EA013251B1 - БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДОМЕНЫ vWFA И/ИЛИ ANT_IG - Google Patents

БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДОМЕНЫ vWFA И/ИЛИ ANT_IG Download PDF

Info

Publication number
EA013251B1
EA013251B1 EA200700951A EA200700951A EA013251B1 EA 013251 B1 EA013251 B1 EA 013251B1 EA 200700951 A EA200700951 A EA 200700951A EA 200700951 A EA200700951 A EA 200700951A EA 013251 B1 EA013251 B1 EA 013251B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
zeo
cancer
disease
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA200700951A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200700951A1 (ru
Inventor
Марк Дуглас Дэвис
Дэвид Михалович
Мелани Йорке
Кристин Пауэр
Original Assignee
Арес Трейдинг С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Арес Трейдинг С.А. filed Critical Арес Трейдинг С.А.
Publication of EA200700951A1 publication Critical patent/EA200700951A1/ru
Publication of EA013251B1 publication Critical patent/EA013251B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/16—Masculine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/18—Feminine contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым белкам (обозначаемым здесь INSP141, INSP142, INSP143 и INSP144), идентифицированным в настоящем описании как рецептороподобные белки сибирской язвы, содержащие домен фактора фон Виллебранда A (vWFA) и внеклеточный домен рецептора токсина сибирской язвы (ANT_IG), и к применению последовательностей указанных белков и нуклеиновых кислот кодирующих генов в целях диагностики, предупреждения и лечения заболевания.

Description

Настоящее изобретение относится к новым белкам (обозначенным здесь ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144), идентифицированным как рецептороподобные белки сибирской язвы, содержащие домен фактора А фон Виллебранда (ν^ΡΑ) и внеклеточный домен рецептора сибирской язвы (ΑΝΤ_ΙΟ), и к использованию этих белков и последовательностей нуклеиновых кислот кодирующих генов в целях диагностики, предупреждения и лечения заболевания.
Все цитированные здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин функциональная геномика применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научноисследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных о последовательностях этих белков.
Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастают, эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков согласно изобретению, позволяют получать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности.
Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств все еще остается актуальной.
Введение
Рецептор токсина сибирской язвы.
Сибирская язва главным образом поражает домашних и диких животных, в частности травоядных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, лошади, мулы и козы. Человек поражается этим заболеванием случайно посредством контакта с заболевшими животными, например через мясо, кости, шкуру, шерсть и экскременты.
Один из компонентов токсина сибирской язвы обладает действием, которое может привести к летальному исходу и которое пока еще не изучено. Смерть наступает из-за недостатка кислорода, вторичного шока, возрастающей проницаемости сосудов и нарушения дыхания. Смерть человека и животных от сибирской язвы часто наступает внезапно и неожиданно. На самой последней стадии заболевания уровень летального токсина в кровотоке быстро возрастает, и его концентрация прямо пропорциональна концентрации микроорганизмов в крови.
Трехкомпонентный токсин сибирской язвы продуцируется бактерией ВасШик апШгасЕ, которая является возбудителем сибирской язвы. Этот токсин способствует проникновению бактерии в иммунную систему и вызывает гибель хозяина в результате системной инфекции. Указанный токсин состоит из трех белков: протективного антигена (ΡΑ) (одной связывающейся с рецептором молекулы) и двух ферментных молекул, называемых фактором отека (ΕΡ) и летальным фактором (ЕР). После высвобождения указанных белков из бактерии в качестве нетоксичных молекул они попадают на поверхность клеток млекопитающих и образуют токсические комплексы, связывающиеся с клетками (Моигсх М. е( а1., Ναι. Вю1есйпо1. 2001, 19, 958-961).
Два компонента указанного токсина ферментативно модифицируют субстраты в цитозоле клеток млекопитающих, где фактор отека (ΕΡ) представляет собой аденилатциклазу, которая нарушает защитную функцию организма посредством различных механизмов, включая супрессию функции нейтрофилов и подавление резистентности хозяина. Летальный фактор (ЬР) представляет собой цинкзависимую протеазу, которая расщепляет активированную митогеном киназу протеинкиназы и вызывает лизис макрофагов. Протективный антиген (ΡΑ), т.е. третий компонент токсина, связывается с клеточным рецептором и опосредует доставку ферментных компонентов в цитозоль (Ьерр1а 8.Н. ЛпШгах (охш. Ιη ЛкЮпек К., бик( Ι., ебйогк. НапбЬоок оГ ехрепшеп(а1 рйагшасо1оду. Вег1ш: 8рппдег: 2000, р. 447-72).
Рецептор токсина сибирской язвы (ΑΤΚ.) кодируется геном эндотелиального маркера опухоли 8 (ΤΕΜ8). Для осуществления первой стадии интоксикации токсином сибирской язвы используют белковый продукт гена ΤΕΜ8. Истинные физиологические функции ΑΤΚ. пока неизвестны, однако очевидно, что ΤΕΜ8 стимулирует развитие рака ободочной кишки (81 Сго1х В. е( а1. (2000), 8аепсе, Αιΐβ. 18: 289 (5482): 1197-1202). Транскрипция ΤΕΜ8 также стимулируется в процессе ангиогенеза. Исследования, проводимые на мышином гене опухолевого эндотелиального маркера 8 ΑΤΕΜ8), дают основание предположить, что шΤΕΜ8 может участвовать в неоваскуляризации опухоли (Сагкоп-^аИег Ε. е( а1. (2001), Сапсег Век. 8ер. 15; 61 (18): 6649-55).
- 1 013251
Белок 2 капиллярного морфогенеза человека (СМО2) имеет доменную структуру, аналогичную ЛТК, и последовательности этих двух белков по всей их длине имеют 40%-ную идентичность. Было экспериментально показано, что СМС2 может связываться с субъединицами токсина сибирской язвы (РА), что дает основание предположить, что механизм действия СМС2 может быть аналогичен механизму АТК (8соЬ1е Н.М. е! а1. (2003), Ргос. Ыа11. Асаб. 8с1. И8А. Арг. 29; 100 (9): 5170-4). Истинные физиологические функции СМС2 неизвестны, однако было показано, что рекомбинантная форма СМС2 способна связываться с коллагеном типа IV и ламинином (Ве11 8. е1 а1. (2001), I. Се11 8с1. Аид; 114 (Р!. 15): 2755-73).
Внеклеточный домен рецептора сибирской язвы (АЫТ_Ю) расположен предположительно во внеклеточной Ν-концевой половине рецептора токсина сибирской язвы. Другой домен рецептора токсина сибирской язвы был найден во внеклеточной части и был назван А№Т_С. Эта часть, вероятно, принадлежит молекуле суперсемейства 1дС и обнаруживает наиболее близкое сходство с доменом 1РТ/ТЮ. Семейство 1РТ/ТЮ состоит из доменов, которые имеют такую же пространственную упаковку, что и иммуноглобулин. Эти домены были обнаружены в рецепторах клеточной поверхности, таких как Ме! и Коп, а также в факторах транскрипции, где они участвуют в связывании ДНК. Рецептор тирозинкиназы Коп имеет общие, присущие всем членам этого подсемейства (Ме! и 8еа), уникальные функциональные свойства: способность к регуляции диссоциации клеток; подвижность и способность к инвазии внеклеточного матрикса (разрушению).
Одним из типичных признаков АТК является внеклеточный домен фактора фон Виллебранда (уАЕА), известный также как домен интегрина (I). Домен уАЕА был обнаружен во многих внеклеточных белках. Примерами таких белков являются фактор В белков комплемента (ЕВ), С2, СК3 и СК4, интегрины и коллаген типов VI, VII, XII, XIV (Реткшк 8.1. е! а1., (1994), I. Мо1. Вю1. Арг. 22; 238 (1): 104-19), а также рецепторы токсина сибирской язвы (Вгаб1еу К. е! а1. (2003), Вюсйет Рйагтасо1. ЕеЬ. 1; 65 (3): 309-14). Функциями, ассоциироваными с белками, содержащими домен уАЕА, являются их действие в качестве компонентов внеклеточного матрикса, гемостаз, клеточная адгезия и действие по механизмам иммунной защиты (Со1отЬа!!1 А. е! а1. (1993), Ма!пх. 1и1.; 13 (4): 297-306).
Домен уАЕА, обнаруженный в белках класса интегринов, был обозначен как домен интегрина I (Ко1апб А. е! а1. (2003), I. Вю1. Сйеш. Арг. 25; 278 (17), 15035-15039). Было показано, что субъединица РА токсина сибирской язвы связывается непосредственно с доменом уАЕА АТК по механизму, который, очевидно, имитирует механизм связывания интегринов с их природными субстратами. Было показано, что растворимая форма этого домена действует в клеточной культуре как эффективный внеклеточный антитоксин сибирской язвы (Вгаб1еу К. е! а1. (2003), Вюсйет. Рйагтасо1. ЕеЬ. 1; 65 (3): 309-14).
Общим мотивом для большинства белков, содержащих домен уАЕА, является зависимый от ионов металла сайт адгезии (МГОА8). Мотив МГОА8 участвует в координиции катионов (например, Мд2+, Мп2+, Ζη2+ и Са2+) и состоит из пяти остатков, Акр-х-8ег-х-8ег, Тйг и Акр (8соЬ1е Н.М. е! а1. (2003), Ргос. Ν!1. Асаб. 8с1. И8А Арг. 29; 100 (9): 5170-4). Мотив МГОА8 расположен во внеклеточном домене уАЕА хелатных комплексов АТК/ТЕМ8, образуемых двухвалентным катионом, который играет решающую роль в связывании РА.
Было показано, что растворимый домен уАЕА АТК (кАТК) блокирует интоксикацию сибирской язвой клеток китайского хомячка (СНО) в клеточной культуре (Вгаб1еу е! а1. №Ш1ге 2001; 414: 225-9; см. также АО 04/052277 и АО 02/46228).
Вгаб1еу е! а1. также сообщали об участии комплекса АТК./ТЕМ8/СМС2 в патогенезе рака, а именно опухолей эндотелия, рака ободочной кишки, рака мочевого пузыря, рака легких и меланомы (Вгаб1еу е! а1. Вюсйетюа1 Рйаттасо1оду, 2003. ^1. 65, р. 309-314).
Было высказано предположение, что лечение инфекций, вызываемых возбудителем сибирской язвы, а также рака может быть осуществлено с использованием нуклеиновой кислоты, которая является антисмысловой по отношению к АТК/ТЕМ8 (АО 04/013313 и АО 04/052277).
Было также высказано предположение, что природный АТК/ТЕМ8/СМО2 играет определенную роль в ангиогенезе (см. Nаηба апб 8!.Сго1х, Сиггеп! Оршюп ίη Опсо1оду, 2004. ^1. 16, р. 44-49). Было показано, что внеклеточный домен ТЕМ8 связывается с субъединицей α3 коллагена VI посредством СООН-концевого домена С5 (№-тба е! а1. Сапсег Кекеагсй, 2004. Vо1. 64, р. 817-820). РА может конкурировать с субъединицей коллагена за связывание с АТК. №-тба е! а1. было высказано предположение, что взаимодействие с ТЕМ8/С5 может играть важную роль в опухолевом ангиогенезе.
Мутации в гене СМО2 (в частности, в домене уАЕА) вызывают два связанных с аллелями расстройства: ювенильный гиалиновый фиброматоз (ЮГФ) и системный гиалиноз у детей Д8Н; Басу е! а1., ΓΝΆ8 2004. 101. № 17, р. 6367-6372).
Кроме того, миссенс-мутации в доменах уАЕА различных белков приводят к заболеваниям человека. Мутации предшественника фактора фон Виллебранда (уАЕ) ассоциируются с заболеванием фон Виллебранда (ОМ[М Асс. № 193400). Мутации предшественника коллагеновой цепи (/.3(+0 ассоциируются с миопатией Бетлема (ОМЕМ Асс. № 120250 и 158810). Мутации предшественника коллагеновой цепи α1 (VII) (длинноцепочечный коллаген) (БС-коллаген) ассоциируются с буллезным дистрофическим эпидермолизом (доминантный ген, ОМ^ Асс. № 120120; рецессивный ген, ОМ^ Асс. № 131750; претибиаль
- 2 013251 ный, доминантный и рецессивный ΟΜΙΜ Асе. № 226600 и ΟΜΙΜ Асе. № 131850).
Некоторые белки, которые содержат одну или несколько копий домена типа А, участвуют в механизмах защиты хозяина, таких как иммунный ответ и воспаление (см., например, Се11ке1 с1 а1., Ыа1иге 81гис1ига1 Вю1оду, 5: 189 (1998)).
В \УО 92/17192 приведена терапевтическая композиция, эффективная для лечения или ингибирования тромбоза и содержащая мономерный полипептид, расположенный во фрагменте зрелой субъединицы фактора фон Виллебранда (ννΕ) дикого типа. \¥О 04/062551 относится к полипептидам, которые содержат, по меньшей мере, однодоменное антитело против ν\νΒ. домена ν\νΒ А1, домена А1 активированного ν\νΒ. домена ν\νΒ А3, дЫЬ и/или коллагена, или к гомологам и/или функциональным частям этих полипептидов, где указанные полипептиды могут быть использованы в диагностике и/или лечении состояний, требующих модуляции опосредованной тромбоцитами агрегации.
Поэтому получение еще большей информации о белках, содержащих домен ч^ЕА и домен ΛΝΤ-ΙΠ в частности об АТК-подобных белках, имеет исключительно важное значение в понимании процессов, лежащих в основе вышеупомянутых патологических состояний, а следовательно, и в разработке более эффективной генной и/или лекарственной терапии указанных расстройств.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что белки, обозначенные здесь ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, представляют собой варианты сплайсинга одной и той же последовательности, которые гомологичны рецептору токсина сибирской язвы. В частности, настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того факта, что полипептиды, описанные в настоящем документе, предпочтительно ΙΝ8Ρ142, обнаруживают ограниченную экспрессию, о чем ранее не высказывалось каких-либо предположений, и эта экспрессия наблюдается в биоптатах ободочной кишки и подвздошной кишки, пораженных ΙΒΌ, а также в биоптатах кожи, пораженной псориазом. Результаты Тас^ао-анализа экспрессии указывали на специфическую картину экспрессии, которая показала, что ΙΝ8Ρ142 стимулирует воспалительный процесс в кишечнике и способствует развитию воспалительных заболеваний кишечника, а также болезней и воспалений кожи.
Эти неожиданно обнаруженные свойства являются характерными свойствами полипептидов согласно изобретению и кодирующих их полинуклеотидов и позволяют использовать указанные полипептиды для приготовления лекарственных средств или фармацевтических композиций.
Все ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 предположительно содержат домен фактора А фон Виллебранда (ννΡΆ) и внеклеточный домен рецептора токсина сибирской язвы (А№Т_Ю). Эти два внеклеточных домена сообщают АТК-подобным белкам токсина сибирской язвы рецепторные связывающие свойства. На фиг. 8 и 9 проиллюстрированы консервативные свойства белков ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, присущие АТК-подобным белкам на структурном и аминокислотном уровне. Домен ч^ЕА идентичен доменам ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144. Домен АЭТ_Ю в белке ΙΝ8Ρ141 слегка отличается от домена АЭТ_Ю в ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144.
Предполагается, что ΙΝ8Ρ141 и ΙΝ8Ρ142 секретируют белки, которые не содержат трансмембранные области.
Предполагается, что ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 содержат сигнальный пептид и трансмембранные области. Что касается ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, то предполагается, что их Ν-конец является внеклеточным, а С-конец является внутриклеточным.
В одном из вариантов своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который:
(ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:2, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:4, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:6, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:8, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:10, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:12, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:14, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:16, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:18, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:20, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:22, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:24, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:128, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:130, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:132, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:134, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:146 и/или 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:148;
(ίί) представляет собой фрагмент, который действует как белок, содержащий домен ч^ЕА и/или А№Т_Ю, предпочтительно как АТК-подобный белок, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
Предпочтительно полипептид согласно первому аспекту изобретения:
(ΐ) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Ε0 ΙΌ ΝΟ:24, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:128 и/или 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:132;
(ίί) представляет собой фрагмент, который действует как белок, содержащий домен ч^ЕА и/или А№Т_Ю, предпочтительно как АТК-подобный белок, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
В соответствии с этим аспектом полипептид согласно изобретению может состоять из одной из вышеуказанных последовательностей, таких как 8Ε0 Ш ΝΟ:2, 8Ε0 ΙΌ ΝΟ:4, 8Ε0 ΙΌ ΝΟ:6, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:8, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:10, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:12, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:14, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:16, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:18, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:20, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:22, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:24, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:128, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:130, 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ:132,
- 3 013251
8ЕО ΙΌ N0:134, 8Ер ΙΌ N0:146 и/или 8Ер ΙΌ N0:148.
Полипептид согласно первому аспекту изобретения может, кроме того, содержать гистидиновую метку. Предпочтительно, если такая гистидиновая метка находится на С-конце указанного полипептида. Предпочтительная гистидиновая метка содержит 1-10 гистидиновых остатков (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков). Более предпочтительно если гистидиновая метка содержит 6 гистидиновых ос8Е0 ГО N0:2, будет далее называться ся ся ся представленную
8Е0 ГО N0:4, будет далее
8Е0 ГО N0:6, будет далее
8Е0 ГО N0:8, будет далее
8ЕО
ГО
N0:10, будет называтьназыватьназыватьдалее назыпредставленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную
8ЕО
8ЕО
8ЕО
8ЕО
8ЕО
8ЕО
8ЕО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
N0:12, будет
N0:14, будет
N0:16, будет
N0:18, будет
N0:20, будет
N0:22, будет
N0:24, будет далее далее далее далее далее далее далее
8Е0 ГО N0:128, будет далее
8Е0 ГО N0:130, будет далее назыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназытатков.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную полипептидом экзона 1 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную полипептидом экзона 2 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную полипептидом экзона 3 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную полипептидом экзона 4 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 5 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 6 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 7 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 8 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 9 ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 10 1Л8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 11 1Л8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом 1Л8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться клонированным полипептидом ЕН8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться клонированным полипептидом 1Ы8Р141 с гистидиновой меткой.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:132, будет далее ваться клонированным зрелым полипептидом 1Д8Р141.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:134, будет далее ваться клонированным зрелым полипептидом 1Д8Р141 с гистидиновой меткой.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:146, будет далее ваться пептидной последовательностью домена у\УЕЛ 1Н8Р141-1Н8Р142-1Н8Р143-1Н8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:148, будет далее ваться пептидной последовательностью домена АИТ_Ю !Л8Р14Г.
Используемый здесь термин полипептиды ЕН8Р141 включает в себя полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 1Л8Р141, полипептид экзона 2 1Д8Р141. полипептид экзона 3 1Д8Р141. полипептид экзона 4 1Л8Р141, полипептид экзона 5 1Ы8Р141, полипептид экзона 6 1Ы8Р141, полипептид экзона 7 1Л8Р141, полипептид экзона 8 ЕН8Р141, полипептид экзона 9 ЕН8Р141, полипептид экзона 10 ЕН8Р141, полипептид экзона 11 1Л8Р141, полипептид 1Ы8Р141, клонированный полипептид 1Ы8Р141, клонированный полипептид 1Ы8Р141 с гистидиновой меткой, клонированный зрелый полипептид 1Ы8Р141, клонированный зрелый полипептид 1Ы8Р141 с гистидиновой меткой, пептидную последовательность домена у\УЕЛ 1Н8Р141-1Н8Р142-1Н8Р143-1Н8Р144, пептидную последовательность домена АИТ_Ю 1Д8Р141.
Предпочтительно полипептид согласно этому аспекту изобретения действует как белок, содержащий домен у\УЕЛ и/или ЛКГ_Ю, предпочтительно как АТВ-подобный белок. Под термином действует как белок, содержащий домен у\УЕЛ и/или АNТ_I^, авторы настоящего изобретения подразумевают, что полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность или структурные признаки, которые могут быть идентифицированы, например, с помощью стандартных методов биотехнологии как консервативные признаки, присущие полипептидам белков, относящихся к семействам белков, содержащих домены у\УЕЛ и/или АКТ_10, функционируют так, что взаимодействие этих полипептидов с лигандом или рецептором не оказывает какого-либо значительного негативного действия по сравнению с функцией полноразмерного полипептида дикого типа. Так, например, домен АДТ_1С определяют по конкретной сигнатуре (данные о конструировании НММЕВ) в базах данных по выравниванию семейств белков и НММ (РЕАМ, Тке РГат Рго1еш ЕатШек Иа1аЬа8е. А1ех с1 а1. МкДсю АеИк Векеагск 2004. Иа1аЬа8е Пкие 32: Ό138-Ό141). Определение функциональных свойств не должно быть ограничено конкретным биоин- 4 013251 формативным средством, таким как РЕАМ, поскольку для детекции консервативных доменов или мотивов существуют и другие средства, имеющие свои собственные конкретные сигнатуры. Кроме того, консервативные остатки в домене АОТ_Ю и в домене у\УЕА. которые, очевидно, имеют важное значение для их правильного функционирования, показаны на фиг. 9 (например, 13 идентичных остатков присутствуют в домене АОТ_Ю во всех членах этого семейства). Более того, специалист в данной области, исходя из выравнивания, показанного на фиг. 9, может создать конкретные сигнатуры для домена у\УЕА и/или домена АЛТ_Ю с применением подходящих средств (например, Рб1-Ыа81).
Под термином функции, аналогичные функции АТК-подобного белка, авторы настоящего изобретения подразумевают, что полипептиды содержат домены у\УЕА и АNТ_Ю, которые имеют свойства, аналогичные белку АТК. Так, например, полипептиды согласно изобретению предпочтительно обладают способностью связываться с токсином, более конкретно - с бактериальным токсином и/или обладают способностью к предупреждению и/или лечению рака.
втором варианте своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, кото-
Во
рый:
(1)
8 ЕС) ГО
8 ЕС) ГО
последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:26, содержит аминокислотную
N0:28, 8 ЕС) ГО N0:30, 8Ер ГО N0:32, 8 ЕС) ГО N0:34, 8 ЕС) ГО N0:36, 8 ЕС) ГО N0:38,
N0:40, 8 ЕС) ГО N0:42, 8 ЕС) ГО N0:44, 8 ЕС) ГО N0:46, 8 ЕС) ГО N0:48, 8 ЕС) ГО N0:50,
8ЕС) ГО N0:52, 8ЕС) ГО N0:136, 8ЕС) ГО N0:146 и/или 8ЕС) ГО N0:150;
(ίί) представляет собой фрагмент, который действует как белок, содержащий домен у\УЕЛ и/или Л№Г_Ю, предпочтительно как АТК-подобный белок, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
Предпочтительно полипептид согласно первому аспекту изобретения:
(ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:52 и/или 8ЕС) ГО N0:136;
(ίί) представляет собой фрагмент, который действует как белок, содержащий домен у\УЕЛ и/или Л№Т_Ю, предпочтительно как АТК-подобный белок, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
В соответствии с этим аспектом изобретения полипептид согласно изобретению может состоять из одной из вышеуказанных последовательностей, таких как 8Е0 ГО N0:26, 8Е0 ГО N0:28, 8Е0 ГО N0:30, 8 ЕС) ГО N0:32, 8 ЕС) ГО N0:34, 8 ЕС) ГО N0:36, 8 ЕС) ГО N0:38, 8 ЕС) ГО N0:44, 8 ЕС) ГО N0:46, 8 ЕС) ГО N0:48, 8 ЕС) ГО N0:50, 8ЕС) ГО N0:146 и/или 8ЕС) ГО N0:150.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 1 ГН8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 2 ГЫ8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 3 ГЫ8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 4 ГЫ8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 5 ГЫ8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 6 ГН8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 7 ГЫ8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 8 ГЫ8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 9 ГЫ8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 10 Ш8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 11 Ш8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 12 Ш8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 13 Ш8Р142.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом Ш8Р142.
ЕС) ГО N0:40, 8 ЕС) ГО N0:42,
ЕС)
ΙΌ
N0:52, 81Т)
ΙΌ N0:136, представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
8ЕС)
ΙΌ
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
ГО
N0:26, будет
N0:28, будет
N0:30, будет
N0:32, будет
N0:34, будет
N0:36, будет
N0:38, будет
N0:40, будет
N0:42, будет
N0:44, будет
N0:46, будет
N0:48, будет
N0:50, будет
N0:52, будет далее далее далее далее далее далее далее далее далее далее далее далее далее далее назыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназы- 5 013251
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:136, будет далее называться клонированным полипептидом ΙΝ8Ρ142.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:146, будет далее называться пептидной последовательностью домена у\УЕЛ ΙΝ8Ρ141-ΙΝ8Ρ142-ΙΝ8Ρ143-ΙΝ8Ρ144.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО Ν0:150, будет далее называться пептидной последовательностью домена ΆΝΤ_ΙΟ ΙΝ8Ρ142-ΙΝ8Ρ143-ΙΝ8Ρ144.
Используемый здесь термин полипептиды ΙΝ8Ρ142 включает в себя полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 3 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 4 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 5 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 6 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 7 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 8 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 9 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 10 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 11 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 12 ΙΝ8Ρ142, полипептид экзона 13 ΙΝ8Ρ142, полипептид ΙΝ8Ρ142, клонированный полипептид ΙΝ8Ρ142, пептидную последовательность домена у\УЕЛ ΙΝ8Ρ141-ΙΝ8Ρ142-ΙΝ8Ρ143-ΙΝ8Ρ144, пептидную последовательность домена ΆΝΤ_ΙΟ ΙΝ8Ρ142-ΙΝ8Ρ143-ΙΝ8Ρ144.
Предпочтительно полипептид согласно этому аспекту изобретения действует как белок, содержащий домен у\УЕЛ и/или ΆΝΤ_ΙΟ, предпочтительно как ΑΤΚ-подобный белок.
В третьем варианте своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который:
(ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО Ν0:54, 8ЕО ΙΌ Ν0:56, 8Ер ΙΌ Ν0:58, 8Ер ΙΌ Ν0:60, 8ЕО ΙΌ Ν0:62, 8ЕО ΙΌ Ν0:64, 8ЕО ΙΌ Ν0:66,
8ЕО ΙΌ Ν0:68, 8ЕО ΙΌ Ν0:70, 8ЕО ΙΌ Ν0:72, 8ЕО ΙΌ Ν0:74, 8ЕО ΙΌ Ν0:76, 8ЕО ΙΌ Ν0:78,
8ЕО ΙΌ Ν0:80, 8ЕО ΙΌ Ν0:82, 8ЕО ΙΌ Ν0:84, 8ЕО ΙΌ Ν0:86, 8ЕО ΙΌ Ν0:88, 8ЕО ΙΌ Ν0:90,
8ЕО ΙΌ Ν0:138, 8ЕО ΙΌ Ν0:140, 8ЕО ΙΌ Ν0:142, 8ЕО ΙΌ Ν0:144, 8ЕО ΙΌ Ν0:146 и/или 8ЕО ΙΌ Ν0:150;
(ίί) представляет собой фрагмент, который действует как белок, содержащий домен у\УЕЛ и/или ΆΝΤ_ΙΟ, предпочтительно как ΆΤΚ-подобный белок, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
Предпочтительно полипептид согласно первому аспекту изобретения:
(ΐ) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:90, 8ЕО ΙΌ Ν0:138 и/или 8ЕО ΙΌ Ν0:141;
(ίί) представляет собой фрагмент, который действует как белок, содержащий домен у^ЕЛ и/или ΆΝΤ_ΙΟ, предпочтительно как ΑΤΚ-подобный белок, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
В соответствии с этим аспектом полипептид согласно изобретению может состоять из одной из вышеуказанных последовательностей, таких как 8Е0 ΙΌ Ν0:54, 8Е0 ΙΌ Ν0:56, 8Е0 ΙΌ Ν0:58,
8ЕО ΙΌ Ν0:60, 8ЕО ΙΌ Ν0:62, 8ЕО ΙΌ Ν0:64, 8ЕО ΙΌ Ν0:66, 8ЕО ΙΌ Ν0:68, 8ЕО ΙΌ Ν0:70,
8ЕО ΙΌ Ν0:72, 8ЕО ΙΌ Ν0:74, 8ЕО ΙΌ Ν0:76, 8ЕО ΙΌ Ν0:78, 8ЕО ΙΌ Ν0:80, 8ЕО ΙΌ Ν0:82,
8ЕО ΙΌ Ν0:84, 8ЕО ΙΌ Ν0:86, 8ЕО ΙΌ Ν0:88, 8ЕО ΙΌ Ν0:90, 8ЕО ΙΌ Ν0:138, 8ЕО ΙΌ Ν0:140, 8ЕО ΙΌ Ν0:142, 8ЕО ΙΌ Ν0:144, 8ЕО ΙΌ Ν0:146 и/или 8ЕО ΙΌ Ν0:150.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:54, будет далее называться полипептидом экзона 1 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:56, будет далее называться полипептидом экзона 2 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:58, будет далее называться полипептидом экзона 3 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:60, будет далее называться полипептидом экзона 4 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:62, будет далее называться полипептидом экзона 5 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:64, будет далее называться полипептидом экзона 6 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:66, будет далее называться полипептидом экзона 7 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:68, будет далее называться полипептидом экзона 8 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:70, будет далее называться полипептидом экзона 9 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:72, будет далее называться полипептидом экзона 10 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:74, будет далее называться полипептидом экзона 11 ΙΝ8Ρ143.
- 6 013251
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:76, будет далее называться полипептидом экзона 12 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:78, будет далее называться полипептидом экзона 13 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:80, будет далее называться полипептидом экзона 14 ΙΝ8Ρ143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:82, будет далее называться полипептидом экзона 15 Ш8Р143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:84, будет далее называться полипептидом экзона 16 Ш8Р143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:86, будет далее называться полипептидом экзона 17 Ш8Р143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:88, будет далее называться полипептидом экзона 18 Ш8Р143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:90, будет далее называться полипептидом Ш8Р143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:138, будет далее называться клонированным полипептидом 1Ы8Р143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:140, будет далее называться клонированным полипептидом Ш8Р143 с гистидиновой меткой.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:142, будет далее называться клонированным зрелым полипептидом 1Ы8Р143.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:144, будет далее называться клонированным зрелым полипептидом Ш8Р143 с гистидиновой меткой.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:146, будет далее называться пептидной последовательностью домена ν\νΕΛ 1Н8Р141-1Н8Р142-1Н8Р143-1Н8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:150, будет далее называться пептидной последовательностью домена ΑΝΤ_Ι6 Ш8Р142-Ш8Р143-Ш8Р144.
Используемый здесь термин полипептиды 1Ы8Р143 включает в себя полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 Ш8Р143. полипептид экзона 2 Ш8Р143. полипептид экзона 3 Ш8Р143.
полипептид экзона 4 1Ы8Р143, полипептид экзона 5 1Ы8Р143, полипептид экзона 6 1Ы8Р143, полипептид экзона 7 1Ы8Р143, полипептид экзона 8 1Ы8Р143, полипептид экзона 9 1Ы8Р143, полипептид экзона 10 1Ы8Р143, полипептид экзона 11 1И8Р143, полипептид экзона 12 1Ы8Р143, полипептид экзона 13 1Ы8Р143, полипептид экзона 14 1Ы8Р143, полипептид экзона 15 1Ы8Р143, полипептид экзона 16 1Ы8Р143, полипептид экзона 17 1Ы8Р143, полипептид экзона 18 1Ы8Р143, полипептид 1Ы8Р143, клонированный полипептид 1Ы8Р143, клонированный полипептид Ш8Р143 с гистидиновой меткой, клонированный зрелый полипептид 1Ы8Р143, клонированный зрелый полипептид Ш8Р143 с гистидиновой меткой, пептидную последовательность домена ν\νΕΛ 1Ы8Р141-1Н8Р1421И8Р143-1Н8Р144, пептидную последовательность домена ΑΝΤ_ΙΟ 1Н8Р142-1Н8Р143-1Н8Р144.
Предпочтительно полипептид согласно этому аспекту изобретения действует как белок, содержащий домен ν\νΡΛ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно как АТВ-подобный белок.
В четвертом варианте своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который:
(ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:92, 8Е0 ГО N0:94, 8Е0 ГО N0:96, 8Е0 ГО N0:98, 8Е0 ГО N0:100, 8Е0 ГО N0:102, 8Е0 ГО N0:104, 8Е0 ГО N0:106, 8Е0 ГО N0:108, 8Е0 ГО N0:110, 8Е0 ГО N0:112, 8Е0 ГО N0:114, 8Е0 ГО N0:116, 8Е0 ГО N0:118, 8Е0 ГО N0:120, 8Е0 ГО N0:122, 8Е0 ГО N0:124, 8Е0 ГО N0:126, 8Е0 ГО N0:146 и/или 8Е0 ГО N0:150;
(ίί) представляет собой фрагмент, который действует как белок, содержащий домен ννΕΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно как АТВ-подобный белок, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
Предпочтительно полипептид согласно первому аспекту изобретения:
(ΐ) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:126;
(ίί) представляет собой фрагмент, который действует как белок, содержащий домен ννΕΆ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно как АТВ-подобный белок, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
- 7 013251
В соответствии с этим аспектом полипептид согласно изобретению может состоять из одной из вышеуказанных последовательностей, таких как 8Е0 ГО N0:92, 8Е0 ГО N0:94, 8Е0 ГО N0:96, 8ЕО ГО N0:98, 8ЕО ГО N0:100, 8ЕО ГО N0:102, 8ЕО ГО N0:104, 8ЕО ГО N0:106, 8ЕО ГО N0:108, 8ЕО ГО N0:110, 8ЕО ГО N0:112, 8ЕО ГО N0:114, 8 ЕС) ГО N0:116, 8ЕС) ГО N0:118, 8ЕС) ГО N0:120, 8ЕС) ГО N0:122, 8ЕС) ГО N0:124, 8ЕС) ГО N0:126, 8ЕС) ГО N0:146 и/или 8ЕС) ГО N0:150.
