EA005921B1 - Ген и белок, ассоциированные с шизофренией - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам гена РАРАР, к полипептидам, кодируемым геном РАРАР, и к антителам, специфичным к таким полипептидам. Настоящее изобретение также относится к способам лечения или диагностики шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения ЦНС. Настоящее изобретение также относится к взаимодействию РАРАР с геном g34 872, который является кандидатом на ген шизофрении.

Description

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам гена РАРАР, к полипептидам, кодируемым геном РАРАР, и к антителам, специфичным к таким полипептидам. Настоящее изобретение также относится к способам лечения или диагностики шизофрении, биполярных нарушений или родственных заболеваний ЦНС. Настоящее изобретение также относится к взаимодействию РАРАР с геном §34872, который является кандидатом на ген шизофрении.

Предшествующий уровень техники

Прогресс, достигнутый в технологическом оснащении современных лабораторий для теоретических и клинических исследований, позволяет проводить более серьезное изучение функций головного мозга и нервной системы как у здоровых индивидуумов, так и у индивидуумов с патологией. Было выдвинуто множество нейробиологических и фармакологических гипотез, касающихся нейрохимических и генетических механизмов, вызывающих нарушения центральной нервной системы (ЦНС), включая психические и нейродегенеративные нарушения. Однако нарушения ЦНС имеют сложную и еще недостаточно ясную этиологию, и их симптомы, которые перекрываются друг с другом, еще недостаточно охарактеризованы и представляют определенные трудности для диагностики. В будущем необходимо разработать такие схемы лечения и лекарственные средства, которые обладали бы более тонким и направленным действием на мультигенные этиологические факторы, а также необходимо разработать новые анализы для выявления людей, страдающих указанными заболеваниями, и для получения более точных диагностических и прогностических данных относительно пациентов, страдающих нарушениями ЦНС.

Нарушения ЦНС могут охватывать заболевания широкого спектра и, соответственно, широкий спектр генетических факторов.

Примерами нарушений ЦНС являются нейродегенеративные заболевания, психотические нарушения, нарушения настроения, аутизм, злоупотребление веществами, вызывающими зависимость, и алкоголизм, задержка умственного развития и другие психические заболевания, включая нарушение познавательной способности, тревожные состояния, нарушения, связанные с приемом пищи, неконтролируемая импульсивность и нарушения личности. Такие нарушения могут быть определены с использованием Руководства по диагностике и статистике психических нарушений, четвертое издание, классификация (Ό8Μ-ΐν) (Ωίαβηοδίδ апб δίαΐίδΐίοαΐ Мапиа1 оГ Меп1а1 Окогбего ΓοιιΠίι сбШоп с1а88гГюа1юп).

Даже при рассмотрении лишь небольшого ряда нарушений ЦНС очевидно, что исходя из отсутствия адекватного лечения и понимания молекулярных механизмов психотических нарушений, шизофрении и биполярных нарушений, которые являются новыми целями терапии настоящего изобретения, необходимо разработать усовершенствованные способы лечения этих нарушений. Что касается шизофрении и биполярного нарушения, то все известные молекулы, используемые для лечения шизофрении, дают побочные эффекты и действуют только на симптомы данного заболевания. Существует крайняя необходимость в получении новых молекул, которые не давали бы побочных эффектов и которые были бы направлены на мишени, участвующие в механизмах, вызывающих шизофрению и биполярные нарушения. Поэтому необходимо разработать способы, облегчающие обнаружения и характеризацию этих мишеней.

Данные о сочетании шизофрении с биполярным нарушением в семьях, данные, полученные при исследовании близнецов и приемных детей, а также отсутствие динамики в заболеваемости во всем мире указывают на то, что шизофрения и биполярное нарушение являются, главным образом, генетическими состояниями, хотя на определенном уровне присутствуют также и внешние факторы риска, такие как необходимые, достаточные или интерактивные этиологические факторы. Так, например, шизофренией страдает 1% всего населения. Но если в семье бабушка или дедушка страдали шизофренией, то риск развития этого заболевания возрастает примерно до 3%, а если один из родителей страдал шизофренией, то этот риск увеличивается примерно до 10%. Если оба родителя страдали шизофренией, то риск составляет приблизительно 40%.

Идентификация гена чувствительности к шизофрении на хромосоме 13с|31-с.|33.

Идентификация генов, участвующих в сообщении конкретного признака, такого как специфическое нарушение центральной нервной системы, например шизофрения, может быть осуществлена с помощью двух главных стратегий, которые используются в настоящее время для генетического картирования, а именно анализ на сцепление генов и исследование на ассоциацию генов. Анализ на сцепление генов требует проведения исследования семейств, в которых наблюдалось множество случаев заболевания индивидуумов, и такое исследование в настоящее время может быть использовано для обнаружения моноили олигогенных наследуемых признаков. В отличие от этого, исследования ассоциации генов позволяют определить частоту встречаемости маркерных аллелей у неродственных индивидуумов с этим признаком (Т+) по сравнению с негативным контролем (Т-) по этому признаку, и такое исследование часто используется для обнаружения полигенной наследуемости.

Генетическая связь или сцепление генов основано на анализе, который позволяет определить, какие из двух соседних последовательностей на хромосоме содержат наименьшее число рекомбинаций, происходящих в результате кроссинговера в процессе мейоза. Для этого была определена точная локализация хромосомных маркеров, таких как микросателлитные маркеры, на геноме. Анализ на сцепление

- 1 005921 генов позволяет вычислить вероятности рекомбинаций на целевом гене с использованием хромосомных маркеров в соответствии с генеалогическим древом, вероятность передачи болезни и переноса маркеров. Таким образом, если конкретный аллель данного маркера передается с данной болезнью более часто, чем вероятность того, что он уже присутствует в нем (уровень рекомбинации от 0 до 0,5), то можно сделать вывод, что рассматриваемый целевой ген присутствует возле этого маркера. С использованием этого метода можно определить локализацию нескольких генов, свидетельствующих о генетической предрасположенности к наследственной злокачественной опухоли. Для включения в исследование на сцепление генов семьи, страдающей наследуемой формой заболевания, она должна удовлетворять критериям информативности, т.е. эта семья должна иметь несколько страдающих этим заболеванием индивидуумов (у которых имеется структурная ДНК) на одно поколение, а в лучшем случае она должна иметь большое число сибсов.

Результаты предварительных исследований на сцепление генов подтвердили предположение, что хромосома 13 по всей вероятности имеет локус чувствительности к шизофрении на 13с.|32 (В1ошп 1.Ь. е! а1., 1998, Ыа1иге СепеПск, 20:70-73; Ып М.А. е! а1., 1997, Нит. Сепе!., 99(3) :417-420). Эти наблюдения позволяют предположить, что локус шизофрении находится на хромосоме 13ц32. что было подтверждено в исследованиях на сцепление генов. Анализ на сцепление генов был успешно применен для картирования простых генетических признаков, которые ясно указывают на характер менделевского наследования и которые имеют высокий уровень пенетрантности, однако, этот метод имеет ряд недостатков. Вопервых, анализ на сцепление генов зависит от выбора генетической модели, подходящей для каждого исследуемого признака. Кроме того, использование анализа на сцепление генов ограничено разрешением, которое может быть достигнуто при его применении, и для более точного анализа типичных 20 м.п.н. областей, которые были предварительно идентифицированы этим методом, требуются дополнительные исследования. Кроме того, анализ на сцепление генов представляет определенные трудности при его применении в целях обнаружения сложных генетических признаков, таких как признаки, обусловленные комбинированным действием множества генов и/или факторов окружающей среды. В этих случаях для подбора адекватного числа семей с данным заболеванием, необходимого для проведения анализа на сцепление генов для конкретных ситуаций, требуется очень большой объем работы и средств. И, наконец, анализ на сцепление генов не может быть применен для исследования признаков, в которых не может участвовать большое число информативных семей.

Позже, вместо использования анализов на сцепление генов был использован альтернативный метод исследований на ассоциацию генов, который позволил идентифицировать новый ген, ассоциированный с шизофренией и биполярным нарушением и обозначенный геном §34872, который локализован в локусе хромосомы 13с|31-с.|33. Этот альтернативный метод предусматривает создание биаллельных маркеров (главным образом, с однонуклеотидным полиморфизмом) в нужной области, идентификацию маркеров, указывающих на неравновесность по сцеплению с шизофренией, и проведение исследований на ассоциацию генов у индивидуумов со случаями неродственной шизофрении и биполярного нарушения, а также у контрольных популяций.

В целом, был сконструирован ВАС-контиг, охватывающий геномный участок-кандидат, с использованием 27 опубликованных ЗТЗ (ЗТЗ - ДНК-маркирующий сайт), локализованных на участке хромосомы 13с|31-с.|33 для скрининга 7 геномных эквивалентных запатентованных ВАС-библиотек. На основе этих материалов были генерированы новые ЗТЗ, что позволило построить плотную физическую карту этой области. В целом, 275 ЗТЗ позволили идентифицировать 255 ВАС, имеющие все возможные размеры и картированные путем хромосомной гибридизации ш δίΐιι для их подтверждения. Новые биаллельные маркеры были генерованы путем частичного секвенирования концов вставки от субклонов некоторых вставок ВАС, локализованных в области 13с|31-с.|33 хромосомы человека. В первой фазе этого анализа для случая шизофрении и контроля была проанализирована первая серия 34 биаллельных маркеров на 9 различных ВАС вдоль локуса-кандидата хромосомы 13с.|31 -с.|33, что позволило идентифицировать субобласть, указывающую на ассоциацию с шизофренией. После проведения этого первого анализа генерировали дополнительные биаллельные маркеры, как описано выше, для построения карты очень высокой плотности нужной области. Была идентифицирована и полностью секвенирована минимальная серия из 35 ВАС, что позволило выявить несколько контигов, включая контиг, состоящий из последовательностей в более чем 900 т.п.н. в нужной области.

Эти биаллельные маркеры были использованы в комбинации с исследованиями, которые проводились в целях уточнения конкретной нужной субобласти, содержат кандидат на ген шизофрении, §34872. В некоторых исследованиях, проводимых на различных популяциях в целях подтверждения ассоциации с указанной субобластью, был определен генотип этих биаллельных маркеров. Исследования на ассоциацию сначала осуществляли на двух различных скринирующих образцах для случаев шизофрении и на контрольных образцах, взятых от индивидуумов, проживающих во французской Канаде, из которых 139 человек имели шизофрению, а 141 человек составляли контрольную группу, и 215 человек имели шизофрению, а 241 человек составляли контрольную группу соответственно, а также на образцах для случаев биполярного нарушения и контрольных образцах, взятых от индивидуумов, проживающих в Аргентине. Данные, полученные в результате нескольких исследований с участием указанных индивидуумов,

- 2 005921 выявили геномную область, имеющую примерно 150 т.п.н. и обнаруживающую значимую ассоциацию с шизофренией. Эта ассоциация была затем подтверждена в независимых исследованиях с использованием образцов для случаев заболевания и контрольных образцов, взятых от больных шизофренией, проживающих в США, а также дополнительных образцов, взятых от индивидуумов, проживающих в Аргентине и во французской Канаде.

Было обнаружено, что геномная область примерно в 150 т.п.н., ассоциированная с шизофренией, содержит ген-кандидат §34872. Кроме того, помимо характеризации структуры интрон-экзон гена §34872 был идентифицирован ряд вариантов мРНК-сплайсинга, включая тканеспецифические варианты мРНК-сплайсинга, и было продемонстрировано присутствие мРНК. Затем пептидный фрагмент, происходящий от полипептидного продукта §34872, аминокислотная последовательность которого показана в 8ЕО Ш Νο: 5, обнаруживал при его внутрибрюшинном введении мышам снижение частоты локомоторных движений и увеличение стереотипии. Последующее обсуждение идентификации гена §34872 приводится в одновременно рассматриваемой заявке на патент США рег. № 09/539333, озаглавленной Гены, белки и биаллельные маркеры, ассоциированные с шизофренией (δοϊιίζορίποηίη а55ос1а1е6 §еие§, рго1еш5 аиб Ыа11е11с тагкег), и в одновременно рассматриваемой международной патентной заявке № РСТ/1В 00/00435, которые были поданы 30 марта 2000 г. и которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Крайне необходимо идентифицировать гены, ассоциированные с шизофренией и биполярным нарушением. Также необходимо идентифицировать гены, участвующие в пути §34 872, и гены, продукты которых функционально взаимодействуют с продуктами гена §34872. Эти гены могут послужить началом нового этапа в лечении шизофрении или биполярных нарушений и также позволят проводить дальнейшие исследования и характеризацию гена §34872 и связанного с ним биологического пути. Сведения об этих генах и связанного с ним биологического пути, ответственных за шизофрению, могут помочь исследователям понять этиологию шизофрении и биполярного нарушения и способствовать разработке лекарственного средства и медицинских препаратов, которые будут направлены на причину, вызывающую эти заболевания. Существует также острая необходимость в разработке новых способов обнаружения чувствительности к шизофрении и биполярным нарушениям, а также способов предупреждения развития шизофрении или контроля за ходом ее развития. Также крайне необходимо разработать средства для диагностики этих заболеваний. Действительно, ранняя идентификация индивидуумов с риском развития шизофрении позволила бы проводить раннее и/или профилактическое лечение. Кроме того, точная оценка потенциальной эффективности лекарственного средства, а также потенциальной толерантности к нему пациентов, позволила бы клиницистам увеличить отношение польза/риск при разработке схем лечения шизофрении и биполярного нарушения.

Таким образом, настоящее изобретение относится к новому гену и белку, который взаимодействует с пептидом §34872. Этот новый ген, обозначенный геном РАРАР, был клонирован авторами настоящего изобретения, которые продемонстрировали, что продукт гена РАРАР взаимодействует с пептидом §34872. Сведения о партнере по связыванию с §34872 дают возможность разработать лекарственные средства для лечения заболеваний ЦНС, опосредованных §34872 и/или РАРАР, и проводить исследования §34872 путем получения средств для детекции РАРАР, §34872 и комплексов §34872-РАРАР или их взаимодействий.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим геномную последовательность нового гена человека, который кодирует белок РАРАР. Геномная последовательность РАРАР включает регуляторную последовательность, расположенную выше (с 5'-конца) и ниже (с 3'конца) от транскрибируемой части указанного гена, и эти регуляторные последовательности также являются частью настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к полной кДНК-последовательности, кодирующей белок РАРАР, а также к полипептидам РАРАР и к антителам, специфически распознающим полипептид РАРАР. Настоящее изобретение также относится к комплексу РАРАР-§34872, не содержащему белка, с которым он обычно ассоциирован, а также к антителам, специфически распознающим указанный комплекс.

Олигонуклеотидные зонды или праймеры, специфически гибридизующиеся с геномной или с кДНК-последовательностью РАРАР, а также способы ДНК-амплификации и детекции с использованием указанных праймеров и зондов также являются частью настоящего изобретения.

Другим объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные векторы, содержащие любые вышеописанные последовательности нуклеиновой кислоты, а в частности рекомбинантные векторы, содержащие регуляторную последовательность РАРАР или последовательность, кодирующую белок РАРАР, а также клетки-хозяева и трансгенные животные, отличные от человека, и содержащие указанные последовательности нуклеиновой кислоты или рекомбинантные векторы.

Настоящее изобретение также относится к способам скрининга веществ или молекул, ингибирующих экспрессию РАРАР, а также к способам скрининга веществ или молекул, которые взаимодействуют с полипептидом РАРАР и которые модулируют активность полипептида РАРАР или нарушают, преду

- 3 005921 преждают, дестабилизируют или усиливают связывание и/или взаимодействие пептидов и/или белков РАРАР и §34872.

И, наконец, настоящее изобретение относится к использованию полипептида РАРАР, антител против этого полипептида и агонистов и антагонистов активности РАРАР для лечения нарушений ЦНС.

Краткое описание последовательностей, представленных в списке последовательностей

8ЕО ГО N0: 1 содержит кДНК-последовательность РАРАР.

8Е0 ГО N0: 2 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую кДНК 8Е0 ГО N0: 1. 8Е0 ГО N0: 3 содержит геномную ДНК-последовательность РАРАР.

8Е0 ГО N0: 4 содержит ДНК-последовательность, кодирующую гибридный белок пептид §34872 щелочная фосфатаза, описанный в примере 1.

8Е0 ГО N0: 5 содержит ДНК-последовательность, кодирующую пептид §34 872, используемый для идентификации и клонирования гена РАРАР, описанного в примере 1.

8Е0 ГО N0: 6 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую ДНК 8Е0 ГО N0: 4.

Подробное описание Идентификация гена РАРАР, локализованного на хромосоме 1р35-р36

Для идентификации белка РАРАР авторами настоящего изобретения был использован метод экспрессионного клонирования, подробно описанный ниже в примере 1. Для этого заявителями был создан с сохранением рамки считывания гибрид кДНК-последовательности, кодирующей пептидный фрагмент §34872, с С-концом секретируемой щелочной фосфатазы (АР) в векторе, содержащем секретируемую сигнальную последовательность, расположенную выше вставки, которая направляет секрецию этого гибридного белка в данную среду, где указанная среда, содержащая этот гибридный белок, может быть собрана, проанализирована на АР-активность и использована в анализе ίη Ши на рецептор/лиганд. Затем авторами настоящего изобретения был проведен анализ ίη Ши на рецептор/лиганд. кДНК, выделенные из кДНК-библиотеки головного мозга человека, клонировали в экспрессирующий вектор и трансфицировали в клетки С08-1. Секретированный АР-гибридный белок использовали в качестве зонда для клонирования РАРАР путем инкубирования клеток со средой, содержащей гибридный белок пептид §34872АР. В случае детекции позитивного клона анализ повторяли с использованием еще более мелких пулов кДНК до тех пор, пока не был идентифицирован единственный клон.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам и к полипептидам, ассоциированным с геном РАРАР. Частью настоящего изобретения также являются олигонуклеотидные зонды или праймеры, специфически гибридизующиеся с геномной или с кДНК-последовательностью РАРАР. Другой целью настоящего изобретения являются рекомбинантные векторы, содержащие любые вышеописанные последовательности нуклеиновой кислоты, а в частности рекомбинантные векторы, включающие регуляторную последовательность РАРАР или последовательность, кодирующую белок РАРАР, а также клетки-хозяева, содержащие указанные последовательности нуклеиновой кислоты или рекомбинантные векторы. Настоящее изобретение также относится к способам скрининга молекул, которые ингибируют экспрессию гена РАРАР и которые модулируют активность белка РАРАР или которые нарушают, предупреждают, дестабилизируют или усиливают связывание и/или взаимодействие пептидов и/или белков РАРАР и §34872. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые специфически направлены против таких полипептидов и которые могут быть использованы в качестве диагностических реагентов.

Идентифицированный ген и белок РАРАР может быть использован при разработке анализов для диагностики шизофрении или биполярных нарушений и при разработке анализов для надежной детекции генетической предрасположенности к шизофрении, к биполярным нарушениям и к родственным заболеваниям. Для лечения указанных нарушений могут быть использованы нуклеиновые кислоты и полипептиды РАРАР, а также антитела против указанных полипептидов. Ген и белок РАРАР и антитела против них могут быть также использованы при разработке схем скрининга лекарственных средств для точной и эффективной оценки терапевтического эффекта и побочных эффектов новых или уже имеющихся лекарственных средств или схем лечения. Кроме того, нуклеиновые кислоты и полипептиды РАРАР могут быть использованы для исследования §34872 и РАРАР и их участия в развитии заболеваний ЦНС.

Определения.

Перед более подробным описанием настоящего изобретения приводятся нижеследующие определения, в которых проиллюстрированы и определены значения и объем используемых в этом изобретении терминов.

Используемые здесь термины ген РАРАР охватывают геномные, мРНК- и кДНКпоследовательности, кодирующие белок РАРАР, включая нетранслируемые регуляторные области геномной ДНК.

Используемый здесь термин гетерологичный белок означает любой белок или полипептид, не являющийся белком РАРАР. Более конкретно, таким гетерологичным белком является соединение, которое может быть использовано в качестве маркера в последующих экспериментах с регуляторной областью РАРАР.

Термин выделенный означает, что данный материал должен быть удален из его природной среды

- 4 005921 (например, природного окружения, если оно имеется). Так, например, природный полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом организме, не является выделенным, но те же самые полинуклеотид, ДНК или полипептид, отделенные от некоторых или всех материалов, имеющихся в природной системе, являются выделенными. Такой полинуклеотид может быть частью вектора, и/или такой полинуклеотид или полипептид может быть частью композиции, и в случае, если они выделены, то данный вектор или композиция не являются частью его природного окружения.

Так, например, природный полинуклеотид, присутствующий в живом организме, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид, отделенный от некоторых или от всех веществ, имеющихся в природной системе, является выделенным. Более конкретно, из понятия выделенный должны быть исключены природные хромосомы (такие как хромосомные препараты), искусственные хромосомные библиотеки, геномные библиотеки и библиотеки кДНК, которые существуют либо в виде препарата, полученного на основе нуклеиновой кислоты ίη νίίτο, либо в виде препарата, полученного на основе трансфицированной/трансформированной клетки-хозяина, где указанные клетки-хозяева представляют собой либо гетерогенный препарат ίη νίίτο, либо высеваются в виде гетерогенной популяции единичных колоний. Конкретными исключениями также являются вышеуказанные библиотеки, где конкретный полинуклеотид составляет менее чем 5% от числа вставок нуклеиновой кислоты в векторных молекулах. Другими конкретными исключениями являются геномные ДНК целых клеток или РНК-препараты целых клеток (включая указанные препараты целых клеток, которые являются механически фрагментированными или ферментативно гидролизованными). Другими конкретными исключениями являются вышеуказанные препараты целых клеток, полученные либо в виде ίη νίίτο-препарата, либо в виде гетерогенной смеси, выделенной путем электрофореза (включая перенос блотов этого препарата), где полипептид настоящего изобретения в дальнейшем не был выделен из гетерологичных полинуклеотидов в среде для электрофореза (например, не был подвергнут последующему вырезанию одной полосы из популяции гетерогенных полос в агарозном геле или в найлоновом блоте).

Используемый здесь термин очищенный необязательно означает абсолютную чистоту, а скорее он имеет относительное толкование. В конкретных случаях может предусматриваться очистка исходного материала или природного материала по крайней мере первого порядка, а предпочтительно второго или третьего порядков, а более предпочтительно четвертого или пятого порядков. Примером может служить очистка в пределах от 0,1%-ной концентрации до 10%-ной концентрации, что составляет очистку второго порядка.

Для иллюстрации, отдельные кДНК-клоны, выделенные из библиотеки кДНК, были очищены стандартным способом до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из этих клонов, не могут быть непосредственно получены ни из библиотеки, ни из полной ДНК человека. Сами клоны кДНК не встречаются в природе, и они могут быть получены путем модификации частично очищенного природного вещества (матричной РНК). Превращение мРНК в библиотеку кДНК приводит к образованию синтетического вещества (кДНК), а чистые отдельные клоны кДНК могут быть выделены из синтетической библиотеки путем клонального отбора. Так, например, создание библиотеки кДНК из матричной РНК и последующее выделение отдельных клонов из этой библиотеки дает приблизительно 10⁴-10⁶-кратную очистку нативного мессенджера.

Используемый здесь термин очищенный необязательно означает абсолютную чистоту, а скорее он имеет относительное толкование. В конкретных случаях может предусматриваться очистка исходного материала или природного материала по крайней мере первого порядка, а предпочтительно второго или третьего порядков, а более предпочтительно четвертого или пятого порядков. Примером может служить очистка в пределах от 0,1 до 10%-ной концентрации, что составляет очистку второго порядка.

Для иллюстрации, отдельные клоны кДНК, выделенные из библиотеки кДНК, были очищены стандартным способом до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из этих клонов, не могут быть непосредственно выделены ни из библиотеки, ни из полной ДНК человека. Сами клоны кДНК не встречаются в природе, и они могут быть получены путем модификации частично очищенного природного вещества (матричной РНК). Превращение мРНК в библиотеку кДНК приводит к образованию синтетического вещества (кДНК), а чистые отдельные клоны кДНК могут быть выделены из синтетической библиотеки путем клонального отбора. Так, например, создание библиотеки кДНК из матричной РНК и последующее выделение отдельных клонов из этой библиотеки дает приблизительно 10⁴-10⁶-кратную очистку нативного мессенджера.

Используемый здесь термин очищенный относится к полипептиду или к полинуклеотиду настоящего изобретения, который был выделен из других соединений, включая, но не ограничиваясь ими, полипептиды или полинуклеотиды, углеводы, липиды и т.п. Термин очищенный может быть использован для идентификации отделения мономерных полипептидов настоящего изобретения от олигомерных форм, таких как гомо- или гетеродимеры, тримеры и т.п. Термин очищенный может быть также использован для идентификации отделения ковалентно связанных полинуклеотидов от линейных полинуклеотидов. Полинуклеотид является, в основном, чистым в том случае, если по крайней мере 50%, а предпочтительно 60-75% образца обнаруживают одиночную полинуклеотидную последовательность и конформацию (линейную по сравнению с ковалентно связанной). В основном, чистый полипептид или по

- 5 005921 линуклеотид обычно составляет примерно 50%, а предпочтительно 60-90 мас.% от всего полипептидного или полинуклеотидного образца соответственно, а обычно его чистота составляет примерно 95%, а предпочтительно примерно более 99%. Чистоту или гомогенность полипептида и полинуклеотида определяют различными способами, хорошо известными специалистам, такими как электрофорез образца в агарозном или в полиакриламидном геле, с последующей визуализацией одиночной полосы после окрашивания геля. Для определенных целей может быть использовано более высокое разрешение с применением ВЭЖХ или других способов, хорошо известных специалистам. В качестве альтернативного варианта осуществления изобретения чистота полипептидов и полинуклеотидов настоящего изобретения может быть определена как по крайней мере, процент чистоты по отношению к гетерологичным полипептидам и полинуклеотидам (ДНК, РНК или оба этих вещества). В качестве предпочтительного варианта осуществления изобретения, полипептиды и полинуклеотиды настоящего изобретения имеют чистоту по крайней мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 98, 99 или 100% по отношению к гетерологичным полипептидам и полинуклеотидам соответственно. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения полипептиды и полинуклеотиды имеют чистоту, составляющую в пределах от любого числа до тысячных долей от 90 до 100% (например, полипептид или полинуклеотид, по крайней мере, с чистотой 99,995%) по отношению к гетерологичным полипептидам или полинуклеотидам соответственно, или их чистота может быть выражена как их массовое отношение ко всем соединениям и молекулам, кроме тех, которые присутствуют в носителе. Каждое число, представляющее процент чистоты, вплоть до тысячных долей может быть заявлено как отдельный тип чистоты.

Термин полипептид означает полимер, состоящий из аминокислот, независимо от длины этого полимера; таким образом, в понятие полипептид входят пептиды, олигопептиды и белки. Этот термин не определяет или не исключает посттрансляционные модификации полипептидов, так, например, термин полипептид охватывает полипептиды, которые включают ковалентно связанные гликозильные группы, ацетильные группы, фосфатные группы, липидные группы и т.п. В это определение входят также полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты, аминокислоты, которые присутствуют только в неродственных биологических системах, модифицированные аминокислоты, происходящие из систем млекопитающих и т.п.), полипептиды с замещенными связями, а также другие модификации, известные специалистам, как природные, так и неприродные.

Используемый здесь термин рекомбинантный полипептид означает полипептиды, которые были искусственно сконструированы и которые содержат по крайней мере две полипептидных последовательности, не присутствующие как непрерывные полипептидные последовательности в его природном окружении, либо этот термин означает полипептиды, которые были экспрессированы рекомбинантным полинуклеотидом.

Используемый здесь термин очищенный полипептид означает полипептид настоящего изобретения, который был выделен из других соединений, включая, но не ограничиваясь ими, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы и другие белки. Полипептид является, в основном, чистым в том случае, если по крайней мере 50%, а предпочтительно 60-75% образца составляет одиночная полипептидная последовательность. В основном, чистый полипептид обычно составляет примерно 50%, а предпочтительно 6090 мас.% образца белка, а обычно примерно 95%, а предпочтительно примерно более 99% по всей массе образца белка. Чистоту или гомогенность полипептида определяют способами, хорошо известными специалистам, такими как электрофорез образца в полиакриламидном геле, с последующей визуализацией одной полипептидной полосы после окрашивания геля. Для определенных целей может быть использовано более высокое разрешение с применением ВЭЖХ или других хорошо известных способов.

Используемый здесь термин животное, отличное от человека, означает любое позвоночное, отличное от человека, птицы, и более обычно млекопитающие, предпочтительно приматы, сельскохозяйственные животные, такие как свиньи, козы, овцы, ослы и лошади, кролики или грызуны, а более предпочтительно крысы или мыши. Используемый здесь термин животное означает любое позвоночное, а предпочтительно млекопитающее. В понятие животное и млекопитающее, помимо животных, перечисленных выше при определении понятия животное, отличное от человека, входит также и человек.

Используемый здесь термин антитело означает полипептид или группу полипептидов, которые состоят по крайней мере из одного связывающего домена, где домен, связывающийся с антителом, формируется в результате укладки вариабельных доменов молекулы антитела с образованием трехмерных связывающих областей, имеющих форму внутренней поверхности и распределение заряда, комплементарные элементам антигенной детерминанты данного антигена, в результате чего обеспечивается осуществление иммунологической реакции с этим антигеном. Антителами являются рекомбинантные белки, содержащие связывающие домены, а также их фрагменты, включая РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)₂ и Р (аЬ')₂-фрагменты.

Используемый здесь термин антигенная детерминанта означает часть молекулы антигена, а в данном случае, полипептид РАРАР, который определяет специфичность реакции антиген-антитело. Термин эпитоп означает антигенную детерминанту полипептида. Эпитоп может содержать по крайней мере 3 аминокислоты в пространственной конформации, которая является уникальной для этого эпитопа. В основном, эпитоп содержит по крайней мере 6 таких аминокислот, а обычно по крайней мере 8-10 та

- 6 005921 ких аминокислот. Методами определения аминокислот, имеющихся в эпитопе, являются рентгеновская кристаллография, 2-мерный ядерный магнитный резонанс и картирование эпитопа, например, метод Рерксап, описанный Сеукеп е! а1. 1984; в публикации РСТ № XVО 84/03564; и в публикации РСТ № XVО 84/03506.

В описании настоящего изобретения термин экспрессионная нуклеотидная последовательность может означать либо полинуклеотид, либо нуклеиновую кислоту. Более точно, термин экспрессионная нуклеотидная последовательность охватывает сам нуклеиновый материал и, таким образом, не ограничивается информацией о последовательности (т.е. последовательности букв, выбранной для обозначения буквенного кода из четырех оснований), которая биохимически характеризует конкретную молекулу ДНК или РНК).

Используемые здесь взаимозаменяемые термины нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды и полинуклеотиды означают последовательности РНК, ДНК или гибридные последовательности РНК/ДНК, состоящие из более чем одного нуклеотида, либо в одноцепочечной, либо в дуплексной форме. Термин нуклеотидный, используемый здесь как прилагательное, означает молекулы, содержащие РНК, ДНК или гибридные последовательности РНК/ДНК любой длины в одноцепочечной или в дуплексной форме. Термин нуклеотид, используемый здесь как существительное, означает отдельные нуклеотиды или ряд нуклеотидов, т. е. молекулу или отдельное звено в более крупной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей пурин или пиримидин, рибозную или дезоксирибозную часть и фосфатную группу, либо фосфодиэфирную связь в случае, когда нуклеотиды находятся внутри олигонуклеотида или полинуклеотида. Хотя используемый здесь термин нуклеотид охватывает модифицированные нуклеотиды, которые содержат по крайней мере одну из модификаций (а) альтернативную связывающую группу, (Ь) аналогичную форму пурина, (с) аналогичную форму пиримидина или (б) аналогичный сахар, например, аналогичные связывающие группы, пурин, пиримидин и сахара, см., например, РСТ-публикацию № νθ 95/04064. Полинуклеотидные последовательности настоящего изобретения могут быть получены любыми известными методами, включая методы синтеза, метод рекомбинантных ДНК, метод ех νίνοгенерирования или их комбинации, а также любые методы очистки, известные специалистам.

Последовательность, которая является функционально связанной с регуляторной последовательностью, такой как промотор, означает, что указанный регуляторный элемент находится в правильной локализации и ориентации по отношению к нуклеиновой кислоте и, тем самым, обеспечивает регуляцию инициации РНК-полимеразы и экспрессию нужной нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин функционально присоединенный относится к присоединению полинуклеотидных элементов в функциональной зависимости. Так, например, промотор или энхансер считаются функционально присоединенными к кодирующей последовательности, если они влияют на транскрипцию данной кодирующей последовательности.

Используемые здесь термины признак и фетотип являются взаимозаменяемыми и означают любое видимое, детектируемое или как-либо иначе определяемое свойство организма, такое как, например, симптомы или чувствительность к заболеванию. Обычно используемые здесь термины признак и фетотип означают симптомы или чувствительность к заболеванию, положительный ответ на лечение или побочные эффекты, ассоциированные с этим лечением. Предпочтительно указанными признаками могут быть, но не ограничиваются ими, злокачественные опухоли, онтогенетические заболевания и нервные болезни.

Используемый здесь термин аллель означает варианты нуклеотидной последовательности. Биаллельный полиморфизм имеет две формы. Дипольные организмы могут быть гомозиготными или гетерозиготными по аллельной форме.

Используемый здесь термин генотип означает идентичность аллелей, присутствующих у индивидуума или в образце. В контексте настоящего изобретения генотип предпочтительно означает описание биаллельных маркерных аллелей, присутствующих у индивидуума или в образце. Термин определение генотипа образца или индивидуума по биаллельному маркеру означает определение специфического аллеля или специфического нуклеотида, присутствующего в биаллельном маркере у данного индивидуума.

Используемый здесь термин мутация означает отличие в ДНК-последовательностях между различными геномами или индивидуумами либо в пределах одного генома или индивидуума, частота встречаемости которого составляет менее 1%.

Используемый здесь термин полиморфизм означает присутствие двух или нескольких альтернативных геномных последовательностей или аллелей в различных геномах или индивидуумах либо в одном геноме или индивидууме. Термин полиморфный относится к состоянию, при котором в популяции могут быть обнаружены два или несколько вариантов специфической геномной последовательности. Термин полиморфный сайт означает локус, в котором имеется изменение. Однонуклеотидный полиморфизм означает замену одного нуклеотида другим нуклеотидом в полиморфном сайте. Делеция одного нуклеотида или инсерция одного нуклеотида также приводит к однонуклеотидному полиморфизму. В контексте настоящего изобретения термин однонуклеотидный полиморфизм предпочтительно означает замену в одном нуклеотиде. Обычно у различных индивидуумов полиморфный сайт может быть занят

- 7 005921 двумя различными нуклеотидами. Используемые здесь термины биаллельный полиморфизм и биаллельный маркер являются взаимозаменяемыми и означают однонуклеотидный полиморфизм, имеющий два аллеля с высокой частотой встречаемости в данной популяции. Термин биаллельный макерный аллель означает нуклеотидные варианты, присутствующие в биаллельном маркерном сайте.

Используемый здесь термин расположенный выше относится к указанию местоположения в направлении к 5'-концу полинуклеотида от конкретной исходной точки.

Используемые здесь термины пары нуклеотидов и пары оснований Уотсона и Крика являются взаимозаменяемыми и означают нуклеотиды, которые могут быть связаны друг с другом водородной связью благодаря идентичности их последовательностей так, как это наблюдается в двухспиральной ДНК с тиминовыми или урацильными остатками, связанными с адениновыми остатками двумя водородными связями и с цитозиновыми и гуаниновыми остатками, связанными тремя водородными связями (см. 8(гуег, Ь., Вюейетуйгу 4-111 ебйюп. 1995).

Используемые здесь термины комплементарный или его комплемент относятся к последовательностям полинуклеотидов, которые способны образовывать пары оснований Уотсона и Крика с другим конкретным полинуклеотидом на протяжении всей комплементарной области. В соответствии с настоящим изобретением считается, что первый олигонуклеотид комплементарен второму полинуклеотиду, если каждое основание первого полинуклеотида спарено с комплементарным ему основанием. Обычно комплементарными основаниями считаются А и Т (или А и и), или С и С. Используемый здесь термин комплемент является синонимом комплементарного полинуклеотида, комплементарной нуклеиновой кислоты и комплементарной нуклеотидной последовательности. Эти термины применяются к парам полинуклеотидов, исходя лишь только из их последовательностей, но не имеют никакого отношения к условиям, при которых эти два полинуклеотида фактически связываются.

Варианты и фрагменты.

1. Полинуклеотиды.

Настоящее изобретение также относится к вариантам и фрагментам описанных здесь полинуклеотидов, а в частности, к гену РАРАР, содержащему один или несколько биаллельных маркеров настоящего изобретения.

Используемый здесь термин варианты полинуклеотидов означает полинуклеотиды, которые отличаются от известного полинуклеотида. Вариант полинуклеотида может быть природным вариантом, таким как природный аллельный вариант, либо он может представлять собой вариант, который не встречается в природе. Такие неприродные варианты полинуклеотида могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, используемые для мутагенеза полинуклеотидов, клеток или организмов. Обычно различия между ними являются незначительными, т.е. нуклеотидные последовательности известного полинуклеотида и варианта имеют большее сходство, а на некоторых участках они вообще идентичны.

