KR20070085342A - ｖＷＦＡ 및/또는 ＡＮＴ_ＩＧ 도메인 보유 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 본 빌리브란트 인자 A(von Willebrand factor A, vWFA)와 비탈저 수용체 세포외(Anthrax receptor extracellular, ANT_IG) 도메인을 보유하는 비탈저 수용체-유사 단백질(anthrax receptor-like protein)로서 확인된 신규한 단백질(INSP141, INSP142, INSP143, INSP144); 질병의 진단, 예방, 치료에서 이들 단백질 및 인코딩 유전자로부터 핵산 서열의 용도에 관계한다.
비탈저 수용체-유사 단백질

Description

ｖＷＦＡ 및/또는 ＡＮＴ_ＩＧ 도메인 보유 단백질{vWFA and/or ANT_IG domain containing proteins}
본 발명은 본 빌리브란트 인자 A(von Willebrand factor A, vWFA)와 비탈저 수용체 세포외(Anthrax receptor extracellular, ANT_IG) 도메인을 보유하는 비탈저 수용체-유사 단백질(anthrax receptor-like protein)로서 확인된 신규한 단백질(INSP141, INSP142, INSP143, INSP144); 질병의 진단, 예방, 치료에서 이들 단백질 및 인코딩 유전자로부터 핵산 서열의 용도에 관계한다.
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 참고문헌으로 첨부된다.
약제 개발 과정은 기능적 유전체학 시대가 도래함에 따라 근본적인 혁명 과정을 겪고 있다. “기능적 유전체학”이란 관심이 있는 단백질 서열에 기능을 부여하기 위해 생체 정보 도구를 이용하는 접근 방법에 적용된다. 이런 도구는 서열 데이터를 만드는 속도가 단백질 서열에 기능을 부여하는 연구실의 능력을 너무 빨리 앞지르기 때문에 그 필요성이 점차 증가되고 있다.
생체 정보 도구는 잠재력 및 정확도에서 증진됨에 따라, 생화학적 특성화의 통상적인 기술을 신속하게 대체되고 있다. 실제로, 본 발명을 확인하는데 이용되는 진보된 생체정보학 도구는 더욱 높은 신뢰도를 부여할 수 있는 결과를 산출할 수 있다.
다양한 연구 기관 및 상업 조직에서는 그들이 이용할 수 있는 서열을 검사하고 있는데, 진행 단계에서 상당한 발견이 이루어지고 있다. 하지만, 연구 및 약제 개발의 목적으로 유전자 및 이들이 인코딩하는 폴리펩티드를 확인하고 더욱 특성화하는 작업이 지속적으로 요구된다.
도입
비탈저 독소 수용체(anthrax toxin receptor)
비탈저(anthrax)는 일차적으로, 가축과 야생 동물, 특히, 초식 동물(herbivorous animal), 예를 들면, 소, 양, 말, 노새, 염소의 질병이다. 인간은 수육, 뼈, 가죽, 털, 배설물을 비롯한 병든 동물과 접촉하는 경우에 우발적으로 감염된다.
비탈저 독소의 한가지 구성요소는 지금 시점에서 이해되지 않는 치명적인 작용 양식을 나타낸다. 폐사는 산소 고갈, 2차 쇼크, 증가된 혈관 투과성, 호흡 부전, 심장 마비에 명백하게 기인한다. 인간이나 동물에서 비탈저로 인한 사망은 주로, 갑작스럽고 예상치 않게 발생한다. 순환하는 상기 치명적 독소의 수준이 상기 질환의 후기에서 급격하게 증가하고, 혈액에서 생물체의 농도에 밀접하게 대응한다.
3부분 독소, 비탈저 독소는 비탈저의 원인 병원체인 탄저균(Bacillus anthracis)에 의해 생산된다. 이는 세균이 면역계를 회피하는데 도움을 주고 전신 감염 동안 숙주를 폐사시킬 수 있다. 상기 독소는 3가지 단백질: 보호 항원(PA)(단일 수용체-결합 모이어티) 및 부종 인자(edema factor, EF)와 치사 인자(lethal factor, LF)라고 하는 2가지 효소 모이어티로 구성된다. 이들 단백질이 무독성 분자로서 상기 세균으로부터 방출되면, 이들은 포유동물 세포의 표면으로 이동하고 독성의 세포-결합된 복합체로 조합된다(Mourez M. et al., Nat. Biotechnol. 2001, 19, 958961).
상기 독소의 2가지 구성요소는 포유동물 세포의 세포질 내에서 기질을 효소적으로 변화시킨다: 부종 인자(EF)는 호중구 기능을 억제하고 숙주 내성(host resistance)을 손상시키는 것을 비롯한 다양한 기전을 통하여 숙주 방어를 무력화시키는 아데닐레이트 시클라아제(adenylate cyclase)이다. 치사 인자(LF)는 유사분열원-활성화된 단백질 키나아제를 절단하고 대식세포의 용해를 유도하는 아연-의존성 프로테아제이다. 세 번째 구성요소, 보호 항원(PA)은 세포 수용체에 결합하고 이들 효소 구성요소의 세포질로의 전달을 매개한다(Leppla SH. Anthrax toxin, In Aktories K, Just I, editors. Handbook of experimental pharmacology. Berlin: Springer; 2000, pp.447-72).
비탈저 독소 수용체(ATR)는 종양 내피 마커(tumor endothelial marker 8, TEM8) 유전자에 의해 인코딩된다. 비탈저 독소는 중독의 첫 번째 단계를 수행하기 위하여 TEM8 유전자의 단백질 산물을 이용한다. ATR의 실제 생리 기능은 아직 밝혀지지 않았지만, TEM8 유전자가 결장직장암에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다(St Croix B. et al (2000) Science Aug 18;289(5482):1197-1202). TEM8 전사는 혈관신 생(angiogenesis) 동안에도 상향 조절된다. 생쥐 종양 내피 마커 8(mTEM8) 유전자에 대한 연구 결과는 mTEM8이 신혈관생성(neovascularization)에 관여한다는 것을 암시한다(Carson-Walter E. et al. (2001) Cancer Res. Sep 15;61(18):6649-55).
인간 모세 형태발생 단백질 2(capillary morphogenesis protein 2, CMG2)는 ATR과 유사한 도메인 조직을 보유하는데, 양 서열은 전장에서 40% 서열 동일성(sequence identity)을 공유한다. 실험적으로, CMG2는 비탈저 독소의 PA 아단위에 결합하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 CMG2가 ATR과 유사한 방식으로 이용된다는 것을 암시한다(Scobie H.M. et al (2003) Proc Natl Acad Sci USA. Apr29; 100(9): 5170-4). CMG2의 실제 생리 기능은 아직 밝혀지지 않았지만, CMG2의 재조합 형태가 IV형 콜라겐과 라미닌(laminin)에 결합하는 것으로 밝혀졌다(BellS. et al. (2001) J Cell Sci. Aug; 114(Pt15): 2755-73).
비탈저 수용체 세포외 도메인(anthrax receptor extracellular domain, ANT_IG)은 비탈저 수용체의 추정된 세포외 N-말단 절반에서 발견된다. 다른 비탈저 수용체 도메인은 세포내 부분에서 발견되고, ANT_C로서 지칭된다. 이는 아마도, Ig 대과(superfamily)의 일부이고, IPT/TIG 도메인과 가장 밀접하게 관련된다. IPT/TIG 집단은 면역글로불린 유사 접힘(fold)을 보유하는 도메인으로 구성된다. 이들 도메인은 Met와 Ron과 같은 세포 표면 수용체 및 DNA 결합에 관여하는 세포내 전사 인자에서 발견된다. Ron 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 수용체는 대과의 다른 구성원(Met와 Sea)과 독특한 기능적 특징: 세포 분리(cell dissociation)의 제어, 운동성(motility), 세포외 기질(extracellular matrix)의 침입(살포)을 공유 한다.
ATR의 한가지 현저한 특징은 인테그린(I) 도메인으로 알려져 있는 세포외 본 빌리브란트 인자 A(vWFA) 도메인이다. vWFA 도메인은 대부분의 대형 세포외 단백질에서 발견된다. 이들 단백질의 실례는 보체 단백질 인자 B(complement protein factor B, FB), C2, CR3과 CR4, 인테그린(integrin)과 콜라겐 타입 VI, VII, XII XIV(Perkins SJ et al, (1994) J Mol Biol.Apr 22;238(1): 104-19)와 비탈저 독소 수용체(Bradley K. et al (2003) Biochem Pharmacol. Feb 1; 65(3): 309-14) 등이다. vWFA 도메인 보유 단백질과 연관된 기능에는 세포외 기질의 구성요소로서 기능, 지혈(hemostasis), 세포 유착(cellulara dhesion), 면역 방어 기전 등이다(Colombatti A. et al (1993) Matrix. Jul; 13(4): 297-306).
인테그린 종류의 단백질에서 발견되는 vWFA 도메인은 인테그린 I 도메인이라 한다(Roland A et al. (2003) J. Biol. Chem. Apr 25; 278(17) 15035-15039). 비탈저 독소의 PA 아단위는 자연 기질에 인테그린의 결합을 최소화시키는 것으로 보이는 방식으로 ATR vWFA 도메인에 직접적으로 결합한다. 이러한 도메인의 가용성 형태는 세포 배양에서 효과적인 세포외 비탈저 항독소로서 기능하는 것으로 밝혀졌다(Bradley K. et al (2003) Biochem Pharmacol. Feb1; 65(3): 309-14).
대부분의 vWFA 도메인 보유 단백질에 공통된 모티프는 금속 이온-의존성 부착 부위(Metal Ion-Dependent Adhesion Site, MIDAS)이다. MIDAS 모티프는 양이온(가령, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Ca2+) 배위(coordination)에 관여하고 5개 잔기, Asp-x- Ser-x-Ser, Thr, Asp로 구성된다(Scobie H. M. et al (2003) Proc Natl Acad Sci USA. Apr 29; 100(9): 5170-4). ATR/TEM8의 세포외 vWFA 도메인 내에 위치한 MIDAS 모티프는 PA 결합에 중요한 이가 양이온을 킬레이트화시킨다.
ATR의 가용성 vWFA 도메인(sATR)은 배양 중인 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 비탈저 중독을 차단하는 기능을 하는 것으로 밝혀졌다(Bradley et al. Nature 2001;414:225-9; WO 04/052277과 WO 02/46228).
Bradley 등은 암, 특히, 내피 종양, 결장직장암, 방광암, 식도암, 폐암, 흑색종에서 ATR/TEM8/CMG2의 관여를 세밀히 조사하였다(Bradley et al. Biochemical Pharmacology 2003.Vol.65.pp.309-314).
ATR/TEM8에 대한 안티센스 핵산은 비탈저 감염 및 암을 치료하는 것으로 제안되었다(WO 04/013313과 WO 04/052277).
ATR/TEM8/CMG2는 혈관신생에서 자연적인 역할을 하는 것으로 제안되었다(참조: Nanda and St.Croix, Current Opinion in Oncology 2004.Vol.16.pp.44-49). TEM8의 세포외 도메인은 COOH-말단 C5 도메인을 통하여 콜라겐 VI의 α3 아단위에 결합하는 것으로 밝혀졌다(Nanda et al., Cancer Research 2004. Vol. 64. pp.817-820). PA는 ATR 결합을 위하여 콜라겐 아단위와 경쟁할 수도 있다. Nanda 등은 TEM8/C5 상호작용이 종양 혈관신생에서 중요한 역할을 한다고 제안한다.
CMG2 유전자(특히, vWFA 도메인) 내에서 돌연변이는 2가지 대립형질 질환(allelic disorder), 연소성 유리질 섬유종증(juvenile hyaline fibromatosis, JFH)과 유아 전신 유리질증(infantile systemic hyalinosis, ISH)을 유발한다(Lacy et al. PNAS 2004. Vol.101. No.17. pp.6367-6372).
이에 더하여, 다양한 단백질의 vWFA 도메인 내에서 미스센스 돌연변이(missense mutation)는 인간 질환을 유발한다. 본 빌리브란트 인자 전구체(Von Willebrand factor precursor, vWF)의 돌연변이는 본 빌리브란트(von Willebrand) 병과 연관한다(OMIM Acc. No. 193400). 콜라겐 알파 3(VI) 사슬 전구체의 돌연변이는 Bethlem 근병증(Bethlem myopathy)(OMIM Acc. Nos. 120250과 158810)과 연관한다. 콜라겐 알파 1(VII) 사슬 전구체(장쇄 콜라겐)(LC 콜라겐)의 돌연변이는 이영양성 표피 수포증과 연관한다(epidermolysis bullosa dystrophica)(dominant, OMIM Acc. No. 120120; recessive, OMIM Acc. No. 131750; pretibial, dominant and recessive OMIM Acc. No. 226600 and OMIM Acc. No. 131850).
A형 도메인의 하나이상의 사본을 보유하는 특정 단백질은 숙주 방어 기전, 예를 들면, 면역 반응과 염증에 참여한다(참조: Celikel et al., Nature Structural Biology 5: 189 (1998)).
WO 92/17192에서는 혈전증을 치료 또는 저해하는데 효과적이고, 야생형 성숙 본 빌리브란트 인자(vWF) 아단위의 단편을 모방한 단량체 폴리펩티드를 함유하는 치료 조성물을 기술한다. WO 04/062551은 혈소판-매개된 응집의 조절을 요하는 질환의 진단 및/또는 치료를 위한, vWF, vWF A1 도메인, 활성화된 vWF의 A1 도메인, vWF A3 도메인, gbIb 및/또는 콜라겐, 이들 폴리펩티드의 동족체 및/또는 기능적 일부분에 대한 적어도 하나의 단일 도메인 항체를 포함하는 폴리펩티드에 관계한다.
이런 이유로, vWFA 도메인과 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 특히, ATR-유사 단백질에 관한 지식은 앞서 언급된 질병 상태(disease state) 및 연관된 질병 상태를 유발하는 기초 경로의 이해를 증진하고, 이들 질환을 치료하는데 더욱 효과적인 유전자 및/또는 치료제를 개발하는데 극히 중요하다.
본 발명은 본 명세서에서 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144로 지칭되는 단백질이 비탈저 독소 수용체와 상동성(homology)을 공유하는, 동일한 서열의 절단접합 변이체라는 발견에 기초한다. 특히, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는, INSP142가 결장과 회장 IBD 생검 샘플 및 건선 피부 생검에서 예상치 않게 제한된 발현을 나타낸다는 놀라운 관찰 결과에 기초한다. Taqman 분석으로부터 발현 결과는 염증성 장 질환, 피부 질환, 염증에서 INSP142의 관여를 암시하는 특이적인 발현 패턴을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 이들의 인코딩 폴리뉴클레오티드를 특징짓는 이와 같은 놀라운 특성으로 인하여, 이들은 약제 또는 제약학적 조성물의 제조에 특히 적합하다.
INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 모두 본 빌리브란트 인자 A(vWFA) 도메인과 비탈저 수용체 세포외(ANT_IG) 도메인을 보유할 것으로 예측된다. 이들 2가지 세포외 도메인은 비탈저 독소 수용체(ATR)-유사 단백질의 수용체 결합 특성을 공여한다. 도 8과 9에서는 구조 수준과 아미노산 수준에서, INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 단백질과 ATR-유사 단백질의 보존된 특징을 보여준다. vWFA 도메인은 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144에서 동일하다. INSP141 단백질에서 ANT_IG 도메인은 INSP142, INSP143, INSP144에서 ANT_IG 도메인과 약간 상이하다.
INSP141과 INSP142는 막통과 영역(transmembrane region)을 보유하지 않는 분비 단백질인 것으로 예측된다.
INSP143과 INSP144는 신호 펩티드와 막통과 영역을 보유하는 것으로 예측된다. INSP143과 INSP144 둘 모두에서, N-말단은 세포외 존재하고 C-말단은 세포내 존재하는 것으로 예측된다.
본 발명의 제 1 특징의 한 구체예에서,
(i) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:1O, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:146 및/또는 SEQ ID NO:148에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드;
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드가 제시된다.
적절하게는, 본 발명의 제 1 특징에 따른 폴리펩티드는
(i) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:128 및/또는 SEQ ID NO:132에 열거된 아미노산 서열을 포함하고;
(ii) vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하고; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물이다.
본 발명의 이러한 특징에 따른 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:146 및/또는 SEQ ID NO:148에 열거된 서열 중에서 하나로 구성된다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드는 히스티딘 태그를 추가로 포함할 수 있다. 적절하게는, 히스티딘 태그는 폴리펩티드의 C-말단에서 관찰된다. 적절하게는, 히스티딘 태그는 1-10개의 히스티딘 잔기(가령, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 잔기)를 포함한다. 더욱 적절하게는, 히스티딘 태그는 6개의 히스티딘 잔기를 포함한다.
SEQ ID NO:2에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 1 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:4에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 2 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:6에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 3 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:8에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 4 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:10에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 5 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:12에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 6 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:14에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 7 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:16에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 8 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:18에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 9 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:20에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 10 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:22에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 엑손 11 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:24에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP141 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:128에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 INSP141 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:130에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 히스티딘 태그 INSP141 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:132에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 성숙 INSP141 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:134에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 성숙 히스티딘 태그 INSP141 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:146에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144”라고 한다. SEQ ID NO:148에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP141”이라고 한다.
본 명세서에서 “INSP141 폴리펩티드”는 INSP141 엑손 1 폴리펩티드, INSP141 엑손 2 폴리펩티드, INSP141 엑손 3 폴리펩티드, INSP141 엑손 4 폴리펩티드, INSP141 엑손 5 폴리펩티드, INSP141 엑손 6 폴리펩티드, INSP141 엑손 7 폴리펩티드, INSP141 엑손 8 폴리펩티드, INSP141 엑손 9 폴리펩티드, INSP141 엑손 10 폴리펩티드, INSP141 엑손 11 폴리펩티드, INSP141 폴리펩티드, 클론된 INSP141 폴리펩티드, 클론된 히스티딘 태그 INSP141 폴리펩티드, 클론된 성숙 INSP141 폴리펩티드, 클론된 성숙 히스티딘 태그 INSP141 폴리펩티드, vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144, ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP141을 포함하는 폴리펩티드를 포괄한다.
적절하게는, 본 발명의 이러한 특징에 따른 폴리펩티드는 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능한다. “vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질로서 기능한다”는 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질 집단의 폴리펩티드 내에서 예로써, 통상적인 생물정보학 도구에 의해 보존된 특징(conserved feature)로서 확인될 수 있는 아미노산 서열 또는 구조적 특징을 포함하고, 따라서 전장 야생형 폴리펩티드의 기능과 비교하여 리간드 또는 수용체와의 상호작용이 별다른 악영향을 받지 않는 폴리펩티드를 지시한다. 가령, ANT_IG 도메인은 Protein Families Database of Alignments와 HMM(PFAM, The Pfam Protein Families Database. Alex et al. Nucleic Acids Research 2004. Database Issue 32:D138-D141)에서 특정한 서명(signature)(HMMER 구축 정보)에 의해 정의된다. 기능성(functionality)의 결정은 PFAM과 같은 특정 생물정보학 도구에 제한되지 않는데, 그 이유는 각각의 다른 도구가 보존된 도메인 또는 모티프를 검출하는 독특하고 특정한 서명을 보유하기 때문이다. 이에 더하여, 적절한 기능을 위하여 중요한 잔기일 것으로 생각되는 ANT_IG 도메인과 vWFA 도메인 내에서 보존된 잔기는 도 9에 표시된다(가령, 모든 집단 구성원에서 ANT_IG 도메인 내에 13개의 동일한 잔기가 존재한다). 게다가, 당업자는 도 9에 도시된 정렬로부터 시작하여, 통상적인 도구(가령, Psi-blast)를 이용하여 vWFA 도메인 및/또는 ANT_IG 도메인 모두에 대한 특정한 서명을 구축할 수 있다.
“ATR-유사 단백질로서 기능한다”는 vWFA와 ANT_IG 도메인을 모두 보유하고 ATR 단백질과 유사한 특성을 갖는 폴리펩티드를 지시한다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드는 독신, 더욱 구체적으로, 세균 독소에 결합할 수 있고, 및/또는 암을 예방하고 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 제 1 특징의 두 번째 구체예에서,
(i) SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:146 및/또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드;
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드가 제시된다.
적절하게는, 본 발명의 제 1 특징에 따른 폴리펩티드는
(i) SEQ ID NO:52 및/또는 SEQ ID NO:136에 열거된 아미노산 서열을 포함하고;
(ii) vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하고; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물이다.
본 발명의 이러한 특징에 따른 폴리펩티드는 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:146 및/또는 SEQ ID NO:150에 열거된 서열 중에서 하나로 구성된다.
SEQ ID NO:26에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 1 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:28에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 2 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:30에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 3 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:32에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 4 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:34에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 5 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:36에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 6 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:38에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 7 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:40에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 8 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:42에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 9 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:44에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 10 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:46에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 11 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:48에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 12 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:50에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 엑손 13 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:52에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP142 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:136에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 INSP142 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:146에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144”라고 한다. SEQ ID NO:150에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP142-INSP143-INSP144”라고 한다.
본 명세서에서 “INSP142 폴리펩티드”는 INSP142 엑손 1 폴리펩티드, INSP142 엑손 2 폴리펩티드, INSP142 엑손 3 폴리펩티드, INSP142 엑손 4 폴리펩티드, INSP142 엑손 5 폴리펩티드, INSP142 엑손 6 폴리펩티드, INSP142 엑손 7 폴리펩티드, INSP142 엑손 8 폴리펩티드, INSP142 엑손 9 폴리펩티드, INSP142 엑손 10 폴리펩티드, INSP142 엑손 11 폴리펩티드, INSP142 엑손 12 폴리펩티드, INSP142 엑손 13 폴리펩티드, INSP142 폴리펩티드, 클론된 INSP142 폴리펩티드, vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144, ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP142-INSP143-INSP144를 포함하는 폴리펩티드를 포괄한다.
적절하게는, 본 발명의 이러한 특징에 따른 폴리펩티드는 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능한다.
본 발명의 제 1 특징의 세 번째 구체예에서,
(i) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146 및/또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드;
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드가 제시된다.
적절하게는, 본 발명의 제 1 특징에 따른 폴리펩티드는
(i) SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:138 및/또는 SEQ ID NO:141에 열거된 아미노산 서열을 포함하고;
(ii) vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하고; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물이다.
본 발명의 이러한 특징에 따른 폴리펩티드는 SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146 및/또는 SEQ ID NO:150에 열거된 서열 중에서 하나로 구성된다.
SEQ ID NO:54에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 1 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:56에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 2 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:58에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 3 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:60에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 4 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:62에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 5 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:64에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 6 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:66에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 7 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:68에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 8 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:70에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 9 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:72에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 10 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:74에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 11 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:76에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 12 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:78에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 13 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:80에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 14 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:82에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 15 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:84에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 16 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:86에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 17 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:88에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 엑손 18 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:90에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP143 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:138에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 INSP143 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:140에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 히스티딘 태그 INSP143 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:142에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 성숙 INSP143 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:144에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“클론된 성숙 히스티딘 태그 INSP143 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:146에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144”라고 한다. SEQ ID NO:150에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP142-INSP143-INSP144”라고 한다.
본 명세서에서 “INSP143 폴리펩티드”는 INSP143 엑손 1 폴리펩티드, INSP143 엑손 2 폴리펩티드, INSP143 엑손 3 폴리펩티드, INSP143 엑손 4 폴리펩티드, INSP143 엑손 5 폴리펩티드, INSP143 엑손 6 폴리펩티드, INSP143 엑손 7 폴리펩티드, INSP143 엑손 8 폴리펩티드, INSP143 엑손 9 폴리펩티드, INSP143 엑손 10 폴리펩티드, INSP143 엑손 11 폴리펩티드, INSP143 엑손 12 폴리펩티드, INSP143 엑손 13 폴리펩티드, INSP143 엑손 14 폴리펩티드, INSP143 엑손 15 폴리펩티드, INSP143 엑손 16 폴리펩티드, INSP143 엑손 17 폴리펩티드, INSP143 엑손 18 폴리펩티드, INSP143 폴리펩티드, 클론된 INSP143 폴리펩티드, 클론된 히스티딘 태그 INSP143 폴리펩티드, 클론된 성숙 INSP143 폴리펩티드, 클론된 성숙 히스티딘 태그 INSP143 폴리펩티드, vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144, ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP142-INSP143-INSP144를 포함하는 폴리펩티드를 포괄한다.
적절하게는, 본 발명의 이러한 특징에 따른 폴리펩티드는 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능한다.
본 발명의 제 1 특징의 네 번째 구체예에서,
(i) SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:146 및/또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(ii) vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드;
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드가 제시된다.
적절하게는, 본 발명의 제 1 특징에 따른 폴리펩티드는
(i) SEQ ID NO:126에 열거된 아미노산 서열을 포함하고;
(ii) vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하고; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물이다.
본 발명의 이러한 특징에 따른 폴리펩티드는 SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:146 및/또는 SEQ ID NO:150에 열거된 서열 중에서 하나로 구성된다.
SEQ ID NO:92에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 1 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:94에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 2 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:96에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 3 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:98에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 4 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:100에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 5 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:102에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 6 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:104에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 7 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:106에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 8 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:108에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 9 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:110에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 10 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:112에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 11 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:114에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 12 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:116에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 13 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:118에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 14 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:120에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 15 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:122에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 16 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:124에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 엑손 17 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:126에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“INSP144 폴리펩티드”라고 한다. SEQ ID NO:146에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144”라고 한다. SEQ ID NO:150에 열거된 서열을 보유하는 폴리펩티드는 이후“ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP142-INSP143-INSP144”라고 한다.
본 명세서에서 “INSP144 폴리펩티드”는 INSP144 엑손 1 폴리펩티드, INSP144 엑손 2 폴리펩티드, INSP144 엑손 3 폴리펩티드, INSP144 엑손 4 폴리펩티드, INSP144 엑손 5 폴리펩티드, INSP144 엑손 6 폴리펩티드, INSP144 엑손 7 폴리펩티드, INSP144 엑손 8 폴리펩티드, INSP144 엑손 9 폴리펩티드, INSP144 엑손 10 폴리펩티드, INSP144 엑손 11 폴리펩티드, INSP144 엑손 12 폴리펩티드, INSP144 엑손 13 폴리펩티드, INSP144 엑손 14 폴리펩티드, INSP144 엑손 15 폴리펩티드, INSP144 엑손 16 폴리펩티드, INSP144 엑손 17 폴리펩티드, INSP144 폴리펩티드, vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144, ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP142-INSP143-INSP144를 포함하는 폴리펩티드를 포괄한다.
적절하게는, “vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질”은 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.0002, 0.00001, 0.000001 또는 0.0000001 보다 낮은 예상치(e-value)로 검출되는 vWFA 및/또는 ANT_IG 모메인을 보유하는 분자이다.
적절하게는, 본 발명의 이러한 특징에 따른 폴리펩티드는 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능한다.
적절하게는, 본 발명의 펩티드의 활성은 아래의 검사법 중에서 적어도 하나에서 확증될 수 있다:
a) Okayasu et al., A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology 1990. Vol. 98, pp. 694-702에 기술된, 덱스트란 황산나트륨(DSS)에 의해 유도된 염증성 장 질환의 생쥐 모형, 또는
b) Borm and Gouma, Drug Discovery Today: Disease Models; Vol.1, No.4, 2004, pp.437-443)에서 세밀히 조사된, 염증성 장 질환의 동물 모형을 비롯하여 시험관내와 생체내 검사법, 또는
c) Kamb and Lassota, Drug Discovery Today: Disease Models; Vol. 1, No. 1, 2004, pp. 31-36)에서 세밀히 조사된 암 모형, 또는 Odashiro et al., Drug Discovery Today: Disease Models 2005; In Press)에서 세밀히 조사된 피부 암 모형, 또는
d) Gutermuth et al., Drug Discovery Today: Disease Models 2005; in press에서 세밀히 조사된, 접촉성 피부염 또는 아토피성 습진의 모형, 또는
e) 정상 세포와 암 세포의 증식이나 생존의 조절, 또는
f) 실시예 9에 기술된 검사법, 또는
g) 혈관신생(angiogenesis) 또는 신혈관생성(neovascularization)의 조절, 또는
h) 세균 중독(bacterial intoxification), 예를 들면, 비탈저 중독(anthrax intoxification)의 조절, 또는
i) 독소, 예를 들면, 세균 독소(bacterial toxin)에 결합하는 능력.
본 발명의 “항원 결정부위”는 항체-결합 부위 또는 T-세포 수용체(TCR)에 결합하는, 본 발명의 폴리펩티드의 일부분이다. 대안으로, “항원 결정부위”는 단일 항체 분자가 결합하는, 본 발명의 폴리펩티드의 표면상의 한 부위이다. 일반적으로, 항원은 다수의 상이한 항원 결정부위를 보유하고, 다수의 상이한 특이성의 항체와 반응한다. 적절하게는, 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 면역특이적이다. 적절하게는, 항체는 융합 단백질의 일부가 아닌 본 발명의 폴리펩티드에 면역특이적이다. 적절하게는, 항체는 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 또는 이의 단편에 면역특이적이다. 항원 결정부위는 일반적으로, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학활성 표면 집합으로 구성되고, 특이적인 3차원 구조 특징 및 특이적인 전하 특성을 보유할 수 있다. 적절하게는, “항원 결정부위”는 항원성인, 다시 말하면, 특이적인 면역 반응을 유도하는 본 발명의 폴리펩티드 상의 특정 화학 작용기를 의미한다.
