EA011261B1

EA011261B1 - Гликопротеин клеточной поверхности

Info

Publication number: EA011261B1
Application number: EA200700425A
Authority: EA
Inventors: Стефен Фитцджералд; Ричард Фаган; Ядвига Бьенковска; Кристин Пауэр; Мелани Йорке-Смит
Original assignee: Арес Трейдинг С.А.
Priority date: 2004-08-11
Filing date: 2005-08-11
Publication date: 2009-02-27
Also published as: KR20070059085A; US8124748B2; JP4999688B2; BRPI0514268A; JP2008509659A; AU2005270994B2; AU2005270994A1; CA2575596A1; IL181173A0; WO2006016172A3; NO20070780L; UA93658C2; GB0417887D0; US20080124309A1; WO2006016172A2; EP1784421A2; CN101039956A; EA200700425A1; MX2007001543A

Abstract

Настоящее изобретение относится к новому белку, обозначенному в настоящей заявке INSP201 и идентифицированному как гликопротеин клеточной поверхности, и к использованию последовательностей этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты кодирующего гена для диагностики, предупреждения и лечения заболевания.

Description

Настоящее изобретение относится к новому белку, обозначаемому ΙΝ8Ρ201 и идентифицированному в настоящей заявке как гликопротеин клеточной поверхности, и к применению этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащей гены, кодирующие указанный белок, в целях диагностики, предупреждения и лечения заболеваний.

Все цитированные здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин функциональная геномика применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научноисследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных о последовательностях этих белков.

Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков согласно изобретению, позволяют получать окончательные результаты с достаточной высокой степенью достоверности.

Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной.

Введение Секретируемые белки

Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки является главным фактором во многих биологических процессах. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками. Это происходит в результате слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида. Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембрано-связанный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые доставляются в секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или несколько трансмембранных доменов. Примерами сигнального пептида, который играет главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса (адгезивные молекулы), протеазы и факторы роста и дифференцировки.

Описание изобретения

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что полипептид ΙΝ8Ρ201 представляет собой гликопротеин клеточной поверхности.

В одном из вариантов своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО N0:2; 8Е0 ГО N0:4, 8ЕО ГО N0:6, 8Ер ГО N0:8, /ЕО ГО N0:10, /ЕО ГО N0:12, /ЕО ГО N0:14, /ЕО ГО N0:16 и/или /ЕО ГО N0:18;

(ίί) представляет собой ее фрагмент, который является членом семейства гликопротеинов клеточной поверхности или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (ί), или (ш) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (п).

Предпочтительно полипептид согласно первому аспекту изобретения содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:12. Такой предпочтительный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:8.

В соответствии со вторым вариантом своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, состоящему из аминокислотных последовательностей, представленных в 8Е0 ГО N0:2; 8ЕО ГО N0:4, /ЕО ГО N0:6, /ЕО ГО N0:8, /ЕО ГО N0:10, /ЕО ГО N0:12, /ЕО ГО N0:14, /ЕО ГО N0:16 и/или 8Е0 ГО N0:18.

Предпочтительно фрагментом, исключенным из объема настоящего изобретения, является фрагмент, состоящий из первых 79 аминокислот 8Е0 ГО N0:8. Этот фрагмент описан в ОеиРер! NСΒI рег. № АХ884746 и в нижеследующих патентных документах под названием Оеиве!: И820050106595, И86822072, 1Ρ2001269182, 1Ρ2002511259, ЕР1033401, №09953051 и И86783961. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ГО N0:2, будет далее называться полипептидом экзона 1

- 1 011261

ΙΝ8Ρ201. Полипептид, имеющий последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:4, будет далее называться полипептидом экзона 2 ΙΝ8Ρ201. Полипептид, имеющий последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:6, будет далее называться полипептидом экзона 3 ΙΝ8Ρ201. Полипептид, имеющий последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ N0:8, будет далее называться полноразмерным полипептидом ΙΝ8Ρ201.

Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что первые 21 аминокислоты полипептида ΙΝ8Ρ201 образуют сигнальный пептид.

Полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ201, не содержащий этой предполагаемой сигнальной последовательности, представлен в 8Е0 ΙΌ Ν0:10. Полноразмерная последовательность полипептида ΙΝ8Ρ201, не содержащая этой предполагаемой сигнальной последовательности, представлена в 8Е0 ΙΌ Ν0:12.

Полипептид, имеющий последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:10, будет далее называться зрелым полипептидом экзона 1 ΙΝ8Ρ201. Полипептид, имеющий последовательность, представленную 8Е0 ΙΌ Ν0:12, будет далее называться зрелым полипептидом ΙΝ8Ρ201.

В настоящей заявке высказывается предположение, что полипептид ΙΝ8Ρ201 содержит определенное число возможных сайтов Ν-гликозилирования. В соответствии с этим, гликопротеины, содержащие (или состоящие из) полипептид(а) ΙΝ8Ρ201, модифицированный(ого) посредством Ν-гликозилирования в одном, двух, трех, четырех, пяти, шести или семи положениях, соответствующих А8п124, ЛщЕэб. Л5п188. Л5п204. А§п220, А§п250 и Лзп268 8Е0 ΙΌ Ν0:8, являются аспектами настоящего изобретения.

В настоящей заявке высказывается предположение, что полипептид ΙΝ8Ρ201 содержит трансмембранную область, локализованную между остатками 406-427, включительно, последовательности 8Е0 ΙΌ Ν0:8. В соответствии с этим, внеклеточные варианты полипептида ΙΝ8Ρ201 являются аспектами настоящего изобретения. Предпочтительно, чтобы такие варианты включали внеклеточные формы, содержащие, или состоящие из них, аминокислотные остатки 1-405 8Е0 ΙΌ Ν0:8, или остатки 22-405, включительно, последовательности 8Е0 ΙΌ Ν0:8, в их апо- и Ν-гликозилированных формах, описанных выше. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:14, будет далее называться внеклеточным полипептидом ΙΝ8Ρ201. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:18, будет далее называться зрелым внеклеточным полипептидом ΙΝ8Ρ201, и этот полипептид не включает аминокислоты, предположительно, образующие сигнальную последовательность полипептида ΙΝ8Ρ201.

Полипептидные варианты такого типа могут быть, в частности, использованы в скрининг-анализах на лиганды, такие как секретируемые лиганды, связывающиеся с полипептидом ΙΝ8Ρ201 и с другими белками указанного типа. Такие варианты могут быть также использованы для количественной оценки указанных лигандов, например для диагностики заболевания, в патогенезе которых эти лиганды и указанный полипептид играют определенную роль.

Аспектом настоящего изобретения также является внутриклеточный вариант полипептида ΙΝ8Ρ201. Таким вариантом является полипептид, состоящий из аминокислотных остатков 428-518, включительно, последовательности 8Е0 ΙΌ Ν0:8. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ Ν0:16, будет далее называться внутриклеточным полипептидом ΙΝ8Ρ201.

Используемый здесь термин полипептиды ΙΝ8Ρ201 включает полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ201, полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ201, полипептид экзона 3 ΙΝ8Ρ201, полноразмерный полипептид ΙΝ8Ρ201, зрелый полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ201, зрелый полипептид ΙΝ8Ρ201, внеклеточный полипептид ΙΝ8Ρ201, зрелый внеклеточный полипептид ΙΝ8Ρ201 и внутриклеточный полипептид ΙΝ8Ρ201. Все эти полипептиды являются аспектами настоящего изобретения.

В соответствии с вышеупомянутыми вариантами первого аспекта настоящего изобретения предпочтительно, чтобы такой полипептид функционировал как секретируемый белок, в частности как член семейства гликопротеинов клеточной поверхности.

Гликопротеины клеточной поверхности представляют значительный интерес для специалиста в области биологии человека, а значит, и физиологии человека, а также в области здравоохранения. Очевидно, что внешняя поверхность клеточной мембраны играет важную роль в образовании тканей и в сохранении их целостности. Внешние поверхности развивающихся и дифференцированных клеток содержат рецепторные молекулы, распознающие системные сигналы, лиганды или гормоны. Связывание или диссоциация лигандов регулирует некоторые из различных функций клеток и приводит их в соответствие с требованиями всей системы организма. Внешняя поверхность клеток также покрыта гликопротеинами и протеогликанами. Такие крупные комплексы белка и полисахаридов образуют тканеспецифический матрикс, в котором клетки, имеющие аналогичную функцию, могут действовать совместно как единая ткань. При эмбриогенезе сортировка и объединение клеток, имеющих общую функцию, облегчается и, вероятно, регулируется благодаря молекулярной специфичности гликопротеиновых и протеогликановых поверхностей данных клеток.

Углеводные цепи представляют собой гликопротеины, связанные Ν- и О-гликозидными связями и образующие сложные структуры. Фактически, Ν- и О-гликановые цепи формируются в эндоплазматическом ретикулуме и в аппарате Гольджи в результате регулируемого каскада гликотрансферазных и гликозидазных реакций процессинга под влиянием событий специфической регуляции (например, на уровне

- 2 011261 экспрессии гена или локализации фермента). Такая комплексная регуляция приводит к образованию сотен структур, некоторые из которых варьируются, в зависимости от типа клеток/тканей или стадии их развития/дифференцировки.

В настоящее время наблюдается всевозрастающий интерес к заболеваниям, вызываемым нарушением гликозилирования, и к терапевтическим гликопротеинам, продуцируемым методами рекомбинантных ДНК. В частности, патологические клетки могут содержать относительные количества указанных структур, которые в большинстве случаев отличаются от нормальных клеток по своим свойствам и могут быть использованы в целях определения стадии заболевания и в целях диагностики. Информация о структурах гликопротеинов, ассоциированных с данным заболеванием и об их функциях, может быть использована в терапии, например, в иммунотерапии, для блокирования клеточной адгезии или предотвращения других процессов связывания или других биологических процессов (Вгоскйаизеп I. е! а1., Ас!а Апа!. 1998; 161(1-4):36-78; Вйайа Р.К. & Микйорабйуау А., Αάν. Вюсйеш. Епд. Вю1есЬпо1. 1999; 64:155201).

Так, например, была исследована взаимосвязь между характером гликозилирования/экспрессии гликопротеинов и прогрессированием рака/развитием злокачественных заболеваний (Оепшз IV. е! а1., Вюсйепп. Вюрйуз. Ас!а. 1999 Эес. 6; 1473 (1) :21-34) или наследственных заболеваний (Иешиз IV. е! а1., Вюаззауз. 1999 Мау; 21 (5) :412-21).

С учетом того, что гликопротеины обычно экспрессируются в виде смесей гликоформ, были разработаны различные методы получения гомогенных гликопептидных и гликопротеиновых материалов для их использования в экспериментах, проводимых в целях биологического исследования гликопротеинов (Сгодап М.1. е! а1., Аиии.К^.Вюсйет. 2002; 71:593-634).

Многие гликопротеины клеточной поверхности подвергаются ограниченному протеолизу под действием клеточных протеаз. Такой механизм слущивания способствует секреции внеклеточных доменов, которые могут влиять на активность связывания других циркулирующих белков, распознаваемых этими внеклеточными доменами. Фактически, такое слущивание внеклеточных доменов в результате изменения клеточных ответов на экзогенные раздражители приводит к развитию ряда патофизиологических процессов, таких как воспаление, дегенерация и апоптоз клеток, а также онкогенез, как было показано в результате интенсивного исследования систем цитокин/рецептор цитокина (Ми11Ьегд 1. е! а1., Еиг. Су1окше №ΐ\ν. 2000 Маг; 11 (1) :27-38; АгпЬаз 1. & Мег1оз-8иагех А. Сигг. Тор. Эем Вю1. 2003; 54:125-44; Пе11о 8ЬатЬа Р. & Во^ба Е; Вю1. Сйет. 2002 1ап; 383 (1):69-83).

Полипептиды согласно первому аспекту настоящего изобретения могут дополнительно содержать гистидиновую метку. Такая гистидиновая метка предпочтительно присутствует у С-конца данного полипептида. Предпочтительно такая гистидиновая метка содержит 1-10 гистидиновых остатков (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков). Более предпочтительно указанная гистидиновая метка содержит 6 гистидиновых остатков.

Антигенная детерминанта согласно изобретению может представлять собой часть полипептида согласно изобретению, которая связывается с антигенсвязывающим сайтом антитела или с Т-клеточным рецептором (ТСВ). Альтернативно, антигенная детерминанта может представлять собой сайт на поверхности полипептида согласно изобретению, с которым связывается одна молекула антитела. Вообще говоря, антиген имеет несколько или множество различных антигенных детерминант и реагирует с антителами, обладающими множеством различных специфичностей. Такое антитело предпочтительно является иммуноспецифичным к полипептиду согласно изобретению. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным к полипептиду согласно изобретению, который не составляет часть гибридного белка. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным к ΙΝ8Ρ201 или к его фрагменту. Антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и могут иметь специфические трехмерные структуры, а также определенный заряд. Предпочтительно термин антигенная детерминанта означает конкретную химическую группу на полипептиде согласно изобретению, которая является антигенной, то есть вырабатывает специфический иммунный ответ.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид согласно первому аспекту изобретения.

Термин очищенная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно означает молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая (1) отделена, по меньшей мере примерно от 50% белков, липидов, углеводов или других соединений, с которыми ассоциируется природная полноразмерная нуклеиновая кислота при ее выделении из клеток-источников; (2) не связана со всеми полинуклеотидами или с их частью, с которыми указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты ассоциируется в природе, (3) функционально присоединена к полинуклеотиду, с которым она не ассоциируется в природе; или (4) не встречается в природе как часть более крупной полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, по существу, не содержит любой(ых) другой(их) примесной(ых) молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты или других примесей, которые присутствуют в ее природном окружении и могут препятствовать использованию этой нуклеиновой кислоты для продуцирования полипептидов или ее терапевтическому, диагностиче

- 3 011261 скому или профилактическому применению или применению в целях исследования.

Предпочтительный вариант изобретения, в частности, относится к молекулам геномных ДНК, которые не входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительно геномная ДНК, в частности, имеющая размер более чем 10 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов), 50 т.п.н., 100 т.п.н., 150 т.п.н., 200 т.п.н., 250 т.п.н. или 300 т.п.н., не входит в объем изобретения. При этом предпочтительно, если такая очищенная молекула нуклеиновой кислоты состоит только из кДНК.

Предпочтительно очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в 8ЕО ΙΌ N0:1 (кодирующей полипептид экзона 1 ΙΝ8Ρ201), 8ЕО ΙΌ N0:3 (кодирующей полипептид экзона 2 ΙΝ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:5 (кодирующей полипептид экзона 3 ΙΝ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:7 (кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:9 (кодирующей зрелый полипептид экзона 1 ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:11 (кодирующей зрелый полипептид ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:13 (кодирующей внеклеточный полипептид ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:15 (кодирующей внутриклеточный полипептид ΙΜ8Ρ201) или 8Е0 ΙΌ N0:17 (кодирующей зрелый внеклеточный полипептид ΙΜ8Ρ201), или представляет собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из указанных последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:1 (кодирующей полипептид экзона 1 ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:3 (кодирующей полипептид экзона 2 ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:5 (кодирующей полипептид экзона 3 ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:7 (кодирующей полипептид ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:9 (кодирующей зрелый полипептид экзона 1 ΙΜ8Ρ201), 8Е0 Ш N0:11 (кодирующей зрелый полипептид ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:13 (кодирующей внеклеточный полипептид ΙΜ8Ρ201), 8Е0 ΙΌ N0:15 (кодирующей внутриклеточный полипептид ΙΜ8Ρ201) или 8Е0 ΙΌ N0:17 (кодирующей зрелый внеклеточный полипептид ΙΜ8Ρ201), или представляющей собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из указанных последовательностей.

В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х88С (150 мМ №С1, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х 88С приблизительно при 65°С.

Используемый здесь термин функциональный эквивалент означает молекулу белка или нуклеиновой кислоты, обладающую функциональными или структурными свойствами, в основном аналогичными свойствам молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Функциональный эквивалент белка может содержать модификации, если такие модификации необходимы для осуществления конкретной функции. Термин функциональный эквивалент включает фрагменты, мутанты, гибриды, варианты, аналоги или химические производные молекулы.

Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая любой одной или несколькими функциональными активностями полипептидов согласно изобретению.

Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая, по существу, аналогична активности ΙΜ8Ρ201 или его фрагмента, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая идентична активности или превышает активность ΙΜ8Ρ201 или его фрагмента, измеренную в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая составляет 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 100% или более от активности ΙΜ8Ρ201 или его фрагментов, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию.

Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть белок или полипептид, обладающий ίη νίνο или ίη νίΐτο активностью, которая по существу аналогична активности полипептидов согласно изобретению. Предпочтительно функциональным эквивалентом может быть белок или полипептид, способный взаимодействовать с другими клеточными или внеклеточными молекулами по механизму, который, по существу, аналогичен механизму взаимодействия соответствующей части полипептидов согласно изобретению. Так, например, в иммуноанализе, функциональный эквивалент может способствовать снижению способности к связыванию антитела с соответствующим пептидом (то есть, пептидом, имеющим модифицированную аминокислотную последовательность, а поэтому являющимся функциональным эквивалентом) полипептида согласно изобретению или с самим полипептидом согласно изобретению, где указанное антитело вырабатывается против соответствующего пептида полипептида согласно изобретению. Эквимолярная концентрация указанного функционального эквивалента будет снижать уровень вышеупомянутого связывания соответствующего пептида по меньшей мере примерно на 5%, предпочтительно примерно на 5-10%, более предпочтительно примерно на 10-25%, еще

- 4 011261 более предпочтительно примерно на 25-30% и наиболее предпочтительно примерно на 40-50%.

Так, например, функциональные эквиваленты могут быть полностью функциональными, либо у них может отсутствовать одна или несколько активностей. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, модификации могут влиять на функцию, например на активности полипептида, которые подтверждают их идентификацию как гликопротеина клеточной поверхности. В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному вектором четвертого аспекта настоящего изобретения.

В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с членами семейства гликопротеинов клеточной поверхности в соответствии с первым аспектом изобретения. Предпочтительно такой лиганд ингибирует функцию полипептида согласно первому аспекту изобретения, который является членом семейства гликопротеинов клеточной поверхности. Лиганды для полипептидов согласно изобретению могут иметь различные формы, включая природные или модифицированные субстраты, ферменты, рецепторы, небольшие органические молекулы, такие как небольшие природные или синтетические органические молекулы размером для 2000 Да, а предпочтительно 800 Да или менее, пептидомиметики, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, антитела, и их структурные или функциональные миметики.

В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным с точки зрения изменения экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или с точки зрения регуляции активности полипептида согласно первому аспекту изобретения.

Такие соединения могут быть идентифицированы с применением описанных здесь методов анализа и скрининга.

Соединение согласно седьмому аспекту изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида.

Важно отметить, что идентификация функции полипептида ΙΝ8Ρ201 дает возможность, разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. Внеклеточные и внутриклеточные формы полипептида ΙΝ8Ρ201, предположительно, являются особенно подходящими для их применения в способах скрининга их источников. Лиганды и соединения согласно шестому и седьмому аспектам изобретения могут быть идентифицированы с использованием таких способов. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению гена или полипептида ΙΝ8Ρ201 в качестве мишени для скрининга кандидатов на лекарственные средства-модуляторы, а в частности лекарственных средств-кандидатов, обладающих активностью, направленной против расстройств, ассоциированных с гликопротеином клеточной поверхности.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с гликопротеином клеточной поверхности, где указанные способы включают в себя выявление способности указанного соединения связываться с геном или полипептидом ΙΝ8Ρ201 или с их фрагментами.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с гликопротеином клеточной поверхности, где указанные способы включают в себя анализ на модуляцию активности гена или полипептида ΙΝ8Ρ201 или их фрагментов.

В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту настоящего изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту настоящего изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту настоящего изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту настоящего изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту настоящего изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики заболеваний, в патогенезе которых участвуют члены семейства гликопротеинов клеточной поверхности. Такими заболеваниями могут быть клеточно-пролиферативные расстройства, включая новообразование, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительные заболевания кишечника, артрит, псориаз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая расстройства центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждения головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; заболевания дыхательных путей, включая хроническую обструктивную болезнь легких и кистозный фиброз; нарушение развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и по

- 5 011261 чечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибковые инфекции и паразитарные инфекции, и другие патологические состояния. Такими заболеваниями предпочтительно являются заболевания, в патогенезе которых участвуют гликопротеины клеточной поверхности. Эти молекулы могут быть также использованы в целях приготовления лекарственного средства для лечения указанных заболеваний. Такие молекулы могут быть также использованы для контрацепции или для лечения репродуктивных расстройств, включая бесплодие.

Молекулы согласно изобретению (то есть полипептиды согласно первому аспекту изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспектам изобретения, вектор согласно четвертому аспекту изобретения, клетка-хозяин согласно пятому аспекту изобретения, лиганд согласно шестому аспекту изобретения или соединение согласно седьмому аспекту изобретения) могут быть, в частности, использованы для лечения или диагностики расстройств/заболеваний (в данном описании изобретения, эти два термина являются взаимозаменяемыми), включая воспаление, дегенерацию и апоптоз клеток и онкогенез.

В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, включающему в себя оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или оценку активности полипептида согласно первому аспекту изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют ίη νίίτο. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания.

Предпочтительный способ детектирования полипептидов согласно первому аспекту изобретения включает в себя стадии (а) контактирования лиганда согласно шестому аспекту изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лигандполипептид; и (Ь) детектирования указанного комплекса.

Что касается девятого аспекта изобретения, то в этой связи следует отметить, что для детектирования аномальных уровней белка существуют различные методы, известные специалисту, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точковую мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы с использованием антител. Подобные методы могут быть использованы в короткий или продолжительный период времени, что позволяет проводить мониторинг терапевтического лечения заболевания у пациента. Настоящее изобретение относится также к наборам, которые могут быть использованы в указанных методах диагностики заболевания.

В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида согласно первому аспекту изобретения в качестве гликопротеина клеточной поверхности. Подходящим применением полипептидов согласно изобретению в качестве гликопротеинов клеточной поверхности является их использование в качестве регулятора клеточного роста, метаболизма или дифференцировки клеток; в качестве части пары рецептор/лиганд и в качестве диагностического маркера для детектирования физиологического или патологического состояния.

В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно первому аспекту изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектор согласно четвертому аспекту изобретения, или клетку-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганд согласно шестому аспекту изобретения, или соединение согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы в целях приготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, лимфома, миелодиспластические синдромы и карцинома, новообразование, меланома, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи, и другие солидные опухоли, гематологические расстройства, такие как макроглобулинемия, аутоиммунные заболевания и воспалительные расстройства, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз, рассеянный склероз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов, В-клеточные расстройства, сердечно-сосудистые расстройства, неврологические расстройства, нарушения развития, бесплодие, нарушения метаболизма, СПИД, почечное заболевание, инфекции и другие патологические состояния.

В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у

- 6 011261 пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида согласно первому аспекту изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектора согласно четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганда согласно шестому аспекту изобретения, или соединения согласно седьмому аспекту изобретения.

В том случае, если заболевания, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида согласно первому аспекту изобретения, ниже, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, то полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И наоборот, в случае, если заболевания, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида согласно первому аспекту изобретения, выше, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, то полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.

Полипептиды ΙΝ8Ρ201 представляют собой гликопротеины клеточной поверхности, а поэтому, они играют определенную роль в развитии многих патологических состояний. Антагонисты полипептидов ΙΝ8Ρ201 представляют особый интерес, поскольку они позволяют благоприятно воздействовать на динамику патологических состояний.

В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным или к животным, которые являются дефицитными по полипептиду первого аспекта настоящего изобретения и не являются человеком и которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни указанного полипептида или вообще не экспрессируют такого полипептида. Указанные трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики данного заболевания.

Различные стандартные методы и процедуры, которые могут применяться для осуществления изобретения, систематизированы ниже. При этом следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными методами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология применяется только для описания конкретных вариантов изобретения, и эта терминология не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

В настоящем описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.

Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения используются стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области.

Более полное описание указанных методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы в качестве консультации, приводятся в следующих работах: 8атЬгоок, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 8есопб ЕбШоп (1989); ΌΝΑ С1ошпд, Уо1ише8 I апб II (Ό.Ν. С1оуег еб. 1985); О11допис1еоббе 8уп1йек1к (М.1. Сай еб. 1984); М1с1е1с Ас1б НуЬпб1/а6оп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нщщпк ебк. 1984); Тгапкспрбоп апб Тгапк1а1юп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нщщпк ебк. 1984); Атта1 Се11 СиЙиге (Κ.Ι. Егекйпеу еб. 1986); 1ттоЫ11/еб Се11к апб Епхутек (1ВЬ Ргекк, 1986); Β. РегЬа1, А. Ргасбса1 Сшбе 1о Мо1еси1аг С1ошпд (1984); 1йе Ме1йобк ш Епхуто1оду кепек (Асабетю Ргекк, 1пс.), екрес1а11у уо1итек 154 & 155; Сепе ТгапкГег Уес1огк Юг МаттаПап Се11к (1.Н. МШег апб М.Р. Са1ок ебк. 1987, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу); 1ттипосйет1са1 Ме1йобк ш Се11 апб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апб Ша1кег, ебк. 1987, Асабетю Ргекк, Ьопбоп); 8сорек (1987) Рго1еш Ригйюабоп: Рппс1р1ек апб Ргасбсе, 8есопб Ебйюп (8рппдег Уег1ад, Ν.Υ.); и НапбЬоок оГ Ехрептеп1а1 1ттипо1оду, Уо1итек Ι-ΐν (Э.М. Шей апб С.С. В1аск\\'е11 ебк. 1986).

Используемый здесь термин полипептид включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированных пептидными связями, то есть пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам или полипептидам), так и к более длинным цепям (белкам).

Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка, либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препро-белка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препро-части этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах, пре-, про- или препро-последовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность, либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.

Полипептид согласно первому аспекту изобретения может образовывать часть гибридного белка.

- 7 011261

Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, про-последовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, такому как соединение, увеличивающее время полужизни указанного полипептида (например, к полиэтиленгликолю).

Гибридный белок полипептида согласно первому аспекту изобретения может, например, содержать иммуноглобулиновый гибрид, то есть гибридный белок, содержащий весь внеклеточный ΙΝ8Ρ201 (например, ΙΝ§Ρ201-ΕΟ) или его фрагмент, слитый с полноразмерным иммуноглобулином или его частью. Методы получения гибридных белков иммуноглобулина хорошо известны специалистам и описаны, например, в XVО 01/03737. Специалистам в данной области известно, что полученный гибридный белок согласно изобретению, по существу, сохраняет биологическую активность полипептида согласно первому аспекту изобретения, такую, например, как ингибирование 1Ь-2, которое может быть определено в ίη νίίτο анализах, описанных в примере 6, или в анализе на рак, описанном в примере 7, или с использованием животных-моделей воспалительного кишечного заболевания, описанных в примере 8. Указанный гибрид может быть получен путем прямого присоединения компонентов или путем их присоединения посредством короткого линкерного пептида, длина которого может составлять по меньшей мере 1-3 аминокислотных остатка или более, например 5, 7, 9, 11 или 13 аминокислотных остатков. Указанным линкером может быть, например, трипептид с последовательностью Е-Е-М (С1и-Рйе-Ме1) или линкерная последовательность, состоящая из 13 аминокислот и содержащая последовательность С1и-Рйе-С1у-А1аС1у-Ееи-Уа1-Ееи-С1у-С1у-С1п-Рйе-Ме1:, встроенную между полипептидом согласно первому аспекту изобретения и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как более длительное время его присутствия в физиологических жидкостях (время полужизни), повышенная удельная активность, повышенный уровень экспрессии, или способность указанного гибридного белка легко подвергаться очистке.

В предпочтительном варианте изобретения полипептид согласно первому аспекту изобретения присоединяют к константной области молекулы 1д, например к Ее-части иммуноглобулина. Предпочтительно такой полипептид присоединяют к областям тяжелой цепи, таким как домены СН2 и СН3, например, но необязательно, вместе с шарнирной областью человеческого ЦС1. Ес-часть может быть, например, мутирована для предупреждения нежелательных активностей, таких как связывание с комплементом, связывание с Ес-рецепторами или т. п.