ГО
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 1 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 2 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 3 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 4 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 5 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 6 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 7 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 8 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 9 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 10 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 11 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 12 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 13 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 14 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 15 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 16 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом экзона 17 Ш8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться полипептидом 1Ы8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, ваться пептидной последовательностью домена у\УЕЛ 1Н8Р141-1Н8Р142-1Н8Р143-1Н8Р144.
Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:150, будет далее ваться пептидной последовательностью домена ЛЭТ_Ю ГЛ8Р142-1Л8Р143-1П8Р144.
Используемый здесь термин полипептид полипептид полипептид полипептид полипептид полипептид экзона 16 Ш8Р144. полипептид экзона 17 Ш8Р144. полипептид Ш8Р144. пептидную последовательность домена у\УЕЛ 1Н8Р141-1Н8Р142-1Н8Р143-1Н8Р144, пептидную последовательность домена ΆΝΤ Ю1И8Р142-1Н8Р143-1Н8Р144.
представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную представленную
8ЕО
8Ер
8Ер
8Ер
ГО
ГО
ГО
N0:92, будет
N0:94, будет
N0:96, будет
N0:98, будет далее далее далее далее
8Е0 ГО N0:100, будет далее
8Е0 ГО N0:102, будет далее
8Е0 ГО N0:104, будет далее
8Е0 ГО N0:106, будет далее
8Е0 ГО N0:108, будет далее
8Е0 ГО N0:110, будет далее
8Е0 ГО N0:112, будет далее
8Е0 ГО N0:114, будет далее
8Е0 ГО N0:116, будет далее
8Е0 ГО N0:118, будет далее
8Е0 ГО N0:120, будет далее
8Е0 ГО N0:122, будет далее
8Е0 ГО N0:124, будет далее
8Е0 ГО N0:126, будет далее
8Е0 ГО N0:146, будет далее экзона экзона экзона экзона экзона
1И8Р144,
1И8Р144,
1Ы8Р144,
1Ы8Р144,
1Ы8Р144, полипептиды Ш8Р144 полипептид полипептид полипептид полипептид полипептид экзона экзона экзона экзона экзона включает
1Ы8Р144,
1Ы8Р144,
1Ы8Р144,
1Ы8Р144,
1Ы8Р144, в себя полипептиды, полипептид полипептид полипептид полипептид полипептид экзона экзона экзона экзона экзона назыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназыназысодержащие
1Ы8Р144,
1Ы8Р144,
1Ы8Р144,
1Ы8Р144,
1Ы8Р144,
Предпочтительно белок, содержащий домен у\УЕЛ и/или Л№Т_Ю, может означать молекулу, содержащую домен у\УЕЛ и/или Л№Г_Ю, детектируемые с величиной ошибки, составляющей менее чем 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, 0,0002, 0,00001, 0,000001 или 0,0000001.
Предпочтительно полипептид согласно этому аспекту изобретения действует как белок, содержащий домен у\УЕЛ и/или Л№Г_Ю, предпочтительно как ΆΤΒ-подобный белок.
- 8 013251
Предпочтительно активность полипептида настоящего изобретения может быть подтверждена по меньшей мере в одном из следующих анализов:
a) в анализах на мышиных моделях воспалительного заболевания кишечника, индуцированного декстрансульфатом натрия (Ό88), описанных Окауаки е! а1. (А иоуе1 те11юё ίη Не ίηάιιοίίοη о£ тейаЫе ехрептеи1а1 аеи1е и сйтошс икетайуе со1ёк ίη т1се. СаЧгоегИегокду 1990. Уо1. 98, р. 694-702), или
b) ίη νίΙΐΌ и ίη у1уо-анализах, а также в анализах на животных-моделях воспалительного заболевания кишечника, описанных Вогт и Соита (Эгид П18соуегу Тоёау: Океане Моёек; Уо1. 1, № 4, 2004, р. 437443), или
c) на моделях рака, описанных КатЬ и Ьа88о1а (Эгид Эксоуегу Тоёау: Океане Моёек; Уо1. 1, № 1, 2004, р. 31-36), или на моделях рака кожи, описанных ОёакЫто е! а1. (Эгид Эксоуегу Тоёау: Океане Моёек, 2005; в печати),
ё) на моделях контактного дерматита или атопической экземы, описанных Си1егти111 е! а1. (Эгид Эксоуегу Тоёау: Океане Моёек, 2005, в печати), или
е) в анализах на модуляцию пролиферации или выживания нормальных и раковых клеток, или
ί) в анализах, описанных в примере 9, или
д) в анализах на модуляцию ангиогенеза или неоваскуляризации, или
1) в анализах на блокаду бактериальной интоксикации, например интоксикации токсином сибирской язвы, или
ί) в анализах на способность связываться с токсином, например с бактериальным токсином.
Антигенная детерминанта согласно изобретению может представлять собой часть полипептида согласно изобретению, которая связывается с антигенсвязывающим сайтом антитела или с Т-клеточным рецептором (ТСВ). Альтернативно, антигенная детерминанта может представлять собой сайт на поверхности полипептида согласно изобретению, с которым связывается одна молекула антитела. Вообще говоря, антиген имеет несколько или множество различных антигенных детерминант и реагирует с антителами, обладающими множеством различных специфичностей. Такое антитело предпочтительно является иммуноспецифичным в отношении полипептида согласно изобретению. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным в отношении полипептида согласно изобретению, который не составляет часть гибридного белка. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным в отношении ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 или их фрагментов. Антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и могут иметь специфические трехмерные структуры, а также определенный заряд. Предпочтительно термин антигенная детерминанта означает конкретную химическую группу на полипептиде согласно изобретению, которая является антигенной, т. е. вызывает выработку специфического иммунного ответа.
Полипептиды АПИ02541 (8ЕО ΙΌ N0:168) и ΙΡΙ00480015.1/ΕΝ8Ρ00000346942 (8ЕО ΙΌ N0:169) и кодирующие их нуклеиново-кислотные последовательности не входят в объем настоящего изобретения.
Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид согласно первому аспекту изобретения.
Термин очищенная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно означает молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая (1) отделена по меньшей мере примерно на 50% от белков, липидов, углеводов или других соединений, с которыми ассоциируется природная полноразмерная нуклеиновая кислота при ее выделении из клеток-источников; (2) не связана со всеми полинуклеотидами или с их частью, с которыми указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты ассоциируется в природе; (3) функционально присоединена к полинуклеотиду, с которым она не ассоциируется в природе; или (4) не встречается в природе как часть более крупной полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, по существу, не содержит любой(ых) другой(их) примесной(ых) молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты или других примесей, которые присутствуют в ее природном окружении и могут препятствовать использованию этой нуклеиновой кислоты для продуцирования полипептидов или ее терапевтическому, диагностическому или профилактическому применению или применению в целях исследования. В предпочтительном варианте изобретения геномные ДНК не входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительно геномная ДНК, в частности ДНК, имеющая размер более чем 10 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов), 50 т.п.н., 100 т.п.н., 150 т.п.н., 200 т.п.н., 250 т.п.н. или 300 т.п.н., не входит в объем изобретения. При этом предпочтительно если такая очищенная молекула нуклеиновой кислоты состоит только из кДНК.
- 9 013251
Предпочтительно очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в
ЗЕО ΙΌ N0:1 (кодирующей полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ141),
ЗЕО ΙΌ N0:3 (кодирующей полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:5 (кодирующей полипептид экзона 3 ΙΝ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:7 (кодирующей полипептид экзона 4 ΙΝ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:9 (кодирующей полипептид экзона 5 ΙΠ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:11 (кодирующей полипептид экзона 6 ΙΠ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:13 (кодирующей полипептид экзона 7 ΙΠ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:15 (кодирующей полипептид экзона 8 ΙΠ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:17 (кодирующей полипептид экзона 9 ΙΠ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:19 (кодирующей полипептид экзона 10 ΙΠ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:21 (кодирующей полипептид экзона 11 ΙΠ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:23 (кодирующей полипептид ΙΠ8Ρ141),
8Е0 ΙΌ N0:25 (кодирующей полипептид экзона 1 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:27 (кодирующей полипептид экзона 2 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:29 (кодирующей полипептид экзона 3 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:31 (кодирующей полипептид экзона 4 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:33 (кодирующей полипептид экзона 5 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:35 (кодирующей полипептид экзона 6 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:37 (кодирующей полипептид экзона 7 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:39 (кодирующей полипептид экзона 8 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:41 (кодирующей полипептид экзона 9 ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:43 (кодирующей полипептид экзона 10 IN8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:45 (кодирующей полипептид экзона 11 IN8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:47 (кодирующей полипептид экзона 12 IN8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:49 (кодирующей полипептид экзона 13 IN8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:51 (кодирующей полипептид ΙΠ8Ρ142),
8Е0 ΙΌ N0:53 (кодирующей полипептид экзона 1 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:55 (кодирующей полипептид экзона 2 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:57 (кодирующей полипептид экзона 3 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:59 (кодирующей полипептид экзона 4 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:61 (кодирующей полипептид экзона 5 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:63 (кодирующей полипептид экзона 6 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:65 (кодирующей полипептид экзона 7 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:67 (кодирующей полипептид экзона 8 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:69 (кодирующей полипептид экзона 9 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:71 (кодирующей полипептид экзона 10 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:73 (кодирующей полипептид экзона 11 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:75 (кодирующей полипептид экзона 12 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:77 (кодирующей полипептид экзона 13 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:79 (кодирующей полипептид экзона 14 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:81 (кодирующей полипептид экзона 15 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:83 (кодирующей полипептид экзона 16 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:85 (кодирующей полипептид экзона 17 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0: 87 (кодирующей полипептид экзона 18 ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:89 (кодирующей полипептид ΙΠ8Ρ143),
8Е0 ΙΌ N0:91 (кодирующей полипептид экзона 1 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:93 (кодирующей полипептид экзона 2 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:95 (кодирующей полипептид экзона 3 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:97 (кодирующей полипептид экзона 4 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:99 (кодирующей полипептид экзона 5 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:101 (кодирующей полипептид экзона 6 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:103 (кодирующей полипептид экзона 7 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:105 (кодирующей полипептид экзона 8 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:107 (кодирующей полипептид экзона 9 ΙΠ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:109 (кодирующей полипептид экзона 10 IN8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:111 (кодирующей полипептид экзона 11 IN8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:113 (кодирующей полипептид экзона 12 IN8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:115 (кодирующей полипептид экзона 13 IN8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:117 (кодирующей полипептид экзона 14 IN8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:119 (кодирующей полипептид экзона 15 IN8Ρ144),
- 10 013251
8ЕО ΙΌ N0:121 (кодирующей полипептид экзона 16 ΙΝ8Ρ144),
8Е0 ΙΌ N0:123 (кодирующей полипептид экзона 17 ΙΝ8Ρ144),
8Е0 ГО N0:125 (кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ144),
8Е0 ГО N0:127 (кодирующей клонированный полипептид ΙΝ8Ρ141),
8Е0 ГО N0:129 (кодирующей клонированный полипептид [N80141 с гистидиновой меткой),
8Е0 ГО N0:131 (кодирующей клонированный зрелый полипептид ΙΗ8Ρ141),
8Е0 ГО N0:133 (кодирующей клонированный зрелый полипептид ΙΗ8Ρ141 с гистидиновой меткой),
8Е0 ГО N0:135 (кодирующей клонированный полипептид ΙΗ8Ρ142),
8Е0 ГО N0:137 (кодирующей клонированный полипептид ΙΗ8Ρ143),
8Е0 ГО N0:139 (кодирующей клонированный полипептид ΙΗ8Ρ143 с гистидиновой меткой),
8Е0 ГО N0:141 (кодирующей клонированный зрелый полипептид ΙΗ8Ρ143),
8Е0 ГО N0:143 (кодирующей клонированный зрелый полипептид ΙΗ8Ρ143 с гистидиновой меткой), 8Е0 ГО N0:145 (кодирующей пептидную последовательность домена у\УЕЛ IN8Ρ141-IN8Ρ142Ι^Ρ^-Ι^Ρ^),
8Е0 ГО N0:147 (кодирующей пептидную последовательность домена ΑNТ_I6-IN8Ρ141),
8Е0 ГО N0:149 (кодирующей пептидную последовательность домена ΑNТ_Ю-IN8Ρ142-IN8Ρ143^^144) или представляет собой избыточный эквивалент или фрагмент любой одной из указанных последовательностей.
Настоящее изобретение относится также к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из любой одной из вышеуказанных последовательностей нуклеиновой кислоты.
В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х 880 (150 мМ N301, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 1,6), 5Х раствор Денхардта, 10% декстрансульфата и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х 880 приблизительно при 65°С.
В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту настоящего изобретения.
В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной вектором согласно четвертому аспекту настоящего изобретения.
В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с белками, содержащими домен у\ОЕЛ и/или ΑΝΓ_ΙΟ согласно первому аспекту изобретения. Предпочтительно такой лиганд ингибирует функцию белков, содержащих домен у\ОЕЛ и/или АИТ-Ю согласно первому аспекту изобретения. Лиганды для полипептида согласно изобретению могут иметь различные формы, включая природные или модифицированные субстраты, ферменты, рецепторы, небольшие органические молекулы, такие как небольшие природные или синтетические органические молекулы размером до 2000 Да, предпочтительно 800 Да или менее, пептидомиметики, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, антитела и их структурные или функциональные миметики. Белки, содержащие домен у\ОЕЛ и/или ЛХТДС согласно изобретению, могут связываться с бактериальными токсинами, например с токсинами сибирской язвы и с ботулиническим токсином С2 клостридий. Настоящее изобретение относится также к полипептиду согласно первому аспекту изобретения, образующему комплекс с бактериальным токсином.
В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным с точки зрения изменения экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или с точки зрения регуляции активности полипептида согласно первому аспекту изобретения.
Такие соединения могут быть идентифицированы с применением описанных здесь методов анализа и скрининга.
Соединение согласно седьмому аспекту изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида.
Важно отметить, что идентификация функции полипептидов экзонов ΙΗ8Ρ141, ΙΗ8Ρ142, ΙΗ8Ρ143 и ΙΗ8Ρ144 и полипептидов ΙΗ8Ρ141, ΙΗ8Ρ142, ΙΗ8Ρ143 и ΙΗ8Ρ144 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. Лиганды и соединения согласно шестому и седьмому аспектам изобретения могут быть идентифицированы такими способами. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению гена или полипептида ΙΗ8Ρ141, ΙΗ8Ρ142, ΙΗ8Ρ143 или ΙΗ8Ρ144 в качестве мишени для скрининга кандидатов на лекарственные средства-модуляторы, в частности на лекарственные средства-кандидаты, обладающие активностью,
- 11 013251 направленной против расстройств, ассоциированных с белком, содержащим домен ν\νΕΛ и/или ΛΝΤ_ΙΟ.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с белком, содержащим домен у\УЕЛ и/или ΆΝΤ_ΙΟ, где указанные способы включают в себя выявление способности указанного соединения связываться с геном или полипептидом ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144 или с их фрагментами.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с белком, содержащим домен у\УРЛ и/или ΛΝΤ_ΙΟ. где указанные способы включают в себя тестирование на модуляцию активности гена или полипептида ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144 или их фрагментов.
В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту настоящего изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту настоящего изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту настоящего изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту настоящего изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики заболеваний, в патогенезе которых участвуют белки, содержащие домен у\УРЛ и/или ΆΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΆΤΚ-подобные белки.
Полипептиды согласно изобретению или их фрагменты (например, фрагменты, содержащие домен фактора Виллебранда (ννΕ) типа А (у\УЕЛ) и/или домен ΛΝΤ_ΙΟ) предпочтительно используются для диагностики и/или лечения заболеваний, которые восприимчивы к терапевтической активности других рецептороподобных белков токсина сибирской язвы (например, ΤΕΜ8 или СМ62).
В частности, полипептиды согласно изобретению могут быть использованы для блокирования бактериальных токсинов. Растворимый домен ν\¥ΕΛ (весь мотив ΜΙΌΛ8; остатки, имеющие важное значение, показаны на фиг. 9) и/или растворимый домен ΛΝΤ_ΙΟ полипептидов согласно изобретению могут быть использованы для блокирования бактериальных токсинов (например, токсинов сибирской язвы, ботулинического токсина С2 клостридий (С1о81пйшш Ьо1и1шиш)) и тем самым для предупреждения или лечения бактериальных инфекций.
Растворимый домен ν\¥ΕΛ и/или домен ΛΝΤ_ΙΟ полипептидов согласно изобретению могут быть присоединены к липидному хвосту, например к гликозилфосфатидилинозиту (ΟΡΙ-хвосту), который действует как рецептор для субъединицы ΡΛ блокируемого бактериального токсина. Ьш & Нерр1а. В П1С 1оитпа1 о£ Вю1ощеа1. Сйешщйу, 2003, Уо1. 278, № 7, р. 5227-5234 описано присоединение внеклеточного домена ΤΕΜ8 к ΟΡΙ-заякоривающей последовательности υΡΛΚ.
Полипептиды согласно изобретению, в частности растворимый домен ν\¥ΕΛ (по всему мотиву ΜΙΌΛ8, остатки, играющие важную роль, показаны на фиг. 9) и/или домен ΛΝΤ_ΙΟ полипептидов согласно изобретению, могут быть использованы также для лечения рака.
Антагонисты полипептидов согласно изобретению, в частности мембрано-связанные изоформы ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, могут быть использованы также для удаления бактериальных токсинов и для лечения рака. Предпочтительно такими антагонистами являются моноклональные антитела или антисмысловые нуклеиновые кислоты. Предпочтительно указанные антагонисты направлены против домена ννΕΛ, более предпочтительно против мотива ΜΙΌΛδ и/или домена ΛΝΤ_ΙΟ.
Другими заболеваниями, которые могут быть подвергнуты лечению, являются клеточнопролиферативные расстройства, включая новообразование, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительные заболевания кишечника, артрит, псориаз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая расстройства центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждения головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; нарушения развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и почечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибковые инфекции и паразитарные инфекции, и другие патологические состояния. Такими заболеваниями предпочтительно являются заболевания, в патогенезе которых участвуют белки, содержащие домен ννΕΛ и/или ΛΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΛΤΚ-подобные белки. Примерами заболеваний, в патогенезе которых участвуют белки, содержащие домен ννΕΛ и/или ΛΝΤ_ΙΟ, являются бактериальные инфекции, бактериальные интоксикации, сибирская язва, заболевания, ассоциированные с блокадой токсинов (например, бактериальных токсинов), рак, опухоль эндотелия, рак ободочной кишки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак легких, меланома, ювенильный гиалиновый фиброматоз (ЮГФ), детский системный гиалиноз (ДСГ), болезнь фон Виллебранда, миопатия Бетлема, дистрофический буллузный эпидермолиз, тромбоз, модуляция агрегации, опосредуемой тромбоцитами, аутоиммунные заболевания и воспаления. Эти молекулы могут быть использованы также в целях приготовления лекарственного средства для лечения указанных забо
- 12 013251 леваний. Такие молекулы могут быть использованы также для контрацепции или для лечения репродуктивных расстройств, включая бесплодие.
Результаты экспрессии, полученные авторами настоящего изобретения и описанные в настоящем документе, неожиданно выявили ограниченную экспрессию ΙΝ8Ρ142 в биоптатах, взятых из ободочной кишки и подвздошной кишки, пораженных ВЗК, а также биоптата кожи, пораженной псориазом. Такой специфический характер экспрессии позволяет сделать вывод о роли ΙΝ8Ρ142 в развитии воспалительных заболеваний кишечника, кожных болезней или воспалений.
Эти неожиданно выявленные свойства, характеризующие полинуклеотиды или соответствующие полипептиды согласно изобретению, делают их особенно подходящими для получения лекарственного средства или фармацевтической композиции.
Особенно предпочтительными заболеваниями являются воспалительные заболевания кишечника, заболевания, ассоциированные с токсинами, рак, кожные болезни, воспаления, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, контактный дерматит, атопическая экзема, рак кровеносной и лимфатической систем, рак кожи, рак пищеварительной системы, рак мочевыделительной системы, рак молочной железы, рак яичника, рак женских половых органов, хориокарцинома, рак легких, опухоли головного мозга, опухоли кости, карциноидная опухоль, рак ободочной кишки, рак носоглотки, ретроперитонеальные саркомы, опухоли мягких тканей, рак щитовидной железы, рак яичек или рак печени. Предпочтительно заболевание, ассоциированное с токсинами, выбрано из заболевания, ассоциированного с бактериальными токсинами, заболевания, ассоциированные с сибирской язвой или с ботулиническим токсином С2 клостридий. Предпочтительно воспалительное заболевание выбрано из болезни Крона или язвенного колита. Предпочтительным кожным заболеванием является псориаз. Предпочтительно раковое заболевание выбрано из рака кровеносной и лимфатической систем, рака кожи, рака пищеварительной системы, рака мочевыделительной системы, рака молочной железы, рака яичника, рака женских половых органов, хориокарциномы, рака легких, опухоли головного мозга, опухоли кости, карциноидной опухоли, рак носоглотки, ретроперитонеальной саркомы, опухолей мягких тканей, рака щитовидной железы, рака яичек или рака печени.
Предпочтительно воспалительное заболевание выбрано из болезни Крона или язвенного колита.
Предпочтительно кожными заболеваниями являются псориаз, контактный дерматит или атопическая экзема.
Указанные молекулы согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому, шестому или седьмому аспектам согласно изобретению могут быть, в частности, использованы в целях приготовления лекарственного средства для лечения указанных заболеваний.
В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или оценку активности полипептида согласно первому аспекту изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют ίη νίίτο. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания.
Предпочтительный способ детекции полипептидов согласно первому аспекту изобретения включает стадии:
(a) контактирования лиганда согласно шестому аспекту изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.
Что касается девятого аспекта изобретения, то в этой связи следует отметить, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, известные специалисту, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точковую мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы с использованием антител. Подобные методы могут быть использованы в короткий или продолжительный период времени, что позволяет проводить мониторинг терапевтического лечения заболевания у пациента. Настоящее изобретение относится также к наборам, которые могут быть использованы в указанных методах диагностики заболевания.
Заболеванием, диагностируемым способом согласно девятому аспекту изобретения, предпочтительно является заболевание, в патогенезе которого участвуют белки, содержащие домен νΑΕΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΑΤΒ-подобные белки.
В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида согласно первому аспекту изобретения, такому как белок, содержащий домен νΑΕΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΑΤΒ-подобный белок. Подходящим применением полипептидов согласно изобретению, таких как белок, содержащий домен νΑΕΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΑΤΒ-подобный белок, является их
- 13 013251 использование в качестве регуляторов клеточного роста, метаболизма или дифференцировки клеток: в качестве части пары рецептор/лиганд и в качестве диагностического маркера для детекции физиологического или патологического состояния, выбранного из вышеуказанного списка. Другими подходящими применениями являются методы скрининга, осуществляемые для идентификации лигандов и других молекул-агонистов или молекул-антагонистов, которые могут быть использованы в целях терапии и диагностики заболеваний и состояний, для лечения которых применим белок указанной категории.
В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно первому аспекту изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектор согласно четвертому аспекту изобретения, или клетку-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганд согласно шестому аспекту изобретения, или соединение согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы в целях приготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний, включая, без ограничения ими, клеточнопролиферативные расстройства, включая новообразования, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли: миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительные заболевания кишечника, артрит, псориаз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждения головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; нарушения развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и почечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибковые инфекции и паразитарные инфекции, и другие патологические состояния. Такими заболеваниями предпочтительно является одно из заболеваний, в патогенезе которого участвуют белки, содержащие домен ν^ΡΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΑΤΒ-подобные белки.
Примерами заболеваний, в патогенезе которых участвуют белки, содержащие домен ν^ΡΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, являются бактериальные инфекции, бактериальные интоксикации, сибирская язва, заболевания, ассоциированные с блокадой токсинов (например, бактериальных токсинов), рак, опухоль эндотелия, рак ободочной кишки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак легких, меланома, ювенильный гиалиновый фиброматоз (ЮГФ), детский системный гиалиноз (ДСГ), болезнь фон Виллебранда, миопатия Бетлема, дистрофический буллузный эпидермолиз, тромбоз, модуляция агрегации, опосредуемой тромбоцитами, аутоиммунные заболевания и воспаления.
В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида согласно первому аспекту изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектора согласно четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганда согласно шестому аспекту изобретения, или соединения согласно седьмому аспекту изобретения.
В случае если пациент страдает заболеванием, при котором у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида согласно первому аспекту изобретения ниже, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, то полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И, наоборот, в случае если пациент страдает заболеванием, при котором у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида согласно первому аспекту изобретения выше, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, то полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.
Полипептиды ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 представляют собой белки, содержащие домен νΨΡΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, поэтому они играют определенную роль в развитии многих патологических состояний. Антагонисты полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 представляют особый интерес, поскольку они позволяют благоприятно воздействовать на механизм модуляции патологических состояний.
- 14 013251
В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным или к животным, которые являются дефицитными по полипептиду первого аспекта настоящего изобретения и не являются человеком и которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни указанного полипептида или вообще не экспрессируют такого полипептида. Указанные трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний, и могут быть использованы также в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики данного заболевания.
Используемый здесь термин функциональный эквивалент означает молекулу белка или нуклеиновой кислоты, обладающую функциональными или структурными свойствами, в основном аналогичными свойствам молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Функциональный эквивалент белка может содержать модификации, если такие модификации необходимы для осуществления конкретной функции. Термин функциональный эквивалент включает фрагменты, мутанты, гибриды, варианты, аналоги или химические производные молекулы.
Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая любой одной или несколькими функциональными активностями полипептидов согласно изобретению.
Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая, по существу, аналогична активности ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 или их фрагментов, и измеренная в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая идентична активности или превышает активность ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 или их фрагментов, измеренную в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая составляет 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 100% или более от активности ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 или их фрагментов, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию.
Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть белок или полипептид, обладающий ίη νίνο или ίη νίΐτο активностью, которая, по существу, аналогична активности полипептидов согласно изобретению. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть белок или полипептид, способный взаимодействовать с другими клеточными или внеклеточными молекулами по механизму, который, по существу, аналогичен механизму взаимодействия соответствующей части полипептидов согласно изобретению. Так, например, в иммуноанализе функциональный эквивалент может способствовать снижению способности к связыванию антитела с соответствующим пептидом (т.е. пептидом, имеющим модифицированную аминокислотную последовательность, а поэтому являющимся функциональным эквивалентом) полипептида согласно изобретению или с самим полипептидом согласно изобретению, где указанное антитело вырабатывается против соответствующего пептида полипептида согласно изобретению. Эквимолярная концентрация указанного функционального эквивалента будет снижать уровень вышеупомянутого связывания соответствующего пептида по меньшей мере примерно на 5%, предпочтительно примерно на 5-10%, более предпочтительно примерно на 10-25%, еще более предпочтительно примерно на 25-30% и наиболее предпочтительно примерно на 40-50%.
Так, например, функциональные эквиваленты могут быть полностью функциональными либо у них может отсутствовать одна или несколько активностей. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением модификации могут влиять на функцию, например на активности полипептида, которые подтверждают наличие у них домена у\УРЛ и/или ΑΝΤ_ΙΟ.
Различные стандартные методы и процедуры, которые могут применяться для осуществления изобретения, систематизированы ниже. При этом следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными методами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология применяется только для описания конкретных вариантов изобретения, и эта терминология не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
В настоящем описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.
Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения используются стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области.
Более полное описание указанных методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы в качестве консультации, приводятся в следующих работах: 8атЬгоок, Мо1еси1аг Οοηίη§: А ЬаЬота1огу Мапиа1, 8ссоп6 Εάίίίοη (1989), ΌΝΑ Οοηίη§. Уо1итек Ι и ΙΙ (Ό.Ν. С1оуег еб. 1985); Ο1^дοηис1еο1^бе 8уп1Нс818 (М.1. Сай, еб. 1984); №.1с1е1с Ас1б Η\Τπ6ίζηΙίοη (Β.Ό. Натек & 8.1. Шддшк, ебк. 1984); Τ^аηкс^^ρ1^οη и ΤπιηκΕ-ιΙίοη (Β.Ό. Натек & 8.1. Н1ддшк, ебк. 1984); Ашта1 Се11 СиИите (Κ..Ι. Бгскйпсу, еб. 1986); [ттоЫ^еб Се11к и Εηζутек ДВЬ Бгекк, 1986);
- 15 013251
B. РегЬа1, Α. РгасПса! Сшбе ίο Мо1еси1аг Οοηίη§ (1984); (Не Мс(1юбк ίη Εηζνιηοίοβν кепек (Λοαάοιηίο Рге§8, Ιηο.). екрес1а11у νοΗιιικκ 154 & 155; Оспе ΤπιηκίοΓ Уссйгк ίο г МаттаНап Се11к (ЕН. МШег и М.Р. Ε’αίοδ. ебк. 1987, С.о1б 8ргшд ΗοιΕογ ^аЬο^аίο^у); IттиηοсΗет^са1 Μеίйοбк ίη Се11 и Μο^π^ί Βίο1ο§\· (Мауег и Аа1кег, ебк. 1987, Αсабет^с Ргекк, Εοηάοη); 8отрек (1987) ЕгсИст Ρи^^ί^саί^οη: Рг1пс1р1с5 и Ргас!1се, ^οηά Εάίίίοη (8ргтдег Усг1ад, Ν.Υ.) и НаηбЬοοк οί ЕхрептеЩа1 Iттиηο1οду, УЫитск Ι-Ιν (И.М. Асй &
C. С. В1аск\\'с11 ебк. 1986).
Используемый здесь термин полипептид включает в себя любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислоты, связанные друг с другом пептидными связями или модифицированные пептидными связями, т.е. пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам или полипептидам), так и к более длинным цепям (белкам).
Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препробелка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препрочасти этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах, пре-, про- или препропоследовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.
Полипептид согласно первому аспекту изобретения может образовывать часть гибридного белка. Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, такому как соединение, увеличивающее время полужизни указанного полипептида (например, полиэтиленгликоль).
В другом предпочтительном варианте изобретения полипептидом согласно изобретению, который может включать последовательность, имеющую 85%-ную гомологию с последовательностями ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, является гибридный белок.
Указанные гибридные белки могут быть получены путем клонирование полипептида, кодирующего полипептид, содержащий последовательность, имеющую 85%-ную гомологию с последовательностями ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, с сохранением рамки считывания последовательностей, кодирующих последовательности гетерологичных белков.
Используемый здесь термин гетерологичный означает любой полипептид, отличающийся от полипептида человека ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144. Примерами гетерологичных последовательностей, которые могут присутствовать в гибридных белках у Ν- или С-конца, являются внеклеточные домены мембрано-связанного белка, константные области иммуноглобулина (Ес-области), домены мультимеризации, домены внеклеточных белков, сигнальные последовательности, экспортные последовательности и последовательности, пригодные для очистки методами аффинной хроматографии.
Многие из этих гетерологичных последовательностей являются коммерчески доступными и применяются для экспрессии в плазмидах, поскольку эти последовательности обычно вводят в гибридные белки, которые сообщают им дополнительные свойства, но не нарушают специфическую биологическую активность белка, входящего в состав данного гибридного белка Негре К., 2003, Αρρ1. МюгоЬю1. ΒίοίεοΗηο1., 60: 523-33). Примерами таких дополнительных свойств являются их более продолжительное время полужизни в физиологических жидкостях, внеклеточная локализация или более легкая очистка, осуществляемая с помощью гистидинового фрагмента, так называемой гистидиновой метки (Семы еί а1. 1989, Гтос. ИаИ. Αсаб. 8сЕ υδΑ, 86: 821-4) или метки НА эпитопа, полученного из белка гемаглютинина [вируса] гриппа (Αί1κοη еί а1. 1994, Се11, 37: 767-78). Если необходимо, то гетерологичные последовательности могут быть элиминированы путем протеолитического расщепления, например путем встраивания протеолитического сайта расщепления между белком и гетерологичной последовательностью и обработки очищенного гибридного белка соответствующей протеазой. Эти свойства являются особенно ценными для гибридных белков, поскольку они облегчают их продуцирование и использование в целях приготовления фармацевтических композиций. Так, например, полипептид ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144 может быть очищен с помощью гексагистидинового пептида, присоединенного к С-концу ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144. Если данный гибридный белок содержит иммуноглобулиновую область, то указанный гибрид может быть получен путем прямого присоединения компонентов или путем их присоединения посредством короткого линкерного пептида, длина которого может составлять по меньшей мере 1-3 аминокислотных остатка или более, например 13 аминокислотных остатков. Указанным линкером может быть, например, трипептид с последовательностью Е-Е-М (СкгЕНс-Мс!) или линкерная последовательность, состоящая из 13 аминокислот и содержащая последовательность С1и-Ρйе-С1у-Α1а-С1у-^еи-Vа1-^еи-С1у-С1у-С1η-Ρйе-Μеί (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:151), встроенную между полипептидом согласно изобретению и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как более длительное время присутствия в физиологических жидкостях (т. е. повышенное время полужизни), повышенная удельная активность, повышенный
- 16 013251 уровень экспрессии или его способность легко подвергаться очистке.
