KR100676229B1

KR100676229B1 - 신경영양성 인자 수용체

Info

Publication number: KR100676229B1
Application number: KR1020017015637A
Authority: KR
Inventors: 마수르스테판레오조제프; 시크미로슬라브; 호에프나겔에버트빌헬무스
Original assignee: 얀센 파마슈티카 엔.브이.
Priority date: 1999-06-29
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2007-01-30
Also published as: WO2001002557A1; ATE335079T1; EP1196560A1; NO20020012D0; US20060069242A1; NO20020012L; GB9915200D0; NO332214B1; ES2269157T3; EP1196560B1; WO2001002557A8; JP4810036B2; IL147350A; ZA200110475B; JP2003504017A; DE60029791D1; CA2377607C; AU779486B2; US7476720B2; KR20020069373A

Abstract

GFRα-4라고 지칭되는 포유동물 수용체 단백질 및 이를 코딩하는 핵산 서열이 개시된다. 또한 그 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터 및 그 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포가 제공된다. 수용체를 발현하는 숙주 세포는 수용체와 관련하여 작용제 또는 길항제를 동정하는데에 사용될 수 있다.

Description

신경영양성 인자 수용체{Neurotrophic factor receptor}

본 발명은 본 명세서에서 GFRα-4라고 지칭되는 신규의 포유동물 수용체 단백질 및 특히 GFRα-4 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환 또는 형질감염된(transfected) 숙주 세포, 단리된 GFRα4 단백질, GFRα-4에 관련하여 작용제 또는 길항제로 작용하는 화합물 및 그들을 동정하는 방법 및 단리된 핵산, 수용체 단백질 또는 상기 작용제 또는 길항제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

신경영양성 (neurotrophic) 성장 인자는 신경의 분화, 발달 및 유지에 포함된다. 이들 단백질은 다양한 유형의 신경 세포의 퇴화를 방지하거나 생존을 촉진할 수 있고, 따라서, 신경퇴화성 질병에 대한 잠재적인 치료제이다. 신경교(Glial) 세포-유래된 신경영양성 인자(GDNF)는 뉴로트로핀으로부터 구조적으로 구별되는 신경영양성 인자의 성장하는 서브패밀리의 제 1 구성원이었다. GDNF는 아미노산 서열내에 7개의 고도로 보전된 시스테인 잔기의 특정 패턴에 의해 특징지워지는, 성장 인자의 형질전환 성장인자 β(TGF-β)의 간접적으로 관련된 구성원이다(Kingsley, 1994). GDNF는 시험관내에서 태아의 전방 중뇌 도파민성 뉴론의 생존 및 기능을 유지하는 그의 능력에 기초한 분석을 사용하여 본래 정제되었다(Linet al., 1993). 중추(CNS) 또는 말초 신경계(PNS)에서의 다른 신경 세포형은 GDNF의 생존 효과에 반응성인 것으로 나타났다(Henderson et al., 1994, Buj-Bello et al., 1995, Mount et al., 1995, Oppenheim et al., 1995). GDNF는 불활성 예비형태이며, 이는 RXXR 인식 부위에서 특정하게 절단되어 활성인 GDNF를 생성한다(Lin et al., 1993). 도파민성 뉴론에 대한 그의 효과의 견지에서, 임상적 시도는 뇌의 흑질에서 도파민성 세포의 높은 퍼센트(70% 까지)를 손실시키는 것을 특징으로 하는 흔한 신경퇴화 질병인 파킨슨씨 병의 가능한 치료로서 평가하였다. GDNF의 외부 투여는 파킨슨씨 질병의 동물 모델에서 효능있는 보호 효과를 갖는다(Henderson er al., 1994, Beck et al., 1995, Tomac et al., 1995, Yan et al., 1995, Gash et al., 1996, Choi-Lundberg et al., 1997, Bilang-Bleuel et al., 1997, mandel et al., 1997).

최근에, 신경영양성 인자의 GDNF 패밀리의 새로운 세개의 구성원이 발견되었다. 뉴르투린(neurturin)(NTN)을 배양물에서 교감신경성 뉴론의 생존을 촉진하는 능력에 기초한 분석을 사용하여 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 콘디셔닝된 배지로부터 정제하였다(Kotzbauer et al., 1996). 성숙한 뉴르투린 단백질은 성숙한 GDNF와 57% 유사하다. 퍼세핀(persephin)은 게놈 DNA를 사용한 퇴화 프라이머 PCR에 의해 발견하였다. 성숙한 GDNF와 같이, 성숙한 단백질은 배양물에서 전방 중뇌 도파민성 뉴론 및 모터(motor) 뉴론의 생존을 촉진한다(Milbrandt et al., 1998). 성숙한 GDNF 및 뉴르투린과 성숙한 퍼세핀 단백질의 유사성은 50%이다. 매우 최근에, 제 4의 구성원이 공공 EMBR 데이터베이스에서의 게놈 DNA 정보를 사용하여 클 로닝되어 에노빈(Enovin)(EVN)(Masure et al., 1999) 또는 아르테민(Artemin) (ARTN)(Baloh et al., 1998b)이라고 명명되었다. 이 인자는 NTN 및 PSP에 ±57% 유사하고, 말초 뉴론에 1차적으로 작용한다.

모두 4개의 GDNF 패밀리 구성원은 하향 세포내 신호 전달을 수행하기 위하여 헤테로다이머 수용체 복합체를 요구한다. GDNF는 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI)-앵커된(anchored) 막 단백질인 GDNF 패밀리 수용체 알파 1(GFRα-1; 또한 GDNFRα, RETL1 또는 TrnR1이라고 명명; GFRα 명명 위원회, 1997) 서브유니트에 결합한다(Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Sanicola et al., 1997). GDNF/GFRα-1 복합체는 이어서 막 결합된 티로신 키나제인 cRET 프로토-온코진에 결합하여 활성화시켜(Durbec et al., 1996, Trupp et al., 1996) cRET에서 티로신 잔기의 인산화를 일으켜 하향(downstream) 신호 전달 경로의 활성화를 일으킨다(Worby et al., 1996). GFRα-1과 유사한 GFRα-2(또한 RETL2, NTNR-α, GDNFR-β 또는 TrnR2)는 다수의 다른 그룹들에 의해 동정되었다(Baloh et al., 1997, Sanicola et al., 1997, Klein et al., 1997, Buj-Bello et al., 1997, Suvanto et al., 1997). 인간 GFRα-1 및 GFRα-2 수용체 서브유니트는 단백질 서열에 있어서 보존된 31개 시스테인 잔기중 30개와 49% 동일하고, 63% 유사하다. 양 수용체는 막에 앵커된 GPI에 포함된 카복시-말단에 소수성 도메인을 함유한다. GFRα-1 및 GFrα-2는 거의 모든 조직에서 널리 발현되고, 발현이 발달과정에서 조절될 수 있다(Sanicola et al., 1997, Widenfalk et al., 1997).

GFRα-1은 GDNF에 대해 바람직한 수용체이고, 반면에, GFRα-2는 선호적으로 뉴르투린과 결합한다(Jing et al., 1996, Treanor et al., 1996, Klein et al., 1997). 그러나, GDNF와 같은 수용체는 형질감연 중 재배열된 프로토-옹코진 아이소형 c (rearranged during transfection proto-oncogene isoform c; cRET)의 존재하에서 GFRα-2에 결합할 수 있고(Sanicola et al., 1997), 뉴르투린은 낮은 친화성으로 GFRα-1과 결합할 수 있기 때문에 또한 이들 성장 인자사이에 얼마의 크로스-톨크(cross-talk)가 있다는 것이 분명하다(Klein et al., 1997). GDNF 및 뉴르트린은 따라서 신경영양성 시그날링 시스템의 일부분이고, 이에의해, 상이한 리간드-결합 서브유니트(GFRα-1 및 GFRα-2)는 동일한 티로신 키나제 서브유니트(cRET)와 상호작용할 수 있다.

최근에, 공수용체의 GFRα 패밀리의 제 3 구성원, GFRα-3이 기술되었다(Jing et al., 1997, Masure et al., 1998, Worby et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). 이 수용체의 아미노산 서열은 GFRα-1 및 GFRα-2와 35% 동일하다. GFRα-3은 발달하는 또는 성인 CNS에서는 발현되지 않으나, 수개의 발달하는 그리고 성인 감각 기관 및 PNS의 교감신경 신경절에서 고도로 발현된다(Widenfalk et al., 1998, Naveilhan et al., 1998, Baloh et al., 1998a). GFRα-3은 에노빈/아르테민에 대한 바람직한 공수용체이고 또한 cRET를 통한 시그날인 것으로 나타났다(Masure er al., 1999, Baloh et al., 1998b). EVN/ARTN과 GFRα-1사이의 크로스톨크가 또한 적어도 시험관내에서 가능한 것으로 보인다.

GFRα 패밀리의 제 4 구성원이 치킨(chicken)에서 확인되었고(Thompson et al., 1998), cRET를 통한 퍼세핀의 시그날링을 매개하는 것으로 나타났다(Enokido et al., 1998). 포유동물 퍼세핀 수용체를 코딩하는 기능성 포유동물 동족체는 발 견되어야 한다.

본 발명은 놀랍게도 본 명세서에서 GFRα-4라고 지칭되는 GDNF 패밀리의 추가의 신규한 포유동물 수용체를 동정하였다. DNA 서열이 클로닝되고, 수용체를 코딩하는 다수의 스플라이스 변이체가 또한 동정되었다.

따라서, 본 발명에 의해 GFRα-4라고 지칭되는 포유동물의 GDNF 패밀리 수용체 α-4를 코딩하는 핵산의 단리된 또는 실질적으로 순수한 형태가 제공된다. 핵산 분자는 바람직하게는 래트, 마우스 또는 인간으로부터 유래한다. 바람직하게는, 상기 핵산 분자에 의해 코딩되는 수용체는 서열 번호 8 또는 9에 예시된 또는 상기 수용체의 기능적 등가물, 유도체 또는 생물학적 전구체를 코딩하는 아미노산 서열을 포함한다.

초기에는, GFRαs의 오직 4개의 구성원이 공지되었다는 사실에 비추어 새로운 수용체는 전에는 GFRα-5라고 불리웠다. 그러나, 지금은 GFRα 패밀리 구성원에 대한 기존 명명법과 부합하고, 본 발명의 GFRα 수용체가 치킨 GFRα-4 수용체의 포유동물 오르토로그(orthologue)인 것을 나타내기 위하여 α-4라고 명명한다.

