CN1346368A - 钾通道互作剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供称为PCIP核酸分子的分离核酸分子,它编码结合钾通道并调节钾通道介导活性的蛋白。本发明还提供反义核酸分子、含PCIP核酸分子的重组表达载体、所述表达载体导入其中的宿主细胞和PCIP基因导入其中或其中PCIP基因破坏的非人类转基因动物。本发明还提供分离的PCIP蛋白、融合蛋白、抗原肽和抗PCIP抗体。还提供利用本发明组合物的诊断方法。

Description

钾通道互作剂及其用途
发明背景
哺乳动物细胞膜对许多细胞和组织的结构完整性和活性具有重要作用。膜生理学中特别令人感兴趣的是研究其作用是直接控制各种药理、生理和细胞过程的跨膜离子通道。已经鉴定了无数离子通道，包括钙通道、钠通道和钾通道，并已对每种离子通道进行了研究，以确定其在脊椎动物细胞和昆虫细胞中的作用。
因为钾通道涉及保持正常的细胞内环境稳定，所以对钾通道的关注更多。其中许多钾通道根据细胞膜电位的变化而开放。鉴定了许多电压控制钾通道，而且表征了其电生理和药理特性。钾电流较钠电流或钙电流的变化更多，而且还参与决定细胞对外部刺激的反应。钾通道的多样性和其重要的生理作用使其更可能成为开发各种疾病治疗药物的靶。
最充分表征的钾通道类型之一是电压控制钾通道。该类型的原型成员是果蝇Shaker基因编码的蛋白。Shal或Kv4家族蛋白是一类电压控制钾通道，它受制于在不同原代细胞记录到的多种自然A型电流。Kv4通道在心肌动作电位复极化中具有重要作用。在神经元中，它们可能包含的Kv4通道和A电流在调节发放速率、动作电位起始和控制对突触输入的树突反应中起作重要的作用。
神经元的基本作用是接受、传导和发送信号。尽管不同目的的信号由不同类型的神经元运载，但是信号形式总是相同的，而且由跨神经元浆膜的电位变化构成。神经元浆膜包含电压控制阳离子通道，其作用是跨浆膜并沿浆膜传播这种电位(也称为动作电位或神经冲动)。
Kv家族通道还包括：(1)延迟整流器型钾通道，它在每个动作电位后使膜复极化以使细胞准备再次发放；和(2)快速失活(A型)钾通道，它主要在亚阈电压时起作用，其作用是降低兴奋细胞达到发放阈的速率。Kv通道除了对动作电位传导是重要的，还控制对去极化例如突触输入的反应并对神经递质释放具有作用。因为电压控制钾通道具有这些活性，所以它是神经元兴奋性的重要调节剂(Hille B.，IonicChannels of Excitable Membranes，第二版，Sunderland，MA：Sinauer，(1992))。
Kv钾通道超家族的结构和功能存在丰富的多样性。这种多样性产生的原因是存在多基因和相同基因产生的RNA转录物的可变剪接。尽管如此，已知Kv钾通道的氨基酸序列具有高度相似性。似乎所有Kv钾通道都包含4个成孔α亚单位，已知部分Kv钾通道具有4个胞质(β亚单位)多肽(Jan L. Y.等(1990)Trends Neurosci 13：415-419，和Pongs，O.等(1995)Sem Neurosci.7：137-146)。已知的Kv通道α亚单位分为4个亚家族，根据其与第一个分离自果蝇的通道的同源性命名为：Kv1或Shaker-相关亚家族；Kv2或Shab相关亚家族；Kv3或Shaw相关亚家族；Kv4或Shal相关亚家族。
Kv4.2和Kv4.3是Kv通道实例(Shal相关亚家族的α亚单位)。Kv4.3具有独特的神经解剖学分布，原因是其mRNA在脑干单胺能神经元和前脑胆碱能神经元中高度表达，它在所述神经元中参与神经递质多巴胺、去甲肾上腺素、5-羟色胺和乙酰胆碱的释放。
该通道还在皮质锥形细胞和中间神经元中高度表达。(Serdio P.等(1996)J.Neurophys 75：2174-2179)。有趣的是，Kv4.3多肽在表达相应mRNA的神经元中高度表达。Kv4.3多肽表达在这些细胞的体树突膜中，人们认为它在此引起K+传导快速失活。Kv4.2mRNA在脑中广泛表达，相应的多肽似乎也集中在体树突膜中，它在此也引起K+传导快速失活(Sheng等(1992)Neuron 9：271-84)。这些体树突A型Kv通道如Kv4.2和Kv4.3可能参与认知和记忆过程，例如整合亚阈值突触反应和传导逆向的动作电位(Hoffman D.A.等(1997)Nature 387：869-875)。
因此，与钾通道蛋白如具有Kv4.2或Kv4.3亚单位的钾通道相互作用并调节其活性的蛋白提供了在表达这些通道的细胞中调节神经元兴奋性或心肌兴奋性如动作电位传导、体树突兴奋性和神经递质释放的新的分子靶。此外，检测编码这些蛋白的基因的基因损害可用于诊断和治疗中枢神经系统疾病，例如癫痫、脊髓小脑性共济失调、焦虑症、抑郁、年龄相关性记忆丧失、偏头痛、肥胖、帕金森氏病或阿耳茨海默氏病；或心血管疾病如心衰、高血压、心房纤维性颤动、扩张性心肌病、特发性心肌病或心绞痛。目录表A.发明概述                                -4-B.附图简述                                -13-C.发明详述                                -18-I.分离的核酸分子                        -31-II.分离的PCIP蛋白和抗PCIP抗体           -54-III.重组表达载体和宿主细胞              -67-IV.药用组合物                           -76-V.本发明的用途和方法                    -83-
A.筛选测定                            -84-
B.检测测定                            -92-
  1.染色体作图                        -93-
  2.组织分型                          -95-
  3.部分PCIP序列在法医生物学中的应用  -96-
C.预测医学                            -97-