В соответствии с настоящим изобретением вариантами полинуклеотидов являются, но не ограничиваются ими, нуклеотидные последовательности, которые по крайней мере на 95% идентичны полинуклеотиду 8ЕЭ ГО N0: 1 или 3, либо любому полинуклеотидному фрагменту, состоящему из 12 смежных нуклеотидов полинуклеотида 8ЕЭ ГО N0: 1 или 3, а предпочтительно по крайней мере на 99%, более предпочтительно по крайней мере на 99,5%, а наиболее предпочтительно по крайней мере на 99,8% идентичны полинуклеотиду 8ЕЭ ГО N0: 1 или 3 или любому полинуклеотидному фрагменту, состоящему из 12 смежных нуклеотидов полинуклеотида 8ЕЭ ГО N0: 1 или 3.

Нуклеотидные модификации, присутствующие в варианте полинуклеотида, могут быть молчащими, а это означает, что они не приводят к изменению аминокислот, кодируемых этим полинуклеотидом. Однако нуклеотидные модификации могут также приводить к заменам, добавлениям, делециям, инсерциям и усечению аминокислот в полипептиде, кодируемом известной последовательностью. Эти замены, делеции или добавления могут включать один или несколько нуклеотидов. Указанные варианты могут иметь модификации в кодирующей или некодирующей области, либо в той и другой. Изменения в кодирующей области могут приводить к продуцированию консервативных или неконсервативных аминокислотных замен, делеций или добавлений.

В контексте настоящего изобретения, особенно в предпочтительном его варианте настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, которые, в основном, сохраняют ту же самую биологическую функцию или активность, что и зрелый белок РАРАР, или к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды, которые сохраняют или имеют повышенную какую-либо определенную биологическую активность, но пониженную какую-либо другую биологическую активность.

Полинуклеотидный фрагмент означает полинуклеотид, имеющий последовательность, которая, в целом, идентична, но не всей данной нуклеотидной последовательности, а предпочтительно нуклеотидной последовательности гена РАРАР и его вариантов. Этот фрагмент может быть частью интрона или экзона гена РАРАР. Он может быть также частью регуляторных областей РАРАР.

Такие фрагменты могут находиться в свободном состоянии, т.е. они не являются частью других полинуклеотидов или не связаны с другими полинуклеотидом, либо они могут находиться в одном более крупном полинуклеотиде, часть или участок которого они образуют. Действительно, несколько из этих фрагментов могут присутствовать в одном более крупном полинуклеотиде.

- 8 005921

Необязательно, такие фрагменты могут состоять или, в основном, состоять из непрерывного участка по крайней мере из 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 смежных нуклеотидов.

2. Полипептиды.

Настоящее изобретение также относится к вариантам, фрагментам, аналогам и производным описанных здесь полипептидов, включая мутированные белки РАРАР.

Таким вариантом может быть 1) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативными или неконсервативными аминокислотными остатками, и такие замененные аминокислотные остатки могут кодироваться, а могут и не кодироваться генетическим кодом, или 2) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков включают замещающую группу, или 3) вариант, в котором мутированный РАРАР присоединен к другому соединению, такому как соединение, которое увеличивает время полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль), или 4) вариант, в котором к мутированному РАРАР присоединены дополнительные аминокислоты, такие как лидерная или секреторная последовательность или последовательность, которая используется для очистки мутированного РАРАР или предпоследовательности белка. Очевидно, что такие варианты входят в объем настоящего изобретения.

Полипептидный фрагмент представляет собой полипептид, имеющий последовательность, которая полностью аналогична части, но не всей последовательности данного полипептида, а предпочтительно полипептид, кодируемый геном РАРАР и его вариантами.

В случае замены аминокислот в аминокислотной последовательности полипептида настоящего изобретения одна или несколько аминокислот могут быть заменены эквивалентными аминокислотами. Используемый здесь термин экспрессируемая эквивалентная аминокислота используется для обозначения любой аминокислоты, которая может быть замещена одной из аминокислот, имеющей аналогичные свойства, которые, например, как известно специалисту в области пептидной химии, в основном, не должны изменять предполагаемую вторичную структуру и гидропатическую природу данного полипептида. Обычно эквивалентные замены могут быть сделаны в пределах нижеследующих групп аминокислот (1) А1а, Рго, О1у, О1и, Акр, О1п, Акп, 8ет, Т1г; (2) Сук, 8ет, Туг, Т1г; (3) Уа1, 11е, Ьеи, Мс1. А1а, Р1е; (4) Ьук, Агд, Ηίκ; (5) Р1е, Туг, Тгр, Ηίκ.

Конкретными вариантами модифицированной пептидной молекулы РАРАР, представляющей интерес для настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, пептидная молекула, которая обладает резистентностью к протеолизу; пептид, в котором пептидная связь -СОИН- модифицирована и заменена на восстановленную связь (СН₂ИН), ретро-инверсосвязь (ИНСО), метиленоксисвязь (СН₂О), тиометиленовую связь (СН₂8), карбасвязь (СН₂СН₂), цетометиленовую связь (СО-СН₂), гидроксиэтиленовую связь (СНОН-СН₂), связь (Ν-Ν), Е-альценовую связь или также связь -СН=СН-. Настоящее изобретение также относится к человеческому полипептиду РАРАР или к его фрагменту или варианту, в которых по крайней мере одна пептидная связь была модифицирована как описано выше.

Указанные фрагменты могут находиться в свободном состоянии, т.е. не являются частью других полипептидов или не присоединяются к другим полипептидам, либо они могут находиться в одном более крупном полипептиде, часть или область которого они образуют. Однако в одном более крупном полипептиде могут находиться несколько фрагментов.

В качестве репрезентативных примеров полипептидных фрагментов настоящего изобретения могут быть упомянуты фрагменты, имеющие длину примерно в 5, 6, 8, 9 или 10-15, 10-20, 15-40 или 30-55 аминокислот. Предпочтительными являются фрагменты, содержащие по крайней мере одну аминокислотную мутацию в белке РАРАР.

Идентичность между нуклеиновыми кислотами или полипептидами

Используемые здесь термины процент идентичности последовательности и процент гомологии являются взаимозаменяемыми и означают степень идентичности и гомологии полинуклеотидов и полипептидов, которая определяется путем сравнения двух первичных последовательностей, оптимально сопоставляемых в окне сравнения, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в данном окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит этих добавлений или делеций), где эти добавления или делеции были внесены для оптимального выравнивания этих двух последовательностей. Процент вычисляют путем определения числа положений, в которых находятся идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки в обеих последовательностях, в результате чего получают число соответствующих положений, делят полученное число соответствующих положений на общее число положений в окне сравнения и полученный результат умножают на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Гомологию оценивают с использованием любого ряда алгоритмов и программ для сравнения последовательностей, известных специалистам. Такими алгоритмами и программами являются, но не ограничиваются ими, ТВЬА8ТИ, ВЬА8ТР, ЕА8ТА, ТЕА8ТА и СЬи8ТАЕ^ (Реагкоп & Ыршап, 1988; А1!кс1и1 е! а1., 1990; Тйошркоп е! а1., 1994; Шддшк е! а1., 1996; А1!бсйи1 е! а1., 1990; А11кс1ш1 е! а1., 1993). В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гомологию последовательностей белков и нуклеиновых кислот оценивают с использованием про

- 9 005921 граммы Ваис Ьоса1 ЛНдптсШ ЗеагсН Тоо1 (ВЬА8Т) (программы поиска в базах данных посредством локального выравнивания последовательностей), хорошо известной специалистам (см., например, Каг1ш & А11ксйи1, 1990; А11ксйи1 с1 а1., 1990, 1993, 1997). В частности, для решения нижеследующих задач были использованы пять конкретных программ ВЬЛ8Т (1) ВЬА8ТР и ВЬЛ8Т3 осуществляют сравнение запрашиваемой аминокислотной последовательности с последовательностями белка базы данных;

(2) ВЬА§ТЫ осуществляет сравнение запрашиваемой нуклеотидной последовательности с нуклеотидными последовательностями базы данных;

(3) ВЬА8ТХ осуществляет сравнение концептуальных продуктов трансляции в шести рамках считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обеих цепей) с последовательностями белка базы данных;

(4) ТВЬА8ТХ осуществляет сравнение запрашиваемой последовательности белка нуклеотидных последовательностей с нуклеотидными последовательностями базы данных, транслируемыми во всех шести рамках считывания; и (5) ТВЬА8ТХ осуществляет сравнение продуктов трансляции в шести рамках считывания запрашиваемой нуклеотидной последовательности с продуктами трансляции нуклеотидных последовательностей базы данных в шести рамках считывания.

Программы ВЬА8Т позволяют идентифицировать гомологичные последовательности путем идентификации аналогичных сегментов, называемых здесь пары сегментов с высокой оценкой, для запрашиваемой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты и тестпоследовательности, которая была получена предпочтительно из базы данных последовательностей белка или нуклеиновой кислоты. Пары сегментов с высокой оценкой предпочтительно идентифицируют (т.е. сопоставляют) методами, в которых используют оценочную матрицу и многие из которых известны специалистам. Предпочтительно используемой оценочной матрицей является матрица ВЬО8иМ62 (Соппс1 с1 а1., 1992; НсшкоГГ & НсшкоГГ. 1993). Могут быть также использованы матрицы РАМ или РАМ250, но они являются менее предпочтительными (см., например, 8с11\\'аг1х & ОауйоГГ, ейк., 1978). Программы ВЬА8Т позволяют оценивать статистическую значимость всех идентифицированных пар сегментов с высокой оценкой и предпочтительно отбирать те сегменты, которые удовлетворяют определенному пользователем порогу значимости, такому как определенный пользователем процент гомологии. Предпочтительно статистическую значимость пары сегментов с высокой оценкой определяют по формуле статистической значимости Кагйи (см., например, Кагйи & А11ксйи1, 1990).

Программы ВЬА8Т могут быть использованы с параметрами по умолчанию или с модифицированными параметрами, введенными пользователем.

Жесткие условия гибридизации

Для определения гибридизующейся нуклеиновой кислоты настоящего изобретения были использованы следующие жесткие условия гибридизации: стадию гибридизации осуществляют при 65°С в присутствии буфера 6 х 88С, 5 х раствора Денхардта, 0,5% ДСН и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося.

После стадии гибридизации осуществляют четыре стадии промывки

- две промывки в течение 5 мин предпочтительно при 65°С в буфере 2 х 88С и 0,1% ДСН;

- одна промывка в течение 30 мин предпочтительно при 65°С в буфере 2 х 88С и 0,1% ДСН;

- одна промывка в течение 10 мин предпочтительно при 65°С в буфере 0,1 х 88С и 0,1% ДСН, эти условия гибридизации являются подходящими для молекулы нуклеиновой кислоты длиной примерно в 20 нуклеотидов. Нет необходимости объяснять, что описанные выше условия гибридизации должны быть адаптированы в соответствии с длиной нужной нуклеиновой кислоты методами, хорошо известными специалистам. Подходящие условия гибридизации могут быть, например, адаптированы в соответствии с методами, описанными в книге Натек & Нэддтк (1985).

Геномные последовательности гена РАРАР

Настоящее изобретение относится к геномной последовательности РАРАР. Настоящее изобретение охватывает ген РАРАР или геномные последовательности РАРАР, состоящие или в основном состоящие из последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 или содержащие указанную последовательность; комплементарную ей последовательность; а также ее фрагменты и варианты. Указанные полинуклеотиды могут быть очищенными, выделенными или рекомбинантными.

Нуклеиновыми кислотами РАРАР являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок, или в основном состоящие или состоящие из указанного непрерывного участка, охватывающего по крайней мере 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 или комплементарной последовательности. Нуклеиновыми кислотами РАРАР могут быть также выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок, или в основном состоящие или состоящие из указанного непрерывного участка, охватывающего по крайней мере 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов, выбранных из группы нуклеотидов в положениях 1-3038, 1-421, 422-557, 2158-2218 и 2620-3039 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 3 или комплементарной последовательности. Настоящее изобретение также охватывает очищенный,

- 10 005921 выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, которая по крайней мере на 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕЭ ГО N0: 3, или комплементарной последовательности, или ее фрагменту. Различия в нуклеотидах по отношению к нуклеотидной последовательности 8ЕЭ ГО N0: 3 могут быть, в основном, случайно распределены по всей длине нуклеиновой кислоты. Тем не менее, предпочтительными нуклеиновыми кислотами являются нуклеиновые кислоты, в которых различия в нуклеотидах по отношению к нуклеотидной последовательности 8ЕЭ ГО N0: 3 преимущественно локализованы за пределами кодирующих последовательностей, содержащихся в экзонах. Эти нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты могут быть использованы в качестве олигонуклеотидных праймеров или зондов для детекции присутствия копии гена РАРАР в тестируемом образце, или альтернативно, для амплификации нужной нуклеотидной последовательности в последовательностях РАРАР. Другим объектом настоящего изобретения является очищенная, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации, описанных выше, с нуклеотидной последовательностью 8ЕЭ ГО N0: 3, или с ее комплементарной последовательностью, или с ее вариантом.

Хотя этот раздел озаглавлен Геномные последовательности РАРАР, однако, следует отметить, что фрагменты нуклеиновой кислоты, имеющие любой размер и любую последовательность, могут также охватывать описанные в этом разделе полинуклеотиды, фланкирующие геномные последовательности РАРАР на любой стороне указанных геномных последовательностей или между двумя или несколькими такими последовательностями.

кДНК-последовательности РАРАР

Было показано, что экспрессия гена РАРАР приводит к продуцированию по крайней мере одной молекулы мРНК, нуклеотидная последовательность которой представлена в 8ЕЭ ГО N0: 1.

Другим объектом настоящего изобретения является очищенная, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность 8ЕЭ ГО N0: 1; комплементарные ей последовательности, а также ее аллельные варианты и фрагменты. Кроме того, предпочтительными полинуклеотидами настоящего изобретения являются очищенные, выделенные или рекомбинантные кДНК РАРАР, состоящие или в основном состоящие из последовательности 8ЕЭ ГО N0: 1, или содержащие эту последовательность. Особенно предпочтительными нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок или в основном состоящие или состоящие из непрерывного участка, охватывающего по крайней мере 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов последовательности 8ЕЭ ГО N0: 1 или комплементарной последовательности. Нуклеиновыми кислотами также являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов 8ЕЭ ГО N0: 1 или комплементарной последовательности, где указанный непрерывный участок включает по крайней мере 1, 2, 3, 3 или 10 из нижеследующих нуклеотидных положений 8ЕЭ ГО N0: 1: 1-140, 141-460, 460-690, 87-346 и 691-1104. Другими предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов 8ЕЭ ГО N0: 1 или комплементарную последовательность, где указанный непрерывный участок охватывает биаллельный маркер.

Настоящее изобретение также относится к выделенной или очищенной нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, имеющий по крайней мере 95%-ную идентичность нуклеотидов с полинуклеотидом 8ЕЭ ГО N0: 1, преимущественно 99%-ную идентичность, предпочтительно 99,5%-ную идентичность, а наиболее предпочтительно 99,8%-ную идентичность нуклеотидов с полинуклеотидом 8ЕЭ ГО N0: 1, или с комплементарной последовательностью, или с ее биологически активным фрагментом.

Другим объектом настоящего изобретения являются очищенные, выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащие полинуклеотид, который гибридизуется в вышеуказанных жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом 8ЕЭ ГО N0: 1 или с комплементарной последовательностью, или с его вариантом, или с биологически активным фрагментом.

кДНК 8ЕЭ ГО N0: 1 включает 5'ИТК-область, начинающуюся от нуклеотида в положении 1 и заканчивающуюся нуклеотидом в положении 86 8ЕЭ ГО N0: 1. кДНК 8ЕЭ ГО N0: 1 включает 3'ИТКобласть, начинающуюся от нуклеотида в положении 347 и заканчивающуюся нуклеотидом в положении 1104 8ЕЭ ГО N0: 1. Сигнал полиаденилирования начинается от нуклеотида в положении 1085 и заканчивается нуклеотидом в положении 1104 8ЕЭ ГО N0: 1.

Следовательно, настоящее изобретение относится к очищенной, выделенной или рекомбинантой нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность 5'ИТК. кДНК РАРАР, комплементарную ей последовательность или ее аллельный вариант. Настоящее изобретение также относится к очищенной, выделенной или нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность 3'ИТК. кДНК РАРАР, комплементарную ей последовательность или ее аллельный вариант.

Хотя этот раздел озаглавлен кДНК последовательности РАРАР, однако, следует отметить, что фрагменты нуклеиновой кислоты, имеющие любой размер и любую последовательность, могут также

- 11 005921 охватывать описанные в этом разделе полинуклеотиды, фланкирующие геномные последовательности РАРАР на любой стороне указанных геномных последовательностей или между двумя или несколькими такими последовательностями.

Кодирующие последовательности

Открытая рамка считывания РАРАР содержится в соответствующей мРНК 8ЕО ΙΌ N0: 1. Более точно, эффективная кодирующая последовательность РАРАР (СЭ8) включает область, расположенную между нуклеотидом в положении 87 (первый нуклеотид кодона АТС) и нуклеотидом в положении 346 (конечный нуклеотид кодона ТСА) 8Е0 ΙΌ N0: 1. Настоящее изобретение также относится к выделенным, очищенным и рекомбинантным полинуклеотидам, кодирующим непрерывный участок по крайней мере из 6 смежных аминокислот, предпочтительно по крайней мере 8 или 10 смежных аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 смежных аминокислот последовательности 8Е0 ΙΩ N0: 2.

Вышеописанный полинуклеотид, который содержит кодирующую последовательность гена РАРАР, может быть экспрессирован в нужной клетке-хозяине или в нужном организме-хозяине при помещении этого полинуклеотида под контроль подходящих сигналов экспрессии. Сигналами экспрессии могут быть либо сигналы, содержащиеся в регуляторных областях в гене РАРАР настоящего изобретения, либо, наоборот, этими сигналами могут быть экзогенные регуляторные последовательности нуклеиновой кислоты. Такой полинуклеотид, помещаемый под контроль подходящих сигналов экспрессии, может быть также встроен в вектор для его экспрессии и/или амплификации.

Регуляторные последовательности РАРАР

Как упоминалось выше, геномная последовательность гена РАРАР содержит регуляторные последовательности в некодирующей 5'-фланкирующей области и в некодирующей 3'-фланкирующей области, которая граничит с кодирующей областью РАРАР, содержащей три экзона этого гена.

Полинуклеотиды, происходящие от 5'- и 3'-регуляторных областей, могут быть использованы для детекции присутствия по крайней мере одной копии нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 3 или ее фрагмента в тестируемом образце.

Промоторная активность 5'-регуляторных областей, находящихся в РАРАР, может быть оценена, как описано ниже.

Для идентификации соответствующих биологически активных полинуклеотидных фрагментов или вариантов 8Е0 ΙΌ N0: 3 следует обратиться к книге 8атЬгоок с! а1. (8атЬгоок, 1989), где описано использование рекомбинантного вектора, несущего маркерный ген (т. е. ген бета-галактозидазы, хлорамфениколацетилтрансферазы и т.п.), экспрессия которого может детектироваться при его помещении под контроль биологически активных полинуклеотидных фрагментов или вариантов 8Е0 ΙΌ N0: 3. Геномные последовательности, локализованные выше первого экзона гена РАРАР, клонировали в репортерный вектор с подходящим промотором, таким как ρδΕΑΡ-основа, р8ЕАР-энхансер, рвда1-основа, рвда1энхансер, или в репортерные векторы с подходящим промотором, рЕСРР-1, изготавливаемые С1оп1сс11. или вектор рСЬ2-основа или рСЬ3-основа с репортерным геном люциферазы без промотора, изготавливаемый Рготеда. Вкратце, каждый из этих векторов с промотором включает сайты множественного клонирования, расположенные выше репортерного гена, кодирующего легко оцениваемый белок, такой как секретированная щелочная фосфатаза, люцифераза, β-галактозидаза или белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне спектра. Последовательности, расположенные выше кодирующей области РАРАР, встраивают в сайты клонирования выше от репортерного гена в обеих ориентациях и вводят в соответствующую клетку-хозяина. Уровень репортерного белка анализируют и сравнивают с уровнем, полученным от вектора, у которого отсутствует вставка в сайте клонирования. Повышенный уровень экспрессии в векторе, содержащем эту вставку, по сравнению с контрольным вектором указывает на присутствие промотора в данной вставке. Если необходимо, то вышерасположенные последовательности могут быть клонированы в векторы, содержащие энхансер для повышения уровня транскрипции, осуществляемой под контролем последовательностей слабого промотора. Значительный уровень вышеуказанной экспрессии, наблюдающийся в векторе, у которого отсутствует вставка, указывает на то, что промоторная последовательность присутствует во встроенной вышерасположенной последовательности.

Промоторная последовательность в вышерасположенной геномной ДНК может быть затем определена путем конструирования гнездовых 5' и/или 3' делеций в вышерасположенной ДНК с использованием стандартной техники, такой как гидролиз экзонуклеазой ΙΙΙ или соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой. Полученные делеционные фрагменты могут быть встроены в репортерный вектор с промотором для того, чтобы определить, оказывает ли эта делеция ослабляющее или полностью ингибирующее влияние на активность промотора, такое как, например, описано в работе Со1е§ е! а1. (1998), описание которой во всей своей полноте вводится в настоящую заявку посредством ссылки. Таким образом, могут быть определены границы этих промоторов. Если это необходимо, то потенциальные отдельные регуляторные сайты внутри этого промотора могут быть идентифицированы с использованием сайтнаправленного мутагенеза или линкерного сканирования либо отдельно, либо в комбинации для элиминации потенциальных сайтов связывания с факторами транскрипции внутри этого промотора. Влияние

- 12 005921 этих мутаций на уровни транскрипции могут быть определены путем введения мутаций в сайты клонирования в репортерные векторы с промотором. Анализы такого типа хорошо известны специалистам и описаны в АО 97/17359, в патенте США № 5374544, в ЕР 582796, в патенте США № 5698389, в патенте США № 5643746, в патенте США № 5502176 и в патенте США № 5266488; описание которых во всей своей полноте вводятся в настоящую заявку посредством ссылки.

Сила и специфичность промотора гена РАРАР может быть оценена по уровням экспрессии детектируемого полинуклеотида, функционально связанного с промотором РАРАР, в клетках и тканях различных типов. Детектируемый полинуклеотид может быть либо полинуклеотидом, который специфически гибридизуется с предварительно определенным олигонуклеотидным зондом, либо с полинуклеотидом, кодирующим детектируемый белок, включая полипептид РАРАР, или его фрагмент, или вариант. Этот тип анализа хорошо известен специалистам и описан в патенте США № 5502176 и в патенте США № 5266488, описания которых во всей своей полноте вводятся в настоящую заявку посредством ссылки. Некоторые из этих методов более подробно описаны ниже.

Полинуклеотиды, несущие регуляторные элементы, локализованные у 5'-конца и у 3'-конца кодирующей области РАРАР, могут быть использованы преимущественно для регуляции транскрипционной и трансляционной активности нужного гетерологичного полинуклеотида.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к очищенной или выделенной нуклеиновой кислоте, включающей полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из 5'- и 3'-регуляторных областей, или к комплементарной последовательности, или к ее биологически активному фрагменту, или варианту. В одном из своих аспектов 5'-регуляторная область содержит нуклеотидную последовательность, локализованную между положениями 1 и 421 8ЕО ГО N0: 3. В одном из аспектов настоящего изобретения 3'-регуляторная область содержит нуклеотидную последовательность, локализованную между положениями 3040 и 3189 8ЕО ГО N0: 3.

Настоящее изобретение также относится к очищенной или выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей полинуклеотид, имеющий по крайней мере 95%-ную идентичность нуклеотидов с полинуклеотидом 8Е0 ГО N0: 1, выбранным из группы, состоящей из 5'- и 3'-регуляторных областей, преимущественно 99%-ную идентичность, предпочтительно 99,5%-ную идентичность, а наиболее предпочтительно 99,8%-ную идентичность с полинуклеотидом 8Е0 ГО N0: 1, выбранным из группы, состоящей из 5'- и 3'регуляторных областей, или с комплементарной последовательностью, или его биологически активным фрагментом.

Другим объектом настоящего изобретения является очищенная или выделенная нуклеиновая кислота, содержащая полинуклеотид, который гибридизуется в описанных здесь жестких условиях гибридизации, описанных выше, с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 5'- и 3'-регуляторных областей, или с комплементарной последовательностью, или с его вариантом, или биологически активным фрагментом.

Предпочтительные фрагменты 5'-регуляторной области имеют длину примерно 1500 или 1000 нуклеотидов, а предпочтительно примерно 500 нуклеотидов, более предпочтительно примерно 400 нуклеотидов, еще более предпочтительно 300 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно примерно 200 нуклеотидов.

Предпочтительные фрагменты 3'-регуляторной области имеют длину по крайней мере 50, 100, 150, 200, 300 или 400 оснований.

Биологически активными производными полинуклеотидов 8Е0 ГО N0: 3 являются полинуклеотиды, содержащие фрагмент, или, альтернативно, содержащиеся во фрагменте указанного полинуклеотида, который является функциональной регуляторной областью, контролирующей экспрессию рекомбинантного полипептида или рекомбинантного полинуклеотида в рекомбинантной клетке-хозяине. Он может действовать как энхансер или как репрессор.

В соответствии с настоящим изобретением нуклеиновая кислота или полинуклеотид является функциональными в качестве регуляторной области, контролирующей экспрессию рекомбинантного полипептида или рекомбинантного полинуклеотида, в том случае, если указанный регуляторный полинуклеотид имеет нуклеотидные последовательности, которые содержат транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности, и такие последовательности являются функционально присоединенными к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют нужный полипептид или нужный полинуклеотид.

Регуляторные полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть получены из нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 3 путем расщепления подходящими рестриктирующими ферментами, как описано, например, в книге 8атЬтоок е1 а1. (1989). Регуляторные полинуклеотиды могут быть также получены путем гидролиза 8Е0 ГО N0: 3 ферментом экзонуклеазой, такой как Ва131 (АаЫко е1 а1., 1986). Эти регуляторные полинуклеотиды могут быть также получены путем химического синтеза нуклеиновых кислот, как описано в настоящей заявке.

Регуляторные полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть частью рекомбинантного экспрессирующего вектора, который может быть использован для экспрессии кодирующей последовательности в нужной клетке-хозяине или в организме-хозяине. Рекомбинантные экспрессирующие векторы

- 13 005921 настоящего изобретения описаны в настоящей заявке.

Предпочтительно 5'-регуляторный полинуклеотид настоящего изобретения включает 5'-нетранслируемую область (5'ИТК.) кДНК РАРАР, или ее биологически активный фрагмент, или вариант.

Предпочтительно З'-регуляторный полинуклеотид настоящего изобретения включает З'-нетранслируемую область (З'ИТК.) кДНК РАРАР, или ее биологически активный фрагмент, или вариант.

Другим объектом настоящего изобретения является очищенная или выделенная нуклеиновая кислота, включающая

a) нуклеиновую кислоту, содержащую регуляторную нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (ί) нуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотид 5'-регуляторной области, или комплементарной ей последовательности;

(ίί) нуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотид, имеющий по крайней мере 95%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью 5'-регуляторной области, или комплементарной ей последовательности;

(ΐϊϊ) нуклеотидной последовательности, содержащей полинуклеотид, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с нуклеотидной последовательностью 5'-регуляторной области, или с комплементарной последовательностью; и (ίν) биологически активного фрагмента или варианта полинуклеотидов в (ί), (й) и (ίίί);

b) полинуклеотид, кодирующий нужный полипептид или нужную нуклеиновую кислоту и функционально присоединенный к нуклеиновой кислоте, определенной выше в (а);

c) необязательно, нуклеиновую кислоту, содержащую З'-регуляторный полинуклеотид, предпочтительно З'-регуляторный полинуклеотид гена РАРАР.

В конкретном варианте определенной выше нуклеиновой кислоты указанная нуклеиновая кислота включает 5'-нетранслируемую область (5'ИТК) кДНК РАРАР, или ее биологически активный фрагмент, или вариант.

Во втором конкретном варианте определенной выше нуклеиновой кислоты, указанная нуклеиновая кислота включает З'-нетранслируемую область (З'ИТК) кДНК РАРАР, или ее биологически активный фрагмент, или вариант.

Регуляторный полинуклеотид 5'-регуляторной области или его биологически активные фрагменты или варианты функционально присоединены у 5'-конца полинуклеотида, кодирующего нужный полипептид или полинуклеотид.

Регуляторный полинуклеотид З'-регуляторной области или его биологически активные фрагменты или варианты функционально присоединены преимущественно у З'-конца полинуклеотида, кодирующего нужный полипептид или полинуклеотид.

Нужный полипептид, кодируемый вышеописанной нуклеиновой кислотой, может иметь любую природу или любое происхождение, включая белки прокариотов или эукариотов. Полипептидами, экспрессируемыми под контролем регуляторной области РАРАР, являются бактериальные, грибковые или вирусные антигены. Такие полипептиды также охватывают эукариотические белки, такие как внутриклеточные белки, например белки домашнего хозяйства, мембрано-ассоциированные белки, такие как рецепторы, и секретированные белки, например эндогенные медиаторы, такие как цитокины. Нужным полипептидом может быть белок РАРАР, а в частности белок аминокислотной последовательности 8Εφ ΙΌ N0: 2, или ее фрагмент, или вариант.

Нужные нуклеиновые кислоты, кодируемые вышеуказанным полинуклеотидом, обычно РНКмолекула, могут быть комплементарны нужному кодирующему полинуклеотиду, например РАРАРкодирующей последовательности, а поэтому они могут быть использованы в качестве антисмыслового полинуклеотида.

Такой полинуклеотид может быть включен в рекомбинантный экспрессирующий вектор для экспрессии нужного полипептида или нужной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине или организмехозяине. Подходящие рекомбинантные векторы, которые содержат определенный здесь полинуклеотид, описаны в других разделах настоящей заявки.

Полинуклеотидные конструкции

Используемые здесь термины полинуклеотидная конструкция и рекомбинантный полинуклеотид являются взаимозаменяемыми и означают линейный или кольцевой, очищенный или выделенный полинуклеотид, который был искусственно сконструирован и который содержит по крайней мере две нуклеотидных последовательности, не являющиеся смежными нуклеотидными последовательностями в их природном окружении.

ДНК-конструкция, которая регулирует временную и пространственную экспрессию гена РАРАР в рекомбинантных клетках-хозяевах и в трансгенных животных

Для исследования физиологических и фенотипических последствий отсутствия синтеза белка РАРАР как на клеточном уровне, так и в многоклеточном организме, настоящее изобретение также охватывает ДНК-конструкции и рекомбинантные векторы, обеспечивающие зависимую от внешних условий экспрессию специфического аллеля геномной последовательности или кДНК-последовательности гена

- 14 005921

РАРАР, а также копии этой геномной последовательности или кДНК, имеющей замены, делеции или добавления одного или нескольких оснований, по сравнению с нуклеотидной последовательностью РАРАР 8Е0 ΙΌ N0: 1 и 3, или ее фрагментом, где указанные замены, делеции или добавления оснований имеются либо в экзоне, либо в интроне, либо в регуляторной последовательности, но предпочтительно в 5'-регуляторной последовательности, или в экзоне геномной последовательности РАРАР, или в кДНК РАРАР 8Е0 ΙΌ N0: 1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность РАРАР содержит биаллельный маркер.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам, содержащим любой из полинуклеотидов, описанных в настоящем изобретении. Более конкретно, полинуклеотидные конструкции настоящего изобретения могут включать любой полинуклеотид, описанный в разделах Геномные последовательности гена РАРАР, кДНК-последовательности РАРАР, Кодирующие области и Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

Первая предпочтительная ДНК-конструкция основана на опероне резистентности к тетрациклину 1с1. происходящем от транспозона Тп10 Е.со11 и используемом для регуляции экспрессии гена РАРАР, как описано Соккеп е! а1. (1992, 1995) и Еибй е! а1. (1994). Такая ДНК-конструкция содержит семь операторных последовательностей 1с1 от Тп10 (1е1ор), которые присоединены либо к минимальному промотору, либо к 5'-регуляторной последовательности гена РАРАР, где указанный минимальный промотор или указанная регуляторная последовательность гена РАРАР функционально присоединена к нужному полинуклеотиду, который кодирует смысловой или антисмысловой олигонуклеотид, или полипептид, включая полипептид РАРАР или его пептидный фрагмент. Эта ДНК-конструкция является функциональной в отношении зависимой от внешних условий экспрессии нужной нуклеотидной последовательности в том случае, когда та же самая клетка также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую репрессор дикого типа (!ТА) или мутантный репрессор (гТА), присоединенный к активирующему домену вирусного белка ΥΡ16 вируса простого герпеса, находящемуся под контролем промотора, такого как энхансер/промотор НСМУ1Е1 ММТУ-ЬТК. Действительно, предпочтительная ДНК-конструкция настоящего изобретения включает полинуклеотид, содержащий последовательности оператора !е!, и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую репрессор !ТА или гТА.

В конкретном варианте осуществления изобретения ДНК-конструкция с зависимой от внешних условий экспрессией содержит последовательность, кодирующую мутантный тетрациклиновый репрессор гТА, где экспрессия нужного полинуклеотида не происходит в отсутствие тетрациклина и индуцируется в его присутствии.

ДНК-конструкции, способствующие гомологичной рекомбинации: векторы замещения

Вторая предпочтительная ДНК-конструкция содержит от 5'-конца до 3'-конца (а) первую нуклеотидную последовательность, которая содержится в геномной последовательности РАРАР; (Ь) нуклеотидную последовательность, содержащую маркер позитивного отбора, такой как маркер резистентности к неомицину (пео); и (с) вторую нуклеотидную последовательность, которая находится в геномной последовательности РАРАР и расположена на геноме ниже первой нуклеотидной последовательности РАРАР (а).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения, эта ДНК-конструкция также включает маркер негативного отбора, расположенный выше нуклеотидной последовательности (а) или ниже нуклеотидной последовательности (с). Маркер негативного отбора предпочтительно содержит ген тимидинкиназы (!к) (ТЕотак е! а1., 1986), ген гигромицина-бета (Те К1е1е е! а1., 1990), ген НрП (Уап бег Ьц§! е! а1., 1991; Ке1б е! а1., 1990) или ген фрагмента дифтерийного токсина А (Э!-А) (№1ба е! а1., 1993; Уащ е! а1., 1990). Маркер позитивного отбора предпочтительно локализован в последовательности экзона РАРАР так, что он прерывает последовательность, кодирующую белок РАРАР. Эти векторы замещения описаны, например, ТЕотак е! а1. (1986; 1987), Мапкоиг е! а1. (1988) и Ко11ег е! а1. (1992).

Первая и вторая нуклеотидные последовательности (а) и (с) могут быть независимо локализованы в регуляторной последовательности РАРАР, в интронной последовательности, в экзонной последовательности или в последовательности, содержащей регуляторную, и/или интронную, и/или экзонную последовательности. Размер нуклеотидных последовательностей (а) и (с) составляет в пределах от 1 до 50 т.п.н., предпочтительно от 1 до 10 т.п.н., более предпочтительно от 2 до 6 т.п.н., а наиболее предпочтительно от 2 до 4 т. п. н.

ДНК-конструкции, способствующие гомологичной рекомбинации: система Сге-1охР

Эти новые ДНК-конструкции позволяют использовать сайт-специфическую рекомбинантную систему фага Р1. Этот фаг Р1 имеет рекомбиназу, обозначенную Сге, которая специфически взаимодействует с 34 парами оснований сайта 1охР. Сайт 1охР состоит из двух палиндромных последовательностей в 13 п.н., разделенных консервативной последовательностью в 8 п.н. (Ноекк е! а1., 1986). Рекомбинация под действием фермента Сге между двумя сайтами 1охР, имеющими идентичную ориентацию, приводит к делеции ДНК-фрагмента.

Система Сге-1охР, используемая в комбинации с техникой гомологичной рекомбинации, была впервые описана Си е! а1. (1993, 1994). Вкратце, нужная нуклеотидная последовательность, встраиваемая в нужное положение генома, имеет по крайней мере два сайта 1охР в той же самой ориентации и расположена у соответствующих концов нуклеотидной последовательности, вырезаемой из рекомбинантного

- 15 005921 генома. Для такого вырезания требуется присутствие фермента рекомбиназы (Сге) в ядре рекомбинантной клетки-хозяина. Фермент рекомбиназа может запускаться в нужное время либо посредством (а) инкубирования рекомбинантных клеток-хозяев в культуральной среде, содержащей этот фермент, путем инъекции фермента Сге непосредственно в нужную клетку, как описано Лгак1 е! а1. (1995), либо путем липофекции этого фермента в клетки, как описано ВаиЬошк е! а1. (1993); (Ь) трансфекции клетки-хозяина вектором, содержащим последовательность, кодирующую Сге и функционально присоединенную к промотору, являющемуся функциональным в рекомбинантной клетке-хозяине и необязательно индуцибельным, где указанный вектор вводят в рекомбинантную клетку-хозяина, как описано Си е! а1. (1993) и 8аиег е! а1. (1988); (с) введения в геном клетки-хозяина полинуклеотида, содержащего последовательность, кодирующую Сге и функционально присоединенную к промотору, являющемуся функциональным в рекомбинантной клетке-хозяине и необязательно индуцибельным, где указанный полинуклеотид встраивают в геном клетки-хозяина либо путем произвольной инсерции, либо гомологичной рекомбинации, как описано Си е! а1. (1994).