따라서, 본 발명은

(a) 서열 번호: 8 또는 9에 나타난 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열;

(b) 서열 번호: 5 또는 6에 나타난 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열;

(c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 하나 또는 수개의 아미노산을 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 (a) 또는 (b)의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드로부터 유래된 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열;

(d) 상보적 가닥이 (a) 내지 (c)의 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열;

(d) 아미노산 서열이 (a) 내지 (d)의 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 30%이상의 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열;

(f) (a) 내지 (e)의 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 단편 또는 에피토프-함유 부분을 포함하는 퍼세핀과 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열;

(g) (a) 내지 (f)의 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 15개의 연속적 뉴클레오타이드를 포함하고, 퍼세핀과 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및

(h) 유전적 코드의 결과로서 (a) 내지 (g)의 뉴클레오타이드 서열로 퇴화된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 구성된 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 포유동물 GDNF 패밀리 수용체 α-4(GFRα-4) 또는 면역학적으로 및/또는 생물학적으로 활성인 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 핵산 분자는 적절한 발현 벡터를 사용하여, 예를 들어 숙주 세포등에서 상기 GFRα-4 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 DNA 분자이고, 보다 바람직하게는 서열 번호 5 내지 7에 예시된 서열을 갖는 cDNA 분자 또는 그의 상보물(complement)이다. 다르게는, 핵산 분자는 고도의 엄격한 조건에서 본 발명의 서열 또는 그의 상보물과 혼성화할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바, 혼성화의 엄격함은 폴리핵산이 안정한 조건을 조건을 언급한다. 혼성화물의 안정성은 혼성화물의 융점(Tm)에서 반영된다. Tm은 화학식:

81.5℃+16.6(log₁₀[Na⁺]+0.41 (%G&C)-600/1(여기에서, 1은 뉴클레오타이드중의 혼성화물의 길이이다)에 의해 접근화될 수 있다. Tm은 서열 상동성에서 매 1% 감소로 대략 1-1.5℃씩 감소한다.

본 발명에 따른 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 핵산은 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열과 일반적으로 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80 또는 90% 및 보다 바람직하게는 적어도 95% 상동성이다.

유리하게는, 안티센스 분자는 프로브로서 또는 약제로서 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물에서 사용될 수 있다.

본 발명의 제 2 면에 따르면, 본 발명에 따른 DNA 분자를 포함하는 DNA 발현 벡터가 제공된다. 이 벡터는 유리하게는 본 발명에 따른 GFRα-4의 발현을 달성하기 위하여 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는 데에 사용될 수 있다. 바람 직하게는, DNA는 숙주 세포를 추후 형질감염 또는 형질전환시키기 위해 플라스미드에 포함된다.

본 발명에 따른 발현 벡터는 상기 DNA 단편의 발현을 실행시킬 수 있는 프로모터 영역과 같은 조절 서열에 작동가능하게(operably) 연결된 본 발명에 따른 핵산을 갖는 벡터를 포함한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 기술된 성분들이 의도된 방법으로 작동하도록 하는 관계로 나란히 놓인 위치를 언급한다. 이러한 벡터는 적절한 숙주 세포속으로 형질전환되어 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 발현을 제공한다. 따라서, 추가의 면에서, 본 발명은 수용체를 코딩하는 코딩 서열의 벡터에 의한 발현을 제공하는 조건하에 상기된 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 배양하고, 발현된 수용체를 회수하는 것을 포함하는 본 발명에 따른 수용체를 제조하는 방법을 제공한다.

벡터는 예를 들어, 복제의 기원(origin), 임의로 상기 뉴클레오타이드의 발현용 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절자가 구비된 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 예를 들어 앰피실린 내성과 같은 하나이상의 선택가능한 마커를 함유할 수 있다.

발현에 요구되는 조절 요소는 RNA 폴리머라제에 결합하는 프로모터 서열 및 리보좀 결합을 위한 전사 개시 서열을 포함한다. 예를 들어, 박테리아 발현 벡터는 Shine-Dalgarno 서열에서 전사 개시를 위한 lac 프로모터와 같은 프로모터 및 출발 코돈 AUG를 포함할 수 있다. 유사하게, 진핵 발현 벡터는 RNA 폴리머라제 II용의 이종성 또는 동종성 프로모터, 하향 폴리아데닐화 시그날, 출발 코돈 AUG, 및 리보좀의 탈착을 위한 종결 코돈을 포함할 수 있다. 이러한 벡터는 시판되거나 본 분야에 잘 알려진 방법에 의해 기술된 서열로부터 조립될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 안티센스 RNA의 생성을 제공하기 위하여 안티센스 배향으로 기술된 벡터에 삽입될 수 있다. 안티센스 RNA 또는 다른 안티센스 핵산은 합성 수단에 의해 생성될 수 있다.

본 발명에 따르면, 한정된 핵산은 동일한 핵산 및 보존 아미노산 치환에서 퇴화 코드에 기인하여 같은 뜻의 코돈(동일한 아미노산 잔기를 특정화하는 상이한 코돈)을 가져오는 염기에서의 특히 치환을 포함하는 아미노 염기 변이를 포함한다. 용어 "핵산 서열"은 또한 염기 변이에 관련하여 주어지는 어떤 단일 가닥 서열에 대한 상보적 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산의 적어도 대략 10개의 인접한 뉴클레오타이드 및 바람직하게는 10 내지 50개의 뉴클레오타이드의 핵산 서열을 제공한다. 이들 서열은 유리하게는 프로브 또는 복제를 개시하는 프라이머등으로서 사용될 수 있다. 이러한 핵산 서열은 예를 들어, 재조합체 또는 합성 수단에 의해 본 분야에 잘 알려진 기술에 따라 생산될 수 있다. 이들은 또한 본 발명에 따른 핵산의 존재를 존재를 검출하기 위한 진단 키트등에서 또한 사용될 수 있다. 이들 시험은 일반적으로 프로브를 혼성화 조건에서 샘플과 접촉시키고, 프로브와 샘플중의 핵산사이의 듀플렉스 또는 트리플렉스 형성의 존재를 검출하는 것을 포함한다.

본 발명에 따르면, 이들 프로브는 고체 지지체에 앵커링(anchored)될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 다중 프로브가 단일 생물학적 샘플에 동시에 혼성화할 수 있는 배열(array)로 존재한다. 프로브는 배열에 스포팅되거나 배열상에서 즉석에서 합성될 수 있다(참조, Lockhart et al., Nature Biotechnology, vol 14, December 1996 "Expression monitering by hybridisation into high density oligonucleotide arrays"). 단일 배열은 분리된 위치에 100, 500 또는 1,000 개 이상의 상이한 프로브를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 서열은 예를 들어 클로닝하려는 유전자의 영역까지 대략 10 내지 50개의 뉴클레오타이드일 수 있는 한쌍의 프라이머를 만들고, 프라이머를 인간 세포로부터의 mRNA, cDNA, 또는 게놈 DNA와 접촉시키고, 원하는 영역을 증폭시키는 조건하에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하고, 증폭된 영역 또는 단편을 분리하고, 증폭된 DNA를 회수하는 것을 일반적으로 포함하는 PCR 클로닝 메카니즘을 사용하는 것과 같은 재조합체 또는 합성 수단을 사용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 정의된 이러한 기술은 삼브룩등에 의해 기술된 바와 같이(Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989) 본 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명에 따른 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 리빌링(revealing) 라벨을 수반할 수 있다. 적절한 라벨은 방사성 동위원소, 예를 들어 ³²P 또는 ³⁵S, 효소 라벨 또는 다른 단백질 라벨, 예를 들어비오틴 또는 형광 마커를 포함한다. 이러한 라벨은 본 발명의 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드에 첨가되어 그자체로 알려진 기술을 사용하여 검출될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴 리펩타이드 또는 그의 기능적 등가물, 유도체 또는 생물학적 전구체를 그의 범위안에 포함한다. 바람직하게는, 단백질은 서열 번호 8 및 9를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "기능적 등가물"은 본 발명에 따른 GFRα-4 수용체와 관련하여 동일한 성질 및 기능성을 나타내는 수용체를 의미한다. "유도체"는 특정 아미노산이 변형되거나 결실되거나 대체될 수 있고, 폴리펩타이드 또는 단백질이 상기 GFRα-4 수용체의 생물학적 활성을 유지하고/하거나, 챌린징 항원으로서 본 발명에 따른 수용체를 사용하여 생성된 항체와 교차 결합할 수 있는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

본 발명의 범위안에는 융합(fusion) 단백질 및 단편을 포함하는 본 발명에 따른 GFRα4-수용체의 혼성화물 및 변형된 형태가 포함된다. 혼성화물 및 변형된 형태는 예를 들어 특정 아미노산이 예를 들어 본 발명의 GFRα-4 수용체와 같은 수용체 특이성을 갖는 단백질을 가져오는 점 돌연변이에 의해 얼마의 변형 또는 대체를 받는 경우를 포함한다.

이와 관련하여, 용어, 생물학적 활성, 수용체 특이성 및 기능적 수용체(단편)은 바람직하게는 퍼세핀과 바람직하게는 특이적으로 결합하는 능력을 포함하고, 본 발명의 GFRα-4는 GDNF, NTN, 및/또는 EVN/ART에 전혀 또는 실질적으로 결합활성을 갖지 않는 다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 GFRα-4, 변이체, 유도체 및 그의 단편의 생물학적 활성, 수용체 특이성 및/또는 기능성, 예를 들어 결합 활성은 바람직하게는 첨부된 실시예에 기술된 바와 같이 본 분야에 잘 알려진 방법에 따라 결정될 수 있다. 바람직하게는, 퍼세핀에 대한 본 발명의 GFRα-4의 K_D는 하기 기술된 실시예에 따라 결정될 때, 1 내지 10 x 10^-9, 특히 바람직하게는 5.9±2.8 x 10^-9이다(참조, 표 6의 기술).

본 발명에 따른 단백질은 핵산 분자에 의해 코딩되고 보존성 아미노산 변화를 갖는 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 모든 가능한 아미노산 변이체를 포함한다. 본 발명에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드는 추가로 상기 단백질 또는 폴리펩타이드에 실질적으로 상동성인 천연적 대립형질 변이체를 포함하는 이러한 서열의 변이체를 포함한다. 이와 관현하여, 실질적으로 상동성은 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드와 적어도 70%, 및 바람직하게는 80 또는 90%의 아미노산 상동성을 갖는 서열로 여겨진다.

