CN1468306A - 与精神分裂症相关的基因及蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PAPAP基因的多核苷酸、由PAPAP基因编码的多肽以及特异性抗这些多肽的抗体。本发明也涉及精神分裂症、双相情感障碍(bipolar disorder)或相关中枢神经系统疾病的治疗或诊断方法。本发明还涉及PAPAP与精神分裂症候选基因g34872之间的相互作用。

Description

与精神分裂症相关的基因及蛋白质
技术领域
本发明涉及PAPAP基因的多核苷酸、由PAPAP基因编码的多肽以及特异性抗这些多肽的抗体。本发明也涉及精神分裂症、双相情感障碍(bipolardisorder)或相关中枢神经系统疾病的治疗或诊断方法。本发明还涉及PAPAP与精神分裂症候选基因g34872之间的相互作用。
背景技术
技术装备方面的进步使基础和临床研究人员能够对健康和患病中的脑及神经系统功能进行越来越深入的研究。就与中枢神经系统(CNS)疾病包括精神疾病和神经退化性疾病有关的神经化学和基因机理论，人们业已提出了许多神经生物学上及药理学上的假设。然而，中枢神经系统疾病很复杂，病原学上知之甚少以及症状重叠，性状不显，故而难以判断。所以，进一步的治疗方案和药物研制的努力会更加复杂，并集中在多基因病因上，而且需要一些新尝试去把患病人群分开，从而为患有中枢神经系统疾病的病人提供更准确的诊断和预后信息。
中枢神经系统疾病包括的范围很广，相应地，遗传因子的范围也很广。中枢神经系统疾病的例子包括神经退化性疾病、精神病(psychotic disorders)、情绪失常(mood disorders)、自闭病、药物成瘾和酗酒、弱智及其它精神疾病(psychiatric diseases)，包括认知能力(cognitive)、焦虑、饮食、冲动控制(impulse-control)及人格障碍(personality disorders)。疾病的定义可采用精神病的诊断和统计手册(Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders)第四版的分类。
即使只考虑中枢神经系统疾病的小亚型(subset)，由于精神病、精神分裂症和双相情感障碍缺乏足够的治疗和对其疾病的分子基础又缺乏认识，很显然，需要在治疗发明上有新目标及改进的治疗方法。对于精神分裂症和双相情感障碍，所有用于治疗精神分裂症的已知分子都有副作用，而且只对疾病症状起作用。故目前迫切需要有一些没有副作用、并针对涉及精神分裂症和双相情感障碍因果机制的目标的新分子。所以，有助发现和表征这些目标的工具是必要的，而且十分有用。
综合家族成员的精神分裂症和双相情感障碍、从双胞胎和收养研究所得的证据以及全球发病均大同小异这一现象，都表明虽然环境危险因子在一定程度上是必要、充分或互相作用的原因，但精神分裂症和双相情感障碍主要还是遗传条件。例如，普通人中有1％会发生精神分裂症，但若一个人的祖父母有精神分裂症，则他患病的危险增大至约3％；若父母一方有精神分裂症，则他患病的危险增大至约10％；若父母双方都有精神分裂症，则他患病的危险增大至约40％。识别染色体13q31-q33上的精神分裂症易感性基因
识别涉及特定中枢神经系统疾病如精神分裂症等特定性状(trait)的基因主要有两种策略，目前均用于基因作图，它们是：连锁分析(linkage analysis)和关联性研究(association studies)。连锁分析需要研究其成员有多人患病的家族，这种分析现在用于检测单个或寡基因固有性状。与之相反，关联性研究检查与负特性(T-)对照组相比无亲戚关系的性状(T+)个体的标记等位基因频率，这种研究通常用于检测多基因遗传。
遗传连锁基于对染色体上两个相邻序列在减数分裂过程中通过交换含有最少重组的一个序列的分析。要进行遗传连锁先使诸如微卫星标记等染色体标记被准确定位于基因组上。遗传连锁分析根据系统树、疾病的传播和标记的传递计算所用染色体标记在目的基因上重组的概率。因此，如果预定标记特定等位基因与疾病一起传播的频率比带有该等位基因(重组水平在0和0.5之间)的机会要多，就可以推断在标记附近可找到所述目的基因。用这种技术可以确定一些表示家族性癌症的遗传倾向性的基因。为了能够用遗传连锁进行研究，患有遗传型疾病的家族成员必须符合“信息性”标准：每一代要有数个成员患病(可获得其结构DNA)，而且该家族最好有众多兄弟姐妹。
以前的连锁研究结果支持染色体13可能在13q32上隐藏一个精神分裂症易感性基因座的假设(Blouin JL等人，Nature Genetics，20：70-73页，1998年；Lin MW等人，Hum.Genet.，99(3)：417-410页，1997年)。这些发现表明通过进行连锁研究可以确定染色体13q32位点上存在精神分裂症基因座。连锁研究也已成功用于绘制清楚显示孟德尔式遗传模式以及具有高外显率的简单遗传性状，但这种方法存在许多缺点。首先，连锁分析受制于选择适合每种研究性状的遗传模型的可靠性。而且，用连锁分析所得到的分辨率也有限，需要进行补充研究来细化最初通过这种方法识别的常见20Mb区。此外，当应用于复杂的基因性状时，例如由于多基因和/或环境因子综合作用而产生的性状时，连锁分析也被证实无能为力。在这样的情况下，需要庞大的人力和财力才能招募到足够数目的患病家族成员，这是用连锁分析对这些情形所需要的。最后，连锁分析不能用于研究无法获得大量信息的家族的性状。
最近，通过一种变换方法，即用关联性研究代替连锁研究来识别一种与新型精神分裂症和双相情感障碍关基因，其被称为g34872基因位于染色体13q31-q33基因座上。这种变换方法包括在有兴趣的区内产生双等位标记(主要是单核苷酸多态性)，识别与精神分裂症连锁失衡的标记，以及在没有亲戚关系的精神分裂症和双相情感障碍病人及对照组人群中进行关联性研究。
简而言之，用位于染色体13q31-q33区的27个公共序列标记位点(STSs)构建一覆盖候选基因组区的细菌人工染色体(BAC)重叠群(contig)，以便筛选一个7种基因组相当的专有BAC文库。从这些材料产生新的序列标记位点，构建该区的密集型物理图谱。总之，275 STSs可以识别255个BAC，这些BAC全部依大小排列，并通过原位染色体杂交技术作图以作验证。以一些位于人染色体13q31-q33区的BAC插入片段的亚克隆插入端的局部排序产生新的双等位标记。在分析的第一阶段，在精神分裂症病例和对照组中分析染色体13q31-q33候选基因座之间9个不同BAC上第一组34个双等位标记，从而识别精神分裂症相关亚区(subregion)。第一次分析后，如上所述，产生另外一些双等位标记，以绘制高度密集型目的区(target region)图谱。识别最小一组有35个BAC，使其完全排序，结果出现几个重叠群，包括一个900kb以上包含目的区序列的重叠群。
这些双等位标记用在关联性研究中，使含有候选精神分裂症基因g34872的有兴趣的特定亚区更加细化。在对不同人群进行的一些研究中双等位标记被基因型分型，以确认与亚区的关联性。关联性研究首先在法裔加拿大人群中精神分裂症病人和对照组的两种不同筛选样本，其分别包括139病例和141个对照受试者以及215病例和241个对照受试者，以及在阿根廷人群中双相情感障碍病例和对照受试者中进行。用这些人进行的一些研究后所得的结果显示大约150kb的基因组区与精神分裂症密切相关。这种关联在用美国精神分裂症人群的病例和对照受试者进行的独立研究以及其它阿根廷人和法裔加拿大人群的样本中再次得到证实。
已发现，与精神分裂症相关的约150kb基因组区含有候选基因g34872。除了表征g34872基因的内含子—外显子结构外，还识别了包括组织特异性mRNA剪接变异型在内的一系列mRNA剪接变异型，而且证明了mRNA的存在。其后，一肽片段自g34872多肽产物中衍生，其氨基酸序列示于SEQ IDNo 5中，这表明当它们被注入小鼠腹膜内，迁移运动频率下降，而定型增加。于2000年3月30日提交、题为“与精神分裂症有关的基因、蛋白质及双等位标记”的共同待批美国专利申请号09/539,333与共同待批国际专利申请号PCT/IB00/00435都对g34872基因的识别作了进一步的讨论，以上两个申请列于本文的参考文献。
目前迫切需要识别涉及精神分裂症和双相情感障碍的基因。同时也有必要识别一些涉及g34872途径的基因以及一些产物与g34872基因产物在功能上相互作用的基因。这些基因在治疗精神分裂症或双相情感障碍中提供新的干预的问题，而且可以进一步研究和表征g34872基因和有关生物途径。认识这些基因和涉及精神分裂症的有关生物途径使研究人员能理解精神分裂症和双相情感障碍的病原，从而研究出针对这些病因的药物和治疗方案。此外，也急切需要寻找检测精神分裂症和双相情感障碍易感性以及预防或跟进这些疾病演化的新方法。诊断工具也证明十分有用。事实上，越早识别受试者有演变精神分裂症的危险，就可以施以早期和/或预防性治疗。而且，准确评估药物的最终效能以及病人对该药物的最终耐量可使临床医生提高精神分裂症和双相情感障碍治疗方案的效益/风险比。
因此，本发明涉及一种与g34872肽相互作用的新型基因和蛋白质。本发明人已经克隆了所述新型基因，称之PAPAP基因，而且证实了PAPAP基因产物与g34872肽相互作用。认识g34872结合配偶体有助开发治疗g34872和/或PAPAP介导的中枢神经系统疾病的药物，以及通过提供PAPAP、g34872和g34872-PAPAP复合物或相互作用的检测机制来研究g34872。
发明内容
本发明涉及核酸分子，其包含编码PAPAP蛋白质的新型人基因的基因组序列。PAPAP基因组序列包括位于所述基因转录部分上游(5’端)和下游(3’端)的调节序列，这些调节序列也是本发明的一部分内容。
本发明也涉及编码PAPAP蛋白质的完整cDNA序列以及PAPAP多肽和特异性识别PAPAP多肽的抗体。本发明还包括PAPAP-g34872复合物，所述复合物不含有与其天然结合的蛋白质，以及特异性识别所述复合物的抗体。
与PAPAP基因组或cDNA序列杂交的寡核苷酸探针或引物、用所述引物和探针进行DNA扩增和检测方法也是本发明的一部分内容。
本发明的另一个目的包括含有上述任何一段核酸序列的重组载体，特别是含有PAPAP调节序列或编码PAPAP蛋白质的序列的重组载体，以及含有所述核酸序列或重组载体的细胞宿主和转基因非人动物。
本发明还涉及抑制PAPAP表达的物质或分子的筛选方法，以及与PAPAP多肽相互作用、调节PAPAP多肽的活性或使PAPAP与g34872肽和/或蛋白质的结合和/或相互作用分裂、受到抑制、不稳定或增强的物质或分子的筛选方法。
最后，本发明涉及PAPAP多肽、其抗体以及PAPAP活性的激动剂和拮抗剂在治疗中枢神经系统疾病中的应用。简要说明序列表出现的序列
SEQ ID No 1含有PAPAP cDNA序列。
SEQ ID No 2含有由SEQ ID No 1 cDNA编码的氨基酸序列。
SEQ ID No 3含有PAPAP基因组DNA序列。
SEQ ID No 4含有编码如实施例1所述的g34872肽—碱性磷酸酶融合蛋白的DNA序列。
SEQ ID No 5含有编码如实施例1所述的用来识别和克隆PAPAP基因的g34872肽的DNA序列。
SEQ ID No 6含有由SEQ ID No 4的DNA编码的氨基酸序列。具体实施方式识别位于染色体1p35-p36上的PAPAP基因
本发明人使用了表达克隆方法来识别PAPAP基因，在本文实施例1中会作进一步叙述。简单地说，发明人在含有位于插入片段指导分泌到媒体的融合蛋白上游处的分泌信号序列的载体中构建了编码具有分泌碱性磷酸酶(AP)C端g34872肽的肽片段的cDNA序列符合读框的融合，如果含有融合蛋白的媒体可被收集，为碱性磷酸酶的活性被分析，并将这种媒体用在原位受体/配体试验中的话。发明人再进行原位受体/配体试验。来自人脑cDNA文库的cDNA被克隆到表达载体，并转染到COS-1细胞。用分泌碱性磷酸酶融合蛋白作为探针，将细胞与含有g34872肽—碱性磷酸酶融合蛋白的媒体一起培养以克隆PAPAP。当检测到阳性克隆时，用cDNA的较小文库重复该试验，直到识别出单个克隆。
故本发明涉及与PAPAP基因相关的多核苷酸和多肽。与PAPAP基因组或cDNA序列特异性杂交的寡核苷酸探针和引物也是本发明的一部分内容。本发明的另一个目的包括含有本发明所述任何一段核酸序列的重组载体，特别是含有PAPAP调节序列或编码PAPAP蛋白质的序列的重组载体，以及含有所述核酸序列或重组载体的细胞宿主。本发明还包括抑制PAPAP表达的物质或分子的筛选方法，以及与PAPAP多肽相互作用、调节PAPAP多肽的活性或使PAPAP和g34872肽和/或蛋白质的结合和/或相互作用分裂、受到抑制、去稳定或增强的物质或分子的筛选方法。本发明也涉及特异性抗这些多肽的抗体，它们用作诊断试剂。
已识别的PAPAP基因和蛋白质可用于设计精神分裂症或双相情感障碍的诊断试验，以及用于设计精神分裂症、双相情感障碍及相关疾病基因易感性的可靠性检测试验。PAPAP核酸和多肽以及抗所述多肽的抗体可用在治疗所述疾病。PAPAP基因和蛋白质及其抗体也可用于设计药物筛选方案，以便准确、有效地评估新的或现有的药物或治疗方案的治疗及潜在的副作用。此外，PAPAP核酸和多肽可用于研究g34872和PAPAP及其在中枢神经系统疾病中的相关连的事物。定义
在详细叙述本发明之前，下面给出一些定义说明和限定用于阐述本发明术语的含义和范围。
本文所用的术语“ PAPAP基因”包括编码PAPAP蛋白质的基因组、mRNA和cRNA序列，包括基因组DNA非翻译调节区。
本文所用的术语“ 异源蛋白质”用于指定除PAPAP蛋白质以外的任何蛋白质或多肽。具体地说，异源蛋白质是在用PAPAP调节区进行的另外一些实验中作为标记的化合物。
术语“ 分离的”要求物质离开其原来的环境(例如，若物质是天然存在的，就离开天然环境)。例如，天然存在于有生命的动物的多核苷酸或多肽就不是分离的，但自天然系统中部分或全部共存物质分离出来的同一些多核苷酸或DNA或多肽就是分离的。这些多核苷酸可以是部分载体和/或这些多核苷酸或多肽可以是部分组合物，由于载体或组合物不属于天然环境的一部分，故这些多核苷酸仍然是分离的。
例如，天然存在于有生命的动物的多核苷酸不是分离的，但自天然系统中部分或全部共存物质分离出来的同一些多核苷酸或多肽就是分离的。特别排除在定义“分离的”之外的是天然存在的染色体(如染色体扩展)、人工染色体文库、基因组文库及作为体外核酸制剂或作为转染/转变宿主细胞制剂存在的cDNA文库，其中宿主细胞是体外异源制剂或作为单个克隆异源制剂而被接种。尤其将上述文库中其特定多核苷酸占载体分子中核酸插入片段数小于5％的文库排除在外。定义“分离的”还尤其不包括总细胞基因组DNA或总细胞RNA制剂(包括用机械剪切或酶消化的所述全部细胞制剂)。“分离的”也特别不包括以上所述作为体外制剂或通过电泳(包括印迹转移)分离的异源混合物的总细胞制剂，其中本发明的多核苷酸没有与电泳媒体的异源多核苷酸作进一步分离(例如，通过从琼脂糖凝胶或尼龙印迹的异源条带群切除单一条带来进一步分离)。
本文所用的术语“纯化的”不要求绝对纯；它只作为一个相对定义。原始材料或天然材料的纯化至少是一个数量级，优选使用两或三个数量级，最好是四或五个数量级。例如，从0.1％浓度到10％浓度的纯度是两个数量级。
为了便于说明，已经将与cDNA文库分离的个体cDNA克隆用常规方法纯化至电泳均一性。由这些克隆所得的序列不能直接从文库或全人DNA制得。这些cDNA克隆不是天然存在的，而是通过操纵局部纯化的天然存在的物质(信使RNA)而制得。mRNA转化为cDNA文库涉及产生合成物质(cDNA)，而纯的个体cDNA克隆通过克隆选择可以与合成文库分离。所以，从信使RNA生成cDNA文库以及后来从该文库分离个体克隆导致天然信使纯化大约104-106倍。
本文所用的术语“纯化的”还描述与其它化合物分离的本发明的多肽或多核苷酸，包括但不限于：多肽或多核苷酸、碳水化合物、脂质等。术语“纯化的”可用于指定与寡聚形式，如同源或异源二聚体、三聚体等，分离的本发明的单聚多肽。术语“纯化的”也可用于指定与线性多核苷酸分离的共价密闭多核苷酸。当样本至少大约50％，最好60-75％具有单个多核苷酸序列和构象(线性对共价密闭)时，多核苷酸基本上是纯的。基本纯的多肽或多核苷酸通常分别约占多肽或多核苷酸样本的50％，最好为60-90％(重量/重量)，更常见的是纯度约为95％，最好是99％以上。众所周知，多肽或多核苷酸纯度或均一度有许多方式测定，如先对样本进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，再观察凝胶染色后的单条带。对于某些用途，用高效液相层析法或本技术领域公知的其它方法可获得高分辨率。作为一个替换实施例，本发明的多肽或多核苷酸的纯化可表示为相对异源多肽和多核苷酸(DNA、RNA或二者)“至少”一个纯度百分比。作为一个优选实施例，本发明的多肽或多核苷酸分别相对异源多肽或多核苷酸的纯度至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、100％。作为另一个优选实施例，多肽或多核苷酸的纯度分别相对异源多肽或多核苷酸在90％和100％之间小数位至第千位的任何一个数字的范围内变化(例如，多肽或多核苷酸的纯度至少99.995％)，或表示为相对除了存在于载体中化合物和分子以外的全部化合物和分子的重量/重量比。本发明要求保护以每个小数位至第千位表示一个纯度百分比的数字表示的各种纯度。
术语“ 多肽”指氨基酸的聚合物，与聚合物长度无关；所以，肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义中。该术语也不指定或排除多肽的表达后修饰，例如，与糖基、乙酰基、磷酸基、脂类基团等共价连接的多肽明确包括在术语多肽中。在该定义内还包括含有一个或多个氨基酸类似物(例如，包括非天然存在的氨基酸、只在不相关生物系统中存在的氨基酸、来自哺乳动物系统经修饰的氨基酸等)的多肽、带有取代键以及本领域技术公知的其它修饰的多肽，无论是天然存在或非天然存在。
本文所用的术语“ 重组多肽”指被人工设计和包括至少两个多肽序列的多肽，这两个多肽序列作为相邻多肽序列在初始天然环境中是找不到的，或者指已由重组多肽表达的多肽。
本文所用的术语“纯化的多肽”指与其它化合物分离的本发明的多肽，这些化合物包括但不限于：核酸、脂质、碳水化合物及其它蛋白质。当样本至少大约50％，最好60-75％具有单个多肽序列时，多肽基本上是纯的。基本纯的多肽通常分别约占蛋白质样本的50％，最好是60-90％(重量/重量)，更常见的纯度约为95％，最好是99％以上。众所周知，多肽纯度或均一度有许多方式测定，如先对样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再观察凝胶染色后的单条多肽条带。对于某些用途，用高效液相层析法或本技术领域公知的其它方法可获得高分辨率。
本文所用的术语“ 非人动物”指任何不是人的脊椎动物、鸟类，而通常指哺乳动物，最好是灵长目动物、家禽，如猪、山羊、绵羊、驴和马、兔或者啮齿目动物，最好是大鼠或小鼠。本文所用的术语“动物”用于指任何脊椎动物，最好是哺乳动物。术语“动物”和“哺乳动物”明确包括人受试者，除非前面带有术语“非人动物”。
本文所用的术语“ 抗体”指由至少一个结合区(binding domain)组成的多肽或多肽群，其中抗体结合区通过折叠抗体分子的可变区而形成，与内表面形状及电荷分布形成三维结合空间，该空间与抗原的抗原决定簇的特征互补，可以与抗原进行免疫反应。抗体包括重组蛋白质，其包括结合区，以及片段，而片段包括Fab、Fab’、F(ab)2和F(ab’)2片段。
本文所用的“ 抗原决定簇”是决定抗原—抗体反应特异件的部分抗原分子，在本发明指PAPAP多肽。“表位”指多肽的抗原决定簇。一个表位在空间构象中可包括至少3个氨基酸，而一个表位就有唯一一个空间构象。通常，一个表位包括至少6个氨基酸，较常见包括至少8-10个氨基酸。确定组成表位的氨基酸的方法包括X射线结晶学、二维核磁共振及表位作图法，例如Geysen等人(1984年)、PCT公开号WO 84/03564及PCT公开号WO 84/03506所述的肽扫描法。
整篇说明书所用的术语“ 核苷酸序列”一般用于指定多核苷酸或核酸。准确地说，术语“核苷酸序列”包括核材料本身，故不限于在生物化学上表征特异性DNA或RNA分子的序列信息(即在四个基本字母中所选择的字母顺序)。
术语“核酸”、“寡核苷酸”及“多核苷酸”在本文是互通的，包括RNA、DNA或RNA/DNA杂交序列，其具有一个以上单链或双螺旋型核苷酸。本文所用的术语“核苷酸”是形容词，描述包括任何长度单链或双螺旋型的RNA、DNA或RNA/DNA杂交序列的分子。术语“核苷酸”在本文也用作名词，指个体核苷酸或核苷酸簇，意味着分子、或大核酸分子中的个体单元，对于寡核苷酸或多核苷酸内的核酸，其包括嘌呤或嘧啶、核糖或脱氧核糖分子、以及磷酸盐基、或磷酸二酯键。虽然术语“核苷酸”本文也用于包括“修饰后的核苷酸”，其包括至少以下一种修饰：(a)变换连接基，(b)嘌呤的类似型，(c)嘧啶的类似型，或(d)糖的类似型，例如，类似连接基、嘌呤、嘧啶及糖的例子可参看PCT公开号WO 95/04064。本发明的多核苷酸序列可用任何已知方法制备，包括合成、重组、体内产生、或其组合、以及用本技术领域已知的任何一种纯化方法。
“ 可操作地连接”在调节序列如启动子的序列，是指所述序列元件相对于核酸处于正确位置和方向，以调控RNA聚合酶的启动和所述核酸的表达。本文所用的术语“可操作地连接”指多核苷酸元件在功能关系上的连接。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，它们可操作地连接在编码序列上。
术语“ 性状”和“表型”在本文是互通的，指有机体任何看得见的、检测得到的或其它可测量的性质，如疾病征状或疾病易感性。本文所用的术语“性状”或“表型”通常指疾病征状或疾病易感性、对治疗的有效应答或相关副作用。所述性状最好是，但不限于，癌症、不断加重的疾病及神经疾病。
本文所用的术语“ 等位基因(allele)”指核苷酸序列的变异型。双等位基因多态性有两种型式。二倍体有机体的等位基因型可以是纯合或杂合的。
本文所用的术语“ 基因型”指存在于个体或样本中等位基因的同一性。在本发明的上下文中，基因型最好指存在于个体或样本的双等位标记等位基因的叙述。术语使样本或个体的双等位标记“基因型分型”包括确定个体在双等位标记上携带的特异性等位基因或特异性核苷酸。
本文所用的术语“ 突变”指频率低于1％的不同基因组或个体之间的DNA序列差异。
本文所用的术语“ 多态件”指不同基因组或个体之间发生两种或多种变换基因组序列或等位基因。“多态的”指在一群序列中可找到两种或多种特异性基因组序列变异型的条件。“多态位点”是变异发生的基因座。单核苷酸多态性是在多态位点上用另一个核苷酸取代一个核苷酸。删除单核苷酸或插入单核苷酸也会产生单核苷酸多态性。在本发明的上下文中，“单核苷酸多态性”最好指单核苷酸取代。通常，不同个体之间的多态位点可以被两个不同核苷酸所置换。术语“ 双等位基因多态性”和“ 双等位基因标记”在本文是互通的，指在一群中具有频率相对较高的两个等位基因的单核苷酸多态性。“双等位标记等位基因”存在于指双等位标记位点上的核苷酸变异型。
本文所用的术语“ 上游”指从特定参考点面向多核苷酸5’端的位置。本文所用的术语“ 碱基配对”和“Watson & Crick碱基配对”在本文是互通的，指由于序列同一性通过氢键相互结合的核苷酸，例如在双螺旋DNA中可以发现胸腺嘌呤或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，而胞嘧啶残基通过三个氢键与鸟嘌呤残基连接(参看Stryer，L.，Biochemistry，第4版，1995年)。
本文所用的术语“ 互补”或“其补体”指能够在整个互补区与另一种特定多核苷酸形成Watson & Crick碱基配对的多核苷酸序列。对本发明来说，当第一个多核苷酸的每个碱基与其互补碱基配对，就认为第一个多核苷酸与第二个多核苷酸互补。互补碱基通常是A和T(或A和U)，或C和G。“补体”在本文是“互补多核苷酸”、“互补核酸”和“互补核苷酸序列”的同义词。这些术语适用于多核苷酸对，但只基于其序列而非基于两个多核苷酸实际结合的任何一组特定条件。变异型和片段1-多核苷酸
本发明也涉及本文所述的多核苷酸变异型和片段，特别是含有一个或多个本发明双等位标记的PAPAP基因。
本文所用的术语多核苷酸变异型是区别于参考多核苷酸的多核苷酸。多核苷酸变异型可以是天然存在的变异型，如天然存在的等位基因变异型，或者它可以是天然存在的未知变异型。这些非天然存在的多核苷酸变异型可由基因突变技术制备，包括施加于多核苷酸、细胞或有机体的突变。通常会限制变异，使参考核苷酸序列和变异型大致相似，许多区是相同的。
本发明的多核苷酸变异型包括，但不限于，与SEQ ID No 1或3多核苷酸或者与SEQ ID No 1或3多核苷酸中具有至少12个连续核苷酸的任何一段多核苷酸片段的同一性至少是95％的核苷酸序列，与SEQ ID No 1或3多核苷酸或者SEQ ID No 1或3多核苷酸中具有至少12个连续核苷酸的任何一段多核苷酸片段的同一性优选至少是99％，同一性更优选至少是99.5％，同一性最好是99.8％。
变异型多核苷酸的核苷酸变化可以是沉默的，这意味着它们不会改变由多核苷酸编码的氨基酸。然而，核苷酸变化也可以导致由参考序列编码的多肽的氨基酸取代、插入、缺失、融合和平截。这些取代、缺失或插入可涉及一个或多个核苷酸。可在编码或非编码区或二者内改变这些变异型。编码区的变化可产生保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或插入。
在本发明的上下文中，特别优选实施例是那些多核苷酸编码基本上保留与成熟PAPAP蛋白质相同的生物功能或活性的多肽的实施例，或者是那些多核苷酸编码保持或增加一种特定生物活性，但降低另一种生物活性的多肽的
实施例。
多核苷酸片段是其序列与给定核苷酸序列，最好是PAPAP基因核苷酸序列及其片段，的一部分而非全部完全一致的多核苷酸。该片段可以是PAPAP基因内含子或外显子的一部分。它也可以是PAPAP调节区的一部分。
这些片段可以“独立的(free-standing)”，即不属于其它多核苷酸，也不与其它多核苷酸融合，或它们可包含在单个较大多核苷酸内，形成多核苷酸的一部分或区域。事实上，这些片段中有几段可存在于单个较大多核苷酸内。
这些片段可选择地由或基本上由一段连续跨距(span)组成，该跨距长至少8、10、12、15、18、20、25、35、40、50、70、80、100、250、500或1000个核苷酸。2-多肽
本发明还涉及本文所述的多肽变异型、片段、类似物及衍生物，包括突变PAPAP蛋白质。
变异型可以作以下变异：1)用保守性或非保守性氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基，而这些取代氨基酸残基可以或不必由遗传密码编码，或2)一个或多个氨基酸残基包括一个取代基，或3)突变PAPAP与另一种化合物融合，如可提高多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)，或4)插入的氨基酸与突变PAPAP融合，例如，前导或分泌序列或用来纯化突变PAPAP的序列或前蛋白序列。这些变异型也为本领域技术人员所知。
多肽片段是一多肽，其序列与给定多肽序列，最好是由PAPAP基因及其变异型编码的多肽的一部分而非全部完全一致。
对于本发明的多肽氨基酸序列中的氨基酸取代，可用“当量(equivalent)”氨基酸取代一个或多个氨基酸。本文所用的术语“当量”氨基酸用于指定任何一个可被具有相似性质的其中一个氨基酸所取代的氨基酸，这样，肽化学领域的技术人员可预测多肽的二级结构和亲水性质基本上无改变。通常，以下几组氨基酸表示当量变化：(1)Ala，Pro，Gly，Glu，Asp，Gln，Asn，Ser，Thr；(2)Cys，Ser，Tyr，Thr；(3)Val，Ile，Leu，Met，Ala，Phe；(4)Lys，Arg，His；(5)Phe，Tyr，Trp，His。
