JPWO2005056791A1 - 新規PlexinポリペプチドとそれをコードするDNA、及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
(Ishikawa,K.,Nagase,T.,Suyama,M.,Miyajima,N.,Tanaka,A.,Kotani,H.Nomura,N.and Ohara,O.,DNA Res.,1998,5:169−176,Prediction of the coding sequences of undidentified human genes X.The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which can code for large proteins in vitro.,GenBank Accession No.AB014520,6,754 bp,1,746aa,Homosapiens,cDNA,KIAA0620,Ohara O.et al.)が報告され、マウス発生過程において血管内皮細胞あるいは中枢神経系(CNS)でヒトKIAA0620関連遺伝子のmRNAが発現していること等が報告(van der Zwaag,B.et al.,Dev.Dyn.,2002,225:336−343)されているが、その機能については不明であった。
本発明の第二の態様として、以下の(a)、(b)又は(c)のDNA:(a)配列番号:2、配列番号16又は配列番号19で示される塩基配列において、配列番号:1で示されるアミノ酸配列(配列番号:2の塩基対第3〜5,240番目の5,238塩基対長)、配列番号:15で示されるアミノ酸配列(配列番号:16の塩基対第3〜5,993番目の5,991塩基対長)、又は配列番号18で示されるアミノ酸配列及びそれらの一部(例えば、以下に示す新規Plexin配列に認められるモチーフの少なくとも一つを有するもの、又は、配列番号1で示されるアミノ酸配列において2番目(メチオニン)〜1,746番目(アラニン)の1,745個のアミノ酸から成るポリペプチド、又は配列番号15で示されるアミノ酸配列において2番目(メチオニン)〜1,997番目(アラニン)の1,996個のアミノ酸から成るポリペプチド)又は全部をコードするDNA;(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;又は(c)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、(a)のポリペプチドの一部又は全部と実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするDNAに係る。
以上の本発明の第一及び第二の態様であるDNAをまとめて、以下、「本発明のDNA」ともいう。本発明のDNAは、新規ポリペプチドをコードするものである。又、本発明はこれらDNAを含む、ラット、マウスあるいはハムスター等の齧歯類由来遺伝子、特にマウス遺伝子にも係る。特に、このようなマウス遺伝子は「マウス(m)KIAA0620遺伝子」又は「mpf00920遺伝子」ともいう。
更に、本発明は本発明のDNA又は遺伝子(以下、「KIAA0620遺伝子」ともいう。)にコードされるポリペプチド(以下、「本発明のポリペプチド」ともいう。)、例えば、本発明のDNA又は遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質であるポリペプチド(以下、「KIAA0620蛋白質」ともいう)に係る。それらは齧歯類における個体発生時の血管内皮細胞(Flk−1陽性細胞:文献1,10,12,14)、又は血管内皮細胞の前駆細胞から血管内皮細胞に分化する途中の細胞の新規な分子マーカーとして有用である。或いは、本発明のポリペプチドは、血管新生に関わるバイオマーカー、抗体作製に必要なアミノ酸配列、血管新生阻害剤等を提供するものとして有用である。
また、本発明は、本発明のDNA又は遺伝子を含む組換えベクター、及び、本発明のポリペプチド若しくはその部分ペプチド(例えば、以下の実施例に示すような、C−末端領域にある数個数十個のアミノ酸配列からなるポリペプチド)、又は該ポリペプチドを含む組換え蛋白質を又はそれらの塩に特異的に結合する抗体に係る。
即ち、本発明のDNA又は遺伝子を用いた、血管増殖分化制御因子又は制御化合物のスクリ−ニング方法、及び該方法に用いる遺伝子発現測定キット;本発明のポリペプチド若しくは組換え蛋白質を用いて作製した蛋白質相互作用検出系又はアゴニスト・アンタゴニスト・生体内リガンド検索系に基づく、血管増殖分化制御因子又は制御化合物のスクリ−ニング方法、及び方法に用いるポリペプチド結合物質測定キット;組換え動物若しくは組換え動物細胞を用いた、血管増殖分化制御因子又は制御化合物のスクリ−ニング方法、及び該方法に用いる血管増殖分化制御活性測定キット;更に、本発明の抗体を用いて作製した蛋白質相互作用検出系、アゴニスト・アンタゴニスト・生体内リガンド検索系に基づく、血管増殖分化制御因子又は制御化合物のスクリ−ニング方法、及び該方法に用いる抗体力測定キット等も提供する。