Получение специфических гибридных белков, содержащих полипептид согласно первому аспекту изобретения и часть иммуноглобулина, описано, например, в примере 11 заявки ν099/09063. Для получения гибридных белков согласно изобретению могут быть также использованы и другие изоформы 1д, такие как изоформы ЦС₂ или ЦС₄. и изоформы других классов 1д, таких, например, как 1дМ или 1дА. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, а также гетеро- или гомомультимерными.

Другие гибридные белки полипептида согласно первому аспекту изобретения могут быть получены путем присоединения доменов, выделенных из других белков, с образованием димеров, тримеров и т. п. Примерами последовательностей белков, которые могут образовывать мультимеры полипептидов согласно изобретению, являются домены, выделенные из таких белков, как НСС (ν097/30161), коллаген X (νθ 04/33486), С4ВР (νθ 04/20639), белки ЕтЬ (νθ 98/02540) или суперспирализованные пептиды (νθ 01/00814). Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ΑΌΡ-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное связывание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование ΟΡΙякоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование, и убихитинизация.

Модификации могут присутствовать в любой области полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбокси-концы. Действительно, блокирование амино- или карбокси-конца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации

- 8 011261 могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения.

Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев, будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будут определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов (см., например, Вгау 2003, №11. Кеу. Эгид. Э1ксоу. 2(7):587-93; Сай & Нйуей 2003, Сигг. Θρίη. Зйис1. Вю1., 13(5):589-94).

Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептиду ΙΝ8Ρ201. Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином гомологичные, если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин идентичность означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей,эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин сходство означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко вычислена (Сотрц1айопа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьекк А.М., еб., ОхГогб Ишуегкйу Ргекк, №\ν Уогк, 1988; Вюсотрцйпд 1пГогтайск апб Сепоте Рго)ес1к. Зтйй Э.А.. еб., Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, 1993; СотрШег Апа1уйк оГ Зесщепсе Эа1а, Рай 1, СйГйп А.М. & СйГйп Н.С., ебк., Нитапа Ргекк, №\ν 1егкеу, 1994; Зециепсе Апа1уйк ш Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Нещ)е, С. Асабетю Ргекк, 1987; и Зес.|иепсе Апа1уйк Рйтег, СйЬккоу М. & Эеуегенх 1., ебк., М. З1оск1оп Ргекк, №\ν Уогк, 1991).

Поэтому, гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых эти полипептиды происходят) и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептида ШЗР201. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть, остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между А1а, Уа1, Ьеи и 11е; между Зег и ТЬг; между кислотными остатками Акр и С1и; между Акп и С1п; между основными остатками Ьук и Агд; или между ароматическими остатками РЬе и Туг. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, то есть от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота, являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются молчащие замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков имеют группу-заместитель.

В соответствии с настоящим изобретением любая замена должна быть предпочтительно консервативной или допустимой заменой, которую обычно определяют как замену, вводящую аминокислоты, имеющие аналогичные химические свойства (например, основная положительно заряженная аминокислота должна быть заменена другой основной, положительно заряженной аминокислотой), которые являются достаточными для сохранения структуры и биологической функции данной молекулы.

В литературе описано множество моделей, с помощью которых может быть осуществлен отбор консервативных аминокислотных замен, исходя из статистических и физико-химических исследований последовательности и/или структуры белков (Кодоу 3.Ι. и №кгакоу А.№, 2001). Эксперименты по конструированию белков показали, что использование специфических подпоследовательностей аминокислот позволяет продуцировать белки с соответствующей укладкой и активные белки и классифицировать аминокислотные синонимичные замены, которые могут легко адаптироваться к белковой структуре и которые могут быть использованы для детектирования функциональных и структурных гомологов и паралогов (Мцгрйу Ь.К. е1 а1., 2000). Группы синонимичных аминокислот и группы более предпочтительных синонимичных аминокислот представлены в табл. 1.

В полипептиды согласно изобретению также могут быть также введены в различных целях специфические неконсервативные мутации. Мутации, снижающие аффинность гликопротеина клеточной поверхности, допускают возможность повторного использования этих полипептидов, а также их применения в других целях, что потенциально повышает их терапевтическую эффективность (КоЬшкоп С.К., 2002). Иммуногенные эпитопы, фактически присутствующие в полипептидах согласно изобретению, могут быть использованы для разработки вакцин (З1еуапоую З., 2002), либо они могут быть удалены пу

- 9 011261 тем модификации их последовательности известными методами отбора мутаций, повышающих стабильность белка, и их коррекции (уаи беи Вигд В. & Еуыпк V., 2002; XVО 02/05146, ХУО 00/34317 и ХУО 98/52976).

Предпочтительной альтернативой синонимичным группам для аминокислотных производных, включенных в пептидомиметики, являются группы, определенные в табл. 2. Неисчерпывающий список аминокислотных производных также включает аминоизомасляную кислоту (А1Ь), гидроксипролин (Нур), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-СООН, индолин-2-карбоновую кислоту, 4-дифторпролин, Ь-тиазолидин4-карбоновую кислоту, Ь-гомопролин, 3,4-дегидропролин, 3,4-дигидроксифенилаланин, циклогексилглицин и фенилглицин.

Термин аминокислотное производное означает аминокислоту, не входящую в 20 кодируемых генетическим кодом природных аминокислот, или химическую молекулу, подобную такой аминокислоте. В частности, такое аминокислотное производное может содержать замещенные или незамещенные молекулы, молекулы с прямой цепью, молекулы с разветвленной цепью или циклоалкильные молекулы, а также может включать один или несколько гетероатомов. Указанные аминокислотные производные могут быть получены бе ηονο, либо они могут быть взяты из коммерчески доступных источников (Са1Ьюсйеш-НоуаЬюсйеш А.С., 8\\'Ц/ег1апб; Ваейеш, И8А).

Различные методы включения неприродных аминокислотных производных в белки с использованием ίη νίΐτο и ίη νίνο систем трансляции для зондирования и/или улучшения структуры и функции белков описаны в литературе (ΌοιίβΙκΠν Ό.Α., 2000). Методы синтеза и получения пептидомиметиков, а также непептидомиметиков также хорошо известны специалистам (ΌοΕΝο\ν51<ί А. е1 а1., 2001; НгиЬу ν.1. & Ваке Р.М., 2000; Задует Т.К., 81гис1иге Вазеб Эгид Иеыдп, ебОеб Ьу Vее^араηб^аη Ρ., Магсе1 Иеккет 1пс., рд.557-663, 1997).

Обычно считается, что два полипептида, имеющие более чем 30%-ную идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы последовательности функционально эквивалентных полипептидов согласно первому аспекту изобретения были более чем на 80% идентичны последовательности полипептида ΙΝ8Ρ201 или его активных фрагментов. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 85, 90, 95, 98 или 99% соответственно.

Функционально эквивалентными полипептидами согласно первому аспекту изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или нескольких методов структурного сопоставления первичных последовательностей путем их выравнивания. Так, например, технология информационной обработки потока геномных данных Цпрйаттайса Сегюте Тйтеабет™), которая составляет один из аспектов способа поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Вюрепбшт, может быть применена (см. заявку РСТ VО 01/69507) для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности по сравнению с полипептидом ΙΝ8Ρ201, высказывается предположение, что они представляют собой члены семейства гликопротеинов клеточной поверхности, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностью полипептида ΙΝ8Ρ201. Термин значительная структурная гомология означает, что технология 1пр11агтаНса Сегюте Тйтеабет™ позволяет предсказать структурную гомологию двух белков с достоверностью по крайней мере 10% и выше.

Полипептид согласно первому аспекту изобретения также включает фрагменты полипептида ΙΝ8Ρ201 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептида ΙΝ8Ρ201, при условии, что эти фрагменты являются членами семейства гликопротеинов клеточной поверхности или имеют общую антигенную детерминанту с полипептидом ΙΝ8Ρ201.

Используемый здесь термин фрагмент означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей аминокислотной последовательности полипептида ΙΝ8Ρ201, либо одному из его функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать по крайней мере η смежных аминокислот данной последовательности, и в зависимости от конкретной последовательности, указанное число η предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.

Предпочтительно минимальная длина фрагмента согласно изобретению составляет 6, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 аминокислот.

Предпочтительно максимальная длина фрагмента согласно изобретению составляет 517, 515, 510, 500, 475, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 аминокислот.

Предпочтительно минимальная длина молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент согласно изобретению, составляет 18, 30, 75, 150, 300, 450, 600, 750, 900, 1050, 1200, 1350 или 1500 нуклеотидов.

Предпочтительно максимальная длина молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент согласно изобретению, составляет 1551, 1545, 1530, 1500, 1425, 1350, 1200, 1050, 900, 750, 600, 450, 300 или 150 нуклеотидов.

Предпочтительно максимальная длина полипептида согласно изобретению составляет 518, 520, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 или 5000 аминокислот.

- 10 011261

Предпочтительно максимальная длина молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид согласно изобретению, составляет 1554, 1560, 1750, 1800, 1950, 2100, 2400, 2700, 3000, 5000, 7500, 10000, 20000, 30000, 50000, 75000 или 100000 нуклеотидов.

Фрагменты полноразмерного полипептида ΙΝ8Ρ201 могут состоять из комбинаций 2 или всех трех 3 последовательностей смежных экзонов в последовательностях полипептидов ΙΝ8Ρ201, соответственно.

Указанные фрагменты могут присутствовать в свободной форме, то есть они могут не быть частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. Однако в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов.

Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие по крайней мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к таким полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для любого читателя-специалиста, такие антитела помимо других применений могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств.

Термин иммуноспецифический означает, что данные антитела имеют, в основном, более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам, описанным ранее. Используемый здесь термин антитело означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как ЕаЬ, Е(аЬ')₂ и Εν, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения.

Под понятием значительно более высокая аффинность авторы подразумевают заметно более высокую аффинность к полипептиду согласно изобретению по сравнению с аффинностью известных секретируемых белков.

При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду согласно изобретению по меньшей мере в 1,5, 2, 5, 10, 100, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ раз или более превышала аффинность по отношению к известным секретируемым белкам, таким как члены семейства гликопротеинов клеточной поверхности.

При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду согласно изобретению значительно превышала аффинность по отношению к известным гликопротеинам клеточной поверхности.

Если предпочтительными являются поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано полипептидом согласно первому аспекту изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Такой связанный полипептид может быть затем использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией.

Моноклональные антитела против полипептидов согласно первому аспекту изобретения могут быть легко получены специалистом в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии хорошо известна специалистам (см., например, КоЫет С. & Мййеш С, №1иге 256:495-497 (1975); КохЬог е1 а1., 1тшипо1о§у Тобау 4:72(1983); Со1е е1 а1., 77-96, Мопос1опа1 ЛпбЬоб1е8 апб Сапсег Тйетару, А1ап В. Шк, 1пс. (1985)).

Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов согласно первому аспекту изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, то есть на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.

Могут быть также использованы и химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см., например, Ьш е1 а1., Ргос. N311. Асаб. δα. И8А, 84, 3439 (1987)).

Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например путем их гуманизации (см., 1опек е1 а1., №1Шге. 321, 522 (1986); Уетйоеуеп е1 а1., 8с1

- 11 011261 епсе, 239, 1534 (1988); КаЬа! е! а1., 1. 1ттипо1., 147, 1709 (1991); Оиееп е! а1., Ргос. Ыа11. Асай. 8οΐ., И8Л, 86, 10029 (1989); Согтап е! а1., Ргос. Ыа11. Асай. 8сг, И8Л, 88, 34181 (1991) и Нойдкоп е! а1., В|о/Тес1то1оду. 9, 421 (1991)). Используемый здесь термин гуманизованное антитело означает молекулы антитела, в которых аминокислоты СИВ и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом.

В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть биспецифическое антитело, то есть антитело, имеющее два различных антигенсвязывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.

Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами согласно изобретению, либо из набора ПЦР-амплифицированных У-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки необученных лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (МсСайег1у 1. е! а1. (1990), №1иге 348, 552-554; Магкк 1. е! а1., (1992) Вю!есйпо1оду 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также повышена путем перестановки цепей (С1асккоп Т. е! а1., (1991) Ыа!иге 352, 624-628).

Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, то есть они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ЕЫ8Л). Для использования в этих целях антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.

Поликлональные антитела, направленные против полипептида согласно изобретению, обычно вырабатываются у животных (например, у кроликов или мышей) посредством нескольких подкожных или внутрибрюшинных инъекций полипептида ΙΝ8Ρ201 и адъюванта. Может оказаться желательным использовать конъюгат полипептида согласно изобретению с белком-носителем, который является иммуногенным у иммунизуемого животного, таким как гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор соевого трипсина. Кроме того, для усиления иммунного ответа используют агрегирующие агенты, такие как квасцы. После иммунизации у животных берут кровь и сыворотку анализируют на титр антитела против ΙΝ8Ρ201.

Моноклональные антитела, направленные против полипептида согласно изобретению, продуцируют любым методом, который позволяет вырабатывать молекулы антитела путем культивирования непрерывной клеточной культуры. Примерами подходящих методов получения моноклональных антител являются гибридомные методы и метод получения человеческой В-клеточной гибридомы. Настоящее изобретение также относится к гибридомным клеточным линиям, продуцирующим моноклональные антитела, реагирующие с полипептидом ΙΝ8Ρ201.

Моноклональные антитела согласно изобретению могут быть модифицированы для их применения в качестве терапевтических средств. Одним из вариантов является химерное антитело, в котором часть тяжелой (Н) и/или легкой (Ь) цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антител, происходящих от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу, а остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующей последовательности антител, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу. Настоящее изобретение также относится к фрагментам таких антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью.

В другом своем варианте моноклональное антитело согласно изобретению является гуманизованным антителом. Вообще говоря, гуманизованное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в это антитело из источника, не относящегося к человеку. Гуманизация может быть осуществлена, например, методами, известными специалистам, путем замены по меньшей мере одной части гипервариабельной области грызунов соответствующими областями человеческого антитела.

Термин антитело или иммуноглобулин охватывает как поликлональное, так и моноклональное антитело. Предпочтительным антителом является моноклональное антитело, реагирующее с антигеном. Термин антитело также включает смеси более чем одного антитела, реагирующего с антигеном (например, смесь моноклональных антител различных типов, реагирующих с антигеном). Термин антитело также включает полноразмерные антитела, их биологически функциональные фрагменты, одноцепочечные антитела и генетически модифицированные антитела, такие как химерные антитела, содержащие части антител более чем одного вида, бифункциональные антитела, конъюгаты антител, гуманизованные и человеческие антитела. Биологически функциональными фрагментами антител, которые также могут быть использованы, являются пептидные фрагменты антитела, достаточные для связывания с антигеном. Используемый здесь термин антитело включает полноразмерное антитело, а также любые его фрагменты (например, Е(аЬ')₂, ЕаЬ', ЕаЬ, Εν), способные связываться с представляющими интерес эпитопами, антигенами или антигенными фрагментами.

Термин очищенное антитело означает антитело, которое, в основном, не содержит других белков, углеводов и липидов, с которыми оно обычно ассоциируется в природе. Такое антитело преимущест

- 12 011261 венно связывается с полипептидами ΙΝ8Ρ201 согласно изобретению (или с его антигенным фрагментом), то есть, в основном, не распознает и не связывается с другими антигенно неродственными молекулами. Очищенное антитело согласно изобретению является предпочтительно иммунореактивным с ΙΝ8Ρ201 конкретного вида и обладает иммунной специфичностью к ΙΝ8Ρ201 конкретного вида, а более предпочтительно является иммуноспецифичным к нативному человеческому ΙΝ8Ρ201.

Термин специфически связывается означает, что данное антитело связывается со специфическим полипептидом, то есть ΙΝ8Ρ201. с высокой авидностью и/или высокой аффинностью. Связывание антитела со своим эпитопом на этом специфическом полипептиде предпочтительно является более сильным, чем связывание того же самого антитела с любым другим эпитопом. Антитела, которые специфически связываются с ΙΝ8Ρ201. могут связываться и с другими полипептидами на более низком, но еще детектируемом уровне (например, на уровне, составляющем 10% или менее от уровня связывания, наблюдаемого для представляющего интерес полипептида). Такое слабое связывание или фоновое связывание можно легко дифференцировать от специфического связывания антитела с представляющим интерес соединением или полипептидом, например, с использованием соответствующего контроля.

Предпочтительно аффинность антитела по отношению к полипептиду согласно изобретению по меньшей мере в 1,5 , 2,5, 10, 100, 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ или более раз превышает аффинность по отношению к другим известным членам семейства ΙΝ8Ρ201.

Термин генетически модифицированные антитела означает антитела, аминокислотная последовательность которых отличается от последовательности нативного антитела. Благодаря релевантности методов рекомбинантных ДНК согласно изобретению, нет необходимости ограничиваться последовательностями аминокислот, обнаруживаемых в природных антителах, то есть антитела могут быть реконструированы для сообщения им желательных свойств. Возможными изменениями является множество замен, которые варьируются в пределах от замены только одной или нескольких аминокислот до полной реконструкции, например, вариабельной или константной области. Вообще говоря, для улучшения или изменения других свойств, таких как фиксация комплемента, взаимодействие с мембранами или другие эффекторные функции, могут быть сделаны модификации в константной области. Для улучшения антигенсвязывающих свойств могут быть сделаны модификации в вариабельной области.

Термин гуманизованное антитело или гуманизованный иммуноглобулин означает иммуноглобулин, содержащий человеческую каркасную область, и по меньшей мере одну, а предпочтительно все гипервариабельные области (СЭЯ), происходящие от нечеловеческого антитела, где любая присутствующая в иммуноглобулине константная область, по существу, по меньшей мере примерно на 85-90%, а предпочтительно по меньшей мере на 95%, идентична константной области человеческого иммуноглобулина. Следовательно, все части гуманизованного иммуноглобулина, возможно, за исключением СЭЯ, по существу идентичны соответствующим частям одной или нескольких нативных последовательностей человеческого иммуноглобулина. См., например, Оиссп е! а1., патенты США №№ 55301101; 5585089; 5693762 и 6180370 (каждый из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Полностью гуманизованные антитела представляют собой молекулы, содержащие вариабельную и константную область человеческого иммуноглобулина. Полностью гуманизованные антитела могут быть использованы в терапии, где их повторное введение необходимо для лечения хронических и рецидивирующих заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания. Один из методов получения полностью человеческих антител заключается в гуманизации мышиной гуморальной иммунной системы, то есть в продуцировании мышиных штаммов, способных вырабатывать человеческий Ι§ (Хепот1се), путем введения локусов человеческого иммуноглобулина (Ιβ) мыши, у которой были инактивированы эндогенные гены Ιβ. Области Ιβ являются исключительно сложными по своей физической структуре, и для конечного продуцирования иммунного ответа широкого ряда необходимо осуществление процессов реаранжировки и экспрессии генов. Разнообразие антител, главным образом, генерируется путем комбинаторной реаранжировки различных генов V, Ό и 1, присутствующих в локусах Ιβ. Такие локусы также содержат чередующиеся регуляторные элементы, осуществляющие регуляцию экспрессии антител, аллельное исключение, переключение классов и созревание аффинности. Введение неаранжированных трансгенов человеческих Ιβ-трансгенов мышам продемонстрировало, что мышиный механизм рекомбинации совместим с механизмом рекомбинации человеческих генов. Кроме того, гибридомы, секретирующие антигенспецифические человеческие тЛЬ различных изотипов, могут быть получены путем иммунизации мышей Хепотюе антигеном.

Полностью гуманизованные антитела и методы их получения известны специалистам (Мепбех е! а1., №11иге Сепебс8 15:14 6-156 (1997); Виддетапп е! а1., Еиг. 1. Iттиηо1. 21:1323-1326 (1991); Топи/ика е! а1., Вгос. №11. Лсаб. 8с1. И8Л, 97:722-727 (2000), заявка на патент \УО 98/24893).

Термин химерное антитело означает антитело, в котором константная область происходит от антитела одного вида (обычно человеческого антитела), а вариабельная область происходит от антитела другого вида (обычно антитела грызуна). Следовательно, химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которого происходят от животных различных видов, таких как молекулы, имеющие вариабельную область, происходящую от мышиного МаЬ и константную область человеческого им

- 13 011261 муноглобулина. Так, например, при использовании мышиных МаЬ, достигаются более высокие выходы из гибридов, но при этом наблюдается более высокая иммуногенность у человека, а поэтому для снижения иммуногенности и для увеличения выхода продукта, главным образом, используются химерные антитела, такие как человеческие/мышиные химерные МаЬ. Химерные антитела и методы их получения известны специалистам (СаЬШу е! а1., Ргос. Νη!1. Асаб. 8οί. И8А, 81:3273-3277 (1984); Моткои е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8с1. И8А, 81:6851-6855 (1984); ВоиНаиие е! а1., книге 312:643-646 (1984); СаЬШу е! а1., Европейская патентная заявка 125023 (опубликованная 14 ноября, 1984); ЫеиЬегдег е! а1., Ыа1иге 314:268-270 (1985); ТашдисЫ е! а1., Европейская патентная заявка 171496 (опубликованная 19 февраля, 1985); Моткой е! а1., Европейская патентная заявка 173494 (опубликованная 5 марта, 1986); ЫеиЬегдег е! а1., заявка РСТ νθ 8601533 (опубликованная 13 марта, 1986); Кибо е! а1., Европейская патентная заявка 184187 (опубликованная 11 июня, 1986); 8абадаи е! а1., 1. 1ттиио1. 137:1066-1074 (1986); ВоЬшкои е! а1., Международная патентная заявка № νθ 8702671 (опубликованная 7 мая, 1987); Ыи е! а1., Ргос. Νη!1. Асаб. 8сг, И8А, 84:3439-3443 (1987); 8ии е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сг, И8А, 84:214-218 (1987); Вейег е! а1., 8аеисе 240:1041-1043 (1988); Шесйтаии е! а1., книге 332:323-327; и 11аг1о\\ & Ьаие, ΛΝΤΙΒΘϋΙΕδ: А ЬАВОВАΤΘΚΥ МАNυА^, см. выше. Эти публикации во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Используемый здесь термин фрагмент антитела означает молекулу, содержащую часть антитела, способного специфически связываться с антигеном, антигенной детерминантой или эпитопом. Следует отметить, что ЕаЬ и Е(аЬ)₂ и другие фрагменты антител, используемых в настоящем изобретении, могут быть использованы для детектирования и количественной оценки их антигенов методами, описанными здесь для молекул интактных антител. Такие фрагменты обычно получают путем протеолитического расщепления с использованием ферментов, таких как папаин (для получения ЕаЬ-фрагментов) или пепсин (для получения Е(аЬ')₂-фрагментов).

Что касается упомянутых здесь антител, то термин моноклональное антитело включает моноклональные антитела, химерные антитела, полностью гуманизованные антитела, антитела против антиидиотипических антител (анти-анти-1б антитела), которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, полученные любыми известными методами, такими как, но не ограничивающимися ими, ферментативное расщепление, пептидный синтез или методы рекомбинантных ДНК. Моноклональные антитела представляют собой, по существу, гомогенную популяцию антител, специфичных к антигенам, где указанные популяции содержат, в основном, аналогичные эпитопсвязывающие сайты. МаЬ могут быть получены методами, известными специалистам. См., например, работы КоЫег О. & М11к!еш С, книге 256:495-497 (1975); патент США № 4376110; АикиЬе1 е! а1., ебк., Наг1оте & Ьаие, ΛΝΤΙΒΘΌΙΕ8: А ЬАВОКАТОВУ МАNυА^, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу, (1988); и СоШдаи е! а1., ебк., Сигши! Рго!осо1к 1и 1ттиио1оду, Огееие РиЬНксЫид Аккос. аиб \Убеу 1и!егкс1еисе, Ν.Υ. (1992-1996), содержание которых во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Такие антитела могут принадлежать к иммуноглобулинам любого класса, включая 1дО, 1дМ, 1дЕ, 1дА, ΟΙΕΌ и любого подкласса. Гибридома, продуцирующая тАЬ согласно изобретению, может быть культивирована ш уйго, 1и к1!и или 1и у1уо. Благодаря продуцированию высоких титров МаЬ 1и у1уо или ш к1!и, этот метод получения является предпочтительным. Термин моноклональное антитело также означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие, например, как ЕаЬ и Е(аЬ')₂, способные связываться с антигеном. ЕаЬ и Е (аЬ')₂-фрагменты не содержат Ес-фрагмента интактного антитела, более быстро выводятся из кровотока и могут обладать способностью к менее неспецифическому связыванию с тканями, чем интактное антитело ^аЫ е! а1., 1. Кис1. Меб. 24:316-325 (1983)).

Считается, что моноклональное антитело способно связываться с молекулой, если оно способно специфически реагировать с указанной молекулой, и если такая реакция приводит к связыванию данной молекулы с антителом.

Антиген представляет собой молекулу или часть молекулы, способную связываться с антителом, где указанный антиген, кроме того, обладает способностью индуцировать у животного вырабатывание антитела, способного связываться с эпитопом такого антигена. Антиген может иметь один или несколько эпитопов. Упомянутый выше термин специфическая реакция означает, что указанное антитело реагирует с высокой степенью селективности с эпитопом на соответствующем антигене, но не с множеством других антигенов, индуцирующих вырабатывание других антител.

Эти антитела, включая фрагменты антител, используемые в настоящем изобретении, могут быть применены для количественной или качественной оценки их антигенов в образце, или для детектирования присутствия клеток, экспрессирующих свои антигены. Такая оценка может быть осуществлена иммунофлуоресцентными методами с использованием флуоресцентно меченого антитела (см. ниже) в комбинации с флуоресцентной микроскопией, проточной цитометрией или флуориметрического детектирования.

Антитела (или их фрагменты), используемые в настоящем изобретении, могут быть применены для гистологического анализа, а также в иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, для 1и к1!и детектирования их антигенов. Детектирование 1и кйи может быть осуществлено путем забора гистологического образца у пациента и обработки такого образца меченым антителом согласно изобрете

- 14 011261 нию. Это антитело (или фрагмент) предпочтительно добавляют к биологическому образцу, либо на этот биологический образец наносят меченое антитело (или его фрагмент). Путем осуществления такой процедуры может быть определено не только присутствие данных антигенов, но также и их распределение в рассматриваемой ткани. Для среднего специалиста совершенно очевидно, что для осуществления ίη Ши детектирования с помощью настоящего изобретения могут быть применены любые модифицированные методы гистологических анализов (таких как процедуры окрашивания) широкого ряда.

Такие анализы на присутствие антигенов обычно включают инкубирование биологического образца, такого как биологические жидкости, тканевые экстракты, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в тканевой культуре в присутствии меченого антитела, способного идентифицировать антигены, и детектирование антитела любыми методами, хорошо известными специалистам.

Биологический образец может быть иммобилизован на твердофазной подложке или на носителе, таком как нитроцеллюлоза, или на другой твердофазной подложке или на другом носителе, способном иммобилизовывать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Затем такая подложка или носитель могут быть промыты подходящими буферами, а затем обработаны меченым антителом согласно изобретению, как было упомянуто выше. Затем твердофазная подложка или носитель могут быть промыты буфером второй раз для удаления несвязанного антитела. Количество несвязанной метки на указанной твердой подложке или на носителе может быть затем оценено стандартными методами.

Молекула антитела согласно изобретению может быть адаптирована для использования в иммунометрическом анализе, также известном как двухсайтовый или сэндвич-анализ. В типичном иммунометрическом анализе, определенное количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) иммобилизуют на твердой подложке или на твердом носителе и добавляют определенное количество детектируемо меченого растворимого антитела, что позволяет детектировать и/или количественно оценивать трехкомпонентный комплекс, образованный антителом, иммобилизованном на твердофазном носителе, антигеном и меченым антителом.