  1.诊断测定                          -97-
  2.预测测定                          -99-
  3.监测临床试验效果                  -105-
D.治疗方法                            -106-
  1.预防方法                          -106-
2.治疗方法                          -107-
3.药物基因组学(pharmacogenomics)    -109-D.实施例                                -111-发明概述
本发明至少部分基于发现了新的核酸分子，其编码的基因产物作用于钾通道蛋白或与作用于钾通道蛋白的本发明基因产物具有显著同源性(共生同源物，paralogs)。钾通道蛋白例如为具有Kv4.2或Kv4.3亚单位的钾通道。本发明核酸分子和其基因产物在本文是指“钾通道互作蛋白”、 PCIP”或“KChIP”核酸和蛋白分子。本发明的PCIP蛋白的作用是例如结合钾通道蛋白、调节钾通道蛋白的活性和/或调节钾通道在细胞例如神经元细胞或心肌细胞中介导的活性。本发明的PCIP分子可用作调节剂调节各种细胞过程，例如神经元细胞或心肌细胞过程。因此，在一个方面，本发明提供编码PCIP蛋白或其生物活性部分的分离的核酸分子以及适合用作检测PCIP编码核酸的引物或杂交探针的核酸片段。
在一个实施方案中，本发明的PCIP核酸分子与以下核苷酸序列(例如全长所述核苷酸序列)或其互补物的同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列。
在另一个优选实施方案中，所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列或其互补物。在另一个优选实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71核苷酸序列或其互补物的至少300、350、400、426、471或583个核苷酸的片段。
在另一个优选实施方案中，PCIP核酸分子包括编码其氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列具有足够同一性的蛋白的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，PCIP核酸分子包括编码其氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、 98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列的同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的蛋白的核苷酸序列。
在另一个优选实施方案中，分离的核酸分子编码1v、9q、p19、W28559、KChIP4a、KChIP4b、33b07、1p和大鼠7s蛋白的氨基酸序列。在又一优选实施方案中，所述核酸分子包括编码其氨基酸序列是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列。在又一优选实施方案中，所述核酸分子为至少426、471或583个核苷酸长度而且编码具有PCIP活性的蛋白(见本文所述)。
本发明的另一实施方案的特征在于核酸分子、优选特异性检测PCIP核酸分子(相对于编码非PCIP蛋白的核酸分子)的PCIP核酸分子。例如在一个实施方案中，这种核酸分子至少为426、400-450、471、450-500、500-550、583、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800和更多核苷酸长度，而且这种核酸分子在严格条件下与包含以下核苷酸序列或其互补物的核酸分子杂交，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列。在优选实施方案中，所述核酸分子至少为15个(例如连续的)核苷酸长度，而且在严格条件下与SEQ ID NO：7的核苷酸93-126、360-462、732-825、1028-1054或1517-1534杂交。在其它优选实施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO：7的核苷酸93-126、360-462、732-825、1028-1054或1517-1534。
在其它优选实施方案中，所述核酸分子为至少15个(例如连续的)核苷酸长度，而且在严格条件下与SEQ ID NO：13的核苷酸1-14、49-116、137-311、345-410、430-482、503-518、662-693、1406-1421、1441-1457、1478-1494或1882-1959杂交。在其它优选实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO：13的核苷酸1-14、49-116、137-311、345-410、430-482、503-518、662-693、1406-1421、1441-1457、1478-1494或1882-1959。
在优选实施方案中，所述核酸分子为至少15个(例如连续的)核苷酸长度，而且在严格条件下与SEQ ID NO：35的核苷酸932-1527、1548-1765、1786-1871、1908-2091、2259-2265或2630-2654杂交。在其它优选实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO：35的核苷酸932-1527、1548-1765、1786-1871、1908-2091、2259-2265或2630-2654。
在其它优选实施方案中，所述核酸分子编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列的多肽的天然等位基因变异体，其中所述核酸分子在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核酸分子杂交。
