, A. et al. , 1996, Genes Cells 1 ： 569-579； Baron, M. D. and Barrett, T.， 1997， J. Virol. 71： 1265 - 1271 ; B ridgen, A. and Elliott, R. M.， 1996， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93： 1540 0-15404) 。これらの方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウイ/レス、麻疹ウィルス、リンダ一ペストゥイノレス、センダイゥイノレスなどを含む所望のパラミクソウィルスベクターおよびその他の（-）鎖醒ウィルスべクタ一を DNAから再構成させることができる。ネガティブ鎖 RNAウィルスは発現される蛋白質量が極めて高く、遺伝子導入可能な細胞種も極めて広い。また、特にセンダイウィルス（SeV) は霊長類において重篤な有害作用を示さず、本発明においてヒトへの遺伝子治療に好適に用いられる（Hurwitz, J. L. et al. , Vaccine 15： 533-540, 1997) 。

ウィルスベクターは、野生型ウィルスの誘導体であってもよい。誘導体とは、ウィルスの遺伝子導入能を完全には損なわないように、ベクターが搭載するウイルス遺伝子またはウィルス蛋白質を改変したベクターを言う。このような改変は、ベクターの複製能を破壊したり、あるいは抗原性を減弱化したりするために行い得る。例えばゥィルスの伝播に必須の遗伝子を欠損させた複製能欠損型ウィルスベクターを用いることができる。パラミクソウィルスベクター DNAにおいては、 F遺伝子、 HN遺伝子、および/または M遺伝子等を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウィルス粒子を形成しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遗伝子およひ 7または他のウィルスのエンベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、導入し発現させることにより、感染性のウィルス粒子を形成させることが可能である。このような欠失型ウィルスベクターの製造方法は公知であり、これに従つてまたは順じて製造することができる (国際公開番号 W000/70055および W000 /70070参照）。ベクターからの外来遺伝子の発現量は、例えば、その遺伝子の上流に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（国際公開番号 W0 01/18223) 。また、ウィルスベクターは、このウィルス以外に由来するェンベロープ蛋白質を含むシユードタイプウィルスベクターであってもよい。このようなエンベロープ蛋白質には、 VSV-Gなどが挙げられる（国際公開番号 W000/70055 おょぴ W000/70070参照）。

またウィルスが持つアクセサリー遺伝子を欠損させてもよい。例えば SeVのァクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックアウトすることにより、培養細胞における遺伝子発現おょぴ複製は障害されることなく、マウス等の宿主に対する SeV の病原性が顕著に減少する（Kato, A. et al. , 1997, J. Virol. 71 : 7266-7272； Kato, A. et al. , 1997, EMBO J. 16 : 578—587 ; Curran, J. et al.， W001/04272, EP1067179) 。このような弱毒化ベクターは、 in vivo または ex vivoにおける毒性の低い遺伝子導入用ウィルスベクターとして特に有用である。

回収したウィルスべクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルトレーシヨン（濾過）、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製 ·分離方法またはその組み合わせにより行うことができる。「実質的に純粋」とは、ウィルスベクターが、それが存在する試料中の成分として主要な割合を占めることを言う。典型的には、実質的に純粋なウィルスベクターは、試料中に含まれる全蛋白質（但しキャリアーおよび安定剤として加えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクター由来の蛋白質の割合が 10%以上、好ましくは 20%以上、より好ましくは 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上を占めることにより確認することができる。パラミクソウイルスの具体的な精製方法としては、例えばセルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド硫酸エステルを用いる方法 (特公昭 62- 30752号公報、特公昭 62- 33879号公報、およぴ特公昭 62- 30753号公報）、およぴフコース硫酸含有多糖および/またはその分解物に吸着させる方法 (W097/32010) 等を例示することができる。