Антитела согласно изобретению могут быть использованы в комбинации с методами иммуноаффинной хроматографии. Более конкретно, такие антитела могут быть помещены на поверхность материала в хроматографической колонке. Затем, очищаемая композиция может быть пропущена через указанную колонку. Если очищаемый образец включает любые полипептиды ΙΝ8Ρ201, которые связываются с антителами, то такие полипептиды ΙΝ8Ρ201 могут быть удалены из образца, а затем очищены.

Следовательно, в целом, методы диагностики могут быть осуществлены ίη νίίτο с использованием клеточного образца (например, пробы крови, биоптата лимфоузлов или ткани), выделенного у млекопитающего, либо они могут быть осуществлены путем ίη νίνο визуализации.

Композиции, содержащие антитела согласно изобретению, могут быть использованы для детектирования присутствия ΙΝ8Ρ201, например, с помощью радиоиммуноанализа, ЕЫ8Л, РЛС8 и т.п. Одна или несколько молекул-меток могут быть присоединены к гуманизованному иммуноглобулину. Примерами молекул-меток являются красители, непроницаемые для рентгеновских лучей, рентгеноконтрастное вещество, флуоресцентные молекулы, спин-меченые молекулы, ферменты и другие молекулы-метки, используемые в диагностике, а в частности, в радиологических методах или в методах визуализации с помощью магнитного резонанса.

Препараты антител 1дО согласно изобретению могут быть преимущественно выделены из антисыворотки согласно изобретению путем аффинной очистки, предпочтительно посредством О-белокиммунопреципитации. Антисыворотка, полученная от иммунизованного животного, может быть использована для детектирования с оптимальной чувствительностью посредством вестерн-иммуноблот-анализа, иммунопреципитации и ЕЬ18Л-анализа полипептидов ΙΝ8Ρ201.

В общих чертах, очищенное антитело или фрагмент антитела согласно изобретению, способное(ый) специфически связываться с антигеном-мишенью, обычно являются оптимальными с точки зрения репродуцируемости, стандартизации или точности детектирования по сравнению с неочищенным препаратом согласно изобретению.

Для среднего специалиста в данной области очевидно, что указанное антитело или фрагмент, имеющее(ий) аффинность, определяемую константой диссоциации, составляющей до 10^-12 для когнатного антигена, может быть получено стандартными методами.

Как было описано выше, указанный препарат может преимущественно содержать антитело или фрагмент антитела, присоединенные к детектируемой молекуле любого типа.

Фрагмент антитела имеет то преимущество, что его размер меньше, чем размер родительского антитела, от которого он происходит, но при этом он сохраняет, по существу, такую же специфичность связывания с антигеном-мишенью, либо такую же специфичность и аффинность связывания, как родительское антитело. Таким образом, благодаря тому, что фрагмент антитела имеет меньший размер, чем родительское антитело, он будет, в основном, иметь гораздо лучшее биологическое распределение в ткани и лучшие диффузные свойства (например, в системе ίη νίνο или в выделенных тканях), чем родительское антитело. Фрагмент антитела, в котором, по существу, отсутствует Рс-область, такой как одноцепочечный Ρν-, РаЬ'-, РаЬ- и Р(аЬ')₂-фрагмент или СОЯ, является предпочтительным для использования в

- 15 011261 целях обработки данного препарата молекулой, способной специфически связываться с такой Есобластью, и в тех случаях когда такое связывание является нежелательным. Обычно такими случаями являются нежелательное связывание Ес-области с когнатным Ес-рецептором, или связывание Ес-области с компонентом комплемента (например, с компонентом С1с.| комплемента, присутствующего в сыворотке). Ес-рецепторы присутствуют на поверхности иммунных клеток многих типов, включая специализированные АПК, такие как дендритные клетки; В-лимфоциты и гранулоциты, такие как нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты, макрофаги и тучные клетки. Таким образом, отсутствие Ес-области во фрагменте антитела может быть особенно предпочтительным для предотвращения нежелательной активации иммунных клеток, опосредуемой Ес-рецептором, или нежелательного каскада реакций активации комплемента, опосредуемых компонентом комплемента, а в частности, при введении указанного препарата индивидууму ίη νίνο.

Е(аЬ')₂ представляет собой фрагмент молекулы антитела, содержащий двухвалентную антигенсвязывающую часть молекулы антитела.

Е(аЬ')₂-препарат согласно изобретению может быть соответствующим образом получен стандартными методами путем обработки указанного препарата антитела, такого как антисыворотка согласно изобретению, ферментом пепсином. Полученный Е(аЬ')₂-продукт представляет собой частицу 58.

ЕаЬ- или ЕаЬ' представляет собой фрагмент молекулы антитела, содержащий одновалентную антигенсвязывающую часть молекулы антитела.

СОВ может быть генерирована, как описано в ЕР0585939 или как описано у 81:гапбЬегд с1 а1. (Ρτοΐβίη Епд. 2001 ί;·ιη; 14 (1):67-74). СОВ согласно изобретению может представлять собой модифицированную СОВ, которая оказывает значительное влияние на модуляцию полипептида ΙΝ8Ρ201. Методы модификации активных пептидов описаны, например 8а\га е1 а1. 1999 (I. Меб. СНет. 42, 3289-3299).

ЕаЬ'-препарат согласно изобретению может быть легко получен стандартными методами путем обработки антителосодержащего препарата согласно изобретению ферментом пепсином с последующим проведением реакции восстановления с получением Е(аЬ')₂. Такое восстановление может быть осуществлено с использованием тиолового восстановителя и с использованием, но необязательно, группы, блокирующей сульфгидрильные группы, полученные в результате расщепления дисульфидных связей. В результате такой обработки получают два моновалентных 3,58 ЕаЬ-фрагмента и Ес-фрагмента.

ЕаЬ-препарат может быть легко получен стандартными методами путем обработки антителосодержащего препарата согласно изобретению, такого как антисыворотка согласно изобретению, ферментом папаином с получением интактной легкой цепи и части тяжелой цепи, состоящей из вариабельного домена и С_н1-домена.

Полное описание генерирования фрагмента антитела путем ферментативной обработки антитела имеется в специальной литературе (см., например, Оо1бепЬегд, патенты США №№ 4036945 и 4331647; ΡοιΒγ В.В., 1959. БюсЬеш I. 73:119-126).

Одноцепочечный Еν-фрагмент (также обозначаемый в литературе 5сРу) представляет собой одноцепочечную молекулу, включающую вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, соединенные подходящим полипептидным линкером.

Е(аЬ')₂-, ЕаЬ'-, ЕаЬ-, 5сРу- или СОВ-препарат согласно изобретению может быть получен методами рекомбинантных ДНК.

Рекомбинантный фрагмент антитела получают путем выделения мРНК из В-лимфоцитов животных, иммунизованных антигеном-мишенью; продуцирования кДНК из мРНК посредством ОТ-ПЦР; и использования указанной кДНК для конструирования библиотеки фагового представления фрагментов антитела. В-лимфоциты могут быть соответствующим образом выделены из селезенки или, альтернативно, из крови, костного мозга или лимфатических узлов иммунизованного животного.

При этом следует отметить, что вышеописанная методика может быть применена для получения препарата, содержащего фрагмент моноклонального антитела согласно изобретению, обладающий, по существу, любой желательной аффинностью и/или специфичностью связывания с антигеном-мишенью. Такой препарат может быть использован в различных целях, при которых предпочтительно использовать реагент, способный связываться с антигеном-мишенью с определенными параметрами связывания.

Поскольку ЕаЬ' имеет структуру, по существу аналогичную структуре ЕаЬ, то препарат настоящего изобретения, содержащий ЕаЬ', может быть использован, в основном, в таких же целях, как препарат, содержащий ЕаЬ, где указанные ЕаЬ'- и ЕаЬ-фрагменты содержат по существу аналогичные вариабельные области тяжелой и легкой цепи. В данном случае, в зависимости от конкретного применения, препарат согласно изобретению, содержащий фрагмент антитела, способный связываться с антигеном-мишенью с максимальной аффинностью, то есть Е (аЬ)2-препарат, согласно изобретению может обладать значительно большим преимуществом по сравнению с ЕаЬ-, ЕаЬ'- или 5сРу-препаратами согласно изобретению, поскольку, в отличие от одновалентного связывания указанного одновалентного фрагмента антитела, Е (аЬ)₂-препарат обладает двухвалентным связыванием с антигеном-мишенью.

Как было упомянуто выше, в зависимости от применения и цели этого применения, препарат, содержащий антитело или его фрагмент, может быть получен от млекопитающего любого вида.

Препарат, содержащий антитело или его фрагмент согласно изобретению, происходящих от млеко

- 16 011261 питающего нужного вида, может быть выделен из сыворотки животного такого вида, иммунизованного антигеном-мишенью.

Препарат согласно изобретению, содержащий человеческое или гуманизованное антитело или его фрагмент, может быть предпочтительным для его применения, предусматривающего введение препарата индивидууму. Так, например, человеческое или гуманизованное антитело или его фрагмент обычно имеют оптимальную иммунологическую переносимость, а поэтому они имеют оптимальное время полужизни ίη νίνο у человека и тем самым обладают оптимальной эффективностью. Дополнительное описание получения и применения человеческих или гуманизованных антител приводится ниже.

Данный препарат может быть использован рег §е, либо он может быть получен в виде активного ингредиента, входящего в состав фармацевтической композиции.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и, в качестве активного ингредиента, антитело или фрагмент антитела согласно изобретению.

Способы получения фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент согласно изобретению в качестве активного ингредиента, и способы применения такой фармацевтической композиции описаны ниже.

Доставку антитела или его фрагмента предпочтительно осуществляют путем введения фармацевтической композиции согласно изобретению, содержащей антитело или его фрагмент согласно изобретению в качестве активного ингредиента.

Указанное антитело или его фрагмент предпочтительно вводят в целях достижения уровня фрагмента антитела, связанного с антигеном-мишенью, достаточного для достижения желательной регуляции биохимической активности.

Средний специалист в данной области, такой как лечащий врач, а более предпочтительно врачспециалист по данному заболеванию, может самостоятельно провести требуемое обследование в целях определения подходящей схемы терапии, включая подходящий способ введения и подходящую дозу антитела или его фрагмента, эффективную для лечения заболевания в соответствии с настоящим изобретением.

Как было описано выше, антиген-мишень (то есть ΙΝ8Ρ201), который представляет собой полипептид, может быть получен различными способами.

Предпочтительно такой антиген-мишень получают стандартным методом химического синтеза.

Указанный антиген-мишень может быть химически синтезирован, например, стандартными методами твердофазного синтеза. Такими методами являются исключительный твердофазный синтез, частичный твердофазный синтез, фракционированная конденсация и классический синтез в растворе. Процедуры твердофазного полипептидного синтеза хорошо известны специалистам [см., например, 81е\гаП е1 а1., 8оНб Рйаке Рерббе ЗупШекщ, 2пб еб., Р1егсе Сйеш1еа1 Сотрапу, (1984)].

Синтезированный полипептид может быть очищен с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии, описанной СгефЫоп Т. |Рго1е1п. 51гис1иге5 апб то1еси1аг рппс1р1е8, XV.Н. Ргеетап апб Со. Ν.Υ. (1983)], а его аминокислотная последовательность может быть подтверждена стандартными методами секвенирования аминокислот.

Как было описано выше, указанный препарат предпочтительно получают путем иммунизации млекопитающего указанным антигеном-мишенью.

Получение препарата ш νί\Ό может быть преимущественно осуществлено путем повторной инъекции млекопитающему антигена-мишени в присутствии адъюванта в соответствии со схемой введения, предусматривающей бустер-стимуляцию продуцирования антител в сыворотке. В случае, если данный антиген-мишень слишком мал для вырабатывания адекватного иммуногенного ответа (называемый в литературе гаптеном), то такой гаптен может быть присоединен к антигенно нейтральному носителю, такому как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) или сывороточный альбумин [например, альбумин бычьей сыворотки (В8Л)] (см., например, патенты США №№ 5189178 и 5239078). Присоединение гаптена к носителю может быть осуществлено различными методами, хорошо известными специалистам, так, например, может быть осуществлено прямое присоединение к аминогруппам, с последующим, но необязательным, восстановлением образующейся имино-связи. Альтернативно, данный носитель может быть присоединен с использованием конденсирующих агентов, таких как дициклогексилкарбодиимид или другие карбодиимидные дегидратирующие агенты. Для такого присоединения могут быть также использованы линкерные соединения, а именно могут быть использованы гомобифункциональные и гетеробифункциональные линкеры, поставляемые фирмой Р1егсе С11е1шса1 Сотрапу, РоскГогб, III. Полученный иммуногенный комплекс может быть затем инъецирован подходящим млекопитающим, таким как коровы, овцы, мыши, кролики и т.п. После вырабатывания антитела ш νί\Ό его титр в сыворотке млекопитающего-хозяина может быть легко определен в соответствии с процедурами иммуноанализов, хорошо известными специалистам в данной области.

Как было описано выше, указанный препарат может преимущественно содержит гуманизованное антитело или его фрагмент.

Гуманизованные антитела или их фрагменты представляют собой генетически сконструированные

- 17 011261 химерные антитела или их фрагменты, имеющие предпочтительно минимальные части, происходящие от нечеловеческих антител. Гуманизованными антителами являются антитела, в которых гипервариабельные области человеческого антитела (антитела-реципиента) заменены остатками гипервариабельной области нечеловеческого антитела (донорного антитела), такого как мышиного, крысиного или кроличьего антитела, обладающего нужными функциональными свойствами. В некоторых случаях каркасные остатки Εν человеческого антитела заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Гуманизованные антитела могут также содержать остатки, не присутствующие в последовательностях антителареципиента, в импортной гипервариабельной области или в каркасной области. В общих чертах, гуманизованное антитело может содержать, по существу, все или по меньшей мере один, а обычно два вариабельных домена, в которых все или, в основном, все гипервариабельные области соответствуют областям нечеловеческого антитела, а все или почти все каркасные области соответствуют областям релевантной человеческой консенсусной последовательности. В оптимальном случае гуманизованные антитела также включают по меньшей мере часть константной области антитела, такой как Ес-область, обычно происходящую от человеческого антитела (см., например, боиек е! а1., №!иге, 321, 522 (1986); Шесйтаии е! а1., №11иге 332:323-329 и Ргекба, 1992, Сигг. 0р. 8бгис!. Вю1. 2:593-596). Методы гуманизации не-человеческих антител или их фрагментов хорошо известны специалистам. В общих чертах, гуманизованное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, не являющегося человеком. Такие нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют импортными остатками, которые обычно происходят от импортного вариабельного домена. Гуманизация может быть осуществлена, по существу, как описано в литературе (см., например, боиек е! а1., №11иге 321, 522 (1986); Шесйтапп е! а1., 1988. №!иге, 332:323-327, УегНоеуеи е! а1., 8с1еисе, 239:1534-1536; патент США № 4816567) путем замены человеческих гипервариабельных областей соответствующими гипервариабельными областями грызунов. В соответствии с этим, такими гуманизованными антителами являются химерные антитела, где вариабельный домен, который, по существу, меньше вариабельного домена интанктного человеческого антитела, заменен соответствующей последовательностью, происходящей от нечеловеческого антитела. Практически, гуманизованными антителами, в основном, могут быть человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельной области, а возможно и некоторые остатки каркасной области заменены остатками, происходящими от аналогичных сайтов антител грызунов. Человеческие антитела или их фрагменты могут быть также получены различными методами, известными специалистам, включая конструирование библиотек фагового представления [см., например, НоодеиЬоот & №т!ег, 1991. 1. Мо1. Вю1. 227:381; Магкк е! а1., 1991. 1. Мо1. Вю1. 222:581; Со1е е! а1., Моиос1оиа1 Аи!1Ьоб1е8 аиб Саисег ТНегару, А1аи В. Ь158, рр. 77 (1985); Воегиег е! а1. 1991. б. ^тииоЕ, 147:86-95). Гуманизованные антитела могут быть также получены путем введения последовательностей, кодирующих области человеческого иммуноглобулина, трансгенным животным, например мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. После антигенной стимуляции продуцирование человеческого антитела наблюдалось у таких животных, которые во всех отношениях имели сходство с человеком, включая реаранжировку генов, сборку цепей и репертуар антител. Полное руководство по осуществлению такой технологии приводится в литературе (см., например, патенты США №№ 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016; Магкк е! а1., 1992. Вю/ТесЬпо1о§у 10:779-783; ЬоиЬегд е! а1., 1994. №11иге 368:856-859; Моткои, 1994. №11иге 368:812-13; ΕΐδΗ^ϋά е! а1., 1996. №11иге Вю!есйио1о§у, 14:845-51; №иЬегдег 1996. №11иге Вю!есйио1о§у, 14:826; ЬоиЬегд & Никхаг, 1995. бЛет. Вет. Iттиио1. 13:65-93).

Антитела-антагонисты против мембрано-связанного Ш8Р201 могут быть использованы для лечения воспалительных и/или аутоиммунных расстройств.

Антитела-агонисты против мембрано-связанного Ш8Р201 могут быть использованы для лечения рака, ВИЧ- и/или ЕВУ-инфекций и гепатита В.

Активность антител против Ш8Р201 может быть продемонстрирована в анализах и/или на животных-моделях, как описано в примерах 6-8.

Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты согласно второму и третьему аспекту изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидные последовательности, представленные в 8ЕО ΙΌ N0:2, /ЕС) ΙΌ N0:4, /ЕС) ΙΌ N0:6, /ЕС) ΙΌ N0:8, /ЕС) ΙΌ N0:10, /ЕС) ΙΌ N0:12, /ЕС) ΙΌ N0:14 и/или 8Е0 ΙΌ N0:16 или 8Е0 ΙΌ N0:18, и функционально эквивалентные полипептиды. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и в целях, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению предпочтительно содержат по крайней мере и смежных нуклеотидов в описанных здесь последовательностях, где и в зависимости от конкретной последовательности предпочтительно равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).

Молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению также являются последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов).

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие

- 18 011261 молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек или выделение из соответствующего организма. РНК-молекулы могут быть, в основном, генерированы путем ίη νίΐτο- или ίη νίνο-транскрипции ДНК-последовательностей.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью.

Термин молекула нуклеиновой кислоты также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (ΡΝΑ). Используемый здесь термин ΡΝΑ означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по крайней мере из пяти нуклеотидов и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Этот концевой лизин сообщает данной композиции растворимость. ΡΝΑ могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно связываются с комплементарной одноцелочечной ДНК и РНК и прекращают элонгацию транскрипта (Νίοίδοη Ρ.Ε. е1 а1. (1993) ЛпОсапсег Эгид Эек. 8:53-63).

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно изобретению, может быть идентична кодирующей последовательности одной или нескольких описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты.

Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид, представленный в любой из последовательностей 8ЕЦ ΙΌ Ν0:2, δΕΟ ΙΌ Ν0:4, 8Ер ΙΌ Ν0:6, 8Ер ΙΌ Ν0:8, δΕΟ ΙΌ Ν0:10, δΕΟ ΙΌ Ν0:12, δΕΟ ΙΌ Ν0:14 и/или δΕΟ ΙΌ Ν0:16 или δΕΟ ΙΌ Ν0:18. Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, но не ограничиваются ими, последовательность, кодирующая только зрелый полипептид; последовательность, кодирующая зрелый полипептид, и дополнительные кодирующие последовательности, такие как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препро-полипептидную последовательность; последовательность, кодирующая зрелый полипептид с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями или без них, либо вместе с другими дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и 3'последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации), в связывании с рибосомой и в обеспечении стабильности мРНК. Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть также вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму и третьему аспектам изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов согласно первому аспекту изобретения. Указанная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо такая молекула может представлять собой вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, к клеткам или к целым организмам.

Среди рассматриваемых вариантов имеются варианты, которые отличаются от вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Такие замены, делеции или инсерции могут быть сделаны в одном или нескольких нуклеотидах. Указанные варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также сконструированы методами, в основном, известными специалистам, включая, в зависимости от целей применения, модификацию клонирования, процессинг и/или экспрессию генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т.п.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид согласно первому аспекту изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы полученная комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным осуществление экспрессии гибридного белка, который может распознаваться коммерчески доступным антителом.

- 19 011261

Гибридный белок может быть также сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, локализованный между последовательностью полипептида согласно изобретению и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка.

Молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также антисмысловые молекулы, которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды согласно изобретению, а поэтому они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (гибридизация). В соответствии с методами, известными среднему специалисту в данной области, такие антисмысловые молекулы, например олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид согласно изобретению, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и, тем самым, предотвращали ее транскрипцию (см., например, Сойеп 1.8., Тгепбз ш Рйатт. 8οΐ., 10, 435 (1989), Окапо, 1. №игосйет. 56, 560 (1991); О'Соппог, 1. №игосйет 56, 560 (1991); Ьее е! а1., М.1с1е1с Ас1бз Вез 6, 3073 (1979); Соопеу е! а1., 8с1епсе 241, 456 (1988); Эегоап е! а1., 8с1епсе 251, 1360 (1991)).

Используемый здесь термин гибридизация означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут быть подвергнуты контакту друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или ВЬОТТО); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (8атЬтоок е! а1., [см. выше]).

Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного специалистам (8атЬтоок е! а1. [см. выше]). В высокой степени гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у VаЫ С.М. и 8.Ь. Вегдег (1987; Ме!йобз Епхуто1. 152:399-407) и К1тте1 А.В. (1987; МеШобз Епхуто1. 152:507-511).

Термин жесткость означает условия реакции гибридизации, которые благоприятствуют ассоциации молекул с большим сходством, но не способствуют ассоциации отличающихся молекул. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х88С (150 мМ №С1, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х 88С приблизительно при 65°С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35°С (8атЬтоок е! а1. [см. выше]). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.

В предпочтительных вариантах этого аспекта, настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ201, и к молекулам нуклеиновой кислоты, которые, в основном, комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая по всей своей длине по меньшей мере на 80% идентична такой кодирующей последовательности, либо чтобы молекула нуклеиновой кислоты была комплементарна указанной молекуле. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, а особенно предпочтительно по меньшей мере на 98%, 99% или более идентичны указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают, в основном, такой же биологической функцией или активностью, как и полипептид ΙΝ8Ρ201.

Настоящее изобретение относится к способу детектирования молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, включающему стадии: (а) контактирования нуклеинового зонда согласно изобретению с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (Ь) детектирования любого из таких образованных дуплексов.

Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептид ΙΝ8Ρ201, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид.

В этой связи наряду с другими известными методами могут быть использованы методы, описанные

- 20 011261 и обсуждаемые ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и, в основном, доступны специалистам и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов согласно изобретению, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Ι, секвеназа (И8 Вюсйеш1са1 Согр., С1сус1апб. ОН), полимераза Тац (Тегкт Е1тег), термостабильная полимераза Т7 (Атегкйат, СЫсадо, ГЁ), или комбинация таких полимераз и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в ЕЕ0ХСЛ8Е АтрППсабоп 8ук1ет и поставляемые О1Ьсо/ВВЬ (ОаййегкЬшд, МО). Способ секвенирования может быть предпочтительно автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат НатШоп М1сго ЬаЬ 2200 (НатШоп, Вепо, КУ), термоячейка Ρе1ΐ^е^ ТНегта1 Сус1ег (ГТС200; Μΐ Векеагсй, ^а1ейо^п, МА), катализатор ΑΒΙ и ДНК-секвенаторы 373 и 377 ЭХА 8ес.|иепсегк (Тегкт Е1тег).

Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептида IN8Ρ201, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам (см., например, СиггеШ ΡιπΤ^Ε ш Мо1еси1аг Вю1оду, АикиЬе1 е( а1. (ебк). Огеепе ΡиЬ1^ксЫηд Аккос(а1ек апб ^беу Iηΐе^кс^еηсе, №\ν Уотк, 1989, 1992). Особенно подходящими являются зонды, содержащие по меньшей мере 15, предпочтительно по меньше мере 30, а более предпочтительно по меньшей мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена (8ЕО ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:5, 8Е0 ΙΌ N0:7, 8Е0 ΙΌ N0:9, 8Е0 ΙΌ N0:11, 8Е0 ΙΌ N0:13, 8Е0 ΙΌ N0:15 и 8Е0 ΙΌ N0:17). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов средний специалист в данной области может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например отдельных членов семейства, типа и/или подтипа.

Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, то есть в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет сильно обрезана, обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных методов детектирования выше расположенных последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (ВАСЕ; см., например, Ргойтап е( а1., ΡNΑ8 И8А 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, проиллюстрированные МатаШоп Т.М. (С1оп1ес11 ЬаЬогаШйек Шс.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется сайт-рестрикционной ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров (8аткат О. (1993) ΡСВ Мебюбк Аррйс. 2:318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (ТпдНа Т. е( а1. (1988) ШсШс Ас1бк Век. 16:8186). Другим методом, который может быть использован в данном случае, является ПЦР с захватом, которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (Ьадеткйот М. е( а1., (1991) ΡСВ Мебюбк Аррйс. 1, 111-119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод багке!· Ю. е( а1. (1991) ШсШс Ас1бк Век. 19:3055-3060). Кроме того, можно использовать ПЦР, гнездовые праймеры и библиотеки Ρ^οтοΐе^Р^ηбе^ТΜ для прогулки по геномной ДНК (С1оп1есй, Ρа1ο А11о, СА). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон.

При скрининге на полноразмерные ДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека ойдо-б(Т) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'нетранскрибируемых регуляторных областей.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок, либо она может быть гибридизована

- 21 011261 с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением, картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важной стадией в подтверждении корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. МсКичск. Мепбейап 1пйегйапсе ίη Мап (имеющейся в настоящее время в библиотеке Уэлльского медицинского университета Джона Хопкинса) (бойп Норкшк ИпКегайу Vе1сй Меб1са1 ЫЬтату). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или других методов обнаружения генов. После предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для детектирования различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т.п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов, страдающих заболеванием.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детектирования мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации ш Ши и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволяют получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в данном заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу.

Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид согласно изобретению, могут быть также использованы методы отключения гена. Одним из методов, который может быть использован для отключения последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (ΒΝΑί) (Е1Ьа§й1г 8.М. е1 а1., №11иге 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНКолигонуклеотиды синтезируют ш νίίτο и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание этих дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, что приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии белка-мишени.

Эффективность методов отключения гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), а на РНК-уровне она может быть оценена с помощью методики, основанной на Тас.|Мап.

Векторы согласно изобретению содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева согласно изобретению, которые могут быть трансформированы, трансфецированы или трансдуцированы векторами согласно изобретению, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клеткихозяева.

Полипептиды согласно изобретению могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам и многие их них подробно описаны у БатЬгоок е1 а1. (см. выше) и Еегпапбех & НоеГПег (1998, еб§. Оепе ехргеСоп хуйепъ. Иапд па1иге Гог 1йе ай оГ ехргеСоп. Асабешк ΡϊΌδδ, 8ап П1едо, Ьопбоп, Войоп, №\ν Уогк, Бубпеу, Токуо, ТотопЮ).

Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у 8атЬгоок е1 а1. (см. выше). В общих чертах, кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях), и необязательно, оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине.

Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусная системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирсусы, такие как §ν40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, вирусы псевдобешенства и ретровирусы, или их комбинации, а также векто

- 22 011261 ры, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные человеческие хромосомы (НАС). Предпочтительными примерами векторов, которые могут быть использованы в соответствии с аспектами настоящего изобретения, относящимися к ΙΝ8Ρ201, являются векторы ρί.’Ρ4-ΤΘΡΘ. ρί.’Β4-ΤΟΡΟΙΝ8Ρ201, ρΕΝΤΚ, ρΕΝΤΚ_ΙΝ8Ρ201Ε^6ΗΙ8, ρΕΑΚ12ά-ΡΑ^ ρΌΕ8Τ12.2, ρΕΑΚ12ά-ΡΑ^ΙΝ8Ρ201Ε^ 6ΗΙ8 и ρΩΕ8Τ12.2_ΙΝ8Ρ201Εί.'-6ΗΙ8.

Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом мозаики табака, ΤΜν) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Τι или ρΒΚ.322); или клеточные системы животных. Для продуцирования полипептидов согласно изобретению могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции.

Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид согласно изобретению, в клетки-хозяева, может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Οηνίδ е1 а1., Ваис Ме11юб5 ίη ΜοΕαιΕπ· Βίοίοβν (1986) и 8ί·ιιΐ'^ΐΌο1< е1 а1. [см. выше]. Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная ΌΕΑΕ-декстраном; трасвекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (см. ЗатЬгсюк е1 а1., 1989, [см. выше], Лн5нЬе1 е1 а1., 1991 [см. выше], δρβΛοΓ, 6ο1άтаη & Ье1нета1б, 1998). В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция).

Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать, последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид или лидерная последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге.

Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и З'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды Β1ικ8πίρ1 (811313^^, ^а^ο11а, СЛ) или плазмиды ρ8ροι11™ (Θί^ο ВЯЬ) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, ΡυΒΙ8ί.Ό и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе 8У40 или ΕΒν с соответствующим селективным маркером.

Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под контролем регуляторных последовательностей, то есть так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать указанную последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в

- 23 011261 соответствующей ориентации, то есть с сохранением рамки считывания.

Указанные регуляторные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт.

Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки, успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа.

Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны специалистам и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детенышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (СО8), клетки С127, клетки 3Т3, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер 62) и ряд других клеточных линий.

В бакуловирусной системе материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, йИег айа, от [пуЦгодеп. 8ап О|едо СА (набор МахВас). В общих чертах, эти методы известны специалистам и подробно описаны у 8итшегк & 8шйй, Техак Адпси1!ига1 Ехрепшеп! 8!айоп Ви11ейп № 1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клетки ОгокорЫ1а 82 и клетки 8робор!ега 8£9.

Специалистам известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в патентах США 5693506, 5659122 и 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны 2епк, Ρйу!οсйет^кΐ^у 30, 3861-3863 (1991).

В частности, можно использовать любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты с последующим продуцированием из них целых регенерированных растений, которые содержат перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, но не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых, а также овощных растений.

Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, Е.сой, 81гер1ошусек и ВасШик киЬййк.

Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, 8. сегеуыае) и клетки АкрегдШик.

Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны специалистам. Примерами являются гены тимидинкиназы (\У|§1ег М. е! а1. (1977) Се11 11:223-32) и аденин-фосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Ьо^у Ι. е! а1. (1980) Се11 22:817-23), которые могут быть использованы в !к- или арг1± -клетках, соответственно.

Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например ген дигидрофолат-редуктазы (ОНЕВ), который сообщает резистентность к метотрексату (^1д1ег М. е1 а1. (1980) Бгос. №!1. Асаб. 8ск 77:3567-70); ген пр!, который сообщает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к 6-418 (Со1Ьеге-6агарт Е. е! а1 (1981) I. Мо1. Вю1. 150:1-14), и гены а1к или ра!, которые сообщают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицинацетилтрансферазе соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам.

Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении. Так, например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид согласно изобретению, находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию тандемного гена.

Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, ко

- 24 011261 дирующую полипептид согласно изобретению, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка, например сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (ЕАС8) или иммуноанализы (такие как твердофазный иммуноферментный анализ [ЕЬ18А] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детектирования и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. Натр!оп В. е! а1. (1990) 8его1о§1са1 МеШобк, а ЬаЬога!огу Мапиа1, АР8 Ргекк, 81 Раи1, ΜΝ) и Маббох Ό.Ε. е! а1., (1983) I. Ехр. Меб., 158, 1211-1216).

Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченых зондов для гибридизации или ПЦРзондов для детектирования последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды согласно изобретению, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченого полинуклеотида. Альтернативно, последовательности, кодирующие полипептид согласно изобретению, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны специалистам, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов ίπ νίΙΐΌ путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или 8Р6, и меченых нуклеотидов. Эти процедуры могут быть проведены с использованием различных коммерчески доступных наборов (Рйагтааа & ир]о1т (Ка1атахоо, М1); Рготеда (МабЦоп XVI) и и.8. Вюсйетюа1 Согр., С^е1апб, ОН)).

Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения детектирования, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.

Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных, а в частности грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект согласно изобретению. Это генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для генерирования животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов согласно изобретению.

Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо известными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае, если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения и/или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков.

Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть также использованы специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды согласно изобретению, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков, являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как гистидинтриптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе удлинения/очистки РЬАС8 (1ттипех Согр., 8еай1е, VА). Для облегчения очистки между доменом для очистки и полипептидом согласно изобретению могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (1№Йгодеп, 8ап О1едо, СА). Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка, содержащего полипептид согласно изобретению, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью 1МАС (аффинной хроматографии на иммобилозованном ионе металла, описанной РогаШ I. е! а1. (1992), Рго!. Ехр. РипГ. 3:263-281), тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов, содержащих гибридные белки, можно найти у Кго11 Ό.Ι. е! а1. (1993; ΩΝΛ Се11 Вю1. 12:441-453).

Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае, клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например, таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (ЕАС8), или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть восстановлена для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то, пе- 25 011261 ред выделением полипептида, эти клетки должны быть сначала подвергнуты лизису.

Как указывалось выше, настоящее изобретение также относится к новым мишеням и к способам скрининга на лекарственные средства-кандидаты или другие нужные вещества. Такие методы скрининга включают анализы на связывание и/или функциональные анализы и могут быть осуществлены ίη νίΐτο, в клеточных системах и ίη νίνο в организме животного.

В этой связи конкретной целью настоящего изобретения является применение полипептида ΙΝ8Ρ201 в качестве мишени для скрининга на лекарственные средства-кандидаты, которые могут быть использованы для лечения или предупреждения расстройств, ассоциированный с гликопротеином клеточной поверхности.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способов отбора биологически активных соединений, где указанные способы включают контактирование соединения-кандидата с геном или полипептидом ΙΝ8Ρ201 и отбор соединений, которые связываются с указанным геном или полипептидом.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способов отбора биологически активных соединений, где указанные способы включают контактирование соединения-кандидата с рекомбинантной клеткой-хозяином, экспрессирующей полипептид ΙΝ8Ρ201, и отбор соединений, которые связываются с указанным полипептидом ΙΝ8Ρ201 на поверхности указанных клеток, и/или которые модулируют активность полипептида ΙΝ8Ρ201.

Термин биологически активное соединение означает любое соединение, обладающее биологической активностью у индивидуума, предпочтительно терапевтической активностью; более предпочтительно соединение, обладающее активностью гликопротеина клеточной поверхности, а еще более предпочтительно соединение, которое может быть использовано для лечения IN§Ρ201-ассоциированных расстройств или в качестве средства для разработки лекарственных препаратов, предназначенных для лечения расстройств, ассоциированных с гликопротеином клеточной поверхности. Биологически активным соединением предпочтительно является соединение, модулирующее активность ΙΝ8Ρ201.

Вышеописанные способы могут быть осуществлены ίη νίΐτο с применением различных устройств и различных условий, включая использование иммобилизованных реагентов, и эти способы могут также включать дополнительную стадию анализа активности выбранных соединений в модели, такой как животное-модель с расстройством, ассоциированным с гликопротеином клеточной поверхности.

Предпочтительными выбранными соединениями являются агонисты ΙΝ8Ρ201, то есть соединения, которые могут связываться с ΙΝ8Ρ201 и имитировать активность его эндогенного лиганда.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа отбора биологически активных соединений, где указанный способ включает контактирование ίη νίΐτο тестируемого соединения с полипептидом ΙΝ8Ρ201 согласно изобретению и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать активность указанного полипептида ΙΝ8Ρ201.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа отбора биологически активных соединений, где указанный способ включает контактирование ίη νίΐτο тестируемого соединения с геном ΙΝ8Ρ201 согласно изобретению и определение способности указанного тестируемого соединения модулировать экспрессию указанного гена ΙΝ8Ρ201, а предпочтительно стимулировать его экспрессию.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу скрининга, отбора или идентификации активных соединений, а в частности соединений, обладающих активностью, направленной на подавление воспаления, дегенерацию клеток, апоптоз и онкогенез, где указанный способ включает контактирование тестируемого соединения с рекомбинантной клеткой-хозяином, содержащей репортерную конструкцию, где указанная конструкция содержит репортерный ген, находящийся под контролем промотора гена ΙΝ8Ρ201, и отбор тестируемых соединений, модулирующих (например, стимулирующих или снижающих, а предпочтительно стимулирующих) экспрессию указанного репортерного гена.

Полипептид согласно изобретению может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из известных методов, применяемых для поиска лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) экспрессию гена или активность полипептида согласно изобретению, а поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или регулировать активность полипептида согласно первому аспекту изобретения.

Соединения-агонисты или соединения-антагонисты могут быть выделены, например, из клеток, бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы, либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе ί.’ο1ίβηη еΐ а1., СиггеШ Ρτοΐο^Π ίη Iттиηο1οду 1(2):С11ар1ег 5 (1991).

Связывание с геном или с полипептидом-мишенью служит показателем способности указанного соединения модулировать активность указанной мишени и, тем самым, оказывать влияние на путь, приводящий к развитию у индивидуума расстройства, ассоциированного с гликопротеином клеточной поверхности. Детектирование связывания может быть осуществлено различными методами, такими как

- 26 011261 мечение соединения-кандидата, анализ на конкурентное связывание с известным меченым лигандом и

т.п. Для проведения анализов на связывание ш νίΙΐΌ указанные полипептиды могут быть использованы, в основном, в чистой форме, в виде суспензии, в форме, иммобилизованной на носителе, или в форме, экспрессируемой в мембране (в форме интактной клетки, мембранного препарата, липосомы и т.п.).

Модуляция активности включает, но не ограничивается ими, стимуляцию поверхностной экспрессии рецептора ΙΝ8Ρ201, модуляцию мультимеризации указанного рецептора (например, образование мультимерных комплексов с другими субъединицами) и т. п. Клетками, используемыми в таких анализах, могут быть любые рекомбинантные клетки (то есть, любые клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ΙΝ8Ρ201) или любые клетки, экспрессирующие эндогенный полипептид ΙΝ8Ρ201. Примерами таких клеток являются, но не ограничиваются ими, прокариотические клетки (такие как бактерии) и эукариотические клетки (такие как клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений и т.п.). Конкретными примерами являются клетки Е.сой, Ρ^сЬ^а ра5!ог15, Нап§епи1а ро1утогрйа, ЛихозассНаготусез ротЬе, дрожжевые клетки К1иутеготусе5 или 8ассЬаготусе§, клеточные линии млекопитающих (например, клетки Уего, клетки СНО, клетки 3Т3, клетки СО8 и т.п.), а также первичные и стабилизированные клеточные культуры млекопитающих (например, культуры фибробластов, эмбриональных клеток, эпителиальных клеток, нервных клеток, адипоцитов и т.п.).

Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие антагонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом согласно изобретению, но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом согласно изобретению и, тем самым, ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может быть подвергнуто ингибированию, что будет приводить к подавлению нормальной биологической активности такого полипептида.

Согласно изобретению полипептид, который используется в таком методе скрининга, может находиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе или может присутствовать на клеточной поверхности, либо он может быть локализован внутри клетки. Вообще говоря, в таких процедурах скрининга могут быть использованы соответствующие клетки или клеточные мембраны, экспрессирующие полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию, либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Затем функциональный ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с ответом контрольных клеток, которые не контактировали с тестируемым соединением. Такой анализ, проводимый с помощью подходящей системы детектирования, позволяет определить, может ли тестируемое соединение давать сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного агониста и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствии тестируемого соединения.

Предпочтительный способ идентификации соединения, являющегося агонистом или антагонистом полипептида согласно изобретению, включает в себя:

(a) контактирование клетки, экспрессирующей (необязательно, на своей поверхности) полипептид согласно первому аспекту изобретения, где указанный полипептид ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом, либо его активации или ингибирования путем измерения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом.

Методы генерирования детектируемых сигналов в анализах описанного здесь типа хорошо известны специалистам. Конкретным примером является совместное введение конструкции, экспрессирующей полипептид согласно изобретению или его фрагмент, такой как ЬВЭ, присутствующий в виде гибрида с ДНК-связывающим доменом СЛЬ4, в клетку вместе с репортерной плазмидой, такой, например, как рЕК-Ьис (81га1адепе Еигоре, Лт^егйат, ТНе №Шег1апЙ8). Эта конкретная плазмида содержит синтетический промотор с пятью тандемными повторами СЛЬ4-связывающих сайтов, регулирующих экспрессию гена люциферазы. При введении потенциального лиганда в клетки, он будет связываться с гибридом СЛЬ4-полипептид и индуцировать транскрипцию гена люциферазы. Мониторинг уровня экспрессии гена люциферазы может быть проведен путем детектирования его активности на устройстве для считывания интенсивности люминесценции (см., например, ЬеНтап е! а1., 1ВС 270, 12953, 1995; Ρπ^πγ е! а1., 1ВС, 277, 39243, 2002).

Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста полипептида согласно изобретению включает в себя:

(а) контактирование меченого или немеченого соединения с полипептидом, иммобилизованным на любом твердом носителе (например, на сферах, пластинах, матричном носителе, чипе), и детектирование

- 27 011261 указанного соединения путем определения присутствия метки или самого соединения;

(b) контактирование клетки, экспрессирующей на своей поверхности полипептид, путем его искусственного заякоривания на клеточной мембране или путем конструирования химерного рецептора, ассоциированного со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (c) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом, либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом, с уровнем сигнала, вырабатываемого в отсутствие данного соединения.

Так, например, может быть применен такой способ, как ЕКЕТ-детектирования лиганда, связанного с полипептидом в присутствии пептидных ко-активаторов (Νογγικ е! а1., 8с1епсе 285, 744, 1999).

Другой предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста полипептида согласно изобретению включает в себя:

(a) контактирование клетки, экспрессирующей (необязательно, на своей поверхности) полипептид, ассоциированный со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, где указанное соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом, либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с указанным полипептидом, с уровнем сигнала, вырабатываемого в отсутствии данного соединения.

В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут, кроме того, включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченого или немеченого лиганда для полипептида.

В другом варианте изобретения способ идентификации агониста или антагониста полипептида согласно изобретению включает в себя:

определение факта ингибирования связывания лиганда с клетками, которые экспрессируют полипептид согласно изобретению (и которые, но необязательно, содержат на своей поверхности полипептид согласно изобретению), или с клеточными мембранами, содержащими такой полипептид, в присутствии соединения-кандидата в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с указанным полипептидом. Считается, что соединение, способствующее снижению уровня связывания с лигандом, является агонистом или антагонистом. При этом, предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченым.

Более конкретно, способ скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом полипептида, включает в себя стадии:

(a) инкубирования меченого лиганда с целой клеткой, экспрессирующей на своей поверхности полипептид согласно изобретению, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид согласно изобретению;

(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной;

(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведение этой смеси до состояния равновесия;

(б) измерения количества меченого лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и (е) сравнения различия в количествах связанного меченого лиганда стадий (Ь) и (б), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (б), считается агонистом или антагонистом.

Аналогичным образом, настоящее изобретение относится к способу скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом полипептида, включающему в себя стадии:

(a) инкубирования меченого лиганда с полипептидом согласно изобретению, иммобилизованным на любом твердом носителе или на клеточной поверхности, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид согласно изобретению;

(b) измерения количества меченого лиганда, связанного с полипептидом согласно изобретению, иммобилизованным на любом твердом носителе, или с целой клеткой или с клеточной мембраной;

(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченого лиганда и полипептида, иммобилизованного на твердом носителе, целой клетки или клеточной мембраны стадии (а), и доведение этой смеси до состояния равновесия;

(б) измерения количества меченого лиганда, связанного с иммобилизованным полипептидом, с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и (е) сравнения различия в количествах связанного меченого лиганда стадий (Ь) и (б), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (б), считается агонистом или антагонистом.

Полипептид ΙΝ8Ρ201 согласно изобретению может модулировать рост и дифференцировку клеток.

- 28 011261

Таким образом, биологическая активность полипептида ШЗР201 может быть оценена в системах, которые позволяют проводить исследование роста и дифференцировки клеток, таких как системы для анализа в культуре органа или системы для анализа колоний клеток в агарозной культуре. Стимуляция или ингибирование пролиферации клеток могут быть измерены с помощью различных анализов.

Так, например, для оценки ингибирования роста клеток может быть использована твердая или жидкая среда. В твердой среде, клетки, рост которых подвергается ингибированию, могут быть отобраны из группы клеток индивидуума путем сравнения размеров образуемых ими колоний. В жидкой среде, ингибирование роста может быть скринировано путем измерения мутности культуральной среды или включения меченого тимидина в ДНК. Обычно включение нуклеозидного аналога в только что синтезированную ДНК может служить основой для измерения пролиферации клеток (то есть активного роста клеток) в данной популяции. Так, например, в качестве реагента для мечения ДНК может быть использован бромдезоксиуридин (ВгбИ), а в качестве детектирующего реагента могут быть использованы мышиные моноклональные антитела против ВгбИ. Это антитело связывается только с клетками, содержащими ДНК, в которую был включен бромдезоксиуридин. В комбинации с этим анализом могут быть использованы различные методы детектирования, включая иммунофлуоресцентные, иммуногистохимические, ЕЫЗА- и колориметрические методы. Наборы, включающие бромдезоксиуридин (ВгбИ) и мышиное моноклональное антитело против ВгбИ, являются коммерчески доступными и поставляются фирмой Воейппдег МаппЬе1т (1пб1апаро11к, ΙΝ).

Влияние полипептида ШЗР201 на дифференцировку клеток может быть оценено посредством контактирования стволовых клеток или эмбриональных клеток с различными количествами полипептида ШЗР201 и оценки такого влияния на дифференцировку стволовых клеток или эмбриональных клеток. Для идентификации полученных клеток могут быть использованы тканеспецифические антитела и методы микроскопии.

Было обнаружено, что полипептид ШЗР201 может также модулировать дозозависимую пролиферацию и дифференцировку клеток иммунной и/или нервной системы в вышеописанных анализах. Таким образом, термин функциональные эквиваленты полипептида ШЗР201 включает полипептиды, которые обладают любой из указанных активностей дозозависимой регуляции роста и дифференцировки клеток в вышеописанных анализах. Хотя степень дозозависимой активности необязательно должна быть идентична активности полипептида ШЗР201, однако предпочтительно, чтобы указанные функциональные эквиваленты обладали, по существу, аналогичной дозозависимой активностью, измеренной в данном анализе, по сравнению с активностью полипептида Ш8Р201.

В некоторых описанных выше вариантах настоящего изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или анализы на конкуренцию с меченым соединением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для детектирования на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом.

Могут быть также разработаны анализы для детектирования влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей указанный полипептид, в клетках. Так, например, может быть разработан такой анализ ЕБ1ЗА, который позволяет измерять секретированные или клеточноассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами, известными специалистам, и такой анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образования связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением.

Другой метод, который может быть использован для скрининга лекарственных средств, позволяет осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с представляющим интерес полипептидом (см. международную патентную заявку АО 84/03564). В этом методе большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом согласно изобретению и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование не нейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными специалистам. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в вышеупомянутых способах скрининга на лекарственные средства.

Специалистам известны и другие методы такого типа. См., например, Абекй С. & ЗоЮ С. Сигг. Меб. СЬет. 2002, 9(9):963-78; Зйапб Е.Ь. Ргод. Эгид. Кек., 2003 61:1-37; НгиЬу V.! ΝηΙ. Кеу. Огид. Э1ксоу. 2002, 1(11):847-58.

Полипептид согласно изобретению может быть использован для идентификации мембраносвязанных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной

- 29 011261 специалистам, такой как анализы на связывание и перекрестное связывание с лигандом, в которых данный полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детектирование или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазмонный резонанс и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть также использованы для идентификации агонистов и антагонистов указанного полипептида, которые конкурируют с указанным полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны специалистам.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к применению полипептида ГЫ8Р201 или его фрагмента, где указанным фрагментом, предпочтительно, является фрагмент, специфичный к гену ГЫ8Р201, в целях выделения или генерирования агониста или стимулятора полипептида ГЫ8Р201 для лечения иммуноассоциированного расстройства, где указанный агонист или стимулятор выбран из группы, состоящей из:

1. специфического антитела или его фрагмента, включая: а) химерное, Ь) гуманизованное или с) полностью человеческое антитело, а также

2. биспецифического или мультиспецифического антитела,

3. одноцепочечного антитела (например, ксЕу), или

4. однодоменного антитела, или

5. пептидо- или непептидомиметика, происходящего от указанных антител, или

6. антитело-миметика, такого как (а) антикалин или (Ь) связывающая молекула на основе фибронектина (например, тринектин или аднектин).

Получение пептидо- или непептидомиметиков из антител известно специалистам (8агадоу1 е1 а1., 1991 и 8агадоу1 е1 а1., 1992).

Антикалины также известны специалистам ШоЦ е1 а1., 2004). Связывающие молекулы на основе фибронектина описаны в патенте США № 6818418 и в ШО 2004029224.

Кроме того, тестируемыми соединениями могут быть соединения различного происхождения, природы и состава, такие как любые небольшие молекулы, нуклеиновые кислоты, липиды, пептиды, полипептиды, включая антитела, такие как химерное, гуманизованное или полностью человеческое антитело или его фрагмент, происходящие от них пептидо- или непептидомиметики, а также биспецифические или мультиспецифические антитела, одноцепочечные антитела (например, ксЕу), однодоменные антитела, антитела-миметики, такие как антикалин или связывающая молекула на основе фибронектина (например, тринектин или аднектин) и т.п., в изолированной форме или в виде их смеси или комбинаций.

Настоящее изобретение также относится к набору для скрининга, используемому в методах идентификации агонистов, антагонистов, лигандов, рецепторов, субстратов и ферментов, описанных выше.

Настоящее изобретение также относится к агонистам, антагонистам, лигандам, рецепторам, субстратам, ферментам и к другим соединениям, модулирующим активность или антигенность полипептида согласно изобретению в соответствии с описанными выше механизмами.

Как указывалось выше, предполагается, что различные молекулы согласно изобретению (то есть полипептиды согласно первому аспекту настоящего изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту настоящего изобретения, вектор согласно четвертому аспекту настоящего изобретения, клетка-хозяин согласно пятому аспекту настоящего изобретения, лиганд согласно шестому аспекту настоящего изобретения и соединение согласно седьмому аспекту настоящего изобретения) могут быть использованы для лечения или диагностики заболеваний. В целях оценки эффективности указанных молекул согласно изобретению для лечения или диагностики заболевания могут быть проведены один или несколько из описанных ниже анализов. Следует отметить, что хотя некоторые из нижеследующих анализов описаны для тестируемых соединений, являющихся белком/полипептидом, однако специалист в данной области может легко модифицировать эти анализы для их применения к другим молекулам согласно изобретению, которые также могут быть использованы в качестве тестируемых соединений.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение согласно изобретению в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов, в качестве вакцин или в качестве других иммуногенных композиций, подробно описанных ниже.

В соответствии с используемой здесь терминологией, композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение [X], считается в основном, не содержащей примесей [здесь, Υ], если по крайней мере 85 мас.% от всего количества Χ+Υ в данной композиции составляет X. Предпочтительно X составляет по крайней мере примерно 90%, а более предпочтительно по крайней мере примерно 95%, 98% или даже 99 мас.% по общей массе Χ+Υ в данной композиции.

Предпочтительно фармацевтические композиции должны содержать терапевтически эффективное

- 30 011261 количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, лиганда или соединения согласно изобретению. Используемый здесь термин терапевтически эффективное количество означает количество терапевтического агента, необходимого для лечения, ослабления или предупреждения рассматриваемого заболевания или состояния, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализе клеточной культуры, например опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. С использованием животного-модели может быть также определен соответствующий интервал концентраций и их способ введения. Полученная информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку.

Точное эффективное количество соединения для введения индивидууму будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, его возраста, веса, пола и режима питания, от времени и частоты введения лекарственного средства, от комбинации(й) лекарственных средств, а также от реактивной чувствительности и толерантности/восприимчивости данного индивидуума к проводимой терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах эффективная доза может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, а предпочтительно от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.

Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для введения терапевтического агента. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что данный носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.

Используемыми здесь фармацевтически приемлемыми солями могут быть, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в Кешшд1оп'8 Ρйа^тасеиΐ^са1 8с1епсе§ (Маск Ριιό. Со., Ν.Σ. 1991).

Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в указанных композициях могут присутствовать и вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т. п. С помощью таких носителей могут быть получены фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для перорального приема пациентом.

Композиции согласно изобретению после их приготовления могут быть непосредственно введены индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, а в частности человек.

Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть введены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедулярное, интратекальное, интравентрикулярное, трансдермальное или чрезкожное введение (см., например, XVО 98/20734), а также подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, внутрикишечное, местное, подъязычное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций согласно изобретению могут быть также использованы аппараты для выстреливания генов или безыгольные шприцы. В основном, терапевтические композиции могут быть приготовлены в виде растворов для инъекций, либо жидких растворов, либо суспензий, или они могут быть получены в виде твердых форм, подходящих для получения растворов или суспензий в жидких носителях перед их инъекцией.

Указанные композиции могут быть непосредственно доставлены, в основном, путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо они могут быть доставлены в интерстициальное пространство ткани. Эти композиции могут быть также введены в пораженный участок. При этом лечение может быть проведено по схеме введения разовой дозы или дробных доз.

Если активность полипептида согласно изобретению превышает активность, требуемую для лечения конкретного патологического состояния, то в данном случае может быть рассмотрено несколько подходов. Один из таких подходов предусматривает введение индивидууму вышеописанного соединения-ингибитора (антагониста) вместе с фармацевтически приемлемым носителем, где указанный ингибитор вводят в количестве, эффективном для ингибирования функции полипептида, например блокирования связывания с лигандами, субстратами, ферментами или рецепторами, либо для ингибирования вторичного сигнала, и, тем самым, эффективном для ослабления симптомов аномального состояния. Такими антагонистами предпочтительно являются антитела. Для минимизации иммуногенности антител, описанных выше, наиболее предпочтительно, чтобы такие антитела были химерными и/или гуманизованны- 31 011261 ми.

В соответствии с другим подходом могут быть введены растворимые формы полипептидов, которые сохраняют аффинность связывания с рассматриваемым лигандом, субстратом, ферментом или рецептором. В основном, такой полипептид может быть введен в виде фрагментов, в которых сохраняются релевантные части.

В альтернативном подходе, экспрессия гена, кодирующего данный полипептид, может быть ингибирована методами блокирования экспрессии, такими как использование молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты (описанных выше), которые могут быть генерированы эндогенно или введены отдельно. Модификации экспрессии генов могут быть получены путем конструирования комплементарных последовательностей или антисмысловых молекул (ДНК, РНК или ΡΝΑ) для осуществления регуляции, 5'областей или регуляторных областей (сигнальной последовательности, промоторов, энхансеров и интронов) гена, кодирующего данный полипептид. Аналогичным образом, такое ингибирование может быть осуществлено с использованием методики спаривания оснований с образованием тройной спирали. Спаривание с образованием тройной спирали используется потому, что оно приводит к нарушению способности двойной спирали раскрываться так, чтобы это оказалось достаточным для связывания с полимеразами, факторами транскрипции или регуляторными молекулами. Успехи в клинической терапии, достигнутые за последнее время благодаря использованию ДНК-триплекса, были описаны в литературе (бее ЕЕ. е1 а1. (1994): НиЬег В.Е. & Β.Ι. Сагг, Мо1еси1аг апб 1ттипо1од1с АрргоасЕеб, Еи1ига РиЫВЫпд Со., М1. К18со, ΝΥ). Комплементарная последовательность или антисмысловая молекула могут быть также сконструированы в целях блокирования трансляции мРНК посредством предотвращения связывания транскрипта с рибосомами.

Такие олигонуклеотиды могут быть введены или генерированы ш δίΐιι в результате экспрессии ш νί\Ό.

