EA006367B1 - Связанные с шизофренией ген и белок потенциалзависимого воротного ионного канала - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к геномной ДНК, кДНК и полипептидным последовательностям CanIon нового белка потенциалзависимого воротного ионного канала. Настоящее изобретение относится также к двуаллельным маркерам CanIon-гена. CanIon-ген может использоваться в качестве биологической мишени для лечения и диагностики шизофрении, биполярного расстройства и других заболеваний и состояний.

Description

Настоящее изобретение относится к гену и белку потенциалзависимого воротного ионного канала и к их роли в заболевании. Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептид Сап1оп, а также к регуляторным областям, локализованным на 5'- и З'-конце указанной кодирующей области. Настоящее изобретение относится также к полипептидам, кодируемым Сап1оп-геном. В настоящем изобретении разработаны способы скринирования модуляторов, т.е. антагонистов Сап1опканала, и способы использования таких модуляторов для лечения или предупреждения различных нарушений или состояний. В настоящем изобретении рассматриваются также антитела, специфичные против таких полипептидов, которые пригодны в качестве диагностических реагентов. Кроме того, настоящее изобретение включает двуаллельные маркеры Сап1оп-гена, пригодные для генетического анализа.

Уровень техники

Достижения в техническом оснащении лабораторий, занятых фундаментальными и клиническими исследованиями, в огромной мере способствовало более глубокому изучению влияния головного мозга и нервной системы на здоровье и болезни. Выдвинут ряд нейробиологических и фармакологических гипотез в отношении нейрохимических и генетических механизмов, имеющих место при нарушениях центральной нервной системы (ЦНС), включающих психические нарушения и нейродегенеративные заболевания. Однако нарушения ЦНС характеризуются сложным и недостаточным пониманием этиологии, а также симптомы, которые перекрываются, плохо описаны, и трудны для измерения. В итоге, будущие схемы лечения и усилия по созданию лекарств нуждаются в усовершенствовании и сосредоточении внимания на мультигенных причинах, а это требует проведения новых демографических исследований заболеваний и получения более точной диагностической и прогностической информации о пациентах, страдающих нарушениями ЦНС.

Нарушения ЦНС охватывают широкий ряд расстройств и соответствующую широкую группу генетических факторов. Примеры расстройств ЦНС включают нейродегенеративные нарушения, психотические расстройства, расстройства в эмоциональном состоянии, аутизм, зависимость от химических веществ и алкоголизм, нарушения болевых ощущений, эпилепсию, задержку психического развития и другие психические заболевания, включая когнитивную функцию, страх, нарушение функции принятия пищи, нарушение функции мотивации и аномалии характера. Нарушения можно определить, используя классификацию Э|адпо5б апб §1аб8бса1 Мапиа1 о£ Меп1а1 Эбогбеп, ίοιιΠίι ебйюп (Диагностический и Статистический Справочник Психических Нарушений) (Ό8Μ-ΐν).

Даже при рассмотрении всего лишь небольшой подгруппы нарушений ЦНС очевидно, что из-за недостатка адекватного лечения и для осмысления молекулярной основы нарушений при шизофрении и биполярном расстройстве, нужны новые цели для терапевтической изобретательности и усовершенствования способов лечения. Что касается шизофрении и биполярного расстройства, все ныне известные молекулы, используемые для их лечения, обладают побочными эффектами и действуют только против симптомов данного заболевания. Существует, таким образом, очень большая потребность в новых молекулах, не связанных с побочными эффектами и направленных против мишеней, которые вовлечены в причинные механизмы шизофрении и биполярного расстройства. Поэтому инструментальные средства, облегчающие открытие и характеристику данных целей, необходимы и полезны.

Потенциалзависимые воротные ионные каналы

Потенциалзависимые воротные ионные каналы являются частью большого семейства макромолекул, функции которых включают контроль и поддержание электрического потенциала клеточных мембран, выделение и трансдукцию сигнала. Эти белки-каналы участвуют в контроле высвобождения нейромедиаторов из нейронов и играют существенную роль в регуляции разнообразных клеточных функций, включая мембранную возбудимость, мышечное сокращение и синаптическую передачу. Основные альфа-субъединицы №1'-каналов и альфа-1-субъединицы Са⁺-каналов состоят, приблизительно, из 2000 аминокислот и составляют путь протекания ионов. В биохимическом анализе обнаружено, что физиологически активный ионный канал составлен из нескольких разных субъединиц. Существует две вспомогательные субъединицы, бета-1 - и бета-2-субъединица, которые очищаются совместно с альфасубъединицей Νι ' -каналов. Что касается Са⁺-каналов, для них идентифицированы дополнительные субъединицы (альфа-2, бета, гамма и сигма) с модуляторным действием. Субъединицы альфа-2 и бета, похоже, усиливают функциональную активность альфа-1-субъединицы Са⁺-каналов. Альфа-субъединицы К⁺каналов ассоциируются с бета-субъединицами в соотношении 1:1, что приводит к усложнению К⁺каналов, проявляющих (альфа)₄(бета)₄ стехиометрию (Тег1аи и соавт., баШгчбхещсйаПеп 85:437-444 (1998). Базовая структура и примеры кальциевых и натриевых ионных каналов рассматриваются, кроме того, например, у ^1Шат8, и соавт., 8с1епсе 257:389-395 (1992); Моп. и соавт., баШге 350:398-402 (1991); и Косб и соавт., 1. Вю1. Сйет. 265 (29):17786-17791 (1990). Нуклеотидная последовательность Са⁺- и Νι ' -ионного канала крысы обладает высоким уровнем гомологии с последовательностью Сап1оп-канала, впоследствии описанного у Ьее и соавт., БЕВ8 Ье11. 445:231-236 (1999).

Альфа-субъединица обладает последовательностью, характерной для всех потенциал-зависимых катионных каналов, и использует один и тот же структурный мотив, включающий пучок из 6 спиралей в доменах, предположительно пронизывающих мембрану. И в натриевых, и в кальциевых каналах данный мотив повторяется в указанной последовательности 4 раза, образуя пучок из 24 спиралей. Данные ами

- 1 006367 нокислотные последовательности высококонсервативны у видов (например, человека и ОгокорШа), а также у разных ионных каналов.

Существует несколько тканеспецифичных фармакологически и электрофизиологически различимых изоформ кальциевых каналов, кодируемых отдельными генами мультигенного семейства. В скелетной мышце каждая группа из плотно связанных альфа-, бета-и гамма-субъединиц ассоциирована с 4 другими с образованием пятичленной макромолекулы. Например, альфа-1-субъединицы кальциевого канала нейрона являются продуктом по меньшей мере семи разных генов, именуемых от А до Н. В иммуноцитохимических исследованиях показано разное распределение альфа-1-субъединиц кальциевого канала. Альфа-1А и альфа-1В экспрессируются главным образом в дендритах и пресинаптических окончаниях, и альфа-1А обычно концентрируется в большем числе нервных окончаний, в альфа-1В. В нервномышечном соединении крысы и человека альфа-1А локализуется пресинаптически, тогда как альфа-1В, так и альфа-1А представлены в ассоциированных с аксоном швановских клетках. Альфа-1Е локализуется главным образом в клеточных телах, в некоторых случаях - в проксимальных дендритах, а также в дистальных ответвлениях клеток Пуркинье. Альфа-1С и альфа-10 локализуются в клеточных телах и в проксимальных дендритах центральных нейронов.

Нативные кальциевые каналы классифицируются на основе их фармакологических и/или электрофизиологических свойств.

Классификация потенциалзависимых кальциевых каналов разделяет их на каналы, активируемые высоким потенциалом (НУА), включающие типы Ь, Ν, Р и О; промежуточным (1УА, В-тип); и активируемые низким потенциалом (ЬУА, Т-тип). (Могепа и соавт., АппаЕ ΝΥ Асаб. 8сг 102-117 (1999).

Основные субъединицы (альфа-1 ) относятся к генному семейству, члены которого могут сами образовывать функциональные каналы при экспрессии в гетерологичных экспрессионных системах. (2йапд и соавт., №игорйагтасо1оду 32(11):1075-1088 (1993), включенный в данное описание путем ссылки). В нативных клетках альфа-1 -субъединицы экспрессируются в виде мультисубъединичных комплексов вместе с вспомогательными субъединицами, которые модифицируют функциональные характеристики альфа-1-субъединицы. Во многих случаях коэкспрессия вспомогательных субъединиц влияет на биофизические свойства данных каналов. Бета-субъединицы, в частности, имеют тенденцию к существенному влиянию на альфа-1 -субъединицы; было показано, что бета-субъединицы изменяют активационные свойства, стационарную инактивацию, кинетику инактивации и максимальное протекание тока.

Большое молекулярное разнообразие каналов получают благодаря существованию множественных форм альфа-1 -субъединиц. Например, было показано, что по-разному сплайсированные формы кальциевых каналов и экспрессируются по-разному и обладают разной чувствительностью к фосфорилированию серин-треониновыми киназами. (Не11 и соавт., Аппак ΝΥ Асаб. 8сг 747:282-293 (1994). Установлено, что мутации генов ионных каналов вовлечены в целый ряд заболеваний, включая некоторые заболевания центральной нервной системы. Примеры мутаций ионных каналов, вызывающих ряд эпизодических нарушений, включая периодический паралич, эпизодическую атаксию, гемикранию, синдром удлинения от интервала ЦТ, пароксизмальную дискинезию, рассматриваются в обзоре Ви1тап и соавт., Нит. Мо1. Сеп. 6(10):1679-1685 (1997). Некоторые нарушения, связанные с мутацией Са⁺-канала, представлены, например, в табл. А (из Могепо, выше).

Таблица А

Заболевание	Субъединица кальциевого канала	Модель
Семейная гемиплегическая мигрень	Альфа-1А	Человек
Эпизодическая атаксия, тип 2	Альфа-1А	Человек
Спинальноцеребеллярная атаксия, тип 6	Альфа-1А	Человек
Фенотипы пьяного и беспомощного	Альфа-1А	Мышь
Синдром Ламберт- Итона	Альфа-1А, а-1В	Человек
Гипокалиемический п ери оди чес кий паралич	Альфа-13	Человек
Мышиная дисплазия	Альфа-13	Мышь
Диабетические жировые фенотипы Цукер	а-1С; а-Ю	Крыса
Летаргический фенотип	Бета-4	Мышь
Злокачественна гипотермия	Альфа-2/δ	Человек
Сзерцание	Гамма	Мышь

- 2 006367

Модуляторы кальциевых и натриевых каналов обычно используются для лечения различных заболеваний и состояний. Например, было показано, что блокаторы кальциевого и/или натриевого канала пригодны для лечения или предупреждения одного или нескольких симптомов, связанных с различными заболеваниями или состояниями, такими как различные заболевания и состояния сердца (например, стенокардия, аритмия), гипертензия, мигрени, неврологические эффекты нарушений мозгового кровообращения, мания, нейролептически индуцированная поздняя дискинезия стенок миокарда, биполярное расстройство, боль, эпилепсия и другие.

Выло показано, что между разными ионными каналами нервной системы имеются существенные функциональные различия. Кроме того, существенные различия имеются между разными мутациями одном и том же гене ионного канала, а также между вариантами сплайсинга одного и того же ионного канала. Таким образом, несмотря на причастность ионных каналов к заболеваниям ЦНС, то, что касается конкретного заболевания, трудно определить какой ионный канал может представлять собой эффективную мишень для терапевтического вмешательства. Первоочередная задача состоит в том, чтобы предоставить ген ионного канала, причастный к шизофрении, биполярному расстройству или заболеваниям, связанным с ними.

Настоящее изобретение предназначается для решения этих и других задач.

Краткое изложение существа изобретения

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, включающих геномную последовательность нового гена человека, который кодирует белок потенциал-зависимого воротного ионного канала, названный Сап1оп. Геномная последовательность Сап1оп включает также регуляторную последовательность, расположенную слева (5'-конец) и справа (З'-конец) от транскрибируемого участка указанного гена, причем такие регуляторные последовательности являются также частью настоящего изобретения.

В настоящем изобретении обеспечивается также полная кДНК-последовательность, кодирующая Сап1оп-белок, а также соответствующий продукт трансляции.

Олигонуклеотидные зонды или праймеры, специфически гибридизующиеся с геномной последовательностью Сап1оп или с кДНК-последовательностью Сап1оп, как и способы амплификации ДНК и способы детекции с использованием указанных праймеров и зондов, также являются частью настоящего изобретения.

Дополнительный объект настоящего изобретения состоит из рекомбинантных векторов, включающих любую из описанных выше последовательностей нуклеиновых кислот и, в частности, рекомбинантных векторов, включающих регуляторную последовательность Сап1оп или последовательность, кодирующую Сап1оп-белок, а также клеток-хозяев и трансгенных животных, исключая человека, включающих указанные последовательности нуклеиновых кислот или рекомбинантные векторы.

Настоящее изобретение рассматривает также двуаллельные маркеры Сап1оп-гена и их использование.

Наконец, настоящее изобретение касается способов скринирования веществ или молекул, которые модулируют экспрессию или активность Сап1оп, а также способов скринирования веществ или молекул, которые взаимодействуют с Сап1оп-полипептидом. Разработаны также способы использования веществ, идентифицированных для данных способов. Например, разработаны способы лечения или предупреждения заболеваний или состояний, включая шизофрению или биполярное расстройство, с использованием антагонистов Сап1оп-канала.

В соответствии с этим, первой целью настоящего изобретения является обеспечение выделенного, выделенного очисткой или рекомбинантного полинуклеотида, включающего любую из нуклеотидных последовательностей, представленных в виде 8ЕО ΙΌ №№ 1-4 или 6, или последовательности, комплементарной любой из данных последовательностей.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение выделенного, выделенного очисткой или рекомбинантного полинуклеотида, включающего непрерывный участок 8ЕО ΙΌ Ыо 4, по меньшей мере из 50 нуклеотидов, причем указанный полинуклеотид кодирует биологически активный Сап1опполипептид.

Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение выделенного, выделенного очисткой или рекомбинантного полинуклеотида, который кодирует Сап1оп-полипептид человека, включающий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Ыо 5, или его биологически активный фрагмент.

В первом варианте осуществления настоящего изобретения любой из описанных в данном описании полинуклеотидов присоединяется к твердому носителю. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данный полинуклеотид включает метку.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание набора полинуклеотидов, включающего по меньшей мере один из описанных в данном описании полинуклеотидов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения данный набор является адресным.

Следующей целью настоящего изобретения является создание рекомбинантного вектора, включающего любой из описанных в данном описании полинуклеотидов, функционально присоединенный к промотору.

- 3 006367

Еще одной целью настоящего изобретения является создание полинуклеотида, присутствие которого в клетке обуславливает изменение в уровне экспрессии Сап1оп-гена. В одном из вариантов настоящего изобретения данный полинуклеотид встраивают в Сап1оп-ген или в геномную область Сап1оп. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения данный полинуклеотид встраивают в промотор гена Сап1оп. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения данный полинуклеотид встраивают с помощью гомологичной рекомбинации, например, путем замены одного или нескольких элементов эндогенного промотора Сап1оп или энхансерной области.

Следующей целью настоящего изобретения является создание клетки-хозяина или не принадлежащего человеческому роду животного-хозяина, включающих любой из описанных в данном описании рекомбинантных векторов или полинуклеотидов.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание клетки-хозяина млекопитающего или млекопитающего-хозяина, не принадлежащего человеческому роду, включающих Сап1оп-ген, разрушенный гомологичной рекомбинацией с помощью нокаутного вектора. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения данная клетка-хозяин включает любой из описанных в данном описании полинуклеотидов.

Следующей целью настоящего изобретения является создание выделенного, выделенного очисткой или рекомбинантного полипептида, включающего аминокислотную последовательность, представленную в виде 8ЕО ГО Ыо 5, или его биологически активный фрагмент.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа получения полипептида, включающего а) создание популяции клеток, включающих полинуклеотид, кодирующий полипептид по п. 13, функционально присоединенный к промотору; Ь) культивирование указанной популяции клеток в условиях, способствующих получению указанного полипептида в указанных клетках; и с) выделение очисткой указанного полипептида из указанной популяции клеток.

Следующей целью настоящего изобретения является разработка способа связывания антитела к Сап1оп с Сап1оп-полипептидом, включающего контактирование указанного антитела с любым из описанных в данном описании Сап1оп-полипептидов в условиях, при которых данное антитело может специфически связываться с указанным полипептидом. Еще одной целью настоящего изобретения является также получение антител или их иммунологически активных фрагментов, которые специфически распознают Сап1оп-белок или эпитоп.

Следующей целью настоящего изобретения является разработка способа обнаружения экспрессии Сап1оп-гена в клетке, причем указанный способ включает следующие стадии: а) контактирование указанной клетки или экстракта из указанной клетки либо с: 1) полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с любым из описанных в данном описании Сап1оп-полинуклеотидов; или и) полипептидом, который специфически связывается с любым из описанных в данном описании Сап1опполипептидов; и Ь) выявление наличия или отсутствия гибридизации между указанным полинуклеотидом и видами РНК в указанной клетке или в экстракте, или наличие или отсутствие связывания указанного полипептида с белком в указанной клетке или в указанном экстракте; где выявление наличия указанной гибридизации или указанного связывания свидетельствует о том, что указанный Сап1оп-ген экспрессируется в указанной клетке. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный полинуклеотид представляет собой праймер, а указанная гибридизация выявляется путем обнаружения наличия продукта амплификации, включающего последовательность указанного праймера. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный полипептид представляет собой антитело, например, антитело к Сап1оп.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа идентификации кандидатного модулятора Сап1оп-полипептида, причем указанный способ включает: а) контактирование любого из описанных в данном описании Сап1оп-полипептидов с тест-соединением; и Ь) определения действительно ли указанное соединение специфически связывается с указанным полипептидом; при этом обнаружение указанного соединения, специфически связанного с указанным полипептидом, свидетельствует о том, что указанное соединение является модулятором-кандидатом указанного Сап1оп-полипептида.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения данный способ, кроме того, включает тестирование биологической активности указанного Сап1оп-полипептида в присутствии указанного модулятора-кандидата, где изменение биологической активности указанного Сап1оп-полипептида в присутствии указанного модулятора-кандидата, по сравнению с биологической активностью в отсутствие указанного модулятора-кандидата, свидетельствует о том, что данный модулятор-кандидат представляет собой модулятор указанного Сап1оп-полипептида.

Следующей целью настоящего изобретения является создание способа идентификации модулятора Сап1оп-полипептида, причем указанный способ включает: а) контактирование любого из описанных в данном описании Сап1оп-полипептидов с тест-соединением; и Ь) обнаружение биологической активности указанного полипептида в присутствии и отсутствии указанного соединения; где выявление разницы в указанной активности в присутствии указанного соединения, в сравнении с активностью в отсутствие указанного соединения, свидетельствует о том, что указанное соединение является модулятором указанного Сап1оп-полипептида.

- 4 006367

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения представлены способы, где указанный полипептид присутствует в клетке или в клеточной мембране, а указанная биологическая активность включает активность потенциал-зависимого воротного ионного канала.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа получения фармацевтической композиции, включающего а) идентификацию модулятора Сап1оп-полипептида с использованием любого из описанных в данном описании способов; и Ь) объединение указанного модулятора с физиологически приемлемым носителем. Разработаны также способы использования фармацевтических композиций.

Разработано также использование любого из описанных в данном описании Сап1оп-модуляторов, полипептидов, полинуклеотидов, или антител для получения лекарственного средства, например, для лечения организма человека или для лечения любого из описанных в данном описании заболеваний или состояний.

Созданы также наборы для использования и детектирования, т νίίτο или т νίνο, представленных Сап1оп-полинуклеотидов и полипептидов.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображена диаграмма, представляющая ВАС-карту области хромосомы 13д. содержащей Сап1оп-ген.

На фиг. 2 изображен блок диаграмм типовой компьютерной системы.

На фиг. 3 изображена структурная схема, иллюстрирующая один из вариантов осуществления процесса 200 по сравнению новой нуклеотидной или белковой последовательности с базой данных последовательностей с целью установления уровней гомологии между новой последовательностью и соответствующей последовательностью базы данных.

На фиг. 4 изображена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов осуществления процесса 250 в компьютере, чтобы определить действительно ли две последовательности гомологичны.

На фиг. 5 изображена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов процесса-идентификатора 300 для выявления в последовательности наличия характерной особенности.

Краткое описание последовательностей, представленных в списке последовательностей

8ЕЦ ГО Ыо 1 содержит геномную последовательность Сап1оп, включающую 5'-регуляторную область (левая нетранскрибируемая область) и экзоны 1-7.

8ЕЦ ГО Ыо 2 содержит геномную последовательность Сап1оп, включающую экзоны 8-27.

8ЕЦ ГО Ыо 3 содержит геномную последовательность Сап1оп, включающую экзоны 28-44, а также З'-регуляторную область (правая нетранскрибируемая область).

8ЕЦ ГО Ыо 4 содержит кДНК-последовательность Сап1оп.

8ЕЦ ГО Ыо 5 содержит аминокислотную последовательность, кодируемую кДНК 8ЕЦ ГО Ыо 4.

8ЕЦ ГО Ыо 6 содержит нуклеотидную последовательность ампликона, который включает двуаллельный маркер А18.

8ЕЦ ГО Ыо 7 содержит праймер, включающий дополнительную 5'-последовательность РИ, ниже описанную в примере 2.

8ЕЦ ГО Ыо 8 содержит праймер, содержащий дополнительную 5'-последовательность ВР, ниже описанную в примере 2.

В соответствии с правилами, относящимися к спискам последовательностей, в данном списке последовательностей используются коды, которые указывают расположение двуаллельных маркеров в данных последовательностях и которые идентифицируют каждый из аллелей, представленный по полиморфному основанию. Код г для данной последовательности свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой гуанин, а другой аллель представляет собой аденин. Код у для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой тимин, тогда как другой аллель представляет собой цитозин. Код т для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой аденин, а другой аллель представляет собой цитозин. Код к для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой гуанин, а другой аллель представляет собой тимин. Код х для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой гуанин, а другой аллель представляет собой цитозин. Код ν для данных последовательностей свидетельствует о том, что один аллель по данному полиморфному основанию представляет собой аденин, а другой аллель представляет собой тимин. Нуклеотидный код исходного аллеля для каждого двуаллельного маркера следующий:

Двуаллельный маркер Исходный аллель

5-124-273 А (например)

В некоторых случаях полиморфные основания двуаллельных маркеров изменяют идентичность аминокислот в кодируемом полипептиде. Это указано в прилагаемом списке последовательностей с использованием элемента УАВ1АЫТ, размещения Хаа в положении данной полиморфной аминокислоты и определения Хаа в виде двух альтернативных аминокислот. Например, если один аллель двуаллельного

- 5 006367 маркера представляет собой кодон САС, который кодирует гистидин, а другой аллель двуаллельного маркера представляет собой САА, который кодирует глутамин, то Список Последовательностей для кодируемого полипептида будет содержать Хаа в положении полиморфной аминокислоты. В данном случае Хаа должен определяться в виде гистидина или глутамина.

В других случаях Хаа может обозначать аминокислоту, идентичность которой неизвестна, вследствие неопределенности нуклеотидной последовательности. В данном случае использование элемента υΝδυΚΕ размещает Хаа в положение неизвестной аминокислоты и значение Хаа считается любым из 20 аминокислот или ограниченным числом аминокислот, подсказанных генетическим кодом.

Подробное описание изобретения

Ассоциация шизофрении и биполярного расстройства в семьях, доказанная при изучении близнецов и усыновления, хотя изменчивость по всему миру отсутствует, свидетельствует о том, что шизофрения и биполярное расстройство в первую очередь представляют собой генетические состояния, хотя факторы риска окружающей среды также до некоторой степени рассматриваются в качестве необходимых, достаточных или воздействующих друг на друга причин. Например, шизофрения встречается у 1% от общей численности населения. Но при наличии шизофрении у одного из дедушек или бабушек риск возникновения данной болезни возрастает до примерно 3%; если же шизофренией страдает один из родителей, этот риск возрастает до примерно 10%. Если оба родителя больны шизофренией, тогда риск возрастает, приблизительно, до 40%.

Идентификация генов, связанных с характерным признаком, таким как специфическое нарушение центральной нервной системы, подобное шизофрении, может быть осуществлена с помощью двух основных подходов, используемых в настоящее время для генетического картирования: анализа сцепления и ассоциативные исследования (исследование сообществ). Анализ сцепления требует изучения семей, в которых заболеванием поражены многие их члены, и в настоящее время пригоден для выявления моно- и олигогенных наследственных признаков. И наоборот, в ассоциативных исследованиях анализируют частоту маркерных аллелей признака (Т+) у несвязанных родством индивидов, сравниваемых с негативным по данному признаку контролем (Т-) и обычно используемых для выявления полигенного наследования.

Генетическая связь или сцепление базируется на анализе, в котором две соседствующие последовательности на хромосоме содержат, по меньшей мере, рекомбинации в результате кроссинговера во время мейоза. Чтобы осуществить это хромосомные маркеры, подобные микросателлитным маркерам, тщательно локализуют в данном геноме. В анализе генетического сцепления рассчитывают вероятность рекомбинаций в данном гене-мишени с использованием хромосомных маркеров, в соответствии с генеалогическим древом, передачей данного заболевания и передачей данных маркеров. Таким образом, если отдельный аллель данного маркера передается вместе с заболеванием более часто, а не случайно (уровень рекомбинации находится между 0 и 0,5), то можно сделать вывод о том, что ген-мишень, о котором идет речь, обнаруживается поблизости от данного маркера. При использовании этого метода можно локализовать несколько генов, демонстрирующих генетическую предрасположенность семейных злокачественных опухолей. Для того чтобы иметь возможность включиться в изучение генетического сцепления, семьи, пораженные наследственной формой данного заболевания, должны удовлетворять критерию информативности: несколько человек (конституциональная ДНК которых доступна) на поколение, должны быть поражены данным заболеванием, и в лучшем случае, обладать большим числом сибсов.

Результаты исследований по сцеплению подтверждают гипотезу о том, что хромосома 13, повидимому, содержит локус предрасположенности к шизофрении на 13с.|32 (В1ошп и соавт., 1998, ΝαШге ОепеДск, 20:70-73; Ып Μν и соавт., Нит. Оепе!., 99(3) (1997):417-420; Вг/и51о\\тс/ и соавт., Ат. I. Нит. Сепе! 65:1096-1103 (1999). Однако, несмотря на то, что анализ сцепления представляет собой мощный метод выявления генов и связанного с ними признака, решение часто невозможно без уровня данной мегабазы данных, а соответствующие исследования часто нуждаются в уточнении анализа участков, первоначально идентифицированных с помощью данного способа.

ВАС-контиг, покрывающий предполагаемую геномную область локуса хромосомы 13ς-31-ς33. конструированы с использованием общедоступных 8Т8, расположенных в данной области хромосомного локуса 13ς31-ς33. для скринирования запатентованной отдельной ВАС-библиотеки, эквивалентной 7геномам. По данным материалам получали новые 8Т8, позволяющие конструировать компактную физическую карту данной области. Определяли размер всех ВАС и картировали с помощью хромосомной гибридизации ш 5Ш.1 для верификации. Идентифицировали минимальную группу ВАС и полностью секвенировали по нескольким контигам, что приводило к получению конечного контига, превышающего 4 млн.п.н. Создание данной карты позволяет идентифицировать Сап1оп-ген, который локализуется в геномной области, демонстрирующей существенное сцепление с шизофренией.

Аминокислотная последовательность Сап1оп характерна для САСНАNNΕ^, 7-элементного фингерпринта, который характеризует альфа-1-субъединицы кальциевых каналов (РеГ. ΡΚΌ0167, ВЬОСК+база данных). Данный фингерпринт получали, исходя из первичного выравнивания 6 последовательностей: мотивы извлекали из консервативных областей петли, поддающихся различению между этими и другими катионными каналами; мотивы 1 и 2 кодируют последовательности между трансмембранными сегментами 4 и 5, а также 5 и 6 (первый внутренний повтор); мотив 3 соответствует последовательности между

- 6 006367 сегментом 6 повтора 1 и сегментом 1 повтора 2; мотив 4 кодирует последовательность между сегментами 5 и 6 повтора 2; мотив 5 соответствует последовательности между сегментом 6 повтора 3 и сегментом 1 повтора 4; а мотивы 6 и 7 кодируют последовательности между сегментами 4 и 5, а также между сегментами 5 и 6 повтора 4.

На фиг. 1 представлены ВАС-контиги, покрывающие представляющую интерес область хромосомы 13, которая включает Сап1оп-ген, и показано геномное расположение Сап1оп-гена относительно генетических маркеров, демонстрирующих наивысшую значимость в исследованиях по сцеплению. В частности, В1ошп и соавт. (1998) осуществили широкое исследование генома на предмет выявления локусов предрасположенности к шизофрении, в 54 комплексных родословных, с использованием 452 микросателлитных маркеров. Наиболее значимое сцепление между шизофренией в семьях обнаруживалось на хромосоме 13с.|32 вблизи маркера Ό138174. ΒΓζι.ΐ5ΐο\νίοζ и соавт. (1999) дали оценку микросателлитным маркерам, охватывающим хромосомы 8 и 13 в 21 обширных Канадских семьях. Маркеры для хромосомной области 13ц дают позитивные оценки ΕΟΌ в каждой используемой аналитической модели: аутосомно-доминантной и аутосомно-рецессивной, с узким или широким определением шизофрении. Максимальные трехточечные ΕΘΌ-оценки были получены с маркером Ό138793 в рецессивно-широкой модели: 3,92 в рекомбинантной фракции (θ) 0,1 при гомогенности и 4,42 с α=0,65 и θ=θ при гетерогенности. На указанной фиг. 1 Сап1оп-ген локализован частично в контиге, помеченном 'Ведюп Е' и частично в контиге, помеченном С0001А10. Данный Сап1оп-ген фланкирован двумя маркерами, демонстрирующими наивысшую значимость в исследованиях по сцеплению. Маркер Ό138174 также находится в контиге С0001А10, а маркер Ό138793 локализован, приблизительно 3,5 млн.п.н. центромернее к Сап1оп-гену.

Существует очень большая потребность в идентификации генов, связанных с шизофренией, биполярным расстройством и другими ЦНС, а также сердечно-сосудистыми заболеваниями и состояниями. Существует также необходимость в идентификации новых ионных каналов, связанных с заболеваниями. Такие гены и белки могут открыть новые перспективы в лечении шизофрении, биполярного расстройства или иных ЦНС-состояний, а также иных состояний, таких как, например, состояния сердца и гипертензия, и позволяют кроме того изучать и характеризовать Сап1оп-ген и связанные с ним биологические пути. Познание таких генов и связанных с ними биологических путей, вовлеченных в данные заболевания и состояния, позволит исследователям понять этиологию, например, шизофрении и биполярного расстройства, и приведет к разработке лекарственных средств и лекарственных препаратов, нацеленных против причины данных заболеваний. Например, соединения, которые блокируют Сап1оп-каналы, могут использоваться для лечения любых заболеваний и состояний, предпочтительно шизофрении или биполярного расстройства, и включающих также болевые нарушения, эпилепсию и различные сердечнососудистые нарушения, такие как сердечная аритмия, стенокардия и гипертензия. Существует также большая необходимость в новых способах выявления предрасположенности к шизофрении, биполярному расстройству и иным состояниям, а также для предотвращения или для наблюдения за развитием любого из этих заболеваний. Диагностические средства могли бы также оказаться в высшей степени полезными. В самом деле, в качестве примера, ранняя идентификация у людей с риском развития шизофрении сделает возможным раннее и/или профилактическое осуществление лечения. Кроме того, точные оценки эффективности лекарственного средства, а также толерантности пациента, даст возможность врачуклиницисту улучшить соотношение между выгодой и риском, что касается схем лечения шизофрении и биполярного расстройства.

В настоящем изобретении рассматриваются полинуклеотиды и полипептиды, относящиеся к Сап1оп-гену. Олигонуклеотидные зонды и праймеры, специфически гибридизующиеся с геномной или кДНК-последовательностью Сап1оп, также являются частью настоящего изобретения. Еще одна цель настоящего изобретения включает создание рекомбинантных векторов, включающих любую из последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в настоящем изобретении, и, в частности, рекомбинантных векторов, включающих регуляторную область Сап1оп-последовательности или последовательность, кодирующую Сап1оп-белок, а также клетки-хозяина, включающие указанные последовательности нуклеиновых кислот или рекомбинантные векторы. Настоящее изобретение включает также способы скринирования молекул, способных модулировать экспрессию или активность Сап1оп-гена или белка, а также способы использования таких молекул для лечения или предупреждения шизофрении, биполярного расстройства или любого заболевания из числа других заболеваний или состояний. В настоящем изобретении рассматриваются также антитела, специфически нацеленные против полипептидов, которые пригодны в качестве диагностических реагентов.

В настоящем изобретении рассматриваются также двуаллельные маркеры, связанные с Сап1оп, и их использование в генетическом анализе, включая изучение сцепления в семьях, изучение сцепление при нарушении равновесия в популяциях и ассоциативные исследования в популяциях больных и здоровых. Важный аспект настоящего изобретения заключается в том, что двуаллельные маркеры позволяют осуществлять ассоциативные исследования для идентификации роли генов, вовлеченных в контроль сложных признаков.

Определения

Перед более подробным описанием настоящего изобретения формулируются следующие ниже оп

- 7 006367 ределения, которые иллюстрируют и задают значение и рамки терминов, используемых для описания представленного в данном описании изобретения.

Используемый в данном описании термин Сап1оп-ген включает в себя геномные, мРНК и кДНК последовательности, кодирующие Сап1оп-белок, в том числе и нетранслируемые регуляторные области геномной ДНК.

Используемый в данном описании термин гетерологичный белок предназначен для обозначения любого белка или полипептида, отличающегося от Сап1оп-белка. Например, гетерологичный белок может представлять собой соединение, которое можно использовать в качестве маркера в дополнительных экспериментах с регуляторной областью Сап1оп.

Термин выделенный требует, чтобы материал был удален из своей первоначальной окружающей среды (например, природной окружающей среды, если он является встречаемым в природе). Например, встречаемый в природе полинуклеотид или полипептид, представленный в живом организме животного, не является выделенным, но тот же полинуклеотид или ДНК, или полипептид, отделенный от некоторых или от всех сосуществующих веществ в данной природной системе, является выделенным. Такой полинуклеотид может являться частью вектора и/или такой полинуклеотид или полипептид может являться частью композиции, и все же являться выделенным, вектор или композиция не являются частью его природного окружения.

Например, встречаемый в природе полинуклеотид, представленный в живом организме животного, не является выделенным, но тот же полинуклеотид, отделенный от некоторых или из всех сопутствующих веществ в природной системе, является выделенным. В частности, исключенными из определения выделенный являются: встречаемые в природе хромосомы (такие как хромосомные распределения), библиотеки искусственных хромосом, геномные библиотеки и кДНК-библиотеки, которые существуют либо в виде ίη уйго препарата нуклеиновой кислоты, либо в виде препарата трансфицированной/трансформированной клетки-хозяина, где данные клетки-хозяева представляют собой либо гетерогенный ίη уйго препарат, либо посеянные в виде гетерогенной популяции из единичных колоний. Исключаются также, в частности, и указанные выше библиотеки, в которых конкретный полинуклеотид составляет менее 5% от числа вставок нуклеиновых кислот в векторные молекулы. Кроме того, исключаются, в частности, препараты геномной ДНК целых клеток или РНК целых клеток (включая указанные выше препараты целых клеток, которые механически нарезаются или энзиматически расщепляются). Кроме того, исключаются, в частности, препараты указанных выше целых клеток в виде либо ίη уйго препарата, либо в виде гетерогенной смеси, разделенной с помощью электрофореза (включая блотинг), где полинуклеотид настоящего изобретения не был дополнительно отделен от гетерологичных полинуклеотидов в электрофоретической среде (например, дополнительное отделение путем вырезания одиночной полосы из гетерогенной популяции полос в агарозном геле или в найлоновом блоте).

Термин выделенный очисткой не требует абсолютной степени очистки; скорее он предназначается в качестве относительного определения. Очистка исходного вещества или природного вещества до по меньшей мере одного порядка величины, предпочтительно двух или трех порядков, и более предпочтительно четырех или пяти порядков, определенно предполагается. В качестве примера, очистка с 0,1% концентрации до 10% концентрации является очисткой на два порядка. В качестве примера, индивидуальные кДНК-клоны, выделенные из кДНК-библиотеки, были традиционно очищены до электрофоретической гомогенности. Последовательности, полученные из данных клонов, невозможно было бы получить непосредственно из данной библиотеки или из тотальной ДНК человека. Данные кДНК-клоны не являются встречаемыми в природе как таковые, но скорее их получают с помощью операции частично выделяемого очисткой встречаемого в природе вещества (информационная РНК). Преобразование мРНК в кДНК-библиотеку включает в себя создание синтетического вещества (кДНК), а очищенные индивидуальные кДНК-клоны могут быть выделены из данной синтетической библиотеки с помощью клональной селекции. Таким образом, создание кДНК-библиотеки из информационной РНК и последовательное выделение индивидуальных клонов из данной библиотеки приводит, приблизительно, к 10⁴-10⁶-кратной очистке нативной РНК.

Кроме того, термин выделенный очисткой используют в данном описании для описания полипептида или полинуклеотида настоящего изобретения, который был отделен от других соединений, включая, но, не ограничиваясь ими, полипептиды или полинуклеотиды, углеводы, липиды и т. п. Термин выделенный очисткой можно использовать для конкретного отделения мономерных полипептидов настоящего изобретения от олигомерных форм, таких как гомо- или гетеродимеры, димеры, тримеры и т. п. Термин выделенный очисткой можно также использовать в отношении специфического отделения ковалентнозамкнутых полинуклеотидов от линейных полинуклеотидов. Любой полинуклеотид является в значительной степени чистым, если по меньшей мере около 50%, предпочтительно 60-75% образца обнаруживает единственную полинуклеотидную последовательность и конформацию (например, линейную в сравнении с ковалентнозамкнутой). В значительной степени чистый полипептид или полинуклеотид обычно включает около 50%, предпочтительно 60-90% мас./мас. полипептидного или полинуклеотидного образца, соответственно, предпочтительно около 95% и более предпочтительно около 99% чистого продукта. Беспримесность полипептида или полинуклеотида или гомогенность показывают с по

- 8 006367 мощью ряда способов, хорошо известных в данной области техники, таких, например, как электрофорез образца в геле агарозы или в геле полиакриламида, с последующей визуализацией единственной полосы после окрашивания геля. Для некоторых целей наибольшее разрешение можно получить с использованием ВЭЖХ или иных способов, хорошо известных в данной области техники. В качестве альтернативного варианта осуществления настоящего изобретения, очистка полипептидов и полинуклеотидов настоящего изобретения может быть выражена, по меньшей мере, в виде процентов чистого вещества по отношению к гетерологичным полипептидам и полинуклеотидам (ДНК, РНК или обоим). В качестве предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения, полипептиды и полинуклеотиды настоящего изобретения обладают, по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 98, 99 или 100% чистоты (беспримесности) относительно, соответственно, гетерологичных полипептидов и полинуклеотидов. В качестве еще более предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения данные полипептиды и полинуклеотиды обладают степенью очистки, колеблющейся от любого числа до тысячной доли, между 90 и 100% (например, полипептид или полинуклеотид по меньшей мере 99,995% чистоты) по отношению, соответственно, к их гетерологичным полипептидам и полинуклеотидам, или в виде соотношения масса/масса по отношению ко всем соединениям и молекулам, отличным от существующих в данном носителе. Каждое число, представляющее процент чистоты, до тысячной доли, можно заявлять в качестве индивидуального вида чистоты.

Термин полипептид относится к полимеру аминокислот, не принимая во внимание длину данного полимера; поэтому пептиды, олигопептиды и белки включены без определения полипептида. Данный термин также не определяет или исключает постэкспрессионные модификации полипептидов, например, полипептидов, которые имеют в своем составе ковалентно присоединенные гликозильные группы, ацетильные группы, фосфатные группы, липидные группы и им подобные, четко подпадаемых под термин полипептид. В данное определение включены также полипептиды, которые содержат один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, не встречаемые в природе аминокислоты, аминокислоты, которые встречаются в природе только в неродственной биологической системе, модифицированные аминокислоты из систем млекопитающих и т.п.), полипептиды с замещенными связями, а также иные модификации, известные в данной области техники, как встречаемые в природе, так и не встречаемые в природе.

Используемый в данном описании термин рекомбинантный полипептид относится к полипептиду, который искусственно создают и который включает по меньшей мере две полипептидные последовательности, которые не обнаруживаются в виде смежных полипептидных последовательностей в их природной среде, или относится к полипептидам, которые экспрессируются из рекомбинантного полинуклеотида.

Используемый в данном описании термин животное, не принадлежащее человеческому роду, относится к любому позвоночному, не принадлежащему человеческому роду, птицам и, более предпочтительно, млекопитающим, предпочтительно приматам, сельскохозяйственным животным, таким как свинья, козы, овцы, ослы и лошади, кролики или грызуны, более предпочтительно крысы или мыши. Используемый в данном описании термин животное относится к любому позвоночному, предпочтительно млекопитающему. Оба термина животное и млекопитающее определенно включают человеческие существа, если не предшествует термин не принадлежащий человеческому роду.

Используемый в данном описании термин антитело относится к полипептиду или к группе полипептидов, которые включают по меньшей мере один связывающий домен, отличающийся тем, что антителосвязывающий домен образуется из упакованных вариабельных доменов молекулы антитела с образованием трехмерного связывающего пространства с формой внутренней поверхности и распределением заряда, комплементарного особенностям антигенной детерминанты антигена, что позволяет иммунологически реагировать с данным антигеном. Антитела имеют в своем составе рекомбинантные белки, включающие связывающие домены, а также фрагменты, включающие РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)₂ и Р(аЬ')₂фрагменты.

Используемая в данном описании антигенная детерминанта представляет собой часть молекулы антигена, в данном случае Сап1оп-полипептида, которая определяет специфичность взаимодействия антиген-антитело. Эпитоп относится к антигенной детерминанте полипептида. Эпитоп может включать не менее 3 аминокислот для пространственной конформации, которая уникальна для данного эпитопа. Как правило, эпитоп включает, по меньшей мере, 6 таких аминокислот, но более обычно, по меньшей мере, 8-10 таких аминокислот. Способы определения аминокислот, которые составляют эпитоп, включают рентгеновскую кристаллографию, 2-мерный ядерный магнитный резонанс и эпитопное картирование, например, способом Рсрьсап. описанном Ссуьсп и соавт., 1984; публикация РСТ Νο \УО84/03564; и публикация РСТ Νο ^084/03506.

На всем протяжении настоящего описания экспрессия нуклеотидной последовательности может употребляться для обозначения полинуклеотида или нуклеиновой кислоты. Более точно, экспрессия нуклеотидной последовательности охватывает собственно материал нуклеиновой кислоты и, следовательно, не ограничивается информацией о последовательности (т.е., последовательности букв, выбранной из четырех букв основания), которая биохимически характеризует специфичность молекулы ДНК

- 9 006367 или РНК.

Используемые в данном описании попеременно термины нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды и полинуклеотиды включают РНК, ДНК или гибридные последовательности РНК/ДНК с более чем одной последовательностью в одноцепочечной или дуплексной форме. Термин нуклеотид используют в данном описании в качестве прилагательного к описанию молекул, включающих РНК, ДНК, или гибридных последовательностей РНК/ДНК любой длины в одноцепочечной или дуплексной форме. Термин нуклеотид, также используемый в данном описании в качестве существительного относится к индивидуальным нуклеотидам или к множеству нуклеотидов, подразумевая молекулу или индивидуальный элемент в большей молекуле нуклеиновой кислоты, включающей пурин или пиримидин, сахарную составляющую рибозы или дезоксирибозы и фосфатную группу, или фосфодиэфирную связь в случае нуклеотидов в олигонуклеотиде или полинуклеотиде. Хотя используемый в данном описании термин нуклеотид охватывает также модифицированные нуклеотиды, которые включают по меньшей мере одну из модификаций (а) альтернативную связывающую группу, (Ь) аналоговую форму пурина, (с) аналоговую форму пиримидина или (б) аналоговый сахар, примеры аналоговых связывающих групп, пурина, пиримидинов и сахаров см., например, в публикации РСТ Νο ^095/04064. Полинуклеотидные последовательности настоящего изобретения могут быть получены любым известным способом, включая синтетический, рекомбинантный, ех νίνο преобразование или их сочетанием, а также используя любые способы очистки, известные в данной области техники.

Последовательность, которую функционально присоединяют к регуляторной последовательности, такой как промотор, означает, что указанный регуляторный элемент находится в правильном положении и ориентации по отношению к нуклеиновой кислоте, для контролирования РНК-полимеразной инициации и экспрессии представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Используемый в данном описании термин функционально присоединенный относится к связыванию полинуклеотидных элементов в функциональной взаимосвязи. Например, промотор или энхансер функционально связывают с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию данной кодирующей последовательности.

Термины признак и фенотип используются в данном описании взаимозаменяемо и относятся к любому видимому, обнаруживаемому или иначе измеряемому свойству организма, такому, например, как симптомы или предрасположенность к заболеванию. Обычно термины признак или фенотип, используемые в данном описании, относят к симптомам или к предрасположенности к заболеванию, к положительному ответу или к побочным эффектам, связанным с лечением. Предпочтительно, указанный признак может представлять собой, без ограничения, психические расстройства, такие как шизофрения или биполярное расстройство, другие ЦНС или нейрональные расстройства, такие как эпилепсия или нарушения болевых ощущений, а также сердечно-сосудистые состояния, такие как стенокардия, гипертензия и аритмия, а также любой аспект, особенность или характеристику любого из данных заболеваний или состояний.

Термин аллель, используемый в данном описании, относят к вариантам нуклеотидной последовательности. Двуаллельный полиморфизм имеет две формы. Диплоидные организмы могут быть гомозиготой или гетерозиготой по аллельной форме.

Термин уровень гетерозиготности, используемый в данном описании, относят к доле индивидуумов в популяции, которые являются гетерозиготами по отдельному аллелю. В двуаллельной системе уровень гетерозиготности равен, в среднем, 2Р_а(1-Р_а), где Р_а соответствует частоте наименее распространенного аллеля. Для использования в генетических исследованиях генный маркер должен обладать адекватным уровнем гетерозиготности, допускающим приемлемую вероятность того, что случайно выбранный субъект будет гетерозиготой.

Термин генотип, используемый в данном описании, относят к тождественности аллелей, представленных у индивидуума или в образце. В контексте настоящего изобретения генотип предпочтительно относят к описанию двуаллельных маркерных аллелей, представленных у индивида или в образце, например, аллели двуаллельных маркеров в Сап1оп-гене или в геномной области. Термин генотипирование образца или индивида по двуаллельному маркеру включает в себя определение конкретного аллеля или конкретного нуклеотида, осуществляемое по индивидуальному двуаллельному маркеру.

Термин мутация, используемый в данном описании, относят к различию в ДНК-последовательности между или среди разных геномов или индивидов, которые обладают частотой ниже 1%.

Термин гаплотип относят к сочетанию аллелей, представленных у индивида или в образце. В контексте настоящего изобретения гаплотип предпочтительно относят к сочетанию двуаллельных маркерных аллелей, обнаруживаемых у данного индивида, и которые могут быть ассоциированы с фенотипом.

Термин полиморфизм, используемый в данном описании, относят к встречаемости одной или нескольких альтернативных геномных последовательностей или аллелей среди или у разных геномов или индивидов. Полиморфный относится к состоянию, в котором два или более вариантов конкретной геномной последовательности могут быть обнаружены в популяции. Полиморфный сайт представляет собой локус, по которому наблюдается изменчивость. Полиморфизм единственного нуклеотида представляет собой замещение одного нуклеотида другим нуклеотидом в данном полиморфном сайте. Делеция единичного нуклеотида или вставка единичного нуклеотида также приводит к возрастанию поли

- 10 006367 морфизма единственного нуклеотида. В контексте настоящего изобретения полиморфизм единственного нуклеотида предпочтительно относится к единичной нуклеотидной замене. Обычно у разных индивидов данный полиморфный сайт может быть занят двумя разными нуклеотидами.

Термины двуаллельный полиморфизм и двуаллельный маркер используются в данном описании взаимозаменяемо и относятся к полиморфизму единственного нуклеотида, обладающего двумя аллелями с достаточно высокой частотой в популяции. Двуаллельный маркерный аллель относится к нуклеотидным вариантам, представленным по сайту двуаллельного маркера. Обычно частота малораспространенного аллеля двуаллельных маркеров настоящего изобретения, как оценка, составляет более чем 1%, предпочтительно его частота превышает 10%, более предпочтительно его частота составляет по меньшей мере 20% (т.е., уровень гетерозиготности составляет, по меньшей мере, 0,32), еще более предпочтительно его частота равна по меньшей мере 30% (т.е., уровень гетерозиготности достигает по меньшей мере 0,42). Двуаллельный маркер, в котором частота малораспространенного аллеля равна 30% или больше, называют высококачественным двуаллельным маркером.

Положение нуклеотидов в полинуклеотиде относительно центра полинуклеотида описывается в данном описании следующим образом. Если полинуклеотид обладает нечетным числом нуклеотидов, то считают, что нуклеотид, равноотстоящий от 3' и 5' концов в данном полинуклеотиде, находится в центре данного полинуклеотида, и любой нуклеотид, непосредственно примыкающий к нуклеотиду в центре, или же сам нуклеотид в центре, считают находящимся в 1 нуклеотиде от центра. При нечетном числе нуклеотидов в полинуклеотиде любую из пяти нуклеотидных позиций в середине полинуклеотида следует считать находящейся в 2 нуклеотидах от центра, и так далее. Если полинуклеотид обладает четным числом нуклеотидов, то в центре данного полинуклеотида будет находиться связь, а не нуклеотид. Таким образом, любой из двух центральных нуклеотидов следует считать находящимися в 1 нуклеотиде от центра, а любой из четырех нуклеотидов в средине данного полинуклеотида следует считать находящимся в 2 нуклеотидах от центра, и так далее. Что касается полиморфизма, который связан с заменой, вставкой или делецией 1 или более нуклеотидов, то данный полиморфизм, аллель или двуаллельный маркер находится в центре полинуклеотида, если разница между расстоянием от замещенных, вставленных или делетированных полинуклеотидов данного полиморфизма до 3'-конца данного полинуклеотида, расстоянием от замещенных, вставленных или делетированных полинуклеотидов данного полиморфизма до 5'-конца данного полинуклеотида, равно нулю или одному нуклеотиду. Если данная разница равна 0-3, тогда данный полиморфизм считают находящимся в 1 нуклеотиде от центра. Если эта разница составляет 0-5, данный полиморфизм считают находящимся в 2 нуклеотидах от центра. Если же эта разница составляет 0-7, то данный полиморфизм считают находящимся в 3 нуклеотидах от центра, и так далее.

Термин левее, используемый в данном описании, относится к месту, которое находится около 5'конца данного полинуклеотида от определенной точки отсчета, или, в случае гена, в направлении от кодирующей последовательности к промотору.

Термины спаренные основания и спаренные основания Уотсона и Крика, используемые в данном описании взаимозаменямо, относятся к нуклеотидам, которые могут быть связаны друг с другом водородной связью, благодаря идентичности их последовательностей, способом, подобным тому, который обнаруживает двухспиральная ДНК для остатков тимина или урацила, связанных с остатками аденина с помощью двух водородных связей, и остатков цитозина и гуанина, связанных с помощью трех водородных связей (См. 81гуег, Ь., ВюсйешШгу, 4'¹' ебйюп. 1995).

Термины комплементарный или его комплемент, используемые в данном описании, относятся к последовательностям полинуклеотидов, которые способны образовывать пары оснований Уотсона и Крика с другим конкретным полинуклеотидом по всей полностью комплементарной области. Для данной цели настоящего изобретения первый полинуклеотид признают комплементарным второму полинуклеотиду, если каждое основание первого полинуклеотида спаривается со своим комплементарным основанием. Комплементарными основаниями являются, как правило, А и Т (или А и и), или С и С. Комплемент используется в данном описании в качестве синонима комплементарного полинуклеотида, комплементарной нуклеиновой кислоты и комплементарной нуклеотидной последовательности. Данные термины, применяемые к парам полинуклеотидов, базируются исключительно на их последовательностях, а не на какой-либо конкретной совокупности условий, при которых данные два полинуклеотида были бы фактически связаны.

Варианты и фрагменты . Полинуклеотиды.

Настоящее изобретение относится также к вариантам и фрагментам описанных в данном описании полинуклеотидов, в частности Сап1оп-гена, содержащим один или более двуаллельных маркеров.

Варианты полинуклеотидов, в виде используемого в данном описании термина, представляют собой полинуклеотиды, которые отличаются от исходного полинуклеотида. Вариант полинуклеотида может быть встречаемым в природе вариантом, таким, например, как встречаемый в природе аллельный вариант, или он может быть вариантом, который не известен в качестве встречаемого в природе. Такие не встречаемые в природе варианты данного полинуклеотида можно создать методами мутагенеза, в том

- 11 006367 числе и теми, которые применимы к полинуклеотидам, клеткам или организмам. Обычно различия столь невелики, что нуклеотидные последовательности исходного и вариантного полинуклеотидов почти полностью совпадают, а по многим участкам идентичны.

Варианты полинуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, включают, без существенного ограничения, нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 95% идентичны полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 8ЕО ΙΌ N08 14, или полинуклеотидному фрагменту по меньшей мере из 12 последовательных нуклеотидов полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 8ЕО ΙΌ N08 1-4, и предпочтительно по меньшей мере идентичны на 99%, более предпочтительно по меньшей мере идентичны на 99,5%, и наиболее предпочтительны по меньшей мере идентичны на 99,8% полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ΙΌ Νο§ 1-4, или любому полинуклеотидному фрагменту по меньшей мере из 12 последовательных нуклеотидов полинуклеотида, выбранного из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 8Е0 ΙΌ Νο 1-4.

Нуклеотидные изменения, присутствующие в вариантном полинуклеотиде, могут быть молчащими, что означает, что они не изменяют аминокислоты, кодируемые данным полинуклеотидом. Однако нуклеотидные изменения могут также приводить и к аминокислотным заменам, добавлениям делециям, слияниям и укорочениям в данном полипептиде, кодируемом начальной последовательностью. В этих заменах, делециях или добавках могут участвовать один или более нуклеотидов. Данные варианты могут являться результатом изменений в кодирующей или некодирующей областях или в обоих. Изменения в кодирующих областях могут создавать консервативные или неконсервативные замены, делеции или добавки.

В контексте настоящего изобретения особенно предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения являются те, в которых данные полинуклеотиды кодируют полипептиды, которые фактически сохраняют ту же биологическую функцию или активность, что и зрелый Сап1оп-белок, или те, в которых данные полинуклеотиды кодируют полипептиды, которые сохраняют или повышают основную биологическую активность, снижая в то же время вспомогательную (вторичную) биологическую активность.

Полинуклеотидный фрагмент представляет собой полинуклеотид, обладающий последовательностью, которая совершенно такая же, что и часть, но не вся данная нуклеотидная последовательность, предпочтительно нуклеотидная последовательность Сап1оп-гена, и его варианты. Данный фрагмент может представлять собой участок интрона или экзона Сап1оп-гена. Он может также представлять собой какую-нибудь часть из регуляторных областей Сап1оп. Предпочтительно такие фрагменты включают по меньшей мере один из двуаллельных маркеров А1-А17 или его комплементов или двуаллельный маркер, сцепленный при нарушении равновесия с одним или несколькими двуаллельными маркерами А1-А17.

Такие фрагменты могут быть автономными, т.е. не являться частью или слившимися с другими полинуклеотидами, или они могут быть включены в отдельный большой полинуклеотид, в котором они образуют сегмент или участок. Действительно, несколько таких фрагментов могут быть представлены в отдельном большом полинуклеотиде.

Факультативно, такие фрагменты могут состоять или состоять в основном из непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов в длину. Совокупность предпочтительных фрагментов содержит по меньшей мере один из двуаллельных маркеров А1-А17 Сап1оп-гена, который описан в данном описании, или его комплементы.

- Полипептиды.

Настоящее изобретение относится также к вариантам, фрагментам, аналогам и производным описанных в данном описании полипептидов, включая мутантные Сап1оп-белки.

Данный вариант может представлять собой 1 ) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком, и такой замещенный аминокислотный остаток может или может не кодироваться с помощью генетического кода, или 2) вариант, в котором один или несколько аминокислотных остатков включают замещенную группу, или 3) вариант, в котором мутантный Сап1оп сливается с другим соединением, таким, например, как соединение, которое увеличивает время полужизни данного полипептида (например, полиэтиленгликоль), или 4) вариант, в котором дополнительные аминокислоты сливаются с мутантным Сап1оп, такой, например, как лидерная или секреторная последовательность или последовательность, которую употребляют для выделения очисткой мутантного Сап1оп, или препротеиновая последовательность. Такие варианты считаются находящимися в компетенции специалистов в данной области техники.

Полипептидный фрагмент представляет собой полипептид, обладающий последовательностью, которая идентична части, но не всей данной полипептидной последовательности, предпочтительно полипептид, кодируемый Сап1оп-геном и его вариантами.

Что касается аминокислотной замены в аминокислотной последовательности полипептида, в соответствии с настоящим изобретением, одну или несколько аминокислот можно заменить эквивалентными аминокислотами. Выражение эквивалентная аминокислота используют в данном описании для обозначения любой аминокислоты, которая может быть заменена одной или несколькими аминокисло

- 12 006367 тами, обладающими аналогичными свойствами, при условии, что специалисты в области химии пептидов могут предполагать вторичную структуру и гидропатичную природу данного полипептида, которые будут оставаться практически неизмененными. Большей частью следующие группы аминокислот соответствуют эквивалентным изменениям: (1) А1а, Рго, С1у, С1и, Акр, С1п, Аки, 8сг, ТЬг; (2) Сук, 8ег, Туг, ТЬг; (3) Уа1, 11е, Ьеи, Мек А1а, РЬе; (4) Бук, Агд, Ηίκ; (5) РЬе, Туг, Тгр, Ηίκ.