又、本発明の遺伝子配列は、個体発生時の血管形成時期の初期から血管形成時期全般を通して血管特異的に発現し、成長後の成体では胃・重層扁平上皮に於いて強い発現、子宮に於いてやや強い発現が、また脳をはじめとする各種臓器に於いて発現していることが今回初めて見出され、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドが血管新生において、あるいは脳をはじめとする各種臓器において、発育、機能保全、更に各種臓器における血管新生が関係する疾患に関わる重要な働きに関わっている可能性が示された。
融合蛋白質として産生させた場合には、適当な蛋白質限定分解酵素を用いて不必要なポリペプチド部分を除去することもできる。
本発明ポリペプチド(蛋白質)又はその塩の存在は、様々な結合アッセイ及び特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ等により測定することができる。
(1)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)(1975年)(2)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座1、蛋白質の化学IV、205、(1977年)(3)矢島治明監修、続医薬品の開発第14巻ペプチド合成広川書店。
又は、一部からなるペプチドは、例えば、C−末端から十数残基の配列或いは配列番号:1で示されるアミノ酸配列の任意の場所の十数残基の部分を公知のペプチド合成装置等を用いて合成することができる。更に、このような部分ペプチドは例えば約50から500アミノ酸長までの長さの適当な部位のポリペプチド、または約500アミノ酸長から全長までの長さの適当な場部位のポリペプチドを選択して、組換え蛋白質として前述の遺伝子組換え技術を用いて製造しても良い。
〔配列番号:1〕本発明のポリペプチドのアミノ酸配列(アミノ酸数:1,746)を示す。
〔配列番号:2〕配列番号:1で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を含む、クローンmpf00920の全塩基配列(6,178塩基対)を示す。
〔配列番号:15〕配列番号1に示される本発明のポリペプチドのN末端側に更に251個のアミノ酸(配列番号11)が付加されたアミノ酸配列(アミノ酸数:1,997)を示す。
〔配列番号:16〕配列番号:配列番号:15で示されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコードするDNAの塩基配列を含む全塩基配列(6,931塩基対)を示す。
〔配列番号:18〕マウス由来の本発明ポリペプチド膜外領域のアミノ酸配列(アミノ酸数:1,337)を示す。
〔配列番号:19〕配列番号:18で示されるアミノ酸配列を有する本発明ポリペプチド膜外領域をコードするDNAの塩基配列を含む全塩基配列(4,011塩基対)を示す。
attB1部位を有するオリゴヌクレオチド:5’−FgcGCACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGCGGCCGC(T)18−3’(F、gおよびcは、それぞれフルオレッセイン基、フォスフォロチオエイト修飾G、フォスフォロチオエイト修飾C残基を表す)をプライマーとして、マウス胎児尾芽(ICRマウス受精11.5日目のS1,S0,S−1,及びS−2に関わる前体節中胚葉及び体節中胚葉)由来mRNAを鋳型にSuperScriptII逆転写酵素キット(インビトロジェン社製)で2本鎖cDNAを合成した。これにattB1部位を有するアダプターをcDNAにライゲーションした。その後、アガロースゲルで1kb−2kb、2kb−3kb、3kb−4kb、4kb−5kb、と5kb−7kbにcDNAをサイズ分画した。これらを、サイズを小さくしたattP pSPORT−1エントリーベクター(インビトロジェン社製)にBP反応により移し換えた後、大腸菌ElectoroMax DH10B株(インビトロジェン社製)にエレクトロポーレーション法により導入した。プレートに出現した106個以上の形質転換体を集め、液体培地中で、37℃で2−3時間培養した後プラスミドを調製した。スーパーコイルドプラスミドの形でサイズ分画した後、LR反応によりattR pBCデスティネーションベクター(インビトロジェン社製)にcDNAを移し換えた。このプラスミドを精製後、DH10B株にエレクトロポーレーション法により導入し、各分画が期待されるサイズになるまで、上記の分画操作を2−3回繰り返した。最後に各分画ごとにDH10B株にプラスミドを導入した。なお、ここで用いた試験管内での相同組み換え反応を利用したクローニングシステムは小原等の方法(Nucreic Acids Res.,29,e22(2001)およびDNA Research Vol.9,47−57(2002))に従った。
