JP2002505104A

JP2002505104A - レクトメディン物質および方法

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Publication number: JP2002505104A
Application number: JP2000534643A
Authority: JP
Inventors: ヨエルエス．ヘイフリック，
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1998-03-04
Filing date: 1999-03-04
Publication date: 2002-02-19
Also published as: AU2980799A; CA2322731A1; WO1999045111A1; EP1060248A1

Abstract

(57)【要約】レクチン結合性のオルファクトメディン様およびムチン様ドメインを含む特徴的な細胞外構造を有する、新規のヒトのトランスメンブランレセプターポリペプチドが開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、レクチン結合性のオルファクトメディン様およびムチン様ドメイン
を含む特徴的な細胞外構造を有する新規のヒトのトランスメンブランレセプター
ポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】

Ｇ−タンパク質結合レセプター(GPCRs)とは、細胞間シグナルを伝達するためにＧ−タンパク質に相互作用するタンパク質である。リガンド結合すると、GP
CRsは、Ｇ−タンパク質サブユニットによって、GTPをGDPに加水分解し始め；GTP
の加水分解は、スイッチを活性化から不活性化へ切り替えることで進行する。
約1000個のGPCRsがあると見積もられており［Clapham、Nature 379:297-299 (19
96)］、今日までに、細胞にレセプターを固定するセブントランスメンブランドメインを含むすべてについて特徴が決定されている。 GPCRsは、他のリガンドの中でも、アヘン、アドレナリン、ヒスタミン、ポリペプチドホルモンおよびフ
ォトンのためのレセプターを含む。これらレセプターは、例えば、細胞間カル
シウム濃度やcAMPレベルに変化をもたらす経路を含む、非常に様々な細胞の第二
メッセンジャー経路に結合される。

【０００３】同定された数々のGPCRsの中でも、CD97は、細胞間接着効果をもたらすタンパク質のサブファミリーの代表格であると思われる［McKnight et al., Immunol T
oday 17:283-287 (1996)］。 CD97と関連レセプターは、細胞間接着に特異的に
関与する細胞外タンパク質結合性ドメインによるGTP加水分解に関与する細胞質ドメインに直接結合するトランスメンブランドメインを含む構造が独特である。

【０００４】 CD97の細胞外アミノ末端領域は、多数の表皮性成長因子様(EGF-様)繰り返しと
、インテグリン結合部位を含む、無数の細胞間接着を含む［Hamann et al., Imm
unol 155: 1942-1950 (1996); Gray et al., J. Immunol 157:5438-5447 (1996)
］。 EGF-様の繰り返しを持ったタンパク質は、細胞接着現象に関与しているようであ
り［Campbell et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 3:385-392 (1993);］、この
所見とも一致して、COS細胞でのCD97の異種発現は、抗CD97モノクローナル抗体の存在下でブロックすることができる、同型細胞凝集を誘発する［Hamann, et a
l., J. Exp. Med. 184:1185-1189 (1996)］。 CD97と関連タンパク質は、セブントランスメンブランレセプターのEGF-7TMサブファミリーと称されている［McK
Night and Gordon, Immunol. Today 17:283-1887 (1996)］。 CD97用に同定されたリガンドは、細胞表面接着レセプターのインテグリンファミリーのメンバー
を含む。様々なインテグリンが、（一文字アミノ酸表記ではRGDと記載される）アルギニン−グリシン−アスパラギン酸の３アミノ酸の配列［D'Souza, et al
., Trends Biochem. Sci., 16:246-250 (1991)］を介して、それらと同起源のリ
ガンドを認識し、かつ相互作用し、そして、この配列は、EGF-様の繰り返しとト
ランスメンブランドメインとの間のCD97の細胞外領域において同定された。

【０００５】 CD97は、翻訳後にタンパク質分解を受け、その結果、細胞外（かつ水溶性かも
しれない）アルファサブユニットとより小さなインテグラルメンブランベータサ
ブユニットをもたらす［Gray et al., J. Immunol. 157:5438-5447 (1996)］。

【０００６】この二つのサブユニットは非共有的に会合しており、そして、アルファサブユ
ニットは、ベータサブユニットとの相互作用を介して細胞表面に保持されている
。タンパク質分解の役割は不明であるが、細胞接着に関与する、セレクチンや
細胞間接着分子(ICAMs)のようなタンパク質に共通するレセプターのダウンレギュレーションのためのメカニズムであるかもしれない。

【０００７】 GPGRsのCD97サブファミリーの他のメンバーが、アミノ酸配列と構造相同性によって同定されており、これらには、ヒトEMR1、HE6、BAI1、ラトロトキシンのカルシウム非依存性レセプター(CIRL)、ラトロフィリン、およびB0457.1およびB
0286.2と命名されたCaenorhabditis elegansのオープンリーディングフレームに
よってコードされたタンパク質を含む［Baud V, et al., Genomics 26:334-344
(1995); McKnight, et al., J. Biol. Chem. 271:486-489 (1996); Krasnoperov
, et al., Neuron 18; 925-937 (1997); Letianova, et al., J. Biol. Chem. 2
72:21504-21508 (1997); Davletov, et al., J. Biol. Chem. 271:23239-23245
(1996); Nishimori, et al., Oncogene 15:2145-2150 (1997)］。 EMR1とそのマウス相同体F4/80は、発現時にマクロファージ特異的であり、また、多数の細胞外EGF-様の繰り返し、桿状柄領域、およびGPCRsの特徴的なトランスメンブランドメインを含む点において構造的にCD97と関連している［Baud V, et al., Ge
nomics 26:334-344 (1995); McKnight, et al., J. Biol. Chem. 271:486-489 (
1996)］。 EMR-1についてのリガンドは何ら同定されておらず、翻訳後にタンパク質がタンパク質分解を受けるかどうかは定かではない。

【０００８】 CIRL[Krasnoperov, et al., Neuron 18; 925-937 (1997); Letianova, et al.
, J. Biol. Chem. 272:21504-21508 (1997); Davletov, et al., J. Biol. Chem
. 271:23239-23245 (1996)]は、中枢神経系のニューロンシナプス末端にて特異的に発現し、そして、CD97のように、タンパク質分解作用による開裂を受けて、
インテグラルメンブランセブン−トランスメンブランベータサブユニットと非共
有的に会合している細胞外アルファサブユニットがもたらされる、と信じられて
いる。ラトロフィリンの開裂は、CD97に保存されているSer-His-Leu/Thr-Asn-
Pheの部位に生じる、と信じられている［Krasnoperov, et al., Neuron 18; 925
-937 (1997)］。 CIRLは、0.5〜1.0nMの範囲で、クロゴケグモ毒素の成分であるラトロトキシンに結合することが知られており、また、クロム親和性のウシの
細胞で発現したCIRLに結合するリガンドの結合は、毒素結合のホールマークであ
る開口分泌をもたらすことが知られている[Krasnoperov, et al., Neuron 18; 9
25-937 (1997)]。アルファラトロトキシン結合は、神経筋駆動終板にて実証さ
れており、この相互作用は、シナプス顆粒からのアセチルコリンの爆発的分泌顆
粒放出を導き、このクモに噛まれた時に特有の筋肉麻痺を招く［Petrennko et a
l., F.E.B.S. Letts. 325:81-85 (1993)］。しかしながら、末梢毒が、CIRLへ
の結合によるものか、または他の関連タンパク質によるものかは不明である。

【０００９】かくして、GPCRsのCD97-様ファミリーの他のメンバー、特に、細胞間接着に関
与するヒトのレセプター、および細胞外シグナルによってモジュレートされた細
胞質代謝経路に関与するヒトのレセプターを同定および特徴付けることが当該技
術分野において希求され続けている。 CD97-様レセプターを同定することで、このレセプターによる異常なシグナルが関連する疾患状態、ならびに、このレセ
プター自体の異常な発現が関連する疾患状態の診断が可能となる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】

本願発明は、精製および単離されたヒトのトランスメンブランレセプターレク
トメディンポリペプチドまたはその断片、すなわち、前記ポリペプチドが、細胞
外レクチン結合性のオルファクトメディン様およびムチン様ドメインを含むヒト
のトランスメンブランレセプターレクトメディンポリペプチドまたはその断片を
提供する。好ましい本発明のポリペプチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸
配列またはその断片、配列番号：４に記載のアミノ酸配列またはその断片、配列
番号：６に記載のアミノ酸配列またはその断片、および配列番号：58に記載のア
ミノ酸配列またはその断片を含む。

【００１１】本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
好ましいポリヌクレオチドは、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５およ
び配列番号：57に記載の配列を含む。本発明は、配列番号：１、配列番号：３
、配列番号：５または配列番号：57に記載のポリヌクレオチド；(b) (a)のポリヌクレオチドの非コード鎖と中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズ
するDNA；および(c) 遺伝コードの縮重がなければ、(a)のポリヌクレオチドの非
コード鎖とハイブリダイズするはずであるDNA、からなるグループから選択されたヒトレクトメディンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本
発明の好ましいポリヌクレオチドは、DNA分子である。好ましいDNA分子は、cD
NA分子及びゲノミックDNA分子である。本発明は、全体的または部分的に化学合成されたDNA分子も提供する。本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドも意図している。

【００１２】本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現構築体、ならびに本発明のポ
リヌクレオチドまたは発現構築体で形質転換またはトランスフェクトされた宿主
細胞も提供する。

【００１３】本発明は、異種プロモーターに操作可能に連結した本発明のポリヌクレオチド
と、異種プロモーターに操作可能に連結した宿主細胞ポリヌクレオチドも提供す
る。

【００１４】他の態様によれば、(a) レクトメディンポリペプチドの発現のために適切な条
件下で本発明の宿主細胞を生育し、および(b) 宿主細胞またはその生育培地から
レクトメディンポリペプチドを単離する、工程を含む、ヒトのレクトメディンポ
リペプチドの製造方法を提供する。

【００１５】本発明は、さらに、本発明のポリペプチドと特異的な免疫反応性を有する抗体
を提供する。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。本
発明は、本願発明の抗体を分泌する細胞、例えば、ハイブリドーマも提供する。
本発明の抗体と特異的な免疫反応性を有する抗イディオタイプ抗体も企図されて
いる。

【００１６】本発明は、レクトメディンポリペプチドの特異的結合パートナー化合物を同定
する方法、すなわち、(a) ある化合物とレクトメディンポリペプチドとの間の結
合を許容する条件下にレクトメディンポリペプチドと化合物とを接触させ、(b)
レクトメディンポリペプチドへの化合物の結合を検出し、及び(c) レクトメディ
ンポリペプチドの特異的結合パートナーとして化合物を同定する、工程を含む方
法も提供する。本発明の方法は、レクトメディンポリペプチドの活性をモジュ
レートする特異的結合パートナーを用いる。ある態様によれば、この化合物は
、レクトメディンポリペプチドの活性を阻害し、また、他の態様によれば、この
化合物は、レクトメディンポリペプチドの活性を増強する。

【００１７】本発明は、レクトメディンポリヌクレオチドの特異的結合パートナー化合物を
同定する方法、すなわち、(a) ある化合物とレクトメディンポリヌクレオチドと
の間の結合を許容する条件下にレクトメディンポリヌクレオチドと化合物とを接
触させ、(b) レクトメディンポリヌクレオチドへの化合物の結合を検出し、及び
(c) レクトメディンポリヌクレオチドの特異的結合パートナーとして化合物を同
定する、工程を含む方法も提供する。本発明の方法は、レクトメディンポリヌ
クレオチドによってコードされたレクトメディンポリペプチドの発現をモジュレ
ートする特異的結合パートナーを用いる。ある態様によれば、この化合物は、
レクトメディンポリペプチドの発現を阻害し、また、他の態様によれば、この化
合物は、レクトメディンポリペプチドの発現を増強する。本発明は、本発明の
方法によって同定された化合物も提供する。

【００１８】他の態様によれば、本発明は、本発明の方法によって同定された化合物と薬学
的に容認しうる担体とを含む組成物も企図している。本発明は、さらに、レク
トメディン関連病状を治療するための医薬を製造するための、本発明の方法によ
って同定された化合物の使用も企図している。

【００１９】本発明は、さらに、レクトメディン関連疾患の治療のための医薬の製造でのレ
クトメディンポリペプチドの使用も企図している。

【００２０】

【発明の実施の形態】

本発明は、レクトメディンと命名されたトランスメンブランの新規ファミリー
に対する精製および単離されたポリペプチド及びその基礎をなすポリヌクレオチ
ドを提供する。本発明は、天然に産するレクトメディンポリヌクレオチドと天
然には産しないレクトメディンポリヌクレオチドの双方とそれらのポリペプチド
産物を含む。天然に産するレクトメディン産物は、レクトメディンファミリー
内の異なる遺伝子とポリペプチド種を含み、これらポリペプチド種には、同じ動
物の細胞内で発現されるもの、例えば、対立変異体と、他の動物の細胞内で発現
される対応する相同物が包含される。本発明は、同じポリヌクレオチドによっ
てコードされたスプライス変異体も提供するが、それらは異なるmRNA転写によっ
てもたらされる。天然に産しないレクトメディン産物は、類似体、断片、融合
（またはキメラ）タンパク質、および電子対共有修飾を有するレクトメディン産
物を含む。タンパク質のレクトメディンファミリーは、レクトメディンタンパ
ク質が、少なくとも一つの細胞外レクチン結合様ドメインと、少なくとも一つの
細胞外オルファクトメディンドメインを含む点において、既知のセブントランス
メンブランファミリーと区別することができる。他の多くのセブントランスメ
ンブランタンパク質とは異なり、レクトメディンファミリーのタンパク質に属す
るタンパク質の構造は、細胞間相互作用に影響を与えるEGF-様結合ドメインは含
んでいない。好適な実施態様によれば、本発明は、配列番号：１、３、５およ
び57に記載の配列を含む。本発明は、配列番号：２、４、６および58に記載の
アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドも包含する。目下のところ、本発
明の好ましいポリペプチドは、配列番号：２、４、６および58に記載のアミノ酸
配列を含む。

【００２１】本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現構築物（ベクター）、ならび
に、本発明のポリヌクレオチドまたは発現構築物が導入されるよう形質転換、ト
ランスフェクト、または電気泳動した宿主細胞も提供する。本発明のポリペプ
チドを製造する方法も企図されている。本発明は、抗体、好ましくは、本発明
のポリペプチドに対して特異的な免疫反応性を有するモノクローナル抗体、なら
びに、これら抗体を分泌する細胞系、例えば、ハイブリドーマをも提供する。

【００２２】本発明は、ヒトのレクトメディンをコードする新規の精製及び単離されたヒト
のポリヌクレオチド（例えば、DNA配列及びmRNA転写物、双方ともセンス及び相補的アンチセンス鎖、さらにそれらのスプライス変異体を含む）を提供する。
本発明のDNA配列には、ゲノミック及びcDNA配列のみならず、全体的または部分的に化学合成されたDNA配列が含まれる。本発明のゲノミックDNAは、本発明の
ポリペプチドのためのタンパク質コード領域を含み、そして、本発明の好ましい
ポリヌクレオチドの対立変異体を包含する。本発明のゲノミックDNAは、これが本発明のレクトメディンcDNAに認められたレクトメディンコード領域を含む点
に関して、レクトメディン以外のポリペプチドをコードするゲノミックDNAと区別できる。本発明のゲノミックDNAはRNAに転写でき、そして、得られたRNA転写物は、転写情報での一つまたはそれ以上のイントロン（すなわち、非コード領
域）が削除または「スプライスアウト」される、一つまたはそれ以上のスプライ
シングを受ける。他のメカニズムによってもスプライシングすることができる
ため、異なる非コードRNA配列の除去とされるが、依然としてレクトメディンポリペプチドをコードしているRNA転写物は、当該技術分野にあってはスプライス変異体と称されているものであり、また、これらは本発明で企図されている。
それ故、本発明で企図されているスプライス変異体は、同じDNA配列によってコードされているが、異なるmRNA転写情報に由来する。当該技術分野において、
対立変異体は、野性型（優勢）遺伝子配列の形態を修飾したものであり、この修
飾が、染色体分離または遺伝変異をもたらす条件へ暴露する間の組み換えによる
ものであることは知られている。野性型遺伝子のような対立変異体は、本来、
天然に産する配列である（これに対して、天然に産しない変異体は、in vitro操
作によってもたらされる）。

【００２３】本発明は、レクトメディンをコードするRNAポリヌクレオチドの逆転写と、それに続く、二本鎖DNAをもたらす相補鎖の第二の鎖合成を経て得られるcDNAをも企図している。

【００２４】本明細書で用いられ当該技術分野において理解される「化学的に合成された」
の語は、ポリヌクレオチドを製造するための、酵素的方法に対して純粋に化学的
な方法を称するものである。「全体的に」合成されたDNA配列は従って、全体に及んで化学的手段により製造されたものであって、そして「部分的に」合成さ
れたDNAは、得られるDNAの一部分だけが化学的手段によって製造されたものであ
る。

【００２５】ヒトのレクトメディンポリペプチドをコードする好ましいDNA配列は、配列番号：１、３、５および57に示される。当業者であれば、本願発明の好ましいDN
Aが、二本鎖分子、例えば、DNAに関するワトソン−クリック塩基対法則に従って
配列番号：１の配列から推定できる配列を有する、相補分子（「非コード鎖」ま
たは「相補体」）に沿った配列番号：１、３、５および57に記載の配列をもった
分子を含むことは容易に想到できるであろう。配列番号：２、４、６および58
のレクトメディンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも好ましい。

【００２６】さらに、本発明は、ヒトのレクトメディンDNAの種相同体、好ましくは哺乳類相同体も企図している。一般に、種相同体とは、本発明のヒトDNAと、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％
、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なく
とも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％または少なくとも
99％を共有する。本発明のポリヌクレオチドに関する配列の「相同」率は、本
明細書では、配列の同一性を最大ならしめるために、必要に応じて、双方の配列
を整列し、かつギャップを導入した後のレクトメディンコード配列でのヌクレオ
チドと同一の候補配列でのヌクレオチド塩基に対する百分率として定義される。