В предпочтительном варианте изобретения полипептид присоединяют к константной области молекулы 1д. Предпочтительно такой полипептид присоединяют к областям тяжелой цепи, таким как домены СН2 и СН3 человеческого 1дС1. Для генерирования гибридных белков согласно изобретению подходящими также являются и другие изоформы 1д, такие как изоформы 1дС2 или 1дС4 или 1д других классов, например 1дМ или 1дЛ. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, а также гетероили гомомультимерными.
ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142 или внеклеточные части ΙΝ8Ρ141 или ΙΝ8Ρ144 могут быть использованы как таковые или как компоненты гибридных белков, таких как Ре-гибриды и/или в комбинации с другими агентами.
В другом варианте изобретения функциональное производное содержит по меньшей мере одну молекулу, присоединенную к одной или нескольким функциональным группам, которые присутствуют в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Одной из таких молекул предпочтительно является полиэтиленовая (ПЭГ) молекула. ПЭГилирование может быть осуществлено различными известными методами, такими как методы, описанные, например, в νθ 99/55377.
Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ΆΌΡ-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное связывание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование ΟΡΙ-якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование, и убихитинизация.
Модификации могут присутствовать в любой области полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде либо того и другого посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения.
Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом, природа и степень модификации по большей части будут определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа.
Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов.
Функционально-эквивалентные полипептиды согласно первому аспекту настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептидам экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептидам ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144. Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином гомологичные, если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида.
Термин идентичность означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки.
Термин сходство означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко вычислена (Сотри1айоиа1 Мо1еси1аг Βίοίοβν. Ьезк А.М. ей., ОхГогй Ишуегайу Ρ^е88, №\ν Уогк, 1988; Вюсотрийид Шогтайсз и Сеноте Ρ^ο^есΐ8, 8тй11 Ό.\ν. ей., Асайетк Ρ^е88, №\ν Уогк, 1993; Сотрикг Аиа1у818 ок 8еднеисе Эа1а, ΡηγΙ 1, СпГПп А.М. & СпГПп Н.С., ейб., Нитапа Ρ^е88, №\ν 1ег8еу, 1994; 8едненсе Аиа1у818 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, уои Нещ)е, С. Асайетк ΡϊΌδδ, 1987 и 8едиеисе Аиа1у818 Ρ^^те^. СпЬбкоу М. & Эеуегеих ί. ейб, М.81оск1оп Ρκδδ, №\ν Уогк, 1991).
- 17 013251
Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых эти полипептиды происходят) и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов экзонов Ш8Р141, Ш8Р142, Ш8Р143 и Ш8Р144 и полипептидов Ш8Р141, Ш8Р142, Ш8Р143 и Ш8Р144. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть, остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между А1а, Vа1, Ьеи и Не; между 8ег и Тйг; между кислотными остатками Акр и С1и; между Акп и С1п; между основными остатками Бук и Агд или между ароматическими остатками Рйе и Туг. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, т.е. от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются молчащие замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков имеют группузаместитель.
В соответствии с настоящим изобретением любая замена должна быть предпочтительно консервативной или допустимой заменой, которую обычно определяют как замену, вводящую аминокислоты, имеющие аналогичные химические свойства (например, основная положительно заряженная аминокислота должна быть заменена другой основной, положительно заряженной аминокислотой), которые являются достаточными для сохранения структуры и биологической функции данной молекулы.
В литературе описано множество моделей, с помощью которых может быть осуществлен отбор консервативных аминокислотных замен исходя из статистических и физико-химических исследований последовательности и/или структуры белков (Кодоу 8.Б и №кгакоу Ά.Ν., 2001). Эксперименты по конструированию белков показали, что использование специфических подпоследовательностей аминокислот позволяет продуцировать белки с соответствующей пространственной упаковкой и активные белки и классифицировать аминокислотные синонимичные замены, которые могут легко адаптироваться к белковой структуре и которые могут быть использованы для детекции функциональных и структурных гомологов и паралогов (Мигрйу Б.К. е! а1., 2000). Группы синонимичных аминокислот и группы более предпочтительных синонимичных аминокислот представлены в табл. 1.
В полипептиды согласно изобретению могут быть также введены в различных целях специфические неконсервативные мутации. Мутации, снижающие аффинность гликопротеина клеточной поверхности, допускают возможность повторного использования этих полипептидов, а также их применения в других целях, что потенциально повышает их терапевтическую эффективность. (КоЫпкоп С.К., 2002). Иммуногенные эпитопы, фактически присутствующие в полипептидах согласно изобретению, могут быть использованы для разработки вакцин (8!еуапоу1с 8., 2002) либо они могут быть удалены путем модификации их последовательности известными методами отбора мутаций, для повышения стабильности белка и коррекции этих эпитопов (уап беп Вигд В. & Еукшк V, 2002; АО 02/05146, АО 00/34317 и АО 98/52976).
Предпочтительной альтернативой синонимичным группам для аминокислотных производных, включенных в пептидомиметики, являются группы, определенные в табл. 2. Неисчерпывающий список аминокислотных производных также включает аминоизомасляную кислоту (А1Ь), гидроксипролин (Нур), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-СООН, индолин-2-карбоновую кислоту, 4-дифторпролин, Б-тиазолидин-4-карбоновую кислоту, Б-гомопролин, 3,4-дегидропролин, 3,4-дигидроксифенилаланин, циклогексилглицин и фенилглицин.
Термин аминокислотное производное означает аминокислоту, не входящую в 20 кодируемых генетическим кодом природных аминокислот, или химическую молекулу, подобную такой аминокислоте. В частности, такое аминокислотное производное может содержать замещенные или незамещенные молекулы, молекулы с прямой цепью, молекулы с разветвленной цепью или циклоалкильные молекулы, а также оно может включать один или несколько гетероатомов. Указанные аминокислотные производные могут быть получены бе поуо либо они могут быть взяты из коммерчески доступных источников (Са1Ыосйет-№уаЬюсйет А.6., 8\\'Нхег1апб; Васйет, И8А).
Различные методы включения неприродных аминокислотных производных в белки с использованием 1п У1!го и т у1уо систем трансляции для зондирования и/или улучшения структуры и функции белков описаны в литературе (БоидНеПу Б.А., 2000). Методы синтеза и получения пептидомиметиков, а также непептидомиметиков также хорошо известны специалистам (Со1еЫо\\'к1<1 А. е! а1., 2001; НгиЬу V.! & Ва1ке Р.М., 2000; 8а\\уег Т.К. 8!гис!иге Вакеб Бгид Бек1дп, ебйеб Ьу Уеегарапб1ап Р., Магсе1 Беккет Шс., р. 557-663, 1997).
Обычно, считается, что два полипептида, имеющие более чем 30%-ную идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы последовательности функционально эквивалентных полипептидов согласно первому аспекту изобретения были более чем на 80% идентичны после
- 18 013251 довательностям полипептидам экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептидам ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 или их активных фрагментов. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 85, 90, 95, 98 или 99% соответственно.
Функционально-эквивалентными полипептидами согласно первому аспекту изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или нескольких методов структурного сопоставления первичных последовательностей путем их выравнивания. Так, например, технология информационной обработки потока геномных данных Цпрйагтайса Сеиоте Тйгеа'ег™), которая составляет один из аспектов способа поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Вюреи'шт™, может быть применена (см. заявку РСТ \νΟ 01/69507) в целях идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности по сравнению с полипептидами экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептидами ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, высказывается предположение, что они представляют собой белки, содержащие ч^ЕА и/или А№Т_Ю, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностью полипептидов экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144. Термин значительная структурная гомология означает структурную гомологию двух белков, которая может быть предсказана с помощью технологии ИчркагтаБса Сепоте Тйгеа'ег™ с достоверностью по меньшей мере 10% и выше.
Полипептиды согласно первому аспекту изобретения также включают фрагменты полипептидов экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептидов экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 при условии, что эти фрагменты представляют собой белки, содержащие домены ч^ЕА и/или А№Т_Ю, или имеют общую антигенную детерминанту с белками, содержащими домен ч^ЕА и/или А№Т_Ю.
Используемый здесь термин фрагмент означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептидов экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 либо одному из его функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать по меньшей мере п смежных аминокислот данной последовательности, и в зависимости от конкретной последовательности указанное число п предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.
Нуклеиновые кислоты согласно изобретению имеют длину, которая предпочтительно составляет 10-2000, более предпочтительно 10-1750 нуклеотидов, еще более предпочтительно 500-1500, наиболее предпочтительно 600-1200, еще наиболее предпочтительно 750-1000 нуклеотидов. Полипептиды согласно изобретению имеют длину, которая предпочтительно составляет 10-700 аминокислот, более предпочтительно 50-600, еще более предпочтительно 100-500, наиболее предпочтительно 200-400, еще наиболее предпочтительно 300-375 аминокислот.
Фрагменты полноразмерных полипептидов экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 могут состоять из комбинаций 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 последовательностей смежных экзонов в полипептидах ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, соответственно.
Указанные фрагменты могут присутствовать в свободной форме, т.е. они не являются частью другого полипептида или не присоединены к другим аминокислотам или полипептидам либо они могут быть включены в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. Однако в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов.
Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие по меньшей мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к таким полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для любого специалиста, такие антитела, помимо других применений, могут быть использованы также в качестве диагностических или терапевтических средств.
Термин иммуноспецифический означает, что данные антитела имеют в основном более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам, описанным ранее. Используемый здесь термин антитело означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как ЕаЬ, Е(аЬ')2 и Еч, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детер
- 19 013251 минантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения.
Под понятием значительно более высокая аффинность авторы подразумевают заметно более высокую аффинность полипептида согласно изобретению по сравнению с аффинностью известных белков, содержащих домен ν^ΡΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΑΤΒ-подобных белков.
При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду согласно изобретению по меньшей мере в 1,5, 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106 раз или более превышала аффинность по отношению к известным белкам, содержащим домен ν^ΡΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ.
При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду согласно изобретению значительно превышала аффинность по отношению к известным белкам, содержащим домен ν^ΡΑ и/или ΑΝΤ_Ι6.
Если предпочтительными являются поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано полипептидом согласно первому аспекту изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Такой связанный полипептид может быть затем использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией.
Моноклональные антитела против полипептидов согласно первому аспекту изобретения могут быть легко получены специалистом в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии хорошо известна специалистам (см. например, КоЫег С. & ΜΠκ^ίη. С. №1Шге. 256: 495-497 (1975); КохЬог е! а1., [ттипо1оду 1обау, 4: 72(1983); Со1е е! а1., 77-96, Μοηοс1οηа1 ΑΠ^^κ и Сапсег !Ъегару, ΑΕη В. Ыкк, Шс. (1985)).
Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов согласно первому аспекту изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, т.е. на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.
Могут быть использованы также и химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см. например, Ьш е! а1., 1’гос. Ν311. Αсаά. 8α. υ8Α, 84, 3439 (1987)).
Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например путем их гуманизации (см., 1опек е! а1., МШие, 321, 522 (1986); УегНоеуеп е! а1., 8с1епсе, 239, 1534 (1988); ВаЬа! е! а1., 1. Iтшиηο1., 147, 1709 (1991); Циееп е! а1., Бгос. Νη!1. Αсаά. 8с1., υ8Α, 86, 10029 (1989); Согшап е! а1., Егос. ЦаИ. Αсаά. 8с1., υ8Α, 88, 34181 (1991) и Нобдкоп е! а1., Вю/Гесйпо1оду, 9, 421 (1991)). Используемый здесь термин гуманизованное антитело означает молекулы антитела, в которых аминокислоты СОВ и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом.
В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть биспецифическое антитело, т.е. антитело, имеющее два различных антигенсвязывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.
Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами согласно изобретению, либо из набора ПЦР-амплифицированных У-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки необученных лимфоцитов может быть использована техника фагового представления (Μ^ηΕΙόγ^ 1. е! а1. (1990), №!иге 348, 552-554; ΜπγΚκ 1. е! а1. (1992) Вю!ес11по1оду 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также повышена путем перестановки цепей (С1асккоп Т. е! а1. (1991), МШие, 352, 624-628).
Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, т. е. они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ΕΕΙ8Α). Для использования в этих целях антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.
- 20 013251
Предпочтительными молекулами нуклеиновых кислот второго и третьего аспектов настоящего изобретения являются молекулы, кодирующие полипептидную последовательность, представленную в 81Т) ΙΌ N0:2, 81Т) ΙΌ N0:4, 81Т) ΙΌ N0:6, 81Т) ΙΌ N0:8, 81Т) ΙΌ N0:10, 81Т) ΙΌ N0:12, 81Т) ΙΌ N0:14,
8ЕО ΙΌ N0:16, 8Е0 ΙΌ N0:18, 8Е0 ΙΌ N0:20, 8Е0 ΙΌ N0:22, 8Е0 ΙΌ N0:24, 8Е0 ΙΌ N0:26,
8Е0 ΙΌ N0:28, 8Е0 ΙΌ N0:30, 8Е0 ΙΌ N0:32, 8Е0 ΙΌ N0:34, 8Е0 ΙΌ N0:36, 8Е0 ΙΌ N0:38,
8Е0 ΙΌ N0:40, 8Е0 ΙΌ N0:42, 8Е0 ΙΌ N0:44, 8Е0 ΙΌ N0:46, 8Е0 ΙΌ N0:48, 8Е0 ΙΌ N0:50,
8Е0 ΙΌ N0:52, 8Е0 ΙΌ N0:54, 8Е0 ΙΌ N0:56, 8Е0 ΙΌ N0:58, 8Е0 ΙΌ N0:60, 8Е0 ΙΌ N0:62,
8Е0 ΙΌ N0:64, 8Е0 ΙΌ N0:66, 8Е0 ΙΌ N0:68, 8Е0 ΙΌ N0:70, 8Е0 ΙΌ N0:72, 8Е0 ΙΌ N0:74,
8Е0 ΙΌ N0:76, 8Е0 ΙΌ N0:78, 8Е0 ΙΌ N0:80, 8Е0 ΙΌ N0:82, 8Е0 ΙΌ N0:84, 8Е0 ΙΌ N0:86,
8Е0 ΙΌ N0:88, 8Е0 ΙΌ N0:90, 8Е0 ΙΌ N0:92, 8Е0 ΙΌ N0:94, 8Е0 ΙΌ N0:96, 8Е0 ΙΌ N0:98,
81Т) ΙΌ N0:100, 81Т) ΙΌ N0:102, 81Т) ΙΌ N0:104, 8 ЕС) ΙΌ N0:106, 8ЕС) ΙΌ N0:108, 8ЕС) ΙΌ N0:110,
8ЕС) ΙΌ N0:112, 8ЕС) ΙΌ N0:114, 8ЕС) ΙΌ N0:116, 8 ЕС) ΙΌ N0:118, 8ЕС) ΙΌ N0:120, 8ЕС) ΙΌ N0:122,
8ЕС) ΙΌ N0:124, 8ЕС) ΙΌ N0:126, 8ЕС) ΙΌ N0:128, 8 ЕС) ΙΌ N0:130, 8ЕС) ΙΌ N0:132, 8ЕС) ΙΌ N0:134,
8ЕС) ΙΌ N0:136, 8ЕС) ΙΌ N0:138, 8ЕС) ΙΌ N0:140, 8 ЕС) ΙΌ N0:142, 8ЕС) ΙΌ N0:144, 8ЕС) ΙΌ N0:146,
8Е0 ΙΌ N0:148 или 8Е0 ΙΌ N0:150, и их функционально эквивалентные полипептиды.
Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению предпочтительно содержат по меньшей мере η смежных нуклеотидов описанных здесь последовательностей, где η в зависимости от конкретной последовательности составляет 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).
Молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению также являются последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, используемых в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов).
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек или выделение из соответствующего организма. РНК-молекулы могут быть в основном генерированы путем ίη νίίΓΟ- или ίη νίνο-транскрипции ДНК-последовательностей.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, известная также как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью.
Термин молекула нуклеиновой кислоты также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (ΡNΑ). Используемый здесь термин ΡNΑ означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по меньшей мере из пяти нуклеотидов и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Этот концевой лизин сообщает данной композиции растворимость. ΡNΑ могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и прекращают элонгацию транскрипта (МсКсн Р.Е. с1 а1. (1993), ΛπΙίοαηοοΓ Эгид Эек. 8: 53-63).
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно изобретению, может быть идентична кодирующей последовательности одной или нескольких описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты.
Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые вследствие вырожденности генетического кода кодируют полипептид, представленный в любой из последовательностей 8ЕС) ΙΌ N0:2, 8ЕС) ΙΌ N0:4, 8ЕС) ΙΌ N0:6, 8ЕС) ΙΌ N0:8, 8ЕС) ΙΌ N0:10, 8ЕС) ΙΌ N0:12, 8ЕС) ΙΌ N0:14,
8Е0 ΙΌ N0:16, 8Е0 ΙΌ N0:18, 8Е0 ΙΌ N0:20, 8Е0 ΙΌ N0:22, 8Е0 ΙΌ N0:24, 8Е0 ΙΌ N0:26,
8Е0 ΙΌ N0:28, 8Е0 ΙΌ N0:30, 8Е0 ΙΌ N0:32, 8Е0 ΙΌ N0:34, 8Е0 ΙΌ N0:36, 8Е0 ΙΌ N0:38,
8Е0 ΙΌ N0:40, 8Е0 ΙΌ N0:42, 8Е0 ΙΌ N0:44, 8Е0 ΙΌ N0:46, 8Е0 ΙΌ N0:48, 8Е0 ΙΌ N0:50,
8Е0 ΙΌ N0:52, 8Е0 ΙΌ N0:54, 8Е0 ΙΌ N0:56, 8Е0 ΙΌ N0:58, 8Е0 ΙΌ N0:60, 8Е0 ΙΌ N0:62,
8Е0 ΙΌ N0:64, 8Е0 ΙΌ N0:66, 8Е0 ΙΌ N0:68, 8Е0 ΙΌ N0:70, 8Е0 ΙΌ N0:72, 8Е0 ΙΌ N0:74,
8Е0 ΙΌ N0:76, 8Е0 ΙΌ N0:78, 8Е0 ΙΌ N0:80, 8Е0 ΙΌ N0:82, 8Е0 ΙΌ N0:84, 8Е0 ΙΌ N0:86,
8Е0 ΙΌ N0:88, 8Е0 ΙΌ N0:90, 8Е0 ΙΌ N0:92, 8Е0 ΙΌ N0:94, 8Е0 ΙΌ N0:96, 8Е0 ΙΌ N0:98,
8ЕС) ΙΌ N0:100, 8ЕС) ΙΌ N0:102, 8ЕС) ΙΌ N0:104, 8 ЕС) ΙΌ N0:106, 8ЕС) ΙΌ N0:108, 8ЕС) ΙΌ N0:110,
8ЕС) ΙΌ N0:112, 8ЕС) ΙΌ N0:114, 8ЕС) ΙΌ N0:116, 8 ЕС) ΙΌ N0:118, 8ЕС) ΙΌ N0:120, 8ЕС) ΙΌ N0:122,
8ЕС) ΙΌ N0:124, 8ЕС) ΙΌ N0:126, 8ЕС) ΙΌ N0:128, 8 ЕС) ΙΌ N0:130, 8ЕС) ΙΌ N0:132, 8ЕС) ΙΌ N0:134,
8ЕС) ΙΌ N0:136, 8ЕС) ΙΌ N0:138, 8ЕС) ΙΌ N0:140, 8 ЕС) ΙΌ N0:142, 8ЕС) ΙΌ N0:144, 8ЕС) ΙΌ N0:146,
8ЕС) ΙΌ N0:148 или 8ЕС) ΙΌ N0:150.
Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, без ограничения ими, последовательность, кодирующая только зрелый полипептид; кодирующая последовательность зрелого полипептида и дополнительные кодирующие последовательности, такие как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препрополипептидную последовательность; кодирующая последовательность зрелого полипептида с вышеупомянутыми дополнительными коди
- 21 013251 рующими последовательностями или без них, либо вместе с другими дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслируемые последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации), в связывании с рибосомой и в обеспечении стабильности мРНК. Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть также вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму и третьему аспектам изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов согласно первому аспекту изобретения. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо такая молекула может представлять собой вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, к клеткам или к целым организмам.
Среди рассматриваемых вариантов имеются варианты, которые отличаются от вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Такие замены, делеции или инсерции могут быть сделаны в одном или нескольких нуклеотидах. Указанные варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области либо в той и другой областях. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также сконструированы методами, в основном известными специалистам, включая в зависимости от целей применения модификацию клонирования, процессинг и/или экспрессию генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т. п.
Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид согласно первому аспекту изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы полученная комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным осуществление экспрессии гибридного белка, который может распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между последовательностью полипептида согласно изобретению и последовательностью гетерологичного белка и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка.
Молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также антисмысловые молекулы, которые частично комплементарны молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды согласно изобретению, поэтому они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (гибридизация). В соответствии с методами, известными среднему специалисту в данной области, такие антисмысловые молекулы, например олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид согласно изобретению, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и тем самым предотвращали ее транскрипцию (см. например, Сойеп 1.З., Ттепбй ίη Ρΐιαηη. Зск, 10, 435 (1989), 0капо, 1. №игосйеш. 56, 560 (1991); 0'Соппог, 1. №игосйеш, 56, 560 (1991); Бее е1 а1., №.1с1ею Ас1бй Вей, 6, 3073 (1979); Соопеу е1 а1., 8с1епсе, 241, 456 (1988); Иетуап е1 а1., Заепсе, 251, 1360 (1991)).
Используемый здесь термин гибридизация означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут быть подвергнуты контакту друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или ВБ0ТТ0); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (декстрансульфата или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (ЗашЬтоок е1 а1. [см. выше]).
Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного специалистам (ЗашЬтоок е1 а1. [см. выше]). По существу, гомологичная молекула будет конкурировать с полностью гомологичной
- 22 013251 молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у \УаН1 С.М. и 8.Ь. Вегдег (1987; Ме11юёк Εηζутο1. 152: 399-407) и К1тте1 А.В. (1987; МеЛоёк Еи7ушо1. 152: 507-511).
Термин жесткость означает условия реакции гибридизации, которые благоприятствуют ассоциации молекул с большим сходством, но не способствуют ассоциации отличающихся молекул. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х 88С (150 мМ №С1, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% декстрансульфата и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х 88С приблизительно при 65°С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35°С (8атЬгоок е! а1. [см. выше]). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.
В предпочтительных вариантах этого аспекта настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по меньшей мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептиды ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, и молекулам нуклеиновой кислоты, которые в основном комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая по всей своей длине по меньшей мере на 80% идентична такой кодирующей последовательности, либо молекула нуклеиновой кислоты была комплементарна указанной молекуле. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, а особенно предпочтительно по меньшей мере на 98, 99% или более идентичны указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают в основном такой же биологической функцией или активностью, как и полипептиды экзонов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и полипептиды ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144.
Настоящее изобретение относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, включающему в себя стадии:
(a) контактирования нуклеинового зонда согласно изобретению с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (b) детекции любого из таких образованных дуплексов.
Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид.
В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы методы, описанные и обсуждаемые ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и в основном доступны специалистам и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов согласно изобретению, обсуждаемых в настоящем изобретении. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Ι, секвеназа (И8 Вюскетка1 Согр., Скуе^ё, ОН), полимераза Тад (Гегкт Е1тег), термостабильная полимераза Т7 (АтегкНат, СЫсадо, ГЬ) или комбинация таких полимераз и, корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в ЕЕОХСА8Е Атр1|Гка1юг1 8ук1ет и поставляемые С1Ьсо/ВВЬ (СайЬеткЬигд, МО). Способ секвенирования может быть предпочтительно автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат НатЛ^ Мкто ЬаЬ 2200 (НатП1оц Всио, Νν), термоячейка Ρе1ΐ^е^ ТНегта1 Сус1ег ^ТС200; М1 ВекеагсН, \Уа1ег1о\\т1. МА), катализатор АВI и ДНК-секвенаторы 373 и 377 (Тегки! Е1тег).
Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептида ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам (см., например, СиггегИ ΡιόΦ^κ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, АикиЬе1 е! а1. (еёк). Стене ΡιιΝίκΟιίι^ АккоааЮк и \УПеу Iиΐе^кс^еисе, №\ν Уогк, 1989, 1992). Особенно подходящими являются зонды, содержащие по меньшей мере 15, предпочтительно по меньше мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена 8ЕО ΙΟ Ν0:1, 8ЕО ГО Ν0:3, 8ЕО ГО Ν0:4, 8ЕО ГО Ν0:7, 8ЕО ГО Ν0:9, 8ЕО ГО Ν0:11, 8ЕО ГО Ν0:13, 8ЕО ГО Ν0:15, 8ЕО ГО Ν0:17, 8 ЕС) ГО Ν0:19, 8 ЕС) ГО Ν0:21, 8 ЕС) ГО Ν0:23, 8 ЕС) ГО Ν0:25, 8 ЕС) ГО Ν0:27, 8 ЕС) ГО Ν0:29, 8 ЕС) ГО Ν0:31, 8 ЕС) ГО Ν0:33, 8 ЕС) ГО Ν0:35, 8 ЕС) ГО Ν0:37, 8 ЕС) ГО Ν0:39, 8 ЕС) ГО Ν0:41,
- 23 013251
ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
N0:43,
N0:55,
N0:67,
N0:79,
N0:91,
N0:103, 8ЕС)
N0:115, 8ЕС)
N0:127, 8ЕС)
ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
N0:45,
N0:57,
N0:69,
N0:81,
N0:93,
N0:105, 8ЕС)
N0:117, 8ЕС)
N0:129, 8ЕС)
ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
N0:47,
N0:59,
N0:71,
N0:83,
N0:95,
N0:107, 8 ЕС)
N0:119, 8 ЕС)
N0:131, 8 ЕС)
ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
N0:49,
N0:61,
N0:73,
N0:85,
N0:97,
N0:109, 8ЕС)
N0:121, 8ЕС)
N0:133, 8ЕС)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
ЕС)
N0:51,
N0:63,
N0:75,
N0:87,
N0:99,
N0:111, 8ЕС)
N0:123, 8ЕС)
N0:135, 8ЕС)
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ
ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ ΙΌ
N0:53,
N0:65,
N0:77,
N0:89, N0:101, N0:113, N0:125, N0:137,
ЕС)
ЕС)
ЕС) 8 ЕС) 8 ЕС) 8ЕС) 8ЕС) 8ЕС)
8ЕС) ΙΌ N0:139, 8ЕС) ΙΌ N0:141, 8ЕС) ΙΌ N0:143, 8ЕС) ΙΌ N0:145, 8ЕС) ΙΌ N0:147 и/или 8ЕС) ΙΌ N0:149.
Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, без ограничения ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов средний специалист в данной области может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес бел ки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например отдельных членов семейства, типа и/или подтипа.
Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, т.е. в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет сильно обрезана, обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных методов детекции выше расположенных последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (КАСЕ; см., например, ЕгоЬтаи е! а1., ΡNА8 И8А, 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, проиллюстрированные МагаШоп™ (С1оп1ссН ЬаЬогаИпез Ιηο.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется сайт-рестрикционной ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров (8агкаг С. (1993), Ρ0Κ Мейюйз Аррйс. 2: 318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть использована также обратная ПЦР (ТгЦНа Т. е! а1. (1988) №.1с1с1с Ас1йз Кез. 16: 8186). Другим методом, который может быть использован в данном случае, является ПЦР с захватом, которая представляет собой ПЦРамплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (ЬадегзКот М. е! а1. , (1991), Ρ0Κ Мейюйз Аррйс. 1, 111-119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод йагкег ΙΌ. е! а1. (1991); №.1с1ею АсИз Кез. 19: 3055-3060. Кроме того, можно использовать ПЦР, гнездовые праймеры и библиотеки ЕготоЮгЕтйегТМ для прогулки по геномной ДНК (С1оп(ес11, Ρа1о А1!о, СА). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон.
При скрининге на полноразмерные кДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека о1Цо-й(Т) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'-нетранскрибируемых регуляторных областей.
В одном из вариантов осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок, либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важной стадией в подтверждение корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности и определения ее точной хромосомной локализации физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. МсКизИк, Мепйейап Iηйе^^ίаηсе ίη Мап (имеющейся в настоящее время в библиотеке Уэлльского медицинского университета Джона Хопкинса) Цойп Норкшз Ишуегзйу \Уе1с11 Мей1са1 ЫЬгагу). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или других методов обнару
- 24 013251 жения генов. После предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть использована также для детекции различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т. п. у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов, страдающих заболеванием.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации ίη кйи и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволяют получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в данном заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу.
Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид согласно изобретению, могут быть использованы также методы отключения гена. Одним из методов, который может быть использован для отключения последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (КЫЛ1) (Е1ЬакЫг 8.М. с1 а1., №1иге, 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНКолигонуклеотиды синтезируют ίη νίΐΓΟ и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание этих дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, что приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии белка-мишени.
Эффективность методов отключения гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), а на РНК-уровне она может быть оценена с помощью методики, основанной на Тас.|Мап.
Векторы согласно изобретению содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева согласно изобретению, которые могут быть трансформированы, трансфецированы или трансдуцированы векторами согласно изобретению, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клеткихозяева.
Полипептиды согласно изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам и многие их них подробно описаны у 8атЬгоок е1 а1. (см. выше) и Еегпапбех & НоеГПег (1998, ебк. Оепе ехргеккюп кук1етк. Иктд паШге Гог 111е ай оГ ехргеккюп. Асабетю Ргекк, 8ап О1едо, Ьопбоп, ВокЮп, №\ν Уогк, 8убпеу, Токуо, ТогоШо).
Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы в основном любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессирующую систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у 8атЬгоок е1 а1. (см. выше). В общих чертах кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях), и необязательно, оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине.
Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусная системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирусы, такие как 8У40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, или их комбинации, а также векторы, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть использованы также искусственные человеческие хромосомы (НАС). Предпочтительными примерами векторов, которые могут быть использованы в соответствии с аспектами настоящего изобретения, относящимися к ГЫ8Р141, 1Ы8Р142, 1Ы8Р143 и 1Ы8Р144, являются векторы рСК4-Т0Р0-ПХ8Р142, рСК4-Т0Р0-ПХ8Р141, рСК4-Т0Р0-ПХ8Р 143-ЕС, р1)Е8Т12.2 1Х8Р1416Н18-У1, рЕАК12б_ПХ8Р141-6Н18-У1, рЕЦТК_1Ц8Р141-6Н18-У1, рЕАК12б_ПХ8Р143-ЕС-6Н18-У1, рЦЕ8Т12б_1Ц8Р143-ЕС-6Н18-У1, р1)0ХИ-/ео1Х8Р14.3-ЕС-6Н18-У1 и рЕАК12б-ПХ8Р142-6Н18.
Особенно подходящими экспрессирующими системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например,
- 25 013251 бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаΜV; вирусом мозаики табака, ΤΜν) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Τι или рВВ322) или клеточные системы животных. Для продуцирования полипептидов согласно изобретению могут быть использованы также бесклеточные системы трансляции.
Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид согласно изобретению, в клетки-хозяева может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Όανίδ е1 а1., Ваис Μеΐйοά8 ίη Μο1есυ1а^ Вю1оду (1986) и 8атЬгоок е1 а1. [см. выше]. Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная ΌΕΛΕ-декстраном; трансфекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (см. 8ашЬгоок е1 а1., 1989, [см. выше], Λυ§υ^1 е1 а1., 1991 [см. выше], 8рес1ог, Оо1йшап & Ье1иета1й, 1998). В эукариотических клетках экспрессирующие системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция).
Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид или лидерная последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге.
Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды В1ие8сг1р1 (81га1:адепе, Ьа1о11а, СА) или плазмиды р8рог11™ (О1Ьсо ВВЬ) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, КЪВКСО и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе 8ν40 или ΕВV с соответствующим селективным маркером.
Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под контролем регуляторных последовательностей, т.е. так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать указанную последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, т.е. с сохранением рамки считывания.
Указанные регуляторные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт.
Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессирующие элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векто
- 26 013251 ре. После введения этого вектора клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки, успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа.
Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны специалистам, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, без ограничения ими, клетки яичника китайского хомячка (СН0), клетки НеЬа, клетки почек детенышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (С08), клетки С127, клетки 3Т3, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер С2) и ряд других клеточных линий.
В бакуловирусной системе материалы для получения экспрессирующих систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, ш1ег айа, от 1пуйгодеп, 8ап О|едо СА (набор МахВас). В общих чертах эти методы известны специалистам и подробно описаны у 8иттегк & 8тйк, Техак Адг1си11ига1 Ехрептеп! 81а1юп Ви11е1ш № 1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клетки ЭгокоркПа 82 и клетки 8ройор1ега 8Е9.
Специалистам известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в патентах США 5693506, 5659122 и 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны 2епк, Рку1оскет1к1гу 30, 3861-3863 (1991).
В частности, можно использовать любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты с последующим продуцированием из них целых регенерированных растений, которые содержат перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, без ограничения ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, а также бобовых и овощных растений.
Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, Е.со11, 81гер1отусек и ВасШик киЬ1Шк.
Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, 8.сегеу1к1ае) и клетки АкрегдШик.
Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны специалистам. Примерами являются гены тимидинкиназы (\Ущ1ег М. е! а1. (1977), Се11, 11: 223-32) и аденин-фосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Ьо^у I. е! а1. (1980), Се11, 22: 817-23), которые могут быть использованы в !к- или аргЕ -клетках соответственно.
Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например ген дигидрофолат-редуктазы (ЭНЕВ), который сообщает резистентность к метотрексату (^1д1ег М. е1 а1. (1980), Ргос. ИаИ. Асай. 8с1. 77: 3567-70); ген пр1, который сообщает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к С-418 (Со1Ьеге-Сагарш Е. е! а1. (1981), 1. Мо1. Вю1. 150: 1-14), и гены а1к или ра1, которые сообщают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицин-ацетилтрансферазе соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам.
Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении. Так, например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид согласно изобретению, находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию тандемного гена.
Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид согласно изобретению, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка, например сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (ЕАС8) или иммуноанализы (такие как твердофазный иммуноферментный анализ [ЕЬ18А] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детекции и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. НашрЮп В. е! а1. (1990), 8его1оДса1 Ме1койк, а ЬаЬога1огу Мапиа1, АР8 Ргекк, 81. Раи1, МЦ) и Маййох Э.Е. е1 а1. (1983), 1. Ехр. Мей. 158, 1211-1216).
- 27 013251
Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченных зондов для гибридизации или ПЦР-зондов для детекции последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды согласно изобретению, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченного полинуклеотида. Альтернативно, последовательности, кодирующие полипептид согласно изобретению, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны специалистам, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов ίη νίίτο путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или 8Ρ6, и меченных нуклеотидов. Эти процедуры могут быть проведены с использованием различных коммерчески доступных наборов (Ρйа^тас^а & ир)о1т (Κа1атаζοο, ΜΙ); Бготеда (Мабтон νΙ) и и.8. В1оскет1са1 Согр., С^е1аЫ, ОН)).
Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения детекции, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т. п.
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы также для генерирования трансгенных животных, в частности грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект согласно изобретению. Это генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для создания животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов согласно изобретению.
Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения и/или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков.
Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть использованы также специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды согласно изобретению, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков, являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как гистидинтриптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе удлинения/очистки ЕЬАО8 Отти^х Согр., 8еай1е, νΑ). Для облегчения очистки между доменом для очистки и полипептидом согласно изобретению могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (Ιηνίίτο^η, 8аη П1едо, СА). Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка, содержащего полипептид согласно изобретению, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью ГМАС (аффинной хроматографии на иммобилизованном ионе металла, описанной ΡοπιΐΗ ί. е1 а1. (1992), Ρτοΐ. Ехр. ΡιιπΓ. 3: 263-281), тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов, содержащих гибридные белки, можно найти у Кго11 Ό.Ι. е1 а1., 1993; ЭДА Се11 Βίο1. 12: 441-453.
Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например, таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (ЕАС8), или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть собрана для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то перед выделением полипептида эти клетки должны быть сначала подвергнуты лизису.
Полипептид согласно изобретению может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из известных методов скрининга, применяемых для поиска лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) экспрессию гена или активность полипептида согласно изобретению, а поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или регулировать активность полипептида согласно первому аспекту изобретения.
- 28 013251
Соединения-агонисты или соединения-антагонисты могут быть выделены, например, из клеток, бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе Сойдаи с1 а1., Сиггеи! РгоЮсоЕ ίη ^тииоБду, 1 (2): Сйар!ег 5 (1991).
Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие антагонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом согласно изобретению, но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом согласно изобретению и тем самым ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может быть подвергнуто ингибированию, что будет приводить к подавлению нормальной биологической активности такого полипептида.
Полипептид согласно изобретению, который используется в таком методе скрининга, может находиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе или может присутствовать на клеточной поверхности либо он может быть локализован внутри клетки. Вообще говоря, в таких процедурах скрининга могут быть использованы соответствующие клетки или клеточные мембраны, экспрессирующие полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Затем функциональный ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с ответом контрольных клеток, которые не контактировали с тестируемым соединением. Такой анализ, проводимый с помощью подходящей системы детекции, позволяет определить, может ли тестируемое соединение давать сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного агониста и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствии тестируемого соединения.
Методы генерирования детектируемых сигналов в анализах описанного здесь типа хорошо известны специалистам. Конкретным примером является совместное введение конструкции, экспрессирующей полипептид согласно изобретению или его фрагмент, такой как ЬВИ, присутствующий в виде гибрида с ДНК-связывающим доменом САЬ4, в клетку вместе с репортерной плазмидой, такой как, например, рЕК-Ьис (81га!адеие Еигоре, Ат^егйат, Тйе №1йег1аий§). Эта конкретная плазмида содержит синтетический промотор с пятью тандемными повторами САЬ4-связывающих сайтов, регулирующих экспрессию гена люциферазы. При введении потенциального лиганда в клетки он будет связываться с гибридом САЬ4-полипептид и индуцировать транскрипцию гена люциферазы. Мониторинг уровня экспрессии гена люциферазы может быть проведен путем детекции его активности на устройстве для считывания интенсивности люминесценции (см., например, Ьейтаи е1 а1., 1ВС 270, 12953, 1995; Ра\гаг е1 а1., 1ВС, 277, 39243, 2002).
Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста полипептида согласно изобретению включает в себя:
(а) контактирование меченного или немеченного соединения с полипептидом, иммобилизованным на любом твердом носителе (например, на сферах, пластинах, матричном носителе, чипе), и детекцию указанного соединения путем определения присутствия метки или самого соединения;
(й) контактирование клетки, экспрессирующей на своей поверхности полипептид путем его искусственного заякоривания на клеточной мембране или путем конструирования химерного рецептора, ассоциированного со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (с) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом, с уровнем сигнала, вырабатываемого в отсутствие данного соединения.
Так, например, может быть применен такой способ, как ЕКЕТ-детекция лиганда, связанного с полипептидом в присутствии пептидных коактиваторов (№гп5 е1 а1., 8с1еисе 285, 744, 1999).
В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут, кроме того, включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченного или немеченного лиганда для полипептида.
В другом варианте изобретения способ идентификации агониста или антагониста полипептида согласно изобретению включает в себя определение факта ингибирования связывания лиганда с полипептидом согласно изобретению на любой твердой или клеточной поверхности в присутствии соединениякандидата в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с указанным полипептидом. При этом считается, что соединение, способствующее снижению уровня связывания с лигандом, является конкурентом, который может действовать как агонист или антагонист. Причем предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченным.
- 29 013251
Более конкретно способ скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом полипептида, включает стадии:
(a) инкубирования меченного лиганда с полипептидом согласно изобретению, присутствующим на твердом носителе, с клеточной поверхностью или с клеточной мембраной, содержащей полипептид согласно изобретению;
(b) определения количества меченного лиганда, связанного с полипептидом на твердом носителе, с интактой клеткой или с клеточной мембраной;
(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченного лиганда и иммобилизованного полипептида на твердом носителе, интактой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведения этой смеси до состояния равновесия;
(ά) определения количества меченного лиганда, связанного с иммобилизованным полипептидом или с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и (е) сравнения различия в количествах связанного меченного лиганда стадий (Ь) и (ά), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (ά), рассматривается как агонист или антагонист.
Было обнаружено, что указанные полипептиды могут модулировать различные физиологические и патологические процессы в зависимости от вводимой дозы в вышеописанных анализах. Таким образом, термин функциональные эквиваленты полипептидов согласно изобретению включают полипептиды, которые обладают любой из указанных дозозависимых модулирующих активностей в вышеописанных анализах. Хотя степень дозозависимой активности необязательно должна быть идентична активности указанных полипептидов согласно изобретению, однако предпочтительно, чтобы в данном анализе на активность указанные функциональные эквиваленты обладали дозозависимой активностью, по существу, аналогичной активности полипептидов согласно изобретению.
Полипептиды экзонов ΙΗ8Ρ141, Ι^ΡΜΣ. Ι^ΡΜ.Ι и Ι^ΡΗΓ и полипептиды ΙΗ8Ρ141, INЗΡ142, INЗΡ143 и INЗΡ144 согласно изобретению могут модулировать рост и дифференцировку клеток. Таким образом, биологическая активность полипептидов экзонов ΙΗ8Ρ141, Ι^ΡΗΣ, Ι^ΡΗ.Ι и INЗΡ144 и полипептидов ΙΗ8Ρ141, Ι^Ρ^, Ι^ΡΜ.Ι и INЗΡ144 может быть оценена в системах, позволяющих проводить исследование роста и дифференцировки клеток, таких как системы тканевых культур ш νίΙΐΌ. Стимуляция или ингибирование пролиферации клеток могут быть измерены с помощью различных анализов.
Так, например, для оценки ингибирования роста клеток может быть использована твердая или жидкая среда. В твердой среде клетки, рост которых подвергается ингибированию, могут быть отобраны из группы клеток индивидуума путем сравнения размеров образуемых ими колоний. В жидкой среде ингибирование роста может быть скринировано путем измерения мутности культуральной среды или включения меченного тимидина в ДНК. Обычно включение нуклеозидного аналога в только что синтезированную ДНК может служить основой для измерения пролиферации клеток (т. е. активного роста клеток) в данной популяции. Так, например, в качестве реагента для мечения ДНК может быть использован бромдезоксиуридин (ВМИ), а в качестве детектирующего реагента могут быть использованы мышиные моноклональные антитела против ВМИ. Это антитело связывается только с клетками, содержащими ДНК, в которую был включен бромдезоксиуридин. В комбинации с этим анализом могут быть использованы различные методы детекции, включая иммунофлуоресцентные, иммуногистохимические, ЕЫЗА- и колориметрические методы. Наборы, включающие бромдезоксиуридин (ВМИ) и мышиное моноклональное антитело против ВМИ, являются коммерчески доступными и поставляются фирмой ВоеБппдег МаппЪеш (М1апаро115, Ш).
Влияние полипептидов экзонов Ι^ΡΜ^ INЗΡ142, Ι^ΡΜ.Γ и INЗΡ144 и полипептидов Ι^ΡΜ^ INЗΡ142, Ι^ΡΜ.Γ и INЗΡ144 согласно изобретению на дифференцировку клеток может быть оценено посредством контактирования стволовых клеток или эмбриональных клеток с различными количествами указанных полипептидов и оценки такого влияния на дифференцировку стволовых клеток или эмбриональных клеток. Для идентификации полученных клеток могут быть использованы тканеспецифические антитела и методы микроскопии.
Было обнаружено, что в вышеописанном анализе полипептиды экзонов Ι^ΡΜ^ INЗΡ142, INЗΡ143 и Ι^ΡΗΓ и полипептиды INЗΡ141, INЗΡ142, Ι^ΡΜ.Γ и INЗΡ144 могут также модулировать пролиферацию и дифференцировку клеток иммунной и/или нервной системы в зависимости от дозы. Таким образом, функциональные эквиваленты полипептидов экзонов Ι^ΡΜ^ INЗΡ142, Ι^ΡΜ.Γ и Ι^ΡΜΓ и полипептидов Ι^ΡΜ^ INЗΡ142, Ι^ΡΗ.Γ и Ι^ΡΗΓ включают полипептиды, которые обладают любой из таких дозозависимых активностей, направленных на регуляцию роста и дифференцировку клеток в вышеописанном анализе. Хотя степень дозозависимой активности необязательно должна быть идентичной активности полипептидов экзонов Ι^ΡΜ^ INЗΡ142, Ι^ΡΗ.Γ и Ι^ΡΜΓ и полипептидов INЗΡ141, INЗΡ142, INЗΡ143 и INЗΡ144, однако предпочтительно, чтобы указанные функциональные эквиваленты обладали, по существу, таким же дозозависимым действием, как и полипептиды экзонов Ι^ΡΜ^ Ι№Ρ142, Ι№Ρ143 и №144 и полипептидов Ι№Ρ141, Ι№Ρ142, Ι№Ρ143 и №144.
- 30 013251
В некоторых описанных выше вариантах настоящего изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, либо анализы на конкуренцию с меченным соединением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для детекции на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом.
Могут быть также разработаны анализы для детекции влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей указанный полипептид в клетках. Так, например, может быть разработан такой анализ ЕЫ8А, который позволяет измерять секретированные или клеточноассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами, известными специалистам, и такой анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образования связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением.
Другой метод, который может быть использован для скрининга лекарственных средств, позволяет осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с представляющим интерес полипептидом (см. Международную патентную заявку АО 84/03564). В этом методе большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом согласно изобретению и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование ненейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными специалистам. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в вышеупомянутых способах скрининга на лекарственные средства.
Методами анализов, которые также подпадают под определение этих терминов в настоящем изобретении, являются методы, преусматривающие использование генов и полипептидов согласно изобретению в анализе на сверхэкспресию или элиминацию. Такие анализы включают изменение уровней указанных генов/полипептидов в клетках и оценку влияния этих изменений на физиологию модифицированных клеток. Так, например, такие эксперименты позволяют более детально выявить механизмы передачи сигналов и метаболические пути, в которых участвуют конкретные гены/полипептиды, а также получить информацию об идентичности полипептидов, с которыми взаимодействуют исследуемые полипептиды и решить проблему разработки методов регуляции уровней родственных генов и белков.
Другими методами поиска лекарственных средств, которые могут быть использованы, является высокоэффективный скрининг соединений, имеющих подходящую аффинность связывания с представляющим интерес полипептидом (см. Международную патентную заявку АО 84/03564). В этом методе большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом согласно изобретению и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование ненейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными специалистам. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в вышеупомянутых способах скрининга на лекарственные средства.
Примеры подходящих анализов, проводимых для идентификации агонистов или антагонистов полипептидов согласно изобретению, описаны в работе Кокеп е! а1., Сигг. Орт. Бгид Б1ксоу. Беуе1. 2003, 6 (2): 224-30.
Полипептид согласно изобретению может быть использован для идентификации мембраносвязанных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной специалистам, такой как анализы на связывание и перекрестное связывание с лигандом, в которых данный полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детекцию или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазмонный резонанс и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть использованы также для идентификации агонистов и антагонистов указанного полипептида, которые конкурируют с указанным полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны специалистам.
- 31 013251
В другом своем варианте настоящее изобретение относится к применению полипептида ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 или его фрагмента, где указанным фрагментом предпочтительно является фрагмент, специфичный к гену ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144, в целях выделения или генерирования агониста или стимулятора полипептида ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 для лечения иммуноассоциированного расстройства, где указанный агонист или стимулятор выбран из группы, состоящей из:
1) специфического антитела или его фрагмента, включая а) химерное, Ь) гуманизованное или с) полностью человеческое антитело:
2) биспецифического или мультиспецифического антитела;
3) одноцепочечного антитела (например, §сРу); или
4) однодоменного антитела; или
5) пептидо- или непептидомиметика, происходящего от указанных антител; или
6) антитело-миметика, такого как (а) антикалин или (Ь) связывающая молекула на основе фибронектина (например, тринектин или аднектин).
Получение пептидо- или непептидомиметиков из антител известно специалистам (8агадоу1 е1 а1., 1991 & 8агадоу1 е1 а1., 1992).
Антикалины известны также специалистам (УоЦ е1 а1., 2004). Связывающие молекулы на основе фибронектина описаны в патенте США № 6818418 и в νΟ 2004029224.
Кроме того, тестируемыми соединениями могут быть соединения различного происхождения, природы и состава, такие как любые небольшие молекулы, нуклеиновые кислоты, липиды, пептиды, полипептиды, включая антитела, такие как химерное, гуманизованное или полностью человеческое антитело или его фрагмент, происходящие от них пептидо- или непептидомиметики, а также биспецифические или мультиспецифические антитела, одноцепочечные антитела (например, §сРу), однодоменные антитела, антитела-миметики, такие как антикалин или связывающая молекула на основе фибронектина (например, тринектин или аднектин) и т.п., в изолированной форме или в виде их смеси или комбинаций.
Настоящее изобретение относится также к набору для скрининга, используемому в методах идентификации агонистов, антагонистов, лигандов, рецепторов, субстратов и ферментов, описанных выше.
Настоящее изобретение относится также к агонистам, антагонистам, лигандам, рецепторам, субстратам, ферментам и к другим соединениям, модулирующим активность или антигенность полипептида согласно изобретению в соответствии с описанными выше механизмами.
Как указывалось выше, предполагается, что различные молекулы согласно изобретению (т.е. полипептиды согласно первому аспекту настоящего изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту настоящего изобретения, вектор согласно четвертому аспекту настоящего изобретения, клетка-хозяин согласно пятому аспекту настоящего изобретения, лиганд согласно шестому аспекту настоящего изобретения, и соединение согласно седьмому аспекту настоящего изобретения) могут быть использованы для лечения или диагностики заболеваний. В целях оценки эффективности указанных молекул согласно изобретению для лечения или диагностики заболевания могут быть проведены один или несколько из описанных ниже анализов. Следует отметить, что хотя некоторые из нижеследующих анализов описаны для тестируемых соединений, являющихся белком/полипептидом, однако специалист в данной области может легко модифицировать эти анализы для их применения к другим молекулам согласно изобретению, которые также могут быть использованы в качестве тестируемых соединений.
Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение согласно изобретению в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов, в качестве вакцин или в качестве других иммуногенных композиций, подробно описанных ниже.
В соответствии с используемой здесь терминологией композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение [X], считается в основном не содержащей примесей [здесь, Υ], если по меньшей мере 85 мас.% от всего количества Χ+Υ в данной композиции составляет X. Предпочтительно X составляет по меньшей мере примерно 90%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 95, 98 или даже 99 мас.% по общей массе Χ+Υ в данной композиции.
Предпочтительно фармацевтические композиции должны содержать терапевтически эффективное количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, лиганда или соединения согласно изобретению. Используемый здесь термин терапевтически эффективное количество означает количество терапевтического агента, необходимого для лечения, ослабления или предупреждения рассматриваемого заболевания или состояния или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализе клеточной культуры, например опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. С использованием животного-модели может быть также определен соответствующий интервал концентраций и способ их введения. Полученная информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку.
- 32 013251
Точное эффективное количество соединения для введения индивидууму будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, его возраста, веса, пола и режима питания, от времени и частоты введения лекарственного средства, от комбинации(й) лекарственных средств, а также от реактивной чувствительности и толерантности/восприимчивости данного индивидуума к проводимой терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах эффективная доза может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.
Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для введения терапевтического агента. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что данный носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.
Используемыми здесь фармацевтически приемлемыми солями могут быть, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Кешшдоп'к Ρйа^тасеυΐ^са1 8с1епсе5 Оаск Ριώ. Со., Ν.Ι. 1991).
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в указанных композициях могут присутствовать и вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т. п. С помощью таких носителей могут быть получены фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для перорального приема пациентом.
Композиции согласно изобретению, после их приготовления, могут быть непосредственно введены индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, в частности человек.
Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть введены различными способами, включая, без ограничения ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное введение (см., например, νθ 98/20734), а также подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, внутрикишечное, местное, подъязычное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций согласно изобретению могут быть использованы также аппараты для выстреливания генов или безыгольные шприцы. В основном терапевтические композиции могут быть приготовлены в виде растворов для инъекций, либо жидких растворов, либо суспензий или они могут быть получены в виде твердых форм, подходящих для получения растворов или суспензий в жидких носителях перед их инъекцией.
Указанные композиции могут быть непосредственно доставлены в основном путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции либо они могут быть доставлены в интерстициальное пространство ткани. Эти композиции могут быть также введены в пораженный участок. При этом лечение может быть проведено по схеме введения разовой дозы или дробных доз.
Если активность полипептида согласно изобретению превышает активность, требуемую для лечения конкретного патологического состояния, то в данном случае может быть рассмотрено несколько подходов. Один из таких подходов предусматривает введение индивидууму вышеописанного соединения-ингибитора (антагониста) вместе с фармацевтически приемлемым носителем, где указанный ингибитор вводят в количестве, эффективном для ингибирования функции полипептида, например блокирования связывания с лигандами, субстратами, ферментами или рецепторами, либо для ингибирования вторичного сигнала и тем самым эффективном для ослабления симптомов аномального состояния. Такими антагонистами предпочтительно являются антитела. Для минимизации иммуногенности антител, описанных выше, наиболее предпочтительно, чтобы такие антитела были химерными и/или гуманизованными.
В соответствии с другим подходом могут быть введены растворимые формы полипептидов, которые сохраняют аффинность связывания с рассматриваемым лигандом, субстратом, ферментом или рецептором. В основном такой полипептид может быть введен в виде фрагментов, в которых сохраняются релевантные части.
В альтернативном подходе экспрессия гена, кодирующего данный полипептид, может быть ингибирована методами блокирования экспрессии, такими как использование молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты (описанных выше), которые могут быть генерированы эндогенно или введены отдельно. Модификации экспрессии генов могут быть получены путем конструирования комплементарных последовательностей или антисмысловых молекул (ДНК, РНК или ΡΝΛ) для осуществления регуляции, 5'-областей или регуляторных областей (сигнальной последовательности, промоторов, энхансеров и ин
- 33 013251 тронов) гена, кодирующего данный полипептид. Аналогичным образом, такое ингибирование может быть осуществлено с использованием методики спаривания оснований с образованием тройной спирали. Спаривание с образованием тройной спирали используется потому, что оно приводит к нарушению способности двойной спирали раскрываться так, чтобы это оказалось достаточным для связывания с полимеразами, факторами транскрипции или регуляторными молекулами. Успехи в клинической терапии, достигнутые за последнее время благодаря использованию ДНК-триплекса, были описаны в литературе (Сее 1Ε. е! а1. (1994): НиЬег ВБ. & ВТ. Сагг, Μο1еси1а^ и [ттипо1од1с Αрр^οасйеκ, Еи!ига ΡιιΝίκΙιίΓΐβ Со., Μ!. К1ксо, ΝΥ). Комплементарная последовательность или антисмысловая молекула могут быть также сконструированы в целях блокирования трансляции мРНК посредством предотвращения связывания транскрипта с рибосомами. Такие олигонуклеотиды могут быть введены или генерированы ш κί!ι.ι в результате экспрессии ш νί\Ό.
Кроме того, экспрессия полипептида согласно изобретению может быть предотвращена с использованием рибозимов, специфичных к мРНК-последовательности, кодирующей этот полипептид. Рибозимы представляют собой каталитически активные РНК, которые могут быть природными или синтетическими (см. например, икшап Ν. е! а1., Сигг. Орт. 8!гис!. Вю1. (1996), 6 (4), 527-33). Синтетические рибозимы могут быть сконструированы так, чтобы они специфически расщепляли мРНК в выбранных положениях и тем самы, предотвращали трансляцию мРНК в функциональный полипептид. Рибозимы могут быть синтезированы с использованием природного рибозофосфатного остова и природных оснований, обычно присутствующих в РНК-молекулах. Альтернативно, рибозимы могут быть синтезированы с использованием неприродных остовов, например 2'-О-метил-РНК, в целях защиты от расщепления рибонуклеазой, и эти рибозимы могут содержать модифицированные основания.
Молекулы РНК могут быть модифицированы в целях увеличения внутриклеточной стабильности и времени полужизни. Возможными модификациями являются, но не ограничиваются ими, присоединение фланкирующих последовательностей у 5'- и/или у 3'-концов данной молекулы или использование в указанном остове молекулы фосфортиоата или 2'-О-метила вместо фосфодиэстеразных связей. Эта концепция может рассматриваться и при продуцировании ΡΝΑ и может быть применена ко всем указанным молекулам посредством включения нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и бутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и аналогичные модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина, которые не могут легко распознаваться эндогенными эндонуклеазами.
Для лечения аномальных состояний, ассоциированных с недостаточной экспрессией полипептида согласно изобретению и его активностью, имеется несколько способов. Один из таких способов предусматривает введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения, которое активирует указанный полипептид, т. е. соединение-агонист, описанный выше, в целях ослабления симптомов патологического состояния. Альтернативно, терапевтическое количество указанного полипептида в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем может быть введено в целях сохранения соответствующего физиологического равновесия данного полипептида.
Для осуществления эндогенного продуцирования данного полипептида соответствующими клетками индивидуума может быть применена генотерапия. Генотерапию используют для перманентного лечения заболеваний, связанных с аномальным продуцированием данного полипептида, путем замены дефектного гена правильным терапевтическим геном.
Генотерапия согласно изобретению может быть осуществлена ш νί\Ό или ех νί\Ό. Для генотерапии ех νί\Ό требуются выделение и очистка клеток, взятых у пациента, введение терапевтического гена и введение генетически модифицированных клеток обратно пациенту. В противоположность этому генотерапия ш νί\Ό не требует выделения и очистки клеток пациентов.
Для введения пациенту обычно используют упакованный терапевтический ген. Носители для доставки генов могут быть невирусными, такими как липосомы, либо они могут представлять собой дефектные по репликации вирусы, такие как аденовирус, описанный Вегкпег КБ., Сигг. Бор. ΜΕι^μΕ Iшшиηο1., 158, 39-66 (1992), или векторы на основе аденоассоциированного вируса (ΑΑν), описанные Μиζусζка Ν. Сигг. 1ор. ΜΕι^μΕ ^шипоЕ, 158, 97-129 (1992) и в патенте США № 5252479. Так, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно изобретению, может быть сконструирована для экспрессии в дефектном по репликации ретровирусном векторе. Затем эта экспрессирующая конструкция может быть выделена и введена в упаковывающую клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, кодирующую указанный полипептид, так, чтобы указанная упаковывающая клетка продуцировала инфекционные вирусные частицы, содержащие нужный ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены индивидууму для конструирования клеток ш νί\Ό и экспрессии полипептида ш νί\Ό (см. СНар!ег 20 Сепе ЗЪегару и о!11ег Μο1еси1а^ Сепебс-Ьакеб 1Ъегареийс Лрр^οасΗеκ (и цитируемые там ссылки), Нишап Μο1еси1а^ Сепебск (1996), Т. 8!гасНап & Α.Ρ.Веаά, ВЮ8 8с1еп(1Пс ОнЬНкНегк ЬШ.).
Другим способом является введение оголенной ДНК, где терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровоток или в мышечную ткань.
- 34 013251
В случае, когда полипептидами или молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению являются агенты, вызывающие заболевание, настоящее изобретение относится к способу их использования в целях получения вакцин для вырабатывания антител против указанного агента, вызывающего заболевание.
Вакцины согласно изобретению могут быть либо профилактическими (т.е. предназначенными для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. предназначенными для лечения заболеваний после инфицирования). Такие вакцины содержат иммунизирующий(е) антиген(ы), иммуноген(ы), полипептид(ы), белок(ки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с описанными выше фармацевтически приемлемыми носителями, где указанным носителем может быть любой носитель, который сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию. Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы (адъюванты). Более того, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид дифтерии, столбняка, холеры, Н.ру1оп и другие патогены.
Поскольку полипептиды могут разлагаться в желудке, то вакцины, содержащие полипептиды, предпочтительно вводят парентерально (например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или чрескожной инъекции). Композициями, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данной композиции изотоничность с кровью реципиента, а также водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители.
Вакцинные композиции согласно изобретению могут быть помещены в емкости для разовых лекарственных форм или для многократного применения. Так, например, эти лекарственные формы могут быть помещены в запаянные ампулы и сосуды, которые могут храниться в замороженном виде и в которые непосредственно перед их использованием необходимо добавить лишь стерильный жидкий носитель. Конкретная доза будет зависеть от удельной активности данной вакцины и может быть легко определена путем рутинного экспериментирования.
Генетическая доставка антител, связывающихся с полипептидами согласно изобретению, может быть осуществлена, например, как описано в Международной патентной заявке АО 98/55607.
Для получения вакцинных композиций может быть использована также технология безыгольного впрыскивания (см., например, \у\у\у.ро\убег|ес1.сот).
Ряд подходящих методов вакцинации и систем для доставки вакцин описаны в Международной патентной заявке АО 00/29428.
Настоящее изобретение относится также к использованию молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению в качестве диагностических реагентов. Детекция мутированной формы гена, представляющей собой молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые ассоциируются с дисфункцией, применяется в качестве диагностического средства, которое может облегчать установление диагноза заболевания или восприимчивости к заболеванию, возникающему в результате пониженной экспрессии, сверхэкспрессии или измененной пространственной или временной экспрессии данного гена. Индивидуумы, несущие мутации в данном гене, могут быть идентифицированы на ДНК-уровне различными методами.
Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для диагностики, могут быть получены из клеток данного индивидуума, таких как клетки крови, мочевины, слюны, биоптата ткани или материала, полученного после аутопсии. Геномная ДНК может быть использована непосредственно для детекции либо перед проведением анализа она может быть амплифицирована ферментативным способом с помощью ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР), амплификации с замещением цепи (8ΌΑ) или другими методами амплификации (см. 8а1к1 е! а1., №11игс. 324, 163-166 (1986); Ве) е! а1., Сгк. Ису. Вюскет. Мо1ес. Вю1., 26, 301-334 (1991); Впкеитеуег е! а1., 1. У1го1. Ме!к., 35, 117-126 (1991), Уап Вгип!, 1. Β^ο/Τескпο1οду, 8, 291294 (1990)).
В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания у пациента, включающему оценку экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно изобретению, и сравнение полученного уровня экспрессии с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия данного заболевания. Этот способ включает в себя следующие стадии:
a) контактирование образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиново-кислотным зондом в жестких условиях, в результате чего образуется гибридный комплекс между молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению и указанным зондом;
b) контактирование контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и
c) детекцию присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детекция уровней гибридного комплекса в образце, взятого у данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, является признаком наличия данного заболевания.
- 35 013251
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, включающему в себя следующие стадии:
a) получение образцов тканей от пациента, исследуемого на наличие заболевания;
b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению из указанного образца ткани;
c) установление диагноза заболевания у данного пациента путем обнаружения присутствия мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с данным заболеванием.
Для облегчения детекции молекул нуклеиновой кислоты в описанных выше способах может быть проведена стадия амплификации, например, с помощью ПЦР.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, включающему в себя следующие стадии:
a) получение образцов тканей от пациента, исследуемого на наличие заболевания;
b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению из указанного образца ткани;
c) установление диагноза заболевания у данного пациента путем обнаружения присутствия мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с данным заболеванием.
Для облегчения детекции молекул нуклеиновой кислоты в описанных выше способах может быть проведена стадия амплификации, например, с помощью ПЦР. Подходящие зонды более подробно обсуждаются ниже.
Делеции и инсерции могут быть детектированы по изменению размера амплифицированного продукта по сравнению с нормальным генотипом. Точковые мутации могут быть идентифицированы путем гибридизации амплифицированной ДНК с меченной РНК согласно изобретению или альтернативно с меченными антисмысловыми ДНК-последовательностями согласно изобретению. Полностью соответствующие последовательности могут быть дифференцированы от дуплексов с ошибочным спариванием путем гидролиза РНКазой или путем оценки различий в температурах плавления. Присутствие или отсутствие мутации у пациента может быть определено посредством контактирования ДНК с нуклеиновокислотным зондом, который гибридизуется с ДНК в жестких условиях, в результате чего образуется гибридная двухцепочечная молекула, где указанная гибридная двухцепочечная молекула имеет негибридизованную часть цепи нуклеиново-кислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и установления присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи нуклеиново-кислотного зонда как показателя наличия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации в соответствующей части ДНК-цепи.
Такие способы диагностики являются особенно ценными для проведения пренатальных и даже неонатальных тестов.
Точковые мутации и другие отличия последовательностей эталонного гена и мутантных генов могут быть идентифицированы другими хорошо известными методами, такими как прямое секвенирование ДНК или определение конформационного полиформизма одноцепочечных последовательностей (см. Огйа еί а1., Ссηοт^ск. 5, 874-879 (1989)). Так, например, секвенирующий праймер может быть использован вместе с двухцепочечным ПЦР-продуктом или с одноцепочечной матричной молекулой, генерированной с помощью модифицированной ПЦР. Определение последовательности осуществляют в соответствии со стандартными процедурами с использованием радиоактивно меченных нуклеотидов или в соответствии с процедурами автоматического секвенирования с использованием флуоресцентных меток. Клонированные ДНК-сегменты могут быть использованы также в качестве зондов для детекции специфических ДНК-сегментов. Чувствительность этого метода значительно повышается при использовании комбинированной ПЦР. Кроме того, точковые мутации и другие модификации последовательностей, такие как полиморфизм, могут быть детектированы, как описано выше, например, с использованием аллель-специфических олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации последовательностей, отличающихся одним нуклеотидом.