次に、こうして得られた全塩基配列に基づき、DNA解析プログラム(Fasta & Blast)を用いたホモロジー検索を実施したところ、公開されているデータベースの中のヒトKIAA0620遺伝子と高いホモロジーを示す候補クローンmpf00920が見出された。更に、別のDNA解析プログラム(BESTFIT)を用いて、このクローンmpf00920とヒトKIAA0620のアミノ酸配列と塩基配列について比較したところ、アミノ酸配列のレベルでは、ヒトKIAA0620遺伝子がコードするアミノ酸配列(1,985アミノ酸長)の238番目から1,985番目(1,748アミノ酸長)と配列番号:1で示されるmpf00920のアミノ酸配列(1,746アミノ酸長)の1番目から1,746番目までアミノ酸配列(1,746アミノ酸長)について、約91.88%のホモロジーを示すことが判明した。また、本発明の配列番号:1で示されるアミノ酸配列(1,746アミノ酸長)の974番目から975番目の間に、ヒトKIAA0620遺伝子がコードするポリペプチドのアミノ酸配列では、2つのアミノ酸、すなわちバリン及びアラニン(V,A)の挿入が認められることが判明した。
本発明のDNAに関して、PROSITE databaseを検索するための蛋白質解析プログラムであるpftools(Bairoch A,Bucher P,Hofmann K,Nucleic AcidsRes.1997 Jan 1;25(1):217−21)、及びPfam databaseを検索するための蛋白質解析プログラムhmmer2.1(Sonnhammer,E.L.L.,Eddy,S.R.,Birney,E.,Bateman,A.,and Durbin,R.,Nucleic Acids Res 1998;26,320−322)を用いてモチ−フ検索を行なった(Suyama et.al.1999 Nucleic Acids Res.27:338−339)。
ヒトKIAA0620遺伝子は、Plexinファミリー(Tamagnone,L.,et at.,2001,Cell,99:71−80)であること、ヒトKIAA0620遺伝子をプローブとしてマウス発生過程においてmRNAを検索した結果、血管内皮細胞あるいは中枢神経系(CNS)でヒトKIAA0620遺伝子とハイブリダイズするmRNAが発現していること等の報告があるが(van der Zwaag,B.et al.,Dev.Dyn.,2002,225:336−343)、本発明の新規Plexin遺伝子のマウス発生過程における、発現部位は不明であった。本発明の遺伝子うちの一つであるマウスmpf00920遺伝子の発生過程における発現部位を検索することを目的として以下の実験を行った。
ヒトにおけるmRNAレベルでのヒトKIAA0620遺伝子の発現頻度についての知見はないが(http://www.kazusa.or.jp/huge/gfpage/KIAA0620/、DNA Res.,1998,5:169−176earch,1997,4:345−349)、ヒトKIAA0620遺伝子と相同性を示すマウスmpf00920遺伝子のマウスにおけるmRNAレベルでの発現頻度について、in situハイブリダイゼーション法により成長後の成体マウスを用いて組織特異的発現を解析することにより検索した。マウスmpf00920遺伝子をPCR法で増幅してProbeを作成するために必要なフォアワードプライマーとリバースプライマーを市販のDNA自動合成機を用いて合成した。フォアワードプライマーの配列を5’−CCCCGGAACTTGAACGTGTC−3’(配列番号:3)、リバースプライマーの配列を5’−CCACCTGTTCAAACTTGTGCTG−3’(配列番号:4)とし、それらのプライマーを用いてマウスmpf00920遺伝子の転写産物をPCR法で増幅すると、アンチセンスあるいはセンスプローブとして働く各々約1,069塩基長(bp)のDNA断片が得られる設計にした。目的とするPCR産物、すなわちアンチセンスあるいはセンスプローブ用の約1,069(bp)DNA断片をPromega社が供給するT−vectorにクローン化した。T−vectorにクローン化した1,069(bp)DNA断片を鋳型とし、T7またはSP6RNAポリメレースを用いてPromega社が示す方法によりマウスmpf00920遺伝子発現産物を検出可能とするアンチセンスcRNAプローブ及び陰性コントロール用として使用するセンスcRNAプローブを作製し、同遺伝子の組織特異的発現解析を目的とする以下の実験に供した。