本发明所述修饰过的PAPAP肽分子的特定例子包括，但不限于，抗蛋白水解的肽分子、修饰过的-CONH-肽键或以(CH2NH)还原键、(NHCO)反键(retroinverso bond)、(CH2-O)亚甲氧键、(CH2-S)硫亚甲键、(CH2CH2)碳键、(CO-CH2)廿二烯酸亚甲基、(CHOH-CH2)羟乙烯键、(N-N)键、E-alcene键或-CH＝CH-键取代的肽。本发明还包括人PAPAP多肽或其片段或变异型，其中至少一个肽键按以上所述进行修饰。
这些片段可以“独立的(free-standing)”，即不属于其它多核苷酸，也不与其它多核苷酸融合，或它们可包含在单个较大多肽内，形成多肽的一部分或区域。然而，一些片段可包含在单个较大的多肽内。
作为本发明多肽片段的典型例子，这些片段长5、6、7、8、9或10至15、10至20、15至40、或30至55个氨基酸。优选是那些在PAPAP蛋白质中含有至少1个氨基酸突变的片段。核酸或多肽之间的同一性
术语“序列同一性百分比”和“同源性百分比”在本文是互通的，指在多核苷酸和多肽之间所作的比较，将两个最优排列的序列在比较窗口中进行比较就可以确定“序列同一性百分比”和“同源性百分比”，其中在比较窗口中部分多核苷酸和多肽序列与参考序列(不包括插入或缺失)相比可包括插入或缺失(即缺口(gap))，使两个序列得到最优排列。计算百分比时确定两个序列具有相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，得出匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口的总位置数，再将所得结果乘以100就得到序列同一性百分比。用本技术领域已知的任何一种序列比较算法和程序来评估同源性。这些算法和程序包括，但不限于，TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson and Lipman，1988年；Altschul等人，1990年；Thompson等人，1994年；Higgins等人，1996年；Altschul等人，1990年；Altschul等人，1993年)。在特别优选实施例中，用本技术领域公知的基本局部相似性搜索工具(BLAST)来评估蛋白质和核酸序列同源性(例如，参见Karlin andAltschul，1990年；Altschul等人，1990、1993、1997年)。具体地说，用5种特定BLAST程序实现以下任务：
(1)BLASTP和BLAST3将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库进行比较；
(2)BLASTN将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库进行比较；
(3)BLASTX将查询核苷酸序列(双链)的六框概念翻译产物与蛋白质序列数据库进行比较；
(4)TBLASTN将查询蛋白质序列与被翻译在全部六读框(six readingframe)(双链)中的核苷酸查询序列进行比较；以及
(5)TBLASTX将核苷酸查询序列的六框翻译与核苷酸序列数据库的六框翻译进行比较。
BLAST程序通过识别查询氨基酸或核酸序列与最好来自蛋白质或核酸序列数据库的测试序列之间的相似片段，本文称之“高分值片段对”(hig-scoring segment pairs)，来识别同源序列。最好利用分值矩阵来识别(即对比)高分值片段对，许多分值矩阵已为本领域所公知。分值矩阵最好采用BLOSUM62矩阵(Gonnet等人，1992年；Henikoff和Henikoff，1993年)。其次采用PAM或PAM250矩阵(参见Schwartz和Dayhoff，eds.，1978年)。BLAST程序评估所有已识别的高分值片段对的统计学意义(statistical significance)，最好选择那些满足使用者规定的差异阈的片段，如使用者规定的同源性百分比。最好用Karlin统计学意义方程式来评估高分值片段对的差异显著(参见Karlin和Altschul，1990年)。
也可以用内定参数或使用者提供的修改参数来使用BLAST程序严格杂交条件
为了限定本发明这样一些杂交核酸严格杂交条件如下：
杂交步骤是在65℃在6xSSC缓冲液、5xDenhardt’s溶液、0.5％SDS及100μg/ml鲑鱼精子DNA存在下进行的。
杂交步骤后进行以下四步清洗步骤：
·最好5分钟内在65℃用2×SSC和0.1％SDS缓冲液洗两次；
·最好在65℃用2×SSC和0.1％SDS缓冲液洗30分钟；
·最好在65℃用0.1×SSC和0.1％SDS缓冲液洗10分钟。
这些杂交条件适合长度大约为20个核苷酸的核酸分子。按照本领域技术人员熟知的技术，以上所述的杂交条件也可根据所需核酸的长度作出调整，在此不再作叙述。例如，根据Hames和Higgins的书(1985年)提供的方法可对适当杂交条件作适应性改变。PAPAP基因的基因组序列
本发明涉及PAPAP基因组序列。本发明包括PAPAP基因或PAPAP基因组序列，该序列由或基本上由SEQ ID No 3序列、其互补序列以及其片段和变异型组成，或包括SEQ ID No 3序列、其互补序列以及其片段和变异型。这些多核苷酸可被纯化、分离或重组。
PAPAP核酸包括分离的、纯化的、或重组多核苷酸，所述多核苷酸包括一段连续跨距，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 3核苷酸或其补体，或者由或基本上由一段连续跨距组成，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No3核苷酸或其补体。PAPAP核酸还包括分离的、纯化的、或重组多核苷酸，所述多核苷酸包括一段连续跨距，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个选自SEQ ID No3核苷酸位置1至3038、1至421、422至557、2158至2218以及2620至3039组成的组的核苷酸或其补体，或者由或基本上由一段连续跨距组成，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个选自SEQ ID No 3核苷酸位置1至3038、1至421、422至557、2158至2218以及2620至3039组成的组的核苷酸或其补体。本发明也包括分离的、纯化的、或重组多核苷酸，其包含的核苷酸序列与SEQ ID No3核苷酸序列或其互补序列或其片段的序列同一性至少是70、75、80、85、90或95％。相对SEQ ID No 3核苷酸序列的核苷酸差异通常随机分布在整个核酸。然而，优选核酸是那些其相对SEQ ID No 3核苷酸序列的核苷酸差异主要位于外显子包含的编码序列外部的核酸。这些核酸及其片段和变异型可用作寡核苷酸引物或探针，以检测测试样本中存在PAPAP基因复制，或用以扩增PAPAP序列内的目的核苷酸序列。本发明的另一个目的包括在上述规定的严格杂交条件下与SEQ ID No 3核苷酸序列或其互补序列或其变异型杂交的分离的、纯化的、或重组核酸。
这一章节题为“PAPAP基因组序列”，需要注意的是，任何大小的核酸片段和序列也包含在本章节所述的多核苷酸中，它们位于PAPAP的基因组序列其中一侧或者在这些基因组序列中两个或多个之间。PAPAP cDNA序列
业已证明，PAPAP基因表达可制备至少一种mRNA，其核酸序列在SEQID No 1已有叙述。
本发明的另一个目的是纯化的、分离的或重组核酸，其包括SEQ ID No 1核苷酸序列、其互补序列及其等位基因变异型和片段。此外，本发明的优选多核苷酸包括纯化的、分离的、或重组PAPAP cDNA，所述PAPAP cDNA由或基本上由一段连续跨距组成，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 1核苷酸或其补体，或者所述PAPAP cDNA包括一段连续跨距组成，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 1核苷酸或其补体。本发明的核酸还包括分离的、纯化的、或重组多核苷酸，所述多核苷酸包括一段连续跨距，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 1核苷酸或其补体，其中所述连续跨距包含至少1、2、3、5、或10个下列SEQ ID No 1核苷酸位置：1至140、141至460、460至690、87至346及691至1104。本发明的优选实施例还包括分离的、纯化的、或重组多核苷酸，所述多核苷酸包括一段连续跨距，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 1核苷酸或其补体，其中所述连续跨距包括双等位标记。
本发明也涉及纯化的或分离的核酸，该核酸包括的多核苷酸与SEQ IDNo 1多核苷酸的核苷酸同一性至少是95％，与SEQ ID No 1多核苷酸、或其互补序列、或其具有生物活性的片段的核苷酸同一性优选有99％，更优选有99.5％，最好有99.8％。
本发明的又一个目的涉及纯化的、分离的或重组核酸，其包括在本文规定的严格杂交条件下与SEQ ID No 1多核苷酸、或其互补序列或其变异型或其具有生物活性的片段杂交的多核苷酸。
SEQ ID No 1的cDNA包括5’-UTR区，其始于SEQ ID No 1位置1的核苷酸，止于位置86的核苷酸。SEQ ID No 1的cDNA包括3’-UTR区，其始于SEQ ID No 1位置347的核苷酸，止于位置1104的核苷酸。聚线苷酸化信号始于SEQ ID No 1位置1085的核苷酸，止于位置1104的核苷酸。
因此，本发明涉及纯化的、分离的或重组核酸，其包括PAPAP cDNA的5’-UTR核苷酸序列、其互补序列或其等位基因变异型。本发明还涉及纯化的、分离的或重组核酸，其包括PAPAP cDNA的3’-UTR核苷酸序列、其互补序列或其等位基因变异型。
这一章节题为“PAPAP cDNA序列”，需要注意的是，任何大小的核酸片段和序列也包含在本章节所述的多核苷酸中，它们位于PAPAP基因组序列其中一侧或者在这些基因组序列中两个或序个之间。编码区
SEQ ID No 1相应mRNA含有PAPAP开放阅读框(open reading frame)。准确地说，有效PAPAP编码序列(CDS)包括SEQ ID No 1核苷酸位置87(ATG密码子的第一个核苷酸)和核苷酸位置346(TGA密码子的最后一个核苷酸)之间的区域。本发明也包括分离的、纯化的和重组多核苷酸，其编码包括一段连续跨距的多肽，而该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8或10个SEQ ID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQ ID No 2氨基酸。
以上揭示的包含PAPAP基因编码序列的多核苷酸受适当表达信号调控时，可在所希望的宿主细胞或所希望的宿主有机体中得到表达。这些表达信号可以是包含在本发明PAPAP基因的调节区中的表达信号，或者与之相反，这些信号也可以是外源调节核序列。当这样一个多核苷酸遇到合适的表达信号时，也可被插入到载体中，以便表达和/或扩增。PAPAP调节序列
如上所述，PAPAP基因的基因组序列在非编码5’侧翼区和非编码3’侧翼区含有调节序列，这些侧翼区邻接含有该基因3个外显子的PAPAP编码区。
自5’和3’调节区衍生的多核苷酸用于检测测试样本至少存在SEQ ID No3核苷酸序列或其片段的复制。
按以下方法评估包含在PAPAP中5’调节区的启动子活性。
为了识别具有生物活性的相关SEQ ID No 3多核苷酸片段或变异型，本领域技术人员可参考Sambrook等人的书(Sambrook，1989年)，书中叙述了携带标记基因的重组载体(即β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶等)的应用，当受具有生物活性的SEQ ID No 3多核苷酸片段或变异型调控时，可检测到标记基因的表达。位于PAPAP基因第一外显子上游的基因组序列被克隆到适当启动子报导基因载体，如通过克隆技术可获得pSEAP-碱基、pSEAP-增强子、pβgal-碱基、pβgal-增强子或pEGFP-1启动子报导载体，或由Promega公司提供的pGL2-碱基或pGL3-碱基无启动子的萤光素酶报导基因载体。简单地说，这些启动子报导基因载体中每个都包括多个位于报导基因上游的克隆位点，而这些报导基因编码容易分析的蛋白质，如分泌碱性磷酸酶、萤光素酶、β半乳糖苷酶、或绿萤光蛋白质。PAPAP编码区上游的序列以两个方向插入到报导基因上游的克隆位点，并导入合适的宿主细胞中。分析报导蛋白质的水平，并且与克隆位点上缺失插入片段的载体的水平进行比较。与对照载体相比，含有插入片段的载体的表达水平有所提高，这表明插入片段存在启动子。若需要，可将上游序列克隆到含有增强子的载体中，以提高弱启动子序列的转录水平。在缺少插入片段的载体中发现以上表达水平有显著提高，表明启动子序列存在于已插入的上游序列中。
上游基因组DNA内的启动子序列可用常规技术，如外切核酸酶III或适当限制性内切核酸酶消化技术，在上游DNA构建嵌套5’和/或3’缺失序列以作进一步限定。例如，Coles等人于1998提出，将所得缺失片段插入到启动子报导基因载体中，以确定缺失序列是否使启动子的活性下降或消失，具体可参考本文的引用文献。这样，就可以限定启动子的界面。若需要，单独用定点诱变或接头分区诱变或用二者的组合消除启动子内可能转录因子结合位，以识别启动子内可能个体调节位点。通过将突变插入到启动子报导基因的克隆位点而可确定这些突变对转录水平的影响。这类测试已为本领域技术人员所公知，WO 97/17359、美国专利US5,374,544、欧洲专利EP 582 796、美国专利US5,698,389、美国专利US 5,643,746、美国专利US 5,502,176及美国专利US5,266,488都有叙述，具体可参考本文的引用文献。
利用与不同种类细胞和组织的PAPAP启动子可操作地连接的可检测多核苷酸的表达水平评估PAPAP基因的启动子的强度和特异性。可检测多核苷酸可以是与预定寡核苷酸探针特异性杂交的多核苷酸，或者是编码可检测蛋白质的多核苷酸，包括PAPAP多肽或其片段或变异型。这类试验已为本领域技术人员所公知，美国专利US5,502,176和美国专利US5,266,488都有叙述，具体可参考本文的引用文献。以下对其中一些方法作详细讨论。
优选使用带有调节元件且位于PAPAP编码区5’端和3’端的多核苷酸，调控所述异源多核苷酸的转录和翻译活性。
所以，本发明也涉及含有多核苷酸的纯化的或分离的核酸，而该多核苷酸选自由5’和3’调节区、或其互补序列或其具有生物活性的片段或变异型组成的组。在一实施例中，“5’调节区”包括位于SEQ ID No 3位置1和421之间的核苷酸序列。在另一实施例中，“3’调节区”包括位于SEQ ID No 3位置3040和3189之间的核苷酸序列。
本发明还涉及含有多核苷酸的纯化的或分离的核酸，而该多核苷酸与选自由5’和3’调节区组成的组的多核苷酸的核苷酸同一性至少是95％，与选自由5’和3’调节区组成的组的多核苷酸、或其互补序列、或其变异型或其具有生物活性的片段的核苷酸同一性优选是99％，更优选是99.5％，最好是99.8％。
本发明的另一个目的包括含有多核苷酸的纯化的、分离的或重组核酸，而该多核苷酸在本文规定的严格杂交条件下与选自由5’和3’调节区的核苷酸序列、或其互补序列、或其变异型或其具有生物活性的片段组成的组的多核苷酸杂交。
5’调节区的优选片段长大约1500或1000个核苷酸，优选长大约500个核苷酸，较优选长大约400个核苷酸，更加优选长大约300个核苷酸，最好长大约200个核苷酸。
3’调节区的优选片段长至少50、100、150、200、300或400个碱基。
具有“生物活性”的SEQ ID No 3多核苷酸衍生物是包含所述多核苷酸片段的多核苷酸，或由所述多核苷酸片段组成的多核苷酸，其起到表达重组细胞宿主中重组多肽或重组多核苷酸的调节区作用。它也可用作增强子或阻抑物。
对本发明而言，如果所述调节多核苷酸含有包含转录和翻译调节信息的核苷酸序列，而这些序列与编码所希望的多肽或所希望的多核苷酸的核苷酸序列可操作地连接，则核酸或多核苷酸会起到表达重组多肽或重组多核苷酸的调节区作用。
本发明的调节多核苷酸可用适当限制酶使SEQ ID No 3核苷酸序列分裂来制备，如Sambrook等人(1989年)提出的方法。调节多核苷酸也可通过诸如Bal31等外切核酸酶消化SEQ ID No 3来制备(Wabiko等人，1986年)。这些调节多核苷酸还可通过核酸化学合成来制备，本说明书的其它章节会有所叙述。
本发明的调节多核苷酸可以是部分重组表达载体，所述表达载体用于表达所希望的宿主细胞或宿主有机体的编码序列。本说明书的其它章节将对本发明的重组表达载体进行叙述。
本发明优选5’调节多核苷酸包括PAPAP cDNA、或其具有生物活性的片段或变异型的5’非翻译区(5’-UTR)。
本发明优选3’调节多核苷酸包括PAPAP cDNA、或其具有生物活性的片段或变异型的3’非翻译区(3’-UTR)。
本发明的又一个目的包括纯化的或分离的核酸，所述核酸包括：
a)含有调节核苷酸序列的核酸，而调节核苷酸序列包括选自由以下核苷酸序列组成的组：
(i)核苷酸序列，该序列含有5’调节区多核苷酸或其互补序列的；
(ii)核苷酸序列，该序列含有与5’调节区核苷酸序列或其互补序列的核苷酸同一性至少为95％的多核苷酸；
(iii)核苷酸序列，该序列含有在严格杂交条件下与5’调节区核苷酸序列或其互补序文杂交的多核苷酸；以及
(iv)在(i)、(ii)和(iii)的多核苷酸中具有生物活性片段或变异型；
b)编码所希望的所述多肽或核酸的多核苷酸，其与上述(a)限定的核酸可操作地连接；
c)可选择地，含有3’调节多核苷酸，最好是PAPAP基因3’调节多核苷酸的核酸。
在上述核酸的一具体实施例中，所述核酸包括PAPAP cDNA 5’非翻译区(5’-UTR)、其具有生物活性的片段或变异型。
在上述核酸的另一具体实施例中，所述核酸包括PAPAP cDNA 3’非翻译区(3’-UTR)、其具有生物活性的片段或变异型。
5’调节区的调节多核苷酸或其具有生物活性的片段或变异型可操作地连接在编码所希望的多肽或多核苷酸的多核苷酸5’端。
3’调节区的调节多核苷酸或其具有生物活性的片段或变异型最好可操作地连接在编码所希望的多肽或多核苷酸的多核苷酸3’端。
由上述核酸编码的所希望的多肽可有各种性质或来源，包括来自原核生物或真核生物的蛋白质。受PAPAP调节区调控而得到表达的多肽包括细菌、真菌或病毒抗原。当然也包括真核生物的蛋白质，例如，“管家”蛋白质等胞内蛋白质、受体等与膜结合的蛋白质以及内源中介体等分泌蛋白质，如细胞因子。所希望的多肽可以是PAPAP蛋白质，特别是SEQ ID No 2氨基酸序列蛋白质或其片段或变异型。
由上述多核苷酸通常是RNA分子编码的所希望的核酸与所希望的编码多核苷酸互补，例如PAPAP编码序列，因而可用作反义多核苷酸。
这样一种多核苷酸可包括在重组表达载体中，以便表达宿主细胞或宿主有机体的所希望的多肽或所希望的核酸。本说明书在其它章节将对含有本文所述多核苷酸的适当重组表达载体再作叙述。多核苷酸构造体(Polynucleotide construct)
术语“多核苷酸构造体”和“重组多核苷酸”在本文是互通的，指用人工设计的线性或环状纯化的或分离的多核苷酸，所述多核苷酸至少包含两个核苷酸序列，而这两个核苷酸序列是在它们初始天然环境中找不到的相邻核苷酸序列。能够操控重组细胞宿主和转基因动物中的时间和空间PAPAP基因表达的DNA构造体
为了在细胞水平和多细胞有机体水平上研究缺少PAPAP基因合成的生理和表型结果，本发明还包括DNA构造体和重组载体，它们能够有条件地表达PAPAP基因组序列或cDNA的特异性等位基因以及该基因组序列或cDNA的复制，所述复制相对于SEQ ID No 1和3的PAPAP核苷酸序列或其片段隐藏一个或多个碱基的取代、缺失或插入，这些碱基的取代、缺失或插入位于外显子、内含子或调节序列内，但最好在5’调节序列或PAPAP基因组序列的外显子内或SEQ ID No 1 PAPAP cDNA内。在一优选实施中，PAPAP序列包含双等位标记。
本发明包括重组载体，其包含本发明所述的任何一个多核苷酸。更具体地说，本发明的多核苷酸构造体可包含在“PAPAP基因的基因组序列”部分、“PAPAP cDNA序列”部分、“编码区”部分、“寡核苷酸探针和引物”部分中所述的任何一个多核苷酸。
按Gossen等人(1992和1995年)以及Furth等人(1994年)所述那样，首选DNA构造体基于用来控制PAPAP基因表达、并来自大肠杆菌(E.coli)转位子Tn10的抗四环素操纵子tet。这样一种DNA构造体含有7个来自Tn10的tet操纵子序列(tetop)，该序列与最小启动子或PAPAP基因5’调节序列融合，所述最小启动子或所述PAPAP基因调节序列可操作地连接在多核苷酸上，该多核苷酸编码有义或反义寡核苷酸或编码包括PAPAP多肽或其肽片段在内的多肽。当同一个细胞也包括编码融合在单纯疱疹病毒的病毒蛋白质VP16活化区的野生型(tTA)或突变(rTA)阻抑物的核苷酸序列，并受诸如HCMVIE1增强子/启动子或MMTV-LTR等启动子调控时，这种DNA构造体就会起到所述核苷酸序列的条件表达系统的作用。事实上，本发明的优选DNA构造体包括含有tet操纵子序列的多核苷酸和含有编码野生型或突变阻抑物的多核苷酸。
在一具体实施例中，条件表达DNA构造体含有编码突变四环素阻抑物rTA的序列，所述多核苷酸的表达在缺乏四环素的情况下是沉默的，在四环素存在下才会被诱导。可以进行同源重组的DNA构造体：置换型载体
次选DNA构造体从5’端至3’端包括：(a)包含在PAPAP基因组序列中的第一核苷酸序列；(b)包括正选择标记的核苷酸序列，如抗新霉素的标记(neo)；以及(c)包含在PAPAP基因组序列中、位于第一PAPAP核苷酸序列(a)下游基因组上的第二核苷酸序列。
在一优选实施例中，这种DNA构造体还包括位于核苷酸序列(a)上游或核苷酸序列(c)下游的负选择标记。负选择标记最好包括胸腺嘧啶核苷激酶(tk)基因(Thomas等人，1986年)、潮霉素β基因(Te Riele等人，1990年)、hprt基因(Van der Lugt等人，1991年；Reid等人，1990年)、白喉毒素A片段(Dt-A)基因(Nada等人，1993年；Yagi等人，1990年)。正选择标记最好位于PAPAP外显子序列内，使编码PAPAP蛋白质的序列断裂。例如，Thomas等人(1986、1987年)、Mansour等人(1988年)以及Koller等人(1992年)对这些置换型载体进行了叙述。
第一和第二核苷酸序列(a)和(c)一般位于PAPAP调节序列、内含子序列、外显子序列或含有调节和/或内含子和/或外显子序列的序列内。核苷酸序列(a)和(c)的大小在1至50kb的范围内，优选在1至10kb的范围内，更优选在2至6kb的范围内，最好在2至4kb的范围内。可以进行同源重组的DNA构造体：Cre-Loxp系统
这些新DNA构造体利用P1噬菌体的位点特异性重组系统。P1噬菌体具有称之Cre的重组酶，它与34碱基对Loxp位点特异性相互作用。Loxp位点由两个被8bp保守序列分隔的13bp回文序列组成(Hoess等人，1986年)。在两个具有同一方向的Loxp位点之间的使Cre酶重组可删除DNA片段。
Gu等人(1993和1994年)首先提出将Cre-Loxp系统与同源重组技术结合使用。简单地说，所述要插入到基因组定向位置的核苷酸序列隐藏至少两个方向相同并位于要从重组基因组切除下来的核苷酸序列两端的Loxp位点。切除事件要求重组细胞宿主胞核内有重组酶(Cre)。通过以下方法可在需要的时间引入重组酶：(a)如Araki等人所述(1995年)，将Cre酶直接注射到所需细胞，或如Baubonis等人所述(1993年)，以脂质转染法使酶转染到细胞，在含有这种酶的培养基中培养重组细胞宿主；(b)如Gu等人(1993年)和Sauer等人(1988年)所述，用包含Cre编码序列的载体转染细胞宿主，所述Cre编码序列与重组细胞宿主中起作用的启动子可操作地连接，其中启动子选择性地具有诱导性，所述载体导入重组细胞宿主中；以及(c)如Gu等人所述(1994年)，在细胞宿主基因组中导入多核苷酸，所述多核苷酸包含与重组细胞宿主中起作用的启动子可操作地连接的Cre编码序列，其中启动子选择性地具有诱导性，所述多核苷酸通过随机插入事件或同源重组事件插入到细胞宿主基因组中。
在一具体实施例中，构建含有通过同源重组插入到PAPAP基因中的序列的载体，使得选择标记以同一方向设在Loxp位点侧边，以Cre酶处理可消除选择标记而保留所述通过同源重组事件已经插入的PAPAP序列。此外，还需要选择两种标记：重组事件选择所用的正选择标记和同源重组事件选择所用的负选择标记。Zou等人(1994年)叙述了使用Cre-Loxp系统的载体和方法。
因此，本发明第三优选DNA构造体从5’端至3’端包括：(a)包含在PAPAP基因组序列中的第一核苷酸序列；(b)包括编码正选择标记的多核苷酸的核苷酸序列，所述核苷酸序列还包括两个限定重组酶识别的位点，如Loxp位点，以及两个置于同一方向的位点的序列；以及(c)包含在PAPAP基因组序列中并位于第一PAPAP核苷酸序列(a)基因组下游的第二核苷酸序列。
限定由重组酶识别的位点如Loxp位点的序列最好位于核苷酸序列(b)内邻接要条件切除核苷酸序列的适当位置上。在一具体实施例中，两个Loxp位点各位于正选择标记序列的一侧，以便发生同源重组事件后在需要的时间进行切除。
在上述第三种DNA构造的使用方法优选实施例中，如Gu等人(1994年)所述，由于在重组宿主细胞的基因组中存在编码可操作地连接在启动子序列的Cre酶的序列，而启动子序列优选是具有诱导性启动子，较优选是组织特异性启动子序列，最好是既具有诱导性，又具有组织特异性的启动子序列，所以在需要的时间要切除邻接重组酶识别的两个位点的多核苷酸片段。
如Gu等人(1994年)所述，在重组细胞宿主基因组内存在Cre酶可导致两种转基因动物的繁殖，第一种转基因动物带有所述自PAPAP衍生的、含有上述Loxp位点的序列，第二种转基因动物带有可操作地连接在适当启动子序列的Cre编码序列。
如Anton和Graham(1995年)以及Kanegae等人(1995年)所述，用基于腺病毒并含有Cre基因的载体可实现在空间和时间上调控Cre酶表达，使细胞转染或有机体在体内转染，运送Cre酶。
以上所述的DNA构造体可用于将本发明所希望的核苷酸序列，优选为PAPAP基因组序列或PAPAP cDNA序列，而最好是PAPAP基因组或cDNA序列的替换复制，导入靶基因组(targeted gene)的预定位置内，从而产生靶基因的替换复制(剔除(knock-out)同源重组)或用另一个同源性足以发生同源重组事件的复制取代靶基因的复制(转殖(knock-in)同源重组)。在一具体实施例中，上述DNA构造体可用于导入包含至少一个双等位标记的PAPAP基因组序列或PAPAP cDNA序列。核反义DNA构造体
含有本发明载体的其它组合物包括核序列SEQ ID No cDNA寡核苷酸片段，最好是包含PAPAP基因起始密码子的片段，作为抑制相应PAPAP基因表达的反义工具。使用本发明反义多核苷酸的优选方法是Sczakiel等人(1995年)或PCT申请WO 95/24223所述的步骤，具体可参考本文的引用文献。
