EA007813B1 - Секретируемый белок - Google Patents

Секретируемый белок Download PDF

Info

Publication number
EA007813B1
EA007813B1 EA200400812A EA200400812A EA007813B1 EA 007813 B1 EA007813 B1 EA 007813B1 EA 200400812 A EA200400812 A EA 200400812A EA 200400812 A EA200400812 A EA 200400812A EA 007813 B1 EA007813 B1 EA 007813B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
disease
nucleic acid
polypeptide
disorders
diseases
Prior art date
Application number
EA200400812A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400812A1 (ru
Inventor
Ричард Джозеф Фэйган
Кристофер Бенджамин Фелпс
Алекс Гаттеридж
Кристин Пауэр
Original Assignee
Арес Трейдинг С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Арес Трейдинг С.А. filed Critical Арес Трейдинг С.А.
Publication of EA200400812A1 publication Critical patent/EA200400812A1/ru
Publication of EA007813B1 publication Critical patent/EA007813B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к новому белку INSP037, идентифицированному в настоящем изобретении как член семейства цитокинов, имеющих структуру с пучком из четырех спиралей, и к применению указанного белка и последовательностей нуклеиновой кислоты кодирующего гена для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.

Description

Настоящее изобретение относится к новому белку ΙΝ8Ρ037, идентифицированному в настоящей заявке как секретируемый белок, в частности, как член семейства цитокинов, имеющих структуру в виде пучка из четырех спиралей, и предпочтительно, как интерферон-гамма-подобная молекула, и к применению этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты кодирующего гена для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.
Все цитируемые публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте введены в настоящее описание посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин функциональная геномика применяется к способам использования средств биоинформатики для определения функций исследуемых последовательностей белков. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научно-исследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных для этих последовательностей.
Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков настоящего изобретения, могут давать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности.
Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, для их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной.
Вводное описание секретируемых белков
Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки является главным фактором во многих биологических процессах. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками. Это происходит в результате слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида. Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембрано-ассоциированный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые нацелены на секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или более трансмембранных доменов. Примерами секретируемых белков, которые играют главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса (адгезивные молекулы), протеазы и факторы роста и дифференцировки. Описание некоторых свойств этих белков приводится ниже.
Вводное описание цитокинов
Цитокины представляют собой семейство факторов роста, секретируемых, главным образом, лейкоцитами, и являются белками-медиаторами, которые действуют как сильные регуляторы, способные влиять на клеточные процессы в субнаномолярных концентрациях. Интерлейкины, нейротропины, факторы роста, интерфероны и хемокины относятся к семейству цитокинов, которые функционируют в комбинации с клеточными рецепторами, регулируя, тем самым, пролиферацию и дифференцировку клеток. Размер цитокинов позволяет им быстро циркулировать по всему организму и разрушаться, когда это необходимо. Широкие исследования, проведенные за последние 20 лет, показали, что цитокины играют определенную роль в регуляции клеточных функций широкого ряда, особенно в иммунном ответе и клеточном росте (Воррапа 8.В. (1996) Ιηάίηη. Т РсФа1г. 63(4):447-52). Цитокины, как и другие факторы роста, отличаются от классических гормонов тем, что они продуцируются рядом клеток различных типов, а не только какой-либо одной конкретной тканью или железой, и, кроме того, оказывают воздействие на широкий ряд клеток посредством взаимодействия с высокоспецифическими аффинными рецепторами, расположенными на клетках-мишенях.
Все системы взаимодействия цитокинов обнаруживают плейотропность (один медиатор, продуцирующий множество эффектов) и избыточность (каждый эффект продуцируется более, чем одним медиатором) (Тппда11 О. с1 а1. (2000) Т11сгар1С. 55(1): 171-5; Те88аго11о Ь. (1998) СуЮкше Сго\\111 Рас!ог Кеу. 9(2):125-137). Действие отдельных цитокинов на клетку может также зависеть от ее концентрации, концентрации других цитокинов, временной последовательности цитокинов и внутреннего состояния клетки (клеточного цикла, присутствия соседних клеток, раковых клеток).
Хотя цитокины обычно представляют собой небольшие белки (менее 200 аминокислот), однако, они часто образуются из более крупных предшественников, которые подвергаются посттрансляционному сплайсингу. Таким образом, помимо пути альтернативного сплайсинга мРНК, существует широкий спектр вариантов каждого цитокина, которые могут, в основном, отличаться по своим биологическим
- 1 007813 эффектам. Были также выделены мембрано-ассоциированные с внеклеточным матриксом формы многих цитокинов (Окаба-Вап М. е! а1. (2000) Ιη!. 1. Вюсйет. Се11. ΒίοΙ. 32(3):263-267; А!атак 8.Р. (1997) ЫГе 8с1. 61(12):1105-1112).
Цитокины могут быть подразделены на семейства, хотя большинство из них не являются родственными. Распределение по категориям обычно осуществляют, исходя из их вторичной структуры, поскольку их последовательности часто имеют очень небольшое сходство. Эти семейства названы по их архетипичному члену, например, ΙΡΝ-подобное, 1Ь-2-подобное, 1Ь-1-подобное, 1Ь-6-подобное и ΤΝΡ-подобное семейство (21о!шк А. е! а1., (2000) 1ттипйу 12(2): 121-127).
Исследования показали, что цитокины участвуют во многих важных реакциях в многоклеточных организмах, таких как регуляция иммунного ответа (ΝΝΙιίΙιίη 1. (1998) Ιη!. 1. Мо1. Меб. 2(1):17-28), воспаление (К1т Р.К. е! а1., (2000) 8игд. С1ш. ΝοήΗ. Ат. 80 (3):885-894), заживление ран (С1агк К.А. (1991) 1. Се11. Вюсйет. 46(1):1-2), эмбриогенез и развитие, и апоптоз (Р1аб Η.Ό. е! а1., (1999) Ра!йоЫо1о§у, 67(56):291-293). Патогенные микроорганизмы (как вирусы, так и бактерии), такие как ВИЧ и вирус, ассоциированный с саркомой Капоши, кодируют антицитокиновые факторы, а также аналоги цитокинов, которые способствуют их взаимодействию с цитокиновыми рецепторами и регулируют иммунный ответ организма (8оххаш 8. е! а1. (2000) Рйагт. Ас1а. Не1у. 74(2-3):305-312; Аок1 Υ. е! а1., (2000) 1. Нета!о1йег. 8!ет. Се11. Кек. 9(2):137-145). Было показано, что кодируемые вирусом цитокины, вирокины, необходимы для патогенности вирусов, что обусловлено их способностью имитировать и разрушать иммунную систему хозяина.
Цитокины могут быть использованы для лечения, профилактики и/или диагностики клинических состояний и заболеваний, которыми являются иммунные расстройства, такие как аутоиммунные заболевания, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительные заболевания, такие как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, ассоциированный с вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз, кожные болезни, болезнь Бехчета, опухолевые заболевания, такие как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина, остеропороз, ожирение, диабет, подагра, сердечно-сосудистые заболевания, реперфузионные поражения, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, инсульт, заболевание печени, СПИД, СПИДассоциированный комплекс, неврологические расстройства, мужское бесплодие, старение и инфекции, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
Было показано, что кодируемый вирусом цитокин, макрофаг-ингибирующий протеин-ΙΙ способен опосредовать селективный рекрутинг клеток Т12-типа и ускользание от цитотоксического иммунного ответа (ХУеЬег К.8. е! а1., (2001) Еиг. 1. Iттиηο1. 2001, 31(8):2458-66). Эти данные свидетельствуют о иммуномодуляторной роли уМГР-ΙΙ, которая направляет рекрутинг воспалительных клеток от ответа ТН1типа к ответу Т12-типа, что способствует их ускользанию от цитотоксических реакций. Поэтому этот белок может быть использован для модуляции заболеваний, при которых наблюдается сверхстимуляция иммунного ответа Т11-типа, таких как синдром раздраженной кишки. В других исследованиях (Каетато!о 8. е! а1. (Ιη!. Тттипо1. 2001 13(5):685-94)) были представлены результаты, которые указывают на то, что по своей эффективности в отношении лечения аутоиммунного диабета уГБ-Ю может значительно превосходить клеточный ГЬ-10. Эти результаты показали, что кодируемые вирусами цитокины, помимо клиренса самого вируса, обладают потенциальной терапевтической ценностью.
Клиническое использование цитокинов основано на их роли, которую они играют как регуляторы иммунной системы (Кобгщиех Р.Н. е! а1., (2000) Сигг. Рйагт. Эек. 6(6):665-680), например, как стимуляторы ответа против рака щитовидной железы (8с1шш1х1ег С. е! а1., (2000) 143(1):15-24). Благодаря своей способности регулировать рост и дифференцировку клеток, цитокины могут быть также использованы в качестве противораковых средств (Бахаг-Мо1паг Е. е! а1., (2000) Су!окше. 12(6):547-554; Сабо К. (2000) 24(4):195-209). Было показано, что в некоторых случаях новые мутации в цитокинах и в цитокиновых рецепторах сообщают резистентность к заболеваниям (уап Эеуеп!ег 8.1. е! а1. (2000) СИепкСе Саге Меб. 26 (кирр1.1):898:8102). Создание синтетических цитокинов (мутеинов) для модуляции активности и исключения возможных побочных эффектов также является важным направлением в научных исследованиях (8йапа1е1! А.В. е! а1. (1998) 95(16):9454-9458).
Как указывалось выше, было показано, что молекулы цитокинов играют определенную роль в изменении физиологических функций, причем многие из них могут играть определенную роль в патологических процессах. Изменение их активности означает изменение фенотипа болезни, и поэтому необходимость в идентификации новых цитокиновых молекул является в высокой степени актуальной, поскольку эти цитокины могут играть определенную или важную роль и быть использованы в разработке методов лечения приведенных выше заболеваний, а также других патологических состояний.
- 2 007813
Вводное описание интерферонов
Интерфероны являются членами семейства цитокинов с укладкой в виде пучка из четырех спиралей. В зависимости от их структуры и стабильности в кислотной среде они были классифицированы как интерфероны типа I или типа II. Исходя из их последовательностей, интерфероны типа I были подразделены на пять групп: интерферон-альфа (ΊΕΝ-α), интерферон-бета (ΊΕΝ-β), интерферон-омега (ΊΕΝ-ω) и интерферон-тау (ΣΕΝ-τ). Что касается интерферонов типа II, то в настоящее время был идентифицирован лишь один интерферон, принадлежащий к этой группе, интерферон-гамма (ΓΕΝ-γ), который продуцируется активированными Т-клетками и ΝΚ-клетками.
Гены интерферонов типа I образуют кластер на человеческой хромосоме 9. По оценкам специалистов, у человека имеется, по крайней мере, 14 неаллельных генов ШИ-а, и число природных белков ШЫа еще больше увеличивается за счет аллельных форм генов !ΕΝ-α (1иззат е1 а1., 1996, I. [ЩсгГсгоп Су!окше Вез. 16:853-9).
Интерфероны обнаруживают свою клеточную активность при связывании со специфическими мембранными рецепторами на клеточной поверхности, инициируя, тем самым, сложный каскад внутриклеточных реакций. Интерфероны типа I индуцируют биологические ответы широкого ряда, включая противовирусные, иммуномодулирующие и антипролиферативные эффекты, в результате чего эти интерфероны, как было подтверждено, являются эффективными для лечения различных заболеваний и состояний.
Интерфероны являются сильными противовирусными средствами, в частности, было обнаружено, что альфа-интерфероны могут быть использованы для лечения различных вирусных инфекций, включая инфекции человека, вызываемые папилломавирусом, вирусом гепатита В и вирусом гепатита С (1аееке1 е1 а1., 2001, 345 (2):1452-7). Интерфероны типа I также ингибируют пролиферацию клеток, и альфаинтерфероны используются в медицине уже в течение многих лет для лечения различных злокачественных заболеваний, включая лейкемический ретикулез, множественную миелому, хронический лимфоцитарный лейкоз, низкодифференцированный лейкоз, саркому Капоши, хронический миелоидный лейкоз, почечно-клеточную карциному и рак яичника. Кроме того, для лечения аутоиммунных заболеваний могут быть использованы интерфероны типа I, при этом интерферон-бета был апробирован для лечения рассеянного склероза.
Интерферон-тау был сначала идентифицирован в гомогенатах оплодотворенного яйца жвачных животных, но впоследствии он был идентифицирован и у человека (см. \УО 96/35789). Хотя интерферон-тау обладает активностью, которая в значительной степени аналогична активности других интерферонов типа I, однако, он также обнаруживает некоторые отличающиеся свойства. В частности, он обладает антилютеолитическим действием, которое стимулирует беременность и ее сохранение (Мат1а1 е1 а1., Вергоб. ГетШ Эсу.. 1997, 9(3):355-80). Кроме того, индуцирование вирусом интерферона-альфа и интерферонабета является кратковременным или продолжается несколько часов, а индуцирование вирусом экспрессии интерферона-тау может продолжаться несколько дней, и при этом было обнаружено, что интерферон-тау обладает антиретровирусным действием, направленным против ВИЧ-1 (Оегеиббге-Воздие! е1 а1., I. Лсс.|щг. ^шипе Пейс. Зупбг. Нит. Ве1гоу|го1. 1996, 11(3):241-6).
Было обнаружено, что секретируемые белки, которые являются членами семейства цитокинов с укладкой в виде пучка из четырех спиралей, играют определенную роль в различных физиологических функциях, многие из которых могут участвовать в патологических процессах. В частности, было обнаружено, что интерфероны играют важную роль в различных физиологических процессах, и поэтому, как было подтверждено, они могут быть использованы для лечения заболеваний широкого ряда. Но, несмотря на это, необходимость в идентификции новых секретируемых белков и новых интерферонов, в частности, в получении новых лекарственных средств для лечения и профилактики заболеваний, остается актуальной.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении белка ΕΝ8Ρ037, который представляет собой секретированный белок, в частности, член класса цитокинов, имеющих структуру в виде пучка из четырех спиралей. Более конкретно, белок ΕΝ8Ρ037 является членом семейства цитокинов, имеющих структуру в виде пучка из четырех спиралей, предпочтительно, подобной интерферону-гамма молекулой.
В одном из вариантов первого аспекта, настоящее изобретение относится к полипептиду, который (ί) содержит аминокислотную последовательность, представленную в 8Еф ГО ΝΟ:36;
(ίί) представляет собой его фрагмент, который обладает функцией секретированного белка, в частности, функцией цитокинов, имеющих структуру в виде пучка из четырех спиралей, более конкретно, интерферон-гамма-подобной функцией, либо который имеет антигенную детерминанту общую с полипептидами (1); или (ш) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (ίί).
Полипептид, имеющий последовательность, представленную 8Еф ГО ΝΟ:36, будет далее называться полипептидом IN8Ρ037. ΕΝ8Ρ037 также называется IΡΑΑΑ44548.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы полипептиды
- 3 007813
ΙΝ8Ρ037 действовали как полипептидные члены семейства цитокинов, имеющих структуру в виде пучка из четырех спиралей, предпочтительно, как интерферон-гамма-подобная молекула. Во втором аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид первого аспекта настоящего изобретения. При этом предпочтительно, чтобы эта очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержала последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в 8ЕО ΙΌ N0:35 (кодирующую полипептид ΙΝ8Ρ037). Предпочтительно, чтобы эта очищенная молекула нуклеиновой кислоты состояла из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в 8Е0 ΙΌ N0:35 (кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ037), или представляла собой избыточный эквивалент или фрагмент этой последовательности.
Термин члены класса цитокинов, имеющих структуру в виде пучка из четырех спиралей хорошо известен в данной области, и каждый специалист, с помощью одного из известных анализов, может легко установить, функционирует ли данный полипептид как член этого класса. Так, например, активность интерферона часто определяют по его противовирусной активности или антипролиферативной активности, направленной на раковые клетки. Примеры анализов можно найти в работе 8еЫ11ет 1.Н., 1. [ЩсгГсгоп Кек. 1986; 6(6):615-25 и СиЬкоп и.Е. е! а1., 1. ]ттипо1. МеШобк (1989) 20; 125 (1-2):105-13.
В третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения. Предпочтительными векторами настоящего изобретения являются ρΌΕ8Τ14-ΙΡΑΑΑ44548-6ΗΙ8 (см. фиг. 10), ΡΟΒΙΙ-Τ0Ρ0-ΙΡΑΑΑ44548 (см. фиг. 11), ρΌΕ8Τ14-ΙΡΑΑΑ44548-6ΗΙ8 (см. фиг. 12) и ρΕΑΚ12ΌΙΡΑΑΑ44548-6ΗΙ8 (см. фиг. 13).
В пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному вектором четвертого аспекта настоящего изобретения.
В шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с секретированным белком и который предпочтительно ингибирует активность секретированного белка, более предпочтительно, ингибирует активность цитокина со структурой в виде пучка из четырех спиралей, и еще более предпочтительно, ингибирует активность интерферон-гамма-подобного полипептида первого аспекта настоящего изобретения.
В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое эффективно модифицирует экспрессию природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или регулирует активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения.
Соединение седьмого аспекта настоящего изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида. Важно отметить, что идентификация функции полипептида ΙΝ8Ρ037 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний.
В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к клетке-хозяину пятого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду шестого аспекта настоящего изобретения, или к соединению седьмого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики. Эти молекулы могут быть также использованы для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения клеточно-пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний. В частности, такими расстройствами могут быть, но не ограничиваются ими, иммунные расстройства, такие как аутоиммунные заболевания, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительные заболевания, такие как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, ассоциированный с вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз, кожные болезни, болезнь Бехчета, опухолевые заболевания, такие как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина, остеропороз, ожирение, диабет, подагра, сердечно-сосудистые заболевания, реперфузионные поражения, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, инсульт, заболевание печени, СПИД, СПИДассоциированный комплекс, неврологические расстройства, мужское бесплодие, старение и инфекции, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
- 4 007813
В девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у человека, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или уровня активности полипептида первого аспекта настоящего изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют ίη νίίτο. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания.
Предпочтительный способ детекции полипептидов первого аспекта настоящего изобретения включает стадии:
(a) контактирования лиганда шестого аспекта настоящего изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.
Что касается девятого аспекта настоящего изобретения, то специалисту известно, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точечную мутацию, методы амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы, в которых используются антитела. Аналогичные методы могут быть использованы в течение коротких или продолжительных промежутков времени, что позволяет наблюдать за терапевтическим лечением заболевания пациента. Настоящее изобретение также относится к набору, который может быть использован в указанных методах диагностики заболевания.
В десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида первого аспекта настоящего изобретения как члена семейства цитокинов, имеющих структуру в виде пучка из четырех спиралей, предпочтительно, интерферон-гамма-подобной молекулы.
В одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид первого аспекта настоящего изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектор четвертого аспекта настоящего изобретения, или лиганд шестого аспекта настоящего изобретения, или соединения седьмого аспекта настоящего изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
В двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к клетке-хозяину пятого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду шестого аспекта настоящего изобретения, или к соединению седьмого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для изготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний, таких как клеточно-пролиферативные расстройства, аутоиммунные/воспалительные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, неврологические расстройства, нарушения развития, метаболические расстройства, инфекции и другие патологические состояния. В частности, такими заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, иммунные расстройства, такие как аутоиммунные заболевания, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительные заболевания, такие как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, ассоциированный с вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз, кожные болезни, болезнь Бехчета, опухолевые заболевания, такие как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина, остеропороз, ожирение, диабет, подагра, сердечно-сосудистые заболевания, реперфузионные поражения, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, инсульт, заболевание печени, СПИД, СПИД-ассоциированный комплекс, неврологические расстройства, мужское бесплодие, старение и инфекции, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
В тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида первого аспекта настоящего изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектора четвертого аспекта настоящего изобретения, или лиганда шестого аспекта настоящего изобретения или соединения седьмого аспекта настоящего изобретения.
Для заболеваний, при которых у пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или при которых активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента,
- 5 007813 полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И наоборот, для заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или при которых активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.
В четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным или к дефицитным по данному полипептиду животным, которые не являются человеком и которые были трансформированы так, чтобы они экспрессировали более высокие или более низкие уровни или вообще не экспрессировали полипептид первого аспекта настоящего изобретения. Такие трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний, и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики такого заболевания.
Краткое описание стандартных способов и методик, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, приводится ниже. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретени, и не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.
В данном описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.
Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы, стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области.
Более полное описание таких методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы для консультации, приводятся в следующих работах: 8атЬгоок Мо1еси1аг С1ошпд; А БаЬогаЮгу Мапиа1, 8есопб Εάίΐίοη (1989); ΌΝΆ С1ошпд, Уо1итек I апб II (Ό.Ν О1оуег еб. 1985); О11допис1ео11бе 8уп1йек1к (М.1. Сай еб. 1984); М.1с1е1с Ас1б НуЬпб|/абоп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нщщпк ебк. 1984); Тгапкспрйоп апб Тгапк1а1юп (Β.Ό. Натек & 8.1. Нщщпк ебк. 1984); Ашта1 Се11 СиНиге (Β.Ι. Егекйпеу еб. 1986); 1ттоЬб|/еб Се11к апб Епхутек (1ВЬ Ргекк, 1986); Β. РегЬа1, А Ргасбса1 Ошбе 1о Мо1еси1аг С1ошпд (1984); 1йе МеШобк ш Епхуто1оду кепек (Асабетю Ргекк, 1пс.), екрес1а11у уо1итек 154 & 155; Сепе ТгапкГег Уес1огк £ог Маттайап Се11к (1.Н. Мй1ег апб М.Р. Са1ок ебк. 1987, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу); 1ттипосйет1са1 МеШобк ш Се11 апб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апб ^а1кег, ебк. 1987, Асабетю Ргекк, Ьопбоп); 8сорек, (1987) Рго1ет Ршгйсабоп: Рппс1р1ек апб Ргасйсе, 8есопб Ебйюп (8рппдег Уег1ад, Ν.Υ.); апб НапбЬоок о£ Ехрептеп1а1 1ттипо1оду, Уо1итек Ι-ΐν (Э.М. \Уей апб С.С. В1аск\\'е11 ебк. 1986).
Используемый термин полипептид включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами. Этот термин относится к коротким цепям (пептидам или полипептидам) и к более длинным цепям (белкам).
Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка, либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препробелка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препрочасти этого белка с продуцированием активного зрелого йолипептида. В таких полипептидах, пре-, про- или препропоследовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность, либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.
Полипептид первого аспекта настоящего изобретения может образовывать часть гибридного белка. Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или более дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, например к соединению, увеличивающему время полужизни полипептида (например, к полиэтиленгликолю).
Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных в данной области. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида,
- 6 007813 сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и АЭР-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование СР1якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование и убихитинизация.
Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим, а природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения.
В большинстве случаев, модификации, которые присутствуют в полипептиде, будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептида, которые получены рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будет определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, картины гликозилирования могут варьироваться у различных типов клеток-хозяина.
Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов.
Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептидам ΙΝ8Ρ037. Два полипептида могут быть определены термином гомологичные, если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин идентичность означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин сходство означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко определена. Сотри1а1юпа1 Мо1еси1аг Вю1оду, Ьезк А.М., ей., ОхГогй Ишуегзйу Ргезз, Νο\ν Уотк, 1988; Вюсотрийпд. 1пГогтаБсз апй Сепоте Рго)ес1з, 8тйй Ό.+., ей.. Асайетк Ргезз, №\ν Уотк, 1993; Сотрикт Апа1уз1з о! Зециепсе ΌαΙα, Рай 1, СпГГш А.М., апй СпГГш, Н.С., ейз., Нитапа Ртезз, №\ν ктзеу, 1994; 8есщепсе Апа1уз1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, уоп Неш)е, С., Асайетк Ргезз, 1987; апй Зециепсе Апа1уз1з Рптег, СпЬзкоу М. апй Оеуегеих 1., ейз., М 81оск1оп Ргезз, №\ν Уотк, 1991).
Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых они происходят), и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов Ш8Р037. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно, консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между А1а, Уа1, Ьеи и 11е; между 8ет и ТНг; между кислотными остатками Азр и С1и; между Азп и С1п; между основными остатками Ьуз и Агд; или между ароматическими остатками Рйе и Туг. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, т.е. от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Наиболее предпочтительными являются молчащие замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Особенно предпочтительными также являются консервативные замены.
Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или более аминокислотных остатков включают группу-заместитель.
Обычно, считается, что два полипептида, имеющие более чем 80% идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения имели степень идентичности последовательности полипептида Ш8Р037 или его активных фрагментов, составляющую более 80%. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 90, 95, 98 или 99% соответственно.
Функционально эквивалентными полипептидами первого аспекта настоящего изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или более методов
- 7 007813 сопоставления структур. Так, например, для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности полипептидам ΙΝ8Ρ037, делается предположение, что они обладают активностью, присущей цитокинам со структурой в виде пучка из четырех спиралей, предпочтительно, активностью интерферон-гамма-подобной молекулы, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностями полипептида ΙΝ8Ρ037, может быть использована технология информационной обработки потока данных для генома (1прйаттабса Сеиоте Тйгеабег), которая составляет один из аспектов методов поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Вюрепбшт (см. совместно рассматриваемую патентную заявку РСТ, РСТ/СВ01/01105). Термин значительная структурная гомология означает, что технология 1ирйагтайса Сепоте Тйтеабег позволяет предсказать с достоверностью 10% и выше, что два белка имеют структурную гомологию.
Полипептиды первого аспекта настоящего изобретения также включают фрагменты полипептидов ΙΝ8Ρ037 и фрагменты функциональных эквивалентов этих полипептидов, при условии, что эти фрагменты сохраняют активность секретируемого белка, а предпочтительно, активность, присущую цитокинам, имеющим структуру с пучком из четырех спиралей, более предпочтительно, активность интерферонгамма-подобной молекулы, либо они имеют антигенную детерминанту, общую для этих полипептидов.
Используемый термин фрагмент означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептидов ΙΝ8Ρ037, либо одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать, по крайней мере, п смежных аминокислот последовательности и в зависимости от конкретной последовательности, п предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.
Указанные фрагменты могут присутствовать в свободной форме т.е. не являться частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. При этом в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов.
Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие, по крайней мере, одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностыо к полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для специалиста, такие антитела, помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств.
Термин иммуноспецифический означает, что антитела имеют, в основном, более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам известного уровня. Используемый термин антитело означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как ЕаЬ, Е(аЬ')2 и Εν, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения.
Если желательно использовать поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизировано полипептидом первого аспекта настоящего изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Затем связанный полипептид может быть использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией.
Моноклональные антитела против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения могут быть легко продуцированы специалистом. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной техники хорошо известна в данной области (см. например, КоЫет С. & М11йеш, С. №1Шге 256:495-497 (1975); КохЬог е! а1., 1ттипо1о§у Тобау 4:72(1983); Со1е е! а1., 77-96, Мопос1опа1 ЛпбЬоб1е8 апб Сапсег Тйетару, А1ап В. Ьщк, 1пс. (1985).
Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, т.е. на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными в данной области, а так
- 8 007813 же они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.
Могут быть также использованы химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см. например, Ьш е! а1., Ргос. №а!1. Асаб. За. ИЗА, 84, 3439 (1987)).
Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их гуманизации, см. 1опе§ е! а1., №а!иге, 321, 522 (1986); УегНоеуеп е! а1., Зс1епсе, 239, 1534 (1988); КаЬа! е! а1., 1. 1ттипо1, 147, 1709 (1991); Оиееп е! а1., Ргос. №11. Асаб. Зс1. ИЗА, 86, 10029 (1989); Согтаи е! а1., Ргос. №аб Асаб. За. ИЗА, 88, 34181 (1991); апб Нобдкоп е! а1., Вю/Тес1то1оду. 9, 421 (1991)). Используемый термин гуманизованное антитело означает молекулы антитела, в которых аминокислоты СЭР. и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но, при этом, оно обладает способностью связываться с донорным антителом.
В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть биспецифическое антитело, т.е. антитело, имеющее два различных антиген-связывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.
Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами настоящего изобретения, либо из набора ПЦР-амплифицированных У-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки необученных лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (МсСайейу 1. е! а1. (1990), №!иге 348, 552-554; Магкк 1. е! а1., (1992) Вю!есйпо1о§у 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также увеличена путем перестановки цепей (С1аск§оп Т. е! а1. (1991) №а!иге 352, 624-628) .
Антитела, генерированные описанными выше методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, то есть они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ЕЫЗА). Для этих целей антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.
Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидные последовательности, представленные в ЗЕф 1Б №0:36, и функционально эквивалентные полипептиды. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и для целей, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, предпочтительно, содержат, по крайней мере, п смежных нуклеотидов в описываемых последовательностях, и в зависимости от конкретной последовательности, п, предпочтительно, равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).
Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также включают последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов).
Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК. Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек, или выделение из микроорганизма. РНК-молекулы могут быть, в основном, генерированы путем ш νίΙΐΌ- или ш уйо-транскрипции ДНК-последовательностей.
Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью.
Термин молекула нуклеиновой кислоты также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (Р№А). Используемый термин Р№А означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по крайней мере из пяти нуклеотидов, и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Концевой лизин придает данной композиции растворимость. Р№А могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они, предпочтительно, связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и приостанавливают элонгацию транскрипта (№1е18еп Р.Е. е! а1. (1993) Апбсапсег Эгид Бек. 8:53-63).
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид ЗЕф 1Б №0:36, может быть идентична кодирующей последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, представленной в ЗЕф 1Б №0:35. Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид ЗЕф 1Б №0:36. Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, но не ограничиваются ими, кодирующая последовательность для отдельного зрелого полипептида; кодирующая последовательность для зрелого полипептида вместе с другими кодирующими последовательностями, такими как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последователь
- 9 007813 ность, такую как про-, пре- или препрополипептидную последовательность; кодирующая последовательность зрелого полипептида с приведенными выше дополнительными кодирующими последовательностями или без них, либо вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и З'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации) и в связывании с рибосомой и обеспечивают стабильность мРНК. Молекулы нуклеиновой кислоты могут также включать вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.
Молекулы нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов первого аспекта настоящего изобретения. Такая молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо указанной молекулой может быть вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, клеткам или к организмам.
Из рассматриваемых вариантов можно отметить варианты, которые отличаются от приведенных выше молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Замены, делеции или инсерции могут быть осуществлены по отношению к одному или более нуклеотидам. Варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.
Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также сконструированы методами, в основном, известными в данной области, включая, в зависимости от различных целей, модификацию клонирования, процессинга и/или экспрессии генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки с помощью ПЦР генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т. п.
Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид первого аспекта настоящего изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным экспрессировать гибридный белок, который будет распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован таким образом, чтобы он содержал сайт расщепления, расположенный между последовательностью полипептида настоящего изобретения и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из гетерологичного белка.
Молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также антисмысловые молекулы, которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды настоящего изобретения, и поэтому они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (в результате гибридизации). Антисмысловые молекулы, такие как олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид настоящего изобретения, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и предупреждали ее транскрипцию в соответствии с методами, хорошо известными специалистам (см. например, Сокеп 1.8., Ттепбк ίη Ркагт. 8ск, 10, 435 (1989), Окапо, 1. Ыеигоскет. 56, 560 (1991); О'Соппог, 1. Ыеигоскет 56, 560 (1991); Ьее е! а1., Иис1е1с Ас1бк Век 6, 3073 (1979); Соопеу е! а1., 8с1епсе 241, 456 (1988); Бегуап е! а1., 8с1епсе 251, 1360 (1991).
Используемый термин гибридизация означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно, одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем две молекулы могут контактировать друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются: тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или ВЬОТТО); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (8атЬтоок е! а1. [см. выше]).
Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного в данной области (8атЬтоок е! а1. [см.вьше]). В основном гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомоло
- 10 007813 гичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у \Уа1й О.М. и 8.Ь. Вегдег (1987; Мебюбк Епхушо1. 152:399-407) и К1шше1 А.Р. (1987; МеФобк Епгушо1. 152:507-511).
Термин жесткость означает условия реакции гибридизации, которые способствуют ассоциации наиболее сходных молекул, но не ассоциации молекул, не обладающих таким сходством. Условия гибридизации высокой жесткости определены как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5Х88С (150 мМ ЫаС1, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х88С приблизительно при 65°С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35°С (8ашЬтоок е1 а1. [см.выше]). Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.
В предпочтительных вариантах этого аспекта настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые, по всей своей длине, по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ΙΝ8Ρ037 (8Еф ΙΌ N0:36), и к молекулам нуклеиновой кислоты, которые, в основном, комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая, по всей своей длине, была по крайней мере на 80% идентична молекулам нуклеиновой кислоты, имеющим последовательность, продуцируемую 8ЕО ΙΌ N0:35, или молекуле нуклеиновой кислоты, комплементарной этой последовательности. При этом предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по крайней мере на 90%, более предпочтительно по крайней мере на 95%, а особенно предпочтительно по крайней мере на 98 или 99% идентичны указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают, в основном, такой же биологической функцией или активностью, что и полипептиды ΙΝ8Ρ037.
Настоящее изобретение относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, включающему стадии:
(a) контактирования нуклеинового зонда настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (b) детекции любого такого образованного дуплекса.
Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды ΙΝ8Ρ037, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид.
В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы описанные и обсуждаемые методы, которые приводятся ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и, в основном, доступны в данной области, и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов настоящего изобретения, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы Ι, секвеназа (И8 Вюсбетюа1 Согр., С1еуе1апб, ОН), полимераза Тас.| (Реткш Е1тег), термостабильная полимераза Т7 (Лтеткйат, СЫсадо, ГЬ) или комбинация таких полимераз и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в ΕΕ0Ν0Ά8Ε Атрбйсабоп 8ук1ет. и поставляемые 01Ьсо/ВКЕ (ОайбегкЬигд, МО) . Способ секвенирования может быть, предпочтительно, автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат НатШоп Мюто ЬаЬ 2200 (НатбЩп, Репо, Νν), термоячейка РеШет Т11егта1 Сус1ег (РТС200; М1 Векеатсй, ^а1ейотеп, МА), катализатор ΑΒΙ и ДНК-секвенаторы 373 и 377 (Реткш Е1тег).
Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептида ΙΝ8Ρ037, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом с использованием стандартных методик, известных в данной области (см., например, СштеШ бюШтой ш Мо1еси1аг Вю1оду, АикиЬе1 е1 а1. (ебк). Отеепе ΡυΜίκ^^ Аккос1а1ек апб \Убеу Шеткшепсе, №\ν Уотк, 1989, 1992). Особенно подходящими являются зонды, содержащие 15, предпочтительно по крайней мере 30, более предпочтительно по крайней мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена (8ЕО ΙΌ Ν0:35). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондо, специалист может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и
- 11 007813 скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например, отдельных членов семейства, типа и/или подтипа.
Во многих случаях выделенные кДНК-последовательности будут неполными, т.е. в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет обрезана, обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных в данной области методов детекции расположенных выше последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (КАСЕ; см., например, Егойтап с1 а1., ΡΝΑ8 И8А 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, проиллюстрированные МагаЙюп ТМ (С1оп1се11 йаЬога1ог1ек 1пс.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется сайт-рестрикционной ПЦР и предусматривает с использование универсальных праймеров (8агкаг С. (1993) РСК МеЕюйк Аррйс. 2:318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (ТгфНа Т. с1 а1. (1988) №с1ею Ас16к Кек. 16:8186). Другим методом, который может быть использован в данном случае, является ПЦР с захватом, которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (ЬадегкГгот М. е1 а1., (1991) РСК МеЛобк Аррйс. 1, 111-119). Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод Рагкег ΕΌ. е1 а1. (1991) №с1ею Ас16к Кек. 19:3055-3060). Кроме того, можно использовать ПЦР, гнездовые праймеры и библиотеки Ргото1егЕш6егТМ для прогулки по геномной ДНК (С1оп1ес11. Ра1о Айо, СА). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон.
При скрининге на полноразмерные ДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека ойдо-б(Т) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'нетранскрибированных регуляторных областей.
В одном из вариантов осуществления изобретения, молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок, либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением, картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важным звеном в подтверждении корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации, физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. МсКикюк, Мепбейап 1пйегйапсе ίη Мап (имеющейся в настоящее время в 1о1т Норкшк Ишуегкйу \Уе1с11 Ме6юа1 Ь1Ьгагу). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или другими методами обнаружения генов. После предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для детекции различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т. п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов с заболеванием.
Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации ш кйи и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволили получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу.
- 12 007813
Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид настоящего изобретения, могут быть также использованы методы отключения гена. Одним из методов, который может быть использован для отключения последовательность-специфического посттрансляционного гена, является интерференция РНК (ΚΝΑί) (Е1Ьа§Ыг 8.М. е( а1., Ыа!иге 2001, 411, 4 94-4 98). Короткие дцРНКолигонуклеотиды синтезируют ίη νίίΓο и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии целевого белка.
Эффективность методов отключения гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), и на РНК-уровне - с помощью методики, основанной на ТацМап.
Векторы настоящего изобретения содержат молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева настоящего изобретения, которые могут быть трансформированы, трансфецированы или трансдуцированы векторами настоящего изобретения, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки-хозяева.
Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие из них подробно описаны у 8атЬгоок е! а1. (см. выше) и Еегпапбех & НоеГПег (1998, еб§. Сепе ехргекыоп куйетк. Иапд па!иге Гог (Не ай оГ ехргекыоп. Асабетк Рге§8, 8ап О1едо, Ьопбоп, Βοκΐοη, №\ν Уогк, 8убпеу, Токуо, ТоΓοηΐο).
Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у 8атЬгоок е( а1. (см.выше). В общих чертах, кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания с рибосомой (для экспрессии в бактериях) и, необязательно, оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине.
Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусные системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирсусы, а также 8У40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, псевдорабивирусы и ретровирусы, или их комбинации, такие как векторы, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные человеческие хромосомы (НАС).
Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах; клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, СаМУ; вирусом мозаики табака, ТМУ) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Т1 или рВК322); или клеточные системы животных. Для продуцирования полипептидов настоящего изобретения могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции.
Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид настоящего изобретения, в клетки-хозяева, может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Όηνίδ е( а1., Ваис Ме(Ноб5 ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1986) и 8атЬгоок е( а1. [см. выше]. Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная ΌΕΑΕ-декстраном; трасфекция; микроинжекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (8атЬгоок е( а1., 1989 [см. выше], Аи§иЬе1 е( а1. [см. выше], 8рес(ог. Со1бтап & Ье1пета1б, 1998). В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интеграция).
Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид, или лидерную последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду, либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при по
- 13 007813 сттрансляционном процессинге.
Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и З'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор 1ас2 фагмиды В1ие8спр1 (81га1адспс. Ьа1о11а, СА) или плазмиды р8рой1ТМ (01Ьсо ВКЕ) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, КИВ18СО и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе 8У40 или ЕВУ с соответствующим селективным маркером.
Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регудяторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под контролем регуляторных' последовательностей, т.е. так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой у регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать, последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, т. е. с сохранением рамки считывания.
Регуляторные последовательности и другие контрольные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт.
Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки, успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа.
Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детенышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (СО8), клетки С127, клетки ЗТЗ, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер 02) и ряд других клеточных линий.
В бакуловирусной системе материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, ш!ег аНа, от 1пу11годеп, 8ап Э|едо СА (набор МахВас). В общих чертах, эти методы известны специалистам и подробно описаны у 8ишшегз & 8тИЪ, Техаз Адг1си11ига1 Ехрепшеп! 81а1юп Ви11е1ш № 1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клетки ЭгозорШа 82 и клетки 8робор1ега 8£9.
В данной области известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются сис
- 14 007813 темы, описанные в И8 5693506, И8 5659122 и И8 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны 2епк, РЬу!осЬет1к!гу 30, 3861-3863 (1991).
В частности, могут быть использованы любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты, и из этих протопластов могут быть затем генерированы целые регенерированные растения, содержащие перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, но, не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых и овощных растений.
Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, Е.со11, 8!гер!отусек и ВасШик киЬ!111к.
Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например 8. сегеуыае) и клетки АкрегдШик.
Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны в данной области. Примерами являются гены тимидинкиназы (^1§1ег М. е! а1. (1977) Се11 11:223-32) и аденин-фосфорибозилтрансферазы Вируса простого герпеса (Ьо^у I. е!. а1. (1980) Се11 22:817-23), которые могут оыть использованы в !к- или аргк-клетках соответственно.
Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например ген дигидрофолатредуктазы (БНРК), который придает резистентность к метотрексату (^1д1ег М. е! а1. (1980) Ргос. №И. Асаб. 8ск 77:3567-70); ген пр!, который придает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к С-418 (Со1Ыеге-6агарт Р. е! а1 (1981) 1. Мо1. Вю1. 150:1-14), и гены а1к или ра!, которые придают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицинацетилтрансферазе соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам.
Хотя присутствие или отсутствие экспрессии маркерного гена позволяет предположить, что присутствует также и нужный ген, однако, его присутствие и экспрессия еще нуждаются в подтверждении. Так, например, если соответствующая последовательность была встроена в последовательность маркерного гена, то трансформированные клетки, содержащие соответствующие последовательности, могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерный ген может находиться в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид настоящего изобретения, находящийся под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индуцирование или отбор обычно указывает также на экспрессию тандемного гена.
Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид настоящего изобретения, и которые экспрессируют указанный полипептид, могут быть идентифицированы различными методами, известными специалистам. Такими методами являются, но не ограничиваются ими, ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизация и биоанализы на присутствие белка, например сортировка клеток по интенсивности флуоресценции (РАС8) или иммуноанализы (таких как твердофазный иммуноферментный анализ [ЕБ18А] и радиоиммуноанализ [РИА]), которые предусматривают использование мембран, растворов или чипов для детекции и/или количественной оценки нуклеиновой кислоты или белка (см. Натр!оп К. е! а1. (1990) 8его1одюа1 Мейобк, а ЬаЫога!огу Мапиа1, АР8 Ргекк, 8! Раи1, МК) и Ма44ох Б.Е. е! а1., (1983) Р Ехр. Ме4. 158, 1211-1216).
Существует широкий ряд методов мечения и конъюгирования, известных специалистам, и эти методы могут быть использованы в различных анализах на присутствие нуклеиновых кислот и аминокислот. Методами, используемыми в целях продуцирования меченых зондов для гибридизации или ПЦРзондов для детекции последовательностей, родственных молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды настоящего изобретения, являются мечение олигонуклеотидами, ник-трансляция, мечение по концам или ПЦР-амплификация с использованием меченого полинуклеотида. Альтернативно, последовательности, кодирующие полипептид настоящего изобретения, могут быть клонированы в вектор для продуцирования мРНК-зонда. Такие векторы известны в данной области, являются коммерчески доступными и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов ш У1!го путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как Т7, Т3 или 8Р6, и меченых нуклеотидов. Эти методики могут быть осуществлены с использованием различных коммерчески доступных наборов (РРагтас1а & Ир)от (Ка1атахоо. М1); Рготеда (Майкоп XVI) и и.8. ВюсЬетюа1 Согр., С1еуе1апй, ОН)).
Подходящими репортерными молекулами или метками, которые могут быть использованы для облегчения детекции, являются радионуклиды, ферменты и флуоресцентные, хемилюминисцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.
Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также использованы для генерирования трансгенных животных, в частности, грызунов. Такие трансгенные животные входят в дополнительный аспект настоящего изобретения. Такое генерирование может быть осуществлено путем локальной модификации соматических клеток или манипуляций с зародышевыми линиями для введения наследуемых модификаций. Такие трансгенные животные могут быть, в частности, использованы для генерирования животных-моделей в целях поиска молекул лекарственных средств, которые являются эффективными в качестве модуляторов полипептидов настоящего изобретения.
Полипептид может быть выделен и очищен из рекомбинантных клеточных культур хорошо извест
- 15 007813 ными методами, включая преципитацию сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионообменную или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиаппатитах и хроматографию на лектине. Для очистки, наиболее подходящей является высокоэффективная жидкостная хроматография. В случае, если данный полипептид был денатурирован в процессе выделения или очистки, то для восстановления активной конформации может быть использована хорошо известная техника рефолдинга белков.
Если необходимо, то для облегчения очистки белков могут быть также использованы специальные векторные конструкции, полученные путем присоединения последовательностей, кодирующих полипептиды настоящего изобретения, к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептидный домен, который облегчает очистку растворимых белков. Примерами таких доменов, облегчающих очистку белков, являются пептиды, образующие хелатные комплексы с металлами, такие как: гистидинтриптофановые модули, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных металлах; домены белка А, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе ЕЬАС8 удлинение/аффинная очистка (1ттипех Согр., 8са111с. ЭДА). Для облегчения очистки между доменом для очистки и полипептидом настоящего изобретения могут быть включены расщепляемые линкерные последовательности, такие как последовательности, специфичные к фактору ХА или энтерокиназе (1пуйгодеп, 8ап П1едо, СА). Один из таких экспрессирующих векторов обеспечивает экспрессию гибридного белка, содержащего полипептид настоящего изобретения, присоединенный к нескольким гистидиновым остаткам, за которыми следуют тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают проведение очистки с помощью 1МАС (аффинной хроматографии на иммобилозованном ионе металла, описанной РогаШ 1. е1 а1. (1992), Рго1. Ехр. РилГ. 3:263-281), тогда как тиоредоксин или рестрикционный сайт энтерокиназы позволяют выделять полипептид из гибридного белка. Обсуждение векторов, содержащих гибридные белки, можно найти у Кго11 Ό.Ι. е1 а1. (1993; ИЫА Се11 Бю1. 12:441-453).
Если экспрессируемый полипептид используется в аналитическом скрининге, то обычно предпочтительно, чтобы он был продуцирован на поверхности клетки-хозяина, в которой он экспрессируется. В этом случае, клетки-хозяева могут быть собраны до их использования в скрининг-анализе, например, таким методом, как сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) или иммуноаффинным методом. Если полипептид секретируется в среду, то такая среда может быть восстановлен для выделения и очистки экспрессированного полипептида. Если полипептид продуцируется внутри клетки, то перед выделением полипептида клетки должны быть сначала подвергнуты лизису.
Полипептид настоящего изобретения может быть использован для скрининга библиотек соединений в любом из известных методов, применяемых для скрининга лекарственных средств. Такие соединения могут стимулировать (служить агонистами) или ингибировать (служить антагонистами) уровень экспрессии гена или активность полипептида настоящего изобретения, и поэтому они составляют дополнительный аспект настоящего изобретения. Предпочтительными соединениями являются соединения, способные влиять на экспрессию природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или регулировать активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения.
Соединения-агонисты или соединения-антагонисты могут быть выделены, например, из клеток, бесклеточных препаратов, химических библиотек или смесей природных продуктов. Такими агонистами или антагонистами могут быть природные или модифицированные субстраты, лиганды, ферменты, рецепторы, либо структурные или функциональные миметики. Подходящее описание таких методов скрининга можно найти в работе Сойдап е1 а1., СиггеШ РгоЮеоЕ ш 1ттипо1оду 1(2):Сйар1ег 5 (1991).
Соединения, которые могут рассматриваться как наиболее вероятные кандидаты на хорошие антагонисты, представляют собой молекулы, которые связываются с полипептидом настоящего изобретения, но не индуцируют каких-либо биологических эффектов полипептида после связывания с ним. Потенциальными антагонистами являются небольшие органические молекулы, пептиды, полипептиды и антитела, которые связываются с полипептидом настоящего изобретения и, тем самым, ингибируют или подавляют его активность. Таким образом, связывание полипептида с нормальными связывающимися клеточными молекулами может ингибироваться так, чтобы подавлялась нормальная биологическая активность полипептида.
Полипептид настоящего изобретения, который используется в таком методе скрининга, может находиться в растворе в свободном состоянии, может быть иммобилизован на твердом носителе, может присутствовать на клеточной поверхности, либо он может быть локализован внутри клетки. В основном, такие методики скрининга предусматривают использование соответствующих клеток или клеточных мембран, экспрессирующих полипептид, который контактирует с тестируемым соединением, что приводит к связыванию, либо к стимуляции или ингибированию функционального ответа. Функциональный ответ клеток, контактируемых с тестируемым соединением, сравнивают с контрольными клетками, которые не контактировали с тестируемым соединением. С помощью подходящей системы детекции такой анализ позволяет определить, может ли тестируемое соединение давать сигнал, генерируемый активацией указанного полипептида. Ингибиторы активации обычно анализируют в присутствии известного аго
- 16 007813 ниста и оценивают влияние этого агониста на активацию в присутствии тестируемого соединения.
Предпочтительный способ идентификации соединения-агониста или соединения-антагониста по отношению к полипептиду настоящего изобретения включает:
(a) контактирование клетки, экспрессирующей на клеточной поверхности полипептид первого аспекта настоящего изобретения, который ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, и при этом соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с указанным полипептидом; и (b) определение события связывания указанного соединения с указанным полипептидом, либо его активации или ингибирования путем измерения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия указанного соединения с полипептидом.
Еще более предпочтительный способ идентификации агониста или антагониста по отношению к полипептиду настоящего изобретения включает:
(a) контактирование клетки, экспрессирующей на клеточной поверхности полипептид, который ассоциирован со вторым компонентом, способным давать детектируемый сигнал в ответ на связывание соединения с указанным полипептидом, и при этом соединение скринируют в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом; и (b) определение события связывания соединения с полипептидом, либо его активации или ингибирования путем сравнения уровня сигнала, генерируемого в результате взаимодействия соединения с полипептидом, с уровнем сигнала, полученного в отсутствии указанного соединения.
В других предпочтительных вариантах изобретения общие методы, описанные выше, могут дополнительно включать осуществление идентификации агониста или антагониста в присутствии меченного или немеченного лиганда для полипептида.
В другом варианте изобретения, способ идентификации агониста или антагониста полипептида настоящего изобретения включает: определение факта ингибирования связывания лиганда с клетками, которые содержат полипептид настоящего изобретения на своей поверхности, или с клеточными мембранами, содержащими такой полипептид, в присутствии соединения-кандидата в условиях, стимулирующих связывание с полипептидом, и определение количества лиганда, связанного с полипептидом. Считается, что соединение, способное приводить к снижению уровня связывания с лигандом, является агонистом или антагонистом. При этом предпочтительно, чтобы указанный лиганд был меченным.
Более конкретно, способ скрининга на соединение, являющееся агонистом или антагонистом к полипептиду, включает стадии:
(a) инкубирования меченного лиганда с целой клеткой, экспрессирующей полипептид настоящего изобретения на клеточной поверхности, или с клеточной мембраной, содержащей полипептид настоящего изобретения;
(b) измерения количества меченного лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной;
(c) добавления соединения-кандидата к смеси меченного лиганда и целой клетки или клеточной мембраны стадии (а) и доведение этой смеси до состояния равновесия;
(б) измерения количества меченного лиганда, связанного с целой клеткой или с клеточной мембраной, после проведения стадии (с); и (е) сравнения различия в количествах связанного меченного лиганда стадий (Ь) и (б), где соединение, вызывающее снижение уровня связывания в стадии (б), считается агонистом или антагонистом.
В описанных выше анализах может быть установлено, что указанные полипептиды модулируют различные физиологические и патологические процессы дозозависимым способом. Так, например, функциональными эквивалентами полипептидов настоящего изобретения являются полипептиды, которые в приведенных выше анализах обладают той же самой дозозависимой модулирующей активностью. Хотя уровень дозозависимой активности необязательно является идентичным уровню полипептидов настоящего изобретения, однако, предпочтительно, чтобы в данном анализе на активность функциональные эквиваленты обнаруживали, в основном, такую же аналогичную зависимость от дозы, как и полипептиды настоящего изобретения.
В некоторых описанных выше вариантах изобретения могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей данный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или с помощью анализа на конкуренцию с меченым соединением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, указанные антитела могут быть использованы для детекции на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с указанным полипептидом.
Могут быть также разработаны анализы для детекции влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей полипептид, в клетках. Так, например, анализ ЕЬ1§Л может быть разработан так, чтобы можно было измерить секретированные или клеточно-ассоциированные
- 17 007813 уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами известными в данной области, и этот анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом модифицированных клеток или тканей. Затем может быть определен уровень образования связывающих комплексов между полипептидом и тестируемым соединением.
Аналитическими способами, которые также входят в объем настоящего изобретения, являются способы, предусматривающие использование генов и полипептидов настоящего изобретения в анализах на сверхэкспрессию или в анализах на исключение. Такие анализы предусматривают манипуляцию с уровнями указанных генов/полипептидов в клетках и оценку влияния этой манипуляции на физиологию клеток, подвергнутых манипуляции. Так, например, такие эксперименты позволяют точно выявить пути передачи сигнала и метаболические пути, в которых участвуют конкретные гены/полипептиды, а также получить информацию относительно идентичности полипептидов, с которыми взаимодействуют исследуемые полипептиды, и найти ключ к разгадке механизмов, с помощью которых регулируются родственные гены и белки.
Альтернативно, могут быть использованы простые анализы на связывание, в которых адгезию тестируемого соединения к поверхности, несущей указанный полипептид, детектируют с помощью метки, непосредственно или опосредованно ассоциированной с тестируемым соединением, или с помощью анализа на конкуренцию с меченым соединением-конкурентом. В другом варианте осуществления изобретения могут быть использованы конкурентные анализы на скрининг лекарственных средств, в которых нейтрализующие антитела, способные связываться с данным полипептидом, специфически конкурируют за связывание с тестируемым соединением. Таким образом, антитела могут быть использованы для детекции на присутствие любого тестируемого соединения, обладающего специфической аффинностью связывания с полипептидом.
Могут быть также разработаны анализы для детекции влияния добавленных тестируемых соединений на продуцирование мРНК, кодирующей полипептид, в клетках. Так, например, анализ ЕЫ8Л может быть разработан так, чтобы можно было измерить секретированные или клеточно-ассоциированные уровни полипептида с использованием моноклональных или поликлональных антител стандартными методами известными специалистам, и этот анализ может быть использован для поиска соединений, которые могут ингибировать или усиливать продуцирование полипептида из соответствующим образом клеток или тканей, подвергнутых манипуляции. Затем может быть определен уровень образования связывающих комплексов между тестируемым полипептидом и соединением.
Другой метод, который может быть использован для скрининга на лекарственные средства, дает возможность осуществлять высокоэффективный скрининг соединений, обладающих подходящей аффинностью связывания с нужным полипептидом (см. Международную патентную заявку \У0 84/03564). В этом методе большое число различных небольших тестируемых соединений синтезируют на твердом субстрате, который затем может быть подвергнут реакции с полипептидом настоящего изобретения и промывке. Одним из способов иммобилизации полипептида является использование не-нейтрализующих антител. Связанный полипептид может быть затем детектирован методами, хорошо известными в данной области. Очищенный полипептид также может быть непосредственно нанесен на планшеты для последующего использования в приведенных выше способах скрининга на лекарственные средства.
Полипептид настоящего изобретения может быть использован для идентификации мембраноассоциированных или растворимых рецепторов с помощью стандартной техники связывания с рецептором, известной в данной области, такой как анализы на связывание и перекрестное сшивание с лигандом, в которых полипептид метят радиоактивным изотопом, химически модифицируют или присоединяют к пептидной последовательности, которая облегчает его детекцию или очистку, и инкубируют с источником предполагаемого рецептора (например, с композицией клеток, клеточными мембранами, клеточными супернатантами, тканевыми экстрактами или с физиологическими жидкостями). Эффективность связывания может быть определена биофизическими методами, такими как поверхностный плазмонный резонанс и спектроскопия. Анализы на связывание могут быть использованы для очистки и клонирования рецептора, но они могут быть также использованы для идентификации агонистов и антагонистов полипептида, которые конкурируют с полипептидом за связывание с рецептором. Стандартные методы проведения скрининг-анализов хорошо известны в данной области.
Настоящее изобретение также относится к набору для скрининга, используемому в методах идентификации агонистов, антагонистов, лигандов, рецепторов, субстратов и ферментов, описанных выше.
Настоящее изобретение также относится к агонистам, антагонистам, лигандам, рецепторам, субстратам, ферментам и к другим соединениям, модулирующим активность или антигенность полипептида настоящего изобретения в соответствии с описанными выше механизмами.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение настоящего изобретения в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем. Эти композиции могут быть использованы в качестве терапевтических или диагностических реагентов, в качестве вакцин или в качестве других иммуногенных композиций, подробно описанных ниже.
- 18 007813
В соответствии с используемой здесь терминологией композиция, содержащая полипептид, нуклеиновую кислоту, лиганд или соединение [X], считается в основном не содержащей примесей [здесь, Υ], если по крайней мере 85 мас.% от всего количества Χ+Υ в данной композиции составляет X. Предпочтительно, X составляет по крайней мере примерно 90% по общей массе Χ+Υ в данной композиции, более предпочтительно по крайней мере примерно 95, 98 или даже 99 мас.%.
Фармацевтические композиции, предпочтительно, должны содержать терапевтически эффективное количество полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты, лиганда или соединения настоящего изобретения. Используемый термин терапевтически эффективное количество означает количество терапевтического агента, необходимого для лечения, ослабления или профилактики рассматриваемого заболевания или состояния, или для достижения детектируемого терапевтического или профилактического эффекта. Для каждого соединения, терапевтически эффективная доза может быть сначала оценена либо в анализе клеточной культуры, например, опухолевых клеток, либо на животных-моделях, обычно на мышах, кроликах, собаках или свиньях. Животное-модель может быть также использовано для определения соответствующего интервала концентраций и способа введения. Такая информация может быть затем использована для определения подходящих доз и способов их введения человеку.