【００２７】本発明によってもたらされるポリヌクレオチド配列情報は、当該技術分野で周
知かつ常法の手順に従って、コードしたポリペプチドの大規模発現を可能ならし
める。これらポリヌクレオチドは、サザンおよび／またはノザンハイブリダイ
ゼーションや、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応、ならびに他の増幅技術を含む周知の技術を用いることで、関連するレクトメディンポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドの同定と単離を可能にする。関連するポリヌ
クレオチドの例として、対立変異体ならびにレクトメディンに相同なポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチド、それに、レクトメディンの生物学的、免疫学
的、および／または物理的特性の一つ以上を具備した構造的に関連するポリペプ
チドを含めた、ヒトおよびヒト以外のゲノミック配列がある。

【００２８】レクトメディンポリペプチドをコードする全長ポリヌクレオチドを開示するこ
とで、当業者による、この全長ポリヌクレオチドから得られる各断片の取得を容
易ならしめる。それ故、本発明は、レクトメディンをコードするポリヌクレオ
チドの断片も提供する。これら断片は、ポリヌクレオチドでの少なくとも10〜
20、そして、好ましくは、少なくとも15個の連続するヌクレオチドを含む。し
かしながら、本発明は、様々な長さの断片をも包含する。好ましくは、本発明
の断片ポリヌクレオチドは、レクトメディンをコードするポリヌクレオチド配列
に独特の配列を含み、それ故、高度または中程度にストリンジェントな条件下で
、レクトメディンをコードするポリヌクレオチド、または独特の配列を含んだそ
のレクトメディン断片にのみ（つまり、「特異的に」）ハイブリダイズする。本発明のゲノミック配列のポリヌクレオチド断片は、コード領域に独特の配列の
みならず、イントロン、調節領域および／または他の未翻訳配列から誘導された
全長配列の断片も含む。本発明のポリヌクレオチドに独特の配列は、他の既知
のポリヌクレオチドとの配列比較を介して認識され、そして、当該技術分野で利
用されている、例えば、公の配列データベースから入手可能な配列プログラムを
使用することで同定できる。

【００２９】本発明は、レクトメディンファミリーのポリペプチドのメンバーをコードする
一つ以上のポリヌクレオチドに保存される、断片ポリヌクレオチドも提供する。
かような断片は、レクトメディンポリヌクレオチドのファミリーに特徴的な配列
を含み、これらは「シグネーチャー配列」とも称されている。保存されたシグ
ネーチャー配列は、容易に認識でき、次いで、レクトメディンファミリーのメン
バーをコードするポリヌクレオチドの単純配列比較に供される。本発明の断片
は、それらが検出可能となるよう標識付けでき、放射性および非放射性ラベルが
含まれる。

【００３０】断片ポリヌクレオチドは、全長または他のレクトメディンコードポリヌクレオ
チドの検出用プローブとして、特に有用である。一つ以上の断片ポリヌクレオ
チドを、レクトメディンをコードするポリヌクレオチドの存在の検出、またはレ
クトメディンをコードするポリヌクレオチド配列での変異を検出するためのキッ
トに用いることができる。

【００３１】本発明はまた、配列番号：１、３、５または57のポリヌクレオチドの非コード
鎖、または相補体と中程度または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズするレクトメディン種をコードするDNA配列も含むものである。遺伝コードの縮重がなければそれとハイブリダイズするはずであるレクトメディンポリペ
プチドをコードするDNA配列が、本発明によってさらに企図される。高度にストリンジェントな条件の例として、45℃での５×SSPEおよび45％ホルムアミドで
のハイブリダイゼーションと、65℃での0.1×SSCによる最終洗浄がある。中程
度にストリンジェントな条件の例として、55℃での１×SSCでの最終洗浄がある。当該技術分野にあっては、Ausebelら、(編）Protocols in Molecular Biolo gy 、John Wiley & Sons(1994) 6.0.3〜6.4.10頁に記載されるように、温度及び緩衝液、または塩濃度を変更することによって同等のストリンジェンシーの条件
にできることは理解されるはずである。ハイブリダイゼーション条件の改変は
、経験的に決定するか、またはプローブのグアノシン／シトシン(GC)塩基対の長
さ及び含有率に基づき正確に算定することが可能である。 Sambrookら（編）、
Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess、Cold Spring Harbor、ニューヨーク(1989) 9.47〜9.51頁に記載される通り
に、ハイブリダイゼーション条件を算定できる。

【００３２】レクトメディンコード配列を組み込んだプラスミド及びウイルスDNAベクターなどの、自己複製する組換え発現構築体も提供される。レクトメディンをコー
ドするポリヌクレオチドが、内在性または外来性発現制御DNA配列及び転写ターミネーターに作動可能に連結された発現構築体も提供される。発現制御DNA配列は、プロモーター、エンハンサーおよびオペレーターを含み、一般に、これら
配列は、発現構築物が利用される発現系に基づいて選択される。好ましいプロ
モーターおよびエンハンサー配列は、一般に、遺伝子発現を増強する性質に関し
て選択され、一方で、オペレーター配列は、一般に、遺伝子発現を調節する性質
に関して選択される。本発明の発現構築物は、この構築物を具備した宿主細胞
の同定を許容する一つまたはそれ以上の選択可能なマーカーをコードする配列も
含みうる。発現構築物は、宿主細胞での相同組換を促進、好ましくは、増進す
る配列も含みうる。本発明の好ましい構築物は、宿主細胞での複製に必要な配
列も含みうる。発現構築物は、コードしたレクトメディンタンパク質の製造の
ために用いることができるが、構築物自体を増幅するためにも用いることができ
る。

【００３３】本発明のさらなる特徴によれば、コードされたレクトメディンポリペプチドの
発現を許容するように、本発明のポリヌクレオチドを含む原核細胞及び真核細胞
を含めた宿主細胞が提供される。本発明のポリヌクレオチドは、環状プラスミ
ドの一部として、または単離されたタンパク質コード領域またはウィルスベクタ
ーを含む線状DNAとして、宿主細胞に導入される。当該技術分野では周知でかつ常套手段でもある宿主細胞へのDNAの導入方法には、形質転換、トランスフェクション、電気泳動、核挿入、または、リポソーム、ミセル、ゴースト細胞およ
びプロトプラストのような担体を用いた融合などがある。本発明の発現系には
、細菌、酵母、真菌、植物、昆虫、無脊椎動物および哺乳類動物の細胞系がある
。本発明の宿主細胞は、レクトメディンと特異的な免疫反応性を有する抗体の
開発のための免疫原の貴重な供給元である。本発明の宿主細胞は、レクトメデ
ィンポリペプチドの大量生産のための方法においてきわめて有用なものでもあり
、かかる方法では、細胞が好適な培地中で生育され、そして例えばイムノアフィ
ニティークロマトグラフィー、レセプターアフィニティークロマトグラフィー、
疎水性相互作用性クロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフ
ィー、サイズ排除濾過、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)、逆相HPLCなどを含む従来のクロマトグラフ法な
ど、当該技術分野で周知の精製方法によって、目的のポリペプチド産物が、細胞
からまたは細胞が生育される培地から単離される。その他の精製方法として、
所望のタンパク質を、特異的な結合パートナーまたは薬剤によって認識されるタ
ッグ、標識またはキレート部分を具備した融合タンパク質として発現および精製
する方法がある。これら精製されたタンパク質は、所望のタンパク質を生成す
るために開裂することも、あるいは無傷融合タンパク質として放置することもで
きる。融合成分の開裂によって、開裂プロセスによって得られた、さらなるア
ミノ酸残基を有する所望の形態のタンパク質が生成される。

【００３４】レクトメディンコーディングDNA配列の知見により、内在性レクトメディンの発現を許容または増加させるような細胞の修飾が可能となる。細胞がより高い
レベルでレクトメディンを発現するよう、異種性のプロモーターのすべてまたは
一部を用いて、天然に生じているレクトメディンプロモーターの全体または一部
を置換することによって、レクトメディンの発現増大をもたらすように細胞を修
飾することができる（例えば、相同組換えによる修飾）。異種性プロモーター
は、レクトメディンをコードする配列に作動可能に連結するように挿入される。
例えば、PCT国際公開第WO 94/12650号、PCT国際公開第WO 92/20808号、及びPCT 国際公開第WO 91/09955号パンフレットを参照されたい。本発明はまた、異種性プロモーターDNAに加えて、増幅可能なマーカーDNA（例えば、ada、dhfr、ならびにカルバミルホスフェートシンターゼ、アスパルテートトランスカルバミラ
ーゼ、及びジヒドロオロターゼをコードする多機能CAD遺伝子など）及び／またはイントロンDNAを、異種性プロモーターDNAと共に挿入してもよい。レクトメ
ディンコーディング配列に連結される場合、標準的な選択方法によるマーカーDN
Aの増幅の結果、細胞でのレクトメディンコーディング配列の共増幅が導かれる。

【００３５】本発明によって提供されるDNA配列情報はさらに、例えば、相同組換えまたは「ノックアウト」戦略［Capecchi、Science、244巻、1288〜1292頁(1989)］によ
る、機能性レクトメディンを発現しない、またはレクトメディンの変異体を発現
する動物の開発も可能になる。かかる動物は、in vivoでのレクトメディン及びレクトメディンのモジュレーターの活性を調べるためのモデルとして有用であ
る。

【００３６】本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによってコードされた、精製及び単
離された哺乳動物レクトメディンポリペプチドを提供する。現在のところ好ま
しいレクトメディンポリペプチドは、配列番号：２、４、６または58に記載のア
ミノ酸配列を含むレクトメディンポリペプチドである。本発明は、(a) 配列番
号：１、３、５または57に記載のDNA配列；(b) (a)のタンパク質コード部分の非
コード鎖と高度なストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子；お
よび(c) 遺伝コードの縮重がなければ、(a)のDNAとハイブリダイズするはずであ
るＤＮＡ分子、からなるグループから選択されるDNAによってコードされたレクトメディンポリペプチドを包含する。

【００３７】本発明は、変異（または類似）レクトメディンポリペプチドをも包含する。ある実施例によれば、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基がレクトメディンアミ
ノ酸配列に補充された、挿入変異体が提供される。挿入は、タンパク質の一方
または両方の末端に行うことができ、あるいはレクトメディンアミノ酸配列の中
間領域に行うこともできる。一方または両方の末端に残基を追加する挿入変異
体として、例えば、融合タンパク質や、アミノ酸タッグまたはアミノ酸標識を具
備したタンパク質がある。

【００３８】他の態様によれば、レクトメディンポリペプチドでの一つまたはそれ以上のア
ミノ酸残基が削除された、削除変異体が提供される。削除は、レクトメディン
ポリペプチドの一方または両方の末端で効果的に行うことができ、あるいはレク
トメディンアミノ酸配列の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を削除することで
行うこともできる。それ故、削除変異体は、レクトメディンポリペプチドの全
断片を含んでいる。

【００３９】さらに他の態様によれば、本発明は、レクトメディンポリペプチドの置換変異
体を提供する。置換変異体には、レクトメディンポリペプチドの一つまたはそ
れ以上のアミノ酸残基が除去し、そして、他の残基で置換してなるポリペプチド
が含まれる。ある態様によれば、現在のところ置換は保存的に進行するが、本
発明は非保存的な置換をも包含する。この目的のための保存置換は、以下の表
Ａ、ＢまたはＣに記載の通り定義される。

【００４０】本発明は、レクトメディンポリペプチドの誘導体も提供する。誘導物として
、アミノ酸残基の挿入、削除または置換以外の修飾が施されたレクトメディンポ
リペプチドがある。好ましくは、現在のところ修飾は共有的に行われ、そして
、例えば、ポリマー、脂質、天然には産しないアミノ酸、他の有機および無機部
分を伴った化学結合を含む。本発明による誘導は、レクトメディンポリペプチ
ドの循環半減期が伸びるように調製したり、あるいは、所望の細胞、組織または
器官に対するポリペプチドの標的精度を高めるためにデザインすることもできる
。

【００４１】本発明は、本発明の好ましいポリペプチドと、少なくとも99％、少なくとも95
％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、少なくとも75％、少な
くとも70％、少なくとも65％、少なくとも60％、少なくとも55％または少なくと
も50％が、同一および／または相同のポリペプチドも包含している。本発明の
好ましいポリペプチドに関するアミノ酸配列の「同一」率は、本明細書では、配
列の同一性を最大ならしめるために、必要に応じて、双方の配列を整列し、かつ
ギャップを導入した後のレクトメディンコード配列での残基と同一の候補配列で
のアミノ酸残基に対する百分率として定義され、いかなる保存置換も配列同一性
の一部としては考慮しない。本発明の好ましいポリペプチドに関する配列の「
相同」率は、本明細書では、配列の同一性を最大ならしめるために、必要に応じ
て、双方の配列を整列し、かつギャップを導入した後のレクトメディンコード配
列での残基と同一の候補配列でのアミノ酸残基に対する百分率として定義され、
いかなる保存置換も配列同一性の一部としては考慮しない。

【００４２】ある態様によれば、整合性を最大ならしめるために、100アミノ酸の長さにおいて４つのギャップが挿入される場合、相同率は、比較される配列での同一のア
ミノ酸残基と整列せしめられる、小さな二つの配列でのアミノ酸残基の百分率と
して算出される[本明細書に参考までに取り込んだ、Dayhoff, in Atlas of Prot eins Sequence and Structure , Vol.5, p.124, National Biochemical Research
Foundation, Washington, D.C. (1972)]。

【００４３】本発明のポリペプチドは、天然の細胞供給源から単離されても、あるいは化学
合成されてもよいが、好ましくは本発明の宿主細胞を用いた組換え法によって製
造される。哺乳類宿主細胞の使用によって、本発明の組換え発現産物に対する
至適な生物学的活性を付与するのに必要かもしれない転写後修飾（例えば、グリ
コシレーション、トランケーション、リピデーション及びリン酸化など）が提供
されることが予測される。グリコシル化および非グリコシル化形態のレクトメ
ディンポリペプチドも、包含している。

【００４４】挿入変異体には、レクトメディン酸配列またはその断片に一つまたはそれ以上
のアミノ酸残基が加えられてなるレクトメディンポリペプチドがある。本発明
の変異体産物には、他のアミノ末端残基を持った成熟レクトメディン産物、すな
わち、リーダー配列またはシグナル配列が除去されたレクトメディン産物をも包
含する。他のアミノ末端残基とは、他のタンパク質由来のものであったり、ま
たは特定のタンパク質由来のため同定不可能な一つまたはそれ以上の残基であっ
たりする。 −１位にさらなるメチオニン残基を有するレクトメディン産物（Me
t^-1-レクトメディン）が企図され、同様に、−２及び−１位にさらなるメチオニ
ン及びリジン残基を有するレクトメディン産物（Met^-2-Lys^-1-PDE10）も企図される。 Met、Met-Lys、Lys残基をさらに複合的に有するレクトメディンの変異体は、細菌細胞型での組換えタンパク質の生産に対して特に有用である。

【００４５】本発明はまた、特異な発現系の使用に起因したさらなるアミノ酸残基を有する
レクトメディン変異体をも含むものである。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質の一部として所望のポリペプチドを発現する市販のベクターの使用によって、その所望のポリペプチド由来のGST成分の切断の結果、−１位にさらなるグリシン残基を有する目的のポリペプチドが提供さ
れる。他のベクター系での発現から得られる変異体もさらに、本発明で企図される。

【００４６】挿入変異体には、レクトメディンポリペプチドのアミノおよび／またはカルボ
キシ末端が他のポリペプチドに融合されてなる、融合タンパク質もある。かよ
うな融合タンパク質の例として、免疫原性ポリペプチド、イムノグロブリン定常
領域、マーカータンパク質（例えば、蛍光性のもの）のような循環半減期が長い
タンパク質、および、所望のレクトメディンポリペプチドの精製を促すタンパク
質またはポリペプチド、例えば、FLAG(登録商標)タッグやポリヒスチジン配列が
ある。

【００４７】削除変異体には、レクトメディンアミノ酸配列から一つまたはそれ以上のアミ
ノ酸残基を削除したレクトメディンポリペプチドがある。本発明の削除変異体
は、レクトメディンポリペプチドの生物学的または免疫学的特性を有する、配列
番号：２、４、６または58に記載の配列のポリペプチド断片を包含する。配列
番号：２、４、６または58の配列での少なくとも５、10、15、20、25、30、35ま
たは40個の連続するアミノ酸を含む断片も、本発明によって企図されている。
好ましいポリペプチド断片は、レクトメディンファミリーのポリペプチドに独特
または特異的な抗原性を呈する。所望の生物学的または免疫学的特性を有する
本発明の断片は、当該技術分野で周知かつ常法のいかなる手順に従っても調製す
ることができる。

【００４８】本発明の置換変異体は、レクトメディンアミノ酸配列での一つまたはそれ以上
のアミノ酸残基を削除し、次いで、他のアミノ酸残基で置き換えてなる、レクト
メディンポリペプチドまたはその断片を含む。変異ポリペプチドには、本発明
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾によって、保存置換が導入
されたポリペプチドも含まれる。アミノ酸は、物理特性と、タンパク質の二次
および三次構造への寄与度に応じて分類される。当該技術分野において、保存
置換とは、あるアミノ酸を、同様の特性を有する他のアミノ酸に置換するもので
あると認識されている。保存置換の例を、以下の表Ａ（1997年３月13日発行の
WO97/09433、第10頁(1996年９月６日出願のPCT/GB96/02197)）に記載した。

【００４９】

【表１Ａ】

【００５０】あるいは、保存アミノ酸は、以下の表Ｂに記載の通り、Lehninger, [Biochemi stry 、第２版、Worth Publishers, Inc. NY:NY(1975), pp.71-77]で定義しているように分類できる。