最好在与PAPAP mRNA的5’端互补的多核苷酸(长15-200bp)中选择反义工具。在一实施例中，使用了与所希望的靶基因不同部分互补的不同反义多核苷酸组合。
本发明的优选反义多核苷酸与含有翻译起始密码子ATG或剪接位点的PAPAP mRNA序列互补。本发明的另一些优选反义多核苷酸与PAPAP mRNA剪接位点互补。
如Liu等人(1994年)所述，本发明的反义多核苷酸最好带有已用自切割核酶序列取代的3’聚腺苷酸化信号，这样，不需要3’端的聚腺苷酸就可以产生RNA聚合酶II转录物，而这些反义多核苷酸不能自胞核输出。在一优选实施例中，这些PAPAP反义多核苷酸在核酶盒还包含组蛋白茎环结构，其可稳定抗3’-5’核酸外切降解的分裂转录物，Eckner等人(1991年)叙述了这样一种结构。寡核苷酸探针和引物
自PAPAP基因衍生的多核苷酸用在检测测试样本中至少存在SEQ ID No1或3核苷酸序列、或其片段、补体或变异型的复制。
本发明特别优选的探针和引物包括分离的、纯化的或重组多核苷酸，所述多核苷酸包含一段连续跨距，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 3核苷酸或其补体。探针和引物还包括分离的、纯化的或重组多核苷酸，所述多核苷酸包含一段连续跨距，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 3核苷酸或其补体，其中所述连续跨距包括至少1个下列SEQ ID No 3核苷酸位置：1至3038、1至142、422至557、2158至2218及2620至3039。本发明的另一些优选探针和引物包括分离的、纯化的或重组多核苷酸，所述多核苷酸包含一段连续跨距，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 1核苷酸或其补体。本发明的又一些优选探针和引物包括分离的、纯化的或重组多核苷酸，所述多核苷酸包含一段连续跨距，该跨距长至少12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500或1000个SEQ ID No 1核苷酸或其补体，其中所述连续跨距包括至少1个以下SEQ ID No 1核苷酸位置：1至140、141至460、460至690、87至346及691至1140。
所以，本发明还涉及核酸探针，其特征在于它们在上述规定的严格杂交条件下与核酸杂交，而核酸选自由SEQ ID No 1和3核苷酸序列或其补体或其互补序列组成的组。
在一实施例中，本发明包括分离的、纯化的或重组多核苷酸，所述多核苷酸由或基本上由一段连续跨距组成，该跨距有8至50个SEQ ID No 1和3之一的核苷酸及其补体，其中所述跨距在所述序列中包含PAPAP相关双等位标记或在具有PAPAP的连锁失衡中包含双等位标记；选择性地，所述连续跨距长18至35个核苷酸，而所述双等位标记可存在于所述多核苷酸中间的4个核苷酸内；选择性地，所述多核苷酸由所述连续跨距组成，而所述连续跨距长25个核苷酸，所述双等位标记存在于所述多核苷酸中间；选择性地，所述连续跨距3’端存在于所述多核苷酸3’端；选择性地，所述连续跨距3’端位于所述多核苷酸3’端，而所述双等位标记存在于所述多核苷酸3’端。
在另一实施例中，本发明包括分离的、纯化的或重组多核苷酸，所述多核苷酸包含8至50个SEQ ID No 1、3核苷酸及其补体的连续跨距，或者由或基本上由8至50个SEQ ID No 1和3核苷酸及其补体的连续跨距组成，其中所述跨距3’端位于所述多核苷酸3’端，而所述多核苷酸3’端位于所述序列PAPAP相关双等位标记或者在其连锁失衡内的双等位标记上游20个核苷酸处。
在又一实施例中，本发明包括用于杂交试验、排序试验以及基于酶的错配检测试验的多核苷酸，所述基于酶的错配检测试验用于确定在SEQ ID No1、3的PAPAP相关双等位标记上的核苷酸及其补体同一性，以及包括用于扩增SEQ ID No 1、3含有的PAPAP相关双等位标记或其补体的多核苷酸片段。
本发明涉及本发明的多核苷酸在确定PAPAP相关双等位标记的核苷酸同一性中的应用，最好是在杂交试验、排序试验、微排序试验或基于酶的错配检测试验以及扩增包含PAPAP相关双等位标记的多核苷酸片段中的应用。
本发明的探针或引物长度在8和1000个核苷酸之间，或者长度具体为至少12、15、18、20、25、35、40、50、60、70、80、100、250、500或1000个核苷酸，更具体地说，这些探针和引物的长度在8、10、15、20或30至100个核苷酸的范围内。较好是长10至50个核苷酸，更好是长10至30个核苷酸。较短的探针或引物有缺乏目的核酸序列特异性的趋势，通常需要较低温度才能与模板形成足够稳定的杂交复合物。较长的探针或引物的生产费用高，有时可自动杂交形成发夹结构。本领域技术人员可凭经验决定探针和引物在一组特定测试条件下的适当长度。
稳定杂化物的形成取决于DNA的熔解温度(Tm)。熔解温度又取决于探针或引物长度、溶液离子强度以及G+C含量。探针或引物的G+C含量越高，熔解温度越高，这是因为G:C对通过3个氢键连接，而A:T对只有2个氢键。本发明探针的GC含量通常在10％和75％之间的范围内变化，优选是在35％和60％之间的范围内变化，更优选是在40和55％之间的范围内变化。
可用任何合适的方法制备引物和探针，例如包括克隆和限制适当序列，进行直接化学合成，如Narang等人(1979年)提出的磷酸二酯法、Brown等人(1979年)提出的磷酸二酯法、Beaucage等人(1981年)提出的亚磷酰胺二乙酯法以及欧洲专利EP 0 707 592所述的固体载体法。
检测探针通常是核酸序列或不带电的核酸类似物，例如，国际专利申请WO 92/20702公开的肽核酸、美国专利US5,185,444、5,034,506和5,142,047所述的吗啉基类似物。由于探针不能另外加入脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)，致使探针无法扩展。这些类似物本身通常是不能扩展的，而核酸探针经过修饰探针3’端也不能扩展，以致羟基无法再延伸。例如，探针3’端的作用是捕获或检测标记，因而会消耗或阻塞羟基。此外，还会使3’羟基全部分裂、置换或被修饰，1993年4月19日提交的美国专利申请号07/049,061叙述了一些修饰，这些修饰也使探针无法扩展。
若需要，用光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学方法引入任何一种本领域已知的可检测标记来标记本发明任何一个多核苷酸。例如，有用的标记包括放射活性物质(包括32P、35S、3H、125I)、萤光染料(包括5-溴脱氧尿苷、萤光素、乙酰氨基芴、毛地黄毒苷)或生物素。多核苷酸最好在其3’和5’端带上标记。法国专利FR-7810975中或Urdea等人(1988年)或Sanchez-Pescador等人(1988年)叙述了核酸片段带有非放射活性标记的例子。另外，本发明的探针具有的结构特征使它们可以扩增信号，例如，Urdea等人(1991年)或欧洲专利EP 0 225 807(Chiron)提出这样一些结构特征是分支(branched)DNA探针。
标记还用于捕获引物，以利于固体载体上的引物或诸如扩展DNA等引物扩展产物的固定。捕获标记附在引物或探针上，是与固相试剂的特异性结合成员(例如生物素和链亲和素)形成结合对的特异性结合成员。所以，取决于多核苷酸或探针携带的标记类型，它可用来捕获或检测目的DNA。而且，需要注意的是，本文所提供的多核苷酸、引物或探针本身可用作捕获标记。例如，若固相试剂的结合成员是核酸序列，可选择将它与引物或探针的互补部分结合，从而使引物或探针固定在固相上。若多核苷酸探针本身作为结合成员，本领域技术人员就会知道探针含有与靶序列不互补的序列或“尾巴”。若多核苷酸引物本身作为捕获标记，引物至少有部分与固相上的核酸自由杂交。DNA标记技术已为技术人员所熟知。
本发明的探针有多种用途。它们较多用在基因组DNA的DNA杂交上。也可用探针检测PCR扩增产物。利用其它技术它们还可用来检测PAPAP基因或mRNA的错配。
本发明任何一个多核苷酸、引物或探针通常固定在固体载体上。已为本领域技术人员所知的固体载体，包括反应盘的孔壁、试管、聚苯乙烯珠粒、磁珠、硝酸纤维素条带、膜、如乳汁颗粒、绵羊(或其它动物)红血细胞、耐久细胞等微粒子。固体载体不是决定因素，由本领域技术人员选取。因此乳汁颗粒、微粒子、磁珠或非磁珠、膜、塑料管、微滴定孔壁、玻璃或硅片、绵羊(或其它动物)红血细胞以及耐久细胞都是合适的固体载体。将核酸固定在固体载体上的适当方法，包括离子、疏水、共价相互作用等。本文所用的固体载体指任何不溶性材料，或通过后续反应变成不溶的。可根据其吸引和固定捕获试剂的内在能力挑选固体载体。此外，固体载体可保留能够吸引和固定捕获试剂的附加受体。附加受体包括带电物质，其电荷与捕获试剂本身或与捕获试剂共轭的带电物质相反。另外，受体分子可以是固定(附着)在固体载体上并能够通过特异性结合反应固定捕获试剂的任何一种特异性结合物质。受体分子能使捕获试剂与固体载体材料在进行试验之前或在试验期间直接结合。所以固相可以是塑料、衍生塑料、磁性或非磁性金属、试管的玻璃或硅表面、微滴定孔、薄片、珠粒、微粒子、嵌片、绵羊(或其它适当动物)红血细胞、耐久细胞及本领域技术人员已知的其它构造。本发明的多核苷酸可单独附着或固定在固体载体上，或以至少2、5、8、10、12、15、20或25个本发明不同的多核苷酸组成的组合附着或固定在单个固体载体上。此外，本发明以外的多核苷酸也可作为本发明一个或多个多核苷酸而附在同一个固体载体上。
所以，本发明还包括检测样本中存在含有SEQ ID No 1或3核苷酸、其片段或变异型以及其互补序列的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使能够与包含在SEQ ID No 1或3核酸、其片段或变异型以及其互补序列的核苷酸序列杂交的一个核酸探针或多个核酸探针与待测样本接触；以及
b)检测探针和样本中的核酸之间形成的杂交复合物。
本发明还涉及检测样本中存在含有SEQ ID No 1或3核苷酸序列、其片段或变异型以及其互补序列的核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)能够与包含在SEQ ID No 1或3核酸、其片段或变异型以及其互补序列的核苷酸序列杂交的一个核酸探针或多个核酸探针；以及
b)可选择地，进行杂交反应所需的试剂。
在该检测方法和试剂盒的第一优选实施例中，所述一个核酸探针或多个核酸探针以可检测的分子标记。在所述方法和试剂盒的第二优选实施例中，所述核酸探针或多个核酸探针固定在底物上。寡核苷酸阵列
可用包含多个本发明寡核苷酸引物或探针的底物检测或扩增PAPAP基因的靶序列(targeted sequence)，还可以检测PAPAP基因编码或非编码序列的突变。
本文列出的任何一个多核苷酸均可附在固体载体的重叠区或任意位置。此外，本发明的多核苷酸可附在有序阵列中，其中每个多核苷酸附在固体载体的不同区，与其它任何一个多核苷酸的附着位点不重叠。这样一个多核苷酸有序阵列最好设计成“可寻址”，记录不同位置，而且可作为试验步骤的一部分被存取。可寻址多核苷酸阵列通常包含多个不同寡核苷酸，其与不同已知位置上的底物表面偶联。弄清每个多核苷酸位置的准确位置，这些“可寻址”阵列在杂交试验中就会特别有用。本发明的多核苷酸可用在任何本技术领域已知的可寻址阵列技术中。这些多核苷酸阵列的一个具体实施例称为GenechipsTM，美国专利US5，143,854、PCT申请WO 90/15070和WO 92/10092都有叙述。通常用将光蚀刻法(photolithographic methods)和固相寡核苷酸合成组合起来的机械合成法或光引导合成法(light directed synthesis)生成这些阵列(Fodor等人，1991年)。研究通常统称“超大型固定聚合物合成”(Very LargeScale Immobilized Polymer synthesis”(VLSIPSTM)技术，其中探针一般固定在嵌片固体表面的高密度阵列内，将寡核苷酸阵列固定在固体载体上。美国专利US5,143,854和US5,412,087以及PCT申请WO 90/15070、WO 92/10092和WO 95/11995提供了一些VLSIPSTM技术，它们叙述了通过光引导合成技术等技术形成寡核苷酸阵列的方法。设计提供固定在固体载体上的核苷酸阵列的策略时，还要研究展示策略，以在嵌片上排列和显示寡核苷酸阵列，尽可能得到最多的杂交模式和序列信息。PCT申请WO 94/12305、WO 94/11530、WO 97/29212和WO 97/31256揭示了这样一些展示策略，具体可参考本文的引用文献。
在本发明寡核苷酸阵列的另一实施例中，最好用寡核苷酸探针矩阵检测PAPAP基因特别是其调节区发生的突变。为了这个特定目的，特别将探针设计成带有可与携带已知突变(缺失、插入或取代一个或几个核苷酸)的基因杂交的核苷酸序列。例如，根据Huang等人(1996年)或Samson等人(1996年)所用的技术，利用已知突变可检测在已识别的PAPAP基因上发生的突变。
另一种用来检测PAPAP基因突变的技术是使用高密度DNA阵列。将每个含有一个高密度DNA阵列单位元件的寡核苷酸探针设计成配合PAPAP基因组DNA或cDNA的特异性序列。所以，用由与目标基因序列互补的寡核苷酸组成的阵列确定靶序列与野生基因序列的同一性，测定其含量，并检测靶序列和PAPAP基因参考野生基因序列之间的差异。在这样一种设计中，称为4L平铺阵列(tiled array)使用一套探针，内有四个探针(A、C、G、T)，它们最好是15个核苷酸寡聚物。在每套四个探针中，完全补体的杂交能力比错配探针的杂交能力更强。因此使用含有4L探针，而整套探针含有在已知野生参考序列中全部可能突变的平铺阵列，来扫描长度为L的核酸目标基因的突变。靶序列的单碱基变化可能会干扰含有15-mer探针套的平铺阵列的杂交信号。结果使突变位置侧的探针信号或“足迹”的特征消失。Chee等人(1996年)对这种技术进行了叙述。
所以，本发明涉及含有至少一种作为探针和引物的上述多核苷酸的核酸分子阵列。本发明优选涉及含有至少两个作为探针和引物的上述多核苷酸的核酸分子阵列。PAPAP蛋白质和多肽片段
本文所用的术语“PAPAP多肽”包括本发明的全部蛋白质和多肽。本发明的组成部分还有由本发明多核苷酸编码的多肽、以及含有这些多肽的融合多肽。本发明包括来自人的PAPAP蛋白质，其包括由或基本上由SEQ ID No2序列组成或包含SEQ ID No 2序列的分离的或纯化的PAPAP蛋白质。
如本文所述，本发明提供PAPAP蛋白质与g34872或肽相关的证据，这些证据表示PAPAP蛋白质是精神分裂症和双相情感障碍及与中枢神经系统疾病有关的遗传易感因子。
本发明涉及由SEQ ID No 1或3的核苷酸序列、或其互补序列或其片段编码的多肽。
本发明包括分离的、纯化的以及重组多肽，所述多肽包含一段连续跨距，该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50或100个SEQ ID No 2氨基酸。在另一优选实施例中，一段连续氨基酸序列包含突变或功能性突变位点，包括PAPAP蛋白质序列中氨基酸的缺失、插入、置换或平截。
本发明还包括分离的、纯化的以及重组多肽，所述多肽包含至少一段氨基酸序列，该序列与SEQ ID No 2氨基酸序列或其片段的氨基酸同一性是70、75、80、85、90、95、98或99％。本发明也包括变异型多肽，而不管它们是否具有正常生物活性。这是因为即使特定多肽分子不具有生物活性，但本领域技术人员还能够知道如何使用这个多肽，例如，用作疫苗或者制备抗体。不具有PAPAP活性的本发明的多肽的其它用途包括在表位作图中作为附加表位、以及用本领域技术人员公知的方法在SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱上作为分子量标记。如以下所述，还可用本发明的多肽在PAPAP蛋白质表达的检测试验中产生所用的多克隆或单克隆抗体，以及作为能增强或抑制PAPAP蛋白功能的激动剂和拮抗剂。此外，这样一些多肽可用在酵母双杂交系统中“捕获”PAPAP蛋白结合蛋白质，它们也是本发明的候选激动剂和拮抗剂。
在其它实施例中，本发明还涉及由PAPAP和g34872多肽形成的复合物。故本发明包括纯化的、分离的或通过重组制备的复合物，该复合物至少有一个PAPAP多肽和至少一个g34872多肽，其中所述PAPAP多肽包含长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50或100个SEQ ID No 2氨基酸。在一优选实施例中，所述g34872多肽包含至少6个SEQ ID No 5氨基酸，优选至少8至10个氨基酸。
另外，对PAPAP多肽结构作进一步的分析表明，本发明的PAPAP多肽可在氨基酸位置69-72(氨基酸NNTD)上包含N-糖基化位点(ASP)。而且，本发明的PAPAP多肽在氨基酸位置26-28(SCR)、53-55(SKR)、71-73(TDK)以及80-82(SPK)上还包含蛋白激酶C磷酸化位点。此外，本发明的PAPAP多肽在氨基酸位置18-23(GGDZGQ)、22-27(GQIFSC)和37-42(GAGQNK)上包含N-豆蔻酰化位点。其它结构现象包括在氨基酸位置8至16以及9至16(氨基酸D----PYG)上有ASP和GLU消旋酶基序。
通过与g34872相互作用，PAPAP多肽除了与精神分裂症和双相情感障碍有关外，还与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CAMK II)蛋白质(查询号AS2711561)共享序列同源性，已经有人提出它参与神经传导的证据。一方面，PAPAP可用作分子伴侣蛋白，例如，PAPAP可增强或阻止g34872与g34872受体相互作用或结合。另一方面，PAPAP在涉及g34872的信号途径上起到相互作用的功能。PAPAP蛋白质最好与人或哺乳动物组织样本分离或从人或哺乳动物基因得到表达。
用本技术领域已知的常规表达方法可制备本发明的PAPAP多肽。将编码所希望的多肽的多核苷酸与适合任何一种可能宿主的表达载体连接。可用真核生物和原核生物的宿主系统以及一些较常见的系统组合形成重组多肽。再将多肽与溶胞或培养基分离，然后纯化至使用所需的纯度。纯化可用本技术领域任何一种已知技术，例如，分化提取、盐分馏、层析法、离心法等。例如，可参照用于各种蛋白质纯化方法的酶技术法。
另外，通过化学合成制备较短蛋白质片段。从人或非人动物细胞或组织提取本发明的蛋白质。蛋白质的纯化方法已为本领域技术人员所知，包括使用去污剂或离液剂使粒子分裂，然后用分化提取，通过离子交换层析法、亲和力层析法、按密度沉降以及凝胶电泳分离多肽。
可使用包括SEQ ID No 1在内的任何一种PAPAP cDAN表达PAPAP蛋白质和多肽。用常规克隆技术将编码要表达的PAPAP蛋白质或多肽的核酸可操作地连接在表达载体的启动子上。表达载体的PAPAP插入片段可包含PAPAP蛋白质或其部分的全编码序列。例如，自PAPAP衍生的插入片段可编码包含至少10个SEQ ID No 2 PAPAP蛋白质连续氨基酸。
表达载体是任何一种本技术领域已知的哺乳动物、酵母、昆虫或细菌表达系统。有许多供应商提供市售载体和表达系统，包括GeneticsInstitute(Cambridge，MA)、Stratagene(La Jolla，California)、Promega(Madison，Wisconsin)以及Invitrogen(San Diego，California)。若需要增强表达和有利蛋白质适当折叠，使导入表达载体的特定表达有机体的密码子前后序列和该序列的密码配对优化，Hatfield等人的美国专利US5,082,767对此进行了解释，具体可参考本文的引用文献。
在一实施例中，PAPAP cDAN的全部编码序列通过cDAN的聚线苷酸化(poly A)信号可操作地连接在表达载体的启动子上。此外，如果编码部分PAPAP蛋白质的核酸缺少用作起始位点的甲硫氨酸，就要用常规技术将起始甲硫氨酸导入在核酸的第一个密码子旁边。类似地，如果PAPAP cDAN的插入片段缺少poly A信号，就要用以下方法将该序列加入到构造体中：例如，用BglI SalI限制性内切核酸酶从pSG5(Stratagene)剪切poly A信号，并将该信号导入哺乳动物表达载体pXT1(Stratagene)中。pXT1含有LTRs和来自莫洛尼鼠类白血病病毒的部分gag基因。构造体内的LTRs位置可有效地进行稳定转染。载体包括单纯疱疹胸苷激酶启动子和选择新霉素基因。按以下方法得到编码PAPAP蛋白质或其部分的核酸：利用与PAPAP cDAN或其部分互补的寡核苷酸引物，通过PCR技术扩增从含有SEQ ID No 2的PAPAP cDAN以及含有导入到相应cDAN 3’引物5’端的5’引物和BglI上的PstI限制性内切酶序列的细菌载体内，确保编码PAPAP蛋白质或其部分的序列置于相对polyA信号适当的位置。将最终PCR反应所得的纯化片段用PstI消化，用外切酶平端，用BglII消化、纯化及与pXT1连接，这时该片段含有polyA信号，用BglII消化。
在产品说明书列出的条件下用脂质转染试剂(Life Technologies，Inc.，Grand Island，New York)将已连接的产品转染到小鼠NIH3 3T3细胞。转染细胞在600ug/ml G418(Sigma，St.Louis，Missouri)生长后，选择阳性转染子。
以上步骤也可用于表达负责检测表型的突变PAPAP蛋白质或其部分。
用常规纯化技术纯化表达蛋白质，如硫酸钠沉淀或基于大小或电荷的层析分离。也用标准免疫层析技术纯化由核酸插入片段编码的蛋白质。在这些步骤中，将含有表达PAPAP蛋白质或其部分的溶液如细胞提取物装在具有抗PAPAP蛋白质或其部分抗体的层析柱，以附在层析基质上。表达蛋白质可与免疫层析柱结合。之后，清洗柱子，移去非特异性结合蛋白。再使特异性结合表达蛋白质排出层析柱，用标准技术回收。
为了确定PAPAP蛋白质或其部分的表达，将从含有表达载体的宿主细胞中得到表达的蛋白质，而所述表达载体含有编码PAPAP蛋白质或其部分的插入片段，与在含有不带插入片段的表达载体的宿主细胞中得到表达的蛋白质进行比较。含有带插入片段的表达载体的细胞样本存在层析带，而含有不带插入片段的表达载体的细胞样本则没有层析带，这表明PAPAP蛋白质或其部分得到表达。通常可以预测PAPAP蛋白质或其部分层析带的迁移率。然而，由于有糖基化、遍在蛋白化(ubiquitination)或酶分裂等修饰，层析带的迁移率可能与预测值不一致。
以下叙述能够特异性识别表达PAPAP蛋白质或其部分的抗体。
如果无法制备抗体，就用嵌合多肽将编码PAPAP蛋白质或其部分的核酸导入设计用于纯化方案的表达载体中。在这样的策略中，使编码PAPAP蛋白质或其部分的核酸与编码嵌合体另一半的基因符合读框地插入。嵌合体的另一半是β-球蛋白或镍结合多肽编码序列。用具有抗β-球蛋白或结合镍的抗体的层析基质纯化嵌合蛋白。在β-球蛋白或镍结合多肽与PAPAP蛋白质及其部分之间构建蛋白酶分裂位点。故通过蛋白酶消化使嵌合体的两个多肽互相分离。
一种用于产生β-球蛋白嵌合蛋白质的表达载体是编码兔β-球蛋白的pSG5(Stratagene)。兔β-球蛋白基因的内含子II有利剪接表达转录，而将聚腺苷酸化信号导入该构造体可提高表达水平。分子生物学的技术人员对这些技术非常熟悉。标准方法参见Davis等人(1986年)叙述的方法，而Stratagene，LifeTechnologies，Inc.或Promega等公司也提供了其它方法。此外，还可用体外翻译系统如体外表达TM翻译试剂盒(Stratagene)由该构造体制备多肽。结合本发明PAPAP多肽的抗体
可使用任何一个PAPAP多肽或整个蛋白质制备能与所述表达PAPAP蛋白质或其片段特异性结合的抗体。
本发明的一种抗体组合物能够与SEQ ID No 2的PAPAP蛋白质特异性结合。特异性结合PAPAP的抗体组合物在酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或其它基于抗体的结合试验中与PAPAP蛋白质第一全长变异型的结合亲和力必须比与PAPAP蛋白质第二全长变异型大至少5％、10％、15％、20％、25％、50％、100％。
在一优选实施例中，本发明涉及能够选择性结合含有表位的多肽的多克隆或单克隆抗体组合物，所述多肽包含一段连续跨距，该跨距长至少6个SEQID No 2氨基酸，优选长至少8至10个氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸。
在其它实施例中，本发明包括能够选择性结合PAPAP和g34872多肽复合物的多克隆或单克隆抗体组合物，其中所述PAPAP多肽包含至少6个SEQID No 2氨基酸，优选至少8至10个氨基酸，更优选至少12、15、20、25、30、40、50或100个SEQ ID No 2氨基酸。在一优选实施例中，所述g34872多肽包含至少6个SEQ ID No 5氨基酸，优选至少有8至10个SEQ ID No 5氨基酸。
一个表位在空间构象可包含至少3个氨基酸，而一个表位有唯一一个空间构象。通常，一个表位包含至少6个这样的氨基酸，较常见是至少8-10个这样的氨基酸。在优选实施例中，抗原表位包含的氨基酸数目是3和50之间的任何一个整数。通过常规方法可制备起表位功能的片段。用Jameson-Wolf抗原分析确定表位，例如，用计算机程序PROTEAN以缺省参数值来确定表位(Version 4.0 Windows，DNASTAR，Inc.，1228 South Park Street Madison，WI.)。
以下示出预测的抗原表位。需要指出的是，免疫表位表只叙述了一些氨基酸残基，其包含的表位用特定算法预测到免疫原性最高。本发明没有具体叙述免疫原性的多肽不能认为不具有抗原性。这是因为它们在体内仍然具有抗原性，但只被选用的特定算法认为不具有抗原性。而用噬菌体展示等方法时这些多肽可能在体内具有抗原性。所以，以下列出的是只包括优选表位的氨基酸残基，并不完整。事实上，所有本发明长至少6个氨基酸的多肽片段都可用作本发明的抗原表位。而且，下面列出的只是由Jameson-Wolf分析确定的主要表位残基。因此可将在N端、C端或在N和C两端上的附加旁侧残基加到本表列出的序列中，产生长至少6个氨基酸并带有表位的部分。通过类似Jameson-Wolf分析的算法或用本文所述或本领域技术人员已知的方法在体内测定抗原应答可确定含有其它免疫原表位的氨基酸残基。
本发明带有表位的片段最好包含6至50个本发明的多肽氨基酸(即包括6和50之间的任何一个整数)。本发明还包括在整数6和全长PAPAP序列之间的抗原片段。优选PAPAP免疫原表位：
Gly 8至Lys-11
Asp-31至Asn-33
Gln-40至Leu-47
Gly-51至Lys-54
Glu-59至Arg-62；以及
Ser-80至Thr-83
本发明还涉及纯化的或分离的抗体，其能够特异性结合突变PAPAP蛋白质、或其含有突变PAPAP蛋白质表位的片段变异型。在另一优选实施例中，本发明涉及能够结合多肽的抗体，所述多肽含有至少10个PAPAP蛋白质连续氨基酸以及包含至少一个由引起突变的性状编码的氨基酸。
目前需要的是表达不同种属PAPAP的野生型或转基因非人动物或哺乳动物而不需要与抗体结合的动物，不表达PAPAP的动物(即本文所述的PAPAP剔除动物)在制备抗体时特别有用。PAPAP剔除动物将全部或大部分PAPAP蛋白质暴露区识别为异种抗原，从而产生具有较宽PAPAP表位阵列的抗体。而且，可用只带有10至30个氨基酸的较小多肽与任何一种PAPAP蛋白质特异性结合。此外，一些动物产生类似抗原序列的PAPAP种，它们的体液免疫系统会优先识别动物天然PAPAP种和抗原序列之间的差异，并在抗原序列中产生抗这些独特位点的抗体。这样一种技术在制备特异性结合PAPAP蛋白质的抗体时特别有用。