폴리펩티드 ADU02541(SEQ ID NO: 168)과 IPI00480015.1/ENSP00000346942(SEQ ID NO: 169) 및 이들의 인코딩 핵산 서열은 본 발명의 범위에서 명확히 배제된다.
제 2 특징에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 정제된 핵산 분자를 제시한다.
적절하게는, “정제된 핵산 분자”는 (1) 전체 핵산이 공급원 세포로부터 분리될 때 자연적으로 함께 관찰되는 단백질, 지질, 탄수화물 또는 다른 물질의 적어도 50%로부터 분리되는, (2) “정제된 핵산 분자”가 자연에서 연결되는 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부에 연결되지 않은, (3) 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 또는 (4) 자연에서 더욱 큰 폴리뉴클레오티드 서열의 일부로서 생성되지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 적절하게는, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 폴리펩티드 생산에서 이의 이용, 또는 이의 치료, 진단, 예방 또는 연구 용도를 간섭하는, 자연 환경에서 관찰되는 임의의 다른 오염 핵산 분자 또는 다른 오염물질이 실질적으로 존재하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 게놈 DNA 분자는 본 발명의 범위에서 배제된다. 적절하게는, 10 kbp(kilo base pairs), 50 kbp, 100 kbp, 150 kbp, 200 kbp, 250 kbp 또는 300 kbp 이상의 게놈 DNA는 본 발명의 범위에서 배제된다. 적절하게는, “정제된 핵산 분자”는 cDNA만으로 구성된다.
적절하게는, 정제된 핵산 분자는 SEQ ID NO:1(INSP141 엑손 1 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:3(INSP141 엑손 2 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:5(INSP141 엑손 3 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:7(INSP141 엑손 4 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:9(INSP141 엑손 5 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:11(INSP141 엑손 6 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:13(INSP141 엑손 7 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:15(INSP141 엑손 8 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:17(INSP141 엑손 9 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:19(INSP141 엑손 10 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:21(INSP141 엑손 11 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:23(INSP141 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:25(INSP142 엑손 1 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:27(INSP142 엑손 2 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:29(INSP142 엑손 3 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:31(INSP142 엑손 4 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:33(INSP142 엑손 5 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:35(INSP142 엑손 6 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:37(INSP142 엑손 7 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:39(INSP142 엑손 8 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:41(INSP142 엑손 9 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:43(INSP142 엑손 10 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:45(INSP142 엑손 11 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:47(INSP142 엑손 12 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:49(INSP142 엑손 13 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:51(INSP142 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:53(INSP143 엑손 1 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:55(INSP143 엑손 2 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:57(INSP143 엑손 3 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:59(INSP143 엑손 4 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:61(INSP143 엑손 5 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:63(INSP143 엑손 6 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:65(INSP143 엑손 7 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:67(INSP143 엑손 8 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:69(INSP143 엑손 9 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:71(INSP143 엑손 10 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:73(INSP143 엑손 11 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:75(INSP143 엑손 12 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:77(INSP143 엑손 13 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:79(INSP143 엑손 14 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:81(INSP143 엑손 15 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:83(INSP143 엑손 16 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:85(INSP143 엑손 17 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:87(INSP143 엑손 18 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:89(INSP143 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:91(INSP144 엑손 1 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:93(INSP144 엑손 2 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:95(INSP144 엑손 3 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:97(INSP144 엑손 4 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:99(INSP144 엑손 5 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:101(INSP144 엑손 6 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:103(INSP144 엑손 7 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:105(INSP144 엑손 8 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:107(INSP144 엑손 9 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:109(INSP144 엑손 10 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:111(INSP144 엑손 11 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:113(INSP144 엑손 12 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:115(INSP144 엑손 13 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:117(INSP144 엑손 14 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:119(INSP143 엑손 15 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:121(INSP144 엑손 16 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:123(INSP144 엑손 17 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:125(INSP144 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:127(클론된 INSP141 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:129(클론된 히스티딘 태그 INSP141 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:131(클론된 성숙 INSP141 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:133(클론된 성숙 히스티딘 태그 INSP141 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:135(클론된 INSP142 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:137(클론된 INSP143 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:139(클론된 히스티딘 태그 INSP143 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:141(클론된 성숙 INSP143 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:143(클론된 성숙 히스티딘 태그 INSP143 폴리펩티드를 인코딩), SEQ ID NO:145(vWFA 도메인 펩티드 서열-INSP141-INSP142-INSP143-INSP144를 인코딩), SEQ ID NO:147(ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP141을 인코딩), SEQ ID NO:149(ANT_IG 도메인 펩티드 서열-INSP142-INSP143-INSP144를 인코딩)에 열거된 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이들 서열의 잉여 등가물이나 단편이다.
또한, 본 발명에서 정제된 핵산 분자는 앞서 열거된 핵산 중에서 하나로 구성된다.
제 3 특징에서, 본 발명은 높은 엄밀도 조건하에, 본 발명의 제 2 특징의 핵산 분자와 혼성화되는 정제된 핵산 분자를 제시한다. 높은 엄밀도 혼성화 조건은 50% 포름아미드, 5XSSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산3나트륨), 5O mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x Denhardts 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 20 ㎍/㎖ 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내에 42℃에서 하룻밤동안 배양, 이후 0.1X SSC 내에 65℃에서 필터 세척으로 정의된다.
제 5 특징에서, 본 발명은 본 발명의 제 4 특징의 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제시한다.
제 6 특징에서, 본 발명은 본 발명의 제 1 특징의 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질에 특이적으로 결합하는 리간드를 제시한다. 적절하게는, 리간드는 본 발명의 제 1 특징의 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질의 기능을 저해한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 리간드는 자연이나 변형된 기질, 효소, 수용체, 소형 유기 분자, 예를 들면, 최대 2000Da, 바람직하게는 800Da 이하의 소형 자연이나 합성 유기 분자, 펩티드 모방체, 무기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 항체, 이들의 구조적 또는 기능적 모방체 등을 비롯한 다양한 형태로 존재한다. 본 발명의 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질은 세균 독소, 예를 들면, 비탈저 독소, 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) C2 독소에 결합할 수 있다. 또한, 본 발명은 세균 독소와 복합된 본 발명의 제 1 특징에 따른 폴리펩티드를 제시한다.
본 발명의 제 7 특징에서는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현을 변형하거나 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드의 활성을 조절하는데 효과적인 화합물을 제시한다.
이들 화합물은 본 명세서에 기술된 검사법과 스크리닝 방법을 이용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 제 7 특징의 화합물은 유전자의 발현 수준 또는 폴리펩티드의 활성을 증가(항진) 또는 감소(길항)시킨다.
중요하게는, INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 기능 확인은 질병의 치료 및/또는 진단에 유효한 화합물을 확인할 수 있는 스크리닝 방법의 설계를 가능하게 한다. 본 발명의 제 6과 제 7 특징에 따른 리간드와 화합물은 이런 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 이들 방법은 본 발명의 특징에 포함된다.
본 발명의 다른 특징은 후보 약제 조절제, 특히, vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질 관련된 질환에 길항하는 후보 약제의 스크리닝을 위한 표적으로서 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 유전자 또는 폴리펩티드의 용도에 관계한다.
본 발명의 또 다른 특징은 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 유전자 또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편에 결합하는 화합물의 능력을 결정하는 단계를 포함하는, vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질 관련된 질환의 치료를 위한 화합물의 스크리닝 방법에 관계한다.
본 발명의 또 다른 특징은 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 유전자 또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편의 활성 조절을 검사하는 단계를 포함하는, vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질 관련된 질환의 치료를 위한 화합물의 스크리닝 방법에 관계한다.
본 발명의 제 8 특징에서는 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는 ATR-유사 단백질이 관여하는 질병의 치료 또는 진단에 이용되는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제 2 특징의 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 4 특징의 벡터, 또는 본 발명의 제 5 특징의 숙주 세포, 또는 본 발명의 제 6 특징의 리간드, 또는 본 발명의 제 7 특징의 화합물을 제시한다.
적절하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편(가령, 본 빌리브란트 인자 A(vWFA)와 비탈저 수용체 세포외(ANT_IG) 도메인을 보유하는 단편)은 다른 비탈저 독소 수용체-유사 단백질(가령, TEM8 또는 CMG2)이 치료 활성을 나타내는 질병의 진단 및/또는 치료에 이용된다.
특히, 본 발명의 폴리펩티드는 세균 독소를 차단하는데 이용된다. 본 발명의 폴리펩티드의 가용성 vWFA 도메인(MIDAS 모티프를 통하여, 결정적인 잔기는 도 9에 도시된다) 및/또는 가용성 ANT_IG 도메인은 세균 독소(가령, 비탈저 독소, 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) C2 독소)를 차단하여 세균 감염을 예방 또는 치료하는데 이용된다.
본 발명의 폴리펩티드의 가용성 vWFA 도메인 및/또는 ANT_IG 도메인은 차단되는 세균 독소의 PA 아단위에 대한 수용체로서 기능하는 지질 꼬리(lipid tail), 예를 들면, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI 꼬리)에 의해 고정된다. Liu and Heppla. The Journal of Biological Chemistry 2003. Vol. 278, No.7, pp. 5227-5234에서는 GPI-고정 서열(anchoring sequence) uPAR에 TEM8 세포외 도메인의 결합을 보고한다.
본 발명의 폴리펩티드, 특히, 본 발명의 폴리펩티드의 가용성 vWFA 도메인(MIDAS 모티프를 통하여, 결정적인 잔기는 도 9에 도시된다) 및/또는 ANT_IG 도메인은 암의 치료에도 이용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 길항제, 특히, 막-결합된 동등형(isoform) INSP143과 INSP144 역시 세균 독소와 암의 치료에 이용될 수 있다. 적절하게는, 이들 길항제는 단클론 항체 또는 안티센스 핵산이다. 적절하게는, 이들 길항제는 vWFA 도메인, 더욱 구체적으로, MIDAS 모티프, 및/또는 ANT_IG 도메인을 표적한다.
치료될 수 있는 다른 질환에는 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측삭 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염; 다른 병리학적 이상이 포함된다. 적절하게는, 질환은 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질이 관여하는 질환이다. vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질이 관여하는 질환의 실례는 세균 감염, 세균 중독, 비탈저, 독소(가령, 세균 독소)의 차단, 암, 내피 종양, 결장직장암, 방광암, 식도암(oesophageal cancer), 폐암, 흑색종, 연소성 유리질 섬유종증(juvenile hyaline fibromatosis, JFH), 유아 전신 유리질증(infantile systemic hyalinosis, ISH), 본 빌리브란트(von Willebrand) 질환, Bethlem 근병증(Bethlem myopathy), 이영양성 표피 수포증(epidermolysis bullosa dystrophica), 혈전증, 혈소판-매개된 응집의 조절, 자가면역 질환, 염증 등이다.
이들 분자는 이런 질환의 치료를 위한 약제의 제조에도 사용될 수 있다. 이들 분자는 피임, 또는 불임을 비롯한 생식 장애의 치료에도 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 획득된 발현 결과는 결장과 회장 IBD 생검 샘플 및 건선 피부 생검에서 INSP42의 예상치 않게 제한된 발현을 보여준다. 이런 특이적인 발현 패턴은 염증성 장 질환, 피부 질환 또는 염증에서 INSP142의 관여를 결정한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 상응하는 폴리펩티드를 특징짓는 이와 같은 놀라운 특성으로 인하여, 이들은 약제 또는 제약학적 조성물의 제조에 특히 적합하다. 특히 선호되는 질환은 염증성 장 질환, 독소-관련된 질환, 암, 피부 질환, 염증, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 접촉성 피부염, 아토피성 습진, 혈액과 림프계로부터 암, 피부암, 소화계 암, 비뇨기계 암, 유방암, 난소암, 부인과 암, 융모암종(choriocarcionoma), 폐암, 뇌종양, 골종양, 카르시노이드 종양, 결장직장암, 비인두암(nasopharyngeal cancer), 복막후 육종(retroperitoneal sarcoma), 연조직 종양, 갑상선암, 고환암 또는 간암이다. 적절하게는, 독소-관련된 질환은 세균 독소-관련된 질환, 비탈저 또는 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) C2 독소-관련된 질환이다. 적절하게는, 염증성 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염에서 선택된다. 적절하게는, 피부 질환은 건선이다. 적절하게는, “암”은 혈액과 림프계로부터 암, 피부암, 소화계 암, 비뇨기계 암, 유방암, 난소암, 부인과 암, 융모암종, 폐암, 뇌종양, 골종양, 카르시노이드 종양, 결장직장암, 비인두암, 복막후 육종, 연조직 종양, 갑상선암, 고환암 또는 간암이다.
적절하게는, 염증성 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염에서 선택된다. 적절하게는, 피부 질환은 건선, 접촉성 피부염 또는 아토피성 습진이다.
본 발명의 제 1 특징, 제 2 특징, 제 3 특징, 제 4 특징, 제 5 특징, 제 6 특징 또는 제 7 특징의 모이어티(moiety)는 이들 질환의 치료를 위한 약제의 제조에도 이용된다.
본 발명의 제 9 특징에서는 환자에서 질병을 진단하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 이런 환자로부터 얻은 조직에서 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현 수준, 또는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드의 활성 수준을 평가하고, 상기 발현이나 활성 수준을 대조 수준과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 대조 수준과 상이한 수준은 질병을 암시한다. 적절하게는, 이런 방법은 시험관내에서 수행된다. 유사한 방법을 이용하여 환자에서 질병의 치료 과정을 모니터할 수 있는데, 시간의 추이에서 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 발현이나 활성 수준의 대조 수준으로의 변화는 질병의 퇴행을 암시한다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 검출하는데 적합한 방법은 (a) 리간드-폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건하에 본 발명의 제 6 특징의 리간드, 예를 들면, 항체를 생물학적 시료와 접촉시키고, (b) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 제 9 특징에 따른 다양한 이런 방법, 예를 들면, 짧은 프로브와의 핵산 혼성화 방법, 점 돌연변이 분석, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 비정상적 단백질 수준을 검출하는 항체를 이용한 방법이 존재한다. 유사한 방법을 이용하여 환자에서 질병의 치료 과정을 단기 또는 장기적으로 모니터할 수 있다. 또한, 본 발명은 질병을 진단하는 이들 방법에 유용한 키트를 제시한다.
적절하게는, 본 발명의 제 9 특징의 방법으로 진단된 질환은 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질이 관여하는, 앞서 기술된 바와 같은 질환이다.
본 발명의 제 10 특징에서는 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드의 용도를 제시한다. vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 용도는 세포 성장, 대사 또는 분화의 조절인자로서 용도; 수용체/리간드 쌍의 일부로서 용도; 앞서 제공된 목록에서 선택되는 생리학적 또는 병리학적 상태에 대한 진단 마커로서 용도이다. 다른 적합한 용도에는 이런 종류의 단백질이 관여하는 질병과 이상의 치료와 진단에 유용한 리간드 및 다른 항진제 또는 길항제 분자를 확인하는 스크리닝 방법에서 용도가 포함된다.
본 발명의 제 11 특징에서는 제약학적으로 허용되는 담체와 공동으로, 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 4 특징의 벡터, 또는 본 발명의 제 5 특징의 숙주 세포, 또는 본 발명의 제 6 특징의 리간드, 또는 본 발명의 제 7 특징의 화합물을 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다.
본 발명의 제 12 특징에서는 질병의 진단 또는 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 4 특징의 벡터, 또는 본 발명의 제 5 특징의 숙주 세포, 또는 본 발명의 제 6 특징의 리간드, 또는 본 발명의 제 7 특징의 화합물을 제시하는데, 상기 질병에는 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측삭 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 세균, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염; 다른 병리학적 이상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 적절하게는, 질환은 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질이 관여하는 질환이다. vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질이 관여하는 질환의 실례는 세균 감염, 세균 중독, 비탈저, 독소(가령, 세균 독소)의 차단, 암, 내피 종양, 결장직장암, 방광암, 식도암(oesophageal cancer), 폐암, 흑색종, 연소성 유리질 섬유종증(juvenile hyaline fibromatosis, JFH), 유아 전신 유리질증(infantile systemic hyalinosis, ISH), 본 빌리브란트(von Willebrand) 질환, Bethlem 근병증(Bethlem myopathy), 이영양성 표피 수포증(epidermolysis bullosa dystrophica), 혈전증, 혈소판-매개된 응집의 조절, 자가면역 질환, 염증 등이다.
본 발명의 제 13 특징에서는 환자에서 질병을 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 핵산 분자, 또는 본 발명의 제 4 특징의 벡터, 또는 본 발명의 제 5 특징의 숙주 세포, 또는 본 발명의 제 6 특징의 리간드, 또는 본 발명의 제 7 특징의 화합물을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현, 또는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드의 활성이 건강한 개체에서 발현이나 활성 수준에 비하여 병든 환자에서 저하되는 질환의 경우에, 환자에게 투여되는 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드 또는 화합물은 항진제이다. 역으로, 자연 유전자의 발현 또는 폴리펩티드의 활성이 건강한 개체에서 발현이나 활성 수준에 비하여 병든 환자에서 증가되는 질환의 경우에, 환자에게 투여되는 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드 또는 화합물은 길항제이다. 이런 길항제의 실례는 안티센스 핵산 분자, 리보자임, 리간드, 예를 들면, 항체이다.
INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드는 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질이고, 따라서 많은 질병 상태에서 일정한 역할을 수행한다. INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 길항제는 이들 질병 상태를 조절하는 방법을 제공한다는 점에서 특히 주목을 받고 있다.
본 발명의 제 14 특징에서는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 더욱 높은, 더욱 낮은 또는 결여된 수준으로 발현하도록 형질전환된 외래유전자도입 또는 녹아웃 비-인간 동물을 제시한다. 이런 외래유전자도입 동물은 질환의 연구에 매우 유용한 모형이며, 이런 질환의 치료 또는 진단에 유효한 화합물의 확인을 위한 스크리닝 과정에도 이용될 수 있다.
본 명세서에서, “기능적 등가물”은 본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 분자와 실질적으로 유사한 기능적 또는 구조적 특징을 보유하는 단백질 또는 핵산 분자를 의미한다. 단백질의 기능적 등가물은 특정 기능의 수행을 위하여 필요에 따라 변형을 포함한다. “기능적 등가물”은 분자의 단편, 돌연변이체, 하이브리드, 변이체, 유사체 또는 화학적 유도체를 포괄한다.
적절하게는, “기능적 등가물”은 본 발명의 폴리펩티드의 한가지이상의 기능적 활성을 보이는 단백질 또는 핵산 분자이다.
적절하게는, “기능적 등가물”은 생물학적 활성이나 기능의 측정을 위한 적절한 분석평가에서 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 또는 이의 단편과 비교하여 실질적으로 유사한 활성을 보이는 단백질 또는 핵산 분자이다. 적절하게는, “기능적 등가물”은 생물학적 활성이나 기능의 측정을 위한 적절한 분석평가에서 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 또는 이의 단편과 비교하여 동일하거나 더욱 높은 활성을 보이는 단백질 또는 핵산 분자이다. 적절하게는, “기능적 등가물”은 생물학적 활성이나 기능의 측정을 위한 적절한 분석평가에서 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 또는 이의 단편과 비교하여 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 100% 또는 그 이상의 활성을 보이는 단백질 또는 핵산 분자이다.
적절하게는, “기능적 등가물”은 본 발명의 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 생체내 또는 시험관내 활성을 나타낼 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 적절하게는, “기능적 등가물”은 본 발명의 폴리펩티드의 상응하는 부분이 다른 세포 또는 세포외 분자와 상호작용하는 방식과 실질적으로 유사한 방식으로 이들 다른 분자와 상호작용할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 가령, “기능적 등가물”은 면역검사에서, 본 발명의 폴리펩티드의 상응하는 펩티드(즉, “기능적 등가물”을 달성하기 위하여 변형된 아미노산 서열의 펩티드), 또는 본 발명의 폴리펩티드 자체에 대한 항체의 결합을 감소시킬 수 있는데, 여기서 상기 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 상응하는 펩티드에 대항하여 생성되었다. 동몰 농도의 기능적 등가물은 상응하는 펩티드의 상기한 결합을 적어도 5%, 바람직하게는, 대략 5% 내지 10%, 더욱 바람직하게는, 대략 10% 내지 25%, 이보다 더욱 바람직하게는, 대략 25% 내지 50%, 가장 바람직하게는, 대략 40% 내지 50% 정도 감소시킨다.
가령, 기능적 등가물은 완전한 기능성이거나, 또는 한가지이상의 활성 기능이 부재할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 변형은 예로써, vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인으로서 실체를 반영하는, 본 발명의 폴리펩티드의 활성 기능에 영향을 줄 수 있다.
본 발명을 실시하는데 이용할 수 있는 표준 기술 및 과정은 아래에 요약하였다. 인지하는 바와 같이, 본 발명은 기술된 특정 방법, 프로토콜, 세포 주, 벡터 및 시약에 국한되지 않는다. 본 명세서에 이용되는 용어는 본 발명의 특정 구체예를 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다
본 명세서에서는 뉴클레오티드 및 핵산에 대하여 표준 약어가 이용된다.
본 발명은 달리 명시하지 않는 경우에, 당분야에 공지된 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 면역학의 통상적인 기술을 이용하여 실시한다.
이런 기술은 기존 문헌에서 충분히 설명된다. 적절한 참고 문헌에는 Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition(1989); DNA Cloning, Volumes I and 11(D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture(R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning(1984); the Methods in Enzymology series(Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes,(1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition(Springer Verlag, N.Y.); Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D.M. Weir and C. C. Blackwell eds. 1986) 등이 포함된다.
본 명세서에서 “폴리펩티드”는 2개 이상의 아미노산이 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 임의의 펩티드 또는 단백질(즉, 펩티드 등입체성계(isostere))을 포괄한다. 폴리펩티드에는 짧은 사슬(펩티드 및 올리고펩티드)과 긴 사슬(단백질)이 모두 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드는 성숙한 단백질 형태이거나, 또는 pre-, pro-, 또는 prepro- 부분의 절단으로 활성화되면 활성 성숙 폴리펩티드를 생산할 수 있는 pre-, pro-, 또는 prepro-단백질 형태이다. 이런 폴리펩티드에서, pre-, pro-, 또는 prepro- 서열은 리더 또는 분비 서열이거나, 또는 성숙한 폴리펩티드 서열의 정제에 이용되는 서열이다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있다. 가령, 분비 또는 리더 서열, pro-서열, 정제를 보조하는 서열, 또는 예로써, 재조합 생산동안 더욱 높은 단백질 안정성을 공여하는 서열을 비롯한 한가지 이상의 부가적인 아미노산을 포함하는 것이 유리하다. 대안으로 또는 부가적으로, 성숙한 폴리펩티드를 다른 화합물, 예를 들면, 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(가령, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합시킬 수도 있다.
더욱 바람직한 구체예에서, INSP141, INSP142, INSP143, INSP144와 적어도 85% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 본 발명의 폴리펩티드는 융합 단백질이다.
이들 융합 단백질은 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144와 적어도 85% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이종성 단백질 서열에 대한 코딩 서열과 인-프레임(in-frame)으로 클로닝함으로써 수득될 수 있다.
본 명세서에서, “이종성”은 인간 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드 이외의 임의의 폴리펩티드를 지칭한다. N- 또는 C-말단에서 융합 단백질에 포함될 수 있는 이종성 서열의 실례는 막-결합된 단백질의 세포외 도메인, 면역글로불린 불변 영역(Fc 영역), 다량체화 도메인, 세포외 단백질의 도메인, 신호 서열, 방출 서열(export sequence), 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 가능하게 하는 서열이다.
이들 이종성 서열의 대부분은 발현 플라스미드 형태로 상업적으로 구입가능한데, 그 이유는 이들 서열이 이들에 융합된 단백질의 특이적인 생물 활성을 현저하게 손상시키지 않으면서 추가적인 특성을 제공하기 위하여 융합 단백질에 포함된다(Terpe K, 2003, Appl Microbiol Biotechnol, 60:523-33). 이들 추가적인 특성의 실례는 체액에서 길어진 반감기, 세포외 국지화(extracellular localization), 또는 “히스티딘 태그”를 형성하는 히스티딘 가닥(Gentz et al. 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86:821-4) 또는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프, “HA” 태그(Wilson et al. 1994, Cell, 37:767-78)에 의해 가능한 더욱 용이해진 정제 절차이다. 필요한 경우에, 이종성 서열은 예로써, 단백질과 이종성 서열 사이에 단백분해 절단 부위를 삽입하고, 정제된 융합 단백질을 적절한 프로테아제에 노출시킴으로써 단백분해 절단에 의해 제거될 수 있다. 이들 특징은 융합 단백질에 특히 중요한데, 그 이유는 이러한 특징이 융합 단백질의 생산 및 제약학적 조성물의 제조에서 이용을 용이하게 하기 때문이다. 가령, INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드는 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144의 C 말단에 융합된 헥사-히스티딘 펩티드에 의해 정제된다. 융합 단백질이 면역글로불린 영역을 포함하는 경우에, 이러한 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 또는 이보다 더욱 긴, 예를 들면, 13개 아미노산 잔기의 짧은 링커 펩티드를 통하여 달성될 수 있다. 상기 링커는 예로써, 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 또는 본 발명의 물질의 서열과 면역글로불린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met(SEQ ID NO:151)을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 연장된 체류 시간(즉, 증가된 반감기), 증가된 특이적 활성, 증가된 발현 수준, 또는 융합단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.
바람직한 구체예에서, 상기 단백질은 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 적절하게는, 이는 선택적으로 인간 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. Ig 분자의 다른 동등형 역시 본 발명에 따른 융합단백질, 예를 들면, 동등형 IgG2 또는 IgG4, 또는 다른 Ig 종류(가령, IgM 또는 IgA)의 생산에 적합하다. 융합 단백질은 단량체 또는 다량체이고, 이종- 또는 동종다량체이다.
INSP141, INSP142, 또는 INSP143 또는 INSP144의 세포외 부분은 Fc 융합체와 같은 융합 단백질의 구성요소로서 및/또는 다른 치료제와의 조합으로, 자체적으로 유용하다.
더욱 바람직한 구체예에서, 기능적 유도체는 하나이상의 기능기에 부착된 적어도 하나의 모이어티를 포함하는데, 이들 기능기는 아미노산 잔기 상에 하나이상의 측쇄로서 존재한다. 적절하게는, 이러한 모이어티는 폴리에틸렌(PEG) 모이어티이다. PEG화는 예로써, WO99/55377에 기술된 바와 같은 공지된 방법으로 수행된다.
폴리펩티드에는 20개의 유전자-인코딩 아미노산 이외의 아미노산도 포함될 수 있는데, 이들 아미노산은 자연적인 과정, 예를 들면, 번역후 가공 또는 당분야에 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 통상적으로 존재할 수 있는 이런 공지의 변형에는 글리코실화반응, 지질 부착, 설페이트화반응, 예로써 글루타민산 잔기의 감마-카르복실화반응, 수산화반응, ADP-리보실화반응 등이 포함된다. 다른 가능한 변형에는 아세틸화반응, 아실화반응, 아미드화반응, 플라빈의 공유 부착, 헤미(haeme) 잔기의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 교차-연결, 고리화반응, 이황화결합 형성, 디메틸화반응, 공유 교차 연결의 형성, 시스테인 형성, 피로글루타메이트 형성, 포밀화반응, GPI 앵커 형성, 요오드화반응, 메틸화반응, 미리스톨화반응, 산화, 단백분해 과정, 포스포릴화반응, 프레닐화반응, 라셈화반응, 세리노일화반응, 아르기닐화반응과 같은 t-RNA 매개된 아미노산의 단백질에 부가, 유비퀴닌화반응 등이 포함된다.
폴리펩티드의 모든 위치, 예를 들면, 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복시 말단에 변형이 일어날 수 있다. 사실, 폴리펩티드에서 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 양쪽 말단 모두의 공유 변형에 의한 차단은 자연 발생 폴리펩티드와 합성 폴리펩티드에서 공통하고, 이런 변형은 본 발명의 폴리펩티드에도 존재한다.
폴리펩티드에서 일어날 수 있는 변형은 폴리펩티드가 어떻게 만들어지는 가에 따라 달라진다. 재조합에 의해 만들어진 폴리펩티드의 경우에, 변형의 성질과 정도는 특정 숙주 세포의 번역후 변형 능력 및 목적 폴리펩티드의 아미노산 서열에 존재하는 변형 신호에 의해 상당 부분 결정된다. 가령, 상이한 유형의 숙주 세포 간에는 글리코실화반응 패턴이 변한다.
본 발명의 폴리펩티드는 임의의 적절한 방법으로 만들 수 있다. 이런 폴리펩티드에는 자연 발생 폴리펩티드(가령, 세포 배양물로부터 정제된 폴리펩티드), 재조합에 의해 만들어진 폴리펩티드(융합 단백질 포함), 합성에 의해 만들어진 폴리펩티드 또는 이들 방법의 조합으로 만들어진 폴리펩티드 등이 포함된다.
본 발명의 제 1 특징의 기능적으로 등가인 폴리펩티드는 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드에 상동성인 폴리펩티드이다. 폴리펩티드의 한 서열이 다른 폴리펩티드의 서열과 동일성이나 유사성이 충분한 경우에, 이들 두 폴리펩티드는 “상동성”이라고 한다. “동일성”이란 배열된 서열의 임의 지점에서 서열 간에 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. “유사성”이란 배열된 서열의 임의 지점에서 아미노산 잔기가 유사한 유형임을 의미한다. 동일성과 유사성 정도는 편의하게 계산할 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1. Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).