Точное эффективное количество соединения для введения индивидууму будет зависеть от тяжести патологического состояния, общего состояния здоровья индивидуума, возраста, массы и пола индивидуума, его режима питания и частоты введения лекарственного средства, а также от комбинации(й) лекарственных средств, чувствительности данного индивидуума на реакцию и его переносимость/восприимчивость к данной терапии. Такое количество может быть определено путем рутинного экспериментирования и может быть установлено врачом-клиницистом. В общих чертах, эффективная доза может составлять от 0,01 до 50 мг/кг, предпочтительно, от 0,05 до 10 мг/кг. Композиции могут быть введены пациенту либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами, лекарственными средствами или гормонами.
Фармацевтическая композиция может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, подходящий для введения терапевтического агента. Такими носителями являются антитела и другие полипептиды, гены и другие терапевтические агенты, такие как липосомы, при условии, что этот носитель сам по себе не индуцирует вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию, и что данный вводимый носитель не является чрезмерно токсичным. Подходящими носителями могут быть крупные макромолекулы с замедленным метаболизмом, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и неактивные вирусные частицы.
Используемыми фармацевтически приемлемыми солями могут быть, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т. п., и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей можно найти в ВеттДоп'з Рйагтасеийса1 Заепсез (Маск РиЬ. Со., Ν.Σ. 1991).
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут, кроме того, содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Кроме того, в указанных композициях могут присутствовать и вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-забуферивающие вещества и т. п. С помощью таких носителей могут быть получены фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п., для перорального введения пациенту.
Композиции настоящего изобретения после их приготовления могут быть непосредственно введены индивидууму. Индивидуумами, подвергаемыми лечению, могут быть животные, в частности, человек.
Фармацевтические композиции, используемые в настоящем изобретении, могут быть введены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедулярное, интратекальное,, интравентрикулярное, трансдермальное или чрескожное введение (см., например, XV0 98/10734), а также подкожное, внутрибрюшинное, интраназальное, кишечное, местное, подъязычное, интравагинальное или ректальное введение. Для введения фармацевтических композиций настоящего изобретения могут быть также использованы генные ружья или безыгольные шприцы. В основном, терапевтические композиции могут быть приготовлены в виде растворов для инъекций, либо в виде жидких растворов или суспензий, либо они могут быть получены в виде твердых форм, подходящих для получения растворов или суспензий в жидких носителях перед их введением путем инъекции.
Указанные композиции могут быть непосредственно доставлены, в основном, путем подкожной, внутрибрюшинной, внутривенной или внутримышечной инъекции, либо они могут быть доставлены в интерстициальное пространство ткани. Композиции могут быть также введены в пораженный участок. При этом лечение может быть проведено по схеме введения разовой дозы или дробных доз.
Если активность полипептида настоящего изобретения превышает активность, требуемую для лечения конкретного патологического состояния, то в данном случае может быть рассмотрено несколько подходов. Один из таких подходов включает введение индивидууму вышеописанного соединенияингибитора (антагониста) вместе с фармацевтически приемлемым носителем, где указанный ингибитор
- 19 007813 вводят в количестве, эффективном для ингибирования функции полипептида, например, блокирования связывания с лигандами, субстратами, ферментами или рецепторами, либо ингибирования вторичного сигнала, и, тем самым, эффективном для ослабления симптомов аномального состояния. Такими антагонистами, предпочтительно, являются антитела. Для минимизации иммуногенности антител, описанных выше, наиболее предпочтительно, чтобы такие антитела были химерными и/или гуманизованными.
В соответствии с другим подходом могут быть введены растворимые формы полипептидов, которые сохраняют аффинность связывания с рассматриваемым лигандом, субстратом, ферментом или рецептором. В основном, такой полипептид может быть введен в виде фрагментов, в которых сохраняются соответствующие части.
В альтернативном подходе экспрессия гена, кодирующего полипептид, может быть ингибирована методами блокирования экспрессии, такими как использование молекул антисмысловой нуклеиновой кислоты (описанных выше), которые могут быть либо эндогенно генерированы, либо введены отдельно. Модификации экспрессии генов могут быть получены путем конструирования комплементарных последовательностей или антисмысловых молекул (ДНК, РНК или РNА) для контролирующих элементов, 5'последовательностей или регуляторных последовательностей (сигнальной последовательности, промоторов, энхансеров и интронов) гена, кодирующего полипептид. Аналогичным образом, ингибирование может быть осуществлено с использованием методики спаривания оснований с образованием тройной спирали. Спаривание с образованием тройной спирали используется исходя из того, что такое спаривание приводит к нарушению способности двойной спирали раскрываться так, чтобы это оказалось достаточным для связывания с полимеразой, факторами транскрипции или регуляторными молекулами. Успехи в клинической терапии, достигнутые за последнее время благодаря использованию ДНК-триплекса, были описаны в литературе (Сее ТЕ. е! а1. (1994): НиЬег В.Е. & Β.Ι. Сагг, Мо1еси1аг апб !ттипо1о§1с АрргоасЬек, Ти!ига РиЬНкЬтд Со., М!. К1ксо, ΝΥ). Комплементарная последовательность или антисмысловая молекула могут быть также сконструированы в целях блокирования трансляции мРНК посредством предотвращения связывания транскрипта с рибосомами. Такие олигонуклеотиды могут быть введены или генерированы ίη κίΐιι в результате экспрессии ίη у1уо.
Кроме того, экспрессия полипептида настоящего изобретения может быть предотвращена с использованием рибозимов, специфичных к мРНК-последовательности, кодирующей этот полипептид. Рибозимы представляют собой каталитически активные РНК, которые могут быть природными или синтетическими (см. например, υ8таη Ν. е! а1., Сшт. Орш. 8!гис!. Вю1. (1996) 6(4), 527-33). Синтетические рибозимы могут быть сконструированы так, чтобы они специфически расщепляли мРНК в выбранных положениях и, тем самым, предотвращали трансляцию мРНК в функциональный полипептид. Рибозимы могут быть синтезированы с использованием природного рибозофосфатного остова и природных оснований, обычно присутствующих в РНК-молекулах. Альтернативно, рибозимы могут быть синтезированы с использованием не-природных остовов, например, 2'-0-метил-РНК, в целях защиты от расщепления рибонуклеазой, и эти рибозимы могут содержать модифицированные основания.
РНК-молекулы могут быть модифицированы в целях увеличения внутриклеточной стабильности и времени полужизни. Возможными модификациями являются, но не ограничиваются ими, присоединение фланкирующих последовательностей у 5'- и/или у 3'-концов молекулы или использование в указанном остове молекулы фосфортиоата или 2'-0-метила вместо фосфодиэстеразных связей. Эта концепция может рассматриваться и при продуцировании РNА и может быть применена ко всем указанным молекулам посредством включения нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и бутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и аналогичные модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина, которые не могут легко распознаваться эндогенными эндонуклеазами.
Для лечения аномальных состояний, ассоциированных с недостаточной экспрессией полипептида настоящего изобретения и его активностью, имеется несколько способов. Один из таких способов предусматривает введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения, которое активирует полипептид, т. е. соединение-агонист, описанное выше, в целях ослабления симптомов патологического состояния. Альтернативно, терапевтическое количество указанного полипептида в комбинации с подходящим фармацевтическим носителем может быть введено в целях сохранения соответствующего физиологического равновесия данного полипептида.
Для осуществления эндогенного продуцирования у индивидуума данного полипептида соответствующими клетками может быть применена генотерапия. Генотерапию используют для перманентного лечения заболеваний, связанных с аномальным продуцированием полипептида, путем замены дефектного гена правильным терапевтическим геном.
Генотерапия настоящего изобретения может быть осуществлена ίη у1уо или ех у1уо. Для генотерапии ех у1уо требуется выделение и очистка клеток, взятых у пациента, введение терапевтического гена и введение генетически модифицированных клеток обратно пациенту. В противоположность этому, генотерапия ίη у1уо не требует выделения и очистки клеток пациента.
Для введения пациенту, терапевтический ген обычно является упакованным. Носители для доставки генов могут быть невирусными, таким как липосомы, либо они могут представлять собой дефектные по репликации вирусы, такие как аденовирус, описанный Вегкпег К.Ь., Сигг. Тор. МкгоЬюк
- 20 007813
1ттипо1., 158, 39-66 (1992) или векторы на основе адено-ассоциированного вируса (АЛУ), описанные Михусхка Ν. Сигг. Тор. М1сгоЫо1. 1ттипо1., 158, 97-129 (1992) и в патенте США № 5252479. Так, например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид настоящего изобретения, может быть сконструирована для экспрессии в дефектном по репликации ретровирусном векторе. Затем эта экспрессионная конструкция может быть выделена и введена в упаковывающую клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, кодирующую указанный полипептид, так, чтобы указанная упаковывающая клетка продуцировала инфекционные вирусные частицы, содержащие нужный ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены индивидууму для конструирования клеток ш у1уо и экспрессии полипептид ш у1уо (см. СРар1ег 20 Сепе ТРегару апй о!Рег Мо1еси1аг СепеРс-Ьазей ТРегареиРс АрргоасРез (и цитируемые там ссылки), Нитап Мо1еси1аг СепеРсз (1996), Т. ИгасРап & А.Р.Неай, ВЮ8 8с1епййс РиЬРзРегз Ий).
Другим способом является введение оголенной ДНК, где терапевтический ген непосредственно инъецируют в кровоток или в мышечную ткань.
В случае, когда полипептидами или молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения являются агенты, вызывающие заболевание, настоящее изобретение относится к их возможному применению в вакцинах для вырабатывания антител против указанного агента, вызывающего заболевания.
Вакцины настоящего изобретения могут быть либо профилактическими (т.е. предназначенными для предупреждения инфекции), либо терапевтическими (т.е. предназначенными для лечения заболеваний после инфицирования). Такие вакцины содержат иммунизирующий(е) антиген(ы), иммуноген(ы), полипептид(ы), белок(ки) или нуклеиновую кислоту, обычно в комбинации с описанными выше фармацевтически приемлемыми носителями, которыми может быть любой носитель, который сам по себе не индуцируют вырабатывание антител, оказывающих негативное воздействие на индивидуума, которому вводят указанную композицию. Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы (адъюванты). Кроме того, антиген или иммуноген может быть конъюгирован с бактериальным токсоидом, таким как токсоид дифтерии, столбняка, холеры, Н. ру1оп и другие патогены.
Поскольку полипептиды могут разрушаться в желудке, то вакцины, содержащие полипептиды, предпочтительно вводят парентерально (например, путем подкожной, внутримышенчной, внутривенной или чрескожной инъекции). Композициями, подходящими для парентерального введения, являются водные и безводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и растворенные вещества, сообщающие данной композиции изотоничность с кровью реципиента, а также водные и безводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие агенты или загустители.
Вакцинные композиции настоящего изобретения могут быть помещены в упаковки для разовых лекарственных форм или для дробных лекарственных форм. Так, например, эти лекарственные формы могут быть помещены в запаянные ампулы и сосуды и могут храниться в замороженном виде, в которые, непосредственно перед их использованием, необходимо лишь добавить стерильный жидкий носитель. Конкретная доза будет зависеть от удельной активности данной вакцины и может быть легко определена путем рутинного экспериментирования.
Настоящее изобретение также относится к применению молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в качестве диагностических реагентов. Детекция мутированной формы гена, характеризующейся существованием молекул нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, которые ассоциируются с дисфункцией, используется в качестве диагностического средства, которое может облегчать установление диагноза заболевания или установления восприимчивости к заболеванию, возникающему в результате пониженной экспрессии, сверхэкспресии или измененной пространственной или временной экспрессии данного гена. Индивидуумы, несущие мутации в данном гене, могут быть идентифицированы на уровне ДНК рядом методов.
Молекулы нуклеиновой кислоты, используемые для диагностики, могут быть получены из клеток данного индивидуума, таких как клетки крови, мочи, слюны, биоптата ткани или материала, полученного после аутопсии. Геномные ДНК могут быть использованы непосредственно для детекции либо перед проведением анализа, они могут быть амплифицированы ферментативно с использованием ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР), амплификации с замещением цепи (§ЦА) или другими методами амплификации (см. 8а1к1 е1 а1., №1иге, 324, 163-166 (1986); Ве.) е1 а1., СгР. Неу. ВюсРет. Мо1ес. Вю1., 26, 301-334 (1991); Викептеуег е1 а1., 1. У1го1. Ме1Р., 35, 117-126 (1991), У ап ВгипЦ 1. В^^сРпо^^у, 8, 291-294 (1990)).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики заболевания у пациента, включающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид настоящего изобретения, и сравнение полученного уровня экспрессии с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия данного заболевания. Этот способ может включать следующие стадии:
а) контактирование образца ткани, взятой у пациента, с нуклеиновокислотным зондом в жестких условиях, в результате чего образуется гибридный комплекс между молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения и указанным зондом;
- 21 007813
b) контактирование контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и
c) детекцию присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, где детекция уровней гибридного комплекса в образце данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, является признаком наличия данного заболевания.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, включающему следующие стадии:
a) получение образцов тканей от пациента, исследуемого на наличие заболевания;
b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения из указанного образца ткани; и
c) установление диагноза заболевания у данного пациента путем обнаружения присутствия мутации молекулы нуклеиновой кислоты, которая ассоциируется с данным заболеванием.
Для облегчения детекции молекулы нуклеиновой кислоты в описанных выше способах, может быть проведена стадия амплификации, например, с помощью ПЦР.
Делеции и инсерции могут быть детектированы по изменению размера амплифицированного продукта по сравнению с нормальным генотипом. Точечная мутация может быть идентифицирована путем гибридизации амплифицированной ДНК с меченой РНК настоящего изобретения, или альтернативно, с меченной антисмысловой ДНК-последовательностью настоящего изобретения. Полностью соответствующие последовательности могут быть дифференцированы от дуплексов с ошибочным спариванием путем гидролиза РНКазой или путем оценки различий в температурах плавления. Присутствие или отсутствие мутации у пациента может быть определено посредством контактирования ДНК с нуклеиновокислотным зондом, который гибридизуется с ДНК в жестких условиях, в результате чего образуется гибридная двухцепочечная молекула, которая имеет не-гибридизованную часть цепи нуклеиновокислотного зонда в любой области, соответствующей мутации, ассоциированной с заболеванием; и установления присутствия или отсутствия не-гибридизованной части цепи нуклеиновокислотного зонда как показателя наличия или отсутствия ассоциированной с заболеванием мутации в соответствующей области ДНКцепи.
Такие способы диагностики являются особенно ценными для проведения пренатальных и даже неонатальных тестов.
Точечные мутации и другие отличия между последовательностями эталонного гена и мутантных генов могут быть идентифицированы другими хорошо известными методами, такими как прямое секвенирование ДНК или определение конформационного полиформизма одноцепочечных последовательностей (см. Огйа е! а1., Сепотюк, 5, 874-879 (1989)). Так, например, секвенирующий праймер может быть использован вместе двухцепочечным ПЦР-продуктом или с одноцепочечной матричной молекулой, генерированной с помощью модифицированной ПЦР. Определение последовательности осуществляют в соответствии со стандартными методиками с использованием радиоактивно меченых нуклеотидов или в соответствии с методиками автоматического секвенирования с использованием флуоресцентных меток. Клонированные ДНК-сегменты могут быть также использованы в качестве зондов для детекции специфических ДНК-сегментов. Чувствительность этого метода значительно повышается при использовании в комбинации с ПЦР. Кроме того, точечные мутации и другие модификации последовательностей, такие как полиморфизм, могут быть детектированы, как описано выше, например, с использованием аллельспецифических олигонуклеотидов для ПЦР-амплификации последовательностей, отличающихся одним нуклеотидом.
Различия в ДНК-последовательностях могут быть также детектированы по изменениям электрофоретической подвижности ДНК-фрагментов в гелях, в присутствии или в отсутствии денатурирующих агентов, либо путем прямого секвенирования ДНК (например, Муегк е! а1., 8с1епсе (1985) 230:1242). Изменения в конкретных положениях данных последовательностей могут быть также выявлены либо путем проведения анализов на защиту от нуклеазы, таких как анализ на защиту от РНКазы или 81, либо путем химического расщепления (см. СоИоп е! а1., Ριό^ №11. Асаб. 8ск И8А (1985) 85:4397-4401).
Помимо стандартного гель-электрофореза и секвенирования ДНК, мутации, такие как микроделеции, анеуплоидии, транслокации и инверсии, могут быть также детектированы путем проведения анализа 1п кйи (см. например, Ке11ег е! а1., ΌΝΑ Ριτ^κ. 2пб Еб., 8!оск!оп ΡΐΌ88. №\ν Уогк, Ν.Υ., И8А (1993)), т.е. ДНК или РНК-последовательности в клетках могут быть проанализированы на мутации, не прибегая к их выделению и/или иммобилизации на мембране. Гибридизация ш κίΐι,ι с флуоресценцией (ΕΙ8Η) является, в настоящее время, наиболее широко используемым методом, и множество его описаний уже появилось в литературе (см. например, Тгасйиск е! а1., 8с1епсе 250, 559-562 (1990) и Тгакк е! а1., Тгепбк, Сепе!., 7, 149-154 (1991)).
В другом варианте осуществления изобретения для проведения эффективного скрининга генетических вариантов, мутаций и полиморфизма может быть создан массив олигонуклеотидных зондов, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Технология создания массивов хорошо известна, находит широкое применение и может быть использована для решения ряда проблем молеку
- 22 007813 лярной генетики, касающихся экспрессии генов, сцепления генов и генетической изменчивости (см. например, М. Скее е! а1., 8с1епсе (1996) Уо1. 274, рр.610-613).
В одном из вариантов осуществления изобретения такой массив может быть получен и использован в соответствии с методами, описанными в заявке РСТ \УО 95/11995 (Скее е! а1.); Ьосккай Ό.Ε е! а1., (1996) Ыа!. Вю!еск. 14:1675-1680); и 8скета М. е! а1. (1996) Ргос. Ыаб. Асаб. 8οΐ. 93:10614-10619). Олигонуклеотидные пары могут быть использованы в количестве от двух пар до одного миллиона пар. Олигомеры синтезируют в соответствующих участках на субстрате с использованием оптически направленного химического синтеза. Таким субстратом может быть бумага, найлон или мембрана другого типа, фильтр, чип, покровное стекло или любой другой твердый носитель. В другом аспекте настоящего изобретения олигонуклеотид может быть синтезирован на поверхности субстрата с использованием процедуры химического связывания и струйного аппарата для нанесения путем разбрызгивания, как описано в заявке РСТ \УО 95/251116 (Ва1бекскетебег е! а1.). В другом своем аспекте для определения порядка расположения кДНК-фрагментов или олигонуклеотидов на поверхности субстрата и связывания этих фрагментов или олигонуклеотидов с поверхностью субстрата могут быть использованы сетчатые массивы, аналогичные массивам для дот (или слот)-блотов, с использованием вакуумной системы и методов термического, УФ-, механического или химического связывания. Массив, такой как массивы, описанные выше, может быть создан вручную или с использованием подходящих устройств (слот-блот или дотблот-аппарата), материалов (любого твердого носителя) и оборудования (включая роботизированную аппаратуру), и этот массив может содержать 8, 24, 96, 384, 1536 или 6144 олигонуклеотидов, или любое другое число от двух и выше одного миллиона, которое является подходящим для эффективного использования коммерчески доступного оборудования.