本发明另一个实施方案提供与PCIP核酸分子(例如PCIP核酸分子的编码链)反义的分离核酸分子。
本发明另一方面提供包含PCIP核酸分子的载体。在某些实施方案中，所述载体是重组表达载体。在另一实施方案中，本发明提供包含本发明载体的宿主细胞。本发明还通过在合适的培养基中培养包含重组表达载体的本发明宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞如非人类哺乳动物细胞，使得产生蛋白(优选PCIP蛋白)，从而提供产生所述蛋白的方法。
本发明另一方面的特征在于分离或重组PCIP蛋白和多肽。在一个实施方案中，所述分离的蛋白、优选PCIP蛋白包含至少一个钙结合结构域。在一个优选实施方案中，所述蛋白、优选PCIP蛋白包含至少一个钙结合结构域，而且具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列的同一性至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。在另一个优选实施方案中，所述蛋白、优选PCIP蛋白包含至少一个钙结合结构域，而且调节钾通道介导的活性。在又一优选实施方案中，所述蛋白、优选PCIP蛋白包括至少一个钙结合结构域，而且其编码核酸分子具有在严格杂交条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71核苷酸序列的核酸分子杂交的核苷酸序列。
在另一实施方案中，本发明的特征在于具有SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72氨基酸序列的蛋白的片段，其中所述片段包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列的至少15个氨基酸(例如连续的氨基酸)。在另一个实施方案中，所述蛋白、优选PCIP蛋白具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NQ：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列。
在另一实施方案中，本发明的特征在于分离的蛋白、优选PCIP蛋白，其编码核酸分子具有的核苷酸序列与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71核苷酸序列或其互补物具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性。
本发明蛋白或其生物活性部分可与非PCIP多肽(例如异源氨基酸序列)有效连接形成融合蛋白。本发明的特征还在于特异性结合本发明蛋白(优选PCIP蛋白)的抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。此外，所述PCIP蛋白或其生物活性部分可加入药用组合物中，此组合物任选包含药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供检测生物样品中是否存在PCIP核酸分子、蛋白或多肽的方法，该方法具体为：使所述生物样品与能够检测PCIP核酸分子、蛋白或多肽的因子接触，以便检测所述生物样品中是否存在PCIP核酸分子、蛋白或多肽。
另一方面，本发明提供检测生物样品中是否存在PCIP活性的方法，具体为：使所述生物样品与能够检测PCIP活性指示剂的因子接触，以便检测所述生物样品中是否存在PCIP活性。
另一方面，本发明提供调节PCIP活性的方法，包括使能够表达PCIP的细胞与调节PCIP活性的因子接触，以便调节所述细胞的PCIP活性。在一个实施方案中，所述因子抑制PCIP活性。在另一实施方案中，所述因子刺激PCIP活性。在一个实施方案中，所述因子是特异性结合PCIP蛋白的抗体。在另一实施方案中，所述因子通过调节PCIP基因的转录或PCIPmRNA的翻译调节PCIP的表达。在又一实施方案中，所述因子为具有与PCIPmRNA或PCIP基因编码链反义的核苷酸序列的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明方法用于通过给予受试者为PCIP调节剂的因子，治疗患有特征为PCIP蛋白或核酸表达或活性异常的疾病的受试者。在一个实施方案中，所述PCIP调节剂为PCIP蛋白。在另一实施方案中，所述PCIP调节剂是PCIP核酸分子。在又一实施方案中，所述PCIP调节剂为肽、肽模拟物或其它小分子。在一个优选实施方案中，特征为PCIP蛋白或核酸表达异常的疾病为CNS疾病或心血管疾病。
本发明还提供鉴定具有以下至少一项特征的基因改变存在与否的诊断测定法：(i)编码PCIP蛋白的基因的异常修饰或突变；(ii)所述基因的调节异常；(iii)PCIP蛋白翻译后修饰异常，其中野生型所述基因编码具有PCIP活性的蛋白。
另一方面本发明提供鉴定结合或调节PCIP蛋白活性的化合物的方法，具体为：提供包括具有PCIP活性的PCIP蛋白的指示组合物，使所述指示组合物与受试化合物接触，测定所述受试化合物对指示组合物的PCIP活性的影响，以鉴定调节PCIP蛋白活性的化合物。
由以下详细描述和权利要求书可了解本发明其它特征和优势。附图简述
图1图示人1v的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：1的核酸1-1463。所示氨基酸序列相当于SEQ IDNO：2的氨基酸1-216。
图2图示大鼠1v的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：3的核酸1-1856。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：4的氨基酸1-245。
图3图示小鼠1v的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：5的核酸1-1907。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：6的氨基酸1-216。