Кроме того, экспрессия полипептида согласно изобретению может быть предотвращена с использованием рибозимов, специфичных к мРНК-последовательности, кодирующей этот полипептид. Рибозимы представляют собой каталитически активные РНК, которые могут быть природными или синтетическими (см., например, Изтап Ν. е1 а1., Сигг. Орт. 81гис1. Вю1. (1996) 6(4), 527-33). Синтетические рибозимы могут быть сконструированы так, чтобы они специфически расщепляли мРНК в выбранных положениях и, тем самым, предотвращали трансляцию мРНК в функциональный полипептид. Рибозимы могут быть синтезированы с использованием природного рибозофосфатного остова и природных оснований, обычно присутствующих в РНК-молекулах. Альтернативно рибозимы могут быть синтезированы с использованием неприродных остовов, например 2'-О-метил-РНК, в целях защиты от расщепления рибонуклеазой, и эти рибозимы могут содержать модифицированные основания.

Молекулы РНК могут быть модифицированы в целях увеличения внутриклеточной стабильности и времени полужизни. Возможными модификациями являются, но не ограничиваются ими, присоединение фланкирующих последовательностей у 5'- и/или у 3'-концов данной молекулы или использование в указанном остове молекулы фосфортиоата или 2'-О-метила вместо фосфодиэстеразных связей. Эта концепция может рассматриваться и при продуцировании ΡNΑ и может быть применена ко всем указанным молекулам посредством включения нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и бутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и аналогичные модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина, которые не могут легко распознаваться эндогенными эндонуклеазами.

Для лечения аномальных состояний, ассоциированных с недостаточной экспрессией полипептида согласно изобретению и его активностью, имеется несколько способов. Один из таких способов предусматривает введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения, которое активирует указанный полипептид, то есть, соединение-агонист, описанный выше, в целях ослабления симптомов патологического состояния. Альтернативно терапевтическое количество указанного полипептида в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем может быть введено в целях сохранения соответствующего физиологического равновесия данного полипептида.

Для осуществления эндогенного продуцирования данного полипептида соответствующими клетками индивидуума может быть применена генотерапия. Генотерапию используют для перманентного лечения заболеваний, связанных с аномальным продуцированием данного полипептида, путем замены дефектного гена правильным терапевтическим геном.

Генотерапия согласно изобретению может быть осуществлена ш νί\Ό или ех νί\Ό. Для генотерапии ех νί\Ό требуется выделение и очистка клеток, взятых у пациента, введение терапевтического гена и введение генетически модифицированных клеток обратно пациенту. В противоположность этому, генотерапия ш νί\Ό не требует выделения и очистки клеток пациентов.

Для введения пациенту обычно используют упакованный терапевтический ген. Носители для доставки генов могут быть невирусными, такие как липосомы, либо они могут представлять собой дефектные по репликации вирусы, такие как аденовирус, описанный Вегкпег К.Ь., Сигг. Тор. М1сгоЫо1. 1ттипо1., 158, 39-66 (1992), или векторы на основе адено-ассоциированного вируса (ААУ), описанные Михусхка Ν. Сигг. Тор. М1сгоЫо1. 1ттипо1., 158, 97-129 (1992) и в патенте США № 5252479. Так, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид согласно изобретению, может быть скон

- 32 011261 струирована для экспрессии в дефектном по репликации ретровирусном векторе. Затем эта экспрессионная конструкция может быть выделена и введена в упаковывающую клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, кодирующую указанный полипептид, так, чтобы указанная упаковывающая клетка продуцировала инфекционные вирусные частицы, содержащие нужный ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены индивидууму для конструирования клеток ίη νίνο и экспрессии полипептида ίη νίνο (см. Сйар!ег 20 Сепе Тйегару апб о!йег Мо1еси1аг Сепебс-Ьакеб ТйегареиНс Лрргоасйек (и цитируемые там ссылки), Нитап Мо1еси1аг Сепебск (1996), Т. 8!гасбап & Α. Ρ. Реаб, ВЮ8 ЗаепбПс ΡιιΝίδΙκίΈ Ь!б).

Другим способом является введение оголенной ДНК, где терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровоток или в мышечную ткань.

В случае, когда полипептидами или молекулами нуклеиновой кислоты согласно изобретению являются агенты, вызывающие заболевание, настоящее изобретение относится к способу их использования в целях получения вакцин для вырабатывания антител против указанного агента, вызывающего заболевание.

Вакцины согласно изобретению могут быть либо профилактическими (то есть предназначенными для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (то есть предназначенными для лечения заболеваний после инфицирования). Такие вакцины содержат иммунизирующий(е) антиген(ы), иммуноген(ы), полипептид(ы), белок(ки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с описанными выше фармацевтически приемлемыми носителями, где указанным носителем может быть любой носитель, который сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию. Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы (адъюванты). Более того, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид дифтерии, столбняка, холеры, Н. ру1оп и другие патогены.

Поскольку полипептиды могут разлагаться в желудке, то вакцины, содержащие полипептиды, предпочтительно вводят парентерально (например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или чрезкожной инъекции). Композициями, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данной композиции изотоничность с кровью реципиента, а также водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители.

Вакцинные композиции согласно изобретению могут быть помещены в емкости для разовых лекарственных форм или для дробных лекарственных форм. Так, например, эти лекарственные формы могут быть помещены в запаянные ампулы и сосуды и могут храниться в замороженном виде, в которые, непосредственно перед их использованием, необходимо добавить лишь стерильный жидкий носитель. Конкретная доза будет зависеть от удельной активности данной вакцины и может быть легко определена путем рутинного экспериментирования.

Генетическая доставка антител, связывающихся с полипептидами согласно изобретению, может быть осуществлена, например, как описано в Международной патентной заявке \¥О 98/55607.

Для получения вакцинных композиций может быть также использована технология безыгольного впрыскивания (см., например, \\л\л\'.ро\\'бег|ес1.сот).

Ряд подходящих методов вакцинации и систем для доставки вакцин описаны в Международной патентной заявке \¥О 00/29428.

Настоящее изобретение также относится к использованию молекул нуклеиновой кислоты согласно изобретению в качестве диагностических реагентов. Детектирование мутированной формы гена, представляющей собой молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые ассоциируются с дисфункцией, применяется в качестве диагностического средства, которое может облегчать установление диагноза заболевания или восприимчивости к заболеванию, возникающему в результате пониженной экспрессии, сверхэкспрессии или измененной пространственной или временной экспрессии данного гена. Индивидуумы, несущие мутации в данном гене, могут быть идентифицированы на ДНК-уровне различными методами.

Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для диагностики, могут быть получены из клеток данного индивидуума, таких как клетки крови, мочевины, слюны, биоптата ткани или материала, полученного после аутопсии. Геномная ДНК может быть использована непосредственно для детектирования, либо, перед проведением анализа, она может быть амплифицирована ферментативным способом с помощью ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР), амплификации с замещением цепи (8ΌΑ) или другими методами амплификации (см. 8а1к1 е! а1., №11иге. 324, 163-166 (1986); Ве.) е! а1., Сп!. Кем Вюсбет. Мо1ес. Вю1., 26, 301-334 (1991); Впкептеуег е! а1., I. νίτο1. Ме!к., 35, 117-126 (1991), Vаη Вгип!, I. Вю/Тескпо1оду, 8, 291-294 (1990)).

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания у пациента, включающему оценку экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно изобретению, и сравнение полученного уровня экспрессии с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия данного заболевания. Этот спо

- 33 011261 соб включает в себя следующие стадии:

a) контактирование образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиновокислотным зондом в жестких условиях, в результате чего образуется гибридный комплекс между молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению и указанным зондом;

b) контактирование контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и

c) детектирование присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детектирование уровней гибридного комплекса в образце, взятого у данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, является признаком наличия данного заболевания.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, включающему в себя следующие стадии:

a) получение образцов тканей от пациента, исследуемого на наличие заболевания;

b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению из указанного образца ткани; и

c) установление диагноза заболевания у данного пациента путем обнаружения присутствия мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с данным заболеванием.

Для облегчения детектирования молекулы нуклеиновой кислоты в описанных выше способах может быть проведена стадия амплификации, например с помощью ПЦР.

Делеции и инсерции могут быть детектированы по изменению размера амплифицированного продукта по сравнению с нормальным генотипом. Точковые мутации могут быть идентифицированы путем гибридизации амплифицированной ДНК с меченой РНК согласно изобретению, или альтернативно, с мечеными антисмысловыми ДНК-последовательностями согласно изобретению. Полностью соответствующие последовательности могут быть дифференцированы от дуплексов с ошибочным спариванием путем гидролиза РНКазой или путем оценки различий в температурах плавления. Присутствие или отсутствие мутации у пациента может быть определено посредством контактирования ДНК с нуклеиновокислотным зондом, который гибридизуется с ДНК в жестких условиях, в результате чего образуется гибридная двухцепочечная молекула, где указанная гибридная двухцепочечная молекула имеет негибридизованную часть цепи нуклеиновокислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и установления присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи нуклеиновокислотного зонда как показателя наличия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации в соответствующей части ДНК-цепи.

Такие способы диагностики являются особенно ценными для проведения пренатальных и даже неонатальных тестов.

Точковые мутации и другие отличия последовательностей эталонного гена и мутантных генов могут быть идентифицированы другими хорошо известными методами, такими как прямое секвенирование ДНК или определение конформационного полиформизма одноцепочечных последовательностей (см. Огйа е! а1., Сепоткз, 5, 874-879 (1989)). Так, например, секвенирующий праймер может быть использован вместе с двухцепочечным ПЦР-продуктом или с одноцепочечной матричной молекулой, генерированной с помощью модифицированной ПЦР. Определение последовательности осуществляют в соответствии со стандартными процедурами с использованием радиоактивно меченых нуклеотидов или в соответствии с процедурами автоматического секвенирования с использованием флуоресцентных меток. Клонированные ДНК-сегменты могут быть также использованы в качестве зондов для детектирования специфических ДНК-сегментов. Чувствительность этого метода значительно повышается при использовании комбинированной ПЦР. Кроме того, точковые мутации и другие модификации последовательностей, такие как полиморфизм, могут быть детектированы, как описано выше, например с использованием аллель-специфических олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации последовательностей, отличающихся одним нуклеотидом.

Различия в ДНК-последовательностях могут быть также детектированы по изменениям электрофоретической подвижности ДНК-фрагментов в гелях в присутствии или в отсутствие денатурирующих агентов, либо путем прямого секвенирования ДНК (например, Муегз е! а1., 8с1епсе (1985) 230:1242). Изменения в конкретных положениях данных последовательностей могут быть также выявлены либо путем проведения анализов на защиту от нуклеазы, таких как анализ на защиту от РНКазы или 81, либо методом химического расщепления (см. Со!!оп е! а1., Ргос. Асаб. 8с1. И8А (1985) 85:4397-4401).

Помимо стандартного гель-электрофореза и секвенирования ДНК, мутации, такие как микроделеции, анеуплоидии, транслокации и инверсии, могут быть также детектированы путем проведения анализа 1п зйи (см., например, Ке11ег е! а1., ЭХА РгоЬез, 2пб Еб., 8!оск!оп Ргезз, №\ν Уогк, Ν.Υ., И8А (1993)), то есть ДНК или РНК-последовательности в клетках могут быть проанализированы на мутации, без их выделения и/или иммобилизации на мембране. В настоящее время наиболее широко используемым методом является гибридизация ш зйи с флуоресценцией (ΡΙ8Η), и в литературе уже появилось множество описаний этого метода (см., например, Тгасйиск е! а1., 8с1епсе 250, 559-562 (1990) и Тгазк е! а1., Тгепбз, Сепе!., 7, 149-154 (1991)).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения для проведения эффективного скринин- 34 011261 га генетических вариантов, мутаций и полиморфизма может быть создан массив олигонуклеотидных зондов, содержащих молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Технология создания массивов хорошо известна специалистам и находит широкое применение, при этом она может быть использована для решения ряда проблем молекулярной генетики, касающихся экспрессии генов, сцепления генов и генетической изменчивости (см., например, М. Сбее е! а1., 8с1еисе (1996) Уо1. 274, рр.610-613).

В одном из вариантов осуществления изобретения такой массив может быть получен и использован в соответствии с методами, описанными в заявке РСТ νθ 95/11995 (Сбее е! а1); Ьоскбаб Ό.Σ. е! а1., (1996) Νι!. Вю!есб. 14:1675-1680); и 8сбеиа М. е! а1. (1996) Ргос. Νι!1. Асаб. δα. 93:10614-10619). Олигонуклеотидные пары могут быть использованы в количестве от двух пар до одного миллиона пар. Эти олигомеры синтезируют в соответствующих участках на субстрате с использованием оптически направленного химического синтеза. Таким субстратом может быть бумага, найлон или мембрана другого типа, фильтр, чип, покровное стекло или любой другой твердый носитель. В другом аспекте согласно изобретению, олигонуклеотид может быть синтезирован на поверхности субстрата с использованием процедуры химического связывания и струйного аппарата для нанесения путем разбрызгивания, как описано в заявке РСТ νθ 95/251116 (Ва1бексбтебег е! а1.). В другом своем аспекте для определения порядка расположения кДНК-фрагментов или олигонуклеотидов на поверхности субстрата и связывания этих фрагментов или олигонуклеотидов с поверхностью субстрата могут быть использованы сетчатые массивы, аналогичные массивам для дот (или слот)-блотов, с применением вакуумной системы и процедур термического, УФ-, механического или химического связывания. Массив, такой как массивы, описанные выше, может быть создан вручную или с помощью подходящих устройств (слот-блот или дот-блот-аппарата), материалов (любого твердого носителя) и оборудования (включая роботизированную аппаратуру), и этот массив может содержать 8, 24, 96, 384, 1536 или 6144 олигонуклеотидов, или любое другое число от двух до более чем одного миллиона, которое является подходящим для эффективного использования коммерчески доступного оборудования.

Помимо методов, описанных выше, заболевания могут быть диагностированы методами, предусматривающими определение в образце, взятом у индивидуума, аномально низкого или аномально высокого уровня полипептида или мРНК. Для количественной оценки полипептидов пониженный или повышенный уровень экспрессии может быть измерен на РНК-уровне любыми методами, хорошо известными специалистам, например путем амплификации нуклеиновых кислот, например, с помощью ПЦР или ОТПЦР, путем проведения анализов на защиту от РНКазы, Нозерн-блот-анализов и других методов гибридизации.

Аналитические методы, которые могут быть использованы для определения уровней полипептида согласно изобретению в образце, взятом у хозяина, хорошо известны специалистам и более подробно обсуждаются выше (включая радиоиммуноанализы, анализы на конкурентное связывание, Вестерн-блотанализ и ЕЫ8А-анализы). В этом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, который включает в себя стадии: (а) контактирования лиганда, описанного выше, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (Ь) детектирования указанного комплекса.

Протоколы, такие как ЕЬ18А, РИА и ЕАС8, разработанные для измерения уровней полипептидов, могут быть, кроме того, взяты за основу для определения измененных или аномальных уровней экспрессии полипептида. Нормальные или стандартные значения для экспрессии полипептида получают путем объединения физиологических жидкостей или клеточных экстрактов, взятых у нормальных млекопитающих, предпочтительно у человека, с антителом против данного полипептида в условиях, подходящих для образования комплекса. Количество образованного стандартного комплекса может быть оценено различными методами, такими как фотометрические методы.

Антитела, которые специфически связываются с полипептидом согласно изобретению, могут быть использованы для диагностики состояний или заболеваний, характеризующихся экспрессией полипептида, или в анализах для наблюдения за пациентами, которым было проведено лечение полипептидами, молекулами нуклеиновой кислоты, лигандами и другими соединениями согласно изобретению. Антитела, подходящие для использования в диагностических целях, могут быть получены способом, аналогичным способу, описанному выше для терапии.

Диагностические анализы на присутствие полипептида осуществляют методами, предусматривающими использование антитела и метки для детектирования полипептида в физиологических жидкостях, экстрактах клеток или тканей человека. При этом могут быть использованы модифицированные или немодифицированные антитела, и эти антитела могут быть помечены путем их ковалентного или нековалентного связывания с репортерной молекулой. При этом могут быть использованы репортерные молекулы широкого ряда, известные специалистам, и некоторые из этих молекул описаны выше.

Количества полипептида, экспрессируемого у индивидуума, в контрольном образце и образце ткани, взятой при биопсии, сравнивают со стандартными величинами. Отклонение величин, полученных для данного индивидуума, от стандартных величин позволяет определить параметры для диагностики заболевания. Диагностический анализ может быть проведен для выявления отсутствия, присутствия и избыточной экспрессии полипептида и для мониторинга регуляции уровней полипептида во время тера- 35 011261 певтического лечения. Такие анализы могут быть также проведены для оценки эффективности конкретного курса терапевтического лечения при исследовании животных в клинических испытаниях или для наблюдения за процессом лечения отдельного пациента.

Диагностический набор согласно изобретению может содержать:

(a) молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению;

(b) полипептид согласно изобретению или (c) лиганд согласно изобретению.

В одном из аспектов настоящего изобретения диагностический набор может включать первый контейнер, содержащий нуклеиновокислотный зонд, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты согласно изобретению; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания. Этот набор может, кроме того, включать третий контейнер, содержащий агент для гидролиза негибридизованной РНК.

В альтернативном аспекте настоящего изобретения, диагностический набор может содержать массив молекул нуклеиновой кислоты, по меньшей мере одной из которых может быть молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению.

Для детектирования полипептида согласно изобретению, диагностический набор может содержать одно или несколько антител, связывающихся с полипептидом согласно изобретению, и реагент, используемый для детектирования реакции связывания между антителом и полипептидом.

Такие наборы могут быть использованы для диагностики заболевания или восприимчивости к заболеванию, в патогенезе которых участвуют члены семейства гликопротеинов клеточной поверхности. Такими заболеваниями могут быть клеточно-пролиферативные расстройства, включая новообразования, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли; миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительные заболевания кишечника, артрит, псориаз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечнососудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая заболевание центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждения головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; заболевания дыхательных путей, включая хроническую обструктивную болезнь легких и кистозный фиброз; нарушения развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и почечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибковые инфекции и паразитарные инфекции, и другие патологические состояния. Такими заболеваниями предпочтительно являются заболевания, в патогенезе которых участвуют лимфоцитарные антигены. Указанные наборы могут быть также использованы для диагностики репродуктивных расстройств, включая бесплодие.

Различные аспекты и варианты настоящего изобретения будут более подробно проиллюстрированы, например, в описании, в частности, относящемся к полипептиду ΙΝ8Ρ201.

При этом следует отметить, что в настоящее изобретение могут быть внесены конкретные модификации, не выходящие за рамки объема изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением, антагонисты растворимого ΙΝ8Ρ201 (например, ΙΝ8Ρ201-Ε0) или агонисты мембраносвязанного ΙΝ8Ρ201 (например, антитела-агонисты) могут быть введены отдельно или в комбинации с некоторыми другими терапевтическими схемами введения или противораковыми средствами (например, схемой введения множества лекарственных средств) в целях достижения аддитивного или синергического эффекта для лечения и/или предупреждения рака, ВИЧи/или ЕВУ-инфекций и гепатита В.

Противораковое средство выбирают из соединений платины, таких как цисплатин и карбоплатин; винкаалкалоидов, таких как винорелбин, винкристин и винбластин; таксанов, таких как доцетаксел и паклитаксел; различных ингибиторов топоизомеразы, ΙΕ-2 и интерферона-α.

В соответствии с настоящим изобретением, агонисты растворимого ΙΝ8Ρ201 (например, ΙΝ8Ρ201ЕС) или антагонисты мембраносвязанного ΙΝ8Ρ201 (например, антитела-антагонисты) могут быть введены отдельно или в комбинации с некоторыми другими терапевтическими схемами введения или средствами (например, схемой введения множества лекарственных средств) в целях достижения аддитивного или синергического эффекта для лечения и/или предупреждения воспалительных и/или аутоиммунных заболеваний.

Противовоспалительное средство выбирают из интерферона-бета, циклоспорина А, такролимуса и сиролимуса.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1 - сайт гликозилирования, предсказанный для ΙΝ8Ρ201 с использованием программы №!ΝΟΕό 1.0.

Фиг. 2 - последовательность кДНК и белка ΙΝ8Ρ201. Положение ПЦР-праймеров, используемых

- 36 011261 для клонирования, показано стрелками. Предсказанный внеклеточный домен обозначен серым цветом.

Фиг. 3 - нуклеотидная последовательность с трансляцией ПЦР-продукта ΙΝδΡ201-Εί.'.

Фиг. 4 - ТацМап-анализ на ΙΝδΡ201-Εί.’ для набора основных тканей (табл. 2).

Фиг. 5 - ТацМап-анализ на ΙΝδΡ201-Εί.’ для сравниваемых тканей (табл. 3).

Фиг. 6 - ТацМап-анализ на ΙΝδΡ201-Εί.' в биоптатах различных тканей кишечника, пораженных воспалительным заболеванием (ВЗК) (табл. 7).

Фиг. 7 - ΙΝ8Ρ201-ЕС-ингибирование секреции Ш-2 из СопА-стимулированных МКПК. На оси X представлена концентрация А3902132/2 в мкг/мл. На оси Υ представлен процент секреции цитокинов Щ-2).

Таблица 1

Аминокислота	Синонимичные группы	Более предпочтительные синонимичные группы
5ег	<Лу, А1а, Зег, ТЬг, Рго	ТЬг, Зег
Аге	Азп, Ьуз, О1п, Аг§, Из	Агд, Ьуз, Из
Ьеи	РЬе, Пе, Уа1, Ьеи, МеС	Пе, Уа1, Ьеи, МеС
Рго	С1у, А1а, Зег, ТЬг, Рго	Рго
ТЬг	О1у, А1а, Зег, ТЬг, Рго	ТЬг, Зег
А1а	С1у, ТЬг, Рго, А1а, Зег	О1у, А1а
Уа1	Мес, РЬе, Пе, Ьеи, Уа1	Мес, Пе, Уа1, Ьеи
С1у	А1а, ТЬг, Рго, Зег, О1у	С1у, А1а
Пе	РЬе, Пе, Уа1, Ьеи, МеС	Пе, Уа1, Ьеи, МеС
РЬе	Тгр, РЬе,Туг	Туг, РЬе
Туг	Тгр, РЬе,Туг	РЬе, Туг
С!у®	Зег, ТЬг, Суз	Суз
ΗΪ8	Азп, Ьуз, О1п, Аг§, Из	Аг§, Ьуз, Из
С1п	О1и, Азп, Азр, С1п	Азп, О1п
Азп	О1и, Азп, Азр, С1п	Азп, О1п
Ьуз	Азп, Ьуз, О1п, Аг§, Из	Аг§, Ьуз, Из
Азр	О1и, Азп, Азр, О1п	Азр, (Ли
С1и	С1и, Азп, Азр, О1п	Азр, (Ли
МеС	РЬе, Пе, Уа1, Ьеи, Ме!	Пе, Уа1, Ьеи, МеС
Тгр	Тгр, РЬе,Туг	Тгр

Таблица 2

Аминокислота	Синонимичные группы
8ег	й-Зег, ТЬг, ϋ-ТЬг, алло-ТЬг, Ме1, В-Ме(, Μεί(Ο), Ο-Μβΐ(Ο), Ь-Суз, В-Суз
Аг§	О-Аг§, Ьуз, ϋ-Ьуз, гомо-Аг^, О-гомо-Аг®, МеС, Пе, Б-МеС, Б-Пе, От, В-От
Ьеи	Β-Ьеи, Уа1, Б-Уа1, А4аА, АдаО, Ьеи, Ο-Ьеи, Мес, Б-МеС
Рго	ϋ-Рго, И-тиазолидин-4-карбоновая кислота, В- или Ь-1-оксазолидин-4карбоновая кислота
ТЬг	Ο-ΊΊιι, 8ег, О-8сг, алло-ТЬг, МеС, О-Мс(, МеС(О), В-МеС(О), Уа1. Б-Уа1
А1а	В-А1а, 61у, А1Ь, В-А1а, Азр, Ь-Суз, ϋ-Суз
Уа1	В-Уа1, Ьеи, ϋ-Ьеи, Пе, ϋ-Пе, Ме1, В-Мс1. АсАаА, АйаС
С1у	А1а, О-А1а, Рго, В-Рго, А1Ь, .бета-А1а, Азр
Не	В-Пе, Уа1, В-Уа1, АПаА, Ас1аС, Ьеи, Ο-Ьеи, МеС, В-МеС
РЬе	ϋ-РЬе, Туг, ϋ-ТЬг, Ь-допа, Ηί$, В-Н1Я, Тгр, Β-Тгр, транс-3,4- или 5фенилпролин, Ас1аА, Ас1а6, цис-3,4- или 5-фенилпролин, Вра, В-Вра
Туг	Ο-Туг, РЬе, Г)-РИе, Ь-допа, ΙΙΪ5,1)-Нь
Суз	О-Суз, £--Ме--Су$, Ме(, Ό-Μεί, ТЬг, ϋ-ТЬг
С1п	0-6111, Азп, Β-Азп, 61и, 0-61 и, Азр, О-Азр
Азп	В-А$п, Азр, ϋ-Азр, 61и, ϋ-61ιι, С1п, ϋ-6ϊη
Ьуз	Β-Ьуз, Аг& О-Аг£, гомо-Аг§, Р-гомо-Аг§, Ме1, О-Ме1, Не, В-Пе, От, В-От
Азр	Β-Азр, Β-Азп, Азп, 61и, ϋ-61ιι, 61п, В-61п
С1и	О-61и, Β-Азр, Азр, Азп, Ο-Азп, 61η, ϋ-ΟΙη

МеС I О-Ме[, 8-Ме-Суз, Не, О-Пе, Ьеи, ϋ-Ьеи, Уа1, ОЛ’а!

- 37 011261

Пример 1. Идентификация и ίη 8^1^сο анализ ΙΝ8Ρ201.

Как описано выше, было предсказано, что полипептид ΙΝ8Ρ201 действует как гликопротеин клеточной поверхности. Данные, полученные с помощью программы 8ί§ηα1Ρ-ΝΝ для ΙΝ8Ρ201, показали, что этот белок содержит лидерную последовательность, которая, очевидно, расщепляется между положениями 21 и 22 данной последовательности (Мекен Н. еΐ а1., 1997, ΡϊΌΝίη Е^шее!!^, 10, 1-6; Мекен Н. & Кгодй А.: Ρκ6κΐίοη ο£ 5ί§ηα1 рер11без алб 5ί§ηα1 πικΙιοιέ Ьу а Ыббеи ΜπγΚου тοбе1. Ιη Ρ^οсееб^ηд8 ο£ 111е δίχΐΠ Ιη^ΓηαΙίοηα1 ί,’οηΙοϊΌΐ^ οη [ЩеШдегИ 8уйет§ £οτ ΜοΗαιΙηΓ Вюкду (Ι8ΜΕ 6), αΙ ΡΐΌ55. Меη1ο ΡογΚ. Са1^Γο^η^а. рр.122-130 (1998)). Присутствие лидерной последовательности подтверждает, что белок ΙΝ8Ρ201 функционирует как секретируемый белок.

Результаты ТМНММ для ΙΝ8Ρ201 показали, что этот полипептид содержит трансмембранный домен, локализованный между остатками 406-428, включительно. ТМНММ представляет собой базу данных, которая позволяет предсказать трансмембранный домен, исходя из известных вторичных структур.

На фиг. 1 представлены результаты, полученные для ΙΝ8Ρ201 с помощью программы №ШС1ус (версия 1.0) (1Шр://\\л\лу.сЬ5.б1и.бк/5егу1се5/№1НС1ус/). NеΐNС1ус представляет собой программу, разработанную на основе алгоритма нейронной сети и предназначенную для идентификации консенсусной последовательности для Ν-связанного гликозилирования, АыъХаа-Зег/Тйг (где Хаа не является Ρτο), и окружающих ее последовательностей, в целях дифференциации акцепторных и неакцепторных последовательностей.

Гликозилирование представляет собой важную посттрансляционную модификацию, и известно, что она влияет на укладку, локализацию, транспорт белка, его растворимость, антигенность, биологическую активность и время полужизни, а также на межклеточные взаимодействия.

Исходя из этих экспериментов и на основе полученных здесь данных о последовательности ΙΝ8Ρ201, могут быть разработаны эксперименты для детектирования присутствия транскрипта ΙΝ8Ρ201 в человеческих тканях всех типов в целях определения его экспрессии в тканях. Кроме того, могут быть разработаны эксперименты для детектирования присутствия транскрипта ΙΝ8Ρ201 во всех нормальных и патологических тканях в целях установления более конкретной роли белка ΙΝ8Ρ201 в патологическом состоянии.

В то же самое время, клонирование гена ΙΝ8Ρ201 из человеческой геномной ДНК обеспечивает высокие уровни экспрессии белка ΙΝ8Ρ201 в прокариотических или в эукариотических экспрессионных системах и облегчает его последующую очистку и характеризацию. Так, например, рекомбинантный ΙΝ8Ρ201 может быть использован для продуцирования ΙΝ8Ρ201-специфических моноклональных или поликлональных антител, которые могут быть затем использованы в последующей биохимической характеризации ΙΝ8Ρ201.

Альтернативно, рекомбинантный ΙΝ8Ρ201 может быть использован в скрининг-анализах широкого ряда, включая анализы, описанные выше.

Пример 2. В настоящее время ведутся работы по клонированию гена, кодирующего полипептид ΙΝ8Ρ201. Такое клонирование может включать получение человеческих кДНК-матриц, например, из различных РНК-образцов для всех нормальных человеческих тканей (которые могут быть закуплены у фирм Οοη^ΐι, 8ΐ^аΐадеηе, ΑιηΝοη, Вюсйат Iη8ΐ^ΐиΐе и получены в лаборатории) с использованием фермента, такого как РНКаза Н-обратная транскриптаза 8ирег5спр1 ΙΙ (Iην^ΐ^οдеη). Библиотеки человеческих кДНК (в бактериофаговых векторах лямбда (λ)) могут быть закуплены у фирм Ск^есй, Iην^ΐ^οдеη, либо они могут быть получены в лаборатории в виде векторов λ СТ10. Для амплификации полноразмерной кодирующей последовательности предполагаемой кДНК могут быть сконструированы пары специфических ПЦР-праймеров с использованием программного обеспечения для конструирования праймеров, такого как Ρπιικγ Пеид^т 8οίΐ\ναΐΌ (8аейШс & Ε6ικαΙίοηα1 δοΓίλναΐΌ, ΡО Вοx 72045, ИлЛат, NС 277222045, И8А). Для амплификации последовательности ДНК каждого предсказанного экзона могут быть также сконструированы пары специфических ПЦР-праймеров с использованием такого же программного обеспечения. Эти выделенные ДНК-фрагменты могут быть сконструированы в нужном порядке с использованием клонирующих векторов, посредством ПЦР и/или реакций рестрикции/лигирования ДНК. ПЦР-праймеры были оптимизированы так, чтобы Тт составляла примерно 55 + 10°С, а содержание СС составляло 40-60%. При этом должны быть отобраны праймеры, обладающие высокой селективностью к последовательности-мишени (ΙΝ8Ρ201) и незначительным неспецифическим праймированием или вообще не обладающие таким неспецифическим праймированием. Затем может быть проведена ПЦР для амплификации представляющей интерес генной последовательности. Процедуры, необходимые для клонирования указанной последовательности, такие как субклонирование ПЦР-продуктов, ПЦР-реакция колоний, получение и секвенирование плазмидной ДНК, и наконец, конструирование экспрессионных векторов клеток млекопитающих, известны специалистам (см., например, VО 03/055913).

Затем для определения уровня распределения и уровней экспрессии полипептида ΙΝ8Ρ201 в тканях ίη νίνο могут быть проведены дополнительные эксперименты на основе описанных здесь нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Так, например, присутствие транскриптов для ΙΝ8Ρ201 может быть определено с помощью ПЦР

- 38 011261 кДНК различных человеческих тканей. В тест-образцах, транскрипт ΙΝ8Ρ201 может присутствовать на очень низких уровнях. Поэтому, крайне необходимо разработать эксперименты для детектирования присутствия транскрипта в различных человеческих тканях, поскольку небольшое количество геномных примесных включений в РНК-препарате может давать ложноположительный результат. Таким образом, перед проведением реакции обратной транскрипции вся РНК должна быть обработана ДНКазой. Кроме того для каждой ткани может быть проведена контрольная реакция, в которой указанная ткань не подвергается обратной транскрипции (контроль без ОТ).

Так, например, для генерирования кДНК с использованием обратной транскриптазы МиШкспр! (ΑΒΙ) и неспецифических гексамерных праймеров может быть взят 1 мкг полноразмерной РНК от каждой ткани. Для каждой ткани проводят контрольную реакцию, в которую добавляют все компоненты, за исключением обратной транскриптазы (контроль без ОТ). Для каждой ткани проводят ПЦР-реакции на образцах обратно транскрибируемой РНК и контрольные реакции без ОТ. ΙΝ8Ρ201-специфические праймеры могут быть легко сконструированы, исходя из полученных здесь данных о последовательности. Присутствие продукта с соответствующей молекулярной массой в образце с обратной транскриптазой, а также отсутствие продукта в контрольном образце без ОТ может свидетельствовать о присутствии транскрипта в этой ткани. Для скрининга на транскрипт ΙΝ8Ρ201 могут быть использованы не только вышеописанные библиотеки, а любые подходящие библиотеки кДНК.

Характер распределения полипептида ΙΝ8Ρ201 в ткани дает дополнительную ценную информацию о функции этих полипептидов.

Кроме того, сверхэкспрессия или недостаточная экспрессия полипептидов в клеточных линиях может служить критерием для определения влияния этого полипептида на активацию транскрипции генома клетки-хозяина. Партнеры по димеризации, ко-активаторы и ко-репрессоры полипептида ΙΝ8Ρ201 могут быть идентифицированы путем иммунопреципитации в комбинации с Вестерн-блот-анализом, и путем иммунопреципитации в комбинации с масс-спектроскопией.

Пример 3. Клонирование внеклеточного домена ΙΝ8Ρ201.

Было предсказано, что ΙΝ8Ρ201 представляет собой однократно проходящий через мембрану трансмембранный белок с неидентифицированным внеклеточным доменом (Ν-концевым) и консервативным внутриклеточным доменом (возможно участвующим в передаче сигнала). ΙΝ8Ρ201 представляет собой полноразмерный предсказанный белок, состоящий из 518 аминокислот (1554 п.н.), кодируемый в 3 экзонах. Предсказанный внеклеточный домен представлен первыми 405 аминокислотами (1215 п. н.). Все домены, за исключением 32 п.н., расположенных в самой крайней 3'-области предсказанного внеклеточного домена, кодируются в экзоне 1.

Пара ПЦР-праймеров (ΙΝ8201-ΟΡ1/ΙΝ8Ρ201-ΟΡ2) (фиг. 2) была сконструирована для амплификации 1215 п.н.-продукта, содержащего полноразмерный предсказанный внеклеточный домен. Обратный ПЦР-праймер ΙΝ8Ρ201-ΟΡ2 имел длину в 51 п.н. и содержал 19 п.н., перекрывающихся с 3'-концом экзона 1, а также 32 п.н. внеклеточного домена, кодируемого в экзоне 2. Эти праймеры использовали в ПЦР с применением геномной ДНК в качестве матрицы. Праймер ΙΝ8Ρ201-ΟΡ2 должен амплифицировать экзон 1 и одновременно добавлять 32 п.н. экзона 2 в ПЦР-продукт. ПЦР-продукты визуализировали на геле, и полосу предсказанного размера очищали и клонировали в клонирующий вектор рСКД-ΤΟΡΟ.

Анализ последовательности выявил клон, содержащий последовательность внеклеточного домена ΙΝ8Ρ201. Этот клон представляет собой плазмиду рСΚ4-ΤΟΡΟ-IN8Ρ201-ΕС.

3.1. Геноспецифические клонирующие праймеры для ПЦР.

Пару ПЦР-праймеров (ΙΝ8Ρ201-ΟΡ1 и ΙΝ8Ρ201-ΟΡ2, табл. 3) конструировали для амплификации 1215 п.н.-продукта, содержащего предсказанную кодирующую последовательность фактической кДНК, с использованием компьютерной программы для конструирования праймеров Ρπιικγ Оеыдпег 8оП\уаге (8с1епйПс & Ебисайопа1 8ойгаге, ΡΟ Вох 72045, Оигйат, NС 27722-2045, И8А). Были отобраны праймеры, обладающие высокой селективностью к последовательности-мишени (ΙΝ8Ρ201).

3.2. ПЦР внеклеточного домена ΙΝ8Ρ201 из геномной ДНК.

Предсказанный внеклеточный домен ΙΝ8Ρ201, по большей части, состоит из одного экзона, а поэтому он может быть амплифицирован из геномной ДНК. В обратный ПЦР-праймер IN8Ρ201-СР2 были включены 32 п.н. внеклеточного домена, присутствующие в экзоне 2, и этот праймер также содержал 19 п.н., перекрывающиеся с 3'-концом экзона 1. ПЦР проводили с использованием геноспецифических клонирующих праймеров ΙΝ8Ρ201-ΟΡ1/ΙΝ8Ρ201-ΟΡ2 и геномной ДНК в качестве матрицы в конечном объеме 50 мкл, содержащем ΙΧ буфер НЦй Е1бе1йу (ΗίΕί) Ρ1аΐ^ηит® Тад, 2 мМ Мд8О₄, 200 мкМ 6ΝΤΡ, 0,2 мкМ каждого клонирующего праймера, 1 единицу ДНК-полимеразы НЦй Е1бе1йу (ΗίΕί) Ρ1аΐ^ηит® Тад (^йгодеп), 100 нг геномной ДНК (Nονадеη Шс.), и ΟΧ, ΙΧ или 2Х раствора для стимуляции ПЦР, ΡΟΡ,. Епйапсег (Чптйгодеп). ПЦР проводили на аппарате М1 Векеагсй ЭХА Епдте, запрограмированном в следующем режиме: 94°С, 2 мин; 35 циклов - 94°С, 30 с, 68°С, 1 мин 30 с, а затем 1 цикл при 68°С в течение 78 мин и цикл выдерживания при 4°С.

Продукты амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1 X ТАЕ-буфере (Чт'йгодеп). ПЦР-продукты с предполагаемой молекулярной массой (1215 п.н.) выделяли из геля с использованием

- 39 011261 системы для очистки ДНК МшЕ1и1е ЭХА Рцпйсабоп 8ук1ет (Р1адеп), элюировали в 10 мкл ЕВ-буфера (10 мМ Трис-НС1, рН 8,5) и сразу субклонировали.

3.3. Субклонирование ПЦР-продуктов.

ПЦР-продукт субклонировали в клонирующий вектор, модифицированный топоизомеразой I (рСК4-ТОРО), с использованием набора для клонирования ТА, поставляемого фирмой Шуйгодеп Согрогабоп, в условиях, рекомендованных производителями. Вкратце, 4 мкл гель-очищенного ПЦР-продукта инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с 1 мкл вектора ТОРО и 1 мкл солевого раствора. Затем штамм ТОР10 Е.соб (Шуйгодеп) трансформировали реакционной смесью следующим образом: 50 мкл-аликвоту однократной дозы клеток ТОР 10 оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси ТОРО. После этого смесь инкубировали в течение 15 мин на льду, а затем подвергали тепловому шоку путем инкубирования при 42°С строго в течение 30 с. Образцы возвращали на лед и добавляли 250 мкл теплой (при комнатной температуре) среды 8ОС. Образцы инкубировали при встряхивании (220 об/мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем, полный объем смеси для трансформации высевали на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.

3.4. ПЦР колоний.

Колонии инокулировали в 50 мкл стерильной воды с помощью стерильной зубочистки. Затем 10 мкл-аликвоту инокулята подвергали ПЦР в полном объеме реакционной смеси 20 мкл, содержащем IX буфер АтрИТац™, 200 мкМ б№ТР, 20 пмоль праймера Т7, 20 пмоль праймера ТЗ и 1 единицу АтрбТас.|™ (АрШеб Вюкуйетк) на аппарате М1 йекеагсй ЭНА Епдте. ПЦР-реакцию осуществляли в следующем режиме: 94°С, 2 мин, 30 циклов при 94°С, 30 с, 48°С, 30 с, и 72°С в течение 1 мин 30 с. Затем образцы оставляли при 4°С (цикл выдерживания) до проведения последующего анализа.

ПЦР-продукты анализировали на 1% агарозном геле в К ТАЕ-буфере. Колонии, которые давали ПЦР-продукты, имеющие приблизительно ожидаемую молекулярную массу (1215 п.н. + 105 п.н., то есть с учетом сайта множественного клонирования (МС8)), культивировали в течение ночи при 37°С в 5 мл Ь-бульона (ЬВ), содержащего ампициллин (100 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об/мин.

3.5. Получение и секвенирование плазмидной ДНК.

Минипрепарат плазмидной ДНК выделяли из 5 мл-культуры с использованием роботизированной системы ВюгоЬо! 8000 (01адеп) или набора Ш1/агб Р1ик 8ν М1шргерк (Рготеда са1. № 1460) в соответствии с инструкциями производителя. Плазмидную ДНК элюировали в 80 мкл стерильной воды. Концентрацию ДНК измеряли на фотометре 8ресбатах 190 (Мо1еси1аг Ьсуюск). Плазмидную ДНК (200-500 нг) подвергали секвенированию с помощью праймеров Т7 и Т3 и геноспецифических праймеров IN8Ρ2018Р1 и ГЫ8Р201-8Р2 с использованием системы терминации цепи красителем ВщЬуе (ЫдОуе-ТетбпаЮг) (АрШеб Вюкук1етк са1. № 4390246) в соответствии с инструкциями производителей. Последовательность праймера представлена в таблице 3. Реакционные смеси для секвенирования очищали на колонках с ЬуеЕх (01адеп) или на планшетах для очистки Моп!аде 8ЕО 96 (Мйброге са1. № Ь8К809624), а затем анализировали на секвенаторе Аррбеб ВюкукЫпк 3700.

Анализ последовательности выявил клон, который имел 100%-ное соответствие с предсказанной последовательностью внеклеточного домена ГЫ8Р201 на аминокислотном уровне. Последовательность клонированного кДНК-фрагмента представлена на фиг. 3. Клонированный ПЦР-продукт находится в плазмиде рСВ4-ТОРО-П\[8Р201-ЕС.

3.6. Конструирование векторов, экспрессирующих ГЫ8Р201-ЕС в клетках млекопитающих.

Плазмиду рСΒ4-ТОΡО-IN8Ρ201-ΕС использовали в качестве ПЦР-матрицы для генерирования клонов, экспрессирующих рЕАК12б и рОЕ8Т12.2, и содержащих последовательность ОРС ГЫ8Р201-ЕС с 3'последовательностью, кодирующей 6Ш8-метку, с применением технологии клонирования Са1е\уау^т™ Дпуйгодеп).

3.7. Генерирование Са1етау-совместимой ОРС ГЫ8Р201-ЕС, присоединенной к последовательности 6Ш8-метки с сохранением рамки считывания.

Первая стадия способа Са1е^ау-клонирования включает двустадийную ПЦР-реакцию, в результате которой генерируется ОРС ГЫ8Р201-ЕС, фланкированная у 5'-конца абВ1-сайтом рекомбинации и последовательностью Козака, а у 3'-конца последовательностью, кодирующей 6-гистидиновую (6Ш8) метку с сохранением рамки считывания, стоп-кодоном и айВ2-сайтом рекомбинации (Са1е\\^гау-совместимая кДНК).

Реакционная смесь для первой ПЦР (в конечном объеме 50 мкл) содержит, соответственно: 1 мкл (30 нг) плазмиды рСК4-ТОРО-ГЫ8Р201-ЕС, 1,5 мкл бNТΡ (10 мМ), 10 мкл 10Х полимеразного буфера РГх, 1 мкл Мд8О₄ (50 мМ), 0,5 мкл каждого геноспецифического праймера (100 мкМ) (IN8Ρ201ΕС-ΕX1 и IN8Ρ201ΕС-ΕX2) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Р1абпцт РГх (Шуйгодеп). ПЦР-реакцию осуществляли в следующем режиме: предварительная стадия денатурации при 95°С, 2 мин, затем 12 циклов при 94°С, 15 с; 55°С, 30 с, и 68°С, 2 мин; и цикл выдерживания при 4°С. Амплифицированный продукт непосредственно очищали с использованием системы очистки ДНК Ш1/агб РСй Ргерк (Рготеда) и разводили в 50 мкл стерильной воды в соответствии с инструкциями производителя.

Реакционная смесь для второй ПЦР (в конечном объеме 50 мкл) содержит 10 мкл очищенного

- 40 011261

ПЦР1-продукта, 1,5 мкл бХГР (10 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера РГх, 1 мкл Мд8О₄ (50 мМ), 0,5 мкл каждого конвертирующего Са!е^ау-праймера (100 мкМ) (прямого праймера ССР и обратного праймера ССР) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Р1а!шит РГх. Вторую ПЦР-реакцию осуществляли в следующем режиме: 95°С, 1 мин; 4 цикла при 94°С, 15 с; 50°С, 30 с и 68°С, 2 мин; 25 циклов при 94°С, 15 с; 55°С, 30 сек и 68°С, 2 мин; с последующим циклом выдерживания при 4°С. 10 мкл-аликвоту визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1 X ТАЕ-буфере (Зт'йгодеп) для подтверждения получения продукта с ожидаемой молекулярной массой (1215+70=1285 п.н.). Остальные 40 мкл загружали на 0,8% агарозный гель в 1 X ТАЕ-буфере и полосу очищали с использованием системы очистки ДНК νί/агб РСВ Ргерк (Рготеда), а затем разводили в 50 мкл стерильной воды в соответствии с инструкциями производителя.

3.8. Субклонирование Са!е^ау-совместимой ОРС Ш8Р201-ЕС во встраивающий Са!е^ау-вектор ΙιΩΟΝΚΙΣ! и в экспрессионные векторы рЕАК12б-РАС и рИЕ8Т12.2.

Вторая стадия процесса Са!е^ау-клонирования включает субклонирование Са!е^аумодифицированного ПЦР-продукта во встраивающий Са!е^ау-вектор р^ΟNВ221 (^йгодеп), которое проводили следующим образом: 5 мкл очищенного ПЦР2-продукта инкубировали с 1,5 мкл вектора ]:>ΟΟΝΚ221 (0,1 мкг/мкл), 2 мкл буфера ВР и 1,5 мкл смеси клоназных ферментов ВР (Зптйгодеп) в конечном объеме 10 мкл при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакцию прекращали добавлением 1 мкл протеиназы К (2 мкг/мл) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту этой реакционной смеси (1 мкл) использовали для трансформации клеток ΌΗ10Β Е.со11 путем электропорации, проводимой следующим образом: 25 мкл-аликвоту электрокомпетентных клеток ΌΗ10Β (ИщЦгодеп) оттаивали на льду и добавляли 1 мкл реакционной смеси ВР. Затем смесь переносили в охлажденную 0,1 см-кювету для электропорации и клетки подвергали электропорации с использованием генератора импульсов ВюВаб Сепе Рикег™ в соответствии с протоколом, рекомендованным производителями. Сразу после электропорации добавляли среду 8ОС (0,5 мл), предварительно нагретую до комнатной температуры. Смесь переносили в 15-миллилитровую пробирку с защелкивающейся крышкой и инкубировали при встряхивании (220 об/мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем аликвоты смеси для трансформации (10 мкл и 50 мкл) высевали на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим канамицин (40 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.

Минипрепарат плазмидной ДНК выделяли из 5 мл-культуры 8 полученных колоний с использованием роботизированной системы О|аргер ВюгоЬо! 8000 (О|адеп). Плазмидную ДНК (150-200 нг) подвергали секвенированию с использованием праймеров 21М13 и М13К.е\\ а также геноспецифических секвенирующих праймеров Ш8Р201-319Е-8Р1 и Ш8Р201-570Е-8Р1, как описано выше, с применением системы терминации цепи красителем ВщЬуе (АрШеб Вюкуйетк са!. № 4336919) в соответствии с инструкциями производителей. Последовательности праймеров представлены в табл. 3. Реакционные смеси для секвенирования очищали на планшетах для очистки Моп!аде 8ЕО 96 (М1Шроге са!. № Ь8К809624), а затем анализировали на секвенаторе АррНеб Вюкуйетк 3700.

Затем, элюат плазмиды (2 мкл или приблизительно 150 нг) от клона, содержащего Ш8Р201-ЕС6Н18-вставку (рΕNТВ_IN8Ρ201-ΕС-6ΗI8), использовали в реакционной смеси для рекомбинации, содержащей 1,5 мкл вектора рЕАК12б-РАС или вектора рИЕ8Т12.2 (0,1 мкг/мкл), 2 мкл ЬВ-буфера и 1,5 мкл ЬВ-клоназы (Зт'йгодеп) в конечном объеме 10 мкл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем реакцию прекращали добавлением 1 мкл протеиназы К (2 мкг/мл) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту этой реакционной смеси (1 мкл) использовали для трансформации клеток ЭН 10В Е.сой путем электропорации, проводимой следующим образом: 25 мкл-аликвоту электрокомпетентных клеток ИН 10В (ПщЦгодеп) оттаивали на льду и добавляли 1 мкл реакционной смеси ЬВ. Затем смесь переносили в охлажденную 0,1 см-кювету для электропорации и клетки подвергали электропорации с использованием генератора импульсов ВюВаб Сепе Рикег™ в соответствии с протоколом, рекомендованным производителями. Сразу после электропорации добавляли среду 8ОС (0,5 мл), предварительно нагретую до комнатной температуры. Смесь переносили в 15-миллилитровую пробирку с защелкивающейся крышкой и инкубировали при встряхивании (220 об/мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем аликвоты смеси для трансформации (10 мкл и 50 мкл) высевали на планшеты с Ь-бульоном (ЬВ), содержащим ампициллин (100 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С.

Минипрепарат плазмидной ДНК выделяли из 5 мл-культуры 6 полученных колоний, субклонированных в каждый вектор, с использованием роботизированной системы О|аргер ВюгоЬо! 8000 (О|адеп). Плазмидную ДНК (200-500 нг) в векторе рЕАК12б-РАС подвергали секвенированию ДНК с использованием праймеров рЕАК12Е и рЕАК12В, а также геноспецифических секвенирующих праймеров Ш8Р201319Е-8Р1 и Ш8Р201-570Е-8Р1, описанных выше. Плазмидную ДНК (200-500 нг) в векторе рЬЕ8Т12.2 подвергали секвенированию с использованием праймеров 21М13 и Μ13Веν, а также геноспецифических секвенирующих праймеров, описанных выше. Последовательности праймеров представлены в табл. 3.

Максипрепарат ДНК, очищенный в градиенте СкС1, получали из 500 мл культуры клона с подтвержденной последовательностью (рЕАК12б-РАС_Ш8Р201-ЕС-6Н18) методом, описанным 8атЬгоок I. е! а1., 1989 (Мо1еси1аг С1ошпд, А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2^пб ебйюп, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк), и плазмидную ДНК ресуспендировали при концентрации 1 мкг/мкл в стерильной воде (или 10 мМ Трис-НС1, рН 8,5) и хранили при -20°С.

- 41 011261

Максипрепарат ДНК, не содержащий эндотоксина, получали из 500 мл культуры клона с подтвержденной последовательностью (рОЕЗТ12.2_ШЗР201-ЕС-6Н1З) с использованием набора ЕпбоРгее Р1акт1б Меда (О1адеп) в соответствии с инструкциями производителей. Очищенную плазмидную ДНК ресуспендировали в ТЕ-буфере, не содержащем эндотоксина, при конечной концентрации по меньшей мере 3 мкг/мкл и хранили при -20°С.

Таблица 3. Праймеры для клонирования и секвенирования ШЗР201

Праймер	Последовательность (5'-*3')
1П5Р201-СР!	АТС ААА ТСА ТТС АОС СОС АТС СТС ТТС СТС СТС ТТС СТС
ΙΝ8Ρ201-ΟΡ2	ТСС 6СС А СО ТОО ТСС ССС САС САС А6Т САС ССС СЮТ СТС СТТ САС ТСС СТС
1МЗР201ЕС-ЕХ1	ОСА ССС ТТС ОСС АСС АТО ААА ТСА ТТС АОС СОО АТ
ВЧ8Р201ЕС-ЕХ2	ТС АТС СТС АТС СТС ТОС ОСС АСО ТОО ТСС ССС САС
ΙΝ8Ρ201-319Ρ-8Ρ1	ОСТ ОАС ТСА СТС АСА АСС ТСАА
ΙΝ8Ρ201-570Ρ-5Ρ2	ТОА АОТ СТС АСА ОСС АСА АС
Прямой праймер ОСР	О ООО АСА АОТ ТТО ТАС ААА ААА ОСА ООС ТТС ОСС АСС
Обратный праймер ССР	ООО ОАС САС ТТТ СТА САА ОАА АОС ТОО ОТТ ТСА АТС СТС АТС СТС АТС СТС
рЕАК12Р	ОСС АОС ТТО ОСА СТТ ОАТ ОТ
рЕАК12К	ОАТ ОСА СОТ ООА СОТ ОТС АО
21М13	ТОТ ААА АСО АСО ССС АОТ
М13КЕУ	САО ОАА АСА ОСТ АТС АСС
Т7	ТАА ТАС ОАС ТСА СТА ТАО О
’тз	АТТ ААС ССТ САС ТАА АОО

Подчеркнутая последовательность = последовательность Козака. Последовательность, показанная жирным шрифтом, = стоп-кодон. Последовательность, показанная курсивом, = Н1к-метка.

Пример 4. Экспрессия клонированной Н1к-меченой плазмиды рЕАК12б-РАС ШЗР201-ЕС-6Н1З методом функциональной геномики в клетках млекопитающих и ее очистка.

Клетки почек человеческого эмбриона 293, экспрессирующие ядерный антиген вируса ЭпштейнаБарра (НЕК2 93-ЕΒNА, 1пуйгодеп), поддерживали в суспензии бессывороточной среды Ех-клеток νΤΚΟ (посевной материал, поддерживающая среда, ЖН). Клетки инокулировали при плотности 1х10⁶ клеток/мл в 250 мл среды РЕМЕ (среда ОМЕМ/Хэмса Р-12 (1:1), 19 мМ НЕРЕЗ, 5 г/л глюкозы, 7,5 мМ Ьглутамина, 4 мл/л 1ТЗ-Х) (все реагенты поставлялись от 1пуйгодеп-Ь1Ге ТесЬпо1од1ек), в которую была добавлена 1% РСЗ. Для трансфекции добавляли смесь 500 мкг ДНК (рЕАК12б-РАС_ШЗР201-ЕС-6Н1З) плюс 10 мкг репортерной ДНК, разведенную в 50 мл РЕМЕ с 1% РСЗ. Затем добавляли 1 мл РЕ1 (1 мг/л реагента Ро1укс1епсе, ИЗА). Эту смесь инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Через 10 мин к клеткам добавляли смесь для трансфекции и культуру инкубировали при 37°С в инкубаторе в течение 90 мин. Реакционную смесь доводили до конечного объема путем добавления остальных 200 мл РЕМЕ с 1% РСЗ, содержащих 2,5 мл реагента Реп-З1гер для предотвращения внесения примесей вследствие нестерильности ДНК. Подтверждение позитивной трансфекции проводили путем качественной оценки флуоресценции на день 6 (Ахюуей 10 2е1кк). На 6-й день (день сбора) супернатант (500 мл) центрифугировали (4°С, 400 х д), а затем помещали в сосуд, содержащий уникальный идентификатор.

4.1. Способ очистки.

500 мл образца культуральной среды, содержащего рекомбинантный белок с С-концевой 6Н1кметкой, разводили одним объемом холодного буфера А (50 мМ N84^04 600 мМ №С1; 8,7% (мас./об) глицерина, рН 7,5) до конечного объема 1000 мл. Образец фильтровали через стерильный 0,22 мкмфильтр (Мййроге, 500 мл-фильтровальное устройство) и выдерживали при 4°С в стерильном 1 литровом сосуде среднего размера Ща1депе).

Очистку осуществляли при 4°С на рабочей станции νΚΙΟΝ (Аррйеб Вюкуйетк), подсоединенной к автоматическому устройству для загрузки образцов (ЪаЬотайс). Процедура очистки состояла из двух последовательных стадий, то есть стадии проведения металлоаффинной хроматографии на колонке с

Рогок 20 МС (Аррйеб Вюкуйетк), загруженной ионами N1 (10х50 мм, 3,93 мл), с последующей заменой буфера на гель-фильтрационной колонке (1,0х15 см) со средой, содержащей сефадекс С-25 (АтегкЬат

РЬагташа).

Для проведения первой стадии хроматографии металлоаффинную колонку регенерировали 30 ко- 42 011261 лоночными объемами раствора ΕΌΤΑ (100 мМ ΕΌΤΑ; 1М ИаС1; рН 8,0), снова загружали ионы Νί путем промывки 15 колоночными объемами 100 мМ раствора Νί8Ο₄, после чего промывали 10 колоночными объемами буфера А, а затем 7 колоночными объемами буфера В (50 мМ Ν3Η₂ΡΟ₄; 600 мМ №С1; 8,7% (масс/об) глицерин, 400 мМ имидазол; рН 7,5), и наконец, уравновешивали 15 колоночными объемами буфера А, содержащего 15 мМ имидазола. Образец переносили с помощью устройства для загрузки образцов ΕιώοιηηΙχ в 200 мл-петлю для образца, а затем загружали на аффинную колонку с металлическим Νί при скорости потока 20 мл/мин. Для переноса всего образца (1000 мл) на Νί-колонку процедуру загрузки повторяли 5 раз. После этого колонку промывали 12 колоночными объемами буфера А, а затем 28 колоночными объемами буфера А, содержащего 20 мМ имидазола. Во время промывки 20 мМ имидазолом непрочно связанные примесные белки элюировались с колонки. И наконец, рекомбинантный Ηίδмеченый белок элюировали 10 колоночными объемами буфера В при скорости потока 2 мл/мин, и элюированный белок собирали в 2,7 мл-фракцию.

Для проведения второй стадии хроматографии гель-фильтрационную колонку с сефадексом О-25 регенерировали 2 мл буфера Ό (1,137 М №С1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ ΚΗ₂ΡΟ₄; 8 мМ Νη_;ΗΡΟ.₁; рН 7,2), а затем уравновешивали 4 колоночными объемами буфера С (137 мМ №С1, 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ ΚΗ₂ΡΟ₄; 8 мМ Ν3₂ΗΡΟ₄; 20% (мас./об) глицерина; рН 7,4). Фракцию пика, элюированную с Νί-колонки, автоматически пропускали через многофункциональное устройство для загрузки образцов, подсоединенное к аппарату νΙ8ΙΟΝ, и загружали в колонку с сефадексом О-25, а затем белок элюировали буфером С при скорости потока 2 мл/мин. Обессоленный образец собирали в 2,7 мл-фракцию. Эту фракцию фильтровали через стерильный центрифужный 0,22 мкм-фильтр (Μί11ίροκ), разделяли на аликвоты, замораживали и хранили при -80°С. Аликвоту данного образца анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (в 4-12% геле ΝιιΡΑΟΕ; Nονеx) посредством окрашивания кумасси синим и путем проведения Вестернблоттинга с использованием анти-Ηίδ антител.

4.2. Окрашивание кумасси синим.

Гель ΝιιΡΑΟΕ окрашивали в растворе для окрашивания, содержащем 0,1% кумасси синего Я250 (30% метанол, 10% уксусная кислота), при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем обесцвечивали в 20% метаноле, 7,5% уксусной кислоте до тех пор, пока фон не становился прозрачным, а полосы белка не становились видимыми.

4.3. Вестерн-блоттинг.

После электрофореза белки подвергали электрофоретическому переносу из геля на нитрицеллюлозную мембрану при 290 мА в течение 1 ч при 4°С. Мембрану блокировали 5% сухим молоком в буфере Е (137 мМ ЫаС1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ ΚΗ₂ΡΟ₄; 8 мМ Ν;ι,Ί ΙΡΟ₄; 0,1% твина 20, рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали со смесью 2 кроличьих поликлональных анти-Ηίδ антител (О-18 и Н-15, 0,2 мгк/мл каждого; 8ал!а Сгнх) в 2,5% сухом молоке в буфере Е в течение ночи при 4°С. После инкубирования в течение еще 1 ч при комнатной температуре мембрану промывали буфером Е (3x10 мин), а затем инкубировали со вторым ПХ-конъюгированным антикроличьем антителом (ΌΑΚΟ, ΗΡΡ 0399), разведенным 1/3000 в буфере Е, содержащем 2,5% сухое молоко, в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки буфером Е (3x10 мин) мембрану проявляли в течение 1 мин с помощью ЭХЛ-набора (АтегШат). Затем мембрану экспонировали с пленкой Η\^ΓΓί1ιη (АтегШат), пленку проявляли и снимок вестерн-блота визуально анализировали.

Пример 5. Оценка уровней экспрессии гена ΙΝ8Ρ201 с помощью анализа ΤηςΜηη.

ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием химического соединения 8УВЯ, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, на системе детектирования последовательности ΑΒΙ ΡΚ18Μ 7700 8ецненсе ^еΐесΐ^οη 8у51еш. Пары ПЦР-праймеров конструировали так, чтобы полученный продукт включал интрон анализируемой последовательности. Уровни экспрессии продуктов определяли в панели ОТ-ПЦР-продуктов, полученных из РНК-образцов с использованием рандомизированных праймеров.

Полноразмерную РНК от каждого образца подвергали обратной транскрипции с использованием системы синтеза первой цепи для ОТ-ПЦР 8иρе^8сπρΐ ΙΙΙ (Ιηνίίτο^η, СаЕ № 18080-051) в конечном реакционном объеме 20 мкл. 2 мкг полноразмерной РНК объединяли с 50 нг рандомизированных гексамерных праймеров, 10 мМ каждого из 6ΑΤΡ, 66ΤΡ, άί,’ΤΡ и 6ΤΤΡ и с ^ΕΡС-обработанной водой в объеме 10 мкл. Смесь инкубировали при 65°С в течение 5 мин, а затем охлаждали на льду в течение 1 мин. В отдельной пробирке получали 10 мкл нижеследующей смеси для синтеза кДНК: 2 мкл 10Х ЯГ-буфера, 4 мкл 2 5 мМ МдС1₂, 2 мкл 0,1М ΌΤΤ, 1 мкл РНКазы Ρηη^ΟυΤ¹™ (40 единиц/мкл) и 1 мкл фермента ЯΤ 8иρе^8сπρΐ™ ΙΙΙ (200 единиц/мкл). Смесь для синтеза кДНК добавляли к смеси РНК/праймер, слегка помешивали, инкубировали при 25°С в течение 10 мин, а затем при 50°С в течение 50 мин. Затем фермент ЯΤ инактивировали путем инкубирования при 85°С в течение 5 мин. Смесь охлаждали на льду, а затем добавляли 1 мкл РНКазы Н Εχο1ί (2 единицы/мкл) и смесь инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Смесь охлаждали на льду, а затем разводили 1/250 стерильной водой. Затем, разведения реакционной смеси обратной транскриптазы анализировали с помощью ПЦР в реальном времени на аппарате ΤηςΜηη (ΡΕ Β^ο8у8ΐет8 7700).

Праймеры для проведения ПЦР человеческого ΙΝ8Ρ201 в реальном времени с использованием

- 43 011261

8УВВ, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназу САБИН (контроль: гены домашнего хозяйства) конструировали с использованием программы для экспрессии праймеров Ρππκγ Ехргекк (ΡΕ Вюкук!етк), последовательности которых представлены ниже: ΙΝ8Ρ201-ΗΟ (с парой праймеров, охватывающих пограничную область между экзоном 1 и экзоном 2), обратный праймер 5'-ТССССССАССАСАСТСАС-3'; прямой праймер 5'-СССАССТСАСССАСТСААСА-3'; СΛΡ^Н, обратный праймер 5'-САТСССАТТТССАТТСАТСАСА-3'; прямой праймер 5'-ССАСССАТСССАААТТСС-3'; интрон-САГИН, обратный праймер 5'-ССТАСТСССАССССхСАТТ3'; прямой праймер 5'-СТСТССТСССАСТССТСАТТТС-3'. Специфичность и оптимальную концентрацию праймеров тестировали на плазмиде рСВ4-ТОΡО-IN8Ρ201-ЕС. Потенциальную примесную геномную ДНК удаляли путем проведения ПЦР-реакций с использованием специфических интронных САΡ^Н-праймеров. Отсутствие неспецифической амплификации подтверждали путем проведения анализа ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в 3,5% агарозном геле для гарантии продуцирования одной полосы с ожидаемой молекулярной массой.

ПЦР в реальном времени с применением соединения 8УВВ, флуоресцирующего в зеленом диапазоне спектра, осуществляли с использованием 5 мкл/лунку ОТ-продуктов, 25 мкл/лунку ПЦР-смеси Мак!ег М1х, содержащей 8УВВ, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра (РЕ Вюкук!етк), урацил-Νгликозилазу АтрЕгаке (иИС) (0,5 единиц/лунку) и 20 мкл праймеров (300 нм). ПЦР проводили при 50°С в течение 2 мин (для инкубирования АтрЕгаке υNС в целях удаления любого урацила, включенного в кДНК), при 95°С в течение 10 мин (для активации золотом АтрйТац) , а затем проводили раунд ПЦР в 40 циклов при 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин на системе детектирования ΛΕΙ Ρ^ΙδΙΗ 7700. Таким образом, образцы кДНК, подвергнутые обратной транскрипции, амплифицировали и определяли их величины С! (пороговое число циклов). Все величины С! были нормализованы по величинам, полученным для конститутивного гена (гена домашнего хозяйства) САΡ^Н. Одна специфическая ДНКполоса для IN8Ρ201-ЕС и САΡ^Н наблюдалась в гель-электрофоретическом анализе. Принцип детектирования, проводимого в реальном времени с использованием ПЦР-смеси Мак!ег М1х, содержащей зеленый 8УВВ основан на непосредственном детектировании ПЦР-продукта путем измерения увеличения интенсивности флуоресценции, обусловленного связыванием зеленого красителя 8УВВ с двухцепочечной ДНК. Различие уровней экспрессии САΡ^Н и ΙΝ8Ρ201-ΗΟ в каждом образце кДНК выражали как разность величин С!, то есть, дельта (δ) С! = С!(САΡ^Н) - 0ΐ(ΙΝ8Ρ201-Η0). Результаты для каждого образца выражали как кратную разность числа циклов, необходимых для детектируемой экспрессии IN8Ρ201-ЕС по отношению к числу циклов, необходимых для САΡ^Н, и вычисляли по формуле кратная разность =2(^-<5^с1). И наконец, был определен уровень экспрессии ΙΝ8Ρ201-ΗΟ в каждом образце кДНК по отношению к уровню экспрессии гена САΡ^Н, где уровень экспрессии САΡ^Н был принят за 100%, путем деления 100 на кратную разность для ΙΝ8Ρ201-ΒΟ Результаты приводятся в табл. 4-9.

Таблица 4

- 44 011261

Таблица 5

Сравнительные ткани	По отношению к <3Α₽ϋΗ (=100)
576 головной мозг	0,01
5140 головной мозг плода	0,03
377 сердце	0, 00
3143 сердце плода	0, 00
378 почки	0,00
3121 почки плода	0,01
3130 полноразмерная РНК почки, пораженной волчанкой	0,00
5135 опухоль почки	0,01
579 печень	0,00
5142 печень плода	0, 00
5127 полноразмерная РНК печени, пораженной волчанкой	0, 01
5131 печень, пораженная циррозом	0,00
5136 опухоль печени	0, 00
380 легкие	0,03
3144 легкие плода	0,00
3128 полноразмерная РНК легких, пораженных волчанкой	0,00
5132 легкие, пораженные циррозом	0, 00
3137 опухоль легких	0,34
584 селезенка	0, 00
3141 селезенка плода	0, 00
3129 полноразмерная РНК селезенки, пораженной волчанкой	0, 00
5133 селезенка, пораженная циррозом	0,00
5117 все нормальные ткани человека	0, 01

Таблица 6

Секреторные и иммунные ткани	По отношению к САРОН (=100)
387 костный мозг	0,02
388 щитовидная железа	0, 03
3115 слюнная железа	0,00
8116 надпочечник	0,00
3123 молочная железа	0,01
3125 гипофиз	0,00
3145 лимфоузел	0,02
3146 жировая ткань	0,02
3148 аппендикс	0,00
3149 кровеносная артерия	0,00
8150 горло	0,00
375 миндалины	0,06
854 строма	0,01
3153 клетки НЬМЕС	0,00
3157 стимулированные клетки НЬМЕС	#КЕЕ!
3155 клетки НАоЕС	0, 00
3158 стимулированные клетки НАоЕС	0, 00
511 РЛ2	0,06
312 РАЗ	0, 00

- 45 011261

Таблица 7

Первичные клетки и клеточные линии (не-лейкоцитарные)	По отношению к 6Α₽ϋΗ (=100)
31 фибробласт АС1518	0, 00
82 Ноыагб АЬ	0,09
53 С1агк N	0,00
34 ΝΓ1	0,20
85 ΝΓ2	0, 19
86 ЗЗсЫ2	0,00
57 ЗЗСА2	0,01
315 ЬЫ1	0, 00
816 ЬаЫ	0, 00
817 ΣΝ14	0,01
318 ЬА13	0,00
89 νηοε2	0,00
810 ΝΗϋΕ3	0,00
555 ОЕНС	0, 00
856 НТ 1080	0, 00
857 МКС-5	0, 01
8152 клетки МоЬ	0, 00
3155 стимулированные клетки МоЬ	0, 00
8156 стимулированные клетки МоЬ	0, 00
520 кератиноциты кожи К1	0,00
521 кератиноциты кожи К2	0, 16

Таблица 8

Первичные клетки и клеточные линии 2 - иммунные и происходящие от ЦНС	По отношению к ОАРЦН (=100)
530 ТНР-1 топо/тас	0,00
535 базофил Κϋ812	0,10
337 КЦ812/РМА	0,05
543 Дигкаб	0,00
358 РВМС1	0,00
559 гранулоциты 1	0, 02
361 РВМС2.2	0,00
897 8Κ-Ν-Α8	0,00
398 ТЕ671 субклон 2	0,04
599 КЕЫЛ	0, 00
5100 и-373 МС	0,00
5101 0-87 МС	0,00
8102 Т98С	0,00
8103 ВЕ(2)-С	0,04
8104 ССЕ-8ТСС1	0,00
8105 ТЕ571	0,01
3106 А172	0,00
2107 132Ν1	0,00

- 46 011261

3108 ЗК-РЫ-БИ	0, 01
3109 3Κ-Ν-3Η	0,26
£38 МОЬТ-4	0, 01
341 ЕОЬ-З	0,06
344 ЕОЬ-3+1Ъ2	0, 02

Таблица 9

1 ВЗК-виоптат	По отношению к ΘΑΡϋΗ (=100)
N1	0,02
N2	0,09
N3	0, 02
N4	0,03
N5	0, 01
N9	0,01
N10	0,03
Οϋΐ	0,59
СР2	0,07
СРЗ	0,30
С04	0,03
СО5	0, 01
счб	0, 13
ΟΏ8	0,15
СО9	0,02
СО10	0, 15
СО13	0,20
СИ6	0,31
СЭ17	0,16
СЭ18	0,03
СЭ19	0,02
СО20	0,02
СО22	0,07
N11	0,30
N14	0,05
N26	2,19
N27	2,79

N29	0,79
N30	0,39
СЭ4 Ыз	0,25
СО6 Ыз	0,35
СО23	0, 24
СЭ24	0,54
ΟΌ25	0,10
0Ώ26	0,39
СО27	0,11
0Ό28	0, 61
□СИ	0,90
ис12	0,31
ис13	0,01
ис14	1,21
ис15	0,58
ис18	0,02
□С19	0,01

- 47 011261

Определение порогового уровня экспрессии Ш8Р201-ЕС по отношению к экспрессии САРЭН, составляющего 0,3, которое было проведено с помощью анализа ТацМаи, неожиданно выявило ограниченную экспрессию Ш8Р163 в одной ткани поджелудочной железы (табл. 4 и фиг. 4) и в одной ткани опухоли легких (табл. 5 и фиг. 5), и высокие уровни экспрессии в различных тканях кишечника, пораженных воспалительным заболеванием (табл. 9 и фиг. 6). Какой-либо экспрессии Ш8Р201-ЕС в нормальных тканях легких не наблюдалось (уровень экспрессии Ш8Р201-ЕС по отношению к САРЭН составлял ниже 0,03). Опухолью легких является бронхогенная карцинома, а более конкретно плоскоклеточная карцинома.

Такая специфическая картина экспрессии позволяет сделать вывод, что Ш8Р201-ЕС участвует в развитии рака легких и воспалительного заболевания кишечника. Эти неожиданные свойства, характеризующие полинуклеотиды или соответствующие полипептиды согласно изобретению, делают их особенно подходящими для приготовления лекарственного средства или фармацевтической композиции. Было неожиданно обнаружено, что полинуклеотиды или соответствующие полипептиды согласно изобретению имеют ограниченную экспрессию в одной ткани поджелудочной железы, в одной ткани опухоли легких и в различных тканях кишечника, пораженных воспалительным заболеванием.

Пример 6. Определение уровней цитокинов, продуцируемых СоиА-стимулированными человеческими МКПК, путем цитометрии с использованием массива сфер (СВА).

6.1. Краткое описание.

Целью настоящего исследования является обнаружение новых модуляторов секреции цитокинов с использованием мононуклеарных клеток периферической крови человека (МКПК), стимулированных митогеном конканавалином А (СоиА).

Белок Ш8Р201-ЕС ингибирует секрецию 1Ь-2 из СоиА-стимулированных человеческих МКПК с Е_тах=80% и ЕС₅₀=8 мкг/мл, при этом какого-либо влияния на уровни ΙΕΝ-γ, ΤΝΕ-α, 1Ь-4, 1Ь-5 или 1Ь-10 не наблюдалось.

6.2. Оборудование и программное обеспечение.

Фотометр ЕХ (ЬаЬкук!ет) для 96-луночного микротитрационного планшета;

Программа Сгарб Раб Рпкт;

Программа Ехсе1;

Проточный цитометр Вес!ои-Оюкшкои;

Программа для анализа СВА;

Шкаф для культивирования клеток;

Инкубатор для культивирования клеток;

Центрифуга;

Пипетки.

6.3. Материалы и реагенты.

Лейкоцитарная пленка;

ЭМЕМ СИВСО ВеР 21331-020;

Человеческая сыворотка типа АВ 8ЮМА ВеГ: Н1513;

Ь-глутамин СИВСО Ве1': 250030-020;

Пенициллин-стрептомицин СШСО ВеР 150070-063;

Фиколл РНАВМАОА ВеГ: 17-1440-03;

96-луночный микротитрационный планшет для культивирования клеток СО8ТАВ ВеГ: 3596;

Конканавалин А 8ЮМА ВеГ: С0412;

Водорастворимый дексаметазон 8ЮМА РеГ:Э2915;

Набор, содержащий СВА с человеческими Т61/Т62 и цитокинами, Вес!ои-О1скшкои ВеГ: 550749;

РВ8 СИВСО ВеГ: 14190-094;

мл стерильного реагента РАЦСОК Вес!ои-Оюкшкои ВеГ: 2070;

Глицерин МЕВСК ВеГ: 1-04092-2500;

96-луночный микротитрационный планшет с коническим дном ИЦПС ВеГ: 249570.

6.4. Метод.

Очистка человеческих МКПК от лейкоцитарной пленки

Лейкоцитарную пленку разводят ЭМЕМ 1:2.

Медленно добавляют 25 мл разведенной крови на 15 мл-слой фиколла в 50 миллилитровую пробирку Фалькона.

Пробирки центрифугируют (2000 об/мин, 20 мин, при комнатной температуре без перерыва).

Интерфазу клеток (кольцо клеток) собирают и клетки промывают 25 мл ЭМЕМ, а затем проводят стадию центрифугирования (1200 об/мин, 5 мин). Эту процедуру повторяют 3 раза. Лейкоцитарная пленка должна давать общее число клеток приблизительно 600х10⁶.

Тест на активность

В 96-луночный микротитрационный планшет добавляют 80 мкл 1,25х10⁶ клеток/мл, разведенных в ЭМЕМ + 2,5% человеческой сыворотки + 1% Ь-глутамина + 1% пенициллина-стрептомицина.

- 48 011261

Добавляют 10 мкл/лунку (одно условие на лунку): 1Н8Р201-ЕС в РВ8 + 20% глицерин (в исходной концентрации 50 мкг/мл).

Добавляют 10 мкл/лунку СопА в концентрации 50 мкг/мл (конечная концентрация СопА составляет 5 мкг/мл).

Через 48 ч, клеточные супернатанты собирают и человеческие цитокины измеряют с использованием набора, содержащего СВА с человеческими Т111/Т112 и цитокинами, Вес1оп-Июкткоп.

СВА-анализ

Смесь сфер с иммобилизованными на них человеческими Т111/Т112 получают в соответствии с инструкциями поставщиков (Набор СВА ВесФп-Июкткоп РеГ: 550749) следующим образом:

Определяют число аналитических пробирок, необходимых для проведения эксперимента.

Каждую суспензию сфер для иммобилизации интенсивно встряхивают в течение нескольких секунд, а затем смешивают.

Для каждого анализа в одну пробирку, помеченую как смешанные сферы для иммобилизации, добавляют 10 мкл-аликвоту каждой сферы для иммобилизации.

Смесь сфер интенсивно встряхивают.

Получение тест-образцов

Супернатанты разводят 1:5 аналитическим разбавителем (20 мкл супернатантов + 60 мкл аналитического разбавителя).

Разведенные образцы смешивают, а затем переносят в 96-луночный микротитрационный планшет с коническим дном (Мтс).

Процедура анализа с использованием СВА, содержащих человеческие Т111/Т112 и цитокины мкл разведенных супернатантов добавляют в 96-луночный микротитрационный планшет с коническим дном (М1пс).

Добавляют 50 мкл смешанных сфер для иммобилизации.

Добавляют 50 мкл реагента для ФЭ-детектирования человеческих Т111/Т112.

Планшет инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре и защищают от прямого воздействия света.

Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин.

Супернатант осторожно удаляют.

В каждую лунку добавляют 200 мкл промывочного буфера и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин.

Супернатант осторожно удаляют.

В каждую лунку добавляют 130 мкл промывочного буфера для ресуспендирования осажденных сфер.

Образцы анализируют на проточном цитометре.

Данные анализируют с использованием пакета прикладных программ СВА, АсШЧу Ваке и Мюгокой Ехсе1.

Результаты выражают как процент секреции цитокинов по сравнению с уровнем цитокинов, полученным путем СопА-стимуляции (100%) по отношению к уровню цитокинов, секретируемых нестимулированными клетками (0%).

6.5. Результаты

Эффект введения ГЫ8Р201-ЕС в СопА-стимулированные человеческие МКПК.

Полученные результаты свидетельствовали о дозозависимом ингибировании секреции 1Ь-2 в присутствии 1Ы8Р201-ЕС. Максимальное ингибирование (Е_тах) достигало 80% с ЕС₅₀=8 мкг/мл.

При этом какого-либо влияния на уровни ΙΡΝ-γ, ΊΝΕ-α, 1Ь-4, 1Ь-5 или 1С-10 не наблюдалось. Поэтому такое ингибирование является 1Ь-2-специфическим.

Негативная регуляция секреции 1Ь-2 из мононуклеарных клеток человеческой периферической крови и экспрессия ГЫ8Р201-ЕС в тканях кишечника, пораженных воспалительным заболеванием, в раковых тканях и в тканях поджелудочной железы рассматривается как показатель участия ГЫ8Р201-ЕС в патогенезе воспаления, 1Ь-2-ассоциированных заболеваний, рака, воспалительного заболевания кишечника и/или расстройств поджелудочной железы.

Агонисты 1Ь-2 известны специалистам. Так, например, фирмой АЬЬоН был получен 1Ь-2содержащий гибридный белок для лечения опухолей. Фирмой Атдеп был получен агонист 1Ь-2 для лечения рака. Фирмой АпйСапсег 1пс был получен агонист 1Ь-2 (АС-9401) для лечения опухоли легких. Фирмой Ар1аОеп ОтЬН был получен агонист 1Ь-2 (пептиды-миметики 1Ь-2) для лечения рака. Фирмой А\'есНп был получен агонист 1Ь-2 (авектин) для лечения опухоли молочной железы. Фирмой Ανеηΐ^к РНагта был получен агонист 1Ь-2 для лечения рака. Корпорацией Вауег Согр был получен агонист 1Ь-2 (ΒΑΥ-50-4798) для лечения ВИЧ-инфекций, почечно-клеточной карциномы и меланомы. Сотрудниками Медицинского колледжа Бэйлора был получен агонист 1Ь-2 (вакцина против 1Ь-2/СИ40Ь

- 49 011261 экспрессирующего лейкоза) для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза. Фирмой Вюдеп был получен модулятор ΙΕ-2 (тецелейкин) для лечения саркомы, синдрома приобретенного иммунодефицита, рака, опухоли толстой кишки и опухоли почек. Фирмой Вютйа И8А был получен агонист ΙΕ-2 (липосомная композиция, пептид) для лечения немелкоклеточного рака легких, ВИЧ-инфекций, опухоли легких и опухоли почек. Фирмой ВоеНппдег [пдеПюпп был получен препарат ВIVВ-2 (вакцина) для лечения меланомы и опухолей. Корпорацией СЫгоп Согр. был получен альдесейкин для лечения ВИЧ-инфекций, почечно-клеточной карциномы, лейкоза, меланомы, неходжкинской лимфомы, рака, опухоли легких и опухоли яичника. Корпорацией СЫгоп Согр. был также получен ПЭГ-интерлейкин-2 для лечения ВИЧинфекций и опухоли головы и шеи. Фирмой ЕМЭ Ьехздеп Везеагсй был получен ЕМЭ-273063 (гибридный белок, содержащий моноклональное антитело) для лечения меланомы и опухоли нервной системы. Фирмой ЕМЭ Ьех1деп Везеагсй был получен NΗ8-I^-2(^20Т) (конъюгированный иммуноглобулин) для лечения рака. Фирмой Е1ате1. ТесЬпо1од1ез был получен агонист Ш-2 для лечения рака. Фирмой ^типех был получен рекомбинантный пептид для лечения вируса гепатита В, меланомы и рака. Сотрудниками Научно-исследовательского института рака была получена вакцина для лечения рака. Сотрудниками Университета Макмастера была получена вакцина (для генотерапии на основе аденовируса) для лечения меланомы, опухоли молочной железы и рака. Сотрудниками Медицинского Университета Южной Каролины был разработан метод лечения путем пептид-СХ-СЪЕ/Ши-вакцинации для лечения рака. Национальным институтом здравоохранения была разработана терапия на основе гена ΙΕ-2 для лечения почечно-клеточной карциномы, меланомы и опухоли толстой кишки. Фирмой РЕ^го1а1 В1о8с1епсез был получен агонист ΙΕ-2 (РВ-1) для лечения рака. Сотрудниками Научно-исследовательского института Скриппса был получен Κ8-ΙΕ-2 (гибридный белок, конъюгированный с моноклональным антителом) для лечения немелкоклеточного рака легких, опухоли предстательной железы, опухоли молочной железы, рака, опухоли головного мозга, опухоли яичника, опухоли ободочной кишки и опухоли почек. Фирмой 8егадеп был получен ^ΑВ-486-I^-2 (гибридный белок, содержащий токсин) для лечения ВИЧ-инфекций, опухолей, ревматоидного артрита и инсулин-зависимого диабета. Фирмой 8егадеп был также получен денилейкин дифтитокс (гибридный белок, содержащий токсин) для лечения немелкоклеточного рака легких, алопеции, ВИЧ-инфекции, хронического лейкоцитарного лейкоза, Т-клеточной лимфомы кожи, лимфомы, псориаза, ревматоидного артрита, неходжкинской лимфомы, реакции трансплантат против хозяина, опухоли головы и шеи, опухоли легких и дерматита. Фирмой 8куеР11агша был получен агонист ΙΕ-2 (пептид) для лечения инфекции. Сотрудниками Детской научно-исследовательской клиники Сент-Юда был получен агонист ΙΕ-2 (вакцина) для лечения опухоли нервной системы. Сотрудниками Государственного научно-исследовательского центра вирусологии и биотехнологии УЕСТОВ был получен агонист ΙΕ-2 (пептид) для лечения рака. Фирмой Такеба Ркагтасеийса1 был получен цельмолейкин для лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита В, и рака. Фирмой Тгапздепе 8А был получен ТС-1024 (для генотерапии на основе аденовирусов) для лечения меланомы и солидной опухоли. Фирмой Тгапздепе 8А был получен ТС-1031 и ТС-4010 (для генотерапии на основе вируса оспы) для лечения немелкоклеточного рака легких, опухоли поджелудочной железы, опухоли предстательной железы, опухоли молочной железы и опухоли яичника. Фирмой Се11 Тйегару был пслучен ТС-2001 для лечения мезотелиомы, почечно-клеточной карциномы, саркомы, меланомы и раковой опухоли молочной железы. Фирмой Тгапзкагуойс Тйегар1ез был получен ΙΕ-2, ТКТ, для лечения почечно-клеточной карциномы. Сотрудниками Калифорнийского университета был получен иСЬА для лечения меланомы, опухоли предстательной железы и опухоли толстой кишки. Сотрудниками Университета Цинциннати была разработана терапия на основе вируса коровьей оспы для лечения опухоли и рака головы и шеи. Сотрудниками Университета Питтсбурга был получен агонист ΙΕ-2 (пептид) для лечения опухоли. Сотрудниками Техасского университета был получен INСN-301 для лечения ВИЧ-инфекции. Фирмой Уа1еп!1з/Восйе была разработана терапия на основе гена ΙΕ-2 сЬ1р1б для лечения опухоли головы и шеи. Фирмой Уа1еп!1з был получен ΙΕ-2/суперантиген-В в целях его применения в терапии геном сЬ1р1б для лечения меланомы. Фирмой Уа1еп!1з был также получен УЪТ8-587 для лечения опухоли легких. Фирмой У1са1 был получен агонист ΙΕ-2 (для генотерапии на основе плазмиды) для лечения меланомы. Фирмой У1са1 был получен лейвектин для лечения почечно-клеточной карциномы, саркомы, лимфомы, меланомы и опухоли предстательной железы. Корпорацией У1годепе!1сз Согр. был получен АЕУАС-ЫЬ-2 (для генотерапии на основе вируса оспы) для лечения рака. Фирмой Υ еаб Везеагсй был получен агонист ΙΕ-2 для лечения нейродегенеративного заболевания.

Антагонисты ΙΕ-2 известны специалистам. Так, например, фирмой АПутах/А\'епЦз был получен иммунодепрессант, а именно антагонист ΙΕ-2 для лечения ревматоидного артрита, аутоиммунного заболевания и сердечно-сосудистого заболевания. Фирмой НуЬгйесй Шс. было получено моноклональное антитело для лечения рака. Фирмой ^типо^сй было получено моноклональное антитело для лечения реакции трансплантат против хозяина. Фирмой 8ипез1з Рйагтасеийса1з был получен антагонист ΙΕ-2 для лечения реакции трансплантат против хозяина.

Функции интерлейкина-2, методы его продуцирования и клиническое применение описаны у СгаППеп & Ьш (Су!ок1пе 28 (2004), рр.109-123).

Указанным ΙΕ-2-ассоциированным заболеванием является новообразование, опухоль легких, рак,

- 50 011261 опухоль молочной железы, ВИЧ-инфекция, почечно-клеточная карцинома, меланома, хронический лимфоцитарный лейкоз, саркома, синдром приобретенного иммунодефицита, опухоль толстой кишки, опухоль почек, немелкоклеточный рак легких, лейкоз, неходжкинская лимфома, опухоль яичника, опухоль головы и шеи, опухоль нервной системы, инфекция, вызываемая вирусом гепатита В, опухоль предстательной железы, опухоль головного мозга, опухоль ободочной кишки, опухоль почек, алопеция, Тклеточная лимфома кожи, лимфома, опухоль нервной системы, солидная опухоль, опухоль поджелудочной железы, мезотелиома, анемия, язвенный колит, рак желудка, склеродермия, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, хронический гепатит В, гипергаммаглобулинемия, лимфопролиферативные расстройства, опосредуемые вирусом Эпштейна-Барра, острый миелоцитарный лейкоз, метастазирующая меланома, артрит, лейкопения, тромбоцитопения, расстройство, ассоциированное с нарушением ангиогенеза, саркома Капоши, расстройство поджелудочной железы или рассеянный склероз.

Предпочтительно рак выбирают из группы, состоящей из рака крови или лимфатической системы, рака кожи, рака пищеварительной системы, рака мочевыделительной системы, рака молочной железы, рака яичника, рака половых органов, хориокарциномы, рака легких, опухолей головного мозга, опухолей костей, карциноидных опухолей, рака носоглотки, саркомы ретроперитонеального пространства, опухолей мягких тканей, рака щитовидной железы или рака с неизвестной первичной локализацией.

Используемые здесь термины опухоли легких или рак легких являются предпочтительно взаимозаменяемыми, и такие опухоли или рак выбирают из группы, состоящей из доброкачественных или злокачественных первичных опухолей или метастазов первичного рака многих других органов и тканей.

Предпочтительно рак легких выбирают из первичных опухолей легких, включая бронхогенную карциному, бронхиальный карциноид, хондроматозную гамартому (доброкачественную), одиночную лимфому, саркому (злокачественную) или многоочаговые лимфомы.

Предпочтительно бронхогенную карциному выбирают из плоскоклеточной карциномы, недифференцированной мелкоклеточной карциномы, недифференцированной крупноклеточной карциномы, аденокарциномы или бронхоальвеолярной карциномы.

Предпочтительно бронхогенной карциномой является плоскоклеточная карцинома или немелкоклеточная карцинома легких.

Предпочтительно рак легких выбирают из метастазов первичного рака кожи, молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, почек, щитовидной железы, желудка, шейки матки, прямой кишки, яичек и кости, и меланомы.

Используемые здесь термины бронхиальный карциноид или бронхиальная аденома могут быть взаимозаменяемыми, и эти опухоли могут быть доброкачественными или злокачественными, и могут возникать в равной степени у людей обоих полов. Их развитие является продолжительным. Эндобронхиальная часть опухоли может вызывать обструкцию просветов главных бронхов. При этом часто возникает сильное кровотечение из верхнего слоя слизистой оболочки. Характерными признаками является рецидивирующая пневмония в той же самой области легких и боли, локализованные в верхнем отделе плевры. Метастазы обычно не характерны, но могут возникать в региональных лимфоузлах.

Предпочтительно расстройствами поджелудочной железы являются острый панкреатит, хронический панкреатит, карцинома поджелудочной железы, включая железисто-клеточную карциному или карциному смешанной популяции панкреатических клеток.

Предпочтительно воспалительным заболеванием кишечника является болезнь Крона или язвенный колит.

Предпочтительно внеклеточная часть мембраносвязанного ΙΝ8Ρ201 (гликозилированного или негликозилированного), его фрагментов и агонистов или антагонистов могут быть использованы для лечения воспаления, ΙΌ-2-ассоциированного расстройства и/или воспалительного заболевания кишечника, а также для трансплантации твердого органа и костного мозга. Комбинация с циклоспорином А, такролимусом или сиролимусом может быть использована для трансплантации твердого органа и костного мозга.

Предпочтительно антагонистами мембраносвязанного ΙΝ8Ρ201 являются нейтрализующие антитела.

Предпочтительно полипептид ΙΝ8Ρ201, не содержащий трансмембранного домена, используют для лечения воспаления, ΙΕ-2-ассоциируемого расстройства и/или воспалительного заболевания кишечника.

Предпочтительно трансмембранный домен локализован между аминокислотами 406-428 8ЕО ΙΌ ΝΟ:8 или 8ЕО ΙΌ ΝΟ:24.

Предпочтительно агонисты мембраносвязанного ΙΝ8Ρ201 используются для лечения рака (например, рака легких, ПКК или меланомы) и/или ΙΕ-2-ассоциируемого расстройства, такого как ВИЧинфекция, ЕВV-инфекция или гепатит В.

Предпочтительно агонистами мембраносвязанного ΙΝ8Ρ201 являются антитела-агонисты.

Предпочтительно внеклеточная часть мембраносвязанного ΙΝ8Ρ201 состоит из последовательностей 8ЕО ΙΌ ΝΟ:14, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:18, 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:22 или 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:28, или содержит эти последовательности. Предпочтительно фрагмент внеклеточной части мембраносвязанного ΙΝ8Ρ201 состоит из после- 51 011261 довательностей 8Е0 ΙΌ ΝΟ:2, 8Е0 ΙΌ ΝΟ:10, 8Е0 ΙΌ ΝΟ:20 или 8Е0 ΙΌ ΝΟ:26 или содержит эти последовательности.

Предпочтительно мембраносвязанный ΙΝ8Ρ201 состоит из последовательностей 8Е0 ΙΌ ΝΟ:8, 8Е0 ΙΌ ΝΟ:12, 8Е0 ΙΌ ΝΟ:24, 8Е0 ΙΌ ΝΟ:30 или содержит эти последовательности, либо он состоит из комбинации экзона 1 и экзона 2 или содержит эти комбинации (то есть 8Е0 ΙΌ ΝΟ:2, 8Е0 ΙΌ ΝΟ:10, 8Е0 ΙΌ ΝΟ:20 или 8Е0 ΙΌ ΝΟ:26 в комбинации с 8Е0 ΙΌ ΝΟ:4).

Пример 7. Анализ для определения активности ΙΚΚ2 в клетках немелкоклеточной карциномы легких (А549).

Фактор некроза опухоли-α (ΈΝΕ-α) представляет собой плейотропный цитокин, имеющий множество функций, включая активацию, дифференцировку и апоптоз клеток. ΪΝΕ-α обладает специфическим апоптотическим и антиапоптотическим действием в клетках определенного типа. Апоптотическое действие ΙΝΕ-α, очевидно, опосредуется позитивной регуляцией активности ΝΕ-кВ. ТМЕ-а-индуцированная активация ΝΕ-кВ приводит к повышению уровней экспрессии нескольких антиапоптотических белков, обеспечивающих защиту этих клеток от гибели. При ингибировании этого пути, ЮТ-а может индуцировать гибель клеток. Активация ΝΡ-кВ опосредуется комплексом ΙΚΚ.

Активность IN8Ρ201-ЕС, его гибридного белка или антитела, направленного против ΙΝ8Ρ201, может быть продемонстрирована с помощью описанного ниже анализа, который позволяет измерять уровень стимуляции активности ΙΚΚ2 в клетках А549, то есть клетках человеческой карциномы легких. Поскольку ΊΝΕ-α может индуцировать про- и антиапоптотический путь, то блокирование экспрессии антиапоптотического гена циклогексимидом может приводить к клеточной гибели. После апоптоза клеток, они отделяются от поверхности клеточной культуры. После фиксации клеток кристаллическим фиолетовым с последующей их промывкой окрашиваются только живые клетки, и такое окрашивание может быть зарегистрировано при 540 нм. Таким образом, эта процедура позволяет определять гибель клеток А549. Обработка клеток А549 цитокином ΊΝΕ-α в присутствии циклогексимида приводит к апоптозу этих клеток. Предварительная обработка клеток интерлейкином ΙΊ-1β или цитокином ТNΡ-α для индуцирования ΙΚΚ-пути, и тем самым позитивная регуляция антиапоптотических генов, могут обеспечивать защиту клеток от гибели, индуцированной обработкой ТНЕ-г/. + циклогексимидом. Во время стадии предварительной обработки интерлейкином ΙΊ-1β блокирование активности ΙΚΚ специфическим ингибитором может прекращать протективное действие ΙΊ-1β, защищающее клетки от гибели, опосредуемой ТNΕ-α + циклогексимидом. Поэтому, такая способность передавать ТNΕ-α-сигнал используется для мониторинга активности ΙΚΚ в клетках А549. Ингибитор ΙΚΚ способен вызывать дозозависимое блокирование ΙΕ-1 β-опосредуемого протективного действия в клетках А549, тогда как ЕСЕ не оказывает такого протективного действия.

Мониторинг ΙΚΚ-активности осуществляют в соответствии со следующим протоколом:

1) клетки А549 высевают (50000 клеток/лунку) и культивируют в течение ночи;

2) эти клетки предварительно обрабатывают ΙΊ-1β (1 нг/мл) или !ΝΕ-α в присутствии или в отсутствии соединения, то есть IN8Ρ201-ЕС, его гибрида или антитела против ΙΝ8Ρ201 в бессывороточной среде в течение ночи. Указанное соединение является специфическим ингибитором ΙΚΚ-активности;

3) указанные клетки обрабатывают ΌΝΕ^α и циклогексимидом в течение 8 ч и

4) проводят мониторинг гибели клеток с использованием кристаллического фиолетового.

Пример 8. Животные-модели.

Активность IN8Ρ201-ЕС, его гибрида или антитела против ΙΝ8Ρ201 может быть продемонстрирована на моделях рака, как описано в публикации ΚатЬ & Ьакко!а (Огид ^^ксоνе^у Тойау: О1кеаке Мойе1к; Уо1.1, № 1, 2004, рр.31-36), на моделях рака легких, как описано в публикации ЬаЬт & Е|ксНег (Огид Όίκсо\^гегу Тойау: О1кеаке Мойе1к; Уо1. 1, № 1, 2004, рр.25-30) или на моделях воспалительного заболевания кишечника, как описано в публикации Вогт е! Войта (Огид ^^ксоνе^у Тойау: О1кеаке Мойе1к; Уо1.1, №4, 2004, рр.437-443).

Кроме того, активность полипептида согласно изобретению может быть подтверждена по меньшей мере в одном из нижеследующих анализов, где:

a. IN8Ρ201-ЕС, его гибрид или антитело против ΙΝ8Ρ201 могут модулировать пролиферацию или выживание нормальных и раковых клеток, или

b. IN8Ρ201-ЕС, его гибрид или антитело против ΙΝ8Ρ201 могут модулировать секрецию ΙΊ-2 в анализе с использованием СопА (пример 6), или

c. IN8Ρ201-ЕС, его гибрид или антитело против ΙΝ8Ρ201 могут модулировать активность ΙΚΚ2 в клетках А549, то есть в клетках человеческой карциномы легких (пример 7).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид, который (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ ΝΟ:2; 8Е0 ΙΌ ΝΟ:4, 8Е0 ΙΌ ΝΟ:6,

- 52 011261 /Ер ΙΌ N0:8, /Ер ΙΌ N0:10, /Ер ΙΌ N0:12, /Ер ΙΌ N0:14, /Ер ΙΌ N0:16, /Ер ΙΌ N0:18, /Ер ΙΌ N0:20, /Ер ΙΌ N0:22, /Ер ΙΌ N0:24, /Ер ΙΌ N0:26, /Ер ΙΌ N0:28 и/или /Ер ΙΌ N0:30; или (ίί) представляет собой функциональный эквивалент (ί).
2. Полипептид по п.1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в /Ер ΙΌ N0:8, /Ер ΙΌ N0:12, /Ер ΙΌ N0:24 и/или /Ер ΙΌ N0:30.
3. Полипептид по п.1, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в /Ер ΙΌ N0:2, /Ер ΙΌ N0:10, /Ер ΙΌ N0:14, /Ер ΙΌ N0:18, /Ер ΙΌ N0:20, /Ер ΙΌ N0:22, /Ер ΙΌ N0:26 и/или /Ер ΙΌ N0:28, или состоит из указанной последовательности.
4. Полипептид по п.1 или 2, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в /Ер ΙΌ N0:2; /Ер ΙΌ N0:4, /Ер ΙΌ N0:6, /Ер ΙΌ N0:8, /Ер ΙΌ N0:10, /Ер ΙΌ N0:12, /Ер ΙΌ N0:14, /Ер ΙΌ N0:16, /Ер ΙΌ N0:18, /Ер ΙΌ N0:20, /Ер ΙΌ N0:22, /Ер ΙΌ N0:24, /Ер ΙΌ N0:26, /Ер ΙΌ N0:28 и/или /Ер ΙΌ N0:30.
5. Полипептид, который является функциональным эквивалентом в соответствии с подпунктом (ίί) по любому из предшествующих пунктов и отличается тем, что гомологичен аминокислотной последовательности, представленной в /Ер ΙΌ N0:2, /Ер ΙΌ N0:4, /Ер ΙΌ N0:6, /Ер ΙΌ N0:8, /Ер ΙΌ N0:10, /Ер ΙΌ N0:12, /Ер ΙΌ N0:14, /Ер ΙΌ N0:16 или /Ер ΙΌ N0:18, и является членом семейства гликопротеинов клеточной поверхности.
6. Полипептид, который является функциональным эквивалентом по любому из пп.1-3 и который более чем на 80%, предпочтительно более чем на 85, 90, 95, 98 или 99%, идентичен аминокислотной последовательности, представленной в /Ер ΙΌ N0:2, /Ер ΙΌ N0:4, /Ер ΙΌ N0:6, /Ер ΙΌ N0:8, /Ер ΙΌ N0:10, /Ер ΙΌ N0:12, /Ер ΙΌ N0:14, /Ер ΙΌ N0:16 или /Ер ΙΌ N0:18, или ее активному фрагменту.
7. Полипептид, который является функциональным эквивалентом по любому из пп.1-6 и который обладает значительной структурной гомологией с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в /Ер ΙΌ N0:2, /Ер ΙΌ N0:4, /Ер ΙΌ N0:6, /Ер ΙΌ N0:8, /Ер ΙΌ N0:10, /Ер ΙΌ N0:12, /Ер ΙΌ N0:14, /Ер ΙΌ N0:16 или /Ер ΙΌ N0:18.
8. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по любому из предшествующих пунктов.
9. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п.8, которая содержит последовательность, представленную в /Ер ΙΌ N0:1, /Ер ΙΌ N0:3, /Ер ΙΌ N0:5, /Ер ΙΌ N0:7, /Ер ΙΌ N0:9, /Ер ΙΌ N0:11, /Ер ΙΌ N0:13, /Ер ΙΌ N0:15, /Ер ΙΌ N0:17, /Ер ΙΌ N0:19, /Ер ΙΌ N0:21, /Ер ΙΌ N0:23, /Ер ΙΌ N0:25, /Ер ΙΌ N0:27 и/или /Ер ΙΌ N0:29, или представляет собой ее избыточный эквивалент или фрагмент.
10. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п.9, которая состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в /Ер ΙΌ N0:1, /Ер ΙΌ N0:3, /Ер ΙΌ N0:5, /Ер ΙΌ N0:7, /Ер ΙΌ N0:9, /Ер ΙΌ N0:11, /Ер ΙΌ N0:13 или /Ер ΙΌ N0:15, /Ер ΙΌ N0:17, /Ер ΙΌ N0:19, /Ер ΙΌ N0:21, /Ер ΙΌ N0:23, /Ер ΙΌ N0:25, /Ер ΙΌ N0:27 и/или /Ер ΙΌ N0:29, или представляет собой ее избыточный эквивалент или фрагмент.
11. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-10 в условиях высокой жесткости.
12. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11.
13. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.12.
14. Лиганд, который специфически связывается с гликопротеином клеточной поверхности по любому из пп.1-7.
15. Лиганд по п.14, который представляет собой антитело.
16. Соединение, которое связывается с полипептидом по любому из пп.1-7, не индуцируя при этом каких-либо биологических эффектов указанного полипептида.
17. Соединение по п.16, которое представляет собой природный или модифицированный субстрат, лиганд, фермент, рецептор либо структурный или функциональный миметик.
18. Гибридный полипептид, содержащий полипептид по любому из пп.1-7, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью.
19. Гибридный полипептид по п.18, где указанной гетерологичной аминокислотной последовательностью является константный домен ЦС или его фрагмент или домен НСС или его фрагмент.
20. Применение полипептида по любому из пп.1-7, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11, вектора по п.12, лиганда по п.14 или 15, соединения по любому из п.16 или 17 или гибридного полипептида по п.18 или 19 в терапии или диагностике заболевания.
21. Способ диагностики заболевания у пациента, включающий оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по любому из пп.1-7, или оценку активности полипептида по любому из пп.1-7 в ткани указанного пациента, и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия заболевания.
22. Способ по п.21, осуществляемый ш νίΙΐΌ.

- 53 011261
23. Способ по п.21 или 22, который включает стадии (а) контактирования лиганда по п.14 или 15 с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (Ь) детектирования указанного комплекса.
24. Способ по п.21 или 22, включающий стадии

a) контактирования образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиновокислотным зондом в жестких условиях, способствующих образованию гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11 и указанным зондом;

b) контактирования контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и

c) детектирования присутствия гибридных комплексов в указанных образах, где детектирование уровней указанного гибридного комплекса в образце, взятом у данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
25. Способ по п.21 или 22, включающий в себя

a) контактирование образца нуклеиновой кислоты ткани, взятой у пациента, с нуклеиновокислотным праймером в жестких условиях, способствующих образованию гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11 и указанным праймером;

b) контактирование контрольного образца с указанным праймером в условиях, аналогичных условиям стадии (а);

c) амплификацию указанного образца нуклеиновой кислоты и

б) детектирование уровня амплифицированной нуклеиновой кислоты в образцах, взятых у пациента, и в контрольных образцах, где детектирование уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты во взятом у пациента образце, которые значительно отличаются от уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
26. Способ по п.21 или 22, включающий

a) получение образца тканей от пациента, обследуемого на наличие заболевания;

b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11 из указанного образца ткани и

c) установление диагноза заболевания данного пациента путем детектирования присутствия мутации в молекуле нуклеиновой кислоты, где указанная мутация ассоциирована с указанным заболеванием и где присутствие такой мутации указывает на наличие заболевания.
27. Способ по п.26, который дополнительно включает в себя амплификацию указанной молекулы нуклеиновой кислоты с образованием амплифицированного продукта и детектирование присутствия или отсутствия мутации в указанном амплифицированном продукте.
28. Способ по пп.26 или 27, где присутствие или отсутствие мутации у пациента определяют путем осуществления контакта указанной молекулы нуклеиновой кислоты с нуклеиновокислотным зондом, который гибридизуется с указанной молекулой нуклеиновой кислоты в жестких условиях, с образованием гибридной двухцепочечной молекулы, где указанная гибридная двухцепочечная молекула имеет негибридизованную часть цепи нуклеиновокислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и детектирования присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи указанного зонда как показателя присутствия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации.
29. Способ по любому из пп.21-28, где указанными заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, воспаление, рак, рак толстой кишки, воспалительное заболевание кишечника, расстройство поджелудочной железы и/или ΙΕ-2-ассоциированное заболевание.
30. Способ по любому из пп.21-28, где указанным заболеванием является заболевание, в патогенезе которого участвует лимфоцитарные антигены.
31. Применение полипептида по любому из пп.1-7 в качестве гликопротеина клеточной поверхности.
32. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-7.
33. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.811.
34. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.12.
35. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяина по п.13.
36. Фармацевтическая композиция, содержащая лиганд по п.14 или 15.
37. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из п.16 или 17.
38. Фармацевтическая композиция, содержащая гибридный полипептид по п.18 или 19.
39. Вакцинная композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-7 или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11.
40. Применение полипептида по любому из пп.1-7, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11, вектора по п.12, клетки-хозяина по п.13, лиганда по п.14 или 15, соединения по любому из п.16 или 17, гибридного полипептида по п.18 или 19 или фармацевтической композиции по любому из пп.3238 для получения лекарственного средства для лечения воспаления, рака, воспалительного заболевания кишечника, расстройства поджелудочной железы и/или ΙΕ-2-ассоциированного заболевания.

- 54 011261
41. Применение полипептида по любому из пп.1-7, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11, вектора по п.12, клетки-хозяина по п.13, лиганда по п.14 или 15, соединения по любому из п.16 или 17, гибридного полипептида по п.18 или 19 или фармацевтической композиции по любому из пп.3238 для получения лекарственного средства для лечения заболевания, в патогенезе которого участвуют лимфоцитарные антигены.
42. Способ лечения заболевания у пациента, включающий в себя введение указанному пациенту полипептида по любому из пп.1-7, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11, вектора по п.12, клетки-хозяина по п.13, лиганда по п.14 или 15, соединения по любому из п.16 или 17, гибридного полипептида по п.18 или 19 или фармацевтической композиции любому из пп.32-38.
43. Способ по п.42, где для лечения заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена или активности указанного полипептида у пациента, страдающего заболеванием, ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, данному пациенту вводят полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, лиганд, соединение или композицию, которые являются агонистами.
44. Способ по п.42, где для лечения заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена или активности указанного полипептида у пациента, страдающего заболеванием, выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, данному пациенту вводят полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, лиганд, соединение или композицию, которые являются антагонистами.
45. Способ мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, включающий в себя мониторинг уровня экспрессии или активности полипептида по любому из пп.1-7 или уровня экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11 в ткани указанного пациента, проводимый в течение определенного периода времени, где изменение указанного уровня экспрессии или активности за определенный промежуток времени по сравнению с контрольным уровнем является показателем рецидива указанного заболевания.
46. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, включающий в себя контактирование полипептида по любому из пп.1-7 с одним или несколькими соединениями, предположительно обладающими аффинностью связывания с указанным полипептидом или молекулой нуклеиновой кислоты; и отбор соединения, которое специфически связывается с указанной молекулой нуклеиновой кислоты или полипептидом.
47. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, включающий в себя контактирование молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11 с одним или несколькими соединениями, предположительно обладающими аффинностью связывания с указанным полипептидом или молекулой нуклеиновой кислоты; и отбор соединения, которое специфически связывается с указанной молекулой нуклеиновой кислоты или полипептидом.
48. Набор, используемый для диагностики заболевания и включающий в себя первый контейнер, содержащий нуклеиновокислотный зонд, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации указанной молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания.
49. Набор по п.45, дополнительно включающий в себя третий контейнер, содержащий агент для гидролиза негибридизованной РНК.
50. Набор, содержащий массив молекул нуклеиновой кислоты, по меньшей мере одной из которых является молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11.
51. Набор, содержащий одно или несколько антител, связывающихся с полипептидом по любому из пп.1-7, и реагент, используемый для детектирования реакции связывания между указанным антителом и указанным полипептидом.
52. Трансгенное или дефицитное по данному полипептиду животное, не являющееся человеком, которое было трансформировано так, что оно экспрессирует более высокие или более низкие уровни полипептида по любому из пп.1-7 или вообще не экспрессирует указанного полипептида.
53. Способ скрининга на соединение, эффективное для лечения заболевания, включающий в себя контактирование трансгенного животного, не являющегося человеком, по п.52 с соединениемкандидатом и оценку эффективности указанного соединения для лечения такого заболевания у указанного животного.
54. Применение полипептида по любому из пп.1-7, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11, вектора по п.12, клетки-хозяина по п.13, лиганда по п.14 или 15, соединения по любому из п.16 или 17, гибридного полипептида по п.18 или 19 или фармацевтической композиции по любому из пп.3238 для оплодотворения в пробирке (ΙΥΡ) или в качестве контрацептива.
55. Применение полипептида по любому из пп.1-7, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.8-11, вектора по п.12, клетки-хозяина по п.13, лиганда по п.14 или 15, соединения по любому из п.16 или 17, гибридного полипептида по п.18 или 19 или фармацевтической композиции по любому из пп.3238 для изготовления контрацептива.
56. Применение полипептида ΙΝ8Ρ201 в качестве мишени для поиска лекарственных средствкандидатов, которые могут быть использованы для лечения или предупреждения расстройства, ассоции

- 55 011261 рованного с гликопротеином клеточной поверхности.
57. Способ отбора биологически активных соединений, включающий в себя (ί) контактирование соединения-кандидата с рекомбинантными клетками-хозяевами, экспрессирующими полипептид ΙΝ8Ρ201;

(ίί) отбор соединений, которые связываются с указанным полипептидом ΙΝ8Ρ201 на поверхности указанных клеток и/или модулируют активность указанного полипептида ΙΝ8Ρ201.