ウィルスの力価は、例えば CIU (Cell-Infected Unit) 測定または赤血球凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる (W000/70070； Kato, A. et a 1. , 1996, Genes Cells 1： 569 - 579； Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y.， Heraagguluti nating virus of Japan-liposome- mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Mo丄 ecu lar Medicine : Humana Press : pp. 295 - 306, 1999； Kiyotani, K. et al. , Viro丄 ogy 177 (1) , 65-74 (1990) ) 。また、 GFP (緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントすることにより力価を定量することができる（例えば GFP-CIUとして）。このようにして測定した力価は、 CIUと同等に扱うことができる（WO00/7OO70) 。得られたベクターは、骨破壊を伴う炎症性疾患に対する予防剤および治療剤となる。特に上記のベクターは、関節リゥマチの予防剤または治療剤として有用である。ウィルスベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。具体的には、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) などと適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。製造されたウィルスベクターを含む組成物は試薬または医薬として有用である。該組成物は、例えば、破骨細胞形成を抑制するための試薬おょぴ医薬として、骨破壊および/または炎症を抑制するための試薬おょぴ医薬として、または骨破壊疾患を予防または治療するための医薬として用いられる。

上記のように製造したベクターを骨破壊を伴う炎症性疾患患者の患部に投与することにより、症状を著しく軽減させることができる。ここで「骨破壊を伴う炎症性疾患」とは、骨の破壊、減少、吸収、および/または粗鬆化と炎症とを伴う疾患を言う。このような疾患としては、特に関節リゥマチ (RA) が挙げられる。本発明の方法を用いて、関節リゥマチの炎症および骨破壊を抑制することができる

。その他にも、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、種々の膠原病に続発する多発性関節炎などの治療も本発明の対象となる。

RAは関節滑膜の持続的な炎症で、その増殖および肥厚の結果、関節軟骨おょぴその周囲の骨破壊により、関節の変形おょぴ骨破壊に到る慢性疾患である。本発明は、 RAの滑膜炎および骨破壊の一元的治療に対して、 FGF2の機能制御、及ぴその細胞内信号伝達系の遮断により RAを治療する方法を提供する。つまり、本発明者らは、 FGF2— FGF受容体 1一 Ras— Raf— MAPキナーゼ系を介した一連の FGF2シグナル伝達系の細胞外及び細胞内阻害を RAに対する治療戦略として提供した。

1 . RA滑膜炎の抑制について

RA滑膜病変の主体は増殖性滑膜炎である。この増殖性滑膜炎において (病的)血管新生という病態生理学的現象に因って形成された新生血管は、 ①滑膜組織への栄養分供給路、 ②炎症細胞の到達経路、 ③破骨細胞前駆細胞の到達経路、 ④サイトカインなどの疾患メディエーターの到達経路という面で RA病態形成及び進展、骨破壌において重要である。従って血管新生因子の機能制御による RA治療戦略は合目的であり、滑膜における血管床の減少に伴つて炎症が抑制されるものと考えられる。また、本発明は血管新生因子の中でも RAにおける炎症及ぴ骨破壌の特異的増悪因子である FGF2の機能制御を標的としていることから、より選択的かつ強力な抗滑膜炎症作用を発揮するものと考えられる。

2 . RA骨破壌の抑制について

先にも述べたように、従来の技術では関節炎症と骨破壊を一元的かつ有効に治療することは困難であった。本宪-明における標的分子である FGF2は、血管新生因子としての生物学的作用のみならず、骨破壊において中心的役割を担う破骨細胞の分化、機能促進因子であることも報告されている。従って、 FGF2の機能制御により滑膜炎進展の抑制に留まらず、破骨細胞分化および機能を直接的に抑制することが可能であり、 RA治療における究極の目標である滑膜炎症、骨関節破壊という両現象の抑制が可能となる。