图4图示大鼠1v1的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：7的核酸1-1534。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：8的氨基酸1-227。
图5图示小鼠1v1的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：9的核酸1-1540。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：10的氨基酸1-227。
图6图示大鼠1vn的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：11的核酸1-955。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：12的氨基酸1-203。
图7图示人9q1的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：13的核酸1-2009。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：14的氨基酸1-270。
图8图示大鼠9q1的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：15的核酸1-1247。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：16的氨基酸1-257。
图9图示小鼠9q1的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：17的核酸1-2343。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：18的氨基酸1-270。
图10图示人9qm的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：19的核酸1-1955。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：20的氨基酸1-252。
图11图示大鼠9qm的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：21的核酸1-2300。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：22的氨基酸1-252。
图12图示人9qs的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：23的核酸1-1859。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：24的氨基酸1-220。
图13图示猴9qs的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：25的核酸1-2191。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：26的氨基酸1-220。
图14图示大鼠9qc的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：27的核酸1-2057。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：28的氨基酸1-252。
图15图示大鼠8t的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：29的核酸1-1904。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：30的氨基酸1-225。
图16图示人p19的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：31的核酸1-619。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：32的氨基酸1-200。
图17图示大鼠p19的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：33的核酸1-442。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NQ：34的氨基酸1-109。
图18图示小鼠p19的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：35的核酸1-2644。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：36的氨基酸1-256。
图19图示人W28559的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：37的核酸1-380。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：38的氨基酸1-126。
图20图示人P193的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：39的核酸1-2176。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：40的氨基酸1-41。
图21为排列的大鼠1v、大鼠9qm和小鼠P19蛋白的示意图，以指示这些蛋白中的保守结构域。
图22图示人9q的基因组DNA序列。图22A图示外显子和其侧翼内含子序列(SEQ ID NO：46)。图22B图示外显子2-11和其侧翼内含子序列(SEQ ID NO：47)。