Различия в ДНК-последовательностях могут быть также детектированы по изменениям электрофоретической подвижности ДНК-фрагментов в гелях в присутствии или в отсутствии денатурирующих агентов либо путем прямого секвенирования ДНК (например, Муегк еί а1., 8с1спсс (1985), 230: 1242). Изменения в конкретных положениях данных последовательностей могут быть также выявлены либо путем проведения анализов на защиту от нуклеазы, таких как анализ на защиту от РНКазы или 81, либо методом химического расщепления (см. ί,’οΙΙοη еί а1., Ггос. №И. Αсаб. 8α. υ8Α (1985), 85: 4397-4401).
Помимо стандартного гель-электрофореза и секвенирования ДНК, мутации, такие как микроделеции, анеуплоидии, транслокации и инверсии, могут быть также детектированы путем проведения анализа ίη кйи (см. например, Ке11ег еί а1., ΌΝΑ Ργό^8, 2п6 Еб., δίοοΠοη Ργο88, Νον ΥοΑ, Ν.Υ., υ8Α (1993)), т.е. ДНК или РНК-последовательности в клетках могут быть проанализированы на мутации, без их выделения и/или иммобилизации на мембране. В настоящее время наиболее широко используемым методом является гибридизация ίη кйи с флуоресценцией (ΕΙ8Η), и в литературе уже появилось множество описаний этого метода (см. например, ΤπκΙιι,κΚ еί а1., 8с1спсс 250, 559-562 (1990) и ^акк еί а1., Τιτι^, Ссмс!., 7, 149-154 (1991)).
- 36 013251
В другом варианте осуществления настоящего изобретения для проведения эффективного скрининга генетических вариантов, мутаций и полиморфизма может быть создан массив олигонуклеотидных зондов, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Технология создания массивов хорошо известна специалистам и находит широкое применение; при этом она может быть использована для решения ряда проблем молекулярной генетики, касающихся экспрессии генов, сцепления генов и генетической изменчивости (см. например, М. СНее е! а1., 8с1епсе (1996). Уо1. 274, р. 610-613).
В одном из вариантов осуществления изобретения такой массив может быть получен и использован в соответствии с методами, описанными в заявке РСТ \νΟ 95/11995 (СНее е! а1.); Ьосккай Ό.Ι. е! а1., (1996), №1. Вю1ес11. 14: 1675-1680) и ЗсНепа Μ. е! а1. (1996), Гтос. №11. Аса'. 8с1. 93: 10614-10619). Олигонуклеотидные пары могут быть использованы в количестве от 2 пар до 1 млн пар. Эти олигомеры синтезируют в соответствующих участках на субстрате с использованием оптически направленного химического синтеза. Таким субстратом может быть бумага, найлон или мембрана другого типа, фильтр, чип, покровное стекло или любой другой твердый носитель. В другом аспекте согласно изобретению олигонуклеотид может быть синтезирован на поверхности субстрата с использованием процедуры химического связывания и струйного аппарата для нанесения путем разбрызгивания, как описано в заявке РСТ νΟ 95/25116 (Ва1'е8скете'ег е! а1.). В другом своем аспекте для определения порядка расположения кДНКфрагментов или олигонуклеотидов на поверхности субстрата и связывания этих фрагментов или олигонуклеотидов с поверхностью субстрата могут быть использованы сетчатые массивы, аналогичные массивам для дот- (или слот-) блотов, с применением вакуумной системы и процедур термического, УФ, механического или химического связывания. Массив, такой как массивы, описанные выше, может быть создан вручную или с помощью подходящих устройств (слот-блот или дот-блот-аппарата), материалов (любого твердого носителя) и оборудования (включая роботизированную аппаратуру), и этот массив может содержать 8, 24, 96, 384, 1536 или 6144 олигонуклеотидов или любое другое число от 2 до более чем 1 млн, которое является подходящим для эффективного использования коммерчески доступного оборудования.
Помимо методов, описанных выше, заболевания могут быть диагностированы методами, предусматривающими определение в образце, взятом у индивидуума, аномально низкого или аномально высокого уровня полипептида или мРНК. Для количественной оценки полипептидов пониженный или повышенный уровень экспрессии может быть измерен на РНК-уровне любыми методами, хорошо известными специалистам, например путем амплификации нуклеиновых кислот, например, с помощью ПЦР или ОТ-ПЦР, путем проведения анализов на защиту от РНКазы, Нозерн-блот-анализов и других методов гибридизации.
Аналитические методы, которые могут быть использованы для определения уровней полипептида согласно изобретению в образце, взятом у хозяина, хорошо известны специалистам и более подробно обсуждаются выше (включая радиоиммуноанализы, анализы на конкурентное связывание, Вестерн-блотанализ и Ε^I8А-анализы). В этом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, который включает в себя стадии:
(a) контактирования лиганда, описанного выше, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.
Протоколы, такие как НиЗА, РИА и ЕАС8, разработанные для измерения уровней полипептидов, могут быть, кроме того, взяты за основу для определения измененных или аномальных уровней экспрессии полипептида. Нормальные или стандартные значения для экспрессии полипептида получают путем объединения физиологических жидкостей или клеточных экстрактов, взятых у нормальных млекопитающих, предпочтительно у человека, с антителом против данного полипептида в условиях, подходящих для образования комплекса. Количество образованного стандартного комплекса может быть оценено различными методами, такими как фотометрические методы.
Антитела, которые специфически связываются с полипептидом согласно изобретению, могут быть использованы для диагностики состояний или заболеваний, характеризующихся экспрессией полипептида, или в анализах для наблюдения за пациентами, которым было проведено лечение полипептидами, молекулами нуклеиновой кислоты, лигандами и другими соединениями согласно изобретению. Антитела, подходящие для использования в диагностических целях, могут быть получены способом, аналогичным способу, описанному выше для терапии. Диагностические анализы на присутствие полипептида осуществляют методами, предусматривающими использование антитела и метки для детекции полипептида в физиологических жидкостях, экстрактах клеток или тканей человека. При этом могут быть использованы модифицированные или немодифицированные антитела, и эти антитела могут быть помечены путем их ковалентного или нековалентного связывания с репортерной молекулой. Кроме того, могут быть использованы репортерные молекулы широкого ряда, известные специалистам, и некоторые из них описаны выше.
Количества полипептида, экспрессируемого у индивидуума, в контрольном образце и образце ткани, взятой при биопсии, сравнивают со стандартными величинами. Отклонение величин, полученных для данного индивидуума, от стандартных величин позволяет определить параметры для диагностики
- 37 013251 заболевания. Диагностический анализ может быть проведен для выявления отсутствия, присутствия и избыточной экспрессии полипептида и для мониторинга регуляции уровней полипептида во время терапевтического лечения. Такие анализы могут быть также проведены для оценки эффективности конкретного курса терапевтического лечения при исследовании животных в клинических испытаниях или для наблюдения за процессом лечения отдельного пациента.
Диагностический набор согласно изобретению может содержать:
(a) молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению;
(b) полипептид согласно изобретению или (c) лиганд согласно изобретению.
В одном из аспектов настоящего изобретения диагностический набор может включать первый контейнер, содержащий нуклеиново-кислотный зонд, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания. Этот набор может, кроме того, включать третий контейнер, содержащий агент для гидролиза негибридизованной РНК.
В альтернативном аспекте настоящего изобретения диагностический набор может содержать массив молекул нуклеиновой кислоты, по меньшей мере одной из которых может быть молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению.
Для детекции полипептида согласно изобретению диагностический набор может содержать одно или несколько антител, связывающихся с полипептидом согласно изобретению, и реагент, используемый для детекции реакции связывания между антителом и полипептидом.
Указанные наборы могут быть использованы для диагностики заболевания или восприимчивости к заболеванию, в патогенезе которых участвуют белки, содержащие Ι-домен. Такими заболеваниями могут быть клеточно-пролиферативные расстройства, включая новообразования, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительные заболевания кишечника, артрит, псориаз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждения головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; нарушения развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и почечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибковые инфекции и паразитарные инфекции, и другие патологические состояния. Такими заболеваниями предпочтительно являются заболевания, в патогенезе которых участвуют белки, содержащие домен у\УЕА и/или А№Г_Ю. Примерами заболеваний, в которых участвуют белки, содержащие домен у\УЕА и/или АNТ_IС, являются бактериальные инфекции, бактериальные интоксикации, сибирская язва, заболевания, ассоциированные с блокадой токсинов (например, бактериальных токсинов), рак, опухоль эндотелия, рак ободочной кишки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак легких, меланома, ювенильный гиалиновый фиброматоз (ЮГФ), детский системный гиалиноз (ДСГ), болезнь фон Виллебранда, миопатия Бетлема, дистрофический буллузный эпидермолиз, тромбоз, модуляция агрегации, опосредуемой тромбоцитами, аутоиммунные заболевания и воспаления. Указанные наборы могут быть использованы также для диагностики репродуктивных расстройств, включая бесплодие.
Различные аспекты и варианты настоящего изобретения будут более подробно проиллюстрированы, например, в описании, в частности, относящемся к полипептидам экзонов ЕЫ8Р141, ЕЫ8Р142, ЕЫ8Р143 и ЕЫ8Р144 и полипептидам ПД8Р141, Ш8Р142, ПД8Р143 и ПД8Р144.
При этом следует отметить, что в настоящее изобретение могут быть внесены конкретные модификации, не выходящие за рамки объема изобретения.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1. Десять лучших результатов поиска, полученных с помощью ВЬА8Т в неизбыточной базе данных NСВI с использованием последовательности 8Е0 ΙΌ N0:24 (полноразмерной последовательности белка ГН8Р141).
Фиг. 2. Сопоставление путем выравнивания, проводимого с помощью ВЬА8Т с использованием последовательности 8Е0 ΙΌ N0:52 (полноразмерной последовательности белка ЕЫ8Р142) и пяти лучших совпадений.
Фиг. 3. Десять лучших результатов поиска, полученных с помощью ВЬА8Т в неизбыточной базе данных NСВI с использованием последовательности 8Е0 ΙΌ N0:90 (полноразмерной последовательности белка ЕН8Р143).
Фиг. 4. Десять лучших результатов поиска, полученных с помощью ВЬА8Т в неизбыточной базе данных NСВI с использованием последовательности 8Е0 ΙΌ N0:126 (полноразмерной последовательности белка ЕЫ8Р144).
- 38 013251
Фиг. 5. Выравнивание кодирующих экзонов Ш8Р141, Ш8Р142, Ш8Р143 и Ш8Р144.
Фиг. 6. Выравнивание ОРС Ш8Р141, Ш8Р142, Ш8Р143, Ш8Р144; Р259А в Ш8Р142 затушеван.
Фиг. 7. Выравнивание нуклеотидов Ш8Р141, Ш8Р142, Ш8Р143, Ш8Р144: прописными буквами обозначена кодирующая последовательность; строчными буквами обозначены нетранслируемые области.
Фиг. 8. Схематическое представление предсказанных и клонированных последовательностей Ш8Р141, Ш8Р142, Ш8Р143, Ш8Р144, ТМЕМ8 и СМ62.
Фиг. 9. Выравнивание аминокислот внеклеточных доменов уАЕА и АЭТ_Ю в Ш8Р141, Ш8Р142, Ш8Р143, Ш8Р144, ТМЕМ8 и СМ62. Идентичные остатки отмечены звездочкой. Присвоение вторичной структуры может быть осуществлено исходя из данных Басу е! а1. РNА8. Уо1. 101. № 17. р. 6367-6372. Пять остатков мотива МГОА8 каждого белка затушеваны. АТК1_НИМА№ NСВI Асс. № с.|9116х2. АТК2_НиМА№ NСВI Асс. № Р58335.
Таблица 1
Аминокислота Синонимичные группы Более предпочтительные
синонимичные з группы
Зег С1у, А1а, Зег ТЬг, Рго ТЬг, Зег
Агд Азп, Ьуз, С1п Агд, ΗΪ8 Агд, Ьуз, ΗΪ3
Ьеи РЬе, Х1е, Уа1 Ьеи, Μβί Не, Уа1, Ьеи МеС
Рго С1у, А1а, Зег ТЬг, Рго Рго
ТЬг С1у, А1а, Зег ТЬг, Рго ТЬг, Зег
А1а с1у, ТЬг, Рго А1а, Зег С1у, А1а
Уа1 МеЪ, РЬе, 11е Ьеи, Уа1 Μθί, Не, Уа1 Ьеи
С1у А1а, ТЬг, Рго Зег, С1у 61у, А1а
Не РЬе, Не, Уа1 Ьеи, Мес Пе, Уа1, Ьеи Мес
РЬе Тгр, РЬе, Туг Туг, РЬе
Туг Тгр, РЬе, Туг РЬе, Туг
Суз Зег, ТЬг, Суз Суз
ΗΪ3 Азп, Ьуз, &1п Агд, ΗΪ3 Агд, Ьуз, Н1з
61п С1и, Азп, Азр С1П Азп, С1П
АЗП С1и, Азп, Азр С1п Азп, С1п
Ьуз Азп, Ьуз, С1п Агд, Н1з Агд, Ьуз, Нхз
Азр С1и, АбП, Азр С1п Азр, С1и
С1и С1и, Азп, Азр В1П Азр, С1и
Ме£ РЬе, 11е, Уа1 Ьеи, Ме11 Не, Уа1, Ьеи Мес
Тгр Тгр, РЬе, Туг Тгр
- 39 013251
Таблица 2
Аминокислота Синонимичные группы
Зег β-Зег, ТЬг, β-ТЬг, алло-ТЬг, МеЬ, β-МеЬ, МеЬ(О), 0МеЬ(О), Ь-Суз, 0-Суз
Агд ϋ-Агд, Ьуз, β-Ьуз, гомо-Агд, β-гомо-Агд, МеЬ, Не, БМеЬ, β-Ые, Огп, β-Огп
Ьеи β-Ьеи, 7а1, В-УаЬ, АйаА, АсЬаС, Ьеи, β-Ьеи, МеЬ, β-МеЬ
Рго β-Рго, Ь-Ь-тиазолидин-4-карбоновая кислота, β- или Ь-1оксазолидин-4-карбоновая кислота
ТЬг β-ТЬг, Зег, β-Зег, алло-ТЬг, МеЬ, Β-МеЬ, МеЬ(О), БМеЬ(О), УаЬ, β-УаЬ
АЬа β-АЬа, СЬу, АЬЬ, В-А1а, Аср, Ь-Сув, β-Суз
УаЬ Б-УаЬ, Ьеи, β-Ьеи, Не, β-Ые, МеЬ, β-МеЬ, АбаА, АЫаС
61у АЬа, β-АЬа, Рго, Р-Рго, АЬЬ, бета-А1а, Аср
Не β-Ые, УаЬ, Б-Уа1, АЙаА, АдаС, Ьеи, β-Ьеи, МеЬ, Б-МеЬ
РЬе β-РЬе, Туг, β-ТЬг, Ь-допа, НЬз, β-НЬз, Тгр, β-Тгр, транс-3,4- или 5-фенилпролин, Ас1аА, АсЬаС, ыис-3,4- или 5-фенилпролин, Вра, β-Вра
Туг β-Туг, РЬе, Β-РЬе, Ь-допа, НЬз, β-НЬз
Суз Р-Суз, 5—Ме—Суз, Меь, β-Меь, ТЬг, β-ТЬг
С1п Б-С1П, Азп, β-Азп, СЬи, β-СЬи, Азр, β-Α3ρ
Азп β-Азп, Азр, β-Азр, СЬи, В-СЬи, СЬп, β-СЬп
Ьуз ϋ-Ьуз, Агд, О-Агд, гомо-Агд, Β-гомо-Агд, Мег, ϋ-Ме!:, Не, Ο-Не, Огп, О-Огп
Азр β-Азр, β-Азп, Азп, СЬи, β-СЬи, СЬп, β-СЬп
СЬи Б-С1и, β-Азр, Азр, Азп, Р-Азп, СЬп, β-СЬп
МеЬ В-МеЬ, 3--Ме—Суз, Не, В-Ые, Ьеи, β-Ьеи, УаЬ, Б-Уа1
Примеры
Пример 1. ΙΝ8Ρ141.
Полипептидной последовательностью, выведенной в результате объединения последовательностей 8ЕО ΙΌ Ν0:2, 8ЕО ΙΌ Ν0:4, 8ЕО ΙΌ Ν0:6, 8ЕО ΙΌ Ν0:8, 8ЕО ΙΌ Ν0:10, 8ЕО ΙΌ Ν0:12, 8ЕО ΙΌ Ν0:14, 8Е0 ΙΌ Ν0:16, 8Е0 ΙΌ Ν0:18, 8Е0 ΙΌ Ν0:20, 8Е0 ΙΌ Ν0:22, является последовательность 8Е0 ΙΌ Ν0:24, которая представляет собой продукт трансляции смежных экзонов ΙΝ8Ρ141. Эта полипептидная последовательность была использована в качестве запрашиваемой последовательности для ВЬА8Тр в неизбыточной базе данных NСΒI. Десять наилучших соответствий показаны на фиг. 1. Как можно видеть на фиг. 1, ΙΝ8Ρ141 является гомологичным белку-предшественнику рецептора токсина сибирской язвы.
Пример 2. ΙΝ8Ρ142.
Полипептидной последовательностью, выведенной в результате объединения последовательностей 8 ЕС) ΙΌ Ν0:26, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:28, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:30, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:32, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:34, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:36,
ЕС) ΙΌ Ν0:38, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:40, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:42, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:44, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:46, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:48,
8Е0 ΙΌ Ν0:50, является последовательность 8Е0 ΙΌ Ν0:52, которая представляет собой продукт трансляции смежных экзонов ΙΝ8Ρ142. Эта полипептидная последовательность была использована в качестве запрашиваемой последовательности для ВЬА8Тр в неизбыточной базе данных NСΒI. Десять наилучших соответствий показаны на фиг. 2. Как можно видеть на фиг. 2, ΙΝ8Ρ141 является гомологичным белкупредшественнику рецептора токсина сибирской язвы.
Пример 3. ΙΝ8Ρ143.
Полипептидной последовательностью, выведенной в результате объединения последовательностей 8 ЕС) ΙΌ Ν0:54, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:56, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:58, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:60, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:62, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:64,
ЕС) ΙΌ Ν0:66, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:68, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:70, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:72, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:74, 8 ЕС) ΙΌ Ν0:76,
8ЕС) ΙΌ Ν0:78, 8ЕС) ΙΌ Ν0:80, 8ЕС) ΙΌ Ν0:82, 8ЕС) ΙΌ Ν0:84, 8ЕС) ΙΌ Ν0:86, 8ЕС) ΙΌ Ν0:88, является последовательность 8ЕО ΙΌ Ν0:90, которая представляет собой продукт трансляции смежных экзонов
ΙΝ8Ρ143. Эта полипептидная последовательность была использована в качестве запрашиваемой последовательности для ВЬА8Тр из неизбыточной базы данных NСΒI. Десять наилучших соответствий показаны на фиг. 3. Как можно видеть на фиг. 3, ΙΝ8Ρ143 является гомологичным белку-предшественнику рецептора токсина сибирской язвы.
- 40 013251
Пример 4. ГЫ8Р144.
Полипептидной последовательностью, выведенной в результате объединения последовательностей 8 ЕС) II) N0:92, 8 ЕС) ГО N0:94, 8 ЕС) ГО N0:96, 8 ЕС) ГО N0:98, 8 ЕС) ГО N0:100, 8 ЕС) ГО N0:102, 8ЕС) ГО N0:104, 8ЕС) ГО N0:106, 8ЕС) ГО N0:108, 8 ЕС) ГО N0:110, 8ЕС) ГО N0:112, 8ЕС) ГО N0:114, 8ЕС) ГО N0:116, 8ЕС) ГО N0:118, 8ЕС) ГО N0:120, 8ЕС) ГО N0:122, 8ЕС) ГО N0:124, является последовательность 8Е0 ГО N0:126, которая представляет собой продукт трансляции смежных экзонов ГЫ8Р144. Эта полипептидная последовательность была использована в качестве запрашиваемой последовательности для ВЬА8Тр из неизбыточной базы данных NСВI. Десять наилучших соответствий показаны на фиг. 4. Как можно видеть на фиг. 4, ЕЫ8Р144 является гомологичным белку-предшественнику рецептора токсина сибирской язвы.
Пример 5. Сигнальная последовательность.
Было предсказано, что все Ш8Р141, 1И8Р142, ЕЫ8Р143 и ЕЫ8Р144 имеют сигнальный пептид, расположенный в начале белка. Сигнальная последовательность, как показано на фиг. 6, охватывает аминокислоты 1-27 (т.е. М68НЕ8Е6РУЕЕУЕЕЕЕЕЕЕРРРЬЕКА (8Е0 ГО N0:152)) полипептидной последовательности ЕЫ8Р141, ЕЫ8Р142, 1Ы8Р143 и ЕЫ8Р144. Сайт отщепления сигнального пептида локализован между остатками 27 и 28 полипептидной последовательности ЕЫ8Р141, ЕЫ8Р142, ЕЫ8Р143 и ЕЫ8Р144.
Пример 6. Предсказания наличия трансмембранных областей.
Было предсказано, что ЕЫ8Р141 и ЕЫ8Р142 представляют собой секретируемые белки, не содержащие трансмембранных областей (фиг. 6 и 7).
Было предсказано, что ЕЫ8Р143 и ЕЫ8Р144 содержат трансмембранную область (фиг. 6 и 7). В обоих ЕЫ8Р143 и ЕЫ8Р144, №конец является внеклеточным, а С-конец является внутриклеточным.
Ш8Р141 и ЕЫ8Р142, представляющие собой растворимые изоформы, могут модулировать функцию интегральных изоформ ЕЫ8Р143 и ЕЫ8Р144.
Пример 7. Результаты клонирования ЕЫ8Р141, ЕЫ8Р142 и ЕЫ8Р143-ЕС.
Ш8Р141, 1И8Р142, ЕЫ8Р143, 1Ы8Р144 представляют собой семейство вариантов сплайсинга рецептороподобной последовательности токсина сибирской язвы, который, как было предсказано, содержит домен νΨΡ-Ι/А. Все последовательности являются полноразмерными и содержат предсказанный сигнальный пептид.
[N80141, как было предсказано, имеет ОРС для 306 аминокислот (918 п.н.), кодируемых 11 экзонами. 1М8Р142, как было предсказано, имеет ОРС для 352 аминокислот (1056 п.н.), кодируемых 13 экзонами. 1М8Р143, как было предсказано, имеет ОРС для 608 аминокислот (1824 п.н.), кодируемых 18 экзонами. 1Ы8Р144, как было предсказано, имеет ОРС для 631 аминокислоты (1893 п.н.), кодируемых 17 экзонами.
Было предсказано, что ЕЫ8Р141 и ЕЫ8Р142 представляют собой секретированные белки. Было предсказано, что ЕЫ8Р143 и ЕЫ8Р144 представляют собой трансмембранные белки типа I. Клонированный внеклеточный домен ЕЫ8Р143 идентичен внеклеточному домену ЕЫ8Р144. Диаграмма выравнивания экзонов различных последовательностей представлена на фиг. 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей ОРС и клонированных последовательностей проиллюстрировано на фиг. 6. Выравнивание предсказанных нуклеотидных последовательностей проиллюстрировано на фиг. 7.
7.1. Получение человеческих матричных кДНК.
кДНК первой цепи получали из различных РНК-образцов для всех нормальных человеческих тканей (которые могут быть закуплены у фирм С1оп!есй, 8!га!адепе, АтЫоп, Вюсйат [пк111и1е и получены в лаборатории) с использованием такого фермента, обратная транскриптаза, обладающая активностью РНКазы Н-, 8ирегкспр! II (^йгодеп) в соответствии с протоколом производителей. В 1,5-мл пробирке Эппендорфа получали раствор, содержащий о11до-(бТ)15-праймер (1 мкл при 500 мкг/мл) (Рготеда), 2 мкг человеческой полноразмерной РНК, 1 мкл 10 мМ смеси 6ЭТР (10 мМ каждого из 6АТР, 66ТР, 6СТР и 6ТТР при нейтральном рН), и стерильную дистиллированную воду, добавленную до конечного объема 12 мкл.
Затем раствор нагревали до 65°С в течение 5 мин и охлаждали на льду. Содержимое пробирки собирали путем быстрого центрифугирования и добавляли 4 мкл 5Х буфера для первой цепи, 2 мкл 0,1 М ЭТТ и 1 мкл ингибитора рекомбинантной рибонуклеазы 1паке0иТ (40 единиц/мкл, ^йгодеп). После этого содержимое пробирки осторожно смешивали и инкубировали при 42°С в течение 2 мин, а затем добавляли 1 мкл (200 единиц) фермента 8ирегкспр! II и смесь осторожно перемешивали путем пипетирования. Смесь инкубировали при 42°С в течение 50 мин, а затем инактивировали путем нагревания при 70°С в течение 15 мин. Для удаления РНК, комплементарной кДНК, добавляли 1 мкл (2 единицы) РНКазы Н Е.соН (бптйгодеп) и реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Конечную реакционную смесь (21 мкл) разводили путем добавления 179 мкл стерильной воды до общего объема 200 мкл. Матричную кДНК, используемую для амплификации IN8Р141-IN8Р144, выделяли из РНК яичек.
- 41 013251
7.2. Библиотеки кДНК.
Библиотеки человеческих кДНК (в векторах бактериофага лямбда (λ)) закупали у фирмы З!га!адеие или С1ои!есй либо приготавливали в векторах λ 2АР или λ СТ 10 в Институте Зегоио Рйагтасеийса1 Кекеагсй й151Ш11е в соответствии с протоколом производителей (З!га!адеие). ДНК бактериофага λ получали из лабораторных культур инфицированного штамма хозяина Е.сой с использованием системы очистки ДНК \У|/агй Ьатййа Ргерк в соответствии с инструкциями производителей (Рготеда, Со грога! ю и, МайБои \νΙ). Библиотеки матричных кДНК, используемые для амплификации IN8Р141-IN8Р144, представляют собой библиотеки, выделенные из яичек, и смешанную библиотеку, выделенную из головного мозга-легких-яичек.
7.3. Геноспецифические клонирующие праймеры для ПЦР.
Пары ПЦР-праймеров, имеющих длину в 18-25 нуклеотидов, конструировали для амплификации предсказанной кодирующей последовательности фактической кДНК с использованием компьютерной программы для конструирования праймеров Рптег Иеыдиег Зой^аге (8с1еиййс & Ейиса!юиа1 Зой^аге, Р0 Вох 72045, Ицгйат, NС 27722-2045, ИЗА). ПЦР-праймеры были оптимизированы так, чтобы их Тт была близкой к 55±10°С, а содержание СС составляло 40-60%. Были отобраны праймеры, обладающие высокой селективностью к последовательности-мишени (ГЫЗР141), при этом неспецифическое праймирование было незначительным или вообще отсутствовало.
7.4. ПЦР-амплификация семейства INЗР141-INЗР144 из человеческих матричных кДНК.
Геноспецифические клонирующие праймеры (ГЫЗР141-СР1 и ГЫЗР141-СР2, табл. 3 и фиг. 7) конструировали для амплификации кДНК-фрагмента размером 985 п.н., который охватывал все предсказанные кодирующие последовательности ГЫЗР141. Указанную пару праймеров использовали вместе с образцами кДНК человеческих яичек и библиотек кДНК в качестве ПЦР-матриц. ПЦР проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 1Х буфер Н1дй Е1йе11!у (ΗίΕί) Р1айиит® Тад, 2 мМ МдЗ04, 200 мкМ йЭТР, 0,2 мкМ каждого клонирующего праймера, 1 единицу ДНК-полимеразы Н1дй Е1йе1йу (ΗίΕί) Р1айиит® Тад Циуйгодеи), приблизительно 20 нг матричной кДНК и 0Х или 1Х раствора для стимуляции ПЦР (Ыуйгодеи).
ПЦР проводили на аппарате М1 Кекеагсй ЭХА Еидте, запрограмированном в следующем режиме: 94°С, 2 мин; 40 циклов при 94°С, 30 с, 57°С, 30 с и 68°С, 1 мин 30 с, а затем 1 цикл при 68°С в течение 8 мин и цикл выдерживания при 4°С.
мкл каждого продукта амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1Х ТАЕ-буфере (Шуйгодеи). В ПЦР-продуктах, амплифицированных из библиотеки матричных кДНК яичек, наблюдались продукты, имеющие приблизительно предполагаемую молекулярную массу. Эти продукты выделяли из геля с использованием системы для очистки ДНК Ц1адеи, МтЕйПе ЭНА Риййсайои ЗуЧет (Ц1адеи), элюировали в 10 мкл ЕВ-буфера (10 мМ Трис-НС1, рН 8,5) и сразу субклонировали.
7.5. Субклонирование ПЦР-продуктов.
ПЦР-продукты субклонировали в клонирующий вектор, модифицированный топоизомеразой Ι (рСК4-Т0Р0), с использованием набора для клонирования ТА, поставляемого фирмой Ыуйгодеи Согрогайои, в условиях, рекомендованных производителями. Вкратце, 4 мкл гельочищенного ПЦРпродукта инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с 1 мкл вектора ТОРО и 1 мкл солевого раствора. Затем штамм ТОР10 Е.сой (Шуйгодеи) трансформировали реакционной смесью следующим образом: 50-мкл аликвоту однократной дозы клеток ТОР10 оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси ТОРО. После этого смесь инкубировали в течение 15 мин на льду, а затем подвергали тепловому шоку путем инкубирования при 42°С строго в течение 30 с. Образцы возвращали на лед и добавляли 250 мкл теплой (комнатной температуры) среды З0С. Образцы инкубировали при встряхивании (220 об/мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем трансформированную смесь высевали на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.
7.6. Получение и секвенирование плазмидной ДНК.
Ряд колоний инокулировали в 5 мл Ь-бульона (ЬВ), содержащего ампициллин (100 мкг/мл), и культивировали в течение ночи при 37°С со встряхиванием при 220 об/мин. Мини-препарат плазмидной ДНК получали из 5 мл культуры с использованием роботизированной системы Вюгойо! 8000 (Ц1адеи) или набора νίζηΓά Рй.15 ЗУ М1шргер8 (Рго те да са!. № 1460) в соответствии с инструкциями производителя. Плазмидную ДНК элюировали в 80 мкл стерильной воды. Концентрацию ДНК измеряли на фотометре Зрес!гатах 190 (Мо1еси1аг Иеуюек). Плазмидную ДНК (200-500 нг) подвергали секвенированию с помощью праймера Т3 с использованием системы терминации цепи красителем В1дИуе (В1дПуе-Тегт1па!ог) (АрШей Вю^уЧепъ са!. № 4390246) в соответствии с инструкциями производителей. Последовательность праймера представлена в табл. 3. Реакционные смеси для секвенирования очищали на колонках с Иуе-Ех (Ц1адеи) или на планшетах для очистки Мои!аде ЗЕО 96 (Мййроге са!.№ БЗКЗ09624), а затем анализировали на секвенаторе Аррйей Вюкуйетк 3700.
- 42 013251
Анализ последовательности выявил клон, который соответствовал ожидаемой последовательности ΙΝ8Ρ142 в амплифицированной области. Выравнивание нуклеотидных последовательностей ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142 и ΙΝ8Ρ143 проиллюстрировано на фиг. 7. Указанная последовательность содержала замену Р259А, которая, вероятно, является следствием ошибки ПЦР. Эта последовательность (1035 п.н.) не была полноразмерной кодирующей последовательностью ΙΝ8Ρ142, что обусловлено положениями ПЦРпраймеров. Последовательность клонированного кДНК-фрагмента представлена на фиг. 7. Клонированный ПЦР-продукт находится в плазмиде рСΚ4-ΤОΡО-IN8Ρ142 (усеченной).
7.7. Конструирование кодирующих последовательностей ΙΝ8Ρ141 и внеклеточного домена ΙΝ8Ρ143 (ЕС) с помощью ПЦР.