따라서, 상동성 폴리펩티드에는 자연 생물학적 변이체(가령, 폴리펩티드가 유래되는 종 내에서 대립형질 변이체 또는 지형적 변이체), INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 돌연변이체(아미노산 치환, 결손 및 삽입을 포함하는 돌연변이체) 등이 포함된다. 이런 돌연변이체에는 보존형 또는 비-보존형 아미노산(바람직하게는, 보존형 아미노산)에 의해 하나이상의 아미노산이 치환된 폴리펩티드가 포함되는데, 이런 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩되거나 인코딩되지 않는다. 전형적으로 이런 치환은 아래의 군 내에서 이루어진다; Ala, Val, Leu, Ile; Ser, Thr; 산성 아미노산 잔기 Asp, Glu; Asn, Gln; 염기성 잔기 Lys, Arg; 또는 방향족 잔기 Phe, Tyr. 5 내지 1O개, 1 내지 5개, 1 내지 3개, 1 내지 2개 또는 1개 아미노산이 치환된, 결실된 또는 임의의 조합으로 부가된 변이체가 바람직하다. 특히, 단백질의 성질 및 활성에 변화를 주지 않는 침묵 치환, 부가, 결실이 바람직하다. 또한, 보존성 치환이 바람직하다. 이런 돌연변이체에는 하나이상의 아미노산 잔기가 치환기를 보유하는 폴리펩티드가 포함된다.
본 발명에서, 임의의 치환은 가급적, 분자의 구조와 생물학적 기능을 보존하기 위하여, 충분히 유사한 화학적 특징을 보유하는 아미노산을 도입하는 치환으로 정의되는 “보존성” 또는 “안전한” 치환이어야 한다(가령, 염기성의 양으로 하전된 아미노산은 다른 염기성의 양으로 하전된 아미노산으로 치환된다).
기존 문헌에서는 단백질의 서열 및/또는 구조에 대한 통계학적 연구와 물리-화학적 연구에 기초하여 보존성 아미노산 치환을 선택할 수 있는 여러 모형을 제시한다(Rogov SI and Nekrasov AN, 2001). 단백질 설계 실험에서, 특이적인 일단의 아미노산의 이용은 접힘가능한 활성 단백질을 생산할 수 있고, 단백질 구조에서 더욱 용이하게 수용될 수 있고 기능적/구조적 동족체(homolog)와 파라로그(paralog)를 검출하는데 이용될 수 있는 아미노산 “유의성” 치환의 분류에 도움이 되는 것으로 밝혀졌다(Murphy LR et al., 2000). 유의성 아미노산 군과 더욱 바람직한 유의성 아미노산 군은 표 1에 도시된다.
상이한 목적으로 본 발명의 폴리펩티드 내에 특이적인 비-보존성 돌연변이 역시 도입할 수 있다. vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질의 친화성을 감소시키는 돌연변이는 재생되고 재활용되는 이의 능력을 증가시키고, 이의 치료 효능을 잠재적으로 증가시킨다(Robinson CR, 2002). 본 발명의 폴리펩티드에 궁극적으로 존재하는 면역원성 에피토프는 백신을 개발하는데 이용하거나(Stevanovic S. 2002), 또는 단백질 안정성을 증가시키는 돌연변이를 선별하기 위한 공지된 방법에 따라 이들 서열을 변형하고 이들을 교정함으로써 제거할 수 있다(van den Burg B and Eijsink V, 2002; WO 02/05146, WO 00/34317, WO 98/52976).
펩티드 모방체에 포함되는 아미노산 유도체에 대한 바람직한 대안적 유의성 군은 표 2에 정의된다. 아미노산 유도체의 무-제한적 목록에는 아미노이소부틸산(Aib), 하이드록시프롤린(Hyp), 1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-3-COOH, 인돌린-2-카르복실산, 4-디플루오르-프롤린, L-티아졸리딘-4-카르복실산, L-호모프롤린, 3,4-디하이드로-프롤린, 3,4-디하이드록시-페닐알라닌, 사이클로헥실-글리신, 페닐글리신 역시 포함된다.
“아미노산 유도체”는 20개의 유전적으로 인코딩된 자연 발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산-유사 화학적 실체를 의미한다. 특히, 아미노산 유도체는 치환되거나 치환되지 않은, 선형, 가지형, 또는 환형 알킬 부분을 포함하고, 하나이상의 헤테로원자를 보유한다. 아미노산 유도체는 de novo에서 제조하거나, 또는 상업적 공급원(Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland; Bachem, USA)으로부터 구입할 수 있다.
단백질 구조와 기능을 탐침하고 및/또는 개선하기 위하여, 시험관내와 생체내 번역 시스템을 이용하여 비자연 아미노산 유도체를 단백질 내로 통합하는 다양한 방법이 기존 문헌(Dougherty DA, 2000)에서 보고되었다. 펩티드 모방체 및 비-펩티드 모방체의 합성과 개발 역시 당분야에 널리 공지되어 있다(Golebiowski A et al., 2001; Hruby VJ and Balse PM, 2000; Sawyer TK, in "Structure Based Drug Design", edited by Veerapandian P. Marcel Dekker Inc., pg. 557-663, 1997).
전형적으로, 2개 폴리펩티드간 30% 이상의 상동성은 기능적 등가로 간주된다. 적절하게는, 본 발명의 제 1 특징의 기능적 등가 폴리펩티드는 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드, 또는 이의 활성 단편과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 더욱 적절하게는, 폴리펩티드는 각각, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 상동성을 갖는다.
본 발명의 제 1 특징의 기능적 등가 폴리펩티드는 한가지이상의 구조적 배열 기술을 이용하여 확인된 폴리펩티드일 수도 있다. 가령, BiopendiumTM 검색 데이터베이스를 만드는데 이용되는 검색 도구의 한 측면을 형성하는 Inpharmatica Genome ThreaderTM(PCT application WO 01/69507) 기술을 이용하여, 현재 기능이 알려지지 않고 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드 서열과 현저한 구조적 상동성을 공유함으로써 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질의 구성원으로 예측되는 폴리펩티드를 확인할 수 있다. “현저한 구조적 상동성”은 Inpharmatica Genome ThreaderTM에 의해 두 단백질의 구조적 상동성이 적어도 10% 이상의 확실성으로 예측됨을 의미한다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드에는 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 단편 및 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 기능적 등가물의 단편 역시 포함되는데, 여기서 이들 단편은 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질이거나 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질과 공통의 항원 결정부위를 갖는다.
본 명세서에서 “단편”은 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 아미노산 서열과 일부분이 동일한 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 등가물을 의미한다. 이들 단편은 상기 서열로부터 유래된 적어도 n개의 연속 아미노산을 포함하고, 특정 서열에 따라, n은 7 또는 그 이상(가령, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 또는 그 이상)이다. 소형 단편은 항원 결정부위를 형성할 수 있다.
적절하게는, 본 발명에 따른 핵산은 10-2000개 뉴클레오티드, 100-1750개 뉴클레오티드, 500-1500개 뉴클레오티드, 600-1200개 뉴클레오티드, 또는 750-1000개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 적절하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 10-700개 아미노산, 50-600개 아미노산, 100-500개 아미노산, 200-400개 아미노산, 또는 300-375개 아미노산 길이를 갖는다.
전장 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 단편은 각각, INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 내에서 이웃하는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 엑손 서열의 조합으로 구성된다.
이들 단편은 “프리-스탠딩(free-standing)”, 다시 말하면, 다른 아미노산이나 폴리펩티드와 융합되거나 일부분을 형성하지 않고, 또는 이들 단편은 더욱 큰 폴리펩티드 내에서 일부분을 형성할 수도 있다. 더욱 큰 폴리펩티드 내에서 일부분을 형성하는 경우에, 본 발명의 단편은 가장 적절하게는, 단일 연속 부분을 형성한다. 가령, 바람직한 특정 구체예는 단편의 아미노 말단에 융합된 Pre- 또는 pro-폴리펩티드 및/또는 단편의 카르보닐 말단에 융합된 추가의 부분을 보유하는 단편에 관계한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 이들의 면역원성 단편(적어도 한 개의 항원 결정부위 포함)을 이용하여, 이들 폴리펩티드에 면역 특이적인 리간드, 예를 들면, 다클론 또는 단클론 항체를 만들 수 있다. 이들 항체를 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 클론을 분리하거나 확인하고, 또는 친화성 크로마토그래피로 이들 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이들 항체는 특히, 치료 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다.
“면역특이적”은 항체가 선행 기술의 다른 관련된 폴리펩티드보다 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 현저하게 높은 친화성을 갖는다는 것을 의미한다. 본 명세서에서, “항체”는 의심되는 항원 결정부위에 결합할 수 있는 완전 분자 및 이들의 단편, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv를 의미한다. 따라서, 이들 항체는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드에 결합한다.
“현저하게 높은 친화성”은 공지의 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질에 대한 친화성과 비교하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 친화성에서 상당한 증가를 의미한다.
적절하게는, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 친화성은 공지의 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질에 대한 친화성의 적어도 1.5-배, 2-배, 5-배, 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 106-배 또는 그 이상이다.
적절하게는, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 친화성은 공지된 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질에 대한 친화성과 비교하여 상당히 증가한다.
다클론 항체가 바람직한 경우에, 생쥐, 토끼, 염소 또는 말과 같은 선택된 동물은 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드로 면역된다. 동물을 면역하는데 이용되는 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술을 이용하여 유도하거나, 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 필요에 따라서, 폴리펩티드는 운반체 단백질에 공액할 수 있다. 폴리펩티드에 화학적으로 결합시키는데 통상적으로 이용되는 운반체는 소 혈청 알부민, 티로글로블린, 키홀 림펫 헤모시아닌 등이다. 이후, 결합된 폴리펩티드를 이용하여 동물을 면역한다. 면역된 동물의 혈청을 채집하고 공지의 절차, 예를 들면, 면역친화성 크로마토그래피로 처리한다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드에 대한 단클론 항체는 당업자가 용이하게 만들 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여 단클론 항체를 만드는 일반적인 방법은 널리 알려져 있다(참조: Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256: 495-497(1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72(1983); Cole et al., 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.(1985)).
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드에 대한 단클론 항체 패널은 다양한 특성, 예를 들면, 이소타입, 에피토프, 친화성 등으로 선별할 수 있다. 단클론 항체는 그들이 지향되는 개별 폴리펩티드를 정제하는데 특히 유용하다. 대안으로, 목적 단클론 항체를 인코딩하는 유전자는 당분야에 공지의 기술인 PCR 기술을 이용하여 하이브리도마에서 분리하고 클론하며 적절한 벡터에서 발현시킬 수 있다.
인간 이외의 동물로부터 유래된 가변 영역이 인간 불변 영역에 결합되거나 융합된 키메라 항체가 이용될 수도 있다(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439(1987)).
항체는 예로써, 인간화(humanization) 반응을 통하여 개체에서 항원성을 적게 나타내도록 변형시킬 수 있다(Jones et al., Nature, 321, 522(1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534(1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709(1991); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 10029(1989); Gorman et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88, 34181(1991); Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421(1991)). 본 명세서에서 “인간화 항체”는 인간이외의 공여자 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인 내에서 선별된 아미노산과 CDR 아미노산이 인간 항체에서 등가의 아미노산 잔기로 대체된 항체 분자를 의미한다. 따라서, 인간화 항체는 인간 항체와는 상당히 유사하지만 공여자 항체의 결합 능력을 갖는다.
다른 대안에서, 항체는 “이중-특이성” 항체, 다시 말하면, 2가지 상이한 항원 결합 도메인을 보유하는 항체일 수 있는데, 각 도메인은 상이한 에피토프를 지향한다.
파지 전시 기술을 이용하여, 유관한 항체를 보유하는지에 대해 스크리닝되는 인간 림프구의 PCR 증폭된 V-유전자 레퍼토리, 또는 고유 라이브러리로부터 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 갖는 항체를 인코딩하는 유전자를 선별할 수 있다(McCafferty, J. et al.,(1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al.,(1992) Biotechnology 10, 779-783). 이들 항체의 친화성은 체인 셔플링(chain shuffling)에 의해 더욱 개선될 수 있다(Clackson, T. et al.,(1991) Nature 352, 624-628).
상기 기술에 의해 만들어지는 단클론이나 다클론 항체는 면역검사, 방사능면역검사(RIA), 또는 효소-연결된 면역흡착 검사(ELISA)에서 시약으로 이용되는 부가적인 용도를 갖는다. 이들 분야에서, 항체는 방사능동위원소, 형광 분자 또는 효소와 같은 분석적으로 검출가능한 시약으로 표지될 수 있다.
본 발명의 제 2와 제 3 특징의 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134; SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150에 열거된 폴리펩티드 서열, 또는 이들의 기능적 등가 폴리펩티드를 인코딩한다. 이들 핵산 분자들은 본 명세서에서 기술된 방법과 분야에 이용될 수 있다. 적절하게는, 본 발명의 핵산 분자는 본 명세서에 개시된 서열로부터 적어도 n개 연속 뉴클레오티드를 포함하는데, 이때 n은 특정 서열에 따라 10 또는 그 이상(예, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 또는 그 이상)이 된다.
본 발명의 핵산 분자에는 상기한 핵산에 상보적인 서열(가령, 안티센스 또는 프로브 목적) 역시 포함된다.
본 발명의 핵산 분자는 mRNA와 같은 RNA, 또는 cDNA, 합성 DNA, 게놈 DNA와 같은 DNA형이 될 수 있다. 클로닝, 화학적 합성 기술, 또는 이의 조합 기술을 이용하여 이들 핵산 분자를 얻을 수 있다. 생물체로부터 분리하거나, 또는 게놈이나 cDNA 라이브러리로부터 고체 상 포스포아미디트 화학적 합성과 같은 화학적 합성 기술을 이용하여 핵산 분자를 만들 수 있다. 일반적으로, RNA 분자는 DNA 서열의 in vitro 또는 in vivo 전사에 의해 만들 수 있다.
핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥으로 되어 있다. 단일 가닥 DNA는 센스 가닥으로 알려진 코딩 가닥이거나, 또는 안티-센스 가닥으로 알려진 비-코딩 가닥일 수 있다.
“핵산 분자”에는 DNA와 RNA 유사체, 예를 들면, 변형된 골격구조를 포함하는 유사체 및 펩티드 핵산(PNA) 역시 포함된다. 본 명세서에서 “PNA”는 가급적, 리신으로 종료되는 아미노산 잔기의 펩티드 골격에 연결된 적어도 5개 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 분자 또는 항-유전자 물질을 의미한다. 말단 리신은 조성물에 용해도를 부여한다. PNA는 세포 내에서 수명을 연장시키기 위해 페길화(pegylation)되는데, 여기서 이들은 상보적인 단일 가닥의 DNA와 RNA에 선호적으로 결합하고 전사체 신장을 종료시킨다(Nielsen, P.E. et al.(1 993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 본원에 개시된 하나이상의 핵산 분자의 코딩 서열과 일치할 수 있다.
이들 분자는 유전자 코드의 축퇴의 결과로써, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134; SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148, SEQ ID NO:150에 열거된 폴리펩티드를 인코딩하는 서로 다른 서열을 보유할 수도 있다. 이런 핵산 분자에는 성숙한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열 자체; 성숙한 폴리펩티드와 추가 코딩 서열, 예를 들면, pro-, pre-, prepro- 폴리펩티드 서열과 같은 리더 또는 분비 서열을 인코딩하는 코딩 서열; 상기한 추가 코딩 서열의 존부하에 전사, 리보솜 결합, mRNA 안정성에 중요한 역할을 수행하는 전사된 비-번역 서열과 같은 비-코딩 5'와 3' 서열(종료 신호 포함)을 비롯한 다른 비-코딩 서열과 함께 성숙한 폴리펩티드의 코딩 서열이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 핵산 분자에는 다른 기능을 제공하는 부가적인 아미노산을 인코딩하는 추가 서열이 포함될 수도 있다.
본 발명의 제 2와 제 3 특징의 핵산 분자는 제 1 특징의 폴리펩티드의 단편 또는 기능적 등가물을 인코딩할 수도 있다. 이런 핵산 분자는 자연-발생 대립형질 변이체와 같은 자연 발생 변이체이거나, 또는 자연 상태에서는 발생하지 않은 변이체이다. 이런 비-자연적 핵산 분자 변이체는 핵산 분자, 세포 또는 유기체에 적용될 수 있는 돌연변이유발 기술로 만들 수 있다.
이런 변이체에는 뉴클레오티드 치환, 결손 또는 삽입에 의해 상기 핵산 분자와는 상이한 변이체가 포함된다. 치환, 결손 또는 삽입에는 하나이상의 뉴클레오티드가 관계한다. 변이체는 코딩이나 비-코딩 또는 둘 모두에서 변화될 수 있다. 코딩 서열에서 변화는 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환, 결손 또는 삽입을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 당분야에 공지된 일반적인 방법을 이용하여, 유전자 생성물(폴리펩티드)의 클로닝, 프로세싱 및/또는 발현을 변화시키는 것을 비롯한 다양한 이유로 조작할 수 있다. 뉴클레오티드 서열을 조작하는데 이용될 수 있는 기술에는 무작위 단편화에 의한 DNA 셔플링 및 유전자 단편과 합성 올리고뉴클레오티드의 PCR 재조합 등이 포함된다. 부위-직접 돌연변이유발은 새로운 제한효소 부위를 삽입하고 글리코실화 패턴을 변경하며 코돈 선호도를 변화시키고 절단 변이체를 만들고 돌연변이를 도입하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 이질성 서열에 결찰시키면 복합된 핵산 분자는 융합 단백질을 인코딩하게 된다. 이런 복합된 핵산 분자 역시 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징에 포함된다. 가령, 폴리펩티드 활성 저해물질에 대한 폴리펩티드 라이브러리를 스크리닝하기 위하여, 복합된 핵산 분자를 이용하여 상업적으로 이용가능한 항체에 의해 인지될 수 있는 융합단백질을 발현하는 것이 유용하다. 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드 서열과 이질성 단백질의 서열사이에 절단 부위가 위치하도록 조작하여, 폴리펩티드가 이질성 단백질로부터 절단 및 정제될 수 있도록 한다.
본 발명의 핵산 분자에는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 부분적으로 상보적이고, 따라서 인코딩 핵산 분자에 혼성화되는 안티센스 분자 역시 포함된다. 올리고뉴클레오티드와 같은 안티센스 분자는 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 표적 핵산을 인지하고 특이적으로 결합하여 이의 전사를 방해해도록 설계될 수 있다(참조: Cohen, J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435(1989), Okano, J. Neurochem. 56. 560(1991); O'Connor, J. Neurochem 56, 560(1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6, 3073(1979); Cooney et al., Science 241, 456(1988); Dervan et al., Science 251, 1360(1991)).
본 명세서에서 “혼성화(반응)”는 수소 결합에 의해 2개 핵산 분자의 상호 연합을 의미한다. 일반적으로, 한 분자는 고형 서포트에 고정되고, 다른 분자는 용액에 자유로운 형태로 존재한다. 이후, 수소 결합이 일어나기 좋은 조건하에서 두 분자를 서로 접촉시킨다. 이런 결합에 영향을 주는 인자는 아래와 같다; 용매의 형태와 용적; 반응 온도; 혼성화 시간; 교반; 고형 서포트에 액상 분자의 비-특이적 부착을 차단하는 물질(Denhardt's 시약 또는 BLOTTO); 분자의 농도; 분자의 연합 속도를 증가시키는 화합물(덱스트란 설페이트 또는 폴리에틸렌 글리콜)의 이용; 혼성화이후 세척 조건의 엄밀도(참조: Sambrook et al. [supra]).
표적 분자에 완전하게 상보적인 분자의 혼성화 저해는 당분야에 공지된 혼성화 분석법으로 검사할 수 있다(Sambrook et al .,supral). 실질적으로 상동한 분자는 다양한 엄밀도 조건하에 표적 분자에 완전히 상동한 분자의 결합을 경쟁하고 저해하게 된다(Wahl, G.M. and S.L. Berger 1987, Methods Enzymol. 152:399-407; Kimmel, A.R. 1987, Methods Enzymol. 152:507-511).
“엄밀도”란 상이한 분자의 연합보다 매우 유사한 분자들의 연합을 유리하게 하는 혼성화 반응 조건을 의미한다. 높은 엄밀도 혼성화 조건은 아래와 같이 정의될 수 있다: 50% 포름아미드, 5XSSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산3나트륨), 5O mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x Denhardts 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 20 ㎍/㎖ 변성되고 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 내에 42℃에서 하룻밤동안 배양, 이후 0.1X SSC 내에 65℃에서 필터 세척. 낮은 엄밀도 조건은 35℃에서 수행되는 혼성화 반응이다(Sambrook et al. [supra]). 적절하게는, 혼성화에 이용되는 조건은 높은 엄밀도 조건이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자에 대하여 전체 길이의 적어도 70% 동일한 핵산 분자 및 이런 핵산 분자에 실제적으로 상보적인 핵산 분자가 된다. 적절하게는, 이런 코딩 서열에 대하여 전체 길이의 적어도 80% 동일한 핵산 분자, 또는 이런 핵산 분자에 상보적인 핵산 분자이다. 이와 관련하여, 전체 길이의 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98%, 99% 또는 그 이상으로 동일한 핵산 분자가 특히 선호된다. 이와 관련하여, 바람직한 구체예는 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능이나 활성을 보유하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 분자를 검출하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다: (a) 이중나선을 형성하는 혼성화 조건하에서 생물학적 시료와 본 발명의 핵산 프로브를 접촉시키고; (b) 형성된 이중나선을 검출한다.
본 발명에 이용될 수 있는 분석법과 관련하여 아래에 부언된 바와 같이, 상기한 핵산 분자는 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드를 인코딩하는 전장 cDNA와 게놈 클론을 분리하고 이런 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자와 높은 서열 유사성을 갖는 상동성이나 오르토로거스(orthologous) 유전자의 cDNA와 게놈 클론을 분리하기 위한 RNA, cDNA, 또는 게놈 DNA의 혼성화 프로브로 이용될 수 있다.
이와 관련하여, 당분야에 공지된 기술 중에서 아래의 기술이 이용되고, 설명 목적으로 하기에 제시된다. DNA 염기서열분석과 분석 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 일반적으로 이용할 수 있으며, 본 명세서에 기술된 본 발명의 많은 구체예를 실행하는데 실제로 이용된다. 이들 방법은 DNA 중합효소 I의 클리노우 단편(Klenow fragment), Sequenase(US Biochemical Corp, Cleveland, OH), Taq 중합효소(Perkin Elmer), 열안정성 T7 중합효소(Amersham, Chicago, IL), 또는 ELONGASE Amplification System(Gibco/BRL, Gaithersburg, MD)에서 볼 수 있는 중합효소와 프루프-리딩(proof-reading) 엑소뉴클레아제의 조합과 같은 효소 등을 이용할 수 있다. 적절하게는, 염기서열분석 과정은 Hamilton Micro Lab 2200(Hamilton, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler(PTC200; MJ Research, Watertown, MA), ABI Catalyst 373과 377 DNA Sequencers(Perkin Elmer)와 같은 기계를 이용하여 자동화된다.
INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드와 등가의 기능을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 분리하는 한가지 방법은 당분야에서 인정되는 표준 과정을 이용하여 자연 프로브 또는 인공-설계된 프로브로 게놈이나 cDNA 라이브러리를 탐색하는 것이다(참조: "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al.(eds). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, New York, 1989,1992). 적절한 인코딩 유전자의 핵산 서열(SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147 및/또는 SEQ ID NO:149)에 상응하거나 이들에 상보적인 적어도 15개, 바람하게는 30개, 더욱 바람하게는 적어도 50개 연속 염기를 포함하는 프로브가 특히 유용한 프로브이다. 이런 프로브는 확인을 용이하게 하는 분석적으로 검출가능한 물질로 표지된다. 유용한 반응물에는 방사능동위원소, 형광 염료 및 검출가능한 산물 형성을 촉매할 수 있는 효소 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 프로브를 이용하면 당업자는 인간, 포유류 또는 다른 동물 종으로부터 목적 단백질을 인코딩하는 게놈 DNA, cDNA, RNA 폴리뉴클레오티드의 상보적인 사본을 분리하고, 이런 공급원에서 예로써, 이러한 집단, 유형 및/또는 아형의 다른 구성원에 대한 관련된 서열을 추가 스크리닝할 수 있다.
많은 경우에, 분리된 cDNA 서열은 폴리펩티드를 인코딩하는 부분이 통상적으로, 5' 말단에서 짧게 절단되기 때문에 불완전하다. 여러 방법을 이용하여 전장 cDNA를 수득하거나 짧은 cDNA를 연장할 수 있다. 이들 서열은 부분 뉴클레오티드 서열을 이용하고, 프로모터와 조절 요소와 같은 상류 서열을 검출하는 당분야에 공지된 다양한 방법을 활용하여 연장할 수 있다. 가령, 이용될 수 있는 한가지 방법은 cDNA 말단의 신속 증폭 방법에 기초한다(RACE; Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988). MarathonTM 기술(Clontech Laboratories Inc.)로 예시되는 이러한 기술의 최근 변형으로, 더욱 긴 cDNA에 대한 검색이 상당히 단순화되었다. 약간 다른 기술인 “제한-부위” PCR에서는 범용 프라이머를 이용하여 공지된 좌위에 인접하는 미지의 핵산 서열을 검색한다(Sarkar, G.(1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). 또한, 역 PCR을 이용하여 공지된 부분에 기초한 다변 프라이머를 이용하여 서열을 연장 또는 증폭할 수 있다(Triglia, T. et al.(1988) Nucleic Acids Res. 16:8186). 이용될 수 있는 다른 방법은 인간과 효모 인공 염색체 DNA 내에서 공지 서열에 인접한 DNA 단편의 PCR 증폭을 수반하는 포획 PCR이다(Lagerstrom, M. et al.(1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119). 미지 서열을 확인하는데 이용할 수 있는 또 다른 방법은 Parker, J.D. et al.,((1991); Nucleic Acids Res. 19:3055-3060)의 방법이다. 이에 더하여, PCR, nested 프라이머 및 게놈 DNA를 보행하는 PromoterFinderTM 라이브러리(Clontech, Palo Alto, CA)를 이용할 수 있다. 이런 과정은 라이브러리 스크리닝이 필요하지 않고, 인트론/엑손 접합 부분을 찾는데 유용하다.
전장 cDNA를 스크리닝하는 경우에, 더욱 큰 cDNA를 포함하도록 크기-선별된 라이브러리를 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 유전자의 5' 부분을 포함하는 서열을 더욱 많이 보유하는 무작위-프라임된 라이브러리가 바람직하다. 무작위-프라임된 라이브러리는 올리고 d(T) 라이브러리가 전장 cDNA를 만들지 못하는 경우에 특히 유용하다. 게놈 라이브러리는 서열을 5' 비-전사된 조절 부분으로 연장하는데 이용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 염색체 위치확인(chromosome localization)에 이용할 수 있다. 이런 기술에서, 핵산 분자는 개별 인간 염색체상의 특정 위치로 특이적으로 표적되고 상기 위치에서 혼성화될 수 있다. 본 발명에 따른 염색체에 관련된 서열의 매핑(mapping)은 유전자-연관된 질환과 이들 서열의 상관관계를 확인하는데 중요한 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치로 매핑되면, 염색체 상에서 서열의 물리적인 위치는 유전자 지도 데이터와 연계될 수 있다. 이런 데이터는 예로써, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(available on-line through Johns Hopkins University Welch Medical Library)에서 찾아볼 수 있다. 이후, 연관 분석(linkage analysis)(물리적으로 인접한 유전자의 공동 유전)을 통하여 동일한 염색체 부분에 매핑된 유전자와 질병의 상관관계를 확인한다. 위치 클로닝 또는 다른 유전자 발견 기술을 이용하면 질병 유전자를 검색하는데 귀중한 정보를 얻을 수 있다. 질병 또는 증후군이 특정 게놈 부분에 유전적으로 연관되어 위치하는 경우에, 상기 부분에 매핑하는 서열은 추가 조사를 위한 연관된 유전자 또는 조절 유전자를 나타낸다. 핵산 분자는 정상 개체, 보균자 또는 병든 개체 사이에 전위(translocation), 역전(inversion) 등으로 인한 염색체상 위치에서 차이를 검출하는 데에도 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 조직 위치측정(tissue localization)에도 유망하다. 이런 기술을 이용하면 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA를 검출하여 조직 내에서 폴리펩티드의 발현 패턴을 결정할 수 있다. 이런 기술에는 in situ 혼성화 기술 및 PCR과 같은 뉴클레오티드 증폭 기술 등이 포함된다. 이들 연구 결과는 유기체 내에서 폴리펩티드의 정상적인 기능을 제시한다. 이에 더하여, mRNA의 정상 발현 패턴과 돌연변이 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 발현 패턴의 비교 연구는 질병에서 돌연변이 폴리펩티드의 역할에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이런 부적절한 발현은 일시적이거나, 지엽적이거나, 또는 정량적인 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 내생적 발현을 하향-조절하기 위하여 유전자 침묵(gene silencing) 방법 역시 수행될 수 있다. RNA 간섭(RNAi) (Elbashir, SM et al., Nature 2001, 411, 494-498)는 이용될 수 있는 서열 특이적 전사후 유전자 침묵의 한가지 방법이다. 짧은 dsRNA 올리고뉴클레오티드를 시험관내에서 합성하고 세포 내에 도입한다. 이들 dsRNA 올리고뉴클레오티드의 서열 특이적인 결합은 표적 mRNA의 분해를 유도하거나, 또는 표적 단백질 발현을 감소시키거나 제거한다.