В конкретном варианте осуществления изобретения вектор, содержащий последовательность, встраиваемую в ген РАРАР путем гомологичной рекомбинации, конструируют так, чтобы селективные маркеры были фланкированы сайтами 1охР в той же самой ориентации, если это возможно, путем обработки ферментом Сге для элиминации селективных маркеров, еще присутствующих в нужных последовательностях РАРАР, которые были инсертированы путем гомологичной рекомбинации. И в этом случае необходимы два селективных маркера: маркер позитивного отбора для отбора на событие рекомбинации и маркер негативного отбора для отбора на событие гомологичной рекомбинации. Векторы и методы с использованием системы Сге-1охР описаны Ζου е! а1. (1994).

Таким образом, третья предпочтительная ДНК-конструкция включает от 5'-конца до 3'-конца: (а) первую нуклеотидную последовательность, которая содержится в геномной последовательности РАРАР; (Ь) нуклеотидную последовательность, содержащую полинуклеотид, кодирующий маркер позитивного отбора, где указанная нуклеотидная последовательность содержит две дополнительные последовательности, определяющие сайт, распознаваемый рекомбиназой, такой как сайт 1охР, причем два этих сайта находятся в одной и той же ориентации; и (с) вторую нуклеотидную последовательность, которая находится в геномной последовательности РАРАР и расположена на геноме ниже первой нуклеотидной последовательности РАРАР (а).

Последовательности, определяющие сайт, распознаваемый рекомбиназой, такой как сайт 1охР, предпочтительно локализованы в нуклеотидной последовательности (Ь) в подходящих положениях, фланкирующих нуклеотидную последовательность, которая должна быть вырезана в зависимости от окружающих условий. В одном из вариантов осуществления изобретения два сайта 1охР локализованы с каждой стороны последовательности маркера позитивного отбора так, чтобы ее вырезание происходило в нужное время после события гомологичной рекомбинации.

В предпочтительном варианте способа, предусматривающего использование третьей ДНКконструкции, описанной выше, вырезание полинуклеотидного фрагмента, фланкированного двумя сайтами, распознаваемыми рекомбиназой, предпочтительно двумя сайтами 1охР, осуществляется в нужное время, благодаря присутствию в геноме рекомбинантной клетки-хозяина последовательности, кодирующей фермент Сге, функционально присоединенный к промоторной последовательности, а предпочтительно к индуцибельному промотору, более предпочтительно к тканеспецифической промоторной последовательности, а наиболее предпочтительно к промоторной последовательности, которая является индуцибельной и тканеспецифической, как описано Си е! а1. (1994).

Присутствие фермента Сге в геноме рекомбинантной клетки-хозяина может быть результатом скрещивания двух трансгенных животных, первого трансгенного животного, несущего нужную последовательность, происходящую от РАРАР и содержащую сайты 1охР, как описано выше, и второго трансгенного животного, несущего последовательность, кодирующую Сге и функционально присоединенную к подходящей промоторной последовательности, как описано Си е! а1. (1994).

Пространственно-временная регуляция экспрессии фермента Сге может быть также достигнута с использованием вектора на основе аденовируса, содержащего ген Сге, который позволяет инфицировать клетки или ίη νίνο инфицировать органы для доставки фермента Сге, как описано Αηΐοη & Сгайат (1995) и Капедае е! а1. (1995).

ДНК-конструкции, описанные выше, могут быть использованы для введения нужной нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, предпочтительно геномной последовательности РАРАР или кДНК-последовательности РАРАР, а наиболее предпочтительно модифицированной копии геномной или кДНК-последовательности РАРАР в заранее определенное положение в целевом геноме, что приводит к генерированию модифицированной копии целевого гена (отключения гомологичной рекомбинации) или к замене копии нужного гена другой копией, в достаточной степени гомологичной для того, чтобы происходило событие гомологичной рекомбинации (включения гомологичной рекомбинации). В конкретном варианте осуществления изобретения ДНК-конструкции, описанные выше, могут быть использованы для введения геномной последовательности РАРАР или кДНК-последовательности РАРАР, включающей по крайней мере один биаллельный маркер.

- 16 005921

Ядерные антисмысловые ДНК-конструкции

Другие композиции, содержащие вектор настоящего изобретения, включающий олигонуклеотидный фрагмент нуклеотидной последовательности кДНК 8Е0 ΙΌ N0, предпочтительно фрагмент, включающий старт-кодон гена РАРАР, могут быть использованы в качестве антисмысловой последовательности, которая ингибирует экспрессию соответствующего гена РАРАР. Предпочтительными методами с использованием антисмыслового полинуклеотида настоящего изобретения являются процедуры, описанные 8схак1с1 с1 а1. (1995), или процедуры, описанные в заявке РСТ № Ш0 95/24223, описание которых во всей своей полноте вводится в настоящую заявку посредством ссылки.

Антисмысловые последовательности предпочтительно выбирают из полинуклеотидов (длиной 15200 п.н.), комплементарных 5'-концу мРНК РАРАР. В одном из вариантов осуществления изобретения используется комбинация различных антисмысловых полинуклеотидов, комплементарных различным частям нужного гена.

Предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения комплементарны последовательности мРНК РАРАР, которая содержит либо кодон инициации трансляции АТС, либо сайт сплайсинга. Другие предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения комплементарны сайту сплайсинга мРНК РАРАР.

Антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения предпочтительно имеют сигнал 3'полиаденилирования, который был заменен саморасщепляющейся последовательностью рибозима так, чтобы транскрипты РНК-полимеразы II продуцировались без ро1у(А) на своих З'-концах, причем эти антисмысловые полинуклеотиды неспособны транспортироваться из ядра, как описано Ьш с1 а1. (1994). В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти антисмысловые полинуклеотиды РАРАР также включают в кластере рибозима гистонную структуру стебель-петля для стабилизации расщепленных транскриптов в целях их защиты от 3'-5'-экзонуклеолитического расщепления, например структуру, описанную Ескпег е! а1. (1991).

Олигонуклеотидные зонды и праймеры

Полинуклеотиды, происходящие от гена РАРАР, могут быть использованы для детекции присутствия, по крайней мере, копии нуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 3, или ее фрагмента, комплемента или варианта в тестируемом образце.

Особенно предпочтительными зондами и праймерами настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 3 или комплементарные последовательности. Зондами и праймерами также являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов 8ЕО ΙΌ N0: 3 или его комплементарные последовательности, где указанный непрерывный участок включает нуклеотид, по крайней мере один из нижеследующих нуклеотидов в положениях 8ЕО ΙΌ N0: 3: 1-3038, 1-421, 422-557, 2158-2218 и 2620-3039. Другими предпочтительными зондами и праймерами настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов 8ЕО ΙΌ N0: 1 или ее комплементарной последовательности. Другими предпочтительными зондами и праймерами настоящего изобретения являются выделенные, очищенные или рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок по крайней мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 смежных нуклеотидов 8ЕО ΙΌ N0: 1 или ее комплементарной последовательности, где указанный непрерывный участок содержит нуклеотид по крайней мере в одном из нижеследующих положений последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 1: 1-140, 141-460, 460-690, 87-346 и 691-1104.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к нуклеиновокислотным зондам, отличающимся тем, что они специфически гибридизуются в описанных выше жестких условиях гибридизации с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 1 и 3, или их вариантов, или их комплементарных последовательностей.

В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение охватывает выделенные, очищенные и рекомбинантные полинуклеотиды, состоящие или в основном состоящие из непрерывного участка, охватывающего 8-50 смежных нуклеотидов любой из последовательностей 8ЕО ΙΌ N0: 1, 3 и их комплементов, где указанный непрерывный участок включает РАРАР-ассоциированный биаллельный маркер в указанной последовательности или биаллельный маркер неравновесности по сцеплению с РАРАР и где указанный непрерывный участок имеет, но необязательно, длину в 18-35 смежных нуклеотидов, а указанный биаллельный маркер находится на расстоянии 4 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида, где указанный полинуклеотид необязательно состоит из указанного непрерывного участка и указанный непрерывный участок имеет длину в 25 смежных нуклеотидов, а указанный биаллельный маркер находится в центре указанного полинуклеотида; при этом, необязательно, 3'-конец указанного непрерывного участка расположен у 3'-конца указанного полинуклеотида и, необязательно, 3'-конец указанного непрерывного участка локализован у 3'-конца указанного полинуклеотида, а указанный биал

- 17 005921 лельный маркер расположен у З'-конца указанного полинуклеотида.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение охватывает выделенные, очищенные и рекомбинантные полинуклеотиды, содержащие непрерывный участок или состоящие или в основном состоящие из указанного непрерывного участка, охватывающего 8-50 смежных нуклеотидов любой последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 1, 3 или их комплементов, где З'-конец указанного непрерывного участка расположен у З'-конца указанного полинуклеотида и где З'-конец указанного полинуклеотида локализован в области в 20 нуклеотидов, расположенных выше РАРАР-ассоциированного биаллельного маркера в указанной последовательности, или биаллельного маркера неравновестности по сцеплению с РАРАР.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение охватывает полинуклеотиды, используемые в гибридизационных анализах, секвенирующих анализах и в ферментативных анализах, проводимых для детекции несоответствия оснований в целях определения идентичности нуклеотидов в РАРАР-ассоциированном биаллельном маркере в 8Е0 ΙΌ N0: 1, 3 или в комплементарных последовательностях; а также полинуклеотиды, используемые для амплификации сегментов нуклеотидов, содержащих РАРАР-ассоциированный биаллельный маркер в 8Е0 Ш N0: 1, 3 или в комплементарных последовательностях.

Настоящее изобретение относится к использованию полинуклеотидов настоящего изобретения для определения идентичности нуклеотидов в РАРАР-ассоциированном биаллельном маркере, предпочтительно в гибридизационных анализах, секвенирующих анализах, микросеквенирующих анализах или в ферментативных анализах, проводимых для детекции несоответствия оснований и для амплификации сегментов нуклеотидов, содержащих РАРАР-ассоциированный биаллельный маркер.

Зонд или праймер настоящего изобретения имеет длину от 8 до 1000 нуклеотидов, или, в частности, длину по крайней мере в 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 или 1000 нуклеотидов. Более конкретно, длина этих зондов и праймеров может составлять в пределах от 8, 10, 15, 20 или 30 до 100 нуклеотидов, а предпочтительно от 10 до 50, а более предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов. Более короткие зонды и праймеры имеют тенденцию к потере специфичности по отношению к последовательности-мишени нуклеиновой кислоты и обычно требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Более длинные зонды и праймеры являются дорогостоящими, и иногда они могут подвергаться самогибридизации с образованием шпилечных структур. Подходящая длина праймеров и зондов в конкретной совокупности аналитических условий может быть определена эмпирически самим специалистом.

Образование стабильных гибридов зависит от температуры плавления (Тт) ДНК. Тт зависит от длины праймера или зонда, ионной силы раствора и содержания С+С. Чем выше содержание С+С в праймере или зонде, тем выше температура плавления, поскольку пары С:С имеют три водородных связи, а пары А: Т имеют только две связи. Содержание СС в зондах настоящего изобретения обычно составляет в пределах от 10 до 75%, предпочтительно от 35 до 60%, а более предпочтительно от 40 до 55%.

Указанные праймеры и зонды могут быть получены любым подходящим методом, включая, например, клонирование и рестрикцию соответствующих последовательностей и прямой химический синтез, например, фосфодиэфирным методом №1гапд βί а1. (1979), фосфодиэфирным методом Вго\уп βί а1. (1979), диэтилфосфорамидитным методом Веаисаде βί а1. (1981) и методом с использованием твердого носителя, описанным в ЕР 0707592.

Детектирующими зондами обычно являются последовательности нуклеиновой кислоты или незаряженные аналоги нуклеиновой кислоты, такие как, например, пептидсодержащие нуклеиновые кислоты, описанные в международной патентной заявке \¥0 92/20702, и морфолиновые аналоги, описанные в патентах США №№ 5185444, 5034506 и 5142047. Этот зонд можно сделать неудлиняемым так, чтобы к этому зонду не могли добавляться другие 6ΝΤΡ. Сами аналоги как внутри, так и снаружи, обычно не удлиняются, а нуклеиновокислотные зонды могут быть сделаны неудлиняемыми путем модификации 3'конца зонда так, чтобы гидроксильная группа не могла больше участвовать в удлинении. Например, 3'конец зонда может быть функционализирован захватывающей или детектирующий меткой так, чтобы, он мог захватывать или как-либо иначе блокировать гидроксильную группу. Альтернативно, 3'гидроксильная группа может быть просто отщеплена, заменена или модифицирована, причем в заявке на патент США, рег. № 07/049061, поданной 19 апреля 1993 г., описаны модификации, которые могут быть использованы для создания неудлиняемого зонда.

Любой из полинуклеотидов настоящего изобретения может быть помечен, если это необходимо, путем включения любой метки, известной специалистам и определяемой спектроскопическими, фотохимическими, биохимическими, иммунохимическими или химическими методами. Так, например, подхо32 35 3 12 дящими метками являются радиоактивные вещества (включая Р, 8, Η, I), флуоресцентные красители (включая 5-бромдезоксиуридин, флуоресцеин, ацетиламинофлуорен, дигоксигенин) или биотин. Полинуклеотиды предпочтительно метят у 3'- и 5'-концов. Примерами методов нерадиоактивного мечения фрагментов нуклеиновой кислоты являются методы, описанные в патенте Франции № ЕВ-7810975, или Игбеа βί а1. (1988), или 8апс11ех-Ре5сабог βί а1. (1988). Кроме того, зонды настоящего изобретения могут иметь структурные свойства, которые позволяют осуществлять амплификацию сигнала, причем такими

- 18 005921 структурными свойствами обладают, например, разветвленные ДНК-зонды, описанные Игбеа е1 а1., 1991 или в европейском патенте № ЕР 0225807 (СЫгои).

Метка может быть также использована для захвата праймера в целях облегчения иммобилизации либо праймера, либо продукта удлинения праймера, такого как амплифицированная ДНК, на твердом носителе. Метка-ловушка присоединяется к праймерам или зондам и может специфически связываться с членом, который образует пару связывания с членом, специфически связывающимся с твердофазным реагентом (например, с биотином и стрептавидином). Поэтому в зависимости от типа метки, которую несет полинуклеотид или зонд, она может быть использована для захвата или для детекции ДНКмишени. Кроме того, следует отметить, что описанные здесь полинуклеотиды, праймеры или зонды сами могут служить меткой-ловушкой. Так, например, в случае, когда членом, связывающимся с твердофазным реагентом, является последовательность нуклеиновой кислоты, то она может быть выбрана так, чтобы она связывалась с комплементарной частью праймера или зонда и, тем самым, иммобилизировала праймер или зонд на твердой фазе. В случаях, когда сам полинуклеотидный зонд служит связывающим членом, для каждого специалиста очевидно, что этот зонд будет содержать последовательность или хвост, которые не являются комплементарными данной мишени. В случае, когда сам полинуклеотидный праймер служит меткой-ловушкой, то по крайней мере часть этого праймера будет свободно гибридизоваться с нуклеиновой кислотой на твердой фазе. Техника мечения ДНК хорошо известна специалистам.

Зонды настоящего изобретения могут быть использованы в различных целях. А именно, они могут быть использованы в Саузерн-гибридизации с геномной ДНК. Эти зонды могут быть также использованы для детекции продуктов ПЦР-амплификации. Они могут быть также использованы для детекции несоответствий в гене РАРАР или мРНК с использованием другой техники.

Любой из полинуклеотидов, праймеров и зондов настоящего изобретения может быть соответствующим образом иммобилизован на твердом носителе. Твердые носители известны специалистам, и ими являются стенки лунок реакционного планшета, тест-пробирки, полистироловые сферы, магнитные сферы, нитроцеллюлозные полоски, мембраны, микрочастицы, такие как латексные частицы, бараньи эритроциты (или эритроциты других животных), дурациты и т.п. Выбор твердого носителя не играет решающей роли и может быть осуществлен по усмотрению специалиста. Таким образом, наиболее подходящими примерами являются латексные частицы, микрочастицы, магнитные или немагнитные сферы, мембраны, пластиковые пробирки, стенки лунок для микротирования, стекло или кремниевые чипы, бараньи эритроциты (или эритроциты других животных) и дурациты. Подходящими методами иммобилизации нуклеиновых кислот на твердых фазах являются ионные, гидрофобные, ковалентные взаимодействия и т.п. Используемый здесь термин твердый носитель означает любой материал, который является нерастворимым или который может быть сделан нерастворимым в результате последующей реакции. Этот твердый носитель может быть выбран так, чтобы он обладал присущей ему способностью захватывать и иммобилизировать захваченный реагент. Альтернативно, твердая фаза может удерживать дополнительный рецептор, который способен захватывать и иммобилизовывать захваченный реагент. Таким дополнительным рецептором может быть заряженное вещество, которое имеет заряд, противоположный заряду самого захватываемого реагента, или заряженное вещество, конъюгированное с захватываемым реагентом. В еще одном альтернативном способе молекулой рецептора может быть любой специфически связывающийся член, который иммобилизован на твердом носителе (присоединен к твердому носителю) и который способен иммобилизировать захваченный реагент посредством реакции специфического связывания. Молекула рецептора способна опосредованно связывать захваченный реагент с твердым носителем перед проведением анализа или в процессе проведения анализа. Так, например, твердой фазой может быть пластик, дериватизированный пластик, магнитный или немагнитный металл, стеклянная или кремниевая поверхность тест-пробирки, микротитрационные лунки, листы, сферы, микрочастицы, чипы, бараньи эритроциты (или эритроциты других животных), дурациты® и другие конфигурации, известные специалистам. Полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть присоединены к твердому носителю или иммобилизованы на твердом носителе отдельно или группами, состоящими по крайней мере из 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 или 25 различных полинуклеотидов настоящего изобретения на одном твердом носителе. Кроме того, полинуклеотиды, не являющиеся полинуклеотидами настоящего изобретения, могут быть присоединены к тому же самому твердому носителю таким же образом, как один или несколько полинуклеотидов настоящего изобретения.

Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу детекции присутствия нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотид 8ЕО ΙΌ N0: 1 или 3, его фрагмент или вариант и комплементарную последовательность, в образце, где указанный способ включает следующие стадии:

a) контактирования нуклеиновокислотного зонда или множества нуклеиновокислотных зондов, которые могут гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, включенной в нуклеиновую кислоту 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 3, или ее фрагментом, или вариантом и комплементарной последовательностью, с анализируемым образцом; и

b) детекции гибридного комплекса, образовавшегося между зондом и нуклеиновой кислотой в данном образце.

- 19 005921

Кроме того, настоящее изобретение относится к набору для детекции присутствия нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0: 1 или 3, ее фрагмент или вариант, и комплементарную последовательность в образце, где указанный набор включает

a) нуклеиновокислотный зонд или множество нуклеиновокислотных зондов, которые могут гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, включенной в нуклеиновую кислоту 8Е0 ГО N0: 1 или 3, или с ее фрагментом, или вариантом и комплементарной последовательностью, и

b) необязательно, реагенты, необходимые для осуществления реакции гибридизации.

В первом предпочтительном варианте изобретения, относящемся к способу детекции и к набору, указанный нуклеиновокислотный зонд или множество нуклеиновокислотных зондов метят детектируемой молекулой. Во втором предпочтительном варианте изобретения, относящемся к способу детекции и к набору, указанный нуклеиновокислотный зонд или множество нуклеиновокислотных зондов иммобилизуют на субстрате.

Олигонуклеотидные массивы

Субстрат, содержащий множество олигонуклеотидных праймеров или зондов настоящего изобретения, может быть использован для детекции или амплификации нужных последовательностей в гене РАРАР, и он может быть также использован для детекции мутаций в кодирующих или в некодирующих последовательностях гена РАРАР.

Любой описанный здесь полинуклеотид может быть присоединен в перекрывающихся областях или в произвольных участках к твердому носителю. Альтернативно, полинуклеотиды настоящего изобретения могут быть присоединены в упорядоченных массивах, где каждый полинуклеотид присоединен в том месте твердого носителя, которое не перекрывается с местом присоединения любого другого полинуклеотида. Предпочтительно такой упорядоченный массив полинуклеотидов называют адресуемым, где различные местоположения регистрируются и могут быть использованы как часть аналитической процедуры. Массивы адресуемых полинуклеотидов обычно содержат множество различных олигонуклеотидных зондов, которые связываются с поверхностью субстрата в различных известных положениях. Знание точного положения каждого полинуклеотида дает возможность использовать эти адресуемые массивы в гибридизационных анализах. Для полинуклеотидов настоящего изобретения может быть применен любой известный метод с использованием адресуемых массивов. Одним из конкретных вариантов таких полинуклеотидых массивов является массив, известный как СеиесЫрк™, который, в основном, описан в патенте США № 5143854; в публикациях РСТ Χν0 90/15070 и 92/10092. В основном, эти массивы могут быть продуцированы методами механического синтеза или прямого светонаправленного синтеза, которые представляют собой комбинацию фотолитографических методов и твердофазного синтеза олигонуклеотидов (Еобог е1 а1., 1991). Иммобилизация массивов олигонуклеотидов на твердых носителях стала возможной благодаря разработке технологии, обычно идентифицируемой как Крупномасштабный синтез иммобилизованных полимеров ('Уегу Ьагде 8са1е ИптоЬШхеб Ро1утег 8уп111е515) (νΕδΙΡδ™), в котором зонды обычно иммобилизованы в массиве высокой плотности на твердой поверхности чипа. Примеры νΈδΙΡδ™ представлены в патентах США №№ 5143854 и 5412087 и в публикациях РСТ XV 0 90/15070, νθ 92/10092 и νθ 95/11995, где описаны методы формирования олигонуклеотидных массивов с использованием такой техники, как светонаправленный синтез. При разработке стратегий для получения массивов олигонуклеотидов, иммобилизованных на твердых носителях, в попытке максимизировать уровни гибридизации и информации о последовательностях были разработаны дополнительные стратегии представления для упорядочения и отображения массивов на чипах. Примеры таких стратегий представления описаны в публикациях РСТ νθ 94/12305, νθ 94/11530, νθ 97/29212 и νθ 97/31256, описания которых во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

В другом варианте олигонуклеотидных массивов настоящего изобретения матрица олигонуклеотидных зондов может быть преимущественно использована для детекции мутаций, присутствующих в гене РАРАР, а предпочтительно в его регуляторной области. Для этих конкретных целей специально конструировали зонды, имеющие последовательность, позволяющую им гибридизоваться с генами, которые несут известные мутации (делецию, инсерцию или замену одного или нескольких нуклеотидов). Термин известные мутации означает мутации в гене РАРАР, который был идентифицирован, например, методом, использованным Ниаид е1 а1. (1996) или 8ат§ои е1 а1. (1996).

Другим методом, который применяется для детекции мутаций в гене РАРАР, является использование ДНК-массивов высокой плотности. Каждый олигонуклеотидный зонд, составляющий единичный элемент ДНК-массива высокой плотности, был сконструирован так, чтобы он соответствовал специфической последовательности геномной ДНК или кДНК РАРАР. Таким образом, массив, состоящий из олигонуклеотидов, комплементарных подпоследовательностям последовательности гена-мишени, используется для определения идентичности последовательности-мишени с последовательностью гена дикого типа в целях измерения его количества и детекции различий между последовательностью-мишенью и сравниваемой последовательностью гена РАРАР дикого типа. В одну такую конструкцию, обозначенную 4Ь-массивом черепичного типа, введена серия из четырех зондов (А, С, С, Т), а предпочтительно 15-нуклеотидные олигонуклеотиды. В каждой серии из четырех зондов абсолютный комплемент будет гибридизоваться более сильно, чем зонды с несоответствиями. Затем нуклеиновокислотную мишень

- 20 005921 длиной Ь сканируют на мутации с использованием массива черепичного типа, содержащего 4Ь-зонды, где весь набор зондов имеет все возможные мутации в известной эталонной последовательности. Гибридизационные сигналы от серии 15-мерного зонда черепичного массива искажаются изменением лишь одного основания в последовательности-мишени. В результате этого происходит характерная потеря сигнала или футпринт для зондов, фланкирующих положение мутации. Эта техника описана СНее е1 а1., 1996.

Таким образом, настоящее изобретение относится к массиву молекул нуклеиновой кислоты, содержащей по крайней мере один полинуклеотид, описанный выше и используемый в качестве зонда или праймера. В предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к массиву молекул нуклеиновой кислоты, содержащей по крайней мере два полинуклеотида, описанные выше и используемые в качестве зондов или праймеров.

Белки и полипептидные фрагменты РАРАР

Используемый здесь термин полипептиды РАРАР охватывает все белки и полипептиды настоящего изобретения. Частью настоящего изобретения также являются полипептиды, кодируемые полинуклеотидами настоящего изобретения, а также гибридные полипептиды, содержащие указанные полипептиды. Настоящее изобретение относится к человеческим белкам РАРАР, включая выделенные или очищенные белки РАРАР, состоящие из или в основном состоящие из последовательности 8ЕР ГО N0: 2, или содержащие эту последовательность.

Как описано в настоящей заявке, авторами настоящего изобретения было продемонстрировано, что белок РАРАР ассоциирован с белком или пептидом §34872, который рассматривается как фактор генетической предрасположенности к шизофрении и биполярным нарушениям, а также к родственным нарушениям ЦНС.

Настоящее изобретение относится к полипептиду, кодируемому нуклеотидной последовательностью 8ЕР ГО N0: 1 или 3, или комплементарной последовательностью, или ее фрагментом.

Настоящее изобретение относится к выделенным, очищенным рекомбинантным полипептидам, содержащим непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 смежных аминокислот 8 Ер ГО N0: 2. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанный непрерывный участок из смежных аминокислот содержит сайт мутации или функциональной мутации, включая делецию, добавление, замену или усечение аминокислот в последовательности белка РАРАР.

Настоящее изобретение также охватывает очищенный, выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по крайней мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%-ную идентичность аминокислот с аминокислотной последовательностью 8ЕР ГО N0: 2 или ее фрагментом. Такие варианты полипептидов входят в настоящее изобретение независимо от того, имеют ли они нормальную биологическую активность или нет. Даже в том случае, если конкретная полипептидная молекула не обладает биологической активностью, для каждого специалиста очевидно, каким образом может быть использован данный полипептид, например, в качестве вакцины или для продуцирования антител. Другими применениями полипептидов настоящего изобретения, которые не обладают РАРАР-активностью, является ыЧег аНа. их использование в качестве эпитопных меток для эпитопного картирования и в качестве маркеров молекулярной массы на ДСН-ПААГ-гелях или на колонках для гель-фильтрации с молекулярным ситом, осуществляемой методами, известными специалистам. Как описано ниже, полипептиды настоящего изобретения могут быть также использованы для продуцирования поликлональных и моноклональных антител, которые могут быть использованы в анализах на детекцию экспрессии белков РАРАР или в качестве агонистов и антагонистов, способных усиливать или ингибировать функции белка РАРАР. Кроме того, такие полипептиды могут быть использованы в дрожжевой двухгибридной системе для захвата белков, связывающихся с белком РАРАР, которые также являются агонистами- и антагонистами-кандидатами настоящего изобретения.

В других вариантах своего осуществления настоящее изобретение также относится к комплексам, образованным полипептидами РАРАР и §34872. Таким образом, настоящее изобретение относится к очищенным, выделенным или рекомбинантно продуцированным комплексам, состоящим по крайней мере из одного полипептида РАРАР и по крайней мере из одного полипептида §34872, где указанный полипептид РАРАР содержит по крайней мере 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕР ГО N0: 2. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полипептид §34872 содержит по крайней мере 6, предпочтительно по крайней мере 8-10 аминокислот 8ЕР ГО N0: 5.

Кроме того, как было предположено, исходя из дополнительного анализа структуры полипептида РАРАР, полипептид РАРАР настоящего изобретения может содержать сайт ^гликозилирования (А8Р) в положениях аминокислот 69-72 (аминокислоты МЫТО). Кроме того, полипептид РАРАР настоящего изобретения может содержать сайт фосфорилирования протеинкиназы С в положениях аминокислот 2628 (8СК), 53-55 (8КК), 71-73 (ТОК) и 80-82 (8РК). Кроме того, полипептид РАРАР может содержать сайт N-миристоилирования в положениях аминокислот 18-23 (ΌΟΩΖΟΡ), 22-27 (СР1Р8С) и 37-42 (САСРНК). Другими структурными аспектами являются мотивы рацемазы А8Р & 6ЬИ в положениях

- 21 005921 аминокислот 8-16 и 9-16 (аминокислоты Ό - РУС).

Помимо своей ассоциации с шизофренией и биполярным нарушением посредством взаимодействия с §34872 полипептид РАРАР также имеет последовательность, гомологичную кальций/кальмодулинзависимого белка протеинкиназы II (САМК11) (рег. № АЗ2711561), участие которого в нейротрансмиссии было продемонстрировано ранее. В одном из аспектов настоящего изобретения РАРАР может действовать как молекулярный шаперон; так, например, РАРАР может усиливать или предотвращать взаимодействие или связывание §34872 с рецептором §34872. В другом аспекте изобретения РАРАР может функционально взаимодействовать с белками §34872 в пути передачи сигнала. Белки РАРАР предпочтительно выделяют из образцов ткани человека или млекопитающего или экспрессируют из генов человека или млекопитающего.

Полипептиды РАРАР настоящего изобретения могут быть получены рутинными методами экспрессии, известными специалистам.

Полинуклеотид, кодирующий нужный полипептид, лигируют в экспрессирующий вектор, подходящий для любого стандартного хозяина. Для получения рекомбинантных полипептидов могут быть использованы как эукариотические, так и прокариотические системы хозяев, и совокупность некоторых наиболее распространенных систем. Затем полипептид выделяют из лизированных клеток или из культуральной среды и очищают до определенной степени, необходимой для использования. Очистку проводят любым известным методом, таким как, например, дифференциальная экстракция, фракционирование солями, хроматография, центрифугирование и т.п. Различные методы очистки белков можно найти, например, в Методах энзимологии (МеШобк ш Епхуто1о§у).

Кроме того, более короткие фрагменты белка продуцируют методами химического синтеза. Альтернативно, белки настоящего изобретения экстрагируют из клеток или тканей человека или других животных. Методы очистки белков известны специалистам, и таким методом является использование детергентов или хаотропных агентов для дизрупции частиц с последующей дифференциальной экстракцией и разделением полипептидов с помощью ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, седиментации в градиенте плотности и гель-электрофореза.

Для экспрессии белков и полипептидов РАРАР может быть использована любая кДНК РАРАР, включая ЗЕО ΙΌ N0: 1. Нуклеиновую кислоту, кодирующую экспрессируемый белок или полипептид РАРАР, функционально присоединяют к промотору в экспрессирующем векторе с использованием стандартной техники клонирования. Вставка РАРАР в экспрессирующем векторе может включать полную кодирующую последовательность для белка РАРАР или его части. Так, например, РАРАР-вставка может кодировать полипептид, содержащий по крайней мере 10 смежных аминокислот белка РАРАР ЗЕЦ ΙΌ N0: 2.

Экспрессирующим вектором являются любые экспрессионные системы млекопитающего, дрожжей, насекомых или бактерий, известные специалистам. Коммерчески доступные векторы и экспрессионные системы поставляются рядом фирм-поставщиков, включая Сенеке I пь111и1е (СатЬпбде, МА), 8!га!а§епе (Ба 1о11а, СакРогша), Рготеда (МабЦоп, АЕсопкп) и 1пукго§еп (Зап Б|е§о, СакРогша). Если это необходимо, то для усиления экспрессии и облегчения правильной укладки белка, окружение кодона и спаривание последовательностей кодонов оптимизируют для конкретного экспрессирующего организма, в который вводят экспрессирующий вектор, как описано в патенте США, На(Пе1б е! а1., № 5082767, описание которого во всей своей полноте вводится в настоящую заявку посредством ссылки.

В одном из вариантов осуществления изобретения полную кодирующую последовательность кДНК РАРАР функционально присоединяют к промотору в экспрессирующем векторе посредством ро1у(А)сигнала кДНК. Альтернативно, если нуклеиновая кислота, кодирующая часть белка РАРАР, у которого отсутствует метионин, служит в качестве сайта инициации, то инициирующий метионин может быть введен после первого кодона нуклеиновой кислоты с использованием стандартной техники. Аналогичным образом, если во вставке из кДНК РАРАР отсутствует ро1у(А)-сигнал, то эта последовательность может быть введена в конструкцию, например, посредством сплайсинга из ро1у(А)-сигнала от рЗС5 (8ка1а§еие) с использованием рестриктирующих эндонуклеаз В§11 и За11 и встроена в экспрессирующий вектор млекопитающего рХТ1 (8!га!а§епе). рХТ1 содержит БТК и часть гена §а§ мышиного вируса лейкоза Молони. Положение ЕТК в данной конструкции позволяет осуществлять стабильную трансфекцию. Указанный вектор включает промотор тимидинкиназы вируса простого герпеса и селективный ген неомицина. Нуклеиновую кислоту, кодирующую белок РАРАР или его часть, получают из бактериального вектора, содержащего кДНК РАРАР ЗЕЦ ΙΌ N0: 2, посредством ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, комплементарных кДНК РАРАР или его части, где указанный вектор содержит последовательности рестриктирующей эндонуклеазы Рк!1, встроенной в 5'-праймер, и рестриктирующей эндонуклеазы Вд111 у 5'-конца соответствующего кДНК-3'-праймера для гарантии того, что последовательность, кодирующая белок РАРАР или его часть, будет правильно расположена по отношению к ро1у А-сигналу. Очищенный фрагмент, полученный в результате ПЦР-реакции, гидролизуют Рк!1, затупляют по концам экзонуклеазой, гидролизуют В§Ш, очищают и лигируют с вектором рХТ1, уже содержащим ро1у(А)-сигнал и гидролизованным В§11Е

Лигированный продукт трансфицируют в мышиные клетки МН3Т3 с использованием липофектина

- 22 005921 (Ы£е Тес11по1од1ек, 1пс., Сгапб 1к1апб, Ие\у Уогк) в условиях, указанных в описании продукта. Положительные трансфектанты отбирают после культивирования трансфицированных клеток в 600 мкг/мл 0418 (81дша, 8!.Ьошк, М1ккошт).

Вышеописанные процедуры могут быть также использованы для экспрессии мутантного белка РАРАР, ответственного за детектируемый фенотип, или его части.

Экспрессированный белок очищают стандартными методами очистки, такими как осаждение сульфатом аммония или хроматографическое разделение по размеру или заряду. Белок, кодируемый нуклеиновокислотной вставкой, может быть также очищен стандартными иммунохроматографическими методами. В таких процедурах раствор, содержащий экспрессированный белок РАРАР или его часть, такой как клеточный экстракт, наносят на колонку, содержащую антитела против белка РАРАР или его части, нанесенные на хроматографическую матрицу. Экспрессированный белок связывается с иммунохроматографической колонкой. Затем колонку промывают для удаления неспецифически связанных белков. Этот специфически связанный экспрессированный белок удаляют из колонки и выделяют стандартными методами.

Для подтверждения экспрессии белка РАРАР или его части белки, экспрессированные из клетокхозяев и содержащие экспрессирующий вектор, включающий вставку, которая кодирует белок РАРАР или его часть, могут быть подвергнуты сравнению с белками, экспрессированными в клетках-хозяевах, содержащих экспрессирующий вектор без вставки. Присутствие полосы в образцах клеток, содержащих экспрессирующий вектор со вставкой, которая отсутствует в образцах клеток, содержащих экспрессирующий вектор без вставки, указывает на то, что был экспрессирован белок РАРАР или его часть. В основном, эта полоса будет иметь подвижность, ожидаемую для белка РАРАР или его части. Однако эта полоса может также иметь подвижность, отличающуюся от ожидаемой подвижности, в случае модификаций, таких как гликозилирование, убихитинизация или ферментативный гидролиз.

Антитела, способные специфически распознавать экспрессированный белок РАРАР или его часть, описаны ниже.

Если продуцирование антитела невозможно, то нуклеиновые кислоты, кодирующие белок РАРАР или его часть, встраивают в экспрессирующие векторы, сконструированные для получения схем очистки с применение химерных полипептидов. В таких стратегиях нуклеиновую кислоту, кодирующую белок РАРАР или его часть, встраивают в той же самой рамке считывания, которую имеет ген, кодирующий другую половину химеры. Другой половиной этой химеры является последовательность, кодирующая β-глобин или никельсвязывающий полипептид. Затем, для очистки химерного белка используют хроматографическую матрицу, имеющую антитело против β-глобина или антитело, связывающееся с никелем. Между геном β-глобина или никельсвязывающего полипептида и геном белка РАРАР или его части конструируют сайты расщепления протеазой. Таким образом, два полипептида химеры могут быть отделены друг от друга посредством расщепления протеазой.