Специфичный вариант осуществления представляющей интерес модифицированной пептидной Сап1оп-молекулы, в соответствии с настоящим изобретением, включает, но не ограничивается указанным, пептидную молекулу, которая устойчива к протеолизу, в которой пептидная связь -СОИН- модифицирована и заменена восстановленной связью (СН₂ИН), связью ге!го шуегко (ИНСО), метиленоксисвязью (СН₂-О), тиометиленовой связью (СН₂-8), карбосвязью (СН₂СН₂), ацетометиленовой связью (СОСН₂), гидроксиэтиленовой связью (СНОН-СН2), Ν-Ν-связью, Е-а1сеп-связью или -СН=СН-связью. В настоящее изобретение включен Сап1оп-полипептид человека или его фрагмент, или его вариант, в котором по меньшей мере одна пептидная связь была модифицирована, как описано выше.

Такие фрагменты могут быть автономными, т.е., не являться частью или слившимися с другими полипептидами, или они могут быть включены в отдельный большой полипептид, в котором они образуют сегмент или участок. Вместе с тем, несколько фрагментов можно включить в один большой полипептид.

В качестве репрезентативных примеров полипептидных фрагментов настоящего изобретения в данном описании можно указать на фрагменты, которые обладают длиной от примерно 5, 6, 7, 8, 9 или 1015, 10-20, 15-40 или 30-55 аминокислот. Предпочтительными являются фрагменты, содержащие, по крайней мере, мутацию одной аминокислоты в белок Сап1оп.

Идентичность нуклеиновых кислот или полипептидов

Термины процент идентичности последовательностей и процент гомологии, используемые в данном описании взаимозаменяемо, применяют для сравнения полинуклеотидов или полипептидов, и определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может включать добавки или делеции (т. е., пробелы) при сравнении с исходной последовательностью (которая не включает добавки или делеции) для оптимального выравнивания двух данных последовательностей. Указанный процент вычисляют путем определения числа позиций, по которым у обоих последовательностей наблюдаются идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки, с получением соответствующих позиций, делением числа соответствующих позиций на общее число позиций в данном окне сравнения и умножением полученного результата на 100 с получением процента идентичности последовательностей. Гомологию оценивают с использованием любого из множества разнообразных алгоритмов сравнения последовательностей и программ, известных в данной области техники. Такие алгоритмы и программы включают, но никоим образом не ограничиваются, ТВЬА8ТИ, ВБА8ТР, РА8ТА, ТРА8ТА и С1.и8ТА1А\' (Реагкоп апб Ыршап, 1988; А1!ксЬи1 и соавт., 1990; ТЬотркоп и соавт., 1994; Шддшк и соавт., 1996; А11кс1ш1 и соавт., 1990; А1!ксЬи1 и соавт., 1993). В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения гомологии последовательностей белков и нуклеиновых кислот оценивают с использованием Вабс Ьоса1 Айдптеп! 8еагсЬ Тоо1 (ВБА8Т), который хорошо известен в данной области техники (см., например, Каг1ш апб А1!ксЬи1, 1990; А1!ксЬи1 и соавт., 1990, 1993, 1997). В частности, пять специфичных ВБА8Т -программ используются для выполнения следующей задачи:

(1) ВБА8ТР и ВЬА8Т3 сравнивают запрашиваемую аминокислотную последовательность с последовательностью белка базы данных;

(2) ВБА8ТИ сравнивает запрашиваемую нуклеотидную последовательность с нуклеотидной последовательностью базы данных;

(3) ВБА8ТХ сравнивает воображаемые продукты трансляции шести рамок запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обе цепи) с последовательностью белка базы данных;

(4) ТВЬА8ТИ сравнивает запрашиваемую последовательность белка с нуклеотидной последовательностью базы данных, транслированную со всех шести открытых рамках считывания (обе цепи); и (5) ТВБА8ТХ сравнивает трансляцию шести рамок запрашиваемой нуклеотидной последовательности с трансляцией шести рамок нуклеотидной последовательности базы данных.

ВЬА8Т-программы идентифицируют гомологичные последовательности путем идентификации сходных сегментов, которые именуются в данном описании как высокооцениваемые пары сегментов, между представляющей интерес аминокислотной или нуклеотидной последовательностью и тестпоследовательностью, которую предпочтительно получают из последовательности белка или нуклеотидной последовательности базы данных. Высокооцениваемые пары сегментов предпочтительно идентифицируют (т.е., выстраивают) с помощью способов оценки матрицы, многие из которых хорошо известны в данной области техники. Предпочтительно используемая матрица оценок представляет собой ВЬО8иМ62-матрицу (Сопле! и соавт., 1992; НешкоГГ апб Неп1ко£Г, 1993). С меньшей предпочтительностью можно также использовать матрицы РАМ или РАМ250 (см., например, 8с11\\'аг1х апб ОауйоГГ. ебк., 1978). ВЬА8Т-программы оценивают статистическую значимость идентифицируемых высокооцениваемых пар сегментов и предпочтительно отбирают те сегменты, которые удовлетворяют порогу значимо

- 13 006367 сти, устанавливаемому пользователем, такому как устанавливаемый пользователем процент гомологии. Предпочтительно статистическая значимость высокооцененной пары сегментов оценивается с использованием формулы статистической значимости Карлина (см., например, Катки апб Лккски1, 1990).

ВЬЛ8Т-программы могут использоваться со значениями параметров по умолчанию или с модифицированными параметрами, созданными пользователем.

Жесткие условия гибридизации

С целью охарактеризовать такую гибридизующуюся нуклеиновую кислоту, в соответствии с настоящим изобретением, жесткие условия гибридизации являются следующими: стадию гибридизации осуществляют при 65°С в присутствии 6 х 88С-буфера, 5 х раствора Денхардта, 0,5% 8Ό8 и 100 мкг/мл ДНК спермы лосося.

Стадию гибридизации осуществляют с последующими четырьмя стадиями отмывки: две отмывки по 5 мин, предпочтительно при 65°С в 2 х 88С и 0,1% δΌδ-буфере; одна отмывка 30 мин, предпочтительно при 65°С в 2 х 88С и 0,1% δΌδ-буфере, одна отмывка 10 мин, предпочтительно при 65°С в 0,1 х 88С и 0,1% δΌδ-буфере, данные условия гибридизации пригодны для молекулы нуклеиновой кислоты длиной около 20 нуклеотидов. Нет необходимости говорить о том, что описанные выше условия гибридизации адаптируют в соответствии с длиной требуемой нуклеиновой кислоты, следуя методам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Подходящие условия гибридизации можно, например, адаптировать в соответствии с указаниями, изложенными в книге Натек и Шддтк (1985).

Геномные последовательности Сап1оп-гена

В настоящем изобретении рассматривают геномную последовательность Сап1оп. Настоящее изобретение включает в себя Сап1оп-ген или геномные Сап1оп-последовательности, состоящие, или в основном состоящие из, или включающие последовательность 8ΕΟ ГО ΝΟκ 1-3, комплементарную ей последовательность, а также ее фрагменты и варианты. Данные полинуклеотиды могут представлять собой полинуклеотиды, выделенные очисткой, выделенные или рекомбинантные.

Настоящее изобретение включает в себя также выделенный очисткой, выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, обладающую, по меньшей мере, 70, 75, 80, 85, 90 или 95% нуклеотидной идентичностью с нуклеотидной последовательностью 8ΕΟ ΙΌ Νοκ 1-3 или с ее комплементарной последовательностью, или с ее фрагментом. Нуклеотидные различия, что касается нуклеотидной последовательности 8ΕΟ ГО Νοκ 1-3, могут быть, как правило, распределены случайно по всей длине нуклеиновой кислоты. Тем не менее, предпочтительными нуклеиновыми кислотами являются те из них, в которых нуклеотидные различия, что касается нуклеотидной последовательности 8ΕΟ ГО Νοκ 1-3, преимущественно локализованы за пределами данных кодирующих последовательностей, содержащихся в экзонах. Данные нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты, могут использоваться в качестве олигонуклеотидных праймеров или зондов с целью обнаружения наличия копии Сап1оп-гена в тест-выборке или, альтернативно, с целью амплифицировать нуклеотидную последовательность-мишень в Сап1оп-последовательностях.

Другой объект настоящего изобретения состоит из выделенной очисткой, выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью 8ΕΟ ГО Νϋ8 1-3 или с комплементарной ей последовательностью, или с ее вариантом, в жестких гибридизационных условиях, как указано выше. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанная выделенная очисткой, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота специфически гибридизуется с полинуклеотидами Сап1оп-гена человека, более предпочтительно, если указанная нуклеиновая кислота способна гибридизоваться с нуклеотидами из Сап1оп-гена человека, но практически неспособна гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью Сап1оп-гена крысы.

Особенно предпочтительная нуклеиновая кислота настоящего изобретения включает выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 10000 нуклеотидов из 8ΕΟ ГО Νϋ8 1-3 или из ее комплементов. Следует отметить, что нуклеотидные фрагменты любого размера и последовательности могут также включаться в полинуклеотиды, описанные в данном разделе.

Геномная нуклеиновая кислота Сап1оп включает 44 экзона. Расположение экзонов в 8ΕΟ ГО Νϋ8 1-3 подробно представлено ниже в табл. В.

- 14 006367

Таблица В

Эквон	Положение в ЗЕО ИЗ Но1	Интрон	Положение в ЗЕф Ιϋ Νοί
Начало	Конец	Начало	Конец
1	2001	2026	1	2027	19187
2	19188	19334	2	19335	22995
3	22996	23178	3	23179	39730
4	39731	39814	4	39815	41336
5	41337	41476	5	41477	41564
6	41565	41693	6	41694	73012
7	73013	73167

Эквок	Положение в 8ЕЙ ΣΟ Νο2	Интрон	Положение в 8Е2 Ιϋ Νο2
Начало	Конец	Начало	Конец
8	43726	43868	7	43869	43997
9	43998	44102	8	44103	52092
10	52093	52179	9	52180	77567
11	77568	77699	10	77700	98225
12	98226	98393	11	98394	106566
13	106567	106758	12	106759	144108
14	144246	144246	13	144247	159793
15	159794	159868	14	159869	191291
16	191292	191428	15	191429	192966
17	192967	193108	16	193109	211539
18	211540	211613	17	211614	225005
19	225006	225107	18	225108	225543

20	225544	225613	19	225614	228449
21	228450	228541	20	228542	228629
22	228630	228752	21	228753	231288
23	231289	231345	22	231346	231588
24	231589	231709	23	231710	231812
25	231813	231944	24	231945	232899
26	232900	233067	25	233068	235354
27	235355	235459

Экзон	Положение в ЗЕО П> ИоЗ	Интгрон	Положение в ЗЕС ю ИоЗ
Начало	Конец	Начало	Конец
28	3895	4001	26	4002	9610
29	9611	9731	27	9732	9815
30	9816	9914	28	9915	15775
31	15776	15869	29	15870	16381
32	16382	16488	30	16489	16696
33	16697	16771	31	16772	17933
34	17934	18053	32	18054	23643
35	23644	23712	33	23713	24927
36	24928	25076	34	25077	25912
37	25913	26006	35	26007	30766
38	30767	30899	36	30900	31560
39	31561	31676	37	31677	34073
40	34044	34201	38	34202	37492
41	37493	3763	39	37644	39651
42	39652	39801	40	39802	41562
43	41563	41680	41	41681	44130
44	44131	45841

- 15 006367

Таким образом, настоящее изобретение содержит выделенные очисткой, выделенные или рекобинантные полинуклеотиды, включающие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей, каждая, из 44 экзонов Сап1оп-гена и, каждая, - из комплементарной ей последовательности. В настоящем изобретении обеспечиваются также выделенные очисткой, выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, включающие сочетание по меньшей мере из двух экзонов Сап1оп-гена, в котором данные полинуклеотиды размещены в нуклеиновой кислоте, от 5'-конца до З'-конца указанной нуклеиновой кислоты, в том же порядке, что и в 8Е0 ΙΌ Ыо 1-3.

Интрон 1 относится к нуклеотидной последовательности, локализованной между экзоном 1 и экзоном 2, и так далее. Положение интронов детально представлено в таблице А. Таким образом, настоящее изобретение содержит выделенные очисткой, выделенные или рекобинантные полинуклеотиды, включающие нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 43 интронов Сап1опгена, или комплементарную ей последовательность.

Хотя данный раздел называется Геномные Последовательности Сап1оп, следует иметь в виду, что нуклеотидные фрагменты любого размера и последовательности могут также включаться в полинуклеотиды, описанные в данном разделе, фланкируя данные геномные последовательности Сап1оп на любой стороне или между двумя или более такими геномными последовательностями.

кДНК-последовательности Сап1оп

Показано, что экспрессия Сап1оп-гена приводит к продуцированию по меньшей мере одного из видов мРНК, последовательности нуклеиновой кислоты, которая приведена в 8Е0 ΙΌ Ыо 4.

Другой объект настоящего изобретения представляет собой выделенную очисткой, выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность 8Е0 ΙΌ Ыо 4, комплементарные ей последовательности, а также аллельные варианты, и ее фрагменты. Кроме того, предпочтительные полинуклеотиды настоящего изобретения включают выделенные очисткой, выделенные или рекомбинантные кДНК Саи!оп, состоящие, в основном состоящие из или включающие последовательность 8Е0 Ш Ыо 4. Особенно предпочтительные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов из 8ЕО ΙΌ Ыо 4 или из ее комплементов. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный непрерывный участок последовательности включает связанный с СаиГои двуаллельный маркер; предпочтительно избранный из группы, состоящей из А12 или А16.

К настоящему изобретению относится также выделенная очисткой или выделенная нуклеиновая кислота, включающая полинуклеотид, обладающий по меньшей мере 95% нуклеотидной идентичностью с полинуклеотидом 8ЕО Ш Ыо 4, преимущественно 99% нуклеотидной идентичностью, предпочтительно 99,5% нуклеотидной идентичностью и наиболее предпочтительно 99,8% нуклеотидной идентичностью с полинуклеотидом 8ЕО Ш Ыо 4, или комплементарная ей последовательность или ее биологически активный фрагмент.

Другая цель настоящего изобретения имеет отношение к выделенным очисткой, выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, включающим полинуклеотид, который гибридизуется в сформулированных в данном описании жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом 8ЕО Ш Ыо 4, или с комплементарной ему последовательностью или с его вариантом, или с его биологически активным фрагментом.

Дополнительная цель настоящего изобретения имеет отношение к выделенному, выделенному очисткой или рекомбинантному полинуклеотиду, который кодирует Сап[оп-полипептид. включающий непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 6 аминокислот 8ЕО Ш Ыо 5, в котором указанный непрерывный участок последовательности включает по меньшей мере 1, 2, 3, 5 или 10 аминокислотных позиций 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 8ЕО ΙΌ Ыо 5. Включен также выделенный, выделенный очисткой или рекомбинантный полинуклеотид, который кодирует СаηIои-полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8ЕО Ш Ыо 5, или производные или ее биологически активные фрагменты, а также выделенный, выделенный очисткой или рекомбинантный полинуклеотид, который кодирует Са^оп-полипептид, идентичный по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 98, 99, 99,5 или 99% аминокислотной последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо 5.

кДНК 8ЕО ΙΌ Ыо 4 включает 5'-ИТР-область, начинающуюся от нуклеотида в положении 1 и заканчивающуюся нуклеотидом в положении 65 8ЕО Ш Ыо 4. кДНК из 8ЕО ΙΌ Ыо кДНК включает 3'иТР-область, начинающуюся от нуклеотида в положении 5283 и заканчивающуюся нуклеотидом в положении 6799 8ЕО ΙΌ Ыо 4.

Следовательно, в настоящем изобретении рассматривается выделенная очисткой, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность 5'ИТР из кДНК СаШоп, комплементарную ей последовательность, или ее аллельный вариант. В настоящем изобретении рассматривается также выделенная очисткой, выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность 3'ИТР из кДНК Са^оп, комплементарную ей последо- 16 006367 вательность, или ее аллельный вариант.

Хотя данный раздел называется кДНК-последовательности Сап1оп, следует иметь ввиду, что нуклеотидные фрагменты любого размера и последовательность могут быть также включены в полинуклеотиды, описанные в данном разделе, фланкируя геномные последовательности Сап1оп на любой стороне или между двумя или несколькими такими геномными последовательностями.

Кодирующие области

Открытая рамка считывания Сап1оп содержится в соответствующей мРНК из 8ЕЦ ГО № кДНК. Точнее эффективная Сап1оп-кодирующая последовательность (СГО8) включает область между нуклеотидной позицией 66 (первый нуклеотид АТС-кодона) и нуклеотидной позицией 5282 (концевой нуклеотид ТСА-кодона) из 8ЕЦ ГО № 4. Настоящее изобретение включает также выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8 или 10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 или 1000 аминокислот 8ЕЦ ГО № 5.

Раскрытый выше полинуклеотид, который содержит кодирующую последовательность Сап1оп-гена, может экспрессироваться в требуемой клетке-хозяине или в требуемом организме-хозяине, если данный полинуклеотид поместить под контроль соответствующих экспрессионных сигналов. Экспрессионные сигналы могут представлять собой или экспрессионные сигналы, содержащиеся в регуляторных районах Сап1оп-гена настоящего изобретения, или в противоположность сигналы могут представлять собой экзогенные регуляторные последовательности нуклеиновых кислот. Такой полинуклеотид, помещенный под соответствующие экспрессионные сигналы, можно также встроить в вектор для его экспрессии и/или амплификации.

Регуляторные Сап1оп-последовательности

Как отмечено, геномная последовательность Сап1оп-гена содержит регуляторные последовательности как в некодирующей 5'-фланкирующей области, так и в некодирующей 3'-фланкирующей области, которые ограничивают Сап1оп-кодирующую область, содержащую 44 экзона данного гена.

Полинуклеотиды, полученные из 5'- и 3'-регуляторных областей, пригодны для того, чтобы выявить наличие, по меньшей мере, копии нуклеотидной последовательности Сап1оп или ее фрагмента в тестируемом образце.

Промоторную активность 5'-регуляторных областей, содержащихся в Сап1оп, можно оценить, как описано ниже. Для того чтобы идентифицировать релевантные биологически активные полинуклеотидные фрагменты или варианты 8ЕЦ ГО № 1, специалистов в данной области техники можно отослать к 8атЬтоок и соавт., 1989, которые описывают использование рекомбинантного вектора, несущего маркерный ген (т.е., бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу и т.п.), экспрессию которого можно обнаружить при помещении его под контроль биологически активных полинуклеотидных фрагментов или вариантов 8ЕЦ ГО № 1. Геномные последовательности, локализованные «левее» первого экзона Сап1оп-гена, клонируют в соответствующий промоторный репортерный вектор, такие как доступные от С.’1оп1ес11 промоторные репортерные векторы р8ЕАР-Ваыс, р8ЕАР-Еп11апсег. рвдаГВаыс, рР§а1Еийапсет или рЕСГР1, или беспромоторный репортерный вектор гена люциферазы от Рготеда рСЬ2-Ьа81с или рСЬЗ-Ьаыс. Вкратце, каждый из этих промоторных репортерных векторов включает множество сайтов клонирования, позиционированных «левее» репортерного гена, кодирующего легко поддающийся анализу белок, такой как секретируемая щелочная фосфатаза, люцифераза, галактозидаза или зеленый флуоресцентный белок. Последовательности, расположенные «левее» от кодирующей Сап1оп-области, встраивают в сайты клонирования «левее» данного репортерного гена в обоих ориентациях и вводят в соответствующую клетку-хозяина. Анализируют уровень репортерного белка и сравнивают с уровнем, полученным для вектора, у которого отсутствует вставка в сайт клонирования. Наличие повышенного уровня экспрессии в векторе, содержащем вставку, по сравнению с уровнем для контрольного вектора, свидетельствует о наличии промотора в данной вставке. При необходимости расположенные слева последовательности могут быть клонированы в векторы, которые содержат энхансер для увеличения уровней транскрипции под слабыми промоторными последовательностями. Существенный уровень повышенной экспрессии, которая наблюдается для вектора, не имеющего вставки, свидетельствует о том, что промоторная последовательность присутствует во встроенной слева последовательности.

Промоторную последовательность, расположенную «левее» геномной ДНК, можно также определить путем создания сгруппированных 5' и/или 3' делеций в расположенной слева ДНК с использованием традиционных методик, таких как обработка экзонуклеазой III или обработка соответствующей эндонуклеазой рестрикции. Полученные делеционные фрагменты можно встроить в данный промоторный репортерный вектор, чтобы определить, действительно ли данная делеция снижает или уничтожает промоторную активность, как это описано, например, у Со1ек и соавт. (1998), раскрытие которой включено в данное описание путем ссылки во всей ее полноте. Таким способом можно определить границы промоторов. При желании можно идентифицировать потенциальные индивидуальные регуляторные сайты внутри промотора с использованием сайт-направленного мутагенеза или линкерного сканирования, которые аннулируют сайты связывания потенциальных транскрипционных факторов внутри промотора,

- 17 006367 индивидуально или в сочетании. Влияние таких мутаций на уровень транскрипции можно определить путем встраивания мутаций в сайты клонирования промоторных репортерных векторов. Данный вид анализа хорошо известен специалистам в данной области техники и описан в νθ 97/17359, патенте США №5374544; ЕР 582796; патенте США №5698389; патенте США №5643746; патенте США №5502176 и патенте США №5266488; раскрытие которых включено в данное описание путем ссылки во всей их полноте.

Силу и специфичность промотора Сап1оп-гена можно оценить через уровни экспрессии детектируемого полинуклеотида, функционально присоединенного к данному Сап1оп-промотору, в разных типах клеток и тканях. Данный детектируемый полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, который специфически гибридизуется с заранее определенным олигонуклеотидным зондом, или полинуклеотид, кодирующий детектируемый белок, в том числе Сап1оп-полипептид или фрагмент или его вариант. Данный вид анализа хорошо известен специалистам в данной области техники и описан в патенте США №5502176; и патенте США №5266488; раскрытие которых включено путем ссылки во всей их полноте. Некоторые способы обсуждаются более подробно ниже.

Полинуклеотиды, несущие регуляторные элементы, локализованные на 5' или на 3'-конце Сап1опкодирующей области, можно преимущественно использовать для контроля транскрипционной и трансляционной активности представляющего интерес гетерологичного полинуклеотида.

Таким образом, в настоящем изобретении рассматривается также выделенная очисткой или выделенная нуклеиновая кислота, включающая полинуклеотид, который выбран из группы, состоящей из 5'и 3'-регуляторных областей, или комплементарную ему последовательность, или ее биологически активный фрагмент или вариант. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения 5'регуляторная область локализована в нуклеотидной последовательности, расположенной между позициями 1 и 2000 8ЕО ΙΌ Ыо 1. 3'- регуляторная область локализована в нуклеотидной последовательности, расположенной между позициями 45842 и 47841 8ЕО ΙΌ Ыо 3.

Настоящее изобретение относится также к выделенной очисткой или выделенной нуклеиновой кислоте, включающей полинуклеотид, обладающий по меньшей мере 95% нуклеотидной идентичности с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из 5' и 3' регуляторных областей, преимущественно 99% нуклеотидной идентичности, предпочтительно 99,5% нуклеотидной идентичности и наиболее предпочтительно 99,8% нуклеотидной идентичности с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из 5' и 3' регуляторных областей, или комплементарной ему последовательностью или его вариантом, или его биологически активным фрагментом.

Другой объект настоящего изобретения включает выделенные очисткой, выделенные или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, включающие полинуклеотид, который гибридизуется в установленных в данном описании жестких условиях гибридизации с полинуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 5' и 3' регуляторных областей, или с комплементарной ему последовательностью или с его вариантом, или с его биологически активным фрагментом.

Предпочтительные фрагменты 5'-регуляторной области обладают длиной около 1500 или 1000 нуклеотидов, предпочтительно около 500 нуклеотидов, более предпочтительно около 400 нуклеотидов, еще более предпочтительно около 300 нуклеотидов и наиболее предпочтительно около 200 нуклеотидов.

Предпочтительные фрагменты 3'-регуляторной области обладают по меньшей мере 50, 100, 150, 200, 300 или 400 п.н. в длину.

Биологически активные полинуклеотидные производные 8ЕО ΙΌ Ыо8 1-3 представляют собой полинуклеотиды, включающие или же состоящие из фрагмента указанного полинуклеотида, который является функционирующим в качестве регуляторной области для экспрессирования рекомбинантного полипептида или рекомбинантного полинуклеотида в рекомбинантной клетке-хозяине. Он должен действовать либо в качестве энхансера, либо как репрессор.

Для цели настоящего изобретения нуклеиновая кислота или полинуклеотид являются функциональными в качестве регуляторной области для экспрессии рекомбинантного полипептида или рекомбинантного полинуклеотида, если указанный регуляторный полинуклеотид содержит нуклеотидные последовательности, которые содержат информацию о регуляции транскрипции и трансляции, и такие последовательности функционально связаны с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют требуемый полипептид или требуемый полинуклеотид.

Регуляторные полинуклеотиды настоящего изобретения можно получить из нуклеотидной последовательности 8ЕО ΙΌ Ыо§ 1 и 3 путем расщепления с использованием соответствующих ферментов рестрикции, что описано, например, в книге 8ашЬтоок и соавт. (1989). Регуляторные полинуклеотиды можно также получить путем обработки 8ЕО ΙΌ Ыо§ 1 и 3 ферментом экзонуклеазой, такой как Ва131 (^аЬ1ко и соавт., 1986). Такие регуляторные полинуклеотиды можно также получить с помощью химического синтеза нуклеиновых кислот, как описано в другом месте в данном описании.

Регуляторные полинуклеотиды, в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой часть рекомбинантного экспрессионного вектора, который можно использовать для экспрессии кодирующей последовательности в требуемой клетке-хозяине или организме-хозяине. Рекомбинантные экспрессионные векторы, в соответствии с настоящим изобретением, описаны в другом месте настояще

- 18 006367 го описания.

Предпочтительный 5'-регуляторный полинуклеотид настоящего изобретения включает 5'нетранслируемую область (5'-ИТР) кДНК Сап1оп, или ее биологически активный фрагмент или ее вариант.

Предпочтительный 3'-регуляторный полинуклеотид настоящего изобретения включает 3'нетранслируемую область (3'-ИТР) кДНК Сап1оп, или ее биологически активный фрагмент или ее вариант.

Дополнительная цель настоящего изобретения включает выделенную очисткой или выделенную нуклеиновую кислоту, включающую:

a) нуклеиновую кислоту, включающую регуляторную нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из (ί) нуклеотидной последовательности, включающей полинуклеотид из 5'-регуляторной области или комплементарную ей последовательность;

(ίί) нуклеотидной последовательности, включающей полинуклеотид, обладающий по меньшей мере 95% нуклеотидной идентичности с нуклеотидной последовательностью из 5' регуляторной области или с комплементарной ей последовательностью;

(ίίί) нуклеотидной последовательности, включающей полинуклеотид, который гибридизуется в жестких гибридизационных условиях с нуклеотидной последовательностью из 5' регуляторной области или с комплементарной ей последовательностью; и (ίν) биологически активного фрагмента или варианта полинуклеотидов в (1), (и) и (ίίί);

b) полинуклеотид, кодирующий требуемый полипептид или представляющую интерес нуклеиновую кислоту, функционально присоединенную к нуклеиновой кислоте, указанной выше в (а);

c) факультативно, нуклеиновую кислоту, включающую 3'-регуляторный полинуклеотид, предпочтительно З'-регуляторный полинуклеотид Сап1оп-гена.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота отличается тем, что указанная нуклеиновая кислота включает 5'-нетранслируемую область (5'ИТР) кДНК Сап1оп, или ее биологически активный фрагмент или ее вариант.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная выше нуклеиновая кислота отличается тем, что указанная нуклеиновая кислота включат 3'-нетранслируемую область (3'ИТР) кДНК Сап1оп, или ее биологически активный фрагмент или ее вариант.

Регуляторный полинуклеотид 5'-регуляторной области или его биологически активные фрагменты или варианты, функционально присоединяют по 5'-концу полинуклеотида, кодирующего требуемый полипептид или полинуклеотид.

Регуляторный полинуклеотид 3'-регуляторной области, или его биологически активные фрагменты или варианты, преимущественно функционально присоединяют по 3'-концу полинуклеотида, кодирующего требуемый полипептид или полинуклеотид.

Требуемый полипептид, кодируемый указанной выше нуклеиновой кислотой, может иметь разную природу или происхождение, включая белки прокариотического или эукариотического происхождения. Полипептиды, экспрессируемые под контролем Сап1оп-регуляторной области, включают антигены бактерий, грибов или вирусов. Включены также эукариотические белки, такие как внутриклеточные белки, подобные белки домашнего хозяйства, связанные с мембраной белки, подобные рецепторам, и секретируемые белки, подобные эндогенным медиаторам, таким как цитокины. Требуемый белок может быть Сап1оп-белком, в частности, белком с аминокислотной последовательностью 8Е0 ΙΌ Ыо 5, или фрагментом или его вариантом.

Требуемые нуклеиновые кислоты, кодируемые указанным выше полинуклеотидом, обычно РНКмолекулой, могут быть комплементарны требуемому кодирующему полинуклеотиду, например, Сап1опкодирующей последовательности, и таким образом использоваться в качестве антисмыслового полинуклеотида.

Такой полинуклеотид может включаться в рекомбинантный экспрессионный вектор, чтобы экспрессировать требуемый полипептид или требуемую нуклеиновую кислоту в клетке-хозяине или в организме-хозяине. Соответствующие рекомбинантные векторы, которые содержит полинуклеотид, такой как описано в данном описании, рассматриваются в другом месте настоящего описания.

Полинуклеотидные конструкции

Термины полинуклеотидная конструкция и рекомбинантный полинуклеотид, используемые в данном описании взаимозаменяемо, относятся к линейным или кольцевым, выделенным очисткой или выделенным полинуклеотидам, которые были искусственно созданы и которые включают по меньшей мере две нуклеотидные последовательности, которые не обнаруживаются в виде непрерывных нуклеотидных последовательностей в их исходном природном окружении.

ДНК-конструкция, которая обеспечивает прямую временную и пространственную экспрессию Сап1оп-гена в рекомбинантных клетках-хозяевах и в трансгенных животных.

Для того чтобы исследовать физиологические и фенотипические последствия отсутствия синтеза Сап1оп-белка, как на клеточном уровне, так и на уровне мультиклеточного организма, в настоящее изо

- 19 006367 бретение включены также ДНК-конструкции и рекомбинантные векторы, обеспечивающие обусловленную экспрессию конкретного аллеля Сап1оп-геномной последовательности или кДНК, а также копии данной геномной последовательности или кДНК, содержащие замены, делеции или добавки из одного или более оснований, что касается Сап1оп-нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ΙΌ Ыох 1-4, или ее фрагмента, причем данные замены, делеции или добавки оснований локализованы в экзоне, интроне или регуляторной последовательности, но предпочтительно в 5'-регуляторной последовательности или в экзоне Сап1оп-геномной последовательности, или в Сап1оп-кДНК 8ЕЦ ΙΌ Ыо 4. В предпочтительном варианте осуществления Сап1оп-последовательность включает двуаллельный маркер настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения Сап1оп-последовательность включает двуаллельный маркер настоящего изобретения, предпочтительно один из двуаллельных маркеров А1-А17.

Настоящее изобретение содержит рекомбинантные векторы, включающие любой один из полинуклеотидов, описанных в настоящем изобретении. В частности, полинуклеотидные конструкции, в соответствии с настоящим изобретением, могут включать любой из полинуклеотидов, описанных в разделе Геномные последовательности Сап1оп-гена, в разделе кДНК-последовательности Сап1оп, в разделе Кодирующие области и в разделе Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

Первую предпочтительную ДНК-конструкцию создают на основе оперона устойчивости к тетрациклину (е( из транспозона Тп10 Е. сой для контроля экспрессии Сап1оп-гена так, как описано у Соххеп и соавт. (1992, 1995) и у Биг(11 и соавт. (1994). Такая ДНК-конструкция содержит семь (е(-операторных последовательностей из Тп10 (1с(ор), которые сливаются с минимальным промотором или с 5'регуляторной последовательностью Сап1оп-гена, причем указанный минимальный промотор или указанную Сап1оп-регуляторную последовательность функционально присоединяют к представляющему интерес полинуклеотиду, который кодирует смысловой или антисмысловой олигонуклеотид или полипептид, включая Сап1оп-полипептид или его пептидный фрагмент. Данная ДНК-конструкция является функциональной в качестве условной экспрессионной системы представляющей интерес нуклеотидной последовательности, где одна и та же клетка включает нуклеотидную последовательность, кодирующую репрессор дикого типа ((ТА) или мутантный (гТА) репрессор, слитый с активирующим доменом вирусного белка УР16 из вируса простого герпеса, помещенного под контроль промотора, такого как НСМУ1Е1 энхансер/промотор или ММТУ-ЬТВ. Фактически предпочтительная ДНК-конструкция настоящего изобретения включает как полинуклеотид, содержащий (е(-операторную последовательность, так и полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую репрессор (ТА или гТА.

В конкретном варианте осуществлении настоящего изобретения условная экспрессионная ДНКконструкция содержит последовательность, кодирующую мутантный тетрациклиновый репрессор гТА, причем экспрессия представляющего интерес полинуклеотида является молчащей в отсутствие тетрациклина и индуцируется в его присутствии.

ДНК-конструкции, обеспечивающие гомологичную рекомбинацию: замещающие векторы

Вторая предпочтительная ДНК-конструкция включает, от 5'-конца до З'-конца: (а) первую нуклеотидную последовательность, которая включена в Сап1оп-геномную последовательность; (Ь) нуклеотидную последовательность, включающую позитивный селективный маркер, такой как маркер устойчивости к неомицину (пео); и (с) вторую нуклеотидную последовательность, которая включена в Сап1опгеномную последовательность и локализована в геноме справа от первой Сап1оп-нуклеотидной последовательности (а).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данная ДНК-конструкция включает также негативный селективный маркер, расположенный слева от нуклеотидной последовательности (а) или справа от нуклеотидной последовательности (с). Предпочтительно, если негативный селективный маркер включает ген тимидинкиназы ((к) (Тйотах и соавт., 1986), ген бета-гигромицина (Те Ктс1е и соавт., 1990), 11рг(-ген (Уап бег Ьидй( и соавт., 1991; Ве1б и соавт., 1990) или фрагмент гена дифтерийного токсина А (Э(-А) (Ыаба и соавт., 1993; Уащ и соавт., 1990). Предпочтительно, если позитивный селективный маркер локализован в экзоне Сап1оп-последовательности так, что разрывает данную последовательность, кодирующую Сап1оп-белок. Данные замещающие векторы описаны, например, у Тйотах и соавт. (1986; 1987), Мапхоиг и соавт. (1988) и у Ко11ег и соавт. (1992).

Безразлично где расположить первую и вторую нуклеотидные последовательности (а) и (с) - в Сап1оп-регуляторной последовательности, в интронной последовательности, в экзонной последовательности или в последовательности, содержащей и регуляторную и/или интронную и/или экзонную последовательности. Размер нуклеотидных последовательностей (а) и (с) колеблется от 1 до 50 т.п.н., предпочтительно от 1 до 10 т.п.н., более предпочтительно от 2 до 6 т.п.н. и наиболее предпочтительно от 2 до 4 т. п. н.

ДНК-конструкции, обеспечивающие гомологичную рекомбинацию: Сге-ЬохР-система.

Такие новые ДНК-конструкции используют в сайт-специфичной рекомбинационной системе фага Р1. Фаг Р1 обладает рекомбиназой, именуемой Сге, которая специфически взаимодействует с 34 парами нуклеотидов 1охР-байта. Данный 1охР-сайт составлен из двух палиндромных последовательностей из 1 3 п.н., разделенных 8 п.н. консервативной последовательности (Ноехх и соавт., 1986). Рекомбинация между

- 20 006367 двумя 1охР-сайтами, обладающими идентичной ориентацией, с помощью Сге-фермента приводила к удалению ДНК-фрагмента.

Сге-1охР-система, используемая в сочетании с методом гомологичной рекомбинации, впервые была описана Си и соавт. (1993, 1994). Вкратце, представляющую интерес нуклеотидную последовательность встраивают в намеченное место генома, содержащего по меньшей мере два 1охР-сайта в одной и той же ориентации и расположенных на соответствующих концах нуклеотидной последовательности, которую вырезают из данного рекомбинантного генома. Данное экцизионное событие требует присутствия в ядре рекомбинантной клетки-хозяина фермента рекомбиназы (Сге). Фермент рекомбиназу можно внести в нужное время либо с помощью (а) инкубации данных рекомбинантных клеток-хозяев в культуральный среде, содержащей данный фермент, с помощью инъекции Сге-фермента прямо в нужную клетку так, как описано у Лгак1 и соавт. (1995), или путем введения данного фермента в клетки-хозяева с помощью липосом так, как описано у ВаиЬошек и соавт. (1993); (Ь) трансфекции клетки-хозяина с помощью вектора, включающего Сге-кодирующую последовательность, функционально присоединенную к функциональному в данной рекобинантной клетке-хозяине промотору, который необязательно является индуцируемым, причем указанный вектор внедряют в данную рекомбинантную клетку-хозяина так, как описано у Си и соавт. (1993) и у 8аиег и соавт. (1988); (с) введения в геном клетки-хозяина полинуклеотида, включающего Сге-кодирующую последовательность, функционально присоединенную к функциональному в данной рекомбинантной клетке-хозяине промотору, который необязательно является индуцируемым, а указанный полинуклеотид встраивается в геном клетки-хозяина либо в результате случайного встраивания, либо в результате гомологичной рекомбинации так, как описано у Си и соавт. (1994).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения векторную последовательность, содержащую последовательность, которую встраивают в Сап1оп-ген с помощью гомологичной рекомбинации, конструируют таким образом, чтобы селективные маркеры фланкировались бы 1охР-сайтами в одной и той же ориентации в результате обработки Сге-ферментом возможно было осуществить удаление селективных маркеров, оставляя представляющие интерес Сап1оп-последовательности, которые были встроены с помощью гомологичной рекомбинации. Снова необходимы два селективных маркера: позитивный селективный маркер - для отбора по рекомбинационному событию, и негативный селективный маркер - для отбора по событию гомологичной рекомбинации. Векторы и способы с использованием Сге1охР-системы описываются у 2ои и соавт. (1994).

В соответствии с этим, третья предпочтительная ДНК-конструкция настоящего изобретения включает, от 5'-конца до 3'-конца: (а) первую нуклеотидную последовательность, которая включается в Сап1оп-геномную последовательность; (Ь) нуклеотидную последовательность, включающую полинуклеотид, кодирующий позитивный селективный маркер, причем указанная нуклеотидная последовательность дополнительно включает две последовательности, определяющие сайт, узнаваемый рекомбиназой, такой как 1охР-сайт, и данные два сайта размещаются в той же самой ориентации; и (с) вторую нуклеотидную последовательность, которая включается в Сап1оп-геномную последовательность и локализуется в данном геноме справа от первой Сап1оп-нуклеотидной последовательности (а).

Последовательности, определяющие сайт, узнаваемый рекомбиназой, такой как 1охР-сайт, предпочтительно расположены в нуклеотидной последовательности (Ь) в соответствующих местах, граничащих с нуклеотидной последовательностью, которую необходимо вырезать. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения два 1охР-сайта расположены с каждой стороны последовательности позитивного селективного маркера для того, чтобы обеспечить ее вырезание в нужное время после проявления события гомологичной рекомбинации.

В предпочтительном варианте осуществления способа с использованием описанной выше третьей ДНК-конструкции, вырезание полинуклеотидного фрагмента, ограниченного двумя сайтами, узнаваемыми рекомбиназой, предпочтительно двумя 1охР-сайтами, осуществляют в нужный момент, обусловленный наличием в геноме рекомбинантной клетки-хозяина последовательности, кодирующей Сгефермент, функционально присоединенный к промоторной последовательности, предпочтительно индуцируемому промотору, более предпочтительно к тканеспецифичной промоторной последовательности и наиболее предпочтительно к промоторной последовательности, которая одновременно является и индуцируемой, и тканеспецифичной, как это описано у Си и соавт. (1994).

Наличие Сге-фермента в геноме рекомбинантной клетки-хозяина может явиться следствием скрещивания двух трансгенных животных, где первое трансгенное животное несет представляющую интерес созданную Сап1оп-последовательность, содержащую описанные выше 1охР-сайты, а второе трансгенное животное несет Сге-кодирующую последовательность, функционально присоединенную к соответствующей промоторной последовательности, так как это описано у Си и соавт. (1994).

Пространственно-временной контроль экспрессии Сге-фермента можно также осуществить на основе аденовирусного вектора, который содержит Сге-ген, обеспечивая тем самым заражение клеток или ίπ у1уо заражение органов, для доставки Сге-фермента, так как это описано у Лп1оп апб Сгайат (1995) и у Капедае и соавт. (1995).

Описанные выше ДНК-конструкции можно использовать для введения требуемой нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, предпочтительно Сап1оп-геномной последовательности

- 21 006367 или кДНК-последовательности Сап1оп, но более предпочтительно - для введения измененной копии геномной или кДНК-последовательности Сап1оп, в заранее определенное местоположение целевого генома, приводящее либо к образованию измененной копии целевого гена (нокаутная гомологичная рекомбинация), либо к замене копии целевого гена другой копией, достаточно гомологичной, чтобы обеспечить прохождение гомологичной рекомбинации (гомологичная рекомбинация с вбиванием). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения описанные выше ДНК-конструкции могут использоваться для встраивания Сап1оп-геномной последовательности или кДНК-последовательности Сап1оп, включающей по меньшей мере один двуаллельный маркер настоящего изобретения, предпочтительно по меньшей мере один двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А17.

Ядерные антисмысловые ДНК-конструкции

Другие композиции содержат вектор настоящего изобретения, включающий олигонуклеотидный фрагмент нуклеотидной последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ыо 4, предпочтительно фрагмент, включающий старт-кодон Сап1оп-гена, в качестве антисмыслового средства, которое подавляет экспрессию соответствующего Сап1оп-гена.

Предпочтительные способы с использованием антисмыслового полинуклеотида, в соответствии с настоящим изобретением, представлены методиками, описанными у 5>схак1е1 и соавт. (1995) или методиками, описанными в РСТ-Заявке № \¥О 95/24223, раскрытие которых включено в данное описание путем ссылки во всей их полноте.

Предпочтительно, антисмысловые средства выбраны среди полинуклеотидов (длиной 15-200 п.н.), которые комплементарны 5'-концу мРНК Сап1оп. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения используется сочетание различных антисмысловых полинуклеотидов, комплементарных разным частям требуемого целевого гена.

Предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды, в соответствии с настоящим изобретением, комплементарны последовательности многих мРНК Сап1оп, которые содержат либо кодон инициации трансляции АТС, либо сайт сплайсинга. Кроме того, предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды, в соответствии с настоящим изобретением, комплементарны сайта сплайсинга мРНК Сап1оп.

Предпочтительно, если антисмысловые полинуклеотиды настоящего изобретения обладают 3'сигналом полиаденилирования, который заменен саморасщепляющейся рибозимной последовательностью так, чтобы транскрипты РНК-полимеразы II получались без поли(А) на их 3'-концах, причем эти антисмысловые полинуклеотиды оказываются неспособными выйти из ядра, что описано у Ьш и соавт. (1994). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения эти Сап1оп-антисмысловые полинуклеотиды включают также, в рибозимной кассете, гистоновую шпилечную структуру, которая стабилизирует расщепляемые транскрипты от 3'-5'-экзонуклеолитической деградации, такая структура описана у Ескпег и соавт. (1991).

Олигонуклеотидные зонды и праймеры

Полинуклеотиды, полученные из Сап1оп-гена, пригодны для выявления присутствия в тестируемом образце, по меньшей мере, копии нуклеотидной последовательности ЗЕЦ ΙΌ Ыо§ 1-4 и 6, или ее фрагмента, комплемента, или варианта.

Особенно предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 или 20000 нуклеотидов ЗЕЦ ΙΌ Ыо§ 1-3 или их комплементов. Кроме того, предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, в которых указанный непрерывный участок последовательности включает двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А17.

Другая цель настоящего изобретения заключается в получении выделенной очисткой, выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность ЗЕЦ ΙΌ Ыо 4, комплементарные ей последовательности, а также аллельные варианты и их фрагменты. Кроме того, предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенную очисткой, выделенную или рекомбинантную Сап1оп-кДНК, состоящую из, фактически состоящую из или включающую последовательность ЗЕЦ ΙΌ Ыо 4. Особенно предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов ЗЕЦ ΙΌ Ыо 4 или их комплементов. Кроме того, предпочтительные зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов ЗЕЦ ΙΌ Ыо 4 или их комплементов, где указанный непрерывный участок последовательности включает двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А12 и А16.

В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения зонды и праймеры настоящего изобретения включают выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды,

- 22 006367 включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 или 400 нуклеотидов 8ЕО ΙΌ Νο 6 или их комплементов. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный непрерывный участок последовательности 8ЕО ГО Νο 6 включает двуаллельный маркер А18.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к зондам нуклеиновых кислот, отличающимся тем, что они специфически гибридизуются в описанных выше жестких условиях с нуклеиновой кислотой, выбранной из группы, состоящей из СапФп-нуклеотидных последовательностей 8ЕО ГО Νο 13 человека, ее вариантов или последовательности, комплементарной ей.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения включены выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полинуклеотиды, состоящие или в основном состоящие из непрерывного участка последовательности из 8-50 нуклеотидов какой-либо одной 8ЕО ГО Νο§ 1-4 или 6, или его комплементов, где указанный участок включает связанный с ΟαηΙοη двуаллельный маркер в указанной последовательности; где необязательно указанный связанный с ΟαηΙοη двуаллельный маркер выбран из группы, состоящей из А1-А1 8, и ее комплементов, или, необязательно, данные двуаллельные маркеры сцеплены при нарушении равновесия. Где, необязательно, указанный участок составляет в длину 18-35 нуклеотидов, а указанный двуаллельный маркер находится в пределах 4 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида; где необязательно указанный полинуклеотид состоит из указанного непрерывного участка последовательности и указанный непрерывный участок последовательности составляет 25 нуклеотидов в длину, а указанный двуаллельный маркер находится в центре указанного полинуклеотида; где необязательно 3'-конец указанного участка непрерывной последовательности представлен на 3'-конце указанного полинуклеотида; и где необязательно 3'-конец указанного непрерывного участка последовательности расположен на 3'-конце указанного полинуклеотида, а указанный двуаллельный маркер представлен на 3'-конце указанного полинуклеотида. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные зонды включают, состоят или в основном состоят из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: Р1-Р18 и комплементарных им последовательностей.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полинуклеотиды, включающие, состоящие, в основном состоящие из непрерывного участка последовательности 8-50 нуклеотидов 8ЕО ГО Νο§ 1-4, или их комплементов, где 3'-конец указанного непрерывного участка последовательности расположен на 3'-конце указанного полинуклеотида, и где 3'-конец указанного полинуклеотида расположен в пределах 20 нуклеотидов слева от связанного с ΟαηΙοη двуаллельного маркера в указанной последовательности; где, необязательно, указанный двуаллельный маркер, связанный с СаηIοη, выбран из группы, состоящей из А1-А18, и их комплементов, или необязательно двуаллельные маркеры, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; где необязательно 3'-конец указанного полинуклеотида расположен в указанной последовательности 1 нуклеотидом «левее» от указанного двуаллельного маркера, связанного с СаηIοη; и где, необязательно, указанный полинуклеотид состоит, в основном, из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: Ό1-Ό18 и Е1-Е18.

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя выделенные, выделенные очисткой или рекомбинантные полинуклеотиды, включающие, состоящие, в основном состоящие, из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: В1-В17 и С1-С17.

В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение включает в себя полинуклеотиды, используемые в гибридизационном анализе, секвенирующем анализе и в анализе ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания для определения нуклеотидной идентичности двуаллельного маркера, связанного с ΟαηΙοη. в 8ЕО ГО Νο§ 1-4 и 6 или в их комплементах, а также полинуклеотиды, используемые для амплификации нуклеотидных сегментов, включающих двуаллельный маркер, связанный с СаηIοη, в 8ЕО ГО Νο§ 1-4 и 6 или в их комплементах; где, необязательно, указанный двуаллельный маркер, связанный с СаηIοη, выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или необязательно двуаллельные маркеры сцеплены к тому же при нарушении равновесия.

В настоящем изобретении рассматривается использование полинуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, для определения нуклеотидной идентичности двуаллельного маркера, связанного с СаηIοη, предпочтительно в гибридизационном анализе, секвенирующем анализе, микросеквенирующем анализе или методом ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания и амплификацией нуклеотидных сегментов, включающих двуаллельный маркер, связанный с СаηIοη.

Зонд или праймер, в соответствии с настоящим изобретением, обладает около 8-1000 нуклеотидов в длину или задан по крайней мере 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидами в длину. Более предпочтительно, длина таких зондов и праймеров может колебаться от 8, 10, 15, 20 или 30-100 нуклеотидов, предпочтительно от 10 до 50, более предпочтительно от 15 до 30 нуклеотидов. У коротких зондов и праймеров обычно недостаточно специфичности для целевой последовательности нуклеиновой кислоты и, как правило, нужны пониженные температуры для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Более длинные зонды и праймеры являются дорогостоящими в изготовлении и могут иногда самогибридизоваться с образованием шпилечных структур. Надлежащую длину для праймеров и зондов под конкретный комплекс аналитических условий может эмпириче

- 23 006367 ски определить специалист в данной области техники. Предпочтительный зонд или праймер состоит из нуклеиновой кислоты, включающей полинуклеотид, выбранный из группы нуклеотидных последовательностей Р1-Р18 и их комплементарных последовательностей, В1-В17, С1-С17, Ό1-Ό18, Е1-Е1 8, для которых соответственные местоположения в списке последовательностей представлены в табл. 1, 2 и З.

Образование стабильных гибридов зависит от температуры плавления (Тт) ДНК. Тт зависит от длины праймера или зонда, ионной силы данного раствора и содержания С+С. Чем выше содержание С+С праймера или зонда, тем выше температура плавления, потому что С:С пары удерживаются тремя Н-связями, тогда как А:Т пары удерживаются только двумя такими связями. СС-содержание в зондах настоящего изобретения, как правило, колеблется между 10 и 75%, предпочтительно между 35 и 60%, и наиболее предпочтительно между 40 и 55%.

Праймеры и зонды можно изготовить любым подходящим способом, включая, например, клонирование и рестрикцию соответствующих последовательностей, а также способом прямого химического синтеза, например, таким как фосфодиэфирный способ №гапд и соавт. (1979), фосфодиэфирный способ Вгочп и соавт. (1979), диэтилфосфоамидитный способ Веаисаде и соавт. (1981) и твердофазный способ, описанный в ЕР 0707592.

Зонды для детекции представляют собой, как правило, последовательности нуклеиновых кислот или незаряженные аналоги нуклеиновых кислот, такие, например, как пептидонуклеиновые кислоты, которые раскрыты в Международной патентной заявке \¥О 92/20702, морфолиновые аналоги, которые описаны в патентах США №№ 5185444; 5034506 и 5142047. Зонд может оказаться не удлиняемым, поскольку дополнительные 6ΝΤΡ невозможно добавить к данному зонду. Внутри себя аналоги, как правило, не удлиняемы, и зонды нуклеиновых кислот могут оказываться неудлиняемыми из-за модификации 3'-конца данного зонда, так что гидроксильная группа уже не способна участвовать в элонгации. Например, 3'-конец данного зонда может быть функционализирован захватом или детекцией метки, чтобы таким образом истратить или иначе блокировать данную гидроксильную группу. С другой стороны, 3'гидроксильная группа может попросту отщепиться, заместиться или модифицироваться патентная заявка США, порядковый №07/049061, поданная 19 апреля 1993 г., описывает модификации, которые могут использоваться для придания зонду неудлиняемости.

Любой полинуклеотид настоящего изобретения можно пометить при желании путем включения любой метки, известной в данной области техники, которая обнаруживается спектроскопическим, фотохимическим, биохимическим, иммунохимическим или химическим способом. Например, используемые 32 35 3 125 метки включают радиоактивные вещества (в том числе, Р , 8 , Н , I ), флуоресцентные красители (в том числе, 5-бромдезоксиуридин, флуоресцеин, ацетиламинофтор, дигоксигенин) или биотин. Предпочтительно, полинуклеотиды метят по их 3'- и 5'-концам. Примеры нерадиоактивного мечения фрагментов нуклеиновых кислот описаны во французском патенте № ЕР-7810975 или у Игбеа и соавт. (1988), или у 8апс11ех-Ре5сабог и соавт. (1988). Кроме того, зонды, в соответствии с настоящим изобретением, могут иметь структурные характеристики, которые делают возможным усиление сигнала, причем такими структурными характеристиками являются, например, разветвленные ДНК-зонды, как те, что описаны у Игбеа и соавт. (1991) или в Европейском патенте № ЕР0225807 (СЫгоп).

Метку можно также использовать для захвата данного праймера, с тем, чтобы обеспечить иммобилизацию на твердом носителе либо данного праймера, либо удлиненного продукта, такого как амплифицированная ДНК. Введенная метка присоединяется к праймерам или к зондам и может представлять собой связывающий член, который образует связывающую пару вместе со специфичным связывающим членом твердофазного реагента (например, биотин и стрептавидин). Поэтому, в зависимости от типа метки, переносимой полинуклеотидом или зондом, ее можно использовать для улавливания или для обнаружения ДНК-мишени. Кроме того, следует иметь в виду, что созданные в данном описании полинуклеотиды, праймеры или зонды могут, сами по себе, служить в качестве захватной метки. Например, в том случае, когда связывающий член твердофазного реагента представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, его можно выбрать так, чтобы он связывал комплементарную часть праймера или зонда с тем, чтобы иммобилизовать данный праймер или зонд на данную твердую фазу. В случае если полинуклеотидный зонд сам служит в качестве связывающего члена, специалисты должны знать, что данный зонд будет содержать последовательность или хвост, который не комплементарен данной мишени. В том случае, если полинуклеотидный праймер сам служит в качестве захватной метки по меньшей мере часть данного праймера будет свободна для гибридизации с нуклеиновой кислотой на твердой фазе. Методы меченья ДНК хорошо известны квалифицированным специалистам.

Зонды настоящего изобретения пригодны для многих целей. Они могут, в частности, использоваться в Саузерн-гибридизации с геномной ДНК. Зонды могут также использоваться для обнаружения продуктов ПЦР-амплификации. При использовании других методик они могут также использоваться для обнаружения несоответствий в Сап1оп-гене или мРНК. Они могут также использоваться для обнаружения экспрессии Сап1оп-гена, например, в Нозерн-блоте.

Любой полинуклеотид, праймер или зонд настоящего изобретения можно удобно иммобилизовать на твердый носитель. Твердые носители хорошо известны специалистам в данной области техники и включают стенки лунок реакционной кюветы, пробирки, шарики из полистирола, магнитные шарики,

- 24 006367 полоски нитроцеллюлозы, мембраны, микрочастицы, такие как латексные частицы, эритроциты барана (или другого животного), йигасу1ек и другие. Твердый носитель не является ключевым и его может выбрать специалист в данной области техники. Таким образом, латексные частицы, микрочастицы, намагниченные и ненамагниченные шарики, мембраны, пластмассовые пробирки, стенки лунок для микротитрования, стеклянное или силиконовое крошево, эритроциты барана (или иных подходящих животных) и йигасу1ек (мозговые оболочки), все, представляют собой подходящие модели. Соответствующие способы иммобилизации нуклеиновых кислот на твердых фазах включают ионное, гидрофобное, ковалентное взаимодействие и т.п. Используемый в данном описании твердый носитель относится к любому нерастворимому материалу, или его можно сделать нерастворимым в последующей реакции. Твердый носитель можно выбрать в соответствии с его способностью притягивать и иммобилизовать захватный реагент. Или же, данная твердая фаза может удерживать дополнительный рецептор, который обладает способностью притягивать и иммобилизовать захватный реагент. Дополнительный рецептор может включать заряженное вещество, которое противоположно заряжено по отношению к собственно захватному реагенту или к заряженному веществу, конъюгированному с данным захватным реагентом. Согласно еще одной альтернативе, рецепторная молекула может представлять собой любой специфический связывающий член, который иммобилизуется на (присоединяется к) твердом носителе, и который обладает способностью иммобилизовать захватный реагент посредством специфичной реакции связывания. Рецепторная молекула делает возможным непрямое связывание захватного реагента с материалом твердого носителя перед осуществлением анализа или в течение осуществления данного анализа. Твердая фаза, таким образом, может быть представлена пластмассой, производными пластмассы, намагниченным или ненамагниченным металлом, стеклянной или силиконовой поверхностью пробирки, лункой для микротитрования, полоской, шариком, микрочастицей, крошкой, эритроцитами барана (или иных подходящих животных), йигасу!ек® и другими формами, хорошо известными среднему специалисту в данной области техники. Полинуклеотиды настоящего изобретения можно присоединять или иммобилизовать на твердом носителе индивидуально или группами по меньшей мере из 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 или 25 разных полинуклеотидов настоящего изобретения с единственным твердым носителем. Кроме того, полинуклеотиды, отличающиеся от полинуклеотидов настоящего изобретения, можно присоединять к тому же твердому носителю, к которому присоединены один или несколько полинуклеотидов настоящего изобретения.