RT−PCR法によりマウスにおけるマウス胎仔発生過程に於けるmKIAA0620のmRNAレベルでの発生段階特異的発現を解析した。フォアワードプライマーの配列を5’−CCCCGGAACTTGAACGTGTC−3’(配列番号:3)、リバースプライマーの配列を5’−CCACCTGTTCAAACTTGTGCTG−3’(配列番号:4)とし、それらのプライマーを用いてマウスmpf00920遺伝子の転写産物をPCR法で増幅すると、アンチセンスあるいはセンスプローブとして働く各々約1,069塩基長(bp)のDNA断片が得られる設計にした。目的とするPCR産物、すなわちアンチセンスあるいはセンスプローブ用の約1,069(bp)DNA断片をPromega社が供給するT−vectorにクローン化した。T−vectorにクローン化した1,069(bp)DNA断片を鋳型とし、T7またはSP6RNAポリメレースを用いてPromega社が示す方法によりマウスmpf00920遺伝子発現産物を検出可能とするアンチセンスcRNAプローブ及び陰性コントロール用として使用するセンスcRNAプローブを作製し、同遺伝子のマウス胎仔発生過程に対応した発現強度解析を目的とする以下の実験に供した。すなわち、各マウス胎仔発生過程における1stストランドcDNAと上記プライマーをそれぞれ混合し、各々についてPCRを行い、マウスKIAA0620遺伝子の転写産物のうち約1,069(bp)DNA断片の増幅を図った。PCRは、TaqポリメラーゼとしてTaKaRa Ex Taq(宝酒造,#RP001A)を用い、上述のDNA混合液を95°C(2.5分)で加熱した後、95°C(30秒)/60°C(30秒)/72°C(30秒)のサイクルを35回繰り返して行った。コントロールとしてFlk1遺伝子発現を検出するプライマーを使用したFLk1転写産物由来約1129bpDNA断片の増幅も同様にして行った。増幅を終えたPCR産物を、サイズマーカーとともに2% agarose gel(Rockland社製、#50070)を用いて電気泳動で分画し、分画したPCR産物の量を半定量的に比較した(図5)。その結果、Flk1はマウス胎仔発生過程に於ける血管形成が開始された7.5d.p.c.で発現が認められ、血管形成時期を通じて9.5d.p.c.に至るまで高発現が継続したのに対し、マウスKIAA0620遺伝子発現は、血管形成が観察されるようになる時期より少し早い6.5d.p.c.で検出され、血管形成時期を通じて9.5d.p.c.に至るまで高発現が継続した。このことにより、従来から血管形成のマーカー遺伝子としていわれてきたFlk1に対し、更に早い時期にKIAA0620は発現し血管形成を誘導していると推察することが出来た。
マウスmKIAA0620(遺伝子名:mpf00920)の5’端はヒトKIAA0620に比較して短く、mKIAA0620塩基配列に対し付加する配列があるのではないかと推測された。しかし、上記(2)においてヒトKIAA0620遺伝子との比較から推測された5’端配列をマウスcDNAライブラリーから取得することは困難を極めた。そこで、長鎖cDNAといった対象テキスト配列が長い材料を哺乳動物のゲノム配列を高速検索することを可能にするために、特開2003−216615号公報に基づくメモリに比較回路を付加したcontent addressable memory(CAM)を用いた配列の長さに計算時間が依存しない並列比較可能な計算機(ハードウエア)開発とその制御アルゴリズム設計を鋭意研究することにより、超並列ゲノムコンパレーターといった改良された新規システムを構築して、長鎖cDNAを対象とした解析方法を完成した。完成した超並列ゲノムコンパレーターを使用し、公開済みのマウスゲノム配列からマウスmKIAA0620に対する大規模・高速塩基配列検索を実施し、公開済みのマウスゲノム配列のなかからmKIAA0620塩基配列に対し付加する配列に関わる情報(配列番号17)を検索し、その結果、以下に具体的に示すように、本発明の配列番号1に示したアミノ酸配列のN末側に付加される251アミノ酸長のアミノ酸配列を取得するために必要なプライマー配列を設計可能にするに至った。