Одним из экспрессирующих векторов, используемых для генерирования β-глобиновых химерных белков, является р8О5 (8!га!адепе), который кодирует кроличий β-глобин. Интрон II гена кроличьего β-глобина облегчает сплайсинг экспрессированного транскрипта, а сигнал полиаденилирования, введенный в данную конструкцию, повышает уровень экспрессии. Эти способы хорошо известны специалистам по молекулярной биологии. Стандартные методы опубликованы в методических руководствах, таких как Эау|б е! а1., (1086), и многие из них разработаны 8!га!адепе, Ы£е Тесйпо1од1ек, 1пс., или Рготеда. Кроме того, полипептид может быть продуцирован из данной конструкции с использованием систем трансляции ш уйго, таких как набор для экспресс-трансляции™ ш уйго (8!га!адепе).

Антитела, которые связываются с полипептидами РАРАР настоящего изобретения

Для генерирования антител, способных связываться с экспрессированным белком РАРАР или его фрагментами, может быть использован любой описанный полипептид или целый белок РАРАР.

Одна из композиций антитела настоящего изобретения способна к специфическому связыванию или специфически связывается с белком РАРАР 8Е0 ΙΌ N0: 2. Композиция антитела, специфически связывающегося с белком РАРАР, должна иметь аффинность связывания для первого полноразмерного варианта белка РАРАР, которая по крайней мере на 5, 10, 15, 20, 50 или 100% превышает аффинность связывания для второго полноразмерного варианта белка РАРАР в ЕЫ8А или другом анализе, основанном на связывании с антителом.

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к композициям антитела поликлонального или моноклонального, которое способно к селективному связыванию или селективно связывается с эпитопсодержащим полипептидом, включающим непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 смежных аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 2.

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к композициям антитела поликлонального или моноклонального, которое способно к селективному связыванию или селективно связываться с комплексом полипептидов РАРАР и д34872, где указанный полипептид РАРАР содержит по крайней мере 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере 8-10 аминокислот, а

- 23 005921 более предпочтительно по крайней мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ГО N0: 2. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный полипептид §34872 содержит по крайней мере 6 аминокислот, а предпочтительно по крайней мере 8-10 аминокислот 8ЕО ГО N0: 5.

Эпитоп может содержать по меньшей мере 3 аминокислоты в пространственной конформации, которая является уникальной для данного эпитопа. Обычно эпитоп состоит по крайней мере из 6 таких аминокислот, а чаще по крайней мере из 8-10 таких аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антигенные эпитопы содержат несколько аминокислот, число которых составляет от 3 до 50. Фрагменты, которые действуют как эпитопы, могут быть получены стандартными методами. Эпитопы могут быть определены с помощью анализа Джеймсона-Вольфа, который осуществляют, например, с помощью компьютерной программы РВ0ТЕАХ с использованием параметров по умолчанию (Уегыои 4.0 \νίηάο\ν5. ОХЛ8ТЛВ. 1пс., 1228 §ои!й Рагк 81гсс1 Майкою XVI).

Предсказанные антигенные эпитопы представлены ниже. Следует отметить, что в списке иммуногенных эпитопов представлены только аминокислотные остатки, содержащиеся в эпитопах, которые, как было предсказано в соответствии с конкретным алгоритмом, имеют наивысшую степень иммуногенности. Полипептиды настоящего изобретения, которые конкретно не описаны как иммуногенные, считаются неантигенными. При этом они все же могут быть антигенными ίη νίνο, но они просто не распознаются конкретно используемым алгоритмом. Альтернативно, эти полипептиды, возможно, являются антигенными ίη νίίτο, как было определено методами фагового представления. Таким образом, перечисленные ниже аминокислотные остатки представляют собой аминокислотные остатки, содержащие лишь предпочтительные эпитопы, но этот список является неполным. Действительно, все фрагменты полипептидов настоящего изобретения, имеющие по крайней мере 6 аминокислот, входят в объем настоящего изобретения и используются в качестве антигенного эпитопа. Кроме того, перечисленные ниже аминокислотные остатки являются лишь критическими остатками эпитопов, определенных с помощью анализа Джеймсона-Вольфа. Так, например, в перечисленные последовательности могут быть добавлены дополнительные фланкирующие остатки либо на №конце, либо на С-конце, либо на обоих N и С-концах для генерирования эпитопсодержащей части, имеющей длину по крайней мере в 6 остатков. Аминокислотные остатки, содержащие другие иммуногенные эпитопы, могут быть определены с помощью алгоритмов, аналогичных анализу Джеймсона-Вольфа, или посредством ίη νίνο-тестирования на антигенный ответ описанными здесь методами или методами, известными специалистам.

Эпитопсодержащие фрагменты настоящего изобретения предпочтительно включают 6-50 аминокислот (т.е. целое число от 6 до 50 включительно) полипептида настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение включает антигенные фрагменты, имеющие длину, начиная от 6 аминокислот и кончая полноразмерной последовательностью РАРАР.

Предпочтительные иммуногенные эпитопы РАРАР:

С1у-8 - Ьу§-11

Акр-31 - Ακη-33

Ο1η-40 - Ьеи-47

С1у-51 - Ьук-54

С1и-59 - Агд-62 и §ег-80 - Тйг-83.

Настоящее изобретение также относится к выделенному или очищенному антителу, способному специфически связываться с мутированным белком РАРАР, или с его фрагментом, или вариантом, содержащим эпитоп мутированного белка РАРАР. В другом своем предпочтительном варианте настоящее изобретение относится к антителу, способному связываться с полипептидом, содержащим по крайней мере 10 смежных аминокислот белка РАРАР и включающим по крайней мере одну аминокислоту, которая может кодироваться мутациями, приводящими к появлению конкретного признака.

Для получения антител желательно использовать животных или млекопитающих дикого типа или трансгенных, не относящихся к человеку, которые экспрессируют тип РАРАР, отличающийся от типа РАРАР, с которым связывается антитело, а особенно предпочтительными являются животные, которые не экспрессируют РАРАР (т.е. описанные здесь животные, у которых отсутствует РАРАР). Животные, у которых отсутствует РАРАР, будут распознавать все области или большинство доступных областей белка РАРАР в качестве чужеродных антигенов, а поэтому они будут продуцировать антитела для более широкого спектра эпитопов РАРАР. Кроме того, более короткие полипептиды, имеющие только 10-30 аминокислот, могут быть использованы для обеспечения специфического связывания с любым белком РАРАР. Кроме того, иммунная система гуморального ответа животных, которые продуцируют молекулы РАРАР, которые являются сходными с антигенной последовательностью, будут преимущественно распознавать различия между нативными РАРАР-молекулами животного и антигенной последовательностью и продуцировать антитела против этих уникальных сайтов в последовательности антигена. Такая техника может быть, в частности, использована для получения антител, специфически связывающихся с любым одним из белков РАРАР.

Препараты антител, полученные в соответствии с любым протоколом, могут быть использованы в количественных иммуноанализах, в которых определяют концентрации ангиген-содержащих веществ в

- 24 005921 биологических образцах; и, кроме того, они могут быть использованы в полуколичественном или качественном анализе для идентификации присутствия антигена в биологическом образце. Эти антитела могут быть также использованы в терапевтических композициях для цитолиза клеток, экспрессирующих данный белок, или для снижения уровня этого белка в организме.

Антитела настоящего изобретения могут быть помечены любыми радиоактивными, флуоресцентными или ферментными метками, известными специалистам.

Поэтому настоящее изобретение также относится к способу специфической детекции присутствия полипептида РАРАР настоящего изобретения в биологическом образце, где указанный способ включает следующие стадии:

a) контактирования биологического образца с поликлональным или моноклональным антителом, которое специфически связывается с полипептидом РАРАР, содержащим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, или с его пептидным фрагментом, или вариантом, и

b) детекции образовавшегося комплекса антиген-антитело.

Настоящее изобретение также относится к диагностическому набору для детекции ίη у11го присутствия полипептида РАРАР настоящего изобретения в биологическом образце, где указанный набор включает

a) поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывается с полипептидом РАРАР, содержащим аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, или с его пептидным фрагментом, или вариантом, необязательно меченные, и

b) реагент, обеспечивающий детекцию образованных комплексов антиген-антитело, где указанный реагент, необязательно, несет метку или сам может распознаваться меченным реагентом, а более конкретно это происходит в случае, когда вышеупомянутое моноклональное или поликлональное антитело само не является меченным.

Таким образом, настоящее изобретение относится к антителам и Т-клеточным антигенным рецепторам (ТСН), которые специфически связываются с полипептидами, а более конкретно с эпитопами указанных полипептидов настоящего изобретения, включая, но не ограничиваясь ими, Ι§0 (включая !цС 1, Ι§62, Ι§63 и Ι§64), Ι§Α (включая Ι§Α1 и Ι§Α2), Ι§Ό, Ι§Ε или Ι§Μ и ΙβΥ. В предпочтительном варианте антителами настоящего изобретения являются фрагменты антител, связывающиеся с человеческим антигеном, включая, но не ограничиваясь ими, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)₂, Р(аЬ')₂, Рб, одноцепочечный Ρν (одру), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанный Ρν (оцру) и фрагменты, содержащие либо домен У_ь, либо домен У_н. Указанные антитела могут быть получены от любого животного, включая птиц и млекопитающих. Предпочтительно указанными антителами являются антитела человека, мыши, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади или курицы.

Антиген-связывающие фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, могут содержать вариабельную область (области), отдельно или в комбинации со следующими полными или неполными областями: шарнирной областью, доменами СН1, СН2 и СН3. В объем настоящего изобретения также входят любые комбинации из вариабельных областей и шарнирных областей и доменов Сн1, Сн2 и СН3. В объем настоящего изобретения также входят химерные, гуманизированные и человеческие моноклональные и поликлональные антитела, специфически связывающиеся с полипептидами настоящего изобретения. В объем настоящего изобретения также входят антитела, которые являются антиидиотипическими по отношению к антителам настоящего изобретения.

Антитела настоящего изобретения могут быть моноспецифическими, биспецифическими, триспецифическими, либо они могут иметь мультиспецифичность более высокого порядка. Мультиспецифические антитела могут быть специфичными для других эпитопов полипептида настоящего изобретения, либо они могут быть специфичными как для полипептида настоящего изобретения, так и для гетерологичных композиций, таких как гетерологичный полипептид или материал твердого носителя. См., например, А0 93/17715; А0 92/08802; А0 91/00360; А0 92/05793; Тий А. е! а1. (1991) 1. ]ттипо1. 147:6069; патенты США №№ 5573920, 4474893, 5601819, 4714681, 4925648; Койе1пу 8.А. е! а1. (1992) 1. Iттипо1. 148:1547-1553.

Антитела настоящего изобретения могут быть описаны или охарактеризованы по их взаимодействию с эпитопом(ами) или эпитопнесущей частью(ями) полипептида настоящего изобретения, которые распознаются или специфически связываются этими антителами. В случае белков настоящего изобретения и секретированных белков, указанные антитела могут специфически связываться с полноразмерным белком, кодируемым нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, со зрелым белком (т.е. белком, генерируемым путем расщепления сигнального пептида), кодируемым нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, с сигнальным пептидом, кодируемым нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, или с любым другим полипептидом настоящего изобретения. Поэтому эпитоп(ы) или эпитопсодержащая полипептидная часть(и) могут быть определены как описано в настоящей заявке, например, по ^концевым и С-концевым положениям, по размеру в смежных аминокислотных остатках или какимлибо другим описанным здесь последовательностям (входящих в список последовательностей). Антитела, которые специфически связываются с любым эпитопом или полипептидом настоящего изобретения, могут быть также исключены как отдельный вид. Поэтому настоящее изобретение относится к антите

- 25 005921 лам, которые специфически связываются с определенными полипептидами настоящего изобретения, что позволяет исключить вышеупомянутые антитела.

Антитела настоящего изобретения могут быть также описаны и охарактеризованы с точки зрения их перекрестной реактивности. Антитела, которые специфически не связываются с любым другим аналогом, ортологом или гомологом полипептидов настоящего изобретения, входят в объем настоящего изобретения. В объем настоящего изобретения также входят антитела, которые не связываются с полипептидами, имеющими менее чем 95%, менее чем 90%, менее чем 85%, менее чем 80%, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60%, менее чем 55% и менее чем 50%-ную идентичность (вычисленную известными и описанными здесь методами) с полипептидом настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, связывающимся лишь с полипептидами, кодируемыми полинуклеотидами, которые гибридизуются с полинуклеотидом настоящего изобретения в жестких условиях гибридизации (как описано в настоящей заявке). Антитела настоящего изобретения могут быть также описаны или охарактеризованы с точки зрения их аффинности связывания. Предпочтительными аффинностями связывания являются аффинности связывания с константой диссоциации или Кй, составляющей менее 5х10^-6М, 10^-6М, 5х10^-7М, 10^-7М, 5х10^-8М, 10^-8М, 5х10^-9М, 10^-9М, 5х10^-10М, 10^-10М, 5х10^-11М, 10^-11М, 5х10^-12М, 10^-12М, 5х10^-13М, 10^-14М, 5х10^-14М, 10^-14М, 5х10^-15М и 10^-15М.

Антитела настоящего изобретения используются в методах, которыми являются, но не ограничиваются ими, известные методы очистки, детекции и нацеливания на полипептиды настоящего изобретения, включая диагностические ίη νίνο и ίη νίίτο методы и терапевтические методы. Так, например, эти антитела используются в иммуноанализах для качественного и количественного измерения уровней полипептидов настоящего изобретения в биологических образцах. См., например, работу Наг1ото е1 а1., ЛКПΒ0ΌΙΕ8: Α ΕΑΒ0ΚΑ.Τ0ΚΥ МЛНиЛЬ (Со1й 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Рге§5, 2пй ей. 1988) (которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Антитела настоящего изобретения могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими композициями. Эти антитела могут быть затем рекомбинантно присоединены к гетерологичному полипептиду у N или С-конца либо они могут быть химически конъюгированы (включая ковалентное или нековалентное конъюгирование) с полипептидами или другими композициями. Так, например, антитела настоящего изобретения могут быть рекомбинантно связаны или конъюгированы с молекулами, используемыми в качестве меток в детектирующих анализах, и с эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства или токсины. См., например, А0 92/08495; А0 91/14438; А0 89/12624; патент США № 5314995 и ЕР 0396387.

Антитела настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим методом, известным специалистам. Так, например, полипептид настоящего изобретения или его антигенный фрагмент может быть введен животному для стимуляции продуцирования сыворотки, содержащей поликлональкые антитела. Термин моноклональное антитело не ограничивается антителами, продуцируемыми с помощью гибридомной техники. Термин антитело означает полипептид или группу полипептидов, состоящих по крайней мере из одного связывающего домена, где этот связывающий домен образуется в результате укладки вариабельных доменов молекулы антитела с образованием трехмерных связывающих областей, имеющих внутреннюю форму поверхностей и распределение заряда, которые комплементарны соответствующим признакам антигенной детерминанты, и, тем самым, обеспечивают возможность иммунологической реакции с антигеном. Термин моноклональное антитело означает антитело, которое происходит от одного клона, включая эукариотический, прокариотический или фаговый клон, но не относится к методу его получения. Моноклональные антитела могут быть получены с использованием многих методов, известных специалистам, включая использование гибридомной техники, техники рекомбинантных ДНК и техники фагового представления.

Гибридомная техника хорошо известна специалистам (см., например, работы Наг1ото е1 а1. (1998); НаттегНпд е1 а1. (1981) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки). ЕаЬ и Е(аЬ')₂-фрагменты могут быть получены, например, из продуцированных гибридомой антител путем протеолитического расщепления ферментами, такими как папаин (для продуцирования ЕаЬфрагментов) или пепсин (для продуцирования Е (аЬ')₂-фрагментов).

Альтернативно, антитела настоящего изобретения могут быть продуцированы с помощью техники рекомбинантных ДНК или путем химического синтеза методом, известным специалистам. Так, например, антитела настоящего изобретения могут быть получены методами фагового представления, известными специалистам. В методах фагового представления домены функциональных антител представлены на поверхности фаговой частицы, которая несет полинуклеотидные последовательности, кодирующие эти частицы. Фаг с нужными связывающими свойствами выбирают из набора антител или из комбинаторной библиотеки антител (например, человеческих или мышиных) путем прямого отбора с использованием непосредственно антигена, обычно антигена, связанного или иммобилизованного на твердой поверхности или сфере. Фагом, используемым в этих методах, обычно является нитчатый фаг, включая £й и М13, с ЕаЬ-доменом, Εν-доменом или стабилизированным дисульфидом Εν-доменом антитела, рекомбинантно присоединенными к фаговому белку, кодируемому либо геном III, либо геном VIII. Примерами

- 26 005921 методов фагового представления, которые могут быть использованы для продуцирования антитела настоящего изобретения, могут служить методы, описанные в работах Впиктаи и. е! а1. (1995); Атек, В.8. е! а1. (1995); КейкЬогоидй С.А. е! а1. (1994); Ре гм с Ь. е! а1. (1997); Витки Ό.Β. е! а1. (1994); РСТ/ОВ 91/01134; АО 90/02809; АО 91/10737; АО 92/01047; АО 92/18619; АО 93/11236; АО 95/15982; АО 95/20401 и в патентах США №№ 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727 и 5733743 (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

Как описано в вышеуказанных работах после фагового отбора антитело-кодирующие области данного фага могут быть выделены и использованы для генерирования целых антител, включая человеческие антитела или любой другой нужный антиген-связывающий фрагмент, и экспрессированы в любом подходящем хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии. Так, например, рекомбинантное продуцирование РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)₂ и Р(аЬ')₂-фрагментов может быть также осуществлено известными методами, такими как методы, описанные в АО 92/22324; МиШпах В.Ь. е! а1. (1992), 8а^а1 Н. е! а1., (1995) и Вейет М. е! а1. (1988) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

Примерами методов, которые могут быть использованы для продуцирования одноцепочечных Ρνфрагментов и антител, являются методы, описанные в патентах США №№ 4946778 и 5258498; Ни§!оп е! а1. (1991); 81ш Ь. е! а1. (1993); и 8кетта А. е! а1. (1988). Для некоторых целей, включая ίη νίνοиспользование антител у человека и использование в детектирующих ίη νίίτο анализах, предпочтительно могут быть использованы химерные, гуманизированные или человеческие антитела. Методы продуцирования химерных антител известны специалистам. См., например, Мотткоп (1985); О1 е! а1. (1986); ОШкк 8.Ό. е! а1., (1989) и патент США № 5807715. Антитела могут быть гуманизированы с использованием ряда методов, включая СЭВ-прививку (ЕР 0239400; АО 91/09967; патенты США №№ 5530101 и 5585089), маскировку или модификацию поверхности (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Рай1ап Е.А. (1991); 8!ийшска О.М. е! а1. (1994); Водикка М.А. е! а1. (1994)) и перестановку цепей (патент США № 5565332). Человеческие антитела могут быть получены рядом методов, известных специалистам, включая методы фагового представления, описанные выше. См. также патенты США №№ 4444887, 4716111, 5545806 и 5814318; АО 98/46645; АО 98/50433; АО 98/24983; АО 96/34096; АО 96/33735 и АО 91/10741 (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, рекомбинантно присоединенным или химически конъюгированным (включая ковалентное или нековалентное конъюгирование) с полипептидом настоящего изобретения. Эти антитела могут быть специфичными к антигенам, не являющимся полипептидами настоящего изобретения. Так, например, антитела могут быть использованы для доставки полипептидов настоящего изобретения в клетки конкретных типов, либо ш У11го. либо ш νί\Ό. путем связывания или конъюгирования полипептидов настоящего изобретения с антителами, специфичными к конкретным рецепторам клеточной поверхности. Антитела, связанные или конъюгированные с полипептидами настоящего изобретения, могут быть также использованы в ш νίΙΐΌ иммуноанализах и в методах очистки, известных специалистам. См., например, НагЬог е! а1., см. выше и АО 93/21232; ЕР 0439095; Хататита М. е! а1. (1994); патент США № 5474981; ОШкк 8.О. е! а1. (1992); Ре11 Н.Р. е! а1. (1991) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим полипептиды настоящего изобретения, связанные или конъюгированные с доменами антител, не являющимися вариабельными областями. Так, например, полипептиды настоящего изобретения могут быть связаны или конъюгированы с Рс-областью антитела или с его частью. Эта часть антитела, соединенная с полипептидом настоящего изобретения, может содержать шарнирную область, домен СН1, домен СН2 и домен СН3 или любую комбинацию целых доменов или их частей. Полипептиды настоящего изобретения могут быть связаны или конъюгированы с вышеуказанными частями антител для увеличения времени полужизни полипептидов ш У1хо или для использования в иммуноанализах в соответствии с методами, известными специалистам. Эти полипептиды могут быть также слиты или конъюгированы с вышеуказанными частями антител с образованием мультимеров. Так, например, Рс-части, соединенные с полипептидами настоящего изобретения, могут образовывать димеры посредством дисульфидной связи между этими Рс-частями. Более крупные мультимерные формы могут быть получены путем соединения полипептидов с частями 1дА и 1дМ. Методы слияния или конъюгирования полипептидов настоящего изобретения с частями антител известны специалистам. См., например, патенты США №№ 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5112946; ЕР 0307434; ЕР 0367166; АО 96/04388, АО 91/06570; АзЬкепаа А. е! а1. (1991); /Репе Х.Х. е! а1. (1995) и У11 Н. е! а1. (1992) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, которые действуют как агонисты или антагонисты для полипептидов настоящего изобретения. Так, например, настоящее изобретение относится к антителам, которые нарушают взаимодействие рецептор/лиганд с полипептидами настоящего изобретения, либо частично, либо полностью. В объем настоящего изобретения входят рецепторспецифические антитела и лиганд-специфические антитела. В объем настоящего изобретения входят ре

- 27 005921 цептор-специфические антитела, которые не предотвращают связывание с лигандом, но предотвращают активацию рецептора. Активация рецептора (т.е. передача сигнала) может быть определена методами, описанными в настоящей заявке, или какими-либо другими известными методами. Настоящее изобретение также включает рецептор-специфические антитела, которые предотвращают связывание с лигандом и активацию рецептора. Аналогичным образом, в объем настоящего изобретения входят нейтрализующие антитела, которые связываются с лигандом и предотвращают связывание лиганда с рецептором, а также антитела, которые связываются с лигандом и тем самым предотвращают активацию рецептора, но не предотвращают связывание лиганда с рецептором. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые активируют этот рецептор. Указанные антитела могут действовать как агонисты по отношению ко всем либо не ко всем биологическим активностям, подвергающимся влиянию лигандопосредованной активации рецептора. Указанные антитела могут быть определены как агонисты или антагонисты биологических активностей, включающих описанные здесь удельные активности. Вышеуказанные антитела-агонисты могут быть получены методами, известными специалистам. См., например, №0 96/40281; патент США № 5811097; Вейд В. е! а1. (1988); СКеп Ζ. е! а1. (1998); Наггор ΓΑ. е! а1. (1998); ΖΙιιι Ζ. е! а1. (1998), Υοοη ϋ.Υ. е! а1. (1998); Рга! М. е! а1., (1998); Рйагб V. е! а1. (1997); Ыаи!агб I. е! а1. (1997); Саг1зоп N.0. е! а1. (1997); Тагутап К.Е. е! а1. (1995); Ми11ег Υ.Α. е! а1. (1998); Вайипек Р. е! а1. (1996) (которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

Как обсуждалось выше, антитела для полипептидов настоящего изобретения могут быть, в свою очередь, использованы для генерирования антиидиотипических антител, которые имитируют полипептиды настоящего изобретения, методами, хорошо известными специалистам. См. например, Сгеепзрап & Вопа (1989); ДШтоГГ (1991). Так, например, антитела, которые связываются с полипептидом и конкурентно ингибируют мультимеризацию полипептида или связывание полипептида настоящего изобретения с лигандом, могут быть использованы для генерирования антиидиотипических антител, которые имитируют мультимеризацию или связывание домена, а, следовательно, связывание и нейтрализацию полипептида или его лиганда. Такие нейтрализующие антиидиотипические антитела могут быть использованы для связывания полипептида настоящего изобретения или для связывания с его лигандом/рецептором и, тем самым, блокирования его биологической активности.

Рекомбинантные векторы

Используемый здесь термин вектор означает кольцевую или линейную молекулу ДНК или РНК, которая является либо двухцепочечной, либо одноцепочечной, и которая содержит по крайней мере один нужный полинуклеотид, предназначенный для его переноса в клетку-хозяина, либо в одноклеточный или в многоклеточный организм хозяина.

Настоящее изобретение охватывает семейство рекомбинантных векторов, включающих регуляторный полинуклеотид, происходящий от геномной последовательности РАРАР, и/или кодирующий полинуклеотид, происходящий либо от геномной последовательности либо от кДНК-последовательности РАРАР.

В общих чертах рекомбинантный вектор настоящего изобретения может содержать любой из описанных здесь полинуклеотидов, включая регуляторные последовательности, кодирующие последовательности и полинуклеотидные конструкции, а также любой праймер или зонд РАРАР, определенный выше. Более конкретно рекомбинантные векторы настоящего изобретения могут содержать любой из полинуклеотидов, описанных в разделах Геномные последовательности гена РАРАР, кДНКпоследовательности РАРАР, Кодирующие области, Полинуклеотидные конструкции и Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

В первом предпочтительном варианте осуществления изобретения рекомбинантный вектор настоящего изобретения используется для амплификации встроенного полинуклеотида, происходящего от геномной последовательности РАРАР 8Еф ΙΌ N0: З или кДНК РАРАР, например кДНК 8Еф ΙΌ N0: 1 в подходящей клетке-хозяине, причем этот полинуклеотид амплифицируется каждый раз, когда реплицируется рекомбинантный вектор.

Во втором предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным векторам, содержащим либо регуляторный полинуклеотид, либо кодирующую нуклеиновую кислоту настоящего изобретения, либо и то, и другое. В некоторых вариантах осуществления изобретения экспрессирующие векторы используются для экспрессии полипептида РАРАР, который может быть затем очищен или, например, использован в лиганд-скринирующих анализах или в качестве иммуногена для вырабатывания специфических антител против белка РАРАР. В других вариантах осуществления изобретения экспрессирующие векторы используются для конструирования трансгенных животных, а также для генной терапии. Для экспрессии необходимо, чтобы в данных векторах вырабатывались соответствующие сигналы, где указанными сигналами являются различные регуляторные элементы, такие как энхансеры/промоторы, происходящие от вирусов или млекопитающих и регулирующие экспрессию нужных генов в клетках-хозяевах. Обычно в экспрессирующие векторы настоящего изобретения вводят маркеры доминантного отбора по лекарственному средству для получения перманентных, стабильных клеточных клонов, экспрессирующих данные продукты, поскольку они представляют собой элементы, которые осуществляют сцепление экспрессии маркера отбора по лекарственному средству с

- 28 005921 экспрессией данного полипептида.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к экспрессирующим векторам, включающим нуклеиновые кислоты, кодирующие белок РАРАР, а предпочтительно белок РАРАР аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2, или его варианты, или фрагменты.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному экспрессирующему вектору, используемому для экспрессии кодирующей последовательности РАРАР, где указанный вектор содержит нуклеиновую кислоту 8Е0 ΙΌ N0: 1.

Некоторые из элементов, которые могут присутствовать в векторах настоящего изобретения, более подробно описаны в следующих разделах.

1. Общие признаки экспрессирующих векторов настоящего изобретения.

Рекомбинантным вектором настоящего изобретения являются, но не ограничиваются ими, УАС (искусственная дрожжевая хромосома), ВАС (искусственная бактериальная хромосома), фаг, фагмида, космида, плазмида или даже линейная ДНК-молекула, которая может представлять собой хромосомную, нехромосомную, полусинтетическую и синтетическую ДНК. Такой рекомбинантный вектор может содержать единицу транскрипции, в состав которой входят (1) генетический элемент или элементы, регулирующие экспрессию, например промоторы или энхансеры. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно длиной примерно 10-300 п.н., которые воздействуют на промотор и, тем самым, усиливают транскрипцию;

(2) структурная или кодирующая последовательность, которая транскрибируется в мРНК и, в конечном счете, транслируется в полипептид, причем указанная структурная или кодирующая последовательность функционально присоединена к регуляторным элементам, описанным в (1); и (3) соответствующая последовательность инициации и терминации транскрипции.

Структурные единицы, предназначенные для использования в дрожжевых или эукариотических экспрессирующих системах предпочтительно включают лидерную последовательность, обеспечивающую внеклеточную секрецию транслированного белка клеткой-хозяином. Альтернативно, если рекомбинантный белок экспрессируется в отсутствие лидерной или транспортной последовательности, то он может включать ^концевой остаток. Затем этот остаток может или не может отщепляться от экспрессируемого рекомбинантного белка с образованием конечного продукта.

В основном, рекомбинантные экспрессирующие векторы включают сайты инициации репликации, селективные маркеры, осуществляющие трансформацию клетки-хозяина, и промотор, происходящий от высокоэкспрессируемого гена, для регуляции транскрипции расположенной ниже структурной последовательности.

Гетерологичная структурная последовательность подвергается укладке в соответствующей фазе с последовательностями инициации и терминации трансляции, а предпочтительно с лидерной последовательностью, способной регулировать секрецию транслируемого белка в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду. В конкретном варианте осуществления изобретения, где вектор адаптирован для трансфекции и экспрессии нужных последовательностей в клетках-хозяевах млекопитающего, предпочтительные векторы содержат сайты инициации репликации в нужном хозяине, подходящие промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания с рибосомой, сигнал полиаденилирования, донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и 5'фланкирующие нетранскрибируемые последовательности. ДНК-последовательности, происходящие от вирусного генома 8У40, например ранний промотор, энхансер, сигналы сплайсинга и полиаденилирования, могут быть использованы для получения необходимых нетранскрибируемых генетических элементов.

Ιη угуо-экспрессия полипептида РАРАР 8Е0 ΙΌ N0: 2, или его фрагментов, или вариантов может быть использована для коррекции генетического дефекта, ассоциированного с экспрессией нативного гена в организме хозяина или для продуцирования биологически неактивного белка РАРАР.

Следовательно, настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим векторам, сконструированным, главным образом, для продуцирования ίη у1уо полипептида РАРАР 8Е0 ΙΌ N0: 2, или его фрагментов, или вариантов путем введения соответствующего генетического материала в организм пациента, подвергаемого лечению. Этот генетический материал может быть введен ίη уПго в клетку, которая была предварительно экстрагирована из этого организма, после чего указанную модифицированную клетку-хозяина снова вводят в указанный организм, непосредственно ίη угуо в подходящую ткань.

2. Регуляторные элементы.

Промоторы

Подходящие промоторные области, используемые в экспрессирующих векторах настоящего изобретения, выбирают с учетом клетки-хозяина, в которой должен экспрессироваться гетерологичный ген. Какой именно промотор используется для регуляции экспрессии нужной последовательности нуклеиновой кислоты не имеет решающего значения, если только он способен регулировать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетках-мишенях. Таким образом, если клеткой-мишенью является человеческая клетка, то предпочтительно, чтобы положение данной кодирующей области нуклеиновой кислоты было

- 29 005921 смежным с данным промотором и находилось под контролем указанного промотора, способного регулировать ее экспрессию в человеческой клетке, например человеческого или вирусного промотора.

Подходящий промотор может быть гетерологичным по отношению к нуклеиновой кислоте, экспрессию которой он регулирует, или, альтернативно, он может быть эндогенным по отношению к нативному полинуклеотиду, содержащему экспрессируемую кодирующую последовательность. Кроме того, указанный промотор является, в основном, гетерологичным по отношению к рекомбинантным векторным последовательностям, в которые была встроена конструкция промотор-кодирующая последовательность.

Промоторные области могут быть выбраны из любого нужного гена с использованием, например, векторов САТ (хлорамфеникол-трансферазы), а более предпочтительно векторов рКК232-8 и рСМ7.

Предпочтительными бактериальными промоторами являются промоторы Ьас1, Ьас2, промоторы РНК-полимеразы бактериофага Т3 или Т7, промоторы §р1. лямбда РК, РЬ и 1гр (ЕР 0036776), промотор полиэдрина или промотор белка р10 бакуловируса (Κίΐ Шуадеи) (8т11й е1 а1., 1983; 0'КеШу е1 а1., 1992), промотор лямбда РК или также промотор 1гс.

Эукариотическими промоторами являются предранний промотор СМУ, промотор тимидинкиназы Н8У, ранний и поздний промотор 8У40, ЬТК от ретровируса и промотор мышиного металлотионеина-Ь. Выбор подходящего вектора и промотора может быть сделан любым специалистом.

Выбор промотора может быть сделан любым специалистом в области генной инженерии. Для этого специалист может, например, обратиться к книге 8атЬгоок е1 а1. (1989) или также к описанию соответствующих процедур, приведенному в работе Ри11ег е1 а1. (1996).

Другие регуляторные элементы

Если используется кДНК-вставка, то для эффективного осуществления полиаденилирования генного транскрипта необходимо ввести сигнал полиаденилирования. Природа сигнала полиаденилирования не имеет решающего значения для успешного осуществления настоящего изобретения, и для этих целей может быть использована любая последовательность, такая как сигналы гормона роста человека и сигналы полиаденилирования 8У40. Элементом экспрессионного кластера может быть также терминатор. Эти элементы могут служить для увеличения уровней транскрипта и для минимизации считывания информации с кластера в другие последовательности.

3. Селектируемые маркеры.

Указанные маркеры должны вводить в данную клетку идентифицируемые изменения, которые позволяют легко идентифицировать клетки, содержащие экспрессионную конструкцию. Такими селективными маркерными генами для отбора трансформированных клеток-хозяев являются предпочтительно ген дигодрофолат-редуктазы или ген резистентности к неомицину для эукариотической клеточной культуры, ТКР1 для 8. сегеу151ае или ген резистентности к тетрациклину, рифампицину или ампициллину для Е.со11, или ген левансахаразы для микобактерий, причем этот последний маркер является маркером негативного отбора.

4. Предпочтительные векторы.

Бактериальные векторы

В качестве репрезентативного, но неограничивающего примера, могут служить используемые в бактериях векторы, которые содержат селективный маркер и бактериальный сайт инициации репликации и которые могут быть получены из коммерчески доступных плазмид, содержащих генетические элементы рВК322 (АТСС 37017). Такими коммерчески доступными векторами являются, например, рКК223-3 (Рйагтас1а, Ирр5а1а, 8^е6еи) и 6ЕМ1 (Рготеда Вю1ес, Ма615ои, ^1, И8А).

Специалистам известно большое число других подходящих и коммерчески доступных векторов, таких как следующие бактериальные векторы: рОЕ70, рОЕ60, рОЕ-9 (Р1адеи), рЬ§, рЭ10, рйадеБспрр р51Х174, рЫиекспр! 8К, рЬккк, рNН8А, рNН16А, РNН18А, рNН46А (81га1адеие); р!гс99а, рКК223-3, рКК233-3, р1)К540, рК1Т5 (Рйагташа), р№Ъ1\1Е0, р8У2САТ, р0644, рХТ1, р86 (81га1адеие); р8УК3, рВРУ, рМ86, р8УЪ (Рйагтас1а); рОЕ-30 (О1Аехрге55).

Бактериофаговые векторы

Вектор на основе бактериофага Р1 может содержать крупные вставки, составляющие примерно от 80 до 100 т.п.н.

Конструирование векторов на основе бактериофага Р1, таких как р158 или р158/иео8, конкретно описаны у 81егпЬегд (1992, 1994). Рекомбинантные клоны Р1, содержащие нуклеотидные последовательности РАРАР, могут быть сконструированы путем встраивания крупных нуклеотидов, составляющих более чем 40 т.п.н. (Ьш1ои е1 а1. 1993). Для генерирования ДНК Р1 в целях проведения трансгенных экспериментов предпочтительным протоколом такого генерирования является протокол, описанный МсСогткк е1 а1. (1994). Вкратце, Е.со11 (предпочтительно, штамм N83529), содержащую плазмиду Р1, культивируют в течение ночи в подходящей питательной среде, содержащей 25 мкг/мл канамицина. ДНК Р1 выделяют из Е.со11 путем щелочного лизиса с использованием набора 0|адег1 Р1а5т1б Мах1 кН (^адеи, Ска15^ог1й, СА, И8А) в соответствии с инструкциями производителей. Затем ДНК Р1 очищают от бактериального лизата на двух колонках Р1адеи-йр 500 с использованием промывочных и элюирующих буферов, содержащихся в данном наборе. После экстракции фенолом/этанолом осуществляют преципитацию

- 30 005921

ДНК 70%-ным этанолом. После солюбилизации ДНК в ТЕ (10 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 1 мМ ΕΌΤΑ) концентрацию ДНК оценивают на спектрофотометре.