【００５１】

【表１Ｂ】

【００５２】さらに他の態様として、保存置換の例を、以下の表Ｃに記載した。

【００５３】本発明は、例えば、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール
またはポリプロピレングリコールのような一つまたはそれ以上の水溶性ポリマー
接着物を含むよう電子対共有の修飾または誘導を行った、レクトメディン産物ま
たはその断片をさらに包含する。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール
（PEG）サブユニットで共有結合修飾されたレクトメディン産物である。水溶性ポリマーは、例えば、レクトメディン産物のアミノ末端などの特定の位置に結
合させても、あるいはポリペプチドの１以上の側鎖に無作為に接着させてもよい
。他の誘導体には、固相支持体、ピン微粒子またはクロマトグラフィー樹脂に固定
したレクトメディン、ならびに一つまたはそれ以上の非タンパク質標識、タッグ
またはキレート剤を含むよう修飾したレクトメディンポリペプチドがある。

【００５４】

【表１Ｃ】

【００５５】さらに本発明によって企図されるのは、レクトメディン産物またはその断片に
対して特異的な抗体（例えば、モノクローナルおよポリクローナル抗体、単鎖抗
体、キメラ抗体、二価性／二特異性抗体、ヒト型化抗体、ヒト抗体、および本発
明のポリペプチドを特異的に認識するCDR配列を含んだ化合物を含むCDR-移植抗体）ならびに他の結合タンパク質である。本発明の好ましい抗体は、その全文
を参考までに本明細書に取り込んだ、1993年６月20日に発行されたWO93/11236号
に記載の方法に従って製造および同定されたヒト抗体である。 Fab、Fab'、F(a
b')₂およびF_vを含む抗体断片も、本発明によって提供される。「特異的」なる
語は、本発明の抗体の可変領域が、レクトメディンポリペプチドに独占的に認識
および結合する（つまり、レクトメディンポリペプチドのファミリーから、ポリ
ペプチドファミリー内で認められる配列の同一性、相同性または類似性にかかわ
らず、レクトメディンポリペプチドを区別可能である）ことを指すが、抗体の可
変領域の外側、特に、分子の定常領域内の配列との相互作用を介して、他のタン
パク質（例えば、S. aureusタンパク質ＡまたはELISA法での他の抗体）とも相互
作用を及ぼす。本発明の抗体の結合特性を決定するためのスクリーニング法は
、当該技術分野では周知でかつ常套手段でもある。かようなスクリーニング法
の総合的な解説については、Harlow et al., (編纂)、Antibodies: A Laborator y Manual ; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)、
第６章を参照されたい。本発明のレクトメディンポリペプチドの断片を認識お
よび結合する抗体は、それらが最初のものであり、かつ、先に定義したようにし
て、レクトメディンポリペプチドに対して特異的であれば、それら抗体も本発明
に包含される。全長レクトメディンポリペプチドに特異的な抗体に関して、レ
クトメディン断片を認識する本発明の抗体は、タンパク質ファミリー内で認めら
れる配列の同一性、相同性または類似性にもかかわらず、レクトメディンポリペ
プチドのファミリーからレクトメディンポリペプチドを区別することができる抗
体である。本発明の抗体は、当該技術分野で周知かつ常套のいかなる方法によ
っても製造することができる。

【００５６】当該技術分野で周知のどの方法でも、非ヒト抗体をヒト型化しうる。ある方
法によれば、非ヒト相補性決定領域(CDRs)が、ヒト抗体または共通の抗体フレー
ムワーク配列に挿入される。次いで、親和性または免疫原生をモジュレートす
るために、抗体フレームワークにさらに改変を加える。

【００５７】本発明の抗体は、例えば、（レクトメディンの活性をモジュレートすることに
よる）治療の目的、レクトメディンを検出または定量するための診断の目的、な
らびにレクトメディンの精製を行う上で有用である。抗体は、細胞、組織、器
官およびそれらの溶解物または抽出物、ならびに、血清、血漿、髄液、尿、痰、
腹水、胸膜水または肺洗浄水を含む液体でのレクトメディンの発現を検出および
／または定量する上で特に有用である。本明細書で記載したいずれかの目的の
ための本願発明の抗体を含むキットも企図されている。一般に、本発明のキッ
トは、それに対して抗体が免疫特異的である対照の抗原も含む。

【００５８】単離または組換レクトメディン産物、レクトメディン変異体、または該産物を
発現する細胞を用いて、特異的な結合タンパク質を同定または開発することがで
きる。結合タンパク質は、レクトメディン産物を精製するため、そして既知の
免疫学的方法を使用して体液及び組織試料中のレクトメディン産物を検出または
定量するために有用である。結合タンパク質はまた、レクトメディンの生物学
的活性、特にシグナル伝達経路に関与する活性をモジュレートする（すなわち、
ブロッキング、阻害する、または抑制する）上で極めて有用である。

【００５９】本発明によってもたらされるDNAとアミノ酸配列の情報は、レクトメディンの構造と作用に体系的分析をも可能ならしめる。レクトメディンに関するDNAとアミノ酸配列の情報は、レクトメディンポリペプチドまたはポリヌクレオチドが
相互作用するであろう結合パートナー化合物をも同定するであろう。レクトメ
ディン活性または発現をモジュレート（すなわち、増大、減少またはブロック）
する薬剤は、レクトメディンポリペプチドまたはポリヌクレオチドと共にインキ
ュベートし、そして、レクトメディン活性または発現に関する効果を決定するこ
とによって同定されよう。レクトメディンの活性をモジュレートする化合物の
選択性は、ある特定のレクトメディンの結合性と、他のレクトメディンポリペプ
チドに関するその結合性とを比較することによって評価することができる。結
合化合物をコードするDNAを同定するためのジ−ハイブリッド法や、既知の結合ポリペプチドとレクトメディンポリペプチドとの相互作用阻害剤を同定するため
のスプリットハイブリッド法のような細胞に基づいた方法や、レクトメディンポ
リペプチド、レクトメディンポリヌクレオチド、または結合パートナーが固定化
されてなる分析法を含むin vitro法、および溶液アッセイ法までもが、本発明に
おいて企図されている。

【００６０】選択性モジュレーターとして、例えば、レクトメディンポリペプチドまたはレ
クトメディンをコードする核酸に特異的に結合する抗体および他のタンパク質ま
たはペプチド、レクトメディンポリペプチドまたはレクトメディン遺伝子配列に
特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および、レクトメディンポリペプチドま
たはその構成核酸と特異的に反応する他の非ペプチド化合物（例えば、単離した
、または合成の有機および無機分子）がある。野性型レクトメディンの酵素活
性または細胞の局在化に影響を与える変異体レクトメディンポリペプチドもまた
、本発明において企図されている。現在のところ、選択性モジュレーターの開
発に好ましい標的として、例えば、(1) 他のタンパク質に接触するレクトメディ
ンポリペプチドの領域、(2) 細胞内にレクトメディンポリペプチドを局在化せし
める領域、(3) 基質に結合するレクトメディン10ポリペプチドの領域、(4) レク
トメディンポリペプチドのアロステリック調節結合部位、(5) 電子対共有修飾が
生物学的活性を調節するレクトメディンポリペプチドの部位、および(6) レクト
メディンサブユニットの多重構成に関与するレクトメディンポリペプチドの領域
がある。さらに他の選択性モジュレーターとして、コードする特異的なレクト
メディンと調節ポリヌクレオチド配列を認識するモジュレーターがある。レク
トメディン活性のモジュレーターは、レクトメディン活性の関与が知られている
様々な疾患や生理学的状態の処置における治療的用途において有用である。

【００６１】本発明のレクトメディンポリペプチドは、レセプター−リガンド相互作用、酵
母に基づいたアッセイシステムおよび哺乳類細胞発現系を研究するためのメラノ
フォアアッセイを含めた、メラノフォア細胞に基づいた高速スループットスクリ
ーニング(HTS)法での使用に適している。参考までに、Jayawickreme and Kost
, Curr. Opin. Biotechnol. 8: 629-634 (1997)を参照されたい。自動化および小型化したHTS法については、例えば、Houston and Banks, Curr. Opin. Biot
echnol. 8: 734-740 (1997)に解説されている。

【００６２】小分子モジュレーターの同定のために用いる多様なライブラリー、すなわち、
(1) 化学ライブラリー、(2) 天然物ライブラリー、および(3) ランダムまたはデ
ザインペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機分子からなる複合ライブラリー
などがある。

【００６３】化学ライブラリーは、既知の化合物の構造類似体、または天然物スクリーニン
グを経て「ヒット(Hits)」または「リーズ(Leads)」として同定される化合物からなる。天然物ライブラリーとは、(1) 土壌、植物または海洋微生物からの培
養物の発酵および抽出、または(2) 植物または海洋微生物の抽出によって、スク
リーニングのための混合物を調製するために用いられる、微生物、動物、植物ま
たは海洋生物のコレクションである。天然物ライブラリーには、ポリケチディ
ス(polyketides)、非リボソームペプチド、およびその変異（天然に産しない）変異体が含まれる。参考までに、Science 282:63-68 (1998)を参照されたい。

【００６４】複合ライブラリーは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、または混合物としての
有機化合物を数多く含んでなる。これらは、伝統的な自動合成方法、PCR、クローニングまたは特許された合成方法によって、容易に調製することができる。

【００６５】特に興味を引くのは、ペプチドとオリゴヌクレオチドの複合ライブラリーであ
る。興味を引く他のライブラリーとして、ペプチド、タンパク質、模造ペプチ
ド、多重合成コレクション、組み換え、およびポリペプチドのライブラリーがあ
る。これらから調製した複合化学およびライブラリーの参考までに、Mayers,
Curr. Opin. Biotechnol. 8: 701-707 (1997)を参照されたい。

【００６６】本明細書に記載した様々なライブラリーを使用したモジュレーターの同定は、
活性をモジュレートするための「ヒット」の能力を至適化ならしめるための、「
ヒット」（または「リーズ」）の候補物の修飾を可能ならしめる。

【００６７】本発明のDNA及びアミノ酸配列の開示を通じて寄与される情報の科学的価値は、明白である。一連の実験にて、レクトメディンに対するcDNAの配列の知見か
ら、レクトメディンや、プロモーター、オペレーター、エンハンサー、リプレッ
サー等のレクトメディン発現制御配列をコードするゲノミックDNA配列の同定が、サザンハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の使用によって可能となる。中程度から高度のストリンジェント条件下に本発明のDNA 配列を用いて行ったDNA/DNAハイブリダイゼーション法で同様に、レクトメディンの対立変異体をコードするDNAの単離が可能となることが予測され；対立変異体は、当該技術分野においてレクトメディンに特異的な生化学的及び／または免
疫学的特性の１以上持つ構造的に関連するタンパク質を含むことが知られるもの
である。同様に、ヒトのレクトメディンと相同なタンパク質をコードする非ヒ
ト種の遺伝子も、サザン分析及び／またはPCR分析によって同定することができ；本発明の種相同性は、レクトメディン関連疾患の研究用動物モデルにおいて特
に有用である。選択手段として、レクトメディンの１以上の生物学的特性を持
つ、他のヒトのレクトメディン産物ならびに非ヒトタンパク質、およびそのタン
パク質をコードするDNAを同定するために相補性試験が有用でありうる。

【００６８】本発明のポリヌクレオチドは、細胞がレクトメディンを発現する能力を検出す
るためのハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。本発明のポ
リヌクレオチドは、１以上の疾患の原因となっているレクトメディン遺伝子座に
おける遺伝的変化を同定するための診断方法に対する基礎となりうる。

【００６９】さらに本発明によって実現されるのは、レクトメディンをコードするポリヌク
レオチドを認識する、またはハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド
である。全長及び断片のアンチセンスポリヌクレオチドが提供される。当業
者であれば、本発明の断片のアンチセンス分子が、(i) レクトメディンRNAを特異的に認識し、それにハイブリダイズする（レクトメディンをコードするDNAと他の既知の分子をコードするDNAとの配列比較によって決定した）分子、ならびに(ii) レクトメディンファミリータンパク質での変異体をコードするRNAを特異
的に認識し、それにハイブリダイズする分子を含むことは想到されるであろう。

【００７０】レクトメディンファミリーのタンパク質の他のメンバーをコードするRNAにハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドも、分子のファミリーに関する
特徴配列またはシグネーチャー配列を同定するための配列比較を介して同定する
ことができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、レクトメディンmRNAを発現
している細胞によるレクトメディンの発現調節に特に関連するものである。

【００７１】レクトメディン発現調節配列またはレクトメディンRNAに特異的に結合することができるアンチセンス核酸（好ましくは、10〜20塩基対オリゴヌクレオチド）
は、細胞に（例えば、ウィルスベクター、あるいはリポソームのようなコロイド
分散系によって）導入される。このアンチセンス核酸は、細胞内のレクトメデ
ィン標的核酸配列に結合し、標的配列の翻訳または転写を防ぐ。ホスホロチオ
エートおよびメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明に
よる治療用途での使用を特に企図している。これらアンチセンスオリゴヌクレ
オチドは、ポリ-L-リジン、トランスフェリンポリリシン、またはコレステロール部分によって、その5'端をさらに修飾される。

【００７２】本発明は、リボザイムの使用を通して、レクトメディンの発現をモジュレート
する方法をさらに企図している。参考までに、Gibson and Shilitoe, Mol. Bi
otech. 7:125-137 (1997)を参照されたい。リボザイム技術は、(i) 相補性RNA
と標的mRNAとのハイブリダイゼーションと(ii)相補鎖に固有のヌクレアーゼ活性
を利用するハイブリダイズしたmRNAの開裂との一連の工程において、レクトメデ
ィンmRNAの翻訳を阻害するために利用することができる。リボザイムは、実験
室的方法で同定することができるが、より好ましくは、標的mRNAの結合可能部位
に基づいてデザインしたものとする［Bramlage, et al., Trends in Biotech 16
: 434-438 (1998)］。標的細胞へのリボザイムの誘導は、当該技術分野で周知
かつ常法の、外因的または内因的いずれかの誘導技術に従って行うことができる
。外因的誘導方法として、標的リポソームまたは局所注射の使用がある。内
因的誘導方法として、ウィルスベクターまたは非ウィルス性プラスミドの使用が
ある。

【００７３】リボザイムは、レクトメディンをコードするポリヌクレオチドに独特の領域に
相補的になるようデザインすると、レクトメディンの発現を特異的にモジュレー
トできる。従って、「特異的なモジュレート」とは、本発明のリボザイムが、
レクトメディンをコードするポリヌクレオチドだけを認識することを意味する。
同様に、レクトメディンファミリーのタンパク質の全部または一部の発現をモジ
ュレートするように、リボザイムをデザインすることができる。この種のリボ
ザイムは、このファミリーのタンパク質をコードするポリヌクレオチドの全部ま
たは一部に保存されたポリヌクレオチド配列を認識するようデザインされる。

【００７４】本発明はさらに、オリゴヌクレオチド特異的トリプルへリックス形成を使用す
る、レクトメディンの翻訳をモジュレートする方法も包含する。参考までに、
Lavrovsky, et al., Biochem. Mol. Med. 62: 11-22 (1997)を参照されたい。
トリプルへリックス形成は、ワトソン−クリックのモデルで定義された主要な溝
内にある二本鎖DNAにハイブリダイズする、配列特異性のオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。配列特異性のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼ
ーションは、その後、例えば、転写因子とポリメラーゼを含む、DNA結合性タンパク質の活性をモジュレートすることができる。ハイブリダイゼーションに適
した標的配列として、レクトメディン発現の転写調節を許容するプロモーターお
よびエンハンサー領域がある。

【００７５】トリプルへリックス形成が可能であるオリゴヌクレオチドは、標的DNA配列の部位特異的電子対共有修飾においても有用である。電子対共有修飾に有用なオ
リゴヌクレオチドは、Lavrovsky, et al.［前出］に記載されたような様々なDNA
損傷物質に結合される。

【００７６】レクトメディン遺伝子産物の標準機能の喪失を招く変異は、レクトメディンが
関与するヒト疾患状態の一因である。本発明は、レクトメディン活性を回復せ
しめるための遺伝子治療を包含し、これは、これら疾患状態（例えば、本明細書
に記載の癌の様々な形態）の処置を示唆するものである。好適な細胞への機能
性レクトメディン遺伝子の誘導は、ベクター、より好ましくはウィルスベクター
(例えば、アデノウィルス、アデノ関連ウィルスあるいはレトロウィルス）を用いて、ex vivo、in situ または in vivoで、あるいは物理的なDNA転移方法（例
えば、リポソームまたは化学処理）を用いて、ex vivoで行うことができる。例えば、Anderson, Nature, vol.392の増補版、no.6679, pp.25-20 (1998)を参照されたい。さらに、遺伝子治療の参考までに、Friedmann, Science, 244: 1
275-1281 (1989); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); およびMiller,
Nature, 357: 455-460 (1992)を参照されたい。さらに、他のヒトの疾患状態
において、レクトメディンの発現および活性阻害の予防が、これら疾患状態を処
置する上で有用であると企図している。アンチセンス治療または遺伝子治療が
、レクトメディンの発現を押さえ込む方向で適用することも企図している。

【００７７】本発明は、本発明のレクトメディンポリペプチドを、一般的には、薬学的に許
容される担体との組合せで含む薬学的組成物をさらに包含する。薬学的組成物
は、薬学的賦形剤、補剤または媒体として機能する、薬学的に許容される（すな
わち、無菌で無毒の）液体、半固体または固体希釈剤のような、薬学的に許容さ
れる担体を任意に含む。希釈剤の例として、ポリオキシエチレンモノラウリル
酸ソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、メチル−およびプロピルヒドロキシ
ベンゾエート、タルク、アルギン酸塩、澱粉、ラクトース、スクロース、デキス
トロース、ソルビトール、マニトール、アラビアゴム、燐酸カルシウム、鉱油、
ココアバター、およびカカオ油などがあるが、これらに限定されない。