3 . ドラッグ 'デリパリ一システムについて

RAに対して有効とされる蛋白製剤を経口的あるいは経静脈的に全身投与した場合、 ①関節滑膜局所への薬剤の到達、 ②局所における有効濃度の獲得、 ③全身諸臓器における副作用の発現、などの解決すべき重要な問題点が残される。一方、本発明による遺伝子治療法は、ベクターを用い滑膜組織に治療遺伝子を発現させることで、関節局所において有効な遺伝子発現レベルを一定期間持続的に獲得することが可能となる。この遺伝子治療技術を用いることで、蛋白が局所あるいは全身で高濃度になることを避けることが可能である。

4 . 生物学的創薬技術について

本発明は FGF2の機能を抑制する遺伝子、または FGF2レセプタ一以降の細胞内シダナノレ伝達系を遮断する遺伝子が組み込まれたベクターを投与する方法を含む。つまり、細胞内シグナル伝達系における単一酵素の選択的阻害によって、より疾患 ·病態特異的な治療薬剤の製造及び治療が可能となる。このように本発明によつて疾患特異的分子の選択的阻害という理想的な生物学的創薬が可能となる。ベクターの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、骨破壊性の炎症がある患部に特異的に到達するように、局所注入されるか、あるいは適当なドラッグデリバリーシステムにより患部に到達するように投与されることが好ましい。パラミクソウィルスベクターであれば、投与されるベクターの濃度は好ましくは約 10⁵ CIU/mlから約 10¹¹ fu/ml , より好ましくは約 10⁷ CIU/mlから約 10⁹ CIU/ ml、最も好ましくは約 1 X 10⁸ CIU/mlから約 5 X 10⁸ CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な担体中で投与することが好ましい。投与量は、 1箇所あたり好ましくは約 10⁵ pfuから 10¹¹ pfu、より好ましくは約 10⁷ pfuから 10⁹ pfu_N 最も好ましくは約 10 ⁸ pfuから 10⁹ pfuで投与する。複数のベクターを組み合わせて投与する場合には、それぞれを上記の量で投与するとよい。投与は 1箇所または複数箇所（2， 3, 4, 5 〜： 10箇所）に投与してよい。エタスビポ投与の場合は、体外（例えば試験管またはシャーレ内）で患者から取り出した細胞などにベクターを接触させる。 M0Iは 1 〜500の間で投与することが好ましく、より好ましくは 2〜300、さらに好ましくは 3〜200である。その後、細胞を患者に注入する。本発明のベクターを含む組成物の投与対象としては、ヒト、およびサル、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ゥシ、ィヌなど全ての非ヒト哺乳動物が含まれる。図面の簡単な説明

図 1は、 Raf阻害薬投与による破骨細胞形成の抑制を示す図である。結果は平均士標準偏差で表した。統計学的解析は one- way AN0VAを用いた。 * ：危険率 pく 0. 01で有意差ありと判定した。（n=各 8培養群（culture groups) ) 。

図 2は、 sFGFR遺伝子導入による AIA治療効果を示す図である。図中、ベクターのインジヱクションは sFGFR遺伝子を搭載した SeVをフットパッド投与した時点を示す。結果は平均土標準誤差で表した。統計学的解析は Mann-Whitney U-testを用い、 * ：危険率 p < 0. 01で有意差ありと判定した。

図 3は、 spry2遺伝子導入による AIA治療効果を示す図である。図中、ベクターインジェクションは spry2遺伝子を搭載した SeVをフットパッド投与した時点を示す。結果は平均土標準誤差で表した。統計学的解析は Mann-Whitney U- testを用いた。 # ：危険率 P < 0. 05、 * ：危険率 pく 0. 01で有意差ありと判定した。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、本明細書の一部として組み込まれる。