配列2に示すmpf00920遺伝子配列の部分配列情報を基にReverse primer(AATCTTGATGTGGTACTCATGGCTCTC,27塩基長,名称GSP1,配列2の3,090番目から3,116番目の27塩基長配列に対する相補的配列:配列番号5)のデザインを行い、マウス胎仔(胎生10.5日齢)から分離・精製したTotal RNAを材料にThermoScript RNaseH−RT(Invitrogen)によるインビトロ逆転写反応(50℃ 60分間)を行い、1st strandcDNA(未確認配列を含む)を合成した。次に上記コンパレータによる予想配列情報(ゲノム配列より予想)からForward primer(AAGCTGCTGGGGCGGGGAGATGGGCT,26塩基長,配列17の72番目から97番目の26塩基長配列:配列番号6)を、又、配列2に示すmpf00920遺伝子配列の部分配列情報を基にしてとGSP1より少し内側にReverse primer(AATGTTGTGTCCTTTGACCCTTAC,24塩基長,名称GSP2,配列2の1,524番目から1,547番目の24塩基長配列に対する相補的配列:配列番号7)をデザインし、PCR反応を用いて、予測配列断片の増幅を行った。しかし、この領域のPCRは、通常の反応条件では増幅反応が起こらず、PCR産物を得ることができなかった。増幅が期待される領域内に反応を阻害する特殊な配列(GCに富む配列)が存在することが推察された。
そこで、GCに富む配列を含む特殊なDNA断片の増幅を可能とすることを目的とし、上記Forward primerとReverse primer(GSP2)を使用して、Platinum Pfx DNA Polymerase(Invitrogen:Cat No.11708−013)と添付のPCRx Enhancer solutionを用い、条件(1×PCRx Enhancer solution条件:Denature:94℃ for15s Anneal:50℃ for 30s Extend:68℃ for 3min30s,40cycles)を新たに設定して伸張反応を行った。その結果、目的とする断片約2,300塩基長を含む約2,314塩基長のDNA断片をPCR反応により増幅することが出来た。
こうして得られた、mpf00920塩基配列に対し5’に付加した251アミノ酸長及び753塩基長の配列についてホモロジー検索を、FASTA等により検索を実施した結果、比較的高いホモロジーを示す配列が2件認められたが、実質的に同一である配列はない。
配列2で示すmpf00921遺伝子配列(5’端配列を欠く非全長cDNA:6,178塩基長)と上記(5)で取得した5’端DNA断片(配列番号10)を含むPCR産物を用いて以下の手順で、ORF該当部位の全長cDNA(配列16)を取得した。最初に配列2で示すmpf00921遺伝子配列(マウスKIAA0620の非全長cDNA)をpBluescript SK(+)のマルチクローニングサイトに挿入して組換えプラスミドを作製した。すなわち、pBluescript SK(+)のマルチクローニングサイトの配列内Bam HIサイトを利用し、同一制限酵素で切断処理した5’端DNA断片をフレームが合うようにデザインしLigationし、大腸菌(DH5α株)の形質転換を行い、目的とする完全長DNA断片を含むプラスミドDNAを取得した。完全長ORFcDNA(5,992塩基長:1,996アミノ酸長のポリペプチドに終始コドンを付加した配列を含めた長さ)を含む上記プラスミドを大腸菌へ形質転換後、精製・回収した。このプラスミドを鋳型に複数の発現コンストラクトを作製した。発現コンストラクト作製には、Gatewayクローニングテクノロジー(Invitrogen:Cat.No.11821−014)システムを利用し、以下の目的PCR産物をpENTR/D−TOPO Vector(Invitrogen:)へ組み込んだエントリークローンを作製した。ネイテイブ蛋白質用として用いるPCR産物は、完全長cDNA(開始コドンから終始コドンまで)として次のプライマーを設計し合成して使用しPCR反応により作製した。すなわち、Forward primerとしてCACCatgggctgtgggcgtggtct(24塩基長,配列16の6番目から25番目の20塩基長配列を含む24塩基長配列:配列番号12)を、Reverse primerはReverse primer1(TCAGGCCTCGCTGTAACACTCATAGA,26塩基長,配列2の5,218番目から5,243番目の26塩基長配列に対する相補的配列,終始コドンを含む:配列番号13)を用いてエントリークローンを作製した。また、タグ付き融合蛋白型用として用いるタグ付きPCR産物は、タグ付き完全長cDNA(開始コドンから終始コドンまで)として次のプライマーを設計し合成して使用しPCR反応により作製した。すなわち、For ard primerは上述のForward primer(CACCatgggctgtgggcgtggtct,24塩基長,配列16の6番目から25番目の20塩基長配列を含む24塩基長配列:配列番号12)をReverse primerはReverse primer2(GGCCTCGCTGTAACACTCATAGA,23塩基長,配列2の5,218番目から5,240番目の23塩基長配列に対する相補的配列,終始コドンを含まない:配列番号14)を用いてエントリークローンを作製した。