【００７８】薬学的組成物は、誘導に便利な形態にパッケージすることができる。これら
組成物は、カプセル、サシェ、カシェ剤、ゼラチン、紙または他の包材で包み込
むことができる。これら免疫原性組成物を適用対象生物に導入した時に適合性
が認められ、また、特に、これら免疫原性組成物が単位投与量で誘導される場合
には、このような誘導形態は好ましい。投与単位ごとに、例えば、錠剤、カプ
セル、坐薬またはカシェ剤のような形態にパッケージすることができる。

【００７９】これら薬学的組成物は、従来の方法、例えば、静脈注射、皮内注射、筋内注射
、乳内注射、腹膜内注射、髄内注射、眼内注射、眼球後内注射、肺内注射（例え
ば、エアロゾル化した薬液）または皮下注射（長時間徐放のデポー投与を含む）
、あるいは、経口、舌下、経鼻、経肛門、経膣または経皮誘導によって、あるい
は、外科的移植、例えば、脾嚢、脳または角膜内への埋設など、のいずれの方法
によっても投与対象に導入される。治療処置は、単回の服用または所定期間に
わたる複数回の服用から構成される。

【００８０】非経口的に投与する場合、レクトメディン産物組成物は、一般に、一日当たり
１μg/kg〜100mg/kgの用量範囲、好ましくは、一日当たり0.1mg/kg〜50mg/kgの用量範囲、そしてより好ましくは一日当たり１mg/kg〜20mg/kgの用量範囲で注射
される。レクトメディン産物組成物は、最初に丸剤で投与し、次いで、薬剤の
治療循環レベルを維持するために連続注入する。当業者であれば、医薬に関す
る十分な経験と個々の患者の臨床状態によって、至適な効果的用量と投与法を定
めるであろう。投与頻度は、薬剤の薬動力学パラメーターと投与経路による。
当業者であれば、投与経路と所望の投薬量に応じて、至適な薬剤処方を決定する
であろう。例えば、その開示を参考までに本明細書に取り込んだ、Remington'
s Pharmaceutical Sciences, 第18版 (1990, Mack Publishing Co., イーストン
、ペンシルベニア州、18042)の第1435〜1712頁を参照されたい。かような調剤
は、身体状態、安定性、in vivoでの放出速度、および投与した薬剤のin vivoで
の清浄速度に影響を与える。投与経路ごとに、体重、体表面積または器官の大
きさに基づいて好適な用量が計算される。上述した調剤のそれぞれが関与する
治療に用いる好適な用量を決定するために必要な計算値の調整は、当業者であれ
ば、とりわけ、用量の情報と本明細書で開示したアッセイ法、ならびに先に検討
したヒトの臨床試験で得られた薬動力学データを参照すれば、過度の実験を経ず
とも常套的に調整できる。血中レベル用量を決定するために確立されたアッセ
イ法を、適切な用量−応答データと組み合わせて使用することで、好適な用量が
突き止められる。最終的な投与計画は、医師に相談し、薬剤の作用に変化を与
える様々な因子、例えば、薬剤の特異活性、患者の傷と意識の程度、年齢、容態
、体重、性別、それに患者の食事、感染の程度、投与時間、および他の臨床的因
子を考慮して決定される。研究が進むにつれて、好適な投薬レベル、および様
々な疾患および状態の治療期間に関する情報が、さらに明らかにされるであろう
。

【００８１】本発明の薬学的組成物および治療方法が、ヒト用医薬および獣医用医薬の分野
で有用であることが明らかになるであろう。よって、哺乳類、好ましくは、ヒ
トまたは他の動物が、処置される対象になるであろう。獣医学的目的での対象
には、例えば、牛、羊、豚、馬および山羊を含む農場動物、犬や猫のようなコン
パニオン動物、外来動物および／または動物園の動物、マウス、ラット、兎、モ
ルモットおよびハムスターを含む実験用動物、および、鶏、七面鳥、アヒルおよ
びガチョウなどの家禽などが含まれる。

【００８２】

【実施例】

本発明は、以下の実施例によって例証されるものである。実施例１には、レ
クトメディンポリペプチドをコードするcDNAの同定及び特徴付けを記載する。
実施例２は、組換えレクトメディンの発現に関するものである。実施例３には
、組換えレクトメディンの特徴付けを記載する。固定化されたレクトメディン
を用いたリガンドアフィニティークロマトグラフィーを、実施例４に記載する。

【００８３】実施例５に、レクトメディン発現のノザン分析を記載する。実施例５には、
哺乳動物細胞タイプにおけるレクトメディンのノザン分析の評価を提供し、一方
実施例６には、in situハイブリダイゼーションから得られた結果を記載する。

【００８４】レクトメディンのクロモソーム局在性を、実施例７に開示する。実施例８は
、レクトメディンに特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体の製造に関
する。実施例９には、レクトメディン発現について述べる。

【００８５】実施例１ヒトレクトメディンの単離と特徴付けレクトメディン−１αの同定 CD97に関連する新規の７回膜貫通型受容体タンパク質をコードする遺伝子を同
定することを目的として、全長のCD97に対するアミノ酸照会配列（配列番号：12
）を用いて、National Center for Biotechnology Information （NCBI、Bethes
da、メリーランド州）発現配列タグ（EST）データベースのTBLASTN検索を実行し
た。このデータベースは、様々な組織供給源から集められたcDNAの一端または両
端を示すDNA配列を含んでいる。CD97のタンパク質配列と、各ESTによってコード
される６つの異なるアミノ酸配列との間の相同性を調べるために、TBLASTNプログラムを使用した。検索において、ESTは６つの読み取り枠で翻訳され、そして製造されるアミノ酸配列を、照会CD97アミノ酸配列と比較するのである。アミノ
酸配列レベルで相同であると同定される配列を調べて、既知タンパク質と対応し
ているものとして陽性に同定されたESTは、すべて破棄した。

【００８６】 CD97、ヒトEMR1、及びネズミF4/80を示すESTが、既知タンパク質と対応してい
るものとして同定されたCD97関連配列の中にあった。加えて、CD97の膜貫通領域
での関連性に対して、様々なESTが統計的に有意な数値を示したが、それらはCD9
7、EMR1、またはF4/80ではなかった。同定されたESTの一つで、GenBank（登録商
標）受託番号No:T47902と称されたもの（配列番号：13）を選択して、全長cDNA の同定を試みた。T47902を選択するに際しての根拠は、かかるESTがヒト胎児脾臓ライブラリーに由来するものであるという、GenBank（登録商標）での記載にあった。

【００８７】ライブラリーのプローブは先ず、GenBankのT47902の配列に基づいたPCRによっ
て製造した。T47902配列を増幅するためのプライマーを、以下の配列番号：14及
び15に示す。 5'TGGAGTTTCAGCTGCTATTG （配列番号：14） 5'TGCCCATCCACAATAGTCTC （配列番号：15）混合ヒト成人脾臓cDNAを標準法によって調製し、そしてベクターpcDNA1.amp（
Invitrogen）［Van der Vieren, M.ら、Immunity 3:683-690(1995)］へ連結した
。その結果得られたプラスミド混合物を大腸菌に形質転換し、そしてこの細菌を
、カルベニシリン（100μg/ml）を含有するLB細菌用プレート上へ播種した。生存しているコロニーを掻き取って集め、プラスミドDNAをアルカリ溶解法によって調製した。350 ngのcDNA、100 ngの各プライマー（配列番号：14及び15）、20
0μMの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（アデノシン、チミジン、シチ
ジン、及びグアノシン）、10 mM Tris-HCl、pH 8.3（25℃にて）、50 mM KCl、1
.5 mM MgCl₂、及び5単位のTaqポリメラーゼ（Perkin Elmer Corp.、Foster City
、カルホルニア州）を含む反応液中でのPCRのための鋳型として、cDNA混合物を使用した。PCRは、最初の変性工程を95℃で７分間、次いで、95℃で１分間の変性、55℃で１分間のハイブリダイゼーション、そして74℃で２分間の伸長の、３
０サイクルを実施した。PCR終了後、反応液10μlを1.5％アガロースゲルにて分離し、そしてエチジウムブロマイド染色後に、306 bpの増幅産物を検出した。そ
の306 bpの産物を、GeneClean（登録商標）（BIO1O1 Inc.、Vista、カリホルニア州）を使用して、製造業者のプロトコルに従ってゲルから溶出し、そしてベク
ターpCR2.1（登録商標）（TA Cloning（登録商標）キット、Invitrogen、Carlsb
ad、カリホルニア州）へと連結した。こうして得られたプラスミド調製物を大腸
菌に形質転換し、その細胞を前記と同様に播種した。DNAミニプレップ用に種々のコロニーを選択し、そしてcDNAインサートを配列決定した。pCR2.1（登録商標
）（TA Cloning（登録商標）ベクターから、EcoRIを用いた消化によって306 bp のインサートを切り出した。消化の後、アガロースゲルにてDNA断片を分画した。およそ306 bpのバンドをゲルから溶出させ、標準法に従って、ランダムプライ
ミングによりラベルした。ラベルされたプローブを使用して、LB/カルベニシリンプレートに播種した細胞のコロニーリフト後に、ナイロン膜状に固定化された
ヒト脾臓成人cDNAライブラリー（前記）をスクリーニングした。

【００８８】２つのcDNAクローン（3.3及び15.3.1と命名）を得て、精製した。クローン3.3
は、およそ4200 bpのインサートを含んでおり、そしてクローン15.3.1はおよそ2
750 bpのインサートを含んでいた。標準自動化技術によって、双方のクローンを
配列決定した。クローン3.3に対するヌクレオチド配列を配列番号：９に示し、これによりコードされると予測されたアミノ酸を、配列番号：10に示す。クロー
ン15.3.1に対するヌクレオチド配列は、配列番号：16に示す。最初は２つのクロ
ーンが単一のcDNA配列を示すと推測され、主により大きな3.3インサートに依存して連続するcDNAを予測した。しかしながら、Kozak翻訳開始配列に先導される枠内ATG翻訳開始部位と枠内終止コドンが見出されないという事実によって証明されたところでは、いずれのインサートとも、完全な読み取り枠をコードしてい
なかった。

【００８９】完全なcDNAの5'端を単離することを目的として、ヒト脾臓cDNAライブラリー（
Marathon（登録商標）cDNA、Clontech、La Jolla、カリホルニア州）を使用して
RACE PCRを行った。PCRで利用したネスト化プライマー（配列番号：17及び18）は、ライブラリーベクターとクローン3.3配列に基づいて設計した。

【００９０】 5'GTGATCCAGCTACAGTTGTGCTCAT （配列番号：17） 5'CTAATGCTTCACAGAATCTCTCTGGC （配列番号：18）ヒト脾臓RNAまたは末梢血白血球RNAから調製したcDNAの5μlを、100 ngの下流ネ
スト化遺伝子特異的プライマー、アダプタープライマーAP1（Marathon（登録商標）cDNAキット；Clontech Inc.、Palo Alto、カリホルニア州）、200μMの各デ
オキシヌクレオチドトリホスフェート（アデノシン、チミジン、シチジン、及び
グアノシン）、10 mM Tris-HC1、pH 8.3（25℃にて）、50 mM KCl、1.5 mM MgC1
₂、 5単位のTaqポリメラーゼと共に、別々の反応液に添加した。PCRは、最初の変性工程を94℃で２分間、次いで、(i)94℃で0.05分間及び74℃で７分間の５サイクル、(ii)94℃で0.05分間及び72℃で７分間の５サイクル、(iii)94℃で0.05 分間及び70℃で７分間の２５サイクルを実施した。増幅の後、反応混合液を1：5
0に希釈し、そしてその5μlを、最初の増幅の場合と同じサイクル条件を用いて、100 ngの上流内部遺伝子特異的プライマー及びアダプタープライマーAP2（Mar
athon（登録商標）cDNAキット、Clontech）を含む第２増幅反応にて使用した。第２反応からの増幅産物を0.9％アガロースゲルにて分離し、次いで前記したとおりのベクターpCR2.1（登録商標）へのサブクローニング用に、ゲル中のおよそ
2 kbのバンドを溶出した。単離された断片は、RACE3.3と命名した。

【００９１】重複部を明らかにするために、RACE3.3配列を脾臓クローン3.3に対する配列と
相関比較すると、1114アミノ酸のポリペプチド（配列番号：34）をコードしてお
り、予測される分子量がおよそ125 kDの、読み取り枠（配列番号：33）が演繹さ
れた。脾臓ライブラリーをスクリーニングするために用いたESTは、CD97との配列類似性に基づいて選択されたのであるけれども、重複するクローンによりコー
ドされるポリペプチドは、GenBank（登録商標）にてこれまでに同定されたいずれかに関連はするがいずれとも異なる、ヒトタンパク質の独自のファミリーを示
すと推測された。予測されるアミノ酸配列に含まれる推定細胞外ドメインは、CD
97様タンパク質ファミリーの特徴たるEGFドメインを含んでおらず、予測されるタンパク質における膜貫通ドメインは、CD97の膜貫通ドメインに約45〜60％しか
一致していなかった。加うるに、RACE3.3及びクローン3.3の組み合わせの読み取
り枠から演繹される予測アミノ酸配列は、CD97に認められない、潜在性レクチン
結合、オルファクトメジン様、及びムチン様の細胞外ドメインを含んでいた。細
胞外レクチン結合様及びオルファクトメジン様ドメインの存在に基づいて、RACE
3.3及びクローン3.3配列によりコードされるポリペプチドは、レクトメディン-1
αと命名された。

【００９２】レクトメディン-1α配列を使用してその後行った、GenBank（登録商標）データベースのBLAST検索によって、レクトメディン-1αは、ラトロフィリンと命名されたα-ラトロトキシンに対するラット受容体［Lenianovaら、J. Biol. Chem.
272:21504-21508 (1997)］、及びα-ラトロトキシンのカルシウム非依存性受容
体（CIRL）[Krasnoperov、前出]に関連していることが示唆された。ヒト・レクトメディン-1α及びラット・ラトロフィリンは双方とも、やはりCD97に認められ
る７回膜貫通領域及び細胞質ドメインに加えて、細胞外レクチン結合様ドメイン
及びオルファクトメジン様ドメインを有している。レクトメディン-1αはまた、
CD97及びラトロフィリンの双方にて観察される切断予定部位に類似する配列も、
アミノ酸残基第809〜814位に含んでいる。これら３つのタンパク質は、類似する
一次配列の特異性をもって、エンドプロテアーゼ（または関連プロテアーゼ）に
よってプロセッシングを受ける可能性がある。これらの類似性に鑑み、レクトメ
ディン-1αは、ラット・ラトロフィリンのヒト相同体に関連するものであるかも
しれず、シナプス前終末における刺激／分泌カップリング及び／または分泌顆粒
遊離に関与し得るのである。しかしながら、中枢神経系外の細胞及び組織型（後
述）におけるレクトメディンの発現は、レクトメディンがラトロフィリンと機能
的に相違していることを示唆している。レクトメディン-1αの全アミノ酸配列は
、ラトロフィリンのものとおよそ80％の一致度であることが見出されたが、ラト
ロフィリン細胞質ドメインのアミノ酸配列は、レクトメディン-1αの予測される
細胞質ドメインと関連性を有していなかった。加えて、ラトロフィリンにおける
開始のメチオニンの配置は、レクトメディン-1αの予測される読み取り枠におけ
るものと相違していた。しかしながら、レクトメディン-1αポリヌクレオチド配
列のさらなる分析の後、異なる読み取り枠でのメチオニンコドンが、始めに予測
された読み取り枠から上流に同定された。ラトロフィリンの開始のメチオニンコ
ドンの位置により密接に関連付けられる上流のメチオニンコドンの配置（膜貫通
領域について）と、その上流メチオニンコドンを用いた読み枠での最初のいくつ
かのアミノ酸も、ラトロフィリンにおける配列と対応していた。

【００９３】ラトロフィリンとの潜在的類似性に鑑み、1114アミノ酸のレクトメディン-1α
読み取り枠をコードするポリヌクレオチド配列を再度、RACE3.3 cDNAの自動化配
列決定の際に得られた生データと比較した。さらに調べることで、第454位のグアノシンヌクレオチドが配列番号：33に入っていたが、生の配列データに存在し
ないことが示された。RACE3.3に対する修正されたヌクレオチド配列（すなわち、無関係なグアノシンヌクレオチドが除かれている）は、クローン3.3の配列（配列番号：９）と共に、1177アミノ酸をコードする読み取り枠を示した。修正さ
れた読み取り枠は、新しく同定された開始のメチオニンで始まり、そして先に同
定されたレクトメディン-1αのレクチン結合様ドメイン、オルファクトメジン様
ドメイン、ムチン様ドメイン、膜貫通及び細胞質ドメインを含んでいた（配列番
号：１）。

【００９４】既知タンパク質との相同性に基づき、レクトメディン-1αタンパク質の様々な
領域におけるドメインを同定した。およそ831アミノ酸の細胞外領域は、以前に報告されたD-ガラクトシド結合レクチン結合様ドメイン［Ozekiら、Biochemistr
y 30:2391-2394(1991)］（配列番号：２のレクトメディン-1αアミノ酸第36〜13
1位）及びオルファクトメジン様ドメイン［Yokoe及びAnhot、Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 90:4655-4659(1993)］（配列番号：２のレクトメディン-1αアミノ
酸第135 〜327位）への相同性を示した。３つの細胞外及び３つの細胞内ドメインは、G-タンパク質結合受容体（GPCR）の特徴である［Koblikaら、Science 238
:650-656(1987)］７回膜貫通ドメインによって分かたれていた（配列番号：２の
アミノ酸第832〜1075位）。102アミノ酸の細胞質領域は、膜貫通領域に隣接して
いた。レクトメディン-1αが、アミノ酸第354から563位（配列番号：２）までに
、多くのセリン及びスレオニン残基（O-グリコシル化され得る）とさらに、多く
のプロリン残基（多くのベータ折部を持つ伸長構造に起因してアルファヘリック
スを破壊する）を有する領域を含むという観察に基づいて、ムチン様ドメインが
同定された。