Пара праймеров для ПЦР-амплификации (ΙΝ8141-ΛΡ1 и IN8Ρ141-АР2, табл. 3 и фиг. 7) была сконструирована для повторной амплификации части последовательности ΙΝ8Ρ142, клонированной в плазмиде рСЯ4-ΤОΡО-IN8Ρ142 (усеченной), которая является общей для кодирующих последовательностей ΙΝ8Ρ141 и ΙΝ8Ρ142, и одновременного добавления самых крайних 3'-концевых IN8Ρ141-специфических 23 п.н. к 3'-концу данного продукта. Был также сконструирован дополнительный ПЦР-праймер (ΙΝ8Ρ143-ΛΡ1, табл. 3 и фиг. 7) для использования вместе с ΙΝ8Ρ141-ΛΡ1 в целях повторной амплификации части последовательности ΙΝ8Ρ142, клонированной в плазмиде рСЯ4-ΤОΡО-IN8Ρ142 (усеченной) и являющейся общей для кодирующих последовательностей ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ142, и одновременного добавления самых крайних 3'-концевых IN8Ρ143-специфических 21 п.н. к 3'-концу данного продукта. Пары праймеров IN8Ρ141-АΡ1/IN8Ρ141-АΡ2 и ΙΝ8Ρ141-ΛΡ1/ΙΝ8Ρ143-ΛΡ1 использовали вместе с плазмидой рСΚ4-ΤОΡО-IN8Ρ142 (усеченной) в качестве ПЦР-матрицы в конечном объеме 50 мкл, содержащем 1Х буфер Нщ11 Ε^άе1^ίу (ΗίΕί) Ρ1аΐ^ηυт® Της, 2 мМ Μ§δΟ4, 200 мкМ άΝΤΡ, 0,2 мкМ каждого праймера для амплификации, 1 единицу ДНК-полимеразы Н1дй Ε^άе1^ίу (ΗίΕί) Ρ1аΐ^ηυт® Τπς (^йгодеп), приблизительно 300 нг плазмидной кДНК и 0Х, 0,5Х, 1Х или 2Х раствора для стимуляции ПЦР (ЗпуЦгодеп).
ПЦР проводили на аппарате Μ1 Кекеагсй ΌΝΛ Епдте, запрограмированном в следующем режиме: 94°С, 2 мин; 30 циклов - 94°С, 30 с, 68°С, 1 мин 30 с, а затем 1 цикл при 68°С в течение 7 мин и цикл выдерживания при 4°С.
Все 50 мкл каждого продукта для амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1Х ТАЕ-буфере (Зпуйгодеп). Продукты, имеющие приблизительно предполагаемую молекулярную массу, выделяли из геля с использованием системы для очистки ДНК ΡΐΌίικβπ νί/агй® ΡίΤ Игерз ΌΝΛ Ρυ^^ί^саί^οη ЗуДет, элюировали в 50 мкл воды и сразу субклонировали.
Таблица 3
Клонирующие и секвенирующие праймеры для доменов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142 и ΙΝ8Ρ143^
Праймер Последовательность (5'-3')
1ЫЗР141-СР1 СТС АСА ССС АСА ССС АСА ТА (ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 153)
1ЫЗР141-СР2 ест ест сат ест сас атт сс (зео ю N0: 154)
ΙΝ3Ρ141-ΑΡ1 АТС ССС АСС САТ САС ТСС СТС ССС ССС ТАС ТТС СТС (ЗЕО Ю ΝΟ: 155)
ΙΝ3Ρ141-ΑΡ2 АСС ТСА СТТ САА ТАС АСТ АСТ ССС ААТ САТ АСТ ССТ ТТС АТТ САА СА (ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 156)
ΙΝ3Ρ143-ΑΡ1 ССС САА ААТ ССС АСА ТСТ ССТ ССТ ССТ САТ ССТ САС АТТ ССТ СТТ С (5Е0 Ιϋ ΝΟ: 157)
21М13 ТСТ ААА АСС АСС ССС АСТ (ЗЕО Ю ΝΟ: 158)
М13ВЕУ САС САА АСА ССТ АТС АСС (ЗЕО Ю ΝΟ: 159)
Т7 ТАА ТАС САС ТСА СТА ТАС С (ЗЕО Ю ΝΟ: 160)
тз АТТ ААС ССТ САС ТАА АСС (ЗЕО Ю ΝΟ: 161)
7.8. Субклонирование ПЦР-продуктов.
ПЦР-продукты субклонировали в клонирующий вектор, модифицированный топоизомеразой Ι (рСКД-ΤΟΡΟ), с использованием набора для клонирования ТА, поставляемого фирмой ИчуЦгодеп Согрогайоп, в условиях, рекомендованных производителями. Вкратце, 4 мкл гельочищенного ПЦР-продукта инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с 1 мкл вектора ТОРО и 1 мкл солевого раствора. Затем штамм ТОР10 Е.сой (Зпуйгодеп) трансформировали реакционной смесью следующим образом: 50-мкл аликвоту однократной дозы клеток ТОР 10 оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси ТОРО. После этого смесь инкубировали в течение 15 мин на льду, а затем подвергали тепловому шоку путем инкубирования при 42°С строго в течение 30 с. Образцы возвращали на лед и добавляли 250 мкл теплой (комнатной температуры) среды 8ОС. Образцы инкубировали при встряхивании (220 об/мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем трансформированную смесь высевали на планшеты с
- 43 013251
Ь-бульоном (ЬВ), содержащим ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.
7.9. ПЦР колоний.
Колонии инокулировали в 50 мкл стерильной воды с помощью стерильной зубочистки. Затем 10-мкл аликвоту инокулята подвергали ПЦР в полном объеме реакционной смеси 20 мкл, содержащем 1Х буфер АтрйТад™, 200 мкМ ёХГР, 20 пмоль праймера Т7, 20 пмоль праймера Т3 и 1 единицу АтрКТад™ (АрШеё Вюкук!етк) на аппарате М1 Векеагсй ЭНА Епдте.
Циклы ПЦР-реакции осуществляли в следующем режиме: 94°С, 2 мин, 30 циклов при 94°С, 30 с, 48°С, 30 с и 72°С в течение 2 мин. Затем образцы оставляли при 4°С (цикл выдерживания) до проведения последующего анализа.
ПЦР-продукты анализировали на 1% агарозном геле в 1Х ТАЕ-буфере. Колонии, которые давали ПЦР-продукты, имеющие приблизительно ожидаемую молекулярную массу (918 п.н. для ΙΝ8Ρ141 или 1056 п.н. для ΙΝ3Ρ143 + 105 п.н., т.е. с учетом сайта множественного клонирования (МСЗ)), культивировали в течение ночи при 37°С в 5 мл Ь-бульона (ЬВ), содержащего ампициллин (100 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об/мин.
7.10. Получение и секвенирование плазмидной ДНК.
Мини-препарат плазмидной ДНК выделяли из 5 мл культуры с использованием роботизированной системы ВюгоЬо! 8000 (фхадец) или набора νί/агё Ρ1υκ 8У М1шргерк (Гготеда са!. № 1460) в соответствии с инструкциями производителя. Плазмидную ДНК элюировали в 80 мкл стерильной воды. Концентрацию ДНК измеряли на фотометре Зресйатах 190 (Мо1еси1аг Эеткек). Плазмидную ДНК (200-500 нг) подвергали секвенированию с помощью праймеров Т3 с использованием системы терминации цепи красителем ВщЭуе (В1дОуе-Тегтта!ог) (Аррйеё В1окук!етк са!. № 4390246) в соответствии с инструкциями производителей. Последовательность праймера представлена в табл. 3. Реакционные смеси для секвенирования очищали на колонках с Эуе-Ех (^^адеи) или на планшетах для очистки МоШаде ЗЕф 96 (М1Шроге са!. № Ь8К809624), а затем анализировали на секвенаторе Аррйеё В1окук!етк 3700.
Анализ последовательности выявил клон, который соответствовал ожидаемой кодирующей последовательности ΙΝ8Ρ141. Указанная последовательность содержала замену Р259А, которая присутствовала в ПЦР-матрице. Последовательность клонированного кДНК-фрагмента представлена на фиг. 7. Плазмидная карта клонированного ПЦР-продукта представляет собой рСВ4-ТОΡО-IN8Ρ141. Был идентифицирован второй клон, который соответствовал ожидаемой кодирующей последовательности домена IN8Ρ143-ΕС. Указанная последовательность также содержала замену Р259А, которая присутствовала в ПЦР-матрице. Последовательность клонированного кДНК-фрагмента представлена на фиг. 7. Плазмидная карта клонированного ПЦР-продукта представляет собой рСВ4-ТОΡО-IN8Ρ143-ΕС.
Пример 8. Экспрессия и очистка ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144.
Могут быть проведены дополнительные эксперименты для того, чтобы определить распределение и уровни экспрессии полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 в тканях ίη у1уо, исходя из описанных здесь нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.
Присутствие транскриптов для ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 может быть установлено с помощью ПЦР кДНК различных человеческих тканей. Транскрипты ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 могут присутствовать в тестируемых образцах на очень низких уровнях. Поэтому при разработке экспериментов для детектирования присутствия транскрипта в различных человеческих тканях необходимо соблюдать крайнюю осторожность, поскольку даже небольшое количество геномных примесных включений в РНК-препарате может давать ложноположительный результат. Таким образом, перед проведением реакции обратной транскрипции вся РНК должна быть обработана ДНКазой. Кроме того, для каждой ткани может быть проведена контрольная реакция, в которой указанная ткань не подвергается обратной транскрипции (контроль без ОТ).
Так, например, для генерирования кДНК с использованием обратной транскриптазы МиШкспр! (АВЦ и неспецифических гексамерных праймеров может быть взят 1 мкг полноразмерной РНК от каждой ткани. Для каждой ткани проводили контрольную реакцию, в которую добавляли все компоненты, за исключением обратной транскриптазы (контроль без ОТ). Для каждой ткани проводили ПЦР-реакции на образцах обратно транскрибируемой РНК и контрольные реакции без ОТ. ΙΝ8Ρ141-, ΙΝ8Ρ142-, ΙΝ8Ρ143и IN8Ρ144-специфические праймеры могут быть легко сконструированы исходя из полученных здесь данных о последовательностях. Присутствие продукта с соответствующей молекулярной массой в образце с обратной транскриптазой, а также отсутствие продукта в контрольном образце без ОТ могут свидетельствовать о присутствии транскрипта в этой ткани. Для скрининга на транскрипты ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 могут быть использованы не только вышеописанные библиотеки, но также и любые подходящие библиотеки кДНК.
Характер распределения полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 в ткани дает дополнительную ценную информацию о функции этих полипептидов.
Кроме того, могут быть проведены дополнительные эксперименты с использованием подходящих экспрессирующих векторов. Так, например, Са!е^ау-экспрессирующие клоны дОЕЗ^З^-ШЗ?^6Ш8-У1 и рΕАК12ё_IN8Ρ141-6НI8-У1 были генерированы для ΙΝ8Ρ141. Последние 23 п.н. клонирую- 44 013251 щего праймера Кеу присоединяли к 3'-концу кодирующих последовательностей ΙΝδΡ141 на предварительно амплифицированной последовательности (которой является альтернативный вариант сплайсинга). Плазмида ΕΝΤΚΥ представляет собой ρΕΝΤΚ_ΙΝ8Ρ141-6ΗΙ8-ν1. Са1е^ау-экспрессирующие клоны ρΕАΚ12й_INδΡ143-ΕС-6ΗIδ-V1 и ρϋΕ8Τ12ά_ΙΝ8Ρ143-Ε^6ΗΙ8-ν1 были генерированы для П\т43-ЕС. Последние 21 п.н. клонирующего праймера Кеу присоединяли к 3'-концу кодирующих последовательностей ΙΝ8Ρ143 на предварительно амплифицированной последовательности (которой является альтернативный вариант сплайсинга). ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 имеют общую клонированную внеклеточную область (ΙΝδΡ153-ΕΟ=ΙΝδΡ154-ΕΟ. Плазмида Ειιΐιχ представляет собой ρ^ΟNΚ-Ζеο_INδΡ143-ΕС-6ΗIδ-V1.
Трансфекция клеточных линий млекопитающих этими векторами может обеспечивать высокий уровень экспрессии белков ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144 и, таким образом, позволяет продолжить исследование функциональных свойств полипептидов ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 и ΙΝ8Ρ144. Подходящие примеры материалов и методов, применяемых в таких экспериментах, описаны ниже.
Клеточная культура.
Клетки почек человеческого эмбриона 293, экспрессирующие ядерный антиген вируса ЭпштейнаБарра (ΗΕΚ 293-ΕВNА, Шуйгодеи), поддерживали в суспензии бессывороточной среды Ех-клеток νΡΚΟ (посевной материал, поддерживающая среда, ШН). За 16-20 ч до трансфекции (день 1), клетки высевали в 2х Т225-колбы (50 мл на колбу в ΌΜΕΜ/Ρ12 (1:1), содержащей посевную среду с 2% РВ8 (1КН) при плотности 2х105 клеток/мл)). На следующий день (день трансфекции 0) проводили трансфекцию с использованием реагента ΚίΡΕΙΤΜ (2 мкл/мкг плазмидной ДНК, Ρο1уΡ1и8-трансфекция). Для каждой колбы плазмидную ДНК трансфецировали вместе с ДНК СРΡ (флуоресцентного репортерного гена). Затем смесь для трансфекции добавляли в 2х Т225-колбы и инкубировали при 37°С (5% СО2) в течение 6 дней. Подтверждение позитивной трансфекции может быть проведено путем качественной оценки флуоресценции на день 1 и день 6 (Ахюуей 10 Ζе^55).
На 6-й день (день сбора) супернатанты из двух колб объединяли и центрифугировали (например, при 4°С, 400хд), а затем помещали в сосуд, содержащий уникальный идентификатор. Одну аликвоту (500 мкл) брали для проведения качественной оценки (ОС) для 6Н18-меченного белка (ОС внутреннего биопроцессинга).
Крупные партии могут быть продуцированы в соответствии с протоколом, называемым ΡΕΙ-трансфекция суспензионных клеток и обозначенным ВΡ/ΡΕI/ΗΗ/02/04, где в качестве агента для трансфекции использовали полиэтиленимин от Ρο1у8с^еисе8.
Способ очистки.
Образец культуральной среды, содержащий рекомбинантный белок с С-концевой 6Н18-меткой, разводили холодным буфером А (50 мМ Να^ΡΟ^ 600 мМ №С1; 8,7% (мас./об.) глицерина, рН 7,5).
Затем образец фильтровали через стерильный фильтр (М1Шроге) и выдерживали при 4°С в стерильном сосуде среднего размера (№11деие).
Очистку осуществляли при 4°С на рабочей станции νΙδΙΟΝ (Аррйей Вю8у81:ет8), подсоединенной к автоматическому устройству для загрузки образцов (ЪаЬотайс). Процедура очистки состояла из двух последовательных стадий, т.е. стадии проведения металлоаффинной хроматографии на колонке с Ρο^ο8 20 МС (Аррйей Вю8у81:ет8), загруженной ионами Νί (4,6х50 мм, 0,83 мл), а затем гель-фильтрации на колонке (1,0х10 см) со средой, содержащей сефадекс С-25 (Атегайат ΡΙκιπηηάΗ).
Для проведения первой стадии хроматографии металлоаффинную колонку регенерировали 30 колоночными объемами раствора ΕΌΤΛ (100 мМ ΕΌΤΛ; 1М №С1; рН 8,0), снова загружали ионы Νί путем промывки 15 колоночными объемами 100 мМ раствора ΝίδΟ4, после чего колонку промывали 10 колоночными объемами буфера А, а затем 7 колоночными объемами буфера В (50 мМ Να^ΡΟ^ 600 мМ ИаС1; 8,7% (мас./об.) глицерина, 400 мМ имидазола; рН 7,5) и, наконец, уравновешивали 15 колоночными объемами буфера А, содержащего 15 мМ имидазола. Образец переносили с помощью устройства для загрузки образцов ЬаЬотаИс в 200-мл петлю для образца, а затем загружали на аффинную колонку с металлическим Νί при скорости потока 10 мл/мин. После этого колонку промывали 12 колоночными объемами буфера А, а затем 28 колоночными объемами буфера А, содержащего 20 мМ имидазола. Во время промывки 20 мМ имидазолом, непрочно связанные примесные белки элюировались с колонки. И, наконец, рекомбинантный Нй-меченный белок элюировали 10 колоночными объемами буфера В при скорости потока 2 мл/мин и элюированный белок собирали.
Для проведения второй стадии хроматографии гель-фильтрационную колонку с сефадексом С-25 регенерировали 2 мл буфера Ό (1,137 М №С1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ ΚΉ2ΡΟ4; 8 мМ Να^ΡΟ/ΐ; рН 7,2), а затем уравновешивали 4 колоночными объемами буфера С (137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ ΚΉ2ΡΟ4; 8 мМ Να^ΡΟ/ΐ; 20% (мас./об.) глицерина; рН 7,4). Фракцию пика, элюированную с Νί-колонки, автоматически загружали на колонку с сефадексом С-25 с помощью многофункционального устройства для загрузки образцов, подсоединенного к аппарату νΙδΙΟΝ, и белок элюировали буфером С при скорости потока 2 мл/мин. Эту фракцию фильтровали через стерильный центрифужный фильтр (Мййроге), замораживали и хранили при -80°С. Аликвоту данного образца анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (в 4-12% геле NиΡАСΕ; №гех) путем проведения Вестерн-блоттинга с использованием ан
- 45 013251 ти-Н15 антител. Гель NиΡАСЕ может быть окрашен в растворе для окрашивания, содержащем 0,1% кумасси синего В250 (30% метанол, 10% уксусная кислота), при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем обесцвечивали в 20% метаноле, 7,5% уксусной кислоте до тех пор, пока фон не становился прозрачным, а полосы белка не становились видимыми.
После электрофореза белки подвергали электрофоретическому переносу из геля на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану блокировали 5% сухим молоком в буфере Е (137 мМ №С1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ ΚΗ2Ρ04; 8 мМ №2ΗΡ04; 0,1% твина 20, рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали со смесью 2 кроличьих поликлональных анти-Н15 антител (С-18 и Н-15, 0,2 мкг/мл каждого; ЗагИа С'гих) в 2,5% сухом молоке в буфере Е в течение ночи при 4°С. После инкубирования в течение еще 1 ч при комнатной температуре мембрану промывали буфером Е (3x10 мин), а затем инкубировали со вторым ПХ-конъюгированным антикроличьим антителом (ΌΑΚ0, ΗΒΡ 0399), разведенным 1/3000 в буфере Е, содержащем 2,5% сухое молоко, в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки буфером Е (3x10 мин) мембрану проявляли в течение 1 мин с помощью ЭХЛ-набора (Ашегййаш, Ρйа^тас^а). Затем мембрану экспонировали с пленкой НурегШш (Ашегййаш Ρйа^тас^а), пленку проявляли и снимок вестерн-блота визуально анализировали.
В образцах, в которых были обнаружены полосы детектируемого белка благодаря окрашиванию кумасси синим, концентрация белка может быть определена с применением набора для анализа белка ВСА ^етее) с использованием сывороточного альбумина в качестве стандарта.
Кроме того, сверхэкспрессия или отсутствие экспрессии полипептидов в клеточных линиях могут быть использованы для определения влияния на активацию транскрипции генома клетки-хозяина. Партнеры по димеризации, коактиваторы и корепрессоры полипептида ΙΗ8Ρ141, INЗΡ142, Ι^ΡΜ.Ι и INЗΡ144 могут быть идентифицированы путем иммунопреципитации, проводимой вместе с Вестернблоттингом, и иммунопреципитации, проводимой вместе с масс-спектроскопией.
Пример 9. Анализы для оценки Т-лимфоцитарных ответов.
Гибель Т-клеток, индуцированная Рай-лигандом.
Этот анализ позволяет выявить новые модуляторы опосредуемой рецепторами клеточной гибели.
В этом анализе Т-клеточный апоптоз был индуцирован путем стимуляции клеток 1игка1 (человеческой Т-клеточной линии) рекомбинантным 6Н1й-меченным Рай-лигандом, объединенным с моноклональным анти-6-Ый антителом. Гибель клеток количественно оценивали по высвобождению БОН, цитоплазматического фермента, высвобождаемого в культуральную среду при гибели клеток. Результаты считывали с помощью колориметрического анализа при 490 нм. Было показано, что Т-клетки являются патогенными при многих аутоиммунных заболеваниях, а поэтому регуляция антигенспецифической гибели Т-клеток представляет собой терапевтическую стратегию (например, применяемую для лечения пациентов с болезнью Крона с использованием анти-ТДР-а антитела).
Реакция человеческих лимфоцитов в смешанной культуре (й-МБВ): пролиферация клеток и секреция цитокинов.
В этом клеточном анализе измеряли влияние новых белков на пролиферацию лимфоцитов и секрецию или ингибирование цитокинов после стимуляции МКПК, взятыми от другого донора (аллореактивность). В этих анализах оценивали функции антигенспецифических Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток, которые играют важную роль в клеточных ответах при любых аутоиммунных заболеваниях. Секретированные цитокины (ΙΕ-2, 4, 5, 10, Т№-а и ШЫ-у) количественно оценивали с помощью СВА.
Примечание. Пролиферация клеток и секреция цитокинов представляют собой независимые ответы.
Реакция мышиных лимфоцитов в смешанной культуре (ш-МБВ): пролиферация клеток.
В этом клеточном анализе оценивали влияние новых белков на пролиферацию лимфоцитов или ингибирование мышиных клеток селезенки после стимуляции клетками селезенки, взятыми от другого донора (мышиного штамма). В этом клеточном анализе оценивали влияние новых белков на Т-лимфоцитарные ответы и антигенпрезентирующие клеточные ответы и полученные данные использовали для подтверждения положительных результатов и идентичных соответствий в й-МБВ-анализах. Этот анализ может быть использован для отбора белков, которые тестируют на мышиной модели человеческих заболеваний.
Человеческие МКПК, стимулированные суперантигеном, ТЗЗТ.
Суперантигены представляют собой сильные модуляторы иммунной системы, влияющие на Т-клетки. Суперантигены влияют на иммунологически опосредуемые расстройства, такие как ВЗК, и воспалительные кожные заболевания, такие как атопический дерматит и псориаз. В этом клеточном анализе исследование, проводимое авторами настоящего изобретения, было конкретно направлено на активацию Т-лимфоцитов посредством ТСВ, но в других условиях, отличающихся условий продуцирования Т-клеточного ответа на классические антигены, в частности, на костимулирующие молекулы.
- 46 013251
Человеческие МКПК, стимулированные сопА или РНА.
В этих клеточных анализах оценивали влияние новых белков на секрецию цитокинов, индуцируемую двумя различными раздражителями, действующими на различные клетки, как было определено в анализе, проводимом с использованием массива сфер с цитокинами (СВА) (ΙΕ-2, ΙΕΝ-γ, ΤΝΡ-α, ΙΕ-5, +-4 и +-10).
Большинство цитокинов могут обладать двойным действием, про- или противовоспалительным действием, в зависимости от повреждения, среды и типа клетки-мишени. Любой белок, обладающий способностью модулировать секрецию цитокинов, может обладать терапевтическим потенциалом (например, снижение уровня ΙΡΝ-γ и ΤΝΡ-α может оказаться благоприятным при лечении Τ111опосредуемого аутоиммунного заболевания, тогда как снижение уровня +-4, +-5, может оказаться благоприятным при лечении Τк2-опосредуемых заболеваний, а индуцирование ΙΠ-10 может представлять особый интерес при лечении ΡС и СКВ).
Анализы для оценки моноцитарного/макрофагального и гранулоцитарного ответов.
Человеческие МКПК, стимулированные ЛПС.
В этом клеточном анализе оценивали влияние новых белков на секрецию цитокинов (ΙΓΝ-γ, ΤΝΈ-α), индуцированных действием ЛПС на моноциты/макрофаги и гранулоциты.
Любой белок, обладающий способностью модулировать секрецию ΙΤΝ-γ и ΤΝΈ-α, может давать благоприятный эффект при лечении Τк1-опосредуемых аутоиммунных заболеваний.
Анализы для оценки нейтрофильных ответов.
Нейтрофилы играют важную роль в патогенезе воспалительных и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит. Хемоаттрактанты лейкоцитов, такие как +-8, инициируют каскад реакций адгезивных взаимодействий между клетками и микрососудистым эндотелием, что приводит к активации, адгезии и, в конечном счете, к миграции нейтрофилов. Инфильтрация нейтрофилов в ткань зависит от реорганизации элеменов цитоскелета, ассоциированных с конкретными изменениями морфологии этих клеток.
Этот клеточный анализ проводят для измерения влияния новых белков на реорганизацию человеческих нейтрофилов в цитоскелете.
Анализы для оценки В-лимфоцитарных ответов.
Считается, что аутоантитела, а также инфильтрация В-клеток играют важную роль в патогенезе различных аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный артрит (ΡΑ), синдром Сьегрена и тяжелая миастения. Полученные уникальные данные показали, что нарушение регуляции гомеостаза В-клеток может негативно влиять на иммунотолерантность, что может приводить тем самым к нежелательному выживанию аутореактивных В-клеток, продуцирующих патогенные антитела и поддерживающих воспалительные процессы. Идентификация новых факторов, которые играют важную роль в регуляции пролиферации, выживании и дифференцировки В-клеток после стимуляции В-клеточного рецептора, имеет важное значение при разработке новых способов лечения.
Пролиферация В-клеток.
В этом клеточном анализе оценивали влияние новых белков на выживание В-клеток. Костимуляция В-клеток.
В этом клеточном анализе оценивали влияние новых белков на костимуляцию В-клеток.
Анализы для оценки моноцитарных и микроглиальных ответов.
Поток кальция в ТНР-1.
Поток Са+ в ΤΗΡ1-клеточном анализе измеряют для оценки влияния новых белков на их способность стимулировать высвобождение внутриклеточного кальция (общие события продуцирования вторичного мессенджера) из эндоплазматического ретикулума.
Пролиферация микроглиальных клеток.
Известно, что в процессе пролиферации предшественников микроглиальных клеток ключевую роль играют различные колониестимулирующие факторы, включая некоторые цитокины. Из них цитокин М-С8Е играет важную роль в конечной стадии созревания макрофагов/микроглиальных клеток и не может быть заменен никаким другим фактором. Оценка этого биологического ответа может дать определенную информацию о влиянии микроглиальной активности, а поэтому позволит идентифицировать молекулы, оказывающие благоприятное действие при лечении ΡΟ
Был разработан клеточный анализ для оценки пролиферативного ответа микроглиальной клеточной линии на М-С8Е. Этот анализ дал оптимальные результаты с точки зрения целесообразности и надежности его осуществления. Указанный анализ проводили в 96-луночных планшетах с использованием нерадиоктивного субстрата, и этот анализ может быть легко автоматизирован.
- 47 013251
Пример 10. Анализ на уровни экспрессии гена ΙΝ8Ρ142 с помощью ПЦР в реальном времени ПадМаи).
Полноразмерную РНК от каждого образца подвергали обратной транскрипции с использованием системы синтеза первой цепи для ОТ-ПЦР 8ирсгкспр1 ΙΙΙ (Ιηνίίτο^η, Са!. № 18080-051) в конечном реакционном объеме 20 мкл. 2 мкг полноразмерной РНК объединяли с 50 нг рандомизированных гексамерных праймеров, 10 мМ каждого из 6ΑΤΡ, 6ΟΤΡ, 6ί.’ΤΡ и 6ΤΤΡ и с ^ΕΡС-обработанной водой в объеме 10 мкл. Смесь инкубировали при 65°С в течение 5 мин, а затем охлаждали на льду в течение 1 мин. В отдельной пробирке получали 10 мкл нижеследующей смеси для синтеза кДНК: 2 мкл 10Х ΒΤ-буфера, 4 мкл 25 мМ МдС12, 2 мкл 0,1 М ΌΤΤ, 1 мкл РНКазы Β^^ΟυΤ™ (40 единиц/мкл) и 1 мкл фермента ОТ 8ирсгкспр!™ ΙΙΙ (200 единиц/мкл). Смесь для синтеза кДНК добавляли к смеси РНК/праймер, слегка помешивали и инкубировали при 25°С в течение 10 мин, а затем при 50°С в течение 50 мин. Затем фермент ОТ инактивировали путем инкубирования при 85°С в течение 5 мин. Смесь охлаждали на льду, а затем добавляли 1 мкл РНКазы Н Εχο1ί (2 единицы/мкл) и смесь инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Смесь охлаждали на льду, а затем разводили 1/250 стерильной водой. Затем разведения реакционной смеси обратной транскриптазы анализировали с помощью ПЦР в реальном времени на аппарате Τа^Μаη (ΡΕ ВюкуЧетк 7700). Праймеры для проведения ПЦР человеческого ΙΝ8Ρ142 и глицеральдегид-3фосфат-дегидрогеназу (контроль: гены домашнего хозяйства, ΟΑΡΌΗ) конструировали с использованием программы для экспрессии праймеров Ριμογ Ехргскк (ΡΕ ВюкуЧетк). Прямой праймер конструировали в экзоне 11. Обратный праймер конструировали в области, охватывающей пограничную область между экзоном 12 и 13. Этот праймер должен идентифицировать ΙΝ8Ρ142 от ΙΝ8Ρ141, но не от ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144.
Последовательности праймеров представлены в табл. 4. Специфичность и оптимальную концентрацию праймеров, используемых в анализе Τа^Μаη, определяли путем тестирования праймеров ΙΝ8Ρ142 на серии разведений плазмиды ρΕΛК12б-IN8Ρ142-6Н^к. Возможные примеси геномной ДНК в кДНК исключали путем проведения ПЦР-реакций с использованием праймеров, специфичных к интронной СΛΡ^Н-последовательности. Отсутствие неспецифической амплификации контролировали путем проведения анализа ПЦР-продуктов на 4% агарозном геле для гарантии продуцирования одной полосы с ожидаемой молекулярной массой.
ПЦР в реальном времени с применением соединения 8ΥΒΒ, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, осуществляли в объеме 50 мкл реакционной смеси, содержащей 25 мкл ПЦР-смеси Мак!сг М1х, включающей 8ΥΒΒ, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (РЕ ВюкуЧетк) (к которой было предварительно добавлено 0,5 единиц урацил-Ы-гликозилазы ΑπηοΕι-η^ (υΝΟ, РЕ Вюкук!стк)), 300 нМ каждого праймера для амплификации и 5 мкл ОТ-ПЦР-продукта. ПЦР проводили с использованием системы детекции ΛΒI ΡΒI8Μ 7700 ПадМаи), запрограммированной в следующем режиме: 1 цикл, 50°С, 2 мин; 1 цикл, 95°С, 10 мин; 40 циклов, 95°С, 15 с, 60°С, 1 мин. Каждую реакцию проводили с 2 повторностями и результаты усредняли.
Праймер-специфические области образцов кДНК, подвергнутых обратной транскрипции, амплифицировали и определяли их величины С! (пороговое число циклов). Величину С! для каждого образца кДНК нормализовали по величинам, полученным для гена домашнего хозяйства ΟΑΡΌΗ. Различие уровней экспрессии между геном ΟΑΡΌΗ и ΙΝ8Ρ142 в каждом образце кДНК выражали как разность величин С!, т.е. дельта (δ) С1=С( (ΟΑΡΌΗ^Ο: (ΙΝ8Ρ142). Результаты для каждого образца выражали как кратную разность числа циклов, необходимых для детектируемой экспрессии гена ΙΝ8Ρ142, по отношению к числу циклов, необходимых для ΟΑΡΌΗ, и вычисляли по формуле кратная разность=2(-5С!). И, наконец, был определен уровень экспрессии гена ΙΝ8Ρ142 в каждом образце кДНК по отношению к уровню экспрессии гена ΟΑΡΌΗ, где уровень экспрессии ΟΑΡΌΗ был принят за 100% путем деления 100 на кратную разность для ΙΝ8Ρ142.
Результаты.
Праймеры для ΙΝ8Ρ142 тестировали на панели приблизительно 100 образцов нормальных человеческих тканей и пораженных человеческих тканей, первичных клеток и клеточных линий, а также на 44 биоптатах, взятых из толстой кишки и подвздошной кишки у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника, и на 38 биоптатах, взятых у пациентов с псориазом после проведения клинических испытаний для ШИВЕ. Используемые праймеры позволяли идентифицировать ΙΝ8Ρ142 от варианта сплайсинга ΙΝ8Ρ141, но не от вариантов сплайсинга ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144. Полученные результаты приводятся в табл. 5-11 и представлены графически на фиг. 10-16. ΙΝ8Ρ142 сначала клонировали из кДНК яичек. Анализ Τа^Μаη нормальных человеческих тканей подтвердил наличие экспрессии ΙΝ8Ρ142 в яичках, однако уровень его экспрессии был очень низким (т.е. составлял 0,15 по отношению к уровню экспрессии ΟΑΡΌΗ, который был равен 100) (фиг. 10). ΙΝ8Ρ142 был также детектирован на аналогичных уровнях в коже, легких и в печени. В первичных клетках и в клеточных линиях ΙΝ8Ρ142 может быть детектирован на аналогичных низких уровнях в клетках костного мозга и в клетках человеческого микрососудистого эндотелия кожи (фиг. 12), а также в нормальных человеческих фибробластах кожи (фиг. 13), в гранулоцитах периферической крови и в происходящих от эозинофилов клеточных линиях ЕОЬ-3. Неожиданно
- 48 013251 было обнаружено, что экспрессия ГЫ8Р142 может быть детектирована во всех образцах биоптатов толстой кишки и подвздошной кишки пациентов с ВЗК (фиг. 15) и в биоптатах кожи, пораженной псориазом, что позволяет предположить о наличии активации мРНК в воспалительных патологических процессах. Исходя из данных экспрессии в первичных клетках и в клеточных линиях было обнаружено, что клетки кожи многих типов могут быть ответственны за экспрессию ГЫ8Р142 при псориазе.