按其中一种方案制备的抗体制剂可用于定量免疫测定中，这种测定确定生物样本中带有抗原的物质的浓度；也可用它们半定量或定性识别生物样本中存在抗原。这些抗体还可用在杀死表达蛋白质或降低身体蛋白质水平的细胞的治疗组合物中。
本发明的抗体可带有本技术领域已知的任何一种放射活性、萤光或酶标记。
所以，本发明涉及一种生物样本中存在本发明PAPAP多肽的特异性检测方法，所述方法包括以下步骤：
a)使生物样本与多克隆或单克隆抗体接触，所述抗体特异性结合含有SEQ ID No 2氨基酸序列的PAPAP多肽、其肽片段或变异型；以及
b)检测所形成的抗原/抗体复合物。
本发明还涉及在体外检测生物样本中存在本发明PAPAP多肽的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：
a)多克隆或单克隆抗体，其特异性结合含有SEQ ID No 2氨基酸序列的PAPAP多肽、其肽片段或变异型，可选择地带有标记；
b)可检测所形成的抗原/抗体复合物的试剂，所述试剂选择性地带有标记，或者本身能够被带有标记的试剂识别，更具体地说，在上述情况下，单克隆或多克隆抗体本身不带标记。
所以，本发明涉及抗体和T细胞抗原受体(TCR)，其与多肽，具体地说，与本发明的多肽表位，包括但不限于IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgA(包括IgA1和IgA2)、IgD、IgE、或IgM和IgY特异性结合。在一优选实施例中，抗体是本发明的人抗原结合抗体片段，包括但不限于，Fab、Fab＇F(ab)2和F(ab＇)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键Fvs(sdFv)以及包含可变轻链区或可变重链区(VL或VH)的片段。抗体可来自任何一种动物，包括鸟类和哺乳动物。抗体最好是人、小鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。
包括单链抗体在内的抗原结合抗体片段可只包括可变区或包括可变区与以下区的全部或部分的组合：铰链区、CH1、CH2和CH3区。本发明也包括可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3区的任意组合。本发明还包括与本发明的多肽特异性结合的嵌合、人源化、以及人单克隆和多克隆抗体。本发明又包括抗本发明抗体的抗独特型抗体。
本发明的抗体可以具有单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性。具有多特异性的抗体可以对本发明的不同多肽表位具有特异性或者既对本发明的多肽，又对异源组合物如异源多肽或固体载体材料具有特异性。例如，参见WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793；Tutt，A.等人，J.Immunol.147：60-69页，1991年；美国专利US5,573,920、4,474,893、5,601,819、4,714,681、4,925,648；Kostelny，S.A..等人，J.Immunol.，148：1547-1553页，1992年。
通过本发明多肽的由抗体识别或与抗体特异性结合的表位或带有表位的部分，可以叙述或者确定本发明的抗体。对于本发明分泌蛋白的蛋白质，抗体可特异性结合由本发明核酸编码的全长蛋白质、由本发明核酸编码的成熟蛋白质(即通过信号肽分裂而产生的蛋白质)、由本发明核酸编码的信号肽、或者本发明任何一个多肽。因此，可如本文所述那样确定表位或带有表位的多肽部分，如通过N端和C端位置、相邻氨基酸残基的大小，或本文所述其它方式(包括序列表)。个体种属不包括特异性结合本发明的任何表位或多肽的抗体。故本发明包括特异性结合本发明特定多肽的抗体，允许抗体排斥。
本发明还对本发明抗体的交叉反应性进行叙述和说明。本发明包括不特异性结合本发明多肽的任何一种类似物、正交物、或同系物的抗体。本发明也包括一些抗体，这些抗体不会结合与本发明多肽的同一性小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％(用本技术领域或本文所述的方法计算)的多肽。本发明还包括只结合由多核苷酸编码的多肽、在严格杂交条件下(如以上所述)与本发明的多核苷酸杂交的抗体。本发明又叙述了本发明抗体的结合亲和力。优选结合亲和力包括具有解离常数或Kd小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15和10-15M的亲和力。
本发明的抗体用在但不限于本技术领域已知的纯化、检测以及定向本发明多肽的方法中，包括体内外诊断和治疗方法。例如，抗体用在免疫测定法中定性和定量测定生物样本中本发明的多肽水平。参见Harlow等人，抗体：实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，1988年)(引用于本文的参考文献)。
本发明的抗体可单独使用或与其它组合物结合使用。抗体也可在N或C端与异源多肽重组融合或与多肽或其它组合物进行化学共轭(包括共价和非共价共轭)。例如，本发明的抗体可与在检测试验中用作标记的分子以及诸如异源多肽、药物或毒素等效应分子重组融合或共轭。参见WO 92/08495、WO91/14438/、WO 89/12624、美国专利US5,314,995以及欧洲专利EP 0 396 387。
可用本技术领域已知的任何一种合适的方法制备本发明的抗体。例如，将本发明的多肽或其抗原片段施加到动物中，诱导产生含有多克隆抗体的血清。术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术制备的抗体。术语“抗体”指多肽或由至少一个结合区组成的多肽群，其中结合区通过折叠抗体分子可变区形成具有内表面形状和电荷分布、并与抗原的抗原决定簇特征互补的三维结合空间而形成，从而与抗原进行免疫反应。术语“单克隆抗体”指自单个克隆包括真核生物、原核生物或噬菌体克隆等衍生的抗体，而不是指其制备方法。本领域已知的各种技术均可制备单克隆抗体，包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术。
杂交瘤技术包括本领域已知的技术(参见Harlow等人，1998年；Hammerlin等人，1981年)(所述文献列于于本文的参考文献中)。例如，通过原核生物分裂用木瓜蛋白酶(制备Fab片段)或胃蛋白酶(制备F(ab＇)2片段)等酶自杂交瘤制备的抗体制备Fab和F(ab＇)2。
此外，可用重组DNA技术或用本技术领域已知的方法通过合成化学制备本发明的抗体。例如，可用本技术领域已知的各种噬菌体展示方法制备本发明的抗体。在噬菌体展示方法中，抗体功能区展示所述粒子在噬菌体粒子表面上携带编码抗体功能区的多核苷酸序列。直接用抗原、通常用与固体表面或珠粒结合或被捕获的抗原选择在所有组成成分或组合抗体文库(例如人或小鼠)中选择具有所需结合性质的噬菌体。这些方法所用的噬菌体通常是丝状噬菌体，包括带有Fab的fd和M13、与噬菌体基因III或基因VIII蛋白质重组融合的Fv或用二硫化物稳定的Fv抗体区。以下文献叙述了用噬菌体展示方法制备本发明抗体的例子：Brinkman U.等人(1995年)、Ames，R.S.等人(1995年)、Kettleborough，C.A.等人(1994年)、Persic，L.等人(1997年)、Burton，D.R.等人(1994年)、PCT/GB91/01134、WO 90/02809、WO 91/10737、WO92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、以及美国专利US5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571，698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727和5,733,743(所述文献列于于本文的参考文献中)。
如上述文献所述，选择噬菌后，使抗体编码区与噬菌体分离，产生全部抗体，包括人抗体或其它任何所希望的抗原结合片段，在任何所希望的宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌中得到表达。例如，用本技术领域已知的方法中采用重组制备Fab、Fab’F(ab)2和F(ab＇)2片段的技术，如以下文献所述的方法：WO 92/22324、Mullinax，R.L.等人(1992年)、Sawai，H.等人(1995年)以及Better，M.等人(1988年)(所述文献列于于本文的参考文献中)。
美国专利US4,946,778和5,258,498、Huston等人(1991年)、Shu，L.等人(1993年以及Skerra，A.等人(1988年)等文献叙述了用于制备单链Fvs和抗体的一些技术。对于某些应用，包括在人体内使用抗体和体外检测试验等，最好用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体的制备方法已为本领域技术人员所知，例如，参见Morrison(1985年)、Oi等人(1986年)、Gillies，S.D.等人(1989年)以及美国专利US5,807,715。可用各种技术使抗体人源化，包括CDR-嫁接(欧洲专利EP 0 239 400、WO 91/09967、美国专利US5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)和重塑(resurfacing)(欧洲专利EP 0 592 106；和EP 0 519 596、Padlan E.A.，(1991年)；Studnicka G.M.等人(1994年)、Roguska M.A.等人(1994年)以及链改组(chain shuffling)(美国专利US 5,565,332)。可用本技术领域已知的各种技术可制备人抗体，包括以上所述的噬菌体展示法。还可参看美国专利US4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318及WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 96/34096、WO 96/33735及WO 91/10741(所述文献列于于本文的参考文献中)。
本发明还包括与本发明多肽重组融合或化学共轭的抗体(包括共价和非共价共轭)。这些抗体对本发明多肽以外的抗原具有特异性。例如，通过使本发明的多肽与对特定细胞表面受体具有特异性的抗体融合或共轭，在试管内或者体内，可用这些抗体将本发明的多肽导向特定细胞型。利用本技术领域已知的方法还可将与本发明多肽融合或共轭的抗体用在体外免疫测定和纯化方法中。例如，参看上述Harbor等人和WO 93/21232、欧洲专利EP 0 439 095、Naramura，M.等人(1994年)、美国专利US 5,474,981、Gillies，S.O.等人(1992年)、Fell，H.P.等人(1991年)(所述文献列于于本文的参考文献中)。
本发明也包括一些组合物，其含有与抗体区而非与可变区融合或共轭的本发明多肽。例如，本发明的多肽可与抗体Fc区或其部分融合或共轭。与本发明多肽融合的抗体部分可包含铰链区、CH1区、CH2区和CH3区或全部区或其部分的任意组合。本发明的多肽可与上述抗体部分融合或共轭，以便用本技术领域已知的方法提高多肽在体内的半衰期或用在免疫测定中。这些多肽也可与上述抗体部分融合或共轭形成多聚物。例如，通过Fc部分之间的二硫键可使与本发明多肽融合的Fc部分形成二聚物。将多肽与IgA和IgM部分融合可形成较高多聚物。将本发明的多肽与抗体部分融合或共轭的方法已为本领域技术所公知。例如，参看美国专利US 5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,112,946、欧洲专利EP 0 307 434、EP 0 367 166、WO96/04388、WO 91/06570、Ashkenazi，A.等人(1991年)、Zheng，X.X.等人(1995年)以及Vil，H.等人(1992年)(所述文献列于于本文的参考文献中)。
本发明又涉及用作本发明多肽的激动剂或拮抗剂的抗体。例如，本发明包括一些抗体，其使与本发明的多肽全部或部分相互作用的受体/配体分裂。本发明包括受体特异性抗体和配体特异性抗体。本发明包括不会阻止配体结合但会阻止受体活化的受体特异性抗体。用本文所述的技术或本领域技术人员已知的其它技术确定受体活化(即信号化)。本发明也包括既阻止配体结合又阻止受体活化的受体特异性抗体。同样，本发明包括与配体结合、阻止配体与受体结合的中和抗体，以及与配体结合以阻止受体活化，但不会阻止配体与受体结合的抗体。本发明还包括使受体活化的抗体。这些抗体可用作受配体介导的受体活化影响的全部或部分生物活性的激动剂。这些抗体可定为包括本文所述的特异活性的生物活性的激动剂或拮抗剂。用本技术领域已知的方法可制备上述激动剂。例如，参看WO 96/40281、美国专利US5,811,097；Deng，B.等人(1998年)、Chen，Z.等人(1998年)、Harrop，J.A.等人(1998年)、Zhu，Z.等人(1998年)、Yoon，D.Y.等人(1998年)、Prat，M.等人(1998年)、Pitard，V.等人(1997年)、Liautard，J.等人(1997年)、Carlson，N.G.等人(1997年)、Taryman，R.E.等人(1995年)、Muller，Y.A.等人(1998年)、Bartunek，P.等人(1996年)(所述文献列于于本文的参考文献中)。
如以上所述，利用本技术领域已知的技术可反过来用本发明的多肽抗体产生“模拟”本发明多肽的抗独特型抗体。参看Greenspan和Bona，(1989年)、Nissinoff，(1991年)。例如，有些抗体与本发明的多肽，并竞争抑制多肽多聚化或抑制本发明的多肽与配体结合，可用它们“模拟”多肽多聚化或结合区产生抗独特型抗体，导致这些抗体与多肽或其配体结合或中和。这样一些中和抗独特型抗体用来与本发明的多肽或其配体/受体结合，从而阻抑其生物活性。重组载体
本文所用的术语“载体”指环状或线性DNA或RNA分子，这些分子是双链或单链，包含至少一个所述多核苷酸，而所述多核苷酸被转染在细胞宿主或单细胞或多细胞有机体内。
本发明包括一族重组载体，其含有自PAPAP基因组序列衍生的调节多核苷酸、和/或PAPAP基因组序列或cDNA序列的编码多核苷酸。
本发明的重组载体通常包括本文所述的任何一个多核苷酸，包括调节序列、编码序列和多核苷酸构造体以及上述任何一种PAPAP引物或探针。更具体地说，本发明的重组载体可包括在“PAPAP基因的基因组序列”部分、“PAPAP cDNA序列”部分、“编码区”部分、“多核苷酸构造体”部分和“寡核苷酸探针和引物”部分所述的任何一个多核苷酸。
在第一优选实施例中，用本发明的重组载体扩增衍生自SEQ ID No 3的PAPAP基因组序列或PAPAP cDNA的插入多核苷酸，例如在合适细胞宿主中的SEQ ID No 1 cDNA，每次重组载体复制时都会扩增这个多核苷酸。
本发明重组载体的第二优选实施例包括含有本发明的调节多核苷酸或编码核酸或二者的表达载体。在一些实施例中，用表达载体表达PAPAP多肽，随后可被纯化并且，例如，用在配体筛选试验中或用作免疫原，以产生抗PAPAP蛋白质的特异性抗体。在另一些实施例中，用表达载体构建转基因动物及用在基因治疗。表达需要在载体中提供适当信号，所述信号包括各种调节元件，如来自病毒和哺乳动物的增强子/启动子，引发所述基因在宿主细胞的表达。本发明的表达载体通常包括主要药物选择标记，其用于构建表达产物的永久、稳定细胞克隆，这是因为它们是连接药物选择标记表达与多肽表达的元件。
更具体地说，本发明涉及表达载体，其包含编码PAPAP蛋白质，最好是SEQ ID No 2氨基酸PAPAP蛋白质或其变异型或片段的核酸。
本发明涉及用于PAPAP编码序列的重组表达载体，其中所述载体包含SEQ ID No 1核酸。
以下部分将详细叙述在本发明的载体中可找到的一些元件。1.本发明表达载体的一般特征
本发明的重组载体包括，但不限于，YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、噬菌体、噬菌粒、粘粒、质粒或者甚至是线性DNA分子(包括染色体、非染色体、半合成和合成DNA)。这样一种重组载体可包含转录单位，该转录单位含有以下组合：
(1)遗传因子或遗传因子组，其在基因表达中起调节作用，例如，启动子或增强子。增强子是顺式DNA因子，通常长10至300bp，作用于启动子以提高转录。
(2)结构或编码序列，其转录到mRNA，而且最后被翻译为多肽，所述结构或编码序列与(1)所述的调节元件可操作地连接；以及
(3)合适的转录起始和终止序列。用于酵母或真核生物的表达系统的结构单位最好包括能够在细胞外分泌由宿主细胞翻译的蛋白质的前导序列。此外，当重组蛋白质在没有前导序列或转运序列的情况下得到表达时，它可包含N端残基。该残基在以后与已表达的重组蛋白质分裂或不必进行分裂，都可以产生终产物。
重组表达载体通常含有复制起点、使宿主细胞转化的选择标记、以及衍生自高度表达的基因以便转录下游结构序列的启动子。在适当阶段用翻译起始和终止序列，最好是能够使已翻译的蛋白质分泌到壁膜间隙或胞外介质的前导序列装配异源结构序列。在一具体实施例中，载体适合在哺乳动物宿主细胞中转染和表达所希望的序列，优选载体含有所希望的宿主的复制起点、合适的启动子和增强子、以及任何需要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化信号、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’旁侧非转录序列。可用衍生自SV40病毒基因组的DNA，例如SV40起始点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化信号提供所需的非转录遗传因子。
可用SEQ ID No 2的PAPAP多肽或其片段或变异型的体内表达校正与宿主有机体中天然基因表达或与无生物活性的PAPAP蛋白质的制备有关的遗传缺陷。
所以，本发明还包括重组表达载体，其主要用于通过在需要治疗的病人有机体中导入适当遗传材料，在体内制备SEQ ID No 2的PAPAP多肽或其片段或变异型。这种遗传材料可体外导入早已自有机体中取出的细胞中，该经过修饰的细胞后来再被导入所述有机体，体内直接导入适当组织。2.调节元件启动子
选择本发明表达载体使用的适当启动子区，要考虑其异源基因已得到表达的细胞宿主。用于调控所述核酸序列表达的特定启动子被认为并不重要，只要它能够使核酸表达导入靶细胞。因此，若人细胞作为靶细胞，最好将核酸编码区设于能够在人细胞得到表达的启动子例如人或病毒启动子的附近，而且受该启动子调控。
适当启动子可与它调控表达的核酸外源或与含有要表达的编码序列的天然多核苷酸内源。此外，启动子通常与已插入构造体启动子/编码序列的重组载体序列外源。
例如，用CAT(氯霉素转移酶)载体，最好用pKK232-8和pCM7载体在任何所希望的基因中选择启动子区。
优选细菌启动子是LacI、LacZ、T3或T7噬菌体RNA聚合酶启动子、gpt、λ-PR、PL和trp启动子(欧洲专利EP 0036776)、多角体蛋白启动子、或来自杆状病毒的p10蛋白启动子(Kit Novagen)(Smith等人，1983年；O’Reilly等人，1992年)、λ-PR启动子或者trc启动子。
真核生物的启动子包括早期CMV、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的LTRs以及小鼠金属硫蛋白-L。本领域技术人员懂得如何选择适当载体和启动子。
基因工程技术人员也能够选择启动子。例如，人们可参看Sambrook等人(1989年)的书或Fuller等人(1996年)所述的步骤。其它调节元件
若用cDNA插入片段，人们一般希望包含聚腺苷酸化信号，使基因转录作适当的聚腺苷酸化。一般认为聚腺苷酸化信号的性质对本发明的成功实施影响不大，可采用任何这样一个序列，如人生长激素和SV40聚腺苷酸化信号。终止子也被认为是表达盒的一个元件。这些元件可用来提高信息水平，以及使从表达盒到其它序列的连读减至最小。3.选择基因
这些基因会使细胞带上可识别的变化，以便较易识别含有表达构造体的细胞。选择转化宿主细胞的选择标记基因最好是二氢叶酸还原酶或抗真核生物的细胞培养基新霉素、S啤酒或四环素的TRP1、抗大肠杆菌(E.coli)的利福霉素或氨苄青霉素、或分枝菌的左聚糖蔗糖酶，后一种标记是负选择标记。4.优选载体细菌载体
作为一种替换但不起限制作用的例子，在细菌应用上使用的表达载体可含有选择标记和细菌复制起点，其衍生自包含pBR322遗传因子(ATCC 37017)的市售质粒。例如，这样一些市售载体包括pKK223-3(Pharmacia，Uppsala，瑞典)以及GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，美国)。
有许多其它合适的市售载体已为本领域技术人员所知，如以下细菌载体：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)；pSVK3、Pbpv、pMSG、pSVL(Pharmacia)；pQE-30(QIAexpress)。噬菌体载体
P1噬菌体载体可包含在大约80至100kb范围内变化的大插入片段。
Stemberg(1992和1994年)主要叙述了P1噬菌体载体的构建，如p158或p158/neo8。设计含有PAPAP核苷酸序列的重组P1克隆，将它插入到大于40kb的大多核苷酸(Linton等人1993年)。为了制备转基因实验用的P1 DNA，优选方案是McCormick等人(1994年)提出的方案。简单地说，包含P1质粒的E.coli(最好是链NS3529)在含有25μg/ml卡那霉素的适当液体培养基中生长过夜。用Qiagen质粒大试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA，美国)按照制造商的使用说明通过碱裂解从E.coli制备P1 DNA。用试剂盒内含的清洗和洗脱缓冲液从两根Qiagen-tip 500层析柱的细菌溶菌产物纯化P1 DNA。先用苯酚/氯仿萃取，再用70％乙醇沉淀DNA。将DNA溶解在TE(10mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA)后，用光谱测量法评估DNA的浓度。
当目的是表达转基因动物通常是转基因小鼠中含有PAPAP核苷酸序列的P1克隆时，需要除去P1 DNA片段的载体序列，例如，在P1多接头(polylinker)内的稀有切割位点(SfiI，NotI或SalI)上分裂P1 DNA。再用类似最初将DNA与YACs分离所用的方法(Schedl等人，1993年；Peterson等人，1993年)，从脉冲场凝胶的载体序列纯化P1插入片段。在此阶段，若需要，在MilliporeUltrafree-MC过滤装置(Millipore，Bedford，MA，美国，极限为30,000分子量)上浓缩所得的纯化插入DNA，然后，在微透析膜(VS型，0.025μM，来自Millipore公司)上对含有100mM氯化钠、30μM精氨、70μM亚精氨的微注射缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.4；250μM EDTA)透析。在1％琼脂糖(Sea Kem GTG；FMC Bio-products)脉冲场凝胶上电泳以及用溴化二氨乙苯啡啶染色评估纯化的P1 DNA插入片段的完整性。杆状病毒载体
SEQ ID No 2的PAPAP多核苷酸或其片段或变异型表达所用的适当载体是可在昆虫细胞和昆虫细胞系中传播的杆状病毒载体。特异性适当宿主载体系统是pVL1392/1393杆状病毒转移载体(Pharmingen)，这种载体用于转染自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)衍生的SF9细胞系(ATCC N°CRL 1711)。
其它用于SEQ ID No 2 PAPAP多肽或其片段或变异型在杆状病毒表达系统中表达的适当载体包括Chai等人(1993年)、Vlasaki等人(1983年)以及Lenhardi等人(1996年)所述的载体。病毒载体
在一具体实施例中，载体衍生自腺病毒。本发明的优选腺病毒载体是Feldman和Steg(1996年)或Ohno等人(1994年)所述的腺病毒载体。本发明该具体实施例的另外一些优选重组腺病毒是人腺病毒型2或5(Ad 2 or Ad 5)或来自动物的腺病毒(法国专利申请FR-93.05954)。
一般认为，选择逆转录病毒载体以及腺相关病毒作为重组基因运送系统，用于在体内转移外源多核苷酸，特别是包括人在内的哺乳动物的体内转移。这些载体将基因运送到细胞的效率较高，而已转移的核酸也稳定整合在宿主染色体DNA中。
本发明体内外基因运送载体中逆转录病毒的制备或构建所用的特别优选逆转录病毒包括选自由水貂细胞转化灶诱导病毒、小鼠肉瘤病毒、网状内皮组织增殖病毒和罗斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma virus)组成的组的逆转录病毒。特别优选小鼠白血病病毒包括4070A和1504A病毒，Abelson(美国模式培养物保藏所(ATCC)编号为VR-999)、Friend(ATCC编号为VR-245)、Gross(ATCC编号为VR-590)、Rauscher(ATCC编号为VR-998)以及莫洛尼氏小鼠白血病病毒(ATCC编号为VR-190；PCT申请WO 94/24298)。特别优选的罗斯肉瘤病毒包括Bryan高滴定度(high titer)(ATCC编号为VR-334、VR-657、VR-726、VR-659和VR-728)。Roth等人(1996年)、PCT申请WO 93/25234、PCT申请号WO 94/06920、Roux等人(1989年)，Julan等人，1992年以及Neda等人(1991年)也叙述了其它优选转录病毒载体。
本发明考虑的另一种病毒载体系统包括腺相关病毒(AAV)。腺相关病毒是天然存在的缺损病毒，所述缺损病毒需要另一种病毒如腺病毒疱疹病毒作为有效复制和增殖生命周期的辅助病毒(Muzyczka等人，1992年)。它也是其中一种可将DNA整合在不分裂细胞中的病毒，整合稳定、频率高(Flotte等人，1992年；Samulski等人，1989年；McLaughlin等人，1989年)。腺相关病毒的一个优点在于初级细胞转导到转化细胞的功效较低。BAC载体
Shizuya等人(1992年)研究了细菌人工染色体(BAC)克隆系统，可以稳定保持大量大肠杆菌(E.coli)基因组DNA片段(100-300kb)。优选BAC载体包括Kim等人(1996年)所述的pBeloBAC11载体。用这种载体按大小选择用酶部分消化的基因组DNA，而酶可使基因组DNA与载体的Bam HI或Hind III位点连接，从而制备BAC文库。T7和SP6 RNA聚合酶转录起始位点位于这些克隆位点侧面，用这些起始位点通过RNA转录或PCR方法可制备终点探针。构建E.coli的BAC文库后，从宿主细胞纯化超螺旋环BAC DNA。在确定大小和将BAC导入受体细胞之前要将这些环状分子转化成线性型式。克隆位点位于两个NotI位点侧面，通过NotI消化从载体切除克隆片段。另外，用市售酶λ终止酶处理BAC载体，导致独特cosN位点分裂，使包含在pBeloBAC11载体的DNA插入片段线性化，但这种分裂方法会产生含有插入DNA和BAS序列的全长BAC克隆。5.重组载体的输送