【００９５】追加のレクトメディン-1α種の同定レクトメディン-1αに対する配列は、クローン3.3及びRACE3.3断片について決
定された配列に基づくものであった。第２のレクトメディンcDNAは、第２の脾臓
クローン15.3.1の配列に基づいても演繹することができた。クローン15.3.1の配
列と15.3.1の対する配列を比較すると、先ずこれらクローンは、クローン3.3（配列番号：７）の第1620位に必要なアデノシンがクローン15.3.1には見かけ上存
在しないことを除いて、双方の5'領域と実質的に同じであった。結果として、ク
ローン15.3.1の読み枠は、クローン3.3の読み枠に比べてずれており、しかしてクローン15.3.1はレクトメディン-1αに認められる特徴的な７回膜貫通ドメイン
を有するタンパク質をコードしていなかった。クローン15.3.1に対する配列に変
異アデノシンが挿入されると、予測されるタンパク質配列は、細胞質ドメイン内
の最初のアミノ酸残基まで、レクトメディン-1αアミノ酸配列と一致した。この
配列は、およそ48アミノ酸の細胞質ドメインを含む、（クローン3.3からのみ由来するレクトメディン-1α cDNAの細胞質ドメインでの107アミノ酸に比較すると
）より短いcDNAを作り出すクローン15.3.1の細胞質領域における、オールターナ
ティブスプライシング部位を示唆するものであった。クローン3.3から演繹されたレクトメディン-1α cDNAはまた、クローン15.3.1で同定される対応するpoly(
A⁺)部位から210ヌクレオチド上流の、オールターナティブpoly(A⁺)部位で終結す
る。これらの相違は、クローン15.3.1がレクトメディン・ファミリーの第２のメ
ンバーであることを示しており、これは、レクトメディン-1βと命名された。レ
クトメディン-1βに対する演繹ポリヌクレオチド配列は、従って、（クローン15
.3.1の5'領域を伸長させた）クローン3.3と（適切な5'端を提供する）RACE3.3配
列からの重複配列を使用して作製され、レクトメディン-1βに対する予測された
完全なcDNA及び演繹されたアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：３及び４に示す
ものである。

【００９６】レクトメディン-1βに対する予測アミノ酸配列の特徴付けによって、レクトメ
ディン-1αについて同定されたものと（配列及び位置の両方の点で）類似した様
々なドメインが提供される。D-ガラクトシド結合レクチン様ドメイン（配列番号
：４のアミノ酸第36〜131位）、オルファクトメジン様ドメイン（配列番号：４のアミノ酸第135〜327位）、及びムチン様ドメイン（配列番号：４のアミノ酸第
354〜563位）を含む、およそ831アミノ酸の細胞外領域が予測される。７回膜貫通ドメイン（配列番号：４のアミノ酸第832〜1075位）は、細胞外ドメインに隣接して位置し、そして48アミノ酸の細胞質領域（配列番号：４のアミノ酸第1076
〜1123位）は膜貫通領域に隣接して位置していた。

【００９７】始めに同定された、T49702と命名されたEST（配列番号：13）は、GenBank（登
録商標）において、71509（配列番号：21）と命名されたcDNAクローンの5'端を示すことが記載されており、そしてクローン71509の3'端を示すDNA配列について
GenBank（登録商標）をさらに検索したところ、T47903と命名された第２のEST（
配列番号：30）が同定された。クローン71509を購入し、配列決定して、さらにレクトメディン-1α及びレクトメディン-1βでの対応する領域と比較した。クロ
ーン71509の配列は、レクトメディン-1α及び1β配列の部分と同じであったが、
レクトメディン-1αとレクトメディン-1βとの比較から明らかとなったオールタ
ーナティブスプライシングのように、クローン71509の配列に基づいて更に別のオールターナティブスプライシングが見出された。詳細には、クローン71509の配列はクローン3.3に認められる106 bpの配列を欠いていることが見出された。クローン15.3.1もまた、同じ106 bpと、5'上流DNAのさらなる97 bpを欠いていた
。従ってクローン15.3.1は、レクトメディン-1αクローンに認められる配列の20
3 bpを欠いたものであった。106 bpの欠失の結果、細胞質ドメインをコードする
領域におけるフレームシフトが引き起こされ、それにより第３のレクトメディン
タンパク質が提供されることとなるのである。この第３のオールターナティブ・
レクトメディンポリヌクレオチド、及び予測されるアミノ酸配列（それぞれ、配
列番号：５及び６）は、レクトメディン-1γと命名された。

【００９８】他のレクトメディンポリペプチドでの場合と同様に、レクトメディン-1γは、
(i)D-ガラクトシド結合レクチン様ドメイン（配列番号：６のアミノ酸第36〜131
位）、オルファクトメジン様ドメイン（配列番号：６のアミノ酸第135〜327位）
、及びムチン様ドメイン（配列番号：６のアミノ酸第354〜563位）を含む、およ
そ831アミノ酸の細胞外領域、(ii)７回膜貫通ドメイン（配列番号：６のアミノ酸第832〜1075位）、ならびに(iii)328アミノ酸の細胞質領域（配列番号：６のアミノ酸第1076〜1403位）を含んでいる。

【００９９】３つのクローンが分岐する配列は、AGジヌクレオチドの存在を伴う規範的3'エ
キソン配列の特徴（hallmark）を示していた。しかしながら、これらの領域は、
高度に保存されたGTジヌクレオチドを含むことが見出されている、一般に認めら
れたイントロンジャンクション配列［GENES IV, B. Lewin, Cell Press, Cambri
dge マサチューセッツ州 (1992),p. 597］とは異なっていた。これらの配列の同
定によって、これらクローンが不完全なRNAスプライシングからでなく（規範的エキソン／イントロンジャンクション配列（AG/GT）が予測されるはずである）、オールターナティブにスプライスされたRNAに由来することが示唆された。

【０１００】レクトメディン-2及びレクトメディン-3 種の同定配列の相同性を有するさらなるESTを同定することを目的として、レクトメディン-1α及びラット・ラトロフィリン（配列番号：19）を、引き続きBLAST検索を行う上での照会配列として使用した。AA683020（配列番号：22）及びM79057（
配列番号：23）と命名された２つのESTが、レクトメディン-1α及びラトロフィリンに密接に関連しているものとして同定された。EST AA683020に対する配列は
、レクトメディン-1α配列（配列番号：22）のヌクレオチド第3275から3643位ま
での領域に対応しており、そしてEST M79057に対応する配列は、レクトメディン
-1αのヌクレオチド第2561から2842位までに対応している。

【０１０１】 BLAST検索の結果は、双方のESTが、レクトメディン-1αをコードするヌクレオ
チド配列よりもラット・ラトロフィリンに、より密接に関連していることを示唆
し、さらにラットタンパク質からレクトメディン-1αを識別し、そしてヒトEST がラット・ラトロフィリンのヒト相同体と推定されるものにより密接に関連し得
ることを示すものであった。しかしながら、これらヒトEST配列とヒトレクトメディン-1αとの間の見かけ上の関連性に鑑みて、AA683020及びM79057 ESTが独自
のレクトメディン-2及びレクトメディン-3種を示すものと定められた。

【０１０２】全長のレクトメディン-2及びレクトメディン-3タンパク質をコードするcDNAを
単離することを目的として、ライブラリーのスクリーニング用のプローブを増幅
すべく、レクトメディン-2及びレクトメディン-3の双方に対するEST配列に基づいてプライマーを設計した。レクトメディン-2配列を増幅するためのプライマー
は、NHlect2.5（配列番号：35）及びNHlect2.3（配列番号：36）であり、レクト
メディン-3配列に対するプライマーは、NHlect.5（配列番号：37）及びNHlect.3
（配列番号：38）であった。 NHlect2.5 GGGCCTCACCTGGGCTTTCGGCCTCCTC （配列番号：35） NHlect2.3 GGACTGGTGCCCCCACGCGTGTCAGCAC （配列番号：36） NHlect.5 CCAACAAGACCCATACCAGCTGTG （配列番号：37） NHlect.3 CTGAGTCTTGTCGATCCCGACC （配列番号：38） PCRは、Clontech ヒト脳 Marathon-Ready（登録商標）cDNAライブラリーを鋳型として使用して行った。反応条件は、最初に94℃にて４分間インキュベートし
、次いで94℃で30秒、50℃で30秒、そして72℃で30秒の２５サイクルを実施し、
その後最終的な伸長工程を72℃にて７分行い、次にPerkin-Elmer GeneAmp（登録
商標）PCR System 9700で4℃に冷却することを含むものとした。この結果得られ
たPCR産物を、低融点アガロース（Gibco/BRL）ゲル及びQIAGEN（登録商標）ゲル
抽出キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。精製された増
幅産物は、TA Cloning（登録商標）キット（Invitrogen）を用いてベクターpCRI
I（登録商標）へと別々にクローニングし、そしてPCRに関わるエラーを同定する
ために配列決定を行った。

【０１０３】 cDNAライブラリーのスクリーニング用のプローブは、pCRII（登録商標）クローンからのEcoRI断片を精製することによって調製した。レクトメディン-2の消化産物から、274及び158 bpのの２つの断片が得られ、そして274 bpの断片が精製された。レクトメディン-3の消化の結果、297 bpのEcoRI断片が得られた。

【０１０４】 LAMBDAZAP（登録商標）ベクター内のヒト胎児脳cDNAライブラリーを、Stratag
ene（La Jolla、カリホルニア州）より購入した。およそ50,000 pfuを２０枚の1
50 mm LBM寒天プレートに、LE392 E.coliと共に播種した。プレートを反転させて37℃にて終夜インキュベートした。翌日、フィルター・レプリカを調製する前
に、プレートを4℃にて２時間冷却した。直径132 mm、排除定格0.45μmを有する
Amersham Hybond（登録商標）N⁺ナイロン転写膜フィルターを使用して各プレートのレプリカを２枚調製した。フィルターを変性用溶液に２分間浸漬し、中和用
溶液に２分間浸漬し、そしてStratagene（登録商標）UV Stratalinker 2400にて
公差結合させた。80 mlのプレハイブリダイゼーション用溶液中、20枚のフィルターを用い、65℃にて終夜プレハイブリダイゼーションを行った。

【０１０５】ハイブリダイゼーションプローブは、ランダムプライミングキット（Boehring
er Mannheim GmbH、ドイツ）を使用し、³²P-dCTP及び³²P-dTTP（各々800 μCi/m
mol、NEN Life Sciences Products）でEcoRI断片をラベルすることにより調製し
た。ラベルされたプローブを、20枚のフィルターにつき20 mlのハイブリダイゼーション用溶液に添加して、65℃にて終夜、ハイブリダイゼーションを行った。
翌日フィルターを洗浄し、そして風乾してから、−70℃にて１〜３日間、オート
ラジオグラフィーに付した。フィルムを現像すると、陽性プラークを拾い、そし
て１滴のクロロホルムを含むファージ希釈用緩衝液500μlに移した。陽性プラー
クの希釈物を調製し、そして100 mmのLBM寒天プレートに播種した。

【０１０６】 82 mmのAmersham Hybond（登録商標）N⁺フィルターを使用し、レプリカフィル
ターを１組だけしか調製しなかったことを除いては前記のとおりに、プレートを
第２回目のスクリーニングに付した。第２回目のスクリーニングから得られた陽
性プラークを第３回目のスクリーニングに付し、ここで、ファージ獲得につき、
陽性プラークのみが拾われたことを確認した。Exassist（登録商標）/SOLRファージ獲得系（Stratagene、La Jolla、カリホルニア州）を使用して、製造業者の
プロトコルに従い陽性プラークを調製した。この獲得手順で、EcoRI制限部位を有するpBluescript（登録商標）SKベクターへとクローニングされた、目的とするDNAを含む大腸菌コロニーが産生された。プラスミドDNAは、Wizard（登録商標
）Plus Miniprep Kit（Promega、Madison、ウィスコンシン州）を使用して精製し、相対サイズを決定するために消化した。

【０１０７】得られた精製クローンを、5'及び3'端の双方でのDNA配列決定により分析した。EST M79057に由来するプローブによって同定された陽性クローンのうち、最長
の単離物のいくつかを、完全なDNA配列分析用に選択した。２つのクローン（2.1
及び2.4と命名）が、1470アミノ酸をコードする完全な読み取り枠を包含する合計で5611 bpの重複DNA配列を含むことが見出された。AA683020プローブを用いて
同定されたクローンのうちのすべてが、EST M79057に由来するクローンと同じ配
列を含んでいた。これらの結果から、AA683020及びM79057 ESTは、単一のmRNA種
からの重複していない領域を示すものであることが示唆された。従って、これら
２つのクローンは、同じレクトメディン-2遺伝子に由来するものであった。レク
トメディン-2をコードするポリヌクレオチドを配列番号：57に示し、そしてその
アミノ酸配列を配列番号：58に示す。

【０１０８】レクトメディン-2の予測されるポリペプチド配列中の様々なドメインの構成は
、レクトメディン-1のものと関連性があった。レクトメディン-2のおよそ851アミノ酸の細胞外ドメインは、D-ガラクトシド結合レクチン様ドメイン（配列番号
：57のアミノ酸第36〜131）と相同な領域を包含しており、７回膜貫通ドメイン（配列番号：57のアミノ酸第852〜1095位）と細胞質領域（配列番号：57のアミノ酸第1096〜1470位）によって、３つの細胞外及び３つの細胞内ドメインが分か
たれていた。レクトメディン-2の細胞質領域は、鎖長及び配列一致度の点でレク
トメディン-1γに最も類似していた。レクトメディン-1γとレクトメディン-2の
ポリペプチド配列全体の比較から、62.5％のアミノ酸一致度が示された。これら
の比較から、レクトメディン-2が、配列ではレクトメディン-1γよりもCIRLによ
り密接に関連していることが示唆された。

【０１０９】全長のレクトメディン-2読み取り枠を作るために、哺乳動物ベクターpcDNA3に
重複クローン2-1及び2-4を集めるように、ストラテジーを設計した。２つのプラ
イマー（配列番号：61及び62）を使用して、cDNAクローン2-1の領域を増幅した。 JD#1 ATATAAGCTTGCTGCCACCATGGCCCGC （配列番号：61） Lecto-3#31 ATGACCCACAGCCCGTTCTC （配列番号：62）プライマーJD#1（配列番号：61）には、クローニングを容易とするためにHind
III部位を組み込んだ。得られた843 bpの増幅産物をHindIII及びBamHIで消化して535 bpのDNA断片を単離した。このクローン2-1由来の535 bpの断片を、クロー
ン2-1由来の1912 bpのBamHI/SalI断片、クローン2-4由来の2904 bpのSalI/EcoRV
DNA断片、及び予めHindIII及びEcoRVで消化しておいたpcDNA3（Invitrogen）に連結した。

【０１１０】さらなるレクトメディン種の同定照会配列としてレクトメディン-1αまたはレクトメディン-2を用いたGenBank
ESTデータベースのBLAST検索で、レクトメディン-1と同じEST配列、レクトメディン-2と同じEST配列、及び既知の両レクトメディンと有意に関連性があるがそれらと異なる複数のESTが同定された。表１を参照されたい。これら独自のレクトメディンESTの一つ（GenBank 受託番号R50822）は、クローン#37438に由来するものであった。クローン#37438を購入して、そのDNA配列を完全に決定した。クローン#37438に対するポリヌクレオチド配列を配列番号：59に示し、そしてコ
ードされるアミノ酸を配列番号：60に示す。クローン#37438の3'配列は、レクト
メディン-1γ及びレクトメディン-2の細胞質ドメインに有意なアミノ酸相同性を
有するタンパク質に対する、予測されるコーディング配列に先導される非翻訳領
域を含んでいる。クローン#37438の5'端は、レクトメディンに関連しておらず、
tRNAシンセターゼに対するヌクレオチド配列と同様であった。このクローンは、
部分的にスプライシングを受けたmRNAを示すものか、またはクローニングによる
アーティファクトかもしれない。

【０１１１】 cDNAクローン#37438を使用して、当該技術分野における標準的な技術によりヒ
ト胎児脳cDNAライブラリーからのおよそ100万のクローンをスクリーニングするための、ラベルされたプローブを作製した。ハイブリダイゼーションは、45％の
ホルムアミドの存在下に43℃にて行い、フィルターを0.1 X SSCにて、68℃で90 分間洗浄した。同定された陽性クローンを均質となるように単離し、そのクロー
ンのうち11について部分的な配列分析を行った。１つのクローン（#11）のDNA配
列が、クローン#37438と同じ3'配列と、レクトメディン-1及びレクトメディン-2
に類似しているが異なる上流コーディング配列内の5'配列を有することが確認さ
れた。

【０１１２】

【表１Ｄ】

【０１１３】実施例２レクトメディンの組換え発現レクトメディン-1α Ａ．レクトメディンイソフォームをコードする発現ベクターを、前記のクロー
ン3.3及びRACE3.3からのDNA断片を組み合わせることによって構築した。

【０１１４】一つの取り組みでは、クローン3.3及びRACE3.3の双方のポリヌクレオチドを先
ず、SacI制限部位を導入するサイレント変異の挿入により、重複領域で修飾する
。所望の制限部位を作るように第1455位でGをCに変化させている、RACE3.3 cDNA
の鋳型から5'配列を増幅すべく、プライマー（配列番号：25及び26）を用いてPC
Rを行う。RACE3.3断片の増幅において、ATG開始コドンでの配列に基づいて5'プライマーを設計し、プライマーはクローニングを容易ならしめるためのBamHI制限部位とKozakコンセンサス配列を導入するものとされる。 5'-TCTTCAGCTGAGCTCTTCAAAACC （配列番号：24） 5'-GGTTTTGAAGAGCTCAGCTGAAGA （配列番号：25） 5'-CAGCAGGGATCCACCATGGTGTCTT- CTGGTTGCAGAATGCGAAGTCTGTGG （配列番号：26） 5'-GACGATGACGCGGCCGCCTATTAAAGAC- TTGTAACCAGCTGCATTTGTCCTTCTC （配列番号：27）配列番号：24及び27に示すプライマーを用いたクローン3.3 DNAの増幅において、3'プライマーは翻訳の終止部位での配列に基づき、そしてNotI制限部位を導入
するように設計される。