Помимо методов, описанных выше, заболевания могут быть диагностированы методами, включающими определение в образце, взятом у индивидуума, аномально низкого или аномально высокого уровня полипептида или мРНК. Для количественной оценки полипептидов, пониженный или повышенный уровень экспрессии может быть измерен на РНК-уровне любыми методами, хорошо известными в данной области, например, путем амплификации нуклеиновых кислот, а именно, с помощью ПЦР или ОТ-ПЦР, путем проведения анализов на защиту от РНКазы, Нозерн-блот-анализов и другими методами гибридизации.
Аналитические методы, которые могут быть использованы для определения уровней полипептида настоящего изобретения в образце, взятом у хозяина, хорошо известны специалистам, и подробно обсуждаются выше (включая радиоиммуноанализы, анализы на конкурентное связывание, Вестерн-блотанализ и ЕЫ8А-анализы). В этом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики, который включает стадии:
(a) контактирования лиганда, описанного выше, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.
Протоколы, такие как ЕЬ18А, РИА и ЕАС8, разработанные для измерения уровней полипептидов, могут быть, кроме того, взяты за основу при определении измененных или аномальных уровней экспрессии полипептида. Нормальные или стандартные значения для экспрессии полипептида получают путем объединения физиологических жидкостей или клеточных экстрактов, взятых у нормальных млекопитающих, предпочтительно у человека, с антителом против полипептида в условиях, подходящих для образования комплекса. Количество образованного стандартного комплекса может быть оценено различными методами, такими как фотометрические методы.
Антитела, которые специфически связываются с полипептидом настоящего изобретения, могут быть использованы для диагностики состояний или заболеваний, характеризующихся экспрессией полипептида, или в анализах для наблюдения за пациентами, которым было проведено лечение полипептидами, молекулами нуклеиновой кислоты, лигандами и другими соединениями настоящего изобретения. Антитела, подходящие для использования в диагностических целях, могут быть получены способом, аналогичным способу, описанному выше для терапии.
Диагностические анализы на присутствие полипептида осуществляют методами, в которых используют антитело и метку для детекции полипептида в физиологических жидкостях или экстрактах клеток или тканей человека. При этом могут быть использованы модифицированные или немодифицированные антитела, и эти антитела могут быть помечены путем их ковалентного или нековалентного связывания с репортерной молекулой. При этом могут быть использованы репортерные молекулы широкого ряда, известные в данной области, и некоторые из них описаны выше.
Количества полипептида, экспрессируемого у индивидуума, в контрольном и зараженном образцах и образце тканей, взятых при биопсии, сравнивают со стандартными величинами. Отклонение величин, полученных для данного индивидуума, от стандартных величин позволяет определить параметры для диагностики заболевания. Диагностический анализ может быть использован для выявления отсутствия, присутствия и избыточной экспрессии полипептида и для мониторинга регуляции уровней полипептида во время терапевтического лечения. Такие анализы могут быть также использованы для оценки эффективности конкретного курса терапевтического лечения при исследовании животных в клинических ис
- 23 007813 пытаниях или для наблюдения за лечением отдельного пациента.
Диагностический набор настоящего изобретения может содержать:
(a) молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения;
(b) полипептид настоящего изобретения или (c) лиганд настоящего изобретения.
В одном из аспектов настоящего изобретения диагностический набор может включать первый контейнер, содержащий нуклеиновокислотный зонд, который гибридизуется в жестких условиях с молекулой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания. Этот набор может, кроме того, включать третий контейнер, содержащий агент для расщепления негибридизованной РНК.
В альтернативном аспекте настоящего изобретения, диагноститический набор может содержать массив молекул нуклеиновой кислоты, по крайней мере одной из которых является молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения.
Для детекции полипептида настоящего изобретения диагностический набор может содержать одно или более антител, связывающихся с полипептидом настоящего изобретения, и реагент, используемый для детекции реакции связывания между антителом и полипептидом.
Такие наборы могут быть использованы для диагностики заболевания или восприимчивости к заболеванию, в частности, для диагностики пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний. В частности, такими заболеваниями являются, но не ограничиваются ими, иммунные расстройства, такие как аутоиммунные заболевания, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительные заболевания, такие как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, ассоциированный с вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз, кожные болезни, болезнь Бехчета, опухолевые заболевания, такие как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина, остеропороз, ожирение, диабет, подагра, сердечно-сосудистые заболевания, реперфузионные поражения, атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сердечная недостаточность, инсульт, заболевание печени, СПИД, СПИДассоциированный комплекс, неврологические расстройства, мужское бесплодие, старение и инфекции, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
Различные аспекты и варианты настоящего изобретения будут более подробно проиллюстрированы на примерах, в частности, для полипептидов ΙΝ8Ρ037.
При этом следует отметить, что в настоящее изобретение могут быть внесены конкретные модификации, не выходящие за объем изобретения.
Краткое описание графического материала
Фиг. 1 - результаты, полученные в результате запроса 8Е0 ΙΌ N0:36 в ШрЬаттабса Оеиоте ТЬтеабет;
фиг. 2 - сопоставление 8Е0 ΙΌ N0:36 с наиболее близкородственной структурой 1прЬаттабса Оепоте ТЬгеабег;
фиг. 3 - предсказанная нуклеотидная последовательность ΙΝ8Ρ037 (содержащая 8Е0 ΙΌ N0:35) с трансляцией (8Е0 ΙΌ N0:36);
фиг. 4 - клонированная нуклеотидная последовательность Ш8Р037 (содержащая 8Е0 ΙΌ N0:35) с трансляцией (8Е0 ΙΌ N0:36), которая продемонстрировала, что предсказанная и клонированная последовательность для Ш8Р037 являются идентичными;
фиг. 5 - карта для Ρ0ΒΙΙ-Τ0Ρ0-ΙΡΑΑΑ44548;
фиг. 6 - карта экспрессирующего вектора рЕАК12б;
фиг. 7 - карта плазмиды р^0NΚ201;
фиг. 8 - карта экспрессирующего вектора ρΕΑΚ126-ΙΡΑΑΑ44548-6ΗΙ8;
фиг. 9 - карта экспрессирующего вектора рЭЕ8Т14 Е.соН;
фиг. 10 - карта плазмиды ρΌΒ8Τ14-ΙΡΑΑΑ44548-6ΗΙ8;
фиг. 11 - нуклеотидная последовательность Ρ0ΚΙΙ-Τ0Ρ0-ΙΡΑΑΑ44548;
фиг. 12 - нуклеотидная последовательность р^Β8Τ14-IΡААА44548-6ΗI8; фиг. 13 - нуклеотидная последовательность рΒАК12^-IΡААА44548-6ΗI8;
фиг. 14 - результаты поиска в базе данных NСΒI-NΚ, полученные для полипептида IN8Ρ037 (8Е0 ΙΌ N0:36), указывают на 100% соответствие и свидетельствуют о том, что IN8Ρ037 является новым;
фиг. 15 - результаты поиска в базе данных NСΒI-тоηίЬ-аа, полученные для полипептида IN8Ρ037
- 24 007813 (ЗЕф ΙΌ №0:36), указывают на 100% соответствие и свидетельствуют о том, что 1№ЗР037 является новым;
фиг. 16 - результаты поиска в базе данных №СВ1-топ1й-п!, полученные для полипептида 1№ЗР037 (ЗЕф 1Б №0:36), указывают на 100% соответствие и свидетельствует о том, что 1№ЗР037 является новым.
Примеры
Пример 1. 1№З5Р037
Полипептидную последовательность, происходящую от ЗЕф 1Б №0:36, которая представляет собой транслируемую последовательность экзонов 1№ЗР037, использовали в качестве запрашиваемой последовательности в программе 1прйагта!юа Сепоте Тйгеабег для поиска белковых структур, присутствующих в базе данных РБВ. Наилучшее соответствие дает структура члена семейства цитокинов, имеющих структуру в виде пучка из четырех спиралей. Последовательность с наилучшим соответствием сопоставляли с запрашиваемой последовательностью с помощью программы Сепоте Тйтеабег с достоверностью 84% (фиг. 1). На фиг. 2 показано сопоставление запрашиваемой последовательности 1№ЗР037 с последовательностью бычьего интерферона-гамма (РБВ-1б9д), т.е. с последовательностью члена семейства цитокинов, имеющих структуру с пучком из четырех спиралей (Рапба1 е! а1., Ас!а СгуйаЛодг Б Вю1 Сгук!а11одг. 2000 1ап; 56 (Р!1):14-24). Следует отметить, что полипептидная последовательность 1№ЗР037 на фиг. 2 обозначена 1РААА445. Члены семейства белков цитокинов, имеющих структуру с пучком из четырех спиралей, обладают ценными терапевтическими свойствами.
1. Клонирование 1РААА4458 из библиотек кДНК
1.1. Библиотеки кДНК
Библиотеки человеческих кДНК (в векторах бактериофага лямбда (λ)) закупали у З1га1адепе или С1оп!ес1 или получали в Научно-исследовательском институте фармакологии Зегопо в векторах λ ΖΆΓ или λ СТ10 в соответствии с протоколом производителей (З!га!адепе). ДНК бактериофага λ получали из лабораторных культур инфицированного штамма-хозяина Е.сой с использованием системы очистки ДНК Χνί/агб ЬатЬба Ргерк в соответствии с инструкциями производителей (Рготеда СогрогаБоп, МабЬоп XVI). Список используемых библиотек и штаммов-хозяев приведен в табл. 1.
1.2. ПЦР предполагаемых кДНК, полученных из фаговой библиотеки ДНК
Полноразмерную предполагаемую кДНК, кодирующую 1РААА44548 (фиг. 3), получали в виде продукта ПЦР-амплификации, состоящего из 264 п. н. (фиг. 4), с использованием геноспецифических клонирующих праймеров (СР1 и СР2, фиг. 3 и табл. II). ПЦР осуществляли в конечном объеме 50 мкл, содержащем 1Х буфер АтрйТад™, 200 мкМ б№ТР, 50 пмоль каждого клонирующего праймера, 2,5 единиц АтрйТад™ (Регкт-Е1тег) и 100 нг каждой фаговой библиотеки ДНК с использованием аппарата М1 Рекеагсй Б№А Епдте с установленной программой, работающей в следующем режиме: 94°С, 1 мин; 40 циклов - 94°С, 1 мин, х°С и у мин, и 72°С (где х означает наименьшую температуру Тт=5°С, а у=1 мин на т.п.н. продукта); и затем 1 цикл - 72°С, 7 мин и цикл выдерживания при 4°С.
Продукты амплификации визуализировали на 0,8% агарозном геле в 1Х буфере ТАЕ (Ьйе Тес1по1од1е5) и ПЦР-продукты, мигрирующие в предполагаемой молекулярной массе, выделяли из геля с использованием системы очистки ДНК ΧνίζηΜ РСР Ргерк Б№А Ршайсайоп Зук!ет (Рготеда). ПЦРпродукты, элюированые в 50 мкл стерильной воды, либо непосредственно субклонировали, либо хранили при -20°С.
1.3. Геноспецифические клонирующие праймеры для ПЦР
Пары ПЦР-праймеров, имеющих длину от 18 до 25 нуклеотидов, конструировали для амплификации полноразмерной последовательности предполагаемой кДНК с использованием программы Рптег Беыдпег Зойгаге (Заепййс & Ебиса1юпа1 Зой^аге, Р0 Вох 72045, Бигйат, №С 27722-2045, ИЗА). ПЦРпраймеры оптимизировали так, чтобы Тт была близка к 55 ± 10°С, и содержание СС составляло 40-60%. Были отобраны праймеры, которые обнаруживали высокую селективность для последовательностимишени 1РААА44548 (низкий уровень или отсутствие неспецифического праймирования).
1.4. Субклонирование ПЦР-продуктов
ПЦР-продукты субклонировали в клонирующий вектор, модифицированный топоизомеразой I (рСКН-Т0Р0) с использованием набора для клонирования ТОРО ТА, закупленного у 1пуйгодеп Согрога!юп (са!. № К4600-01 и К3575-01 соответственно), и с использованием условий, указанных производителем. Кратко, 4 мкл выделенного из геля ПЦР-продукта, полученного в результате амплификации библиотеки последовательностей гипофиза человека (библиотека номер 3), инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре с 1 мкл вектора ТОРО и 1 мкл солевого раствора. Затем реакционную смесь трансформировали в штамм ТОР 10 Е.со11 (1пуйгодеп) следующим образом: 50 мкл-аликвоту клеток 0пе З1о! ТОРО оттаивали на льду и добавляли 2 мкл реакционной смеси ТОРО. Смесь инкубировали в течение 15 ч на льду, затем подвергали тепловому шоку путем инкубирования при 42°С в течение точно 30 с. Затем образцы снова помещали на лед и добавляли 250 мкл теплой среды З0С (при комнатной температуре). Образцы инкубировали со встряхиванием (220 об/мин) в течение 1 ч при 37°С. Затем смесь для трансформации высевали на чашки с Ь-бульоном (ЬВ), содержащие ампициллин (10 мкг/мл), и инкубировали в течение ночи при 37°С. Резистентные к ампициллину колонии, содержащие кДНК-вставки,
- 25 007813 идентифицировали с помощью ПЦР колоний.
1.5. ПЦР колоний
Колонии инокулировали в 50 мкл стерильной воды с использованием стерильной зубочистки. Затем 10 мкл-аликвоту инокулята подвергали ПЦР в общем реакционном объеме 20 мкл, как описано выше, за исключением того, что в качестве пар праймеров использовали 8Ρ6 (5') и Т7. Циклы проводили в следующих условиях: 94°С, 2 мин, 30 циклов при 94°С, 30 с; 47°С, 30 с и 72°С, 1 мин; 1 цикл, 72°С, 7 мин. Затем, перед проведением анализа образцы выдерживали при 4°С (цикл выдерживания).
Продукты ПЦР-реакции анализировали на 1% агарозных гелях в буфере 1Х ТАЕ. Колонии, которые давали ПЦР-продукт предполагаемого размера (264 п.н. -кДНК+187 п.н., что обусловлено присутствием сайта множественного клонирования или МС8), культивировали в течение ночи при 37°С в 5 мл Ьбульона (ЕВ), содержащего ампициллин (50 мкг/мл), со встряхиванием при 220 об./мин при 37°С.
1.6. Получение и секвенирование плазмидной ДНК
Минипрепараты плазмидной ДНК получали из 5 мл культур с использованием роботизированной системы Ц|аргер ТигЬо 9600 (Оищеп) или набора Χνί/агб Ρΐυκ 8У М1шргер (Тготеда са!. № 1460) в соответствии с инструкциями производителей. Плазмидную ДНК элюировали в 100 мкл стерильной воды. Концентрацию ДНК измеряли с использованием фотометра Эппендорфа ВО. Затем плазмидную ДНК (200-500 нг) подвергали секвенированию с использованием праймера Т7 и праймера 8Ρ6 и с использованием системы В1дЦуеТегтта1ог (Αρρ^ά ВюкукЮтк са!. № 4390246) в соответствии с инструкциями производителя. Реакционные смеси для секвенирования очищали на колонках с Эуе-Εχ (О|адеп) или на планшетах для очистки Моп!аде 8ЕЦ 96 (М^11^ρο^е са!. № Ь8К809624) и затем анализировали на секвенаторе Αρρ^ά ВюкукЮтк 3700.
2. Конструирование плазмид для экспрессии ΙΡΑΑΑ44548 в клетках ΗΕΚ293/ΕΒΝΑ
Клон ρί.’ΡΠ-Τ0Ρ0. содержащий полноразмерную кодирующую последовательность (0КР) ΙΡΑΑΑ44548, идентифицированную путем ДНК-секвенирования ДНК (фиг. 5), затем использовали для субклонирования вставки в вектор для экспрессии ρΕΑΚ12ά в клетках млекопитающего (фиг. 6) с использованием методики клонирования Са!е^ау™ Цпуйгодеп). Указанная клонированная последовательность содержала замену одного нуклеотида Α134Ο (фиг. 4).
2.1. Генерирование Са1е\\лу-совместимой 0КР ΙΡΑΑΑ44548, присоединенной к последовательности-метке 6ΗΙ8, с сохранением рамки считывания
Первая стадия способа клонирования Са1е\\гау включает двухстадийную ПЦР-реакцию, которая генерирует 0КР ΙΡΑΑΑ44548, фланкированную у 5'-конца сайтом рекомбинации а!!В1 и последовательностью Козака, и у 3'-конца - последовательностью, кодирующей, с сохранением рамки считывания, 6гистидиновую (6ΗΙ8) метку, стоп-кодоном и сайтом рекомбинации а!!В2 (Са!е^ау-совместимой кДНК). Первая ПЦР-реакционная смесь (в конечном объеме 50 мкл) содержала: 25 нг ρСШI-Τ0Ρ0-IΡΑΑΑ44548 (плазмида 13124 и фиг. 5), 2 мкл άΝΤΡ (5мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера Ρ£χ, 0,5 мкл каждого геноспецифического праймера (100 мкМ) (прямого праймера ЕХ1 и обратного праймера ЕХ1) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Ρ£χ Ρ1а!^ηит Цпуйгодеп). ПЦР-реакцию осуществляли с использованием начальной стадии денатурации при 95°С, 2 мин, с последующим проведением 12 циклов при 94°С, 15 с, и 68°С, 30 с. ПЦР-продукты очищали непосредственно из реакционной смеси с использованием системы очистки ДНК ΧνίζπΓά Ρί,Έ ΡΐΌρ (Гготеда) в соответствии с инструкциями производителей. Вторая ПЦРреакционная смесь (в конечном объеме 50 мкл) содержала: 10 мкл очищенного ПЦР-продукта, 2 мкл άΝΤΡ (5 мМ), 5 мкл 10Х полимеразного буфера Ρ£χ, 0,5 мкл каждого праймера для конверсии Са1е\уау (100 мкМ) (прямого праймера 6СΡ и обратного праймера 6СΡ) и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Ρ£χ Ρ1аΐ^ηит. Вторую ПЦР-реакцию осуществляли в следующих условиях: 95°С, 1 мин, 4 цикла при 94°С, 15 с; 45°С, 30 с и 68°С, 3,5 мин; 25 циклов при 94°С, 15 с; 55°С, 30 с и 68°С, 3,5 мин. ПЦР-продукты очищали, как описано выше.
Альтернативно, для экспрессии ΙΡΑΑΑ44548 в Ε^ΐί, генерировали 0КР, которая содержала последовательность Шайна-Дальгарно, расположенную выше инициирующего метионинового кодона, с использованием геноспецифических праймеров (прямого праймера ЕХЗ и обратного праймера ЕХ2) в первой ПЦР, и праймеров ОСТЕ и ОСТР в условиях, описанных выше. Полученный ПЦР-продукт обозначали 8Ό-ΙΡΑΑΑ44548.