マウスKIAA0620遺伝子がコードするポリペプチドの一部からなるアミノ酸配列をもとに、ペプチド合成して作製した合成ペプチドを免疫原(抗原)として、常法に従い、ウサギポリクローナル抗体を作製した。抗原としてはmpf00920ポリペプチド配列のうちC−末端から約169アミノ酸離れたところにある15アミノ酸長配列(配列:FLEEQAEKRGISDPD)に対し末端にシステインを付加した合成ペプチド(配列:CFLEEQAEKRGISDPD)を、そのN−末で担体とするキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)にキャリアーカップリングさせ、担体と結合した合成ペプチドを80%から90%の純度にまで精製したものを抗原として用いた。日本白色種家兎(メス)に初回は抗原量0.15mgにて皮内免疫を、その後は約2週間ごとに抗原量0.3mgにて4回の感作を実施して合計5回の皮内免疫を行った。3回目、4回目の各皮内免疫の後の約5週間目、約7週間目に各々5mlの試験採血を行い、HRPO(ホースラディッシュパーオキシダーゼ)結合ヤギIgG抗ウサギ抗体(CAPPEL社製)を用いたELISA法にて抗原に対する抗体値を測定した。全部で2回の試験採血において、夫々、1,000倍希釈、2,000倍希釈、4,000倍希釈、8,000倍希釈、16,000倍希釈にて吸光度(490nm)が3となり、試験採血において抗体価の十分な上昇を確認された。この2回目の試験採血の後、約8週目にに5回の感作を実施し、その後、約9週間目に抗体精製用の全採血を行った。採血した血液から血清を遠心にて分離し抗血清を得た。その抗血清を、ウサギポリクローナル抗体(anti−mKIAA0620ab)として用いた。
上記で得られた精製ウサギポリクローナル抗体を用い、ウエスタンブロット法にて各種遺伝子導入細胞でのマウスKIAA0620蛋白質の検出を試みた。遺伝子導入細胞からの蛋白質回収操作については、マウスKIAA0620遺伝子強制発現ベクター導入HEK293T細胞を培養ディッシュ上でPBS(−)溶液で洗浄し、Lysis Buffer(TNE buffer)を用いピペッティング操作を繰り返して可溶化させ、可溶化した溶液を28Gの注射針を通し、次に、遠心操作(700g,10min)後,上清をサンプル液として回収した。サンプル液にはマウスKIAA0620遺伝子導入細胞由来蛋白質が含まれる。その他のサンプルとして、マウスKIAA0620蛋白質のV5融合蛋白質型を発現する発現ベクターを導入したHEK293T細胞を使用し、上記と同様な方法でサンプル液を調製した。各種サンプル液をポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)にて分画した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ポリアクリルアミドゲルの各レーンに約20マイクログラムの各種遺伝子導入細胞由来蛋白質をアプライして電気泳動で分画し、次に分画した蛋白質をメンブレンにブロットし、ブロットしたメンブレンに対し500または1000倍希釈した抗体を用いて免疫染色反応を行った。すなわち、ポリアクリルアミドゲル電気泳動はInvitrogen社製の4〜12%Tris−Glycine Gel(#No.EC6035Box)を用いて行い、BioRad社製のセミドライ式トランスファーセルを用いて蛋白質を転写し、メンブレンにブロットした。二次抗体には5000倍希釈したBiosource社製Goat Anti−Rabbit IgG,HRP−conjugate抗体(#No.ALI0404)を用い、検出には同社のECL Western blotting Detection Reagents(#No.RPN2133)を用いた。分子量を知る目的でナカライテスク社製のプレステインドタンパク質マーカー(High Range,SDS−PAGE(#No.26039−75)を各サンプルとともに電気泳動した。