Выводы.
Полученные результаты неожиданно выявили ограниченную экспрессию ГЫ8Р142 в образцах биоптатов толстой кишки и подвздошной кишки пациентов с ВЗК и в биоптатах кожи, пораженной псориазом.
Этот специфический характер экспрессии позволяет сделать вывод об участии ГЫ8Р142 в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника, кожных болезней или воспалений.
Воспалительные заболевания предпочтительно выбирают из болезни Крона или язвенного колита.
Кожными болезнями предпочтительно являются псориаз, контактный дерматит или атопическая экзема.
Эти неожиданные свойства, характеризующие полинуклеотиды или соответствующие полипептиды согласно изобретению, делают их особенно подходящими для приготовления лекарственного средства или фармацевтической композиции. Это обусловлено тем, что полинуклеотиды или соответствующие полипептиды согласно изобретению, как было неожиданно обнаружено, имеют ограниченный уровень экспрессии в конкретных тканях.
Таблица 4
Последовательности ПЦР-праймеров ТадМап
Праймер Последовательность (5'-> 3')
ΙΝ3Ρ142-936Γ СССТС5СССААААСТАСАААА (ЗЕО Ю N0: 162)
ΙΝ3Ρ142-1044Κ ААСАСААССАСАТСТССТССТЗ (ЗЕО Ю ΝΟ: 163)
НСАРОН-Е' ССАСССАТ66САААТТСС (ЗЕО 10 N0: 164)
ЬЗАРОН-К ЗАТСССАТТТССАТТЗАТ5АСА (ЗЕО Ю N0: 165)
интрон-Г16АР0Н-Г ССТАСТСССАСеССТТТСАТТ (БЕО 10 N0: 166)
интрон-ЪСАРОН-В СТСТССТСССАСТССТ5АТТТ (ЗЕО Ю N0: 167)
- 49 013251
Таблица 5
Экспрессия ΙΝ8Ρ142 в основных человеческих тканях, измеренная с помощью ОТ-ПЦР (Τа^Μаη)
Набор основных тканей СЪ ЬСАРПН СЬ ΗΙΝ3Ρ142 дельта 1 си Кратная разность По 1 отношению к САРЦН (=100)
376 головной мозг 20,56 34,02 -13,46 11268,44 0,01
577 сердце 21,36 34,10 -12,74 6841,04 0,01
578 почки 19, 93 32, 53 -12,60 6186,90 0,02
379 печень 22,79 33,77 -10,98 2019,80 0,05
380 легкие 22,92 33, 00 -10,09 1086,14 0,09
581 плацента 21,81 33,82 -12,01 4124,49 0,02
582 скелетная мышца 17,74 33,86 -16,12 71220,26 0,00
383 тонкая кишка 21,65 34,50 -12,85 7383,04 0,01
384 селезенка 21,71 34,74 -13,04 8393,17 0,01
585 тимус 21, 01 32,63 -11,62 3147,52 0, 03
586 матка 21, 56 32,58 -11,03 2083,80 0, 05
889 спинной мозг 20,13 34,60 -14,47 22693,63 0, 00
590 шейка матки 24,27 36, 00 -11,73 3396,74 0, 03
391 толстая кишка 21,50 33,64 -12,14 4513,40 0,02
892 яичник 23,24 33,83 -10,59 1541,37 0,06
893 предстательная железа 20, 88 33, 33 -12,45 5575,94 0,02
594 яички 21,88 31,24 -9,36 654,84 0, 15
895 кожа 24,39 34,08 -9,70 828,87 0,12
8113 поджелудочная железа 23,26 33,45 -10,19 1164,10 0,09
3119 молочная железа 21,52 35,58 -14,06 17020,67 0,01
5120 желудок 21,66 32, 61 -10,95 1978,24 0,05
3122 глаза 22,16 33,32 -11,16 2280,29 0,04
5147 мочевой пузырь 21,46 34,08 -12,62 6295,04 0, 02
- 50 013251
Таблица 6
Экспрессия ΙΗ8Ρ142 в сравнительных человеческих тканях, измеренная с помощью ОТ-ПЦР (ТадМап)
Сравнительные ткани Οι ЛСАРОН ΪΊΪΝΞΡ142 дельта СГ Кратная разность По отношению к САРОН (=100)
376 головной мозг 21,31 33, 81 -12,50 5789,68 0,02
8140 головной мозг плода 19,73 32,72 -12,98 8088,64 0,01
377 сердце 22,60 35,60 -13,00 8181,72 0,01
3143 сердце плода 19,89 34,15 -14,26 19580,66 0,01
378 почки 20,94 33,37 -12,43 5512,82 0,02
3121 почки плода 20,41 34,04 -13,63 12673, 55 0,01
3130 полноразмерная РНК почки, пораженной волчанкой 22,79 33,98 -11,20 2347,74 0,04
3135 опухоль почки 20,57 33,27 -12,70 6667,30 0, 01
379 печень 23,85 32, 73 -8,38 470,18 0,21
3142 печень плода 21,08 33, 72 -12,64 6374,85 0,02
3127 полноразмерная РНК печени, пораженной волчанкой 24,39 34,07 -9, 67 816,10 0,12
5131 печень, пораженная циррозом 22,99 35,29 -12,30 5057,32 0, 02
5136 опухоль печени 19,24 34,12 -14,88 30182,81 0,00
580 легкие 23,65 33,42 -9,76 868,58 0,12
3144 легкие плода 19,29 32,75 -13,45 11203,00 0,01
8128 полноразмерная РНК легких, пораженных волчанкой 21,14 36, 92 -15,78 56206,04 0,00
5132 легкие, пораженные циррозом 18, 13 33,36 -15,23 38387,17 0, 00
5137 опухоль легких 22,72 34,12 -11,50 2894,56 0,03
584 селезенка 22,24 34,84 -12,60 6229,86 0,02
5141 селезенка плода 22,06 32,99 -10,93 1947,23 0,05
3129 полноразмерная РНК селезенки, пораженной волчанкой 23, 62 33,82 -10,20 1174,15 0,09
3133 селезенка, пораженная циррозом 20,99 33,30 -12,32 5104,76 0,03
8117 все нормальные ткани человека 17,56 33, 41 -15,85 59095,31 0,00
- 51 013251
Таблица 7
Экспрессия ΙΝ8Ρ142 в секреторных и иммунных тканях, измеренная с помощью ОТ-ПЦР (Τа^Μаη)
Образцы секреторных и иммунных тканей съ ЬСАРОН СХ ΗΙΝ5Ρ142 дельта Οι Кратная разность по отношению к 6ΑΡΏΗ (=100)
387 костный мозг 23, 63 33,33 -9,70 831,14 0,12
388 щитовидная железа 22,77 33,36 -10,59 1536,53 0,07
5115 слюнная железа 22,95 35,11 -12,16 4585,12 0,02
3116 надпочечник 21,94 34,62 -12,68 6546,78 0,02
5123 иолочная железа 25,03 36,20 -11,17 2302,46 0, 04
3125 гипофиз 23,48 34,11 -10,62 1578,89 0, 06
3145 лимфоузел 23,28 35,23 -11,95 3965,59 0, 03
5146 жировая ткань 20,35 35,40 -15,05 33879,59 0, 00
3148 аппендикс 22,60 33,76 -11,17 2296,39 0,04
5149 кровеносная артерия 22,55 35,87 -13,32 10218,47 0,01
5150 горло 21,03 34,87 -13,85 14750,27 0,01
575 миндалины 25,36 37,12 -11,76 3466,37 0,03
554 строма 22,17 34,02 -11,86 3709,47 0,03
5153 клетки НОМЕС 24,32 34,27 -9,96 993,65 0, 10
5157 стимулированные клетки НОМЕС 24,36 34,63 -10,27 1237,64 0,08
3155 клетки НАоЕС 21,61 34,44 -12,83 7302,87 0,01
3158 стимулированные клетки НАоЕС 20,94 34,05 -13,11 8361,15 0,01
511 ΗΆ2 22,78 34,43 -11,65 3204,93 0,03
512 КАЗ 21,45 34,59 -13,15 9058,87 0,01
513 ОА1 26,13 39,39 -13,26 9782,59 0,01
519 ОА4 21,79 34,27 -12,47 5686,33 0,02
- 52 013251
Таблица 8
Экспрессия ΙΝ8Ρ142 в первичных клетках и клеточных линиях, измеренная с помощью ОТ-ПЦР (ΤοςΜοπ)
Первичные клетки и клеточные линии 1 СИ ЬСАРОН СЕ Ϊ1ΙΝ3Ρ142 дельта СЪ Кратная разность По отношению к САРОН (=100}
31 фибробласт АС1518 21,54 34,72 -13, 18 9258,32 0,01
32 Нома г ά АЬ 21,23 33, 97 -12,74 6844,32 0,01
33 С1агк N 20,59 35, 30 -14,71 26795,20 0,00
34 ΝΓ1 20, 69 34,13 -13,44 11132,82 0, 01
35 ΝΓ2 22,05 33, 96 -11,91 3843,39 0,03
36 ЗЗсЫ2 19, 93 34, 16 -14,23 19207,12 0,01
3? 35СА2 19,11 33, 27 -14,16 18280,44 0, 01
315 20,23 33, 88 -13,66 12923,86 0,01
316 1аЫ 17,60 34,36 -16,76 110689,17 0,00
317 1Ν14 20,96 34,26 -13,29 10048,88 0,01
518 ЬА13 19,11 33, 88 -14,77 27965,97 0,00
39 ΝΗΟΓ2 23,84 34,10 -10,26 1230,13 0, 08
310 ΝΗϋΡ3 24,58 34,75 -10,17 1148,35 0,09
355 ЛЕНС 20,53 34,16 -13,63 12655,39 0,01
356 НТ 1080 19,81 34,96 -15,15 36287,57 0,00
357 МКС-5 20,31 35,68 -15,37 42276,07 0,00
3152 клетки МоЬ 21,68 34,18 -12,50 5775,85 0,02
3155 стимулированные клетки МоЬ 20,44 34,57 -14,13 17932,97 0,01
3156 стимулированные клетки МоЬ 19,60 34, 06 -14,45 22429,61 0, 00
320 кератиноциты кожи К1 22,46 35,57 -13,10 8800,61 0, 01
321 кератиноциты кожи К2 22, 93 34,39 -11,41 2728,24 0, 04
- 53 013251
Таблица 9
Экспрессия [N80142 в первичных клетках и клеточных линиях иммунной системы или ЦНС, измеренная с помощью ОТ-ПЦР (ТадМаи)
Первичные клетки и клеточные линии 2 СР 5САР0Н СР ЫИЗР142 дельта Сё Кратная разность По отношению к САРбН (=100)
330 ТНР-1 шопо/тас 19,42 32,52 -13,10 8772,67 0, 01
335 базофил Ки312 13,91 32,55 -13,64 12735,76 0, 01
337 Ки812/РМА 20,29 36,16 -15,87 59778,10 0, 00
343 Лигкар 19,54 32,78 -13,24 9648,25 0,01
558 РВМС1 21,68 33,98 -12,30 5052,75 0,02
359 гранулоциты 1 23,97 33, 84 -9,88 940,48 0,11
361 РВМС2.2 22,12 33,56 -11,44 2787,83 0, 04
397 3Κ-Ν-Α3 19,94 33,72 -13,78 14049,81 0,01
398 ТЕ671 субклон 2 19, 76 33,76 -14,00 16356,00 0, 01
399 КЕЬЬУ 18,07 32,83 -14,76 27723,88 0,00
3100 Ц-373 Мб 19,55 32,78 -13,24 9648,51 0,01
3101 Ц-87 МС 20,86 33,50 -12,64 6365,99 0,02
5102 Т98С 13,61 33, 69 -15,08 34577,36 0, 00
5103 ВЕ(2}-С 19,21 33,21 -14,00 16387,20 0, 01
3104 ССЕ-ЗТСС1 20,19 32,31 -12,62 6274,56 0,02
5105 ТЕ671 20,50 34,11 -13,60 12448,79 0,01
5106 А172 19,71 33,12 -13,42 10928,99 0,01
3107 132Ν1 19, 15 33,29 -14,14 18035,48 0,01
5108 5Κ-ΡΝ-ΌΗ 19,97 33,28 -13,31 10145,36 0,01
338 МОЕТ-4 24,90 33,77 -3,36 465,96 0,21
841 ЕОЬ-3 23,64 33,13 -9,49 713,73 0,14
344 ЕОЬ-3+11,2 24,03 34,34 -10,27 1232,74 0,08
- 54 013251
Таблица 10
Экспрессия INЗΡ142 в биоптатах, взятых из пораженной толстой кишки и подвздошной кишки, измеренная с помощью ОТ-ПЦР (ТадМап)
Пластина с ВЗК-биоптатом С1 ЬСАРОН СТ ΜΝ8Ρ142 дельта с1 Кратная разность По отношению к САРОН (=1001
N1 24,43 33,67 •9,25 607,54 0,16
N2 22.86 32,88 -101)3 1042,30 0,10
N4 22,08 34,05 -11,97 4001.87 0,02
N5 23,15 32,65 -9,50 723,01 0,14
ΝΒ 22,73 32,10 -9,37 662,65 0,15
N10 23.38 32,67 -9,29 626,27 0,16
Сй2 22,25 3341 -11,16 2295,06 0,04
соз 21,30 31,92 -10,62 1575,62 0,06
СЕМ 21,40 31,66 •10,26 1222,40 0,08
С05 24,04 32,88 *8ϊ85 460,18 0,22
сое 23,46 32,31 -835 460,46 0,22
СО8 22,12 33,19 -11,07 2148,23 0,05
СОВ 24,74 3333 -8,58 383,93 0,26
СОЮ 23.18 34,11 •10,93 1950,65 0,05
СО13 24,11 32,82 8,72 420,26 0,24
сою 24,35 32,77 -842 342,90 0,29
СО17 25,58 33,02 -7,44 174,20 0,57
СОТ 8 22,88 37,3« -14,47 227204*5 0,00
СОЮ 23,33 33,35 •10,02 1038,70 0,10
Сй20 24,12 34,57 -1045 1399,73 0,07
СО22 22,04 32,10 -10,05 1061,10 0,09
N11 23,80 33,78 -10,18 1160,09 0,09
N14 22,86 3348 -10,62 1577,89 0,06
N26 23,48 35,52 -12,04 4211,20 0,02
N27 23,86 34,92 -11,06 2133,33 0,05
N29 24,61 35,11 -10,50 1449,35 0,07
N30 22,56 32,01 -9,45 697,17 0,14
ССМ Ь13 22,91 31,80 -8,89 475,04 0,21
СО6 Ыз 23,04 32,4« -9,42 683,91 0,15
СЕ>23 25,11 32,42 -7,31 158,27 0,63
СО24 22,72 33,53 -10,81 1792,74 0,06
СО 25 23,50 31,90 -8,40 336,65 0,30
СО26 23,18 32,30 -9,12 557,15 0,18
СО27 24,58 32,56 -7,98 252,07 0,40
С£>28 23,15 32,50 -9,35 654,35 0,15
ОС11 23,39 32,69 -9,30 630,64 0,16
исю 22,61 33,70 -11,09 2184,24 0,05
исю 22,96 32,15 -9,19 584,33 0,17
ис14 23,09 31,27 -8,18 290,95 0,34
исю 23,10 32,85 -9,75 861,54 0,12
исю 24,78 33,02 -8,24 302,49 0,33
исю 22,74 32,58 -9,84 918,60 0,11
- 55 013251
Таблица 11
Экспрессия ГЫ8Р142 в биоптатах, взятых из пораженной кожи после проведения клинических испытаний для Ю8ВР, измеренная с помощью ОТ-ПЦР (ТадМап)
Псориаз Οί ПСАРБН се Ρ1ΙΝ5Ρ142 дельта се Кратная разность По отношению к САРОН (=100)
#11 А2872102-2 21,03 32,84 -11,81 3593,11 0,03
#16 А2872103-1 24,86 33,95 -9, 09 544,94 0,18
#28 А2872023-1 22,50 35,02 -12,51 5842,32 0, 02
#36 А2872028-1 24,83 33,76 -8,94 490,55 0,20
#39 А2872025-1 24,43 32,88 -8,44 347,88 0,29
#59 Е1328972-3 24,60 33,26 -8, бб 403,74 0,25
#60 Е1328972-2 22,21 32, 91 -10,70 1658,02 0, 06
#61 Е1329004 24,60 33, 37 -8,77 435,59 0,23
#63 Е1328973-3 22,93 33,91 -10,97 2011,18 0,05
#64 Е1329003-2 20,81 31,87 -11,06 2135,78 0,05
#66 Е1328974-4 21,77 33, 42 -11,65 3224,67 0, 03
#68 Е1328975-3 24,59 32, 55 -7,96 249,05 0, 40
#69 Е1328975-4 23,59 33, 57 -9,97 1005,76 0,10
#70 Е1329006-1 22,27 33,00 -10,73 1693,79 0,06
#72 Е1328976-4 23, 54 32,71 -9,16 573,83 0, 17
#73 Е1329005-1 23, 80 33,50 -9,70 330,24 0, 12
#74 Е1328977-2 24,17 32,97 -8,79 443,66 0,23
#75 Е1328977-3 22,90 32,88 -9, 98 1010,36 0, 10
#77 Е1348411-3 23, 53 32,47 -8, 95 493,01 0,20
#78 Е1348411-2 21, 64 34,12 -12,48 5716,81 0,02
#79 Е1348411-1 21, 83 31,29 -9,45 701,55 0, 14
#80 Е1348414-2 22,67 32,17 -9,49 720,55 0,14
#81 Е1348414-1 22,12 32,54 -10,42 1374,76 0,07
#82 Е1348446-1 23,42 31,65 -8,23 299,96 0,33
#83 Е1348415-3 20, 95 32, 19 -11,24 2412,57 0,04
#84 Ε134Θ415-2 21,77 32, 86 -11,09 2181,45 0,05
#85 Е1348442-1 21,00 32,15 -11,15 2265,41 0,04
#86 Е1348416-3 25,00 33,31 -8,31 317,58 0,31
#88 Е1348445-1 23,70 33,27 -9, 57 760,60 0,13
#91 Е1317749-2 24,53 31,94 -7,41 170,59 0, 59
#95 Е1317719-2 24,94 32,12 -7,18 145,45 0, 69
#96 Е1317719-3 21,69 31,74 -10,05 1059,76 0,09
#97 Е1317751-2 23,25 33,13 -9,88 943,38 0,11
#98 Е1317723-2 24,09 35, 40 -11,32 2550,43 0, 04
#99 Е1317723-3 22,10 32,31 -10,21 1186,53 0,08
#101 Е1317718-2 20,26 32, 63 -12,38 5312,87 0, 02
#102 Е1317718-3 22, 52 33, 42 -10,89 1899,79 0,05
#103 Е1317750-2 23,82 32,43 -8,61 390,29 0,26
- 56 013251

Claims (1)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Полипептид, который:
    (ΐ) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ΙΌ ΝΟ:2, 3Ε0 ΙΌ ΝΟ:4, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:6, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:8, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:10, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:12, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:14, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:16, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:18, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:20, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:22, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:24, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:128, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:130, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:132, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:134, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:146 и/или 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:148; или (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ГА, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (1); или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    2. Полипептид по п.1, который:
    (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ΙΌ ΝΟ:24, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:128 или 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:132;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ЕА, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    3. Полипептид по п.1 или 2, который:
    (ί) состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 3Ε0 ΙΌ ΝΟ:2, 3Ε0 ΙΌ ΝΟ:4, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:6, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:8, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:10, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:12, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:14, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:16, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:18, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:20, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:22, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:24, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:128, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:130, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:132, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:134, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:146 и/или 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:148; или (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ВА, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    4. Полипептид, который:
    (ΐ) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ΙΌ ΝΟ:26, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:28, 8Ερ ΙΌ ΝΟ:30, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:32, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:34, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:36, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:38, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:40, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:42, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:44, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:46, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:48, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:50, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:52, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:136, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:146 и/или 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:150;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ΡА, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    5. Полипептид по п.4, который:
    (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 3Ε0 ΙΌ ΝΟ:52 или 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:156;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ΡА, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    6. Полипептид по п.4 или 5, который:
    (ί) состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 3Ε0 ΙΌ ΝΟ:26, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:28, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:30, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:32, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:34, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:36, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:38, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:40, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:42, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:44, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:46, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:48, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:50, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:52, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:136, 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:146 и/или 3ΕΟ ΙΌ ΝΟ:150;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ΡА, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί),
    - 57 013251 или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    7. Полипептид, который:
    (ΐ)
    ΙΌ
    ΙΌ
    ΙΌ содержит аминокислотную
    Ν0:56, ЗЕО ΙΌ Ν0:58, ЗЕО
    Ν0:68, ЗЕО ΙΌ Ν0:70, ЗЕО
    Ν0:80, ЗЕО ΙΌ Ν0:82, ЗЕО последовательность,
    ΙΌ Ν0:60, ЗЕО ΙΌ ΙΌ Ν0:72, ЗЕО ΙΌ ΙΌ Ν0:84, ЗЕО ΙΌ представленную в ЗЕО ΙΌ
    Ν0:62, ЗЕО ΙΌ Ν0:64, ЗЕО ΙΌ
    Ν0:74, ЗЕО ΙΌ Ν0:76, ЗЕО ΙΌ
    Ν0:86, ЗЕО ΙΌ Ν0:88, ЗЕО ΙΌ
    Ν0:54,
    Ν0:66,
    Ν0:78,
    Ν0:90,
    ЗЕф
    ЗЕф
    ЗЕф ЗЕО ΙΌ Ν0:138, ЗЕО ΙΌ Ν0:140, ЗЕО ΙΌ Ν0:142, ЗЕО ΙΌ Ν0:144, ЗЕО ΙΌ Ν0:146 и/или ЗЕО ΙΌ Ν0:150;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ΡΆ, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    8. Полипептид по п.7, который:
    (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕф ΙΌ Ν0:90, ЗЕО ΙΌ Ν0:137 или ЗЕО ΙΌ Ν0:141;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ₽А, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    9. Полипептид по п.7 или 8, который:
    (1)
    ΙΌ
    ΙΌ
    ΙΌ содержит аминокислотную
    Ν0:56, ЗЕО ΙΌ Ν0:58, ЗЕО
    Ν0:68, ЗЕО ΙΌ Ν0:70, ЗЕО
    Ν0:80, ЗЕО ΙΌ Ν0:82, ЗЕО последовательность,
    ΙΌ Ν0:60, ЗЕО ΙΌ ΙΌ Ν0:72, ЗЕО ΙΌ ΙΌ Ν0:84, ЗЕО ΙΌ представленную в ЗЕО ΙΌ
    Ν0:62, ЗЕО ΙΌ Ν0:64, ЗЕО ΙΌ
    Ν0:74, ЗЕО ΙΌ Ν0:76, ЗЕО ΙΌ
    Ν0:86, ЗЕО ΙΌ Ν0:88, ЗЕО ΙΌ
    Ν0:54,
    Ν0:66,
    Ν0:78,
    Ν0:90,
    ЗЕО
    ЗЕО
    ЗЕО ЗЕО ΙΌ Ν0:138, ЗЕО ΙΌ Ν0:140, ЗЕО ΙΌ Ν0:142, ЗЕО ΙΌ Ν0:144, ЗЕО ΙΌ Ν0:146 и/или ЗЕО ΙΌ Ν0:150;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ₽А, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    10. Полипептид, который:
    (ΐ) содержит аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕф ΙΌ Ν0:92, ЗЕО ΙΌ Ν0:94, ЗЕО ΙΌ Ν0:96, ЗЕО ΙΌ Ν0:98, ЗЕО ΙΌ Ν0:100, ЗЕО ΙΌ Ν0:102, ЗЕО ΙΌ Ν0:104, ЗЕО ΙΌ Ν0:106, ЗЕО ΙΌ Ν0:108, ЗЕО ΙΌ Ν0:110, ЗЕО ΙΌ Ν0:112, ЗЕО ΙΌ Ν0:114, ЗЕО ΙΌ Ν0:116, ЗЕО ΙΌ Ν0:118, ЗЕО ΙΌ Ν0:120, ЗЕО ΙΌ Ν0:122, ЗЕО ΙΌ Ν0:124, ЗЕО ΙΌ Ν0:126, ЗЕО ΙΌ Ν0:146 и/или ЗЕО ΙΌ Ν0:148;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ₽А, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    11. Полипептид по п.10, который:
    (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕф ΙΌ Ν0:126;
    (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы ₽А, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί), или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    12. Полипептид по п.10 или 11, который:
    (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕф ΙΌ Ν0:92, ЗЕО ΙΌ Ν0:94, ЗЕО ΙΌ Ν0:96, ЗЕО ΙΌ Ν0:98, ЗЕО ΙΌ Ν0:100, ЗЕО ΙΌ Ν0:102, ЗЕО ΙΌ Ν0:104, ЗЕО ΙΌ Ν0:106, ЗЕО ΙΌ Ν0:108, ЗЕО ΙΌ Ν0:110, ЗЕО ΙΌ Ν0:112, ЗЕО ΙΌ Ν0:114, ЗЕО ΙΌ Ν0:116, ЗЕО ΙΌ Ν0:118, ЗЕО ΙΌ Ν0:120, ЗЕО ΙΌ Ν0:122, ЗЕО ΙΌ Ν0:124, ЗЕО ΙΌ Ν0:126, ЗЕО ΙΌ Ν0:146 и/или ЗЕО ΙΌ Ν0:148;
    - 58 013251 (ίί) представляет собой ее фрагмент, который связывается с субъединицей токсина сибирской язвы РА, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы, или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (ί),
    ГО ГО ГО ГО ГО ГО ГО ГО ГО ГО ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    МО: 12,
    МО:24,
    МО:36,
    МО:48,
    МО:60,
    МО:72,
    МО:84,
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО МО:2, 8 ЕС) ГО МО:4, 8 ЕС) ГО МО:6, 8 ЕС) ГО МО:8, МО: 14,
    МО:26,
    МО:38,
    МО:50,
    МО:62,
    МО:74,
    МО:86,
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    МО: 16,
    МО:28,
    МО:40,
    МО:52,
    МО:64,
    МО:76,
    МО:88,
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    МО: 18,
    МО:30,
    МО:42,
    МО:54,
    МО:66,
    МО:78,
    МО:90,
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    ЕС) ГО МО:96, 8 ЕС) ГО МО:98, 8 ЕС) ГО МО: 100, 8 ЕС) ГО МО: 102,
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    МО: 10,
    МО:22,
    МО:34,
    МО:46,
    МО:58,
    МО:70,
    МО:82,
    МО:94,
    МО: 106, 8ЕС) ГО МО:108, 8ЕС) ГО МО:110, 8 ЕС) ГО МО:112, 8ЕС) ГО МО:114, 8ЕС)
    МО: 118, 8ЕС) ГО МО:120, 8ЕС) ГО МО:122, 8 ЕС) ГО МО:124, 8ЕС) ГО МО:126, 8ЕС)
    МО: 130, 8ЕС) ГО МО:132, 8ЕС) ГО МО:134, 8 ЕС) ГО МО:136, 8ЕС) ГО МО:138, 8ЕС)
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО го го го го
    МО:20,
    МО:32,
    МО:44,
    МО:56,
    МО:68,
    МО:80,
    МО:92, МО: 104, МО:116, МО:128, МО:140,
    8ЕО ГО МО: 14, 8ЕО ГО МО:16, 8ЕО ГО МО:18, 8ЕО ГО МО:20, 8ЕО ГО МО:22, 8ЕО 8ЕО ГО МО:26, 8ЕО ГО МО:28, 8ЕО ГО МО:30, 8ЕО ГО МО:32, 8ЕО ГО МО:34, 8ЕО 8ЕО ГО МО:38, 8ЕО ГО МО:40, 8ЕО ГО МО:42, 8ЕО ГО МО:44, 8ЕО ГО МО:46, 8ЕО 8ЕО ГО МО:50, 8ЕО ГО МО:52, 8ЕО ГО МО:54, 8ЕО ГО МО:56, 8ЕО ГО МО:58, 8ЕО 8ЕО ГО МО:62, 8ЕО ГО МО:64, 8ЕО ГО МО:66, 8ЕО ГО МО:68, 8ЕО ГО МО:70, 8ЕО 8ЕО ГО МО:74, 8ЕО ГО МО:76, 8ЕО ГО МО:78, 8ЕО ГО МО:80, 8ЕО ГО МО:82, 8ЕО 8ЕО ГО МО:86, 8ЕО ГО МО:88, 8ЕО ГО МО:90, 8ЕО ГО МО:92, 8ЕО ГО МО:94, 8ЕО 8ЕО ГО МО:98, 8ЕО I Ό МО:100, 8ЕЦ I Ό МО:102, 8ЕЦ ГО МО: 104, 8ЕЦ : ГО МО:106, 8ЕО
    ГО
    ГО
    ГО
    МО: 110, 8ЕС) ГО МО:112, 8ЕС) ГО МО:114, 8 ЕС) ГО МО:116, 8ЕС) ГО МО:118, 8ЕС)
    МО:122, 8ЕС) ГО МО:124, 8ЕС) ГО МО:126, 8 ЕС) ГО МО:128, 8ЕС) ГО МО:130, 8ЕС)
    МО:134, 8ЕС) ГО МО:136, 8ЕС) ГО МО:138, 8 ЕС) ГО МО:140, 8ЕС) ГО МО:142, 8ЕС) или (ίίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί), имеющий активность, определенную в (ίί).
    13. Полипептид, являющийся функциональным эквивалентом полипептида согласно части (ίίί) любого из предшествующих пунктов и отличающийся тем, что он является гомологом аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ
    8ЕС) ГО МО:142, 8ЕС) ГО МО:144, 8ЕС) ГО МО:146, 8ЕС) ГО МО:148 или 8ЕЦ ГО МО:150, связывается с субъединицей токсина сибирской язвы РА, хелатирует двухвалентный катион, необходимый для связывания токсина сибирской язвы, или блокирует интоксикацию сибирской язвы.
    14. Полипептид, который представляет собой фрагмент или функциональный эквивалент по любому из предшествующих пунктов, имеющий последовательность, которая более чем на 50%, предпочтительно более чем на 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕЦ ГО МО:2, 8ЕЦ ГО МО:4, 8ЕЦ ГО МО:6, 8ЕЦ ГО МО:8, 8ЕЦ ГО МО:10, 8ЕЦ ГО МО:12,
    МО:24, МО:36, МО:48, МО:60, МО:72, МО:84, МО:96, МО:108, МО:120, МО:132, МО:144,
    ГО ГО ГО ГО ГО ГО ГО го го го го
    8ЕС)
    8ЕС)
    8ЕС)
    8ЕЦ ГО МО:146, 8ЕЦ ГО МО:148 или 8ЕЦ ГО МО:150, или ее активному фрагменту.
    15. Полипептид, который представляет собой функциональный эквивалент по любому из предшествующих пунктов и который обладает значительной структурной гомологией с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕЦ ГО МО:2, 8ЕЦ ГО МО:4, 8ЕЦ ГО МО:6,
    8ЕО ГО МО:8, 8ЕО ГО МО:10, 8ЕО ГО МО:12, 8ЕО ГО МО:14, 8ЕО ГО МО:16, 8ЕО ГО МО:18, 8ЕО ГО МО:20, 8ЕО ГО МО:22, 8ЕО ГО МО:24, 8ЕО ГО МО:26, 8ЕО ГО МО:28, 8ЕО ГО МО:30, 8ЕО ГО МО:32, 8ЕО ГО МО:34, 8ЕО ГО МО:36, 8ЕО ГО МО:38, 8ЕО ГО МО:40, 8ЕО ГО МО:42, 8ЕО ГО МО:44, 8ЕО ГО МО:46, 8ЕО ГО МО:48, 8ЕО ГО МО:50, 8ЕО ГО МО:52, 8ЕО ГО МО:54, 8ЕО ГО МО:56, 8ЕО ГО МО:58, 8ЕО ГО МО:60, 8ЕО ГО МО:62, 8ЕО ГО МО:64, 8ЕО ГО МО:66, 8ЕО ГО МО:68, 8ЕО ГО МО:70, 8ЕО ГО МО:72, 8ЕО ГО МО:74, 8ЕО ГО МО:76, 8ЕО ГО МО:78, 8ЕО ГО МО:80, 8ЕО ГО МО:82, 8ЕО ГО МО:84, 8ЕО ГО МО:86, 8ЕО ГО МО:88, 8ЕО ГО МО:90,
    МО:92,
    8ЕЦ
    ЕС) ГО МО:96, 8 ЕС) ГО ΝΘ:98, 8 ЕС) ГО МО: 100, 8 ЕС) ГО МО: 102,
    ГО
    ГО ГО
    ГО
    ГО
    МО:94,
    МО:106, 8ЕС) ГО МО:108, 8 ЕС) ГО МО:110, 8ЕС) ГО МО:112, 8ЕС) ГО МО:114,
    МО:118, 8ЕС) ГО МО:120, 8 ЕС) ГО МО:122, 8ЕС) ГО МО:124, 8ЕС) ГО МО:126,
    МО:130, 8ЕС) ГО МО:132, 8 ЕС) ГО МО:134, 8ЕС) ГО МО:136, 8ЕС) ГО МО:138,
    ЕС)
    8ЕС) ГО МО:104, 8ЕС) 8ЕС) ГО МО: 116, 8ЕС) 8ЕС) ГО МО:128, 8ЕС)
    8ЕС) ГО МО:140, 8ЕС) ГО МО:142, 8ЕС) ГО МО:144, 8ЕС) ГО МО:146, 8ЕС) ГО МО:148 или 8ЕС) ГО МО:150.