실질적인 상동성은 본 발명의 GFRα-4의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 특정한 정도의 서열 동일성을 나타내는 것을 의미한다. 바람직하게는, 이들은 적어도 30%, 바람직하게는 40%, 보다 바람직하게는 50%, 더욱 보다 바람직하게는 60%, 가장 바람직하게는 70%의 동일성을 유지하고, 특히, 적어도 80%, 바람직하게는 90% 이상 및 더욱 보다 바람직하게는 95% 이상의 동일성이 서열 번호 5 내지 9에 기술된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 관련하여 각각 원해진다. 쿼리(query) 서열(본 발명의 서열)과, 또한 글로벌 서열 배열이라고 언급되는 대상 서열사이의 가장 좋은 전체 매치를 결정하기 위한 바람직한 방법은 예를 들어 Brutlag et al.의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다(Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245.). 서열 배열에서, 쿼리 서열과 대상 서열은 모두 DNA 서열이다. RNA 서열은 U를 T로 전환시켜 비교할 수 있다. 상기 글로벌 서열 배열의 결과는 퍼센트 동일성이다. 상동성/일치성을 결정하기 위하여 사용될 수 있는 추가의 프로그램이 하기 및 실시예에서 기술된다. 상기된 서열과 상동성인 서열은 예를 들어 동일한 생물학적 기능을 갖는 변형을 나타내는, 특히 동일하거나, 실질적으로 동일한 수용체 특이성, 즉 결합 특이성을 코딩하는 상기 서열의 변형물이다. 이들은 다른 포유동물로부터의 서열과 같은 천연 변이, 또는 돌연변이일 수있다. 이들 돌연변이는 천연적으로 일어나거나 돌연변이 유발 기술에 의해 얻어질 수있다. 대립 형질 변이는 천연적으로 일어나는 대립형질 변이체 및 합성적으로 생성되거나 유전적으로 조작된 변이체이다. 바람직한 구체예에서, 서열은 마우스로부터, 보다 바람직하게는 인간으로부터 유래된다. 이들 서열은 또한 아직 알려지지 않은 기능의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 기존 데이터 베이스로부터 찾을 수 있다. 예를 들어, 쿼리 서열로서 동정된 래트 GFRα-4 서열을 사용한 EMBL 데이터베이스상의 BLAST 조사는 래트 GFRα-4 서열의 부분(엑손 2, 3 및 4)과 거의 동일한 부분을 갖는 게놈 마우스 서열(수탁 번호 AF155960) 및 게놈 인간 서열(인간 게놈 DNA로부터 유래된 콘티그.(contig.)를 함유하는 수탁 번호 AC017113)을 얻었다. 이들 뉴클레오타이드 서열은 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 추가의 면은 본 명세서에서 기술된 DNA 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 포함하고, 이 숙주 세포는 바람직하게는 진핵 세포를 포함하고, 이 진핵 세포는 예를 들어 포유동물 세포, 곤충 세포, 또는 효모 세포, 등일 수 있다. 한 구체예에서, 세포는 인간 태아 신장 세포 및 바람직하게는 HEK293 세포주의 세포를 포함한다. 다르게는, 세포는 NIH/3T3 마우스 섬유아세포 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 COS-7 세포를 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 추가로 제공되는 것은 본 발명에 따른 GFRα-4를 발현할 수 있는 또는 상기 수용체의 기능적 등가물, 또는 유도체 또는 생물학적 전구체를 발현할 수 있는 트랜스진(transgene)을 포함하는 트랜스제닉 세포, 조직 또는 유기체이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "발현할 수 있는 트랜스진"은 GFRα-4와 같은 기능 및/또는 활성을 갖는 인간 수용체의 발현에 이르는 적절한 핵산 서열을 의미한다. 트랜스진은 예를 들어 게놈에 혼입되거나 외부 크로모좀 상태의 cDNA를 포함하는 래트 세포로부터 분리된 게놈 핵산 서열 또는 합성 핵산을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 트랜스진은 본 발명에 따른 GFRα-4를 코딩하는 핵산 서열 또는 상기 핵산의 기능적 단편을 포함한다. 상기 핵산의 기능적 단편은 GFRα-4 수용체를 코딩하는 유전자 또는 cDNA 또는 상기 GFRα-4의 기능적 등가물 또는 생물학적 전구체의 단편을 의미하고, 이 단편은 기능적 수용체 단백질을 생산하도록 발현될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 돌연변이의 결실을 포함할 수 있으나, 여전히 기능적 수용체를 코딩한다.

본 발명에 의해 추가로 제공되는 것은 서열 번호 2에 예시된 아미노산 서열을 갖는 단리되고 정제된 GFRα-4 단백질 또는 상기 수용체의 기능적 단편 또는 생물학적 전구체 또는 다르게는, 본 발명에 따른 트랜스제닉 세포, 조직 또는 유기체 에 의해 발현되는 GFRα-4 단백질이다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 것은 GFRα-4를 발현하는 세포로부터의 막 제조물이다.

본 발명은 또한 안티센스 기술의 사용에 의해 생체내에서 GFRα-4를 억제하는 것에 관한 것이다. 안티센스 기술은 3중 나선 형성 또는 안티센스 DNA 또는 RNA를 통해 유전자 발현을 조절하기 위하여 사용될 수 있고, 이 양 방법은 폴리뉴클레오타이드가 DNA 또는 RNA에 결합하는 것에 기초한다.

예를 들어, 본 발명의 단백질을 코딩하는 성숙 단백질 서열의 5'-코딩 부분은 길이가 10 내지 40 염기쌍의 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드를 설계하는 데에 사용된다. DNA 올리고뉴클레오타이드는 전사에 포함된 유전자의 영역에 상보적으로 설계되어(3중 나선-참조 Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073(1979); Cooney et al., Science, 241-456 (1988); and Dervan et al., Science, 251:1360(1991)), 이에 의해 GFRα-4의 전사 및 생산을 방지한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오타이드는 생체내에서 mRNA와 혼성화하여 mRNA가 GFRα-4 수용체로 번역되는 것을 블로킹한다.

약제 또는 약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 본 발명에 따른 GFRα-4 수용체에 대한 항체가 또한 제공된다.

본 발명의 GFRα-4에 대한 항체는 유리하게는 본 분야에 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 숙주 동물, 예를 들어 마우스를 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 에피토프로 접종하고, 면역 혈청을 회수하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 Kohler R. and Milstein C., Nature(1975) 256, 495-497에 의해 기술된 바와 같은 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 항체를 샘플과 반응시키고 그에 결합하는 단백질을 동정하는 방법에서 또한 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 항체를 포함하고, 항체를 상기 샘플과 반응시키기 위한 수단을 포함하는, 상기 방법을 수행하기 위한 키트가 또한 제공될 수 있다.

유리하게는, 본 발명에 따른 항체는 약제로서, 또는 본 발명의 GFRα-4의 발현과 관련된 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 상기 항체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있는 단백질은 Chien et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582에 의해 처음 제안된 두 개-혼성화물 벡터를 사용하여 단백질-단백질 상호작용을 조사하여 동정될 수 있다.

이 기술은 리포터 유전자를 활성화시키는 전사 인자의 생체내에서의 기능적 재구성에 기초한다. 보다 특히, 이 기술은 적절한 숙주 세포에 DNA 결합 도메인 및 활성화 도메인을 갖는 전사 인자에 의해 조절되는 프로모터 조절하의 리포터 유전자를 포함하는 DNA 구조물을 적절한 숙주 세포에 제공하고, 숙주 세포에서 본 발명에 따른 핵산 서열의 단편 또는 모두 및 전사 인자의 상기 DNA 결합 도메인 또는 상기 활성화 도메인의 제 1 융합(fusion)을 코딩하는 제 1 혼성화물 DNA 서열을 발현시키며, 숙주에서 제 1 융합에 혼입되지 않은 전사 인자의 DNA 결합 또는 활성화 도메인과 함께 조사되는 추정상의 결합 단백질을 코딩하는 라이브러리등과 같은 적 어도 하나의 제 2의 혼성화물 DNA 서열을 발현시키고; 숙주 세포내의 리포터 유전자의 존재를 검출하여 본 발명에 따른 단백질과 조사되는 단백질의 결합을 검출하며; 임의로 결합 단백질을 코딩하는 제 2 혼성화물 DNA 서열을 단리하는 것을 포함한다.

GFRα-4 수용체에 결합하는 단백질은 이 기술을 이용하여 동정될 수 있다. 동정된 단백질은 이들 단백질의 작용제/길항제로서 작용하는 화합물을 동정하기 위하여 또한 사용될 수 있다. 수용체의 구조는 수용체의 작용제 또는 길항제를 설계하는 데에 또한 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명에 따른 인간 GFRα-4 수용체의 작용제 또는 길항제를 또한 포함하고, 이 작용제 또는 길항제는 약제로서 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 약제학적 조성물에서 또한 사용될 수 있다.

길항제 또는 작용제는 GFRα-4를 발현하는 세포를 시험하려는 화합물과 접촉시키고, 예를 들어 신호 전달 경로에서 cRET 또는 유사한 단백질의 존재하에서 상기 세포에서 인산화의 정도를 모니터링하거나 시토센서 또는 리간드 결합 분석에 의해 GFRα-4 매개된 기능적 또는 생물학적 반응의 정도를 모니터링하여 동정할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 본 명세서에서 정의된 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 트랜스제닉 세포일 수 있다. GFRα-4의 작용제 및 길항제는 예를 들어 GFRα-4를 포함하는 막 제조물을 GFRα-4가 성분인 신호 전달 경로에 포함된 cRET 또는 다른 유사한 단백질의 존재하에서 시험하려는 화합물과 접촉시키고, GFRα-4와 cRET 또는 상기 유사한 단백질의 상호작용을 모니터링하여 또한 동정될 수 있다. 유리하 게는, GFRα-4와 관련하여 작용제 또는 길항제로서 동정되는 화합물 또는 분자는 상기 언급된 약제학적 조성물에서 또는 약제로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 의해 제공되는 것은 GFRα-4 또는 그의 기능적 등가물이 속하는 신호 전달 경로에 작용하는 분자 또는 화합물이다. 다르게는, 상기 분자는 GFRα-4가 성분인 신호 전달 경로에서 GFRα-4 또는 그의 기능적 등가물의 cRET 또는 유사한 단백질과의 복합체 형성 또는 상호 작용을 방해할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기된 스크리닝 방법의 어느 하나; 및 부가적으로

(i) 환자에게 치료 유효량으로 GFRα-4의 길항제 또는 작용제를 제공하기에 충분한 양으로 상기 방법에서 수득되거나 동정된 화합물 또는 그의 생리학적으로 허용되는 유사체 또는 그의 유도체를 합성하고/하거나;

(ii) 상기 방법에서 수득되거나 동정된 화합물 또는 그의 유사체 또는 유도체를 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하는 단계들을 포함하는 본 발명에 따른 GFRα-4의 길항제 또는 작용제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법에 의해 단리된 화합물은 또한 유사체 화합물의 개발을 위한 선두 화합물로서 작용한다. 유사체는 주요 작용기가 선두 화합물과 실질적으로 같은 방법으로 GFRα-4에 제공되게 하는 안정화된 배위 및 분자 배좌를 가져야 한다. 특히, 유사체 화합물은 결합 영역에 비교될 수 있는 공간적 전자 성질을 가지나 빈번히 약 2 kD 이하 및 바람직하게는 약 1 kD 이하의 분자량을 가지면서 선두 화합물보다 작을 수 있다. 유사체 화합물의 동정은 모순없는 장(SCF) 분석, 배위 상호작용(CI) 분석 , 및 노말 모드 다이나믹 분석과 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있 다. 이들 기술을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다; 예를 들어, Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions(Alan Liss, New York, 1989). 화학적 유도체 및 유사체의 제조 방법은 본 분야에 숙련된자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Beilstein, handbook of Organic Chemistery, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA에 기술되어 있다. 또한 상기 유도체 및 유사체는 본 분야에 공지된 방법에 따라 그들의 효과에 대해 시험될 수 있다. 또한, 펩티도미메틱(peptidomimetics) 및/또는 컴퓨터가 도움이 된 적절한 유도체 및 유사체의 설계가 사용될 수 있다.

GFRα-4에 관련하여 작용제 또는 길항제로서 또는 GFRα-4가 부분인 신호 전달 경로를 방해하는 리간드 또는 화합물로서 동정된 화합물이 유리하게 예를 들어 위장 암에서 및 또한 GFRα-4 기능부전과 관련될 수 있는 질병의 치료에서와 같은 다양한 암(carcinomas)외에 예를 들어 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 모터 뉴론 질병, 말초 신경 장해, 척추 손상, 가계 히르쉬스프렁(hirschsprung) 병과 같은 신경퇴화성 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서 사용될 수 있다. 길항제로서 동정된 화합물은 암의 치료 또는 고통을 경감시키는 약제의 제조에서 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 추가로 본 발명에 따른 GFRα-4의 리간드를 동정하는 방법을 포함하며, 이 방법은 상기 수용체를 세포 추출물 또는 다르게는 GFRα-4 리간드로서 그의 잠재력에 대해 시험하려는 화합물과 접촉시키고, GFRα-4에 결합하는 분자 를 단리하는 것을 포함한다.