[実施例 1 ] 培養破骨細胞形成に与える Raf阻害薬の影響

1 . ラット骨髄由来マクロファージの分離培養

ラット骨髄由来マクロファージはマクロファージコロニー刺激因子（Macrophag e colony stimulating factor: M-CSF) を用いて分離培養した。 8頭のチャールズリパーグレード Lewisラット（6週齢、 KBTオリエンタル、鳥栖、佐賀）を用い、麻酔下に頸椎脱臼により犠牲死させ、頸動脈を切断し脱血した。無菌下に両側の大腿骨及ぴ脛骨の骨幹部を摘出、培養液（a - modified essential medium: α -ΜΕΜ (GIBCO BRL, Rockville, Maryland, USA) ) を骨髄腔に注入し骨髄細胞を採取した。 0. 727% NH₄Cl-0. 017% Tris-Cl (pH7. 2) -phosphate buffered saline (PBS) 溶液を用いて赤血球を.洗浄後、 10%仔牛血清（fetal bovine serum: FBS) 、リコンビナントヒト M- CSF (recombinant human M - CSF : rhM-CSF, 10 ng/ml, CHEMICON Int ernational, Inc. Temecula, CA) 含有 a -MEMを用い 180 mlフラスコに 5 X 10⁶個撒いた。 3日後、 PBSにて洗浄し、 0. 05% trypsine/0. 02% EDTA含有 PBSで接着細胞を剥がし、 180 mlフラスコに 10⁶個撒いた。 3日後、同様の方法で細胞を回収し液体窒素中に保存した。この方法で分離したラット骨髄由来マクロファージを M- CSF依存フット骨齒マクロファ¹ ~ン (M—CSr - dependent bone marrow macrophages： MDBM ) と定義した。

2 . 破骨細胞形成に与える Raf阻害薬の影響

予めjf整した 10% FBS、 rhM-CSF (10 ng/ml) _N recombinant human soluble rece ptor activator of nucleus factor-kappa B ligand (sRANKL, 50 ng/ml, PeproT ech EL, Ltd. London, U. K. )、及ぴ recombinant human FGF basic (rhFGF-2, 10η g/ml, Genzyme/Techne, Minneapolis, MN, USA)含有 CK - MEMを用い、 96穴プレートに MDBMを 5 X 10³個/冊 11で撒いた。接着後、 dimethylsulfoxide (DMS0) に溶解した Raf阻害薬 (Raf- 1 Kinase Inhibitor I， Caloiochem, San Diego, CA, USA) -a 添加した（10 i l/well) 。コントロール群には DMS0のみを同量添カ卩した。 3日後に培養液を交換し、再度 Raf阻害薬を添加した。培養開始より 7日目に leukocyte aci d phosphatase kit (Sigma Chemical Co. , St. Louis, M0, USA)を用いて酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（tartrate- resistant acid phosphatase : TRAP) 染色を施行、 TRAP陽性の 3核以上を有する多核巨細胞を破骨細胞と定義し形成破骨細胞数を比較検討した。その結果、 Raf阻害薬投与により濃度依存的に破骨細胞形成が抑制され、いずれの濃度においてもコントロールとの有意差が認められた（図 1 ) 。

[実施例 2 ] AIAに与える sFGFR遺伝子導入の影響： FGF-2細胞外遮断〈方法〉 1 . AIAモデル

AIAは、結核菌の死菌 (Mycobacterium Butyricum Desiccated: MBD, Difco, De troit, MI, USA) 1 mgを鉱物油 (NACALAI TESQUE, 京都） 100 に懸濁し、ラットの尾根部に皮下投与した。

2 . FGF- 2細胞外遮断実験プロトコール

糸且換セングイウイノレスベタター (recombinant Sendai virus vector： SeV) を用いたラットへの直接的遺伝子導入法により炎症局所で標的遺伝子を発現させ、関節炎に与える影響を検討した。具体的には、関節炎の発症を確認し、アジュパント投与後 14日目に AIA+sFGFR群（n=40足）では可溶型 FGFレセプター遺伝子（s oluble FGF receptor : sFGFR, 配列番号： 1 ) 搭載 SeV (SeV-sFGFR) を、対照群の AIA+luciferase群 (n=28足) ではホタルルシフェラーゼ遺伝子搭載 (SeV-lucif erase) をそれぞれ 10⁸ pfu/足でフットパッドに投与した。

