ES2274588T3 - Composiciones de los canales de calcio a baja tension y procedimientos correspondientes. - Google Patents
Composiciones de los canales de calcio a baja tension y procedimientos correspondientes. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2274588T3 ES2274588T3 ES98962884T ES98962884T ES2274588T3 ES 2274588 T3 ES2274588 T3 ES 2274588T3 ES 98962884 T ES98962884 T ES 98962884T ES 98962884 T ES98962884 T ES 98962884T ES 2274588 T3 ES2274588 T3 ES 2274588T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- subunit
- channels
- calcium
- cells
- subunits
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un fragmento de ácido nucleico aislado que codifica una subunidad a1H de baja tensión de un canal de calcio animal, en el que la secuencia de nucleótidos comprende la porción codificadora de la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID números 12 - 16.
Description
Composiciones de los canales de calcio activas a
baja tensión y procedimientos correspondientes.
La presente invención se refiere a biología
molecular y farmacobiología. Más particularmente, la invención se
refiere a las composiciones de los canales de calcio y
procedimientos de preparación y uso de los mismos.
Los canales de calcio son proteínas de
multisubunidades, que se extienden sobre las membranas que permiten
controlar la entrada de iones Ca^{2+} en las células a partir del
fluido extracelular. Las células del reino animal, y al menos
algunas células bacterianas, fúngicas y vegetales, poseen uno o más
tipos del canal de calcio. El tipo más común de los canales de
calcio es dependiente de la tensión. Todas las células
"excitables" en animales, tales como neuronas del sistema
nervioso central (SNC), células nerviosas periféricas y células
musculares, incluyendo aquellas de los músculos esqueléticos,
músculos cardíacos, y músculos lisos arteriales, que tienen canales
de calcio dependientes de la tensión (VGCCs). La "apertura" de
un canal dependiente de voltaje que permite un influjo de los iones
de Ca^{2+} en las células requiere una despolarización hasta un
cierto nivel de la diferencia de potencial entre el interior de la
célula que lleva la célula. La velocidad de influjo de Ca^{2+} en
la célula depende de su diferencia de potencial.
Los canales de calcio son proteínas de
multisubunidades que contienen dos grandes subunidades, denominadas
\alpha_{1} y \alpha_{2}, que tienen pesos moleculares entre
aproximadamente 130 y aproximadamente 200 kilodaltons ("kD"),
y uno a tres subunidades más pequeñas diferentes de menos de
aproximadamente 60 kD de peso molecular. Al menos una de las
subunidades mayores y posiblemente alguna de las subunidades más
pequeñas están glicosiladas. Algunas de las subunidades son capaces
de estar fosforiladas. La subunidad \alpha_{1} tiene un peso
molecular de aproximadamente 150 a aproximadamente 170 kD cuando se
analiza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de
dodecilsulfato de sodio (SDS) después del aislamiento a partir de
tejido muscular de mamíferos y tiene sitios de unión específicos
para diversos 1,4-dihidropiridinas (DHPs) y
fenilalquilaminas. En condiciones no reductoras (en presencia de
N-etilmaleimida), la subunidad \alpha_{2} migra
en SDS - PAGE como una banda correspondiente a un peso molecular de
aproximadamente 160-190 kD. Tras la reducción, y
fragmento grande y fragmentos más pequeños se liberan. La subunidad
\beta del canal de calcio de músculo esquelético de conejo es una
proteína fosforilada que tiene un peso molecular de
52-65 kD como se determina mediante análisis de SDS
- PAGE. Esta subunidad es insensible a las condiciones reductoras.
La subunidad \gamma del canal de calcio parece ser una
glicoproteína con un peso molecular aparente de
30-33 kD, como se determina mediante análisis de
SDS - PAGE.
Con el fin de estudiar la estructura de los
canales de calcio, se necesitan grandes cantidades de proteína de
los canales puros. Debido a la naturaleza compleja de estas
proteínas de multisubunidades, las concentraciones variables de los
canales de calcio en las fuentes de tejido de la proteína, la
presencia de poblaciones mixtas de los canales de calcio en los
tejidos, las dificultades en la obtención de tejidos de interés, y
las modificaciones de la proteína nativa que se puede producir
durante el procedimiento de aislamiento, es extremadamente difícil
de obtener grandes cantidades de proteína de los canales de calcio
altamente purificada, completamente intacta.
Debido a que los canales de calcio están
presentes en diversos tejidos y tienen un papel central en la
regulación de las concentraciones de ion de calcio intracelular,
están implicados en un número de los procesos vitales en animales,
incluyendo liberación del neurotransmisor, contracción
intramuscular, actividad del marcapasos, y secreción de hormonas y
otras sustancias. Estos procedimientos parecen estar implicados en
numerosos trastornos humanos, tales como trastornos del sistema
nervioso central y enfermedades cardiovasculares. Los canales de
calcio, de este modo, también están implicados en numerosos
trastornos. Un número de compuestos útiles para tratar diversas
enfermedades cardiovasculares, incluyendo seres humanos, se cree que
ejercen sus efectos beneficiosos mediante la modulación de
funciones de los canales de calcio dependientes de la tensión
presentes en el músculo liso cardíaco y/o vascular. Muchos de estos
compuestos se unen a los canales de calcio y bloquean, o reducen la
velocidad de, influjo de Ca^{2+} en las células en respuesta a la
despolarización de la membrana celular.
Los resultados de los estudios de expresión
recombinante de los clones de ADNc que codifican la subunidad
\alpha_{1} de los canales de calcio de conejo y transcripciones
de los clones de ADNc indican que las formas de la subunidad
\alpha_{1} de del poro a través de las el calcio entra en las
células. La relevancia de las corrientes de bario generadas en
estas células recombinantes a la corriente real generada por los
canales de calcio que contienen como un componente las subunidades
\alpha_{1} in vivo no está claro. Con el fin de
caracterizar completamente y precisamente y evaluar los tipos de
canales de calcio diferentes, sin embargo, es esencial examinar las
propiedades funcionales de los canales de calcio recombinantes que
contienen todas las subunidades como se encuentran in
vivo.
Con el fin de llevar a cabo este examen y
entender completamente la estructura y función de los canales de
calcio, es crítico identificar y caracterizar como muchas
subunidades de los canales de calcio. También con el fin de
preparar células recombinantes para uso en la identificación de los
compuestos que interactúan con canales de calcio, es necesario ser
capaz de producir células que expresan poblaciones uniformes de
canales de calcio que contienen las subunidades definidas.
Un entendimiento de la farmacología de los
compuestos que interactúan con los canales de calcio en otros
sistemas de órganos, tales como el SNC, puede ayudar en el diseño
racional de los compuestos que actúan específicamente con los
subtipos de canales de calcio humanos que tienen los efectos
terapéuticos deseados, tales como en el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos y cardiovasculares. Sin embargo, tal
entendimiento y la capacidad de diseñar racionalmente los
compuestos eficaces se han complicado por una incapacidad de
determinar independientemente los tipos de los canales de calcio
humanos y la naturaleza molecular de los subtipos individuales,
particularmente en el SNC, y mediante la incapacidad de las
preparaciones puras de subtipos de los canales específicos para uso
para evaluación de la especificidad de los compuestos que efectúan
los canales de calcio y el uso de tal ADN para expresión de las
subunidades de los canales de calcio y canales de calcio funcionales
ayudarían en la selección y diseño de compuestos terapéuticamente
eficaces.
Se han identificado múltiples tipos de canales
de calcio en células de mamíferos a partir de diversos tejidos,
incluyendo músculo esquelético, músculo cardíaco, pulmón, músculo
liso y cerebro, (véase, por ejemplo, Bean, B. P. (1989) Ann.
Rev. Physiol. 51: 367-384\alpha y Hess, P.
(1990) Ann. Rev. Neurosci. 56: 337). Los tipos diferentes de
los canales de calcio se han categorizado ampliamente en cuatro
clases, tipo L-, T-, P-, Q y R, distinguidos por cinética de
corriente, manteniendo la sensibilidad potencial y sensibilidad a
los agonistas y antagonistas de los canales de calcio. La
determinación primaria de la diversidad entre los canales de calcio
es la naturaleza de la subunidad \alpha_{1} que forma el poro.
El ácido nucleico que codifica las numerosas subunidades
\alpha_{1} se han clonado y se han expresado las subunidades
expresadas. Se han establecido las correlaciones entre las
subunidades \alpha_{1} y las corrientes de Ca^{2+} definidas
operacionalmente. Seis producto génicos
\alpha_{1A}-\alpha_{1-E} y
\alpha_{1S} participan en la formación de canales activados por
alta tensión, que incluyen los canales de tipo L, N, P, Q y R.
Se han descrito las subunidades \alpha_{1}
humanas que codifican ADN, que incluyen las subunidades
\alpha_{1A}-, \alpha_{1B}-, \alpha_{1C}-,
\alpha_{1D}- y \alpha_{1E}- y variantes de ayuste de los
mismos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº
5.429.921, patente de Estados Unidos Nº 5.846.756, patente de
Estados Unidos Nº 5.851.824, solicitud PCT internacional publicada
Nº PCT/US92/06903, y la solicitud PCT internacional publicada Nº
PCT/US94/09230). Estas subunidades parecen participar en la
formación de los canales de calcio de alta tensión (HVA), que
además de estas subunidades \alpha_{1}, incluye una subunidad
\beta y una subunidad \alpha_{2}, incluyendo \delta, que se
une a \alpha_{2} mediante un puente disulfuro y proviene del
mismo precursor. Las propiedades biofísicas y farmacológicas de cada
canal derivan principalmente de la subunidad \alpha_{1}, pero
están modulados por subunidades auxiliares, principalmente las
subunidades \betaasociadas al canal. Las subunidades \beta se
ha mostrado que incrementan la amplitud de la corriente máxima,
para desplazar las curvas de activación/inactivación hacia
potenciales más hiperpolarizados y alterar la cinética de
activación e inactivación (véase, por ejemplo, Lambert y col.,
(1997) J. Neurosci. 17: 6621-6625). La subunidad
\alpha_{2}\delta, que es específica de tejido, incrementa la
corriente generada por cualquier subunidad \alpha_{1} y
potencia la respuesta estimuladora de las subunidades \beta.
Se conoce poco sobre los canales que se han
denominado canales T o canales LVA (activado por baja tensión). Los
canales de calcio, activados por baja tensión (LVA), es decir de
tipo T se encuentran de manera reseñada en una diversidad de tipos
de células. Los canales activados por baja tensión (LVA) o de tipo T
se distribuyen también de manera amplia en el sistema nervioso
central y periférico y aparentemente implicados en una estructura
extensa de procesos neuronales diferentes.
En general se cree que las corrientes de tipo T
no se diferencial fundamentalmente de otras corrientes de
Ca^{2+}. Del mismo modo que los canales de HVA, los canales de
tipo T son selectivamente permeables a cationes divalentes,
mientras que una mínima concentración de cationes divalentes esté
presente en el medio externo. Para las corrientes LVA (o tipo T),
esta concentración mínima de Ca^{2+} es aproximadamente 25 \mum,
y para las corrientes de HVA es aproximadamente 1 \muM. La
corriente de tipo T se indica que se satura con una k_{d} de
aproximadamente 10 mM de Ca^{2+}, que es similar a la reseñada
para corrientes de HVA. Sin embargo, los canales parece que
muestran ciertas diferencias. Se diferencian en su permeabilidad
relativa a los cationes divalentes. En general, los canales de HVA
no son más permeables a Ba^{2+} que a Ca^{2+}; el tipo T es
igual o ligeramente menos permeable a Ba^{2+} que a Ca^{2+}. Los
canales de tipo T se cree que también muestran
activación/inactivación más lenta y cinética de desactivación y se
ha reseñado que muestran sensibilidad relativamente más alto a
Ni^{2+}. este tipo de canal se activa cerca del potencial restante
de la membrana, y se cree que es responsable de la generación de
actividad de descarga repetitiva u oscilaciones neuronales
intrínsecas y para la entrada de Ca^{2+} que acompaña a la
actividad de adición (véase, por ejemplo, Huguenard (1996) Annual
Rev. Physiol. 58: 329-348). Los datos recientes
sugieren que al subunidades \beta identificadas hasta la fecha no
pueden ser una subunidad de canal de tipo T constitutiva (véase,
Lambert y col., (1997) J. Neurosci. 17: 6621-6625).
La estructura de los canales de calcio que generan las diversas
corrientes de LVA. Ninguna de las subunidades \alpha_{1}
clonadas previamente parecen tener todas las propiedades que se han
atribuido a los canales de tipo T (o LVA) activados por baja
tensión.
Cribbs LL (1998) Circ Res, 83 (1):
103-109 describe la clonación y caracterización de
la subunidad alfa 1H de la familia de genes de los canales de
Ca^{2+} de tipo T de corazón humano (documento publicado en julio
de 1998).
En esta memoria descriptiva es un objeto
proporcionar ácido nucleico que codifica las subunidades de los
canales de calcio específicos que tienen propiedades estructurales
y funcionales que difieren de los canales de tipo HVA. También es
un objeto de la presente memoria descriptiva proporcionar ácido
nucleico que codifica canales que tienen actividades que se han
atribuido a los canales de tipo T y proporcionar células
eucarióticas que llevan canales de calcio específicos de tejido o
específicos de subtipo. También es un objeto proporcionar ensayos
para la identificación de compuestos potencialmente terapéuticos que
actúan como moduladores de la actividad de los canales de calcio,
particularmente los específicos para canales que muestran
propiedades de los canales de tipo T y otros tipos de canales.
Se proporcionan los fragmentos de ácidos
nucleicos aislados y purificados que codifican las subunidades de
los canales de calcio. Las subunidades forman canales activados por
baja tensión (LVA), particularmente los canales que tienen
propiedades asociadas a los canales de tipo T. Las subunidades y
resultados proporcionados en esta memoria descriptiva, proporcionan
una familia de subunidades \alpha_{1H} que corresponden a
canales LVA, o de tipo. Los canales que contienen estas subunidades
tienen la capacidad de abrirse a baja diferencia de potencial, pero
permanecen abiertos durante períodos de tiempo moderados. Estos
canales se localizan en lugares fisiológicos críticos, incluyendo
neuronas en el tálamo, hipotálamo, y tronco cerebral, y por
consiguiente pueden estar implicados en las funciones nerviosas
autonómicas, quizás implicadas en la regulación de actividades
cardiovasculares tales como insuficiencia cardíaca, inervación y
tono del músculo liso arterial y venoso, ritmo pulmonar y otras
actividades fisiológicas críticas.
Se proporciona el ADN que codifica estas
subunidades \alpha_{1H} de un canal de calcio animal, y ARN que
codifica tales subunidades, hechas de transcripciones de tal ADN. En
particular, se proporciona el ácido nucleico que codifica los
canales de calcio de tipo T, denominadas subunidades
\alpha_{1H}(denominadas \alpha_{1F} en el documento
de prioridad solicitud de Estados Unidos Nº de serie 08/984.709) de
un canal de calcio, particularmente un canal de calcio animal y más
particularmente un canal de calcio de mamíferos.
De particular interés en esta memoria
descriptiva es el ácido nucleico que codifica las subunidades
\alpha_{1H} de los canales de calcio, particularmente canales
de calcio de mamíferos. Se proporciona ácido nucleico que codifica
subunidades \alpha_{1H} ejemplares. Se proporciona el ácido
nucleico que codifica dos variantes de ayuste, denominadas
\alpha_{1H-1} y
\alpha_{1H-2}, a partir de los canales de calcio
humanos. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos codificados
de las subunidades ejemplificadas se muestran en las SEQ ID números
12 (\alpha_{1H-1}), 15
(\alpha_{1H-1}) y 16
(\alpha_{1H-2}). Las SEQ ID números 12 y 15
difieren solamente en que el aminoácido 2230 (bases
6983-6985) es Asp (GAC) en la SEQ ID Nº 15 y Glu
(GAA) en la SEQ ID Nº 12.
Este ácido nucleico se puede usar para aislar
variantes, incluyendo variantes de ayuste adicionales del ácido
nucleico que codifica las subunidades \alpha_{1H}, las variantes
alélicas y las subunidades \alpha_{1H} de otros animales,
particularmente mamíferos. Tal ácido nucleico incluye el ADN que
codifica la subunidad \alpha_{1H-1} que tiene
sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos codificada por el
ADN expuesto en las SEQ ID Números 12 y 15. Este ácido nucleico
también se puede usar para aislar el ADN que codifica las
subunidades \alpha_{1H} de otras especies, particularmente otros
mamíferos.
También se proporciona ácido nucleico que
codifica una segunda variante de ayuste, denominada
\alpha_{1H-2}. la secuencia de ácido nucleico
de esta variante, difiere de \alpha_{1H-1} en
que tiene una supresión de 957 nucleótidos, que dan como resultado
la pérdida de 319 aminoácidos (que corresponden a los aminoácidos
470-788 de \alpha_{1H-1}).
También se incluyen cualesquiera subunidades que
están codificadas por ácido nucleico que contienen los nucleótidos
nt 1506 a nt 2627 de la SEQ ID Nº 12 ó 15 o las subunidades que
están codificadas por ácido nucleico que se hibrida,
preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad, a una sonda
derivada de esta región que codifica un canal T, que se puede
identificar usando los procedimientos en esta memoria
descriptiva.
La subunidad \alpha_{1H} difiere de las
subunidades de los canales de calcio
\alpha_{1A}-\alpha_{1E} en un número de
aspectos. Primero, el bucle intracelular posicionado entre los
dominios transmembrana I y II considerablemente más largo que los
canales de calcio de HVA. Por ejemplo, como se ejemplifica en las
SEQ ID números 12 y 15 y descritos más adelante, el bucle
intracelular entre los dominios I y II es mayor que 1, 100 nt (1122
nt), mientras que la región correspondiente en los canales de calcio
de HVA varía entre 351 y 381 nt de longitud. De este modo, el bucle
intracelular de \alpha_{1H} contiene aproximadamente 370 restos
de aminoácidos adicionales (aa 420 a aa 794 de la SEQ ID Nº 12) no
encontrados en las subunidades \alpha_{1} de los canales de
calcio de HVA. Además, la secuencia de aminoácidos codificada de
esta región de bucle es altamente rica en prolina y contiene una
región de poli-HIS de 9 residuos de histidina
consecutivos.
Otras características diferenciadoras de la
subunidad \alpha_{1H}, incluyen la ausencia de residuos de
aminoácidos en el bucle intracelular entre los dominios
transmembrana I y II que se sabe que son críticos (por ejemplo,
véase De Waard y col., (1996) FEBS Letters 380:
272-276; Pragnell y col., (1994) Nature 368:
67-70) para la interacción entre una subunidad
\alpha_{1} y una subunidad \beta. La subunidad \alpha_{1H}
también contiene un bucle extracelular notablemente grande en el
dominio I entre IS5 e IS6. Las subunidades de los canales de calcio
\alpha_{1H} de HVA proporcionadas en esta memoria descriptiva
contienen 249-270 residuos de nucleótidos en este
bucle. Por el contrario, la subunidad \alpha_{1H} humana
contienen 426 restos de nucleótidos en este bucle. El bucle
intracelular entre los dominios III y IV transmembrana también es
ligeramente mayor que las subuniaddes \alpha_{1} de HVA (186 nt
comparado con 159-162 nt).
Se describen las sondas de ácido nucleico, que
se pueden marcar para detección, que contienen al menos 16, o, si
desea, 20 ó 30 o más, nucleótidos contiguos de ácido nucleico que
codifican \alpha_{1H}. También se describen los procedimientos
que usan las sondas para el aislamiento y clonación del ADN que
codifica la subunidad de los canales de calcio, que incluyen
variantes de ayuste dentro de tejidos y sus variantes entre
tejidos. Las regiones particularmente preferidas a partir de las que
se construyen las sondas para el aislamiento de ADN que codifica
una subunidad \alpha_{1H} humana incluyen la secuencia de ácido
nucleico que codifica el bucle intracelular notablemente largo
entre los dominios I y II transmembrana (por ejemplo, nt 1506 a nt
2627 de las SEQ ID números 12 y 15). Las sondas para aislar el ADN
que codifica un una subunidad \alpha_{1H} humana tienen
preferiblemente 16 nucleótidos contiguos de longitud. En algunos
casos, se usan sondas de 30 ó 50 nucleótidos y en otros casos se
usan sondas entre 50 y 100 nucleótidos.
Se proporcionan células eucarióticas que
contienen ADN heterólogo que codifica una o más de las subunidades
de los canales de calcio, particularmente las subunidades de los
canales de calcio humanos, o que contienen transcripciones de ARN
de clones de ADN que codifican una o más subunidades. Una sola
subunidad \alpha_{1H} puede formar un canal. Sin embargo, la
combinación requerida de las subunidades para la formación de
canales activos en células seleccionadas, se puede determinar
empíricamente usando los procedimientos en esta memoria
descriptiva. Por ejemplo, si un subtipo de \alpha_{1}
seleccionado o variante no forma un canal activo en una línea
celular seleccionada, una subunidad o subuniaddes adicionales se
pueden añadir hasta que se forma un canal activo. Otras subunidades
se pueden añadir para determinar los efectos de tal adición.
En realizaciones preferidas, las células
contienen ADN o ARN que codifican una subunidad \alpha_{1H} de
un animal, preferiblemente, de un canal de calcio de mamífero. Las
realizaciones en las que las células contienen ácido nucleico que
codifica una \alpha_{1H} son de particular interés en esta
memoria descriptiva. En otra realización, las células contienen ADN
o ARN que codifican subunidades heterólogas adicionales, incluyendo
una \alpha_{2}\delta. Las células también pueden incluir ácido
nucleico que codifican una subunidad \beta y/o una subunidad
\gamma. En tales realizaciones, se proporcionan células
eucarióticas transfectadas estable o transitoriamente con cualquier
combinación de uno, dos, tres o cuatro de los clones de ADN que
codifican subunidades, tal como ADN que codifica cualquiera de
\alpha_{1}, \alpha_{1} + \beta, \alpha_{1} + \beta
+ \alpha_{2}. Las células eucarióticas proporcionadas en esta
memoria descriptiva contienen ácido nucleico heterólogo que
codifica una subunidad \alpha_{1H} y opcionalmente una subunidad
\alpha_{2} y/o una subunidad \beta y/o una subunidad
\gamma.
En realizaciones preferidas, las células
eucarióticas expresan canales de calcio funcionales, heterólogos
que son capaces de controlar el paso de iones selectivos de los
canales de calcio y/o compuestos de unión que, a concentraciones
fisiológicas, modulan la actividad del canal de calcio heterólogo.
En ciertas realizaciones, los canales de calcio heterólogos
incluyen al menos una subunidad de los canales de calcio
heterólogos. En las realizaciones más preferidas, los canales de
calcio que se expresan sobre la superficie de las células
eucarióticas están compuestas sustancialmente o completamente de
subunidades codificadas por el ADN o ARN heterólogo. En
realizaciones preferidas, los canales de calcio heterólogos de tales
células se pueden distinguir de cualquiera de los canales de calcio
endógenos de la célula huésped. Tales células proporcionan un medio
de obtener poblaciones homogéneas de canales de calcio. Típicamente,
las células contienen el canal de calcio seleccionado como el único
canal de ion heterólogo expresado por la célula.
En ciertas realizaciones las células
eucarióticas recombinantes que contienen el ADN heterólogo que
codifica las subuniaddes de los canales de calcio se producen
mediante la transfección con ADN que codifica una o más de las
subunidades o se inyectan con transcripciones de ARN de ADN que
codifica una o más de las subunidades de los canales de calcio. El
ADN se puede introducir como un fragmento de ADN lineal o se puede
incluir en un vector de expresión para la expresión estable o
transitoria del ADN que codifica la subunidad. También se
proporcionan los vectores que contienen ADN que codifican
subunidades de los canales de calcio humanos.
Las células eucarióticas que expresan los
canales de calcio heterólogos se pueden usar en ensayos para la
función de los canales de calcio o, en el caso de las células
transformadas con menos ácido nucleicos codificadores de las
subunidades que los necesarios para constituir un canal de calcio de
tipo humano recombinante y funcional, dichas células se pueden usar
para valorar los efectos de las subunidades adicionales en la
actividad de los canales de calcio. Las subunidades adicionales se
pueden proporcionar mediante la transfección posterior de dicha
célula con uno o más clones de ADN o transcripciones de ARN que
codifican las subunidades de los canales de calcio de tipo
humano.
Las células eucarióticas recombinantes que
expresan los canales de calcio heterólogos pertenecientes a la
membrana se pueden usar en los procedimientos para identificar
compuestos que modulan la actividad de los canales de calcio. En
particular, las células se usan en ensayos que identifican los
agonistas y antagonistas de la actividad de los canales de calcio
en seres humanos y/o la valoración de la contribución de las
diversas subunidades de los canales de calcio para el transporte y
regulación del transporte de los iones de calcio. Debido a que las
células constituyen poblaciones homogéneas de de los canales de
calcio, proporcionan un medio de identificar los agonistas y
antagonistas de la actividad de los canales de calcio que son
específicos para cada una de dichas poblaciones.
Las células proporcionadas en esta memoria
descriptiva se pueden usar para determinar la función de los canales
de tipo T y distribución de tejidos y para identificar los
compuestos que modulan la actividad de los canales de tipo T.
Debido a que los canales de tipo T son operativos en las neuronas en
el tálamo, hipotálamo, y tronco cerebral, y pueden estar implicadas
en las funciones nerviosas autonómicas, en la regulación de
actividades cardiovasculares tales como ritmo cardíaco, inervación
y tono del músculo liso arterial y venosa, ritmo pulmonar y otros
procesos fundamentales, ensayos diseñados para valorar tales
actividades y ensayos los moduladores de identidad de estas
actividades proporcionan un medio de entender los procesos
fundamentales y también un medio de identificar nuevos candidatos
de fármacos para una serie de trastornos.
También se proporcionan los ensayos que usan las
células eucarióticas para identificar compuestos que modulan la
actividad de los canales de calcio. En la práctica de estos ensayos
la célula eucariótica que expresa un canal de calcio heterólogo,
que contiene al menos una subunidad codificada por el ADN
proporcionado en esta memoria descriptiva, está en una solución que
contiene un compuesto de ensayo y un ión selectivo de los canales
de calcio, la membrana celular se desmoraliza y se detecta la
intensidad de corriente en la célula. Si el compuesto de ensayo es
uno que modula la actividad de los canales de calcio, la corriente
que se detecta es diferente de la producida mediante la
despolarización de la misma célula o sustancialmente idéntica en
presencia del mismo ión selectivo de los canales de calcio pero en
ausencia del compuesto. En las realizaciones preferidas, antes de
la etapa de despolarización, la célula se mantiene a un potencial de
mantenimiento que inactiva sustancialmente los canales de calcio
que son endógenos a la célula. También en realizaciones preferidas,
las células son células de mamíferos, más preferiblemente células
HEK u ovocitos de anfibios.
Las células que expresan los canales T o canales
LVA se pueden usar en ensayos que seleccionan compuestos que tienen
actividad como moduladores, particularmente antagonistas, de la
actividad de estos canales.
Se proporciona los ensayos basados en
transcripción para identificar compuestos que modulan la actividad
de los canales de calcio (véanse, las patentes de Estados Unidos
números 5.436.128 y 5.401.6291, particularmente canales de calcio
que contienen una subunidad \alpha_{1H}. Estos ensayos usan
células que expresan los canales de calcio, particularmente los
canales de calcio que contienen una subunidad \alpha_{1H}, y más
preferiblemente una subunidad \alpha_{1H} codificada por ADN
heterólogo, y también contienen ácido nucleico que codifica una
construcción de gen indicador que contiene un gen indicador en
enlace operativo con uno o más elementos de control de
transcripción que está regulado por un canal de calcio. Los ensayos
se efectúan comparando la diferencia en la cantidad de
transcripción de un gen indicador en las células proporcionadas en
presencia del compuesto con la cantidad de transcripción en ausencia
del compuesto, o con la cantidad de transcripción en ausencia del
canal de calcio heterólogo, por lo cual los compuestos que modulan
la actividad del canal de calcio heterólogo en la célula se
identifican. El gen indicador es cualquier gen conocido por los
expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limita a al gen que
codifica la cloranfenicol acetiltransferasa, el gen que codifica la
luciferasa de luciérnaga, el gen que codifica la luciferasa
bacteriana, el gen que codifica la
\beta-galactosidasa o el gen que codifica la
fosfatasa alcalina, y el elemento de control transcripcional es
cualquier elemento conocido por los expertos en la técnica, que
incluye, pero no se limita a elementos sensibles de suero,
elementos sensibles a monofosfato de adenosina cíclica, el promotor
del gen c-fos, el promotor del gen de péptido
intestinal vasoactivo, el promotor del gen de somatostatina, el
promotor de proencefalina, el promotor del gen de la
fosfoenolpiruvato carboxiquinasa o el promotor del gen del factor 1
A de crecimiento nervioso y los elementos sensibles a los niveles
de iones de calcio intracelular.
Otros ensayos en los que la actividad receptora
en respuesta a los compuestos de ensayo se mide también se puede
practicar con las células proporcionadas en esta memoria descriptiva
(véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº
5.670.113).
Debido a que los canales de tipo T parece que
están asociados con una diversidad de funciones clave, las células
que expresan los canales de T y ensayos que usan tales células serán
útiles para la identificación de compuestos para el tratamiento de
de una diversidad de trastornos, enfermedades y afecciones. Los
compuestos identificados pueden ser candidatos para uso en el
tratamiento de trastornos y afecciones asociadas a la actividad de
los canales T. Tales actividades incluyen, pero no se limitan a,
las que están implicadas en la excitabilidad del músculo, secreción
y actividad del marcapasos, ondas completas dependientes de
Ca^{2+}, oscilaciones neuronales, y potenciación de señales
sinápticas, para la mejora de la conformidad en hipertensión
sistólica, o mejora del tono vascular, tal como la disminución del
fluido vascular, y otros. Otros trastornos incluyen, pero no se
limitan a hipertensión, trastornos cardiovasculares, incluyendo pero
sin limitación a: infarto de miocardio, arritmia cardíaca,
insuficiencia cardíaca angina de pecho, trastornos neurológicos,
tales como esquizofrenia, epilepsia y depresión, trastornos de los
músculos periféricos, trastornos respiratorios y trastornos
endocrinos.
En particular, las células que expresan canales
de LVA, tales como las subunidades \alpha_{1H}, son útiles para
identificar compuestos que son candidatos para el tratamiento de
trastornos asociados a tejidos de conducción, tales como células
con función del marcapasos arteriales, fibras de Purkinje, y también
músculos lisos coronarios. Tales trastornos incluyen, pero no se
limitan a, compuestos útiles para el tratamiento de cardiovascular,
tal como angina, vascular, tal como hipertensión, y terapias
urológicas, hepática, reproductora, complementarias para el
reestablecimiento del ritmo cardíaco normal y rendimiento cardíaco
que después de lesión traumática, ataque al corazón y otras
lesiones cardíacas; tratamientos de infarto de miocardio (MI), post
- MI y en un ajuste agudo. Otros compuestos que interaccionan con
LVA, particularmente los canales de calcio de tipo T, pueden ser
eficaces para aumentar la fuerza contráctil cardíaca, tal como la
medida por la presión ventricular izquierda y diastólica, y sin
cambiar la presión sanguínea o ritmo cardíaco. En un agudo pueden
ser eficaces otros compuestos para disminuir la formación de tejido
cicatrizado, tal como el medido por la deposición de colágeno o
espesor del septo, y sin efectos cardiovasculares. Los ensayos
pueden identificar compuestos útiles en la regulación del tono
muscular liso vascular, o bien mediante vasodilatación o
vasoconstricción en: (a) tratamientos para reestablecimiento del
control de la presión sanguínea, por ejemplo, después de lesión
traumática, cirugía o desviación cardiovascular, y en tratamientos
profilácticos diseñados para minimizar los efectos cardiovasculares
de fármacos anestésicos; (b) tratamientos para mejorar los reflejos
vasculares y control de presión sanguínea mediante el sistema
nervioso autónomo; para identificar los compuestos útiles en el
tratamiento de enfermedades urológicas: (a) tratamiento y
restauración de la función renal después de cirugía, lesión
traumática, uremia y reacciones adversas de fármacos; (b)
tratamiento de disfunciones de vejiga; y (c) toxicidad neuronal
urémica e hipotensión en pacientes en hemodiálisis; trastornos
reproductores, para la identificación de compuestos útiles en el
tratamiento de: (a) trastornos de la función sexual que incluyen
impotencia; (b) impotencia alcohólica (en control autónomo que
puede estar sometido a controles de los canales de calcio);
trastornos hepáticos para identificar compuestos útiles en el
tratamiento y reducción de la toxicidad neuronal y daño en el
sistema nervioso autónomo que produce por el exceso agudo de consumo
de alcohol; trastornos neurológicos para la identificación de
compuestos útiles en el tratamiento de: (a) epilepsia y epilepsia
diencefálica; (b) enfermedad de Parkinson; (c) control de
temperatura aberrante, tales como, anormalidades de temblores y
secreción de la glándulas sudoríparas y suministro de la sangre
vascular periférica; (d) funciones aberrantes de la pituitaria e
hipotálamo que incluye secreción anormal de noradrenalina, dopamina
y otras hormonas; para sistema respiratorio tal como en el
tratamiento de la respiración anormal, por ejemplo, complicaciones
postquirúrgicas y anestésicas; y trastornos endocrinos, para
identificar compuestos útiles en el tratamiento de la secreción
aberrante de hormonas incluyendo por ejemplo, tratamientos posibles
de la sobreproducción de insulina, tiroxina, adrenalina, y otros
desequilibrios hormonales.
Se proporcionan las subunidades de los canales
de calcio \alpha_{1H} y canales de calcio humanos purificados
que contienen tales subunidades. Las subunidades y canales se pueden
aislar a partir de una célula eucariótica transfectada con ácido
nucleico que codifica la subunidad.
Se describen inmunoglobulinas o anticuerpos
obtenidos a partir del suero de de un animal inmunizado con una
preparación sustancialmente pura de un canal de calcio humano,
subunidad de canal de calcio o fragmento que contiene epítope de
una subunidad de canal de calcio. También se describen los
anticuerpos monoclonales producidos usando un canal de calcio,
subunidad de canal de calcio o fragmento que contiene epítopes de
los mismos como un inmunógeno. También se pueden usar como
inmunógenos proteínas de fusión de E. coli que incluyen una
subunidad de los canales de calcio humanos. Tales proteínas de
fusión pueden contener una proteína bacteriana o porción de las
mismas, tales como la proteína TrpE de E. coli, condensada a
un péptido de subunidades de los canales de calcio. Las
inmunoglobulinas que se producen usando las subunidades de los
canales de calcio o canales de calcio purificados como inmunógenos
tienen, entre otras propiedades, la capacidad de unirse
específicamente y preferentemente y/o producir la
inmunoprecipitación de un canal de calcio humano o una subunidad del
mismo que puede estar presente en una muestra biológica o una
solución derivada de tal muestra biológica. Tales anticuerpos
también se pueden usar para aislar selectivamente células que
expresan canales de calcio que contienen la subunidad para las que
son específicos los anticuerpos.
También se proporcionan los procedimientos para
modular la actividad de los canales iónicos mediante la puesta en
contacto de los canales de calcio con una cantidad eficaz de los
anticuerpos descritos anteriormente.
De este modo, se proporcionan los ensayos para
identificar los compuestos que modulan la actividad de los canales
de calcio LVA, particularmente los canales de tipo T así como los
compuestos identificados mediante los procedimientos.
También se proporcionan procedimientos para la
diagnosis de los trastornos, mediados pos los canales de calcio
LVA, particularmente mediados por los canales de calcio de tipo T.
Los procedimientos de diagnosis implicarán la detección de
expresión o función aberrante de los canales, tales como secuencias
de aminoácidos alteradas y perfiles farmacológicos y perfiles
electrofisiológicos alterados comparados con los canales de tipo
salvaje. Tales procedimientos típicamente pueden emplear
anticuerpos específicos para el canal alterado o sondas de ácido
nucleico para detectar genes o transcripciones alterados.
La Figura 1 muestra la dependencia de la tensión
de activación (moo) e inactivación de estado constante (h) de
canales de calcio \alpha_{1H} expresados transitoriamente en
células HEK. La dependencia de la tensión de la activación (moo) se
determinó a partir del análisis de la corriente de cola. Las
corrientes de cola se normalizaron con respecto a la corriente de
cola de pico máximo obtenida a + 60 mV y se representaron
gráficamente (símbolos en círculos en blanco, media \pm error
típico de la media; n = 11) contra el potencial de ensayo. Los
datos se ajustaron mediante la suma de dos funciones Boltzman
m \infty = FA * [1 + exp (-(V_{ensayo} -
V1/2, A)/KA)]1 + F_{B} *[1 + exp (-(V_{ensayo} - V_{1/2.
B})/K_{B})]^{-1}, F_{A} = 0,67, V_{1/2} = -21,5 mV, k_{A}
= 7,5, F_{B} = 0,33, V_{1/2}._{B} = 25,5 mV, k_{B} = 14,7.
La inactivación en estado constante (h \infty) se determinó a
partir de un potencial de mantenimiento de - 100 mV mediante un
pulso de ensayo a -20 mV (p1), seguido de un prepulso de 20 segundos
desde - 100 mV a - 10 mV en decrementos (p H antiguo) precedido de
un segundo pulso de ensayo a - 20 mM (p2). Las amplitudes de
corrientes normalizadas se representaron gráficamente (símbolos de
círculo en negro, media \pm error típico de la media; n = 9)
contra el potencial de mantenimiento. Los datos se ajustaron
mediante una función de Boltzman
h \infty = [1 + exp ((V_{mantenida} - V1/2,
A)/k)]^{-1}, V_{1/2} = 63,9 mV, k = 3,9 mV.
La Figura 2 muestra la cinética de activación
(Figura 2A) e inactivación (Figura 2B) de los canales de calcio
\alpha_{1H} (\alpha_{1H -1}); la cinética de activación e
inactivación se determinaron a partir de los indicios de corriente
mediante ajuste de una función exponencial a la fase creciente (Fig.
2A) o menguante (Fig. 2B) de la corriente (a la dependencia de la
tensión para la activación e inactivación sigue aproximadamente una
función exponencial).
La Figura 3 muestra esquemáticamente las
características de la subunidad \alpha_{1H -1} y muestra el
alineamiento de la secuencia de aminoácidos de \alpha_{1H} con
\alpha_{1D} y \alpha_{1E} en cada una de las cuatro
regiones de poros; * indica los residuos implicados en la
selectividad de iones en cada una de las cuatro regiones de poros;
el bucle grande inusualmente en las subunidades \alpha_{1H}
entre dominios transmembrana I y II.
La Figura 4A muestra las corrientes de cola
inducidas por la repolarización a - 90 mV después de una etapa de
10 ms de despolarización entre - 80 y - 10 mV, para las mediciones
de las corrientes de cola las tasas de digitalización/filtro eran
50/16 kHz. La mengua de la corriente de cola se ajustó a una función
bi-exponencial de la forma I = A_{0} + A_{1}
exp (-t/\tau_{1}) + A_{2} exp (-t/\tau_{2}). El perfil de
mengua biexponencial de la corriente de cola se observó en cada
célula examinada (n = 12). Las Figuras 4B y 4C muestran la
dependencia de la tensión sw las constantes de tiempo \tau_{1} y
\tau_{2} para la desactivación de la corriente (Figura 4B) y
las fracciones de corriente A_{1} y A_{2} (Figura 4C).
Salvo que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos usados en esta memoria descriptiva
tienen el mismo significado como entienden comúnmente los expertos
en la técnica a la que esta invención pertenece.
La referencia a cada una de las subunidades de
los canales de calcio incluye las subunidades que se describen
específicamente en esta memoria descriptiva y las subunidades de los
canales de calcio codificadas por ácido nucleico que se puede
aislar usando el ácido nucleico descrito como sondas y seleccionando
un ADNc humano apropiado o genoteca genómica en al menos baja
rigurosidad, preferiblemente alta rigurosidad. Tal ADN incluye ADN
que codifica proteínas que tienen aproximadamente 40% de homología,
típicamente al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia
teniendo en cuenta huecos) con cualquiera de las proteínas de
subunidades descritas en esta memoria descriptiva o ADN o ARN que
se híbrida en condiciones de al menos baja rigurosidad al ADN
proporcionado en esta memoria descriptiva y la proteína codificada
por tal ADN muestra características identificativas adicionales,
tales como función o peso molecular. En particular, la referencia a
una subunidad \alpha_{1H} se refiere a subunidades que se
pueden aislar a partir de genotecas de ácido nucleico a partir de
cualquier fuente deseada usando el ácido nucleico descrito en esta
memoria descriptiva como una sonda. La subunidad codificada
caracterizada por la presencia del bucle intracelular notablemente
largo entre los dominios transmembrana I y II, y/o proteínas
atribuidas a los canales de tipo T o tipo LVA.
Se entiende que las subunidades que están
codificadas por las transcripciones que representan variantes de
ayuste de las subunidades descritas u otras tales subunidades pueden
mostrar menos de 40% de homología global con cualquier subunidad
individual, pero incluirán regiones de tal homología con una o más
de tales subunidades. También se entiende que 40% de homología se
refiere a proteínas que comparten aproximadamente 40% de sus
aminoácidos en común o que comparten algo menos, pero incluyen
sustituciones conservadoras de aminoácidos, en las que la actividad
de la proteína no se altera sustancialmente.
Las subunidades y fragmentos de ADN que
codifican tales subunidades se proporcionan en esta memoria
descriptiva o son conocidas por los expertos en la técnica (véase,
las aplicaciones PCT internacionales publicadas números WO
89/09834, WO 93/04083, WO 95/04822, patentes de Estados Unidos
Números 5.792.846, 5.726.035, 5.407.820, 5.686.241, 5.618.720,
5.710.250, 5.429.921, 5.429.921 y 5.386.025) incluyen cualesquiera
subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2}, \beta o \gamma de un
canal de calcio humano.
Se proporcionan en esta memoria descriptiva el
ácido nucleico que codifica las subunidades LVA, particularmente
las subunidades \alpha_{1H} de canales de calcio humanos o de
otros animales. En particular, tales fragmentos de ADN incluyen un
fragmento de ácido nucleico aislado que codifica una subunidad
\alpha_{1H} activada por baja tensión de un canal de calcio
animal en el que la secuencia de nucleótidos comprende la parte
codificadora de la secuencia de nucleótidos establecida en
cualquiera de las SEQ ID números 12-16.
En una realización es ácido nucleico que
codifica una subunidad \alpha_{1H-1} o
\alpha_{1H-2} que comprende la parte
codificadora de la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera
de las secuencias números 12, 15 ó 16.
Como se usa en esta memoria descriptiva, los
tipos de subunidades \alpha_{1}, codificadas por genes
diferentes, se designan como tipo \alpha_{1A}, \alpha_{1B},
\alpha_{1C}, \alpha_{1D}, \alpha_{1E} y
\alpha_{1H}. Estos tipos también se han denominado VDCC IV para
\alpha_{1B}, VDCC II para \alpha_{1C} y VDCC III para
\alpha_{1D}. Los subtipos de subunidades que son variantes de
ayuste, se denominan, por ejemplo, \alpha_{1H - 1},
\alpha_{1H - 2}, \alpha_{1B - 1}, \alpha_{1B - 2},
\alpha_{1C - 1}, etc.
Así pues, como se usa en esta memoria
descriptiva, el ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica la subunidad
\alpha_{1} se refiere al ácido nucleico que se hibrida al ADN
proporcionado en esta memoria descriptiva en condiciones de al
menos baja rigurosidad, típicamente alta rigurosidad, o codifica una
subunidad que tiene más o menos aproximadamente 40% de homología
con la proteína codificada por el ADN descrito en esta memoria
descriptiva que codifica una subunidad \alpha_{1} de un canal de
calcio humano. En el caso de los canales de LVA, el ácido nucleico
que codifica una subunidad que se hibrida en al menos baja
rigurosidad, preferiblemente alta rigurosidad, al ácido nucleico
que codifica una subunidad \alpha_{1}, y que codifica una
subunidad que tiene las propiedades de LVA requeridas en ensayos
para tal actividad, como las descritas en esta memoria descriptiva.
Las variantes de ayuste tendrán porcentajes variables de homología
(o identidad) global, pero se derivará del mismo gen e incluirá
regiones de 100% de identidad.
En particular, una variante de ayuste de
cualquiera de las subunidades \alpha_{1} (o cualquiera de las
subunidades particularmente descritas en esta memoria descriptiva)
contendrán regiones (al menos un exón) de divergencia y una o más
regiones (al menos un exón, típicamente más que aproximadamente 16
nucleótidos, y generalmente sustancialmente más) que tienen 100% de
homología con uno o más de los subtipos de las subunidades
\alpha_{1} proporcionadas en esta memoria descriptiva, y también
contendrán una región que tiene sustancialmente menos homología, ya
que se deriva de de un exón diferente. Está bien dentro de los
expertos en la técnica identificar exones y variantes de ayuste.
Así, por ejemplo, una subunidad \alpha_{1H} será fácilmente
identificable, debido a que comparte aproximadamente 40% de
homología de proteína con una de las subunidades \alpha_{1H}
descritas en esta memoria descriptiva, e incluirá al menos una
región (un exón) que es 100% homóloga. También tendrá actividad,
como se describe más adelante, que indica que es una subunidad
\alpha_{1} de LVA.
En esta memoria descriptiva se indica, que
identidad y homología se refieren al porcentaje de aminoácidos
cuando se comparan proteínas o nucleótidos cuando se comparan ácidos
nucleicos que están compartidos. Están disponibles numerosos
programas de ordenador para la determinación de la identidad. En
todos los casos, las penalizaciones de huecos pretendidos y otros
parámetros son los defectos establecidos por el fabricante. Aunque
no se necesitan realmente cuando existe un alto grado (90% o más) de
identidad entre las secuencias de tales programas incluyen, pero no
se limitan a programas de alineación de secuencias disponibles,
tales como el programa Enastar "MegAlign" (Madison, WI) y el
programa "Gap" del Grupo de Ordenadores de Genética de la
Universidad de Wisconsin (UWG) (Madison, WI), para determinar un
porcentaje de identidad de secuencia (véase, también, von Heijne,
titulado "Sequence Análisis in Molecular Biology: Treasure Trove
of Trivial Pursuit" Academis Press (1987) Apéndice 2 (que citan
a UWG y Dnastar entre siete programas de software disponibles
comercialmente)).
Una subunidad \alpha_{1} se puede
identificar por su capacidad de formar un canal de calcio.
Típicamente, las subunidades \alpha_{1} tienen masas
moleculares mayores que al menos aproximadamente 120 kD. También
los estudios hidropáticos de las secuencia de los aminoácidos de la
subunidad \alpha_{1} deducida indican que las subunidades
\alpha_{1} contienen cuatro repeticiones internas, conteniendo
cada una seis dominios transmembrana. Una subunidad \alpha_{1H}
se identifica por su capacidad de formar poros y también la
activación por baja tensión del canal resultante.
La actividad de un canal de calcio se puede
valorar in vitro mediante los procedimientos conocidos por
los expertos en la técnica, que incluyen los procedimientos
electrofisiológicos y otros descritos en esta memoria descriptiva.
Típicamente, las subunidades \alpha_{1} incluyen regiones con
las que interactúan directa o indirectamente uno o más moduladores
de la actividad de los canales de calcio tal como un
1,4-DHP o \omega-CgTx.G Los tipos
de las subunidades \alpha_{1} se pueden distinguir mediante
cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica,
que se incluyen en función de su especificad de unión. Por ejemplo,
se ha encontrado en esta memoria descriptiva que las subunidades
\alpha_{1B} participan en la formación de canales que se han
mencionado anteriormente como los canales de tipo N, las subunidades
\alpha_{1D} participan en la formación de canales que se habían
mencionado anteriormente como canales de tipo L y las subunidades
\alpha_{1A} parece que participan en la formación de canales que
exhiben características típicas de canales que se habían
previamente denominado tipo P, y las subunidades \alpha_{1H}
parece que participan en los canales que muestran actividades
asociadas a los canales de tipo T. De este modo, por ejemplo, la
actividad de los canales que contienen la subunidad \alpha_{1B}
es insensible a los 1,4-DHP; mientras que la
actividad de los canales que contienen la subunidad \alpha_{1D}
se modula o se alteran mediante 1,4-DHP. Actualmente
se prefiere aludir a los canales de calcio en función de las
características farmacológicas y cinética de corriente y evitar
designaciones históricas. Los tipos y subtipos de las subunidades
\alpha_{1} se pueden caracterizar en función de los efectos de
dichos moduladores en la subunidad o un canal que contiene la
subunidad así como diferencias en corrientes y cinética de la
corriente producida por los canales de calcio que contienen la
subunidad. Las subunidades \alpha_{1h} se pueden además
identificar mediante la presencia de regiones de bucle intracelular
notablemente largas, tales como entre los dominios transmembrana I y
II (por ejemplo, nt 1506 a nt 2627 de la SEQ ID Nº 12), y también
el bucle en el dominio I.
En particular el ácido nucleico que codifica la
subunidad \alpha_{1H} como se usa en esta memoria descriptiva,
se hidridará en condiciones de alta rigurosidad al ácido nucleico
descrito en esta memoria descriptiva como las SEQ ID números 12, 15
y 16, y formarán un canal en una célula de mamífero, tal como una
célula HEK, que muestra propiedades electrofisiológicas y/o
farmacológicas de un canal LVA o T. Las propiedades
electrofisiológicas incluyen uno o más de las siguientes
propiedades electrofisiológicas una conductancia relativa de
Ba^{2+} de aproximadamente 5 pS (picosegundos) a aproximadamente
9 pS, un tiempo de activación de 2 a aproximadamente 8
milisegundos, un valor V_{1/2} de cinética de activación de
aproximadamente - 60 milivoltios a aproximadamente 26 milivoltios,
un tiempo de activación de aproximadamente 10 a aproximadamente 30
milisegundos, un valor V_{1/2} de cinética de activación de
aproximadamente -100 milivoltios a aproximadamente - 500
milivoltios, y un tiempo de desactivación de cola de
aproximadamente 2 a aproximadamente 12 milisegundos.
Además, el canal resultante puede tenor
propiedades farmacológicas, tal como un grado relativamente alto de
sensibilidad a mibefradil, metoxiacetato de (1S,
2S)-2-[2-[[3-(1H-bencimidazol-2-il)propil]metil-amino]etil]-6-fluoro-1-isopropil-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-ilo
(hoffman-LaRoche, Inc) y/o un grado relativamente
alto de resistencia a las toxinas del caracol Conus GVIA y MVIIC
así como las toxinas de arácnidos AgaIIIA y AgaIVA comparado con
los canales de calcio HVA.
Como se utiliza en esta memoria descriptiva, una
subunidad \alpha_{2} se codifica mediante un ácido nucleico
(ADN o ARN) descrito por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº
5.407.820, patente de Estados Unidos Nº 5.792.846, y la solicitud
PCT internacional Nº WO 95/04822 que codifica una subunidad
\alpha_{2} de un canal de calcio de mamíferos o que se hibrida
a ADN en condiciones de baja rigurosidad, preferiblemente alta
rigurosidad, o codifica una proteína que tiene al menos
aproximadamente 40% de homología, típicamente al menos
aproximadamente 90% de identidad, teniendo en cuenta los huecos, con
la que se describe en esta memoria descriptiva. Tal ADN codifica
una proteína que típicamente tiene una masa molecular mayor que
aproximadamente 120 kD, pero no forma un canal de calcio en la
ausencia de una subunidad \alpha_{1}, y puede alterar la
actividad de un canal de calcio que contiene una subunidad
\alpha_{1}. Los subtipos de la subunidad \alpha_{2} que
surgen como variantes de ayuste se designan mediante una letra
minúscula, tal como \alpha_{2a}, ... \alpha_{2e}. Además,
la subunidad \alpha_{2} y el fragmento grande producido cuando
la proteína se somete a condiciones reductoras parece que está
glicosilado con al menos azúcares unidos a N y no se unen
específicamente a los 1,4-DHP y fenilalquilaminas
que se unen específicamente a la subunidad \alpha_{1}. El
fragmento más pequeño, el fragmento C-terminal se
denomina la subunidad \delta e incluye los aminoácidos de
aproximadamente 946 (numerado según la solicitud PCT internacional
Nº WO 95/04822, por ejemplo, SEQ ID Nº 11 en ese documento) a
aproximadamente el extremo C. Este fragmento se puede disociar de la
parte restante de \alpha_{2} cuando al subunidad \alpha_{2}
se expone a condiciones reductoras. Para los propósitos en esta
memoria descriptiva \alpha_{2} también se denomina
\alpha_{2}\delta. De este modo la referencia a
\alpha_{2}\delta significa la subunidad \alpha_{2},
incluyendo la parte \delta C-terminal.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
subunidad \beta está codificada por el ADN descrito, por ejemplo,
en la patente de Estados Unidos Nº 5.407.820, patente de Estados
Unidos Nº 5.792.846, y la solicitud PCT internacional Nº WO
95/04822 o que se hibrida al ADN proporcionado en esta memoria
descriptiva en condiciones de baja rigurosidad, preferiblemente
alta rigurosidad, o codifica una proteína que tiene al menos
aproximadamente 40% de homología, típicamente aproximadamente al
menos 90% de homología) con la descrita en esta memoria descriptiva
y es una proteína que típicamente tiene un peso molecular menor que
las subunidades \alpha y del orden de aproximadamente
50-80 kD, no forma un canal de calcio detectable en
ausencia de una subunidad \alpha_{1}, pero puede alterar la
actividad de un canal de calcio que contiene una subunidad
\alpha_{1} o que contiene una subunidad \alpha_{1} y
\alpha_{2}.
Los tipos de la subunidad \beta que están
codificados por genes diferentes se designan con subíndices tales
como \beta_{1}, \beta_{2}, \beta_{3} y \beta_{4}.
Los subtipos de las unidades \beta que surgen como variantes de
ayuste de un tipo particular se designan con un subíndice numérico
referente al subtipo y a la variante. Tales subtipos incluyen, pero
sin limitación las variantes de ayuste de \beta_{1}, incluyendo
\beta_{1 - 1}-\beta_{1 - 5} y variantes
\beta_{2}, incluyendo y
\beta_{2C}-\beta_{2E}.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
subunidad \gamma es una subunidad de canal de calcio codificada
por el ADN descrito por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº
5.726.035 y 5.386.025; véase también Jay y col. (1990) Science 248:
490-492 y Lett y col., (* 1998) Nature Genetics 19:
340-347) y se puede aislar e identificar usando el
ácido nucleico descrito en ese documento como una sonda mediante la
hibridación u otro procedimiento tal conocido por los expertos en
la técnica, en el que los clones de longitud completa que codifican
una subunidad \gamma se puede aislar o construir. Una subunidad
\gamma estará codificada por ADN que se hibrida al ADN
proporcionado en ese documento en condiciones de baja rigurosidad,
preferiblemente alta rigurosidad, muestra homología de secuencia
suficiente para codificar una proteína que tiene aproximadamente
40% de homología con la subunidad \gamma descrita en esta memoria
descriptiva.
De este modo, los expertos en la técnica, a la
luz de la descripción en esta memoria descriptiva, pueden
identificar el ADN que codifica las subunidades \alpha_{1},
\alpha_{2}, \beta, \delta y \gamma de las subunidades de
los canales de calcio, que incluyen los tipos codificados por genes
diferentes y subtipos que representan variantes de ayuste. Por
ejemplo, las sondas de ADN o ARN basadas en el ADN descrito ene esta
memoria descriptiva se pueden usar para seleccionar una genoteca
apropiada, incluyendo una genoteca genómica o de ADNc, para
hibridación a la sonda y obtienen ADN en uno o más clones que
incluye un fragmento abierto de lectura que codifica una proteína
entera. Posteriormente a la selección de una genoteca apropiada con
el ADN descrito en esta memoria descriptiva, el ADN aislado se
puede examinar para la presencia de una fase abierta de lectura a
partir de la cual se puede deducir la secuencia de la proteína
codificada. La determinación del peso molecular y comparación con
las secuencias en esta memoria descriptiva deben revelar la
identidad de la subunidad como una subunidad \alpha_{1},
\alpha_{2} etc. Los ensayos funcionales, pueden si es necesario,
usarse para determinar si la subunidad es una subunidad
\alpha_{1}, \alpha_{2} o \beta.
Por ejemplo, el ADN que codifica \alpha_{1A}
se puede aislar seleccionando una genoteca apropiada con ADN, que
codifica toda o una parte de la subunidad \alpha_{1A} humana.
Tal ADN incluye el ADN en el fago depositado en el número de acceso
75293 de la ATCC que codifica una parte de una subunidad
\alpha_{1}. El ADN que codifica una subunidad \alpha_{1A}
se puede obtener a partir de una genoteca apropiada mediante
selección con un oligonucleótido que tiene toda o una parte de la
secuencia de una subunidad \alpha_{1A} (véase, por ejemplo la
solicitud PCT internacional publicada Nº WO 95/04822,
particularmente las SEQ ID números 21, 22 y/o 23 o con el ADN en el
fago depositado en ese documento). Como alternativa, tal ADN puede
tener la secuencia codificadora que codifica una subunidad
\alpha_{1A}. Se puede usar cualquier procedimiento conocido por
los expertos en la técnica para el aislamiento e identificación de
ADN y preparación de clones genómicos o de ADNc de longitud
completa, que incluyen los procedimientos ejemplificados en esta
memoria descriptiva.
El ADN que codifica \alpha_{1H} se puede
aislar mediante la selección de de una línea celular de carcinoma
de tiroides medular humana (células TT) u otra genoteca de ADNc
humana adecuada con sondas de ADN preparadas a partir de ácido
nucleico proporcionadas en esta memoria descriptiva. Los clones de
longitud completa se construyen y expresan como se describe y
ejemplifica en esta memoria descriptiva y los canales resultantes
ensayados para verificar que el ácido nucleico codificador codifica
un canal LVA.
La subunidad codificada mediante el ADN aislado
se puede identificar por comparación con el ADN y las secuencias de
aminoácidos de las subunidades proporcionadas en esta memoria
descriptiva. Las variantes de ayuste comparten amplias regiones de
homología, pero incluyen regiones no homólogas, subunidades
codificadas por genes diferentes comparten una distribución
uniforme de secuencias no homólogas.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
variante de ayuste se refiere a una variante producida mediante
procesamiento diferencial de una transcripción primaria de ADN
genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm. Las
variantes de ayuste se pueden producir dentro de un único tipo de
tejido o entre tejidos (variantes específicas de tejido). Así pues,
los clones de ADNc que codifican subtipos de subunidades de calcio
que tienen regiones de aminoácidos y regiones idénticas de
diferentes secuencias de aminoácidos se denominan en esta memoria
descriptiva "variantes de ayuste".
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
"ion selectivo de los canales de calcio" es un ion que es capaz
de fluir a través, o que está bloqueado para fluir a través de, un
canal de calcio que atraviesa una membrana celular en condiciones
que sustancialmente de manera similar permitirían o bloquearían el
flujo de Ca^{2+}. Ba^{2+} es un ejemplo de un ion que es un ion
selectivo de los canales de calcio.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
compuesto que modula la actividad de los canales de calcio es uno
que afecta a la capacidad del canal de calcio para pasar iones
selectivos de canales de calcio o afecta a otras características de
los canales de calcio detectables, tal como la cinética de
corriente. Tales compuestos incluyen antagonistas y agonistas de
canales de calcio y compuestos que ejercen su efecto sobre la
actividad del canal de calcio directa o indirectamente.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
subunidad o proteína "sustancialmente pura" es una subunidad o
proteína que está sustancialmente libre de otros contaminantes
polipeptídicos que parecen homogéneos mediante SDS - PAGE o se
secuencia no ambiguamente.
Como se usa en esta memoria descriptiva, se
hibrida selectivamente significa que un fragmento de ADN se hibrida
a un segundo fragmento con especificidad suficiente para permitir
que el segundo fragmento se identifique o aísle de entre una
pluralidad de fragmentos. En general, la hibridación selectiva se
produce en condiciones de alta rigurosidad.
Como se usa en esta memoria descriptiva, ADN y
ARN heterólogo o foráneo se usan indistintamente y se refiere a ADN
o ARN que no son de origen natural como parte del genoma en el que
está presente o que se encuentra en un lugar o lugares en el genoma
que difieren de aquel porque se produce en la naturaleza. Es ADN o
ARN que no es endógeno para la célula y se ha introducido
artificialmente en la célula. Los ejemplos de ADN heterólogo
incluyen, pero sin limitación, ADN que codifica una subunidad de los
canales de calcio y ADN que codifica ARN o proteínas que median o
alteran la expresión de ADN endógeno afectando la transfección,
traducción, u otros procesos biológicos regulables. La célula que
expresa el ADN heterólogo, tal como ADN que codifica la subunidad
de los canales de calcio, puede contener ADN que codifica la misma o
diferentes subunidades de los canales de calcio. El ADN heterólogo
no necesita expresarse y se puede introducir de una manera tal que
se integra en el genoma de la células hospedadora o se mantiene
episomalmente.
Como se usa en esta memoria descriptiva, enlace
operativo de ADN heterólogo a secuencias reguladoras y efectoras de
nucleótidos, tales como promotores, potenciadores, sitios de
detención transcripcional y traduccional, y otras secuencias señal,
se refiere a la relación funcional entre tal ADN y tales secuencias
de nucleótidos. Por ejemplo, enlace operativo de ADN heterólogo a
un promotor se refiere a la relación física y funcional entre el
ADN y el promotor de manera que la transcripción de tal ADN se
inicia a partir del promotor mediante una ARN polimerasa que
específicamente reconoce, se une a y transcribe el ADN en la fase de
lectura.
Como se usa en esta memoria descriptiva, ADN
aislado, sustancialmente puro se refiere a fragmentos de ADN
purificados de acuerdo a las técnica habituales empleadas por los
expertos en la técnica [véase, por ejemplo, Maniatis y col., (1982)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY].
Como se usa en esta memoria descriptiva, la
expresión se refiere al proceso mediante el que el ácido nucleico
se transcribe en ARNm y se traduce en péptidos, polipéptidos, o
proteínas. Si el ácido nucleico se deriva de ADN genómico, la
expresión puede, si se selecciona una célula u organismo hospedador
eucariótico apropiada, incluir ayuste del ARNm.
Como se usa en esta memoria descriptiva, vector
o plásmido se refiere a elementos discretos que se usan para
introducir ADN heterólogo en células para bien la expresión del ADN
heterólogo o para replicación del ADN heterólogo clonado. La
selección y uso de tales vectores y plásmidos están dentro del nivel
de experiencia en la técnica.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el
vector de expresión incluye vectores capaces de expresar fragmentos
de ADN que están en unión operativa con secuencias reguladoras, tal
como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión
de tales fragmentos de ADN. De este modo, un vector de expresión se
refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un
plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, tras la
introducción en una célula hospedadora apropiada, da como resultado
la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados
los conocen bien los expertos en la técnica e incluyen los que son
replicables en células eucarióticas y/o células procarióticas y las
que permanecen episomales o se pueden integrar en el genoma de la
célula hospedadora.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
región promotora se refiere a la porción de ADN de un gen que
controla la transcripción de ADN al que se une operativamente. La
región promotora incluye secuencias específicas de ADN que son
suficientes para el reconocimiento de ARN polimerasa, unión e inicio
de transcripción. Esta porción de la región promotora se denomina
promotor. Además, la región promotora incluye secuencias que modulan
este reconocimiento, unión y actividad de inicio de transcripción
de la ARN polimerasa. Estas secuencias pueden actuar en cis
o puede ser responsable de los factores actuando en trans.
Los promotores, que dependen de la naturaleza de la regulación
pueden ser constitutivos o regulados.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
célula eucariótica recombinante es una célula eucariótica que
contiene ADN o ARN heterólogo.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
canal de calcio recombinante o heterólogo se refiere a un canal de
calcio que contiene una o más subunidades que se codifican por ADN
heterólogo que se ha introducido y expresado en una célula
eucariótica que expresa el canal de calcio recombinante. Un canal de
calcio recombinante también puede incluir las subunidades que se
producen por ADN endógeno a la célula. En ciertas realizaciones, el
canal de calcio recombinante o heterólogo pueden contener solamente
unidades que están codificadas por el ADN heterólogo.
Como se usa en esta memoria descriptiva,
"funcional" con respecto a un canal de calcio recombinante o
heterólogo significa que el canal es capaz de proporcionar y
regular la entrada de los iones selectivos de los canales de
calcio, incluyendo, pero sin limitación, Ca^{2+} o Ba^{2+}, en
respuesta a un estímulo y/o ligandos de unión con afinidad para el
canal. Preferiblemente tal actividad de los canales de calcio es
distinguible, tal como electrofisiológico, farmacológico y otros
medios conocidos por los expertos en la técnica, de cualquier
actividad de los canales de calcio endógenos en la célula
hospedadora.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
canal de tipo T o canal de tipo LVA típicamente se refiere a un
canal de calcio que muestra una corriente de calcio de bajo umbral
que se activa e inactiva a tensiones bajas comparado con los
canales de calcio (tales como los que incluyen una subunidad
\alpha_{1D}) denominados canales activados por alta tensión
(HVA). Además o como alternativa, un canal de tipo T se puede
caracterizar mediante características biofísicas distintas, tales
como velocidades de desactivación lentas, conductancias muy bajas
(5-9 pS) e inactivación dependiente de la tensión.
Los canales T pueden mostrar un grado relativamente alto de
sensibilidad a mibefradil (Hoffman - LaRoche, Inc) y/o un alto
relativamente alto de resistencia a resistencia a las toxinas del
caracol Conus GVIA y MVIIC así como las toxinas de arácnidos AgaIIIA
y AgaIVA comparado con los canales de calcio HVA. Estos canales
también típicamente muestran afinidad reducida para calcio. Los
canales de tipo T o canales de tipo LVA también pueden estar
caracterizados al nivel de ácido nucleico mediante la presencia de
uno o más bucles intracelulares extendidos (véase, pro ejemplo, SEQ
ID Nº 12, 15 y 16) entre dominios transmembrana, tales como entre
dominios transmembrana I y II.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente
como se expone en una SEC ID Nº particular incluye proteína que
tiene la misma función pero pueden incluir variaciones menores en
secuencia, tal como cambios conservadores de aminoácidos o
supresiones o inserciones menores que no alteran la actividad del
péptido. La actividad de una proteína de la subunidad receptora de
los canales de calcio, particularmente un canal de tipo LVA o T, se
refiere a su capacidad para formar canales de calcio funcionales con
otras de tales subunidades. Un canal de tipo T tendrá las
propiedades discernidoras definidas en esta memoria descriptiva.
Como se usa en esta memoria descriptiva, una
concentración fisiológica de un compuesto es la que es necesaria y
suficiente para que un proceso biológico se produzca. Por ejemplo,
una concentración fisiológica de un ion selectivo de los canales de
calcio es una concentración del ion selectivo de los canales de
calcio necesaria y suficiente para proporcionar una corriente
interior cuando los canales se abren.
Como se usa en esta memoria descriptiva,
actividad de un canal de calcio se refiere al movimiento de un ion
selectivo de los canales de calcio a través de un canal de calcio.
Tal actividad se puede medir mediante cualquier proceso conocido
por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, la
medición de la cantidad de corriente que fluye a través del canal
recombinante en respuesta a un estímulo.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
"ensayo funcional" se refiere a un ensayo que identifica
canales de calcio funcionales. Así pues, un ensayo funcional, es un
ensayo que evalúa la función.
Como entienden los expertos en la técnica, los
procedimientos de ensayo para identificar los compuestos, tales
como antagonistas y agonistas, que modulan la actividad de los
canales de calcio, generalmente requieren comparación con un
control. Un tipo de una célula "control" o cultivo
"control" es una célula o cultivo que se trata sustancialmente
la misma como la célula o cultivo expuesto al compuesto de ensayo
excepto que el cultivo control no está expuesto al compuesto de
ensayo. Otro tipo de célula "control" o cultivo "control"
puede ser una célula o un cultivo de células que son idénticas a
las células transfectadas excepto que las células empleadas para el
cultivo control no expresan los canales de calcio funcionales. En
esta situación, la respuesta de la célula de ensayo al compuesto de
ensayo comparada con la respuesta (o carencia de respuesta) de la
célula negativa al compuesto de ensayo, cuando las células o
cultivos de cada tipo se exponen a sustancialmente las mismas
condiciones de reacción en presencia del compuesto que se está
ensayando. Por ejemplo, en los procedimientos que usan
procedimientos electrofisiológicos de patch clamp, la misma célula
se puede ensayar en presencia y ausencia del compuesto de ensayo,
cambiando la solución externa que baña la célula como se conoce en
la técnica.
También se entiende que cada una de las
subunidades descritas en esta memoria descriptiva se pueden
modificar realizando sustituciones conservadoras de aminoácidos y
las sustituciones modificadas resultantes se contemplan en esta
memoria descriptiva. Las sustituciones conservadoras adecuadas de
los aminoácidos las conocen los expertos en esta técnica y se
pueden realizar generalmente sin alterar la actividad biológica de
la molécula resultante. Los expertos en esta técnica reconocen que,
en general, las sustituciones únicas de aminoácidos en las regiones
no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la
actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson y col., Molecular
Biology of the Gene, edición 4ª, 1987, The Bejamin/Cummings Pub.
Co., p. 224). Dichas sustituciones se realizan preferiblemente,
aunque no exclusivamente, de acuerdo con las expuestas en la tabla
1 como sigue:
| Residuo original | Sustitución conservadora | ||
| Ala (A) | Gly; Ser | ||
| Arg (R) | Lys | ||
| Asn (N) | Gln; His | ||
| Cys (C) | Ser | ||
| Gln (Q) | Asn | ||
| Glu (E) | Asp | ||
| Gly (G) | Ala; Pro | ||
| His (H) | Asn; Gln | ||
| Ile (I) | Leu; Val | ||
| Leu (L) | Ile; Val | ||
| Lys (K) | Arg; Gln; Glu | ||
| Met (M) | Leu; Tyr; Ile | ||
| Phe (F) | Met; Leu; Tyr | ||
| Ser (S) | Thr | ||
| Thr (T) | Ser | ||
| Trp (W) | Tyr | ||
| Tyr (Y) | Trp; Phe | ||
| Val (V) | Ile; Leu |
Se pueden permitir también otras sustituciones y
se pueden determinar empíricamente o de acuerdo con sustituciones
conservadoras. Cualquiera de dichas modificaciones del polipéptido
se puede efectuar mediante cualquiera de los procedimientos
conocidos por los expertos en esta técnica., que incluyen la
mutagénesis de sitio específico o de sitio dirigido de ADN que
codifica la proteína y el uso de procedimientos de ampliación de ADN
que usan cebadores para introducir y ampliar las alteraciones en el
molde de ADN.
Como se usa en esta memoria descriptiva,
tratamiento significa cualquier manera en la que los síntomas de
una afección,, trastorno o enfermedad se mejoran o de otra manera se
alteran de manera beneficiosa. tratamiento también abarca cualquier
uso farmacéutico de las composiciones en esta memoria descriptiva,
tal como el uso como agentes anticonceptivos.
Como se usa en esta memoria descriptiva, un
trastorno mediado por los canales de calcio activados por LVA se
refiere a trastornos que están asociados a las actividades de los
canales de LVA. Los trastornos mediados por los canales de calcio
de tipo T trastornos mediados por los canales de calcio activados
por LVA que están asociados con los canales de tipo T. Tales
trastornos incluyen, pero no se limitan a: trastornos
cardiovasculares, hepáticos, endocrinos, urológicos, reproductores,
musculares, neurológicos y otros trastornos en los que los canales
de LVA, particularmente los canales de tipo T, juegan un papel o
bien en la mediación del trastorno que de alguna manera contribuye
a ello.
Como se usa en esta memoria descriptiva, la
mejora de los síntomas de un trastorno particular mediante la
administración de una composición farmacéuticamente particular se
refiere a cualquier disminución, o bien permanente o temporal,
duradera o transitoria se puede atribuir a o asociada a la
administración de la composición.
Como se usa en esta memoria descriptiva,
sustancialmente puro significa suficientemente homogéneo para
aparecer impurezas libres o fácilmente detectables como se
determina mediante procedimientos convencionales de análisis, tal
como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), usados por los
expertos en la técnica para determinar tal pureza, o suficientemente
pura de manera que la purificación adicional no alteraría de manera
detectable las propiedades físicas y químicas, tal como actividades
enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los procedimientos para
la purificación de los compuestos para producir compuestos
sustancialmente químicamente puros son conocidos por los expertos en
la técnica. Sin embargo, un compuesto sustancialmente puro puede
ser una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, la purificación
adicional puede incrementar la actividad específica del
compuesto.
Como se usa en esta memoria descriptiva, la
actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de
un compuesto o respuestas fisiológicas que se producen tras la
administración in vivo de un compuesto, composición u otra
mezcla. De esta menara la actividad biológica abarca los efectos
terapéuticos y actividad farmacéutica de tales compuestos,
composiciones y mezclas.
Se proporcionan los procedimientos para
identificar y aislar ácido nucleico (ADN y ARN) que codifica las
subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2}, \beta y \gamma,
particularmente las subunidades \alpha_{1H} LVA de los canales
de calcio de tipo humano.
La identificación y aislamiento de tal ácido
nucleico se puede llevar a cabo mediante hibridación, en condiciones
apropiadas, al menos rigurosidad, preferiblemente alta rigurosidad,
a ADN humano digerido con enzimas de restricción con una sonda
marcada que tiene al menos 16 o más nucleótidos (25, 30 o más
largos) y derivados de cualquier porción contigua de ADN que tiene
una secuencia de nucleótidos expuestos en esta memoria descriptiva
mediante el número de identificación de la secuencia. Una vez que
el fragmento de hibridación se identifica en la reacción de
hibridación, se puede clonar empleando técnicas de clonación
estándar conocidas por los expertos en la técnica. Los clones de
longitud completa se pueden identificar mediante la presencia de una
fase de lectura abierta completa y la identidad de la proteína
codificada verificada mediante comparación de secuencias con las
subunidades proporcionadas en esta memoria descriptiva y mediante
ensayos funcionales para valorar la capacidad de formación de los
canales de calcio u otra función. Este procedimiento se puede
utilizar para identificar el ADN genómico que codifica la subunidad
o ADNc que codifica las variantes de ayuste de las subunidades de
los canales de calcio de tipo humano generadas por ayuste
alternativo de la transcripción primaria del ADN de la subunidad
genómica. Por ejemplo, ADN, ADNc o ADN genómico que codifica una
subunidad de los canales de calcio se puede identificar mediante
hibridación a una sonda de ADN y caracterizarse mediante los
procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, tales como
los de mapeo de restricción y secuenciación de ADN y compararse con
el ADN proporcionado en esta memoria descriptiva con el fin de
identificar la heterogeneidad o divergencia en las secuencia de
ADN. Tales diferencias de secuencias pueden indicar que las
transcripciones a partir de los cuales se produjo ADNc se originan
de un ayuste alternativo de un transcripción primaria, si las
regiones no homólogas y homólogas se agrupan., o de un gen diferente
si las regiones no homólogas se distribuyen por todo el ADN
clonado. Las variantes de ayuste comparten regiones de 100% de
homología. Como se ha indicado en esta memoria descriptiva, el
ácido nucleico resultante se puede expresar en células y las
células resultantes ensayarse para verificar o averiguar que los
canales de calcio expresados muestran propiedades farmacológicas
y/o electrofisiológicas de los canales LVA o T.
Se puede usar cualquier procedimiento adecuado
para aislar los genes que utilizan el ADN proporcionado en esta
memoria descriptiva. Por ejemplo, los oligonucleótidos
correspondientes a las regiones de las diferencias de secuencias se
han usado para aislar, mediante hibridación, ADN que codifica la
variante de ayuste de longitud completa y se pueden usar para
aislar clones genómicos. Una sonda, a base de una secuencia de
nucleótidos descrita en esta memoria descriptiva que codifica al
menos una porción de una subunidad de un canal de calcio de tipo
humano, tal como un exón de tejido específico, se puede usar como
sonda para clonar el ADN relativo, para clonar un clon de ADNc o
clon genómico que codifica la subunidad de los canales de calcio de
tipo humano.
Se describen el marcado, incluyendo, pero no
limitado a, radiactivamente o enzimáticamente marcado, ARN o ADN de
hebra sencilla de al menos 16 bases contiguas, generalmente al menos
30 bases contiguas de un ácido nucleico que codifica al menos una
porción de una subunidad de los canales de calcio de tipo humano, la
secuencia de cuyo ácido nucleico corresponde a un segmento de una
secuencia de ácido nucleico descrito en esta memoria descriptiva
mediante la referencia a una SEC ID Nº. Tales segmentos de ácido
nucleico se pueden usar como sondas en los procedimientos
proporcionados en esta memoria descriptiva para clonar ADN que
codifica las subunidades de los canales de calcio. Véase, en
general, Sambrook y col., (1989) Molecular cloning: A Laboratory
Manual, edición 2ª, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Además, las técnicas de amplificación de ácidos
nucleicos, que se conocen bien en la técnica, se pueden usar para
localizar las variantes de ayuste de las subunidades de los canales
de calcio mediante el empleo de los oligonucleótidos a base de
secuencias de ADN circundantes de los cebadores de las secuencias
divergentes para ampliar ARN humano o ADN genómico. Las
determinaciones del tamaño y secuencia de los productos de
ampliación pueden revelar las variantes de ayuste. Además, el
aislamiento de las secuencias de ADN genómicos de tipo humano
mediante hibridación puede producir ADN que contiene múltiples
exones, separados por intrones, que corresponden a diferentes
variantes de ayuste de transcripciones que codifican las subunidades
de los canales de calcio de tipo humano.
El ADN que codifica tipos y subtipos de cada una
de las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2}, \beta y
\gamma de los canales de calcio de tipo humano dependiente de
voltaje se ha clonado en esta memoria descriptiva mediante la
ampliación de ácido nucleico de ADNc de tejidos seleccionados o
mediante la selección de genotecas de ADNc de tipo humano
preparadas a partir de poli A+ ARNm aislado de líneas celulares o
tejido de origen humano tal como los canales de calcio. Entre las
fuentes de dichas células o tejido para obtener ARNm están el
tejido de cerebro humano o una línea celular humana de origen
neural, tal como una línea celular de neuroblastoma, músculo
esquelético humano o células de músculo liso y similares. Los
procedimientos para preparar bibliotecas de ADNc se conocen bien en
la técnica (véase en general Ausubel y col. (1987) Current Protocols
in Molecular Biology, Wiley - Interscience, Nueva York; y Davis y
col., (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science
Publishing Co., Nueva York).
Las regiones preferidas a partir de las cuales
se construyen sondas incluyen las secuencias codificadoras de 5'
y/o 3', las secuencias pronosticadas para codificar dominios
transmembrana, secuencias pronosticadas para codificar bucles
citoplásmicos, secuencias señal, sitios de unión a ligandos y otras
secuencias funcionalmente significativas (véase la tabla más
adelante). Tanto el ADN que codifica la subunidad de longitud
completa como los fragmentos del mismo se pueden usar como sondas,
preferiblemente marcado por medios de marcaje adecuados para la
pronta detección. Cuando los fragmentos se usan como sondas,
preferiblemente las secuencias de ADN serán típicamente de la
porción que codifica el extremo carboxi del ADN y más
preferiblemente incluirá porciones que codifican los dominios
transmembrana pronosticados a base de análisis hidropáticos de la
secuencia de aminoácidos deducida [véase, por ejemplo, Kyte y
Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 167: 105].
Se han preparado las ribosondas que son
específicas para los tipos o subtipos de las subunidades de los
canales de calcio de tipo humano. Estas sondas son útiles para
identificar la expresión de las subunidades particulares en tejidos
y células seleccionadas. Las regiones a partir de las cuales se
preparan las sondas se identificaron comparando el ADN y las
secuencias de aminoácidos de todos los subtipos de las subunidades
\alpha o \beta conocidas. Se seleccionaron las regiones de
menor homología, preferiblemente las secuencias derivadas de tipo
humano y generalmente aproximadamente 250 a aproximadamente 600
nucleótidos. Se han preparado numerosas ribosondas para las
subunidades \alpha o \beta; algunas de éstas se enumeran en la
siguiente tabla.
Para las sondas específicas de \alpha_{1H}
(y también anticuerpos), se pueden usar las regiones únicas a las
subunidades \alpha_{1H}, tales como los bucles intracelulares
extendidos presentes en estos canales. Para los anticuerpos
específicos de \alpha_{1H-1} la región presente
en \alpha_{1H-1} y ausente de
\alpha_{1H-2} puede ser útil para el propósito
de la preparación de las sondas específicas de la subunidad.
De este modo los clones de ADN y fragmentos de
los mismos proporcionados en esta memoria descriptiva se pueden
usar para aislar clones genómicos que codifican cada subunidad y
aislar cualquier variante de ayuste mediante la selección de
hibridación de genotecas preparadas a partir de diferentes tejidos
humanos. Las técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos, que
se conocen bien en la técnica, también se pueden usar para localizar
el ADN que codifica las variantes de ayuste de las subunidades de
los canales de calcio de tipo humano. Esto se lleva acabo mediante
el empleo de oligonucleótidos a base de secuencias de ADN que rodean
la(s) secuencia(s) divergente(s) como cebadores
para amplificar ARN humano o ADN genómico. Las determinaciones del
tamaño y secuencia de los productos de amplificación pueden revelar
la existencia de variantes de ayuste. Además, el aislamiento de
secuencias de ADN genómico humano mediante hibridación puede
producir ADN que contiene múltiples exones, separados por intrones,
que corresponden a diferentes variantes de ayuste de transcripciones
que codifican las subunidades de los canales de calcio de tipo
humano.
Una vez que se aísla el ADN que codifica una
subunidad de los canales de calcio se pueden emplear los ensayos de
protección de ribonucleasa (ARNasa) para determinar qué tejidos
expresan el ARNm que codifica una subunidad o una variante de los
canales de calcio particular. Estos ensayos proporcionan un medio
sensible para detectar y cuantificar una especie de ARN en una
mezcla de complejos del ARN total celular. El ADN de la subunidad
se marca y se hibridiza con ARN celular. Si está presente ARNm
complementario en el ARN celular, se produce un híbrido ADN - ARN.
Después la muestra de ARN se trata con ARNasa, que se degrada a ARN
de hebra sencilla. Cualesquiera de los híbridos ARN - ADN se
protege de la degradación con ARNasa y se puede visualizar mediante
electroforesis en gel y autorradiografía. Las técnicas de
hibridación in situ se pueden también usar para determinar
qué tejidos expresan ARNm que codifica una subunidad de los canales
de calcio particular. Los clones de ADN que codifican las
subunidades marcadas se hibridan con diferentes ayustes de tejidos
diferentes para visualizar la expresión de ARNm de las
subunidades.
Con respecto a cada una de las subunidades
(\alpha_{1}, \alpha_{2}, \beta o \gamma) de los canales
de calcio de tipo humano, una vez que se ha identificado el ADN que
codifica la subunidad de los canales mediante un procedimiento de
selección de ácidos nucleicos, se usó el clon aislado para selección
adicional con el fin de identificar los clones de superposición.
Algunos de los fragmentos de ADN clonados pueden y se han clonado
en un vector apropiado tal como pIBI24/25 (IBI, New Haven, CT),
M13mp18/19, pGEM4, pGEM3, pGEM 7Z, pSP72 y otro de tales vectores
conocidos por los expertos en esta técnica y caracterizados por
secuenciación de ADN y mapeo con enzimas de restricción. De este
modo una serie secuencial de clones superpuestos se pueden generar
para cada una de las subunidades hasta que se pueda preparar un clon
de longitud completa mediante procedimientos conocidos por los
expertos en la técnica, que incluye la identificación de los codones
de iniciación de la traducción (comienzo) y terminación de la
traducción (parada). Para la expresión del ADN clonado, la región
no codificadora en 5' y otras regiones de control de transcripción y
traducción de dicho clon se pueden reemplazar con un sitio de unión
al ribosoma eficaz y otras regiones reguladoras como se conoce en la
técnica. Si se considera necesario se pueden efectuar otras
modificaciones del extremo 5', conocidas por los expertos en la
técnica, que también se pueden requerir para optimizar la eficacia
de la traducción y la transcripción.
Los ejemplos 1-3 más adelante,
describen en detalle la clonación de ADN que codifica las variantes
de ayuste \alpha_{1H} y propiedades electrofisiológicas y
farmacológicas de las mismas. Excepto cuando se indique, los
procedimientos de expresión y otros datos se describen con
referencia al ácido nucleico que codifica
\alpha_{1H-1}. Se entiende que los
procedimientos ejemplificados se pueden usar para aislar variantes
de ayuste adicionales y subunidades relacionadas de seres humanos y
otros mamíferos y animales y también se pueden usar para expresar
tal ácido nucleico para producir células para uso en la selección de
ensayos para identificar compuestos que modulan la actividad de los
canales activados de LVA, particularmente los canales de tipo T. El
ácido nucleico también se puede usar en ensayos de diagnóstico para
identificar mutaciones y para producir proteínas y después
anticuerpos para uso como reactivos en ensayos de diagnóstico para
trastornos asociados a las actividades de los canales de calcio de
tipo T.
Se proporcionan en esta memoria descriptiva el
ácido nucleico que codifica las subunidades \alpha_{1} que
forman los canales LVA. El ácido nucleico proporcionado en esta
memoria descriptiva también se puede usar para aislar canales
relacionados a partir de otros tejidos, y otros mamíferos y
animales.
Los canales de calcio que contienen
\alpha_{1H} deben mostrar propiedades que difieren de los
canales HVA conocidos, formados a partir de las subunidades de los
canales de calcio \alpha_{1A}-\alpha_{1E}.
Tales diferencias pueden incluir activación por baja tensión,
inactivación dependiente de la tensión, sensibilidad relativamente
alta a mibefradil y resistencia relativamente alta a las toxinas de
caracol y arácnidos que muestran la mayoría de los canales HVA (por
ejemplo toxinas del veneno de arañas
\omega-AgaIIIA y \omega-AgaIVA
y la toxina del caracol Conos GVIA. Además las subunidades
\alpha_{1H} se pueden identificar mediante homología con otras
subunidades \alpha_{1} y adicionalmente mediante la presencia de
un bucle intracelular extendido en la subunidad codificada (véase,
por ejemplo, SEQ ID Nº 12, nucleótidos 1506-2627)
localizada entre los dominios trnasmembrana I y II. esta región en
\alpha_{1H} se extiende comparada con otras subunidades
\alpha_{1} de los canales de calcio, tales como
\alpha_{1A}-\alpha_{1E}.
El ADN que codifica una subunidad
\alpha_{1H} se puede aislar usando el ADN proporcionado en esta
memoria descriptiva. En particular, las sondas de al menos
aproximadamente 16 nucleótidos o 30 nucleótidos u otra longitud
adecuada, tal como 30, 100 etc. bases, se pueden usar para
seleccionar genotecas seleccionadas, incluyendo genotecas de ADN de
mamífero. Las genotecas seleccionadas se preparan preferiblemente a
partir de tejido de mamífero o fuentes celulares conocidas por
expresar los canales de tipo T. La secuencia de la sonda se basa
preferiblemente en la secuencia del bucle intracelular localizado
entre los dominios transmembrana I y II (véase, por ejemplo, las
SEQ ID Números 12 y 15).
El ADN que codifica la subunidad \alpha_{1H}
se aisló mediante la amplificación de una región de genes que
codifican una subunidad \alpha_{1} expresada en una línea
celular de carcinoma de tiroides humano (células TT) usando
cebadores de oligonucleótidos degenerados.
La línea celular TT se deriva de un carcinoma de
tiroides medular humano y se ha usado para estudiar la secreción de
calcitonina y expresión de genes (deBustros y col., (1986) J. Biol.
Chem. 261: 8036-8041; deBustros y col 1990 Mol.
Cell. Biol. 10: 1773-1778). Los registros de células
enteras de estas células revelan que solamente los canales de
calcio controlados por tensión expresados mediante estas células
están activados por bajo voltaje, inactivando rápidamente y
desactivando lentamente, que son propiedades biofísicas consistentes
con un canal de tipo T.
Una parte de uno de los clones positivos se usó
para seleccionar además una genoteca de ADNc de carcinoma de
tiroides para identificar clones de superposición que se extienden
sobre la longitud entera de la secuencia de nucleótidos que
codifican la subunidad \alpha_{1H} humana. Un clon de ADN de
\alpha_{1H} de longitud completa se puede construir mediante
partes de ligación de los clones de ADNc parcial como se describe en
el ejemplo 1. La SEQ ID Nº 15 establece la secuencia de nucleótidos
de un clon que codifica una subunidad
\alpha_{1H-1} así como la secuencia de
aminoácidos deducida.
Se detectaron dos variantes de ayuste
\alpha_{1H-1} y
\alpha_{1H-2}, mediante RT - PCR (ampliación de
transcriptasa inversa) usando ARN de tejidos múltiples. La isoforma
\alpha_{1H-2} (SEQ ID Nº 16) contiene una
supresión de 957 nucleótidos, con relación a
\alpha_{1H-1} (SEQ ID números 12 y 15) en el
bucle intracelular, es decir nt 1506 a nt 2627 de la SEQ ID nº
12).
La subunidad \alpha_{1H-1}
muestra notables diferencias de secuencia, así como ciertas
similitudes estructurales a las subunidades \alpha_{1}
previamente clonadas. Notablemente, la secuencia de aminoácidos
deducida de \alpha_{1H-1} comparte menos de un
30% de identidad de secuencia global con los ácidos nucleicos que
codifican \alpha_{1A}-\alpha_{1E} humanas,
que codifican los canales de calcio activados por alta tensión. El
análisis de transferencia Northern indica que las transcripciones
del ARNm para \alpha_{1H} se expresan en el cerebro,
principalmente en la amígdala, núcleo caudal y putamen,
principalmente en el hígado, riñón y corazón.
Específicamente, una comparación del asido
nucleico y secuencias de aminoácidos deducidos de esta subunidad de
los canales de calcio \alpha_{1H} con otras subunidades
\alpha_{1} humanas revela varias características distintas.
Existen notables diferencias entre las secuencias de \alpha_{1H}
y \alpha_{1} HVA. Primero, el bucle intracelular entre los
dominios I y II transmembrana es notablemente más largo. Como se
ejemplifica en la SEQ ID Nº 12, el bucle intracelular de la
subunidad \alpha_{1H} humana es 1.122 nt de longitud mientras
que los bucles intracelulares correspondientes en las otras
subunidades \alpha_{1H} humanas descritas en esta memoria
descriptiva varían entre 351 y 381 nt de longitud. De este modo, el
bucle intracelular de \alpha_{1H} humana es aproximadamente 250
aminoácidos más largo que las subunidades \alpha_{1H} humanas
encontradas en los canales de calcio HVA. La secuencia de
aminoácidos deducida de esta región (aa 420 a aa 794 de la SEQ ID
Nº 12) contiene un número mayor de resto de prolina e incluye una
región poli - HIS de 9 restos histidina contiguos (aa 52 a aa 528
de la SEQ ID Nº 12) y una región donde 8 de 10 restos son alanina.
El bucle intracelular grande localizado entre los dominios
transmembrana I y II parece los bucles intracelulares grandes
encontrados en una localización correspondiente en las subunidades
\alpha de los canales de sodio alguna de las cuales pueden
funcionar como hormonas. Se ha propuesto que los canales de tipo T
tienen una actividad que es un híbrido entre los canales de calcio
HVA y canales de sodio. Las subunidades \alpha_{1H}
proporcionadas en esta memoria descriptiva también pueden funcionar
como canales de sodio.
Segundo, la subunidad \alpha_{1H} humana
aislada carece de restos de aminoácidos que se sabe generalmente
que son críticos (por ejemplo, véase De Warrd y col., (1996) FEBS
Letters 380: 272-276; Pragnell y col., (1994)
Nature 368: 67-70) para la interacción entre las
subunidades \alpha_{1} y las subunidades \beta. Existen al
menos trece restos localizados en este bucle intracelular entre los
dominios transmembrana I y II que forman un motivo que está
altamente conservado entre las subunidades \alpha_{1}, tales
como \alpha_{1A}-\alpha_{1E} descritas en
esta memoria descriptiva (véase también Pragnell y col., (1994)
Nature 368: 67-70). En particular, este bucle
carece del dominio de interacción \alpha_{1} (AID) implicado en
al unión de la subunidad \beta. También ausente de esta región es
el motivo de unión G\beta\gamma, GlnXXGluArg, originalmente
identificado en la adenilil ciclasa 2 y encontrado en las
subunidades de tipo no L, HVA \alpha_{1}. Sin embargo se
produce una secuencia idéntica dentro del bucle intracelular
II-III de la secuencia \alpha_{1H}, que sugiere
una posible interacción de G\beta\gamma en esta región. La
subunidad \alpha_{1H} también contiene diferencias en los
determinantes de selectividad de ion encontrada en los engarces
S5-S6 de los canales HVA. En los bucles de poros
S5-S6 del dominio III y IV, los restos glutamato que
juegan un papel crítico en la selectividad de Ca^{2+} y
permeación de iones se reemplazan por restos aspartato.
Tercero, la subunidad \alpha_{1H} humana
tiene otro bucle extracelular notablemente largo en el dominio I
localizado entre IS5 e IS6. Este bucle extracelular varía entre 249
a 270 restos de nucleótidos en otras subunidades \alpha_{1}
humanas mientras que la subunidad \alpha_{1H} humana tiene 426
restos de nucleótidos. Otras características discernidoras se
pueden averiguar y de ha averiguado que mediante la expresión de la
subunidad en las células como se ha descrito en esta memoria
descriptiva.
El ácido nucleico que codifica la subunidad
\alpha_{1H} se puede usar para seleccionar genotecas apropiadas,
particularmente genotecas de mamíferos, y mas particularmente
genotecas de mamíferos de tejidos o células que muestran la
actividad de los canales de tipo T. La subunidad codificada se puede
identificar por las propiedades discernidoras indicadas
anteriormente. Las sondas de ácido nucleico del clon que codifica
\alpha_{1H-1} se usó para identificar y aislar
clones que
codifican una segunda variante, denominada \alpha_{1H-2}, que tiene una supresión de 957 pares de bases con relación a \alpha_{1H-1}.
codifican una segunda variante, denominada \alpha_{1H-2}, que tiene una supresión de 957 pares de bases con relación a \alpha_{1H-1}.
La subunidad \alpha_{1H} forma un canal
funcional en dos sistemas de expresión diferentes sin la adición de
las subunidades \alpha_{2}\delta y \beta. La ausencia de un
sitio de interacción de la subunidad \beta dentro del bucle
I-II de la secuencia de \alpha_{1H} es
consistente con la reseña de que la supresión de la subunidad
\beta con oligonucleótidos de sentido contrario en los ganglios
nudosos no tiene efecto sobre las corrientes de tipo T en esa
región. Además, ninguna de las subunidades \beta conocidas en las
células HEK293 se detectó mediante análisis de Western usando
antisueros específicos de la subunidad \beta, indicando que las
subunidades \beta clonadas anteriormente pueden no jugar un papel
en la formación de canales de Ca^{2+} LVA que contienen
\alpha_{1H}. Los ovocitos y células HEK293 expresan una
subunidad \alpha_{2}\delta y que las células TT, la fuente de
las subunidades \alpha_{1H} descritas en este documento,
expresan cantidades relativamente altas de la proteína
\alpha_{2}\delta. Por consiguiente, es posible que los
canales que contienen \alpha_{1H} expresados, contengan la
subunidad \alpha_{2}\delta, y que la subunidad
\alpha_{2}\delta es un componente de los canales de calcio que
contienen \alpha_{1H} nativa.
Transferencias de Northern que contienen ARNm
humano de varios tejidos neuronales y no neuronales se sondaron con
fragmentos marcados generados a partir del ADNc de \alpha_{1H}
de longitud completa. Una única transcripción de \sim8,5 kb está
presente en todos los tejidos examinados, que incluyen corazón,
cerebro, placenta, pulmón, músculo esquelético, riñón, páncreas.
Los tejidos neuronales incluían cerebelo, córtex cerebral, médula,
médula espinal, lóbulo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal,
putamen, amígdala, núcleo caudal, cuerpo calloso, hipocampo,
sustancia nigra, núcleo subtalámico y tálamo. En los tejidos no
neuronales, los niveles de expresión más altos se encuentran en el
riñón,
hígado, y corazón. En el cerebro, la transcripción de \alpha_{1H} es la más abundante en la amígdala, núcleo caudal, y putamen.
hígado, y corazón. En el cerebro, la transcripción de \alpha_{1H} es la más abundante en la amígdala, núcleo caudal, y putamen.
El ADN que codifica las subunidades
\alpha_{1} adicionales se pueden aislar e identificar usando el
ADN proporcionado en esta memoria descriptiva como se describe para
las subunidades \alpha_{1A}, \alpha_{1B}, \alpha_{1C},
\alpha_{1D}, \alpha_{1E} y \alpha_{1H} o usando otros
procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. En
particular, el ADN proporcionado en esta memoria descriptiva se
puede usar para seleccionar genotecas adecuadas para aislar el ADN
relacionado. Los clones de longitud completa se pueden construir
usando procedimientos, tales como los descritos en esta memoria
descriptiva y las subunidades resultantes caracterizadas por
comparación de sus secuencias y las propiedades electrofisiológicas
y farmacológicas con las subunidades ejemplificadas en esta memoria
descriptiva.
Un número de genes de la subunidad
\alpha_{1} de los canales de calcio dependiente de la tensión,
que se expresan en el SNC y otros tejidos, se han identificado y se
han denominado \alpha_{1A}, \alpha_{1B} (o VDCC IV),
\alpha_{1C} (o VDCC II), \alpha_{1D} (o VDCC III),
\alpha_{1E} y \alpha_{1H}. Se ha aislado el ADN, aislado de
genotecas de ADN que codifica cada una de los tipos de las
subunidades. También se proporciona el ADN que codifica cada uno de
los tipos que aparecen como variantes de ayuste. Los subtipos se
designan en esta memoria descriptiva, por ejemplo, como
\alpha_{1B-1},
\alpha_{1B-2}. La subunidad \alpha_{1H} es
de particular interés en esta memoria descriptiva.
Los tipos de la subunidad \alpha_{1} A, B,
C, D, E y F de los canales de calcio dependientes de la tensión, y
subtipos de los mismos, se diferencian con respecto a la
sensibilidad a las clases conocidas de los agonistas y antagonistas
de los canales de calcio, tales como los DHP, las fenilalquilaminas,
la conotoxina omega (\omega-CgTx), la
\omega-agatoxina IV de la araña de tela en embudo
y las pirazonoilguanidinas y o en otras propiedades físicas y
estructurales. Estos tipos de subunidad también parece que difieren
en el potencial de mantenimiento y en la cinética de corrientes
producidas tras la despolarización de las membranas celulares que
contienen canales de calcio que incluyen tipos diferentes de las
subunidades \alpha_{1}.
Se proporciona el ADN que codifica una subunidad
\alpha_{1} que se une a al menos un compuesto seleccionado de
entre dihidropiridinas, fenilalquilaminas,
\omega-CgTx, componentes de la toxina de la araña
de tela en embudo y pirazonoilguanidinas. Por ejemplo, la subunidad
\alpha_{1B} proporcionada en esta memoria descriptiva parece
interactuar específicamente con \omega-CgTx en los
canales de tipo N y la subunidad \alpha_{1D} proporcionada en
esta memoria descriptiva interactúa específicamente con los DHP en
los canales de tipo L.
Los anticuerpos, monoclonales o policlonales,
específicos de los subtipos de las subunidades de de los canales de
calcio o para los tipos de los canales de calcio se pueden preparar
empleando técnicas estándar, conocidas por los expertos en la
técnica, que usan las proteínas de las subunidades o porciones de
las mismas como antígenos. Se pueden usar los anticuerpos de la las
proteínas antipéptido y antifusión (véase, por ejemplo, Bahouth y
col., (1991) Trends Pharmacol. Sci. 12: 338-343;
Current Protocols in Molecular Bilogy (Ausubel y col., eds.) John
Wiley y Sons, Nueva York (1984)). Los factores a considerar en la
selección de las porciones de las subunidades de los canales de
calcio para uso como inmunógenos (o bien en forma de un péptido
sintético o en forma de una proteína de fusión bacteriana producida
por recombinación) incluyen la accesibilidad antigénica (es decir,
dominios extracelulares y citoplásmicos), singularidad a la
subunidad particular y otros factores conocidos por los expertos en
esta técnica. Los anticuerpos tienen usos terapéuticos y también uso
en ensayos de diagnóstico.
La disponibilidad de los anticuerpos específicos
de las subunidades hace posible la aplicación de la técnica de
inmunohistoquímica para controlar la distribución y la densidad de
la expresión de diversas subunidades (por ejemplo, en tejido de
cerebro normal frente a enfermo). Dichos anticuerpos se podrían
también emplear en diagnostico, tales como la diagnosis LES y
aplicaciones terapéuticas, tales como usando los anticuerpos que
modulan las actividades de los canales de calcio.
Los anticuerpos se pueden administrar a un
sujeto empleando procedimientos convencionales, tales como por
ejemplo, mediante inyección intraperitoneal, intramuscular,
intravenosa o subcutánea, implante o formas transdérmicas de
administración y los similares. Un experto en la técnica puede
determinar empíricamente las formas de dosis, regímenes de
tratamiento, etc., dependiendo de la forma de administración
empleada.
Se han preparado los anticuerpos monoclonales
específicos de subunidades y antisueros policlonales. Las regiones
de las que los antígenos venían se identificaron comparando las
secuencias del ADN y de aminoácidos de todos los subtipos de las
subunidades \alpha o \beta conocidas. Se seleccionaron las
regiones de menos homología, preferiblemente las secuencias
derivadas de seres humanos. Las regiones o proteínas de fusión
seleccionadas que contenían las regiones seleccionadas se
utilizaron como inmunógenos. También se realizaron los análisis de
hidrofobicidad de los residuos en las regiones proteicas
seleccionadas y proteínas de fusión; se evitan las regiones de alta
hidrofobicidad. También, y más importante, cuando se preparan las
proteínas de fusión en hospedadores bacterianos, se evitan los
codones raros. En particular, se evita la inclusión de 3 o más
codones raros sucesivos en un hospedador seleccionado. Se han
preparado numerosos anticuerpos, policlonales y monoclonales,
específicos para los tipos o subtipos de las subunidades \alpha o
\beta; algunos de éstos se enumeran en la tabla siguiente. Los
ejemplos de anticuerpos ejemplares y antígenos de péptidos usados
para preparar los anticuerpos se exponen en la siguiente tabla:
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas de fusión de GST son cada una
específica para la región de bucle citoplásmica
IIS6-IIS1, que es una región de homología de
subtipos baja para todos los subtipos, incluyendo \alpha_{1C} y
\alpha_{1D}, para las que se preparan fusiones similares y
antisueros.
Usando procedimientos similares, se pueden
preparar los anticuerpos específicos para las subunidades de LVA,
particularmente las subunidades \alpha_{1H} proporcionadas en
esta memoria descriptiva, usando, por ejemplo, bucles
intracelulares extendidos. Tales anticuerpos tendrán uso en ensayos
de diagnóstico para trastornos en los que están implicados canales
de calcio LVA.
El ADN que codifica una o más de las subunidades
de los canales de calcio o una porción de una subunidad de los
canales de calcio se puede introducir en una célula hospedadora para
la expresión o replicación del ADN. Dicho ADN se puede introducir
usando los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos o
usando los procedimientos bien conocidos por los expertos en la
técnica. Se conoce bien en la técnica la incorporación de ADN
clonado en un vector de expresión adecuado, la transfección de
células eucarióticas con un vector de plásmidos o una combinación
de vectores de plásmidos, que codifican cada uno de ellos uno o más
genes distintos o con ADN lineal, y la selección de células
transfectadas [véase por ejemplo, Sambrook y col., (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición,
Cold Spring Harbor Laboratiry Press).
El ácido nucleico clonado de longitud completa
que codifica cualquiera de las subunidades de un canal de calcio de
tipo humano se puede introducir en un vector plásmido para la
expresión en una célula eucariótica. Dicho ADN puede ser ADN o ADNc
o ARN genómico. Actualmente las células preferidas son aquellas que
contienen ADN heterólogo que codifica la subunidad \alpha_{1H}.
Las células huéspedes se pueden transfectar con uno o una
combinación de los plásmidos, cada uno de los cuales codifica al
menos una subunidad de los canales de calcio. Como alternativa, las
células hospedadoras se pueden transfectar con ADN lineal utilizando
procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Mientras que el ADN proporcionado en esta
memoria descriptiva se puede expresar en cualquier célula
eucariótica, incluyendo las células de levaduras tales como P.
pastoris [véase, por ejemplo, Cregg y col., (1987)
Bio/Technology 5: 479], se prefieren los sistemas de expresión de
mamíferos para la expresión del ADN que codifica las subunidades de
los canales de calcio de tipo humano proporcionado en esta memoria
descriptiva.
El ADN heterólogo se puede introducir mediante
cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica,
tal como transfección con un vector que codifica el ADN heterólogo.
Los vectores particularmente preferidos para la transfección de
células de mamíferos son los vectores de expresión pSV2dhfr, que
contienen el promotor temprano SV40, gen dhfr de ratón, sitios de
poliadenilación y ayuste y las secuencias necesarias para mantener
el vector en las bacterias, vectores a base de promotores de
citomegalovirus (abreviadamente CNV) tales como pCDNA1, o
pcDNA-amp y vectores a base de promotores de MMTV.
El vector ocDNA1 es un vector de expresión eucariótico que contiene
un promotor de citomegalovirus (CMV) que es un promotor constitutivo
reconocido por la ARN polimerasa II de células huéspedes de
mamífero. El ADN que codifica las subunidades de los canales de
calcio de tipo humano se han insertado en el vector pCDNA 1 en una
porción inmediatamente siguiente al promotor de CMV. Actualmente se
prefiere el vector pCDNA1 y se ha usado para expresar las
subunidades \alpha_{1H} en células de mamífero.
Las células de mamíferos transfectadas temporal
o establemente se pueden preparar mediante procedimientos conocidos
en la técnica transfectando las células con un vector de expresión
que tiene un gen marcador seleccionable tal como el gen para
timidinaquinasa, dihidrofolatorreductasa, resistencia a la neomicina
o los similares y, para transfección temporal, desarrollando las
células transfectadas en condiciones selectivas para las células
que expresan el gen marcador. Los canales de calcio funcionales
dependientes de la tensión se han producido en las células HEK 293
transfectadas con un derivado del vector pCDNA1 que contiene el ADN
que codifica una subunidad de los canales de calcio de tipo
humano.
El ADN heterólogo se puede mantener en las
células como un elemento episomal o se pueden integrar en ADN
cromosómico de la célula. Después las células recombinantes
resultantes se pueden cultivar o subcultivar (o multiplicadas por
cultivo, en el caso de células de mamíferos) a partir de dicho
cultivo o un subcultivo del mismo. Los procedimientos para la
transfección, inyección y cultivo de células recombinantes los
conocen bien los expertos en la técnica. Las células eucarióticas
en las que se puede introducir ADN o ARN incluyen todas las células
que se pueden transfectar mediante dichos ADN o ARNo en las que
dicho ADN se puede inyectar. Virtualmente cualquier célula
eucariótica puede servir como vehículo para el ADN heterólogo. Las
células preferidas son las que también pueden expresar en ADN y ARN
y las células más preferidas son las que pueden formar canales de
calcio recombinantes o heterólogos que incluyen una o más
subunidades codificadas por el ADN heterólogo. Dichas células se
pueden identificar empíricamente o seleccionarse de entre las
conocidas que son fácilmente transfectadas o inyectadas. Las
células preferidas para introducir ADN incluyen las que se pueden
transfectar temporal o establemente e incluyen, pero no se limitan
a, las células de origen mamífero, tales como las células COS,
células L de ratón, células CHO, células de riñón embrionario de
tipo humano, células de mono verde africano y otras de dichas
células conocidas por los expertos en la técnica, células de
anfibios, tales como ovocitos de Xenopus lavéis o las de
levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia
pastoris. Las células preferidas para expresar transcripciones
de ARN inyectado o cDNA incluyen ovocitos de Xenopus lavéis.
Las células que se prefieren para la trasnfección de ADN son las
que se pueden transfectar fácil y eficazmente. Dichas células las
conocen los expertos en la técnica o se pueden identificar
empíricamente. Las células preferidas incluyen células DG44 y
células HEK 293, particularmente las células HEK 293 que se pueden
congelar en nitrógeno líquido y después descongelarse y volverse a
desarrollar. Dichas células HEK 293 se describen, por ejemplo en la
patente de Estados Unidos Nº 5.024.939 de Gorman [véase también
Stillman y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:
2051-2060].
Las células se pueden usar como vehículos para
replicar ADN heterólogo introducido en ellas o para expresar o para
expresar el ADN introducido en ellas. En ciertas realizaciones, las
células se usan como vehículos para expresar el ADN heterólogo como
medio para producir sustancialmente subunidades de los canales de
calcio de tipo humano o los canales de calcio heterólogos. Las
células hospedadoras que contienen el ADN heterólogo se pueden
cultivar en condiciones en las que se expresan los canales de
calcio. Las subunidades de los canales de calcio se pueden
purificar usando los procedimientos de de purificación de proteínas
conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo se pueden
usar, los anticuerpos, tales como los proporcionados en esta
memoria descriptiva, que se unen específicamente a uno o más de las
subunidades para purificación de afinidad de la subunidad o los
canales de calcio que contienen las subunidades.
Sustancialmente se proporcionan las subunidades
puras de las subunidades \alpha_{1} de los canales de calcio de
un canal de calcio de tipo humano, las subunidades \alpha_{2} de
los canales de calcio de un canal de calcio de tipo humano y las
subunidades \beta de los canales de calcio de un canal de calcio
de tipo humano y subunidades \gamma de un canal de calcio de tipo
humano. Sustancialmente también se proporcionan los canales de
calcio puros aislados que contienen al menos una de las subunidades
de los canales de calcio de tipo humano. Sustancialmente también se
proporcionan los canales de calcio puros que contienen una mezcla
de una o más subunidades codificadas por la células hospedadora y
una o más subunidades codificadas por ADN o ARN heterólogos que se
han introducido en la célula. Sustancialmente también se
proporcionan los canales de calcio de un tipo específico de
tejido.
En una realización, se proporcionan las células
eucarióticas que contienen ADN heterólogo que codifica al menos una
subunidad \alpha_{1H} de un canal de calcio que expresa la
subunidad \alpha_{1H} y forman canales de calcio que contienen
\alpha_{1H} de tipo humano homomérica funcional. Estas células
se pueden usar para seleccionar los compuestos que modulan la
actividad de los canales de tipo T y canales de calcio de tipo
LVA.
En otra realización, se proporcionan las células
eucarióticas que contienen ADN heterólogo que codifica al menos una
subunidad \alpha_{1H} de un canal de calcio de tipo humano, una
subunidad \alpha_{2} de un canal de calcio de tipo humano, una
subunidad \beta de un canal de calcio de tipo humano y una
subunidad \gamma de un canal de calcio de tipo humano. De acuerdo
con una realización preferida, el ADN heterólogo se expresa en la
célula eucariótica y codifica preferentemente una subunidad
\alpha_{1H} de los canales de calcio de tipo humano.
El ADN que codifica la subunidad
\alpha_{1H-1} se expresó de manera transitoria
en células HEK203 y se asoció con la expresión de una proteína
\alpha_{1H-1} de aproximadamente 260 kDa
\alpha_{1H-1}, como se identifica por análisis
SDS - PAGE/transferencia de Western.
Las corrientes de Ba^{2+} o Ca^{2+}
registradas de las células HEK293 que expresan transitoriamente los
canales \alpha_{1H-1}, y se encontró que
mostraban propiedades biofísicas y farmacológicas características
de corrientes de canales de calcio activadas por baja tensión, es
decir, de tipo T. Se obtuvieron resultados similares en ovocitos de
Xenopus que expresan \alpha_{1H-1}.
Los expertos en la técnica conocen los
procedimientos electrofisiológicos para medir la actividad de los
canales de calcio y se ejemplifican en esta memoria descriptiva.
Cualquiera de dichos procedimientos se puede usar con el fin de
detectar la formación de canales de calcio funcionales y
caracterizar la cinética y otras características de las corrientes
resultantes. Los estudios farmacológicos se pueden combinar con las
mediciones electrofisiológicas con el fin de caracterizar
posteriormente los canales de calcio.
Con respecto a las mediciones de la actividad de
los canales de calcio heterólogos funcionales, preferiblemente, la
actividad de los canales iónicos endógenos y, si se desea, la
actividad de los canales heterólogos de los canales que no
contienen las subunidades deseadas de una célula hospedadora se
pueden inhibir en un grado significativo mediante medios químicos,
farmacológicos y electrofisiológicos, que incluyen el uso del
potencial de mantenimiento diferencial para incrementar la relación
S/R (señal/ruido) de la actividad medida de los canales de calcio
heterólogos.
De este modo, las diversas combinaciones de las
subunidades codificadas por el ARN proporcionado en esta memoria
descriptiva se introducen en las células eucarióticas. Las células
resultantes se pueden examinar para averiguar si los canales
funcionales se expresan y para determinar las propiedades de los
canales. En los aspectos particularmente preferidos, la célula
eucariótica que contiene el ARN heterólogo los expresa y forma una
actividad de los canales de calcio funcionales recombinantes. En
los aspectos más preferidos, la actividad de los canales de calcio
recombinantes se detecta fácilmente debido a que es un tipo que no
está en la célula hospedadora no transfectada o es de una magnitud
y/o propiedades farmacológicas o exhibe propiedades biofísicas no
mostradas en la célula no transfectada.
Las células eucarióticas se pueden transfectar
con diversas combinaciones de los subtipos de subunidades
proporcionadas en esta memoria descriptiva. Las células resultantes
proporcionaran una población uniforme de los canales de calcio para
estudio de la actividad de los canales de calcio y para uso en los
ensayos de análisis de fármacos proporcionados en esta memoria
descriptiva. Los experimentos que se han realizado han demostrado la
inadecuación de los esquemas de clasificación anteriores.
Entre las células transfectadas preferidas está
una célula eucariótica recombinante con un canal de calcio
heterólogo funcional. La célula recombinante se puede producir
mediante la introducción expresión de transcripciones de ARN o ARN
heterólogos que codifican una subunidad \alpha_{1} de de un
canal de calcio de tipo humano, más preferiblemente expresando
también un ARN heterólogo que codifica una subunidad \beta de un
canal de calcio de tipo humano y/o ARN heterólogo que codifica una
subunidad \alpha_{2} de un canal de calcio de tipo humano. Se
prefiere especialmente la expresión en dicha célula recombinante de
cada una de las subunidades \alpha_{1H}, \beta y
\alpha_{2} codificadas por dichas transcripciones de ARN o ARN
heterólogos, y opcionalmente la expresión de la transcripción de
ADN o ARN heterólogos que codifican una subunidad \gamma de un
canal de calcio de tipo humano. Los canales de calcio funcionales
preferiblemente pueden incluir al menos una subunidad
\alpha_{1H} y una subunidad \beta de un canal de calcio de
tipo humano. Las células eucarióticas que expresan estas dos
subunidades y también las células que expresan subunidades
adicionales se han preparado mediante transfección de ADN y
mediante inyección de transcripciones de ARN. Dichas células han
exhibido la actividad de los canales de calcio dependientes de
tensión atribuibles a los canales de calcio que contienen una o más
de las subunidades de los canales de calcio heterólogos de tipo
humano. Por ejemplo, las células eucarióticas que expresan los
canales de calcio heterólogos conteniendo una subunidad
\alpha_{2} además de la subunidad \alpha_{1} y una
subunidad \beta han mostrado que exhiben un flujo aumentado de
iones selectivos de calcio a través de la membrana celular en
respuesta a la despolarización, que indica que la subunidad
\alpha_{2} puede potenciar la función de los canales de calcio.
Las células que se han cotransfectado con relaciones crecientes de
\alpha_{2} a \alpha_{1} y se ha medido la actividad de los
canales de calcio resultantes. Los resultados indican que el
incremento de la cantidad de ARN que codifica \alpha_{2}
relativo a las otras subunidades transfectadas incrementa la
actividad de los canales de calcio.
Se prefieren las células eucarióticas que
expresan los canales de calcio heterólogos que contienen una
subunidad \alpha_{1H} como un homómero y al menos una subunidad
\alpha_{1H} de tipo humano y opcionalmente una subunidad
\alpha_{2}\delta y/o una subunidad \beta de tipo humano. Las
células eucarióticas trasformadas con una composición que contiene
ADN o una transcripción de ARN que codifica una subunidad
\alpha_{1H} sola o en combinación con una subunidad \beta y/o
\alpha_{2} se pueden producir para producir las células que
expresan los canales de calcio funcionales. Ya que las células
recombinantes que expresan los canales de calcio de tipo humano que
contienen todas las subunidades humanas codificadas por los ADN o
ARN heterólogos son las que se prefieren especialmente, es deseable
inyectar o transferir dichas células hospedadoras con una
concentración suficiente de los ácidos nucleicos que codifican las
subunidades para formar los canales de calcio que contienen las
subunidades de tipo humano codificadas por ADN o ARN heterólogos.
Las cantidades y relaciones precisas de ADN y ARN que codifican las
subunidades se pueden determinar empíricamente y optimizarse para
una combinación particular de subunidades, células y condiciones de
ensayo.
En particular, las células de mamíferos se han
transfectado temporal y establemente con ARN que codifica una o más
subunidades de los canales de calcio de tipo humano. Dichas células
expresan los canales de calcio heterólogos que exhiben propiedades
farmacológicas y electrofisiológicas que se pueden atribuir a los
canales de calcio de tipo humano. Sin embargo, dichas células
representan poblaciones homogéneas y los datos farmacológicos y
electrofisiológicos proporcionan la adquisición de una nueva
percepción de la actividad de los canales de calcio de tipo humano
hasta ahora irrealizable. Por ejemplo, las células HEK que se han
transfectado temporalmente con ADN que codifica las subunidades
\alpha_{1E-1}, \alpha_{2b} y
\beta_{1-3}. Las células resultantes expresan
temporalmente estas subunidades, que forman canales de calcio que
tienen propiedades que parecen ser una clase farmacológicamente
distinta de los canales de calcio activados con voltaje distintas de
las de los acanales de tipo L-, N- T- y P-. Las corrientes de
\alpha_{1E} observadas eran insensibles a los fármacos y
toxinas previamente usadas para definir otras clases de canales de
calcio activados con tensión.
Las células HEK que se han transfectado de
manera transitoria con ADN que codifica
\alpha_{1E-1}, \alpha_{2b} y
\beta_{1-2} expresan canales de calcio
heterólogos que muestran sensibilidad a la conotoxina w y corrientes
típicas de los canales de calcio de tipo N. Se ha encontrado que la
alteración de las relaciones molares de
\alpha_{1E-1}, \alpha_{2b} y
\beta_{1-2} introducidas en las células para
lograr niveles equivalentes de ARNm incrementaron
significativamente el número de receptores por célula, la densidad
de células, y afectaban a la K_{d} de la conotoxina \omega.
Las propiedades electrofisiológicas de estos
canales producidas a partir de \alpha_{1E-1},
\alpha_{2b} y \beta_{1-2} se compararon con
las de los canales producidas mediante la transfección transitoria
de células HEK con ADN que codifica
\alpha_{1E-1}, \alpha_{2b} y
\beta_{1-3}. Los canales muestran una
dependencia de tensión similar de activación, sustancialmente
dependencia de tensión idéntica, cinética similar de activación y
corrientes de cola que se podrían ajustar mediante una única
exponencial. La dependencia de tensión de la cinética de
inactivación era significativamente diferente en todas las tensiones
examinadas.
En ciertas realizaciones, la célula eucariótica
con un canal de calcio heterólogo se produce mediante la
introducción de una primera composición en la célula que contiene
al menos una transcripción de ARN que se traduce en la célula en
una subunidad de un canal de calcio de tipo humano. En realizaciones
preferidas, las subunidades que se traducen incluyen una subunidad
\alpha_{1H} de un canal de calcio de tipo humano. Más
preferiblemente, la composición que se introduce contiene una
transcripción de ARN que codifica una subunidad de \alpha_{1H}
de un canal de calcio de tipo human y también contiene (1) una
transcripción de ARN que codifica una subunidad \beta de un canal
de calcio humano y/o (2) una transcripción de ARN que codifica una
subunidad de \alpha_{2} de un canal de calcio de tipo humano.
Se prefiere especialmente la introducción de un ARN que codifica una
subunidad de \alpha_{1H}, una de \beta y una de
\alpha_{2} de canales de calcio de tipo humano, y opcionalmente
una subunidad \gamma de un canal de calcio de tipo humano. Los
procedimientos para la transcripción in vitro de un ADN
clonado y la inyección del ARN resultante en células eucarióticas se
conocen bien en la técnica. Las transcripciones de cualquier ADN de
longitud completa que codifica cualquiera de las subunidades de un
canal de calcio de tipo humano se puede inyectar solo o en
combinación con otras transcripciones en células eucarióticas para
la expresión en las células. Se prefieren particularmente lo
ovocitos de anfibios para la expresión de las transcripciones in
vivo de los clones de ADNc de las subunidades de los canales de
calcio de tipo humano proporcionados en esta memoria descriptiva.
Los ovocitos de anfibios que expresan los canales de calcio
heterólogos funcionales se han producido mediante este
procedimiento.
Como se describe en los ejemplos, el ácido
nucleico que codifica \alpha_{1H-1} y el ácido
nucleico que codifica \alpha_{1H-2} se ha
expresado en células de mamífero y en ovocitos de anfibio. Se han
estudiado las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas.
Las propiedades biofísicas de los canales
\alpha_{1H}^{2+} humanos recombinantes expresados en las
células HEK293 y ovocitos de Xenopuus están de acuerdo,
indicando que las propiedades biofísicas de los canales
\alpha_{1H} de tipo humano recombinantes son independientes del
sistema de expresión. Varias características biofísicas apoyan la
conclusión de que la subunidad \alpha_{1H} de tipo humano es la
formación de poros de un canal de tipo T. Las velocidades de
activación, inactivación, y desactivación y la conductancia de los
canales individuales de los canales que contienen \alpha_{1H}
están dentro de los intervalos descritos para los canales de tipo
T. El valor de conductancia de 9 pS medido en este estudio está
cerca del valor determinado para los canales que contienen
\alpha_{1G} de rata y es significativamente menor que los
determinados para los canales HVA recombinantes. Además, los
canales que contienen \alpha_{1H} conducen Ba^{2+} y Ca^{2+}
igualmente bien, consistente con el hallazgo de que la conductancia
de los canales de tipo T para Ba^{2+} y Ca^{2+} es casi
equivalente en la mayoría de los tipos de células.
Los canales de Ca^{2+} que contienen
\alpha_{1H} muestran un perfil farmacológico que difiere de los
canales de HVA. Las corrientes mediadas por \alpha_{1H} están
inhibidas por Ni^{2+}, amiloride, y mibefradil (Ro
40-5967), agentes mostrados que reducen las
corrientes de LVA en numerosos tipos de células. Por el contrario,
etosuximida, un agente antiepiléptico que inhibe las corrientes de
LVA en algunos tipos de células, no tenían ningún efecto sobre las
corrientes mediadas por \alpha_{1H}. Aunque los moduladores de
los canales de Ca^{2+} de tipo T nimodipina y
(-)-Bay K 8644 tienen poco efecto a una
concentración de 1 \muM sobre los canales que contienen
\alpha_{1H}, ambos compuestos producían una inhibición notable a
una concentración de 10 \muM, consistente con sus efectos sobre
los canales de tipo T en neuronas del hipotálamo de ratas (Alkaike
y col., 1989). En resumen, las propiedades farmacológicas de los
canales que contienen \alpha_{1H} descritas en esta memoria
descriptiva tienen muchas similitudes con los canales de tipo T
nativos estudiados en una diversidad de tipos de células. Los
perfiles farmacológicos de Leo canales de tipo T varían
considerablemente entre los tipos de células, y no se ha
identificado ninguna característica farmacológica de sello de los
canales de tipo T. estos resultados son consistentes con el
hallazgo en esta memoria descriptiva de que múltiples subunidades
\alpha_{1} son responsables de los perfiles farmacológicos de
una familia de los canales de tipo LVA, o T.
Entre los usos para las células eucarióticas que
expresan de una forma recombinante una o más de las subunidades son
ensayos para determinar si un compuesto de ensayo tiene actividad
agonista o antagonista de los canales de calcio. Estas células
eucarióticas también se pueden usar para seleccionar a partir de
agonistas y antagonistas de los canales de calcio conocidos los que
exhiben una especificidad de los subtipos de los canales de calcio
particulares y por lo tanto seleccionar los compuestos que tienen
potencial como agentes terapéuticos de enfermedad o tejido
específico.
Se proporcionan los procedimientos in
vitro para identificar compuestos, tales como agonista y
antagonistas de los canales de calcio, que modulan la actividad de
los canales de calcio que usan células eucarióticas que expresan
los canales de calcio heterólogos de tipo humano.
En particular, los ensayos usan células
eucarióticas que expresan subunidades de canales de calcio
heterólogos de calcio humano codificados por ADN heterólogo
proporcionado en esta memoria descriptiva, para seleccionar los
agonistas y los antagonistas potenciales de los canales de calcio
que son específicos para los canales de calcio de tipo humano y
particularmente para seleccionar los compuestos que son específicos
para los subtipos de los canales de calcio de tipo humano
particulares. Dichos ensayos se pueden usar junto con los
procedimientos de diseño de fármaco racional para seleccionar entre
agonistas y antagonistas que se diferencian ligeramente en
estructura, los que son particularmente útiles para modular la
actividad de los canales de calcio de tipo humano y diseñar o
seleccionar los compuestos que muestran actividades de agonistas y
antagonistas de los canales de calcio de subtipos o tejidos
específicos. Estos ensayos deben predecir exactamente la eficacia
terapéutica relativa de un compuesto para el tratamiento de ciertos
trastornos en seres humanos. Además, ya que se proporcionan las
subunidades de los canales de calcio específicas de subtipos y
tejidos, las células con canales de calcio recombinantes
específicos de subtipos y tejidos se pueden preparar y utilizar en
ensayos para la identificación de fármacos de subtipos y tejidos
específicos de los canales de calcio de tipo humano.
Deseablemente, la célula hospedadora para la
expresión de las subunidades de los canales de calcio endógenas del
tipo o en una cantidad que sustancialmente interfiere con la
detección de las subunidades de los canales de calcio heterólogos
en ensayos de unión de ligandos o detección de la función de de los
canales de calcio heterólogos tal como la generación de la
corriente de calcinen ensayos funcionales. También, las células
hospedadoras preferiblemente no deben producir canales de calcio
endógenos que interactúan de maneta detectable con los compuestos
que tienen, a concentraciones fisiológicas (generalmente nanomolares
o picomolares) afinidad por los canales de calcio que contienen una
o todas las subunidades de los canales de calcio de tipo humano
proporcionados en esta memoria descriptiva.
Con respecto a los ensayos de ligandos para
identificar un compuesto que tiene una afinidad para los canales de
calcio, se emplean las células que expresan, preferiblemente, al
menos una subunidad de \alpha_{1H} heteróloga. Las células
eucarióticas transfectadas que expresan al menos una subunidad de
\alpha_{1} se pueden usar para determinar la capacidad de un
compuesto de ensayo para unirse específicamente a los canales de
calcio heterólogos mediante, por ejemplo, la evaluación de la
capacidad del compuesto de ensayo para inhibir la interacción de un
compuesto marcado conocido para interactuar específicamente con los
canales de calcio. Dichos ensayos de unión de ligandos se pueden
realizar sobre células transfectadas o membranas preparadas de las
mismas.
La capacidad de un compuesto de para unirse o de
otra manera interactuar con las membranas que contienen los canales
de calcio heterólogos que contienen la subunidad \alpha_{1H} se
pueden determinar usando cualquier procedimiento adecuado, tal como
los análisis de unión competitiva, tales como los estudios de
Scatchard, en los que la capacidad de unión de tales membranas se
determina en presencia y ausencia de una o más concentraciones de
un compuesto que tiene afinidad conocida para el canal de calcio.
Cuando es necesario, los resultados, se pueden comparar a un
experimento de control diseñado de acuerdo a los procedimientos
estándar conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo,
como control negativo, los resultados se pueden comparar a los de
los ensayos de una preparación de membranas tratada idénticamente a
partir de células hospedadoras que no se han transfectado con uno o
más ácidos nucleicos que codifican las subunidades.
Los ensayos implican poner en contacto la
membrana celular de una célula eucariótica recombinante que expresa
al menos una subunidad de un canal de calcio de tipo humano con un
compuesto de ensayo y midiendo la capacidad del compuesto de ensayo
de unirse específicamente a la membrana o alterar o modular la
actividad de un canal de calcio heterólogo en la membrana.
En las realizaciones preferidas, el ensayo
utiliza una célula recombinante que tiene un canal de calcio que
contiene una subunidad \alpha_{1H} de un canal de calcio de tipo
humano. En otras realizaciones preferidas, el ensayo usa una célula
recombinante que tiene un canal de calcio que contiene una subunidad
\alpha_{1H} de un canal de calcio de tipo humano en combinación
con una subunidad \beta de un canal de calcio humano y/o una
subunidad \alpha_{2} de un canal de calcio de tipo humano. Las
células recombinantes que expresan los canales de calcio
heterólogos que contienen cada una de las subunidades de tipo humano
\alpha_{1H} y opcionalmente una \beta y/o \alpha_{2}, y,
opcionalmente, una subunidad \gamma de un canal de calcio de tipo
humano se prefieren especialmente para uso en tales ensayos.
En ciertas realizaciones, los ensayos para
identificar los compuestos que modulan la actividad de los canales
de calcio se ejercen mediante la medición de la actividad de los
canales de calcio de una célula eucariótica que tiene un canal de
calcio heterólogo funcional cuando dichas célula se expone a una
solución que contiene el compuesto de ensayo y un ión selectivo del
canal de calcio y comparando la actividad medida de los canales de
calcio con la actividad de los canales de calcio de la misma célula
o una célula de control idéntica sustancialmente en una solución
que no contiene el compuesto de ensayo. La célula se mantiene en una
solución que contiene una concentración de iones de de los canales
de calcio selectivos suficiente para proporcionar una corriente
interna cuando se abre el canal. Las células recombinantes que
expresan los canales de calcio que incluyen cada una de las
subunidades de tipo humano \alpha_{1H}, \beta y
\alpha_{2}, y, opcionalmente, una subunidad \gamma de una
canal de calcio de tipo humano, se prefieren especialmente para uso
en dichos ensayos. Los expertos en la técnica conocen los
procedimientos para ejercer dichos ensayos. Por ejemplo, para
procedimientos similares aplicados con ovocitos de Xenopus
laevis y receptores de acetilcolina, véase Mishina y col.,
[(1985) Nature] 313: 364 y con dichos ovocitos y canales de
calcio [véase, Noda y col (1986) Nature 322: 826: 828]. Para
estudios similares que se han llevado a cabo con el receptor de
acetilcolina véase, por ejemplo, Claudio y col., [(1987)
Science 238: 1688-1694]. Los ensayos basados
en transcripciones también se contemplan en esta memoria
descriptiva.
Los canales de calcio recombinantes o
heterólogos funcionales se pueden identificar mediante cualquier
procedimiento conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo,
se pueden usar los procedimientos electrofisiológicos para medir la
corriente a través de una membrana selectiva de iones de una célula
que se conocen bien. La cantidad y duración del flujo de iones de
calcio selectivos mediante los canales de calcio heterólogos de una
célula recombinante que contiene ADN que codifica una o más de las
subunidades proporcionadas en esta memoria descriptiva se han
medido usando un electrodo doble y las técnicas de pinzamiento zonal
de las célula completa. Con el fin de mejorar la sensibilidad de
los ensayos, se pueden utilizar los procedimientos conocidos para
eliminar o reducir las corrientes no de calcio y las corrientes de
calcio que se producen a partir de los canales de calcio endógenos,
cuando se miden las corrientes de calcio a través los canales
recombinantes. Por ejemplo, el DHP Bay K 8644 potencia
específicamente la función de los canales de calcio de tipo L
mediante el incremento de la duración del estado abierto de los
canales [véase, por ejemplo, Hess, J. B. y col., (1984)
Nature 311: 538-534]. La apertura prolongada
de los canales da como resultado corrientes de calcio de magnitud y
duración aumentada. Las corrientes de cola se pueden observar tras
la repolarización de la membrana celular después de la activación
de los canales iónicos mediante un comando de voltaje de
despolarización. Los canales abiertos requieren un tiempo finito
para cerrarse o "desactivarse" después de la depolarización y
la corriente que fluye a través de durante este período se denomina
corriente de cola. Debido a que el Bay K 8644 prolonga los
acontecimientos de apertura en los canales de calcio, esto tiendo a
prolongar estas corrientes de cola y hacerlas más pronunciadas.
En la práctica de estos ensayos, las células
transfectadas estable o temporalmente o células inyectadas que
expresan los canales de calcio de tipo humano dependiente de voltaje
que contienen una o más de las subunidaes de un canal de calcio de
tipo humano su puede usar deseablemente en ensayos para identificar
agentes, tales como los agonistas y antagonistas de los canales de
calcio, que modulan la actividad de los canales de calcio. El
ensayo funcional de la actividad de los compuestos de ensayo, que
incluyen los compuestos que tienen una actividad desconocida, de la
actividad del agonista o antagonista para determinar si el compuesto
de ensayo potencia, inhibe o de otra manera altera el flujo de los
iones de calcio u otros iones a través de un canal de calcio se
pueden llevar a cabo mediante (a) mantener una célula eucariótica
que se transfecta o se inyecta para expresar un canal de calcio
heterólogo funcional capaz de regular el flujo de los iones
selectivos de los canales de calcio en la célula en un medio que
contiene iones selectivos de los canales de calcio (i) en presencia
de y (ii) en ausencia de un compuesto de ensayo; (b) mantener la
célula en condiciones tales que los canales de calcio heterólogos
están cerrados sustancialmente y los canales de calcio endógenos de
la célula están sustancialmente inhibidos (c) despolarizar la
membrana de la célula mantenida en la etapa (b) a un grado y
durante una duración de tiempo suficiente para ocasionar
(preferiblemente, solamente sustancialmente) los canales de calcio
heterólogos para hacerse permeables a los iones selectivos de los
canales de calcio; y (d) comparar la cantidad y duración del flujo
de corriente en la célula en presencia del compuesto de ensayo al
del flujo de corriente en la célula, o una célula sustancialmente
similar en ausencia del compuesto de ensayo.
Los ensayos que de esta manera usan células,
proporcionados en esta memoria descriptiva, que expresan los
canales de calcio heterólogos funcionales y miden funcionalmente,
tal como electrofisiológicamente, la capacidad de un compuesto de
ensayo para potenciar, antagonizar o de otra manera modular la
magnitud y duración del flujo de los iones selectivos de los
canales de calcio, tales como Ca^{++} o Ba^{++}, a través del
canal heterólogo funcional. La cantidad de corriente que fluye a
través de los canales de calcio recombinantes de una célula se
puede determinar directamente, tal como electrofisiológicamente, o
mediante el control de una reacción independiente que se produce
intracelularmente y que está directamente influenciada de una manera
dependiente del ión calcio (u otro). Se puede utilizar cualquier
procedimiento para valorar la actividad de un canal de calcio junto
con las células y ensayos proporcionados en esta memoria
descriptiva. Por ejemplo, en una realización del procedimiento para
ensayar un compuesto para su capacidad de modular la actividad de
los canales de calcio, la cantidad de corriente se mide por su
modulación de una reacción que es sensible a los iones de los iones
selectivos de los canales de calcio y utiliza una célula eucariótica
que expresa un canal de calcio heterólogo y también contiene un
elemento de control transcripcional unido operativamente para la
expresión a un gen estructural que codifica una proteína indicadora.
El elemento de control transcripcional usado para la transcripción
del gen indicador es sensible en la célula a un ión selectivo de los
canales de calcio, tales como Ca^{2+} y Ba^{2+}. Los detalles
de dichos ensayos fundamentados transcripcionales se describen en
la solicitud de patente internacional PCT Nº PCT/US91/5625,
presentada el 7 de agosto de 1991, de propiedad común con la
presente, que reivindica prioridad a la solicitud de Estados Unidos
de propiedad y cesión común en tramitación con la presente nº de
serie 07/563.751, presentada el 7 de agosto de 1990; véase también,
la solicitud de patente internacional PCT publicada PCT US92/11090,
de propiedad común con la presente, que corresponde con las
solicitudes de Estados Unidos en tramitación con la presente números
de serie 08/229.150 y 08/244.985. El contenido de estas solicitudes
se incorpora en estas memorias descriptivas por referencia a
ellas.
Se transfectaron células HEK con ADN y se
inyectaron ovocitos con ácido nucleico proporcionado en esta memoria
descriptiva. La célula expresaba canales de calcio, que después se
caracterizaban electrofisiológicamente y farmacológicamente. Estso
resultados se describen en los ejemplos. Ambas variantes de ayuste
formaban canales de calcio que mostraban propiedades asociadas a
los canales de tipo T. Se observaron propiedades específicas de
variantes.
Estas diferencias observadas en las secuencias
de aminoácidos de \alpha_{1H- 1},
\alpha_{1H-2} dará como resultados notables
diferencias en la susceptibilidad de estos receptores para la
regulación celular, particularmente ya que la región observada de
la divergencia de secuencias reside en la región de engarce
citosólica entre los dominios I y II y la región de secuencia
análoga en los canales de calcio activados por alta tensión se han
implicado en la unión de proteínas reguladoras citosólicas. Las
diferencias observadas en las propiedades biofísicas de
\alpha_{1H-1} y
\alpha_{1H-2} son también probablemente
indicadoras de las diferencias en al sensibilidad de estas dos
subunidades de canales diferentes a los compuestos farmacéuticos.
De este modo, parece probable que los canales de calcio activados
por baja tensión que contienen o bien la subunidad
\alpha_{1H-1} o
\alpha_{1H-2} se someterá a diferentes controles
reguladores, y diferentes perfiles de susceptibilidad a los
compuestos farmacéuticos. Por ejemplo, la amiloride bloquea la
corriente de tipo T en células de neuroblastoma con una CI_{50}
de \sim50 \muM, mientras que en las neuronas del hipocampo la
amiloride 300 \alpha_{1H- 1}, \alpha_{1H-2}
dará reduce la corriente de tipo T en solamente 40%.
A este respecto, cada canal de \alpha_{1H}
diferente es una diana de selección separada para el desarrollo de
compuestos fármacos farmacéuticos. Los efectos diferenciales de
fármacos sobre diferentes células neurales y en diferentes tejidos
neurales se pueden entender basándose en diferentes patrones de
expresión de \alpha_{1H-1} y/o
\alpha_{1H-2} in vivo y proporcionará un
medio de identificar fármacos específicos de cada subtipo y
trastornos o afecciones asociados. La variación de secuencia
observada en las subunidades \alpha_{1H} explica la
variabilidad farmacológica observada de los canales de calcio de
tipo T en diferentes tejidos nativos, proporcionando una
herramienta útil para identificar candidatos fármacos
terapéuticos.
Las diferencias en la funcionalidad de
\alpha_{1H-1} y
\alpha_{1H-2} y la expresión en diferentes
tejidos proporciona la base para usar células recombinantes que
expresan canales de calcio que tienen o bien la subunidad
\alpha_{1H-1} o
\alpha_{1H-2}. Los agonistas y antagonistas
capaces de afectar de manera diferencial los canales de calcio que
contienen estas dos subunidades diferentes deben ser útiles para
dirigir la intervención terapéutica en localizaciones neurales
seleccionadas, por ejemplo, para neuronas cardiovasculares neuronas
de tipo marcapasos cardiaco que expresan
\alpha_{1H-2}.Los canales de calcio formados a
partir de subunidades \alpha_{1H} se abren a pequeños cambios
en el potencial de membrana, pero solamente permiten un influjo de
Ca ^{2+} moderado antes de cerrarse. Permitiendo un influjo
moderado de de iones divalentes los canales que contienen
\alpha_{1H} canales es probable que:
- (i)
- participen en rutas que desencadenan cambios en la expresión de genes en respuesta a un cambio sutil en la diferencia de potencial de membrana, es decir, en tipos de células neuronales y no neuronales (por ejemplo, en la activación de células inmunes tales como células T, en activación de células de riñón e hígado en respuesta a cambios metabólicos;
- (ii)
- ejercen controles sutiles sobre la excitabilidad o accesibilidad global de neuronas para la transmisión sináptica, tal como en la determinación de qué neuronas responderán a los estímulos, y en qué grado, tal como en neuronas y ganglios periféricos;
- (iii)
- determinan el grado de respuestas neurales a los estímulos tales como dolor crónico;
- (iv)
- regulan la sensibilidad de las neuronas en centros neurales críticos de manera que las células neurales en estos centros están protegidas de los efectos adversos asociados a ondas completas excesivas (por ejemplo, en el marcapasos cardiaco);
- (v)
- actúan para establecer el patrón de estado constante de inactivación de neuronas en regiones diferentes del cerebro, (por ejemplo, en respuesta al sueño, sexo, emoción, depresión, fatiga y los otros estímulos o condiciones).
Después de la transfección transitoria de
células HEK 293 con un ADN que codifica la subunidad
\alpha_{1H}, se observaron corrientes de Ba ^{2+} que se
activaban e inactivaban rápidamente. Se midieron las corrientes de
Ba ^{2+} (15 mM) inducidas mediante despolarizaciones de etapa a
diversos potenciales de ensayo a partir de un potencial de
mantenimiento de - 90 mV. Las corrientes se activaron a un potencial
de ensayo de - 50 mV, con máximos entre - 20 y - 10 mV, y se
invertían a un potencial de membrana más positivo que + 60 mV. Se
obtuvieron resultados similares con
Ca ^{2+} (15 mV) como el vehículo de carga.
Ca ^{2+} (15 mV) como el vehículo de carga.
Un sello de los canales de LVA es su velocidad
lenta de desactivación, que se refleja en una disminución de la
función de de las corrientes de cola. La constante de tiempo de esta
disminución es \sim10 veces más lenta para los canales de LVA
(2-12 ms) que para los canales de HVA < 300
\mus. Se observó una lenta disminución de las corrientes de cola
mediadas por \alpha_{1H-1} durante un período de
\sim15 ms. Por el contrario que la disminución monoexponencial de
las corrientes de cola para muchos canales de Ca ^{2+} de tipo T
nativos, las corrientes de cola de los canales de
\alpha_{1H-1} mostraban una disminución
biexponencial. A un potencial de ensayo de - 20 mV, la velocidad de
disminución del componente lento, que comprende 88,1 \pm 33,8% de
la corriente total, era 2,1 \pm 1,06 ms (n = 6), que es similar a
las observadas en
los canales de Ca ^{2+} de tipo T nativos. La velocidad de disminución del último componente era 0,64 \pm 0,21 ms (n = 6).
los canales de Ca ^{2+} de tipo T nativos. La velocidad de disminución del último componente era 0,64 \pm 0,21 ms (n = 6).
Los registros de match clamp de células enteras
se realizaron en células HEK 293 que expresan transitoriamente la
subunidad \alpha_{1H-1} humana. Las
despolarizaciones por etapas inducían corrientes internas de Ba
^{2+} que se activan lentamente y se inactivan rápidamente (2,8
\pm 0,6 y 16,9 \pm 5,3 ms a - 20 mV). La curva de activación de
\alpha_{1H-1} se desplaza a la izquierda (V1/2:
- 29,5 mV) comparada con los canales de Ca ^{2+} de HVA. Las
corrientes de cola de los canales que contienen
\alpha_{1H-1} disminuyen rápidamente (\tau1,
\tau2, \pm 1,0, 0,6, \pm 0,2 ms). La permeabilidad para Ba
^{2+} y Ca ^{2+} era prácticamente idéntica. La conductancia de
los canales individuales, determinada con 110 mM Ba como vehículo de
carga, es 9 ps.
La dependencia de la tensión de la activación de
los canales de Ca ^{2+} que contienen
\alpha_{1H-1} se determinó a partir del
análisis de las corrientes de cola. Las amplitudes de las corrientes
de cola normalizadas se representaron gráficamente como una función
del potencial de ensayo y reveló una curva de activación bifásica
que se ajustó mediante la suma de dos funciones de Boltzmann (Figura
1). Los potenciales para la activación semimáxima de los términos
de Boltzmann individuales eran como sigue: V_{^{1}/_{2} \ A}: -
25,1 \pm 3 3,0 mV; y V _{^{1}/_{2} \ B}: + 25,5 \pm 3 9,9 mV
(n = 11). Se ha reseñado previamente un valor similar a V 1/2 A para
la dependencia de tensión de la activación de los canales de Ca
^{2+} de tipo T en la línea celular TT humana (-27 mV). El valor
del segundo término de Boltzmann V _{^{1}/_{2} \ B} es algo
similar al reseñado para los canales de Ca ^{2+} HVA. Usando un
protocolo similar, las corrientes de cola de los canales de Ca
^{2+} HVA disminuyen con las constantes de tiempo de < 300
\mus, mientras que con \alpha_{1H} los más prominentes a los
potenciales de ensayo cierran a V _{^{1}/_{2} \ B}. La
disponibilidad de los canales de Ca ^{2+} que contienen
\alpha_{1H} para la apertura dependía de la membrana para el
potencial como se muestra en la Fig. 1. El potencial para la
inactivación en estado constante semimáxima (V _{^{1}/_{2}}) era -
63,2 \pm 2,0 mV (n = 9).
La inactivación rápida de los canales de Ca
^{2+} de \alpha_{1H} era altamente dependiente de la tensión.
la disminución de corriente se describía mejor con una función
exponencial variando las constantes de tiempo entre 42,2 \pm 7,8
y 8,8 \pm 3,8 ms a potenciales de membrana entre - 50 y + 30 mV (n
= 6; datos no mostrados). La cinética de activación de los canales
de Ca ^{2+} de \alpha_{1H} eran también dependientes de la
tensión con constantes de tiempo variando entre 9,9 \pm 4,7 y 0,9
\pm 0,3 ms para potenciales de membrana entre -50 y +30 mV (n =
8; datos no mostrados). Los canales de Ca ^{2+} de \alpha_{1H}
se inactivaban completamente durante la despolarización de 150 ms.
La recuperación de la inactivación se produjo en un período de
\sim3 s con un componente rápido (\tau = 37 \pm 9 ms; 16,5
\pm 4,6% de todos los canales) y un componente lento (\tau = 37
\pm 61 ms; 78 \pm 8,5% de todos los canales; n = 3; datos no
mostrados). Para confirmar las propiedades biofísicas de los
canales \alpha_{1H} recombinantes observados en los registros de
células completas a partir de las células HEK 293, se ensayó la
expresión funcional de \alpha_{1H} en ovocitos de
Xenopus. Se observaron las corrientes sustanciales (< 1
\muA) después de la inyección de transcripciones \alpha_{1H \
solas}. La cinética de activación e inactivación, así como las
propiedades de inactivación de estado constante, eran similares a
las obtenidas en las células HEK 293 (véanse los ejemplos).
Las propiedades de los canales individuales de
los canales de Ca ^{2+} \alpha_{1H} en las células HEK 293 se
determinaron en los registros unidos a células con 110 mM de Ba
^{2+} como el vehículo de carga. Los registros de los canales
individuales a un potencial de ensayo de - 30 mV a partir de un
parche que contiene al menos tres \alpha_{1H} mostraban que las
aperturas de los canales de producían en ráfagas y se agrupaban
principalmente en el primer tercio del pulso despolarizante de 10
ms, especialmente con despolarizaciones más fuertes.
Ocasionalmente, la actividad de los canales se ampliaba a lo largo
del recorrido completo. El transcurso del tiempo de la corriente
promediada conjunta registrada a - 30 mV en 110 mM de Ba ^{2+} era
similar a la corriente de Ba ^{2+} de células enteras de
\alpha_{1H} registrada a - 40 mV en 15 mM
Ba ^{2+}. Las corrientes se compararon a diferentes potenciales para compensar el desplazamiento en la curva de activación con potenciales más positivos debido al incremento en la concentración divalente. La relación de corriente - tensión unitaria produjo una conductancia de pendiente unitaria de 9,06 \pm 0,22 ps (N = 4).
Ba ^{2+}. Las corrientes se compararon a diferentes potenciales para compensar el desplazamiento en la curva de activación con potenciales más positivos debido al incremento en la concentración divalente. La relación de corriente - tensión unitaria produjo una conductancia de pendiente unitaria de 9,06 \pm 0,22 ps (N = 4).
Se evaluaron las propiedades biofísicas de los
canales de calcio que contenían la subunidad \alpha_{1H}
humana. Los registros de células enteras de células HEK 293
transfectadas transitoriamente indican que al relación corriente -
tensión, permeabilidad a Ca ^{2+} y Ba ^{2+}, cinética de
activación, y conductancia de los canales individuales de los
canales de calcio que contenían subunidades \alpha_{1H} eran
similares a los de los canales de calcio de tipo T nativos en los
tejidos. Las corrientes de cola de los canales \alpha_{1H}
mostraron una disminución biexponencial, que muestra un componente
más rápido y más lento. A potenciales de membrana muy negativos (-
150 a - 100 mV) el componente rápido (R: 200-450
\mus) dominaba el proceso de inactivación, mientras que a
potenciales despolarizantes > - 50 mV dominaba el componente más
lento (2-3 ms). En el potencial de membrana
restante, es decir, \leq - 80 mV, ambos componentes contribuían de
manera igual.
Las propiedades farmacológicas de los canales de
calcio que contienen \alpha_{1H} también eran consistentes con
las observadas para los canales de calcio de tipo T nativos. De
manera interesante, la sensibilidad de los canales de calcio que
contienen \alpha_{1H} a Cd ^{2+} o Amiloride era
aproximadamente 10 veces menor cuando se expresaban en células HEK
293 que cuando se expresan en ovocitos de Xenopus.
Los datos indican que las subunidades de los
canales de calcio de \alpha_{1H} humana tienen propiedades
consistentes con los canales de calcio de tipo T nativos y, como
tal, \alpha_{1H} representa un miembro en la familia de rápido
crecimiento de los canales de calcio activados por baja tensión.
En relación con el tratamiento terapéutico de
diversos estados patológicos, la disponibilidad del ADN que
codifica las subunidades de de los canales de calcio de tipo humano
permite la identificación de cualesquiera alteraciones en tales
genes (por ejemplo, mutaciones) que pueden correlacionarse con la
existencia de ciertos estados patológicos. Además, se hace posible
la creación de modelos animales de dichos estados patológicos
mediante la introducción específica de dichas mutaciones en los
fragmentos de ADN sintéticos que después se pueden introducir en
animales de laboratorio o en sistemas de ensayo in vitro para
determinar los efectos de los mismos.
También, la selección genética se puede llevar a
cabo utilizando las secuencias de nucleótidos como sondas. De este
modo las muestras de ácidos nucleicos a partir de sujetos que tienen
estados patológicos sospechosos de implicar alteración/modificación
de una cualquiera o más de las subunidades de los canales de calcio
se puede seleccionar con sondas apropiadas para determinar si
existe cualquier anormalidad con respecto a cualquiera de los
canales de calcio endógenos. De manera similar los sujetos que
tienen una historia familiar de estados patológicos relativos a la
disfunción de los canales de calcio se puede seleccionar para
determinar si también ellos están predispuestos a dichos estados
patológicos.
Los trastornos y para los que los ensayos de
selección se pueden desarrollar y también para los que los
compuestos candidatos para el tratamiento de los trastornos
incluyen, pero no se limitan a: tratamientos cardíacos, tales como
infarto de miocardio, arritmia cardíaca, insuficiencia cardíaca, y
angina de pecho. Los compuestos identificados serán útiles en: (a)
terapias complementarias para reestablecer el ritmo cardíaco normal
y el rendimiento cardíaco después de lesión traumática, ataque
cardíaco y otras lesiones cardíacas; (b) tratamientos de infarto de
miocardio (MI), escenario después de infarto de miocardio y agudo.
Los compuestos pueden ser eficaces para incrementar la fuerza
contráctil cardíaca, tal como la medida por la presión diastólica
final ventricular, y sin cambiar la presión sanguínea del ritmo
cardíaco. En un escenario agudo los compuestos pueden ser eficaces
para disminuir la formación de tejido cicatrizado, tal como la
medida por deposición de colágeno o espesor de septos, y sin
efectos cardiodepresores. Los compuestos identificados serán útiles
para ensayos y para diagnosis y selección de compuestos serán
útiles en relación con tratamientos vasculares e hipertensión, para
identificar compuestos útiles en la regulación del tono muscular
liso vascular, incluyendo vasodilatación y vasoconstricción. Tales
compuestos se pueden usar en (a) tratamiento para reestablecer el
control de presión sanguínea, por ejemplo, después de lesión
traumática, cirugía y derivación cardiopulmonar, y tratamientos
profilácticos diseñados para minimizar los efectos cardiovasculares
de fármacos anestésicos; (b) tratamientos para mejorar los reflejos
vasculares y control de presión sanguínea mediante el sistema
nervioso autónomo. Otras afecciones incluyen, urológicas, para
identificar los compuestos útiles en: (a) tratar y reestablecer la
función renal después de cirugía, lesión traumática y reacciones de
fármacos adversas; (b) tratar disfunciones de vejiga; y (c)
toxicidad neuronal urémica e hipotensión en pacientes con
hemodiálisis; afecciones reproductoras, para identificar los
compuestos útiles en el tratamiento de: (a) trastornos de función
sexual que incluyen impotencia; y (b) impotencia alcohólica (en
control autónomo que puede estar sometido a controles de los canales
T); hepática, para identificar los compuestos útiles en el
tratamiento y reducción de la toxicidad neuronal y daño del sistema
nervioso autónomo que se produce por el consumo excesivo agudo de
alcohol; afecciones neurológicas para identificar compuestos útiles
en el tratamiento de: (a) epilepsia y epilepsia diencefálica;
(b) enfermedad de parkinson; (c) control de
temperatura aberrante, tal como anormalidades de temblor y secreción
de las glándulas sudoríparas y suministro de sangre vascular
periférica;
(d) funciones de la pituitaria e hipotalámicas
aberrantes que incluyen la secreción anormal de noradrenalina,
dopamina y otras hormonas; afecciones respiratorias, para
identificar compuestos útiles en el tratamiento de respiración
anormal, tal como, complicaciones después de cirugía de anestésicos;
trastornos endocrinos para identificar compuestos útiles en el
tratamiento de secreción aberrante de hormonas tales como
tratamientos para la sobreproducción de hormonas que incluyen
insulina, tiroxina, y adrenalina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se incluyen solamente
con propósitos ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la
invención.
Usando ARNm y células TT, se usó un
planteamiento de PCR degenerado para aislar ácido nucleico que
codifica uña subunidad \alpha_{1H-1}. Se aisló
el ácido nucleico que codifica una subunidad
\alpha_{1H-1} y ácido nucleico que codifica una
subunidad denominada \alpha_{1H-2}. Se
expresaron el ácido nucleico se introdujo en células HEK 293 y
ovocitos de Xenopus y canales de calcio activados por
tensión. Estos canales muestran propiedades farmacológicas y
electrofisiológicas consistentes con canales LVA, de tipo T
nativos.
Se sintetizaron el siguiente cebador de PCR de
20 mer de hebra de polaridad positiva, que corresponde a los
nucleótidos 1945-1964 de ADN que codifica una
subunidad \alpha_{1E} humana:
| AC(A/C/G/T)GTGTT(C/T)CAGATCCTGAC | (cebador 1) SEQ ID Nº 4 |
\newpage
También se sintetizó un cebador de PCR de 22
nucleótidos de polaridad negativa, correspondiente a los nucleótidos
3919 a 3940 de \alpha_{1E} humana:
| T(C/T)CCCTTGAAGAGCTG(A/C/G/T)ACCCC | (Cebador 2) SEQ ID Nº 1 |
Los cebadores de polaridad positiva y polaridad
negativa se usaron en las reacciones de amplificación con ADNc
preparados a partir de células TT y Pfu ADN polimerasa (Stratagene
Inc., San Diego, CA).
Condiciones de reacción: 95ºC durante 5
minutos seguido de 20 segundos de cada uno a 95ºC; después de 20
segundos a 42ºC; 2,5 minutos a 72ºC; y, 30 ciclos de 20 segundos
cada uno a 95ºC seguido de 20 segundos a 50ºC y finalmente 2,5
minutos a 72ºC. El producto de reacción se denomina en esta memoria
descriptiva (más adelante) "los productos de PCR
originales".
Se diseñó un segundo cebador de oligonucleótido
degenerado 5' correspondiente a una porción de la secuencia
reseñada para C. elegans, cósmico C54D2 (Nº de acceso del
Genebank U37548), como una porción de la secuencia de hebra de
polaridad positiva que se alinea con una porción de la secuencia de
ADn de la subunidad \alpha_{1E} humana entre el nucleótido 3598
y 3614. Este cebador tenía la siguiente secuencia:
| GA(A/G)ATGATGATGAA(A/G)GT | (cebador 3) SEQ ID Nº 10 |
El cebador 3 se usó en una reacción de
amplificación jerarquizada con los productos de PCR originales y el
cebador 2.
Aislamiento y caracterización de los
clones: Se construyó una genoteca de ADNc recombinante en un
vector fago \lambdagt10 usando ARN seleccionado de poli
(A)^{+} a partir de la línea celular TT. Aproximadamente
1,5 x 10^{6} se seleccionaron con el fragmento PCR en alta
rigurosidad (hibridación: formamida al 50%, 5X SSPE, 5X Denhardt's,
SDS al 0,2%, 200 \mug/ml de ADN de esperma de arenque durante
16-18 horas a 42ºC; lavado: 6 lavados de 30 minutos
cada uno en 0,1 X SSPE, SDS al 0,1% a 65ºC).
Análisis de transferencia Northern: Se
seleccionaron tejidos múltiples en transferencias Northern usando 2
\mug de Poli (A) ^{+} ARN por banda (Clontech, palo Alto, CA).
Las transferencias se sondaron a alta rigurosidad, como se ha
descrito anteriormente, con fragmentos marcados generados a partir
del ADNc de \alpha_{1H} de longitud completa, es decir,
nucleótido - 6 a 7390.
Análisis de transferencia Western: Se
aislaron membranas celulares (total) a partir de células HEK 293 que
expresan diferentes subunidades \alpha_{1H}; se separaron las
proteínas de membrana mediante SDS - PAGE; se transfirieron a
nitrocelulosa; y, se transfirieron usando un antisuero anti
\alpha_{1H} policlonal y tampón TBS - T. Las proteínas
transferidas se visualizaron usando el kit de reactivo Lumiglo (KPL,
Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
Células de carcinoma de tiroides medular humano
(células TT; Nº de acceso CRL 1803 de ATCC) se hicieron crecer en
medio DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10% a 37ºC en
atmósfera de CO_{2} al 5% y ARN citoplásmico total se aisló a
partir de cuarenta placas de 10 cm usando un kit de aislamiento de
ARN "midi-prep" (Qiagen) según las
instrucciones del fabricante. El protocolo supone el uso del
detergente NP40 que lisa la membrana celular en condiciones suaves
de manera que la membrana nuclear permanece intacta por lo tanto
eliminando de manera incompleta las transcripciones de ARN
ayustadas de la preparación.
Se aisló PoliA + ARN a partir de ARN
citoplásmico total usando dos pases en una columna de
oligo(dT)-celulosa. En resumen,
2-3 mg de ARN citoplásmico total se volvió a
suspender en tampón NETS (NaCl 500 mM, EDTA 10 mM, Tris 10 mM, pH
7,4, SDS al 0,2%) y se pasó lentamente en una columna que contenía
0,5 g de oligo(dT)-celulosa (Collaborative
Research) equilibrado en tampón NETS. La columna se lavó con 30 ml
de tampón NETS y poliA + ARN se eluyó usando aproximadamente 3 ml
de tampón ETS (EDTA 10 mM, Tris 10 mM, pH 7,4, SDS al 0,2%). La
resistencia iónico del tampón que contiene poli A + ARN se ajustó
hasta NaCl 500 mM y se pasó durante una segunda columna de oligo
(dT) - celulosa esencialmente como se ha descrito anteriormente.
Después de la elución de la segunda columna, el poliA + ARN se
precipitó dos veces en etanol y se volvió a suspender en
H_{2}O.
Se sintetizó ADNc de doble hebra (ADNdsc) según
los procedimientos habituales [véase, por ejemplo, Gubler y col.,
(1985) Gene 25: 263-269; Lapeyre y col., (1985 37:
215-220). En resumen, la síntesis de la primera
hebra de ADNc se inició usando poliA + ARN de células TT como molde
y usando cebadores al azar y transcriptasa inversa de Virus de
leucemia murina de Molones (MMLV - RT). La segunda hebra se
sintetizó usando una combinación de la ADN polimeradsa de E.
coli, ADN ligasa de E. coli y ARNasa H.
\newpage
Las regiones de ADN de hebra sencilla se
convirtieron en ADN de doble hebra usando la ADN polimerasa de T4
que genera fragmentos de doble hebra de extremo romo. Adaptadores de
sitio de endonucleasa de restricción
EcoRI:
EcoRI:
| 5' CGTGCACGTCACGCTAG 3' | (SEQ ID NO. 2) |
| 3' GCACGTGCAGTGCGATCTTAA 5' | (SEQ ID NO. 3) |
se ligaron al ADNc de doble hebra
usando un protocolo habitual (véase, por ejemplo, Sambrook y col.,
(1989) en: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Capítulo 8). El ADN de doble hebra
con los adaptadores EcoRI ligados se purificaron a partir de los
adaptadores libres o no ligados mediante cromatografía en columna
usando resina Sepharose CL-4B seguido de la
selección por tamaño del ADNc en un gel de azarosa al 1,2%. Después
de visualizar el ADN resuelto usando bromuro de etidio, se aislaron
dos fracciones de ADNc, > 3,5 kb y 1,0-3,5 kb a
partir del gel y se insertaron en el vector
\lambdagt10.
El \lambdagt10 ligado que contenía la
inserción de ADNc se empaquetó en los virones del fago \lambda
in vitro usando el kit de empaquetamiento Gigapack III Gold
(Stratagene, La Jolla, CA). Usando este procedimiento, se
obtuvieron genotecas de fago de \sim ^{1,5 \ x \ 106}
recombinantes para la fracción de ADNc > 3,5 kb y \sim 10 x
10^{6} recombinantes para la fracción de ADN entre 1,0 y 3,5
kb.
Se aisló el ADN que codifica una pequeña región
de las subunidades \alpha_{1} de tipo humano codificado en las
células TT usando amplificación degenerada a base de PCR (por
ejemplo, véase Williams y col., J. Biol. Chem. 269:
22347-22357). Estos fragmentos amplificados se
usaron para generar sondas de ADN para el aislamiento de ADN que
codifica la subunidad \alpha_{1H} de los canales de calcio de
tipo humano de longitud completa.
Como se ha indicado anteriormente, se
sintetizaron dos conjuntos de nucleótidos degenerados basándose en
las regiones flanqueantes del bucle II-III que se
sabe que comparten un alto grado de identidad de secuencia contra
las subunidades \alpha_{1} de los canales de calcio tipo humano
conocidas: 1) dos oligonucleótidos degenerados complementarios a
las regiones del bucle IIS5-IIS6 se sintetizaron
como cebadores cadena arriba de 5' (SEQ ID números 4 y 5); y 2) dos
oligonucleótidos degenerados complementarios a una porción del
segmento transmembrana IIIS5 se sintetizaron como cebadores cadena
debajo de 3' (SEQ ID números 6 y 7).
Estos fragmentos de oligonucleótidos degenerados
se usaron como pares de cebadores en reacciones de amplificación de
PCR jerarquizadas usando la ADN polimerasa de Pfu (Stratagene, La
Jolla, CA) y las reacciones se realizaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se colocaron las muestras en un
termociclador disponible comercialmente (Perkin - Elmer) y las
reacciones de amplificación se establecieron como sigue: 1 ciclo, 5
min a 95ºC; 5 ciclos, 20 segundos a 95ºC/20 segundos a 42ºC/2,5 min
a 72ºC; 30 ciclos, 20 segundos a 95ºC/20 segundos a 50ºC/2,5 min a
72ºC; y 1 ciclo , 7 min a 72ºC. Los productos de ADN amplificados se
sometieron a electroforesis sobre un gel de azarosa usando
procedimientos convencionales.
Para amplificar el ADN que codifica una porción
de una subunidad \alpha_{1H} de los canales de calcio de tipo
humano, se sintetizaron tres oligonucleótidos degenerados (SEQ ID
números 8-10) que comparten complementariedad
parcial con una región del dominio III como cebadores en 5'. La
región está abarcada dentro de todos los fragmentos que codifican
\alpha_{1} amplificados de la sección C anterior. Se usaron dos
oligonucleótidos basados en las secuencias en IIIS2 (SEQ ID números
8 y 10) como cebadores en 5' junto con los cebadores transmembrana
3'IIIS5 usados en las reacciones de PCR iniciales (SEQ ID Números 6
y 7 para amplificar el ADN que codifica una porción de la subunidad
\alpha_{1H} de tipo humano usando los productos amplificados
como moldes.
Los productos amplificados de ADN se subclonaron
en el vector romo de PCR (Invitrogen), ADN plásmido se purificó a
partir de transformantes aislados y se determinó la secuencia de ADN
de cada inserción. Se identificó un fragmento de 340 pares de bases
(SEQ ID Nº 11; nt 4271 a 4610 de la SEQ ID Nº 12) que comparte
aproximadamente 55-60% de identidad de secuencia
con las subunidades \alpha_{1H} de los canales de calcio de tipo
humano conocidas. Este fragmento de ADN llamado PCR1, se usó como
una sonda de ADN para aislar ADN que codifica una subunidad
\alpha_{1H} de los canales de calcio de tipo humano.
La hibridación de ácidos nucleicos radiomarcados
con ADN inmovilizado para el propósito de selección de genotecas de
ADNc, transferencias de Southern de ADN, o transferencias Northern
se realizaron de manera rutinaria en condiciones de hibridación
convencionales (hibridación: formamida desionizada al 50%, 200
\mug/ml de ADN de esperma de arenque sonicado (nº de catálogo,
Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) 5 x SSPE, 5 x
Denhardt's, 42ºC; lavado: 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%, 65ºC). Los
receptores de SSPE y Denhardt's y la preparación de formamida
desionizada se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., (1989)
Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, capítulo 8). En algunas hibridaciones, se usaron
condiciones de menor rigurosidad ya que la formamida desionizada al
10% reemplazaba la formamida desionizada al 50% descrita para las
condiciones de hibridación habituales.
Las condiciones de lavado para retirar la sonda
no específica de los filtros era rigurosidad o bien alta, media, o
baja como se describe más adelante:
1) alta rigurosidad: 0,1 x SSPE, SDS al 0,1%,
65ºC
2) media rigurosidad: 0,2 x SSPE, SDS al 0,1%,
50ºC
3) baja rigurosidad: 1,0 x SSPE, SDS al 0,1%,
50ºC
Se entiende que se pueden lograr rigurosidades
equivalentes usando tampones, sales y temperaturas alternativos.
Aproximadamente se sembraron 1,5 x 10^{5}
recombinantes de las inserciones que contienen genotecas de fago de
células TT > 3,5 kb y se prepararon toma de muestras por
duplicado a partir de cada placa. Las réplicas se sondaron con PCR1
radiomarcado usando condiciones de hibridación convencionales, se
lavaron los filtros y se identificaron aproximadamente 100 placas
positivas. Inicialmente, 5 positivas,
\lambda1.201-\lambda1.205, se seleccionaron
para la purificación y caracterización de placas.
La digestión con endonucleasa de restricción de
ADN purificado aislado a partir de
\lambda1.201-\lambda1.205 con EcoRI indicaba
que el clon 1.201 contiene la inserción original de \sim350 pares
de bases del fragmento PCR1, mientras que los clones 1.202, 1.203,
1.204 y 1.205 contienen inserciones de \sim1100, \sim4000,
\sim2600 y \sim2200 nt, respectivamente.
Las secuencias de ADNc de \alpha_{1H} de
longitud completa se expone en la SEQ ID Nº 12. Una lista de clones
de ADN parciales usados para caracterizar la secuencia de
\alpha_{1H} y la posición de nucleótido de cada clon con
relación a la secuencia de ADNc de \alpha_{1H} de longitud
completa se muestra más adelante. El aislamiento y caracterización
de estos clones se describen más adelante.
1.305 nt 1 a 3530 de la SEQ ID Nº 12
1.205 nt 2432 a 4658 de la SEQ ID Nº 12
1.204 nt 3154 a 5699 de la SEQ ID Nº 12
PCR1 nt 4271 a 4610 de la SEQ ID Nº 12
1.202 nt 4372 a 5476 de la SEQ ID Nº 12
1.203 nt 3891 a 7898 de la SEQ ID Nº 12
La secuenciación de ADN de cada inserción reveló
que el clon 1.202 contiene la inserción de 1105 pares de bases
correspondiente al nt 4372 a 5476 de la SEQ ID Nº 12; el clon 1.203
contiene la inserción de 4008 pares de bases correspondiente a nt
3891 a 7898 de la SEQ ID Nº 12; el clon 1.204 contiene la inserción
de 2546 pares de bases correspondiente a nt 3154 a 5699 de la SEQ
ID Nº 12; y el clon 1.205 contiene la inserción de 2227 pares de
bases correspondiente a nt 2432 a 4658 de la SEQ ID Nº 12. Estos
cuatro clones de ADN contienen secuencias de superposición que
codifican un marco abierto de lectura de aproximadamente 6,6 kb que
codifica una mayoría de la subunidad \alpha_{1H} de, incluyendo
el extremo carboxi entero y el codón de parada traduccional en la
fase.
El ADN que codifica el extremo 5' de la
subunidad \alpha_{1H} de los canales de calcio de tipo humano
se aisló usando un fragmento de endonucleasa de restricción
EcoRI-NcoI de 548 pares de bases del extremo 5' del
clon 1.205 (nt 2432 a nt 2979 SEQ ID Nº 12) para volver a
seleccionar la genoteca de ADNc de células TT en condiciones de
alta rigurosidad.
En resumen, el ADN que codifica el extremo amino
del calcio \alpha_{1H} que contiene inserciones de > 3,5 kb
se incubó con el fragmento de restricción purificado y se hibridó a
42ºC y se lavó en condiciones de alta rigurosidad como se ha
descrito anteriormente.
Un clon recombinante 1.305, se identificó que
contiene una inserción de 3.530 nucleótidos que comparte en su
extremo 3' aproximadamente 1,1 kb de identidad de secuencia con el
extremo 5' del clon 1.205 (\sim nt 2432 a nt 3530 SEQ ID Nº 12) y
también contiene 2,4 kb de secuencia cadena arriba del sitio EcoRI
localizado en el extremo 5' del clon 1.205 (nt 2433 a nt 2438 SEQ
ID Nº 12). Esta secuencia codifica el codón de inicio ATG (nt 249 a
nt 251 SEQ ID Nº 12) y 1049 aminoácidos del extremo amino de la
subunidad \alpha_{1H} así como 248 pares de bases de la
secuencia no traducida en 5', incluyendo un sitio de unión de
ribosoma de consenso (nt 244 a nt 248 de la SEQ ID Nº 12.)
También se identificaron otros dos recombinantes
(SEQ ID números 13 y 14) que comparten aproximadamente 1,1 kb de
identidad de secuencia con el extremo 3' del clon 1.305 pero difiere
en la longitud de la secuencia de ADN que corresponde al bucle
intracelular extendido localizado entre los dominios I y II
transmembrana.
Se pueden ligar porciones de estos clones de
ADNc parciales para generar un ADNc de \alpha_{1H} de longitud
completa que usa sitios de endonucleasa de restricción común
compartidos entre los fragmentos que codifican \alpha_{1H}. Un
clon que codifica \alpha_{1H} de longitud completa se construyó
mediante 1) combinación del ADN que codifica el extremo 5' de
\alpha_{1H} presente en el clon 1.305 con el clon 1.205 usando
un sitio EcoRI común (nt 2433 a 2438 SEQ ID Nº 12); y 2) el clon
resultante, que codifica el extremo amino de \alpha_{1H} se
combinó con las secuencias terminales carboxi de \alpha_{1H}
codificadas en el clon 1.203 que usa el sitio de endonucleasa de
restricción EcoRV compartido entre el clon 1.205 y 1.203 (nt
4517-4522 de la SEQ ID Nº 12). La subunidad
\alpha_{1H} de de los canales de calcio de tipo humano de
longitud completa tiene 2353 restos de aminoácidos de longitud (SEQ
ID Nº 12). La construcción de expresión se ensambló en pCDNA1
(Invitrogen, San Diego, CA) e incluía un sitio de unión de ribosoma
de consenso (RBS) seguido de la secuencia que codifica
\alpha_{1H} de longitud completa (véase, para una descripción de
vectores basados en pcDNA 1 que contienen el RBS, véase, por
ejemplo, en la solicitud PCT internacional, Nº PCT/US94/09230,
véase, también la solicitud de Estados Unidos nº de serie
08/149.097, la patente de Estados Unidos Nº 5.851.824, y la patente
de Estados Unidos Nº 5.846.756). La construcción resultante se
denominó pcDNA 1\alpha_{1H}RBS.
Las corrientes de los canales de tipo T son
heterogéneas entre los diferentes tipos de células, con perfiles
variable de biofísicas y farmacológicas, y como se muestra en este y
los siguientes ejemplos se pueden producir por la expresión de
subtipos de la subunidad \alpha_{1} diferentes en células
diferentes.
Como se ha descrito anteriormente, los cebadores
1 y 2 de PCR, elegidos basándose en un alineamiento de las
secuencias \alpha_{1A}-\alpha_{1E} en la
región del bucle II/III citoplásmica central y el cebador 3
(GA(A/G)ATGATGATGAA(A/G)GT SEQ ID Nº 10)
se eligió después de considerar las secuencias de C. elegans
relacionadas con \alpha_{1} en el cósmico C54D2 con las
secuencias de ácido nucleico que codifican \alpha_{1} de tipo
humano.
Los ácidos nucleicos codificadores relacionados
con \alpha_{1} se amplificaron en dos etapas a partir de
poli(A) + ARN celular de TT, usando los cebadores 1 y 2
primero en una reacción de amplificación degenerada seguido del
cebador 3 y cebador 2 en una amplificación de PCR jerarquizada. Esto
da como resultado la amplificación de un fragmento de 340
nucleótidos que codifica una porción de la subunidad
\alpha_{1H}. Este producto de amplificación se usó como una
sonda para seleccionar la genoteca para aislar clones de ácido
nucleico que codifican una subunidad \alpha_{1H} de longitud
completa.
Usando una base de cebador sobre al secuencia de
\alpha_{1H-1} y RT - PCR en diversos tejidos,
las transcripciones con una supresión en fase con relación a
\alpha_{1H-1} se identificaron y se aislaron a
partir de la genoteca de células TT. Los fragmentos que extienden
esta supresión se aislaron y, cuando se alinearon se emparejaron
con la secuencia de \alpha_{1H-1} excepto para
una supresión de 957 pares de bases. un clon de longitud completa,
denominado \alpha_{1H-2} (véase la SEQ ID Nº
16), se construyó a partir de estos fragmentos, y se insertó en el
pcADN1 con el RBS como para \alpha_{1H-1}. Las
transcripciones de \alpha_{1H-2} se
identificaron en todos los tejidos examinados.
El ácido nucleico que codifica
\alpha_{1H-2} se produce por un ARN ayustado
alternativamente y tiene 957 nucleótidos en supresión de fase con
relación a \alpha_{1H-1}, como se detecta en los
productos PCR de numerosos tejidos y células, incluyendo ADNc
celular TT, ADNc de amígdala, ADNc de núcleo caudal, ADNc de
putamen, ADNc de corazón, ADNc de riñón y ADNc de hígado. Los
cebadores de PCR eran: (i) cebador de 5' correspondiente a la hebra
de polaridad positiva de \alpha_{1H-1} en el
nucleótido 1373 a 1393; (ii) cebador de 3' correspondiente a la
hebra de polaridad negativa de \alpha_{1H-1} en
el nucleótido 2657 a 2680.
Las SEQ ID números 12 y 15 muestran la secuencia
de nucleótidos de \alpha_{1H-1}. La secuencia
que codifica \alpha_{1H-1} comienza en el
nucleótido 249 y termina en 7310. (SEQ ID números 12 y 15 difieren
en consideraciones menores, por ejemplo, aminoácido 2230 (bases
6983-6985) es Asp (GAC) en al SEQ ID Nº 15 y Glu
(GAA) en la SEQ ID Nº 12).
La SEQ ID Nº 16 muestra la secuencia de
nucleótidos de la variante de ayuste
\alpha_{1H-2}. La secuencia codificadora para
\alpha_{1H-2} comienza en 249 y termina en
6353.
Los clones de ácido nucleico que codifican el
subtipo de los canales de calcio de tipo T \alpha_{1H} se
aislaron a partir de células TT. Aunque similar en la topografía de
la secuencia de nucleótidos global a otras subunidades de
\alpha_{1} HVA previamente clonadas, la subunidad
\alpha_{1H} contenía varias características inusuales,
incluyendo un gran bucle de dominio I-II, ausencia
del dominio de interacción de \alpha_{1} común, y propiedades
de selectividad de iones alterados. Se identificaron dos isoformas
de \alpha_{1H} denominadas \alpha_{1H-1} y
\alpha_{1H-2}. La primera
\alpha_{1H-1} es la mayor de las dos, y la
segunda \alpha_{1H-2} es la más pequeña de las
dos que contienen una supresión de 957 nucleótidos en el bucle
I-II con relación a
\alpha_{1H-1}. La secuencia de nucleótidos de
\alpha_{1H-1} se establece en la SEQ ID Nº 12 y
Nº 15 y la de \alpha_{1H-2} se establece en la
SEQ ID Nº 16. \alpha_{1H-2} contiene una
supresión de 957 nucleótidos con relación a
\alpha_{1H-1} que da como resultado una pérdida
de 319 aminoácidos (aminoácidos 470-788 de
\alpha1H-1) desde dentro del bucle intracelular
entre los dominios I y II. La supresión de la variante de ayuste se
identificó mediante PCR en todas las células y tejidos examinados.
Éstos incluyen células TT, amígdala, núcleo caudal, putamen,
corazón, riñón y células del hígado. En la expresión del cerebro es
principalmente en la amígdala, núcleo caudal y putamen. Hígado,
riñón y corazón tienen altos niveles. La secuencia codificadora
para \alpha_{1H-1} comienza en el nucleótido 249
y termina en el nucleótido 7310 mientras que la secuencia
codificadora para \alpha_{1H-2} comienza en el
nucleótido 249 y termina en el nucleótido 6353.
Antisuero policlonal se construyó para el
dominio de bucle intracelular II-III supuesto de la
subunidad \alpha_{1H}. Seguido de la expresión transitoria en
células HEK 293 se detectó una proteína del tamaño apropiado
mediante SDS - PAGE y transferencia de Western. La caracterización
funcional de los canales \alpha_{1H} de tipo humano se
proporciona en el Ejemplo 3.
Los materiales y procedimientos para el estudio
biofísico y farmacología de las subunidades de los canales de
calcio se describen en este Ejemplo y el Ejemplo 4 más adelante con
referencia a las subunidades previamente clonadas. Tales
procedimientos u otros procedimientos similares conocidos por los
expertos en la técnica se han usado para estudiar estas propiedades
de las subunidades \alpha_{1H-1} como se
describen en este Ejemplo.
Electrofisiología: Se transfectaron
transitoriamente células HEK 293 con 6 \mug de pcDNA1
\alpha_{1H}RBS usando un procedimiento de fosfato de Ca ^{2+}
convencional (véase, por ejemplo, el Ejemplo más adelante, también
Williams y col (1992) Neuron, 8: 71-84, para
procedimiento de transfección). pCMVCD4, un plásmido de expresión
de CD humano, se incluyó en las transfecciones como un marcador que
permite la identificación de células transfectadas. Antes de
registrar, las células se lavaron con solución de Ringer de
mamíferos, se incubaron durante aproximadamente 10 minutos en una
solución que contiene una dilución 1/1000 de perlas Dyna
M-450 CD4 (Dyna Inc., Lake Success, NY) y se
volvieron a lavar con solución de Ringer de mamíferos para retirar
el exceso de perlas. La expresión funcional de los canales de
\alpha_{1H} en células transfectadas se evaluó
24-48 horas después de la transfección usando la
técnica de match clamp de células enteras. Todos los registros se
realizaron en células individuales a temperatura ambiente
(19-24ºC). Las corrientes de células enteras se
registraron usando un Axopatch - 200A (Axon Instruments, Foster
City, CA) o un amplificador de patch clamp EPC-9
(HEKA elektronic, Lambretcht, Alemania), filtrado de paso bajo a 1
kHz (-3 dB, filtro Bessel de poste 8) y se digitalizó a una
velocidad de 10 kHz, salvo que se establezca otra cosa. Las pipetas
se fabricaron de vidrio de borosilicato (TW150, WPI, Sarasota, FI)),
revestidas con Sylgard (Dow Corning Midland, MI), y tenía una
resistencia de 1,1-2,0 M\Omega cuando se llena con
solución interna. La resistencia en serie era 2-5
M\Omega y se usó generalmente compensación de resistencia en serie
de 70-90%. La solución de pipeta contenía (en mM):
135 CsCl, 10 EGTA, 1 MfCl_{2}, 10 HEPES (pH 7,3, ajustado con Cs -
OH). La solución externa contenía (en mM): 15 BaCl_{2} o
CaCl_{2}, 150 Colina C1, 1 MgCl_{2}, 5 TEA-OH y
10 HEPES (pH 7,3, ajustado con HCl). Los registros de los canales
individuales contenían (en mM): 110 BaCl_{2}, 10 HEPES (pH 7,3,
ajustado con TEA-OH). El potencial de membrana de
las células individuales HEK 293 se estableció a cero con una
solución que contenía (en mM): 140 aspartato de K, 5 EGTA, y 10
HEPES (pH 7,3). Los potenciales de membrana en los registros de los
canales individuales no estaban corregidos para la compensación del
potencial de unión de líquido (+ 12 mV). Las corrientes de pérdida
lineal y capacitivas residuales se restaron en línea usando un
protocolo P/4 (registro de células enteras) o se escalaron rastreos
de canales individuales sin actividad (registros de los canales
individuales).
Fármacos: Mibefradil (Ro
40-5967) fue un regalo de F. Hoffman - LaROche.
Nimodiina y (-)Bay-8644 se obtuvieron de Research
Biochemiclas (Natick, MA). Las toxinas de péptidos
w-CgTx GVIA (conotoxina) y
\omega-CmTx MVIIC (conotoxina) se obtuvieron de
Bachem (Torrance, A). Todos los compuestos restantes se obtuvieron
de Sigma. Las soluciones madre se prepararon en dimetil sulfóxido
(amiloride, nimodipina), etanol ((-) BayK-8644) o
agua (verapamil, mibefradil, etosuximida,
\omega-CmT x GVIA y \omega-CmTx
MVIIC) y se almacenó a 4ºC. Los fármacos se prepararon recientes
cada día experimental a partir de soluciones madre y se aplicaron
mediante una bomba peristáltica a un caudal de < 0,5 ml/min. La
concentración de disolvente máxima en al solución de ensayo final
era < 0,1%. A estas concentraciones estos disolventes no tienen
efecto sobre las corrientes mediadas por \alpha_{1H}.
Estudios de ovocitos de Xenopus: Ranas
Xenopus laevis se compraron en Nasco (Fort Atkinson,
Wisconsin). Los ovocitos se incubaron en solución libre de Ca
^{2+} que contenía NaCl 88 mM, MgSO_{4} 0,82 mM, NaHCO_{3}
2,4 mM, HEPES 10 mM y 1,5 mg/ml de colagenasa A (Worthington,
Freehold NJ; Tipo 4, 1,5 horas y posteriormente Sigma, St. Louis,
MO, Eipo 1A, 0,5 horas). Después del tratamiento de colagenasa, los
ovocitos se transfirieron a solución de Ringer de rana que contenía
NaCl 88 mM, KCl 1 mM, CaCl_{2} 0,91 mM, MgSO_{4} 0,82 mM,
Ca(NO_{3})_{2} 0,33 mM, NaHCO_{3} 2,4 mM y
HEPES 10 mM. En estas condiciones, no se requería la retirada manual
de la capa de células de folículo. Los ovocitos se inyectaron con
50 ng (1 \mug/ml) de transcripciones in vitro que
codifican la subunidad \alpha_{1H} y se incubaron durante
3-5 días a 19ºC antes de registrar. El medio de
incubación era solución de Ringer de rana que contenía
penicilina/estreptomicina (Sigma; 10 ml/l), gentamicina (Sigma; 1
ml/l y suero de caballo inactivado por calo al 5% (Gibco,
Gaithersburg, MD). Se deslizaron los electrodos en un deslizador
horizontal (Modelo P80, Sutter Instruments, Novato, CA); se llenaron
con KCl 3 M; y se seleccionaron para resistencias en el intervalo
entre 0,5-2,0 M\Omega. Los datos se registraron
usando un GeneClamp 500; se digitalizaron a 1-5
kHz; y se almacenaron en discos magnéticos para análisis fuera de
línea usando software pClamp o Axograph (Axon Instruments). Las
corrientes de
Ba ^{2+} o Ca ^{2+} se registraron en una solución que contenía TEA-OH 36 mM, KOH 2,5 mM, manitol 75 mM, HEPES 10 mM y Ba(OH)_{2} o Ca(OH)_{2} 15 mM respectivamente a pH 7,3. Las corrientes se restaron las pérdidas de corriente usando el protocolo P/6. Para bloquear las corrientes de cloruro activadas por Ca ^{2+}, se incluyó ácido niflúmico (300 \muM) en los experimentos en los que se midió la permeabilidad relativa de los canales de \alpha_{1H} a Ba ^{2+} o Ca ^{2+}. Todos los valores se indican como media \pm D. E. salvo que se establezca otra cosa. Los fármacos (anteriores) se aplicaron mediante un sistema de infiltración de alimentación por gravedad. A las concentraciones usadas en esta memoria descriptiva, los disolventes no tenían efecto sobre las corrientes mediadas por \alpha_{1H}.
Ba ^{2+} o Ca ^{2+} se registraron en una solución que contenía TEA-OH 36 mM, KOH 2,5 mM, manitol 75 mM, HEPES 10 mM y Ba(OH)_{2} o Ca(OH)_{2} 15 mM respectivamente a pH 7,3. Las corrientes se restaron las pérdidas de corriente usando el protocolo P/6. Para bloquear las corrientes de cloruro activadas por Ca ^{2+}, se incluyó ácido niflúmico (300 \muM) en los experimentos en los que se midió la permeabilidad relativa de los canales de \alpha_{1H} a Ba ^{2+} o Ca ^{2+}. Todos los valores se indican como media \pm D. E. salvo que se establezca otra cosa. Los fármacos (anteriores) se aplicaron mediante un sistema de infiltración de alimentación por gravedad. A las concentraciones usadas en esta memoria descriptiva, los disolventes no tenían efecto sobre las corrientes mediadas por \alpha_{1H}.
La rápida inactivación de los canales de Ca
^{2+} de \alpha_{1H-1} eran altamente
dependientes de la tensión. La disminución de corriente se
describió mejor con una función exponencial variando las constantes
de tiempo entre 42,2 \pm 7,8 y 8,8 \pm 3,8 ms a potenciales de
membrana entre - 50 y + 30 mV (N = 6; datos no mostrados). La
cinética de activación de los canales de Ca ^{2+} de
\alpha_{1H-1} era también dependiente de la
tensión variando las constantes de tiempo entre 9,9 \pm 4,7 y 0,9
\pm 0,3 ms para potenciales de membrana entre - 50 y + 30 mV (n =
8; datos no mostrados). Los canales de
Ca ^{2+} de \alpha_{1H-1} se inactivaron completamente durante la despolarización de 150 ms. La recuperación de la inactivación se produjo en un período de \sim3 s con un componente rápido (\tau = 37 \pm 9 ms; 16,5 \pm 4,6% de todos los canales) y un componente lento (\tau = 37 \pm 61 ms; 78 \pm 8,5% de todos los canales; n = 3; datos no mostrados). Para confirmar las propiedades biofísicas de los canales \alpha_{1H} recombinantes observados en los registros de células completas a partir de las células HEK 293, se ensayó la expresión funcional de \alpha_{1H} en ovocitos de Xenopus. Se observaron solas las corrientes sustanciales (< 1 \muA) después de la inyección de transcripciones \alpha_{1H}.
Ca ^{2+} de \alpha_{1H-1} se inactivaron completamente durante la despolarización de 150 ms. La recuperación de la inactivación se produjo en un período de \sim3 s con un componente rápido (\tau = 37 \pm 9 ms; 16,5 \pm 4,6% de todos los canales) y un componente lento (\tau = 37 \pm 61 ms; 78 \pm 8,5% de todos los canales; n = 3; datos no mostrados). Para confirmar las propiedades biofísicas de los canales \alpha_{1H} recombinantes observados en los registros de células completas a partir de las células HEK 293, se ensayó la expresión funcional de \alpha_{1H} en ovocitos de Xenopus. Se observaron solas las corrientes sustanciales (< 1 \muA) después de la inyección de transcripciones \alpha_{1H}.
Se determinó la relación corriente - tensión
para Ba ^{2+} o Ca ^{2+} a partir de pequeñas cantidades.
Después de la transfección transitoria de las células HEK 293 con
un ADN que codifica la subunidad \alpha_{1H-1},
se observaron las corrientes de Ba ^{2+} que se inactivaban e
inactivaban rápidamente. Se midieron las corrientes de Ba ^{2+}
(15 mM) inducidas mediante las despolarizaciones por etapas para
diversos potenciales de ensayo a partir de un potencial de
mantenimiento de - 90 mV. Las corrientes se activaron a un potencial
de ensayo de - 50 mV, con máximos entre - 20 y - 10 mV, y se
invirtieron a un potencial de membrana más positivo que + 60 mV. Se
obtuvieron resultados similares con Ca ^{2+} (15 mM) como el
vehículo de carga.
La Figura 1 muestra la dependencia de la tensión
de la activación (moo) e inactivación en estado constante (h) de
los canales de calcio de \alpha_{1H} de tipo humano expresados
transitoriamente en células HEK. La dependencia de tensión de la
activación (moo) se determinó a partir del análisis de las
corrientes de cola. Las corrientes de cola se normalizaron con
respecto a la corriente de cola de pico máximo obtenida a +60 mV y
se representaron gráficamente (símbolos en círculos en blanco, media
\pm error típico de la media; n = 11) contra el potencial de
ensayo. Los datos se ajustaron mediante la suma de dos funciones
Boltzman
m \infty = FA * [1 + exp (-(V_{ensayo} -
V1/2, A)/KA)]1 + F_{B} *[1 + exp (-(V_{ensayo} - V_{^{1}/_{2}.
\ B})/K_{B})]^{-1}, F_{A} = 0,67, V_{^{1}/_{2}} = -21,5
mV, k_{A} = 7,5, F_{B} = 0,33, V_{^{1}/_{2}}\cdot_{B} =
25,5 mV, k_{B} = 14,7. La inactivación en estado constante (h
\infty) se determinó a partir de un potencial de mantenimiento de
- 100 mV mediante un pulso de ensayo a - 20 mV (p1), seguido de un
prepulso de 20 segundos desde - 100 mV a - 10 mV en decrementos (p
H antiguo) precedido de un segundo pulso de ensayo a - 20 mM (p2).
Las amplitudes de corrientes normalizadas se representaron
gráficamente (símbolos de círculo en negro, media \pm error
típico de la media; n = 9) contra el potencial de mantenimiento. Los
datos se ajustaron mediante una función de Boltzmann h \infty =
[1 + exp ((V_{mantenida} - V1/2, A)/k)]^{-1}, V_{^{1}/_{2}} =
63,9 mV, k = 3,9 mV.
Se estudiaron los perfiles de desactivación de
las corrientes de cola para los canales de calcio de \alpha_{1H}
en células HEK transfectadas de manera transitoria. Un sello de los
canales de LVA es su velocidad lenta de desactivación, que se
refleja en un disminución de actuación de las corrientes de cola. La
constante de tiempo de esta disminución es \sim10 veces más lenta
para los canales de LVA (2-12 ms) que para los
canales de HVA < 300 \mus. Se observó una lenta disminución de
las corrientes de cola mediadas por \alpha_{1H} durante un
período de \sim15 ms. Al contrario que la disminución
monoexponencial de las corrientes de cola reseñadas para muchos
canales de Ca ^{2+} nativos, las corrientes de cola de los canales
de \alpha_{1H-1} mostraron una disminución
biexponencial. A un potencial de ensayo de - 20 mV, la velocidad de
disminución del componente lento, que comprende 88,1 \pm 33,8% de
la corriente total, era 2,1 \pm 1,06 ms (n = 6), que es similar a
las observadas en los canales de Ca ^{2+} de tipo T nativos. La
velocidad de disminución del componente más rápido era 0,64 \pm
0,21 ms (n = 6). La lenta disminución de las corrientes de cola
mediadas por \alpha_{1H} se observaron durante un período de 15
ms.
La dependencia de tensión de la activación de
\alpha_{1H} que contiene los canales de Ca ^{2+} se determinó
a partir del análisis de las corrientes de cola. Las amplitudes de
las corrientes de cola normalizadas se representaron gráficamente
como una función de potencial de ensayo y reveló una curva de
activación bifásica que se ajustó mediante la suma de dos funciones
Boltzmann (Figura 1). Los potenciales para la activación semimáxima
de los términos de Boltzmann individuales eran como sigue: V
_{^{1}/_{2} \ A}: - 25,1 \pm 3 3,0 mV; y V _{^{1}/_{2} \ B}: +
25,5 \pm 3 9,9 mV (n = 11). Se ha reseñado previamente un valor
similar a V _{1/2 A} para la dependencia de tensión de la
activación de los canales de Ca ^{2+} de tipo T en la línea
celular TT humana (-27 mV). El valor del segundo término de
Boltzmann V _{^{1}/_{2} \ B} es algo similar al reseñado para los
canales de Ca ^{2+} HVA. Usando un protocolo similar, las
corrientes de cola de los canales de Ca ^{2+} HVA disminuyen con
las constantes de tiempo de < 300 \mus, mientras que con
\alpha_{1H} los más prominentes a los potenciales de ensayo
cierran a V _{^{1}/_{2} \ B}. La disponibilidad de los canales de
Ca ^{2+} que contienen \alpha_{1H} para la apertura dependía
de la membrana para el potencial como se muestra en la Figura 1. El
potencial para la inactivación en estado constante semimáxima (V
_{^{1}/_{2}}) era - 63,2 \pm 2,0 mV (n = 9).
La Figura 2 muestra la cinética de activación de
(Figura 2A) e inactivación (Figura 2B) de los canales de calcio de
\alpha_{1H}. La cinética de activación e inactivación se
determinaron a partir de pequeñas cantidades de corrientes mediante
ajuste de una función exponencial para aumentar (Figura 2A) o
disminuir (Figura 2B) la fase de la corriente. la dependencia de la
tensión para la activación e inactivación sigue aproximadamente una
función exponencial.
Se evaluó la recuperación de los canales de
\alpha_{1H} expresados de manera transitoria en células HEK 293
a partir de la inactivación inducida usando un protocolo de doble
pulso usando la despolarización de pulsos hasta - 20 mV. La
fracción de los canales recuperados se representó gráficamente
contra los intervalos entre pulsos y los puntos de datos se
ajustaron mediante una función biexponencial en la forma 1 = Ao + A1
exp (-t/\tau1) + A2 exp (-t/\tau2). \tau1:35 ms, A1: 0,165,
\tau2:337 ms, A2: 0,788.
Se determinaron las propiedades de los canales
de Ca ^{2+} de \alpha_{1H} en células HEK 293 en los
registros unidos a células con Ba ^{2+} 110 mM como el vehículo de
carga. Los registros de los canales individuales a un potencial de
ensayo de - 30 mV a partir de un parche a que contiene al menos tres
\alpha_{1H} mostraban que las aperturas de los canales de
producían en ráfagas y se agrupaban principalmente en el primer
tercio del pulso despolarizante de 10 ms, especialmente con
despolarizaciones más fuertes. Ocasionalmente, la actividad de los
canales se ampliaba a lo largo del recorrido completo. El transcurso
del tiempo de la corriente promediada conjunta registrada a - 30 mV
en 110 mM de Ba ^{2+} era similar a la corriente de Ba ^{2+} de
células enteras de \alpha_{1H} registrada a - 40 mV en 15
mM
Ba ^{2+}. Las corrientes se compararon a diferentes potenciales para compensar el desplazamiento en la curva de activación con potenciales más positivos debido al incremento en la concentración divalente. La relación de corriente - tensión unitaria produjo una conductancia de pendiente unitaria de 9,06 \pm 0,22 ps (n = 4).
Ba ^{2+}. Las corrientes se compararon a diferentes potenciales para compensar el desplazamiento en la curva de activación con potenciales más positivos debido al incremento en la concentración divalente. La relación de corriente - tensión unitaria produjo una conductancia de pendiente unitaria de 9,06 \pm 0,22 ps (n = 4).
Los canales de calcio de \alpha_{1H} de tipo
humano se caracterizaron además mediante la expresión transitoria
de ARNm de \alpha_{1H} en ovocitos de Xenopus. La inyección
de ARNm de \alpha_{1H-1} solo dio como
resultado la expresión de grandes corrientes, es decir, típicamente
> 1 \muA cuando se registra en Ba ^{2+} 15 mM. Los canales
de \alpha_{1H} se activaron a aproximadamente - 50 mV con
respuestas máximas entre - 30 mV y - 40 mV, que es consistente con
los canales activados por baja tensión. La permeabilidad de los
canales de \alpha_{1H} a Ca ^{2+} era ligeramente mayor que a
Ba ^{2+}. Al contrario que con el canal de alta tensión, los
canales de \alpha_{1H} se activaban lentamente (\tau = 13,4
\pm 1,9 ms en el máximo de la curva I-V, 12,2
\pm 1,5 ms a - 20 mV). Los canales de \alpha_{1H} expresados
en ovocitos eran sensibles a la inactivación de estado constante a
potenciales de membrana relativamente negativos (V1/2 = 64,5 \pm
1,0 mV) y se recuperaron rápidamente de la inactivación (\tau de
recuperación = 330 ms). Estos valores eran muy similares a los
obtenidos a partir de los canales de \alpha_{1H} expresados en
las células HEK 293. Las corrientes de Ba ^{2+} a lo largo de los
canales de \alpha_{1H} en ovocitos eran sensibles al bloqueo
mediante Ni ^{2+} y Cd con valores de CI_{50} de 6,3 \muM y
8,3 \muM, respectivamente. De los antagonistas ensayados,
solamente amiloride (CI_{50} = 2 \muM) inhibían de manera
notable las corrientes de ba ^{2+} mediadas por \alpha_{1H} a
través de los canales de \alpha_{1H} expresados en ovocitos.
Tomados juntos los resultados indican que \alpha_{1H} representa
una subunidad de los canales de calcio activados por baja
tensión.
Las relaciones corriente - tensión para las
corrientes Ba ^{2+} (15 mM) se registraron a partir de ovocitos
individuales inyectados con ARNm que codifica la subunidad
\alpha_{1H} de tipo humano. Las corrientes de Ba ^{2+} se
activaron a un potencial de membrana de aproximadamente - 50 mV y
máximos a - 30 mV. Las velocidades de inactivación relativas de los
canales de \alpha_{1H} de tipo humano se investigaron en
diferentes preparaciones de ovocitos y se compararon con las
velocidades de inactivación de los canales de
\alpha1A-2\alpha2b\delta\beta4a; canales
\alpha1B-1\alpha2b\delta\beta3a; y canales
\alpha1E-3\alpha2b\delta\beta1b. Las
corrientes de Ba ^{2+} se indujeron usando un comando de tensión
en el intervalo de - 120 mV a - 30 mV para los canales de
\alpha_{1H}, o - 90 mV a 0 mV o + 10 mV para los otros canales
que contienen \alpha_{1A}, \alpha_{1B} y \alpha_{1E}
respectivas. Los resultados presentados muestran el intervalo de
activación relativamente electro negativo de los canales de
\alpha_{1H} en comparación con los canales de calcio
\alpha1A-2\alpha2b\delta\beta4a,
\alpha1B-1\alpha2b\delta\beta3a y
\alpha1E- 3\alpha2b\delta\beta1b.
Las propiedades de permeabilidad e inactivación
de los canales de \alpha_{1H} se investigaron en ovocitos
mediante el estudio de las corrientes de Ba ^{2+} y Ca ^{2+}.
Los resultados muestran que las corrientes de Ba^{2+} no eran
significativamente mayores que las corrientes de Ca ^{2+} en
ovocitos que expresan la subunidad \alpha_{1H}. Los resultados
presentados en las curvas de inactivación de estado constante
normalizadas para las corrientes de Ba ^{2+} mediadas por
\alpha_{1H}, donde V1/2 se calculó para que fueran iguales a un
valor de - 64,5 \pm 1,0 mV. Se usó un protocolo de doble pulso, es
decir, con incremento de intervalos de tiempo entre pulsos para
examinar la recuperación de los canales de \alpha_{1H} de la
inactivación. Los resultados de la recuperación relativa de los
canales representados gráficamente contra el intervalo entre pulsos
(ms) y demostraron que las corrientes de los canales de
\alpha_{1H} se recuperaron rápidamente de la inactivación, con
una constante de tiempo media de 330 ms (n = 5).
Cd ^{2+} se encontró que antagoniza las
corrientes de \alpha_{1H} de tipo humano de bajo umbral en
ovocitos en una concentración diferente de Cd ^{2+}, una
CI_{50} de 10,3 \muM como se calculó. Ni ^{2+} también se
encontró que antagoniza los canales de \alpha_{1H} de tipo
humano de bajo umbral en ovocitos, y también de una manera
dependiente de la concentración. Se ensayó la inhibición de las
corrientes de Ba ^{2+} producidas mediante concentraciones
diferentes de Ni ^{2+} (n = 4 experimentos; n_{H} = 0,84). La
CI_{50} calculada para Ni ^{2+} era 6,3 \muM. El antagonismo
por Ni ^{2+} y Ba ^{2+} era ampliamente reversible.
Además, cada uno de Amiloride y Midefrabil
bloqueaban las corrientes de Ba ^{2+} de bajo umbral de una manera
dependiente de la concentración que proporcionaba una CI_{50}
calculada de 1,6 \muM para Amiloride; media de 7 experimentos,
n_{H} = 0,62) y media de 2,1 \muM para Midefradil; media de 4
experimentos, n_{H} = 0,71).
Estos resultados demuestran que la incorporación
de de una subunidad \alpha_{1H} en los canales de calcio
funcionales en las membranas de células, transmite las propiedades
electrofisiológicas y biofísicas de los canales de calcio,
particularmente de tipo T, activados por baja tensión sobre aquellos
canales. Los canales que contienen \alpha_{1H} se activaron
rápidamente a potenciales de membrana relativamente negativos (es
decir, V _{1/2} = 64,5 mV), y también se activaron rápidamente (es
decir, \tau = 12,2 ms a - 20 mV). Se observó la actividad de
apertura de los canales máxima a un potencial de membrana de - 30
mV. estos canales también mostraron aproximadamente una
permeabilidad igual para Ca ^{2+} y Ba ^{2+}.
Las propiedades farmacológicas de los canales
que contienen \alpha_{1H} también eran consistentes con
aquellas de los canales de calcio de bajo umbral. Están bloqueados
por Ni ^{2+} (CI_{50} = 6,3 \muM), Cd ^{2+} (CI_{50} =
10,3 \muM), Amiloride (CI_{50} = 16,1 \muM) y Mibefradil
(CI_{50} = 2,1 \muM).
La Tabla 4 resume las propiedades biofísicas de:
(i) canales de calcio que contienen
\alpha_{1H-1} de tipo humano expresados en
células HEK 293, (ii) canales que contienen
\alpha_{1H-1} de tipo humano expresados en
ovocitos de Xenopus, y (iv) canales de calcio de tipo T
humanos expresados en diversos tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades biofísicas de
\alpha_{1H-2}, reveló un desplazamiento en el V
_{^{1}/_{2}} de la inactivación isocrónica (20 segundos) a - 73
mV comparado con un V _{^{1}/_{2}} de - 62,5 mV para
\alpha_{1H-1}. La V _{^{1}/_{2}} de
\alpha_{1H-2}, de este modo muestra un intervalo
más cercano a los valores de V _{^{1}/_{2}} reseñados para
ciertos canales de calcio de tipo T (Huguenard (1996) Annual Rev.
Physiol. 58: 329-348). Por ejemplo, en condiciones
de registro similares la V_{^{1}/_{2}} de inactivación isocrónica
para los canales T en las neuronas del asta dorsal (DHN) del
movimiento se reseña que es - 82 mV, mientras que la V
_{^{1}/_{2}} registrado en las neuronas geniculadas laterales
(LGN) dorsales del movimiento es - 64 mV. Además, la V
_{^{1}/_{2}} de \alpha_{1H-2} más
estrechamente aproxima la V _{^{1}/_{2}} en DHN de ratas nativas
al valor para \alpha_{1H-1}, que, en su lugar,
se hace más cercano al valor registrado para los canales de calcio
de tipo T en LGN. De este modo, las diferencias observadas de la
secuencia de aminoácidos de las subunidades
\alpha_{1H-1} y
\alpha_{1H-2} parece que está ligado a las
diferencias en al distribución de tejidos de estas dos formas
diferentes del canal de \alpha_{1H-1}. Estos
resultados también proporcionan la base para entender los amplios
intervalos diferentes observados de valores que se han reseñado
para la inactivación de V _{^{1}/_{2}} de los canales de calcio
de tipo T (- 100 a - 50 mV) en tejidos diferentes (véase, por
ejemplo, Huguenard (1996) Annual Rev. Physiol. 58:
329-348).
La Tabla 5 resume las propiedades biofísicas de
los canales de calcio que contienen las subunidades \alpha_{1H}
de tipo humano.
Se ensayo la sensibilidad de los canales de Ca
^{2+} de \alpha_{1H} expresados en células HEK 293 a varios
agentes conocidos que se sabe que actúan en VGCCs (tabla más
adelante). Las corrientes mediadas por \alpha_{1H} eran 10
veces más sensibles a Ni ^{2+} (CI_{50} = 6,6 \muM) que a Cd
^{2+} (CI_{50} = 104 \muM). Las corrientes también se
inhibían por los antagonistas de los canales de tipo T amiloride
(CI_{50} = 167 \muM) y mibefradil (51,0 \pm 10,0% a 1 \muM;
n = 5). Por el contrario, el antagonista de los canales de tipo T
eoxsuximide producía poca inhibición de las corrientes mediadas por
\alpha_{1H} (7,2 \pm 1,8% de inhibición a 300 \muM; n = 5).
El inhibidor de los canales de calcio verapamil, el antagonista de
tipo L nimopidine, y el agonista de tipo L (-)Bay K 8644 tenía poco
efecto sobre los canales de \alpha_{1H} a una concentración de
1 \muM. Una concentración más alta (10 \muM) de nimodipina o
(-)Bay K 8644 producía una notable inhibición (43,7 \pm 4,1%, n =
4, y 18,1 \pm 9,1%, n = 5, respectivamente). Las toxinas de
péptido \omega- CgTx GVIA y \omega-CmTx MVIIC a
una concentración de 1 \muM proporcionó poca o ninguna inhibición
de las corrientes mediadas por \alpha_{1H}.
Los estudios farmacéuticos revelan que el
siguiente orden de graduación de potencia para la inhibición que
contienen \alpha_{1H-1}: Ni ^{2+} (CI_{50} =
6,6 \muM) \approx mibefradil (51% a 1 \muM) > Cd ^{2+}
(CI_{50} = 167 \muM) >> Etosuximide (7% a 300 \muM).
Nimodipine, Verapamil, \omega-CgTx GVIA y
\omega-CmTx MVIIC tiene poco efecto
(0-17%) a una concentración de 1 \muM. Estos
hallazgos demuestran que los canales de calcio que contienen
\alpha_{1H} tienen propiedades correspondientes a canales de
calcio de LVA, o de tipo T nativos.
La tabla 6 resume el perfil farmacológico de los
canales de calcio que contienen \alpha_{1H} expresados en
células HEK 293. Con la excepción de \omega-CmTx
MVIIC, en todos los casos el vehículo de carga era Ba ^{2+} 15
mM. En el caso de \omega-CmTx MVIIC el vehículo de
carga era Ba ^{2+} 2 mM debido a que \omega-CmTx
MVIIC era un inhibidor más eficaz a concentraciones divalentes
menores Los valores para el % de bloqueo son media \pm D E (n).
Los valores de CI_{50} se calcularon a partir de los datos de
ajuste de curva sigmoidea (Prism, Graphpad, Inc.) para los puntos
de datos de 3 a 6 determinaciones.
Los procedimientos y ensayos descritos en este
ejemplo, se pueden emplear usando el ácido nucleico que codifica
una subunidad \alpha_{1H} en lugar de las subunidades
\alpha_{1} ejemplificadas más adelante. De particular interés
son las células que expresan la subunidad \alpha_{1H} sola, como
hormonas, monómeros o multímeros, o en combinación con las
subunidades \alpha_{2} seleccionadas.
Las células DG44 [células de ovario de hámster
chino dhfr; véase, por ejemplo, Urlaub, G. y col., (1986) Som.
Cell Molec. Genet. 12: 555-566] obtenidas de
Lawrence Chasin en la Universidad de Columbia se transfectaron
establemente mediante los procedimientos de precipitación con
CaPO_{4} [Wigler y col., (1979) Proc. Natl. Acad. Sci.
Estados Unidos 76: 1373-1376] con el vector pSV2dhfr
que contenía el ADNc de la subunidad \alpha_{2} de los canales
de calcio neuronales de tipo humano para la expresión/selección
policistrónica en células transfectadas. Se desarrollaron los
transfectantes en medio DMEM al 10% sin hipoxantina o timidita con
el fin de seleccionar las células que habían incorporado el vector
de expresión. Se establecieron doce líneas celulares transfectantes
según indicaba su capacidad para sobrevivir en este medio.
Se extrajo el ARN total según el procedimiento
de Birnboim [(1988) Nuc. Acids Res. 16:
1487-1497] a partir de cuatro líneas celulares de
DG44 que se habían transfectado establemente con pSV2dhfr que
contenía el ADNc de la subunidad \alpha_{2} de los canales de
calcio neuronales de tipo humano. Se separó el ARN (\sim15 \mug
por banda) en un gel de azarosa al 1% formaldehído, se transfirió a
nitrocelulosa y se hibridó al ADNc de \alpha_{2} de los canales
de calcio neuronales de tipo humano cebado aleatoriamente
(hibridación: formamida al 50%, SSOE 5 x, solución de Denhardt 5 x,
42ºC; lavado: SSPE 0,2 x, SDS al 0,1%, 65ºC.) El análisis de
transferencia de Northern del ARN total de cuatro de las líneas
celulares de DG44 que se habían transfectado establemente con
pSV2dhfr que contenía el ADNc de la subunidad \alpha_{2} de los
canales de calcio neuronales de tipo humano reveló que una de las
cuatro líneas celulares contenía el tamaño de ARNm de hibridación
esperado para la transcripción del ADNc de la subunidad
\alpha_{2}. (500 nt en función del tamaño del ADNc) cuando se
desarrolla en presencia de butirato de sodio 10 mM durante dos días.
El butirato induce no específicamente la transcripción y a menudo
se usa para inducir el promotor temprano de SV40 [Gorman, C. y
Howard, B. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 1631]. Esta línea
celular, 44\alpha_{2}-9, también producía
espacies de ARNm más pequeñas (varias especies) y mayores (6800 nt)
que el tamaño esperado para la transcripción del ADN de
\alpha_{2} de (5000 nt) que se hibridó a la sonda a base de ADNc
de \alpha_{2}. Las transcripciones de 5000 y 6800 nt producidos
mediante este transfectante debe contener la subunidad
\alpha_{2} entera que codifica la secuencia y por lo tanto debe
producir una proteína de la subunidad \alpha_{2} de longitud
completa. Una transcripción de 8000 nucleótidos que se hibrida
débilmente estaba presente en las células de DG44 no transfectadas
y transfectadas. Aparentemente, las células DG44 transcriben un gen
de la subunidad de \alpha_{2} de los canales de calcio o
similar a niveles bajos. El nivel de expresión de esta transcripción
de la subunidad \alpha_{2} endógena no parecía estar afectada
mediante la exposición de las células al butirato antes del
aislamiento de ARN para análisis de northern.
Se extrajo la proteína total de tres de las
líneas celulares de DG44 que se habían transfectado establemente
con pSV2dhfrque contenía el ADNc de la subunidad \alpha_{2} de
los canales de calcio neuronales de tipo humano. Aproximadamente se
sonicaron 10^{7} células en 300 \mul de una solución que
contenía HEPES 50 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Un volumen igual de
tinte de carga 2 x [Laemmli, Reino Unido, (1970). Nature 227:
680] se añadió a las muestras y se sometió la proteína a
electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8% y después se
electrotransfirió a nitrocelulosa. La nitrocelulosa se incubó con
antisueros de cobayas policlonales (dilución 1:200) dirigido contra
la subunidad \alpha_{2} de los canales de calcio de los músculos
esqueléticos de conejo (obtenidos de K. Campbell, Universidad de
Iowa) seguido de la incubación con proteína A-[^{125}I]. La
transferencia se expuso a una película de Rayos X a -70ºC. Las
muestras reducidas de la proteína de las células transfectadas así
como de las células no transfectadas contenían proteína
inmunorreactiva del tamaño esperado para la subunidad
\alpha_{2} del canal de calcio neuronal de tipo humano
(130-150 kDa). El nivel de esta proteína
inmunorreactiva era más alto en las células
44\alpha_{2}-9 que se habían desarrollado en
presencia de butirato de sodio 10 mM que en las células
44\alpha_{2}-9 que se desarrollaron en ausencia
de butirato de sodio. Estos datos se correlacionan bien con los
obtenidos en los análisis de northern del ARN total de las células
44\alpha_{2}-9 y DG44 transfectadas. La línea
celular 44\alpha_{2}-9 también producía una
proteína inmunorreactiva de 110 kd que bien puede ser un producto de
degradación proteolítica de la subunidad \alpha_{2} de longitud
completa o un producto de traducción de uno de los ARNm más cortos
(< 5000 nt) producido en esta línea celular que se hibridaza a la
sonda de ADNc de la subunidad \alpha_{2}.
Las células de riñón embrionarias de tipo humano
(células HEK 293) se transfectaron transitoria y establemente con
el ADN neuronal humano que codifica las subunidadaes de los canales
de calcio. Los transfectantes individuales se analizaron
electrofisiológicamente para la presencia de corrientes de bario
activadas por la tensión y los canales de calcio dependientes de la
tensión.
Los vectores de expresión separados que
contienen ADN que codifica las subunidades \alpha_{1},
\alpha_{2} y \beta_{1} de los canales de calcio neuronales
de tipo humano, plásmidos pVDCCIII (A), pHBCaCH\alpha_{2}A y
pHBCaCH\beta_{1a}RBS (A), respectivamente se construyeron como
se describe en la solicitud PCT internacional Nº PCT/US94/09230,
véase, también la solicitud de Estados Unidos Nº de serie
08/149.097. Estos tres vectores se utilizaron para cotransfectar
transitoriamente las células HEK 293. Para la transfección estable
de las células HEK 293 se utilizó el vector
pHBCaCH\beta_{1b}RBS (A) en lugar de pHBCaCH\beta_{1a}RBS
(A) para introducir el ADN que codifica la subunidad \beta_{1}
en las células junto con pVDCCIII (A) y pHBCaCH\alpha_{2}A.
Los vectores de expresión pVDCCIII (A),
pHBCaCH\alpha_{2}A y pHBCaCH\beta_{1a}RBS (A) se utilizaron
en dos conjuntos de transfecciones transitoriaes de células HK 293
(Nº de acceso de la ATCC CRL1573). En un procedimiento de
transfección, las células HEK 293 se cotransfectaron
transitoriamente con el plásmido de expresión de ADNc de la
subunidad \alpha_{1}, el plásmido de expresión de ADNc de la
subunidad \alpha_{2}, el plásmido de expresión de ADNc de la
subunidad \beta_{2} y el plásmido pCMV\betagal (Clontech
Laboratorios, Palo Alto, CA). El plásmido pCMV\betagal contiene
el gen lacZ (que codifica la
\beta-galactosidasa de E. coli) fusionada
al promotor de citomegalovirus (CMV) y se incluyó en esta
transfección como gen marcador para controlar la eficacia de la
transfección. En el otro procedimiento de transfección, las células
HEK 293 se cotransfectaron transitoriamente con en plásmido
pVDCCIII de expresión de ADNc de la subunidad \alpha_{1} y
pCMV\betagal. En ambas transfecciones, 2-4 x
10^{6} células HEK 293 en placas de cultivo de tejidos de 10 cm
se cotransfectaron transitoriamente con 5 \mug de cada uno de los
plásmidos incluidos en los experimentos según los procedimientos de
transfección de precipitación con CaPO_{4} (Wigler y col., (1979)
Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 76:
1373-1376). Se analizaron los transfectantes para la
expresión de \beta-galactosidasa mediante la
tinción directa del producto de una reacción que implica
\beta-galactosidasa y el sustrato de
X-gal [Jones, J. R. (1986) EMBO 5:
3133-3142] y mediante la medición de la actividad de
la \beta-galactosidasa [Miller, J. H. (1972)
Experiments in Molecular Genetics, pp. 352-355, Cold
Spring Harbor Press]. Para evaluar la expresión del ADNc de las
subunidades en estos transfectantes, se analizaron las células para
la producción de las transcripciones de las subunidades (análisis de
northern), producción de las proteínas de inducción (análisis de
inmunotransferencia de lisados celulares) y expresión de los canales
de calcio funcionales (análisis electrofisiológico).
Se transfectaron células HEK 293 usando el
procedimiento de transfección de fosfato de calcio [Current
Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Wiley Inter - Science,
Supplement 14, Unit 9.1.1-9.1.9 (1990)]. Placas de
diez cm que contenía cada una entre uno y dos millones de células
HEK 293 se transfectaron con 1 ml de precipitado de ADN/fosfato de
calcio que contenía 5 \mug de pVDCCIII (A), 5 \mug de pVDCCIII
(A), 5 \mug de pHBCaCH\alpha_{2}A, 5 \mug de
pHBCaCH\beta_{1b}RBS (A), 5 \mug de pCMVBgal y 1 \mug de
pSV2neo (como marcador seleccionable). Después de
10-20 días se desarrollo en medio que contenía 500
\mug de G418, se habían formado las colonias y se aislaron usando
cilindros de clonación.
Se ensayaron los transfectantes transitorios
para la expresión de la \beta-galactosidasa
mediante ensayos de actividad de
\beta-galactosidasa (Miller, J. H., (1972)
Experiments in Molecular Genetics, p. 352-355, Cold
Spring Harbor Press) de lisados de células (preparados como se
describe en la solicitud PCT internacional Nº PCT/US94/09230,
véase, también la solicitud de Estados Unidos Nº de serie
08/149.097) y la tinción de las células fijadas (Jones, J. R.
(1986) EMBO 5: 3133-3142). Los resultados de
estos ensayos indican que aproximadamente el 30% de las células HEK
293 se habían transfectado.
Se aisló Poli A+ ARN usando el kit de Invitrogen
Fast Trak (Invitrogen, San Diego, CA) de células HEK 293
transfectadas transitoriamente con ADN que codifica cada una de las
subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen
lacZ o la subunidad \alpha_{1} y el gen lacZ. Se
sometió el ARN a electroforesis en un gel de agarosa y se
transfirió a nitrocelulosa. Después la nitrocelulosa se hibridó con
una o más de las siguientes sondas marcadas radiactivamente: el gen
lacZ, el ADNc que codifica la subunidad \alpha_{1D} de
los canales de calcio neuronales de tipo humano, el ADNc que
codifica la subunidad \alpha_{2} de los canales de calcio
neuronales de tipo humano o el ADNc que codifica la subunidad
\beta_{1} de los canales de calcio neuronales de tipo humano.
Dos transcripciones que se hibridaron con el ADNc que codifica la
subunidad \alpha_{1} se detectaron en las células HEK 293
transfectadas con el ADN que codifica las subunidades
\alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen lacZ
así como en las células HEK 293 transfectadas con el ADNc de la
subunidad \alpha_{1} y el gen lacZ. Una especie de ARNm
tenía el tamaño esperado para la transcripción del ADNc de la
subunidad \alpha_{1} (8000 nucleótidos). La segunda especie de
ARN era más pequeña (4000 nucleótidos) que el tamaño esperado para
esta transcripción. El ARN del tamaño esperado para la
transcripción del gen lacZ se detectó en las células
transfectadas con el ADNc que codifica las subunidades
\alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen lacZ
y en las células transfectadas con el ADNc de la subunidad
\alpha_{1} y el gen lacZ mediante hibridación a la
secuencia del gen lacZ.
El ARN de las células transfectadas con el ADNc
que codifica las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y
\beta_{1} y el gen lacZ también se hibridaron con las
sondas del ADNc de las subunidades \alpha_{2} y \beta_{1}.
Se hibridaron dos especies de ARNm a la sonda de ADNc de la
subunidad \alpha_{2}. Una especie era del tamaño esperado para
la transcripción del ADNc de la subunidad \alpha_{2} (4000
nucleótidos). Las otras especies eran mayores (6000 nucleótidos)
que el tamaño esperado de esta transcripción. Múltiples especies de
ARN en las células cotransfectadas con el ADNc que codifica las
subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen
lacZ se hibridaron a la sonda de ADNc de la subunidad
\beta_{1}. Se produjeron múltiples transcripciones de la
subunidad \beta de tamaños variables ya que el vector de expresión
del ADNc de la subunidad \beta contiene dos sitios de adición de
poli A^{+} potenciales.
Las células HEK 293 individuales transfectadas
transitoriamente se ensayaron para la presencia de corrientes de
bario dependientes de tensión usando la variante de célula entera de
la técnica de pinzamiento zonal [Hamill y col., (1981). Pflugers
Arch. 391: 85-100]. Las células HEK 293
transfectadas transitoriamente con pCMV\betagal se ensayaron
solamente para corrientes de bario como un control negativo en estos
experimentos. Se situaron las células en una solución de baño que
contenía iones de bario para servir como portador de corriente. Se
utilizó cloruro de colina en lugar de NaCl o KCl como el componente
principal de la sal de la solución del baño para eliminar las
corrientes a través de los canales de sodio y potasio. La solución
del baño contenía MgCl_{2} 1 mM y se tamponó a pH 7,3 con HEPES
10 mM (pH ajustado con hidróxido de sodio o de tetraetilamonio).
Las pipetas zonales se llenaron con una solución que contenía CsCl
135 mM, MgCl_{2} 1 mM, glucosa 10 mM, EGTA 10 mM, ATP 4 mM y
HEPES 10 mM (pH ajustado hasta 7,3 con hidróxido de
tetraetilamonio). Los iones de cesio y tetraetilamonio bloquean la
mayoría de los tipos de los canales de potasio. Las pipetas se
recubrieron con Sylgard (Dow - Corning, Midland, MI) y tenían
resistencias entre 1 y 4 megohm. Las corrientes se midieron
mediante un resistor de headstage de 500 megohm con el amplificador
Axopatch IC (Axon Instruments, Foster City, CA), interconectada con
un tablero de adquisición de datos Labmaster (Scientific Solutions,
Solon, OH) en un PC compatible IBM. Se utilizó PClamp (Axon
instruments) para generar los comandos de tensión y adquirir datos.
Se analizaron los datos con los programas pClamp o Quattro
Professional (Borland Internacional, Scotts Valley, CA).
Para aplicar los fármacos, se usaron pipetas de
"golpe de pistón" posicionadas dentro de varios micrómetros de
la célula en estudio para aplicar las soluciones mediante aplicación
a presión. El fármaco utilizado para la caracterización
farmacológica se disolvió en una solución idéntica a la solución del
baño. Las muestras de una solución madre 10 mM de Bay K 8644 (RBI,
Natick, MA) que se había preparado en DMSO, se diluyeron hasta una
concentración final de 1 \muM en una solución del baño que
contenía Ba^{2+} 15 mM antes de que se aplicaran.
Se analizaron veintiún controles negativos de
células HEK 293 (transfectadas transitoriamente con el vector de
expresión pCMV\betagal del gen lacZ solamente mediante la
variante de la célula completa del procedimiento del match clamp
para registrar las corrientes. Solamente una célula mostró una
corriente interna de bario discernible; esta corriente no se afectó
por la presencia de Bay K 8644 1 \muM. Además, la aplicación de
Bay K 8644 a cuatro células que no mostraron corrientes de
Ba^{2+} no producían la aparición de ninguna corriente.
Dos días después de la transfección transitoria
de las células HEK 293 con el ADNc que codifica las subunidades
\alpha_{1}, \alpha_{2} y \beta_{1} y el gen lacZ,
se ensayaron los transfectantes individuales para las corrientes de
bario dependientes de la tensión. Las corrientes. Se registraron las
corrientes en nueve transfectantes. Debido a que la eficacia de la
transfección de una célula puede variar de la eficacia de
transfección de otra célula, el grado de expresión de las proteínas
heterólogas en los transfectantes individuales varía y algunas
células no incorporan o expresan el ADN extraño. Las corrientes de
bario internas se detectaron en dos de estos nueve transfectantes.
En estos ensayos el potencial de mantenimiento era de -90 mV. Se
despolarizó la membrana en una serie de etapas de tensión a
diferentes potenciales de ensayo y se registró la corriente en
presencia y ausencia Bay K 8644 1 \muM. La corriente de bario
interna se potenció significativamente en magnitud mediante la
adición de Bay K 8644. La mayor corriente de bario interna
(\sim160 pA) se registró cuando la membrana se despolarizó hasta
0 mV en presencia de Bay K 8644 1 \muM. Una comparación de las
curvas I-V, generadas mediante el trazado de de la
curva mayor registrada después de cada despolarización frete a la
tensión de despolarización, correspondiente a los registros
llevados a cabo en ausencia y presencia de Bay K 8644 ilustraron el
aumento de de la corriente activada por tensión en presencia de Bay
K 8644.
Las corrientes de cola pronunciadas se
detectaron en los trazados de las corrientes generadas en presencia
de Bay K 8644 en las células HEK 293 transfectadas con el ADNc que
codifica las subunidades \alpha_{1}, \alpha_{2} y
\beta_{1} y el gen lacZ, indicando que los canales de
calcio recombinantes responsables de las corrientes de bario
activadas por tensión registradas en esta transfectada parecía ser
sensible a DHP.
La segunda de las dos células transfectadas que
mostraba corrientes de bario internas expresaba una corriente de
\sim50 pA cuando se despolarizaba la membrana desde - 90 mV. Esta
corriente se bloqueaba casi completamente con cadmio 200 \muM, un
bloqueante de los canales de calcio establecido.
Diez células que se transfectaron
transitoriamente con el ADN que codifica la subunidad \alpha_{1}
y el gen lacZ se analizaron mediante los procedimientos de
pinzamiento zonal de células enteras dios días después de la
transfección. Una de estas células mostró una corriente de bario
interna de 30 pA. Esta corriente amplificada dos veces en presencia
de Bay K 8644 1 \muM. además, se detectaron pequeñas corrientes de
cola en presencia de Bay K 8644. Estos datos indican que la
expresión del el ADNc que codifica las subunidades \alpha_{1D}
de los acanales de calcio neuronales de tipo humano en las células
HEK 293 produce un canal de calcio funcional sensible a DHP.
Las células HEK 293 individuales transfectadas
establemente se ensayaron electrofisiológicamente para la presencia
de corrientes de bario dependientes de la tensión como se describe
para el análisis de electrofisiológicamente de células HEK 293
transfectadas transitoriamente (véase el ejemplo VII. B. 2c.). En un
esfuerzo para maximizar la actividad de de los canales de calcio
mediante la fosforilación mediada por quinasas dependiente de AMP
cíclico [Pelzer y col., (1990) Rev. Physiol. Biochem.
Pharmacol 114: 107-207], se añadió cAMP (sal
sódica 250 \muM) a la solución de la pipeta y se añadió forskolin
(10 \muM) a la solución del baño en alguno de los registros. Se
obtuvieron resultados cualitativamente similares si estos compuestos
estaban presentes o no.
Se registraron corrientes de bario de las
células transfectadas establemente en ausencia y presencia de Bay K
8644 (1 \muM). Cuando se despolarizó la célula hasta - 10 mV desde
un potencial de mantenimiento de - 90 mV en ausencia de Bay K 8644,
se registró una corriente de aproximadamente 35 pA con una corriente
de cola que se desactivaba rápidamente. Durante la aplicación de
Bay K 8644, un protocolo despolarizante idéntico producía como
respuesta una corriente de aproximadamente 75 pA, acompañada de una
corriente de cola aumentada y prolongada. Se valoró la magnitud
máxima de las corrientes registradas desde este mismo canal como
función de una serie de tensiones despolarizantes. Las respuestas
en presencia de Bay K 8644 no solamente aumentaban, sino que la
relación de la tensión de la corriente entera se desplazaba
aproximadamente - 10 mV. Así que, se observaron tres típicos
contrastes de acción de Bay K 8644, a saber magnitud de aumento de
corriente, corrientes de cola prolongadas y tensión de activación
desplazada negativamente, que indicaban claramente la expresión de
un canal de calcio sensible a DHP en estas células transfectadas
establemente.. No se observaron ninguno de dichos efectos en las
células HEK 293 no transfectadas, bien con o sin cAMP o
forskolin.
Se construyeron vectores de expresión
adicionales usando pCMV. El ADNc de \alpha_{1D} de longitud
completa de pVDCCIII (A) (véase la solicitud PCT internacional Nº
PCT/US94/09230, véase, también la solicitud de Estados Unidos Nº de
serie 08/149.097), el ADNc de \alpha_{2} de longitud completa
contenido en un fragmento EcoRI de 3600 kp de HBCaCH \alpha_{2}
(véase la solicitud PCT internacional Nº PCT/US94/09230, véase,
también la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 08/149.097) y un
ADNc de la subunidad \beta_{1} de longitud completa de
pHBCaCH\beta_{1b}RBS (A) (véase la solicitud PCT internacional
Nº PCT/US94/09230, véase, también la solicitud de Estados Unidos Nº
de serie 08/149.097) se subclonaron separadamente en el plásmido
pCMV\betagal. El plásmido pCMV\betagal se digirió con
NotI para retirar el gen lacZ. La porción del vector
restante del plásmido, denominada pCMV, se despuntó en los sitios
NotI. El ADN que codifica \alpha_{2} de longitud
completa y el ADN que codifica \beta_{1}, contenidos los
fragmentos EcoRI separados se aislaron, se despuntaron y se
ligaron separadamente al fragmento del vector despuntado de pCMV que
localizan el ADN entre el promotor de CMV y los sitios de
poliadenilación de SV40 en pCMV. Para ligar el ADNc que codifica
\alpha_{1D} con pCMV, los sitios de restricción en los
poliengarces inmediatamente 5' del promotor de CMV e inmediatamente
3' del sitio de poliadenilación SV40 se retiraron de pCMV. Se añadió
un poliengarce en el sitio NotI. El polienengarce tenía la
siguiente secuencia de los sitios de reconocimiento de enzimas de
restricción:
Después el ADN que codifica \alpha_{1D}
aislado como un fragmento BamHI/XhoI de pVDCCIII (A) se ligó
a pCMV digerido con XbaII/SalI para situarlo entre el
promotor de CMV y el sitio de poliadenilación de SV40.
El plásmido pCMV contiene el promotor CMV lo
mismo que pADNc1, pero difiere de pADNc en la localización de los
sitios de donante de ayuste/aceptor de ayuste relativos al ADN que
codifica la subunidad insertada. Después de la inserción el ADN que
codifica la subunidad en pCMV los sitios de donante de
ayuste/aceptor de ayuste se localizan en 3' del promotor de CMV y
5' del codón de partida de ADN que codifica la subunidad. Después
de la inserción del ADN que codifica la subunidad en pADNc1, los
sitios de donante de ayuste/aceptor de ayuste se localizan en 3'
del codón de parada del ADNc de la subunidad.
Las células HEK 293 se cotransfectaron con el
ADN que codifica las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y
\beta_{1} en pCMV o con el ADN que codifica las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta en pADNc1 (vectores
pVDCCIII (A), pHBCaCH\alpha_{2}A y
pHBCaCH\beta_{1b}RBS (A), respectivamente, como se describe en el ejemplo VII. B. 1. a. El plásmido pCMV\betagal se incluyó en cada transfección como una medida de la eficacia de transfección. Los resultados de los ensayos de \beta-galactosidasa de los transfectantes (véase la solicitud PCT internacional Nº PCT/US94/09230, véase, también la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 08/149.097), indicaron que las células HEK 293 se transfectaron de manera igual eficazmente con plásmidos a base de pCMV- y pADNc1. Sin embargo, los plásmidos, a base de pADNc1 se prefieren actualmente para la expresión de los receptores de los canales de calcio.
pHBCaCH\beta_{1b}RBS (A), respectivamente, como se describe en el ejemplo VII. B. 1. a. El plásmido pCMV\betagal se incluyó en cada transfección como una medida de la eficacia de transfección. Los resultados de los ensayos de \beta-galactosidasa de los transfectantes (véase la solicitud PCT internacional Nº PCT/US94/09230, véase, también la solicitud de Estados Unidos Nº de serie 08/149.097), indicaron que las células HEK 293 se transfectaron de manera igual eficazmente con plásmidos a base de pCMV- y pADNc1. Sin embargo, los plásmidos, a base de pADNc1 se prefieren actualmente para la expresión de los receptores de los canales de calcio.
Se inyectaron diversas combinaciones de las
transcripciones de ADN que codifican las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1} preparados in
vitro en ovocitos de Xenopus laevis. Los inyectados con
combinaciones que incluyen \alpha_{1D} exhibían corrientes de
bario activadas por tensión.
Las transcripciones que codifican las
subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1} de los
canales de calcio neuronales de tipo humano se sintetizaron según
las instrucciones del kit CAPPING de ARNm de mCAP (Stratagene La
Jolla, CA, número de catálogo 200350). Como se describe en la
solicitud PCT internacional Nº PCT/US94/09230, véase, también la
solicitud de Estados Unidos Nº de serie 08/149.097 los plásmidos
pVDCC III. RBS (A), que contenían pADNc1 y el ADNc de
\alpha_{1D} que comienza con un sitio de unión a ribosomas y el
codón octavo ATG de la secuencia codificadora, el plásmido
pHBCaCH\alpha_{1}A que contiene pADNc1 y un ADNc de la
subunidad \alpha_{2}, y el plásmido pHBCaCH\beta_{1b}RSB (A)
que contiene pADNc1 y el ADN de \beta_{1} carente de la
secuencia de intrones y que contiene un sitio de unión a ribosomas
se linealizaron mediante digestión de restricción. Los plásmidos
que codifican la subunidad \alpha_{2} y el ADNc de
\alpha_{1D} se digirieron con XhoI y el plásmido que
codifica la subunidad \beta_{1} se digirió con EcoRV. La
inserción de ADN se transcribió con RNApolimerasa de T7.
Los ovocitos de Xenopus laevis se
aislaron y se desfolicularon mediante tratamiento con colagenasa y
se mantuvieron en NaCl 100 mM, KCl 2 mM, CaCl_{2} 1,8 mM, HEPES 5
mM, pH7,6, 20 \mug/ml de estreptomicina a 19-25ºC
durante 2 a 5 días después de la inyección y antes de realizar los
registros. Para cada transcripción que se inyectó en el ovocito, se
inyectaron 6 ng del ARNm específico por célula en un volumen total
de 50 nl.
Se examinaron los ovocitos inyectados para las
corrientes de bario dependientes de la tensión usando los
procedimientos de pinzamiento de tensión de dos electrodos [Dascal,
N. (1987) CRC Crit. Rev. Biochem. 22: 317]. Se utilizó el
paquete de software pClamp (Axon Instruments) junto con una
interconexión de adquisición de datos Labmaster de 125 kHz para
generar los comandos de tensión y adquirir y analizar los datos.
También se utilizó Quattro Professional en este análisis. Se
digitalizaron las señales de las corrientes a 1 - 5 kHz y se
filtraron apropiadamente. La solución del baño contenía lo
siguiente: BaCl_{2} 40 mM, cloruro de tetraetilamonio 36 mM
(abreviadamente TEA-Cl), ClK 2 mM,
4-aminopiridina 5 mM, ácido niflúmico 0,15 mM, HEPES
5 mM, pH 7,6.
Se examinaron los ovocitos no inyectados
mediante los procedimientos de pinzamiento de tensión de dos
electrodos y se detectó una corriente interna de Ba^{2+} muy
pequeña solamente en una de las siete células analizadas.
Los ovocitos coinyectados con las
transcripciones de las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y
\beta_{1} expresaban corrientes de bario interna mantenidas
tras la despolarización de la membrana de un potencial de
mantenimiento de - 90 mV o - 50 mV (154 \pm 129 nA, n = 21). Estas
corrientes mostraban típicamente una inactivación pequeña cuando se
administraron los pulsos de prueba variando entre 140 y 700 mseg. La
despolarización a una serie de tensiones reveló corrientes que
primero aparecían a aproximadamente - 30 mV con máximo a
aproximadamente 0 mV.
\newpage
La aplicación de la DHP Bay K 8644 incrementaba
la magnitud de las corrientes, prolongaba las corrientes de cola
presentes tras la repolarización de la célula e inducía un
desplazamiento hiperpolarizante en la activación de la corriente.
El Bay K 8644 se preparó reciente a partir de una solución madre en
DMSO y se introdujo en forma de un concentrado 10 x directamente en
el baño de 60 \mul mientras la bomba de perfusión se desconectaba.
La concentración de DMSO de las soluciones de los fármacos diluidos
en contacto con la célula nunca excedía de 0,1%. Los experimentos
de control mostraron que 0,1% de DMSO no tenían ningún efecto sobre
las corrientes de las membranas.
La aplicación del antagonista de DHP nifedipina
(solución madre preparada en DMSO y aplicada a la célula como se ha
descrito para la aplicación de Bay K 8644) bloqueaba una fracción
sustancial (91 \pm 6%, n = 7) de la corriente interna de bario en
ovocitos coinyectados con transcripciones de las subunidades
\alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1}. Un componente
inactivador residual de la corriente interna de bario permanecía
típicamente después de la aplicación de la nifedipina. La corriente
interna de bario se bloqueó completamente mediante Cd^{2+} 50
\muM pero solamente aproximadamente un 15% mediante Ni^{2+} 100
\muM.
Se investigó el efecto de \omegaCgTX en las
corrientes de bario internas en los ovocitos coinyectados con las
transcripciones de las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y
\beta_{1}. El \omegaCgTX (Bachem, Inc, Torrance CA) se
preparó en la solución de baño de BaCl_{2} 15 mM más 0,1% de
citocromo C (Sigma) para servir como proteína portadora. Los
experimentos de control mostraron que el citocromo C no tenía ningún
efecto sobre las corrientes. Una serie de pulsos de tensión entre
un potencial de mantenimiento de - 90 mV a 0 mV se registró a
intervalos de 20 mseg. Para reducir la inhibición de unión a
\omegaCgTX por cationes divalentes, los registros se hicieron en
BaCl_{2} 15 mM, cloruro de tetraetilamonio 73,5 mM y el resto de
los ingredientes idénticos a la solución registradora de Ba^{2+}
40 mM. El Bay K 8644 se aplicó a la célula antes de la adición a
\omegaCgTXcon el fin de determinar el efecto de \omegaCgTX en el
componente de las corrientes sensibles a DHP que se distinguían por
las corrientes de cola prolongadas. La corriente de bario interna
se bloqueó débilmente (54 \pm 29%, n = 7) y reversiblemente
mediante concentraciones relativamente altas (10-15
\muM) de \omegaCgTX. Las corrientes de prueba y las corrientes
de cola acompañantes se bloquearon progresivamente en dos a tres
minutos después de la aplicación de \omegaCgTX pero ambas se
recuperaban parcialmente a medida que el \omegaCgTX fluía del
baño.
La contribución de las subunidades
\alpha_{2} y \beta_{1} a la corriente de bario interna en
ovocitos inyectados con las transcripciones que codifican las
subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1} se
valoraron mediante la expresión de la subunidad \alpha_{1D} sola
o en combinación bien con la subunidad \beta_{1} o la subunidad
\alpha_{2}. En los ovocitos inyectados solamente con la
transcripción de un ADNc de \alpha_{1D}, no se detectaron
corrientes de Ba^{2+} (n = 3). En los ovocitos inyectados con las
transcripciones de los ADNc de \alpha_{1D} y \beta_{1}, se
detectaron pequeñas corrientes de Ba^{2+} (108 \pm 39 nA) tras
la despolarización de la membrana de un potencial de mantenimiento
de - 90 mV que se parece a las corrientes observadas en las células
inyectadas con las transcripciones de los ADNc de \alpha_{1D},
\alpha_{2} y \beta_{1} aunque la magnitud de la corriente
era menor. En dos de los cuatro ovocitos inyectados con
transcripciones del ADN que codifica \alpha_{1D} y que codifica
\beta_{1}, las corrientes de Ba^{2+} exhibían una sensibilidad
a Bay K 8644 que era similar a la sensibilidad de Bay K 8644 de las
corrientes Ba^{2+} expresadas en los ovocitos inyectados con las
transcripciones que codifican las subunidades \alpha_{1D},
\alpha_{1-},\alpha_{2-} y \beta_{1}.
Tres de los cinco ovocitos inyectados con las
transcripciones que codifican las subunidades \alpha_{1D} y
\alpha_{2} exhibían corrientes muy pequeñas de Ba^{2+}
(15-30 nA) tras la despolarización de la membrana
de un potencial de mantenimiento de - 90 mV. Estas corrientes de
bario mostraron poca o ninguna respuesta a Bay K 8644.
Para evaluar la contribución de la subunidad de
\alpha_{1} \alpha_{1D} a las corrientes de bario internas
detectadas en los ovocitos coinyectados con las transcripciones que
codifican las subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y
\beta_{1} de, los ovocitos inyectados con las transcripciones
que codifican las subunidades \alpha_{2} y/o \beta_{1} de
los canales de calcio neuronales de tipo humano se ensayaron para
las corrientes de bario. Los ovocitos inyectados con las
transcripciones que codifican la subunidad \alpha_{2} no
mostraba ninguna corriente de bario interna detectable (n = 5). Los
ovocitos inyectados con las transcripciones que codifican una
subunidad \beta_{1} mostraban corrientes de bario internan
mensurables (54 \pm 23 nA, n = 5) tras la despolarización y
ovocitos inyectados con las transcripciones que codifican las
subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} mostraron corrientes
internas de bario que eran aproximadamente 50% mayores (80 \pm 61
nA, n = 18) que las detectadas en ovocitos inyectados con
transcripciones del ADN que codifica \beta_{1} solamente.
Las corrientes de bario internas en ovocitos
inyectados con transcripciones que codifican la subunidad
\beta_{1} o las subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} se
observaron primero cuando la membrana estaba despolarizada hasta -
30 mM de un potencial de mantenimiento de - 90 mV y maximizada
cuando se despolarizaba la membrana hasta 10 a 20 mV.
Microscópicamente, las corrientes en los ovocitos inyectados con las
transcripciones que codifican las subunidades \alpha_{2} y
\beta_{1} o con transcripciones que codifican la subunidad
\beta_{1} eran indistinguibles. En contraste a las corrientes en
ovocitos coinyectados las transcripciones de los ADNc de las
subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1}, estas
corrientes mostraban una inactivación significativa durante el
pulso de prueba y una fuerte sensibilidad para el potencial de
mantenimiento. Las corrientes de bario internas en ovocitos
coinyectados con transcripciones que codifican las subunidades
\alpha_{2} y \beta_{1} usualmente inactivados hasta
10-60% de la magnitud máxima durante un pulso de
140 mseg. y eran significativamente más sensibles al potencial de
mantenimiento que las de en ovocitos coinyectados con las
transcripciones que codifican las subunidades \alpha_{1D},
\alpha_{2} y \beta_{1}. cambiando el potencial de
mantenimiento de las membranas de ovocitos coinyectados con las
transcripciones que codifican las subunidades \alpha_{2} y
\beta_{1} entre - 90 y - 50 mV daba como resultado
aproximadamente 81% (n = 11) de reducción en la magnitud de la
corriente de bario interna de estas células. En contraste, la
corriente de bario interna medida en ovocitos coinyectados con las
transcripciones que codifican las subunidades \alpha_{1D},
\alpha_{2} y \beta_{1} se redujeron aproximadamente 24% (n =
11) cuando el potencial de mantenimiento se cambió de - 90 a - 50
mV.
Las corrientes de bario internas detectadas en
ovocitos inyectados con las transcripciones que codifican las
subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} se distinguen
farmacológicamente de las observadas en ovocitos coinyectados con
transcripciones que codifican las subunidades \alpha_{1D},
\alpha_{2} y \beta_{1}. Los ovocitos inyectados con las
transcripciones que codifican las subunidades \alpha_{2} y
\beta_{1} mostraban corrientes de bario internas que eran
insensibles a Bay K 8644 (n = 11). La sensibilidad a nifedipina era
difícil de medir debido a la sensibilidad al potencial de
mantenimiento de la nifedipina y la corriente observada en los
ovocitos inyectados con las transcripciones que codifican las
subunidades \alpha_{2} y \beta_{1}. En cualquier caso, dos
ovocitos que se coinyectaron con las transcripciones que codifican
las subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} mostraban corrientes
de bario internas (25 a 45 nA) medibles que eran insensibles a la
nifedipina (5 a 10 \muM), cuando se desporalizaban de un potencial
de mantenimiento de - 50 mV. Las corrientes de bario internas en
ovocitos inyectados con las transcripciones que codifican las
subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} mostraban la misma
sensibilidad a los metales pesados que las corrientes detectadas en
ovocitos inyectados con las transcripciones que codifican las
subunidades \alpha_{1D}, \alpha_{2} y \beta_{1}.
La corriente de bario interna detectada en
ovocitos inyectados con las transcripciones que codifican las
subunidades \alpha_{2} y \beta_{1} tenían propiedades
farmacológicas y biofísicas que se parecen a las corrientes de
calcio en ovocitos de Xenopus no inyectados. Debido a que los
aminoácidos de esta subunidad \beta_{1} de los canales de
calcio neuronales de tipo humano carecen de segmentos hidrófobos
capaces de formar dominios transmembrana, es improbable que las
subunidades recombinantes \beta_{1} solo puedan formar un canal
iónico. Es más probable que una subunidad \alpha_{1} endógena
homóloga existe en ovocitos y que la actividad mediada por tal
subunidad \alpha_{1} se potencia mediante la expresión de una
subunidad \beta_{1} neuronal de de tipo humano.
Aunque la materia sujeto de la invención se ha
descrito con alguna especificidad, se pueden realizar modificaciones
evidentes para los expertos en la técnica sin salirse del alcance
de la invención. Ya que tales modificaciones serán evidentes para
los expertos en la técnica, se pretende que esta invención esté
limitada solamente por el alcance de las reivindicaciones
anexas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SIBIS Neurosciences, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 505 COAST BLVD SOUTH, SUITE 300
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92037 - 4641
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Mark E, Williams
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 946 Jasmine Court
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Carlsbad
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92009
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Kenneth A, Stauderman
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 3615 Lotus Dr.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Michael M, Harpold
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1462 Encina Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Santa Fe
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nuevo México
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 87505-4726
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Michael Hans
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 2635 Clemente Terrace
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92122
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Arturo Urrutia
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 778 Beech Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Uchla Vista
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 91910
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Mark S. Washburn
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1535 Kings Cross Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Cardiff
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 92007
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS DE LOS CANALES DE CALCIO.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Heller Ehrman White y McAuliffe
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4250 Executive Square, 7º Piso
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92307
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (SOFTWARE): FastSEQ Version 1.5 y PatentIn 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de diciembre de 1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 09/188.932
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 10 de noviembre de 1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/984.709
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de diciembre de 1997
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- ABOGADO/INFORMACIÓN DEL AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Seidman, Stephanie L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.779
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 24735-9815PC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (619) 450-8400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (619) 450-8499
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- INVENTOR/SOLICITANTE
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTYCCCTTGAA GAGCTGNACC CC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTGCACGTC ACGCTAG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCTAGCG TGACGTGCAC G
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACNGTGTTYC AGATCCTGAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCTGACNG GNGARGACTG GAA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTYCCCTTGAA GAGCTGNACN GC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTYCCCTTGA AGAGCTGNAC CCC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACTGYATYA CCCTGGC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATYACCCTGG CNATGGAGCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGARATGATGA TGAARGT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 342 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7898 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificadora
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 249 ... 7307
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1669 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1413 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7898 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificadora
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 249 ... 7307
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: \alpha_{1H-1}
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LONGITUD: 6941 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD NEGATIVA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificadora
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 249 … 6353
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: \alpha_{1H-2}
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (28)
1. Un fragmento de ácido nucleico aislado que
codifica una subunidad \alpha_{1H} de baja tensión de un canal
de calcio animal, en el que la secuencia de nucleótidos comprende la
porción codificadora de la secuencia de nucleótidos expuesta en
cualquiera de las SEQ ID números 12-16.
2. El ácido nucleico de la reivindicación 1 que
codifica una subunidad \alpha_{1H-1} o
\alpha_{1H-2} que comprende la porción
codificadora de la secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera
de las SEQ ID números 12, 15 ó 16.
3. Una célula eucariótica, que comprende ácido
nucleico heterólogo que codifica una subunidad \alpha_{1H}, en
la que la subunidad \alpha_{1H} está codificada por el ácido
nucleico de la reivindicación 1 ó 2.
4. La célula de la reivindicación 3, que
comprende además ácido nucleico que codifica una subunidad
\alpha_{2}\delta de un canal de calcio.
5. La célula eucariótica de la reivindicación 3
o reivindicación 4 que tiene un canal de calcio heterólogo que
contiene al menos una subunidad codificada por el ácido nucleico de
la reivindicación 1 ó 2.
6. La célula eucariótica de cualquiera de las
reivindicaciones 3-5 seleccionada entre el grupo
constituido por células HEK 293, células de ovario de hámster chino,
células de mono verde africano, y células L de ratón.
7. La célula eucariótica de cualquiera de las
reivindicaciones 3-5 que es un ovocito de
anfibio.
8. La célula eucariótica de la reivindicación 5,
en la que el canal de calcio heterólogo comprende una pluralidad de
subunidades \alpha_{1H} codificados por la porción codificadora
de la secuencia de nucleótidos expuestos en cualquiera de las SEQ
ID Números 12-16.
9. La célula eucariótica de la reivindicación 8,
en la que las subunidades \alpha_{1H} comprenden un
homómero.
10. La célula eucariótica de cualquiera de las
reivindicaciones 3-9, en la que el ácido nucleico
heterólogo codifica un canal de calcio de tipo T.
11. Un procedimiento de identificación de un
compuesto que modula la actividad de un canal de calcio que
contiene una subunidad \alpha_{1H}, que comprende:
suspender una célula eucariótica de cualquiera
de las reivindicaciones 3-10 que contiene un canal
de calcio funcional que contiene una subunidad \alpha_{1H} en
una solución que contiene el compuesto y un ion selectivo de los
canales de calcio:
despolarizar la membrana celular de la célula;
y
detectar la corriente o iones que fluyen en la
célula,
en la que:
la corriente que se detecta es diferente de la
producida mediante despolarización de la misma célula antes de la
adición del compuesto o una preparación de célula de ensayo idéntica
desarrollado en paralelo a la cual el compuesto no se añade más
tarde, en presencia del mismo ion selectivo de los canales de
calcio, si es necesario, con un control.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que antes de la etapa de despolarización la célula se mantiene a
un potencial de mantenimiento que sustancialmente inactiva los
canales de calcio que son endógenos a la célula.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que:
la célula es un ovocito de anfibio;
las subunidades heterólogas están codificadas
por el ácido nucleico inyectado en el ovocito; y
las subunidades heterólogas incluyen una
subunidad \alpha_{1H} codificada por el ácido nucleico de la
reivindicación 1 ó 2.
14. El procedimiento de las reivindicaciones 11
ó 12, en el que la célula es una célula HEK y al subunidad
heteróloga está codificada por el ácido nucleico heterólogo de la
reivindicación 1 ó 2.
15. Una subunidad \alpha_{1H}
sustancialmente pura codificada por la molécula de ácido nucleico
de la reivindicación 1 ó 2.
16. Un procedimiento para identificar ácidos
nucleicos que codifican una subunidad \alpha_{1H} de un canal
de calcio que está codificada por la porción codificadora de la
secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID
números 12-16, que comprende hibridar en condiciones
de al menos baja estringencia (1,0 x SSPE, SDS al 0,1%, 50ºC) una
sonda de ARN o ADN de al menos 16 bases de longitud, que comprenden
al menos 16 bases de ácidos nucleicos contiguos de una secuencia de
nucleótidos que codifica una subunidad \alpha_{1H} de un canal
de calcio que está codificada por la porción codificadora de la
secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID
números 12-16.
17. El procedimiento de la reivindicación 16 en
el que la sonda contiene al menos 30 bases de ácido nucleico
contiguas que codifican la subunidad \alpha_{1H} de un canal de
calcio que está codificada por el ácido nucleico de la
reivindicación 1 ó 2.
18. El procedimiento de la reivindicación 16 ó
17, en el que la hibridación se efectúa en condiciones de alta
rigurosidad (0,1 SSPE, SDS al 0,1%, 65ºC).
19. Un procedimiento para identificar células o
tejidos que expresan un ácido nucleicos que codifica una subunidad
\alpha_{1H} de los canales de calcio dicha subunidad
\alpha_{1H} está codificada por la porción codificadora de la
secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID
números 12-16, que comprende hibridar en
condiciones de al menos baja estringencia (1,0 x SSPE, SDS al 0,1%,
50ºC) una sonda como se ha definido en la reivindicación 16 ó 17
con ARNm expresado en las células o tejidos o ADNc producida a
partir del ARNm, y por lo tanto identificar las células o tejido que
expresan ARNm que codifica la subunidad.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en
el que la hibridación se efectúa en condiciones de alta
estringencia (0,1 SSPE, SDS al 0,1%, 65ºC).
21. Una molécula de proteína aislada, que
comprende la secuencia de aminoácidos codificada por los
nucleótidos 1506 a 2627 de la SEQ ID nº 12.
22. La molécula de ácido nucleico aislada que
comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en los nucleótidos
1506 a 2627 de la SEQ ID nº 12.
23. El ácido nucleico de la reivindicación 1, 2
ó 22 que es ARN.
24. El ácido nucleico de 1, 2 ó 22 que es
ADN.
25. La célula de una cualquiera de las
reivindicaciones 3-10 que comprende además ácido
nucleico que codifica una construcción de gen indicador que confíen
un gen indicador en enlace operativo con uno o más elementos de
control transcripcional que se regula mediante un canal de
calcio.
26. Un procedimiento de identificación de los
compuestos que modulan la actividad de un canal de calcio activado
por baja tensión, comprendiendo el procedimiento:
comparar la diferencia en la cantidad de
transcripción del gen indicador en al célula de la reivindicación
25 en la presencia del compuesto con la cantidad de transcripción en
la ausencia del compuesto, o con la cantidad de transcripción en la
ausencia del canal de calcio heterólogo, por lo cual se identifican
los compuestos que modulan la actividad del canal de calcio
heterólogo en la célula.
27. Un ensayo de selección para identificar un
compuesto que modula la actividad de un canal de calcio activado
por baja tensión (LVA) que comprende las etapas de:
poner en contacto el compuesto de ensayo con una
célula funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10;
y
medir la actividad del canal de calcio de LVA en
la célula antes y después de la adición del compuesto de ensayo en
una célula comparable que no expresa el canal de calcio LVA; y
determinar que el compuesto de ensayo modula la
actividad del canal de calcio LVA si al medición después de la
adición del compuesto es diferente de la medición antes de la
adición del compuesto o si la medición en presencia del canal de
calcio LVA es diferente de la medición en ausencia del canal de
calcio LVA.
28. El procedimiento de la reivindicación 27, en
el que la célula expresa un canal de calcio de baja tensión que
tiene una conductancia relativa de Ba ^{2+} de aproximadamente 5
pS a aproximadamente 9 ps, un tiempo de activación de
aproximadamente 2 a aproximadamente 8 milisegundos, una cinética de
valor V _{1/2} de activación de aproximadamente - 60 milivoltios
a aproximadamente 26 milivoltios, un tiempo de inactivación de
aproximadamente 10 a aproximadamente 30 milisegundos, una cinética
de valor V _{1/2} de inactivación de aproximadamente - 100
milivoltios a aproximadamente - 500 milivoltios, y un tiempo de
desactivación de cola de aproximadamente 2 a aproximadamente 12
milisegundos.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US984709 | 1997-12-03 | ||
| US08/984,709 US6528630B1 (en) | 1997-12-03 | 1997-12-03 | Calcium channel compositions and methods |
| US18893298A | 1998-11-10 | 1998-11-10 | |
| US188932 | 1998-11-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2274588T3 true ES2274588T3 (es) | 2007-05-16 |
Family
ID=26884607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98962884T Expired - Lifetime ES2274588T3 (es) | 1997-12-03 | 1998-12-03 | Composiciones de los canales de calcio a baja tension y procedimientos correspondientes. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1042468B1 (es) |
| JP (1) | JP2001525161A (es) |
| AT (1) | ATE342973T1 (es) |
| AU (1) | AU760309B2 (es) |
| CA (1) | CA2312195A1 (es) |
| DE (1) | DE69836229T2 (es) |
| ES (1) | ES2274588T3 (es) |
| WO (1) | WO1999028342A2 (es) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7297504B1 (en) | 1997-02-28 | 2007-11-20 | Neuromed Pharmaceuticals Ltd. | Methods for identifying agonists and antagonists of human T-type calcium channels |
| CA2377931A1 (en) | 1999-07-02 | 2001-01-11 | Neuromed Technologies, Inc. | Novel mammalian calcium channels and related probes, cell lines and methods |
| JP2003512602A (ja) * | 1999-09-16 | 2003-04-02 | ワーナー−ランバート・カンパニー | α２δ−１サブユニット結合リガンドのスクリーニング方法 |
| US6358706B1 (en) | 1999-10-26 | 2002-03-19 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | DNA encoding human alpha1G-C T-Type calcium channel |
| WO2001083752A2 (en) * | 2000-04-29 | 2001-11-08 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | 23949 and 32391, human ion channels and uses thereof |
| WO2002028431A1 (fr) * | 2000-10-02 | 2002-04-11 | Nippon Chemiphar Co.,Ltd. | Remedes destines a des maladies hepatiques et renfermant un antagoniste du canal calcique comme principe actif |
| UA79927C2 (en) * | 2000-12-05 | 2007-08-10 | Serono Genetics Inst Sa | Polynucleotide, coding a polypeptide of potential-depending portal ionic human channel (canion), polypeptyde, antibody, method for identification of candidate modulator of canion-polypeptyde, method for treatment of bipolar disorder or schizophrenia and use of an antibody for production of drugs for treatment of schizophrenia or bipolar disorder |
| KR20030037081A (ko) * | 2001-11-02 | 2003-05-12 | 한국과학기술연구원 | Ｔ 타입 칼슘채널을 조절하여 복통을 억제하는 방법 |
| JP2005518346A (ja) * | 2001-11-07 | 2005-06-23 | メディカル リサーチ カウンセル | ドパミン作動性ニューロンの調節 |
| US7223754B2 (en) | 2003-03-10 | 2007-05-29 | Dynogen Pharmaceuticals, Inc. | Thiazolidinone, oxazolidinone, and imidazolone derivatives for treating lower urinary tract and related disorders |
| WO2004080444A2 (en) | 2003-03-10 | 2004-09-23 | Dynogen Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating lower urinary tract disorders and the related disorders vulvodynia and vulvar vestibulitis using cav2.2 subunit calcium channel modulators |
| WO2005000285A2 (en) | 2003-06-13 | 2005-01-06 | Dynogen Pharmaceuticals, Inc. | METHODS OF TREATING NON-INFLAMMATORY GASTROINTESTINAL TRACT DISORDERS USING Cav2.2 SUBUNIT CALCIUM CHANNEL MODULATORS |
| CA2555208A1 (en) * | 2004-02-18 | 2005-09-01 | Merck & Co., Inc. | Nucleic acid molecules encoding novel murine low-voltage activated calcium channel proteins, designated-alpha 1h, encoded proteins and methods of use thereof |
| WO2006064981A1 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | Korea Institute Of Science And Technology | Methods for relieving neurophathic pain by modulating alpha1g t-type calcium channels and mice lacking alpha 1g t-type calcium channels |
| US8273749B2 (en) | 2007-10-04 | 2012-09-25 | Merck Sharp & Dohme Corp. | N-substituted oxindoline derivatives as calcium channel blockers |
| JP2010540629A (ja) | 2007-10-04 | 2010-12-24 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | カルシウムチャネル遮断薬としての置換アリールスルホン誘導体 |
| ES2842289T3 (es) | 2008-02-29 | 2021-07-13 | Vm Therapeutics Llc | Compuestos para tratar el síndrome del dolor y otros trastornos |
| US8987310B2 (en) | 2009-10-30 | 2015-03-24 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Heterocycle amide T-type calcium channel antagonists |
| AU2011223883B2 (en) | 2010-03-01 | 2015-10-08 | Cavion, Inc. | Cancer diagnosis and imaging |
| WO2013148640A1 (en) | 2012-03-29 | 2013-10-03 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Imidazolyl methyl piperidine t-type calcium channel antagonists |
| JP7086072B2 (ja) | 2016-12-02 | 2022-06-17 | ソフィオン・バイオサイエンス・アクティーゼルスカブ | シールエンハンサー |
| WO2018100206A1 (en) * | 2016-12-02 | 2018-06-07 | Sophion Bioscience A/S | Seal enhancer |
| CN115979923B (zh) * | 2023-03-20 | 2023-06-27 | 中国有色金属工业昆明勘察设计研究院有限公司 | 一种尾矿库渗透破坏模拟试验装置及试验方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE286976T1 (de) * | 1991-08-15 | 2005-01-15 | Merck & Co Inc | Menschliche calcium-kanale und verwendungen davon |
| SG63615A1 (en) * | 1993-07-30 | 1999-03-30 | Neurex Corp | Dna encoding a human calcium channel alpha-ie subunit |
-
1998
- 1998-12-03 CA CA002312195A patent/CA2312195A1/en not_active Abandoned
- 1998-12-03 AU AU18026/99A patent/AU760309B2/en not_active Ceased
- 1998-12-03 EP EP98962884A patent/EP1042468B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-03 DE DE69836229T patent/DE69836229T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-03 AT AT98962884T patent/ATE342973T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-12-03 ES ES98962884T patent/ES2274588T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-03 WO PCT/US1998/025671 patent/WO1999028342A2/en active IP Right Grant
- 1998-12-03 JP JP2000523233A patent/JP2001525161A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1802699A (en) | 1999-06-16 |
| EP1042468B1 (en) | 2006-10-18 |
| EP1042468A2 (en) | 2000-10-11 |
| AU760309B2 (en) | 2003-05-15 |
| DE69836229D1 (de) | 2006-11-30 |
| CA2312195A1 (en) | 1999-06-10 |
| ATE342973T1 (de) | 2006-11-15 |
| WO1999028342A2 (en) | 1999-06-10 |
| JP2001525161A (ja) | 2001-12-11 |
| DE69836229T2 (de) | 2007-08-23 |
| WO1999028342A3 (en) | 1999-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2274588T3 (es) | Composiciones de los canales de calcio a baja tension y procedimientos correspondientes. | |
| ES2199964T3 (es) | Composiciones relativas a canales de calcio humanos y procedimientos de uso. | |
| US5429921A (en) | Assays for agonists and antagonists of recombinant human calcium channels | |
| Klugbauer et al. | Calcium channel α 2 δ subunits: Differential expression, function, and drug binding | |
| ES2235417T3 (es) | Composiciones de canales de calcio humanos y procedimientos. | |
| US5876958A (en) | Assays of cells expressing human calcium channels containing α1 β subunits | |
| WO1995004820A1 (en) | CLONING OF MAMMALIAN INWARD RECTIFIER POTASSIUM CHANNEL cDNAs | |
| US6646109B1 (en) | Cloning and expression of a novel acetylcholine-gated ion channel receptor subunit | |
| JP2002514055A (ja) | ガラニンｇａｌｒ３受容体をコードするｄｎａおよびその使用 | |
| JP2004501627A (ja) | 哺乳動物２ｐドメインメカノ感受性ｋ＋チャネル、そのクローニングおよび利用 | |
| US5846757A (en) | Human calcium channel α1, α2, and β subunits and assays using them | |
| CA2250567A1 (en) | Receptor and transporter antagonists | |
| US6703485B2 (en) | Brain and heart cyclic nucleotide gated ion channel compounds and uses thereof | |
| US7960127B2 (en) | TRP8, a transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells | |
| US20050170397A1 (en) | Novel receptors | |
| US5851824A (en) | Human calcium channel α-1C/α-1D, α-2, β-1, and γsubunits and cells expressing the DNA | |
| ES2250993T3 (es) | Composiciones del receptor nicotinico neumonal humano de acetilcolina y procedimientos que emplean el mismo. | |
| Nargeot et al. | Molecular basis of the diversity of calcium channels in cardiovascular tissues | |
| McAllister et al. | Alternative splicing of micro-exons creates multiple forms of the insect cell adhesion molecule fasciclin I | |
| US6528630B1 (en) | Calcium channel compositions and methods | |
| CA2350334C (en) | New family of mammalian potassium channels, their cloning and their use, especially for the screening of drugs | |
| US5945509A (en) | Glutamate receptor compositions and method | |
| Helton | Cloning and characterization of alternatively spliced voltage-gated calcium channel subunits | |
| Ruiz | The cloning of an olfactory channel from mouse heart | |
| JONES et al. | JOHN ELLIS, ELIZABETH NOVOTNY, SHUA-HUA Yu, FRANK DORJE, JURGEN WESS, and Mark R. BRANN |