진단 키트가 또한 본 발명에 의해 제공되고, 이 키트는 본 발명에 따른 GFRα-4 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 고도로 엄격한 조건하에서 그에 혼성화할 수 있는 분자, 상기 핵산 분자의 단편, 본 발명에 따른 안티센스 분자의 어느 것을 포함하는 프로브, 및 시험하려는 생물학적 물질을 상기 핵산 프로브와 접촉시키는 수단을 포함한다. 본 발명에 따른 진단 키트는 또한 GFRα-4에 관련하여 작용제 또는 길항제 또는 항체, 바람직하게는 GFRα-4에 대한 모노클로날 항체를 또한 포함 할 수 있다. 따라서, 유리하게는, 키트는 세포 발현 또는 상기 수용체에서의 결함 또는 유전적 결함등을 확인하기 위하여 또는 화합물이 GFRα-4 수용체의 작용제 또는 길항제인지를 결정하기 위하여 적절하게 사용될 수 있다. 화합물이 GFRα-4에 관련하여 작용제 또는 길항제인지를 결정하는 키트는 본 발명에 따른 상기 수용체를 발현하는 세포 또는 막 제조물, 상기 세포와 상기 화합물을 접촉시키기 위한 수단 및 예를 들어 상기 세포에서의 인산화의 수준을 측정하여 또는 시토센서 또는 GFRα-4가 성분인 시스날 형질도입 경로에 포함되는 cRET 또는 유사한 단백질의 존재하에서 리간드 결합 분석에 의해 GFRα-4 매개된 기능적 또는 생물학적 반응의 수준을 모니터링 하기 위한 수단을 포함할 수 있다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 하기 예시적 구체예에서 보다 분명히 이해될 수 있다.

도 1은 래트 GFRα-4 유전자의 구조를 예시한다. 상부 라인은 bp로 규모를 나타낸다. 하부 라인은 래트 GFRα-4 유전자의 게놈 구조를 나타낸다. 엑손은 박스에 의해 나타내지고, 넘버링되며, 인트론 서열은 라인으로 표시되어 있다. 인트론 및 엑손의 크기(bp)는 다이아그램 상부에 나타내진다. 번역 출발 코돈은 화살에 의해 나타내지고, 종료 코돈은 별표에 의해 나타내진다. 인트론 서열을 스프라이싱하여 얻어진 변이체 A 및 B의 cDNA 서열은 게놈 서열 아래에 나타내진다. 인트론 5의 대안적인 스플라이싱은 스플라이스 변이체 B에서 초기 종료 코돈을 가져온다. 변이체 A 및 B의 예견된 단백질 서열은 하부에 나타내진다. 예견된 시그날 펩타이드, 추정상의 N-글리코실화 부위 및 GPI-절단에 대한 하나 또는 두개의 가능한 부위가 앞선 소수성 COOH-종료 영역(오직 변이체 A에서만)이 다이그램상에 나타내져 있다.

도 2는 래트 GFRα-4의 스플라이스 변이체 A 및 B의 예견된 단백질 서열의 배열이다. 래트 GFRα-4 스플라이스 변이체 A 및 B의 서열은 ClustalW 배열 프로그램(EMBL, Heidelberg, Germany)을 사용하여 배열되었다. 2개 변이체사이에 보존되는 아미노산 잔기는 검은 지역에 포함된다. 아미노산 잔기는 오른쪽으로 넘버링되었다. 점선은 배열을 최적화하기 위하여 서열에 도입된 갭을 나타낸다.

도 3은 GFRα-4 패밀리 구성원의 예견된 단백질 서열의 배열이다. 래트 GFRα-4 변이체 A 및 B, 래트 GFRα-1(EMBL acc. no. U59486), 래트 GFRα-2(EMBL acc. no. AF003825), 마우스 GFRα-3(EMBL acc. no. AB008833) 및 치킨 GFRα-4(EMBL acc. no. AF045162)를 ClustalW 배열 프로그램(EMBL, Heidelberg, Germany)를 사용하여 배열되었다. 모두 6개 단백질사이에 보존되는 아미노산 잔기는 검은 지역에 포함되어 있다. 서열 4 또는 5사이에 보존되는 잔기는 회색으로 그늘지게 하였다. 모든 6개 GFRα사이에 보존되는 시스테인 잔기는 서열위에 별표로 나타냈다. 아미노산 잔기는 오른쪽으로 넘버링되었다. 점선은 배열을 최적화하기 위하여 서열에 도입된 갭을 나타낸다.

도 4는 설치류 GFRα-4 mRNA 발현의 노던 블랏 분석이다. 상이한 조직에서의 래트 및 마우스 GFRα-4 mRNA의 발현은 폴리(A)-풍부 RNA의 블랏을 분석하기 위하여 래트 GFRα-4의 코딩 서열에 상응하는 프로브를 사용하여 평가하였다. (A) 래트 다중 조직 노던(MTN) 블랏; (B) 마우스 MTN 블랏 및 (C) 마우스 배아(embryo) MTN 블랏. 겉보기 크기는 각 패널의 좌측으로 수평 라인에 나타냈다(킬로염기 쌍).

도 5. 래트 GFRα-4 유전자는 크로모좀 3q36상에 위치한다. 두 개 래트 GFRα-4 프로브의 혼합물을 FISH 분석을 위해 사용하였다. (A) 래트 크로모좀 3의 중간 부분상의 이중-스폿 FISH 시그날(화살표). (B) 래트 크로모좀 3q36 상의 GFRα-4 유전자 로커스의 위치.

PCR 및 DNA 서열화를 위한 올리고뉴클레오타이드 합성

사용된 모든 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 Eurogenetic(Seraing, Belgium)로부터 주문하였다. 삽입물-특이적 서열화 프라이머(15- 및 16-머) 및 PCR 반응에서 사용하기 위한 프라이머는 수작업으로 설계하였다. DNA를 Qiagen-tip-20 또는 -100 음이온 교환 또는 Qiaquick spin 컬럼(Qiagen GmbH, Duesseldorf, Germany)상에서 제조하고, 30 ㎕ TE-버퍼(10 mM Tris.HCl, 1mM EDTA (소듐염), pH 8.0)중에서 칼럼으로부터 회수하였다. 서열화 반응은 ABI prism BigDye Terminator Cycle 서열화 키트를 사용하여 양 가닥에 수행하고, Applied Biosystems 377XL sequencer(Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, CA, USA)상에 러닝시켰다. Sequencer^TM 소프트웨어를 서열 조립 및 수작업 편집을 위해 사용하였다(GeneCodes, AnnArbor, MI, USA).

GFRα 패밀리의 신규의 구성원을 코딩하는 cDNA 서열의 동정

쿼리 서열로서 인간 GFRα-1, GFRα-2 또는 GFRα-3 DNA 또는 단백질 서열을 사용하여, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990) 조사를 공공 EMBL 데이터베이스의 매일 업데이트상에서 수행하였다. EMBL 수탁번호 AU035938을 갖는 마우스 EST(발현된 서열 tag)는 GFRα-1, GFRα-2 및 GFRα-3에 상동성을 보였다. BLAST 분석에 의해 얻어진 가장 작은 합계 확률(SSP)이 표 1에 요약되어 있다.

표 1: BLAST 결과

AU035938(서열 1)은 마우스 뇌 cDNA 라이브러리로부터 유래된 792 bp의 서열이다. 번역시 GFRα 패밀리의 다른 구성원과의 지속적인 상동성을 얻기위하여, 프레임 시프트를 DNA 서열내의 위치 165 근처에 도입해야한다. 이것이 서열화 에러 에 기인하는 것인지 또는 다른 설명이 있는지 분명치 않다. 쿼리 서열로서 이 EST 서열을 사용하여, 공공 EMBL 데이터베이스에 대한 BLAST 조사를 반복하였다. 하나의 추가의 클론(acc. no. AA823200; 서열 2)은 1e-18의 유의적인 SSP를 얻었다. 마우스 포유동물 선(gland) cDNA 라이브러리로부터 유래된 497 bp 클론의 조사시, 오직 처음 bp가 AU035938(위치 353 내지 415)의 부분과 동일하였다. AA823200 서열의 나머지는 AU035938과 상이하였으나, 번역된 아미노산 서열이 다른 GFRα과 상동성을 나타내는 부분을 함유했다. 그러므로, AU035938 및 AA823200이 GFRα-4라고 불리는 동일한 수용체의 두 개의 변이체 형태를 나타낼 수 있다는 가설이 세워졌다.

마우스 GFRα-4 cDNA의 클로닝

먼저, 본 발명자들은 마우스 뇌 및 마우스 배아로부터 유래된 Marathon Ready^TM cDNAs(Clontech Laboratories, Palo alto, CA, USA)상에서 마우스 GFRα-4 cDNA의 단편을 증폭시키려고 시도하였다. 프라이머를 마우스 GFRα-4의 274 bp 단편을 증폭시키도록 EST 서열(EMBL acc. no. AU035938 및 AA823200)을 사용하여 설계하였다. 마우스의 GFRα-4를 증폭시키기 위해 사용된 프라이머를 하기 표에 나타낸다.

표 2: 마우스 GFRα-4 DNA 서열을 증폭시키기 위하여 사용된 프라이머

PCR 반응을 Taq 폴리머라제 시스템(Boeringer Mannheim, Mannheim, Germany)을 사용하여 수행하였다. PCR 반응을 1 x Taq PCR 반응 버퍼, 0.25 mM dNTP, 0.5 μM의 프라이머 마우스-GFRα4-sp2 및 마우스-GFRα4-ap2, 1 ㎕의 Taq 폴리머라제 및 2 ㎕의 마우스 배아 또는 마우스 뇌 Marathon Ready^TM cDNA를 함유하는 50 ㎕의 총 부피로 수행하였다. 샘플을 95℃에서 5분간 가열하고, 최종 단계는 72℃에서 7분하는 단계로 하여 94℃에서 30 초, 60℃에서 1분 및 72℃에서 45초하는 사이클링을 35사이클동안 수행하였다. 반-네스티드된(semi-nested) PCR을 이어서 프라이머 마우스-GFRα4-sp3 및 마우스- GFRα4-ap2와 함께 1 ㎕의 1차 PCR 반응물에서 수행하였다. PCR 반응을 1x Taq PCR 반응 버퍼, 0.25 mM dNTP, 0.5 μM의 프라이머 마우스-GFRα4-sp3 및 마우스-GFRα4-ap2, 1㎕의 Taq 폴리머라제 및 1㎕의 1차 PCR 생성물을 함유하는 50 ㎕의 총 부피로 수행하였다. 샘플을 95℃까지 5분동안 가열하고, 최종 단계는 72℃에서 7분간 하여 94℃에서 30초, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 45초하는 사이클링을 35사이클동안 수행하였다. PCR 생성물을 1x TAE 버퍼(40 mM 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA (소듐염), pH 8.3)중의 1% (w/v) 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 예상되는 크기(270 bp)의 PCR 단편을 겔로부터 절개하여 Qiaquick gel 추출 키트(Quiagen Gmbh, Hilden, Germany)로 정제하였다. PCR 단편을 서열화하여 그들의 아이덴티티(identity)를 확인하였다. 수득된 서열은 EST 데이터베이스 서열에 상응하였다. 마우스 GFRα-4의 상향 및 하향 코딩 서열을 결정하기 위하여, 5' 및 3' 레이스(RACE) 실험을 수행하였다. 이들 실험은 예 상대로 수행되지 않고, 일부점에서는 프레임 시프트가 번역후 다른 GFRα와 일치하는 상동성을 얻기 위하여 마우스 GFRα-4 서열에 도입되어야 하기 때문에, 본 발명자들은 마우스 GFRα-4의 래트 상동체의 클로닝으로 시프트하기로 결정하였다.