3 . 後肢容積の測定

関節炎による後肢腫脹を定量ィ匕する目的でボリュームメーター（MK - 550; 室町器械、東京）を用いて後肢容積 (hind paw volume : hpv) を経時的に測定した。

4 . レントゲン学的骨 ·関節破壊の評価

レントゲン学的骨 .関節破壊を検討する目的で、 Day21および Day28でラットを犠牲死させ、下腿の中央部で後肢を切断し軟線撮影 (C B-2 ; ソフテックス社、東京）を施行し、レントゲン学的骨 ·関節破壊の程度を 5段階に分類し評価した。本実施例のレントゲン学的骨 '関節破壊指数（Radiological Index: RI) は以下の通りである。（0：所見なし、 1：軽度の骨萎縮及ぴ軟部陰影の腫脹、 2：関節裂隙の狭小化及び中等度の骨萎縮、 3：骨 ·軟骨ビランまたは中等度の関節破壊、 4：高度の骨破壊による関節構造の消失）。

廳〉

図 2 Aに経時的後肢容積を示す。 Day21における後肢容積は AIA+sFGFR群が 3. 06土 0. 1、 AIA+luciferase群が 3. 93±0. 11 ml、 Day28においては AIA+sFGFR群が 2. 85±0 . 1、 AIA+ludferase群が 3. 29士 0. 12 mlであり、いずれの時点においても sFGFR遺伝子導入による FGF-2細胞外シグナル遮断により後肢腫脹が有意に抑制された。図 2 Bに Dayl4から Day21における容積変化率を示す。その結果、 AIA+sFGFR群が 0 . 18±0. 07、 AIA+ludf erase群が 0. 86± 0. 09mlであり、ベクター投与後 7日における容積変化率においても FGF-2細胞外シグナル遮断により有意に抑制された。

図 2 Cにレントゲン学的骨 ·関節破壌指数を示す。 Day21では AIA+sFGFR群が 1. 42 ±0. 29 (n=12足) 、 AIA+luciferase群が 1. 9±0. 28 (n=10足) 、 Day28では AIA+sFG FR群が 1. 27±0. 18 (n=26足) 、 AIA+lucぱ erase群が 3. 0±0. 21 (n=14足) であり、 Day28において FGF- 2細胞外シグナル遮断により骨 ·関節破壊が有意に抑制された

[実施例 3 ] AIAに与える spry2遺伝子導入の影響： FGF- 2細胞内シグナル遮断〈方法〉

1 . AIAモテノレ

結核囷のタ E囷 (Mycobacterium Butyricum Desiccated: MBD， Difco 1 mg 鉱物油（NACALAI TESQUE) 100 μ ΐに懸濁し、ラットの尾根部に皮下投与した。

2 . FGF-2細胞内遮断実験プロトコール

組換セングづウイノレスベタタ一 (recombinant Sendai virus vector: SeV) を用いたラットへの直接的遺伝子導入法により炎症局所で標的遺伝子を発現させ、関節炎に与える影響を検討した。具体的には、関節炎の発症を確認し、アジュパント投与後 14日目に AIA+spry2群 (n=33足）では human sprouty2遺伝子 (spry2 ; 配列番号： 3 ) 搭載 SeV (SeV-spry2) を、対照群の AIA+ludferase群（n=33足）ではホタルルシフェラーゼ遺伝子搭載 SeV (SeV-luciferase) をそれぞれ 10⁸ pfu/ 足でフットパッドに投与した。

3 . 後肢容積の測定

関節炎による後肢腫脹を定量化する目的でボリュームメーター（MK- 550; 室町器械）を用いて後肢容積 (hind paw volume : hpv) を経時的に測定した。 4. レントゲン学的骨'関節破壊の評価