상기한 유전자 침묵 방법의 효능은 폴리펩티드 발현의 측정(가령, 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로)을 통하여 평가하고, RNA 수준에서 TaqMan-기초된 방법을 이용하여 평가할 수 있다.
본 발명의 벡터는 본 발명의 핵산 분자를 포함하며, 클로닝이나 발현 벡터가 될 수 있다. 본 발명의 숙주 세포는 벡터에 의해 형질전환, 형질감염 또는 형질도입된 진핵이나 원핵 세포이다.
본 발명의 폴리펩티드는 숙주 내에 포함된 벡터에서 그들의 인코딩된 핵산 분자의 발현으로 재조합 형태로 만들어질 수 있다. 이런 발현 방법은 당분야에 공지되어 있다(Sambrook et al(supra); Fernandez & Hoeffler(1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto).
일반적으로, 필요 숙주에서 폴리펩티드를 만들기 위하여 핵산 분자를 유지, 증폭 또는 발현하는데 적절한 임의의 시스템 또는 벡터를 이용한다. 적절한 뉴클레오티드 서열은 다양한 널리 공지된 통상적인 기술, 예를 들면, Sambrook et al.,(supra)에 기술된 기술에 의해 발현 시스템 내로 삽입한다. 일반적으로, 인코딩 유전자는 프로모터, 리보솜 결합 부분(박테리아 발현의 경우), 선택적으로 오퍼레이터와 같은 조절 요소의 통제하에 위치시켜, 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열이 형질전환된 숙주 세포에서 RNA 내로 전사되도록 한다.
적절한 발현 시스템에는 예로써, 크로모좀, 에피솜, 바이러스-유도된 시스템 등이 포함되는데, 예를 들면 세균성 플라스미드, 박테리오파지, 트랜스포존, 효모 에피솜, 삽입 요소, 효모 염색체 원소; 배큘로바이러스, 파포바 바이러스(가령, SV40), 우두 바이러스, 아데노바이러스, 가금류 폭스 바이러스, 가사공수병 바이러스, 레트로바이러스와 같은 바이러스, 또는 이들의 조합, 예를 들면, 플라스미드 및 코스미드와 파게미드를 비롯한 박테리오파지 유전자 요소로부터 유래된 조합 등으로부터 유래된 벡터가 포함된다. 또한, 인간 인공 염색체(HAC)를 이용하여 플라스미드 내에서 유지되고 발현될 수 있는 것보다 더욱 큰 DNA 단편을 운반할 수 있다. INSP141, INSP142, INSP143, INSP144와 관련하여 본 발명에 이용하기 적합한 벡터의 실례는 pCR4-TOPO-INSP142, pCR4-TOPO-INSP141, pCR4-TOPO-INSP143-EC, pDEST12.2_INSP141-6HIS-V1, pEAK12d_INSP141-6HIS-V1, pENTR_INSP141-6HIS-V1, pEAK12d_INSP143-EC-6HIS-V1, pDEST12d_INSP143-EC-6HIS-V1, pDONR-Zeo_INSP143-EC-6HIS-V1, pEAK12d-INSP142-6HIS이다.
특히 적절한 발현 시스템에는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(가령, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(가령, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 발현 벡터(가령, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템이 포함된다. 무-세포(cell-free) 번역 시스템을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 만들 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자의 숙주 세포 내로의 도입은 많은 표준 실험 매뉴얼에 기술된 방법으로 달성할 수 있다(Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology(1986); Sambrook et al.,(supra)). 특히 적절한 방법에는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 형질감염, 미세주입, 양이온 지질-매개된 형질감염, 전기천공, 형질도입, 스크레이프 로딩(scrape loading), 발리스틱 도입(ballistic introduction) 또는 감염 등이 포함된다(참조: Sambrook et al., 1989 [supra]; Ausubel et al., 1991 [supra]; Spector, Goldman & Leinwald 1998). 진핵 세포에서 발현 시스템은 필요에 따라 달라 일시적(가령, 에피솜)이거나 영구적(염색체 통합)일 수 있다.
인코딩 핵산 분자에는 소포체의 내강, 세포질 공간 또는 세포외 환경으로 번역된 폴리펩티드의 분비를 위한 조절 서열, 예를 들면, 신호 펩티드 또는 리더 서열을 인코딩하는 서열이 포함되거나 포함되지 않을 수 있다. 이런 신호는 폴리펩티드에 내생이거나 이질성 신호일 수 있다. 리더 서열은 번역후 가공에서 세균 숙주에 의해 제거될 수 있다.
조절 서열 이외에, 숙주 세포 성장과 관련된 폴리펩티드의 발현 조절을 가능하게 하는 조절 서열을 추가하는 것도 바람직하다. 조절 서열의 예는 조절 화합물의 존재를 비롯한 화학적 또는 물리적인 자극, 또는 다양한 온도 또는 대사 조건에 반응하여 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 서열이다. 조절 서열은 벡터의 비-번역 부분, 예를 들면, 인헨서, 프로모터, 5'와 3' 비-번역 부분이다. 이들은 숙주 세포 단백질과 상호작용하여 전사 및 번역을 수행한다. 이런 조절 서열은 강도 및 특이성에서 가변적이다. 이용된 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 구조성과 유도성 프로모터를 비롯한 많은 임의의 적절한 전사 및 번역 요소를 이용할 수 있다. 가령, 세균 시스템 내에서 클로닝되는 경우에, Bluescript 파게미드의 하이브리드 lacZ 프로모터(Stratagene, LaJolla, CA), pSportITM 플라스미드(Gibco BRL) 등과 같은 유도성 프로모터를 이용할 수 있다. 곤충 세포에는 배큘로바이러스 폴리헤드린 프로모터를 이용할 수 있다. 식물 세포의 게놈(가령, 열 쇼크, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스(가령, 바이러스성 프로모터 또는 리더 서열)로부터 유래된 프로모터 또는 인헨서는 벡터 내로 클론될 수 있다. 포유동물 세포 시스템에서는 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터가 바람직하다. 서열의 다중 사본을 포함하는 세포주를 만들 필요가 있는 경우에, 적절한 선별가능 마커와 함께, SV40 또는 EBV에 기초한 벡터를 이용할 수 있다.
특정 핵산 코딩 서열이 적절한 조절 서열을 갖는 벡터에 위치하도록 발현벡터를 작제하는데, 조절 서열에 대한 코딩 서열의 위치와 방향은 코딩 서열이 조절 서열의 “통제”하에 전사되도록 한다, 다시 말하면, 조절 서열에서 DNA 분자에 결합하는 RAN 중합효소는 코딩 서열을 전사한다. 일부 경우에, 리딩 프레임을 유지하는 적절한 방향으로 조절 서열에 부착되도록 서열의 변화가 필요할 수도 있다.
벡터 내로 코딩 서열을 삽입하기에 앞서 제어 서열 및 다른 조절 서열을 핵산 코딩 서열에 결찰시킬 수도 있다. 대안으로, 코딩 서열은 제어 서열 및 적절한 제한 부위를 이미 포함하고 있는 발현벡터 내로 직접 클론될 수 있다.
재조합 폴리펩티드를 장기간 다량 생산하고자 하는 경우에, 안정적인 발현이 바람직하다. 가령, 목적 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주는 동일하거나 별개의 벡터 상에 바이러스 복제 원점 및/또는 내생적 발현 요소와 선별가능 마커 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입이후, 세포는 선별가능 배지로 이전하기에 앞서, 풍부한 배지에서 1-2일간 생장시킨다. 선별가능 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하는 것인데, 이의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 생장 및 회수를 가능하도록 한다. 안정적으로 형질전환된 세포의 저항성 클론은 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 이용하여 증식시킬 수 있다.
발현을 위한 숙주로 이용가능한 포유류 세포주는 당분야에 공지되어 있는데, 여기에는 중국 햄스터 난소(CHO), HeLa, 아기 햄스터 신장(BHK), 원숭이 신장(COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, Bowes 흑색종, 인간 간세포 암종(예, Hep G2) 세포 및 다른 다양한 세포주를 포함하나 이들에 국한되지 않는, American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 입수가능한 많은 영속화 세포주가 포함된다.
배큘로바이러스 시스템의 경우에, 배큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템의 재료는 키트 형태로 상업적으로 구입가능하다(Invitrogen, San Diego CA(the "MaxBac" 키트)). 이들 기술은 당업자에 전반적으로 공지되어 있고, Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555(1987)에서 상세하게 기술한다. 이런 시스템에 사용하기 특히 적합한 숙주 세포는 초파리(Drosophila) S2와 거염벌레(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포이다.
많은 식물 세포 배양액 및 전체 식물 유전자 발현 시스템이 당분야에 공지되어 있다. 적절한 식물 세포 유전자 발현 시스템의 예에는 US 5,693,506; US 5,659,122; US 5,608,143에 기술된 것들이 포함된다. 식물 세포 배양액 내에서 유전자 발현의 다른 예는 Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863(1991)에서 기술된다.
특히, 원형질체를 분리할 수 있고 온전한 재생 식물로 배양할 수 있는 모든 식물을 이용하여 전이된 유전자를 보유하는 전체 식물을 회수할 수 있다. 실질적으로, 모든 식물이 사탕수수, 사탕무, 목화, 과일, 다른 나무, 콩과식물, 채소 등을 포함하지만 이들에 국한되지 않는 배양된 세포 또는 조직으로부터 재생될 수 있다.
특히 바람직한 세균성 숙주 세포에는 연쇄상구균(streptococci), 포도상구균(staphylococci), 대장균(E. coli), 스트렙토미세스(Streptomyces), 바실루스 서브틸리스 세포(Bacillus subtilis) 등이 포함된다.
진균 발현에 적합한 숙주 세포에는 효모 세포(가령, S. cerevisiae) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포 등이 포함된다.
당분야에 공지된 선별 시스템을 이용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 전형적으로, tk- 세포 또는 aprt± 세포에서 각각 이용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 카이나제 유전자(Wigler, M. et al.,(1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트란스퍼라제(Lowy, I. et al.(1980) Cell 22:817-23) 유전자이다.
또한, 선별을 위한 기초로서 항-대사물질, 항생제 또는 제초제 내성을 이용할 수 있다; 가령, 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)(Wigler, M. et al.(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); 아미노글리코시드 네오마이신 및 G418에 내성을 부여하는 npt(Colbere-Garapin, F. et al(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); 클로로설푸론 및 포스피노트로신 아세틸트랜스퍼라아제에 각각 내성을 부여하는 als 또는 pat 등이 포함된다. 부가적인 선별가능 유전자에 대해서도 기술되는데, 이들의 예는 당업자에게 명백하다.
마커 유전자의 발현 유무가 목적 유전자의 존재를 암시하긴 하지만, 이의 존재와 발현은 확증을 필요로 한다. 가령, 관련 서열이 마커 유전자 서열 내로 삽입되는 경우에, 마커 유전자 기능의 부재로 적절한 서열을 포함하는 형질전환된 서열을 확증할 수 있다. 대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터 통제하에 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열과 나란하게 위치시킬 수 있다. 일반적으로, 유도 또는 선별에 대한 반응으로 마커 유전자의 발현은 나란히 위치하는 유전자의 발현을 암시한다.
대안으로, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고 상기 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포는 당분야에 공지된 다양한 절차로 확인할 수 있다. 이들 절차에는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화 및 핵산이나 단백질의 검출 또는 정량을 위한 막, 용액 또는 칩 기초한 기술을 수반하는 단백질 생물분석, 예를 들면, 형광 활성화된 세포 소팅(FACS) 또는 면역검사 기술(효소-결합된 면역흡착 검사[ELISA] 및 방사능면역검사[RIA]) 등이 포함된다(참조: Hampton, R. et al.(1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, MN); Maddox, D.E. et al.(1983) J. Exp. Med, 158, 1211-1216).
다양한 라벨 및 공액 기술은 당분야에 공지되어 있고, 다양한 핵산과 아미노산 검사에 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자와 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 혼성화 또는 PCR 프로브의 생산 수단에는 표지된 폴리뉴클레오티드를 이용한 올리고라벨링, 새김눈 번역, 말단-라벨링 또는 PCR 증폭 등이 포함된다. 대안으로, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열은 mRNA 프로브를 만들기 위해 벡터 내로 클론될 수 있다. 이런 벡터는 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 구입가능하며 T7, T3 또는 SP6과 같은 적절한 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오티드를 추가하여 in vitro에서 RNA 프로브를 합성하는데 이용할 수 있다. 이들 과정은 상업적으로 구입가능한 키트를 이용하여 수행할 수 있다(Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo, MI); Promega(Madison WI); U.S. Biochemical Corp.,(Cleveland, OH)).
용이한 검출을 위하여 이용하기 적합한 리포터 분자에는 방사능핵종, 효소, 형광, 화학발광이나 발색 물질, 기질, 보조인자, 저해물질, 자성 입자 등이 포함된다.
본 발명에 따른 핵산 분자를 이용하여 유전자도입 동물, 특히, 설치류 동물을 만들 수 있다. 이런 유전자도입 동물 역시 본 발명의 특징에 속한다. 체세포를 변형하거나 유전가능한 변형을 통합하는 생식세포계 요법을 이용하여 유전자도입 동물을 만들 수 있다. 이런 유전자도입 동물은 특히, 본 발명의 폴리펩티드의 조절물질로서 효과적인 약제 분자에 대한 동물 모형을 만드는데 이용될 수 있다.
공지의 방법으로 재조합 세포 배양액으로부터 폴리펩티드를 회수하고 정제할 수 있는데, 이용할 수 있는 방법으로는 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온이나 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피 등이 포함된다. 정제에는 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 특히 유용하다. 단백질을 재접힘하기 위한 널리 공지된 기술을 이용하여, 정제 및/또는 분리 과정동안 폴리펩티드가 변성되는 경우에 활성 형태를 재생할 수 있다.
원하는 경우에 특화된 벡터 작제를 이용하여, 용해성 단백질의 정제를 조장하는 폴리펩티드 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 서열에 결합시킴으로써 단백질 정제를 촉진할 수 있다. 이런 정제-촉진 도메인에는 고정된 금속에서 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속-킬레이트화 펩티드, 고정된 면역글로불린에서 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인; FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, WA)에 이용되는 도메인 등이 포함된다. 정제 도메인과 본 발명의 폴리펩티드 사이에, 인자 XA 또는 엔테로키나아제(Invitrogen, San Diego, CA)에 특이적인 것들과 같은 절단가능 링커 서열을 포함시켜 정제를 촉진할 수 있다. 이와 같은 발현 벡터는 티오레독신(thioredoxin) 또는 엔테로키나아제(enterokinase) 절단 부위를 선행하는 여러 히스티딘 잔기에 융합된 본 발명의 폴리펩티드를 보유하는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 IMAC(고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피)(Porath, J. et al.(1992), Prot. Exp. Purif. 3: 263-281)에 의한 정제를 촉진하는 반면, 티오레독신 또는 엔테로키나아제 절단 부위는 융합 단백질로부터 폴리펩티드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 포함하는 벡터는 Kroll, D.J. et al.(1993; DNA Cell Biol. 12.441-453)에서 기술된다.
스크리닝 검사에 이용되는 폴리펩티드를 발현하는 경우에, 일반적으로 폴리펩티드는 이를 발현하는 숙주 세포의 표면에서 생산되도록 하는 것이 바람직하다. 이런 경우에, 스크리닝 검사에 앞서, 예로써 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 면역친화성 기술 등을 이용하여 숙주 세포를 수득한다. 폴리펩티드가 배지 내로 분비되는 경우에, 발현된 폴리펩티드를 회수하고 정제하기 위하여 배지를 회수할 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생산되는 경우에, 세포를 먼저 용해시키고, 폴리펩티드를 회수한다.
본 발명의 폴리펩티드는 다양한 약제 스크리닝 기술을 이용하여 화합물 라이브러리를 스크리닝하는데 이용할 수 있다. 이들 화합물은 본 발명의 유전자의 발현 수준 또는 본 발명의 폴리펩티드의 활성 수준을 증가(항진) 또는 저해(길항)할 수 있는데, 이 또한 본 발명의 특징이 된다. 바람직한 화합물은 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현을 변화시키거나, 또는 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드 활성을 조절하는데 유효하다.
항진제 또는 길항제 화합물은 예로써, 세포, 무-세포 제조물, 화학 라이브러리 또는 자연 생성물 혼합물로부터 분리할 수 있다. 이들 항진제 또는 길항제는 자연이나 변형된 기질, 리간드, 효소, 수용체, 구조적 또는 기능적 모방체 등이 될 수 있다. 이런 스크리닝 기술에 대하여 Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)를 참조한다.
길항제로서 가장 유망한 화합물은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 경우에 상기 폴리펩티드의 생물학적 효과를 유도하지 않는 분자이다. 유망한 항진제에는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하여 이의 활성을 저해 또는 제거할 수 있는 소형 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 항체 등이 포함된다. 이런 방식으로, 정상적인 세포 결합 분자에 폴리펩티드의 결합이 저해되고, 상기 폴리펩티드의 정상적인 생물학적 활성이 차단된다.
이런 스크리닝 기술에 이용되는 본 발명의 폴리펩티드는 용액에서 유리된 형태, 고형 서포트에 고착된 형태, 세포 표면에서 생성된 형태 또는 세포내에 위치하는 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 이런 스크리닝 절차는 검사 화합물과 접촉하는 폴리펩티드를 발현하는 적절한 세포 또는 세포막을 이용하여 결합, 또는 기능적 반응의 촉진이나 저해를 관찰하는 단계를 수반한다. 검사 화합물과 접촉된 세포의 기능적 반응은 검사 화합물과 접촉하지 않은 대조 세포의 기능적 반응과 비교한다. 이런 검사에서는 적절한 검출 시스템을 이용하여, 검사 화합물이 폴리펩티드 활성화에 의해 발생되는 신호를 유발하는 지를 평가한다. 일반적으로, 활성화의 저해물질은 공지된 항진제의 존재하에 분석하고, 항진제에 의한 활성화에 대한 효과는 검사 화합물의 존재하에 관찰한다.
본 명세서에 기술된 유형의 검사법에서 검출가능 신호를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 특정 실례는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현하는 구조체, 또는 LBD와 같은 단편을 GAL4 DNA 결합 도메인과의 융합으로, 리포터 플라스미드와 함께 세포 내로 동시-형질감염시키는 것인데, 이의 예는 pFR-Luc(Stratagene Europe, Amsterdam, The Netherlands)이다. 이러한 특정 플라스미드는 루시페라제 유전자의 발현을 통제하는 GAL4 결합 부위의 5개 직별 반복(tandem repeat)과 함께 합성 프로모터를 보유한다. 잠재적 리간드가 이들 세포에 부가되면, 이는 GAL4-폴리펩티드 융합체에 결합하고 루시페라제 유전자의 전사를 유도한다. 루시페라제 발현의 수준은 발광 판독기를 이용하여 이의 활성으로 모니터할 수 있다(참조: Lehman et al. JBC 270, 12953, 1995; Pawar et al. JBC, 277, 39243, 2002).
본 발명의 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제를 확인하는 다른 바람직한 방법은 아래의 단계를 포함한다:
(a) 임의의 고형 서포트(가령, 구체, 플레이트, 매트릭스 서포트, 칩)에 고정된 폴리펩티드와 표지되거나 표지되지 않은 화합물을 접촉시키고, 라벨 또는 화합물 자체의 존재를 평가함으로써 화합물을 검출하며;
(b) 폴리펩티드에 결합을 허용하는 조건하에서, 폴리펩티드를 세포막에 인공적으로 고정하거나, 또는 상기 폴리펩티드에 대한 화합물의 결합에 반응하여 검출가능 신호를 제공할 수 있는 제 2 성분과 연합되는 키메라 수용체를 구성함으로써 표면상에 상기 폴리펩티드를 발현하는 세포와 선별되는 화합물을 접촉시키고;
(c) 화합물과 폴리펩티드의 상호작용으로 발생된 신호 수준과 화합물이 없을 경우의 신호 수준과 비교함으로써 상기 화합물이 상기 폴리펩티드에 결합하여 이를 활성화시키는지 또는 저해하는지를 결정한다.
가령, 펩티드 보조-활성인자(Norris et al, Science 285, 744, 1999)의 존재하에 폴리펩티드에 결합된 리간드의 FRET 검출과 같은 방법을 이용할 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 앞서 기술된 포괄적인 방법에는 폴리펩티드에 대한 표지되거나 표지되지 않은 리간드의 존재하에 항진제 또는 길항제를 확인하는 단계가 추가로 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제를 확인하는 방법의 또 다른 구체예는 아래의 단계를 포함한다:
폴리펩티드에 결합을 허용하는 조건하에서 후보 화합물 존재하에 임의의 고체 또는 이의 세포 표면에서 본 발명의 리간드 폴리펩티드의 결합 저해를 결정하고; 상기 폴리펩티드에 결합된 리간드의 양을 결정한다. 리간드의 결합을 감소시킬 수 있는 화합물은 항진제 또는 길항제로서 작용하는 경쟁물질로서 간주된다. 적절하게는, 리간드는 표지된다.
더욱 구체적으로, 폴리펩티드 길항제 또는 항진제 화합물을 스크리닝하는 방법은 아래와 같은 단계를 포함한다:
(a) 임의의 고형 서포트 또는 세포 표면 상에서 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드를 보유하는 세포막과 함께, 표지된 리간드를 배양하고;
(b) 고형 서포트, 전체 세포 또는 세포막 상에서 폴리펩티드에 결합된 표지된 리간드의 양을 측정하고;
(c) (a) 단계의 고형 서포트, 전체 세포 또는 세포막 상에 고정된 폴리펩티드 및 표지된 리간드의 혼합물에 후보 화합물을 첨가하여 혼합물이 평형에 이르도록 하고;
(d) (c) 단계이후 고정된 폴리펩티드 또는 전체 세포 또는 세포막에 결합된 표지된 리간드의 양을 측정하고;
(e) (b)와 (d) 단계에서 결합된 표지된 리간드에서 차이를 비교하고, (d) 단계에서 결합 감소를 유도하는 화합물은 항진제 또는 길항제로서 간주한다.
이들 폴리펩티드는 앞서 기술된 검사법에서 용량-의존성 방식으로 다양한 생리학적 과정과 병리학적 과정을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 “기능적 등가물”은 앞서 기술된 검사법에서 용량-의존성 방식으로 동일한 조절 활성을 보이는 임의의 폴리펩티드를 포괄한다. 이런 용량-의존성 활성의 정도가 본 발명의 폴리펩티드에서와 동일할 필요는 없지만, “기능성 등가물”은 일정한 활성 검사에서 본 발명의 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 용량-의존성을 보인다.
본 발명의 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드는 세포 성장과 분화를 조절할 수 있다. 따라서, INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 생물학적 활성은 세포 성장과 분화의 연구가 가능한 시스템, 예를 들면, 시험관내 조직 배양 시스템에서 조사할 수 있다. 세포 증식의 촉진 또는 저해는 다양한 검사법으로 측정할 수 있다.
가령, 세포 성장 저해를 관찰하기 위하여, 고체 또는 액체 배지를 이용할 수 있다. 고체 배지에서, 성장이 저해되는 세포는 형성된 콜로니의 크기를 비교함으로써 실험 대상 세포군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 액체 배지에서, 성장 저해는 배양 배지 탁도 또는 표지된 티미딘의 DNA 함입을 측정함으로써 조사될 수 있다. 전형적으로, 새로 합성된 DNA 내로 뉴클레오시드 유사체의 함입은 세포 개체군에서 증식(즉, 활성 세포 성장)을 측정하는데 이용된다. 가령, 브로모디옥시우리딘(BrdU)은 DNA 라벨링 시약으로서 이용될 수 있고, 항-BrdU 생쥐 단클론 항체는 검출 시약으로서 이용될 수 있다. 상기 항체는 브로모디옥시우리딘이 함입된 DNA를 포함하는 세포에만 결합된다. 이러한 검사법과 공동으로, 다수의 검출 방법, 예를 들면, 면역형광, 면역조직화학, ELISA, 비색 방법을 이용할 수 있다. 브로모디옥시우리딘(BrdU)과 항-BrdU 생쥐 단클론 항체를 포함하는 키트는 Boehringer Mannheim(Indianapolis, IN)으로부터 상업적으로 구입가능하다.
세포 분화에 대한 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 효과는 다양한 양의 폴리펩티드를 줄기 세포 또는 배아 세포와 접촉시키고, 이들 줄기 세포 또는 배아 세포의 분화에 대한 효과를 관찰함으로써 측정할 수 있다. 결과의 세포는 조직-특이적 항체와 검경을 이용하여 확인할 수 있다.
또한, INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드는 앞서 기술된 검사법에서 용량-의존성 방식으로 면역 및/또는 신경 줄기 세포 증식과 분화를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 “기능성 등가물”은 앞서 기술된 검사법에서 용량-의존성 방식으로 동일한 성장과 분화 조절 활성을 보이는 임의의 폴리펩티드를 포괄한다. 이런 용량-의존성 활성의 정도가 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드에서와 동일할 필요는 없지만, “기능성 등가물”은 일정한 활성 검사에서 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드에 실질적으로 유사한 용량-의존성을 보인다.
상기한 특정 구체예에서, 간단한 결합 검사법을 이용할 수 있는데, 여기서 폴리펩티드를 보유하는 표면에 검사 화합물의 부착은 검사 화합물과 직접 또는 간접으로 결합된 라벨에 의해 검출되거나 표지된 경쟁 물질과의 경쟁을 수반하는 검사법으로 검출된다. 다른 구체예에서, 경쟁성 약제 스크리닝 검사법을 이용할 수 있는데, 여기서 폴리펩티드에 결합할 수 있는 중화 항체는 결합에 대하여 검사 화합물과 특이적으로 경쟁한다. 이런 방식으로, 항체는 폴리펩티드에 특이적인 결합 친화성을 보유하는 검사 화합물의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다.
세포에서 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 생산에 대한 첨가된 검사 화합물의 효과를 검출하는 검사법을 설계할 수도 있다. 가령, 당분야에 공지된 표준 방법으로 단클론이나 다클론 항체를 이용하여 폴리펩티드의 분비되거나 세포-결합된 수준을 측정하는 ELISA를 구성할 수 있는데, 이는 적절하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 폴리펩티드 생산을 저해하거나 강화하는 화합물을 검색하는데 이용될 수 있다. 이후, 폴리펩티드와 검사 화합물 사이에 결합 복합체의 형성을 측정한다.
이용될 수 있는 다른 약제 스크리닝 기술은 목적 폴리펩티드에 적절한 결합 친화성을 갖는 화합물의 초고속 스크리닝을 제공한다(International patent application WO84/03564). 이러한 방법에서, 다수의 상이한 소형 검사 화합물이 고형 기질 상에 합성되는데, 이들은 이후, 본 발명의 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 폴리펩티드를 고정시키는 한가지 방법은 비-중화 항체를 이용하는 것이다. 이후, 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 결합된 폴리펩티드를 검출한다. 정제된 폴리펩티드는 상기한 약제 스크리닝 기술에 이용되는 플레이트 내에 직접 피복될 수 있다.
본 발명에 포함되는 임의의 검사법은 과다발현이나 제거 검사법에서 본 발명의 유전자와 폴리펩티드를 이용한다. 이런 검사법은 세포에서 이들 유전자/폴리펩티드의 수준 조작 및 조작된 세포의 생리에 대한 이런 조작 작업의 충격 평가를 수반한다. 가령, 이런 실험은 특정 유전자/폴리펩티드가 연관되고, 연구된 폴리펩티드와 상호작용하는 폴리펩티드 실체에 대한 정보를 발생시키며, 관련된 유전자와 단백질이 조절되는 방법에 관한 단서를 제공하는 신호 생성과 대사 경로의 세부적인 내용을 밝힌다.
이용될 수 있는 다른 약제 스크리닝 기술은 목적하는 폴리펩티드에 적절한 결합 친화성을 가지는 화합물의 초고속 스크리닝을 제공한다(International patent application WO84/03564). 상기 방법에서, 다수의 상이한 작은 시험 화합물이 고형 기질 상에 합성되는데, 이들은 이후 본 발명의 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 폴리펩티드를 고정시키는 한 가지 방법은 비-중화 항체를 이용하는 것이다. 그 다음, 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 결합된 폴리펩티드를 검출한다. 정제된 폴리펩티드는 상기한 약제 스크리닝 기술에 이용되는 플레이트에 직접 피복될 수도 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제의 확인에 적합한 검사법의 실례는 Rosen et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2003 6(2): 224-30에 기술된다.
본 발명의 폴리펩티드는 당분야에 공지된 표준 수용체 결합 기술, 예를 들면, 폴리펩티드가 방사성 동위원소로 표지되거나, 화학적으로 변형되거나, 또는 이의 검출 또는 정제를 조장하고 추정 수용체의 공급원(가령, 세포, 세포막, 세포 현탁액, 조직 추출물, 체액의 조성물)과 함께 배양되는 펩티드 서열에 융합되는 리간드 결합과 교차결합 검사법을 통하여 막-결합되거나 용해성 수용체를 확인하는데 이용될 수 있다. 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 및 분광학(spectroscopy)과 같은 생체물리학적 기술을 이용하여 결합 효력을 측정할 수 있다. 결합 검사법은 수용체의 정제와 클로닝에 이용할 수 있을 뿐만 아니라 수용체에 대한 폴리펩티드의 결합을 경쟁하는, 폴리펩티드의 항진제 또는 길항제를 확인할 수도 있다. 스크리닝 검사를 수행하기 위한 표준 방법은 당분야에 공지되어 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드 또는 이의 단편의 용도에 관계하는데, 여기서 상기 단편은 가급적, 면역 관련된 질환의 치료를 위한 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드의 항진제 또는 촉진물질을 분리하거나 생성하기 위한 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 유전자-특이적 단편이고, 상기 항진제 또는 촉진물질은 아래에서 선택된다:
1. a) 키메라 항체, b) 인간화 항체 또는 c) 완전 인간 항체를 비롯한 특이적인 항체 또는 이의 단편
2. 이중특이적(bispecific) 또는 다중특이적(multispecific) 항체,
3. 단일 사슬(가령, scFv), 또는
4. 단일 도메인 항체, 또는
5. 상기 항체로부터 유래된 펩티드- 또는 비-펩티드 모방체(mimetic),
6. a) 안티칼린(anticalin) 또는 b) 피브로넥틴-기초된 결합 분자(가령, 트리넥틴(trinectin) 또는 아드넥틴(adnectin))와 같은 항체-모방체.