为了使本发明多核苷酸和多核苷酸构造体得到表达，必须将这些构造体送入细胞。这种输送可在体外实现，如在转化细胞系的实验步骤中，或者在体内外实现，如在处理一些疾病状态时。
病毒感染是其中一种机制，其中表达构造体被包在感染病毒粒子内。
本发明也考虑了一些将多核苷酸转移到培养哺乳动物细胞的非病毒方法，包括但不限于，磷酸钙沉淀(Graham等人，1973年；Chen等人，1987年)、DEAE-葡聚糖(Gopal，1985年)、电穿孔(Tur-Kaspa等人，1986年；Potte等人，1984年)、直接微注射(Harland等人，1985年)、DNA装载脂质体(Nicolau等人，1982；Fraley等人，1979年)以及受体介导转染(Wu和Wu，1987和1988年)。其中一些技术在体内外的应用获得成功。
一旦将表达多核苷酸输入细胞，它可稳定地整合在受体细胞的基因组中。这种整合在关连位置(cognate location)，而且与同源重组(基因取代)的方向一致，或者它可整合在任意、非特定位置(基因增大)。在另外一些实施例中，核酸可以作为独立、附加型DNA片段稳定地保持在细胞中。这样一些核酸片段或“附加体”编码得到充分保持和复制的序列，与宿主细胞循环无关或与宿主细胞循环同步。
在一具体实施例中，在体内将蛋白质或多肽送到脊椎动物细胞的方法包括以下步骤：使含有生理可接受载体和可操作地编码所述多肽的裸露多核苷酸的制剂导入到包含该细胞的组织胞间隙，其中裸露多核苷酸导入细胞内部，具有生理效应。这种方法特别适用于体外转移，但也可用于体内。
PCT申请公开号WO11092(Vical Inc.)和PCT申请公开号WO 95/11307(Institut Pasteur，INSERM，Universitéd’Ottawa)以及Tacson等人(1996年)和Huygen等人(1996年)的论文叙述了用于体内外包含“裸露”多核苷酸的组合物。
如Klein等人(1987年)所述，本发明的另一实施例中，通过粒子轰击(生物弹)将本发明裸露多核苷酸包括本发明多核苷酸构造体转移到细胞，所述粒子是被加速至已涂有DNA的高速微发射物，这样，它们可穿过细胞膜，不必杀死细胞就可进入细胞内。
在又一实施例中，本发明的多核苷酸被截留在脂质体内(Ghosh和Bacchawat，1991年；Wong等人，1980年；Nicolau等人，1987年)。
在一具体实施例中，本发明提供体内制备本文所述的PAPAP蛋白质或多肽组合物。该组合物含有可操作地编码该多肽的裸露多核苷酸，它溶于生理上可接受的载体溶液中，适合引入组织导致组织细胞表达所述蛋白质或多肽。
被注射到所希望的宿主有机体的载体含量随注射位点而变化。作为指标性量，在动物体内，优选在哺乳动物体内例如小鼠体内，注射的载体在0.1和100μg之间。
在本发明的另一个载体实施例中，它在体外被导入宿主细胞内，优选导入从待处理的动物采集到的宿主细胞内，更优选为体细胞，如肌细胞。在后一步骤中，使已用编码所希望的PAPAP多肽或其所希望的片段的载体转化的细胞重新导入动物体内，以便在体内局部或系统性地输送重组蛋白质。细胞宿主
本发明的另一个目的包括已经用本文所述其中一个多核苷酸，特别是含有PAPAP调节多核苷酸或SEQ ID No 1或3 PAPAP多肽编码序列的多核苷酸或其片段或其变异型，转化或转染的宿主细胞。本发明也包括已用上述其中一种重组载体转化(原核生物的细胞)或转染(真核生物的细胞)的宿主细胞。更具体地说，本发明的细胞宿主可包括在“PAPAP基因的基因组序列”部分、“PAPAP cDNA序列”部分、“编码区”部分、“多核苷酸构造体”部分、“寡核苷酸探针和引物”部分所述的任何一个多核苷酸。
本发明的另一种附加重组细胞宿主包括本文所述的任何一种载体，特别是在“重组载体”部分所述的任何一种载体。
以下是用作本发明表达载体受体的优选宿主细胞：
a)原核生物的宿主细胞：大肠杆菌株(I.E.DH5-c株)、枯草芽孢杆菌、沙门氏杆菌、以及象假单胞杆菌属、链霉菌属、葡萄球菌属等菌属株。
b)真核生物的宿主细胞：海拉细胞(Hela cells)(ATCC编号为CCL2、编号为CCL2.1、编号为CCL2.2)、Cv1细胞(ATCC编号为CCL70)、COS细胞(ATCC编号为CRL1650、编号为CRL1651)、Sf-9细胞(ATCC编号为CRL1711)、C127细胞(ATCC编号为CRL-1804)、3T3(ATCC编号为CRL-6361)、CHO(ATCC编号为CCL-61)、人肾293(ATCC编号为45504、CRL-1573)以及BHK(ECACC编号为84100501、84111301)。
c)其它哺乳动物宿主细胞。
哺乳动物细胞通常是人细胞的PAPAP基因表达可能产生缺陷，或者它可继续插入PAPAP基因组或cDNA序列，以用本发明的PAPAP多核苷酸取代动物细胞基因组中PAPAP基因的相应部分。用上述具有特异性的DNA构造通过同源重组事件可作出这些基因变化。
一种可供使用的细胞宿主是哺乳动物合子，如小鼠合子。例如，小鼠合子用所述纯化DNA分子进行微注射，例如，在含有100mM氯化钠、30μM精氨和70μM亚精氨的10mM pH7.4 Tris-HCl、250μM EDTA中浓度已调整至BAC插入片段为1ng/ml的、P1噬菌体插入片段为3ng/μl的纯化DNA分子。如Schedl等人(1993年)所述，当要注射的DNA尺寸较大时，可使用多胺和高盐浓度，避免该DNA发生机械断裂。
可将本发明的任何一个多核苷酸，包括本文所述的DNA构造体，导入胚胎干(ES)细胞系内，最好导入小鼠胚胎干细胞系内。胚胎干细胞系衍生自植入前胚细胞的内部细胞群集中多能、未定型(uncommitted)的细胞。以下是优选胚胎干细胞系：ES-E14TG2a(ATCC编号为CRL-1821)、ES-D3(ATCC编号为CRL1934和CRL-11632)、YS001(ATCC编号为CRL-11776)、36.5(ATCC编号为CRL-11116)。为了使胚胎干细胞保持未定型状态，它们要在生长抑制饲养细胞存在下培养，而这些饲养细胞提供适当信号以保留这种胚胎表型以及用作胚胎干细胞粘附的基质。优选饲养细胞是由任何一种小鼠杆菌的第13至第14日胚胎的组织制得的初级胚胎成纤维细胞，如Abbondanzo等人(1993年)所述，它们保持在培养基中，如Robertson(1987年)所述，由于扩散，或如Pease和Williams(1990年)所述，在LIF抑制浓度存在下，它们的生长被抑制。
利用常规方法可用宿主细胞的构造体制备由重组序列编码的基因产物。
适当宿主转化和宿主生长至合适的细胞密度后，以变温或化学诱导等适当方法诱导选择启动子，并使细胞培养多一段时期。
一般通过离心采集细胞，以物理或化学方式分裂，保留所得原提取物作进一步纯化。
任何一种适当方法都可分裂蛋白质表达所用的微生物细胞，包括冻融循环、超声波、机械断裂、或使用溶胞剂。这些方法已为本领域技术人员公知。PAPAP基因活化
本发明还包括脊椎动物，最好是哺乳动物特别是人的初级、二级和固定化同源重组宿主细胞，这些细胞被构建成：a)将外源(异源)多核苷酸插入到靶基因的内源染色体DNA中，b)删除内源染色体DNA，和/或c)用外源多核苷酸取代内源染色体DNA。插入、删除、和/或取代多核苷酸序列可以成为靶基因和/或调节区的编码序列，如可操作地连接靶基因相关的启动子和增强子序列。
本发明也涉及体内外同源重组宿主细胞的制备方法，其中使在细胞中得不到正常表达的靶基因表达发生改变。这种改变最好能在正常生长条件或适合制备由靶基因编码的多肽的条件下引起靶基因表达。这种方法包括以下步骤：(a)用多核苷酸构造体转染体内外细胞，该多核苷酸构造体包括：(i)靶序列；(ii)调节序列和/或编码序列；以及(iii)若需要，不成对剪接供体位点，从而产生转染细胞；以及(b)在适合同源重组的条件下保持体内外转染细胞。
本发明还涉及改变体内外细胞靶基因表达的方法，其中基因在细胞中得不到正常表达，该方法包括以下步骤：(a)用多核苷酸构造体转染体内外细胞，该多核苷酸构造体包括：(i)靶序列；(ii)调节序列和/或编码序列；以及(iii)若需要，不成对剪接供体位点，从而产生转染细胞；以及(b)在适合同源重组的条件下保持体内外转染细胞，从而制备同源重组细胞；以及(c)在适合基因表达的条件下保持体内外同源重组细胞。
本发明又涉及通过改变靶内源基因在体内外细胞中的表达来制备本发明多肽的方法，其中基因在细胞中得不到正常表达，该方法包括以下步骤：(a)用多核苷酸构造体转染体外细胞，该多核苷酸构造体包括：(i)靶序列；(ii)调节序列和/或编码序列；以及(iii)若需要，不成对剪接供体位点，从而产生转染细胞；(b)在适合同源重组的条件下保持体内外转染细胞，从而制备同源重组细胞；以及(c)在适合基因表达的条件下保持体内外同源重组细胞，从而制备多肽。
本发明还涉及改变靶基因在细胞型中的表达的多核苷酸构造体，而靶基因在细胞型中得不到正常表达。当多核苷酸构造体插入到目的细胞染色体DNA时就会发生这种情况，其中多核苷酸构造体包括：a)靶序列；b)调节序列和/或编码序列；以及c)若需要，不成对剪接供体位点。本发明也包括上述多核苷酸构造体，其中构造体还包括编码多肽、而且用染色体DNA进行同源重组后与靶内源基因符合读框的多核苷酸。
用本技术领域已知的技术制备组合物及其实施方法，可参考以下专利：美国专利US6,054,288、6,048,729、6,048,724、6,048,524、5,994,127、5,968,502、5,965,125、5,869,239、5,817,789、5,783,385、5,733,761、5,641,670、5,580,734；国际专利申请WO 96/29411、WO 94/12650；以及科技论文包括Koller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935页，(1989年)(具体可参考本文的引用文献)。转基因动物
本文所用的术语“转基因动物”或“宿主动物”指其基因组由于遗传和人工操纵而包含本发明其中一个核酸的动物。优选动物是非人动物，包括属于选自鼠(例如小鼠)、家鼠(例如大鼠)、以及Oryctogalus(例如兔)的属，它们的基因组通过人工和遗传插入本发明的核酸而发生改变。在一实施例中，本发明包括非人宿主哺乳动物和含有本发明重组载体或用剔除载体进行同源重组而分裂的PAPAP基因的动物。
本发明的全部转基因动物在它们的多个细胞中含有克隆重组或合成DNA序列，更具体地说，含有其中一个纯化的或分离的核酸，该核酸含有PAPAP编码序列、PAPAP调节多核苷酸、多核苷酸构造体或编码本文所述反义多核苷酸的DNA序列。
本发明的转基因动物通常包括任何一个多核苷酸、重组载体以及本发明所述的细胞宿主。更具体地说，本发明的转基因动物可包括在“PAPAP基因的基因组序列”部分、“PAPAP cDNA序列”部分、“编码区”部分、“多核苷酸构造体”部分、“寡核苷酸探针和引物”部分、“重组载体”部分和“细胞宿主”部分所述的任何一个多核苷酸。
在第一优选实施例中，这些转基因动物是优良实验模型，用于研究与细胞分化有关的多种病理，特别是其基因组内插入一个或多个编码天然PAPAP蛋白质或突变PAPAP蛋白质的多核苷酸复制的转基因动物。
在第二优选实施例中，这些转基因动物在PAPAP基因调节多核苷酸的调控下表达所述希望的多肽，使所述蛋白质合成的产率高，最后导致所述蛋白质得到组织特异性表达。
按照本领域技术人员所知的常规技术可设计本发明的转基因动物。关于转基因动物制备的详情，特别是转基因小鼠，可参考1989年10月授权的美国专利US4,873,191、1995年11月7日授权的美国专利US5,464,764、以及1998年8月4日授权的美国专利US 5,789,215，这些文献列于本文的参考文献中，揭示转基因小鼠的制备方法。
用本发明的步骤制备本发明的转基因动物，动物的基因组引入了外源遗传材料。这些步骤包括获取遗传材料或其部分，所述遗传材料或其部分编码PAPAP编码序列PAPAP调节多核苷酸、或编码本文所述反义PAPAP多核苷酸的DNA序列。
将本发明的重组多核苷酸插入到胚细胞或胚胎干细胞系内。这种插入最好如Thomas等人所述(1987年)用电穿孔进行。筛选要进行电穿孔的细胞(如通过选择标记选择、通过PCR或DNA印迹分析法选择)，以便最好用同源重组事件找到已经将外源重组多核苷酸整合在其基因组中的阳性细胞。Mansour等人(1988年)叙述了本发明所用的一个阳性—阴性选择步骤的示例。
接着，按Bradley(1987年)所述使阳性细胞分离、克隆并注入到3.5天大的小鼠胚泡中。再将这些胚泡插入雌性宿主动物，生长一段时期。
另外，按Wood等人(1993年)或Nagy等人(1993年)所述使阳性胚胎干细胞与处于2.5天大8-16细胞期(桑椹期)的胚胎接触，胚胎干细胞被内化，全面克隆包括产生种系的细胞在内的胚泡。
测试雌性宿主后代以确定哪一种是转基因动物，例如哪一种动物包括插入外源DNA序列，以及哪一种动物是野生型。
所以，本发明还涉及含有本发明的核酸、重组载体或重组宿主细胞的转基因动物。衍生自本发明转基因动物的重组细胞系
本发明的又一目的包括从本文所述的转基因动物制得的重组宿主细胞。在一实施例中，本发明包括衍生自非人宿主哺乳动物和动物的细胞，这些动物含有本发明重组载体或用剔除载体进行同源重组分裂的PAPAP基因。
由本发明转基因动物的任何组织得到的细胞可在体外构建重组细胞系，例如，如Chou(1989年)和Shay等人(1991年)所述，用表达诸如SV40大T抗原等onc-基因的载体转染初级细胞培养基。精神分裂症和双相情感障碍的治疗化合物的识别试验
本发明提供测试化合物的试验，其用于测试化合物治疗中枢神经系统疾病的能力，特别是减轻PAPAP介导的中枢神经系统疾病症状的能力。在一优选实施例中，测试化合物减轻PAPAP介导的精神分裂症或双相情感障碍症状的能力。测试化合物治疗相关疾病的能力，其中包括精神病、情绪失常、自闭病、药物成瘾和酗酒、弱智及其它精神疾病，包括认知能力、焦虑、饮食、冲动控制及人格障碍，定义参见精神病的诊断和统计手册第四版的分类。
本发明也提供细胞和动物，包括灵长类和啮齿类、精神分裂症和双相情感障碍以及相关疾病的模型。
一方面，本发明提供影响PAPAP活性的化合物不基于细胞、基于细胞和基于动物的识别试验。任何一种机理都有可能影响PAPAP活性；在一些实施例中，调节PAPAP基因表达水平或PAPAP基因产物活性会影响PAPAP活性。
另一方面，本发明提供影响g34872活性的化合物不基于细胞、基于细胞和基于动物的识别试验。调节PAPAP基因表达水平或PAPAP基因产物活性可影响g34872活性。影响g34872活性的化合物的识别试验最好能够检测到PAPAP与g34872多肽的相互作用，或者能够检测到PAPAP-g34872复合物。
这些方法可识别直接或间接影响PAPAP或g34872活性的化合物。可用本发明不基于细胞、基于细胞和基于动物的试验识别作用在PAPAP途径元件而非作用于PAPAP本身的化合物。然后将这些化合物作为治疗药物来调节PAPAP及其它涉及精神分裂症和双相情感障碍以及相关疾病的基因产物。基于细胞和不基于细胞的试验
一方面，可用基于同源重组或非同源重组细胞的试验识别调节PAPAP活性的化合物。
另一方面，本发明基于细胞的试验包括治疗精神分裂症、双相情感障碍和相关中枢神经系统疾病的化合物的识别方法，所述方法包括(a)使细胞以一定浓度与测试化合物接触一段时间，时间的长度足以减轻与精神分裂症、双相情感障碍或相关中枢神经系统疾病相关的终点，以及(b)确定细胞中PAPAP活性水平或PAPAP-g34872相互作用或复合物。例如，测定细胞的mRNA转录水平、PAPAP肽表达、定位或蛋白活性就可以测定PAPAP活性。测试化合物最好是能够或推测能够减轻精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病症状的化合物。选择能够调节PAPAP活性的测试化合物以用于药物研制。本文在小标题为“调节PAPAP基因表达的配体的筛选方法”部分还叙述了这样一些基于细胞的试验。
另一方面，本发明基于细胞的试验包括治疗精神分裂症或双相情感障碍的化合物的识别方法，所述方法包括(a)使细胞与足以引起精神分裂症相关或双相情感障碍相关的终点的PAPAP活性水平接触，以及(b)使所述细胞与测试化合物接触。然后，根据其减轻所述精神分裂症相关或双相情感障碍相关的终点的能力选择测试化合物。可用任何一种合适的方法确定PAPAP活性，包括但不限于提供含有PAPAP核苷酸序列的载体，用能够提高PAPAP表达的化合物处理所述细胞以及用PAPAP肽处理所述细胞。测试化合物最好是能够或推测能够减轻精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病症状的化合物；此外，测试化合物也可以是推测能够使精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病的终点加剧的化合物。选择能够减轻精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病任何一种可检测症状或终点的测试化合物以用于药物研制。本领域技术人员可确定适当细胞系；最好采用细胞系或神经源。
在另一个实施例中，本发明提供PAPAP基于细胞和不基于细胞的试验，以确定PAPAP肽是否与细胞表面结合，以及识别治疗与PAPAP受体相互作用的精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病的化合物。在这样一个实施例中，将PAPAP多核苷酸或其片段克隆到本文所述的表达载体中。通过大小、电荷、免疫层析或其它本领域技术人员熟知的技术纯化蛋白质。纯化后，用本领域技术人员已知的技术标记蛋白质。将标记蛋白质与衍生自各种器官或组织的细胞或细胞系一起培养，使蛋白质与细胞表面的任何一种受体结合。培养后，洗涤细胞，去掉非特异性结合的蛋白质。用自动放射线照相术检测标记蛋白质。此外，使无标记的蛋白质与细胞一起培养，并用带有可检测标记的抗体检测，如附在抗体上的萤光分子。通过进行竞争分析，其中各种含量无标记的蛋白质与标记蛋白质一起培养，以分析细胞表面结合特异性。结合细胞表面的标记蛋白质的含量随着竞争性无标记蛋白质的含量的增加而降低。作为对照，在一些结合反应中包括与标记蛋白质无关的各种含量无标记蛋白质。结合细胞表面的标记蛋白质含量在结合反应中不会随着不相关无标记蛋白质含量的增加而下降，这表明由核酸编码的蛋白质特异性结合细胞表面。以下实施例1显示了这样一个试验。在一实施例中，PAPAP结合可用于检测和定位g34872多肽。
在另一实施例中，本发明包括不基于细胞的结合试验，其中PAPAP多肽的制备和纯化方法参照上述基于细胞的结合试验。纯化后，使蛋白质带上标记，并与细胞膜提取物或分离物一起培养，而这些胞膜提取物或分离物衍生自任何器官、组织或所述器官或组织组合的任何所希望的细胞。培养后，洗涤胞膜，去掉非特异性结合蛋白质。用自动放射线照相术检测标记蛋白质。通过进行竞争分析，其中各种含量的测试化合物与标记蛋白质一起培养，以分析PAPAP胞膜结合特异性。将包括待测多肽在内的任何所希望的测试化合物与细胞一起培养。测试化合物用带有可检测标记的抗体检测，如附在抗体上的萤光分子。结合细胞表面的标记PAPAP多肽的含量随着竞争测试化合物含量的增加而降低。作为对照，在一些结合反应中包括各种含量无标记的蛋白质或与测试化合物无关的化合物。可选择能够使结合细胞膜的PAPAP含量下降的测试化合物作为候选治疗化合物。在一实施例中，PAPAP结合可用于检测g34872多肽。
在基于细胞和不基于细胞试验的优选实施例中，所述PAPAP多肽含有一段连续跨距，该跨距长至少4、6或8个SEQ ID No 2相邻氨基酸。
所述基于细胞的试验可包括任何合适来源的细胞；特别优选的细胞是人细胞、灵长类细胞、非人灵长类和小鼠细胞。基于动物模型的试验
也可用基于非人动物的试验识别调节PAPAP活性的化合物，研究PAPAP以及研究g34872和g34872生物途径。本发明包括基于动物模型和动物的试验，合适的动物包括非转基因或转基因动物，包括缺失PAPAP基因或有条件地表达PAPAP基因、或含有PAPAP基因或人变换型的动物。
所以，本发明包括用能够直接或间接调节PAPAP活性的测试化合物治疗患有精神分裂症或双相情感障碍或其症状的动物。
在一实施例中，本发明基于动物的试验包括治疗精神分裂症或双相情感障碍的测试化合物的识别方法，所述方法包括(a)使动物以一定浓度与测试化合物接触一段时间，时间的长度足以减轻与精神分裂症或双相情感障碍相关的终点，以及(b)确定所述动物中一位点上PAPAP活性水平或PAPAP-g34872相互作用或复合物。测定任何合适的细胞、组织或位点的PAPAP活性。测试化合物最好是能够或推测能够减轻精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病症状的化合物。选择性地，所述测试化合物能够或推测能够调节PAPAP活性。选择能够调节PAPAP活性的测试化合物以用于药物研制。本文给出一些测试化合物的例子(例如，苯并二氮、选择血清素重摄取抑制剂等)。
在另一实施例中，本发明基于动物的试验包括治疗精神分裂症或双相情感障碍的化合物的识别方法，所述方法包括(a)使动物与足以引起精神分裂症相关或与双相情感障碍相关症状或终点的PAPAP活性水平接触，以及(b)使所述动物与测试化合物接触。然后，根据其减轻所述精神分裂症相关或双相情感障碍相关的终点的能力选择测试化合物。可用任何一种合适的方法确定PAPAP活性，包括但不限于提供含有PAPAP核苷酸序列的载体，用能够提高PAPAP表达的化合物处理所述动物以及用PAPAP肽处理所述细胞。所述动物最好用含有一段连续跨距的PAPAP肽处理，而该跨距长至少4、6个或优选长8个SEQ ID No 2的相邻氨基酸。测试化合物最好是能够或推测能够减轻精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病症状的化合物。此外，测试化合物是推测能够加剧精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病症状的化合物。选择能够减轻精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病中任何一种可检测症状或终点的测试化合物以用于药物研制。
在一实施例中，用PAPAP肽处理小鼠，并与测试化合物接触，通过观察定型(stereotypy)评估精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病所显示的症状。在其它实施例中，用选自由内部笼观察(home cage observation)、神经评估(neurological evaluation)、应激诱发低温(stress-induced hypothermia)、强制游泳(forced swim)、PTZ发作(PTZ seizure)、运动活性(locomotor activity)、尾部悬吊(tail suspension)、举高型十字迷宫(elevated plus maze)、新型物体识别(novelobject recognition)、预脉冲抑制(prepulse inhibition)、热疼痛(thermal pain)、Y型迷宫(Y-maze)以及代谢室试验(metabolic chamber tests)(用Psychogenics Inc.公司的PsychoscreenTM试验)组成的组中至少一种试验评估所述症状。其它试验可参看Crawley等人，Horm.Behav.31(3)：197-211页，(1997年)和Crawley，Brain Res 835(1)：18-26页，(1999年)。
本发明的方法可筛选任何适合的测试化合物。用本发明的方法筛选的化合物包括小有机或无机分子、核酸，包括来自随机或定向多核苷酸文库的多核苷酸，肽，包括衍生自随机或定向肽文库的肽、可溶性肽、融合肽、以及磷酸肽，抗体，包括多克隆、单克隆、嵌合、人源化和抗独特型抗体、以及单链抗体、FAb、F(ab＇)2和Fab表达文库片段及其表位结合片段。在一些实施例中，能够减轻或加剧精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病症状或终点的化合物包括，例如一般抗精神病药、神经安定药、非典型神经安定药、抗抑郁剂、抗焦虑药、去甲肾上腺素能激动剂和拮抗剂、多巴胺能激动剂和拮抗剂、5-羟色胺重摄取抑制剂、苯并二氮。
在这些试验中，例如，可给动物施加(例如静脉内、腹膜内、肌内、口腔或其它部位)各种剂量水平的测试化合物。例如，如上所述用RNA印迹、免疫测定、PCR技术等比较血液或所选取的组织的PAPAP水平来确定化合物对PAPAP表达的影响。可使用任何一种合适的动物。所述动物最好是灵长类、非人灵长类、哺乳动物或小鼠。也可用人源化小鼠作为测试动物，这种小鼠的内源小鼠蛋白质被切除(剔除)，用标准转基因方法加入同源人蛋白质。这样的小鼠只表达人型蛋白质。可用只表达人PAPAP的人源化小鼠研究体内中枢神经系统疾病症状对调节PAPAP蛋白质或mRNA水平、或PAPAP-g34872相互作用或复合物的潜在试剂的应答。作为一个例子，制备带有人apoE4基因的转基因小鼠。它们再与缺失内源apoE的小鼠系一起培育，培植成带有人蛋白质的动物模型，一般认为这样的动物模型有助研究阿兹海默氏(Alzheimers)病理。利用这样一些转基因动物仔细分析疾病的生化和生理步骤，以及研究预防疾病的疗法(Loring等人，Neurobiol.Aging 17：173页，(1996年)，列于本文的参考文献中)。与PAPAP多肽相互作用的物质的筛选方法
对本发明而言，配体意味着分子，如蛋白质、肽、抗体或任何一种能够结合PAPAP蛋白质或其片段或变异型或调节编码PAPAP多核苷酸或其片段或变异型的合成化合物。
在本发明的配体筛选方法中，使待测生物样本或已限定的分子作为PAPAP蛋白质推定配体(putative ligand)与相应纯化PAPAP蛋白质接触，例如，如本文以上所述由重组细胞宿主产生的纯化的相应重组PAPAP蛋白质，以便在该蛋白质和待测推定配体分子之间形成复合物。
作为一个举例说明的例子，为了研究PAPAP蛋白质或含有一段连续跨距的片段，而该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQID No 2氨基酸，与药物或小分子的相互作用，例如，可用Wang等人(1997年)所述的通过组合化学方法、结合高效液相层析法的微量透析，或用Bush等人(1997年)所述的亲和毛细管电泳法等制备的分子，具体可参考本文的引用文献。
在另外一些方法中，按照以下测定方法可识别肽、药物、脂肪酸、脂蛋白、或小分子，其与PAPAP蛋白质或含有一段连续跨距的片段，而该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQ ID No 2氨基酸，相互作用。用可检测的标记来标记待测结合分子，如萤光、放射活性、或酶标记，并使该分子在发生特异性结合的条件下与固定化PAPAP蛋白质或其片段接触。去掉非特异性结合分子后，用适当方法检测结合分子。
本发明的另一个目的包括与PAPAP多肽相互作用的候选物质的筛选方法和试剂盒。
本发明涉及所述与PAPAP蛋白质或其片段或变异型相互作用的物质的筛选方法。由于它们能够通过共价或非共价键与PAPAP蛋白质或其片段或变异型结合，所以这些物质可供体内外使用。
在体外，所述相互作用的分子可用作检测工具，识别样本最好是生物样本中存在PAPAP蛋白质。