2.2. Субклонирование Са1е\\лу -совместимой 0КР ΙΡΑΑΑ44548 во встраивающий вектор ρΌ0ΝΚ201 Са1е\\лу и экспрессирующий вектор ρΕΑΚ12ά
Вторая стадия способа клонирования Са1е\\лу включает субклонирование Са1е\\лумодифицированного ПЦР-продукта во встраивающий вектор ρΌ0ΝΚ201 Са1е\\лу Цпуйгодеп, фиг. 7), которое осуществляли следующим образом: 5 мкл очищенного ПЦР-продукта инкубировали с 1,5 мкл вектора ρΌ0ΝΒ201 (0,1 мкг/мкл), 2 мкл буфера ВР и 1,5 мкл клоназной ферментной смеси ВР Цпуйгодеп) при комнатной температуре в течение 1 ч.
Реакцию прекращали добавлением протеиназы Κ (2 мкг) и инкубировали при 37°С еще 10 мин. Аликвоту реакционной смеси (2 мкл) трансформировали в клетки ЦШ0В Б.сок путем электропорации с использованием импульсного устройства Вюгаб Оепе ΡιιΙί^Γ. Трансформанты высевали на ЬВ-планшеты с канамицином. Плазмидный минипрепарат ДНК (М^η^-ρ^еρ) приготавливали из 1-4 полученных колоний
- 26 007813 с использованием набора Αι/агб Р1ик 8ν М1шргерк (Рготеда) и затем 1,5 мкл плазмидного элюата использовали в реакционной смеси для рекомбинации, содержащей 1,5 мкл вектора рЕАК12б (фиг. 6) (0,1 мкг/мл), 2 мкл буфера БК и 1,5 мкл клоназы БК (Гпуйгодеп) в конечном объеме 10 мкл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем реакцию прекращали добавлением протеиназы К (2 мкг) и смесь инкубировали при 37°С в течение еще 10 мин. Аликвоту реакционной смеси (1 мкл) использовали для трансформации клеток ЭН10Б Е.сой путем электропорации.
Клоны, содержащие правильную вставку, идентифицировали путем проведения ПЦР колоний, как описано выше, за исключением того, что для этой ПЦР использовали праймеры рЕАК12б (рЕАК12б Е и рЕАК12б К). Плазмидный минипрепарат ДНК выделяли из клонов, содержащих правильную вставку, с использованием роботизированной системы 01аргер ТигЬо 9600 (Р1адеп) или вручную с использованием набора Αι/агб Р1ик 8ν М1шргер (Рготеда) и последовательность подтверждали с использованием праймеров рЕАК12б Е и рЕАК12б К.
Очищенный в градиенте СкС1 максипрепарат ДНК плазмиды рЕАК12б-1РААА44548-6Н18 (плазмида ГО номер 112775, фиг. 8) получали из 500 мл культуры клонов с подтвержденной последовательностью (8атЬгоок, I. е! а1., Мо1еси1аг С1опт§: А БаЬога1огу Мапиа1, 2пб есШюп, 1989, Сок! 8рппц НагЬог БаЬога1огу Ргекк), ресуспендировали при концентрации 1 мкг/мл в стерильной воде и хранили при -20°С.
2.3. Субклонирование Са1етеау-совместимой ОКЕ 8О-ГРААА44548 во встраивающий вектор рООИК201 Са1етеау и экспрессирующий вектор рБЕ8Т14 Е.сой
Са1етеау-совместимую ОКЕ 8О-ГРААА44548, содержащую в той же рамке считывания последовательность, кодирующую 3'-6Н18-метку, и последовательность Шайна-Дальгарно, расположенную у 5'конца, субклонировали в р^ОNК201 с использованием клоназы ВР. Затем полученную плазмиду использовали в реакции рекомбинации с экспрессирующим вектором рОЕ8Т14 Е.сой (закупленным у ГпуЦгодеп, фиг. 9) с использованием клоназы БК, как описано выше. Полученная экспрессионная плазмида (рОЕ8Т14-ГРААА44548-6Н18) (фиг. 10, плазмида ГО 12896) представляла собой последовательность, подтвержденную, как описано выше. Для экспрессии в Е.сой, СкС1-очищенный максипрепарат ДНК снова трансформировали в штамм-хозяин ВБ21 Е.сой. Экспрессию встроенной кДНК осуществляли под контролем промотора Т7.
2.4. Конструирование экспрессирующего вектора рЕАК12б
Вектор рЕАК12б представляет собой совместимый с системой клонирования Са1етеау вариант вектора рЕАК12 для экспрессии в клетках млекопитающих (закупленного у Ебде Вюкук1етк), в котором нужную кДНК экспрессировали под контролем человеческого промотора ЕЕ1а. Вектор рЕАК12б генерировали, как описано ниже:
рЕАК12 расщепляли рестриктирующими ферментами НтбШ и ΝθΐΙ, затупляли по концам фрагментом Кленова (\'е\у Епд1апб Вю1аЬк) и дефосфорилировали с использованием щелочной фосфатазы кишечника теленка (Кос1е). После дефосфорилирования вектор лигировали, с сохранением рамки считывания, с затупленным по концам кластером С Са1етеау (система конверсии вектора Са1етеау, Гпуйгодеп, са1. № 11828-019), который содержит сайты рекомбинации АПК, фланкирующие ген ссбВ и ген резистентности к хлорамфениколу, и трансформировали в клетки ΏΒ3.1 Е.сой (которые обеспечивают амплификацию векторов, содержащих ген ссбВ). Минипрепарат ДНК выделяли из нескольких полученных колоний с использованием набора Αι/агб Р1ик 8ν М1шргер (Рготеда) и расщепляли ферментами Аке1/ЕсоК1 для идентификации клонов с получением фрагмента длиной 670 п.н., что указывало на то, что кластер был встроен в правильной ориентации. Полученная плазмида была обозначена рЕАК12б (фиг. 6).
3. Идентификация кДНК-библиотек, содержащих ГРААА44548 ПЦР-продукты, полученные с использованием СР1 и СР2 и мигрирующие при правильном размере (264 п.н.), идентифицировали в библиотеках 3, 8 и 12 (для гипофиза, коры головного мозга и почки плода, соответственно).
Таблица I Библиотеки кДНК человека
Библиотека Источник ткани/клетки Ёектор Штамм- хозяин Поставщик . № в каталоге
1 Головной мозг плода человека йар 11 ХБ1- В1ие МКГ’ БСгаСадепе 936206
- 27 007813
2 Яичник человека СТЮ ЬЕ392 С1опТесЬ НЫ098а
3 Гипофиз человека СТЮ ЬЕ392 С1опРесЬ НЫ097а
4 Плацента человека СТ11 ЪЕ392 С1оп£есЬ НЫ075Р
5 Яички человека СТ11 ЬЕ392 С1опРесЪ НЫОЮЬ
6 Черное вещество человеки СТЮ ΣΕ392 Получено авторами
7 Головной мозг плода человека СТЮ ГЕ392 Получено авторами
8 Кора головного мозга человека СТЮ ГЕ392 Получено авторами
9 Толстая кишка человека СТЮ ΣΕ392 С1опТесЬ НЫ034а
10 Головной мозг плода человека СТЮ ЬЕ392 СТопбесЬ НЬ1065а
11 Легкие плода человека СТЮ ЪЕ392 С1опбесН НЪ1072а
12 Почки плода человека СТЮ ΣΕ392 С1опТесН НЫ071а
13 Печень плода человека СТЮ ЬЕ392 С1опРесН НЫ064а
14 Костный мозг человека СТЮ ΣΕ392 сюпресь НЪ1058а
15 Моноциты периферической крови человека СТЮ ЬЕ392 С1опбесН НЬ1050а
16 Плацента человека СТЮ ГЕ392 Получено авторами
17 3Η3Υ3Υ человека СТЮ ЬЕ392 Получено авторами
18 Человеческая клеточная линия и373 СТЮ ЬЕ392 Получено авторами
19 Человеческая клеточная линия СЕРос-1 ϋηϊ 2 ар хы- Ё1ие МК.Г* ЗТгаТадепе 936206
20 Сетчатка глаза человека СТЮ ЬЕ392 С1опбесН НЛ1132а
21 Мочевой пузырь человека СТЮ ЪЕ392 Получено авторами
22 Человеческие тромбоциты υηί Ζβρ ХЬ1- В1ие МЕЕ' Получено авторами
23 Человеческая нейробластома Кап+ТЗ СТЮ ЬЕ392 Получено авторами
24 Гладкая мышца бронхов человека СТ10 ГЕ392 Получено авторами
25 Гладкая мышца бронхов человека СТЮ ГЕ392 Получено авторами
- 28 007813
26 Тимус человека СТЮ ЬЕ392 С1оп-ЬесЬ НЬ1127а
27 5'-фрагмент селезенки человека СТ11 ГЕ392 С1опкесН НЪ1134Ь
28 Моноциты периферической крови человека СТЮ ЪЕ392 С1опкесЬ НЫ050а
29 Яички человека СТЮ ЬЕ392 С1опкесЬ НЫ065а
30 Головной МОЗГ плода человека СТЮ ЬЕ392 С1опРесЬ НЫ065а
31 Черное вещество человека СТЮ ЬЕ392 С1опБесН НЫОЭЗа
32 Плацента человека #11 СТ11 1>Е392 С1опРес11 НЫ075а
33 Головной мозг плода человека СТЮ ЬЕ392 С1опкесН Сделано по заказу
34 Плацента человека #59 СТЮ ЬЕ392 С1оп1:есН НЪ5014а
35 Гипофиз человека СТЮ ЪЕ392 СТопРесЬ НЫ097а
36 Поджелудочная железа человека #63 υηϊ гар хк ХЬ1В1ие МНЕ' Зкгакадепе 937208
37 Плацента ~ _ л-1 п # X 27 СТ11 ЪЕ392 С1опкесН НЫ008
38 5'-фрагмент печени человека СТ11 ЬЕ392 С1опкес11 НЪ1115Ь
39 Человеческая матка гарему хк ХЪ1ВЮе МКГ' Зкгакадепе 980207
40 кДНК-библиотека крупных вставок почки человека Тг1р1Е х2 ХЪ1- В1ие С1опкесИ НЬ5507и
Таблица II
Праймеры для клонирования 1РААА4 4548
Праймер Название Последовательность (5'->3' ) Положение Тт °С % СС
СР1 2С5 прямой ОСА ТСА АСА АСА ТСС АСТ АА ’ 28 58 40
СР2 2С6 обратный САТ ТСТ ААА СТС ТСС САТ СТ 291С 57 40
Таблица III
Праймеры для субклонирования и секвенирования ЩААА44548
Праймер Название Последовательность (5'—>3')
ССР прямой 1-С1 аРЕВ1-К С ССС АСА ЛСТ ТТС ТЛС ЛАЛ АЛЛ ССА ССС ТТС ССС АСС
ССР обратный 22АЗ аЮВ2-зкор- ΗΪ36-Κ ССС САС САС ТТТ СТА САА САА АСС ТСС СТТ ТСА АТС СТС АТС СТС АТС СТС
- 29 007813
ССР-50 прямой ΙΙΙ-Α1 а£ЕВ1- Шайна-Дальгарно- Р а аса аса аст ттс тас ааа ааа ССА ССС ТТС СААаОСА'ЦА
ЕХ1 прямой 32А5 а£±В1р- ΙΡΑΑΑ44548-1Ε ССА ССС ТТС ССС АСС АТС АСТ ТСА ССА ААС САА СТА А
ЕХ2 обратный 32А8 ΙΡΑΑΑ44548- Нбр-234В ста атс ста атс ста аас тст ссс АТС ТСС АТТ ТСТ
υν Ъ 1_|АЭ прямой Т Т _ Т О А Λ С /1 О Шайна-Дальгарно1Г 7\ -7\ 7Х Γ'Γ'ΊΚ Г'Г'Г' гр гр/*4 /’/'П /»Λ ГП ΤΚΤί -Ά ΆΆΆ ЧДЧ7Ч-, X ± ОНА кЗкЛА ЧЛАХ А1А САТ АТС АСТ ТСА ССА ААС САА СТ
рЕАК12-Г 32ϋ1 ССС АСС ТТС ССА СТТ САТ СТ
рЕАК12-Р 3202 САТ ССА ССТ ССА ССТ СТС АС
8Р6 АТТ ТАС СТС АСА СТА ТАС
Т7 ТАА ТАС САС ТСА СТА ТАС СС .
рОЕ5Т14-К . ТСС САС САС ССА АСТ САС СТТ .
Подчеркнутая последовательность = последовательность Козака
Последовательность, обозначенная жирным шрифтом = стоп-кодон
Последовательность, обозначенная курсивом = метка Н18
Последовательность в затененной рамке = последовательность Шайна-Дальгарно (сайт связывания с рибосомой).
4. Экспрессия клонированных IΡΑΑΑ44548-8-6НI8 в клетках млекопитающих (плазмида № 12118)
4.1. Культура клеток
Клетки почек эмбриона человека 293, экспрессирующие ядерный антиген вируса Эпштейна Барра (ΗΕΚ293-ΕΒΝΑ, Iην^ΐ^одеη), поддерживали в суспензии бессывороточной среды Ех-клеток УРКО (посевной материал, поддерживающая среда, ЖН). За 16-20 ч до трансфекции (день 1) клетки высевали во флаконы с 2х Т225 (50 мл на флакон в среде ΌΜΕΜ/Ε12 (1:1)), содержащие посевную среду с 2% РВ8 (ЖН), при плотности 2х105 клеток/мл). На следующий день (день трансфекции 0) осуществляли трансфекцию с использованием реагента ^РЕТ™ (2 мкл/мкг плазмидной ДНК, Ро1уР1и8-трансфекция). Для каждого флакона, 113 мкг плазмиды (№ 12118) совместно трансфецировали 2,3 мкг ОГР (флуоресцентного репортерного гена). Затем смесь для трансфекции добавляли во флаконы с 2х Т225 и инкубировали при 37°С (5% СО2) в течение 6 дней.
Подтверждение позитивной трансфекции проводили путем качественной оценки флуоресценции на день 1 и на день 6 (Ахюуег! 10 /е188).
На 6-й день (день сбора) супернатанты (100 мл) из двух флаконов объединяли и центрифугировали (4°С, 400 г) и затем помещали в сосуд, содержащий уникальный идентификатор.
Одну аликвоту (500 мкл) оставляли для проведения количественной оценки (ОС) 6хН18-меченного белка (ОС внутреннего биопроцессинга).
Крупномасштабные партии получали в соответствии с протоколом под названием РЕЕ трансфекция суспензионных клеток, описанным в литературе под кодовым названием ВΡ/ΡΕI/НН/02/04, с использованием полиэтиленамина от Ро1у8с1епсе8, используемого в качестве агента для трансфекции.
В этом протоколе использовали следующие количества реагентов:
Для 400 мл-центрифуги: клетки 1Е6 11ек293ЕВ\А/мл в 200 мл ГЕМЕ, 1% ГВ8,
400 мкг плазмиды № 12118 разводили в 10 мл 1% среды ГЕМЕ и добавляли 800 мкг Р13; через 90 мин после трансфекции добавляли 1% среду ГЕМЕ до общего объема 400 мл. Центрифугу оставляли в сосуде с культурой на 6 дней до сбора культуры.
4.2. Способ очистки
Образец культуральной среды (100 или 400 мл), содержащей рекомбинантный белок с С-концевой меткой 6Н18, разводили одним объемом холодного буфера А (50 мМ №Н2РО4; 600 мМ №С1; 8,7% (мас./об.) глицерина, рН 7,5) до конечного объема 200 и 800 мл, соответственно. Образец фильтровали через стерильный фильтр 0,22 мкм (Мййроге, 500 мл-фильтровальное устройство) и выдерживали при 4°С в стерильном квадратном сосуде со средой (Халепе).
Очистку осуществляли при 4°С на рабочей станции Υ^ΟΝ (Аррйеб Вю8у81ет8), подсоединенной к автоматическому устройству для загрузки образцов (ЕаЬотайс). Процедура очистки состояла из двух последовательных стадий, т.е. сначала проводили металлоаффинную хроматографию на колонке с Рого8 20 МС (Аррйеб Вю8у81ет8), загруженной ионами Νί (4,6x50 мм, 0,83 мл), и затем проводили гельфильтрацию на колонке (1,0x10 см) со средой, содержащей сефадекс О-25 (Атегайат Рйагтата).
Для проведения первой стадии хроматографии, металлоаффинную колонку регенерировали 30 колоночными объемами раствора ЕОТА (100 мМ Е.1УЕА; 1 М №С1; рН 8,0), снова загружали ионы металла путем промывки 15 колоночными объемами 100 мМ раствора Νΐ8Ο4, после чего промывали 10 колоночными объемами буфера А, затем промывали 7 колоночными объемами буфера В (50 мМ №Н2РО4; 600 мМ №С1; 8,7% (мас./об.) глицерин, 400 мМ имидазол; рН 7,5) и, наконец, уравновешивали 15 колоноч
- 30 007813 ными объемами буфера А, содержащего 15 мМ имидазола. Образец переносили с помощью устройства для загрузки образцов ЬаЬотабс в 200 мл-петлю для образца и затем загружали на аффинную колонку с металлическим N1 при скорости потока 10 мл/мин. В случае использования большего количества образца, 400 мл, процедуру переноса и загрузки повторяли 4 раза. После этого колонку промывали 12 колоночными объемами буфера А и затем 28 колоночными объемами буфера А, содержащего 20 мМ имидазола. Во время промывки 20 мМ имидазолом слабо связанные примесные белки элюировались с колонки. И, наконец, рекомбинантный Ηίκ-меченный белок элюировали 10 колоночными объемами буфера В при скорости потока 2 мл/мин и элюированный белок собирали в 1,6 мл-фракции.
Для проведения второй стадии хроматографии гель-фильтрационную колонку с сефадексом С-25 регенерировали 2 мл буфера Ό (1,137 М №аС1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ КН2РО4; 8 мМ NаΗ2РΟ4; рН 7,2), а затем уравновешивали 4 колоночными объемами буфера С (137 мМ №аС1, 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ КН2РО4; 8 мМ №12НРО4; 20% (мас./об.) глицерин; рН 7,4). Фракции пиков, элюированные с Νί-колонки, автоматически пропускали через многофункциональное устройство для загрузки образцов, подсоединенное к рабочей станции νΐδΙΟΝ, загружали в колонку с сефадексом С-25 и затем белок элюировали буфером С при скорости потока 2 мл/мин. Обессоленный образец собирали в 2,2 мл-фракцию. Эту фракцию фильтровали через стерильный центрифужный фильтр 0,22 мкм (М1Шроге), замораживали и хранили при 80°С. Аликвоту образца анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ (в 4-12% геле NиРАСЕ; №охех) путем окрашивания кумасси и Вестерн-блоттинга с использованием анти-Ηίκ антител.
Окрашивание кумасси. Гель NиРАСЕ окрашивали в растворе для окрашивания, содержащем 0,1% кумасси синего К250 (30% метанол, 10% уксусная кислота), при комнатной температуре в течение 1 ч и затем обесцвечивали в 20% метаноле, 7,5% уксусной кислоте до тех пор, пока фон не становился прозрачным, а полосы белка - видимыми.