Если целью является экспрессия клона Р1, содержащего нуклеотидные последовательности РАРАР, в трансгенном животном, обычно в трансгенной мыши, то желательно удалить векторные последовательности из ДНК-фрагмента Р1, например, путем отщепления ДНК Р1 в редко разрезающихся сайтах в полилинкере Р1 (8Й1, Νο!ΐ или 8аИ). Затем вставку Р1 выделяют из векторных последовательностей на агарозном геле в импульсном поле методами, аналогичными методам, которые были недавно описаны для выделения ДНК из УАС (8сйеб1 е! а1., 1993а; РеЮгюм е! а1., 1993). На этой стадии полученную очищенную ДНК-вставку концентрируют, если это необходимо, на миллипористом фильтре ΜίΙΙίροΐΌ и1!гайее-МС Еб!ег Ипй (Μίΐΐίροΐΐ, Веб&гб, МА, И8А - предельная молекулярная масса 30000), а затем диализуют против буфера для микроинжекции (10 мМ Трис-НС1, рН 7,4; 250 мкМ ΕΌΤΑ), содержащего 100 мМ №С1, 30 мкМ спермина, 70 мкМ спермидина, на мембране для микродиализа (тип У8, 0,025 мкМ от Μί11ίροΐΐ). Целостность очищенной ДНК-вставки Р1 оценивают с помощью электрофореза в импульсном поле на 1% агарозном геле (8еа Кет СТС; ЕМС Вю-ргобисЦ) и с окрашиванием этидийбромидом.

Бакуловирусные векторы

Подходящим вектором для экспрессии полипептида РАРАР 8ЕЦ ΙΌ N0:2, или его фрагментов, или вариантов является вектор на основе бакуловируса, который размножается в клетках насекомого или в клеточных линиях насекомых. Особенно подходящей векторной системой хозяина является бакуловирусный вектор переноса рУЪ1392/1393 (Рйагттдеп), который используют для трансфекции клеточной линии 8Е9 (АТСС № СКЬ 1711), происходящей от 8ρο6ορΝπι йид1регба.

В соответствии с настоящим изобретением другими подходящими векторами для экспрессии полипептида РАРАР 8ЕЦ ΙΌ N0: 2, или его фрагментов, или вариантов в бакуловирусной системе экспрессии являются векторы, описанные Сйа1 е! а1. (1993), У1акак е! а1. (1983) и БепНагб е! а1. (1996).

Вирусные векторы

В одном конкретном варианте осуществления изобретения вектор получают из аденовируса. Предпочтительными аденовирусными векторами настоящего изобретения являются векторы, описанные Ее1бтап & 8!ед (1996) или Οΐιηο е! а1. (1994). В соответствии с настоящим изобретением, другим предпочтительным рекомбинантным аденовирусом является аденовирус человека типа 2 или 5 (Аб 2 или Аб 5) или аденовирус, происходящий от животного (заявка на патент Франции № ЕК-93.05954).

В качестве систем доставки рекомбинантного гена для переноса экзогенных полинуклеотидов ίη νίνο, в частности, млекопитающим, включая человека, обычно используются векторы, полученные на основе ретровирусов и аденоассоциированных вирусов. Эти векторы обеспечивают эффективную доставку генов в клетки, и перенесенные нуклеиновые кислоты стабильно интегрируются в хромосомную ДНК хозяина.

Особенно предпочтительными ретровирусами для получения или конструирования ретровирусных носителей для ίη νίνο или ίη νίίτο для доставки гена настоящего изобретения являются ретровирусы, выбранные из группы, состоящей из фокус-индуцирующего вируса клеток норки, вируса саркомы мыши, вируса ретикулоэндотелиоза и вируса саркомы Рауса. Особенно предпочтительными вирусами мышиного лейкоза являются штаммы 4070А и 1504А, вирусы Абельсона (АТСС № УК-999), Фрейнда (АТСС № УК-245), Гросса (АТСС № УК-590), Раушера (АТСС № УК-998) и вирус мышиного лейкоза Молони (АТСС № УК-190; заявка РСТ № νΟ 94/24298). Особенно предпочтительными вирусами саркомы Рауса являются вирус Бриана с высоким титром (АТСС № УК-334, УК-657, УК-726, УК-659 и УК-728). Другими предпочтительными ретровирусными векторами являются векторы, описанные Ρο!1ι е! а1. (1996), в заявке РСТ № νΟ 93/25234, в заявке РСТ № νΟ 94/06920, Ροιιχ е! а1., 1989, Шип е! а1., 1992 и №ба е! а1., 1991.

Другая система вирусных векторов, которая может быть использована в настоящем изобретении, содержит аденоассоциированный вирус (ААУ). Этот аденоассоциированный вирус является природным дефектным вирусом, которому для его эффективной репликации и для продуктивного клеточного цикла, требуется другой вирус-помощник, такой как аденовирус или герпесвирус (Ми/усхка е! а1., 1992). Он также является одним из нескольких вирусов, которые могут интегрировать свою ДНК в неделящиеся клетки и обнаруживают высокую частоту стабильной интеграции (ЕШйе е! а1., 1992; 8ати1§к1 е! а1., 1989; МсЬаидЫт е! а1., 1989). Одним из преимущественных признаков ААУ является то, что его эффективность трансдукции в первичные клетки меньше, чем в трансформированные клетки.

ВАС-векторы

Система клонирования искусственной бактериальной хромосомы (ВАС) (8Ыгиуа е! а1., 1992) была разработана для стабильного поддерживания крупных фрагментов геномной ДНК (100-300 т.п.н.) в Ε^ο1ί. Предпочтительным ВАС-вектором является вектор рВеШВАСП, описанный К1т е! а1. (1996). ВАС-библиотеки, содержащие этот вектор, получают с использованием отобранной по размеру геномной ДНК, частично гидролизованной ферментами, которые позволяют ее лигировать либо в ВатН1-сайт, либо в НшбШ-сайт в данном векторе. Эти сайты клонирования фланкируются сайтами инициации транскрипции РНК-полимеразы Т7 и 8Р6, которые могут быть использованы для генерирования концевых зондов либо путем транскрипции РНК, либо ПЦР-методами. После конструирования ВАС-библиотеки в

- 31 005921

Е.сой ВАС-ДНК выделяют из клетки-хозяина в виде суперспирализованного кольца. После превращения этих кольцевых молекул в их линейную форму определяют их размер и эти ВАС вводят в клетки реципиента. Клонирующий сайт фланкирован двумя №П-сайтами, что позволяет вырезать эти клонированные сегменты из вектора посредством №П-гидролиза. Альтернативно, ДНК-вставка, содержащаяся в векторе рВе1оВАС11, может быть линеаризована путем обработки ВАС-вектора коммерчески доступным ферментом лямбда-терминазой, что приводит к его разрезанию в уникальном сок№сайте, но этот метод гидролиза дает полноразмерный ВАС-клон, содержащий как ДНК-вставку, так и ВАСпоследовательности.

5. Доставка рекомбинантных векторов.

Для осуществления экспрессии полинуклеотидов и полинуклеотидных конструкций настоящего изобретения эти конструкции должны быть доставлены в клетку. Такая доставка может быть осуществлена ίη уйго лабораторными процедурами, проводимыми для трансформации клеточных линий, ίη угуо или ех у1уо, а также для лечения некоторых патологических состояний.

Одним из таких механизмов является инфицирование вирусом, где экспрессионная конструкция инкапсулирована в инфекционную вирусную частицу.

В настоящем изобретении также рассматривается несколько невирусных способов переноса полинуклеотидов в культивируемые клетки млекопитающих, и такими способами являются, но не ограничиваются ими, преципитация фосфатом кальция (Сгайат е! а1., 1973; Сйеп е! а1., 1987); ОЕАЕ-декстрановая трансфекция (Сора1 е! а1., 1985), электропорация (Тиг-Какра е! а1., 1986; Ро!!ег е! а1., 1984), прямая микроинжекция (Наг1апй е! а1., 1985), использование ДНК-нагруженных липосом (№со1аи е! а1., 1982; Рга1еу е! а1., 1979) и опосредованная рецептором трансфекция (Ши & Ши, 1987; 1988). Некоторые из этих методов могут быть успешно адаптированы для использования ίη у1уо или ех у1уо.

После доставки экспрессируемого полинуклеотида в клетку он может стабильно интегрироваться в геном клетки-реципиента. Эта интеграция может происходить в когнатной локализации и ориентации посредством гомологичной рекомбинации (замены гена) либо она может происходить в случайном неспецифическом положении (добавление гена). В других вариантах осуществления изобретения нуклеиновая кислота может стабильно поддерживаться в клетке как отдельный, эписомный сегмент ДНК. Такие сегменты нуклеиновой кислоты или эписомы кодируют последовательности, подходящие для их сохранения и репликации независимо или синхронизовано с циклом клетки-хозяина.

Один из конкретных вариантов осуществления метода доставки белка или пептида вовнутрь клетки позвоночного ίη у1уо включает стадию введения препарата, содержащего физиологически приемлемый носитель и голый полинуклеотид, функционально кодирующий нужный полипептид в интерстициальном пространстве ткани, содержащей данную клетку, в результате чего этот голый полинуклеотид проникает вовнутрь клетки и обладает физиологическим действием. Этот способ, в частности, применяется для переноса ίη уйго, но он может быть также применен и для переноса ίη у1уо.

Композиции для использования ίη уйго и ίη у1уо, включающие голый полинуклеотид, описаны в заявке РСТ № Ш0 90/11092 (Уюа1 Шс.), а также в заявке РСТ № Ш0 95/11307 (ΙηκΙίΙιιΙ Рак!еиг, Ш^ЕКМ. Ишуегкйе 6'011а\\'а) и в статьях Таской е! а1. (1996) и Наудеи е! а1. (1996).

В другом варианте осуществления изобретения, перенос голого полинуклеотида настоящего изобретения, включая полинуклеотидную конструкцию настоящего изобретения, в клетки может быть осуществлен путем бомбардировки частицами (биобаллистики), где указанные частицы представляют собой микроснаряды, покрытые ДНК и ускоряемые с высокой скоростью, которая позволяет им пробивать клеточные мембраны и проникать в клетки, не вызывая их гибель, так, как описано К1еш е! а1. (1987).

В другом варианте осуществления изобретения полинуклеотид настоящего изобретения может быть инкапсулирован в липосому (Сйокй & Вассйа^а! 1991; Шоид е! а1., 1980; №со1аи е! а1., 1987).

В конкретном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к композиции для ίη угуо продуцирования описанного здесь белка или полипептида РАРАР. Эта композиция содержит голый полинуклеотид, функционально кодирующий указанный полипептид, в растворе, в физиологически приемлемом носителе, и подходящий для введения в ткань так, чтобы клетки этой ткани экспрессировали указанный белок или полипептид.

Количество вектора, инъецируемого в нужный организм хозяина, варьируется в зависимости от участка инъекции. В качестве примера указанный вектор может быть инъецирован в дозе, составляющей от 0,1 до 100 мкг, в организм животного, предпочтительно млекопитающего, например мыши.

В другом варианте вектора настоящего изобретения этот вектор может быть введен в клеткухозяина ίη уйго, а предпочтительно в клетку-хозяина, предварительно выделенную из организма обработанного животного, а более предпочтительно в соматическую клетку, такую как мышечная клетка. В последующей стадии клетку, которая была трансформирована вектором, кодирующим нужный полипептид РАРАР или его нужный фрагмент, снова вводят в организм животного для местной или системной доставки рекомбинантного белка в данный организм.

Клетки-хозяева

Другим объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, которая была трансформирована или трансфицирована одним из описанных здесь полинуклеотидов, а в частности, полинуклеотидом, со

- 32 005921 держащим либо регуляторный полинуклеотид РАРАР, либо кодирующую область полипептида РАРАР 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 3, или его фрагментом, или вариантом. Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, которые были трансформированы (прокариотические клетки) или трансфицированы (эукариотические клетки), рекомбинантным вектором, таким как один из векторов, описанных выше. Более конкретно, клетки-хозяева настоящего изобретения могут включать любой из полинуклеотидов, описанных в разделах Геномные последовательности гена РАРАР, кДНК-последовательности РАРАР, Кодирующие области, Полинуклеотидные конструкции и Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

Другая рекомбинантная клетка-хозяин настоящего изобретения содержит любой из описанных здесь векторов, а более конкретно любой из векторов, описанных в разделе Рекомбинантные векторы.

Предпочтительными клетками-хозяевами, используемыми в качестве реципиентов для экспрессирующих векторов настоящего изобретения, являются

a) прокариотические клетки-хозяева: штаммы ЕксЕепсЫа со11 (штамм Ι.Ε. ΌΗ5α), ВасШик кнЫШк, 8а1топе11а [урЫтипит и штаммы таких видов, как Ркеиботопак, 81гер1отусек и 81ар11у1ососси8.

b) эукариотические клетки-хозяева: клетки НеЬа (АТСС № ССЬ2; № ССЬ2.1; № ССЬ2.2), клетки Ον1 (АТСС № ССЬ70), клетки С08 (АТСС № СВЫ650; № СКЫ651), клетки 8Е9 (АТСС № СКЫ711), клетки С127 (АТСС № СВЬ-1804), клетки 3Т3 (АТСС № СВЬ-6361), клетки СНО (АТСС № ССЬ-61), клетки почек человека 2ЭЗ (АТСС № 45504; № СВЬ-1573) и клетки ВНК (ЕСАСС № 84100501; № 84111301).

c) другие клетки-хозяева млекопитающих.

Экспрессия гена РАРАР в клетках млекопитающих, а обычно человека, может быть сделана дефектной или, альтернативно, она может быть осуществлена путем инсерции геномной или кДНКпоследовательности РАРАР с заменой соответствующего гена-аналога РАРАР в геноме клетки млекопитающего полинуклеотидом РАРАР настоящего изобретения. Эти генетические альтерации могут быть генерированы посредством событий гомологичной рекомбинации с использованием специфических ДНК-конструкций, которые были предварительно описаны ранее.

Одним из видов используемых клеток-хозяев являются зиготы млекопитающих, такие как мышиные зиготы. Так, например, в мышиные зиготы может быть введена путем микроинжекции представляющая интерес очищенная молекула ДНК, например очищенная молекула ДНК, которая предварительно была доведена до концентрации в пределах от 1 нг/мл для ВАС-вставок, и до 3 нг/мкл для вставок бактериофага Р1, в 10 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 250 мкМ ЕЭТА, содержащего 100 мМ №С1, 30 мкМ спермина и 70 мкМ спермидина. Если указанная микроинъецируемая ДНК имеет большой размер, то во избежание механического повреждения этой ДНК могут быть использованы полиамины и высокие концентрации солей, как описано 8с11еб1 еί а1 (1993Ь).

Любой из полинуклеотидов настоящего изобретения, включая описанные здесь ДНК-конструкции, может быть введен в линию эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), а предпочтительно мышиную линию ЭСК. Линии ЭСК происходят от плюрипотентных некоммитированных клеток внутренней клеточной массы бластоцистов перед имплантацией. Предпочтительными линиями ЭСК являются Е8-Е14ТС2а (АТСС № СКЬ-1821), Ε8-Ό3 (АТСС № СНЕ 1934 и № СКЬ-11632), Υ8001 (АТСС № СНЕ11776), 36,5 (АТСС № СКЕ-11116). Для поддержания ЭСК в некоммитированном состоянии их культивируют в присутствии питающих клеток с ингибированным ростом, которые передают соответствующие сигналы для сохранения этого эмбрионального фенотипа и служат в качестве матрицы для адгезии ЭСК. Предпочтительными питающими клетками являются первичные эмбриональные фибробласты, которые получают из ткани 13-дневных 14 эмбрионов фактически любого мышиного штамма, поддерживаемых в культуре, как описано АЬЬопбапхо еί а1. (1993), и рост которых ингибируется путем их облучения, как описано НоЬеПкоп (1987), либо благодаря присутствию ингибирующей концентрации ЫЕ, как описано Реаке & ^1Шатк (1990).

Эти конструкции в клетках-хозяевах могут быть использованы соответствующим образом для продуцирования генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью.

После трансформации подходящего хозяина и культивирования хозяина до соответствующей клеточной плотности выбранный промотор индуцируется подходящими способами, такими как изменение температуры или химическая индукция, и клетки культивируют еще в течение некоторого времени.

Клетки обычно собирают путем центрифугирования, разрушают физическими или химическими методами и полученный неочищенный экстракт сохраняют для последующей очистки.

Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, могут быть разрушены стандартными способами, включая проведение циклов замораживания-оттаивания, обработку ультразвуком, механическую дизрупцию или использование агентов для лизиса клеток. Эти методы хорошо известны специалистам.

Активация гена РАРАР

Настоящее изобретение также относится к первичным, вторичным и иммобилизованным рекомбинантным клеткам, полученным посредством гомологичной рекомбинации из клеток позвоночных, предпочтительно клеток млекопитающих, а особенно предпочтительно из клеток человека, которые были

- 33 005921 сконструированы для а) встраивания экзогенных (гетерологичных) полинуклеотидов в эндогенную хромосомную ДНК нужного гена, (Ь) делетирования эндогенных хромосомных ДНК и/или (с) замены эндогенной хромосомной ДНК экзогенными полинуклеотидами. Инсерции, делеции и/или замены полинуклеотидных последовательностей могут быть осуществлены в кодирующих последовательностях целевого гена и/или в регуляторных областях, таких как промоторные и энхансерные последовательности, функционально ассоциированные с целевым геном.

Настоящее изобретение также относится к способу получения рекомбинантных клеток-хозяев, продуцированных посредством гомологичной рекомбинации ίη νίίΐΌ или ίη νί\Ό, где экспрессия целевого гена, аномально экспрессируемого в данной клетке, является измененной. Такое изменение предпочтительно приводит к экспрессии целевого гена в нормальных условиях роста или в условиях, подходящих для продуцирования полипептида, кодируемого целевым геном. Этот способ включает стадии (a) трансфекции клетки ίη νίΐΐΌ или ίη νί\Ό полинуклеотидной конструкцией, которая содержит (ί) последовательность для доставки; (ίί) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность и (ίίί) донорный сайт непарного сплайсинга, если необходимо, с продуцированием трансфицированной клетки;

(b) поддержания трансфицированной клетки ίη νίίΐΌ или ίη νί\Ό в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации.

Настоящее изобретение также относится к способу изменения экспрессии целевого гена в клетке ίη νίΐΐΌ или ίη νί\Ό, где указанный ген аномально экспрессируется, причем указанный способ включает стадии (a) трансфекции клетки ίη νίΐΐΌ или ίη νί\Ό полинуклеотидной конструкцией, которая содержит (ί) последовательность для доставки; (ίί) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность и (ίίί) донорный сайт непарного сплайсинга, если это необходимо, с продуцированием трансфицированной клетки;

(b) поддержания трансфицированной клетки ίη νίίΐΌ или ίη νί\Ό в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации, с продуцированием рекомбинантной клетки посредством гомологичной рекомбинации; и (c) поддерживания указанной рекомбинантной клетки ίη νίΐΐΌ или ίη νί\Ό в условиях, подходящих для экспрессии данного гена.

Настоящее изобретение также относится к способу получения полипептида настоящего изобретения путем изменения экспрессии целевого эндогенного гена в клетках-хозяевах ίη νίίго или ίη νί\Ό. где указанный ген аномально экспрессируется в данной клетке; причем указанный способ включает стадии (a) трансфекции клетки ίη νίΐΐΌ или ίη νί\Ό полинуклеотидной конструкцией, которая содержит (ί) последовательность для доставки; (ίί) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность и (ίίί) донорный сайт непарного сплайсинга, если необходимо, с продуцированием трансфицированной клетки;

(b) поддержания трансфицированной клетки ίη νίίΐΌ или ίη νί\Ό в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации, с продуцированием гомологично рекомбинантной клетки; и (c) поддерживания рекомбинантной клетки, продуцированной посредством гомологичной рекомбинации ίη νίίΐΌ или ίη νί\Ό, в условиях, подходящих для экспрессии данного гена, с получением указанного полипептида.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидой конструкции, которая изменяет экспрессию целевого гена в клетке определенного типа, в которой он аномально экспрессируется. Это происходит в случае, когда данную полинуклеотидную конструкцию встраивают в хромосомную ДНК клетки-мишени, где указанная полинуклеотидная конструкция содержит (а) последовательность для доставки; (Ь) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность и (с) донорный сайт непарного сплайсинга, если это необходимо. Кроме того, настоящее изобретение включает полинуклеотидую конструкцию, описанную выше, где указанная конструкция, кроме того, содержит полинуклеотид, который кодирует полипептид и находится в той же самой рамке считывания с целевым эндогенным геном после осуществления гомологичной рекомбинации в хромосомной ДНК.

Эти композиции могут быть продуцированы, а указанные методы могут быть осуществлены, как описано в патентах США №№ 6054288; 6048729; 6048724; 6048524; 5994127; 5968502; 5965125; 5869239; 5817789; 5783385; 5733761; 5641670; 5580734; в международных публикациях №№ νθ 96/29411, νθ 94/12650 и в научных статьях, включая 1994; Яо11ег е1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8сг И8А 86:8932-8935 (1989) (описания которых во всей своей полноте вводятся в настоящую заявку посредством ссылки).

Трансгенные животные

Используемые здесь термины трансгенные животные или животные-хозяева означают животных, имеющих геном, который был генетически или искусственно модифицирован так, чтобы он включал одну из нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Предпочтительными животными являются млекопитающие, но не человек, принадлежащие к роду, выбранному из Мик (например, мыши), Яайик (например, крысы) и 0гус1ода1ик (например, кролики), имеющие геном, который был искусственно или генетически модифицирован путем встраивания в него нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В

- 34 005921 одном из своих предпочтительных вариантов настоящее изобретение относится к млекопитающимхозяевам, не являющимся человеком, и к другим животным, содержащим рекомбинантный вектор настоящего изобретения или ген РАРАР, разрушенный посредством гомологичной рекомбинации с нокаут-вектором.

Во многих клетках всех указанных трансгенных животных имеется клонированная рекомбинантная или синтетическая ДНК-последовательность, а более конкретно, одна из очищенных или выделенных нуклеиновых кислот, содержащих РАРАР-кодирующую последовательность, регуляторную последовательность РАРАР, полинуклеотидную конструкцию или ДНК-последовательность, кодирующую антисмысловой полипептид, такой как полипептид, описанный в настоящей заявке.

В основном, трансгенное животное настоящего изобретения содержит любой один из полинуклеотидов, рекомбинантных векторов и клеток-хозяев, описанных в настоящем изобретении. Более конкретно, трансгенные животные настоящего изобретения могут содержать любой из полинуклеотидов, описанных в разделах Геномные последовательности гена РАРАР, кДНК-последовательности РАРАР, Кодирующие области, Полинуклеотидные конструкции и Олигонуклеотидные зонды и праймеры, Рекомбинантные векторы и Клетки-хозяева.

В первом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные трансгенные животные могут служить хорошими экспериментальными моделями для исследования различных патологий, ассоциированных с дифференцировкой клетки, а в частности, настоящее изобретение относится к трансгенным животным, в геном которых были встроены одна или несколько копий полинуклеотида, кодирующего нативный белок РАРАР или, альтернативно, белок мутант РАРАР.

Во втором предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные трансгенные животные могут экспрессировать нужный полинуклеотид под контролем регуляторных полинуклеотидов гена РАРАР, что приводит к хорошему выходу при синтезе нужного белка, а фактически к тканеспецифической экспрессии представляющего интерес белка.

Конструирование трансгенных животных настоящего изобретения может быть осуществлено стандартными методами, хорошо известными специалистам. Более подробное описание продуцирования трансгенных животных, а в частности трансгенных мышей, можно найти в патентах США № 4873191, выданном 10 октября 1989 г.; № 5464764, выданном 7 ноября 1995 г.; и № 5789215, выданном 4 августа 1998 г.; где указанные документы для описания методов продуцирования трансгенных мышей вводятся в настоящую заявку посредством ссылки.

Трансгенные животные настоящего изобретения были продуцированы в соответствии с процедурами, в результате которых было получено животное с геномом, имеющим включенный в него экзогенный генетический материал. Указанная процедура предусматривает получение генетического материала или его части, которая содержит либо кодирующую последовательность РАРАР, либо регуляторный полинуклеотид РАРАР, либо ДНК-последовательность, кодирующую антисмысловой полинуклеотид РАРАР, например полинуклеотид, описанный в настоящей заявке.

Рекомбинантный полинуклеотид настоящего изобретения встраивают в эмбриональную клеточную линию или в линию эмбриональных стволовых (ЭС) клеток. Встраивание предпочтительно осуществляют путем электропорации, например, как описано ТБотак е1 а1. (1987). Клетки, подвергаемые электропорации, скринируют (например, путем отбора с помощью селективных маркеров либо с помощью ПЦР или Саузерн-блот-анализа) на позитивные клетки, которые имеют в своем геноме интегрированный экзогенный рекомбинантный полинуклеотид, продуцированный предпочтительно в результате событий гомологичной рекомбинации. Иллюстративным примером процедуры позитивного-негативного отбора, которая может быть использована в соответствии с настоящим изобретением, является процедура, описанная Маикоиг е1 а1. (1988).

Затем позитивные клетки выделяют, клонируют и инъецируют в 3,5-дневные бластоцисты мышей, как описано Вгаб1еу (1987). После этого бластоцисты вводят самкам животных-хозяев и оставляют на некоторое время для роста.

Альтернативно, позитивные ЭС-клетки подвергают контакту с 2,5-дневными эмбрионами на 8-16клеточной стадии (морулы), как описано \Уооб е1 а1. (1993) или №1ду е1 а1. (1993), причем эти ЭС-клетки интернализируют для образования обширных колоний бластоцистов, включая клетки, которые продуцируют зародышевую клеточную линию.

Потомство самки животного-хозяина тестируют для того, чтобы определить, какие животные являются трансгенными, т.е. имеют встроенную экзогенную ДНК-последовательность, а какие животные являются животными дикого типа.

Таким образом, настоящее изобретение относится к трансгенному животному, содержащему нуклеиновую кислоту, рекомбинантный экспрессирующий вектор или рекомбинантную клетку-хозяина настоящего изобретения.

Рекомбинантные клеточные линии, происходящие от трансгенных животных настоящего изобретения

Другим объектом настоящего изобретения являются рекомбинантные клетки-хозяева, полученные от описанных здесь трансгенных животных. В одном из вариантов своего осуществления настоящее изо

- 35 005921 бретение охватывает клетки, полученные от млекопитающих-хозяев, не относящихся к человеку, и животных, содержащих рекомбинантный вектор настоящего изобретения или ген РАРАР, подвергнутый дизрупции в результате гомологичной рекомбинации с нокаут-вектором.

Рекомбинантные клеточные линии могут быть продуцированы ίη уйго из клеток, полученных из любой ткани трансгенного животного в соответствии с настоящим изобретением, например, путем трансфекции первичных клеточных культур векторами, экспрессирующими онкогены, такие как большой Т-антиген 8У40, как описано СНои (1989) и 8Еау е! а1. (1991).

Анализы на идентификацию соединений для лечения шизофрении и биполярного нарушения

Настоящее изобретение относится к анализам, которые могут быть использованы для тестирования соединений на их способность к лечению нарушений ЦНС, а в частности к ослаблению симптомов нарушений ЦНС, опосредованных РАРАР. В предпочтительных вариантах своего осуществления настоящее изобретение относится к соединениям, тестируемым на их способность ослаблять симптомы шизофрении или биполярного нарушения, опосредованных РАРАР.

Такие соединения могут быть также протестированы на их способность к лечению родственных нарушений, включая психотические нарушения, нарушения настроения, аутизм, злоупотребление веществами, вызывающими зависимость, и алкоголизм, задержку умственного развития и другие психические заболевания, включая нарушение познавательной способности, тревожные состояния, нарушения, связанные с приемом пищи, неконтролируемую импульсивность и нарушение личности, определенные в соответствии с Руководством по диагностике и статистике психических нарушений, четвертое издание, классификация (Э^М-ГУ).

Настоящее изобретение также относится к клеткам и животным, включая приматов и грызунов, к моделям шизофрении и биполярного нарушения и родственных нарушений.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к неклеточным анализам или к анализам, проводимым с использованием клеток и животных, для идентификации таких соединений, которые влияют на активность РАРАР. Активность РАРАР может быть подвергнута изменению под действием любого механизма; а в некоторых вариантах осуществления изобретения активность РАРАР может быть изменена путем модуляции уровня экспрессии гена РАРАР или активности генного продукта РАРАР.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к неклеточным анализам или к анализам, проводимым с использованием клеток и животных, для идентификации соединений, которые влияют на активность §34872. Активность §34872 может быть изменена путем модуляции уровня экспрессии гена РАРАР или активности генного продукта РАРАР. Предпочтительно анализы для идентификации соединений, влияющих на активность §34872, позволяют детектировать взаимодействие полипептидов РАРАР и §34872 или детектировать комплексы РАРАР-§34872.

Способы настоящего изобретения позволяют идентифицировать соединения, которые непосредственно или опосредованно влияют на активность РАРАР или §34872. Анализы настоящего изобретения, проводимые без использования клеток или с использованием клеток и животных, могут применяться для идентификации соединений, которые влияют на элемент пути РАРАР, а не на сам РАРАР. Затем эти соединения могут быть использованы в качестве терапевтического средства для модуляции РАРАР и других генных продуктов, ассоциированных с шизофренией, с биполярным нарушением и с родственными нарушениями.

Клеточные и неклеточные анализы

В одном аспекте клеточные анализы, проводимые с использованием рекомбинантных или нерекомбинантных клеток, могут применяться для идентификации соединений, модулирующих активность РАРАР.

В одном аспекте изобретения клеточный анализ настоящего изобретения относится к способу идентификации тестируемого соединения для лечения шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения ЦНС, предусматривающему (а) обработку клеток тестируемым соединением при концентрации и в течение времени, достаточных для ослабления имеющегося на данный момент состояния, ассоциированного с шизофренией, биполярным нарушением или родственным нарушением ЦНС, и (Ь) определения уровня активности РАРАР или взаимодействия РАРАР-§34872 или их комплексов в клетке. Активность РАРАР может быть измерена, например, путем анализа клетки на уровень мРНКтранскриптов, уровень экспрессии пептида РАРАР, локализацию или активность белка. Предпочтительным тестируемым соединением является соединение, способное или предположительно способное ослаблять симптом шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения. Тестируемые соединения, способные модулировать активность РАРАР, могут быть отобраны для использования при разработке лекарственных средств. Такие клеточные анализы подробно описаны в разделе, озаглавленном Способ скрининга лигандов, модулирующих экспрессию гена РАРАР.

В другом аспекте осуществления клеточного анализа настоящее изобретение включает способ идентификации соединения для лечения шизофрении или биполярного нарушения, предусматривающий (а) обработку клеток, имеющих РАРАР с уровнем активности, достаточным для стимуляции соответствующего состояния, ассоциированного с шизофренией или биполярным нарушением, и (Ь) обработку указанной клетки тестируемым соединением. Затем тестируемое соединение может быть отобрано на его

- 36 005921 способность ослаблять указанное имеющееся на данный момент состояние, ассоциированное с шизофренией или биполярным нарушением. Активность РАРАР может быть индуцирована любым подходящим методом, включая, но не ограничиваясь ими, получение вектора, содержащего нуклеотидную последовательность РАРАР, обработку указанной клетки соединением, способным повышать уровень экспрессии РАРАР, и обработку указанной клетки пептидом РАРАР. Предпочтительным тестируемым соединением является соединение, способное или предположительно способное ослаблять симптом шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения; и, альтернативно, соединение, которое, как предполагается, усиливает имеющееся состояние, ассоциированное с шизофренией, биполярным нарушением или родственным нарушением. Тестируемое соединение, способное ослаблять любой детектируемый симптом или имеющееся состояние, ассоциированное с шизофренией, биполярным нарушением или родственным нарушением, может быть отобрано для разработки лекарственных средств. Подходящие клеточные линии могут быть определены любым специалистом; при этом предпочтительно использовать клеточные линии, происходящие из нервной системы.

В другом варианте настоящее изобретение относится к клеточным и к неклеточным анализам РАРАР, проводимым для детекции связывания пептидов РАРАР с клеточной поверхностью, и для идентификации соединений, которые могут быть использованы для лечения шизофрении, биполярного нарушения или родственных нарушений и которые взаимодействуют с рецептором РАРАР. В одном из таких вариантов полинуклеотид РАРАР или его фрагменты клонируют в экспрессирующие векторы, например в векторы, описанные в настоящей заявке. Белки фракционируют по размеру, заряду и очищают с помощью иммунохроматографии или другими методами, известными специалистам. После очистки белки метят методами, известными специалистам. Меченные белки инкубируют с клетками или с клеточными линиями, происходящими от различных органов или тканей, в результате чего эти белки связываются с любым рецептором, присутствующем на клеточной поверхности. После инкубирования клетки промывают для удаления неспецифически связанного белка. Меченные белки детектируют с помощью авторадиографии. Альтернативно, немеченные белки могут быть инкубированы с клетками и детектированы с использованием антител, имеющих детектируемую метку, такую как присоединенная к ним флуоресцентная молекула. Специфичность связывания с клеточной поверхностью может быть проанализирована путем проведения конкурентного анализа, в котором различные количества немеченного белка инкубируют с меченным белком. Количество меченного белка, связанного с клеточной поверхностью, снижается по мере увеличения количества конкурентного немеченного белка. В качестве контроля в некоторые реакции связывания включают различные количества немеченного белка, не родственного меченному белку. Количество меченного белка, связанного с клеточной поверхностью, не снижается в реакциях связывания, содержащих повышенные количества неродственного немеченного белка, что указывает на то, что белок, кодируемый нуклеиновой кислотой, специфически связывается с клеточной поверхностью. Один из примеров такого анализа описан ниже в примере 1. В одном аспекте настоящего изобретения связывание с РАРАР может быть использовано для детекции и определения локализации полипептида д34872.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к неклеточным анализам на связывание, где полипептид РАРАР получают и очищают так же, как и в вышеописанных клеточных анализах на связывание. После очистки белки метят и инкубируют с экстрактом клеточных мембран или с изолятом, происходящим от любых нужных клеток, взятых из любых представляющих интерес органов, тканей или их комбинаций, в результате чего полипептид РАРАР связывается с любым рецептором, присутствующим на мембране. После инкубирования эти мембраны промывают для удаления неспецифически связанного белка. Меченные белки детектируют с помощью авторадиографии. Специфичность связывания РАРАР с мембраной может быть проанализирована путем проведения конкурентного анализа, в котором различные количества тестируемого соединения инкубируют с меченным белком. Любое нужное тестируемое соединение, включая тестируемые полипептиды, может быть инкубировано с клетками. Тестируемые соединения могут быть детектированы с использованием антител, имеющих детектируемую метку, такую как присоединенная к ним флуоресцентная молекула. Количество меченного полипептида РАРАР, связанного с клеточной поверхностью, снижается по мере увеличения количества конкурентного тестируемого соединения. В качестве контроля в некоторые реакции связывания включают различные количества немеченного белка или соединения, не родственного с тестируемым соединением. Тестируемое соединение, способное снижать количество РАРАР, связанного с клеточными мембранами, может быть отобрано как терапевтическое соединение-кандидат. В одном аспекте изобретения связывание с РАРАР может быть использовано для детекции полипептида д34872.

В предпочтительных вариантах клеточных и неклеточных анализов указанный пептид РАРАР включает непрерывный участок, охватывающий по крайней мере 4, 6 или 8 смежных аминокислот последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 2.

Клеточные анализы могут предусматривать использование клеток из любого подходящего источника, при этом особенно предпочтительными клетками являются клетки человека, клетки приматов, клетки приматов, не относящихся к человеку, и мышиные клетки.

- 37 005921

Анализ с использованием животных в качестве моделей

Анализы, основанные на животных, не являющихся человеком, могут быть также использованы для идентификации соединений, которые модулируют активность РАРАР, для исследования РАРАР, а также для исследования §34872 и биологического пути §34872. Настоящее изобретение относится к животным, используемым в качестве моделей, и к подходящим анализам, основанным на использовании этих животных, таких как нетрансгеннные или трансгенные животные, включая животных, не имеющих гена РАРАР, или экспрессирующих ген РАРАР в зависимости от внешних условий, или имеющих человеческий или модифицированный ген РАРАР.

Таким образом, настоящее изобретение относится к обработке животных, имеющих шизофрению и биполярное нарушение или их симптомы, тестируемым соединением, способным прямо или опосредованно модулировать активность РАРАР.

В одном аспекте изобретения анализ, проводимый с использованием животных, включает осуществление способа идентификации тестируемого соединения для лечения шизофрении или биполярного нарушения, предусматривающего (а) обработку животного тестируемым соединением при концентрации и в течение времени, достаточных для ослабления имеющегося на данный момент состояния, ассоциированного с шизофренией или с биполярным нарушением, и (Ь) определения уровня активности РАРАР или взаимодействия РАРАР-§34 872 или их комплексов в определенном участке организма животного. Активность РАРАР может быть измерена, например, с помощью анализа любой подходящей клетки, ткани или участка организма. Предпочтительным тестируемым соединением является соединение, способное или предположительно способное ослаблять симптом шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения. Необязательно, указанное тестируемое соединение способно или предположительно способно модулировать активность РАРАР. Тестируемые соединения, способные модулировать активность РАРАР, могут быть отобраны для использования при разработке лекарственных средств. Некоторые примеры тестируемых соединений приводятся в настоящем описании (например, бензодиазепины, селективные ингибиторы поглощения серотонина и т.п.).