Следовательно, настоящее изобретение включает также способ для обнаружения присутствующей нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш Иок 1-4 и 6, ее фрагмента или варианта, и комплементарную ей последовательность, в образце, причем указанный способ включает следующие стадии:

a) приведение в контакт зонда нуклеиновой кислоты или совокупности зондов нуклеиновой кислоты, которые могут гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, включенной в нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 8ЕО Ш Иок 1-4 и 6, их фрагмента или варианта, и комплементарную ей последовательность, и анализируемого образца; и

b) выявление гибридного комплекса, образованного между зондом и нуклеиновой кислотой данного образца.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается набор для детектирования присутствующей нуклеиновой кислоты, включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей 8ЕО Ш Иок 1-4 и 6, ее фрагмента или варианта, и комплементарную ей последовательность, в образце, причем указанный набор включает:

a) зонд нуклеиновой кислоты или множество данных зондов нуклеиновой кислоты, которые могут гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью, включенной в нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей 8ЕО Ш Иок 1-4 и 6, ее фрагмента или варианта, и комплементарной ей последовательности; и

b) необязательно, реагенты, необходимые для осуществления реакции гибридизации.

В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный способ детекции и набор, отличаются тем, что указанный зонд нуклеиновой кислоты или множество данных зондов нуклеиновой кислоты метят с помощью детектируемой молекулы. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ и набор отличаются тем, что указанный зонд нуклеиновой кислоты или множество данных зондов нуклеиновой кислоты были иммобилизованы на субстрате. В третьем предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данный зонд нуклеиновой кислоты или множество данных зондов нуклеиновой кислоты включают либо последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей Р1-Р18 и комплементарной им последовательности, В1-В17, С1-С17, Ό1-Ό18, Е1-Е18, либо двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов.

Олигонуклеотидные наборы

Любой субстрат, включающий множество олигонуклеотидных праймеров или зондов настоящего изобретения, может использоваться либо для детекции или амплификации последовательностеймишеней Сап1оп-гена, либо может также использоваться для детекции мутаций в кодирующих и некодирующих последовательностях Сап1оп-гена.

- 25 006367

Любой созданный в данном описании полинуклеотид можно присоединить в области перекрывания или в случайные места данного твердого носителя. Альтернативно, полинуклеотиды настоящего изобретения можно присоединить в виде упорядоченного набора, где каждый полинуклеотид присоединяется к определенной области твердого носителя, которая не перекрывается с участком присоединения любого другого полинуклеотида. Предпочтительно, такой упорядоченный набор полинуклеотидов создают адресным, где отдельные участки регистрируются и могут быть доступны как часть аналитического метода. Адресные полинуклеотидные наборы обычно включают множество различных олигонуклеотидных зондов, которые связаны с поверхностью субстрата в разных известных местах. Знание точного расположения каждого полинуклеотида делает эти адресные наборы особенно пригодными для методов гибридизации. Любая технология адресного набора, известная в данной области техники, может использоваться для полинуклеотидов настоящего изобретения. Один из конкретных вариантов осуществления данных полинуклеотидных наборов известен в качестве СепесЫрк™, и в основном описан в патенте США №5143854; публикациях РСТ \УО 90/15070 и 92/10092. Данные наборы обычно можно получить с использованием методов автоматизированного синтеза или методов светонаправленного синтеза, которые включают сочетание фотолитографических способов и твердофазного олигонуклеотидного синтеза (Гобог и соавт., 1991). Иммобилизация наборов олигонуклеотидов на твердых носителях представляется возможной благодаря развитию технологии, обычно идентифицируемой как Уегу Ьагде Зса1е 1ттоЫΙί/еб Ро1утег ЗугИкебк (Крупномасштабный синтез иммобилизованного полимера) (УЬ81Р8™), в которой, как правило, зонды иммобилизуются в виде набора с высокой плотностью на твердой поверхности чипа. Примеры технологий УБ81Р8™ представлены в патентах США №№5143854; и 5412087, а также в публикациях РСТ \УО 90/15070, \УО 92/10092 и \УО 95/11995, в которых описываются способы создания олигонуклеотидных наборов с помощью таких методов, как методы по светонаправленному синтезу. В разработанных методиках, предназначенных для создания наборов нуклеотидов, иммобилизованных на твердых носителях, дополнительно были разработаны методики представления для приведения в порядок и представления олигонуклеотидных наборов на чипах в попытке извлечь максимальную пользу из паттернов гибридизации и информации о последовательности. Примеры таких методик представления раскрыты в публикациях РСТ \УО 94/12305, \УО 94/11530, \УО 97/29212 и \УО 97/31256, раскрытие которых включено путем ссылки во всей их полноте.

В другом варианте осуществления олигонуклеотидных наборов настоящего изобретения матрица олигонуклеотидного зонда может преимущественно использоваться для обнаружения мутаций, встречаемых в Сап1оп-гене и предпочтительно в его регуляторной области. Для этой конкретной цели специально создают зонды, которые обладают нуклеотидной последовательностью, обеспечивающей их гибридизацию с генами, которые несут известные мутации (в результате делеции, вставки или замены одного или нескольких нуклеотидов). Для известных мутаций это означает, что мутации в Сап1оп-гене были идентифицированы в соответствии, например, с методом, используемым Ниапд и соавт. (1996) и Заткоп и соавт. (1996).

В другом методе, который используется для обнаружения мутаций в С.'ап1оп-гене. используют набор ДНК высокой плотности. Каждый олигонуклеотидный зонд, составляющий единичный элемент набора ДНК высокой плотности, создается для сопоставления специфичной субпоследовательности геномной ДНК или кДНК Сап1оп. Таким образом, набор, состоящий из олигонуклеотидов, комплементарных субпоследовательностям из последовательности гена-мишени, используют для определения идентичности целевой последовательности с последовательностью природного гена, измерения его количества, обнаружения различий между целевой последовательностью и стандартной последовательностью природного гена из Сап1оп-гена. Одна такая конструкция, названная 4Ь-плиточный набор (4Ь б1еб аггау), представляет собой группу из четырех зондов (А, С, С, Т), предпочтительно 15-нуклеотидных олигомеров. В каждой группе из четырех зондов полный комплемент будет гибридизоваться более интенсивно, чем комплементарно несогласованные зонды. Следовательно, целевая нуклеиновая кислота длиной Ь сканируется по мутациям с помощью «плиточного» набора, содержащего 4Ь-зонды, причем весь набор зондов содержит все возможные мутации в известной стандартной природной последовательности. Гибридизационные сигналы группы 15-мерного зонда «плиточного» набора нарушаются из-за единственной замены основания в целевой последовательности. Вследствие этого происходит характерная утрата сигнала или футпринта для зондов, фланкирующих положение мутации. Данный метод описан Скее и соавт. (1996).

Следовательно, в настоящем изобретении рассматривается набор молекул нуклеиновых кислот, включающих по меньшей мере один полинуклеотид, описанный выше в качестве зондов и праймеров. Предпочтительно, в настоящем изобретении рассматривается набор нуклеиновой кислоты, включающей, по меньшей мере два полинуклеотида описанных выше в качестве зондов и праймеров.

Дополнительная цель настоящего изобретения заключается в создании набора последовательностей нуклеиновых кислот, включающих по меньшей мере одну из последовательностей, выбранную из группы, состоящей из Р1-Р18, В1-В17, С1-С17, Ό1-Ό18, Е1-Е18, комплементарных ей последовательностей, ее фрагментов по меньшей мере из 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30 или 40 последовательных нуклеотидов либо по меньшей мере одну последовательность, включающую двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18, и его комплементов.

- 26 006367

Настоящее изобретение относится также к набору последовательностей нуклеиновых кислот, включающих либо по меньшей мере две последовательности, выбранные из группы, состоящей из Р1-Р18, В1В17, С1-С17, Ό1-Ό18, Е1-Е18, комплементарных ей последовательностей, ее фрагмента по меньшей мере из 8 последовательных нуклеотидов, либо по меньшей мере две последовательности, включающие двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18, и его комплементов.

Сап1оп-белки и полипептидные фрагменты

Термин Сап1оп-полипептиды используется в данном описании для охвата всех белков и полипептидов настоящего изобретения. Кроме того, образующей частью настоящего изобретения являются полипептиды, кодируемые полинуклеотидами настоящего изобретения, а также слитые полипептиды, включающие такие полипептиды. В настоящем изобретении содержатся Сап1оп-белки людей, включая выделенные или выделенные очисткой Сап1оп-белки, состоящие, состоящие в основном или включающие последовательность 8Ε0 ΙΌ № 5.

В настоящем изобретении рассматривается полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΌ № 1-4 и 6, комплементарной ей последовательностью или ее фрагментом.

В настоящем изобретении содержатся выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полипептиды, включающие непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 или 1700 аминокислот 5ΕΟ ΙΌ № 5. В других предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения непрерывный участок из аминокислот включает участок с мутацией или функциональной мутацией, включающий делецию, добавку, перестановку, укороченные аминокислоты в белковой последовательности Сап!оп.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, настоящее изобретение содержит выделенные, выделенные очисткой и рекомбинантные полипептиды, включающие непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 6 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 8-10 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 или 1700 аминокислот 8ΕΟ ΙΌ № 5, где непрерывный участок включает, по меньшей мере, 1, 2, 3, 5 или 10 аминокислотных позиций 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 из 5ΕΟ ΙΌ № 5. Предпочтительно, указанный непрерывный участок 8ΕΟ ΙΌ № 5 включает остаток Аланина в положении 277; Серин в положении 338; Валин в положении 574; Лейцин в положении 678; Серин в положении 680; Треонин в положении 683; Гистидин в положении 691; Серин в положении 692; Серин в положении 695; Алании в положении 696; Изолейцин в положении 697; Изолейцин в положении 894; Лизин в положении 1480; Аргинин в положении 1481; Глицин в положении 1483; Валин в положении 1484; Изолейцин в положении 1485; Аспарагин в положении 1630; Серин в положении 1631; Метионин в положении 1632; Треонин в положении 1636; Алании в положении 1660; Фенилаланин в положении 1667; Треонин в положении 1707; и/или Алании в положении 1709. Обеспечены также полинуклеотиды, кодирующие любой из этих полипептидов.

Настоящее изобретение включает также в себя выделенные очисткой, выделенные или рекомбинантные полипептиды, включающие аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% аминокислотной идентичностью с аминокислотной последовательностью 8ΕΟ ΙΌ № 5 или с ее фрагментом.

Сайоп-белки предпочтительно выделяют из тканевых образцов человека или млекопитающих или экспрессируют из генов человека или млекопитающих. Сайоп-полипептиды настоящего изобретения могут быть получены с использованием стандартных способов экспрессии, известных в данной области техники. Полинуклеотид, кодирующий требуемый полипептид, лигируют в экспрессионный вектор, приемлемый для любого удобного хозяина. Эукариотическая и прокариотическая хозяйская система, та и другая, используются для создания рекомбинантных полипептидов, при этом кратко излагаются некоторые наиболее распространенные системы. Затем полипептид выделяют из лизированных клеток или из культуральной среды и выделяют очисткой до степени, необходимой для его предполагаемого использования. Очистку осуществляют с помощью любого метода, известного в данной области техники, например, дифференциальным экстрагированием, солевым фракционированием, хроматографией, центрифугированием и т.п. См., например, МеФокк т Εηζутο1οду для разнообразных способов по выделению очисткой белков.

Кроме того, короткие белковые фрагменты получают химическим синтезом. Альтернативно, белки настоящего изобретения экстрагируют из клеток или тканей людей или животных, не принадлежащих человеческому роду. Способы выделения очисткой белков известны в данной области техники и включают использование детергентов или хаотропных агентов, которые дезинтегрируют (разобщают) частицы, за которым следует дифференциальное экстрагирование и разделение полипептидов с помощью ионообменной хроматографии, хроматографии по сродству, осаждения в соответствии с плотностью и гель-электрофореза.

Любая кДНК СапТоп, включая 8ΕΟ ΙΌ № 4, может использоваться для экспрессии СапТоп-белков и

- 27 006367 полипептидов. Нуклеиновую кислоту, кодирующую экспрессируемый Сап1оп-белок или полипептид, функционально присоединяют к промотору в экспрессионном векторе с использованием традиционной техники клонирования. Сап1оп-вставка в данный экспрессионный вектор может включать полную кодирующую последовательность для Сап1оп-белка или его части.

Экспрессионный вектор представляет собой любую экспрессионную систему млекопитающего, дрожжей, насекомого или бактерии, известную в данной области техники. Коммерчески доступные векторы и экспрессионные системы можно получить от разных поставщиков, включая СепеЕск ИчкЕЕПе (СатЬпбде, МА), 8!га!адепе (Ьа 1о11а, СайГогтаа), Рготеда (Майкоп, νίκ^^ω) и 1пуйгодеп (8ап Эчедо, СайГогтаа). При желании для усиления экспрессии и обеспечения надлежащей упаковки белка, для конкретного экспрессионного организма, в который интродуцирован экспрессионный вектор, оптимизируют кодоновый фон и спаривание кодонов данной последовательности, в соответствии с разъяснениями На!Пе1б и соавт., патент США №5082767, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полную кодирующую последовательность кДНК Сап1оп, включая полиА-сигнал кДНК, функционально присоединяют к промотору данного экспрессионного вектора. Альтернативно, если нуклеиновая кислота кодирует часть Сап1оп-белка, в котором отсутствует метионин, служащий в качестве сайта инициации, инициирующий метионин можно встроить рядом с первым кодоном данной нуклеиновой кислоты с использованием традиционных методов. Также, если в данной вставке из кДНК Сап1оп отсутствует полиА-сигнал, данную последовательность можно добавить в конструкцию, например, путем вырезания полиА-сигнала из р8О5 (8!га!адепе) с использованием эндонуклеаз рестрикции Вд11 и 8а11 и встраивания в экспрессионный вектор рХТ1 (8!га!адепе) млекопитающего. рХТ1 содержит ЬТК и часть дад-гена вируса лейкоза мышей Молони. Положение ЬТК в данной конструкции делает возможной эффективную стабильную трансфекцию. Данный вектор включает тимидинкиназный промотор вируса простого герпеса и селективный ген неомицина. Нуклеиновую кислоту, кодирующую Сап1оп-белок или его часть, получают с помощью ПЦР из бактериального вектора, содержащего Сап1оп-кДНК 8ЕО ГО № 5 с использованием олигонуклеотидных праймеров, комплементарных Сап1оп-кДНК или ее части и содержащих последовательность для рестрицированной эндонуклеазы ΡκΐΙ, встраиваемую в 5'-праймер, и Вд111-последовательность, встраиваемую в 5'конец соответствующего 3'-праймера кДНК, обеспечивая данной последовательности, кодирующей Сап1оп-белок или его часть, надлежащее расположение относительно полиА-сигнала. Выделенный очисткой фрагмент, полученный в окончательной ПЦР-реакции, расщепляют с помощью ΡκΐΙ, затупляют по концам нуклеазой, расщепляют с помощью Вд1 ΙΙ, выделяют очисткой и лигируют с ХТ1, содержащем полиА-сигнал и расщепляют с помощью Вд111.

Данный лигированный продукт можно трансфицировать в мышиные Ы1Н3Т3-клетки с использованием ЫроГесйп (ЫГе Тесйпо1од1ек, 1пс., Сгапб 1к1ап6, Νον Уогк) в условиях, вкратце изложенных в описании к данному продукту. Позитивные трансфектанты отбирают после выращивания трансфицированных клеток в 600 ид/мл С418 (81дта, 8ΐ. Ьошк, МЕкошт).

Приведенные выше протоколы можно также использовать для экспрессии мутантного Сап1опбелка, ответственного за обнаруживаемый фенотип, или его части.

Экспрессированный белок можно выделить очисткой с использованием традиционных методов очистки, таких как осаждение сульфатом аммония или хроматографическим разделением по размеру или заряду. Белок, кодируемый встроенной нуклеиновой кислотой, можно также выделить очисткой с использованием стандартных иммунохроматографических методов. В таких протоколах раствор, такой как клеточный экстракт, содержащий экспрессированный Сап1оп-белок или его часть, наносят на колонку, содержащую антитела к Сап1оп-белку или его части, которые присоединяют к хроматографическому матриксу. Экспрессированному белку дают возможность связаться иммунохроматографической колонкой. Затем колонку промывают для удаления неспецифически связавшихся белков. После чего специфически связавшийся экспрессированный белок высвобождают из колонки и извлекают с использованием стандартных методов.

Для подтверждения экспрессии Сап1оп-белка или его части, белки, экспрессированные из клетокхозяев, содержащих экспрессионный вектор, содержащий вставку, кодирующую Сап1оп-белок или его часть, можно сравнить с белками, экспрессированными из клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор без вставки. Наличие полосы в образцах клеток, содержащих экспрессионный вектор со вставкой, которая отсутствует в образцах из клеток, содержащих экспрессионный вектор без вставки, свидетельствует о том, что Сап1оп-белок или его часть экспрессируются. Как правило, данная полоса будет обладать подвижностью, ожидаемой для Сап1оп-белка или его части. Однако данная полоса может обладать подвижностью, отличающейся от ожидаемой из-за модификаций, таких как гликозилирование, убихитинизиция или ферментативное расщепление.

Антитела, способные специфически распознавать экспрессированный Сап1оп-белок или его часть, описаны ниже.

Когда образование антител невозможно, нуклеиновые кислоты, кодирующие Сап1оп-белок или его часть, встраиваются в экспрессионный вектор, созданный для использования в схемах очистки, исполь- 28 006367 зующих химерные полипептиды. В таких методиках нуклеиновая кислота, кодирующая Сап1оп-белок или его часть, встраивается в открытую рамку считывания вместе с геном, кодирующим другую половину данной химеры. Другая половина химеры представляет собой последовательность β-глобина или последовательность, кодирующую полипептид, связывающий никель. Хроматографический матрикс, содержащий антитело к β-глобину или присоединенный к нему никель, используется для выделения очисткой химерного белка. Сайты протеазного расщепления создают генноинженерным способом между геном β-глобина или никель-связывающим полипептидом и Сап1оп-белком или его частью. Таким образом, два полипептида химеры отделяются друг от друга с помощью протеазного расщепления.

Пригодным экспрессионным вектором для образования β-глобиновых химерных белков является р8С5 (8!га!адепе), который кодирует β-глобин кролика. Интрон II кроличьего гена β-глобин обеспечивает сплайсинг экспрессируемого транскрипта, а сигнал полиаденилирования, встраиваемый в данную конструкцию, повышает уровень экспрессии. Эти методы хорошо известны в данной области молекулярной биологии. Стандартные способы опубликованы в руководствах, как например, Эау1ек и соавт. (1986), но многие способы доступны от 81га1адепе, ЫГе Тес^о^тек, 1пс., или Рготеда. Полипептид можно дополнительно получить из конструкции с использованием ш у1уо трансляционных систем, таких как 1п убго Ехргекк™ Тгапк1абоп КД (8!га!адепе).

Антитела, которые связывают Сап1оп-полипептиды настоящего изобретения

Любой Сап1оп-полипептид или целый белок можно использовать для получения антител, способных специфически связываться с экспрессируемым Сап1оп-белком или его фрагментами, которые описаны.

Антительная композиция настоящего изобретения способна специфически или селективно связываться с вариантом Сап1оп-белка 8Е0 ΙΌ Ио 5. Для антительной композиции, которая специфически связывается с первым вариантом Сап1оп, необходимо продемонстрировать в ЕЫ8А, К1А или ином анализе по связыванию антител по меньшей мере на 5, 10, 15, 20, 25, 50 или 100% более высокое связывание по сродству для полноразмерного первого варианта Сап1оп-белка, чем для полноразмерного второго варианта Сап1оп-белка. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антительная композиция способна специфически связывать Сап1оп-белок человека.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматриваются антительные композиции, поликлональные или моноклональные, способные селективно связывать или селективно связываться с эпитоп-содержащим полипептидом, включающим непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 или 1000 аминокислот 8ЕО ΙΌ Ио 5. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный непрерывный участок последовательности включает по меньшей мере 1, 2, 3, 5 или 10 аминокислотных позиций 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 8ЕЕ) ΙΌ Ио 5.

Любой Сап1оп-полипептид или целый белок можно использовать для получения антител, способных, как описано, специфически связываться с экспрессируемым Сап1оп-белком или его фрагментами.

Эпитоп может включать не менее 3 аминокислот для пространственной конформации, которая является уникальной для данного эпитопа. Как правило, эпитоп состоит по меньшей мере из 6 таких аминокислот, но чаще по меньшей мере из 8-10 таких аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антигенные эпитопы включают ряд аминокислот, которые составляют любое целое число между 3 и 50.

Фрагменты, которые функционируют в качестве эпитопов можно получить с помощью любого традиционного способа. Эпитопы можно определить в антигеном анализе 1атекоп-\Уо1Г. например, применяя компьютерную программу РКОТЕАИ с использованием значений параметров по умолчанию (Уегкюп 4.0 ^1пбо^к, ЭИА8ТАК, 1пс., 1228 8ои!Ь Рагк 81гее1 Мабкоп, XVI).

В настоящем изобретении рассматривается также выделенное очисткой или выделенное антитело, способное специфически связаться с мутантным Сап1оп-белком, его фрагментом или вариантом, включающим эпитоп мутантного Сап1оп-белка. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассматривается антитело, способное связаться с полипептидом, включающим по меньшей мере 10 последовательных аминокислот Сап1оп-белка и включающего по меньшей мере одну из аминокислот, которая может кодироваться мутациями, определяющими данный признак.

Животные или млекопитающие, не принадлежащие человеческому роду, природные или трансгенные, которые экспрессируют разные виды Сап1оп, отличные от Сап1оп, к которому требуется связывание антитела, а также животные, которые не экспрессируют Сап1оп (т.е., Сап1оп-нокаутное животное, которое описано в данном описании), особенно пригодны для получения антител. Сап1оп-нокаутные животные будут распознавать все или большинство находящихся на поверхности участков Сап1оп-белка в качестве чужеродных антигенов и, вследствие этого, производить антитела с более широким набором СапIол-эпитопов. Кроме того, меньшие полипептиды, всего лишь с 10-30 аминокислотами, могут быть пригодны для получения специфичного связывания с одним из Сап1оп-белков. К тому же, гуморальная

- 29 006367 иммунная система животных, которая продуцируют виды Сап1оп, имеющие сходство с антигенной последовательностью, будет предпочтительно распознавать различия между нативными Сап1оп-видами животного и данной антигенной последовательностью, и продуцировать антитела к этим уникальным сайтам в последовательности данного антигена. Такой метод особенно пригоден для получения антител, которые специфически связываются с любым отдельным Сап1оп-белком.

Препараты антител, полученные в соответствии с любым протоколом, пригодны для количественного иммуноанализа, в котором определяют концентрации несущих антиген веществ в биологических образцах; их также используют, полуколичественно или количественно, для идентификации антигена, присутствующего в биологическом образце. Антитела можно также использовать в терапевтических композициях для уничтожения клеток, экспрессирующих данный белок или для снижения уровня данного белка в данном организме.

Антитела настоящего изобретения можно метить радиоактивной, флуоресцентной или ферментной меткой, известной в данной области техники.

Поэтому настоящее изобретение относится также к способу детектирования специфически присутствующего в биологическом образце Сап1оп-полипептида в соответствии с настоящим изобретением, причем указанный способ включает следующие стадии:

a) приведения в контакт данного биологического образца с поликлональным или моноклональным антителом, которое специфически связывает Сап1оп-полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ Ыо 5, или его пептидный фрагмент или вариант; и

b) детектирования образованного комплекса антиген-антитело. В настоящем изобретении рассматривается также диагностический набор для детектирования в биологическом образце, в соответствии с настоящим изобретением, наличия ίη убго Сап1оп-полипептида, где указанный набор включает:

a) поликлональное или моноклональное антитело, которое специфически связывает Сап1опполипептид, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ Ыо 5, или его пептидный фрагмент или вариант, необязательно меченый;

b) реагент, обеспечивающий детекцию образованных комплексов антиген-антитело, причем указанный реагент необязательно несет метку или способен распознавать самого себя с помощью меченного реагента, в частности, в случае, если указанное выше моноклональное или поликлональное антитело само не является меченым.

Настоящее изобретение относится, таким образом, к антителам и Т-клеточным антигенным рецепторам (ТСВ), которые специфически связывают полипептиды и, в частности, эпитопы полипептидов настоящего изобретения, включая, но, не ограничиваясь ими, 1дС (в том числе 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4), 1дА (в том числе 1дА1 и 1дА2), Ι§ϋ, 1дЕ или 1дМ и 1дУ. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные антитела, представляющие собой антительные фрагменты настоящего изобретения, связывающие антиген человека, включают, но не ограничиваются ими, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ)2 и Е(аЬ')2, Еб, одноцепочечные Еу5 (ксЕу), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидной связью Еу5 (§6Еу) и фрагменты, включающие домен V,. или ν_Η. Антитела можно получить у любого животного, в том числе у птиц и млекопитающих. Предпочтительны антитела человека, мыши, кролика, козы, морской свинки, верблюда, лошади или обезьяны.

Антиген-связывающие антительные фрагменты, включая одноцепочечные антитела, могут включать вариабельную область(и), отдельно или в сочетании с полной или частичной: шарнирной областью, доменами СН1, СН2 и СН3. В настоящее изобретение включены также любые сочетания вариабельной области(ей) и шарнирной области, доменов СН1, СН2 и СН3. Кроме того, настоящее изобретение включает химерные, гуманизированные, а также моноклональные и поликлональные антитела человека, которые специфически связывают полипептиды настоящего изобретения. Настоящее изобретение к тому же включает антитела, которые являются антиидиотипическими к антителам настоящего изобретения.

Антитела настоящего изобретения могут быть моноспецифичными, биспецифичными, триспецифичными или обладать более высокой мультиспецифичностью. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичны для разных эпитопов полипептида настоящего изобретения или могут быть специфичны для полипептида настоящего изобретения, а также для гетерологичных композиций, таких как гетерологичный полипептид или вещество твердого носителя. См., например, АО 93/17715; АО 92/08802; АО 91/00360; АО 92/05793; Тиб и соавт. (1991) 1. 1шшипо1. 147:60-69; патенты №№5573920, 4474893, 5601819, 4714681, 4925648; Ко51е1пу и соавт. (1992) 1. 1шшипо1. 148:1547-1553.

Антитела настоящего изобретения могут быть описаны или охарактеризованы в пределах эпитопа(ов) или эпитопнесущей части(ей) полипептида настоящего изобретения, которые распознаются или специфически связываются с данным антителом. В случае белков настоящего изобретения, секретируемых белков, антитела могут специфически связывать полноразмерный белок, кодируемый нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, зрелый белок (т.е., белок, образованный в результате отщепления сигнального пептида), кодируемый нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, сигнальный пептид, кодируемый нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, или любой другой полипептид настоящего изобретения. Поэтому эпитоп(ы) или эпитоп, несущий часть(и) полипептида, можно точно определить, как описано в данном описании, например, по Ν-концевому и С-концевому положению, по размеру в

- 30 006367 контиге аминокислотных остатков или описать иначе (включая список последовательностей). Антитела, которые специфически связывают любой эпитоп или полипептид настоящего изобретения, можно также исключить в качестве индивидуальных видов. Таким образом, настоящее изобретение включает антитела, которые специфически связывают определенные (заданные) полипептиды настоящего изобретения, и позволяют исключить одинаковые.

Антитела настоящего изобретения можно также описать или точно определить в пределах их перекрестной реактивности. В настоящее изобретение включены антитела, которые специфически не связывают любой другой аналог, ортолог или гомолог полипептидов настоящего изобретения. В настоящее изобретение включены также антитела, которые не связывают полипептиды менее чем с 95%, менее чем с 90%, менее чем с 85%, менее чем с 80%, менее чем с 75%, менее чем с 70%, менее чем с 65%, менее чем с 60%, менее чем с 55%, менее чем с 50% идентичностью (что рассчитано с использованием способов, известных в данной области техники и описанных в данном описании) с полипептидом настоящего изобретения. Кроме того, в настоящее изобретение включены антитела, которые связывают лишь полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые гибридизуются с полинуклеотидом настоящего изобретения в жестких гибридизационных условиях (как описано в данном описании). Антитела настоящего изобретения могут быть также описаны или точно определены в терминах их связывания по сродству. Предпочтительное связывание по сродству проявляют антитела с константой диссоциации или К4 меньше 5х10^-6М, 10^-6М, 5х10^-7М, 10^-7М, 5х10^-8М, 10^-8М, 5х10^-9М, 10^-9М, 5х10^-10М, 10^-10М, 5х10^-11М, 10^-11М, 5х10^-12М, 10^-12М, 5х10^-13М, 10^-13М, 5х10^-14М, 10^-14М, 5х10^-15М и 10^-15М.

Используемые антитела настоящего изобретения включаются, но не ограничиваются ими, в известные в данной области техники способы по выделению очисткой, обнаружения и мишенирования полипептидов настоящего изобретения, в том числе ш νίΙΐΌ и ш νί\Ό диагностические и терапевтические способы. Например, в иммуноанализе антитела используют для качественного и количественного измерения уровня полипептидов настоящего изобретения в биологических образцах. См., например, Наг1оте и соавт., АЫТП’О1)1Е8: А ЬАВОРАТОРУ \1АМ.'АЕ. (Со14 8ргш§ НагЬог ЬаЬогаФгу Рге§8, 2^ы е4. 1988) (включенный в данное описание путем ссылки во всей его полноте).

Антитела настоящего изобретения могут использоваться отдельно или в сочетании с другими композициями. Данные антитела можно, кроме того, рекомбинантно сливать с гетерологичным полипептидом по Ν- или С-концу или химически конъюгировать (включая ковалентную и нековалентную конъюгацию) с полипептидами или с другими композициями. Например, антитела настоящего изобретения можно рекомбинантно слить или конъюгировать с молекулами, пригодными в качестве метки для детекционных анализов, и с эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства или токсины. См., например, \¥О 92/08495; \УО 91/14438; \УО 89/12624; Патент США №5314995; и ЕР 0396387.

Антитела настоящего изобретения можно получить любым подходящим способом, известным в данной области техники. Например, полипептид настоящего изобретения или его антигенный фрагмент можно вводить животному для того, чтобы индуцировать образование сыворотки, содержащей поликлональные антитела. Термин моноклональное антитело не ограничен антителами, получаемыми с помощью гибридомной техники. Термин антитело относится к полипептиду или к группе полипептидов, которые включают по меньшей мере один связывающий домен, где связывающий домен образуется из упакованных вариабельных доменов антительной молекулы с образованием трехмерного связывающего пространства, причем форма и заряд внутренней поверхности являются комплементарными элементам антигенной детерминанты антигена, что обеспечивает иммунологическое взаимодействие с антигеном. Термин моноклональное антитело относится к антителу, которое получают из одиночного клона, в том числе эукариотического, прокариотического или фагового клона, но не к способу, с помощью которого его получают. Моноклональные антитела можно получить с использованием весьма разнообразных методов, известных в данной области техники, в том числе с использованием гибридомной, рекомбинантной и фаговой дисплейной технологии.

Гибридомные методы включают методы, известные в данной области техники (см., например, Наг1о\у и соавт. (1998)); Наттег1т§ и соавт. (1981) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте). Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')2 можно получить, например, из гибридомно-полученных антител в результате протеолитического расщепления, с использованием ферментов, таких как папаин (для получения ЕаЬ-фрагментов) или пепсин (для образования Е(аЬ')2-фрагментов).

Альтернативно антитела настоящего изобретения можно получить путем применения техники рекомбинантных ДНК или с помощью химического синтеза с использованием способов, известных в данной области техники. Например, антитела настоящего изобретения можно получить с использованием разнообразных способов фагового дисплея, известных в данной области техники. В способах фагового дисплея функциональные антительные домены представлены на поверхности фаговой частицы, которая несет кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Фаг с требуемой связывающей способностью выбирают из набора или из комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши) путем прямого отбора по антигену, как правило, антигену, связанному или захваченному твердой по

- 31 006367 верхностью или шариком. Используемый в этих способах фаг обычно представляет собой нитчатый фаг, включающий Гб и М13 с РаЬ, Ρν или стабилизированные дисульфидной связью Ρν-домены антитела, рекомбинантно слитые с фаговым геном ΙΙΙ фага или с белком гена УШ. Примеры способов фагового дисплея, которые можно использовать для создания антител настоящего изобретения, включают способы, которые описаны у Вппктап и соавт. (1995); Атек и соавт. (1995); КеГЙеЬогоидй и соавт. (1994); Регкю и соавт. (1997); ВшТОп и соавт. (1994); РСТ/6В91/01134; νθ 90/02809; νθ 91/10737; νθ 92/01047; νθ 92/18619; νθ 93/11236; ν095/15982; νθ 95/20401; и патенты США №№5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727 и 5733743 (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).

Как описано в указанных выше ссылках, после фаговой селекции кодирующие антитело области можно выделить из данного фага и использовать для образования целых антител, в том числе и антител человека, или любого другого требуемого антигенсвязывающего фрагмента и экспрессировать в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, растительные клетки, дрожжевые и бактериальные. Например, методы для рекомбинантного производства фрагментов РаЬ, РаЬ', Р(аЬ)2 и Р(аЬ')2, можно также употребить, используя способы, известные в данной области техники, способы, раскрытые в νθ 92/22324; МиШпах и соавт. (1992); а также 8а\\И1 и соавт. (1995); а также Вейег и соавт. (1998) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).

Примеры методик, которые можно использовать для получения одноцепочечных Ρνκ и антител, включают методики, описанные в патентах США №№4946778 и 5258498; НикГоп и соавт. (1991); 81ш и соавт. (1993); и 8кегга и соавт. (1988). Для определенного использования, включая ш νί\Ό использование антител у людей и ш ν 11го детекционные анализы, предпочтительным может оказаться использование химерных, гуманизированных или антител человека. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области техники. См. например, Моггкоп (1985); 01 и соавт. (1986); 61Ше8, 8.Ό. и соавт. (1989); и патент США №5807715. Антитела можно гуманизировать с использованием разнообразных методов, включая СИВ-трансплантацию (ЕР 0239400; νθ 91/09967; патент США №5530101; и №5585089), облицовку или перекладку (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Раб1ап Е.А. (1991); 8Гибшска 6.М. и соавт. (1994); Водикка М.А. и соавт. (1994) и перестановку цепи (патент США № 5565332). Антитела человека можно создать разнообразными способами, известными в данной области техники, включая описанные выше способы фагового дисплея. См. также патенты США №№ 4444887, 4716111, 5545806, и 5814318; νθ 98/46645; νθ 98/50433; νθ 98/24893; νθ 96/34096; νθ 96/33735; и νθ 91/10741 (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).

В настоящее изобретение дополнительно включены рекомбинантно слитые антитела или химически конъюгированные (включая ковалентную и нековалентную конъюгацию) с полипептидом настоящего изобретения. Данные антитела могут оказаться специфичными для антигенов, отличных от полипептидов настоящего изобретения. Например, антитела можно использовать для мишенирования полипептидов настоящего изобретения в отдельных типах клеток либо ш νί(го. либо ш νί\Ό. путем слияния или конъюгации полипептидов настоящего изобретения с антителами, специфичными к отдельным рецепторам клеточной поверхности. Антитела, слитые или конъюгированные с полипептидами настоящего изобретения, можно также использовать в иммуноанализе ш νί(ΐΌ и в способах очистки с использованием способов, известных в данной области техники. См. например, НагЬог и соавт. выше и νθ 93/21232; ЕР 0439095; Ыагатига, Н. и соавт. (1994); патент США №5474981; 61Ше8 δ.θ. и соавт. (1992); Ре11 Н.Р. и соавт. (1991) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).

Настоящее изобретение содержит также композиции, включающие полипептиды настоящего изобретения, слитые или конъюгированные с доменами антитела, отличными от вариабельных областей. Например, полипептиды настоящего изобретения можно соединить путем слияния или конъюгировать с Рс-областью антитела или ее частью. Данная антительная часть, соединенная путем слияния с полипептидом настоящего изобретения, может включать шарнирную область, СН1-домен, СН2-домен и СН3домен или любое сочетание целых доменов или их частей. Полипептиды настоящего изобретения можно соединить путем слияния или конъюгировать с указанными выше частями антитела для повышения ш νί\Ό времени полужизни полипептидов или для использования в иммунном анализе с использованием способов, известных в данной области техники. Полипептиды можно также соединить путем слияния или конъюгировать с указанными выше частями антитела с образованием мультимеров. Например, Рссегменты, слитые с полипептидами настоящего изобретения, могут образовывать димеры в результате дисульфидного связывания между Рс-сегментами. Большие мультимерные формы можно создать путем слияния полипептидов с участками Ι§Α или !дМ. Способы слияния или конъюгации полипептидов настоящего изобретения с участками антител хорошо известны в данной области техники. См. например, патенты США №№5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5112946; ЕР 0307434, ЕР 0367166; νθ 96/04388, νθ 91/06570; АкНкепах! А и соавт. (1991); 2кепд Х.Х. и соавт. (1995); и Уб Н. и соавт. (1992) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).

Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам, которые действуют в качестве агонистов или антагонистов полипептидов настоящего изобретения. Например, настоящее изобретение включает антитела, которые частично или полностью нарушают рецептор/лигандные взаимодействия с поли

- 32 006367 пептидами настоящего изобретения. Включены также рецепторспецифичные антитела и лигандспецифичные антитела. Включены также рецепторспецифичные антитела, которые не предотвращают лигандное связывание, но предотвращают рецепторную активацию. Рецепторную активацию (т.е., сигнализацию) можно определить описанными в данном описании методами или другими методами, известными в данной области техники. Включены также рецепторспецифичные антитела, которые предотвращают как лигандное связывание, так и рецепторную активацию. Более того, включены нейтрализующие антитела, которые связывают данный лиганд и предотвращают связывание данного лиганда с данным рецептором, а также антитела, которые связывают данный лиганд и тем самым предотвращают рецепторную активацию, но не предохраняют данный лиганд от связывания данным рецептором. Кроме того, включены антитела, которые активируют данный рецептор. Эти антитела могут действовать в качестве агонистов в отношении либо всех или не всех биологических активностей, порождаемых лиганд-опосредованной рецепторной активацией. Антитела могут быть специализированными в качестве агонистов или антагонистов биологических активностей, включая описанные в данном описании специфические активности. Указанные выше антительные агонисты можно создать с использованием способов, известных в данной области техники. См. например, \¥О 96/40281; патент США №5811097; Эепд В. и соавт. (1998); СНеп Ζ. и соавт. (1998); Наггор ТА. и соавт. (1998); Ζΐιιι Ζ. и соавт. (1998); Уооп Ό.Υ. и соавт. (1998); Рга1 М. и соавт. (1998); Рйагб V. и соавт. (1997); Ыаи1агб 1. и соавт. (1997); Сагкоп ΝΌ. и соавт. (1997); Тагутап Р.Е. и соавт. (1995); Ми11ег Υ.Α. и соавт. (1998); Вайипек Р. и соавт. (1996) (указанные ссылки включены путем ссылки во всей их полноте).

Как указано выше, антитела полипептидов настоящего изобретения могут, в свою очередь, утилизироваться с образованием антиидиотипических антител, которые имитируют полипептиды настоящего изобретения, с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. См., например, Сгеепзрап апб Вопа (1989); ΝίδδίπίΓΓ (1991). Например, антитела, которые связывают и конкурентно ингибируют полипептидную мультимеризацию или связывание полипептида настоящего изобретения с лигандом, могут использоваться для получения антиидиотипов, которые имитируют полипептидную мультимеризацию или связывающий домен и, как следствие, связывают и нейтрализуют полипептид или его лиганд. Такие нейтрализующие антиидиотипические антитела можно использовать для связывания полипептида настоящего изобретения или для связывания его лигандов/рецепторов, и таким образом блокировать их биологическую активность.

Двуаллельные маркеры, связанные с Сап1оп

Преимущество двуаллельных маркеров настоящего изобретения

Сап1оп-связанные двуаллельные маркеры настоящего изобретения обеспечивают ряд существенных преимуществ по сравнению с другими генетическими маркерами, такими как РЕЬР (Полиморфизм длины фрагментов рестрикции) и νΝΤΚ (Вариабельность числа тандемных повторов) маркеры.

Первым поколением маркеров явились КЕРЬ, которые представляют собой вариации, модифицирующие длину рестрикционного фрагмента. Однако способы, используемые для идентификации и типирования КЕЬР, являются достаточно неэкономичными по материалам, усилиям и времени. Вторым поколением генетических маркеров были νΝΤΚ, которые можно распределить по категориям в качестве минисателлитов или микросателлитов. Минисателлиты представляют собой тандемно повторяющиеся последовательности ДНК, представленные блоками из 5-50 повторов, которые распределяются по областям хромосом человека в диапазоне длины от 0,1 до 20 т.п.н. Так как они представляют много возможных аллелей, их информативное содержание очень высоко. Минисателлиты оценивают, осуществляя Саузерн-блоттирование для идентификации числа тандемных повторов, присутствующих в образце нуклеиновой кислоты из отдельного тестируемого организма. Однако существует лишь 1 0⁴ потенциальных νΝΤΚ, которые можно типировать Саузерн-блоттингом. Кроме того, создание и анализ КЕЬР-маркеров и νΝΤΚ-маркеров в больших количествах являются дорогостоящим и трудоемким.

Полиморфизм единственного нуклеотида или двуаллельные маркеры можно использовать таким же образом, что и КЕЬР и νΝΤΚ, но он обладает некоторыми преимуществами. 8ИР густо распределены в геноме человека и представляет наиболее частый тип изменчивости. По имеющимся оценкам в геноме человека рассеяно более 10⁷-сайтов по 3х10⁹ пар оснований. Таким образом, 8ИР встречается с большей частотой и с большей однородностью, чем КЕЬР-маркеры и νΝΤΚ-маркеры, и это означает, что существует большая вероятность обнаружения такого маркера в непосредственной близости от представляющего интерес генетического локуса. 8ИР менее вариабельны, чем νΝΤΚ-маркеры, и мутационно более стабильны.

Кроме того, различные формы охарактеризованного полиморфизма единственного нуклеотида, такие как двуаллельные маркеры настоящего изобретения, часто легко различимы, в результате чего легче типируются стандартными методами. Двуаллельные маркеры обладают аллелями, отличающимися единственным нуклеотидом, и обладают только двумя общими аллелями, что обеспечивает параллельную детекцию и получение автоматизированной оценки. Двуаллельные маркеры настоящего изобретения обеспечивают возможность быстрого, высокопроизводительного генотипирования большого числа индивидов.

Двуаллельные маркеры густо распределены в геноме, достаточно информативны и могут анализи

- 33 006367 роваться в большом количестве. Объединенный эффект этих преимуществ делает двуаллельные маркеры чрезвычайно ценными в генетических исследованиях. Двуаллельные маркеры могут использоваться при изучении сцепления в семьях, в способах изучения общих аллелей, в исследованиях сцепления при нарушении равновесия в популяциях, в исследовании ассоциаций в популяциях заболевших и здоровых индивидов или в популяциях с позитивным признаком и в популяциях с негативным признаком. Существенный аспект настоящего изобретения заключается в том, что двуаллельные маркеры позволяют осуществлять ассоциативные исследования по идентификации генов, участвующих в комплексных признаках. В ассоциативных исследованиях анализируют частоту маркерных аллелей в несвязанных (неродственных) популяциях заболевших и здоровых индивидов и, как правило, используют для обнаружения полигенных или единичных признаков. Ассоциативные исследования можно осуществлять в общей популяции и они не ограничиваются исследованиями, выполняемыми на родственных индивидах в пораженных заболеванием семьях (исследования по сцеплению). Двуаллельные маркеры в разных генах можно скринировать параллельно для прямой ассоциации заболевания или ответа на лечение. Данный подход по множественным генам является мощным инструментом в разных генетических исследованиях человека, поскольку он определяет необходимость создания статистического показателя для проверки синергического эффекта множественных генетических факторов на отдельный фенотип, лекарственный ответ, спорадический признак или болезненное состояние со сложной генетической этиологией.

Ген-кандидат настоящего изобретения

Различные подходы можно применить для осуществления ассоциативных исследований: широкое ассоциативное исследование генома, ассоциативные исследования кандидатной области и ассоциативные исследования гена-кандидата. Широкое ассоциативное исследование генома опирается на скрининг равномерно распределенных и покрывающих весь геном генетических маркеров. Изучение генакандидата основано на исследовании генетических маркеров, специфически локализованных в генах, потенциально участвующих в биологическом пути, связанным с интересующим признаком. В настоящем изобретении ген-кандидат представлен Сап1оп. Анализ данного кандидатного гена отчетливо предоставляет упрощенный метод для идентификации генов и генных полиморфизмов, связанных с отдельными конкретными признаками при наличии определенной информации, касающейся биологии данного признака. Однако следует отметить, что все двуаллельные маркеры, раскрытые в настоящей заявке, можно использовать как часть или как часть ассоциированных исследований кандидатной области широких ассоциативных исследований генома, и такое использование специально рассматривается в настоящем изобретении и формуле изобретения.

Двуаллельные маркеры, связанные с Сап1оп, и связанные с ними полинуклеотиды

В настоящем изобретении рассматриваются также двуаллельные маркеры, связанные с Сап1оп. Используемый в данном описании термин двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, относится к группе двуаллельных маркеров, сцепленных при нарушении равновесия с Сап1оп-геном. Термин двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, включает двуаллельные маркеры, обозначенные А1-А17.

Часть двуаллельных маркеров настоящего изобретения раскрыты в табл. 2. Они также описаны в качестве полиморфизма единственного нуклеотида для признаков, связанных 8Е0 ГО 1-4 и 6. Пары праймеров, обеспечивающих амплификацию нуклеиновой кислоты, содержащей полиморфный нуклеотид из одного Сап1оп-двуаллельного маркера, приведены в табл. 1 примера 2.

Двуаллельных маркеров, связанных с Сап1оп, А1-А17, локализованы в геномной последовательности Сап1оп. Двуаллельные маркеры А12 и А16 локализованы в экзонах Сап1оп. Двуаллельный маркер А18 фланкирует Сап1оп-ген.

Настоящее изобретение относится также к выделенной очисткой и/или выделенной нуклеотидной последовательности, включающей полиморфное основание двуаллельного маркера, связанного с Сап1оп. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения данный двуаллельный маркер выбран из группы, состоящей из А1-А18, и их комплементов. Данная последовательность содержит около 8-1000 нуклеотидов в длину и предпочтительно включает, по меньшей мере, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ГО 1-4 и 6, или ее варианта, или комплементарной ей последовательности. Эти нуклеотидные последовательности включают полиморфное основание либо из аллеля 1, либо из аллеля 2 рассматриваемого двуаллельного маркера. Указанный двуаллельный маркер может находиться, необязательно, в пределах 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида или в центре указанного полинуклеотида. 3'-Конец указанного непрерывного участка последовательности может присутствовать, необязательно, на 3'-конце указанного полинуклеотида. Двуаллельный маркер может быть представлен, необязательно, на 3'-конце указанного полинуклеотида. Указанный полинуклеотид может дополнительно включать, необязательно, метку. Указанный полинуклеотид можно присоединить, необязательно, к твердому носителю. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выше полинуклеотиды можно использовать отдельно или в любом сочетании.

Настоящее изобретение относится также к выделенной очисткой и/или выделенной нуклеотидной последовательности, непрерывно включающей около 8-1000 нуклеотидов и/или предпочтительно по

- 34 006367 меньшей мере 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ Кок 1-4 и 6, или ее варианта, или комплементарной ей последовательности. 3'-Конец указанного полинуклеотида может быть локализован, необязательно, в пределах по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов «левее» от связанного с Сап1оп двуаллельного маркера в указанной последовательности. Указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17. 3'-Конец указанного полинуклеотида может быть локализован, необязательно, в пределах по меньшей мере 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидов «левее» от связанного с Сап1оп двуаллельного маркера в указанной последовательности. 3'-Конец указанного полинуклеотида может быть локализован, необязательно, на 1 нуклеотид «левее» от связанного с Сап1оп двуаллельного маркера в указанной последовательности. Указанный полинуклеотид может дополнительно включать, необязательно, метку. Указанный полинуклеотид может быть присоединен, необязательно, к твердому носителю. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выше полинуклеотиды можно использовать отдельно или в любом сочетании.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательности, включающие полиморфное основание одного из двуаллельных маркеров, перечисленных в табл. 2, выбраны из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей, которые обладают непрерывным участком, который состоит из полинуклеотида, который включен в полинуклеотид или который включает полинуклеотид, выбранный из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, изложенных в виде ампликонов, перечисленных в табл. 1, или его вариант, или комплементарную ему последовательность.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается нуклеиновая кислота, кодирующая Сап1опбелок, где указанная нуклеиновая кислота включает полиморфное основание двуаллельного маркера, выбранного из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов.

Настоящее изобретение включает также использование любого полинуклеотида для определения идентичности одного или более нуклеотидов в двуаллельном маркере, связанном с Сап1оп, или любой полинуклеотид для использования в указанном определении. Кроме того, полинуклеотиды настоящего изобретения, используемые для определения идентичности одного или нескольких нуклеотидов в двуаллельном маркере, связанном с Сап1оп, включают полинуклеотиды с любым дополнительным ограничением, описанным в данном описании, или следующие ниже полинуклеотиды, указанные отдельно или в любом сочетании. Указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или двуаллельных маркеров необязательно сцепленных к тому же при нарушении равновесия; указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или двуаллельных маркеров, необязательно сцепленных к тому же при нарушении равновесия; указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или двуаллельных маркеров, необязательно сцепленных к тому же при нарушении равновесия. Указанный полинуклеотид может включать, необязательно, последовательность, раскрытую в настоящем описании. Указанный полинуклеотид может состоять, необязательно, или в основном состоять из любого полинуклеотида, описанного в настоящем описании. Указанное определение можно осуществить, необязательно, в гибридизационном анализе, секвенирующем анализе, микросеквенирующем анализе или в анализе методом ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания. Указанный полинуклеотид можно присоединить, необязательно, к твердому носителю, матрице или адресной матрице. Указанный полинуклеотид, необязательно, может быть меченным. Предпочтительный полинуклеотид можно использовать в гибридизационном анализе для установления идентичности определенного нуклеотида в связанном с Сап1оп двуаллельном маркере. Другой предпочтительный полинуклеотид можно использовать в секвенирующем или микросеквенирующем анализе для определения идентичности нуклеотида в связанном с Сап1оп двуаллельном маркере. Третий предпочтительный полинуклеотид можно использовать в анализе методом ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания для определения идентичности нуклеотида в связанном с Сап1оп двуаллельном маркере. Четвертый предпочтительный полинуклеотид можно использовать для амплификации полинуклеотидного сегмента, включающего связанный с Сап1оп двуаллельный маркер. Любой из описанных выше полинуклеотидов можно присоединить, необязательно, к твердому носителю, матрице или к адресной матрице. Указанный полинуклеотид может быть, но необязательно, меченным.

Настоящее изобретение дополнительно включает в себя использование любого полинуклеотида для или любого полинуклеотида для использования для амплификации нуклеотидного сегмента, включающего связанный с Сап1оп двуаллельный маркер. Кроме того, полинуклеотиды настоящего изобретения, используемые для амплификации нуклеотидного сегмента, включающего связанный с Сап1оп двуаллельный маркер, включают в себя полинуклеотиды с любым дополнительным ограничением, описанным в данном описании, или следующие ниже полинуклеотиды, указанные отдельно или в любом сочетании. Указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или двуаллельных маркеров необязательно, к тому же, находящихся в со

- 35 006367 стоянии сцепления при нарушении равновесия; указанный двуаллельный маркер, связанный с СаηIοη, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или указанные двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; необязательно указанный двуаллельный маркер, связанный с СпИци, выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; указанный полинуклеотид может включать необязательно последовательность, раскрытую в настоящем описании; указанный полинуклеотид может необязательно состоять или в основном состоять из полинуклеотида, описанного в настоящем описании; указанная амплификация необязательно может осуществляться с помощью ПЦР или ЛЦР. Указанный полинуклеотид необязательно может присоединяться к твердому носителю, матрице или адресной матрице. Указанный полинуклеотид необязательно может быть меченным.

Праймеры для амплификации или реакции секвенирования полинуклеотида, включающего двуаллельный маркер настоящего изобретения, может быть создан из раскрытых последовательностей с помощью любого способа, известного в данной области техники. Предпочтительный набор праймеров приспособлен так, что 3'-конец непрерывного участка последовательности, идентичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ Νο§ 1-4 и 6, или из последовательности, комплементарной им, или из ее варианта, присутствует на 3'-конце данного праймера. Такая конфигурация позволяет 3'концу данного праймера гибридизоваться с выбранной последовательностью нуклеиновой кислоты и резко увеличивать эффективность данного праймера в амплификации или в реакциях секвенирования. Аллельспецифичные праймеры можно создать так, что полиморфное основание двуаллельного маркера находится на 3'-конце непрерывного участка последовательности, а непрерывный участок последовательности находится на 3'-конце данного праймера. Такие аллельспецифичные праймеры стремятся избирательно начать процесс амплификации или реакцию секвенирования, если они используются с образцом нуклеиновой кислоты, который содержит один из двух аллелей, представленный в двуаллельном маркере. 3'-конец праймера настоящего изобретения может быть локализован в пределах или, по меньшей мере, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 или 1000 нуклеотидами «левее» от связанного с СаηIοη двуаллельного маркера в указанной последовательности или в любом другом месте, которое соответствует их предполагаемому использованию в секвенировании, амплификации или расположению новых последовательностей или маркеров. Поэтому другой набор предпочтительных амплификационных праймеров включает выделенный полинуклеотид, в основном состоящий из непрерывного участка последовательности в 8-50 нуклеотидов в последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ Νο§ 1-4 и 6, или комплементарной ей последовательности, или ее варианта, где 3'-конец указанного непрерывного участка последовательности локализован по 3'-концу указанного полинуклеотида, и где 3'конец указанного полинуклеотида локализован «левее» связанного с СаηIοη двуаллельного маркера в указанной последовательности. Предпочтительно, эти амплификационные праймеры включают последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей В1-В17 и С1-С17. Праймеры с 3'концами, локализованными на 1 нуклеотид «левее» от двуаллельного маркера СаηIοη, особенно полезны в микросеквенирующем анализе. Предпочтительные микросеквенирующие праймеры описаны в табл. 4. Указанный двуаллельный маркер, связанный с СаηIοη, выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; указанный двуаллельный маркер, связанный с СаηIοη, выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; указанный двуаллельный маркер, связанный с СаηIοη, выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия. Микросеквенирующие праймеры выбраны, но необязательно, из группы нуклеотидных последовательностей Ό1-Ό18 и Е1-Е18.

Зонды настоящего изобретения можно создать из раскрытых последовательностей любым способом, известным в данной области техники, в частности, с помощью способов, которые обеспечивают тестирование при наличии раскрытого в данном описании маркера. Предпочтительный набор зондов можно создать для использования в гибридизационном анализе настоящего изобретения любым способом, известным в данной области техники, так что они избирательно связываются с одним аллелем двуаллельного маркера, но не с другим, в соответствии с любой конкретной совокупностью условий анализа. Предпочтительные гибридизационные зонды включают полиморфное основание из аллеля 1 или аллеля 2 рассматриваемого двуаллельного маркера. Указанный двуаллельный маркер может находиться, необязательно, в пределах 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотида(ов) от центра гибридизационного зонда или в центре указанного зонда. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения данные зонды выбирают из группы, содержащей каждую из последовательностей Р1-Р18 и каждую из комплементарных им последовательностей.

Следует отметить, что полинуклеотиды настоящего изобретения не ограничиваются имеющими точные фланкирующие последовательности, окружающие полиморфные основания, которые перечислены в списке последовательностей. Следует иметь в виду, что фланкирующие последовательности, окружающие двуаллельные маркеры, могут быть удлинены или укорочены до любого размера, сопоставимо

- 36 006367 го с их предполагаемым использованием, и в настоящем изобретении, в частности, такие последовательности рассматриваются. Для фланкирующих областей вне непрерывного участка последовательности не требуется быть гомологичными нативным фланкирующим последовательностям, которые действительно встречаются у людей. Специально рассматривается добавление любой нуклеотидной последовательности, которая сопоставима с нуклеотидами, предназначенными для использования.

Праймеры и зонды можно пометить или иммобилизовать на твердом носителе, как описано в Олигонуклеотидных зондах и праймерах.

Полинуклеотиды настоящего изобретения, которые присоединяют к твердому носителю, включают в себя полинуклеотиды с любым дополнительным ограничением, описанным в данном описании, или следующие ниже полинуклеотиды, указанные отдельно или в любом сочетании. Указанные полинуклеотиды могут быть определены, необязательно, как индивидуально присоединенные или в группах, по меньшей мере, из 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 или 25 отдельных полинуклеотидов настоящего изобретения, к единственному твердому носителю. Полинуклеотиды, отличающиеся от полинуклеотидов настоящего изобретения, необязательно могут присоединяться к одному и тому же твердому носителю в качестве полинуклеотидов настоящего изобретения. Если к твердому носителю присоединяется множество полинуклеотидов, они могут присоединяться необязательно случайным образом или в виде упорядоченного набора. Указанный упорядоченный набор может быть необязательно адресным.

Настоящее изобретение включает в себя также диагностические наборы, включающие один или более полинуклеотидов настоящего изобретения вместе с частью или со всеми необходимыми реагентами и инструкциями для генотипирования обследуемого индивида для определения идентичности нуклеотида в связанном с Сагбоп двуаллельным маркере. Полинуклеотиды набора могут необязательно присоединяться к твердому носителю или являться частью набора или адресным набором полинуклеотидов. Данный набор можно создать для определения идентичности нуклеотида в позиции маркера любым способом, известным в данной области техники, включающим, но не ограничивающимся указанным, способ аналитического секвенирования, способ аналитического микросеквенирования, способ аналитической гибридизации или способ ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания.