候选物质的筛选方法包括以下步骤：
a)提供多肽，其包含PAPAP蛋白质或片段，或者由或基本上由PAPAP蛋白质或片段组成，而所述片段含有一段连续跨距，该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，较优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQ ID No 2氨基酸；
b)制备候选物质；
c)使所述多肽与所述候选物质接触；
d)检测在所述多肽与所述候选物质之间形成的复合物。
在一实施例中，本发明涉及用PAPAP研究中枢神经系统疾病的g34872途径。相互作用的物质的筛选方法可用于检测PAPAP和g34872之间的相互作用。所以，本发明也包括：
a)提供多肽，其包含PAPAP蛋白质或片段，或者由或基本上由PAPAP蛋白质或片段组成，而所述片段含有一段连续跨距，该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，较优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQ ID No 2氨基酸；
b)制备g34872多肽；
c)使所述PAPAP多肽与g34872多肽接触；
d)检测在所述PAPAP多肽与所述g34872多肽之间形成的复合物。
所述g34872多肽优选含有至少4、6个或最好含有8个SEQ ID No 5氨基酸序列的相邻氨基酸。
本发明还涉及与PAPAP多肽相互作用的候选物质的筛选试剂盒，其中所述试剂盒包括：
a)带有氨基酸序列的PAPAP多肽，所述氨基酸序列选自由SEQ ID No 2氨基酸序列，或含有一段连续跨距的肽片段组成的组，而该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQ ID No2氨基酸；
b)检测工具，其可选择地用于检测PAPAP蛋白质或肽片段或其变异型与候选物质之间形成的复合物。
在上述试剂盒的优选实施例中，检测工具包括抗PAPAP蛋白质或肽片段或其变异型的单克隆或多克隆抗体。
可分析各种候选物质或分子与PAPAP多肽的相互作用。这些物质或分子包括但不限于天然或合成有机化合物或来自生物的分子，如多肽。当候选物质或分子包括多肽时，这个多肽可以是来自基于噬菌体的随机肽文库的噬菌体克隆所得的表达产物，或者多肽可以是适合在载体中进行双杂交筛选试验的克隆cDNA文库所得的表达产物。
本发明还涉及用于进行上述筛选方法的试剂盒。这些试剂盒最好包括PAPAP多肽或其片段或变异型，可选择地包括用于检测PAPAP多肽或其片段或变异型与候选物质之间所形成的复合物的检测工具。在一优选实施例中，检测工具包括抗相应PAPAP多肽或其片段或变异型的单克隆或多克隆抗体。A.从随机肽文库制得的候选配体
在筛选方法的具体实施例中，推定配体是包含在噬菌体载体中的DNA插入片段表达产物(Parmley和Smith，1988年)。特别使用随机肽噬菌体文库。随机DNA插入片段编码长8至20个氨基酸的肽(Oldenburg K.R.等人，1992年；Valadon P.等人，1996年；Lucas A.H.，1994年；Westerink M.A.J.，1995年；Felici F.等人，1991年)。根据该具体实施例，保留表达与固定化PAPAP蛋白质结合的蛋白质的重组噬菌体，随后用抗PAPAP蛋白质的多克隆或单克隆抗体免疫沉淀在PAPAP蛋白质与重组噬菌体之间形成的复合物。
一旦构建了重组噬菌体的配体文库，就将噬菌体群与固定化PAPAP蛋白质接触。然后，洗涤复合物制剂，去掉非特异性结合的重组噬菌体。特异性结合PAPAP蛋白质的噬菌体用缓冲液(酸性pH)洗脱或用由杂交瘤抗PAPAP制成的单克隆抗体免疫沉淀，随后用细菌(例如大肠杆菌)过度感染来扩增这些噬菌体群。选择步骤可重复多次，最好重复2至4次，以便选择更具特异性的重组噬菌体克隆。最后一步包括通过在感染细胞和分离物中的表达来表达另一个宿主/载体系统的噬菌体插入片段，或者对包含在所选重组噬菌体中的插入片段进行排序，来表征由所选重组噬菌体克隆制得的肽。B.通过竞争实验制得的候选配体
此外，在竞争实验中可识别肽、药物、或小分子，其结合PAPAP蛋白质或含有一段连续跨距的片段，该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQ ID No 2氨基酸。在这些试验中，PAPAP蛋白质或其片段固定在表面上，如塑料平板。在带有可检测标记的已知PAPAP蛋白质配体存在下，增加肽、药物、或小分子的含量，并与固定化PAPAP蛋白质或其片段接触。例如，可用萤光、放射活性、或酶标记来标记PAPAP配体，使其可被检测到。在测试分子存在下测量带有可检测标记的已知配体含量，以确定测试分子结合PAPAP蛋白质或其片段的能力。当存在待测分子时，结合PAPAP蛋白质的已知配体含量有所下降，这表明测试分子能够结合PAPAP蛋白质或其片段。C.通过亲和层析法制得的候选配体
用含有PAPAP蛋白质或其片段的亲和层析柱也找到一些蛋白质或其它分子，它们与PAPAP蛋白质或其片段相互作用，而所述片段含有一段连续跨距的片段，该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQID No 2氨基酸。利用常规技术可将PAPAP蛋白质或其片段附在层析柱上，这些技术包括与适当层析柱基质化学偶合，如琼脂糖、Affi Gel、或其它本领域技术人员熟悉的基质。在此方法的一些实施例中，亲和层析柱含有嵌合蛋白质，其中PAPAP蛋白质或其片段与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合。将上述细胞蛋白质或表达蛋白质的文库装在亲和层析柱上。然后如Ramunsen等人(1997年)所述在2-D电泳凝胶上分离和分析，所述文献列于本文的参考文献中。此外，用基于电泳的方法使留在亲和层析柱上的蛋白质纯化和排序。同样的方法可用于分离抗体、筛选噬菌体展示产物或筛选噬菌体展示人抗体。D.由光生物传感方法制得的候选配体
如Edwards和Leatherbarrow(1997年)以及Szabo等人(1995年)所述，用光生物传感方法筛选与PAPAP蛋白质或其片段相互作用的蛋白质，而所述片段含有一段连续跨距的片段，该跨距长至少6个SEQ ID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQ ID No 2氨基酸。所述文献列于本文的参考文献中。这种技术可实时检测分子之间的相互作用，而无需标记分子。这种技术基于表面电浆共振现象。简单地说，待测候选配体分子附在表面(如羟甲基葡聚糖基质)上。光束直射不包含待测样本的表面一侧，并自所述表面反射。表面电浆共振现象使反射光强度随角度和波长的特定组合而降低。候选配体分子的结合导致表面的折射率发生改变，检测这种改变即是检测表面电浆共振信号的变化。为了筛选能够与PAPAP蛋白质或其片段相互作用的候选配体分子或物质，使PAPAP蛋白质或其片段固定在表面上。该表面包括待分析候选分子流经的细胞一侧。检测PAPAP蛋白质或其片段上候选分子的结合是检测表面电浆共振信号的变化。待测候选分子可以是蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、或用组合化学制备的小分子。实施这种技术时，通过将真核生物或原核生物的细胞或含有内源或重组表达PAPAP蛋白质的脂质固定在它们的表面上。
这种方法的主要优点是它可确定PAPAP蛋白质和与PAPAP蛋白质相互作用的分子之间的结合速率。故可用强或相反地用弱缔合常数选择与PAPAP蛋白质或其片段相互作用的特异性配体分子。E.通过双杂交筛选试验制得的候选配体
取决于诱饵蛋白质(bait portein)与酵母Gal4蛋白质DNA结合区的融合，酵母双杂交系统用于研究体内蛋白质—蛋白质的相互作用(Fields和Song，1989年)。美国专利US5,667,973和US5,283,173(Fields等人)叙述了这种技术，两项专利揭示的技术内容列于本文的参考文献中。
用双杂交试验筛选文库的一般步骤可按Harper等人(1993年)或Cho等人(1998年)或者Fromont-Racine等人(1997)所提出的方法。
诱饵蛋白质或多肽包括PAPAP多肽或片段，或者由或基本上由PAPAP多肽或片段组成，所述片段含有一段连续跨距的片段，该跨距长至少6个SEQID No 2氨基酸，优选长至少8至10个SEQ ID No 2氨基酸，更优选长至少12、15、20、25、30、40、50、或100个SEQ ID No 2氨基酸。
更准确地说，编码PAPAP多肽或片段或变异体的核苷酸与编码GAL4蛋白质DNA结合区的多核苷酸融合，该融合核苷酸序列插入到适当表达载中，例如pAS2或pM3。
接着，在特别设计的载体中构建人cDNA文库，使人cDNA插入片段与编码GAL4蛋白质转录区的载体中的核苷酸序列融合。使用的载体最好是pACT载体。由人cDNA文库的核苷酸插入片段编码的多肽称为“请求”(“pray”)多肽。
第三载体含有可检测标记基因，如受调节序列控制的β半乳糖基因或CAT基因，而该调节序列应答既含有转录活化区，又含有DNA结合区的Gal4蛋白质。例如，使用载体pG5EC。
也可使用两种不同酵母菌株。作为举例说明但不起限制作用的例子是以下两种不同酵母菌株：
-Y190，其表型是(MATa，Leu2-3，112ura3-12，trp1-901，his3-D200，ade2-101，gal4Dgal180D URA3 GAL-LacZ，LYS GAL-HIS3，cyhr)；
-Y187，其表型是(MATa gal4 gal80 his3 trp1-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3，
-112 URA3 GAL-lacZmet-)，Y187是Y190的相反接合型。
简单地说，将20μg的pAS2/PAPAP和20μg的pACT-cDNA文库一起转化到酵母菌株Y190。在缺失组氨酸、亮氨酸和色氨酸，但含有组氨酸合成抑制剂3-AT(50mM)的最小介质上选择生长转化体。通过提升滤过分析(filter liftassay)筛选阳性克隆的β半乳糖。然后使两种阳性克隆(His+、β-gal+)在缺失组氨酸、亮氨酸但含有色氨酸和环己酰亚胺(10mg/ml)的平板上生长，选择丧失pAS2/PAPAP脂质，但保留pACT-cDNA文库脂质。使所得Y190菌株与表达PAPAP或不相关调控蛋白质的Y187菌株接合；如Harper等人(1993年)和Bram等人(1993年)所述的环孢素亲合素B、核纤层蛋白或SNF与Gal4融合，以及通过提升滤过分析筛选β半乳糖。与调控Gal4融合接合后是βgal的酵母克隆被认为是假阳性。
在本发明双杂交方法的另一个实施例中，用Matchmaker双杂交系统2(产品号K1604-1，Clontech)评估PAPAP或其片段或变异体与细胞蛋白质之间的相互作用。如本文引用的参考文献中Matchmaker双杂交系统2(产品号K1604-1，Clontech)内附手册所述，将编码PAPAP蛋白质或其部分的核酸插入到表达载体上，使它们与编码酵母转录激活剂GAL14 DNA结合区符合读框。将所希望的cDNA特别是cDNA插入第二表达载体，使它们与编码GAL14活化区的DNA符合读框。这两种表达质粒转化为酵母，而酵母接种在选择介质上，所述选择介质选择每种表达载体上的选择标记表达以及HIS3基因依赖于GAL4的表达。筛选能够在缺失组氨酸的介质上生长的转化体的依赖于GAL4的lacZ表达。在组氨酸和lacZ试验中均呈阳性的那些细胞含有PAPAP与由初始选择cDNA插入片段编码的蛋白质或肽之间的相互作用。与PAPAP基因调节序列相互作用的物质的筛选方法
本发明也涉及能够与PAPAP基因调节序列相互作用的物质或分子的筛选方法，例如启动子或增强子序列。
如本文参考文献中所引用的Clontech公司的Matchmaker单杂交系统试剂盒(产品号K1603-1)内附的使用手册所述，用单杂交系统可识别编码能够与PAPAP基因调节序列相互作用的蛋白质的核酸，更具体地说，核苷酸选自由5’或3’调节区的多核苷酸或其片段或变异型组成的组，而变异型最好含有本发明的其中一个双等位标记。简单地说，使目的核苷酸序列克隆在选择报导序列上游，将所得的DNA构造体整合在酵母基因组中(Saccharomycescerevisiae)。再用在编码结合PAPAP基因调节序列的候选蛋白质的cDNA与编码诸如GAL4等酵母转录因子活化区的序列之间含有融合蛋白的文库转化其基因组含有报导序列的酵母细胞。将重组酵母细胞接种在液体培养基中，以选择表达报导序列的细胞。这样所选择的重组酵母细胞含有能够结合PAPAP基因目的调节序列的融合蛋白。然后，使编码融合蛋白的cDNA排序，克隆到体外表达或转录载体中。利用本领域技术人员熟悉的技术可确定被编码的多肽与PAPAP基因目的调节序列的结合，如凝胶阻滞试验或DNA酶(DNAse)保护分析。
如Fried和Crothers(1981年)、Gamer和Revzin(1981年)以及Dent和Latchman(1993年)所述，也可单独地进行凝胶阻滞试验以筛选能够与PAPAP基因调节序列相互作用的候选分子，具体可参考本文的引用文献。这些技术基于与蛋白质结合的DNA片段比同一段无结合的DNA片段移动得慢这一原理。简单地说，使目的核苷酸序列带上标记。再将已标记的目的核苷酸序列与含有转录因子的总胞核提取物或不同待测候选分子接触。通过移动阻滞进行凝胶或毛细管电泳后检测PAPAP基因目的调节序列与候选分子或转录因子之间的相互作用。调节PAPAP基因表达的配体的筛选方法
本发明的又一个主题是调节PAPAP基因表达的分子的筛选方法。这样一种筛选方法包括以下步骤：
a)培养在其自身启动子的调控下用编码PAPAP蛋白质或其变异型或片段的核苷酸序列转染原核生物或真核生物的细胞；
b)使经过培养的细胞与待测分子接触；
c)定量测定PAPAP蛋白质或其变异型或片段的表达。
在一实施例中，编码PAPAP蛋白质或其变异型或片段的核苷酸序列包括至少一个PAPAP相关双等位标记的等位基因及其补体。
使用本领域技术人员熟知的DNA重组技术，将编码DNA序列的PAPAP蛋白质插入到表达载体的启动子序列下游处。作为一个举例的例子，PAPAP基因的启动子序列包含在5’调节区核酸中。
在mRNA水平或蛋白质水平上都可定量测定PAPAP蛋白质的表达。对于后一种情况，例如，在ELISA或放射免疫测定试验中用多克隆或单克隆抗体定量测定已制成的PAPAP蛋白质含量。
在一优选实施例中，用对PAPAP具有特异性的引物对定量测定cDNA的PCR扩增结果，而所述cDNA由培养过的PAPAP转染宿主细胞的全mRNA通过逆转录而制得，就可以定量测定PAPAP mRNA。
本发明还涉及能够提高，或者相反，能够降低PAPAP基因表达水平的物质或分子的筛选方法。这样一种方法使本领域技术人员可以选择对PAPAP基因表达水平具有调节作用，而且可用作包含在精神分裂症、双相情感障碍或相关中枢神经系统疾病病人的治疗药物组合物中有效成分的物质。
所以，本发明的部分内容是调节PAPAP基因表达的候选物质或分子的筛选方法，该方法包括以下步骤：
·提供含有核酸的重组细胞宿主，其中所述核酸含有5’调节区核苷酸序列或其位于编码可检测蛋白质的多核苷酸上游且具有生物活性的片段或变异型；
·制备候选物质；以及
·确定候选物质调节编码可检测蛋白质的多核苷酸表达水平的能力。
在另一实施例中，含有5’调节区核苷酸序列或其具有生物活性的片段或变异型的核酸也包括SEQ ID No 1的PAPAP cDNA 5’非翻译(UTR)区，或其具有生物活性的片段或变异型。
在编码可检测蛋白质的优选多核苷酸中，还包括编码β-半乳糖苷酶、绿萤光蛋白质(GFP)以及氯霉素转移酶(CAT)的多核苷酸。
本发明也涉及本文所述筛选方法使用的试剂盒。这些试剂盒包括一重组载体，其使位于上游且可操作地连接在编码可检测蛋白质或PAPAP蛋白质或其片段或变异型的多核苷酸上的5’调节区核苷酸序列或其具有生物活性的片段或变异型得到表达。
在另一个调节PAPAP基因表达的候选物质或分子的筛选方法的实施例中，所述方法包括以下步骤：
a)提供含有核酸的重组细胞宿主，其中所述核酸含有SEQ ID No 1的PAPAP cDNA 5’UTR序列，或其具有生物活性的片段或变异型之一，5’UTR序列或其具有生物活性的片段或变异型可操作地连接在编码可检测蛋白质的多核苷酸上；
b)制备候选物质；以及
c)确定候选物质调节编码可检测蛋白质的多核苷酸表达水平的能力。
在上述筛选方法的具体实施例中，含有核苷酸序列的核酸，而该核苷酸序列选自由SEQ ID No 1的PAPAP cDNA 5’UTR序列或其具有生物活性的片段或变异型之一组成的组，包括与PAPAP 5’UTR序列内源的启动子序列。
在上述筛选方法的另一具体实施例中，含有核苷酸序列的核酸，而该核苷酸序列选自由SEQ ID No 1的PAPAP cDNA 5’UTR序列或其具有生物活性的片段或变异型之一组成的组，包括与PAPAP 5’UTR序列外源的启动子序列。
在又一个实施例中，含有PAPAP cDNA或SEQ ID No 1的5’UTR序列或其具有生物活性的片段的核酸包括PAPAP相关双等位标记或其补体。
本发明也包括调节PAPAP基因表达的候选物质的筛选试剂盒，其中所述试剂盒包括一重组载体，其含有包括可操作地连接在编码可检测蛋白质的多核苷酸上的SEQ ID No 1的PAPAP cDNA 5’UTR序列，或者其具有生物活性的片段或变异型之一的核酸。
要设计上述筛选方法使用的合适的重组载体，最好参照本发明详细叙述优选重组载体的部分。
如国际专利申请公开号WO 97/05277所述的方法，用长探针利用溶液杂交分析PAPAP表达水平和模式，具体可参考本文的引用文献。简单地说，将上述PAPAP cDNA或PAPAP基因组DNA或其片段插入在紧靠噬菌体(T3、T7或SP6)RNA聚合酶启动子下游处的克隆位点上以产生反义RNA。PAPAP插入片段最好含有至少100个或以上基因组DNA序列或cDNA序列相邻核苷酸。在含有经修饰的核糖核苷酸(即生物素-UTP和DIG-UTP)的核糖核苷酸存在下使质粒线性化或转录。该过量双标记RNA与从所述细胞或组织分离的mRNA在溶液中杂交。杂交在标准严格杂交条件(在40-50℃，含有80％甲酰胺、pH值为7-8的0.4M氯化钠缓冲液中杂交16小时)下进行。用对单链RNA具有特异性的核糖核苷酸(即RNA酶CL3、T1、Phy M、U2或A)通过消化去掉没有杂交的探针。经生物素-UTP修饰就能够在涂有链霉抗生物素的微滴定板上捕获杂化物。经DIG修饰就能够用与碱性磷酸酶偶联的抗DIG抗体通过ELISA检测或定量测定杂化物。
也可用阵列定量测定PAPAP基因表达。本文所述的术语阵列意味着多个核酸的排列有一维、二维或多维，而该多个核酸长度要足以特异性检测能够与其杂交的mRNA的表达。例如，阵列可包含多个核酸，所述多个核酸衍生自要对其表达水平进行评估的基因。这些阵列可包括PAPAP基因组DNA、PAPAP cDNA序列或其互补序列或其片段，特别是那些含有至少一个PAPAP相关双等位标记的PAPAP基因组DNA、PAPAP cDNA序列或其互补序列或其片段。这些片段最好长至少15个核苷酸。在其它实施例中，片段长至少25个核苷酸。在一些实施例中，片段长至少50个核苷酸。较优选的是，片段长至少100个核苷酸。在另一个优选实施例中，片段长至少100个核苷酸以上。在一些实施例中片段可以长500个核苷酸以上。
例如，按照Schena等人(1995和1996年)所述的方法，用互补DNA微阵列定量测定PAPAP基因表达。通过PCR技术扩增全长PAPAP cDNA或其片段，用高速机器人技术(high-speed robotics)使它们从96孔微滴定板移到硅烷化显微镜玻片上重新排列。印刷阵列(printed arrays)在潮湿室中培养，使阵列元件进行水合作用，在0.2％SDS中洗一次，时间为1分钟，在水中洗两次，时间为1分钟，在硼氢化钠溶液中洗一次，时间为5分钟。在95℃将阵列浸在水中2分钟，转移到0.2％SDS浸1分钟，用水洗两次，风干，黑暗中储存于25℃。
使细胞或组织mRNA分离出来，或从市场购买，通过单次逆转录制备探针。在60℃ 14×14mm玻璃盖玻片上使探针与1cm2微阵列杂交6-12小时。阵列在25℃低严格洗涤缓冲液(1×SSC/0.2％SDS)中洗5分钟，再在室温下高严格洗涤缓冲液(0.1×SSC/0.2％SDS)中洗10分钟。用设有定做过滤装置的萤光激光扫描装置在0.1×SSC溶液中扫描阵列。算出两种不同杂交的平均比值，就可以测定准确的差异表达。
也可用Pietu等人(1996年)所述方法，用互补DNA阵列中全长PAPAPcDNA或其片段定量分析PAPAP基因表达。全长PAPAP cDNA或其片段通过PCR技术扩增，并点滴在膜上。然后，以放射活性核苷酸标记源自各种组织或细胞的mRNA。在控制条件下进行杂交和洗涤后，用磷屏成像(phosphoimaging)或自动放射线照相术检测已杂交的mRNA。重复实验，然后定量分析具有差异表达的mRNA。
此外，也可如Lockhart等人(1996年)和Sosnowsky等人(1997年)所述，通过高密度核苷酸阵列用PAPAP基因组DNA、PAPAP cDNA或其片段对表达进行分析。由PAPAP基因组DNA序列、PAPAP cDNA序列或其互补序列直接在嵌片上合成含有15-20个核苷酸的寡核苷酸(其中包括Lockhart等人)，或待合成后再置于嵌片上(其中包括Sosnowski等人)。寡核苷酸最好长大约20个核苷酸。
由适当mRNA群合成以适当化合物如生物素、洋地黄毒苷或萤光染料标记的PAPAP cDNA探针，然后使这些探针随机片段化为平均大小是50至100个核苷酸的片段。接着将所述探针与嵌片杂交。按Lockhart等人所述的方法洗涤后，施加不同电场(Sosnowski等人，1997年)，检测和定量测定染料或标记化合物。重复杂交。在不同cDNA样本的同一个目的寡核苷酸上对源自cDNA探针的信号密度进行比较分析，结果显示PAPAP mRNA的表达有差异。PAPAP基因表达的抑制方法
本发明其它治疗组合物的优点包括用PAPAP核酸序列的寡核苷酸片段作为反义工具或三螺旋工具抑制相应PAPAP基因的表达。
反义方法
本发明反义多核苷酸使用的优选方法是Sczakiel等人(1995年)所述的步骤。
最好在与PAPAP mRNA 5’端互补的多核苷酸(长15-200bp)中选择反义工具。在另一个实施例中，使用与所希望的靶基因不同部分互补的不同反义多核苷酸的组合。
本发明优选反义多核苷酸与含有翻译起始密码子ATG或剪接供体或受体位点的PAPAP mRNA序列互补。
反义核酸的长度和解链温度要足以形成胞内双链体，其稳定性足以抑制双链体中PAPAP mRNA的表达。Green等人(1986年)以及Izant和Weintraub(1984年)叙述了设计适合用于基因治疗的反义核酸的策略，具体可参考本文的引用文献。
在一些策略中，将PAPAP编码区相对启动子的方向逆转，以便转录在细胞中正常转录的反向链，从而制成反义分子。用体外转录系统如采用T7或SP6聚合酶产生转录的那些系统转录反义分子。另一种方法包括使含有反义序列的DNA与在适当表达载体的启动子可操作地连接，以便在体内转录PAPAP反义核酸。
另外，Rossi等人(1991年)、国际申请WO 94/23026、WO 95/04141、WO92/18522以及欧洲申请EP 0 572 287 A2也叙述了一些适当反义策略。
本发明采用的另一种可供选择的反义技术包括使用核酶，所述核酶通过其互补多核苷酸尾部与靶序列结合，而且通过水解其目的位点(即“锤头核酶”(“hammerhead ribozymes”))使核酶分裂为相应RNA。简单地说，锤头核酶的简化循环包括(1)通过互补反义序列使序列特异性结合目的RNA；(2)使目的链的裂解基序特异性水解位点；以及(3)释放分裂产物，产生另一个催化循环。事实上，最好使用长链反义多核苷酸(长至少30个碱基)或带有长反义臂的核酶。将这些反义核酶与亲脂基团通过共价键结合或将脂质体用作适当载体，得到反义核酶的优选输送系统。按Sczakiel等人(1995年)所述方法制备本发明的优选反义核酶，具体制备步骤可参照本文参考文献所引述的文章。三螺旋方法
也可用PAPAP基因组DNA抑制基于胞内三螺旋形成的PAPAP基因表达。
用三螺旋寡核苷酸抑制基因组的转录。它们特别适用于研究当细胞与特定基因有关时其活性的变化。
类似地，可用部分PAPAP基因组DNA研究细胞内PAPAP转录的抑制效应。一般认为，同源嘌呤序列在三螺旋策略中是最有用的。然而，同源嘧啶序列可抑制基因表达。这些同源嘧啶寡核苷酸与同源嘌呤的主沟(major groove)即同源嘧啶序列结合。故两种来自PAPAP基因组DNA的序列也在本发明的范围内。
为了用三螺旋方法进行治疗策略，首先扫描PAPAP基因组DNA序列，以识别一段从10-mer至20-mer的同源嘧啶或同源嘌呤序列，该序列可用在基于三螺旋抑制PAPAP表达的策略。识别候选同源嘧啶或同源嘌呤序列后，将含有候选序列的各种含量寡核苷酸导入表达PAPAP基因的组织培养细胞中，以评估它们抑制PAPAP表达的效率。
可用本领域技术人员已知的各种方法将寡核苷酸导入细胞中，包括但不限于磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染或天然摄取。
用RNA印迹、RNA酶保护分析或基于PCR的策略等技术盐测已经用寡核苷酸处理过的细胞中PAPAP基因的转录水平，从而盐测处理过的细胞中改变后的细胞功能或下降后的PAPAP表达。
如在反义方法中已有叙述，用在上述反义方法中所述的技术以根据体外结果计算出的剂量将有效抑制组织培养细胞基因表达的寡核苷酸导入体内。
在一些实施例中，用α端基异构体取代寡核苷酸单位的天然(β)端基异构体，产生对核酶具有更大抗性的寡核苷酸。此外，可使溴乙啶等嵌入剂附在α寡核苷酸3’端上，稳定三螺旋。要了解适合形成三螺旋的寡核苷酸的制备方法，可参看本文的引用文献Griffin等人(1989年)。药物组合物和制剂调节PAPAP的化合物
用本文所述方法可识别在体内外选择性地调节PAPAP活性或调节PAPAP-g34872相互作用的化合物。例如，通过本发明方法识别的化合物包括对PAPAP肽具有结合特异性的抗体。当然，PAPAP类似物也可用于调节PAPAP介导的活性以及与精神分裂症或双相情感障碍相关的有关生理条件。一般认为，本发明的分析方法基于PAPAP在中枢神经系统疾病中的作用，它们可用于识别能够干扰疾病途径的化合物。适应症
当PAPAP显示出与精神分裂症和双相情感障碍有关时，涉及PAPAP的适应症包括各种中枢神经系统疾病。神经系统疾病的遗传基础比较复杂，通常具有一些共同的症状。具体地说，如本文所述，适应症可包括精神分裂症和其它精神病、神经退化性疾病、情绪失常、自闭病、药物成瘾和酗酒、弱智及其它精神疾病，包括认知能力、焦虑、饮食、冲动控制及人格障碍。疾病的定义可参考精神病的诊断和统计手册第四版的分类。药物制剂及施药途径
用本发明方法识别的化合物可单独或将它们与适当载体或赋形剂混合而成的药物组合物以有效治疗剂量施加到包括病人在内的哺乳动物中，治疗或减缓精神分裂症和双相情感障碍相关疾病。有效治疗剂量进一步指足够使以本文所述方法确定的症状有所减缓的化合物剂量。有效治疗剂量最好适合连续周期性服用或施用。制剂技术和直接使用的化合物的施用可参照最新版的“Remington＇s药物科学”，Mack出版社，Easton，PA。施药途径