レントゲン学的骨 ·関節破壊を検討する目的で、 Day21および Day28でラットを犠牲死させ、下腿の中央部で後肢を切断し軟線撮影 (CMB-2 ; ソフテックス社）を施行し、レントゲン学的骨 ·関節破壊の程度を 5段階に分類し評価した。本実施例のレントゲン学的骨 ·関節破壊指数（Radiological Index: RI) は以下の通りである。（0：所見なし、 1：軽度の骨萎縮及び軟部陰影の腫脹、 2：関節裂隙の狭小化及ぴ中等度の骨萎縮、 3：骨 ·軟骨ビランまたは中等度の関節破壊、 4：高度の骨破壊による関節構造の消失）。

〈結果〉

図 3 Aに経時的後肢容積を示す。 03721にぉける後肢容積は + 2群が3. 33± 0. 1、 AIA+luciferase群が 3. 85±0. 12 ml、 Day28においては AIA+spry2群が 3. 07 ± 0 • 12、 AIA+luc:iferase群が 3. 38±0. 16 mlであり、いずれの時点においても spry2遺伝子導入による FGFRl/Ras/Raf/MAPKを介した FGF-2細胞内シグナル遮断により後肢腫脹が有意に抑制された。

図 3 Bに Dayl4から Day21における容積変化率を示す。その結果、 AIA+spry2群が 0 . 21±0. 07、 AIA+luciferase群が 0. 77±0. 08 mlであり、ベクター投与後 7日における容積変化率においても FGF-2細胞内シグナル遮断により後肢腫脹が有意に抑制された。

図 3 Cにレントゲン学的骨 ·関節破壊指数を示す。 Day21では AIA+spry2群が 1. 36 ±0. 20 (n=ll足）、 AIA+luciferase群が 2. 27±0. 33 (n=ll足）、 Day28では AIA+sp ry2群が 1. 82 土 0. 19 (n=22足) 、 AIA+luciferase群が 3. 0±0. 28 (n=22足) であり、いずれの時点においても FGF- 2細胞内シグナル遮断により骨 ·関節破壌が有意に抑制された。産業上の利用の可能性

本発明により、「FGF2の機能阻害またはそのシグナル伝達経路の阻害」という概念のもとより疾患特異的かつ有効で更により安全な生物学的創薬が可能となる。また、 RA治療戦略において血管新生因子 FGF2分子を標的とすることで、関節炎症の抑制のみならず、病期進展の抑制、更に骨破壊に至らないようにする有効な治療法が確立される。

Claims

請求の範囲

1 . 骨破壊を伴う炎症性疾患の治療方法であって、線維芽細胞増殖因子- 2 (FGF2) 一 FGF受容体 1一 Ras— Raf— MAPキナーゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸をコードするベクターを投与する工程を含む方法。

2 . ベクターが一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルスベクターである、請求項 1に記載の方法。

3 . 一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、請求項 2に記載の方法。

4 . 該シグナル伝達を阻害する蛋白質が、可溶性 FGF受容体、 sprouty- 2、および s predからなる群より選択される、請求項 1に記載の方法。

5 . 該疾患が関節リゥマチである、請求項 1に記載の方法。

6 . 骨破壊を伴う炎症性疾患の治療組成物であって、線維芽細胞増殖因子- 2 (FGF 2)一 FGF受容体 1一 Ras— Raf— MAPキナ一ゼを介するシグナル伝達を阻害する蛋白質または核酸をコードするベクター、および薬学的に許容される担体を含む組成物

7 . ベクターが一本鎖ネガティブ鎖 R Aウィルスベクターである、請求項 6に記載の組成物。

8 . 一本鎖ネガティブ鎖 RNAウィルスベクターがセンダイウィルスべクターである、請求項 7に記載の組成物。

9 . 該シグナル伝達を阻害する蛋白質が、可溶性 FGF受容体、 sprouty- 2、および s predからなる群より選択される、請求項 6に記載の組成物。

1 0 . 該疾患が関節リウマチである、請求項 6に記載の組成物。