항체로부터 펩티드- 또는 비-펩티드 모방체의 생성은 당분야에 공지되어 있다(Saragovi et al., 1991; Saragovi et al., 1992).
안티칼린 역시 당분야에 공지되어 있다(Vogt et al., 2004). 피브로넥틴-기초된 결합 분자는 US6818418과 W02004029224에서 기술된다.
더 나아가, 검사 화합물은 다양한 기원, 특성, 조성을 나타내는데, 이의 예는 분리된 형태 또는 혼합물이나 조합으로, 임의의 소형 분자, 핵산, 지질, 펩티드; 항체(가령, 키메라 항체, 인간화 항체, 완전 인간 항체 또는 항체 단편, 이들로부터 유래된 펩티드- 또는 비-펩티드 모방체, 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 단일 사슬(가령, scFv)이나 단일 도메인 항체 또는 항체-모방체, 예를 들면, 안티칼린 또는 피브로넥틴-기초된 결합 분자(가령, 트리넥틴 또는 아드넥틴))를 비롯한 폴리펩티드 등이다.
본 발명에는 상기한 항진제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소를 확인하는 방법에 유용한 스크리닝 키트 역시 포함된다.
본 발명에는 앞서 기술된 방법에 의해 확인된 본 발명의 폴리펩티드의 활성 또는 항원성을 조절할 수 있는 항진제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소가 포함된다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 다양한 모이어티(즉, 본 발명의 제 1 특징의 폴리펩티드, 본 발명의 제 2 또는 제 3 특징의 핵산 분자, 본 발명의 제 4 특징의 벡터, 본 발명의 제 5 특징의 숙주 세포, 본 발명의 제 6 특징의 리간드, 본 발명의 제 7 특징의 화합물)는 질병의 치료 또는 진단에 유용하다. 질병의 치료 또는 진단에서 본 발명에 따른 모이어티의 유용성을 평가하기 위하여, 아래의 검사법 중에서 한가지 이상을 수행할 수 있다. 주의할 점은 아래의 검사법 중의 일부에서 검사 화합물이 단백질/폴리펩티드로서 언급되지만, 본 발명의 다른 모이어티 역시 “검사 화합물”로서 이용될 수 있도록 당업자에게 이들 검사법을 용의하게 개정할 수 있다.
또한, 본 발명은 적절한 제약학적 담체와 복합된 본 발명의 폴리펩티드, 핵산, 리간드 또는 화합물을 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다. 이들 조성물은 하기에 상술된 바와 같이, 치료 또는 진단 시약, 백신 또는 다른 면역 조성물로서 적합하다.
본 명세서에서 폴리펩티드, 핵산, 리간드 또는 화합물[X]를 함유하는 조성물에서 화합물[x]과 불순물[Y]의 총 중량당 적어도 85%가 X인 경우에, “실질적으로 불순물[Y]이 없는” 조성물이라고 할 수 있다. 적절하게는, X는 조성물에서 X+Y의 총 중량당 적어도 90%로 구성되고, 바람직하게는 총 중량의 적어도 95%, 98% 또는 99%로 구성된다.
적절하게는, 제약학적 조성물은 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드 또는 화합물의 치료 효과량을 함유한다. 본 명세서에서 “치료 효과량”은 표적하는 질환이나 질병을 치료, 경감 또는 예방하거나, 또는 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는데 필요한 치료제의 양을 의미한다. 임의의 화합물에서, 치료 효과량은 예로써, 신생물 세포, 또는 동물 모형, 일반적으로, 생쥐, 토끼, 개 또는 돼지의 세포 배양 검사에서 초기에 측정할 수 있다. 상기 동물 모형은 적절한 농도 범위와 투여 경로를 결정하는 데에도 이용될 수 있다. 이후, 이런 정보를 활용하여 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정할 수 있다.
인간 개체에서 정확한 효과량은 질병의 심각성, 개체의 전반적인 건강 상태, 개체의 연령, 체중, 성별, 식이, 투여 빈도와 기간, 약제 조합, 반응 민감성, 치료에 대한 내약성/반응에 좌우된다. 통상적인 실험을 통하여 효과량을 결정할 수 있는데, 이는 임상의의 판단 범주에 속한다. 일반적으로, 효과량은 0.01 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.05 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏ 범위이다. 조성물은 환자에 개별적으로 투여하거나, 또는 다른 치료제, 약제 또는 호르몬과 공동으로 투여할 수 있다.
제약학적 조성물은 치료제 투여를 위한 제약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수도 있다. 이런 담체에는 항체와 다른 폴리펩티드, 유전자, 리포좀과 같은 다른 치료제가 포함되는데, 담체는 조성물을 섭취하는 개체에 유해한 항체 생산을 유도하지 않아야 하고, 과도한 독성없이 투여될 수 있어야 한다. 적절한 담체는 크고 느리게 물질 대사되는 거대분자, 예를 들면, 단백질, 폴리사카라이드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 공중합체, 불활성 바이러스 입자 등이다.
제약학적으로 허용되는 염에는 예로써, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등과 같은 유기산염이 포함된다. 제약학적으로 허용되는 담체는 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co., N.J. 1991)를 참고한다.
치료 조성물에서 제약학적으로 허용되는 담체에는 물, 염수, 글리세롤, 에탄올과 같은 액체가 추가로 포함될 수 있다. 이에 더하여, 가습제, 유화제, pH 완충제 등과 같은 보조 물질이 이들 조성물에 포함될 수 있다. 이런 담체를 이용하면, 제약학적 조성물은 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등과 같은 환자가 복용가능한 형태로 조제될 수 있다.
일단 조제된 본 발명의 조성물은 환자에게 직접적으로 투여할 수 있다. 치료 대상은 동물, 특히, 인간 개체이다.
본 발명에 이용되는 제약학적 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척수강내, 심실내, 경피(transdermal) 또는 경피부(transcutaneous)(참조, W098/20734), 피하, 복막내, 비강, 경장, 국소, 혀밑, 질내 또는 직장을 비롯한 다양한 경로로 투여될 수 있다. 유전자 총 또는 하이포스프레이(hypospray)를 이용하여 본 발명의 조성물을 투여할 수도 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액 형태의 주사액으로 제조된다; 주사 직전에 액체 운반제에 용해 또는 현탁에 적합한 고체 형태로 제조될 수도 있다.
조성물을 직접 전달하는 방법은 주사, 피하, 복막내, 정맥내, 근육내로 주사하거나, 또는 조직의 간질(間質) 공간으로 전달하는 것이다. 조성물은 병소 내로 투여할 수도 있다. 투약 처리는 1회 투약 과정 또는 다회 투약 과정으로 제공될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 활성이 특정 질병 상태에서 과도하게 나타나는 경우에, 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 한가지 방법은 상기한 바와 같이 저해 화합물(길항제) 및 예로써, 리간드, 기질, 효소, 수용체의 결합을 차단하거나 보조 신호를 저해함으로써 폴리펩티드 기능을 저해하는 효과량의 제약학적으로 허용되는 담체를 개체에 투여하여 비정상적 상태를 경감시키는 것이다. 적절하게는, 길항제는 항체이다. 가장 적절하게는, 항체는 앞서 기술한 바와 같이, 면역원성을 최소화하는 인간화 및/또는 키메라 항체이다.
다른 방법으로, 목적하는 리간드, 기질, 효소, 수용체에 대한 결합 친화성을 보유하는 용해성 형태의 폴리펩티드를 투여할 수도 있다. 전형적으로, 이러한 폴리펩티드는 유관한 부분을 보유하는 단편 형태로 투여된다.
또 다른 방법으로, 내부적으로 생성되거나 별도로 투여된 안티센스 핵산 분자의 이용과 같은 발현 저해 기술을 이용하여, 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현을 저해할 수 있다. 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 통제, 5' 또는 조절 부분(신호 서열, 프로모터, 인헨서, 인트론)에 상보적인 서열 또는 안티센스 분자(DNA, RNA 또는 PNA)를 설계함으로써 유전자 발현을 변화시킬 수 있다. 유사하게, “삼중 나선” 염기쌍 방법을 이용하여 저해를 달성할 수 있다. 삼중 나선 염기쌍 형성 기술은 삼중 나선이 중합효소, 전사 인자 또는 조절 분자의 결합을 위하여 이중 나선이 충분히 개방되는 능력을 저해하기 때문에 유용하다. 최근에, 삼중 나선 DNA를 이용한 치료법의 진전이 여러 문헌에서 보고되고 있다(Gee, J.E. et al.(1994) In: Huber, B.E. and B.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). 상보적인 서열 또는 안티센스 분자를 설계하여 전사체가 리보솜에 결합하는 것을 차단함으로써 mRNA의 전사를 저해할 수 있다. 이런 올리고뉴클레오티드는 in vivo 투여되거나, 또는 in vivo 발현으로 in situ 생성될 수 있다.
이에 더하여, 인코딩 mRNA 서열에 특이적인 리보자임을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드 발현을 차단할 수도 있다. 리보자임은 자연이나 합성 형태의 촉매 활성 RNA이다(참조: Usman, N, et al., Curr. Opin. Struct. Biol(1996) 6(4), 527-33). 선택된 위치에서 mRNA를 특이적으로 절단할 수 있는 합성 리보자임을 설계하여, mRNA가 기능적 폴리펩티드로 번역되는 것을 방지할 수 있다. RNA 분자에서 정상적으로 관찰되는 자연 리보즈 포스페이트 골격과 자연 염기로 리보자임을 합성할 수 있다. 대안으로, 리보자임은 리보뉴클레아제 분해로부터 보호를 제공하기 위하여 비-자연 골격, 예를 들면, 2'-O-메틸 RNA로 합성되고, 변형된 염기를 보유한다.
RNA 분자를 변형시켜, 세포내 안정성과 반감기를 증가시킬 수 있다. 가능한 변형 방법에는 분자의 골격 내에서, 상기 분자의 5' 및/또는 3' 말단에 인접 서열의 부가, 또는 포스포디에스테라제 연쇄가 아닌 포스포로티오에이트 또는 2'O-메틸의 이용 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 개념은 PNA 생산에서 고유하고, 내생적 엔도뉴클레아제에 의해 용이하게 인지되지 않는 비-전통적 염기, 예를 들면, 이노신, 큐에오신, 부토신을 비롯하여 아세틸-, 메틸-, 티오-변형된 형태 및 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민, 우리딘의 유사하게 변형된 형태의 함입으로 이들 분자 모두에서 확대될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 과소 발현 및 이의 활성과 관련된 비정상적 상태의 치료에는 여러 방법이 이용가능하다. 한가지 방법은 비정상적 상태를 완화시키기 위하여 폴리펩티드를 활성화시키는 화합물, 다시 말하면, 앞서 기술된 항진제의 효과량을 개체에 투여하는 것이다. 대안으로, 적절한 제약학적 담체와 공동으로 폴리펩티드의 치료 효과량을 투여하여 폴리펩티드의 적절한 생리학적 균형을 복원한다.
유전자 요법을 이용하여 개체에서 관련 세포에 의한 폴리펩티드의 내적 생산에 달성할 수 있다. 유전자 요법은 결함 유전자를 교정된 치료 유전자로 대체함으로써 폴리펩티드의 부적절한 생산을 영구적으로 치유하는데 이용된다.
본 발명의 유전자 요법은 in vivo 또는 ex vivo에서 수행될 수 있다. ex vivo 유전자 요법은 환자 세포의 분리와 정제, 치료 유전자의 도입, 유전적으로 변형된 세포의 환자 내로 역도입이 요구된다. 대조적으로, in vivo 유전자 요법은 환자 세포의 분리와 정제 과정이 필요하지 않다.
전형적으로, 치료 유전자는 환자에 투여하기 위하여 “포장”된다. 유전자 운반체는 비-바이러스성 물질, 예를 들면, 리포좀, 또는 복제-결함 바이러스, 예를 들면, Berkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66(1992)에 기술된 아데노바이러스 또는 Muzyczka, N., in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129(1992)와 U.S. Patent No. 5.252,479에 기술된 아데노-연합된 바이러스(AAV) 벡터이다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자는 복제-결함성 레트로바이러스 벡터에서 발현을 위하여 조작될 수 있다. 이후, 이런 발현 구조체는 분리하고, 폴리펩티드를 인코딩하는 RNA를 포함하는 레트로바이러스 플라스미드 벡터로 형질도입된 포장 세포에 도입하여, 포장 세포가 목적 유전자를 포함하는 감염성 바이러스성 입자를 생산할 수 있도록 한다. 이들 생산 세포를 개체에 투여하여, in vivo에서 세포를 조작하고 폴리펩티드를 발현시킨다(참조: Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, in Human Molecular Genetics(1996), T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).
다른 방법은 “나신 DNA”의 투여인데, 여기서 치료 유전자는 혈류 또는 근육 조직에 직접 주입된다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 질병-원인 물질인 경우에, 본 발명에서 이들 폴리펩티드 또는 핵산 분자는 이러한 질병 원인 물질에 대한 항체를 생성하는 백신에 사용될 수 있다.
본 발명의 백신은 예방(즉, 감염 방지) 또는 치료(즉, 감염후 질병 치료)를 목적으로 한다. 이들 백신은 통상적으로, 앞서 기술된 제약학적으로 허용되는 담체(조성물을 섭취하는 개체에서 유해한 항체 생산을 유도하지 않은 임의의 담체 포함)와 함께, 면역화 항원, 면역원, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 분자를 함유한다. 게다가, 이들 담체는 면역촉진 물질(“어쥬번트”)로 기능할 수도 있다. 더 나아가, 항원 또는 면역원은 디프테리아, 파상풍(테타누스), 콜레라, 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 및 다른 병원균으로부터 톡소이드(toxoid)와 같은 세균성 톡소이드에 공액될 수 있다.
폴리펩티드는 위에서 분해되기 때문에, 폴리펩티드를 함유하는 백신은 비경구(가령, 피하, 근육내, 정맥내, 또는 경피 주사) 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여에 적합한 조성물에는 항산화제, 완충제, 정균제, 개체의 혈액에서 조성물에 등장성을 부여하는 용질을 함유하는 수용성과 비-수용성 무균 주사 용액 및 현탁제 또는 농후제(thickening agent)를 함유하는 수용성과 비-수용성 무균 현탁액이 포함된다.
본 발명의 백신 조성물은 단위 투약 또는 다중 투약 용기로 제공될 수 있다. 가령, 밀봉된 앰풀과 바이알은 냉동 건조 상태로 보관되는데, 이는 사용 직전에 무균 액상 담체만 첨가하면 된다. 용량은 백신의 특정 활성에 따라 좌우되는데, 통상적인 실험으로 편의하게 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에 결합하는 항체의 유전자 전달은 예로써, 국제 특허 출원 WO98/55607에 기술된 바와 같이 달성될 수도 있다.
제트 주입(참조: www.powderject.com)으로 언급되는 기술 역시 백신 조성물의 조제에 유용하다.
예방접종을 위한 다수의 적절한 방법 및 백신 전달 시스템은 국제 특허 출원 WO00/29428에서 기술된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자의 진단 시약으로의 용도에 관계한다. 기능이상과 연관된 본 발명의 핵산 분자에 의해 특성화되는 유전자의 돌연변이 형태의 검출은 유전자의 과소 발현, 과다 발현, 변형된 공간적 또는 시간적 발현 등으로 인한 질병 또는 이런 질병에 대한 민감성을 정의하거나 진단하는 진단 도구를 제공한다. 다양한 기술을 이용하여, DNA 수준에서 유전자 내에 돌연변이를 보유하는 개체를 확인할 수 있다.
진단용 핵산 분자는 혈액, 뇨, 타액, 조직 생검 또는 부검 물질과 같은 개체의 세포로부터 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 검출에 직접적으로 이용하거나, 또는 분석에 앞서 PCR, 리가아제 연쇄 반응(LCR), 가닥 치환 증폭(SDA) 또는 다른 증폭 기술을 이용하여 효소적으로 증폭할 수 있다(참조: Saiki et al., Nature, 324, 163-166(1986); Bej, et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334(1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35, 117-126(1991); Van Brunt, J., Bio/Technology, 8, 291-294(1990)).
한 구체예에서, 본 발명은 환자에서 질병을 진단하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현 수준을 평가하고, 발현 수준을 대조 수준과 비교하는 단계를 포함하는데, 이때 대조 수준과 상이한 수준은 질병을 암시한다. 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:
a) 본 발명의 핵산 분자와 프로브간 하이브리드 복합체의 형성이 가능한 엄밀도 조건하에서 환자로부터 얻은 조직 시료와 핵산 프로브를 접촉시키고;
b) (a) 단계에서 이용된 동일한 조건하에서 프로브와 대조 시료를 접촉시키고;
c) 시료에서 하이브리드 복합체의 존재를 검출하고,
이때 대조 시료에서 하이브리드 복합체의 수준과 비교하여 환자 시료에서 하이브리드 복합체의 상이한 수준의 검출은 질병을 암시한다.
본 발명은 아래의 단계를 포함하는 다른 진단 방법을 제시한다:
a) 질병을 검사받는 환자로부터 조직 시료를 얻고;
b) 조직 시료로부터 본 발명의 핵산 분자를 분리하고;
c) 핵산 분자에서 질병과 연관된 돌연변이의 존재를 검출하여 환자에서 질병을 진단한다.
상기한 방법에서 핵산 분자의 검출을 보조하기 위하여, 예로써 PCR을 이용한 증폭 단계가 포함될 수 있다.
본 발명은 아래의 단계를 포함하는 또 다른 진단 방법을 제시한다:
a) 질병을 검사받는 환자로부터 조직 시료를 얻고;
b) 조직 시료로부터 본 발명의 핵산 분자를 분리하고;
c) 핵산 분자에서 질병과 연관된 돌연변이의 존재를 검출하여 환자에서 질병을 진단한다.
상기한 방법에서 핵산 분자의 검출을 보조하기 위하여, 예로써 PCR을 이용한 증폭 단계가 포함될 수 있다. 적절한 프로브는 앞서 상세히 기술되었다.
정상 유전자형과 비교하여 증폭된 산물의 크기에서 변화로 결실 및 삽입을 확인할 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 본 발명의 표지된 RNA 또는 본 발명의 표지된 안티센스 DNA 서열에 혼성화시켜 확인할 수 있다. RNase 절단에 의해 또는 용융 온도에서 차이를 확인하여, 부정합된 이중나선과 완전하게 정합된 서열을 구별할 수 있다. 환자에서 돌연변이 유무는 하이브리드-이중 가닥 분자가 형성되는 엄밀도 조건하에서 DNA에 혼성화되는 핵산 프로브와 DNA를 접촉시키고, 여기서 하이브리드 이중-가닥 분자는 질병과 연관된 돌연변이에 상응하는 임의의 부분에서 핵산 프로브 가닥의 혼성화되지 않은 부분을 보유하고; DNA 가닥의 상응하는 부분에 질병-연관된 돌연변이 유무의 지표로서 프로브 가닥의 혼성화되지 않은 부분의 유무를 검출함으로써 확인할 수 있다.
이런 진단은 태아 및 신생아 검사에서 특히 유용하다.
참고 유전자와 “돌연변이 유전자”사이에 점 돌연변이 및 다른 서열 차이는 다른 널리 공지된 기술, 예를 들면, 직접 DNA 염기서열분석 또는 단일-가닥 형태 다형성으로 확인할 수 있다(참조: Orita et al., Genomics, 5, 874-879(1989)). 가령, 염기서열분석 프라이머는 이중 가닥 PCR 생성물, 또는 변형된 PCR에 의해 생성된 단일-가닥 주형 분자와 함께 사용할 수 있다. 서열 결정은 방사능표지된 뉴클레오티드를 이용한 통상적인 절차, 또는 형광-태그를 이용한 자동 염기서열분석 과정으로 수행된다. 또한, 클론된 DNA 절편을 프로브로 이용하여 특정 DNA 단편을 검출할 수도 있다. PCR과 병용하는 경우에 상기 방법의 민감성이 현저하게 향상된다. 게다가, 예로써 단일 뉴클레오티드에 의해 구별되는 서열의 PCR 증폭을 위한 대립형질-특이적 올리고뉴클레오티드를 이용하여 점 돌연변이 및 다형성과 같은 다른 서열 변이, 예를 들면, 다형성을 검출할 수 있다.
또한, 변성제 유무에 관계없이 겔 내에 DNA 단편의 전기영동 이동성 변화 또는 직접 DNA 염기서열분석으로 DNA 서열 차이를 확인할 수 있다(Myers et al., Science(1985) 230:1242). 특정 위치에서 서열 변화는 RNase 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 검사법 또는 화학적 절단 방법으로 확인할 수 있다(참조: Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985) 85: 4397-4401).
통상의 겔 전기영동 및 DNA 염기서열분석 이외에, 마이크로결실(microdeletion), 이수체(aneuploidy), 전치(translocation), 역위(inversion)와 같은 돌연변이는 in situ 분석으로 검출할 수도 있다(참조: Keller et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, New York, N.Y., USA(1993)), 다시 말하면, 세포 내에서 DNA 또는 RNA 서열은 분리 및/또는 막 내로 고정할 필요 없이 돌연변이를 분석할 수 있다. 현재, 형광 in situ 혼성화(FISH)가 가장 일반적으로 이용된다(참조: Trachuck et al., Science, 250, 559-562(1990); Trask et al., Trends, Genet., 7, 149-154(1991)).
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브 어레이를 구성하여 유전자 변이, 돌연변이, 다형성을 효과적으로 스크리닝할 수 있다. 어레이 기술은 널리 공지되어 있고 보편적으로 이용될 수 있는데, 유전자 발현, 유전적 연쇄, 유전자 변이성을 비롯한 분자 유전학에서 다양한 문제를 해결하고 있다(M. Chee et al., Science(1996), Vol 274, pp 610-613).
한 구체예에서, 어레이는 PCT 출원 W095/11995(Chee et al); Lockhart, D. J. et al.(1996) Nat. Biotech. 14. 1675-1680); Schena, M. et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619)에 기술된 방법으로 제조하고 이용한다. 올리고뉴클레오티드 쌍은 2 내지 1백만 개 범위이다. 올리고머는 광-직접 화학 공정을 이용하여 기질상의 지정된 지역에서 합성한다. 기질은 종이, 나일론 또는 다른 종류의 막, 필터, 칩, 유리 슬라이드 또는 다른 적절한 고형 서포트이다. 다른 측면에서, PCT 출원 W095/25116(Baldeschweiler et al)에 기술된 바와 같이, 화학 결합 과정 및 잉크젯 적용 장치를 이용하여 기질 표면상에 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 다른 측면에서, 도트(또는 슬롯) 반점(blot)과 유사한 “격자” 어레이를 이용하여 진공 시스템, 열, UV, 기계적 또는 화학적 결합 과정에 따라 기질 표면상에 cDNA 단편 또는 올리고뉴클레오티드를 배열하고 연결할 수 있다. 앞서 기술된 바와 같은 어레이는 수동으로 또는 이용가능 장치(슬롯 반점 또는 도트 반점 장치), 재료(임의의 적절한 고형 서포트), 기계(로봇 장치 포함)를 이용하여 만들 수 있는데, 8개, 24개, 96개, 384개, 1536개 또는 6144개 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 상업적으로 구입가능한 장치를 효과적으로 이용할 수 있도록 하는 2 내지 1백만 개 이상 범위의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
상기한 방법에 더하여, 개체에서 유래된 시료로부터 폴리펩티드 또는 mRNA의 비정상적인 증가 또는 감소 수준을 결정하여 질병을 진단할 수 있다. 폴리펩티드를 정량하는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블랏팅, 다른 혼성화 방법과 같은 핵산 증폭을 이용하여 RNA 수준에서 발현의 증가 또는 감소를 측정할 수 있다.
숙주로부터 유래된 시료에서 본 발명의 폴리펩티드 수준을 결정하는데 이용될 수 있는 분석 기술은 당분야에 공지되어 있는데, 이들 중의 일부(방사능면역검사, 경쟁-결합 검사, 웨스턴 블랏 분석, ELISA 검사 포함)는 앞서 상술되었다. 본 발명의 이런 특징은 아래의 단계를 포함하는 진단 방법을 제시한다; (a) 리간드-폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건하에서 생물학적 시료와 상기한 리간드를 접촉시키고; (b) 상기 복합체를 검출한다.
폴리펩티드 수준을 측정하는 ELISA, RIA, FACS와 같은 프로토콜은 폴리펩티드 발현의 변화되거나 비정상적인 수준에 대한 기초를 추가적으로 제공한다. 폴리펩티드 발현에 대한 정상 또는 표준 값은 복합체 형성에 적합한 조건하에서 폴리펩티드에 대한 항체와 정상적인 포유류 개체, 바람직하게는 인간으로부터 채취한 세포 추출물 또는 체액을 복합시켜 확립한다. 표준 복합체 형성 양은 광도계 수단과 같은 다양한 방법으로 정량할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 폴리펩티드 발현으로 특성화되는 질병 또는 상태의 진단, 또는 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 리간드, 기타 화합물로 치료되는 환자를 모니터하는 검사에 이용될 수 있다. 진단 목적에 유용한 항체는 치료제에서와 동일한 방식으로 만들 수 있다. 폴리펩티드의 진단 검사법에는 인간 체액, 또는 세포 또는 조직의 추출물에서 폴리펩티드를 검출하기 위하여 라벨과 항체를 이용하는 방법이 포함된다. 이들 항체는 변형하거나 변형하지 않고 이용할 수 있고, 리포터 분자와 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합시켜 표지할 수 있다. 당분야에 공지된 다양한 리포터 분자를 이용할 수 있는데, 일부는 앞서 기술하였다.
개체, 대조 및 생검 조직에서 얻은 질병 시료에서 발현된 폴리펩티드의 양은 표준 수치와 비교한다. 표준과 개체 수치간 편차는 질병 진단을 위한 파라미터를 확립한다. 진단 검사법을 이용하여 폴리펩티드 발현의 부재, 존재, 과다 발현을 구별하고, 치료 개입(therapeutic intervention) 동안 폴리펩티드 수준의 조절을 모니터할 수 있다. 이들 검사법은 동물 연구, 임상 시험, 또는 개별 환자의 치료 모니터링에서 특정 치료 섭생의 효과를 평가하는 데에도 이용될 수 있다.
본 발명의 진단 키트는
(a) 본 발명의 핵산 분자;
(b) 본 발명의 폴리펩티드; 또는
(c) 본 발명의 리간드를 포함한다.
본 발명의 한 특징에서, 진단 키트는 엄밀도 조건하에서 본 발명의 핵산 분자와 혼성화될 수 있는 핵산 프로브를 보유하는 제 1 용기; 핵산 분자를 증폭하는데 유용한 프라이머를 보유하는 제 2 용기; 질병 진단을 조장하는 프로브와 프라이머에 대한 사용 설명서를 포함한다. 키트에는 혼성화되지 않은 RNA를 절단하는 약품을 보유하는 제 3 용기가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 특징에서, 진단 키트에는 핵산 분자 어레이가 포함되는데, 이들 중에서 적어도 하나는 본 발명의 핵산 분자이다.
본 발명의 폴리펩티드를 검출하기 위하여, 진단 키트는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 하나이상의 항체 및 상기 항체와 폴리펩티드 사이에 결합 반응을 검출하는데 유용한 시약을 포함한다.
이들 키트는 I-도메인 보유 단백질이 관여하는 질병 또는 이런 질병에 대한 감수성을 진단하는데 유용할 것이다. 이런 질환에는 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측삭 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염; 다른 병리학적 이상이 포함된다. 적절하게는, 질환은 vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질이 관여하는 질환이다. vWFA 및/또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질이 관여하는 질환의 실례는 세균 감염, 세균 중독, 비탈저, 독소(가령, 세균 독소)의 차단, 암, 내피 종양, 결장직장암, 방광암, 식도암(oesophageal cancer), 폐암, 흑색종, 연소성 유리질 섬유종증(juvenile hyaline fibromatosis, JFH), 유아 전신 유리질증(infantile systemic hyalinosis, ISH), 본 빌리브란트(von Willebrand) 질환, Bethlem 근병증(Bethlem myopathy), 이영양성 표피 수포증(epidermolysis bullosa dystrophica), 혈전증, 혈소판-매개된 응집의 조절, 자가면역 질환, 염증 등이다. 이들 키트는 불임을 비롯한 생식 장애의 확인에도 이용될 수 있다.
본 발명의 다양한 특징 및 구체예는 특히 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 엑손 폴리펩티드와 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드에 관련된 실시예를 통하여 더욱 상세하게 기술된다.
당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 이러한 상세의 개변이 가능하다.
도 1: SEQ ID NO:24(INSP141 전체 단백질 서열)를 이용한, NCBI 비-중복 데 이터베이스에 대한 BLAST로부터 최상위 10개의 결과.