래트 GFRα-4 cDNA 서열의 동정 및 클로닝

상기된 수탁 번호 AU035938 및 AA823200를 갖는 cDNA 서열을 독점의 LifeSeq 및 ZooSeq 데이터베이스(Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA, USA)에 대한 BLAST 조사에서 쿼리 서열로서 사용하였다. 마우스 GFRα-4 서열에 높은 상동성을 갖는 두개의 래트 클론을 동정하였다: 번호 701290919H1(270 bp; AU035938(SSP=1.1e-32) 및 AA823200(SSP=1.3e-21로 히트) 및 번호 701291473H1(250 bp; 오직 AA823200(SSP=4.3e-42)로 히트). 공지된 GFRα 단백질 서열에 대해 클론 701291473H1 및 701290919H1으로부터 유래된 번역된 단백질 서열을 비교하여, 서열 701290919H1이 아마도 서열 701291473H1에 대해 5'로 위치되고 이들 서열은 완전한 GFRα-4 cDNA 서열에서 거의 서로 인접한 것이 추론될 수 있다. 그러므로, 두개의 포워드 프라이머(래트-GFRα4-sp1 및 래트-GFRα4-sp2)는 서열 701290919H1의 5' 영역에 설계되었고, 두 개의 역 프라이머(래트-GFRα-ap1 및 래트-GFRα4-ap2)는 서열 701291473H1에 위치되었다. PCR 실험에서 사용된 모든 프라이머 서열은 표 3에 요약되어 있다.

표 3: 래트 GFRα-4 서열의 증폭을 위해 사용된 프라이머. 레이스-ap1 및 레이스-ap2 프라이머는 Marathon Ready^TM cDNA 키트에 포함된다.

PCR을 뇌-유래된 cDNA에서 래트 GFRα-4의 존재를 확인하기 위하여 래트 뇌 Quickclone cDNA(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA)상의 프라이머 래트-GFRα4-sp1 및 래트-GFRα4-ap1을 사용하여 수행하였다. 래트 GFRα-4 서열을 코딩하는 DNA 서열이 이 지역에 높은 G+C 함량을 갖기 때문에, PCR 반응을 어드벤테이지-GC PCR 키트(Clontech)를 사용하여 수행하였다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1M GC-MELTae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-sp1 및 래트-GFRα4-ap1, 1 ㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 1 ㎕의 래트 뇌 Quickclone cDNA를 함유하는 50 ㎕의 총 부피에서 수행하였다. 샘플을 95℃로 1분간 가열하고, 사이클링을 최종 단계는 72℃에서 7분간하여 95℃에서 1분간, 56℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간하는 사이클링을 30 사이클동안 수행하였다. 네스 티드된 PCR을 이어서 프라이머 래트-GFRα4-sp2 및 래트-GFRα4-ap2로 1 ㎕의 1차 PCR 반응물에 수행하였다. PCR반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELTae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-sp2 및 래트-GFRα4-ap2, 1 ㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 1㎕의 1차 PCR 생성물을 함유하는 50 ㎕의 총 부피로 수행하였다. 샘플을 95℃에서 1분간 가열하고, 최종 단계를 72℃에서 7 분으로 하여 95℃에서 30초, 56℃에서 1분 및 72℃에서 1분간하는 사이클링을 25사이클동안 수행하였다. PCR 생성물을 1x TAE 버퍼(40 mM 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA(소듐 염), pH 8.3)중의 1%(w/v) 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 각각 대략 1100 및 200 bp의 두개의 PCR 단편을 겔로부터 절개하여 Qiaquick 겔 추출 키트(Qiagen Gmbh, Hilden, Germany)로 정제하였다. PCR 단편을 서열화하여 그들의 아이덴티티를 확인하였다. 가장 작은 단편은 결합된 서열 701290919H1 및 701291473H1에 상응하는 211 bp의 서열을 얻었다. 보다 큰 단편은 5' 말단에서 18 bp, 3' 말단에서 59 bp 및 211 bp 단편의 서열에 상응하는 92 bp의 내부 스트레치를 얻었으나, 사이에 추가의 서열 스트레치를 가졌다. 이 단편은 래트 GFRα-4의 변이체를 나타냈다.

클론 701291919H1 및 701291473H1을 Incyte Pharmaceuticals로부터 얻었고, 삽입물을 완전히 서열화하였다. 이 서열은 본 출원에 포함된다(서열 3-701290919H1 및 서열 4=701291473H1). 양 클론은 동일한 7일된 래트 뇌 피질 cDNA 라이브러리로부터 유래하였다. 양 클론은 5' 말단에서(701291473H1에서 처음 134 bp 및 701290919H1에서 처음 227개 bp)에서 상이하고, 그이후는 동일하였다. 양쪽 은 종료 코돈(701291473H1에서 184-186 위치 및 701290919H1에서 277-279 위치)까지의 GFRα-4 코딩 서열의 부분을 함유한다. 이때, 폴리(A)-테일(tail)이 이어지는 549 bp의 3' 비번역된 영역이 양 클론에 존재한다. 본 발명자들은 양 클론이 래트 GFRα-4 유전자의 상이한 변이체이라고 가설을 세웠다. 프라이머 (래트-GFRα4-ap3 및 래트-GFRα4-ap4)는 래트 GFRα-4 cDNA의 5'-말단을 결정하기 위하여 5' 레이스 실험을 수행하도록 양 변이체에 공통인 서열의 부분상에 설계하였다. 먼저, 5' 레이스 PCR을 래트 뇌 Marathon Ready^TM cDNA(Clontech)상에서 수행하였다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1 M 또는 1.5M GC-MELTae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-ap3 및 레이스-ap1, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 5 ㎕의 래트 뇌 Marathon Ready^TM cDNA를 함유하는 50㎕의 총부피로 수행하였다. 샘플을 30초동안 95℃로 가열하고, 최종 단계를 68℃에서 7분 동안하여, 95℃에서 30초, 72℃에서 4분간하는 사이클링을 5 사이클동안 수행하고, 이어서 95℃에서 30초, 70℃에서 4분의 사이클링을 5사이클동안, 이어서 95℃에서 30초, 68℃에서 4분하는 사이클링을 25사이클동안 수행하였다. 이어서 네스티드된 PCR을 프라이머 래트-GFRα4-ap4 및 레이스-ap2와 함께 1 ㎕의 1차 PCR 반응물에 수행하였다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1 M 또는 1.5M GC-MELTae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-ap4 및 레이스-ap1, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 1 ㎕의 1차 PCR 생성물을 함유하는 50㎕의 총부피로 수행하였다. 사이클링을 1차 PCR과 정확히 같은 파라미터를 사용하여 수행하 였다. PCR 생성물을 1x TAE 버퍼(40 mM 트리스-아세테이트, 1 mM EDTA(소듐 염), pH 8.3)중에서 1% (w/v) 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 대략 350 bp의 단편을 겔로부터 절개하여 제조자의 지시(Invitrogen BV, Leek, The Nethelands)에 따라 TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 플라스미드 벡터 pCR2.1-TOPO에 클로닝시켰다. 생성된 클론중의 하나는 5' 방향에서 래트 GFRα-4 서열을 연장하는 387 bp의 삽입물 서열을 얻었다. 번역시, 이 추가의 cDNA 서열은 내부 종료 코돈이 없고, 다른 공지된 GFRα 서열과 실질적인 상동성을 갖는 단백질 서열을 얻었다. 어떤 추정상의 ATG 출발 코돈도 이 추가의 서열내에서 검출될 수 없기 때문에, 신규의 프라이머(래트-GFRα4-ap5 및 래트-GFRα-ap6)를 추가의 5' 레이스 실험을 수행하기 위하여 이 서열의 5' 말단에 설계하였다. 먼저, 5'-레이스 PCR을 래트 심장 Marathon Ready^TM cDNA(Clontech)상에서 수행하였다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1M GC-MELtae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-ap5 및 레이스-ap1, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 5 ㎕의 래트 심장 Marathon Ready^TM cDNA를 함유하는 50㎕의 총 부피로 수행하였다. 샘플을 95℃에서 30초간 가열하고, 최종 단계는 68℃에서 7분으로 하여 95℃에서 30초, 72℃에서 4분간하는 사이클링을 5 사이클동안, 이어서 95℃에서 30초, 70℃에서 4분하는 사이클링을 5 사이클동안, 이어서 95℃에서 30초, 70℃에서 4분하는 사이클링을 5사이클동안, 이어서 95℃에서 30초, 68℃에서 4분간하는 사이클링을 25 사이클동안 수행하였다. 이어서 네스티드된 PCR 반응을 프라이머 래트-GFRα4-ap6 및 레이스- ap2와 함께 1㎕의 1차 PCR 반응물상에 수행하였다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELTae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-ap6 및 레이스-ap1, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 1 ㎕의 1차 PCR 생성물을 함유하는 50㎕의 총부피로 수행하였다. 사이클링을 1차 PCR과 정확히 같은 파라미터를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 대략 200 bp의 단편을 겔로부터 절개하고, 상기된 바와 같이 TOTO TA 클로닝 키트를 사용하여 플라스미드 벡터 pCR2.1-TOPO에 클로닝시켰다. 두개의 생성된 클론의 서열화는 래트 GFRα-4 서열을 5' 방향으로 또다른 128 bp로 연장시켰다. 이 서열에 기초하여, 또다른 프라이머 세트(래트-GFRα4-ap7 및 래트-GFRα4-ap8)을 추가의 5' 레이스 실험을 수행하기 위하여 설계하였다. 레이스 PCR을 래트 뇌, 심장 및 신장 Marathon Ready^TM cDNA상에 수행하였다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1M GC-MELtae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-ap7b 및 레이스-ap1, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 5 ㎕의 래트 심장, 뇌 또는 신장 Marathon Ready^TM cDNA를 함유하는 50㎕의 총 부피로 수행하였다. 샘플을 95℃에서 30초간 가열하고, 최종 단계는 68℃에서 7분으로 하여 95℃에서 30초, 72℃에서 4분간하는 사이클링을 5 사이클동안, 이어서 95℃에서 30초, 70℃에서 4분간하는 사이클링을 5사이클동안, 이어서 95℃에서 30초, 68℃에서 4분간하는 사이클링을 25 사이클동안 수행하였다. 이어서 네스티드된 PCR 반응을 프라이머 래트-GFRα4-ap8 및 레이스-ap2와 함께 1㎕의 1차 PCR 반응물상에 수행하였다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELTae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-ap8 및 레이스-ap2, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 1 ㎕의 1차 PCR 생성물을 함유하는 50㎕의 총부피로 수행하였다. 사이클링을 1차 PCR과 정확히 같은 파라미터를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 대략 200 bp 내지 1200 bp 크기의 수개 단편을 겔로부터 볼 수 있고, 절개하여, TOTO TA 클로닝을 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO에 클로닝시켰다. 수개 클론의 삽입물을 서열화했다. 이들 클론으로부터, 래트 GFRα-4의 서열이 5' 방향에서 연장될 수 있다. 두개의 상이한 서열을 동정하였다. 한 서열은 5' 방향에서 215 bp로 래트 GFRα-4 서열을 연장하였고, 인-프레임 상향 출발 코돈이 앞선 인-프레임 출발 코돈을 포함하였다. 생성된 예견된 단백질 서열(53개의 추가의 아미노산 서열 잔기)은 예견된 29개 아미노산 잔기의 시그날 펩타이드를 포함한다(Wisconsin package version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin, USA; score 7.0, probability 1.171e-02에 포함된 SPScan 프로그램에 의해 결정된바). 이들 5' 레이스 실험에 의해 결정된 다른 서열은 래트 GFRα-4 서열을 5' 방향으로 552 bp 연장하였고, 또한 인-프레임 상향 종료 코돈이 앞선 인-프레임 출발 코돈을 포함하였다. 이 신규 서열의 가장 3' 79개 염기 쌍은 215 bp의 3' 79개 염기쌍과 동일하였으나, 서열의 나머지는 상이하였다. 그러나, 생성된 예견된 단백질 서열(113개의 추가의 아미노산 잔기)은 NH₂-말단에 예견된 시그날 펩타이드 서열을 갖지 않았다(SPScan, GCG 패키지). Incyte 데이터베이스로 부터의 서열과 함께 이후의 5' 레이스 실험으로부터 생성된 상이한 부분적 cDNA 서열이 비교되었고, 수개의 가능한 래트 GFRα-4 변이체에 합병되었다. 동정된 변이체중 어느 것이 현실적인지를 확인하기 위하여 프라이머를 5' 번역 출발 코돈(552 bp 레이스 단편으로부터 생성된 "긴" 5' 변이체용 프라이머 래트-GFRα4-sp4 및 래트-GFRα4-sp5 및 215 bp 레이스 단편으로부터 생성된 "짧은 5' 변이체용 래트-GFRα4-sp6) 및 3'의 번역 종료 코돈(래트-GFRα4-ap9 및 래트-GFRα4-ap10)과 함께 설계되었다. 이어서, 이들 프라이머들을 상이한 래트 조직으로부터 유래된 cDNA를 사용하여 완전 GFRα-4 코딩 서열을 증폭하기 위하여 사용하였다.