マウス胎仔網膜血管における於けるmKIAA0620遺伝子のmRNAレベルでの時間的・空間的発現を解析した。フォアワードプライマーの配列を5’−CCCCGGAACTTGAACGTGTC−3’(配列番号:3)、リバースプライマーの配列を5’−CCACCTGTTCAAACTTGTGCTG−3’(配列番号:4)とし、それらのプライマーを用いてマウスmpf00920遺伝子の転写産物をPCR法で増幅すると、アンチセンスあるいはセンスプローブとして働く各々約1,069塩基長(bp)のDNA断片が得られる設計にした。目的とするPCR産物、すなわちアンチセンスあるいはセンスプローブ用の約1,069(bp)DNA断片をPromega社が供給するT−vectorにクローン化した。T−vectorにクローン化した1,069(bp)DNA断片を鋳型とし、RNA合成酵素(Roche社、DIG RNA Labeling Kit)を用いてRoche社が示す方法によりマウスmpf00920遺伝子発現産物を検出可能とするアンチセンスcRNAプローブ及び陰性コントロール用として使用するセンスcRNAプローブを作製し、新生仔ICRマウスより摘出した網膜におけるマウスKIAA0620遺伝子の発現を網膜フラットマウントin situハイブリダイゼーション法により観察した。また、抗マウス4型コラーゲン抗体(LSL社、ウサギポリクローナル抗体)を用いた免疫染色法を同一サンプルにて行い、網膜血管網の観察を同時に行ない血管に沿ってマウスKIAA0620遺伝子発現が認められることを確認した。これらの実験結果から、新生仔マウス(生後2ないし4日)網膜における発達途上の血管では、特に新生血管先端部位の内皮細胞においてマウスKIAA0620遺伝子発現が非常に強く認められた。これに対し、生後7日マウス網膜では、マウスKIAA0620遺伝子発現は網膜周辺部における血管新生部位に認められるのみで、すでに血管が形成されている網膜中心部では、当該遺伝子の発現が著しく消退していることが認められた(図7)。
本発明のポリペプチド配列についてモチーフ検索を行った結果、Semaphorin/CD100 antigenドメイン、3つのPlexin/Semaphorin/integrinドメイン、及び3つのCell surface receptor IPT/TIGを有し、かつC−末端側に膜貫通(TM)セグメントが存在する構成である、全く新しいタイプの齧歯類由来新規Plexinポリペプチドといえる。
段落番号0079で記載したように、SOSUIという汎用transmenbrane(TM)segment検索用プログラムにより検索すると、配列番号:1に示されるアミノ酸配列のうちN−末端側から1,090−1,112番目(配列番号15ではN−末端側から1,341−1,363番目)にETAIVVSIVICSVLLLLSVVALFで示される膜貫通(TM)セグメントが見出された。膜貫通(TM)セグメントの存在により、本発明のポリペプチドが膜蛋白質であることが推察されたが、実際に以下の実験の結果から膜蛋白質であることを確認した。
上記(10)と同様に、各エントリークローンをLR Clonase酵素ミックス(Invitrogen:Cat.No.11791−019)を用いた部位特異的組換え反応により発現用デステイネーションベクター(pcDNA−DEST40 vector、pEF5/FRT/V5−DEST:前者はCMVプロモーター、後者はEF−1αプロモーター制御下にて発現するプラスミドベクター)へ組換えて発現ベクターの構築を行い、マウスKIAA0620全長ネイテイブ蛋白質、及びマウスKIAA0620全長−V5、マウスKIAA0620膜外領域−V5、マウスKIAA0620全長−GFP、マウスKIAA0620膜外領域−GFP、マウスKIAA0620全長−DsRed、マウスKIAA0620膜外領域−DsRed、マウスKIAA0620全長−ヒトIgG1Fc断片、マウスKIAA0620膜外領域−ヒトIgG1Fc断片融合蛋白質型の哺乳類細胞での強制発現ベクターを構築した。これらをTransfection試薬(Fugene6;Roche社)を用いてヒト胎児由来腎細胞(HEK293細胞)に遺伝子導入し、遺伝子導入細胞を作製し、それぞれの融合蛋白質の発現を以下のようにして確認した。
構築したマウスKIAA0620全長又は膜外領域−GFP融合蛋白質発現プラスミドベクター(目的遺伝子をクローニングしたFlp−In用発現ベクター、インビトロジェン社が供給するpEF5/FRT/V5−DEST由来)、及びマウスKIAA0620全長又は膜外領域−DsRed融合蛋白質発現プラスミドベクター(目的遺伝子をクローニングしたFlp−In用発現ベクター、インビトロジェン社が供給するpEF5/FRT/V5−DEST由来)をそれぞれインビトロジェン社が供給するFlp−in発現システムを用いて、ヒト胎児由来腎細胞(HEK293細胞)に遺伝子導入し、KIAA0620全長ポリペプチドあるいは同膜外領域の遺伝子導入強制発現安定株を作製した。
配列番号:18に示される1,337個のアミノ酸配列(配列番号:15に示されるアミノ酸配列の第2番目から第1,338番目と同一)からなる膜外領域ポリペプチドとヒトIgG1Fc断片領域と遺伝子組換え法を用いて融合し、さらにこの遺伝子産物をCAGプロモーター制御下にて発現するプラスミドベクターを作製した。これをMirus社TransIT−LT1 Transfection Reagentsを用いて293T細胞に遺伝子導入し、無血清培地(Invitogen社Gibco CD293)にて3日間培養した後、ProteinGカラム(Amersham Biosciences社、HiTrap(商標)Protein G HP)を用いて培養上清からマウスKIAA0620膜外部分−IgG1Fc融合蛋白質を精製した。