도 2: SEQ ID NO:52(INSP142 전체 단백질 서열)와 최상위 5개 적중(hit) 사이에 BLAST에 의해 산출된 정렬.
도 3: SEQ ID NO:90(INSP143 전체 단백질 서열)을 이용한, NCBI 비-중복 데이터베이스에 대한 BLAST로부터 최상위 10개의 결과.
도 4: SEQ ID NO:126(INSP144 전체 단백질 서열)을 이용한, NCBI 비-중복 데이터베이스에 대한 BLAST로부터 최상위 10개의 결과.
도 5: INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 코딩 엑손의 정렬.
도 6: INSP141, INSP142, INSP143, INSP144의 ORF의 정렬. INSP142에서 P259A는 회색으로 표시된다.
도 7: INSP141, INSP142, INSP143, INSP144의 뉴클레오티드 정렬. 위쪽 케이스는 코딩 서열을 나타낸다. 아래쪽 케이스는 비번역 영역을 나타낸다.
도 8: 예측되고 클론된 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144, TMEM8, CMG2의 개요도.
도 9: INSP141, INSP142, INSP143, INSP144, TMEM8, CMG2의 세포외 vWFA와 ANT_IG 도메인의 아미노산 정렬. 동일한 잔기는 별표로 표시된다. 2차 구조 지정(secondary structure assignment)은 Lacy et al. PNAS. VOL.101. No.17. pp.6367-6372로부터 추론될 수 있다. 각 단백질의 5개 MIDAS 모티프 잔기는 회색으로 표시된다. ATR1_HUMAN: NCBI Acc. No. q9h6x2. ATR2_HUMAN: NCBI Acc. No. P58335.
도 10: RT-PCR(TaqMan)에 의해 측정된, 주요 인간 조직에서 INSP142의 발현.
도 11: RT-PCR(TaqMan)에 의해 측정된, 비교 인간 조직에서 INSP142의 발현
도 12: RT-PCR(TaqMan)에 의해 측정된, 분비와 면역 조직에서 INSP142의 발현.
도 13: RT-PCR(TaqMan)에 의해 측정된, 일차 세포와 세포주에서 INSP142의 발현.
도 14: RT-PCR(TaqMan)에 의해 측정된, 면역이나 CNS 기원의 일차 세포와 세포주에서 INSP142의 발현.
도 15: RT-PCR(TaqMan)에 의해 측정된, 병든 결장과 회장 생검에서 INSP142의 발현.
도 16: RT-PCR(TaqMan)에 의해 측정된, IL18BP 임상 시험으로부터 병든 피부 생검에서 INSP142의 발현.
아미노산 유의성 군 더욱 바람직한 유의성 군
Ser Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Thr, Ser
Arg Asn, Lys, Gln, Arg, His Arg, Lys, His
Leu Phe, Ile, Val, Leu, Met Ile, Val, Leu, Met
Pro Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Pro
Thr Gly, Ala, Ser, Thr, Pro Thr, Ser
Ala Gly, Thr, Pro, Ala, Ser Gly, Ala
Val Met, Phe, Ile, Leu, Val Met, Ile, Val, Leu
Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Gly, Ala
Ile Phe, Ile, Val, Leu, Met Ile, Val, Leu, Met
Phe Trp, Phe,Tyr Tyr, Phe
Tyr Trp, Phe,Tyr Phe, Tyr
Cys Ser, Thr, Cys Cys
His Asn, Lys, Gln, Arg, His Arg, Lys, His
Gln Glu, Asn, Asp, Gln Asn, Gln
Asn Glu, Asn, Asp, Gln Asn, Gln
Lys Asn, Lys, Gln, Arg, His Arg, Lys, His
Asp Glu, Asn, Asp, Gln Asp, Glu
Glu Glu, Asn, Asp, Gln Asp, Glu
Met Phe, Ile, Val, Leu, Met Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp, Phe,Tyr Trp
아미노산 유의성 군
Ser D-Ser, Thr, D-Thr, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), L-Cys, D-Cys
Arg D-Arg, Lys, D-Lys ,homo-Arg, D-homo-Arg, Met, Ile, D-.Met, D-Ile, Orn, D-Orn
Leu D-Leu, Val, D-Val, AdaA, AdaG, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Pro D-Pro, L-I-티아졸리딘-4-카르복실산, D- 또는 L-1-옥사졸리딘-4-카르복실산
Thr D-Thr, Ser, D-Ser, allo-Thr, Met, D-Met, Met(O), D-Met(O), Val, D-Val
Ala D-Ala, Gly, Aib, B-Ala, Acp, L-Cys, D-Cys
Val D-Val, Leu, D-Leu, Ile, D-Ile, Met, D-Met, AdaA, AdaG
Gly Ala, D-Ala, Pro, D-Pro, Aib, .beta.-Ala, Acp
Ile D-Ile, Val, D-Val, AdaA, AdaG, Leu, D-Leu, Met, D-Met
Phe D-Phe, Tyr, D-Thr, L-Dopa, His, D-His, Trp, D-Trp, Trans-3,4, 또는 5-페닐프롤린, AdaA, AdaG, cis-3,4, 또는 5-페닐프롤린, Bpa, D-Bpa
Tyr D-Tyr, Phe, D-Phe, L-Dopa, His, D-His
Cys D-Cys, S--Me--Cys, Met, D-Met, Thr, D-Thr
Gln D-Gln, Asn, D-Asn, Glu, D-Glu, Asp, D-Asp
Asn D-Asn, Asp, D-Asp, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Lys D-Lys, Arg, D-Arg, homo-Arg, D-homo-Arg, Met, D-Met, Ile, D-Ile, Orn, D-Orn
Asp D-Asp, D-Asn, Asn, Glu, D-Glu, Gln, D-Gln
Glu D-Glu, D-Asp, Asp, Asn, D-Asn, Gln, D-Gln
Met D-Met, S--Me--Cys, Ile, D-Ile, Leu, D-Leu, Val, D-Val
실시예 1: INSP141
SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22를 결합시켜 유도된 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:24인데, 이는 INSP141로부터 연속 엑손의 번역을 나타낸다. 상기 폴리펩티드 서열은 NCBI 비-중복 데이터베이스의 BLASTp에 대한 쿼리(query)로서 이용되었다. 최상위 10개의 매치(match)는 도 1에 도시된다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, INSP141은 비탈저 독소 수용체 전구체 단백질과 상동성을 공유한다.
실시예 2: INSP142
SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, EQ ID NO:48, SEQ ID NO:50을 결합시켜 유도된 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:52인데, 이는 INSP142로부터 연속 엑손의 번역을 나타낸다. 상기 폴리펩티드 서열은 NCBI 비-중복 데이터베이스의 BLASTp에 대한 쿼리(query)로서 이용되었다. 최상위 10개의 매치(match)는 도 2에 도시된다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, INSP141은 비탈저 독소 수용체 전구체 단백질과 상동성을 공유한다.
실시예 3: INSP143
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88을 결합시켜 유도된 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:90인데, 이는 INSP143으로부터 연속 엑손의 번역을 나타낸다. 상기 폴리펩티드 서열은 NCBI 비-중복 데이터베이스의 BLASTp에 대한 쿼리(query)로서 이용되었다. 최상위 10개의 매치(match)는 도 3에 도시된다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, INSP143은 비탈저 독소 수용체 전구체 단백질과 상동성을 공유한다.
실시예 4: INSP144
SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108 SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124를 결합시켜 유도된 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:126인데, 이는 INSP143으로부터 연속 엑손의 번역을 나타낸다. 상기 폴리펩티드 서열은 NCBI 비-중복 데이터베이스의 BLASTp에 대한 쿼리(query)로서 이용되었다. 최상위 10개의 매치(match)는 도 4에 도시된다. 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, INSP141은 비탈저 독소 수용체 전구체 단백질과 상동성을 공유한다.
실시예 5: 신호 서열
INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 모두 단백질의 시작 지점에 신호 펩티드(signal peptide)를 보유하는 것으로 예측된다. 도 6에 따른 신호 서열은 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드 서열의 아미노산 1 내지 27(즉, MGSHESLGPYFLVFLLLLLLPPPLFRA(SEQ ID NO: 152)에 걸쳐 있다. 신호 펩티드 절단 부위는 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드 서열의 잔기 27과 28 사이에 존재한다.
실시예 6: 막통과 예측
INSP141과 INSP142는 막통과 영역(transmembrane region)을 보유하지 않는 분비 단백질인 것으로 예측된다(도 6과 7).
INSP143과 INSP144는 막통과 영역을 보유하는 것으로 예측된다(도 6과 7).
INSP143과 INSP144 둘 모두에서, N-말단은 세포외 존재하고 C-말단은 세포내 존재하는 것으로 예측된다.
INSP141과 INSP142는 가용성 동등형이며, 내부 동등형 INSP143과 INSP144의 기능을 조절할 수 있다.
실시예 7: 클로닝 INSP141, INSP142, INSP143-EC의 요약
INSP141, INSP142, INSP143, INSP144는 vWF-I/A 도메인을 보유하는 비탈저 수용체-유사 서열 예측의 절단접합 변이체 집단이다. 이들 모든 서열은 전장이고, 예측된 신호 펩티드를 보유한다.
INSP141은 11개 엑손에 인코딩된 306개 아미노산 ORF(918 bp)에 대한 예측이다. INSP142는 13개 엑손에 인코딩된 352개 아미노산 ORF(1056 bp)에 대한 예측이다. INSP143은 18개 엑손에 인코딩된 608개 아미노산 ORF(1824 bp)에 대한 예측이다. INSP144는 17개 엑손에 인코딩된 631개 아미노산 ORF(1893 bp)에 대한 예측이다. INSP141과 INSP142는 분비 단백질인 것으로 예측된다. INSP143과 INSP144는 I형 막통과 단백질인 것으로 예측된다. INSP143에서 클론된 세포외 도메인은 INSP144의 세포외 도메인과 일치한다. 상이한 서열의 엑손의 정렬 도표는 도 5에 도시된다. ORF의 아미노산 서열과 클론된 서열의 정렬은 도 6에 도시된다. 이들 예측의 뉴클레오티드 서열의 정렬은 도 7에 도시된다.
7.1 인간 cDNA 주형의 제조
첫 번째 가닥 cDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라, Superscript II RNase H- 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 다양한 정상 인간 조직 전체 RNA 샘플(Clontech, Stratagene, Ambion, Biochain Institute, 사내 제조)로부터 준비하였다.
올리고(dT)5 프라이머(500 ㎍/㎖에서 1㎕)(Promega),
2 ㎍ 인간 전체 RNA,
1 ㎕ 10 mM dNTP 혼합물(각각 10 mM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 중성 pH),
무균 증류수(12 ㎕ 최종 부피)를 1.5 ㎖ Eppendorf 튜브에서 제조하였다.
이후, 상기 용액은 5분간 65℃로 가열하고 얼음 위에서 냉각시켰다. 내용물은 짧은 원심분리로 수거하고 4 ㎕의 5X 일차-가닥 완충액, 2 ㎕ 0.1 M DTT, 1 ㎕ RnaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 저해물질(40 unit/㎕, Invitrogen)을 첨가하였다. 튜브의 내용물은 부드럽게 혼합하고 42℃에서 2분간 배양하였다; 이후, 1 ㎕(200 unit)의 SuperScript II 효소를 첨가하고 피펫팅(pipetting)으로 부드럽게 혼합하였다. 혼합물은 42℃에서 50분간 배양하고, 이후 70℃에서 15분간 가열하여 불활성화시켰다. cDNA에 상보적인 RNA를 제거하기 위하여, 1 ㎕(2 unit)의 대장균(E. coli) RNase H(Invitrogen)를 첨가하고, 반응 혼합물은 37℃에서 20분간 배양하였다. 최종 21 ㎕ 반응 혼합물은 179 ㎕ 무균수를 첨가하여 희석하고 200 ㎕의 최종 부피를 제공하였다. INSP141-INSP144의 증폭에 이용되는 cDNA 주형은 고환 RNA로부터 획득하였다.
7.2 cDNA 라이브러리
인간 cDNA 라이브러리(박테리오파지 람다(λ) 벡터)는 Stratagene 또는 Clontech로부터 구입하거나, 또는 제조업체(Stratagene)의 프로토콜에 따라 Serono Pharmaceutical Research Institute에서 λ ZAP 또는 λ GT10 벡터 내에 제조하였다. 박테리오파지 λ DNA는 제조업체(Promega, Corporation, Madison WI)의 프로토콜에 따라, Wizard Lambda Preps DNA 정제 시스템을 이용하여, 감염된 대장균(E. coli) 숙주 균주의 소규모 배양액으로부터 준비하였다. INSP141-INSP144의 증폭에 이용되는 cDNA 라이브러리 주형은 고환 라이브러리 및 혼합된 뇌-폐-고환 라이브러리로부터 획득하였다.
7.3 PCR을 위한 유전자 특이적 클로닝 프라이머
Primer Designer Software(Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)를 이용한 가상 cDNA의 예측된 코딩 서열을 증폭하기 위하여 18개 내지 25개 염기 길이를 보유하는 한 쌍의 PCR 프라이머를 설계하였다. PCR 프라이머는 55 ± 10℃에 근접하는 Tm 및 40-60%의 GC 함량을 보유하도록 최적화되었다. 비-특이적인 프라임 없이 표적 서열(INSP141)에 높은 선택성을 보유하는 프라이머가 선택되었다.
7.4 인간 cDNA 주형으로부터 INSP141-INSP144 집단의 PCR 증폭
예측된 INSP141cds의 전체를 커버하는 985 bp의 cDNA 단편을 증폭하기 위하여 유전자-특이적 클로닝 프라이머(INSP141-CP1과 INSP141-CP2, 표 3과 도 7)를 설계하였다. 상기 프라이머 쌍은 인간 고환 cDNA 샘플 및 PCR 주형으로서 cDNA 라이브러리와 함께 이용되었다. PCR은
1X PlatinumTaq High Fidelity(HiFi) 완충액,
2 mM MgSO4,
200 μM dNTP,
각각 0.2 μM의 클로닝 프라이머,
1 unit의 PlatinumTaq DNA Polymerase High Fidelity(HiFi)(Invitrogen)
대략 20 ng의 주형 cDNA
0X 또는 1X PCRx 인헨서 용액(Invitrogen)을 포함하는 50 ㎕ 최종 부피에서 수행되었다.
사이클링(cycling)은 아래와 같이 프로그램된 MJ Research DNA Engine을 이용하여 수행되었다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 57℃에서 30초, 68℃에서 1분 30초의 40회 주기; 이후, 68℃에서 8분의 1회 주기; 4℃에서 홀딩 주기.
각 증폭 산물(30 ㎕)은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로오스 겔에서 가시화시켰다. 대략적으로, 예측된 분자량의 산물이 고환 cDNA 라이브러리 주형으로부터 증폭된 PCR 산물에서 관찰되었다. 이들 산물은 Qiagen MinElute DNA Purification System(Qiagen)을 이용하여 겔로부터 정제하고, 10 ㎕의 EB 완충액(10mM Tris.Cl, pH 8.5)에서 용리시키고, 직접 서브클론하였다.
7.5 PCR 산물의 서브클로닝(subcloning)
이들 PCR 산물은 제조업체에 의해 명시된 조건에 따라, Invitrogen Corporation로부터 구입된 TA 클로닝 키트를 이용하여 위상이성질화효소 I 변형된 클로닝 벡터(pCR4-TOPO) 내에 서브클론하였다. 간단히 말하면, 4 ㎕의 겔 정제된 PCR 산물은 1 ㎕ TOPO 벡터와 1 ㎕ 염 용액과 함께 실온에서 15분간 배양하였다. 이후, 반응 혼합물은 아래와 같이 대장균(E. coli) 균주 TOP10(Invitrogen) 내로 형질전환시켰다: 50 ㎕ 분량의 One Shot TOP10 세포를 얼음 위에서 해동시키고 2 ㎕의 TOPO 반응물을 첨가하였다. 혼합물은 얼음 위에서 15분간 배양하고, 이후 42℃에서 정확하게 30초 배양으로 열 충격시켰다. 샘플은 얼음으로 되돌리고 250 ㎕의 따뜻한(실온) SOC 배지를 첨가하였다. 샘플은 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 형질전환 혼합물은 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
7.6 플라스미드 DNA 제조와 염기서열분석
다수의 콜로니는 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 5 ㎖ L-액체배지(LB)에 접종하고 220 rpm에서 교반하면서 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다. 제조업체의 지시에 따라 Biorobot 8000 로봇 시스템(Qiagen) 또는 Wizard Plus SV Minipreps 키트(Promega cat. no. 1460)를 이용하여 5 ㎖ 배양액으로부터 Miniprep 플라스미드 DNA를 준비하였다. 플라스미드 DNA는 80 ㎕ 무균수에 용리시켰다. DNA 농도는 Spectramax 190 광도계(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업체의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 T3 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 3에 도시한다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 서열화장치에서 분석하였다.
서열 분석에서, 증폭된 영역 내에서 예측된 INSP142 서열에 대응하는 클론이 확인되었다. INSP141, INSP142, INSP143의 뉴클레오티드 서열의 정렬은 도 7에 도시된다. 치환 P259A를 보유하는 서열은 PCR-유도된 오류인 것으로 추정되었다. 상기 서열(1035bp)은 PCR 프라이머 위치로 인하여 INSP142cds의 전장이 아니다. 클론된 cDNA 단편의 서열은 도 7로부터 추론된다. 클론된 PCR 산물의 플라스미드는 pCR4-TOPO-INSP142(절두됨)이다.
7.7 PCR에 의한 INSP141cds와 INSP143-세포외 도메인(EC)의 발생
INSP141과 INSP142cds에 공통적인, 플라스미드 pCR4-TOPO-INSP142(절두됨)에 클론된 INSP142 서열 부분을 재-증폭하고, 이와 동시에 3'-최말단 INSP141-특이적 23 bp를 산물의 3' 말단에 추가하기 위하여 한 쌍의 PCR 증폭 프라이머(INSP141-AP1과 INSP141-AP2, 표 3과 도 7)를 설계하였다. 또한, INSP143과 INSP144cds에 공통적인, 플라스미드 pCR4-TOPO-INSP142(절두됨)에 클론된 INSP142 서열 부분을 재-증폭하고, 이와 동시에 3'-최말단 INSP143-특이적 21 bp를 산물의 3' 말단에 추가하기 위하여 INSP141-AP1을 이용한 추가의 PCR 프라이머(INSP143-AP1, 표 3과 도 7)를 설계하였다. INSP141-AP1/INSP141-AP2와 INSP141-AP1/INSP143-AP1 프라이머 쌍은 PCR 주형으로서 플라스미드 pCR4-TOPO-INSP142(절두됨)와 함께,
1X PlatinumTaq High Fidelity(HiFi) 완충액,
2 mM MgSO4,
200 μM dNTP,
각각 0.2 μM의 증폭 프라이머,
1 unit의 PlatinumTaq DNA Polymerase High Fidelity(HiFi)(Invitrogen)
대략 300 ng의 플라스미드 cDNA
0X, 0.5X, 1X, 또는 2X PCRx 인헨서 용액(Invitrogen)을 포함하는 50 ㎕ 최종 부피에서 이용되었다.
사이클링(cycling)은 아래와 같이 프로그램된 MJ Research DNA Engine을 이용하여 수행되었다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 68℃에서 1분 30초의 30회 주기; 이후, 68℃에서 7분의 1회 주기; 4℃에서 홀딩 주기.
각 증폭 산물(50 ㎕)은 1 X TAE 완충액(Invitrogen)에 담긴 0.8% 아가로오스 겔에서 가시화시켰다. 대략적으로, 예측된 분자량의 산물은 Promega WizardPCR Preps DNA Purification System을 이용하여 겔로부터 정제하고, 50 ㎕의 물에 용리시키고, 직접 서브클론하였다.
INSP141, INSP142, INSP143-EC 도메인 클로닝과 염기서열분석 프라이머
프라이머 서열(5’- 3’)
INSP141-CP1 GTC ACA GGG ACA GCC AGA TA (SEQ ID NO: 153)
INSP141-CP2 GCT GGT GAT GCT GAC ATT GC (SEQ ID NO: 154)
INSP141-AP1 ATG GGG AGC CAT GAG TCC CTG GGG CCC TAC TTC CTG (SEQ ID NO: 155)
INSP141-AP2 AGC TGA CTT CAA TAG AGT ACT CCC AAT GAT AGT GCT TTC ATT GAA GA (SEQ ID NO: 156)
INSP143-AP1 GCG GAA AAT GCC ACA TGT GGT GCT GGT GAT GCT GAC ATT GCT CTT G (SEQ ID NO: 157)
21M13 TGT AAA ACG ACG GCC AGT (SEQ ID NO: 158)
M13REV CAG GAA ACA GCT ATG ACC (SEQ ID NO: 159)
T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG G (SEQ ID NO: 160)
T3 ATT AAC CCT CAC TAA AGG (SEQ ID NO: 161)
7.8 PCR 산물의 서브클로닝(subcloning)
이들 PCR 산물은 제조업체에 의해 명시된 조건에 따라, Invitrogen Corporation로부터 구입된 TA 클로닝 키트를 이용하여 위상이성질화효소 I 변형된 클로닝 벡터(pCR4-TOPO) 내에 서브클론하였다. 간단히 말하면, 4 ㎕의 겔 정제된 PCR 산물은 1 ㎕ TOPO 벡터와 1 ㎕ 염 용액과 함께 실온에서 15분간 배양하였다. 이후, 반응 혼합물은 아래와 같이 대장균(E. coli) 균주 TOP10(Invitrogen) 내로 형질전환시켰다: 50 ㎕ 분량의 One Shot TOP10 세포를 얼음 위에서 해동시키고 2 ㎕의 TOPO 반응물을 첨가하였다. 혼합물은 얼음 위에서 15분간 배양하고, 이후 42℃에서 정확하게 30초 배양으로 열 충격시켰다. 샘플은 얼음으로 되돌리고 250 ㎕의 따뜻한(실온) SOC 배지를 첨가하였다. 샘플은 교반(220 rpm)하면서 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 형질전환 혼합물은 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 L-액체배지(LB) 평판에 도말하고 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다.
7.9 콜로니 PCR
콜로니는 무균 이쑤시개를 이용하여 50 ㎕ 무균수에 접종하였다. 이후, 10 ㎕ 분량의 접종물은 MJ Research DNA Engine을 이용하여,
1X AmpliTaqTM 완충액,
200 μM dNTP,
20 pmole T7 프라이머,
20 pmole T3 프라이머,
1 unit의 AmpliTaqTM(Perkin Elmer)을 포함하는 20 ㎕의 최종 반응 부피에서 PCR을 수행하였다.
사이클링 조건은 아래와 같았다: 94℃에서 2분; 94℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 2분의 30회 주기. 샘플은 추가 분석에 앞서 4℃에 유지시켰다(홀딩 주기).
PCR 반응 산물은 1 X TAE 완충액에 담긴 1% 아가로오스 겔에서 분석하였다. 예측된 분자량(복수 클로닝 부위(MCS)에 기인한 INSP141의 경우 918 bp 또는 INSP143의 경우 1056 bp + 105 bp)의 PCR 산물을 제공하는 콜로니는 220 rpm에서 교반하면서, 암피실린(100 ㎍/㎖)을 포함하는 5 ㎖ L-액체배지(LB) 내에 37℃에서 하룻밤동안 성장시켰다.
7.10 플라스미드 DNA 제조와 염기서열분석
제조업체의 지시에 따라 Biorobot 8000 로봇 시스템(Qiagen) 또는 Wizard Plus SV Minipreps 키트(Promega cat. no. 1460)를 이용하여 5 ㎖ 배양액으로부터 Miniprep 플라스미드 DNA를 준비하였다. 플라스미드 DNA는 80 ㎕ 무균수에 용리시켰다. DNA 농도는 Spectramax 190 광도계(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다. 플라스미드 DNA(200-500 ng)는 제조업체의 지시에 따라 BigDye Terminator 시스템(Applied Biosystems cat. no. 4390246)을 이용하여 T3 프라이머로 DNA 염기서열분석하였다. 프라이머 서열은 표 3에 도시된다. 염기서열분석 반응물은 Dye-Ex 칼럼(Qiagen) 또는 Montage SEQ 96 정화 평판(Millipore cat. no. LSKS09624)을 이용하여 정제하고, 이후 Applied Biosystems 3700 염기서열분석기에서 분석하였다.
서열 분석에서, 예측된 INSP141 cds에 대응하는 클론이 확인되었다. 상기 서열은 PCR 주형 내에 존재했던 치환 P259A를 보유하였다. 클론된 cDNA 단편의 서열은 도 7로부터 추론된다. 클론된 PCR 산물은 플라스미드 지도는 pCR4-TOPO-INSP141이다. 예측된 INSP143-EC 도메인 cds에 대응하는 두 번째 클론이 확인되었다. 상기 서열 역시 PCR 주형 내에 존재했던 치환 P259A를 보유하였다. 클론된 cDNA 단편의 서열은 도 7로부터 추론된다. 클론된 PCR 산물은 플라스미드 지도는 pCR4-TOPO-INSP143-EC이다.
실시예 8: INSP141, INSP142, INSP143, INSP144의 발현과 정제
본 명세서에 개시된 뉴클레오티드와 아미노산 서열에 기초하여, 생체내에서 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 조직 분포와 발현 수준을 결정하기 위하여 추가적인 실험을 수행한다.
INSP141, INSP142, INSP143, INSP144에 대한 전사체의 존재는 상이한 인간 조직으로부터 유래된 cDNA의 PCR로 조사한다. INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 전사체는 검사 샘플에서 매우 낮은 수준으로 존재한다. 이런 이류로, RNA 제조물에서 소량의 게놈 오염물질이 가양성(false positive) 결과를 유발하기 때문에 다양한 인간 조직에서 전사체의 존재를 확립하는 실험의 설계에는 극도의 주의가 요구된다. 따라서, 모든 RNA는 역전사에 사용하기에 앞서, DNAse로 처리해야 한다. 이에 더하여, 각 조직에서, 역전사가 수행되지 않는 대조 반응물(a-ve RT 대조)을 설정한다.
가령, 각 조직으로부터 1 ㎍의 전체 RNA를 이용하여, Multiscript 역전사효소(ABI)와 무작위 헥사머 프라이머로 cDNA를 산출한다. 각 조직에서, 역전사효소를 제외하고 모든 구성 요소가 첨가된 대조 반응물(-ve RT 대조)을 설정한다. 역전사된 RNA 샘플 및 마이너스 RT 대조에서 각 조직에 대한 PCR 반응물을 설정한다. INSP141, INSP142, INSP143, INSP144-특이적 프라이머는 본 명세서에 개시된 서열 정보에 기초하여 용이하게 설계할 수 있다. 마이너스 RT 대조에서 산물의 부재와 함께, 역전사된 샘플에서 정확한 분자량 산물의 존재는 상기 조직에서 전사체의 존재에 대한 증거로서 간주된다. 상기한 바와 같이 산출된 전사체뿐만 아니라 임의의 적절한 cDNA 라이브러리가 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 전사체를 선별하는데 이용될 수 있다.
INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 조직 분포 패턴은 이들 폴리펩티드의 기능과 관련하여 더욱 유용한 정보를 추가로 제공한다.
이에 더하여, 적절한 발현 벡터를 이용하여 추가적인 실험을 수행한다. 가령, INSP141에 대하여 게이트웨이(gateway) 발현 클론 pDEST12.2_INSP141-6HIS-V1과 pEAK12d_INSP141-6HIS-V1을 생성하였다. 상기 Rev 클로닝 프라이머의 마지막 23 bp는 INSP141 cds의 3' 말단을 앞서 증폭된 서열(이는 택일적 절단접합 변이체이다)에 부가하였다. 엔트리(ENTRY) 플라스미드는 pENTR_INSP1416HIS-V1이다. INSP143-EC에 대하여 게이트웨이 발현 클론 pEAK12d_INSP143-EC-6HIS-V1과 pDEST12d_INSP143-EC-6HIS-V1을 생성하였다. 상기 Rev 클로닝 프라이머의 마지막 21 bp는 INSP143 cds의 3' 말단을 앞서 증폭된 서열(이는 택일적 절단접합 변이체이다)에 부가하였다. INSP143과 INSP144는 클론된 세포외 영역(INSP153-EC=INSP154-EC)을 공통적으로 보유한다. 엔트리 플라스미드는 pDONR-Zeo_INSP143-EC-6HIS-V1이다.
이들 벡터로 포유동물 세포주의 형질감염은 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 단백질의 높은 수준 발현을 가능하게 하고, 따라서 INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 기능적 특성의 지속적 조사를 가능하게 한다. 아래의 재료와 방법은 이들 실험에 적합한 전형이다.
세포 배양
Epstein-Barr 바이러스 핵 항원을 발현하는 인간 태아 신장 293 세포(HEK293-EBNA, Invitrogen)는 Ex-cell VPRO 혈청-없는 배지(종균(seed stock), 유지 배지, JRH)에서 현탁 상태로 유지시킨다. 형질감염이전 16시 내지 20시(Day-1)에, 세포는 2x T225 플라스크(2x105 세포/㎖ 밀도로 2% FBS 접종 배지(JRH)를 포함하는 DMEM/F 12(1:1)에서 플라스크당 50 ㎖)에 접종한다. 다음날(Day 0), JetPEITM 시약(2 ㎕/㎍의 플라스미드 DNA, PolyPlus-transfection)을 이용하여 형질감염을 수행한다. 각 플라스크에서, 플라스미드 DNA는 GFP(형광 리포터 유전자) DNA로 동시-형질감염시킨다. 이후, 형질감염 혼합물은 2xT225 플라스크에 첨가하고 37℃(5% CO2)에서 6일동안 배양한다. 양성 형질감염의 확증은 Day 1과 Day 6에서 정량적 형광 검사로 수행한다(Axiovert 10 Zeiss).