먼저 "긴" 5' 변이체를 코딩하는 서열을 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1M GC-MELtae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-sp4 및 레트-GFRα4-ap9, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 5 ㎕의 래트 심장, 뇌 또는 신장 Marathon Ready^TM cDNA를 함유하는 50㎕의 총 부피로 수행하였다. 샘플을 95℃에서 1 분간 가열하고, 최종 단계는 72℃에서 7분으로 하여 95℃에서 45초, 57℃에서 1분 및 72℃에서 1분간하는 사이클링을 35 사이클동안 수행하였다. 이어서 네스티드된 PCR 반응을 프라이머 래트-GFRα4-sp5 및 래트-GFRα4-ap10과 함께 1차 PCR 반응물상에 수행하였다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1 M GC-MELTae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-sp5 및 래트-GFRα4-ap10, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 1 ㎕의 1차 PCR 생성물을 함유하는 50㎕의 총부피로 수행하였다. 사이클링 을 35 대신에 30 PCR 사이클을 사용하는 것을 제외하고는 1차 PCR과 정확히 같은 파라미터를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 대략 1000 bp 내지 1250 bp 크기의 수개 단편을 겔로부터 절개하여, TOTO TA 클로닝을 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO에 클로닝시켰다. 수개 클론의 삽입물을 서열화했다. 이어서, "짧은" 5' 변이체를 코딩하는 서열을 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 반응을 1x GC cDNA PCR 반응 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1M GC-MELtae, 200 nM의 프라이머 래트-GFRα4-sp6 및 레트-GFRα4-ap9, 1㎕의 어드벤테이지 KlenTaq 폴리머라제 혼합물 및 5 ㎕의 래트 심장 Marathon Ready^TM cDNA를 함유하는 50㎕의 총 부피로 수행하였다. 샘플을 95℃에서 5 분간 가열하고, 최종 단계는 72℃에서 7분으로 하여 94℃에서 30초, 57℃에서 1분 및 72℃에서 30초하는 사이클링을 35 사이클동안 수행하였다. PCR 생성물을 1% 아가로즈 겔상에서 분석하였다. 대략 1500 bp 내지 2200 bp 크기의 수개 단편을 겔로부터 절개하여, TOTO TA 클로닝을 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO에 클로닝시켰다. 수개 클론의 삽입물을 서열화했다. 모든 얻어진 서열(16개의 생성된 클론이 완전히 서열화됐다)의 분석은 래트 GFRα-4 DNA 서열을 확인된 모든 변이체에 공통인 6개 서열 스트레치로 분리되게 하였으며, 5개의 게재 서열 스트레치는 변이체에 따라 존재되거나 결여되었다. 모든 5개의 게재 서열은 5' 및 3' 스플라이스 부위 콘센서스 부위(인트론 서열의 5' 말단에서 GT 및 3' 말단에서 AG)(Senapathy et al., 1990)(참조 하기 표 4)를 함유하며, 따라서 잠재적으로 스플라이스되지 않은 인트론을 나타낼 수 있다.

동정된 변이체가 특정 mRNA 전사물의 비스플라이된 인트론의 보존으로부터 생성될 수 있다는 가설을 강화하기 위하여, 래트 GFRα-4 서열을 인간 GFRα-1의 게놈 서열(Angrist et al., 1998)에 비교하였다. 이 분석으로부터, 모든 전사물에 공통인 GFRα-4 서열이 GFRα-1에 있는 엑손과 일치한다는 것이 명백해졌다(하기 표 4 참조). 일부 전사물중에 결여된 게재 서열은 인간 GFRα-1중의 인트론 서열과 일치하였다. 그러므로, 본 발명자들은 모든 게재 서열을 비스플라이스된 인트론으로 고려하였다. 엑손 5 및 엑손 6사이에 존재하는 인트론은 두개의 상이한 방법으로 스플라이스될 수있고, 변이체 A 및 변이체 B 라고 본 발명인들이 부르는 래트 GFRα-4의 두개의 상이한 스플라이스 변이체의 존재를 가져온다.

서열 5는 인트론 서열(인트론 1: bp 125 내지 684; 인트론 2: bp 1040 내지 1088; 인트론 3: bp 1199 내지 1278; 인트론 4: bp 1414 내지 2154; 인트론 5A: bp 2247 내지 2385 및 인트론 5B: bp 2231 내지 2314)을 포함하는 래트 GFRα-4에 대한 콘센서스 서열을 나타낸다. 폴리몰피즘이 서열 5에서 위치 2244에서 검출되었고, T는 서열화된 클론의 50%에서 C는 다른 50%에서 발견되었다. 이 폴리몰피즘은 GPI-앵커링에 포함되는 소수성 영역에서 W 내지 R의 단백질(변이체 A)에서 아미노산 변화에 이른다. 도 1은 도식적으로 인트론 서열의 스플라이싱후 스플라이스 변이체 A 및 B에 대해 유래된 cDNA와 함께 래트 GFRα-4 유전자의 구조 및 특성과 함께 변이체 A 및 B의 번역된 단백질 서열을 보여준다. 표 4는 동정된 인트론 및 엑손의 크기와 함께 인트론-엑손 경계에서 DNA 서열을 보여준다. 오른 쪽 컬럼은 인간 GFRα-1의 게놈 서열(Angrist et al., 1998)내의 상응하는 엑손의 크기를 보여 준다.

표 4: 래트 GFRα-4의 인트론-엑손 구조

인트론 1 내지 4 및 인트론 5A(서열 6; 변이체 A)를 제거하여 수득된 콘센서스 서열은 29.7 kDa의 계산된 분자량 및 8.92의 등전점을 갖는 273개 아미노산 잔기의 단백질(서열 8)로 번역된다. 인트론 1 내지 4 및 인트론 5B를 제거하여 수득된 콘센서스 서열(서열 7; 변이체 B)은 28.0 kDa의 계산된 분자량 및 8.91의 등전점을 갖는 258개 아미노산 잔기의 단백질(서열 9)로 번역된다. 도 2는 래트 GFRα-4의 변이체 A 및 B의 배열을 보여준다. 단백질 서열은 공지된 GFRα 서열과 유사하고, 오직 카복시-말단에서의 조그만 아미노산 스트레치에서 서로 다르다. 이들 두 서열은 아마도 생물학적으로 활성인 GFRα-변이체를 나타낸다. 서열화된 모든 다른 변이체는 하나이상의 인트론 서열을 함유하기 때문에, 이들은 아마도 RNA 가공의 중간체이다. 이들 모든 중간체가 정제된 mRNA로부터 유래된 cDNA에서 존재하는지 및 완전히 스플라이스된 mRNA 전사물로부터 유래된 cDNA 서열을 증폭하는 것이 어려운지 이유는 분명하지 않다. GFRα-1 내지 -4는 Asp, Cys, Ala, Ser, Gly 또는 Asn(Gerber et al., 1992)과 같은 세개의 조그만 아미노산 서열의 스트레 치를 함유하는 소수성 서열이 앞선 17-31개의 아미노산 잔기의 소수성 영역으로 구성되는 글리코실-포스파티딜 이노시톨(GPI)-앵커된 단백질의 전형인 COOH-말단 서열로 특징화된다. GFRα-4 변이체 A 단백질 서열은 두개의 가능한 GPI 절단 부위(위치 234 내지 236의 DSS 또는 250-252 위치의 NAG)가 앞선 21개 아미노산 잔기(위치 253 내지 273)의 소수성 카복시 말단을 갖는다. 변이체 B는 보다 짧은 소수성 카복시 말단을 가져, GPI-앵커링이 이 변이체에는 가능하지 않다는 것을 의미한다. 이는 변이체 B가 래트 GFRα-4 수용체의 가용성 형태란 것을 의미할 수 있다. 29개 아미노산의 예견된 시그날 펩타이드는 양 변이체(GCG 패키지; 스코어 7.0, 확률 1.171e-02에 포함된 SPScan 프로그램에 의해 결정된 바)에 존재한다. 또한, N-결합된 글리코실화를 위한 하나의 가능한 부위(단백질에서 위치 192 내지 194의 NVS)가 존재한다.

최근에, 마우스 GFRα-1 내지 -3 및 치킨 GFRα-4의 서열의 비교에 기초한 GFRα의 도메인 구조에 대한 모델이 제안되었다(Airaksinen et al., 1999). 모델은 보다 적게 보존된 어댑터 서열과 함께 결합된 3개의 보존된 시스테인-풍부 도메인을 포함한다. 분자는 GPI-앵커에 의해 막에 앵커링된다. 래트 GFRα-4는 제 2 및 제 3 시스테인-풍부 영역 및 가능한 GPI-앵커(적어도 변이체 A경우)를 또한 함유하기 때문에 이 모델에 부분적으로 일치한다. 그러나, 이는 첫번째 시스테인-풍부 영역이 결여되어 있다는 점에서 다른 GFRα와는 상당히 다르다. 도 3은 래트 GFRα-1(EMBL acc. no. U59486), 래트 GFRα-2(EMBL acc. no. AF003825), 마우스 GFRα-3(EMBL acc. no. AB008833) 및 치킨 GFRα-4(EMBL acc. no. AF045162)와 함께 래 트 GFRα-4 변이체 A 및 B의 배열을 보여준다. 배열은 ClustalW 배열 프로그램(EMBL, Heidelberg, Germany)을 사용하여 수행하였다. GFRα 패밀리의 구성원간의 일치성 퍼센트 및 유사성 퍼센트는 GeneDoc 소프트웨어 기구(qjwus 2.5.000)을 사용하여 서열의 페어와이즈(pairwise) 비교에 의해 계산하고, 그 결과는 하기 표 5에 나타낸다.