Claims (19)
- 以下の(a)又は(b)のポリペプチドをコードする塩基配列から成るDNA:(a)配列番号:1、配列番号:15又は配列番号18で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部又は全部から成るポリペプチド;又は(b)配列番号:1、配列番号:15又は配列番号:18で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成り、(a)のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
- 以下の(a)、(b)又は(c)のDNA:(a)配列番号:2、配列番号:16又は配列番号19で示される塩基配列において、配列番号:1、配列番号:15又は配列番号:18で示されるアミノ酸配列の一部又は全部をコードするDNA;(b)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA;又は(c)(a)のDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、(a)のDNAがコードするポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有する蛋白質をコードするDNA。
- 請求項1又は2記載のDNAを含む齧歯類由来遺伝子。
- 齧歯類がマウスである請求項3記載の遺伝子。
- 以下の(a)又は(b)のポリペプチド:(a)配列番号:1、配列番号:15又は配列番号:18で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部または全部から成るポリペプチド;又は(b)配列番号:1、配列番号:15又は配列番号:18で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列の一部または全部から成り、(a)のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチド。
- 請求項1若しくは2記載のDNA、又は請求項3若しくは4記載の遺伝子を導入した宿主細胞で作製される組換え蛋白質である、請求項5記載のポリペプチド。
- 請求項1若しくは2記載のDNA、又は請求項3若しくは4記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項7記載の組換えベクターを導入した組換え動物細胞。
- 請求項7記載の組換えベクターを導入した組換え動物。
- 請求項5又は6記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
- 請求項1若しくは2記載のDNA、又は請求項3若しくは4記載の遺伝子を用いた、血管増殖分化制御因子又は血管増殖分化を制御する化合物のスクリ−ニング方法。
- 請求項11記載のスクリ−ニング方法に使用する、遺伝子発現測定キット。
- 請求項5又は6記載のポリペプチドを用いた、生体内血管増殖分化制御因子又は血管増殖分化を制御する化合物のスクリ−ニング方法。
- 請求項13記載のスクリ−ニング方法に使用する、ポリペプチド結合物質測定キット。
- 請求項8又は9記載の組換え動物又は組換え動物細胞を用いた、生体内血管増殖分化制御因子又は血管増殖分化を制御する化合物のスクリ−ニング方法。
- 請求項15記載のスクリ−ニング方法に使用する、該分化制御因子、化合物の血管増殖分化制御活性測定キット。
- 請求項10記載の抗体を用いた、血管増殖分化制御因子又は血管増殖分化を制御する化合物のスクリ−ニング方法。
- 請求項17記載のスクリ−ニング方法に使用する、抗体力価測定キット。
- 以下の(a)又は(b)のポリペプチド:(a)配列番号:18で示されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列の一部または全部から成るポリペプチド;又は(b)配列番号:18で示されるアミノ酸配列において、一部のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列の一部または全部から成り、(a)のポリペプチドと実質的に同質の生物学的活性を有するポリペプチドを活性成分として含む血管新生阻害剤。
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