Day 6(수거일)에, 이들 두 플라스크로부터 상층액은 모으고 원심분리하며(가령, 4℃, 400g) 독특한 확인물질을 포함하는 용기에 위치시킨다. 6His-태그 단백질의 QC(내부 생물가공 QC)를 위하여 1 분량(500㎕)을 보관한다.
규모 확대 배치(batch)는 폴리에틸렌이민(Polyscience)을 형질감염 작용제로 이용하는, “현탁 세포의 PEI 형질감염”이라고 하는 프로토콜(BP/PEI/HH/02/04)에 따라 수행된다.
정제 과정
C-말단 6His 태그를 보유하는 재조합 단백질을 포함하는 배양 배지 샘플은 냉각 완충액 A(50 mM NaH2PO4; 600 mM NaCl; 8.7%(w/v) 글리세롤, pH 7.5)로 희석하였다. 샘플은 무균 필터(Millipore)에 통과시켜 여과하고 무균 사각 배지 병(Nalgene) 내에서 4℃에 유지시켰다.
정제는 자동 시료 적하장치(Labomatic)에 연결된 VISION workstation(Applied Biosystems) 상에서 4℃에서 수행하였다. 정제 과정은 2단계, Ni 이온으로 충전된 Poros 20 MC(Applied Biosystems) 칼럼(4.6 x 50 mm, 0.83 ㎖) 상에서 금속 친화성 크로마토그래피, 이후 Sephadex G-25 배지(Amersharn Pharmacia) 칼럼(1.0 x 10 cm) 상에서 겔 여과로 구성되었다.
제 1 크로마토그래피 단계에서, 금속 친화성 칼럼은 30 칼럼 용적의 EDTA 용액(100 mM EDTA; 1M NaCl; pH 8.0)으로 재생시키고, 15 칼럼 용적의 100 mM NiSO4 용액으로 세척하여 Ni 이온으로 재충전하며, 10 칼럼 용적의 완충액 A와 7 칼럼 용적의 완충액 B(50 mM NaH2PO4; 600 mM NaCl; 8.7%(w/v) 글리세롤, 400 mM; 이미다졸, pH 7.5)로 순차적으로 세척하고, 최종적으로, 15 mM 이미다졸을 함유하는 15 칼럼 용적의 완충액 A로 평형시켰다. 시료는 Labomatic 시료 적하장치로 200 ㎖ 샘플 루프로 옮기고, 후속으로 분당 10 ㎖ 유속으로 Ni 금속 친화성 칼럼에 충전시켰다. 칼럼은 12 칼럼 용적의 완충액 A, 이후 20 mM 이미다졸을 함유하는 28 칼럼 용적의 완충액 A로 세척하였다. 20 mM 이미다졸 세척 동안, 느슨하게 결합된 오염 단백질이 칼럼으로부터 용리되었다. 최종적으로, 재조합 His-표지된 단백질은 분당 2㎖ 유속으로 10 칼럼 용적의 완충액 B로 용리시키고, 용리된 단백질은 수집하였다.
제 2 크로마토그래피 단계에서, Sephadex G-25 겔-여과 칼럼은 2㎖ 완충액 D(1.137M NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH2PO4; 8 mM Na2HP04; pH 7.2)로 재생시키고, 후속으로 4 칼럼 용적의 완충액 C(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4; 8 mM Na2HP04; 20%(w/v) 글리세롤; pH 7.4)로 평형시켰다. Ni-칼럼으로부터 용리되는 피크 분획물은 VISION 상에서 통합 샘플 적하장치를 통하여 Sephadex G-25 칼럼으로 자동 적하하고, 단백질은 분당 2㎖ 유속으로 완충액 C로 용리하였다. 분획물은 무균 원심분리 필터(Millipore)를 통하여 여과하고 동결시키며 -80℃에서 보관하였다. 샘플 1 분량은 SDS-PAGE(4-12% NuPAGE gel; Novex) 웨스턴 블랏 상에서 항-His 항체로 분석하였다. NuPAGE 겔은 실온에서 1시간동안 0.1% 코마시 블루 R250 염색 용액(30% 메탄올, 10% 아세트산)에서 염색하고, 후속으로 배경 부분이 투명해지고 단백질 밴드가 선명하게 보일 때까지 20% 메탄올, 7.5% 아세트산에서 탈색시켰다.
전기영동이후, 단백질은 겔로부터 니트로셀룰로오스 막으로 전기적으로 이동시켰다. 막은 완충액 E(137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 1.5 mM KH2PO4; 8 mM Na2HP04; 0.1% Tween 20, pH 7.4)에 담긴 5% 우유 분말로 실온에서 1시간동안 차단하고, 후속으로 완충액 E에 담긴 2.5% 우유 분말에서 2가지 토끼 다클론 항-His 항체(G-18과 H-15, 각각 0.2 ㎍/㎖; Santa Cruz)의 혼합물과 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 실온에서 1시간동안 추가로 배양한 이후, 막은 완충액 E(3 x 10 min)로 세척하고, 이후 2.5% 우유 분말을 함유하는 완충액 E에서 1/3000으로 희석된 2차 HRP-공액된 항-토끼 항체(DAKO, HRP 0399)와 함께 실온에서 2시간동안 배양하였다. 완충액 E(3 x 10 min)로 세척한 이후, 막은 ECL 키트(Amersham Pharmacia)로 1분간 전개시켰다. 막은 후속으로 Hyperfilm(Amersham Pharmacia)에 노출시키고, 필름은 현상하고, 웨스턴 블랏 이미지는 시각적으로 분석하였다.
코마시 염색에서 검출가능 단백질 밴드를 보인 샘플에서, 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 하는 BCA 단백질 검사 키트(Pierce)를 이용하여 결정하였다.
더 나아가, 세포주에서 이들 폴리펩티드의 과다발현 또는 발현의 녹다운을 이용하여 숙주 세포 게놈의 전사 활성화에 대한 효과를 결정하였다. INSP141, INSP142, INSP143, INSP144 폴리펩티드의 이합체화 파트너, 보조-활성인자, 보조-억제자는 면역침전과 웨스턴 블랏팅의 조합 및 면역침전과 질량 분광분석의 조합으로 확인할 수 있다.
실시예 9: T 림프구 반응을 표적하는 검사법
Fas-리간드-유도된 T 세포 사멸.
본 검사법은 수용체 매개된 세포 사멸의 새로운 조절인자를 확인한다.
본 검사법에서, T 세포 아폽토시스(apoptosis)는 단클론 항 6-his 항체와 결합된 재조합 6 히스티딘-태그 Fas 리간드로 Jurkat 세포(인간 T 세포주)를 자극함으로써 유도된다. 사멸은 세포가 죽어가는 동안에 배양 배지에 방출된 세포질 효소, LDH의 방출에 의해 정량된다. 판독(read out)은 490nm에서 비색 검사 판독(colorimetric assay read)으로 수행된다. T 세포는 여러 자가면역 질환에서 병원성인 것으로 밝혀졌는데, 항원-특이적 T 세포 사멸의 조절이 치료 전략(가령, 크론병 환자에서 항-TNF-α 치료)이다.
인간-MLR: 증식과 사이토킨 분비.
본 세포-기초된 검사법은 다른 공여자로부터 PBMC에 의한 자극(동종반응성, alloreactivity)이후 림프구 증식 및 사이토킨 분비 또는 저해에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다. 이들 검사법은 항원-특이적 T 세포와 항원 제시 세포(antigen presenting cell) 기능을 조사하는데, 이들 기능은 임의의 자가면역 질환에서 결정적인 세포 반응이다. 분비된 사이토킨(IL-2, 4, 5, 10, TNF-α, IFN-γ)은 CBA에 의해 정량된다.
주의: 증식과 사이토킨 분비는 독립적인 반응이다.
생쥐-MLR: 증식.
본 세포-기초된 검사법은 다른 공여체(생쥐 균주)로부터 비장 세포에 의한 자극이후 림프구 증식 또는 생쥐 비장 세포의 저해에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다. 이러한 세포 기초된 검사법은 T 림프구와 항원 제시 세포(antigen presenting cell) 반응에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정하고, h-MLR 검사에서 양성의 활성과 히트(hit) 정체를 확증하는데 이용된다. 본 검사법은 인간 질환의 뮤린 모형에서 검사되는 단백질을 선별하는데 이용된다.
초항원(superantigen), TSST와 자극된 인간 PBMC.
초항원은 T 세포에 영향을 주는 면역계의 강한 조절물질이다. 초항원은 면역학적으로 매개된 질환, 예를 들면, IBD, 염증성 피부 질환(가령, 아토피성 피부염), 건선에 영향을 준다. 이러한 세포 검사법에서는 전통적인 항원, 특히, 보조-자극 분자에 대한 T 세포 반응과는 상이한 필요조건으로, TCR에 의한 T 림프구 활성화를 특이적으로 표적한다.
ConA 또는 PHA로 자극된 인간 PBMC.
이들 세포-기초된 검사법은 사이토킨 비드 어레이(CBA) 검사에 의해 측정된, 상이한 세포에 작용하는 2가지 서로 다른 자극에 의해 유도된 사이토킨 분비 (IL-2, IFN-γ, TNF-α, IL-5, IL-4, IL-10)에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
대부분의 사이토킨은 손상, 주위 환경, 세포 표적에 따라, 이중 작용: 친-염증성 또는 항-염증성 작용을 나타낼 수 있다. 사이토킨 분비를 조절하는 능력을 갖는 단백질은 치료 잠재력을 갖는다(가령, IFN-γ와 TNF-α의 감소는 Th1-매개된 자가면역 질환에 유익하고, 대조적으로, IL-4와 IL-5의 감소는 Th2-매개된 질환에 유익하고, IL-10의 유도는 MS와 SLE에 유익하다).
단핵구/대식세포 및 과립구 반응을 표적하는 검사법.
LPS로 자극된 인간 PBMC.
본 세포-기초된 검사법은 단핵구/대식세포 및 과립구에 작용하는 LPS에 의해 유도된 사이토킨 분비(IFN-γ, TNF-α)에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
IFN-γ과 TNF-α 분비를 조절하는 능력을 갖는 단백질은 Th1-매개된 자가면역 질환에 유익하다.
호중구 반응을 표적하는 검사법.
호중구(neutrophil)는 염증 및 류머티스 관절염과 같은 자가면역 질환에 중요하다. IL-8과 같은 백혈구 화학주성인자(Leukocyte chemo-attractant)는 세포와 미세-혈관 사이에 일련의 점착성 상호작용(adhesive interaction)을 유인하여 호중구의 활성화, 유착, 최종적으로 이동을 유도한다. 호중구의 조직 침윤은 이들 세포의 세포 형태에서 특정한 변화와 연관된 세포골결 요소(cytoskeleton element)의 재편에 좌우된다.
이러한 세포-기초된 검사법은 인간 호중구의 세포골격 재편(cytoskeleton reorganization)에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
B 림프구 반응을 표적하는 검사법.
자기항체 및 침윤 B 세포는 다양한 자가면역 질환, 예를 들면, 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE), 류머티스 관절염(RA), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 중증근무력증(myasthenia gravis)의 병인에 중요한 것으로 생각된다. B 세포 항상성(homeostasis)에서 조절이상(disregulation)은 면역 관용(immune tolerance)에 영향을 주어 자기반응성 B 세포 생산 병원성 항체의 부적절한 생존 및 지속적인 염증을 유발하는 것으로 확인되었다. B 세포 수용체 유인이후 B 세포 증식, 생존, 분화의 조절에서 결정적인 역할을 하는 새로운 인자의 확인은 신규한 치료법의 개발에서 매우 적절하다.
B 세포 증식.
본 세포-기초된 검사법은 B 세포 생존에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
B 세포 공동-자극.
본 세포-기초된 검사법은 B 세포 공동-자극에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
단핵구와 소교세포(microglial) 반응을 표적하는 검사법.
THP-1 칼슘 유동(calcium flux).
THP1-세포 검사법에서 Ca+-유동은 소포체(endoplasmic reticulum)로부터 세포내 칼슘 방출(일반적인 2차 메신저 현상)을 유인하는 능력에 대한 신규한 단백질의 효과를 측정한다.
소교세포 증식.
소교세포 선조의 증식동안, 일부 사이토킨을 비롯한 다수의 콜로니-자극 인자가 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이들 중에서, M-CSF는 대식세포/소교세포의 성숙의 최종 단계에 중요하고, 다른 인자에 의해 대체될 수 없다. 이러한 생물학적 반응의 평가는 소교세포 활성에 영향을 주는 방식으로서, MS로부터 치료 잠재력을 갖진 분자를 확인하는 기회를 제공한다.
M-CSF에 대한 소교세포 세포주의 증식 반응을 측정하기 위한 세포-기초된 검사법이 개발되었다. 실현가능성(feasibility)과 강건성(robustness) 단계는 최적 결과를 보였다.
이러한 검사법은 96 웰 평판에서 수행되고, 비-방사성 기질이 요구되며, 간편하게 자동화된다.
실시예 10 - 실시간 PCR(TaqMan)에 의한 INSP142 유전자 발현 수준의 분석
각 샘플로부터 전체 RNA는 20 ㎕의 최종 반응 부피에서 RT-PCR용 Superscript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen, Cat. No. 18080-051)을 이용하여 역전사시켰다. 2 ㎍의 전체 RNA는 50 ng 무작위 헥사머 프라이머, 각 1OmM의 dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 10 ㎕의 부피에서 DEPC-처리된 물과 혼합하였다. 혼합물은 65℃에서 5분간 배양하고, 이후 얼음 위에서 1분간 냉각시켰다. 아래의 10 ㎕ cDNA 합성 혼합물을 별개의 튜브에서 준비하였다: 2 ㎕ 1OX RT 완충액, 4 ㎕ 25mM MgCl2, 2 ㎕ O.1M DTT, 1 ㎕ RnaseOUTTM(40 unit/㎕), 1 ㎕ SuperScriptTM III RT 효소(200 unit/㎕). 상기 cDNA 합성 혼합물은 RNA/프라이머 혼합물에 첨가하고, 부드럽게 교반하고, 25℃에서 10분간, 이후 50℃에서 50분간 배양하였다. 이후, RT 효소는 85℃에서 5분간 배양함으로써 불활성화시켰다. 혼합물은 얼음 위에서 냉각시키고, 이후 1 ㎕의 대장균(E. coli) Rnase H(2 unit/㎕)를 첨가하고, 혼합물은 37℃에서 20분간 배양하였다. 혼합물은 얼음 위에서 냉각시키고 무균수로 1/250 희석하였다. 역전사효소 반응물의 희석액은 TaqMan 장치(PE Biosystems 7700)에서 실시간 PCR 분석하였다. Primer Express 소프트웨어(PE Biosystems)를 이용하여 인간 INSP142 및 하우스 키핑(house-keeping) 조절 유전자 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)에 대한 PCR 프라이머를 설계하였다: 정방향 프라이머는 엑손 11에서 설계하였다. 역방향 프라이머는 엑손 12-13 경계에 걸쳐 설계하였다. 상기 프라이머는 INSP142를 INSP141로부터 구별하지만 INSP143 또는 INSP144로부터 구별하지 못한다.
이들 프라이머의 서열은 표 4에 도시된다. TaqMan 분석에 이용되는 특이성과 최적 프라이머 농도는 플라스미드 pEAK12d-INSP142-6HIS의 일련의 희석액 상에서 INSP142 프라이머를 검사함으로써 결정하였다. cDNA의 잠재적 게놈 DNA 오염은 GAPDH 인트론 서열에 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 반응을 수행함으로써 배제하였다. 비-특이적인 증폭의 부재는 4% 아가로즈 겔 상에서 이들 PCR 산물을 분석하여 예측된 분자량의 단일 밴드가 생성되는 지를 확인함으로써 확증하였다.
SYBR Green Real-Time PCR 반응은 25 ㎕/웰의 SYBR Green PCR 마스터 혼합물(PE Biosystem)(0.5 단위 AmpErase Uracil N-Glycosylase(UNG, PE Biosystems)가 미리 첨가됨), 300 nM의 각 증폭 프라이머, 5 ㎕의 RT-산물을 포함하는 50㎕의 반응 용적에서 수행하였다. 사이클링은 아래와 같이 프로그램된 ABI PRISM 7700(TaqMan) Detection System을 이용하여 수행하였다: 50℃에서 2분간 1회 주기; 95℃에서 10분간 1회 주기; 95℃에서 15초간, 60℃에서 1분간 40회 주기. 각 반응은 중복 수행하고, 결과는 평균하였다.
역전사된 cDNA 샘플의 프라이머-특이적 영역은 이런 방식으로 증폭하고, 이들의 주기 역치(cycle threshold, Ct) 값을 결정하였다. 각 cDNA 샘플에 대한 Ct 값은 아래와 같이 하우스키핑 유전자 GAPDH의 Ct 값에 표준화시켰다. 각 cDNA 샘플에서 GAPDH 유전자와 INSP1412 유전자 사이에 발현 수준의 차이는 Ct 값에서 차이, 다시 말하면, 델타(δ) Ct = Ct (GAPDH) - Ct (INSP142)로서 표시되었다. 이후, 각 샘플에 대한 결과는 발현 차이(fold difference) 공식 = 2(-δCt)에 따라, GAPDH에 대한 발현과 비교하여 현저한 INSP142 유전자 발현에 요구되는 주기 횟수에서 발현 차이로 표시하였다. 최종적으로, 각 cDNA 샘플에서 INSP142 유전자의 발현 수준은 INSP142에 대한 발현 차이로 100을 나눔으로써 GAPDH 유전자 발현 수준과 비교하였다(여기서, GAPDH 발현 수준 = 100%).
결과
INSP142 프라이머는 IL18BP 임상 시험으로부터 44개의 염증성 장 질환 결장과 회장 생검 및 38개의 건선 생검 이외에, 대략 100개의 정상과 병든 인간 조직 샘플, 일차 세포와 세포주에서 검사하였다. 이용된 이들 프라이머는 INSP142를 절단접합 변이체 INSP141로부터 구별할 수 있었지만 절단접합 변이체 INSP143 또는 INSP144로부터 구별할 수 없었다. 결과는 표 5-11에 도시되고, 아래 도 10-16에 그래프로 제시된다. INSP142는 고환 cDNA로부터 최초 클론되었다. 정상 인간 조직의 Taqman 분석에서, 고환에서 INSP142의 발현이 확인되었지만, 발현 수준이 극히 낮았다(GAPDH = 100에 비하여 0.15)(도 10). INSP142는 피부, 폐, 간에서도 유사한 수준으로 검출되었다. 일차 세포와 세포주에서, INSP142는 호산구 유래된 세포주 EOL-3에서 뿐만 아니라 골수와 인간 진피 미세혈관 내피세포(도 12), 정상 인간 진피 섬유아세포(도 13), 말초혈 과립구에서 유사하게 낮은 수준으로 검출될 수 있었다. 놀랍게도, INSP142 발현은 모든 결장과 회장 IBD 생검 샘플(도 15) 및 건선 피부 생검에서 검출될 수 있었는데, 이는 염증성 질환 과정에서 상기 mRNA의 상향조절을 암시한다. 일차 세포와 세포주에서 발현 데이터에 기초하여, 피부에서 복수의 세포 유형이 건선에서 INSP142의 발현을 담당할 수 있을 것으로 생각된다.
결론
발현 결과는 결장과 회장 IBD 생검 샘플 및 건선 피부 생검에서 INSP142의 예상치 않게 제한된 발현을 입증한다.
이런 특이적인 발현 패턴은 염증성 장 질환, 피부 질환 또는 염증에 INSP142 관여의 결론을 도출한다.
적절하게는, 염증성 장 질환은 크론병 또는 궤양성 대장염에서 선택된다.
적절하게는, 피부 질환은 건선, 접촉성 피부염 또는 아토피성 습진에서 선택된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 상응하는 폴리펩티드를 특징짓는 이들 놀라운 특성으로 인하여, 이들은 약제 또는 제약학적 조성물의 제조에 특히 적합하다. 이런 이유로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 상응하는 폴리펩티드는 특정 조직에서 예상치 않게 제한된 발현을 나타낸다.
TaqMan PCR 프라이머 서열
프라이머 서열(5’-3’)
INSP142-936F CCCTGGGCCAAAACTAGAAAA (SEQ ID NO: 162)
INSP142-1044R AAGAGAAGGACATGTGGTGCTG (SEQ ID NO: 163)
hGAPDH-F CCACCCATGGCAAATTCC (SEQ ID NO: 164)
hGAPDH-R GATGGGATTTCCATTGATGACA (SEQ ID NO: 165)
인트론-hGAPDH-F CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT (SEQ ID NO: 166)
인트론-hGAPDH-R CTGTGCTCCCACTCCTGATTT (SEQ ID NO: 167)
Figure 112007035203880-PCT00001
Figure 112007035203880-PCT00002
Figure 112007035203880-PCT00003
Figure 112007035203880-PCT00004
Figure 112007035203880-PCT00005
Figure 112007035203880-PCT00006
RT-PCR(TaqMan)에 의해 측정된, IL18BP 임상 시험으로부터 병든 피부 생검에서 INSP142의 발현.