Способы идентификации двуаллельных маркеров йе ηονο

Для скринирования геномного фрагмента на полиморфизм единственного нуклеотида можно использовать различные способы, такие как дифференциальная гибридизация с олигонуклеотидными зондами, обнаружение изменений в подвижности, измеряемой с помощью гель-электрофореза, или прямым секвенированием амплифицированной нуклеиновой кислоты. Предпочтительный способ идентификации двуаллельных маркеров включает сравнительное секвенирование фрагментов геномной ДНК у соответствующего числа не связанных родством индивидов.

В первом варианте осуществления настоящего изобретения образцы ДНК от не связанных родством индивидов объединяют вместе, после чего представляющую интерес геномную ДНК амплифицируют и секвенируют. Затем полученные таким образом нуклеотидные последовательности анализируют, чтобы идентифицировать достоверный полиморфизм. Одно из основных преимуществ данного способа заключается в том, что объединение образцов ДНК в значительной степени снижает количество реакций амплификации и реакций секвенирования ДНК, которые следует осуществить. Кроме того, данный способ достаточно чувствителен, так что полученный таким образом двуаллельный маркер обычно демонстрирует достаточную частоту своего менее распространенного аллеля, который полезен для проведения ассоциативных исследований.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения образцы ДНК не объединяют и поэтому их амплифицируют и секвенируют индивидуально. Данный способ, как правило, предпочтителен, если двуаллельные маркеры нуждаются в идентификации, чтобы осуществить ассоциативные исследования в рамках кандидатных генов. Предпочтительно, в случае двуаллельных маркеров можно скринировать высокозначимые генные области, такие как промоторные области или экзонные области. Двуаллельный маркер, полученный с использованием данного способа, может проявить меньшую информативность для проведения ассоциативных исследований, например, если частота его наименее частого аллеля составляет менее чем около 1 0%. Вместе с тем такой двуаллельный маркер будет достаточно информативным для проведения ассоциативных исследований и, кроме того, ценным из-за того, что включение менее информативных двуаллельных маркеров в исследования настоящего изобретения по генетическому анализу может обеспечить в некоторых случаях прямую идентификацию каузальных (определяющих данный признак) мутаций, которые могут, в зависимости от их пенетрантности, оказаться редкими мутациями.

Ниже следует описание различных параметров предпочтительного способа, используемого заявителями для идентификации двуаллельных маркеров настоящего изобретения.

Образцы геномной ДНК

Образцы геномной ДНК, из которых создают двуаллельные маркеры настоящего изобретения, предпочтительно получают от не связанных родством индивидов, соответствующих гетерогенной популяции с известным этническим фоном. Число индивидов, от которых получают образцы ДНК, может существенно варьировать, предпочтительно от около 10 до около 1000, предпочтительно от около 50 до около 200 индивидуумов. Как правило, предпочтительно собирать образцы ДНК по меньшей мере от

- 37 006367 около 1 00 индивидуумов, для того чтобы обладать достаточно полиморфным разнообразием в данной популяции, чтобы идентифицировать столько маркеров, сколько возможно и чтобы получить статистически значимые результаты.

Что касается источника геномной ДНК, которую подвергают анализу, то анализируемым образцом может быть любой образец без какого-либо особого ограничения. Такие анализируемые образцы включают биологические образцы, которые можно проанализировать описанными в данном описании способами настоящего изобретения, и включают жидкости организма человека и животного, такие как цельная кровь, сыворотка, плазма, спинномозговая жидкость, моча, лимфатическая жидкость и различные внешние выделения при дыхании, выделения кишечного и мочеполого трактов, слезы, слюну, молоко, лейкоциты, миеломы и тому подобное; биологические жидкости, такие как супернатанты клеточных культур; фиксированные тканевые образцы, включая злокачественную и незлокачественную ткань и ткани лимфатических узлов; пункции костного мозга и образцы фиксированных клеток. Предпочтительным источником геномной ДНК, используемой в настоящем изобретении, является периферическая венозная кровь каждого донора. Методы получения геномной ДНК из биологических образцов хорошо известны квалифицированным специалистам. Подробности предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения приведены в примере 1. Специалист в данной области техники может выбрать для амплификации объединенные или необъединенные ДНК-образцы.

Амплификация ДНК

Идентификации двуаллельных маркеров в образце геномной ДНК может способствовать использование способов амплификации ДНК. Для стадии амплификации образцы ДНК можно объединить или не объединять. Методы амплификации ДНК хорошо известны специалистам в данной области техники.

Методы амплификации, используемые в контексте настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, лигазную цепную реакцию (ЬСР), описанную в ЕР-А-320308, \УО 9320227 и ЕР-А439182, полимеразную цепную реакцию (РСР, РТ-РСР) и такие методы, как амплификация на основе последовательности нуклеиновой кислоты (ЫА8ВА), описанная у Оиа1еШ ЬС. и соавт. (1990) и у СошрЮп 1. (1991), О-бета амплификация, которая описана в Европейской Патентной Заявке №4544610, амплификация с замещением цепи, как описано у \Уа1кег и соавт. (1996) и ЕР А 684315, и опосредованная мишенью амплификация, как описано в публикации РСТ \УО 9322461.

ЬСР и Оар ЬСР являются экспоненциальными амплификационными методами, обе зависят от ДНК-лигазы, которая соединяет смежные праймеры, отжигаемые к молекуле ДНК. В лигазной цепной реакции (ЬСР) используют пару зондов, которые включают два первичных [основных] (первый и второй) и два вторичных [вспомогательных] (третий и четвертый) зонда, которые все используются в молярном избытке к мишени. Первый зонд гибридизуется с первым сегментом данной цепи-мишени, а второй зонд гибридизуется со вторым сегментом данной цепи-мишени, причем первый и второй сегменты являются смежными, так что первичные зонды примыкают друг к другу в 5'фосфат-3'гидроксильной взаимосвязи, и так что лигаза может ковалентно сочетать или лигировать два зонда в соединенный путем слияния продукт. Кроме того, третий (вторичный) зонд может гибридизоваться с частью первого зонда, а четвертый (вторичный) зонд может гибридизоваться с частью второго зонда путем аналогичного примыкания. Конечно, если данная мишень исходно состоит из двух цепей, то в первом случае вторичные зонды также будут гибридизоваться с комплементом-мишенью. После того, как лигированная цепь первичных зондов отделена от цепи-мишени, она будет гибридизоваться с третьим и четвертым зондом, которые могут быть лигированы с образованием комплементарного, вторичного лигированного продукта. Важно осознавать, что данные лигированные продукты функционально эквивалентны данной мишени или ее комплементу. В результате повторения циклов гибридизации и лигирования достигается амплификация последовательности-мишени. Описан также способ мультиплексной ЬСР (\УО 9320227). Оар ЬСР (ОЬСР) представляет собой вариант ЬСР, в котором зонды не соседствуют, а разделены 2-3 основаниями.

Что касается амплификации мРНК, то в рамках настоящего изобретения мРНК обратно транскрибируют в кДНК с последующей полимеразной цепной реакцией (РТ-РСР); или с использованием в обоих стадиях единственного фермента, как описано в патенте США №5322770, или с использованием Асимметричной Оар ЬСР (РТ-АОЬСР), как описано у Маг5Йа11 и соавт. (1994). АОЬСР представляет собой модификацию ОЬСР, которая делает возможной амплификацию РНК.

Техника ПЦР является предпочтительной техникой амплификации, используемой в настоящем изобретении. Разнообразные методы ПЦР хорошо известны специалистам в данной области техники. Обзор техники ПЦР см. у \У1Ше (1997) и в публикации, озаглавленной РСР МеШобк апб Арр11са(1оп8 (1991, Со1б 8рг1пц НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк). В каждой из этих методик ПЦР-праймеры для каждой из сторон амплифицируемой последовательности нуклеиновой кислоты добавляются к соответствующим образом приготовленному образцу нуклеиновой кислоты вместе с бЫТР и термостабильной полимеразой, такой как Тас.|-полимераза, Р£и-полимераза или УеШ-полимераза. Нуклеиновую кислоту данного образца денатурируют и ПЦР-праймеры специфически гибридизуются с комплементарными нуклеотидными последовательностями в данном образце. Гибридизующиеся праймеры удлиняются. Поэтому инициируется очередной цикл денатурации, гибридизации и удлинения. Такие циклы повторяются много раз с образо

- 38 006367 ванием амплифицируемого фрагмента, содержащего нуклеотидную последовательность между праймерными сайтами. ПЦР дополнительно была описана в нескольких патентах, в том числе в Патентах США №№4683195; 4683202; и 4965188, раскрытие которых включено в данное описание путем ссылки во всей их полноте.

Техника ПЦР представляет собой предпочтительную технику амплификации, используемую для идентификации новых двуаллельных маркеров. Типичный пример реакции ПЦР, подходящей для целей настоящего изобретения, представлен в примере 2.

Одним из аспектов настоящего изобретения является способ амплификации Сап1оп-гена человека, в частности, фрагмента геномной последовательности 8ЕО Ш Ио 1-3 или кДНК-последовательности 8ЕО Ш Ио 4, ее фрагмента или ее вариант в анализируемом образце, предпочтительно с использованием ПЦР. Данный способ включает следующие стадии:

a) контактирования анализируемого образца с реагентами реакции амплификации, включающими пару праймеров амплификации, как описано выше, и локализованных на любой стороне амплифицируемого полинуклеотидного участка, и

b) необязательного детектирования продуктов амплификации.

В настоящем изобретении рассматривается также набор для амплификации последовательности Сап1оп-гена, в частности, участка геномной последовательности 8ЕО Ш Ио 1-3 или кДНКпоследовательности 8ЕО Ш Ио 4 или ее варианта в анализируемом образце, где указанный набор включает:

a) пару олигонуклеотидных праймеров, локализованных на любом участке амплифицируемого района Сап1оп;

b) необязательно реагенты, необходимые для выполнения реакции амплификации.

В одном из вариантов осуществления указанного выше способа амплификации и набора реагентов к нему продукт амплификации детектируют путем гибридизации с меченым зондом, обладающим последовательностью, которая комплементарна амплифицированному участку. В другом варианте осуществления указанного выше способа амплификации и набора реагентов к нему праймеры включают последовательность, которая выбрана из группы, состоящей из нуклеотидных последовательностей В1-В17, С1С17, Ό1-Ό18, и Е1-Е18.

В первом варианте осуществления настоящего изобретения двуаллельные маркеры идентифицируют с использованием информации о геномной последовательности, которая создана заявителями. Фрагменты секвенированной геномной ДНК используют для создания праймеров для амплификации (500 п.н.)-фрагментов. (500 п.н.)-фрагменты амплифицируют из геномной ДНК и сканируют на наличие двуаллельных маркеров. Праймеры можно создать с использованием программного обеспечения Θ8Ρ (Н11Нег Ь. апй Сгееп Ρ., 1991). Все праймеры могут находиться «левее» специфичных оснований-мишеней, общий олигонуклеотидный хвост которых служит в качестве секвенирующего праймера. Специалистам в данной области техники хорошо известно удлинение праймеров, которое можно использовать для этих целей.

Предпочтительные праймеры, пригодные для амплификации геномных последовательностей, кодирующих Сап1оп-ген, фокусируются на промоторах, экзонах и сайтах сплайсинга генов. Двуаллельный маркер обнаруживает более высокую вероятность возможного появления каузальной мутации, если он локализован в этих функциональных участках данного гена. Предпочтительные праймеры амплификации настоящего изобретения включают нуклеотидные последовательности В1-В17 и С1-С17, дополнительно детализированные в примере 2, табл. 1 .

Секвенирование амплифицированной геномной ДНК и идентификация полиморфизма единственного нуклеотида

Продукты амплификации, полученные как описано выше, затем секвенируют с использованием любого способа, известного и доступного квалифицированным специалистам. Способы секвенирования ДНК с использованием дидезоксиопосредованного метода (метод Сэнгера) или метода МаксамГилберта, широко известны специалистам в данной области техники. Такие методы раскрыты, например, у 8ашЬгоок и соавт. (1989). Альтернативные способы включают гибридизацию с набором зондов ДНК высокой плотности, как описано у Сйее и соавт. (1996).

Предпочтительно, амплифицированную ДНК подвергают автоматизированным дидезокситерминирующим секвенирующим реакциям с использованием протокола циклического секвенирования с праймером, меченым красителем. Продукты реакций секвенирования разделяют на секвенирующих гелях и полученные последовательности определяют с использованием анализа визуализации геля. Поиск полиморфизма основан на наличии накладывающихся пиков в электрофоретическом паттерне, полученном для разных оснований, встреченных в одной и той же позиции. Поскольку каждый дидезокситерминатор помечен отличающейся флуоресцентной молекулой, то два пика, соответствуя двуаллельному сайту, представлены разным цветом, соответствуя двум отличающимся нуклеотидам по одной и той же позиции в данной последовательности. Однако присутствие двух пиков может оказаться артефактом, обусловленным фоновым шумом. Чтобы исключить такой артефакт, секвенируют две цепи ДНК и сравнивают их по двум полученным пикам. Последовательность квалифицируют как полиморфную в том слу

- 39 006367 чае, если полиморфизм обнаруживается на обеих цепях.

Указанная выше методика позволяет идентифицировать те продукты амплификации, которые содержат двуаллельные маркеры. Граница выявления частоты двуаллельного полиморфизма, обнаруженного путем секвенирования пулов из 100 индивидов, составляет приблизительно 0,1 для минорного аллеля, что подтверждается пулами секвенирования для известных аллельных частот. Однако более 90% двуаллельного полиморфизма, обнаруженного методом объединения, характеризуется частотой минорного аллеля, превышающей значение 0,25. Поэтому, двуаллельные маркеры, выбранные с помощью данного метода, обладают частотой по меньшей мере 0,1 для минорного аллеля и менее 0,9 для основного аллеля. Предпочтительно, если частота составляет по крайней мере 0,2 для минорного аллеля и менее 0,8 для основного аллеля, более предпочтительно по меньшей мере 0,3 для минорного аллеля и менее 0,7 для основного аллеля, таким образом уровень гетерозиготности превышает 0,18, предпочтительно выше 0,32, более предпочтительно выше 0,42.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения двуаллельные маркеры детектируется путем секвенирования индивидуальных образцов ДНК, где частота минорного аллеля, такого как двуаллельный маркер, может составлять менее 0,1.

Проверка достоверности двуаллельных маркеров настоящего изобретения

Полиморфизм оценивают по его пригодности в качестве генетических маркеров путем подтверждения того, что оба аллеля присутствуют в популяции. Проверка достоверности двуаллельных маркеров осуществляется путем генотипирования группы индивидов способом настоящего изобретения и демонстрации того, что оба аллеля присутствуют. Микросеквенирование является предпочтительным методом генотипирования аллелей. Проверка достоверности с помощью операции генотипирования осуществляют на индивидуальных образцах, полученных от каждого индивида данной группы или путем генотипирования объединенной выборки, полученной от более чем одного индивида. Данная группа может равняться одному индивиду, если этот индивид является гетерозиготой по аллелю, о котором идет речь. Предпочтительно группа содержит по меньшей мере три индивида, более предпочтительно данная группа содержит пять или шесть индивидов, так что единственный тест на достоверность, вполне вероятно, приведет к подтверждению существования большинства тестируемых двуаллельных маркеров. Следует, однако, иметь ввиду, что при осуществлении теста на достоверность в небольшой группе можно столкнуться с ложным отрицательным результатом, если в качестве результата ошибки выборки ни один из проверяемых индивидов не несет один из двух данных аллелей. Таким образом, метод проверки достоверности менее пригоден для демонстрации того, что отдельный исходный результат представляет собой артефакт, а не демонстрации того, что в конкретной позиции последовательности существует подлинный двуаллельный маркер. Методы изучения генотипирования, гаплотипирования, ассоциации и взаимодействия настоящего изобретения можно необязательно осуществлять исключительно в отношении достоверности двуаллельных маркеров.

Оценка частоты двуаллельных маркеров настоящего изобретения

Проверенные на достоверность двуаллельные маркеры далее оценивают на их пригодность в качестве генетических маркеров определения частоты менее распространенного аллеля в сайте двуаллельного маркера. Чем больше частота менее распространенного аллеля, тем выше пригодность двуаллельного маркера для исследований по ассоциации и взаимодействию. Определение наименее распространенного аллеля осуществляется путем генотипирования группы индивидов способом настоящего изобретения и демонстрацией присутствия обоих аллелей. Это определение частоты с помощью операции генотипирования осуществляют на индивидуальных образцах, полученных от каждого индивида данной группы или путем генотипирования объединенной выборки, полученной от более чем одного индивида. Данная группа должна быть достаточно большой, чтобы представлять данную популяцию как целое. Предпочтительно данная группа содержит по меньшей мере 20 индивидов, более предпочтительно данная группа содержит по меньшей мере 50 индивидов, более предпочтительно данная группа содержит по меньшей мере 1 00 индивидов. Разумеется, большая группа увеличит точность определения частоты, вследствие снижения ошибки выборки. Двуаллельный маркер, у которого частота менее распространенного аллеля составляет 30% или больше, называют высококачественным двуаллельным маркером. Методы изучения генотипирования, гаплотипирования, ассоциации и взаимодействия настоящего изобретения можно необязательно осуществлять лишь с двуаллельными маркерами высокого качества.

Способы индивидуального генотипирования по двуаллельным маркерам

Разработаны способы определения генотипа биологического образца по одному или нескольким двуаллельным маркерам настоящего изобретения, которые все могут осуществляться ш νί(ΐΌ. Такие способы генотипирования включают определение идентичности нуклеотида в сайте Сап1оп-двуаллельного маркера любым способом, известным в данной области техники. Такие способы находят применение при генотипировании больных и здоровых популяций в ассоциативных исследованиях, а также при генотипировании индивидов в контексте выявления аллелей двуаллельных маркеров, которые, как установлено, ассоциированы с данным признаком, и в этом случае обе копии двуаллельного маркера, представленные в геноме индивида, определяются так, что индивид можно классифицировать как гомозиготу или гетерозиготу по отдельному аллелю.

- 40 006367

Данные способы генотипирования осуществляют на образцах нуклеиновых кислот, полученных от отдельного индивида или на объединенных образцах ДНК.

Генотипирование можно осуществлять с использованием аналогичных способов, которые описаны выше для идентификации двуаллельных маркеров, или с использованием других способов генотипирования, таких как описано ниже. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения сравнение последовательностей амплифицированных геномных фрагментов от разных индивидов используют для идентификации новых двуаллельных маркеров, а микросеквенирование используется при генотипировании известных двуаллельных маркеров для применения в диагностическом и ассоциативном исследовании.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает в себя способы генотипирования, включающие определение идентичности нуклеотида в Сап[оп-связанном двуаллельном маркере или в его дополнении в биологическом образце; где указанный Сайоп-связанный двуаллельный маркер необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или необязательно двуаллельные маркеры при этом неравновесно сцеплены; где указанный Сагкоп-связанный двуаллельный маркер необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или необязательно двуаллельные маркеры при этом неравновесно сцеплены; где указанный Сайоп-связанный двуаллельный маркер необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или необязательно двуаллельные маркеры при этом неравновесно сцеплены; где указанный биологический образец необязательно получен от отдельного индивида; где идентичность нуклеотидов в указанном двуаллельном маркере необязательно определяют по обоим копиям указанного двуаллельного маркера, представленного в указанном геноме индивида; где указанный биологический образец необязательно получен от многих индивидов. Способы генотипирования настоящего изобретения необязательно включают в себя способы с любым дополнительным ограничением, описанным в данном описании, или следующие ниже способы, указанные отдельно или в любом сочетании. Указанный способ необязательно осуществляют т х'Иго; кроме того, необязательно включение амплификации части указанной последовательности, включающей двуаллельный маркер, перед указанной стадией определения. Где указанную амплификацию необязательно осуществляют с помощью ПЦР, ЛЦР или репликацией рекомбинантного вектора, включающего ориджин репликации и указанный фрагмент, в клетке-хозяине; где указанное определение необязательно осуществляют с помощью гибридизационного анализа, секвенирующего анализа, микросеквенирующего анализа или метода ферментного выявления дефекта комплементарного спаривания.

Происхождение нуклеиновых кислот для генотипирования

Любую нуклеиновую кислоту, выделенную очисткой или не выделенную очисткой, можно использовать в качестве исходной нуклеиновой кислоты, если содержит или предположительно содержит требуемую специфичную последовательность нуклеиновой кислоты. ДНК или РНК можно экстрагировать из клеток, тканей, жидкостей организма и тому подобное. Хотя нуклеиновые кислоты, используемые в способах генотипирования настоящего изобретения можно получить от любого млекопитающего, под обследуемыми субъектами и индивидами, у которых взяты образцы нуклеиновой кислоты, подразумевают человека.

Амплификация фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры

Обеспечены способы и полинуклеотиды для амплификации сегмента нуклеотидов, включающие один или несколько двуаллельных маркеров настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что амплификация фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры, может осуществляться разными способами и для разных целей и не ограничивается генотипированием. Тем не менее, многие способы генотипирования, хотя и не все, требуют предварительной амплификации участка ДНК, несущего интересующий двуаллельный маркер. Такие способы специфически увеличивают концентрацию или общее количество последовательностей, которые включают двуаллельный маркер или включают такой участок, и последовательности, локализованные вблизи или на расстоянии от него. Диагностический анализ может быть также основан на амплификации сегментов ДНК, несущих двуаллельный маркер настоящего изобретения. Амплификацию ДНК можно осуществить любым способом, известным в данной области техники. Методы амплификации описаны выше в разделе, озаглавленном Амплификация ДНК.

Некоторые из таких методов амплификации особенно подходят для обнаружения полиморфизма единственного нуклеотида и делают возможной одновременную амплификацию последовательностимишени и идентификацию полиморфного нуклеотида, как это описано ниже.

Идентификация описанных выше двуаллельных маркеров позволяет создать соответствующие олигонуклеотиды, которые можно использовать в качестве праймеров для амплификации фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры настоящего изобретения. Амплификацию можно осуществить с использованием праймеров, первоначально используемых для открытия описанных в данном описании новых двуаллельных маркеров, или любого набора праймеров, обеспечивающих амплификацию фрагмента ДНК, включающего двуаллельный маркер настоящего изобретения.

В некоторых вариантах настоящего изобретения созданы праймеры для амплификации фрагмента ДНК, содержащего один или несколько двуаллельных маркеров настоящего изобретения. Предпочтительные амплификационные праймеры перечислены в примере 2. Следует иметь ввиду, что данные пе

- 41 006367 речисленные праймеры являются лишь иллюстративными, и что также используют любой другой набор праймеров, который производит продукты амплификации, содержащие один или несколько двуаллельных маркеров настоящего изобретения.

Расстояние между праймерами определяет длину амплифицированного сегмента. В контексте настоящего изобретения амплифицированные сегменты, несущие двуаллельные маркеры, можно расположить по размеру от, по меньшей мере, около 25 п.н. до 35 т.п.н. Фрагменты амплификации с 25-3000 п.н. являются обычными, фрагменты с 50-1000 п.н. являются предпочтительными, а фрагменты со 100-600 п.н. являются высокопредпочтительными. Следует иметь в виду, что праймеры амплификации двуаллельных маркеров могут представлять собой любую последовательность, которая делает возможной специфичную амплификацию любого фрагмента ДНК, несущего данные маркеры. Праймеры амплификации можно метить или иммобилизовать на твердом носителе, как описано в разделе Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

Способ генотипирования образцов ДНК по двуаллельным маркерам

Для идентификации нуклеотида, присутствующего в сайте двуаллельного маркера, можно использовать любой способ, известный в данной области техники. Поскольку данный детектируемый аллель двуаллельного маркера был идентифицирован и точно определен в настоящем изобретении, детекция оказывается простой для среднего специалиста в данной области техники, с применением любой из имеющихся методик. Многие способы генотипирования требуют осуществления предварительной амплификации области ДНК, несущей интересующий двуаллельный маркер. Хотя в настоящее время амплификация мишени или сигнала часто предпочтительна, сверхчувствительные способы детекции, которые не требуют амплификации, также включены в современные способы генотипирования. Способы, хорошо известные специалистам в данной области техники, которые могут использоваться для выявления двуаллельного полиморфизма, включают такие способы, как стандартный дот-блот анализ, анализ однонитевого конформационного полиморфизма (88СР), описанного Опе1а и соавт. (1989), денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ΌΟΟΕ), гетеродуплексный анализ, обнаружение расщепления ошибочного спаривания и другие традиционные методики, которые описаны у 811еГПе1б и соавт. (1991), \У1Ше и соавт. (1992), Сготре и соавт. (1989 и 1993). Другой способ определения идентичности нуклеотида, присутствующего в конкретном полиморфном сайте, использует специализированное, устойчивое к экзонуклеазе, нуклеотидное производное, как описано в патенте США №4656127.

Предпочтительные способы подразумевают прямое определение идентичности нуклеотида, присутствующего в сайте двуаллельного маркера, с помощью анализа секвенирования, анализа ферментного выявления дефекта комплементарно спаривания или гибридизационного анализа. Далее следует описание некоторых предпочтительных способов. Особо предпочтительным способом является метод микросеквенирования. Используемый, в основном, в данном описании термин секвенирование относится к полимеразному удлинению дуплексных комплексов праймер/матрица и включает традиционное секвенирование и микросеквенирование.

1) Секвенирующий анализ.

Нуклеотид, присутствующий в полиморфном сайте, можно определить с помощью способов секвенирования. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения образцы ДНК перед секвенированием подвергают ПЦР-амплификации, как описано выше. Способы секвенирования ДНК описаны в разделе Секвенирование амплифицированной геномной ДНК и идентификация полиморфизма единственного нуклеотида.

Предпочтительно, амплифицированную ДНК подвергают автоматизированному дидезокситерминирующему секвенированию с использованием протокола цикла секвенирования с праймером, меченным красителем. Секвенирующий анализ делает возможной идентификацию основания, присутствующего в сайте двуаллельного маркера.

2) Микросеквенирующий анализ.

В микросеквенирующих способах нуклеотид полиморфного сайта в ДНК-мишени выявляют с помощью реакции однонуклеотидного праймерного удлинения. Данный способ включает в себя соответствующие микросеквенирующие праймеры, которые гибридизуются как раз «левее» от представляющего интерес полиморфного основания в нуклеиновой кислоте-мишени. Используют полимеразу, которая специфически удлиняет 3'-конец праймера на один-единственный 66ΝΤΡ (терминатор цепи), комплементарный нуклеотиду полиморфного сайта. Затем идентичность включенного нуклеотида определяют любым подходящим образом.

Обычно реакции микросеквенирования осуществляют с использованием флуоресцентных 66ΝΤΡ и достроенные микросеквенирующие праймеры анализируют с помощью электрофореза на секвенаторе ΑΒΙ 377 для определения идентичности встроенного нуклеотида, как описано в ЕР 412883, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Альтернативно, можно использовать капиллярный электрофорез, для того, чтобы одновременно проанализировать большое число продуктов микросеквенирования. Пример типичной микросеквенирующей методики, которую можно использовать в контексте настоящего изобретения, представлен в примере 4.

Для меченья и детекции 66ΝΤΡ можно применить разные методы. Способ гомогеннофазной детек

- 42 006367 ции основан на флуоресцентном переносе энергии резонанса, описанный Скеп апб К\\'ок (1997) и Скеп и соавт. (1997). В данном способе амплифицированные фрагменты геномной ДНК, содержащие полиморфные сайты, инкубируют с праймером, меченным флуоресцеином по 5'-концу в присутствии аллельных меченных красителем дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов и модифицированной Тад-полимеразы. Меченный красителем праймер удлиняется на одно основание с помощью красителя-терминатора, специфичного для данного аллеля, представленного в данной матрице. В конце реакции генотипирования интенсивность флуоресценции двух красителей в данной реакционной смеси анализируют непосредственно без разделения или выделения очисткой. Все эти стадии можно осуществить в одной и той же пробирке, а изменения флуоресценции отслеживать в реальном времени. Альтернативно, удлиненный праймер можно анализировать с помощью ΜΑΕΌΙ-ТОЕ-масс-спектрометрии. Данное основание в полиморфном сайте определяют по массе, добавляемой к праймеру микросеквенирования (см. НаГГ апб 8т1гпоу, 1997).

Микросеквенирование можно осуществить с помощью ставшего традиционным или усовершенствованного способа микросеквенирования или с помощью его вариантов. Альтернативные способы включают несколько твердофазных методик микросеквенирования. Основным протоколом по микросеквенированию является тот же протокол, который описан выше, за исключением того, что данный способ осуществляют в виде анализа в гетерогенной фазе, в котором данный праймер или молекулу-мишень иммобилизуют или улавливают на твердый носитель. Чтобы упростить анализ отделения праймера и добавления терминирующего нуклеотида, олигонуклеотиды присоединяют к твердому носителю или модифицируют таким образом, чтобы позволить разделение по сродству, а также полимеразное удлинение. 5'-Концы и внутренние нуклеотиды синтетических олигонуклеотидов можно модифицировать несколькими разными путями, позволяющими применять разные методы разделения по сродству, например, биотинилирование. При использовании в олигонуклеотидах единственной аффинной группы, данные олигонуклеотиды можно отделить от встроенного терминирующего реагента. Это исключает необходимость физического разделения или разделения по размеру. При использовании более одной аффинной группы от данного терминирующего реагента можно отделить и анализировать одновременно более одного олигонуклеотида. Это позволяет проводить анализ нескольких видов нуклеиновой кислоты или получать больше информации о последовательности нуклеиновой кислоты на реакцию удлинения. Аффинная группа не является необходимой в праймировании олигонуклеотида, но могла бы быть альтернативно представлена на данной матрице. Например, иммобилизацию можно осуществлять путем взаимодействия между биотинилированной ДНК и микротитрационными лунками, покрытыми стрептавидином или частицами из полистирола, покрытыми авидином. Таким же образом, олигонуклеотиды или матрицы можно присоединить к твердому носителю в высокоплотном виде. В таких твердофазных микросеквенирующих реакциях встроенные 66ΝΓΡ могут быть радиоактивно меченными (8ууапеп, 1994) или связаны с флуоресцеином (Ыуак апб Нашег, 1994). Детекцию радиоактивно меченных 66ΝΓΡ можно осуществлять с помощью сцинтилляционных методов. Детекцию флуоресцеин-связанных 66ΝΓΡ можно строить на связывании антифлуоресцеинового антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой, с последующей инкубацией с хроматографическим субстратом (таким как пара-нитрофенилфосфат). Другие возможные пары детекции репортера включают: 66ΝΓΡ, связанный с динитрофенилом (ΌΝΡ), и конъюгат анти-ΌΝΡ щелочная фосфатаза (Нади и соавт., 1993) или биотинилированный 66ΝΓΡ и стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена, с орто-фенилендиамином в качестве субстрата (νθ 92/15712, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте). Еще в одном альтернативном твердофазном методе микросеквенирования Жгеп и соавт. (1993) описывают способ, основывающийся на детекции ДНК-полимеразной активности в энзиматическом люминометрическом анализе детекции неорганического пирофосфата (ЕЬГОА).

Ρаκΐ^ηеη и соавт. (1997) описывают способ многократной детекции полиморфизма единственного нуклеотида, в котором принцип твердофазного микросеквенирования применяется к формату олигонуклеотидного набора. Высокоплотные наборы ДНК-зондов, присоединенные к твердому носителю (ДНКчип), описаны ниже.

Одним из аспектов настоящего изобретения является создание полинуклеотидов и способов генотипирования одного или нескольких двуаллельных маркеров настоящего изобретения, осуществляемых с помощью анализа микросеквенирования. Предпочтительные праймеры микросеквенирования включают нуклеотидные последовательности Ό1-Ό18 и Е1-Е18. Следует иметь в виду, что микросеквенирующие праймеры, перечисленные в примере 4, являются всего лишь иллюстративными, и что можно использовать любой праймер, обладающий 3'-концом, непосредственно примыкающим к данному полиморфному нуклеотиду. Подобно этому, следует иметь в виду, что микросеквенирующий анализ можно осуществлять для любого двуаллельного маркера или для любого сочетания двуаллельных маркеров настоящего изобретения. Одним из аспектов настоящего изобретения является твердый носитель, который включает один или несколько микросеквенирующих праймеров, перечисленных в примере 4, или их фрагменты, включающие по крайней мере 8, 12, 15, 20, 25, 30, 40 или 50 их последовательных нуклеотидов, пока такие совместимые с описанным праймером и обладающие 3'-концом непосредственно «левее» от соответствующего двуаллельного маркера, для определения идентичности нуклеотида в сайте двуаллельного

- 43 006367 маркера.

3) Основанный на полимеразах и лигазах анализ выявления ошибочного спаривания.

Одним из аспектов настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотидов и способов для определения аллеля одного или нескольких двуаллельных маркеров настоящего изобретения в биологическом образце с помощью анализа по выявлению ошибочного спаривания, основанного на полимеразах и/или лигазах. Проведение таких анализов основывается на специфичности полимераз и лигаз. Реакция полимеризации определяет особенно жесткие требования к правильному спариванию оснований 3'-конца праймера для амплификации, а соединение двух олигонуклеотидов, гибридизующихся с последовательностью ДНК-мишени, является весьма чувствительным к несоответствиям вблизи сайта лигирования, особенно на 3'-конце. Кроме того, способы, праймеры и различные параметры для амплификации фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры настоящего изобретения, описаны выше в разделе Амплификация фрагментов ДНК, включающих двуаллельные маркеры.

Аллельная специфичность праймеров амплификации

Дифференциацию аллелей двуаллельного маркера можно осуществлять с помощью специфической амплификации, селективной стратегии, при помощи которой один из аллелей амплифицируется в отсутствие амплификации другого аллеля. Для аллельспецифичной амплификации по меньшей мере один член пары праймеров является достаточно комплементарным области Сайоп-гена, включающей полиморфное основание двуаллельного маркера настоящего изобретения, который к тому же гибридизуется и начинает амплификацию. Такие праймеры способны различать эти два аллеля двуаллельного маркера.

Это осуществляется путем помещения полиморфного основания на 3'-конец одного из праймеров амплификации. Поскольку удлинение начинается с 3'-конца праймера, ошибочное спаривание в данном положении или вблизи него обладает ингибирующим действием на амплификацию. Поэтому в соответствующих условиях амплификации праймеры направляют амплификацию только на комплементарный к нему аллель. Определение точного расположения ошибочного спаривания и соответствующих условий исследования находятся в пределах компетенции среднего специалиста в данной области техники.

Способы, основанные на лигировании/амплификации

Метод олигонуклеотидного лигирования (ОЬА) использует два олигонуклеотида, которые создают способными гибридизоваться с примыкающими последовательностями однонитевых молекулмишеней. Один из олигонуклеотидов биотинилирован, а другой поддается обнаружению благодаря метке. При обнаружении в молекуле-мишени точно комплементарной последовательности, данные олигонуклеотиды будут гибридизоваться так, что их концы соединятся впритык и создадут субстрат для лигирования, который можно захватить и детектировать. ОЬА способен детектировать полиморфизм единственного нуклеотида и может быть преимущественно объединен с ПЦР, как описано у Ыюкегкои и соавт. (1990). В данном способе ПЦР используют для осуществления экспоненциальной амплификации ДНКмишени, которую затем детектируют с использованием ОЬА.

Другие способы амплификации, которые особенно пригодны для обнаружения полиморфизма единственного нуклеотида, включают ЬСИ (лигазную цепную реакцию), Сар ЬСВ (СЬСВ), которые описаны выше в разделе Амплификация ДНК. ЬСИ использует две пары зондов для экспоненциальной амплификации конкретной мишени.

Последовательности каждой пары олигонуклеотидов выбраны таким образом, чтобы дать возможность паре гибридизоваться с примыкающими последовательностями одной и той же цепи данной мишени. Такая гибридизация образует субстрат для матрично-зависимой лигазы. В соответствии с настоящим изобретением ЬСИ можно осуществить с олигонуклеотидами, обладающими проксимальной и дистальной последовательностями одной и той же цепи сайта двуаллельного маркера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения создают один из двух олигонуклеотидов, который включает сайт двуаллельного маркера. В таком варианте осуществления настоящего изобретения реакционные условия выбраны так, чтобы данные олигонуклеотиды могли быть лигированы вместе лишь в том случае, если данная молекула-мишень либо содержит, либо не содержит специфичный нуклеотид, который комплементарен двуаллельному маркеру в олигонуклеотиде. В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения данные олигонуклеотиды не включают данный двуаллельный маркер, так что, когда они гибридизуются с молекулой-мишенью, создается дар (пробел), как описано в \УО 90/01069, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Данный пробел заполняется комплементарными ЙЫТР (при посредничестве ДНК-полимеразы) или с помощью дополнительной пары олигонуклеотидов. Таким образом, в конце каждого цикла, каждая одиночная цепь обладает комплементом, способным служить в качестве мишени в течение следующего цикла и получают экспоненциальную аллельспецифичную амплификацию желательной последовательности.

Ь1да8е/Ро1утега8е-теб1а1еб Сепейс Вй АпаЬъП™ (Анализ небольшого генетического фрагмента при посредничестве лигазы/полимеразы)™ представляет собой еще один способ определения идентичности нуклеотида в заранее выбранном сайте молекулы нуклеиновой кислоты (\УО 95/21271). Данный способ включает в себя введение нуклеозидтрифосфата, который комплементарен нуклеотиду, присутствующему в заранее выбранном сайте на конце молекулы праймера, и их последующее лигирование со вторым олигонуклеотидом. Данную реакцию отслеживают путем детектирования специфической метки,

- 44 006367 присоединенной к твердой фазе данной реакции или путем детектирования в растворе.

4) Способы гибридизационного анализа.

Предпочтительный способ определения идентичности нуклеотида, присутствующего в сайте двуаллельного маркера, включает гибридизацию нуклеиновых кислот. Гибридизационные зонды, которые удобно использовать в таких реакциях, предпочтительно включают указанные в данном описании зонды. Можно использовать любой гибридизационный анализ, включая Саузерн-гибридизацию, Нозернгибридизацию, дот-блот-гибридизацию и твердофазную гибридизацию (см. 8атЬгоок и соавт., 1989).

Гибридизация относится к образованию дуплексной структуры двумя однонитевыми нуклеиновыми кислотами, вследствие комплементарности спариваемых оснований. Гибридизация может происходить между точно комплементарными цепями нуклеиновой кислоты или между цепями нуклеиновой кислоты, которая содержит минорные области ошибочного спаривания. Можно создать специфичные зонды, которые гибридизуются с одной формой двуаллельного маркера, но не с другой, и поэтому способны различать разные аллельные формы. Аллельспецифичные зонды часто используются парами, причем один член такой пары демонстрирует полное совпадение с последовательностью-мишенью, содержащей первоначальный аллель, а другой - демонстрирует полное совпадение с последовательностьюмишенью, содержащий альтернативный аллель. Условия гибридизации должны быть достаточно жесткими, чтобы существовала существенная разница в интенсивности гибридизации между аллелями, и, в основном, предпочтителен по существу бинарный ответ, в силу чего зонд гибридизуется только с одним из таких аллелей. Жесткие, специфичные для последовательности, гибридизационные условия, в которых зонд гибридизуется только с точно комплементарной последовательностью-мишенью, хорошо известны в данной области техники (8ашЬгоок и соавт., 1989). Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться при разных обстоятельствах. Как правило, жесткие условия выбирают таким образом, чтобы они были примерно на 5°С ниже температуры плавления (Тт) специфичной последовательности при определенной ионной силе и рН. Хотя такую гибридизацию можно осуществить в растворе, предпочтительно использовать твердофазный метод гибридизации. ДНК-мишень, включающую двуаллельный маркер настоящего изобретения, можно амплифицировать перед реакцией гибридизации. Присутствие специфичного аллеля в данном образце определяют путем детектирования наличия или отсутствия стабильных гибридных дуплексов, образованных между данным зондом и данной ДНКмишенью. Детекцию гибридных дуплексов можно осуществлять многими способами. Хорошо известны разные виды метода детекции, в которых используют детектируемые метки, связанные с данной мишенью или с данным зондом для детекции образованных гибридных дуплексов. Обычно гибридизационные дуплексы отделяют от негибридизованных нуклеиновых кислот, после чего метки, связанные с образовавшимися дуплексами, детектируются. Специалистам в данной области известно, что стадии отмывки можно использовать для отмывки избытка ДНК-мишени или зонда, а также несвязавшегося конъюгата. Кроме того, стандартные гетерогенные виды анализа являются подходящими для детекции полученных гибридов с использованием меток, присутствующих в праймерах и зондах.

Два усовершенствованных в последнее время метода позволяют дискриминировать аллели на основе гибридизации без необходимости разделений или отмывок (см. Ьап4е§геп и. и соавт., 1998). Преимущество метода ТадМап в том, что в нем используется 5'-нуклеазная активность ДНК-полимеразы Тад для расщепления ДНК-зонда, специфически отжигаемого с накапливающимся продуктом амплификации. ТадМап-зонды метят с помощью донор-акцепторной пары красителей, которые взаимодействуют путем флуоресцентного переноса энергии. Расщепление ТадМап-зонда, в результате продвижения полимеразы в течение амплификации, разъединяет донорный краситель от подавляющего красителя-акцептора, существенно увеличивая флуоресценцию донора. Все реагенты, необходимые для выявления двух аллельных вариантов, можно собрать к началу реакции, а результаты отследить в реальном времени (см. Ы\^гак и соавт., 1995). В альтернативном методе, основанном на гомогенной гибридизации, для различения аллелей используют молекулярные маяки. Молекулярные маяки представляют собой олигонуклеотидные зонды шпилечной формы, которые сообщают о наличии специфичной нуклеиновой кислоты в гомогенных растворах. При связывании со своими мишенями они подвергаются конформационной реорганизации, которая восстанавливает флуоресценцию внутренне потушенного флуорофора (Туа§1 и соавт., 1998).

Созданные в данном описании полинуклеотиды можно использовать для получения зондов, которые можно использовать в гибридизационном анализе для детекции аллелей двуаллельного маркера в биологических образцах. Данные зонды характеризуются тем, что они предпочтительно включают 8-50 нуклеотидов и тем, что они достаточно комплементарны последовательности, включающей двуаллельный маркер настоящего изобретения, с тем чтобы гибридизоваться с ней, и предпочтительно достаточно специфичны для различения последовательности-мишени всего с одним нуклеотидным изменением. Особенно предпочтительный зонд составляет 25 нуклеотидов в длину. Предпочтительно двуаллельный маркер находится в 4 нуклеотидах от центра данного полинуклеотидного зонда. В особенно предпочтительных пробах двуаллельный маркер находится в центре указанного полинуклеотида. Предпочтительные зонды включают нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из ампликонов списка табл. 1 и комплементарных им последовательностей, или ее фрагмент, причем указанный

- 45 006367 фрагмент включает по меньшей мере около 8 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 10, 15, 20, более предпочтительно 25, 30, 40, 47 или 50 последовательных нуклеотидов и содержит полиморфное основание. Предпочтительные зонды включают нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из Р1-Р18 и последовательностей, комплементарных им. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения полиморфное(ые) основание(я) находятся в пределах 5, 4, 3, 2, 1 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида, более предпочтительно - в центре указанного полинуклеотида.

Предпочтительно зонды настоящего изобретения являются меченными и иммобилизованными на твердом носителе. Метки и твердые носители описаны также в разделе Олигонуклеотидные зонды и праймеры. Данные зонды могут быть не удлиняемыми, как описано в разделе Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

При анализе гибридизации аллельспецифичного зонда можно обнаружить присутствие или отсутствие аллеля двуаллельного маркера в данном образце. Высокопроизводительная параллельная гибридизация в виде набора специфически включена в методы гибридизации и описывается ниже.

5) Гибридизация с адресными наборами олигонуклеотидов.

Методы гибридизации, основанные на олигонуклеотидных наборах, зависят от различий в гибридизационной стабильности коротких олигонуклеотидов, которые полностью совпадают, и несовпадающих вариантов последовательности-мишени. Эффективный доступ к информации о полиморфизме получают через основную структуру, включающую высокоплотные наборы олигонуклеотидных зондов, присоединенных на выбранной позиции к твердому носителю (например, чип). Каждый ДНК-чип может содержать от тысяч до миллионов индивидуальных синтетических ДНК-зондов, выстроенных в подобную сетке структуру и миниатюризированную до размера монеты в 1 0 центов.

Технология чипа уже с успехом применяется во многих случаях. Например, в мутантных штаммах 8. сегеуыае скринированию на наличие мутаций был подвергнут ген ВВСА 1, протеазный ген в Н1У-1вирусе (Нас1а и соавт., 1996; 8Ыоетакег и соавт., 1996; Коха1 и соавт., 1996). Чипы разного вида для обнаружения двуаллельного полиморфизма можно получить на основании индивидуальных заказов у АГГуте1пх (СепеСЫр™) , Нукед (НуСЫр апб НуСпоШск) и РгоЮдепе ЬаЬогайпек.

В общем, в данных способах используют наборы олигонуклеотидных зондов, которые комплементарны сегментам последовательности-мишени нуклеиновой кислоты индивида, последовательностимишени которого включают полиморфный маркер. ЕР 785280, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте, описывает плиточную стратегию для обнаружения полиморфизма единственного нуклеотида. Вкратце, наборы в основном могут быть плиточными для большого числа конкретных полиморфизмов. Под плиточным покрытием в основном подразумевается синтез определенного набора олигонуклеотидных зондов, которые создают последовательность, комплементарную представляющей интерес последовательности-мишени, а также заданную изменчивость этой последовательности, например, замена одной или нескольких данных позиций одним или несколькими членами базисного набора нуклеотидов. Плиточные стратегии описаны также в Заявке РСТ № \¥О 95/11995. В конкретном аспекте наборы являются плиточными для ряда специфичных, идентифицированных последовательностей двуаллельного маркера. В частности, данный набор делают плиточным для включения ряда детекционных блоков, каждый из которых является специфичным для конкретного двуаллельного маркера или набора двуаллельных маркеров. Например, детекционный блок может быть «плиточным» для включения ряда зондов, которые охватывают участок последовательности, включающий специфичный полиморфизм. Чтобы обеспечить получение зондов, которые комплементарны каждому аллелю, зонды синтезируют парами, отличающимися по двуаллельному маркеру. Кроме зондов, отличающихся по полиморфному основанию, однозамещенные зонды также, как правило, укладывают плитками внутри данного детекционного блока. Такие монозамещенные зонды обладают определенным числом оснований или вплоть до определенного числа оснований в любом направлении от данного полиморфизма, замещенных на остающиеся нуклеотиды (выбранными из А, Т, С, С и и). Обычно зонды в плиточном детекционном блоке будут включать замены позиций последовательности вплоть до позиций и, включая позиции, которые находятся в 5 основаниях от двуаллельного маркера. Монозамещенные зонды обеспечивают внутренние контроли «плиточного» набора для распознавания действительной гибридизации от артефактной перекрестной гибридизации. По окончании гибридизации с последовательностью-мишенью и отмывки полученной матрицы, данную матрицу сканируют для определения в данной матрице позиции, с которой гибридизуется искомая последовательность-мишень. Затем данные гибридизации сканированной матрицы анализируют, чтобы идентифицировать наличие того или иного аллеля данного двуаллельного маркера в данном образце. Гибридизацию и сканирование можно осуществить так, как описано в заявке РСТ № \¥О 92/10092 и \УО 95/11995 и в патенте США №5424186.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чипы могут включать матрицу последовательностей нуклеиновых кислот с фрагментами длиной около 15 нуклеотидов. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения чип может включать матрицу, включающую по меньшей мере одну из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из ампликонов, представленных в табл. 1 , и комплементарных им последовательностей, или их фрагментов, причем

- 46 006367 указанный фрагмент включает по меньшей мере около 8 последовательных нуклеотидов, предпочтительно 10, 15, 20, более предпочтительно 25, 30, 40, 47 или 50 последовательных нуклеотидов и содержит полиморфное основание. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанное полиморфное основание находится в пределах 5, 4, 3, 2, 1 нуклеотидов от центра указанного полинуклеотида, более предпочтительно - в центре указанного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения чип может включать матрицу по меньшей мере из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более из данных полинуклеотидов настоящего изобретения. Твердые носители и полинуклеотиды настоящего изобретения, присоединенные к твердым носителям, описаны также в разделе Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

6) Интегрированные системы.

Другой метод, который может использоваться для анализа полиморфизмов, включает многосоставные интегрированные системы, которые миниатюризируют и компартаментализуют такие технологические процессы, как ПЦР и реакции капиллярного электрофореза в одном функциональном устройстве. Например, такой метод раскрыт в патенте США №5589136, раскрытие которого включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте, который описывает интеграцию ПЦР-амплификации и капиллярного электрофореза в чипах.

Интегрированные системы можно предусматривать, в основном, при использовании микрофлюидальных систем. Эти системы включают набор микроканалов, созданных в стекле, силиконе, кварце или в пластиковом тонком диске, включенным в микрочип. Передвижение образцов контролируется электрическими, электроосмотическими или гидростатическими силами, прикладываемыми к разным областям микрочипа для создания функциональных микроскопических волн и насосов в отсутствие движущихся частей.

Что касается генотипирования двуаллельных маркеров, то микрофлюидальная система может интегрировать амплификацию нуклеиновых кислот, микросеквенирование, капиллярный электрофорез и способ детекции, такой как флуоресцентная детекция, созданная лазерным излучением.

Способы генетического анализа с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения

Для генетического анализа сложных признаков доступны разные способы (см. Ьапбег апб 8сЕогк, 1994). Поиск генов, чувствительных к заболеванию, осуществляют с использованием двух основных способов: методом сцепления, в котором ищут доказательство совместной сегрегации локуса и предполагаемого локуса, контролирующего признак, с использованием исследования семей, и методом ассоциации, в котором ищут доказательство статистически значимой ассоциации между аллелем и признаком или аллелем, определяющим признак (Кпоигу и соавт., 1993). В целом, двуаллельные маркеры настоящего изобретения находят использование для любого способа, известного в данной области техники, для демонстрации статистически значимой корреляции между генотипом и фенотипом. Такие двуаллельные маркеры могут использоваться в параметрических и непараметрических способах анализа сцепления. Предпочтительно, двуаллельные маркеры настоящего изобретения используются для идентификации генов, ассоциированных с детектируемыми признаками, с использованием ассоциативных исследований, подхода, который не требует использовать пораженные семьи, и который позволяет идентифицировать гены, ассоциированные с комплексными и отдельными признаками.

Генетический анализ с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения можно осуществлять в любом масштабе. Можно использовать целую совокупность двуаллельных маркеров настоящего изобретения или любую подгруппу двуаллельных маркеров настоящего изобретения, соответствующую гену-кандидату. Кроме того, можно использовать любую совокупность генетических маркеров, включая двуаллельный маркер настоящего изобретения. Совокупность двуаллельных полиморфизмов, которую можно было бы использовать в качестве генетических маркеров в сочетании с двуаллельными маркерами настоящего изобретения, описана в \УО 98/20165. Как указано выше, следует отметить, что двуаллельные маркеры настоящего изобретения могут быть включены в любую полную или неполную генетическую карту генома человека. Эти различные применения конкретно рассматриваются в настоящем изобретении и формуле изобретения.

Анализ сцепления

Анализ сцепления основывается на установлении корреляции между переносом (передачей) генетических маркеров и тем, как конкретный признак передается в поколениях в пределах семьи. Таким образом, целью анализа сцепления является обнаружение маркерного локуса, который демонстрирует одновременное распределение представляющего интерес признака в родословных.

Параметрические способы

Если данные доступны в ряду последовательных поколений, существует благоприятная возможность исследовать степень сцепления между парами локусов. Оценки доли рекомбинаций делают возможным располагать и размещать локусы на генетической карте. Для локусов, которые представляют собой генетические маркеры, можно создать генетическую карту, после чего можно рассчитать силу сцепления между маркерами и признаками и использовать в качестве указания относительного расположения маркеров и генов, влияющих на эти признаки (^Ме1г, 1996). Классический способ анализа сцепле

- 47 006367 ния представляет собой способ логарифмической оценки вероятности (Ιοά) (см. ΜοΠοη, 1955; 0й, 1991). Вычисление Ιοά-оценок требует детализации схемы наследования для данного заболевания (параметрический способ). Как правило, длина идентифицируемой кандидатной области, с использованием анализа сцепления, составляет между 2 и 20 млн.п.н. После идентификации кандидатной области, как описано выше, анализ рекомбинантных индивидов, с использованием дополнительных маркеров, позволяет дополнительно очертить кандидатную область. Исследование анализа сцепления, в общем, рассчитано максимально на использование 5000 микросателлитных маркеров, ограничивая таким образом максимальную теоретически достигаемую разрешающую способность анализа сцепления до около, в среднем, 600 т. п. н.

Анализ сцепления был успешно применен для картирования простых генетических признаков, которые демонстрируют примеры четкого Менделевского наследования, и которые обладают высокой пенетрантностью (т. е., соотношение между числом позитивных носителей аллеля а признака и общим числом носителей а в данной популяции). Однако параметрический анализ сцепления страдает от различных недостатков. Во-первых, он ограничен надежностью в выборе генетической модели, подходящей для каждого исследуемого признака. Более того, как уже упоминалось, достигаемая разрешающая способность, с использованием анализа сцепления, ограничена, и исследование комплементарности требует усовершенствования анализа типичных областей в 2 млн п.н. - 20 млн п.н., исходно идентифицированных с помощью анализа сцепления. Кроме того, доказано, что параметрические методы анализа сцепления трудны для применения к комплексным генетическим признакам, таким, которые связанные с объединенным действием множества генов и/или факторов окружающей среды. Очень трудно адекватно моделировать данные признаки методом подсчета Ιοά-балла. В таких случаях требуются чрезмерно большое усилие и затраты для комплектования адекватного количества пораженных болезнью семей, необходимых для анализа сцепления, применительно к этим ситуациям, что недавно обсуждали ВЬск αηά Мепкамдах (1996).

Непараметрические способы

Преимущество так называемых непараметрических способов для анализа сцепления заключается в том, что они не требуют детализации схемы наследования для данной болезни, они способствуют большему использованию в анализе комплексных признаков. В непараметрических способах предпринимаются попытки доказать, что картина наследования хромосомной области не согласуется со случайным Менделевским расщеплением, демонстрируя, что пораженные болезнью родственники наследуют идентичные копии данной области чаще, чем при случайном ожидании. Пораженные болезнью родственники должны демонстрировать избыток совместно используемого аллеля даже в присутствии неполной пенетрантности и полигенном наследовании. В непараметрическом анализе сцепления уровень совпадения по маркерному локусу у двух индивидов можно измерить либо с помощью числа аллелей, идентичных по состоянию (ΙΒ8), либо с помощью числа аллелей, идентичных по происхождению (ΙΒΌ). Анализ пораженных болезнью пары сибсов представляет собой хорошо известный специальный случай и является простейшей формой этих способов.

Двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно использовать и в параметрическом и в непараметрическом анализе сцепления. Предпочтительно двуаллельные маркеры можно использовать в непараметрических способах, которые позволяют картировать гены, участвующие в комплексных признаках. Двуаллельные маркеры настоящего изобретения могут использоваться в ΙΒΌ- и ΙΒδ-способах для картирования генов, воздействующих на комплексный признак. В таких исследованиях, используя преимущество высокой плотности распределения двуаллельных маркеров, несколько смежных локусов двуаллельных маркеров можно объединить для достижения эффективности, достигаемой мультиаллельными маркерами (Ζ1ι;·ιο и соавт., 1998).

Популяционные ассоциативные исследования

Настоящее изобретение включает способы идентификации с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения в том случае, когда СаηIοη-ген ассоциирован с выявляемым признаком. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение включает способы выявления ассоциации между аллелем двуаллельного маркера или двуаллельным маркерным гаплотипом и признаком. Кроме того, настоящее изобретение включает способы идентификации аллеля, определяющего признак при неравновесии по сцеплению с любым аллелем двуаллельного маркера настоящего изобретения.

Как указано выше, для осуществления ассоциативных исследований можно использовать альтернативные подходы: широкое ассоциативное исследование генома, ассоциативное исследование кандидатной области и ассоциативное исследование гена-кандидата. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения двуаллельные маркеры настоящего изобретения используются для осуществления ассоциативных исследований кандидатного гена. Указанный метод гена-кандидата несомненно дает быструю оценку идентификации генов и генного полиморфизма, связанного с отдельным признаком, если доступны некоторые сведения по биологии данного признака. Кроме того, двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно встроить в любую карту генетических маркеров генома человека для того, чтобы осуществить широкие ассоциативные исследования генома. Способы создания высокоплотной карты двуаллельных маркеров описаны в предварительной патентной заявке США с порядко- 48 006367 вым номером 60/082614. Двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно, кроме того, встроить в любую карту конкретной кандидатной области генома (например, конкретной хромосомы или конкретного хромосомного сегмента).

Как указано выше, ассоциативные исследования можно осуществить в генеральной совокупности и не ограничиваться исследованиями, осуществляемыми на родственниках в пораженных болезнью семьях. Ассоциативные исследования представляются чрезвычайно ценными, поскольку позволяют анализировать отдельные или мультифакторные признаки. Более того, ассоциативные исследования представляют собой мощный способ картирования на малом участке гена, обеспечивая более тонкое картирование аллелей, контролирующих признак, чем исследования по сцеплению. Исследования, базирующиеся на родословных, часто лишь сужают местоположение аллеля, контролирующего данный признак. Следовательно, ассоциативные исследования с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения можно применять для уточнения местоположения аллеля, контролирующего признак, в кандидатной области, идентифицируемой способами анализа по сцеплению. Более того, в том случае, если интересующий хромосомный сегмент, представляющий ген-кандидат, такой как ген-кандидат настоящего изобретения, был идентифицирован, для данной представляющей интерес области можно использовать упрощенную идентификацию аллеля, контролирующего данный признак. Двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно использовать для демонстрации ассоциации гена-кандидата с признаком. Такое использование, в частности, подразумевается в настоящем изобретении.

Определение частоты аллеля двуаллельного маркера или гаплотипа двуаллельного маркера в популяции

Ассоциативными исследованиями выясняются взаимосвязи частот аллелей между локусами.

Определение частоты аллеля в популяции

Аллельные частоты двуаллельных маркеров в популяциях определяют с использованием одного из способов, описанного выше под заголовком Способы индивидуального генотипирования по двуаллельным маркерам, или любым методом генотипирования, подходящим для данной обозначенной цели. Генотипирование объединенных образцов или индивидуальных образцов может определить частоту аллеля двуаллельного маркера в популяции. Одним из путей по уменьшению числа требуемых операций генотипирования заключается в использовании объединенных образцов. Основным препятствием для использования объединенных образцов является ограничение точности и воспроизводимости при определении точных концентраций ДНК в собранных пулах.

Индивидуальное генотипирование образцов предусматривает более высокую чувствительность, воспроизводимость и точность и является предпочтительным способом настоящего изобретения. Целесообразно генотипировать каждого индивида отдельно, и для определения частоты аллеля двуаллельного маркера или генотипа в данной популяции применяют простой генный подсчет.

Настоящее изобретение относится также к способам оценки частоты аллеля в популяции, включающим: а) генотипирование индивидов указанной популяции по указанному двуаллельному маркеру, в соответствии со способом настоящего изобретения; Ь) определение пропорционального представительства указанного двуаллельного маркера в указанной популяции. Кроме того, способы настоящего изобретения оценки частоты аллеля в популяции включают способы любого дополнительного ограничения, описанного в данном сообщении, или следующие ниже способы, указанные отдельно или в любом сочетании; где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно обнаруживают нарушение равновесия по сцеплению; где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно неравновесно сцеплены; где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно обнаруживают нарушение равновесия по сцеплению. Определение частоты аллеля двуаллельного маркера в популяции можно осуществить, необязательно, в результате определения идентичности нуклеотидов обоих копий указанного двуаллельного маркера, присутствующего в данном геноме каждого индивида в указанной популяции, и вычисления для данной популяции пропорционального представительства указанного нуклеотида по указанному двуаллельному маркеру, связанному с Сап1оп. Определение пропорционального представительства можно, необязательно, осуществить в результате осуществления способа генотипирования настоящего изобретения в объединенном биологическом образце, полученным от представительного числа индивидов, или от каждого индивида, в указанной популяции, и вычисления пропорционального количества указанного нуклеотида в сравнении с общим количеством.

Определение частоты гаплотипа в популяции

Гаметическая фаза гаплотипов неизвестна, если диплоидные организмы являются гетерозиготами более чем по одному локусу. Иногда, при использовании генеалогических данных для семей, можно предположить гаметическую фазу (Рег1т и соавт., 1994). Если генеалогические данные недоступны, можно применить разные методики. Одна из таких возможностей заключается в том, что гетерозиготдиплоидов по многим сайтам можно исключить из данного анализа, оставляя лишь гомозиготных и гете

- 49 006367 розиготных по одному сайту индивидов, однако, данный метод может привести к возможной погрешности относительно структуры образца и недооценке низкочастотных гаплотипов. Другая возможность заключается в том, что одиночные хромосомы можно изучать самостоятельно, например, с помощью асимметричной ПЦР-амплификации (см. №\\1оп и соавт., 1989; \Уи и соавт., 1989) или в результате выделения отдельной хромосомы путем предельного разбавления с последующей ПЦР-амплификацией (см. Κ^μ и соавт., 1990). Кроме того, образец можно гаплотипировать по достаточно близким двуаллельным маркерам с помощью двойной ПЦР-амплификации специфичных аллелей (8агкаг, С апб 8оттег 8.8., 1991). Такие методы не являются вполне удовлетворительными из-за их технической сложности, влекущей за собой удорожание, их недостаточного обобщения в большом масштабе или из-за возможных смещений. Чтобы преодолеть данные трудности, можно использовать алгоритм для определения фазы генотипов ПЦР-амплифицированных ДНК, предложенный С1агк, А.С. (1990). Вкратце, основная идея заключается в начальном заполнении списка гаплотипов, присутствующих в данном образце, в результате обследования индивидов, которые однозначно являются полными гомозиготами и гетерозиготами по одному сайту. Затем скринируют других индивидов в том же самом образце на возможную встречаемость ранее определенных гаплотипов. При каждой позитивной идентификации в список установленных гаплотипов добавляют комплементарный гаплотип до тех пор, пока информация по данной фазе для всех индивидов не будет разложена или не будет идентифицирована как далее неразлагаемая. Данным способом для каждого мультигетерозиготного индивида определяют единственный гаплотип, хотя, при наличии более чем одного гетерозиготного сайта, возможны и другие гаплотипы. Альтернативно, можно использовать способы, оценивающие частоты гаплотипов в популяции без определения гаплотипов каждого индивида. Предпочтительно, если способ основывается на алгоритме максимизации математического ожидания (ЕМ) (Эетр51ег и соавт., 1977), лежащего в основе оценок максимального правдоподобия частот гаплотипов при использовании допущения равновесия Харди-Вайнберга (случайное скрещивание) (см. ЕхсоШег Ь. апб 81а1к1п М. 1995). Данный ЕМ-алгоритм обобщает итерационный метод максимального правдоподобия для оценки, пригодной для противоречивых данных и/или неполных. ЕМ-алгоритм используют для разложения гетерозигот на гаплотипы. Оценки гаплотипов дополнительно описываются ниже под заголовком Статистические методы. Можно использовать любой другой метод, известный в данной области техники, для определения частоты гаплотипа в популяции.

Настоящее изобретение включает также способы определения частоты гаплотипа для совокупности двуаллельных маркеров в популяции, включающие следующие стадии: а) генотипирование по меньшей мере одного двуаллельного маркера, связанного с Сап1оп, в соответствии со способом настоящего изобретения для каждого индивида в указанной популяции; Ь) генотипирование второго двуаллельного маркера в результате определения идентичности нуклеотидов по указанному второму двуаллельному маркеру для обеих копий указанного второго двуаллельного маркера, представленного в геноме каждого индивида в указанной популяции: и с) применение способа определения гаплотипа к идентичным нуклеотидам, установленным на стадиях а) и Ь) для получения оценки указанной частоты. Кроме того, способы определения частоты гаплотипа настоящего изобретения включают способы с любым дополнительным ограничением, описанным в данном сообщении, или следующие ниже способы, указанные отдельно или в любом сочетании: где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, сцеплены при нарушении равновесия; где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, демонстрируют нарушение равновесия по сцеплению; где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, неравновесно сцеплены. Указанный способ определения гаплотипа необязательно осуществляют с помощью асимметричной ПЦР-амплификации, двойной ПЦР-амплификации специфичных аллелей, алгоритма С1агк или алгоритма максимизации математического ожидания.

Анализ сцепления при нарушении равновесия

Нарушение равновесия по сцеплению представляет собой неслучайную ассоциацию аллелей по двум или более локусам и является мощным инструментом для картирования генов, участвующих в контроле признаков заболевания (см. А_рока Κ.8. и соавт., 1997). Двуаллельные маркеры, поскольку они компактно расположены в геноме человека и могут быть генотипированы в большем числе случаев по сравнению с другими видами генетических маркеров (такими, как РЕбР- или νΝΤΚ-маркеры), особенно пригодны для генетического анализа, основанного на изучении равновесия по сцеплению.

Когда мутация заболевания впервые внедряется в популяцию (посредством новой мутации или иммиграции носителя мутации), она непременно находится в отдельной (одной) хромосоме и, поэтому, в отдельной генетической среде или анцестральном (предковом, родовом) гаплотипом связанных маркеров. Следовательно, между такими маркерами и мутацией, контролирующей заболевание, существует полное нарушение равновесия: мутация, контролирующая заболевание, обнаруживается только в присутствии специфичной группы маркерных аллелей. В течение жизни последовательных поколений между мутацией, контролирующей заболевание, и таким маркерным полиморфизмом происходят рекомби

- 50 006367 нантные события, и указанное нарушение равновесия постепенно исчезает. Скорость этого исчезновения является функцией частоты рекомбинации, так что маркеры, ближе всего расположенные к гену, контролирующему заболевание, будут обнаруживать более высокую степень нарушения равновесия, чем отдаленные маркеры. Если не происходит нарушения в результате рекомбинаци, то анцестральные гаплотипы и нарушение равновесия по сцеплению между маркерными аллелями разных локусов могут прослеживаться не только в родословных, но также и в популяциях. Нарушение равновесия по сцеплению обычно наблюдается в виде ассоциации между одним специфичным аллелем одного локуса и другим специфичным аллелем второго локуса.

Паттерн или кривая нарушения равновесия между заболеванием и маркерным локусом, как ожидается, демонстрирует максимум, который наблюдается по локусу, контролирующему заболевание. Следовательно, степень сцепления при нарушении равновесия между аллелем, контролирующим заболевание, и тесно связанными генетическими маркерами может давать ценную информацию, относящуюся к местоположению гена, контролирующего данное заболевание. Для тонкого картирования локуса, контролирующего заболевание, полезно обладать определенным знанием картины сцепления при нарушении равновесия, которое существует между маркерами в исследуемой области. Как указано выше, уровень картирования, осуществляемый посредством анализа сцепления при нарушении равновесия, представляется более высоким, чем в исследованиях по сцеплению. Высокая плотность распределения двуаллельных маркеров, сочетаемая с анализом сцепления при нарушении равновесия, создает мощный инструмент для тонкого картирования. Разные способы, которые рассчитывают сцепление при нарушении равновесия, описаны ниже под заголовком Статистические методы.

Популяционные исследования ассоциаций признак-маркер у больных и здоровых

Как указано выше, встречаемость пар специфичных аллелей разных локусов в одной и той же хромосоме не является случайным, а отклонение от случайности называют нарушением равновесия по сцеплению или сцеплением при нарушении равновесия. Ассоциативные исследования сосредоточены на популяционных частотах и опираются на феномен нарушении равновесия по сцеплению. Если специфичный аллель данного гена непосредственно контролирует конкретный признак, его частота будет статистически выше в пораженной болезнью популяции индивидов (признак позитивный), по сравнению с частотой в популяции с негативным признаком или в случайной контрольной (здоровой) популяции. Изза наличия нарушения равновесия по сцеплению частота всех других аллелей, представленных в данном гаплотипе, несущем аллель, контролирующий признак, будет также повышенной у индивидов с позитивным признаком по сравнению с индивидами с негативным признаком или в рандомизированной контрольной выборке. Поэтому ассоциация между данным признаком и любым аллелем (особенно, аллелем двуаллельного маркера) при нарушении равновесия по сцеплению с аллелем, определяющим признак, будет достаточной, чтобы предположить наличие гена, контролирующего признак, в этой конкретной области. Популяции больных и здоровых можно генотипировать по двуаллельным маркерам для идентификации ассоциаций, которые точно определяют местонахождение аллеля, определяющего признак. Так любой маркер при нарушении равновесия по одному данному маркеру, связанному с признаком, будет ассоциирован с данным признаком. Нарушение равновесия по сцеплению позволяет соответствующие частоты в популяциях больных и здоровых с ограниченным числом генетических полиморфизмов (особенно двуаллельных маркеров) анализировать в качестве альтернативных при скринировании всех возможных функциональных полиморфизмов для того, чтобы найти аллели, определяющие признак. Ассоциативные исследования сопоставляют частоту маркерных аллелей в несвязанных родством популяциях больных и здоровых, и представляют мощный инструмент для изучения комплексных признаков.

Популяции больных и здоровых (критерии включения)

Популяционные исследования, основанные на ассоциации, не затрагивают наследование в семьях, а сопоставляют распространение отдельного генетического маркера, или группы маркеров, в популяциях больных и здоровых. Они представляют собой исследования больных и здоровых, основанные на сравнении не связанных родством больных (пораженных заболеванием или позитивные по признаку) индивидов и не связанных родством здоровых (непораженных, отрицательных по признаку или случайных) индивидов. Предпочтительно, если контрольная группа (здоровых) составлена из непораженных заболеванием или негативных по признаку индивидов. Кроме того, данная контрольная группа этнически сопоставима с популяцией людей, пораженных заболеванием. Более того, данная контрольная группа предпочтительно сопоставима с популяцией больных по основному известному фактору смешения для данного признака в исследовании (например, подобрана по возрасту или по зависимому от возраста признаку). Теоретически индивидов по двум образцам объединяют таким образом, чтобы между ними ожидались различия только по своему статусу заболевания. Термины популяция с позитивным признаком, популяция больных и популяция пораженных заболеванием используются в данном описании как взаимозаменяемые.

Существенной ступенью в изучении комплексных признаков с использованием ассоциативных исследований является подбор популяций больных и здоровых (см. Ьаийег апй ЗсНогк. 1994). Основное действие при подборе популяций больных и здоровых заключается в клиническом определении данного признака или фенотипа. Любой генетический признак можно проанализировать ассоциативным спосо

- 51 006367 бом, предложенным в данном описании, путем тщательного подбора индивидов, которые фенотипически включаются в группы с позитивным признаком и негативным признаком. Чаще используют четыре критерия: клинический фенотип, возраст при возникновении заболевания, история семьи и отягощенность. Процедура отбора непрерывных или количественных признаков (таких как, например, артериальное давление) включает отбор индивидов на краях распределения фенотипа при исследовании данного признака так, чтобы включить в данные позитивные и негативные популяции неперекрывающиеся фенотипы. Предпочтительно, если популяции больных и здоровых составляют фенотипически гомогенные популяции. Позитивные и негативные популяции по данному признаку включают фенотипически однородные популяции индивидов, соответствующие в исследовании, каждая, 1-98%, предпочтительно 1-80%, более предпочтительно 1-50%, еще более предпочтительно 1-30%, наиболее предпочтительно 1-20% от общей популяции, и предпочтительно выбраны из индивидов, демонстрирующих неперекрывающиеся фенотипы. Чем четче разница между двумя фенотипами по данному признаку, тем больше вероятность обнаружения ассоциации с двуаллельными маркерами. Отбор таких резко отличных и, вместе с тем, относительно однородных фенотипов делает возможным эффективное сравнение в ассоциативных исследованиях и вероятное обнаружение четких различий на генетическом уровне, при условии, что размеры популяционных выборок для исследования довольно значительны.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения первая группа из 50-300 индивидов с позитивным признаком, предпочтительно около 1 00 индивидов, набрана в соответствии с их фенотипами. Аналогичное количество контрольных индивидов также включено в такие исследования.

Ассоциативный анализ

Настоящее изобретение включает также способы выявления ассоциации между генотипом и фенотипом, включающие следующие стадии: а) определение частоты по меньшей мере одного двуаллельного маркера, связанного с Сап1оп, в популяции с позитивным признаком, в соответствии со способом генотипирования настоящего изобретения; Ь) определение частоты указанного двуаллельного маркера, связанного с Сап1оп, в контрольной популяции, в соответствии со способом генотипирования настоящего изобретения; и с) определение существования статистически значимой ассоциации между указанным генотипом и указанным фенотипом. Кроме того, указанные способы выявления ассоциации между генотипом и фенотипом в настоящем изобретении включают способы для любого дополнительного ограничения, описанного в данном описании, или следующие ниже способы, указанные отдельно или в любом сочетании: где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А1 8 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно неравновесно сцеплены; где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А1 7 и их комплементов, или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно неравновесно сцеплены; указанный двуаллельный маркер, связанный с Сап1оп, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов или, к тому же, двуаллельные маркеры необязательно неравновесно сцеплены. Указанная контрольная популяция может необязательно представлять собой популяцию с негативным признаком или произвольную популяцию. Каждую из указанных стадий генотипирования а) и Ь) необязательно осуществлять на объединенном биологическом образце, полученном от каждой указанной популяции. Каждую из указанных стадий генотипирования а) и Ь) необязательно осуществлять отдельно на биологических образцах, полученных от каждого индивида в указанной популяции или в ее субвыборке.

Общая методология осуществления ассоциативных исследований с использованием двуаллельных маркеров, полученных из области, несущей ген-кандидат, заключается в обследовании двух групп индивидов (популяции больных и здоровых) с тем, чтобы измерить и статистически сравнить аллельные частоты двуаллельных маркеров настоящего изобретения в обеих группах.

Если статистически значимая ассоциация с признаком идентифицируется по меньшей мере для одного или более анализируемых двуаллельных маркеров, то следует предположить, что: либо ассоциируемый аллель непосредственно ответствен за определяемый им признак (т.е. ассоциированный аллель представляет собой аллель, определяющий данный признак), либо, что более вероятно, данный ассоциированный аллель неравновесно сцеплен с аллелем, определяющим данный признак. Специфические характеристики ассоциированного аллеля относительно функции гена-кандидата, как правило, дают дополнительное представление о взаимосвязи ассоциированного аллеля и данного признака (причинноследственную взаимосвязь или сцепление при нарушении равновесия). Если данные факты указывают, что данный ассоциированный аллель в данном гене-кандидате, вероятнее всего, не является аллелем, определяющим данный признак, но вместе с тем, неравновесно сцеплен с подлинным аллелем, определяющим данный признак, тогда аллель, определяющий данный признак, можно обнаружить путем секвенирования вблизи ассоциированного маркера и осуществить дальнейшие ассоциативные исследования полиморфизма, который обнаружен итеративным образом.

Ассоциативные исследования осуществляют, как правило, в две последовательные стадии. В первой фазе (на первой стадии) частоты приведенных двуаллельных маркеров гена-кандидата определяют для популяций с позитивным признаком и для контрольных популяций. Во второй фазе (на второй стадии) анализа позицию генетических локусов, ответственных за данный признак, дополнительно уточня

- 52 006367 ют с использованием маркеров повышенной плотности из значимой области. Однако если исследуемый ген-кандидат относительно невелик по длине, как в случае с Сагбоп, одной стадии может оказаться достаточно для установления значимых ассоциаций.

Анализ гаплотипов

Как указано выше, когда хромосома, несущая аллель заболевания, впервые появляется в популяции, то ли в результате мутации, то ли миграции, мутантный аллель непременно находится на хромосоме, обладающей группой сцепленных маркеров: анцестральный гаплотип. Данный гаплотип можно проследить в популяциях и проанализировать его статистическую ассоциацию с данным признаком. Исследования комплементирующей одиночной (аллельная) ассоциации вместе с мультиточечными ассоциативными исследованиями, именуемыми также гаплотипными исследованиями, повышают статистическую мощность ассоциативных исследований. Поэтому, изучение гаплотипной ассоциации позволяет определить частоту и тип анцестрального носителя гаплотипа. Анализ гаплотипа важен тем, что он повышает возможность статистического анализа рассматриваемых индивидуальных маркеров.

На первой стадии частотного анализа гаплотипов определяют частоту возможных гаплотипов на основе различных сочетаний идентифицированных двуаллельных маркеров настоящего изобретения. Затем данную частоту гаплотипов сравнивают в отдельных популяциях индивидов с позитивным признаком и контрольными. Количество индивидов с позитивным признаком, в большинстве случаев между 30 и 300, с предпочтительной численностью индивидов, колеблющейся между 50 и 150, подвергают данному анализу для получения статистически значимых результатов. Эти же соображения применяют к используемым в данном исследовании численностям индивидов, непораженных заболеванием (или случайно выбранным здоровым индивидам). По результатам этого первого анализа получают частоты гаплотипа для популяций больных и здоровых, для каждой определяют частоту гаплотипа, р-значение и рассчитывают соотношение баллов. При обнаружении статистически значимой ассоциации относительный риск для индивида, несущего данный гаплотип, который соответствует пораженному данным исследуемым признаком, может быть аппроксимирован (приблизительно точным).

Дополнительный вариант осуществления настоящего изобретения включает способы обнаружения ассоциации между гаплотипом и фенотипом, включающими стадии: а) оценки частоты по меньшей мере одного гаплотипа в популяции с позитивным признаком, в соответствии со способом настоящего изобретения оценки частоты гаплотипа; Ь) оценки частоты указанного гаплотипа в контрольной популяции, в соответствии со способом настоящего изобретения оценки частоты гаплотипа; и с) определения статистически значимой ассоциации, существующей между указанным гаплотипом и указанным фенотипом. Кроме того, данные способы обнаружения ассоциации между гаплотипом и фенотипом настоящего изобретения включают способы с любым дополнительным ограничением, где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сагбоп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, или данные двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, неравновесно сцеплены; где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сагбоп, необязательно выбран из группы, состоящей из А1-А17 и их комплементов, или данные двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, обнаруживают нарушение равновесия по сцеплению; где указанный двуаллельный маркер, связанный с Сагбоп, необязательно выбран из группы, состоящей из А12 и А16 и их комплементов, или данные двуаллельные маркеры необязательно, к тому же, неравновесно сцеплены. Указанная контрольная популяция необязательно представляет собой негативную по признаку популяцию или произвольную популяцию. Указанный способ необязательно включает дополнительные стадии определения фенотипа в указанной позитивной по признаку популяции и в указанной контрольной популяции перед стадией с).

Анализ взаимодействия

Двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно также использовать для идентификации паттернов двуаллельных маркеров, ассоциированных с выявляемыми признаками, полученными в полигенном взаимодействии. Анализ генетического взаимодействия между аллелями несцепленных локусов требуют индивидуального генотипирования с использованием описанных в данном описании методов. Анализ аллельного взаимодействия в выбранной совокупности двуаллельных маркеров с соответствующим уровнем статистической значимости можно рассматривать в качестве гаплотипного анализа. Анализ взаимодействия включает стратификацацию популяций больных и здоровых относительно данного гаплотипа для первого локуса и осуществление гаплотипного анализа по второму локусу в каждой субпопуляции.

Статистические методы, используемые для исследования ассоциации, дополнительно описаны ниже.

Проверка сцепления при наличии ассоциации

Двуаллельные маркеры настоящего изобретения могут использоваться, кроме того, в ТЭТ (тест передача/нарушение равновесия). ТЭТ проверяет сцепление и ассоциацию и не изменяется при популяционной стратификации. ТЭТ нуждается в данных по пораженным заболеванием индивидам и их родителям или в данных от непораженных заболеванием сибсов, но не их родителей (см. 8р1е1тап 8. и соавт., 1993; 8сйа1б Ό.Ρ и соавт., 1996, 8р1е1тап 8. апб Е\уеп5 ν.Γ, 1998). Такие объединенные тесты уменьшают, как правило, количество ложно-позитивных ошибок при раздельном анализе.

- 53 006367

Статистические методы

Вообще, любой способ, известный в данной области техники, можно использовать для проверки статистически значимой корреляции признака и генотипа.

1) Способы анализа сцепления.

Статистические методы и компьютерные программы, пригодные для анализа сцепления, хорошо известны специалистам в данной области техники (см. ТегМШдег Ю. апб θΐΐ 1. 1994; θΐΐ 1. 1991).

2) Способы оценки частот гаплотипов в популяции.

Как указано выше, при подсчете генотипов часто невозможно отличить гетерозиготы так, чтобы можно было легко подсчитать частоты гаплотипов. Если гаметическая фаза неизвестна, то оценить гаплотипные частоты можно из мультилокусных генотипических данных. Любой способ, известный специалисту в данной области техники, можно использовать для оценки гаплотипных частот (см. Ьапде К., 1997; Vе^^, В.8., 1996). Предпочтительно, максимально-правдоподобные частоты гаплотипов подсчитывают с использованием алгоритма максимизации математического ожидания (ЕМ) (см. ЭетркГег и соавт., 1977; ЕхсоГйег Ь. апб 81а(к1п М., 1995). Данная операция представляет собой итерационный процесс, нацеленный на получение максимально правдоподобных оценок частот гаплотипов по данным мультилокусного генотипа, когда гаметическая фаза неизвестна. Гаплотипные оценки осуществляют, как правило, путем применения ЕМ-алгоритма с использованием, например, ЕМ-НΑР^θ-программы (НаМеу М.Е. и соавт., 1994) или Аг1ес.|шп-программы (8сЬпе1бег и соавт., 1997). ЕМ-алгоритм представляет собой обобщенный итерационный метод максимального правдоподобия для оценивания и кратко описан ниже.

Следует учесть, что в представленном разделе Способы оценки частот гаплотипов в популяции фенотипы относятся к мультилокусным генотипам неизвестной гаплотипной фазы. Генотипы относятся к мультилокусным генотипам известной гаплотипной фазы.

Предположим, имеется выборка из N не связанных родством индивидов, типированных по К маркерам. Данные исследования представлены К-локусными фенотипами неизвестной фазы, которые можно распределить в качестве Р разных фенотипов. Далее, допустим, что мы имеем Н возможных гаплотипов (для случая К двуаллельных маркеров мы имеем максимальное число возможных гаплотипов Н=2^К).

Для фенотипа.) с с, возможных генотипов имеем:

= ^\р(генотип (О) =

Уравнение 1 где Р, означает вероятность фенотипа .), а Р(1_к,1₁) означает вероятность генотипа 1, составленного гаплотипами 11|._: и Ь_;. При случайном скрещивании (т.е. равновесие Харди-Вайнберга), Р(1_к,1₁) выражено в виде:

Р(И_к,/»,) = Р(к_к )² ДЛЯ А* = А,, и

Ж ,Л,) = 2Р(А_к )Р(Н,) для А* * А,.

Уравнение 2

Е-М-алгоритм состоит из следующих стадий: Первая, генотипические частоты оценивают из совокупности исходных значений гаплотипных частот. Эти гаплотипные частоты обозначают как Р1⁽⁰⁾, Р2⁽⁰⁾, Р3⁽⁰⁾,..., Рн⁽⁰⁾. Исходные значения гаплотипных частот можно получить с помощью генератора случайных чисел или каким-либо иным образом, хорошо известным в данной области техники. Данная стадия называется стадией Ожидания. Следующая стадия данного способа, названная стадией Максимизации, заключается в использовании оценок генотипических частот, которые пересчитаны для гаплотипных частот. Первая итерация оценок гаплотипной частоты обозначается при помощи Р1⁽¹⁾, Р2⁽¹⁾, Р3⁽¹⁾,..., Рн⁽¹⁾. В итоге стадия Ожидания на итерации к состоит из вычисления вероятности размещения каждого фенотипа в различные вероятностные генотипы, основанные на гаплотипных частотах в предшествующей итерации:

Уравнение 3 где и, равно числу индивидов с фенотипом.), а Р, (1_к, 1₁)^(к) является вероятностью генотипа 1_к,1₁ в фенотипе у На стадии Максимизации, которая эквивалентна методу подсчета генов (8тЦ1т Апп. Нит. Сепе(., 21:254-276, 1957), гаплотипные частоты переоценивают на основании генотипических оценок:

λ^<ϊ+ι>=|ς Σ^ΑΑ)^ω· ^ζ /-1 ί-Ι

Уравнение 4 где δ₁₍ представляет собой показатель изменчивости, в котором подсчитывается величина встречаемости, с которой гаплотип ( представлен в генотипе ί; он имеет значения 0, 1 и 2.

ЕМ-итерации прекращают при достижении следующего критерия. При использовании расчетных оценок по методу максимального правдоподобия (МЬЕ) можно допустить, что фенотипы .) распределя

- 54 006367 ются полиномиально. В каждой итерации к можно вычислить одну Ь-функцию правдоподобия. Сходимость достигается при разнице лог-правдоподобия между двумя последовательными итерациями, равной некоему малому числу, предпочтительно 1 0^-7.

3) Способы вычисления сцепления между маркерами при нарушении равновесия.

Ряд методов могут использоваться для вычисления сцепления при нарушении равновесия по между любыми двумя генетическими позициями, практически сцепление при нарушении равновесия оценивают, используя статистический тест на ассоциацию для гаплотипных данных, взятых из популяции.

Сцепление при нарушении равновесия между любой парой двуаллельных маркеров, включающей по меньшей мере один из двуаллельных маркеров настоящего изобретения (М₁, МД имеющих аллели (а₁/Ь₁) по маркеру М₁ и аллели (а^Ь,) по маркеру М,, можно вычислить для каждой аллельной комбинации (а₁,а_,; а₁,Ь,; и Д,аД в соответствии с формулой Р|ахха:

Δ*^= 1/Θ4 - V (Θ4 + 03) (Θ4 +Θ2), где:

θ4=--= частоте генотипов, не обладающих аллелем а₁ для М₁ и не обладающих аллелем а, для М, θ3=-+= частоте генотипов, не обладающих аллелем а₁ для М₁ и обладающих аллелем а, для М, θ2=+-= частоте генотипов, обладающих аллелем а₁ для М₁ и не обладающих аллелем а, для М, Сцепление при нарушении равновесия (ЬЭ) между парами двуаллельных маркеров (М₁, М,) можно также вычислить для каждой аллельной комбинации (а1, а_); а1, Ь); Ь^а, и Ь^Ь,) в соответствии с оценкой максимального правдоподобия (МЬЕ) для дельта (объединенный коэффициент нарушения генотипического равновесия), как описано у Vе^^ ^еД В.8., 1996). МЬЕ для объединенного коэффициента сцепления при нарушении равновесия равна:

где Π|=Σ фенотипа (а₁/а₁, а,/а,). π₂=Σ фенотипа (а₁/а₁, а/ЬД п₃=Е фенотипа (а₁/Ь₁, а/аД π₄=Σ фенотипа (а₁/Ь₁, а|/Ь|) и N равно числу индивидов в данной выборке.

Данная формула позволяет оценить нарушение равновесия по сцеплению между аллелями, только при наличии данных по генотипу, а не по гаплотипу.

Другой способ вычисления сцепления при нарушении равновесия между маркерами заключается в следующем. Для сцепленных двуаллельных маркеров, М₁(а₁/Ь₁) и М,(аДД аппроксимирующих равновесие Харди-Вайнберга, можно оценить частоты четырех возможных гаплотипов в данной популяции в соответствии с методом, описанным выше.

Оценка гаметического нарушения равновесия между а1 и а_) проста:

= рг(егтлотип(а^а_}У)-рг(а_г).рГ(а_}).

где рг (а₁) означает вероятность аллеля а₁, а рг(а_,) означает вероятность аллеля а,, и где рг(гаплотип (а^аД оценивается, как указано выше в уравнении 3.

Для сцепленного двуаллельного маркера необходимо провести только одно измерение нарушения равновесия, чтобы описать ассоциацию между М₁ и М·,.

Затем нормируют полученное выше значение и рассчитывают следующим образом

0¼ = Цйм / тах (-рг(аД рг(а,), -рг(ЪД рЩД) при В’а^ОаиДтах (рг(ЬД ргф), рДаД рг(^)) при

Специалистам легко понять, что можно использовать и другие способы вычисления сцепления при нарушении равновесия.

Сцепление при нарушении равновесия в группе двуаллельных маркеров, обладающих адекватным уровнем гетерозиготности, можно определить путем генотипирования 50-1000 не связанных родством индивидов, предпочтительно 75-200, более предпочтительно около 100.

4) Проверка на ассоциацию.

Способы определения статистической значимости корреляции между фенотипом и генотипом, в данном случае аллеля в двуаллельном маркере или гаплотипа, слагаемых из таких аллелей, можно найти с помощью любого статистического теста, известного в данной области техники при любом приемлемом пороге статистической значимости, который требуется. Применение конкретных способов и порогов значимости находится в компетенции среднего специалиста в данной области техники.

Проверку на ассоциацию осуществляют путем определения частоты аллеля двуаллельного маркера в больной и контрольной популяциях и сравнения данных частот с помощью статистического критерия, чтобы определить является ли их различие частот статистически значимым, что должно указывать на корреляцию между исследуемым данным признаком и аллелем двуаллельного маркера. Подобным образом осуществляют анализ гаплотипа путем определения частот всех возможных гаплотипов для данной группы двуаллельных маркеров в больной и контрольной популяциях, и сравнивают эти частоты с помощью статистического критерия, чтобы определить, соответствует ли их статистически значимое различие корреляции между исследуемым гаплотипом и фенотипом (признаком). Можно использовать лю

- 55 006367 бой статистический инструмент, пригодный для проверки статистически значимой ассоциации между генотипом и фенотипом. В качестве статистического критерия предпочтительно использовать критерий хи-квадрат с одной степенью свободы. Вычисляют Р-значение (Р-значение является вероятностью того, что статистический результат большой или больше, чем наблюдаемая величина для случайного события).

Статистическая значимость

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, значимость для целей диагностики, либо в качестве позитивного основания для дальнейших диагностических тестов или в качестве предварительной начальной точки для ранней превентивной терапии, р-значение, связанное с ассоциацией двуаллельного маркера, составляет предпочтительно около 1 х 10^-2 или меньше, более предпочтительно около 1 х 1 0^-4 или меньше, для анализа одного двуаллельного маркера, и около 1 х 1 0^-3 или меньше, еще более предпочтительно 1 х 10^-6 или меньше и наиболее предпочтительно около 1 х 10^-8 или меньше, для гаплотипного анализа, рассматривающего два или более маркера. Считают, что данные значения приложимы к любым исследованиям по ассоциации, рассматривающим одиночный маркер или их множественное сочетание.

Специалисты могут использовать область значений, изложенных выше, в качестве исходной точки для осуществления исследований по ассоциации с двуаллельными маркерами настоящего изобретения. При этом могут обнаружиться значимые ассоциации между двуаллельными маркерами настоящего изобретения и признаком, которые используются для целей диагностики и лекарственного скринирования.

Фенотипическая перестановка

Чтобы подтвердить обнаруженную выше статистическую значимость гаплотипного анализа на первой стадии, можно было бы осуществить последующий анализ, в котором данные по больным и здоровым индивидам объединяются и рэндомизируются в отношении данного фенотипического признака. Данные каждого индивидуального генотипирования распределяются случайным образом на две группы, которые содержат одинаковое число индивидов по больной и здоровой популяциям, используемых для составления данных, полученных на первой стадии. Вторая стадия гаплотипного анализа предпочтитель но осуществляется на этих искусственных группах, предпочтительно по маркерам, включенным в данный гаплотипный анализ первой стадии, демонстрируя наивысший относительный коэффициент риска. Данный эксперимент повторяют, предпочтительно по меньшей мере 1 00-1 000 раз. Повторяемые итерации позволяют определить вероятность случайного тестирования гаплотипа.

Определение статистической ассоциации

Обращаясь к проблеме ложных позитивов, можно осуществить сходный анализ для случайных геномных областей у тех же больных и контрольных популяциях. Результаты для случайных областей и кандидатной области сравнивают, как описано в находящейся на рассмотрении предварительной патентной заявке США с названием Способы, программное и аппаратное обеспечение для идентификации геномных областей гена, ассоциированного с обнаруживаемым признаком, порядковый номер 60/107986, поданной 10 ноября 1998 г., содержание которой включено в данное описание путем ссылки.

5) Оценка факторов риска.

Ассоциация между фактором риска (в генетической эпидемиологии фактор риска подразумевает наличие или отсутствии некоего аллеля или гаплотипа в маркерных локусах) и заболеванием измеряется соотношением шансов (ОК) и относительным риском (ЯК) . Когда Р(К⁺) представляет собой вероятность развития заболевания у индивидов с К, а Р(К^-) представляет собой вероятность для индивидов в отсутствие фактора риска, тогда относительный риск равен просто соотношению двух вероятностей, то есть:

КК=Р(К⁺)/Р(К^-).

В исследованиях заболевание-контроль прямое измерение относительного риска осуществить невозможно из-за выборочного обследования. Однако соотношение шансов обеспечивает достаточно хорошую аппроксимацию относительного риска для редко встречающихся заболеваний и может быть вы числено:

ОК= (Г⁺/(1-Р%)/<Р*/<1-РЭ)

Р⁺ представляет собой частоту выявляемости фактора риска в популяции больных, а Р^- представляет собой частоту выявляемости фактора риска в контроле. Р⁺ и Р^- вычисляют с использованием аллельных или гаплотипных частот в данном исследовании и зависят от лежащей в основании генетической модели (доминантной, рецессивной, аддитивной...).

Можно также оценить атрибутивный риск, который описывает пропорцию индивидов в популяции, обнаруживающей признак, связанный с данным риском. Данное измерение представляется важным для количественного определения роли специфичного фактора в этиологии заболевания и в рамках влияния фактора риска на здравоохранение. Важность данного измерения для здравоохранения лежит в определении доли случаев заболевания в данной популяции, которые можно было бы предупредить, если бы не

- 56 006367 отсутствие проявления интереса. АВ определяют следующим образом:

АВ=Р_Е(ВВ-1)/(Р_Е (ВВ-1)+1).

АВ означает риск, свойственный аллелю двуаллельного маркера или гаплотипу двуаллельного маркера. Р_Е означает частоту проявления аллеля или гаплотипа в популяции в целом; а ВВ означает относительный риск, который, являясь аппроксимированным для соотношения шансов, при исследовании данного признака, обладает относительно низкой частотой в генеральной совокупности.

Идентификация двуаллельных маркеров при нарушении равновесия для двуаллельных маркеров настоящего изобретения

После идентификации первого двуаллельного маркера в представляющей интерес геномной области, специалисты в данной области техники, используя указания настоящего изобретения, могут легко идентифицировать дополнительные двуаллельные маркеры, сцепленные при нарушении равновесия с данным первым маркером. Как указано ранее, любой маркер, сцепленный при нарушении равновесия с первым маркером, ассоциированным с признаком, будет ассоциироваться с данным признаком. Поэтому после ассоциации, продемонстрированной между данным двуаллельным маркером и признаком, обнаружение дополнительных двуаллельных маркеров, ассоциированных с данным признаком, представляет большой интерес для того, чтобы увеличить плотность двуаллельных маркеров в данной конкретной области. Каузальный ген или мутация будут обнаруживаться вблизи данного маркера или группы маркеров, демонстрируя наивысшую корреляцию с данным признаком.

Идентификация дополнительных маркеров в сцеплении при нарушении равновесия с данным маркером включает: (а) амплификацию геномного фрагмента, включающего первый двуаллельный маркер, у множества индивидов; (Ь) идентификацию вторых двуаллельных маркеров в данной геномной области, несущей указанный первый двуаллельный маркер; (с) проведение анализа нарушения равновесия сцепления между указанным первым двуаллельным маркером и вторыми двуаллельными маркерами; и (б) отбор указанного второго двуаллельного маркера, который сцеплен при нарушении равновесия с указанным первым маркером. Рассматриваются также субкомбинации, включающие стадии (Ь) и (с).

Способы идентификации двуаллельных маркеров и проведения описанного в данном описании анализа сцепления при нарушении равновесия может осуществить специалист без чрезмерного экспериментирования. Настоящее изобретение рассматривает также двуаллельные маркеры, которые находятся в состоянии нарушения равновесия по сцеплению с двуаллельными маркерами А1-А18 и которые, как ожидается, представлены аналогичными характеристиками в рамках их соответствующей ассоциации с данным признаком.

Идентификация функциональных мутаций

Мутации по СаηIοи-гену, которые ответственны за выявляемый фенотип или признак, могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей СаЫоп-гена индивидов с позитивным признаком и контрольных индивидов. После того, как позитивная ассоциация подтверждена с помощью двуаллельного маркера настоящего изобретения, идентифицированный локус можно просканировать в отношении наличия мутаций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, функциональные области, такие как экзоны и сайты сплайсинга, промоторы и другие регуляторные области СаиIοи-гена, сканируют на наличие мутаций. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения последовательность Сайоп-гена сравнивают у индивидов с позитивным признаком и у контрольных индивидов. Предпочтительно, если показаны индивиды с позитивным признаком, несущие гаплотип, который ассоциирован с данным признаком, и индивиды с негативным признаком, не несущие гаплотип или аллель, ассоциированный с данным признаком. Обнаруживаемый признак или фенотип может включать различные проявления изменений Сап1оп-функции.

Метод выявления мутации в сущности аналогичен методу, используемому для идентификации двуаллельного маркера. Способ, используемый для обнаружения таких мутаций включает, как правило, следующие стадии:

амплификации области Сайоп-гена, включающей двуаллельный маркер или группу двуаллельных маркеров, ассоциированных с данным признаком в образцах ДНК пациентов с позитивным признаком и образцах ДНК людей в контроле;

секвенирования амплифицированной области;

сравнения последовательностей ДНК индивидов с позитивным признаком и индивидов в контроле; определения мутаций, специфичных для пациентов с позитивным признаком.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный двуаллельный маркер выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов. Затем, путем скринирования целесообразно проверить более крупные популяции больных и здоровых с помощью любого метода генотипирования, который описан в данном описании, предпочтительно с использованием метода микросеквенирования в индивидуальном тест-варианте. Полиморфизм рассматривают в виде кандидатных мутаций при наличии частот у больных и в контроле, сопоставимых с ожидаемыми результатами по ассоциации.

Полиморфизм рассматривают в виде кандидатных признак-определяющих мутаций, если они обнаруживают статистически значимую корреляцию с выявляемым фенотипом.

- 57 006367

Двуаллельные маркеры настоящего изобретения в способах генетического диагностирования

Сап1оп-последовательность нуклеиновой кислоты и двуаллельные маркеры настоящего изобретения можно также использовать для создания диагностических тестов (диагностикумов) способных идентифицировать индивиды, генотипы которых несут риск развития выявляемого признака в последующее время. Такой диагноз может быть пригоден для определения, мониторинга, прогноза и/или профилактики или лечения многочисленных заболеваний или состояний, включая шизофрению, биполярное расстройство и другие нарушения ЦНС, такие как эпилепсия и нарушения болевых ощущений, сердечнососудистые состояния, такие как порок сердца, гипертензия, аритмия, и многочисленные другие заболевания и состояния.

Методы диагностики настоящего изобретения могут использовать различные методологии для определения присутствия у обследуемого человека паттерна двуаллельного маркера, ассоциированного с повышенным риском развития выявляемого признака, или у индивида, страдающего от выявляемого признака, как результата конкретной мутации, включая способы, которые делают возможным анализ индивидуальных хромосом для гаплотипирования, такие как исследование семей, ДНК-анализ отдельного спермия или соматических гибридов.

В настоящем изобретении созданы диагностические способы определения индивида с риском развития заболевания или страдающего от заболевания, возникшего в результате мутации или полиморфизма в Сап1оп-гене. В настоящем изобретении созданы также способы определения индивида, обладающего восприимчивостью к шизофрении и биполярному расстройству, или к любому другому состоянию, связанному с кальциевыми каналами, известному в данной области техники и описанному в данном описании.

Данные способы включают получение образца нуклеиновой кислоты от данного индивида и определение в образце нуклеиновой кислоты наличия по меньшей мере одного аллеля или по меньшей мере одного гаплотипа двуаллельного маркера, свидетельствующего о риске развития данного признака, или свидетельствующего о том, что у данного индивида проявляется данный признак из-за обладания конкретным Сап1оп-полиморфизмом или конкретной мутацией (аллельопределяющий признак).

Предпочтительно, для таких диагностических способов образец нуклеиновой кислоты получают от данного индивида и данный образец генотипируют с использованием способов, описанных выше в разделе Способы генотипирования образцов ДНК по двуаллельным маркерам. Данная диагностика может основываться на одиночном двуаллельном маркере или на группе двуаллельных маркеров.

В каждом из этих способов образец нуклеиновой кислоты получают от обследуемого субъекта, после чего определяют паттерн двуаллельного маркера одного или нескольких двуаллельных маркеров А1-А18.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения на образце нуклеиновой кислоты осуществляют ПЦР-амплификацию, чтобы амплифицировать области, в которых идентифицируют полиморфизм, ассоциированный с выявляемым фенотипом. Полученные продукты амплификации секвенируют для определения индивидуального обладания одним или несколькими Сап1оп-полиморфизмами, ассоциированными с выявляемым фенотипом. Праймеры, используемые для получения продуктов амплификации, могут включать праймеры, приведенные в табл. 1 . Альтернативно, данный образец нуклеиновой кислоты подвергают реакциям микросеквенирования, как описано выше, для определения индивида, обладающего одним или несколькими Сап1оп-полиморфизмами, ассоциированными с выявляемым фенотипом, возникшим в результате мутации или полиморфизма в Сап1оп-гене. Праймеры, используемые в реакциях микросеквенирования, могут включать праймеры, приведенные в табл. 4. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данный образец нуклеиновой кислоты контактирует с одним или несколькими аллельспецифичными олигонуклеотидными зондами, которые специфически гибридизуются с одним или несколькими Сап1оп-аллелями, ассоциированными с выявляемым фенотипом. Зонды, используемые для гибридизационного анализа, включают зонды, приведенные в табл. 3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, данный образец нуклеиновой кислоты контактирует со вторым Сап1оп-олигонуклеотидом, способным произвести продукт амплификации при использовании с аллельспецифичным олигонуклеотидом в реакции амплификации. Присутствие продукта амплификации в данной реакции амплификации свидетельствует о том, что данный индивид обладает одним или несколькими Сап1оп-аллелями, ассоциированными с выявляемым фенотипом.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения определяется идентичность определенного нуклеотида, присутствующего по меньшей мере в одном двуаллельном маркере, выбранном из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов, и выявляемым признаком является шизофрения и биполярное расстройство. Диагностический набор включает любой из полинуклеотидов настоящего изобретения.

Такие диагностические способы чрезвычайно полезны и при некоторых обстоятельствах могут использоваться для инициации превентивного лечения или для учета индивида, несущего значимый гаплотип, который предвосхищает диагностические знаки, такие как минорные симптомы.

Диагностика, которая анализирует и предсказывает реакцию на лекарственное средство или побочные эффекты на лекарственное средство, может использоваться для определения индивида, нуждающегося в лечении с помощью конкретного лекарственного средства. Например, если диагноз указывает на

- 58 006367 вероятность того, что индивид будет положительно реагировать на лечение конкретным лекарственным средством, то данное лекарственное средство можно назначать данному индивиду. Напротив, если диагноз свидетельствует, что индивид, вероятно, реагирует отрицательно на лечение конкретным лекарственным средством, можно предписать альтернативный курс лечения. Отрицательную реакцию можно определить как отсутствие эффективной реакции или наличие токсических побочных эффектов.

Клинические испытания лекарственного средства представляют собой другое применение для маркеров настоящего изобретения. Один или несколько маркеров, показывающих реакцию на агент, действующий против шизофрении или биполярного расстройства или иного состояния, связанного с кальциевыми каналами, или показывающих реакцию в виде побочных эффектов на агент, действующий против шизофрении или биполярного расстройства, или иного состояния, связанного с кальциевыми каналами, можно идентифицировать с использованием описанных выше способов. Соответственно, потенциальных участников клинических испытаний такого агента можно скринировать для идентификации индивидов, которые вероятнее всего положительно отреагируют на данное лекарственное средство, и для исключения тех, которые, вероятно, испытают побочные эффекты. Таким образом, эффективность лекарственного лечения можно измерить у индивидов, которые положительно реагируют на данное лекарственное средство, без снижения измеряемости в результате включения индивидов, которые едва ли отреагируют положительно в данном исследовании, и без риска возникновения нежелательных проблем, связанных с безопасностью.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения данный признак, который представляет собой шизофрению или биполярное расстройство, анализируют с использованием представленных диагностик. Вместе с тем, настоящее изобретение также включает в себя любой из описанных в данном описании превентивных, диагностических, прогностических и терапевтических способов с использованием двуаллельных маркеров настоящего изобретения в способах предупреждающих, диагностирующих, управляющих или лечащих родственные заболевания, особенно связанные с расстройствами ЦНС. В примере осуществления родственные заболевания могут включать психотические нарушения, расстройства эмоционального состояния, аутизм, зависимость от химических веществ и алкоголизм, нарушение болевых ощущений, эпилепсию, задержку психического развития и другие психические заболевания, включая когнитивную функцию, страх, нарушение функции принятия пищи, нарушение функции мотивации и расстройство личности, которые определяются в соответствии с четвертым изданием классификации П1адпо818 апб 81аЙ8бса1 Мапиа1 о£ Меп!а1 О18огбег8 (Ό8Μ-ΐν). Другие нарушения включают сердечно-сосудистые расстройства, такие как стенокардия, гипертензия или аритмии.

Рекомбинантные векторы

Используемый в данном описании термин вектор подразумевает кольцевую или линейную молекулу ДНК или РНК, которая является двухцепочечной либо одноцепочечной, и которая включает по меньшей мере один полинуклеотид, представляющий интерес, который требуется перенести в клеткухозяина или в одноклеточный, или в многоклеточный организм-хозяин.

Настоящее изобретение включает в себя семейство рекомбинантных векторов, которые включают регуляторный полинуклеотид, полученный из Сап1оп-геномной последовательности, и/или кодирующий полинуклеотид либо из Сап1оп-геномной последовательности, либо из кДНК-последовательности.

Как правило, рекомбинантный вектор настоящего изобретения может включать любой из описанных в данном описании полинуклеотидов, включая регуляторные последовательности, кодирующие последовательности и полинуклеотидные конструкции, а также любой Сап1оп-праймер или зонд, как указано выше. В частности, рекомбинантные векторы настоящего изобретения могут включать любой из полинуклеотидов, описанных в разделе Геномные последовательности Сап1оп-гена, в разделе Сап1опкДНК-последовательности, в разделе Кодирующие области, в разделе Полинуклеотидные конструкции и в разделе Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный вектор настоящего изобретения используют для амплификации встраиваемого полинуклеотида, полученного из геномной последовательности 8ЕО ΙΌ № 1-3 или 6 или Сап1оп-кДНК, например, кДНК с 8ЕЦ ГО № 4, в соответствующей клетке-хозяине, данный полинуклеотид амплифицируется каждый раз, когда происходит репликация данного рекомбинантного вектора.

Другой предпочтительный вариант осуществления рекомбинантных векторов, в соответствии с настоящим изобретением, включает экспрессионные векторы, включающие либо регуляторный полинуклеотид, либо кодирующую нуклеиновую кислоту настоящего изобретения, либо и тот и другую. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессионные векторы используют для экспрессии Сап1оп-полипептида, который затем можно выделить очисткой и, например, использовать в анализе по скринированию лиганда или в качестве иммуногена с тем, чтобы вызвать продукцию специфичных антител, направленных против Сап1оп-белка. В других вариантах осуществления настоящего изобретения данные экспрессионные векторы используют для создания трансгенных животных, а также для генотерапии. Экспрессия требует, чтобы в векторах создавались соответствующие сигналы, причем указанные сигналы включают различные регуляторные элементы, такие как энхансеры/промоторы из источников вируса и млекопитающих, которые приводят в действие в клетках-хозяевах экспрессию инте

- 59 006367 ресующих генов. Доминантные лекарственные селективные маркеры для создания долговременных стабильных клеточных клонов, экспрессирующих данные продукты, как правило, включены в экспрессионные векторы настоящего изобретения, так как они являются элементами, которые связывают экспрессию данных лекарственных селективных маркеров с экспрессией данного полипептида.

Более подробно, настоящее изобретение относится к экспрессионным векторам, которые включают нуклеиновые кислоты, кодирующие Сап1оп-белок, предпочтительно Сап1оп-белок аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ Ыо 5, или его варианты или фрагменты.

Настоящее изобретение относится также к рекомбинантному экспрессионному вектору, пригодному для экспрессии Сап1оп-кодирующей последовательности, где указанный вектор включает нуклеиновую кислоту 8ЕЦ ΙΌ Ыо 4.

Рекомбинантные векторы, включающие нуклеиновую кислоту, содержащую двуаллельный маркер, связанный с Сап!оп, также являются частью настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный двуаллельный маркер выбран из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов.

Некоторые элементы, которые можно найти в векторах настоящего изобретения, описаны более подробно в нижеследующих разделах.

Настоящее изобретение включает также первичные, вторичные, иммортализованные гомологично рекомбинантные клетки-хозяева позвоночных, предпочтительно млекопитающих и, в частности, человека, которые были созданы биотехнологически для: а) встраивания экзогенных (гетерологичных) полинуклеотидов в эндогенную хромосомную ДНК гена-мишени, Ь) удаления эндогенной хромосомной ДНК, и/или с) замены эндогенной хромосомной ДНК экзогенными полинуклеотидами. Вставки, делеции и/или замены полинуклеотидных последовательностей могут представлять собой кодирующие последовательности гена-мишени и/или регуляторные области, такие как промоторные и энхансерные последовательности, функционально присоединенные к гену-мишени.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу создания гомологичной рекомбинантной клетки-хозяина ш ν 11го или ш у1уо, в котором экспрессия гена-мишени, аномально экспрессируемого в данной клетке, изменяется. Предпочтительно изменение вызывает экспрессию данного гена-мишени в нормальных условиях роста или в условиях, пригодных для продуцирования полипептида, кодируемого данным геном-мишенью. Данный способ включает следующие стадии: (а) трансфицирования данной клетки ш ν 11го или ш у1уо при помощи полинуклеотидной конструкции, причем данная полинуклеотидная конструкция включает: (ί) нацеливающую последовательность; (и) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность; и (ίίί) неспаренный донорный сайт сплайсинга, если требуется, в результате чего продуцируется трансфицированная клетка; и (Ь) сохранения данной трансфицированной клетки ш уйго или ш у1уо в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации.

Настоящее изобретение относится, кроме того, к способу изменения экспрессии гена-мишени в клетке ш у 11го или ш угуо, где данный ген экспрессируется в данной клетке аномально, включающему следующие стадии: (а) трансфицирования данной клетки ш у 11го или ш у1уо полинуклеотидной конструкцией, причем данная полинуклеотидная конструкция включает: (ί) нацеливающую последовательность; (ίί) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность; (ίίί) неспаренный донорный сайт сплайсинга, если требуется, в результате чего продуцируется трансфицированная клетка; и (Ь) сохранения данной трансфицированной клетки ш У11го или ш у1уо в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации, посредством которой продуцируется гомологично рекомбинантная клетка; и (с) сохранения гомологично рекомбинантной клетки ш У11го или ш у1уо в условиях, подходящих для экспрессии данного гена.

Кроме того, настоящее изобретение имеет отношение к способу создания полипептида настоящего изобретения путем изменения экспрессии целевого эндогенного гена в клетке ш у 11го или ш у1уо, где данный ген экспрессируется в данной клетке аномально, включающему следующие стадии: а) трансфицирования данной клетки ш У11го полинуклеотидной конструкцией, включающей: (ί) нацеливающую последовательность; (ίί) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность; и (ίίί) неспаренный донорный сайт сплайсинга, если требуется, продуцируя тем самым трансфицированную клетку; (Ь) сохранения данной трансфицированной клетки ш у 11го или ш у1уо в условиях, подходящих для гомологичной рекомбинации, продуцируя таким образом гомологично рекомбинантную клетку; и (с) сохранения гомологично рекомбинантной клетки ш у 11го или ш у1уо в условиях, подходящих для экспрессии данного гена, создавая таким образом данный полипептид.

Настоящее изобретение имеет также отношение к полинуклеотидной конструкции, которая изменяет экспрессию целевого гена в типичной клетке, в которой данный ген экспрессируется аномально. Это происходит в том случае, если данная полинуклеотидная конструкция встраивается в хромосомную ДНК клетки-мишени, где данная полинуклеотидная конструкция включает: а) нацеливающую последовательность; Ь) регуляторную последовательность и/или кодирующую последовательность; и с) неспаренный донорный сайт сплайсинга, если требуется.

Дополнительно включаются полинуклеотидные конструкции, как описано выше, где данная конструкция дополнительно включает полинуклеотид, который кодирует полипептид, и находится в рамке

- 60 006367 считывания с эндогенным геном-мишенью после гомологичной рекомбинации с хромосомной ДНК.

Композиции можно получить и способы осуществить с помощью методов, известных в данной области техники, которые описаны в патентах США №№: 6054288; 6048729; 6048724; 6048524; 5994127; 5968502; 5965125; 5869239; 5817789; 5783385; 5733761; 5641670; 5580734; в международных публикациях №№: ^096/29411. ^094/12650; и научных статьях, включающих Во11ег и соавт., 86:8932-8935 (1989).

1. Основные характерные особенности экспрессионных векторов настоящего изобретения.

В соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный вектор включает, но не ограничивается ими, УЛС (искусственная хромосома дрожжей), ВАС (искусственная хромосома бактерий), фаг, фагемиду, космиду, плазмиду или даже линейную молекулу ДНК, которая может включать хромосомную, нехромосомную, полусинтетическую и синтетическую ДНК. Такой рекомбинантный вектор может включать транскрипционный элемент, включающий совокупность из (1 ) генетического элемента или элементов, играющих регуляторную роль в экспрессии гена, например, промоторы или энхансеры. Энхансеры являются цис-действующими элементами ДНК, обычно длиной от около 10 до 300 п.н., которые действуют на промотор для увеличения транскрипции.

(2) структурной или кодирующей последовательности, которая транскрибируется в мРНК и, в конечном счете, транслируется в полипептид, причем указанная структурная кодирующая последовательность функционально присоединяется к регуляторным элементам, описанным в (1 ); и (3) соответствующих последовательностей инициации транскрипции и терминации. Структурные единицы, предназначенные для использования в дрожжевой или эукариотической экспрессионных системах, предпочтительно включают лидерную последовательность, делающую возможной внеклеточную секрецию транслируемого белка клеткой-хозяином. Альтернативно, если рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать И-концевой остаток. Данный остаток может или не может быть впоследствии отщеплен от экспрессированного рекомбинантного белка для создания конечного продукта.

В большинстве случаев рекомбинантные экспрессионные векторы будут включать ориджины репликации, селективные маркеры, позволяющие трансформировать клетку-хозяина, и промотор, полученный из высокоэкспрессируемого гена, который контролирует транскрипцию расположенного правее структурной последовательности. Гетерологичную структурную последовательность собирают в соответствующей фазе последовательностями инициации трансляции и терминации, и предпочтительно с лидерной последовательностью, способной направлять секрецию транслируемого белка в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду. В специфичном варианте осуществления настоящего изобретения, в котором данный вектор адаптирован для трансфицирования и экспрессирования требуемых последовательностей в клетках-хозяевах млекопитающих, предпочтительные векторы будут включать ориджин репликации требуемого хозяина, подходящий промотор и энхансер, а также любые необходимые сайты связывания рибосом, сигнал полиаденилирования, донорный и акцепторный сайты сплайсинга, последовательности терминации транскрипции и нетранскрибируемые 5'-фланкирующие последовательности. Последовательности ДНК, полученные из генома вируса 8У40, например, 8У40ориджина, раннего промотора, энхансера и сигналов сплайсинга и полиаденилирования, можно использовать для создания требуемых нетранскрибируемых генетических элементов.

1п У1уо-экспрессия Сап1оп-полипептида 8Е0 Ш Ио 5, или его фрагментов или его вариантов, может оказаться пригодной для того, чтобы исправить генетический дефект, связанный с экспрессией нативного гена в организме-хозяине, или для получения биологически неактивного Сап1оп-белка.

Следовательно, настоящее изобретение включает также рекомбинантные экспрессионные векторы, созданные главным образом для ш У1уо-получения Сап1оп-полипептида 8Е0 Ш Ио 5, или его фрагментов или его вариантов, путем введения соответствующего генетического материала в организм лечащегося пациента. Данный генетический материал можно вводят ш νίΙΐΌ в клетку, которую раньше извлекли из данного организма, затем модифицированную клетку вновь ввели в указанный организм, непосредственно ш у1уо в соответствующую ткань.

2. Регуляторные элементы.

Промоторы

Подходящие промоторные области, используемые в соответствии с настоящим изобретением, в экспрессионных векторах, выбраны с учетом клетки-хозяина, в которой экспрессируется данный гетерологичный ген. Конкретный промотор, используемый для контроля экспрессии представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты не считается существенным, до тех пор, пока он способен управлять экспрессией нуклеиновой кислоты в данной клетке-мишени. Поэтому если клетка человека является мишенью, предпочтительно поместить нуклеотидную кодирующую область по соседству и под контролем промотора, такого как, например, промотор человека или вирусный промотор, который способен экспрессироваться в клетке человека.

Подходящий промотор может быть гетерологичным по отношению к нуклеиновой кислоте, экспрессию которой он контролирует, или, альтернативно, он может быть эндогенным к данному нативному полинуклеотиду, содержащему кодирующую экспрессируемую последовательность. Кроме того, данный промотор, как правило, гетерологичен по отношению к рекомбинантным векторным последовательно

- 61 006367 стям, в которые встраивается данная конструкция промотор/кодирующая последовательность.

Промоторные области можно выбрать из любого желаемого гена с использованием, например, САТ (хлорамфениколтрансферазных) векторов и более предпочтительно с использованием векторов РКК2328 и рСМ7.

Предпочтительными бактериальными промоторами являются промоторы Ьасф Γ;κΖ, РНКполимеразные промоторы бактериофага Т3 или Т7, промоторы др!, лямбда РК. РЬ и !гр (ЕР 0036776), промотор гена полиэдрина или промотор белка р10 бакуловируса (Кй Nονадеη) (8тйЬ и соавт., 1983; 0'КеШу и соавт., 1992), промотор лямбда РК или также !гс-промотор.

Эукариотические промоторы включают предранний СМУ, тимидинкиназный Н8У, ранний и поздний 8У40. ЬТК из ретровируса и металлотионеин-Ь мыши. Выбор удобного вектора и промотора определяется на уровне специалиста в данной области техники.

Выбор промотора определяется квалификацией специалиста в области генной инженерии. Для этого, например, можно обратиться к 8ηιηΗοο1< и соавт. (1989) или к методам, описанным также у Еи11ег и соавт. (1996).

Другие регуляторные элементы

Если используют кДНК-вставку, то, как правило, желательно включить сигнал полиаденилирования, который осуществляет надлежащее полиаденилирование генного транскрипта. Природа сигнала полиаденилирования не считается ключевой для успешного осуществления настоящего изобретения, и можно использовать такую последовательность как последовательность гормона роста человека и сигнал полиаденилирования 8У40. В качестве элемента экспрессионной кассеты рассматривают также терминатор. Эти элементы могут служить для повышения уровней мРНК и для минимизации сквозного прочтения генетической информации из данной кассеты в другие последовательности.

3. Селективные маркеры.

Такие маркеры должны обеспечивать клетку идентифицируемым изменением, позволяющим легкую идентификацию клеток, содержащих данную экспрессионную конструкцию. Селективные маркерные гены для отбора трансформированных клеток-хозяев, обладают предпочтительно дигидрофолатредуктазной или неомициновой устойчивостью в культуре эукариотических клеток, ТКИ для С. сегегыае. или тетрациклиновой, рифампициновой или амплицилиновой устойчивостью для Е. ^1ί, или левансахаразной устойчивостью для микробактерий, данный последний маркер является негативным селективным маркером.

4. Предпочтительные векторы.

Бактериальные векторы

В качестве представительного, но не ограничивающего примера, пригодные экспрессионные векторы для бактериального применения могут включать селективный маркер и бактериальный ориджин репликации, полученный из коммерчески доступных плазмид, включающих генетические элементы ρΒΚ322 (АТСС 37017). Такие коммерческие векторы включают, например, рКК223-3 (Рйагтааа. Ирр8а1а, Швеция) и 6ΕΜΙ (Рготеда Бю1ес. Μηάίδοη. ^Ι, США).

Специалистам в данной области техники известно большое количество других подходящих и коммерчески доступных векторов, таких как следующие бактериальные векторы: рОЕ70. рОЕ60. рОЕ-9 (0|адег1). рЬ§, рЭ10. рйадекспр!, рь1Х 174, рЫиекспр! 8К, рЬккк, рИН8А, рИН16А, рИН18А, рИН46А (НШИадеие): р!гс99а. рКК223-3. рКК233-3. рЭК540. рШТ5 (РйагтаОа); р\\'1.\Е0. р8У2САТ. р0С>44. рХТ1. р86 (8!^а!адеηе); р8УК3. ρΒРV, рМ8С. р8УЪ (Рйагтааа); рОЕ-30 (О!Аехрге55).

Векторы бактериофага

Вектор бактериофага Р1 может содержать большие вставки в диапазоне от около 80 до около 100 т. п. н.

Конструкция векторов бактериофага Р1, таких как р158 или р158/пео8, полнее всего описаны 8!етЬегд (1992, 1994). Рекомбинантные клоны Р1, включающие СаηIοη-нуклеотидные последовательности, можно создать путем встраивания больших полинуклеотидов из более чем 40 т.п.н. (Τίη!οη и соавт., 1993). Для получения ДНК Р1 для трансгенных экспериментов предпочтительным протоколом является протокол, описанный Мс^гтюк и соавт. (1994). Вкратце, Е. отН (предпочтительно штамм Ν83529), несущих плазмиду Р1, выращивают в течение ночи в соответствующей бульонной среде, содержащей 25 мкг/мл канамицина. ДНК Р1 получают из Е. отН путем щелочного лизиса с использованием набора 0|адег1 Р1а§т1б Мах1 (01адег1. 01ιηΐ5\νοΓΐ1ι. СА, США), в соответствии с инструкциями производителя. ДНК Р1 выделяют очисткой из полученного бактериального лизата на двух колонках ^^адеη-!^ρ 500 с использованием промывочного и элюирующего буферов, содержащихся в данном наборе. Затем, перед осаждением ДНК 70%-м этанолом, проводят экстрагирование смесью фенол/хлороформ. После солюбилизации осажденной ДНК в ТЕ (10 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА), концентрацию солюбилизированной ДНК определяют на спектрофотометре.

Если целью является экспрессия клона Р1, включающего СаηIοη-нуклеотидные последовательности, в трансгенном животном, обычно в трансгенных мышах, желательно удалить векторные последовательности из ДНК-фрагмента Р1, например, путем расщепления ДНК Р1 по редкоразрезаемым сайтам внутри Р1-полилинкера (δίΐΙ. Νο!Ι или 8аП). Затем Р1-вставку выделяют очисткой из векторных последо

- 62 006367 вательностей, подвергнутых гель-электрофорезу в пульсирующем поле, с использованием методов, аналогичных методам, которые первоначально предлагались для выделения ДНК из УАС (8сйеб1 и соавт., 1993а; Ρеΐе^κоπ и соавт., 1993). На этой стадии полученная, выделенная очисткой, вставка ДНК может быть сконцентрирована, при необходимости, на фильтровальной установке МчШроге ийгаГгее-МС (М1Шроге, ВебГогб, МА, США - в пределах молекулярной массы 30000) и затем диализована против буфера для микроинъекций (10 мМ Трис-НС1, рН 7,4; 250 мкМ ЭДТА), содержащего 100 мМ №С1, 30 мкМ спермина, 70 мкМ спермидина, в мембране для микродиализа (тип У8, 0,025 мкМ от МчШроге). Целостность выделенной очисткой ДНК-вставки Р1 определяют с помощью электрофореза в пульсирующем поле в 1%-м агарозном (8еа Кет СТС; ЕМС Вю-ргобис!к) геле и окрашивают этидийбромидом.

Бакуловирусные векторы

Подходящим вектором для экспрессии Сап1оп-полипептида 8ЕО ΙΌ № 5 или его фрагментов или вариантов является бакуловирусный вектор, который можно размножить в клетках и в клеточных линиях насекомых. Специфичной подходящей хозяйской векторной системой является бакуловирусный трансфер-вектор рУЪ 13 92/1393 (Ρйа^т^πдеπ), который используют для трансфицирования клеточной линии 8Е9 (АТСС №СКЬ 1711), которую получают из 8робор!ега Ггидчрегба.

Другие подходящие векторы для экспрессии Сап1оп-полипептида 8ЕО ΙΌ № 5 или его фрагментов или вариантов в бакуловирусной экспрессионной системе включают векторы, описанные у Скн и соавт. (1993), У1акак и соавт. (1983) и Ьепкагб и соавт. (1996).

Вирусные векторы

В одном из специфичных вариантов осуществления настоящего изобретения вектор получают из аденовируса. В соответствии с настоящим изобретением предпочтительные аденовирусные векторы представляют собой векторы, которые описаны у Ее1бтап апб 8!ед (1996) или у Окпо и соавт. (1994). Другой предпочтительный рекомбинантный аденовирус, в соответствии с осуществлением данного специфичного варианта, представленного в настоящем изобретении, представляет собой аденовирус человека тип 2 или 5 (Аб 2 или Аб 5) или аденовирус животного происхождения (см., например, французская патентная заявка № ЕК-93.05954).

Под ретровирусными векторами и аденоассоциированными вирусными векторами подразумевают, главным образом, рекомбинантные системы доставки генов, выбранные для переноса экзогенных полинуклеотидов ΐπ учуо, в частности, млекопитающим, включая людей. Данные векторы обеспечивают эффективную доставку генов в клетки, а перенесенные нуклеиновые кислоты стабильно интегрируются в хромосомную ДНК данного хозяина.

Особенно предпочтительные препараты ретровирусов или ретровирусные конструкциипереносчики настоящего изобретения для доставки генов ш уйго или ш учуо включают ретровирусы, выбранные из группы, состоящей из вируса, индуцирующего очаг клеток норки, вируса саркомы мышей, вируса ретикулоэндотелиоза и вируса саркомы Рауса. Особенно предпочтительные вирусы лейкоза мышей включают вирусы 4070А и 1504А, АЬе1коп (АТСС № УК-999), Епепб (АТСС N УК-245), Сгокк (АТСС N УК-590), Каиксйег (АТСС N УК-998) и вирус лейкоза мышей Молони (АТСС N УК-190; Заявка ΡΟΓ № νθ 94/24298). Особенно предпочтительные вирусы саркомы Рауса включают Вгуап с высоким титром (АТСС N(>8 УК-334, УК-657, УК-726, УК-659 и УК-728). Другие предпочтительные ретровирусные векторы представляют собой ретровирусы, которые описаны у Ко!1 и соавт. (1996), заявка РСТ № νθ 93/25234, заявка ΡСТ № νθ 94/06920, Коих и соавт., 1989, 1и1ап и соавт., 1992 и №ба и соавт., 1991.

Еще одна вирусная векторная система, которая рассматривается в настоящем изобретении, включает аденоассоциированный вирус (ААУ). Аденоассоциированный вирус представляет собой встречаемый в природе дефектный вирус, который нуждается в другом вирусе, таком как аденовирус или герпесвирус, в качестве вируса-помощника для эффективной репликации и продуктивного жизненного цикла (Михусхка и соавт., 1992). Это один из немногих вирусов, который может интегрировать свою ДНК в неделящиеся клетки и проявляют высокую частоту устойчивой интеграции (Е1о!!е и соавт., 1992; 8ати1кк1 и соавт., 1989; МсЬаидЫт и соавт., 1989). Отличительной чертой ААУ является его уменьшенная эффективность в отношении трансдуцирования первичных клеток по сравнению с трансформированными клетками.

ВАС векторы

Клонирующая система бактериальной искусственной хромосомы (ВАС) (81ихиуа и соавт., 1992) была создана для устойчивого сохранения в Е. сой больших фрагментов геномной ДНК (100-300 т.п.н.). Предпочтительный ВАС-вектор включает вектор рВе1оВАС11, который был описан К1т и соавт. (1996). С помощью данного вектора получают ВАС-библиотеки, а с использованием отобранной по размеру геномной ДНК, которую частично расщепляют ферментами, их можно лигировать в сайты Ват Н1 или НшбШ данного вектора. Фланкирование этих клонирующих сайтов осуществляют Т7 и 8Ρ6 РНКполимеразными сайтами инициации транскрипции, которые можно использовать для создания концевых зондов с помощью методов РНК-транскрипции или ПЦР. После создания ВАС-библиотеки в Е. со11, ДНК ВАС выделяют очисткой из клетки-хозяина в виде сверхспирализованной кольцевой молекулы. Преобразованию таких кольцевых молекул в линейную форму предшествует определение размера и введение

- 63 006367

ВАС в реципиентные клетки. Клонирующие сайты фланкируют с помощью двух Ио1 ΐ-сайтов, что позволяет вырезать клонированные сегменты из данного вектора в результате расщепления Ио1 I. Альтернативно, ДНК-вставку, содержащую вектор рВе1оВАС11, можно линеализировать путем обработки ВАСвектора коммерчески доступным ферментом лямбда-терминаза, что приводит к расщеплению уникального сокИ-сайта, но данный способ расщепления дает полноразмерный ВАС-клон, содержащий последовательности и ДНК-вставки и ВАС.

5. Доставка рекомбинантных векторов.

Для того чтобы эффективно экспрессировать полинуклеотиды и полинуклеотидные конструкции настоящего изобретения, данные конструкции необходимо доставить в клетку. Такую доставку можно осуществить ш νίΙΐΌ, как в лабораторных методах трансформирования клеточных линий или ш у1уо, или ех у1уо, так и при лечении некоторых болезненных состояний.

Одним из механизмов является вирусная инфекция, при которой экспрессионная конструкция инкапсулируется в вирусные частицы, вызывающие заражение.

В настоящем изобретении рассматривается также несколько невирусных способов переноса полинуклеотидов в культивируемые клетки млекопитающих, которые включают, без ограничения, осаждение кальцийфосфатом (Сгайат и соавт., 1973; Сйеп и соавт., 1987), ОЕАЕ-декстраном (Сора1, 1985), электропорацией Цм-Ка^ра и соавт., 1986; Ройег и соавт., 1984), прямой микроинъекцией (Наг1апб и соавт., 1985), нагруженными ДНК липосомами (№со1аи и соавт., 1982; Ега1еу и соавт., 1979) и рецепторопосредованной трансфекцией (\Ун апб \¥и, 1987; 1988). Некоторые из таких методов можно успешно адаптировать для 1п у1уо или ех у1уо использования.

После доставки в клетку экспрессионный полинуклеотид можно стабильно интегрировать в геном реципиентной клетки. Данная интеграция может произойти в соответствующем месте и ориентации с помощью гомологичной рекомбинации (замещение гена) или его можно интегрировать произвольно, не помещая в конкретное место (аугментация гена). Еще в одних вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновую кислоту можно стабильно сохранять в клетке в виде отдельного зписомного сегмента ДНК. Такие сегменты нуклеиновых кислот или эписомы кодируют последовательности, достаточные для сохранения и репликации синхронно с циклом клетки-хозяина или независимо от указанного цикла.

Один из специфичных вариантов способа доставки 1п у1уо белка или пептида внутрь клетки позвоночного включает стадию введения препарата, включающего физиологически приемлемый носитель и «голый» полинуклеотид, оперативно кодирующий представляющий интерес полипептид во внутритканевом пространстве ткани, включающей данную клетку, посредством чего «голый» полинуклеотид помещается внутрь клетки, и обладающей физиологическим действием. Это особенно применимо для переноса ш У11го, но можно также применить и для шу1уо.

Композиции для использования ш У11го и ш у1уо, включающие «голый» полинуклеотид, описаны в заявке РСТ № \¥О 90/11092 (Щса1 1пс.), а также в заявке РСТ № \¥О 95/11307 (1пййи1 РаДеиг, IN8ЕΚΜ, Ишуегайе б'Ойача), а также в статьях Τас8οп и соавт. (1996) и Ниудеп и соавт. (1996).

Еще в одном варианте настоящего изобретения перенос «голого» полинуклеотида настоящего изобретения, включающего полинуклеотидную конструкцию настоящего изобретения, в клетки, можно задействовать с помощью бомбардировки микрочастицами (биолистика), причем указанные частицы, покрытые ДНК, ускоряются до высокой скорости, что позволяет им пронзать клеточные мембраны и проникать в клетки без их повреждения так, как описано К1ет и соавт. (1987).

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид настоящего изобретения может быть включен в липосому (Сйокй апб Вассйача!, 1991; \Уопд и соавт., 1980; №со1аи и соавт., 1987).

В специфичном варианте осуществления настоящего изобретения создана композиция для получения 1п у1уо описанного в данном описании Сап1оп-белка или полипептида. Она включает «голый» полинуклеотид, оперативно кодирующий данный полипептид, в растворе физиологически приемлемого носителя, и подходящего для введения в ткань, что определяет появление клеток данной ткани, которые экспрессируют указанный белок или полипептид.

Количество вектора, которое инъецируется в желаемый организм-хозяин, варьирует в соответствии с местом инъекции. В качестве примерной дозы, в тело животного, предпочтительно тело млекопитающего, например тело мыши, следует инъецировать 0,1 -1 00 мкг вектора.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения вектор в соответствии с настоящим изобретением, можно вводить в клетку-хозяина ш У11го, предпочтительно в клетку-хозяина, предварительно взятую у животного, подвергающегося лечению, и более предпочтительно в соматическую клетку, такую как клетка мышц. На следующей стадии клетку, которую трансформировали вектором, кодирующим требуемый Сап1оп-полипептид или требуемый его фрагмент, реинтродуцируют в тело животного для того, чтобы доставить рекомбинантный белок в данное тело либо местно, либо системно.

Клетки-хозяева

Другая цель настоящего изобретения включает клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные описанными в данном описании полинуклеотидами, и, в частности, полинуклеотидом,

- 64 006367 включающим Сап1оп-регуляторный полинуклеотид или кодирующую последовательность Сап1опполипептида, выбранную из группы, состоящей из 8ЕЦ ΙΌ Кок 1-4 или их фрагментов или вариантов. Включены также клетки-хозяева, которые трансформируют (прокариотические клетки) или которые трансфицируют (эукариотические клетки) рекомбинантным вектором, таким как один из тех, которые описаны выше. В частности, клетки-хозяева настоящего изобретения могут включать любой из полинуклеотидов, описанных в разделе Геномные последовательности Сап1оп-гена, в разделе Сап1оп-кДНКпоследовательности, в разделе Кодирующие области, в разделе Полинуклеотидные конструкции и в разделе Олигонуклеотидные зонды и праймеры.

Кроме того, рекомбинантная клетка-хозяин, в соответствии с настоящим изобретением, включает полинуклеотид, содержащий двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов.

Дополнительная рекомбинантная клетка-хозяин, в соответствии с настоящим изобретением, включает любой из описанных в данном описании векторов, в частности, любой из векторов, описанных в разделе Рекомбинантные векторы.

Предпочтительными клетками-хозяевами, используемыми в качестве реципиентов для экспрессионных векторов настоящего изобретения, являются следующие:

a) Прокариотические клетки-хозяева: штаммы ЕксйейсШа со11 (штамм 1.ЕГОН5-а), ВасШик киЫШк, 8а1топе11а 1урЫтигшт и штаммы видов, подобных Ркеиботопак, 81гер1отусек и 81арЫ1ососсик.

b) Эукариотические клетки-хозяева: НеЬа-клетки (АТСС №ССЬ2; №ССЬ2.1; №ССЬ2.2), Су 1клетки (АТСС №ССЬ70), СО8-клетки (АТСС №СВЬ1650; №СВЫ651), 8Г-9-клетки (АТСС №СВЬ1711), С127-клетки (АТСС №СВЬ-1804), ЗТЗ (АТССС №СВЬ-6361), СНО (АТСС №ССЬ-61), 293-клетки почек человека (АТСС Ν°45504; №СВЬ-1573) и ВНК (ЕСАСС №84100501; №84111301).

c) Другие клетки-хозяева млекопитающих.

Экспрессия Сап1оп-ген в клетках млекопитающих, прежде всего человека, может оказаться дефектной или же она может осуществляться в результате вставки геномной Сап1оп-последовательности или кДНК-последовательности Сап1оп с заменой копии Сап1оп-гена в геноме клетки животного на Сап1опполинуклеотид согласно настоящему изобретению. Такие генетические изменения можно осуществить путем гомологичных рекомбинационных событий с использованием специфических ДНК-конструкций, которые были описаны выше.

Одним из видов клеток-хозяев, которые можно использовать, являются зиготы млекопитающих, такие как мышиные зиготы. Например, мышиные зиготы можно подвергнуть микроинъекции выделенной очисткой, представляющей интерес молекулой ДНК, например, выделенной очисткой молекулой ДНК, которая предварительно доведена до концентрации 1 нг/мл для ВАС-вставок до 3 нг/мкл для вставок бактериофага Р1 в 10 мМ Трис-НС1, рН 7,4, 250 мкМ ЭДТА, содержащего 100 мМ №С1, 30 мкМ спермина и 70 мкМ спермидина. При микроинъекции ДНК большого размера можно использовать полиамины и высокие концентрации соли для того, чтобы исключить механическое повреждение данной ДНК, как описано 8сЫеб1 и соавт. (1993Ь).

Любой из полинуклеотидов настоящего изобретения, включая описанные в данном описании ДНКконструкции, можно ввести в эмбриональную стволовую (Е8) клеточную линию, предпочтительно мышиную Е8-клеточную линию. Е8-клеточные линии получают из плюрипотентных, некоммитированных клеток внутренней клеточной массы преимплантированных бластоцист. Предпочтительными Е8клеточными линиями являются следующие: Е8-Е14ТС2а (АТСС п°СВЕ-1821), Е8-Э3 (АТСС п°СВЬ1934 и п°СВЬ-11632), Υ8001 (АТСС п°СВЬ-11776), 36,5 (АТСС п°СКЬ-11116). Для сохранения Е8клеток в некоммитированном состоянии, их культивируют в присутствии фидерных клеток с подавленным ростом, которые создают соответствующие сигналы, предохраняющие этот эмбриональный фенотип и служат в качестве матрикса для адгезии Е8-клетки. Предпочтительными фидерными клетками являются первичные эмбриональные фибробласты, которые создаются из ткани 13-14-дневных эмбрионов практически любого мышиного штамма, которые поддерживаются в культуре так, как это описано у АЬЬопбапхо и соавт. (1993), и рост которых подавляется в результате облучения так, как описано у ИоЬеПкоп (1987), или в присутствии ингибирующей концентрации ЫЕ так, как описано у Реаке апб ХУПНатк (1990).

Конструкции для клеток-хозяев можно использовать традиционным образом для получения генного продукта, кодируемого рекомбинантной последовательностью.

После трансформации соответствующего хозяина и роста данного хозяина до надлежащей клеточной плотности, выбранный промотор индуцируют подходящими средствами, такими как температурный сдвиг или химическая индукция, и клетки культивируют в течение дополнительного периода.

Клетки собирают, как правило, центрифугированием, разрушением с помощью физических или химических средств, и полученный неочищенный экстракт оставляют для последующей очистки.

Микробные клетки, используемые для экспрессии белков, можно разрушить любым удобным способом, включая циклическое замораживание-оттаивание, ультразвуковую обработку, механическое разрушение или используя агенты, лизирующие клетки. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области техники.

- 65 006367

Трансгенные животные

Термины трансгенные животные или животные-хозяева, используют в данном описании для обозначения животных, которые, обладая своим геном, подвергаются генетическому и искусственному воздействию так, что включают одну из нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Предпочтительными животными являются млекопитающие, не относящиеся к человеческому роду, и включают млекопитающих, принадлежащих роду, выбранному из Мик (например мыши), Вайик (например крысы) и Огус1ода1ик (например кролики), геном которых искусственно и генетически изменяют встраиванием нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение включает в себя млекопитающих-хозяев, не принадлежащих человеческому роду, и животных, включающих рекомбинантный вектор настоящего изобретения или Сагбоп-ген, разрушенный гомологичной рекомбинацией с помощью нокаутного вектора.

Трансгенные животные настоящего изобретения, все, включают во множестве своих клеток клонированную рекомбинантную или синтетическую ДНК-последовательность, одну из выделенных очисткой или выделенных нуклеиновых кислот, включающих Сагбоп-кодирующую последовательность, СаиIоирегуляторный полинуклеотид, полинуклеотидную конструкцию или ДНК-последовательность, кодирующую антисмысловой полинуклеотид, такой как описанный в настоящем подробном описании.

Как правило, трансгенное животное, в соответствии с настоящим изобретением, включает любой один из полинуклеотидов, рекомбинантных векторов и клеток-хозяев, описанных в настоящем изобретении. В частности, трансгенные животные настоящего изобретения могут включать любой из полинуклеотидов, описанных в разделе Геномные последовательности СаиIои-гена, в разделе СаиIои-кДНКпоследовательности, в разделе Кодирующие области, в разделе Полинуклеотидные конструкции, в разделе Олигонуклеотидные зонды и праймеры, в разделе Рекомбинантные векторы и в разделе Клетки-хозяева.

Кроме того, трансгенные животные, в соответствии с настоящим изобретением, содержат в своих клеточных телах и/или в своих линиях зародышевых клеток полинуклеотид, включающий двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А18 и их комплементов.

В первом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения трансгенные животные могут представлять собой хорошие экспериментальные модели с целью изучения разнообразных патологий, связанных с клеточной дифференциацией, в частности, трансгенные животные, в геном которых встраивают одну или несколько копий полинуклеотида, кодирующего нативный СаηIои-белок, или, альтернативно, мутантный СаиIои-белок.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения трансгенные животные могут экспрессировать представляющий интерес требуемый полипептид под контролем регуляторных полинуклеотидов СаиIои-гена, приводя к хорошему выходу в синтезе данного, представляющего интерес белка и, в конечном счете, к тканеспецифичной тканевой экспрессии данного, представляющего интерес белка.

Создание трансгенных животных настоящего изобретения можно осуществить в соответствии с общепринятыми методиками, хорошо известными специалистам в данной области техники. Дополнительные подробности, относящиеся к получению трансгенных животных и специфически трансгенных мышей, можно найти, например, в патентах США №№4873191, 5464764 и 5789215, каждый из которых включен здесь путем ссылки.

Трансгенные животные настоящего изобретения получают путем применения методов, которые дают животное с геномом, в который введен экзогенный генетический материал. Данный метод включает получение генетического материала или его части, который кодирует СаиIои-кодирующую последовательность, СаиIои-регуляторный полинуклеотид либо ДНК-последовательность, кодирующую СаηIоиантисмысловой полинуклеотид, такой как описано в настоящем описании.

Рекомбинантный полинуклеотид настоящего изобретения встраивают в эмбриональную или в Е8стволовую клеточную линию. Данную вставку предпочтительно осуществляют с использованием электропорации так, как описано у Т1ютак и соавт. (1987). Указанные клетки подвергают электропорации и скринируют (например, путем отбора с помощью селективных маркеров, ПЦР или с помощью Саузернблот-анализа), чтобы обнаружить позитивные клетки, которые интегрировали экзогенный рекомбинантный полинуклеотид в свой геном, предпочтительно с помощью гомологичного рекомбинантного события. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать иллюстративный позитивнонегативный метод отбора, описанный Мапкоиг и соавт. (1988).

Затем позитивные клетки выделяют, клонируют и инъецируют в 3,5-дневные бластоциты мышей так, как описано у Вгаб1еу (1987). Данные бластоцисты вводят затем самке животного-хозяина и позволяют расти до условного момента.

Альтернативно, позитивные Е8-клетки приводят в контакт с 2,5-дневными эмбрионами на 8-16клеточной стадии (морула) так, как описано у \Уооб и соавт. (1993) или у Ыаду и соавт. (1993), Е8клетки, которые интернализуются с обширной колонизацией бластоцисты, включают клетки, которые дадут начало зародышевой линии.

Потомство хозяйской самки тестируют, чтобы определить, какие животные являются трансгенны

- 66 006367 ми, например, включают экзогенную ДНК-последовательность, а какие представляют собой дикий тип.

Таким образом, настоящее изобретение включает также в себя трансгенное животное, содержащее нуклеиновую кислоту, рекомбинантный экспрессионный вектор или рекомбинантную клетку-хозяина, в соответствии с настоящим изобретением.

Рекомбинантные клеточные линии, полученные от трансгенных животных настоящего изобретения

Дополнительная цель настоящего изобретения включает рекомбинантные клетки-хозяева, полученные от описанных в данном описании трансгенных животных. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает в себя клетки, полученные от млекопитающих-хозяев, не принадлежащих человеческому роду, и от животных, содержащих рекомбинантный вектор настоящего изобретения или Сап1оп-ген, разрушенный гомологичной рекомбинацией с помощью нокаутного вектора.

Рекомбинантные клеточные линии можно основать ίπ νί(ΐΌ из клеток, полученных из любой ткани трансгенного животного в соответствии с настоящим изобретением, например, путем трансфекции культуры первичных клеток с помощью векторов, экспрессирующих опс-гены, таких как большой Т-антиген на основе 8У40, как описано у С1юи (1989) и 81ι;·ι\ν и соавт. (1991).

Способы скринирования Сап1оп-модуляторов и Сап1оп взаимодействующих соединений

Для многих вариантов осуществления настоящего изобретения созданы соединения, которые взаимодействуют, связывают, активируют или подавляют экспрессию или активность Сап1оп-полипептидов, каналов и полинуклеотидов. Такие соединения могут представлять собой какое-либо органическое или неорганическое соединение, включая, но, не ограничиваясь ими, полипептиды, полинуклеотиды, липиды, углеводы, нуклеотиды, аминокислоты или малые молекулы ингибиторов или активаторов. Как указано в другом месте данной заявки, такие соединения пригодны для лечения или предупреждения любого из большого числа заболеваний или состояний. Для лечения или предупреждения психических нарушений, таких как шизофрения или биполярное расстройство, предпочтительно использовать ингибиторы Сап1оп-активности или экспрессии.

Способы скринирования модуляторов Сап1оп-канала

Соединения, способные связываться с Сап1оп, и соединения, способные модулировать Сап1опфункцию, имеют важное применение в лечении заболевания. Хорошо установлено, что потенциалзависимые воротные ионные каналы, как правило, являются лекарственными мишенями, потому что они фармакологически доступны, кодируются разными генами и, как правило, функционируют в виде сообществ мультимерных белков, обеспечивающих высокую степень функциональной и анатомической специфичности. Более того, поскольку ионный канал, открываясь и закрываясь, двигает заряженные потенциалчувствительные аминокислоты, что приводит к изменению конформационного состояния, ионные каналы позволяют создать состояние, зависящее от молекул, которые, например, свяжут лишь каналы, находящиеся в состоянии токопроведения (активированные) или нетокопроведения (инактивированные).

Кроме того, было показано, что множество модуляторов кальциевых каналов эффективны для лечения или предупреждения многих заболеваний и состояний. Например, было показано, что ингибиторы кальциевых каналов эффективны против сердечнососудистых заболеваний и состояний (например, стенокардии, аритмий, гиперетензии), а также расстройств ЦНС и нейрональных нарушений (например, мигреней, неврологических последствий инсульта, мании, индуцированной нейролептиками поздней дискинезии, шизофрении, биполярного расстройства, нарушении болевых ощущений, эпилепсии и других). Кроме того, было показано, что агонисты кальциевых каналов эффективны для различных применений, таких как уменьшение продолжительности и иным способом истощающего действия местной анестезии. Антагонисты и агонисты Сап1оп-каналов аналогичным образом пригодны для лечения или предупреждения таких и иных заболеваний и состояний. Например, Сап1оп-антагонисты пригодны для лечения или предупреждения шизофрении и биполярного расстройства.

Поскольку активация потенциал-зависимых воротных ионных каналов не требует связывания с агонистами, соединения предпочтительно скринируют против функциональных Сап1оп-каналов. Анализ может включать методы функционального и радиолигандного связывания, применяемые к клеткам (пузырькам или мембранам), экспрессирующим нативные или клонированные каналы, или проверку целых клеток. Для анализа функциональных целых клеток можно использовать электрофизиологические методы, такие как метод фиксации потенциала. В анализе можно использовать любой тип потенциалзависимого воротного канала, предпочтительно каналы типов Ь, Ы, и Т. Можно измерить также кинетику протекания ионов через данный канал, например, с использованием методов флуоресценции, конечного радиоактивного индикатора или методов клеточной выживаемости.

Анализ можно осуществить с использованием различных токсинов, ядов или соединений, которые, связываясь, открывают или закрывают каналы (Эепуег и соавт., Эгид Э|хс. Тобау 3(7):323-332 (1998), включенный в данном описании путем ссылки во всей его полноте). Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает в себя использование любого из большого числа известных агонистов и антагонистов кальциевых каналов, например, в качестве позитивного или негативного контроля. Примеры подходящих известных антагонистов кальциевых каналов включают фенилалкиламины (например, верапамил), бензотиазепины (например, дилтиазем) и дигидропиридины (например, нифедипин); агони

- 67 006367 сты кальциевых каналов включают РРЬ-64176 и ΒΑΥ К 8644; агонисты натриевых каналов включают Ва1гаско1охт; а антагонисты натриевых каналов включают спирадолин, мексилетин, И-54494А ((+/-)-цис-3,4-дихлор-Ы-метил-М-[2-(1-пирролидинил)циклогексил]бензамид. Такие соединения можно также использовать в качестве проводящих соединений, т.е. служащих в качестве стартовых молекул для создания или обнаружения производных молекул, которые специфически связываются с Сап!опканалами или модулируют их.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения анализ настоящего изобретения включает способ скрининга кандидатного вещества, включающий следующие стадии:

a) создания (ί) образца или клетки-хозяина, содержащих полипептид, включающий, в основном состоящий, или состоящий из Сап!оп-белка или его фрагмента, или (ίί) рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий, в основном состоящий или состоящий из Сап!оп-белка или его фрагмента;

b) получения кандидатного вещества;

c) приведения в контакт указанной клетки-хозяина с указанным кандидатным веществом;

к) определения эффекта указанного кандидатного вещества на Сап!оп-активность.

Определение эффекта кандидатного вещества на Сап!оп-активность можно осуществить в соответствии с хорошо известными способами. Предпочтительно, эффект кандидатного вещества на Сап!опактивность представляет собой агонистический или антагонистический эффект. Как правило, соединение подавляет Сап!оп, если его способность транспортировать ионы (например, Са2+ или №+) снижается. Соединение стимулирует Сап!оп, если повышается его способность транспортировать ионы.

Сап!оп-активность можно обнаружить при использовании любого подходящего способа. В предпочтительных примерах Сап[оп-активность выявляют путем измерения сигнального события. Хотя сигнальное событие может включать любое соответствующее изменение молекулярной характеристики или параметра клетки, неограничивающие примеры сигнального события включают изменения потока ионов, такого как изменение образования потока Са2+, или №+, или К+, или ферментной активности.

Один из аспектов состоит в отслеживании ионного потока путем измерения электрофизиологических свойств Сап!оп-канала с использованием, например, методов измерения потока в одной клетке или на небольшом участке мембраны. В других примерах используют флуоресцентную или радиоактивную метки для выявления перемещения известного Сап[оп-связывающего соединения или для выявления ионного потока через клетку (например, меченный Са2+ или №+). Можно использовать индикатор физиологических параметров клетки, такой, например, как флуоресцентный индикатор клеточной жизнеспособности. В других примерах можно выявлять изменение физического положения индикатора с тем, чтобы использовать активированный флуоресценцией клеточный сортинг для идентификации исключения или поглощения физиологического индикатора.

Образец, используемый для анализа настоящего изобретения, содержит полипептид или клеткухозяина, зкспрессирующую полипептид, включающий, в основном состоящий, состоящий из Сап!опбелка или его фрагмента, или (ίί) рекомбинантную клетку-хозяина, экспрессирующую полинуклеотид, кодирующий полипептид, включающий, в основном состоящий, состоящий из Сап!оп-белка или его фрагмента. Предпочтительно, Сап!оп-анализ настоящего изобретения включает использование рекомбинантной клетки-хозяина, экспрессирующей функциональный Сап!оп-полипептид. Клетки-хозяева могут экспрессировать или включать функциональную альфа-субъединицу Сап!оп-канала или могут экспрессировать или включать одну или несколько дополнительных субъединиц ионного канала, или комплексный ионный канал, включающий Сап!оп. Предпочтительно используется клетка-хозяин, которая обладает низкой эндогенной экспрессией ионного канала или обладает низкой фоновой проводимостью, в частности Са2+ и/или №+.

Радиолигандное связывание

Одним из аспектов настоящего изобретения является скринирование Сап!оп-канала путем идентификации высокоаффинного лиганда, который связывается с представляющим интерес сайтом Сап!оп и предпочтительно обладает требуемым модулирующим эффектом, и выявления способности испытываемого соединения замещать указанный меченный лиганд. Список токсикологических/фармакологических агентов, используемых в анализах потенциал-зависимых воротных (Са2+, №+ и К+) каналов приведен у Эепуег и соавт. (выше). Данный способ в основном пригоден для выявления соединений, которые связываются с одним и тем же сайтом или аллостерически соединяются с указанным сайтом, в виде меченного лиганда, однако не предоставляют информацию о свойствах данного соединения как об агонисте или антагонисте.

Анализы, основанные на флуоресцентной и радиоактивной индикации клетки

В другом анализе Сап!оп-функцию можно проследить путем измерения изменения внутриклеточной концентрации проницаемого иона с использованием флуоресцентно индикаторных ионов или радиоактивно индикаторных ионов.

Обычно ионные каналы, такие как Ыа+-каналы инактивируются в течение миллисекунд после стимуляции потенциала. Са2+-каналы не инактивируются или в меньшей степени инактивируются и могут открываться при высокой К+-деполяризации. В анализах, основанных на флуоресценцентной и радиоак

- 68 006367 тивной индикации клетки, Сагбоп-канал можно, как правило, активировать с помощью токсина или любого испытываемого соединения, или высокой К+-деполяризацией, так, чтобы данный канал оказался открытым в течение длительного периода времени (вплоть до нескольких минут).

В анализах с флуоресценцией используют доступные флуоресцентные Са2+-красители (например, Е1ио-3, Са1с1ит дгееи-1, Молекулярные Зонды, ОР, США). Са2+-каналы можно активировать деполяризацией мембраны с помощью изотоничного раствора, а Ыа+-каналы - с помощью токсина или иного соединения, и полученное в результате нестационарное передвижение флуоресценции в данной клетке можно измерить на протяжении 20-60 с. Системы по измерению флуоресценции и приборы дополнительно описываются у Эепуег и соавт. (выше). Радиоактивные индикаторы 22Ыа+ и 14С-гуанидин обычно используют для анализа Ыа+-каналов, а 45Са2+ используют для анализа Са2+-каналов. В предпочтительном варианте, описанном у Эепуег и соавт. (выше), высокопроизводительный клеточный анализ СапХог осуществляют с использованием сцинтилляционных Су1о51аг-Т-микроплашек (Атегкйат Шегпа1юпа1, и.К.).

В последующих анализах функцию Са2+-ионного канала отслеживают путем измерения мембранного потенциала с помощью индикатора мембранного потенциала. Высокое электрическое сопротивление биологических мембран позволяет малым ионным потокам через плазматическую мембрану вызывать большие изменения мембранного потенциала. Таким образом, анализ потенциала удобно использовать для выявления общего ионного потока через мембраны. Клеточные линии, как правило, выбирают так, чтобы минимизировать действие эндогенных ионных каналов. Ряд красителей, доступных в качестве индикаторных красителей мембранного потенциала, делятся на красители быстрого и медленного ответа, а также на потенциал-сенсорные красители, основанные на ЕРЕТ (Аигога Вюкаепсек. СА, США; обзор Сопха1ех и соавт., Эгид Э15с. Тобау 4(9):431-439 (1999).

Жизнеспособность клеток

В анализах жизнеспособности клеток активность ионных каналов и поток ионов непосредственно связаны с жизнеспособностью клетки. Клеточные системы дрожжей и млекопитающих пригодны для тестирования ионного канала-мишени. Например, используют дрожжевую систему, представленную ион-специфичной, дефицитной по поглощению К+ клеточной линией 8ассйаготусе5 сегеу151ае, в которой представляющий интерес функциональный К+-канал экспрессируется в данной клеточной линии, восстанавливая тем самым поглощение К+ и способствуя клеточному выживанию (Апбегкоп и соавт. 8утр. 8ос. Ехр. Вю1. 48:85-97 (1994)). Такой анализ для Са2+ или Ыа+-каналов можно применять для идентификации соединений, способных блокировать Сагбоп-функцию. Доступны также клеточные системы млекопитающих, такие как Ыа+-каналы, анализируемые с использованием колориметрических данных по жизнеспособности нейробластомных клеток млекопитающих. Клетки обрабатывают с помощью открывателя Ыа+—каналов и ингибитора Ыа+/К+-насоса, чтобы способствовать созданию летального избытка внутриклеточного Ыа+. Обработка с помощью испытываемого соединения, способного блокировать данные каналы, будет увеличивать клеточную жизнеспособность, а соединения, которые усиливают открывание каналов, в последующем будут способствовать гибели клеток (Магдег и соавт., Апа1. Вюс1ет. 214:190-194 (1993)).

Электрофизиология

Электрофизиологические методы фиксации потенциала включают измерение ионного тока, протекающего через один или множество каналов. Единственным микроэлектродом контролируют мембранный потенциал, когда электрический ток измеряют в отдельной клетке или на небольшом участке мембраны (НатШ, Р£цдег5 Агс1. 391, 85-100 (1981)). Ионный ток можно, следовательно, измерить в присутствии или в отсутствие представляющего интерес испытываемого соединения. Была создана система для скрининга большого числа соединений (Ыеигокеагсй А/8, О1о51гир, Дания; О1екег и соавт., УоНаде да1еб юг с11аппе1 тоби1а1ог5, 7-8 ЭесетЬег, РЫ1абе1рЫа РА, США (1995); Эепуег и соавт., выше).

Способы скринирования веществ, взаимодействующих с Сап1оп-полипептидом

Для цели настоящего изобретения под лигандом подразумевают молекулу, такую как белок, пептид, антитело или любое синтетическое химическое соединение, способное связаться с СаиIои-белком или с одним из его фрагментов или вариантов, или модулировать экспрессию полинуклеотида, кодирующего Сагбоп, его фрагмент или вариант.

В соответствии с настоящим изобретением в способе скринирования лиганда биологический образец или указанную молекулу, которую испытывают в качестве предполагаемого лиганда СагНом-белка, приводят в контакт с соответствующим выделенным очисткой Сапюг-белком, например, с соответствующим очищенным рекомбинантным Сашоп-белком, полученным с помощью рекомбинантной клеткихозяина, как описано выше, с тем, чтобы создать комплекс между данным белком и испытываемой предполагаемой лигандной молекулой.

В качестве иллюстративного примера, для изучения взаимодействия Сагбоп-белка или фрагмента, включающего непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000 аминокислот 8ЕО ΙΌ Ыо 5, с лекарственным средством или с малыми молекулами, такими как молекулы, полученные с помощью методов комбинаторной химии, могут

- 69 006367 быть использованы метод микродиализа, соединенный с ВЭЖХ, описанный \Уапд и соавт. (1997), или метод капиллярного электрофореза по сродству, описанный Βιΐδΐι и соавт. (1997), раскрытие которых включено путем ссылки.

В дополнительных способах пептиды, лекарственные средства, жирные кислоты, липопротеины или малые молекулы, которые взаимодействуют с Сайоп-белком или с фрагментом, включающим непрерывный участок последовательности, по меньшей мере, из 6 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 8-10 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ № 5, могут быть идентифицированы с использованием анализов, таких как следующие ниже. Испытываемую на связывание молекулу метят детектируемой меткой, такой как флуоресцентная, радиоактивная или ферментная метка, и помещают для контактирования с иммобилизованным Сайоп-белком или его фрагментом в условиях, позволяющих происходить специфическому связыванию. После удаления неспецифически связавшихся молекул, связавшиеся молекулы детектируют с использованием подходящих средств.

Другая цель настоящего изобретения включает способы и наборы для скринирования кандидатных веществ, которые взаимодействуют с Сайоп-полипептидом.

Настоящее изобретение относится к способам скринирования представляющих интерес веществ, которые взаимодействуют с Сайоп-белком или с каким-либо его фрагментом или вариантом. Исходя из их способности связываться ковалентно или нековалентно с Сайоп-белком или с его фрагментом или вариантом, данные вещества или молекулы могут преимущественно использоваться ш νίΙΐΌ и ίΐ'ΐ νί\Ό.

Указанные взаимодействующие молекулы могут использоваться ш νίΙΐΌ в качестве детекционных средств идентификации присутствия Сайоп-белка в образце, предпочтительно в биологическом образце.

Способ для скринирования кандидатного вещества, включает следующие стадии:

a) создания полипептида, включающего, в основном состоящего, состоящего из Сайоп-белка или фрагмента, включающего непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ № 5;

b) получения кандидатного вещества;

c) приведения в контакт указанного полипептида с указанным кандидатным веществом;

б) выявления комплексов, образованных между указанным полипептидом и указанным кандидатным веществом.

Кроме того, в настоящем изобретении рассматривается набор для скринирования кандидатного вещества, взаимодействующего с СаиIοи-полипептидом, где указанный набор включает:

a) Сайоп-белок, обладающий аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных последовательности 8ЕО ΙΌ № 5 или ее пептидного фрагмента, включающего непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ № 5;

b) факультативно, средства, пригодные для выявления комплекса, образованного между Сайопбелком или его пептидным фрагментом или вариантом и кандидатным веществом.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в описанном выше наборе, детекционные средства включают моноклональные или поликлональные антитела, направленные против Сайоп-белка или его пептидного фрагмента или варианта.

Можно проанализировать разнообразные кандидатные вещества на взаимодействие с Сайопполипептидом. Данные вещества или молекулы включают, без ограничения, природные или синтетические органические соединения или молекулы биологического происхождения, такие как полипептиды. Если кандидатное вещество или молекула включает полипептид, то полипептид может представлять собой экспрессионный продукт, полученный из фагового клона, относящегося к произвольно созданной пептидной библиотеке на основе фага, или, альтернативно, данный полипептид может представлять собой экспрессионный продукт, полученный из кДНК-библиотеки, клонированной в вектор, пригодный для осуществления дигибридного скринирующего анализа.

Настоящее изобретение относится также к наборам, пригодным для осуществления описанного выше способа скринирования. Предпочтительно, такие наборы включают Сайоп-полипептид или его фрагмент или вариант и, факультативно, средства, пригодные для выявления комплекса, образованного между Сайоп-полипептидом или его фрагментом или вариантом и данным кандидатным веществом. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения детекционные средства включают моноклональные и поликлональные антитела, специфичные к соответствующему Сайоп-полипептиду или его фрагменту или варианту.

А. Лиганды-кандидаты, полученные из произвольных пептидных библиотек.

В конкретном варианте осуществления способа скринирования настоящего изобретения, предполагаемый лиганд представляет собой экспрессионный продукт ДНК-вставки, содержащейся в фаговом векторе (Рагт1еу апб 8ιηί11ι, 1988). В данном случае используются произвольные пептидные библиотеки на основе фагов. Произвольные ДНК-вставки кодируют пептиды длиной 8-20 аминокислот (О1бепЬигд К.В.

- 70 006367 и соавт., 1992; Уа1а4оп Р., и соавт., 1996; Ьисак А.Н., 1994; ХУеЧеппк М.А.1., 1995; Ее11С1 Е. и соавт., 1991). В соответствии с этим конкретным вариантом, рекомбинантные фаги, экспрессирующие белок, который связывается с иммобилизованным Сап1оп-белком, сохраняется, а комплекс, образованный между Сап1оп-белком и рекомбинантным фагом, можно впоследствии иммунопреципитировать с помощью поликлонального или моноклонального антитела, специфичного к Сап1оп-белку.

После того как лигандную библиотеку в рекомбинантных фагах сконструировали, фаговую популяцию приводят в контакт с иммобилизованным Сап1оп-белком. Затем полученные комплексы отмывают для того, чтобы удалить неспецифически связавшиеся рекомбинантные фаги. Фаги, которые специфически связались с Сап1оп-белком, элюируют буфером (кислый рН) или иммунопреципитируют моноклональным антителом, продуцированным в гибридомой анти-Сап1оп, и данную фаговую популяцию впоследствии размножают с помощью сверхинфицированных бактерий (например, Е. со11). Селекционную стадию можно повторить несколько раз, предпочтительно 2-4 раза, для того, чтобы отобрать более специфичные рекомбинантные фаговые клоны. Последняя стадия включает характеристику данного пептида, продуцированного рекомбинантным фаговым клоном, либо путем экспрессии в инфицированных бактериях и выделения, экспрессируя фаговую вставку в другой системе хозяин-векторная ДНК, либо секвенированием данной вставки, содержащейся в отобранных рекомбинантных фагах.

B. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью конкурентных экспериментов.

Альтернативно, пептиды, лекарственные средства или малые молекулы, которые связываются с Сап1оп-белком или фрагментом, включающим непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ Ыо 5, можно идентифицировать в конкурентных экспериментах. В таких анализах Сап1оп-белок или его фрагмент, иммобилизуют на поверхности, такой как пластмассовый планшет. Увеличивающиеся количества пептидов, лекарственных средств или малых молекул, контактируют с иммобилизованным Сап1оп-белком или его фрагментом в присутствии обнаруживаемого с помощью метки известного лиганда Сап1оп-белка. Например, Сап1оплиганд можно пометить меткой с помощью флуоресцентной, радиоактивной или ферментной метки. Способность испытываемой молекулы связывать Сап1оп-белок или его фрагмент, определяют измерением количества обнаруживаемой метки в известном лиганде, связавшемся в присутствии данной тестмолекулы. Уменьшение количества известного лиганда, связавшегося с Сап1оп-белком или его фрагментом, при наличии тест-молекулы, свидетельствует о том, что данная тест-молекула способна связываться с Сап1оп-белком или его фрагментом.

C. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью аффинной хроматографии.

Белки или иные молекулы, взаимодействующие с Сап1оп-белком или фрагментом, включающим непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ Ыо 5, можно индуцировать с помощью аффинной хроматографии. В таком анализе Сап1оп-белок или его фрагмент можно присоединить к колонке с использованием традиционных методов, в том числе химически связать с соответствующим связующим веществом колонки, таким как агароза, А£й Се1® или с иными матрицами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Для некоторых вариантов осуществления данного способа аффинная колонка содержит химерные белки, в которых Сап1оп-белок или его фрагмент, соединен путем слияния с глутатион-8-трансферазой (С8Т). Смесь клеточных белков или пул экспрессированных белков, которые описаны выше, наносят на аффинную колонку. Белки или другие молекулы, взаимодействующие с Сап1оп-белком или его фрагментом, присоединяемые к данной колонке, можно затем выделить и проанализировать 2Э-гель-электрофорезом, как описано у Ратипкепа и соавт. (1997), раскрытие которого включено путем ссылки. Альтернативно, белки, удерживаемые на данной аффинной колонке, можно выделить очисткой способами, основанными на электрофорезе, и секвенировать. Тот же самый способ можно использовать для выделения антител, для скринирования продуктов фагового дисплея или для скринирования антител человека фагового дисплея.

Ό. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью способов оптического биосенсора.

Белки, взаимодействующие с Сап1оп-белком или с фрагментом, включающим непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕО ΙΌ Ыо 5, можно также скринировать с использованием Оптического Биосенсора, как описано у Е4\гаг45 ап4 ЕеаШегЬагготе (1997), а также у 8хаЬо и соавт. (1995), раскрытие которых включено путем ссылки. Данный способ позволяет обнаруживать взаимодействие между молекулами в реальном времени, без необходимости метить молекулы. Данный метод основан на явлении поверхностного плазменного резонанса (8РР). Вкратце, тестируемую молекулу лиганда-кандидата присоединяют к поверхности (такой как карбоксиметилдекстрановая матрица). Луч света, направленный на сторону поверхности, которая не содержит тестируемого образца, отражается указанной поверхностью. Эффект 8РР вызывает уменьшение интенсивности отраженного света, что взаимосвязано с определенным углом и длиной волны. Связывание молекул лиганда-кандидата обуславливает изменение коэффициента преломления на

- 71 006367 поверхности, изменение которого обнаруживается в виде изменения 8РК-сигнала. Для скринирования молекул лиганда-кандидата или веществ, которые способны взаимодействовать с Сап1оп-белком или его фрагментом, Сап1оп-белок или его фрагмент иммобилизуют на поверхности. Данная поверхность включает одну сторону клетки, через которую протекает анализируемая молекула-кандидат. Связывание молекулы-кандидата к Сап1оп-белку или его фрагменту обнаруживается в виде изменения 8РК-сигнала. Тестируемые молекулы-кандидаты могут представлять собой белки, пептиды, углеводы, липиды или малые молекулы, образованные с помощью комбинаторной химии. Данный метод можно также осуществлять путем иммобилизации эукариотических или прокариотических клеток или липидных везикул, демонстрирующих на своей поверхности эндогенно или рекомбинантно экспрессируемый Сап1оп-белок.

Основное преимущество данного способа заключается в том, что он позволяет определить скорость связывания Сап1оп-белка и молекул, взаимодействующих с Сап1оп-белком. Таким образом представляется возможным специально выбрать лигандные молекулы, взаимодействующие с Сап1оп-белком или с его фрагментом, благодаря константам сильной или, наоборот, слабой ассоциации.

Е. Лиганды-кандидаты, полученные с помощью дигибридного скринирующего анализа.

Для изучения ш у1уо взаимодействий белок-белок создана дрожжевая дигибридная система (Ие1бк апб 8опд, 1989), основывающаяся на слиянии белка-затравки с ДНК-связывающим доменом дрожжевого 6а14-белка. Данный метод описан в патентах США №№ 5667973 и 5283173 (Ие1бк и соавт.), представленные там методические указания включены путем ссылки.

Основную операцию скринирования библиотеки с помощью дигибридного анализа можно осуществить как описано у Нагрег и соавт. (1993), у СЬо и соавт. (1998) или у ЕготоШ-Касте и соавт. (1997).

Затравочный белок или полипептид включает, состоит в основном или состоит из Сап1опполипептида или фрагмента, включающего непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 100 аминокислот 8ЕД ΙΌ Ио 5.

Более точно, нуклеотидную последовательность, кодирующую СалIол-полипептид, его фрагмент или вариант, соединяют путем слияния с полинуклеотидом, кодирующим ДНК-связывающий домен САЬ4-белка, причем полученную слитую нуклеотидную последовательность встраивают в соответствующий экспрессионный вектор, например, рА82 или рМ3.

Затем в специально созданном векторе конструируют кДНК-библиотеку человека так, чтобы кДНКвставка человека сливалась с нуклеотидной последовательностью в векторе, который кодирует транскрипционный домен САЬ4-белка. Предпочтительно, данный используемый вектор представляет собой рАСТ-вектор. Полипептиды, кодируемые нуклеотидными вставками из кДНК-библиотеки человека, являются полипептидами- добычами.

Третий вектор содержит детектируемый маркерный ген, такой как бета-галактозидазный ген или САТ-ген, который помещают под контроль регуляторной последовательности, которая ответственна за связывание полноразмерного Са14-белка, содержащего домен активации транскрипции и ДНКсвязывающий домен. Можно использовать, например, рС5ЕС-вектор.

Используются также два разных дрожжевых штамма. В качестве иллюстративного, но не ограничивающего примера, два разных дрожжевых штамма могут являться следующими штаммами:

Υ190, фенотип которого представляет собой (МАТа, Ьеи2-3, 112 ига3-12, !гр1-901, Ь1к3-П200, абе2101, да14Эда1180Э ИКА3 6АЬ-Ьас2, ΕΥ8 6АБ-Н183, суЬ');

Υ187, фенотип которого представляет собой (МАТа да14 да180 Ь1к3 !гр1-901 абе2-101 ига3-52 1еи2-3, -112ИКА3 САЬ-1ас2те!^-), который представляет собой тип спаривания противоположный Υ190.

Вкратце, 20 мкг рА82/Сап1оп и 20 мкг рАСТ-кДНК-библиотеки котрансформируют в дрожжевой штамм Υ190. Полученные трансформанты отбирают по росту на минимальной среде без гистидина, лейцина и триптофана, но содержащей ингибитор синтеза тистидина 3-АТ (50 мМ). Позитивные колонии скринируют на бета-галактозидазу с помощью анализа отпечатков на фильтре. Затем двойные позитивные колонии (Н1к⁺, Ье1а-даЕ) выращивают на чашках без гистидина, лейцина, но с триптофаном и циклогексимидом (10 мг/мл) для отбора колоний с утраченными рА82/СалIол-плазмидами, но сохранившими плазмиды рАСТ-кДНК-библиотеки. Полученные Υ190-штаммы спаривают с Υ187-штаммами, экспрессирующими Сап1оп или неродственные контрольные белки; такие как циклофилин В, ламин или 8ИЕ1, в виде 6а14-химер, как описано у Нагрег и соавт. (1993) и у Вгат и соавт. (Вгат К.1. и соавт., 1993), и скринируют на бета-галактозидазу с помощью анализа скринирования колоний на фильтре. Дрожжевые клоны, которые представляют собой Ье!а да1- после спаривания с контрольными Са14-химерами, считают ложнопозитивными.

В другом варианте осуществления дигибридного способа, в соответствии с настоящим изобретением, взаимодействие между Сап1оп или его фрагментом или вариантом с клеточными белками можно оценить с помощью Ма!сЬтакег Т\го НуЬпб 8ук1ет 2 (Са!а1од Ио К1604-1, С1оп1есН). Как описано в инструкции, прилагаемой к Ма!сЬтакег Т\го НуЬпб 8ук1ет 2 (Са!а1од Ио К1604-1, С1оп1есН), раскрытие которой включено в данное описание путем ссылки, нуклеиновые кислоты, кодирующие Сап1оп-белок или его часть, встраивают в экспрессионный вектор так, чтобы они находились в рамке считывания с ДНК, кодирующей ДНК-связывающий домен дрожжевого транскрипционного активатора САБ4. Тре

- 72 006367 буемая кДНК, предпочтительно кДНК человека, встраивается во второй экспрессионный вектор так, чтобы они находились в рамке считывания с ДНК, кодирующей активаторный домен САЬ4. Две данные экспрессионные плазмиды трансформируют в дрожжи и трансформированные дрожжи высевают на селективную среду, которая селектирует по экспрессии селективных маркеров в каждом экспрессионном векторе, а также САЬ4-зависимой экспрессии Н183-гена. Трансформанты, способные расти на среде без гистидина, скринируют на САЬ4-зависимую 1ас2-экспрессию. Те клетки, которые оказываются позитивными при гистидиновом отборе и 1ас2-анализе, удерживают взаимодействие между Сап1оп и белком или пептидом, кодируемым исходно выбранной кДНК-вставкой.

Способ скринирования веществ, взаимодействующих с регуляторными последовательностями Сап1оп-гена

В настоящем изобретении рассматривается также способ скринирования веществ или молекул, которые способны взаимодействовать с регуляторными последовательностями Сап1оп-гена, такими как, например, промоторная или энхансерная последовательности.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, которые способны взаимодействовать с регуляторными последовательностями Сап1оп-гена, более предпочтительно с нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из полинуклеотидов 5'- и 3'-регуляторной области или ее фрагмента или варианта, и предпочтительно варианта, включающего один из двуаллельных маркеров настоящего изобретения, могут быть идентифицированы с использованием моногибридной системы, такой, которая описана в проспекте, прилагаемом к набору Ма1сйтакег Опе-НуЬпб 8у§1ет от С1оп1ес11 (Са1а1од Ке£ п° К1603-1), методические указания которого, представленные в данном описании, включены путем ссылки. Вкратце, нуклеотидную последовательность-мишень клонируют слева от селективной репортерной последовательности, а полученную ДНК-конструкцию интегрируют в дрожжевой геном (Зассйаготусек сегеуШае). Дрожжевые клетки, содержащие в своем геноме данную репортерную последовательность, трансформируют затем с помощью библиотеки, включающей кДНК, кодирующие белки-кандидаты для связывания с регуляторными последовательностями Сап1оп-гена, слитые с последовательностями, кодирующими активаторный домен дрожжевого фактора транскрипции, такого как САЬ4. Рекомбинантные дрожжевые клетки высевают в культуральный бульон для селекции клеток, экспрессирующих указанную репортерную последовательность. Отобранные таким образом рекомбинантные дрожжевые клетки содержат слитый белок, который способен связываться с регуляторной последовательностью-мишенью Сап1оп-гена. После чего кДНК, кодирующие слитые белки, секвенируют и их можно клонировать 1п уйго в экспрессионный или транскрипционный векторы. Связывание кодируемых полипептидов с регуляторными последовательностями-мишенями Сап1оп-гена можно подтвердить методами, известными специалистам в данной области техники, такими как метод задержки в геле или метод защиты от ДНКазы.

Метод задержки в геле можно также осуществить независимо для того, чтобы скринировать молекулы-кандидаты, которые способны взаимодействовать с регуляторными последовательностями Сап1опгена так, как описано у Епеб апб Сго1йег8 (1981), у Сагпег апб Реухт (1981) и у Эеп1 апб Ьа1сйтап (1993), методические указания представленных там публикаций включены путем ссылки. Данные методы основываются на принципе, согласно которому фрагмент ДНК, который связывается с белком, мигрирует медленнее, чем такой же несвязавшийся ДНК-фрагмент. Вкратце, метят нуклеотидную последовательность-мишень. Затем меченную нуклеотидную последовательность-мишень приводят в контакт либо с тотальным ядерным экстрактом из клеток, содержащим факторы транскрипции, либо с разными тестируемыми молекулами-кандидатами. Взаимодействие между регуляторной последовательностьюмишенью Сап1оп-гена и молекулой-кандидатом или фактором транскрипции выявляют после гелевого или капиллярного электрофореза благодаря задержке миграции.

Способы скринирования лигандов, которые модулируют экспрессию Сап1оп-гена

Другим объектом рассмотрения настоящего изобретения является способ скринирования молекул, которые модулируют экспрессию Сап1оп-белка. Такой способ скринирования включает следующие стадии:

a) культивирования прокариотической или эукариотической клетки, которую трансформировали нуклеотидной последовательностью, кодирующей Сап1оп-белок, его вариант или фрагмент, помещенной под контроль своего собственного промотора;

b) приведения в контакт данной культивируемой клетки и тестируемой молекулы;

c) количественной оценки экспрессии Сап1оп-белка или его варианта или фрагмента.

В варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая Сап1оп-белок или его вариант или фрагмент, включает аллель по меньшей мере одного из двуаллельных маркеров А12 или А16 и их комплементов.

Используя методы рекомбинантных ДНК, хорошо известные специалистам в данной области техники, последовательность ДНК, кодирующую Сап1оп-белок, встраивают в экспрессионный вектор, справа от его промоторной последовательности. В качестве иллюстративного примера, промоторная последовательность Сап1оп-гена содержится в нуклеиновой кислоте 5'-регуляторной области.

Количественную оценку экспрессии Сап1оп-белка можно осуществить либо на уровне мРНК, либо на белковом уровне. В последнем случае можно использовать поликлональные или моноклональные ан

- 73 006367 титела для измерения количества синтезированного СаШоп-белка, например, в ЕЫ8А или ША-анализом.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения количественное измерение СаШоп-мРНК осуществляют с помощью количественной ПЦР-амплификации кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции тотальной мРНК из культивированных клеток-хозяев, трасфицированных Сагбоп, с использованием пары праймеров, специфичных для СаШоп.

В настоящем изобретении рассматривается также способ скринирования веществ или молекул, которые способны повысить или понизить уровень экспрессии СаШоп-гена. Такой способ может позволить специалисту в данной области техники выбрать вещества, проявляющие регулирующее действие на уровень экспрессии Сап[оп-гена, и которые могут быть пригодны в качестве активных ингредиентов, включаемых в фармацевтические композиции для лечения пациентов, страдающих от любой описанной в данном описании болезни.

Таким образом, в настоящем изобретении создан также способ скринирования кандидатного вещества или молекулы, которые модулируют экспрессию СаШоп-гена, причем данный способ включает следующие стадии:

создания рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность 5'-регуляторной области или ее биологически активный фрагмент или вариант, локализованную «левее» полинуклеотида, кодирующего выявляемый белок;

получения кандидатного вещества и определения способности кандидатного вещества модулировать уровень экспрессии полинуклеотида, кодирующего выявляемый белок.

В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, включающая нуклеотидную последовательность 5'-регуляторной области или ее биологически активный фрагмент или вариант, включает также 5'ИТВ-область СаШоп-кДНК 8Е0 ΙΌ Ыо 4 или ее биологически активные фрагменты или варианты.

Среди предпочтительных полинуклеотидов, кодирующих выявляемый белок, можно привести полинуклеотиды, кодирующие бета-галактозидазу, зеленый флуоресцентный белок (СРВ) и хлорамфениколацетилтрансферазу (САТ).

Настоящее изобретение относится также к наборам, пригодным для осуществления описанного в данном описании способа скринирования. Предпочтительно, такие наборы включают рекомбинантный вектор, который обеспечивает экспрессию нуклеотидной последовательности 5'-регуляторной области или ее биологически активного фрагмента или варианта, локализованной «левее» и функционально присоединенной к полинуклеотиду, кодирующему выявляемый белок или СаШоп-белок или его фрагмент или вариант.

В другом способе скринирования кандидатного вещества или молекулы, которые модулируют экспрессию СаШоп-гена, данный способ включает следующие стадии:

a) создания рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, где указанная нуклеиновая кислота включает 5'ИТВ-последовательность СаШоп-кДНК 8 ЕС ΙΌ Ыо 4 или один из ее биологически активных фрагментов или вариантов, причем 5'ИТВ-последовательность или ее биологически активный фрагмент или вариант функционально присоединен к полинуклеотиду, кодирующему выявляемый белок;

b) получения кандидатного вещества; и

c) определения способности кандидатного вещества модулировать уровни экспрессии полинуклеотида, кодирующего выявляемый белок.

В конкретном варианте осуществления указанного выше способа скринирования, нуклеиновая кислота, которая включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5'ИТВпоследовательности СаШоп-кДНК 8Е0 ΙΌ Ыо 4 или из ее биологически активных фрагментов или вариантов, включает промоторную последовательность, которая является эндогенной относительно Сагйон5'ИТВ-последовательности.

В другом конкретном варианте осуществления указанного выше способа скринирования нуклеиновая кислота, которая включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 5'ИТВ-последовательности СаШоп-кДНК 8Е0 ΙΌ Ыо 4 или одного из ее биологически активных фрагментов или вариантов, включает промоторную последовательность, которая является экзогенной по отношению к указанной в данном описании СаШоп^'иТВ-последовательности.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота, включающая 5'ИТВ-последовательность СаШоп-кДНК или 8Е0 ΙΌ Ыо 4 или ее биологически активные фрагменты, включает двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А12 или А16 или их комплементов.

Кроме того, настоящее изобретение включает набор для скринирования кандидатного вещества, модулирующего экспрессию СагИоп-гена, где указанный набор включает рекомбинантный вектор, который включает нуклеиновую кислоту, включающую 5'ИТВ-последовательность СаШоп-кДНК 8Е0 ΙΌ Ыо 4 или один из ее биологически активных фрагментов или вариантов, причем данная 5'ИТВ

- 74 006367 последовательность или ее биологически активный фрагмент или вариант функционально присоединен к полинуклеотиду, кодирующему выявляемый белок.

Уровни экспрессии и паттерны Сап1оп можно анализировать в гибридизационном растворе с помощью длинных зондов, как описано в международной патентной заявке № \¥0 97/05277, полное содержание которой включено в данное описание путем ссылки. Вкратце, Сап1оп-кДНК или геномная ДНК Сап1оп, описанные выше, или их фрагменты встраивают в клонирующий сайт сразу правее от промотора РНК-полимеразы бактериофага (Т3, Т7 или 8Ρ6) для получения антисмысловой РНК. Предпочтительно, СаиIοи-вставка включает по меньшей мере 100 или более последовательных нуклеотидов из геномной ДНК-последовательности или из кДНК-последовательностей. Полученную плазмиду линеаризуют и транскрибируют в присутствии рибонуклеотидов, включающих модифицированные рибонуклеотиды (т.е. биотин-υΤΡ и ΌΙΟ-ϋΤΡ). Избыток такой вдвойне меченной РНК гибридизуют в растворе с мРНК, выделенной из представляющих интерес клеток или тканей. Гибридизацию осуществляют в стандартных жестких условиях (40-50°С в течение 16 ч в 80% формамиде, 0,4М ИаС1-буфере, рН 7-8). Непрогибридизовавшийся зонд удаляют путем расщепления рибонуклеазами, специфичными для одноцепочечной РНК (т.е. РНКазы СЬ3. Τ1. БНу М, ϋ2 или А). Наличие биотин-иТВ-модификации делает возможным поглощение гибрида на планшете для микротитрования, покрытого стрептавидином. Наличие ΌΙΟ-модификации делает возможным выявление гибрида и его количественную оценку в ЕЬ18Л с использованием антитела к Э1С. соединенного со щелочной фосфатазой.

Количественный анализ экспрессии Сап1оп-гена можно также осуществить с использованием наборов. Используемый в данном описании термин набор означает одномерное, двухмерное или мультимерное расположение множества нуклеиновых кислот достаточной длины, которые позволяют специфически обнаруживать экспрессию мРНК, способных гибридизоваться с ними. Например, наборы могут содержать множество нуклеиновых кислот, полученных из генов, для которых оценивают уровни экспрессии. Данные наборы могут включать геномную ДНК Сап1оп, кДНК-последовательности Сап1оп или последовательности, комплементарные им или их фрагментам, в частности, последовательности, включающие по меньшей мере один из двуаллельных маркеров в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно по меньшей мере один из двуаллельных маркеров А1-А1 7. Предпочтительно фрагменты составляют по меньшей мере 1 5 нуклеотидов в длину. В других вариантах осуществления настоящего изобретения данные фрагменты содержат по меньшей мере 25 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данные фрагменты содержат по меньшей мере 50 нуклеотидов в длину. Более предпочтительно если данные фрагменты содержат по меньшей мере 100 нуклеотидов в длину. В других предпочтительных вариантах фрагменты содержат более 1 00 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данные фрагменты могут содержать более 500 нуклеотидов в длину.

Например, количественный анализ экспрессии Сап1оп-гена можно осуществлять с помощью микронабора комплементарной ДНК, как описано у 8с11епа и соавт. (1995 и 1996). Полноразмерные кДНК Сап1оп или их фрагменты амплифицируют с помощью ПЦР и выкладывают из 96-луночного планшета для микротитрования на силилированные предметные стекла для микроскопа с использованием высокоскоростной роботехники. Отпечатанные наборы инкубируют во влажной камере, чтобы обеспечить обводнение элементов набора, и ополаскивают однократно в 0,2% 8Э8 в течение 1 мин, дважды в воде в течение 1 мин, и однократно в течение 5 мин в растворе борогидрида натрия. Данные наборы погружают в воду на 2 мин при 95°С, переносят в 0,2% 8Ό8 на 1 мин, дважды ополаскивают водой, сушат на воздухе и хранят в темноте при 25°С.

Клеточную или тканевую мРНК выделяют или закупают, а зонды получают с помощью обратной транскрипции за один цикл. Зонды гибридизуют с 1 см² микронабором под стеклянным покровным стеклом с размером 14 х 14 мм в течение 6-12 ч при 60°С. Наборы отмывают в течение 5 мин при 25°С в нежестком промывочном буфере (1 х 88С/0.2% 8Ό8), затем в течение 10 мин при комнатной температуре в очень строгом промывочном буфере (0,1 х 88С/0.2% 8Ό8). Наборы сканируют в 0,1 х 88С с использованием флуоресцентного лазерного сканирующего устройства, совпадающего с обычным фильтровальным набором. Точные измерения дифференциальной экспрессии получают благодаря средним соотношениям двух независимых гибридизаций.

Количественный анализ экспрессии Сап1оп-гена можно также осуществить с помощью полноразмерных кДНК Сап1оп или их фрагментов в наборе комплементарных ДНК, как описано у Ρ^еΐи и соавт. (1996). Полноразмерную Сайоп-кДНК или ее фрагменты амплифицируют ПЦР и распределяют на мембранах. Затем мРНК, происходящие из разных тканей или клеток, метят радиоактивными нуклеотидами. После гибридизации и отмывки в контролируемых условиях с помощью фосфорной визуализации или радиоавтографией выявляют гибридизованные мРНК. Проводят повторные эксперименты и затем осуществляют количественный анализ по разному экспрессируемых мРНК.

Альтернативно, экспрессионный анализ с использованием геномной ДНК Сап1оп, кДНК Сап1оп или ее фрагментов можно сделать с помощью нуклеотидных наборов высокой плотности, как описано у ЬоскЕай и соавт. (1996) и 8окпо\\'кку и соавт. (1997). Олигонуклеотиды в 15-20 нуклеотидов из последовательностей геномной ДНК Сап1оп или кДНК-последовательностей Сап1оп, особенно тех из них, кото

- 75 006367 рые включают по меньшей мере один из двуаллельных маркеров в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно по крайней мере один из двуаллельных маркеров, выбранных из группы, состоящей из А1-А17 или комплементарных им последовательностей, синтезируют непосредственно на чипе (Ьоскйай и соавт., выше) или синтезируют и затем переносят на чип (8охпо^хк1 и соавт., выше). Предпочтительно длина олигонуклеотидов составляет около 20 нуклеотидов.

Зонды кДНК Сап1оп, меченые с помощью соответствующего соединения, такого как биотин, дигоксигенин или флуоресцентный краситель, синтезируют из соответствующей мРНК-популяции и затем фрагментируют случайным образом на куски размером 50-100 нуклеотидов. Затем данные зонды гибридизуют с чипом. После отмывки, как описано у Ьоскйай и соавт., выше, и приложения разных электрических полей (8охпо^хк1 и соавт., 1997) красители или меченные соединения выявляют и количественно определяют. Осуществляют повторные гибридизации. Сравнительный анализ интенсивности сигнала, идущего от кДНК-зондов на одном и том же олигонуклеотиде-мишени в разных образцах кДНК, свидетельствует о разной экспрессии мРНК Сап1оп.

Способы ингибирования экспрессии Сап1оп-гена

Другие терапевтические композиции, в соответствии с настоящим изобретением, включают олигонуклеотидный фрагмент нуклеиновой последовательности Сап1оп в качестве антисмыслового инструмента или трехспирального инструмента, который ингибирует экспрессию соответствующего Сап1опгена. Предпочтительный фрагмент нуклеиновой последовательности Сап1оп включает аллель, по меньшей мере, одного из двуаллельных маркеров А1-А17.

Антисмысловой способ

Предпочтительные способы использования антисмысловых полинуклеотидов, в соответствии с настоящим изобретением, представлены методами, описанными у 5>схак1е1 и соавт. (1995).

Предпочтительно антисмысловые инструменты выбраны из полинуклеотидов (длиной 15-200 т.п.н.), которые комплементарны 5'-концу Сап1оп-мРНК. В другом варианте осуществления настоящего изобретения используют сочетание разных антисмысловых полинуклеотидов, комплементарных разным частям требуемого гена-мишени.

Предпочтительные антисмысловые полинуклеотиды, в соответствии с настоящим изобретением, комплементарны последовательностям мРНК Сап1оп, которые содержат кодон инициации трансляции АТС либо донорный, либо акцепторный сайт сплайсинга.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты должны обладать длиной и температурой плавления, позволяющими образовать внутриклеточный дуплекс достаточной стабильности для ингибирования экспрессии Сап1оп-мРНК в этом дуплексе. Методология создания антисмысловых нуклеиновых кислот, пригодных для использования в генной терапии, приводится у Сгееп и соавт. (1986) и 1хап( апб ХУейКгаиЬ (1984), раскрытие которых включено в данное описание путем ссылки.

В некоторых методах антисмысловые молекулы получают путем изменения ориентации Сап1опкодирующей области относительно промотора так, чтобы транскрибировать цепь, противоположную той, которая нормально транскрибируется в данной клетке. Антисмысловые молекулы можно транскрибировать с использованием ш νί(ΐΌ систем транскрипции, таких как те, которые используют Т7- или 8Р6полимеразу для создания транскрипта. Другой подход включает в себя транскрипцию антисмысловых нуклеиновых кислот Сап1оп 1п νί\Ό в результате функционального присоединения ДНК, содержащей антисмысловую последовательность, к промотору в соответствующем экспрессионном векторе.

Альтернативно, подходящие антисмысловые методы представляют собой те методы, которые описаны у Вохх1 и соавт. (1991), в международных заявках №№ \¥О 94/23026, \УО 95/04141, \УО 92/18522 и в европейской патентной заявке № ЕР 0572287А2.

Альтернатива антисмысловой технологии, которая используется в соответствии с настоящим изобретением, включает использование рибозимов, которые связываются с последовательностью-мишенью с помощью их комплементарных полинуклеотидных хвостов, которые расщепляют соответствующую РНК в результате гидролиза ее сайта-мишени (а именно рибозимов в форме головки молотка). Вкратце, упрощенный цикл рибозима в форме головки молотка включает (1) последовательность, специфически связывающуюся с РНК-мишенью с помощью комплементарных антисмысловых последовательностей; (2) сайт-специфичный гидролиз расщепляемого мотива цепи-мишени; и (3) высвобождение расщепляемых продуктов, которые дают начало другому каталитическому циклу. Действительно, использование длинноцепочечного антисмыслового полинуклеотида (по меньшей мере, длиной 30 оснований) или рибозимов с длинными антисмысловыми плечами дает преимущество. Предпочтительная система доставки для антисмыслового рибозима осуществляется в результате ковалентного связывания таких антисмысловых рибозимов с липофильными группами или с использованием липосом в качестве удобного вектора. Предпочтительные антисмысловые рибозимы, в соответствии с настоящим изобретением, получают как описано у 5>схак1е1 и соавт. (1995), причем специфические методы получения, на которые ссылаются в указанной статье, включены здесь путем ссылки.

Трехспиральный метод

Геномную ДНК Сап1оп можно также использовать для подавления экспрессии Сап1оп-гена на основе внутриклеточного трехспирального образования.

- 76 006367

Трехспиральные олигонуклеотиды используются для подавления транскрипции из генома. Они особенно пригодны для изучения изменений клеточной активности при их ассоциации с конкретным геном.

Аналогично, часть геномной ДНК СаηIои можно использовать для изучения эффекта ингибирования транскрипции СаηIои в клетке. Традиционно гомопуриновые последовательности считают наиболее пригодными для трехспиральных методов. Но и гомопиримидиновые последовательности также могут подавлять экспрессию гена. Такие гомопиримидиновые олигонуклеотиды связываются с большой бороздкой в гомопурин:гомопиримидиновых последовательностях. Поэтому в рамках настоящего изобретения рассматриваются оба типа последовательностей геномной ДНК СаиIои.

Для осуществления методов генной терапии с использованием трехспирального подхода, последовательности геномной ДНК СаиIои прежде всего сканируют для того, чтобы идентифицировать 10мерные - 20-мерные гомопиримидиновые или гомопуриновые участки, которые могли бы использоваться в методах, основанных на трех спиралях, для подавления экспрессии СаиIои. После идентификации кандидатных гомопиримидиновых или гомопуриновых участков, их эффективность в подавлении экспрессии СаиIои определяют путем введения в клетки тканевой культуры, в которой экспрессируется СаηIои-ген, изменяющихся количеств олигонуклеотидов, содержащих последовательности-кандидаты.

Данные олигонуклеотиды можно вводить в клетки с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, включающих, но не ограниченных ими, кальций-фосфатное осаждение, ЭЕАЕ-Декстран, электропорацию, липосом-опосредованную трансфекцию или нативное поглощение.

Обработанные клетки отслеживают по измененной клеточной функции или сниженной СаηIоиэкспрессии с использованием таких методов, как Нозерн-блоттинг, метод защиты от РНКазы или методы на основе ПЦР для определения уровней транскрипции СаиIои-гена в клетках, которые были обработаны данным олигонуклеотидом.

Олигонуклеотиды, которые оказываются эффективными в подавлении генной экспрессии в клетках тканевой культуры, можно затем ввести т у1уо с использованием описанных выше методов антисмыслового подхода в дозе, рассчитанной на основе результатов ш уйго, как описано для антисмыслового подхода.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения природные (бета) аномеры олигонуклеотидных элементов можно заменить альфа-аномерами для придания данному олигонуклеотиду большей устойчивости к нуклеазам. Кроме того, интеркалирующий агент, такой как бромистый этидий и т.п., можно присоединить к 3'-концу альфа-олигонуклеотида, чтобы стабилизировать трехнитевую структуру. Информацию об образовании олигонуклеотидов, подходящих для трехнитевого образования, см. в работе Спйш и соавт. (1989), которая таким образом включена с помощью данной ссылки.

Фармацевтические композиции и рецептурные составы

Соединения, модулирующие Сап1оп

С использованием описанных в данном описании способов можно идентифицировать соединенияагонисты или антагонисты СаηIоη, которые селективно модулируют активность СаиIои ш уйго и т у1уо. Настоящее изобретение включает, таким образом, способы лечения шизофрении, биполярного расстройства или любые иные описанные в данном описании заболевания или состояния пациентов, включающие введение эффективного количества соединения, модулирующего СаηIои. Предпочтительно, указанное соединение представляет собой селективно СаиIои-модулирующее соединение. Соединения, идентифицируемые способом настоящего изобретения, включают, например, антитела, обладающие связывающей специфичностью для СаηIои-полипептида человека. Предполагается, что гомологи СаηIои могут быть пригодны для модулирования СаиIои-опосредованной активности и связанного с ней физиологического состояния, ассоциированного с шизофренией или биполярным расстройством. Кроме того, вообще предполагается, что способы анализа настоящего изобретения, базирующиеся на роли СаиIои в нарушении центральной нервной системы, могут быть пригодны для идентификации соединений, способных воздействовать на каскадный анализ настоящего изобретения. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения пациента, страдающего шизофренией или биполярным расстройством, лечат путем введения данному пациенту фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество антагониста Сагйоп.

Показания

Несмотря на то, что СапIои связан с геномной областью, ассоциированной с шизофренией и биполярным расстройством, показания на использование СаηIои могут включать различные нарушения центральной нервной системы. Предполагается, что нарушения нервной системы обладают комплексной генетической основой и часто характеризуются общими симптомами. В частности, как описано в данном описании, показания могут включать шизофрению и другие психические расстройства, социальные расстройства, аутизм, зависимость от химических веществ и алкоголизм, нарушения болевых ощущений, эпилепсию, задержку психического развития, и другие психические заболевания, включая когнитивную функцию, страх, нарушение функции принятия пищи, нарушение функции мотивации и расстройство личности, которые определяются в соответствии с четвертым изданием классификации О|адпок1к апй

- 77 006367

8!аб§бса1 Мапиа1 о£ Меп!а1 Эбогбеп, (Ό8Μ-Ιν). Кроме того, много сердечно-сосудистых расстройств, такие как стенокардия, гипертензия и аритмии, можно также лечить с использованием модуляторов Сагбоп. предпочтительно антагонистов.

Фармацевтические рецептурные составы и способы введения

Соединения, идентифицированные с использованием способов настоящего изобретения, можно вводить млекопитающему, в том числе больному человеку, отдельно или в виде фармацевтических композиций, в которых они смешаны с подходящими носителями или наполнителем(ями) в терапевтически эффективных дозах, для лечения или улучшения состояния больного шизофренией или биполярным расстройством и близкими расстройствами.

Терапевтически эффективная доза относится еще и к такому количеству соединения, которое достаточно для улучшения симптомов, как определено описанными в данном описании способами. Предпочтительно, терапевтически эффективная дозировка применима для продолжительного периодического использования или введения. Методы подбора состава и введения соединений настоящей заявки можно найти в Вешшдоп'к Рбагтасеибса1 Зшепсек, Маск РиЬбкЫпд Со., ЕаДоп. РА, последнее издание.

Способы введения

Подходящие способы введения включают пероральное, ректальное, трансмукозальное или интестинальное введение, парентеральную доставку, в том числе внутримышечные, подкожные, внутримозговые инъекции, а также интратекальные, прямые внутрижелудочковые, внутривенные, внутрибрюшинные, интраназальные или внутриглазные инъекции.

Особенно пригодный способ введения соединения для лечения заболевания центральной нервной системы включает хирургическую имплантацию устройства для доставки соединения в течение продолжительного периода времени. В частности, рассматривается длительное высвобождение рецептурных составов заявляемых лекарственных средств.

Композиция/Рецептурная смесь

Фармацевтические композиции и лекарственные средства для применения в соответствии с настоящим изобретением формируют традиционным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные вещества. Оптимальный рецептурный состав зависит от выбранного способа введения.

Для инъекции агенты настоящего изобретения можно ввести в водные растворы, предпочтительно физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой раствор, такой как фосфатный или бикарбонатный буфер. Для трансмукозального введения в рецептурной смеси можно использовать смачивающие вещества, подходящие для прохождения через буфер. Такие смачивающие вещества в большинстве случаев известны в данной области техники.

Фармацевтические препараты, которые можно использовать перорально, включают сделанные из желатины раздвижные капсулы, а также сделанные из желатины и пластификатора, такого как глицерин или сорбит, герметичные капсулы. Раздвижные капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителями, такими как лактоза, связывающими веществами, такими как крахмалы, и/или лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах данные активные соединения могут находиться в растворенном состоянии, или быть суспендированными в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленовые гликоли. Кроме того, можно добавить стабилизаторы. Все рецептурные смеси для перорального введения должны быть дозированы для такого введения.

Для трансбуккального введения данные композиции можно создавать в виде таблеток или лепешек традиционным способом.

Для введения путем ингаляции используемые соединения настоящего изобретения удобно доставлять в виде распыляемого аэрозоля, находящегося в герметичной упаковке или в аэрозольном аппарате, с использованием соответствующего газа-вытеснителя, например, диоксида углерода. В случае герметизированного аэрозоля дозированную единицу можно определить с помощью клапана, обеспечивающего получение любого контролируемого количества аэрозоля. Капсулы и ампулы, например, из желатины, для использования в ингаляторе или инсуффляторе, можно создать в виде рецептурной смеси, содержащей порошок данного соединения и соответствующую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.

Можно создать составные соединения для парентерального введения путем инъекции, например, путем болюсной инъекции или непрерывного вливания. Рецептурные смеси для инъекции можно представить в виде дозированной формы, например, в ампулах или в виде упаковки лекарственного средства для многократного приема с добавлением консерванта. Данные композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в водных носителях, и могут содержать фармакологические агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты.

Фармацевтические рецептурные смеси для парентерального введения включают водные растворы данных активных соединений в водорастворимой форме. Водные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость данной суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Факультативно указанная суспензия может также содержать соответствующие стабилизаторы или

- 78 006367 агенты, которые повышают растворимость данных соединений, обеспечивая получение высококонцентрированных растворов.

Альтернативно, данный активный ингредиент может находиться в порошковой или лиофилизованной форме для связывания перед использованием с соответствующим растворителем, таким как стерильная апирогенная вода.

Кроме того, помимо описанных выше рецептурных смесей, данные соединения можно составить в виде препаратов-депо. Такие рецептурные смеси длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Поэтому, например, данные соединения можно включить в препарат вместе с полимерным или гидрофобным веществом (например, в виде эмульсии в соответствующем масле) или с ионообменными смолами, или с малорастворимыми производными, например, в виде малорастворимой соли.

Кроме того, данные соединения можно доставлять с использованием системы с замедленным высвобождением, такой как полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих данный терапевтический агент. Были созданы различные вещества с замедленным высвобождением, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Капсулы с замедленным высвобождением, в зависимости от их химической природы, могут высвобождать данные соединения в течение нескольких недель вплоть до 1 00 дней.

В зависимости от химической природы и биологической стабильности терапевтического агента можно применять дополнительные методы для стабилизации белка.

Фармацевтические композиции могут также включать соответствующую твердую или гелевую фазу-носитель или фазу-наполнитель. Примеры таких носителей или наполнителей включают, но не ограничиваются ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатину и полимеры, такие как полиэтиленгликоли.

Эффективное дозирование

Фармацевтические композиции, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в эффективном количестве для достижения их предполагаемой цели. В частности, терапевтически эффективное количество означает количество, эффективное для предотвращения развития или смягчения существующих симптомов подвергнутого лечению больного. Определение эффективных количеств находится в рамках возможностей специалиста в данной области техники, особенно в свете представленного в данном описании подробного описания.

Для любого соединения, используемого в данном способе настоящего изобретения, терапевтически эффективную дозу можно исходно определить в клеточной культуре и дозу можно разработать для животных моделей. Такие сведения можно использовать для более точного определения пригодных доз для человека.

Терапевтически эффективная доза имеет отношение к такому количеству данного соединения, которое приводит к ослаблению симптомов у больного. Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения БЭ50 (летальная доза для 50% тестируемой популяции) и ЕЭ50 (терапевтически эффективная доза для 50% тестируемой популяции). Дозовое соотношение между токсическим и терапевтическим эффектами соответствует терапевтическому индексу лекарства и может быть выражено в виде соотношения между БЭ50 и ЕЭ50. Соединения, которые проявляют высокие терапевтические индексы, предпочтительны.

Данные, полученные в этих исследованиях клеточных культур и животных, можно использовать для определения диапазона дозирования применительно к человеку. Дозирование таких соединений находится предпочтительно в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ЕЭ50, с небольшой или в отсутствие токсичности. Дозировка может варьировать в зависимости от вида используемой дозы и способа ее введения. Точный состав, способ введения и дозировку может выбрать каждый врач, обследующий состояние пациента (См., например, Е1пд1 и соавт.) 1975, в Рйагтасо1одюа1 Ва818 оГ ЛюгереиН^. С11.1).

Варианты осуществления настоящего изобретения, связанные с применением компьютера

Используемый в данном описании термин коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают в себя нуклеотидные последовательности, включающие, в основном состоящие, состоящие из любого нижеследующего: а) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 10000 нуклеотидов 8ЕО ΙΌ Νο 1-3; Ь) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов 8ЕО ΙΌ Νο 4 или ее комплементов; с) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, где указанный непрерывный участок последовательности включает двуаллельный маркер, выбранный из группы, состоящей из А1-А17; б) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 или 400 нуклеотидов 8ЕО ΙΌ Νο 6; е) непрерывного участка последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 или 400 нуклеотидов

- 79 006367 δΕΟ ΙΌ № 6, где указанный непрерывный участок последовательности включает двуаллельный маркер А18; и ί) нуклеотидной последовательности, комплементарной любой из предшествующих нуклеотидных последовательностей.

Кроме того, коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают нуклеотидные последовательности, гомологичные: а) непрерывному участку последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 10000 нуклеотидов 8ΕΟ ΙΌ № 1-3; Ь) непрерывному участку последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 или 6000 нуклеотидов 8ΕΟ ΙΌ № 4; с) непрерывному участку последовательности по меньшей мере из 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 или 400 нуклеотидов δΕΟ ΙΌ № 6; и к) последовательностям, комплементарным любой предшествующей последовательности. Гомологичные последовательности относятся к последовательности, обладающей по меньшей мере 99, 98, 97, 96, 95, 90, 85, 80 или 75% гомологией с данными непрерывными участками последовательности. Гомологию можно определить с использованием любого описанного в данном описании способа, в том числе ΒΌΑδΤ2Ν со значениями параметров по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами. Гомологичные последовательности могут также включать РНК-последовательности, в коде нуклеиновых кислот которых настоящего изобретения уридины заменяют тимином. Следует иметь ввиду, что коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут быть представлены традиционным односимвольным форматом (См. внутреннюю заднюю сторону книги δΐ^Γ, ЬиЬеп. В1оскет181гу, 3^гк екШоп. ХУ.Н.Егеетап & Со., №\ν Υο^к) или любым иным форматом или кодом, который регистрирует идентичность нуклеотидов в последовательности.

Используемый в данном описании термин полипептидные коды настоящего изобретения включает в себя полипептидные последовательности, включающие непрерывный участок последовательности по меньшей мере из 6, 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 или 1700 аминокислот δΕΟ ΙΌ № 5. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный непрерывный участок последовательности включает по меньшей мере 1, 2, 3, 5 или 10 аминокислотных позиций 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 δΕΟ ΙΌ № 5. Следует иметь ввиду, что полипептидные коды настоящего изобретения могут быть представлены в традиционном односимвольном формате или трехбуквенном формате (См. внутреннюю заднюю сторону книги δίΓχ^Γ. ЬиЬеп. Вюскет181гу, 3^гк екШоп. ХУ.Н.Егеетап & Со., №\ν Υο^к) или в любом ином формате или коде, который регистрирует идентичность полипептидов в последовательности.

Для специалистов в данной области техники является понятным, что коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения и полипептидные коды настоящего изобретения могут сохраняться, регистрироваться и обрабатываться на любом носителе, который может быть прочитан с помощью компьютера и предоставлен ему. Используемые в данном описании термины регистрировать и сохранять относятся к способу сохранения информации на компьютерном носителе. Специалистам в данной области техники легко усвоить любой из ныне известных способов записи информации на компьютерном носителе в пригодном для чтения виде, созданном производителями, включающим один или несколько кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или один или несколько полипептидных кодов настоящего изобретения. Другой аспект настоящего изобретения заключается в том, что компьютерный носитель, пригодный для чтения, обладает записью на нем по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Другой аспект настоящего изобретения заключается в том, что компьютерный носитель, пригодный для чтения, обладает записью на нем по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 полипептидных кодов настоящего изобретения.

Компьютерный носитель, пригодный для чтения, включает магнитный носитель, пригодный для чтения, оптический носитель, электронный носитель, пригодный для чтения, и магнитнооптический носитель. Например, компьютерный носитель, пригодный для чтения, может быть представлен жестким диском, дискетой, магнитной лентой, СО-КОМ, цифровым универсальным диском (ОУО), запоминающим устройством прямого доступа (КАМ) или постоянными запоминающими устройствами (КОМ), а также другими видами носителей, известных специалистам в данной области техники.

Варианты осуществления настоящего изобретения включают системы, в частности компьютерные системы, которые сохраняют и контролируют описанную в данном описании информацию о последовательности. Один из примеров компьютерной системы 100 иллюстрируется в виде блока диаграмм на фиг. 2. Используемый в данном описании термин компьютерная система относится к компонентам технического обеспечения, а данные компонентов сохранения используются для анализа нуклеотидных последовательностей кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или аминокислотных последовательностей полипептидных кодов настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения компьютерная система 100 представляет собой сервер δиη Επ^Γρπ!^ 1000 (διπι МюгокуЧетк. Ра1о Ако, СА). Компьютерная система 100 предпочтительно включает процессор для обработки данных, а также доступа и контроля данных о последовательности. Процессор 1 05 может представлять собой любой из хорошо известных типов процессорных элементов, такой как Репкит ΙΙΙ от Μδΐ

- 80 006367

Согрогайоп, или аналогичный процессор от 8ип, Мо!ого1а, Сотрас.| ог 1п1етайопа1 Вшкпекк МасЫпек.

Предпочтительно, компьютерная система 1 00 представляет собой основную целевую систему, которая включает процессор 105 и один или несколько внутренних компонентов 110 хранения данных для сохранения данных и одно или несколько поисковых устройств для поиска данных, сохраняемых в компонентах хранения данных. Специалистам в данной области следует иметь ввиду, что годится любая из ныне существующих компьютерных систем.

В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения компьютерная система 100 включает процессор 105, который соединен шиной, которая соединяется с основным запоминающим устройством 115 (предпочтительно представленным в виде ВАМ) и одним или несколькими внутренними устройствами 110 сохранения памяти, такими как накопитель на жестких дисках и/или иные компьютерные носители для чтения, обладающие записанными данными. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения компьютерная система 100, кроме того, включает одно или несколько поисковых устройств 118 для чтения сохраненных данных на внутренних устройствах 110 сохранения данных.

Поисковое устройство данных 118 может представлять собой, например, дисковод для дискеты, дисковод для компакт-диска, накопитель для магнитной ленты и т.д. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения внутреннее устройство 110 для сохранения данных представляет собой съемный компьютерный носитель для чтения, такой как дискета, компакт-диск, магнитная лента и т. д., содержащий логическую схему управления и/или записанные данные. Компьютерная система 1 00 может преимущественно включать или программироваться с помощью соответствующего программного обеспечения для прочтения логической схемы управления и/или данных из компонента хранения данных, однажды введенных в устройство поиска данных.

Компьютерная система 1 00 включает дисплей 1 20, который используется для выведения данных на экран пользователя компьютера. Следует также иметь ввиду, что компьютерную систему 1 00 можно подсоединить к другим компьютерным системам 125а-с в сеть или в глобальную сеть для создания централизованного доступа в компьютерную систему 1 00.

Программное обеспечение для доступа и обработки данных по нуклеотидным последовательностям кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или по аминокислотным последовательностям полипептидных кодов настоящего изобретения (таких как инструменты поиска, инструменты сравнения, и инструменты моделирования и т.п.) могут постоянно храниться в основной памяти 115 в период исполнения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения компьютерная система 1 00 может, кроме того, включать программу сравнения последовательности для сравнения указанных выше кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или полипептидных кодов настоящего изобретения, сохраняемых на компьютерном носителе для прочтения, со стандартной нуклеотидной или полипептидной последовательностями, сохраняемыми на компьютерном носителе для прочтения. Программа сравнения последовательности относится к одной или нескольким программам, которые выполняются на компьютерной системе 1 00 для сравнения нуклеотидной или полипептидной последовательностей с другими нуклеотидными или полипептидными последовательностями и/или соединениями, включающими, но не ограничивающимися ими, пептиды, пептидомиметики и химические агенты, хранимые в средствах хранения данных. Например, программа сравнения последовательности может сравнить нуклеотидные последовательности кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или аминокислотные последовательности полипептидных кодов настоящего изобретения, сохраняемые на компьютерном носителе для прочтения, со стандартными последовательностями, сохраняемыми в компьютерном носителе для прочтения, чтобы идентифицировать гомологи, мотивы, вовлеченные в биологическую функцию, или структурные мотивы. Разнообразные программы сравнения последовательности, идентифицированные в данном патентном описании, подразумевают в частности использование данного аспекта настоящего изобретения.

На фиг. 3 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов процесса 200 для сравнения новой нуклеотидной или полипептидной последовательности с последовательностями базы данных с тем, чтобы определить уровень гомологии между данной новой последовательностью и последовательностями из базы данных. Последовательности из базы данных могут представлять собой собственную базу данных, сохраняемую в компьютерной системе 1 00, или общедоступную базу данных, такую как СЕ№АЫК, Р1В ОВ 8У188РВОТ, которые доступны через Интернет.

Процесс 200 начинают со стартового положения 201 и затем перемещают в положение 202, в котором сравниваемая новая последовательность хранится в памяти компьютерной системы 1 00. Как указано выше, память может быть представлена памятью любого типа, в том числе ВАМ или внутренним запоминающим устройством.

Затем процесс 200 перемещается в положение 204, в котором последовательности базы данных открыты для анализа и сравнения. Процесс 200 затем перемещается в положение 206, в котором первая последовательность, хранимая в базе данных, прочитывается в память данного компьютера. Затем осуществляют сравнение в положении 210, чтобы определить является ли первая последовательность той же, что и вторая последовательность. Важно отметить, что данный шаг не ограничивается осуществлени

- 81 006367 ем точного сравнения между новой последовательностью и первой последовательностью базы данных. Хорошо известные способы для сравнения двух нуклеотидных или полипептидных последовательностей, даже если они не идентичны, известны специалистам в данной области техники. Например, в одну из последовательностей можно ввести пробелы для того, чтобы повысить уровень гомологии между двумя тестируемыми последовательностями. Параметры, которые контролируют ввод пробелов и иных особенностей в последовательность во время сравнения, обычно вводит пользователь данной компьютерной системы.

После осуществления сравнения двух последовательностей в положении 210, определение производят в положении 21 0, являются ли две данные последовательности одинаковыми. Понятно, что термин одинаковые не ограничивается абсолютно идентичными последовательностями. Последовательности, которые находятся в гомологичных параметрах, введенных пользователем, будут помечены в процессе 200 как одинаковые.

Если сделано определение, что данные две последовательности являются одинаковыми, процесс 200 перемещают в положение 214, в котором название последовательности из базы данных выводится пользователем на дисплей. Данное положение извещает пользователя о том, что последовательность с выведенным названием удовлетворяет введенной ограниченной гомологии. После того как наименование сохраняемой последовательности демонстрируется пользователю, процесс 200 перемещается в положение 218, в котором определяют, имеются ли еще в базе данных последовательности. Если в базе данных нет больше последовательностей, тогда процесс 200 завершают в конце положения 220. Однако если в базе данных имеются еще последовательности, то процесс 200 перемещают в положение 224, где курсор передвигают к следующей последовательности базы данных так, что ее можно сравнить с новой последовательностью. Таким образом, новую последовательность выравнивают и сравнивают с каждой последовательностью базы данных.

Следует отметить, что если определение выполнено в положении 21 2, в котором последовательности не является гомологами, тогда процесс 200 следует двигать сразу в положение 218 для того, чтобы определить, доступны ли другие последовательности базы данных для сравнения.

Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения представляет собой компьютерную систему, включающую процессор, устройство сохранения данных, обладающее сохраненным в нем кодом нуклеиновых кислот настоящего изобретения или полипептидным кодом настоящего изобретения, устройство для сохранения данных, обладающее восстановимо сохраненными стандартными нуклеотидными последовательностями или полипептидными последовательностями, сравниваемыми с кодом нуклеиновых кислот настоящего изобретения или с полипептидным кодом настоящего изобретения, и программой сравнения последовательности для осуществления сравнения. Программа сравнения последовательности может показывать уровень гомологии между сравниваемыми последовательностями или идентифицировать мотивы, вовлеченные в биологическую функцию, а также структурные мотивы кода нуклеиновых кислот настоящего изобретения и полипептидных кодов настоящего изобретения, или она может идентифицировать структурные мотивы в последовательностях, которые сравниваются с данными кодами нуклеиновых кислот и с полипептидными кодами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения устройство сохранения данных может хранить в себе последовательности, по меньшей мере, из 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или полипептидных кодов настоящего изобретения.

Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ определения уровня гомологии между кодом нуклеиновых кислот настоящего изобретения и стандартной нуклеотидной последовательностью, включающей стадии прочтения кода нуклеиновых кислот и стандартной нуклеотидной последовательности путем использования компьютерной программы, которая определяет уровень гомологии, и определяет гомологию между кодом нуклеиновых кислот и стандартной нуклеотидной последовательностью с помощью компьютерной программы. Компьютерная программа может представлять собой любую из числа компьютерных программ по определению уровней гомологии, включая те, которые перечислены в данном описании, включая В^А§Т2N со значениями параметров по умолчанию или с любыми модифицированными параметрами. Данный способ можно реализовать с использованием описанных выше компьютерных систем. Данный способ можно также осуществить путем прочтения 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 описанных выше кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения через использование данной компьютерной программы и определения гомологии между кодами нуклеиновых кислот и стандартными нуклеотидными последовательностями.

На фиг. 4 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов осуществления процесса 250 в компьютере для определения гомологичности двух последовательностей. Процесс 250 начинают с запуска в положении 252, а затем перемещают в положение 254, в котором первую сравниваемую последовательность сохраняют в память. Затем и вторую сравниваемую последовательность сохраняют в память в положении 256. После этого процесс 250 перемещают в положение 260, в котором прочитывают первый символ первой последовательности, и перемещают в положение 262, в котором прочитывают первый символ второй последовательности. Следовало бы иметь ввиду, что если данная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, то, как правило, сим

- 82 006367 вол должен быть либо А, Т, С, С, либо и. Если же данная последовательность представляет собой белковую последовательность, то она должна находиться в однобуквенном аминокислотном коде с тем, чтобы можно было легко сравнить первую и последующие последовательности.

Затем определяют тождественность двух символов в положении 264. Если они тождественны, то процесс 250 перемещают в положение 268, в котором прочитывают очередные символы в первой и второй последовательностях. Затем определяют тождество следующих символов. Если они тождественны, то процесс 250 продолжает этот цикл до двух символов, которые не тождественны. Если определят, что эти следующие два символа не тождественны, процесс 250 перемещают в положение 274, чтобы еще определить наличие символов для прочтения в любой последовательности.

Если символы для прочтения отсутствуют, то процесс 250 перемещают в положение 276, в котором уровень гомологии между первой и второй последовательностями выводится данному пользователю. Уровень гомологии определяют путем вычисления доли символов в последовательностях, которые были одинаковыми из общего числа символов для первой последовательности. Таким образом, если каждый символ первой 1 00 нуклеотидной последовательности совместить с каждым символом второй последовательности, то уровень гомологии составит 1 00%.

Альтернативно, компьютерная программа может представлять собой компьютерную программу, которая сравнивает нуклеотидные последовательности кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения со стандартной последовательностью нуклеиновой кислоты по одной или нескольким позициям. Факультативно такая программа регистрирует длину и идентичность встроенных, делетированных или замещенных нуклеотидов по отношению к последовательности стандартного полинуклеотида, либо кода нуклеиновых кислот настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения компьютерная программа может представлять собой программу, которая определяет в нуклеотидных последовательностях кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения присутствие одного или нескольких полиморфизмов единственного нуклеотида (8ΝΈ) по отношению к стандартной нуклеотидной последовательности. Каждый полиморфизм единственного нуклеотида может включать замену, вставку или делецию единственного основания.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ определения уровня гомологии между полипептидным кодом настоящего изобретения и последовательностью стандартного полипептида, включающий стадии прочтения полипептидного кода настоящего изобретения и последовательности стандартного полипептида путем использования компьютерной программы, которая определяет уровни гомологии, и определения гомологии между полипептидным кодом и последовательностью стандартного полипептида, используя компьютерную программу.

Соответственно, другой аспект настоящего изобретения представляет способ определения кода нуклеиновых кислот, отличающегося по одному или нескольким нуклеотидам от стандартной нуклеотидной последовательности, включающий стадии прочтения кода данной нуклеиновой кислоты и стандартной нуклеотидной последовательности путем использования компьютерной программы, которая идентифицирует различия между последовательностями нуклеиновой кислоты, и идентификации различий между кодом данной нуклеиновой кислоты и данной стандартной нуклеотидной последовательностью с помощью компьютерной программы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения данная компьютерная программа представляет собой программу, которая идентифицирует полиморфизмы единственных нуклеотидов. Данный способ можно осуществить с помощью описанных выше компьютерных систем и способа, проиллюстрированного на фиг. 4. Данный способ можно также осуществить в результате прочтения по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения и стандартных нуклеотидных последовательностей, через использование данной компьютерной программы, и идентификации различий между кодами данной нуклеиновой кислоты и данными стандартными нуклеотидными последовательностями с помощью данной компьютерной программы.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения компьютерная система, кроме того, может включать идентификатор, идентифицирующий элементы в нуклеотидных последовательностях кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или в аминокислотных последовательностях полипептидных кодов настоящего изобретения.

Идентификатор относится к одной или нескольким программам, которые идентифицируют определенные элементы в описанных выше нуклеотидных последовательностях кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или в аминокислотных последовательностях полипептидных кодов настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения идентификатор может включать программу, которая идентифицирует открытую рамку считывания в кДНК-кодах настоящего изобретения.

На фиг. 5 представлена схема последовательности операций, иллюстрирующая один из вариантов идентификатора процесса 300 по выявлению присутствия элемента в последовательности. Процесс 300 начинается с начального положения 302 и затем перемещается в положение 304, в котором первая последовательность, проверенная по элементам, сохраняется в памяти 115 компьютерной системы 1 00. Затем процесс 300 перемещается в положение 306, в котором открываются элементы последовательности

- 83 006367 базы данных. Такая база данных должна включать список символов каждого элемента в соответствии с наименованием данного элемента. Например, названный элемент мог бы представлять собой Кодон Инициации, а символом мог бы быть АТО. Другой пример элемента мог бы именоваться ТААТАА Вох, а символ данного элемента был бы ТААТАА. Пример такой базы данных выпускается Ишуегайу о£ ХУЬсопмп Оегейск Сотри1ег Огоир (ууу.дсд.сот).

После того, как базу данных элементов открыли в положении 306, процесс 300 перемещается в положение 308, в котором первый элемент прочитывается из данной базы данных. Сравнение символа первого элемента с первой последовательностью затем осуществляют в положении 310. Затем осуществляют определение в положении 316 по нахождению символа элемента в первой последовательности. Если символ обнаруживается, тогда процесс 300 перемещается в положение 318, в котором наименование найденного элемента выводится на экран дисплея пользователя.

Затем процесс 300 перемещается в положение 320, в котором определяют движущиеся элементы, существующие в данной базе данных. Если элементов больше нет, то процесс 300 завершают в конце положения 324. Однако, если в данной базе данных имеются еще элементы, то процесс 300 прочитывает элемент следующей последовательности в положении 326 и цикл возвращают в положение 310, в котором символ следующего элемента сравнивают с символом элемента первой последовательности.

Следует отметить, что если символ элемента не обнаруживается в первой последовательности в положении 316, то процесс 300 перемещается сразу в положение 320 для того, чтобы определить существование других элементов в данной базе данных.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения идентификатор может включать программу молекулярного моделирования, которая определяет 3-мерную структуру полипептидов и кодов настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения программа молекулярного моделирования идентифицирует последовательности-мишени, которые в большинстве своем совместимы с профилями, представляющими структурную конфигурацию остатков в известных трехмерных белковых структурах (См., например, патент США № 5436850). В другом методе известные трехмерные структуры белков данного семейства накладывают одну на другую, чтобы определить структурно консервативные области в этом семействе. Эта белок-моделирующая методика также использует известную трехмерную структуру гомологичного белка для аппроксимации структуры полипептидных кодов настоящего изобретения (См., например, патент США № 5557535). Традиционные методы моделирования гомологии использовали, как обычно принято, для построения моделей протеаз или антител (8о\уб11атйп и соавт. (1997). Сравнительные подходы могут также использоваться для построения трехмерных моделей белка, если представляющий интерес белок обладает последовательностью, плохо идентифицирующейся с матричными белками. В некоторых случаях белки свернуты в сходные трехмерные структуры, несмотря на то, что их последовательности характеризуются очень низкой идентичностью. Например, трехмерные структуры ряда спиральных цитокинов скручены в сходную трехмерную топологию, несмотря на слабую гомологию последовательностей.

Недавно созданные способы поточной обработки данных в настоящее время делают возможной идентификацию паттернов вероятностной упаковки для ряда ситуаций, где структурная связанность между мишенью и матриц(ей)ами не выявляется на уровне последовательностей. В гибридных способах, в которых распознавание укладки осуществляется с использованием Ми1Др1е 8ес.|иепсе Тйгеабтд (Поточная обработка данных для множества последовательностей), структурная эквивалентность выводится по данным поточной обработки с использованием программы метрической геометрии ОРАООЫ для создания модели с низким разрешением, а полностью атомизированное отображение создают с использованием пакета молекулярного моделирования, такого как риЛЫТА.

В соответствии с данным 3-стадийным методом матрицы-кандидаты сначала идентифицируют с использованием нового алгоритма распознавания упорядоченной укладки М8Т, который способен осуществлять одновременную поточную обработку множества совмещенных последовательностей в одну или несколько 3-Ό структур. На второй стадии структурные эквиваленты, полученные по выходным данным М8Т, преобразуют в ограничения промежутков между остатками и вводят в программу метрической геометрии ПРАООЫ, вместе с вспомогательной информацией, полученной из прогноза о вторичной структуре. Данная программа объединяет ограничения для несмещенного способа и быстро создает большое число подтверждений модели с низким разрешением. На третьей стадии эти подтверждения модели с низким разрешением преобразуют в полностью атомизированные модели и подвергают энергетической минимизации с использованием пакета молекулярного моделирования РИАЫТА (см. например, Акхоб! и соавт. (1997).

Результаты анализа молекулярного моделирования используют затем в методах по рациональному созданию лекарственного средства, чтобы идентифицировать агенты, которые модулируют активность полипептидных кодов настоящего изобретения.

В соответствии с этим, другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ идентификации элемента в кодах нуклеиновых кислот настоящего изобретения или в полипептидных кодах настоящего изобретения, включающий прочтение кода(ов) или полипептидного кода(ов) нуклеиновых кислот через использование компьютерной программы, которая идентифицирует элементы в ней, и иден

- 84 006367 тификацию элементов в коде(ах) нуклеиновых кислот или в полипептидном(ых) коде(ах) с помощью данной компьютерной программы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения компьютерная программа включает компьютерную программу, которая идентифицирует открытые рамки считывания. В другом варианте осуществления настоящего изобретения компьютерная программа идентифицирует структурные мотивы полинуклеотидной последовательности. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения данная компьютерная программа включает программу молекулярного моделирования. Данный способ можно осуществить путем прочтения отдельной последовательности или по меньшей мере 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения, либо полипептидных кодов настоящего изобретения через использование данной компьютерной программы и идентификации элементов в данных кодах нуклеиновых кислот или полипептидных кодах с помощью данной компьютерной программы.

Коды нуклеиновых кислот настоящего изобретения или полипептидные коды настоящего изобретения можно сохранять и управлять разнообразными программами процессорных данных в разных форматах. Например, их можно сохранять в виде текста в файле обработки текста, таком как МгсгокойХУОВЭ или ^ОВЭРЕВЕЕСТ или в виде А8СП-файла для разнообразных программ базы данных, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как ΌΒ2, 8УВА8Е или ОВАСЙЕ. Кроме того, многие компьютерные программы и базы данных можно использовать в качестве программ сравнения последовательностей, идентификаторов или поставщиков стандартных нуклеотидных или полипептидных последовательностей для сравнения с кодами нуклеиновых кислот настоящего изобретения или с полипептидными кодами настоящего изобретения. Нижеследующий список не следует рассматривать как ограничение настоящего изобретения, но как руководство к программам и базам данных, которые пригодны для кодов нуклеиновых кислот настоящего изобретения или для полипептидных кодов настоящего изобретения. Программы и базы данных, которые можно использовать, включают, но не ограничиваются перечисленным: МасРайегп (ЕМВЙ), О18соуегуВа8е (Мо1еси1аг Аррйсайоп Сгоир), СепеМте (Мо1еси1аг АррНсабоп Сгоир), Йоок (Мо1еси1аг Аррксайоп Сгоир), МасЬоок (Мо1еси1аг Аррксайоп Сгоир), ВЙА8Т и В1.А8Т2 ^СВЦ Β1.Α8ΤΝ и ВВА8Т.Х (АЙ8сЬи1 и соавт., 1990), ЕАЗТА (Реагкоп апб Ыртап, 1988), ЕА8ТЭВ (ВгиЙад и соавт., 1990), Са1а1у81 (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Ичс.). Са1а1у81/8НАРЕ (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Щс.), Сегш8².ОВАссе88 (Мо1еси1аг 8ипи1а1юп8 Шс.), НуроСеп (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Шс.), ^МдЫ ΙΙ (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Шс.), Э|8соуег (Мо1еси1аг 81ти1абоп8 Шс.), СНАВМт (Мо1еси1аг 8ипи1а1юп8 Шс.), Рейх (Мо1еси1аг 81ти1абоп8 Шс.), Эе1Р1п (Мо1еси1аг 8|ти1акоп8 Шс.), ОиаШеММ (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Шс.), Ното1оду (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Щс.), Мобе1ег (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Щс.), Ι8Ι8 (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Шс.), Оиап1а/Рго1ет Ое81дп (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Щс.), ^еЬЬаЬ (Мо1еси1аг 8ипи1а1юп8 Шс.), ^еЬйаЬ О1уег8Йу Ехр1огег (Мо1еси1аг 8ппи1а1юп8 Шс.)/ Сепе Ехр1огег (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Шс.), 8ес.|Ео1б (Мо1еси1аг 81ти1айоп8 Шс.), 1ке ЕМВЙ/8те188рго1ет ба1аЬа8е, 1ке МОЙ АуайаЫе Скеииса18 ЭйесЮгу ба1аЬа8е, 1ке МОЙ Эгид Эа1а Верой ба1а Ьа8е, 1ке Сотргейеп81уе Меб1ста1 Скет181гу ба1аЬа8е, Оег\уеп18'8 \Уог1б Эгид Шбех ба1аЬа8е, 1ке ВюВу1еМа81егП1е ба1аЬа8е, 1ке СепЬапк ба1аЬа8е и Сеп8ес.|п базы данных. Многие другие программы и базы данных будут очевидны специалистам в данной области техники с учетом настоящего описания.

Мотивы, которые можно выявлять с использованием указанных выше программ, включают последовательности, кодирующие лейциновые застежки, мотивы спираль-поворот-спираль, сайт гликозилирования, сайты убихитинизации, альфа-спирали и бета-конфигурации, сигнальные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды, которые управляют секрецией кодируемых белков, последовательности, вовлеченные в регуляцию транскрипции, такие как гомеобоксы, кислотные участки, энзиматически активные сайты, связывающие субстрат сайты и ферментативно расщепляемые сайты.

В данной заявке приводятся ссылки на различные публикации, патенты и опубликованные патентные заявки. Раскрытие данных публикаций, патентов и опубликованных описаний изобретений к патентам, на которые ссылаются в данной заявке, включены путем ссылки в представленном изложении для наиболее полного удовлетворительного описания области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Примеры

Пример 1 . Идентификация двуаллельных маркеров - экстрагирование ДНК.

Доноры не связаны родством и здоровы. Они были представлены достаточным разнообразием для типичной Французской гетерогенной популяции. От 1 00 индивидов была получена ДНК и проверена на наличие двуаллельных маркеров.

От каждого донора брали 30 мл периферической венозной крови с добавлением ЭДТА. Клетки (осадок) собирали центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об./мин. Эритроциты лизировали с помощью лизирующего раствора (50 мл конечный объем: 10 мМ Трис рН 7,6; 5 мМ МдС1₂; 10 мМ №1С1). Данный раствор центрифугировали (10 мин, 2000 об./мин) столько раз, сколько необходимо для удаления остаточных эритроцитов в супернатанте, после ресуспендирования клеточного осадка в данном лизирующем растворе.

Осадок лейкоцитов лизировали в течение ночи при 42°С 3,7 мл лизирующего раствора, состоящего из

- 85 006367 мл ТЕ 10-2 (Трис-НС1 10 мМ, ЭДТА 2 мМ)/ЫаС1 0,4М,

200 мкл 8Ό8 10%,

500 мкл К-протеиназы (2 мг К-протеиназы в ТЕ 10-2/ЫаС1 0,4М).

Для экстрагирования белков добавляли 1 мл насыщенного ЫаС1 (6 М) (1/3,5 ν/ν). После энергичного перемешивания данный раствор центрифугировали в течение 20 мин при 10000 об./мин.

Для осаждения ДНК к полученному супернатанту приливали 2-3 объема 100% этанола и раствор центрифугировали в течение 30 мин при 2000 об./мин. Полученный раствор ДНК трижды промывали 70%-м этанолом для удаления солей и центрифугировали в течение 20 мин при 2000 об./мин. Полученный осадок сушили при 37°С и ресуспендировали в 1 мл ТЕ 10-1 или в 1 мл воды. Концентрацию ДНК определяли путем измерения ОП при 260 нм (1 единица ОП=50 мкг/мл ДНК).

Чтобы определить присутствие белков в данном растворе ДНК определяли отношение ОП 260/ОП 280. В последующих описанных ниже примерах использовали только препараты ДНК, обладающие ОП 260/ОП 280 между 1,8 и 2.

Объединенную ДНК получали смешиванием эквивалентных количеств ДНК от каждого индивида. Пример 2. Идентификация двуаллельных маркеров: амплификация геномной ДНК с помощью ПЦР. Амплификацию образцов специфичных геномных последовательностей ДНК примера 1 осуществляли на объединенной ранее полученной ДНК. Кроме того, аналогичным образом амплифицировали 50 индивидуальных образцов.

ПЦР-анализ осуществляли с использованием следующего протокола:

Конечный объем	25 мкл
ДНК		2 нг/мкл
М§С12		2 мМ
4ЫТР (каждого)		200 мкМ
Праймер (каждого)		2,9 нг/мкл
Атр11 Тад Со14 ДНК-полимераза	0,05 единиц/мкл
ПЦР-буфер	(10х=0,1М ТрисНС1 рН8.3 0,5М КС1) 1х

Каждую пару первых праймеров создавали с использованием информации о последовательности из описанного в данном описании Сап1оп-гена и О8Р-ирограммного обеспечения (Н1Шег & Сгееп. 1991). Длина первой пары праймеров составляла около 20 нуклеотидов и обладала последовательностью, раскрытой в табл. 1 в колонке, помеченной Ри и РР.

Таблица 1

Ампликон	Диапазон позиций ампликона ЗЕО Ю 1	Название праймера	Диапазон позиций амплифихационното праймера в ЗЕО ГО Νο 1	Название праймера	Комплементарный диапазон позиций амплификационного праймера а ЗЕО ГО Но 1
99-62626	12343	12810	В1	12343	12363	С1	12793	12810
99-62632	13814	14296	В2	13814	13832	С2	14279	14296
99-62633	24863	25396	ВЗ	24863	24881	СЗ	25378	25396
99-62611	69198	69650	В4	69198	69218	С4	69632	69650
99-62605	73005	73483	В5	73005	73022	С5	73466	73483
99-62635	79808	80334	В6	79808	79826	С6	80314	80334
Ампликон	Диапазон позиций амплихона в ЗЕО ΙΟ 2	Название праймера	Диапазон позиций амПЛИфикаЦИОННОТО праймера в ЗЕО Ю N0 2	Название праймера	Комплементарный диапазон позиций амплификациояното праймера в ЗЕО ГО Νο 2
99-79335	51031	51559	В7	51031	51051	С7	51539	51559
99-79336	60925	61374	В8	60925	60945	С8	61354	61374
99-79338	80271	80720	В9	80271	80290	С9	80700	80720
99-79339	91037	91486	В10	91037	91056	СЮ	91466	91486
99-79314	100285	100784	В11	100285	100305	СИ	100764	100784
99-79316	106568	107020	В12	106568	106585	С12	107000	107020
99-79322	165864	166401	В13	165864	165884	С13	166381	166401
99-79306	235713	236210	В14	235713	235732	С14	236190	236210

- 86 006367

Ампликон	Диапазон позиций ампликона а 8ЕЗ Ю 3	Название праймера	Диапазон позиций амплификациоиного праймера в ЗВД ΙΟ Ыо 3	Название праймера	Комплементарный диапазон позиций амплификациоиного праймера в ЗЕф Ю Ыо 3
99-79310	31618	32100	В15	31618	31635	С15	32080	32100
99-79311	42324	42723	В16	42324	42344	С16	42704	42723
Ампликон	Диапазон позиций ампликона в ЗЕф ΙΟ 6	Название праймера	Диапазон позиций амплификациоиного праймера а ЗЕО Ю Ыо в	Название праймера	Комплементарный диапазон позиций амплификациоиного праймера в ЗЕО Ю Ыо 6
99-62617			В17	1	20	С17	435	453

Предпочтительно, праймеры содержали общий олигонуклеотидный хвост «левее» от специфичных оснований, намеченных для амплификации, который пригоден для секвенирования.

Праймеры РИ содержат следующую дополнительную РИ 5'-последовательность:

ТСТААААССАСССССАСТ;

праймеры ВР содержат следующую ВР 5'-последовательность: САССАААСАССТАТСАСС.

Праймер, содержащий дополнительную РИ 5'-последовательность приведен в 8ЕЦ ΙΌ Ыо 7. Праймер, содержащий дополнительную ВР 5'-последовательность приведен в 8ЕЦ ΙΌ Ыо 8.

Синтез данных праймеров осуществляли с помощью фосфорамидитного способа в синтезаторе СЕЫ8ЕТ ИРР8 24.1.

Амплификацию ДНК осуществляли в амплификаторе Сешик ΙΙ. После нагревания до 95°С в течение 10 мин проводили 40 циклов. Каждый цикл включал: 30 с при 95°С, 54°С в течение 1 мин и 30 с при 72°С. Конечное удлинение 10 мин 72°С завершало амплификацию. Количества полученных продуктов амплификации определяли в 96-луночных планшетах для микротитрования с использованием флуорометра и Ркодгееп в качестве интеркалирующего агента (Мо1еси1аг РгоЬек).

Пример 3. Идентификация двуаллельных маркеров. Секвенирование амплифицированной геномной ДНК и идентификация полиморфизмов.

Секвенирование амплифицированной ДНК, полученной в примере 2, осуществляли на секвенаторе АШ 377. Последовательности продуктов амплификации определяли с использованием автоматизированных реакций дидезокситерминирующего секвенирования согласно протоколу цикла секвенирования, терминированного красителем. Продукты реакций секвенирования разделяли в секвенирующих гелях и последовательности определяли с использованием анализа визуализацией геля (ΑΒΙ Рпкт ОЫА 8есщепстд Апа1ук1к кой^аге (2.1.2 уегкюи)).

Затем оценивали данные о последовательностях, чтобы в полученных амплифицированных фрагментах обнаружить присутствие двуаллельных маркеров. Поиск полиморфизма основан на присутствии наложенных пиков в электрофоретической картине, полученных для разных оснований, встреченных в одной и той же позиции, как описано раньше.

В 17 амплифицированных фрагментах выявлено 18 двуаллельных маркеров. Локализация этих двуаллельных маркеров показана в табл. 2.

- 87 006367

Таблица 2

Ампликон	вм	Название маркера	Полиморфизм	Позиция ВМ в ЗЕО 10
Ал1	Ал2	ΝΟ1	N04
99-6226	А1	99-62626-168			12642
99-62632	А2	99-62632-275			14088
99-62633	АЗ	99-6263-409			24981
99-62611	А4	99-62611-51			6924 8
99-62605	А5	99-62605-56			73428
99-62635	А6	99-62635-443		1	80250
Ампликон	ВМ	Название маркера	Полиморфизм	Позиция ВМ в ВЕС ГО
Ал1	Ал2	Νο2	Νο4
99-79335	А7	99-79335-60			51090
99-79336	А8	99-79336-369			61293
99-79338	А9	99-79338-332			80602
99-79314	А10	99-79314-201			100845
99-79314	АН	99-79314-225			100509
99-79316	А12	99-79316-158			106725	1658
99-7932	А13	99-79322-224			166087
99-79322	А14	99-79322-473			166336
99-79306	А15	99-79306-182			235894
Ампликон	ВМ	Название маркера	Полиморфизм	Позиция ВМ в ЗЕО П>
Ал1	Ал2	Νο3	Νο4
99-79310	А16	99-79310-29			31646	4481
99-79311	А17	99-79311-50			42373
Ампликон	ВМ	Название маркера	Полиморфизм	Позиция ВМ в ЗЕО ГО
Ал1	Ал2	N06
99-62617	А18	99-62617-105			105

ВМ относится к двуаллельному маркеру. Ал1 и ал2 относится, соответственно, к аллелю 1 и аллелю 2 данного двуаллельного маркера.

Таблица 3

ВМ	Название маркера	Диапазон позиций зондов в 8Е0 ГО Νο 1	Зондн
А1	99-62626-168	12630	12654	Р1
А2	99-62632-275	14076	14100	Р2
АЗ	99-62633-409	24969	24993	₽3
А4	99-62611-51	69236	69260	Р4
А5	99-62605-56	73416	73440	Р5
А6	99-62635	80238	80262	Р6
ВМ	Название маркера	Диапазон позиций зондов в ЗЕО ΙΟ Νο 2	Зондн
А7	99-79335-60	51078	51102	Р7
А8	99-79336-369	61281	61305	Р8
А9	99-79338-332	80590	80614	Р9
А10	99-79314-201	100473	100497	РЮ
А11	99-79314-225	100497	100521	Р11
А12	99-79316-158	106713	106737	Р12
А13	99-79322-224	166075	166099	Р13
А14	99-79322-473	166324	166348	Р14
А15	99-79306-182	235882	235906	Р15
ВМ	Название маркера	Диапазон позиций зондов в 8Е^ Ю Νο 3	Зондн
А16	99-79310-29	31634	31658	Р16
А17	99-79311-50	42361	42385	Р17
ВМ	Название маркера	Диапазон позиций зондов в ВЕС ГО Νο 6	Зондн
А18	99-62617-105	93	117	Р18

- 88 006367

Проверка достоверности полиморфизма с помощью микросеквенирования

Двуаллельные маркеры, идентифицированные в примере 3, в последующем получали подтверждение, а их соответствующие частоты были определены с помощью микросеквенирования.

Микросеквенирование осуществляли для каждого индивидуального образца ДНК, описанного в Примере 1 .

Амплификацию геномной ДНК индивидов осуществляли с помощью ПЦР, как описано выше, для выявления двуаллельных маркеров с одним и тем же набором ПЦР-праймеров (Таблица 1 ).

Предпочтительные праймеры, используемые для микросеквенирования, составляли в длину около 1 9 нуклеотидов и гибридизовались непосредственно слева от рассматриваемого полиморфного основания. В соответствии с настоящим изобретением, данные праймеры, используемые для микросеквенирования, подробно представлены в табл. 4.

Таблица 4

Наименование маркера	Дауэлле льный маркер	И1в. 1	Диапазон позиций микросеквеяирушцего праймера ш1з 1 а ЗЕО ГО Но 1	М13.	2	Диапазон комплементарных позиций михросекаенирупцего праймера ηϊβ. 2 в ЗЕО ГО Νο 1
99-62626-166	А1	ϋΐ	12623	12641	Е1		12643	12661
99-62632	А2	ϋ2	14069	14087	Е2		12642	12661
99-62633-409	АЗ	Ω3	24962	24980	ЕЗ		24982	25000
99-62611-51	А4	Ω4	69229	69247	Е4		69249	69267
99-62605-56	А5	05	73409	73427	Е5		73429	73447
99-62635-443	А6	Ω6	80231	8024 9	Е6		80251	80269
Наименование маркера	Дауалле лышй маркер	Μίβ. 1	Диапазон позиций микросеквенирукщего праймера т!з 1 а 8Е0 ГО Νο 1	М13.	2	Диапазон комплементарных позиций микросеквенирухтеето праймера т±а. 2 а 8Е2 ГО Νο 2
99-79335-60	А7	□7	51071	51089	Е7		51091	51109
99-79336-369	А8	08	61274	61292	Е8		61294	61312
99-79338-332	А9	ϋ9	80583	80601	Е9		80603	80621
99-79314-201	А10	Ο10	100466	100484	Е10		100486	100504
99-79314-225	АН	И11	100490	100508	Е11		100510	100528
99-79316-158	А12	012	106706	106724	Е12		106726	106744
99-79322-224	А13	ϋ13	166068	166086	Е13		166088	166106
99-79322-473	А14	014	166317	166335	Е14		166337	166355
99-79306-182	А15	ϋ15	235875	235893	Е15		235895	235913
Наименование маркера	Дауалле лышй маркер	Μίβ. 1	Диапазон позиций микросекаенирухцех*о праймера ш1в 1 в ЗЕ5 ГО Νο 3	Μϊβ.	2	Диапазон комплементарных позиций микросеквенцрукцех'О праймера ηίβ. 2 в ЗЕО ГО Νο 3
99-79310-29	А16	Ώ16	31627	31645	Е16		31647	31665
99-79311-50	А17	ϋ17	42354	42372	Е17		42374	42392
Наименование маркера	Дауалле лышй маркер	Μΐβ. 1	Диапазон позиций михросекзешфуквшго праймера ш1з 1 в ЗВД ГО Νο 6	Μίβ.	2	Диапазон позиций микросеквеиирукцего праймера т!з. 2 в ЗЕ2 ГО ΝΟ 6
99-62617-105	А18	ϋ18	86	104	Е18		106	124

ΜΪ8 1 и Μίδ 2 относятся, соответственно, к микросеквенирующим праймерам, которые гибридизуются с некодирующей цепью Сап1оп-гена или с кодирующей цепью Сап1оп-гена.

Реакцию микросеквенирования осуществляли следующим образом:

После выделения очисткой продуктов амплификации реакционную микросеквенирующую смесь получали путем добавления, в конечном объеме 20 мкл: 1 0 пмолей микросеквенирующего олигонуклеотида, 1 Ед. Термосеквеназы (Атегзйат Е79000С), 1,25 мкл термосеквеназного буфера (260 мМ Трис НС1 рН 9,5, 65 мМ МдС1₂) и два соответствующих 66ΝΤΡ (Регкш Е1тег, Эуе Тегтта1ог 8е1 401095), комплементарных нуклеотидам по полиморфному сайту каждого тестируемого двуаллельного маркера, следуя рекомендациям производителя. Через 4 мин при 94°С в амплификаторе Те1габ РТС-225 (М1 Кезеагсй) осуществляли 20 ПЦР-циклов из 15 с при 55°С, 5 с при 72°С и 10 с при 94°С. Затем с помощью этанольного осаждения удаляли невключенный терминирующий краситель. Образцы окончательно ресуспендировали в формамид-ЭДТА-буфере для насыщения и нагревали в течение 2 мин при 95°С перед загрузкой

- 89 006367 в полиакриламидный секвенирующий гель. Данные получали с помощью ДНК-секвенатора АВ1 РК18М 377 и обрабатывали с использованием программного обеспечения Сап1оп8САЫ (Регкт Е1тег).

После гелевого анализа данные автоматизированно обрабатывали с помощью программного обеспечения, которое позволяет определять аллели двуаллельного маркера, представленные в каждом амплифицированном фрагменте.

Данная программа оценивает такие факторы, как насколько интенсивность сигналов, получаемых в осуществленных выше операциях микросеквенирования, является слабой, нормальной или интенсивной или же данные сигналы являются неоднозначными. Кроме того, данная программа идентифицирует существенные пики (по форме и высоте). В числе существенных пиков, пики, соответствующие сайтумишени, идентифицировали по их положению. Если два существенных пика обнаруживаются в одном и том же положении, каждый образец относят к категории гомозиготного или гетерозиготного типа на основе соотношения высоты пика.

Пример 5. Получение антительных композиций к Сап1оп-белку.

Из трансфицированных или трансформированных клеток, содержащих экспрессионный вектор, кодирующий Сап1оп-белок или его часть, выделяют практически чистый белок или полипептид. Концентрацию белка конечного препарата доводят, например, путем концентрирования на устройстве с Апйсопфильтром, до уровня нескольких микрограмм/мл. Затем моноклональные или поликлональные антитела к данному белку можно получить следующим образом.

A. Получение моноклональных антител путем гибридомного слияния.

Моноклональные антитела к эпитопам Сап1оп-белка или к его части можно получить из мышиных гибридом в соответствии с классическим способом КоЫег, С. апб МПх(ет, С. (1975) или производными от него способами. См. также Наг1о\\; Е. апб Ό. Ьапе, 1988.

Вкратце, мышь периодически инокулируют несколькими микрограммами Сап1оп-белка или его части на протяжении нескольких недель. Затем мышь умерщвляют и выделяют клетки селезенки, продуцирующие антитела. Выделенные клетки селезенки сливают с помощью полиэтиленгликоля с мышиными миеломными клетками, а излишек неслившихся клеток разрушают выращиванием на селективной среде, включающей аминоптерин (НАТ-среда). Успешно слившиеся клетки разбавляют и аликвоты разбавления помещают в лунки планшета для микротитрования, где данная культура продолжает расти. Антителопродуцирующие клоны идентифицируют путем выявления антител в супернатантной жидкости лунок с помощью методов иммунологического анализа, таких как ЕЫ8А, впервые описанного Епдуа11 (1980), и его производного способа. Отобранные позитивные клоны можно увеличить в объеме и собрать для использования их продукт в виде моноклональных антител. Подробные методы получения моноклональных антител описаны у Όπνίχ Ь. и соавт. Вах1с Ме(1юбх ш Мо1еси1аг Вю1оду (Основные методы молекулярной биологии), Е1хеу1ег Ыете Уогк, 8ес(юп 21-2.

B. Получение поликлональных антител с помощью иммунизации.

Поликлональную антисыворотку, содержащую антитела к гетерогенным эпитопам Сап1оп-белка или его части, можно получить путем иммунизации животного, не принадлежащего человеческому роду, Сап1оп-белком или его частью, который может быть немодифицированным или модифицированным для усиления иммуногенности. Подходящим животным, не принадлежащим человеческому роду, предпочтительно является выбранное млекопитающее, обычно, мышь, крыса, кролик, коза или лошадь. Альтернативно, неочищенный препарат, который обогащали по концентрации Сап1оп, можно использовать для образования антител. Такие белки, фрагменты или препараты вводят не принадлежащему человеческому роду млекопитающему в присутствии соответствующего адъюванта (например, гидроксида алюминия, ΒΙΒΙ и т.п.), который известен в данной области техники. Кроме того, белок, фрагмент или препарат может быть предварительно обработан агентом, который повышает антигенность, такие агенты известны в данной области техники и включают, например, метилированный бычий сывороточный альбумин (тВ8А), бычий сывороточный альбумин (В8А), поверхностный антиген гепатита В и гемоцианин улитки фиссурелии (КЬН). Собирают сыворотку иммунизированного животного, обрабатывают и тестируют в соответствии с известными методами. Если собранная сыворотка содержит поликлональные антитела с нежелательными эпитопами, тогда поликлональные антитела можно выделить очисткой с помощью иммуноаффинной хроматографии.

На получение эффективных поликлональных антител влияют многие факторы, связанные с антигеном и видовым статусом хозяина. Кроме того, животные-хозяева по-разному отвечают на место инокуляции и дозу, причем несоответствующие или чрезмерные дозы антигена приводят к снижению титра антисыворотки. Небольшие дозы (на уровне нг) вводимого антигена во многие интрадермальные места оказываются более надежными. Методы получения и обработки поликлональной антисыворотки известны в данной области техники, см. например, Мауег апб \Уа1кег (1987). Протокол эффективной иммунизации кроликов можно найти у Уайикайгх 1. и соавт. (1971).

Повторные инъекции можно осуществлять с регулярными интервалами и собирать антисыворотку, когда титр ее антител, определяемый полуколичественно, например, с помощью двойной иммунодиффузии в агаре против известных концентраций данного антигена, начинает падать. См., например, ОисЫег1опу О. и соавт. (1973). Плато кривой концентрации антител обычно находится в пределах от 0,1 до 0,2

- 90 006367 мг/мл сыворотки (около 12 мкМ). Сродство антисыворотки по антигену определяют путем получения конкурентных кривых связывания, как описано, например, Е1кбег Ό. (1980).

Препараты антител, полученные в соответствии с моноклональным или поликлональным протоколом, пригодны для количественного иммунологического анализа, в котором определяют концентрации веществ, несущих антиген, в биологических образцах; их также используют полуколичественно или количественно для идентификации наличия антигена в биологическом образце. Данные антитела могут также использоваться в терапевтических композициях для уничтожения клеток, экспрессирующих данный белок или для снижения уровня данного белка в данном организме.

Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были проиллюстрированы и описаны, следует иметь в виду, что специалисты в данной области техники могут внести в него различные изменения, не выходя за рамки существа и объема настоящего изобретения.

Ссылки

АЬЬопбапхо 81 е! а1., 1993, Ме!бобк ш Епгуто1оду, Асабетк Ргекк, Ые\х Уогк, рр 803-823.

Арока В.8. е! а1., Ат. 1. Нит. Сепе!., 60:1439-1447, 1997.

А1!ксби1 е! а1., 1990, 1. Мо1. Бю1. 215(3):403-410.

А11кс1ш1 е! а1., 1993, Ыа!иге Сепебск 3:266-272.

А1!ксби1 е! а1., 1997, Ыис. Аабк Век. 25:3389-3402.

Атек, В.8. е! а1. 1. Iттиηо1. Ме!бобк 184:177-186 (1995).

Апбегкоп е! а1., 8утр. 8ос. Ехр. Вю1. 48: 85-97 (1994).

Ап!оп М. е! а1., 1995, 1. νΐΐΌ1., 69 : 4600-4606.

Агак1 К е! а1. (1995) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8с1. И8А. 92(1): 160-4.

АзЬкепаа, А. е! а1. РЫА8 88:10535-10539 (1991).

Акхоб| е! а1., Рго!етк: 81гис!иге, Еипсбоп, апб Сепебск, 8ирр1етеп! 1:38-42 (1997).

АикиЬе1 е! а1. (1989) Сиггеп! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вк1оду, Сгееп РиЬбкЫпд Аккос1а!ек апб Абеу Ιπ!егкс1епсе, Ν.Υ.

Ваг!ипек Р. е! а1. Су!окте 8(1):14-20 (1996).

ВаиЬошк А. (1993) Ыис1ек Ас1бк Век. 21(9): 2025-9.

Веаисаде е! а1., Те!габебгоп Ьеб 1981,22: 1859-1862.

Ве!!ег М. е! а1. 8с1епсе 240:1041-1043(1988).

В1ошп 1Ь е! а1. Ыа!иге Сепебск, 20: 70-73 (1998).

Вгаб1еу А., 1987, Ргобисбоп апб апа1ук1к оГ сЫтаепс тке. Ш; Е.Ь ВоЬебкоп (Еб.), Тега!осагстотак апб етЬгуошс к!ет се11к: А ргасбса1 арргоасб. ΙΒ6 Ргекк, ОхГогб, рр.113.

Вгат В.1. е! а1., 1993, Мо1. Се11 Вю1., 13 : 4760-4769.

Вппктап и. е! а1. 1. Iттиηо1. Ме!бобк 182:41-50 (1995).

Вго\\п Е.Ь., Ве1ада)е В., Вуап М.1., Кбогапа Н.С., Мебюбк Епхуто1 1979;68:109-151.

Вги!1ад е! а1. Сотр. Арр. Вю8С1. 6:237-245,1990.

Вгхик1о\\кх е! а1., Ат. 1. Нит. Сепе!. 65:1096-1103 (1999).

Ви1тап е! а1., Нит. Мо1. Сеп. 6(10) 1679-1685 (1997).

Вибоп О.В. е! а1. Абуапсек т ИптипоОду 57:191-280 (1994).

Викб е! а1., 1997, 1. Сбгота!одг., 777: 311-328.

Саг1коп, Ы.С. е! а1. 1. Вю1. Сбет. 272(17): 11295-11301 (1997).

Сба1 Н. е! а1. (1993) Вк!есбпо1. Арр1. Вксбет. 18:259-273.

Сбее е! а1. (1996) 8скпсе. 274:610-614.

Сбеп апб Кгоок, Ыис1ек Ас1бк Векеагсб 25:347-353 1997.

Сбеп е! а1. (1987) Мо1. Се11. Вю1 7:2745-2752.

Сбеп е! а1. Ргос. Ыа!1. Асаб. 8а. И8А 94/20 10756-10761, 1997.

Сбеп Ζ. е! а1. Сапсег Век. 58(16): 3668-3678 (1998).

Сбо В1 е! а1., 1998, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8а. И8А, 95(7): 3752-3757.

Сбои Ι.Υ., 1989, Мо1. Епбосппо1., 3: 1511-1514.

С1агк А.С. (1990) Мо1. Вю1. Еуо1. 7:111-122.

Со1ек В., Сак\\'е11 В., ВиЬткх!ет О.С., Нит Мо1 Сепе! 1998;7:791-800.

Сотр!оп 1. (1991) Ыа!иге. 350(6313):91-92.

Эау1к Ь.С., МГО. О1Ьпег, апб 1.Е. Вабеу, Вакк Ме!бобк т Мо1еси1аг Вк1оду, еб., Е1кеукг Ргекк, ΝΥ, 1986.

Эетрк1ег е! а1., (1977) 1. В. 8!а!. 8ос, 39В:1-38.

Пепу В. е! а1. В1ооб 92(6): 1981-1988(1998).

Эеп1 Ό8 & Ьакбтап Ό8 (1993) Тбе ЭЫА тоЬИйу кЫГ! аккау. Ш: Тгапкспрбоп Еас!огк: А.

Ргасбса1 Арргоасб (Ьакбтап Ό8, еб.) рр1-26. ОхГогб: ΙΚ6 Ргекк Эепуег е! а1., Эгид Эбе. Тобау 3(7): 323-332 (1998).

Ескпег В. е! а1. (1991) ЕМВО 1. 10:3513-3522.

Еб\уагбк е! Ьеа!бегЬагготе, Апа1убса1 Вксбеткбу, 246, 1-6 (1997).

Епдуа11 Е., Ме!б. Епхуто1. 70:419(1980).

- 91 006367

ЕхсоГйег й. апб 81аШп М. (1995) Мо1. Вю1. Еуо1, 12(5): 921-927.

Ее1бтап апб 8!ед, 1996, Мебесте/8с1епсек, куп!йеке, 12:47-55.

Еейс1 Е., 1991, I. Мо1. Вю1., Уо1. 222:301-310.

Ее11 Н.Р. е! а1. I. 1ттипо1. 146:2446-2452(1991).

Е1е1бк апб 8опд, 1989, №1иге, 340 : 245-246.

Е1кйег Ό., Сйар. 42 т: Мапиа1 оГ Сйшса1 1ттипо1оду, 2б Еб. (Воке апб Епебтап, Ебк.) Атег. 8ос. Еог М1сгоЬю1., УакШпд1оп, О.С. (1980).

Е1о!!е е! а1. (1992) Л/я. I. Векр1г. Се11 Мо1. Вю1. 7:349-356.

Еобог е! а1. (1991) 8с1епсе 251:767-777.

Ега1еу е! а1. (1979) Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А. 76:3348-3352.

Епеб М., Сго1йегк О.М., №.1с1ею Ас1бк Век 1981;9:6505-6525.

Еготоп!-Васше М. е! а1., 1997, №11иге Сепейск, 16(3) : 277-282.

Еи11ег 8. А. е! а1. (1996) 1ттипо1оду т Сштеп! Рго1осо1к т Мо1еси1аг В1о1оду, АикиЬе1 е! а1.Ебк, 1ойп \УПеу & 8опк, 1пс., И8А.

Еиг!й Р.А. е! а1. (1994). Ргос. №11. Асаб 8с1 И8А. 91:9302-9306.

Сагпег М.М., Веухт А., №ис1е1с Ас1бк Век 1981;9:3047-3060.

Сеукеп Н. Мало е! а1. 1984. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И.8.А. 81:3998-4002.

Сйокй апб Вассйа^а!, 1991, Тагдейпд оГйрокотек !о йера!осу!ек, т: Й1уег Океакек, Тагде!еб б1адпокк апб !йегару иктд кресШс гесер!огк апб йдапбк. \Уи е! а1. Ебк., Магсе1 йекекег, Νον Уогк, рр. 87-104.

Сййек 8.Ό. е! а1. 1. 1ттипо1. Ме!йобк 125:191-202(1989).

Сййек 8.О. е! а1. Р№А8 89:1428-1432(1992).

Соппе! е! а1., 1992, 8с1епсе 256:1443-1445.

Соп/а1е/ е! а1., Эгид Й1кс. Тобау 4(9): 431:439 (1999).

Сора1(1985)АГо/. Се11. Вю1., 5:1188-1190.

Соккеп М. е! а1. (1992) Ргос. №а!1. Асаб. 8сй И8А. 89:5547-5551.

Соккеп М. е! а1. (1995) 8аепсе. 268:1766-1769.

Сгайат е! а1. (1973) У1го1оду 52:456-457.

Сгееп е! а1., Апп. Веу. Вюсйет. 55:569-597 (1986).

Сгеепкрап апб Вопа, ЕА8ЕВ 1. 7(5):437-444 (1989).

СпГйп е! а1. 8с1епсе 245:967-971 (1989).

Сготре М. (1993) №а!иге Сепейск. 5:111-117.

Сготре М. е! а1. (1989) Ргос. №а!1. Асаб. 8сй И.8.А. 86:5855-5892.

Си Н. е! а1. (1993) Се11 73:1155-1164.

Си Н. е! а1. (1994) 8с1епсе 265:103-106.

Сиа!е1й 1.С. е! а1. Ргос. №а!1. Асаб. 8с1. И8А. 35:273-286.

Нас1а 1.С., Вгобу Й.С., СЫее М.8., Еобог 8.Р., Со1йпк Е.8., №а! Сепе! 1996; 14(4):441-447.

На11 Ь. А. апб 8тйпоу I. Р. (1997) Сепоте Векеагсй, 7:378-388.

Натек В.й. апб Н1ддтк 8.1. (1985) №1с1ею Ас1б НуЬпб1/айоп: А Ргасйса1 АрргоасЫ.

Натек апб Натй1, РГидегк Агсй. 391, 85-100 (1981).

Наттегйпд, е! а1., т: \1О\ОС1.О\А1. АNТIВО^IЕ8 А\1) Т-СЕЬЬ НУВВТООМА8 563-681 (Е1кеу1ег,№.У., 1981).

Нади Ь., УеЬег Т., А1ехапбгоуа Ь., йикт М., Вапк1 М., 1а1апко А., Сйп Сйет 1993;39(1 №! 1):22822287.

Наг1апб е! а1. (1985) 1. Се11 Вю1. 101:1094-1095.

Наг1о\у Е., апб Ό. Йапе. 1988. АпйЬоб1ек А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, рр. 53242.

Нагрег 1.У. е! а1., 1993, Се11, 75 : 805-816.

Наггор ЙА. е! а1. 1. Iттипо1. 161(4): 1786-1794(1998).

На\\!еу М.Е. е! а1. (1994) Ат. 1. Рйук. Ап!йгоро1. 18:104.

Не11 е! а1., Аппа1к Ν.Υ. Асаб. 8с1. 747:282-293 (1994).

НешкоГГ апб НешкоГГ, 1993, Рго1етк 17:49-61.

Н1ддтк е! а1., 1996, Ме!йобк Еп/уто1. 266:383-402.

Н|ддтк Еб., [Вй Ргекк, ОхГогб.

Нййег й. апб Сгееп Р. Ме!йобк Арр1., 1991, 1: 124-8.

Ноекк е! а1. (1986) №1с1ею Ас1бк Век. 14:2287-2300.

Ниапд й. е! а1. (1996) Сапсег Век 56(5):1137-1141.

Ник!оп е! а1. Ме!йобк т Еп/уто1оду 203:46-88 (1991).

Ниудеп е! а1. (1996) ΝιΙι.^ МебШпе. 2(8):893-898.

Пап! 1.С., У епИгаиЬ Н, Се11 1984 Арг.; 36(4):1007-15.

1и1ап е! а1. (1992) 1. Сеп. У1го1. 73:3251-3255.

Капедае Υ. е! а1., №с1. Ас1бк Век. 23:3816-3821 (1995).

Кагйп апб А1!ксйи1, 1990, Ргос. №!1. Асаб. 8сй И8А 87:2267-2268.

- 92 006367

КеСЙеЬогоидк, С.А. еС а1. Еиг. 1. Iттипо1. 24:952-958(1994).

Ккоигу к е( а1., РипбатепСа1к оГ Сепейс Ер1бетю1оду, θχίοι^ ипЫегкйу Ргекк, ЫУ, 1993.

К1т И-Ι еС а1. (1996) Сепоткк 34:213-218.

К1ет еС а1. (1987) ЫаСиге. 327:70-73. Коск., еС а1., 1Вю1.Скет. 265 (29): 17786-17791 (1990) КоЫег, С. апб МйкСет, С., ЫаСиге 256:495 (1975) Ко11ег еС а1. (1992) Аппи. Веν. Iттипо1. 10:705-730.

Коха1 МЛ., 8как Ы., 8кеп Ы., Уапд В., Рисш1 В., Мепдап Т.С., В1сктап Ό.Ό., Мотк Ό., НиЬЬе11 Е., Скее М., Стдегак Т.В., ЫаС Меб 1996;2(7):753-759.

Ьапбег апб 8скогк, 8с1епсе, 265, 2037-2048, 1994.

Ьапбедгеп и. еС а1. (1998) Сепоте Векеагск, 8:769-776.

Ьапде К. (1997) Ма!кетайса1 апб 81айкйса1 МеСкобк Гог Сепейс Апа1ук1к. 8рппдег, Ыете Уогк.

Еее еС а1., РЕВ8 ЬеСС. 445 231:236 (1999).

Ьепкагб Т. еС а1. (1996) Сепе. 169:187-190.

Ыаи1агб, 1. еС а1. СуСоктбе 9(4):233-241(1997).

Ьт М^. еС а1. Нит. СепеС., 99(3): 417-420 (1997).

ЬтСоп М.Р. еС а1. (1993) 1. С1т. ^екС. 92:3029-3037.

Ьш Ζ. еС а1. (1994)Ргос. ЫаС1. Асаб. 8ск И8А. 91:4528-4262.

Блуак еС а1., ЫаСиге Сепейск, 9:341-342, 1995.

Ыуак К.1, Натег Ι.ν., Нит МиСаС 1994;3 (4):379-385.

Ьосккай еС а1. ЫаСиге ВюСескпокду 14: 1675-1680, 1996.

Ьисак А.Н., 1994, Ш : ОеуекртепС апб СНшса1 Икек оГ Наетроркйик Ь СощидаСе.

Мапдег еС а1., Апа1. Вюскет. 214: 190-194 (1993).

Мапкоиг 8.Ь. еС а1. (1988) ЫаСиге. 336:348-352.

Магкка11 В. Ь. еС а1. (994) РСВ МеСкобк апб Аррйсайопк. 4:80-84.

МсСогтск еС а1. (1994) СепеС. Апа1. Теск. Арр1 11:158-164.

МсЬаидккп В.А. еС а1. (1996) Ат. 1. Нит. СепеС. 59:561- 569.

Могепа еС а1., Аппа1к ЫУ Асаб. 8ск 102-117 (1999).

Мои, еС а1., ЫаСиге 350: 398-402 (1991).

Моткоп, 8с1епсе 229:1202 (1985).

Мойоп Ы.Е., АтЭ. Нит.СепеС., 7:277-318, 1955.

Ми11ег, У.А. еС а1. 8СгисСиге 6(9): 1153-1167(1998).

МиШпах, В.Ь. еС а1. ВюТескпк|иек 12(6):864-869(1992).

Михусхка еС а1. (1992) Сигг. Торкк т М1сго, апб Iттиπо1. 158:97-129.

Ыаба 8. еС а1. (1993) Се11 73:1125-1135.

Ыаду А. еС а1., 1993, Ргос. ЫаС1. Асаб. 8ск И8А, 90: 8424-8428.

Ыагатига, М. еС а1. Iттипо1. ЬеС1. 39:91-99(1994).

Ыагапд 8.А., Нкшпд Н.М., Вгоиккеаи В., МеСкобк Епхуто1. 1979;68:90-98.

Ыеба еС а1. (1991) 1. Вю1. Скет. 266:14143-14146.

ЫеМоп еС а1. (1989) Ыис1ек Ас1бк Век. 17:2503-2516.

Ыккегкоп О.А. еС а1. (1990) Ргос. ЫаС1. Асаб. 8ск И.8.А. 87:8923-8927.

Ы1со1аи С. еС а1., 1987, МеСкобк Еп/утоЙ 149:157-76.

Ы1со1аи еС а1. (1982) Вюскпп. Вюркук. АсСа. 721:185-190.

ЫкктоГГ, 1. Тттипок 147(8): 2429-2438 (1991).

Ыугеп Р., Рейегккоп В., Ик1еп М., Апа1. Вюскет. 1993;208(1): 171-175.

θ^ί1^ еС а1. (1992) Васи1оу|гик Ехргеккюп УесСогк: А ЬаЬогаСогу Мапиа1. ν. Н. Ргеетап апб Со., Ые\х Уогк.

θ1№ еС а1. (1994) 8с1епсе. 265:781-784.

θί еС а1., ВюТескпк|иек 4:214 (1986).

θ1^ώϋΓ§ К.В. еС а1., 1992, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск, 89:5393-5397.

θ1екеп еС а1., Уо1Саде даСеб юп скаппе1 тоби1аСогк, 7-8 ОесетЬег, РЫ1абе1рк1а РА, _УИ8А (1995). (кПа еС а1. (1989) Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И.8.А. 86: 2776-2770.

θ« 1., Апа1ук1к оГ Нитап Сепейс Ыпкаде, 1окп Норкшк Ипгуегкйу Ргекк, Ва1йтоге, 1991. θискСе^1оπу, θ. еС а1., Скар. 19 ш: НапбЬоок оГ Е.хрептепЫ [ттипо1оду Ό. V^е^ (еб) В1аск\\е11 (1973).

Раб1ап Е.А., Мо1еси1аг [ттипо1оду 28(4/5): 489-498(1991).

Рагт1еу апб 8ткк, Сепе, 1988, 73:305-318.

Ракйпеп еС а1., Сепоте Векеагск 1997; 7:606-614.

Реагкоп апб Ыртап, 1988, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И8А 85(8):2444-2448.

Реаке 8. апб ^Нат В.8., 1990, Ехр. Се11. Век., 190:209-211.

Регкп еС а1. (1994)Ат. 1. Нит. СепеС. 55:777-787.

Регкю, Ь. еС а1. Сепе 187 9-18(1997).

РеСегкоп еС а1., 1993, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8ск И8А, 90 : 7593-7597.

Р1еги еС а1. Сепоте Векеагск 6:492-503, 1996.

- 93 006367

ΡιΕιγγΕ У. е! а1. 1. 1ттипо1. Ме!йобк 205(2):177-190(1997).

Ρоΐΐе^ е! а1. (1984) Ρϊόο. ΝιΚ Асаб δα. υ.δ.Ά. 81 (22) :7161-7165.

Ρϊ3ί, М. е! а1. 1. Се11. δοΐ. 11 1(Ρ!2): 237-247(1998).

Катипкеп е! а1., 1997, Е1ес!горйогек1к, 18 : 588-598.

Ке1б Ь.Н. е! а1. (1990) Ρϊόο. №!1. Асаб. δα. υ.δ.Α 87:4299-4303.

К1ксй, Ν. апб Мепкапдак, К. δ^ι^, 273:1516-1517, 1996.

КоЬейкоп Е., 1987, ЕтЬгуо-бейуеб к!ет се11 йпек. 1п: Е.1. КоЬейкоп Еб. Тега!осагстотак апб етЬпошс к!ет се11к: а ргасйса1 арргоасй. ШЬ Ριό^, ОхГогб, рр. 71.

Кодикка М.А. е! а1. Ρ^δ 91:969-973, (1994).

Коккч е! а1., Ρ1ηγμη^1. Тйег. 50:245-254, (1991).

Ко!й 1.А. е! а1. (1996) №-11иге Мебюте. 2(9):985-991.

Коих е! а1. (1989) Ρϊόο. N311. Асаб. δα. υ.δ.Α 86:9079-9083.

Киапо е! а1. (1990) Ρι-ос. №11. Асаб. δοΐ. υ.δΛ. 87:6296-6300.

δатЬ^оок 1., Ргйксй Е.Р., апб Т. Матайк. (1989) Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1. 2еб. Со1б δр^^пд НагЬог ЬаЬога!огу, Со1б δр^^пд НагЬог, №\ν Уогк.

δатκоп М. е! а1. (1996)А^го!оге,382(6593):722-725. δати1κк^ е! а1. (1989) 1. У1го1. 63:3822-3828.

δаηсйеζ-Ρеκсабо^ К. (1988) 1. С1ш. М1сгоЫо1. 26(10): 1934-1938. δа^ка^, С. апб δотте^ δ.δ. (1991)Вю!есйтдиек.

δππ^'Γ В. е! а1. (1988) Ρι-ос. Νι!1. Асаб. δα. υ.δ.Α 85:5166-5170.

δаνа^, Н. е! а1. АК1 34:26-34 (1995).

δ^ώ А. е! а1., 1993а, АПиге, 362: 258-261.

δсйеб1 е! а1., 1993Ь, №1с1ею Асчбк Кек., 21: 4783-4787.

δΟκιτι е! а1. δ^ι^ 270:467-470, 1995.

δΟκίΜ е! а1., 1996, Ρι-ос. ΝηΛ Асаб. δ^ υδΑ·93(20):10614-10619.

δсйηе^бе^ е! а1., (1997) Аг1едтп: А δойνа^е Рог Ρори1аί^оπ Сепейск Эа1а Апа1ук1к. υшνе^κ^ίу оГ Сепеуа.

δΟηνηΓίζ апб ОауйоГГ, ебк., 1978, Ма!псек Гог Ое!ес!тд О1к!апсе Ке1айопкЫрк: А!1ак оГ ΡΐΌΡίιι δедиепсе апб δύ-π^υΐ, Аак1ппд1оп: №!юпа1 Вютебюа1 Кекеагсй Роипбайоп.

δсζак^е1 С. е! а1. (1995) Тгепбк М1сгоЪю1. 3(6):213-217.

δйау Ι.ν. е! а1., 1991, Вюсйет. Вюрйук. Ас!а, 1072: 1-7.

δйеГйе1б У.С. е! а1. (1991) Ρι-ос. Νι!1. Асаб. δα. υ.δΛ. 49:699-706. δ^ζυ^η е! а1. (1992) Ρι-ос. №111 Асаб. δα. υ.δΑ 89:8794-8797.

δйоетаке^ Ό.Ό., е! а1., №11. Сепе!. 1996;14(4):450-456 δΐυ Ь. е! а1. ΡNАδ 90:7995-7999 (1993).

δΐ^ιτη А. е! а1. δ^ι^ 240:1038-1040 (1988).

διιιιΕι (1957) Апп. Нит. Сепе!. 21:254-276. διιιιΕι е!а1. (1983) Мо. Се11 Вю1. 3:2156-2165.

δоκпоνκк^ КС, е! а1., Ρι-ос Νι11 Асаб δ^ ША 1997;94:1119-1123. δоνбйат^η^ е! а1., Ρι^ώЕпдтеегтд 10:207, 215 (1997).

δр^е1таηη δ. апб Е\гепк V.!, Ат. 1. Нит. Сепе!., 62:450-458, 1998. δр^е1таηη δ. е!. а1.,Ат. 1. Нит. Сепе!., 52:506-516, 1993.

8!е1пЬегд ΝΑ. (1992) Тгепбк Сепе!. 8:1-16.

З&гпЬегдКЬ. (1994) Матт. Сепоте. 5:397-404.

δίΓΛ^Γ, Ь., Вюсйет1к!гу, 4!й ебйюп, 1995.

δ!ибп^ска С.М. е! а1. ΡΐΌΡίιι Епдтеегтд 7(6):805-814(1994).

δуνапеп А.С., Сйп. СЫт.Ас1а 1994;226(2):225-236.

δζаЬо А. е! а1. Сигг Орт δϋ-ис! Вю1 5, 699-705 (1995).

Таскоп е! а1. (1996) ^Шге Мебюте. 2(8):888-892.

Тагутап К.Е. е! а1. Неигоп 14 (4):755-762 (1995) δΟκ^ Ό.Ι. е! а1., Сепе!. Ер1бетю1.,13:423-450, 1996. Те К1е1е е! а1. (1990) ΝιΕικ. 348:649-651.

Тег1аи е! а1., Nаιи^ν^κκеηκсйаГιеη 85: 437-444 (1998).

ТегМШдег Ι.Ό. апб О!! 1., НапбЬоок оГ Нитап Сепейс Ыпкаде, 1ойп Норктк υη^νе^κ^ίу Ριό^, Ьопбоп, 1994.

Тйотак К.К. е! а1. (1986) Се11. 44:419-428.

Тйотак К.К. е! а1. (1987) Се11. 51:503-512.

Тйотркоп е! а1., 1994, Ν^ΕΕ Асчбк Кек. 22 (2):4673-4680.

Тиг-Какра е! а1. (1986) М. Се11. Вю1. 6:716-718.

Туадч е! а1. (1998) ^Шге Вю!есйпо1оду. 16:49-53.

Шбеа Μδ. (1988) ^сЫс Асчбк Кекеагсй. 11:4937-4957.

Шбеа Μδ. е! а1.( 1991) Ν^ΕΕ Асчбк δутр. δе^. 24:197-200.

Уайикайгк, 1. е! а1. 1. Сйп. Епбосгто1. Ме!аЬ. 33:988-991(1971).

- 94 006367 ν^άοη Р.. е! а1.. 1996. 1. Μο1. Βίο1.. 261:11-22.

Уни бег кпд! е! а1. (1991) Сене. 105:263-267.

У1. Н. е! а1. РНА8 89:11337-11341(1992).

У1азак К. е! а1. (1983) Еиг. 1. БюсЬет. 135:123-126.

\\аЬ1ко е! а1. (1986).Ό№4.5(4):305-314.

\\а1кег е! а1. (1996) С1т. СЬет. 42:9-13.

ХУамд е! а1.. 1997. СЬ^οта!οд^аρЬ^а, 44: 205-208.

\ей. Β.8. (1996) СемеНс ба!а ЛпнЬъй ΙΙ: МеПюбз £ογ Э|5сге1е ρορи1аΐ^οη дегебс Эа1а. Зшаиег Λ^οα Ιηα. διιΐ'κά^ιΊΗηά. МА. И.8.А.

\Уез1еп11к М.А.Ь. 1995. Ргос. №!1. Асаб. 8сЦ 92:4021-4025.

\Ь1!е. М.Б. е! а1. (1992) бегот^з. 12:301-306.

\Ь1!е. М.Б. е! а1. (1997) бегот^з. 12:301-306.

\11Ьат8. е! а1. 8с1е11се 257: 389-395 (1992).

\ο^ е! а1. 6е11е. 10:87-94 (1980).

\οοά З.А. е! а1.. 1993. Ргос. Ναΐ1. Асаб. δα. И8А. 90: 4582-4585.

\и аЩ \и (1987) 1. Βίο1 СЬет. 262:4429-4432.

\и нп6 \и (1988) Β^οсЬет^8!^у. 27:887-892.

\и е! а1. (1989) Ргос. Να!1. Асаб. 8οΐ. И.8.А. 86:2757.

Уад1 Т. е! а1. (1990)Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8οΐ. И.8.А. 87:9918-9922.

Υοοη. Ό.Υ. е! а1. 1. Iттиηο1. 160(7): 3170-3179(1998).

Ζΐιαι^ е! а1.. Nеи^ορЬа^тасο1οду 32 (11): 1075-1088 (1993).

Ζΐιαο е! а1.. Ат. 1. Нит. 6еηе!.. 63:225-240. 1998.

Ζ№^. Х.Х. е! а1. 1. Iттиηο1. 154:5590-5600(1995).

Ζΐιιι. Ζ. е! а1. Сагое!· Кез. 58(15): 3209-3214(1998).

Ζου Υ. К. е! а1. (1994) Сигг. ΒίοΕ 4:1099-1103.

Claims (24)

1. Выделенный, выделенный очисткой или рекомбинантный полинуклеотид, включающий любую из нуклеотидных последовательностей, представленную в виде 8ЕО ΙΌ Νο 1-4 или 6, или последовательность, комплементарную любой из этих последовательностей.

2. Выделенный, выделенный очисткой или рекомбинантный полинуклеотид, включающий непрерывный участок последовательности 8ЕО ΙΌ Νο 4 по меньшей мере из 50 нуклеотидов, где указанный полинуклеотид кодирует биологически активный СаηIοη-полипептид.

3. Выделенный, выделенный очисткой или рекомбинантный полинуклеотид, который кодирует СаηIοη-полипептид человека, включающий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ Νο 5 или ее биологически активный фрагмент.

4. Полинуклеотид по любому из пп. 1-3, присоединенный к твердому носителю.

5. Полинуклеотид по любому из пп. 1 -4, дополнительно включающий метку.

6. Набор полинуклеотидов, включающий по меньшей мере один полинуклеотид по п.4.

7. Набор по п.6, где указанный набор является адресным.

8. Рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотид по любому из пп. 1-3.

9. Рекомбинантный вектор, включающий полинуклеотид по п.2 или 3, функционально присоединенный к промотору.

10. Клетка-хозяин, включающая рекомбинантный вектор по п.8 или 9.

11. Животное-хозяин или млекопитающее-хозяин, не принадлежащее человеческому роду, включающее рекомбинантный вектор по п.8 или 9.

12. Клетка млекопитающего-хозяина, включающая СаηIοη-ген, разрушенный гомологичной рекомбинацией с помощью нокаутного вектора.

13. Млекопитающий-хозяин, не принадлежащий человеческому роду, включающий СаηIοη-тен, разрушенный гомологичной рекомбинацией с помощью нокаутного вектора.

1 4. Выделенный, выделенный очисткой или рекомбинантный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, представленную в виде 8ЕО ΙΌ Νο 5, или его биологически активный фрагмент.

1 5. Способ получения полипептида, включающий

a) создание популяции клеток, включающих полинуклеотид, кодирующий полипептид по п.14, функционально присоединенный к промотору;

b) культивирование указанной популяции клеток в условиях, подходящих для получения в указанных клетках указанного полипептида; и

c) выделение очисткой указанного полипептида из указанной популяции клеток.

16. Способ связывания антитела к ί.'αηΙοη с полипептидом по п.14, включающий контактирование указанного антитела с указанным полипептидом в условиях, в которых указанное антитело может спе

- 95 006367 цифически связаться с указанным полипептидом.

17. Способ обнаружения в клетке экспрессии СаηIοи-гена, включающий следующие стадии:

a) контактирование указанной клетки или экстракта из указанной клетки с

ί) полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с полинуклеотидом по пп. 1, 2 или 3 или

и) полипептидом, который специфически связывается с полипептидом по п.14; и

b) обнаружение наличия или отсутствия гибридизации между указанным полинуклеотидом и видами РНК в указанной клетке или экстракте или наличия или отсутствия связывания указанного полипептида с белком в указанной клетке или экстракте;

где обнаружение наличия указанной гибридизации или указанного связывания свидетельствует о том, что указанный Сап1оп-ген экспрессируется в указанной клетке.

18. Способ по п. 17, в котором указанный полинуклеотид представляет собой олигонуклеотидный праймер и в котором указанная гибридизация обнаруживается путем детектирования наличия продукта амплификации, включающего последовательность указанного праймера.

19. Способ по п.17, в котором указанный полипептид представляет собой антитело к Сап1оп.

20. Способ идентификации кандидатного модулятора СаηIοи-полипептида, включающий

a) контактирование полипептида по п. 1 4 с тест-соединением и

b) определение специфического связывания указанного соединения с указанным полипептидом; где обнаружение того, что указанное соединение специфически связывается с указанным полипептидом свидетельствует о том, что указанное соединение является кандидатным модулятором указанного Сап1оп-полипептида.

21. Способ по п.20, включающий, кроме того, тестирование активности указанного Сап1опполипептида в присутствии указанного кандидатного модулятора, где различие в активности указанного СапIοи-πолиπеπтида в присутствии указанного кандидатного модулятора по сравнению с активностью в отсутствие указанного кандидатного модулятора свидетельствует о том, что данный кандидатный модулятор представляет собой модулятор указанного Сап1оп-полипептида.

22. Способ идентификации модулятора СаηIοи-полипептида, включающий

a) контактирование полипептида по п.14 с тест-соединением и

b) обнаружение активности указанного полипептида в присутствии и отсутствие указанного соединения;

где обнаружение различия в указанной активности в присутствии указанного соединения по сравнению с активностью в отсутствие указанного соединения свидетельствует о том, что указанное соединение представляет собой модулятор указанного Сап1оп-полипептида.

23. Способ по п.21 или 22, в котором указанный полипептид представлен в клетке или в клеточной мембране и в котором указанная активность включает активность потенциалзависимого воротного ионного канала.

24. Способ получения фармацевтической композиции, включающий

a) идентификацию модулятора Сап1оп-полипептида с использованием способа по любому из пп.2023 и

b) объединение указанного модулятора с физиологически приемлемым носителем.