【０１１５】この結果得られる増幅産物、5'BamHI部位及び3'SalI部位を持つRACE3.3断片、
ならびに5'SalI部位及びNotI部位を持つクローン3.3 DNAを、適切な酵素で消化し、共に連結させて、そしてBamHI及びNotIで予め消化された哺乳動物発現ベクターpcDNA+3（Invitrogen、Carlsbad、カリホルニア州）へとクローニングする。

【０１１６】Ｂ．別の取り組みとして、前記のRACE3.3を増幅するために使用された5'プライマーと、やはり前記のクローン3.3 DNAを増幅するために使用された3'プライマーとを用い、PCRを使用してレクトメディン-1αをコードするDNAを作製する。

【０１１７】 PCRにおいて、RACE3.3及びクローン3.3 DNAの双方を、２つのプライマーと組み合わせる。最初の変性工程の後、RACE3.3及びクローン3.3 DNAは、重複する領
域を越えてアニールし、そして二本鎖領域は、完全な二本鎖のレクトメディン-1
α DNAを産生する最初の伸長反応におけるプライマーとしての役割を果たすはず
である。引き続いての増幅は、5'及び3'プライマーからの伸長から得られるもの
とされよう。次いで増幅産物を精製し、BamHI及びNotIで消化して、そして同じ酵素で予め消化しておいたpcDNAベクターに挿入する。

【０１１８】Ｃ．さらに別の取り組みにおいて、「レクトメディン-1αをコードする発現ベ
クターを、二工程の手順で構築した。最初に、クローン3.3のXbaI断片とプライマー3.3.24（配列番号：52）とLecto 3' express（配列番号：27）をTaqポリメラーゼと共に使用して、PCRを実施した。 CCTACCACAGCTGTGACAATAACTTCTTCAGCTGAGC （配列番号：52）第２のPCRは、鋳型DNAとしてRACE3.3のEcoRI断片、ならびにプライマーLecto5'e
xpress（配列番号：26）及びLecto6（配列番号：25）をVent（登録商標）ポリメ
ラーゼ（New England Biolabs、Beverly、マサチューセッツ州）と共に使用して
行った。２つの増幅産物を精製し、変性、及びアニーリングした。これら２つの
断片はおよそ100ヌクレオチドの領域で重複しているので、アニーリングの結果、レクトメディン-1α全コーディング領域にわたる部分的二本鎖の分子が得られ
ることになる。Taqポリメラーゼを用いた伸長によって、先ず二本鎖レクトメディン-1αコーディング領域が作られる。この二本鎖分子を次いで、配列番号：26
及び27に示すプライマーを使用して増幅した。配列番号：26のプライマーはBamH
I制限部位、それに続いてKozakコンセンサス開始部位を導入するように設計した
。得られた増幅産物は、NotI及びBamHIで消化し、そしてレクトメディン-1α断片をゲル精製した。断片を、予めBamHI及びNotIで消化しておいたpcDNA3（Invit
rogen、Carlsbad、カリホルニア州）へと連結した。pcDNA3 Lectomedin-1α#2と
命名された、この結果得られたプラスミドの配列分析から、増幅プロセスでいく
つかのエラーが導入されていることが示唆された。正しいレクトメディン-1αコ
ーディング配列は、エラーを含まないpcDNA3 Lectomedin-1α#2の領域から構築されて、以下のとおりRACE3.3及びクローン3.3の断片に連結された。

【０１１９】 pcDNA3 Lectomedin-1α#2からの166 bpのHindIII/BglII断片、RACE3.3からの6
28 bpのBglII/BstXI断片、及びLectomedin-1α#2からの775 bpのBstXI/ApaI断片
を、予めBstXI及びApaIで消化しておいたpBluescript（登録商標）KS+（pBSKS）
（Stratagene）の存在下に連結した。得られたプラスミドは、pBSKSlectoHindII
I/ApaI#6と命名された。

【０１２０】別の反応において、クローン3.3からの306 bpのApaI/EcoRI断片及びクローン3
.3からの2486 bpのEcoRI/EcoRI断片を、予めApaI及びEcoRIで消化しておいたpBS
KSの存在下に連結した。得られたプラスミドは、pBSKSlecto1alphaEcoRI/ApaI#6
と命名された。

【０１２１】プラスミドpNEF6及びpDEF2は、選択用のネオマイシン（G418）耐性に加えて、
チャイニーズハムスター卵巣伸長因子１をコードする遺伝子をエンコードしてい
る。pNEF6及びpDEF2の構築は、以下のとおりに行った。

【０１２２】プラスミドpEF1/XNは、pDC31（WO 98/49829）からの2.22 NotI/SmaI断片と共に、Klenowポリメラーゼで平滑末端化されたXbaI部位を有するpSK/EF1.12（WO 9
8/49829、1998年11月5日公開、引用することにより本明細書に組み入れることと
する）11 kbのNotI/XbaI断片の連結によって作製した。

【０１２３】プラスミドpNEF3は、pSKEF1.7（WO 98/49829）からの4.19 kbのSalI/NsiI断片
（Klenowポリメラーゼで、NsiI断片は平滑末端化されている）を、pNEF1（WO 98
/49829）からの7.96 kbのSalI/PmeI断片と連結することによって作製した。

【０１２４】プラスミドpNEF6は、pNEF5からの19.7 kbのXbaI/Asp718断片を、pRc/CMv（Inv
itrogen）からの0.844 kbのXbaI/Asp718断片と連結することによって構築した。

【０１２５】 736 bpのNotI/HindIII断片（イントロン配列を含んでいる）をDEF2より単離し
、そしてpBSKSlectoHindIII/ApaI#14からの1571のHindIII/ApaI断片（Kozak配列
、転写開始部位、及びアミノ酸1〜515に対するコーディング領域を包含している
）、pBSKSlecto1alphaEcoRI/ApaI#6からの3714 bpのApaI/XbaI断片（レクトメデ
ィン-1αのアミノ酸第516〜1177位をコードし、そして終止コドン及び非翻訳配列を包含している）、ならびに予めXbaI及びNotIで消化しておいたpNEF6と組み合わせた。得られたプラスミドはpNEF6LectomedinA#3.1と命名された。

【０１２６】レクトメディン-1β及びレクトメディン-1γ クローン15.3.1及びクローン71509を別々に、プライマーlecto3.3.10及び3.3.
19を用いて増幅した。 TCAGACACTCATACTGCTGTG （配列番号：49） CACAGTCCACAACTTGCAC （配列番号：50）得られた増幅産物は、StuI及びNcoIで消化し、そして15.3.1（レクトメディン-1
β）からの113 bp及び71509（レクトメディン-1γ）からの210 bpを精製した。各断片を別々に、予めStuI及びNcoIで消化しておいたpBSKSlecto1alphaEcoRI/Ap
aI#6に連結した。得られたプラスミドは、pBSKSlecto1betaEcoRI/ApaI#7及びpBS
KSlecto1gammaEcoRI/ApaI#6と命名された。

【０１２７】レクトメディン-1β発現プラスミドを作るために、pBSKSlecto1alphaEcoRI/Ap
aI#6からの3714 bpのApaI/XbaI断片をpBSKSlecto1betaEcoRI/ApaI#7からの2586
bpのApaI/XbaI断片に置換したことを除いてはレクトメディン-1α発現プラスミドの構築に対して前記した反応を繰り返し、プラスミドpNEF6Lectomedin1B#4.2 と命名した。

【０１２８】レクトメディン-1γ発現プラスミドを作るために、pBSKSlecto1alphaEcoRI/Ap
aI#6からの3714 bpのApaI/XbaI断片をpBSKSlecto1gammaEcoRI/ApaI#6からの2683
bpのApaI/XbaI断片に置換したことを除いては同様のレクトメディン-1α反応を
行って、プラスミドpNEF6Lectomedin1Gを得た。

【０１２９】可溶性レクトメディン-1 Ig融合タンパク質の発現レクトメディン-1の可溶性欠切型を、ヒトイムノグロブリンG1ヒンジ及び定常
重鎖領域2及び3［ヒンジ CH2-CH3］配列［Sadhuら、Cell Adhesion and Commun.
2:429-440 (1994)］との融合タンパク質として親ベクターpDC37においてコード
する発現構築体も調製した。ヒトIgG1ヒンジ-CH2コーディング配列と共にヒトVC
AM-1をコードする、プラスミドpDC37は、SalIでの消化によって作製され、Kleno
wポリメラーゼで穴埋めし、そしてSalI部位を除くように平滑末端連結されたpDC
31の誘導体である。

【０１３０】プラスミドpDC37/VCAM1.Ig1.2cをHindIII及びSalIで消化し、VCAM-1コーディング領域を欠く断片を単離した。単離されたHindIII/SalI断片を、pcDNA3Lectom
edin-1a#2からの1571 bpのHindIII/ApaI断片、及びプライマーlecto Sal Ig（配
列番号：51）及び3.3.24（配列番号：52）を用いて調製されたクローン3.3由来の増幅産物と連結した。

【０１３１】 lecto Sal Ig （配列番号：51） GACGCTGGTCGACTAGGTGGCTGCATGCACACGTTGTTCG 3.3.24 （配列番号：52） CCTACCACAGCTGTGACAATAACTTCTTCAGCTGAGC プライマーlecto Sal Igは、IgG1コーディング配列への枠内連結が可能となるよ
うな、ユニークなSalI部位（レクトメディン-1のコドン第811位の後）を増幅産物に作り出した。この結果得られたプラスミドは、pDC37Lecto.Ig#7と命名された。

【０１３２】 pDEF2からの736 bpのNcoI/HindIII断片を、pcDNA3 Lectomedin-1a#2からの157
1 bpのHindIII/ApaIII断片（Kozak配列、開始部位、及びレクトメディン-1αのアミノ酸第1〜515位をコードする）、pDC37Lecto.Ig#7からの1788 bpのApaI/Xba
I断片（IgG配列に融合されたレクトメディン-1由来のアミノ酸第516〜811位をコ
ードする）、及び予めNotI及びXbaIで消化されたpDEF14に連結した。得られたプ
ラスミドは、pDEF14Lecto.Ig#2と命名された。

【０１３３】プラスミドpDEF14Lecto.Ig#2は、DHFR^-DG44 CHO細胞にトランスフェクトされ、そして安定にトランスフェクトされた細胞が選択された。

【０１３４】実施例３組換えレクトメディンの特徴付け組換え細胞におけるタンパク質発現レベルの特徴付けは、ポリクローナル抗血
清（実施例８に記載のごとくに調製される）を使用して行われ、そしてラトロト
キシン結合（後述）及び／または分泌顆粒含量に関する機能分析はこれまでに報
告されているとおりに行われる。

【０１３５】最初の特徴付けにおいて、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を、標準法（すなわち、リン酸カルシウム法またはカチオン脂質法）によってレクトメデ
ィン-1α発現構築体でトランスフェクトした。48時間インキュベートした後、1 ％Triton（特徴付け）X-100及びプロテアーゼインヒビターを含有するPBS中で細
胞を溶解し、そして界面活性剤可溶性画分中のタンパク質をSDS-PAGEによって分
離した。ニトロセルロース膜に転写した後、レクトメディン-1αに対して免疫特
異性を有するウサギ抗血清（免疫原としてのアミノ酸432〜852に対して作製した
もの）と共にブロットをインキュベートした。ヤギ抗ウサギIgG（セイヨウワサビペルオキシダーゼとの接合体）を使用して免疫反応性を検出し、その後化学発
光検出とX線フィルムへの露光（Renaissance（登録商標）検出キット、NEN Life
Sciences、Boston、マサチューセッツ州を使用）を行った。

【０１３６】機能的特徴付けのためには、トランスフェクションによるDNA構築体を直ちに容認する、内分泌系の分泌細胞を使用する。機能的特徴付けに有用な細胞には、
例えば、マウス下垂体前葉副腎皮質ホルモン分泌（corticotroph）無限継代固定
細胞（AtT20; ATCC CCL 89）、ラット膵島インスリノーマ無限継代固定細胞（Ri
nM5F）、またはヒト下垂体成長ホルモン分泌無限継代固定細胞（GH3; ATCC CCL
82.1）が包含される。タンパク質合成を許容するのに適切な時間経過した後、ア
ルファ−ラトロトキシン（またはその他のリガンド）と共にトランスフェクトさ
れた細胞をインキュベートし、その後酵素結合免疫吸収アッセイ（ELISA）またはラジオイムノアッセイ（RIA）を使用してタンパク質の分泌刺激を検出する。例えば、例証された細胞系からの分泌増大は、AtT20細胞からの副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、RinM5F細胞からのインスリン放出、またはGH3細胞からの成長ホルモンの遊離の検出によって成し遂げられる。

【０１３７】加えて、レクトメディン-1はG-タンパク質結合タンパク質であるので、リガン
ド結合は、例えば細胞内セカンドメッセンジャー・エフェクター経路活性変化（
例えば、環状AMP（cAMP）の生産の増大または細胞内カルシウム濃度の変化）を誘発する。これらのタイプの変化は、例えば、cAMPのRIA検出またはカルシウム結合指示薬の蛍光検出（すなわち、Fura 2）などの標準技術によって測定される
。

【０１３８】例として挙げられる結合アッセイは、これまでに報告されている［Meldolesi 、J. Neurochem. 38: 1559-1569 (1982)、Petrenkoら、EMBO J, 9:2023-2027(19
90)］。細胞をベクターDNAのみ（対照細胞）またはレクトメディン-1をコードす
る発現プラスミド（アッセイ細胞）でトランスフェクトする。アッセイ及び対照
細胞の双方とも、緩衝液（120 mM NaCl、4.7 mM KCl、各々1.2 mMのMgSO₄、K₂HP
O₄、及びCaCI₂、20 mM Na₂HPO₄-HCl、pH 7.4、及び10 mMグルコース）中にホモジナイズし、そしてタンパク質濃度を標準法によって定量する。対照細胞または
トランスフェクトされたアッセイ細胞膜の既知量を、ニトロセルロース紙にスポ
ットして、24ウェルディッシュのウェルに別々に入れる。100 mM KCl、2 mM CaC
l₂、及び20 mM Tris、pH 7.7を含有する緩衝液で紙を一度洗浄し、そして1.5％（重量/容量）となるようにウシ血清アルブミン（BSA）を補充した同様の緩衝液
（ブロッキング用緩衝液）中で１時間インキュベートする。1500〜2000 Ci/mmol
の比活性にラベルされた、0.1から1.2 nMまで¹²⁵I-ラベル・アルファ−ラトロト
キシンを含有するブロッキング用緩衝液の溶液で、過剰量（100 nM）の非ラベル
毒素の存在下または非存在下に、固定化タンパク質と共に３０分間インキュベー
トする。1 mlのブロッキング用緩衝液で20分間にわたり３回、紙を濯ぎ、そして
残存している１分当たりのカウント数をガンマカウンターで定量する。非特異的
結合は、大過剰量の非ラベル毒素の存在下でラベル毒素をインキュベートした後
に残存している放射活性カウント数の値として定量化される。比活性を、スポッ
トされたタンパク質のミリグラム数当たりの結合毒素ナノモル数に変換し、その
データを、結合毒素ナノモル数対非結合毒素のナノモル数としてプロットする。
データを、［非結合毒素対結合毒素］で割った結合毒素の数値に変換して、結合
部位の数に対するスキャッチャードプロット（受容体上に単一の毒素結合部位が
ある場合の結果としては直線的なプロットとなることが予測される）を導く。

【０１３９】さらなる特徴付けにおいて、レクトメディン融合タンパク質Lecto-1Ig（実施例２）を、プロテインAセファロース（登録商標）（Amersham Pharmacia Biotec
h、Piscataway、ニュージャージー州）アフィニティークロマトグラフィー、ならびにG10及びE10と命名された２つのクローンのうちの１つに由来する馴化生育
培地を使用して精製した。培地をカラムに付して、次いでそれを50 mM Tris、pH
7.5、50 mM NaClで充分に洗浄した。50 mMクエン酸、pH 4.0、そして50 mMクエ
ン酸、pH 3.0を含有する緩衝液でタンパク質を溶出した。タンパク質のほとんど
は、pH 3.0の緩衝液で溶出された。タンパク質画分を集め、1 M Tris、pH 8.0で
中和してPBSに対して透析した。精製されたタンパク質は、濾過し、等分して−7
0℃で瞬間冷凍した。

【０１４０】アミノ末端配列決定によって、タンパク質の成熟アミノ末端が第26位のフェニ
ルアラニン残基であると同定されることが示された。この観察によって、組換え
タンパク質がCHO細胞のシグナルペプチダーゼによって認識及び切断されること、ならびにアミノ末端はブロックされていないことが示唆された。

【０１４１】サイズ排除クロマトグラフィーでは、およそ650 kDalの分子量のタンパク質で
あることが示唆され、これに比べSDS PAGEで調べた分子量はおよそ170 kDalであ
った。ゲル濾過の結果で、４つのモノマーの組合せで650 kDalタンパク質が作ら
れることが示唆された。

【０１４２】このタンパク質を、10 mM Na₂HPO₄(pH 6.8)、5 mM EDTA、0.25％ Triton（登録商標）X-100、0.5% SDS、及び0.5％β-メルカプトエタノール（BME）中でN-グ
リコシダーゼ F、O-グリコシダーゼ、及び／またはニューロミニダーゼ（Boehri
nger Mannheim）で37℃にて処置すると、タンパク質の分子量が低下するという結果が得られた。N-グリコシダーゼ Fのみで処置した後には、モノマータンパク
質の分子量はおよそ130 kDalであった。N-グリコシダーゼ F、O-グリコシダーゼ
、及びニューロミニダーゼで処置した後には、モノマータンパク質の分子量はお
よそ125 kDalであった。これらの観察結果より、SDS PAGEで観察された分子量は
、およそ40 kDalのN-結合炭化水素及びおよそ5 kDalのO-結合炭化水素に起因し得ることが示される。