표 5: GFRα 패밀리의 구성원 사이의 일치성% 및 유사성%(괄호사이에). 분석에서 사용된 서열의 수탁번호는 명세서에 언급된다.

신경영양성 인자의 GDNF 패밀리의 네개 구성원은 지금까지 확인되었다(GDNF, NTN, PSP, EVN/ARTN). 공통의 트랜스막 티로신 키나제, cRET와 조합하여 특정한 GPI-연결된 GFRα수용체(GDNF 에 대해 GFRα-1, NTN에 대해 GFRα-2, EVN/ARTN에 대해 GFRα-3 및 PSP에 대해 (치킨) GFRα-4)에 대한 결합을 통한 모두 네개의 시그날. PSPM에 대한 공수용체인 GFRα-4는 치킨에서는 확인되었으나, 포유동물에서는 상대가 아직 밝혀지지 않았다.

본 출원에서 기술된 래트 GFRα-4와 치킨 GFRα-4사이의 유사성은 37%(27% 유사성)이어서, 래트 GFRα-4가 GFRα 패밀리의 신규한 구성원임을 제시한다. GFRα-4는 포유동물 포세핀 수용체일 수 있거나, 다르게는 비확인된 GDNF 패밀리 구성원에 대한 수용체일 수 있다.

GFRα-4에 대한 퍼세핀의 특이적 결합

가용성 GFRα-IgG-Fc 융합 단백질의 발현을 위한 구조물은 다음과 같이 만들어 졌다. 시그날 펩타이드를 코딩하는 서열 및 GPI-앵커링에 포함된 COOH-말단 소수성 영역을 코딩하는 서열을 제외한, 인간 GFRα-1, GFRα-2 및 GFRα-3, 치킨 GFRα-4 및 래트 GFRα-4 변이체 A(아미노산 잔기 27 내지 427, 20 내지 431, 28 내지 371, 20 내지 399 및 29 내지 252 각각)의 cDNA 영역을 발현 벡터 시그날 pIg 플러스(R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, (UK))에 인-프레임 클로닝시켰다. 모든 구조물의 삽입물을 완전한 DNA 서열 분석에 의해 확인하였다. 이들 구조물로부터 발현된 생성된 단백질은 17개의 아미노산 잔기 NH₂-말단 CD33 시그날 펩타이드, 각각의 GFRα 단백질 영역 및 243개 아미노산 잔기 COOH-말단 인간 IgG₁-Fc 융합 도메인을 함유한다. 융합 단백질을 CHO 세포에서 발현하고, 기술된 바와 같이 정제하였다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 10% 가열 불활성화된 소 태아 혈청이 보충된 DMEM/F12 배지에서 일상적으로 배양하였다. 세포를 최적화된 Lipofectamine Plus 방법을 사용하여 GFRα-IgGFc 융합 구조물로 형질감염시켰다(transfected). 이를 위해, 총량 6.5 ㎍의 DNA를 750㎕의 혈청이 없는 배지중의 17.5 ㎕ PLUS 시약과 함께 실온에서 15분동안 인큐베이션하였다. Lipofectamine을 50배 희석시켜 혈청 없는 배양 배지에 넣고, 이 혼합물의 750㎕를 DNA 용액에 첨가하였다. 실온에서 15분간 인큐베이션후, 3.5 ml의 혈청 없는 배지를 첨가하며, 혼합물을 세포에 넣었다(100 mm 페트리디쉬). 세포를 5% CO₂에서 37℃에서 3시간동안 인큐베이션시키 고, 그후, 20% 가열 불활성화된 소 태아 혈청을 함유하는 배양 배지 5 ml를 첨가하였다. 24시간후, 배지를 정규 배양 배지로 교체했다. 이 최적화된 조건을 사용한 형질감염 효율은 전형적으로 50-60%이었다. 영속적인 형질감염 경우, 선택 배지는 800㎍ G418 또는 800㎍ G418 및 800㎍의 히그로마이신을 함유했다. 항생제 내성 클론을 성장하게 하고, 특이적 항체를 사용하여 발현에 대해 분석하였다. GFRα-IgGFc 융합 단백질을 영속적으로 또는 일시적으로 형질감염된 CHO 세포의 배지로부터 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 결합된 단백질을 0.1 M Na-시트레이트, pH 3.0으로 용출시키고 1 M 트리스 버퍼, pH 8.4(희석 비 1:6)에 모았다. 단백질 농도를 1.5의 구별 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정하였다. 표면 플래즈몬 공명(SPR) 실험을 BIACORE 3000 인스트러먼트(Biocore AB, Uppsala, Sweden)을 사용하여 25℃에서 수행하였다. 센서 칩 CM5, 아미노 커플링 키트 및 사용된 버퍼를 Biacore AB로부터 또한 수득하였다. 재조합체 PSP, NTN, EVN/ART 및 GDNF를 고정화된 리간드로서 사용하였다. 재조합체 인간 GDNF는 R&D Systems Europe Ltd.(Abingdon, UK)로부터 입수하였다. NH₂-말단 6His-태그된 재조합체 인간 NTN, 래트 PSP 및 인간 EVN/ART를 앞서 기술된바와 같이(Creedon et al., 1997) 이.콜라이에서 생산하였다. CM5 센서 칩의 카복실화 매트릭스를 먼저 400 mM N-에틸-N'-(3- 디메틸아미노프로필)-카보디이미드 및 100 mM의 N-하이드록시-숙신이미드의 1:1 혼합물로 10분동안 활성화시켰다. 재조합체 신경 영향성 인자를 5㎕/분의 유동 속도로 10 mM 소듐 아세테이트 버퍼, pH 4.5중의 활성화된 표 면에 가하였다. 비반응된 카복실 그룹은 1 M 에탄올아민-HCl로 블로킹시켰다. 결합 실험을 위하여, 가용성 GFRα-IgGFc 융합 단백질을 30 ㎕/분으로 kinject 프로그램을 사용하여 초융합시켰다. kinetic 실험에서 사용된 GFRα-IgGFc의 농도는 Hepes 버퍼된 염수중(150 mM Nacl, 3.5 mM EDTA 소듐 염, 0.005% 폴리소르베이트 20, 10 mM Hepes, pH 7.4)중에서 1 내지 100 nM이었다. 고정화된 리간드에 대한 GFRα 수용체의 결합을 3분동안 모니터링하고, 1 분동안 분리하며, 10 mM 글리신 버퍼로 재생시켰다. 분리는 Hepes 버퍼된 염수로 초융합하여 개시하였다. 센서 데이터의 질을 개선하기 위하여, 이중 참조를 사용하였다(Myszka, 1999). 데이터를 BIACORE 평가 소트웨어(버젼 3.0.1)를 사용한 글로벌 분석을 사용하여 분석하였다. 글로벌 분석은 결합률(K_a) 및 분리율(K_d)을 동시에 계산하고, 겉보기 평형 분리 상수(K_D)은 이어서 k_d/k_a으로 계산된다. 간단한 1:1 Langmuir 모델을 데이터를 적합하게 하는데에 사용하였다. PSP에 대한 특이적 결합은 래트 및 치킨 GFRα-4-IgGFc 융합 단백질로 검출될 수 있다. GFRα4-IgGFc의 관찰된 결합은 GDNF, NTN 또는 EVN/ART에 결합하지 않기 때문에 특이적이다. 대조 실험은 GDNF에 대한 GFRα-1의 결합, NTN에 대한 GFRα-2의 결합 및 EVN/ART에 대한 GFRα-3의 결합을 확인하였다. 래트 및 치킨 GFRα-4-IgGFc의 다른 농도에서의 세 개의 결정을 사용하여 얻어진 결합 곡선으로부터, 결합 상수 k_a( 결합률) 및 k_d(분리율)를 유도하였다(표 6).

표 6: 치킨 GFRα-4 및 래트 GFRα-4에 대한 퍼세핀 결합

SPR에 의해 결정된 고정화된 퍼세핀에 결합하는 치킨 GFRα-4-IgGFc 및 래트 GFRα-4-IgGFc에 대한 결합 상수. 평균 결합률(k_a), 분리율(k_d) 및 겉보기 평형 분리상수(K_D)±표준 에러를 각각의 가용성 수용체의 상이한 농도에서 3개의 결정을 사용하여 얻어진 결합 곡선으로부터 유도하였다.

겉보기 K_D값은 양 융합 단백질 경우 매우 유사했지만, R_MAX 값은 상당히 달랐다. ∼1000 상대 유니트(RU)의 결합 수준을 치킨 GFRα-4-IgGFc경우 일상적으로 수득하였고, 반면에, 래트 GFRα4-IgGFc의 결합 수준은 대략 20배 낮은 50-60 RU 주변이었다. 이는 활성 치킨 GFRα-4-IgGFc 및 래트 GFRα-4-IgGFc 융합 단백질의 농도에서의 차이에 기인할 수 있다. 5.9±2.8 nM(n=3)의 계산된 평형 분리 상수 K_D는 래트 GFRα-4가 퍼세핀에 특이적인 수용체임을 제시한다.

노던 블랏 분석

상이한 설치류 조직으로부터 유래된 2 ㎍의 폴리(A)-풍부 RNA를 함유하는 노던 블랏(마우스 MTN^TM 블랏, 마우스 배아 MTN^TM 블랏 및 래트 MTN^TM 블랏; Clontech Laboratories)을 제조자의 지시에 따라 래트 GFRα-4 코딩 서열로부터 (서열 번호 6에서 처럼)으로부터 유래된 α-[³²P]-dCTP 랜덤-프라이밍 표지된 (HighPrime kit, Roche Diagnostic) 948 bp 단편으로 혼성화시켰다. 엄격한 세척을 50℃(두개의 마우스 블랏) 또는 55℃(래트 블랏)에서 0.1x SSC/0.1% SDS중에서 수행하였다. 결과를 도 4에 나타냈다. 래트에서, 매우 약한 시그날이 심장, 뇌, 간 및 고환에서 2.3 kb 주위에서 검출할 수 있었다. 보다 약한 제 2 전사물이 동일한 조직에서 1.4 kb 주위에서 존재하였다. 마우스에서, 1.35 kb 전사물이 뇌 및 고환에서 가장 강렬하였고, 매우 약한 시그날이 2 kb 주위에 존재했다. 1.35 kb 전사물의 매우 낮은 mRNA 발현이 또한 15일 및 17일 마우스 배아에서 또한 존재하였다. 보다 작은 전사물의 크기는 GFRα-4 코딩 서열의 예견된 크기(±880 bp + 570 bp의 3' 비번역된 영역)와 일치한다.