图23图示猴KChIP4a的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：48的核酸1-2413。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：49的氨基酸1-233。
图24图示猴KChIP4b的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：50的核酸1-1591。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：51的氨基酸1-233。
图25图示KChIP4a、KChIP4b、9q1、1v、p19和相关的人共生同源物(hsncspara)W28559的序列对比。与所述共有序列相同的氨基酸为黑色阴影，保守的氨基酸为灰色阴影。
图26图示大鼠33b07的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：52的核酸1-2051。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：53的氨基酸1-407。
图27图示人33b07的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：54的核酸1-4148。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：55的氨基酸1-414。
图28图示大鼠1p的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：56的核酸1-2643。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：57的氨基酸1-267。
图29图示大鼠7s的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：58的核酸1-2929。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：59的氨基酸1-270。
图30图示大鼠29x的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：60的核酸1-1489。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：61的氨基酸1-351。
图31图示大鼠25r的cDNA序列。所示核苷酸序列相当于SEQ IDNO：62的核酸1-1194。
图32图示大鼠5p的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：63的核酸1-600。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：64的氨基酸1-95。
图33图示大鼠7q的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：65的核酸1-639。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：66的氨基酸1-212。
图34图示大鼠19r的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：67的核酸1-816。所示氨基酸序列相当于SEQID NO：68的氨基酸1-271。
图35图示猴KChIP4c的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：69的核酸1-2263。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：70的氨基酸1-229。
图36图示猴KChIP4d的cDNA序列和预定氨基酸序列。所示核苷酸序列相当于SEQ ID NO：71的核酸1-2259。所示氨基酸序列相当于SEQ ID NO：72的氨基酸1-250。
图37图示KChIP4a、KChIP4b、KChIP4c和KChIP4d的序列对比。
图38图示表达具有或没有KChIP2(9q1)的Kv4.2的CHO细胞电流曲线(current trace)。将细胞电压固定在-80mV，并在200ms内从-60mV呈阶梯式递增至+50mV。右侧图面所示为不同试验电压的峰值电流幅度。图38进一步用表格显示所述峰值电流幅度和KChIP2(9q1)对Kv4.2的动力学作用。KChIP2表达改变峰值电流幅度、失活和失活时间常数的恢复以及活化V1/2。
图39图示表达具有或没有KChIP3(p19)的Kv4.2的CHO细胞电流曲线。将细胞电压固定在-80mV，并在200ms内从-60mV呈阶梯式递增至+50mV。右侧图面所示为不同试验电压的峰值电流幅度。图39进一步用表格显示所述峰值电流幅度和KChIP3(p19)对Kv4.2的动力学作用。KChIP3表达改变峰值电流幅度、失活和失活时间常数的恢复以及失活V1/2。
图40图示电生理实验结果，证实KChIP1共表达显著改变在CHO细胞表达的Kv4.2通道的电流密度和动力学。
图40A图示Kv4.2转染CHO细胞的电流曲线。使细胞连续从保持电压-80mV至受试电压-60至50mV去极化激发电流。电流曲线为利用p/5方法减去的泄漏电流。以与(b)相同放大比例显示电流轴，以突出电流幅度变化。插图-描记放大电流轴50mV的单一电流以显示电流激活和失活的动力学。
图40B图示等量Kv4.2和KCIP1的DNA转染细胞的与(a)相同的电流曲线。
图40C图示Kv4.2单独转染细胞(n＝11)或与KChIP1共转染细胞(n＝9)在不同电压的峰值电流幅度。
图40D和40E图示使用2个脉冲方法的失活恢复。使用第一个至50mV的脉冲使单独的Kv4.2(D)或与KChIP1共表达的Kv4.2(E)进入失活状态，然后在第一脉冲后的不同时间施以至50 mV的第二脉冲。在所有脉冲之前和之后保持电压为-80mV。