    16. Полипептид, который представляет собой фрагмент по пп.1-14, имеющий антигенную детерминанту, общую с полипептидом согласно части (ί) любого из пп.1, 4, 7, 10 или 13, и состоящий из 7 или более аминокислотных остатков аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕЦ ГО NО:2, 8ЕС) ГО МО:4, 8ЕС) ГО МО:6, 8ЕС) ГО МО:8, 8ЕС) ГО МО:10, 8ЕС) ГО МО:12, 8ЕС) ГО МО:14, 8ЕС) ГО МО:16, 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ 8ЕЦ
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    МО:18,
    МО:30,
    МО:42,
    МО:54,
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    8ЕЦ
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    МО:20,
    МО:32,
    МО:44,
    МО:56,
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    МО:26,
    МО:38,
    МО:50,
    МО:62,
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ГО ГО го го
    МО:28,
    МО:40,
    МО:52,
    МО:64,
    МО:22,
    МО:34,
    МО:46,
    МО:58,
    МО:24,
    МО:36,
    МО:48,
    МО:60,
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ЕС)
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    ГО
    - 59 013251
    ЕС) ΙΌ N0:66, 8 ЕС) ΙΌ N0:68, 8 ЕС) ΙΌ N0:70, 8 ЕС) ΙΌ N0:72, 8 ЕС) ΙΌ N0:74, 8 ЕС) ΙΌ N0:76,
    ЕС) ΙΌ N0:78, 8 ЕС) ΙΌ N0:80, 8 ЕС) ΙΌ N0:82, 8 ЕС) ΙΌ N0:84, 8 ЕС) ΙΌ N0:86, 8 ЕС) ΙΌ N0:88,
    ЕС) ΙΌ N0:90, 8 ЕС) ΙΌ N0:92, 8 ЕС) ΙΌ N0:94, 8 ЕС) ΙΌ N0:96, 8 ЕС) ΙΌ N0:98, 8 ЕС) ΙΌ N0:100,
    8ЕС) ΙΌ N0:102, 8ЕС) ΙΌ N0:104, 8ЕС) ΙΌ N0:106, 8 ЕС) ΙΌ N0:108, 8ЕС) ΙΌ N0:110, 8ЕС) ΙΌ N0:112,
    8ЕС) ΙΌ N0:114, 8ЕС) ΙΌ N0:116, 8ЕС) ΙΌ N0:118, 8 ЕС) ΙΌ N0:128, 8ЕС) ΙΌ N0:130, 8ЕС) ΙΌ N0:132,
    8ЕС) ΙΌ N0:134, 8ЕС) ΙΌ N0:136, 8ЕС) ΙΌ N0:138, 8 ЕС) ΙΌ N0:140, 8ЕС) ΙΌ N0:142, 8ЕС) ΙΌ N0:144,
    8ЕС) ΙΌ N0:146, 8ЕС) ΙΌ N0:148 или 8ЕС) ΙΌ N0:150.
    17. Гибридный белок, содержащий полипептид по любому из предшествующих пунктов.
    18. Гибридный белок по п.17, содержащий Ж8₽141, IN8Ρ142, внеклеточную часть ΙΗ8Ρ143 или внеклеточную часть ΙΗ8Ρ144.
    19. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по любому из предшествующих пунктов.
    20. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п.19, которая содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в 8ЕЦ ΙΌ N0:1, 8ЕЦ ΙΌ N0:3, 8ЕЦ ΙΌ N0:5, 8ЕЦ ΙΌ N0:7,
    8 ЕС) ΙΌ N0:9, 8 ЕС) ΙΌ N0:11, 8 ЕС) ΙΌ N0:13, 8 ЕС) ΙΌ N0:15, 8 ЕС) ΙΌ N0:17, 8Ер ΙΌ N0:19, 8 ЕС) ΙΌ N0:21, 8 ЕС) ΙΌ N0:23, 8 ЕС) ΙΌ N0:25, 8 ЕС) ΙΌ N0:27, 8 ЕС) ΙΌ N0:29, 8 ЕС) ΙΌ N0:31, 8 ЕС) ΙΌ N0:33, 8 ЕС) ΙΌ N0:35, 8 ЕС) ΙΌ N0:37, 8 ЕС) ΙΌ N0:39, 8 ЕС) ΙΌ N0:41, 8 ЕС) ΙΌ N0:43, 8 ЕС) ΙΌ N0:45, 8 ЕС) ΙΌ N0:47, 8 ЕС) ΙΌ N0:49, 8 ЕС) ΙΌ N0:51, 8 ЕС) ΙΌ N0:53, 8 ЕС) ΙΌ N0:55, 8 ЕС) ΙΌ N0:57, 8 ЕС) ΙΌ N0:59, 8 ЕС) ΙΌ N0:61, 8 ЕС) ΙΌ N0:63, 8 ЕС) ΙΌ N0:65, 8 ЕС) ΙΌ N0:67, 8 ЕС) ΙΌ N0:69, 8 ЕС) ΙΌ N0:71, 8 ЕС) ΙΌ N0:73, 8 ЕС) ΙΌ N0:75, 8 ЕС) ΙΌ N0:77, 8 ЕС) ΙΌ N0:79, 8 ЕС) ΙΌ N0:81, 8 ЕС) ΙΌ N0:83, 8 ЕС) ΙΌ N0:85, 8 ЕС) ΙΌ N0:87, 8 ЕС) ΙΌ N0:89, 8 ЕС) ΙΌ N0:91, 8 ЕС) ΙΌ N0:93, 8Ер ΙΌ N0:95, 8 ЕС) : ΙΌ N0:97, ! 8 ЕС) Ι Ό N0:99, 8 ,ЕО Ι] Ό N0:101, 8 ЕС) ΙΌ N0:103,
    8ЕС) ΙΌ N0:105, 8ЕС) ΙΌ N0:107, 8ЕС) ΙΌ N0:109, 8 ЕС) ΙΌ N0:111, 8ЕС) ΙΌ N0:113, 8ЕС) ΙΌ N0:115,
    8ЕС) ΙΌ N0:117, 8ЕС) ΙΌ N0:119, 8ЕС) ΙΌ N0:121, 8ЕС) ΙΌ ^:123,8Ер ΙΌ N0:125, 8ЕС) ΙΌ N0:127,
    8ЕС) ΙΌ N0:129, 8ЕС) ΙΌ N0:131, 8ЕС) ΙΌ N0:133, 8 ЕС) ΙΌ N0:135, 8ЕС) ΙΌ N0:137, 8ЕС) ΙΌ N0:139,
    8ЕЦ ΙΌ N0:141 и/или 8ЕЦ ΙΌ N0:143, или представляет собой ее избыточный эквивалент или фрагмент.
    21. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п.19, которая состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в 8ЕЦ ΙΌ N0:1, 8ЕЦ ΙΌ N0:3, 8ЕЦ ΙΌ N0:5, 8ЕЦ ΙΌ N0:7,
    8 ЕС) ΙΌ N0:9, 8 ЕС) ΙΌ N0:11, 8 ЕС) ΙΌ N0:13, 8 ЕС) ΙΌ N0:15, 8 ЕС) ΙΌ N0:17, 8Ер ΙΌ N0:19, 8 ЕС) ΙΌ N0:21, 8 ЕС) ΙΌ N0:23, 8 ЕС) ΙΌ N0:25, 8 ЕС) ΙΌ N0:27, 8 ЕС) ΙΌ N0:29, 8ЕС) ΙΌ N0:31, 8 ЕС) ΙΌ N0:33, 8 ЕС) ΙΌ N0:35, 8 ЕС) ΙΌ N0:37, 8 ЕС) ΙΌ N0:39, 8ЕС) ΙΌ N0:41, 8ЕС) ΙΌ N0:43, 8 ЕС) ΙΌ N0:45, 8 ЕС) ΙΌ N0:47, 8 ЕС) ΙΌ N0:49, 8 ЕС) ΙΌ N0:51, 8ЕС) ΙΌ N0:53, 8ЕС) ΙΌ N0:55, 8 ЕС) ΙΌ N0:57, 8 ЕС) ΙΌ N0:59, 8 ЕС) ΙΌ N0:61, 8 ЕС) ΙΌ N0:63, 8ЕС) ΙΌ N0:65, 8ЕС) ΙΌ N0:67, 8 ЕС) ΙΌ N0:69, 8 ЕС) ΙΌ N0:71, 8 ЕС) ΙΌ N0:73, 8 ЕС) ΙΌ N0:75, 8ЕС) ΙΌ N0:77, 8ЕС) ΙΌ N0:79, 8 ЕС) ΙΌ N0:81, 8 ЕС) ΙΌ N0:83, 8 ЕС) ΙΌ N0:85, 8 ЕС) ΙΌ N0:87, 8ЕС) ΙΌ N0:89, 8ЕС) ΙΌ N0:91, 8 ЕС) ΙΌ N0:93, 8Ер ΙΌ N0:95, 8 ЕС) : ΙΌ N0:97, ! 8 ЕС) Ι Ό N0:99, 8 ,ЕО Ι] Ό N0:101, 8ЕР ΙΌ N0:103,
    8ЕС) ΙΌ N0:105, 8ЕС) ΙΌ N0:107, 8ЕС) ΙΌ N0:109, 8 ЕС) ΙΌ N0:111, 8ЕС) ΙΌ N0:113, 8ЕС) ΙΌ N0:115,
    8ЕС) ΙΌ N0:117, 8ЕС) ΙΌ N0:119, 8ЕС) ΙΌ N0:121, 8 ЕС) ΙΌ N0:123, 8ЕС) ΙΌ N0:125, 8ЕС) ΙΌ N0:127,
    8ЕС) ΙΌ N0:129, 8ЕС) ΙΌ N0:131, 8ЕС) ΙΌ N0:133, 8 ЕС) ΙΌ N0:135, 8ЕС) ΙΌ N0:137, 8ЕС) ΙΌ N0:139,
    8ЕС) ΙΌ N0:141, 8ЕС) ΙΌ N0:143, 8ЕС) ΙΌ N0:145, 8ЕС) ΙΌ N0:147 и/или 8ЕС) ΙΌ N0:149, и/или представляет собой ее избыточный эквивалент или фрагмент.
    22. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-21 в условиях высокой жесткости.
    23. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22.
    24. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.23.
    25. Лиганд, который специфически связывается с полипептидом по любому из пп.1-18.
    26. Лиганд по п.25, который представляет собой антитело.
    27. Применение полипептида по любому из пп.1-18 в терапии или в диагностике заболевания.
    28. Способ диагностики заболевания у пациента, включающий в себя оценку активности полипептида по любому из пп.1-18 в ткани, полученной у указанного пациента, и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия заболевания.
    29. Способ по п.28, осуществляемый ίη νίΐιυ.
    30. Способ по п.28 или 29, который включает в себя стадии (а) контактирования лиганда по п.25 или 26 с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лигандполипептид; и (Ь) детектирования указанного комплекса.
    31. Способ по п.28 или 29, включающий в себя:
    a) контактирование образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиново-кислотным зондом в жестких условиях, способствующих образованию гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22, и указанным зондом;
    b) контактирование контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и
    - 60 013251
    с) детектирование присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детектирование уровней указанного гибридного комплекса в образце, взятом у данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
    32. Способ по п.28 или 29, включающий в себя:
    a) контактирование образца нуклеиновой кислоты ткани, взятой у пациента, с нуклеиновокислотным праймером в жестких условиях, способствующих образованию гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22 и указанным праймером;
    b) контактирование контрольного образца с указанным праймером в условиях, аналогичных условиям стадии (а);
    c) амплификацию указанного образца нуклеиновой кислоты и
    б) детектирование уровня амплифицированной нуклеиновой кислоты в образцах, взятых у пациента, и в контрольных образцах, где детектирование уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты во взятом у пациента образце, которые значительно отличаются от уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
    33. Способ по п.28 или 29, включающий в себя:
    a) взятие образца ткани у пациента, обследуемого на наличие заболевания;
    b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22 из указанного образца ткани и
    c) установление диагноза заболевания у указанного пациента путем детектирования присутствия мутации в молекуле нуклеиновой кислоты, где указанная мутация ассоциируется с указанным заболеванием и где наличие такой мутации указывает на наличие заболевания.
    34. Способ по п.33, который дополнительно включает в себя амплификацию указанной молекулы нуклеиновой кислоты, с образованием амплифицированного продукта, и детектирование наличия или отсутствия мутации в указанном амплифицированном продукте.
    35. Способ по п.33 или 34, где наличие или отсутствие мутации у пациента определяют путем осуществления контакта указанной молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеиново-кислотным зондом, который гибридизуется с указанной молекулой нуклеиновой кислоты в жестких условиях с образованием гибридной двухцепочечной молекулы, где указанная гибридная двухцепочечная молекула имеет негибридизованную часть цепи нуклеиново-кислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и детектирования наличия или отсутствия негибридизованной части цепи указанного зонда как показателя наличия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации.
    36. Способ по любому из пп.28-35, где указанными заболеваниями являются, без ограничения, клеточно-пролиферативные расстройства, включая новообразования, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждение головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; нарушения развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и почечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, грибковые инфекции, паразитарные инфекции, бактериальные инфекции, бактериальные интоксикации; сибирская язва, заболевания, ассоциированные с блокадой токсинов (например, бактериальных токсинов), рак, опухоль эндотелия, рак ободочной кишки, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак легких, меланома, ювенильный гиалиновый фиброматоз (ЮГФ), детский системный гиалиноз (ДСГ), болезнь фон Виллебранда, миопатия Бетлема, дистрофический буллезный эпидермолиз, тромбоз, модуляция опосредуемой тромбоцитами агрегации, аутоиммунные заболевания, воспаления и другие патологические состояния.
    37. Способ по любому из пп.28-35, где указанным заболеванием является воспалительное заболевание кишечника, заболевание, ассоциированное с токсинами, рак, кожные болезни, воспаления, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, контактный дерматит, атопическая экзема, рак кровеносной и лимфатической систем, рак кожи, рак пищеварительной системы, рак мочевыделительной системы, рак молочной железы, рак яичника, рак женских половых органов, хориокарцинома, рак легких, опухоли головного мозга, опухоли кости, карциноидная опухоль, рак ободочной кишки, рак носоглотки, ретроперитонеальные саркомы, опухоли мягких тканей, рак щитовидной железы, рак яичек или рак печени, заболевание, ассоциированное с бактериальным токсином, заболевание, ассоциированное с токсином сибирской язвы или ботулиническим токсином С2 клостридий, болезнь Крона или язвенный колит, псориаз, рак кровеносной и лимфатической систем, рак кожи, рак пищеварительной системы, рак мочевыделительной системы, рак молочной железы, рак яичника, рак женских половых органов, хориокарцинома, рак легких, опухоли головного мозга, опухоли кости, карциноидная опухоль, рак носоглотки, ретроперитонеальные саркомы, опухоли мягких тканей, рак щитовидной железы, рак яичек или рак печени.
    - 61 013251
    38. Способ по любому из пп.28-36, где указанным заболеванием является заболевание, в патогенезе которого участвуют белки, содержащие домен νΑΕΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΑΤΚ-подобные белки.
    39. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-18.
    40. Вакцинная композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-18 или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22.
    41. Применение фармацевтической композиции по п.39 для получения лекарственного средства для лечения клеточно-пролиферативных расстройств, включая новообразования, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли; миелопролиферативных расстройств, таких как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунных/воспалительных заболеваний, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистых заболеваний, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологических расстройств, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждение головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; нарушений развития; метаболических расстройств, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИДа и почечного заболевания; инфекций, включая вирусные инфекции, грибковые инфекции, паразитарные инфекции, бактериальные инфекции, бактериальные интоксикации, сибирскую язву; заболеваний, ассоциированных с блокадой токсинов (например, бактериальных токсинов), рака, опухоли эндотелия, рака ободочной кишки, рака мочевого пузыря, рака пищевода, рака легких, меланомы, ювенильного гиалинового фиброматоза (ЮГФ), детского системного гиалиноза (ДСГ), болезни фон Виллебранда, миопатии Бетлема, дистрофического буллезного эпидермолиза, тромбоза, модуляции опосредуемой тромбоцитами агрегации, аутоиммуных заболеваний, воспаления и других патологических состояний.
    42. Применение фармацевтической композиции по п.39 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, в патогенезе которого участвуют белки, содержащие домен νАΡΑ и/или ΑΝΤ_ΙΟ, предпочтительно ΑΤΚ-подобные белки.
    43. Способ лечения заболевания у пациента, включающий в себя введение указанному пациенту молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22, вектора по п.23, клетки-хозяина по п.24, где заболевание выбрано из группы, включающей воспалительные заболевания кишечника, заболевания, ассоциированные с токсинами, предпочтительно ассоциированные с бактериальными токсинами, заболевания, ассоциированные с сибирской язвой или с ботулиническим токсином С2 клостридий, рак, кожные болезни, воспаления, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, контактный дерматит, атопическая экзема, рак кровеносной и лимфатической систем, рак кожи, рак пищеварительной системы, рак мочевыделительной системы, рак молочной железы, рак яичника, рак женских половых органов, хориокарцинома, рак легких, опухоли головного мозга, опухоли кости, карциноидная опухоль, рак ободочной кишки, рак носоглотки, опухоль эндотелия, рак мочевого пузыря, рак пищевода, ретроперитонеальные саркомы, опухоли мягких тканей, рак щитовидной железы, рак яичек или рак печени, клеточно-пролиферативные расстройства, включая новообразования, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, артрит, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, модуляцию агрегации, опосредуемой тромбоцитами, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждения головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; нарушения развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и почечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибковые инфекции и паразитарные инфекции, ювенильный гиалиновый фиброматоз (ЮГФ), детский системный гиалиноз (ДСГ), болезнь фон Виллебранда, миопатия Бетлема, дистрофический буллузный эпидермолиз, аутоиммунные заболевания и воспаления.
    44. Способ по п.43, согласно которому для лечения заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена у пациента, страдающего указанным заболеванием, ниже, чем уровень указанной экспрессии у здорового пациента, данному пациенту вводят молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, которые являются агонистами.
    45. Способ по п.43, согласно которому для лечения заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена у пациента, страдающего указанным заболеванием, выше, чем уровень указанной экспрессии у здорового пациента, данному пациенту вводят молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, которые являются антагонистами.
    46. Способ лечения заболевания у пациента, включающий в себя введение указанному пациенту полипептида по любому из пп.1-18, лиганда по п.25 или 26 или фармацевтической композиции по п.39,
    - 62 013251 где заболевание выбрано из группы, включающей воспалительные заболевания кишечника, заболевания, ассоциированные с токсинами, предпочтительно ассоциированные с бактериальными токсинами, заболевания, ассоциированные с сибирской язвой или с ботулиническим токсином С2 клостридий, рак, кожные болезни, воспаления, болезнь Крона, язвенный колит, псориаз, контактный дерматит, атопическая экзема, рак кровеносной и лимфатической систем, рак кожи, рак пищеварительной системы, рак мочевыделительной системы, рак молочной железы, рак яичника, рак женских половых органов, хориокарцинома, рак легких, опухоли головного мозга, опухоли кости, карциноидная опухоль, рак ободочной кишки, рак носоглотки, опухоль эндотелия, рак мочевого пузыря, рак пищевода, ретроперитонеальные саркомы, опухоли мягких тканей, рак щитовидной железы, рак яичек или рак печени, клеточно-пролиферативные расстройства, включая новообразования, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, артрит, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, модуляцию агрегации, опосредуемой тромбоцитами, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждения головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; нарушения развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и почечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибковые инфекции и паразитарные инфекции, ювенильный гиалиновый фиброматоз (ЮГФ), детский системный гиалиноз (ДСГ), болезнь фон Виллебранда, миопатия Бетлема, дистрофический буллузный эпидермолиз, аутоиммунные заболевания и воспаления.
    47. Способ по п.46, согласно которому для лечения заболеваний, при которых уровень активности указанного полипептида у пациента, страдающего указанным заболеванием, ниже, чем уровень указанной активности у здорового пациента, данному пациенту вводят полипептид, лиганд или композицию, которые являются агонистами.
    48. Способ по п.46, согласно которому для лечения заболеваний, при которых уровень активности указанного полипептида у пациента, страдающего указанным заболеванием, выше, чем уровень указанной активности у здорового пациента, данному пациенту вводят полипептид, лиганд или композицию, которые являются антагонистами.
    49. Способ мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, предусматривающий мониторинг уровня экспрессии или активности полипептида по любому из пп.1-18 или уровня экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22 в ткани указанного пациента за определенный период времени, где изменение указанного уровня экспрессии или активности за определенный промежуток времени по сравнению с контрольным уровнем является показателем рецидива указанного заболевания.
    50. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, предусматривающий приведение в контакт молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22 с одним или несколькими соединениями, предположительно обладающими аффинностью связывания с указанной молекулой нуклеиновой кислоты; и отбор соединения, которое специфически связывается с указанной молекулой нуклеиновой кислоты.
    51. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, предусматривающий приведение в контакт полипептида по любому из пп.1-18 с одним или несколькими соединениями, предположительно обладающими аффинностью связывания с указанным полипептидом; и отбор соединения, которое специфически связывается с указанным полипептидом.
    52. Набор, используемый для диагностики заболевания и включающий в себя первый контейнер, содержащий нуклеиново-кислотный зонд, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации указанной молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию указанных зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания.
    53. Набор по п.52, который дополнительно включает в себя третий контейнер, содержащий агент для гидролиза негибридизованной РНК.
    54. Набор, содержащий массив молекул нуклеиновой кислоты, по меньшей мере одной из которых является молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.19-22.
    55. Набор, включающий в себя одно или несколько антител, связывающихся с полипептидом по любому из пп.1-18, и реагент, используемый для детекции реакции связывания между указанным антителом и указанным полипептидом.
    56. Трансгенное или дефицитное [по данному полипептиду] животное, не являющееся человеком, которое было трансформировано так, что оно экспрессирует более высокие или более низкие уровни полипептида по любому из пп.1-18 или вообще не экспрессирует указанный полипептид.
    - 63 013251
    57. Способ скрининга на соединение, эффективное для лечения заболевания, предусматривающий контактирование трансгенного животного, не являющегося человеком, по п.56 с соединениемкандидатом и оценку эффективности указанного соединения в отношении указанного заболевания у указанного животного.
    58. Применение фармацевтической композиции по п.39 при оплодотворении в пробирке (ΙνΕ) или в качестве контрацептива.
    59. Применение фармацевтической композиции по п.39 при изготовлении контрацептива.
    60. Применение полипептида ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144 в качестве мишени для скрининга лекарственных средств-кандидатов, которые могут быть использованы для лечения или предупреждения расстройства, ассоциированного с белком, содержащим домен ννΕΛ и/или ΛΝΤ_ΙΟ.
    61. Способ отбора биологически активных соединений, предусматривающий:
    (ΐ) контактирование соединения-кандидата с рекомбинантными клетками-хозяевами, экспрессирующими полипептид ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144;
    (ίί) отбор соединений, которые связываются с указанным полипептидом ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144 на поверхности указанных клеток и/или модулируют активность указанного полипептида ΙΝ8Ρ141, ΙΝ8Ρ142, ΙΝ8Ρ143 или ΙΝ8Ρ144.
    Десять лучших результатов поиска с помощью ΙΝ8Ρ141 с использованием βΕ-Λ^Τ]! в неизбыточной базе данных NСВI
    ΪΝ8Ρ141 запрос - ΙΝ3Ρ141 (306 символов )
    База данных асе кодирующие прспедоваП|Льностм наизбыточиой базы СепВапк
    Трансляции еРРВ+ЗихззРгоТ+РИгтРКЕ'
    448 673 символа ; 466 090 050 символов
    Поиск сделан
    Последовательности, обнаруживающие эначительное выравнивание аналогичный гипотетическому Белку ге£|Х₽_113625.3] ге£|Ν₽_766396.1| гипотетический белок 49334Э0Л1 [Миэ тивоиЗив] ...
    Зр|09С252|АТК МО1ЩЕ Предшественник рецептора токсина сибирской язвы (ТигПСГ вПС1О. . , ге£|ХР_132709.1| «£|ΝΡ_444262.1| ге£|ΝΡ 115584.1| ге£|МР_060623 2|
    ОЬ} | ВАС03731 1[ дЬ|ААР04016.1|
    ДБ]|НАА91707.1|
    4Э334Э0Л1 [Нот гипотетический вело* кДНК ΗΙΚΕΝ 2310008Л6 [Миг тиэси1из[ предшественник маркере В опухолевого эндотелиального Белка инофирмы 2.
    предшественник маркера в опухолевого эндотелиального белка кзофориы 1 ; . . .
    предшественник маркера В опухолевого эндотелмальмого белка нзоформы Ϊ , , (Ното зар!епг] нендеетифицировонный белковый продукт
    Капиллярный белок морфогенеза 2 нендаитафнцированный белковый продукт [Ното эарЗепэ) (Ното зар1епв]
    Оценка (биты) вегтичи! Ξ 407 е-113 284 1е-75 225 ЭС’58 225 8е-58 223 4е-57 223 4е-57 223 4е-57 193 Зв'48 193 Зе-48 172 8е-42
    Аналогичный гипотетическому белку
    933430Л1 [Ното вар!елз) длина » 483
EA200700951A 2004-10-28 2005-10-28 БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДОМЕНЫ vWFA И/ИЛИ ANT_IG EA013251B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0423974.5A GB0423974D0 (en) 2004-10-28 2004-10-28 Proteins
PCT/GB2005/004191 WO2006046072A2 (en) 2004-10-28 2005-10-28 VWFA AND/OR ANT&lowbar;IG DOMAIN CONTAINING PROTEINS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200700951A1 EA200700951A1 (ru) 2007-12-28
EA013251B1 true EA013251B1 (ru) 2010-04-30

Family

ID=33515721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200700951A EA013251B1 (ru) 2004-10-28 2005-10-28 БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДОМЕНЫ vWFA И/ИЛИ ANT_IG

Country Status (15)

Country Link
US (1) US8222371B2 (ru)
EP (1) EP1812462A2 (ru)
JP (1) JP2008517616A (ru)
KR (1) KR20070085342A (ru)
CN (1) CN101115767B (ru)
AU (1) AU2005298445B2 (ru)
BR (1) BRPI0517362A (ru)
CA (1) CA2584732A1 (ru)
EA (1) EA013251B1 (ru)
GB (1) GB0423974D0 (ru)
IL (1) IL182749A (ru)
MX (1) MX2007005054A (ru)
NO (1) NO20072076L (ru)
UA (1) UA93661C2 (ru)
WO (1) WO2006046072A2 (ru)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001257445B2 (en) 2000-04-28 2006-11-02 Planet Biotechnology, Inc. Immunoadhesin for the prevention of rhinovirus infection
ES2426194T3 (es) * 2005-08-02 2013-10-21 Planet Biotechnology, Inc. Proteínas quiméricas del receptor de toxina mejoradas y proteínas quiméricas del receptor de toxina para el tratamiento y la prevención de anthrax
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
US8680019B2 (en) * 2007-08-10 2014-03-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin Type III binding-domain libraries
AU2008287426B2 (en) * 2007-08-10 2014-06-26 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
US8759293B2 (en) * 2009-11-13 2014-06-24 Grifols Therapeutics Inc. von Willebrand factor (vWF)-containing preparations, and methods, kits, and uses related thereto
WO2013152351A2 (en) * 2012-04-06 2013-10-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fusion polypeptides and methods of use thereof
RU2013131870A (ru) * 2013-07-11 2015-01-20 Павлов Владимир Игоревич Способ обнаружения наличия, тяжести, риска и предрасположенности к рецидивам, а также лечения и реакции на лечение воспаления мочевыводящих путей и наборы для его описания

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2174845C2 (ru) * 1993-01-26 2001-10-20 Америкэн Хоум Продактс Корпорэйшн Композиции и способы доставки генетического материала
WO2002010217A2 (en) * 2000-08-02 2002-02-07 The Johns Hopkins University Endothelial cell expression patterns
EP1293569A2 (en) * 2001-09-14 2003-03-19 Helix Research Institute Full-length cDNAs
WO2003033515A1 (en) * 2001-10-15 2003-04-24 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of acne vulgaris
US20030144193A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-31 Rottman James B. TANGO 197 and TANGO 216 compositions and methods

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7074913B2 (en) * 2000-12-05 2006-07-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Receptor for B anthracis toxin
WO2004013313A2 (en) * 2002-03-28 2004-02-12 University Of Florida Antisense nucleic acids
WO2004093804A2 (en) 2003-04-18 2004-11-04 Five Prime Therapeutics, Inc. Human polypeptides encoded by polynucleotides and methods of their use
WO2005108415A2 (en) 2004-04-30 2005-11-17 Biogen Idec Ma Inc. Membrane associated molecules

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2174845C2 (ru) * 1993-01-26 2001-10-20 Америкэн Хоум Продактс Корпорэйшн Композиции и способы доставки генетического материала
WO2002010217A2 (en) * 2000-08-02 2002-02-07 The Johns Hopkins University Endothelial cell expression patterns
EP1293569A2 (en) * 2001-09-14 2003-03-19 Helix Research Institute Full-length cDNAs
WO2003033515A1 (en) * 2001-10-15 2003-04-24 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of acne vulgaris
US20030144193A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-31 Rottman James B. TANGO 197 and TANGO 216 compositions and methods

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRADLEY K.A. et al. Anthrax toxin receptor proteins, Biochemical Pharmacology., 2003, v. 65, n. 3, p. 309-314 *
SCOBIE H.M. et al. Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, v. 100, n. 9, p. 5170-5174 *
VENTER J.C. et al. The sequence of the human genome, Science, 2001, v. 291, n. 5507, p. 1304-1351, hGG1982922, Homo sapience, Ôäû EAW53676, obnaruzheno na sayte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&id=119574061 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20090104197A1 (en) 2009-04-23
MX2007005054A (es) 2007-06-19
WO2006046072A3 (en) 2007-01-25
EP1812462A2 (en) 2007-08-01
WO2006046072A2 (en) 2006-05-04
NO20072076L (no) 2007-07-25
AU2005298445B2 (en) 2011-08-25
CN101115767B (zh) 2011-06-22
UA93661C2 (ru) 2011-03-10
KR20070085342A (ko) 2007-08-27
AU2005298445A1 (en) 2006-05-04
BRPI0517362A (pt) 2008-10-07
IL182749A0 (en) 2007-07-24
US8222371B2 (en) 2012-07-17
JP2008517616A (ja) 2008-05-29
GB0423974D0 (en) 2004-12-01
CA2584732A1 (en) 2006-05-04
IL182749A (en) 2012-09-24
EA200700951A1 (ru) 2007-12-28
CN101115767A (zh) 2008-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100607612B1 (ko) 종양의 진단 및 치료를 위한 방법 및 이를 위한 조성물
JPH09509570A (ja) Ｍｔｓ−１遺伝子により転移性癌の診断
JP2002502589A (ja) ４５個のヒト分泌タンパク質
KR20070100235A (ko) 종양의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법
EA013251B1 (ru) БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДОМЕНЫ vWFA И/ИЛИ ANT_IG
JP2005502312A (ja) タンパク質およびそれをコードする核酸
EA007985B1 (ru) Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен
JP2002539773A (ja) 分泌タンパク質およびそれらをコードする核酸
JP2001515349A (ja) Ｔｍ４ｓｆヒト腫瘍関連抗原
US20040010119A1 (en) Novel proteins and nucleic acids encoding same
JP2002500633A (ja) Ｅｄｇ−１様受容体
JP2002505871A (ja) ３１個のヒト分泌タンパク質
EA007611B1 (ru) Белок, имеющий в своей структуре цистиновые узлы
JP2005529153A (ja) 線維芽細胞増殖因子の組成物および使用の方法
EA011261B1 (ru) Гликопротеин клеточной поверхности
JP2003525634A (ja) Ｆｃｔｒｘと命名されたタンパク質およびこれをコードする核酸
JP2004509602A (ja) ポリペプチド、およびそれをコードする核酸
US20030054446A1 (en) Novel retina-specific human proteins C7orf9, C12orf7, MPP4 and F379
JP2002504361A (ja) ３６個のヒト分泌タンパク質
CA2395714A1 (en) Novel tachykinin-like polypeptides and use thereof
JP2003526369A (ja) 新規ポリヌクレオチドおよび同一物をコードする核酸
JP2003527831A (ja) エンドゼピン様ポリペプチドおよびエンドゼピン様ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
US7462447B2 (en) Methods for evaluating susceptibility to a bone homeostasis disorder
JP2002502601A (ja) 樹状富化分泌リンパ球活性化分子
JP2002505104A (ja) レクトメディン物質および方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU