ES2271092T3

ES2271092T3 - Gen y proteina del canal ionico dependiente del voltaje asociado a la esquizofrenia.

Info

Publication number: ES2271092T3
Application number: ES01984902T
Authority: ES
Inventors: Daniel Cohen; Ilya Chumakov; Anne-Marie Simon; Hadi Abderrahim
Original assignee: Serono Genetics Institute SA
Current assignee: Merck Biodevelopment SAS
Priority date: 2000-12-05
Filing date: 2001-12-04
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2021-12-04
Also published as: JP2004525614A; EA200300642A1; AU3357302A; CN1777676A; US20040091497A1; WO2002046404A2; WO2002046404A9; MXPA03005069A; ATE339500T1; EP1339840B1; EA200500974A1; EA008252B1; DE60123109T2; IL156073A0; AU2002233573B2; KR20030074643A; BR0115937A; WO2002046404A3; CA2430712A1; US20080184381A1

Abstract

El uso de un anticuerpo o dominio de unión al antígeno que se une específicamente al polipéptido mostrado en la SEC ID NO:5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esquizofrenia o trastorno bipolar.

Description

Gen y proteína del canal iónico dependiente del voltaje asociado a la esquizofrenia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un gen y proteína del canal iónico dependiente del voltaje y su papel en la enfermedad. La invención se refiere a los polinucleótidos que codifican un polipéptido de CanIon además de las regiones regulatorios localizadas en los extremos 5' y 3' de dicha región codificadora. La invención también trata de polipéptidos codificados por el gen de CanIon. La invención también proporciona métodos para la detección de moduladores, por ej., antagonistas, del canal de CanIon y métodos de uso de tales moduladores para el tratamiento o prevención de diversas enfermedades o afecciones. La invención también trata de anticuerpos dirigidos específicamente contra tales polipéptidos que son útiles como reactivos de diagnóstico. La invención además abarca marcadores bialélicos del gen de CanIon útiles para el análisis genético.

Antecedentes de la invención

Los avances en el arsenal tecnológico disponible para los investigadores básicos y clínicos han permitido estudios cada vez más sofisticadas de las funciones del cerebro y sistema nervioso en la salud y enfermedad. Numerosas hipótesis neurobiológicas y farmacológicas se han propuesto con respecto a los mecanismos neuroquímicos y genéticos involucrados en los trastornos del sistema nervioso central (SNC), que incluyen los trastornos psiquiátricos y enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, los trastornos del SNC presentan etiologías complejas y mal comprendidas, así como también síntomas que se superponen, mal caracterizadas y difíciles de evaluar. Como consecuencia, se requerirán futuros regímenes de tratamiento y esfuerzos para el desarrollo de fármacos que sean más sofisticados y centrados en causas multigénicas y necesitarán nuevos ensayos para las poblaciones de enfermedad del segmento y proporcionan información diagnóstica y pronóstica más precisa sobre los pacientes que sufren de trastornos de SNC.

Los trastornos del SNC pueden abarcar un amplio rango de trastornos y correspondientemente un amplio rango de factores genéticos. Los ejemplos de trastornos del SNC incluyen trastornos neurodegenerativos, trastornos psicóticos, trastornos del estado de ánimo, autismo, dependencia de sustancias y alcoholismo, trastornos del dolor, epilepsia, retardo mental u otras enfermedades psiquiátricas que incluyen trastornos cognitivos, ansiedad, de la alimentación, de control de impulsos y personalidad. Los trastornos se pueden definir mediante la clasificación del Manual de Diagnóstico y Estadística de los Trastornos Mentales cuarta edición (DSM-IV).

Aun cuando se considera solo un pequeño subconjunto de trastornos del SNC, es evidente por la falta de un tratamiento adecuado y de la comprensión de la base molecular de los trastornos de esquizofrenia y trastornos bipolares que se necesitan nuevos blancos para la invención terapéutica y métodos de tratamiento mejorados. Para la esquizofrenia y el trastorno bipolar, todos las moléculas conocidas actualmente que se usan para su tratamiento presentan efectos secundarios y actúan solo contra los síntomas de la enfermedad. En consecuencia, hay una gran necesidad de nuevas moléculas sin efectos secundarios asociados y dirigidas contra blancos que están involucrados en los mecanismos causales de la esquizofrenia y trastorno bipolar. En consecuencia, son necesarias y útiles las herramientas que facilitan el descubrimiento y caracterización de estos blancos.

Canales de iones dependientes del voltaje

Los canales de iones dependiente del voltaje son parte de una gran familia de macromoléculas cuyas funciones incluyen el control y mantenimiento del potencial eléctrico a través de las membranas celulares, secreción y transducción de señales. Estas proteínas del canal están comprometidas en el control de la liberación del neurotransmisor de las neuronas y cumplen un papel importante en la regulación de una variedad de funciones celulares, que incluyen la excitabilidad de membrana, contracción muscular y transmisión sináptica. Las principales subunidades alfa de los canales de Na+ y las subunidades alfa-1 de los canales de Ca+ consisten en aproximadamente 2000 aminoácidos y contienen la vía de conducción de iones. El análisis bioquímico ha revelado que el canal iónico fisiológicamente activo está compuesto de varias subunidades diferentes. Existen dos subunidades auxiliares que copurifican con la subunidad alfa de los canales de Na+, la subunidad beta-1 y beta-2. Para los canales de Ca+, se han identificado subunidades adicionales (alfa-2, beta, gamma y sigma) con acción modulatoria. La subunidades alfa-2 y beta parecen aumentar la actividad funcional de la subunidad alfa-1 de los canales de Ca+. Las subunidades alfa de los canales de K+ están asociadas con las subunidades beta en un modo 1:1 fashion lo que produce un complejo del canal de K+ que presenta estequiometría (alfa)_{4}(beta)_{4} (Terlau et al., Naturwissenschaften 85:437-444 (1998)). La estructura básica y los ejemplos de los canales de iones de calcio y sodio se describen también, por ej., en Williams, et al. Science 257:389-395 (1992); Mori, et al., Nature 350:398-402 (1991); y Koch, et al., J.Biol.Chem. 265 (29):17786-17791 (1990). Una secuencia de ácido nucleico del canal iónico de Ca+ y Na+ de la rata que comparte un alto nivel de homología de secuencia con el canal de CanIon se describe también en Lee et al., FEBS Lett. 445 231:236 (1999).

Las subunidades alfa comparten características de secuencia con todos los canales catiónicos dependientes del voltaje y aprovechan el mismo motivo estructural que comprende un haz de 6 hélices de dominios que abarcan el potencial de membrana. En ambos canales de sodio y calcio, este motivo se repite 4 veces en la secuencia para dar un haz de 24 hélices. Las secuencias de aminoácidos están altamente conservadas entre especies (por ej., humano y Drosophila), y entre diferentes canales de iones.

Existen varias isoformas de canales de calcio específicas de tejido, farmacológica y electrofisiológicamente distintas, codificadas por genes separados de una familia multigénica. En el músculo esquelético, cada ensamblaje estrechamente unido de las subunidades alfa, beta y gamma asociadas con otras 4 para formar una macromolécula pentamérica. Pro ejemplo, las subunidades alfa-1 del canal de calcio neuronal son el producto de por lo menos siete genes diferentes de nominados alfa-1 A a H. Los estudios inmunocitoquímicos han demostrado una distribución diferencial de las subunidades alfa-1 del canal de calcio. Las subunidades alfa-1A y alfa-1B se expresan principalmente en dendritas y terminales presinápticas y alfa-1A se concentró generalmente en un mayor número de terminales nerviosa que alfa-1 B. En la unión neuromuscular de ratas y seres humanos, alfa 1A se localiza en forma presináptica, mientras que alfa-1B y alfa-1A están ambas presentes en las células de Schwann asociadas al axón. Alfa 1E se localiza principalmente en los cuerpos celulares, en algunos casos en las dendritas proximales además de las ramas distales de las células de Purkinje. Alfa 1C y alfa-1D se localizan en los cuerpos celulares y en las dendritas proximales de las neuronas centrales.

Los canales de calcio nativo han sido clasificados sobre la base de sus propiedades farmacológicas y/o electrofisiológicas. La clasificación de los canales de calcio dependientes del voltaje los divide en activados por voltaje alto (HVA), que incluyen los tipos L-, N-, P- y Q; intermedios (IVA, tipo R); y activados por voltaje bajo (LVA, tipo T). (Morena et al., Annals NY Acad. Sol. 102-117 (1999).

La principales subunidades (alfa-1) pertenecen a una familia génica cuyos miembros pueden formar canales funcionales por ellos mismos cuando se expresan en sistemas de expresión heteróloga (Zhang et al, Neuropharmacology 32(11):1075-1088 (1993). En las células nativas, las subunidades alfa-1 se expresan como complejos multisubunidades con subunidades secundarias que modifican las propiedades funcionales de la subunidad alfa-1. En muchos casos, la coexpresión de subunidades auxiliares afecta las propiedades biofísicas de los canales. Las subunidades beta en particular tienden a tener efectos importantes sobre las subunidades alfa-1; se ha demostrado que las subunidades beta alteran las propiedades de activación, inactivación del estado estacionario, cinética de la inactivación y corriente pico.

Gran parte de la diversidad molecular de los canales se produce por la existencia de múltiples formas de la subunidades alfa-1. Por ejemplo, se ha demostrado que las formas empalmadas en formas diferente de los canales de calcio se expresan en forma diferencial y tiene sensibilidades diferentes para la fosforilación por serina-treonina quinasas (Hell et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 747:282-293 (1994)). Se ha demostrado que las mutaciones de los genes del canal iónico están comprometidas en un amplio rango de enfermedades, que incluyen enfermedades del sistema nervioso central. Los ejemplos de mutaciones del canal iónico que causan varios trastornos eposódicos que incluyen parálisis periódica, ataxia episódica, migraña, síndrome de QT largo y disquinesia paroxística se revisan en Bulman et al., Hum. Mel. Gen. 6(10) 1679-1685 (1997). Varios trastornos de la mutación de los canales de Ca+, por ejemplo, se muestran en la Tabla A (de Moreno, supra).

TABLA A

Enfermedad	Subunidad del canal	Modelo
	de calcio
Migraña hemipléjica familiar	Alfa-1A	Humano
Ataxia Episódica tipo 2	Alfa-1A	Humano
Ataxia espinocerebelar tipo 6	Alfa-1A	Humano
Fenotipos tottering y Learner	Alfa-1A	Ratón
Síndrome de Lambert-Eaton	Alfa-1A, \alpha-1B	Humano
Parálisis hipopotasémica periódica	Alfa-1S	Humano
Disgenesia muscular	Alfa-1S	Ratón
Fenotipos diabéticos grasos de Zucker	\alpha-1C; \alpha-1D	Rata
Fenotipo letárgico	Beta-4	Ratón
Hipotermia maligna	Alfa-2/\delta	Humano
Stargazer	Gamma	Ratón

Los moduladores de los canales de calcio y sodio también se usan comúnmente en el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones. Por ejemplo, se ha demostrado que los bloqueadores de los canales de calcio y/o sodio son útiles para el tratamiento o prevención de uno o más síntomas asociados con diversas enfermedades y afecciones tale como varias enfermedades y afecciones cardíacas (por ej., angina, arritmias), hipertensión, migrañas, efectos neurológicos de los accidentes cerebrovasculares, manía, disquinesia tardía inducida por neurolépticos, trastorno bipolar, dolor, epilepsia y otras.

Se ha demostrado que existen diferencias funcionales importantes en el sistema nervioso entre los diferentes canales iónicos. Además, existen diferencias funcionales entre las diferentes mutaciones del mismo gen del canal iónico como así también entre las variantes de empalme del mismo canal iónico. De esta manera, a pesar de la vinculación de los canales iónicos con las enfermedades del SNC, ha sido difícil predecir cuál canal iónico puede ser un blanco efectivo para la intervención terapéutica en una enfermedad particular. Uno de los problemas ha sido proporcionar un gen del canal iónico implicado en la esquizofrenia, trastorno bipolar o enfermedades relacionadas con las mismas.

La presente invención se refiere a estas y otras necesidades.

Síntesis de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la identificación de sustancias o moléculas que modulan la expresión o actividad de una proteína canal iónico dependiente del voltaje, llamada CanIon, como así también a métodos para la detección de sustancias o moléculas que interactúan con el polipéptido canal iónico. También se proporcionan métodos de uso de estas sustancias identificadas en estos métodos. Por ejemplo, se proporcionan métodos de tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones que incluyen esquizofrenia o trastorno bipolar mediante antagonistas de canales iónicos.

En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo o dominio de unión al antígeno que se une específicamente al polipéptido mostrado como SEC ID NO:5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esquizofrenia o trastorno bipolar.

En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso in vitro de un anticuerpo o dominio de unión al antígeno que se une específicamente al polipéptido mostrado como SEC ID NO:5 en el diagnóstico de la esquizofrenia o trastorno bipolar.

En una realización, cualquiera de los anticuerpos o dominios de unión al antígeno descriptos en la presente memoria es quimérico, humano o humanizado.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una herramienta antisentido que inhibe la expresión del canal iónico codificado por un polinucléotido mostrado como SEC ID.NO:1, 2, 3 o 4 que comprende un fragmento del polinucléotido mostrado como SEC ID NO:1, 2, 3 o 4 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esquizofrenia o trastorno bipolar. En una realización, la herramienta antisentido es una ribozima.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los anticuerpos, dominios de unión al antígeno o herramientas antisentido descriptos en la presente, y un vehículo o excipiente adecuado.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para identificar un modulador candidato de un polipéptido de un canal iónico, dicho método que comprende: a) poner en contacto un polipéptido que comprende un polipéptido mostrado como SEC ID NO:5 con un compuesto de ensayo; y b) determinar si dicho compuesto se une específicamente a dicho polipéptido; donde una detección de que dicho compuesto se une específicamente a dicho polipéptido indica que dicho compuesto es un modulador candidato de dicho polipéptido canal iónico.

En una realización, el método también comprende ensayar la actividad biológica de dicho polipéptido canal iónico en presencia de dicho modulador candidato, donde una alteración en la actividad biológica de dicho polipéptido canal iónico en presencia de dicho modulador candidato en comparación con la actividad en ausencia de dicho modulador candidato indica que el modulador candidato es un modulador de dicho polipéptido canal iónico.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de identificar un modulador de un polipéptido canal iónico, dicho método que comprende: a) poner en contacto un polipéptido que comprende un polipéptido mostrado como la SEC ID NO:5 con un compuesto de ensayo y b) detectar la actividad de dicho polipéptido en presencia o ausencia de dicho compuesto, donde una detección de una diferencia en dicha actividad en presencia o ausencia de dicho compuesto en comparación con la actividad en ausencia de dicho compuesto indica que dicho compuesto es un modulador de dicho polipéptido canal iónico.

En una realización de los presentes métodos, dicho polipéptido está presente en una célula o membrana celular, y dicha actividad biológica comprende la actividad de canal iónico dependiente del voltaje.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende a) identificar un modulador del polipéptido canal iónico utilizando cualquiera de los métodos descriptos en la presente memoria; y b) combinar dicho modulador con un vehículo fisiológicamente aceptable. También se proporcionan métodos de uso de las composiciones farmacéuticas.

También se proporcionan usos de los moduladores, polipéptidos, polinucleótidos o anticuerpos de canales iónicos descriptos en la presente memoria para la preparación de un medicamento, por ej., para el tratamiento del cuerpo humano o para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades o afecciones descriptas en la presente memoria.

También se proporcionan kits para usar y detectar los presentes polinucleótidos y polipéptidos de canales iónicos in vitro o in vivo.

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de marcadores bialélicos del gen del canal iónico para determinar si un individuo está en riesgo o sufre de esquizofrenia o trastorno bipolar.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que muestra un mapa BAC de la región 13q del cromosoma que contiene el gen CanIon.

Breve descripción de las secuencias proporcionadas en el listado de secuencias

La SEC ID No 1 contiene una secuencia genómica de CanIon que comprende la región regulatoria 5' (región no transcripta secuencia arriba) y exones 1 a 7.

La SEC ID No 2 contiene una secuencia genómica de CanIon que comprende los exones 8 27.

La SEC ID No 3 contiene una secuencia genómica de CanIon que comprende los exones 28 a 44, y la región regulatoria 3' (región no transcripta secuencia abajo).

La SEC ID No 4 contiene la secuencia de ADNc de CanIon.

La SEC ID No 5 contiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de la SEC ID No 4.

La SEC ID No 6 contiene la secuencia de nucléotidos del amplicón que comprende el marcador bialélico A1 8.

La SEC ID No 7 contiene un cebador que contiene la secuencia adicional PU 5' descripta adicionalmente en el Ejemplo 2.

La SEC ID No 8 contiene un cebador que contiene la secuencia adicional RP 5' descripta adicionalmente en el Ejemplo 2.

De acuerdo con las regulaciones relacionadas con el listado de secuencias, se han usado los siguientes códigos en el listado de secuencia para indicar las localizaciones de los marcadores bialélicos dentro de la secuencias y para identificar cada uno de los alelos presentes en la base polimórfica. El código "r" de las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una guanina, mientras que el otro alelo es una adenina. El código "y" de las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una timina, mientras que el otro alelo es una citosina. El código "m" de las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una adenina, mientras que el otro alelo es una citosina. El código "k" de las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una guanina, mientras que el otro alelo es una timina. El código "s" de las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una guanina, mientras que el otro alelo es una citosina. El código "w" de las secuencias indica que un alelo de la base polimórfica es una adenina, mientras que el otro alelo es una timina. El código del nucleótido del alelo original para cada marcador bialélico es el siguiente:

Marcador bialélico	Alelo original
5-124-273	A (por ejemplo)

En algunos casos, las bases polimórficas de los marcadores bialélicos alteran la identidad de uno de los aminoácidos del polipéptido codificado. Esto se indica en el Listado de secuencias que acompaña por el uso de la VARIANTE característica, la colocación de un Xaa en la posición del aminoácido polimórfico y la definición de Xaa como los dos aminoácidos alternativos. Por ejemplo, si un alelo de un marcador bialélico es el codón CAC, que codifica histidina, mientras el otro alelo del marcador bialélico es CAA, que codifica glutamina, el listado de secuencias para el polipéptido codificado contendrá un Xaa en la localización del aminoácido polimórfico. En este caso, Xaa se definiría como histidina o glutamina.

En otros casos, Xaa puede indicar un aminoácido cuya identidad es desconocida debido a la ambigüedad de la secuencia nucleotídica. En este caso, se usa el rasgo UNSURE, la colocación de un Xaa en la posición del aminoácido desconocido y la definición de Xaa como cualquiera de los 20 aminoácidos o un número limitado de aminoácido sugeridos por el código genético.

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Descripción detallada

La suma de esquizofrenia y trastorno bipolar en familias, la evidencia de los estudios de gemelos y adopción y la carencia de variación de la incidencia mundial, indica que la esquizofrenia y el trastorno bipolar son ante todo afecciones genéticas, si bien los factores de riesgo ambientales también están implicados en cierto nivel como causas necesaria, suficiente o interactiva. Por ejemplo, la esquizofrenia se produce en el 1% de la población general. Pero, si hay un abuelo con esquizofrenia, el riesgo de contraer la enfermedad aumenta a aproximadamente el 3%; si existe un padre con esquizofrenia el riesgo aumenta a aproximadamente el 10%. Cuando ambos padres sufren esquizofrenia, el riesgo aumenta aproximadamente al 40%.

La identificación de los genes involucrados en un rasgo particular tal como un trastorno del sistema nervioso específico, como esquizofrenia, se puede llevara cabo mediante dos estrategias principales empleadas en la actualidad para le mapeo genético: análisis de unión y estudios de asociación. El análisis del ligación requiere el estudio de las familias con múltiples individuos afectados y es en la actualidad útil para la detección de rasgos heredados mono- u oligogénicos. A la inversa, los estudios de asociación examina la frecuencia de marcadores alélicos en individuos con rasgos no relacionados (T+) en comparación con controles con rasgos negativos (T-) y generalmente se emplean en la detección de herencia poligénica.

El enlace o "ligación" genético se basa en un análisis de cuál de dos secuencias vecinas de un cromosoma contiene las mínimas recombinaciones por cruza durante la meiosis. Para hacer esto, se han localizado con precisión marcadores cromosómicos, como los marcadores microsatélite, en el genoma. El análisis del ligación genético calcula las probabilidades de recombinaciones del gen blanco con los marcadores cromosómicos empleados, de acuerdo con el árbol genealógico, la transmisión de la enfermedad y la transmisión de los marcadores. De esta manera, si un alelo particular de un marcador dado se transmite con la enfermedad con más frecuencia que si fuera por azar (nivel de recombinación entre 0 y 0,5), es posible deducir que el gen blanco en cuestión se halla en la vecindad del marcador. Mediante esta técnica, ha sido posible localizar varios genes que demuestran una predisposición genética de los cánceres familiares. Con el fin de poderse incluir en un estudio de ligación genético, las familias afectadas por una forma hereditaria de la enfermedad debe satisfacer el criterio de "contenido de la información": varios sujetos afectados (y cuyo ADN constitucional está disponible) por generación, y en el mejor de los casos que tiene un gran número de hermanos.

Los resultados de los estudios de ligación avalaron la hipótesis de que el cromosoma 13 probablemente albergaba un locus de sensibilidad a la esquizofrenia en 13q32 (Blouin JL et al., 1998, Nature Genetics, 20:70-73; Lin MW et al., Hum. Genet., 99(3) (1997):417-420; Brzustowicz et al., Am. J. Hum. Genet. 65:1096-1103 (1999)). Sin embargo, mientras el análisis es un método poderoso para detectar genes involucrados en un rasgo, con frecuencia no es posible la resolución más allá del nivel de la megabase y con frecuencia se requieren estudios complementarios para refinar el análisis de las regiones inicialmente identificadas mediante este método.

Un cóntigo BAC que cubre una región genómica candidata del locus cromosómico 13q-31-q33 se construyó mediante los STS públicos localizados en la región q33 del cromosoma 13831 para seleccionar una genoteca BAC propietaria equivalente del genoma 7. A partir de estos materiales, se generaron nuevos STS que permiten la construcción de un mapa físico denso de la región de los Los BAC se evaluaron en tamaño y mapearon por hibridación cromosómica in situ para la verificación. Se identificó un conjunto mínimo de SACS y se secuenció completamente, lo cual produjo varios cóntigos que conducen a la construcción final de un cóntigo de más de 4 Mb. La construcción de este mapa condujo a la identificación del gen de CanIon que se localiza dentro de una región genómica que muestra una ligación significativa a la esquizofrenia.

La secuencia de aminoácidos de CanIon es característica de CACHANNEL, una huella genética de 7 elementos que proporciona un distintivo pata la subunidad Alfa-1 de los canales de calcio (Ref. PR00167, base de datos BLOCKs+). La huella digital derivada de un alineamiento inicial de 6 motivos de secuencias se trazaron de regiones conservadas del bucle capaces de distinguirse entre estos y otros canales de cationes; los motivos 1 y 2 codifican a los que están entre los segmentos de transmembrana 4 y 5, y 5 y 6 (primer repetición interna); el motivo 3 corresponde a entre el segmento 6 de la repetición 1 y el segmento 1 de la repetición 2; el motivo 4 codifica entre los segmentos 5 y 6 de la repetición 2; el motivo 5 corresponde entre el segmento 6 de la repetición 3 y el segmento 1 de la repetición 4; y los motivos 6 y 7 codifican a los que están entre los segmentos 4 y 5,y 5 y 6 de la repetición 4.

La Figura 1 muestra que los cóntigos de BAC cubren una región del cromosoma 13 de interés que incluye el gen CanIon, y muestra la localización genómica del gen CanIon en relación con los marcadores genéticos que muestran la mayor significación en los estudios de ligación. En particular, Blouin et al. (1998) realizó un barrido amplio del genoma de los locus de sensibilidad a esquizofrenia empleando 452 marcadores microsatélite de los linajes del complejo 54. El ligación más significativo entre la esquizofrenia familiar se halló en el cromosoma 13q32 cerca del marcador D13S174. Brzustowics et al. (1999) evaluaron los marcadores microsatélite que abarcan los cromosomas 8 y 13 en 21 familias canadienses extendidas. Los marcadores de la región 13q del cromosoma produjeron puntajes de LOD positivos en cada modelo de análisis usado: dominante autosómico y recesivo, con la definición restringida o amplia de esquizofrenia. Los máximos puntajes LOD de tres puntos se obtuvieron con le marcador D13S793 con un modelo recesivo amplio: 3.92 en la fracción recombinante (\theta).1 bajo homogeneidad y 4.42 con \alpha=.65 y \theta=0 bajo heterogeneidad. En referencia al Figura 1, el gen CanIon se localiza parcialmente en el cóntigo marcado "Región E" y parcialmente en el cóntigo marcado C0001A10. El gen CanIon está flanqueado por los dos marcadores que muestran mayor significación en los estudios de ligación. El marcador D13S174 está también en el cóntigo C0001A10, mientras que el marcador D13S793 está localizado aproximadamente 3,5 Mb en relación centromérica con el gen de
CanIon.

Existe una gran necesidad de identificar los genes involucrados en la esquizofrenia, trastorno bipolar y otras enfermedades y afecciones del SNC y cardiovascular. También hay necesidad de identificar nuevos canales iónicos involucrados en las enfermedades. Estos genes y proteínas pueden proporcionar nuevos puntos de intervención para el tratamiento de la esquizofrenia, trastorno bipolar u otras afecciones del SNC, además de otras afecciones tales como afecciones cardíacas e hipertensión, y permiten el estudio y caracterización adicional del gen de CanIon y su vía biológica relacionada. El conocimiento de estos genes y las vías biológicas relacionadas implicadas en estas enfermedades y afecciones permitirán a los investigadores comprender la etiología de por ej., esquizofrenia y trastorno bipolar y conducirán a los fármacos y medicaciones que se dirigen contra las causas de estas enfermedades. Por ejemplo, los compuestos que bloquean canales de CanIon se pueden usar para tratar cualquiera de varias enfermedades o afecciones, con preferencia esquizofrenia o trastorno bipolar y que también incluyen trastornos del dolor, epilepsia y diversos trastornos cardiovasculares tales como arritmias cardíacas, angina e hipertensión. Existe también gran necesidad para hallar nuevos métodos de detección de susceptibilidad a esquizofrenia, trastorno bipolar y otras afecciones, además de prevención o seguimiento del desarrollo de cualquiera de estas enfermedades. Los instrumentos diagnósticos también podrían demostrar ser extremadamente útiles. En efecto, para dar un ejemplo, la identificación precoz de sujetos con riesgo desarrollar esquizofrenia permitiría la administración del tratamiento precoz y/o profiláctico. Además, las mediciones precisas de la eficacia de un medicamento además de la tolerancia del paciente pueden permitir a los médicos mejorar la relación riesgo/beneficio de los regímenes de tratamiento de la esquizofrenia y trastorno bipolar.

La presente invención abarca los métodos de detección de moléculas por la capacidad de modular la expresión o actividad del gen o proteína del canal iónico, además de lo métodos de uso de tales moléculas para el tratamiento o prevención de la esquizofrenia, trastorno bipolar o alguna de varias enfermedades o afecciones diferentes. La invención también trata del uso de anticuerpo y dominios de unión del antígeno que se unen en forma específica a tales polipéptidos para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esquizofrenia y un trastorno bipolar.

La presente invención abarca el uso de una herramienta antisentido que inhibe la expresión del polipéptido canal iónico que comprende un fragmento del gen del canal iónico para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esquizofrenia o un trastorno bipolar.

La invención también trata de los marcadores bialélicos relacionados con el canal iónico y sus uso en métodos de análisis genético que incluye estudios de ligacións familiares, estudios de desequilibrio de conexión en estudios poblaciones y estudios de asociación en poblaciones de casos controles. Un aspecto importante de la presente invención es que los marcadores bialélicos permiten que se realicen estudios de asociación para identificar el papel de los genes involucrados en los rasgos complejos.

Definiciones

Antes de describir la invención con mayor detalle, se exponen las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y alcance de los términos usados para describir la invención en la presente memoria.

Los términos "gen CanIon", cuando se usa en la presente memoria, abarca secuencias genómicas, ARNm y ADNc que codifican la proteína de CanIon, que incluye las regiones regulatorias no traducidas del ADN genómico.

El término "proteína heteróloga", cuando se usa en la presente memoria, está destinado a designar alguna proteína o polipéptido diferente de la proteína de CanIon. Por ejemplo, la proteína heteróloga puede ser un compuesto que se puede usar como un marcador en experimentos adicionales con una región regulatoria de CanIon.

El término "aislado" requiere que el material sea retirado de su ambiente original (por ej., el ambiente natural si este se produce en forma natural). Por ejemplo, un polinucléotido o polipéptido que se produce naturalmente presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucelótido o ADN o polipéptido, separado de algunos todos los materiales coexistentes en los sistemas naturales, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucléotido o polipéptido podrían ser parte de una composición, y aún ser aislados debido a que el vector o composición no es parte de su ambiente natural.

Por ejemplo, un polinucléotido que se produce naturalmente presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucelótido, separado de algunos todos los materiales coexistentes en los sistemas naturales, está aislado. Específicamente excluidos de la definición de "aislado" son: cromosomas que se producen naturalmente (tales como extensiones de cromosomas), genotecas de cromosomas artificiales, genotecas genómicas y genotecas de ADNc que existen tanto como una preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación de célula hospedante transfectada/transformada, donde las células hospedantes son una preparación heterogénea in vitro o incubada como una población heterogénea de colonias únicas. También están específicamente excluidas, las genotecas anteriores donde un polinucleótido especificado se compone con menos de 5% de varios insertos de ácido nucleico de las moléculas del vector. También están específicamente excluidas el ADN genómico de la célula total o las preparaciones de ARN de la célula total (que incluyen dichas preparaciones de célula completa que están fragmentada mecánicamente o digeridas enzimáticamente). Además están específicamente excluidas las preparaciones de célula completa anteriores tanto en una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis (que incluyen transferencias de la misma) donde el polinucleótido de la invención no ha sido separado adicionalmente de los polinucléotidos heterólogos del medio de electroforesis (por ej., separación adicional por escisión de una calle única de una población de calles heterogéneas en un gel de agarosa o transferencia en nylon).

El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, se considera como una definición relativa. Esta expresamente contemplada la purificación del material de partida o material natural material en por lo menos un orden de magnitud, con preferencia dos o tres órdenes de magnitud y con más preferencia cuatro o cinco órdenes de magnitud. Como un ejemplo, la purificación de 0,1% de concentración a 10% de concentración es dos órdenes de magnitud. Para ilustrar, los clones de ADNc individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado convencionalmente por homogeneidad electroforética. Las secuencias obtenidas de estos clones no se podrían obtener directamente de la genoteca o de el ADN humano total. Los clones de ADNc no se producen en forma natural como tales, sino que mas buen se obtiene por manipulación de una sustancia que se produce en forma natural parcialmente purificada (ARN mensajero). La conversión de ARNm en una genoteca de ADNc implica la creación de una sustancia sintética (ADNc) y los clones individuales de ADNc se pueden aislar de la genoteca sintética por selección clonal. De este modo, se crea una genoteca de ADNc del ARN mensajero y posteriormente se aíslan clones individuales de esa genoteca que produce una purificación de aproximadamente 10^{4}-10^{6} veces del mensaje nativo.

El término "purificado" también se usa en la presente memoria para describir un polipéptido o polinucleótido de la invención que ha sido separado de los otros compuestos que incluyen, pero sin limitación, polipéptidos o polinucleótidos, carbohidratos, lípidos, etc. El término "purificado" se puede usar para especificar la separación de polipéptidos monoméricos de la invención de las formas oligoméricas tales como homo- o hetero dímeros, trímeros, etc. El término "purificado" también se puede usar para especificar la separación de may de polinucleótidos cerrados en forma covalente a partir de sus polinucleótidos lineales. Un polinucleótido es sustancialmente puro cuando por lo menos aproximadamente 50%, con preferencia 60 a 75% de una muestra presenta una secuencia y conformación del polinucleótido única (por ej., lineal versus covalentemente cerrado). Un polipéptido o polinucleótido sustancialmente puro comprende típicamente aproximadamente 50%, con preferencia 60 a 90% peso/peso de una muestra de polipéptido o polinucleótido, respectivamente, más usualmente aproximadamente 95%, y con preferencia es por encima de aproximadamente 99% puro. La pureza del polipéptido y polinucleótido, u homogeneidad, está indicada por varios medios bien conocidos en la técnica, tales como la electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida de una muestra, seguida por la visualización de una calle única después la tinción del gel. Para ciertos propósitos, una mayor resolución se puede proporcionar por medio de HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica. Como realización alternativa, la purificación de los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se puede expresar como "por lo menos" un porcentaje de pureza en relación con los polipéptidos y polinucleótidos heterólogos (ADN, ARN o ambos). Como realización preferida, los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención son por lo menos; 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99%, o 100% puro con respecto a los polipéptidos y polinucleótidos heterólogos, respectivamente. Como una realización adicional preferida los polipéptidos y polinucleótidos tiene una pureza que varía de cualquier número a la milésima posición, entre 90% y 100% (por ej., un polipéptido o polinucleótido por lo menos 99,995% puro) con respecto a los polipéptidos y polinucleótidos heterólogos, respectivamente, o como una proporción peso/peso en relación con todos los compuestos y moléculas diferentes que las que existen el vehículo. Cada número que representa un por ciento de pureza, hasta la milésima posición, puede ser reivindicado como una especie individual de pureza.

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos sin tomar en consideración la longitud del polímero; de este modo, los péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidas en la definición de polipéptido. Este término tampoco especifica o excluye las modificaciones pos-expresión de los polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos que incluyen la unión covalente de los grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos y similares estás expresamente comprendidos por el término polipéptido. También están incluidos en la definición los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos que no se producen naturalmente, aminoácidos que solo se producen naturalmente en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos modificados de sistemas mamíferos, etc.), polipéptidos con uniones sustituidas, además de otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto que se producen naturalmente como los que se no se producen naturalmente.

El término "polipéptido recombinante" se usa en la presente memoria para referirse a los polipéptidos que han sido diseñados artificialmente y que comprenden por lo menos dos secuencias polipeptídicas que no se hallan como secuencias polipeptídicas contiguas en su ambiente natural inicial o se refiere a los polipéptidos que han sido expresado a partir de un polinucleótido recombinante.

Como se usa en la presente memoria, el término "animal no humano" se refiere a cualquier vertebrado no humano, pájaros y más usualmente mamíferos, con preferencia primates, animales de granja tales como cerdos, cabras, ovejas, burros y caballos, conejos o roedores, con más preferencia ratas o ratones. Como se usa en la presente memoria, el término "animal" se usa para referirse a cualquier vertebrado, con preferencia un mamífero. Ambos términos "animal" y "mamífero" abarca expresamente sujetos humanos a menos que este precedida por el término "no humano".

Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que comprenden por lo menos un dominio de unión, donde un dominio de unión del anticuerpo está formado del plegado de dominios variables de una molécula de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensionales con una forma de superficie interna y distribución de carga complementaria con las características de un determinante antigénico de un antígeno, que permite una reacción inmunológica con el antígeno. Los anticuerpos incluyen proteínas recombinantes que comprenden los dominios de unión, además de los fragmentos, que incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab)_{2}, y F(ab')_{2}.

Como se usa en la presente memoria, un "determinante antigénico" es la porción de una molécula de antígeno, en este caso un polipéptido CanIon, que determina la especificidad de la reacción del antígeno anticuerpo. Un "epítope" se refiere a un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítope puede comprender solamente 3 aminoácidos en una conformación espacial que es única para el epítope. Generalmente un epítope comprende por lo menos 6 de tales aminoácidos, y más usualmente por lo menos 8-10 de tales aminoácidos. Los métodos para determinar los aminoácidos que componen un epítope incluyen la cristalografía de rayos x, resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones y mapeo de epítopes por ej. el método Pepscan descripto por Geysen et al. 1984; Publicación PCT No. WO 84103564; y Publicación PCT No. WO 84103506.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, la expresión "secuencia de nucleótidos" se puede empelar para designar en forma indistinta a un polinucleótido o un ácido nucleico. Más precisamente, la expresión "secuencia de nucleótidos" abarca el material nucleico en sí mismo y de este modo no está restringido a la información de la secuencia (es decir, la sucesión de letras elegidas entre las cuatro letras básicas) que caracterizan bioquímicamente una molécula de ADN o ARN específica.

Como se usan en forma indistinta en la presente memoria, los términos "ácidos nucleicos", "oligonucleótidos" y "polinucleótidos" incluyen las secuencias híbridas de ARN, ADN o ARN/ADN de un nucleótido forma de cadena simple o bicatenaria. El término "nucleótido" se usa en la presente memoria como un adjetivo para describir moléculas que comprenden secuencias híbridas de cualquier longitud de ARN, ADN o ARN/ADN de un nucleótido forma de cadena simple o bicatenaria. El término "nucleótido" también se usa en la presente memoria como un sustantivo para referirse a nucleótidos individuales o variedades de nucleótidos, que significan una molécula, o unidad individual en una molécula de ácido nucleico más grande, que comprende una purina o pirimidina, un residuos de azúcar ribosa o desoxirribosa y un grupo fosfato, o unión fosfodiéster en el caso de los nucleótidos dentro de un oligonucléotido o polinucleótido. Si bien el término "nucleótido" también se usa en la presente memoria para abarcar "nucleótidos modificados" que comprende por lo menos una de las siguientes modificaciones (a) un grupo de unión alternativo, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga de pirimidina, o (d) un azúcar análogo, para ejemplos de los grupos de unión análogos, purina, pirimidinas y azúcares, ver por ejemplo publicación PCT No. WO 95/04064. Las secuencias de polinucleótidos de la invención se pueden preparar por cualquier método conocido, que incluye métodos de síntesis, recombinantes, de generación ex vivo o una combinación de los mismos, además de la utilización de alguno de los métodos de purificación conocidos en la técnica.

Una secuencia que está "operativamente unida" a una secuencia regulatoria tal como un promotor significa que dicho elemento regulatorio está en la localización y orientación correcta en relación con el ácido nucleico para controlar la iniciación y expresión de ARN polimerasa del ácido nucleico de interés. Como se usa en la presente memoria, el término "operativamente unido" se refiere al unión de los elementos del polinucleótido en una relación funcional. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificadora si esta afecta la transcripción de la secuencia codificadora.

Los términos "rasgo" y "fenotipo" se usan en forma indistinta en la presente memoria y se refieren a cualquier propiedad visible, detectable o aparte de eso medible de un organismo tal como síntomas de o susceptibilidad a una enfermedad por ejemplo. Típicamente los términos "rasgo" o "fenotipo" se usan en la presente memoria para referirse a los síntomas de o susceptibilidad a una enfermedad, respuesta benéfica a o efectos secundarios a un tratamiento. Con preferencia, dicho rasgo puede ser, sin limitación, trastornos psiquiátricos tales como esquizofrenia o trastorno bipolar, otros trastornos del SNC o neuronales tal como epilepsia o trastornos del dolor, además de afecciones cardiovascular tales como anginas, hipertensión y arritmias, así también como cualquier aspecto, rasgo o características de alguna de estas enfermedades o afecciones.

El término "alelo" se usa en la presente memoria para referirse a las variantes de una secuencia de nucleótidos. Un polimorfismo bialélico tiene dos formas. Los organismos diploides pueden ser homócigos o heterócigos para una forma alélica.

El término "tasa de heterocigosidad" se usa en la presente memoria para referirse a la incidencia de los individuos en la población que son heterócigos en un alelo particular. En un sistema bialélico, la tasa de heterocigosidad es sobre un promedio igual a 2P_{a}(1-P_{a}), donde P_{a} es la frecuencia del alelo menos común. Con el fin de ser útil para los estudios genéticos, un marcador genético debería tener un nivel adecuado de heterocigosidad para permitir una probabilidad razonable de que una persona seleccionada al azar será heteróciga.

El término "genotipo" como se usa en la presente memoria se refiere ala identidad de los alelos presentes en un individuo o muestra. En el contexto de la presente invención, un genotipo con preferencia se refiere a la descripción de los alelos del marcador bialélico presente en un individuo o muestra, por ej., los alelos de los marcadores bialélicos dentro del gen CanIon o región genómica. El término "genotipificación" de una muestra o individuo para un marcador bialélico involucra determinar el alelo específico o el nucleótido específico portado por un individuo en el marcador bialélico.

El término "mutación" como se usa en la presente memoria se refiere a una diferencia en la secuencia de ADN entre diferentes genomas o individuos que tiene una frecuencia por debajo del 1%.

El término "haplotipo" se refiere a una combinación de alelos presentes en un individuo o muestra. En el contexto de la presente invención, un haplotipo con preferencia se refiere a una combinación de alelos del marcador bialélico hallados en un individuo dado y el cual se puede asociar con un fenotipo.

El término "polimorfismo" como se usa en la presente memoria se refiere a la presencia de dos o más secuencias genómicas o alelos alternativos entre dos o más genomas o individuos diferentes. "Polimórfico" se refiere a la afección en la que dos o más variantes de una secuencia genómica específica se pueden hallar en una población. Un "sitio polimórfico" es el locus en cual se produce la variación. Un polimorfismo de nucleótido único es el reemplazo de un nucleótido por otro nucleótido en el sitio polimórfico. La supresión de un nucleótido único o la inserción de un nucleótido único también originan polimorfismos de nucleótido único. En el contexto de la presente invención, el "polimorfismo de nucleótido único" con preferencia se refiere a una sustitución de nucleótido único. Típicamente, entre diferentes individuos, el sitio polimórfico puede ser ocupado por dos diferentes nucleótidos.

El término "polimorfismo bialélico" y "marcador bialélico" se usan en forma indistinta en la presente memoria para referirse a un polimorfismo de nucleótido único que tiene dos alelos en una frecuencia basta alta en la población. Un "alelo del marcador bialélico" se refiere a las variantes de nucleótidos presentes en un sitio del marcador bialélico. Típicamente, se ha convalidado la frecuencia del alelo menos común de los marcadores bialélicos de la presente invención que es mayor del 1%, con preferencia la frecuencia es mayor del 10%, con más preferencia la frecuencia es por lo menos del 20% (es decir, la tasa de heterocigosidad es de por lo menos 0,32), aun con más preferencia la frecuencia es por lo menos del 30% (es decir, la tasa de heterocigosidad es de por lo menos 0,42). Un marcador bialélico donde la frecuencia de los alelos menos comunes es del 30% o más se denomina "marcador bialélico de alta calidad".

La localización de nucleótidos en un polinucleótido con respecto al centro del polinucleótido se describen en la presente memoria de la siguiente manera Cuando un polinucleótido tiene un número impar de nucleótidos, se considera que el nucleótido a una distancia igual de los extremos 3' y 5' del polinucleótido está "en el centro" del polinucleótido, y cualquier nucleótido inmediatamente adyacente al nucleótido en el centro, o el nucleótido en el centro mismo se considera que está "dentro de 1 nucleótido del centro". Con un número impar de nucleótidos de un polinucleótido, se debería considerar que cualquiera de las cinco posiciones de nucleótidos del medio del polinucleótido está en los 2 nucleótidos del centro y similares. Cuando un polinucleótido tiene un número par de nucleótidos, debería haber un enlace y no un nucleótido en el centro del polinucleótido. De este modo, se debería considerar que cualquiera de los dos nucleótidos está "en 1 nucleótido del centro" y se debería considerar que cualquiera de los cuatro nucleótidos del medio del polinucleótido esta "en los 2 nucleótidos del centro" y etcétera. Para los polimorfismos que involucran la sustitución, inserción o supresión de 1 o más nucleótidos, el polimorfismo, marcador alélico o bialélico está "en el centro" de un polinucleótido si la diferencia entre la distancia de los polinucleótidos sustituidos, insertados o suprimidos del polimorfismo y el extremo 3' del polinucleótido y la distancia de los polinucleótidos sustituido, insertado o suprimido del polimorfismo y el extremo 5' del polinucleótido es cero o un nucleótido. Si esta diferencia es 0 a 3, entonces se considera que el polimorfismo está "en 1 nucleótido del centro". Si la diferencia es 0 a 5, se considera que el polimorfismo está "en 2 nucleótidos del centro". Si la diferencia es 0 a 7, se considera que el polimorfismo está "en 3 nucleótidos del centro" y etcétera.

El término "corriente arriba" se usa en la presente memoria para referirse a una localización que es hacia el extremo 5' del polinucleótido de un punto de referencia específica o en el caso de un gen, en la dirección que corre de la secuencia codificadora al promotor.

Los términos "con bases apareadas" y "con apareamiento de bases de Watson & Crick" se usan en forma indistinta en la presente memoria para referirse a los nucleótidos que se pueden unir por hidrógeno a otro en virtud de sus identidades de secuencia en una manera similar a la que se halló en ADN de doble hélice con residuos de timina o uracilo unidos a residuos de adenina por dos enlaces de hidrógeno y residuos de citosina y guanina unidos por tres enlaces de hidrógeno (ver Stryer, L., Biochemistry, 4t^{h} edición, 1995).

Los términos "complementario/a" o "complemento del mismo" se usan en la presente memoria para referirse a las secuencias de polinucleótidos que son capaces de formar un apareamiento de bases de Watson & Crick con otro polinucleótido especificado a lo largo de la totalidad de la región complementaria. Para el propósito de la presente invención, se estima que un primer polinucleótido es complementario con el segundo polinucleótido cuando cada base en el primer polinucleótido se aparea con su base complementaria. Las bases complementarias son, generalmente, A y T (o A y U), o C y G. "Complemento" se usa en la presente memoria como un sinónimo de "polinucleótido complementario", "ácido nucleico complementario" y "secuencia nucleotídica complementaria". Estos términos se aplican a pares de polinucleótidos basadas únicamente en sus secuencias y no en cualquier conjunto de condiciones bajo las cuales los dos polinucleótidos se unirían realmente.

Variantes y fragmentos 1- Polinucleótidos

Son adecuados para el uso en la presente invención las variantes y fragmentos de los polinucleótidos descriptos en la presente memoria, en particular de un gen de CanIon que contiene uno o más marcadores bialélicos.

Las variantes de los polinucleótidos, como el término usado en presente memoria, son los polinucleótidos que difieren de un polinucleótido de referencia. Una variante de un polinucleótido puede ser una variante que se produce naturalmente tal como una variante alélica que se produce naturalmente o puede ser una variante que no se sabe que se produce naturalmente. Tales variantes del polinucleótido que no se producen naturalmente se pueden preparar por técnicas de mutagénesis, que incluyen a las aplicadas a los polinucleótidos, células u organismos. Generalmente, las diferencias se limitan a que las secuencias de nucleótidos de la referencia y las variantes son muy similares globalmente y en muchas regiones idénticas.

Las variantes de los polinucleótidos adecuadas para el uso en la presente invención incluyen, pero sin limitación, secuencias de nucleótidos que son por lo menos 95% idénticas a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 4 o de cualquier fragmento de polinucleótido de por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 4, y con preferencia por lo menos 99% idéntica, más particularmente por lo menos 99,5% idéntica y con mayor preferencia por lo menos 99,8% idéntica a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 4 de cualquier fragmento de polinucleótido de por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 4.

Los cambios de nucleótidos presentes en una variante de polinucleótido puede ser silente, lo cual significa que no alteran los aminoácidos codificados por el polinucleótido. Sin embargo, los cambios de nucleótidos también pueden producir sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las sustituciones, supresiones o adiciones pueden involucrar uno o más nucleótidos. Se pueden alterar las variantes en las regiones codificadoras o no codificadoras o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, supresiones o adiciones conservadoras o no conservadoras de aminoácidos.

Las realizaciones particularmente preferidas adecuadas para usar en la presente invención son aquellas en las cuales los polinucleótidos codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que la proteína de CanIon madura o aquellas en las cuales los polinucleótidos codifican polipéptidos que mantienen o aumentan una actividad biológica particular, mientras se reduce una segunda actividad biológica.

Un fragmento de polinucleótido es un polinucleótido que tiene una secuencia que es completamente igual en parte pero no el total de una secuencia de nucleótido dada, con preferencia la secuencia de nucleótido de un gen de CanIon y variantes del mismo. El fragmento puede ser una porción de un intrón o un exón de un gen de CanIon. También puede ser una porción de las regiones regulatorias de CanIon. Con preferencia, tales fragmentos comprenden por lo menos uno de los marcadores bialélicos A1 a A17 o los complementos del mismo o un marcadores bialélico en desequilibrio de unión con uno o más de los marcadores bialélicos A1 a A17.

Tales fragmentos pueden estar "libres", es decir, no son parte o no están fusionados a otros polinucleótidos, o ellos pueden estar comprendidos dentro de un polinucleótido único más grande en el cual ellos forman una parte o región. En efecto, varios de estos fragmentos pueden estar presentes dentro de un polinucleótido único más grande.

Opcionalmente, tales fragmentos pueden consistir en o consistir esencialmente de un espacio contiguo de por lo menos 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos de longitud. Un conjunto de fragmentos preferidos contiene por lo menos uno de los marcadores bialélicos A1 a A17 del gen de CanIon que se describió en la presente memoria o los complementos del mismo.

2- Polipéptidos

Son adecuados para el uso en la presente invención variantes, fragmentos, análogos y derivados de los polipéptidos descriptos en la presente memoria, que incluyen las proteínas CanIon mutadas.

La variante puede ser 1) una en la cual uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado y tal residuo de aminoácido sustituido puedo o no puede estar codificado por el código genético, o 2) una en la cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente o 3) una en la cual el CanIon mutado está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o 4) una en la cual los aminoácidos adicionales está fusionados al CanIon mutado, tal como una secuencia líder o secretoria o una secuencia que se emplea para la purificación de CanIon mutado o una secuencia de proteína. Tales variantes están consideradas dentro del alcance de los expertos en la técnica.

Un fragmento de polipéptido es un polipéptido que tiene una secuencia que es completamente igual en parte pero no el total de un polipéptido dado, con preferencia un polipéptido codificado por el gen de CanIon y las variantes del mismo.

En el caso de una sustitución de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de acuerdo con la invención, uno o varios aminoácidos se pueden reemplazar por aminoácidos "equivalentes". La expresión aminoácido "equivalente" se usa en la presente memoria para designar a cualquier aminoácido que puede ser sustituido por uno de los aminoácidos que tienen propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos podría esperar que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanezca sustancialmente sin cambios. Generalmente, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios equivalentes: (I) Ala, Pro, Gli, Glu, Asp, Gin, Asn, Ser, Tr, (2) Cis, Ser, Tir, Tr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lis, Arg, His; (5) Phe, Tir, Trp, His.

Una realización especifica de una molécula modificada del péptido de CanIon de interés adecuada para el uso en la presente invención incluye, pero sin limitaciones, a una molécula de péptido que es resistente a la proteólisis, es un péptido en el cual el enlace péptido-CONH está modificado y reemplazado por un enlace reducido (CH2NH), un enlace retro inverso (NHCO), un enlace metilenoxi (CH2-O), un enlace tiometileno (CH2-S), una enlace carba (CH2CH2), un enlace cetometileno (CO-CH2), a un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2), un enlace (N-N) y un enlace E-alceno o también un enlace -CH=CH-. Para el uso en la presente invención es adecuado un polipéptido CanIon humano o un fragmento o una variante del mismo en la cual por lo menos un enlace peptídico que ha sido modificado como se describió anteriormente.

Tales fragmentos pueden estar "libres", es decir, es decir, no son parte o no están fusionados a otros polipéptidos o ellos pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido único más grande en el cual ellos forman una parte o región. Sin embargo, varios fragmentos pueden estar comprendidos en un polipéptido único más grande.

Como ejemplos representativos de los fragmentos de polipéptido adecuados para uso en la invención, se puede mencionar a los que tienen de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 o 10 a 15, 10 a 20, 15 a 40, o 30 a 55 aminoácidos de largo. Los fragmentos preferidos son los que contienen por lo menos una mutación de aminoácido en la proteína de CanIon.

Identidad entre ácidos nucleicos o polipéptidos

Los términos "porcentaje de identidad de secuencia" y "porcentaje de homología" se usan en forma indistinta en la presente memoria para referirse a las comparaciones entre polinucleótidos y polipéptidos, y se determinan por comparación de dos secuencia con alineamiento óptimo a través de una ventana de comparación, en la que una porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos de la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, brechas) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula por la determinación del número de posiciones en las que aparece el residuo idéntico de la base de ácido nucleico o aminoácido en ambas secuencias para producir el numero de posiciones apareadas, se divide el número de posiciones apareadas por le número total de posiciones de la ventana de comparación y se multiplica el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identidad de secuencia. La homología se evalúa mediante alguno de la variedad de algoritmos y programas de comparación de secuencia conocidos en la técnica. Tales algoritmos y programas incluyen, pero no implican una limitación a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (Pearson and Lipman, 1988; Altschul et al., 1990; Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996; Altschul et al., 1990; Altschul et al, 1993). En una realización particularmente preferida, las homologías de la secuencia de proteína y ácido nucleico se evalúan mediante la herramienta de búsqueda de alineamiento local de bases ("BLAST") que es bien conocido en la técnica (ver, por ej., Karlin and Altschul, 1990; Altschul et al., 1990, 1993, 1997). En particular, se emplean cinco programas BLAST específicos para realizar la siguiente tarea:

(1) BLASTP y BLASTS compara una secuencia de aminoácidos desconocida contra una secuencia de proteína de una base de datos;

(2) BLASTN compara una secuencia de nucleótido desconocida contra una secuencia de nucleótido de una base de datos;

(3) BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de nucleótido desconocida (ambas cadenas) contra una secuencia de proteína de una base de datos;

(4) TBLASTN compara una secuencia de proteína desconocida contra una secuencia de nucleótido de una base de datos traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas); y

(5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia de nucleótidos desconocida contra las traducciones de seis marcos de una secuencia de nucleótidos de una base de datos.

Los programas BLAST identifican secuencias homólogas por identificación de segmentos similares, que se mencionan en la presente memoria como "pares de segmentos de alto puntaje" entre una secuencia desconocida de aminoácidos o ácidos nucleicos y una secuencia de ensayo que se obtiene con preferencia de una secuencia de proteína o ácidos nucleicos de una base de datos. Los pares de segmentos de alto puntaje se identifican con preferencia (es decir, se alinean) por medio de matrices de puntaje, muchas de las cuales son conocidas en la técnica. Con preferencia, se usa la matriz de puntaje BLOSUM62 (Gannet et al., 1992; Henikoff and Henikoff, 1993). Con menor preferencia, se pueden usar PAM o PAM250 (ver, por ej., Schwartz and Dayhoff, eds., 1978). Los programas BLAST evalúan la significación estadística de todos los pares de segmentos de alto puntaje identificados y con preferencia selecciona los segmentos que satisfacen el umbral especificado por el usuario de significación, tal como un porcentaje de homología especificado por el usuario. Con preferencia, la significación estadística de un par de segmentos de alto puntaje se evalúa mediante la fórmula de significación estadística de Karlin (ver, por ej., Karlin y Altschul, 1990). Los programas BLAST se pueden usar con parámetros en defecto o con parámetros proporcionados por el usuario.

Condiciones rigurosas de hibridación

Con el propósito de definir tal hibridación de ácido nucleico, las condiciones de hibridación rigurosas son las siguientes:

El paso de hibridación se realiza a 65°C en presencia de buffer SSC 6 x, solución de Denhardt 5x, SDS 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón.

El paso de hibridación se continúa con cuatro pasos de lavado:

- dos lavados de 5 min, con preferencia a 65°C en SSC 2 x y buffer SDS 0,1% SDS;

- un lavado de 30 min, con preferencia a 65°C en SSC 2 x y buffer SDS 0,1%;

- un lavado de 10 min, con preferencia a 65°C en SSC 0,1 x y SDS 0,1%,

estas condiciones de hibridación son adecuadas para una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. No hay necesidad de decir que las condiciones de hibridación descriptas anteriormente se deben adaptar a la longitud del ácido nucleico deseado, siguiendo las técnicas bien conocidas por los expertos. Las condiciones de hibridación adecuadas se pueden adaptar. por ejemplo de acuerdo con las instrucciones descriptas en el libro de Hames y Higgins (1985).

Secuencias genómicas del gen CanIon

Es adecuado para el uso en la presente invención el gen CanIon o las secuencias genómicas de CanIon que consisten en esencialmente o comprenden la secuencia de las SEC ID Nos 1 a 3, una secuencia del mismo, además de los fragmentos y variantes de los mismos. Estos polinucleótidos puede ser purificados, aislados o recombinantes.

Es adecuado para el uso en la presente invención es un polinucleótido purificado, aislado o recombinante que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, o 95% de identidad de nucleótidos con una secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 3 o una secuencia complementaria de la misma o un fragmento de la misma. Las diferencias de nucleótidos en cuanto a la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 3 generalmente se puede distribuir al azar en todo el ácido nucleico entero. Sin embargo, los ácidos nucleicos preferidos son aquellos en los que la diferencia de nucleótidos en cuanto a la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 3 se localizan predominantemente fuera de las secuencias codificadoras contenidas en los exones. Estos ácidos nucleicos, además de sus fragmentos y variantes, se pueden usar como cebadores o sondas de oligonucleótidos para detectar la presencia de una copia del gen de CanIon en una muestra de ensayo o alternativamente para amplificar una secuencia de nucleótidos blanco dentro de las secuencias de CanIon.

Es adecuado para el uso en la presente invención un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante se hibridiza con la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 3 o una secuencia complementaria de la misma o un fragmento de la misma, en las condiciones de hibridización rigurosas como se definió anteriormente. En realizaciones preferidas, dicho ácido nucleico purificado, aislado o recombinante se hibridiza específicamente con los polinucleótidos del gen de CanIon humano, con más preferencia dicho ácido nucleico es capaz de hibridizar a los nucleótidos del gen de CanIon humano pero es sustancialmente incapaz de hibridizar con una secuencia de ácido nucleico del gen de CanIon de rata.

Los ácidos nucleicos particularmente preferidos adecuado para el uso en la presente invención incluyen polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o 10000 nucleótidos de las SEC ID No 1 a 3 o los complementos de la misma. Se debe advertir que los fragmentos de ácido nucleico de cualquier tamaño y secuencias también pueden estar comprendidos por los polinucleótidos descriptos en esta sección.

El ácido nucleico genómico de CanIon comprende 44 exones. Las posiciones del exón en las SEC ID No 1 a 3 se detallan a continuación en la

TABLA B

1

2

De este modo, son adecuados para el uso en la invención los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los 44 exones del gen de CanIon y cada una de las secuencias complementarias de las mismas. La invención también proporciona ácidos nucleicos purificados, aislados o recombinantes que comprenden una combinación de por lo menos dos exones del gen de CanIon, donde los polinucleótidos se disponen dentro del ácido nucleico del extremo 5' al extremo 3' de dicho ácido nucleico, en el mismo orden que en la SEC ID No 1 a 3.

El intrón 1 se refiere a la secuencia de nucleótidos localizada entre el Exón 1 y Exón 2, etcétera. La posición de los intrones se detalla en la Tabla A. De este modo, son adecuados para el uso en la invención los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los 43 intrones del gen CanIon o una secuencia complementaria de la misma.

Si bien esta sección se titula "secuencias genómicas de CanIon" se debe advertir que los fragmentos de ácido nucleico de cualquier tamaño y secuencias también pueden estar comprendidos por los polinucleótidos descriptos en esta sección, flanqueando las secuencias genómicas de CanIon en otro lado o entre dos o más de tales secuencias genómicas.

Secuencias de ADNc de CanIon

Se ha demostrado que la expresión del gen de CanIon conduce a la producción de por lo menos una especie de ARNm, cuya secuencia de ácidos nucleicos se expone en la SEC ID No 4.

Es adecuado para el uso en la presente invención un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID No 4, secuencias complementarias de las mismas, además de variantes alélicas y fragmentos de las mismas. Además los polinucleótidos preferidos de la invención incluyen los ADNc de CanIon purificados, aislados o recombinantes que consisten en, consisten esencialmente en o comprenden la secuencia de la SEC ID No 4. Los ácidos nucleicos particularmente preferidos de la invención incluyen polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o 6000 nucleótidos de la SEC ID No 4 o los complementos de las mismas. En realizaciones preferidas, dicho espacio contiguo comprende un marcador bialélico relacionado con CanIon; con preferencia seleccionado del grupo que consiste en A12 y A16.

Es adecuado para el uso en la presente invención un ácido nucleico purificado o aislado que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 95% de identidad de nucleótidos con un polinucleótido de la SEC ID No 4, ventajosamente 99% de identidad de nucleótido, con preferencia 99,5% de identidad de nucleótidos y con mayor con preferencia 99,8% de identidad de nucleótidos con un polinucleótido de la SEC ID No 4, o una secuencia complementaria de la misma o un fragmento biológicamente activo de la misma.

Son adecuados para el uso en la presente invención los ácidos nucleicos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un polinucleótido que hibridiza en condiciones de hibridación rigurosas definidas en la presente memoria, con un polinucleótido de la SEC ID No 4, o una secuencia complementaria de la misma, o una variante de la misma o un fragmento biológicamente activo de la misma.

Son adecuados para el uso en la presente invención un polinucleótido purificado, aislado o recombinante que codifica un polipéptido de CanIon que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos SEC ID No 5, en que dicho espacio contiguo incluye por lo menos 1, 2, 3, 5 o 10 de las posiciones de aminoácidos 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 de la SEC ID No 5. También es adecuado para el uso en la presente invención un polinucleótido purificado, aislado o recombinante que codifica un polipéptido de CanIon que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5, o derivados o fragmentos biológicamente activos de la misma, además de un polinucleótido purificado, aislado o recombinante que codifica un polipéptido de CanIon por lo menos 80, 85, 90, 95, 98, 99, 99,5 o 99,8% idéntico a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5.

El ADNc de la SEC ID No 4 incluye una región 5'-UTR que comienza en el nucleótido de la posición 1 y finaliza en el nucleótido de la posición 65 de la SEC ID No 4. El ADNc de la SEC ID No ADNc incluye una región 3'-UTR que comienza en el nucleótido de la posición 5283 y finaliza en el nucleótido de la posición 6799 de la SEC ID No 4.

Por consiguiente, es adecuado para el uso en la presente invención un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos de la 5'UTR del ADNc de CanIon, una secuencia complementaria de la misma o una variante alélica de la misma. También es adecuado para el uso en la presente invención un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos de la 3'UTR del ADNC de CanIon, una secuencia complementaria de la misma o una variante alélica de la misma.

Si bien esta sección se titula "secuencias de ADNc de CanIon" se debe advertir que los fragmentos de ácido nucleico de cualquier tamaño y secuencias también pueden estar comprendidos por los polinucleótidos descriptos en esta sección, flanqueando las secuencias genómicas de CanIon en otro lado o entre dos o más de tales secuencias genómicas.

Regiones codificadoras

El marco de lectura abierto del gen CanIon está contenido en el correspondiente ARNm de la SEC ID No ADNc. Más precisamente, la secuencia codificadora de CanIon (CDS) efectiva incluye la región entre la posición 66 (primer nucleótido de codón ATG)y la posición del nucleótido 5282 (nucleótido final del codón TGA) de la SEC ID No 4. La presente invención también abarca polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que codifican polipéptidos que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, con preferencia por lo menos 8 o 10 aminoácidos, con más preferencia por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 o 1000 aminoácidos de la SEC ID No 5.

El polinucleótido descripto anteriormente que contiene la región codificadora del gen de CanIon se puede expresar en una célula hospedante deseada o un organismo hospedador deseado, cuando este polinucleótido se coloca bajo el control de las señales de expresión adecuadas. las señales de expresión pueden ser las señales de expresión contenidas en las regiones regulatorias del gen de CanIon de la invención o en contraste las señales pueden ser secuencias nucleicas regulatorias exógenas. Tal polinucleótido, cuando se coloca bajo las señales de expresión adecuada, también se pueden insertar en un vector para su expresión y/o amplificación.

Secuencias regulatorias de CanIon

Como se mencionó, la secuencia genómica del gen de CanIon contiene secuencias regulatorias tanto en la región flanqueante no codificadora 5' y la región flanqueante no codificadora 3' que limita la región codificadora de CanIon que contiene los 44 exones de este gen.

Los polinucleótidos derivados de las regiones regulatorias 5' y 3' son útiles para detectar la presencia de por lo menos una copia de una secuencia de nucleótidos de CanIon o un fragmento de la misma en una muestra de ensayo.

La actividad promotora de las regiones regulatorias 5' contenidas en CanIon se puede evaluar como se describe a continuación. Para identificar los fragmentos de polinucleótido biológicamente activos relevantes o las variantes de la SEC ID No 1, un experto en la técnica se puede referir a Sambrook et al. (1989) que describe el uso de un vector recombinante que porta un gen marcador (es decir, beta galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, etc.), cuya expresión se puede detectar cuando se lo coloca bajo el control fragmentos de polinucleótido biológicamente activos o variantes de la SEC ID No 1. La secuencias genómicas localizadas corriente arriba del primer exón del gen de CanIon se clonan en un vector indicador promotor adecuado, tal como los vectores pSEAP-Basic, pSEAP-potenciador, p(3gal-Basic, p(Sgal-potenciador o indicador promotor pEGFP-1 disponibles en Clontech, o pGL2-basic o pGL3-basic o vector del gen indicador de luciferasa menos promotor de Promega. Brevemente, cada uno de estos vectores indicadores promotores incluyen sitios de clonación ubicados corriente arriba de un gen indicador que codifica una proteína que se puede ensayar fácilmente tal como fosfatasa alcalina secretada, luciferasa, \beta-galactosidasa, o proteína verde fluorescente. Las secuencias corriente arriba de la región codificadora de CanIon se insertan en los sitios de clonación corriente arriba del gen indicador en ambas orientaciones y se introduce en una célula hospedante apropiada. Se ensaya el nivel de la proteína indicadora y se compara con el nivel obtenido de un vector que carece de un inserto para el sitio de clonación. La presencia de un nivel de expresión elevada e en el vector que contiene el inserto en comparación con el nivel del vector control indica la presencia de un promotor en inserto. Si es necesario, las secuencias corriente arriba se pueden clonar en vectores que contienen un potenciador para aumentar los niveles de transcripción de las secuencias promotoras débiles. Un nivel de expresión importante mencionado que se observa con el vector que carece de un inserto indica que una secuencia del promotor está presente la secuencia insertada corriente arriba.

La secuencia promotora dentro del ADN genómico corriente arriba se puede definir adicionalmente por la construcción de supresiones 5' y/o 3' anidadas en el ADN corriente arriba usando técnicas convencionales tales como Exonucleasa III o digestión con endonucleasa de restricción apropiada. Los fragmentos de supresión resultante se pueden insertar en el vector indicador promotor para determinar si la supresión ha reducido u obliterado la actividad del promotor, tal como describió, por ejemplo, Coles et al. (1998). De esta manera, los límites de los promotores se pueden definir si se desea, los potenciales sitios regulatorios individuales dentro del promotor se puede identificar mediante mutagénesis dirigida al sitio o barrido del ligador para obliterar los sitios de unión al factor de transcripción potencial dentro del promotor en forma individual o en combinación. Los efectos de estas mutaciones en los niveles de transcripción se pueden determinar por la inserción de las mutaciones en los sitios de clonación en vectores indicadores promotores. Este tipo de ensayo es bien conocido por los expertos en la técnica y se describe en WO 97/17359, Patente Estadounidense No. 5.374.544; EP 582.796; Patente Estadounidense No. 5.698.389; US 5.643.746; Patente Estadounidense No. 5.502.176; y Patente Estadounidense 5.266.488.

La potencia y especificidad del promotor del gen de CanIon se puede evaluar mediante la expresión de los niveles de un polinucleótido detectable operativamente unido al promotor de CanIon en tipos diferentes tipos de células y tejidos. El polinucleótido detectable puede ser un polinucleótido que se hibridiza específicamente con una sonda de oligonucleótido predefinida o un polinucleótido que codifica una proteína detectable, que incluye un polipéptido de CanIon o un fragmento o una variante de la misma Este tipo de ensayo es bien conocido por los expertos en la técnica y se describe en la Patente Estadounidense No. 5.502.176; y la Patente Estadounidense No. 5.266.488. Alguno de los métodos se discuten con más detalle más adelante.

Los polinucleótidos que portan los elementos regulatorios localizados en el extremo 5' y en el extremo 3' de la región codificadora de CanIon se puede usar ventajosamente para controlar la actividad transcripcional y traduccional de un polinucleótido heterólogo de interés.

De este modo, es adecuado para el uso en la presente invención un ácido nucleico purificado o aislado que comprende un polinucleótido que se selecciona de un grupo que consiste en las regiones regulatorias 5' y 3' o una secuencia complementaria de la misma o un fragmento biológicamente activo o una variante de la misma. En realizaciones preferidas, la región regulatoria "5" se localiza en la secuencia de nucleótidos localizada entre las posiciones 1 y 2000 de la SEC ID No 1. La "región regulatoria" "3" se localiza en la secuencia de nucleótidos ubicada entre las posiciones 45842 y 47841 de la SEC ID No 3.

Es adecuado para el uso en la presente invención un ácido nucleico purificado o aislado que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 95% de identidad de nucleótidos con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las regiones regulatorias 5' y 3', ventajosamente 99% de identidad de nucleótido, con preferencia 99,5% de identidad de nucleótidos y con mayor preferencia 99,8% de identidad de nucleótidos con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las regiones regulatorias 5' y 3' o una secuencia complementaria de la misma o una variante o un fragmento biológicamente activo de la misma.

Es adecuado para el uso en la presente invención un ácido nucleico purificado o aislado que comprende un polinucleótido que hibridiza, en las condiciones de hibridación rigurosas definida en la presente memoria, con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de las regiones regulatorias 5'- y 3' o una secuencia complementaria de la misma o una variante de la misma o un fragmento biológicamente activo de la misma.

Los fragmentos preferidos de la región regulatoria 5' tiene una longitud de aproximadamente 1500 o 1000 nucleótidos, con preferencia de aproximadamente 500 nucleótidos, con más preferencia aproximadamente 400 nucleótidos, aun con más con preferencia 300 nucleótidos y con mayor preferencia aproximadamente 200 nucleótidos.

Los fragmentos preferidos de la región regulatoria 3' tienen por lo menos 50, 100, 150, 200, 300 o 400 bases de longitud.

Los derivados de polinucleótido "biológicamente activos" de las SEC ID Nos 1 y 3 son los polinucleótidos que comprenden o alternativamente consisten en un fragmento de dicho polinucleótido que es funcional como una región regulatoria para la expresión de un polipéptido recombinante o un polinucleótido recombinante en una célula hospedante recombinante. Este podría actuar como un potenciador o un represor.

Para el propósito de la invención, un ácido nucleico o polinucleótido es "funcional" como una región regulatoria para la expresión de un polipéptido recombinante o polinucleótido recombinante si dicha polinucleótido regulatorio contiene las secuencias de nucleótidos que contienen información regulatoria transcripcional y traduccional, y tales secuencias están "operativamente unidas" a secuencias de nucleótidos que codifican al polipéptido deseado o el polinucleótido deseado.

Los polinucleótidos regulatorios adecuados para usar en la invención se pueden preparar a partir de la secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 y 3 por escisión mediante enzimas de restricción adecuadas como se describe por ejemplo en el libro de Sambrook et al. (1989). Los polinucleótidos regulatorios se pueden preparar por digestión de las SEC ID Nos 1 y 3 por una enzima endonucleasa, tal como Ba131 (Wabiko et al, 1996). Estos polinucleótidos regulatorios también se pueden preparar por síntesis química como se describe en otra parte de la memoria descriptiva.

Los polinucleótidos regulatorios adecuados para usar en la invención puede ser parte de un vector de expresión recombinante que se puede usar para expresar una secuencia codificadora en una célula hospedante u organismo hospedador deseados. Los vectores de expresión recombinante de acuerdo con la invención se describen en otra parte de la memoria descriptiva.

Un polinucleótido regulatorio 5' adecuado para usar en la invención preferido incluye la región 5' no traducida (5'-UTR) del ADNc de CanIon o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma.

Un polinucleótido regulatorio 3' adecuado para usar en la invención preferido incluye la región no traducida 3' (3'-UTR) del ADNc de CanIon o o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma.

Un objeto adicional de la invención consiste en un ácido nucleico purificado o aislado que comprende:

a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos regulatoria seleccionada del grupo que consiste en:

(i): una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido de la región regulatoria 5' o una secuencia complementaria de la misma;

(ii): una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 95% de identidad de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la región regulatoria 5' o una secuencia complementaria de la misma;

(iii): una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido que hibridiza en condiciones de hibridación rigurosas con la secuencia de nucleótidos de la región regulatoria 5' o una secuencia complementaria de la misma; y

(iv): un fragmento biológicamente activo o una variante de los polinucleótidos en (i), (ii) y (iii);

b) un polinucleótido que codifica un polipéptido deseado o un ácido nucleico de interés, operativamente unido al ácido nucleico definido anteriormente (a);

c) opcionalmente, un ácido nucleico que comprende un polinucleótido regulatorio 3', con preferencia polinucleótido regulatorio 3' del gen de CanIon.

En una realización específica del ácido nucleico definido anteriormente, dicho ácido nucleico incluye la región no traducida 5' (5'-UTR) del ADNc del gen de CanIon o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma.

En una segunda realización específica del ácido nucleico definido anteriormente, dicho ácido nucleico incluye la región no traducida 3' (3'-UTR) del ADNc de CanIon o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma.

El polinucleótido de la región regulatoria 5' o sus fragmentos o variantes biológicamente activos, está operativamente unido al extremo 5 del polinucleótido que codifica el polipéptido o polinucleótido deseado.

El polinucleótido de la región regulatoria 3' o sus fragmentos o variantes biológicamente activos está ventajosamente operativamente unida en el extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido o polinucleótido deseado.

El polipéptido deseado codificado por el ácido nucleico anteriormente descripto puede ser de naturaleza u origen diverso, que abarca proteínas de origen procariota o eucariota. Entre los polipéptidos expresados bajo control de una región regulatoria CanIon incluye antígenos bacterianos, fúngicos o virales. También están abarcadas las proteínas eucariotas tales como proteínas intracelulares, como proteínas tipo "constitutivas", proteínas unidas a membranas, tipo receptores y proteínas secretadas como mediadores endógenos tales como las citoquinas. El polipéptido deseado puede ser la proteína de CanIon, especialmente la proteína de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5, o un fragmento o una variante de la misma.

Los ácidos nucleicos deseados codificados por el polinucleótido anteriormente descripto, usualmente una molécula de ARN, pueden ser complementarios al polinucleótido codificador deseado, por ejemplo para la secuencia codificadora de CanIon y de este modo útil como un polinucleótido antisentido.

Tal polinucleótido se puede incluir en un vector de expresión recombinante para expresar el polipéptido deseado o el ácido nucleico deseado en la célula hospedante o en el organismo hospedador. Los vectores recombinantes adecuados que contienen un polinucleótido tal como se describe en la presente memoria se revelan en otra parte de la memoria descriptiva.

Construcciones de polinucleótidos

Los términos "construcción de polinucleótidos" y "polinucleótido recombinante" se usan en forma indistinta en la presente memoria para referirse a polinucleótidos lineales o circulares, purificados o aislados que han sido diseñados en forma artificial y que comprenden por lo menos dos secuencias de nucleótidos que no se hallan como secuencias de nucleótidos contiguas en su ambientes natural inicial.

Construcción de ADN que permite dirigir la expresión temporal u espacial del gen de CanIonen células hospedantes recombinantes y en animales transgénicos

Con el fin de estudiar las consecuencias fisiológicas y fenotípicas de la carencia de síntesis de la proteína de CanIon, tanto a nivel celular como a nivel de organismos multicelulares, la invención también abarca construcciones de ADN y vectores recombinantes que permiten una expresión condicional de un alelo específico de la secuencia genómica o ADNc de CanIon y también una copia de esta secuencia genómica o ADNc que alberga sustituciones, supresiones o adiciones de una o más bases en cuanto a la secuencia de nucleótidos de CanIon de las SEC ID Nos 1 a 4, o un fragmento de la misma, estas sustituciones, supresiones o adiciones de bases se localizan tanto en un exón, un intrón o una secuencia regulatoria, pero con preferencia en la secuencia regulatoria 5' o en un exón de la secuencia genómica de CanIon o dentro del ADNc de CanIon de la SEC ID No 4. En una realización preferida, la secuencia de CanIon comprende un marcador bialélico adecuado para usar en la presente invención. En una realización preferida, la secuencia de CanIon comprende un marcador bialélico adecuado para usar en la presente invención, con preferencia uno de los marcadores bialélicos es A1 a A17.

Son adecuados para usar en la invención los vectores recombinantes que comprenden a alguno de los polinucleótidos descriptos en la presente invención. Más particularmente, las construcciones de polinucleótidos de acuerdo con la presente invención pueden comprender a alguno de los polinucleótidos descriptos en sección "Secuencias genómicas del gen de CanIon", la sección "Secuencias de ADNc de CanIon", la sección "Regiones codificadoras" y la sección "Sondas y cebadores de oligonucleótidos".

Una primera construcción de ADN preferida se basa en el operón tet de resistencia a tetraciclina proveniente de transposón de E. coli Tn10 para controlar la expresión del gen de CanIon, tal como fue descripto por Gossen et al. (1992, 1995) y Furth et al. (1994). Tal construcción de ADN contiene siete secuencias del operador tet de Tn10 (tetop) que está fusionados tanto a un promotor mínimo o una secuencia regulatoria 5' del gen de CanIon, dicho promotor mínimo o dicha secuencia regulatoria de CanIon está operativamente unida a un polinucleótido de interés que codifica tanto a un oligonucleótido homosentido como antisentido o forma un polipéptido, que incluye un polipéptido de CanIon o fragmento del péptido del mismo. Esta construcción de ADN es funcional como un sistema de expresión condicional para la secuencia de nucleótidos de interés cuando la misma célula también comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el represor tipo salvaje (tTA) o el mutante (rTA) fusionado al dominio de activación de la proteína viral VP16 del virus del herpes simplex, colocado bajo el control de un promotor, tal como el potenciador/promotor HCMVIE1 o el MMTV-LTR. En efecto, una construcción de ADN preferida de la invención comprende tanto el polinucleótido que contiene las secuencias del operador tet y como el polinucleótido que contiene la secuencia codificadora para el represor tTA o rTA.

En una realización específica, la construcción de ADN de expresión condicional contiene la secuencia que codifica el represor de tetraciclina mutante rTA, la expresión del polinucleótido de interés es silente en ausencia de tetraciclina y se induce en su presencia.

Construcciones de ADN que permiten la recombinación homóloga: Vectores de reemplazo

Una segunda construcción de ADN preferida comprenderá del extremo 5' al extremo 3': (a) una primer secuencia de nucleótidos que está comprendida en la secuencia genómica de CanIon; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende un marcador selectivo positivo, tal como el marcador para resistencia a neomicina (neo); y (c) una segunda secuencia de nucleótidos que está comprendida en la secuencia genómica de CanIon y se localiza en el genoma corriente abajo de la primer secuencia de nucleótidos de CanIon (a).

En una realización preferida, esta construcción de ADN también comprende un marcador selectivo negativo localizado corriente arriba de la secuencia de nucleótidos (a) o corriente abajo de la secuencia de nucleótidos (c). Con preferencia, el marcador selectivo negativo comprende el gen de la timidina quinasa (tk) (Thomas et al., 1986), el gen de la higromicina beta (Te Miele et al., 1990), el gen hprt gene (Van der Lugt et al., 1991; Reid et al., 1990) o el gen del fragmento de la toxina A de Difteria (Dt-A) (Nada et al., 1993; Yagi et al. 1990). Con preferencia, el marcador de selección positivo se localiza dentro de la secuencia del exón CanIon de modo de interrumpir la secuencia codificadora de la proteína de CanIon. Estos vectores de reemplazo se describen, por ejemplo, en Thomas et al. (1986; 1987), Mansour et al. (1988) y Koller et al. (1992).

La primera y segunda secuencias de nucleótidos (a) y (c) se puede localizar en forma indiferente dentro de una secuencia regulatoria de CanIon, una secuencia intrónica, una secuencia del exón o una secuencia que contiene secuencias regulatorias y/o secuencias intrónicas y/o del exón. El tamaño de las secuencias de nucleótidos (a) y (c) varía de 1 a 50 kb, con preferencia de 1 a 10 kb, con más preferencia de 2 a 6 kb y con mayor preferencia de 2 a 4 kb.

Construcciones de ADN que permiten la recombinación homóloga: Sistema Cre-LoxP

Estas nuevas construcciones de ADN emplean el sistema de recombinación de sitio específico del fago P1. El fago P1 posee una recombinasa llamada Cre que interactúa específicamente con un sitio loxP de 34 pares de bases. El sitio loxP está compuesto de dos secuencias palindrómicas de 13 pb separadas por una secuencia conservada de 8 pb (Hoess et al., 1986). La recombinación con la enzima Cre entre los dos sitios loxP que presentan una orientación idéntica conduce a la supresión del fragmento de ADN.

El sistema Cre-loxP empleado en combinación con una técnica de recombinación homóloga ha sido descripto por Gu et al. (1993, 1994). En breves palabras, una secuencia de nucleótidos de interés se inserta en una localización específica del genoma que alberga por lo menos dos sitios IoxP en la misma orientación y se localiza en sus respectivos extremos de una secuencia de nucleótidos para escindirla del genoma recombinante. El evento de escisión requiere la presencia de la enzima recombinasa (Cre) dentro del núcleo de la célula hospedante recombinante. La enzima recombinasa se puede poner en el momento deseado por (a) incubación de las células hospedantes recombinantes en un medio de cultivo que contiene esta enzima por medio dela inyección de la enzima Cre directamente en la célula deseada, tal como fue descripto por Araki et al. (1995), o por lipofección del enzima en las células, tal como fue descripto por Baubonis et al. (1993); (b) transfección de la célula hospedante con un vector que comprende la secuencia codificadora de Cre operativamente unida a un promotor funcional de la célula hospedante recombinante, tal promotor es opcionalmente inducible, dicho vector se introduce en la célula hospedante recombinante, tal como fue descripto por Gu et al. (1993) y Sauer et al. (1988); (c) introducción en el genoma de la célula hospedante de un polinucleótido que comprende la secuencia codificadora Cre operativamente unida a un promotor funcional de la célula hospedante recombinante, tal promotor es opcionalmente inducible y dicho polinucleótido se inserta en el genoma de la célula hospedante por un evento de inserción al azar o un evento de recombinación homóloga, tal como fue descripto por Gu et al. (1994).

En una realización específica, el vector que contiene la secuencia que se insertará en el gen de CanIon por recombinación homóloga se construye de una manera tal que los marcadores seleccionables son flanqueados por los sitios IoxP de igual orientación, es posible, por medio del tratamiento con la enzima Cre, eliminar los marcadores seleccionables mientras se dejan las secuencias de CanIon de interés que han sido insertadas por un evento de recombinación homóloga. Otra vez, se necesitan marcadores seleccionables: un marcador de selección positivo para seleccionar el evento de recombinación y un marcador de selección negativo para seleccionar el evento de recombinación homólogo. Los vectores y métodos que usan el sistema Cre-loxP se describen en Zou et al. (1994).

De este modo, una tercera construcción de ADN adecuada para usar en la invención comprende, del extremo 5' al extremo 3': (a) una primer secuencia de nucleótidos que está comprendida en la secuencia genómica de CanIon; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido que codifica un marcador de selección positivo, dicha secuencia de nucleótidos comprende adicionalmente dos secuencias que define un sitio reconocido por una recombinasa, tal como un sitio IoxP, los dos sitios se colocan en la misma orientación; y (c) una segunda secuencia de nucleótidos que está comprendida en la secuencia genómica de CanIon y está localizada en el genoma corriente abajo de la primer secuencia de nucleótidos de CanIon (a).

Las secuencias que definen un sitio reconocido por una recombinasa, tal como el sitio loxP, están con preferencia localizadas dentro de la secuencia de nucleótidos (b) en condiciones adecuadas rodeando la secuencia de nucleótidos para los cuales se busca la escisión condicional. En una realización específica, los dos sitios loxP se localizan a cada lado de la secuencia del marcador de selección positiva, con el fin de permitir su escisión en un momento deseado después de que se ha producido el evento de recombinación homóloga.

En una realización preferida de un método que emplea la tercer construcción de ADN descripta anteriormente, la escisión del fragmento del polinucleótido rodeado por los dos sitios reconocidos por una recombinasa, con preferencia los dos sitios loxP, se realiza en el momento deseado, debido a la presencia dentro del genoma de la célula hospedante recombinante de una secuencia codificadora de la enzima Cre operativamente unida a una secuencia promotora, con preferencia un promotor inducible, con más preferencia una secuencia de un promotor específico de tejido y con mayor preferencia una secuencia promotora que es tanto inducible como específica de tejido, tal como fue descripto por Gu et al. (1994).

La presencia de la enzima Cre dentro del genoma de la célula hospedante recombinante puede resultar de la cruza de dos animales transgénicos, el primer animal transgénico que porta la secuencia derivada de CanIon de interés que contiene los sitios loxP se describió anteriormente y el segundo animal transgénico que porta la secuencia codificadora de Cre operativamente unida a una secuencia de promotor adecuada, tal como fue descripto por Gu et al. (1994).

El control espacio-temporal de la expresión de la enzima Cre también se puede lograr con un vector basado en adenovirus que contiene el gen Cre, de este modo se permite la infección de las células o infección in vivo de órganos, para la administración de la enzima Cre, tal como fue descripto por Anton y Graham (1995) y Kanegae et al. (1995).

Las construcciones de ADN descriptas anteriormente se pueden usar para introducir una secuencia de nucleótidos deseada adecuada para el uso de la invención, con preferencia una secuencia genómica de CanIon o una secuencia de ADNc de CanIon y con mayor preferencia de una copia alterada de una secuencia genómica de CanIon o una secuencia de ADNc, dentro de una localización predeterminada de un genoma específico, que conduce tanto a la generación de una copia alterada de un gen específico (recombinación homóloga knockout) como al reemplazo de una copia del gen específico por otra copia suficientemente homóloga para permitir que se produzca el evento de recombinación homologa (recombinación homóloga knockout). En una realización específica, las construcciones de ADN descriptas anteriormente se pueden usar para introducir una secuencia genómica de CanIon o una secuencia de ADNc de CanIon que comprende por lo menos un marcador bialélico adecuado para usar en la presente invención, con preferencia por lo menos un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1 a A17.

Construcciones de ADN antisentido nucleares

Otras composiciones que contienen un vector de la invención que comprenden un fragmento de oligonucleótido de la secuencia de ácido nucleico SEC ID No 4, con preferencia un fragmento que incluye el codón de iniciación del gen de CanIon, como una herramienta antisentido que inhibe la expresión del correspondiente gen de CanIon. Los métodos preferidos que usan polinucleótidos antisentido adecuados para el uso en la presente invención son los procedimientos descriptos por Sczakiel et al. (1995) o los descriptos en la solicitud de PCT No WO 95/24223.

Con preferencia, las herramientas antisentido se eligen entre los polinucleótidos (15-200 pb de largo) que son complementarios al extremo 5' del ARNm de CanIon. En una realización, se usan combinaciones de polinucleótidos antisentido diferentes complementarios con partes diferentes del gen seleccionado deseado.

Los polinucleótidos antisentido preferidos adecuados para el uso en la presente invención son complementarios con una secuencia de los ARNm de CanIon que contiene tanto el codón de iniciación de traducción ATG o un sitio de empalme. Además los polinucleótidos antisentido preferidos de acuerdo con la invención son complementarios del sitio de empalme del ARNm de CanIon.

Con preferencia, los polinucleótidos antisentido adecuado para el uso en la invención tienen una señal de poliadenilación 3' que ha sido reemplazado con una secuencia de ribozima de auto-escisión, para que los transcriptos de ARN polimerasa II se produzcan sin poli(A) en sus extremos 3', estos los polinucleótidos antisentido son incapaces de exportarse del núcleos, tal como fue descripto por Liu et al. (1994). En una realización preferida, estos los polinucleótidos antisentido de CanIon también comprenden, dentro del casete de la ribozima, una estructura en forma de horquilla de la histona para estabilizar transcriptos escindidos contra la degradación exonucleolítica 3'-5', tal como la estructura descriptas por Eckner et al. (1991).

Sondas y cebadores oliqonucleotídicos

Los polinucleótidos derivados del gen de CanIon son útiles para detectar la presencia de por lo menos una copia de una secuencia de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 4 y 6, o un fragmento, complemento, o variante de la misma de una muestra de ensayo.

Las sondas y cebadores particularmente preferidas adecuadas para el uso en la invención incluyen a los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 o 20000 nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 3 o los complementos de la misma. Además las sondas y cebadores preferidos adecuados para el uso en la invención incluyen a los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes, donde dicho espacio contiguo comprende un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1a A17.

Adecuado para usar en la invención es un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID No 4, secuencia complementaria de la misma, además las variantes alélicas, y fragmentos de la misma. Además, las sondas y cebadores preferidas adecuadas para el uso en la invención incluyen a los ADNc de CanIon purificado, aislado o recombinante que consisten en, consisten esencialmente en o comprenden la secuencia de la SEC ID No 4. Las sondas y cebadores particularmente preferidos de la invención incluyen a los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o 6000 nucleótidos de la SEC ID No 4 o los complementos de la misma. Además las sondas y cebadores preferidas adecuadas para usar en la invención incluyen a los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o 6000 nucleótidos de la SEC ID No 4 o los complementos de la misma, donde dicho espacio contiguo comprende un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A12 a A16.

En realizaciones adicionales, las sondas y cebadores adecuadas para usar en la invención incluyen a los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 o 400 nucleótidos de la SEC ID No 6 o los complementos de la misma. En realizaciones preferidas, dicho espacio contiguo de la SEC ID No 6 comprende un marcador bialélico A18.

De este modo, la invención también se refiere a sondas de ácido nucleico caracterizadas porque se hibridizan específicamente, en condiciones de hibridación rigurosas definidas anteriormente con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de CanIon humanas de las SEC ID Nos 1 a 3, o una variante de la misma o una secuencia complementaria de la misma.

En una realización adecuada para usar en la invención están los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que consisten en, consisten esencialmente en un espacio contiguo de 8 a 50 nucleótidos de cualquiera de las SEC ID Nos 1 a 4 y 6, el complemento de la misma, donde dicho espacio contiguo incluye un marcador bialélico relacionado con CanIon en dicha secuencia; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos de los mismos u opcionalmente los marcadores bialélicos de desequilibrio de unión del mismo. Opcionalmente, donde dicho espacio contiguo tiene de 18 a 35 nucleótidos de longitud y dicho marcador bialélico está dentro de los 4 nucleótidos del centro de dicho polinucleótido; opcionalmente, donde dicho polinucleótido consiste en dicho espacio contiguo es de 25 nucleótidos de largo y dicho marcador bialélico está en el centro del polinucleótido; opcionalmente, donde el extremo 3' de dicho espacio contiguo está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido; y opcionalmente, donde el extremo 3' de dicho espacio contiguo está localizado en el extremo 3' de dicho polinucleótido y dicho marcador bialélico está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido. En una realización preferida, dichas sondas comprenden, consisten o consisten esencialmente de una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: P1 a P18 y las secuencias complementarias de la misma.

En otra realización adecuada para usar en la invención están los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden, consisten en, consisten esencialmente en un espacio contiguo de 8 a 50 nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 4, o los complementos de las mismas, donde el extremo 3' de dicho espacio contiguo se ubica en el extremo 3' de dicho polinucleótido, y donde el extremo 3' de dicho polinucleótido se localiza en los 20 nucleótidos corriente arriba de un marcador bialélico relacionado con CanIon de dicha secuencia, opcionalmente donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos de los mismos, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de unión de los mismos; opcionalmente, donde el extremo 3' de dicho polinucleótido se localiza 1 nucleótido corriente arriba de un marcador bialélico relacionado con CanIon de dicha secuencia y opcionalmente, donde dicho polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: D1 a D18 y E1 a E18.

En una realización adicional, son adecuados para usar en la invención los polinucleótidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden, consisten en o consisten esencialmente de una secuencia seleccionada de las siguientes secuencias: B1 a B17 y C1 a C17.

En una realización adicional, son adecuado para usar en la invención los polinucleótidos para uso en ensayos de hibridación, ensayos de secuenciación y ensayos de detección de errores de apareamientos basados en enzimas para determinar la identidad del nucleótido de un marcador bialélico relacionado con CanIon de las SEC ID Nos 1 a 4 y 6, o los complementos de la misma, además de los polinucleótidos para usar en la amplificación de los segmentos de los nucleótidos que comprende un marcador bialélico relacionado con CanIon de las SEC ID Nos 1 a 4 y 6, o los complementos de la misma; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de unión con el mismo.

Esta invención se refiere al uso de los polinucleótidos adecuados para usar en la invención para determinar la identidad del nucleótido de un marcador bialélico relacionado con CanIon, con preferencia en ensayo de hibridación, ensayo de secuenciación, ensayo de microsecuenciación, o un ensayo de detección de errores de apareamientos basado en enzimas y en la amplificación de segmentos de nucleótidos que comprenden un marcador bialélico relacionado con CanIon.

Una sonda o cebador adecuado para usar en la invención tiene entre 8 y 1000 nucleótidos de longitud o se especifica que es de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos de longitud. Más particularmente, la longitud de estas sondas y cebadores pueden variar de 8, 10, 15, 20, o 30 a 100 nucleótidos, con preferencia de 10 a 50, con más preferencia de 15 a 30 nucleótidos. Los cebadores y sondas más cortas tienden a carecer de especificidad para una secuencia de ácido nucleico seleccionada y generalmente requiere temperaturas más frías para formar complejos híbridos con el molde suficientemente estables. Los cebadores y sondas más largos son costosos para producir y algunas veces auto-hibridizar para formar estructuras de horquilla. La longitud apropiada para los cebadores y sondas en un conjunto particular de condiciones de ensayo puede ser determinada empíricamente por un experto en la técnica. Una sonda o cebador preferido consiste en un ácido nucleico que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo de secuencias de nucleótidos de P1 a P18 y la secuencia complementaria del mismo, B1 a B 17, C1 a C17, D1 a D18, E1 a E18, para las cuales se proporcionan las localizaciones respectivas en el listado de secuencia en las Tablas 1, 2, y 3.

La formación de los híbridos más estables depende de la temperatura de fusión (Tm) del ADN. La Tm depende de la longitud del cebador o sonda, la fuerza iónica de la solución y el contenido de G+C. A mayor contenido de G+C del cebador o sonda, mayor es la temperatura de fusión ya que los pares G:C se toman por tres enlaces H mientras que los pares A:T tienen solo dos. El contenido de GC de las sondas de la invención usualmente varía entre 10 y 75%, con preferencia entre 35 y 60%, y con más preferencia entre 40 y 55%.

Los cebadores y sondas se pueden preparar por cualquier método, que incluyen, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias apropiadas y dirigen la síntesis química por un método tal como el método fosfodiéster de Narang et al. (1979), el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979), el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) y el método de soporte sólido descripto en EP 0 707 592.

Las sondas de detección son generalmente secuencias de ácido nucleico o análogos de ácido nucleico descargados tales como, por ejemplo ácido nucleicos peptídicos que están descriptos en solicitud de Patente internacional WO 92/20702, análogos de morfolina que se describen las Patentes Estadounidenses numeradas 5.185.444; 5.034.506 y 5.142.047. La sonda se puede haber vuelto "no extendible" o sea que no se pueden agregar dNTP adicionales a la sonda. Los análogos ya de por sí usualmente son no extendibles y las sondas de ácido nucleico se pueden volver no extendibles por la modificación del extremo 3' de la sonda de manera que el grupo hidroxilo ya no sea capaz de participar en la elongación. Por ejemplo, el extremo 3' de la sonda puede funcionar con la captura o detección de la marca para de este modo consumir o por otra parte bloquear el grupo hidroxilo. Alternativamente, el grupo hidroxilo 3' simplemente se puede escindir, reemplazar o modificar, la solicitud de Patente Estadounidense Serie No. 07/049,061 presentada el 19 de abril de 1993 describe las modificaciones, que se pueden usar para convertir a una sonda en no extendible.

Alguno de los polinucleótidos adecuados para el uso en la presente invención se pueden marcar, si se desea, por la incorporación de cualquiera de las marcas conocidas en la técnica que son detectables por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, las marcas útiles incluyen sustancias radiactivas (que incluyen ^{32}P, ^{25}S, ^{3}H, ^{125}1), colorantes fluorescentes (que incluyen 5-bromodesoxiuridina, fluoresceína, acetilaminofluoreno, digoxigenina) o biotina. Con preferencia, los polinucleótidos se marcan en sus extremos 3' y 5'. Los ejemplos de marcado no radiactivo de los fragmentos de ácido nucleico se describen en la patente francesa No. FR-7810975 o en Urdea et al. (1988) o Sanchez-Pescador et al. (1988). Además, las sondas de acuerdo con la presente invención pueden tener características estructurales tales que les permitan la amplificación de la señal, tales características estructurales son, por ejemplo, sondas de ADN ramificado como las descriptas por Urdea et al. (1991) o en la patente Europea No. EP 0 225 807 (Chiron).

Un marcador también se puede usar para capturar el cebador, con el fin de facilitar la inmovilización del cebador o de un producto de extensión del cebador, tal como ADN amplificado, en un soporte sólido. Un marcador de captura se une a los cebadores o sondas y puede ser un miembro de unión específica que forma un par de unión con el miembro de unión específica con los reactivos de fase sólida (por ej. biotina y estreptavidina). En consecuencia, de acuerdo con el tipo de marcador transportado por un polinucleótido o una sonda, se puede emplear para capturar o detectar el ADN específico. Además, se debe entender que los polinucleótidos, cebadores o sondas proporcionados en la presente memoria pueden por sí mismos, actuar como marcador de captura. Por ejemplo, en el caso de que el miembro de unión con los reactivos de fase sólida sea una secuencia de ácido nucleico, ésta se puede seleccionar de manera tal que se una a una porción complementaria de un cebador o sonda para de este modo, inmovilizar el cebador o sonda en la fase sólida. En los casos en los que una sonda de polinucleótido actúa por sí misma como miembro de unión, los expertos en la técnica reconocerán que la sonda contendrá una secuencia o "cola'" que no sea complementaria con el blanco. En el caso donde un cebador polinucleotídico sirva por sí mismo como marcador de captura, por lo menos una porción del cebador estará libre de hibridizar con un ácido nucleico en la fase sólida. Las técnicas de marcación de ADN son bien conocidas por el técnico experto.

Las sondas adecuadas para el uso en la presente invención son útiles para varios propósitos. Ellas se pueden usar notablemente en hibridación Southern del ADN genómico. También se pueden usar para detectar productos de amplificación de PCR. También se pueden usar para detectar errores de apareamiento en el gen o ARNm de CanIon mediante otras técnicas. También se pueden usar para detectar expresión de un gen de CanIon, por ej. en una transferencia Northern.

Algunos de los polinucleótidos, cebadores y sondas adecuados para el uso en la presente invención se pueden inmovilizar en forma conveniente en un soporte sólido. Los soportes sólidos son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen las paredes de los pocillos de una cubeta de reacción, tubos de ensayo, microesferas de poliestireno, microesferas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de látex, eritrocitos de oveja (u otro animal), duracites y otros. El soporte sólido no es crítico y puede ser seleccionado por un experto en la técnica. De este modo, las partículas de látex, micropartículas, microesferas magnéticas o no magnéticas, membranas, tubos plásticos, paredes de los pocillos de microtitulación, chips de silicona o vidrio, eritrocitos de oveja (u otros de animales adecuados) y duracytes® son ejemplos adecuados. Los métodos adecuados para inmovilizar ácidos nucleicos en fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes y similares. Un soporte sólido, como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier material que es insoluble, o se puede volver insoluble por una reacción posterior. El soporte sólido se puede elegir para su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo de captura. Alternativamente, la fase sólida puede retener un receptor adicional que tiene capacidad para atraer e inmovilizar el reactivo de captura. El receptor adicional puede incluir una sustancia cargada que está cargada en forma opuesta con respecto al reactivo de captura mismo o una sustancia cargada conjugada al reactivo de captura. Como otra realización alternativa, la molécula del receptor puede ser de un miembro de unión específica que está inmovilizado sobre (unido a) el soporte sólido y que tiene la capacidad de inmovilizar al reactivo de captura mediante una reacción de unión específica. La molécula del receptor permite la unión directa del reactivo de captura a un material de soporte sólido antes de la realización del ensayo o durante la realización del ensayo. La fase sólida, en consecuencia, puede ser, un plástico, derivado de plástico, metal magnético no magnético, superficie de vidrio o silicona de un tubo de ensayo, pocillo de microtitulación, lámina, microesfera, micropartícula, chip, eritrocito de oveja (o de otro animal adecuado), duracytes® y otras configuraciones conocidas por los que tienen experiencia en la técnica. Los polinucleótidos de la invención se puede unir a o inmovilizarse en un soporte sólido en forma individual o en grupo de por lo menos 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20, o 25 polinucleótidos distintos de la invención a un soporte sólido único. Además, los polinucleótidos diferentes de los adecuados para usar en la invención se pueden unir al mismo soporte como uno o más polinucleótidos adecuados para usar en la invención.

Por consiguiente, un método adecuado para usar en la invención es un método para detectar la presencia de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo que consiste en las SEC ID Nos 1 a 4 y 6, un fragmento o variante de la misma una secuencia complementaria de la misma de una muestra, dicho método que comprende los siguientes pasos de:

a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico o una pluralidad de las sondas de ácido nucleico que pueden hibridizar con una secuencia de nucleótidos incluidas en una forma de ácido nucleico seleccionada seleccionado del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 4 y 6, un fragmento o una variante de la misma y una secuencia complementaria de la misma y la muestra se ensaya y b) detectar el complejo del híbrido formado entre la sonda y un ácido nucleico de la muestra. Es adecuado para usar en la invención un kit para detectar la presencia de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo que consiste en las SEC ID Nos 1 a 4 y 6, un fragmento o variante de la misma y una secuencia complementaria de la misma en una muestra, dicho kit comprende:

a) una sonda de ácido nucleico o una pluralidad de sondas de ácido nucleico que pueden hibridizar con una secuencia de nucleótidos incluida en una forma de ácido nucleico seleccionada que consiste en las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nos 1 a 4 y 6, un fragmento o variante del mismo y una secuencia complementaria de la misma; y

b) opcionalmente, los reactivos necesarios para realizar la reacción de hibridación.

En una primera realización preferida de este método y kit de detección, dicha sonda de ácido nucleico o la pluralidad de sondas de ácido nucleico se marcan con una molécula detectable. En una segunda realización preferida de dicho método y kit, dicha sonda de ácido nucleico o la pluralidad de sondas de ácido nucleico han sido inmovilizadas en un sustrato. En una tercera realización preferida, sonda de ácido nucleico o la pluralidad de sondas de ácido nucleico comprenden una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de P1 a P16 y la secuencia complementaria de la misma, B1 a B17, C1 a C17, D1 a D18, E1 a E18 o un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1 a A18 y los complementos del mismo.

Matrices de oligonucleótidos

Un sustrato que comprende una pluralidad de cebadores o sondas oligonucleotídicos de la invención se puede usar para detectar o amplificar las secuencias seleccionadas del gen de CanIon y también se puede usar para detectar mutaciones de las secuencias codificadoras o no codificadoras del gen de CanIon.

Cualquiera de los polinucleótidos proporcionados en la presente memoria se puede unir en áreas superpuestas o en localizaciones al azar sobre el soporte sólido. Alternativamente los polinucleótidos adecuado para usar en la invención se pueden unir en una matriz ordenada donde cada polinucleótido se une a una región distinta del soporte sólido que no se superpone con el sitio de unión de cualquier otro polinucleótido. Con preferencia, tal matriz ordenada de polinucleótidos se diseña para ser "dirigible" en la que se registran las distintas ubicaciones y a las que se puede acceder como parte de un procedimiento de ensayo. Las matrices de polinucleótidos dirigidas típicamente comprenden una pluralidad de sondas de oligonucleótidos diferentes que se acoplan a una superficie de un sustrato en distintas ubicaciones conocidas. El conocimiento de la ubicación exacta de cada polinucleótido convierte a estas matrices "dirigibles" en particularmente útiles para los ensayos de hibridación. Cualquier tecnología de matrices conocidos en la técnica se puede emplear con los polinucleótidos de la invención. Una realización particular de las matrices de polinucleótidos se conoce como Genechips^{TM}, y se ha descripto generalmente en la Patente Estadounidense 5.143.854; publicaciones PCT WO 90/15070 y 92110092. Estas matrices se pueden producir generalmente mediante métodos de síntesis mecánicos o métodos de síntesis dirigidos por la luz que incorporan una combinación de métodos fotolitográficos y síntesis de oligonucleótidos en fase sólida (Fodor et al., 1991). Las matrices de inmovilización de los oligonucleótidos en soporte sólido se han vuelto posibles debido al desarrollo de una tecnología identificada generalmente como "Síntesis de polímeros inmovilizados en gran escala" (VISIPS^{TM}) en la cual, típicamente, las sondas se inmovilizan en una matriz de muy alta densidad sobre una superficie sólida de un chip. Los ejemplos de tecnologías VLSIPS^{TM}' se proporcionan en las Patentes estadounidenses 5.143.854; y 5.412.087 y en las publicaciones PCT WO 90/15070, WO 92/10092 y WO 95/11995, las que describen los métodos para formar matrices de oligonucleótidos mediante técnicas tales como técnicas de síntesis dirigidas por la luz. Para el diseño de estrategias dirigidas a la provisión de matrices de nucleótidos inmovilizados en soportes sólidos, se desarrollaron estrategias se presentación adicionales para ordenar y desplegar las matrices de oligonucleótidos en los chip en un esfuerzo para maximizar los patrones de hibridación y la información de secuencia. Los ejemplos de tales estrategias se presentación se describen en las Publicaciones PCT WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 y WO 97/31256.

En otra realización de las matrices de oligonucleótidos adecuadas para usar en la invención, se puede usar en forma ventajosa una matriz de sonda de oligonucleótido para detectar las mutaciones que se producen en el gen de CanIon y con preferencia en su región regulatoria. Para este propósito particular, se diseñan específicamente sondas que tengan una secuencia de nucleótidos que permita su hibridación con los genes que portan mutaciones conocidas (tanto por supresión, inserción o sustitución de uno o varios nucleótidos). Por mutaciones conocidas, se entiende a las mutaciones del gen de CanIon que han sido identificadas de acuerdo con, por ejemplo, la técnica usada por Huang et al. (1998) o Samson et al. (1996).

Otra técnica que se usa para detectar mutaciones en el gen de CanIon es el uso de una matriz de ADN de alta densidad. Cada sonda de oligonucleótido que constituye un elemento unitario de la matriz de ADN de alta densidad está diseñada para combinarse con una subsecuencia específica del ADN o ADNc de CanIon. De esta manera, una matriz que consiste en oligonucleótidos complementarios con las subsecuencias de la secuencia del gen blanco se usa para determinar la identidad de la secuencia blanco con la secuencia del gen salvaje, medir su proporción y detectar diferencias entre la secuencia blanco y la secuencia del gen salvaje de referencia del gen de CanIon. En tal diseño, denominado matriz en capas 4L está implementado un conjunto de cuatro sondas (A, C, G, T), con preferencia oligómeros de 15 nucleótidos. En cada conjunto de cuatro sondas, el complemento perfecto hibridizará más intensamente que las ondas mal apareadas. Por consiguiente, se barre un ácido nucleico blanco de longitud L para buscar mutaciones con una matriz en capas que contiene sondas 4L, el conjunto total de sondas que contiene todas las mutaciones posibles de la secuencia de referencia salvaje. Las señales de hibridación de la de la matriz sonda en capas del conjunto de las sondas 15-mer se alteran por un cambio de bases único de la secuencia blanco. Como consecuencia, hay una pérdida característica de señal o una "huella genética" para las sondas que flanquean una posición de mutación. Esta técnica fue descripta por Chee et al. (1996).

Por consiguiente, es adecuado para usar en la invención una matriz de moléculas de ácido nucleico que comprenden por lo menos un polinucleótido descripto anteriormente como sondas y cebadores. Con preferencia es adecuado para usar en la invención una matriz de ácido nucleicos que comprende por lo menos dos polinucleótidos descriptos anteriormente como sondas y cebadores.

Adecuado para usar en la invención es una matriz de secuencias de ácido nucleico que comprenden por lo menos una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en P1 a P18, B1 a B17, C1 a C17, D1 a D18, E1 a E18, las secuencias complementarias de las mismas, un fragmento de la misma de por lo menos 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, o 40 nucleótidos consecutivos del mismo y por lo menos una secuencia que comprende un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1 a A18 y los complementos del mismo.

Adecuado para usar en la invención es una matriz de secuencias de ácido nucleico que comprenden por lo menos dos de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en P1 a P18, B1 a B17, C1 a C17, D1 a D18, E1 a E18, las secuencias complementarias de las mismas, un fragmento de la misma de por lo menos 8 nucleótidos consecutivos del mismo y por lo menos dos secuencias que comprenden un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1 a A18 y los complementos del mismo.

Proteínas y fragmentos del polipéptido de CanIon

El término "polipéptidos de CanIon" se usa en la presente memoria para abarcar todas las proteínas y polipéptidos de la presente invención. También son adecuados para usar en la invención los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención, además de péptidos de fusión que comprenden tales polipéptidos. La invención comprende las proteínas de CanIon de humanos, que incluyen proteínas de CanIon aisladas o purificados que consisten en, consiste esencialmente en o comprende la secuencia de la SEC ID No 5.

Es adecuado para usar en la invención el polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID No 1 a 4 y 6, una secuencia complementaria de la misma o un fragmento del mismo.

Son adecuados para usar en la invención los polipéptidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, con preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, con más preferencia por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 o 1700 aminoácidos de la SEC ID No 5. En otras realizaciones preferidas la extensión contigua de aminoácidos comprende el sitio de una mutación o mutación funcional, que incluye una supresión, adición, intercambio o truncamiento de aminoácidos de la secuencia de la proteína de CanIon. En realizaciones preferidas, son adecuados para usar en la invención los polipéptidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, con preferencia por lo menos s 8 a 10 aminoácidos, con más preferencia por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 o 1700 aminoácidos de la SEC ID No 5, donde dicho espacio contiguo incluye por lo menos 1, 2, 3, 5 o 10 de las posiciones de aminoácidos 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 de la SEC ID No 5. Con preferencia, donde dicho espacio contiguo de la SEC ID No 5 comprende un residuo de alanina de la posición 277; una serina de la posición 338; una valina de la posición 574; una leucina de la posición 678; una serina de la posición 680; una treonina de la posición 683; una histidina de la posición 691; una serina de la posición 692; una serina de la posición 695; una alanina de la posición 696; una isoleucina de la posición 697; una isoleucina de la posición 894; una lisina de la posición 1480; una arginina de la posición 1481; una glicina de la posición 1483; una valina de la posición 1484; una isoleucina de la posición 1485; una asparagina de la posición 1630; una serina de la posición 1631; una metionina de la posición 1632; una treonina de la posición 1636; una alanina de la posición 1660; una fenilalanina de la posición 1667; una treonina de la posición 1707; y/o una alanina de la posición 1709. También se proporciona los polinucleótidos que codifican estos polipéptidos.

Son adecuados para usar en la invención los polipéptidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5 o un fragmento del mismo.

Las proteínas de CanIon con preferencia se aíslan de muestras de tejido humanas o de mamífero o se expresan a partir de genes humanos o de mamíferos. Los polipéptidos de CanIon adecuados para usar en la invención se pueden realizar mediante métodos de expresión de rutina conocidos en la técnica. El polinucleótido que codifica el polipéptido deseado, se liga en un vector de expresión adecuado para cualquier huésped conveniente. Tantos los sistemas hospedantes eucariotas como procariotas se usan para formar polipéptidos recombinantes y un resumen de algunos de los sistemas más comunes. El polipéptido luego se aísla de las células lisadas o del medio de cultivo y se purifica hasta el punto que se necesita para el uso al que esta destinado. La purificación es por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, extracción diferencial, fraccionamiento con sales, cromatografía, centrifugación y similares. Ver, por ejemplo, Métodos de Enzimología por una variedad de métodos para purificar proteínas.

Además, los fragmentos de proteínas más cortos se producen por síntesis química. Alternativamente las proteínas de la invención se extraen de las células o tejidos de seres humanos o animales no humanos. Los métodos para purificar proteínas son conocidos en la técnica e incluyen el uso de detergentes o agentes caotrópicos para alterar partículas seguidas por extracción diferencial y separación de los polipéptidos por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, sedimentación de acuerdo con la densidad y electroforesis en gel.

Cualquier ADNc de CanIon, que incluyen la SEC ID No 4, se puede usar para expresar proteínas y polipéptidos de CanIon. El ácido nucleico que codifica la proteína o polipéptido de CanIon expresada está operativamente unido a un promotor en un vector de expresión empleando tecnología de clonación convencional. El inserto de CanIon en el vector de expresión vector puede comprender la secuencia codificadora completa para la proteína de CanIon o una porción de la misma.

El vector de expresión es alguno de los sistemas de expresión de los mamíferos, levaduras, insecto o bacteria conocidos en la técnica. Los vectores y sistemas de expresión que se comercializan están disponibles de una variedad de proveedores que incluyen Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin), e Invitrogen (San Diego, California). Si se deseara, para aumentar la expresión y facilitar el plegado apropiado de la proteína, el contexto del codón y el apareamiento codónico de la secuencia se optimiza para el organismo de expresión particular en el cual se introduce el vector de expresión, como se explica en Hatfield, et al., Patente Estadounidense No. 5.082.767.

En una realización, la secuencia codificadora completa del ADNc de CanIon a través de la señal poliA del ADNc está operativamente unida a un promotor del vector de expresión. Alternativamente, si el ácido nucleico que codifica una porción de la proteína de CanIon carece de una metionina para actuar como sitio de iniciación, se puede introducir una metionina iniciadora próxima al primer codón del ácido nucleico mediante técnicas convencionales. De forma similar, si el inserto del ADNc de CanIon carece de una señal poliA, se puede agregar esta secuencia a la construcción, por ejemplo, por empalme de la señal poliA de pSG5 (Stratagene) mediante enzimas de restricción de las endonucleasa EglI y SalI e incorporación de este en el vector de expresión de mamífero pXT1 (Stratagene). El pXT1 contiene los LTR y una porción de l gen gag del virus de leucemia murina Moloney. La posición de los LTR de la construcción permite una eficiente transfección. El vector incluye el promotor timidina quinasa de herpes simplex y el gen seleccionable de neomicina. El ácido nucleico que codifica una proteína de CanIon o una porción de la misma se obtiene por PCR de un vector bacteriano que contiene el ADNc de CanIon de la SEC ID No 5 mediante cebadores de oligonucleótidos complementarios al ADNc de CanIon o una porción de la misma y que contiene secuencias de endonucleasas de restricción para PstI incorporado en el cebador 5' y BglII en el extremo 5' del correspondiente cebador 3' de ADNc, teniendo cuidado para asegurar que la secuencia que codifica la proteína de CanIon o una porción de la misma se ubica correctamente con respecto a la señal de poliA. El fragmento purificado obtenido de la reacción de PCR resultante se digiere con PstI, se corta en forma roma con una exonucleasa, se digiere con BglII, purifica y liga a pXTI, que ahora contiene una señal de poliA y se digiere con BglII.

El producto ligado se puede transfectar en células de ratón NIH 3T3 mediante Lipofectin (Life Technologies, Inc., Grand Island, New York) en las condiciones descriptas en la especificación del producto. Los transfectantes positivos se seleccionan después del crecimiento de las células transfectadas en 600 \mug/ml de G418 (Sigma, St. Louis, Missouri).

Los procedimientos anteriores también se pueden usar para expresar una proteína de CanIon mutante responsable de un fenotipo detectable o una porción del mismo.

La proteína expresada se puede purificar mediante técnicas de purificación convencional tales como precipitación con sulfato de amonio o separación cromatográfica basado en el tamaño o carga. La proteína codificada por el inserto de ácido nucleico también se puede purificar mediante técnicas inmunocromatográficas. En tales procedimientos, una solución que contiene la proteína de CanIon expresada o una porción de la misma, tal como un extracto celular, se aplica a una columna que tiene anticuerpos contra la proteína de CanIon o una porción de la misma se une al matriz de cromatografía. La proteína expresada se deja unir a la columna de inmunocromatografía. A partir de entonces, la columna se lava para eliminar las proteínas unidas en forma no específica. La proteína expresada unida en forma específica se libera luego de la columna y se recupera mediante técnicas estándares.

Para confirmar la expresión de la proteína de CanIon o una porción de la misma, las proteínas expresadas provenientes de células hospedantes que contienen un vector de expresión que contiene un inserto que codifica la proteína de CanIon o una porción de la misma se puede comparar con las proteínas expresadas en las células hospedantes que contienen el vector de expresión sin un inserto. La presencia de una calle en las muestras de células que contienen el vector de expresión con un inserto que está ausente en las muestras de células que contienen el vector de expresión sin un inserto indica que la proteína de CanIon o una porción de la misma se está expresando. Generalmente, la calle presentará la movilidad esperada para la proteína de CanIon o porción de la misma. Sin embargo, la calle puede presentar una movilidad diferente que la esperada como resultado de modificaciones tales como glicosilación, ubiquitinación o escisión enzimática.

Los anticuerpos que pueden reconocer específicamente a la proteína de CanIon expresada o una porción de la misma se describen a continuación.

Si no es posible la producción de anticuerpos, los ácidos nucleicos que codifican la proteína de CanIon o una porción de la misma se incorporan en vectores de expresión diseñados para usar en esquemas de purificación que emplean polipéptidos quiméricos. En tales estrategias el ácido nucleico que codifica la proteína de CanIon o una porción de la misma se inserta en marco con el gen que codifica la otra mitad de la quimera. La otra mitad de la quimera es \beta-globina o un polipéptido que se une al níquel que codifica la secuencia. Una matriz de cromatografía que tiene un anticuerpo \beta-globina o unido a níquel del mismo luego se usa para purificar la proteína quimérica. Los sitios de escisión de la proteasa se manipulan genéticamente entre el gen de \beta-globina o el polipéptido unido al níquel y la proteína de CanIon o una porción de la misma. De este modo, los dos polipéptidos de la quimera se separan entre sí por digestión con proteasas.

Un vector de expresión útil para generar proteínas quiméricas de \beta-globina es pSG5 (Stratagene), que codifica la \beta-globina de conejo. El intrón II del gen de \beta-globina de conejo facilita el empalme del transcripto expresado, y la señal de poliadenilación incorporada en la construcción aumenta le nivel de expresión. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la técnica de la biología molecular. Los métodos estándares se publican en textos de métodos tales como Davis et al. (1986) y muchos de los métodos están disponibles en Stratagene, Life Technologies, Inc., o Promega. El polipéptido se puede producir adicionalmente a partir de la construcción mediante sistemas de traducción in vitro tales como el kit de traducción in vitro Express^{TM} (Stratagene).

Anticuerpos que se unen a los polipéptidos de CanIon de la invención

Se puede usar cualquier polipéptido de CanIon o la proteína completa para generar anticuerpos que se pueden unir específicamente a una proteína de CanIon expresada o fragmentos de la misma como fue descripto.

Una composición de anticuerpo adecuada para usar en la invención es capaz de unirse específicamente o selectivamente a la variante de la proteína de CanIon de la SEC ID No 5. Para una composición de anticuerpo que se puede unir específicamente a una primer variante de CanIon, se debe demostrar que por lo menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, o 100% mas de afinidad de unión para una primer variante de longitud completa de la proteína de CanIon que para una segunda variante de longitud completa de la proteína de CanIon en un ensayo de unión ELISA, RIA, y otro basado en anticuerpo. En una realización preferida una composición de anticuerpo es capaz de unirse específicamente a una proteína de CanIon humana.

En una realización preferida, son adecuadas para usar en la invención las composiciones de anticuerpo, tanto policlonal como monoclonal, capaces de unirse selectivamente o unirse selectivamente a un polipéptido que contiene un epítope que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, con preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, con más preferencia por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 o 1000 aminoácidos de la SEC ID No 5. En realizaciones preferidas, dicho espacio contiguo incluye por lo menos 1, 2, 3, 5 o 10 de las posiciones de los aminoácidos 277, 33 8, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 de la SEC ID No 5.

Se puede usar cualquier polipéptido de CanIon o la proteína completa para generar anticuerpos que se pueden unir específicamente a una proteína de CanIon expresada o fragmentos de la misma tal como se describió.

Un epítope puede comprender solo 3 aminoácidos en una conformación espacial, que es única para el epítope. Generalmente, un epítope consiste en por lo menos 6 de tales aminoácidos, y con más frecuencia de por lo menos 8-10 de tales aminoácidos. En una realización preferida, los epítopes antigénicos comprenden un número de aminoácidos que es un número entero entre 3 y 50. Los fragmentos que funcionan como epítopes se pueden producir por medios convencionales. Los epítopes se pueden determinar por un análisis antigénico de Jameson-Wolf, por ejemplo, realizado mediante un programa de computación PROTEAN, que emplea parámetros en defecto (Versión 4.0 Windows, ADN STAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI.

Es adecuado para usar en la invención un anticuerpo purificado o aislado capaz de unirse específicamente a una proteína de CanIon mutada o un fragmento o variante de la misma que comprende un epítope de una proteína de CanIon mutada. En otra realización preferida, la presente invención trata de un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido que comprende por lo menos 10 aminoácidos consecutivos de una proteína de CanIon e incluye por lo menos uno de los aminoácidos que pueden codificar por las mutaciones que causa el rasgo.

Los animales no humanos y mamíferos, ya sean de tipo salvaje o transgénico, que expresen una especie diferente de CanIon de la cual para la que se desea la unión al anticuerpo y los animales que no expresan CanIon (es decir un animal que carece del gen de CanIon como se describe en la presente memoria) son particularmente útiles para preparar anticuerpos. Los animales carentes de CanIon reconocerán el total o la mayor parte de las regiones expuestas de una proteína de CanIon como antígenos extraños y en consecuencia, producirán anticuerpos con una matriz más amplia de epítopes de CanIon. Además, los polipéptidos más pequeños con sólo 10 a 30 aminoácidos pueden ser útiles para obtener una unión específica a cualquiera de las proteínas de CanIon. Además, el sistema inmune humoral de los animales que producen una especie de CanIon que se parece a la secuencia antigénica reconocerán con preferencia las diferencias entre las especies de CanIon nativas de los animales y la secuencia del antígeno, y producen los anticuerpos para estos sitios únicos de la secuencia antigénica. Tal técnica será particularmente útil para obtener anticuerpos que se unen específicamente a cualquiera de las proteínas de CanIon.

Las preparaciones de anticuerpos preparadas de acuerdo con el protocolo son útiles para los inmunoensayos cuantitativos que determinan concentraciones de las sustancias que portan antígenos en muestras biológicas; estas también se usan en forma semi-cuantitativa o cualitativa para identificar la presencia de antígeno en la muestra biológica. Los anticuerpos se pueden usar también en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína o reducir los niveles de la proteína en el cuerpo.

Los anticuerpos adecuados para usar en la invención pueden estar marcados con cualquiera de las marcas radioactivas, fluorescentes o enzimáticas conocidas en la técnica.

Por consiguiente, es adecuado para usar en la invención un método para detectar específicamente la presencia de un polipéptido de CanIon de acuerdo con la invención en una muestra biológica, dicho método comprende los siguientes pasos:

a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de CanIon que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5, o un fragmento del péptido o una variante del mismo; y

b) detectar el complejo anticuerpo-antígeno formado.

La invención también trata de un kit diagnóstico para detectar la presencia in vitro de un polipéptido canal iónico en una muestra biológica, donde dicho kit comprende:

a) un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente a un polipéptido canal iónico que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5, o a un fragmento del péptido o una variante del mismo, opcionalmente marcado;

b) un reactivo que permite la detección de los complejos antígeno-anticuerpo formados, dicho reactivo que porta opcionalmente una marca, o es capaz de ser reconocido por un reactivo marcado, más particularmente en el caso en que el anticuerpo monoclonal o policlonal mencionado anteriormente no está marcado por sí mismo.

Son adecuados para usar en la invención los anticuerpos y receptores de los antígenos de células T (TCR), que se que se unen específicamente a los polipéptidos, y más específicamente, a los epítopes de los polipéptidos de la presente invención, que incluyen, pero sin limitación, IgG (que incluyen IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4), IgA (que incluyen IgA1 y IgA2), IgD, IgE, o IgM e IgY. En una realización preferida los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno humano de la presente invención que incluyen, pero sin limitación, Fab, Fab' F(ab)2 y F(ab)2, Fd, Fvs de (scFv) cadena simple, anticuerpos de cadena simple, Fvs unidos a puentes disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden tanto al dominio V_{L} como al V_{H}. Los anticuerpos pueden ser de origen animal que incluyen a aves y mamíferos. Con preferencia, los anticuerpos son humanos, murinos, conejo, cabra, cobayo, camello, caballo o pollo.

Los fragmentos del anticuerpo de unión al antígeno, que incluyen anticuerpos de cadena simple, pueden comprender las regiones(s) variables solas o en combinación con el total o parte de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2 y CH3. También se incluyen en la invención cualquiera de las combinaciones de regione(s) variables y la región bisagra, dominios CH1, CH2, y CH3. La presente invención incluye adicionalmente el uso de anticuerpos monoclonales y policlonales quiméricos, humanizados y humanos, que se unen específicamente los polipéptidos de la presente invención. Son adecuados para usar en la invención los anticuerpos que son anticuerpos anti-idiotípicos descriptos en la presente memoria.

Los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o presentan mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para epítopes diferentes de un polipéptido de la presente invención o pueden ser específicos para un polipéptido de la presente invención además de las composiciones heterólogas, tales como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Ver, por ej, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92105793; Tuff, et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; Patentes Estadounidenses Nos. 5.573.920, 4.474.893, 5.601.819, 4.714.681, 4.925.648; Kostelny, et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553.

Los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención se pueden describir o especificar en términos de los epítope(s) o porcion(es) que portan epítopes de un polipéptido de la presente invención, que son reconocidos o específicamente unidos por el anticuerpo. En el caso de las proteínas de la presente invención proteínas secretadas, los anticuerpos se pueden unir específicamente a una proteína de longitud completa codificada por un ácido nucleico de la presente invención, una proteína madura (es decir, la proteína generada por escisión del péptido señal) codificado por un ácido nucleico de la presente invención, un péptido señal codificado por un ácido nucleico de la presente invención o otro polipéptido de la presente invención. En consecuencia, los epítope(s) o porcion(es) de polipéptidos que portan epítopes pueden estar especificados como se describe en la presente memoria, por ej., posiciones N-terminal y C-terminal, por tamaño de los residuos de aminoácidos contiguos o descriptos en otra parte de la presente memoria (que incluyen el listado de secuencias). Los anticuerpos que se unen específicamente a cualquier epítope o polipéptido de la presente invención también pueden ser excluidos como especies individuales. Por consiguiente, la presente invención incluye anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos específicos de la presente invención y permite la exclusión del mismo.

Los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención también se pueden describir o especificar en términos de su reactividad cruzada. Los anticuerpos que no se unen específicamente a algún otro análogo, ortólogo u homólogo de los polipéptidos de la presente invención están incluidos. Los anticuerpos que no se unen a los polipéptidos con menos de 95%, menos de 90%, menos de 55%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, y menos de 50% de identidad (tal como se calcula con los métodos conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria) con el polipéptido de la presente invención también está incluidos en la presente invención. También son adecuados para el uso en la presente invención los anticuerpos que sólo se unen a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridizan a un polinucleótido de la presente invención en condiciones de hibridación rigurosas (como se describe en la presente memoria). Los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención también se pueden describir o especificar en términos de su afinidad de unión. Las afinidades de unión preferidas incluyen a aquellas con constantes de disociación o Kd de menos de 5X10^{-}^{6}M, 10^{-}^{6}M, 5X10^{-}^{7}M, 10^{-}^{7}M, 5X10^{-}^{8}M, 10^{-}^{8}M, 5X10^{-}^{9}M, 10^{-}^{9}M, 5X10^{-}^{10}M, 10^{-}^{10}M, 5X10^{-}^{11}M, 10^{-}^{11}M, 5X10^{-}^{12}M, 10^{-}^{12}M, 5X10^{-}^{13}M, 10^{-}^{13}M, 5X10^{-}^{14}M, 10^{-}^{14}M, 5X10^{-}^{15}M y 10^{-}^{15}M.

Los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención tienen usos que incluyen, pero sin limitaciones a, métodos conocidos en la técnica para purificar, detectar y seleccionar los polipéptidos de la presente invención que incluyen métodos diagnósticos y terapéuticos in vitro e in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tiene uso en inmunoensayos para medir en forma cualitativa o cuantitativa los niveles de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas. Ver, por ej., Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988).

Los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención se pueden usar solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos se pueden fusionar en forma recombinante a un polipéptido heterólogo en el extremo N- o C-terminal o conjugarse químicamente (que incluye las conjugaciones covalentes y no covalentes) a los polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención se pueden fusionar en forma recombinante o conjugar con las moléculas útiles como marcadores en los ensayos de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Ver, por ej., WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente Estadounidense 5.314.995; y EP 0396 387.

Los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención se pueden preparar por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un polipéptido de la presente invención o un fragmento antigénico del mismo se puede administrar a un animal para inducir la producción de un suero que contiene anticuerpos policlonales. El término "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos por la tecnología del hibridoma. El término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o un grupo de polipéptidos que comprenden por lo menos un dominio de unión, donde se forma un dominio de unión a partir del plegado de los dominios variables de una molécula de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensionales con una forma de superficie interna y distribución de carga complementaria a los rasgos de un determinante de un antígeno, que permite una reacción inmunológica con el antígeno. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon único, que incluye un clon eucariota, procariota o fago y no el método por el cual se produce. Los anticuerpos monoclonales se puede n preparar mediante una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen el uso de la tecnología del hibridoma, recombinante, y el despliegue en fagos.

Las técnicas del hibridoma incluyen a las conocidas en la técnica (ver, por ej., Harlow et al. (1998); Hammerling, et al. (1981). Los fragmentos Fab y F(ab')2 se pueden producir, por ejemplo, a partir de anticuerpos producidos en el hibridoma por escisión proteolítica empelando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos de Fab) o pepsina (para producir fragmentos de F(ab')2).

Alternativamente, los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención se pueden producir mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante o mediante la síntesis química usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos adecuados para el uso en la presente invención se pueden preparar mediante diversos métodos de despliegue de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de despliegue de fagos, los dominios funcionales de los anticuerpos se despliegan en la superficie de una partícula de fago, que lleva secuencias de polinucleótido que los codifican. Se seleccionan fagos con una propiedad de unión deseada a partir de un repertorio o genoteca combinatoria de anticuerpos (por ej. humano o murino) por medio de la selección en forma directa con el antígeno, típicamente antígeno unido o capturado en una superficie o microesfera sólida. Los fagos que se usan en estos métodos son típicamente fagos filamentosos que incluyen los dominios de anticuerpo fd y M13 con Fab, Fv o Fv estabilizado con puente disulfuro fusionado en forma recombinante al gen III del fago o a la proteína del gen VIII. Los ejemplos de métodos de despliegue de fagos que se pueden usar para preparar anticuerpos de la presente invención incluyen a los descriptos en Brinkman, et al. (1995); Ames, et al. (1995); Kettleborough, et al. (1994); Persic, et al. (1997); Burton, et al. (1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92118619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las Patentes Estadounidenses Nos. 5.698.426, 5.223.409, 5.403.484; 5.580.717, 5.427.908, 5.750.753, 5.821.047, 5.571.698, 5.427.908, 5.516.637, 5.780.225, 5.658.727 y 5.733.743.

Como se describió en las referencias anteriores, después de la selección del fago, las regiones codificadoras del anticuerpo del fago se pueden aislar y usar para generar anticuerpos totales, que incluyen anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado y expresado en cualquier huésped deseado que incluyen células mamíferas, células de insectos, células de plantas, levaduras y bacterias. Por ejemplo, las técnicas para producir en forma recombinante los fragmentos Fab, Fab' F(ab)2 y F(ab')2 se puede emplear también mediante métodos conocidos en la técnica tales como los descriptos en WO 92/22324; Mullinax, et al. (1992); y Sawai, et al. (1995); y Better, et al. (1988).

Los ejemplos de las técnicas que se pueden usar para producir los anticuerpos y Fv de cadena simple incluyen a los que se describen en las Patentes Estadounidenses 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al. (1991); Shu, et al. (1993); y Skerra, et al. (1988). Para algunos usos, que incluyen el uso de anticuerpos in vivo en seres humanos y en ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Ver por ej., Morrison (1985); Ol et al., (1986); Gillies, S.D. et al. (1989); y la Patente Estadounidense 5.807.715. Los anticuerpos pueden ser humanizados mediante una variedad de técnicas que incluyen trasplante de CDR (EP 0 239 400; WO 91/09967; Patente Estadounidense 5.530.101; y 5.585.089), revestimiento o reconstrucción superficial (en el original en inglés, resurfacing) (EP 0 592106; EP 0 519 596; Padlan E.A., (1991); Studnicka G.M. et al. (1994); Roguska M.A. et al. (1994), y transposición de cadenas (Patente Estadounidense 5.565.332). Los anticuerpos humanos se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen el despliegue de fagos descripto anteriormente. Ver también, Patentes Estadounidenses 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806, y 5.814.318; WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741.

También son adecuados para el uso en la presente invención loa anticuerpos fusionados en forma recombinante o conjugado químicamente (que incluyen tanto las conjugaciones covalentes como no covalentes) a un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser específicos para los antígenos diferentes de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar para seleccionar los polipéptidos de la presente invención para lo tipos celulares particulares, tanto in vitro como in vivo, por fusión o conjugación de los polipéptidos de la presente invención con anticuerpos específicos para los receptores de la superficie celular particular. Los anticuerpos fusionados o conjugados a los polipéptidos de la presente invención se pueden usar también en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación que usan métodos conocidos en la técnica. Ver por ej., Harbor et al. supra y WO 93/21232; EP 0 439 095; Naramura, M. et al. (1994); Patente Estadounidense 5.474.981; Gillies, S.O. et al. (1992); Fell, H.P. et al. (1991).

También son adecuadas para usar en la invención las composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados a los dominios del anticuerpo diferentes de las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos adecuado para el uso en la presente invención se pueden fusionar o conjugar a una región Fc del anticuerpo o porción del mismo. La porción del anticuerpo fusionado a un polipéptido adecuado para el uso en la presente invención puede comprender la región bisagra, dominio CH1, dominio CH2 y dominio CH3 o cualquier combinación de todos los dominios o porciones del mismo. Los polipéptidos adecuados para el uso en la presente invención se pueden fusionar o conjugar a las porciones anteriormente mencionadas para aumentar la vida media in vivo de los polipéptidos para usar en inmunoensayos mediante métodos conocidos en la técnica. Los polipéptidos también se pueden fusionar o conjugar a las pociones de anticuerpos anteriores para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones de Fc fusionadas a los polipéptidos de la presente invención pueden formar dímeros a través de puentes disulfuro entre las porciones Fc. Las formas multiméricas superiores se pueden preparar por fusión de los polipéptidos a las porciones de IgA e IgM. Los métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención a las porciones de anticuerpo son conocidos en la técnica. Ver por ej., Patentes Estadounidenses 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.112,946; EP 0307434, EP 0367166; WO96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi, A. et al. (1991); Zheng, X.X. et al. (1995); y Vil, H. et al. (1992). Los anticuerpos que actúan como agonistas o antagonistas de los polipéptidos descriptos en la presente memoria son adecuados para usar en la presente
invención.

Por ejemplo, son adecuados para usar en la invención los anticuerpos que alteran las interacciones receptor/ligando con los polipéptidos descriptos en la presente memoria tanto en forma parcial o completa. Se incluyen los anticuerpos tanto específicos de receptor como específicos de ligandos. Se incluyen los anticuerpos específicos de receptores, que no impiden la unión al ligando pero impiden la activación del receptor. La activación del receptor (es decir, señalización) se puede determinar por técnicas descriptas en la presente memoria o por lo demás conocidas en la técnica. También se incluyen los anticuerpos específicos de receptores que impiden la unión al ligando y la activación del receptor. Asimismo, se incluyen los anticuerpos neutralizantes que se unen la ligando e impiden la unión del ligando al receptor, además de los anticuerpos que se unen la ligando, de este modo se impide la activación del receptor, pero no impide que el ligando se una al receptor. Además se incluye a los anticuerpos que activan el receptor. Estos anticuerpos pueden actuar a como agonistas para el total o menos de todas las actividades biológicas afectadas por la activación del receptor mediado por el ligando. Los anticuerpos pueden ser especificados como agonistas o antagonistas para las actividades biológicas que comprenden actividades específicas descriptas en la presente memoria. Los agonistas de los anticuerpos anteriores se pueden preparar por métodos conocidos en la técnica. Ver por ej., WO 96/40281; Patente Estadounidense 5.811.097; Deng, B. et al. (1998); Chen, Z. et al. (1998); Harrop, J.A. et al. (1998); Zhu, Z. et al. (1998); Yoon, D.Y. et al. (1998); Prat, M. et al. (1998): Pltard, V. et al. (1997); Llautard, J. et al. (1997); Carlson, NO. et al. (1997); Taryman, R.E. et al. (1995); Muller, Y.A. et al. (1998); Bartunek, P. et al. (1996).

Como se describió anteriormente, los anticuerpos de los polipéptidos adecuados para usar en la invención pueden, a su vez utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotípicos que "simulan" a los polipéptidos adecuados para usar en la invención empleando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Ver, por ej. Greenspan and Bona, (1989); Nissinoff, (1991). Por ejemplo, los anticuerpos que se unen e inhiben competitivamente la multimerización del polipéptido o la unión de un polipéptido de la invención al ligando se pueden usar para genera anti-idiotipos que"simulan" multimerización del polipéptido o la unión al dominio y como consecuencia, se unen y neutralizan al polipéptido o su ligando. Tales anticuerpos anti-idiotípicos de neutralización se pueden usar para unirse al polipéptido de la invención o se unen a sus ligandos/receptores, y de este modo, bloquean su actividad biológica.

Marcadores bialélicos relacionados con CanIon Ventajas de los marcadores bialélicos de la presente invención

Los marcadores bialélicos relacionados con CanIon adecuados para el uso en la presente invención ofrecen varias ventajas importantes sobre otros marcadores genéticos tales como los marcadores de RFLP (Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción) y VNTR (número variable de repeticiones en tándem).

La primera generación de marcadores, fueron los RFLP, que son variaciones que modifican la longitud de un fragmento de restricción. Pero los métodos usados para identificar y tipificar a los RFLP son relativamente costosos de materiales, esfuerzos y tiempo. La segunda generación de marcadores genéticos fueron los VNTR, que se pueden clasificar como minisatélites o microsatélites. Los minisatélites son secuencias de ADN repetidas en tandem presentes en unidades de 5-50 repeticiones que se distribuyen a lo largo de las regiones de los cromosomas humanos que varían de 0,1 a 20 kilobases de longitud. Debido a que ellos presentan muchos alelos posibles, su contenido informativo es muy alto. Los minisatélites se clasifican por a realización de transferencias Southern para identificar el número de repeticiones en tándem presentes en una muestra de ácido nucleico del individuo que se esta ensayando. Sin embargo, hay solo 10^{4} VNTR potenciales que se pueden tipificar por transferencias Southern. Además, los marcadores RFLP y VNTR son costosos y requieren mucho tiempo para el desarrollo y ensayo de en grandes cantidades.

El polimorfismo de nucleótido único o los marcadores bialélicos se pueden usar de la misma manera que los RFLP y VNTR pero ofrecen varias ventajas. Los SNP están espaciados densamente en el genoma humano y representan el tipo más frecuente de variación. Un número estimado de más de 10^{7} sitios se esparcen a lo largo de los 3x 10^{9} pares de bases del genoma humano. En consecuencia, el SNP se produce a mayor frecuencia y con mayor uniformidad que los marcadores RFLP o VNTR, lo que significa que existe una mayor probabilidad de que tal marcador se hallará en proximidad íntima con el locus genético de interés. Los SNP son menos variables que los marcadores VNTR pero son más estables desde el punto de vistas de las mutaciones.

También, las diferentes formas de polimorfismo de nucleótido único caracterizado, tal como los marcadores bialélicos de la presente invención, con frecuencia son más fáciles de distinguir y pueden en consecuencia tipificarse fácilmente en forma rutinaria. Los marcadores bialélicos presentan alelos basados en un nucleótido único y tienen solo dos alelos comunes, que permiten la detección altamente paralela y la clasificación automatizada. Los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención brindan la posibilidad de la genotipificación rápida de alto rendimiento de un gran número de individuos.

Los marcadores bialélicos están densamente espaciados en el genoma, son suficientemente informativos y se pueden ensayar en grandes cantidades. Los efectos combinados de estas ventajas producen marcadores bialélicos extremadamente valiosos para los estudios genéticos. Los marcadores bialélicos se pueden usar en estudios de ligación familiar, e métodos de alelos compartidos, estudios de desequilibrio de conexión en poblaciones, en estudios de asociación de poblaciones de casos y controles o poblaciones de rasgos positivos y rasgos negativos. Un aspecto importante de la presente invención es que los marcadores bialélicos permiten los estudios de asociación realizados para identificar genes involucradas en rasgos de complejos. Los estudios de asociación examinan la frecuencia de los marcadores alélicos en poblaciones de casos no relacionados y controles y se emplean generalmente para la detección de rasgos poligénicos o esporádicos. Los estudios de asociación se pueden realizar en la población general y no están limitados a estudios realizados en individuos relacionados en familias afectadas (estudios de ligación). Los marcadores bialélicos de diferentes genes se pueden detectar en paralelo para asociación directa con la enfermedad o respuesta a un tratamiento. Este método de gen múltiple es una poderosa herramienta para una variedad de estudios genéticos humanos ya que este proporciona la fuerza estadística necesaria para examinar el efecto sinérgico de los múltiples factores genéticos múltiple sobre un fenotipo particular, respuesta a los fármacos, rasgo esporádico o estado de enfermedad con una etiología genética compleja.

Gen candidato de la presente invención

Se pueden emplear diferentes métodos para realizar estudios de asociación: estudios de asociación de genoma amplio, estudios de asociación de región candidata y estudios de asociación de gen candidato. Los estudios de asociación del genoma amplio dependen de la detección de los marcadores genéticos uniformemente espaciados y que cubren el genoma completo. El método del gen candidato se basa en el estudio de los marcadores genéticos localizados específicamente en los genes potencialmente involucrados en una vía biológica relacionada con el rasgo de interés. En la presente invención, el CanIon es el gen candidato. El análisis del gen candidato proporciona claramente un enfoque de rápida realización para la identificación de genes y polimorfismos del gen relacionado con un rasgo particular cuando alguna información acerca de biología del rasgo está disponible. Sin embargo se debe advertir que todos los marcadores bialélicos descriptos en la presente solicitud se pueden emplear como parte de los estudios de asociación de genoma amplio o como parte de los estudios de asociación de la región candidata y tales usos están específicamente contemplados en la presente invención y las reivindicaciones.

Marcadores bialélicos relacionados con CanIon y polinucleótidos relacionados con los mismos

Son adecuados para usar en la invención los marcadores bialélicos relacionados con CanIon. Como se usa en la presente memoria el término "marcador bialélico relacionado con CanIon" se relaciona con un conjunto de marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el gen de CanIon. El término marcador bialélico relacionado con CanIon incluye los marcadores bialélicos designados A1 a A17.

Una porción de los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se describen en la Tabla 2. Estos también se describen como un polimorfismo de base única de los rasgos relacionados con las SEC ID Nos 1 a 4 y 6. Los pares de cebadores que permiten la amplificación de un ácido nucleico que contiene la base polimórfica de un marcador bialélico CanIon se listan en la Tabla 1 del Ejemplo 2.

Los marcadores bialélicos relacionados con CanIon, A1 a A17, se localizan en la secuencia genómica de CanIon. Los marcadores bialélicos A12 y A16 se localizan en los exones CanIon. El marcador bialélico A18 es el que flanquea el gen de CanIon.

Es adecuada para usar en la invención una secuencia de nucleótidos purificada y/o aislada que comprende una base polimórfica de un marcador bialélico relacionado con CanIon. En realizaciones preferidas, el marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo. La secuencia presenta entre 8 y 1000 nucleótidos de longitud y con preferencia comprende por lo menos 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 o 1000 contiguos o nucleótidos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 1 a 4 y 6 o una variante dela misma o una secuencia complementaria de la misma. Estas secuencias de nucleótidos comprenden la base polimórfica del alelo 1 o alelo 2 del marcador bialélico. Opcionalmente, dicho marcador bialélico puede estar dentro tener de 6, 5, 4, 3, 2, o 1 nucleótidos del centro de dicho polinucleótido o en el centro de dicho polinucleótido. Opcionalmente, el extremo 3' de dicho espacio contiguo puede estar presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido. Opcionalmente, el marcador bialélico puede estar presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender adicionalmente una marca. Opcionalmente, dicho polinucleótido se puede unir a un soporte sólido. En una realización adicional, los polinucleótidos definidos anteriormente se pueden usar solos o en alguna combinación.

Es adecuada para usar en la invención una secuencia de nucleótidos purificada y/o aislada que comprende entre 8 y 1000 nucleótidos contiguos, y/o con preferencia por lo menos 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos contiguos de una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 1 a 4 o una variante de la misma o una secuencia complementaria de la misma. Opcionalmente, el extremo 3' de dicho polinucleótido puede estar localizado dentro o por lo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500, o 1000 nucleótidos corriente arriba de un marcador bialélico relacionado con CanIon en dicha secuencia. Opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A17; Opcionalmente, el extremo 3' de dicho polinucleótido puede estar localizado dentro o por lo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500, o 1000 nucleótidos corriente arriba de un marcador bialélico relacionado con CanIon en dicha secuencia. Opcionalmente, el extremo 3' de dicho polinucleótido puede estar localizado 1 nucleótido corriente arriba de un marcador bialélico relacionado con CanIon en dicha secuencia. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender adicionalmente una marca. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar unido a un soporte sólido. En
una realización adicional, los polinucleótidos definidos anteriormente se puede usar solo o en ninguna combinación.

En una realización preferida, las secuencias que comprenden una base polimórfica de uno de los marcadores bialélicos listados en la Tabla 2 se seleccionan del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos que tiene un espacio contiguo de, que consiste en, que están comprendidos en, o que comprenden de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los ácido nucleicos de las secuencias expuestas como los amplicones listados en la Tabla 1 o una variante de la misma o una secuencia complementaria de la misma.

Es adecuado para usar en la invención un ácido nucleico que codifica la proteína de CanIon, donde dicho ácido nucleico comprende una base polimórfica de un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A12 y A16 y los complementos del mismo.

Son adecuados para usar en la invención cualquier polinucleótido para, o cualquier polinucleótido para uso en, la determinación de la identidad de uno o más nucleótidos en un marcador bialélico relacionado con CanIon. Además, los polinucleótidos adecuados para usar en la invención para usar en la determinación de la identidad de uno más nucleótidos en el marcador bialélico relacionado con CanIon abarca polinucleótidos con alguna limitación adicional descripta en esta revelación o los siguientes, especificado solo o en alguna combinación. Opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos de los mismos u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A11 y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A12 y A16, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender una secuencia descripta en la presente memoria descriptiva; opcionalmente, dicho polinucleótido puede consistir en o consiste esencialmente en cualquier polinucleótido descripto en la presente memoria descriptiva; opcionalmente, dicha determinación se puede realizar en un ensayo de hibridación, ensayo de secuenciación, ensayo de microsecuenciación o un ensayo de detección de apareamiento erróneo basado en enzimas; opcionalmente, dicho polinucleótido se puede unir a un soporte sólido, matriz o matriz dirigida; opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar marcado. Un polinucleótido preferido se puede usar en un ensayo de hibridación para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico relacionado con CanIon. Otra polinucleótido preferido se puede usar en un ensayo de secuenciación o microsecuenciación para determinar la identidad del nucleótido en el marcador bialélico relacionado con CanIon. Un tercer polinucleótido preferido se puede usar en un ensayo de detección de apareamiento erróneo basado en enzima para determinar la identidad del nucleótido en el marcador bialélico relacionado con CanIon. Un cuarto polinucleótido preferido se puede usar en la amplificación de un segmento de polinucleótidos que comprende un marcador bialélico relacionado con CanIon. Opcionalmente, cualquiera de los polinucleótidos descriptos anteriormente se puede unir a un soporte sólido, matriz o matriz dirigida; opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar marcado.

Adicionalmente, es adecuado para usar en la invención cualquier polinucleótido para, o cualquier polinucleótido para uso en, la amplificación del segmento de nucleótidos que comprende un marcador bialélico relacionado con CanIon. Además, los polinucleótidos adecuados para usar en la invención para usar en la la amplificación del segmento de nucleótidos que comprende un marcador bialélico relacionado con CanIon abarca polinucleótidos con alguna limitación adicional descripta en esta revelación, o las siguientes, especificadas solas o en alguna combinación: opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A12 y A16, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho polinucleótido puede comprender una secuencia descripta en la presente memoria descriptiva; opcionalmente, dicho polinucleótido puede consistir en, o consistir esencialmente en algún polinucleótido descripto en la presente memoria descriptiva; opcionalmente, dicha amplificación se puede llevar a cabo por PCR o LCR. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar unido a un soporte sólido, matriz o matriz dirigida. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar marcado.

Los cebadores para amplificación o reacción de secuenciación de un polinucleótido que comprende un marcador bialélico adecuado para usar en la invención se pueden diseñar a partir de la secuencias descriptas por cualquier de los métodos conocidos en la técnica. Un conjunto de cebadores preferidos se crea para que el extremo 3' del espacio contiguo de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 1 a 4 y 6 o una secuencia complementaria de la misma o una variante de la misma está presente en el extremo 3' del cebador. Tal configuración permite que el extremo 3' del cebador se hibridiza a una secuencia de ácido nucleico seleccionada y aumenta en forma espectacular la eficiencia del cebador para las reacciones de amplificación o secuenciación. Los cebadores específicos de alelo se pueden diseñar para que una base polimórfica de un marcador bialélico está en el extremo 3' del espacio contiguo y el espacio contiguo está presente en el extremo 3' del cebador. Tales cebadores específicos de alelo tienden a cebar selectivamente la reacción de amplificación o secuenciación siempre que ellas se usan con una muestra de ácido nucleico que contiene uno de los alelos presentes en un marcador bialélico. El extremo 3' del cebador adecuado para usar en la invención puede estar localizado dentro o por lo menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500, o 1000 nucleótidos corriente arriba de un marcador bialélico relacionado con CanIon en dicha secuencia o en cualquier localización que fuera apropiada para su uso previsto para la secuenciación, amplificación o la localización de nuevas secuencias o marcadores. De este modo, otro conjunto de cebadores amplificadores preferidos comprenden un polinucleótido aislado que consiste esencialmente en un espacio contiguo de 8 a 50 nucleótidos en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nos 1 a 4 y 6 o una secuencia complementaria de la misma o una variante de la misma, donde el extremo 3' de dicho espacio contiguo está localizado en el extremo 3' de dicho polinucleótido, y donde el extremo 3' de dicho polinucleótido está localizado corriente arriba de un marcador bialélico relacionado con CanIon en dicha secuencia. Con preferencia, estos cebadores de amplificación comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias 61 a B17 y C1 a C17. Los cebadores con sus extremos 3' localizados 1 nucleótido corriente arriba de un marcador bialélico relacionado con CanIon tiene una utilidad especial como ensayos de microsecuenciación. LOs cebadores de microsecuenciación preferidos se describen en la Tabla 4. Opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A17, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A12 y A16, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, los cebadores de microsecuenciación se seleccionan del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos D1 a D18 y E1 a E18.

Las sondas adecuadas para el uso en la presente invención se pueden diseñar a partir de las secuencias reveladas por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, en particular métodos que permiten examinar si un marcador revelado en la presente memoria está presente. Un conjunto preferido de sondas se puede diseñar para el uso en ensayos de hibridación de la invención de una manera conocida en la técnica de modo que estos se unan selectivamente a un alelo de un marcador bialélico, pero no al otro en el conjunto particular en condiciones de ensayo. Las sondas de hibridación preferidas comprenden la base polimórfica del alelo 1 o alelo 2 del marcador bialélico considerado. Opcionalmente, dicho marcador bialélico puede estar dentro de 6, 5, 4, 3, 2, o 1 nucleótido(s) del centro de la sonda de hibridación o el centro de dicha sonda. En una realización preferida, las sondas se seleccionan del grupo que consiste en cada una de las secuencias P1 a P18 y cada una de las secuencias complementarias de las mismas.

Se debe advertir que los polinucleótidos adecuados para el uso en la presente invención no está limitados a tener las secuencias flanqueantes exactas que rodean las bases polimórficas que se enumeran en el Listado de secuencias. Más bien, se apreciará que secuencias flanqueantes que rodean los marcadores bialélicos se pueden prolongar o acortar hasta un punto compatible con su uso previsto y la presente invención contempla en forma específica a tales secuencias. Las regiones flanqueantes exteriores del espacio contiguo no necesitan ser homólogas a las secuencias flanqueantes nativas que aparecen realmente en los sujetos humanos. La adición de cualquier secuencia de nucleótidos que es compatible con los nucleótidos destinados al uso está específicamente contemplada.

Las sondas y cebadores pueden estar marcados o inmovilizados en un soporte sólido como se describe en "Sondas y cebadores oligonucleotídicos".

Los polinucleótidos adecuados para usar en la invención que se unen a un soporte sólido abarcan los polinucleótidos con alguna limitación adicional descripta en esta revelación, o las siguientes especificadas sola o una cualquier combinación: Opcionalmente, dichos polinucleótidos pueden estar especificados como unidos en forma individual o en grupos de por lo menos 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20,o 25 polinucleótidos distintos de la invención a un soporte sólido único. Opcionalmente, los polinucleótidos diferentes que los adecuados para usar en la invención pueden unir al mismo soporte sólido como polinucleótidos de la invención. Opcionalmente, cuando los polinucleótidos se unen a un soporte sólido se pueden unir en localizaciones al azar o en una matriz ordenada. Opcionalmente, dicha matriz ordenada puede ser una matriz dirigible.

La presente invención también abarca kits diagnósticos que comprenden uno o más polinucleótidos de la invención con una porción o el total de los reactivos e instrucciones necesarios para la genotipificación de un sujeto de ensayo para la determinación de la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con CanIon. Los polinucleótidos de un kit puede estar unido opcionalmente a un soporte sólido, o ser parte de una matriz o matriz dirigida de polinucleótidos. El kit puede proporcionar la determinación de la identidad del nucleótido en la posición del marcador por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, un método de ensayo de secuenciación, un método de microsecuenciación, un método de ensayo de hibridación o un método de detección de error de apareamiento basado en enzimas.

Métodos para identificación de novo de marcadores bialélicos

Se puede usar cualquiera de una variedad de métodos para seleccionar un fragmento genómico por los polimorfismos de nucleótido único tales como hibridación diferencial con sondas de oligonucleótidos, detección de cambios de movilidad mediada en elctroforesis en gel o secuenciación directa del ácido nucleico amplificado. Un método preferido para identificar marcadores bialélicos incluye la secuenciación comparativa de los fragmentos de ADN genómicos a partir de un número apropiado de individuos no relacionados.

En una primera realización, las muestras de ADN de individuos no relacionados se mezclan juntas, después de lo cual se amplifica y secuencia el ADN genómico de interés. Las secuencias de nucleótidos así obtenidas luego se analizan para identificar polimorfismos significativos. Una de las principales ventajas de este método reside en el hecho que la mezcla de las muestras de ADN reducen sustancialmente el número de las reacciones de amplificación de ADN y las reacciones de secuenciación, que se pueden llevara cabo. Además este método es suficientemente sensible de manera que un marcador bialélico obtenido de este modo, usualmente demuestra que una frecuencia suficiente de su alelo menos común es útil para realizar los estudios de asociación.

En una segunda realización, las muestras de ADN no se mezclan y en consecuencia se amplifican y secuencia en forma individual. Este método es usualmente preferido cuando los marcadores bialélicos necesitan ser identificados para realizar estudios de asociación en los genes candidatos. Con preferencia, las regiones génicas relevantes tales como las regiones promotoras o regiones exónicas se pueden seleccionar para los marcadores bialélicos. Un marcador bialélico obtenido mediante este método puede mostrar un grado menor de contenido de información para realizar estudios de asociación, por ej. si la frecuencia de su alelo menos frecuente puede ser menos de aproximadamente 10%. Tal marcador bialélico será, sin embargo, lo suficientemente informativo para realizar estudios de asociación y además se apreciará que la inclusión de marcadores bialélicos menos informativos en los estudios de análisis genéticos de la presente invención, puede permitir en algunos casos, la identificación directa de las mutaciones causales, las que pueden ser, dependiendo de su penetrancia, mutaciones raras.

La siguiente es una descripción de los diversos parámetros de un método preferido usado por los inventores para la identificación de los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención.

Muestras de ADN genómico

Las muestras de ADN genómico de las cuales se generan los marcadores bialélicos de la presente invención se obtienen con preferencia de individuos no relacionados que corresponden a una población heterogénea de antecedentes étnicos conocidos. El número de individuos de los cuales se obtienen las muestras de ADN puede variar sustancialmente, con preferencia de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000, con preferencia de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 individuos. Usualmente se prefiere recoger muestras de ADN de por lo menos aproximadamente 100 individuos para tener suficiente diversidad polimórfica en una población dada para identificar tantos marcadores como posibles y generar resultados estadísticamente significativos.

En lo que respecta a la fuente del ADN genómico que se someterá a análisis, cualquier muestra de ensayo puede ser prevista sin ninguna limitación particular. Estas muestras de ensayo incluyen muestras biológicas, que se pueden ensayar por los métodos de la presente invención descriptos en la presente memoria e incluyen líquidos corporales humanos y animales tales como sangre entera, suero, plasma, liquido cerebroespinal, orina, líquidos linfáticos y diversas secreciones externas de los aparatos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, leucocitos, mielomas y similares; líquidos biológicos tales como sobrenadantes de cultivos celulares; especímenes de tejidos fijados que incluyen tejidos tumorales y no tumorales y tejidos de ganglios linfáticos; aspirados de médula ósea y especimenes de células fijas. La fuente preferida de ADN genómico usada en la presente invención proviene de sangre venosa periférica de cada donante. Las técnicas para preparar ADN genómico de muestras biológicas son bien conocidas por los técnicos expertos. Los detalles de una realización preferida se proporcionan en el Ejemplo 1. El experto en la técnica puede elegir amplificar muestras de ADN combinadas o no combinadas.

Amplificación de ADN

La identificación de los marcadores bialélicos en una muestra de ADN genómico se puede facilitar mediante el uso de métodos de amplificación ADN. Las muestras de ADN se pueden combinar o no combinar para el paso de amplificación. Las técnicas de amplificación de ADN son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Las técnicas de amplificación de ADN que se pueden usar en el contexto de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la reacción en cadena de ligasa (LCR) descripta en EP-A-320 308, WO 9320227 y EP-A-439 182, la reacción en cadena de polimerasa (PCR, RT-PCR) y técnicas tales como amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) descripta en Guatelli J.C., et al. (1990) y en Compton J. (1991), amplificación Q-beta como se describe en la solicitud de la Patente Europea No 4544610, amplificación del desplazamiento de cadena como se describe en Walker et al. (1996) y EP A 684 315 y amplificación mediada por blanco como se describe en la Publicación PCT Publication WO 9322461.

Las LCR y Gap LCR son técnicas de amplificación exponencial, que dependen de la ADN ligasa para unir los cebadores adyacentes apareados a una molécula de ADN. En la reacción en cadena de ligasa (LCR), se usan pares de sondas que incluyen dos sondas primarias (primera y segunda) y dos secundarias (tercera y cuarta), las cuales se emplean en exceso molar con el blanco. La primer sonda hibridiza a un primer segmento de la cadena blanco y la segunda hibridiza a un segundo segmento de la cadena blanco, el primer y segundo segmentos está contiguos de modo que las sondas primarias colindan entre sí en relación con 5' fosfato-3'hidroxilo, y de modo que una ligasa se puede fusionar o ligar en forma covalente a las dos sondas en un producto fusionado. Además, una tercera sonda (secundaria) se puede hibridizar a una porción de la primer sonda y una cuarta sonda (secundaria) puede hibridizar a una porción de la segunda sonda en un modo adyacente. Por supuesto, si el blanco es inicialmente de doble cadena, las sondas secundarias también hibridizar al complemento blanco en primera instancia. Una vez que la cadena ligada de las sondas primarias se separa de la cadena blanco, esta se hibridizará con la tercera y cuarta sondas, que se puede ligar para formar un producto ligado secundario complementario. Es importante para lograr que los productos ligados sean funcionalmente equivalentes tanto a el blanco como a su complemento. Mediante ciclos repetidos de hibridación y ligación, se logra la amplificación de la secuencia blanco. Un método para la LCR múltiplex también ha sido descripto (WO 9320227). La LCR Gap (GLCR) es una versión de LCR en la que las sondas no son adyacentes sino que estás separadas por 2 a 3 bases.

Para la amplificación de los ARNm está dentro del alcance de la presente invención transcribir en forma reversa ARNn en ADNc seguido por la reacción en cadena de la polimerasa (RT-P'CR); o, usar una enzima única en ambos pasos como se describe en la Patente Estadounidense No. 5.322.770 o usar LCR Gap asimétrica (RT-AGLCR) como se describe en Marshall et al. (1994). AGLCR es una modificación de GLCR que permite la amplificación del
ARN.

La tecnología PCR es la técnica de amplificación preferida usada en la presente invención. Una variedad de técnicas PCR son familiares para el experto en la técnica. Para una revisión de la tecnología de PCR, ver White (1997) y la publicación titulada "Métodos y aplicaciones de PCR" (1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En cada uno de estos procedimientos de PCR, los cebadores PCR en cualquier lado de la secuencia de ácido nucleico que se amplifica se agregan la muestra de ácido nucleico preparada adecuadamente junto con los dNTP y una polimerasa termoestable tal como la polimerasa Taq, polimerasa Pfu o polimerasa Vent. El ácido nucleico de la muestra está desnaturalizada y los cebadores de PCR se hibridizan específicamente a secuencias de ácido nucleico complementarias de la muestra. Los cebadores hibridizados se extienden. A partir de aquí, se inicia otro ciclo de desnaturalización, hibridización y extensión. Los ciclos se repiten múltiples veces para producir un fragmento amplificado que contiene la secuencia del ácido nucleico entre los sitios del cebador. La PCR se ha descripto adicionalmente en varias patentes que incluyen las Patentes Estadounidenses 4.683.195; 4.683.202; y 4.965.188.

La tecnología PCR es la técnica de amplificación preferida usada para identificar nuevos marcadores bialélicos. Un ejemplo típico de una reacción de PCR adecuada para los propósitos de la presente invención se proporciona en el Ejemplo 2.

Es adecuado para el uso en la presente invención un método para la amplificación del gen de CanIon humano, en particular de un fragmento de la secuencia genómica de las SEC ID No 1 a 3 o de la secuencia de ADNc de la SEC ID No 4, o un fragmento o variante del mismo en una muestra de ensayo, con preferencia mediante PCR. Este método comprende los pasos de:

a) poner en contacto una muestra de ensayo con los reactivos de la reacción de amplificación que comprende un par de cebadores de amplificación como se describió anteriormente, y se localizan en cualquier lado de la región del polinucleótido que se amplificará y

b) opcionalmente, detectar los productos de amplificación.

La invención también trata de un kit para la amplificación de una secuencia del gen de CanIon, particularmente de una porción de la secuencia genómica de la SEC ID No 1 a 3 o la secuencia de ADNc de la SEC ID No 4, o una variante de la misma en una muestra de ensayo, donde dicho kit comprende:

a) un par de cebadores de oligonucleótido localizados en cualquier lado de la región de CanIon que se amplifica;

b) opcionalmente, los reactivos necesarios para realizar la reacción amplificación.

En una realización del anterior método y kit de amplificación, el producto de amplificación se detecta por hibridación con una sonda marcada que tiene una secuencia que es complementaria con la región amplificada. En otra realización del método y kit de amplificación, los cebadores comprenden una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de B1 a B17, C1 a C17, D1 a D18, y E1 a E18.

En una primera realización adecuada para usar en la presente invención, se identifican los marcadores bialélicos mediante la información de la secuencia genómica generada por los inventores. Los fragmentos de ADN genómico secuenciados se usan para diseñar cebadores para la amplificación de fragmentos de 500 pb. Estos fragmentos de 500 pb se amplifican del ADN genómico y se barren para buscar marcadores bialélicos. Los cebadores se pueden diseñar mediante el programa de computación OSP (Hillier L. and Green P., 1991). Todos los cebadores pueden contener, corriente arriba de las bases blanco específicas, una cola de oligonucleótidos comunes que actúa como un cebador de secuenciación. Estos expertos en la técnica esta familiarizados con las extensiones del cebador, que se pueden usar para estos propósitos.

Los cebadores preferidos, útiles para la amplificación de las secuencias genómicas que codifican el gen de CanIon, se centran en los promotores, exones y sitios de empalme de los genes. Un marcador bialélico presenta una mayor probabilidad de ser una mutación causal final si se localiza en estas regiones funcionales del gen. Los cebadores de amplificación preferidos de la invención incluyen las secuencias de nucleótidos B1 a B17 y C1 a C17, que se detallan adicionalmente en el Ejemplo 2, Tabla 1.

Secuenciación del ADN genómico amplificado e identificación de polimorfismos de nucleótido único

Los productos de amplificación generados como se describió anteriormente, luego se secuencian mediante cualquiera de los métodos conocidos y disponibles para los técnicos expertos. Los métodos de secuenciación del ADN que emplean el método mediado con dideoxi (método de Sanger) o el método de Maxam-Gilbert son ampliamente conocidos por los expertos en la técnica. Tales métodos se describen por ejemplo en Sambrook et al. (1989). Los métodos alternativos incluyen matrices de sonda de ADN e alta densidad como los que se describen en Chee et al. (1996).

Con preferencia, el ADN amplificado se somete a reacciones de secuenciación automatizadas con el terminador dideoxi empleando un protocolo de secuenciación del ciclo cebador-colorante. Los productos de las reacciones de secuenciación se corren en geles de secuenciación y las secuencias se determinan mediante el análisis de las imágenes del gel. La búsqueda de polimorfismo se basa en la presencia de picos sobrepuestos en el patrón de electroforesis que resultan de las diferentes bases que aparecen en la misma posición. Debido a que cada terminador dideoxi está marcado con una molécula fluorescente diferente, los dos picos que correspondiente s a un sitio bialélico presentan colores distintos que corresponden a dos nucleótidos diferentes en la misma posición de la secuencia. Sin embargo, la presencia de dos picos puede ser un artefacto debido al ruido de fondo. Para excluir tal artefacto, las dos cadenas de DN se secuencian y se lleva a cabo una comparación entre los picos. Para ser registrada como una secuencia polimórfica, el polimorfismo se debe detectar en ambas cadenas.

El procedimiento anterior permite que estos productos de amplificación, que contienen los marcadores bialélicos sean identificados. El límite de detección para la frecuencia de los polimorfismos bialélicos detectados por las mezclas de secuenciación de 100 individuos es aproximadamente 0,1 para el alelo menor, como se verifica por las mezclas de secuenciación de frecuencias alélicas conocidas. Sin embargo, más del 90% de los polimorfismos bialélicos detectados por el método de mezclado presente una frecuencia para el alelo menor superior a 0,25. En consecuencia, los marcadores bialélicos seleccionados por este método presentan una frecuencia de por lo menos 0,1 para el alelo menor y menos de 0,9 para el alelo mayor. Con preferencia, por lo menos 0,2 para el alelo menor y menos de 0,8 para el alelo mayor, con más preferencia por lo menos 0,3 para el alelo menor y menos de 0,7 para el alelo mayor, de este modo una tasa de heterocigosidad mayor de 0,18, con preferencia mayor de 0,32, con más preferencia mayor de 0,42.

En otra realización, los marcadores bialélicos se detectan por la secuenciación de muestras de ADN individual, la frecuencia del alelo menor de tal marcador bialélico puede ser de menos de 0,1.

Validación de los marcadores bialélicos de la presente invención

Se evalúan los polimorfismos para determinar su utilidad como marcadores genéticos por medio de la validación de que ambos alelos están presentes en una población. La validación de los marcadores bialélicos se obtiene por la genotipificación de un grupo de individuos por un método de la invención y la demostración de que ambos alelos están presentes. La microsecuenciación es un método preferido genotipificación de alelos. La validación del paso de genotipificación se puede realizar en muestras de individuos derivados de cada individuo del grupo o por genotipificación de una muestra combinada derivada de más de un individuo. El grupo puede ser tal pequeño como un individuo si ese individuo es heterócigo para el alelo en cuestión. Con preferencia el grupo contiene por lo menos tres individuos, con más preferencia el grupo contiene cinco o seis individuos, de manera que un ensayo de validación único será más probable que produzca la validación de más de los marcadores bialélicos que se están ensayando. Se debe advertir, sin embargo, que cuando el ensayo de validación se realiza con un grupo pequeño, este puede producir un resultado falsos negativos si como resultado del error de muestreo ninguno de los individuos ensayados lleva uno de los dos alelos. De este modo, el proceso de validación es menos útil para demostrar que un resultado inicial particular es un artefacto, que para demostrar que hay un marcador bialélico de buen fe en una posición particular de una secuencia Todos los métodos de genotipificación, haplotipificación, estudios de asociación e interacción de la invención se pueden realizar opcionalmente únicamente con marcadores bialélicos validados.

Evaluación de la frecuencia de los marcadores bialélicos de la presente invención

Los marcadores bialélicos se evalúan adicionalmente en cuanto a su utilidad como marcadores genéticos por la determinación de la frecuencia del alelo menos común en el sitio del marcador bialélico. A mayor frecuencia del menos común de los alelos, mayor es la utilidad del marcador bialélico en los estudios de asociación e interacción. La determinación del menos común del alelo se obtiene por la genotipificación de un grupo de individuos por un método de la invención y la demostración de que ambos alelos están presentes. Esta determinación de la frecuencia por el paso de genotipificación se puede realizar en muestras de individuos derivados de cada individuo del grupo o por genotipificación de una muestra combinada derivada de más de un individuo. El grupo puede ser lo suficientemente grande para ser representativo de la población como total. Con preferencia el grupo contiene por lo menos 20 individuos, con más preferencia el grupo contiene por lo menos 50 individuos, con mayor preferencia el grupo contiene por lo menos 100 individuos. Por supuesto a mayor grupo, mayor precisión de la determinación de frecuencia debida a la reducción del error de muestreo. Un marcador bialélico en el que la frecuencia del alelo menos común es 30% o más se denomina un "marcador bialélico de alta calidad". Todos los métodos de genotipificación, haplotipificación, estudios de asociación e interacción de la invención se pueden realizar opcionalmente únicamente con marcadores bialélicos de alta calidad.

Métodos para la genotipificación de un individuo en lo que respecta a los marcadores bialélicos

Se proporcionan métodos para genotipificar una muestra biológica en lo que respecta a uno o más de los marcadores bialélicos de la presente invención, todos los cuales se pueden realizar in vitro. Tales métodos de genotipificación, comprenden la determinación de la identidad de un nucleótido en un sitio marcador bialélico de CanIon por medio de cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos se usan para genotipificar poblaciones de casos y controles en estudios de asociación además de individuos en el contexto de la detección de los alelos de los marcadores bialélicos que se sabe que están asociados con un rasgo dado, en cuyo caso se determinan ambas copias del marcador bialélico presente en el genoma de los individuos de modo que un individuo se pueda clasificar como homócigo o heterócigo para un alelo particular.

Estos métodos de genotipificación se pueden realizar en muestras de ácido nucleico derivadas de muestras de ADN de un individuo o combinadas únicas.

La genotipificación se puede realizar mediante métodos similares a los que se describieron anteriormente para la identificación de los marcadores bialélicos o mediante otros métodos de genotipificación tales como los que se describen adicionalmente más adelante. En realizaciones preferidas, la comparación de secuencias de los fragmentos genómicos amplificados de diferentes individuos se usa para identificar nuevos marcadores bialélicos mientras que la microsecuenciación se usa para la genotipificación de marcadores bialélicos conocidos para aplicaciones en diagnóstico y estudios de asociación.

Son adecuados para usar en la invención los métodos de genotipificación que comprenden la determinación de la identidad de un nucleótido en marcador bialélico relacionado con CanIon o el complemento del mismo en una muestra biológica; opcionalmente, donde dicho marcador relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo o opcionalmente, los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A17, y los complementos del mismo u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo ; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A12 y A16, y los complementos del mismo u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicha muestra biológica deriva de un sujeto único; opcionalmente, donde la identidad de los nucleótidos en dicho marcador bialélico se determina para ambas copias de dicho marcador bialélico presente en dicho genoma del individuo; opcionalmente, donde dicha muestra biológica deriva de múltiples sujetos; opcionalmente, los métodos de genotipificación adecuados para usar en la invención abarcan métodos con alguna limitación descrita en esta revelación, o en las siguientes, especificadas solas o en cualquier combinación; opcionalmente, dicho método se realiza in vitro; opcionalmente, además comprende amplificar una porción de dicha secuencia que comprende el marcador bialélico antes de dicho paso de determinación; opcionalmente, donde dicha amplificación se realiza por PCR, LCR, o replicación de un vector recombinante que comprende un origen de replicación y dicho fragmento en una célula hospedante, opcionalmente, donde dicha determinación se realiza por un ensayo de hibridación, un ensayo de secuenciación, un ensayo de microsecuenciación o un ensayo de detección de apareamientos erróneos basados en una enzima.

Fuente de ácidos nucleicos para genotipificación

Cualquier fuente de ácidos nucleicos, en forma purificada o no purificada se puede utilizar como ácido nucleico de partida, siempre que este contenga o se sospeche que contiene la secuencia deseada de ácido nucleico específico. El ADN o ARN se puede extraer de células, tejidos, líquidos corporales y similares como se describió anteriormente. Aunque los ácidos nucleicos para usar en los métodos de genotipificación adecuados para usar en la invención se pueden derivar de cualquier fuente de mamíferos, generalmente se entiende que los sujetos e individuos de ensayo de los cuales se toman las muestras de ácido nucleico son seres humanos.

Amplificación de los fragmentos de ADN que comprenden marcadores bialélicos

Los métodos y polinucleótidos proporcionados para amplificar un segmento de nucleótidos que comprenden uno o más marcadores bialélicos adecuados para usar en la presente invención. Se apreciará que la amplificación de fragmentos de ADN que comprende marcadores bialélicos se puede usar en diversos métodos y para diversos propósitos y no está restringida a la genotipificación. No obstante, muchos métodos de genotipificación, si bien no todos, requieren la amplificación previa de la región del ADN que lleva el marcador bialélico de interés. Tales métodos aumentan específicamente la concentración o el número total de secuencias de que abarcan el marcador bialélico o incluyen ese sitio y las secuencias localizadas en forma distal o proximal a ellas. Los ensayos diagnósticos también puede n depender de la amplificación de los segmentos de ADN que llevan un marcador bialélico de la presente invención. La amplificación del ADN se puede obtener por cualquier método conocido en la técnica. Las técnicas de amplificación se describieron anteriormente en la sección titulada "amplificación de ADN".

Algunos de estos métodos de amplificación son particularmente adecuados para la detección de polimorfismos de nucleótido único y permiten la amplificación simultánea de una secuencia blanco y la identificación del nucleótido polimórfico como se describe adicionalmente más adelante.

La identificación de los marcadores bialélicos que se describieron anteriormente permite el diseño de oligonucleótidos apropiados, que se pueden usar como cebadores para amplificar fragmentos de ADN que comprenden los marcadores bialélicos de la presente invención. La amplificación se puede realizar mediante los cebadores usados inicialmente para descubrir nuevos marcadores descriptos en la presente memoria o algún conjunto de cebadores que permiten la amplificación de un fragmento de ADN que comprende un marcador bialélico de la presente invención.

Son adecuados para el uso en la presente invención los cebadores para amplificar un fragmento de ADN que contiene uno o más marcadores bialélicos de la presente invención. Los cebadores de amplificación preferidos se listan en el Ejemplo 2. Se apreciará que los cebadores listados son simplemente ejemplos y que cualquier otro conjunto de cebadores que producen productos de amplificación que contienen uno o más marcadores bialélicos de la presente invención también es útil.

El espaciado de los cebadores determina la longitud del segmento que se amplifica. En el contexto de la presente invención, los segmentos amplificados que portan marcadores bialélicos pueden variar en tamaño de por lo menos aproximadamente 25 pb a 35 pb. Los fragmentos de amplificación de 25-3000 pb son típicos, los fragmentos de 50-1000 son preferidos y los fragmentos de 100-600 pb son los más preferidos. Se apreciará que los cebadores de amplificación para los marcadores bialélicos pueden ser de cualquier secuencia que permita la amplificación específica de algún fragmento de ADN que lleva los marcadores. Los cebadores de amplificación pueden estar marcados o inmovilizados en un soporte sólido como se describió en "Sondas y cebadores oligonucleotídicos".

Métodos de genotipificación de muestras de ADN para marcadores bialélicos

Cualquiera de los métodos conocidos en la técnica se puede usar para identificar el nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico. Ya que el el alelo del marcador bialélico detectado se ha identificado y especificado en la presente invención, la detección será simple para un experto en la técnica por el empleo de alguna de las técnicas. Muchos estudios de genotipificación requieren la amplificación previa de la región del ADN que lleva el marcador bialélico de interés. Si bien en la actualidad con frecuencia se prefiere la amplificación de un blanco o señal, los métodos de detección ultrasensibles que no requieren amplificación están también comprendidos por los presentes métodos de genotipificación. Los métodos bien conocidos por los expertos en la técnica que se pueden usar para detectar polimorfismos bialélicos incluyen métodos tales como, análisis de transferencia de mancha convencionales, análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP) descripto por Orita et al. (1989), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE), análisis de heteroduplex, detección de escisión de apareamiento erróneo y otras técnicas convencionales como se describen en Sheffield et al. (1991), White et al. (1992), Grompe et al. (1989 y 1993). Otro método para determinar la identidad del nucleótido presente en un sitio polimórfico particular emplea un derivado de nucleótido resistente a exonucleasa especializado como se describe en la Patente Estadounidense 4.656.127.

Los métodos preferidos incluyen directamente la determinación de la identidad del nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico por un ensayo de secuenciación, ensayo de detección apareamiento erróneo basado en enzimas o un ensayo de hibridación. La siguiente es una descripción de algunos métodos preferidos. Un método altamente preferido es la técnica de microsecuenciación. El término "secuenciación" se usa generalmente en la presente memoria para referirse la extensión de la polimerasa de los complejos de molde/cebador dúplex e incluye a la secuenciación y la microsecuenciación.

1) Ensayos de secuenciación

El nucleótido presente en un sitio polimórfico se puede determinar por métodos de secuenciación. En una realización preferida, las muestras de ADN se someten a la amplificación PCR antes de la secuenciación como se describió anteriormente. Los métodos de secuenciación de ADN se describen en "Secuenciación de ADN genómico amplificado e identificación de polimorfismos de nucleótido único".

Con preferencia, el ADN amplificado se somete a reacciones de secuenciación del terminador dideoxi automatizadas que usan un protocolo de secuenciación del ciclo cebado-colorante. El análisis de secuencia permite la identificación de la base presente en el sitio del marcador bialélico.

2) Ensayos de microsecuenciación

En los métodos de microsecuenciación, el nucleótido del sitio polimórfico de un ADN blanco se detecta por una reacción de extensión del cebador de nucleótido único. Este método incluye los cebadores de microsecuenciación apropiados que, hibridizan exactamente corriente arriba de la base polimórfica de interés del ácido nucleico blanco. Se usa una polimerasa para extender en forma específica el extremo 3' del cebador con un ddNTP único (terminador de cadena) complementario con el nucleótido en el sitio polimórfico. Luego se determina la identidad del nucleótido incorporado de cualquier manera adecuada.

Típicamente, las reacciones de microsecuenciación se llevan a cabo mediante ddNTP fluorescentes y los cebadores de microsecuenciación extendidos se analizan por electroforesis en máquinas de secuenciación ABI 377 para determinar la identidad del nucleótido incorporado descripto en EP 412 883, cuya revelación está incorporada en su totalidad en la presente memoria como referencia. Alternativamente se puede usar la electroforesis capilar para procesar un mayor número de ensayos simultáneamente. Un ejemplo de un procedimiento microsecuenciación que es adecuado para el uso en la presente invención se proporciona en el Ejemplo 4.

Se pueden usar diferentes enfoques para la marcación y detección de los ddNTP. Un método de detección de fase homogénea se basa en la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia ha sido descripto por Chen y Kwok (1997) y Chen et al. (1997). En este método, los fragmentos de ADN genómico amplificado que contienen sitios polimórficos se incuban en un cebador marcado con 5'-fluoresceína en presencia de trifosfatos de didesoxirribonucleósido alélicos marcados con colorante y una Taq polymerasa modificada. El cebador marcado con colorante se extiende una base por el terminador con colorante específico para el alelo presente en el molde. En el fin de la reacción de genotipificación, se analizan directamente las intensidades de fluorescencia de los dos colorantes de la mezcla de reacción sin separación o purificación. Todos estos pasos se pueden realizar en el mismo tubo y se pueden controlar los cambios de fluorescencia en tiempo real. Alternativamente, el cebador extendido se puede analizar por espectrometría de masas MALDITOF. La base del sitio polimórfico se identifica por la masa agregada en el cebador de microsecuenciación (ver Haff and Smirnov, 1997).

La microsecuenciación se puede obtener por el método establecido de microsecuenciación o por desarrollos o derivados del mismo. Los métodos alternativos incluyen varias técnicas de microsecuenciación en fase sólida. El protocolo de microsecuenciación básico es el mismo descripto previamente, excepto que el método se realiza como un ensayo de fase heterogénea, en la cual el cebador o la molécula blanco está inmovilizado o captura en un soporte sólido. Para simplificar la separación del cebador y el análisis de adición del nucleótido terminal, los oligonucleótidos están unidos a soportes sólidos o están modificados de manera tal que la separación de afinidad además de la extensión de polimerasa. Los extremos 5' y los nucleótidos internos de los oligonucleótidos sintéticos se pueden modificar en varias formas diferentes para permitir los métodos de separación de afinidad, por ej., biotinilación. Si un grupo de afinidad único se usa en los oligonucleótidos, los oligonucleótidos se pueden separar del reactivo terminador incorporado. Este elimina la necesidad de separación física o por tamaño. Más de un oligonucleótido se puede separar del reactivo terminador y analizar simultáneamente si se usa más de un grupo de afinidad. Esto permite el análisis varias especies de ácido nucleico o más información de secuencia de ácido nucleico por extensión de la reacción. El grupo de afinidad no necesita el cebado del oligonucleótido pero alternativamente podría estar presente en el molde. Por ejemplo, la inmovilización se puede realizar por medio de una interacción entre ADN biotinilado y los pocillos de micro-titulación recubierto con estreptavidina o partículas de poliestireno recubiertas con avidina. De la misma manera, los oligonucleótidos o moldes pueden estar unidos a un soporte sólido en un formato de alta densidad. En tales las reacciones de microsecuenciación en fase sólida, los ddNTP incorporados pueden estar radiomarcados (Syvanen, 1994) o unidos a fluoresceína (Livak and Hainer, 1994). La detección de los ddNTP radiomarcados se puede lograr mediante técnicas de centelleo. La detección de ddNTP unidos a fluoresceína se puede basar en la unión del anticuerpo de antifluoresceína conjugado con fosfatasa alcalina, seguido por la incubación con un sustrato cromogénico (tal como fosfato de p-nitrofenilo). Otros pares de detección-indicador posible incluyen: ddNTP unido a dinitrofenilo (DNP) y el conjugado de fosfatasa alcalina anti-DNP (Harju et al., 1993) o ddNTP biotinilado y estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante con o-fenilendiamina como sustrato (WO 92/15712). Como procedimiento inclusive alternativo de microsecuenciación en fase sólida, Nyren et al. (1993) se describe un método que depende de la detección de la actividad ADN polimerasa por un ensayo de detección de pirofosfato inorgánico luminométrico enzimático (ELIDA).

Pastinen et al. (1997) describe un método de detección multiplex de polimorfismo de nucleótido único en el cual el principio de minisecuenciación en fase sólida se aplica a un de formato de matriz de oligonucleótido. Las matrices de alta densidad de sondas de ADN unidas a un soporte sólido (chips de ADN) se detallan adicionalmente a continuación.

Son adecuados para el uso en la presente invención los polinucleótidos y métodos para genotipificar uno o más marcadores bialélicos de la presente invención por la realización de un ensayo de una microsecuenciación. Los cebadores de microsecuenciación preferidos incluir las secuencias de nucleótidos D1 a D18 y E1 a E18. Será apreciado que los cebadores de microsecuenciación listados en el Ejemplo 4 son simplemente ejemplos y que se puede usar cualquier cebador que tiene un extremo 3' inmediatamente adyacente al nucleótido polimórfico. De forma similar, se apreciará que el análisis de microsecuenciación se puede realizar para cualquier marcador bialélico o cualquiera de la combinación de marcadores bialélicos de la presente invención. Es adecuado para el uso en la presente invención un soporte sólido que incluye uno o más de los cebadores de microsecuenciación listados en el Ejemplo 4 o fragmentos que comprenden por lo menos 8, 12, 15, 20, 25, 30, 40, o 50 nucleótidos consecutivos del mismo, al punto que tales longitudes son compatibles con el cebador descripto y que tiene un término 3' inmediatamente corriente arriba del marcador bialélico correspondiente, para la determinación de la identidad de un nucleótido en un sitio del marcador bialélico.

3) Ensayos de detección de apareamientos erróneos basados en polimerasas y ligasas

Son adecuados para el uso en la presente invención los polinucleótidos y métodos para determinar el alelo de uno o más marcadores bialélicos de la presente invención en una muestra biológica, por medio de ensayos de detección de apareamientos erróneos basados en polimerasas y/o ligasas. Estos ensayos se basan en la especificidad de las polimerasas y ligasas. Las reacciones de polimerización tienen requerimientos particularmente rigurosos para el apareamiento de bases correcto del extremo 3' del cebador de amplificación y la unión de dos oligonucleótidos hibridizados a una secuencia de ADN blanco es relativamente sensible a los apareamientos erróneos cercanos al sitio de ligación, especialmente en el extremo 3'. Los métodos, cebadores y varios de los parámetros para amplificar fragmentos de ADN que comprenden marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se describieron anteriormente en "Amplificación de los fragmentos de ADN que comprenden marcadores bialélicos".

Cebadores de amplificación específica de alelos

La discriminación entre los dos alelos de un marcador bialélico se puede lograr también por la amplificación específica del alelo, una estrategia selectiva por la cual uno de los alelos se amplifica sin la amplificación del otro alelo. Para la amplificación específica del alelo, por lo menos un miembro del par de cebadores es suficientemente complementario con una región de un gen de CanIon que comprende la base polimórfica de un marcador bialélico de la presente invención para hibridizar con el mismo ye iniciar la amplificación. Tales cebadores pueden discriminar entre los dos alelos de un marcador bialélico.

Esto se obtiene al colocar la base polimórfica en el extremo 3' de uno de los cebadores de amplificación. Debido a que las formas de extensión del extremo 3' del cebador, un apareamiento erróneo en o cerca de esta posición tiene un efecto inhibitorio sobre la amplificación. En consecuencia, en condiciones de amplificación apropiadas, estos cebadores sólo dirigen la amplificación de su alelo complementario. La determinación de la localización precisa del apareamiento erróneo y las correspondientes condiciones de ensayo están dentro de la experiencia ordinaria de la técnica.

Métodos basados en ligación/amplificación

El "ensayo de ligación de oligonucleótidos" (OLA) emplea dos oligonucleótidos diseñados para poder hibridizar a secuencias adyacentes de una cadena simple de las moléculas blanco. Uno de los oligonucleótidos está biotinilado y el otro esta marcado en forma detectable. Si la secuencia complementaria precisa se halla en la molécula blanco, los oligonucleótidos se hibridizarán de modo que sus terminales colinden y creen un sustrato de ligación que pueda ser capturado y detectado. El OLA es capa de detectar polimorfismos de nucleótido único y se puede combinar ventajosamente con PCR como se describen Nickerson et al. (1990). En este método, se usa la PCR para obtener la amplificación exponencial del ADN blanco, que luego se detecta por OLA.

Otros métodos de amplificación particularmente adecuados para la detección de polimorfismo de nucleótido único incluye a LCR (reacción en cadena de ligasa), Gap LCR (GLCR) que se describieron anteriormente en "Amplificación de ADN". La LCR usa dos pares de sondas para amplificar en forma exponencial un blanco específico. Las secuencias de cada par de oligonucleótidos, se selecciona para permitir que el par hibridice a secuencias adyacentes de la misma cadena del blanco. Tal hibridación forma un sustrato de una ligasa dependiente del molde. La LCR se puede realizar con oligonucleótidos que tienen las secuencias proximales y distales de la misma cadena de un sitio del marcador bialélico. En una realización, se diseñará cada oligonucleótido para que incluya el sitio del marcador bialélico. En tal realización, las condiciones de reacción se seleccionan para que los oligonucleótidos se puedan ligar juntos solo si cada una de las moléculas blanco contiene o carece del nucléotido específico que es complementario con el marcador bialélico del oligonucleótido. En una realización alternativa, los oligonucleótidos incluirán el marcador bialélico, de modo que cuando estos se hibridizan con la molécula blanco, se crea una "brecha" como se describe en WO 90/01069. Esta brecha luego se llena con los dNTP complementarios (mediados por ADN polimerasa), o por un par de oligonucleótidos adicional. De esta manera al fin de cada ciclo, cada cadena simple presenta un complemento que puede actuar como blanco durante el próximo ciclo y se obtiene la amplificación específica de alelo exponencial de la secuencia deseada.

Ligase/Polymerase-mediated Genetic Bit Análisis^{TM} es otro método para determinar la identidad de un nucleótido en un sitio pre-seleccionado de una molécula de ácido nucleico (WO 95/21271). Este método incluye la incorporación de un trifosfato de nucléosido que es complementario con el nucleótido presente en el sitio pre-seleccionado en el extremo de una molécula de cebador y su ligación posterior a un segundo oligonucleótido. La reacción se monitorea por la detección de una marca específica unida a la fase sólida de la reacción o por detección en solución.

4) Métodos de ensayo de hibridación

Un método preferido para determinar la identidad del nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico incluye la hibridación del ácido nucleico. Las sondas de hibridación, que se pueden usar en forma conveniente en tales reacciones, con preferencia incluyen las sondas definidas en la presente memoria. Se puede usar cualquier ensayo de hibridación que incluye a hibridación Southern, hibridación Northern, hibridación sobre mancha e hibridación en fase sólida (ver Sambrook et al., 1989).

La hibridación se refiere a la formación de una estructura bicatenaria por medio de dos ácido nucleicos de cadena simple debida al apareamiento de bases complementarias. La hibridación se puede producir entre cadenas de ácido nucleico exactamente complementarias o entre cadena de ácido nucleico que contienen menos regiones de apareamientos erróneos. Se pueden diseñar sondas específicas que hibridizan a una forma del marcador bialélico y no a la otra y por consiguiente pueden discriminar entre formas alélicas diferentes. Las sondas específicas de alelo con frecuencia se usan de a pares, un miembro de un para que presenta un apareamiento perfecto con una secuencia blanco que contiene el alelo original y otra que presenta un apareamiento perfecto con una secuencia blanco que contiene el alelo alternativo. Las condiciones de hibridación deberán ser lo suficientemente rigurosas para que haya una diferencia significativa en la intensidad de hibridación entre los alelos, y con preferencia una respuesta esencialmente binaria, por la cual una sonda hibridiza a solo uno de los alelos. Las condiciones de rigurosidad de la hibridación específica de secuencia, en las cuales una sonda hibridizará sólo la secuencia blanco exactamente complementaria son bien conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989). Las condiciones de rigurosidad dependen de las secuencias y serán diferentes en circunstancias diferentes. Generalmente, las condiciones de rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC más bajo que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Si bien tal hibridación se puede realizar en solución, se prefiere emplear un ensayo de hibridación en fase sólida. El ADN blanco que comprende un marcador bialélico adecuado para el uso en la presente invención se puede amplificar antes de la reacción de hibridación. La presencia de un alelo específico en la muestra se determina por la detección de la presencia o ausencia de duplex híbridos estables formados entre la sonda y el ADN blanco. La detección de duplex híbridos se puede realizar por varios métodos. Varios formatos de ensayo de detección son bien conocidos que usan marcadores detectables unidos a cualquier blanco o la sonda que permite la detección de los duplex híbridos. Típicamente, los duplex de hibridación se separan de los ácido nucleicos no hibridizados y luego se detectan los marcadores unidos a los duplex. Los expertos en la técnica reconocerán que los pasos de lavado se pueden emplear para lavar el exceso del ADN o sonda blanco además del conjugado no unido. Además, los formatos de ensayo hetero-
géneos estándares son adecuados para detectar lo los híbridos mediante las marcas presentes en los cebadores y sondas.

Dos ensayos desarrollados recientemente permiten la discriminación de la hibridación basado en alelos sin necesidad de separaciones o lavados (ver Landegren U. et al., 1998). El ensayo TaqMan toma ventaja de la actividad nuclesa 5' de la Taq ADN polimerasa para digerir una sonda de ADN apareada e n forma específica al producto de amplificación acumulados. Las sondas de TaqMan están marcadas con un par de dador-aceptor de colorante que interactúa por medio de la transferencia de energía de fluorescencia. La escisión de la sonda TaqMan por el avance de la polimerasa durante la amplificación disocia el colorante del dador del colorante aceptor de inactivación, mayormente aumenta la fluorescencia del dador. Todos los reactivos necesarios para detectar dos variantes alélicas se puede ensamblar en el comienzo de la reacción y los resultados se monitorean en tiempo real (ver Livak et al., 1995). En un procedimiento basado en la hibridación homogénea alternativa, se usan balizas moleculares para las discriminaciones de los alelos. Las balizas moleculares son sondas de oligonucleótidos de forma de horquilla que indican la presencia de ácidos nucleicos específicos en soluciones homogéneas. Cuando éstas se unen a sus blancos sufren una reorganización conformacional que restaura la fluorescencia de un fluoróforo inactivado en forma interna (Tyagi et al., 1998).

Los polinucleótidos proporcionados en la presente memoria se pueden usar para producir sondas que se puede usar en ensayos de hibridación para la detección de los alelos del marcador bialélico en muestras biológicas. Estas sondas se caracterizan en que ellas con preferencia comprenden entre 8 y 50 nucleótidos, y en que ellas son suficientemente complementarias con la secuencia que comprende un marcador bialélico adecuado para el uso en la presente invención para hibridizar con la misma y con preferencia suficientemente específica para poder discriminar la secuencia seleccionada para solo una variación del nucleótido. Una sonda preferida particularmente de 25 nucleótidos de longitud. Con preferencia el marcador bialélico está dentro de 4 nucleótidos del centro de la sonda de polinucleótido. En particular sondas preferida, el marcador bialélico está en el centro de dicho polinucleótido. Las sondas preferidas comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los amplicones listados en la Tabla 1 y las secuencias complementarias de la misma o un fragmento del mismo, dicho fragmento que comprende por lo menos aproximadamente 8 nucleótidos consecutivos, con preferencia 10, 15, 20, con más preferencia 25, 30, 40, 47, o 50 nucleótidos consecutivos y que contienen una base polimórfica. Las sondas preferidas comprenden una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en P1 a P18 y las secuencias complementarias de las mismas. En realizaciones preferidas las bases(s) polimórfica(s) son 5, 4, 3, 2, 1, nucleótidos del centro de dicho polinucleótido, con más preferencia en el centro de dicho polinucleótido.

Con preferencia las sondas adecuadas para el uso en la presente invención están marcadas o inmovilizadas en un soporte sólido. Las marcas y los soportes sólidos se describen adicionalmente en "Sondas y cebadores oligonucleotídicos". las ondas pueden ser no extendibles tal como se describe en "Sondas y cebadores oligonucleotiídicos".

Por el ensayo de hibridación con una sonda específica de alelo, se puede detectar la presencia o ausencia de un alelo del marcador bialélico de una muestra dada. La hibridación paralela de alto rendimiento en formato de matriz está comprendida específicamente dentro de los "ensayos de hibridación" y se describen a continuación.

5) Hibridación a matrices dirigibles de oligonucleótidos

Los ensayos de hibridación basados en matrices de oligonucleótidos dependen de las diferencias de estabilidad de hibridación de los oligonucleótidos cortos a las variantes de secuencia blanco perfectamente apareadas y apareadas con errores. El acceso eficiente a la información del polimorfismo se obtiene mediante un a estructura básica que comprende matrices de alta densidad de sondas de oligonucleótidos unidas a un soporte sólido (por ej., el chip) en posiciones seleccionadas. Cada chip de ADN puede contener miles de millones de sondas de ADN sintético individuales dispuestas en un patrón tipo cuadrícula y miniaturizado al tamaño de una moneda de diez centavos.

La tecnología del chip ya ha sido aplicada con éxito en numerosos casos. Por ejemplo, la selección de mutaciones ha sido levada a cabo en el gen BRCA1, en cepas mutantes de S. cerevisiae, y en el gen de la proteasa del virus HIV-1 (Hacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996; Kozal et al., 1996). Los chips de varios formatos para usar en la detección de polimorfismos bialélicos se pueden producir sobre una base especializada de Affymetrix (GeneChip^{rfi}), Hyseq (HyChip and HyG-nostics), y Protogene Laboratories.

En general, estos métodos emplean matrices de sondas de oligonucleótidos que son complementarias con lo segmentos de la a secuencia del ácido nucleico blanco de un individuo cuyas secuencias blanco incluyen un marcador polimórfico. EP 785280 describe una estrategia de embaldosado genético (en el original, en inglés tiling) para la detección de polimorfismos de nucleótido único. Brevemente, las matrices generalmente se pueden "embaldosar" para dar un gran número de polimorfismos específicos. Por "embaldosado" generalmente se entiende a la síntesis de un conjunto definido de sondas de oligonucleótido que se componen de una secuencia complementaria con la secuencia blanco de interés, además de las variaciones preseleccionadas de esta secuencia, por ej., sustitución de una o más posiciones dadas con uno o más miembros del conjunto base de nucleótidos. Las estrategias de embaldosado se describen adicionalmente en la solicitud PCT No. WO 95/11995. En un aspecto particular, las matrices se embaldosan para varias secuencias específicas del marcador bialélico identificadas. En particular, la matriz se embaldosó para incluir el número de bloques de detección, cada bloque de detección es específico para un marcador bialélico específico o un conjunto de marcadores bialélicos. Por ejemplo, un bloque de detección se puede embaldosar para incluir varias sondas, que abarcan el segmento de secuencia que incluye un polimorfismo específico. Para asegurar que las sondas son complementarias con cada alelo, las sondas se sintetizan en pares que difieren en el marcador bialélico. Además de las sondas que difieren en la base polimórfica, las sondas monosustituidas generalmente también se embaldosaron dentro del bloque de detección. Estas sondas monosustituidas presentan bases en y más de cierto número de bases en cada dirección del polimorfismo, sustituidas con los nucleótidos restantes (seleccionados de A, T, G, C y U). Típicamente las sondas en un bloque de detección embaldosado incluirá sustituciones de las posiciones de la secuencia de hasta y que incluyen a las que tienen 5 fuera del marcador bialélico. Las sondas monosustituidas proporcionan controles internos para la matriz embaldosada para distinguir la hibridación real de la hibridación cruzada de tipo artefacto. Después de completar la hibridación con la secuencia blanco y lavado de la matriz, se realiza un barrido de la matriz para determinar la posición de la matriz en la cual se hibridiza la secuencia blanco. Los datos de hibridación de la matriz barrida luego se analiza para identificar que alelo o alelos de los marcador bialélicos están presentes en la muestra. La hibridación y barrido se puede llevar a cabo como se describe en la solicitud PCT No. WO 92/10092 y WO 95/11995 y la Patente Estadounidense No. 5.424.186.

De este modo en algunas realizaciones, los chips pueden comprender una matriz de secuencias de ácido nucleico de los fragmento de aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En realizaciones adicionales, el chip puede comprender una matriz que incluye por lo menos una de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en los amplicones listados en la Tabla 1 y las secuencias complementarias de las mismas, o un fragmento del mismo, dicho fragmento que comprende por lo menos aproximadamente 8 nucleótidos consecutivos, con preferencia 10, 15, 20, con más preferencia 25, 30, 40, 47 o 50 nucleótidos consecutivos y que contienen una base polimórfica. En realizaciones preferidas la base polimórfica es de 5, 4, 3, 2, 1, nucleótidos del centro de dicho polinucleótido, con más preferencia en el centro de dicho polinucleótido. En algunas realizaciones, el chip puede comprender una matriz de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más de estos polinucleótidos de la invención. Los soportes sólidos y polinucleótidos adecuados para el uso en la presente invención unidos a soportes sólidos se describen adicionalmente en "Sondas y cebadores de oligonucleótidos".

6) Sistemas Integrados

Otra técnica, que se puede usar para analizar polimorfismos, incluye a los sistemas integrados con multicomponentes, que miniaturizan y dividen en diferentes categorías a los procesos tales como reacciones de PCR y electroforesis capilar en un dispositivo funcional simple. Un ejemplo de tal técnica se revela en la Patente Estadounidense 5.589.136, que describe la integración de la amplificación por PCR y la electroforesis capilar en chips.

Los sistemas integrados se pueden considerar principalmente cuando se usan sistemas microfluídicos. Estos sistemas comprenden un patrón de microcanales diseñado en obleas de vidrio, silicio, cuarzo o plástico incluidas en un microchip. Los movimientos de las muestras están controlados por fuerzas eléctricas, electroosmóticas o hidrostáticas aplicadas a diferentes áreas del microchip para crear válvulas y bombas microscópicas funcionales sin partes móviles.

Para la genotipificación de los marcadores bialélicos, el sistema microfluídico puede integrar la amplificación, microsecuenciación, electroforesis capilar y un método de detección de ácido nucleico tal como detección de fluorescencia inducida por láser.

Métodos de análisis genético que utilizan los marcadores bialélicos de la presente invención

Están disponibles diferentes métodos para el análisis genético de los rasgos complejos (ver Lander and Schork, 1994). La búsqueda para determinar los genes sensibles a la enfermedad se realiza mediante dos métodos principales: el método del ligación en el cual se busca la evidencia de la cosegregación entre un locus y un locus del rasgo putativo mediante estudios familiares, y el método de asociación en el cual se busca la evidencia de la asociación estadísticamente significativa entre un alelo y un rasgo o un alelo que causa un rasgo (Khoury et al., 1993). En general, los marcadores bialélicos de la presente invención se usan en cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para demostrar una correlación estadísticamente significativa entre un genotipo y un fenotipo. Los marcadores bialélicos se pueden usar en métodos de ligación paramétricos y no paramétricos. Con preferencia, los marcadores bialélicos de la presente invención se usan para identificar a los genes asociados con rasgos detectables mediante estudios de asociación, un método que no requiere el uso de familias afectadas y que permite la identificación de genes asociados con rasgos complejos y esporádicos.

El análisis genético mediante los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se puede realizar en cualquier escala. Se puede usar el conjunto completo de marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención o cualquier subconjunto de los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención correspondiente al gen candidato. Además, se puede usar cualquier conjunto de marcadores genéticos que incluyen un marcador bialélico adecuado para el uso en la presente invención. Un conjunto de polimorfismos bialélicos que podían usar como marcadores genéticos en combinación con los marcadores bialélicos de la presente invención ha sido descripto en WO 98/20165. Como se mencionó anteriormente, se debe advertir que los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se pueden incluir en cualquier mapa genético completo o parcial del genoma humano. Estos usos diferentes están contemplados en la presente invención y reivindicaciones.

Análisis de conexión

El análisis de conexión se basa en el establecimiento de una correlación entre la transmisión de los marcadores genéticos y la de un rasgo específico a lo largo de las generaciones de una familia. De este modo, el propósito del análisis de conexión es para detectar los locus del marcador que presentan cosegregación con un rasgo de interés en los linajes.

Métodos paramétricos

Cuando los datos de generaciones sucesivas están disponibles hay una oportunidad para estudiar el grado de conexión entre los pares de loci. Los estimados de la fracción de recombinación permiten que los loci se ordenen y coloquen en un mapa genético. Con los loci que son marcadores genéticos, se puede establecer un mapa genético y luego se puede calcular la intensidad de ligación entre marcadores y rasgos y también se usa para indicar las posiciones relativas de los marcadores y genes que afectan a estos rasgos (Weir, 1996). El método clásico para el análisis del conexión es el logaritmo del método de puntuación de probabilidades (lod) (ver Morton, 1955; Ott, 1991). El cálculo de las puntuaciones lod requiere la especificación del modo de herencia para la enfermedad (método paramétrico). Generalmente, la longitud de la región candidata identificada mediante análisis del conexión está entre 2 y 20 Mb. Una vez que se identifica una región candidata como se describió anteriormente, el análisis de individuos recombinantes mediante marcadores adicionales permite la delineación adicional de la región candidata. Los estudios del análisis de conexión generalmente han dependido del uso de un máximo de 5.000 marcadores microsatélite, de este modo se limita la resolución alcanzable teórica máxima del análisis de conexión a aproximadamente 600 kb en promedio.

El análisis del ligación se ha aplicado en forma exitosa a los rasgos genéticos simples de un mapa que muestran patrones de herencia Mendeliana clara y que tienen una alta penetrancia (es decir, la proporción entre el número de vehículos de rasgos positivos de un alelo y el número total de un vehículo en la población). Sin embargo, el análisis del ligación paramétrico sufre de una variedad de inconvenientes. Primero, está limitado por su dependencia de la elección de un modelo genético adecuado para cada rasgo estudiado. Además, como ya se mencionó, la resolución alcanzable mediante el análisis de conexión está limitada y se requieren estudios complementarios para refinar el análisis de las regiones típicas de 2 Mb a 20 Mb identificadas inicialmente por medio del análisis de conexión. Además, se ha comprobado que los métodos del análisis de conexión paramétrico son difíciles cuando se aplican a rasgos genéticos complejos, tal como los debidos a la acción combinada de los genes múltiples y/o factores ambientales. Es muy difícilbasar estosfactores adecuadamente en el análisis de puntuación lod. En tales casos, se necesitan demasiado esfuerzo y costo para reclutar el número adecuado de familias afectadas que se requiere para aplicar el análisis de conexión en estas situaciones, como recientemente fue descripto por Risch and Merikangas (1996).

Métodos no paramétricos

La ventaja de los llamados métodos no paramétricos para el análisis de conexión es que estos no requieren especificación del modo de herencia para la enfermedad, estos tienden a ser más útiles para el análisis de rasgos complejos. En los métodos no paramétricos, se trata de comprobar que el patrón de herencia de una región cromosómica no es compatible con la segregación mendeliana al azar mediante la demostración de que los parientes afectados heredan copias idénticas de la región con más frecuencia que la esperada por casualidad. Los parientes afectados deberán mostrar exceso de "alelo compartido" incluso en presencia de penetrancia incompleta y herencia poligénica. En el análisis de conexión no paramétrico, se puede medir el grado de acuerdo con un locus del marcador en dos individuos por el número de alelos de estado idéntico (IBS) o por el número de alelos por ascendencia (BD). El análisis del par de hermanos afectados es un caso especial bien conocido y es la forma más simple de estos métodos.

Los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se pueden usar para el análisis de conexión tanto paramétrico como no paramétrico. Con preferencia, los marcadores bialélicos se pueden usar en métodos no paramétricos que permiten el mapeo de los genes involucrados en los rasgos complejos. Los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se pueden usar en métodos BD- e IBS- para mapear genes que afectan un rasgo complejo. En tales estudios, se aprovecha la alta densidad de los marcadores bialélicos, varios loci de marcadores bialélicos adyacentes se mezclan para lograr la eficiencia alcanzada por los marcadores multialélicos (Zhao et al., 1998)

Estudios de asociación de población

La presente invención comprende métodos para identificar si el gen de CanIon está asociado con un rasgo detectable que emplea los marcadores bialélicos de la presente invención. En una realización la presente invención comprende el método para detectar una asociación entre un alelo del marcador bialélico o un haplotipo del marcador bialélico y un rasgo. Además, la invención comprende métodos para identificar un rasgo que causa alelo es desequilibrio de unión con cualquier alelo del marcador bialélico de la presente invención.

Como se describió anteriormente, se pueden emplear métodos alternativos para realizar estudios de asociación: estudios de asociación del genoma amplio, estudios de asociación de la región candidata y estudios de asociación del gen candidato. En una realización preferida, los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se usan para realizar estudios de asociación del gen candidato. El análisis del gen candidato proporciona claramente un método "de atajo" para la identificación de genes y polimorfismos de genes relacionados con un rasgo particular cuando se dispone de algo de información concerniente a la biología del rasgo. Además, los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se pueden incorporar en cualquier mapa de marcadores genéticos del genoma humano con el fin de realizar estudios de asociación de genoma amplio. Los métodos para generar un mapa de alta densidad de marcadores bialélicos ha sido descripto en la solicitud de Patente Estadounidense Provisional serie número 60/082,614. Los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención puede estar además incorporado en un algún mapa de una región candidata específica del genoma (un cromosoma específico o un segmento cromosómico específico, por ejemplo).

Como se mencionó anteriormente, los estudios de asociación se pueden realizar en la población general y no están limitados a los estudios realizados en individuos relacionados en las familias afectadas. Los estudios de asociación son extremadamente valiosos ya que ellos permiten el análisis de rasgos esporádicos o multifactoriales. Además, los estudios de asociación constituyen un poderoso método de mapeo de pequeña escala que permite un mapeo mucho más detallado de los rasgos que causan alelos que los estudios de ligación. Los estudios basados en linajes con frecuencia solo estrechan la localización del rasgo que origina el alelo. Los estudios de asociación que usan los marcadores bialélicos de la presente invención por consiguiente se pueden usar para refinar la localización de un rasgo que origina el alelo en una región candidata identificada por los métodos de análisis de ligación. Además, una vez que se ha identificado el segmento del cromosoma de interés, la presencia de un gen candidato tal como un gen candidato de la presente invención, en la región de interés puede proporcionar un "atajo" para la identificación del rasgo que origina el alelo. Los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se pueden usar para demostrar que un gen candidato esta asociado con un rasgo. Tales usos están específicamente contemplados en la presente invención.

Determinación de la frecuencia de un marcador bialélico o de un haplotipo de un marcador bialélico de una población

Los estudios de asociación exploran las relaciones entre las frecuencias para los conjuntos de alelos entre locus.

Determinación de la frecuencia de un alelo de una población

Las frecuencias alélicas de los marcadores bialélicos de la poblaciones se pueden determinar mediante uno de lo métodos descriptos anteriormente bajo el título "Métodos para la genotipificación de un individuo para marcadores bialélicos", o cualquier procedimiento adecuado de genotipificación destinado a este propósito. La genotipificación de las muestras combinadas o las muestras individuales puede determinar la frecuencia de un alelo de un marcador bialélico de una población. Una forma de reducir el número de genotipificaciones requeridas es usar muestras combinadas. El principal obstáculo de usar mezclas combinadas está en términos de precisión y reproducibilidad para determinar las concentraciones exactas de ADN para la preparación de las mezclas. La genotipificación de las muestras individuales proporciona mayor sensibilidad, reproducibilidad y precisión y; es el método preferido usado en la presente invención. Con preferencia, cada individuo se genotipifica en forma separada y se aplica el recuento de genes únicos para determinar la frecuencia de un alelo de un marcador bialélico o un genotipo de una población dada.

Son adecuados para usar en la invención los métodos de estimación de la frecuencia de un alelo de una población que comprende:

a) genotipificar a los individuos de dicha población para dicho marcador bialélico de acuerdo con el método de la presente invención;

b) determinar la representación proporcional de dicho marcador bialélico en dicha población. Además, los métodos de estimación de la frecuencia de un alelo en una población de la invención abarca métodos con alguna limitación descripto en esta revelación o las especificadas solas o en alguna combinación; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relaciona do con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A17, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A12 y A16, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; Opcionalmente, determinar la frecuencia de un alelo del marcador bialélico en una población se puede lograr por la determinación de la identidad de los nucleótidos para ambas copias de dicho marcador bialélico presente en el genoma de cada individuo en dicha población y el cálculo de la representación proporcional de dicho nucleótido en dicho marcador bialélico relacionado con CanIon para la población; opcionalmente, determinar la representación proporcional se puede lograr mediante la realización de un método de genetipificación de la invención de una muestra biológica combinada derivada de un número representativo de individuos, o cada individuo, en dicha población y el cálculo de una cantidad proporcional de dicho nucleótido comparado con el total.

Determinación de la frecuencia de un haplotipo en una población

Se desconoce la fase gamética de los haplotipos cuando los individuos diploides son heterócigos en más de un locus. Mediante la información genealógica algunas veces se puede inferir la fase gamética de las familias (Perlin et al., 1994). Cuando la información genealógica no está disponible se pueden usar diferentes estrategias. Una posibilidad es que los diploides heterócigos de sitios múltiples se puede eliminar del análisis, manteniendo sólo los individuos homocigotas y los heterocigotas de sitio único, pero este método podría conducir a un posible sesgo de la composición de la muestra y a la subestimación de los haplotipos de baja frecuencia. Otra posibilidad es que los cromosomas únicos se pueden estudiar en forma independiente, por ejemplo, por amplificación de PCR asimétrica (ver Newton et al, 1989; Wu et al., 1989) o por aislamiento de los cromosomas únicos por dilución límite seguida por amplificación PCR (ver Roane et al., 1990). Además, una muestra se puede tipificar en haplotipos para obtener marcadores bialélicos suficientemente cercanos por la amplificación doble por PCR de los alelos específicos (Sarkar, G. y Sommer S. S., 1991). Estos métodos no son plenamente satisfactorios debido a su complejidad técnica, el costo adicional que suponen, su falta de generalización a gran escala o los posibles sesgos que ellos introducen. Para superar estas dificultades, se puede usar un algoritmo para inferir la fase de los genotipos de ADN amplificados por PCR introducido por Clark, A.G. (1990). En breves palabras, el principio es comenzar a llenar en forma preliminar una lista de haplotipos presentes en la muestra por medio del examen de individuos inequívocos, o sea, homocigotas completos y heterocigotas de sitio único. Luego se seleccionaron otros individuos de la misma muestra para hallar la posible aparición de haplotipos previamente reconocidos. Para cada identificación positiva, se agrega el haplotipo complementario a la lista de haplotipos reconocidos hasta que fase de información para todos los individuos sea resuelta o identificada como no resuelta. Este método asigna un haplotipo único a cada multiheterocigota, mientras que varios haplotipos sean posibles cuando hay más de un sitio heterocigota. Alternativamente, se pueden usar métodos que estiman las frecuencias de haplotipos en una población sin asignación de haplotipos a cada individuo. Con preferencia, se usa un método basado en un algoritmo de expectativa-maximización (EM) (Dempster et al., 1977) que conduce a los estimados de probabilidad máxima de las frecuencias de haplotipos bajo la suposición de las proporciones de Hardy-Weinberg (apareamiento al azar) (ver Excoffier L. y Slatkin M., 1995). El algoritmo EM es un método de probabilidad máxima iterativa generalizada para la estimación que es útil cuando los datos son ambiguos y/o incompletos. El algoritmo EM se usa para resolver heterocigotas en haplotipos. Las estimaciones de haplotipos se describen adicionalmente bajo le título "Métodos estadísticos" Se puede usar cualquiera de los otros métodos conocidos en la técnica para determinar o estimar la frecuencia de un haplotipo en una población.

La estimación de la frecuencia de un haplotipo para un conjunto de marcadores bialélicos en una población, comprende los pasos de: a) genotipificar por lo menos un marcador bialélico relacionado con CanIon de acuerdo con el material de acuerdo de la invención para cada individuo en población; b) genotipificar un segundo marcador bialélico por la determinación de la identidad de los nucleótidos en dicho segundo marcador bialélico para ambas copias de dicho segundo marcador bialélico presente en el genoma de cada individuo de dicha población; y c) aplicar un método de determinación de haplotipos para las identidades de los nucleótidos determinados en los pasos a) y b) para obtener un estimado de dicha frecuencia. Además, los métodos de estimación de la frecuencia de un haplotipo de la invención comprenden métodos con alguna limitación descriptos en esta revelación, o los siguientes especificado solos o en alguna combinación: opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A17, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A12 y A16, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicho método de determinación de haplotipo se realiza por amplificación por PCR asimétrica, amplificación por PCR doble de alelos específicos, el algoritmo de Clark o un algoritmo de expectativa-maximización.

Análisis del desequilibrio de conexión

El desequilibrio de conexión es la asociación no aleatoria de los alelos en dos o más locus y representa una poderosa herramienta para el mapeo de genes involucrados de los rasgos de enfermedad (ver Ajioka R.S. et al., 1997). Los marcadores bialélicos, debido a que están son densamente espaciados en el genoma humano y se pueden genotipificar en números mayores que otros tipos de marcadores genéticos (tales como marcadores RFLP o VNTR), son particularmente útiles en los análisis genéticos basados en el desequilibrio de conexión.

Cuando una mutación de la enfermedad se introduce primero en una población (por una mutación nueva o la inmigración de un vehículo de mutación), estas necesariamente reside en un cromosoma único y de este modo un haplotipo único "antecedente" o "ancestral" de los marcadores conectados. Por consiguiente, el desequilibrio completo es simple entre estos marcadores y la mutación de la enfermedad: se halla la mutación de la enfermedad solo en presencia de un conjunto específico de alelos marcadores. A través de sucesivas generaciones se producen los eventos de recombinación entre la mutación de enfermedad y estos polimorfismos marcadores, y el desequilibrio se disipa gradualmente. El ritmo de esta disipación es una función de la frecuencia de recombinación, de modo que los marcadores más cercanos al gen de la enfermedad manifestarán niveles superiores de desequilibrio que los que están más lejos. Cuando no se alteran por la recombinación, los haplotipos "ancestrales" y el desequilibrio de conexión entre los alelos marcadores en diferentes locus se puede seguir el rastro no solo a través de los linajes sino también a trasvés de poblaciones. El desequilibrio de conexiones usualmente se considera como una asociación entre un alelo específico en un locus y otro alelo específico en un segundo locus.

Se espera que el patrón o curva de desequilibrio entre la mutación de la enfermedad y locus del marcador presenten un máximo que se produce en el locus de la enfermedad. Por consiguiente, la proporción de desequilibrio de conexión entre un alelo de la enfermedad y los marcadores genéticos estrechamente ligados puede producir información valiosa con respecto al localización del gen de la enfermedad. Para el mapeo de pequeña escala de un locus de la enfermedad, es útil tener algún conocimiento de los patrones de desequilibrio de conexión que existe entre los marcadores en la región estudiada. Como se mencionó anteriormente la resolución del mapeo obtenida mediante el análisis del desequilibrio de conexión es mucho mayor que la de los estudios de conexión. La alta densidad de los marcadores bialélicos combinada con el análisis de desequilibrio de conexión proporciona herramientas poderosas para el mapeo de pequeña escala. Diferentes métodos para calcular el desequilibrio de conexión se describen más adelante bajo el título "Métodos estadísticos".

Estudios de control de casos basados en la población de asociaciones de marcadores de rasgos

Como se mencionó anteriormente, la aparición de pares de alelos específicos en diferentes locus en el mismo cromosoma no es al azar y la desviación respecto del azar se llama desequilibrio de conexión. Los estudios de asociación se centran en las frecuencias de la población y dependen del fenómeno del desequilibrio de conexión. Si un alelo específico en un gen dado está directamente involucrado en el origen de rasgo particular, su frecuencia aumentará en forma estadística en una población afectada (rasgo positivo), cuando se compara con la frecuencia en una población con rasgo negativo o en una población control aleatoria. Como consecuencia de la existencia del desequilibrio de conexión, la frecuencia de todos los otros alelos presentes en el haplotipo que porta el alelo causante del rasgo también aumentará en individuos con rasgo positivo en comparación con los individuos con rasgo negativo o controles aleatorios. Por eso, la asociación entre el rasgo y algún alelo (específicamente un alelo del marcador bialélico) en el desequilibrio de conexión con el alelo causante del rasgo bastará para sugerir la presencia de un gen relacionado con el rasgo en esa región particular. Las poblaciones de casos y controles se puede genotipificar para hallar los marcadores bialélicos para identificar asociaciones que se ubican casi en el alelo causante del rasgo. Cualquier marcador en desequilibrio de conexión con un marcador dado asociado con un rasgo estará asociado con el rasgo. El desequilibrio de conexión permite analizar las frecuencias relativas en poblaciones de casos y controles de un número limitado de polimorfismos genéticos (específicamente marcadores bialélicos) como una alternativa para la detección de todos los polimorfismos funcionales posibles con el fin de hallar alelos causantes del rasgo. Los estudios de asociación comparan la frecuencia de los alelos de los marcadores en poblaciones de casos y controles no relacionados y representan herramientas poderosas para la disección de los rasgos complejos.

Poblaciones de control de casos (criterios de inclusión)

Los estudios de asociación basados en poblaciones no se ocupan de la herencia familiar pero comparan la prevalencia de un marcador genético particular, o un conjunto de marcadores, en poblaciones de control de casos. Estos son estudios de control de casos que se basan en la comparación de casos de individuos no relacionados (afectados o con rasgo positivos) e individuos control no relacionados (no afectados, con rasgo negativo o al azar). Con preferencia, el grupo control está compuesto de individuos no afectados, o con rasgo negativo. Además, el grupo control es comparativo desde el punto de vista étnico con la población del caso. Además, el grupo control con preferencia se aparea con la población de caso con respecto al principal factor de confusión conocido para el rasgo en estudio (por ejemplo apareado por edad para un rasgo dependiente de la edad). En forma ideal, los individuos de las dos muestras se aparean de modo tal que solo difieren en sus estados de enfermedad. Los términos "población con rasgo positivo", "población del caso" y "población afectada" se usan de forma indistinta en la presente memoria.

Un paso importante en la disección de los rasgos complejos mediante los estudios de asociación es la elección de las poblaciones de control de casos (ver Lander and Schork, 1994). Un paso principal de la elección de las poblaciones de control de casos es la definición clínica de un rasgo o fenotipo dado. Cualquier rasgo genético se puede analizar por el método de asociación propuesto aquí por medio de la selección cuidadosa de los individuos que se incluirán en los grupos fenotípicos con rasgo positivo y con rasgo negativo. Con frecuencia son útiles cuatro criterios: fenotipo clínico, edad del comienzo, antecedentes familiares y gravedad. El procedimiento de selección para los rasgos continuos o cuantitativos (tales como presión sanguínea por ejemplo) incluye la selección de individuos en los extremos opuestos de la distribución fenotípica del rasgo en estudio, de modo que incluya a estas poblaciones con rasgos positivos y rasgos negativos con fenotipos no superpuestos. Con preferencia, las poblaciones de control de casos comprenden poblaciones fenotípicamente homogéneas. Las poblaciones con rasgos positivos y rasgos negativos comprenden poblaciones fenotípicamente uniformes de individuos representando cada uno entre 1 y 98%, con preferencia entre 1 y 80%, con más preferencia entre 1 y 50%, y con más preferencia entre 1 y 30%, con mayor preferencia entre 1 y 20% de la población total en estudio, y con preferencia seleccionada entre los individuos que exhiben fenotipos no superpuestos. Cuando la diferencia es más clara entre los dos rasgos fenotípicos, mayor es la probabilidad de detectar una asociación con los marcadores bialélicos. La selección de estos fenotipos extremadamente diferentes pero relativamente uniformes permite las comparaciones eficientes en los estudios de asociación y la posible detección de diferencias marcadas a nivel genético, siempre que los tamaños de las muestras de las poblaciones en estudio sean de suficiente significación.

En realizaciones preferidas, un primer grupo de entre 50 y 300 individuos con rasgo positivo, con preferencia aproximadamente 100 individuos, se reclutan de acuerdo con sus fenotipos. Se incluye un número similar de individuos control en tales estudios.

Análisis de asociación

La invención también comprende los métodos de detección de la asociación entre un genotipo y un fenotipo, que comprende los pasos de: a) determinar la frecuencia de por lo menos un marcador bialélico relacionado con CanIon en una población con rasgo positivo de acuerdo con un método de genotipificación de la invención; b) determinar la frecuencia de dicho marcador bialélico relacionado con CanIon en una población control de acuerdo con un con un método de genotipificación de la invención; y c) determinar si existe una asociación estadísticamente significativa entre dicho genotipo y dicho fenotipo. Además, los métodos de detección de una asociación entre un genotipo y un fenotipo de la invención abarcan los métodos con alguna limitación descriptos en esta revelación o los siguientes especificados solo o en alguna combinación: opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A17, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A12 y A16, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicha población puede ser una población con rasgo negativo o una población al azar; opcionalmente, cada uno de dichos pasos de genotipificación a) y b) se pueden realizar una muestra biológica combinada derivada de cada una de dichas poblaciones; cada uno de dichos pasos de genotipificación a) y b) se pueden realizar en forma separada en muestras biológicas derivadas de cada individuo en dicha población o una submuestra del mismo.

La estrategia general para realizar los estudios de asociación mediante marcadores bialélicos derivados de una región que porta un gen candidato es para barrer dos grupos de individuos (poblaciones de control de casos) con el fin de medir y comparar estadísticamente las frecuencias de los alelos de los marcadores bialélicos de la presente invención en ambos grupos.

Si se identifica una asociación estadísticamente significativa con un rasgo para por lo menos una o más de los marcadores bialélicos analizados, se puede asumir que: el alelo asociado es directamente responsable para causar el rasgo (es decir, el alelo asociado es alelo causante del rasgo), o más probablemente el alelo asociado está en desequilibrio de conexión con el alelo causante del rasgo. Las características específicas del alelo asociado con respecto a la función del gen candidato usualmente brindan una comprensión adicional de la relación entre el alelo asociado y el rasgo (causal o en desequilibrio de conexión). Si la evidencia indica que el alelo asociado dentro del gen candidato es más probablemente no el alelo que causa el rasgos sino está en desequilibrio de conexión con el rasgo real del alelo que causa el rasgo, luego el alelo que causa el rasgo se puede hallar por secuenciación de la vecindad del marcador asociado y se realiza estudios de asociación adicional con los polimorfismos que se revelan de una manera iterativa.

Los estudios de asociación usualmente se ejecutan en dos pasos sucesivos. En una primera fase, las frecuencias de un número reducido de marcadores bialélicos del gen candidato se determinan en las poblaciones con rasgo positivo y control. En una segunda fase del análisis, la posición de los locus genéticos responsables para el rasgo dado que se refina adicionalmente mediante una densidad superior densidad de marcadores de la región relevante Sin embargo si el gen candidato en estudio es relativamente pequeño de longitud, como en el caso de CanIon, puede ser suficiente una fase única para establecer asociaciones significativas.

Análisis de haplotipos

Como se describió anteriormente, cuando un cromosoma que porta un alelo de la enfermedad primero aparece en una población como resultado de una mutación o migración, el alelo mutante necesariamente reside en un cromosoma que tiene un conjunto de marcadores ligados: el haplotipo ancestral. Este haplotipo se puede rastrear través de poblaciones y se puede analizar su asociación estadística con un rasgo dado. La complementación de los estudios de asociación de punto único (alélico) con los estudios de asociación de puntos múltiples también llamado estudios de haplotipos aumenta el poder estadístico de los estudios de asociación. De ese modo, un estudio de asociación de haplotipos permite definir la frecuencia y el tipo del haplotipo portador ancestral. Un análisis de haplotipo es importante ya que aumenta el poder estadístico de un análisis que incluye a los marcadores individuales.

En una primera etapa de un análisis de frecuencia de haplotipo, se determina la frecuencia de los posibles haplotipos sobre la base de diferentes combinaciones de los marcadores bialélicos identificados de la invención. La frecuencia de haplotipos luego se compara con las distintas poblaciones de individuos con rasgos positivos y controles. El número de individuos con rasgos positivos, que se deben someter a este análisis para obtener resultados estadísticamente significativos usualmente varía entre 30 y 300, con un número preferido de individuos que varía entre 50 y 150. Las mismas consideraciones se aplican al número de individuos no afectados (o control al azar) usado en este estudio. Los resultados de este primer análisis proporciona las frecuencias de haplotipo en las poblaciones de casos y controles, para cada frecuencia de haplotipo evaluada se calculan un valor p y una relación de probabilidades. Si se halla una asociación estadísticamente significativa se puede aproximar el riesgo relativo para un individuo que porta el haplotipo dado de un ser afectado con el rasgo en estudio.

Los métodos de detección de una asociación entre un haplotipo y un fenotipo comprende los pasos de: a) estimar la frecuencia de por lo menos un haplotipo en una población con rasgo positivo, de acuerdo con un método de la invención para estimar la frecuencia de un haplotipo; b) estimar la frecuencia de dicho haplotipo en una población control, de acuerdo con el método de la invención para estimar la frecuencia de un haplotipo y c) determinar si existe una asociación estadísticamente significativa entre dicho haplotipo y dicho fenotipo. Además, los métodos para detectar una asociación entre un haplotipo y un fenotipo de la invención abarcan los métodos con alguna limitación adicional descripta en esta revelación, o los siguientes: opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A1 a A17, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, donde dicho marcador bialélico relacionado con CanIon se selecciona del grupo que consiste en A12 y A16, y los complementos del mismo, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con el mismo; opcionalmente, dicha población control es una población con rasgo negativo, o una población al azar. Opcionalmente, dicho método comprende los pasos adicionales de la determinación del fenotipo en dicha población con rasgo positivo y dichas poblaciones control antes del paso c).

Análisis de interacciones

Los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se pueden usar también para identificar patrones de los marcadores bialélicos asociados con rasgos detectables que resultan de las interacciones poligénicas. El análisis de la interacción genética entre los alelos en loci no conectados requiere la genotipificación del individuo mediante las técnicas descriptas en la presente memoria. El análisis de la interacción alélica entre un conjunto seleccionado de marcadores bialélicos con un nivel apropiado de significación estadística se puede considerar como un análisis de haplotipos. El análisis de la interacción comprende la estratificación de las poblaciones de casos y controles con respecto a un haplotipo dado para el primer locus y la realización del análisis de haplotipo con el segundo locus con cada subpoblación.

Los métodos estadísticos usados en los estudios de asociación se describen adicionalmente a continuación.

Pruebas de conexión en presencia de asociación

Los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención se pueden usar adicionalmente en TDT (prueba de transmisión/desequilibrio). Las pruebas de TDT para la conexión y la asociación no están afectadas por la estratificación de la población. La TDT requiere datos para los individuos afectados y sus progenitores o datos de hermanos no afectados en vez de los progenitores (ver Spielmann S. et al., 1993; Schaid D.J. et al., 1996, Spielmann S. and Ewens W.J., 1998). Tales pruebas combinadas generalmente reducen los errores falsos positivos producidos por análisis separado.

Métodos estadísticos

En general, se pueden usar cualquier método conocido en la técnica para probar si un rasgo y un genotipo muestra una correlación estadísticamente significativa.

1) Métodos de análisis de conexión

Los métodos estadísticos y los programas de computación útiles para el análisis de ligación son bien conocidos por los expertos en la técnica (ver Terwilliger J.D. and Ott J., 1994; Ott J., 1991).

2) Métodos para estimar las frecuencias de haplotipos en una población

Como se describió anteriormente, cuando se clasifican los genotipos, con frecuencia no es posible distinguir heterocigotas de modo que las no se pueden inferir fácilmente las frecuencias del haplotipo. Cuando no se conoce la fase gamética, se pueden estimar las frecuencias del haplotipo a partir de los datos genotípicos del multilocus. Se puede usar cualquier método conocido por los expertos en la técnica para estimar las frecuencias del haplotipo (ver Lange K., 1997; Weir, B.S., 1996). Con preferencia, las frecuencias del haplotipo de probabilidad máxima se computan mediante un algoritmo de expectativa-maximización (EM) (ver Dempster et al., 1977; Excoffier L. y Slatkin M., 1995). Este procedimiento es un proceso iterativo que se propone obtener estimados de probabilidad máxima de las frecuencias del haplotipo de los datos del genotipo del multi-locus cuando la fase gamética es desconocida. Las estimaciones del haplotipo se realizan usualmente por la aplicación de un algoritmo EM que usa por ejemplo el programa EM-HAPLO (Hawley M. E. et al., 1994) o el programa Arlequin (Schneider et al., 1997). El algoritmo EM es un método de estimación iterativo generalizado para calcular probabilidad máxima que se describe brevemente a continuación.

Se advierte que en la presente sección, "Métodos para estimar frecuencias de haplotipo en una población" los fenotipos se referirán a los genotipos de locus múltiples con una fase haplotípica desconocida. Los genotipos se referirán a los genotipos de locus múltiples con una fase haplotípica desconocida.

Suponga que se tiene una muestra de N individuos no relacionados tipificados para los marcadores K. Los datos observados son de los fenotipos del locus K de la fase desconocida que se pueden clasificar con fenotipos F diferentes. Además, suponga que tenemos haplotipos posibles H (en el caso de los marcadores bialélicos K, nosotros tenemos el número máximo de haplotipos posibles H= 2^{K}).

fenotipo j con c_{j} genotipos posibles, nosotros tenemos:

Ecuación 1P_{j} = \sum\limits^{c_{j}}_{i=1} P (genotipo(i)) = \sum\limits^{c_{j}}_{i=1} P (h_{k},h_{l}).

donde P_{j} es la probabilidad del fenotipo f^{th} y P(h_{k},h_{l}) es la probabilidad del genotipo compuesto de los haplotipos h_{k} y h_{l}. Bajo apareamiento al azar (es decir, equilibrio de Hardy-Weinberg), P(h_{k}h_{l}) se expresa como:

\quad

P(h_{k},h_{l}) = P(h_{k})^{2} \ para \ h_{k} = h_{l},

\hskip0.1cm

P(h_{k},h_{l}) = 2P(h_{k}) P(h_{l}) \ para \hskip0.1cm h_{k} \neq h_{l}.: Ecuación 2

El algoritmo EM esta compuesto de los siguientes pasos: primero, se estiman las frecuencias del genotipo a partir de un conjunto de valores iniciales de frecuencias de haplotipo. Estas frecuencias de haplotipo se indican P_{1}^{(0)}, P_{2}^{(0)}, P_{3}^{(0)},.... P_{H}^{(0)}. Los valores iniciales para las frecuencias de haplotipo se pueden obtener a partir de un número generador aleatorio o de alguna otra manera bien conocida en la técnica. Este paso se refiere al paso de Expectativa. El próximo paso del método, llamado paso de Maximización, consiste en usar los estimados para las frecuencias de genotipos para recalcular las frecuencias de haplotipo. Los primeros estimados de la frecuencia de haplotipo por iteración se indican como P_{1}^{(1)}, P_{2}^{(1)}, P_{3}^{(1)},.... P_{H}^{(1)}. En general, el paso de Expectativa en la enésima iteración consiste en el cálculo de la probabilidad de colocar cada fenotipo en los diferentes genotipos posibles basados en las frecuencias de haplotipo de la iteración previa:

Ecuación 3P(h_{k},h_{l})^{(s)} = \frac{n_{j}}{N} \left[\frac{P_{j}(h_{k},h_{l})^{(s)}}{P_{j}}\right],

donde n_{j}, es el número de individuos con el fenotipo f^{th} y P_{j} (h_{k}, h_{l})^{(s)} es la probabilidad del genotipo h_{k}, h_{l} en el fenotipo j. En el paso de Maximización, que es equivalente al método de recuento de genes (Smith, Ann. Hum. Genet., 21:254-276, 1957), las frecuencias de haplotipo se reestiman sobre la base de los estimados del genotipo:

Ecuación 4P_{l}{}^{(s+1)} = \frac{1}{2} \sum\limits^{F}_{j=1} \ \sum\limits^{c_{j}}_{i=1} \delta_{it} P_{j} (h_{k},h_{l})^{(s)}.

Aquí, \delta, es una variable indicadora que calcula el número de apariciones de ese haplotipo t presente en el i-ésimo genotipo; toma los valores de 0, 1 y 2.

Las iteraciones E-M cesan cuando se la alcanzado el siguiente criterio. Empleando la teoría de estimación de probabilidad (MLE), se supone que los fenotipos j se distribuyen de forma multinominal. En cada iteración s, se puede calcular la función de probabilidad L. La convergencia se obtiene cuando la diferencia del log de la probabilidad entre dos iteraciones consecutivas es menor que algún número pequeño, con preferencia 10-^{7}.

3) Métodos para calcular desequilibrio de conexión entre marcadores

Se pueden usar varios métodos para calcular el desequilibrio de conexión entre dos posiciones genéticas, en la práctica el desequilibrio de conexión se mide por la aplicación de una prueba de asociación estadística para los datos del haplotipo tomados de una población.

El desequilibrio de conexión entre cualquier par de marcadores bialélicos que comprenden por lo menos uno de los marcadores bialélicos de la presente invención (M_{i}, M_{j}) que presenta los alelos (a_{l}/b_{i}) en el marcador M_{i} y alelos (a_{j}/b_{j}) en el marcador M_{j} se pueden calcular para cada combinación de alelos (a_{i} a_{i}; a_{i} b_{i}; b_{i} a_{j} y b_{i},b_{j}), de acuerdo con la fórmula de Piazza:

\Delta_{aiaj}\surd\theta4 - \surd(\theta4 + \theta3) (\theta4 + \theta2), donde:

\theta4= - - = frecuencia de genotipos que no tienen alelos a_{i} en M_{i}, y no tienen alelo a_{i} en M_{j}

\theta3= -+ = frecuencia de genotipos que no tienen alelos a_{i} en M_{i} y tienen alelos a_{i} en M_{j}

\theta2= + = frecuencia de genotipos que tienen alelos a_{i} en M_{i} y no tienen alelos a_{i} en M_{j}

El desequilibrio de conexión (LD) entre pares de marcadores bialélicos (M_{i}, M_{j}) también se puede calcular para cada combinación de alelos (a_{i} a_{i}; a_{i} b_{i)};(b_{i} a_{j} y b_{i},b_{j}), de acuerdo con el estimado de probabilidad máxima (MLE) para delta (el coeficiente de desequilibrio genotípico del compuesto), como se describe en Weir (Weir B. S., 1998). El MLE para el desequilibrio de conexión del compuesto es:

D_{aiaj} = (2n_{1} + n_{2} + n_{3} + n_{4}/2)/N - 2(pr(a_{i}). \ pr(a_{j}))

Donde n_{1} = \Sigma de fenotipo (a_{i}/a_{i}, a_{lj}a_{i}), n_{2} = \Sigma de fenotipo (a_{i}/a_{i},a_{j}/b_{j}), n_{3} = \Sigma de fenotipo(a_{j}/a_{i}, a_{j}/a_{j}), n_{4} = \Sigma de fenotipo 2 (a_{j}/b_{i}, a_{j}/b_{j}) y N es el número de individuos de la muestra.

Esta fórmula permite el desequilibrio de conexión entre los alelos estimados cuando sólo están disponibles los datos del genotipo y no del haplotipo.

Otro medio de calcular el desequilibrio de conexión entre marcadores es el siguiente. Para una cupla de marcadores bialélicos, M_{i} (a/b) y M_{j},(a_{j}lb_{i}), se ajustada al equilibrio de Hardy-Weinberg, se puede estimar las cuatro frecuencias de haplotipo posibles en un población dada de acuerdo con el método descripto anteriormente.

La estimación del desequilibrio gamético entre ai y aj es simplemente

D_{aiaj} = pr(haplotipo(a_{i},a_{j})) - pr(a_{i}) . pr(a_{j}).

Donde pr(a_{i}) es la probabilidad del alelo a_{i} y pr(a_{j}) es la probabilidad del alelo a_{i} y donde pr(haplotipo (a_{i}, a_{l})) se estima como en la Ecuación 3 anterior.

Para una cupla de marcadores bialélicos solo es necesaria una medida del desequilibrio para describir la asociación entre M_{i} y M_{j}

Luego el valor normalizado de los anteriores se calcula con las siguientes fórmulas:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  D'_{aiaj} = D_{aiaj}/máx (-pr(a_{i}) . \ pr(a_{j}),
\ -pr(b_{i}) . \ pr(b_{j}))   \hskip0.5cm  \+ con
D _{aiaj}  < 0\cr \+\cr   D'_{aiaj} = D_{aiaj}/máx
(pr(b_{i}) . \ pr(a_{j}), \ pr(a_{i}) . \
pr(b_{j}))  \+ con D _{aiaj}  >
0\cr}

Los expertos apreciarán fácilmente que se pueden usar otros métodos de cálculo de desequilibrio de conexión.

El desequilibrio de conexión entre un conjunto de marcadores bialélicos que tienen una tasa de heterocigosidad adecuada se puede determinar por genotipificación entre 50 y 1000 individuos no relacionados, con preferencia entre 75 y 200, con más preferencia alrededor de 100.

\vskip1.000000\baselineskip

4) Pruebas de asociación

Los métodos para establecer la significación estadística de una correlación entre un fenotipo y un genotipo, en este caso un alelo de un marcador bialélico o un haplotipo compuesto de tales alelos, se pueden determinar por alguna de las pruebas estadísticas conocidas en la técnica y con cualquier umbral aceptado de significación estadística requerida. La aplicación de métodos y umbrales de significación particulares son bien conocidos por los que tiene experiencia ordinaria en la técnica.

La prueba de asociación se realiza por la determinación de la frecuencia de un alelo del marcador bialélico de poblaciones de casos y controles y se comparan estas frecuencias con una prueba estadística para determinar si una diferencia estadísticamente significativa de la frecuencia indicaría una correlación entre el rasgo y el alelo del marcador bialélico en estudio. De forma similar, se realiza un análisis de haplotipo por estimación de las frecuencias de todos los posibles haplotipos para un conjunto de marcadores bialélicos dados en poblaciones de control de casos, y la comparación de estas frecuencias con una prueba estadística para determinar si esta es correlación estadísticamente significativa entre el haplotipo y el fenotipo (rasgo) en estudio. Se puede usar cualquier herramienta estadística útil para probar la asociación estadísticamente significativa entre un genotipo y un fenotipo. Con preferencia la prueba estadística empleada es la prueba de chi cuadrado con un grado de libertad. Se calcula el valor P (el valor P es la probabilidad estadística grande o más grande que la observada podría ocurrir por casualidad).

Significación estadística

En realizaciones preferidas, la significación para propósitos diagnósticos, tanto como una base posible para pruebas diagnósticas adicionales o como punto de partida preliminar para la terapia preventiva precoz, el valor p relacionado con una asociación del marcador bialélico es con preferencia aproximadamente 1 x10^{-2} o menor, con más preferencia aproximadamente 1x10^{-4} o menos, para un análisis marcador bialélico único y aproximadamente 1 x 10^{3} o menor, aun con más preferencia 1 x 19^{-6} o menor y con mayor preferencia de aproximadamente 1 x 10^{-8} o menor, para un análisis de haplotipos que incluye dos o más marcadores. Se considera que estos valores son aplicables a cualquier estudio de asociación que involucra combinaciones de marcadores simples y múltiples.

El experto puede usar los rangos de valores expuestos anteriormente como punto de partida con el fin de llevar acabo los estudios de asociación con marcadores bialélicos de la presente invención. Continuando con esto, las asociaciones significativas entre los marcadores bialélicos de la presente invención y un rasgo se pueden revelar y usar con propósitos de diagnóstico e identificación de fármacos.

Permutación fenotípica

Con el fin de confirmar la significación estadística de la primer etapa del análisis de haplotipo descripta anteriormente, sería adecuado realizar análisis adicionales en los cuales los datos de genotipificación de los individuos de los casos y controles se mezclan y aleatorizan con respecto al rasgo fenotípico. Cada dato de genotipificación individual se destina aleatoriamente a dos grupos, que contienen el mismo número de individuos como las poblaciones de casos y controles usadas para compilar los datos obtenidos en la primer etapa. Una segunda etapa del análisis de haplotipo se ejecuta con preferencia en estos grupos artificiales, con preferencia para los marcadores incluidos en el haplotipo de la primera etapa del análisis que muestra mayor coeficiente de riesgo relativo. Este experimento se reitera con preferencia por lo menos entre 100 y 10000 veces. Las iteraciones repetidas permiten la determinación de la probabilidad para obtener el haplotipo ensayado por casualidad.

Evaluación de la asociación estadística

Para tratar el problema de los falsos positivos se puede realizar análisis similar con las mismas poblaciones de casos y controles en regiones genómicas aleatorias. Los resultados de las regiones aleatorias y la región candidata se comparan como se describe en una solicitud de Patente Estadounidense Provisional titulada "Métodos, programas de computación y aparatos para la identificación de regiones genómicas que albergan un gen asociado con un rasgo detectable", U.S. Serie Número 60/107,986, presentada el 10 de noviembre de 1998.

5) Evaluación de factores de riesgo

La asociación entre un factor de riesgo (en epidemiología genética el factor de riesgo es la presencia o ausencia de un determinado alelo o haplotipo en el locus del marcador del locus) y una enfermedad se evalúa por la relación de probabilidad (OR) y por el riesgo relativo (RR). Si P(R^{+}) es la probabilidad de desarrollo de la enfermedad en individuos con R y P(R-) es la probabilidad para los individuos sin el factor de riesgo, luego el riesgo relativo es simplemente la relación de las dos probabilidades, o sea:

RR = P(R^{+})/P(R^{-})

En los estudios de control de casos, no se pueden obtener medidas directas del riesgo relativo debido al diseño del muestreo. Sin embargo, la relación de probabilidad permite una buena aproximación del riesgo relativo para las enfermedades de baja incidencia y se puede calcular:

\hskip5.2cm

200

OR = (F^{+}/(1-F^{+}))/(F^{-}/1-F^{-}))

F^{+} es la frecuencia de la exposición al factor de riesgo en los casos y F es la frecuencia de la de la exposición al factor de riesgo en los controles. F^{+} y F se calculan mediante las frecuencias alélicas o de haplotipo del estudio y depende adicionalmente del modelo genético subyacente (dominante, recesivo, aditivo...).

Se puede estimar adicionalmente el riego atribuible (AR) que describe la proporción de individuos de una población que presentan un rasgo debido a un factor de riesgo dado. Esta medida es importante para cuantificar el papel de un factor específico en la etiología de la enfermedad y en términos de salud publica el impacto de un factor de riesgo. La importancia para la salud pública de esta medida reside en la estimación de la proporción de los casos de enfermedad en la población que puede ser prevenida si la exposición de interés estuviera ausente. AR se determina como sigue:

AR = P_{E} (RR-1) / (P_{E} (RR-1)+1)

AR es el riesgo atribuible a un alelo del marcador bialélico o un haplotipo del marcador bialélico. P_{E} es la frecuencia de exposición de un alelo o un haplotipo en la población general; y RR es el riesgo relativo que, está aproximado con la relación de probabilidad cuando el rasgo en estudio presenta una incidencia relativamente baja en la población general.

Identificación de los marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con los marcadores bialélicos de la invención

Una vez que se ha identificado un primer marcador bialélico en una región genómica de interés, el profesional experto en la técnica, empleando las enseñanzas de la presente invención, puede identificar fácilmente marcadores bialélicos en desequilibrio de conexión con este primer marcador. Como se mencionó antes cualquier marcador en desequilibrio de conexión con un primer marcador asociado con un rasgo estará asociado con el rasgo. Por eso, una vez que se ha demostrado una asociación entre un marcador bialélico dado y un rasgo, el descubrimiento de los marcadores bialélicos asociados con este rasgo es de gran interés con el fin de aumentar la densidad de marcadores bialélicos en esta región particular. El gen o mutación causal se hallará en la vecindad del marcador o conjunto de marcadores que muestran la mayor correlación con el rasgo.

La identificación de marcadores adicionales en desequilibrio de conexión con un marcador dado incluye:

(a) amplificar le el fragmento genómico que comprende un primer marcador bialélico a partir de una pluralidad de individuos;

(b) identificar el segundo de los marcadores bialélicos en la región genómica que alberga dicho primer marcador bialélico;

(c) realizar un análisis en desequilibrio de conexión entre dicho primer marcador bialélico y segundo marcador bialélico; y

(d) seleccionar dichos segundos marcadores bialélicos que están en desequilibrio de conexión con dicho primer marcador. Las subcombinaciones comprenden los pasos (b) y (c) también están contempladas.

Los métodos para identificar marcadores bialélicos y realizar el análisis de desequilibrio de conexión se describen en la presente memoria y pueden ser llevados a cabo por los expertos sin excesiva experimentación. La presente invención también trata de los marcadores bialélicos que está en desequilibrio de conexión con los marcadores bialélicos A1 a A18 y de los que se espera que presenten características similares en términos de asociación respectiva con un rasgo dado.

Identificación de mutaciones funcionales

Las mutaciones del gen de CanIon que son responsables de un fenotipo o rasgo detectable se pueden identificar por la comparación de las secuencias del gen de CanIon de los individuos con rasgo positivo y control. Una vez que se confirma una asociación positiva con un marcador bialélico de la presente invención, se puede realizar un barrido del locus identificado para buscar mutaciones. En una realización preferida, las regiones funcionales tales como exones y sitios de empalme, promotores y otras regiones regulatorias del gen de CanIon se barren en busca de mutaciones. En una realización preferida la secuencia del gen de CanIon se compara en individuos con rasgo positivo y controles. Con preferencia, los individuos con rasgo positivo llevan el haplotipo que se ha demostrado que está asociado con el rasgo y los individuos con rasgo negativo no portan el haplotipo o alelo asociado con el rasgo. El rasgo o fenotipo detectable puede comprender una variedad de manifestaciones de la función de CanIon alterada.

El procedimiento de detección de la mutación esencialmente similar al que se usa para la identificación del marcador bialélico. El método usado para detectar tales mutaciones generalmente comprende los siguientes pasos:

- amplificación de la región del gen de CanIon que comprende un marcador bialélico o un grupos de marcadores bialélicos asociados con el rasgo de las muestras de ADN de los pacientes con rasgo positivo y los controles del rasgo negativo;

- secuenciación de la región amplificada;

- comparación de las secuencias de ADN de los individuos con rasgo positivo y los controles;

- determinación de las mutaciones específicas a los pacientes con rasgo positivo.

En una realización, dicho marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo. Se prefiere que los polimorfismos candidatos luego se verifiquen por la identificación de luna población mayo de casos y controles por medio de cualquier procedimiento de genotipificación tal como los que se describen en la presente memoria, con preferencia mediante una técnica de microsecuenciación en un formato de ensayo individual. Los polimorfismos se consideran como mutaciones candidatas cuando están presentes en los casos y controles en frecuencias compatibles con los resultados de asociación esperados. Los polimorfismos se consideran como mutaciones candidatas "causantes del rasgo" cuando exhiben una correlación estadísticamente significativa con el fenotipo detectable.

Marcadores bialélicos de la invención en métodos de diagnósticos genéticos

La secuencia del ácido nucleico del canal iónico y los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la presente invención también se pueden usar para desarrollar pruebas diagnósticas que permiten identificar individuos que expresan un rasgo detectable como resultado de un genotipo específico o individuos cuyos genotipos los ponen en riesgo de desarrollar un rasgo detectable con posterioridad en el tiempo. Tal diagnóstico puede ser útil en la estadificación, control, pronósticos y/o terapia profiláctica o curativa de numerosas enfermedades o afecciones que incluyen esquizofrenia, trastorno bipolar y otros trastornos del SNC tales como epilepsia y trastornos del dolor, afecciones cardiovasculares tales como enfermedad cardíaca, hipertensión, arritmias, y numerosas enfermedades y
afecciones.

Las técnicas diagnósticas de la presente invención pueden emplear una variedad de metodologías para determinar si un sujeto de ensayo tiene un patrón del marcador bialélico asociado con un riesgo aumentado de desarrollo de un rasgo detectable o si el individuo sufre de un rasgo detectable como resultado de una mutación particular, e incluyen a los métodos que permiten el análisis de los cromosomas individuales para tipificar en haplotipos, tales como estudios familiares, análisis del ADN de esperma o híbridos somáticos.

La presente invención proporciona métodos diagnósticos para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar una enfermedad o sufre de esa enfermedad como resultado de una mutación o un polimorfismo del gen del canal iónico. La presente invención también proporciona métodos para determinar si un individuo tiene susceptibilidad a la esquizofrenia y trastorno bipolar o a cualquiera de las otras afecciones relacionadas con los canales de calcio conocidas en la técnica o descripta en la presente memoria.

Estos métodos incluyen obtener una muestra de ácido nucleico del individuo y determinar si la muestra de ácido nucleico contiene por lo menos un alelo o por lo menos un haplotipo del marcador bialélico, indicador de un riesgo del desarrollo del rasgo o que indica que el individuo expresa el rasgo como resultado de la posesión de un polimorfismo o mutación del canal iónico particular (alelo que causa el rasgo).

Con preferencia, en tales métodos diagnósticos, se obtiene una muestra de ácido nucleico del individuo y esta muestra se genotipifica mediante los métodos descriptos anteriormente en "Métodos de genotipificación de muestras de ADN para marcadores bialélicos". Los diagnósticos se pueden basar en un marcador bialélico único o un grupo de marcadores bialélicos.

En cada uno de estos métodos, se obtiene una muestra de ácido nucleico del sujeto de ensayo y se determina el patrón del marcador bialélico de uno o más de los marcadores bialélicos A1 a A18.

En una realización, se realiza una amplificación PCR en la muestra de ácido nucleico para amplificar regiones en las cuales se han identificado polimorfismos asociados con un fenotipo detectable. Los productos de amplificación se secuencian para determinar si le individuo posee uno o más polimorfismos asociados con un fenotipo detectable. Los cebadores usados para generar los productos de amplificación pueden comprender los cebadores listados en la Tabla 1. Alternativamente, la muestra de ácido nucleico se somete a las reacciones de microsecuenciación descriptas anteriormente para determinar si el individuo posee uno o más polimorfismos del canal iónico asociados con un fenotipo detectable que resulta de una mutación o un polimorfismo del gen del canal iónico. Los cebadores usados en las reacciones de microsecuenciación pueden incluir los cebadores listados en la Tabla 4. En otra realización, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con una o más sondas de oligonucleótido específicas que específicamente hibridiza a uno o más alelos del canal asociados con un fenotipo detectable. Las sondas usadas en el ensayo de hibridación puede incluir las sondas listadas en la Tabla 3. En otra realización, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con un segundo oligonucleótido del canal iónico capaz de producir un producto de amplificación cuando se usa con el oligonucleótido específico del alelo en una reacción de amplificación. La presencia de un producto de amplificación en la reacción de amplificación indica que el individuo posee uno o más alelos del canal iónico asociados con un fenotipo detectable.

En una realización preferida se determina la identidad del nucleótido presente en por lo menos un, marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1 a A18 y los complementos del mismo y los complementos del mismo, y el rasgo detectable es esquizofrenia y trastorno bipolar. Los kits de diagnóstico comprenden los polinucleótidos descriptos en la presente memoria.

Estos métodos de diagnóstico son extremadamente valiosos ya que estos se pueden usar, en determinadas circunstancias para iniciar tratamientos preventivos o permitir a un individuo que porta un haplotipo significativo prever signos de advertencia tales como síntomas menores.

Los métodos diagnósticos, que analizan y predicen la respuesta a un fármaco o efectos secundarios a un fármaco, se pueden usar para determinar si un individuo se deberá tratar con un fármaco particular. Por ejemplo, si el diagnóstico indica una probabilidad que un individuo responderá en forma positiva al tratamiento con un fármaco particular, el fármaco se puede administrar al individuo. A la inversa, si el diagnóstico indica que un individuo probablemente responda en forma negativa al tratamiento con un fármaco particular, se puede prescribir un tipo de tratamiento alternativo. Una respuesta negativa se puede definir tanto como la ausencia de una respuesta eficaz como la presencia de efectos secundarios tóxicos.

Los ensayos clínicos de fármacos representan otra aplicación para los marcadores adecuados para el uso en la presente invención. Uno o más marcadores indicadores de la respuesta a un agente que actúa contra la esquizofrenia o trastorno bipolar u otra afección relacionada con los canales de calcio o a los efectos secundarios de un agente que actúa contra la esquizofrenia o trastorno bipolar u otra afección relacionada con los canales de calcio, se pueden identificar mediante los métodos descriptos anteriormente. A partir de entonces, los potenciales participantes en los ensayos clínicos de tal agente se pueden seleccionar para identificar a los individuos que más probablemente responderán al fármaco y excluir a los que probablemente experimenten efectos secundarios. De esta manera, se puede evaluar efectividad del tratamiento del fármaco en individuos que responden positivamente al fármaco sin reducir la medición como resultado de la inclusión de individuos que poco probablemente respondan en forma positiva en el estudio sin el riego de problemas de seguridad indeseable.

En realizaciones particularmente preferidas, el rasgo analizado mediante el presente diagnóstico es esquizofrenia o trastorno bipolar. Sin embargo, la presente invención también comprende cualquier a de los métodos de prevención, diagnóstico, pronóstico y tratamiento descripto en la presente memoria mediante los marcadores bialélicos de la invención en los métodos de prevención, diagnóstico, control y tratamiento de los trastornos relacionados, en particular trastornos del SNC relacionados. A modo de ejemplo,los trastornos relacionados pueden comprender trastornos psicóticos, trastornos del estado de ánimo, autismo, dependencia de sustancias y alcoholismo, trastornos del dolor, epilepsia, retardo mental y otras enfermedades psiquiátricas que incluyen trastornos cognitivos, ansiedad, alimentación, control del impulso y de personalidad, como se define en la clasificación del Manual Diagnóstico y estadística de los trastornos mentales cuarta edición (DSM-IV). Otros trastornos incluyen trastornos cardiovasculares tales como angina, hipertensión o arritmias.

Vectores recombinantes

El término "vector" se usa en la presente memoria para designar tanto una molécula de ADN o ARN circular o lineal, que es bicatenaria o monocatenaria y que comprende por lo menos un polinucleótido de interés que se trata de transferir a una célula hospedante en un organismo hospedador unicelular o multicelular.

Es adecuado para el uso en la presente invención una familia de vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido regulatorio derivado de la secuencia genómica de CanIon y/o polinucleótido codificador de la secuencia genómica de CanIon o la secuencia de ADNc.

Generalmente, un vector recombinante de la invención puede comprender a cualquiera de los polinucleótidos descriptos en la presente memoria, que incluyen las secuencias regulatorias, secuencias codificadoras y construcciones de polinucleótidos, además de cualquier cebador o sonda de CanIon definidos anteriormente. Más particularmente, los vectores recombinantes adecuados para el uso en la presente invención pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos descriptos en la sección "Secuencias genómicas del gen de CanIon", la sección "Secuencias de ADNc de CanIon", sección "Regiones codificadoras", sección "Construcciones de polinucleótidos" y la sección "Sondas y cebadores oligonucleotídicos".

En una realización preferida, un vector recombinante adecuado para usar en la invención se usa para amplificar el polinucleótido insertado derivado de una secuencia genómica de la SEC ID No 1 a 3 o 6 o un ADNc de CanIon, por ejemplo el ADNc de la SEC ID No 4 en una célula hospedante adecuada, este polinucleótido se amplifica cada vez que el vector recombinante se replica.

Una segunda realización preferida adecuada para el uso de los vectores recombinantes de acuerdo con la invención comprende los vectores de expresión que comprende un polinucleótido regulatorio o un ácido nucleico codificador de la invención o ambos. En ciertas realizaciones, los vectores de expresión se emplean para expresar el polipéptido de CanIon que se pueden purificar luego y por ejemplo se usan en ensayos de identificación de ligandos o como inmunógeno con el fin de originar anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína de CanIon. En otras realizaciones, los vectores de expresión se usan para construir animales transgénicos y también para terapia génica. La expresión requiere que las señales apropiadas se proporcionen en los vectores, dichas señales incluyen diferentes elementos regulatorios, tales como potenciadores/promotores de las fuentes virales y de mamíferos que conducen la expresión de los genes de interés en las células hospedantes. Los marcadores de selección del fármaco dominante para establecer clones permanentes y estables que expresan los productos se incluyen generalmente en los vectores de expresión de la invención, ya
que ellos son elementos que unen la expresión de los marcadores de selección del fármaco al expresión del polipéptido.

Más particularmente adecuados para el uso en la presente invención son los vectores de expresión que incluyen ácidos nucleicos que codifican una proteína de CanIon, con preferencia la proteína de CanIon de la secuencia de aminoácidos de la SEO ID No 5 o variantes o fragmentos de las mismas.

Es adecuado para usar en la invención un vector de expresión recombinante útil para la expresión de la secuencia codificadora de CanIon, donde dicho vector comprende un ácido nucleico de la SEC ID No 4.

Los vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico que contiene un marcador bialélico relacionado con CanIon es también parte de la invención. En una realización preferida, dicho marcador bialélico se selecciona del grupo que consiste en A1 a A18, y los complementos del mismo.

Algunos de los elementos que se pueden hallar en los vectores de la presente invención se describen con más detalle en las siguientes secciones.

Son adecuados para el uso en la presente invención las células hospedantes primarias, secundarias y recombinantes homólogamente inmortalizadas de origen vertebrado, con preferencia origen mamífero en particular origen humano, que ha sido manipulado genéticamente a: a) polinucleótidos exógeno insertos (heterólogos) en ADN cromosómico endógeno de un gen blanco, b) suprimir el ADN cromosómico endógeno y/o c) reemplazar el ADN cromosómico endógeno con los polinucleótidos exógenos. Las inserciones, supresiones y/o reemplazos de las secuencias de polinucleótidos pueden ser las secuencias codificadoras del gen blanco y/o las regiones regulatorios, tales como las secuencias del promotor y potenciador, operativamente asociados con el gen blanco.

Es adecuado para el uso en la presente invención un método de preparación de una célula hospedante recombinada homólogamente in vitro o in vivo, donde la expresión de un gen blanco que no se expresa normalmente en la célula está alterada. Con preferencia la alteración causa la expresión del gen blanco en condiciones normales o en condiciones adecuadas para producir el polipéptido codificado por el gen blanco. El método comprende los pasos de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo en con una construcción del polinucleótido, la construcción del polinucleótido que comprende; (i) una secuencia seleccionada; (U) a secuencia regulatoria y/o una secuencia codificadora; y (iii) un sitio dador de empalme no apareado, si fuera necesario, de este modo se produce una célula transfectada; y (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga.

Es adecuado para el uso en la presente invención un método para alterar la expresión de un gen blanco en una célula in vitro o in vivo donde el gen no esta expresado normalmente en la célula, que comprende los pasos de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo en con una construcción del polinucleótido, la construcción del polinucleótido que comprende: (i) una secuencia seleccionada; (ii) una secuencia regulatoria y/o una secuencia codificadora; y (iii) un sitio dador de empalme no apareado, si fuera necesario, de este modo se produce una célula transfectada; y (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga, de este modo se produce una célula recombinada en forma homóloga; y (c) mantener la célula recombinada en forma homóloga in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la expresión del gen.

Es adecuado para el uso en la presente invención un método para preparar un polipéptido de la presente invención por alteración de la expresión de un gen endógeno blanco en una célula in vitro o in vivo donde el gen no esta expresado normalmente en la célula, que comprende los pasos de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo en con una construcción del polinucleótido, la construcción del polinucleótido que comprende: (i) una secuencia seleccionada; (ii) una secuencia regulatoria y/o una secuencia codificadora; y (iii) un sitio dador de empalme no apareado, si fuera necesario, de este modo se produce una célula transfectada; y (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la recombinación homóloga, de este modo se produce una célula recombinada en forma homóloga; y (c) mantener la célula recombinada en forma homóloga in vitro o in vivo en condiciones apropiadas para la expresión del gen, de este modo se prepara el polipéptido.

Es adecuado para el uso en la presente invención es una construcción del polinucleótido que altera la expresión de un gen blanco en un tipo celular en el cual el gen no se expresa normalmente. Esto se produce cuando la construcción del polinucleótido se inserta en el ADN cromosómico de la célula blanco, donde la construcción del polinucleótido comprende: a): (i) una secuencia seleccionada; (ii) a secuencia regulatoria y/o una secuencia codificadora; y (iii) un sitio dador de empalme no apareado, si fuera necesario. Además se incluyen las construcciones de polinucleótidos, como se describió anteriormente, donde la construcción además comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está en marco con el gen endógeno blanco después de la recombinación homóloga con ADN cromosómico.

Las composiciones se pueden producir, y los métodos realizar por técnicas conocidas en la técnica, tales como los descriptos en las Patentes Estadounidenses Nos: 6.054.288; 6.046.729; 6.048.724; 6.048.524; 5.994.127; 5.968.502; 5.965.125; 5.869.239; 5.817.789; 5.783.385; 5.733.761; 5.641.670; 5.580.734; Publicación Internacional Nos: WO96/29411, WO 94/12650; y los artículos científicos que incluyen Koller et al., PNAS 86:8932-8935 (1989).

1. Características generales de los vectores de expresión de la invención

Un vector recombinante adecuado para usar en la invención comprende, pero sin limitación, un YAC (cromosoma de levadura artificial), un BAC (cromosoma bacteriano artificial), un fago, un fagémido, un cósmido], un plásmido o incluso una molécula de ADN lineal que puede comprender un ADN cromosómico, no cromosómico, semi-sintético y sintético. Tal vector recombinante puede comprender una unidad transcripcional que comprende un ensamblaje de:

(1) un elemento o elementos genéticos que tiene un papel regulatorio de la expresión génica, por ejemplo promotores o potenciadores. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, usualmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud que actúa sobre el promotor para aumentar la transcripción.

(2) una secuencia estructural o codificadora que se transcribe en el ARNm y finalmente se traduce en un polipéptido, dicha secuencia estructural o codificadora está operativamente unida a los elementos regulatorios descriptos en (1); y

(3) las secuencias de iniciación y terminación de transcripción apropiadas. Las unidades estructurales que se usan en los sistemas de expresión de levaduras o eucariotas con preferencia incluyen una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedante. Alternativamente, cuando se expresa una proteína recombinante sin una secuencia líder o de transporte, esta puede incluir un residuo N-terminal. Este residuo se puede o no escindir posteriormente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.

Generalmente, los vectores de expresión recombinante incluirán orígenes de replicación, marcadores seleccionables que permiten la transformación de célula hospedante y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en una fase apropiada con las secuencias de iniciación y terminación de traducción y con preferencia una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. En una realización específica donde el vector se adapta para la transfeccción y expresión de las secuencias deseadas en las células hospedantes de mamíferos, los vectores preferidos comprenderán un origen de replicación en el huésped deseado, un promotor y potenciador adecuado y también cualquiera de los sitios de unión al ribosoma necesarios, señales de poliadenilación, sitios dadores y aceptores, secuencias de terminación transcripcional y secuencias flanqueantes 5' no transcriptas. Las secuencias de ADN derivan del genoma viral de SV40, por ejemplo el origen de SV40, promotor temprano, potenciador, señales de empalme y poliadenilación se pueden usar para proporcionar los elementos genéticos no transcriptos requeridos.

La expresión in vivo de un polipéptido de CanIon de la SEC ID No 5 o fragmentos o variantes de los mismos pueden ser útiles para corregir un defecto genético relacionado con la expresión del gen nativo en un organismo hospedador o la producción de una proteína de CanIon biológicamente inactiva.

Por consiguiente son adecuados para el uso en la presente invención los vectores de expresión recombinante diseñados principalmente para la producción in vivo del polipéptido de CanIon de la SEC ID No 5 o fragmentos o variantes de las mismas por la introducción del material genético apropiado en el organismo del paciente tratado. Este material genético se puede introducir in vitro en una célula que ha sido previamente extraída del organismo, la célula modificada posteriormente se reintroduce en dicho organismo, directamente in vivo en el tejido apropiado.

2. Elementos regulatorios Promotores

Las regiones promotoras adecuadas que se usan en los vectores de expresión adecuadas para el uso en la presente invención se eligen tomando en cuenta la célula hospedante en la cual se expresa el gen heterólogo. El promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés no se considera que es importante, mientras que esta sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula blanco. De este modo, cuando se identifica una célula humana, es preferible para ubicar la región codificadora del ácido nucleico adyacente y bajo el control de un promotor que es capaz de expresarse en una célula humana, tal como por ejemplo, un promotor humano o viral.

Un promotor adecuado puede ser heterólogo con al ácido nucleico para el cual este controla la expresión o alternativamente puede ser endógeno del polinucleótido nativo que contiene la secuencia codificadora expresada. Adicionalmente, el promotor generalmente es heterólogo con respecto a las secuencias del vector recombinante dentro del cual se ha insertado la construcción del promotor/secuencia codificadora.

Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado mediante, por ejemplo, vectores CAT(cloranfenicol transferasa) y con más preferencia los vectores pKK232-8 y pCM7.

Los promotores bacterianos preferidos son LacI, LacZ, los promotores de ARN polimerasa del bacteriófago T3 o T7, el gpt, y los promotores lambda PR, PL y trp (EP 0036776), el promotor polihedrina o el promotor de la proteína p10 del baculovirus (Kit Novagen) (Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992), el promotor lambda PR o también el promotor trc.

Los promotores eucariotas incluyen a CMV temprano inmediato, HSV timidina quinasa, SV40 temprano y tardío, LTRS del retrovirus y metalotioneína-L de ratón. La selección de un vector y promotor conveniente es bien conocido dentro de la experiencia de ordinaria de la técnica.

La elección de un promotor está dentro de la capacidad de un experto en e campo de la ingeniería genética. Por ejemplo, se puede referir a Sambrook et al. (1989) o también a los procedimientos descriptos por Fuller et al. (1996).

Otros elementos regulatorios

Cuando se emplea un ADNc, se deseará generalmente incluir una señal de poliadenilación para efectuar una poliadenilación apropiada del transcripto del gen. La naturaleza de la señal de poliadenilación no se considera crucial para la práctica exitosa de la invención y cualquiera de tales secuencias se puede emplear como la hormona de crecimiento humana y las señales de poliadenilación de SV40. También está contemplado como un elemento del casete de expresión un terminador. Estos elementos pueden actuar para aumentar el nivel de mensaje y minimizar la ultralectura del casete en otras secuencias.

3. Marcadores seleccionables

Tales marcadores conferirían un cambio identificable a la célula que permite la identificación fácil de las células que contienen la construcción de expresión. Los genes del marcador seleccionable para la selección de las células hospedantes transformadas son con preferencia dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina para el cultivo de la célula eucariota, TRP1 para S. cerevisiae o tetraciclina, resistencia a rifampicina o ampicilina en E.coli, o levansacarasa para micobacterias, esta última es un marcador de selección negativo.

4. Vectores preferidos Vectores bacterianos

Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso e bacterias puede comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación derivado de plásmidos disponibles en el comercio que comprenden elementos genéticos de pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA).

Gran número de otros vectores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y están disponibles en el comercio, tales como los siguientes vectores bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNHBA, pNH16A, pNHI 8A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QlAexpress).

Vectores de bacteriófago

El vector del bacteriófago P1 puede contener insertos más grandes que varían de aproximadamente 80 a aproximadamente 100 kb.

La construcción de los vectores del bacteriófago P1 tales como los vectores p158 o p158/neo8 se describen en forma notable en Sternberg (1992, 1994). Los clones recombinantes P1 que comprenden secuencias de nucleótidos de CanIon se pueden diseñar por la inserción de polinucleótidos grandes de más de 40 kb (Linton et al., 1993). Para generar el ADN de P1 para los experimentos transgénicos, un protocolo preferido es el descripto por McCormick et al. (1994). Brevemente, E. coli (con preferencia la cepa NS3529) que alberga el plásmido P1 se incubó toda la noche en un medio del caldo adecuado que contiene 25 \mug/ml de kanamicina. El ADN de P1 se prepara a partir de E. coli por lisis alcalina mediante el kit Qiagen Plasmid Maxi (Qiagen, Chatsworth, CA, USA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN de P1 ADN se purifica a partir del lisado bacteriano en dos columnas Qiagen-tip 500, empleando buffers de lavado y elución contenidos en el kit. Luego se realizó una extracción con fenol/cloroformo antes de precipitar el ADN con etanol 70%. Después de solubilizar el ADN en TE (Tris-HCI10 mM, pH 7.4, EDTA1 mM), la concentración del ADN se mide por espectrofotometría.

Cuando la meta es expresar un clon P1 que comprende las secuencias del nucleótido de CanIon en un animal transgénico, típicamente un ratón transgénico, es deseable eliminar las secuencias del vector del fragmento del ADN de P1, por ejemplo por escisión del ADN de P1 en sitio de corte poco frecuente dentro del poli-ligador P1 (SfiI, NotI o SalI). El inserto P1 luego se purifica de las secuencias del vector en un gel de agarosa de capo pulsante, mediante métodos similares a los que se informaron originalmente para el aislamiento de ADN de los YAC (Schedl et al., 1993a; Peterson et al., 1993). En esta etapa, el inserto de ADN purificado resultante se puede concentrar, si fuera necesario, en una unidad Millipore Ultrafree-MC Filter (Millipore, Bedford, MA, USA -peso molecular límite 30.000) y luego se dializa contra el buffer de microinyección (Tris-HCI 10 mM, pH 7.4; EDTA 250 \muM) que contiene NaCl100 mM, espermina 30 \muM, espermidina 70 \muM en una membrana de microdiálisis (tipo VS, 0,025 \muM de Millipore). El carácter intacto del inserto de ADN P1 purificado se evalúa por electroforesis en gel de agarosa 1% de capo pulsante (Sea Kern GTG; FMC Die-products) y tinción con bromuro de etidio.

Vectores de baculovirus

Un vector adecuado para la expresión del polipéptido de CanIon de la SEC ID No 5 o fragmentos o variantes de las mismas es un vector de baculovirus que se puede propagar en células de insectos y líneas celulares de insectos. Un sistema adecuado de vector hospedador específico es el vector de transferencia de baculovirus pVL1392/1393 (Pharmingen) que se usa para transfectar la línea celular SF9 (ATCC N°CRL 1711) que s deriva de Spodoptera frugiperda.

Otros vectores adecuados para la expresión del polipéptido de CanIon de la SEC ID No 5 o fragmentos o variantes de las mismas en un sistema de expresión del baculovirus incluye a los descriptos por Chai et al. (1993), Vlasak et al. (1983) y Lenhard et al. (1996).

Vectores virales

En una realización específica, el vector deriva de un adenovirus. Los vectores de adenovirus preferidos de acuerdo con la invención son los descriptos por Feldman y Steg (1996) u Ohno et al. (1994). Otro adenovirus recombinante preferido de acuerdo con esta realización específica de la presente invención es el adenovirus humano tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad 5) o un adenovirus de origen animal (ver, por ej., solicitud de patente Francesa N° FR-93.05954).

Los vectores de retrovirus son vectores de virus adeno-asociados que se considera que generalmente son sistemas de liberación de genes recombinantes de elección para la transferencia de polinucleótidos exógenos in vivo, particularmente a mamíferos que incluyen a los seres humanos. Estos vectores proporcionan una liberación eficiente de genes en las células y los ácidos nucleicos transferidos se integran en forma estable en el ADN cromosómico del
hospedante.

Los retrovirus particularmente preferidos para la preparación o construcción de retrovirus in vitro o en vehículos de liberación del gen in vitro de la presente invención incluye retrovirus seleccionados del grupo que consiste en el virus inductor del foco de células-Mink, virus del sarcoma murino, virus de la reticuloendoteliosis y virus del sarcoma Rous. Los virus particularmente preferidos de la leucemia murina incluyen los virus 4070A y 1504A, Abelson (ATCC No VR-999), Friend (ATCC No VR-245), Gross (ATCC No VR-590), Rauscher (ATCC No VR-998) y virus de leucemia murina Moloney (ATCC No VR-190; PCT Solicitud No WO 94/24298).Los virus del sarcoma de Rous virus particularmente preferidos incluyen Bryan de título alto (ATCC Nos VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 y VR-728). Otros vectores retrovirales preferidos son los descriptos en Roth et al. (1996), Solicitud PCT No WO 93/25234, Solicitud PCT No WO 94/06920, Roux et al., 1989, Julan et al., 1992 y Neda et al., 1991.

Otro sistema más de vector viral adecuado para usar en la invención comprende el virus adeno-asociado (AAV). El virus adenoasociado es un virus defectuoso que se produce en forma natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus del herpes, como un virus auxiliar para la replicación eficiente y un ciclo de vida productivo (Muzyczka et al., 1992). También es uno de los pocos virus que puede integrar su ADN en células que no se dividen y exhiben una frecuencia alta de integración estable (Motto et al., 1992; Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1989). Una característica ventajosa de los AAV proviene de su reducida eficacia para transducir células primarias a células transformadas.

Vectores BAC

El sistema de clonación del cromosoma bacteriano artificial (BAC) (Shizuya et al., 1992) ha sido desarrollado para mantener en forma estable fragmentos grandes de ADN genómico (100-300 kb) en E coli. Un vector de BAC preferido comprende un vector pBcloBAC11 que ha sido descripto por Kim et al. (1996). Las genotecas de BAC se preparan con este vector empleando ADN genómico de tamaño seleccionado que ha sido parcialmente digerido mediante enzimas que permiten el ligación en los sitios BamHI o HindIII del vector. Flanqueando estos sitios de clonación está los sitios de iniciación de transcripción de la ARN polimerasa T7 y SP6 que se pueden usar para generar sondas finales por métodos de transcripción de ARN o PCR. Después de la construcción de una genoteca BAC en E. coli, el ADN de BAC se purifica de la célula hospedante como un círculo superenrollado. La conversión de estas moléculas circulares en una forma lineal precede a la determinación del tamaño e introducción de los BAC en las células recipientes. El sitio de clonación está flanqueado por dos sitios NotI, que permiten que los segmentos clonados se escindan del vector por la digestión de NotI. Alternativamente, el inserto de ADN contenido en el vector pBeloBAC11se puede linealizar por el tratamiento del vector BAC vector con la enzima lambda terminasa disponible en el comercio que produce la escisión del sitio único cosN, pero este método de escisión origina el clon BAC de longitud completa que contiene tanto al ADN inserto como las secuencias de BAC.

5. Administración de vectores recombinantes

Con el fin de efectuar la expresión de los polinucleótidos y las construcciones de polinucleótidos adecuados para usar en la invención, estas construcciones se deben administrar en una célula. Esta administración puede lograrse in vitro, como en los procedimientos de laboratorio para transformar las líneas celulares o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados de enfermedad.

Un mecanismo es la infección viral donde la construcción de expresión está encapsulada en una partícula viral infecciosa.

Varios métodos no virales para la transferencia de polinucleótidos en células de mamíferos cultivadas son adecuadas para usar en la presente invención e incluyen, sin limitaciones, la precipitación con fosfato de calcio (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987;), DEAE-dextrano (copal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland et al., 1985), liposomas cargados con ADN (Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979), y transfección mediada por receptor (Wu and Wu, 1987; 1988). Algunas de estas técnicas se pueden adaptar con éxito para le uso in vivo o ex vivo.

Una vez que el polinucleótido de expresión se ha administrado en la célula, se puede integrar en forma estable en el genoma de la célula recipiente. Esta integración puede ser en la localización y orientación del cognado por medio de la recombinación homóloga (reemplazo génico) o se puede integrar al azar, en una localización no específica (aumento génico). En otras realizaciones adicionales, el ácido nucleico se puede mantener en forma estable en la célula como segmento separado de ADN episómico. Tales segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican las suficientes secuencias para permitir el mantenimiento y replicación independiente o en sincronización con el ciclo de la célula hospedante.

Una realización específica para un método para la administración de una proteína o péptido del interior de una célula de un vertebrado in vivo comprende el paso de introducir una preparación que comprende un vehículo aceptable para uso fisiológico y un polinucleótido desnudo operativamente unido con el polipéptido de interés en el espacio intersticial de un tejido que comprende la célula, por el cual el polinucleótido desnudo es captado en el interior de la célula y tiene un efecto fisiológico. Estos es particularmente aplicable para la transferencia in vitro pero además se puede aplicar in vivo.

Las composiciones para uso in vitro e in vivo que comprenden un polinucleótido "desnudo" como se describe en la solicitud PCT No. WO 90/11092 (Vical Inc.) y también en la Solicitud PCT No. WO 95/11307 (Institut Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa) además de los artículos de Tacson et al. (1996) y de Huygen et al. (1996).

En otra realización aún, la transferencia de un polinucleótido desnudo adecuado para usar en la invención, que incluye una construcción del polinucleótido de la invención, en células se puede realizar con un bombardeo de partículas (biolístico), dichas partículas son microproyectiles recubiertos de ADN acelerados a una alta velocidad que les permite perforar las membranas e ingresar a las células sin destruirlas, tal como fue descripto por Klein et al.
(1987).

En una realización adicional, el polinucleótido adecuado para usar en la invención se puede encapsular en un liposoma (Ghosh and Bacchawat, 1991; Wong et al., 1980; Nicolau et al., 1987).

Es adecuado para usar en la invención una composición para la producción in vivo de la proteína o polipéptido de CanIon descripto en la presente memoria. Esta comprende un polinucleótido desnudo operativamente unido qu codifica para este polipéptido, en solución con un vehículo aceptable para uso fisiológico y adecuado para la introducción en un tejido para originar células del tejido que expresen dicha proteína o polipéptido.

La cantidad del vector que se debe inyectar en el organismo hospedante deseado varía de acuerdo con el sitio de inyección. Como una dosis indicativa, se inyectará entre 0,1 y 100 \mug del vector en el cuerpo del animal, con preferencia un cuerpo de mamífero, por ejemplo un cuerpo de ratón.

En otra realización del vector adecuado para usar en la invención, ese se puede introducir in vitro en una célula hospedante, con preferencia en una célula hospedante previamente recolectada del animal que se va a tratar y con más preferencia una célula somática tal como una célula muscular. En un paso subsiguiente, la célula que se ha transformado con el vector que codifica para el polipéptido de CanIon deseado o el fragmento deseado del mismo se reintroduce en el cuerpo del animal con el fin de liberar la proteína recombinante dentro del cuerpo ya sea en forma local o sistémica.

Células hospedantes

Es adecuada para el uso en la presente invención una célula hospedante que ha sido transformada o transfectada con uno de los polinucleótidos descriptos en la presente memoria y en particular un polinucleótido que comprende un polinucleótido de CanIon regulatorio o la secuencia codificadora del polipéptido de CanIon seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID Nos 1 a 4 o un fragmento o variante de las mismas. También son adecuadas las células hospedantes que se transforman (células procariotas) o que se transfectan (células eucariotas) con un vector recombinante tal como uno de los descriptos anteriormente. Más particularmente, las células hospedantes de la presente invención pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos descriptos en la sección "Secuencias genómicas del gen de CanIon", la sección "Secuencias de ADNc de CanIon", la sección "Regiones codificadoras", la sección "Construcciones de polinucleótidos" y la sección "Sondas y cebadores oligonucleotídicos".

Una célula hospedante recombinante adicional de acuerdo con la invención comprende un polinucleótido que contiene un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1 a A18 y los complementos del mismo.

Una célula hospedante recombinante adicional de acuerdo con la invención comprende a cualquiera de los vectores descriptos en la presente memoria, más particularmente cualquiera de los vectores descriptos en la sección "Vectores recombinantes".

Las células hospedantes preferidas que se usan como recipientes de los vectores de expresión adecuadas para usar en la invención son las siguientes:

a) Células hospedantes procariotas: cepas de Escherichia coli (I.E.DH5-cepa \alpha), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y cepas de especies como Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.

b) Células hospedantes eucariotas: células HeLa (ATCC N°CCL2; N°CCL2.1; N°CCL2.2), células Cv 1 (ATCC N°CCL70), células COS (ATCC N°CRL1650; N°CRL1651), células Sf-9 (ATCC N°CRL1711), células C127 (ATCC N° CRL-1804), 3T3 (ATCC N° CRL-6361), CHO (ATCC N° COL-61), células de riñón humano 293. (ATCC N° 45504; N° CRL-1573) y BHK (ECACC N° 84100501; N° 84111301).

c) Otras células hospedantes de mamíferos.

La expresión del gen de CanIon de mamíferos, y típicamente en seres humanos, puede producir células defectuosas o alternativamente puede ser precedida con la inserción de una secuencia genómica o de ADNc de CanIon con el reemplazo de la contraparte del gen de CanIon en el genoma de una célula de animal por un polinucleótido de CanIon adecuado para uso en la invención. Estas alteraciones genéticas se pueden generar por eventos de recombinación homóloga mediante construcciones de ADN específicas que han sido previamente descriptas.

Una clase de células hospedantes que se pueden usar son los cigotos de mamífero, tales como los cigotos murinos. Por ejemplo, los cigotos murinos pueden experimentar la microinyección con una molécula de ADN purificado de interés, por ejemplo una molécula de ADN purificado que ha sido previamente ajustado a una concentración que varía de 1 ng/ml -para insertos de BAC- 3 ng/\mul -para insertos del bacteriófago P1- en Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 250 \muM que contiene NaCl 100 mM, espermina 30 \muM, y espermidina 70 \muM. Cuando el ADN que se va a microinyectar tiene un gran tamaño, se pueden usar poliaminas y altas concentraciones de sal con el fin de evitar la alteración mecánica de este ADN, tal como fue descripto por Schedl et al. (1993b).

Cualquiera de los polinucleótidos adecuados para usar en la invención, que incluyen a las construcciones de ADN descriptas en la presente memoria, se pueden introducir en una línea de células troncales embrionarias (ES), con preferencia una línea celular ES de ratón. Las líneas celulares ES derivan de células indiferenciadas pluripotentes de la masa de células interiores de los blastocistos de pre-implantación. Las líneas celulares ES preferidas son las siguientes: ES-E14TG2a (ATCC n° CRL-1821), ES-D3 (ATCC n° CRL1934 y n° CRL-11632), YS001 (ATCC n° CRL-11776), 36.5 (ATCC n° CRL-11116). Para mantener las células ES en un estado indiferenciado, estas se cultivan en presencia de célula de soporte con crecimiento inhibido que proporcionan las señales apropiadas para conservar el fenotipo embrionario y actuar como matriz para la adherencia de las células ES. Las células de soporte preferidas son fibroblastos embrionarios primarios que se establecen en el tejido de los embriones del día 13- y día 14 de prácticamente cualquier cepa de ratón, que se mantiene en cultivo, tal como fue descripto por Abbondanzo et al. (1993) y que tiene inhibido el crecimiento por irradiación, tal como fue descripto por Robertson (1987), o por la presencia de una concentración inhibitoria de LIF, tal como fue descripto por Pease y Williams (1990).

Las construcciones de las células hospedantes se pueden usar en forma convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante.

Después de la transformación de un huésped adecuado y el crecimiento del huésped a una apropiada densidad celular, el promotor seleccionado está inducido por medios apropiados, tales como el cambio de temperatura o inducción química y las células se cultivan durante un período inicial.

Las células generalmente se recogieron por centrifugación, se alteran por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante se retiene para purificación adicional.

Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas pueden ser alteradas por cualquier método conveniente, que incluye el ciclo de descongelamiento-congelamiento, sonicación, alteración mecánica o uso de agentes de lisado. Tales métodos son bien conocidos por los profesionales expertos.

Animales transgénicos

Los términos "animales transgénicos" o "animales hospedantes"' se usan en la presente memoria para designar a los animales que tiene en su genoma genética y artificialmente manipulado e modo de incluir uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. Los animales preferidos son mamíferos no humanos e incluyen a los que pertenecen a un género seleccionado de Mus (por ej. ratones), Rattus (por ej. ratas) y Oryctogalus (por ej. conejos) que tiene en su genoma artificial y genéticamente alterado por la inserción de un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Son adecuadas para usar en la invención los mamíferos y animales hospedadores no humanos que comprenden un vector recombinante de la invención o un gen de CanIon alterado por la recombinación homóloga con un vector knock out.

Los animales transgénicos adecuados para usar en la invención incluyen dentro de una pluralidad de sus células una secuencia de ADN recombinante o sintético clonado, más específicamente una de los ácidos nucleicos purificados o aislados que comprende una secuencia codificadora de CanIon, un polinucleótido regulatorio de CanIon, una construcción de polinucleótido o una secuencia de ADN que codifica un polinucleótido antisentido tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

Generalmente, un animal transgénico adecuado para el uso en la presente invención comprende cualquiera de los polinucleótidos, los vectores recombinantes y las células hospedantes descriptas en la presente invención. Más particularmente, los animales transgénicas de la presente invención pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos descriptos en la sección "Secuencias genómicas del gen de CanIon", la sección "Secuencias de ADNc de CanIon", la sección "Regiones codificadoras", la sección "Construcciones de polinucleótidos", la sección "Sondas y cebadores Oligonucleotídicos", la sección "Vectores recombinantes" y la sección "Células hospedantes".

Además los animales transgénicos adecuados para usar en la invención contienen en sus líneas somáticas y/o sus células de líneas germinales, un polinucleótido que comprende un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1 a A18 y los complementos del mismo.

En una primera realización preferida, estos animales transgénicos pueden ser buenos modelos experimentales para estudiar las diversas patologías relacionadas con la diferenciación celular, en particular concernientes a animales transgénicos en cuyo genoma se ha insertado una o varias copias de un polinucleótido que codifica una proteína de CanIon nativa o alternativamente una proteína de CanIon mutante.

En una segunda realización preferida, estos animales transgénicos pueden expresar un polipéptido deseado de interés bajo el control de los polinucleótidos regulatorios del gen de CanIon, que producen buenos rendimientos de la síntesis de esta proteína de interés y finalmente una expresión específica de tejido de esta proteína de interés.

El diseño de los animales transgénicos adecuados para uso en la invención se puede realizar de acuerdo con las técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica. Los detalles adicionales con respecto a la producción de estos animales transgénico y específicamente ratones transgénicos se pueden hallar, por ej., en las Patentes Estadounidenses Nos 4.873.191; 5.464.764; y 5.789.215.

Los animales transgénicos adecuados para el uso en la presente invención se producen por la aplicación de procedimientos que originan un animal con un genoma que ha incorporado material genético exógeno. El procedimiento incluye la obtención del material genético o una porción del mismo, que codifica una secuencia codificadora de CanIon, un polinucleótido regulatorio de CanIon o una secuencia de ADN que codifica un polinucleótido de CanIon antisentido tal como se describe en la presente memoria.

Un polinucleótido recombinante adecuado para usar en la invención se inserta en una línea de célula madre embrionaria o ES. La inserción con preferencia se realiza mediante la electroporación, tal como fue descripto por Thomas et al. (1987). Las células sometidas a electroporación se seleccionan (por ej. por selección por medio de marcadores seleccionables, por PCR o análisis de transferencia Southern) para hallar células positivas que tiene integrado el polinucleótido recombinante exógeno en su genoma, con preferencia por medio de un evento de recombinación homólogo. Se puede usar un procedimiento de selección ilustrativo positivo-negativo descripto por Mansour et al. (1988).

Luego, se aíslan las células positivas, se clonan e inyectan en blastocistos de 3,5 días de ratones, tal como fue descripto por Bradley (1987). Los blastocistos luego se insertan en un animal hospedante hembra y permitió cultivar a término.

Alternativamente, las células ES positivas se pone en contacto con embriones de 2,5 días en la etapa celular 8-16 (mórula) tal como fue descripto por Wood et al. (1993) o porNagy et al. (1993), las células ES se internalizan para colonizar en forma extensiva los blastocistos, que incluyen a las células que originarán la línea germinal.

La cría de la hospedante hembra se ensaya para determinar que animales son transgénicos por ej., incluyen la secuencia de ADN exógena insertada y cuales son de tipo salvaje.

Es adecuado para usar en la invención es un animal transgénico que contienen un ácido nucleico, un vector e expresión recombinante o una célula hospedante recombinante descripta en la presente memoria.

Líneas celulares recombinantes derivadas de los animales transgénicos de la invención.

Son adecuadas para el uso en la presente invención las células hospedantes recombinantes obtenidas de un animal transgénico descripto en la presente memoria. En una realización la invención abarca las células derivadas de mamíferos y animales hospedadores no humanos que comprenden un vector recombinante de la invención o un gen de CanIon alterado por la recombinación homóloga con un vector knock out.

Las líneas celulares recombinantes se pueden establecer in vitro a partir de células obtenidas de cualquier tejido de un animal transgénico de acuerdo con la invención, por ejemplo por transfección de los cultivos celulares primarios con vectores que expresan onc-genes tales como antígeno T grande de SV40, como se describe en Chou (1989) y Shay et al (1991).

Métodos de selección de moduladores de CanIon y compuestos interactuantes

Son adecuadas para el uso en la presente invención los compuestos que interactúan con, se unen o activan o inhiben la expresión o actividad de los polipéptidos, canales y polinucleótidos de CanIon. Tales compuestos pueden ser compuestos orgánicos o inorgánicos, que incluyen, pero sin limitaciones a, polipéptidos, polinucleótidos, lípidos, carbohidratos, nucleótidos, aminoácidos, o activadores o inhibidores de pequeñas moléculas. Como se describe en otra parte de esta memoria, tales compuestos son útiles para el tratamiento o prevención de alguna de una gran número de enfermedades o afecciones. Con preferencia, los inhibidores de la actividad o expresión de CanIon se usan en el tratamiento o prevención de trastorno psiquiatricotal como esquizofrenia o trastorno bipolar.

Métodos de selección para moduladores de canales CanIon

Los compuestos que se pueden unir a CanIon y los compuestos que pueden modular al función de CanIon tienen importantes aplicaciones en el tratamiento de enfermedades. Los canales iónicos dependientes del voltaje generalmente se establecen como blancos de los fármacos ya que ellos son accesibles desde el punto de vista farmacológico, codificados por una variedad de genes y usualmente operan como ensamblajes de proteínas multiméricas, que producen un alto grado de especificidad funcional y anatómica. Además, porque la apertura y cierre del canal iónico que involucra el movimiento de los aminoácidos sensibles al voltaje cargado conduce a cambios de los estados de conformación, los canales iónicos permiten el diseño de moléculas dependientes del estado que, por ejemplo, se unen solo a canales que están en estado de conducción (activado) o no conducción (inactivado).

Además, se ha demostrado que numerosos moduladores del canal de calcio son eficaces para el tratamiento o prevención de numerosas enfermedades o afecciones. Por ejemplo, se ha demostrado que los inhibidores de los canales de calcio son efectivos contra diferentes enfermedades y afecciones cardiovasculares (por ej., angina, arritmias, hipertensión), además de trastornos del SNC y neuronales (por ej., migrañas, efectos neurológicos de los accidentes cerebrovasculares, manía, disquinesia tardía inducida por neurolépticos, esquizofrenia, trastorno bipolar, dolor, epilepsia y otras). Además, se ha demostrado que los agonistas de los canales de calcio son efectivos para varias aplicaciones, tales como en la reducción de la duración de la y por otra parte de la atenuación de los efectos de la anestesia local. Los antagonistas y agonistas de los canales de CanIon son de modo parecido útiles para el tratamiento o prevención de estos y otras enfermedades y afecciones. Por ejemplo, los antagonistas de CanIon son útiles en el tratamiento o prevención de la esquizofrenia y trastorno bipolar.

Debido a que los canales iónicos dependientes de voltaje no requieren la unión al agonista para la activación, los compuestos con preferencia se identifican frente a los canales de CanIon funcionales. Los ensayos pueden incluir métodos de unión funcional y por radioligandos aplicadas a las células (vesículas o membranas) que expresan canales nativos o clonados o a los ensayos de célula entera. Los ensayos de células enteras funcionales pueden usar técnicas electrofisiológicas, tales como pinzamiento zonal. Los ensayos pueden involucrar cualquier tipo de canal dependiente de voltaje, con preferencia canales tipo L, Nn y T. También se puede medir la cinética del flujo de iones a través del canal, por ej., mediante fluorescencia, radiotrazador de punto final o técnicas de viabilidad celular.

Los ensayos también pueden hacer uso de diferentes toxinas, venenos o compuestos que se unen y abren o cierran canales (Denyer et al., Drug Disc. Today 3(7): 323-332 (1998). En una realización, los presentes ensayos involucran el uso de cualquiera del gran número de agonistas y antagonistas de los canales de calcio conocidos, por ej., como controles positivos o negativos. Los ejemplos de tales antagonistas de los canales de calcio conocidos incluyen fenilalquilaminas (por ej., verapamilo), benzotiacepinas (por ej., diltiazem), y dihidropiridinas (por ej., nifedipina); los agonistas de los canales de calcio incluyen FPL-64176 y BAY K 8644; los agonistas de los canales de sodio incluye Batrachotoxina; y los antagonistas de los canales de sodio incluyen espiradolina, mexiletino, U-54494A ((+/-) -cis-3,4-Dicloro-N-metil-N-[2-(1-pirrolidinil)-ciclohexil]-benzamida). Tales compuestos se pueden usar también como compuestos "guía", es decir, para actuar como moléculas de partida para el diseño o descubrimiento de moléculas derivadas que se unen o modulan específicamente los canales de CanIon.

En realizaciones preferidas, los ensayos de la invención comprenden u método para la identificación de una sustancia candidata comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar(I) una muestra o una célula hospedante que contiene un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una proteína de CanIon o un fragmento de la misma, o (ii) una célula hospedante recombinante que expresa un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una proteína de CanIon o un fragmento de la misma;

b) obtener una sustancia candidata;

c) poner en contacto dicha célula hospedante con dicha sustancia candidata;

d) determinar el efecto de dicha sustancia candidata en la actividad de CanIon.

La determinación del efecto de la sustancia candidata en la actividad de CanIon se puede lograr de acuerdo con los métodos conocidos. Con preferencia, el efecto de la sustancia candidata en la actividad de CanIon es un efecto agonista o antagonista. Generalmente, un compuesto inhibe a CanIon si la capacidad de transporte de iones (por ej., Ca2+o Na+) está disminuida. Un compuesto estimula a CanIon si la capacidad de transporte de iones está aumentada.

La actividad de CanIon se puede detectar mediante cualquiera de los métodos adecuados. En ejemplos preferidos, la actividad de CanIon se detecta por la medición de un evento de señalización. Si bien un evento de señalización puede comprender cualquier cambio adecuado de una característica o parámetro molecular de la célula, los ejemplos no limitantes de un evento de señalización incluye cambios en los flujos de iones, tales como cambios en o generación de u flujo de Ca2+ o Na+, o K+ o activación de la enzima.

En un aspecto, el flujo iónico se puede monitorear por la medición de propiedades electrofisiológicas del canal de CanIon, mediante por ejemplo técnicas para medición de la corriente de la célula entera a partir de una célula única o en parches de membrana. En otros ejemplos, las marcas fluorescentes o radiactivas se pueden usar para detectar el desplazamiento de un compuesto de unión a CanIon conocido o para detectar el flujo iónico a través de una célula (por ej., Ca2+ o Na+ marcado). Se puede usar un indicador de los parámetros fisiológicos de una célula, tales como un indicador fluorescente para la viabilidad celular. En otros ejemplos, se puede detectar el cambio de la localización física de un indicador, tal como el uso de una clasificación de células activadas por fluorescencia para identificar la exclusión o captación de un indicador fisiológico.

La muestra usada en el ensayo de la invención contiene un polipéptido o una célula hospedante que expresa un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una proteína de CanIon o un fragmentos del mismo, o (ii) una célula hospedante recombinante que expresa un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una proteína de CanIon o un fragmentos del mismo. Con preferencia, los ensayos de CanIon de la invención involucra el uso de una célula hospedante recombinante que expresa un polipéptido de CanIon funcional. Las células hospedantes pueden expresar o comprender una subunidad funcional alfa del canal de CanIon o pueden expresar o comprender uno o más subunidades de canal iónico o un complejo del canal iónico que comprende CanIon. Con preferencia, se usa una célula hospedante que tiene baja expresión del canal iónico endógeno o tiene bajo umbral de conductancia iónico, particularmente Ca2+ y/o Na+.

Unión a radioligando

En un aspecto, un canal iónico se puede seleccionar por la identificación de un ligando de alta afinidad que se une a un sitio de CanIon de interés y con preferencia tiene un efecto modulatorio deseado y la detección de la capacidad de un compuesto de ensayo de desplazar dicho ligando marcado. Las listas de agentes toxicológicos/farmacológicos usados en los ensayos de canales dependientes del voltaje (Ca2+, Na+ y K+) se proporcionan en Denyer et al. (supra). Este método es generalmente adecuado para detectar compuestos que se unen la mismo sitio o se acoplan alostéricamente al sitio, como el ligando marcado, pero no proporciona información como las propiedades agonistas o antagonistas del compuesto.

Ensayos celulares basados en fluorescencia y radiotrazadores

En otro ensayo, la función de CanIon se puede monitorear por la medición de cambios en la concentración intracelular del ion permeable mediante indicadores de iones fluorescentes o iones radiomarcados.

Típicamente, los canales iónicos tales como los canales de Na+ inactivan en milisegundos después de la estimulación del voltaje. Los canales de Ca2+ exhiben ningún o menor grado de inactivación y se pueden abrir por alta despolarización de K+. En los ensayos de células basados en fluorescencia o radiotrazador, el canal iónico se puede activar generalmente por una toxina o cualquier compuesto de ensayo, o alta despolarización de K+, de modo tal que el canal se abre durante periodos prolongados (hasta muchos minutos).

En ensayos basados en fluorescencia, los colorantes fluorescentes de Ca2+ están disponibles para el uso (por ej., Fluo-3, calcio verde -1, sondas moleculares, OR, U.S.A). Los canales de Ca2+ se pueden activar por la despolarización de la membrana con una solución isotónica o los canales de Na+ con una toxina u otro compuesto y el movimiento transitorio resultante de la fluorescencia en la célula se puede medir durante 20 a 60 s. Los sistemas y dispositivos de medición de fluorescencia se describen adicionalmente en Denyer et al. (supra). Los radiotrazadores ^{22}Na+ y ^{14}C guanidina se usan comúnmente para le análisis de los canales de Na+ y ^{45}Ca2+ para el análisis de los canales de Ca2+. En una realización preferida descripta en Denyer et al. (supra), se usan las microplacas Cytostar-Tscintillating (Amersham International, U.K.) para llevar a cabo los ensayos basados en células de CanIon de alto rendimiento.

En ensayos adicionales, se controla la función de Ca2+ de un canal iónico por la medición de un potencial de membrana con un indicador de potencial de membrana. La alta resistencia eléctrica de las membranas biológicas permiten corrientes iónicas bajas a través de las membranas plasmáticas para originar grandes cambios del potencial de membrana. Los ensayos de voltaje se pueden emplear convenientemente de este modo para detectar el flujo de iones genéricos a través de las membranas. Las líneas celulares se eligen generalmente de modo que se minimicen tales efectos de los canales iónicos endógenos. Una variedad de colorantes están disponibles como colorantes del indicador de potencial de membrana, divididos en colorantes de respuesta rápida y lenta, además de los colorantes del sensor de voltaje basados en FRET. (Aurora Biosciences, CA, USA; revisado en Gonzalez et al., Drug Disc. Today 4(9): 431:439 (1999).

Viabilidad celular

En los ensayos de viabilidad celular, la actividad del canal iónico y el flujo de iones están directamente relacionados con la viabilidad celular. Ambos sistemas de levaduras y células de mamíferos están disponibles para ensayar un blanco de canal iónico. Por ejemplo, se ha usado un sistema de levadura que emplea una línea celular de Saccharomyces cerevisiae deficiente en la captación de K+ específica de iones, en el cual un canal de K+ funcional de interés se expresa en la línea celular, de este modo se restaura la captación de K+ y la promoción de la supervivencia celular. (Anderson et al., Symp. Soc. Exp. Biol. 48: 85-97 (1994)) Tales ensayos para los canales de Ca2+ o Na+ se pueden usar para identificar compuestos capaces de bloquear la función de CanIon. Los sistemas celulares de mamífero están también disponibles, tales como un ensayo del canal de Na+ empleando células de neuroblastoma de mamíferos con una lectura colorimétrica de viabilidad celular. Las células se tratan con un abridor del canal de Na+ y un inhibidor de la bomba de Na+/K+ para promover una sobrecarga de Na+ intracelular letal. El tratamiento con un compuesto de ensayo capaz de bloquear el canal mejorará la viabilidad celular, tales compuestos que aumentan la apertura del canal promoverán adicionalmente la muerte celular. (Manger et al., Anal. Biochem. 214: 190-194 (1993).

Electrofisiología

Las técnicas de pinzamiento del voltaje electrofisiológico involucran la medición del flujo de corriente iónica a través de uno o muchos canales. Un microelectrodo simple se usa para controlar el voltaje de membrana mientras se mide el flujo de corriente a través de una célula única o parche de membrana. (Hamill, Pfugers Arch. 391, 85-100 (1981). La corriente iónica de este modo se puede medir en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo de interés. Se ha diseñado un sistema de detección del compuesto a gran escala (Neurosearch NS, Glostrup, Denmark; Olesen et al., Voltage gated/on channel modulators, 7-8 de diciembre, Philadelphia PA, USA (1995); Denyer et al., supra).

Métodos de detección para sustancias que interactúan con un polipéptido de CanIon

Para el propósito de la presente invención, un ligando significa una molécula, tal como una proteína, un péptido, un anticuerpo o cualquier compuesto químico sintético capaz de unirse a la proteína de CanIon o uno de sus fragmentos o variantes o para modular la expresión del polinucleótido que codifica para CanIon o un fragmento o variante del mismo.

En el método de detección del ligando de acuerdo con la presente invención, una muestra biológica o una molécula definida ensayada como un ligando putativo de la proteína de CanIon se pone en contacto con la correspondiente proteína de CanIon purificada, por ejemplo la correspondiente proteína de CanIon purificada recombinante producida por una célula hospedante recombinante como se describe en la presente memoria antes, con el fin de formar un complejo entre esta proteína y la molécula del ligando putativo ensayada.

Como ejemplo ilustrativo, para estudiar la interacción de un polipéptido que comprende un polipéptido como se muestra en la EC ID No 5, con fármacos o pequeñas moléculas, tales como las moléculas generadas a través de métodos químicos combinatorios, la microdiálisis se acopla al método de HPLC descripto por Wang et al. (1997) o el método de electroforesis capilar afinidad descripto por Bush et al. (1997).

En métodos adicionales, se pueden identificar péptidos, fármacos, ácidos grasos, lipoproteínas moléculas pequeñas que interactúan con un polipéptido que comprende un polipéptido como se muestra en la SEC ID No 5, mediante ensayos tales como los siguientes. La molécula para el ensayo de unión se marca con una marca detectable, tal como una marca fluorescente, radioactiva o enzimática y se pone en contacto con el polipéptido inmovilizado en condiciones que permiten que se produzca la unión específica. Después de la eliminación de las moléculas unidas en forma no específica, se detectan las moléculas unidas empleando medios apropiados.

Otro objeto de la presente invención comprende métodos y kits para la detección de sustancias candidatas que interactúan con un polipéptido canal iónico.

La presente invención se relaciona con métodos para la detección de sustancias de interés que interactúan con la proteína de CanIon o un fragmento o variante de la misma. Por su capacidad de unirse en forma covalente o no covalente a una proteína de CanIon o a un fragmento variante de la misma, estas sustancias o moléculas se pueden usar ventajosamente tanto in vitro como in vivo.

In vitro, se pueden usar dichas moléculas interactuantes como medios de detección para identificar la presencia de un polipéptido canal iónico en una muestra, con preferencia una muestra biológica.

Un método para la detección de una sustancia candidata comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar un polipéptido que comprende un polipéptido como se muestra en la SEC ID No 5;

b) obtener una sustancia candidata

c) poner en contacto dicho polipéptido con dicha sustancia candidata;

d) detectar los complejos formados entre dicho polipéptido y dicha sustancia candidata.

La invención también trata de un kit para la detección de una sustancia candidata que interactúa con el polipéptido canal iónico, donde dicho kit comprende:

a) un polipéptido canal iónico que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5 de un fragmento del péptido o una variante del mismo;

b) opcionalmente medios útiles para detectar el complejo formado entre el polipéptido canal iónico o un fragmento del péptido o una variante del mismo y la sustancia candidata.

En una realización preferida del kit descripto anteriormente, los medios de detección comprenden anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos a contra el polipéptido canal iónico o o un fragmento del péptido o una variante del mismo.

Se pueden ensayar varias sustancias o moléculas candidatas para determinar la interacción con un polipéptido de CanIon. Estas sustancias o moléculas incluyen, sin limitación a, compuestos orgánicos naturales o sintéticos de origen biológico tales como polipéptidos. Cuando la sustancia o molécula candidata comprende un polipéptido, este polipéptido puede ser el producto de expresión de un clon del fago perteneciente a una genoteca de péptidos aleatoria basado en fago o alternativamente el polipéptido puede ser el producto de expresión resultante de una genoteca de ADNc clonada en un vector adecuado para realizar un ensayo de detección de dos híbridos.

La invención también se relaciona con kits útiles para realizar el método de detección descripto de aquí en adelante. Con preferencia, tales kits comprenden un canal iónico o un fragmento o variante de los mismos y opcionalmente medios útiles para detectar el complejo formado entre el polipéptido de CanIon o su fragmento o variante y la sustancia candidata. En una realización preferida los medios de detección comprenden anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra el correspondiente polipéptido canal iónico o un fragmento o variante de los mismos.

A. Ligandos candidatos obtenidos a partir de genotecas de péptidos aleatorios

En una realización particular del método de detección, el ligando putativo es el producto de expresión de un inserto de ADN contenido en un vector del fago (Parmley y Smith, 1988). Específicamente, se usan las genotecas de fagos de péptidos aleatorios. Los insertos de ADN aleatorios codifican para los péptidos de 8 a 20 aminoácidos de longitud (Oldenburg K.R. et al., 1992; Valadon P., et al., 1996; Lucas A.H., 1994; Westerink M.A.J., 1995; Felici F. et al., 1991). De acuerdo con esta realización particular, se retienen los fagos recombinantes que expresan una proteína que se une a la proteína de CanIon inmovilizada y el complejo formado entre la proteína de CanIon y el fago recombinante posteriormente se puede inmunoprecipitar por un anticuerpo policlonal o monoclonal dirigido contra la proteína de CanIon.

Una vez que se ha construido la genoteca de los fagos recombinantes, la población de fagos se pone en contacto con la proteína de CanIon inmovilizada. Luego la preparación de los complejos se lava para eliminar los fagos recombinantes unidos en forma no específica. Los fagos que se unen específicamente a la proteína de CanIon luego se eluyen con un buffer (pH ácido) o se inmunoprecipitan con el anticuerpo monoclonal producido por le hibridoma anti-CanIon y esta población de fagos posteriormente se amplifica por una sobreinfección de la bacteria (por ejemplo E. coli). El paso de selección se puede repetir varias veces, con preferencia 2-4 veces, con el fin de seleccionar los clones de fagos recombinantes más específicos. El último paso comprende la caracterización del péptido producido por los clones de fagos recombinantes seleccionados ya sea por expresión in la bacteria infectada y asilamiento, expresión del fago inserto en otro sistema del vector hospedador o por secuenciación del inserto contenido en los fagos recombinantes seleccionados.

B. Ligandos candidatos obtenidos por experimentos de competencia

Alternativamente, los péptidos, fármacos o moléculas pequeñas se unen la polipéptido canal iónico que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5 o un fragmento del péptido o una variante del mismo. En tales ensayos, el polipéptido canal iónico, o un fragmento del mismo, se inmoviliza a una superficie, tal como una placa de plástico. Cantidades crecientes de los péptidos, fármacos o moléculas pequeñas se ponen en contacto con el polipéptido canal iónico inmovilizado, o un fragmento del mismo, en presencia de un ligando conocido del polipéptido canal iónico con marca detectable. Por ejemplo, el ligando del polipéptido canal iónico marcado en forma detectable con una señal fluorescente, radioactiva o enzimática. La capacidad de la molécula de ensayo de unirse al polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo, se determina por la medición de la cantidad de ligando conocido marcado en forma detectable unido en presencia de la molécula de ensayo. Una disminución de la cantidad de ligando conocido unido al polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo, cuando la molécula de ensayo está presente indicó que la molécula de ensayo puede unirse al polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo.

C. Ligandos candidatos obtenidos por cromatografía de afinidad

Las proteínas u otras moléculas interactúan con el polipéptido canal iónico que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5 o un fragmento del péptido o una variante del mismo. El polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo, se puede unir al columna mediante técnicas convencionales que incluyen acoplamiento químico a una matriz de columna adecuada tal como agarosa, Affi Gel®, u otras matrices familiares para los expertos en la técnica. En alguna realizaciones de este método, la columna de afinidad contiene proteínas quiméricas en la cual la proteína de CanIon o un fragmento de la misma se fusiona a la glutatión S transferasa (GST). Una mezcla de proteínas celulares o combinación de proteínas expresadas como se describió anteriormente se aplica a la columna de afinidad. Las proteínas u otras moléculas que interactúan con el polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo unidas a la columna luego se pueden aislar y analizar por electroforesis en gel 2-D como se describió anteriormente en Ramunsen et al. (1997). Alternativamente, las proteínas retenidas en la columna de afinidad se pueden purificar por métodos basados en electroforesis y secuenciar. El mismo método se puede usar para aislar anticuerpos, para detectar productos por despliegue del fago, o detectar los anticuerpos humanos por despliegue del fago.

D. Ligandos candidatos obtenidos por métodos con biosensor óptico

Las proteínas que interactúan con el polipéptido canal iónico que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5 o un fragmento del péptido o una variante del mismo también se pueden detectar por medio de un biosensor óptico como se describe en Edwards y Leatherbarrow (1997) y también en Szabo et al. (1995). Esta técnica permite la detección de las interacciones entre las moléculas en tiempo real, sin necesidad de moléculas marcadas. Esta técnica se basa en el fenómeno de la resonancia del plasmón superficial (SPR). Brevemente, la molécula del ligando candidato para el ensayo se une a una superficie (tal como una matriz de carboximetil dextrano). Un rayo de luz se dirige hacia el lado de la superficie que no contiene la muestra de ensayo y es reflejada por dicha superficie. El fenómeno de SPR causa una disminución de la intensidad de la luz reflejada con una asociación específica de ángulo y longitud de onda. La unión de las moléculas del ligando candidato origina un cambio en el índice de refracción sobre la superficie, tal cambio se detecta como un cambio en la señal de SPR. para la detección de las moléculas o sustancias del ligando candidato que puede interactuar con el polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo, el polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo, se inmoviliza sobre una superficie. Esta superficie comprende un lado de una celda a través de la cual fluye la molécula candidata ensayada. La unión de la molécula candidata al polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo se detecta como un cambio de la señal de SPR. Las moléculas candidatas ensayadas pueden ser proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos o moléculas pequeñas generadas por reacciones químicas de combinación. Esta técnica también se puede realizar por la inmovilización de células eucariotas o procariotas o vesículas lipídicas que exhiben un polipéptido canal iónico endógeno o expresado en forma recombinante en su superficie.

La principal ventaja del método es que permite la determinación de la velocidad de asociación entre el polipéptido canal iónico y las moléculas interactuantes con el polipéptido canal iónico. De este modo es posible seleccionar específicamente moléculas de ligando que interactúen con el polipéptido canal iónico o un fragmento del mismo, mediante constantes de asociación fuertes o, a la inversa, débiles.

E. Ligandos candidatos obtenidos mediante un ensayo de detección de dos híbridos

El sistema de ensayo de dos híbridos en levaduras está diseñado para estudiar la interacción proteína-proteína in vivo (fields y Song, 1989), y depende de la fusión de una proteína cebo al dominio de unión del ADN de la proteína Gal4 de la levadura. Esta técnica también se describe en las Patentes Estadounidenses Nos. US 5.667.973 5.283.173 (Fields et al.).

El procedimiento general de la selección de la genoteca por el ensayo de dos híbridos se puede realizar como se describe en Harper et al. (1993), Cho et al. (1998), o Fromont-Racine et al. (1997).

La proteína o polipéptido cebo comprende, consiste esencialmente o consiste en un polipéptido canal iónico que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID No 5 o un fragmento del péptido o una variante del mismo.

Más precisamente, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido canal iónico o un fragmento o variante del mismo se fusiona a un polinucleótido que codifica el dominio de unión al ADN de la proteica GAL4, la secuencia de nucleótidos fusionada se inserta en un vector de expresión adecuada, por ejemplo pAS2 o pM3.

Luego, una genoteca de ADNc humana se construye en un vector diseñado especialmente, de modo tal que el inserto ADNc human se fusiona a una secuencia de nucleótidos del vector que codifica el dominio transcripcional de la proteína GAL4. Con preferencia, el vector se usa en el vector pACT vector. Los polipéptidos codificados por los insertos de nucleótidos de la genoteca de ADNc se denominan polipéptidos "presa".

Un tercer vector contiene un gen marcador detectable, tal como el gen de beta galactosidasa o gen de CAT que se coloca bajo el control de una secuencia de regulación que responde a la unión de una proteína completa Gal4 que contiene ambos dominios de activación de transcripción de y unión a ADN, por ejemplo, se puede usar el vector pG5EC.

También se usan dos cepas de levaduras diferentes. Como un ejemplo ilustrativo pero no limitante, se pueden usar las dos cepas de levadura diferentes siguientes:

- Y190, cuyo fenotipo es (MATa, Leu2-3,112 ura3-12, trp1-901, his3-0200, ade2-101, gal4Dgal180D URA3 GAL-LacZ, LYS GAL-H/33, cyh')

- Y187, cuyo fenotipo es (MATa gal4 ga/80 his3 trpl-901 ade2-101 ura3-52/eu2-3, -112 URA3 GAL-lacZmet), el cual es el tipo de apareamiento opuesto de Y190.

Brevemente, 20 \mug de la genoteca de pAS2/CanIon y 20 \mug de pACT-ADNc se co-transforman en cepas de levaduras Y190. Los transformantes se seleccionan para el crecimiento en un medio mínimo que carece de histidina, leucina y triptofano, pero que contiene el inhibidor de la síntesis de histidina 3-AT (50 mM). Se seleccionan las colonias positivas para la beta galactosidasa por un ensayo de liberación del filtro. Las colonias dobles positivas (His., beta-gal+) luego se incubaron en placas que carecen de histidina, leucina, pero contiene triptofano y cicloheximida (10 mg/ml) para seleccionar por pérdida de los plásmidos de pAS2/CanIon por retención de los plásmidos de la genoteca de pACT-ADNc. Las cepas resultantes Y190 se aparean con las cepas Y187 que expresan las proteínas de CanIon o control no relacionadas; tales como las ciclofilinas B, lamina o SNF1, como fusiones Ga14 como se describe en Harper et al. (1993) y en Bram et al. (Bram RJ et al., 1993), y se seleccionan por beta galactosidasa por ensayo de liberación de filtro. Los clones de levaduras que son beta gal- después del apareamiento con las fusiones de Gal4 control se consideran falsos positivos.

En otra realización del método de dos híbridos de acuerdo con la invención, se puede evaluar la interacción entre el CanIon o un fragmento o variante del mismo con las proteínas celulares mediante el Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catálogo No. K1604-1, Clontech). Como se describe en el manual que acompaña el Matchmaker Two Hybrid System 2 (Catálogo No. K1604-1, Clontech), los ácidos nucleicos que codifican la proteína de CanIon o una porción de la misma, se insertan en un vector de expresión de modo tal que estos están en marco con el ADN que codifica el dominio de unión de ADN del activador GAL4 de la transcripción de levaduras. Un ADNc deseado, con preferencia el ADNc humano, se inserta en un segundo vector de expresión de modo tal que ellos están en marco con el ADN que codifica el dominio de activación de GAL4. Los dos plásmidos de expresión se transforman en levaduras y las levaduras se incuban en un medio de selección que selecciona para la expresión de marcadores seleccionables en cada uno de los vectores de expresión además de la expresión dependiente de GAL4 del gen HIS3. Los transformantes capaces de crecer en un medio carente de histidina se selecciona por la expresión de lacZ dependiente de GAL4. Estas células que son positivas en ambos ensayos de selección de histidina e lacZ contienen interacción entre CanIon y la proteína o péptido codificado por le inserto de ADNc seleccionado inicialmente.

Método de detección de sustancias que interactúan con las secuencias regulatorias del gen de CanIon

La presente invención también trata de un método para la detección de sustancias o moléculas que pueden interactuar con las secuencias regulatorias del gen de CanIon, tal como por ejemplo las secuencias del promotor o potenciador.

Los ácidos nucleicos que codifican las proteínas que pueden interactuar con las secuencias regulatorias del gen de CanIon, más particularmente una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en los polinucleótidos de la región regulatoria 5' y 3' o un fragmento o variante de la misma y con preferencia una variante que comprende uno de los marcadores bialélicos adecuados para el uso en la invención, se puede identificar mediante un sistema de un híbrido, tal como en que se describe en el cuadernillo adjunto en el kit Matchmaker One-Hybrid System de Clontech (Catalog Ref. n° K1603-1). Brevemente, la secuencia de nucleótidos blanco se clona corriente arriba de una secuencia indicadora seleccionable y la construcción del ADN resultante se integra en el genoma de la levadura (Saccharomyces cerevisiae). Las células de levaduras que contienen la secuencia indicadora en su genoma luego se transforman con una genoteca que comprende moléculas de fusión entre los ADNcs que codifican proteínas candidatas para unirse en las secuencias regulatorias del gen de CanIon y secuencias que codifican el dominio del activador de un factor de transcripción de una levadura tal como GAL4. Las células recombinantes de levaduras se incuban en un caldo de cultivo para seleccionar células que expresan la secuencia indicadora. Las células recombinantes de levaduras de este modo seleccionados contienen una proteína de fusión que es capaz de unirse sobre la secuencia regulatoria blanco del gen de CanIon. Luego, los ADNcs que codifican las proteínas de fusión se secuencian y se pueden clonar en los vectores de expresión o transcripción in vitro. La unión de los polipéptidos codificados a las secuencias regulatorias blanco del gen de CanIon se pueden confirmar las técnicas familiares para los expertos en la técnica, tal como los ensayos de retardo en geles o ensayos de protección de ADNsa.

Los ensayos de retardo en geles también se pueden realizar en forma independiente para detectar moléculas candidatas que pueden interactuar con las secuencias regulatorias del gen de CanIon, tal como fue descripto por Fried y Crothers (1981), Garner y Revzin (1981) y Dent y Latchman (1993). Estas técnicas se basan en el principio de acuerdo con el cual el fragmento de ADN que se une a una proteína migra más lento que le mismo fragmento de ADN no unido. Brevemente, la secuencia de nucleótidos blanco está marcada. Luego la secuencia de nucleótidos blanco marcada se ponen en contacto con un extracto nuclear total de las células que contienen factores de transcripción, o con moléculas candidatas diferentes ensayadas. La interacción entre la secuencia regulatoria blanco del gen de CanIon y la molécula candidata o el factor de transcripción se detecta después de la electroforesis del gel o capilar mediante un retardo de la migración.

Método para la detección de ligandos que modulan la expresión del gen de CanIon

Es adecuado para usar en la invención un método para la detección de moléculas que modulan la expresión de la proteína de CanIon. Tal método de detección comprende los pasos de:

a) cultivar una célula procariota o eucariota que ha sido transfectado con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de CanIon o una variante o un fragmento del mismo, colocada bajo el control de su propio promotor,

b) poner en contacto la célula cultivada con una molécula de ensayo;

c) cuantificar la expresión de la proteína de CanIon o una variante o un fragmento del mismo.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de CanIon o una variante o un fragmento del mismo comprende un alelo de por lo menos uno de los marcadores bialélicos A12 o A16 y los complementos del mismo.

Mediante las técnicas de recombinación de ADN bien conocidos por un experto en la técnica, la proteína de CanIon que codifica la secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión, corriente abajo de su secuencia promotora. Como un ejemplo ilustrativo, la secuencia promotora del gen de CanIon está contenida en el ácido nucleico de la región regulatoria 5'.

La cuantificación de la expresión de la proteína de CanIon se puede realizar tanto a nivel del ARNm como a nivel de la proteína. En le último caso, se pueden usar anticuerpos monoclonales o policlonales para cuantificar las cantidades de la proteína de que se ha producido, por ejemplo en un ensayo de ELISA o RIA.

En una realización preferida, la cuantificación del ARNm de CanIon se realiza por una amplificación por PCR cuantitativa del ADNc obtenido por una transcripción reversa del ARNm total de la célula hospedante cultivada de CanIon -transfectada mediante un par de cebadores específicos para CanIon.

Es adecuado para el uso en la presente invención un método para detectar sustancias o moléculas que pueden aumentar o disminuir el nivel de expresión del gen de CanIon. Tal método puede permitir a un experto en la técnica para seleccionar sustancias que ejercen un efecto regulador en el nivel de expresión del gen de CanIon y que puede ser útil como los elementos activos incluidos composiciones farmacéuticas para tratar los pacientes que sufren de cualquiera de las enfermedades descriptas en la presente memoria.

De este modo, es adecuado para el uso en la presente invención un método para la detección de una sustancia o molécula candidata que modula la expresión del gen de CanIon, este método comprende los siguientes pasos:

- proporcionar una célula hospedante recombinante que contiene un ácido nucleico, donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de la región regulatoria 5' o un fragmento o una variante biológicamente activo del mismo localizada corriente arriba del polinucleótido que codifica una proteína detectable;

- obtener una sustancia candidata; y

- determinar la capacidad de la sustancia candidata para modular los niveles de expresión del polinucleótido que codifica la proteína detectable.

En una realización adicional, el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la región regulatoria 5' o un fragmento o una variante biológicamente activo del mismo también incluye una región 5'UTR del ADNc de CanIon de la SEC ID No 4, o uno de sus fragmentos biológicamente activos o variantes del mismo.

Entre los polinucleótidos preferidos que codifican una proteína detectable, se deben citar polinucleótidos que codifican una beta galactosidasa, proteína fluorescente verde (GFP) y cloranfenicol acetil transferasa (CAT).

Son adecuados para el uso en la presente invención los kits útiles para realizar el método de detección descripto en la presente memoria. Con preferencia, tales kits comprenden un vector recombinante que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos de la región regulatoria 5' o un fragmento o una variante biológicamente activo del mismo localizada corriente arriba del polinucleótido y operativamente unida a un polinucleótido de acuerdo con una proteína detectable o la proteína de CanIon o un fragmento o variante de las mismas.

En otro método para la detección de una sustancia o molécula candidata que modula la expresión del gen de CanIon, el método comprende los siguientes pasos:

a): proporcionar una célula hospedante recombinante que contiene un ácido nucleico, donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de 5'UTR del ADNc de CanIon de la SEC ID No 4, o uno de sus fragmentos biológicamente activos o variantes del mismo, la secuencia de 5'UTR o sus fragmentos o variantes biológicamente activos que están operativamente unidos a un polinucleótido que codifica una proteína detectable;

b): obtener una sustancia candidata; y

c): determinar la capacidad de la sustancia candidata para modular los niveles de expresión del polinucleótido que codifica la proteína detectable.

En una realización específica del método de detección anterior, el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia 5'UTR del ADNc de CanIon de la SEC ID No 4, o uno de sus fragmentos o variantes biológicamente activos del mismo, incluye una secuencia promotora que es endógena con respecto a la secuencia 5'UTR de CanIon.

En otra realización específica del método de detección anterior, el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de 5'UTR de del ADNc de CanIon de la SEC ID No 4, o uno de sus fragmentos o variantes biológicamente activos del mismo, incluye una secuencia del promotor que es exógena con respecto a la secuencia de 5'UTR de CanIon definida en la presente memoria.

En otra realización específica, el ácido nucleico que comprende una secuencia de 5'-UTR del ADNc de CanIon de la SEC ID No 4 o fragmentos biológicamente activos del mismo incluye un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A12 o A16 o los complementos del mismo.

Es adecuado para usar en la invención un kit para la detección de una sustancia candidata que modula la expresión del gen de CanIon, donde dicho kit comprende un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que incluye una secuencia de 5'-UTR del ADNc de CanIon de la SEC ID No 4 o uno de sus fragmentos o variantes biológicamente activos del mismo, la secuencia de 5'UTR o su fragmento o variante biológicamente activo operativamente unida a un polinucleótido que codifica una proteína detectable.

Los niveles y patrones de expresión de CanIon se pueden analizar por la hibridación de la solución con sondas largas como se describe en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 97/05277. Brevemente, el ADNc de CanIon o el ADN genómico de CanIon descripto anteriormente o fragmentos del mismo, se inserta en un sitio de clonación inmediatamente corriente abajo de un promotor de ARN polimerasa del bacteriófago (T3, T7 o SP6) para producir un ARN antisentido. Con preferencia, el inserto de CanIon comprende por lo menos 100 o más nucleótidos consecutivos de la secuencia genómica del ADNo las secuencias de ADNc. El plásmido se linealiza y trasncribe en presencia de ribonucleótidos que comprenden ribonucleótidos modificados (es decir. biotina-UTP y DIG-UTP). Un exceso de este ARN marcado en forma doble se hibridiza en solución con el ARNm aislado de las células o tejidos de interés. La hibridación se realiza en condiciones de rigurosidad estándar (40-50°C durante 16 horas en formamida 80%, buffer NaCl 0,4 M, pH 7-8). La sonda no hibridizada se elimina por digestión con ribonucleasas específicas para ARN de cadena simple (es decir ARNasas CL3, T1, Phy M, U2 o A). La presencia de la modificación de biotina-UTP permite la captura del híbrido en una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina. La presencia de la modificación DIG permite que
el híbrido sea detectado y cuantificado por ELISA mediante un anticuerpo anti-DIG acoplado a la fosfatasa alcalina.

El análisis cuantitativo de la expresión del gen de CanIon también se puede realizar mediante matrices. Como se usa en la presente memoria, el término matriz significa una disposición unidimensional, dos dimensiones o multidimensional de una pluralidad de los ácido nucleicos de longitud suficiente para permitir la detección específica de la expresión de los ARNm que pueden hibridizar a los mimos. Por ejemplo, las matrices pueden contener una pluralidad de los ácido nucleicos derivados de los genes cuyos niveles de expresión se evalúan. Las matrices pueden incluir el ADN genómico de CanIon, las secuencias del ADNc de CanIon o las secuencias complementarias de las mismas o fragmentos del mismo, particularmente estos comprenden por lo menos uno de los marcadores bialélicos de acuerdo con la presente invención, con preferencia por lo menos uno de los marcadores bialélicos A1 a A17. Con preferencia, los fragmentos son por lo menos de 15 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos son por lo menos de 25 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los fragmentos son por lo menos de 50 nucleótidos de longitud. Con más preferencia, los fragmentos son por lo menos de 100 nucleótidos de longitud. En otra realización preferida, los fragmentos son más de 100 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones los fragmentos pueden ser más de 500 nucleótidos de longitud.

Por ejemplo, el análisis cuantitativo de la expresión del gen de CanIon se puede realizar con una micromatriz de ADN complementario como se describe en Schena et al. (1995 y 1996). Los ADNc de CanIon de longitud completa o fragmentos del mismo se amplifican por PCR y se dispone en una placa de microtitulación de 96 pocillos en extendidos de microscopio sililado mediante robótica de alta velocidad. Las matrices impresas se incuban en una cámara de humedad para permitir la rehidratación de los elementos de la matriz y se enjuagan, una vez en SDS 0,2% durante 1 min, dos veces en aguadurante 1 min y una vez durante 5 min en una solución de borohidruro de sodio. Las matrices se sumergen en agua durante 2 min a 95°C, se transfieren a SDS 0,2% durante 1 min, se enjuagan dos veces con agua, secan al aire y conservan en la oscuridad a 25°C.

El ARNm de la célula o tejido se aísla o se obtiene en forma comercial y se preparan las sondas por una única ronda de transcripción reversa. Las sondas se hibridizan en micromatrices de 1 cm^{2} bajo una cubierta de vidrio 14 x 14 mm durante 6-12 horas a 60°C. Los matrices se lavan durante 5 minutos a 25°C en un buffer de lavado de baja rigurosidad (1 x SSC/SDS 0,2%), luego durante 10 min a temperatura ambiente en un buffer de alta rigurosidad (0,1 x SSC/SDS 0,2%). Las matrices se barren en 0,1 x SSC mediante un dispositivo de barrido de fluorescencia láser ajustado a un juego de filtros comunes. Las mediciones de expresión diferencial precisas se obtienen tomando el promedio de las relaciones de dos hibridaciones independientes.

El análisis cuantitativo de la expresión del gen de CanIon también se pueden realizar con los ADNc de CanIon de longitud completo o fragmentos del mismo en las matrices de ADN complementario se describen en Pietu et al. (1996). El ADNc de CanIon de longitud completo o fragmentos del mismo se amplifica por PCR y se salpican las membranas. Luego, los ARNm que se originan de diferentes tejidos o células se marcan con nucleótidos radioactivos. Después de la hibridación y lavado en condiciones controladas, los ARNm hibridizados se detectan por imágenes de fósforo o autorradiografía. Se realizan los experimentos por duplicado y luego se lleva a cabo un análisis cuantitativo de ARNm expresado en forma diferencial.

Alternativamente, el análisis de la expresión mediante el ADN genómico de CanIon, el ADNc de CanIon o fragmentos del mismo se puede hacer mediante matrices de nucleótidos de alta densidad como se describe en Lockhart et al. (1996) y Sosnowsky et al. (1997). Los oligonucleótidos de 15-50 nucleótidos de la secuencias del ADN genómico de CanIon o el ADNc de CanIon, particularmente las que comprenden por lo menos uno de los marcadores bialélicos de acuerdo con la presente invención, con preferencia por lo menos un marcador bialélico seleccionado del grupo que consiste en A1 a A17, o las secuencias complementarias del mismo, se sintetizan directamente en el chip (Lockhart et al., supra) o se sintetizan y luego se dirigen la chip (Sosnowski et al., supra). Con preferencia, los oligonucleótidos son aproximadamente 20 nucleótidos de longitud.

Las sondas de ADNc de CanIon marcadas con un compuesto apropiado, tal como biotina, digoxigenina o colorante fluorescente se sintetizan a partir de la población de ARNm apropiada y luego se fragmentan al azar en un tamaño promedio de 50 a 100 nucleótidos. Las sondas luego se hibridizan al chip. Después del lavado como se describe en Lackhartet al., supra y la aplicación de campos eléctricos diferentes (Sosnowsky et al., 1997), los colorantes o compuestos marcados se detectan y cuantifican. Se realizan las hibridaciones por duplicado. El análisis comparativo de la intensidad de la señal que origina las sondas de ADNc en el mismo oligonucleótido blanco en muestras de ADNc diferentes indica una expresión diferencial del ARNm de CanIon.

Métodos para inhibir la expresión de un gen de CanIon

Otras composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención comprenden ventajosamente un fragmento de oligonucleótido de la secuencia nucleica de CanIon como una herramienta antisentido o una herramienta triple hélice que inhibe la expresión del gen de CanIon correspondiente. Un fragmento preferido de la secuencia nucleica de CanIon comprende un alelo de por lo menos uno de los marcadores bialélicos A1 a A17.

Enfoque antisentido

Los métodos preferidos para usar polinucleótidos antisentido de acuerdo con la presente invención son los procedimientos descriptos por Sczakiel et al. (1995).

Con preferencia, las herramientas antisentido se eligen entre los polinucleótidos (15-200 pb de largo) que son complementarias con el extremo 5' de ARNm de CanIon ARNm En otra realización, se usa una combinación de diferentes polinucleótidos antisentido complementarios con partes diferentes del gen blanco deseado.

Los polinucleótidos antisentido preferidos de acuerdo con la presente invención son complementarios con una secuencia de los ARNm de CanIon contienen tanto el codón de iniciación de traducción ATG o un dador de empalme o sitio aceptor.

Los ácidos nucleicos antisentido deben tener una longitud y temperatura de fusión suficiente para permitir la formación de un duplex intracelular que tiene estabilidad suficiente para inhibir la expresión del ARNm de CanIon ARNm en el duplex. Las estrategias para diseñar ácidos nucleicos antisentido adecuados para el uso en la terapia génica se revelan en Green et aL (1986) e Izant y Weintraub (1984).

En algunas estrategias, las moléculas antisentido se obtienen por inversión de la orientación de la región codificadora de CanIon con respecto a un promotor de modo que transcribe la cadena opuesta de la cual se transcribe normalmente en la célula. Las moléculas antisentido se pueden transcribir mediante los sistemas de transcripción in vitro tales como las que emplean T7 o SP6 polimerasa para generar el transcripto. Otro método incluye la transcripción de los ácidos nucleicos antisentido de CanIon in vivo por unión operativa al ADN que contiene la secuencia antisentido a un promotor en un vector de expresión adecuado.

Alternativamente, las estrategias antisentido adecuadas son las descriptas por Rossi et al. (1991), en las solicitudes internacionales Nos. WO 94/23026, WO 95/04141, WO 92/18522 y la solicitud de Patente Europea No. EP 0 572 287 A2.

Una alternativa a la tecnología antisentido que se usa de acuerdo con la presente invención comprende mediante ribozimas que unirán a una secuencia blanco por medio de su cola de polinucleótido complementaria y que escindirá el ARN correspondiente por hidrólisis de su sitio blanco (a saber "ribozima cabeza de martillo"). Brevemente, el ciclo simplificado de una ribozima cabeza de martillo comprende (1) una secuencia de unión específica al ARN blanco por medio de secuencias antisentido complementarias; (2) hidrólisis sitio-específica del motivo escindible de la cadena blanco; y (3) liberación de los productos de escisión, que da origen a otro ciclo catalítico. En efecto, el uso de un polinucleótido antisentido de cadena larga (por lo menos 30 bases de largo) o de ribozimas con ramas antisentido largas es ventajoso. Un sistema de liberación preferido para la ribozima antisentido se obtiene por la unión covalente de estas ribozimas antisentido a grupos lipofílicos o al uso de liposomas como un vector conveniente. Las ribozimas antisentido preferidas de acuerdo con la presente invención se preparan como se describe en Sczakiel et al. (1995).

Enfoque de triple hélice

El ADN genómico de CanIon también se puede usar para inhibir la expresión del gen de CanIon basado en la formación de la triple hélice intracelular.

Los oligonucleótidos de triple hélice se usan para inhibir la transcripción a partir de un genoma. Estos son particularmente útiles para el estudio de las alteraciones de la actividad celular cuando se asocia con el gen particular.

Asimismo, una porción del ADN genómico de CanIon genomic ADN se puede usar para estudiar el efecto de inhibir la transcripción de CanIon dentro de una célula. Tradicionalmente, se consideraron que las secuencias de homopurina son las más útiles para las estrategias de la triple hélice. Sin embargo, las secuencias de homopurina también pueden inhibir la expresión génica. Tales oligonucleótidos de homopiridina se unen la principal surco de las secuencias homopurina:homopirimidina. De este modo, ambos tipos de secuencias del ADN genómico de CanIon están contempladas dentro del alcance de la invención.

Para llevar a cabo las estrategias de la terapia génica mediante el método de la triple hélice, primero se barren las secuencias del ADN genómico de CanIon para identificar extensiones de homopiridina u homopurina de 10-mer a 20-mer que se podrían usar en estrategias basadas en la triple hélice por la inhibición de la expresión de CanIon. Después de la identificación de extensiones de homopiridina u homopurina candidatas, se evalúa su eficiencia para inhibir la expresión de CanIon `por medio de la introducción de cantidades variadas de oligonucleótidos que contienen las secuencias candidatas en células de cultivos de tejidos que expresan el gen de CanIon.

Los oligonucleótidos se pueden introducir en las células empleando una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero sin limitación, la precipitación con fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas o captación nativa.

Las células tratadas se monitorean en cuanto a la función alterada o expresión de CanIon reducida mediante técnicas tales como transferencia Northern, ensayos de protección de ARNasa o estrategias basadas en PCR para controlar los niveles de transcripción del gen de CanIon en las células que han sido tratadas con el oligonucleótido.

Los oligonucleótidos que son efectivos para inhibir la expresión génica en las células de cultivos tisulares luego se pueden introducir in vivo mediante las técnicas descriptas anteriormente en el método antisentido con una dosis calculada basada en los resultados in vitro, como se describe en un método antisentido.

En algunas realizaciones, los anómeros (beta) naturales de las unidades de oligonucleótidos se pueden reemplazar con anómeros alfa para producir el oligonucleótido más resistente a las nucleasas. Además, un agente de intercalación tal como bromuro de etidio o similares, se puede unir al extremo 3' y el oligonucleótido alfa para estabilizar la triple hélice. Para la información de la generación de los oligonucleótidos adecuados para formación de la triple hélice ver Griffin et al. (1989).

Composiciones y formulaciones farmacéuticas Compuestos que modulan CanIon

Empleando los métodos revelados en la presente memoria, se pueden identificar los compuestos agonistas o antagonistas de CanIon que modulan selectivamente la actividad de CanIon in vitro e in vivo. La invención de este modo abarca los métodos de tratamiento de la esquizofrenia, trastorno bipolar o cualquiera de los otras enfermedades o afecciones descriptas en la presente memoria en un paciente que comprende la administración de una cantidad efectiva de un compuesto que modula a CanIon. Con preferencia, dicho compuesto es un compuesto en forma selectiva a CanIon. Los compuestos identificados por le proceso de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos que tienen especificidad de unión para un polipéptido de CanIon humano, también se espera que los homólogos de CanIon pueden ser útiles para modular la actividad mediada por CanIon y la afección fisiológica asociada con la esquizofrenia o trastorno bipolar. Generalmente, además se espera que los métodos de ensayo de la presente invención basados en el papel del CanIon en el trastorno del sistema nervioso central se puedan usar para identificar compuestos capaces de intervenir en la cascada de ensayo de la invención. En una realización preferida, un paciente que sufre de esquizofrenia o trastorno bipolar se trata por la administración al paciente de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de CanIon.

Indicaciones

Si bien CanIon se une a la región genómica asociada con esquizofrenia y trastorno bipolar, las indicaciones que involucran a CanIon pueden incluir varios trastornos del sistema nervioso central. Se espera que los trastornos del sistema nervioso tengan bases genéticas complejas y con frecuencia comparten ciertos síntomas. En particular, como se describe en la presente memoria, las indicaciones pueden incluir esquizofrenia y otros trastornos psicóticos, trastornos del estado de ánimo, autismo, dependencia de sustancias y alcoholismo, epilepsia, trastornos del dolor, retardo mental y otras enfermedades psiquiátricas que incluyen trastornos cognitivos, ansiedad, alimentación, control de impulsos y de personalidad, como se definen en la v clasificación del Manual de diagnóstico y estadística de los trastornos mentales cuarta edición (DSMIV). Además, también se pueden tratar numerosos trastornos cardiovasculares que incluyen a angina, hipertensión, y arritmias mediante los moduladores de CanIon, con preferencia
antagonistas.

Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

Los compuestos identificados mediante los métodos de la presente invención se pueden administrar a un mamífero, que incluyen a un paciente humano, solo o en composiciones farmacéuticas donde estas se mezclan con vehículo(s) o excipiente(s) adecuados en dosis terapéuticamente efectivas para tratar o mejora los trastornos relacionados con la esquizofrenia o trastorno bipolar. Una dosis terapéuticamente efectiva además se refiere a la cantidad del compuesto suficiente para producir una mejora de los síntomas tal como se determina por los métodos descriptos en la presente memoria. Con preferencia, una dosis terapéuticamente efectiva es adecuada para el uso o administración periódica. Las técnica para la formulación y administración de los compuestos de la presente solicitud se pueden hallar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Vías de administración

Las vías de administración adecuadas incluyen la administración oral, rectal, transmucosa o intestinal, liberación parenteral que incluye inyecciones intramuscular, subcutánea, intramedular, además de inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular. Un método particularmente útil de administración de los compuestos para el tratamiento de la enfermedad del sistema nervioso central incluye la implantación quirúrgica de un dispositivo para la administración del compuesto durante un periodo de tiempo extendido. Están particularmente contempladas las formulaciones de liberación sostenida de los medicamentos inventados.

Composición/Formulación

Las composiciones farmacéuticas y medicamentos para el uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular en forma convencional empleando uno o más vehículos aceptables para uso fisiológico que comprende excipientes y auxiliares. La formulación apropiada es dependiente de la vía de administración elegida.

Para la inyección, los agentes de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, con preferencia en buffers fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hanks, solución de Ringer o buffer salino fisiológicotal como un buffer de fosfato o bicarbonato. Para la administración por la transmucosa, se usan agentes penetrantes apropiados para permeabilizar la membrana en la formulación. Tales agentes penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas duras compuestas de gelatina, así también como blandas, cápsulas selladas compuestas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras puede contener los elementos activos en una mezcla con rellenos tales como lactosa, aglutinantes como almidones, y/o lubricantes tal como talco o estearato de magnesio y opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, el compuesto activo se puede disolver o suspender en líquidos adecuados, tal como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deberán ser en dosis adecuadas para tal administración.

Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de aerosol de aspersión a partir de envases presurizados o un nebulizador con el uso de un gas propelente adecuado, por ej. dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosis se puede determinar por la provisión de una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ej., gelatina, para usar en un inhalador o insuflador, se pueden formular con una mezcla de polvo que contiene el compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Los compuestos se pueden formular para administración parenteral por inyección, por ej., por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar de formas de unidades, por ej., en ampollas o recipientes de dosis múltiples con un conservante agregado. Las composiciones pueden adoptar tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos y pueden contener agentes de la formulación tal como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen a soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble. Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como celulosa carboximetil sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también contiene agentes o estabilizantes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Alternativamente, el elemento activo puede estar en forma de polvo o de liofilizado para la constitución con un vehículo adecuado, tal como agua estéril libre de pirógenos, antes del uso.

Además de las formulaciones descriptas anteriormente, los compuestos también se pueden formular como una preparación en depósito. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección intramuscular. De este modo, por ejemplo, los compuestos se pueden formular materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o en resinas de intercambio iónico, o como derivados solubles en poca cantidad,por ejemplo, como una sal soluble en poca cantidad.

Adicionalmente, los compuestos se pueden administrar mediante un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido varios materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su naturaleza química, libera los compuestos durante unas pocas semanas hasta más de 100 días.

De acuerdo con su naturaleza química y estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de las proteínas.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también vehículo o excipientes adecuados en fase sólida o en gel. Los ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen pero sin limitaciones a carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

Dosis efectiva

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en la presente invención incluyen composiciones donde los elementos activos están contenidos en una proporción efectiva para lograr su propósito. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad efectiva para evitar el desarrollo o aliviar los síntomas existentes del sujeto tratado. La determinación de las cantidades efectivas están dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la revelación detallada proporcionada en la presente memoria.

Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente de los ensayos de cultivos celulares y se puede formular una dosis en modelos animales. Tal información se puede usar para determinar más exactamente las dosis útiles en seres humanos.

Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a esa cantidad de compuesto que produce la mejora de los síntomas del paciente. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales, por ej., para la determinación de la LD50, (dosis letal para el 50% de la población de ensayo) y la ED50 (dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de la dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación entre LD50 y ED50. Los compuestos que presentan índices terapéuticos altos son los preferidos.

Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivos celulares y estudios de animales se pueden usar para formular un rango de dosis para el uso en seres humanos. La dosis de tales compuestos está con preferencia dentro de las concentraciones circulantes que incluyen la ED50, con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este rango de acuerdo con la forma de dosis empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosis pueden ser elegidas por el médico individual en vista de la afección del paciente. (Ver por ej., Fing1 et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1).

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de marcadores bialélicos - Extracción de ADN

Los dadores fueron no relacionados y saludables. Presentaron diversidad suficiente para ser representativos de una población francesa heterogénea. Se extrajo el ADN de 100 individuos y se ensayo para la detección de los marcadores bialélicos.

Se tomaron 30 ml de sangren venosa periférica de cada donante en presencia de EDTA. Se recogieron las células (sedimento) después de la centrifugación durante 10 minutos a 2000 rpm. Se lisaron los eritrocitos con una solución de lisis (volumen final 50 ml: Tris 10 mM pH 7,6; MgCl_{2} 5 mM; NaCl 10 mM). La solución se centrifugó (10 minutos, 2000 rpm) tantas veces como fuera necesario para eliminar los eritrocitos residuales presentes en el sobrenadante, después de la resuspensión del sedimento en la solución de lisis.

El sedimento de los leucocitos se lisó durante toda la noche a 42°C con 3,7 ml de solución de lisis compuesta de:

- 3 ml de TE 10-2 (Tris-HCI 10 mM, EDTA 2 mM)/NaCl 0,4 M

- 200 \mul de SDS 10%

- 500 \mul de K-proteinasa (2 mg de K-proteinasa en TE 10-2 NaCl 0,4 M)

Para la extracción de las proteínas, se agregó 1 ml de NaCl saturado (6M) (1/3,5 v/v). Después de la agitación vigorosa, la solución se centrifugó durante 20 minutos a 10.000 rpm.

Para la preparación de ADN, se agregaron 2 a 3 volúmenes de etanol 100% al sobrenadante previo y la solución se centrifugó durante 30 minutos a 2000 rpm. La solución de ADN se enjuagó tres veces con etanol 70% para eliminar las sales, y se centrifugó durante 20 minutos a 2000 rpm. El sedimento se secó a 37°C, y se resuspendió en 1 ml de TE 10-1 o 1 ml de agua. La concentración de ADN se evaluó por la medición de la DO a 260 nm (1 unidad de DO = 50 \mug/ml de ADN).

Para determinar la presencia de las proteínas en la solución de ADN, se determinó la relación de DO 260/DO 280. Sola las preparaciones de ADN que tienen una relación DO 260/DO 280 entre 1,8 y 2 se usaron en los ejemplos subsiguiente que se describen a continuación.

La combinación se constituyó por la mezcla de cantidades equivalentes de ADN de cada individuo.

Ejemplo 2 Identificación de marcadores bialélicos: Amplificación del ADN genómico por PCR

La amplificación de las secuencias genómicas específicas de las muestras de ADN del ejemplo 1 se llevó a cabo con una mezcla de ADN obtenida previamente. Además, se amplificaron de modo similar 50 muestras individuales.

Los ensayos de PCR se realizaron mediante el siguiente protocolo:

Volumen final	25/\mul
ADN	2 ng/\mul
MgCl_{2}	2 mM
dNTP (cada uno)	200/\muM
cebador (cada uno)	2,9 ng/\mul
Arnpli Taq Gold ADN polimerasa	0,05 unidad/\mul
Buffer de PCR (10x=TrisHCl 0,1M pH 8,3 KCl 0,5M) 1x

Cada par de primeros cebadores se diseñó mediante la información de secuencia del gen de CanIon revelado la presente memoria y el programa de computación OSP (Hillier & Green, 1991). Este primer par de cebadores fue de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud y presentó las secuencias descriptas en la Tabla 1 en las columnas marcadas PU y RP.

TABLA 1

3

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Con preferencia, los cebadores contenían una cola de oligonucleótidos común corriente arriba de las bases específicas identificadas para la amplificación que fue útil para la secuenciación.

Los cebadores PU contienen la siguiente secuencia adicional PU 5': TGTAAAACGACGGCCAGT; los cebadores RP contienen la siguiente secuencia RP 5': CAGGAAACAGCTATGACC. El cebador que contiene la secuencia adicional PU 5' se lista en la SEC ID No 7. El cebador que contiene la secuencia adicional l RP 5' se lista en la SEC ID No 8.

La síntesis de estos cebadores se realizó siguiendo el método de fosforamidita en un sintetizador GENSET UFPS 24.1.

La amplificación de ADN se llevó a cabo en un termociclador Genius II. Después del calentamiento a 95°C durante 10 min, se realizaron 40 ciclos. Cada ciclo comprendió: 30 segundos a 95°C, 54°C durante 1 min, y 30 segundos a 72°C. Para la elongación final, 10 min a 72°C y finalizó la amplificación. Las cantidades de los productos de amplificación obtenidos se determinaron en palcas de microtitulación de 96 pocillos, empleando fluorómetro y Picogreen como agente intercalante (Molecular Probes).

Ejemplo 3 Identificación de Marcadores bialélicos - Secuenciación de ADN genómico amplificado e identificación de polimorfismos

La secuenciación del ADN amplificado obtenido del ejemplo 2 se llevó a cabo en los secuenciadores ABI 377. Las secuencias de los productos de amplificación se determinaron empleando reacciones de secuenciación automatizadas del terminador dideoxi con un protocolo de secuenciación del ciclo terminador con colorante. Los productos de las reacciones de secuenciación se corrieron en geles de secuenciación y las secuencias se determinaron mediante el análisis de imágenes en geles (ADN programa de análisis de secuenciación de ADN ABI Prism (2.1.2 versión)).

Los datos de secuencia se evaluaron para detectar la presencia de los marcadores bialélicos dentro de los fragmentos amplificados. La búsqueda de polimorfismos se basó en la presencia de picos superpuestos en el patrón de electroforesis que resulta de las diferentes bases que aparecen en la misma posición como se describió previamente.

En los 17 fragmentos de amplificación, se detectaron 18 marcadores bialélicos. La localización de estos marcadores bialélicos son las que muestran en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

4

BM se refiere al "marcador bialélico". All1 y all2 se refieren respectivamente al alelo 1 y alelo 2 del marcador bialélico.

TABLA 3

5

6

Ejemplo 4 Validación de los polimorfismos mediante microsecuenciación

Los marcadores bialélicos identificados en el Ejemplo 3 se confirmaron y sus respectivas frecuencias se determinaron la microsecuenciación, La microsecuenciación se llevó a cabo para cada muestra de ADN individual en El Ejemplo 1.

La amplificación a partir del ADN genómico de los individuos se realizó por PCR como se describió anteriormente para la detección de los marcadores bialélicos con el mismo conjunto de los cebadores de PCR (Tabla 1).

Los cebadores preferidos usados en la microsecuenciación fueron de aproximadamente 19 nucleótidos de longitud e hibridizan exactamente corriente arriba de la base polimórfica considerada. De acuerdo con la invención, los cebadores usados en la microsecuenciación se detallan en la Tabla 4.

TABLA 4

7

Mis 1 y Mis 2 se refieren respectivamente a los cebadores que hibridizan con la cadena no codificadora del gen de CanIon o con la cadena codificadora del gen de CanIon.

La reacción de microsecuenciación se realizó como sigue:

Después de la purificación de los productos de amplificación, la mezcla de reacción de microsecuenciación se preparó por adición en un volumen final de 20 \muI: 10 pmol de oligonucleótido de microsecuenciación, 1 U de Termosequenasa (Amersham E79000G), 1,25 \muI de buffer de Thermosequenasa (Tris HCI 260 mM, pH 9,5, MgCl_{2}
65 mM), y los dos ddNTP fluorescentes apropiados (Perkin Elmer, Dye Terminator Set 401095) complementarios con los nucleótidos en el sitio polimórfico de cada marcador bialélico ensayado siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después de 4 minutos a 94°C, 20 ciclo de PCR de 15 segundos a 55°C, 5 segundos a 72°C, y 10 segundos a 94°C se realizaron en un termociclador Tetrad PTC-225 (MJ Research). Los terminadores con colorante no incorporados luego se eliminaron por precipitación con etanol. Las muestras se resuspendieron finalmente en buffer de carga formamida-EDTA y se calentaron durante 2 minutos a 95°C antes de cargarse en un gen de secuenciación de poliacrilamida. Los datos se recogieron con un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 y se procesaron mediante el programa de computación CanIonSCAN (Perkin Elmer).

Después del análisis del gel, los datos se procesaron automáticamente con un programa de computación que permite la determinación de los alelos de los marcadores bialélicos presentes en cada fragmento amplificado.

El programa de computación evalúa factores tales como si las intensidades de las señales que resultan de los procedimientos de micro-secuenciación anteriores son débiles, normales o saturadas o si las señales son ambiguas. Además, el programa de computación identifica los picos significativos (de acuerdo con el criterio de forma y altura). Entre los picos significativos, se identifican los picos correspondientes al sitio blanco sobre la base de su posición. Cuando dos picos significativos se detectan en la misma posición, cada muestra se categoriza en una clasificación como un tipo homócigo o heterócigo basado en la relación de altura.

Ejemplo 5 Preparación de composiciones de anticuerpo para la proteína de CanIon

La proteína o polipéptido sustancialmente pura se aísla de las células transfectadas o transformadas que contienen un vector de expresión que codifica una proteína de CanIon o una porción de la misma. La concentración de la proteína en la preparación final se ajusta, por ejemplo, por concentración en un dispositivo de filtro Amicon a un nivel de unos pocos microgramos/ml. El anticuerpo monoclonal o policlonal para la proteína se puede preparar de la siguiente
forma:

A. Producción de anticuerpos monoclonales por fusión de hibridoma

El anticuerpo monoclonal para los epítopes de la proteína de CanIon o una porción de la misma se puede preparar a partir de hibridomas murinos de acuerdo con el método clásico de Kohler, G. y Milstein, C., (1975) o sus métodos derivados. Ver también Harlow, E., y D. Lane. 1988.

Brevemente, se inocula repetidamente un ratón con unos pocos microgramos de la proteína de CanIon o una porción de la misma durante un periodo de unas pocas semanas. Luego el ratón se sacrifica y se aíslan las células productoras de anticuerpos del bazo. Las células del bazo se fusionan por medio de polietilenglicol con las células de mieloma de ratón y se destruye el exceso de células no fusionadas por el crecimiento del en un medio selectivo que comprende aminopterina (medio HAT). Las células fusionadas con éxito se diluyen y las alícuotas de la dilución se colocan en los pocillos de una placa de microtitulación donde el crecimiento del cultivo continúa. Los clones productores de anticuerpo se identifican por la detección del anticuerpo en el sobrenadante líquido de los pocillos por procedimientos de inmunoensayo, tal como ELISA, como fue descripto originalmente por Engvall (1980), y los métodos derivados del mismo. Los clones seleccionados positivos se pueden expandir y se recogen sus productos de anticuerpo monoclonal para su uso. Los procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales se describen en Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2.

B. Producción de anticuerpos policlonales por inmunización

El antisuero policlonal que contiene anticuerpos para los epítopes heterogéneos de la proteína de CanIon o una porción de la misma se puede prepara por la inmunización adecuada de un animal no humano con la proteína de CanIon o una porción de la misma, que puede estar no modificada o modificada para aumentar la inmunogenicidad. Un animal no humano adecuado, es con preferencia un mamífero no humano seleccionado, usualmente de ratón, rata, conejo, cabra o caballo. Alternativamente, se puede usar una preparación bruta que ha sido enriquecida para la concentración de CanIon para generar anticuerpos. Tales proteínas, fragmentos o preparaciones se introducen en un mamífero no humano en presencia de un adyuvante apropiado (por ej. hidróxido de aluminio, RIBI, etc.) que es conocido en la técnica. Además la proteína, fragmento o reparación se puede pretratar con un agente que aumentará la antigenicidad, tales agentes son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, albúmina sérica bovina metilada (mBSA), albúmina sérica bovina (BSA), antígeno de superficie de la Hepatitis B y hemocianina de lapa californiana (KLH). El de suero del animal inmunizado se recoge, trata y ensaya de acuerdo con los procedimientos conocidos. Si le suero contiene anticuerpos policlonales para epítopes no deseados, los anticuerpos policlonales se pueden purificar por cromatografía de inmunoafinidad.

La producción de anticuerpos policlonales está afectada por muchos factores relacionados con los antígenos y las especies hospedantes. También los animales hospedadores varían en la respuesta al sitio de las inoculaciones y dosis, tanto con dosis inadecuadas como excesivas del antígeno que produce un bajo titulo de antisuero. Las dosis bajas (nivel de ng) de antígeno administrado en sitios intradérmicos múltiples parece ser más confiable. Las técnicas para producir y procesar antisuero policlonal son conocidas en la técnica, ver por ejemplo, Mayer y Walker (1987). Un protocolo de inmunización efectivo para conejos se puede hallar en Vaitukaitis, J. et al. (1971).

Las inyecciones de refuerzo se pueden dar a intervalos regulares y se recoge el antisuero cuando su titulo de anticuerpos, determinado en forma semi-cuantitativa, por ejemplo, por inmunodifusión doble en agar frente a concentraciones conocidas en del antígeno, comienza a caer. Ver por ejemplo, Ouchterlony, O. et al. (1973). La concentración de la meseta del anticuerpo está usualmente en el rango de 0,1 a 0,2 mg/ml del suero (aproximadamente 12 p.M). La afinidad de los antisueros para el antígeno se determina mediante la preparación de curvas de unión competitivas, como se describe, por ejemplo, en Fisher, D. (1980).

Las preparaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el protocolo monoclonal o policlonal son útiles para los inmunoensayos cuantitativos que determina las concentraciones de las sustancias que portan el antígeno en las nuestras biológicas; estas también se usan en forma semi-cuantitativa o cualitativa para identificar la presencia del antígeno en una muestra biológica. Los anticuerpos también se pueden usar en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína o reducir los niveles de la proteína del cuerpo.

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<110> GENSET

\vskip0.400000\baselineskip

<120> GEN Y PROTEÍNA DEL CANAL IÓNICO DEPENDIENTE DEL VOLTAJE ASOCIADO A LA ESQUIZOFRENIA

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 93.WO1

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2001-12-04

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/251,317 <151> 2000-12-05

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 82293

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..2000

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región reguladora en 5'

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 2001..2026

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 1

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 19188..19334

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 2

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 22996..23178

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 3

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 39731..39814

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 4

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 41337..41476

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 5

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 41565..41693

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 6

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 73013..73167

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 7

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12642

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62626-168: base polimórfica A o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14088

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62632-275: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24981

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62633-409: base polimórfica A o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 69248

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62611-51: base polimórfica A o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 73428

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62605-56: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80250

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62635-443: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12343..12363

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62626.rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12793..12810

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62626.complementario de pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 13814..13832

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62632.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14279..14296

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62632.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24863..24881

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62633.rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 25378..25396

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62633.complementario de pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 69198..69218

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62611.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 69632..69650

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62611.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 73005..73022

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62605.rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 73466..73483

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62605.complementario de pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 79808..79826

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62635.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80314..80334

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62635.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12623..12641

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62626-168.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12643..12661

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62626-168.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14069..14087

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62632-275.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14089..14107

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62632-275.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24962..24980

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62633-409.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24982..25000

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62633-409.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 69229..69247

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62611-51.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 69249..69267

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62611-51.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 73409..73427

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62605-56.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 73429..73447

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62605-56.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80231..80249

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62635-443.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80251..80269

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62635-443.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 12630..12654

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62626-168.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 14076..14100

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62632-275.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24969..24993

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62633-409.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 69236..69260

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62611-51.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 73416..73440

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62605-56.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80238..80262

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62635-443.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

8

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, g, c o t

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 237961

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 43726..43868

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 8

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 43998..44102

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 9

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 52093..52179

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 10

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 77568..77699

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 11

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 98226..98393

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 12

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 106567..106758

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 13

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 144109..144246

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 14

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 159794..159868

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 15

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 191292..191428

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 16

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 192967..193108

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 17

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 211540..211613

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 18

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 225006..225107

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 19

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 225544..225613

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 20

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 228450..228541

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 21

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 228630..228752

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 22

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 231289..231345

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 23

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 231589..231709

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 24

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 231813..231944

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 25

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 232900..233067

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 26

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 235355..235459

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 27

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 51090

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79335-60: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 61293

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79336-369: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80602

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79338-332: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100485

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314-201: base polimórfica G o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100509

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314-225: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 106725

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79316-158: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166087

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322-224: base polimórfica G o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166336

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322-473: base polimórfica A o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 235894

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79306-182: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 51031..51051

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79335.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 51539..51559

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79335.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 60925..60945

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79336.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 61354..61374

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79336.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80271..80290

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79338.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80700..80720

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79338.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 91037..91056

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79339.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 91466..91486

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79339.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100285..100305

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100764..100784

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 106568..106585

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79316.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 107000..107020

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79316.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 165864..165884

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166381..166401

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 235713..235732

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79306.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 236190..236210

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79306.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 51071..51089

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79335-60.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 51091..51109

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79335-60.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 61274..61292

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79336-369.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 61294..61312

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79336-369.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80583..80601

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79338-332.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80603..80621

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79338-332.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100466..100484

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314-201.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100486..100504

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314-201.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100490..100508

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314-225.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100510..100528

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314-225.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 106706..106724

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79316-158.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 106726..106744

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79316-158.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166068..166086

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322-224.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166088..166106

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322-224.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166317..166335

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322-473.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166337..166355

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322-473.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 235875..235893

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79306-182.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 235895..235913

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79306-182.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 51078..51102

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79335-60.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 61281..61305

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79336-369.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 80590..80614

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79338-332.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100473..100497

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314-201.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 100497..100521

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79314-225.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 106713..106737

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79316-158.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166075..166099

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322-224.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 166324..166348

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79322-473.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 235882..235906

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79306-182.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<222>

31

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, g, c o t

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47841

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 3895..4001

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 28

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9611..9731

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 29

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 9816..9914

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 30

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 15776..15869

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 31

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16382..16488

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 32

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 16697..16771

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 33

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 17934..18053

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 34

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 23644..23712

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 35

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 24928..25076

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 36

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 25913..26006

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 37

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 30767..30899

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 38

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 31561..31676

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 39

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 34044..34201

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 40

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 37493..37643

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 41

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 39652..39801

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 42

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 41563..41680

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 43

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 44131..45841

\vskip0.400000\baselineskip

<223> exón 44

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 45842..47841

\vskip0.400000\baselineskip

<223> región reguladora en 3'

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 31646

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79310-29: base polimórfica A o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 42373

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79311-50: base polimórfica G o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 31618..31635

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79310.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 32080..32100

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79310.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 42324..42344

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79311.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 42704..42723

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79311.complementario de rp

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 31627..31645

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79310-29.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 31647..31665

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79310-29.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 42354..42372

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79311-50.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 42374..42392

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79311-50.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 31634..31658

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79310-29.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 42361..42385

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79311-50.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 26, 350..351, 353, 356..357, 366..367, 371, 383, 389, 392, 396, 399..400 404, 411..412, 416, 421..422, 435..438, 440, 442, 446..447, 450, 455 457..459, 461, 463..465, 1805, 2175, 2328, 2402, 2561, 4048, 4661, 6659 6799, 7509, 7534, 8289..8290, 8294, 10663, 10789, 11052, 12083, 12904 13017, 13916, 14116..14117, 14680, 14971..14974, 17093, 18448, 18669 18767, 18808..18811, 18838, 18971, 18985, 20714, 20903, 21355..21367 22901, 24093, 24112..24115, 24171..24173, 24868..24869, 25356, 25797 25879, 26062, 26234, 26824, 27130, 27254, 27437, 28745, 28781, 29278, 29475 29526..29528, 29617, 31152, 31790..31791, 31796, 32011, 32262..
32273 32296, 32415, 33656, 33719, 39140, 39142, 39343, 39944, 40945..40947 41948, 42166..42169, 43371..
43372 46709..46720

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n=a, g, c o t

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

99

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6799

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..65

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 66..5282

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> 3'UTR

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 5283..6799

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal_poliA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6081..6086

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> señal_poliA

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 6777..6782

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1658

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79316-158: base polimórfica C o T

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 4481

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-79310-29: base polimórfica A o C

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

113

114

115

116

117

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1738

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapien

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

1180

119

120

121

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> alelo

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62617-105: base polimórfica G o C

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 93..117

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62617-105.sonda

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 86..104

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62617-105.mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 106..124

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62617-105.complementario de mis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 1..20

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62617.pu

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión_cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 435..453

\vskip0.400000\baselineskip

<223> 99-62617.complementario de rp

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico PU para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador oligonucleotídico RP para la secuenciación

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgacc

\hfill

18

Claims

1. El uso de un anticuerpo o dominio de unión al antígeno que se une específicamente al polipéptido mostrado en la SEC ID NO:5 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la esquizofrenia o trastorno bipolar.

2. El uso in vitro de un anticuerpo o dominio de unión al antígeno que se une específicamente al polipéptido mostrado en la SEC ID NO:5 en el diagnóstico de la esquizofrenia o trastorno bipolar.

3. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, donde el anticuerpo o dominio de unión al antígeno es quimérico, humanizado o humano.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el anticuerpo o dominio de unión al antígeno es un anticuerpo de cadena única o un dominio de unión al antígeno.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo o dominio de unión al antígeno es monoespecífico, biespecífico, triespecífico o multiespecífico.

6. El uso de una herramienta antisentido que inhibe la expresión del canal iónico codificado por un polinucléotido que se muestra en la SEC ID NO:1, 2, 3 o 4 que comprende un fragmento del polinucléotido mostrado como SEC ID NO:1, 2, 3 o 4 en la preparación de un medicamento para la esquizofrenia o trastorno bipolar.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, donde la herramienta antisentido es una ribozima.

8. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una herramienta antisentido como se describe en las reivindicaciones 6 y 7 y un vehículo o excipiente adecuado.

9. Un método para identificar un modulador candidato de un polipéptido canal iónico para el tratamiento de la esquizofrenia o trastorno bipolar, dicho método que comprende:

a) poner en contacto un polipéptido que comprende un polipéptido como se muestra en la SEC ID NO:5 con un compuesto de ensayo; y

b) determinar si dicho compuesto se une en forma específica a dicho polipéptido; donde una detección de que dicho compuesto se une en forma específica a dicho polipéptido indica que dicho compuesto es un modulador candidato de dicho polipéptido canal iónico.

10. El método de la reivindicación 9 que además comprende ensayar la actividad de canal iónico de dicho polipéptido canal iónico en presencia de dicho modulador candidato, donde una diferencia en la actividad de dicho polipéptido canal iónico en presencia de dicho modulador candidato en comparación con la actividad en ausencia de dicho modulador candidato indica que un modulador candidato es un modulador de dicho polipéptido canal iónico.

11. Un método de identificación de un modulador de un polipéptido canal iónico para el tratamiento de la esquizofrenia o trastorno bipolar, dicho método que comprende:

b) detectar la actividad de canal iónico de dicho polipéptido en presencia o ausencia de dicho compuesto;

donde una detección de una diferencia en dicha actividad en presencia de dicho compuesto en comparación con la actividad en ausencia de dicho compuesto indica que dicho compuesto es un modulador de dicho polipéptido canal iónico.

12. Un kit de diagnóstico para diagnosticar esquizofrenia o trastorno bipolar que comprende:

a) un anticuerpo policlonal o monoclonal que específicamente se une a un polipéptido canal iónico que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:5, o a un fragmento del péptido, opcionalmente marcado;

b) un reactivo que permite la detección de los complejos antígeno-anticuerpo formados, dicho reactivo que porta opcionalmente un marcador o es capaz de ser reconocido él mismo por un reactivo marcado.