【０１４３】実施例４リガンドアフィニティークロマトグラフィーレクトメディン-1を単離することを目的として、レクトメディン-1が固定化さ
れたアフィニティーカラムを作製した。要約すると、10 mgの精製sLecto-1IgをC
NBr-活性化セファロース（登録商標）4B（Amersham Pharmacia）に、製造業者に
よるプロトコルに従って結合させた。96％を上回る量のレクトメディンタンパク
質が樹脂に結合した。

【０１４４】ヒト脾臓（3.48 g）から、界面活性剤抽出物を調製した。1％ Triton（登録商
標）X-100、25 mM Tris、pH 8、150 mM NaCl、5 mMヨードアセタミド、5 mM EDT
A、1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、及び1μg/mlペプスタチン及びアプロチニンを含有する緩衝液15 mlで、Waringブレンダーを用いて組織をホモジナイズした。ホモジナイズ作業は、低速度で行った。得られたホモジ
ネートを氷上で１時間冷却し、そして100,000 x gで60分間遠心分離した。上清（およそ120 mgの総タンパク質）を、sLecto-1Igが結合した樹脂と、4℃にて終夜、攪拌しながら混合した。樹脂から排水しそして、10 mM Tris (pH 8)、150 m
M NaCl、そして 10 mM Tris (pH 8)、1 M NaClで充分に洗浄した。タンパク質は
、５倍樹脂容量の100 mM D-ラクトース、10 mM Tris、pH 8.0、150 mM NaClを用
いて溶出した。５つの等量の画分を集めた。樹脂はさらに、４倍樹脂容量の100
mMグリシン、pH 2.0で溶出して４との等量の画分を集め、1 M Tris、pH 8.0で中
和した。次いで樹脂は10 mM Tris、pH 8.0/150 mM NaClで中和した。樹脂から得
られた画分をSDS PAGEで分析し、その結果およそ95、71、55及び30 kDalのバンドが検出された。

【０１４５】最も高いタンパク質収量の画分を回転濃縮（spin concentrate）（Ultrafree （登録商標）10、Millipore、New Bedford、マサチューセッツ州）して、そのタ
ンパク質を12％SDS-PAGEで分離した。クマシーブルー染色によって、ラクトース
での溶出液中に、およそ30〜32、55、70、及び80〜95 kDalの４つの主要タンパク質のバンドが現れた。バンドをゲルから切り出し、50：50のアセトニトリル：
水にて２回濯いで、そして配列分析を実施するまで−70℃にて保存した。配列決
定の結果、30〜32 kDalのタンパク質はMac-2（ガレクチン-3とも称される、GenB
ank（登録商標）受託番号No:g106937）であり、55 kDalのタンパク質はフィブリ
ノーゲンγA鎖（GenBank（登録商標）受託番号No:g71827）であり、そして80〜8
5 kDalのタンパク質はイムノグロブリンミュー鎖定常領域であることが示唆され
た。

【０１４６】 Mac-2（ガレクチン-3）は、数多くの免疫細胞集団及び上皮で合成され、そして主要な非インテグリン・ラミニン結合タンパク質である［Perilloら、J. Mol.
Med. 76:402-412 (1998)］。最近の観察により、Mac-2は浸潤単球に関連した初
期アテローム硬化性障害にある血管に発現することが示唆された。正常な血管に
は、発現は検出されなかった。発現はまた、培養中の大動脈平滑筋細胞において
も検出され、さらに高コレステロール血症の摂生給餌後の動物やバルーン血管形
成術後にも検出された［Ararら、FEES Letts.430:307-311(1998)、Nachtigalら、Am. J. Pathol. 152:1199-1208 (1998)］。Mac-2は正常な線維芽細胞の増殖、
神経細胞の接着、及び神経突起の成長を刺激する［Inohjaraら、Exp. Cell. Res
. 245:294-302 (1998); Peshevaら、J. Neurosci. Res. 54:639-654 (1998)］。

【０１４７】レクトメディンアフィニティークロマトグラフィーから得られた結合の結果か
ら、当該技術に鑑み、浸潤マクロファージによってアテローム発生中にMac-2が分泌されること、そして血管中膜の平滑筋細胞上に発現されるレクトメディン-1
への結合にはアテローム性動脈硬化での平滑筋増殖が必要とされるのかもしれな
いことが示唆される。

【０１４８】実施例５ノザン分析ヒトのレクトメディン-1α発現を評価することを目的として、市販の複数組織
ブロット（Clontech、Palo Alto、カリホルニア州）を使用し、様々なヒト組織供給源から由来するRNAについてノザンブロット分析を行った。使用したプローブは、クローン3.3の細胞外領域（配列番号：７の塩基第1860〜2350位）に由来する531 bpのBstXI断片であった。ハイブリダイゼーションは、Express-Hyb（登
録商標）Solution（Clontech）中で68℃にて２時間行い、最後の洗浄は0.1 X SS
C中で68℃にて１時間実施した。

【０１４９】この結果、6.6及び7 kbの２つの主な転写物の発現が示唆された。最高の発現レベルは、脾臓、前立腺、及び肺に検出された。もっと低いシグナルが、十二指
腸、胎盤、胸腺、精巣、結腸粘膜、心臓、及び肝臓に認められた。卵巣及び末梢
血白血球には、シグナルは観察されなかった。

【０１５０】実施例６ In situハイブリダイゼーションノザン分析での結果を証明するために、様々なヒト組織断片を使用してin sit
uハイブリダイゼーションを行った。

【０１５１】 in situハイブリダイゼーション分析用のプローブは、以下のとおりに調製した。クローン3.3は、合成配列の第1459位のGヌクレオチドをCに変えることによってcDNAの5'端近傍にSacI部位を含めるよう、PCRによって設計した。626 bpのS
acI/EcoRI断片を調製して、pBSSK（Stratagene、La Jolla、カリホルニア州）へ
とサブクローニングした。これにより得られたプラスミドを、EcoRIまたはSacI のいずれかを用いて線状化した。SacIで線状化されたDNAの端部は、T4 DNAポリメラーゼを用いた標準法によって平滑にした。線状DNAを使用して、脾臓、肺、前立腺、心臓、胸腺、十二指腸からの組織切片についてのin situハイブリダイゼーション用の、³⁵Sラベルされたセンスまたはアンチセンスプローブを作製した。

【０１５２】ハイブリダイゼーション実験から得られた結果は、センス鎖の対照プローブで
のバックグランドが高いため、なんらかの結論に達するものではなかった。

【０１５３】レクトメディン-1 mRNAの局在性にかかる別の研究法において、レクトメディン-1 DNAの他の２つの断片を、pBluescript（登録商標）ベクターへサブクローニングした。レクトメディン-1α（配列番号：１）の1238 bpのBamHI/SacI断片をサブクローニングした。このクローンを含む代表的なクローンをプローブBSと
命名した。レクトメディン-1α（配列番号：１）の2855 bpのBamHI/XbaI断片をサブクローニングし、１つの代表的なクローンを単離してプローブBXと命名した
。BS及びBXの双方からの³⁵Sラベルされたセンス及びアンチセンスプローブを当該技術分野での標準的方法により調製し、そしてヒト脳の後頭皮質、小脳及び視
床；心室中隔、洞房結節及び心臓の心房；小腸、脾臓、肺、前立腺、副腎及び膵
臓からの組織切片とハイブリダイズさせた。

【０１５４】特異シグナルが、心筋細胞（心臓）、副腎皮質の内分泌細胞、後頭皮質ニュー
ロン及び小脳プルキンエニューロン、顆粒層ニューロン及びいくらかの分子層ニ
ューロンにおいて、アンチセンスBSプローブを用いた場合に観察された。アンチ
センスBXプローブでは、前立腺の分泌細胞の下位集団に特異シグナルが存在する
ことを除いて、同様のパターンが得られた。

【０１５５】実施例７ヒトレクトメディンのクロモソーム局在性レクトメディン-1αをコードする遺伝子のクロモソーム局在性をマッピングす
ることを目的として、クローン3.3とRACE3.3配列とを組み合わせることによって
演繹された連続レクトメディン-1α cDNAを、NCBI Sequence-Tagged Sites（STS
）データベースを検索するための照会配列として使用した。

【０１５６】２つのSTSが同定され（SHGC-36772及びWI-11936と命名）、これらは放射線ハイブリッド・マッピング技術によってクロモソーム1にマッピングされた。STS W
I-11936のマッピングはさらに、クロモソーム遺伝子座1p31に詳細解明された。

【０１５７】レクトメディン-2に対する遺伝子のクロモソーム局在性を同定するために、BL
ASTアルゴリズムを用いて、GenBank（登録商標）ハイスループットゲノム配列ヌ
クレオチドデータベースを照会すべく、全長のヌクレオチド配列を使用した。そ
の結果、クロモソーム17の一部分がレクトメディン-2のDNA配列の一部分と同一性を有することが示唆された。クロモソーム17のこの領域の局在性についてNCBI
のヒトGenemap '98の照会を行ったところ、レクトメディン-2遺伝子はクロモソーム17p11.1-q12にマッピングされることが示された。

【０１５８】レクトメディン-3に対する遺伝子の局在性を同定するために、National Cente
r for Biotechnology Information（NCBI）のUnigeneデータベースの受託番号照
会（EST R50822を使用）を行った。その結果、ヒトクロモソーム4にマッピングされる、R50822を含めたESTのクラスターが同定された。NCBIのヒトGenemap'98
outを検索することによって局在性の詳細解明を行い、これによってR50822を含むESTのクラスターは、4q12-13.3に割り当てられた。

【０１５９】実施例８レクトメディンに対する抗体の製造細胞外レクトメディン-1断片を用いたポリクローナル抗血清の生成レクトメディン-1αの細胞外領域（配列番号：１の432〜852位の残基）をコー
ドする大腸菌発現ベクターを、そのアミノ末端にビオチン化タッグを付けた融合
タンパク質として構築した。「Biolect 1st ECD」と命名されたこのプラスミドは、以下のようにして構築した。

【０１６０】クローン3.3（配列番号：10の432〜852位の残基に由来するアミノ酸をコードする配列番号：９の1508〜2772位のヌクレオチド）の1283bpの断片を増幅するた
めに、PCRプライマー「lecto-1」と「lecto-2」（それぞれ配列番号：31および3
2）を用いた。レクトメディン-1ポリペプチドのこの領域は、ラトロフィリンと約69％が同一である。

【０１６１】プライマーlecto-1 配列番号：31 5'-TACAACCATGGGCACAACTGTAGCTGG プライマーlecto-2 配列番号：32 5'-TACAAGATCTAGCAGATAGCCAGGCAAACAAGGG プライマーlecto-1は、増幅産物のNcoI制限部位（上記下線部）に導入し、また、プライマーlecto-2は、BglII制限部位（上記下線部）と翻訳末端部位に導入
した。増幅した断片は、プラスミドBiolect 1st ECDを形成するために予めNco
IとBglIIで消化したプラスミドarabio1bにサブクローニングした。このプラス
ミドarabio1bは、Salmonella typhimuriumアラビノースプロモーターとaraC遺伝
子、ならびにビオチントランスフェラーゼ遺伝子を含む[Kashishian, et al., J
. Bio. Chem. 273:27412-27419 (1998)]。最終構築物での発現産物は、そのＮ
末端にビオチンタッグ、そして、そのＣ末端にレクトメディン-1アミノ酸の432 〜852位を具備した、約55kDaの融合タンパク質をもたらす。

【０１６２】プラスミドBiolect 1st ECDは、標準的方法によって大腸菌を形質転換し、そして、プラスミドを調製するために、単一コロニーを分離および生育せしめた。
所望のプラスミドを含む培養物を、ビオチン(4μM)を補充したLB/カルベニシリンにて、30℃で生育せしめ、そして、アラビノース(0.5%)の存在下で、16時間誘
発せしめた。遠心分離によって細菌を回収し、そして、氷上で、15分間、TEN 緩衝液（50mM Tris-塩酸、25℃でpH 7.5、0.5mM EDTA、0.3M 塩化ナトリウム）に含まれる鶏卵リゾチーム(10μg/ml)で溶解した。氷上でインキュベーション
した後、NP-40洗浄剤を最終濃度が0.2%になるように添加し、そして、得られた混合物を氷上で手短に超音波粉砕した。 15,000×ｇ、10分間の遠心分離によっ
て不溶性物質を除去し、次いで、別のTEN緩衝液でペレットを５回洗浄した後、超音波粉砕と遠心分離を行った。 SDS-PAGEでの予備分離に向けて、最終ペレッ
トを、２×試料装填用緩衝液に溶解した。

【０１６３】ゲルを30分間、0.4M 塩化カリウムで処理した後に、55kDaの主要バンドが生成
した。この55kDaのバンドをゲルから切り出し、そして、0.5% DSD-PAGE緩衝液
が流れる透析管に融合タンパク質を溶出した。回収したタンパク質を濃縮し、
回転透析し（分子量30,000カットオフUltrafree(登録商標)遠心分離濾過装置、ミリポア社、ベッドフォード、マサチューセッツ州）、そして保存した。

【０１６４】精製したタンパク質は、周知の手順に従って抗血清を作るために、二匹のウサ
ギを免疫処置するために用いた。すなわち、免疫血清を得るために（#7324と#
7278と称する）二匹のニュージーランド白ウサギの採血を行い、次いで、完全フ
ロインドアジュバンドで乳化した精製Biolect 1st ECD融合タンパク質の250μg で免疫処置した。これらのウサギには、250μgの精製融合タンパク質を含む不
完全フロインドアジュバンドで繰り返し処置した。最初の三回の処置は１ヶ月
間隔で実施し、次いで、三回目と四回目の処置は３ヶ月間隔で実施し、さらに、
四回目と五回目の処置はさらに１ヶ月間隔で実施した。抗体価を決定するため
に、２、３、４および５回目の各処置の２週間後に、耳の静脈に穴を開けて採血
を行った。

【０１６５】脳、皮質、肺、脾臓、肝臓、骨格筋、海馬および前立腺腫瘍細胞系PC-3(ATCC,
CRL 1435)を含む組織／細胞系からの抽出物を用いて、得られたポリクローナル血清に関して免疫沈降を行った。 200、180、170および70kDaの分子量のタンパ
ク質が検出され、これらは、全長タンパク質、タンパク質分解断片、およびα、
βおよびγタンパク質を含むレクトメディンのイソ体を表しているのであろう。

【０１６６】第１回目の処置を終えた#7324のウサギから得た血清を、当該技術分野での標準方法に従って、抗原特異的アフィニティークロマトグラフィーに適用した。
要するに、10mM Tris、pH 7.5に調整した0.45または0.8のマイクロ濾過血清(100
×ｇの上清)の10mlを、攪拌しながら、４℃で、16時間、sLecto-1Igアガロースビーズと共にインキュベートした。このビーズを回収し、20ベッド体積の0.5M
塩化ナトリウム、10mM Tris、pH 7.5で、OD₂₈₀の吸光度が0.03に至るまで洗浄した。５ベッド体積の100mMグリシン、pH 2.5で、結合した抗体を溶出した。溶出物を0.5ml画分として回収し、そして、１mM Tris、pH８で中和した。 sLecto-1Ig
アガロースビーズを、50mM Tris、pH7.5／150mM 塩化ナトリウムで中和し、そし
て、0.1％タイムルールを補充した同じ緩衝液にて、４℃で保存した。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の存在に関して、SDS-PAGEによって画分を分析した。
ピーク画分をプールし、緩衝液をPBSに交換し、体積を90％にまで減じた。最終産物を等体積の滅菌グリセロールと共に混合し、分別し、瞬間冷凍し、そして
、用時まで−70℃で保存した。

【０１６７】合成レクトメディン-1細胞質プラスミドを用いたポリクローナル抗血清の生成レクトメディン-1のα、βおよびγイソ体のカルボキシ末端細胞質領域に特異
的なペプチドを、ニュージーランド白ウサギにてポリクローナル抗血清を製造す
るための免疫源として合成した。これらペプチドは、レクトメディン1α（配列番号：53）、レクトメディン1β（配列番号：54）およびレクトメディン1γ（
配列番号：55）の細胞質領域でのDNA配列からデザインした。 Cys-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-His-Leu-Glu-Leu-Leu-Leu-Gly-Gln-Ile-Ala 配列番号：53 Cys-Thr-Arg-Thr-Ser-Ala-Arg-Tyr-Ser-Ser-Gyl-Thr-Gln-Asp-Ile-His 配列番号：54 Cys-Glu-Gly-Asp-Val-Arg-Glu-Gly-Gln-Met-Gln-Leu-Val-Thr-Ser-Leu 配列番号：55 関連レクトメディン-2（配列番号：63）およびレクトメディン-3（配列番号：64
）タンパク質のカルボキシ末端領域を含むペプチドも合成した。 Cys-Pro-Gly-Pro-Asp-Gly-Asp-Gly-Gln-Met-Gln-Leu-Val-Thr-Ser-Leu 配列番号：63 Cys-Pro-Glu-Gly-Ser-Ser-Lys-Gly-Pro-Ala-His-Leu-Val-Thr-Ser-Leu 配列番号：64 合成したペプチドはそれぞれ、製造業者の推奨するプロトコールに従って、キー
ホールリンペットヘモシアニン(KLH)(Imject社、ピアス)に接合した。ウサギの採血を行い、完全フロインドアジュバンドに含まれる接合ペプチドを、ウサギ
一匹当たり、100μgを注射し、２匹のウサギについてはイソ体を注射した。こ
れらウサギを、３週間間隔で、不完全フロインドアジュバンドに含まれる同用量
の抗原で処置した。三回目の注射をして10日後に動物の採血を行い、ELISAで血清力価を決定した。