건선 Ct hGAPDH Ct hINSP142 delta ct 발현 차이 GAPDH와 비교하여 (=100)
#11 A2872102-2 21.03 32.84 -11.81 3593.11 0.03
#16 A2872103-1 24.86 33.95 -9.09 544.94 0.18
#28 A2872023-1 22.50 35.02 -12.51 5842.32 0.02
#36 A2872028-1 24.83 33.76 -8.94 490.55 0.20
#39 A2872025-1 24.43 32.88 -8.44 347.88 0.29
#59 E1328972-3 24.60 33.26 -8.66 403.74 0.25
#60 E1328972-2 22.21 32.91 -10.70 1658.02 0.06
#61 E1329004 24.60 33.37 -8.77 435.59 0.23
#63 E1328973-3 22.93 33.91 -10.97 2011.18 0.05
#64 E1329003-2 20.81 31.87 -11.06 2135.78 0.05
#66 E1328974-4 21.77 33.42 -11.65 3224.67 0.03
#68 E1328975-3 24.59 32.55 -7.96 249.05 0.40
#69 E1328975-4 23.59 33.57 -9.97 1005.76 0.10
#70 E1329006-1 22.27 33.00 -10.73 1693.79 0.06
#72 E1328976-4 23.54 32.71 -9.16 573.83 0.17
#73 E1329005-1 23.80 33.50 -9.70 830.24 0.12
#74 E1328977-2 24.17 32.97 -8.79 443.66 0.23
#75 E1328977-3 22.90 32.88 -9.98 1010.36 0.10
#77 E1348411-3 23.53 32.47 -8.95 493.01 0.20
#78 E1348411-2 21.64 34.12 -12.48 5716.81 0.02
#79 E1348411-1 21.83 31.29 -9.45 701.55 0.14
#80 E1348414-2 22.67 32.17 -9.49 720.55 0.14
#81 E1348414-1 22.12 32.54 -10.42 1374.76 0.07
#82 E1348446-1 23.42 31.65 -8.23 299.96 0.33
#83 E1348415-3 20.95 32.19 -11.24 2412.57 0.04
#84 E1348415-2 21.77 32.86 -11.09 2181.45 0.05
#85 E1348442-1 21.00 32.15 -11.15 2265.41 0.04
#86 E1348416-3 25.00 33.31 -8.31 317.58 0.31
#88 E1348445-1 23.70 33.27 -9.57 760.60 0.13
#91 E1317749-2 24.53 31.94 -7.41 170.59 0.59
#95 E1317719-2 24.94 32.12 -7.18 145.45 0.69
#96 E1317719-3 21.69 31.74 -10.05 1059.76 0.09
#97 E1317751-2 23.25 33.13 -9.88 943.38 0.11
#98 E1317723-2 24.09 35.40 -11.32 2550.43 0.04
#99 E1317723-3 22.10 32.31 -10.21 1186.53 0.08
#101 E1317718-2 20.26 32.63 -12.38 5312.87 0.02
#102 E1317718-3 22.52 33.42 -10.89 1899.79 0.05
#103 E1317750-2 23.82 32.43 -8.61 390.29 0.26
Figure 112007035203880-PCT00007
Figure 112007035203880-PCT00008
Figure 112007035203880-PCT00009
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ttgcagattt atcttcaatg aaagcactat cattgggagt 900 actctattga agtcagcttg a 921 <210> 24 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Gly Ser His Glu Ser Leu Gly Pro Tyr Phe Leu Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ser Leu Arg Tyr 20 25 30 His Gly Pro Asp Trp Arg Ile Phe His Arg Leu Ala Leu Gly Ser Arg 35 40 45 Arg Ala His His His His Gly Pro Gly Trp Arg Gln His Trp Arg Gln 50 55 60 Gly Gln Ala Gly His Arg Cys Gln Gly Ser Phe Asp Leu Tyr Phe Ile 65 70 75 80 Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Asn Asn Asn Trp Ile Asp Leu Tyr Met 85 90 95 Trp Val Glu Glu Thr Val Ala Arg Phe Gln Ser Pro Asn Ile Arg Met 100 105 110 Cys Phe Ile Thr Tyr Ser Thr Asp Gly Gln Thr Val Leu Pro Leu Thr 115 120 125 Ser Asp Lys Asn Arg Ile Lys Asn Gly Leu Asp Gln Leu Gln Lys Ile 130 135 140 Val Pro Asp Gly His Thr Phe Met Gln Ala Gly Phe Arg Lys Ala Ile 145 150 155 160 Gln Gln Ile Glu Ser Phe Asn Ser Gly Asn Lys Val Pro Ser Met Ile 165 170 175 Ile Ala Met Thr Asp Gly Glu Leu Val Ala 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cattgatgaa 900 aagccaacca gtatcgacaa taattccatg aattgccctg ggccaaaact agaaaaacct 960 ggagaggagt actctattga agtcagcttg aacaaaggca aaacattctt caagagcaat 1020 gtcagcatca ccagcaccac atgtggcatt ttccgcaact ggctctattt tgtgccactc 1080 ctgctgcttg tgccactgct gctgtgttgt gtctggcggc tgtgccgcaa gcagactgtc 1140 aaggagccac cacctgtgca gaagccagaa aaggagccag agcaggaaaa accaccatca 1200 ccaccaccac cgcctccgcc tccaccacct ccactcccac ctccgccccc agctcctgta 1260 aacacctgcc ccactgtgat tatttgttgc tgtggatgcc aaggagtggg cgggatgaga 1320 aggatagagg gcaatctgga taccttttgt gacctctctc acgcaagctg ccaccaggtg 1380 ccatggatgt gttgtcagag cagggaccag gggaggtacc tcagcttagc ccttgcacag 1440 tcccaatatg cacaggctcc ctgctgccca aggatctgct ttccacacag ccaggagtgc 1500 ctttccctac cacaggctcc ctgcagccca aggatgtgcc tgagacacag ccgggagtgc 1560 ctcgccctca aacaggctcg ctgcagccca aacatctgcc tgagacacag cccggagtac 1620 ttttcccaag cacagactct gtgcaaccca aagagctgcc ttcaacccag ccgggagtgc 1680 ctccccctca cctgctcctc caggtgccgc ctccccccag ctaggtgctt gaggcctccc 1740 tccaggatgc tgccgctgct gtccccactg ctcaggcaca cggcagaacc ccctttgtca 1800 ctccccccct cagagcccaa cttctaa 1827 <210> 90 <211> 608 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Met Gly Ser His Glu Ser Leu Gly Pro Tyr Phe Leu Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ser Leu Arg Tyr 20 25 30 His Gly Pro Asp Trp Arg Ile Phe His Arg Leu Ala Leu Gly Ser Arg 35 40 45 Arg Ala His His His His Gly Pro Gly Trp Arg Gln His Trp Arg Gln 50 55 60 Gly Gln Ala Gly His Arg Cys Gln Gly Ser Phe Asp Leu Tyr Phe Ile 65 70 75 80 Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Asn Asn Asn Trp Ile Asp Leu Tyr Met 85 90 95 Trp Val Glu Glu Thr Val Ala Arg Phe Gln Ser Pro Asn Ile Arg Met 100 105 110 Cys Phe Ile Thr Tyr Ser Thr Asp Gly Gln Thr Val Leu Pro Leu Thr 115 120 125 Ser Asp Lys Asn Arg Ile Lys Asn Gly Leu Asp Gln Leu Gln Lys Ile 130 135 140 Val Pro Asp Gly His Thr Phe Met Gln Ala Gly Phe Arg Lys Ala Ile 145 150 155 160 Gln Gln Ile Glu Ser Phe Asn Ser Gly Asn Lys Val Pro Ser Met Ile 165 170 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Ser Phe Asn Ser Gly Asn Lys 130 135 140 Val Pro Ser Met Ile Ile Ala Met Thr Asp Gly Glu Leu Val Ala His 145 150 155 160 Ala Phe Gln Asp Thr Leu Arg Glu Ala Gln Lys Ala Arg Lys Leu Gly 165 170 175 Ala Asn Val Tyr Thr Leu Gly Val Ala Asp Tyr Asn Leu Asp Gln Ile 180 185 190 Thr Ala Ile Ala Asp Ser Pro Gly His Val Phe Ala Val Glu Asn Gly 195 200 205 Phe Lys Ala Leu Arg Ser Thr Ile Asp Ala Leu Thr Ser Lys Val Cys 210 215 220 Leu Asp Val Thr Ser Val Glu Pro Ser Ser Glu Cys Val Gly Glu Pro 225 230 235 240 Tyr His Val Val Ile His Gly Asn Gly Phe Gln Asn Leu Lys Lys Arg 245 250 255 Asp Glu Val Ile Cys Arg Phe Ile Phe Asn Glu Ser Thr Ile Ile Asp 260 265 270 Glu Lys Pro Thr Ser Ile Asp Asn Asn Ser Met Asn Cys Pro Gly Pro 275 280 285 Lys Leu Glu Lys Pro Gly Glu Glu Tyr Ser Ile Glu Val Ser Leu Asn 290 295 300 Lys Gly Lys Thr Phe Phe Lys Ser Asn Val Ser Ile Thr Ser Thr Thr 305 310 315 320 Cys Gly Ile Phe Arg His His His His His His 325 330 <210> 145 <211> 516 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 tttgacctct acttcatctt ggacaagtct ggcagcgtga acaataactg gattgacctt 60 tatatgtggg tggaggaaac agtggcgagg ttccaaagcc caaatattcg gatgtgcttc 120 atcacctact ccacagacgg ccagactgtc ttgccactca cctcagacaa gaatagaata 180 aaaaacggtc ttgaccaact tcagaaaatt gtgcctgacg gtcacacatt catgcaggca 240 ggatttagaa aggcaattca acagatcgaa agtttcaact ccggaaacaa ggttcccagc 300 atgattattg ctatgactga tggagaactg gtggcacatg catttcagga cactctcaga 360 gaagctcaaa aggctcggaa actgggggcc aacgtttaca ccctgggtgt ggctgattat 420 aatctggacc agataacagc aattgcagac agccctggcc acgtgtttgc agtggagaat 480 ggcttcaagg ccctgagaag caccattgat gccctc 516 <210> 146 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Phe Asp Leu Tyr Phe Ile Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Asn Asn Asn 1 5 10 15 Trp Ile Asp Leu Tyr Met Trp Val Glu Glu Thr Val Ala Arg Phe Gln 20 25 30 Ser Pro Asn Ile Arg Met Cys Phe Ile Thr Tyr Ser Thr Asp Gly Gln 35 40 45 Thr Val Leu Pro Leu Thr Ser Asp Lys Asn Arg Ile Lys Asn Gly Leu 50 55 60 Asp Gln Leu Gln Lys Ile Val Pro Asp Gly His Thr Phe Met Gln Ala 65 70 75 80 Gly Phe Arg Lys Ala Ile Gln Gln Ile Glu Ser Phe Asn Ser Gly Asn 85 90 95 Lys Val Pro Ser Met Ile Ile Ala Met Thr Asp Gly Glu Leu Val Ala 100 105 110 His Ala Phe Gln Asp Thr Leu Arg Glu Ala Gln Lys Ala Arg Lys Leu 115 120 125 Gly Ala Asn Val Tyr Thr Leu Gly Val Ala Asp Tyr Asn Leu Asp Gln 130 135 140 Ile Thr Ala Ile Ala Asp Ser Pro Gly His Val Phe Ala Val Glu Asn 145 150 155 160 Gly Phe Lys Ala Leu Arg Ser Thr Ile Asp Ala Leu 165 170 <210> 147 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 acgtcaaagg tctgtcttga tgtgacatcg gtggagcctt cctctgagtg tgtaggagaa 60 ccctaccatg tggttattca tggaaatggc tttcagaatc taaagaaacg ggatgaagtt 120 atttgcagat ttatcttcaa tgaaagcact atcattggga gtactctatt gaag 174 <210> 148 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Thr Ser Lys Val Cys Leu Asp Val Thr Ser Val Glu Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Cys Val Gly Glu Pro Tyr His Val Val Ile His Gly Asn Gly Phe Gln 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Arg Asp Glu Val Ile Cys Arg Phe Ile Phe Asn Glu 35 40 45 Ser Thr Ile Ile Gly Ser Thr Leu Leu Lys 50 55 <210> 149 <211> 174 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 acgtcaaagg tctgtcttga tgtgacatcg gtggagcctt cctctgagtg tgtaggagaa 60 ccctaccatg tggttattca tggaaatggc tttcagaatc taaagaaacg ggatgaagtt 120 atttgcagat ttatcttcaa tgaaagcact atcattgatg aaaagccaac cagt 174 <210> 150 <211> 58 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Thr Ser Lys Val Cys Leu Asp Val Thr Ser Val Glu Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Cys Val Gly Glu Pro Tyr His Val Val Ile His Gly Asn Gly Phe Gln 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Arg Asp Glu Val Ile Cys Arg Phe Ile Phe Asn Glu 35 40 45 Ser Thr Ile Ile Asp Glu Lys Pro Thr Ser 50 55 <210> 151 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion protein linker sequence <400> 151 Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met 1 5 10 <210> 152 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Met Gly Ser His Glu Ser Leu Gly Pro Tyr Phe Leu Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Leu Phe Arg Ala 20 25 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer INSP141-CP1 <400> 153 gtcacaggga cagccagata 20 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer INSP141-CP2 <400> 154 gctggtgatg ctgacattgc 20 <210> 155 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer INSP141-AP1 <400> 155 atggggagcc atgagtccct ggggccctac ttcctg 36 <210> 156 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer INSP141-AP2 <400> 156 agctgacttc aatagagtac tcccaatgat agtgctttca ttgaaga 47 <210> 157 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer INSP143-AP1 <400> 157 gcggaaaatg ccacatgtgg tgctggtgat gctgacattg ctcttg 46 <210> 158 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 21M13 <400> 158 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 159 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer M13REV <400> 159 caggaaacag ctatgacc 18 <210> 160 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer T7 <400> 160 taatacgact cactatagg 19 <210> 161 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer T3 <400> 161 attaaccctc actaaagg 18 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer INSP142-936F <400> 162 ccctgggcca aaactagaaa a 21 <210> 163 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer INSP142-1044R <400> 163 aagagaagga catgtggtgc tg 22 <210> 164 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hGAPDH-F <400> 164 ccacccatgg caaattcc 18 <210> 165 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hGAPDH-R <400> 165 gatgggattt ccattgatga ca 22 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Intron-hGAPDH-F <400> 166 cctagtccca gggctttgat t 21 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Intron-hGAPDH-R <400> 167 ctgtgctccc actcctgatt t 21 <210> 168 <211> 500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Met Gly Ser His Glu Ser Leu Gly Pro Tyr Phe Leu Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ser Leu Arg Tyr 20 25 30 His Gly Pro Asp Trp Arg Ile Phe His Arg Leu Ala Leu Gly Ser Arg 35 40 45 Arg Ala His His His His Gly Pro Gly Trp Arg Gln His Trp Arg Gln 50 55 60 Gly Gln Ala Gly His Arg Cys Gln Gly Ser Phe Asp Leu Tyr Phe Ile 65 70 75 80 Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Asn Asn Asn Trp Ile Asp Leu Tyr Met 85 90 95 Trp Val Glu Glu Thr Val Ala Arg Phe Gln Ser Pro Asn Ile Arg Met 100 105 110 Cys Phe Ile Thr Tyr Ser Thr Asp Gly Gln Thr Val Leu Pro Leu Thr 115 120 125 Ser Asp Lys Asn Arg Ile Lys Asn Gly Leu Asp Gln Leu Gln Lys Ile 130 135 140 Val Pro Asp Gly His Thr Phe Met Gln Ala Gly Phe Arg Lys Ala Ile 145 150 155 160 Gln Gln Ile Glu Ser Phe Asn Ser Gly Asn Lys Val Pro Ser Met Ile 165 170 175 Ile Ala Met Thr Asp Gly Glu Leu Val Ala His Ala Phe Gln Asp Thr 180 185 190 Leu Arg Glu Ala Gln Lys Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Val Tyr Thr 195 200 205 Leu Gly Val Ala Asp Tyr Asn Leu Asp Gln Ile Thr Ala Ile Ala Asp 210 215 220 Ser Pro Gly His Val Phe Ala Val Glu Asn Gly Phe Lys Ala Leu Arg 225 230 235 240 Ser Thr Ile Asp Ala Leu Thr Ser Lys Val Cys Leu Asp Val Thr Ser 245 250 255 Val Glu Pro Ser Ser Glu Cys Val Gly Glu Pro Tyr His Val Val Ile 260 265 270 His Gly Asn Gly Phe Gln Asn Leu Lys Lys Arg Asp Glu Val Ile Cys 275 280 285 Arg Phe Ile Phe Asn Glu Ser Thr Ile Ile Asp Glu Lys Pro Thr Ser 290 295 300 Ile Asp Asn Asn Ser Met Asn Cys Pro Gly Pro Lys Leu Glu Lys Pro 305 310 315 320 Gly Glu Glu Tyr Ser Ile Glu Val Ser Leu Asn Lys Gly Lys Thr Phe 325 330 335 Phe Lys Ser Asn Val Ser Ile Thr Ser Thr Thr Cys Val Ser Thr Ser 340 345 350 Met Gly Leu Gln Thr Cys Met Arg Thr Val Gln Ser Leu Cys Thr Arg 355 360 365 Arg Ser Thr Glu Lys Ala Asp Arg Ser Gln Ala Val Pro Glu Ser Ser 370 375 380 Val Cys Ser Arg His Leu Arg Leu Leu Gln Pro Gly Phe Trp Met Val 385 390 395 400 Gln Ala Pro Glu Met Ser Leu Ser Ala Pro Ser Pro Ser Pro Val Val 405 410 415 Cys Pro Leu Leu Leu Leu Lys Gly Arg Leu Ser Gly Thr Arg Thr Arg 420 425 430 Ala Gln Leu Gln Glu Ala Pro Gly Asn Gly Asp Ala Val Pro Gln Gly 435 440 445 Ile Phe Arg Asn Trp Leu Tyr Phe Val Pro Leu Leu Leu Leu Val Pro 450 455 460 Leu Leu Leu Cys Cys Val Trp Arg Leu Cys Arg Lys Gln Ala Ser Ala 465 470 475 480 Pro Cys Pro Pro Ser Ser Gly Ala Gln Ala Gln Ala His Pro Leu Arg 485 490 495 Asp Ser Asn Met 500 <210> 169 <211> 641 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> IPI00480015.1 <400> 169 Met Gly Ser His Glu Ser Leu Gly Pro Tyr Phe Leu Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Pro Pro Pro Leu Phe Arg Ala Gly Ser Leu Arg Tyr 20 25 30 His Gly Pro Asp Trp Arg Ile Phe His Arg Leu Ala Leu Gly Ser Arg 35 40 45 Arg Ala His His His His Gly Pro Gly Trp Arg Gln His Trp Arg Gln 50 55 60 Gly Gln Ala Gly His Arg Cys Gln Gly Ser Phe Asp Leu Tyr Phe Ile 65 70 75 80 Leu Asp Lys Ser Gly Ser Val Asn Asn Asn Trp Ile Asp Leu Tyr Met 85 90 95 Trp Val Glu Glu Thr Val Ala Arg Phe Gln Ser Pro Asn Ile Arg Met 100 105 110 Cys Phe Ile Thr Tyr Ser Thr Asp Gly Gln Thr Val Leu Pro Leu Thr 115 120 125 Ser Asp Lys Asn Arg Ile Lys Asn Gly Leu Asp Gln Leu Gln Lys Ile 130 135 140 Val Pro Asp Gly His Thr Phe Met Gln Ala Gly Phe Arg Lys Ala Ile 145 150 155 160 Gln Gln Ile Glu Ser Phe Asn Ser Gly Asn Lys Val Pro Ser Met Ile 165 170 175 Ile Ala Met Thr Asp Gly Glu Leu Val Ala His Ala Phe Gln Asp Thr 180 185 190 Leu Arg Glu Ala Gln Lys Ala Arg Lys Leu Gly Ala Asn Val Tyr Thr 195 200 205 Leu Gly Val Ala Asp Tyr Asn Leu Asp Gln Val Ile Pro Ser Ser Pro 210 215 220 Gly His Val Phe Ala Val Glu Asn Gly Phe Lys Ala Leu Arg Ser Thr 225 230 235 240 Ile Asp Ala Leu Thr Ser Lys Val Cys Leu Asp Val Thr Ser Val Glu 245 250 255 Pro Ser Ser Glu Cys Val Gly Glu Pro Tyr His Val Val Ile His Gly 260 265 270 Asn Gly Phe Gln Asn Leu Lys Lys Arg Asp Glu Val Ile Cys Arg Phe 275 280 285 Ile Phe Asn Glu Ser Thr Ile Ile Asp Glu Lys Pro Thr Ser Ile Asp 290 295 300 Asn Asn Ser Met Asn Cys Pro Gly Pro Lys Leu Glu Lys Pro Gly Glu 305 310 315 320 Glu Tyr Ser Ile Glu Val Ser Leu Asn Lys Gly Lys Thr Phe Phe Lys 325 330 335 Ser Asn Val Ser Ile Thr Ser Thr Thr Cys Arg Pro Pro Arg Pro Ser 340 345 350 Tyr Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Gly Ile Phe Arg Asn Trp Leu Tyr 355 360 365 Phe Val Pro Leu Leu Leu Leu Val Pro Leu Leu Leu Cys Cys Val Trp 370 375 380 Arg Leu Cys Arg Lys Gln Ala Ser Ala Pro Cys Pro Pro Ser Ser Gly 385 390 395 400 Ala Gln Ala Gln Ala His Pro Leu Arg Asp Ser Asn Met Arg Arg Ser 405 410 415 Leu Pro Gly Thr Ser Ser Gln Ala Gln Gly Gly Gln Ser Asp Thr Pro 420 425 430 Lys Ala Val Leu Cys Pro Gly Ala Pro Gly Gln Gly Pro Ser Cys Val 435 440 445 Gln Gly Gln Gly Arg Ala Arg Pro Pro Pro Ser Ser Leu Ser Pro Val 450 455 460 Asn Thr Cys Pro Thr Val Ile Ile Cys Cys Cys Gly Cys Gln Gly Val 465 470 475 480 Gly Gly Met Arg Arg Ile Glu Gly Asn Leu Asp Thr Phe Cys Asp Leu 485 490 495 Ser His Ala Ser Cys His Gln Val Pro Trp Met Cys Cys Gln Ser Arg 500 505 510 Asp Gln Gly Arg Tyr Leu Ser Leu Ala Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Ala 515 520 525 Gln Ala Pro Cys Cys Pro Arg Ile Cys Phe Pro His Ser Gln Glu Cys 530 535 540 Leu Ser Leu Pro Gln Ala Pro Cys Ser Pro Arg Met Cys Leu Arg His 545 550 555 560 Ser Arg Glu Glu Cys Leu Ala Arg Lys Gln Ala Pro Cys Ser Pro Arg 565 570 575 Ile Cys Leu Arg His Ser Pro Glu Tyr Phe Ser Gln Ala Gln Thr Leu 580 585 590 Cys Asn Pro Lys Ser Cys Leu Gln Pro Ser Arg Glu Cys Leu Pro Leu 595 600 605 Thr Cys Ser Ser Arg Cys Arg Leu Pro Pro Ala Arg Cys Leu Arg Pro 610 615 620 Pro Ser Arg Met Leu Pro Leu Leu Ser Pro Leu Leu Arg His Thr Ala 625 630 635 640 Glu

Claims (61)

  1. 아래에서 선택되는 폴리펩티드:
    (i) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:148에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 128 또는 SEQ ID NO: 132에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:148에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  4. 아래에서 선택되는 폴리펩티드:
    (i) SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, EQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  5. 제 4항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO: 52 또는 SEQ ID NO: 156에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  6. 제 4항 또는 5항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, EQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  7. 아래에서 선택되는 폴리펩티드:
    (i) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  8. 제 7항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 137 또는 SEQ ID NO: 141에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제 7항 또는 8항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  10. 아래에서 선택되는 폴리펩티드:
    (i) SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:148에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  11. 제 10항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO: 126에 열거된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제 10항 또는 11항에 있어서,
    (i) SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:146 또는 SEQ ID NO:148에 열거된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드;
    (ii) vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 기능하는 이의 단편이거나, 또는 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 폴리펩티드; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 등가물인 폴리펩티드.
  13. 전술한 항중 어느 한 항의 (iii)에 따른 기능적 등가물인 폴리펩티드에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148 또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열과 상동하고, vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 전술한 항중 어느 한 항에 열거된 단편 또는 기능적 등가물인 폴리펩티드에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148 또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열, 또는 이의 활성 단편과 50% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 보유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  15. 전술한 항중 어느 한 항에 열거된 기능적 등가물인 폴리펩티드에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148 또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드와 현저한 구조적 상동성을 보이는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  16. 제 1항 내지 14항중 어느 한 항에 열거된 단편인 폴리펩티드에 있어서, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36 SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:122, SEQ ID NO:124, SEQ ID NO:126, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:130, SEQ ID NO:132, SEQ ID NO:134, SEQ ID NO:136, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:140, SEQ ID NO:142, SEQ ID NO:144, SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:148 또는 SEQ ID NO:150에 열거된 아미노산 서열로부터 7개 이상의 아미노산 잔기로 구성되는 제 1항, 4항, 7항, 10항, 13항중 어느 한 항의 (i)의 폴리펩티드와 공통의 항원 결정부위를 보유하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  17. 전술한 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
  18. 제 17항에 있어서, INSP141, INSP142, INSP143의 세포외 부분, 또는 INSP144의 세포외 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  19. 전술한 항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 정제된 핵산 분자.
  20. 제 19항에 있어서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141 또는 SEQ ID NO:143에 열거된 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이들의 잉여 등가물이나 단편인 것을 특징으로 하는 정제된 핵산 분자.
  21. 제 19항에 있어서, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:107, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:121, SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO:135, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141, SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147 또는 SEQ ID NO:149에 열거된 핵산 서열로 구성되거나, 또는 이들의 잉여 등가물이나 단편인 것을 특징으로 하는 정제된 핵산 분자.
  22. 높은 엄밀도 조건하에서 제 19항 내지 21항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자와 혼성화되는 정제된 핵산 분자.
  23. 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 열거된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  24. 제 23항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  25. 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 리간드.
  26. 제 25항에 있어서, 항체인 것을 특징으로 하는 리간드.
  27. 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 발현이나 활성 수준을 증가 또는 감소시키는 화합물.
  28. 제 27항에 있어서, 폴리펩티드의 생물학적 효과를 유도하지 않으면서 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 결합하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 제 28항에 있어서, 자연이나 변형된 기질, 리간드, 효소, 수용체, 또는 구조적 또는 기능적 모방체(mimetic)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 질병의 치료 또는 진단에 사용되는 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 23항에 따른 벡터, 제 24항에 따른 숙주 세포, 제 25항 또는 26항에 따른 리간드, 제 27항 내지 29항중 어느 한 항에 따른 화합물.
  31. 환자에서 질병을 진단하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    상기 환자로부터 얻은 조직에서 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 자연 유전자의 발현 수준, 또는 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 활성 수준을 평가하고;
    상기 발현이나 활성 수준을 대조 수준과 비교하고,
    여기서 대조 수준과 상이한 수준은 질병을 암시한다.
  32. 제 31항에 있어서, 시험관내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 31항 또는 32항에 있어서,
    (a) 리간드-폴리펩티드 복합체의 형성에 적합한 조건하에 본 발명의 제 25항 또는 26항의 리간드를 생물학적 샘플과 접촉시키고,
    (b) 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 31항 또는 32항에 있어서,
    a) 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자와 프로브간 하이브리 드 복합체 형성이 가능한 엄밀도 조건하에서 환자로부터 얻은 조직 샘플과 핵산 프로브를 접촉시키고;
    b) a) 단계에서 이용된 동일한 조건하에서 프로브와 대조 샘플을 접촉시키고;
    c) 샘플에서 하이브리드 복합체의 존재를 검출하고,
    여기서, 대조 샘플에서 하이브리드 복합체의 수준과 비교하여 환자 샘플에서 하이브리드 복합체의 상이한 수준의 검출은 질병을 암시한다.
  35. 제 31항 또는 32항에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자와 프라이머간 하이브리드 복합체의 형성이 가능한 엄밀도 조건하에서 핵산 프라이머와 환자 조직의 핵산 샘플을 접촉시키고;
    b) a) 단계에서와 동일한 조건하에서 대조 샘플과 프라이머를 접촉시키고;
    c) 견본 핵산을 증폭하고;
    d) 환자 샘플과 대조 샘플로부터 증폭된 핵산의 수준을 검출하고;
    여기서, 대조 샘플에서 증폭된 핵산 수준과 비교하여 환자 샘플에서 증폭된 핵산의 현저하게 상이한 수준의 검출은 질병을 암시한다.
  36. 제 31항 또는 32항에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    a) 질병을 검사받는 환자로부터 조직 샘플을 얻고;
    b) 조직 샘플로부터 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 분리하고;
    c) 질병의 지표로서 핵산 분자에서 질병과 연관된 돌연변이의 존재를 검출하여 환자에서 질병을 진단한다.
  37. 제 36항에 있어서, 핵산 분자를 증폭하여 증폭 산물을 만들고, 증폭 산물에서 돌연변이 유무를 검출하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36항 또는 37항에 있어서, 하이브리드-이중 가닥 분자를 형성하는 엄밀도 조건하에서 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 프로브와 핵산 분자를 접촉시키고, 여기서 하이브리드 이중-가닥 분자는 질병과 연관된 돌연변이에 상응하는 임의의 부분에서 핵산 프로브 가닥의 혼성화되지 않은 부분을 보유하고; 질병-연관된 돌연변이 유무의 지표로서 프로브 가닥의 혼성화되지 않은 부분의 유무를 검출함으로써 환자에서 돌연변이 유무를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 31항 내지 38항중 어느 한 항에 있어서, 질병에는 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시 스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측삭 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염, 세균 중독, 비탈저, 독소(가령, 세균 독소)의 차단, 암, 내피 종양, 결장직장암, 방광암, 식도암(oesophageal cancer), 폐암, 흑색종, 연소성 유리질 섬유종증(juvenile hyaline fibromatosis, JFH), 유아 전신 유리질증(infantile systemic hyalinosis, ISH), 본 빌리브란트(von Willebrand) 질환, Bethlem 근병증(Bethlem myopathy), 이영양성 표피 수포증(epidermolysis bullosa dystrophica), 혈전증, 혈소판-매개된 응집의 조절, 자가면역 질환, 염증, 다른 병리학적 이상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 31항 내지 38항중 어느 한 항에 있어서, 질병은 염증성 장 질환, 독소-관련된 질환, 암, 피부 질환, 염증, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 접촉성 피부염, 아토피성 습진, 혈액과 림프계로부터 암, 피부암, 소화계 암, 비뇨기계 암, 유방암, 난소암, 부인과 암, 융모암종(choriocarcionoma), 폐암, 뇌종양, 골종양, 카르시노이드 종양, 결장직장암, 비인두암(nasopharyngeal cancer), 복막후 육종(retroperitoneal sarcoma), 연조직 종양, 갑상선암, 고환암, 간암, 세균 독소- 관련된 질환, 비탈저, 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum) C2 독소-관련된 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 혈액과 림프계로부터 암, 피부암, 소화계 암, 비뇨기계 암, 유방암, 난소암, 부인과 암, 융모암종, 폐암, 뇌종양, 골종양, 카르시노이드 종양, 결장직장암, 비인두암, 복막후 육종, 연조직 종양, 갑상선암, 고환암 또는 간암인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 31항 내지 39항중 어느 한 항에 있어서, 질병은 vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질이 관여하는 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질로서 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 용도.
  43. 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 23항에 따른 벡터, 제 24항에 따른 숙주 세포, 제 25항 또는 26항에 따른 리간드, 제 27항 내지 29항중 어느 한 항에 따른 화합물을 함유하는 제약학적 조성물.
  44. 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 함유하는 백신 조성물.
  45. 신생물, 흑색종, 폐암, 결장직장암, 유방암, 췌장암, 두경부암, 다른 고형암을 비롯한 세포 증식성 질환; 백혈병, 비-호지킨 림프종, 백혈구 감소증, 혈소판 감소증, 혈관신생 질환, 카포시스 육종을 비롯한 골수증식성 질환; 알레르기, 염증성 장 질환, 관절염, 건선, 호흡기 염증, 천식, 장기 이식 거부반응을 비롯한 자가면역/염증 질환; 고혈압, 부종, 협심증, 죽상경화증, 혈전증, 패혈증, 쇼크, 재관류 손상, 허혈을 비롯한 심혈관 질환; 중추신경계 질환, 알츠하이머병, 뇌 손상, 근위축성 측삭 경화증, 통증을 비롯한 신경학적 질환; 발달 장애; 당뇨병, 골다공증, 비만을 비롯한 대사 장애; AIDS와 신장 질환; 바이러스 감염, 세균 감염, 진균 감염, 기생충 감염을 비롯한 감염; 세균 중독, 비탈저, 독소(가령, 세균 독소)의 차단, 암, 내피 종양, 결장직장암, 방광암, 식도암(oesophageal cancer), 폐암, 흑색종, 연소성 유리질 섬유종증(juvenile hyaline fibromatosis, JFH), 유아 전신 유리질증(infantile systemic hyalinosis, ISH), 본 빌리브란트(von Willebrand) 질환, Bethlem 근병증(Bethlem myopathy), 이영양성 표피 수포증(epidermolysis bullosa dystrophica), 혈전증, 혈소판-매개된 응집의 조절, 자가면역 질환, 염증, 다른 병리학적 이상의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 23항에 따른 벡터, 제 24항에 따른 숙주 세포, 제 25항 또는 26항에 따른 리간드, 제 27항 내지 29항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 43항에 다른 제약학적 조성물.
  46. vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질, 바람직하게는, ATR-유사 단백질이 관여하는 질환의 치료를 위한 약제의 제조에 사용되는 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 23항에 따른 벡터, 제 24항에 따른 숙주 세포, 제 25항 또는 26항에 따른 리간드, 제 27항 내지 29항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 43항에 다른 제약학적 조성물.
  47. 환자에서 질병을 치료하는 방법에 있어서, 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 23항에 따른 벡터, 제 24항에 따른 숙주 세포, 제 25항 또는 26항에 따른 리간드, 제 27항 내지 29항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 43항에 다른 제약학적 조성물을 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 건강한 개체에서 발현이나 활성 수준과 비교하여 자연 유전자의 발현 또는 폴리펩티드의 활성이 병든 환자에서 감소하는 질병의 경우에, 환자에 투여되는 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 리간드, 화합물 또는 조성물은 항진제인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 47항에 있어서, 건강한 개체에서 발현이나 활성 수준과 비교하여 자연 유 전자의 발현 또는 폴리펩티드의 활성이 병든 환자에서 증가하는 질병의 경우에, 환자에 투여되는 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 리간드, 화합물 또는 조성물은 길항제인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 환자에서 질병 치료를 모니터하는 방법에 있어서, 환자의 조직에서 일정 기간 동안 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 발현이나 활성 수준, 또는 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자의 발현 수준을 모니터하고, 시간이 경과함에 따라 활성이나 발현 수준이 대조 수치에 근접하는 것은 질병으로부터 회복을 암시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 질병의 진단 또는 치료에 효과적인 화합물을 확인하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 상기 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 결합 친화성을 갖는 것으로 생각되는 한가지이상의 화합물과 접촉시키고;
    이들 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 화합물을 선별한다.
  52. 질병을 진단하는데 유용한 키트에 있어서,
    엄밀도 조건하에서 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자와 혼성화되는 핵산 프로브를 보유하는 제 1 용기;
    핵산 분자를 증폭하는데 유용한 프라이머를 보유하는 제 2 용기;
    질병 진단을 용이하게 하는, 상기 프로브와 프라이머의 사용 설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  53. 제 52항에 있어서, 혼성화되지 않은 RNA를 절단하는 약품을 보유하는 제 3 용기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  54. 핵산 분자 어레이를 포함하고, 어레이중 적어도 하나는 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자인 키트.
  55. 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드에 결합하는 하나이상의 항체 및 상기 항체와 상기 폴리펩티드 사이의 결합 반응을 검출하는데 유용한 시약을 포함하는 진단 키트.
  56. 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 더욱 높거나 낮은 수준으로 발현하거나 이런 폴리펩티드를 발현하지 않도록 형질전환된 유전자도입 또는 녹아웃(knockout)된 인간이외의 동물.
  57. 질병을 치료하는데 효과적인 화합물을 스크리닝하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    제 56항에 따른 인간이외의 유전자도입 동물과 후보 화합물을 접촉시키고;
    동물에서 질병에 대한 화합물의 효과를 결정한다.
  58. IVF 또는 피임제 용도로 사용되는 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 23항에 따른 벡터, 제 24항에 따른 숙주 세포, 제 25항 또는 26항에 따른 리간드, 제 27항 내지 29항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 43항에 따른 제약학적 조성물.
  59. 피임제의 제조에 사용되는 제 1항 내지 18항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 19항 내지 22항중 어느 한 항에 따른 핵산 분자, 제 23항에 따른 벡터, 제 24항에 따른 숙주 세포, 제 25항 또는 26항에 따른 리간드, 제 27항 내지 29항중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 제 43항에 따른 제약학적 조성물.
  60. vWFA 또는 ANT_IG 도메인 보유 단백질 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 후보 약제를 스크리닝하기 위한 표적으로서 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드의 용도.
  61. 생물학적 활성 화합물을 선별하는 방법에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 후보 화합물과 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드를 발현하는 재조합 숙주 세포를 접촉시키고;
    (ii) 상기 세포의 표면에서 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드에 결합하거나, 또는 INSP141, INSP142, INSP143 또는 INSP144 폴리펩티드의 활성을 조절하는 화합물을 선별한다.
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