В другом аспекте изобретения анализ, проводимый с использованием животных, включает осуществление способа идентификации соединения для лечения шизофрении или биполярного нарушения, предусматривающий (а) обработку животного пептидом РАРАР с уровнем активности, достаточным для стимуляции симптомов или соответствующего состояния, ассоциированного с шизофренией или биполярным нарушением, и (Ь) обработку указанной клетки тестируемым соединением. Затем тестируемое соединение может быть отобрано на его способность ослаблять указанные состояния, ассоциированные с шизофренией или биполярным нарушением. Активность РАРАР может быть индуцирована любым подходящим методом, включая, но не ограничиваясь ими, получение вектора, содержащего нуклеотидную последовательность РАРАР, обработку указанной клетки соединением, способным повышать уровень экспрессии РАРАР, и обработку указанной клетки пептидом РАРАР. Предпочтительно указанное животное обрабатывают пептидом РАРАР, содержащим непрерывный участок, охватывающий по крайней мере 4, 6 или 8 смежных аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2. Предпочтительным тестируемым соединением является соединение, способное или предположительно способное ослаблять симптом шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения; и, альтернативно, соединение, которое, как предполагается, усиливает симптом шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения. Тестируемое соединение, способное ослаблять любой детектируемый симптом или имеющееся состояние, ассоциированные с шизофренией, биполярным нарушением или родственным нарушением, может быть отобрано для его использования в разработке лекарственных средств.

В одном варианте осуществления изобретения мышь обрабатывают пептидом РАРАР, подвергают контакту с тестируемым соединением, после чего оценивают на симптомы, характерные для шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения, путем наблюдения за стереотипией. В других вариантах осуществления изобретения указанные симптомы оценивают путем проведения по крайней мере одного теста, выбранного из группы, включающей наблюдения за животным, находящимся в клетке его обитания, неврологическую оценку; тесты на индуцированную стрессом гипотермию, принудительное плаванье, РТ2-припадок, и на двигательную активность; тест путем подвешивания за хвост; наблюдение в лабиринте Плюс; тесты на распознавание новых объектов, на препульсивное торможение и на болевое ощущение, вызываемое тепловым раздражителем; тест с использованием Υ-лабиринта и тест с использованием метаболической камеры (тесты Ркусйоксгееп™ от Ркусйодешск Лс.). Описание других тестов можно найти, например, у С’га\\'1еу е1 а1., Ногт. Вейау. 31(3):197-211 (1997); СгаМеу, Вгаш Кек. 835(1):18-26 (1999).

В способах скрининга настоящего изобретения может быть использовано любое подходящее тестируемое соединение. Примерами соединений, которые могут быть скринированы в способах настоящего изобретения, являются небольшие органические или неорганические молекулы, нуклеиновые кислоты, включая полинуклеотиды из рандомизированных и направленных полинуклеотидных библиотек, пептиды, включая пептиды, кодируемые рандомизированными и направленными пептидными библиотеками, растворимые пептиды, гибридные пептиды и фосфопептиды, антитела, включая поликлональные, моноклональные, химерные, гуманизированные и антиидиотипические антитела, одноцепочечные антитела,

- 38 005921 фрагменты ЕаЬ, Е(аЬ')₂ и экспрессионную библиотеку ЕаЬ-фрагментов и их эпитоп-связывающие фрагменты. В некоторых аспектах настоящего изобретения соединением, способным улучшать или усиливать симптом или имеющиеся состояния шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения, могут быть, например, антипсихотические лекарственные средства общего действия, нейролептики, атипические нейролептики, антидепрессанты, седативные лекарственные средства, норадренергические агонисты и антагонисты общего действия, допаминергические агонисты и антагонисты, ингибиторы поглощения серотонина, бензодиазепины.

В этих анализах тестируемое соединение может быть введено (например, ί.ν., ί.ρ., 1.ш., перорально или каким-либо другим способом) животному, например, в различных дозах. Действие данного соединения на экспрессию РАРАР определяют путем сравнения уровней РАРАР, например, в кровотоке или в выбранной ткани с помощью Нозерн-блот-анализа, иммуноанализа, ПЦР и т.п., как описано выше. При этом может быть использовано любое подходящее животное. Предпочтительным животным является примат, примат, не являющийся человеком, млекопитающее или мышь. В качестве тестируемого животного могут быть также использованы гуманизированные мыши, то есть мыши, у которых эндогенный мышиный белок был удален (нокаут), а вместо этого был добавлен гомологичный человеческий белок с применением стандартной техники получения трансгенных животных. У такой мыши будет экспрессироваться только человеческая форма белка.

Гуманизированная мышь, экспрессирующая только человеческий РАРАР, может быть использована для исследования ίη νίνο-реакций, симптоматичных для нарушений ЦНС, которые будут продуцироваться в ответ на потенциальные агенты, регулирующие уровни белка РАРАР или мРНК, либо уровни взаимодействия РАРАР-§34872 или их комплексов. В качестве примера могут служить трансгенные мыши, несущие ген человеческого ароЕ4. Затем этих мышей скрещивают с мышиной линией, у которой отсутствует эндогенный ароЕ, в результате чего получают животное-модель, несущее человеческие белки, которые, очевидно, могут служить моделью для развития болезни Альцгеймера. Такие трансгенные животные могут быть использованы для отдельного анализа биохимических и физиологических стадий заболевания и для разработки способа терапии заболевания (работа, Εοηη§ е! а1., №игоЬю1. Α§ίη§ 17:173 (1996), которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Методы скрининга веществ, взаимодействующих с полипептидом РАРАР

В соответствии с настоящим изобретением лиганд означает молекулу, такую как белок, пептид, антитело или любое химически синтезированное соединение, способное связываться с белком РАРАР или с одним из его фрагментов или вариантов, или модулировать экспрессию полинуклеотида, кодирующего РАРАР, его фрагмент или вариант.

В способе скрининга лигандов настоящего изобретения биологический образец или определенную тестируемую молекулу, которая предположительно является лигандом белка РАРАР, подвергают контакту с соответствующим очищенным белком РАРАР, например с соответствующим очищенным рекомбинантным белком РАРАР, продуцируемым рекомбинантными клетками-хозяевами, описанными выше, в целях образования комплекса между этим белком и предполагаемой тестируемой молекулой-лигандом.

В качестве иллюстративного примера для исследования взаимодействия белка РАРАР или его фрагмента, содержащего непрерывный участок, состоящий по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 2, с лекарственными средствами или небольшими молекулами, такими как молекулы, генерированные методом комбинаторного химического синтеза, проводят микродиализ в сочетании с ВЭЖХ, как описано \ν;·ιη§ е! а1. (1997), или аффинный капиллярный электрофорез, описанный Βιικίι е! а1. (1997), и эти описания вводятся в настоящую заявку посредством ссылки.

В других способах пептиды, лекарственные средства, жирные кислоты, липопротеины или небольшие молекулы, которые взаимодействуют с белком РАРАР или с его фрагментом, содержащим непрерывный участок, состоящий по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 810 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 2, могут быть идентифицированы с использованием анализа, описанного ниже. Молекулу, тестируемую на связывание, метят детектируемой меткой, такой как флуоресцентная, радиоактивная или ферментативная метка, и подвергают контакту с иммобилизованным белком РАРАР или с его фрагментом в условиях, которые благоприятствуют специфическому связыванию. После удаления неспецифически связанных молекул связанные молекулы детектируют с использованием соответствующих средств.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способов скрининга веществкандидатов, которые взаимодействуют с полипептидом РАРАР.

Настоящее изобретение относится к способам скрининга веществ-кандидатов, которые взаимодействуют с полипептидом РАРАР, или его фрагментом, или вариантом. В соответствии со своей способностью ковалентно или нековалентно связываться с белком РАРАР, или его фрагментом, или вариантом, эти вещества или молекулы могут быть преимущественно использованы как ίη νίΐτο, так и ίη νίνο.

Ιη νίΐτο, указанные взаимодействующие молекулы могут быть использованы как детектирующие средства для идентификации присутствия белка РАРАР в образце, предпочтительно в биологическом образце.

- 39 005921

Способ скрининга веществ-кандидатов включает следующие стадии:

a) получения полипептида, содержащего, или в основном состоящего, или состоящего из белка РАРАР или его фрагмента, содержащего непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 2;

b) получения вещества-кандидата;

c) контактирования указанного полипептида с указанным веществом-кандидатом;

б) детекции комплексов, образованных между указанным полипептидом и указанным веществомкандидатом.

В одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к использованию РАРАР для исследования пути §34872 при нарушениях ЦНС. Способы скрининга на взаимодействие веществ могут быть использованы для детекции взаимодействия РАРАР и §34872. Таким образом, этот способ настоящего изобретения также предусматривает:

a) получение полипептида, содержащего, или в основном состоящего, или состоящего из белка, или его фрагмента, содержащего непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 2;

b) получение полипептида §34872;

c) контактирование указанного полипептида РАРАР с указанным полипептидом §34872;

б) детекцию комплексов, образованных между указанным полипептидом РАРАР и указанным полипептидом §34872.

Предпочтительно указанный полипептид §34872 содержит по крайней мере 4, 6 или предпочтительно 8 смежных аминокислот в аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 5.

Настоящее изобретение относится к набору для скрининга вещества-кондидата, взаимодействующего с полипептидом РАРАР, где указанный набор содержит:

a) белок РАРАР, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей 8Е0 ΙΌ N0: 2 или пептидного фрагмента, содержащего непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8Е0 ΙΌ N0: 2;

b) необязательно, средство, используемое для детекции комплекса, образованного указанным белком РАРАР, его пептидным фрагментом или вариантом с указанным веществом-кандидатом.

В предпочтительном варианте набора, описанного выше, средство для детекции включает моноклональные или поликлональные антитела, направленные против белка РАРАР, или его пептидного фрагмента, или варианта.

Различные вещества или молекулы-кандидаты могут быть проанализированы на взаимодействие с полипептидом РАРАР. Такими веществами или молекулами являются, но не ограничиваются ими, природные или синтетические органические соединения или молекулы биологического происхождения, такие как полипептиды. Если вещество или молекула-кандидат содержит полипептид, то этот полипептид может быть продуктом экспрессии фагового клона, принадлежащего к рандомизированной пептидной фаговой библиотеке, или альтернативно, этот полипептид может быть продуктом экспрессии кДНКбиблиотеки, клонированной в вектор, подходящий для осуществления скрининг-анализа на двухкомпонентный гибрид.

Настоящее изобретение также относится к набору, используемому для осуществления способа скрининга, описанного выше. Такие наборы содержат предпочтительно полипептид РАРАР или его фрагмент или вариант и, необязательно, средство, используемое для детекции комплекса, образованного между указанным полипептидом РАРАР и указанным веществом-кандидатом. В предпочтительном варианте указанное средство для детекции включает моноклональные или поликлональные антитела, направленные против полипептида белка РАРАР, или его фрагмента, или варианта.

А. Лиганды-кандидаты, полученные из рандомизированной библиотеки пептидов.

В конкретном варианте осуществления способа скрининга предполагаемым лигандом является продукт экспрессии кДНК-вставки в фаговом векторе (Рагт1еу & 8тйй, 1988). Более конкретно, используются фаговые рандомизированные библиотеки пептидов. Рандомизированные ДНК-вставки кодируют пептиды длиной от 8 до 20 аминокислот (01бепЬиг§ К.Н. е! а1., 1992; Уа1абоп Р. е! а1., 1996; Ьисак А.Н. 1994; АеЧеппк М.АЛ., 1995; Ре11с1 Р. е! а1., 1991). В соответствии с этим конкретным вариантом получают рекомбинантные фаги, экспрессирующие белок, который связывается с иммобилизованным белком РАРАР и удерживает его; а затем комплекс, образованный между белком РАРАР и рекомбинантным фагом, может быть подвергнут иммунопреципитации с использованием поликлонального или моноклонального антитела, направленного против белка РАРАР.

После конструирования библиотеки лигандов в рекомбинантных фагах фаговую популяцию подвергают контактированию с иммобилизованным белком РАРАР. Затем препарат комплексов промывают для удаления неспецифически связанных рекомбинантных фагов. Фаги, которые специфически связыва

- 40 005921 ются с белком РАРАР, затем элюируют буфером (с кислотным рН) или подвергают иммунопреципитации с использованием моноклонального антитела, продуцированного гибридомой против РАРАР, и эту фаговую популяцию затем амплифицируют посредством сверхинфицирования бактериями (например, Е.со11). Стадию отбора можно повторять несколько раз, предпочтительно 2-4 раза, в целях отбора более специфичных рекомбинантных фаговых клонов. Последней стадией является характеризация пептида, продуцированного отобранными рекомбинантными фаговыми клонами или путем экспрессии в инфицированной бактерии и выделения и экспрессии фаговой вставки в другой системе вектор-хозяин либо путем секвенирования вставки, содержащейся в отобранных рекомбинантных фагах.

B. Лиганды-кандидаты, полученные в экспериментах на конкурентное связывание.

Альтернативно, пептиды, лекарственные средства или небольшие молекулы, которые связываются с белком РАРАР или с его фрагментом, содержащим непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот ЗЕЦ ΙΌ N0: 2, могут быть идентифицированы в экспериментах на конкурентное связывание. В таких анализах белок РАРАР или его фрагмент иммобилизуют на поверхности, такой как пластиковый планшет. Затем указанный иммобилизованный белок РАРАР или его фрагмент подвергают контактированию с возрастающими количествами пептидов, лекарственных средств или небольших молекул в присутствии известного детектируемого меченного лиганда для белка РАРАР. Так, например, РАРАР-лиганд может быть детектируемо помечен флуоресцентной, радиоактивной или ферментативной меткой. Способность тестируемой молекулы связываться с белком РАРАР или с его фрагментом определяют путем измерения количества известного детектируемо меченного связанного лиганда в присутствии тестируемой молекулы. Снижение количества известного лиганда, связанного с белком РАРАР или его фрагментом, в случае присутствия тестируемой молекулы указывает на то, что эта тестируемая молекула способна связываться с белком РАРАР или с его фрагментом.

C. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью аффинной хроматографии.

Белки или другие молекулы, взаимодействующие с белком РАРАР или его фрагментом, содержащим непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот ЗЕЦ ΙΌ N0: 2, могут быть также детектированы с использованием аффинных колонок, содержащих белок РАРАР или его фрагмент. Белок РАРАР или его фрагмент может быть связан с колонкой с использованием стандартной техники, включая химическое связывание с подходящим носителем на колонке, таким как агароза, АГП Се1® или другие носители, которые обычно используются специалистами. В некоторых вариантах осуществления этого метода аффинная колонка содержит химерные белки, в которых белок РАРАР или его фрагмент образует гибрид с глутатион-З-трансферазой (СЗТ). На указанную аффинную колонку наносят смесь клеточных белков или пул экспрессированных белков, описанных выше. Затем белки или другие молекулы, взаимодействующие с белком РАРАР или его фрагментом и связанные с колонкой, могут быть выделены и проанализированы путем элекрофореза на двухмерном геле, как описано в работе Иатшъеп е! а1. (1997), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки. Альтернативно, белки, удерживаемые на аффинной колонке, могут быть очищены с помощью электрофореза и секвенированы. Тот же самый метод может быть использован в целях выделения антител для осуществления скрининга продуктов фагового представления или для скрининга человеческих антител фагового представления.

Р. Лиганды-кандидаты, полученные с использованием оптических биосенсоров.

Белки, взаимодействующие с белком РАРАР или с его фрагментом, содержащим непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот ЗЕЦ ΙΌ N0: 2, могут быть также скринированы с использованием оптического биосенсора, как описано в работе Еб^агбк & Ееа111егЬагго\у (1997), а также в работе Зйахо е! а1. (1995), описание которых вводится в настоящую заявку посредством ссылки. Эти методы позволяют осуществлять детекцию взаимодействий между молекулами в режиме реального времени и не требуют использования меченных молекул. Этот метод основан на явлении поверхностного плазмонного резонанса (НИР). Вкратце, тестируемую лигандную молекулукандидата связывают с поверхностью (такой как карбоксиметилдекстрановая матрица). Луч света направляется на ту сторону поверхности, которая не содержит тестируемого образца, и отражается указанной поверхностью. Явление НИР вызывает изменение интенсивности отраженного света в зависимости от угла и длины волны падающего света. Связывание лигандных молекул-кандидатов приводит к изменению показателя преломления на поверхности, и это изменение детектируется как изменение сигнала ППР. Для скрининга лигандных молекул- или веществ-кандидатов, которые способны взаимодействовать с белком РАРАР или с его фрагментом, белок РАРАР или его фрагмент иммобилизуют на поверхности. Эта поверхность на одной своей стороне имеет ячейку, через которую проходит исследуемая молекула-кандидат. Связывание молекулы-кандидата с белком РАРАР или с его фрагментом детектируют как изменение ППР-сигнала. Тестируемыми молекулами-кандидатами могут быть белки, пептиды, углеводы, липиды или небольшие молекулы, генерированные методами комбинаторной химии. Эти методы

- 41 005921 могут быть также осуществлены путем иммобилизации эукариотических или прокариотических клеток или липидных везикул, содержащих на своей поверхности эндогенный или рекомбинантно экспрессированный белок РАРАР.

Главное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет определять скорость ассоциации между белком РАРАР и молекулами, взаимодействующими с этим белком РАРАР. Поэтому он дает возможность специфически отбирать лигандные молекулы, взаимодействующие с белком РАРАР или с его фрагментом, по константам сильной или, наоборот, слабой ассоциации.

Е. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью скрининг-анализа на двухкомпонентные гибриды.

Для исследования взаимодействия белок-белок ίη νί\Ό конструируют дрожжевую двухкомпонентную гибридную систему (Е1е1й8 & 8опд, 1989) путем слияния белка-приманки с ДНК-связывающим доменом дрожжевого белка Са14. Этот метод также описан в патенте США № 5667973 и в патенте США № 5283173 (Е1е1й§ е! а1.), которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Общая процедура скрининга библиотеки с помощью анализа на двухкомпонентный гибрид может быть осуществлена как описано Нагрег е! а1. (1993), или как описано С1о е! а1. (1998), или также Еготоп!Касте е! а1. (1997).

Белок или полипептид-приманка содержит, или в основном состоит, или состоит из полипептида РАРАР или его фрагмента, содержащего непрерывный участок по крайней мере из 6 аминокислот, предпочтительно,по крайней мере из 8-10 аминокислот, а более предпочтительно по крайней мере из 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ГО N0: 2.

Более конкретно, нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид РАРАР, или его фрагмент, или вариант, соединяют с полинуклеотидом, кодирующим ДНК-связывающий домен белка СаЬ4, где указанную гибридную нуклеотидную последовательность встраивают в подходящий экспрессирующий вектор, например рА82 или рМ3.

Затем библиотеку кДНК человека создают в специально сконструированном векторе так, чтобы человеческая кДНК-вставка была присоединена к нуклеотидной последовательности в векторе, кодирующем транскрипционный домен СаЬ4. Предпочтительным вектором является вектор рАСТ. Полипептиды, кодированные нуклеотидными вставками библиотеки человеческих кДНК, называют полипептидамижертвами.

Третий вектор содержит детектируемый маркерный ген, такой как ген бета-галактозидазы или ген САТ, который находится под контролем регуляторной последовательности, ответственной за связывание с полноразмерным белком СаЬ4 и содержащей домен активации транскрипции и ДНК-связывающий домен. Так, например, может быть использован вектор рС5ЕС.

Могут быть также использованы два различных дрожжевых штамма. В качестве иллюстрирующего, но не ограничивающего примера двух дрожжевых штаммов могут служить следующие штаммы:

Υ190, фенотип которого представляет собой: (МАТа, Ьеи2-3, 112 ига3-12, !гр1-901, 1183-0200, айе2101, да140даЛ800 ИКА3 6АЬ-Ьас2, ΕΥ8 6АЬ-Ш83, су1^г);

Υ187, фенотип которого представляет собой: (МАТа да 14 да180 1183 1гр1-901 айе2-101 ига3-52 1еи 23, -112 иКА3 СЛЬ-1ас2те1^-) и который имеет тип скрещивания, противоположный типу скрещивания Υ190.

Вкратце, 20 мкг рА82/РАРАР и 20 мкг библиотеки кДНК рАСТ котрансформируют дрожжевым штаммом Υ190. Трансформанты отбирают для культивирования на минимальных средах, не содержащих гистидина, лейцина и триптофана, но содержащих ингибитор синтеза гистидина 3-АТ (50 мМ). Позитивные колонии скринируют на бета-галактозидазу с помощью анализа на фильтрах. Затем двойные позитивные колонии (Н18⁺, Ье!а-да1⁺) культивируют на планшетах, не содержащих гистидина и лейцина, но содержащих триптофан и циклогексимид (10 мг/мл) для отбора на потерю плазмиды рА82/РАРАР, но сохранение плазмидных библиотек рАСТ-кДНК. Полученные штаммы Υ190 скрещивают со штаммами Υ187, экспрессирующими РАРАР или неродственные контрольные белки, такие как циклофилин В, ламин или 8№1, используемые в качестве 6аЬ4-гибридов, как описано Нагрег е! а1. (1993) и Вгат е! а1. (Вгат КЗ. е! а1. 1993), и скринируют на бета-галактозидазу с помощью анализа на фильтрах. Дрожжевые клоны, которые представляет собой Ье!а-да1-гибриды после скрещивания с контрольными СаЬ4гибридами, рассматриваются как ложноположительные.

В другом варианте метода с использованием двухкомпонентного гибрида настоящего изобретения взаимодействие РАРАР, или его фрагмента, или варианта с клеточными белками может быть оценено с использованием руководства Ма!с1такег Т\го НуЬпй 8у81ет 2 (Са!а1од КеГ. № К1604-1, С1оп!ес1). Как описано в руководстве Ма!с1такег Т\го НуЬпй 8у81ет 2 (Са!а1од КеГ. К1604-1, С1оп!ес1), описание которого вводится в настоящую заявку посредством ссылки, нуклеиновые кислоты, кодирующие белок РАРАР или его фрагмент, встраивают в экспрессирующий вектор так, чтобы он был в одной рамке считывания с ДНК, кодирующей ДНК-связывающий домен дрожжевого активатора транскрипции СаЬ4. Нужную кДНК, предпочтительно человеческую кДНК, встраивают во второй экспрессирующий вектор так, чтобы они были в одной рамке считывания с ДНК, кодирующей домен активации СаЬ4. Эти две экспрессирующие плазмиды трансформируют в дрожжи и эти дрожжи высевают на селективную среду,

- 42 005921 которая позволяет проводить отбор на экспрессию селективных маркеров на каждом из экспрессирующих векторов, а также на СаЬ4-зависимую экспрессию гена Н18З. Трансформанты, способные расти на среде, не содержащей гистидина, скринируют на СаЬ4-зависимую экспрессию 1ηοΖ. Клетки, которые являются положительными в анализе на гистидин и 1ηοΖ. обнаруживают взаимодействие между РАРАР и белком или пептидом, кодируемыми предварительно отобранной кДНК-вставкой.

Способ скрининга веществ, взаимодействующих с регуляторными последовательностями гена РАРАР

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга веществ или молекул, способных взаимодействовать с регуляторными последовательностями гена РАРАР, такими как, например, промоторные или энхансерные последовательности.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, способные взаимодействовать с регуляторными последовательностями гена РАРАР, а более предпочтительно с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из полинуклеотидов 5'- и З'-регуляторной области, или их фрагментов, или вариантов, а предпочтительно с вариантом, содержащим один из биаллельных маркеров настоящего изобретения, могут быть идентифицированы с использованием одногибридной системы, такой как система, описанная в буклете, входящем в набор Ма!сйтакег 0пе-НуЬпб 8у§!ет кй от С1оп!есй (Са!а1од Ке£. № К1604-1), техническое описание которого вводится в настоящую заявку посредством ссылки. Вкратце, нужную нуклеотидную последовательность клонируют выше от селективной репортерной последовательности и полученную ДНК-конструкцию интегрируют в дрожжевой геном (Зассйаготусек се^еν^8^ае). Затем дрожжевые клетки, содержащие репортерную последовательность в своем геноме, трансформируют библиотекой, содержащей гибридные молекулы между кДНК, кодирующими белки-кандидаты на связывание с регуляторными последовательностями гена РАРАР, и последовательностями, кодирующими домен-активатор дрожжевого фактора транскрипции, такой как СаЬ4. Рекомбинантные дрожжевые клетки высевают в культуральную среду для отбора клеток, экспрессирующих эту репортерную последовательность. Таким образом, отобранные рекомбинантные дрожжевые клетки содержат гибридный белок, способный связываться с нужной регуляторной последовательностью гена РАРАР. Затем кДНК, кодирующие гибридные белки, секвенируют, и эти последовательности могут быть клонированы в экспрессирующие или трансрикпционные векторы ш уйго. Связывание кодируемых полипептидов с целевыми регуляторными последовательностями гена РАРАР может быть подтверждено методами, известными специалистам, такими как анализы на замедление подвижности в геле или анализы на защиту от ДНКазы.

Анализы на замедление подвижности в геле могут быть также осуществлены независимо в целях скрининга на молекулы-кандидаты, способные взаимодействовать с регуляторными последовательностями гена РАРАР, как описано Елей & Сго!йег8 (1981), Сагпег & Κ^νζω (1981) и Эеп1 & Ьа!сйтап (199З), и описания этих публикаций вводится в настоящую заявку посредством ссылки. Указанные методы основаны на том принципе, согласно которому ДНК-фрагмент, связывающийся с белком, мигрирует медленней, чем тот же самый несвязанный ДНК-фрагмент. Вкратце, нужную нуклеотидную последовательность метят. Затем эту нужную меченную нуклеотидную последовательность подвергают контакту либо с полным ядерным клеточным экстрактом, содержащим факторы транскрипции, либо с различными тестируемым молекулами-кандидатами. Взаимодействие между нужной регуляторной последовательностью гена РАРАР и молекулой-кандидатом или фактором транскрипции детектируют посредством гельэлектрофореза или капиллярного электрофореза по замедлению подвижности.

Метод скрининга лигандов, которые модулируют экспрессию гена РАРАР

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа скрининга молекул, которые модулируют экспрессию белка РАРАР. Указанный способ скрининга включает стадии

a) культивирования прокариотической или эукариотической клетки, которая была трансфицирована нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок РАРАР, или его вариант, или фрагмент и находящейся под контролем своего собственного промотора;

b) контактирования указанной культивированной клетки с тестируемой молекулой;

c) количественной оценки экспрессии белка РАРАР, или его варианта, или фрагмента.

В одном из вариантов осуществления изобретения, нуклеотидная последовательность, кодирующая белок РАРАР или его вариант или фрагмент, содержит аллель по крайней мере одного из РАРАРассоциированных биаллельных маркеров и его комплементы.

С использованием техники рекомбинантных ДНК, хорошо известной специалистам, ДНКпоследовательность, кодирующую белок РАРАР, встраивают в экспрессирующий вектор ниже от его промоторной последовательности. В качестве иллюстрирующего примера может служить промоторная последовательность гена РАРАР, которая содержится в нуклеиновой кислоте 5'-регуляторной области.

Количественная оценка экспрессии белка РАРАР может быть осуществлена либо на уровне мРНК, либо на уровне белка. В последнем случае, поликлональные или моноклональные антитела могут быть использованы для оценки количеств белка продуцированного РАРАР, например, в анализах ЕЬ18А или РИА.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения количественную оценку мРНК РАРАР

- 4З 005921 осуществляют путем количественной ПЦР-амплификации кДНК, полученной посредством обратной транскрипции полноразмерной мРНК культивированной РАРАР-трансфицированной клетки-хозяина с использованием пары праймеров, являющихся специфичными для РАРАР.

Настоящее изобретение также относится к способу скрининга веществ или молекул, которые также способны увеличивать или, наоборот, уменьшать уровень экспрессии гена РАРАР. Такой способ дает возможность специалисту отбирать вещества, которые обладают действием, регулирующим уровень экспрессии гена РАРАР, и которые могут быть использованы в качестве активных ингредиентов, входящих в состав фармацевтических композиций, для лечения пациентов, страдающих от шизофрении, биполярного нарушения или родственного нарушения центральной нервной системы.

Таким образом, частью настоящего изобретения также является способ скрининга вещества или молекулы-кандидата, которая модулирует экспрессию гена РАРАР, где указанный способ включает следующие стадии:

- получения рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность 5'-регуляторной области или ее биологически активных фрагментов или вариантов, расположенных выше от полинуклеотида, кодирующего детектируемый белок;

- получения вещества-кандидата и

- определения способности указанного вещества-кандидата модулировать уровни экспрессии полинуклеотида, кодирующего детектируемый белок.

В другом варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность 5'-регуляторной области, или ее биологически активного фрагмента, или варианта, также включает 5'ИТК-область кДНК РАРАР 8Ер ГО N0:1, или один из ее биологически активных фрагментов или вариантов.

Среди предпочтительных полинуклеотидов, кодирующих детектируемый белок, могут быть упомянуты полинуклеотиды, кодирующие бета-галактозидазу, белок, флуоресцирующий в зеленом диапазоне (СЕР), и хлорамфениколацетил-трансферазу (САТ).

Настоящее изобретение также относится к наборам, используемым для осуществления описанного здесь способа скрининга. Такие наборы предпочтительно содержат рекомбинантный вектор, обеспечивающий экспрессию нуклеотидной последовательности 5'-регуляторной области, или ее биологически активного фрагмента, или варианта, расположенных выше и функционально присоединенных к полинуклеотиду, кодирующему детектируемый белок или белок РАРАР, или его фрагмент, или вариант.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к способу скрининга вещества или молекулы-кандидата, которые модулируют экспрессию гена РАРАР, где указанный способ включает следующие стадии:

a) получения рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность 5'ИТК-последовательности кДНК РАРАР 8Ер ГО N0: 1 или один из ее биологически активных фрагментов или вариантов, где указанная 5'ИТК-последовательность или ее биологически активный фрагмент или вариант функционально присоединены к полинуклеотиду, кодирующему детектируемый белок;

b) получения вещества-кандидата и

c) определения способности указанного вещества-кандидата модулировать уровни экспрессии полинуклеотида, кодирующего детектируемый белок.

В конкретном варианте осуществления вышеуказанного способа скрининга нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5'ИТКпоследовательности кДНК РАРАР 8Ер ГО N0: 1 или одного из ее биологически активных фрагментов или вариантов, включает промоторную последовательность, которая является эндогенной по отношению к 5'ИТК-последовательности РАРАР.

В другом конкретном варианте осуществления вышеуказанного способа скрининга нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5'ИТКпоследовательности кДНК РАРАР 8Ер ГО N0: 1 или одного из ее биологически активных фрагментов или вариантов, включает промоторную последовательность, которая является экзогенной по отношению к определенной здесь 5'ИТК-последовательности РАРАР.

В другом предпочтительном варианте 5'ИТК-последовательность кДНК РАРАР 8Ер ГО N0: 1 или ее биологически активные фрагменты включает РАРАР-ассоциированный биаллельный маркер или его комплементы.

Настоящее изобретение также относится к наборам, используемым для осуществления способа скрининга вещества-кандидата, модулирующего экспрессию гена РАРАР, где указанный набор включает рекомбинантный вектор, который содержит нуклеиновую кислоту, включающую 5'ИТКпоследовательность кДНК РАРАР 8Ер ГО N0: 1, или один из ее биологически активных фрагментов, или вариантов, причем указанная 5'ИТК-последовательность, или ее биологически активный фрагмент, или вариант функционально присоединены к полинуклеотиду, кодирующему детектируемый белок.

Для конструирования подходящего рекомбинантного вектора, используемого для проведения опи

- 44 005921 санных выше способов скрининга, следует обратиться к разделу настоящей заявки, где подробно описаны предпочтительные рекомбинантные векторы настоящего изобретения.

Уровни и характер экспрессии РАРАР могут быть проанализированы путем гибридизации в растворе с длинными зондами, как описано в международной патентной заявке № Ш0 97/05277, содержание которой целиком вводится в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, кДНК РАРАР или геномную ДНК РАРАР, описанные выше, или их фрагменты встраивают в сайт клонирования непосредственно ниже от промотора РНК-полимеразы бактериофага (Т3, Т7 или 8Р6) для продуцирования антисмысловой РНК. РАРАР-вставка предпочтительно включает по крайней мере 100 или более непрерывно следующих друг за другом нуклеотидов геномной ДНК-последовательности или кДНКпоследовательности. Эту плазмиду линеаризуют и транскрибируют в присутствии рибонуклеотидов, содержащих модифицированные рибонуклеотиды (т.е. биотин-ИТР и НЮ-ИТР). Избыток этой ДНК с двойной меткой гибридизуют в растворе с мРНК, выделенной из нужных клеток или тканей. Гибридизацию осуществляют в стандартных жестких условиях (40-50°С в течение 16 ч в 80%-ном формамиде, 0,4М буфере №С1, рН 7-8). Негибридизованный зонд удаляют путем гидролиза рибонуклеазами, специфичными для одноцепочечной РНК (т.е. РНКазами СЬ3, Т1, РЕу М, И2 или А). Присутствие модификации биотин-ИТР позволяет захватывать этот гибрид на микротитрационном планшете, покрытом стрептавидином. Наличие ИЮ-модификации позволяет детектировать и количественно оценивать этот гибрид с помощью ЕБ18А с использованием анти-ЛЮ антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой.

Количественный анализ экспрессии гена РАРАР может быть также осуществлен с использованием массивов. Используемый здесь термин массив означает одномерную, двухмерную или мультимерную матрицу из множества нуклеиновых кислот, имеющих длину, достаточную для обеспечения специфической детекции экспрессии мРНК, способных гибридизоваться с ними. Так, например, указанные массивы могут содержать множество нуклеиновых кислот, происходящих от генов, уровни экспрессии которых необходимо оценить. Эти массивы могут включать геномную ДНК РАРАР, кДНК-последовательности РАРАР или комплементарные последовательности или их фрагменты, а в частности, последовательности, включающие по крайней мере один РАРАР-ассоциированный биаллельный маркер. Предпочтительными являются фрагменты, имеющие длину по крайней мере в 15 нуклеотидов. В других вариантах осуществления изобретения указанные фрагменты имеют длину по крайней мере в 25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные фрагменты имеют длину по крайней мере в 50 нуклеотидов. Более предпочтительно указанные фрагменты имеют длину по крайней мере в 100 нуклеотидов. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные фрагменты имеют длину более чем в 100 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные фрагменты могут иметь длину более чем в 500 нуклеотидов.

Так, например, количественный анализ экспрессии гена РАРАР может быть осуществлен с использованием микромассива комплементарных ДНК, как описано 8сЕепа е! а1. (1995 и 1996). Полноразмерные кДНК РАРАР или их фрагменты амплифицируют с помощью ПЦР и располагают в виде массивов в 96-луночном микротирационном планшете на силилированных предметных стеклах микроскопа с использованием высокоскоростной робототехники. Отпечатанные массивы инкубируют во влажной камере для регидратации элементов массива и промывают, один раз в 0,2% ДСН в течение 1 мин, два раза в воде в течение 1 мин и один раз в растворе борогидрида натрия в течение 5 мин. Эти массивы погружают в воду на 2 мин при 95°С, переносят в 0,2% ДСН на 1 мин, дважды промывают водой, сушат воздухом и оставляют в темноте при 25°С.

мРНК выделяют из клеток и тканей или получают коммерчески доступную мРНК и приготавливают зонды с помощью одного раунда обратной транскрипции. Зонды гибридизуют в течение 6-12 ч при 60°С с 1 см² микромассивами на 14 х 14 мм стекле, покрытом покровным стеклом. Матрицы промывают промывочным буфером низкой жесткости (1 х 88С/0,2% ДСН) в течение 5 мин при 25°С, а затем промывочным буфером высокой жесткости (0,1 х 88С/0,2% ДСН) в течение 10 мин при комнатной температуре. Массивы сканируют в 0,1 х 88С с использованием флуоресцентного лазерного сканирующего устройства, снабженного серией стандартных фильтров. Точные данные дифференциальной экспрессии получают путем вычисления среднего значения отношений для двух независимых гибридизаций.

Количественный анализ экспрессии гена РАРАР может быть также осуществлен с использованием полноразмерных кДНК РАРАР или их фрагментов в комплементарных ДНК-массивах, как описано Р1е!и е! а1. (1996). Полноразмерную кДНК РАРАР или ее фрагменты подвергают ПЦР-амплификации и наносят на мембраны в виде пятен. Затем мРНК, происходящие от различных тканей или клеток, метят радиоактивными нуклеотидами. После гибридизации и промывки в регулируемых условиях гибридизованные мРНК детектируют путем люминесцентной визуализации или авторадиографии. Осуществляли повторные эксперименты, а затем проводили количественный анализ дифференциально экспрессированных мРНК.

Альтернативно, экспрессионный анализ с использованием геномной ДНК РАРАР, кДНК РАРАР или ее фрагментов может быть осуществлен на нуклеотидных массивах высокой плотности, как описано ЬоскЕай е! а1. (1996) и 8окпо\ткку е! а1. (1997). Олигонуклеотиды длиной в 15-50 нуклеотидов, происходящие от последовательностей геномной ДНК РАРАР, кДНК-последовательностей РАРАР или компле

- 45 005921 ментарных последовательностей, синтезируют непосредственно на чипе (Ьоскйай е! а1., см. выше) или сначала синтезируют, а затем переносят на чип (8окпо^кку е! а1., см. выше). Олигонуклеотиды предпочтительно имеют длину примерно в 20 нуклеотидов.

кДНК-зонды для РАРАР, меченные соответствующим соединением, таким как биотин, дигоксигенин или флуоресцентный краситель, синтезируют из соответствующей мРНК-популяции, а затем подвергают рандомизированной фрагментации до среднего размера в 50-100 нуклеотидов. Затем указанные зонды гибридизуют с чипом. После промывки, как описано Ьоскйай е! а1. (см. выше), и наложения различных электрических полей (8окпотекку е! а1., 1997) красители или соединения для мечения детектируют и количественно оценивают. Затем осуществляют повторные гибридизации. Сравнительный анализ интенсивности сигнала, идущего от кДНК-зондов на один и тот же олигонуклеотид-мишень, в различных кДНК-образцах указывает на дифференциальную экспрессию мРНК РАРАР.

Способы ингибирования экспрессии гена РАРАР

Другие терапевтические композиции настоящего изобретения преимущественно включают олигонуклеотидный фрагмент нуклеотидной последовательности РАРАР в качестве антисмысловой последовательности или последовательности тройной спирали, которая ингибирует экспрессию соответствующего гена РАРАР.

Метод с использованием антисмысловых последовательностей

Предпочтительные методы с использованием антисмыслового полинуклеотида настоящего изобретения предусматривают проведение процедур, описанных 8схак1е1 е! а1. (1995).

Антисмысловые последовательности, предпочтительно, выбирают из полинуклеотидов (длиной 15200 п.н.), которые являются комплементарными 5'-концу мРНК РАРАР. В другом варианте изобретения используется комбинация различных антисмысловых полинуклеотидов, комплементарных различным частям нужного гена-мишени.

Предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения комплементарны последовательности мРНК РАРАР, которая содержит либо кодон инициации трансляции АТС, либо донорный или акцепторный сайт сплайсинга.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты должны иметь длину и температуру плавления, достаточные для образования внутриклеточного дуплекса, имеющего стабильность, достаточную для ингибирования экспрессии мРНК РАРАР в этом дуплексе. Стратегии конструирования антисмысловых нуклеиновых кислот, подходящих для использования в генной терапии, описаны в работе Сгееп е! а1. (1986) и 1хап1 & ^ет!гаиЬ (1984), которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

В некоторых стратегиях антисмысловые молекулы получают путем изменения ориентации кодирующей области РАРАР на обратную по отношению к промотору так, чтобы транскрибировалась цепь, обратная той цепи, которая обычно транскрибируется в клетке. Антисмысловые молекулы могут быть транскрибированы с применением ш уйго-систем транскрипции, таких как системы, в которых используется полимераза Т7 или 8Р6 для генерирования транскрипта. Другой метод предусматривает транскрипцию антисмысловых нуклеиновых кислот РАРАР ш у1уо путем функционального присоединения ДНК, содержащей антисмысловую последовательность, к промотору в подходящем экспрессирующем векторе.

Альтернативно, подходящими стратегиями с использованием антисмысловых последовательностей являются стратегии, описаннные Кокк1 е! а1. (1991) в международных заявках №№ XVО 94/23026, XVО 95/04141, ^О 92/18522 и в европейской патентной заявке № ЕР 0572287 А2.

В качестве альтернативы технологии антисмысловых последовательностей, используемой в настоящем изобретении, могут быть использованы рибозимы, которые связываются с последовательностью-мишенью посредством своего комплементарного полинуклеотидного хвоста и которые расщепляют соответствующую РНК путем гидролиза в ее нужном сайте (а именно молоткообразные рибозимы). Вкратце, упрощенный цикл молоткообразного рибозима включает (1) специфическое связывание его последовательности с мРНК-мишенью посредством комплементарных антисмысловых последовательностей; (2) сайтспецифический гидролиз расщепляемого мотива цепи-мишени; и (3) высвобождение гидролизованных продуктов, которые стимулируют другой каталитический цикл. Действительно, использование длинноцепочечного антисмыслового полинуклеотида (по крайней мере из 30 оснований) или рибозимов с длинными антисмысловыми плечами являются предпочтительным. Предпочтительная система доставки антисмыслового рибозима может быть получена путем ковалентного связывания этих антисмысловых рибозимов с липофильными группами или путем использования липосом в качестве стандартного носителя. Предпочтительные антисмысловые рибозимы настоящего изобретения получают, как описано 8схак1е1 е! а1. (1995), и конкретное описание процедур их получения, приводимое в указанной статье, вводится в настоящую заявку посредством ссылки.

Метод с использованием тройной спирали

Геномная ДНК РАРАР может быть также использована для ингибирования экспрессии гена РАРАР, основанного на образовании внутриклеточной тройной спирали.

Олигонуклеотиды тройной спирали используют для ингибирования транскрипции с генома. Они могут быть, в частности, использованы для исследования изменения клеточной активности, если она ассоциирована с конкретным геном.

- 46 005921

Аналогичным образом, часть геномной ДНК РАРАР может быть использована для исследования действия, направленного на ингибирование транскрипции РАРАР в клетке. Традиционно гомопуриновые последовательности рассматриваются как наиболее подходящие последовательности для использования в стратегиях тройных спиралей. Однако гомопиримидиновые последовательности также могут ингибировать экспрессию гена. Такие гомопиримидиновые олигонуклеотиды связываются с главной бороздкой в гомопуриновых:гомопиримидиновых последовательностях. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят оба типа последовательностей геномной ДНК РАРАР.

Для осуществления стратегий генной терапии методом тройных спиралей последовательности геномной ДНК РАРАР сначала сканируют для идентификации 10-20-мерных гомопиримидиновых или гомопуриновых фрагментов, которые могут быть использованы в стратегиях тройных спиралей для ингибирования экспрессии РАРАР. После идентификации гомопиримидиновых или гомопуриновых фрагментов-кандидатов их эффективность в ингибировании экспрессии РАРАР оценивают путем введения различных количеств олигонуклеотидов, содержащих данные последовательности-кандидаты, в клетки тканевых культур, которые экспрессируют этот ген РАРАР.

Указанные олигонуклеотиды могут быть введены в клетки различными методами, известными специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, преципитацию фосфатом кальция, ОЕАЕ-декстрановую трансфекцию, электропорацию, трансфекцию, опосредованную липосомами, или нативное поглощение.

Затем проводят мониторинг обработанных клеток на изменение клеточной функции или на снижение уровней экспрессии РАРАР такими методами, как Нозерн-блот-анализ, анализы на защиту от РНКазы или ПЦР-стратегии, для оценки уровней транскрипции гена РАРАР в клетках, обработанных указанным олигонуклеотидом.

Олигонуклеотиды, которые являются эффективными в ингибировании экспрессии гена в клетках тканевых культур, могут быть затем введены ш νί\Ό методами, описанными выше в разделе Метод антисмысловых последовательностей, в дозах, установленных исходя из ш νίϋΌ-результатов, как описано в указанном разделе.

В некоторых вариантах настоящего изобретения природные бета-аномеры олигонуклеотидных звеньев могут быть заменены альфа-аномерами для сообщения этому олигонуклеотиду большей резистентности к нуклеазам. Кроме того, интеркалирующий агент, такой как этидийбромид или т. п., может быть присоединен к 3'-концу альфа-олигонуклеотида для стабилизации тройной спирали. Сведения по генерированию олигонуклеотидов, подходящих для образования тройной спирали, можно найти в работе ОпГйп е! а1. (1989), которая вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Фармацевтические композиции и препараты РАРАР-модулирующие соединения

С использованием описанных здесь методов могут быть идентифицированы соединения, которые селективно модулируют РАРАР-активность или модулируют взаимодействие РАРАР-д34872 ш νίΙΐΌ и ш νί\Ό. Соединениями, идентифицированными способом настоящего изобретения, являются, например, антитела, обладающие специфичностью связывания с пептидом РАРАР. Также предполагается, что гомологи РАРАР могут быть использованы для модуляции РАРАР-опосредованной активности и родственного физиологического состояния, ассоциированного с шизофренией или биполярным нарушением. В общих чертах, предполагается, что аналитические методы настоящего изобретения, основанные на роли РАРАР в нарушениях центральной нервной системы, могут быть использованы для идентификации соединений, способных воздействовать на путь развития заболевания.

Показания

Хотя было продемонстрировано, что РАРАР ассоциируется с шизофренией и биполярным нарушением, однако, было показано, что РАРАР может участвовать в различных нарушениях центральной нервной системы. Предполагается, что нарушения нервной системы должны иметь сложную генетическую основу и часто имеют определенные общие симптомы. В частности, как описано в настоящей заявке, показаниями могут служить шизофрения и другие психотические нарушения, нейродегенеративные нарушения, нарушения настроения, аутизм, злоупотребление веществами, вызывающими зависимость, и алкоголизм, задержка умственного развития и другие психические заболевания, включая нарушение познавательной способности, тревожные состояния, нарушения, связанные с приемом пищи, неконтролируемая импульсивность и нарушения личности, которые могут быть определены с использованием Руководства по диагностике и статистике психических нарушений, четвертое издание, классификация (ОЗМ-ГУ).

Фармацевтические композиции и способы введения

Соединения, идентифицированные способами настоящего изобретения, могут быть введены млекопитающему, включая человека, отдельно или в фармацевтических композициях, в которых они смешаны с подходящими носителями или наполнителями в терапевтически эффективных дозах, для лечения или ослабления симптомов шизофрении и биполярных родственных нарушений. Термин терапевтически эффективная доза означает количество соединения, достаточные для ослабления симптомов, определенных описанными здесь методами. Предпочтительно терапевтически эффективная доза является подходящей для непрерывного или периодического использования или введения. Методы получения и введения соединений настоящего изобретения можно найти в руководстве Веттд1оп'5 Рйаттасеи!1са1 δοΐ

- 47 005921 еисек, Маск РиЬЩЫид. Со., ЕакЮп, РА, последнее издание.

Способы введения

Подходящими способами введения являются пероральное, ректальное, трансмукозальное или внутрикишечное введение, парентеральная доставка, включая внутримышечные, подкожные, интрамедуллярные инъекции, а также интратекальные, прямые интравентрикулярные, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции. Особенно ценным методом введения соединений для лечения заболеваний центральной нервной системы является хирургическая имплантация устройства для доставки соединения в течение длительного промежутка времени, такой как интратекальная доставка, включая вливание в цереброспинальную жидкость через имплантированный насос (поставляемый МеШгошс, Лс., Мшиеаройк, М№). В частности, рассматриваются препараты настоящего изобретения для пролонгированного высвобождения лекарственного средства.

Композиция/препарат

Фармацевтические композиции и препараты для использования в целях настоящего изобретения могут быть получены стандартным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и добавки. Конкретный состав композиции зависит от выбранного способа введения.

Для инъекций агенты настоящего изобретения могут быть введены в водные растворы, а предпочтительно в физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический раствор, такой как фосфатный или бикарбонатный буфер. Для введения через слизистую в данной композиции используются диффундирующие реагенты, подходящие для прохождения через мембрану. Такие диффундирующие реагенты, в основном, известны специалистам.

Фармацевтическими препаратами, которые могут быть использованы для перорального введения, являются пуш-фит-капсулы (рикй-ДГ'-капсулы с плотной подгонкой двух половинок), изготовленные из желатина, а также мягкие герметично запаянные капсулы, изготовленные из желатина или пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Эти пуш-фит-капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связующими агентами, такими как крахмалы, и/или замасливателями, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно со стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Все композиции для перорального введения должны вводиться в дозах, подходящих для такого введения.

Для трансбуккального введения композиции могут быть получены в форме таблеток или пастилок, изготовленных стандартным способом.

Для введения путем ингаляции соединения, используемые в соответствии с настоящим изобретением, обычно доставляют в форме аэрозольного спрея из аэрозольной упаковки или распылителя с использованием подходящего газообразного пропеллента, например двуокиси углерода. В случае использования аэрозольного ингалятора разовая доза может быть установлена с помощью клапана для доставки дозируемого количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе могут быть изготовлены так, чтобы они содержали порошкообразную смесь соединения и подходящей порошкообразной основы, такой как лактоза или крахмал.

Эти соединения могут быть приготовлены для парентерального введения путем инъекции, например путем инъекции или непрерывного вливания болюса. Препараты для инъекции могут быть изготовлены в виде разовой лекарственной формы, например, в ампулах или в контейнерах для многократного приема с добавлением консерванта. Эти композиции могут иметь форму суспензий, растворов или эмульсий в водных носителях и могут содержать технологические добавки, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных соединений в водорастворимой форме. Водные суспензии могут содержать вещества, повышающие вязкость этой суспензии, такие как натрийсодержащая карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Эта суспензия может также, но необязательно, содержать подходящие стабилизаторы или агенты, повышающие растворимость соединений, что позволяет получать в высокой степени концентрированные растворы.

Альтернативно, активный ингредиент может иметь форму порошка или лиофилизованную форму для разведения подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода, непосредственно перед использованием.

Помимо описанных выше композиций эти соединения могут быть также приготовлены в виде депопрепарата. Такие композиции продолжительного действия могут быть введены путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Так, например, указанные соединения могут быть приготовлены с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсий в подходящем масле) или ионообменных смол, либо они могут быть изготовлены в виде слабо растворимых производных на слаборастворимой соли.

Кроме того, указанные соединения могут быть доставлены с использованием системы пролонгиро

- 48 005921 ванного высвобождения, такой как полупроницаемая матрица из твердых гидрофобных полимеров, содержащих терапевтический агент. Имеются различные уже разработанные материалы пролонгированного высвобождения, которые хорошо известны специалистам. Капсулы пролонгированного высвобождения, в зависимости от их химической природы, высвобождают соединения в течение периода времени от нескольких недель и до более чем 100 дней.

В зависимости от химической природы и биологической стабильности терапевтического реагента могут быть использованы дополнительные стратегии стабилизации белка.

Фармацевтические композиции могут также включать подходящие твердофазные или гелевые носители или наполнители. Примерами таких носителей или наполнителей являются, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Эффективные дозы

Фармацевтическими композициями, подходящими для использования в настоящем изобретении, являются композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения нужной цели. Более конкретно термин терапевтически эффективное количество означает количество, эффективное для предупреждения развития или для ослабления уже имеющихся симптомов у индивидуума, подвергаемого лечению. Определение эффективных количеств может быть осуществлено любым специалистом, а особенно исходя из приведенного здесь подробного описания.

Для любого соединения, используемого в способе настоящего изобретения, терапевтически эффективная доза может быть установлена, исходя из анализов клеточных культур, и такая доза может быть введена животным с моделью заболевания. Полученная информация может быть использована для более точного определения подходящих доз для введения человеку.

Термин терапевтически эффективная доза означает количество соединения, которое приводит к ослаблению симптомов у пациента. Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений может быть определена в соответствии со стандартными фармацевтическими процедурами с использованием клеточных культур или экспериментальных животных, например, для определения ЬО₅₀ (доза, летальная для 50% тестируемой популяции) и ΕΌ₅₀ (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Отношение доз с токсическим и терапевтическим эффектом представляет собой терапевтический индекс, который может быть выражен как отношение между ЬП₅₀ и ΕΌ₅₀. Предпочтительными являются соединения, которые имеют высокий терапевтический индекс.

Данные, полученные на основе анализов клеточных культур и исследований животных, могут быть использованы для получения доз в интервалах, подходящих для введения человеку. Доза таких соединений предпочтительно составляет в пределах концентраций в кровотоке порядка ΕΌ₅₀ и имеет низкую токсичность или вообще не имеет токсичности. Доза может варьироваться в этих пределах в зависимости от используемой лекарственной формы и способа введения. Точный состав, способ введения и доза могут быть индивидуально выбраны лечащим врачом, исходя из состояния пациента (см., например, Етд1 е1 а1., Тйе Рйагтасо1од1са1 Вак1к оГ Тйегареийск, С11.1).

Предупреждение, диагноз и лечение психических заболеваний

Как описано выше, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к получению лекарственного средства для лечения психических заболеваний, а в частности, шизофрении и биполярного нарушения. Настоящее изобретение также относится к лекарственным средствам, действующим на РАРАР.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения лекарственные средства настоящего изобретения влияют на РАРАР либо путем непосредственного воздействия на РАРАР, на субъединицу, ассоциированную с РАРАР-комплексом, на комплекс РАРАР-д34872, либо опосредованно путем воздействия на путь РАРАР. Так, например, лекарственные средства могут модулировать, а более предпочтительно снижать уровень РАРАР-активности, присутствующей в клетке или в конкретной ткани, либо повышать или снижать активность белка РАРАР. В некоторых вариантах своего осуществления настоящее изобретение также относится к использованию соединения, способного повышать или снижать уровень экспрессии РАРАР или активность белка РАРАР, для получения или промышленного изготовления лекарственного средства. Указанное соединение предпочтительно используется для лечения психических заболеваний, а предпочтительно для лечения шизофрении или биполярного нарушения. Предпочтительно указанное соединение действует непосредственно путем связывания с РАРАР, д34872 или рецептором РАРАР. Указанным д34872 может быть любой полипептид д34872, включая полипептид 8ΕΟ ΙΌ N0: 5 или полипептид, описанный в совместно рассматриваемой патентной заявке 09/539333, озаглавленной Гены, белки и биаллельные маркеры, ассоциированные с шизофренией, и поданной 30 марта 2000 г.

Такие лекарственные средства могут также повышать или снижать активность соединения, аналогичного РАРАР, т.е. соединения, включающего аминокислотную последовательность, имеющую по крайней мере 25%-ную идентичность с последовательностью 8Ε0 ΙΌ N0: 2; соединения, включающего аминокислотную последовательность, имеющую по крайней мере 50%-ную идентичность с последовательностью 8Ε0 ΙΌ N0: 2; и соединения, включающего аминокислотную последовательность, имеющую

- 49 005921 по крайней мере 80%-ную идентичность с последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.

Лекарственные средства, которые повышают или уменьшают активности указанных соединений у индивидуума, могут быть использованы для ослабления или предупреждения симптомов у индивидуума, страдающего от психического заболевания или имеющего предрасположенность к психическому заболеванию, обсуждаемому в настоящей заявке.

Альтернативно, РАРАР-активность может быть повышена или снижена посредством экспрессии генов, кодирующих идентифицированные РАРАР-модулирующие соединения, с использованием генной терапии. Примеры векторов и промоторов, подходящих для использования в генной терапии, описаны выше. РАРАР-активность может быть также повышена или снижена путем продуцирования антитела, которое связывается с пептидом РАРАР, с рецептором РАРАР или с родственным белком, а также с фрагментами этих белков. Такие антитела могут модулировать взаимодействия между РАРАР и рецептором РАРАР или родственным белком. Антитела и способы их получения подробно описаны в настоящей заявке.

Как описано выше, настоящее изобретение относится к клеточным анализам для идентификации соединений в целях их использования для лечения психического заболевания. Эти анализы основаны на детекции экспрессии РАРАР, измерении активности белка РАРАР, либо они основаны на определении других имеющихся на данный момент патологических признаков шизофрении, биполярного нарушения или родственного психического нарушения. Соединениями для лечения психического заболевания являются производные белков или пептидов, которые обладают способностью ингибировать активность белка РАРАР дикого типа и которые могут быть идентифицированы по определению их способности связываться с белком РАРАР дикого типа. Такими соединениями также являются антитела, небольшие молекулы и лекарственные средства, которые могут быть получены с использованием ряда методов синтеза, известных специалистам, включая методы, основанные на комбинаторной химии. Способы идентификации соединений и способы получения композиций и введения лекарственных средств подробно описаны в настоящей заявке.

Использование РАРАР в методах диагностики или обнаружения предрасположенности к нарушениям ЦНС

У индивидуумов, страдающих шизофренией, биполярным нарушением или родственным нарушением или имеющих предрасположенность к этим заболеваниям, могут экспрессироваться аномальные уровни РАРАР. Индивидуумы, у которых наблюдается пониженная или повышенная РАРАР-активность в их плазме, физиологических жидкостях или в тканях, относятся к группе повышенного риска развития шизофрении, биполярного нарушения или различных нарушений ЦНС или психических состояний, ассоциированных с общим механизмом развития заболевания. В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу выявления у индивидуума риска развития указанного нарушения или диагностирования такого нарушения (например, шизофрении и биполярного нарушения или других психотических нарушений, нарушений настроения, аутизма, злоупотребления веществами, вызывающими зависимость, или алкоголизма, задержки умственного развития и других психических заболеваний, включая нарушение познавательной способности, тревожные состояния, нарушения, связанные с приемом пищи, неконтролируемая импульсивность и нарушения личности, которые могут быть определены с использованием Руководства по диагностике и статистике психических нарушений, четвертое издание, классификация (Ό8Μ-Ιν)), где указанный способ предусматривает определение наличия у индивидуума аномального уровня РАРАР-активности, включая активность белка РАРАР, и/или экспрессию мРНК РАРАР, или аномального уровня белка РАРАР в плазме, в физиологических жидкостях или в тканях. Уровень РАРАР или аналогичных соединений в плазме, в физиологических жидкостях или в тканях может быть определен с использованием ряда методов. В частности, уровень белка РАРАР может быть определен с использованием, например, Вестерн-блот-анализов или электрофореза белка. Детекция РАРАР может быть также осуществлена с использованием антитела, направленного против полипептида РАРАР настоящего изобретения.

Детекция специфического связывания с антителом указывает на присутствие полипептида РАРАР в данном образце (например, ЕЫ8А). Это может указывать на патологическое состояние, ассоциированное с РАРАР.

В другом аспекте один или несколько биаллельных маркеров РАРАР, их полиморфизм или варианты могут быть также использованы для разработки диагностических тестов в целях идентификации индивидуумов, у которых экспрессируется детектируемый признак как показатель специфического генотипа, или индивидуумов, генотип которых указывает на риск развития у них в будущем детектируемого признака. Такой признак, анализируемый с использованием способов диагностики настоящего изобретения, может быть использован для диагностики любого детектируемого признака, включая предрасположенность к шизофрении, биполярному нарушению или к родственному нарушению, такому как нарушения, описанные выше; возраст, в котором начнут появляться детектируемые симптомы; благоприятный ответ на лечение одного из указанных нарушений или на побочные эффекты, ассоциированные с этим лечением. Такая диагностика может быть использована для мониторинга, прогнозирования и/или профилактического или терапевтического лечения данного нарушения. Указанные диагностические способы

- 50 005921 основаны на знании нуклеиновокислотной последовательности РАРАР и позволяют использовать различные методики для того, чтобы определить, имеет ли обследуемый индивид генотип, ассоциированный с повышенным риском развития детектируемого признака, либо данный индивид имеет детектируемый признак в результате конкретной мутации, а в частности, эти способы позволяют осуществлять анализы хромосом индивидуумов для определения их гаплотипа, такие как, например, исследование семей, лишь один анализ ДНК спермы или обследование соматических гибридов. Такие диагностические способы могут позволять детектировать специфические аллели, присутствующие в последовательности РАРАР, включая регуляторные последовательности РАРАР или, обычно, присутствующие на хромосоме человека в области 13с.|33. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу детекции нуклеиновой кислоты, содержащей по крайней мере одну нуклеотидную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 1 или 3, или ее фрагмент, или комплементарную последовательность.

Указанные способы предусматривают получение образца нуклеиновой кислоты от данного индивидуума и определение того факта, содержит ли этот образец нуклеиновой кислоты по крайней мере один аллель или по крайней мере один гаплотип биаллельного маркера, указывающего на риск развития данного признака или указывающего на экспрессию у данного индивидуума данного признака, обусловленную наличием конкретного РАРАР-ассоциированного полиморфизма или РАРАР-ассоциированной мутации (аллеля, сообщающего данный признак).

Такая диагностика может быть основана лишь на одном биаллельном маркере или на группе биаллельных маркеров. В каждом из этих методов у исследуемого индивидуума берут образец нуклеиновой кислоты и определяют тип одного или нескольких биаллельных маркеров настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения проводят ПЦР-амплификацию на образце нуклеиновой кислоты для амплификации областей, в которых был идентифицирован полиморфизм, ассоциированный с детектируемым фенотипом. Продукты амплификации секвенируют для того, чтобы определить, имеет ли данный индивидуум один или несколько связанных с РАРАР полиморфизмов, ассоциированных с детектируемым фенотипом. Альтернативно, образец нуклеиновой кислоты подвергают реакциям микросеквенирования для того, чтобы определить, имеет ли данный индивидуум один или несколько РАРАРродственных полиморфизмов, ассоциированных с детектируемым фенотипом и вызванных мутацией или полиморфизмом в гене РАРАР человека. В другом варианте осуществления изобретения образец нуклеиновой кислоты подвергают контактированию с одним или несколькими специфическими олигонуклеотидными зондами, которые специфически гибридизуются с одним или несколькими РАРАРаллелями, ассоциированными с детектируемым фенотипом. В другом варианте осуществления изобретения образец нуклеиновой кислоты подвергают контактированию со вторым олигонуклеотидом, способным продуцировать продукт амплификации при его использовании вместе с аллель-специфическим олигонуклеотидом в реакции амплификации.

Присутствие продукта амплификации в реакции амплификации указывает на то, что данный индивидуум имеет один или несколько РАРАР-аллелей, ассоциированных с детектируемым фенотипом. В предпочтительном варианте указанным детектируемым признаком является шизофрения или биполярное нарушение. Диагностические наборы содержат любые полинуклеотиды настоящего изобретения. Указанные диагностические способы являются исключительно эффективными, а в некоторых случаях их можно уже начать использовать для профилактического лечения индивидуума или для предсказания у этого индивидуума признака-предвестника симптомов, таких как малые симптомы.

Диагностика, которая предусматривает анализ и предсказание ответа на лекарственное средство или побочных эффектов этого лекарственного средства, может быть использована для того, чтобы определить, можно ли лечить данного индивидуума конкретным лекарственным средством. Так, например, если такая диагностика указывает на вероятность того, что данный индивидуум будет иметь положительную реакцию на лечение конкретным лекарственным средством, то это лекарственное средство может быть введено данному индивидууму. И наоборот, если такая диагностика указывает на вероятность продуцирования у данного индивидуума негативной реакции на лечение конкретным лекарственным средством, то этому индивидууму может быть назначен альтернативный курс лечения. Негативная реакция может быть определена либо по отсутствию эффективного ответа, или по наличию токсичных побочных эффектов.

Клинические испытания лекарственных средств представляют собой другое применение диагностических способов настоящего изобретения. Один или несколько маркеров, являющихся показателями ответа на агент, действующий против шизофрении, или на продуцирование побочных эффектов, вызываемых агентом, действующим против шизофрении, могут быть идентифицированы описанными выше способами. Затем может быть проведено обследование потенциальных участников в клинических испытаниях данного агента в целях идентификации тех индивидуумов, которые, по всей вероятности, будут иметь благоприятный ответ на лечение данным лекарственным средством, и исключить тех индивидуумов, у которых, вероятно, будут продуцироваться побочные эффекты. Таким образом, эффективность лечения лекарственным средством может быть определена у индивидуумов, у которых наблюдается положительный ответ на данное лекарственное средство, причем качество такого определения не будет снижаться в результате включения индивидуумов, которые в данном исследовании имеют низкую веро

- 51 005921 ятность положительного ответа, а также будет исключен риск развития у них нежелательных побочных эффектов.

Предупреждение и лечение заболеваний

Так, например, из-за риска суицида обнаружение чувствительности к шизофрении, биполярному нарушению, а также к другому психическому заболеванию у данного индивидуума имеет очень важное значение. Следовательно, настоящее изобретение относится к способу лечения нарушения ЦНС, включая, в частности, шизофрению, биполярное нарушение или родственное нарушение, где указанный способ включает следующие стадии:

- отбор индивидуума, ДНК которого содержит аллели РАРАР-ассоциированного полиморфизма, биаллельный маркер или группу биаллельных маркеров, или индивидуума, у которого наблюдается аномальная экспрессия мРНК РАРАР или активность белка РАРАР, ассоциированные с нарушением ЦНС;

- обследование указанного индивидуума на появление у него (и необязательно развития) симптомов, ассоциированных с указанным нарушением ЦНС; и

- назначение указанному индивидууму лечения, направленного против указанного нарушения ЦНС или против его симптомов, на соответствующей стадии данного заболевания.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения нарушения ЦНС, включающему следующие стадии:

- отбор индивидуума, ДНК которого содержит аллели РАРАР-ассоциированного полиморфизма, биаллельный маркер или группу биаллельных маркеров, или индивидуума, у которого наблюдается аномальная экспрессия мРНК РАРАР или активность белка РАРАР, ассоциированные с нарушением ЦНС;

- назначение указанному индивидууму профилактического лечения, направленного против указанного нарушения ЦНС.

В еще одном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения нарушения ЦНС, включающему следующие стадии:

- отбор индивидуума, ДНК которого содержит аллели РАРАР-ассоциированного полиморфизма, биаллельный маркер или группу биаллельных маркеров, или индивидуума, у которого наблюдается аномальная экспрессия мРНК РАРАР или активность белка РАРАР, ассоциированные с нарушением ЦНС;

- назначение указанному индивидууму профилактического лечения, направленного против указанного нарушения ЦНС;

- обследование указанного индивидуума на появление и развития у него симптомов указанного нарушения ЦНС; и необязательно,

- назначение указанному индивидууму лечения, направленного против указанного нарушения ЦНС или против его симптомов, на соответствующей стадии данного заболевания.

В целях определения курса лечения индивидуума, страдающего данным заболеванием, настоящее изобретение также относится к способу лечения нарушения ЦНС, включающему следующие стадии:

- отбора индивидуума, страдающего шизофренией или биполярным нарушением, ДНК которого содержит аллели РАРАР-ассоциированного полиморфизма, биаллельный маркер или группу биаллельных маркеров, или индивидуума, у которого наблюдается аномальная экспрессия мРНК РАРАР или активность белка РАРАР, ассоциированная с тяжелым нарушением ЦНС или его симптомами; и

- назначение указанному индивидууму лечения, направленного против указанного нарушения ЦНС или его симптомов.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения нарушения ЦНС у отобранной группы индивидуумов. Указанный способ предусматривает:

- отбор индивидуума, страдающего нарушением ЦНС и имеющего ДНК, содержащую аллели РАРАР-ассоциированного полиморфизма, биаллельный маркер или группу биаллельных маркеров, или индивидуума, у которого наблюдается аномальная экспрессия мРНК РАРАР или активность белка РАРАР, ассоциированные с положительным ответом на лечение эффективным количеством лекарственного средства, направленного против указанного нарушения ЦНС или его симптомов;

- и/или отбор индивидуума, ДНК которого не содержит аллелей РАРАР-ассоциированного полиморфизма, биаллельного маркера или группы биаллельных маркеров, или индивидуума, у которого наблюдается аномальная экспрессия мРНК РАРАР или активность белка РАРАР, ассоциированные с негативным ответом на лечение указанным лекарственным средством; и

- назначение указанному отобранному индивидууму лечения эффективным количеством указанного лекарственного средства в подходящих интервалах.

В контексте настоящего изобретения термин положительный ответ на лекарственное средство может быть определен как ослабление симптомов заболевания. В контексте настоящего изобретения термин отрицательный ответ на лекарственное средство может быть определен как отсутствие положительного ответа на лекарственное средство, при котором не происходит ослабления симптомов заболевания или наблюдаются побочные эффекты после введения лекарственного средства.

Предпочтительными нарушениями ЦНС в способах настоящего изобретения являются шизофрения и биполярное нарушение. Однако настоящее изобретение также относится к предупреждению, диагностике, прогнозированию и лечению, описанным здесь в способах предупреждения, диагностики, терапии

- 52 005921 и лечения родственных нарушений, а в частности, родственных нарушений ЦНС. Примерами родственных нарушений могут служить психотические нарушения, нарушения настроения, аутизм, злоупотребления веществами, вызывающими зависимость, или алкоголизм, задержка умственного развития и другие психические заболевания, включая нарушение познавательной способности, тревожные состояния, нарушения, связанные с приемом пищи, неконтролируемая импульсивность и нарушения личности, определенные с использованием Руководства по диагностике и статистике психических нарушений, четвертое издание, классификация (Ό8Μ-Ιν).

Настоящее изобретение также относится к способу определения вероятности положительного ответа индивидуума на лечение лекарственным средством. Этот способ предусматривает идентификацию первой группы индивидуумов, у которых наблюдается положительный ответ на указанное лекарственное средство, и второй группы индивидуумов, у которых наблюдается отрицательный ответ на указанное лекарственное средство. Один или несколько биаллельных маркеров идентифицируют в первой группе, у которой наблюдался положительный ответ на указанное лекарственное средство, либо один или несколько биаллельных маркеров идентифицируют во второй группе, у которой наблюдался отрицательный ответ на указанное лекарственное средство. Указанные биаллельные маркеры могут быть идентифицированы описанными здесь методами.

Затем у тестированного индивидуума берут образец ДНК. Этот образец ДНК анализируют на содержание в нем аллелей одного или нескольких биаллельных маркеров, ассоциированных с положительным ответом на лечение указанным лекарственным средством и/или на содержание в нем аллелей одного или нескольких биаллельных маркеров, ассоциированных с отрицательным ответом на лечение указанным лекарственным средством.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанное лекарственное средство может быть введено индивидууму при клиническом испытании, если указанный образец ДНК содержит аллели одного или нескольких биаллельных маркеров, ассоциированных с положительным ответом на лечение указанным лекарственным средством, и/или если указанный образец ДНК не содержит аллелей одного или нескольких биаллельных маркеров, ассоциированных с отрицательным ответом на лечение указанным лекарственным средством. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанным лекарственным средством является лекарственное средство, действующее против шизофрении или биполярного нарушения.

С использованием способа настоящего изобретения оценка эффективности лекарственного средства может быть проведена в группе индивидуумов, у которых, вероятно, будет наблюдаться благоприятный ответ на данное лекарственное средство.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ использования лекарственного средства, предусматривающий получение образца ДНК от индивидуума, оценка на содержание в этом образце ДНК аллелей одного или нескольких биаллельных маркеров, ассоциированных с положительным ответом на указанное лекарственное средство и/или на содержание в указанном ДНК-образце аллелей одного или нескольких биаллельных маркеров, ассоциированных с отрицательным ответом на лекарственное средство, и введение указанного лекарственного средства указанному индивидууму, если этот ДНКобразец содержит аллели одного или нескольких биаллельных маркеров, ассоциированных с положительным ответом на указанное лекарственное средство, и/или если этот ДНК-образец не содержит аллели одного или нескольких биаллельных маркеров, ассоциированных с отрицательным ответом на указанное лекарственное средство.

Настоящее изобретение относится к способу клинического испытания лекарственного средства, а предпочтительно лекарственного средства, действующего против шизофрении, биполярного нарушения или его симптомов. Указанный способ включает следующие стадии:

- введение гетерогенной популяции индивидуумов лекарственного средства, а предпочтительно лекарственного средства, действующего против шизофрении, или биполярного нарушения, или их симптомов;

- идентификация первой популяции индивидуумов, у которой наблюдается положительный ответ на указанное лекарственное средство, и второй популяции индивидуумов, у которой наблюдается отрицательный ответ на указанное лекарственное средство;

- идентификация биаллельных маркеров у указанной первой популяции, у которой наблюдается положительный ответ на указанное лекарственное средство;

- отбор индивидуумов, ДНК которых содержит биаллельные маркеры, ассоциированные с положительным ответом на указанное лекарственное средство; и

- введение указанного лекарственного средства указанным индивидуумам.

Очевидно, что такие способы крайне необходимы для увеличения отношения польза/риск благодаря введению лекарственных средств, которые могут вызывать нежелательные побочные эффекты и/или которые являются неэффективными для той группы пациентов, которым им обычно назначают.

После установления диагноза индивидууму, страдающему шизофренией или биполярным нарушением, проводят скрининг-тесты для того, чтобы определить, содержит ли ДНК данного индивидуума аллели биаллельного маркера или группу биаллельных маркеров, ассоциированных с положительным

- 53 005921 ответом на лечение или с отрицательным ответом на лечение, которое может вызывать побочные эффекты или которое является неэффективным.

Отбор пациентов, подвергаемых лечению способом настоящего изобретения, может быть осуществлен методами детекции, описанными выше. Индивидуумами, которые должны быть отобраны, являются предпочтительно такие индивидуумы, ДНК которых не содержат аллелей биаллельного маркера или группу биаллельных маркеров, ассоциированных с отрицательным ответом на лечение. Знание о генетической предрасположенности индивидуума к невосприимчивости или к развитию побочных эффектов в ответ на введение данного лекарственного средства позволяет клиницисту назначать лечение подходящими лекарственными средствами против шизофрении, или биполярного нарушения, или их симптомов.

После определения генетической предрасположенности данного пациента врач-клиницист может назначить подходящее лечение, о котором известно, что оно не дает или почти не дает, негативного ответа, а в частности, побочных эффектов у пациента.

В настоящей заявке процитированы различные публикации, патенты и опубликованные патентные заявки. Описание этих публикаций, патентов и опубликованных описаний патентов, на которые имеются ссылки в настоящей заявке, вводятся в настоящее описание посредством ссылки для более полного описания материала, к которому относится настоящее изобретение.

Примеры

Пример 1. Анализ на связывание с рецептором ίη όιι (окрашивание клеток).

АР-гибридная конструкция.

Лигирование с сохранением рамки считывания кДНК-последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность пептида РАР (8Е0 ΙΌ N0: 5), с С-концом секретируемой щелочной фосфатазы (АР) осуществляли в зкспрессирующем векторе рАР!ад. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности (гибридного) белка, встроенные в указанный вектор, представлены в 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 6 соответственно.