Вестерн-блоттинг. После электрофореза белки подвергали электрофоретическому переносу из геля на нитрицеллюлозную мембрану при 290 мА в течение 1 ч при 4°С. Мембрану блокировали 5% сухим молоком в буфере Е (137 мМ №аС1; 2,7 мМ КС1; 1,5 мМ КН2рО4; 8 мМ №-ьНРО4; 0,1% твина 20, рН 7,4) в течение 1 ч при комнатной температуре и затем инкубировали со смесью 2 кроличьих поликлональных анти-Ηίκ антител (С-18 и Н-15, 0,2 мгк/мл каждого; 8ап1а Сгих) в 2,5% сухом молоке в буфере Е в течение ночи при 4°С. После инкубирования в течение еще 1 ч при комнатной температуре, мембрану промывали буфером Е (3x10 мин) и затем инкубировали со вторым ПХ-конъюгированным антикроличьем антителом (ЭАКО, НКР 0399), разведенным 1/3000 в буфере Е, содержащем 2,5% сухое молоко, в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки буфера Е (3x10 мин) мембрану проявляли в течение 1 мин с помощью ЭХЛ-набора (АтегкБат РБагтааа). Затем мембрану экспонировали с пленкой НурегГйт (АтегкБат РБагтааа), пленку проявляли и снимок вестерн-блота визуально анализировали.
Анализ на белок. Концентрацию белка в образцах определяли с использованием набора для анализа на белок ВСА (Р1егсе), содержащего альбумин бычьей сыворотки в качестве стандарта, и после окрашивания кумасси обнаруживали детектируемые полосы белка.
4.3. Экспрессия 1РААА44548-8ЕС-6Н18 в бактериальных клетках (плазмида № 12896)
Ниже описан способ, в котором для продуцирования белка использовали бактериальный штамм ВЬ-21 ΌΕ3 Е.сой. ВЬ21 ΌΕ3 представляет собой часть систем экспрессии на основе РНК-полимеразы Т7, широко используемых для сверхэкспрессии рекомбинантных белков.
4.4. Трансформация бактериального штамма ВЬ-21 (ΌΕ3):
Была использована методика Т88-метода, протокол которой был взят у Сйипд СТ. е1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8οΐ. И8А (1989) 86:2172-2175.
Для проведения Т88-метода 10-100 нг ДНК (2 мкл) рекомбинантной плазмиды № 12896 добавляли к компетентным клеткам ВЬ21 и помещали на 20 мин на лед. Затем добавляли среду 8ОС (0,8 мл) и пробирку инкубировали при 37°С, 200 об./мин в течение 1 ч. Из этой культуры отбирали 20 мкл и 200 мклобразцов и засевали на ЬВ-чашки, содержащие ампициллин (конечная концентрация 40 мкг/мл), и затем оставляли на ночь при 37°С.
На следующий день выделяли 3 колонии, которые использовали для приготовления глицериновых маточных растворов, тестировали на экспрессию в экспериментах, проводимых в шейкерных колбах, после чего культуру переносили в ферментер (одну из трех колоний выбирали для крупномасштабного культивирования, поскольку все они были одинаково приготовлены в шейкерных колбах).
4.5. Получение посевного материала для длительного хранения рекомбинантного штамма Е.сой мл-пробирку, содержащую ЬВ-среду с 40 мкг/мл ампициллина (конечная концентрация), инокулировали моноколонией, взятой из чашки со свежей агаровой средой. Бактерии культивировали в течение ночи при 37°С, 200 об/мин. На следующее утро брали 50 мкл-образцы ночной культуры для инокуляции 5 мл пробирки со свежей ЬВ-средой (+антибиотики) и инкубировали в течение 2-3 ч при 37°С, 200 об/мин для доведения бактерий до экспоненциальной фазы роста.
Затем в культуру добавляли 5 мл 20% глицерина и содержимое смешивали. Затем 1,5 мл разливали пипеткой в каждый из 5 сосудов, находящихся в криогенных условиях и содержащих посевной материал, хранимый при -80°С (внутренний глицериновый маточный раствор).
- 31 007813
4.6. Экспрессия в 5-литровом масштабе:
Рекомбинантный штамм размножали в 5-литровом перемешиваемом реакторе Вю1айИе (рабочий реактор, содержащий 5 л среды ЕСРМ 1 (имеющей состав, указанный в табл. IV), содержащей соответствующий антибиотик (в конечной концентрации 40 мкг/мл)) и 0,5% глюкозы во избежание преждевременного индуцирования промотора Т7. При этом получали только опытную партию 2464, которую затем подвергали очистке.
Инокулят получали в 500 миллилитровой шейкерной колбе с ЬВ-средой (+ антибиотики, 0,5% глюкоза) с использованием бактерий, взятых из одной петли замороженных бактерий (снятые путем соскоба с одного сосуда с глицериновым маточным раствором) и культивировали в течение 9 ч, после чего проводили автоматическую инокуляцию. Когда клетки достигали ΘΌ 10 (обычно после 7-9-часового роста), продуцирование белка индуцировали 1РТС в конечной концентрации 1 мМ. Индуцирование осуществляли в течение 3 ч.
На протяжении всего процесса роста и индуцирования, в ферментере поддерживали следующие условия: 50% концентрация растворенного кислорода, 300-700 об/мин в зависимости от рО2, рН 7,0. рО2 поддерживали путем барботирования воздухом +/-О2 при 25 мл/мин. 5 мл образца вводили через каждый час и оптическую плотность измеряли при 600 нм.
Клетки собирали и центрифугировали при 400 об/мин (8огуа11 КС 3В). Осадок замораживали при -20°С и хранили до проведения следующей обработки.
Присутствие белка в клеточных экстрактах оценивали путем окрашивания кумасси ПААГ-геля с ДСН.
Таблица IV Состав ЕСРМ1
Компонент Источник Комментарии КбНЦ. Ееинищ Ог^ил. Тип
СаС12.2Н2 ЗТОСК Маточный раствор=1,32 10 мл/л НТ Основной
САЗ.АА Згдта Ферментативн ый 20 г/л НТ Основной
СЪУСЕКО 0, 87 Или безводный 46 г/л НТ Основной
К2НРО4 ЗТОСК Маточный раствор=400 10 мл/л НТ Основной
К23О4 ЗТОСК Маточный раствор=104 22,7 мл/л НТ Основной
КН2РО4 ЗТОСК Маточный раствор=100 10 мл/л НТ Основной
МдС12.6Н2 Маточный раствор Маточный раствор=1М 2 мл/л ΓΙ Вспомога тельный
ΝΗ4Ο1 ЗТОСК Маточный раствор=100 10 мл/л НТ Основной
Микроэлем енты Маточный раствор Состав маточного раствора 10 мл/л НТ Основной
Υ.Ε ϋίίοο 3 г/л НТ Основной
Было добавлено несколько капель противовспенивателя РРС Р2000.
Таблица V
Микроэлементы
Компонент Комментарии Концентрац ИЯ Едини цы Стериль ность Тип
Молибдат аммония РН доводили до 7-8 0, 01 г/л НТ Основной
0θ(Ν03)26Η Ω/Λ 0,01 г/л нт Основной
СиС12 2Н2О 0,01 г/л нт Основной
ΕΌΤΑ Растворяли в 5 г/л НТ Основной
ЕеС13 6Н2О 0,5 г/л ΕΙ Основной
ΖηΟ 0,05 г/л НТ Основной
Каждый элемент отдельно растворяли в НС1.
- 32 007813
4.7. Способ очистки г замороженной бактериальной пасты суспендировали в 270 мл буфера А (50 мМ \а1 ΠΡΟ.μ 600 мМ №С1, 1 мМ ΡΜ8Р, 1 мМ бензамидина, 8,7% (мас/об) глицерина, рН 7,5), в который была добавлена 1 таблетка полного набора ингибиторов протеазы, не содержащего ЕЭТА (Косйе)/50 мл. Бактерии подвергали лизису путем двухкратного пропускания через устройство для дизрупции клеток Ζ-ρ1πδ (Сопз!ап! Се11 П18гирйоп 8у8!етз), работающего под давлением 1300 бар.
Затем образец центрифугировали при 36000хд в течение 30 мин. Затем на колонку с №-ЫТАагарозой (2,5х3,0 см), уравновешенную в буфере А, загружали супернатант (300 мл) при скорости потока 4 мл/мин.
Колонку промывали 100 мл буфера А, затем 85 мл 20 мМ имидазола в буфере А. Белки элюировали 300 мл линейного градиента 20-250 мМ имидазола в буфере А при скорости потока 3 мл/мин и затем собирали 7,5 мл-фракции. Образец каждой второй фракции разводили 1/6 в буфере для образца с восстанавливающим ДСН, загружали в количестве 15 мкл/лунка в 4-12% гель УиГаде ^оуех) и после проведения электрофореза гель окрашивали кумасси синим.
Фракции с самой высокой концентрацией IΡΑΑΑ44548 (фракции 36-42) объединяли, и их общий объем составлял 53 мл (пул Ν1). Фракции с обеих сторон пула Ν1 с более низкой чистотой и концентрацией (фракции 32-35 + 43-44) объединяли в пул Ν2 с объемом 44 мл.
Пулы, полученные с Νί-колонки, дополнительно очищали на колонке с Р-сефарозой Раз! Р1ош, (1,5x12 см), уравновешенной в буфере В (50 мМ Трис-НС1, 1 мМ бензамидина, рН 7,5). 52 мл пула Ν1 разводили 300 мл буфера В и 648 мл Н20 до конечного объема 1000 мл. Образец загружали на колонку при скорости потока 5 мл/мин, колонку промывали 150 мл буфера В и белки элюировали 160 мл линейного градиента 0-400 мМ NаС1 в буфере В. Фракции, 2 мл, собирали и анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси, как описано выше. Фракции 28-30 (пул Р1) содержали одну полосу белка с ожидаемой молекулярной массой 9,6 кДа. Фракции 31-33 (пул Р2), кроме того, содержали полосу-белка с молекулярной массой приблизительно 20 кДа, что указывало на образование димера.
мл пула Ν2, полученного с Νί-колонки, разводили 300 мл буфера В и 657 мл Н20 до объема 1000 мл. Образец загружали на колонку с Р-сефарозой, белок элюировали и фракции анализировали, как было описано для пула Ν1. Фракции 28-30 (пул Р3) содержали одну полосу белка с ожидаемой молекулярной массой 9,6 кДа. Каждый Р-пул имел объем 5,5 мл.
Пулы, полученные из колонки с Р-сефарозой, пропускали через гель-фильтрационную колонку с сефадексом О75 (НгБоаб 16/60, Ρйа^тас^а). Колонку промывали 0,5М \а011 и уравновешивали в ΡВ8. Прогон осуществляли при скорости потока 1 мл/мин и в колонку загружали 5 мл пулов. 2 мл-фракции собирали и анализировали в геле, окрашенном кумасси после электрофореза в ДСН-ПААГ, как описано выше.
IΡΑΑΑ44548 из пула Р1 элюировался во фракциях 31-35 (9,5 мл) (81), белок из пула О- элюировался в двух пиках во фракциях 31-34 (7,5 мл) (82) и во фракциях 26-28 (5,8 мл) (83), а белок из пула 03 элюировался во фракциях 32-35 (7,5 мл) (84). Анализ пула 83 на невосстанавливающем ДСН-ПААГ показал, что этот пул содержал более чем 80% белка в виде димеров, тогда как другие пулы содержали лишь следовые количества таких димеров. Пулы 81 и 82 имели сравнимую чистоту и концентрацию, и были собраны в один пул 81Ь (9,5+7,5=17 мл).
Концентрации белка определяли путем измерения поглощения при 280 нм с использованием вычисленного молярного коэффициента экстинкции 7090 и молекулярной массы 9625. Было обнаружено, что молекулярная масса указанного белка в пулах 81Ь и 84, как было определено с помощью массспектрометрии, составляла 9624,6. Было также определено, что молекулярная масса в пуле 83 составляла 19252,2, что свидетельствовало о присутствии в этом пуле димеров с дисульфидным мостиком. Пулы анализировали на ЛПС, и их содержание составляло 1,1 и 3,4 ед./мг.
Краткое описание очищенных пулов
Пул Концентрация Общее количество Номер
партии
Пул 51Ь 2,1 мг/мл 35,7 мг 2
Пул 53 1,7 мг/мл 9, 8 мг 3
Пул 54 0,95 мг/мл 7,1 мг б
Было выделено всего 52 мг чистого белка или 0,77 мг/г бактериальной пасты. Все три пула имели чистоту свыше 97%, как было определено с помощью ОФ-ВЭЖХ.
- 33 007813
Список последовательностей
ЗЕ<2 Ю N0:35 (нуклеотидная последовательность ΙΝ3Ρ037)
1 АТСАСТТСАС САААС6ААСТ АААТАА6СТ6 ССАТ6САССА АТССТ6САСА
51 ААСАСАСАТА ТСТСАССТТТ САОАСАСАСА АТТСААААТА ТСТ6Т6ТТ6А
101 АСААССТСАА А6АААТТСАА САТААСАСА6 А6АА66ААТС САОААТТСТА
1 4Ί ФГППЛПАЛ1Ф ЛФААСЯДАГЛ ЛФЛ5П1ПЛХЛП
Л и Л А X П. X ПЛМГЮПЪП ΧΙΓΧ X X игшг&х η Λ X Л Г1ГЧП<Л53\ЗГЖ η. X
201 ААТТСТ66А6 ТТСА6АААТ6 СА6АТ66САС АСТТТА6
3Εζ) Ιϋ N0:36 (последовательность белка ΙΝ3Ρ037)
МТЭРЫЕБИКЬ ΡΗΤΝΡ6ΕΤΕΙ С0ЪЗЕ)ТЕЕК1 ЗУЬКЫЬКЕЮ МЯТЕКЕЗМЬ δϋΚΥΚΚΟΙΕΙ' ΙΚ6Ν0ΑΕΙΙ.Ε ЬШИАОбТЪ
Другими заболеваниями являются меланомы с метастазами (Уа1кйатрауап и., С1т Сапсег Кек. 2002 Оес:8(12):3696-701), хронический гепатит (8етт Б1уег Όΐκ 2002:22 8ирр1 1:7), заболевания, ассоциированные с нарушением противомикробого иммунитета (Водйап, Сиггеп! Ортюп т 1ттипо1оду 2000, 12:419-424), ВИЧ-инфекции (Пегеиййге-Вокдие! Ν. е! а1., I. Лсс]ии 1ттипе Эейс. 8упйг. Нит. Ке!гоую1. 1996 Маг 1:11(3):241-6), раковые заболевания человека и вирусные заболевания (РГеГГег Б.М., 8етт Опсо1. 1997 ,Ιιιιι 24:89-63-69), болезнь Пейрони (Басу е! а1., 1п!. I. 1тро!. Кек. 2002, Ос!. 14(5):336-9), туберкулез (П1е11 е! а1., I. 1пГес!. Э1к. 2002, Оес.15;186(12):1835-9), хроническое заболевание легких (Ое1 I. е! а1., Ас!а Раей1а!г. 2002:91(11):1194-9), острый и хронический периодонтит (Ооп/а1ек БК. е! а1., I. сйп. Репойоп!о1 2002 8ер. 29(9):816-22), псориаз (К1тЬа11 е! а1., Агсй Эегта!о1 2002 Ос!. 138(10):1341-6), реакция трансплантат против хозяина (Мшга Υ. е! а1., В1оой 2002 Ос!. 1:100(7):2650-8), синдром Шегрена (Апауа е! а1., I. Кйеита!о1 2002 8ер. 29 (9):1874-6) и болезнь Крона (8сйт1! А. е! а1., Еиг. Су!окте ΝΕ1\ν. 2002 1и1-8ер:13(3):298-305.

Claims (57)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Полипептид, который:
    (ί) содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕР Ш NО:36;
    (ΐΐ) представляет собой его фрагмент, обладающий функцией секретируемого белка, в частности, функцией цитокинов, имеющих в своей структуре пучок из четырех спиралей, более конкретно, интерферон-гамма-подобной функцией, либо содержащий антигенную детерминанту, общую с полипептидами (1); или (ίίΐ) представляет собой функциональный эквивалент (ί) или (11).
  2. 2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что функционирует как секретируемый белок, в частности, является членом класса цитокинов, имеющих в своей структуре пучок из четырех спиралей, предпочтительно представляет собой интерферон-гамма-подобную молекулу.
  3. 3. Полипептид, который представляет собой функциональный эквивалент по п.1 (111), являющийся гомологичным аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕР Ш NО:36, и обладающий активностью секретируемого белка, в частности, активностью цитокинов, имеющих в своей структуре пучок из четырех спиралей, и наиболее предпочтительно интерферон-гамма-подобной активностью.
  4. 4. Фрагмент или функциональный эквивалент по любому из предшествующих пунктов, который идентичен аминокислотной последовательности, представленной в 8ЕР Ш NО:36, или ее активному фрагменту, более чем на 80%, предпочтительно более чем 90, 95, 98 или 99%.
  5. 5. Функциональный эквивалент по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что обладает значительной структурной гомологией с полипептидом, аминокислотная последовательность которого представлена в 8ЕС) Ш NО:36.
  6. 6. Фрагмент по любому из пп.1, 2 или 4, имеющий антигенную детерминанту, общую с полипептидом по подпункту (ί) п.1, которая состоит из 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более) аминокислотных остатков последовательности 8ЕР Ш NО:36.
  7. 7. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по любому из предшествующих пунктов.
  8. 8. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты по п.7, отличающаяся тем, что имеет последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в 8ЕР Ш NО:35, или представляет собой избыточный эквивалент или фрагмент.
  9. 9. Очищенная молекула нуклеиновой кислоты, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты по п.7 или 8.
  10. 10. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9.
  11. 11. Клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.10.
    - 34 007813
  12. 12. Лиганд, который специфически связывается с указанным секретируемым белком и который предпочтительно ингибирует его активность, в частности, предпочтительно ингибирует активность цитокина с четырьмя спиральными пучками, и еще более предпочтительно ингибирует активность интерферон-гамма-подобного полипептида по любому из пп.1-6.
  13. 13. Лиганд по п.12, отличающийся тем, что представляет собой антитело.
  14. 14. Соединение, которое повышает или снижает уровень экспрессии или активности полипептида по любому из пп.1-6.
  15. 15. Соединение по п.14, отличающееся тем, что связывается с полипептидом по любому из пп.1-6, не индуцируя при этом каких-либо биологических эффектов полипептида.
  16. 16. Соединение по п.14 или 15, отличающееся тем, что представляет собой природный или модифицированный субстрат, лиганд, фермент, рецептор, или структурный, или функциональный миметик.
  17. 17. Применение полипептида по любому из пп.1-6 в терапии или в диагностике заболевания.
  18. 18. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 в терапии или в диагностике заболевания.
  19. 19. Применение вектора по п.10 в терапии или в диагностике заболевания.
  20. 20. Применение клетки-хозяина по п.11 в терапии или в диагностике заболевания.
  21. 21. Применение лиганда по п.12 или 13 в терапии или в диагностике заболевания.
  22. 22. Применение соединения по любому из пп.14-16 в терапии или в диагностике заболевания.
  23. 23. Способ диагностики заболевания у пациента, предусматривающий оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид по любому из пп.1-6, или оценку активности полипептида по любому из пп.1-6, в ткани указанного пациента, и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, отличающийся от указанного контрольного уровня, является признаком наличия заболевания.
  24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что осуществляется ίη У1!го.
  25. 25. Способ по п.23 или 24, отличающийся тем, что предусматривает стадии:
    (a) контактирования лиганда по п.12 или 13 с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.