【０１６８】すなわち、Immulon(登録商標)４(Dynax Technologies、チャンティリィー、バ
ージニア州)プレートを、２μg/mlの非接合ペプチドでコートした。これらプレートは、0.5%魚類皮膚ゼラチンでブロックし、そして洗浄した。前免疫血清
と各ウサギから得た試験血液の連続希釈液を、ペプチドでコートしたプレートに
てインキュベートした。洗浄をした後、ヤギ抗ウサギセイヨウワサビペルオキ
シダーゼ(HRP)接合二次抗体を添加した。これらプレートを洗浄し、そして、テトラメチルベンジダイン(TMB)(Sigma)試薬でシグナルを検出した。

【０１６９】レクトメディン-1βペプチドで免疫処置した#6484と#6453のウサギから得た血
清では、3000倍希釈した前免疫血清よりも３倍強い反応性が認められた。レク
トメディン-1γで免疫処置した#6868と#6307のウサギから得た血清では、3000倍
希釈した前免疫血清よりも３倍強い反応性が認められた。レクトメディン-1α
で免疫処置した#7347と#6490のウサギから得た血清では、200倍希釈した前免疫血清よりも３倍強い反応性が認められた。

【０１７０】これら結果から、第二のレクトメディン-1αペプチド（配列番号：56）が合成
され、別の二匹のウサギに関して、上述した免疫処置プロコトールが繰り返され
た。これらウサギから得た血清は、上述したようにして、特異反応性について
アッセイされた。 Cys-Ser-Arg-Ile-Arg-Arg-Met-Trp-Asn-Asp-Thr-Val-Arg-Lys-Gln-Ser 配列番号：56 モノクローナル抗体の製造レクトメディンポリペプチドに免疫特異的なモノクローナル抗体の製造の試み
において、以下の手順を実行した。

【０１７１】０日目に５匹の６〜12週齢のBALB/cマウスの採血を行い、完全フロインドアジ
ュバンドに含まれる、上述した、20μlのレクトメディン-1α、レクトメディン-
1βまたはレクトメディン-1γポリペプチド（配列番号：53、54および55）を、（合計60μlを）皮下注射して免疫処置した。 21、41および62日目に、不完全フロインドアジュバンドに含まれる各ペプチドの10μl（合計30μl）で、各マウ
スを処置した。 72日目に採血し、そして、特異的マウス抗体をヤギ抗マウス-H
RPで検出した以外は、ポリクローナル血清の生成の項目で述べたようにして、各
ペプチドに対する反応性をELISAで決定した。

【０１７２】５匹のマウスすべてから得た免疫血清は、レクトメディン-1βおよびレクトメ
ディン-1γペプチドに対して、12800倍希釈した前免疫血清よりも大きな反応性を示した。すべてのマウスから得た血清は、レクトメディン-1αペプチドに対
して中度の反応性を示した。

【０１７３】レクトメディン-1γ、レクトメディン-2およびレクトメディン-3の末端に認め
られる同様のエピトープを認識する交差反応性抗体をスクリーニングするために
、レクトメディン-2とレクトメディン-3（配列番号：58および）のカルボキシ末
端を含む他のペプチドを合成した。

【０１７４】レクトメディン-1αへの免疫反応を起こすための他の方法として、他の５匹の
マウスを、上述したようにして、第二のレクトメディン-1αペプチド（配列番号
：56）で免疫処置する。融合およびハイブリドーマクローニングに先行して、
各マウスから得た免疫血清を、ELISAによって（上述したようにして）レクトメディン-1α反応性について試験する。

【０１７５】免疫処置した動物の脾臓を無菌的に取り出し、そして、２mM L-グルタミン、１mM ピルビン酸ナトリウム、100単位／mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンが補充され、かつ血清を含まないRPMI1640(Gibco社、カナダ) に浸した二枚の顕微鏡用ガラスプレートの磨端面の間で脾臓をすりつぶすことで
、単一細胞懸濁液を形成する。この細胞懸濁液を、滅菌した70メッシュのNite
x細胞濾過器（Becton Dickinson、パルシパニー、ニュージャージー州）で濾過し、200×ｇで、５分間、遠心分離して洗浄を２度行い、そして、20mlの血清を含まないRPMI1640でペレットを再懸濁する。もとのBalb/cマウスから得た胸腺
細胞も、同様の方法で調製する。

【０１７６】約２×10⁸個の脾臓細胞を、（融合前の３日間、11％ウシ胎児血清[FBS]を含ん
だRPMIにて対数増殖期を維持した）４×10⁷個のNS-1細胞と合わせる。これら細胞を慎重に遠心分離し、そして上清を吸引する。細胞ペレットをどかして、
１分間にわたって、攪拌しながら、２mlの37℃のPEG1500（75mM HEPESにて50％の濃度、pH 8.0)を加え、次いで、７分間にわたって、血清を含まない14mlのRPM
Iを添加する。さらに別のRPMIを添加することができ、そして、細胞は200×ｇ
で10分間遠心分離される。上清を廃棄して後、15％FBS、100mMヒポキサンチン
ナトリウム、0.4mM アミノプテリン、16mM チミジン(HAT)(Gibco)、25単位/mlの
IL-6(Boehringer Mannheim)および1.5×10⁶胸腺細胞/mlを含む200mlのRPMIでペレットを再懸濁する。この懸濁液を、200μl/ウェルの濃度で、96-ウェル平板
組織培養用プレート(Corning社、英国)に分注する。融合して後の２、４および６日目に、各ウェルから100mlを吸引し、そして、10単位/mlのIL-6を含み、か
つ胸腺細胞を欠いた100μl/ウェルのプレート用培地を添加して、細胞に栄養を供給する。

【０１７７】集密度が60〜80％になる（８〜10日目）まで細胞が成長した時に、各ウェルか
ら培養上清を取り除き、ELISAによってレクトメディンに対する反応性をスクリーニングする。 ELISAは、以下のようにして実施する。 Immulon(登録商標)４
プレート(Dynatech、ケンブリッジ、マサチューセッツ州)を、50mM 炭酸塩緩衝液、pH 9.6に含まれる100ng/ウェルの免疫原を50μl/ウェルで、４℃にて、コー
トする。これらプレートは、0.05％のTween(登録商標)20を含むPBS(PBST)で洗
浄し、そして、37℃にて、0.5％魚類皮膚ゼラチンで30分間ブロックする。上述したようにしてプレートを洗浄し、そして、50μlの培養上清を添加する。 3
7℃にて、30分間インキュベートした後、上述したようにしてプレートを洗浄し、そして、セイヨウワサビペルオキシダーゼが接合したヤギ抗マウスIgG(fc)(Ja
ckson ImmunoResearch、ウェストグローブ、ペンシルバニア州)[PBSTで1:10,000
に希釈したもの]の50μlを添加する。プレートを37℃にて、30分間インキュベ
ートし、PBSTで洗浄し、そして、pH 4.5の100mMクエン酸塩に含まれる１mg/ml T
MB (Sigma社)と0.15ml/30％H₂O₂ mlからなる100μlの基質を加える。 50μlの1
5％硫酸を加えて呈色反応を停止する。 450nmでの吸光度を、プレートリーダー
(Dynatech)で読み取る。

【０１７８】実施例９レクトメディンの発現のための免疫細胞化学上述したようにして、ウサギ#7234にて生成した（そしてアフィニティー精製した）ポリクローナル抗血清を、ヒトとラットの組織でのレクトメディンの発現
パターンを決定するために用いた。ヒトの組織は、国立疾病交換研究所(NDRI 、フィラデルフィア、ペンシルベニア州)から入手し、これらには、ヒトの脳（皮質および小脳）、心臓（隔壁および心房）、前立腺、肺、肝臓、脾臓、小腸、
副腎および動脈（腎臓、肺臓および鎖骨）が含まれていた。大動脈は、ルイジ
アナ州立大学メディカルセンターの若年アテローム性動脈硬化症の病理決定(PDA
Y)研究所から得た。ラットの組織は、当該技術分野で周知かつ常套の手順に従
って調製した。

【０１７９】凍結組織をOCT(Tissue-Tek)に埋設し、６ミクロンの厚さに切断し、Superfros
t(登録商標)プラス(VWR Scientific)スライドに載せ、そして、アッセイが始まるまで−20℃で保存した。パラフィン包埋、フォルマリン固定試料は、アッセ
イが始まるまで室温で保存した。アッセイに先駆けて、室温下で５分間、エー
テルで固定された脳の組織を除いて、凍結組織は、４℃で、２分間、アセトンで
固定した。フォルマリン固定した組織は、キシレン、100％エタノール、95％エタノールおよび70％エタノールのそれぞれで、３分間の洗浄を２回行ってパラ
フィンを除去した。固定した低温切断片を、0.1％アジ化ナトリウムおよび0.3
3％過酸化水素を含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)でインキュベートすることに
より、15分間のインキュベーションの間に、内因性のペルオキシダーゼ活性は消
失した。特に指示の無い限り、すべてのインキュベーションは、室温下で行っ
た。スライドをTBST（20mM Trizma(登録商標)塩基［Sigma］、150mM塩化ナトリウム、0.05％ Tween(登録商標)、pH 7.2）で濯ぎ、そして、TBSTに、30％ノルマルヒ
ト血清アルブミン(Boston Biomedica)、５％ノルマルヤギ血清(Harlan)および２
％ウシ血清アルブミン(Sigma)を含む溶液で、30分間ブロッキングを行った。非特異的な結合性は、アビジンとビオチンのブロック溶液（SP-2001、Vector La
bs、バーリンガム、カリフォルニア州）を用いた、15分間の連続インキュベーシ
ョンによってブロックされる。各インキュベーションの後に、スライドをTBST
で濯いだ。１μg/ml〜５μg/mlの範囲の濃度の当初の抗体を、各切片に１時間
塗布し、その後、スライドをTBSTで３度洗浄した。ペルオキシダーゼ（Vector
Labs)が接合したビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体を、ブロック溶液で１：200に希釈し、スライドに30分間塗布した。スライドを５分間洗浄し、そして、ABC El
ite試薬（アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼキットPK-6100、Vector Labs ）で、30分間インキュベートした。スライドを、１回当たり５分間で、TBSTで
２度洗浄した。基質溶液（ペルオキシダーゼのためのDAB基質キット、Vector
Labs）をスライドに塗布し、そして、約５分間にわたって、所望の色強度にまで
発色せしめた。脱イオン水で反応を停止し、Gillのヘマトキシリン(Sigma)溶液でスライドを対比染色し、水で濯ぎ、エタノールで脱水し、そして、光学顕微
鏡による検鏡のために細胞封止載置用培地(Stephens Scientific)を用いて載置した。

【０１８０】ヒトの大脳皮質では、7234血清の標識が、ニューロン（大小のピリミダルニュ
ーロンを含む）の部分集合、顆粒細胞、脈管系の平滑筋細胞にて検出された。ヒトの小脳を染色する7234血清は、プルキンエニューロンおよび顆粒細胞層での
ニューロンに局在していた。ヒトの心臓（隔壁と心房区画）では心筋細胞にて
免疫反応性が認められ、これは、境界板と称される収縮機器の平面を横断する心
臓域筋細胞接合部で特に顕著であった。

【０１８１】市販のコネクシン抗体（Zymed、サンフランシスコ、カリフォルニア州）を用いた、境界板で認められるコネクシンを染色する二重標識試験では、コネクシン
抗体と7234抗血清の染色箇所が境界板上に共存し、先の結果を追証する結果とな
った。

【０１８２】ヒトの前立腺の切片では、弱い基質細胞の標識と細胞質骨格筋の染色が認めら
れた。肺での染色箇所は、軟骨といくつかの気管支平滑筋で認められ、ある細
胞の染色度は、他の細胞より大きかった。副腎の髄質では、染色度が大きかっ
た。

【０１８３】ヒトの肝臓、脾臓および小腸では、免疫反応性の特異的パターンは認められな
かった。ヒトの大動脈では、脈管内皮膜（管腔側筋肉層）と皮膜内部（中間筋
肉層）に本来位置する管壁において、7234血清による免疫反応性が認められた。
胸部大動脈、肺動脈および腎臓動脈のそれぞれは、同様の染色パターンを呈した
。染色パターンと、平滑筋α−アクチンに対する抗体（平滑筋細胞用の承認済
マーカー）とを比較した場合、レクトメディン-1の免疫反応性は、基本的には、
同じ細胞（すなわち、平滑筋細胞）で認められた。

【０１８４】ラット細胞での7234血清による染色は、ヒトの組織で認められたのと同等のパ
ターンを示した。脳に関しては、いくつかの神経の集合と脈管系の平滑筋肉が
染色されていた。心臓に関しては、円盤、心筋細胞および脈管系平滑筋肉のす
べてにおいて免疫反応性が認められた。

【０１８５】特定の実施態様によって本発明を説明してきたが、多くの修正や変更が当業者
に想起されようことが予期される。しかして、添付の特許請求の範囲に示される
限定によってしか、本発明の範囲は限定されるべきでない。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 5/00 ＡＢ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 DA02 EA04 FA15 GA13 GA18 HA12 HA15 4B065 AA91X AA93Y AB01 AC14 BA05 CA24 CA44 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 EA21 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】精製および単離されたヒトのトランスメンブランレセプター
レクトメディンポリペプチドまたはその断片であって、前記ポリペプチドが、細
胞外レクチン結合性のオルファクトメディン様およびムチン様ドメインを含む。
【請求項２】成熟レクトメディンポリペプチドである請求項１に記載のポ
リペプチド。
【請求項３】配列番号：２に記載のアミノ酸配列またはその断片を含む請
求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】配列番号：４に記載のアミノ酸配列またはその断片を含む請
求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】配列番号：６に記載のアミノ酸配列またはその断片を含む請
求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】配列番号：58に記載のアミノ酸配列またはその断片を含む請
求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】請求項１乃至６のいずれかに記載のポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド。
【請求項８】配列番号：１に記載の配列を含む請求項７に記載のポリヌク
レオチド。
【請求項９】配列番号：３に記載の配列を含む請求項７に記載のポリヌク
レオチド。
【請求項１０】配列番号：５に記載の配列を含む請求項７に記載のポリヌ
クレオチド。
【請求項１１】配列番号：57に記載の配列を含む請求項７に記載のポリヌ
クレオチド。
【請求項１２】以下のグループ、すなわち、 (a) 請求項８乃至11に記載のポリヌクレオチド； (b) (a)のポリヌクレオチドの非コード鎖と中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；および (c) 遺伝コードの縮重がなければ、(a)のポリヌクレオチドの非コード鎖とハイブリダイズするはずであるＤＮＡ、よりなるグループから選択される、ヒトのレクトメディンポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド。
【請求項１３】ＤＮＡ分子である請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】ｃＤＮＡ分子である請求項13に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】全体的または部分的に化学合成されたＤＮＡ分子である請
求項13に記載のＤＮＡ。
【請求項１６】請求項16に記載のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダ
イズするアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項１７】請求項12に記載のポリヌクレオチドを含む発現構築体。
【請求項１８】請求項17に記載のポリヌクレオチドで形質転換またはトラ
ンスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１９】異種プロモーターに操作可能に連結した請求項12に記載の
ポリヌクレオチド。
【請求項２０】請求項19に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項２１】以下の工程、すなわち、 (a) レクトメディンポリペプチドの発現のために適切な条件下で請求項
18または20に記載の宿主細胞を生育し、および (b) 宿主細胞またはその生育培地からレクトメディンポリペプチドを単
離する、工程を含む、レクトメディンポリペプチドの製造方法。
【請求項２２】請求項１乃至６のいずれかに記載のポリペプチドと特異的
な免疫反応性を有する抗体。
【請求項２３】モノクローナル抗体である請求項22に記載の抗体。
【請求項２４】請求項23に記載の抗体を分泌するハイブリドーマ。
【請求項２５】請求項23に記載の抗体と特異的な免疫反応性を有する抗イ
ディオタイプ抗体。
【請求項２６】請求項１乃至６のいずれかに記載のレクトメディンポリペ
プチドの特異的結合パートナー化合物を同定する方法であって、 (a) ある化合物とレクトメディンポリペプチドとの間の結合を許容する
条件下にレクトメディンポリペプチドと化合物とを接触させ、 (b) レクトメディンポリペプチドへの化合物の結合を検出し、および (c) レクトメディンポリペプチドの特異的結合パートナーとして化合物
を同定する、工程を含む方法。
【請求項２７】前記特異的結合パートナーが、レクトメディンポリペプチ
ドの活性をモジュレートする請求項26に記載の方法。
【請求項２８】前記化合物が、レクトメディンポリペプチドの活性を阻害
する請求項26に記載の方法。
【請求項２９】前記化合物が、レクトメディンポリペプチドの活性を増強
する請求項26に記載の方法。
【請求項３０】請求項12に記載のレクトメディンポリヌクレオチドの特異
的結合パートナー化合物を同定する方法で、 (a) ある化合物とレクトメディンポリヌクレオチドとの間の結合を許容
する条件下にレクトメディンポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、 (b) レクトメディンポリヌクレオチドへの化合物の結合を検出し、及び (c) レクトメディンポリヌクレオチドの特異的結合パートナーとして化
合物を同定する、工程を含む方法。
【請求項３１】前記特異的結合パートナーが、レクトメディンポリヌクレ
オチドによりコードされるレクトメディンポリペプチドの発現をモジュレートす
る請求項30に記載の方法。
【請求項３２】前記化合物が、レクトメディンポリペプチドの発現を阻害
する請求項31に記載の方法。
【請求項３３】前記化合物が、レクトメディンポリペプチドの発現を増強
する請求項31に記載の方法。
【請求項３４】請求項26又は30に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項３５】請求項34に記載の化合物と、薬学的に容認しうる担体とを
含む組成物。