Этот вектор содержит секретируемую сигнальную последовательность, расположенную выше вставки, которая направляет секретируемый гибридный белок в среду. Среды, содержащие этот гибридный белок, могут быть собраны, проанализированы на АР-активность и использованы в анализе ίη όιι на рецептор/лиганд.

Затем АР-гибридный белок трансфицировали в клетки 293Т и стабильные трансфектанты отбирали по резистентности к зеоцину. Среды от клеток, содержащие стабильные трансфектанты, собирали через каждые 3 дня и анализировали на АР-активность. Затем эту среду, содержащую АР-гибрид, использовали для анализа ίη кйи на связывание с рецептором, проводимого как описано ниже.

Библиотеку кДНК головного мозга человека конструировали с использованием набора для синтеза кДНК 81га1а8ег1е. Эту кДНК клонировали в экспрессирующий вектор рМТ21-лео млекопитающего (СспНшПег). Плазмидную ДНК получали из пулов ~1000 колоний с использованием набора 01аРгер δρίη Мзшргер (01а§е1'1). Эти пулы ДНК затем подвергали кратковременной трансфекции в клетки СО8-1 как описано ниже. Два микрограмма ДНК от каждого пула кДНК головного мозга человека разводили в 200 мкл бессывороточной среды (среды ΌΜΕΜ от СФот ВРЬ без добавок). Затем образовывали комплекс ДНК с реагентом РЬИ8 путем добавления 12 мкл (смешанного перед использованием) реагента РЬИ8 к ДНК в бессывороточной среде. 200 мкл комплекса ДНΚ-Р^υ8-липοфектамин добавляли в лунки, содержащие клетки С08-1, засеянные при концентрации 0,25 х 10⁵ клеток на лунку в 6-луночных планшетах (35 мм) за один день до трансфекции (в полной среде, не содержащей антибиотиков). Перед добавлением комплекса ДНК/липофектамин/РЬи8 полную среду удаляли с клеток и заменяли 800 мкл бессывороточной среды. Клетки инкубировали при 37° в 5% С0₂ в течение 3 ч, а затем среду в каждой лунке заменяли 2 мл полной среды.

Клонирование рецептора/лиганда.

Секретированный АР-гибридный белок использовали в качестве зонда для клонирования РАРАР путем экспрессии в соответствии со стратегиями клонирования.

Через два дня после трансфекции начиналось окрашивание клеток. Культуральную среду удаляли из 6-луночных планшетов с клетками. Прикрепленные клетки один раз промывали 2 мл промывочного буфера НВНА ((50 мл 10Х НВ88 (1Х), 0,25 г В8А (0,5 мг/мл), 10 мл 1М НЕРЕ8, рН 7,5 (20 мМ), доведенного до 500 мл с использованием йН₂О)) и инкубировали в течение 90 мин при комнатной температуре с 2 мл среды, содержащей гибридный РАРАР-белок, или среды, содержащей АР (в качестве негативного контроля). Затем среду удаляли и образец промывали по крайней мере 5 раз 2 мл буфера НВНА в течение 10 мин. После этого буфер НВНА полностью удаляли и клетки фиксировали в течение 30 с с использованием 2 мл фиксирующего реагента (60%-ный ацетон, 3%-ный формальдегид, 20 мМ НЕРЕ8, рН 7,5). Этот фиксирующий реагент сразу удаляли и образец дважды промывали 2 мл буфера Н8 на лунку ((15 мл 5М №101 (150 мМ), 10 мл 1М НЕРЕ8, рН 7,5 (20 мМ), доведенного до 500 мл с использованием йН₂О)). Образец инкубировали в буфере Н8 при 65°С в течение 100 мин для термоинактивации эндогенной АР. Буфер Н8 удаляли и АР-активность, связанную с клеточной поверхностью, окрашивали 1 мл реагента для анализа АР (50 мМ 1М Трис-НС1, рН 9,5 (100 мМ), 10 мл 5М №101 (100 мМ), 2,5 мл 1М

- 54 005921

МдС1₂ (5 мМ), доведенного до 500 мл, к которым были добавлены Ν^ до конечной концентрации 0,33 мг/мл и ВС1Р до конечной концентрации 0,17 мг/мл.).

После детекции позитивного клона анализ повторяли с использованием более мелких пулов кДНК до тех пор, пока не был идентифицирован единственный клон (нуклеиновая кислота РАРАР).

Пример 2. Получение композиций антитела с белком РАРАР.

В основном, чистый белок или полипептид выделяли из трансфицированных или трансформированных клеток, содержащих экспрессирующий вектор, кодирующий белок РАРАР или его часть.

Концентрацию белка в конечном препарате доводили, например, путем его концентривания на фильтре Аткои до уровня в несколько микрограммов/мл. Затем моноклональное или поликлональное антитело против данного белка может быть получено следующим образом.

A. Продуцирование моноклонального антитела методом гибридомного слияния.

Моноклональное антитело против эпитопов в белке РАРАР или в его части может быть получено из мышиных гибридов классическими методами, описанными КоЫег С. & МШкт С. (1975), или модифицированными методами. См. также Наг1оте Е. & Ό. Еаие, 1988.

Вкратце, мышь повторно инокулировали несколькими микрограммами белка РАРАР или его части в течение нескольких недель. Затем мышь умерщвляли и из ее селезенки выделяли антителопродуцирующие клетки. Клетки селезенки подвергали слиянию с помощью полиэтиленгликоля с мышиными миеломными клетками, а избыток неслитых клеток разрушали путем культивирования этой системы на селективных средах, содержащих аминоптерин (среды НАТ). Успешно гибридизованные клетки разводили и аликвоты этого разведения помещали в лунки микротитрационного планшета, в котором продолжали выращивание этой культуры. Антителопродуцирующие клоны идентифицировали путем детекции антитела в супернатанте в лунках с помощью процедур иммуноанализа, такого как ЕЬ18А, впервые описанного Еидуа11 (1980), и модифицированными методами. Отобранные позитивные клоны могут быть размножены, и их продукт с моноклональным антителом может быть собран для дальнейшего использования. Подробное описание продуцирования моноклонального антитела описано у Οηνίδ Ь. е1 а1., Ва§1с МеШобБ ш Мо1еси1аг Вк1оду Екеукг, Νονν Уогк 8есбои 21-2.

B. Продуцирование поликлонального антитела путем иммунизации.

Поликлональная антисыворотка, содержащая антитела к гетерогенным эпитопам белка РАРАР или его части, может быть получена путем иммунизации подходящих, не являющихся человеком животных белком РАРАР или его фрагментом, который может быть немодифицирован или модифицирован для усиления иммуногенности. Подходящим животным, но не человеком, является предпочтительно млекопитающее, но не человек, а обычно мышь, крыса, кролик, коза или лошадь. Альтернативно, неочищенный препарат, который имеет повышенную концентрацию РАРАР, может быть использован для генерирования антител. Такие белки, их фрагменты или препараты вводят млекопитающему, не являющемуся человеком, в присутствии подходящего адъюванта (например, гидроксида алюминия, К1В1 и т.п.), известного специалистам. Кроме того, этот белок, его фрагмент или препарат могут быть предварительно обработаны агентом, повышающим антигенность, причем, такие агенты известны специалистам, и ими являются, например, метилированный альбумин бычьей сыворотки (тВ8А), альбумин бычьей сыворотки (В8А), поверхностный антиген гепатита В и гемоцианин лимфы улитки (КЬН). Сыворотку иммунизованного животного собирали, обрабатывали и тестировали в соответствии с известными процедурами. Если сыворотка содержит поликлональные антитела против нежелательных эпитопов, то эти поликлональные антитела могут быть очищены с помощью иммуноаффинной хроматографии.

Эффективное продуцирование поликлональных антител зависит от многих факторов, связанных как с типом антигена, так и с видом хозяина. Кроме того, животные-хозяева отличаются по своему ответу на участок инокуляции и дозу, при этом неадекватная или избыточная доза антигена приводит к продуцированию антисыворотки с низким титром антитела. Малые дозы (на уровне нг) антигена, вводимого внутрикожно во многие участки, очевидно, являются наиболее надежными. Методы продуцирования и обработки поликлональной антисыворотки известны специалистам, см., например, Мауег & \Уа1кег (1987). Протокол эффективной иммунизации кроликов можно найти у УабикаШБ 1. е1 а1. (1971).

Бустер-инъекции могут быть введены регулярно через соответствующие интервалы времени, и антисыворотку собирают в том случае, если титр антитела, определенный полуколичественным методом, например методом двойной иммунодиффузии в агаре против известных концентраций антигена, начинает снижаться. См., например, 0иск1ег1оиу О. е1 а1. (1973). Плато на кривой концентрации антитела составляет обычно в пределах от 0,1 до 0,2 мг/мл сыворотки (примерно 12 мкМ). Аффинность антисыворотки, содержащей антитела против данного антигена, определяют путем построения кривых конкурентного связывания, как описано, например, ЕЫ1ег Ό. (1980).

Препараты антител, полученные в соответствии с протоколом продуцирования моноклональных или поликлональных антител, могут быть использованы в количественных иммуноанализах, которые определяют концентрации антигенсодержащих веществ в биологических образцах; они могут быть также использованы в полуколичественных или в качественных анализах для идентификации присутствия антигена в биологическом образце. Эти антитела могут быть также использованы в терапевтических композициях, предназначенных для цитолиза клеток, экспрессирующих данный белок, или для снижения

- 55 005921 уровней данного белка в организме.

Хотя настоящее изобретение было проиллюстрировано и описано на предпочтительных вариантах его осуществления, однако, в него могут быть внесены различные изменения, не выходящие за рамки существа и объема настоящего изобретения.

Аббопбапхо 8.1. е! а1., 1993, Ме!йобк ш Епхуто1о§у, Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, рр 803-823

А_)кка К.8. е! а1., Ат. I. Нит. Сепе!., 60:1439-1447, 1997

А1!ксйи1 е! а1., 1990, I. Мо1. Вю1. 215 (3):403-410

А11кс1и.11 е! а1., 1993, Книге Сепекск 3:266-272

А1!ксйи1 е! а1., 1997, Шс. Ас1бк Кек. 25:3389-3402

Атек, К.8. е! а1., I. Iттиио1. Ме!йобк 184:177-186 (1995)

Ап!оп М. е! а1., 1995, I. Уйо1., 69:4600-4606

Агак1 К е! а1., (1995), Ргос. №к. Асаб. Зск ИЗА. 92(1):160-4

Ак11кеиах1 А. е! а1., Р^З 88:10535-10539 (1991)

Акхоб| е! а1., Рго!етк:Зкис!иге, Рипскоп, апб Сепекск, Зирр1етеп! 1:38-42 (1997)

АикиЬе1 е! а1., (1989), Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вк1оду, Сгееп РиЬккЫпд Аккос1а!ек апб Айеу Шкгкскпсе, КУ.

Вайипек Р. е! а1., Су!окте 8(1):14-20 (1996)

ВаиЬошк А., (1993), №с1ек Ас1бк Кек. 21(9): 2025-9

Веаисаде е! а1., Те!гайебгоп Ье!! 1981, 22:1859-1862

Ве!!ег, М. е! а1., Зскпсе 240:1041-1043 (1988)

Вгаб1еу А., 1987, Ргобископ апб апа1ук1к оГ сЫтаепс тке. Ш: Е.Е КоЬейкоп (Еб.), Тега!осагсшотак апб етЬгуошс к!ет се11к: А ргас!ка1 арргоасй. ΙΒ6 Ргекк, 0хГогб, рр. 113

Вгат К.1. е! а1., 1993, Мо1. Се11 Вю1., 13:4760-4769

Вппктап и. е! а1., 1. Iттиио1. Ме!йобк 182:41-50 (1995)

Вго\уп Е.Ь., Ве1а§а)е К, Куап М.1., Кйогапа Н.С, Ме!йобк Епхуто1 1979; 68:109-151

ВгиНад е! а1., Сотр. Арр. Вккск 6:237-245, 1990

Вийоп, Б.К. е! а1. Абуапсек т Iттиио1о§у 57:191-280 (1994)

Викй е! а1., 1997, 1. СЬгота!о§г., 777:311-328.

Саг1коп N.0. е! а1., 1. Вю1. Сйет. 272 (17):11295-11301 (1997)

Сйа1 Н. е! а1., (1993), Вк^с^ок Арр1. Вксйет. 18:259-273

Сйее е! а1., (1996), Зскпсе. 274:610-614

Сйеп апб К\уок №с1ек Ас1бк Кекеагсй 25:347-353 1997

Сйеп е! а1., (1987), Мо1. Се11. Вю1. 7:2745-2752

Сйеп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. Зск ИЗА 94/20 10756-10761, 1997

Сйеп Ζ., е! а1. Сапсег Кек. 58 (16) 3668-3678 (1998)

Сйо К.1. е! а1., 1998, Ргос. №!1. Асаб. Зск ИЗА, 95(7):3752-3757.

Сйои 1.У., 1989, Мо1. Епбосппо1, 3:1511-1514

С1агк А.С., (1990), Мо1. Вю1. Еуо1. 7:111-122

Со1ек К, Сак\уе11 К, КиЬткЛет Б.С., Нит Мо1 Сепе! 1998; 7:791-800

Сотр!оп 1. (1991) №!иге. 350 (6313):91-92

БауЕ Ь.С., М.Б. Б1бпег, апб 1.Р. Ва!!еу, Вакк Ме!йобк ш Мо1еси1аг В1о1оду, еб., Е1ке\кг Ргекк, КУ, 1986

Бенд, В. е! а1. В1ооб 92 (6): 1981-1988 (1998)

Беп! Б.З. & Еакйтап Б.З. (1993) Тйе БХА тоЬййу кЫГ! аккау. Ш: Т^аикс^^р!^ои Рас!огк: А Ргас!ка1 Арргоасй (Еа!сйтап БЗ, еб.) рр. 1-26. 0хГогб: ΙΒ6 Ргекк

Ескпег К. е! а1. (1991) ЕМВ0 1. 10:3513-3522

Еб\уагбк е! Ееа111егбагго\у, Апа1у!ка1 Вксйеткку, 246, 1-6 (1997)

Епдуай Е., Ме!й. Епхуток 70:419 (1980)

Ре1бтап апб З!ед, 1996, Мебесше/Зскпсек, куп!йеке, 12:47-55

Река Р., 1991, 1. Мо1. Вю1., Уо1. 222:301-310

Ре11, Н.Р. е! а1. 1. Ι^π^Ι 146:2446-2452 (1991)

Рк1бк апб Зопд, 1989, Книге, 340:245-246

Р1кйег Б., Сйар. 42 т: Мапиа1 оГ С11шса1 бптипокду, 2б Еб. (Коке апб Рпебтап, Ебк.) Атег. Зос. Рог МкгоЬкк, АакЫпд!оп, Б.С. (1980)

Нойе е! а1., (1992), Ат. 1. Кекрй. Се11 Мо1. Вю1. 7:349-356

Робог е! а1., (1991), Зскпсе 251:767-777

Рга1еу е! а1., (1979), Ргос. №ΐ1. Асаб. Зск ИЗА. 76:3348-3352

Ргкб М., Сго!йегк Б.М., К1с1ек Ас1бк Кек 1981; 9:6505-6525

Рготоп!-Касте М. е! а1., 1997, Книге Сепекск, 16(3):277-282

Ри11ег З.А. е! а1., (1996), бптипокду ш Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1о§у, АикиЬе1 е! а1. Ебк, 1обп Акеу & Зопк, бчс., ИЗА

Рийй Р.А. е! а1., (1994), Ргос. №!1. Асаб. Зс1 ИЗА 91:9302-9306

- 56 005921

Сагпег М.М., Кеу/т А., ΜιαΕία Ас1бк Кек 1981/ 9:3047-3060

Сеукеп Н. Мало е! а1., 1984, Ргос. №6. Асаб. 8с1. И.8.А. 81:3998-4002

СНокН апб Вассбата!, 1991, Тагдебпд оГ брокотек Ю Нера!осу!ек, Г№ Ыуег ^^кеакек, Тагде!еб б1адпо81к апб Шегару иктд кресШс гесер!огк апб бдапбк. \Уи е! а1. Ебк., Магсе1 Эекекег №\ν Уогк, рр. 87-104

С1Шек 8ГО. е! а1., 1. 1ттипо1. Ме!Нобк 125:191-202 (1989)

С1Шек 8.0. е! а1., Р^8 89:1428-1432 (1992)

Соппе! е! а1., 1992, 8с1епсе 256:1443-1445

Сора1 (1985) Мо1. Се11. Вю1., 5:1188-1190

Соккеп М. е! а1., (1992), Ргос. №б. Асаб. 8сг И8А 89:5547-5551

Соккеп М. е! а1., (1995), 8с1епсе. 268:1766-1769

СгаНат е! а1., (1973), У1го1оду 52:456-457

Сгееп е! а1., Агт. Кеу. ВюсНет. 55:569-597 (1986)

Сгеепкрап апб Вопа, ЕА8ЕВ 1. 7(5):437-444 (1989)

СбГйп е! а1. 8аепсе 245:967-971 (1989)

Сготре М., (1993), №!иге Сепебск. 5:111-117

Сготре М. е! а1., (1989), Ргос. КаИ. Асаб. 8сг И.8.А. 86:5855-5892

Си Н. е! а1., (1993), Се11 73:1155-1164

Си Н. е! а1., (1994), 8аепсе 265:103-106

Сиа!еШ ЕС. е! а1. Ргос. N011. Асаб. 8сг И8А. 35:273-286

Нас1а ЕС., Вгобу Ь.С., СНее М.8., Еобог 8.Р., СоШпк Е.8., №! Сепе! 1996; 14(4):441-447

На11 Ь.А. апб 8т1гпоу 1.Р. (1997) Сепоте КекеагсН, 7:378-388

Натек В.Э. апб Шддтк 8.1. (1985) №.1с1е1с Ас1б НуЬпб|/а1юп: А Ргасбса1 АрргоасН. Натек апб Н1ддтк Еб., 1КЬ Ргекк, 0хГогб

Нади Ь., ХУеЬег Т., А1ехапбгоуа Ь., Ьикт М., Капк1 М., 1а1апко А., Сбп СНет 1993; 39 (11Р! 1):22822287

Наг1апб е! а1., (1985), 1. Се11. Вю1. 101:1094-1095

Наг1о\\' Е., апб Э. Ьапе. 1988. АпбЬоб1ек А ЬаЬога!огу Мапиа1. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, рр. 53242

Нагрег Е№. е! а1., 1993, Се11, 75:805-816

Наттегбпд, е! а1., т: ХЮХ0С1.0ХА1. АХЕ1В0ШЕ8 АХО Т-СЕЬЬ Н¥ВК1П0МА8 563-681 (Е1кеу1ег, КУ, 1981)

Наггор, ЕЛ. е! а1. 1. 1ттипо1. 161 (4):1786-1794 (1998)

На\\'1еу М.Е. е! а1. (1994) Ат. 1. РНук. Ап!Нгоро1. 18:104

НешкоГГ апб НешкоГГ, 1993, Рго!етк 17:49-61

Шддтк е! а1., 1996, Мебюбк ЕпхутоГ 266:383-402

Н1Шег Ь. апб Сгееп Р. Ме!Нобк Арр1, 1991, 1:124-8

Ноекк е! а1. (1986) N^1010 Ас1бк Кек. 14:2287-2300

Ниапд Ь. е! а1., (1996), Сапсег Кек 56 (5):1137-1141

Ник!оп е! а1. Мебюбк т Епхуто1оду 203:46-88 (1991)

Ниудеп е! а1. (1996) ^^е Мебюте. 2 (8):893-898

Пап! ЕС., \\ епПгаиЬ Н., Се11 1984 Арг; 36 (4) :1007-15

1и1ап е! а1., (1992), 1. Сеп. Убо1. 73:3251-3255

Капедае У.е! а1., N^1. Ас1бк Кек. 23:3816-3821 (1995)

Кагбп апб А1!ксНи1, 1990, Ргос. №6. Асаб. 8сГ И8А 87:2267-2268

КеШеЬогоидН, С.А. е! а1. Еиг. 1. 1ттипо1. 24:952-958 (1994)

КНоигу 1. е! а1., Еипбатеп1а1к оГ Сепебс Ер1бетю1оду, 0хГогб Итуегкйу Ргекк, NΥ, 1993

Кт И-Е е! а1., (1996), Сепотюк 34:213-218

К1ет е! а1., (1987), №!ηΐΌ. 327:70-73

КоЫег С. апб М11к!ет С, N3!^ 256:495 (1975)

Ко11ег е! а1., (1992), Аппи. Кеу. 1ттипо1. 10:705-730

Коха1 М.Е, 8НаН К, 8Неп К, Уапд К., Еисш1 К., Мебдап Т.С., КюНтап ^.^., Мотк ^., НиЬЬе11 Е., СНее М., Стдегак Т.К., №! Меб 1996; 2(7):753-759

Ьапбедгеп и. е! а1. (1998) Сепоте КекеагсН, 8:769-776

Ьапде К. (1997) Ма1Нетабса1 апб 8!абкбса1 Ме!Нобк Гог Сепебс Апа1ук1к. 8рбпдег, Хеν Уогк

ЬепНагб Т. е! а1.. (1996). Сепе. 169:187-190

Ыаи!агб 1. е! а1. Су!октбе 9(4):233-241(1997)

Ып!оп М.Е.е! а1., (1993), 1. С1т. 1пуек!. 92:3029-3037

Ьш Ζ. е! а1., (1994), Ргос. №6. Асаб. 8сг И8А. 91:4528-4262

Ыуак е! а1., ^^е Сепебск, 9:341-342,1995

Ыуак К.Е, Натег Е№., Нит Ми!а! 1994; 3(4):379-385

ЬоскНаб е! а1. ^^е Вю!есНпо1оду 14:1675-1680, 1996

Ьисак А.Н., 1994, 1п: Эеуе1ортеп1 апб С11шса1 Икек оГ НаетрорНбик Ь Соп)ида!е

- 57 005921

Мапзоиг 8.Б. е! а1. (1988) №11иге. ЗЗ6:З48-З52

Магзйа11 К.Ь. е! а1. (1994) РСК Ме!йобз апб Аррйсайопз. 4:80-84

МсСогтюк е! а1. (1994) Сепе!. Апа1. Тесй. Арр1. 11:158-164

МсЬаидЫт В.А. е! а1. (1996) Ат. I. Нит. Сепе!. 59:561-569

Мойоп №Е., Ат. I. Нит. Сепе!, 7:277-З18, 1955 Мотзоп, 8с1епсе 229:1202 (1985)

Ми11ег, ΥΑ. е! а1. 8!гис!иге 6(9):115З-1167 (1998)

МиШпах, К.Ь. е! а1. В1о Тесйтциез 12(6):864-869(1992)

Миζусζка е! а1. (1992) Сигг. Торюз т М1сго, апб 1ттипо1. 158:97-129 №ба 8. е! а1. (199З) Се11 7З:1125-11З5 №1§у А. е! а1., 199З, Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 90:8424-8428 №гатига, М. е! а1. 1ттипо1. Ье!!. З9:91-99(1994) №1гапд 8.А., Нзшпд Н.М., Вгоиззеаи К., Ме!йобз Εηζутο1 1979; 68:90-98 №ба е! а1. (1991) I. Вю1. Сйет. 266:1414З-14146 №\\1оп е! а1. (1989) №1с1ею Ас1бз Кез. 17:250З-2516 №скегзоп О.А. е! а1. (1990) Ргос. №!1. Асаб. 8ск И.8.А. 87:892З-8927 №со1аи С. е! а1., 1987, Ме!йобз Εηζутο1., 149:157-76 №со1аи е! а1. (1982) ВюсЫт. Вюрйуз. Ас!а. 721:185-190 №ззто££ I. 1ттипо1. 147(8): 2429-24З8 (1991)

Дугеи Р., Рейегззоп В., ИЬ1еп М., Апа1 Вюсйет 199З; 208 (1) :171-175 е! а1., Вю Тесйтциез 4:214 (1986)

0'Кей1у е! а1., (1992), Васи1оу1гиз Ехргеззюп Vес!ο^з: А ЬаЬога!огу Мапиа1. №. Н. Ргеетап апб Со., №\ν Уогк

0йпо е! а1. (1994) 8с1епсе. 265:781-784

01бепЬигд К.К. е! а1., 1992, Ргос. №!1. Асаб. 8ск, 89:5З9З-5З97

0гйа е! а1. (1989) Ргос. №!1. Асаб. 8ск и.8.А. 86:2776-2770

0исй!ег1опу, 0. е! а1., Сйар. 19 т: НапбЬоок о£ Ехрептеп!а1 1ттипо1оду Ό. №1ег (еб) В1аск\уе11 (197З)

Раб1ап Е.А., Мо1еси1аг 1ттипо1оду 28(4/5):489-98 (1991)

Рагт1еу апб 8тйй, Сепе, 1988, 7З:З05-З18

Разйпеп е! а1., Сепоте Кезеагсй 1997; 7:606-614

Реагзоп апб Ыртап, 1988, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 85 (8) :2444-2448

Реазе 8. апз №ййат К.8., 1990, Ехр. Се11. Кез., 190:209-211

Регзю, Ь. е! а1. Сепе 187 9-18 (1997)

Регйп е! а1. (1994) Ат. I. Нит. Сепе! 55:777-787

Ре!егзоп е! а1., 199З, Ргос. №6. Асаб. 8ск И8А. 90:759З-7597

Р1е!и е! а1. Сепоте Кезеагсй 6:492-50З, 1996

Рйагб V. е! а1. I. 1ттипо1. Ме!йобз 205(2):177-190 (1997)

Ро!!ег е! а1. (1984) Ргос. №6. Асаб. 8ск И.8.А. 81 (22) :7161-7165

Рга! М. е! а1. I. Се11. 8с1. 111(Р!2):2З7-247 (1998)

Катипзеп е! а1., 1997, Е1есйорйогез1з, 18:588-598

Ке1б Ь.Н. е! а1. (1990) Ргос. №6. Асаб. 8ск И.8.А. 87:4299-4З0З

КоЬейзоп Е., 1987, ЕтЬгуо-бегКеб з!ет се11 йпез. 1п: Еб. КоЬейзоп Еб. Тега!осагстотаз апб етЬпошс з!ет се11з: а ргасйса1 арргоасй. 1КЬ Ргезз, 0х£огб, рр. 71

Кодизка М.А. е! а1. РМВ 91:969-97З, (1994)

Козз1 е! а1., Рйагтасо1. Тйег. 50:245-254, (1991)

Ко!й ЕА. е! а1. (1996) Шше Мебюте, 2(9):985-991

Коих е! а1. (1989) Ргос. №6. Асаб. 8ск И.8.А. 86:9079-908З

Киапо е! а1. (1990) Ргос. N011. Асаб. 8ск и.8.А. 87:6296-6З00

8атЬгоок I., Ргйзсй Е.Р., апб Т. Машайз. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А йаЬога!огу Мапиа1. 2еб. Со1б 8рппд НагЬог йаЬога!огу, Со1б 8рппд НагЬог, №\ν Уο^к

8атзоп М, е! а1. (1996) ^Шю, З82 (659З) :722-725

8ати1зк1 е! а1. (1989) I. νίΐΌ1. 6З:З822-З828

8аηсйеζ-Резсабο^ К. (1988) I. Сйп. МюгоЬю1. 26(10):19З4-19З8

8агкаг С. апб 8оттег 8.8. (1991) Вю1ес1тк|иез

8аиег В. е! а1. (1988) Ргос. №11. Асаб. 8ск и.8.А. 85:5166-5170

8амш Н. е! а1. АЖ! З4:26-З4 (1995)

8сйа1б Ό.Ε е! а1., Сепе!. Ер1бетю1., 1З:42З-450, 1996

8сйеб1 А. е! а1., 199За, ^Шю, З62:258-261

8сйеб1 е! а1., 199ЗЬ, N^1010 Ас1бз Кез., 21:478З-4787

8сйепа е! а1. 8с1епсе 270:467-470, 1995

8сйепа е! а1., 1996, Ргос №Й Асаб 8с1 И8А, 9З (20) : 10614-10619

8сйпе1бег е! а1. (1997) Абедшп: А 8ой^аге Рог Рори1а!юп Сепейсз Эа1а Апа1уз1з. Ипгуегзйу о£ Сеηеνа

- 58 005921

ЗсН\уаг1х апб ОауЕоГГ, ебк., 1978, Майтсек Гог Ое!есйп§ Э|к1апсе Ве1айопкЫрк: А!1ак оГ Рго!еш Зесщенсе апб 8!гис!иге, \акЫп§!оп: №Юопа1 Вюшебка1 ВекеагсЕ ЕоипбаДоп

Зс/акВ1 С. е! а1. (1995) Тгепбк М1сгоЫо1. 3(6):213-217

8Еау 1\ν. е! а1., 1991, ВюсЕет. ВюрЕук. Ас!а, 1072:1-7

ЗЕеГДе1б У.С. е! а1. (1991) Ргос. N811. Асаб. Зск и.З.А. 49:699-706

ЗЫхиуа е! а1. (1992) Ргос. №И. Асаб. δα. и.З.А. 89:8794-8797

8Еоетакег Ό.Ό., е! а1., №11 Сепе! 1996; 14 (4) :450-456

ЗЕи Ь. е! а1. РтЗ 90:7995-7999(1993)

8кегга А. е! а1. Зскпсе 240:1038-1040. (1988)

ЗтйЕ (1957) Апп. Нит. Сепе! 21:254-276

ЗтйЕе! а1. (1983) Мо1. Се11. Вю1. 3:2156-2165

Зокпо\\кк1 В.С., е! а1., Ргос №!1 Асаб 8οΐ ИЗА 1997; 94:1119-1123

8о\\'б11атт1 е! а1., Рго!ет Епдтеейпд 10:207,215 (1997)

8р1е1тапп δ. апб Е\уепк Ш.Р, Ат. 1. Нит. Сепе!, 62:450-458, 1998

8р1е1тапп δ. е! а1., Ат. 1. Нит. Сепе!., 52:506-516, 1993

8!етЬег§ КЬ. (1992) Тгепбк Сепе! 8:1-16

З!етЬегд КЬ. (1994) Матт. Сепоте. 5:397-404 δΙην^Γ Ь, В1осЕет1к!гу, 4!Е ебйюп, 1995

З!ибп1ска С.М. е! а1. Рго!ет Епдтееппд 7(6):805-814 (1994)

Зууапеп А.С., С1т СЫт Ас!а 1994; 226 (2) : 225-236

ЗхаЬо А. е! а1. Сигг 0рт З!гис! Вю1 5, 699-705 (1995)

Таскоп е! а1. (1996) №11иге Мебкте. 2(8):888-892

Тагутап В.Е. е! а1. №игоп 14(4):755-762(1995)

Те В1е1е е! а1. (1990) №пиге. 348:649-651

ТегЩШдег ΕΌ. апб 0й 1., НапбЬоок оГ Нитап СепеДс Ыпкаде, 1оЕп Норктк Итуегкйу Ргекк, Ьопбоп, 1994

ТЕотак К.В. е! а1. (1986) Се11. 44:419-428

ТЕотак К.В. е! а1. (1987) Се11. 51:503-512

ТЕотркоп е! а1., 1994, №1с1ек Ас1бк Век. 22 (2) :4673-4680

Тиг-Какра е! а1. (1986) Мо1. Се11. Вю1. 6:716-718

Туа§1 е! а1. (1998) №11иге Вю!есЕпо1о§у. 16:49-53

Игбеа М.З. (1988) №.1с1ек Ас1бк ВекеагсЕ. 11:4937-4957

Игбеа М.З. е! а1. (1991) №1с1еВ Ас1бк δутр. Зег. 24:197-200

УайикаФк, 1. е! а1. 1. С1т. Епбосйпо1. Ме!аЬ. 33:988-991 (1971)

Уа1абоп Р., е! а1., 1996, 1. Мо1. Вю1, 261:11-22

Уап бег Ьи§! е! а1. (1991) Сепе. 105:263-267

Уй Н. е! а1. РтЗ 89:11337-11341 (1992)

У1акак В. е! а1. (1983) Еиг. 1. ВюсЕет. 135:123-126

ШаЬ1ко е! а1. (1986) ОХА. 5 (4): 305-314 \а1кег е! а1. (1996) СИп. СЕет. 42:9-13 \апд е! а1., 1997, СЕгота!о§гарЫа, 44: 205-208 \\ек!еппк М.АЛ, 1995, Ргос. №!1. Асаб. Зск, 92:4021-4025 \\'кпе М.В. е! а1. (1992) Сепоткк. 12:301-306 \Ы!е М.В. е! а1. (1997) Сепоткк. 12:301-306 \опд е! а1. (1980) Сепе. 10:87-94 \ооб З.А. е! а1., 1993, Ргос. №!1. Асаб. Зсй ИЗА, 90:4582-4585 \и апб \и (1987) 1. Вю1. СЕет. 262:4429-4432 \и апб \и (1988) ВюсЕеткйу. 27:887-892 \и е! а1. (1989) Ргос. №Й. Асаб. δα. и.З.А. 86:2757

Уа§1 Т.е! а1. (1990) Ргос. №Й. Асаб. Зсй и.З.А. 87:9918-9922

Уооп Ό.Υ. е! а1. I. 1ттипо1. 160 (7):3170-3179 (1998)

2Еао е! а1., Ат. 1. Нит. Сепе!, 63:225-240, 1998

2Ееп§, Х.Х. е! а1. I. 1ттипо1. 154:5590-5600 (1995)

2Еи Ζ. е! а1. Сапсег Век. 58(15):3209-3214(1998)

Ζои Υ-В. е! а1. (1994) Сигг. Вю1. 4:1099-1103

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из

   a) полинуклеотида, кодирующего полипептид РАРАР, содержащий аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ N0: 2;

   b) полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность ЗЕО ΙΌ N0: 1, 3 или их ком

   - 59 005921 племент;

   с) полинуклеотида, по меньшей мере на 95% идентичного полинуклеотиду, указанному в (Ь); и

   б) полинуклеотида, представляющего собой вариант или фрагмент полинуклеотидных последовательностей, указанных в (а)-(с), и состоящего по меньшей мере из 50 нуклеотидов.
2. 2. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид по п.1.
3. 3. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный вектор по п.2.
4. 4. Животное или млекопитающее-хозяин, отличное от человека и содержащее рекомбинантный вектор по п.2.
5. 5. Полинуклеотид по п.1, который дополнительно включает метку, причем указанный полинуклеотид связан с твердой поверхностью.
6. 6. Антисмысловой инструмент, ингибирующий экспрессию гена РАРАР.
7. 7. Полипептид РАРАР, где аминокислотная последовательность

   a) кодируется любым из полинуклеотидов по п.1 или

   b) по меньшей мере на 70% идентична аминокислотной последовательности 8ΕΟ ΙΌ N0: 2.
8. 8. Способ продуцирования полипептида РАРАР, предусматривающий

   a) получение клетки-хозяина, содержащей рекомбинантный вектор по п.2;

   b) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, благоприятствующих экспрессии указанного полипептида РАРАР;

   c) выделение полипептида РАРАР, продуцируемого указанной клеткой-хозяином.
9. 9. Антитело или антиген-связывающий фрагмент антитела, которые селективно связываются с полипептидом по п.7.
10. 10. Антитело по п.9, которое является химерным, гуманизированным или человеческим антителом.
11. 11. Антитело по п.9 или 10, которое является моноспецифичным, биспецифичным, триспецифичным или мультиспецифичным антителом.
12. 12. Антитело по любому из пп.9, 10 или 11, которое является одноцепочечным антителом.
13. 13. Способ специфической детекции присутствия полипептида РАРАР в биологическом образце, предусматривающий:

    a) контактирование указанного биологического образца с антителом по п.9, 10, 11 или 12 и

    b) детекцию комплекса антиген-антитело, образованного указанным антителом и указанным полипептидом.
14. 14. Способ диагностики психического нарушения, в частности, шизофрении или биполярного расстройства, или риска его развития у субъекта, предусматривающий определение активности полипептида РАРАР по п.7 и/или экспрессии мРНК РАРАР в плазме, жидкостях организма или тканях организма.
15. 15. Трансгенное животное, отличное от человека и содержащее полинуклеотид по п.1, вектор по п.2 или клетку-хозяина по п.3.
16. 16. Способ скрининга веществ, взаимодействующих с полипептидом РАРАР, предусматривающий

    a) получение полипептида по п.7;

    b) контактирование указанного полипептида с указанным веществом-кандидатом и

    c) определение образования комплекса между указанным полипептидом и указанным веществомкандидатом.
17. 17. Способ скрининга веществ, модулирующих экспрессию полинуклеотида, кодирующего РАРАР, предусматривающий

    a) культивирование прокариотических или эукариотических клеток, трансфицированных полинуклеотидом по п.1;

    b) контактирование указанной культивированной клетки с указанной молекулой-кандидатом и

    c) детекцию экспрессии указанного белка РАРАР в присутствии указанной молекулы-кандидата.
18. 18. Применение антитела по п.9, 10, 11 или 12 или вещества, определяемого в соответствии с любым из способов по п.16 или 17, для приготовления лекарственного препарата для лечения психического нарушения, в частности шизофрении или биполярного расстройства.