  26. 26. Способ по п.23 или 24, предусматривающий стадии:
    a) контактирования образца ткани, взятой у пациента, с зондом нуклеиновой кислоты в жестких условиях, при которых возможно образование гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 и зондом;
    b) контактирования контрольного образца с указанным зондом в условиях, аналогичных условиям стадии (а); и
    c) детекции присутствия гибридных комплексов в указанных образцах, при этом детекция уровней гибридного комплекса в образце данного пациента, которые отличаются от уровней гибридного комплекса в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
  27. 27. Способ по п.23 или 24, предусматривающий:
    a) контактирование образца нуклеиновой кислоты ткани, взятой у пациента, с праймером нуклеиновой кислоты в жестких условиях, при которых возможно образование гибридного комплекса между молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 и праймером;
    b) контактирование контрольного образца с указанным праймером в условиях, аналогичных условиям стадии (а);
    c) амплификацию указанного образца нуклеиновой кислоты и
    б) детекцию уровня амплифицированной нуклеиновой кислоты в образцах, взятых у пациента, и в контрольных образцах, при этом детекция уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в образце пациента, которые значительно отличаются от уровней амплифицированной нуклеиновой кислоты в контрольном образце, указывает на наличие заболевания.
  28. 28. Способ по п.23 или 24, предусматривающий:
    a) получение образца тканей от пациента, исследуемого на наличие заболевания;
    b) выделение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 из указанного образца ткани и
    c) установление диагноза заболевания у пациента путем обнаружения присутствия мутации в молекуле нуклеиновой кислоты, которая обуславливает заболевание и указывает на наличие заболевания.
  29. 29. Способ по п.28, отличающийся тем, что дополнительно предусматривает амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты с образованием амплифицированного продукта и детекцию присутствия или отсутствия мутации в амплифицированном продукте.
  30. 30. Способ по п.28 или 29, отличающийся тем, что присутствие или отсутствие мутации у пациента определяют путем контактирования указанной молекулы нуклеиновой кислоты с зондом нуклеиновой кислоты, который в жестких условиях гибридизуется с указанной молекулой нуклеиновой кислоты с образованием гибридной двухцепочечной молекулы, которая имеет негибридизованную часть цепи зонда нуклеиновой кислоты в любой области, соответствующей мутации, обуславливающей заболевание; и детекции присутствия или отсутствия негибридизованной части цепи зонда как показателя присутствия
    - 35 007813 или отсутствия обуславливающей заболевание мутации.
  31. 31. Способ по любому из пп.23-30, отличающийся тем, что указанное заболевание выбрано из пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний, в частности, иммунных расстройств, таких как аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительных заболеваний, таких как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, обусловленной вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз; кожных болезней, болезни Бехчета, опухолевых заболеваний, таких как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина; остеропороза, ожирения, диабета, подагры, сердечно-сосудистых заболеваний, реперфузионных поражений, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, инсульта, заболевания печени, СПИДа, СПИДассоциированного комплекса, неврологических расстройств, мужского бесплодия, старения и инфекций, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
  32. 32. Применение полипептида по любому из пп.1-6 в качестве секретируемого белка, в частности члена класса цитокинов, имеющих структуру с пучком из четырех спиралей, более предпочтительно в качестве интерферон-гамма-подобной молекулы.
  33. 33. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-6.
  34. 34. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9.
  35. 35. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по п.10.
  36. 36. Фармацевтическая композиция, содержащая клетку-хозяин по п.11.
  37. 37. Фармацевтическая композиция, содержащая лиганд по п.12 или 13.
  38. 38. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.14-16.
  39. 39. Вакцинная композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-6 или молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9.
  40. 40. Применение полипептида по любому из пп.1-6 для производства лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний, в частности, иммунных расстройств, таких как аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительных заболеваний, таких как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, обусловленной вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз; кожных болезней, болезни Бехчета, опухолевых заболеваний, таких как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина; остеропороза, ожирения, диабета, подагры, сердечно-сосудистых заболеваний, реперфузионных поражений, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, инсульта, заболевания печени, СПИДа, СПИД-ассоциированного комплекса, неврологических расстройств, мужского бесплодия, старения и инфекций, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
  41. 41. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 для производства лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний, в частности, иммунных расстройств, таких как аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительных заболеваний, таких как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, обусловленной вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз; кожных болезней, болезни Бехчета, опухолевых заболеваний, таких как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина; остеропороза, ожирения, диабета, подагры, сердечно-сосудистых заболеваний, реперфузионных по
    - 36 007813 ражений, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, инсульта, заболевания печени, СПИДа, СПИД-ассоциированного комплекса, неврологических расстройств, мужского бесплодия, старения и инфекций, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
  42. 42. Применение вектора по п.10 для производства лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний, в частности, иммунных расстройств, таких как аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительных заболеваний, таких как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, обусловленной вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз; кожных болезней, болезни Бехчета, опухолевых заболеваний, таких как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина; остеропороза, ожирения, диабета, подагры, сердечно-сосудистых заболеваний, реперфузионных поражений, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, инсульта, заболевания печени, СПИДа, СПИДассоциированного комплекса, неврологических расстройств, мужского бесплодия, старения и инфекций, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
  43. 43. Применение клетки-хозяина п.11 для производства лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний, в частности, иммунных расстройств, таких как аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительных заболеваний, таких как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, обусловленной вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз; кожных болезней, болезни Бехчета, опухолевых заболеваний, таких как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина; остеропороза, ожирения, диабета, подагры, сердечно-сосудистых заболеваний, реперфузионных поражений, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, инсульта, заболевания печени, СПИДа, СПИДассоциированного комплекса, неврологических расстройств, мужского бесплодия, старения и инфекций, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
  44. 44. Применение лиганда по п.12 или 13 для производства лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний, в частности, иммунных расстройств, таких как аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительных заболеваний, таких как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, обусловленной вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз; кожных болезней, болезни Бехчета, опухолевых заболеваний, таких как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина; остеропороза, ожирения, диабета, подагры, сердечно-сосудистых заболеваний, реперфузионных поражений, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, инсульта, заболевания печени, СПИДа, СПИДассоциированного комплекса, неврологических расстройств, мужского бесплодия, старения и инфекций, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
  45. 45. Применение соединения по любому из пп.14-16 для производства лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний, в частности, иммунных расстройств, таких как
    - 37 007813 аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительных заболеваний, таких как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, обусловленной вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз; кожных болезней, болезни Бехчета, опухолевых заболеваний, таких как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина; остеропороза, ожирения, диабета, подагры, сердечно-сосудистых заболеваний, реперфузионных поражений, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, инсульта, заболевания печени, СПИДа, СПИД-ассоциированного комплекса, неврологических расстройств, мужского бесплодия, старения и инфекций, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
  46. 46. Применение фармацевтической композиции по п.33-38 для производства лекарственного средства для лечения пролиферативных расстройств, аутоиммунных/воспалительных заболеваний, сердечнососудистых заболеваний, неврологических расстройств, нарушений развития, метаболических расстройств, инфекций и других патологических состояний, в частности, иммунных расстройств, таких как аутоиммунное заболевание, ревматоидный артрит, остеоартрит, псориаз, системная красная волчанка и рассеянный склероз; воспалительных заболеваний, таких как аллергия, ринит, конъюнктивит, гломерулонефрит, увеит, болезнь Крона, язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, панкреатит, воспаление пищеварительной системы, сепсис, эндотоксический шок, септический шок, кахексия, миалгия, анкилозирующий спондилит, злокачественная миастения, синдром усталости, обусловленной вирусной инфекцией, легочное заболевание, респираторный дистресс-синдром, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, воспаление дыхательных путей, заживление ран, эндометриоз; кожных болезней, болезни Бехчета, опухолевых заболеваний, таких как меланома, саркома, опухоль почек, опухоль толстой кишки, гематологическая болезнь, миелопролиферативные расстройства, болезнь Ходжкина; остеропороза, ожирения, диабета, подагры, сердечно-сосудистых заболеваний, реперфузионных поражений, атеросклероза, ишемической болезни сердца, сердечной недостаточности, инсульта, заболевания печени, СПИДа, СПИД-ассоциированного комплекса, неврологических расстройств, мужского бесплодия, старения и инфекций, включая плазмодиевую инфекцию, бактериальную инфекцию и вирусную инфекцию, в частности, инфекцию, вызываемую герпесвирусом 5 (цитомегаловирусом) человека.
  47. 47. Способ лечения заболевания у пациента, предусматривающий введение пациенту полипептида по любому из пп.1-6, молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9, вектора по п.10, клеткихозяин по п.11, лиганда по п.12 или 13, соединения по любому из пп.14-16 или фармацевтической композиции по п.33-38.
  48. 48. Способ по п.47, отличающийся тем, что используется для лечения заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена или активности полипептида у пациента с заболеванием ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, при этом пациенту вводят полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, лиганд, соединение или композицию, которые являются агонистами.
  49. 49. Способ по п.47, отличающийся тем, что используется для лечения заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена или активности полипептида у пациента с заболеванием выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, при этом пациенту вводят полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, лиганд, соединение или композицию, которые являются антагонистами.
  50. 50. Способ мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, предусматривающий мониторинг, в течение определенного периода времени, уровня экспрессии или активности полипептида по любому из пп.1-6, или уровня экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 в ткани указанного пациента, при этом изменение указанного уровня экспрессии или активности за определенный промежуток времени по сравнению с контрольным уровнем является показателем регресса указанного заболевания.
  51. 51. Способ идентификации соединения, которое является эффективным для лечения и/или диагностики заболевания, предусматривающий контактирование полипептида по любому из пп.1-6 или молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9 с одним или более соединениями, предположительно обладающими аффинностью связывания с указанным полипептидом или молекулой нуклеиновой кислоты, и отбор соединения, которое специфически связывается с указанной молекулой нуклеиновой кислоты или полипептидом.
  52. 52. Набор, используемый для диагностики заболевания, содержащий первый контейнер, содержащий зонд нуклеиновой кислоты, который в жестких условиях гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9; второй контейнер, содержащий праймеры, подходящие для амплификации указанной молекулы нуклеиновой кислоты; и инструкции по использованию зонда и праймеров для облегчения диагностики заболевания.
    - 38 007813
  53. 53. Набор по п.52, отличающийся тем, что дополнительно содержит третий контейнер, содержащий агент для расщепления негибридизованной РНК.
  54. 54. Набор, содержащий массив молекул нуклеиновой кислоты, по крайней мере одной из которых является молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.7-9.
  55. 55. Набор, содержащий одно или несколько антител, связывающихся с полипептидом по любому из пп.1-6, и реагент, используемый для детекции реакции связывания между указанным антителом и указанным полипептидом.
  56. 56. Трансгенное или «нокаут» животное, не являющееся человеком, трансформированное с целью экспрессии более высоких, более низких уровней полипептида по любому из пп.1-6, или с целью отсутствия такой экспрессии.
  57. 57. Способ скрининга соединения, эффективного для лечения заболевания, предусматривающий контактирование трансгенного животного, не являющегося человеком, по п.56, с предполагаемым соединением, и оценку эффективности указанного соединения для лечения заболевания у указанного животного.
EA200400812A 2001-12-21 2002-12-23 Секретируемый белок EA007813B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0130720.6A GB0130720D0 (en) 2001-12-21 2001-12-21 Proteins
PCT/GB2002/005914 WO2003055913A2 (en) 2001-12-21 2002-12-23 Secreted protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200400812A1 EA200400812A1 (ru) 2005-06-30
EA007813B1 true EA007813B1 (ru) 2007-02-27

Family

ID=9928221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400812A EA007813B1 (ru) 2001-12-21 2002-12-23 Секретируемый белок

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20040106778A1 (ru)
EP (3) EP1463756A2 (ru)
JP (3) JP2005528083A (ru)
KR (1) KR20040086247A (ru)
CN (1) CN1620467A (ru)
AU (3) AU2002353224B2 (ru)
BR (1) BR0215284A (ru)
CA (3) CA2470594A1 (ru)
EA (1) EA007813B1 (ru)
GB (1) GB0130720D0 (ru)
IL (1) IL162598A0 (ru)
MX (1) MXPA04006049A (ru)
WO (3) WO2003055913A2 (ru)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070016967A1 (en) * 2002-12-04 2007-01-18 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Novel IFNgamma-like polypeptides
EP1636262A1 (en) * 2003-06-20 2006-03-22 Ares Trading S.A. Interferon gamma-like protein
GB0314456D0 (en) * 2003-06-20 2003-07-23 Ares Trading Sa Interferon gamma-like protein
CA2535021A1 (en) * 2003-09-08 2005-03-17 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Use of insp035 to treat fibrotic disease
ZA200606224B (en) * 2004-02-02 2007-11-28 Ambrx Inc Modified human growth hormone polypeptides and their uses
AU2005211385B2 (en) * 2004-02-02 2008-12-11 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone polypeptides and their uses
US20050260155A1 (en) * 2004-05-18 2005-11-24 Gopala Kovvali Compositions and methods for treatment of ulcerative colitis
WO2006105913A1 (en) * 2005-04-04 2006-10-12 Julius-Maximillians-Universität Würzburg Tripeptides that down regulate the activity of plasma membrane transporters including sodium-d-glucose cotransporter sglt1
US7943328B1 (en) 2006-03-03 2011-05-17 Prometheus Laboratories Inc. Method and system for assisting in diagnosing irritable bowel syndrome
US8432899B2 (en) 2007-02-22 2013-04-30 Aylus Networks, Inc. Systems and methods for enabling IP signaling in wireless networks
US9026117B2 (en) 2006-05-16 2015-05-05 Aylus Networks, Inc. Systems and methods for real-time cellular-to-internet video transfer
US20080085524A1 (en) * 2006-08-15 2008-04-10 Prometheus Laboratories Inc. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
US20100094560A1 (en) * 2006-08-15 2010-04-15 Prometheus Laboratories Inc. Methods for diagnosing irritable bowel syndrome
CA2726481C (en) * 2008-06-04 2016-11-08 Kci Licensing, Inc. Detecting infection in reduced pressure wound treatment
CN105288602A (zh) * 2011-10-20 2016-02-03 新干细胞肿瘤学有限责任公司 具有γ干扰素的抗原呈递癌症疫苗

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6245966B1 (en) * 1998-07-14 2001-06-12 University Technology Corporation Adenoviral mediated gene transfer into lymphocytes
JP2003501034A (ja) * 1999-06-01 2003-01-14 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ４ヘリックス束タンパク質ｚｓｉｇ８１
EP1242598A2 (en) * 1999-12-30 2002-09-25 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of colon cancer and methods for their use
CN1188172C (zh) * 2000-01-10 2005-02-09 马克西根控股公司 G－csf偶联物
US20020048763A1 (en) * 2000-02-04 2002-04-25 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis
US6436703B1 (en) * 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
AU2001280889A1 (en) * 2000-07-31 2002-02-13 Gene Logic, Inc. Molecular toxicology modeling
US20050112610A1 (en) * 2003-04-16 2005-05-26 Applied Dna Sciences, Inc. System and method for marking textiles with nucleic acids
GB0314456D0 (en) * 2003-06-20 2003-07-23 Ares Trading Sa Interferon gamma-like protein

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL 'Online! 14 November 1997 (1997-11-14). Database accession no. B50602, XP002244756, the whole document *
DATABASE EMBL 'Online! 20 March 2000 (2000-03-20). Database accession no. AC026118 XP002244755, nt 171824-172060 *
DATABASE EMBL 'Online! 21 May 1998 (1998-05-21). Database accession no. AQ010151, XP002244757, the whole document *
DATABASE EMBL 'Online! 27 February 2002 (2002-02-27). Database accession no. AC112641, XP002244754, nt 47052-47288 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2005528083A (ja) 2005-09-22
JP2005532034A (ja) 2005-10-27
WO2003055913A3 (en) 2003-08-21
WO2003054012A3 (en) 2003-11-20
CA2470594A1 (en) 2003-07-03
MXPA04006049A (es) 2004-09-27
AU2002353224A2 (en) 2003-07-09
CA2470666A1 (en) 2003-07-10
IL162598A0 (en) 2005-11-20
KR20040086247A (ko) 2004-10-08
EP1468018A2 (en) 2004-10-20
AU2002353224B2 (en) 2008-04-10
US20050106679A1 (en) 2005-05-19
WO2003055912A2 (en) 2003-07-10
BR0215284A (pt) 2004-12-14
US20050042731A1 (en) 2005-02-24
CN1620467A (zh) 2005-05-25
AU2002353227A1 (en) 2003-07-15
WO2003055913A2 (en) 2003-07-10
EP1468019A2 (en) 2004-10-20
EA200400812A1 (ru) 2005-06-30
CA2471306A1 (en) 2003-07-10
EP1463756A2 (en) 2004-10-06
AU2002353227A8 (en) 2003-07-15
WO2003055912A3 (en) 2003-12-31
JP2005528086A (ja) 2005-09-22
AU2002353224A1 (en) 2003-07-09
WO2003054012A2 (en) 2003-07-03
US20040106778A1 (en) 2004-06-03
AU2002356317A1 (en) 2003-07-15
GB0130720D0 (en) 2002-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA011816B1 (ru) Белок липокалин
US8754199B2 (en) Tango 240 nucleic acids and uses thereof
JP2002531069A (ja) タンパク質のカプサイシン／バニロイド受容体ファミリーの新規メンバー及びそれらの使用
EA007813B1 (ru) Секретируемый белок
US20030170630A1 (en) Proteins and nucleic acids encoding same
EA007985B1 (ru) Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен
US20040010119A1 (en) Novel proteins and nucleic acids encoding same
JP2004512821A (ja) Ｎｏｖｘタンパク質およびそれをコードする核酸。診断的使用および治療的使用
EA013251B1 (ru) БЕЛКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ДОМЕНЫ vWFA И/ИЛИ ANT_IG
EP1710299A2 (en) Secreted proteins and nucleic acids encoding them
EA007611B1 (ru) Белок, имеющий в своей структуре цистиновые узлы
EA005921B1 (ru) Ген и белок, ассоциированные с шизофренией
ES2352339T3 (es) Proteínas defensinas.
EA010405B1 (ru) Семейство секретируемых белков
JP2004511222A (ja) タンパク質およびそれをコードする核酸
JP2004501623A (ja) ポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチド
EA011261B1 (ru) Гликопротеин клеточной поверхности
JP2002530064A (ja) Ｅｇｆ様核酸およびポリペプチド、ならびにその使用
US6903201B2 (en) Proteins and nucleic acids encoding same
JP2002514078A (ja) Ｆｔｈｍａ−０７０関連蛋白質ファミリーおよびｔ８５関連蛋白質ファミリーの新規分子ならびにそれらの使用
JP3517988B2 (ja) ヒトマッカード−ジョセフ病関連蛋白質、その蛋白質をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子、そのＤＮＡまたは遺伝子を含むベクター、その発現ベクターで形質転換された宿主細胞、マッカード−ジョセフ病の診断方法および治療剤
US20040115761A1 (en) Polypeptides and nucleic acids encoding same
TW442494B (en) Novel, ATP-sensitive potassium-channel proteins and genes for the same
EP2301947A2 (en) Secreted proteins and uses thereof
JPH10510518A (ja) ヒト血管ｉｂｐ様成長因子

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU