UA79927C2 - Polynucleotide, coding a polypeptide of potential-depending portal ionic human channel (canion), polypeptyde, antibody, method for identification of candidate modulator of canion-polypeptyde, method for treatment of bipolar disorder or schizophrenia and use of an antibody for production of drugs for treatment of schizophrenia or bipolar disorder - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до гена і білка потенціал-залежного ворітного іонного каналу та до їх ролі у захворюванні. Даний винахід відноситься до полінуклеотидів, які кодують поліпептид Сапіоп, а також до регуляторних ділянок, локалізованих на 5- і 3-кінці вказаної ділянки, що кодує. Даний винахід відноситься також до поліпептидів, які кодуються Сапіоп--еном. У даному винаході розроблені способи скринування модуляторів, тобто антагоністів Сапіоп-каналу, і способи використання таких модуляторів для лікування або попередження різних порушень або станів. У даному винаході розглядаються також антитіла, специфічні проти 70 таких поліпептидів, які придатні як діагностичні реагенти. Крім того, даний винахід включає двоалельні маркери Сапіоп-гена, придатні для генетичного аналізу.

Досягнення у технічному оснащенні лабораторій, які займаються фундаментальними та клінічними дослідженнями, великою мірою сприяли більш глибокому вивченню впливу головного мозку і нервової системи на здоров'я та хвороби. Запропонований ряд нейробіологічних і фармакологічних гіпотез по відношенню до 12 нейрохімічних і генетичних механізмів, які мають місце при порушеннях центральної нервової системи (ЦНС), що включають психічні порушення та нейродегенеративні захворювання. Однак порушення ЦНС характеризуються складним і недостатнім розумінням етіології, а також симптоми, які перекриваються, погано описані, і важкі для вимірювання. У результаті, майбутні схеми лікування та зусилля по створенню ліків потребують вдосконалення і зосередження уваги на мультигенних причинах, а це вимагає проведення нових демографічних досліджень захворювань і одержання більш точної діагностичної і прогностичної інформації про пацієнтів, які страждають порушеннями ЦНС.

Порушення ЦНС охоплюють широкий ряд розладів і відповідну широку групу генетичних факторів. Приклади розладів ЦНС включають нейродегенеративні порушення, психотичні розлади, розлади в емоційному стані, аутизм, залежність від хімічних речовин і алкоголізм, порушення больових відчуттів, епілепсію, затримку с психічного розвитку та інші психічні захворювання, включаючи когнітивну функцію, страх, порушення функції Ге) приймання їжі, порушення функції мотивації і аномалії характеру. Порушення можна визначити, використовуючи класифікацію Оіадповізв апа (айвіса! Мапа! ої Мепіа! Оізогдеге Той еййоп (Діагностичний |і

Статистичний Довідник Психічних Порушень) (ОЗМ-1ІМ).

Навіть при розгляді всього лише невеликої підгрупи порушень ЦНС очевидно, що через нестачу адекватного в лікування і для осмислення молекулярної основи порушень при шизофренії та біполярному розладі, потрібні нові с цілі для терапевтичної винахідливості і вдосконалення способів лікування. Що стосується шизофренії та біполярного розладу, всі зараз відомі молекули, які використовуються для їх лікування, володіють побічними о ефектами і діють тільки проти симптомів даного захворювання. Існує, таким чином, дуже велика потреба унових ду молекулах, не зв'язаних з побічними ефектами і направлених проти мішеней, які залучені до причинних механізмів шизофренії та біполярного розладу. Тому, інструментальні засоби, які полегшують відкриття і в характеристику даних цілей, необхідні та корисні.

Потенціал-залежні ворітні іонні канали

Потенціал-залежні ворітні іонні канали є частиною великого сімейства макромолекул, функції яких включають « контроль і підтримку електричного потенціалу клітинних мембран, виділення і трансдукцію сигналу. Ці З 70 білки-канали беруть участь у контролі вивільнення нейромедіаторів з нейронів і грають істотну роль у с регуляції різноманітних клітинних функцій, включаючи мембранну збудливість, м'язове скорочення та синаптичну :з» передачу. Основні альфа-субодиниці Ма"-каналів і альфа-1-субодиниці Са"-каналів складаються, приблизно, з 2000 амінокислот і складають шлях протікання іонів. У біохімічному аналізі виявлено, що фізіологічно активний іонний канал складений з декількох різних субодиниць. Існує дві допоміжні субодиниці, бета-1- і -1 що бета-2-субодиниця, які очищуються спільно з альфа-субодиницею Ма "-каналів. Що стосується Са"-каналів, для них ідентифіковані додаткові субодиниці (альфа-2, бета, гамма та сигма) з модуляторною дією. Субодиниці ік альфа-2 і бета, схоже, посилюють функціональну активність альфа-1-субодиниці Са"-каналів. Альфа-субодиниці (Те) К"-каналів асоціюються з бета-субодиницями у співвідношенні 1:11, що приводить до ускладнення К "-каналів, які проявляють (альфа) (бета). стехіометрію |Тегпац і співавт., Майпміззепзспайеп 85: 437-444 (1998)|. о Базова структура і приклади кальцієвих і натрієвих іонних каналів розглядаються, крім того, наприклад, у "І МУШіате, і співавт., Зсіепсе 257: 389-395 (1992); Могі, і співавт., Маїшге 350:398-402 (1991); ї Косі, і співавт., у. Віої. Спет. 265 (29): 17786-17791 (1990)). Нуклеотидна послідовність Са"- і Ма"-іонного каналу щура володіє високим рівнем гомології з послідовністю Сапіоп-каналу, потім описаного у | ее і співавт., РЕВЗ І! ей. 445:231-236 (1999)|.

Альфа-субодиниця володіє послідовністю, характерною для всіх потенціал-залежних катіонних каналів, і о використовує один і той же структурний мотив, який включає пучок з б спіралей у доменах, що можливо іме) пронизують мембрану. І у натрієвих, і у кальцієвих каналах даний мотив повторюється у вказаній послідовності 4 рази, утворюючи пучок з 24 спіралей. Дані амінокислотні послідовності висококонсервативні у видів 60 (наприклад, людини і ОгозорпПіа), а також у різних іонних каналів.

Існує декілька тканинноспецифічних ізоформ кальцієвих каналів, які фармакологічно та електрофізіологічно розрізняються, що кодуються окремими генами мультигенного сімейства. У скелетному м'язі кожна група з щільно зв'язаних альфа-, бета-і гамма-субодиниць асоційована з 4 іншими з утворенням п'ятичленної макромолекули. Наприклад, альфа-1-субодиниці кальцієвого каналу нейрона є продуктом, щонайменше, семи 65 різних генів, які іменуються від А до Н. В імуноцитохімічних дослідженнях показаний різний розподіл альфа-1-субодиниць кальцієвого каналу. Альфа-1А і альфа-18 експресуються головним чином у дендритах і пресинаптичних закінченнях, і альфа-ТА звичайно концентрується у більшому числі нервових закінчень, в альфа-18. У нервово-м'язовому з'єднанні щура і людини альфа-1А локалізується пресинаптично, тоді як альфа-18, так і альфа-1А представлені в асоційованих з аксоном шванівських клітинах. Альфа-ІЕ локалізується

Головним чином у клітинних тілах, у деяких випадках - у проксимальних дендритах, а також у дистальних відгалуженнях клітин Пуркін'є. Альфа-1С і альфа-100 локалізуються у клітинних тілах і у проксимальних дендритах центральних нейронів.

Нативні кальцієві канали класифікуються на основі їх фармакологічних і/або електрофізіологічних властивостей. Класифікація потенціал-залежних кальцієвих каналів розподіляє їх на канали, що активуються 7/0 Високим потенціалом (НМА), які включають типи Г, М, Р ї О; проміжні (МА, К-тип); і ті, що активуються низьким потенціалом (МА, Т-тип). |Могепа і співавт., АппаІв МУ Асад. 5сі. 102-117 (1999)).

Основні субодиниці (альфа-1) відносяться до генного сімейства, члени якого можуть самі утворювати функціональні канали при експресії у гетерологічних експресійних системах (|7лапд і співавт.,

Меицгорпагтасоїоду 32(11): 1075-1088 (1993)), включений у даний опис за допомогою посилання). У нативних /5 клітинах альфа-1-субодиниці експресуються у вигляді мультисубодиничних комплексів разом з допоміжними субодиницями, які модифікують функціональні характеристики альфа-1-субодиниці. У багатьох випадках коекспресія допоміжних субодиниць впливає на біофізичні властивості даних каналів. Бета-субодиниці, зокрема, мають тенденцію до істотного впливу на альфа-1-субодиниці; було показано, що бета-субодиниці змінюють активаційні властивості, стаціонарну інактивацію, кінетику інактивації та максимальне протікання струму.

Велику молекулярну різноманітність каналів одержують завдяки існуванню численних форм альфа-1-субодиниць. Наприклад, було показано, що по-різному сплайсовані форми кальцієвих каналів і експресуються по-різному і володіють різною чутливістю до фосфорилювання серин-треоніновими кіназами. (Неї! і співавт., Аппаіїв МУ Асай. Зсі. 747:282-293 (1994)Ї. Встановлено, що мутації генів іонних каналів залучені до цілого ряду захворювань, включаючи деякі захворювання центральної нервової системи. Приклади мутацій сч іонних каналів, що викликають ряд епізодичних порушень, включаючи періодичний параліч, епізодичну атаксію, гемікранію, синдром подовження від інтервалу ОТ, пароксизмальну дискінезію, розглядаються в огляді (Виїтап і і) співавт., Нит. Мої. Сеп. 6(10): 1679-1685 (1997)). Деякі порушення, зв'язані з мутацією Са "-каналу, представлені, наприклад, у Таблиці А (з Могепо, вище). ча зо см

Ф

Ф зв ча д-18 « 4 З с г»

Модулятори кальцієвих і натрієвих каналів звичайно використовуються для лікування різних захворювань і -І станів. Наприклад, було показано, що блокатори кальцієвого і/або натрієвого каналу, придатні для лікування або попередження одного або декількох симптомів, зв'язаних з різними захворюваннями або станами, такими як се) різні захворювання і стани серця (наприклад, стенокардія, аритмія), гіпертензія, мігрені, неврологічні ефекти о порушень мозкового кровообігу, манія, нейролептично індукована пізня дискінезія стінок міокарда, біполярний

ВОЗЛОаД, біль, епілепсія та інші. де Було показано, що між різними іонними каналами нервової системи є істотні функціональні відмінності. Крім

І того, істотні відмінності є між різними мутаціями в одному і тому ж гені іонного каналу, а також між варіантами сплайсингу одного і того ж іонного каналу. Таким чином, незважаючи на причетність іонних каналів до захворювань ЦНС, то, що стосується конкретного захворювання, важко визначити який іонний канал може бв являти собою ефективну мішень для терапевтичного втручання. Першочергова задача полягає у тому, щоб надати ген іонного каналу, причетний до шизофренії, біполярного розладу або захворювань, пов'язаних з ними.

Ф) Даний винахід призначається для розв'язання цих та інших задач. ко Даний винахід відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що включають геномну послідовність нового гена людини, який кодує білок потенціал-залежного ворітного іонного каналу, що називається Сапіоп. Геномна во послідовність Сапіоп включає також регуляторну послідовність, розташовану ліворуч (5-кінець) і праворуч (3'-кінець) від ділянки, що транскрибується, вказаного гена, причому такі регуляторні послідовності є також частиною даного винаходу.

У даному винаході забезпечується також повна кДНК-послідовність, що кодує Сапіоп-білок, а також відповідний продукт трансляції. 65 Олігонуклеотидні зонди або праймери, які специфічно гібридизуються з геномною послідовністю Сапіоп або з

КДНК-послідовністю Сапіоп, як і способи ампліфікації ДНК і способи детекції з використанням вказаних праймерів і зондів, також є частиною даного винаходу.

Додатковий об'єкт даного винаходу складається з рекомбінантних векторів, які включають будь-яку з описаних вище послідовностей нуклеїнових кислот і, зокрема, рекомбінантних векторів, що включають Вегуляторну послідовність Сапіоп або послідовність, що кодує Сапіоп-білок, а також клітин-хазяїв і трансгенних тварин, виключаючи людину, які включають вказані послідовності нуклеїнових кислот або рекомбінантні вектори.

Даний винахід розглядає також двоалельні маркери Сапіоп-гена та їх використання.

Нарешті, даний винахід стосується способів скринування речовин або молекул, які модулюють експресію або 70 активність Сапіоп, а також способів скринування речовин або молекул, які взаємодіють з Сапіоп-поліпептидом.

Розроблені також способи використання речовин, ідентифікованих для даних способів. Наприклад, розроблені способи лікування або попередження захворювань або станів, включаючи шизофренію або біполярний розлад, з використанням антагоністів Сапіоп-каналу.

Відповідно до цього, першою метою даного винаходу є забезпечення виділеного, виділеного очищенням або /5 рекомбінантного полінуклеотиду, що включає будь-яку з нуклеотидних послідовностей, представлених у вигляді

ЗЕО ІЮ Мо 1-4 або 6, або послідовності, комплементарної будь-якій з даних послідовностей.

Іншою метою даного винаходу є забезпечення виділеного, виділеного очищенням або рекомбінантного полінуклеотиду, що включає безперервну ділянку ЗЕО ІЮО Мо 4, щонайменше, з 50 нуклеотидів, причому вказаний полінуклеотид кодує біологічно активний Сапіоп-поліпептид.

Ще однією метою даного винаходу є забезпечення виділеного, виділеного очищенням або рекомбінантного полінуклеотиду, який кодує Сапіоп-поліпептид людини, що включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо 5, або його біологічно активний фрагмент.

У першому варіанті здійснення даного винаходу будь-який з описаних у даному описі полінуклеотидів приєднується до твердого носія. В іншому варіанті здійснення даного винаходу даний полінуклеотид включає сч ге Мітку.

Ще однією метою даного винаходу є створення набору полінуклеотидів, який включає, щонайменше, один з і) описаних у даному описі полінуклеотидів. В одному з варіантів здійснення даного винаходу даний набір є адресним.

Наступною метою даного винаходу є створення рекомбінантного вектора, що включає будь-який зописаниху Кк зо даному описі полінуклеотидів, функціонально приєднаний до промотору.

Ще однією метою даного винаходу є створення полінуклеотиду, присутність якого у клітині обумовлює зміну у с рівні експресії Сапіоп-гена. В одному з варіантів даного винаходу даний полінуклеотид вбудовують у Сапіоп-ген Ге! або у геномну ділянку Сапіоп. В одному з варіантів здійснення даного винаходу даний полінуклеотид вбудовують у промотор гена Сапіоп. В одному з варіантів здійснення даного винаходу даний полінуклеотид вбудовують за ме)

Зв Допомогою гомологічної рекомбінації, наприклад, шляхом заміни одного або декількох елементів ендогенного ї- промотору Сапіоп або енхансерної ділянки.

Наступною метою даного винаходу є створення клітини-хазяїна або тварини-хазяїна, що не належить до людського роду, що включає будь-який з описаних у даному описі рекомбінантних векторів або полінуклеотидів.

Ще однією метою даного винаходу є створення клітини-хазяїна ссавця або ссавця-хазяїна, що не належить « до людського роду, що включає Сапіоп-ген, зруйнований гомологічною рекомбінацією за допомогою нокаутного у с вектора. В одному з варіантів здійснення даного винаходу дана клітина-хазяїн включає будь-який з описаних у . даному описі полінуклеотидів. а Наступною метою даного винаходу є створення виділеного, виділеного очищенням або рекомбінантного поліпептиду, що включає амінокислотну послідовність, представлену у вигляді ЗЕО ІЮО Мо 5, або його біологічно активний фрагмент. -І Ще однією метою даного винаходу є розробка способу одержання поліпептиду, що включає а) створення популяції клітин, які включають полінуклеотид, що кодує поліпептид за п.13, функціонально приєднаний до ік промотору; Б) культивування вказаної популяції клітин в умовах, які сприяють одержанню вказаного поліпептиду

Ге) у вказаних клітинах; і с) виділення очищенням вказаного поліпептиду з вказаної популяції клітин.

Наступною метою даного винаходу є розробка способу зв'язування антитіла до Сапіоп з о Сапіоп-поліпептидом, що включає контактування вказаного антитіла з будь-яким з описаних у даному описі "М Сапіоп-поліпептидів в умовах, при яких дане антитіло може специфічно зв'язуватися з вказаним поліпептидом.

Ще однією метою даного винаходу є також одержання антитіл або їх імунологічно активних фрагментів, які специфічно розпізнають Сапіоп-білок або епітоп.

Наступною метою даного винаходу є розробка способу виявлення експресії Сапіоп-гена у клітині, причому вказаний спосіб включає наступні стадії: а) контактування вказаної клітини або екстракту з вказаної клітини (Ф, або з: ї) полінуклеотидом, який гібридизується у жорстких умовах з будь-яким з описаних у даному описі ка Сапіоп-полінуклеотидів; або ії) поліпептидом, який специфічно зв'язується з будь-яким з описаних у даному описі Сапіоп-поліпептидів; і Б) виявлення наявності або відсутності гібридизації між вказаним полінуклеотидом бо 1 видами РНК у вказаній клітині або в екстракті, або наявності або відсутності зв'язування вказаного поліпептиду з білком у вказаній клітині або у вказаному екстракті; де виявлення наявності вказаної гібридизації або вказаного зв'язування свідчить про те, що вказаний Сапіоп-ген експресується у вказаній клітині. В одному з варіантів здійснення даного винаходу вказаний полінуклеотид являє собою праймер, а вказана гібридизація виявляється шляхом виявлення наявності продукту ампліфікації, що включає послідовність 65 вказаного праймеру. В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказаний поліпептид являє собою антитіло, наприклад, антитіло до Сапіоп.

Ще однією метою даного винаходу є розробка способу ідентифікації кандидатного модулятора

Сапіоп-поліпептиду, причому вказаний спосіб включає: а) контактування будь-якого з описаних у даному описі

Сапіоп-поліпептидів з тест-сполукою; і Б) визначення чи дійсно вказана сполука специфічно зв'язується з

Вказаним поліпептидом; при цьому виявлення вказаної сполуки, специфічно зв'язаної з вказаним поліпептидом, свідчить про те, що вказана сполука є модулятором-кандидатом вказаного Сапіоп-поліпептиду.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу даний спосіб крім того включає тестування біологічної активності вказаного Сапіоп-поліпептиду в присутності вказаного модулятора-кандидата, де зміна біологічної активності вказаного Сапіоп-поліпептиду в присутності вказаного модулятора-кандидата, у порівнянні з 70 біологічною активністю за відсутності вказаного модулятора-кандидата, свідчить про те, що даний модулятор-кандидат являє собою модулятор вказаного Сапіоп-поліпептиду.

Наступною метою даного винаходу є створення способу ідентифікації модулятора Сапіоп-поліпептиду, причому вказаний спосіб включає: а) контактування будь-якого з описаних у даному описі Сапіоп-поліпептидів з тест-сполукою; і Б) виявлення біологічної активності вказаного поліпептиду в присутності і за відсутності /5 вказаної сполуки; де виявлення різниці у вказаній активності в присутності вказаної сполуки, у порівнянні з активністю за відсутності вказаної сполуки, свідчить про те, що вказана сполука є модулятором вказаного

Сапіоп-поліпептиду.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу представлені способи, де вказаний поліпептид присутній у клітині або у клітинній мембрані, а вказана біологічна активність включає активність потенціал-залежного

Ворітного іонного каналу.

Ще однією метою даного винаходу є створення способу одержання фармацевтичної композиції, що включає а) ідентифікацію модулятора Сапіоп-поліпептиду з використанням будь-якого з описаних у даному описі способів; і 5) об'єднання вказаного модулятора з фізіологічно прийнятним носієм. Розроблені також способи використання фармацевтичних композицій. сч

Розроблене також використання будь-якого з описаних у даному описі Сапіоп-модуляторів, поліпептидів, полінуклеотидів, або антитіл для одержання лікарського засобу, наприклад, для лікування організму людини або і) для лікування будь-якого з описаних у даному описі захворювань або станів.

Створені також набори для використання і детектування, іп мйго або іп мімо, представлених

Сапіоп-полінуклеотидів і поліпептидів. М зо Короткий опис креслень

На Фіг.1 зображена діаграма, що представляє ВАС-карту ділянки хромосоми 134, яка містить Сапіоп-ген. с

На Фіг.2 зображений блок діаграм типової комп'ютерної системи. Ге!

На Фіг.3 зображена структурна схема, яка ілюструє один з варіантів здійснення процесу 200 по порівнянню нової нуклеотидної або білкової послідовності з базою даних послідовностей з метою встановлення рівнів (22) гомології між новою послідовністю і відповідною послідовністю бази даних. ї-

На Фіг.4 зображена схема послідовності операцій, яка ілюструє один з варіантів здійснення процесу 250 у комп'ютері, щоб визначити чи дійсно дві послідовності є гомологічними.

На Фіг.5 зображена схема послідовності операцій, яка ілюструє один з варіантів процесу-ідентифікатора 300 для виявлення у послідовності наявності характерної особливості. «

Короткий опис послідовностей, представлених у списку послідовностей з с ЗЕО ІО Мо 1 містить геномну послідовність Сапіоп, яка включає 5'-регуляторну ділянку ("ліва" ділянка, що не транскрибується) та екзони 1-7. з ЗЕО ІЮ Мо 2 містить геномну послідовність Сапіоп, яка включає екзони 8-27.

ЗБО ІО Мо З містить геномну послідовність Сапіоп, яка включає екзони 28-44, а також З3'-регуляторну ділянку (права" ділянка, що не транскрибується). -І ЗЕО ІЮ Мо 4 містить кКДНК-послідовність Сапіоп.

ЗЕО ІО Мо 5 містить амінокислотну послідовність, що кодується КДНК 5ЕО ІЮО Мо 4. ік 5ЕО ІЮ Мо 6 містить нуклеотидну послідовність амплікону, який включає двоалельний маркер А18.

Ге) ЗЕО ІЮ Мо 7 містить праймер, що включає додаткову 5'-послідовність РУ, нижче описану у Прикладі 2. 5ЕО ІЮ Мо 8 містить праймер, що містить додаткову 5'-послідовність КР, нижче описану у Прикладі 2. де Відповідно до правил, що відносяться до Списків Послідовностей, у даному Списку Послідовностей

І використовуються коди, які вказують розташування двоалельних маркерів у даних послідовностях і які ідентифікують кожний з алелів, представлений по поліморфній основі. Код "г" для даної послідовності свідчить про те, що один алель по даній поліморфній основі являє собою гуанін, а інший алель являє собою аденін. Код "у" для даних послідовностей свідчить про те, що один алель по даній поліморфній основі являє собою тимін, тоді як інший алель являє собою цитозин. Код "т" для даних послідовностей свідчить про те, що один алель по (Ф) даній поліморфній основі являє собою аденін, а інший алель являє собою цитозин. Код "К' для даних ка послідовностей свідчить про те, що один алель по даній поліморфній основі являє собою гуанін, а інший алель являє собою тимін. Код "5" для даних послідовностей свідчить про те, що один алель по даній поліморфній во основі являє собою гуанін, а інший алель являє собою цитозин. Код "м" для даних послідовностей свідчить про те, що один алель по даній поліморфній основі являє собою аденін, а інший алель являє собою тимін.

Нуклеотидний код вихідного алеля для кожного двоалельного маркера наступний:

Двоалельний маркер Вихідний алель 65 5-124-273 А (наприклад)

У деяких випадках поліморфні основи двоалельних маркерів змінюють ідентичність амінокислот у поліпептиді, що кодується. Це вказано у доданому Списку Послідовностей з використанням елемента МАКІАМТ, розміщення Хаа у положенні даної поліморфної амінокислоти і визначення Хаа у вигляді двох альтернативних амінокислот. Наприклад, якщо один алель двоалельного маркера являє собою кодон САС, який кодує гістидин, а інший алель двоалельного маркера являє собою САА, який кодує глутамін, то Список Послідовностей для поліпептиду, що кодується, буде містити Хаа у положенні поліморфної амінокислоти. У цьому випадку Хаа повинен визначатися у вигляді гістидину або глутаміну.

В інших випадках Хаа може означати амінокислоту, ідентичність якої невідома, внаслідок невизначеності 7/0 Нуклеотидної послідовності. У цьому випадку використання елемента ОМЗОМКЕ розміщує Хаа у положення невідомої амінокислоти і значення Хаа вважається будь-яким з 20 амінокислот або обмеженим числом амінокислот, підказаних генетичним кодом.

Асоціація шизофренії та біполярного розладу у сім'ях, доведена при вивченні близнюків і усиновлення, хоча мінливість по всьому світу відсутня, свідчить про те, що шизофренія та біполярний розлад насамперед являють /5 Собою генетичні стани, хоча фактори ризику навколишнього середовища також до деякого ступеня розглядаються як необхідні, достатні або такі, що впливають одна на одну причини. Наприклад, шизофренія зустрічається у 195 від загальної чисельності населення. Але за наявності шизофренії у одного з дідусів або бабусь ризик виникнення даної хвороби зростає до приблизно 395; якщо ж шизофренією страждає один з батьків, цей ризик зростає до приблизно 1095. Якщо обидва батьки хворі шизофренією, тоді ризик зростає, приблизно, до 409.

Ідентифікація генів, зв'язаних з характерною ознакою, такою як специфічне порушення центральної нервової системи, подібне до шизофренії може бути здійснена за допомогою двох основних підходів, які використовуються у наш час для генетичного картування: аналізу зчеплення та асоціативних досліджень (дослідження співтовариств). Аналіз зчеплення потребує вивчення сімей, в яких захворюванням уражено багато сч їх членів, і у наш час придатний для виявлення моно- та олігогенних спадкових ознак. | навпаки, в асоціативних дослідженнях аналізують частоту маркерних алелів ознаки (Тж-) у незв'язаних спорідненням і) індивідів, що порівнюються з негативним за даною ознакою контролем (Т-) і звичайно використовуються для виявлення полігенного успадковування.

Генетичний зв'язок або зчеплення базується на аналізі, в якому дві сусідні послідовності на хромосомі М

Зо Містять, щонайменше, рекомбінації у результаті кросинговеру під час мейозу. Щоб здійснити це хромосомні маркери, подібні мікросателітним маркерам, ретельно локалізують у даному геномі. В аналізі генетичного с зчеплення розраховують ймовірність рекомбінацій у даному гені-мішені з використанням хромосомних маркерів, Ге! відповідно до генеалогічного дерева, передачі даного захворювання і передачі даних маркерів. Таким чином, якщо окремий алель даного маркера передається разом із захворюванням більш часто, а не випадково (рівень Ме рекомбінації знаходиться між 0 і 0,5), то можна зробити висновок про те, що ген-мішень, про який йде мова, ї- виявляється поблизу від даного маркера. При використанні даного методу можна локалізувати декілька генів, що демонструють генетичну схильність сімейних злоякісних пухлин. Для того щоб мати можливість включитися у вивчення генетичного зчеплення, сім'ї, уражені спадковою формою даного захворювання, повинні задовольняти критерію "Інформативності": декілька чоловік (конституційна ДНК яких доступна) на покоління, повинні бути « уражені даним захворюванням, і щонайбільше, володіти великим числом сибсів. з с Результати досліджень по зчепленню підтверджують гіпотезу про те, що хромосома 13, очевидно, містить локус схильності до шизофренії на 13432 |Віоціп | і співавт., 1998, Майте Сепеїйїсв, 20:70-73; іп ММУ і ;» співавт., Нит. Сепеї., 99(3) (1997):417-420; Вггивіом/іс» і співавт., Ат. у). Нит. Сепеї. 65:1096-1103 (1999)).

Однак, незважаючи на те, що аналіз зчеплення являє собою потужний метод виявлення генів і зв'язаної з ними

Ознаки, розв'язання часто неможливе без рівня даної мегабази даних, а відповідні дослідження часто -І потребують уточнення аналізу ділянок, які спочатку ідентифіковані за допомогою даного способу.

ВАС-контиг, що покриває передбачувану геномну ділянку локусу хромосоми 134-31-433, конструйований з ік використанням загальнодоступних ЗТ5, розташованих у даній ділянці хромосомного локусу 134-31-433, для

Ге) скринування запатентованої окремої ВАС-бібліотеки, еквівалентної 7-геномам. За даними матеріалами 5о одержували нові ТЗ, що дозволяють конструювати компактну фізичну карту даної ділянки. Визначали розмір ю всіх ВАС і картували за допомогою хромосомної гібридизації іп зи для верифікації. Ідентифікували мінімальну "М групу ВАС і повністю секвенували по декількох контигах, що приводило до одержання кінцевого контигу, який перевищує 4млн.п.н. Створення даної карти дозволяє ідентифікувати Сапіоп-ген, який локалізується у геномній ділянці, що демонструє істотне зчеплення з шизофренією.

Амінокислотна послідовність Сапіоп характерна для САСНАММЕЇ, 7-елементного фінгерпринту, який характеризує альфа-1-субодиниці кальцієвих каналів (Кеї. РКО0О167, ВІ ОСКибаза даних). Даний фінгерпринт (Ф, одержували, виходячи з первинного вирівнювання б послідовностей: мотиви витягували з консервативних ка ділянок петлі, що піддаються розрізненню між цими та іншими катіонними каналами; мотиви 1 і 2 кодують послідовності між трансмембранними сегментами 4 і 5, а також 5 і 6 (перший внутрішній повтор); мотив З во відповідає послідовності між сегментом б повтору 1 і сегментом 1 повтору 2; мотив 4 кодує послідовність між сегментами 5 і 6 повтору 2; мотив 5 відповідає послідовності між сегментом 6 повтору З і сегментом 1 повтору 4; а мотиви 6 і 7 кодують послідовності між сегментами 4 і 5, а також між сегментами 5 і 6 повтору 4.

На Фіг.1 представлені ВАС-контиги, які покривають ділянку хромосоми 13, що представляє інтерес, яка включає Сапіоп-ген, і показане геномне розташування Сапіоп-гена відносно генетичних маркерів, що 65 демонструють найвищу значимість у дослідженнях по зчепленню. Зокрема, Віоціп і співавт. (1998) здійснили широке дослідження геному на предмет виявлення локусів схильності до шизофренії, у 54 комплексних родоводах, з використанням 452 мікросателітних маркерів. Найбільш значиме зчеплення між шизофренією у сім'ях виявлялося на хромосомі 13432 поблизу маркера 0135174. Вггивіоміс: і співавт. (1999) дали оцінку мікросателітним маркерам, що охоплюють хромосоми 8 і 13 в 21 великій Канадській сім'ї Маркери для хромосомної ділянки 134 дають позитивні оцінки ГОЮ у кожній аналітичній моделі, що використовується: аутосомно-домінантній і аутосомно-рецесивній, з вузьким або широким визначенням шизофренії. Максимальні триточкові ГОЮО-оцінки були одержані з маркером 0135793 у рецесивно-широкій моделі: 3,92 у рекомбінантній фракції (6) 0,1 при гомогенності і 4,42 з А-0,65 і 0-9 при гетерогенності. На вказаній Фіг.1 Сапіоп-ген локалізований частково у контигу, позначеному "Кедіоп Е' і частково у контигу, позначеному СО0О0О1ТА10. Даний 7/0. Сапіоп-ген рланкований двома маркерами, що демонструють найвищу значимість у дослідженнях по зчепленню.

Маркер 0135174 також знаходиться у контигу СО0О0О1А1О, а маркер 0135793 локалізований, приблизно

З,Бмлн.п.н. центромірніше до Сапіоп-гена.

Існує дуже велика потреба в ідентифікації генів, зв'язаних з шизофренією, біполярним розладом та іншими

ЦНС, а також серцево-судинними захворюваннями і станами. Існує також необхідність в ідентифікації нових 7/5 іонних каналів, зв'язаних із захворюваннями. Такі гени і білки можуть відкрити нові перспективи у лікуванні шизофренії, біполярного розладу або інших ЦНеО-станів, а також інших станів, таких як, наприклад, стани серця та гіпертензія, і дозволяють крім того вивчати і характеризувати Сапіоп-ген і зв'язані з ним біологічні шляхи. Пізнання таких генів і зв'язаних з ними біологічних шляхів, залучених до даних захворювань і станів, дозволить дослідникам зрозуміти етіологію, наприклад, шизофренії та біполярного розладу, і приведе до розробки лікарських засобів і лікарських препаратів, націлених проти причини даних захворювань. Наприклад, сполуки, які блокують Сапіоп-канали, можуть використовуватися для лікування будь-яких захворювань і станів, переважно шизофренії або біполярного розладу, і включають також больові порушення, епілепсію та різні серцево-судинні порушення, такі як серцева аритмія, стенокардія і гіпертензія. Існує також велика необхідність у нових способах виявлення схильності до шизофренії, біполярного розладу та інших станів, а с також для запобігання або для спостереження за розвитком будь-якого з даних захворювань. Діагностичні засоби могли б також виявитися дуже корисними. Дійсно, як приклад, рання ідентифікація у людей з ризиком о розвитку шизофренії зробить можливим раннє і/або профілактичне здійснення лікування. Крім того, точні оцінки ефективності лікарського засобу, а також толерантності пацієнта, дадуть можливість лікареві-клініцисту поліпшити співвідношення між вигодою і ризиком, що стосується схем лікування шизофренії та біполярного ча зо розладу.

У даному винаході розглядаються полінуклеотиди і поліпептиди, що відносяться до Сапіоп-гена. с

Олігонуклеотидні зонди і праймери, які специфічно гібридизуються з геномною або кКДНК-послідовністю Сапіоп, Ф також є частиною даного винаходу. Ще одна мета даного винаходу включає створення рекомбінантних векторів, що включають будь-яку з послідовностей нуклеїнових кислот, описаних у даному винаході, і, зокрема, о рекомбінантних векторів, що включають регуляторну ділянку Сапіоп-послідовності або послідовність, яка кодує ї-

Сапіоп-білок, а також клітини-хазяїна, що включають вказані послідовності нуклеїнових кислот або рекомбінантні вектори. Даний винахід включає також способи скринування молекул, здатних модулювати експресію або активність Сапіоп-гена або білка, а також способи використання таких молекул для лікування або попередження шизофренії, біполярного розладу або будь-якого захворювання з числа інших захворювань або « 70 станів. У даному винаході розглядаються також антитіла, специфічно націлені проти поліпептидів, які придатні шщ с як діагностичні реагенти. й У даному винаході розглядаються також двоалельні маркери, зв'язані з Сапіоп, та їх використання у "» генетичному аналізі, включаючи вивчення зчеплення у сім'ях, вивчення зчеплення при порушенні рівноваги у популяціях і асоціативні дослідження у популяціях хворих і здорових. Важливий аспект даного винаходу полягає

У тому, що двоалельні маркери дозволяють здійснювати асоціативні дослідження для ідентифікації ролі генів, -І залучених до контролю складних ознак.

Визначення о Перед більш докладним описом даного винаходу формулюються визначення, що йдуть нижче, які ілюструють

Ге) і задають значення та рамки термінів, що використовуються для опису представленого у даному описі винаходу.

Термін "Сапіоп-ген" що використовується у даному описі, включає в себе геномні, мРНК і кднкК де послідовності, що кодують Сапіоп-білок, у тому числі і регуляторні ділянки, які не транслюються, геномної ДНК. "І Термін "гетерологічний білок", що використовується у даному описі, призначений для позначення будь-якого білка або поліпептиду, який відрізняється від Сапіоп-білка. Наприклад, гетерологічний білок може являти собою сполуку, яку можна використовувати як маркер у додаткових експериментах з регуляторною ділянкою Сапіоп.

Термін "виділений" вимагає, щоб матеріал був видалений зі свого первинного навколишнього середовища (наприклад, природного навколишнього середовища, якщо він є таким, що зустрічається у природі). Наприклад іФ) полінуклеотид або поліпептид, що зустрічається у природі, представлений у живому організмі тварини, не є ко виділеним, але той же полінуклеотид або ДНК, або поліпептид, відділений від деяких або від усіх співіснуючих речовин у даній природній системі, є виділеним. Такий полінуклеотид може бути частиною вектора і/або такий бо полінуклеотид або поліпептид може бути частиною композиції, і все ж бути виділеним, вектор або композиція не є частиною його природного оточення.

Наприклад полінуклеотид, що зустрічається у природі, представлений у живому організмі тварини, не є виділеним, але той же полінуклеотид, відділений від деяких або з усіх супровідних речовин у природній системі, є виділеним. Зокрема, виключеними з визначення "виділений" є: хромосоми (такі як хромосомні б5 розподіли), що зустрічаються у природі, бібліотеки штучних хромосом, геномні бібліотеки і кДНК-бібліотеки, які існують або у вигляді іп мйго препарату нуклеїнової кислоти, або у вигляді препарату трансфікованої/трансформованої клітини-хазяїна, де дані клітини-хазяї являють собою або гетерогенний іп мйго препарат, або посіяні у вигляді гетерогенної популяції з одиничних колоній. Виключаються також, зокрема, і вказані вище бібліотеки, в яких конкретний полінуклеотид складає менше 595 від числа вставок нуклеїнових кислот у векторні молекули. Крім того, виключаються, зокрема, препарати геномної ДНК цілих клітин або РНК цілих клітин (включаючи вказані вище препарати цілих клітин, які механічно нарізаються або ензиматично розщеплюються). Крім того, виключаються, зокрема, препарати вказаних вище цілих клітин у вигляді або іп мйго препарату, або у вигляді гетерогенної суміші, розділеної за допомогою електрофорезу (включаючи блотинг), де полінуклеотид даного винаходу не був додатково відділений від гетерологічних полінуклеотидів в /о електрофоретичному середовищі (наприклад, додаткове відділення шляхом вирізання одиночної смуги з гетерогенної популяції смуг в агарозному гелі або у нейлоновому блоті).

Термін "виділений очищенням" не вимагає абсолютного ступеня очищення; швидше він призначається як відносне визначення. Очищення вихідної речовини або природної речовини до, щонайменше, одного порядку величини, переважно двох або трьох порядків, і більш переважно чотирьох або п'яти порядків, безперечно передбачається. Як приклад, очищення з 0,195 концентрації до 1095 концентрації є очищенням на два порядки.

Як приклад, індивідуальні кДНК-клони, виділені з кДНК-бібліотеки, були традиційно очищені до електрофоретичної гомогенності. Послідовності, одержані з даних клонів, неможливо було б одержати безпосередньо з даної бібліотеки або з тотальної ДНК людини. Дані кДНК-клони не є клонами, що зустрічаються у природі як такі але швидше їх одержують за допомогою операції речовини (інформаційна РНК), що 2о Зустрічається у природі, яка частково виділяється очищенням. Перетворення мРНК у КДНК-бібліотеку включає в себе створення синтетичної речовини (кКДНК), а очищені індивідуальні КДНК-клони можуть бути виділені з даної синтетичної бібліотеки за допомогою клональної селекції. Таким чином, створення кДНК-бібліотеки з інформаційної РНК і послідовне виділення індивідуальних клонів з даної бібліотеки приводить, приблизно, до 107-105-кратного очищення нативної РНК. с

Крім того, термін "виділений очищенням" використовують у даному описі для описання поліпептиду або полінуклеотиду даного винаходу, який був відділений від інших сполук, включаючи, але, не обмежуючись ними, і) поліпептиди або полінуклеотиди, вуглеводні, ліпіди і т.п. Термін "виділений очищенням" можна використовувати для конкретного відділення мономерних поліпептидів даного винаходу від олігомерних форм, таких як гомо- або гетеродимери, димери, тримери і т.п. Термін "виділений очищенням" можна також використовувати відносно рч- специфічного відділення ковалентнозамкнених полінуклеотидів від лінійних полінуклеотидів. Будь-який полінуклеотид є у значному ступені чистим, якщо, щонайменше, близько 5095, переважно 60-7595 зразка виявляє с єдину полінуклеотидну послідовність і конформацію (наприклад, лінійну у порівнянні з ковалентнозамкненою). У ФУ значному ступені чистий поліпептид або полінуклеотид звичайно включає близько 5095, переважно 60-9090 маса/маса поліпептидного або полінуклеотидного зразка, відповідно, переважно близько 9595 і більш переважно о близько 9995 чистого продукту. Бездомішковість поліпептиду або полінуклеотиду або гомогенність показують за допомогою ряду способів, добре відомих у даній області техніки, таких, наприклад, як електрофорез зразка у гелі агарози або у гелі поліакриламіду, з подальшою візуалізацією єдиної смуги після забарвлювання гелю. Для деяких цілей найбільше розрізнення можна одержати з використанням ВЕРХ або інших способів, добре відомих « у даній області техніки. Як альтернативний варіант здійснення даного винаходу, очищення поліпептидів і полінуклеотидів даного винаходу може бути виражене, щонайменше, у вигляді процентів чистої речовини по й с відношенню до гетерологічних поліпептидів і полінуклеотидів (ДНК, РНК або обох). Як переважний варіант ц здійснення даного винаходу, поліпептиди і полінуклеотиди даного винаходу володіють, щонайменше, 1095, 2095, и"? ЗО, 4095, 5095, бОЗо, 7095, 80905, 9095, 9595, 965, 9895, 9995 або 10095 чистоти (бездомішковості) відносно, відповідно, гетерологічних поліпептидів і полінуклеотидів. Як ще більш переважний варіант здійснення даного 5 винаходу дані поліпептиди і полінуклеотиди володіють ступенем очищення, що коливається від будь-якого числа -І до тисячної частки, між 9095 і 10095 (наприклад, поліпептид або полінуклеотид, щонайменше, 99,99595 чистоти) по відношенню, відповідно, до їх гетерологічних поліпептидів і полінуклеотидів, або у вигляді співвідношення о маса/маса по відношенню до всіх сполук і молекул, які відрізняються від тих, що існують у даному носії. Кожне (Се) число, що представляє процент чистоти, до тисячної частки, можна заявляти як індивідуальний вид чистоти.

Термін "поліпептид" відноситься до полімеру амінокислот, не беручи до уваги довжину даного полімеру; тому о пептиди, олігопептиди та білки включені без визначення поліпептиду. Даний термін також не визначає або "І виключає постекспресійні модифікації поліпептидів, наприклад, поліпептидів, які мають у своєму складі ковалентно приєднані глікозильні групи, ацетильні групи, фосфатні групи, ліпідні групи і до них подібні, що чітко підпадають під термін поліпептид. У дане визначення включені також поліпептиди, які містять один або декілька аналогів амінокислот (включаючи, наприклад, амінокислоти, що не зустрічаються у природі, амінокислоти, які зустрічаються у природі тільки у неспорідненій біологічній системі, модифіковані іФ) амінокислоти з систем ссавців і т.п.), поліпептиди із заміщеними зв'язками, а також інші модифікації, відомі ко у даній області техніки, як такі, що зустрічаються у природі, так і такі, що не зустрічаються у природі.

Термін "рекомбінантний поліпептид", що використовується у даному описі, відноситься до поліпептиду, який бо штучно створюють і який включає, щонайменше, дві поліпептидні послідовності, які не виявляються у вигляді суміжних поліпептидних послідовностей в їх природному середовищі, або відноситься до поліпептидів, які експресуються з рекомбінантного полінуклеотиду.

Термін "тварина, що не належить до людського роду", який використовується у даному описі, відноситься до будь-якого хребетного, що не належить до людського роду, птахів і, більш переважно, ссавців, переважно 65 приматів, сільськогосподарських тварин, таких як свині, кози, вівці, осли і коні, кролики або гризуни, більш переважно щури або миші. Термін "тварина", що використовується у даному описі, відноситься до будь-якого хребетного, переважно ссавця. Обидва терміни "тварина" і "ссавець" безперечно включають людські істоти, якщо не передує термін "такий, що не належить до людського роду".

Термін "антитіло", що використовується у даному описі, відноситься до поліпептиду або до групи поліпептидів, які включають, щонайменше, один зв'язувальний домен, який відрізняється тим, що антитіло-зв'язувальний домен утворюється з упакованих варіабельних доменів молекули антитіла з утворенням тривимірного зв'язувального простору з формою внутрішньої поверхні і розподілом заряду, комплементарного особливостям антигенної детермінанти антигену, що дозволяє імунологічно реагувати з даним антигеном.

Антитіла мають у своєму складі рекомбінантні білки, що включають зв'язувальні домени, а також фрагменти, які 7/0 Включають Раб, Раб", К(аб)» і Р(ар)»-фрагменти.

Термін "антигенна детермінанта", що використовується у даному описі, являє собою частину молекули антигену, у даному випадку Сапіоп-поліпептиду, яка визначає специфічність взаємодії антиген-антитіло. "Епітоп" відноситься до антигенної детермінанти поліпептиду. Епітоп може включати не менше З амінокислот для просторової конформації, яка є унікальною для даного епітопу. Як правило, епітоп включає, щонайменше, 6 у/5 таких амінокислот, але більш звичайно, щонайменше, 8-Ю таких амінокислот. Способи визначення амінокислот, які складають епітоп, включають рентгенівську кристалографію, 2-вимірний ядерний магнітний резонанс та епітопне картування, наприклад, способом Рерзсап, |описаним Сеузеп і співавт., 1984; Публікація РСТ Мо

УО84/03564; і Публікація РСТ Мо М/О84/035061.

Протягом всього даного опису експресія "нуклеотидної послідовності" може вживатися для позначення полінуклеотиду або нуклеїнової кислоти. Більш точно, експресія "нуклеотидної послідовності" охоплює власне матеріал нуклеїнової кислоти і, отже, не обмежується інформацією про послідовність (тобто, послідовність букв, вибрану з чотирьох букв основи), яка біохімічно характеризує специфічність молекули ДНК або РНК.

Терміни "нуклеїнові кислоти", "олігонуклеотиди" і "полінуклеотиди", що використовуються у даному описі поперемінно, включають РНК, ДНК або гібридні послідовності РНК/ДНК з більш ніж однією послідовністю в сч одноланцюжковій або дуплексній формі. Термін "нуклеотид" використовують у даному описі як прикметник до опису молекул, що включають РНК, ДНК, або гібридних послідовностей РНК/ДНК будь-якої довжини в (8) одноланцюжковій або дуплексній формі. Термін "нуклеотид", що також використовується у даному описі як іменник, відноситься до індивідуальних нуклеотидів або до великої кількості нуклеотидів, маючи на увазі молекулу або індивідуальний елемент у більшій молекулі нуклеїнової кислоти, що включає пурин або піримідин, М зо Чукрову складову рибози або дезоксирибози і фосфатну групу, або фосфодіефірний зв'язок у випадку нуклеотидів в олігонуклеотиді або полінуклеотиді. Хоча термін "нуклеотид", що використовується у даному с описі, охоплює також "модифіковані нуклеотиди", які включають, щонайменше, одну з модифікацій (а) Ге! альтернативну зв'язувальну групу, (Б) аналогову форму пурину, (с) аналогову форму піримідину або (а) аналоговий цукор, приклади аналогових зв'язувальних груп, пурину, піримідинів і цукру Ідив., наприклад, у Ме публікації РСТ Мо УУООБ/04064). Полінуклеотидні послідовності даного винаходу можуть бути одержані ї- будь-яким відомим способом, включаючи синтетичний, рекомбінантний, ех мімо перетворення або їх поєднанням, а також використовуючи будь-які способи очищення, відомі у даній області техніки.

Послідовність, яку "функціонально приєднують" до регуляторної послідовності, такої як промотор, означає, що вказаний регуляторний елемент знаходиться у правильному положенні та орієнтації по відношенню до « Нуклеїнової кислоти, для контролювання РНК-полімеразної ініціації та експресії нуклеїнової кислоти, що з с представляє інтерес. Термін "функціонально приєднаний", що використовується у даному описі, відноситься до зв'язування полінуклеотидних елементів у функціональному взаємозв'язку. Наприклад, промотор або енхансер ;» функціонально зв'язують з послідовністю, що кодує, якщо він впливає на транскрипцію даної послідовності, що кодує.

Терміни "ознака" і "фенотип" використовуються у даному описі взаємозамінно і відносяться до будь-якої -І видимої, такої, що виявляється або інакше вимірюється властивості організму, такої, наприклад, як симптоми або схильність до захворювання. Звичайно терміни "ознака" або "фенотип", що використовуються у даному се) описі, відносять до симптомів або до схильності до захворювання, до позитивної відповіді або до побічних

Ге) ефектів, зв'язаних з лікуванням. Переважно, вказана ознака може являти собою, без обмеження, психічні розпади, такі як шизофренія або біполярний розлад, інші ЦНС або нейрональні розлади, такі як епілепсія або ю порушення больових відчуттів, а також серцево-судинні стани, такі як стенокардія, гіпертензія і аритмія, а

І також будь-який аспект, особливість або характеристику будь-якого з даних захворювань або станів.

Термін "алель", що використовується у даному описі, відносять до варіантів нуклеотидної послідовності.

Двоалельний поліморфізм має дві форми. Диплоїдні організми можуть бути гомозиготою або гетерозиготою за ов алельною формою.

Термін "рівень гетерозиготності", що використовується у даному описі, відносять до частини індивідів у

Ф) популяції, які є гетерозиготами по окремому алелю. У двоалельній системі рівень гетерозиготності дорівнює, у ка середньому, 2РА(1-Ра), де Ра відповідає частоті найменш поширеного алеля. Для використання у генетичних дослідженнях генний маркер повинен володіти адекватним рівнем гетерозиготності, що допускає прийнятну бор ймовірність того, що випадково вибраний суб'єкт буде гетерозиготою.

Термін "генотип", що використовується у даному описі, відносять до тотожності апелів, представлених у індивіда або у зразку. У контексті даного винаходу генотип переважно відносять до опису двоалельних маркерних апелів, представлених у індивіда або у зразку, наприклад, алелі двоалельних маркерів в Сапіоп-гені або у геномній ділянці. Термін "генотипування" зразка або індивіда по двоалельному маркеру включає в себе 65 визначення конкретного алеля або конкретного нуклеотиду, що здійснюється по індивідуальному двоалельному маркеру.

Термін "мутація", що використовується у даному описі, відносять до відмінності у ДНК-послідовності між або серед різних геномів або індивідів, які володіють частотою нижче 195.

Термін "гаплотип" відносять до поєднання алелів, представлених у індивіда або у зразку. У контексті даного винаходу гаплотип переважно відносять до поєднання двоалельних маркерних алелів, що виявляються у даного індивіда, і можуть бути асоційовані з фенотипом.

Термін "поліморфізм", що використовується у даному описі, відносять до зустрічальності однієї або декількох альтернативних геномних послідовностей або алелів серед або у різних геномів або індивідів. "Поліморфний" відноситься до стану, в якому два або більше варіантів конкретної геномної послідовності можуть 70 бути виявлені у популяції. "Поліморфний сайт" являє собою локус, по якому спостерігається мінливість.

Поліморфізм єдиного нуклеотиду являє собою заміщення одного нуклеотиду іншим нуклеотидом у даному поліморфному сайті. Делеція одиничного нуклеотиду або вставка одиничного нуклеотиду також приводить до зростання поліморфізму єдиного нуклеотиду. У контексті даного винаходу "поліморфізм єдиного нуклеотиду" переважно відноситься до одиничної нуклеотидної заміни. Звичайно, у різних індивідів даний поліморфний сайт /5 Може бути зайнятий двома різними нуклеотидами.

Терміни "двоалельний поліморфізм" і "двоалельний маркер" використовуються у даному описі взаємозамінно і відносяться до поліморфізму єдиного нуклеотиду, що володіє двома алелями з досить високою частотою у популяції. "Двоалельний маркерний алель" відноситься до нуклеотидних варіантів, представлених по сайту двоалельного маркера. Звичайно, частота малорозповсюдженого алеля двоалельних маркерів даного винаходу, як оцінка, складає більше ніж 195, переважно його частота перевищує 1095, більш переважно його частота складає, щонайменше, 2095 (тобто, рівень гетерозиготності складає, щонайменше, 0,32), ще більш переважно його частота дорівнює, щонайменше, 3095 (тобто, рівень гетерозиготності досягає, щонайменше, 0,42).

Двоалельний маркер, в якому частота малорозповсюдженого алеля дорівнює 3095 або більше, називають "високоякісним двоалельним маркером". сч

Положення нуклеотидів у полінуклеотиді відносно центра полінуклеотиду описується у даному описі наступним чином. Якщо полінуклеотид володіє непарним числом нуклеотидів, то вважають, що нуклеотид, і) рівновіддалений від 3 і 5' кінців у даному полінуклеотиді, знаходиться "у центрі" даного полінуклеотиду. і будь-який нуклеотид, що безпосередньо примикає до нуклеотиду у центрі, або ж сам нуклеотид у центрі, вважають таким, що знаходиться "в 1 нуклеотиді від центра". При непарному числі нуклеотидів у полінуклеотиді р. зо будь-яку з п'яти нуклеотидних позицій у середині полінуклеотиду потрібно вважати такою, що знаходиться "в 2 нуклеотидах від центра", і так далі. Якщо полінуклеотид володіє парним числом нуклеотидів, то у центрі даного с полінуклеотиду буде знаходитися зв'язок, а не нуклеотид. Таким чином, будь-який з двох центральних б нуклеотидів потрібно вважати таким, що знаходяться "в 1 нуклеотиді від центра", а будь-який з чотирьох нуклеотидів у середині даного полінуклеотиду потрібно вважати таким, що знаходиться "в 2 нуклеотидах від (22) центра", і так далі. Що стосується поліморфізму, який зв'язаний із заміною, вставкою або делецією 1 або ї- більше нуклеотидів, то даний поліморфізм, алель або двоалельний маркер знаходиться "у центрі" полінуклеотиду, якщо різниця між відстанню від заміщених, вставлених або делетованих полінуклеотидів даного поліморфізму до 3-кінця даного полінуклеотиду, відстанню від заміщених, вставлених або делетованих полінуклеотидів даного поліморфізму до 5'-кінця даного полінуклеотиду, дорівнює нулю або одному нуклеотиду. «

Якщо дана різниця дорівнює 0-3, тоді даний поліморфізм вважають таким, що знаходиться "в 1 нуклеотиді від з с центра". Якщо дана різниця складає 0-5, даний поліморфізм вважають таким, що знаходиться "в 2 нуклеотидах . від центра". Якщо ж дана різниця складає 0-7, то даний поліморфізм вважають таким, що знаходиться "в З и? нуклеотидах від центра", і так далі.

Термін "лівіше", що використовується у даному описі, відноситься до місця, яке знаходиться біля 5-кінця даного полінуклеотиду від певної точки відліку, або, у випадку гена, у напрямі від послідовності, що кодує, -І до промотору.

Терміни "спарені основи" і "спарені основи Уотсона і Крика", що використовуються у даному описі се) взаємозамінно, відносяться до нуклеотидів, які можуть бути зв'язані один з одним водневим зв'язком, завдяки

Ге) ідентичності їх послідовностей, способом, подібним до того, який виявляє двоспіральна ДНК для залишків тиміну або урацилу, зв'язаних із залишками аденіну за допомогою двох водневих зв'язків, і залишків цитозину і де гуаніну, зв'язаних за допомогою трьох водневих зв'язків див. 5ігуег, І.., Віоспетівігу, 4й еадйіоп, 1995). "М Терміни "комплементарний" або "його комплемент", що використовуються у даному описі, відносяться до послідовностей полінуклеотидів, які здатні утворювати пари основ Уотсона і Крика з іншим конкретним полінуклеотидом по всій повністю комплементарній ділянці. Для даної мети даного винаходу перший в Полінуклеотид визнають комплементарним другому полінуклеотиду, якщо кожна основа першого полінуклеотиду спарюється зі своєю комплементарною основою. Комплементарними основами є, як правило, А і Т (або А і У),

Ф) або С і б. "Комплемент" використовується у даному описі як синонім "комплементарного полінуклеотиду", ка "комплементарної нуклеїнової кислоти" і "комплементарної нуклеотидної послідовності". Дані терміни, що застосовуються до пар полінуклеотидів, базуються виключно на їх послідовностях, а не на якій-небудь во конкретній сукупності умов, при яких дані два полінуклеотиди були б фактично зв'язані.

Варіанти і фрагменти 1 - Полінуклеотиди

Даний винахід відноситься також, до варіантів і фрагментів описаних у даному описі полінуклеотидів, зокрема, Сапіоп-гена, що містить один або більше двоалельних маркерів. 65 Варіанти полінуклеотидів, як термін, що використовується у даному описі, являють собою полінуклеотиди, які відрізняються від вихідного полінуклеотиду. Варіант полінуклеотиду може бути варіантом, що зустрічається у природі, таким, наприклад, як алельний варіант, що зустрічається у природі, або він може бути варіантом, який не відомий як такий, що зустрічається у природі. Такі варіанти даного полінуклеотиду, що не зустрічаються у природі, можна створити методами мутагенезу, у тому числі і тими, які застосовні до полінуклеотидів, клітин або організмів. Звичайно, відмінності є такими невеликими, що нуклеотидні послідовності вихідного і варіантного полінуклеотидів майже повністю співпадають, а по багатьох ділянках ідентичні.

Варіанти полінуклеотидів, відповідно до даного винаходу, включають, без істотного обмеження, нуклеотидні послідовності, які щонайменше, на 9595 ідентичні полінуклеотиду, вибраному з групи, що складається з 7/0 нуклеотидних послідовностей ЗЕСО 10 Моз 1-4, або полінуклеотидному фрагменту, щонайменше, з 12 послідовних нуклеотидів полінуклеотиду, вибраного з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей

ЗЕО ІЮО Моз 1-4, і переважно, щонайменше, ідентичні на 9995, більш переважно, щонайменше, ідентичні на 99,595, і найбільш переважно, щонайменше, ідентичні на 99,895 полінуклеотиду, вибраному з групи, яка складається з нуклеотидних послідовностей ЕС ІЮО Мов 1-4, або будь-якому полінуклеотидному фрагменту, щонайменше, з 12 послідовних нуклеотидів полінуклеотиду, вибраного з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей ЗЕО ІЮ Мо 1-4.

Нуклеотидні зміни, які присутні у варіантному полінуклеотиді, можуть бути такими, які мовчать, це означає, що вони не змінюють амінокислоти, які кодуються даним полінуклеотидом. Однак нуклеотидні зміни можуть також приводити і до амінокислотних замін, додавань, делецій, злиттів і укорочень у даному поліпептиді, що кодується початковою послідовністю. У даних замінах, делеціях або додаваннях можуть брати участь один або більше нуклеотидів. Дані варіанти можуть бути результатом змін у ділянці, що кодує або не кодує, або в обох. Зміни у ділянках, що кодують, можуть створювати консервативні або неконсервативні заміни, делеції або додавання.

У контексті даного винаходу особливо переважними варіантами здійснення даного винаходу є ті, в яких дані с об полінуклеотиди кодують поліпептиди, які фактично зберігають ту ж біологічну функцію або активність, що і зрілий Сапіоп-білок, або ті, в яких дані полінуклеотиди кодують поліпептиди, які зберігають або підвищують (8) основну біологічну активність, знижуючи у той же час допоміжну (вторинну) біологічну активність.

Полінуклеотидний фрагмент являє собою полінуклеотид, що володіє послідовністю, яка абсолютно така ж, що і частина, але не вся дана нуклеотидна послідовність, переважно нуклеотидна послідовність Сапіоп-гена, та М зо його варіанти. Даний фрагмент може являти собою ділянку інтрону або екзону Сапіоп-гена. Він може також являти собою яку-небудь частину з регуляторних ділянок Сапіоп. Переважно, такі фрагменти включають, с щонайменше, один з двоалельних маркерів А1-А17 або його комплементів або двоалельний маркер, зчеплений б при порушенні рівноваги з одним або декількома двоалельними маркерами А1-А17.

Такі фрагменти можуть бути "автономними", тобто, не бути частиною або такими, що злилися з іншими, ме) полінуклеотидами, або вони можуть бути включені в окремий великий полінуклеотид, в якому вони утворюють ча сегмент або ділянку. Дійсно, декілька таких фрагментів можуть бути представлені в окремому великому полінуклеотиді.

Факультативно, такі фрагменти можуть складатися або складатися в основному з безперервної ділянки послідовності, щонайменше, з 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 або 1000 « Нуклеотидів у довжину. Сукупність переважних фрагментів містить, щонайменше, один з двоалельних маркерів сплю) с А1-А17 Сапіоп-гена, який описаний у даному описі, або його комплементи. 2 - Поліпептиди з Даний винахід відноситься також до варіантів, фрагментів, аналогів і похідних описаних у даному описі поліпептидів, включаючи мутантні Сапіоп-білки.

Даний варіант може являти собою 1) варіант, в якому один або декілька амінокислотних залишків замінені -І консервативним або неконсервативним амінокислотним залишком, і такий заміщений амінокислотний залишок може кодуватися або може не кодуватися за допомогою генетичного коду, або 2) варіант, в якому один або ік декілька амінокислотних залишків включають заміщену групу, або 3) варіант, в якому мутантний Сапіоп со зливається з іншою сполукою, такою, наприклад, як сполука, яка збільшує час напівжиття даного поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь), або 4) варіант, в якому додаткові амінокислоти зливаються з мутантним Сапіоп, ко такою, наприклад, як лідерна або секреторна послідовність або послідовність, яку використовують для виділення "М очищенням мутантного Сапіоп, або препротеїнова послідовність. Ці варіанти вважаються такими, що знаходяться у компетенції фахівців у даній області техніки.

Поліпептидний фрагмент являє собою поліпептид, що володіє послідовністю, яка ідентична частині, але не всій даній поліпептидній послідовності, переважно поліпептид, що кодується Сапіоп-геном і його варіантами.

Що стосується амінокислотної заміни в амінокислотній послідовності поліпептиду, відповідно до даного (Ф) винаходу, одну або декілька амінокислот можна замінити "еквівалентними" амінокислотами. Вираз ка "еквівалентна" амінокислота використовують у даному описі для позначення будь-якої амінокислоти, яка може бути замінена однією або декількома амінокислотами, що володіють аналогічними во властивостями, за умови, що фахівці в області хімії пептидів можуть передбачати вторинну структуру і гідропатичну природу даного поліпептиду, які будуть залишатися практично незміненими. Переважно наступні групи амінокислот відповідають еквівалентним змінам: (1) Аа, Рго, СУ, Сім, Авр, СіІп, Авп, бег, ТАг; (2)

Сув, Зег, Туг, ТАг; (3) Маї, Пе, Геим, Меї, Аа, РНе; (4) Гуз, Ага, Нів; (3) Ре, Туг, Тір, Нів.

Специфічний варіант здійснення модифікованої пептидної Сапіоп-молекули, що представляє інтерес, 65 відповідно до даного винаходу, включає, але не обмежується вказаним, пептидну молекулу, яка стійка до протеолізу, в якій пептидний зв'язок - СОМН- модифікований і замінений відновленим зв'язком (СН2МН), зв'язком гейго іпмегго (МНСО), метиленоксизв'язком (СН2-О), тіометиленовим зв'язком (СН2-5), карбозв'язком (СН2СНЗ), ацетометиленовим зв'язком (СО-СН2), гідроксіетиленовим зв'язком (СНОН-СН2), М-М-зв'язком, Е-аісеп-зв'язком або -СНАСН-зв'язком. До даного винаходу включений Сапіоп-поліпептид людини або його фрагмент, або його

Варіант, в якому, щонайменше, один пептидний зв'язок був модифікований, як описано вище.

Такі фрагменти можуть бути "автономними", тобто, не бути частиною або такими, що злилися з іншими поліпептидами, або вони можуть бути включені в окремий великий поліпептид, в якому вони утворюють сегмент або ділянку. Разом з тим, декілька фрагментів можна включити в один великий поліпептид.

Як репрезентативні приклади поліпептидних фрагментів даного винаходу у даному описі можна вказати на 70 фрагменти, які володіють довжиною приблизно 5, 6, 7, 8, 9 або 10-15, 10-20, 15-40 або 30-55 амінокислот.

Переважними є фрагменти, що містять, принаймні, мутацію однієї амінокислоти у білок Сапіоп.

Ідентичність нуклеїнових кислот або поліпептидів

Терміни "процент ідентичності послідовностей" і "процент гомології", що використовуються у даному описі взаємозамінно, застосовують для порівняння полінуклеотидів або поліпептидів, і визначають за допомогою порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей у вікні порівняння, де частина полінуклеотидної або поліпептидної послідовності у вікні порівняння може включати додавання або делеції (тобто, пропуски) при порівнянні з вихідною послідовністю (яка не включає додавання або делеції) для оптимального вирівнювання двох даних послідовностей. Вказаний процент обчислюють шляхом визначення числа позицій, по яких у обох послідовностей спостерігаються ідентичні основи нуклеїнових кислот або амінокислотні залишки, з одержанням відповідних позицій, діленням числа відповідних позицій на загальне число позицій у даному вікні порівняння і множенням одержаного результату на 100 з одержанням процента ідентичності послідовностей. Гомологію оцінюють з використанням будь-якого з великої кількості різноманітних алгоритмів порівняння послідовностей і програм, відомих у даній області техніки. Такі алгоритми і програми включають, але жодним чином не обмежуються, ТВІ АТМ, ВІ АЗТР, РА5ТА, ТЕАЗТА і СІ О5ТАЇ МУ (Реагзоп апа Ііртап, 1988; АїЇїв8спиЇ і співавт., сч 1990; Тпотрзоп і співавт., 1994; Ніддіпв і співавт., 1996; АЙйвспц! і співавт., 1990; Аеспці і співавт., 1993). В особливо переважному варіанті здійснення даного винаходу гомології послідовностей білків і і) нуклеїнових кислот оцінюють з використанням Вазвіс І оса! АІдптепі Зеагсп Тоо! ("ВІ А5Т"), що добре відомий у даній області техніки (див., наприклад, Капіп апа Аївеспцші, 1990; АНвспш! і співавт., 1990, 1993, 1997).

Зокрема, п'ять специфічних ВІ АЗТ-програм використовуються для виконання наступної задачі: М зо (1) ВГАЗТР і ВГ А5ТЗ порівнюють запитувану амінокислотну послідовність з послідовністю білка бази даних; (2) ВГА5ЗТМ порівнює запитувану нуклеотидну послідовність з нуклеотидною послідовністю бази даних; с (3) ВГ А5ТХ порівнює уявні продукти трансляції шести рамок запитуваної нуклеотидної послідовності (обидва Ге! ланцюги) з послідовністю білка бази даних; (4) ТВА5БТМ порівнює запитувану послідовність білка з нуклеотидною послідовністю бази даних, що ме)

Зв транслюється з усіх шести відкритих рамок зчитування (обидва ланцюги); і ї- (5) ТВГА5ТХ порівнює трансляцію шести рамок запитуваної нуклеотидної послідовності з трансляцією шести рамок нуклеотидної послідовності бази даних.

ВІ АБЗТ-програми ідентифікують гомологічні послідовності шляхом ідентифікації схожих сегментів, які іменуються у даному описі як "високооцінювані пари сегментів", між амінокислотною або нуклеотидною « послідовністю, що представляє інтерес, і тест-послідовністю, яку переважно одержують з послідовності білка з с або нуклеотидної послідовності бази даних. Високооцінювані пари сегментів переважно ідентифікують (тобто, розміщують) за допомогою способів оцінки матриці, багато з яких добре відомі у даній області техніки. Матриця ;» оцінок, що переважно використовується, являє собою ВІ О5ИМб62-матрицю |ІСоппеї і співавт., 1992; Непікоїї апа

Непікоїї, 1993). З меншою перевагою можна також використовувати матриці РАМ або РАМ25О |див., наприклад,

Зспмагг апа Оаурпої, еав., 1978). ВІ АЗТ-програми оцінюють статистичну значимість високооцінюваних пар -І сегментів, що ідентифікуються, і переважно відбирають ті сегменти, які задовольняють порогу значимості, що встановлюється користувачем, такому як процент, який встановлюється користувачем гомології. Переважно ік статистична значимість високооцінюваної пари сегментів оцінюється з використанням формули статистичної

Ге) значимості Карліна І|див., наприклад, Каїіїйп апа Аїївспиї, 19901.

ВІ АЗТ-програми можуть використовуватися зі значеннями параметрів за умовчанням або з модифікованими о параметрами, створеними користувачем. "М Жорсткі умови гібридизації

З метою охарактеризувати таку нуклеїнову кислоту, що гібридизується, відповідно до даного винаходу, жорсткі умови гібридизації є наступними: стадію гібридизації здійснюють при 6593 в присутності бхЗ5С-буфера, Бхрозчину Денхардта, 0,595 ЗО5 і 100мкг/мл ДНК сперми лосося. (Ф, Стадію гібридизації здійснюють з наступними чотирма стадіями відмивання: ко - два відмивання по 5хв., переважно при 652С в 25555 і 0,195 5О5-буфері; - одне відмивання ЗОхв., переважно при 659С в 255552 і 0,195 505-буфері, 60 - одне відмивання 10Охв., переважно при 652С в 0,1х5552 і 0,195 505-буфері, дані умови гібридизації придатні для молекули нуклеїнової кислоти довжиною близько 20 нуклеотидів. Немає необхідності говорити про те, що описані вище умови гібридизації адаптують відповідно до довжини необхідної нуклеїнової кислоти, дотримуючись методів, добре відомих фахівцям у даній області техніки. Придатні умови гібридизації можна, наприклад, адаптувати відповідно до вказівок, |викладених у книзі Натевз і Ніддіпз (1985)) 65 Геномні послідовності Сапіоп-гена

У даному винаході розглядають геномну послідовність Сапіоп. Даний винахід включає в себе Сапіоп-ген або геномні Сапіоп-послідовності, що складаються, або в основному складаються з, або включають послідовність

ЗЕО ІЮО Моз 1-3, комплементарну їй послідовність, а також її фрагменти і варіанти. Дані полінуклеотиди можуть являти собою полінуклеотиди, виділені очищенням, виділені або рекомбінантні.

Даний винахід включає в себе також виділений очищенням, виділений або рекомбінантний полінуклеотид, що включає нуклеотидну послідовність, яка володіє, щонайменше, 70, 75, 80, 85, 90 або 9595 нуклеотидною ідентичністю з нуклеотидною послідовністю 5ЕС І Мов 1-3 або з її комплементарною послідовністю, або з її фрагментом. Нуклеотидні відмінності, що стосуються нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮ Моз 1-3, можуть бути, як правило, розподілені випадково по всій довжині нуклеїнової кислоти. Проте, переважними нуклеїновими /0 Кислотами є ті з них, в яких нуклеотидні відмінності, що стосуються нуклеотидної послідовності «ЕС ІЮ Мов 1-3, переважно локалізовані за межами даних послідовностей, що кодують, які містяться в екзонах. Дані нуклеїнові кислоти, а також їх фрагменти і варіанти, можуть використовуватися як олігонуклеотидні праймери або зонди з метою виявлення наявності копії Сапіоп-гена у тест-вибірці або, альтернативно, з метою ампліфікувати нуклеотидну послідовність-мішень в Сапіоп-послідовностях.

Інший об'єкт даного винаходу складається з виділеної очищенням, виділеної або рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка гібридизується з нуклеотидною послідовністю ЕС І Моз 1-3 або з комплементарною їй послідовністю, або з її варіантом, у жорстких гібридизаційних умовах, як вказано вище. У переважних варіантах здійснення даного винаходу вказана виділена очищенням, виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота специфічно гібридизується з полінуклеотидами Сапіоп-гена людини, більш переважно, якщо вказана нуклеїнова 2о Кислота здатна гібридизуватися з нуклеотидами з Сапіоп-гена людини, але практично нездатна гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю Сапіоп-гена щура.

Особливо переважна нуклеїнова кислота даного винаходу включає виділені, виділені очищенням або рекомбінантні полінуклеотиди, що включають безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25,30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000,2000, 3000, 4000, 5000 або 10000 нуклеотидів з с дв ЗЕО ІО Моз 1-3 або з її комплементів. Потрібно зазначити, що нуклеотидні фрагменти будь-якого розміру і о послідовності можуть також включатися у полінуклеотиди, описані у даному розділі.

Геномна нуклеїнова кислота Сапіоп включає 44 екзони. Розташування екзонів у ЕС ІЮ Мов 1-3 докладно представлене нижче у Таблиці В. ча з т я шкі я Ф

Ф зв ча вив 0 | 60мво | тво в тя 101001 ч с . Свят 0 язво01000язвю 0 яз » 8 яю айо» | 8 моз 0 Бюва 0 вхеа | вмт | 9 вив тт 1 - о

Ф ю та о т во ваванв | озвя | 00000001 бо 29 9611 9731 27 9732 9815 о і мі хм яви | 01711111

Таким чином, даний винахід містить виділені очищенням, виділені або рекобінантні полінуклеотиди, що включають нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається, кожна, з 44 екзонів Сапіоп-гена і, кожна, - з комплементарної їй послідовності. У даному винаході забезпечуються також виділені очищенням, виділені або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що включають поєднання, щонайменше, з двох екзонів

Сапіоп-гена, в якому дані полінуклеотиди розміщені у нуклеїновій кислоті, від 5-кінця до 3-кінця вказаної нуклеїнової кислоти, у тому ж порядку, що і в ЗЕО ІЮО Мо 1-3.

Інтрон 1 відноситься до нуклеотидної послідовності, локалізованої між Екзоном 1 і Екзоном 2, і так далі. Га

Положення інтронів детально представлене у Таблиці А. Таким чином, даний винахід містить виділені очищенням, виділені або рекобінантні долінуклеотиди, що включають нуклеотидну послідовність, вибрану з о групи, яка складається з 43 інтронів Сапіоп-гена, або комплементарну їй послідовність.

Хоча даний розділ називається "Геномні Послідовності Сапіоп", потрібно мати на увазі, що нуклеотидні фрагменти будь-якого розміру і послідовності можуть також включатися у полінуклеотиди, описані у даному ч- розділі, фланкуючи дані геномні послідовності Сапіоп на будь-якій стороні або між двома або більше такими геномними послідовностями. с

КДНЕ-послідовності Сапіоп Ге»)

Показано, що експресія Сапіоп--ена приводить до продукування, щонайменше, одного з видів мРНК, послідовності нуклеїнової кислоти, яка приведена в 5ЕО ІЮ Мо 4. о

Інший об'єкт даного винаходу являє собою виділену очищенням, виділену або рекомбінантну нуклеїнову ч- кислоту, що включає нуклеотидну послідовність ЗЕО ІО Мо 4, комплементарні їй послідовності, а також алельні варіанти, та її фрагменти. Крім того, переважні полінуклеотиди даного винаходу включають виділені очищенням, виділені або рекомбінантні кДНК Сапіоп, що складаються, в основному складаються з або включають « послідовність ЗЕО І Мо 4. Особливо переважні нуклеїнові кислоти даного винаходу включають виділені, виділені очищенням або рекомбінантні полінуклеотиди, що включають безперервну ділянку послідовності, - с щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, З000, 4000, ц 5000 або 6000 нуклеотидів з ЗЕО ІЮ Мо 4 або з її комплементів. У переважних варіантах здійснення даного "» винаходу вказана безперервна ділянка послідовності включає зв'язаний з Сапіоп двоалельний маркер; переважно вибраний з групи, що складається з А12 або А16.

До даного винаходу відноситься також виділена очищенням або виділена нуклеїнова кислота, яка включає -І полінуклеотид, що володіє, щонайменше, 9595 нуклеотидною ідентичністю з полінуклеотидом ЗЕО ІЮ Мо 4, переважно 9995 нуклеотидною ідентичністю, переважно 99,595 нуклеотидною ідентичністю і найбільш переважно ї-о 99,895 нуклеотидною ідентичністю з полінуклеотидом 5ЕО ІЮ Мо 4, або комплементарна їй послідовність або її (се) біологічно активний фрагмент.

Інша мета даного винаходу має відношення до виділених очищенням, виділених або рекомбінантних ді нуклеїнових кислот, що включають полінуклеотид, який гібридизується у сформульованих у даному описі "І жорстких умовах гібридизації з полінуклеотидом ЗЕО ІЮО Мо 4, або з комплементарною йому послідовністю або з його варіантом, або з його біологічно активним фрагментом.

Додаткова мета даного винаходу має відношення до виділеного, виділеного очищенням або рекомбінантного полінуклеотиду, який кодує Сапіоп-поліпептид, що включає безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 6 амінокислот 5ЗЕО ІЮО Мо 5, в якому вказана безперервна ділянка послідовності включає, щонайменше, 1, 2, З, 5 о або 10 амінокислотних позицій 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, ко 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 5ЕО ІЮО Мо 5. Включений також виділений, виділений очищенням або рекомбінантний полінуклеотид, який кодує Сапіоп- поліпептид, що включає амінокислотну бо послідовність ЗЕО ІЮО Мо 5, або її похідні або біологічно активні фрагменти, а також виділений, виділений очищенням або рекомбінантний полінуклеотид, який кодує Сапіоп-поліпептид, ідентичний, щонайменше, на 80, 85, 90, 95, 98, 99, 99,5 або 9995 амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ Мо 5.

КДНК 5ЕО ІО Мо 4 включає 5-ОТК-ділянку, що починається від нуклеотиду у положенні 1 і закінчується нуклеотидом у положенні 65 5ЕО ІЮ Мо 4. КДНК з 5ЕО ІО Мо 4 включає 3-ОТК-ділянку, що починається від 65 Ннуклеотиду у положенні 5283 і закінчується нуклеотидом у положенні 6799 5ЕО ІО Мо 4.

Отже, у даному винаході розглядається виділена очищенням, виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота, що включає нуклеотидну послідовність 5-0ТК з кКДНК Сапіоп, комплементарну їй послідовність, або її алельний варіант. У даному винаході розглядається також виділена очищенням, виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота, що включає нуклеотидну послідовність 3-ОТК з кДНК Сапіоп, комплементарну їй послідовність, або її алельний варіант.

Хоча даний розділ називається "кКкДНК-послідовності Сапіоп", потрібно мати на увазі, що нуклеотидні фрагменти будь-якого розміру і послідовність можуть бути також включені у полінуклеотиди, описані у даному розділі, фланкуючи геномні послідовності Сапіоп на будь-якій стороні або між двома або декількома такими геномними послідовностями. 70 Ділянки, що кодують

Відкрита рамка зчитування Сапіоп міститься у відповідній МРНК з 5ЕО ІЮО Мо 4 кКДНК. Точніше, ефективна послідовність (СО5), що кодує Сапіоп, включає ділянку між нуклеотидною позицією 66 (перший нуклеотид

АТО-кодону) і нуклеотидною позицією 5282 (кінцевий нуклеотид ТЗА-кодону) з ЗЕО ІЮ Мо 4. Даний винахід включає також виділені, виділені очищенням і рекомбінантні полінуклеотиди, які кодують поліпептиди, що /5 Включають безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 6 амінокислот, переважно, щонайменше, 8 або 10 амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 або 1000 амінокислот ЗЕО ІО Мо 5.

Розкритий вище полінуклеотид, який містить послідовність Сапіоп-гена, що кодує, може експресуватися у необхідній клітині-хазяїні або у необхідному організмі-хазяїні якщо даний полінуклеотид помістити під

Контроль відповідних експресійних сигналів. Експресійні сигнали можуть являти собою або експресійні сигнали, що містяться у регуляторних районах Сапіоп-гена даного винаходу, або на противагу сигнали можуть являти собою екзогенні регуляторні послідовності нуклеїнових кислот. Такий полінуклеотид, поміщений під відповідні експресійні сигнали, можна також вбудувати у вектор для його експресії і/або ампліфікації.

Регуляторні Сапіоп-послідовності сч

Як відмічено, геномна послідовність Сапіоп-гена містить регуляторні послідовності як у 5'-фланкувальній ділянці, що не кодує, так і у 3'і-рланкувальній ділянці, що не кодує, які обмежують ділянку, що кодує Сапіоп, і) яка містить 44 екзони даного гена.

Полінуклеотиди, одержані з 5- і З'-регуляторних ділянок, придатні для того, щоб виявити наявність, щонайменше, копії нуклеотидної послідовності Сапіоп або її фрагмента у зразку, що тестується. М зо Промоторну активність 5'-регуляторних ділянок, що містяться у Сапіоп, можна оцінити, як описано нижче.

Для того щоб ідентифікувати релевантні біологічно активні полінуклеотидні фрагменти або варіанти ЗЕО ІЮ Мо 1, с фахівців у даній області техніки можна відіслати до ЗатбгоокК і співавт., 1989, які описують використання Ге! рекомбінантного вектора, що несе маркерний ген (тобто, бета-галактозидазу, хлорамфеніколацетилтрансферазу і т.п), експресію якого можна виявити при поміщенні його під контроль біологічно активних полінуклеотидних ме) фрагментів або варіантів ЗЕО 10 Мо 1. Геномні послідовності, локалізовані "лівіше" першого екзону ї-

Сапіоп-гена, клонують у відповідний промоторний репортерний вектор, такий як доступні від Сіопіеспи Промоторні репортерні вектори рЗЕАР-Вавзіс, резЕАР-Еппапсег, рВоаІ-Вазіс, рВдаІ-Епнпапсег або рЕСЕРІ, або безпромоторний репортерний вектор гена люциферази від Рготеда рої 2-равіс або рої 3-разіс. Коротко кажучи, кожний з цих промоторних репортерних векторів включає велику кількість сайтів клонування, позиціонованих « "лівіше" репортерного гена, що кодує білок, який легко піддається аналізу, такий як лужна фосфатаза, що з с секретується, люцифераза, В-галактозидаза або зелений флуоресцентний білок. Послідовності, розташовані . "лівіше" від ділянки, що кодує Сапіоп, вбудовують у сайти клонування "лівіше" даного репортерного гена в обох и?» орієнтаціях і вводять у відповідну клітину-хазяїна. Аналізують рівень репортерного білка і порівнюють з рівнем, одержаним для вектора, у якого відсутня вставка у сайт клонування. Наявність підвищеного рівня експресії у векторі, що містить вставку, у порівнянні з рівнем для контрольного вектора, свідчить про -І наявність промотору у даній вставці. За необхідності розташовані ліворуч послідовності можуть бути клоновані у вектори, які містять енхансер для збільшення рівнів транскрипції під слабкими промоторними послідовностями. ік Істотний рівень підвищеної експресії, яка спостерігається для вектора, що не має вставки, свідчить про те, що

Ге) промоторна послідовність присутня у вбудованій ліворуч послідовності.

Промоторну послідовність, що розташована "лівіше" геномної ДНК, можна також визначити шляхом ю створення згрупованих 5' і/або 3 делецій у розташованій ліворуч ДНК з використанням традиційних методик,

І таких як обробка Екзонуклеазою І або обробка відповідною ендонуклеазою рестрикції. Одержані делеційні фрагменти можна вбудувати у даний промоторний репортерний вектор, щоб визначити, чи дійсно дана делеція знижує або знищує промоторну активність, як це описано, наприклад, у Соіез і співавт. (1998), розкриття якої ов Включене у даний опис за допомогою посилання у всій її повноті. Таким способом можна визначити межі промоторів. За бажанням можна ідентифікувати потенційні індивідуальні регуляторні сайти всередині промотору (Ф, з використанням сайт-направленого мутагенезу або лінкерного сканування, які анулюють сайти зв'язування ка потенційних транскрипційних факторів всередині промотору, індивідуально або у поєднанні. Вплив таких мутацій на рівень транскрипції можна визначити шляхом вбудовування мутацій у сайти клонування промоторних бо репортерних векторів. Даний вид аналізу добре відомий фахівцям у даній області техніки і (описаний у УМО 97/17359, Патенті США Мо5374544; ЕР 582796; Патенті США Мо5698389; Патенті США Мо5643746; Патенті США

Мо5502176; і Патенті США Мо5266488); розкриття яких включене у даний опис за допомогою посилання у всій їх повноті.

Силу і специфічність промотору Сапіоп--ена можна оцінити через рівні експресії полінуклеотиду, що 65 детектується, функціонально приєднаного до даного Сапіоп-промотору, у різних типах клітин і тканинах. Даний полінуклеотид, що детектується, може являти собою полінуклеотид, який специфічно гібридизується із заздалегідь визначеним олігонуклеотидним зондом, або полінуклеотид, що кодує білок, який детектується, у тому числі Сапіоп-поліпептид або фрагмент або його варіант. Даний вид аналізу добре відомий фахівцям у даній області техніки і (описаний у Патенті США Мо5502176; і Патенті СІЛА Мо52664881; розкриття яких включене за

Допомогою посилання у всій їх повноті. Деякі способи обговорюються більш детально нижче.

Полінуклеотиди, що несуть регуляторні елементи, локалізовані на 5 або на 3-кінці ділянки, що кодує

Сапіоп, можна переважно використовувати для контролю транскрипційної і трансляційної активності гетерологічного полінуклеотиду, що представляє інтерес.

Таким чином, у даному винаході розглядається також виділена очищенням або виділена нуклеїнова кислота, /0 що включає полінуклеотид, який вибраний з групи, що складається з 5- і 3-регуляторних ділянок, або комплементарну йому послідовність, або її біологічно активний фрагмент або варіант. У переважних варіантах здійснення даного винаходу "5'-регуляторна ділянка" локалізована у нуклеотидній послідовності, розташованій між позиціями 1 і 2000 ЗЕО ІО Мо 1. "З'єрегуляторна ділянка" локалізована у нуклеотидній послідовності, розташованій між позиціями 45842 і 47841 5ЕО ІО Мо 3.

Даний винахід відноситься також до виділеної очищенням або виділеної нуклеїнової кислоти, що включає полінуклеотид, який володіє, щонайменше, 9595 нуклеотидної ідентичності з полінуклеотидом, вибраним з групи, яка складається з 5 і 3 регуляторних ділянок, переважно 9995 нуклеотидної ідентичності, переважно 99,590 нуклеотидної ідентичності і найбільш переважно 99,895 нуклеотидної ідентичності з полінуклеотидом, вибраним з групи, що складається з 5 і 3 регуляторних ділянок, або комплементарною йому послідовністю або його 2о варіантом, або його біологічно активним фрагментом.

Інший об'єкт даного винаходу включає виділені очищенням, виділені або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що включають полінуклеотид, який гібридизується у встановлених у даному описі жорстких умовах гібридизації з полінуклеотидом, вибраним з групи, яка складається з нуклеотидних послідовностей 5! і 3 регуляторних ділянок, або з комплементарною йому послідовністю або з його варіантом, або з його біологічно активним с фрагментом.

Переважні фрагменти 5'-регуляторної ділянки володіють довжиною близько 1500 або 1000 нуклеотидів, і9) переважно близько 500 нуклеотидів, більш переважно близько 400 нуклеотидів, ще більш переважно близько

З00 нуклеотидів і найбільш переважно близько 200 нуклеотидів.

Переважні фрагменти 3'-регуляторної ділянки володіють, щонайменше, 50, 100, 150, 200, 300 або 40Оп.н. у рч- довжину. "Біологічно активні" полінуклеотидні похідні зЗЕО ІЮ Моз 1-3 являють собою полінуклеотиди, що включають с або ж складаються з фрагмента вказаного полінуклеотиду, який є таким, що функціонує як регуляторна ділянка Ге»! для експресування рекомбінантного поліпептиду або рекомбінантного полінуклеотиду у рекомбінантній клітині-хазяїні. Він повинен діяти або як енхансер, або як репресор. о

Для мети даного винаходу нуклеїнова кислота або полінуклеотид є "функціональними" як регуляторна - ділянка для експресії рекомбінантного поліпептиду або рекомбінантного полінуклеотиду, якщо вказаний регуляторний полінуклеотид містить нуклеотидні послідовності, які містять інформацію про регуляцію транскрипції і трансляції, і такі послідовності "функціонально зв'язані" з нуклеотидними послідовностями, які « кодують необхідний поліпептид або необхідний полінуклеотид.

Регуляторні полінуклеотиди даного винаходу можна одержати з нуклеотидної послідовності ЗЕО ОО Моз 113 У с за допомогою розщеплення з використанням відповідних ферментів рестрикції, що описано, наприклад, у книзі ц Затьгоок і співавт. (1989). Регуляторні полінуклеотиди можна також одержати шляхом обробки 5ЕО ІЮО Моз 1 і З "» ферментом екзонуклеазою, такою як Ва131 (У/аріко і співавт., 1986). Такі регуляторні полінуклеотиди можна також одержати за допомогою хімічного синтезу нуклеїнових кислот, як описано в іншому місці у даному описі.

Регуляторні полінуклеотиди, відповідно до даного винаходу, можуть являти собою частину рекомбінантного -І експресійного вектора, який можна використовувати для експресії послідовності, що кодує, у необхідній клітині-хазяїні або організмі-хазяїні. Рекомбінантні експресійні вектори, відповідно до даного винаходу, іш описані в іншому місці даного опису. (Се) Переважний 5'-регуляторний полінуклеотид даного винаходу включає ділянку 5, що не транслюється, (5-ШТК) кКДНК Сапіоп, або її біологічно активний фрагмент або її варіант. о Переважний 3'-регуляторний полінуклеотид даного винаходу включає ділянку 3 і, що не транслюється, що (3-ОТК) кДдНК Сапіоп, або її біологічно активний фрагмент або її варіант.

Додаткова мета даного винаходу включає виділену очищенням або виділену нуклеїнову кислоту, що включає: а) нуклеїнову кислоту, що включає регуляторну нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається 3: о (Ї) нуклеотидної послідовності, що включає полінуклеотид з 5'-регуляторної ділянки або комплементарну їй іме) послідовність; (ї) нуклеотидної послідовності, що включає полінуклеотид, який володіє, щонайменше, 9595 нуклеотидної 60 ідентичності з нуклеотидною послідовністю з 5'-регуляторної ділянки або з комплементарною їй послідовністю; (її) нуклеотидної послідовності, що включає полінуклеотид, який гібридизується у жорстких гібридизаційних умовах з нуклеотидною послідовністю з 5'-регуляторної ділянки або з комплементарною їй послідовністю; і (ім) біологічно активного фрагмента або варіанта полінуклеотидів в (і), (ії) і (іїї); 65 Б) полінуклеотид, який кодує необхідний поліпептид або нуклеїнову кислоту, що представляє інтерес, функціонально приєднану до нуклеїнової кислоти, вказаної вище в (а);

с) факультативно, нуклеїнову кислоту, що включає 3-регуляторний полінуклеотид, переважно

З'-регуляторний полінуклеотид Сапіоп-гена.

У конкретному варіанті здійснення даного винаходу вказана вище нуклеїнова кислота відрізняється тим, що

Вказана нуклеїнова кислота включає ділянку 5, що не транслюється, (5-0ОТК) кКДНК Сапіоп, або її біологічно активний фрагмент або її варіант.

В іншому конкретному варіанті здійснення даного винаходу вказана вище нуклеїнова кислота відрізняється тим, що вказана нуклеїнова кислота включає ділянку 3, що не транслюється, (З'ЮТК) кКДНК Сапіоп, або її біологічно активний фрагмент або її варіант. 70 Регуляторний полінуклеотид 5'-регуляторної ділянки або його біологічно активні фрагменти або варіанти, функціонально приєднують по 5-кінцю полінуклеотиду, що кодує необхідний поліпептид або полінуклеотид.

Регуляторний полінуклеотид З'-регуляторної ділянки, або його біологічно активні фрагменти або варіанти, переважно функціонально приєднують по 3-кінцю полінуклеотиду, що кодує необхідний поліпептид або полінуклеотид.

Необхідний поліпептид, що кодується вказаною вище нуклеїновою кислотою, може мати різну природу або походження, включаючи білки прокаріотичного або еукаріотичного походження. Поліпептиди, які експресуються під контролем Сапіоп-регуляторної ділянки, включають антигени бактерій, грибів або вірусів. Включені також еукаріотичні білки, такі як внутрішньоклітинні білки, подібні білки "домашнього господарства", зв'язані з мембраною білки, подібні рецепторам, і білки, що секретуються, подібні ендогенним медіаторам, таким як цитокіни. Необхідний білок може бути Сапіоп-білком, зокрема, білком з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ Мо 5, або фрагментом або його варіантом.

Необхідні нуклеїнові кислоти, що кодуються вказаним вище полінуклеотидом, звичайно РНК-молекулою, можуть бути комплементарні необхідному полінуклеотиду, що кодує, наприклад, послідовності, яка кодує Сапіоп, і таким чином використовуватися як антисмисловий полінуклеотид. с

Такий полінуклеотид може включатися у рекомбінантний експресійний вектор, щоб експресувати необхідний поліпептид або необхідну нуклеїнову кислоту у клітині-хазяїні або в організмі-хазяїні. Відповідні і) рекомбінантні вектори, які містять полінуклеотид, такий як описаний у даному описі, розглядаються в іншому місці даного опису.

Полінуклеотидні конструкції М зо Терміни "полінуклеотидна конструкція" і "рекомбінантний полінуклеотид", що використовуються у даному описі взаємозамінно, відносяться до лінійних або кільцевих, виділених очищенням або виділених с полінуклеотидів, які були штучно створені і які включають, щонайменше, дві нуклеотидні послідовності, що не Ге! виявляються у вигляді безперервних нуклеотидних послідовностей в їх вихідному природному оточенні.

ДНК-конструкція, яка забезпечує пряму часову і просторову експресію Сапіоп-гена у рекомбінантних ме) з5 Клітинах-хазяях і у трансгенних тваринах ча

Для того щоб дослідити фізіологічні і фенотипічні наслідки відсутності синтезу Сапіоп-білка, як на клітинному рівні, так і на рівні мультиклітинного організму, у даний винахід включені також ДНК-конструкції та рекомбінантні вектори, що забезпечують обумовлену експресію конкретного алеля Сапіоп-геномної послідовності або кДНК, а також копії даної геномної послідовності або кДНК, які містять заміни, делеції або « додавання з однієї або більше основ, що стосується Сапіоп-нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮ Моз 1-4, або її з с фрагмента, причому дані заміни, делеції або додавання основ локалізовані в екзоні, інтроні або регуляторній послідовності, але переважно у 5'-регуляторній послідовності або в екзоні Сапіоп-геномної послідовності, або з в Сапіоп--ДНК ЗЕО ІО Мо 4. У переважному варіанті здійснення Сапіоп-послідовність включає двоалельний маркер даного винаходу. У переважному варіанті здійснення даного винаходу Сапіоп-послідовність включає двоалельний маркер даного винаходу, переважно один з двоалельних маркерів А1-А17. -І Даний винахід містить рекомбінантні вектори, що включають будь-який один з полінуклеотидів, описаних у даному винаході. Зокрема, полінуклеотидні конструкції, відповідно до даного винаходу, можуть включати се) будь-який з полінуклеотидів, описаних у розділі "Геномні Послідовності Сапіоп-гена", у розділі

Ге) "КДНК-послідовності Сапіоп", у розділі "Ділянки, що кодують" та у розділі "Олігонуклеотидні Зонди і Праймери".

Першу переважну ДНК-конструкцію створюють на основі оперону стійкості до тетрацикліну (геї з транспозону ю Тип10 Е. соїї для контролю експресії Сапіоп-гена так, |Як описано у боззеп і співавт. (1992, 1995) і у ЕРигій і "М співавт. (1994)). Така ДНК-конструкція містить сім (еїбоператорних послідовностей з Тп10 ((ейфор), які зливаються з мінімальним промотором або з 5'-регуляторною послідовністю Сапіоп-гена, причому вказаний мінімальний промотор або вказану Сапіоп-регуляторну послідовність функціонально приєднують до ов Полінуклеотиду, що представляє інтерес, який кодує смисловий або антисмисловий олігонуклеотид або поліпептид, включаючи Сапіоп-поліпептид або його пептидний фрагмент. Дана ДНК-конструкція є

Ф) функціональною як умовна експресійна система нуклеотидної послідовності, що представляє інтерес, де одна і ка та ж клітина включає нуклеотидну послідовність, що кодує репресор дикого типу (ТА) або мутантний (гТА) репресор, злитий з активуючим доменом вірусного білка МР16б з вірусу простого герпесу, поміщеного під бо Контроль промотору, такого як НОСММІЕЇ1 енхансер/промотор або ММТМ-ІТК. Фактично переважна

ДНК-конструкція даного винаходу включає як полінуклеотид, що містить іеїоператорну послідовність, так і полінуклеотид, що містить послідовність, яка кодує репресор (ТА або гТА.

У конкретному варіанті здійсненні даного винаходу умовна експресійна ДНК-конструкція містить послідовність, яка кодує мутантний тетрацикліновий репресор гТА, причому експресія полінуклеотиду, що 65 представляє інтерес, є такою, що мовчить, за відсутності тетрацикліну та індукується в його присутності.

ДНК-конструкції, що забезпечують гомологічну рекомбінацію: замінні вектори

Друга переважна ДНК-конструкція включає, від 5-кінця до 3-кінця: (а) першу нуклеотидну послідовність, яка включена в Сапіоп-геномну послідовність; (Б) нуклеотидну послідовність, що включає позитивний селективний маркер, такий як маркер стійкості до неоміцину (пео); і (с) другу нуклеотидну послідовність, яка Включена в Сапіоп-геномну послідовність і локалізована у геномі праворуч від першої Сапіоп-нуклеотидної послідовності (а).

У переважному варіанті здійснення даного винаходу дана ДНК-конструкція включає також негативний селективний маркер, розташований ліворуч від нуклеотидної послідовності (а) або праворуч від нуклеотидної послідовності (с). Переважно, якщо негативний селективний маркер включає ген тимідинкінази (ІК) |Ппотаз і /о співавт., 1986), ген бета-гігроміцину (Ті Кіде і співавт., 1990), Пргі--ен |(Мап дег І цднЕ і співавт., 1991;

Кеїй і співавт., 1990) або фрагмент гена дифтерійного токсину А (СІ1-А) |Мада і співавт., 1993; Маді і співавт., 1990). Переважно, якщо позитивний селективний маркер локалізований в екзоні Сапіоп-послідовності так, що розриває дану послідовність, яка кодує Сапіоп-білок. Дані замінні вектори (описані, наприклад, у

Тротазг і співавт. (1986; 1987), Мапгзоиг і співавт. (1988) і у КоїЇег і співавт. (1992)).

Не має значення де розташувати першу і другу нуклеотидні послідовності (а) і (с) - в Сапіоп-регуляторній послідовності, в інтронній послідовності, в екзонній послідовності або у послідовності, що містить і регуляторну і/або інтронну, і/або екзонну послідовності. Розмір нуклеотидних послідовностей (а) і (с) коливається від 1 до Б5О0т.п.н., переважно від 1 до 1От.п.н., більш переважно від 2 до бт.п.н. і найбільш переважно від 2 до 4т.п.н.

ДНК-конструкції, що забезпечують гомологічну рекомбінацію: Сте-І охР-система

Такі нові ДНК-конструкції використовують у сайт-специфічній рекомбінаційний системі фага РІ. Фаг Р1 володіє рекомбіназою, що іменується Стге, яка специфічно взаємодіє з 34 парами нуклеотидів ІохР-сайта. Даний

ІохР-сайт складений з двох паліндромних послідовностей з 1Зп.н., розділених 8п.н. консервативної послідовності (Ноезв і співавт., 1986). Рекомбінація між двома ІохР-сайтами, що володіють ідентичною сч ов орієнтацією, за допомогою.Сте-ферменту приводила до видалення ДНК-фрагмента.

Стге-ІохР-система, що використовується у поєднанні з методом гомологічної рекомбінації, вперше була о (описана Си і співавт. (1993, 1994)). Коротко, нуклеотидну послідовність, що представляє інтерес, вбудовують у намічене місце геному, який містить, щонайменше, два ІохР-сайти в одній і тій же орієнтації і розташованих на відповідних кінцях нуклеотидної послідовності, яку вирізають з даного рекомбінантного геному. Дана ча

Зо екцизійна подія вимагає присутності в ядрі рекомбінантної клітини-хазяїна ферменту рекомбінази (Сте). Фермент рекомбіназу можна внести у потрібний час або за допомогою (а) інкубації даних рекомбінантних клітин-хазяїв у с культуральному середовищі, що містить даний фермент, за допомогою ін'єкції Сте-ферменту прямо у потрібну ду клітину так, (як описано у Агакі і співавт. (1995)), або шляхом введення даного ферменту у клітини-хазяї за допомогою ліпосом так, (як описано у Вацропіез і співавт. (1993)); (Б) трансфекції клітини-хазяїна за іа допомогою вектора, що включає послідовність, яка кодує Сте, функціонально приєднану до функціонального у ї- даній рекобінантній клітині-хазяїні промотору, який необов'язково є таким, що індукується, причому вказаний вектор вводять у дану рекомбінантну клітину-хазяїна так, |Як описано у Си і співавт. (1993) і у Зацег і співавт. (1988))|; (с) введення у геном клітини-хазяїна полінуклеотиду, що включає послідовність, яка кодує

Стге, функціонально приєднану до функціонального у даній рекомбінантній клітині-хазяїні промотору, який « необов'язково є таким, що індукується, а вказаний полінуклеотид вбудовується у геном клітини-хазяїна або 8 с внаслідок випадкового вбудовування, або внаслідок гомологічної рекомбінації так, (як описано у Си і співавт. й (1994). «» У конкретному варіанті здійснення даного винаходу векторну послідовність, що містить послідовність, яку вбудовують у Сапіоп-ген за допомогою гомологічної рекомбінації, конструюють таким чином, щоб селективні маркери фланкувалися б ІохР-сайтами в одній і тій же орієнтації внаслідок обробки Сте-ферментом і можливо -і було здійснити видалення селективних маркерів, залишаючи Сапіоп-послідовності, що представляють інтерес, які були вбудовані за допомогою гомологічної рекомбінації. Знову необхідні два селективних маркери: о позитивний селективний маркер - для відбору за рекомбінаційною подією, і негативний селективний маркер - для

Те) відбору за подією гомологічної рекомбінації. Вектори і способи з використанням Сге-ІохР-системи (описуються у бони і співавт. (1994). о Відповідно до цього, третя переважна ДНК-конструкція даного винаходу включає, від 5-кінця до 3-кінця: "І (а) першу нуклеотидну послідовність, яка включається в Сапіоп-геномну послідовність; (Б) нуклеотидну послідовність, що включає полінуклеотид, який кодує позитивний селективний маркер, причому вказана нуклеотидна послідовність додатково включає дві послідовності, що визначають сайт, який пізнається рекомбіназою, такий як ІохР-сайт, і дані два сайти розміщуються у тій же самій орієнтації; і (с) другу нуклеотидну послідовність, яка включається в Сапіоп-геномну послідовність і локалізується у даному геномі іФ) праворуч від першої Сапіоп-нуклеотидної послідовності (а). ко Послідовності, що визначають сайт, який пізнається рекомбіназою, такий як ІохР-сайт, переважно розташовані у нуклеотидній послідовності (Б) у відповідних місцях, що межують з нуклеотидною послідовністю, бо яку необхідно вирізати. В одному з конкретних варіантів здійснення даного винаходу два ІохР-сайти розташовані з кожної сторони послідовності позитивного селективного маркера для того, щоб забезпечити її вирізання у потрібний час після проявлення події гомологічної рекомбінації.

У переважному варіанті здійснення способу з використанням описаної вище третьої ДНК-конструкції, вирізання полінуклеотидного фрагмента, обмеженого двома сайгами, які пізнаються рекомбіназою, переважно б5 двома ІохР-сайтами, здійснюють у потрібний момент, обумовлений наявністю у геномі рекомбінантної клітини-хазяїна послідовності, що кодує Сте-фермент, функціонально приєднаний до промоторної послідовності,

промотору, що переважно індукується, більш переважно до тканинноспецифічної промоторної послідовності і найбільш переважно до промоторної послідовності, яка одночасно є і такою, що індукується, і тканинноспецифічною, (як це описано у би і співавт. (1994)|.

Наявність Стге-ферменту у геномі рекомбінантної клітини-хазяїна може бути наслідком схрещування двох трансгенних тварин, де перша трансгенна тварина несе створену Сапіоп-послідовність, яка представляє інтерес, що містить описані вище ІохР-сайти, а друга трансгенна тварина несе послідовність, що кодує Сге, функціонально приєднану до відповідної промоторної послідовності, (так як це описано у би і співавт. (1994)).

Просторово-часовий контроль експресії Сге-ферменту можна також здійснити на основі аденовірусного /о вектора, який містить Сте-ген, забезпечуючи тим самим зараження клітин або іп мімо зараження органів, для доставки Сте-ферменту, (так як це описано у Апіоп апа Сгапат (1995) і у Капедає і співавт. (1995)).

Описані вище ДНК-конструкції можна використовувати для введення необхідної нуклеотидної послідовності даного винаходу, переважно Сапіоп-геномної послідовності або кДНК-послідовності Сапіоп, але більш переважно - для введення зміненої копії геномної або кДНК-послідовності Сапіоп, у заздалегідь визначене 7/5 Місцеположення цільового геному, що приводить або до утворення зміненої копії цільового гена (нокаутна гомологічна рекомбінація), або до заміни копії цільового гена іншою копією, досить гомологічною, щоб забезпечити проходження гомологічної рекомбінації (гомологічна рекомбінація з вбиванням). У конкретному варіанті здійснення даного винаходу описані вище ДНК-конструкції можуть використовуватися для вбудовування

Сапіоп-геномної послідовності або кКДНК-послідовності Сапісп, що включає, щонайменше, один двоалельний го маркер даного винаходу, переважно, щонайменше, один двоалельний маркер, вибраний з групи, яка складається з А1-А17.

Ядерні антисмислові ДНК-конструкції

Інші композиції містять вектор даного винаходу, який включає олігонуклеотидний фрагмент нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮ Мо 4, переважно фрагмент, що включає старт-кодон Сапіоп-гена, як антисмисловий засіб, сч який пригнічує експресію відповідного Сапіоп-гена.

Переважні способи з використанням антисмислового полінуклеотиду, відповідно до даного винаходу, і) представлені методиками, |описаними у Зслакіє!ї і співавт. (1995) або методиками, описаними у РСТ-Заявці

МоУО 95/24223|, розкриття яких включене у даний опис за допомогою посилання у всій їх повноті.

Переважно, антисмислові засоби вибрані серед полінуклеотидів (довжиною 15-200п.н.), які є М

Зз0р Комплементарними 5-кінцю мРНК Сапіоп. В одному з варіантів здійснення даного винаходу використовується поєднання різних антисмислових полінуклеотидів, які є комплементарними різним частинам необхідного с цільового гена. Ге!

Переважні антисмислові полінуклеотиди, відповідно до даного винаходу, є комплементарними послідовності багатьох мРНК Сапіоп, які містять або кодон ініціації трансляції АТО, або сайт сплайсингу. Крім того, ме) з5 переважні антисмислові полінуклеотиди, відповідно до даного винаходу, є комплементарними сайту сплайсингу ча

МРНК Сапіоп.

Переважно, якщо антисмислові полінуклеотиди даного винаходу володіють З і сигналом поліаденілювання, який замінений рибозимною послідовністю, що саморозщеплюється, так, щоб транскрипти РНК-полімерази ІІ « виходили без полі(А) на їх 3-кінцях, причому дані антисмислові полінуклеотиди виявляються нездатними вийти з 70 ядра, що описано у іш і співавт. (1994). У переважному варіанті здійснення даного винаходу ці - с Сапіоп-антисмислові полінуклеотиди включають також, у рибозимній касеті, гістонову шпилькову структуру, яка ц стабілізує транскрипти, що розщеплюються, від 3'-5'-екзонуклеолітичної деградації, (така структура описана у "» Ескпег і співавт. (1991).

Олігонуклеотидні зонди і праймери

Полінуклеотиди, одержані з Сапіоп-гена, придатні для виявлення присутності у зразку, що тестується, -І щонайменше, копії нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮО Моз 1-4 і 6, або її фрагмента, комплементу, або варіанта.

Особливо переважні зонди і праймери даного винаходу включають виділені, виділені очищенням або о рекомбінантні полінуклеотиди, що включають безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, (Се) 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10000 або 20000 нуклеотидів ЗЕО ІЮ

Мов 1-3 або їх комплементів. Крім того, переважні зонди і праймери даного винаходу включають виділені, де виділені очищенням або рекомбінантні полінуклеотиди, в яких вказана безперервна ділянка послідовності "І включає двоалельний маркер, вибраний з групи, що складається з А1-А17.

Інша мета даного винаходу полягає в одержанні виділеної очищенням, виділеної або рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка включає нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ Мо 4, комплементарні їй послідовності, а також алельні варіанти та їх фрагменти. Крім того, переважні зонди і праймери даного винаходу включають виділену очищенням, виділену або рекомбінантну Сапіоп-кДНК, шо складається з, фактично складається з або іФ) включає послідовність ЗЕО ІЮО Мо 4. Особливо переважні зонди і праймери даного винаходу включають виділені, ко виділені очищенням або рекомбінантні полінуклеотиди, що включають безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, бо 5000 або 6000 нуклеотидів ЗЕСО ІО Мо 4 або їх комплементів. Крім того, переважні зонди і праймери даного винаходу включають виділені, виділені очищенням або рекомбінантні полінуклеотиди, що включають безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 або 6000 нуклеотидів ЗЕО ІО Мо 4 або їх комплементів, де вказана безперервна ділянка послідовності включає двоалельний маркер, вибраний з групи, яка складається з А12 і А16. 65 У додаткових варіантах здійснення даного винаходу зонди і праймери даного винаходу включають виділені, виділені очищенням або рекомбінантні полінуклеотиди, що включають безперервну ділянку послідовності,

щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 або 400 нуклеотидів ЗЕО

ІО Мо 6 або їх комплементів. У переважних варіантах здійснення даного винаходу вказана безперервна ділянка послідовності ЗЕО ІЮО Мо 6 включає двоалельний маркер А18.

Таким чином, даний винахід відноситься також до зондів нуклеїнових кислот, які відрізняються тим, що вони специфічно гібридизуються в описаних вище жорстких умовах з нуклеїновою кислотою, вибраною з групи, яка складається з Сапіоп-чуклеотидних послідовностей ЗЕСО ІЮО Мо 1-3 людини, її варіантів або послідовності, комплементарної їй.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу включені виділені, виділені очищенням і рекомбінантні 70 полінуклеотиди, які складаються або в основному складаються з безперервної ділянки послідовності з 8-50 нуклеотидів якої-небудь однієї ЗЕСО ІЮО Моз 1-4 або б, або її комплементів, де вказана ділянка включає зв'язаний з Сапіоп двоалельний маркер у вказаній послідовності; де необов'язково вказаний зв'язаний з Сапіоп двоалельний маркер вибраний з групи, що складається з А1-А18, та її комплементів, або, необов'язково, дані двоалельні маркери зчеплені при порушенні рівноваги. Де, необов'язково, вказана ділянка складає у довжину 7/5 18-35 нуклеотидів, а вказаний двоалельний маркер знаходиться у межах 4 нуклеотидів від центра вказаного полінуклеотиду; де необов'язково вказаний полінуклеотид складається з вказаної безперервної ділянки послідовності і вказана безперервна ділянка послідовності складає 25 нуклеотидів у довжину, а вказаний двоалельний маркер знаходиться у центрі вказаного полінуклеотиду; де необов'язково 3'-кінець вказаної ділянки безперервної послідовності представлений на 3-кінці вказаного полінуклеотиду; і де необов'язково 3'-кінець 2о вказаної безперервної ділянки послідовності розташований на 3-кінці вказаного полінуклеотиду, а вказаний двоалельний маркер представлений на 3'-кінці вказаного полінуклеотиду. У переважному варіанті здійснення даного винаходу вказані зонди включають, складаються або в основному складаються з послідовності, вибраної з наступних послідовностей: Р1-Р18 та комплементарних їм послідовностей.

В іншому варіанті здійснення даний винахід включає в себе виділені, виділені очищенням і рекомбінантні сч полінуклеотиди, які включають, складаються, в основному складаються з безперервної ділянки послідовності 8-50 нуклеотидів 5ЕО І Моз 1-4, або їх комплементів, де 3-кінець вказаної безперервної ділянки (8) послідовності розташований на 3-кінці вказаного полінуклеотиду, і де 3-кінець вказаного полінуклеотиду розташований у межах 20 нуклеотидів ліворуч від зв'язаного з Сапіоп двоалельного маркера у вказаній послідовності; де, необов'язково, вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, вибраний з групи, яка ї-

Зо складається з А1-А18, та їх комплементів, або необов'язково двоалельні маркери, до того ж, зчеплені при порушенні рівноваги; де необов'язково 3-кінець вказаного полінуклеотиду розташований у вказаній с послідовності 1 нуклеотидом "лівіше" від вказаного двоалельного маркера, зв'язаного з Сапіоп; і де, Ге! необов'язково, вказаний полінуклеотид складається, в основному, з послідовності, вибраної з наступних послідовностей: 0О1-018 і Е1-Е18. (22)

Ще в одному варіанті здійснення даний винахід включає в себе виділені, виділені очищенням або ї- рекомбінантні полінуклеотиди, які включають, складаються, в основному складаються, з послідовності, вибраної з наступних послідовностей: В1-817 і С1-С17.

У додатковому варіанті здійснення даний винахід включає в себе полінуклеотиди, що використовуються у гібридизаційному аналізі, аналізі, що секвенує, та в аналізі ферментного виявлення дефекту комплементарного « спарювання для визначення нуклеотидної ідентичності двоалельного маркера, зв'язаного з Сапіоп, в зЕО ІЮО Мов з с 1-4 і 6 або в їх комплементах, а також полінуклеотиди, що використовуються для ампліфікації нуклеотидних сегментів, які включають двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, в ЗЕО ІО Моз 1-4 і 6 або в їх комплементах; з де, необов'язково, вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, вибраний з групи, яка складається з

А1-А18 та їх комплементів, або необов'язково двоалельні маркери зчеплені до того ж при порушенні рівноваги.

У даному винаході розглядається використання полінуклеотидів, відповідно до даного винаходу, для -І визначення нуклеотидної ідентичності двоалельного маркера, зв'язаного з Сапіоп, переважно у гібридизаційному аналізі, аналізі, що секвенує, аналізі що мікросеквенує, або методом ферментного виявлення дефекту ісе) комплементарного спарювання і ампліфікацією нуклеотидних сегментів, що включають двоалельний маркер, со зв'язаний з Сапіоп.

Зонд або праймер, відповідно до даного винаходу, володіє близько 8-1000 нуклеотидів у довжину або де заданий, принаймні, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 або 1000 нуклеотидами у "М довжину. Більш переважно, довжина таких зондів і праймерів може коливатися від 8, 10, 15, 20 або 30-100 нуклеотидів, переважно від 10 до 50, більш переважно від 15 до 30 нуклеотидів. У коротких зондів і праймерів звичайно недостатньо специфічності для цільової послідовності нуклеїнової кислоти і, як правило, потрібні в Знижені температури для утворення досить стабільних гібридних комплексів з матрицею. Більш довгі зонди і праймери є такими, що дорого коштують у виготовленні і можуть іноді самогібридизуватися з утворенням

Ф) шпилькових структур. Необхідну довжину для праймерів і зондів під конкретний комплекс аналітичних умов може ка емпірично визначити фахівець у даній області техніки. Переважний зонд або праймер складається з нуклеїнової кислоти, що включає полінуклеотид, вибраний з групи нуклеотидних послідовностей Р1і-Р18 та їх бо Комплементарних послідовностей, В1-817, С1-С17, 001-018, Е1-Е18, для яких відповідні місцеположення у списку послідовностей представлені у Таблицях 1, 2 і 3.

Утворення стабільних гібридів залежить від температури плавлення (Тт) ДНК. Тт залежить від довжини праймеру або зонда, іонної сили даного розчину і вмісту СС. Чим вище вміст С-С праймеру або зонда, тим вище температура плавлення, тому що :С пари утримуються трьома Н-зв'язками, тоді як А:Т пари утримуються 65 тільки двома такими зв'язками. ЗС-вміст у зондах даного винаходу, як правило, коливається між 10 і 7590, переважно між 35 і 6095, і найбільш переважно між 40 і 55965.

Праймери і зонди можна виготовити будь-яким відповідним способом, включаючи, наприклад, клонування та рестрикцію відповідних послідовностей, а також способом прямого хімічного синтезу, наприклад, таким як фосфодіефірний спосіб Магапуд і співавт. (1979), фосфодіефірний спосіб Вгомуп і співавт. (1979), діетилфосфоамідитний спосіб Веаисаде і співавт. (1981) і твердофазовий спосіб, |описаний в ЕР 07075921.

Зонди для детекції являють собою, як правило, послідовності нуклеїнових кислот або незаряджені аналоги нуклеїнових кислот, такі, наприклад, як пептидонуклеїнові кислоти, (які розкриті у Міжнародній Патентній

Заявці УМО 92/20702І, морфолінові аналоги, (які описані у Патентах США МоМо5185444; 5034506 і 5142047). Зонд може виявитися "таким, що не подовжується", оскільки додаткові ОМТР неможливо додати до даного зонда. 7/0 Всередині себе аналоги, як правило, не подовжуються, і зонди нуклеїнових кислот можуть виявлятися такими, що не подовжуються, через модифікацію 3'-кінця даного зонда, так що гідроксильна група вже не здатна брати участь в елонгації. Наприклад, 3'-кінець даного зонда може бути функціоналізований захопленням або детекцією мітки, щоб таким чином витратити або інакше блокувати дану гідроксильну групу. З іншого боку, 3'-гідроксильна група може просто відщепитися, заміститися або модифікуватися, |Патентна Заявка США, порядковий 7/5 Ме07/049061, подана 19 квітня 1993р.), описує модифікації, які можуть використовуватися для надання зонду неподовжуваності.

Будь-який полінуклеотид даного винаходу можна позначити за бажанням шляхом включення будь-якої мітки, відомої у даній області техніки, яка виявляється спектроскопічним, фотохімічним, біохімічним, імунохімічним або хімічним способом. Наприклад, мітки, що використовуються, включають радіоактивні речовини (у тому числі,

Р, 535, НЗ, 1125), флуоресцентні барвники (у тому числі, Х-бромдезоксиуридин, флуоресцеїн, ацетиламінофтор, дигоксигенін) або біотин. Переважно, полінуклеотиди мітять по їх 3- і 5'і-кінцях. Приклади нерадіоактивного мічення фрагментів нуклеїнових кислот (описані у Французькому патенті МоєкК-7810975 або у Огаеа і співавт. (1988), або у Запспег-Резсадог і співавт. (1988))Ї. Крім того, зонди, відповідно до даного винаходу, можуть мати структурні характеристики, які роблять можливим посилення сигналу, причому такими структурними с характеристиками є, наприклад, розгалужені ДНК-зонди, як ті, що (описані у Огдеа і співавт. (1991) або в

Європейському патенті МОЕРО225807 (Спігоп)). і)

Мітку можна також використовувати для захоплення даного праймеру, з тим, щоб забезпечити іммобілізацію на твердому носії або даного праймеру, або подовженого продукту, такого як ампліфікована ДНК. Введена мітка приєднується до праймерів або до зондів і може являти собою зв'язувальний член, який утворює зв'язувальну - пару разом із специфічним зв'язувальним членом твердофазового реагенту (наприклад, біотин і стрептавідин).

Тому, в залежності від типу мітки, що переноситься полінуклеотидом або зондом, її можна використовувати для с уловлювання або для виявлення ДНК-мішені. Крім того, потрібно мати на увазі, що створені у даному описі Ге»! полінуклеотиди, праймери або зонди можуть, самі по собі, служити як мітка захоплення. Наприклад, у тому випадку, коли зв'язувальний член твердофазового реагенту являє собою послідовність нуклеїнової кислоти, його о можна вибрати так, щоб він зв'язував комплементарну частину праймеру або зонда з тим, щоб іммобілізувати ча даний праймер або зонд на дану тверду фазу. У випадку якщо полінуклеотидний зонд сам служить як зв'язувальний член, фахівці повинні знати, що даний зонд буде містити послідовність або "хвіст", який не є комплементарним даній мішені. У тому випадку, якщо полінуклеотидний праймер сам служить як мітка « захоплення, щонайменше, частина даного праймеру буде вільна для гібридизації з нуклеїновою кислотою на 70 твердій фазі. Методи мічення ДНК добре відомі кваліфікованим фахівцям. - с Зонди даного винаходу придатні для багатьох цілей. Вони можуть, зокрема, використовуватися у ц Саузерн-гібридизації з геномною ДНК. Зонди можуть також використовуватися для виявлення продуктів "» ПЛР-ампліфікації. При використанні інших методик вони можуть також використовуватися для виявлення невідповідностей у Сапіоп-гені або мРНК. Вони можуть також використовуватися для виявлення експресії Сапіоп-гена, наприклад, у Нозерн-блоті. -І Будь-який полінуклеотид, праймер або зонд даного винаходу можна зручно іммобілізувати на твердий носій.

Тверді носії добре відомі фахівцям у даній області техніки і включають стінки ямок реакційної кювети, іш пробірки, кульки з полістиролу, магнітні кульки, смужки нітроцелюлози, мембрани, мікрочастинки, такі як (Се) латексні частинки, еритроцити барана (або іншої тварини), дигасуїез та інші. Твердий носій не є ключовим і його може вибрати фахівець у даній області техніки. Таким чином, латексні частинки, мікрочастинки, ді намагнічені і ненамагнічені кульки, мембрани, пластмасові пробірки, стінки ямок для мікротитрування, скляне "І або силіконове кришиво, еритроцити барана (або інших відповідних тварин) і дигасуїгез (мозкові оболонки), всі, являють собою відповідні моделі. Відповідні способи іммобілізації нуклеїнових кислот на твердих фазах включають іонну, гідрофобну, ковалентну взаємодію і т.п. Твердий носій, що використовується у даному описі

Відноситься до будь-якого нерозчинного матеріалу, або його можна зробити нерозчинним у подальшій реакції.

Твердий носій можна вибрати відповідно до його здатності притягувати та іммобілізувати реагент захоплення. о Або ж, дана тверда фаза може утримувати додатковий рецептор, який володіє здатністю притягувати та ко іммобілізувати реагент захоплення. Додатковий рецептор може включати заряджену речовину, яка протилежно заряджена по відношенню до власне реагенту захоплення або до зарядженої речовини, кон'югованоїз даним бо реагентом захоплення. Відповідно до ще однієї альтернативи, рецепторна молекула може являти собою будь-який специфічний зв'язувальний член, який іммобілізується на (приєднується до) твердому носії, і який володіє здатністю іммобілізувати реагент захоплення за допомогою специфічної реакції зв'язування. Рецепторна молекула робить можливим непряме зв'язування реагенту захоплення з матеріалом твердого носія перед здійсненням аналізу або протягом здійснення даного аналізу. Тверда фаза, таким чином, може бути 65 представлена пластмасою, похідними пластмаси, намагніченим або ненамагніченим металом, скляною або силіконовою поверхнею пробірки, ямкою для мікротитрування, смужкою, кулькою, мікрочастинкою, кришивом,

еритроцитами барана (або інших відповідних тварин), дигасуїезсяЮ та іншими формами, добре відомими середньому фахівцеві у даній області техніки. Полінуклеотиди даного винаходу можна приєднувати або іммобілізувати на твердому носії індивідуально або групами, щонайменше, з 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 або 25 різних полінуклеотидів даного винаходу з єдиним твердим носієм. Крім того, полінуклеотиди, які відрізняються від полінуклеотидів даного винаходу, можна приєднувати до того ж твердого носія, до якого приєднані один або декілька полінуклеотидів даного винаходу.

Отже, даний винахід включає також спосіб для виявлення присутньої нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з ЗЕО ІЮО Моз 1-4 і 6, її фрагмента або варіанта, 7/0 | комплементарну їй послідовність, у зразку, причому вказаний спосіб включає наступні стадії: а) приведення у контакт зонда нуклеїнової кислоти або сукупності зондів нуклеїнової кислоти, які можуть гібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, що включена у нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, яка складається з нуклеотидних послідовностей 5ЕО ІЮ Моз 1-4 і 6, їх фрагмента або варіанта, і комплементарну їй послідовність, і зразка, що аналізується; і р) виявлення гібридного комплексу, утвореного між зондом і нуклеїновою кислотою даного зразка.

Крім того, у даному винаході розглядається набір для детектування присутньої нуклеїнової кислоти, що включає нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕСО ІЮ Моз 1-4 і 6, її фрагмента або варіанта, і комплементарну їй послідовність, у зразку, причому вказаний набір включає: а) зонд нуклеїнової кислоти або велику кількість даних зондів нуклеїнової кислоти, які можуть Пібридизуватися з нуклеотидною послідовністю, що включена у нуклеїнову кислоту, вибрану з групи, яка складається з нуклеотидних послідовностей ЗЕО ІЮ Моз 1-4 і 6, її фрагмента або варіанта, і комплементарної їй послідовності; і

Б) необов'язково, реагенти, необхідні для здійснення реакції гібридизації.

У першому переважному варіанті здійснення даного винаходу даний спосіб детекції та набір, відрізняються сч б ТИМ, ЩО вказаний зонд нуклеїнової кислоти або велику кількість даних зондів нуклеїнової кислоти мітять за допомогою молекули, що детектується. В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу вказаний і) спосіб і набір відрізняються тим, що вказаний зонд нуклеїнової кислоти або велика кількість даних зондів нуклеїнової кислоти були іммобілізовані на субстрат. У третьому переважному варіанті здійснення даного винаходу даний зонд нуклеїнової кислоти або велика кількість даних зондів нуклеїнової кислоти включають або М зо послідовність, яка вибрана з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей Р1-Р18 і комплементарної їм послідовності, В1-817, С1-С17, 001-018, Е1-Е18, або двоалельний маркер, вибраний з групи, що складається з с

А1-А18 та їх комплементів. Ге!

Олігонуклеотидні набори

Будь-який субстрат, що включає велику кількість олігонуклеотидних праймерів або зондів даного винаходу, Ме

Зз5 Може використовуватися або для детекції або ампліфікації послідовностей-мішеней Сапіоп-гена, або може також ї- використовуватися для детекції мутацій у послідовностях Сапіоп-гена, що кодують і не кодують.

Будь-який створений у даному описі полінуклеотид можна приєднати в ділянці перекриття або до випадкових місць даного твердого носія. Альтернативно, полінуклеотиди даного винаходу можна приєднати у вигляді впорядкованого набору, де кожний полінуклеотид приєднується до визначеної ділянки твердого носія, яка не « перекривається з ділянкою приєднання будь-якого іншого полінуклеотиду. Переважно, такий впорядкований в с набір полінуклеотидів створюють "адресним", де окремі ділянки реєструються і можуть бути доступні як частина аналітичного методу. Адресні полінуклеотидні набори звичайно включають велику кількість різних ;» олігонуклеотидних зондів, які зв'язані з поверхнею субстрату у різних відомих місцях. Знання точного розташування кожного полінуклеотиду робить дані "адресні" набори особливо придатними для методів гібридизації. Будь-яка технологія адресного набору, відома у даній області техніки, може використовуватися -І для полінуклеотидів даного винаходу. Один з конкретних варіантів здійснення даних полінуклеотидних наборів відомий як Сепеспірзтм, і в основному описаний у Патенті СІЛА Мо5143854; публікаціях РСТ УМО 90/15070 і о 92/10092. Дані набори звичайно можна одержати з використанням методів автоматизованого синтезу або

Те) методів світлонаправленого синтезу, які включають поєднання фотолітографічних способів і твердофазового 5р олігонуклеотидного синтезу |Родог і співавт., 1991). Іммобілізація наборів олігонуклеотидів на твердих носіях де представляється можливою завдяки розвитку технології, що звичайно ідентифікується як "Мегу І агде ЗсаЇе "І Іттобіїїгей Роїутег Зупіпезів" (Великомасштабний синтез іммобілізованого полімеру) (МІ ЗІР тм), в якій, як правило, зонди іммобілізуються у вигляді набору з високою щільністю на твердій поверхні чіпу. Приклади технологій МІ 5ІР5тм представлені (у Патентах США МоМо5143854; і 5412087, а також у Публікаціях РСТ УМО 90/15070, МО 92/10092 і МО 95/11995), в яких описуються способи створення олігонуклеотидних наборів за допомогою таких методів, як методи з світлонаправленого синтезу. У розроблених методиках, призначених для і) створення наборів нуклеотидів, іммобілізованих на твердих носіях, додатково були розроблені методики ко представлення для приведення у порядок і представлення олігонуклеотидних наборів на чіпах у спробі одержати максимальну користь з патернів гібридизації та інформації про послідовність. Приклади таких методик 60 представлення розкриті (у Публікаціях РСТ УМО 94/12305, УМО 94/11530, УМО 97/29212 ії МО 97/31256), розкриття яких включене за допомогою посилання у всій їх повноті.

В іншому варіанті здійснення олігонуклеотидних наборів даного винаходу матриця олігонуклеотидного зонда може переважно використовуватися для виявлення мутацій, що зустрічаються у Сапіоп-гені і переважно в його регуляторній ділянці. Для цієї конкретної мети спеціально створюють зонди, які володіють нуклеотидною 65 послідовністю, що забезпечує їх гібридизацію з генами, які несуть відомі мутації (у результаті делеції, вставки або заміни одного або декількох нуклеотидів). Для відомих мутацій це означає, що мутації у

Сапіоп-гені були ідентифіковані відповідно до, наприклад, методу, що використовується |(Ниапуд і співавт. (1996) і Затвгоп і співавт. (1996)|.

В іншому методі, який використовується для виявлення мутацій у Сапіоп-гені, використовують набір ДНК високої щільності. Кожний олігонуклеотидний зонд, який складає одиничний елемент набору ДНК високої щільності, створюється для порівняння специфічної субпослідовності геномної ДНК або кДНК Сапіоп. Таким чином, набір, що складається з олігонуклеотидів, які є комплементарними субпослідовностям з послідовності гена-мішені, використовують для визначення ідентичності цільової послідовності з послідовністю природного гена, вимірювання його кількості, виявлення відмінностей між цільовою послідовністю і стандартною 7/0 послідовністю природного гена з Сапіоп-гена. Одна така конструкція, що називається 4| "плитковий" набір (41.

Шеа аггау), являє собою групу з чотирьох зондів (А, С, с, Т), переважно 15-нуклеотидних олігомерів. У кожній групі з чотирьох зондів повний комплемент буде гібридизуватися більш інтенсивно, ніж комплементарно неузгоджені зонди. Отже, цільова нуклеїнова кислота довжиною | сканується по мутаціях за допомогою "плиткового" набору, що містить 4Ї-зонди, причому весь набір зондів містить всі можливі мутації у відомій стандартній природній послідовності. Гібридизаційні сигнали групи 15-мірного зонда "плиткового" набору порушуються через єдину заміну основи у цільовій послідовності. Внаслідок цього відбувається характерна втрата сигналу або "футпринту" для зондів, які фланкують положення мутації. Даний метод (описаний Спнеєе і співавт. (1996).

Отже, у даному винаході розглядається набір молекул нуклеїнових кислот, які включають, щонайменше, один 2о полінуклеотид, описаний вище як зонди і праймери. Переважно, у даному винаході розглядається набір нуклеїнової кислоти, яка включає, щонайменше, два полінуклеотиди, описані вище як зонди і праймери.

Додаткова мета даного винаходу полягає у створенні набору послідовностей нуклеїнових кислот, які включають, щонайменше, одну з послідовностей, вибрану з групи, що складається з Р1-Р18, В1-817, С1-С17, 0р1-018, Е1-Е18, комплементарних їй послідовностей, її фрагментів, щонайменше, з 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 30 сч або 40 послідовних нуклеотидів або, щонайменше, одну послідовність, яка включає двоалельний маркер, вибраний з групи, що складається з А1-А18, і його комплементів. і)

Даний винахід відноситься також до набору послідовностей нуклеїнових кислот, які включають або, щонайменше, дві послідовності, вибрані з групи, що складається з Р1-Р18, В1-817, С1-С17, 001-018, Е1-Е18, комплементарних їй послідовностей, її фрагмента, щонайменше, з 8 послідовних нуклеотидів, або, щонайменше, М зо дві послідовності, які включають двоалельний маркер, вибраний з групи, що складається з А1-А18, і його комплементів. с

Сапіоп-білки та поліпептидні фрагменти Ге!

Термін "Сапіоп-поліпептиди" використовується у даному описі для охоплення всіх білків і поліпептидів даного винаходу. Крім того, твірною частиною даного винаходу є поліпептиди, що кодуються полінуклеотидами Ме)

Зз5 даного винаходу, а також злиті поліпептиди, які включають такі поліпептиди. У даному винаході містяться ї-

Сапіоп-білки людей, включаючи виділені або виділені очищенням Сапіоп-білки, що складаються, складаються в основному або включають послідовність ЗЕО ІЮО Мо 5.

У даному винаході розглядається поліпептид, що кодується нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з ЗЕО ІО Мо 1-4 і 6, комплементарною їй послідовністю або її фрагментом. «

У даному винаході містяться виділені, виділені очищенням і рекомбінантні поліпептиди, які включають з с безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 6 амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, з 1600 або 1700 амінокислот ЗЕО ІО Мо 5. В інших переважних варіантах здійснення даного винаходу безперервна ділянка з амінокислот включає ділянку з мутацією або функціональною мутацією, що включає делецію, додавання, перестановку, укорочені амінокислоти у білковій послідовності Сапіоп. -І У переважних варіантах здійснення даного винаходу, даний винахід містить виділені, виділені очищенням і рекомбінантні поліпептиди, які включають безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 6 амінокислот, се) переважно, щонайменше, 8-Ю амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, со 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 або 1700 амінокислот ЗЕО ІО Мо 5, де безперервна ділянка

Включає, щонайменше, 1, 2, 3, 5 або 10 амінокислотних позицій 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, ко 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 з 5ЕО ІЮО Мо 5. "М Переважно, вказана безперервна ділянка 5ЕО ІЮО Мо 5 включає залишок Аланіну у положенні 277; Серии у положенні 338; Валін у положенні 574; Лейцин у положенні 678; Серии у положенні 680; Треонін у положенні 683;

Гістидин у положенні 691; Серии у положенні 692; Серии у положенні 695; Аланін у положенні 696; Ізолейцин у ов положенні 697; Ізолейцин у положенні 894; Лізин у положенні 1480; Аргінін у положенні 1481; Гліцин у положенні 1483; Валін у положенні 1484; Ізолейцин у положенні 1485; Аспарагін у положенні 1630; Серии у

Ф) положенні 1631; Метіонін у положенні 1632; Треонін у положенні 1636; Аланін у положенні 1660; Фенілаланін у ка положенні 1667; Треонін у положенні 1707; і/або Аланін у положенні 1709. Забезпечені також полінуклеотиди, які кодують будь-який з даних поліпептидів. во Даний винахід включає також в себе виділені очищенням, виділені або рекомбінантні поліпептиди, які включають амінокислотну послідовність, що володіє, щонайменше, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 або 99965 амінокислотною ідентичністю з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ Мо 5 або з її фрагментом.

Сапіоп-білки переважно виділяють з тканинних зразків людини або ссавців або експресують з генів людини або ссавців. Сапіоп-поліпептиди даного винаходу можуть бути одержані з використанням стандартних способів 65 експресії відомих у даній області техніки. Полінуклеотид, що кодує необхідний поліпептид, лігують в експресійний вектор, прийнятний для будь-якого зручного хазяїна. Еукаріотична і прокаріотична хазяйська система, та й інша, використовуються для створення рекомбінантних поліпептидів, при цьому коротко викладаються деякі найбільш поширені системи. Потім поліпептид виділяють з лізованих клітин або з культурального середовища і виділяють очищенням до ступеня, необхідного для його передбачуваного

Використання. Очищення здійснюють за допомогою будь-якого методу, відомого у даній області техніки, наприклад, диференційним екстрагуванням, сольовим фракціонуванням, хроматографією, центрифугуванням і т.п. Див., наприклад, Меїйод3з іп Епгутоіоду для різноманітних способів з виділення очищенням білків.

Крім того, короткі білкові фрагменти одержують хімічним синтезом. Альтернативно, білки даного винаходу екстрагують з клітин або тканин людей або тварин, що не належать до людського роду. Способи виділення 7/0 очищенням білків відомі у даній області техніки і включають використання детергентів або хаотропних агентів, які дезінтегрують (роз'єднують) частинки, за яким йде диференційне екстрагування та поділ поліпептидів за допомогою іонообмінної хроматографії, хроматографії за спорідненням, осадження відповідно до щільності і гель-електрофорезу.

Будь-яка кКДНК Сапіоп, включаючи ЗЕО І Мо 4, може використовуватися для експресії Сапіоп-білків і /5 поліпептидів. Нуклеїнову кислоту, яка кодує такий, що експресується Сапіоп-білок або поліпептид, функціонально приєднують до промотору в експресійному векторі з використанням традиційної техніки клонування. Сапіоп-вставка у даний експресійний вектор може включати повну послідовність, що кодує, для

Сапіоп-білка або його частини.

Експресійний вектор являє собою будь-яку експресійну систему ссавця, дріжджів, комахи або бактерії,

Відому У даній області техніки. Комерційно доступні вектори та експресійні системи можна одержати від різних постачальників, включаючи Сепеїйісв Іпвійше (Сатрьгідде, МА), Зігаїадепе (ла оїа, Саїйогпіа), Рготеда (Мадізоп, МУУізсопвзіп) та Іпмігодеп (Зап Оіедо, Саїйогпіа) За бажанням, для посилення експресії і забезпечення належного пакування білка, для конкретного експресійного організму, в який інтродукований експресійний вектор, оптимізують кодоновий фон і спарювання кодонів даної послідовності, відповідно до сч ов роз'яснень (Найівйа і співавт., Патент США Ме5082767), розкриття якого включене у даний опис за допомогою о посилання у всій його повноті.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу повну послідовність КДНК Сапіоп, що кодує, включаючи поліА-сигнал КДНК, функціонально приєднують до промотору даного експресійного вектора. Альтернативно, якщо нуклеїнова кислота кодує частину Сапіоп-білка, в якому відсутній метіонін, що служить як сайт ініціації, М зо метіонін, який ініціює, можна вбудувати поруч з першим кодоном даної нуклеїнової кислоти з використанням традиційних методів. Також, якщо у даній вставці з КДНК Сапіоп відсутній поліА-сигнал, дану послідовність с можна додати у конструкцію, наприклад, шляхом вирізання поліА-сигналу з рес5 (5ігаїадепе) з використанням Ге! ендонуклеаз рестрикції Ва і За та вбудовування в експресійний вектор рХТІ (бігаїадепе) ссавця. РХТІ містить ГТК і частину дад-гена вірусу лейкозу мишей Молоні. Положення ІТК у даній конструкції робить ме)

Зб МОожлИВОю ефективну стабільну трансфекцію. Даний вектор включає тимідинкіназний промотор вірусу простого ї- герпесу і селективний ген неоміцину. Нуклеїнову кислоту, що кодує Сапіоп-білок або його частину, одержують за допомогою ПЛР з бактеріального вектора, що містить Сапіосп-кдНК ЗЕ ІО Мо 5 з використанням олігонуклеотидних праймерів, які є комплементарними Сапіоп-кДНК або її частині і містять послідовність для рестриційованої ендонуклеази РзіЇ, що вбудовується у 5-праймер, і ВоПП-послідовність, що вбудовується в « 5-кінець відповідного З'і'-праймеру кДНК, забезпечуючи даній послідовності, яка кодує Сапіоп-білок або його в с частину, належне розташування відносно поліА-сигналу. Виділений очищенням фрагмент, одержаний в . остаточній ПЛР-реакції, розщеплюють за допомогою РзїЇ, затуплюють на кінцях нуклеазою, розщеплюють за и?» допомогою ВаїЇ, виділяють очищенням та лігують з ХТ1, що містить поліА-сигнал і розщеплюють за допомогою

Ва.

Даний лігований продукт можна трансфікувати у мишачі МІНЗТЗ-клітини з використанням І іроїесіїп І їе -І Тесппоіодіев, Іпс., сгапа Івіапа, Мемж/ МогкК в умовах, коротко викладених в описі до даного продукту. Позитивні трансфектанти відбирають після вирощування трансфікованих клітин в бОбид/мл 5418 (Зідта, 51. Іоців, ік Міззоцгі).

Ге) Приведені вище протоколи можна також використовувати для експресії мутантного Сапіоп-білка, Відповідального за фенотип, що виявляється, або його частини. о Експресований білок можна виділити очищенням з використанням традиційних методів очищення, таких як "М осадження сульфатом амонію або хроматографічним розподілом за розміром або зарядом. Білок, що кодується вбудованою нуклесшновою кислотою, можна також виділити очищенням з використанням стандартних імунохроматографічних методів. У таких протоколах розчин, такий як клітинний екстракт, що містить 5Б експресований Сапіоп-білок або його частину, наносять на колонку, яка містить антитіла до Сапіоп-білка або його частини, які приєднують до хроматографічного матриксу. Експресованому білку дають можливість

Ф) зв'язатися імунохроматографічною колонкою. Потім колонку промивають для видалення білків, що неспецифічно ка зв'язалися. Після чого експресований білок, що специфічно зв'язався, вивільняють з колонки та дістають з використанням стандартних методів. во Для підтвердження експресії Сапіоп-білка або його частини, білки, експресованні з клітин-хазяїв, що містять експресійний вектор, який містить вставку, що кодує Сапіоп-білок або його частину, можна порівняти з білками, експресованими з клітин-хазяїв, які містять експресійний вектор без вставки. Наявність смуги у зразках клітин, що містять експресійний вектор з вставкою, яка відсутня у зразках з клітин, що містять експресійний вектор без вставки, свідчить про те, що Сапіоп-білок або його частина експресуються. Як правило, 65 дана смуга буде володіти рухомістю, очікуваною для Сапіоп-білка або його частини. Однак дана смуга може володіти рухомістю, яка відрізняється від очікуваної через модифікації, такі як глікозилування,

убіхітинізація або ферментативне розщеплення.

Антитіла, здатні специфічно розпізнавати експресований Сапіоп-білок або його частину, описані нижче.

Коли утворення антитіл неможливе, нуклеїнові кислоти, що кодують Сапіоп-білок або його частину, вбудовуються в експресійний вектор, створений для використання у схемах очищення, що використовують химерні поліпептиди. У таких методиках нуклеїнова кислота, що кодує Сапіоп-білок або його частину, вбудовується у відкриту рамку зчитування разом з геном, який кодує іншу половину даної химери. Інша половина химери являє собою послідовність В-глобіну або послідовність, що кодує поліпептид, який зв'язує нікель.

Хроматографічний матрикс, що містить антитіло до В-глобіну або приєднаний до нього нікель, використовується 7/0 для виділення очищенням химерного білка. Сайти протеазного розщеплення створюють генноінженерним способом між геном В-глобіну або нікелезв'язувальним поліпептидом і Сапіоп-білком або його частиною. Таким чином, два поліпептиди химери відділяються один від одного за допомогою протеазного розщеплення.

Придатним експресійним вектором для утворення В-глобінових химерних білків є рео5 (Зігаїадепе), який кодує В-глобін кролика. Інтрон ІЇ кролячого гена В-глобін забезпечує сплайсинг транскрипту, що експресується, /5 а сигнал поліаденілювання, що вбудовується у дану конструкцію, підвищує рівень експресії. Ці методи добре відомі у даній області молекулярної біології. Стандартні способи опубліковані у керівництвах, (як наприклад,

Оаміез і співавт. (1986)), але багато способів є доступними від Зігаїйадепе, Ме Тесппоодіе5, Іпс., або

Рготеда. Поліпептид можна додатково одержати з конструкції з використанням іп мімо трансляційних систем, таких як Іп міго Ехргезвтм Тгапвіайоп Кії (Зігагадепе).

Антитіла, які зв'язують Сапіоп-поліпептиди даного винаходу

Будь-який Сапіоп-поліпептид або цілий білок можна використовувати для одержання антитіл, здатних специфічно зв'язуватися з Сапіоп-білком, що експресується, або його фрагментами, які описані.

Антитільна композиція даного винаходу здатна специфічно або селективно зв'язуватися з варіантом

Сапіоп-білка ЗЕО ІО Мо 5. Для антитільної композиції, яка специфічно зв'язується з першим варіантом Сапіоп, с необхідно продемонструвати в ЕГІЗА, КІА або іншому аналізі по зв'язуванню антитіл, щонайменше, на 590, 1090, 15965, 20905, 2595, 5096 або 10095 більш високе зв'язування за спорідненням для повнорозмірного першого варіанта о

Сапіоп-білка, ніж для повнорозмірного другого варіанта Сапіоп-білка. У переважному варіанті здійснення даного винаходу антитільна композиція здатна специфічно зв'язувати Сапіоп-білок людини.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу розглядаються антитільні композиції, поліклональні або ча Моноклональні, здатні селективно зв'язувати або селективно зв'язуватися з поліпептидом, що містить епітоп, який включає безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 6 амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 с амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 або 1000 Ф амінокислот БЕО ІО Мо 5. У переважних варіантах здійснення даного винаходу вказана безперервна ділянка послідовності включає, щонайменше, 1, 2, 3, 5 або 10 амінокислотних позицій 277, 338, 574, 678, 680, 683, б» 591, 692, 695, 696, 697, 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 Мк

ЗБОЮ Мо 5.

Будь-який Сапіоп-поліпептид або цілий білок можна використовувати для одержання антитіл, здатних, як описано, специфічно зв'язуватися з Сапіоп-білюом, що експресується, або його фрагментами.

Епітоп може включати не менше З амінокислот для просторової конформації, яка є унікальною для даного « 70 епітопу. Як правило, епітоп складається, щонайменше, з 6 таких амінокислот, але частіше, щонайменше, з 8-10 шщ с таких амінокислот. У переважному варіанті здійснення даного винаходу антигенні епітопи включають ряд й амінокислот, які складають будь-яке ціле число між З і 50. Фрагменти, які функціонують як епітопи можна "» одержати за допомогою будь-якого традиційного способу. Епітопи можна визначити в антигенному аналізі

Уатезоп-Моїї, наприклад, застосовуючи комп'ютерну програму РКОТЕАМ з використанням значень параметрів за умовчанням (Мегвіоп 4.0 М/іпаожв, ОМАЗТАК, Іпс., 1228 зоцій Рагк зігееї Мадізоп, УМ). -і У даному винаході розглядається також виділене очищенням або виділене антитіло, здатне специфічно зв'язуватися з мутантним Сапіоп-білююм, його фрагментом або варіантом, що включає епітоп мутантного іс, Сапіоп-білка. В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу розглядається антитіло, здатне

Те) зв'язуватися з поліпептидом, який включає, щонайменше, 10 послідовних амінокислот Сапіоп-білка і включає, 5р щонайменше, одну з амінокислот, яка може кодуватися мутаціями, що визначають дану ознаку. де Тварини або ссавці, які не належать до людського роду, природні або трансгенні, які експресують різні "І види Сапіоп, що відрізняються від Сапіоп, до якого потрібне зв'язування антитіла, а також тварини, які не експресують Сапіоп (тобто, Сапіоп-нокаутні тварини, які описані у даному описі), особливо придатні для одержання антитіл. Сапіоп-нокаутні тварини будуть розпізнавати всі або більшість ділянок Сапіоп-білка, що

Знаходяться на поверхні, як чужорідні антигени і, внаслідок цього, виробляти антитіла з більш широким набором

Сапіоп-епітопів. Крім того, менші поліпептиди, всього лише з 10-30 амінокислотами, можуть бути придатні для іФ) одержання специфічного зв'язування з одним з Сапіоп-білків. До того ж, гуморальна імунна система тварин, яка ко продукує види Сапіоп, що мають схожість з антигенною послідовністю, буде переважно розпізнавати відмінності між нативними Сапіоп-видами тварини і даною антигенною послідовністю, і продукувати антитіла до цих бо унікальних сайтів у послідовності даного антигену. Такий метод особливо придатний для одержання антитіл, які специфічно зв'язуються з будь-яким окремим Сапіоп-білком.

Препарати антитіл, одержані відповідно до будь-якого протоколу, придатні для кількісного імуноаналізу, в якому визначають концентрації речовин, що несуть антиген, у біологічних зразках; їх також використовують, напівкількісно або кількісно, для ідентифікації антигену, що присутній у біологічному зразку. Антитіла можна б5 також використовувати у терапевтичних композиціях для знищення клітин, які експресують даний білок, або для зниження рівня даного білка у даному організмі.

Антитіла даного винаходу можна мітити радіоактивною, флуоресцентною або ферментною міткою, відомою у даній області техніки.

Тому, даний винахід відноситься також до способу детектування специфічно присутнього у біологічному зразку Сапіоп-поліпептиду відповідно до даного винаходу, причому вказаний спосіб включає наступні стадії: а) приведення у контакт даного біологічного зразка з поліклональним або моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язує Сапіоп-поліпептид, що включає амінокислотну послідовність ЗЕС ІО Мо 5, або його пептидний фрагмент або варіант; і

Б) детектування утвореного комплексу антиген-антитіло. 70 У даному винаході розглядається також діагностичний набір для детектування у біологічному зразку, відповідно до даного винаходу, наявності іп міго Сапіоп-поліпептиду, де вказаний набір включає: а) поліклональне або моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язує Сапіоп-поліпептид, що включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО Мо 5, або його пептидний фрагмент або варіант, необов'язково мічений;

Б) реагент, що забезпечує детекцію утворених комплексів антиген-антитіло, причому вказаний реагент /5 необов'язково несе мітку або здатний розпізнавати самого себе за допомогою міченого реагенту, зокрема, у випадку, якщо вказане вище моноклональне або поліклональне антитіло саме не є міченим.

Даний винахід відноситься, таким чином, до антитіл і Т-клітинних антигенних рецепторів (ТСК), які специфічно зв'язують поліпептиди і, зокрема, епітопи поліпептидів даного винаходу, включаючи, але, не обмежуючись ними, дос (у тому числі ІдсіІ, Ідо2, ІдСЗ і Ідс4), ІДА (у тому числі ІДЗАЇ ї ІдЧА2), 940, ЧЕ або 9М ї І9У. У переважному варіанті здійснення даного винаходу дані антитіла, що являють собою антитільні фрагменти даного винаходу, які зв'язують антиген людини, включають, але не обмежуються ними, Раб, Раб,

Кабр)2 і К(ар)2, га, одноланцюжкові Руз (зсЕму), одноланцюжкові антитіла, зв'язані дисульфідним зв'язком Ем (вагу) і фрагменти, що включають домен М, або Му. Антитіла можна одержати у будь-якої тварини, у тому числі у птахів і ссавців. Переважні антитіла людини, миші, кролика, кози, морської свинки, верблюда, коня або мавпи. сч

Антиген-зв'язувальні антитільні фрагменти, включаючи одноланцюжкові антитіла, можуть включати варіабельну ділянку(и), окремо або у поєднанні з повною або частковою: шарнірною ділянкою, доменами СНІ, і)

СН? ї СНЗ. У даний винахід включені також будь-які поєднання варіабельної ділянки(ок) і шарнірної ділянки, доменів СНІ, СН2 ії СНЗ. Крім того, даний винахід включає химерні, гуманізовані, а також моноклональні і поліклональні антитіла людини, які специфічно зв'язують поліпептиди даного винаходу. Даний винахід до того ж М зо Включає антитіла, які є антиідіотиповими до антитіл даного винаходу.

Антитіла даного винаходу можуть бути моноспецифічними, біспецифічними, триспецифічними або володіти с більш високою мультиспецифічністю. Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічними для різних епітопів Ге! поліпептиду даного винаходу або можуть бути специфічними для поліпептиду даного винаходу, а також для гетерологічних композицій, таких як гетерологічний поліпептид або речовина твердого носія. |Див., наприклад, ме) з5 УМО 93/17715; МО 92/08802; МО 91/00360; УМО 92/05793; Тик і співавт. (1991) У. Іттипої. 147: 60-69; Патенти Мк.

МоМо5573920, 4474893, 5601819, 4714681, 4925648; КозіевіІпу і співавт. (1992) 9. Іттіпої. 148: 1547-1553

Антитіла даного винаходу можуть бути описані або охарактеризовані у межах епітопу(ів) або частин(и), що несе епітоп, поліпептиду даного винаходу, які розпізнаються або специфічно зв'язуються з даним антитілом. У випадку білків даного винаходу, білків, що секретуються, антитіла можуть специфічно зв'язувати повнорозмірний « білок, що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, зрілий білок (тобто, білок, утворений внаслідок з с відщеплення сигнального пептиду), що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, сигнальний пептид, що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, або будь-який інший поліпептид даного винаходу. Тому, ;» епітоп(и) або епітоп, що несе частину(и) поліпептиду, можна точно визначити, як описано у даному описі, наприклад, за М-кінцевим і С-кінцевим положенням, за розміром у контигу амінокислотних залишків або описати

Інакше (включаючи список послідовностей). Антитіла, які специфічно зв'язують будь-який епітоп або поліпептид -І даного винаходу, можна також виключити як індивідуальні види. Таким чином, даний винахід включає антитіла, які специфічно зв'язують визначені (задані) поліпептиди даного винаходу, і дозволяють виключити однакові. ік Антитіла даного винаходу можна також описати або точно визначити у межах їх перехресної реактивності. У

Ге) даний винахід включені антитіла, які специфічно не зв'язують будь-який інший аналог, ортолог або гомолог поліпептидів даного винаходу. У даний винахід включені також антитіла, які не зв'язують поліпептиди менше ніж ко з 9595, менше ніж з 9095, менше ніж з 8595, менше ніж з 8095, менше ніж з 7595, менше ніж з 7095, менше ніж з "М 6595, менше ніж з 6095, менше ніж з 55965, менше ніж з 5095 ідентичністю (що розраховано з використанням способів, відомих у даній області техніки і описаних у даному описі) з поліпептидом даного винаходу. Крім того, у даний винахід включені антитіла, які зв'язують лише поліпептиди, що кодуються полінуклеотидами, які

Б ГПібридизуються з полінуклеотидом даного винаходу у жорстких гібридизаційних умовах (як описано у даному описі). Антитіла даного винаходу можуть бути також описані або точно визначені у термінах їх зв'язування за

Ф) спорідненням. Переважне зв'язування за спорідненням проявляють антитіла з константою дисоціації або Ка

Гх) менше 5Х10М, 109М, 5Х10М, 1077М, 5Х109М, 109М, 5Х109М, 109М, 5Х1079М, 1079М, 5Х107М, 1071, 5Х10712М, 1072М, 5Х107З3М, 1073М, 5Х107М, 1077М, 5Х1075М ї 10775М. 60 Антитіла даного винаходу, що використовуються, включаються, але не обмежуються ними, у відомі у даній області техніки способи по виділенню очищенням, виявленню і мішенуванню поліпептидів даного винаходу, у тому числі іп мйго та іп мімо діагностичні і терапевтичні способи. Наприклад, в імуноаналізі антитіла використовують для якісного і кількісного вимірювання рівня поліпептидів даного винаходу у біологічних зразках. Див., наприклад, Нагіом/ і співавт., АМТІВОСІЕЄ5: А ГАВОКАТОКУ МАМИОАЇ, (Соїд Зргіпд Нагрог 65 | арогаюгу Ргевв, 279 ед. 1988) (включений у даний опис за допомогою посилання у всій його повноті).

Антитіла даного винаходу можуть використовуватися окремо або у поєднанні з іншими композиціями. Дані антитіла можна, крім того, рекомбінантно зливати з гетерологічним поліпептидом по М- або С-кінцю або хімічно кон'югувати (включаючи ковалентну і нековалентну кон'югацію) з поліпептидами або з іншими композиціями.

Наприклад, антитіла даного винаходу можна рекомбінантно зливати або кон'югувати з молекулами, придатними до Як мітка для детекційних аналізів, і з еректорними молекулами, такими як гетерологічні поліпептиди, лікарські засоби або токсини. |ІДив., наприклад, УМО 92/08495; МО 91/14438; УМО 89/12624; Патент США Мо53149955і ЕР О 396387.)

Антитіла даного винаходу можна одержати будь-яким відповідним способом, відомим у даній області техніки.

Наприклад, поліпептид даного винаходу або його антигенний фрагмент можна вводити тварині для того, щоб 7/0 індукувати утворення сироватки, що містить поліклональні антитіла. Термін "моноклональне антитіло" не обмежений антитілами, які одержують за допомогою гібридомної техніки. Термін "антитіло" відноситься до поліпептиду або до групи поліпептидів, які включають, щонайменше, один зв'язувальний домен, де зв'язувальний домен утворюється з упакованих варіабельних доменів антитільної молекули з утворенням тривимірного зв'язувального простору, причому форма і заряд внутрішньої поверхні є комплементарними /5 елементам антигенної детермінанти антигену, що забезпечує імунологічну взаємодію з антигеном. Термін "моноклональне антитіло" відноситься до антитіла яке одержують з окремого клону, у тому числі еукаріотичного, прокаріотичного або фагового клону, але не до способу, за допомогою якого його одержують.

Моноклональні антитіла можна одержати з використанням досить різноманітних методів, відомих у даній області техніки, у тому числі з використанням гібридомної, рекомбінантної та фагової дисплейної технології.

Гібридомні методи включають методи, відомі у даній області техніки |див., наприклад, Нагіом/ і співавт. (1998); Наттетгійо і співавт. (1981) вказані посилання включені за допомогою посилання у всій їх повноті).

Фрагменти Ра і К(аб)2 можна одержати, наприклад, з гібридомно-одержаних антитіл внаслідок протеолітичного розщеплення, з використанням ферментів, таких як папаїн (для одержання Рар-фрагментів) або пепсин (для утворення Р(аБ')2-фрагментів). сч

Альтернативно, антитіла даного винаходу можна одержати шляхом застосування техніки рекомбінантних

ДНК або за допомогою хімічного синтезу з використанням способів, відомих у даній області техніки. Наприклад, (8) антитіла даного винаходу можна одержати з використанням різноманітних способів фагового дисплея, відомих у даній області техніки. У способах фагового дисплея функціональні антитільні домени представлені на поверхні фагової частинки, яка несе полінуклеотидні послідовності, що кодують їх. Фаг з необхідною зв'язувальною М зо Здатністю вибирають з набору або з комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людини або миші) шляхом прямого відбору по антигену, як правило, антигену, зв'язаному або захопленому твердою поверхнею або с кулькою. Фаг, що використовується у цих способах, звичайно являє собою нитчастий фаг, що включає їй і М13 з Ге!

Еаб, Рм або стабілізовані дисульфідним зв'язком ЕРу-домени антитіла, рекомбінантно злиті з фаговим геном ПІ фага або з білком гена МІ. Приклади способів фагового дисплея, які можна використовувати для створення ме) антитіл даного винаходу, включають способи, (які описані у ВгіпКтап і співавт. (1995); Атевз і співавт. ї- (1995); КешШерогоцдий і співавт. (1994); Регвіс і співавт. (1997); Випоп і співавт. (1994); РСТ/5891/01134;

МО 90/02809; УМО 91/10737; МО 92/01047; МО 92/18619; УМО 93/11236; УМО 95/15982; МО 95/20401; і Патенти

США МоМо5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727 і 5733743) (вказані посилання включені за допомогою посилання у всій їх повноті). «

Як описано у вказаних вище посиланнях, після фагової селекції ділянки, що кодують антитіло, можна з с виділити з даного фага і використовувати для утворення цілих антитіл, у тому числі і антитіл людини, або будь-якого іншого необхідного антигензв'язувального фрагмента і експресувати у будь-якому бажаному хазяїні, з включаючи клітини ссавців, клітини комах, рослинні клітини, дріжджові та бактеріальні. Наприклад, методи для рекомбінантного виробництва фрагментів Бар, Раб, Р(авр)2 і Р(ар)2, можна також використовувати,

Використовуючи способи, відомі у даній області техніки, |(способи, розкриті в МУМО 92/22324; Миїїпах і співавт. -І (1992); а також Зам/аі і співавт. (1995); а також ВеЦег і співавт. (1998)| (вказані посилання включені за допомогою посилання у всій їх повноті). і, Приклади методик, які можна використовувати для одержання одноланцюжкових Гуз та антитіл, включають

Ге) методики, (описані у Патентах США МоМо4946778 і 5258498; Нивіоп і співавт. (1991); Зп! і співавт. (1993); і Зкеїта і співавт. (1988)). Для визначеного використання, включаючи іп мімо використання антитіл у людей та іп ю міго детекційні аналізи, переважним може виявитися використання химерних, гуманізованих або антитіл людини. "М Способи одержання химерних антитіл добре відомі у даній області техніки. |Див. наприклад, Могтізоп (1985); Ої і співавт. (1986); СіШевз, 5.0. і співавт. (1989); і Патент США Мо5807715.| Антитіла можна гуманізувати з використанням різноманітних методів, включаючи СОК-трансплантацію (ЕР 0239400; УУО 91/09967; Патент США

Мо5530101; і Мо5585089), облицювання або перекладання (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Радіап Е.А. (1991); Бішапіска

С.М. і співавт. (1994); Кодизка М.А. і співавт. (1994) і перестановку ланцюга Патент США Мо5565332). Антитіла (Ф) людини можна створити різноманітними способами, відомими у даній області техніки, включаючи описані вище ка способи фагового дисплея. Див. також Патенти США МоМо4444887, 4716111, 5545806, і 5814318; МО 98/46645;

МО 98/50433; УМО 98/24893; МО 96/34096; МО 96/33735; і МО 91/10741) (вказані посилання включені за бо допомогою посилання у всій їх повноті).

У даний винахід додатково включені рекомбінантно злиті антитіла або хімічно кон'юговані (включаючи ковалентну і нековалентну кон'югацію) з поліпептидом даного винаходу. Дані антитіла можуть виявитися специфічними для антигенів, що відрізняються від поліпептидів даного винаходу. Наприклад, антитіла можна використовувати для мішенування поліпептидів даного винаходу в окремих типах клітин або іп міо, або іп 65 мімо, шляхом злиття або кон'югації поліпептидів даного винаходу з антитілами, специфічними до окремих рецепторів клітинної поверхні. Антитіла, злиті або кон'юговані з поліпептидами даного винаходу, можна також використовувати в імуноаналізі іп мійго та у способах очищення з використанням способів, відомих у даній області техніки. |Див. наприклад, Нагрог і співавт. вище і УМО 93/21232; ЕР 0439095; Магатига, Н. і співавт. (1994); Патент США Мо5474981; СШіез 5.0. і співавт. (1992); РеїЇ Н.Р. і співавт. (1991)| (вказані посилання включені за допомогою посилання у всій їх повноті).

Даний винахід містить також композиції, що включають поліпептиди даного винаходу, злиті або кон'юговані з доменами антитіла, які відрізняються від варіабельних ділянок. Наприклад, поліпептиди даного винаходу можна з'єднати шляхом злиття або кон'югувати з Ес-ділянкою антитіла або її частиною. Дана антитільна частина, з'єднана шляхом злиття з поліпептидом даного винаходу, може включати шарнірну ділянку, СНІ1-домен, 70 СН2-домен і СНЗ-домен або будь-яке поєднання цілих доменів або їх частин. Поліпептиди даного винаходу можна з'єднати шляхом злиття або кон'югувати з вказаними вище частинами антитіла для підвищення іп мімо часу напівжиття поліпептидів або для використання в імунному аналізі з використанням способів, відомих у даній області техніки. Поліпептиди можна також з'єднати шляхом злиття або кон'югувати з вказаними вище частинами антитіла з утворенням мультимерів. Наприклад, Ес-сегменти, злиті з поліпептидами даного винаходу, 7/5 Можуть утворювати димери внаслідок дисульфідного зв'язування між Ро-сегментами. Великі мультимерні форми можна створити шляхом злиття поліпептидів з ділянками ІдА або ІдДМ. Способи злиття або кон'югації поліпептидів даного винаходу з ділянками антитіл добре відомі у даній області техніки. |Див. наприклад, Патенти США

МоМо5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851, 5112946; ЕР 0307434, ЕР 0367166; УУО 96/04388, МО 91/06570; АвпКепагі А і співавт. (1991); 2пйепд Х.Х. і співавт. (1995); і Мі Н ї співавт. (1992)| (вказані посилання включені за допомогою посилання у всій їх повноті).

Крім того, даний винахід відноситься до антитіл, які діють як агоністи або антагоністи поліпептидів даного винаходу. Наприклад, даний винахід включає антитіла, які частково або повністю порушують рецептор/лігандні взаємодії з поліпептидами даного винаходу. Включені також рецепторспецифічні антитіла і лігандспецифічні антитіла. Включені також рецепторспецифічні антитіла, які не запобігають лігандному сч ов Зв'язуванню, але запобігають рецепторній активації. Рецепторну активацію (тобто, сигналізацію) можна визначити описаними у даному описі методами або іншими методами, відомими у даній області техніки. (8)

Включені також рецепторспецифічні антитіла, які запобігають як лігандному зв'язуванню, так і рецепторній активації. Більш того включені нейтралізуючі антитіла, які зв'язують даний ліганд і запобігають зв'язуванню даного ліганду з даним рецептором, а також антитіла, які зв'язують даний ліганд і тим самим запобігають М зо рецепторній активації, але не запобігають зв'язуванню даного ліганду з даним рецептором. Крім того, включені антитіла, які активують даний рецептор. Ці антитіла можуть діяти як агоністи у відношенні або всіх або не с всіх біологічних активностей, що породжуються ліганд-опосередкованою рецепторною активацією. Антитіла Ге! можуть бути спеціалізованими як агоністи або антагоністи біологічних активностей, включаючи описані у даному описі специфічні активності. Вказані вище антитільні агоністи можна створити з використанням способів, ме) відомих у даній області техніки. |Див. наприклад, УМО 96/40281; Патент США Мо5811097; Оепд В. і співавт. М (1998); Спеп 7. і співавт. (1998); Нагтор .А. і співавт. (1998); 2пи, 7. і співавт. (1998); Мооп, О.М. і співавт. (1998); Ргаї, М. і співавт. (1998); Рйага, М. і співавт. (1997); Ііашага, 9. і співавт. (1997);

Сагівоп, М.С. і співавт. (1997); Тагутап, К.Е. і співавт. (1995); МиШПег, М.А. і співавт. (1998); Вапипек,

Р. і співавт. (1996)) (вказані посилання включені за допомогою посилання у всій їх повноті). «

Як вказано вище, антитіла поліпептидів даного винаходу можуть, у свою чергу, утилізуватися з утворенням в с антиідіотипових антитіл, які "імітують" поліпептиди даного винаходу, з використанням методів, добре відомих фахівцям у даній області техніки. |Див., наприклад, Сгеепзрап апа Вопа (1989); Мівзіпії (1991). Наприклад, ;» антитіла, які зв'язують і конкурентно інгібують поліпептидну мультимеризацію або зв'язування поліпептиду даного винаходу з лігандом, можуть використовуватися для одержання антиідіотипів, які "імітують" поліпептидну

Мультимеризацію або зв'язувальний домен і, як наслідок, зв'язують і нейтралізують поліпептид або його ліганд. -І Такі нейтралізуючі антиідіотипові антитіла можна використовувати для зв'язування поліпептиду даного винаходу або для зв'язування його лігандів/рецепторів, і таким чином блокувати їх біологічну активність. ік Двоалельні маркери, зв'язані з Сапіоп со Перевага двоалельних маркерів даного винаходу

Сапіоп-зв'язані двоалельні маркери даного винаходу забезпечують ряд істотних переваг у порівнянні з ю іншими генетичними маркерами, такими як КЕР (Поліморфізм довжини фрагментів рестрикції) і ММК "М (Варіабельність числа тандемних повторів) маркери.

Першим поколінням маркерів були КЕРІ, що являють собою варіації, які модифікують довжину рестрикційного фрагмента. Однак способи, що використовуються для ідентифікації і типування КР Р, є досить дв Неекономічними за матеріалами, зусиллями та часом. Другим поколінням генетичних маркерів були ММТК, які можна розподілити по категоріях як мінісателіти або мікросателіти. Мінісателіти являють собою послідовності (Ф) ДНК, що тандемно повторюються, представлені блоками з 5-50 повторів, які розподіляються по ділянках ка хромосом людини у діапазоні довжини від 0,1 до 20т.п.н. Оскільки вони являють собою багато можливих алелів, їх інформативний зміст дуже високий. Мінісателіти оцінюють, здійснюючи Саузерн-блотування для ідентифікації бо числа тандемних повторів, що присутні у зразку нуклеїнової кислоти з окремого організму, який тестується.

Однак існує лише 107 потенційних ММТЕ, які можна типувати Саузерн-блотуванням. Крім того, створення і аналіз

КЕ Р-маркерів і ММТК-маркерів у великих кількостях є таким, що дорого коштує, і трудомістким.

Поліморфізм єдиного нуклеотиду або двоалельні маркери можна використовувати таким же чином, що і

КЕГР ї ММТК, але він володіє деякими перевагами. ЗМР густо розподілені у геномі людини і являють собою б5 найбільш частий тип мінливості. За наявними оцінками у геномі людини розсіяно більше 107-сайтів по 3ЗхХ109 пар основ. Таким чином, ЗМР зустрічається з більшою частотою і з більшою однорідністю, ніж КР Р-маркери і

УМТЕ-маркери, і це означає, що існує велика ймовірність виявлення такого маркера у безпосередній близькості від генетичного локуса, що представляє інтерес. ЗМР менш варіабельні, ніж ММТК-маркери, і мутаційно більш стабільні.

Крім того, різні форми охарактеризованого поліморфізму єдиного нуклеотиду, такі як двоалельні маркери даного винаходу, часто легко помітні, внаслідок чого легше типуються стандартними методами. Двоалельні маркери володіють алелями, відмінними єдиним нуклеотидом, і володіють тільки двома спільними алелями, що забезпечує паралельну детекцію та одержання автоматизованої оцінки. Двоалельні маркери даного винаходу забезпечують можливість швидкого, високопродуктивного генотипування великого числа індивідів. 70 Двоалельні маркери густо розподілені у геномі, досить інформативні та можуть аналізуватися у великій кількості. Об'єднаний ефект цих переваг робить двоалельні маркери надзвичайно цінними у генетичних дослідженнях. Двоалельні маркери можуть використовуватися при вивченні зчеплення у сім'ях, у способах вивчення спільних алелів, у дослідженнях зчеплення при порушенні рівноваги у популяціях, у дослідженні асоціацій у популяціях хворих і здорових індивідів або у популяціях з позитивною ознакою і у популяціях з /5 негативною ознакою. Істотний аспект даного винаходу полягає у тому, що двоалельні маркери дозволяють здійснювати асоціативні дослідження з ідентифікації генів, що беруть участь у комплексних ознаках. В асоціативних дослідженнях аналізують частоту маркерних алелів у незв'язаних (неродинних) популяціях хворих і здорових індивідів і, як правило, використовують для виявлення полігенних або одиничних ознак. Асоціативні дослідження можна здійснювати у спільній популяції і вони не обмежуються дослідженнями, що виконуються на родинних індивідах в уражених захворюванням сім'ях (дослідження по зчепленню). Двоалельні маркери у різних генах можна скринувати паралельно для прямої асоціації захворювання або відповіді на лікування. Даний підхід по численних генах є потужним інструментом у різних генетичних дослідженнях людини, оскільки він визначає необхідність створення статистичного показника для перевірки синергічного ефекту численних генетичних факторів на окремий фенотип, лікарську відповідь, спорадичну ознаку або хворобливий стан зі складною сч оре генетичною етіологією.

Ген-кандидат даного винаходу і)

Різні підходи можна застосовувати для здійснення асоціативних досліджень: широке асоціативне дослідження геному, асоціативні дослідження кандидатної ділянки та асоціативні дослідження гена-кандидату.

Широке асоціативне дослідження геному спирається на скринінг генетичних маркерів, що рівномірно розподілені М

Зо | покривають весь геном. Вивчення гена-кандидату базується на дослідженні генетичних маркерів, специфічно локалізованих у генах, які потенційно беруть участь у біологічному шляху, зв'язаному з ознакою, що с представляє інтерес. У даному винаході ген-кандидат представлений Сапіоп. Аналіз даного кандидатного гена Ге! чітко надає спрощений метод для ідентифікації генів і генних поліморфізмів, зв'язаних з окремими конкретними ознаками за наявності певної інформації, що стосується біології даної ознаки. Однак потрібно зазначити, що ме) з5 Всі двоалельні маркери, розкриті у даний заявці, можна використовувати як частину або як частину асоційованих ча досліджень кандидатної ділянки широких асоціативних досліджень геному, і таке використання спеціально розглядається у даному винаході та формулі винаходу.

Двоалельні маркери, зв'язані з Сапіоп, і зв'язані з ними полінуклеотиди

У даному винаході розглядаються також двоалельні маркери, зв'язані з Сапіоп. Термін "двоалельний маркер, « зв'язаний з Сапіоп", що використовується у даному описі, відноситься до групи двоалельних маркерів, зчеплених пл») с при порушенні рівноваги з Сапіоп-геном. Термін двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, включає двоалельні маркери, позначені А1-А17. ;» Частина двоалельних маркерів даного винаходу розкрита у Таблиці 2. Вони також описані як поліморфізм єдиного нуклеотиду для ознак, зв'язаних ЗЕО ІЮ Моз 1-4 і 6. Пари праймерів, які забезпечують ампліфікацію Нуклеїнової кислоти, що містить поліморфний нуклеотид з одного Сапіоп-двоалельного маркера, приведені у -І Таблиці 1 Прикладу 2. 17 двоалельних маркерів, зв'язаних з Сапіоп, А1-А17, локалізовані у геномній послідовності Сапіоп. ік Двоалельні маркери А12 і А16 локалізовані в екзонах Сапіоп. Двоалельний маркер А18 фланкує Сапіоп-ген.

Ге) Даний винахід відноситься також до виділеної очищенням і/або виділеної нуклеотидної послідовності, що 5р Включає поліморфну основу двоалельного маркера, зв'язаного з Сапіоп. У переважних варіантах здійснення де даного винаходу даний двоалельний маркер вибраний з групи, що складається з А1-А18, та їх комплементів. "М Дана послідовність містить близько 8-1000 нуклеотидів у довжину і переважно включає, щонайменше, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 або 1000 нуклеотидів безперервної нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ Моз 1-4 і 6, або її варіанта, або комплементарної їй послідовності. Дані нуклеотидні послідовності включають поліморфну основу або з алеля 1, або з алеля 2 двоалельного маркера, що розглядається. Вказаний двоалельний маркер може знаходитися, необов'язково, у

Ф) межах 6, 5, 4, 3, 2 або 1 нуклеотидів від центра вказаного полінуклеотиду або у центрі вказаного ка полінуклеотиду. 3-кінець вказаної безперервної ділянки послідовності може бути присутнім, необов'язково, на 3-кінці вказаного полінуклеотиду. Двоалельний маркер може бути представлений, необов'язково, на 3'-кінці бо вказаного полінуклеотиду. Вказаний полінуклеотид може додатково включати, необов'язково, мітку. Вказаний полінуклеотид можна приєднати, необов'язково, до твердого носія. У додатковому варіанті здійснення даного винаходу вказані вище полінуклеотиди можна використовувати окремо або у будь-якому поєднанні.

Даний винахід відноситься також до виділеної очищенням і/або виділеної нуклеотидної послідовності, яка безперервно включає близько 8-1000 нуклеотидів і/або переважно, щонайменше, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 65 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 або 1000 нуклеотидів безперервної нуклеотидної послідовності, вибраної з групи, що складається з БЕО ІЮ Мов 1-4 і 6, або її варіанта, або комплементарної їй послідовності. З3'-кінець вказаного полінуклеотиду може бути локалізований, необов'язково, у межах, щонайменше, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 або 1000 нуклеотидів "лівіше" від зв'язаного з Сапіоп двоалельного маркера у вказаній послідовності. Вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А17. 3-кінець вказаного полінуклеотиду може бути локалізований, необов'язково, у межах, щонайменше, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 або 1000 нуклеотидів "лівіше" від зв'язаного з Сапіоп двоалельного маркера у вказаній послідовності. 3З'-кінець вказаного полінуклеотиду може бути локалізований, необов'язково, на 1 нуклеотид "лівіше" від зв'язаного з Сапіоп двоалельного маркера у вказаній послідовності. Вказаний полінуклеотид може додатково включати, необов'язково, мітку. Вказаний 70 полінуклеотид може бути приєднаний, необов'язково, до твердого носія. У додатковому варіанті здійснення даного винаходу вказані вище полінуклеотиди можна використовувати окремо або у будь-якому поєднанні.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу послідовності, що включають поліморфну основу одного з двоалельних маркерів, перерахованих у Таблиці 2, вибрані з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей, які володіють безперервною ділянкою, що складається з полінуклеотиду, який включений у /5 Пполінуклеотид або який включає полінуклеотид, вибраний з групи, що складається з послідовностей нуклеїнових кислот, викладених у вигляді ампліконів, перерахованих у Таблиці 1, або його варіант, або комплементарну йому послідовність.

Крім того, у даному винаході розглядається нуклеїнова кислота, що кодує Сапіоп-білок, де вказана нуклеїнова кислота включає поліморфну основу двоалельного маркера, вибраного з групи, яка складається з 20. А12 і А16 та їх комплементів.

Даний винахід включає також використання будь-якого полінуклеотиду для визначення ідентичності одного або більше нуклеотидів у двоалельному маркері, зв'язаному з Сапіоп, або будь-який полінуклеотид для використання у вказаному визначенні. Крім того, полінуклеотиди даного винаходу, що використовуються для визначення ідентичності одного або декількох нуклеотидів у двоалельному маркері, зв'язаному з Сапіоп, сч об Включають полінуклеотиди з будь-яким додатковим обмеженням, описаним у даному описі, або полінуклеотиди, що йдуть нижче, вказані окремо або у будь-якому поєднанні. Вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, і) необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів, або двоалельних маркерів необов'язково зчеплених до того ж при порушенні рівноваги; вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, що складається з А1-А17 та їх комплементів, або двоалельних маркерів, М зо необов'язково зчеплених до того ж при порушенні рівноваги; вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А12 і А16 та їх комплементів, або двоалельних маркерів, с необов'язково зчеплених до того ж при порушенні рівноваги. Вказаний полінуклеотид може включати, б необов'язково, послідовність, розкриту у даному описі. Вказаний полінуклеотид може складатися, необов'язково, або в основному складатися з будь-якого полінуклеотиду, описаного у даному описі. Вказане визначення можна Ме здійснити, необов'язково, у гібридизаційному аналізі, аналізі, що секвенує, аналізі, що мікросеквенує, або в ї- аналізі методом ферментного виявлення дефекту комплементарного спарювання. Вказаний полінуклеотид можна приєднати, необов'язково, до твердого носія, матриці або адресної матриці. Вказаний полінуклеотид, необов'язково, може бути міченим. Переважний полінуклеотид можна використовувати у гібридизаційному аналізі для встановлення ідентичності визначеного нуклеотиду у зв'язаному з Сапіоп двоалельному маркері. «

Інший переважний полінуклеотид можна використовувати в аналізі, що секвенує або мікросеквенує, для в с визначення ідентичності нуклеотиду у зв'язаному з Сапіоп двоалельному маркері. Третій переважний полінуклеотид можна використовувати в аналізі методом ферментного виявлення дефекту комплементарного ;» спарювання для визначення ідентичності нуклеотиду у зв'язаному з Сапіоп двоалельному маркері. Четвертий переважний полінуклеотид можна використовувати для ампліфікації полінуклеотидного сегмента, що включає зв'язаний з Сапіоп двоалельний маркер. Будь-який з описаних вище полінуклеотидів можна приєднати, -І необов'язково, до твердого носія, матриці або до адресної матриці. Вказаний полінуклеотид може бути, але необов'язково, міченим. і, Даний винахід додатково включає в себе використання будь-якого полінуклеотиду для або будь-якого

Ге) полінуклеотиду для використання для ампліфікації нуклеотидного сегмента, що включає зв'язаний з Сапіоп двоалельний маркер. Крім того, полінуклеотиди даного винаходу, які використовуються для ампліфікації о нуклеотидного сегмента, що включає зв'язаний з Сапіоп двоалельний маркер, включають в себе полінуклеотиди

І з будь-яким додатковим обмеженням, описаним у даному описі, або полінуклеотиди, що йдуть нижче, вказані окремо або у будь-якому поєднанні. Вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів, або двоалельних маркерів, що необов'язково, до того ж ов Знаходяться у стані зчеплення при порушенні рівноваги; вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А17 та їх комплементів, або вказані двоалельні маркери (Ф, необов'язково, до того ж, зчеплені при порушенні рівноваги; необов'язково вказаний двоалельний маркер, ка зв'язаний з Сапіоп, вибраний з групи, яка складається з А12 і А16 та їх комплементів, або двоалельні маркери необов'язково, до того ж, зчеплені при порушенні рівноваги; вказаний полінуклеотид може включати бор необов'язково послідовність, розкриту у даному описі; вказаний полінуклеотид може необов'язково складатися або в основному складатися з полінуклеотиду, описаного у даному описі; вказана ампліфікація необов'язково може здійснюватися за допомогою ПЛР або ЛЛР. Вказаний полінуклеотид необов'язково може приєднуватися до твердого носія, матриці або адресної матриці. Вказаний полінуклеотид необов'язково може бути міченим.

Праймери для ампліфікації або реакції секвенування полінуклеотиду, що включає двоалельний маркер 65 даного винаходу, можуть бути створені з розкритих послідовностей за допомогою будь-якого способу, відомого у даній області техніки. Переважний набір праймерів пристосований так, що 3-кінець безперервної ділянки послідовності, ідентичної послідовності, вибраної з групи, що складається з ЗЕСО ІЮО Моз 1-4 і 6, або з послідовності, комплементарної їм, або з її варіанта, присутній на 3-кінці даного праймеру. Така конфігурація дозволяє 3'-кінцю даного праймеру гібридизуватися з вибраною послідовністю нуклеїнової кислоти і різко збільшувати ефективність даного праймеру в ампліфікації або у реакціях секвенування. Алельспецифичні праймери можна створити так, що поліморфна основа двоалельного маркера знаходиться на 3'-кінець безперервної ділянки послідовності, а безперервна ділянка послідовності знаходиться на 3-кінці даного праймеру. Такі алельспецифичні праймери прагнуть вибірно почати процес ампліфікації або реакцію секвенування, якщо вони використовуються із зразком нуклеїнової кислоти, який містить один з двох алелів, /о представлений у двоалельному маркері. 3-кінець праймеру даного винаходу може бути локалізований у межах або, щонайменше, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 або 1000 нуклеотидами "лівіше" від зв'язаного з Сапіоп двоалельного маркера у вказаній послідовності або у будь-якому іншому місці, яке відповідає їх передбачуваному використанню у секвенуванні, ампліфікації або розташуванню нових послідовностей або маркерів. Тому інший набір переважних ампліфікаційних праймерів включає виділений /5 Полінуклеотид, що в основному складається з безперервної ділянки послідовності у 8-50 нуклеотидів у послідовності, вибраній з групи, яка складається з ЗЕО ІЮ Моз 1-4 і 6, або комплементарної їй послідовності, або її варіанта, де 3-кінець вказаної безперервної ділянки послідовності локалізований по З3'-кінцю вказаного полінуклеотиду, і де Зі-кінець вказаного полінуклеотиду локалізований "лівіше" зв'язаного з Сапіоп двоалельного маркера у вказаній послідовності. Переважно, дані ампліфікаційні праймери включають послідовність, вибрану з групи, що складається з послідовностей В1-817 і С1-С17. Праймери з 3-кінцями, локалізованими на 1 нуклеотид "лівіше" від двоалельного маркера Сапіоп, особливо корисні в аналізі, що мікросеквенує. Переважні праймери, що мікросеквенують, описані у Таблиці 4. Вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, вибраний з групи, яка складається з А 1-А 18 та їх комплементів, або двоалельні маркери необов'язково, до того ж, зчеплені при порушенні рівноваги; вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, Га вибраний з групи, яка складається з А1-А17 та їх комплементів, або двоалельні маркери необов'язково, до того ж, зчеплені при порушенні рівноваги; вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, вибраний з групи, що і) складається з А12 і А16 та їх комплементів, або двоалельні маркери необов'язково, до того ж, зчеплені при порушенні рівноваги. Праймери, що мікросеквенують, вибрані, але необов'язково, з групи нуклеотидних послідовностей Ю1-018 і Е1-Е 18. -

Зонди даного винаходу можна створити з розкритих послідовностей будь-яким способом, відомим у даній області техніки, зокрема за допомогою способів, які забезпечують тестування при наявності розкритого у даному с описі маркеру. Переважний набір зондів можна створити для використання у гібридизаційному аналізі даного Ге»! винаходу будь-яким способом, відомим у даній області техніки, так що вони вибірно зв'язуються з одним алелем двоалельного маркера, але не з іншим, відповідно до будь-якої конкретної сукупності умов аналізу. Переважні о гібридизаційні зонди включають поліморфну основу з алеля 1 або алеля 2 двоалельного маркера, що - розглядається. Вказаний двоалельний маркер може знаходитися, необов'язково, у межах 6, 5, 4, 3, 2 або 1 нуклеотиду(ів) від центра гібридизаційного зонда або у центрі вказаного зонда. У переважному варіанті здійснення даного винаходу дані зонди вибирають з групи, що містить кожну з послідовностей Р1-Р18 і кожну з « комплементарних їм послідовностей.

Потрібно зазначити, що полінуклеотиди даного винаходу не обмежуються такими, що мають точні фланкуючі ей с послідовності, які оточують поліморфні основи, що перераховані у Списку Послідовностей. Потрібно мати на ц увазі, що фланкуючі послідовності, які оточують двоалельні маркери, можуть бути подовжені або укорочені до "» будь-якого розміру, порівнянного з їх передбачуваним використанням, і у даному винаході, зокрема, такі послідовності розглядаються. Для фланкуючих ділянок поза безперервною ділянкою послідовності не потрібно бути гомологічними нативним фланкуючим послідовностям, які дійсно зустрічаються у людей. Спеціально -І розглядається додавання будь-якої нуклеотидної послідовності, яка порівнянна з нуклеотидами, призначеними для використання. іш Праймери і зонди можна позначити або іммобілізувати на твердому носії, як описано в "Олігонуклеотидних (Се) зондах і праймерах".

Полінуклеотиди даного винаходу, які приєднують до твердого носія, включають в себе полінуклеотиди з о будь-яким додатковим обмеженням, описаним у даному описі, або полінуклеотиди, що йдуть нижче, вказані "І окремо або у будь-якому поєднанні. Вказані полінуклеотиди можуть бути визначені, необов'язково, як індивідуально приєднані або у групах, щонайменше, з 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 або 25 окремих полінуклеотидів даного винаходу, до єдиного твердого носія. Полінуклеотиди, які відрізняються від полінуклеотидів даного винаходу, необов'язково можуть приєднуватися до одного і того ж твердого носія як полінуклеотиди даного винаходу. Якщо до твердого носія приєднується велика кількість полінуклеотидів, вони можуть приєднуватися о необов'язково випадковим чином або у вигляді впорядкованого набору. Вказаний впорядкований набір може ко бути необов'язково адресним.

Даний винахід включає в себе також діагностичні набори, що включають один або більше полінуклеотидів бо даного винаходу разом з частиною або з усіма необхідними реагентами та інструкціями для генотипування індивіда, що обстежується, для визначення ідентичності нуклеотиду у зв'язаному з Сапіоп двоалельному маркері. Полінуклеотиди набору можуть необов'язково приєднуватися до твердого носія або бути частиною набору або адресним набором полінуклеотидів. Даний набір можна створити для визначення ідентичності нуклеотиду у позиції маркера будь-яким способом, відомим у даній області техніки, що включає, але не 65 обмежується вказаним, спосіб аналітичного секвенування, спосіб аналітичного мікросеквенування, спосіб аналітичної гібридизації або спосіб ферментного виявлення дефекту комплементарного спарювання.

Способи ідентифікації двоалельних маркерів де похо

Для скринування геномного фрагмента на поліморфізм єдиного нуклеотиду можна використовувати різні способи, такі як диференційна гібридизація з олігонуклеотидними зондами, виявлення змін у рухливості, що вимірюється за допомогою гель-електрофорезу, або прямим секвенуванням ампліфікованої нуклеїнової кислоти.

Переважний спосіб ідентифікації двоалельних маркерів включає порівняльне секвенування фрагментів геномної

ДНК у відповідного числа не зв'язаних спорідненням індивідів.

У першому варіанті здійснення даного винаходу зразки ДНК від не зв'язаних спорідненням індивідів об'єднують разом, після чого геномну ДНК, що представляє інтерес, ампліфікують і секвенують. Потім, одержані /0 таким чином нуклеотидні послідовності аналізують, щоб ідентифікувати достовірний поліморфізм. Одна з основних переваг даного способу полягає у тому, що об'єднання зразків ДНК значною мірою знижує кількість реакцій ампліфікації та реакцій секвенування ДНК, які потрібно здійснити. Крім того, даний спосіб досить чутливий, так що одержаний таким чином двоалельний маркер звичайно демонструє достатню частоту свого менш поширеного алеля, який корисний для проведення асоціативних досліджень.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу зразки ДНК не об'єднують і тому їх ампліфікують і секвенують індивідуально. Даний спосіб, як правило, переважний, якщо двоалельні маркери потребують ідентифікації, щоб здійснити асоціативні дослідження у рамках кандидатних генів. Переважно, у випадку двоалельних маркерів можна скринувати високозначимі генні ділянки, такі як промоторні ділянки або екзонні ділянки. Двоалельний маркер, одержаний з використанням даного способу, може проявити меншу інформативність для проведення 2о асоціативних досліджень, наприклад, якщо частота його найменш частого алеля складає менше ніж близько 1096. Разом з тим, такий двоалельний маркер буде досить інформативним для проведення асоціативних досліджень і, крім того, цінним через те, що включення менш інформативних двоалельних маркерів у дослідження даного винаходу за генетичним аналізом може забезпечити у деяких випадках пряму ідентифікацію каузальних (що визначають дану ознаку) мутацій, які можуть, в залежності від їх пенетрантності, виявитися сч ов рідкими мутаціями.

Нижче йде опис різних параметрів переважного способу, що використовується заявниками для ідентифікації і) двоалельних маркерів даного винаходу.

Зразки геномної ДНК

Зразки геномної ДНК, з яких створюють двоалельні маркери даного винаходу, переважно одержують від не М зо зв'язаних спорідненням індивідів, відповідних гетерогенній популяції з відомим етнічним фоном. Число індивідів, від яких одержують зразки ДНК, може істотно варіювати, переважно від близько 10 до близько 1000, с переважно від близько 50 до близько 200 індивідів. Як правило, переважно збирати зразки ДНК, щонайменше, Ге! від близько 100 індивідів, для того, щоб володіти досить поліморфною різноманітністю у даній популяції, щоб ідентифікувати стільки маркерів, скільки можливо, і щоб одержати статистично значимі результати. ме)

Що стосується джерела геномної ДНК, яку піддають аналізу, то зразком, що аналізується, може бути ї- будь-який зразок без якого-небудь особливого обмеження. Такі зразки, що аналізуються, включають біологічні зразки, які можна проаналізувати описаними у даному описі способами даного винаходу, і включають рідини організму людини і тварини, такі як суцільна кров, сироватка, плазма, спинномозкова рідина, сеча, лімфатична рідина та різні зовнішні виділення при диханні, виділення кишкового і сечостатевого трактів, сльози, слину, «

Молоко, лейкоцити, мієломи і тому подібне; біологічні рідини, такі як супернатанти клітинних культур; з с фіксовані тканинні зразки, включаючи злоякісну і не злоякісну тканину і тканини лімфатичних вузлів; пункції . кісткового мозку і зразки фіксованих клітин. Переважним джерелом геномної ДНК, що використовується у даному и?» винаході, є периферична венозна кров кожного донора. Методи одержання геномної ДНК з біологічних зразків добре відомі кваліфікованим фахівцям. Подробиці переважного варіанта здійснення даного винаходу приведені

У Прикладі 1. Фахівець у даній області техніки може вибрати для ампліфікації об'єднані або необ'єднані -І ДдНЕ-зразки.

Ампліфікація ДНК ік Ідентифікації двоалельних маркерів у зразку геномної ДНК може сприяти використання способів ампліфікації

Ге) ДНК. Для стадії ампліфікації зразки ДНК можна об'єднати або не об'єднувати. Методи ампліфікації ДНК добре

Відомі фахівцям у даній області техніки. ю Методи ампліфікації, що використовуються у контексті даного винаходу, включають, але не обмежуються "М ними, лігазну ланцюгову реакцію (СК), (описану в ЕР-А-320308, МО 9320227 і ЕР-А-4391821), полімеразну ланцюгову реакцію (РОК, КТ-РСК) і такі методи, як ампліфікація на основі послідовності нуклеїнової кислоти (МАЗВА), (описана у Сзцаїей .С. і співавт. (1990) та у Сотріоп .). (1991)), О-бета ампліфікація, (яка дв описана в Європейській Патентній Заявці Мо4544610), ампліфікація із заміщенням ланцюга, (як описано у УмМаїкКег і співавт. (1996) ії ЕР А 684315), і опосередкована мішенню ампліфікація, |Як описано у публікації РСТ УУО

Ф) 93224611. ка ЇСК ії бар СК є експонентними ампліфікаційними методами, обидві залежать від ДНК-лігази, яка з'єднує суміжні праймери, що відпалюють до молекули ДНК. У лігазній ланцюговій реакції (СК) використовують пару бо зондів, які включають два первинних (основних) (перший і другий) і два вторинних |допоміжних) (третій і четвертий) зонди, які всі використовуються у молярному надлишку до мішені. Перший зонд гібридизується з першим сегментом даного ланцюга-мішені, а другий зонд гібридизується з другим сегментом даного ланцюга-мішені, причому перший і другий сегменти є суміжними, так що первинні зонди примикають один до одного у 5'фосфат-З'гідроксильному взаємозв'язку, і так що лігаза може ковалентно поєднувати або лігувати два в5 Зонди У з'єднаний шляхом злиття продукт. Крім того, третій (вторинний) зонд може гібридизуватися з частиною першого зонда, а четвертий (вторинний) зонд може гібридизуватися з частиною другого зонда шляхом аналогічного примикання. Звичайно, якщо дана мішень початково складається з двох ланцюгів, то у першому випадку вторинні зонди також будуть гібридизуватися з комплементом-мішенню. Після того, як лігований ланцюг первинних зондів відділений від ланцюга-мішені, він буде гібридизуватися з третім і четвертим зондом, які

Можуть бути ліговані з утворенням комплементарного, вторинного лігованого продукту. Важливо усвідомлювати, що дані ліговані продукти функціонально еквівалентні даній мішені або її комплементу. Внаслідок повторення циклів гібридизації та лігування досягається ампліфікація послідовності-мішені. Описаний також спосіб мультиплексної І СК (МО 93202271. Сар І СК (СІ СК) являє собою варіант І СК, в якому зонди не є сусідніми, а розділені 2-3 основами. 70 Що стосується ампліфікації мРНК, то у рамках даного винаходу мРНК зворотно транскрибують у кКДНК з подальшою полімеразною ланцюговою реакцією (КТ-РСК); або з використанням в обох стадіях єдиного ферменту, (як описано у Патенті США Мо53227701, або з використанням Асиметричної Сар І СК (КТ-АСІ СК), (як описано у Магепа| і співавт. (1994). АСІСК являє собою модифікацію СІ СК, яка робить можливою ампліфікацію РНК.

Техніка ПЛР є переважною технікою ампліфікації, що використовується у даному винаході. Різноманітні методи ПЛР добре відомі фахівцям у даній області техніки. Огляд техніки ПЛР |див. у МУпіе (1997) та у публікації, названій ""СК Меїйподз апа Арріїсайопе" (1991, Соїй бргіпд Нагрог І арогаїогу Ргевзв)). У кожній з цих методик ПЛР-праймери для кожної із сторін послідовності нуклеїнової кислоти, що ампліфікується, додаються до відповідним чином приготованого зразка нуклеїнової кислоти разом з аМТР і термостабільною полімеразою, такою як Тад-полімераза, Ріи-полімераза або Мепі-полімераза. Нуклеїнову кислоту даного зразка денатурують і ПЛР-праймери специфічно гібридизуються з комплементарними нуклеотидними послідовностями у даному зразку. Праймери, що гібридизуються, подовжуються. Тому ініціюється наступний цикл денатурації, гібридизації та подовження. Такі цикли повторюються багато разів з утворенням фрагмента, що ампліфікується, який містить нуклеотидну послідовність між праймерними сайтами. ПЛР додатково була описана у декількох сч ов патентах, у тому числі (у Патентах США МоМмо4683195; 4683202; і 4965188), розкриття яких включене у даний опис о за допомогою посилання у всій їх повноті.

Техніка ПЛР являє собою переважну техніку ампліфікації, що використовується для ідентифікації нових двоалельних маркерів. Типовий приклад реакції ПЛР, відповідної для цілей даного винаходу, представлений у

Прикладі 2. М зо Одним з аспектів даного винаходу є спосіб ампліфікації Сапіоп-гена людини, зокрема, фрагмента геномної послідовності ЗЕО ІЮ Мо 1-3 або кДНК-послідовності 5ЕС ІЮО Мо 4, її фрагмента або її варіант у зразку, що с аналізується, переважно з використанням ПЛР. Даний спосіб включає наступні стадії: Ге! а) контактування зразка, який аналізується, з реагентами реакції ампліфікації що включають пару праймерів ампліфікації, як описано вище, і локалізовані на будь-якій стороні полінуклеотидної ділянки, що ме) ампліфікується, і ї-

Б) необов'язкового детектування продуктів ампліфікації.

У даному винаході розглядається також набір для ампліфікації послідовності Сапіоп-гена, зокрема, ділянки геномної послідовності ЗЕС І Мо 1-3 або кДНК-послідовності ЗЕО ІЮО Мо 4 або її варіанта у зразку, що аналізується, де вказаний набір включає: « а) пару олігонуклеотидних праймерів, локалізованих на будь-якій ділянці району Сапіоп, що ампліфікується; з с Б) необов'язково реагенти, необхідні для виконання реакції ампліфікації.

В одному з варіантів здійснення вказаного вище способу ампліфікації і набору реагентів до нього продукт з ампліфікації детектують шляхом гібридизації з міченим зондом, що володіє послідовністю, комплементарною ампліфікованій ділянці. В іншому варіанті здійснення вказаного вище способу ампліфікації і набору реагентів до нього праймери включають послідовність, яка вибрана з групи, що складається з нуклеотидних -І послідовностей В1-817, С1-С17, 001-018, і Е1-Е18.

У першому варіанті здійснення даного винаходу двоалельні маркери ідентифікують з використанням ік інформації про геномну послідовність, яка створена заявниками. Фрагменти секвенованої геномної ДНК

Ге) використовують для створення праймерів для ампліфікації (50Оп.н.)-фрагментів. (50О0п.н.)-фрагменти 5ор ампліфікують з геномною ДНК і сканують на наявність двоалельних маркерів. Праймери можна створити з ю використанням програмного забезпечення О5Р (НіШег І. апа Сгееп Р., 1991). Всі праймери можуть знаходитися "М "лівіше" специфічних основ-мішеней, спільний олігонуклеотидний хвіст яких служить як праймер, що секвенує.

Фахівцям у даній області техніки добре відоме подовження праймерів, яке можна використовувати для даних цілей.

Переважні праймери, придатні для ампліфікації геномних послідовностей, що кодують Сапіоп-ген, фокусуються на промоторах, екзонах і сайтах сплайсингу генів. Двоалельний маркер виявляє більш високу

Ф) ймовірність можливої появи каузальної мутації, якщо він локалізований у цих функціональних ділянках даного ка гена. Переважні праймери ампліфікації даного винаходу включають нуклеотидні послідовності В1-817 ії С1-С17, додатково деталізовані у Прикладі 2 Таблиці 1. во Секвенування ампліфікованої геномної ДНК та ідентифікація поліморфізму единого нуклеотиду

Продукти ампліфікації, одержані як описано вище, потім секвенують з використанням будь-якого способу, відомого і доступного кваліфікованим фахівцям. Способи секвенування ДНК з використанням дидезокси-опосередкованого методу (метод Сенгера) або методу Максам-Гілберта, широко відомі фахівцям у даній області техніки. Такі методи розкриті, |наприклад, у Затьгоок і співавт. (1989)). Альтернативні способи б5 Включають гібридизацію з набором зондів ДНК високої щільності, (як описано у Спее і співавт. (1996)).

Переважно, ампліфіковану ДНК піддають автоматизованим дидезокситермінуючим реакціям, що секвенують,

з використанням протоколу циклічного секвенування з праймером, міченим барвником. Продукти реакцій секвенування розділяють на гелях, що секвенують, і одержані послідовності визначають з використанням аналізу візуалізації гелю. Пошук поліморфізму базується на наявності піків, що накладаються, в електрофоретичному патерні одержаному для різних основ, зустрінутих в одній і тій же опозиції. Оскільки кожний дидезокситермінатор помічений відмінною флуоресцентною молекулою, то два піки, відповідаючи двоалельному сайту, представлені різним кольором, відповідаючи двом відмінним нуклеотидам по одній і тій же позиції у даній послідовності. Однак присутність двох піків може виявитися артефактом, обумовленим фоновим шумом.

Щоб виключити такий артефакт, секвенують два ланцюги ДНК і порівнюють їх за двома одержаними піками. 7/0 Послідовність кваліфікують як поліморфну у тому випадку, якщо поліморфізм виявляється на обох ланцюгах.

Вказана вище методика дозволяє ідентифікувати ті продукти ампліфікації, які містять двоалельні маркери.

Межа виявлення частоти двоалельного поліморфізму, виявленого шляхом секвенування пулів з 100 індивідів, складає приблизно 0,1 для мінорного алеля, що підтверджується пулами секвенування для відомих алельних частот. Однак більше 9095 двоалельного поліморфізму, виявленого методом об'єднання, характеризується 7/5 частотою мінорного алеля, що перевищує значення 0,25. Тому, двоалельні маркери, вибрані за допомогою даного методу, володіють частотою, щонайменше, 0,1 для мінорного алеля і менше 0,9 для основного алеля.

Переважно, якщо частота складає, принаймні, 0,2 для мінорного алеля і менше 0,8 для основного алеля, більш переважно, щонайменше, 0,3 для мінорного алеля і менше 0,7 для основного алеля, таким чином рівень гетерозиготності перевищує 0,18, переважно вище 0,32, більш переважно вище 0,42.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу двоалельні маркери детектуються шляхом секвенування індивідуальних зразків ДНК, де частота мінорного алеля, такого як двоалельний маркер, може складати менше 01.

Перевірка достовірності двоалельних маркерів даного винаходу

Поліморфізм оцінюють за його придатністю як генетичні маркери шляхом підтвердження того, що обидва сч ов алелі присутні у популяції. Перевірка достовірності двоалельних маркерів здійснюється шляхом генотипування групи індивідів способом даного винаходу і демонстрації того, що обидва алелі присутні. Мікросеквенування є і) переважним методом генотипування алелів. Перевірку достовірності за допомогою операції генотипування здійснюють на індивідуальних зразках, одержаних від кожного індивіда даної групи або шляхом генотипування об'єднаної вибірки, одержаної від більше ніж одного індивіда. Дана група може дорівнювати одному індивіду, М зо якщо цей індивід є гетерозиготою по алелю, про який йде мова. Переважно група містить, щонайменше, три індивіди, більш переважно дана група містить п'ять або шість індивідів, так що єдиний тест на достовірність, с цілком ймовірно, приведе до підтвердження існування більшості двоалельних маркерів, що тестуються. Слід, Ге! однак, мати на увазі, що при здійсненні тесту на достовірність у невеликій групі можна зіткнутися з помилковим негативним результатом, якщо як результат помилки вибірки жоден з індивідів, які перевіряються, Ме) з5 Не несе один з двох даних алелів. Таким чином, метод перевірки достовірності менш придатний для ча демонстрації того, що окремий вихідний результат являє собою артефакт, а не демонстрації того, що у конкретній позиції послідовності існує справжній двоалельний маркер. Методи вивчення генотипування, гаплотипування, асоціації та взаємодії даного винаходу можна необов'язково здійснювати виключно відносно достовірності двоалельних маркерів. «

Оцінка частоти двоалельних маркерів даного винаходу в с Перевірені на достовірність двоалельні маркери далі оцінюють на їх придатність як генетичні маркери визначення частоти менш поширеного алеля у сайті двоалельного маркера. Чим більше частота менш з поширеного алеля, тим вище придатність двоалельного маркера для досліджень по асоціації та взаємодії.

Визначення найменш поширеного алеля здійснюється шляхом генотипування групи індивідів способом даного винаходу і демонстрацією присутності обох алелів. Це визначення частоти за допомогою операції генотипування -І здійснюють на індивідуальних зразках, одержаних від кожного індивіда даної групи або шляхом генотипування об'єднаної вибірки, одержаної від більш ніж одного індивіда. Дана група повинна бути досить великою, щоб ік представляти дану популяцію як ціле. Переважно дана група містить, щонайменше, 20 індивідів, більш

Ге) переважно дана група містить, щонайменше, 50 індивідів, більш переважно дана група містить, щонайменше, 100 індивідів. Зрозуміло, велика група збільшить точність визначення частоти, внаслідок зниження помилки ю вибірки. Двоалельний маркер, у якого частота менш поширеного алеля складає 3095 або більше, називають "М "високоякісним двоалельним маркером". Методи вивчення генотипування, гаплотипування, асоціації та взаємодії даного винаходу можна необов'язково здійснювати лише з двоалельними маркерами високої якості.

Способи індивідуального генотипування за двоалельними маркерами 5Б Розроблені способи визначення генотипу біологічного зразка за одним або декількома двоалельними маркерами даного винаходу, які всі можуть здійснюватися іп міго. Такі способи генотипування включають (Ф) визначення ідентичності нуклеотиду у сайті Сапіоп-двоалельного маркера будь-яким способом, відомим у даній ка області техніки. Такі способи знаходять застосування при генотипуванні хворих і здорових популяцій в асоціативних дослідженнях, а також при генотипуванні індивідів у контексті виявлення алелів двоалельних во маркерів, які, як встановлено, асоційовані з даною ознакою, і у цьому випадку обидві копії двоалельного маркера, представлені у геномі індивіда, визначаються так, що індивід можна класифікувати як гомозиготу або гетерозиготу за окремим алелем.

Дані способи генотипування здійснюють на зразках нуклеїнових кислот, одержаних від окремого індивіда або на об'єднаних зразках ДНК. 65 Генотипування можна здійснювати з використанням аналогічних способів, які описані вище для ідентифікації двоалельних маркерів, або з використанням інших способів генотипування, таких як описані нижче. У переважних варіантах здійснення даного винаходу порівняння послідовностей ампліфікованих геномних фрагментів від різних індивідів використовують для ідентифікації нових двоалельних маркерів, а мікросеквенування використовується при генотипуванні відомих двоалельних маркерів для застосування у діагностичному та асоціативному дослідженні.

Один з варіантів здійснення даного винаходу включає в себе способи генотипування, які включають визначення ідентичності нуклеотиду в Сапіоп-зв'язаному двоалельному маркері або у його доповненні у біологічному зразку; де вказаний Сапіоп-зв'язаний двоалельний маркер необов'язково вибраний з групи, що складається з А1-А18 та їх комплементів, або необов'язково двоалельні маркери при цьому нерівноважно 7/0 зчеплені; де вказаний Сапіоп-зв'язаний двоалельний маркер необов'язково вибраний з групи, що складається з

А1-А17 та їх комплементів, або необов'язково двоалельні маркери при цьому нерівноважно зчеплені; де вказаний Сапіоп-зв'язаний двоалельний маркер необов'язково вибраний з групи, яка складається з А12 і А16 та їх комплементів, або необов'язково двоалельні маркери при цьому нерівноважно зчеплені; де вказаний біологічний зразок необов'язково одержаний від окремого індивіда; де ідентичність нуклеотидів у вказаному /5 двоалельному маркері необов'язково визначають за обома копіями вказаного двоалельного маркера, представленого у вказаному геномі індивіда; де вказаний біологічний зразок необов'язково одержаний від багатьох індивідів. Способи генотипування даного винаходу необов'язково включають в себе способи з будь-яким додатковим обмеженням, описаним у даному описі, або способи, що йдуть нижче, вказані окремо або у будь-якому поєднанні. Вказаний спосіб необов'язково здійснюють іп міо; крім того, необов'язкове включення ампліфікації частини вказаної послідовності яка включає двоалельний маркер, перед вказаною стадією визначення. Де вказану ампліфікацію необов'язково здійснюють за допомогою ПЛР, ЛЛР або реплікацією рекомбінантного вектора, що включає оріджин реплікації і вказаний фрагмент, у клітині-хазяїні; де вказане визначення необов'язково здійснюють за допомогою гібридизаційного аналізу, аналізу, що секвенує, аналізу, що мікросеквенує, або методу ферментного виявлення дефекту комплементарного спарювання. с

Походження нуклеїнових кислот для генотипування

Будь-яку нуклеїнову кислоту, виділену очищенням або не виділену очищенням, можна використовувати як і) вихідну нуклеїнову кислоту, якщо містить або приблизно містить необхідну специфічну послідовність нуклеїнової кислоти. ДНК або РНК можна екстрагувати з клітин, тканин, рідин організму і тому подібного. Хоча нуклеїнові кислоти, що використовуються у способах генотипування даного винаходу можна одержати від будь-якого ї- зо бсавця, під суб'єктами, яких обстежують, та індивідами, у яких взяті зразки нуклеїнової кислоти, мають на увазі людину. с

Ампліфікація фрагментів ДНК, що включають двоалельні маркери Ге!

Забезпечені способи і полінуклеотиди для ампліфікації сегмента нуклеотидів, що включають один або декілька двоалельних маркерів даного винаходу. Потрібно мати на увазі, що ампліфікація фрагментів ДНК, які ме) з5 Включають двоалельні маркери, може здійснюватися різними способами та для різних цілей і не обмежується ча генотипуванням. Проте, багато способів генотипування, хоча і не всі, потребують попередньої ампліфікації ділянки ДНК, що несе двоалельний маркер, який представляє інтерес. Такі способи специфічно збільшують концентрацію або загальну кількість послідовностей, які включають двоалельний маркер або включають таку ділянку, і послідовності, локалізовані поблизу або на відстані від неї. Діагностичний аналіз може також « базуватися на ампліфікації сегментів ДНК, що несуть двоалельний маркер даного винаходу. Ампліфікацію ДНК пт) с можна здійснити будь-яким способом, відомим у даній області техніки. Методи ампліфікації описані вище у розділі, названому "Ампліфікація ДНК". ;» Деякі з таких методів ампліфікації особливо підходять для виявлення поліморфізму єдиного нуклеотиду і роблять можливою одночасну ампліфікацію послідовності-мішені та ідентифікацію поліморфного нуклеотиду, як це описано нижче. -І Ідентифікація описаних вище двоалельних маркерів дозволяє створити відповідні олігонуклеотиди, які можна використовувати як праймери для ампліфікації фрагментів ДНК, що включають двоалельні маркери даного ік винаходу. Ампліфікацію можна здійснити з використанням праймерів, які спочатку використовуються для со відкриття описаних у даному описі нових двоалельних маркерів, або будь-якого набору праймерів, що забезпечує ампліфікацію фрагмента ДНК, який включає двоалельний маркер даного винаходу. ю У деяких варіантах даного винаходу створені праймери для ампліфікації фрагмента ДНК, що містить один "М або декілька двоалельних маркерів даного винаходу. Переважні ампліфікаційні праймери перераховані у

Прикладі 2. Потрібно мати на увазі, що дані перераховані праймери є лише ілюстративними, і що також використовують будь-який інший набір праймерів, який виробляє продукти ампліфікації, що містять один або декілька двоалельних маркерів даного винаходу.

Відстань між праймерами визначає довжину ампліфікованого сегмента. У контексті даного винаходу

Ф) ампліфікованні сегменти, що несуть двоалельні маркери, можна розташувати за розміром від, щонайменше, ка близько 25п.н. до ЗБт.п.н. Фрагменти ампліфікації з 25-300О0п.н. є звичайними, фрагменти з 50-1000п.н. є переважними, а фрагменти з 100-600п.н. є найбільш переважними. Потрібно мати на увазі, що праймери бо ампліфікації двоалельних маркерів можуть являти собою будь-яку послідовність, яка робить можливою специфічну ампліфікацію будь-якого фрагмента ДНК, що несе дані маркери. Праймери ампліфікації можна мітити або іммобілізувати на твердому носії, як описано у розділі "Олігонуклеотидні зонди і праймери".

Спосіб генотипування зразків ДНК за двоалельними маркерами

Для ідентифікації нуклеотиду, присутнього у сайті двоалельного маркера, можна використовувати будь-який 65 спосіб, відомий у даній області техніки. Оскільки даний алель, що детектується, двоалельного маркера був ідентифікований і точно визначений у даному винаході, детекція виявляється простою для середнього фахівця у даній області техніки, із застосуванням будь-якої з наявних методик. Багато способів генотипування потребує здійснення попередньої ампліфікації ділянки ДНК, що несе двоалельний маркер, який представляє інтерес. Хоча у наш час ампліфікація мішені або сигналу часто переважна, надчутливі способи детекції, які не потребують ампліфікації, також включені до сучасних способів генотипування. Способи, добре відомі фахівцям у даній області техніки, які можуть використовуватися для виявлення двоалельного поліморфізму, включають такі способи, як стандартний дот-блот аналіз, аналіз однониткового конформаційного поліморфізму (З5СР), описаного Огівеїа і співавт. (1989), градієнтний гель-електрофорез, що денатурує (ООСЕ), гетеродуплексний аналіз, виявлення розщеплення помилкового спарювання та інші традиційні методики, (які описані у Зпейіеїа і /о співавт. (1991), МУпйе і співавт. (1992), Сготре і співавт. (1989 і 1993)). Інший спосіб визначення ідентичності нуклеотиду, присутнього у конкретному поліморфному сайті, використовує спеціалізоване, стійке до екзонуклеази, нуклеотидне похідне, (як описано у Патенті США Мо4656127).

Переважні способи передбачають пряме визначення ідентичності нуклеотиду, присутнього у сайті двоалельного маркера, за допомогою аналізу секвенування, аналізу ферментного виявлення дефекту 7/5 Комплементарного спарювання або гібридизаційного аналізу. Далі йде опис деяких переважних способів.

Особливо переважним способом є метод мікросеквенування. Термін "секвеновані", що використовується, в основному, у даному описі, відноситься до полімеразного подовження дуплексних комплексів праймер/матриця і включає традиційне секвенування та мікросеквенування. 1) Аналіз, що секвенує

Нуклеотид, присутній у поліморфному сайті, можна визначити за допомогою способів секвенування. У переважному варіанті здійснення даного винаходу зразки ДНК перед секвенуванням піддають ПЛР-ампліфікації, як описано вище. Способи секвенування ДНК описані у розділі "Секвенування ампліфікованої геномної ДНК та ідентифікація поліморфізму єдиного нуклеотиду".

Переважно, ампліфіковану ДНК піддають автоматизованому дидезокси-термінуючому секвенуванню з сч ов Використанням протоколу циклу секвенування з праймером, міченим барвником. Аналіз, що секвенує, робить можливим ідентифікацію основи, присутнього у сайті двоалельного маркера. і) 2) Аналіз, що мікросеквенує

У способах, що мікросеквенують, нуклеотид поліморфного сайту у ДНК-мішені виявляють за допомогою реакції однонуклеотидного праймерного подовження. Даний спосіб включає в себе відповідні праймери, що М

Зо Мікросеквенують, які гібридизуються якраз "лівіше" від поліморфної основи, що представляє інтерес, у нуклеїновій кислоті-мішені. Використовують полімеразу, яка специфічно подовжує 3'-кінець праймеру на с один-єдиний ЯаМТР (термінатор ланцюга), комплементарний нуклеотиду поліморфного сайту. Потім ідентичність Ге! включеного нуклеотиду визначають будь-яким відповідним чином.

Звичайно, реакції мікросеквенування здійснюють з використанням флуоресцентних 4амтТР і добудовані ме) праймери, що мікросеквенують, аналізують за допомогою електрофорезу на секвенаторі АВІ 377 для визначення ї- ідентичності вбудованого нуклеотиду, |Як описано в ЕР 412883), розкриття якого включене у даний опис за допомогою посилання у всій його повноті. Альтернативно, можна використовувати капілярний електрофорез, для того, щоб одночасно проаналізувати велике число продуктів мікросеквенування. Приклад типової методики, що мікросеквенує, яку можна використовувати у контексті даного винаходу, представлений у Прикладі 4. «

Для мічення та детекції ФАМТР можна застосовувати різні методи. Спосіб гомогеннофазової детекції з с базується на флуоресцентному перенесенні енергії резонансу, (описаний Спеп апа Кжок (1997) і СНеп і співавт. . (1997)). У даному способі ампліфіковані фрагменти геномної ДНК, що містять поліморфні сайти, інкубують з и?» праймером, міченим флуоресцеїном по 5-кінцю у присутності алельних мічених барвником дидезоксирибонуклеозидтрифосфатів і модифікованої Тад-полімерази. Мічений барвником праймер подовжується на одну основу за допомогою барвника-термінатора, специфічного для даного алеля, -І представленого у даній матриці. У кінці реакції генотипування інтенсивність флуоресценції двох барвників у даній реакційній суміші аналізують безпосередньо без поділу або виділення очищенням. Всі ці стадії можна ік здійснити в одній і тій же пробірці, а зміни флуоресценції відстежувати у реальному часі. Альтернативно,

Ге) подовжений праймер можна аналізувати за допомогою МА! 0І-ТОЕР-мас-спектрометрії. Дану основу у 5р поліморфному сайті визначають за масою, що додається до праймеру мікросеквенування |див. Наї апа Зтігпом, ю 19971.

І Мікросеквенування можна здійснити за допомогою способу мікросеквенування, що став традиційним, або вдосконаленого або за допомогою його варіантів. Альтернативні способи включають декілька твердофазових методик мікросеквенування. Основним протоколом з мікросеквенування є той же протокол, який описаний вище, ов За винятком того, що даний спосіб здійснюють у вигляді аналізу у гетерогенній фазі, в якому даний праймер або молекулу-мішень іммобілізують або уловлюють на твердий носій. Щоб спростити аналіз відділення праймеру і (Ф, додавання нуклеотиду, що термінує, олігонуклеотиди приєднують до твердого носія або модифікують таким ка чином, щоб дозволити поділ за спорідненням, а також полімеразне подовження. 5'-кінці та внутрішні нуклеотиди синтетичних олігонуклеотидів можна модифікувати декількома різними шляхами, які дозволяють застосовувати во різні методи поділу за спорідненням, наприклад, біотинілювання. При використанні в олігонуклеотидах єдиної афінної групи, дані олігонуклеотиди можна відділити від вбудованого реагенту, що термінує. Це виключає необхідність фізичного поділу або поділу за розміром. При використанні більше однієї афінної групи від даного реагенту, що термінує, можна відділити і аналізувати одночасно більше одного олігонуклеотиду. Це дозволяє проводити аналіз декількох видів нуклеїнової кислоти або одержувати більше інформації про послідовності 65 нуклеїнової кислоти на реакцію подовження. Афінна група не є необхідною у праймуванні олігонуклеотиду, але могла б бути альтернативно представлена на даній матриці. Наприклад, іммобілізацію можна здійснювати шляхом взаємодії між біотинільованою ДНК і мікротитраційними ямками, покритими стрептавідином або частинками з полістиролу, покритими авідином. Таким же чином, олігонуклеотиди або матриці можна приєднувати до твердого носія у високощільному вигляді. У таких твердофазових реакціях, що мікросеквенують, вбудовані З44МТР можуть бути радіоактивно міченими |Зумапеп, 19941) або зв'язані з флуоресцеїном | імак апа

Наїпег, 1994). Детекцію радіоактивно мічених ЗаМТР можна здійснювати за допомогою сцинтиляційних методів.

Детекцію флуоресцеїн-зв'язаних даМмТР можна будувати на зв'язуванні антифлуоресцеїнового антитіла, кон'югованого з лужною фосфатазою, з подальшою інкубацією з хроматографічним субстратом (таким як пара-нітрофенілфосфат). Інші можливі пари детекції репортера включають: дамтТР, зв'язаний з динітрофенілом 7/0 ХОМР), ї кон'югат анти-ОМР лужної фосфатази |Нагпи і співавт., 1993) або біотинільований аамМтР і стрептавідин, кон'югований з пероксидазою хрону, з орто-фенілендіаміном як субстрат МО 92/157121, розкриття якого включене у даний опис за допомогою посилання у всій його повноті). Ще в одному альтернативному твердофазовому методі мікросеквенування |Мугеп і співавт. (1993))| описують спосіб, що базується на детекції

ДНК-полімеразної активності в ензиматичному люмінеметричному аналізі детекції неорганічного пірофосфату 7/5 (ЕНОА).

ІРазіїпеп і співавт. (1997) описують спосіб багаторазової детекції поліморфізму єдиного нуклеотиду, в якому принцип твердофазового мікросеквенування застосовується до формату олігонуклеотидного набору.

Високощільні набори ДНК-зондів, приєднані до твердого носія (ДНК-чіп), описані нижче.

Одним з аспектів даного винаходу є створення полінуклеотидів і способів генотипування одного або 2о декількох двоалельних маркерів даного винаходу, здійснюваних за допомогою аналізу мікросеквенування.

Переважні праймери мікросеквенування включають нуклеотидні послідовності О1-018 і Е1-Е18. Потрібно мати на увазі, що праймери, які мікросеквенують, перераховані у Прикладі 4, є всього лише ілюстративними, і що можна використовувати будь-який праймер, який володіє 3-кінцем, що безпосередньо примикає до даного поліморфного нуклеотиду. Подібно до цього, потрібно мати на увазі, що аналіз, який мікросеквенує, можна сч

Здійснювати для будь-якого двоалельного маркера або для будь-якого поєднання двоалельних маркерів даного винаходу. Одним з аспектів даного винаходу є твердий носій, який включає один або декілька праймерів, що і) мікросеквенують, перерахованих у Прикладі 4, або їх фрагменти, які включають, принаймні, 8, 12, 15, 20, 25, 30, 40 або 50 їх послідовних нуклеотидів, поки такі сумісні з описаним праймером і володіють 3'-кінцем безпосередньо "лівіше" від відповідного двоалельного маркера, для визначення ідентичності нуклеотиду у сайті М зо двоалельного маркера. 3) Аналіз виявлення помилкового спарювання, що базується на полімеразах і лігазах с

Одним з аспектів даного винаходу є забезпечення полінуклеотидів і способів для визначення алеля одного б або декількох двоалельних маркерів даного винаходу у біологічному зразку за допомогою аналізу з виявлення помилкового спарювання, що базується на полімеразах і/або лігазах. Проведення таких аналізів базується на ме) специфічності полімераз і лігаз. Реакція полімеризації визначає особливо жорсткі вимоги до правильного ї- спарювання основ 3-кінця праймеру для ампліфікації, а з'єднання двох олігонуклеотидів, які гібридизуються з послідовністю ДНК-мішені, є досить чутливим до невідповідностей поблизу сайту літування, особливо на 3-кінці. Крім того, способи, праймери і різні параметри для ампліфікації фрагментів ДНК, що включають двоалельні маркери даного винаходу, описані вище у розділі "Ампліфікація фрагментів ДНК, що включають « двоалельні маркери". з с Алельна специфічність праймерів ампліфікації . Диференціацію алелів двоалельного маркера можна здійснювати за допомогою специфічної ампліфікації, и?» селективної стратегії за допомогою якої один з алелів ампліфікується за відсутності ампліфікації іншого алеля. Для алельспецифічної ампліфікації, щонайменше, один член пари праймерів є досить комплементарним ділянці Сапіоп-гена, що включає поліморфну основу двоалельного маркера даного винаходу, який до того ж -І гібридизується і починає ампліфікацію. Такі праймери здатні розрізняти ці два алелі двоалельного маркеру.

Це здійснюється шляхом поміщення поліморфної основи на 3'-кінець одного з праймерів ампліфікації. і, Оскільки подовження починається з 3-кінця праймеру, помилкове спарювання у даному положенні або поблизу

Ге) нього володіє дією, що інгібує, на ампліфікацію. Тому у відповідних умовах ампліфікації праймери направляють ампліфікацію тільки на комплементарний до нього алель. Визначення точного розташування помилкового ю спарювання і відповідних умов дослідження знаходяться у межах компетенції середнього фахівця у даній

І області техніки.

Способи, що базуються на лігуванні/ампліфікації "Метод олігонуклеотидного лігування" (ОА) використовує два олігонуклеотиди, які створюють здатними

Б ГПібридизуватися з послідовностями, що примикають, однониткових молекул-мішеней. Один з олігонуклеотидів біотинільований, а інший піддається виявленню завдяки мітці. При виявленні у молекулі-мішені точно (Ф) комплементарної послідовності, дані олігонуклеотиди будуть гібридизуватися так, що їх кінці з'єднаються ка впритул і створять субстрат для лігування, який можна захопити і детектувати. ОЇ А здатний детектувати поліморфізм єдиного нуклеотиду і може бути переважно об'єднаний з ПЛР, |як описано у МісКегвоп і співавт. 6о Й1990)). У даному способі ПЛР використовують для здійснення експонентної ампліфікації ДНК-мішені, яку потім детектують з використанням ОА.

Інші способи ампліфікації, які особливо придатні для виявлення поліморфізму єдиного нуклеотиду, включають І СК (лігазну ланцюгову реакцію), Сар ГСК (СІ СК), які описані вище у розділі "Ампліфікація ДНК".

ЇСК використовує дві пари зондів для експонентної ампліфікації конкретної мішені. Послідовності кожної пари 65 олігонуклеотидів вибрані таким чином, щоб дати можливість парі гібридизуватися з послідовностями, що примикають, одного і того ж ланцюга даної мішені. Така гібридизація утворює субстрат для матрично-залежної лігази. Відповідно до даного винаходу І СК можна здійснити з олігонуклеотидами, які володіють проксимальною і дистальною послідовностями одного і того ж ланцюга сайту двоалельного маркера. В одному з варіантів здійснення даного винаходу створюють один з двох олігонуклеотидів, який включає сайт двоалельного маркера.

У такому варіанті здійснення даного винаходу реакційні умови вибрані так, щоб дані олігонуклеотиди могли бути ліговані разом лише у тому випадку, якщо дана молекула-мішень або містить, або не містить специфічний нуклеотид, який є комплементарним двоалельному маркеру в олігонуклеотиді. В альтернативному варіанті здійснення даного винаходу дані олігонуклеотиди не включають даний двоалельний маркер, тому, коли вони гібридизуються з молекулою-мішенню, створюється "дар" (пропуск), (Як описано у УМО 90/010691, розкриття якого /о0 Включене у даний опис за допомогою посилання у всій його повноті. Даний пропуск "заповнюється" комплементарними ЯМТР (за посередництвом ДНК-полімерази) або за допомогою додаткової пари олігонуклеотидів. Таким чином, у кінці кожного циклу, кожний одиночний ланцюг володіє комплементом, здатним служити як мішень протягом наступного циклу і одержують експонентну алельспецифічну ампліфікацію бажаної послідовності.

І ідазе/РоїЇутегазе-тедіаге(й Сепеїйїс Вії Апаїузівтм (Аналіз невеликого генетичного фрагмента за посередництвом лігази/полімерази)їм являє собою ще один спосіб визначення ідентичності нуклеотиду у заздалегідь вибраному сайті молекули нуклеїнової кислоти (ММО 95/21271). Даний спосіб включає в себе введення нуклеозидтрифосфату, який є комплементарним нуклеотиду, присутньому у заздалегідь вибраному сайті на кінці молекули праймеру, та їх подальше лігування з другим олігонуклеотидом. Дану реакцію 2о Відстежують шляхом детектування специфічної мітки, приєднаної до твердої фази даної реакції або шляхом детектування у розчині. 4) Способи гібридизаційного аналізу

Переважний спосіб визначення ідентичності нуклеотиду, присутнього у сайті двоалельного маркера, включає гібридизацію нуклеїнових кислот. Гібридизаційні зонди, які зручно використовувати у таких реакціях, переважно Га включають вказані у даному описі зонди. Можна використовувати будь-який гібридизаційний аналіз, включаючи

Саузерн-гібридизацію, Нозерн-гібридизацію, дот-блот-гібридизацію і твердофазову гібридизацію |див. Затьгсок і і) співавт., 1989).

Гібридизація відноситься до утворення дуплексної структури двома однонитковими нуклеїновими кислотами, внаслідок комплементарності основ, що спарюються. Гібридизація може відбуватися між точно ч-

Ккомплементарними ланцюгами нуклеїнової кислоти або між ланцюгами нуклеїнової кислоти, яка містить мінорні ділянки помилкового спарювання. Можна створити специфічні зонди, які гібридизуються з однією формою с двоалельного маркера, але не з іншою, і тому здатні розрізняти різні алельні форми. Алельспецифічні зонди Ге») часто використовуються парами, причому один член такої пари демонструє повний збіг з послідовністю-мішенню, що містить первинний алель, а інший - демонструє повний збіг з послідовністю-мішенню, що містить б з5 альтернативний алель. Умови гібридизації повинні бути досить жорсткими, щоб існувала істотна різниця в ч- інтенсивності гібридизації між алелями, і, в основному, переважна по суті бінарна відповідь, внаслідок чого зонд гібридизується тільки з одним з таких алелів. Жорсткі, специфічні для послідовності, гібридизаційні умови, в яких зонд гібридизується тільки з точно комплементарною послідовністю-мішенню, добре відомі у даній « області техніки |(ЗатьгоокК і співавт., 1989). Жорсткі умови залежать від послідовності і будуть відрізнятися за різних обставин. Як правило, жорсткі умови вибирають таким чином, щоб вони були приблизно на 5еС нижче й с температури плавлення (Тт) специфічної послідовності при певній іонній силі та рН. Хоча таку гібридизацію а можна здійснити у розчині, переважно використовувати твердофазовий метод гібридизації. ДНК-мішень, що "» включає двоалельний маркер даного винаходу, можна ампліфікувати перед реакцією гібридизації. Присутність специфічного алеля у даному зразку визначають шляхом детектування наявності або відсутності стабільних гібридних дуплексів, утворених між даним зондом і даною ДНК-мішенню. Детекцію гібридних дуплексів можна -| здійснювати багатьма способами. Добре відомі різні види методу детекції, в яких використовують мітки, що с детектуються, зв'язані з даною мішенню або з даним зондом для детекції утворених гібридних дуплексів.

Звичайно, гібридизаційні дуплекси відділяють від негібридизованих нуклеїнових кислот, після чого мітки, (се) зв'язані з дуплексами, які утворилися, детектуються. Фахівцям у даній області відомо, що стадії відмивання юю 50 можна використовувати для відмивання надлишку ДНК-мішені або зонда, а також кон'югата, що не зв'язався.

Крім того, стандартні гетерогенні види аналізу є відповідними для детекції одержаних гібридів з використанням що міток, присутніх у праймерах і зондах.

Два вдосконалених останнім часом методи дозволяють дискримінувати алелі на основі гібридизації без необхідності розділень або відмивання |див. І апдедгеп М. і співавт., 1998). Перевага методу ТадмМап у тому, що в ньому використовується 5-нуклеазна активність ДНК-полімерази Тад для розщеплення ДНК-зонда, що специфічно випалюється з продуктом ампліфікації, який нагромаджується. ТадМап-зонди мітять за допомогою о донор-акцепторної пари барвників, які взаємодіють шляхом флуоресцентного перенесення енергії. Розщеплення іме) ТадМап-зонда, внаслідок просування полімерази протягом ампліфікації, роз'єднує донорний барвник від переважного барвника-акцептора, істотно збільшуючи флуоресценцію донора. Всі реагенти, необхідні для 60о виявлення двох алельних варіантів, можна зібрати до початку реакції, а результати відстежити у реальному часі див. мак і співавт., 1995). В альтернативному методі, що базується на гомогенній гібридизації, для розрізнення алелів використовують молекулярні маяки. Молекулярні маяки являють собою олігонуклеотидні зонди шпилькової форми, які повідомляють про наявність специфічної нуклеїнової кислоти у гомогенних розчинах. При зв'язуванні зі своїми мішенями вони зазнають конформаційної реорганізації, яка відновлює 65 флуоресценцію внутрішньо погашеного флуорофору |Туаді і співавт., 1998).

Створені у даному описі полінуклеотиди можна використовувати для одержання зондів, які можна використовувати у гібридизаційному аналізі для детекції алелів двоалельного маркера у біологічних зразках.

Дані зонди характеризуються тим, що вони переважно включають 8-50 нуклеотидів і тим, що вони досить комплементарні послідовності, яка включає двоалельний маркер даного винаходу, з тим щоб гібридизуватися з нею, і переважно досить специфічні для розрізнення послідовності-мішені всього з однією нуклеотидною зміною.

Особливо переважний зонд складає 25 нуклеотидів у довжину. Переважно двоалельний маркер знаходиться у 4 нуклеотидах від центра даного полінуклеотидного зонда. В особливо переважних пробах двоалельний маркер знаходиться у центрі вказаного полінуклеотиду. Переважні зонди включають нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з ампліконів списку Таблиці 1 і комплементарних їм послідовностей, або її фрагмент, 7/0 причому вказаний фрагмент включає, щонайменше, близько 8 послідовних нуклеотидів, переважно 10, 15, 20, більш переважно 25, 30, 40, 47 або 50 послідовних нуклеотидів і містить поліморфну основу. Переважні зонди включають нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, яка складається з Р1-Р18 і послідовностей, комплементарних їм. У переважних варіантах здійснення даного винаходу поліморфнаб(ї) основа(и) знаходяться у межах 5, 4, 3, 2, 1 нуклеотидів від центра вказаного полінуклеотиду, більш переважно - у центрі вказаного 7/5 Пполінуклеотиду.

Переважно зонди даного винаходу є міченими та іммобілізованими на твердому носії. Мітки і тверді носії описані також у розділі "Олігонуклеотидні зонди і праймери". Дані зонди можуть бути такими, що не подовжуються, як описано у розділі "Олігонуклеотидні зонди і праймери".

При аналізі гібридизації алельспецифічного зонда можна виявити присутність або відсутність алеля го двоалельного маркера у даному зразку. Високопродуктивна паралельна гібридизація у вигляді набору специфічно включена у "методи гібридизації" та описується нижче. 5) Гібридизація з адресними наборами олігонуклеотидів

Методи гібридизації що базуються на олігонуклеотидних наборах, залежать від відмінностей у гібридизаційній стабільності коротких олігонуклеотидів, які повністю співпадають, і варіантів, що не сч об співпадають, послідовності-мішені. Ефективний доступ до інформації про поліморфізм одержують через основну структуру, яка включає високощільні набори олігонуклеотидних зондів, приєднаних на вибраній позиції до і) твердого носія (наприклад, чіп). Кожний ДНК-чіп може містити від тисяч до мільйонів індивідуальних синтетичних ДНК-зондів, вибудованих у подібну сітці структуру і мініатюризовану до розміру монети в 10 центів.

Технологія чіпу вже з успіхом застосовується у багатьох випадках. Наприклад, у мутантних штамах 5. М

Зо бегемівідае скринуванню на наявність мутацій був підданий ген ВКСА 1, протеазний ген в НІМ-1-вірусі ІНасіа і співавт., 1996; ЗпоетакКег і співавт., 1996; Кола! і співавт., 1996). Чіпи різного вигляду для виявлення с двоалельного поліморфізму можна одержати на основі індивідуальних замовлень у АПутейіх (СепеСпіртм), (3

Нузезд (Ну Спір апа Ну Опозіїсв) і Ргоодепе І арогаюгіев.

Загалом, у даних способах використовують набори олігонуклеотидних зондів, що є комплементарними о сегментам послідовності-мішені нуклеїнової кислоти індивіда, послідовності-мішені якого включають ї- поліморфний маркер. (ЕР 785280), розкриття якого включене у даний опис за допомогою посилання у всій його повноті, описує "плиткову" стратегію для виявлення поліморфізму єдиного нуклеотиду. Коротко, набори в основному можуть бути "плитковими" для великого числа конкретних поліморфізмів. Під "плитковим" покриттям в основному мається на увазі синтез визначеного набору олігонуклеотидних зондів, які створюють послідовність, «

Комплементарну послідовності-мішені, що представляє інтерес, а також задану мінливість цієї послідовності, шщ с наприклад, заміна однієї або декількох даних позицій одним або декількома членами базисного набору й нуклеотидів. "Плиткові" стратегії описані також (у Заявці РСТ Мо МУО 95/11995). У конкретному аспекті набори є и? "плитковими" для ряду специфічних, ідентифікованих послідовностей двоалельного маркера. Зокрема, даний набір роблять "плитковим" для включення ряду детекційних блоків, кожний з яких є специфічним для конкретного двоалельного маркера або набору двоалельних маркерів. Наприклад, детекціний блок може бути "плитковим" -і для включення ряду зондів, які охоплюють ділянку послідовності, що включає специфічний поліморфізм. Щоб забезпечити одержання зондів, які є комплементарними кожному апелю, зонди синтезують парами, що о відрізняються за двоалельним маркером. Крім зондів, які відрізняються за поліморфною основою, однозаміщені

Те) зонди також, як правило, укладають "плитками" всередині даного детекційного блока. Такі монозаміщені зонди 5р Володіють певним числом основ або аж до певного числа основ у будь-якому напрямі від даного поліморфізму, де заміщених на нуклеотиди, що залишаються (вибрані з А, Т, б, С та М). Звичайно зонди у "плитковому" "І детекційному блоці будуть включати заміни позицій послідовності аж до позицій і, включаючи позиції, які знаходяться в 5 основах від двоалельного маркера. Монозаміщені зонди забезпечують внутрішні контролі "плиткового" набору для розпізнавання дійсної гібридизації від артефактної перехресної гібридизації. По Закінченню гібридизації з послідовністю-мішенню та відмивання одержаної матриці, дану матрицю сканують для визначення у даній матриці позиції, з якої гібридизується шукана послідовність-мішень. Потім дані іФ) гібридизації сканованої матриці аналізують, щоб ідентифікувати наявність того або іншого алеля даного ко двоалельного маркера у даному зразку. Гібридизацію і сканування можна здійснити так, (як описано у Заявці

РОСТ Мо М/О 92/10092 і МО 95/11995 та у Патенті США Мо54241861. во Таким чином, у деяких варіантах здійснення даного винаходу чіпи можуть включати матрицю послідовностей нуклеїнових кислот з фрагментами довжиною близько 15 нуклеотидів. У додаткових варіантах здійснення даного винаходу чіп може включати матрицю, яка включає, щонайменше, одну з послідовностей, вибраних з групи, що складається з ампліконів, представлених у таблиці 1, і комплементарних їм послідовностей, або їх фрагментів, причому вказаний фрагмент включає, щонайменше, близько 8 послідовних нуклеотидів, переважно 10, 15, 20, 65 більш переважно 25, 30, 40, 47 або 50 послідовних нуклеотидів і містить поліморфну основу. У переважних варіантах здійснення даного винаходу вказана поліморфна основа знаходиться у межах 5, 4, 3, 2, 1 нуклеотидів від центра вказаного полінуклеотиду, більш переважно - у центрі вказаного полінуклеотиду. У деяких варіантах здійснення даного винаходу чіп може включати матрицю, щонайменше, з 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 або більше з даних полінуклеотидів даного винаходу. Тверді носії і полінуклеотиди даного винаходу, приєднані до твердих носіїв, описані також у розділі "Олігонуклеотидні зонди і праймери". 6) Інтегровані системи

Інший метод, який може використовуватися для аналізу поліморфізму, включає багатоскладові інтегровані системи, які мініатюризують і компартаменталізують такі технологічні процеси, як ПЛР і реакції капілярного електрофорезу в одному функціональному пристрої. Наприклад, такий метод розкритий (У Патенті США 7/0 Ме5589136), розкриття якого включене у даний опис за допомогою посилання у всій його повноті, який описує інтеграцію ПЛР-ампліфікації та капілярного електрофорезу у чіпах.

Інтегровані системи можна передбачати, в основному, при використанні мікрофлюїдальних систем. Ці системи включають набір мікроканалів, створених у склі, силіконі, кварці або у пластиковому тонкому диску, включеному у мікрочіп. Пересування зразків контролюється електричними, електроосмотичними або 7/5 Підростатичними силами, що прикладаються до різних ділянок мікрочіпу для створення функціональних мікроскопічних хвиль і насосів за відсутності частин, що рухаються.

Що стосується генотипування двоалельних маркерів, то мікрофлюїдальна система може інтегрувати ампліфікацію нуклеїнових кислот, мікросеквенування, капілярний електрофорез і спосіб детекції, такої як флуоресцентна детекція, утворена лазерним випромінюванням.

Способи генетичного аналізу з використанням двоалельних маркерів даного винаходу

Для генетичного аналізу складних ознак доступні різні способи |див. І апдег апа бспогк, 19941). Пошук генів, чутливих до захворювання, здійснюють з використанням двох основних способів: методом зчеплення, в якому шукають доказ спільної сегрегації локусу і передбачуваного локусу, що контролює ознаку, з використанням дослідження сімей, і методом асоціації, в якому шукають доказ статистично значимої асоціації між алелем та сч об ознакою або алелем, що визначає ознаку |Кпоигу і співавт., 1993). Загалом, двоалельні маркери даного винаходу знаходять використання для будь-якого способу, відомого у даній області техніки, для демонстрації статистично (8) значимої кореляції між генотипом і фенотипом. Такі двоалельні маркери можуть використовуватися у параметричних і непараметричних способах аналізу зчеплення. Переважно, двоалельні маркери даного винаходу використовуються для ідентифікації генів, асоційованих з ознаками, що детектуються, з використанням М зо асоціативних досліджень, підходу, який не вимагає використовувати уражені сім'ї і який дозволяє ідентифікувати гени, асоційовані з комплексними та окремими ознаками. с

Генетичний аналіз з використанням двоалельних маркерів даного винаходу можна здійснювати у будь-якому ду масштабі. Можна використовувати цілу сукупність двоалельних маркерів даного винаходу або будь-яку підгрупу двоалельних маркерів даного винаходу, що відповідає гену-кандидату. Крім того, можна використовувати Ме будь-яку сукупність генетичних маркерів, включаючи двоалельний маркер даного винаходу. Сукупність ча двоалельних поліморфізмів, яку можна було б використовувати як генетичні маркери у поєднанні з двоалельними маркерами даного винаходу, |описана у УУО 98/20165). Як вказано вище, потрібно зазначити, що двоалельні маркери даного винаходу можуть бути включені у будь-яку повну або неповну генетичну карту геному людини. Ці різні застосування конкретно розглядаються у даному винаході та формулі винаходу. «

Аналіз зчеплення з с Аналіз зчеплення базується на встановленні кореляції між перенесенням (передачею) генетичних маркерів і тим, як конкретна ознака передається у поколіннях у межах сім'ї. Таким чином, метою аналізу зчеплення є ;» виявлення маркерного локусу, який демонструє одночасний розподіл ознаки, що представляє інтерес, у родоводах.

Параметричні способи -І Якщо дані доступні у ряді послідовних поколінь, існує сприятлива можливість дослідити ступінь зчеплення між парами локусів. Оцінки частки рекомбінацій роблять можливим розташовувати і розміщувати локуси на ік генетичній карті. Для локусів, які являють собою генетичні маркери, можна створити генетичну карту, після со чого можна розрахувати силу зчеплення між маркерами та ознаками і використати як вказівку відносного 5ор розташування маркерів і генів, що впливають на ці ознаки (МУеїг, 1996). Класичний спосіб аналізу зчеплення ю являє собою спосіб логарифмічної оцінки ймовірності (04) див. Могіоп, 1955; ОН, 1991). Обчислення "М Іод-оцінок вимагає деталізації схеми успадковування для даного захворювання (параметричний спосіб). Як правило, довжина кандидатної ділянки, що ідентифікується, з використанням аналізу зчеплення, складає між 2 і 2Омлн.п.н. Після ідентифікації кандидатної ділянки, як описано вище, аналіз рекомбінантних індивідів, з ВИиКОристанням додаткових маркерів, дозволяє додатково окреслити кандидатну ділянку. Дослідження аналізу зчеплення, загалом, розраховане максимально на використання 5000 мікросателітних маркерів, обмежуючи (Ф, таким чином максимальну роздільну здатність аналізу зчеплення, що теоретично досягається, до близько, у ка середньому, бООт.п.н.

Аналіз зчеплення був успішно застосований для картування простих генетичних ознак, які демонструють бо приклади чіткого Менделівського успадковування, і які володіють високою пенетрантністю (тобто, співвідношення між числом позитивних носіїв апеля а ознаки і загальним числом носіїв а у даній популяції). Однак параметричний аналіз зчеплення страждає від різних недоліків. По-перше, він обмежений надійністю у виборі генетичної моделі, придатної для кожної ознаки, що досліджується. Більш того як вже згадувалося, роздільна здатність, що досягається, з використанням аналізу зчеплення, обмежена, і дослідження комплементарності 65 Вимагає вдосконалення аналізу типових ділянок у 2млн.п.н. - 2О0млн.п.н., які початково ідентифіковані за допомогою аналізу зчеплення. Крім того, доведено, що параметричні методи аналізу зчеплення важкі для застосування до комплексних генетичних ознак, таких, які зв'язані з об'єднаною дією множини генів і/або факторів навколишнього середовища. Дуже важко адекватно моделювати дані ознаки методом підрахунку

Іод-бала. У таких випадках потрібні надзвичайно велике зусилля і витрати для комплектування адекватної кількості уражених хворобою сімей, необхідних для аналізу зчеплення, застосовно до цих ситуацій, що нещодавно обговорювали Ківзсп апа Мегікапдаз (1996).

Непараметричні способи

Перевага так званих непараметричних способів для аналізу зчеплення полягає у тому, що вони не вимагають деталізації схеми успадковування для даної хвороби, вони сприяють більшому використанню в аналізі 7/0 Комплексних ознак. У непараметричних способах робляться спроби довести, що картина успадковування хромосомної ділянки не узгоджується з випадковим Менделівським розщепленням, демонструючи, що уражені хворобою родичі успадковують ідентичні копії даної ділянки частіше, ніж при випадковому очікуванні. Уражені хворобою родичі повинні демонструвати надлишок "алеля, що спільно використовується" навіть в присутності неповної пенетрантності і полігенному успадковуванні. У непараметричному аналізі зчеплення рівень збігу по /5 маркерному локусу у двох індивідів можна виміряти або за допомогою числа алелів, ідентичних за станом (ІВ5), або за допомогою числа алелів, ідентичних за походженням (ІВО). Аналіз уражених хворобою пари сибсів являє собою добре відомий спеціальний випадок і є найпростішою формою даних способів.

Двоалельні маркери даного винаходу можна використовувати і у параметричному і у непараметричному аналізі зчеплення. Переважно двоалельні маркери можна використовувати у непараметричних способах, які 2о дозволяють картувати гени, що беруть участь у комплексних ознаках. Двоалельні маркери даного винаходу можуть використовуватися в ІВО- та ІВ5-способах для картування генів, що впливають на комплексну ознаку. У таких дослідженнях, використовуючи перевагу високої щільності розподілу двоалельних маркерів, декілька суміжних локусів двоалельних маркерів можна об'єднати для досягнення ефективності, яка досягається мультиалельними маркерами (2пНао і співавт., 1998). сч

Популяційні асоціативні дослідження

Даний винахід включає способи ідентифікації з використанням двоалельних маркерів даного винаходу у тому і) випадку, коли Сапіоп-ген асоційований з ознакою, що виявляється. В одному з варіантів здійснення даний винахід включає способи виявлення асоціації між апелем двоалельного маркера або двоалельним маркерним гаплотипом і ознакою. Крім того, даний винахід включає способи ідентифікації алеля, що визначає ознаку при М зо нерівновазі по зчепленню з будь-яким апелем двоалельного маркера даного винаходу.

Як вказано вище, для здійснення асоціативних досліджень можна використовувати альтернативні підходи: с широке асоціативне дослідження геному, асоціативне дослідження кандидатної ділянки та асоціативне Ге! дослідження гена-кандидата. У переважному варіанті здійснення даного винаходу двоалельні маркери даного винаходу використовуються для здійснення асоціативних досліджень кандидатного гена. Вказаний метод Ме

Зв Гена-кандидата безсумнівно дає швидку оцінку ідентифікації генів і генного поліморфізму, зв'язаного з окремою ї- ознакою, якщо доступні деякі відомості з біології даної ознаки. Крім того, двоалельні маркери даного винаходу можна вбудувати у будь-яку карту генетичних маркерів геному людини для того, щоб здійснити широкі асоціативні дослідження геному. Способи створення високощільної карти двоалельних маркерів (описані у

Попередній Патентній заявці США з порядковим номером 60/082614). Двоалельні маркери даного винаходу «

Можна, крім того, вбудувати у будь-яку карту конкретної кандидатної ділянки геному (наприклад, конкретної з с хромосоми або конкретного хромосомного сегмента). . Як вказано вище, асоціативні дослідження можна здійснити у генеральній сукупності їі не обмежуватися и? дослідженнями, які здійснюються на родичах в уражених хворобою сім'ях. Асоціативні дослідження є надзвичайно цінними, оскільки дозволяють аналізувати окремі або мультифакторні ознаки. Більш того асоціативні дослідження являють собою потужний спосіб картування на малій ділянці гена, забезпечуючи більш -І тонке картування алелів, що контролюють ознаку, ніж дослідження по зчепленню. Дослідження, що базуються на родоводах, часто лише звужують місцеположення алеля, який контролює дану ознаку. Отже, асоціативні і, дослідження з використанням двоалельних маркерів даного винаходу можна застосовувати для уточнення

Ге) місцеположення алеля, що контролює ознаку, у кандидатній ділянці, що ідентифікується способами аналізу по Зчепленню. Більш того, у тому випадку, якщо хромосомний сегмент, який представляє інтерес, що являє собою о ген-кандидат, такий як ген-кандидат даного винаходу, був ідентифікований, для даної ділянки, що представляє "М інтерес, можна використовувати спрощену ідентифікацію алеля, який контролює дану ознаку. Двоалельні маркери даного винаходу можна використовувати для демонстрації асоціації гена-кандидата з ознакою. Таке використання, зокрема, припускається у даному винаході. 5Б Визначення частоти алеля двоалельного маркера або гаплотипу двоалельного маркера у популяції

Асоціативними дослідженнями з'ясовуються взаємозв'язки частот алелів між локусами.

Ф) Визначення частоти алеля у популяції ка Алельні частоти двоалельних маркерів у популяціях визначають з використанням одного зі способів, описаного вище під заголовком "Способи індивідуального генотипування за двоалельними маркерами", або во будь-яким методом генотипування, відповідним для даної позначеної мети. Генотипування об'єднаних зразків або індивідуальних зразків може визначити частоту алеля двоалельного маркера у популяції. Один із шляхів по зменшенню числа необхідних операцій генотипування полягає у використанні об'єднаних зразків. Основною перешкодою для використання об'єднаних зразків є обмеження точності і відтворюваності при визначенні точних концентрацій ДНК у зібраних пулах. Індивідуальне генотипування зразків передбачає більш високу чутливість, 65 відтворюваність і точність і є переважним способом даного винаходу. Доцільно генотипувати кожного індивіда окремо, і для визначення частоти алеля двоалельного маркера або генотипу у даній популяції застосовують простий генний підрахунок.

Даний винахід відноситься також до способів оцінки частоти алеля у популяції, що включають: а) генотипування індивідів вказаної популяції за вказаним двоалельним маркером, відповідно до способу даного винаходу; Б) визначення пропорційного представництва вказаного двоалельного маркера у вказаній популяції.

Крім того, способи даного винаходу оцінки частоти алеля у популяції включають способи будь-якого додаткового обмеження, описаного у даному описі, або способи, що йдуть нижче, вказані окремо або у будь-якому поєднанні; де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, що складається з А1-А18 та їх комплементів, або, до того ж, двоалельні маркери необов'язково виявляють порушення рівноваги по 7/0 Зчепленню; де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, що складається з А1-А17 та їх комплементів, або, до того ж, двоалельні маркери необов'язково нерівноважно зчеплені; де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, що складається з А12 і А16 та їх комплементів, або, до того ж, двоалельні маркери необов'язково виявляють порушення рівноваги по зчепленню. Визначення частоти алеля двоалельного маркера у популяції можна здійснити, /5 необов'язково, внаслідок визначення ідентичності нуклеотидів обох копій вказаного двоалельного маркера, присутнього у даному геномі кожного індивіда у вказаній популяції, і обчислення для даної популяції пропорційного представництва вказаного нуклеотиду за вказаним двоалельним маркером, зв'язаним з Сапіоп.

Визначення пропорційного представництва можна, необов'язково, здійснити внаслідок здійснення способу генотипування даного винаходу в об'єднаному біологічному зразку, одержаному від представницького числа індивідів, або від кожного індивіда, у вказаній популяції, та обчислення пропорційної кількості вказаного нуклеотиду у порівнянні із загальною кількістю.

Визначення частоти гаплотипу у популяції

Гаметична фаза гаплотипів невідома, якщо диплоїдні організми є гетерозиготами більше ніж по одному локусу. Іноді, при використанні генеалогічних даних для сімей, можна передбачити гаметичну фазу (Регійп і сч співавт., 1994). Якщо генеалогічні дані недоступні, можна застосовувати різні методики. Одна з таких можливостей полягає у тому, що гетерозигот-диплоїдів по багатьох сайтах можна виключити з даного аналізу, і) залишаючи лише гомозиготних і гетерозиготних по одному сайту індивідів, однак, даний метод може привести до можливої погрішності відносно структури зразка і недооцінки низькочастотних гаплотипів. юІнша можливість полягає у тому, що одиночні хромосоми можна вивчати самостійно, наприклад, за допомогою асиметричної ї- зо ПЛР-ампліфікації |див. Меулоп і співавт., 1989; МУ і співавт., 1989) або внаслідок виділення окремої хромосоми шляхом граничного розбавлення з подальшою ПЛР-ампліфікацією |див. Киапо і співавт., 1990). Крім с того, зразок можна гаплотипувати по досить близьких двоалельних маркерах за допомогою подвійної /(3у

ПЛР-ампліфікації специфічних алелів (Загкаг, 5 апа Боттег 5.5., 1991). Такі методи не є цілком задовільними через їх технічну складність, що тягне за собою подорожчання, їх недостатнє узагальнення у великому масштабі ме) або через можливі зміщення. Щоб подолати дані труднощі, можна використовувати алгоритм для визначення ча фази генотипів ПЛР-ампліфікованих ДНК, Ізапропонований Сіагк, А.О. (1990)). Коротко, основна ідея полягає у початковому заповненні списку гаплотипів, присутніх у даному зразку, внаслідок обстеження індивідів, які однозначно є повними гомозиготами і гетерозиготами по одному сайту. Потім скринують інших індивідів у тому ж самому зразку на можливу зустрічальність раніше визначених гаплотипів. При кожній позитивній ідентифікації у « бписок встановлених гаплотипів додають комплементарний гаплотип доти, доки інформація по даній фазі для з с всіх індивідів не буде розкладена або не буде ідентифікована як така, що далі не розкладається. Даним способом для кожного мультигетерозиготного індивіда визначають єдиний гаплотип, хоча, за наявністю більш ;» ніж одного гетерозиготного сайта, можливі й інші гаплотипи. Альтернативно, можна використовувати способи, що оцінюють частоти гаплотипів у популяції без визначення гаплотипів кожного індивіда. Переважно, якщо спосіб базується на алгоритмі максимізації математичного очікування (ЕМ) (Оетрзіег і співавт., 1977), яке -І лежить в основі оцінок максимальної правдоподібності частот гаплотипів при використанні припущення рівноваги

Харді-Вайнберга (випадкове схрещування) |див. Ехсопіег І. апа Зіаїкіп М. 1995). Даний ЕМмМ-алгоритм узагальнює се) ітераційний метод, максимальної правдоподібності для оцінки, придатної для суперечливих даних і/або со неповних. ЕМ-алгоритм використовують для розкладання гетерозигот на гаплотипи. Оцінки гаплотипів додатково 5р описуються нижче під заголовком "Статистичні методи". Можна використовувати будь-який інший метод, відомий ю у даній області техніки, для визначення частоти гаплотипу у популяції.

І Даний винахід включає також способи визначення частоти гаплотипу для сукупності двоалельних маркерів у популяції що включають наступні стадії: а) генотипування, щонайменше, одного двоалельного маркера, зв'язаного з Сапіоп, відповідно до способу даного винаходу для кожного індивіда у вказаній популяції; Б) вв генотипування другого двоалельного маркера внаслідок визначення ідентичності нуклеотидів за вказаним другим двоалельним маркером для обох копій вказаного другого двоалельного маркера, представленого у

Ф) геномі кожного індивіда у вказаній популяції; і с) застосування способу визначення гаплотипу до ідентичних ка нуклеотидів, встановлених на стадіях а) і Б) для одержання оцінки вказаної частоти. Крім того, способи визначення частоти гаплотипу даного винаходу включають способи з будь-яким додатковим обмеженням, бор описаним у даному описі, або способи, що йдуть нижче, вказані окремо або у будь-якому поєднанні: де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів, або двоалельні маркери необов'язково, до того ж, зчеплені при порушенні рівноваги; де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А17 та їх комплементів, або двоалельні маркери необов'язково, до того ж, демонструють порушення рівноваги по б5 Зчепленню; де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А12 і А16 та їх комплементів, або двоалельні маркери необов'язково, до того ж, нерівноважно зчеплені. Вказаний спосіб визначення гаплотипу необов'язково здійснюють за допомогою асиметричної

ПЛР-ампліфікації, подвійної ПЛР-ампліфікації специфічних алелів, алгоритму Сіагк або алгоритму максимізації математичного очікування.

Аналіз зчеплення при порушенні рівноваги

Порушення рівноваги по зчепленню являє собою невипадкову асоціацію алелів по двох або більше локусах і є потужним інструментом для картування генів, які беруть участь у контролі ознак захворювання |див. АокКа

К.5. і співавт., 1997). Двоалельні маркери, оскільки вони компактно розташовані у геномі людини і можуть бути генотиповані у більшому числі випадків у порівнянні з іншими видами генетичних маркерів (такими, як КРЇ Р- або 7/0 УМтк-маркери), особливо придатні для генетичного аналізу, що базується на вивченні рівноваги по зчепленню.

Коли мутація захворювання вперше проникає у популяцію (за допомогою нової мутації або імміграції носія мутації), вона неодмінно знаходиться в окремій (одній) хромосомі і, тому, в окремому генетичному "середовищі" або "анцестральному" (предковому, родовому) гаплотипі зв'язаних маркерів. Отже, між такими маркерами і мутацією, яка контролює захворювання, існує повне порушення рівноваги: мутація, що контролює захворювання, /5 Виявляється тільки в присутності специфічної групи маркерних апелів. Протягом життя послідовних поколінь між мутацією, яка контролює захворювання, і таким маркерним поліморфізмом відбуваються рекомбінантні події, і вказане порушення рівноваги поступово зникає. Швидкість цього зникнення є функцією частоти рекомбінації, так що маркери, ближче всього розташовані до гена, який контролює захворювання, будуть виявляти більш високий ступінь порушення рівноваги, ніж віддалені маркери. Якщо не відбувається порушення у результаті рекомбінації, 2о то "анцестральні" гаплотипи і порушення рівноваги по зчепленню між маркерними алелями різних локусів можуть простежуватися не тільки у родоводах, але також і у популяціях. Порушення рівноваги по зчепленню звичайно спостерігається у вигляді асоціації між одним специфічним алелем одного локусу та іншим специфічним апелем другого локусу.

Патерн або крива порушення рівноваги між захворюванням і маркерним локусом, як очікується, демонструє с г максимум, який спостерігається по локусу, що контролює захворювання. Отже, ступінь зчеплення при порушенні рівноваги між алелем, який контролює захворювання, і тісно зв'язаними генетичними маркерами може давати і) цінну інформацію, що відноситься до місцеположення гена, який контролює дане захворювання. Для тонкого картування локусу, що контролює захворювання, корисно володіти певним знанням картини зчеплення при порушенні рівноваги, яке існує між маркерами у ділянці, що досліджується. Як вказано вище, рівень картування, М зо який здійснюється за допомогою аналізу зчеплення при порушенні рівноваги, є більш високим, ніж у дослідженнях по зчепленню. Висока щільність розподілу двоалельних маркерів, яка поєднується з аналізом с зчеплення при порушенні рівноваги, створює потужний інструмент для тонкого картування. Різні способи, які Ге! розраховують зчеплення при порушенні рівноваги, описані нижче під заголовком "Статистичні методи".

Популяційні дослідження асоціацій ознака-маркер у хворих і здорових ме)

Як вказано вище, зустрічальність пар специфічних алелів різних локусів в одній і тій же хромосомі не є ї- випадковим, а відхилення від випадковості називають порушенням рівноваги по зчепленню або зчепленням при порушенні рівноваги. Асоціативні дослідження зосереджені на популяційних частотах і спираються на феномен порушення рівноваги по зчепленню. Якщо специфічний алель даного гена безпосередньо контролює конкретну ознаку, його частота буде статистично вищою в ураженій хворобою популяції індивідів (ознака позитивна), У « Порівнянні з частотою у популяції з негативною ознакою або у випадковій контрольній (здоровій) популяції. з с Через наявність порушення рівноваги по зчепленню частота всіх інших алелів, представлених у даному гаплотипі, що несе алель, який контролює ознаку, буде також підвищеною в індивідів з позитивною ознакою у ;» порівнянні з індивідами з негативною ознакою або у рандомізованій контрольній вибірці. Тому, асоціація між даною ознакою і будь-яким алелем (особливо, алелем двоалельного маркера) при порушенні рівноваги по

Зчепленню з алелем, що визначає ознаку, буде достатньою, щоб припустити наявність гена, який контролює -І ознаку, у цій конкретній ділянці. Популяції хворих і здорових можна генотипувати по двоалельних маркерах для ідентифікації асоціацій, які точно визначають місцезнаходження алеля, що визначає ознаку. Так будь-який і, маркер при порушенні рівноваги по одному даному маркеру, зв'язаному з ознакою, буде асоційований з даною

Ге) ознакою. Порушення рівноваги по зчепленню дозволяє відповідні частоти у популяціях хворих і здорових з обмеженим числом генетичних поліморфізмів (особливо двоалельних маркерів) аналізувати як альтернативні ю при скринуванні всіх можливих функціональних поліморфізмів для того, щоб знайти алелі, що визначають "М ознаку. Асоціативні дослідження порівнюють частоту маркерних алелів у незв'язаних спорідненням популяціях хворих і здорових, і являють собою потужний інструмент для вивчення комплексних ознак.

Популяції хворих і здорових ("критерії включення)

Популяційні дослідження, що базуються на асоціації, не стосуються успадковування у сім'ях, а порівнюють поширення окремого генетичного маркера, або групи маркерів, у популяціях хворих і здорових. Вони являють

Ф) собою дослідження хворих і здорових, що базуються на порівнянні не зв'язаних спорідненням хворих (уражених ка захворюванням або позитивні за ознакою) індивідів і не зв'язаних спорідненням здорових (неуражених, негативних за ознакою або випадкових) індивідів. Переважно, якщо контрольна група (здорових) складена з бо неуражених захворюванням або негативних за ознакою індивідів. Крім того, дана контрольна група етнічно порівнянна з популяцією людей, уражених захворюванням. Більш того дана контрольна група переважно порівнянна з популяцією хворих за основним відомим фактором змішування для даної ознаки у дослідженні (наприклад, підібрана за віком або за залежною від віку ознакою). Теоретично, індивідів за двома зразками об'єднують таким чином, щоб між ними очікувалися відмінності тільки за своїм статусом захворювання. Терміни 65 "популяція з позитивною ознакою", "популяція хворих" і "популяція уражених захворюванням" використовуються у даному описі як взаємозамінні.

Істотним ступенем у вивченні комплексних ознак з використанням асоціативних досліджень є підбір популяцій хворих і здорових |див. І апаег апа Зспогк, 1994). Основна дія при підборі популяцій хворих і здорових полягає у клінічному визначенні даної ознаки або фенотипу. Будь-яку генетичну ознаку можна проаналізувати асоціативним способом, запропонованим у даному описі, шляхом ретельного підбору індивідів, які фенотипічно включаються у групи з позитивною ознакою і негативною ознакою. Частіше використовують чотири критерії: клінічний фенотип, вік при виникненні захворювання, історію сім'ї та обтяженість. Процедура відбору безперервних або кількісних ознак (таких як, наприклад, артеріальний тиск) включає відбір індивідів на краях розподілу фенотипу при дослідженні даної ознаки так, щоб включити у дані позитивні і негативні популяції 7/0 фенотипи, що не перекриваються. Переважно, якщо популяції хворих і здорових складають фенотипічно гомогенні популяції. Позитивні і негативні популяції за даною ознакою включають фенотипічно однорідні популяції індивідів, відповідні у дослідженні, кожна, 1-9895, переважно 1-8095, більш переважно 1-5095, ще більш переважно 1-3095, найбільш переважно 1-2095 від спільної популяції, і переважно вибрані з індивідів, які демонструють фенотипи, що не перекриваються. Чим чіткіше різниця між двома фенотипами за даною ознакою, у5 ТИМ більше ймовірність виявлення асоціації з двоалельними маркерами. Відбір таких різко відмінних і, разом з тим, відносно однорідних фенотипів робить можливим, ефективне порівняння в асоціативних дослідженнях і ймовірне виявлення чітких відмінностей на генетичному рівні, за умови, що розміри популяційних вибірок для дослідження досить значні.

У переважних варіантах здійснення даного винаходу перша група з 50-300 індивідів з позитивною ознакою, 2о переважно близько 100 індивідів, набрана відповідно до їх фенотипів. Аналогічна кількість контрольних індивідів також включена у такі дослідження.

Асоціативний аналіз

Даний винахід включає також способи виявлення асоціації між генотипом і фенотипом, що включають наступні стадії: а) визначення частоти, щонайменше, одного двоалельного маркера, зв'язаного з Сапіоп, у сч популяції з позитивною ознакою, відповідно до способу генотипування даного винаходу; 5) визначення частоти вказаного двоалельного маркера, зв'язаного з Сапіоп, у контрольній популяції, відповідно до способу (8) генотипування даного винаходу; і с) визначення існування статистично значимої асоціації між вказаним генотипом і вказаним фенотипом. Крім того, вказані способи виявлення асоціації між генотипом і фенотипом у даному винаході включають способи для будь-якого додаткового обмеження, описаного у даному описі, або ї- зо способи, що йдуть нижче, вказані окремо або у будь-якому поєднанні: де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів, або, до того с ж, двоалельні маркери необов'язково нерівноважно зчеплені; де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з б

Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А17 та їх комплементів, або, до того ж, двоалельні маркери необов'язково нерівноважно зчеплені; вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, (22) необов'язково вибраний з групи, яка складається з А12 і А16 та їх комплементів, або, до того ж, двоалельні ї- маркери необов'язково нерівноважно зчеплені. Вказана контрольна популяція може необов'язково являти собою популяцію з негативною ознакою або довільну популяцію. Кожну з вказаних стадій генотипування а) і Б) необов'язково здійснювати на об'єднаному біологічному зразку, одержаному від кожної вказаної популяції. Кожну з вказаних стадій генотипування а) і Б) необов'язково здійснювати окремо на біологічних зразках, одержаних «

Від кожного індивіда у вказаній популяції або в її субвибірці. в с Загальна методологія здійснення асоціативних досліджень з використанням двоалельних маркерів, . одержаних з ділянки, що несе ген-кандидат, полягає в обстеженні двох груп індивідів (популяції хворих і а здорових) з тим, щоб виміряти і статистично порівняти алельні частоти двоалельних маркерів даного винаходу в обох групах.

Якщо статистично значима асоціація з ознакою ідентифікується, щонайменше, для одного або більше -І двоалельних маркерів, які аналізуються, то потрібно припустити, що або алель, який асоціюється, є безпосередньо відповідальним за ознаку, що визначається ним, (тобто асоційований алель являє собою алель, ік який визначає дану ознаку), або, що більш ймовірно, даний асоційований алель нерівноважно зчеплений з

Ге) алелем, який визначає дану ознаку. Специфічні характеристики асоційованого алеля відносно функції гена-кандидата, як правило, дають додаткове уявлення про взаємозв'язок асоційованого алеля та даної ознаки ю (причинно-наслідковий взаємозв'язок або зчеплення при порушенні рівноваги). Якщо дані факти вказують, що

І даний асоційований алель у даному гені-кандидаті, найвірогідніше, не є алелем, який визначає дану ознаку, але разом з тим, нерівноважно зчеплений зі справжнім алелем, що визначає дану ознаку, тоді алель, який визначає дану ознаку, можна виявити шляхом секвенування поблизу асоційованого маркера і здійснити подальші в асоціативні дослідження поліморфізму, що виявлений ітеративним чином.

Асоціативні дослідження здійснюють, як правило, у дві послідовні стадії. У першій фазі (на першій стадії) (Ф, частоти приведених двоалельних маркерів гена-кандидата визначають для популяцій з позитивною ознакою і ка для контрольних популяцій. У другій фазі (на другій стадії) аналізу позицію генетичних локусів, відповідальних за дану ознаку, додатково уточнюють з використанням маркерів підвищеної щільності із значимої бо Ділянки. Однак, якщо ген-кандидат, який досліджується, відносно невеликий за довжиною, як у випадку з Сапіоп, однієї стадії може виявитися досить для встановлення значимих асоціацій.

Аналіз гаплотипів

Як вказано вище, коли хромосома, що несе алель захворювання, вперше з'являється у популяції, або внаслідок мутації, або міграції, мутантний алель неодмінно знаходиться на хромосомі, яка володіє групою 65 Зчеплених маркерів: анцестральний гаплотип. Даний гаплотип можна прослідити у популяціях і проаналізувати його статистичну асоціацію з даною ознакою. Дослідження одиночної (алельна) асоціації, що комплементує,

разом з мультиточковими асоціативними дослідженнями, які іменуються також гаплотипними дослідженнями, підвищують статистичну потужність асоціативних досліджень. Тому, вивчення гаплотипної асоціації дозволяє визначити частоту і тип анцестрального носія гаплотипу. Аналіз гаплотипу важливий тим, що він підвищує можливість статистичного аналізу індивідуальних маркерів, які розглядаються.

На першій стадії частотного аналізу гаплотипів визначають частоту можливих гаплотипів на основі різних поєднань ідентифікованих двоалельних маркерів даного винаходу. Потім дану частоту гаплотипів порівнюють в окремих популяціях індивідів з позитивною ознакою і контрольними. Кількість індивідів з позитивною ознакою, у більшості випадків між ЗО і 300, з переважною чисельністю індивідів, що коливається між 50 і 150, піддають /о даному аналізу для одержання статистично значимих результатів. Ці ж міркування застосовують до чисельностей індивідів, які використовуються у даному дослідженні, неуражених захворюванням (або випадково вибраних здорових індивідів). За результатами цього першого аналізу одержують частоти гаплотипу для популяцій хворих і здорових, для кожної визначають частоту гаплотипу, р-значення і розраховують співвідношення балів. При виявленні статистично значимої асоціації відносний ризик для індивіда, що несе /5 даний гаплотип, який відповідає ураженому даною ознакою, що досліджується, може бути апроксимований (приблизно точний).

Додатковий варіант здійснення даного винаходу включає способи виявлення асоціації між гаплотипом і фенотипом, що включають стадії: а) оцінки частоти, щонайменше, одного гаплотипу у популяції з позитивною ознакою, відповідно до способу даного винаходу оцінки частоти гаплотипу; Б) оцінки частоти вказаного 2о Гаплотипу у контрольній популяції, відповідно до способу даного винаходу оцінки частоти гаплотипу; і с) визначення статистично значимої асоціації, яка існує між вказаним гаплотипом і вказаним фенотипом. Крім того, дані способи виявлення асоціації між гаплотипом і фенотипом даного винаходу включають способи з будь-яким додатковим обмеженням, де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів, або дані двоалельні маркери необов'язково, до того ж, сч г Нерівноважно зчеплені; де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, що складається з А1-А17 та їх комплементів, або дані двоалельні маркери необов'язково, до того ж, виявляють (8) порушення рівноваги по зчепленню; де вказаний двоалельний маркер, зв'язаний з Сапіоп, необов'язково вибраний з групи, яка складається з А12 і А16 та їх комплементів, або дані двоалельні маркери необов'язково, до того ж, нерівноважно зчеплені. Вказана контрольна популяція необов'язково являє собою негативну за ї- зо ознакою популяцію або довільну популяцію. Вказаний спосіб необов'язково включає додаткові стадії визначення фенотипу у вказаній позитивній за ознакою популяції та у вказаній контрольній популяції перед стадією с). с

Аналіз взаємодії Ге!

Двоалельні маркери даного винаходу можна також використовувати для ідентифікації патернів двоалельних маркерів, асоційованих з ознаками, що виявляються, одержаними у полігенній взаємодії. Аналіз генетичної ме) з5 взаємодії між алелями незчеплених локусів потребує індивідуального генотипування з використанням описаних ча у даному описі методів. Аналіз алельної взаємодії у вибраній сукупності двоалельних маркерів з відповідним рівнем статистичної значимості можна розглядати як гаплотипний аналіз. Аналіз взаємодії включає стратифікацію популяцій хворих і здорових відносно даного гаплотипу для першого локусу і здійснення гаплотипного аналізу по другому локусу у кожній субпопуляції. «

Статистичні методи, що використовуються для дослідження асоціації, додатково описані нижче. з с Перевірка зчеплення за наявності асоціації

Двоалельні маркери даного винаходу можуть використовуватися, крім того, у ТОТ (тест передача/порушення ;» рівноваги). ТОТ перевіряє зчеплення та асоціацію і не змінюється при популяційній стратифікації. ТОТ потребує даних по уражених захворюванням індивідах та їх батьках або даних від неуражених захворюванням сибсів, але

НЕ їх батьків |див. Зріеітап 5. і співавт., 1993; Зспаійй О.). і співавт., 1996, Зрівітап 5. апа Емжепз МУ/.)., -І 1998). Такі об'єднані тести зменшують, як правило, кількість хибно-позитивних помилок при роздільному аналізі.

Статистичні методи се) Взагалі, будь-який спосіб, відомий у даній області техніки, можна використовувати для перевірки

Ге) статистично значимої кореляції ознаки і генотипу. 1) Способи аналізу зчеплення ю Статистичні методи і комп'ютерні програми, придатні для аналізу зчеплення, добре відомі фахівцям у даній "М області техніки (див. ТепміПідег 9.0. апа ой ., 1994; ОФ., 19911. 2) Способи оцінки частот гаплотипів у популяції

Як вказано вище, при підрахунку генотипів часто неможливо відрізнити гетерозиготи так, щоб можна було ов легко підрахувати частоти гаплотипів. Якщо гаметична фаза невідома, то оцінити гаплотипні частоти можна з мультилокусних генотипних даних. Будь-який спосіб, відомий фахівцеві у даній області техніки, можна (Ф) використовувати для оцінки гаплотипних частот |див. І апде К., 1997; УМеїг, В.5., 1996). Переважно, максимально ка правдоподібні частоти гаплотипів підраховують з використанням алгоритму максимізації математичного очікування (ЕМ) |див. Юетрвзіег і співавт., 1977; ЕхсоПШег |. апа 5біаїкіп М., 1995). Дана операція являє бо собою ітераційний процес, націлений на одержання максимально правдоподібних оцінок частот гаплотипів за даними мультилокусного генотипу, коли гаметична фаза невідома. Гаплотипні оцінки здійснюють, як правило, шляхом застосування ЕМ-алгоритму з використанням, наприклад, ЕМ-НАРІ О-програми |Наміеу М.БЕ. і співавт., 1994) або Апедпціп-програми |Зсппеїдег і співавт., 1997)Ї. ЕМ-алгоритм являє собою узагальнений ітераційний метод максимальної правдоподібності для оцінювання і коротко описаний нижче. 65 Потрібно врахувати, що у представленому розділі "Способи оцінки частот гаплотипів у популяції" фенотипи відносяться до мультилокусних генотипів невідомої гаплотипної фази. Генотипи відносяться до мультилокусних генотипів відомої гаплотипної фази.

Припустимо, є вибірка з М не зв'язаних спорідненням індивідів, типованих за К маркерами. Дані дослідження представлені К-локусними фенотипами невідомої фази, які можна розподілити як Е різні фенотипи. Далі,

Припустимо, що ми маємо Н можливих гаплотипів (для випадку К двоалельних маркерів ми маємо максимальне число можливих гаплотипів Н-2/У.

Для фенотипу ) з с) можливих генотипів маємо: с в 1 /0 Р; - Ху Рігенотип (0) - РК, Й і-і ї-і де Р; означає ймовірність фенотипу ), а Р(НКй) означає ймовірність генотипу і, складеного гаплотипами НК і п. При випадковому схрещуванні (тобто рівновага Харді-Вайнберга), Р(пу,й;) виражено у вигляді: т Р(пюйОсР(Ю для пен, 2

Р(пюпі)н2Р(пЮВР(ПІ) для пк;

ЕМ-алгоритм складається з наступних стадій: Перша, генотипні частоти оцінюють із сукупності вихідних значень гаплотипних частот. Дані гаплотипні частоти означають як Р), Р»С), Ра)... РНО), Вихідні значення таплотипних частот можна одержати за допомогою генератора випадкових чисел або яким-небудь іншим чином, добре відомим у даній області техніки. Дана стадія називається стадією Очікування. Наступна стадія даного способу, яка називається стадією Максимізації, полягає у використанні оцінок генотипних частот, які перераховані для гаплотипних частот. Перша ітерація оцінок гаплотипної частоти позначається за допомогою дв РІО, РО, Р.О... РН), У результаті стадія Очікування на ітерації з складається з обчислення ймовірності см розміщення кожного фенотипу у різні ймовірнісні генотипи, які базуються на гаплотипних частотах у попередній (8) ітерації: пвх? м зо Рівно се м| В сч (о) де п; дорівнює числу індивідів з фенотипом ), а Рійюпі) є ймовірністю генотипу Пк, й; у фенотипі |). На стадії Максимізації, яка еквівалентна методу підрахунку генів (Зтйй, Апп. Нит. Сепеї.,, 21:254-276, 1957), б» Ггаплотипні частоти переоцінюють на основі генотипних оцінок: ї- 1Е, 2 й в з Хан « 1-1 їі | | | | | . - де бу являє собою показник мінливості, в якому підраховується величина зустрічальності, з якої гаплотип ї с представлений у генотипі і; він має значення 0, 1 і 2. :з» ЕМ-ітерації припиняють при досягненні наступного критерію. При використанні розрахункових оцінок за методом максимальної правдоподібності (МІ Е) можна припустити, що фенотипи | розподіляються поліноміально. У кожній ітерації з можна обчислити одну І -функцію правдоподібності. Збіжність досягається при -І різниці лог-правдоподібності між двома послідовними ітераціями, що дорівнює деякому малому числу, переважно 1077. іс, 3) Способи обчислення зчеплення між маркерами при порушенні рівноваги

Ге) Ряд методів може використовуватися для обчислення зчеплення при порушенні рівноваги між будь-якими 5ор двома генетичними позиціями, практично зчеплення при порушенні рівноваги оцінюють, використовуючи о статистичний тест на асоціацію для гаплотипних даних, взятих з популяції. "І Зчеплення при порушенні рівноваги між будь-якою парою двоалельних маркерів, яка включає, щонайменше, один з двоалельних маркерів даного винаходу (Мі,М)), що мають алелі (а,р) по маркеру М; та алелі (ар) по маркеру М, можна обчислити для кожної алельної комбінації (ага; аб; і Бра) відповідно до формули Ріагла: во 00 Ававіт 040342), де:

Ф) 04-. - частоті генотипів, що не володіють алелем а; для М; і не володіють алелем а;для М; ко 03-.ж- частоті генотипів, що не володіють алелем а; для М; і володіють алелем а; для М; дог частоті генотипів, що володіють алелем а; для М; і не володіють алелем а;для М; 60 Зчеплення при порушенні рівноваги (І.О) між парами двоалельних маркерів (М.М) можна також обчислити для кожної алельної комбінації (а;,а; аб; Б;,а, і 5,5) відповідно до оцінки максимальної правдоподібності (МІ Е) для дельта (об'єднаний коефіцієнт порушення генотипної рівноваги), (як описано у УУеїг (УУеіг В.5., 19963). МІ Е для об'єднаного коефіцієнта зчеплення при порушенні рівноваги дорівнює:

Оаіах(гпукповпзкпаг/2)/мч-2(рка). ріка), 65 де пі-У; фенотипу (а/а;, а/а), по-у; фенотипу (а/а;, а/а), пз-У; фенотипу (а/а;, а/а), па-У; фенотипу (а/а;, а/а)) і М дорівнює числу індивідів у даній вибірці.

Дана формула дозволяє оцінити порушення рівноваги по зчепленню між алелями, тільки за наявності даних по генотипу, а не по гаплотипу.

Інший спосіб обчислення зчеплення при порушенні рівноваги між маркерами полягає у наступному. Для Зчеплених двоалельних маркерів, М(а/Б;) і М(а/5)), що апроксимують рівновагу Харді-Вайнберга, можна оцінити частоти чотирьох можливих гаплотипів у даній популяції відповідно до методу, описаного вище.

Оцінка гаметичного порушення рівноваги між а; і а; проста:

Одіді"рг(гаплотип(а;а))-ра;).р(а/), де ра) означає ймовірність алеля а,,а рі(а) означає ймовірність алеля а), і де рг(гаплотип(а;а)) 7/о оцінюється, як вказано вище у Рівнянні 3.

Для зчепленого двоалельного маркера необхідно провести тільки одне вимірювання порушення рівноваги, щоб описати асоціацію між М; і М..

Потім нормують одержане вище значення і розраховують наступним чином:

О гід Озвідутах(-р(а). ра), -р(Б). р(Б)) при ОдіаухО б аа Оавідутах(рцв). ра), ра). р(б/)) при Огір"

Фахівцям легко зрозуміти, що можна використовувати й інші способи обчислення зчеплення при порушенні рівноваги.

Зчеплення при порушенні рівноваги у групі двоалельних маркерів, що володіють адекватним рівнем гетерозиготності, можна визначити шляхом генотипування 50-1000 не зв'язаних спорідненням індивідів, 2о переважно 75-200, більш переважно близько 100. 4) Перевірка на асоціацію

Способи визначення статистичної значимості кореляції між фенотипом і генотипом, у даному випадку алеля у двоалельном маркері або гаплотипу, що складається з таких алелів, можна знайти за допомогою будь-якого статистичного тесту, відомого у даній області техніки при будь-якому прийнятному порозі статистичної сч об ЗНачИимоОсті, який є необхідним. Застосування конкретних способів і порогів значимості знаходиться у компетенції середнього фахівця у даній області техніки. і)

Перевірку на асоціацію здійснюють шляхом визначення частоти алеля двоалельного маркера у хворій та контрольній популяціях і порівняння даних частот за допомогою статистичного критерію, щоб визначити чи є їх відмінність частот статистично значимою, що повинно вказувати на кореляцію між даною ознакою, що ї- зо досліджується, і алелем двоалельного маркера. Подібним чином здійснюють аналіз гаплотипу шляхом визначення частот всіх можливих гаплотипів для даної групи двоалельних маркерів у хворій та контрольній с популяціях, і порівнюють ці частоти за допомогою статистичного критерію, щоб визначити, чи відповідає їх Ге! статистично значима відмінність кореляції між гаплотипом, що досліджується, і фенотипом (ознакою). Можна використовувати будь-який статистичний інструмент, придатний для перевірки статистично значимої асоціації ме) між генотипом і фенотипом. Як статистичний критерій переважно використовувати критерій хі-квадрат з одним ї- ступенем свободи. Обчислюють Р-значення (Р-значення є ймовірністю того, що статистичний результат великий або більше, ніж величина, за якою спостерігають, для випадкової події).

Статистична значимість

У переважних варіантах здійснення даного винаходу, значимість для цілей діагностики, або як позитивна « основа для подальших діагностичних тестів або як попередня початкова точка для ранньої превентивної терапії, з с р-значення, зв'язане з асоціацією двоалельного маркера, складає переважно близько 1 х1077 або менше, більш а переважно близько 1х1077 або менше, для аналізу одного двоалельного маркера, і близько 1х1033 або менше,

Б ще більш переважно 1х1077 або менше і найбільш переважно близько 1х109 або менше, для гаплотипного аналізу, що розглядає два або більше маркери. Вважають, що дані значення застосовні до будь-яких досліджень по асоціації, які розглядають окремий маркер або їх множинне поєднання. це. Фахівці можуть використовувати область значень, викладених вище, як вихідну точку для здійснення

Ге) досліджень по асоціації з двоалельними маркерами даного винаходу. При цьому можуть виявитися значимі асоціації між двоалельними маркерами даного винаходу і ознакою, які використовуються для цілей діагностики іс, та лікарського скринування. ма 70 Фенотипічна перестановка

Щоб підтвердити виявлену вище статистичну значимість гаплотипного аналізу на першій стадії, можна було б "М здійснити подальший аналіз, в якому дані по хворих і здорових індивідах об'єднуються та рендомізуються відносно даної фенотипічної ознаки. Дані кожного індивідуального генотипування розподіляються випадковим чином на дві групи, які містять однакове число індивідів по хворій і здоровій популяціях, що використовуються 22 для складання даних, одержаних на першій стадії. Друга стадія гаплотипного аналізу переважно здійснюється на

ГФ) цих штучних групах, переважно по маркерах, що включені у даний гаплотипний аналіз першої стадії, юю демонструючи найвищий відносний коефіцієнт ризику. Даний експеримент повторюють, переважно, щонайменше, 1100-1000 разів. Ітерації що повторюються, дозволяють визначити ймовірність випадкового тестування гаплотипу. 60 Визначення статистичної асоціації

Звертаючись до проблеми хибних позитивів, можна здійснити подібний аналіз для випадкових геномних ділянок у тих же хворих і контрольних популяціях. Результати для випадкових ділянок і кандидатної ділянки порівнюють, як описано у Попередній Патентній Заявці США, що знаходиться на розгляді, з назвою "Способи, програмне і апаратне забезпечення для ідентифікації геномних ділянок гена, асоційованого з ознакою, що бо виявляється", порядковий номер 60/107986, поданої 10 листопада 1998р., зміст якої включений у даний опис за допомогою посилання. 5) Оцінка факторів ризику

Асоціація між фактором ризику (у генетичній епідеміології фактор ризику передбачає наявність або відсутність деякого алеля або гаплотину у маркерних локусах) і захворюванням вимірюється співвідношенням шансів (ОК) і відносним ризиком (ЕЕ). Коли Р(В") являє собою ймовірність розвитку захворювання у індивідів з

К, а Р(КУ) являє собою ймовірність для індивідів за відсутності фактора ризику, тоді відносний ризик дорівнює просто співвідношенню двох ймовірностей, тобто: вЕК-Р(В УР(КУ

У дослідженнях захворювання-контроль пряме вимірювання відносного ризику здійснити неможливо через вибіркове обстеження. Однак співвідношення шансів забезпечує досить хорошу апроксимацію відносного ризику для захворювань, що рідко зустрічаються, і може бути обчислене: ов- пекан 1-5 1-7

ОВІ(Е"Д1-ЕЗДЕ Х1-Е))

Е" являє собою частоту виявлення фактора ризику у популяції хворих, а Е 7" являє собою частоту виявлення фактора ризику у контролі. Е" і Ег обчислюють з використанням алельних або гаплотипних частот у даному дослідженні і залежать від генетичної моделі (домінантної, рецесивної, адитивної...), що лежить в основі.

Можна також оцінити атрибутивний ризик, який описує пропорцію індивідів у популяції, що виявляє ознаку, зв'язану з даним ризиком. Дане вимірювання є важливим для кількісного визначення ролі специфічного фактора в етіології захворювання і у рамках впливу фактора ризику на охорону здоров'я. Важливість даного вимірювання для охорони здоров'я полягає у визначенні частки випадків захворювання у даній популяції, які можна було б попередити, якби не відсутність проявлення інтересу. АК визначають наступним чином: с

АКАРЕ(ВК-1М(РЕ(КНК-1) 1) о

АК означає ризик, властивий алелю двоалельного маркера або гаплотипу двоалельного маркера. Ре означає частоту проявлення алеля або гаплотипу у популяції загалом; а КК означає відносний ризик, який, будучи апроксимованим для співвідношення шансів, при дослідженні даної ознаки, володіє відносно низькою частотою у генеральній сукупності. -

Ідентифікація двоалельних маркерів при порушенні рівноваги для двоалельних маркерів даного винаходу с

Після ідентифікації першого двоалельного маркера у геномній ділянці, що представляє інтерес, фахівці у даній області техніки, використовуючи вказівки даного винаходу, можуть легко ідентифікувати додаткові (22) двоалельні маркери, зчеплені при порушенні рівноваги з даним першим маркером. Як вказано раніше, будь-який (ду маркер, зчеплений при порушенні рівноваги з першим маркером, асоційованим з ознакою, буде асоціюватися з

Зо даною ознакою. Тому, після асоціації, продемонстрованої між даним двоалельним маркером і ознакою, в. виявлення додаткових двоалельних маркерів, асоційованих з даною ознакою, являє собою великий інтерес для того, щоб збільшити щільність двоалельних маркерів у даній конкретній ділянці. Каузальний ген або мутація будуть виявлятися поблизу даного маркера або групи маркерів, демонструючи найвищу кореляцію з даною « ознакою.

Ідентифікація додаткових маркерів у зчепленні при порушенні рівноваги з даним маркером включає: (а) З с ампліфікацію геномного фрагмента, що включає перший двоалельний маркер, у великої кількості індивідів; (Б) "» ідентифікацію других двоалельних маркерів у даній геномній ділянці, що несе вказаний перший двоалельний " маркер; (с) проведення аналізу порушення рівноваги зчеплення між вказаним першим двоалельним маркером і другими двоалельними маркерами; і (4) відбір вказаного другого двоалельного маркера, який зчеплений при порушенні рівноваги з вказаним першим маркером. Розглядаються також субкомбінації, що включають стадії (Б) і ш- (с).

Ге) Способи ідентифікації двоалельних маркерів і проведення описаного у даному описі аналізу зчеплення при порушенні рівноваги може здійснити фахівець без надмірного експериментування. Даний винахід розглядає і, також двоалельні маркери, які знаходяться у стані порушення рівноваги по зчепленню з двоалельними ко 20 маркерами А1-А18 і які, як очікується, представлені аналогічними характеристиками у рамках їх відповідної асоціації з даною ознакою. "М Ідентифікація функціональних мутацій

Мутації по Сапіоп-гену, які відповідальні за фенотип або ознаку, що виявляється, можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння послідовностей Сапіоп-гена індивідів з позитивною ознакою і контрольних 22 індивідів. Після того, як позитивна асоціація підтверджена за допомогою двоалельного маркера даного

ГФ) винаходу, ідентифікований локус можна проскакувати відносно наявності мутацій. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, функціональні ділянки, такі як екзони і сайта сплайсингу, промотори та інші де регуляторні ділянки Сапіоп-гена, сканують на наявність мутацій. У переважному варіанті здійснення даного винаходу послідовність Сапіоп-гена порівнюють в індивідів з позитивною ознакою і у контрольних індивідів. 60 Переважно, якщо показані індивіди з позитивною ознакою, що несуть гаплотип, який асоційований з даною ознакою, та індивіди з негативною ознакою, що не несуть гаплотип або алель, асоційований з даною ознакою.

Ознака або фенотип, що виявляється, може включати різні проявлення змін Сапіоп-функції.

Метод виявлення мутації по суті аналогічний методу, що використовується для ідентифікації двоалельного маркера. Спосіб, що використовується для виявлення таких мутацій, включає, як правило, наступні стадії: бо - ампліфікації ділянки Сапіоп-гена, що включає двоалельний маркер або групу двоалельних маркерів, -БО0-

асоційованих з даною ознакою у зразках ДНК пацієнтів з позитивною ознакою і зразках ДНК людей у контролі; - секвенування ампліфікованої ділянки; - порівняння послідовностей ДНК індивідів з позитивною ознакою та індивідів у контролі; - визначення мутацій, специфічних для пацієнтів з позитивною ознакою.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу вказаний двоалельний маркер вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів. Потім, шляхом скринування доцільно перевірити більш великі популяції хворих і здорових за допомогою будь-якого методу генотипування, який описаний у даному описі, переважно з використанням методу мікросеквенування в індивідуальному тест-варіанті. Поліморфізм /о розглядають у вигляді кандидатних мутацій за наявності частот у хворих і у контролі, порівнянних з очікуваними результатами по асоціації.

Поліморфізм розглядають у вигляді кандидатних "що визначають ознаку" мутацій, якщо вони виявляють статистично значиму кореляцію з фенотипом, що виявляється.

Двоалельні маркери даного винаходу у способах генетичного діагностування

Сапіоп-послідовність нуклеїнової кислоти і двоалельні маркери даного винаходу можна також використовувати для створення діагностичних тестів (діагностикумів) здатних ідентифікувати індивідів, генотипи яких несуть ризик розвитку ознаки, що виявляється, у подальшому. Такий діагноз може бути придатний для визначення, моніторингу, прогнозу і/або профілактики або лікування численних захворювань або станів, включаючи шизофренію, біполярний розлад та інші порушення ЦНС, такі як епілепсія і порушення больових

Відчуттів, серцево-судинні стани, такі як порок серця, гіпертензія, аритмія, та численні інші захворювання і стани.

Методи діагностики даного винаходу можуть використовувати різні методології для визначення присутності у людини, яку обстежують, патерна двоалельного маркера, асоційованої з підвищеним ризиком розвитку ознаки, що виявляється, або в індивіда, який страждає від ознаки, що виявляється, як результату конкретної мутації, включаючи способи, які роблять можливим аналіз індивідуальних хромосом для гаплотипування, такі як с дослідження сімей, ДНК-аналіз окремого спермія або соматичних гібридів.

У даному винаході створені діагностичні способи визначення індивіда з ризиком розвитку захворювання або і) такого, який страждає від захворювання, що виникло внаслідок мутації або поліморфізму в Сапіоп-гені. У даному винаході створені також способи визначення індивіда, що володіє сприйнятливістю до шизофренії та біполярного розладу, або до будь-якого іншого стану, зв'язаного з кальцієвими каналами, відомого у даній області техніки М зо і описаного у даному описі.

Дані способи включають одержання зразка нуклеїнової кислоти від даного індивіда і визначення у зразку с нуклеїнової кислоти наявності, щонайменше, одного алеля або, щонайменше, одного гаплотипу двоалельного б маркера, що свідчить про ризик розвитку даної ознаки, або свідчить про те, що у даного індивіда виявляється дана ознака через володіння конкретним Сапіоп-поліморфізмом або конкретною мутацією (ознака, що визначає ме) алель). ї-

Переважно, для таких діагностичних способів зразок нуклеїнової кислоти одержують від даного індивіда і даний зразок генотипують з використанням способів, описаних вище у розділі "Способи генотипування зразків

ДНК по двоалельних маркерах". Дана діагностика може базуватися на окремому двоалельному маркері або на групі двоалельних маркерів. «

У кожному з цих способів зразок нуклеїнової кислоти одержують від суб'єкта, якого обстежують, після чого з с визначають патерн двоалельного маркера одного або декількох двоалельних маркерів А1-А18.

В одному з варіантів здійснення даного винаходу на зразку нуклеїнової кислоти здійснюють ;» ПЛР-ампліфікацію, щоб ампліфікувати ділянки, в яких ідентифікують поліморфізм, асоційований з фенотипом, що виявляється. Одержані продукти ампліфікації секвенують для визначення індивідуального володіння одним або декількома Сапіоп-поліморфізмами, асоційованими з фенотипом, що виявляється. Праймери, які -І використовуються для одержання продуктів ампліфікації, можуть включати праймери, приведені у Таблиці 1.

Альтернативно, даний зразок нуклеїнової кислоти піддають реакціям мікросеквенування, як описано вище, для се) визначення індивіда, що володіє одним або декількома Сапіоп-поліморфізмами, асоційованими з фенотипом, що

Ге) виявляється, який виник внаслідок мутації або поліморфізму у Сапіоп-гені. Праймери, що використовуються у 5о реакціях мікросеквенування, можуть включати праймери, приведені у Таблиці 4. В іншому варіанті здійснення ю даного винаходу даний зразок нуклеїнової кислоти контактує з одним або декількома алельспецифічними "М олігонуклеотидними зондами, які специфічно гібридизуються з одним або декількома Сапіоп-алелями, асоційованими з фенотипом, що виявляється. Зонди, які використовуються для гібридизаційного аналізу, включають зонди, приведені у Таблиці 3. В іншому варіанті здійснення даного винаходу, даний зразок в Нуклеїнової кислоти контактує з другим Сапіоп-олігонуклеотидом, здатним виробити продукт ампліфікації при використанні з алельспецифічним олігонуклеотидом у реакції ампліфікації. Присутність продукту ампліфікації у (Ф) даній реакції ампліфікації свідчить про те, що даний індивід володіє одним або декількома Сапіоп-алелями, ка асоційованими з фенотипом, що виявляється.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу визначається ідентичність визначеного нуклеотиду, який во присутній, щонайменше, в одному двоалельному маркері, вибраному з групи, що складається з А1-А18 та їх комплементів, і ознакою, що виявляється, є шизофренія та біполярний розлад. Діагностичний набір включає будь-який з полінуклеотидів даного винаходу.

Такі діагностичні способи надзвичайно корисні і за деяких обставин можуть використовуватися для ініціації превентивного лікування або для обліку індивіда, що несе значимий гаплотип, який передбачає діагностичні 65 Знаки, такі як мінорні симптоми.

Діагностика, яка аналізує і передбачає реакцію на лікарський засіб або побічні ефекти на лікарський засіб, може використовуватися для визначення індивіда, який потребує лікування за допомогою конкретного лікарського засобу. Наприклад, якщо діагноз вказує на ймовірність того, що індивід буде позитивно реагувати на лікування конкретним лікарським засобом, то даний лікарський засіб можна призначати даному індивіду.

Навпаки, якщо діагноз свідчить, що індивід, ймовірно, реагує негативно на лікування конкретним лікарським засобом, можна призначити альтернативний курс лікування. Негативну реакцію можна визначити як відсутність ефективної реакції або наявність токсичних побічних ефектів.

Клінічні випробування лікарського засобу являють собою інше застосування для маркерів даного винаходу.

Один або декілька маркерів, що показують реакцію на агент, який діє проти шизофренії або біполярного розладу 70 або іншого стану, зв'язаного з кальцієвими каналами, або показують реакцію у вигляді побічних ефектів на агент, що діє проти шизофренії або біполярного розладу, або іншого стану, зв'язаного з кальцієвими каналами, можна ідентифікувати з використанням описаних вище способів. Відповідно, потенційних учасників клінічних випробувань такого агента можна скринувати для ідентифікації індивідів, які найвірогідніше позитивно відреагують на даний лікарський засіб, і для виключення тих, які, ймовірно, відчують побічні ефекти. Таким 7/5 чином, ефективність лікарського лікування можна виміряти в індивідів, які позитивно реагують на даний лікарський засіб, без зниження вимірюваності внаслідок включення індивідів, які навряд чи відреагують позитивно у даному дослідженні, і без ризику виникнення небажаних проблем, зв'язаних з безпекою.

У конкретних варіантах здійснення даного винаходу дану ознаку, яка являє собою шизофренію або біполярний розлад, аналізують з використанням представлених діагностик. Разом з тим, даний винахід також го Включає в себе будь-який з описаних у даному описі превентивних, діагностичних, прогностичних і терапевтичних способів з використанням двоалельних маркерів даного винаходу у способах, що запобігають, діагностують, керують або лікують споріднені захворювання, особливо зв'язані з розладами ЦНС. У прикладі здійснення споріднені захворювання можуть включати психотичні порушення, розлади емоційного стану, аутизм, залежність від хімічних речовин і алкоголізм, порушення больових відчуттів, епілепсію, затримку психічного сч ов розвитку та інші психічні захворювання, включаючи когнітивну функцію, страх, порушення функції приймання їжі, порушення функції мотивації і розлад особистості, які визначаються відповідно до четвертого видання і) класифікації Оіадповіз апа (аййзіїсаї Мапа! ої Мепіа! Оівогдегв (0О5М-ІМ). Інші порушення включають серцево-судинні розлади, такі як стенокардія, гіпертензія або аритмії.

Рекомбінантні вектори М зо Термін "вектор", що використовується у даному описі, має на увазі кільцеву або лінійну молекулу ДНК або

РНК, яка є дволанцюжковою або одноланцюжковою, і яка включає, щонайменше, один полінуклеотид, що с представляє інтерес, який потрібно перенести у клітину-хазяїна або в одноклітинний, або у багатоклітинний б організм-хазяїн.

Даний винахід включає у себе сімейство рекомбінантних векторів, які включають регуляторний ме) полінуклеотид, одержаний з Сапіоп-геномної послідовності, і/або полінуклеотид, що кодує, або з ї-

Сапіоп-геномної послідовності, або з кКДНК-послідовності.

Як правило, рекомбінантний вектор даного винаходу може включати будь-який з описаних у даному описі полінуклеотидів, включаючи регуляторні послідовності, послідовності, що кодують, і полінуклеотидні конструкції, а також будь-який Сапіоп-праймер або зонд, як вказано вище. Зокрема, рекомбінантні вектори « даного винаходу можуть включати будь-який з полінуклеотидів, описаних у розділі Теномні послідовності з с Сапіоп-гена", у розділі "Сапіоп-кДНК-послідовності", у розділі "Ділянки, що кодують", у розділі "Полінуклеотидні конструкції" та у розділі "Олігонуклеотидні зонди і праймери". ;» У першому переважному варіанті здійснення даного винаходу рекомбінантний вектор даного винаходу використовують для ампліфікації полінуклеотиду, що вбудовується, одержаного з геномної послідовності ЗЕО ІЮ

Мо 1-3 або б або Сапіоп-кДдНК, наприклад, кКДНК з ЗЕО ІО Мо 4, у відповідній клітині-хазяїні, даний -І полінуклеотид ампліфікується кожний раз, коли відбувається реплікація даного рекомбінантного вектора.

Інший переважний варіант здійснення рекомбінантних векторів, відповідно до даного винаходу, включає і, експресійні вектори, які включають або регуляторний полінуклеотид, або нуклеїнову кислоту, що кодує, даного

Ге) винаходу, або і те і інше. У деяких варіантах здійснення даного винаходу експресійні вектори використовують 5р для експресії Сапіоп-поліпептиду, який потім можна виділити очищенням і, наприклад, використовувати в аналізі о по скринуванню ліганду або як імуногена з тим, щоб викликати продукування специфічних антитіл, направлених "М проти Сапіоп-білка. В інших варіантах здійснення даного винаходу дані експресійні вектори використовують для створення трансгенних тварин, а також для генотерапії. Експресія вимагає, щоб у векторах утворювалися відповідні сигнали, причому вказані сигнали включають різні регуляторні елементи, такі як енхансери/промотори ов З джерел вірусу і ссавців, які приводять у дію у клітинах-хазяях експресію генів, що представляють інтерес.

Домінантні лікарські селективні маркери для створення довготривалих стабільних клітинних клонів, що (Ф, експресують дані продукти, як правило, включені в експресійні вектори даного винаходу, оскільки вони є ка елементами, які зв'язують експресію даних лікарських селективних маркерів з експресією даного поліпептиду.

Більш детально, даний винахід відноситься до експресійних векторів, які включають нуклеїнові кислоти, що бо Кодують Сапіоп-білок, переважно Сапіоп-білок амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ Мо 5, або його варіанти або фрагменти.

Даний винахід відноситься також до рекомбінантного експресійного вектора, придатного для експресії послідовності, що кодує Сапіоп, де вказаний вектор включає нуклеїнову кислоту ЗЕО ІЮ Мо 4.

Рекомбінантні вектори, що включають нуклеїнову кислоту, яка містить двоалельний маркер, зв'язаний з 65 Сапіоп, також є частиною даного винаходу. У переважному варіанті здійснення даного винаходу вказаний двоалельний маркер вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів.

Деякі елементи, які можна знайти у векторах даного винаходу, описані більш детально у наведених нижче розділах.

Даний винахід включає також первинні, вторинні, іморталізовані гомологічно рекомбінантні клітини-хазяї хребетних, переважно ссавців і, зокрема, людини, які були створені біотехнологічно для: а) вбудовування екзогенних (гетерологічних) полінуклеотидів в ендогенну хромосомну ДНК гена-мішені, В) видалення ендогенної хромосомної ДНК, і/або с) заміни ендогенної хромосомної ДНК екзогенними полінуклеотидами. Вставки, делеції і/або заміни полінуклеотидних послідовностей можуть являти собою послідовності гена-мішені, що кодують, і/або регуляторні ділянки, такі як промоторні та енхансерні послідовності, функціонально приєднані до гена-мішені. 70 Крім того, даний винахід відноситься до способу створення гомологічної рекомбінантної клітини-хазяїна іп міо або іп мімо, в якому експресія гена-мішені, що аномально експресується у даній клітині, змінюється.

Переважно зміна викликає експресію даного гена-мішені у нормальних умовах росту або в умовах, придатних для продукування поліпептиду, що кодується даним геном-мішенню. Даний спосіб включає наступні стадії: (а) трансфікування даної клітини іп мйго або іп мімо за допомогою полінуклеотидної конструкції, причому дана 7/5 Пполінуклеотидна конструкція включає: (ії) послідовність, що націлює; (ії) регуляторну послідовність і/або послідовність, що кодує; і (ії) неспарений донорний сайт сплайсингу, якщо потрібно, внаслідок чого продукується трансфікована клітина; і (Б) збереження даної трансфікованої клітини іп мйго або іп мімо в умовах, придатних для гомологічної рекомбінації.

Даний винахід відноситься, крім того, до способу зміни експресії гена-мішені у клітині іп мйго або іп

УМО, де даний ген експресується у даній клітині аномально, що включає наступні стадії: (а) трансфікування даної клітини іп міго або іп мімо полінуклеотидною конструкцією, причому дана полінуклеотидна конструкція включає: (ї) послідовність, що націлює; (ії) регуляторну послідовність і/або послідовність, що кодує; (її) неспарений донорний сайт сплайсингу, якщо потрібно, внаслідок чого продукується трансфікована клітина; і (Б) збереження даної трансфікованої клітини іп мійго або іп мімо в умовах, придатних для гомологічної сч рекомбінації, за допомогою якої продукується гомологічно рекомбінантна клітина; і (с) збереження гомологічно рекомбінантної клітини іп міїго або іп мімо в умовах, придатних для експресії даного гена. (8)

Крім того, даний винахід має відношення до способу створення поліпептиду даного винаходу шляхом зміни експресії цільового ендогенного гена у клітині іп мйго або іп мімо, де даний ген експресується у даній клітині аномально, що включає наступні стадії: а) трансфікування даної клітини іп міо полінуклеотидною М зо Конструкцією, що включає: (і) послідовність, що націлює; (її) регуляторну послідовність і/або послідовність, що кодує; і (ії) неспарений донорний сайт сплайсингу, якщо потрібно, продукуючи тим самим трансфіковану с клітину; (Б) збереження даної трансфікованої клітини іп мйго або іп мімо в умовах, придатних для Ге! гомологічної рекомбінації, продукуючи таким чином гомологічно рекомбінантну клітину; і (с) збереження гомологічно рекомбінантної клітини іп мійго або іп мімо в умовах, придатних для експресії даного гена, (22) з5 створюючи таким чином даний поліпептид. ча

Даний винахід має також відношення до полінуклеотидної конструкції, яка змінює експресію цільового гена у типовій клітині, в якій даний ген експресується аномально. Це відбувається у тому випадку, якщо дана полінуклеотидна конструкція вбудовується у хромосомну ДНК клітини-мішені, де дана полінуклеотидна конструкція включає: а) послідовність, що націлює; Б) регуляторну послідовність і/або послідовність, що «

КоДдує; | с) неспарений донорний сайт сплайсингу, якщо потрібно. Додатково включаються полінуклеотидні з с конструкції, як описано вище, де дана конструкція додатково включає полінуклеотид, який кодує поліпептид, і знаходиться у рамці зчитування з ендогенним геном-мішенню після гомологічної рекомбінації з хромосомної :» днк.

Композиції можна одержати і способи здійснити за допомогою методів, відомих у даній області техніки, (які описані у Патентах США МоМо: 6054288; 6048729; 6048724; 6048524; 5994127; 5968502; 5965125; 5869239; -І 5817789; 5783385; 5733761; 5641670; 5580734; у Міжнародних Публікаціях МоМо: УУО096/29411, М/О94/12650; і наукових статтях, що включають КопПег і співавт., 86:8932-8935 (1989)|. ік 1. Основні характерні особливості експресійних векторів даного винаходу

Ге) Відповідно до даного винаходу рекомбінантний вектор включає, але не обмежується ними, ХАС (штучна 5ор хромосома дріжджів), ВАС (штучна хромосома бактерій), фаг, фагеміду, косміду, плазміду або навіть лінійну ю молекулу ДНК, яка може включати хромосомну, нехромосомну, напівсинтетичну і синтетичну ДНК. Такий

І рекомбінантний вектор може включати транскрипційний елемент, що включає сукупність з: (1) генетичного елемента або елементів, які грають регуляторну роль в експресії гена, наприклад, промотори або енхансери. Енхансери є цис-діючими елементами ДНК, звичайно довжиною від близько 10 до дв ЗбОп.н., які діють на промотор для збільшення транскрипції. (2) структурної послідовності або послідовності, що кодує, яка транскрибується у мРНК і, зрештою, (Ф, транслюється у поліпептид, причому вказана структурна послідовність або послідовність, що кодує, ка функціонально приєднується до регуляторних елементів, описаних в (1); і (3) відповідних послідовностей ініціації транскрипції і термінації. Структурні одиниці, призначені для бо Використання." у дріжджовій або еукаріотичній експресійних системах, переважно включають лідерну послідовність, що робить можливою позаклітинну секрецію білка, який транслюється, клітиною-хазяїном.

Альтернативно, якщо рекомбінантний білок експресується без лідерної або транспортної послідовності, він може включати М-кінцевий залишок. Даний залишок може або не може бути згодом відщеплений від експресованого рекомбінантного білка для створення кінцевого продукту. 65 У більшості випадків рекомбінантні експресійні вектори будуть включати оріджини реплікації, селективні маркери, що дозволяють трансформувати клітину-хазяїна, і промотор, одержаний з гена, що високо експресується, який контролює транскрипцію розташованого "правіше" структурної послідовності. Гетерологічну структурну послідовність збирають у відповідній фазі послідовностями ініціації трансляції і термінації, і переважно з лідерною послідовністю, здатною направляти секрецію білка, що транслюється, у периплазматичний простір або у позаклітинне середовище. У специфічному варіанті здійснення даного винаходу, в якому даний вектор адаптований для трансфікування та експресування необхідних послідовностей у клітинах-хазяях ссавців, переважні вектори будуть включати оріджин реплікації необхідного хазяїна, відповідний промотор і енхансер, а також будь-які необхідні сайти зв'язування рибосом, сигнал поліаденілювання, донорний і акцепторний сайти сплайсингу, послідовності термінації транскрипції і 7/0 5-фланкуючі послідовності, що не транскрибуються. Послідовності ДНК, одержані з геному вірусу ЗМ40, наприклад, ЗМ40-оріджину, раннього промотору, енхансера і сигналів сплайсингу та поліаденілювання, можна використовувати для створення необхідних генетичних елементів, що не транскрибуються.

Іп мімо-експресія Сапіоп-поліпептиду ЗЕО ІЮО Мо 5, або його фрагментів або його варіантів, може виявитися придатною для того, щоб виправити генетичний дефект, зв'язаний з експресією нативного гена в організмі-хазяїні, або для одержання біологічно неактивного Сапіоп-білка.

Отже, даний винахід включає також рекомбінантні експресійні вектори, створені головним чином для іп мімо-одержання Сапіоп-поліпептиду ЗЕО ІЮО Мо 5, або його фрагментів або його варіантів, шляхом введення відповідного генетичного матеріалу в організм пацієнта, який лікується. Даний генетичний матеріал можна вводити іп міго у клітину, яку раніше дістали з даного організму, потім модифіковану клітину знову ввели у вказаний організм, безпосередньо іп мімо у відповідну тканину. 2. Регуляторні елементи

Промотори

Відповідні промоторні ділянки, що використовуються відповідно до даного винаходу, в експресійних векторах, вибрані з врахуванням клітини-хазяїна, в якій експресується даний гетерологічний ген. Конкретний сч промотор, що використовується для контролю експресії послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє о інтерес, не вважається істотним, доти, доки він здатний керувати експресією нуклеїнової кислоти у даній клітині-мішені. Тому, якщо клітина людини є мішенню, переважно помістити нуклеотидну ділянку, що кодує, по сусідству і під контролем промотору, такого як, наприклад, промотор людини або вірусний промотор, який здатний експресуватися у клітині людини. ї- зо Відповідний промотор може бути гетерологічним по відношенню до нуклеїнової кислоти, експресію якої він контролює, або, альтернативно, він може бути ендогенним до даного нативного полінуклеотиду, який містить с послідовність, що кодує, яку експресують. Крім того, даний промотор, як правило, гетерологічний по відношенню (у до рекомбінантних векторних послідовностей, в які вбудовується дана конструкція промотор/послідовність, що кодує. Ме

Промоторні ділянки можна вибрати з будь-якого бажаного гена з використанням, наприклад, САТ ї- (хлорамфеніколтрансферазних) векторів і більш переважно з використанням векторів рКК232-8 і рем.

Переважними бактеріальними промоторами є опромотори іасі, Іас/, РНкК-полімеразні промотори бактеріофага ТЗ або Т7, промотори орі, лямбда РК, РІ і ігр (ЕР 0036776), промотор гена поліедрину або промотор білка ріО бакуловірусу (КИ Момадеп) (Зтій і співавт., 1983; О'КейУу і співавт., 1992), промотор « лямбда РК або також Іго-промотор. в с Еукаріотичні промотори включають передранній СМУ, тимідинкіназний НОМ, ранній і пізній ЗМ40, ІТК з . ретровірусу і металотіонеїн-Ї миші. Вибір зручного вектора і промотору визначається на рівні фахівця у даній а області техніки.

Вибір промотору визначається кваліфікацією фахівця в області генної інженерії. Для цього, наприклад,

Можна звернутися до затьгоок і співавт. (1989) або до методів, (описаних також у Ешіег і співавт. (1996). -І Інші регуляторні елементи

Якщо використовують кКДНК-вставку, то, як правило, бажано включити сигнал поліаденілювання, який і, здійснює належне поліаденілювання генного транскрипту. Природа сигналу поліаденілювання не вважається со ключовою для успішного здійснення даного винаходу, і можна використовувати таку послідовність як 5ор послідовність гормону росту людини і сигнал поліаденілювання ЗМ40. Як елемент експресійної касети ю розглядають також термінатор. Ці елементи можуть служити для підвищення рівнів мРНК і для мінімізації "М крізного зчитування генетичної інформації з даної касети в інші послідовності.

З. Селективні маркери

Такі маркери повинні забезпечувати клітину зміною, що ідентифікується, яка дозволяє легку ідентифікацію дв клітин, що містять дану експресійну конструкцію. Селективні маркерні гени для відбору трансформованих клітин-хазяїв, володіють переважно дигідрофолатредуктазною або неоміциновою стійкістю у культурі

Ф) еукаріотичних клітин, ТКРІ для С сегемізіде або тетрацикліновою, рифампіциновою або ампліциліновою ка стійкістю для Е. соїї, або левансахаразною стійкістю для мікробактерій, даний останній маркер є негативним селективним маркером. во 4. Переважні вектори

Бактеріальні вектори

Як представницький, але не обмежувальний приклад, придатні експресійні вектори для бактеріального застосування можуть включати селективний маркер і бактеріальний оріджин реплікації, одержаний з комерційно доступних плазмід, що включають генетичні елементи рВК322 (АТСС 37017). Такі комерційні вектори включають, 65 наприклад, ркк223-3 (Рпапгтасіа, Оррзаїа, Швеція) і СЕМІ (Рготеда Віоїес, Мадізоп, УМІ, США).

Фахівцям у даній області техніки відома велика кількість інших придатних і комерційно доступних векторів, -Б4-

таких як наступні бактеріальні вектори: рОЕ7О, рОЕбО, роОЕ-9 (Оіадеп), роз, рОІО, ріадезсгірі, реіХ174, ррісезсгірі ЗК, різК5, рМНВА, рМНІбА, рМНІ8А, рМНабА (5ігагадепе); рігс99а, ркКК223-3, рКК233-3, рОМКБ40, рАІТ5 (Ріагтасіа); рум МЕС, реМ2САТ, роб44, рхХТтІі, ро (Зігаїадепе); рРМКЗ, рРВРМУ, рМО, рамі (РПагтасіа);

ВОЕ-30 (ОІАехргевв).

Вектори бактеріофага

Вектор бактеріофага Р1 може містити великі вставки у діапазоні від близько 80 до близько 100т.п.н.

Конструкція векторів бактеріофага РІ, таких як р1!58 або р158/пео8, повніше всього |описана (егпрега (1992, 1994)). Рекомбінантні клони Р1, що включають Сапіоп-нуклеотидні послідовності, можна створити шляхом 70 вбудовування великих полінуклеотидів з більше ніж 40От.п.н. (І іпіоп і співавт., 1993). Для одержання ДНК Р1 для трансгенних експериментів переважним протоколом є протокол, |Описаний МеСогтіск і співавт. (1994)|.

Коротко, Е. соїї (переважно штам М53529), що несуть плазміду Р1, вирощують протягом ночі у відповідному бульйонному середовищі, яке містить 25мкг/мл канаміцину. ДНК Р1 одержують з Е. соїї шляхом лужного лізису з використанням набору Оіадеп Ріазтіа Махі (Оіадеп, Спаївжогій, СА, США), відповідно до інструкцій виробника. 7/5 ДНК РІ виділяють очищенням з одержаного бактеріального лізату на двох колонках Оіадеп-йр 500 з використанням промивального буферу та буферу, який елюює, що містяться у даному наборі. Потім, перед осадженням ДНК 7095-м етанолом, проводять екстрагування сумішшю фенол/хлороформ. Після солюбілізації осадженої ДНК в ТЕ (10мМ Трис-НСІ, рН7.4, їТмМ ЕДТА), концентрацію солюбілізованої ДНК визначають на спектрофотометрі.

Якщо метою є експресія клону РІ, що включає Сапіоп-нуклеотидні послідовності, у трансгенній тварині, звичайно у трансгенних мишах, бажано видалити векторні послідовності з ДНК-фрагмента РІ, наприклад, шляхом розщеплення ДНК Р1 по сайтах, що рідко розрізаються, всередині Р1-полілінкера (51ЇЇ, Мої! або заїЇ).

Потім Рі-вставку виділяють очищенням з векторних послідовностей, підданих гель-електрофорезу у пульсуючому полі, з використанням методів, аналогічних методам, які спочатку пропонувалися для виділення с

ДНК з МАС |Зснеді і співавт., 1993а; Регйеггоп і співавт., 1993). На цій стадії одержана, виділена очищенням вставка ДНК може бути сконцентрована, за необхідності, на фільтрувальній установці МіПроге ШОГгаїгее-МС і) (МіШроге, Ведіога, МА, США - у межах молекулярної маси 30000) і потім діалізована проти буфера для мікроін'єкцій (10мММ Трис-НСЇІ, рН7 4; 250мкМ ЕДТА), що містить 100мМ Масі, ЗОмкМ сперміну, 7ОмкМ спермідину, у мембрані для мікродіалізу (тип М5, 0,025мкМ від МіШіроге). Цілісність виділеної очищенням ДНК-вставки Р1 М зо визначають за допомогою електрофорезу у пульсуючому полі в 17о-му агарозному (Зеа Кет СТО; ЕМО

Віо-ргодисів) гелі та забарвлюють етидійбромідом. с

Бакуловірусні вектори Ге!

Відповідним вектором для експресії Сапіоп-поліпептиду ЗЕО ІЮ Мо 5 або його фрагментів або варіантів є бакуловірусний вектор, який можна розмножити у клітинах і у клітинних лініях комах. Специфічною придатною ме) хазяйською векторною системою є бакуловірусний трансфер-вектор рмі 1392/1393 (РНагтіпдеп), який ї- використовують для трансфікування клітинної лінії 5Е9 (АТСС МоСкКІ 1711), яку одержують з Зродоріега

Ттидірегаа.

Інші відповідні вектори для експресії Сапіоп-поліпептиду ЗЕО ІЮ Мо 5 або його фрагментів або варіантів у бакуловірусній експресійній системі включають вектори, (описані у Спаії і співавт. (1993), Міазак і співавт. « 1983) і І еппага і співавт. (1996). з с Вірусні вектори . В одному із специфічних варіантів здійснення даного винаходу вектор одержують з аденовірусу. Відповідно и?» до даного винаходу переважні аденовірусні вектори являють собою вектори, |які описані у Геіїдтап апа 5іед (1996) або у Оппо і співавт. (1994)). Інший переважний рекомбінантний аденовірус, відповідно до здійснення даного специфічного варіанта, представленого у даному винаході, являє собою аденовірус людини тип 2 або 5 -І (Аа 2 або Аа 5) або аденовірус тваринного походження |див., наприклад, Французька патентна заявка

Моє к-93.05954). ік Під ретровірусними векторами і аденоасоційованими вірусними векторами мають на увазі, головним чином,

Ге) рекомбінантні системи доставки генів, вибрані для перенесення екзогенних полінуклеотидів іп мімо, зокрема, 5ор бсавцем, включаючи людей. Дані вектори забезпечують ефективну доставку генів у клітини, а перенесені ю нуклеїнові кислоти стабільно інтегруються у хромосомну ДНК даного хазяїна. "М Особливо переважні препарати ретровірусів або ретровірусні конструкції-переносники даного винаходу для доставки генів іп міго або іп мімо включають ретровіруси, вибрані з групи, що складається з вірусу, який індукує осередок клітин норки, вірусу саркоми мишей, вірусу ретикулоендотеліозу і вірусу саркоми Рауса.

Особливо перевалені віруси лейкозу мишей включають віруси 4070А і 1504А, Абеізоп (АТОС Мо УкК-999), Егіепа (АТСС Мо М-245), Сгозз (АТСС Мо М-590), Каизспег (АТОС Мо МК-998) і вірус лейкозу мишей Молоні (АТС

Ф) Мо МА-190; |Заявка РСТ МоууО 94/242981). Особливо переважні віруси саркоми Рауса включають Вгуап з високим ка титром (АТС Моз МК-334, МК-657, МК-726, МкК-659 і МкК-728). Інші переважні ретровірусні вектори являють собою ретровіруси, (які описані у Коїй і співавт. (1996), Заявка РСТ МоУУО 93/25234, Заявка РСТ МоМ/О 94/06920, во Коих і співавт., 1989, цап і співавт., 1992 і Меда і співавт., 19911.

Ще одна вірусна векторна система, яка розглядається у даному винаході, включає аденоасоційований вірус (ААМ). Аденоасоційований вірус являє собою дефектний вірус, що зустрічається у природі, який потребує іншого вірусу, такого як аденовірус або герпес-вірус, як вірус-помічник для ефективної реплікації та продуктивного життєвого циклу |МигусагКа і співавт., 19921. Це один з небагатьох вірусів, який може інтегрувати свою ДНК у 65 клітини, що не діляться, і проявляє високу частоту стійкої інтеграції (Біобе і співавт., 1992; ЗатиївкКі і співавт., 1989; Мсі ацдпіїп і співавт., 1989). Відмітною рисою ААМ є його зменшена ефективність відносно трансдукування первинних клітин у порівнянні з трансформованими клітинами.

ВАС вектори

Система, що клонує, бактеріальної штучної хромосоми (ВАС) |Зпі2цуа і співавт., 19921) була створена для стійкого збереження в Е. соїї великих фрагментів геномної ДНК (100-300т.п.н.). Переважний ВАС-вектор включає вектор рВеювАСІ11, (який був описаний Кіш і співавт. (1996). За допомогою даного вектора одержують

ВАС-бібліотекио, а з використанням відібраної за розміром геномної ДНК, яку частково розщеплюють ферментами, їх можна лігувати у сайти Ват НІ або Ніпайї|Ї даного вектора. Фланкування цих сайтів, що клонують, здійснюють Т7 і 5Рб РНК-полімеразними сайтами ініціації транскрипції, які можна використовувати для 7/0 творення кінцевих зондів за допомогою методів РНК-транскрипції або ПЛР. Після створення ВАС-бібліотеки в Е. сої, ДНК ВАС виділяють очищенням з клітини-хазяїна у вигляді надспіралізованої кільцевої молекули.

Перетворенню таких кільцевих молекул у лінійну форму передує визначення розміру і введення ВАС у реципієнтні клітини. Сайти, що клонують, фланкують за допомогою двох Мої І-сайтів, що дозволяє вирізати клоновані сегменти з даного вектора у результаті розщеплення Мої І. Альтернативно, ДНК-вставку, що містить /5 Вектор рВеювВАСІТ1, можна лінеалізувати шляхом обробки ВАС-вектора комерційно доступним ферментом лямбда-терміназа, що приводить до розщеплення унікального созМ-сайта, але даний спосіб розщеплення дає повнорозмірний ВАС-клон, який містить послідовності і ДНК-вставки і ВАС. 5. Доставка рекомбінантних векторів

Для того щоб ефективно експресувати полінуклеотиди і полінуклеотидні конструкції даного винаходу, дані

Конструкції необхідно доставити у клітину. Таку доставку можна здійснити іп міо, як у лабораторних методах трансформування клітинних ліній або іп мімо, або ех мімо, так і при лікуванні деяких хворобливих станів.

Одним з механізмів є вірусна інфекція, при якій експресійна конструкція інкапсулюється у вірусні частинки, які спричиняють зараження.

У даному винаході розглядається також декілька невірусних способів перенесення полінуклеотидів у клітини сч ов ссавців, що культивуються, які включають, без обмеження, осадження кальційфосфатом |Сганат і співавт., 1973; Спеп і співавт., 1987), ОЕАЕ-декстраном (|Сора!ї, 1985), електропорацією |Гиг-Казра і співавт., 1986; і)

РоЧег і співавт., 1984), прямою мікроін'єкцією |Нагапа і співавт., 1985), навантаженими ДНК ліпосомами

ІМісоїаи і співавт., 1982; Егаієу і співавт., 1979) і рецептор-опосередкованою трансфекцією (Ми апа УУи, 1987; 1988). Деякі з таких методів можна успішно адаптувати для іп мімо або ех мімо використання. М зо Після доставки у клітину експресійний полінуклеотид можна стабільно інтегрувати у геном реципієнтної клітини. Дана інтеграція може відбутися у відповідному місці та орієнтації за допомогою гомологічної с рекомбінації (заміщення гена) або його можна інтегрувати довільно, не поміщаючи у конкретне місце Ге! (аугментація гена). Ще в одних варіантах здійснення даного винаходу нуклеїнову кислоту можна стабільно

Зберігати у клітині у вигляді окремого епісомного сегмента ДНК. Такі сегменти нуклеїнових кислот або ме) "епісоми" кодують послідовності, достатні для збереження і реплікації синхронно з циклом клітини-хазяїна або ї- незалежно від вказаного циклу.

Один із специфічних варіантів способу доставки іп мімо білка або пептиду всередину клітини хребетного включає стадію введення препарату, що включає фізіологічно прийнятний носій і "голий" полінуклеотид, який оперативно кодує поліпептид, що представляє інтерес, у внутрішньотканинному просторі тканини, яка включає « дану клітину, за допомогою чого "голий" полінуклеотид поміщається всередину клітини, і володіє фізіологічною з с дією. Це особливо застосовно для перенесення іп мігго, але можна також застосувати і для іп мімо.

Композиції для використання іп міго та іп мімо, що включають "голий" полінуклеотид, (описані у заявці ;» РСТ МоуУуО 90/11092 (Міса! Іпс.), а також у заявці РСТ Мо 95/11307 (Іпзійцшї Разіециг, ІМ5ЕКМ, Опімегейе аОКауа), а також у статтях Тасвоп і співавт, (1996) і Ниоудеп і співавт. (1996).

Ще в одному варіанті даного винаходу перенесення "голого" полінуклеотиду даного винаходу, що включає -І полінуклеотид ну конструкцію даного винаходу, у клітини, можна задіяти за допомогою бомбардування мікрочастинками (біолістика), причому вказані частинки, покриті ДНК, прискорюються до високої швидкості, що ік дозволяє їм пронизувати клітинні мембрани і проникати у клітини без їх пошкодження так, (як описано Кіеїп і

Ге) співавт. (1987).

У додатковому варіанті здійснення даного винаходу полінуклеотид даного винаходу може бути включений у де ліпосому (Спові апа Васспамаї, 1991; Ууопа і співавт., 1980; МісоїЇаи і співавт., 1987). "М У специфічному варіанті здійснення даного винаходу створена композиція для одержання іп мімо описаного у даному описі Сапіоп-білка або поліпептиду. Вона включає "голий" полінуклеотид, що оперативно кодує даний поліпептид, у розчині фізіологічно прийнятного носія, і відповідного для введення у тканину, що визначає ов появу клітин даної тканини, які експресують вказаний білок або поліпептид.

Кількість вектора, яка ін'єкується у бажаний організм-хазяїн, варіює відповідно до місця ін'єкції. Як

Ф) приблизну дозу, у тіло тварини, переважно тіло ссавця, наприклад тіло миші, потрібно ін'єкувати 0,1-100мкг ка вектора.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу вектор відповідно до даного винаходу, можна вводити у во клітину-хазяїна іп міго, переважно у клітину-хазяїна, заздалегідь взяту у тварини, яка піддається лікування,

Її більш переважно у соматичну клітину, таку як клітина м'язів. На наступній стадії клітину, яку трансформували вектором, що кодує необхідний Сапіоп-поліпептид або необхідний його фрагмент, реінтродукують у тіло тварини для того, щоб доставити рекомбінантний білок у дане тіло або місцево, або системно. 65 Клітини-хазяї

Інша мета даного винаходу включає клітини-хазяї, трансформовані або трансфіковані описаними у даному -58в-

описі полінуклеотидами, і, зокрема, полінуклеотидом, що включає Сапіоп-регуляторний полінуклеотид або послідовність Сапіоп-поліпептиду, що кодує, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ Моз 1-4 або їх фрагментів або варіантів. Включені також клітини-хазяї, які трансформують (прокаріотичні клітини) або які трансфікують (еукаріотичні клітини) рекомбінантним вектором, таким як один з тих, що описані вище. Зокрема, клітини-хазяї даного винаходу можуть включати будь-який з полінуклеотидів, описаних у розділі "Геномні послідовності Сапіоп-гена", у розділі "Сапіоп-кКДНК-послідовності", у розділі "Ділянки, що кодують", у розділі "Полінуклеотидні конструкції" та у розділі "Олігонуклеотидні зонди і праймери".

Крім того, рекомбінантна клітина-хазяїн, відповідно до даного винаходу, включає полінуклеотид, що містить 70 двоалельний маркер, вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів.

Додаткова рекомбінантна клітина-хазяїн, відповідно до даного винаходу, включає будь-який з описаних у даному описі векторів, зокрема, будь-який з векторів, описаних у розділі "Рекомбінантні вектори".

Переважними клітинами-хазяями, що використовуються як реципієнти для експресійних векторів даного винаходу, є наступні: а) Прокаріотичні клітини-хазяї: штами ЕЕвзсПпегіспіа соїї (штам ІЕ.ОН5Б-А), Васійив зибійв, ЗаІтопейа

Іурпітигіт і штами видів, подібних Рзейдотопаз, Зігеріотусез і ЗФарпіПососсив.

Б) Еукаріотичні клітини-хазяї: Неї а-клітини (АТСОС М 2СС12; МеССІ12.1; МеСС12.2), См 1-клітини (АТСС

МеССІ 70), СО5-клітини (АТОС МеСтКІ 1650; МеСКІ 1651), 51-9-клітини (АТОС МеСКІ 1711), С127-клітини (АТОС

МеСтТІ-1804), 33 (АТССС МеСтІ-6361), СНО (АТС Мессі -61), 293-клітини нирок людини (АТСС Ме45504;

МеСтІ-1573) ії ВНК (ЕСАСС Ме84100501; Ме84111301). с) Інші клітини-хазяї ссавців.

Експресія Сапіоп-генів у клітинах ссавців, передусім людини, може виявитися дефектною або ж вона може здійснюватися внаслідок вставки геномної Сапіоп-послідовності або кКДНК-послідовності Сапіоп із заміною копії

Сапіоп-гена у геномі клітини тварини на Сапіоп-полінуклеотид відповідно до даного винаходу. Такі генетичні са зміни можна здійснити шляхом гомологічних рекомбінаційних подій з використанням специфічних (5)

ДНК-конструкцій, які були описані вище.

Одним з видів клітин-хазяїв, які можна використовувати, є зиготи ссавців, такі як мишачі зиготи.

Наприклад, мишачі зиготи можна піддати мікроін'єкції виділеною очищенням молекулою ДНК, що представляє інтерес, наприклад, виділеною очищенням молекулою ДНК, яка заздалегідь доведена до концентрації нг/мл для ї- ВАсС-вставок до З нг/мкл для вставок бактеріофага Р1 в 10мМ Трис-НСЇ, рН7 4, 250мкМ ЕДТА, що містить 100ММ сч масі, ЗОмкМ сперміну і 7ОмкМ спермідину. При мікроін'єкції ДНК великого розміру можна використовувати поліаміни і високі концентрації солі для того, щоб виключити механічне пошкодження даної ДНК, (як описано Ге) зепеаді і співавт. (19936)|. Ф

Будь-який з полінуклеотидів даного винаходу, включаючи описані у даному описі ДНК-конструкції, можна ввести в ембріональну стовбурову (Е5) клітинну лінію, переважно мишачу Еб-клітинну лінію. Еб-клітинні лінії че одержують з плюрипотентних, некомітованих клітин внутрішньої клітинної маси преімплантованих бластоцист.

Переважними Ез5-клітинними лініями є наступні: ЕЗ-Е14702а (АТСС пеСтІ-1821), Е5-ОЗ (АТС пес -1934 і пеСКІ-11632), М5О0О1 (АТСС пеСКІ-11776), 36,5 (АТС пеСКІ-11116). Для збереження Еб-клітин. у « некомітованому стані, їх культивують у присутності фідерних клітин з пригніченим ростом, які створюють відповідні сигнали, що охороняють цей ембріональний фенотип і служать як матрикс для адгезії Еб-клітини. о) с Переважними фідерними клітинами є первинні ембріональні фібробласти, які утворюються з тканини "» 13-14-денних ембріонів практично будь-якого мишачого штаму, що підтримуються у культурі так, (як це описано у " Арропаапго і співавт. (1993)), і ріст яких пригнічується внаслідок опромінення так, |Як описано у Кобегізоп (1987)), або у присутності концентрації ГІР, що інгібує, так, (як описано у Реазе апа УМіШПатзвг (1990).

Конструкції для клітин-хазяїв можна використовувати традиційним чином для одержання генного продукту, - що кодується рекомбінантною послідовністю. о Після трансформації відповідного хазяїна і росту даного хазяїна до належної клітинної щільності, вибраний промотор індукують відповідними засобами, такими як температурний зсув або хімічна індукція, і клітини ісе) культивують протягом додаткового періоду. г 20 Клітини збирають, як правило, центрифугуванням, руйнуванням за допомогою фізичних або хімічних засобів, і одержаний неочищений екстракт залишають для подальшого очищення. "м Мікробні клітини, що використовуються для експресії білків, можна зруйнувати будь-яким зручним способом, включаючи циклічне заморожування-відтавання, ультразвукову обробку, механічне руйнування або використовуючи агенти, що лізують клітини. Такі способи добре відомі фахівцям у даній області техніки. 29 Трансгенні тварини

ГФ! Терміни "трансгенні тварини" або "тварини-хазяї", використовують у даному описі для позначення тварин, які, володіючи своїм геном, піддаються генетичному і штучному впливу так, що включають одну з нуклеїнових о кислот даного винаходу. Переважними тваринами є ссавці, які не відносяться до людського роду, і включають ссавців, що належать роду, вибраному з Мивз (наприклад миші), Кайиз (наприклад щури) і Огусіода|Шв5 60 (наприклад кролики), геном яких штучно і генетично змінюють вбудовуванням нуклеїнової кислоти даного винаходу. В одному з варіантів здійснення даний винахід включає в себе ссавців-хазяїв, що не належать до людського роду, і тварин, що включають рекомбінантний вектор даного винаходу або Сапіоп-ген, зруйнований гомологічною рекомбінацією за допомогою нокаутного вектора.

Трансгенні тварини даного винаходу, всі, включають у великій кількості своїх клітин клоновану бо рекомбінантну або синтетичну ДНК-послідовність, одну з виділених очищенням або виділених нуклеїнових кислот, що включають послідовність, яка кодує Сапіоп, Сапіоп-регуляторний полінуклеотид, полінуклеотидну конструкцію або ДНК-послідовність, що кодує антисмисловий полінуклеотид, такий як описаний у даному докладному описі.

Як правило, трансгенна тварина, відповідно до даного винаходу, включає будь-який один з полінуклеотидів, рекомбінантних векторів і клітин-хазяїв, описаних у даному винаході. Зокрема, трансгенні тварини даного винаходу можуть включати будь-який з полінуклеотидів, описаних у розділі Теномні послідовності Сапіоп-гена", у розділі "Сапіоп-кДНК-послідовностію, у розділі "Ділянки, що кодують", у розділі "Полінуклеотидні конструкції", у розділі "Олігонуклеотидні зонди і праймери", у розділі "Рекомбінантні вектори" та у розділі "Клітини-хазяї". 70 Крім того, трансгенні тварини, відповідно до даного винаходу, містять у своїх клітинних тілах і/або у своїх лініях зародкових клітин полінуклеотид, що включає двоалельний маркер, вибраний з групи, яка складається з А1-А18 та їх комплементів.

У першому переважному варіанті здійснення даного винаходу трансгенні тварини можуть являти собою хороші експериментальні моделі з метою вивчення різноманітних патологій, зв'язаних з клітинною 7/5 диференціацією, зокрема, трансгенні тварини, у геном яких вбудовують одну або декілька копій полінуклеотиду, що кодує нативний Сапіоп-білок, або, альтернативно, мутантний Сапіоп-білок.

В іншому переважному варіанті здійснення даного винаходу трансгенні тварини можуть експресувати необхідний поліпептид, що представляє інтерес, під контролем регуляторних полінуклеотидів Сапіоп-гена, приводячи до хорошого виходу у синтезі даного білка що представляє інтерес, і, зрештою, до тканинноспецифічної тканинної експресії даного білка, що представляє інтерес.

Створення трансгенних тварин даного винаходу можна здійснити відповідно до загальноприйнятих методик, добре відомих фахівцям у даній області техніки. Додаткові подробиці, що відносяться до одержання трансгенних тварин і специфічно трансгенних мишей, можна знайти, |наприклад, у Патентах США МоМо4873191, 5464764 і 5789215), кожний з яких включений тут за допомогою посилання. сч

Трансгенні тварини даного винаходу одержують шляхом застосування методів, які дають тварину з геномом, в який введений екзогенний генетичний матеріал. Даний метод включає одержання генетичного матеріалу або і) його частини, який кодує послідовність, що кодує Сапіоп, Сапіоп-регуляторний полінуклеотид або

ДНК-послідовність, що кодує Сапіоп-антисмисловий полінуклеотид, такий як описаний у даному описі.

Рекомбінантний полінуклеотид даного винаходу вбудовують в ембріональну або в ЕбЗ-стовбурову клітинну Кк.

Зо Лінію. Дану вставку переважно здійснюють з використанням електропорації так, |Як описано у Тпотазг і співавт. (1987)). Вказані клітини піддають електропорації та скринують (наприклад, шляхом відбору за допомогою с селективних маркерів, ПЛР або за допомогою Саузерн-блот-аналізу), щоб виявити позитивні клітини, які Ге! інтегрували екзогенний рекомбінантний полінуклеотид у свій геном, переважно за допомогою гомологічної рекомбінантної події. Відповідно до даного винаходу можна використовувати ілюстративний (22) позитивно-негативний метод відбору, |описаний Мапзоиг і співавт. (1988). ї-

Потім позитивні клітини виділяють, клонують та ін'єкують у 3,5-денні бластоцисти мишей так, (як описано у

Вгадієу (1987)). Дані бластоцисти вводять потім самці тварини-хазяїна і дозволяють рости до умовного моменту.

Альтернативно, позитивні Еб-клітини приводять у контакт з 2,5-денними ембріонами на 8-16-клітинній стадії (морула) так, (як описано у МУсод і співавт. (1993) або у Маду і співавт. (1993)), Еб-клітини, які « Інтерналізуються з великою колонізацією бластоцисти, включають клітини, які дадуть початок зародковій лінії. з с Потомство хазяйської самки тестують, щоб визначити, які тварини є трансгенними, наприклад, включають екзогенну ДНК-послідовність, а які являють собою дикий тип. ;» Таким чином, даний винахід включає також в себе трансгенну тварину, яка містить нуклеїнову кислоту, рекомбінантний експресійний вектор або рекомбінантну клітину-хазяїна, відповідно до даного винаходу.

Рекомбінантні клітинні лінії, одержані від трансгенних тварин даного винаходу -І Додаткова мета даного винаходу включає рекомбінантні клітини-хазяї, одержані від описаних у даному описі трансгенних тварин. Один з варіантів здійснення даного винаходу включає в себе клітини, одержані від се) ссавців-хазяїв, що не належать до людського роду, і від тварин, які містять рекомбінантний вектор даного со винаходу або Сапіоп-ген, зруйнований гомологічною рекомбінацією за допомогою нокаутного вектора.

Рекомбінантні клітинні лінії можна утворити іп міго з клітин, одержаних з будь-якої тканини трансгенної ю тварини відповідно до даного винаходу, наприклад, шляхом трансфекції культури первинних клітин за "М допомогою векторів, що експресують опс-гени, таких як великий Т-антиген на основі ЗМ40, (як описано у Спо (1989) і Зпаму і співавт. (1991)).

Способи скринування Сапіоп-модуляторів і Сапіоп взаємодіючих сполук

Для багатьох варіантів здійснення даного винаходу створені сполуки, які взаємодіють, зв'язують, активують або пригнічують експресію або активність Сапіоп-поліпептидів, каналів і полінуклеотидів. Такі сполуки можуть (Ф, являти собою яку-небудь органічну або неорганічну сполуку, включаючи, але, не обмежуючись ними, ка поліпептиди, полінуклеотиди, ліпіди, вуглеводи, нуклеотиди, амінокислоти або малі молекули інгібіторів або активаторів. Як вказано в іншому місці даної заявки, такі сполуки придатні для лікування або попередження бо будь-якого з великого числа захворювань або станів. Для лікування або попередження психічних порушень, таких як шизофренія або біполярний розлад, переважно використовувати інгібітори Сапіоп-активності або експресії.

Способи скринування модуляторів Сапіоп-каналу

Сполуки, здатні зв'язуватися з Сапіоп, і сполуки, здатні модулювати Сапіоп-функцію, мають важливе 65 Застосування у лікуванні захворювання. Добре встановлено, що потенціал-залежні ворітні іонні канали, як правило, є лікарськими мішенями, тому що вони фармакологічно доступні, кодуються різними генами і, як правило, функціонують у вигляді угруповань мультимерних білків, що забезпечують високий ступінь функціональної та анатомічної специфічності. Більш того, оскільки іонний канал, відкриваючись і закриваючись, рухає заряджені потенціалчутливі амінокислоти, що приводить до зміни конформаційного стану, іонні канали дозволяють створити стан, який залежить від молекул, що, наприклад, зв'язують лише канали, які знаходяться у стані струмопроведення (активовані) або неструмопроведення (інактивовані).

Крім того, було показано, що велика кількість модуляторів кальцієвих каналів ефективна для лікування або попередження багатьох захворювань і станів. Наприклад, було показано, що інгібітори кальцієвих каналів ефективні проти серцево-судинних захворювань і станів (наприклад, стенокардії, аритмії, гіпертензії), а також /о розладів ЦНС і нейрональних порушень (наприклад, мігреней, неврологічних наслідків інсульту, манії, індукованої нейролептиками пізньої дискінезії, шизофренії, біполярного розладу, порушення больових відчуттів, епілепсії та інших). Крім того, було показано, що агоністи кальцієвих каналів ефективні для різних застосувань, таких як зменшення тривалості та іншим способом дії, що виснажує, місцевої анестезії.

Антагоністи і агоністи Сапіоп-каналів аналогічним чином придатні для лікування або попередження таких та інших захворювань і станів. Наприклад, Сапіоп-антагоністи придатні для лікування або попередження шизофренії та біполярного розладу.

Оскільки активація потенціал-залежних ворітних іонних каналів не потребує зв'язування з агоністами, сполуки переважно скринують проти функціональних Сапіоп-каналів. Аналіз може включати методи функціонального і радіолігандного зв'язування, що застосовуються до клітин (пухирців або мембран), які 2о експресують нативні або клоновані канали, або перевірку цілих клітин. Для аналізу функціональних цілих клітин можна використовувати електрофізіологічні методи, такі як метод фіксації потенціалу. В аналізі можна використовувати будь-який тип потенціал-залежного ворітного каналу, переважно канали типів І, М, і Т. Можна виміряти також кінетику протікання іонів через даний канал, наприклад, з використанням методів флуоресценції, кінцевого радіоактивного індикатора або методів клітинної виживаності. сч

Аналіз можна здійснити з використанням різних токсинів, отрут або сполук, які, зв'язуючись, відкривають або закривають канали |Оепуег і співавт., Огид Оізс. Тодау 3(7):323-332 (1998)), включений у даний опис за і) допомогою посилання у всій його повноті). Один з варіантів здійснення даного винаходу включає в себе використання будь-якого з великого числа відомих агоністів і антагоністів кальцієвих каналів, наприклад, як позитивний або негативний контроль. Приклади придатних відомих антагоністів кальцієвих каналів включають м. зо фенілалкіламіни (наприклад, верапаміл), бензотіазепіни (наприклад, дилтіазем) і дигідропіридини (наприклад, ніфедипін); агоністи кальцієвих каналів включають ЕРІ-64176 і ВАМ К 8644; агоністи натрієвих каналів с включають Ваїгаспоїохіп; а антагоністи натрієвих каналів включають спірадолін, мексилетин, 0-54494А Ге! ((4/-)-цис-3,4-дихлор-М-метил-М-(2-(1-піролідиніл)циклогексилі|Сензамід. Такі сполуки можна також використовувати як "провідні" сполуки, тобто ті, що служать як стартові молекули для створення або виявлення ме) похідних молекул, які специфічно зв'язуються з Сапіоп-каналами або модулюють їх. ї-

У переважних варіантах здійснення даного винаходу аналіз даного винаходу включає спосіб скринінгу кандидатної речовини, що включає наступні стадії: а) створення (ї) зразка або клітини-хазяїна, що містять поліпептид, який включає, в основному такий, що складається, або складається з Сапіоп-білка або його фрагмента, або (ії) рекомбінантної клітини-хазяїна, яка « експресує полінуклеотид, що кодує поліпептид, який включає, в основному такий, що складається або в с складається з Сапіоп-білка або його фрагмента; . 5) одержання кандидатної речовини; а с) приведення у контакт вказаної клітини-хазяїна з вказаною кандидатною речовиною; 4) визначення ефекту вказаної кандидатної речовини на Сапіоп-активність. Визначення ефекту кандидатної речовини на Сапіоп-активність можна здійснити відповідно до добре відомих способів. Переважно, ефект -І кандидатної речовини на Сапіоп-активність являє собою агоністичний або антагоністичний ефект. Як правило, сполука пригнічує Сапіоп, якщо її здатність транспортувати іони (наприклад, Са2-- або Мак) знижується. Сполука ік стимулює Сапіоп, якщо підвищується її здатність транспортувати іони.

Ге) Сапіоп-активність можна виявити при використанні будь-якого відповідного способу. У переважних прикладах

Сапіоп-активність виявляють шляхом вимірювання сигнальної події. Хоча сигнальна подія може включати ю будь-яку відповідну зміну молекулярної характеристики або параметра клітини, не обмежувальні приклади "М сигнальної події включають зміни потоку іонів, такого як зміна утворення потоку Са? або Мах, або Ки, або ферментної активності.

Один з аспектів полягає у відстеженні іонного потоку шляхом вимірювання електрофізіологічних властивостей Сапіоп-каналу з використанням, наприклад, методів вимірювання потоку в одній клітині або на невеликій ділянці мембрани. В інших прикладах використовують флуоресцентну або радіоактивну мітки для

Ф) виявлення переміщення відомої Сапіоп-зв'язувальної сполуки або для виявлення іонного потоку через клітину ка (наприклад, мічений Са? або Маж). Можна використовувати індикатор фізіологічних параметрів клітини, такий, наприклад, як флуоресцентний індикатор клітинної життєздатності. В інших прикладах можна виявляти зміну бо фізичного положення індикатора з тим, щоб використовувати активований флуоресценцією клітинний сортинг для ідентифікації виключення або поглинання фізіологічного індикатора.

Зразок, що використовується для аналізу даного винаходу, містить: (ії) поліпептид або клітину-хазяїна, що експресує поліпептид, який включає, в основному такий, що складається, складається з Сапіоп-білка або його фрагмента, або (ії) рекомбінантну клітину-хазяїна, що експресує полінуклеотид, який кодує поліпептид, що 65 Включає, в основному такий, що складається, складається з Сапіоп-білка або його фрагмента. Переважно,

Сапіоп-аналіз даного винаходу включає використання рекомбінантної клітини-хазяїна, що експресує функціональний Сапіоп-поліпептид. Клітини-хазяї можуть експресувати або включати функціональну альфа-субодиницю Сапіоп-каналу або можуть експресувати або включати одну або декілька додаткових субодиниць іонного каналу, або комплексний іонний канал, що включає Сапіоп. Переважно використовується клітина-хазяїн, яка володіє низькою ендогенною експресією іонного каналу або володіє низькою фоновою провідністю, зокрема Саг- і/або Мак.

Радіолігандне зв 'язування

Одним з аспектів даного винаходу є скринування Сапіоп-каналу шляхом ідентифікації високоафінного ліганду, який зв'язується з сайтом Сапіоп, що представляє інтерес, і переважно володіє необхідним ефектом, що 7/0 Ммодулює, і виявлення здатності сполуки, що випробовується, заміщати вказаний мічений ліганд. Список токсикологічних/фармакологічних агентів, які використовуються в аналізах потенціал-залежних ворітних (Сак,

Мат їі Кжк) каналів приведений у Оепуег і співавт. (вище). Даний спосіб в основному придатний для виявлення сполук, які зв'язуються з одним і тим же сайтом або алостерично з'єднуються з вказаним сайтом, у вигляді міченого ліганду, однак не надають інформації про властивості даної сполуки як про агоніст або антагоніст.

Аналізи, що базуються на флуоресцентній і радіоактивній індикації клітини

В іншому аналізі Сапіоп-функцію можна прослідити шляхом вимірювання зміни внутрішньоклітинної концентрації проникного іона з використанням флуоресцентно індикаторних іонів або радіоактивно індикаторних іонів.

Звичайно, іонні канали, такі як Мо--канали інактивуються протягом мілісекунд після стимуляції потенціалу. 2о Саг-канали не Іінактивуються або у меншому ступені інактивуються і можуть відкриватися при високій

Кі-деполяризації. В аналізах, які базуються на флуоресцентній та радіоактивній індикації клітини,

Сапіоп-канал можна, як правило, активувати за допомогою токсину або будь-якої сполуки, що випробовується, або високою К--деполяризацією, так, щоб даний канал виявився відкритим протягом тривалого періоду часу (аж до декількох хвилин). сч

В аналізах з флуоресценцією використовують доступні флуоресцентні Са2барвники (наприклад, Рішо-3,

Саїсіцт дгееп-1, Молекулярні Зонди, ОК, США). Са2--канали можна активувати деполяризацією мембрани за і) допомогою ізотонічного розчину, а Маж-канали - за допомогою токсину або іншої сполуки, і одержане у результаті нестаціонарне пересування флуоресценції у даній клітині можна виміряти протягом 20-бОсек.

Системи по вимірюванню флуоресценції і прилади додатково описуються у Оепуег і співавт. (вище). Радіоактивні М зо індикатори 22Матк і 14С-гуанідин звичайно використовують для аналізу Мо--каналів, а 45Са?- використовують для аналізу Са?-каналів. У переважному варіанті, описаному у Оепуег і співавт. (вище), високопродуктивний с клітинний аналіз Сапіоп здійснюють з використанням сцинтиляційних Суозіаг-Т-мікроплашок (Атегзпат Ге!

Іпіегпайопаї, О.К).

У подальших аналізах функцію Са2--іонного каналу відстежують шляхом вимірювання мембранного ме) потенціалу за допомогою індикатора мембранного потенціалу. Високий електричний опір біологічних мембран ї- дозволяє малим іонним потокам через плазматичну мембрану викликати великі зміни мембранного потенціалу.

Таким чином, аналіз потенціалу зручно використовувати для виявлення спільного іонного потоку Через мембрани. Клітинні лінії, як правило, вибирають так, щоб мінімізувати дію ендогенних іонних каналів. Ряд барвників, доступних як індикаторні барвники мембранного потенціалу, діляться на барвники швидкої і повільної « відповіді, а також на потенціал-сенсорні барвники, що базуються на ЕКЕТ |Айгога Віозсіепсез, СА, США; огляд з с Сопзлаїе? і співавт., Огид Оівс. Тодау 4(9):431-439(1999)).

Життєздатність клітин з В аналізах життєздатності клітин активність іонних каналів і потік іонів безпосередньо зв'язані з життєздатністю клітини. Клітинні системи дріжджів і ссавців придатні для тестування іонного каналу-мішені.

Наприклад, використовують дріжджову систему, представлену іон-специфічною, дефіцитною за поглинанням -І Киіклітинною лінією Засспаготусевз сегемізіде, в якій функціональний Ка-канал, що представляє інтерес, експресується у даній клітинній лінії, відновлюючи тим самим поглинання Ки і сприяючи клітинному виживанню ік ІАпдегвоп і співавт. Зутр. Зос. Ехр. Віої. 48:85-97 (1994)). Такий аналіз для Са? або Маж-каналів можна

Ге) застосовувати для ідентифікації сполук, здатних блокувати Сапіоп-функцію. Доступні також клітинні системи ссавців, такі як Мо--канали, що аналізуються з використанням колориметричних даних по життєздатності ю нейробластомних клітин ссавців. Клітини обробляють за допомогою відкривача Мож-каналів та інгібітору "М Мазт/Ки-насоса, щоб сприяти створенню летального надлишку внутрішньоклітинного Маж. Обробка за допомогою сполуки, що випробовується, здатної блокувати дані канали, буде збільшувати клітинну життєздатність, а сполуки, які посилюють відкривання каналів, у подальшому будуть сприяти загибелі клітин (Мапаоег і співавт., б паї. Віоспет. 214:190-194 (1993).

Електрофізіологія

Ф) Електрофізіологічні методи фіксації потенціалу включають вимірювання іонного струму, що протікає через ка один або велику кількість каналів. Єдиним мікроелектродом контролюють мембранний потенціал, коли електричний струм вимірюють в окремій клітині або на невеликій ділянці мембрани |ІНатіїЇ, Редеге Агсйп. 391, 6о /85-100 (1981). Іонний струм можна, отже, виміряти в присутності або за відсутності сполуки, яка представляє інтерес, що випробовується. Була створена система для скринінгу великого числа сполук (Мецйгозеагсп А/5,

Сіовігир, Данія; ОІезеп і співавт., МоМаде даїедй іоп спаппе! тоаціайгв, 7-8 ЮОесетрбег, РпйадеІрпіа РА, США (1995); Оепуег і співавт., вище).

Способи скринування речовин, що взаємодіють з Сапіоп-поліпептидом 65 Для мети даного винаходу під лігандом мають на увазі молекулу, таку як білок, пептид, антитіло або будь-яку синтетичну хімічну сполуку, здатну зв'язуватися з Сапіоп-білком або з одним з його фрагментів або варіантів, або модулювати експресію полінуклеотиду, що кодує Сапіоп, його фрагмент або варіант.

Відповідно до даного винаходу у способі скринування ліганду біологічний зразок або вказану молекулу, яку випробовують як передбачуваний ліганд Сапіоп-білка, приводять у контакт з відповідним виділеним очищенням

Сапіоп-білком, наприклад, з відповідним очищеним рекомбінантним Сапіоп-білком, одержаним за допомогою рекомбінантної клітини-хазяїна, як описано вище, з тим, щоб створити комплекс між даним білком і передбачуваною лігандною молекулою, що випробовується.

Як ілюстративний приклад, для вивчення взаємодії Сапіоп-білка або фрагмента, який включає безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з б амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 амінокислот, більш /о переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 або 1000 амінокислот ЗЕО ІЮ Мо 5, з лікарським засобом або з малими молекулами, такими як молекули, одержані за допомогою методів комбінаторної хімії, можуть бути використані метод мікродіалізу, з'єднаний з ВЕРХ, (описаний У/апад і співавт. (1997)), або метод капілярного електрофорезу за спорідненістю, | описаний Визв і співавт. (1997)), розкриття яких включене за допомогою посилання.

У додаткових способах пептиди, лікарські засоби, жирні кислоти, ліпопротеїни або малі молекули, які взаємодіють з Сапіоп-білком або з фрагментом, який включає безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 6 амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІО Мо 5, можуть бути ідентифіковані з використанням аналізів, таких як ті, що йдуть нижче. Молекулу, що випробовується на зв'язування, мітять міткою, яка детектується, такою як флуоресцентна, радіоактивна або ферментна мітка, і поміщають для контактування з іммобілізованим

Сапіоп-білком або його фрагментом в умовах, що дозволяють відбуватися специфічному зв'язування. Після видалення молекул, що неспецифічно зв'язалися, молекули, які зв'язалися детектують з використанням відповідних засобів.

Інша мета даного винаходу включає способи і набори для скринування кандидатних речовин, які взаємодіють с дв З Сапіоп-поліпептидом.

Даний винахід відноситься до способів скринування речовин, що представляють інтерес, які взаємодіють з (8)

Сапіоп-білюом або з яким-небудь його фрагментом або варіантом. Виходячи з їх здатності зв'язуватися ковалентно або нековалентно з Сапіоп-білюом або з його фрагментом або варіантом, дані речовини або молекули можуть переважно використовуватися іп мігго та іп мімо. М зо Вказані молекули, що взаємодіють, можуть використовуватися іп міго як детекційні засоби ідентифікації присутності Сапіоп-білка у зразку, переважно у біологічному зразку. с

Спосіб для скринування кандидатної речовини, включає наступні стадії: Ге! а) створення поліпептиду, що включає, в основному складається, складається з Сапіоп-білка або фрагмента, що включає безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з б амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 ме) амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮ Мо 5; ї- 5) одержання кандидатної речовини; с) приведення у контакт вказаного поліпептиду з вказаною кандидатною речовиною; а) виявлення комплексів, утворених між вказаним поліпептидом і вказаною кандидатною речовиною.

Крім того, у даному винаході розглядається набір для скринування кандидатної речовини, що взаємодіє з «

Сапіоп-поліпептидом, де вказаний набір включає: з с а) Сапіоп-білок, що володіє амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з . амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮО Мо 5 або її пептидного фрагмента, що включає безперервну ділянку и? послідовності, щонайменше, з б амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮ Мо 5;

Б) факультативно, засоби, придатні для виявлення комплексу, утвореного між Сапіоп-білююом або його -І пептидним фрагментом або варіантом і кандидатною речовиною.

У переважному варіанті здійснення даного винаходу в описаному вище наборі, детекційні засоби включають ік моноклональні або поліклональні антитіла, направлені проти Сапіоп-білка або його пептидного фрагмента або

Ге) варіанта.

Можна проаналізувати різноманітні кандидатні речовини на взаємодію з Сапіоп-поліпептидом. Дані речовини о або молекули включають, без обмеження, природні або синтетичні органічні сполуки або молекули біологічного

І походження, такі як поліпептиди. Якщо кандидатна речовина або молекула включає поліпептид, то поліпептид може являти собою експресійний продукт, одержаний з фагового клону, що відноситься до довільно створеної пептидної бібліотеки на основі фага, або, альтернативно, даний поліпептид може являти собою експресійний ов продукт, одержаний з кКДНК-бібліотеки, клонованної у вектор, придатний для здійснення дигібридного аналізу, що скринує. (Ф, Даний винахід відноситься також до наборів, придатних для здійснення описаного вище способу ка скринування. Переважно, такі набори включають Сапіоп-поліпептид або його фрагмент або варіант і, факультативно, засоби, придатні для виявлення комплексу, утвореного між Сапіоп-поліпептидом або його бо фрагментом або варіантом і даною кандидатною речовиною. У переважному варіанті здійснення даного винаходу детекційні засоби включають моноклональні та поліклональні антитіла, специфічні до відповідного

Сапіоп-поліпептиду або його фрагмента або варіанта.

А. Ліганди-кандидати, одержані з довільних пептидних бібліотек

У конкретному варіанті здійснення способу скринування даного винаходу, передбачуваний ліганд являє 65 собою експресійний продукт ДНК-вставки, що міститься у фаговому векторі (Рагтіеу апа Зтіїй, 1988). У цьому випадку використовуються довільні пептидні бібліотеки на основі фагів. Довільні ДНК-вставки кодують пептиди довжиною 8-20 амінокислот |ОІдепригд К.К. і співавт., 1992; Маіадоп Р., і співавт., 1996; І исаз А.Н., 1994;

МУезієегіпк М.А.0., 1995; Реїїсі Р. і співавт., 1991). Відповідно до цього конкретного варіанта, рекомбінантні фаги, що експресують білок, який зв'язується з іммобілізованим Сапіоп-білком, зберігається, а комплекс, утворений між Сапіоп-білююм і рекомбінантним фагом, можна згодом імунопреципітувати за допомогою поліклонального або моноклонального антитіла, специфічного до Сапіоп-білка.

Після того як лігандну бібліотеку у рекомбінантних фагах сконструювали, фагову популяцію приводять у контакт з іммобілізованим Сапіоп-білком. Потім одержані комплекси відмивають для того, щоб видалити рекомбінантні фаги, які неспецифічно зв'язалися. Фаги, які специфічно зв'язалися з Сапіоп-білююм, елююють 70 буфером (кислий рН) або імунопреципітують моноклональним антитілом, що продуковане у гібридомій анти-Сапіоп, і дану фагову популяцію згодом розмножують за допомогою понадінфікованих бактерій (наприклад,

Е. сої). Селекційну стадію можна повторити декілька разів, переважно 2-4 рази, для того, щоб відібрати більш специфічні рекомбінантні фагові клони. Остання стадія включає характеристику даного пептиду, що продукований рекомбінантним фаговим клоном, або шляхом експресії в інфікованих бактеріях і виділення, /5 експресуючи фагову вставку в іншій системі "хазяїн-векторна ДНК", або секвенуванням даної вставки, що міститься у відібраних рекомбінантних фагах.

В. Ліганди-кандидати, одержані за допомогою конкурентних експериментів

Альтернативно, пептиди, лікарські засоби або малі молекули, які зв'язуються з Сапіоп-білком або фрагментом, що включає безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з б амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот

ЗЕО ІЮО Мо 5, можна ідентифікувати у конкурентних експериментах. У таких аналізах Сапіоп-білок або його фрагмент, іммобілізують на поверхні, такій як пластмасовий планшет. Кількості пептидів, лікарських засобів або малих молекул, що збільшуються, контактують з іммобілізованим Сапіоп-білююом або його фрагментом в присутності відомого ліганду Сапіоп-білка, що виявляється за допомогою мітки. Наприклад, Сапіоп-ліганд можна сч об позначити міткою за допомогою флуоресцентного, радіоактивного або ферментного мічення. Здатність молекули, що випробовується, зв'язувати Сапіоп-білок або його фрагмент, визначають вимірюванням кількості і) мітки, що виявляється, у відомому ліганді, який зв'язався у присутності даної тест-молекули. Зменшення кількості відомого ліганду, що зв'язалася з Сапіоп-білюом або його фрагментом, за наявності тест-молекули, свідчить про те, що дана тест-молекула здатна зв'язуватися з Сапіоп-білком або його фрагментом. М зо С. Ліганди-кандидати, одержані за допомогою афінної хроматографії

Білки або інші молекули, що взаємодіють з Сапіоп-білком або фрагментом, який включає безперервну с ділянку послідовності, щонайменше, з б амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 амінокислот, більш Ге! переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮО Мо 5, можна індукувати за допомогою афінної хроматографії. У такому аналізі Сапіоп-білок або його фрагмент можна приєднати до колонки ме) зв З використанням традиційних методів, у тому числі хімічно зв'язати з відповідною зв'язувальною речовиною ї- колонки, такою як агароза, Ай (зе або з іншими матрицями, добре відомими фахівцям у даній області техніки.

Для деяких варіантів здійснення даного способу афінна колонка містить химерні білки, в яких Сапіоп-білок або його фрагмент, з'єднаний шляхом злиття з глутатіон-з-трансферазою (55). Суміш клітинних білків або пул експресованих білків, які описані вище, наносять на афінну колонку. Білки або інші молекули, які взаємодіють « 40. 3 Сапіоп-білком або його фрагментом, що приєднують до даної колонки, можна потім виділити і проаналізувати пт) с 20-гель-електрофорезом, (як описано у Катипзепа і співавт. (1997)), розкриття якого включене за допомогою . посилання. Альтернативно, білки, що утримуються на даній афінній колонці, можна виділити очищенням и?» способами, які базуються на електрофорезі, і секвенувати. Той же самий спосіб можна використовувати для виділення антитіл, для скринування продуктів фагового дисплея або для скринування антитіл людини фагового

ДИСПЛЕЯ. -І р. Ліганди-кандидати, одержані за допомогою способів оптичного біосенсора

Білки, які взаємодіють з Сапіоп-білююом або з фрагментом, що включає безперервну ділянку послідовності, се) щонайменше, з 6 амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12,

Ге) 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮО Мо 5, можна також скринувати з використанням Оптичного Біосенсора, як описано у Едмагаз апа І еаіеграгтом/ (1997), а також у 52або і співавт. (1995), розкриття яких о включене за допомогою посилання. Даний спосіб дозволяє виявляти взаємодію між молекулами у реальному

І часі, без необхідності мітити молекули. Даний метод базується на явищі поверхневого плазмового резонансу (ЗРК). Коротко, молекулу ліганду-кандидата, що тестується, приєднують до поверхні (такої як карбоксиметилдекстранова матриця). Промінь світла, направлений на сторону поверхні, яка не містить зразка, дв що тестується, відбивається вказаною поверхнею. Ефект ЗРК викликає зменшення інтенсивності відбитого світла, що взаємозв'язане з певним кутом і довжиною хвилі. Зв'язування молекул ліганду-кандидата обумовлює

Ф) зміну коефіцієнта заломлення на поверхні, зміна якого виявляється у вигляді зміни З5РЕ-сигналу. Для ка скринування молекул ліганду-кандидата або речовин, які здатні взаємодіяти з Сапіоп-білююом або його фрагментом, Сапіоп-білок або його фрагмент іммобілізують на поверхні. Дана поверхня включає одну сторону бо Клітини, через яку протікає молекула-кандидат, що аналізується. Зв'язування молекули-кандидата до

Сапіоп-білка або його фрагмента виявляється у вигляді зміни ЗРЕ-сигналу. Молекули-кандидати, що тестуються, можуть являти собою білки, пептиди, вуглеводи, ліпіди або малі молекули, утворені за допомогою комбінаторної хімії. Даний метод можна також здійснювати шляхом іммобілізації еукаріотичних або прокаріотичних клітин або ліпідних везикул, що демонструють на своїй поверхні Сапіоп-білок, який ендогенно 65 або рекомбінантно експресують.

Основна перевага даного способу полягає у тому, що він дозволяє визначити швидкість зв'язування

Сапіоп-білка і молекул, які взаємодіють з Сапіоп-білююом. Таким чином представляється можливим спеціально вибрати лігандні молекули, що взаємодіють з Сапіоп-білком або з його фрагментом, завдяки константам сильної або, навпаки, слабкої асоціації.

Е. Ліганди-кандидати, одержані за допомогою дигібридного аналізу, що скринує

Для вивчення іп мімо взаємодій білок-білок створена дріжджова дигібридна система (Ріеіаз апа Зопа, 1989), що базується на злитті білка-затравки з ДНК-зв'язувальним доменом дріжджового Са14-білка. Даний метод описаний у Патентах США МоМо5667973 і 5283173 (Ріеідз і співавт.)), представлені там методичні вказівки включені за допомогою посилання. 70 Основну операцію скринування бібліотеки за допомогою дигібридного аналізу можна здійснити (як описано у

Нагрег і співавт. (1993), у Спо і співавт. (1998) або у Еготопі-Касіпе і співавт. (1997)).

Затравковий білок або поліпептид включає, складається в основному або складається з Сапіоп-поліпептиду або фрагмента, що включає безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з б амінокислот, переважно, щонайменше, 8-10 амінокислот, більш переважно, щонайменше, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот у75 ЗЕ ИО Мо 5.

Більш точно, нуклеотидну послідовність, що кодує Сапіоп-поліпептид, його фрагмент або варіант, з'єднують шляхом злиття з полінуклеотидом, що кодує ДНК-зв'язувальний домен СА 4-білка, причому одержану злиту нуклеотидну послідовність вбудовують у відповідний експресійний вектор, наприклад, рА52 або рМ3.

Потім у спеціально створеному векторі конструюють кКДНК-бібліотеку людини так, щоб кКДНК-вставка людини

Зпливалася з нуклеотидною послідовністю у векторі, який кодує транскрипційний домен САЇ 4-білка. Переважно, даний вектор, що використовується, являє собою рАСтТ-вектор. Поліпептиди, які кодуються нуклеотидними вставками з кКДНК-бібліотеки людини, є поліпептидами- "здобиччю".

Третій вектор містить маркерний ген, що детектується, такий як бета-галактозидазний ген або САТ-ген, який поміщають під контроль регуляторної послідовності, яка є відповідальною за зв'язування повнорозмірного сч

СаіІ4-білка, що містить домен активації транскрипції і ДНК-зв'язувальний домен. Можна використовувати, наприклад, рОо5ЕС-вектор. і)

Використовуються також два різних дріжджових штами. Як ілюстративний, але не обмежувальний приклад, два різних дріжджових штами можуть бути наступними штамами: - М190, фенотип якого являє собою (МАТАа, І еш2-3, 112 игаз-12, їгр1-901, піз3-0200, аде2-101, да4Ода!вор М з0 УКАЗ БАЇ-І ас, І УЗ ЗАЇІ-НІЗЗ, сум); - М187, фенотип якого являє собою (МАТа, даї14, даї!80, піз3, (гр1-901, аде2-101, ига3-52, Іеи2-3, -112ОКАЗ с

САЇ -Іас/тегї), який являє собою тип спарювання протилежний У190. Ге»!

Коротко, 20 мкг рАЗ2/Сапіоп і 20мкг рАСТ-КДНК-бібліотеки котрансформують у дріжджовий штам У190.

Одержані трансформанти відбирають за ростом на мінімальному середовищі без гістидину, лейцину і о триптофану, але такому, що містить інгібітор синтезу тистидину З3-АТ (5ОММ). Позитивні колонії скричують на р бета-галактозидазу за допомогою аналізу відбитків на фільтрі. Потім подвійні позитивні колонії (Нів", реїа-да!") вирощують на чашках без гістидину, лейцину, але з триптофаном і циклогексімідом (1Омг/мл) для відбору колоній з втраченими рАб82/Сапіоп-плазмідами, але такими, що зберегли плазміди рАСТ-кДНК-бібліотеки. «

Одержані У190-штами спарюють з У187-штамами, які експресують Сапіоп або неспоріднені контрольні білки; такі як циклофілін В, ламін або ЗМЕ1, у вигляді СаІ4-химер, (як описано у Нагрег і співавт. (1993) і у Вгат і - с співавт. (Вгат Ку і співавт., 1993)), і скринують на бета-галактозидазу за допомогою аналізу скринування а колоній на фільтрі. Дріжджові клони, які являють собою бБейа даІ- після спарювання з контрольними ,» Саі4-химерами, вважають хибнопозитивними.

В іншому варіанті здійснення дигібридного способу, відповідно до даного винаходу, взаємодію між Сапіоп або його фрагментом або варіантом з клітинними білками можна оцінити за допомогою Маїсптакег Тмо Нубгіа -і Зувіет 2 (Сааіод Мо К1604-1, Сіопіесп). Як описано в інструкції, що додається до Маїсптакег Тмо Нубгіа со Зувіет 2 (Сайаіюд Мо К1604-1, Сіопіесп), розкриття якої включене у даний опис за допомогою посилання, нуклеїнові кислоти, що кодують Сапіоп-білок або його частину, вбудовують в експресійний вектор так, щоб вони (Се) знаходилися у рамці зчитування з ДНК, яка кодує ДНК-зв'язувальний домен дріжджового транскрипційного т 50 активатора САГ4. Необхідна кКДНК, переважно кКДНК людини, вбудовується у другий експресійний вектор так, щоб вони знаходилися у рамці зчитування з ДНК, яка кодує активаторний домен САЇ4. Дві дані експресійні що плазміди трансформують у дріжджі і трансформовані дріжджі висівають на селективне середовище, яке селектує по експресії селективних маркерів у кожному експресійному векторі, а також САЇ 4-залежній експресії

НІЗЗ-гена. Трансформанти, здатні рости на середовищі без гістидину, скринують на сАЇ 4-залежну |ас7-експресію. Ті клітини, які виявляються позитивними при гістидиновому відборі і Іас7-аналізі, утримують взаємодію між Сапіоп та білком або пептидом, що кодується початково вибраною кДНК-вставкою. о Спосіб скринування речовин, які взаємодіють з регуляторними послідовностями Сапіоп-гена іме) У даному винаході розглядається також спосіб скринування речовин або молекул, які здатні взаємодіяти з регуляторними послідовностями Сапіоп-гена, такими як, наприклад, промоторна або енхансерна послідовності. 60 Нуклеїнові кислоти, що кодують білки, які здатні взаємодіяти з регуляторними послідовностями Сапіоп-гена, більш переважно з нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з полінуклеотидів 5'-- і

З'-регуляторної ділянки або її фрагмента або варіанта, і переважно варіанта, що включає один з двоалельних маркерів даного винаходу, можуть бути ідентифіковані з використанням моногібридної системи, такої, яка описана у проспекті, що додається до набору Маїсптакег Опе-Нубгій Зузіет від Сіопіесп (Саїаіод Кеї по 65 К1603-1), методичні вказівки якого, представлені у даному описі, включені за допомогою посилання. Коротко, нуклеотидну послідовність-мішень клонують ліворуч від селективної репортерної послідовності, а одержану

ДНК-конструкцію інтегрують у дріжджовий геном (Засспаготусез сегемівіає). Дріжджові клітини, які містять у своєму геномі дану репортерну послідовність, трансформують потім за допомогою бібліотеки, що включає кКДНК, білки-кандидати, які кодують, для зв'язування з регуляторними послідовностями Сапіоп-гена, злиті з послідовностями, що кодують активаторний домен дріжджового фактора транскрипції, такого як сСАЇ4.

Рекомбінантні дріжджові клітини висівають у культуральний бульйон для селекції клітин, які експресують вказану репортерну послідовність. Відібрані таким чином рекомбінантні дріжджові клітини містять злитий білок, який здатний зв'язуватися з регуляторною послідовністю-мішенню Сапіоп-гена. Після чого КДНК, що кодують злиті білки, секвенують і їх можна клонувати іп міго в експресійний або транскрипційний вектори. Зв'язування 70 поліпептидів, що кодуються, з регуляторними послідовностями-мішенями Сапіоп-гена можна підтвердити методами, відомими фахівцям у даній області техніки, такими як метод затримки у гелі або метод захисту від

ДНкКази.

Метод затримки у гелі можна також здійснити незалежно для того, щоб скринувати молекули-кандидати, які здатні взаємодіяти з регуляторними послідовностями Сапіоп-гена так, (як описано у Егіеа апа СтгоїНегз (1981), /5 У батег апа Кеуліп (1981) ї у Оепі апа Гаїсптап (1993)), методичні вказівки представлених там публікацій включені за допомогою посилання. Дані методи базуються на принципі, відповідно до якого фрагмент ДНК, який зв'язується з білком, мігрує повільніше, ніж такий же ДНК-фрагмент, що не зв'язався. Коротко, мітять нуклеотидну послідовність-мішень. Потім мічену нуклеотидну послідовність-мішень приводять у контакт або з тотальним ядерним екстрактом з клітин, що містить фактори транскрипції, або з різними 2о Ммолекулами-кандидатами, що тестуються. Взаємодію між регуляторною послідовністю-мішенню Сапіоп-гена і молекулою-кандидатом або фактором транскрипції виявляють після гелевого або капілярного електрофорезу завдяки затримці міграції.

Способи скринування лігандів, які модулюють експресію Сапіоп-гена Іншим об'єктом розгляду даного винаходу є спосіб скринування молекул, які модулюють експресію Сапіоп-білка. Такий спосіб скринування сч ов Включає наступні стадії: а) культивування прокаріотичної або еукаріотичної клітини, яку трансформували нуклеотидною і) послідовністю, що кодує Сапіоп-білок, його варіант або фрагмент, поміщеної під контроль свого власного промотору;

Б) приведення у контакт даної клітини, що культивується, і молекули, що тестується; М зо с) кількісної оцінки експресії Сапіоп-білка або його варіанта або фрагмента.

У варіанті здійснення даного винаходу нуклеотидна послідовність, що кодує Сапіоп-білок або його варіант с або фрагмент, включає алель, щонайменше, одного з двоалельних маркерів А12 або А16 та їх комплементів. Ге!

Використовуючи методи рекомбінантних ДНК, добре відомі фахівцям у даній області техніки, послідовність

ДНК, що кодує Сапіоп-білок, вбудовують в експресійний вектор, праворуч від його промоторної послідовності. Як ме) ілюстративний приклад, промоторна послідовність Сапіоп-гена міститься у нуклеїновій кислоті 5'-регуляторної ї- ділянки.

Кількісну оцінку експресії Сапіоп-білка можна здійснити або на рівні мРНК, або на білковому рівні. В останньому випадку можна використовувати поліклональні або моноклональні антитіла для вимірювання кількості синтезованого Сапіоп-білка, наприклад, в ЕГІЗА або КіІА-аналізом. «

У переважному варіанті здійснення даного винаходу кількісне вимірювання Сапіоп-мМмРНК здійснюють за з с допомогою кількісної ПЛР-ампліфікації КДНК, одержаної за допомогою зворотної транскрипції тотальної мРНК з культивованих клітин-хазяїв, трасфікованих Сапіоп, з використанням пари праймерів, специфічних для Сапіоп. ;» У даному винаході розглядається також спосіб скринування речовин або молекул, які здатні підвищити або знизити рівень експресії Сапіоп-гена. Такий спосіб може дозволити фахівцеві у даній області техніки вибрати речовини, що виявляють регулюючу дію на рівень експресії Сапіоп-гена, і які можуть бути придатні як активні -І інгредієнти, що включаються у фармацевтичні композиції для лікування пацієнтів, які страждають від будь-якої описаної у даному описі хвороби. і, Таким чином, у даному винаході створений також спосіб скринування кандидатної речовини або молекули, які

Ге) модулюють експресію Сапіоп-гена, причому даний спосіб включає наступні стадії: - створення рекомбінантної клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, де вказана нуклеїнова кислота ю включає нуклеотидну послідовність 5'-регуляторної ділянки або її біологічно активний фрагмент або варіант, "М локалізовану "лівіше" полінуклеотиду, що кодує білок, який виявляється; - одержання кандидатної речовини; і - визначення здатності кандидатної речовини модулювати рівень експресії полінуклеотиду, що кодує білок,

ЯКИЙ ВИЯВЛЯЄТЬСЯ.

У додатковому варіанті здійснення даного винаходу нуклеїнова кислота, що включає нуклеотидну

Ф) послідовність 5'-регуляторної ділянки або її біологічно активний фрагмент або варіант, включає також ка 5БИТЕ-ділянку Сапіоп-кКДНК 5ЕО ІО Мо 4 або її біологічно активні фрагменти або варіанти.

Серед переважних полінуклеотидів, що кодують білок, який виявляється, можна привести полінуклеотиди, бо що кодують бета-галактозидазу, зелений флуоресцентний білок (ЗЕК) і хлорамфеніколацетилтрансферазу (САТ).

Даний винахід відноситься також до наборів, придатних для здійснення описаного у даному описі способу скринування. Переважно, такі набори включають рекомбінантний вектор, який забезпечує експресію нуклеотидної послідовності 5'-регуляторної ділянки або її біологічно активного фрагмента або варіанта, 65 локалізованої "лівіше" і функціонально приєднаної до полінуклеотиду, що кодує білок, який виявляється, або

Сапіоп-білок або його фрагмент або варіант.

В іншому способі скринування кандидатної речовини або молекули, які модулюють експресію Сапіоп-гена, даний спосіб включає наступні стадії: а) створення рекомбінантної клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, де вказана нуклеїнова кислота

Включає 5'ІШіІ-послідовність Сапіоп-к«ДНК 5ЕО ІО Мо 4 або один з її біологічно активних фрагментів або варіантів, причому 5'ШТК-послідовність або її біологічно активний фрагмент або варіант функціонально приєднаний до полінуклеотиду, що кодує білок, який виявляється;

В) одержання кандидатної речовини; і с) визначення здатності кандидатної речовини модулювати рівні експресії полінуклеотиду, що кодує білок, 7/0 Який виявляється.

У конкретному варіанті здійснення вказаного вище способу скринування, нуклеїнова кислота, яка включає нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з Б'ТК-послідовності Сапіоп-кдНК 5ЕО І Мо 4 або з її біологічно активних фрагментів або варіантів, включає промоторну послідовність, яка є ендогенною відносно Сапіоп-5'ОТК-послідовності.

В іншому конкретному варіанті здійснення вказаного вище способу скринування нуклеїнова кислота, яка включає нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5'ЮТК-послідовності Сапіоп--ДНК ЗЕО ІЮ

Мо 4 або одного з її біологічно активних фрагментів або варіантів, включає промоторну послідовність, яка є екзогенною по відношенню до вказаної у даному описі Сапіоп-5'ОТК-послідовності.

У додатковому переважному варіанті здійснення даного винаходу нуклеїнова кислота, що включає

БИТЕК-послідовність Сапіоп-кДНК або ЗЕО ІО Мо 4 або її біологічно активні фрагменти, включає двоалельний маркер, вибраний з групи, яка складається з А12 або А16 або їх комплементів.

Крім того, даний винахід включає набір для скринування кандидатної речовини, що модулює експресію

Сапіоп-гена, де вказаний набір включає рекомбінантний вектор, який включає нуклеїнову кислоту, що включає

БИТЕ-послідовність Сапіоп-кдНК ЗЕО ІО Мо 4 або один з її біологічно активних фрагментів або варіантів, с ов причому дана З'ОТК-послідовність або її біологічно активний фрагмент або варіант функціонально приєднаний до полінуклеотиду, що кодує білок, який виявляється. і)

Рівні експресії і патерни Сапіоп можна аналізувати у гібридизаційному розчині за допомогою довгих зондів, (як описано у Міжнародній Патентній Заявці МоУУО 97/05277)|, повний зміст якої включений у даний опис за допомогою посилання. Коротко, Сапіоп-кДНК або геномну ДНК Сапіоп, описані вище, або їх фрагменти М зо вбудовують у сайт, що клонує, відразу "правіше" від промотору РНК-полімерази бактеріофага (Т3, 77 або 5Рб) для одержання антисмислової РНК. Переважно, Сапіоп-вставка включає, щонайменше, 100 або більше с послідовних нуклеотидів з геномної ДНК-послідовності або з кДНК-послідовностей. Одержану плазміду Ге! лінеаризують і транскрибують у присутності рибонуклеотидів, що включають модифіковані рибонуклеотиди (тобто біотин-ОТР і БІС-ОТР). Надлишок такої подвійно міченої РНК гібридизують у розчині з мРНК, виділеній з ме) клітин або тканин, що представляють інтерес. Гібридизацію здійснюють у стандартних жорстких умовах (40-502С ї- протягом 16 годин в 8095 формаміді, 0,4М Масі-буфері, рН7-8). Зонд, що непрогібридизувався, видаляють шляхом розщеплення рибонуклеазами, специфічними для одноланцюжкової РНК (тобто РНкКази СІ 3, Т1, РАМУ М,

ОЦ2 або А). Наявність біотин-ОТР-модифікації робить можливим поглинання гібриду на планшеті для мікротитрування, покритого стрептавідином. Наявність ОІС-модифікації робить можливим виявлення гібриду і « його кількісну оцінку в ЕГІЗА з використанням антитіла до Біб, з'єднаного з лужною фосфатазою. шщ с Кількісний аналіз експресії Сапіоп-гена можна також здійснити з використанням наборів. Термін "набір", що й використовується у даному описі, означає одновимірне, двовимірне або мультивимірне розташування великої и? кількості нуклеїнових кислот достатньої довжини, які дозволяють специфічно виявляти експресію мРНК, здатних гібридизуватися з ними. Наприклад, набори можуть містити велику кількість нуклеїнових кислот, одержаних з

Генів, для яких оцінюють рівні експресії. Дані набори можуть включати геномну ДНК Сапіоп, кДНК-послідовності -і Сапіоп або послідовності, комплементарні їм або їх фрагментам, зокрема, послідовності, що включають, щонайменше, один з двоалельних маркерів, відповідно до даного винаходу, переважно, щонайменше, один з о двоалельних маркерів А1-А17. Переважно, фрагменти складають, щонайменше, 15 нуклеотидів у довжину. В

Те) інших варіантах здійснення даного винаходу дані фрагменти містять, щонайменше, 25 нуклеотидів у довжину. У деяких варіантах здійснення даного винаходу дані фрагменти містять, щонайменше, 50 нуклеотидів у довжину. де Більш переважно, якщо дані фрагменти містять, щонайменше, 100 нуклеотидів у довжину. В інших переважних "І варіантах фрагменти містять більше 100 нуклеотидів у довжину. У деяких варіантах здійснення даного винаходу дані фрагменти можуть містити більше 500 нуклеотидів у довжину.

Наприклад, кількісний аналіз експресії Сапіоп--ена можна здійснювати за допомогою мікронабору Комплементарної ДНК, |Як описано у Зспепа і співавт. (1995 і 1996)). Повнорозмірні КДНК Сапіоп або їх фрагменти ампліфікують за допомогою ПЛР і викладають з 9б-ямкового планшету для мікротитрування на іФ) силільовані предметні скельця для мікроскопа з використанням високошвидкісної роботехніки. Друковані набори км інкубують у вологій камері, щоб забезпечити обводнення елементів набору, і обполіскують одноразово в 0,290

ЗО5 протягом 1 хв., двічі у воді протягом 1хв., і одноразово протягом 5хв. у розчині борогідриду натрію. Дані бо набори занурюють у воду на 2хв. при 952С, переносять в 0,290 5О5 на 1хв., двічі обполіскують водою, сушать на повітрі і зберігають у темряві при 2526.

Клітинну або тканинну мРНК виділяють або купують, а зонди одержують за допомогою зворотної транскрипції за один цикл. Зонди гібридизують з 1см2 мікронабором під скляним покривним скельцем з розміром 14 х14мм протягом 6-12 годин при 602С. Набори відмивають протягом 5 хв. при 2592С в нежорсткому промивальному бо буфері (1хХ55С/0,296 505), потім протягом 10хв. при кімнатній температурі у дуже строгому промивальному буфері (0,1х55270,295 5053). Набори сканують в 0,1х55С з використанням флуоресцентного лазерного пристрою, що сканує, який співпадає зі звичайним фільтрувальним набором. Точні вимірювання диференційної експресії одержують завдяки середнім співвідношенням двох незалежних гібридизацій.

Кількісний аналіз експресії Сапіоп-гена можна також здійснити за допомогою повнорозмірних кДНК Сапіоп або їх фрагментів у наборі комплементарних ДНК, (як описано у Ріеш і співавт. (1996)). Повнорозмірну

Сапіоп-кДНК або її фрагменти ампліфікують ПЛР і розподіляють на мембранах. Потім мРНК, що походять з різних тканин або клітин, мітять радіоактивними нуклеотидами. Після гібридизації і відмивання в умовах, що контролюються, за допомогою фосфорної візуалізації або радіоавтографією виявляють гібридизовані мРНК. 7/0 Проводять повторні експерименти і потім здійснюють кількісний аналіз мРНК, що по різному експресуються.

Альтернативно, експресійний аналіз з використанням геномної ДНК Сапіоп, кДНК Сапіоп або її фрагментів можна зробити за допомогою нуклеотидних наборів високої щільності, (як описано у І оскКнНагі і співавт. (1996) і

ЗозпомузКу і співавт. (1997)). Олігонуклеотиди у 15-20 нуклеотидів з послідовностей геномної ДНК Сапіоп або

КДНК-послідовностей Сапіоп, особливо тих з них, які включають, щонайменше, один з двоалельних маркерів, 75 Відповідно до даного винаходу, переважно, принаймні, один з двоалельних маркерів, вибраних з групи, яка складається з А1-А17 або комплементарних їм послідовностей, синтезують безпосередньо на чіпі (І осКНаг| і співавт., вище) або синтезують і потім переносять на чіп (ЗозпомузКкі і співавт., вище). Переважно, довжина олігонуклеотидів складає близько 20 нуклеотидів.

Зонди кДНК Сапіоп, мічені за допомогою відповідної сполуки, такої як біотин, дигоксигенін або флуоресцентний барвник, синтезують з відповідної мРНК-популяції і потім фрагментують випадковим чином на шматки розміром 50-100 нуклеотидів. Потім дані зонди гібридизують з чіпом. Після відмивання, як описано у

І осКнагі і співавт., вище, і прикладення різних електричних полів |ЗозпомувКі і співавт., 1997| барвники або мічені сполуки виявляють і кількісно визначають. Здійснюють повторні гібридизації. Порівняльний аналіз інтенсивності сигналу, що йде від кКДНК-зондів на одному і тому ж олігонуклеотиді-мішені у різних зразках с

КДНК, свідчить про різну експресію мРНК Сапіоп.

Способи інгібування експресії Сапіоп-гена о

Інші терапевтичні композиції, відповідно до даного винаходу, включають олігонуклеотидний фрагмент нуклеїнової послідовності Сапіоп як антисмисловий інструмент або триспіральний інструмент, який інгібує експресію відповідного Сапіоп-гена. Переважний фрагмент нуклеїнової послідовності Сапіоп включає алель, ре щонайменше, одного з двоалельних маркерів А1-А17.

Антисмисловий спосіб сч

Переважні способи використання антисмислових полінуклеотидів, відповідно до даного винаходу, Ф представлені методами, (описаними у 5слгакіев! і співавт. (1995)|.

Переважно, антисмислові інструменти вибрані з полінуклеотидів (довжиною 15-200От.п.н.), які є іа

Комплементарними 5-кінцю Сапіоп-мРНК. В іншому варіанті здійснення даного винаходу використовують ї- поєднання різних антисмислових полінуклеотидів, комплементарних різним частинам необхідного гена-мішені.

Переважні антисмислові полінуклеотиди, відповідно до даного винаходу, є комплементарними послідовностям МРНК Сапіоп, які містять кодон ініціації трансляції АТО або донорний, або акцепторний сайт сплайсингу. «

Антисмислові нуклеїнові кислоти повинні володіти довжиною і температурою плавлення, що дозволяють шщ с утворити внутрішньоклітинний дуплекс достатньої стабільності для інгібування експресії Сапіоп-мР НК у цьому й дуплексі. Методологія створення антисмислових нуклеїнових кислот, придатних для використання у генній «» терапії, приводиться (у Огееп і співавт. (1986) та Ігапі апа МУУеіпігао (1984)), розкриття яких включене у даний опис за допомогою посилання.

У деяких методах антисмислові молекули одержують шляхом зміни орієнтації ділянки, що кодує Сапіоп, -І відносно промотору так, щоб транскрибувати ланцюг, протилежний тому, який нормально транскрибується у даній клітині. Антисмислові молекули можна транскрибувати з використанням іп міго систем транскрипції, таких о як ті, що використовують Т7- або ЗРб-полімеразу для створення транскрипту. Інший підхід включає в себе

Те) транскрипцію антисмислових нуклеїнових кислот Сапіоп іп мімо внаслідок функціонального приєднання ДНК, що 5р Містить антисмислову послідовність, до промотору у відповідному експресійному векторі. о Альтернативно, відповідні антисмислові методи являють собою ті методи, |які описані у Коззі і співавт. "І (1991), у Міжнародних Заявках МоМоуУуО 94/23026, УМО 95/04141, УМО 92/18522 і в Європейській Патентній Заявці

МОЕР 0572287А21.

Альтернатива антисмисловій технології, яка використовується відповідно до даного винаходу, включає використання рибозимів, які зв'язуються з послідовністю-мішенню за допомогою їх комплементарних полінуклеотидних хвостів, які розщеплюють відповідну РНК внаслідок гідролізу її сайта-мішені (а саме іФ) рибозимів у формі "голівки молотка"). Коротко, спрощений цикл рибозиму у формі "голівки молотка" включає (1) ко послідовність, що специфічно зв'язується з РНК-мішенню за допомогою комплементарних антисмислових послідовностей; (2) сайт-специфічний гідроліз мотиву, що розщеплюється, ланцюга-мішені; і (3) вивільнення бо продуктів, що розщеплюються, які дають початок іншому каталітичному циклу. Дійсно, використання довголанцюжкового антисмислового полінуклеотиду (щонайменше, довжиною З0 основ) або рибозимів з довгими антисмисловими плечами дає перевагу. Переважна система доставки для антисмислового рибозиму здійснюється внаслідок ковалентного зв'язування таких антисмислових рибозимів з ліпофільними групами або з використанням ліпосом як зручного вектора. Переважні антисмислові рибозими, відповідно до даного винаходу, 65 одержують (як описано у зслгакіе! і співавт. (1995)), причому специфічні методи одержання, на які посилаються у вказаній статті, включені тут за допомогою посилання.

Триспіральний метод

Геномну ДНК Сапіоп можна також використовувати для пригнічення експресії Сапіоп-гена на основі внутрішньоклітинного триспірального утворення.

Триспіральні олігонуклеотиди використовуються для пригнічення транскрипції з геному. Вони особливо придатні для вивчення змін клітинної активності при їх асоціації з конкретним геном.

Аналогічно, частину геномної ДНК Сапіоп можна використовувати для вивчення ефекту інгібування транскрипції Сапіоп у клітині. Традиційно гомопуринові послідовності вважають найбільш придатними для триспіральних методів. Але і гомопіримідинові послідовності також можуть пригнічувати експресію гена. Такі 7/0 Гомопіримідинові олігонуклеотиди зв'язуються з великою борозенкою у гомопурин:томопіримідинових послідовностях. Тому, у рамках даного винаходу розглядаються обидва типи послідовностей геномної ДНК

Сапіоп.

Для здійснення методів генної терапії з використанням триспірального підходу, послідовності геномної ДНК

Сапіоп передусім сканують для того, щоб ідентифікувати 10-мірні - 20-мірні гомопіримідинові або гомопуринові /5 ділянки, які могли б використовуватися у методах, що базуються на трьох спіралях, для пригнічення експресії

Сапіоп. Після ідентифікації кандидатних гомопіримідинових або гомопуринових ділянок, їх ефективність у пригніченні експресії Сапіоп визначають шляхом введення у клітини тканинної культури, в якій експресується

Сапіоп-ген, кількостей олігонуклеотидів, що змінюються, які містять послідовності-кандидати.

Дані олігонуклеотиди можна вводити у клітини з використанням способів, відомих фахівцям у даній області техніки, що включають, але не обмежуються ними, кальцій-фосфатне осадження, ОЕАЕ-Декстран, електропорацію, ліпосом-опосередковану трансфекцію або нативне поглинання.

Оброблені клітини відстежують по зміненій клітинній функції або зниженій Сапіоп-експресії з використанням таких методів, як Нозерн-блотинг, метод захисту від РНКази або методи на основі ПЛР для визначення рівнів транскрипції Сапіоп-гена у клітинах, які були оброблені даним олігонуклеотидом. сч

Олігонуклеотиди, які виявляються ефективними у пригніченні генної експресії у клітинах тканинної о культури, можна потім ввести іп мімо з використанням описаних вище методів антисмислового підходу дозою, розрахованою на основі результатів іп міго, як описано для антисмислового підходу.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу природні (бета) аномери олігонуклеотидних елементів можна замінити альфа-аномерами для надання даному олігонуклеотиду більшої стійкості до нуклеаз. Крім того, агент, М

Зо що інтеркалює, такий як бромистий етидій і т.п., можна приєднати до 3-кінця альфа-олігонуклеотиду, щоб стабілізувати триниткову структуру. Інформацію про утворення олігонуклеотидів, придатних для триниткового с утворення, |див. у роботі сгійіп і співавт. (1989)), яка таким чином включена за допомогою даного посилання. Ге!

Фармацевтичні композиції та рецептурні склади

Сполуки, що модулюють Сапіоп ме)

З використанням описаних у даному описі способів можна ідентифікувати сполуки-агоністи або антагоністи ї-

Сапіоп, які селективно модулюють активність Сапіоп іп міго та іп мімо. Даний винахід включає, таким чином, способи лікування шизофренії, біполярного розладу або будь-які інші описані у даному описі захворювання або стани пацієнтів, що включають введення ефективної кількості сполуки, яка модулює Сапіоп. Переважно, вказана сполука являє собою селективно сполуку, що модулює Сапіоп. Сполуки, які ідентифікуються способом даного « винаходу, включають, наприклад, антитіла, що володіють зв'язувальною специфічністю для Сапіоп-поліпептиду з с людини. Припускається, що гомологи Сапіоп можуть бути придатні для модулювання Сапіоп-опосередкованої активності і зв'язаного з нею фізіологічного стану, асоційованого з шизофренією або біполярним розладом. Крім ;» того, взагалі припускається, що способи аналізу даного винаходу, які базуються на ролі Сапіоп у порушенні центральної нервової системи, можуть бути придатні для ідентифікації сполук, здатних впливати на каскадний аналіз даного винаходу. У переважному варіанті здійснення даного винаходу пацієнта, який страждає -І шизофренією або біполярним розладом, лікують шляхом введення даному пацієнту фармацевтичної композиції, що включає терапевтично ефективну кількість антагоніста Сапіоп. і, Показання

Ге) Незважаючи на те, що Сапіоп зв'язаний з геномною ділянкою, асоційованою з шизофренією та біполярним 5р розладом, показання на використання Сапіоп можуть включати різні порушення центральної нервової системи. о Припускається, що порушення нервової системи володіють комплексною генетичною основою і часто

І характеризуються спільними симптомами. Зокрема, як описано у даному описі, показання можуть включати шизофренію та інші психічні розлади, соціальні розлади, аутизм, залежність від хімічних речовин і алкоголізм, порушення больових відчуттів, епілепсію, затримку психічного розвитку, та інші психічні захворювання, дв Включаючи когнітивну функцію, страх, порушення функції приймання їжі, порушення функції мотивації і розлад особистості, які визначаються відповідно до четвертого видання класифікації Оіадповіз апа зіаїйівіїса! Мапиаї

Ф) ої Мепіа! Оізогаеге (ОЗМ-ІМ). Крім того, багато серцево-судинних розладів, такі як стенокардія, гіпертензія і ка аритмія, можна також лікувати з використанням модуляторів Сапіоп, переважно антагоністів.

Фармацевтичні рецептурні склади і способи введення во Сполуки, ідентифіковані з використанням способів даного винаходу, можна вводити ссавцеві, у тому числі хворій людині, окремо або у вигляді фармацевтичних композицій, в яких вони змішані з відповідними носіями або наповнювачем(ами) у терапевтично ефективних дозах, для лікування або поліпшення стану хворого шизофренією або біполярним розладом і близькими розладами. Терапевтично ефективна доза відноситься ще й до такої кількості сполуки, якої досить для поліпшення симптомів, як визначено описаними у даному описі 65 способами. Переважно, терапевтично ефективне дозування застосовне для тривалого періодичного використання або введення. Методи підбору складу і введення сполук даної заявки можна знайти у "Кетіпдіоп'з

Рпагтасеціїса! Зсіепсев", Маск Рибіїзпіпуд Со., Еавіоп, РА, останнє видання.

Способи введення

Відповідні способи введення включають пероральне, ректальне, трансмукозальне або інтестинальне введення, парентеральну доставку, У тому числі внутрішньом'язові, підшкірні, внутрішньомозкові ін'єкції, а також інтратекальні, прямі внутрішньошлуночкові, внутрішньовенні, внутрішньо-черевинні, інтраназальні або внутрьшньоочні ін'єкції. Особливо придатний спосіб введення сполуки для лікування захворювання центральної нервової системи включає хірургічну імплантацію пристрою для доставки сполуки протягом тривалого періоду часу. Зокрема, розглядається тривале вивільнення рецептурних складів лікарських засобів, що заявляються. 70 Композиція/Рецептурна суміш

Фармацевтичні композиції і лікарські засоби для застосування відповідно до даного винаходу формують традиційним способом з використанням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв, включаючи наповнювачі і допоміжні речовини. Оптимальний рецептурний склад залежить від вибраного способу введення.

Для ін'єкції, агенти даного винаходу можна ввести у водні розчини, переважно фізіологічно сумісні буфери, /5 такі як розчин Хенкса, розчин Рінгера або фізіологічний сольовий розчин, такий як фосфатний або бікарбонатний буфер. Для трансмукозального введення у рецептурній суміші можна використовувати змочувальні речовини, придатні для проходження через буфер. Такі змочувальні речовини у більшості випадків відомі у даній області техніки.

Фармацевтичні препарати, які можна використовувати перорально, включають зроблені з желатини розсувні 2о Капсули, а також зроблені з желатини і пластифікатора, такого як гліцерин або сорбіт, герметичні капсули.

Розсувні капсули можуть містити активні інгредієнти у суміші з наповнювачами, такими як лактоза, зв'язувальними речовинами, такими як крохмаль, і/або лубрикантами, такими як тальк або стеарат магнію, і, необов'язково, стабілізаторами. У м'яких капсулах дані активні сполуки можуть знаходитися у розчиненому стані, або бути суспендованими у відповідних рідинах, таких як жирні масла, рідкий парафін або рідкі сч об поліетиленові гліколі. Крім того, можна додати стабілізатори. Всі рецептурні суміші для перорального введення повинні бути дозовані для такого введення. і)

Для трансбукального введення дані композиції можна створювати у вигляді таблеток або пастилок традиційним способом.

Для введення шляхом інгаляції сполуки даного винаходу, що використовуються, зручно доставляти у вигляді ї- зо аерозолю, який розпилюється, що знаходиться у герметичній упаковці або в аерозольному апараті, з використанням відповідного газу-витісника, наприклад, діоксиду вуглецю. У випадку герметизованого аерозолю с дозовану одиницю можна визначити за допомогою клапана, що забезпечує одержання будь-якої контрольованої (33 кількості аерозолю. Капсули і ампули, наприклад, з желатини, для використання в інгаляторі або інсуфляторі, можна створити у вигляді рецептурної суміші, що містить порошок даної сполуки і відповідну порошкову основу, ме) з5 таку як лактоза або крохмаль. ча

Можна створити складові сполуки для парентерального введення шляхом ін'єкції, наприклад, шляхом болюсної ін'єкції або безперервного вливання. Рецептурні суміші для ін'єкції можна представити у вигляді дозованої форми, наприклад, в ампулах або у вигляді упаковки лікарського засобу для багаторазового прийому з додаванням консерванту. Дані композиції можуть приймати такі форми, як суспензії, розчини або емульсії у «

Водних носіях, Її можуть містити фармакологічні агенти, такі як агенти, що суспендують, стабілізують і/або з с диспергують.

Фармацевтичні рецептурні суміші для парентерального введення включають водні розчини даних активних ;» сполук у водорозчинній формі. Водні суспензії можуть містити речовини, які збільшують в'язкість даної суспензії, такі як карбоксиметилцелюлоза, сорбіт або декстран. Факультативно вказана суспензія може також містити відповідні стабілізатори або агенти, які підвищують розчинність даних сполук, забезпечуючи одержання -І висококонцентрованих розчинів.

Альтернативно, даний активний інгредієнт може знаходитися у порошковій або ліофілізованій формі для і, зв'язування перед використанням з відповідним розчинником, таким як стерильна апірогенна вода.

Ге) Крім того, крім описаних вище рецептурних сумішей, дані сполуки можна скласти у вигляді препаратів-депо. 5о Такі рецептурні суміші тривалої дії можна вводити шляхом імплантації (наприклад, підшкірно або ю внутрішньом'язово) або шляхом внутрішньом'язової ін'єкції. Тому, наприклад, дані сполуки можна включити у "М препарат разом з полімерною або гідрофобною речовиною (наприклад, у вигляді емульсії у відповідному маслі) або з іонообмінними смолами, або з малорозчинними похідними, наприклад, у вигляді малорозчинної солі.

Крім того, дані сполуки можна доставляти з використанням системи з уповільненим вивільненням, такої як дв Напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, що містять даний терапевтичний агент. Були створені різні речовини з уповільненим вивільненням, які добре відомі фахівцям у даній області техніки. Капсули з

Ф) уповільненим вивільненням, в залежності від їх хімічної природи, можуть вивільняти дані сполуки протягом ка декількох тижнів аж до 100 днів.

В залежності від хімічної природи і біологічної стабільності терапевтичного агента можна застосовувати во додаткові методи для стабілізації білка.

Фармацевтичні композиції можуть також включати відповідну тверду або сгелеву фазу-носій або фазу-наповнювач. Приклади таких носіїв або наповнювачів включають, але не обмежуються ними, карбонат кальцію, фосфат кальцію, різні цукори, крохмалі, похідні целюлози, желатину і полімери, такі як поліетиленгліколі. 65 Ефективне дозування

Фармацевтичні композиції, придатні для використання у даному винаході, включають композиції, в яких активні інгредієнти містяться в ефективній кількості для досягнення їх передбачуваної мети. Зокрема, терапевтично ефективна кількість означає кількість, ефективну для запобігання розвитку або пом'якшення існуючих симптомів хворого, який піддається лікуванню. Визначення ефективних кількостей знаходиться у рамках можливостей фахівця у даній області техніки, особливо у світлі представленого у даному описі докладного опису.

Для будь-якої сполуки, що використовується у даному способі даного винаходу, терапевтично ефективну дозу можна початково визначити у клітинній культурі і дозу можна розробити для тваринних моделей. Такі відомості можна використовувати для більш точного визначення придатних доз для людини. 70 Терапевтично ефективна доза має відношення до такої кількості даної сполуки, яка приводить до послаблення симптомів у хворого. Токсичність і терапевтичну ефективність таких сполук можна визначити за допомогою стандартних фармацевтичних процедур на клітинних культурах або експериментальних тваринах, наприклад, для визначення І 050 (летальна доза для 5095 популяції, що тестується) і ЕО5О (терапевтично ефективна доза для 50905 популяції, що тестується). Дозове співвідношення між токсичним і терапевтичним /5 ефектами відповідає терапевтичному індексу ліків Її може бути виражене у вигляді співвідношення між І О50 і

ЕО50. Сполуки, які виявляють високі терапевтичні індекси, переважні.

Дані, одержані у цих дослідженнях клітинних культур і тварин, можна використовувати для визначення діапазону дозування застосовно до людини. Дозування таких сполук знаходиться переважно у межах діапазону циркулюючих концентрацій, які включають ЕОБО, з невеликою або за відсутності токсичності. Дозування може варіювати в залежності від виду дози, що використовується, і способу її введення. Точний склад, спосіб введення і дозування може вибрати кожний лікар, який обстежує стан пацієнта |див., наприклад, Ріпа! і співавт., 1975, у "Рпаптасоїодіса! Вавзівз ої Тпегареціїсв", СА.11.

Варіанти здійснення даного винаходу, зв'язані із застосуванням комп'ютера

Термін "коди нуклеїнових кислот даного винаходу", що використовується у даному описі включає в себе сч нуклеотидні послідовності, які включають, в основному складаються, складаються з будь-якої наведеної нижче: а) безперервної ділянки послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, (8) 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 або 10000 нуклеотидів ЗЕО ІЮО Мо 1-3; Б) безперервної ділянки послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 або 6000 нуклеотидів ЗЕО ІЮО Мо 4 або її комплементів; с) безперервної ділянки ї- зо послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, де вказана безперервна ділянка послідовності включає двоалельний маркер, вибраний з групи, яка с складається з А1-А17; 4) безперервної ділянки послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, Ге! 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 або 400 нуклеотидів ЗЕО ІО Мо 6; е) безперервної ділянки послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 або 400 (22) нуклеотидів ЗЕО ІО Мо 6, де вказана безперервна ділянка послідовності включає двоалельний маркер А18; і ї) ї- нуклеотидної послідовності, комплементарної будь-якій з попередніх нуклеотидних послідовностей.

Крім того, "коди нуклеїнових кислот даного винаходу" включають нуклеотидні послідовності, гомологічні: а) безперервній ділянці послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 або 10000 нуклеотидів ЗЕО ІЮО Мо 1-3; Б) безперервній ділянці « послідовності, щонайменше, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000, ств) с 2000, 3000, 4000, 5000 або 6000 нуклеотидів ЗЕО ІЮО Мо 4; с) безперервній ділянці послідовності, щонайменше, з

Й 12, 15, 18, 20,25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300 або 400 нуклеотидів ЗЕО ІО Мо 6; і а) и? послідовностям, комплементарним будь-якій попередній послідовності. Гомологічні послідовності відносяться до послідовності, яка володіє, щонайменше, 9995, 9895, 9790, 9695, 9595, 9095, 8595, 8095 або 7595 гомологією з даними безперервними ділянками послідовності. Гомологію можна визначити з використанням будь-якого -І описаного у даному описі способу, у тому числі ВГАЗТ2М зі значеннями параметрів за умовчанням або з будь-якими модифікованими параметрами. Гомологічні послідовності можуть також включати РНК-послідовності, ік у коді нуклеїнових кислот яких даного винаходу уридини замінюють тиміном. Потрібно мати на увазі, що коди со нуклеїнових кислот даного винаходу можуть бути представлені традиційним односимвольним форматом |(див.

Внутрішню задню сторону книги Зігуег, І обрегі. Віоспетівігу, З едйоп. МУ.Н.Егеетап 5 Со., Мем/ Могк| або ді будь-яким іншим форматом або кодом, який реєструє ідентичність нуклеотидів у послідовності. "І Термін "поліпептидні коди даного винаходу", що використовується у даному описі, включає в себе поліпептидні послідовності, які включають безперервну ділянку послідовності, щонайменше, з 6, 8, 10, 12, 15, 20,25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 700, 1000, 1200, 1400, 1600 або 1700 амінокислот ЗЕО ІЮ Мо 9. У переважних варіантах здійснення даного винаходу вказана безперервна ділянка послідовності включає, щонайменше, 1, 2, З, 5 або 10 амінокислотних позицій 277, 338, 574, 678, 680, 683, 691, 692, 695, 696, 697, о 894, 1480, 1481, 1483, 1484, 1485, 1630, 1631, 1632, 1636, 1660, 1667, 1707, 1709 ЗЕО ІО Мо 5. Потрібно мати ко на увазі, що поліпептидні коди даного винаходу можуть бути представлені у традиційному односимвольному форматі або трибуквеному форматі |див. внутрішню задню сторону книги Зігуег, І регі. Віоспетівігу, З бо еайіоп. М.Н. Ргеетап 85 Со., Мем/ Хогк| або у будь-якому іншому форматі або коді, який реєструє ідентичність поліпептидів у послідовності.

Для фахівців у даній області техніки є зрозумілим, що коди нуклеїнових кислот даного винаходу і поліпептидні коди даного винаходу можуть зберігатися, реєструватися і оброблятися на будь-якому носії, який може бути зчитаний за допомогою комп'ютера і наданий йому. Терміни "реєструвати" і "зберігати", що 65 використовуються у даному описі, відносяться до способу збереження інформації на комп'ютерному носії.

Фахівцям у даній області техніки легко засвоїти будь-який з нині відомих способів запису інформації на комп'ютерному носії у придатному для читання вигляді, створеному виробниками, що включає один або декілька кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або один або декілька поліпептидних кодів даного винаходу. Інший аспект даного винаходу полягає у тому, що комп'ютерний носій, придатний для читання, володіє записом на ньому, щонайменше, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 або 50 кодів нуклеїнових кислот даного винаходу. Інший аспект даного винаходу полягає у тому, що комп'ютерний носій, придатний для читання, володіє записом на ньому, щонайменше, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 або 50 поліпептидних кодів даного винаходу.

Комп'ютерний носій, придатний для читання, включає магнітний носій, придатний для читання, оптичний носій, електронний носій, придатний для читання, і магнітно-оптичний носій. Наприклад, комп'ютерний носій, 70 придатний для читання, може бути представлений жорстким диском, дискетою, магнітною стрічкою, СО-КОМ, цифровим універсальним диском (ОМ), пристроєм, що запам'ятовує, прямого доступу (КАМ) або постійними пристроями, що запам'ятовують (КОМ), а також іншими видами носіїв, відомих фахівцям у даній області техніки.

Варіанти здійснення даного винаходу включають системи, зокрема комп'ютерні системи, які зберігають і контролюють описану у даному описі інформацію про послідовність. Один з прикладів комп'ютерної системи 100 /5 ілюструється у вигляді блока діаграм на Фіг.2. Термін "комп'ютерна система", що використовується у даному описі, відноситься до компонентів технічного забезпечення, а дані компонентів збереження використовуються для аналізу нуклеотидних послідовностей кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або амінокислотних послідовностей поліпептидних кодів даного винаходу. В одному з варіантів здійснення даного винаходу комп'ютерна система 100 являє собою сервер Зип Епіегргізе 1000 (З!ип Місгозувіетв, Раїо А, СА).

Комп'ютерна система 100 переважно включає процесор для обробки даних, а також доступу і контролю даних про послідовність. Процесор 105 може являти собою будь-який з добре відомих типів процесорних елементів, такий як Репійшт | від Іпіє! Согрогайоп, або аналогічний процесор від Зицп, Моїіогоїа, Сотрад ог

Іпіегпайопа! Виїзпезз Маспіпезв.

Переважно, комп'ютерна система 100 являє собою основну цільову систему, яка включає процесор 105 |і сч рб ОДИН або декілька внутрішніх компонентів 110 зберігання даних для збереження даних і один або декілька пошукових пристроїв для пошуку даних, які зберігаються у компонентах зберігання даних. Фахівцям у даній і) області потрібно мати на увазі, що придатною є будь-яка з нині існуючих комп'ютерних систем.

В одному з конкретних варіантів здійснення даного винаходу комп'ютерна система 100 включає процесор 105, який з'єднаний шиною, що з'єднується з основним пристроєм 115, який запам'ятовує (переважно М зо представленим у вигляді КАМ) ї одним або декількома внутрішніми пристроями 110 для збереження пам'яті, такими як накопичувач на жорстких дисках і/або інші комп'ютерні носії для читання, що володіють записаними с даними. У деяких варіантах здійснення даного винаходу комп'ютерна система 100, крім того, включає один або Ге! декілька пошукових пристроїв 118 для читання збережених даних на внутрішніх пристроях 110 для збереження даних. Ме)

Пошуковий пристрій даних 118 може являти собою, наприклад, дисковод для дискети, дисковод для ча компакт-диску, накопичувач для магнітної стрічки і т.д. У деяких варіантах здійснення даного винаходу внутрішній пристрій 110 для збереження даних являє собою знімний комп'ютерний носій для читання, такий як дискета, компакт-диск, магнітна стрічка і т.д., що містить логічну схему керування і/або записані дані.

Комп'ютерна система 100 може переважно включати або програмуватися за допомогою відповідного « програмного забезпечення для зчитування логічної схеми керування і/або даних з компонента зберігання даних, в с раніше введених у пристрій для пошуку даних.

Комп'ютерна система 100 включає дисплей 120, який використовується для виведення даних на екран ;» користувача комп'ютера. Потрібно також мати на увазі, що комп'ютерну систему 100 можна приєднати до інших комп'ютерних систем 125а-с у мережу або у глобальну мережу для створення централізованого доступу у Комп'ютерну систему 100. -І Програмне забезпечення для доступу і обробки даних по нуклеотидних послідовностях кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або по амінокислотних послідовностях поліпептидних кодів даного винаходу (таких як ік інструменти пошуку, інструменти порівняння та інструменти моделювання, і т.п.) можуть постійно зберігатися в

Ге) основній пам'яті 115 у період виконання.

У деяких варіантах здійснення даного винаходу комп'ютерна система 100 може, крім того, включати програму де порівняння послідовності для порівняння вказаних вище кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або "М поліпептидних кодів даного винаходу, що зберігається на комп'ютерному носії для зчитування, зі стандартною нуклеотидною або поліпептидною послідовностями, які зберігаються на комп'ютерному носії для зчитування. "Програма порівняння послідовності" відноситься до однієї або декількох програм, які виконуються на комп'ютерній системі 100 для порівняння нуклеотидної або поліпептидної послідовностей з іншими нуклеотидними або поліпептидними послідовностями і/або сполуками, які включають, але не обмежуються ними, (Ф) пептиди, пептидоміметики і хімічні агенти, що зберігаються у засобах зберігання даних. Наприклад, програма ка порівняння послідовності може порівняти нуклеотидні послідовності кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або амінокислотні послідовності поліпептидних кодів даного винаходу, що зберігаються на комп'ютерному носії бо для зчитування, зі стандартними послідовностями, які зберігаються у комп'ютерному носії для зчитування, щоб ідентифікувати гомологи, мотиви, залучені до біологічної функції, або структурні мотиви. Різноманітні програми порівняння послідовності, ідентифіковані у даному патентному описі, передбачають використання даного аспекту даного винаходу.

На Фіг.3 представлена схема послідовності операцій, що ілюструє один з варіантів процесу 200 для 65 порівняння нової нуклеотидної або поліпептидної послідовності з послідовностями бази даних з тим, щоб визначити рівень гомології між даною новою послідовністю і послідовностями з бази даних. Послідовності з бази даних можуть являти собою власну базу даних, що зберігається у комп'ютерній системі 100, або загальнодоступну базу даних, таку як ЗЕМВАМК, РІК ОК 5УМУТЗЗРЕОТ, які доступні через Інтернет.

Процес 200 починають зі стартового положення 201 і потім переміщують у положення 202, в якому нова послідовність, що порівнюється, зберігається у пам'яті комп'ютерної системи 100. Як вказано вище, пам'ять може бути представлена пам'яттю будь-якого типу, у тому числі КАМ або внутрішнім пристроєм, що запам'ятовує.

Потім процес 200 переміщується у положення 204, в якому послідовності бази даних відкриті для аналізу і порівняння. Процес 200 потім переміщується у положення 206, в якому перша послідовність, що зберігається у 70 базі даних, зчитується у пам'ять даного комп'ютера. Потім здійснюють порівняння у положенні 210, щоб визначити чи є перша послідовність тією ж, що і друга послідовність. Важливо зазначити, що даний крок не обмежується здійсненням точного порівняння між новою послідовністю і першою послідовністю бази даних.

Добре відомі способи для порівняння двох нуклеотидних або поліпептидних послідовностей, навіть якщо вони не ідентичні, відомі фахівцям у даній області техніки. Наприклад, в одну з послідовностей можна ввести пропуски /5 для того, щоб підвищити рівень гомології між двома послідовностями, які тестуються. Параметри, що контролюють введення пропусків та інших особливостей у послідовність під час порівняння, звичайно вводить користувач даної комп'ютерної системи.

Після здійснення порівняння двох послідовностей у положенні 210, визначення здійснюють у положенні 210, чи є дві дані послідовності однаковими. Зрозуміло, що термін "однакові" не обмежується абсолютно ідентичними 2о послідовностями. Послідовності, які знаходяться у гомологічних параметрах, введених користувачем, будуть помічені у процесі 200 як "однакові".

Якщо зроблене визначення, що дані дві послідовності є однаковими, процес 200 переміщують у положення 214, в якому назва послідовності з бази даних виводиться користувачем на дисплей. Дане положення сповіщає користувача про те, що послідовність з виведеною назвою задовольняє введеній обмеженій гомології. Після того сч рбв ЯК найменування послідовності, що зберігається, демонструється користувачеві, процес 200 переміщується у положення 218, в якому визначають, чи є ще у базі даних послідовності. Якщо у базі даних немає більше (8) послідовностей, тоді процес 200 завершують у кінці положення 220. Однак, якщо у базі даних є ще послідовності, то процес 200 переміщують у положення 224, де курсор пересувають до наступної послідовності бази даних так, що її можна порівняти з новою послідовністю. Таким чином, нову послідовність вирівнюють і М зо порівнюють з кожною послідовністю бази даних.

Потрібно зазначити, що якщо визначення виконане у положенні 212, в якому послідовності не є гомологами, с тоді процес 200 потрібно рухати відразу у положення 218 для того, щоб визначити, чи доступні інші Ге! послідовності бази даних для порівняння.

Таким чином, один з аспектів даного винаходу являє собою комп'ютерну систему, що включає процесор, Ме пристрій для збереження даних, який володіє збереженим у ньому кодом нуклеїнових кислот даного винаходу ча або поліпептидним кодом даного винаходу, пристрій для збереження даних, що володіє відновно збереженими стандартними нуклеотидними послідовностями або поліпептидними послідовностями, які порівнюються з кодом нуклеїнових кислот даного винаходу або з поліпептидним кодом даного винаходу, і програмою порівняння послідовності для здійснення порівняння. Програма порівняння послідовності може показувати рівень гомології «

Між послідовностями, що порівнюються, або ідентифікувати мотиви, залучені до біологічної функції, а також з с структурні мотиви коду нуклеїнових кислот даного винаходу і поліпептидних кодів даного винаходу, або вона . може ідентифікувати структурні мотиви у послідовностях, які порівнюються з даними кодами нуклеїнових кислот і а з поліпептидними кодами. У деяких варіантах здійснення даного винаходу пристрій для збереження даних може зберігати у собі послідовності, щонайменше, з 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 або 50 кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або поліпептидних кодів даного винаходу. -І Інший аспект даного винаходу являє собою спосіб визначення рівня гомології між кодом нуклеїнових кислот даного винаходу і стандартною нуклеотидною послідовністю, що включає стадії зчитування коду нуклеїнових ік кислот і стандартної нуклеотидної послідовності шляхом використання комп'ютерної програми, яка визначає

Ге) рівень гомології, і визначає гомологію між кодом нуклеїнових кислот і стандартною нуклеотидною послідовністю за допомогою комп'ютерної програми. Комп'ютерна програма може являти собою будь-яку з числа комп'ютерних ю програм з визначення рівнів гомології, включаючи ті, які перераховані у даному описі, включаючи ВІ АТОМ зі

І значеннями параметрів за умовчанням або з будь-якими модифікованими параметрами. Даний спосіб можна реалізувати з використанням описаних вище комп'ютерних систем. Даний спосіб можна також здійснити шляхом зчитування 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 або 50 описаних вище кодів нуклеїнових кислот даного винаходу шляхом дв Використання даної комп'ютерної програми і визначення гомології між кодами нуклеїнових кислот і стандартними нуклеотидними послідовностями.

Ф) На Фіг.4 представлена схема послідовності операцій, що ілюструє один з варіантів здійснення процесу 250 у ка комп'ютері для визначення гомологічності двох послідовностей. Процес 250 починають із запуску у положенні 252, а потім переміщують у положення 254, в якому першу послідовність, що порівнюється, зберігають у пам'ять. бо Потім ї другу послідовність, що порівнюється, зберігають у пам'ять у положенні 256. Після цього процес 250 переміщують у положення 260, в якому зчитують перший символ першої послідовності, і переміщують у положення 262, в якому зчитують перший символ другої послідовності. Потрібно було б мати на увазі, що якщо дана послідовність являє собою нуклеотидну послідовність, то, як правило, символ повинен бути або А, Т, С, 0, або О. Якщо ж дана послідовність являє собою білкову послідовність, то вона повинна знаходитися в 65 однобуквеному амінокислотному коді з тим, щоб можна було легко порівняти першу і наступні послідовності.

Потім визначають тотожність двох символів у положенні 264. Якщо вони тотожні, то процес 250 переміщують у положення 268, в якому зчитують чергові символи у першій і другій послідовностях. Потім визначають тотожність наступних символів. Якщо вони тотожні, то процес 250 продовжує цей цикл до двох символів, які не тотожні. Якщо визначать, що ці наступні два символи не тотожні, процес 250 переміщують у положення 274, щоб ще визначити наявність символів для зчитування у будь-якій послідовності.

Якщо символи для зчитування відсутні, то процес 250 переміщують у положення 276, в якому рівень гомології між першою і другою послідовностями виводиться даному користувачеві. Рівень гомології визначають шляхом обчислення частки символів у послідовностях, які були однаковими із загального числа символів для першої послідовності. Таким чином, якщо кожний символ першої 100 нуклеотидної послідовності поєднати з кожним /0 бимМволоМ другої послідовності, то рівень гомології складатиме 100905.

Альтернативно, комп'ютерна програма може являти собою комп'ютерну програму, яка порівнює нуклеотидні послідовності кодів нуклеїнових кислот даного винаходу зі стандартною послідовністю нуклеїнової кислоти по одній або декількох позиціях. Факультативно така програма реєструє довжину та ідентичність вбудованих, делегованих або заміщених нуклеотидів по відношенню до послідовності стандартного полінуклеотиду, або коду /5 Нуклеїнових кислот даного винаходу. В одному з варіантів здійснення даного винаходу комп'ютерна програма може являти собою програму, яка визначає у нуклеотидних послідовностях кодів нуклеїнових кислот даного винаходу присутність одного або декількох поліморфізмів єдиного нуклеотиду (ЗМР) по відношенню до стандартної нуклеотидної послідовності. Кожний поліморфізм єдиного нуклеотиду може включати заміну, вставку або делецію єдиної основи.

Іншим аспектом даного винаходу є спосіб визначення рівня гомології між поліпептидним кодом даного винаходу і послідовністю стандартного поліпептиду, що включає стадії зчитування поліпептидного коду даного винаходу і послідовності стандартного поліпептиду шляхом використання комп'ютерної програми, яка визначає рівні гомології, і визначення гомології між поліпептидним кодом і послідовністю стандартного поліпептиду, використовуючи комп'ютерну програму. с

Відповідно, інший аспект даного винаходу представляє спосіб визначення коду нуклеїнових кислот, відмінного по одному або декількох нуклеотидах від стандартної нуклеотидної послідовності, що включає стадії (8) зчитування коду даної нуклеїнової кислоти і стандартної нуклеотидної послідовності шляхом використання комп'ютерної програми, яка ідентифікує відмінності між послідовностями нуклеїнової кислоти, та ідентифікації відмінностей між кодом даної нуклеїнової кислоти і даною стандартною нуклеотидною послідовністю за М

Ззор допомогою комп'ютерної програми. У деяких варіантах здійснення даного винаходу дана комп'ютерна програма являє собою програму, яка ідентифікує поліморфізм єдиних нуклеотидів. Даний спосіб можна здійснити за с допомогою описаних вище комп'ютерних систем і способу, проілюстрованого на Фіг.4. Даний спосіб можна також Ге! здійснити внаслідок зчитування, щонайменше, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 або 50 кодів нуклеїнових кислот даного винаходу і стандартних нуклеотидних послідовностей, шляхом використання даної комп'ютерної програми, та (22) ідентифікації відмінностей між кодами даної нуклеїнової кислоти і даними стандартними нуклеотидними ї- послідовностями за допомогою даної комп'ютерної програми.

В інших варіантах здійснення даного винаходу комп'ютерна система, крім того, може включати ідентифікатор, який ідентифікує елементи у нуклеотидних послідовностях кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або в амінокислотних послідовностях поліпептидних кодів даного винаходу. « "Ідентифікатор" відноситься до однієї або декількох програм, які ідентифікують певні елементи в описаних з с вище нуклеотидних послідовностях кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або в амінокислотних послідовностях поліпептидних кодів даного винаходу. В одному з варіантів здійснення даного винаходу ;» ідентифікатор може включати програму, яка ідентифікує відкриту рамку зчитування у кДНК-кодах даного винаходу.

На Фіг.5 представлена схема послідовності операцій, що ілюструє один з варіантів ідентифікатора процесу -І З00 по виявленню присутності елемента у послідовності. Процес З00 починається з початкового положення 302 і потім переміщується у положення 304, в якому перша послідовність, перевірена по елементах, зберігається у ік пам'яті 115 комп'ютерної системи 100. Потім процес 300 переміщується у положення 306, в якому відкриваються со елементи послідовності бази даних. Така база даних повинна включати список символів кожного елемента відповідно до найменування даного елемента. Наприклад, названий елемент міг би являти собою "Колон ю Ініціації", а символом міг би бути "АТО". ІНШИЙ приклад елемента міг би іменуватися "ТААТАА Вох", а символ "М даного елемента був би "ТААТАА". Приклад такої бази даних випускається Опімегейу ої МУізсопзіп Сепеїйїсв

Сотршег ОСгоир (м/мли.дсаЯ.сот).

Після того, як базу даних елементів відкрили у положенні 306, процес 300 переміщується у положення 308, в ов якому перший елемент зчитується з даної бази даних. Порівняння символу першого елемента з першою послідовністю потім здійснюють у положенні 310. Потім здійснюють визначення у положенні 316 по знаходженню

Ф) символу елемента у першій послідовності. Якщо символ виявляється, тоді процес 300 переміщується у ка положення 318, в якому найменування знайденого елемента виводиться на екран дисплея користувача.

Потім процес 300 переміщується у положення 320, в якому визначають елементи, що рухаються, які існують у во даній базі даних. Якщо елементів більше немає, то процес 300 завершують у кінці положення 324. Однак, якщо у даній базі даних є ще елементи, то процес 300 зчитує елемент наступної послідовності у положенні 326 і цикл повертають у положення 310, в якому символ наступного елемента порівнюють з символом елемента першої послідовності.

Потрібно зазначити, що якщо символ елемента не виявляється у першій послідовності у положенні 316, то 65 процес З00 переміщується відразу у положення 320 для того, щоб визначити існування інших елементів у даній базі даних.

В іншому варіанті здійснення даного винаходу ідентифікатор може включати програму молекулярного моделювання, яка визначає З-мірну структуру поліпептидів і кодів даного винаходу. У деяких варіантах здійснення даного винаходу програма молекулярного моделювання ідентифікує послідовності-мішені, які у більшості своїй сумісні з профілями, які представляють структурну конфігурацію залишків у відомих тривимірних білкових структурах |Див., наприклад, Патент США Мо5436850). В іншому методі відомі тривимірні структури білків даного сімейства накладають одну на іншу, щоб визначити структурно консервативні ділянки у цьому сімействі. Ця білок-«моделююча методика також використовує відому тривимірну структуру гомологічного білка для апроксимації структури поліпептидних кодів даного винаходу (Див., наприклад, Патент США Мо5557535). 7/0 Традиційні методи моделювання гомології використовували, як звичайно прийнято, для побудови моделей протеаз або антитіл |ЗомаНатіпі і співавт. (1997)). Порівняльні підходи можуть також використовуватися для побудови тривимірних моделей білка, якщо білок, що представляє інтерес, володіє послідовністю, яка погано ідентифікується з матричними білками. У деяких випадках білки згорнуті у схожі тривимірні структури, незважаючи на те, що їх послідовності характеризуються дуже низькою ідентичністю. Наприклад, тривимірні 7/5 бтруктури ряду спіральних цитокінів скручені у схожу тривимірну топологію, незважаючи на слабку гомологію послідовностей.

Нещодавно створені способи потокової обробки даних у наш час роблять можливою ідентифікацію патернів ймовірнісної упаковки для ряду ситуацій, де структурна зв'язаність між мішенню і матрицею(ями) не виявляється на рівні послідовностей. У гібридних способах, в яких розпізнавання укладання здійснюється з використанням МиїШЩріеє Зедцепсе ТНгеадіпу (Потокова обробка даних для великої кількості послідовностей), структурна еквівалентність виводиться за даними потокової обробки з використанням програми метричної геометрії

ОКАСОМ для створення моделі з низьким розрізненням, а повністю атомізоване відображення створюють з використанням пакету молекулярного моделювання, такого як ООАМТА.

Відповідно до даного З-стадійного методу матриці-кандидати спочатку ідентифікують з використанням нового сч ов апгоритму розпізнавання впорядкованого укладання МТ, який здатний здійснювати одночасну потокову обробку великої кількості поєднаних послідовностей в одну або декілька 3-0 структур. На другій стадії і) структурні еквіваленти, одержані за вихідними даними МТ, перетворюють в обмеження проміжків між залишками і вводять у програму метричної геометрії ОКАСОМ, разом з допоміжною інформацією, одержаною з прогнозу про вторинну структуру. Дана програма об'єднує обмеження для незміщеного способу і швидко ї- зо створює велике число підтверджень моделі з низьким розрізненням. На третій стадії ці підтвердження моделі з низьким розрізненням перетворюють у повністю атомізовані моделі і піддають енергетичній мінімізації з с використанням пакету молекулярного моделювання ООАМТА |див. наприклад, Авгоді і співавт. (1997). Ге!

Результати аналізу молекулярного моделювання використовують потім у методах з раціонального створення лікарського засобу, щоб ідентифікувати агенти, які модулюють активність поліпептидних кодів даного винаходу. (22)

Відповідно до цього, інший аспект даного винаходу являє собою спосіб ідентифікації елемента у кодах ї- нуклеїнових кислот даного винаходу або у поліпептидних кодах даного винаходу, що включає зчитування коду(ів) або поліпептидного коду(ів) нуклеїнових кислот шляхом використання комп'ютерної програми, яка ідентифікує елементи у ній, та ідентифікацію елементів у коді(ах) нуклеїнових кислот або у поліпептидному(их) коді(ах) за допомогою даної комп'ютерної програми. В одному з варіантів здійснення даного винаходу «

Комп'ютерна програма включає комп'ютерну програму, яка ідентифікує відкриті рамки зчитування. В іншому з с варіанті здійснення даного винаходу комп'ютерна програма ідентифікує структурні мотиви полінуклеотидної послідовності. У додатковому варіанті здійснення даного винаходу дана комп'ютерна програма включає ;» програму молекулярного моделювання. Даний спосіб можна здійснити шляхом зчитування окремої послідовності або, щонайменше, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 або 50 кодів нуклеїнових кислот даного винаходу, або поліпептидних

Кодів даного винаходу шляхом використання даної комп'ютерної програми та ідентифікації елементів у даних -І кодах нуклеїнових кислот або поліпептидних кодах за допомогою даної комп'ютерної програми.

Коди нуклеїнових кислот даного винаходу або поліпептидні коди даного винаходу можна зберігати і керувати ік різноманітними програмами процесорних даних у різних форматах. Наприклад, їх можна зберігати у вигляді со тексту у файлі обробки тексту, такому як МісгозоП/ОКО або УМОКОРЕКЕЕСТ або у вигляді АЗСІІ-файлу для різноманітних програм бази даних, добре відомих фахівцям у даній області техніки, таких як ОВ2, ЗУВАЗЕ або ю ОКАСІЕ. Крім того, багато комп'ютерних програм і баз даних можна використовувати як програми порівняння

І послідовностей, ідентифікатори або постачальники стандартних нуклеотидних або поліпептидних послідовностей для порівняння з кодами нуклеїнових кислот даного винаходу або з поліпептидними кодами даного винаходу. Наведений нижче список не треба розглядати як обмеження даного винаходу, але як керівництво до програм і баз даних, які придатні для кодів нуклеїнових кислот даного винаходу або для поліпептидних кодів даного винаходу. Програми і бази даних, які можна використовувати, включають, але не

Ф) обмежуються перерахованим: МасРайегп (ЕМВІ), ОізсомегуВазе (МоїЇесцшіаг Арріїсайоп (згоир), Сепеміпе ка (МоїІесшіаг Арріїсайоп гор), ЇоокК (МоїІесшіаг Арріїсайоп гоцр), МасіоокК (Моіесшаг Арріїсайоп гор),

ВІ АЗТ і ВГ АЗТ2 (МСВІ), ВІ АЗТМ і ВІ АБТХ (Аївспиі і співавт., 1990), РАЗТА (Реаггоп апа І іртап, 1988), РАЗТОВ 6о (Вищад і співавт., 1990), Сайауві (МоЇІесшаг Зітшиіакцопз Іпс.), СайаузуУЗНАРЕ (Моїіесшіаг зЗітшиіайопе8 Іпс.),

Сепив2.ОВАссевзз (Моїесціаг Зітшиайопе Іпс.), Нуробеп (Моїесціаг бітиайопве Іпс.), ІпвіднЕ І (Моіесшаг

Зітишайопе Іпс.), Оівсомег (МоЇесціаг БЗітшіайопе Іпс-, СНАКМт (Моіесціаг Зітшишацопе Іпс.), Реїїх (МоІесшаг Зітишіаєцопе Іпс.), ЮОеІРйпі (Моіесшіаг Бітшацйопе пс.) Оцапіемм (Моїесцшіаг Зітшіайопе Іпс.),

Нотоїоду (Моїіесшаг Зітшишанопе Іпс.), Модеїег (МоїЇесцшіаг Зітиайопе Іпс.), І5БІЗ (МоїЇесшіаг бЗітшиацоп5 65 Іпс.), Омапіа/Ргоївїп ЮОевідп (Моїесціаг Зітиайопе пс.) УМеріар (Моіесшаг Зітиацопе Іпс.), УУері ар

Оімегейу Ехріогег (МоїЇесціаг Зітиацйопе Іпс.), Сепе Ехріогег (МоІесшіаг Зітшаєцйопе Іпс.), Зедегоїай

(МоІесшаг Зітшайопе Іпс.), Ше ЕМВІ/5м/івзвзргоїеіп даїаразе, Ше МОЇ Амаїаріе СпетісаІз Оігесіогу дагавразе,

Ше МОЇ Огид Оайа Керогі дага разе, те Сотргепепзіме Меадісіпа! Спетівігу даїаразе, ЮОепмепів'є Могій Огод

Іпдех дайаразе, ШТте ВіоВуїеМазвзіеггїЇе аагаразе, (Ше Сепрапк даїаразе і Сепзедп бази даних. Багато інших програм і баз даних будуть очевидні фахівцям у даній області техніки з врахуванням даного опису.

Мотиви, які можна виявляти з використанням вказаних вище програм, включають послідовності, що кодують лейцинові застібки, мотиви спіраль-поворот-спіраль, сайт глікозилування, сайти убіхітинізації, альфа-спіралі

Її бета-конфігурації, сигнальні послідовності, що кодують сигнальні пептиди, які керують секрецією білків, що кодуються, послідовності, залучені до регуляції транскрипції, такі як гомеобокси, кислотні ділянки, 7/0 ензиматично активні сайти, сайти, що зв'язують субстрат, і сайти, що ферментативно розщеплюються.

У даній заявці приводяться посилання на різні публікації, патенти і опубліковані патентні заявки.

Розкриття даних публікацій, патентів і опублікованих описів винаходів до патентів, на які посилаються у даній заявці, включені за допомогою посилання у представленому викладі для найбільш повного задовільного опису області техніки, до якої відноситься даний винахід.

Приклади

Приклад 1

Ідентифікація двоалельних маркерів - Екстрагування ДНК

Донори не зв'язані спорідненням і здорові. Вони були представлені достатньою різноманітністю для типової

Французької гетерогенної популяції. Від 100 індивідів була одержана ДНК і перевірена на наявність двоалельних 2о маркерів.

Від кожного донора брали ЗОмл периферичної венозної крові з додаванням ЕДТА. Клітини (осад) збирали центрифугуванням протягом 10 хвилин при 2000об./хв. Еритроцити лізували за допомогою розчину, що лізує (5Омл кінцевий об'єм: 10ММ Трис рН7,б; 5мМ МосСі»; л10мМ Масі). Даний розчин центрифугували (10 хвилин, 2000об./хв.) стільки разів, скільки необхідно для видалення залишкових еритроцитів у супернатанті, після сч ов ресуспендування клітинного осаду у даному розчині, що лізує.

Осад лейкоцитів лізували протягом ночі при 422 3,7мл розчину, що лізує, який складається з: і) - Змл ТЕ 10-2 (Трис-НСІ 10ММ, ЕДТА 2мму/Масі 0,4М - 200мкл ЗО 1090 - БоОмкл К-протеїнази (2мг К-протеїнази в ТЕ-2/Масі 0,4М). ча

Для екстрагування білків додавали їмл насиченого Масі (ЄМ) (1/3,5 М/М). Після енергійного перемішування даний розчин центрифугували протягом 20 хвилин при 10000об./хв. с

Для осадження ДНК до одержаного супернатанту доливали 2-3 об'єми 10095 етанолу і розчин Ге») центрифугували протягом 30 хвилин при 2000об./хв. Одержаний розчин ДНК тричі промивали 7095-м етанолом для видалення солей і центрифугували протягом 20 хвилин при 2000об./хв. Одержаний осад сушили при 372С і іа ресуспендували в їмл ТЕ 10-1 або в їмл води. Концентрацію ДНК визначали шляхом вимірювання ОП при ч- 260нм (1 одиниця ОП-5Омкг/мл ДНК).

Щоб визначити присутність білків у даному розчині ДНК визначали відношення ОП 260/ОП 280. У подальших описаних нижче прикладах використовували тільки препарати ДНК, що володіють ОП 260/ОП 280 між 1,8 і 2. «

Об'єднану ДНК одержували змішуванням еквівалентних кількостей ДНК від кожного індивіда.

Приклад 2 - с Ідентифікація двоалельних маркерів: ампліфікація геномної ДНК за допомогою ПЛР ц Ампліфікацію зразків специфічних геномних послідовностей ДНК прикладу 1 здійснювали на об'єднаній "» раніше одержаній ДНК. Крім того, аналогічним чином ампліфікували 50 індивідуальних зразків.

ПЛР-аналіз здійснювали з використанням наступного протоколу: -і Кінцевий об'єм 25мМкл днк 2гнг/мкл іс, Мас» 2ММ (се) аМтР (кожного) 200мкМ праймер (кожного) 2,Знг/мкл о Атрії Тад Со ДНК-полімераза О,О5одиниць/мкл що ПЛР-буфер (10х-0,1М Триснсї рна,З 0,5М КС) їх

Кожну пару перших праймерів створювали з використанням інформації про послідовність з описаного у даному описі Сапіоп-гена і О5Р-програмного забезпечення (Нійег 85 Сгееп, 1991). Довжина першої пари праймерів складала близько 20 нуклеотидів і володіла послідовністю, розкритою у Таблиці 1 у колонці, о поміченій РО і ВР. іме) " амплікону в ЗЕО ІО 1 праймеру (ампліфікаційного праймеру в ЗЕСО)|праймеру ампліфікаційного праймеру в ЗЕО ІО Мо 1

ІО Мо 1 бо 99-62611| 69198 69650 ві 69198 69218 СА 69632 69650 зебжвє твоє 0 воззя | ве 00твов 005000 с6|000воа 000000ввя амплікону в ЗЕО ІО 2 праймеру (ампліфікаційного праймеру в ЗЕСО праймеру ампліфікаційного праймеру в ЗЕС ІО Мо 2

Іо Мо2 зетезв вит: вою | ве 0воомо|00вожо000се000воо 0000008 ді

Амплікон (Діапазон позицій Назва Діапазон позицій Назва Комплементарний діапазон позицій

Шо наш ня

ІО Мо З амплікону в ЗЕО ІО 6 праймеру (ампліфікаційного праймеру в ЗЕСО праймеру ампліфікаційного праймеру в ЗЕС ІО Мо 6

ІО Мо 6 веваит! 0711 ви | 77717717) с я |в

Переважно, праймери містили спільний олігонуклеотидний хвіст "лівіше" від специфічних основ, намічених ре для ампліфікації, який придатний для секвенування. см

Праймери РИ містять наступну додаткову РИ 5-послідовність: ТЗТААААСОАСОСССАСТ; (о) праймери КР містять наступну КР 5-послідовність:

САССААДАСАОСТАТОАСОС.

Праймер, що містить додаткову РУ 5'-послідовність приведений в 5ЕО ІЮО Мо 7. Праймер, що містить М додаткову КР 5'-послідовність приведений в ЗЕО ІЮ Мо 8.

Синтез даних праймерів здійснювали за допомогою фосфорамідитного способу у синтезаторі СЕМЗЕТ ОБРЗ СІ 24.1. ФУ

Ампліфікацію ДНК здійснювали в ампліфікаторі Сепісз ІІ. Після нагрівання до 9523 протягом 1Охв. проводили 40 циклів. Кожний цикл включав: ЗОсек. при 95922, 5492 протягом хв. і ЗОсек. при 72920. Кінцеве подовження, (є) 1Охв. 729, завершувало ампліфікацію. Кількості одержаних продуктів ампліфікації визначали у 9б-ямкових ча планшетах для мікротитрування з використанням флуорометра і Рісодгееп як агента, що інтеркалює (Моїесшаг

Ргобезв).

Приклад З

Ідентифікація двоалельних маркерів - Секвенування ампліфікованої гейомної ДНКта ідентифікація « поліморфізмів шщ с Секвенування ампліфікованої ДНК, одержаної у прикладі 2, здійснювали на секвенаторі АВІ 377. й Послідовності продуктів ампліфікації визначали з використанням автоматизованих реакцій «» дидезокситермінуючого секвенування відповідно до протоколу циклу секвенування, термінованого барвником.

Продукти реакцій секвенування розділяли у гелях, що секвенують, і послідовності визначали з використанням аналізу візуалізацією гелю (АВІ Ргізт ОМА зеднпепсіпу Апаїузіз зоїммаге (2.1.2 мегвіоп)). -І Потім оцінювали дані про послідовності, щоб в одержаних ампліфікованих фрагментах виявити присутність двоалельних маркерів. Пошук поліморфізму базується на присутності накладених піків в електрофоретичній ее, картині, одержаних для різних основ, зустрітих в одній і тій же позиції, як описано раніше.

Ге) В 17 ампліфікованих фрагментах виявлено 18 двоалельних маркерів.

Локалізація цих двоалельних маркерів показана у Таблиці 2. іме) -4

Амплікон| ВМ (Назва маркера

НИ НН кві внсе з зе дебет 00000 зевовзо |до зевовзают 000000 о зебжвха лз| зебжхю 00000 и ю зевжи ле веєжитьмо 00000000 веж зебжвов в веж 0000 во зебвяв ле |зебжзиних 01000 вою

Амплікон| ВМ (Назва маркера затв ветеззикю 0000000 вою зетезя лю |зелоззез 0000623 вв зетезв ле | зелоззвз 0000 в» 99-79314 |АТО 99-79314-201 100845 зате зетемттє | 10001 ою 1 зетозв Ат вет 00000Ло6'Б0вбв соте (діз зетезоєам 000000 левви зотезоз для зеловоаятя 00000 л6в3ю зате зетезовлв? 000000 озввва

Амплікон| ВМ (Назва маркера зетамо|лів вето 0000000 вв 0зави о зате хи вето 0001000 яв

Амплікон| ВМ (Назва маркера дм | мб евовіт дів вевовіттов 1161

ВМ відноситься до "двоалельного маркера". Алі і Ал2 відносяться, відповідно, до алеля 1 і алеля 2 даного двоалельного маркера. дт|веввюльв по 0000пввеРІ сч

ГУ нс: З НН НС о

АВ ве-тезавзвЮ 00ов'я 0000000візо Рв пз ветезвзю вові Ре м зо ся

Ф щ з м « н- с и Приклад 4 є» Перевірка достовірності поліморфізму за допомогою мікросеквенування

Двоалельні маркери, ідентифіковані у прикладі З, у подальшому одержували підтвердження, а їх відповідні частоти були визначені за допомогою мікросеквенування. Мікросеквенування здійснювали для кожного - і індивідуального зразка ДНК, описаного у Прикладі 1. с Ампліфікацію геномної ДНК індивідів здійснювали за допомогою ПЛР, як описано вище, для виявлення двоалельних маркерів з одним і тим же набором ПЛР-праймерів (Таблиця 1). (Се) Переважні праймери, що використовуються для мікросеквенування, складали у довжину близько 19 7 50 нуклеотидів та гібридизувалися безпосередньо ліворуч від поліморфної основи, що розглядається. Відповідно до даного винаходу, дані праймери, які використовуються для мікросеквенування, детально представлені у Таблиці і 4. » маркера маркер 1 мікросеквенує, в ЗЕО ІО Мо 1 2 2, що мікросеквенує, в ЗЕО ІЮ Мо 1 о ю во зевовзвняя лво0006000оваи0000овоме вб)00оваі00000000овою маркера маркер 1 мікросеквенує, в ЗЕО ІЮ Мо 2 2 2, що мікросеквенує, в ЗЕО ІЮ Мо 2 вв 99-79336-369 АВ ов 61274 61292 ЕВ 61294 61312

Сзетевввяа| ле 109| ово О0овоби в) вози 76 маркера маркер 1 мікросеквенує, в ЗЕО ІЮ Мо З 2 2, що мікросеквенує, в ЗЕО ІЮ Мо З маркера маркер 1 мікросеквенує, в ЗЕО ІЮ Мо 6 2 2, що мікросеквенує, в ЗЕО ІЮ Мо 6 (везбовітлов | дів Зв) вб1оя0 дів о6|7771ля

Мів 1 ї Мів 2 відносяться, відповідно, до праймерів, що мікросеквенують, які гібридизуються з ланцюгом

Сапіоп-гена, що не кодує, або з ланцюгом Сапіоп-гена, що кодує.

Реакцію мікросеквенування здійснювали наступним чином:

Після виділення очищенням продуктів ампліфікації реакційну суміш, що мікросеквенує, одержували шляхом додавання, у кінцевому об'ємі 20мкл: їОпмолей олігонуклеотиду, що мікросеквенує, ТОд. Термосеквенази (Атегзпат Е790000), 1,25мкл термосеквеназного буферу (260мММ Трис НС! рНО,5, б65ММ Мосі») і два відповідних ЗаМтТР (РегкКкіп ЕІтег, Юуе Тегтіпайїг Зеї 401095), комплементарних нуклеотидам по поліморфному сайту кожного двоалельного маркера, який тестується, слідуючи рекомендаціям виробника. Через 4 хвилини при 949С в ампліфікаторі Тейгад РТОС-225 (МУ Кезеагсі) здійснювали 20 ПЛР-циклів з 15сек. при 559С, 5сек. при 7220 с 295 | 10сек, при 942. Потім за допомогою етанольного осадження видаляли невключений барвник, що термінує. Ге)

Зразки остаточно ресуспендували у формамід-ЕДТА-буфері для насичення і нагрівали протягом 2хв. при 952 перед завантаженням у поліакриламідний гель, що секвенує. Дані одержували за допомогою ДНК-секвенатора

АВІ РКІЗМ 377 і обробляли з використанням програмного забезпечення Сапіосп5САМ (Регкіп ЕІтег). їм

Після гелевого аналізу дані автоматизовано обробляли за допомогою програмного забезпечення, яке дозволяє визначати алелі двоалельного маркера, представлені у кожному ампліфікованому фрагменті. с

Дана програма оцінює такі фактори, як наскільки інтенсивність сигналів, що одержують, у здійснених вище Фу операціях мікросеквенування, є слабкою, нормальною або інтенсивною або ж дані сигнали є неоднозначними.

Крім того, дана програма ідентифікує істотні піки (за формою і висотою). У числі істотних піків, піки, які (22) відповідають сайту-мішені, ідентифікували за їх положенням. Якщо два істотних піки виявляються в одному і М тому ж положенні, кожний зразок відносять до категорії гомозиготного або гетерозиготного типу на основі співвідношення висоти піку.

Приклад 5

Одержання антитільних композицій до Сапіоп-білка « 20 З трансфікованих або трансформованих клітин, що містять експресійний вектор, який кодує Сапіоп-білок або -в його частину, виділяють практично чистий білок або поліпептид. Концентрацію білка кінцевого препарату с доводять, наприклад, шляхом концентрування на пристрої з Атісоп-фільтром, до рівня декількох мікрограм/мл. :з» Потім моноклональні або поліклональні антитіла до даного білка можна одержати наступним чином:

А. Одержання моноклональних антитіл шляхом гібридомного злиття 415 Моноклональні антитіла до епітопів Сапіоп-білка або до його частини можна одержати з мишачих гібридом -1 відповідно до класичного способу |Копіег, с. апа Міївівїй, С. (1975) або похідними від нього способами.

ІДив. також Нагіому, Е. апа О. І апе, 19881 се) Коротко, мишу періодично інокулюють декількома мікрограмами Сапіоп-білка або його частини протягом со декількох тижнів. Потім мишу умертвляють і виділяють клітини селезінки, що продукують антитіла. Виділені 5 Клітини селезінки зливають за допомогою поліетиленгліколю з мишачими мієломними клітинами, а надлишок іме) клітин, які не злилися, руйнують вирощуванням на селективному середовищі, що включає аміноптерин «м (НАТ-середовище). Клітини, що успішно злилися, розводять і аліквоти розведення поміщають в ямки планшета для мікротитрування, де дана культура продовжує рости. Клони, що продукують антитіло, ідентифікують шляхом виявлення антитіл у супернатантній рідині ямок за допомогою методів імунологічного аналізу, таких як ЕГІЗА, вв Вперше описаного Еподмаї! (19803), і його похідного способу. Відібрані позитивні клони можна збільшити в об'ємі і зібрати для використання їх продукт у вигляді моноклональних антитіл. Докладні методи одержання (Ф) моноклональних антитіл (описані у Юаміз Ї. і співавт. Вазіс Меїйодз іп Моїіесшіаг Віоїюсду (Основні методи г молекулярної біології), ЕІземіег, Мем ХогКк, Зесійоп 21-21.

В. Одержання поліклональних антитіл за допомогою імунізації во Поліклональну антисироватку, що містить антитіла до гетерогенних епітопів Сапіоп-білка або його частини, можна одержати шляхом імунізації тварини, яка не належить до людського роду, Сапіоп-білююом або його частиною, який може бути не модифікованим або модифікованим для посилення імуногенності. Відповідною твариною, яка не належить до людського роду, переважно є вибраний ссавець, звичайно, миша, щур, кролик, коза або кінь. Альтернативно, неочищений препарат, ве який збагачували по концентрації Сапіоп, можна використовувати для утворення антитіл. Такі білки, фрагменти або препарати вводять ссавцеві, що не належить до людського роду, у присутності відповідного ад'юванту (наприклад, гідроксиду алюмінію, КІВІ і т.п.), який відомий у даній області техніки. Крім того, білок, фрагмент або препарат може бути заздалегідь оброблений агентом, який підвищує антигенність, такі агенти відомі у даній області техніки і включають, наприклад, метильований бичачий сироватковий альбумін (тВ5А), бичачий сироватковий альбумін (В5А), поверхневий антиген гепатиту В і гемоціанін равлика фісурелії (КІН). Збирають сироватку імунізованої тварини, обробляють і тестують відповідно до відомих методів. Якщо зібрана сироватка містить поліклональні антитіла з небажаними епітопами, тоді поліклональні антитіла можна виділити очищенням за допомогою імуноафінної хроматографії.

На одержання ефективних поліклональних антитіл впливає багато факторів, зв'язаних з антигеном і видовим /о статусом хазяїна. Крім того, тварини-хазяї по-різному відповідають за місце інокуляції та дозу, причому невідповідні або надмірні дози антигену приводять до зниження титру антисироватки. Невеликі дози (на рівні нг) антигену, що вводиться, у багато інтрадермальних місць виявляються більш надійними. Методи одержання і обробки поліклональної антисироватки відомі у даній області техніки, |див. наприклад, Мауег апа УУаїкег (1987)). Протокол ефективної імунізації кроликів можна знайти у (МайикКаїйз . і співавт. (1971).

Повторні ін'єкції можна здійснювати з регулярними інтервалами і збирати антисироватку, коли титр її антитіл, що визначається напівкількісно, наприклад, за допомогою подвійної імунодифузії в агарі проти відомих концентрацій даного антигену, починає падати. |Див., наприклад, О!йиспіепопу О. і співавт. (1973)). Плато кривої концентрації антитіл звичайно знаходиться у межах від 0,1 до 0,2мг/мл сироватки (близько 12мкМ).

Споріднення антисироватки по антигену визначають шляхом одержання конкурентних кривих зв'язування, |Як описано, наприклад, ГРізнег 0. (1980)).

Препарати антитіл, одержані відповідно до моноклональних або поліклональних протоколів, придатні для кількісного імунологічного аналізу, в якому визначають концентрації речовин, які несуть антиген, у біологічних зразках; їх також використовують напівкількісно або кількісно для ідентифікації наявності антигену у біологічному зразку. Дані антитіла можуть також використовуватися у терапевтичних композиціях для с об Знищення клітин, що експресують даний білок або для зниження рівня даного білка у даному організмі.

Хоча переважні варіанти здійснення даного винаходу були проілюстровані та описані, потрібно мати на і) увазі, що фахівці у даній області техніки можуть внести у нього різні зміни, не виходячи за рамки суті та об'єму даного винаходу.

Посилання М зо Арропаапго 5. еї аї., 1993, Меїйодвз іп Епгутоіоду, Асадетіс Ргезв, Мем" ХогК, рр 803-823

АйоКа К.5. е а), Ат. 9. Нит. Сепеї., 60:1439-1447, 1997 с

АЇЇвспциі еї аї., 1990, 9. Мої. Віо!. 215(3):403-410 б

АїЇївспи! еї аї., 1993, Машге Сепеїйісв 3:266-272

АЇївспи! еї аї., 1997, Мис. Асіаз Кев. 25:3389-3402 (22)

Атез, К.5. ейаї. 9. Іттипої!. Меїйоадз 184:177-186(1995) ї-

Апаегзоп еї аіІ., Зутр. Зос. Ехр. Вісі. 48:85-97 (1994)

Апоп М. еї аї., 1995, 9. Міго!., 69:4600-4606

Агакі К еї а. (1995) Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА. 92(1):160-4.

АзПпКепа?і, А. еі ам. РМА5 88:10535-10539(1991) «

Азгоді еї аї!., Ргоїеіпез:з(гисішге, Рипсійоп, апа Сепеїйісв, З урріетепі 1:38-42 (1997) з с А!йвзиреі еї аї. (1989)Сигтепі РгоїосоЇїв іп МоіІесцшіаг Віоіоду, Огееп Рибіїзпіпуд Авзосіаїез апа Уміеу

Іпіегезсіепсе, М. У. ;» Вапипек, Р. еї аіІ. СуюкКіпе 8(1): 14-20 (1996)

Ваибопіз МУ. (1993) Мисівїс Асіаз Кев. 21(9):2025-9

Веаийсаде еї а!., Теггапедгоп ГІ ек 1981, 22:1859-1862 -І Вецнег,М. еї аїЇ. Зсіепсе 240:1041-1043(1988)

Віоціп ДЇ. еї аЇ. Майге Сепеїісв, 20: 70-73 (1998) ік Вгадіеу А., 1987, Ргодисіоп апа апаїувів ої спітаегіс тісе. Іп: Еу. Кобрегізоп (Е4.), Тегаюсагсіпотаз

Ге) апа етьгуопіс віет сеїІв: А ргасіїса! арргоасі. ІК! Ргезв, Охіога, рр.113.

Вгат КУ еї а!., 1993, Мої. Сеї! Віо!., 13:4760-4769 ю ВгіпКктап . еї аї. 9. Іттипої. Меїподз 182:41-50 (1995) "М Вгом/п ЕГ, ВеїЇгоа|е К, Куап МУ), Кпогапа ЕС, Меїйодз Епгутої 1979; 68:109-151

ВгшНад ег а. Сотр. Арр. Віовсі. 6:237-245,1990

Вггивіомісг еї а|., Ат. У). Нит. Сепеї. 65:1096-1103 (1999)

Виїтап еї аі., Нит. Мої. Сеп. 6(10) 1679-1685 (1997)

Випіоп, О.К. еї а). Адмапсез іп ІттипоіЇоду 57:191-280(1994) (Ф) Вигн еї аї., 1997, У. Спготайоаг, 777: 311-328 ка Сагізоп, М.О. еї а. 9. Вісі. Спет. 272(17): 11295-11301(1997)

Снаї Н. еї аї. (1993) Віогеснпої. Аррі. Віоспет. 18:259-273 во СНее еї а. (1996) 5сіепсе. 274:610-614

Спеп апа Кжок Мисівїс Асіаз Кезеагсі 25:347-353 1997

Спеп еї а). (1987) Мої. Сеї. Віо! 7:2745-2752

Спеп еї а. Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА 94/20 10756-10761,1997

Спеп, 7. ег аіІ. Сапсег Кев. 58(16):3668-3678(1998) 65 Спо КУ еї аї., 1998, Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА, 95(7):3752-3757

Споцу.М., 1989, Мої. Епаостіпо!.,3:1511-1514

Сіагк А.О. (1990) Мої. Віо!. Емої. 7:111-122.

Соіез К, Сазмеї| К, Кибіпз2еїіп ОС, Нит Мої Сепеї 1998; 7:791-800

Сотрюп 4. (1991) Маїиге. 350(6313):91-92

Ррамів І.0., М.О. Оірпег, апа 9.Р. Вабцеу, Вавзіс Меїйподз іп МоіІесшіаг Віоіоду, ед., ЕІвеміег Ргезз, МУ, 1986

Оетрзівг еї аї., (1977) 9. К. 8(аї. ос, 398.1-38. его, В. ег аІ. Віоса 92(6): 1981-1988(1998) еп о5 8 І аїсптап О5 (1993) Тне ОМА тобіїйу зпій аззау. Іп: Тгапвсгіріоп Расіоге: А

Ргасіїсаї Арргоаспй (Іайсптап О5, ей.) ррі-26. Охіога: ІК! Ргезз ЮОепуег еї а. Огид Оівс. Тодау 3(7): 7/0 323-332 (1998)

ЕскКкпег К. еї а. (1991) ЕМВО 3. 10:3513-3522

Едмагаз еї І еаїпеграгтом, Апа/мііса! Віоспетівігу, 246, 1-6 (1997)

Епомаї, Е., Мей. Епгутої. 70:419(1980)

Ехсопіег І. апа Зіаїкіп М. (1995) Мої. Віої. Емої, 12(5): 921-927

ЕРеідтап апа 5іед, 1996, Медесіпе/Зсіепсевз, зупіпезе, 12:47-55

Ееїїсі Р., 1991, 9. Мої. Віої., Мої. 222:301-310

Ееї, Н.Р. еї а. 9. Іттипої. 146:2446-2452(1991)

Рівіїдз апа опо, 1989, Майшге, 340: 245-246

ЕРівпег, О., Спар. 42 іп: Мапиаї! ої Сіїпісаї Іттипоіоду, 24 Ей. (Козе апа Егіедтап, Ед».) Атег. Бос. Гог Місгобіо!., УМазпіпдіюп, О.С. (1980)

Ріоне еї а!. (1992) Л/я. 3. Кегзріг. СеїЇ Мої. Вісі. 7:349-356.

Еодогега)!. (1991) Зсіепсе 251:767-777.

Егаїеу еї аї. (1979) Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА. 76:3348-3352.

Епеа М, Стоїпеге ОМ, Мисіеїс Асіаз Кез 1981; 9:6505-6525 сч

Еготопі-Касіпе М. еї а!., 1997, Майте Сепеїйісв, 16(3): 277-282.

Ешіег 5. А. еї аї!. (1996) Іттипоіоду іп Ситепі Ргоїосоїів іп МоІесціаг Віоіоду, А!зибеї еї аі.Еадв, допйп УМіеу Є і)

Бопвг, Іпс., ОА

Еипй Р.А. еї аї. (1994) Ргос. Май). Асад Зсі ОБА. 91:9302-9306

Сагпег ММ, Кем?іп А, Мисієвїс Асіаз Кез 1981; 9:3047-3060 М зо Сеузеп Н. Магіо еї а). 1984. Ргос. Май). Асай. 5сі. О.5.А. 81:3998-4002

Спо апа Васспауа!і 1991, Тагдейпу ої ІПрозотевз (о Пераїосуїез, ІМ: І імег Оівеазев5, Тагдейей аіадповів с апа (пегару изіпд зресіїіс гесеріог: апа ІІдапавз. УУи ег а). Едв., Магсе! ОеКеКег, Мем ХогК, рр.87-104 Ге!

СШіез, 5.0. еї аї. 9. Іттипої. Меїпоадв 125:191-202(1989)

СіШев, 5.0. ег ам. РМАБЗ 89:1428-1432(1992) Ме

Соппеї еї аї., 1992, Зсіепсе 256:1443-1445 ї-

Соплаїе?г еї а!., Огид Оівс. Тодау 4(9): 431:439 (1999)

Сораї! (1985)Агто/. СеїІ. Віої., 5:1188-1190. боззеп М. еї а. (1992) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА. 89:5547-5551. бозвзеп М. еї аї. (1995) 5сіепсе. 268:1766-1769. «

Сганат еї аї. (1973) Мігоїоду 52:456-457. з с Огееп еї аї, Апп. Кеу. Віоспет. 55:569-597 (1986) . Сгеепзрап апа Вопа, ЕАБЕВ .). 7(5):437-444 (1989) и?» Стгійіп еї а). Зсіепсе 245:967-971 (1989)

Сготре, М. (1993) Маїиге Сепеїїісв. 5:111-117.

Сготре, М. еї а). (1989) Ргос. Май). Асад. 5сі. ЮО.5.А. 86:5855-5892. -І би Н. еї а. (1993) Сеї! 73:1155-1164. би Н. еї аї. (1994) Зсіепсе 265:103-106. і, спагеїї УС еї а). Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА. 35:273-286

Ге) Насіа 90, Вгоду І С, Спее М5, Родог 5Р, Соїпв Е5, Уа Сепеї 1996; 14 (4):441-447

Наї! у. А. апа 5тігпом І. Р. (1997) бепоте Кезеагсі, 7:378-388. ю Натез 8.0. апа Ніддіпе 5.9. (1985), Мисіеїс Асіа НуБбгідігайоп: А РгасіїсаІ Арргоасі. "М Натез апа Натії), Рецдетге Агсп. 391, 85-100 (1981).

Наттегінпо, еї аі., іп: МОМОСІ ОМА АМТІВООІЕ5 АМО Т-СЕГ НУВКІСОМАЗ 563-681 (ЕІвемієг, М.У., 1981)

Наг)и Г, У/ерег Т, Аіехапагома І, І оКіп М, Капкі М, даіапко А, Сіїп Спет 1993;39(1 ІРІ 1):2282-2287 5Б Напапгпга еї а. (1985) 9. Сеї! Віо! 101:1094-1095.

Нагіому, Е., апа 0. І апе. 1988. Апііродіез А І арогаїогу Мапиаї, Соїд 5ргіпд Нагбог І арогайогу, рр.53-242 (Ф) Нагрег МУ еї а!ї., 1993, Сеїі, 75: 805-816 ка Нагтор, -.А. еї а. 9. Іттипої. 161(4)3: 1786-1794(1998)

Наулеу М.Е. еї а). (1994) Ат. У). Рпувз. Апіпгорої!. 18:104. 60 Неї! еї а!ї., Аппаїз М.У. Асад. зсі. 747:282-293 (1994)

Непікопапанегпікоїї, 1993, Ргоїеїпз 17:49-61

Нідвіпз еї аї., 1996, Меїйодзв Епгутої. 266:383-402

Нідвдіпз Еа., ІКГ. Ргезз, ОХІОГО.

Нійег Г. апа Сгееп Р. Меїйодз Аррі, 1991, 1: 124-8. 65 Ноезз еї аї. (1986) Мисіеїс Асіаз Кев. 14:2287-2300.

Ниапа І. еї а!ї. (1996) Сапсег Кез 56(5): 1137-1141.

Низюгп еї а). Меїйоавз іп Епгутоїоду 203:46-88(1991)

Ниудеп еї а!. (1996) Майте Меаісіпе. 2(8):893-898.

Ігапі У, МУеіпігаць Н, СеїІ 1984 Арг; 36(4): 1007-15

Ушап еї аї. (1992) 9. Сеп. Міго!ї. 73:3251-3255.

Капедаєе У. ега!., Мисі. Асіаз Кевз. 23:3816-3821(1995).

Каїпіп апа АїЇївспиї, 1990, Ргос. Маїй!. Асад. 5сі. ОА 87:2267-2268

КешШербогоцой, С.А. еї а). Еишг. 9. Іттипої. 24:952-958(1994)

Кпошигу . еї аіІ., Еипдатепіа!в ої Сепеїйїс Ерідетіоіоду, Охтога Опімегейу Ргезв, МУ, 1993 70 Кігп О-У. еї а. (1996) Сепотісв 34:213-218.

КіІєїп еї аї. (1987) Майте. 327:70-73.

Коси, еї аї., У.Віої.Спет. 265 (29): 17786-17791 (1990)

Копіег, 0. апа Міївівїп, С, Майте 256:495 (1975)

Коїег еї аї. (1992) Аппи. Кеум. Іттипої. 10:705-730.

Коза! МУ, 5пап М, Зпеп М, Мапод К, Рисіпі К, Мегідап ТС, Кісптап СО, Могтів ОЮ, Ниббеї! Е, Спее М, Сіпдегаз

ТК, Маї Мей 1996;2(7):753-759

Ї апаег апа ЗсногкК, Зсіепсе, 265, 2037-2048, 1994

Ї апдедгеп М. еї а). (1998) Сепоте Кезеагсі, 8:769-776.

Ї апде К. (1997) Маїнетаїйсаї апа 5і(айівіїса! Мейоз Тог Сепеїйс Апаїувів. Зргіпдег, Мем/ Могк

Ї ее е( аІ., РЕВЗ І ек. 445 231:236 (1999).

І еппнагат. еї аї. (1996) Сепе. 169:187-190.

ШПОашіага, 9. еї ам. СуюкКіпае 9 (4):233-241 (1997) уп ММУ еї а). Нит. Сепеї., 99(3): 417-420 (1997)

Млюоп М. Р. еї аї. (1993) у. Сііп. Іпмеві. 92:3029-3037. с

Ши 2. еї а. (1994) Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА. 91:4528-4262. мак еї аї., Майге Сепеїїісв, 9:341-342, 1995 (8) умак КУ, Наїіпег УМ, Нит Ма гаї 1994; 3(4):379-385

Ї оскнаг! еї а). Майшге ВіоїесппоЇоду 14: 1675-1680, 1996

Г исаз А.Н., 1994, Іп: Оемеіортепі апа Сіїпіса! Овзез ої Наетрорпйиз Б Сопічцчдасе; М зо Мапаег еї а/ї., Апаї. Віоспет. 214: 190-194 (1993).

Мапзоиг 5.Ї.. еї а). (1988) Майшге. 336:348-352. с

Маггнпаї! МК. Г. еї аї. (1994) РОК Меїйвосдвз апа Арріїсакопв. 4:80-84. Ге!

МссСогтіск еї аї. (1994) Сепеї. Апа!. Тесп. Аррі 11:158-164.

Меїі ацопіїп В.А. еї аї. (1996) Ат. 9. Нит. Сепеї. 59:561-569. ме)

Могепа еї аі., Аппаів МУ Асад. 5сі. 102-117 (1999) ї-

Могі, еї аіІ., Маїшге 350: 398-402 (1991)

Могтізоп, Зсіепсе 229:1202 (1985)

Могпіоп М.Е., Ат.). Нит.Сепеї., 7:277-318, 1955

МиПег, У.А. еї аї. Зігисіиге 6(9): 1153-1167(1998) «

Миїйіпах, К.Г. еї аІ. ВіоТесппіднез 12(6):864-869(1992) з с Мигусгка еї аї. (1992) Сигт. Торісв іп Місто, апа Іттипої. 158:97-129.

Й Мада 5. еї аї. (1993) СеїІ 73:1125-1135. и? Маду А. еї а!., 1993, Ргос. Май). Асай. сі. ОБА, 90: 8424-8428.

Магатига, М. еї аї. Іттипої. Гей. 39:91-99(1994)

Магапо 5А, Нвішпд НМ, Вгоиззеаи К, Меїйодз Епгутої 1979; 68:90-98 -І Меаа еї а). (1991) 9. Віої. Спет. 266:14143-14146.

Меулоп еї аї. (1989) Мисівїс Асідз Кев. 17:2503-2516. ік Міскеггоп О.А. еї аї. (1990) Ргос. Маїй!. Асад. Зсі. О.5.А. 87:8923-8927.

Ге) Місоїаи С еї аї., 1987, Ме(йодз Епгутої., 149:157-76.

Місоїач еї а!. (1982) Віоспіт. Віорпувз. Асіа. 721:185-190. о Міввіпої, у. Іттипої. 147(8): 2429-2438 (1991). "М Мугеп Р, Ребегезоп В, Опіеп М, Апаї! Віоспет 1993; 208(1): 171-175

О'КейуУ еї аї. (1992) Васцомігиз Ехргезвіоп Месіогег: А І арогаїогу Мапиа)!. МУ. Н. Егеетап апа Со., Мем Хогк.

Опгпо еї аї. (1994) Зсіепсе. 265:781-784.

ОЇ еї аі!., ВіоТесппіднез 4:214 (1986)

ОіІдеприго К.М. еї аї., 1992, Ргос. Маї!. Асад. Зсі., 89:5393-5397.

Ф) Оїезеп еї аі., Мо(аде даїеа іоп спаппе! тоадціагв, 7-8 Оесетрег, Рпйадеїрпіа РА, ХА (1995) ка Огіа еї а. (1989) Ргос. Май). Асад. Зсі. 0О.5.А. 86: 2776-2770.

ОК )., Апаїувзів ої Нитап Сепеїс І іпкаде, допп НоркКіпз Опімегейу Ргезз, ВаШтоге, 1991 во Ои!спіегіопу, О. еї аі., Спар. 19 іп: Напарсок ої Ехрегітепіа! Іттипоїіоду О. УМег (ей) ВіасКмеї! (1973)

Радіап Е.А., МоіІесшаг Іттипоіоду 28(4/5): 489-498(1991)

Рагтіеу апа 5тійй, Сепе, 1988, 73:305-318

Равіїіпеп єї аіІ., зепоте Кезеагсі 1997; 7:606-614

Реаггоп апа І іртап, 1988, Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 85(8):2444-2448 65 Реазе 5. апа МУШіат К.5., 1990, Ехр. СеїЇ. Кев, 190: 209-211.

Репіп еї а. (1994)Ат. у). Нит. Сепеї. 55:777-787.

Регзіс, І. еї аЇ. Сепе 187 9-18(1997)

Регйегзоп еї а!., 1993, Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА, 90: 7593-7597.

Ріеги еї аі. Сепоте Кезеагсіп 6:492-503, 1996

Ріїгага, М. еї а. У. Іттипої. Ме(подз 205(2): 177-190 (1997)

Роцег егйа)!. (1984) Ргос. Маї). Асай сі. О.5.А. 81 (22).-7161-7165.

Ргаї, М. еї а). 9. СеїІ. сі. 11 (РІ): 237-247(1998)

Катипвгеп еї а/!., 1997, ЕІесігорпогевів, 18: 588-598.

Кеїа Г.Н. еї а. (1990) Ргос. Май. Асаа. Зсі. 0О.5.А. 87:4299-4303. 70 Ківсі, М. апа Мегікапдавз, К. Зсіепсе, 273:1516-1517, 1996

Кобрегізоп Е., 1987, Етрбгуо-дегімей вієет сеї Ппев. Іп: Е.). Кобрегізоп Ей. Тегафосагсіпотаз апа етрбгіопіс віет сеїІв: а ргасіїса!| арргоаспі. ІК! Ргезз, Охіога, рр.71.

Кодизка М.А. еї ам. РМАБ5 91:969-973, (1994)

Коззві еї аІ.,, Рпагтасої. Тпег. 50:245-254, (1991)

Ко 3). А. еї а). (1996) Майшге Меаісіпе. 2 (9):985-991.

Коих еї а!. (1989) Ргос. Май. Асай. 5сі. О.5.А. 86:9079-9083.

Киапо еї аї. (1990) Ргос. Май! Асай. 5сі. О.5.А. 87:6296-6300.

ЗатргооК, ., Епівси, Е.Р., апа Т. Мапіайів. (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогаїюгу МапиаЇ. 2ей. Соїай

Зргіпд Нагброг І арогайгу, Соїд Зргіпд Нагрог, Мем" Могк.

Затвоп М, еї а. (1996)Агоїоге, 382 (6593): 722-725.

Затиївкі еї аї. (1989) 9. Мігої. 63:3822-3828.

Запспе:-Резсадогк. (1988) 9. Сіїп. Місгобвіо!ї. 26(10): 1934-1938. загкаг, б. апа Зоттег 5.5. (1991) Віобїесппідцев. зацег В. еї аії. (1988) Ргос. Май. Асай. 5сі. О.5.А. 85:5166-5170. сч зЗамаї, Н. еїг аі. АУКІ 34:26-34(1995) зсепеаді А. еї а!., 1993а, Майшге, 362: 258-261. (8) зепеаді еї аї., 199360, Мисіевїс Асіаз Кезв., 21: 4783-4787.

Зепепа еї а). Зсіепсе 270:467-470, 1995 зЗспепа еї аї., 1996, Ргос Маї! Асад 5сі ОБА,. 93(20): 10614-10619. М зо Зсппеїдег еї аІ(1997) Апедціп: А Зоїймаге Рог Роршайоп Сепеїйісв Оайа Апаїувів. Опімегейу ої Сепема.

Зспулагіг апа Оаупоїй, есдв., 1978, Маїйгісез їог ОЮеїйесіпо Оівіапсе КеїайопеПпірв: Айаз ої Ргоїевіп с

Зедцепсе апа зЗігисіиге, УУазпіпдіоп: Майопаї! Віотедіса! Кезеагсп! РГошпаайоп Ге!

Зсгаківї 0. еї а). (1995) Тгепаз Місгобіої!. 3(6):213-217. зЗпау УМ. еї а!., 1991, Віоспет. Віорпуз. Асіа, 1072: 1-7. (22)

Зпетіеїа, М.С. еї а. (1991) Ргос. Маї). Асад. Зсі. 0О.5.А. 49:699-706. ча

Зпігицуа еї а!. (1992) Ргос. Май! Асай. 5сі. ОО.5.А. 89:8794-8797.

ЗпоетакКег ОО, еї аї., Маї Сепеї 1996;14(4):450-456

ЗПпиМ, І. егаі. РМАЗ 90:7995-7999(1993)

ЗкКе!їта, А. еї а). 5сіепсе 240:1038-1040. (1988) «

Зтійй (1957) Апп. Нит. Сепеї. 21:254-276. з с тій еї а!. (1983) Мо/. Сеї! Віо!. 3:2156-2165. . Бозпомузкі КО, єї аї., Ргос Маї! Асад сі ОБА 1997; 94:1119-1123 и?» зЗомжанатіпі еї аі!., Ргоївіп Епдіпеегіпд 10:207, 215 (1997)

Зріеітапп 5. апа Єжепз МУ.)., Ат. У). Нит. Сепеї., 62:450-458, 1998

Зріеітапп 5. еї 5/.,Ат. У. Нит. Сепеї., 52:506-516, 1993 -І Зіеіпрего М... (1992) Тгепаз Сепеї. 8:1-16.

ЗіегпбрегоМ.Г.. (1994) Матт. Сепоте. 5:397-404. іш Зігуег, І.., Віоспетівігу, 4" едйіоп, 1995 (Се) зіцапіска О.М. еї а). Ргоївіп Епдіпеегіпу 7(6):805-814 (1994)

Зумапеп АС, Сііп СпітАсіа 1994; 226 (2):225-236 ді Згаро А. еї аіІ. Сигг Оріп 5ігисі Віо! 5, 699-705 (1995) "І Тасзвоп еї а). (1996) Майшиге Меадісіпе. 2(8):888-892.

Тагутап, К.Е. еї а. Мешгоп 14(4):755-762(1995) 5снаїа 0... еї аіІ., Сепеї. Ерідетіо!., 13:423-450,1996

Те Кіевїйе еї аї. (1990) Майте. 348:649-651.

Тепац еї аї., Маїгміззепзспанеп 85: 437-444 (1998)

ТепмійПдег У.О. апа ОК ., Напарсок ої Нитап Сепеїс І іпкаде, допп НоркКіпз Опімегейу Ргезв, І опаоп, 1994 о Тпотаз К.К. еї а. (1986) СеїІ. 44:419-428. іме) Тпотазг К.М. еї а!. (1987) СеїЇ. 51:503-512.

Тпотргоп еї аї., 1994, Мисіевїс Асідз Кев. 22 (2):4673-4680 во Тиг-Кагвра еї аї. (1986)М»/. Сеї|. Вісі. 6:716-718.

Туаді еї аї. (1998) Майте Віосїесппоіоду. 16:49-53.

Огаєа М.5. (1988) Мисівїс Асіаз Кезеагсп. 11:4937-4957.

Огаеєа М.5. еї а!. (1991) Мисівїс Асіаз 5утр. Зег. 24:197-200.

Маїйчкаїйїв, У. еї а. 9. Сііп. Епдосгіпо!ї. Мей(ар. 33:988-991(1971) 65 Маїадоп Р., еї аї, 1996, у. Мої. Віої., 261.11-22.

Мап дег І цаї еї аї. (1991) Сепе. 105:263-267.

МІЇ, Н. есаІ. РМАЗ 89:11337-11341(1992)

Міазак КМ. еї аї. (1983) Єиг. 9. Віоспет. 135:123-126.

Ууабріко еї аї. (1986).0М04.5(4):305-314.

УуаїКкег еї а). (1996) Сііп. Спет. 42:9-13.

Уапо еї аї, 1997, Спготайодгарніа, 44: 205-208.

МУеїг, 8.5. (1996) Сепеїйіс дайа Апаїувзів ІІ: Меїйподв їТог Оівсгеге роршіайоп депеїіс Юаїа, Зіпацег Аввос,

Іпс., Зипаепапа, МА, О.5.А.

МезіегіпкК М.А.), 1995, Ргос. Маї). Асай. Зсі, 92:4021-4025 70 МУУпе, М.В. еї а. (1992) Сепотісв. 12:301-306.

МУУпе, М.В. еї а. (1997) Сепотісв. 12:301-306.

УУШіатв, еї а). Зсіепсе 257: 389-395 (1992)

Уопа еї аІ. Сепе. 10:87-94 (1980)

Умоса 5.А. еї аї, 1993, Ргос. Маїй). Асад. Зсі. ОБА, 90: 4582-4585. уми апа уи (1987) 9. Віо! Спет. 262:4429-4432.

Ми апа Уи (1988) Віоспетівігу. 27:887-892.

Ми еї а). (1989) Ргос. Май. Асайд. Зсі. Ш.5.А. 86:2757.

Уаді Т. еї аї. (1990) Ргос. Май). Асад. сі. 0О.5.А. 87:9918-9922.

Мооп, О.У. еї а. 9. Іттипої. 160(7): 3170-3179(1998) 7папао еї аії, Мепгорпагтасоїоду 32 (11): 1075-1088 (1993) 7пао ег а). Ат. 9. Нит. Сепеї, 63:225-240, 1998 7пепо, Х.Х. еї аї. 9. Іттипої. 154:5590-5600(1995) 7, 2. ег а). Сапсег Кев. 58(15): 3209-3214(1998) 70 У. К. еї а. (1994) Ситт. Віо!. 4:1099-1103. с о

Claims (17)

Формула винаходу

1. Виділений, очищений або рекомбінантний полінуклеотид, який кодує поліпептид потенціалзалежного їч- зо ворітного іонного каналу людини (Сапіоп), а) що складається з будь-якої з нуклеотидних послідовностей, представлених як ЗЕО ІЮ МО: 1-3; або с Б) що складається з: о ї) нуклеотидної послідовності, представленої як БЗЕО ІЮ МО: 4, її) послідовності, комплементарної будь-якій з послідовностей (а); або (22) ії) полінуклеотиду, що кодує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО: 5. чн

2. Полінуклеотид за п.1, прикріплений до твердого носія та/або мітки.

3. Рекомбінантний вектор, що включає полінуклеотид за п. 1

4. Клітина-хазяїн, яка включає рекомбінантний вектор за п. 3.

5. Тварина-хазяїн, що не є людиною, що включає рекомбінантний вектор за п. 3, де твариною-хазяїном, « 70 Зокрема, є ссавець. ш-в с

6. Клітина ссавця-хазяїна, що не є людиною, що включає Сапіоп-ген, який відповідає послідовностям ЗЕО ІЮ МО: 1-3 або 4, розірваний гомологічною рекомбінацією за допомогою нокаутного вектора. :з»

7. Виділений, очищений або рекомбінантний поліпептид потенціалзалежного ворітного іонного каналу людини, який включає амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО 5.

8. Спосіб одержання поліпептиду, який включає: -І а) створення популяції клітин, які включають полінуклеотид, що кодує поліпептид за п. 7, функціонально приєднаний до промотору; ре) Б) культивування вказаної популяції клітин в умовах, придатних для одержання у вказаних клітинах со вказаного поліпептиду; і с) виділення очищенням вказаного поліпептиду з вказаної популяції клітин. їмо)

9. Антитіло або його антигензв'язуючий фрагмент, що специфічно зв'язують поліпептид за п. 7. «М

10. Антитіло за п. 9, яке є химерним, гуманізованим або людським моноклональним антитілом.

11. Спосіб ідентифікації кандидатного модулятора Сапіоп-поліпептиду, що включає: а) контактування поліпептиду за п. 7 з тест-сполукою; і 5) визначення специфічного зв'язування вказаної сполуки з вказаним поліпептидом; де виявлення того, що вказана сполука специфічно зв'язується з вказаним поліпептидом свідчить про те, що (Ф) вказана сполука є кандидатним модулятором вказаного Сапіоп-поліпептиду. ГІ

12. Спосіб за п.11, що включає, крім того, тестування активності іон-каналу вказаного Сапіоп-поліпептиду у присутності вказаного кандидатного модулятора, де відмінність в активності вказаного Сапіоп-поліпептиду у во присутності вказаного кандидатного модулятора у порівнянні з активністю за відсутності вказаного кандидатного модулятора свідчить про те, що даний кандидатний модулятор являє собою модулятор вказаного Сапіоп-поліпептиду.

13. Спосіб за п. 11, де спосіб придатний для ідентифікації модулятора для лікування шизофренії або біполярного розладу. 65

14. Спосіб ідентифікації модулятора Сапіоп-поліпептиду, що включає: а) контактування поліпептиду за п. 7 з тест-сполукою; і р) виявлення активності іон-каналу вказаного поліпептиду в присутності і за відсутності вказаної сполуки; де виявлення відмінності у вказаній активності в присутності вказаної сполуки у порівнянні з активністю за відсутності вказаної сполуки свідчить про те, що вказана сполука являє собою модулятор вказаного Сапіоп-поліпептиду.

15. Спосіб за п. 14, де спосіб придатний для ідентифікації модулятора для лікування шизофренії або біполярного розладу.

16. Застосування антитіла за будь-яким з пп. 9, 10 для виробництва ліків для лікування шизофренії або біполярного розладу. 70

17. Спосіб лікування біполярного розладу або шизофренії, що включає введення антитіла за будь-яким з пп. 9, 10 пацієнту, який цього потребує. с щі 6) ча с (о) (о)

м. -

с . и? -І се) се) іме) що іме) 60 б5