래트, 마우스 및 인간 GFRα-4의 크로모좀 위치화

0.95 kb 래트 GFRα-4 cDNA 단편(변이체 A의 완전 래트 GFRα-4 코딩 서열을 함유하는) 및 래트 GFRα-4 게놈 서열에 상응하는 2.3 kb 단편(서열 번호 5 참조)을 래트 크로모좀에 대한 형광 즉석 혼성화(FISH) 분석에서 프로브로서 사용하였다. 이들 프로브는 부분적으로 겹쳤다. 두 개 프로브의 혼합물(1 ㎕의 총 DNA)을 닉(nick) 번역(Life Technologies)에 의해 디곡시게닌-11-dUTP(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)으로 표지화하여 200-400 bp 크기의 최종 프로브 단편을 만들었다. 표지된 프로브를 혼성화 버퍼(50% 포름아미드, 2x SSC, 10% 덱스트란 설페이트)와 혼합했다. 변성후, 혼합물을 70% 포름아미드, 2x SSC중에서 72℃에서 2분간 변성된 메타페이즈 래트 크로모좀 슬라이드(Islam and Levan, 1987, Helou et al., 1998)상에 위치시켰다. 37℃에서 48시간 혼성화후, 제조물을 50% 포름아미드, 2x SSC중에서 15분간 세척했다. 표지된 크로모좀의 검출을 표준 FITC 항-디곡시게닌에 의해 수행하였다. 크로모좀 스프레드를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 카운터스테이닝하였다. 결과가 100개의 상이한 세포의 현미경 사진으로부터 유도됐다. 프로브의 작은 크기 때문에, 상당한 배경이 있었다. 가장 잘 연구된 세포가 위치 RNO3q36(도 5)에서 표지를 나타냈다. 메타페이즈 연구의 약 35%가 RNO3의 상동체에서 "이중 스폿" 표지를 나타내고, 반면에, 약 50%가 상동체의 오직 하나 또는 양 상동체상의 "단일 스폿" 표지에서 이중 스폿을 가졌다. 다른 크로모좀 부위는 수개의 세포에서 표지를 나타내지 않았다. 비교 맵핑에 기초하여, 상응하는 마우스 위치가 MMU2(밴드 F)에 위치할 것으로 기대되었고, 유전자에 대한 가능한 인간 위치는 HSA2, HSA15 또는 HSA20이다. 이와 일치하여, EMBL 데이터베이스(마우스에 대해 수탁 번호 AF155960 및 인간에 대해 AC017113)가 각각 마우스 크로모좀 2(BAC 클론 389B9) 및 인간 크로모좀 2(EMBL 수탁번호 AC013324; BAC388 K 24map2)로부터 유도되었다.

약어의 목록

ARTN 아르메틴

BLAST 기초 국부적 배열 서치 기구

bp 염기쌍

cDNA 상보적 DNA

CNS 중추 신경계

EST 발현된 서열 태그(tag)

GDNF 신경교(glial) 세포주 유래된 신경영양성 인자

GFRα GDNF 패밀리 수용체 α

GPI 글리코실 포스파티딜 이노시톨

NTN 뉴르투린

PCR 폴리머라제 연쇄 반응

PNS 말초 신경계

PSP 퍼스핀

SSP 가장작은 합계 확률

TGF-β 형질전환 성장 인자 β

<110> Janssen Pharmaceutica N.V. et al <120> Neurotrophic Factor Receptor <130> 53202/001 <140> PCT/EP00/04918 <141> 2000-05-26 <150> GB 9915200.1 <151> 1999-05-29 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 792 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 gtgcgccgag cgccggcgcc agactttcgc gcccgcctgc gcgttctccg gcccggggtt 60 ggtgccgccc tcttgcctgg agcccctgga gcgctgcgag cgcagccgcc tgtgccggtg 120 cgtgcgtgcg gggcgggctg ggccgctcac ccgcgtccgg gcgcgcgcag gccccgtctc 180 cttgccttcc aggcctcatg cgctcccgcg cccggctccc gcgaccgctg cccggaggag 240 gggggcccgc gttgtctgcg cgtctacgca ggcctcatgg gcaccgtggt cacccccaac 300 tacctggaca acgtgagcgc gcgcgttgcg ccctggtgcg gctgtgcggc cagtggaaac 360 cggcgcgaag aatgcgaagc cttccgcaag ctctttacaa ggaacccctg cttgggtgag 420 ggggcctgga ggtcccgggg aaccacggat gtctgtggcc caatccaagc tgcctggccc 480 gtgggtctta tttacgtcgc atcatgtttg gtgtgggcga tggacaatgt gcacatgcca 540 tggtacgtgg gtggaagtca agcgttaaaa cgtgtccaat ggnctggaag ttggccttcc 600 ttttgacact natggggtgg gcctttcttc atggtgngcc 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Ala Cys Ala Glu Arg Arg Arg 100 105 110 Gln Thr Phe Ala Pro Ala Cys Ala Phe Ser Gly Pro Gln Leu Ala Pro 115 120 125 Pro Ser Cys Leu Lys Pro Leu Asp Arg Cys Glu Arg Ser Arg Arg Cys 130 135 140 Arg Pro Arg Leu Phe Ala Phe Gln Ala Ser Cys Ala Pro Ala Pro Gly 145 150 155 160 Ser Arg Asp Gly Cys Pro Glu Glu Gly Gly Pro Arg Cys Leu Arg Ala 165 170 175 Tyr Ala Gly Leu Val Gly Thr Val Val Thr Pro Asn Tyr Leu Asp Asn 180 185 190 Val Ser Ala Arg Val Ala Pro Trp Cys Gly Cys Glu Ala Ser Gly Asn 195 200 205 Arg Arg Glu Glu Cys Glu Ala Phe Arg Lys Leu Phe Thr Arg Asn Pro 210 215 220 Cys Leu Asp Gly Ala Ile Gln Ala Phe Asp Ser Ser Gln Pro Ser Val 225 230 235 240 Leu Gln Asp Gln Trp Asn Pro Tyr Gln Asn Ala Gly Cys Cys Phe Leu 245 250 255 Trp Val Ser Ser Met Ser Ile Leu Thr Ala Leu Ala Leu Gln Ala Leu 260 265 270 Leu <210> 9 <211> 258 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 9 Met Leu Ser Gly Ala Tyr Leu Arg Val Leu Asn Glu Arg Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Val Leu Trp Ser Leu Gly Cys Gln Arg Gly Ser Ala Ser 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240 Leu Gln Asp Gln Trp Asn Pro Tyr Gln Asn Ala Gly Gln Ala Lys Val 245 250 255 Glu Ala

Claims

서열 번호 5, 6 또는 7에 나타낸 서열을 갖는 포유동물 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 (GDNF) 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)를 코딩하는 핵산 분자.
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제 1 항에 있어서, 서열 번호 8 또는 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 포유동물 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)를 코딩하는 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, DNA 분자인 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 상기 DNA 분자가 cDNA 분자인 핵산 분자.
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제 1 항에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 단리된 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4).
제 1 항 또는 제 3 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 DNA 발현 벡터.
제 9 항에 따른 벡터로 형질전환 또는 형질감염된(transfected) 숙주 세포.
제 10 항에 있어서, 진핵세포인 숙주 세포.
제 10 항에 있어서, 포유동물 세포인 숙주 세포.
제 12 항에 있어서, 인간 배아 신장 세포 HEK293 또는 Cos-7 세포인 숙주 세포.
제1항 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한항에 따른 핵산 분자를 포함하는 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 단백질을 발현할 수 있는 트랜스진을 포함하는 인간을 제외한 트랜스제닉 세포, 조직 또는 유기체.
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서열 번호 8 또는 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단리된 포유동물 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4).
약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제1항 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한항에 따른 핵산 분자를 포함하는,

신경퇴화성 질병, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 모터 뉴론 질병, 말초 신경 장해, 척추 손상, 가계 히르쉬스프렁(hirschsprung) 병 또는 암(carcinoma)을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제 21 항에 따른 수용체를 포함하는,

신경퇴화성 질병, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 모터 뉴론 질병, 말초 신경 장해, 척추 손상, 가계 히르쉬스프렁(hirschsprung) 병 또는 암(carcinoma)을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
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제 8 항 또는 제 21 항에 따른 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)를 발현하는 세포를 시험하려는 화합물과 접촉시키고; 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 매개된 기능적 또는 생물학적 반응의 수준을 모니터링하는 것을 포함하는, 화합물이 제 8 항 또는 제 21 항에 따른 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)에 관련하여 작용제 또는 길항제인지를 결정하는 방법.
제 26 항에 있어서, 상기 세포가 제 10항에 따른 세포인 방법.
제 26 항에 있어서, 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 매개된 기능적 또는 생물학적 반응이 상기 세포에서 인산화의 수준을 포함하는 방법.
제 8 항 또는 제 21 항에 따른 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)를 발현하는 세포의 막 제조물을 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)가 성분인 신호 전달 경로에서 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)와 상호반응하는 형질감염 중 재배열된 프로토-온코진 아이소형 c (rearranged during transfection proto-oncogene isoform c; cRET)의 존재하에서 화합물과 접촉시키고; 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)와 형질감염 중 재배열된 프로토-온코진 아이소형 c (cRET)의 상호반응의 수준을 모니터링하는 것을 포함하는, 화합물이 제 8 항 또는 제 21 항에 따른 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)와 관련하여 작용제, 길항제 또는 리간드인지를 결정하는 방법.
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서열 번호 8 또는 9에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 단백질에 특이적인 항체.
약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제 36 항에 따른 항체를 포함하는,

신경퇴화성 질병, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 모터 뉴론 질병, 말초 신경 장해, 척추 손상, 가계 히르쉬스프렁(hirschsprung) 병 또는 암(carcinoma)을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제 8 항 또는 제 21 항에 따른 수용체를 세포 추출물 또는 시험하려는 화합물과 접촉시키고; 수용체에 결합된 어느 분자를 단리하는 것을 포함하는, 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 단백질에 대한 리간드를 동정하는 방법.
제 10 항에 따른 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)를 발현하는 세포를 화합물과 접촉시키고; 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 매개된 기능적 또는 생물학적 반응의 수준을 모니터링하는 것을 포함하는, 화합물이 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)에 대한 리간드인지를 결정하는 방법.
제 39 항에 있어서, 상기 세포내의 인산화 수준을 모니터링하는 것을 포함하는 방법.
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제 10 항에 따른 세포; 상기 세포를 화합물과 접촉시키기 위한 수단; 및 상기 세포에서 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 매개된 기능적 또는 생물학적 반응의 수준을 모니터링하는 수단을 포함하는 화합물이 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)의 작용제 또는 길항제인지를 결정하는 키트.
제 43 항에 있어서, 상기 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 매개된 기능적 또는 생물학적 반응이 상기 세포에서 인산화의 수준을 포함하는 키트.
제 1 항 또는 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 프로브 및 시험하고자 하는 생물학적 물질을 상기 프로브와 접촉시키기 위한 수단을 포함하는 진단학적 키트.
제 10 항에 따른 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)를 발현하는 세포로부터의 막 제조물; 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)가 성분인 신호 전달 경로에 포함된 형질감염 중 재배열된 프로토-온코진 아이소형 c (cRET)의 존재하에서 상기 조제물과 상기 화합물을 접촉시키기 위한 수단; 및 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4)와 형질감염 중 재배열된 프로토-온코진 아이소형 c (cRET) 사이의 상호반응을 측정하기 위한 수단을 포함하는 화합물이 신경교 세포-유래된 신경영양성 인자 패밀리 수용체 α-4 (GFRα-4) 단백질의 리간드인지를 결정하기 위한 키트.