施药的适当途径包括口服、经直肠、跨粘膜、或经肠道施加，经肠胃外输送，包括肌内、皮下、髓内注射以及胸内、直接心室、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。施加中枢神经系统疾病的治疗化合物的一种特别有用的方法包括通过手术植入在一段延长时间内输送化合物的装置，例如通过植入的泵(来自Medtronic，Inc.公司，Minneapolis，MN)在鞘内输送包括输注入脊髓液。特别是输送本发明的药物缓释制剂。组合物/制剂
用含有赋形剂和辅助剂的一种或多种生理上可接受的载体以常规方式配制用于本发明的药物组合物和药剂。合适的制剂取决于所选择的施药途径。
本发明用于注射的药剂可配制成水溶液，最好是在生理上兼容的缓冲液，如Hanks＇s溶液、林格(Ringer＇s)溶液，或者生理盐水，如磷酸盐或碳酸氢盐缓冲液。用于跨粘膜施药时，可在制剂中使用适合待渗透屏障的渗透剂。这些渗透剂通常已为本领域所公知。
供口服的药物制剂包括由明胶制成的推入契合(push-fit)胶囊、以及由明胶和诸如甘油或山梨醇增塑剂制成的密封软胶囊。推入契合胶囊可含有有效成分和填充物，如乳糖，结合剂，如淀粉，和/或润滑剂，如滑石或硬脂酸镁，以及可选择地，稳定剂组成的混合物。在软胶囊中，有效化合物可溶于或悬浮于适当液体中，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙烯乙二醇。此外，还可加入稳定剂。所有供口服施用的制剂应配成适合施用的剂量。
以常规方式将口服组合物配制成片剂或锭剂形式。
本发明以吸入方式施药的化合物借助适当气体推进剂如二气化碳很容易从加压包或啧雾器以气溶胶形式输送。如果是加压气溶胶，通过瓣膜(valve)确定剂量单位以输送计量含量。例如用于吸入剂或吹入剂的明胶胶囊或药筒，可配制成含有化合物和诸如乳糖或淀粉等适当粉底的粉末混合物。
也可配制经肠胃外注射例如团注注射(bolus injection)或连续静脉输注而施加的化合物。供注射的制剂配成加入防腐剂的单位剂量形式，例如安瓿或多剂量容器。组合物还可制成悬浮液、溶液或乳液水溶液等形式，并可含有配剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
经肠胃外施药的药物制剂包括以水溶型式存在的有效化合物水溶液。悬浮水溶液可包含增大悬浮液粘度的物质，如羟甲基纤维素钠、山梨醇、或葡聚糖。选择性地，悬浮液还可包含适当稳定剂或增加化合物溶解性，从而可以制成高浓度溶液的试剂。
此外，有效成分使用前可以与适当载体如无菌无致热原的水形成粉末或冻干型。
除了上述制剂外，化合物也可配成贮存制剂。这样一些制剂的有效期较长，可通过植入(如皮下或肌内)或通过肌内注射而施加。例如，可使化合物与适当聚合或疏水性物质(如在可接受的油中作为乳剂)或离子交树脂一起配制，或作为微溶衍生物，如作为微溶盐。
另外，可用缓释系统输送化合物，如含有治疗药剂的固体疏水聚合物的半渗透基质。现已确定的缓释物质有很多种，它们已为本领域技术人员所公知。根据其化学性质，缓释胶囊释放化合物的时间为几星期，甚至长达100天以上。
取决于治疗药剂的化学性质和生物稳定性，可采用另外一些稳定蛋白质的策略。
药物组合物也可包含适当的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的例子包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶以及聚合物，如聚乙二醇。有效剂量
适合本发明使用的药物组合物包括一些组合物，其中所包含的有效成分的有效量能够达到预期目的。更具体地说，有效治疗量是指有效预防疾病的演化或减缓接受治疗的受试者的现有症状的量。确定有效量对于本领域技术人员是显而易见的，特别是参照本发明详细叙述的内容。
由细胞培养分析可初步估计到本发明方法使用的任何一种化合物的有效治疗量，而剂量可在动物模型中试用。利用这些信息可更准确地确定人类使用的剂量。
有效治疗剂量指能够减缓病人症状的化合物用量。用标准制药步骤在细胞培养基或实验动物可确定这些化合物的毒性和治疗功效，如确定LD50(对50％试验群具有剂量毒性)和ED50(对50％试验群具有治疗功效)。毒性与治疗功效的比率是治疗指标，它可表示为LD50与ED50之间的比值。优先选择治疗指标较高的化合物。
由细胞培养基试验和动物研究所得的数据可用于配制人使用的剂量范围。这些化合物的剂量最好在计算浓度包括ED50的范围内，要毒性低或者无毒性。剂量在这个范围的变化取决于所用的剂量及采用的施药途径。根源病人的状况由各个医生选择准确的制剂和施药途径(例如，参看Fingl等人的“治疗的药理基础”第一章，1975年)。精神疾病的预防、诊断和治疗
如以上所述，本发明的一部分内容涉及精神疾病特别是精神分裂症和双相情感障碍的治疗药物的制备。所以本发明包括对PAPAP起作用的药物。
在优选实施例中，本发明的药物对PAPAP起作用，要么直接作用于PAPAP、与PAPAP复合物相关的亚基(subunit)、PAPAP-g34872复合物，要么间接作用于PAPAP途径。例如，这些药物可调节，最好是降低发生在细胞或特定组织中的PAPAP活性水平或者增加或降低PAPAP蛋白质的活性。所以，在一些实施例中本发明包括能够增加或降低PAPAP表达或PAPAP蛋白质活性的化合物在制备或生产药物上的应用。所述化合物优选用于治疗精神疾病，最好用于治疗精神分裂症和双相情感障碍。所述化合物最好通过与PAPAP、g34872、PAPAP受体结合而发挥作用。所述g34872可以是任何g34872多肽，包括SEQ ID No 5多肽或于2000年3月提交的共同待批专利申请09/539,333题为“精神分裂症相关基因、蛋白质及双等位标记”所述的多肽。
这些药物也可增加或降低PAPAP类似化合物、其氨基酸序列与SEQ IDNo 2序列的氨基酸同一性至少为25％的化合物、其氨基酸序列与SEQ ID No 2序列的氨基酸同一性至少为50％的化合物、以及其氨基酸序列与SEQ ID No 2序列的氨基酸同一性至少为80％的化合物的活性。
如本文讨论，增加或降低这些化合物在个体内的活性的药物可用于减缓或预防患有或感染精神疾病的个体的症状。
此外，用基因治疗表达编码由已识别的PAPAP介导的化合物的基因可增加或降低PAPAP活性。适用于基因治疗的载体和启动子的例子可参照以上所述。而制备结合PAPAP肽、PAPAP受体或其相关蛋白质以及这些蛋白质片段的抗体也可增加或降低PAPAP活性。这些抗体可调节PAPAP与PAPAP受体或其相关蛋白质之间的相互作用。本文还会进一步叙述制备它们的抗体或方法。
如上所述，本发明提供识别治疗精神疾病的化合物的细胞分析(cellularassays)。这些分析基于PAPAP表达的检测、PAPAP蛋白质活性的测量、或基于精神分裂症、双相情感障碍或相关精神疾病的其它适当疾病终点的确定。治疗精神疾病的化合物包括能够抑制野生型PAPAP蛋白质活性的衍生蛋白质或肽，通过确定它们结合野生型PAPAP蛋白质的能力就可以识别这些化合物。化合物也包括抗体以及用本领域技术人员熟知的各种合成方法包括基于组合化学的技术制成的小分子和药物。本文会进一步叙述化合物的识别方法、制剂的制备及药物施加方法。易患中枢神经系统疾病的倾向的诊断或检测方法中的PAPAP
感染或易患精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病的个体可能表达异常PAPAP的异常水平。在他们的血浆、体液、或身体组织中PAPAP活性有增加或降低的个体可能处于演化精神分裂症、双相情感障碍或各种中枢神经系统疾病或与常见疾病机制有关的精神病情的危险。本发明在实施例中提供个体是否有可能患上或者是否现在已有这样一种疾病(例如，精神分裂症、双相情感障碍或其它精神病、情绪失常、自闭病、药物成瘾和酗酒、弱智及其它精神疾病，包括认知能力、焦虑、饮食、冲动控制及人格障碍，疾病的定义可采用精神病的诊断和统计手册第四版的分类)的判断方法，该方法包括判断个体的PAPAP活性水平是否有异常，包括PAPAP蛋白质活性和/或PAPAPmRNA表达，或者在血浆、体液、或身体组织中PAPAP蛋白质的异常水平。可用各种方法确定血浆、体液、或身体组织中PAPAP或类似化合物的水平。具体地说，例如用蛋白质印迹或蛋白质电泳确定PAPAP蛋白质的水平。也可用抗本发明PAPAP多肽的抗体检测PAPAP。检测到与抗体的特异性结合，表明样本中存在PAPAP多肽(例如ELISA)。这也反映与PAPAP相关的病理状态。
另一方面，也可用一个或多个PAPAP双等位标记、多态性或变异型研究诊断试验，所述诊断试验能够识别表达由于特异性基因型而导致产生的可检测性状的个体，或者识别表达其基因型使他们以后有可能演化为可检测性状的个体。用本发明诊断方法分析的性状可诊断任何可检测的性状，包括精神分裂症、双相情感障碍或相关疾病如本文实施例中所述的那些疾病的倾向、可检测症状发作的年龄、与所述疾病治疗有关的有益应答或副作用。这样一种诊断可用于疾病的盐测、预后和/或预防或治愈性治疗。这些诊断技术基于对PAPAP核酸序列的认识，可采用各种方法论确定待测受试者是否有一种基因型，该基因型与增加演化可检测性状的危险有关，或者确定个体是否由于特定的突变而具有可检测的性状，这些方法包括能够分析个体染色体的单位型的方法，如家族研究、单精子DNA分析或体细胞杂交物。这些诊断技术可包括检测存在于PAPAP序列包括PAPAP调节序列或通常是人染色体13q33区内的特异性等位基因。具体地说，本发明涉及检测包含至少一段SEQ ID No1或3核苷酸序列或其片段或其互补序列的核酸序列。
这些方法包括从个体采集核酸样本，确定核酸样本是否含有至少一个等位基因或至少一个双等位标记单位型，其表示有演化性状的危险或表示该个体表达由于具有特定PAPAP相关多态性或突变(引起性状的等位基因)而产生的性状。
这些诊断方法可基于单个双等位标记或一组双等位标记。这些方法中每一种都是从待测受试者采集核酸样本，确定本发明一个或多个双等位标记的双等位标记模式。在一个实施例中，对核酸样本进行PCR扩增，以便扩增其与可检测表型相关的多态性已被识别的区域。对扩增产物进行序列分析，确定个体是否有一种或多种与可检测表型有关的PAPAP相关多态性。此外，使核酸样本进行微排序反应，确定个体是否有一种或多种与由于人PAPAP基因突变或多态性而产生的可检测表型有关的PAPAP相关多态性。在另一个实施例中，使核酸样本与一个或多个等位基因特异性寡核苷酸探针接触，所述探针与一个或多个与可检测表型有关的PAPAP相关等位基因特异性杂交。在另一个实施例中，使核酸样本与第二个寡核苷酸接触，该寡核苷酸当与等位基因特异性寡核苷酸一起用在扩增反应时能够产生扩增产物。扩增反应中存在扩增产物表明个体有一个或多个与可检测表型有关的PAPAP相关等位基因。在一优选实施例中，可检测性状是精神分裂症和双相情感障碍。诊断试剂盒包括本发明的任何一个多核苷酸。这些诊断方法非常有用，这是因为它们在一些情况中可用于启动预防性治疗，或者可使携带显著单位型的个体预知症兆，如不严重的症状等。
应用分析或预测药物反应或药物的副作用的诊断方法可确定个体是否应该用特定药物进行治疗。例如，如果诊断显示个体可能会对用特定药物进行的治疗呈阳性反应，就可以给个体施加该药物。相反，如果诊断显示个体可能会用特定药物进行的治疗呈阴性反应，就要换另一种疗法。阴性反应的定义为缺乏有效应答或存在有毒副作用。
本发明诊断方法的另一种应用是临床药物试验。用上述方法可识别一个或多个标记，所述标记显示对精神分裂症起作用的药剂或对精神分裂症起作用的药剂副作用的应答。然后，在这样一种药剂的临床试验中筛选潜在参与物，以识别那些对药物的反应最有可能呈阳性的个体，排除那些可能有副作用的个体。以这种方式，测量对药物反应呈阳性的个体中药物治疗的有效性，由于研究包括可能呈阳性的个体，所以测量的结果不会下降，而且不存在不希望看到的安全问题的危险。疾病的预防和管理
例如，由于有自杀的危险，所以对精神分裂症、双相情感障碍及其它精神疾病的易感性的检测变得非常重要。故本发明涉及中枢神经系统疾病特别包括精神分裂症或双相情感障碍或其相关疾病的治疗方法，所述方法包括以下步骤：
·选择个体，该个体的DNA含有PAPAP相关多态性或一个双等位标记或一组双等位标记等位基因，或者该个体中与中枢神经系统疾病相关的PAPAP mRNA表达或PAPAP蛋白质活性异常；
·跟进所述个体表现出来与所述中枢神经系统疾病相关的症状；
·在疾病的适当阶段给所述个体施加对中枢神经系统疾病或其症状起作用的治疗。
本发明的另一个实施例包括中枢神经系统疾病的治疗方法，所述方法包括以下步骤：
·选择个体，该个体的DNA含有PAPAP相关多态性或一个双等位标记或一组双等位标记等位基因，或者该个体中与中枢神经系统疾病相关的PAPAP mRNA表达或PAPAP蛋白质活性异常；
·给所述个体施加所述中枢神经系统疾病的预防性治疗。
在又一个实施例中，本发明涉及中枢神经系统疾病的治疗方法，所述方法包括以下步骤：
·选择个体，该个体的DNA含有PAPAP相关多态性或一个双等位标记或一组双等位标记等位基因，或者该个体中与中枢神经系统疾病相关的PAPAP mRNA表达或PAPAP蛋白质活性异常；
·给所述个体施加中枢神经系统疾病的预防性治疗；
·跟进所述个体的所述中枢神经系统疾病症状的表现和发展；
·在疾病的适当阶段给所述个体施加对中枢神经系统疾病或其症状起作用的治疗。
对于确定患病个体的治疗方案，本发明还涉及中枢神经系统疾病的治疗方法，所述方法包括以下步骤：
·选择有精神分裂症或双相情感障碍的个体，该个体的DNA含有PAPAP相关多态性或一个双等位标记或一组双等位标记等位基因，或者该个体中与中枢神经系统疾病或其症状的严重性相关的PAPAP mRNA表达或PAPAP蛋白质活性异常；
·给所述个体施加对所述中枢神经系统疾病或其症状起作用的治疗。
本发明还涉及在挑选的一群个体中中枢神经系统疾病的治疗方法，所述方法包括以下步骤：
·选择有中枢神经系统疾病的个体，该个体的DNA含有PAPAP相关多态性或一个双等位标记或一组双等位标记的等位基因，或者该个体中与用对所述中枢神经系统疾病或其症状起作用的有效治疗量药物进行的治疗呈阳性反应相关的PAPAP mRNA表达或PAPAP蛋白质活性异常；
·和/或该个体的DNA不包含PAPAP相关多态性或一个双等位标记或一组双等位标记的等位基因，或者该个体中与用所述药物进行的治疗呈阴性反应相关的PAPAP mRNA表达或PAPAP蛋白质活性异常；
·每隔一段适当时间给所选择的个体施加有效量所述药物。
在本发明的上下文中，对药物呈“阳性反应”定义为包括疾病相关症状有所减缓。在本发明的上下文中，对药物呈“阴性反应”定义为包括对药物缺乏阳性反应，导致症状没有减缓或在施加药物后出现副作用。
在本发明的方法中，中枢神经系统疾病最好是精神分裂症和双相情感障碍。然而，本发明也包括在预防、诊断、管理和治疗相关疾病，特别是相关中枢神经系统疾病的方法中本文所述的任何一种预防、诊断、预后和治疗方法。作为举例说明，相关疾病包括精神病、情绪失常、自闭病、药物成瘾和酗酒、弱智及其它精神疾病，包括认知能力、焦虑、饮食、冲动控制及人格障碍，疾病的定义可采用精神病的诊断和统计手册第四版的分类。
本发明也涉及受试者是否可能对药物治疗呈阳性反应的判断方法。该方法包括识别对所述药物呈阳性反应的第一组个体以及识别对所述药物呈阴性反应的第二组个体。在对所述药物呈阳性反应的第一组个体中识别一个或多个双等位标记，或者在对所述药物呈阴性反应的第二组个体中识别一个或多个双等位标记。用本文所述的技术识别双等位标记。
然后，从待测受试者采集DNA样本。对该DNA样本进行分析，确定它是否含有一个或多个与用药物治疗呈阳性反应相关的双等位标记等位基因，和/或含有一个或多个与用药物治疗呈阴性反应相关的双等位标记等位基因。
在一些实施例中，如果DNA样本含有一个或多个与用药物治疗呈阳性反应相关的双等位标记等位基因和/或如果DNA样本缺乏一个或多个与用药物治疗呈阴性反应相关的双等位标记等位基因，就可以在临床试验中给受试者施加这些药物。在优选实施例中，这些药物是对精神分裂症和双相情感障碍起作用的药。
利用本发明的方法，在可能对药物呈阳性反应的一群个体中评估药物功效。
本发明的另一部分内容是药物的使用方法，该方法包括从受试者采集DNA样本，判断DNA样本是否含有一个或多个与对药物呈阳性反应相关的双等位标记等位基因和/或判断DNA样本是否含有一个或多个与对药物呈阴性反应相关的双等位标记等位基因，如果DNA样本含有一个或多个与对药物呈阳性反应相关的双等位标记等位基因和/或如果DNA样本缺乏一个或多个与对药物呈阴性反应相关的双等位标记等位基因，就给受试者施加这些药物。
本发明也涉及药物最好是对精神分裂症或双相情感障碍或其症状起作用的药物的临床试验方法。该方法包括以下步骤：
·给一组异源个体施加药物，最好是容易对精神分裂症或双相情感障碍或其症状起作用的药物；
·识别对所述药物呈阳性反应的第一组个体以及识别对所述药物呈阴性反应的第二组个体；
·在所述对所述药物呈阳性反应的第一组个体中识别双等位标记；
·选择一些个体，其DNA含有与对所述药物呈阳性反应相关的双等位标记；以及
·给所述个体施加所述药物。
一般认为这样一些方法对提高药物施用的效益/危险比值有显著效果，而施加该药物可能会引起不希望看到的副作用和/或即使正常施用对部分病人不起作用。
一旦个体被诊断为有精神分裂症或双相情感障碍，就进行选择试验以确定该个体的DNA是否含有一个双等位标记或一组双等位标记等位基因，其与对治疗呈阳性反应或对治疗呈阴性反应包括副作用或无反应相关。
通过以上所述的检测方法选择用本发明方法治疗的病人。选择的病人最好是那些DNA不包含与对治疗呈阴性反应相关的一个双等位标记或一组双等位标记等位基因。弄清个体容易出现无反应的基因倾向或对特定药物有副作用，临床医生就可以直接施以适当药物治疗精神分裂症或双相情感障碍或其症状。
一旦确定了病人的基因倾向，临床医生就可以选择在病人身上不会出现或者只在边上出现的阴性反应特别是副作用的适当治疗。
本申请都引用了各种出版书籍、专利和已公开的专利申请。本申请引用的这些出版书籍、专利和已公开的专利申请的内容均列于本文的参考文献，以充分叙述本发明所属技术领域的现状。
实施例1 原位受体结合分析(细胞染色)碱性磷酸酶融合构造体
在pAPtag表达载体中构建编码PAP肽氨基酸序列(SEQ ID No 5)的cDNA序列与分泌碱性磷酸酶(AP)符合读框的融合。SEQ ID No 4和SEQ ID No 6分别显示插入在载体的(融合)蛋白序列的核苷酸和氨基酸序列。
该载体包含位于引导融合蛋白分泌到介质中的插入片段上游处的分泌信号序列。收集、分析含有融合蛋白的介质的碱性磷酸酶活性，将这种介质用于原位受体/配体分析。
接着，将碱性磷酸酶融合蛋白转染到293T细胞，按照Zeocin抗性选择稳定的转染体。每3天收集来自含有稳定转染体的细胞的介质，并分析碱性磷酸酶的活性。之后，按下述方法用这种含有介质的碱性磷酸酶融合进行原位受体结合分析。
用Stratagene公司的cDNA合成试剂盒构建人脑cDNA文库。将该cDNA克隆到哺乳动物表达载体pMT21-neo(GenHunter)。用QiaPrep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从含有大约1000个克隆的文库制备质粒DNA。按照以下方法再将这些DNA文库瞬时转染到COS-1细胞。每个人脑cDNA文库各取2毫克DNA，稀释至200ul不含血清的培养基(Gibco-BRL公司的DMEM培养基，不含添加剂)。将12ul(使用前混合)PLUS试剂加入不含血清的培养基中的DNA，使DNA与PLUS试剂复合。取200ul DNA-PLUS-脂质转染胺(Lipofectamine)试剂复合物，加入含有Cos-1细胞的孔中，而Cos-1细胞在转染(在不含抗生素的完全培养基中)前一天以每孔0.25×105个细胞接种在6孔皿(35mm)中。加入DNA/Lipofectamine/PLUS复合物前，将细胞的完全培养基除去，代之以800ul不含血清的培养基。细胞在37℃ 5％二氧化碳的条件下培养3小时；再用2ml完全培养基代替各个孔中的培养基。受体/配体的受体克隆
利用表达克隆策略以分泌碱性磷酸酶作为探针克隆PAPAP。
转染后两天，开始进行细胞染色。去掉6孔皿中细胞的培养基。附着的细胞用2ml HBHA洗涤缓冲液((用去离子水将50ml 10X HBSS(1X)、0.25克BSA(0.5mg/ml)、10ml 1M pH7.5 HEPES(20mM)配成500ml))洗一次，并与2ml含有培养基的PAP-AP融合蛋白或含有培养基的AP(作为负调控)在室温下培养90分钟。去掉培养基，样本用2ml HBHA缓冲液至少洗5次，时间为10分钟。完全去掉HBHA缓冲液，细胞用2ml固定剂(60％丙酮、3％甲醛、20mM pH值等于7.5的HEPES)固定30秒。立即去掉固定剂，样本用每孔2mlHS缓冲液((用去离子水将15ml 5M氯化钠(150mM)、10ml 1M pH7.5的HEPES(20mM)配成500ml))洗两次。该样本在65℃与HS缓冲液培养100分钟，直至使内源碱性磷酸酶热失活。去掉HS缓冲液，用1ml碱性磷酸酶分析试剂((将50ml 1M pH9.5 Tris-HCl(100mM)、10ml 5M氯化钠(100mM)、2.5ml 1M氯化镁(5mM)配成500ml，向该溶液加入NBT使终浓度达到0.33mg/ml，以及加入BCIP使终浓度达到0.17mg/ml))使细胞表面结合碱性磷酸酶活性染色。
检测阳性克隆，用较小cDNA文库重复该分析，直至识别到单克隆(PAPAP核酸)实施例2 抗PAPAP蛋白质抗体组合物的制备
使基本上纯的蛋白质或多肽与含有编码PAPAP蛋白质或其部分的表达载体的转染或转化细胞分离。例如，在Amicon的过滤装置上浓缩最终制剂的蛋白质，使浓度达至每毫升几微克的水平。然后，按以下方法制备抗蛋白质的单克隆或多克隆抗体。A：通过杂交瘤融合制备单克降抗体
根据Kohler，G.和Milstein，C.(1975年)所述的常规方法或者Harlow，E.和D.Lane.(1988年)所述的衍生方法从小鼠杂交瘤可制备抗PAPAP蛋白质或其部分中表位的单克隆抗体。
简单地说，将小鼠与几微克PAPAP蛋白质或其部分重复培养几星期。然后杀死小鼠，分离制备脾细胞的抗体。脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过聚乙二醇融合，在含有氨基喋呤的选择介质(HAT介质)上使系统生长，从而破坏过量无融合的细胞。稀释成功地融合的细胞，将稀释液等分置于微滴定孔板的孔中，其培养基会继续生长。通过免疫分析步骤，如Engvall(1980年)最初提出的ELISA及其衍生方法，检测孔内上清液中的抗体来识别制备抗体的克隆。扩展所选择的阳性克隆，收集它们的单克隆抗体产物，备用。Davis，L.等人在“分子生物学的基本方法”(Elsevier出版公司，纽约)第21-2章节中叙述了制备单克隆抗体的详细步骤。B.通过免疫制备多克隆抗体
用PAPAP蛋白质或其部分使合适的非人动物免疫可制备多克隆抗血清，其含有与PAPAP蛋白质或其部分的表位异源的抗体，这种多克隆抗血清不进行修饰或经修饰都可以提高免疫原性。合适的非人动物最好选择非人哺乳动物，通常是小鼠、大鼠、兔、山羊或马。另外，也可使用PAPAP浓度已经浓缩的粗制剂来制备抗体。在本领域技术人员熟悉的适当佐剂(例如氢氧化铝、RIBI等)存在下，将这样一些蛋白质、片段或制剂导入非人哺乳动物中。此外，也可用增加抗原性的试剂预处理蛋白质、片段或制剂，这样一些试剂已为本领域技术人员所知，例如，包括甲基化牛血清白蛋白(mBSA)、牛血清白蛋白(BSA)、乙型肝炎表面抗原以及钥孔血蓝蛋白(KLH)。按照已知步骤收集、处理和测试免疫动物的血清。如果血清含有抗不希望的表位的多克隆抗体，就用免疫亲和层析法纯化这些多克隆抗体。
许多与抗原和宿主种属有关的因数均会影响多克隆抗体的有效制备。而且，宿主动物随着接种位点和剂量而变化，剂量不足或过量都会得到低滴定抗血清。看起来，在皮内多个位点施加小剂量(纳克水平)抗原是最可靠的。制备和处理多克隆抗血清的技术已为本领域技术人员所知，例如，可参看Mayer和Walker(1987年)。Vaitukaitis，J.等人(1971年)也发现了兔的有效免疫方案。
每隔一段时间进行强化注射，当用半定量确定，如在琼脂上对已知浓度的抗原进行双免疫扩散，其抗体滴定开始下降时收集抗血清，可参看Ouchterlony，O.等人(1973年)。抗体的平台浓度(plateau concentration)通常在0.1至0.2mg/ml血清(大约12μM)的范围内。例如，按Fisher，D.(1980年)所述方法绘制竞争结合曲线以确定抗血清对抗原的亲和力。
根据单克隆或多克隆方案制备的抗体制剂可用于定量免疫分析，其确定生物样本中带有的抗原物质浓度；它们也可用于半定量或定性识别生物样本中存在抗原。这些抗体还可用于治疗组合物，该组合物杀死表达蛋白质的细胞或使体内蛋白质水平下降。
以上列举和说明了本发明的优选实施例，这将使人完全了解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可以作出各种变化。
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                         Met Trp Glu Val Leu Pro Tyr Gly Asp
                         1               5gag aag ctg agc ccc tac ggc gac ggc ggc gac gtg ggc cag atc ttc    161Glu Lys Leu Ser Pro Tyr Gly Asp Gly Gly Asp Val Gly Gln Ile Phe10                  15                  20                  25tcc tgc cgc ctg cag gac acc aac aac ttc ttc ggc gcc ggg cag aac    209Ser Cys Arg Leu Gln Asp Thr Asn Asn Phe Phe Gly Ala Gly Gln Asn
            30                  35                  40aag cgg ccg ccc aag ctg ggc cag atc ggc cgg agc aag cgg gtt gtt    257Lys Arg Pro Pro Lys Leu Gly Gln Ile Gly Arg Ser Lys Arg Val Val
        45                  50                  55att gaa gat gat agg att gat gac gtg ctg aaa aat atg acc gac aag    305Ile Glu Asp Asp Arg Ile Asp Asp Val Leu Lys Asn Met Thr Asp Lys
    60                  65                  70gca cct ctg gtg tct aac tcc cca aag aca atg agt taa gggagagaat    354Ala Pro Leu Val Ser Asn Ser Pro Lys Thr Met Ser*
75                  80                  85aggaacggcg gtaacagtta ttggcaaaaa gcatgaaaag agaaagcact ttgaaattta 414ttactagctt gtacccacga tgaaatcaac aacctgtatc tggtatatgc ccggagacag 474attaggcgaa ggaggaagag agagagaaga aaggcttggg ccctctacaa ataaaataaa 534aaaaaaaaat ttaaaataat aaaatcccta tatcccatat aagaataaaa gagtctcagt 594gcagtattgg caaaattaaa tccatttctt tttaatacgg gaatattggc attatagatc 654tggattttga ccacttaatg aagcggcacc ccaggtgttt tgaggtgttg gcattcttcg 714ctgatttggc tgttcccaat gtttacatta tttaatcttg caaaaatggt tctgtgcact 774tggatgtgaa atgctgtcca gttttatttt ttttatgttg ttatccttgg atgtacaaaa 834aattcagaaa atgatctctg tagatattct gttttatttt ggtcatcttt agaagttatc 894aggaatgtgt ttaaaacaag aagagaactt ttctaaggaa tgatacatag aaaagatttt 954attttaaaat gagttgtaaa gcttgtgttt ctttgttgct gcaagctatc tgcccaagtt 1014aatgcaaatg gacacatttt ttatgtcaga aaaacacaca cacacacaca cacacacaca 1074cacacacacg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                  1104<210>2<211>85<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Trp Glu Val Leu Pro Tyr Gly Asp Glu Lys Leu Ser Pro Tyr Gly1               5                   10                  15Asp Gly Gly Asp Val Gly Gln Ile Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp Thr
        20                  25                  30Asn Asn Phe Phe Gly Ala Gly Gln Asn Lys Arg Pro Pro Lys Leu Gly
    35                  40                  45Gln Ile Gly Arg Ser Lys Arg Val Val Ile Glu Asp Asp Arg Ile Asp
50                  55                  60Asp Val Leu Lys Asn Met Thr Asp Lys Ala Pro Leu Val Ser Asn Ser65                  70                  75                  80Pro Lys Thr Met Ser
            85<210>3<211>3189<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3ccctcccctc cccctccgcc cctcgcagcc ccgccgctcg cagctcccag tctgcctccc 60cgaaccggcg ccgccgcccg cactcgccgc aggaccggcc cgcccggctc ccggggtgcg 120ccctcctcgg tcccgcgccc tccgggctcg cagggacgtc tcctccctcc cggctcgcgg 180ccccgcccgg cccggccccc gcccagagcc ccagcgcgcc gaggatgtga gtcctgctcg 240cctctggcgg agcagcagcc actcgcgcgc ggagccggag cgcagcgcag cgcagccgcg 300ggcgctctcc gggccgctcg cgcgagtgcc gcgctcttgc cctagcggcg tcccccggcc 360tctcgccggc gccaccgccg cagcagcccg cgggccgtcc ccggccggcc gcccccggcc 420ccagcgccgc tgaccctgtc cgccgcgggc ggggacgcgg tcggaggagg cgccgcggcg 480gagcccccgg acgcgaccat gtcggaggtg ctgccctacg gcgacgagaa gctgagcccc 540tacggcgacg gcggcgacgt gggccagatc ttctcctgcc gcctgcagga caccaacaac 600ttcttcggcg ccgggcagaa caagcggccg cccaagctgg gccagatcgg ccggagcaag 660cggggtgagt tcgcggcccc cttgtctgac accccctttt tcccgcgccg cggcctgaac 720aagggttgcg gaggtctccc acccgctgga gcccgttcag acctgacgga atcccttctt 780gcagaattgg gggatcccgc actgcgggtc cggctgaagc gggtcgcagg aacgcgtccc 840cctaagccgg atccccggct gggtcaccct gggggcgtgg cggcttctag cagcagctgg 900gggtctccac ccgcgcggca aagtttgctt tttgatttgc gccccccacc cccgcctttt 960gcgcagtgta gtcacagctg cactcgctcc ataaccctgt ggggaggggg gcccaaggac 1020ccccagggga cggcgtgggg acctgcgtgg ggaggatccc attcctgcgg ggaaggctag 1080ggtgttcggg tcgcacgggc ttttcattgt tacttggctt gggagggggt ttgccaggcc 1140tgggcgatcc gcgcgagagc tggaaaagcc ccagagaggc ggagacgcag agaggctccg 1200agaggagctc cagagacgcg gggacaatga gggggaccga cggctgcaga gagagactga 1260gacgcaggga tggaggggag ggggtacgct ggagaccgag ggtggcagag accgagacaa 1320agctcccgag aggggagctg aagcgggaga gacagagccg aggacgcgcg tttggggagg 1380acgcagaagc cgccgaaaca ataagggcga ccgacacctt agacagggag agacagagac 1440ctcgatcggc tgccggccgt cgcgccgagg gacgatggag ggactgagaa aggcgaggct 1500aagtcgagac ggtaagagag gccgaggtta cggcatgtgt ccctggcagg cagcgaaggg 1560aggctctgac ctctgcggca gcggggagcg cggggcggcc gagtcagtcg gccagcggct 1620gggagagggc gcgcaggagg gggcgcccgc ccaggccagg ccctaacccc cacccgctgc 1680gcgtcgtggg aaccggtttt ggcgtcccct cctggttccg ctcatctccg cacctagcct 1740tgcccaccgg agctgcgctc gggacttacc tggggtcccg agacccaaag actttggctc 1800cctctcctat cccagctcca gacatttctg tctaaattag tgcgcctggt gcggggagga 1860cgcgggccag tgcgcgccct ggctgcagca ggagcggctg ggttggcgcc ctctgtttcc 1920ttttctcaga atggagctgg gacgcaggct ggaggataga gggtggtggg tggttcagag 1980gaaagcaggg aagggacccc tggcagggac ggaggatgga gctgtttcac cgcgcagtga 2040gccctgctcc ctcgccctct cctctcccga cctcccactc tgggcataac gggaaatgtc 2100agagacctct ggctaggccc cagcgcgctc acctctcttt tccccccttt ttttgcagtt 2160gttattgaag atgataggat tgatgacgtg ctgaaaaata tgaccgacaa ggcacctcct 2220ggtgtctaac tcccccaaag acaatgagtt aagggagaga ataagaacgg cggtaacagt 2280tattggcaaa aagcatgaaa agagaaagca ctttgaaatt tattactagc ttgctaccca 2340cgatgaaatc aacaacctgt atctggtatc aggccgggag acagatgagg cgagaggagg 2400aggaggagga ggagaaggct ctgggctcct ctgcaaaaat aaaaataaaa aaataaataa 2460aattttaaaa ataataaaaa ttcactatat acacatataa agaaataaaa agaagtctca 2520gttgcagcta tttgtcaaaa ttaatatcca tttcttttta tatacggtga atattgcgca 2580attatagatc tggattttga accacttaat gaagcggcaa caccaggtgt tttgaggtgt 2640tggcattctt cgctgatttg gctgttccca atgtttacat tatttaatct tgcaaaaatg 2700gttctgtgca cttggatgtg aaatgctgtc cagttttatt ttttttatgt tgttatcctt 2760ggatgtacaa aaaattcaga aaatgatctc tgtagatatt ctgttttatt ttggtcatct 2820ttagaagtta tcaggaatgt gtttaaaaca agaagagaac ttttctaagg aatgatacat 2880agaaaagatt ttattttaaa atgagttgta aagcttgtgt ttctttgttg ctgcaagcta 2940tctgcccaag ttaatgcaaa tggacacatt ttttatgtca gaaaaacaca cacacacaca 3000cacacacaca cacacacaca cgaaaaacaa agaaaaaaat gcttgagctt tttctaactt 3060ccccttgcag tctgttgtgt gagcagcctg tttatttctc taatattatg tcagtttatt 3120ctctttaatg gactgtaaaa aaatgtaatc acaagagtgc caaattcttg aaatgccaaa 3180aggctttta                                                         3189<210>4<211>1779<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60gacgcggccc agccggccag gcgcgcgcgc cgtacgtacg aagcttacca gcctctagaa 120cgaatgtgga cctgcaacta caaccagcaa aaagaccagt catgcaacca caaggaaata 180acttctacca aagctgaaag aagatcttcc ggaatcatcc cagttgagga ggagaacccg 240gacttctgga accgcgaggc agccgaggcc ctgggtgccg ccaagaagct gcagcctgca 300cagacagccg ccaagaacct catcatcttc ctgggcgatg ggatgggggt gtctacggtg 360acagctgcca ggatcctaaa agggcagaag aaggacaaac tggggcctga gatacccctg 420gccatggacc gcttcccata tgtggctctg tccaagacat acaatgtaga caaacatgtg 480ccagacagtg gagccacagc cacggcctac ctgtgcgggg tcaagggcaa cttccagacc 540attggcttga gtgcagccgc ccgctttaac cagtgcaaca cgacacgcgg caacgaggtc 600atctccgtga tgaatcgggc caagaaagca gggaagtcag tgggagtggt aaccaccaca 660cgagtgcagc acgcctcgcc agccggcacc tacgcccaca cggtgaaccg caactggtac 720tcggacgccg acgtgcctgc ctcggcccgc caggaggggt gccaggacat cgctacgcag 780ctcatctcca acatggacat tgacgtgatc ctaggtggag gccgaaagta catgtttccc 840atgggaaccc cagaccctga gtacccagat gactacagcc aaggtgggac caggctggac 900gggaagaatc tggtgcagga atggctggcg aagcgccagg gtgcccggta tgtgtggaac 960cgcactgagc tcatgcagg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        20                  25                  30<210>6<211>592<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro1               5                   10                  15Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Arg Thr
        20                  25                  30Tyr Glu Ala Tyr Gln Pro Leu Glu Arg Met Trp Thr Cys Asn Tyr Asn
    35                  40                  45Gln Gln Lys Asp Gln Ser Cys Asn His Lys Glu Ile Thr Ser Thr Lys
50                  55                  60Ala Glu Arg Arg Ser Ser Gly Ile Ile Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro65                  70                  75                  80Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala Lys Lys
            85                  90                  95Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu Ile Ile Phe Leu Gly
        100                 105                 110Asp Gly Met Gly Val Ser Thr Val Thr Ala Ala Arg Ile Leu Lys Gly
    115                 120                 125Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro Glu Ile Pro Leu Ala Met Asp Arg
130                 135                 140Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val145                 150                 155                 160Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly
            165                 170                 175Asn Phe Gln Thr Ile Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys
        180                 185                 190Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val Ile Ser Val Met Asn Arg Ala Lys
    195                 200                 205Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His
210                 215                 220Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr225                 230                 235                 240Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp
            245                 250                 255Ile Ala Thr Gln Leu Ile Ser Asn Met Asp Ile Asp Val Ile Leu Gly
        260                 265                 270Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr
    275                 280                 285Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu
290                 295                 300Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn305                 310                 315                 320Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu
            325                 330                 335Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu Ile His Arg Asp
        340                 345                 350Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg
    355                 360                 365Leu Leu Ser Arg Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly
370                 375                 380Arg Ile Asp His Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu Thr385                 390                 395                 400Glu Thr Ile Met Phe Asp Asp Ala Ile Glu Arg Ala Gly Gln Leu Thr
            405                 410                 415Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val
        420                 425                 430Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser Ile Phe Gly Leu
    435                 440                 445Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu Leu Tyr
450                 455                 460Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val465                 470                 475                 480Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val
            485                 490                 495Pro Leu Asp Glu Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala
        500                 505                 510Arg Gly Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe
    515                 520                 525Ile Ala His Val Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala
530                 535                 540Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly545                 550                 555                 560Tyr Leu Glu Glu Ala Leu Ser Leu Glu Gly Pro Glu Gln Lys Leu Ile
            565                 570                 575Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His
        580                 585                 590

Claims (13)

1.一种经分离、纯化或重组的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸编码SEQID No 2的PAPAP多肽。
2.一种经分离、纯化或重组的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸包含SEQID No 1核苷酸序列或其补体。
3.一种重组载体，其特征在于：所述载体含有如权利要求1所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有如权利要求3所述的重组载体。
5.一种非人宿主动物或哺乳动物，其特征在于：所述动物含有如权利要求3所述的重组载体。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于：所述多核苷酸还含有标记。
7.一种经分离或纯化的PAPAP多肽，其特征在于：所述PAPAP多肽由SEQID No 1核苷酸序列编码。
8.一种经分离或纯化的PAPAP多肽，其特征在于：所述PAPAP多肽含有SEQID No 2氨基酸序列。
9.一种PAPAP多肽的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
a)提供含有如权利要求1所述的重组载体的宿主细胞；
b)在有助于所述PAPAP多肽表达的条件下培养所述宿主细胞；
c)回收由所述宿主细胞产生的PAPAP多肽。
10.一种经分离或纯化的抗体组合物，其特征在于：所述抗体组合物选择性地结合如权利要求8所述的多肽。
11.一种生物样本中存在PAPAP多肽的特异性检测方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
a)使该生物样本与如权利要求8所述的PAPAP多肽特异性结合的抗体接触；以及
b)检测在所述抗体与所述多肽之间形成的抗原—抗体复合物。
12.一种候选物质的筛选方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
a)提供如权利要求8所述的多肽；
b)使所述多肽与所述候选物质接触；
c)确定复合物是否在所述多肽与所述候选物质之间形成。
13.一种候选物质的筛选方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
a)培养在其自身启动子的调控下的原核生物或真核生物的细胞，所述细胞业已以编码PAPAP蛋白质的核苷酸序列转染；
b)使培养过的细胞与所述候选分子接触；以及
c)在所述候选分子存在下检测所述PAPAP蛋白质的表达。
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