图40F图示对Kv4.2(n＝8)和Kv4.2+KChIP1(n＝5)转染细胞脉冲之间的峰值电流恢复的百分率的总结。从失活恢复的时间常数符合单指数。
图41图示人KChIP家族成员与Ca2+传感蛋白的恢复蛋白家族的密切相关成员的序列对比。(HIP：人hippocalcin；NCS1：大鼠神经元钙传感蛋白1)。使用PAM250残基重量表和默认参数的Clustal方法，利用适用于Macintosh(DNASTAR 4.00版)的MegAlign程序进行排列对齐，而且使用BOXSHADES进行虚线(shade)排列。与所述共有序列相同的残基为黑色虚线，保守取代为浅灰色(shadedgrey)。X、Y、Z和-X、-Y、-Z表示结合EF手钙离子的残基位置。
图42图示IOSCA区的物理图谱。
图43图示显示h9q和与IOSCA和癫痫有关的已知标记的位置的连锁图。发明详述
本发明至少部分基于发现了新的核酸分子，其编码的基因产物作用于钾通道蛋白或与作用于钾通道蛋白的本发明基因产物具有显著同源性(共生同源物，paralogs)。钾通道蛋白例如为具有Kv4.2或Kv4.3亚单位的钾通道。本发明核酸分子和其基因产物在本文是指“钾通道互作蛋白”、 PCIP”或“KChIP”核酸和蛋白分子。本发明的PCIP蛋白最好作用于(例如结合)钾通道蛋白、调节钾通道蛋白的活性和/或调节钾通道在细胞例如神经元细胞或心肌细胞中介导的活性。
本文使用的术语“PCIP家族”当指本发明的蛋白和核酸分子时，意指两种或多种具有本文定义的PCIP活性的蛋白或核酸分子。这类PCIP家族成员可以是天然存在或非天然存在的成员，而且可以是相同物种或不同物种的成员。例如PCIP家族可以包括第一种人来源蛋白以及其它不同的人来源蛋白，或者可以包括非人类来源的同系物。
本发明可交换使用的“PCIP活性”、“PCIP生物活性”或“PCIP功能活性”是指按照标准技术体内或体外测定，PCIP蛋白、多肽或核酸分子对PCIP效应细胞或PCIP蛋白底物的活性。在一个实施方案中，PCIP活性为直接活性，例如与PCIP靶分子的结合活性。本文使用的“靶分子”或“结合配偶体”为PCIP蛋白与其天然结合或作用的分子，使得实现PCIP介导的功能。PCIP靶分子可以是本发明的非PCIP分子或PCIP蛋白或多肽。在一个典型实施方案中，PCIP靶分子是PCIP配体。另一方面，PCIP活性是间接活性，例如PCIP蛋白与PCIP配体作用介导的细胞信号活动。本文描述了PCIP的生物活性。
例如，本发明PCIP蛋白可以具有一种或多种以下活性：(1)它们可作用于(例如结合)钾通道蛋白或其部分；(2)它们可调节钾通道蛋白或其部分的磷酸化状态；(3)它们可作用于(例如结合)钙，而且可以例如起作钙依赖性激酶的作用，例如以钙依赖性方式磷酸化钾通道或G蛋白连接的受体；(4)它们可作用于(例如结合)钙，而且可以例如在细胞过程中以钙依赖性方式起作用，例如用作钙依赖性转录因子；(5)它们可以调节细胞(例如神经元细胞如感觉神经元细胞或运动神经元细胞或心肌细胞)钾通道介导的活性，以例如有益地影响所述细胞；(6)它们可调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞中的染色质形成；(7)它们可调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的囊泡运输和蛋白转运；(8)它们可调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的细胞因子的信号活动；(9)它们可调节钾通道蛋白或其部分与细胞骨架的结合；(10)它们可调节细胞增殖；(11)它们可调节神经递质释放；(12)它们可调节膜兴奋性；(13)它们可影响膜的静息电位；(14)它们可调节动作电位的波形和频率；和(15)它们可调节兴奋阈。
本文使用的“钾通道”包括参与兴奋性细胞的信号接受、传导和传递的蛋白或多肽。钾通道通常表达于电兴奋性细胞例如神经元细胞、心肌细胞、骨骼肌和平滑肌细胞、肾脏细胞、内分泌细胞和卵细胞，并可形成例如由成孔亚单位和胞质亚单位组成的杂多聚体结构。钾通道实例包括：(1)电压控制钾通道，(2)配体控制钾通道，和(3)机械控制钾通道。关于钾通道的详细描述参见Kandel E.R.等，Principlesof Neural Science，第二版，(Elsevier Science Publishing Co.，Inc.，N.Y.(1985))，其内容通过引用结合到本文中。已经证实本发明的PCIP蛋白作用于例如具有Kv4.3亚单位或Kv4.2亚单位的钾通道。
本文使用的“钾通道介导的活性”包括参与例如与神经系统或心脏接受、传导和传递信号有关的钾通道的活性，所述钾通道例如为神经元细胞或心肌细胞钾通道。钾通道介导活性包括细胞(例如神经元细胞或心肌细胞)释放神经递质(如多巴胺或去甲肾上腺素)；调节膜静息电位、动作电位波形和频率和兴奋阈；以及调节例如神经元细胞或心肌细胞的过程，例如突触亚阈反应的整合和反向传播动作电位的传导。
因为本发明的PCIP蛋白调节钾通道介导活性，所以它们可用作钾通道相关疾病和/或神经系统相关疾病的新的诊断试剂和治疗药物。而且，本发明PCIP蛋白调节Kv4钾通道，例如具有Kv4.2或Kv4.3亚单位的钾通道，它构成哺乳动物心脏称为Ito(瞬时外向电流)的电压控制K+电流的基础(Kaab S.等(1988)Circulation98(14)：1383-93；DixonJ.E.等(1996)Circulation Research 79(4)：659-68；Nerbonne JM(1998)Journal of Neurobiology 37(1)：37-59；Barry D.M.等(1998)CirculationResearch 83(5)：560-7；Barry D.M.等(1996)Annal Review of Physiology58：363-94。此电流是心肌细胞在动作电位期间快速复极化的基础。它还通过控制心肌细胞达到发放随后的动作电位的阈值的速率影响心跳间隔。
还知道心脏肥大患者的所述电流向下调节，导致心脏动作电位延长。人们认为这些患者的动作电位延长导致心肌钙负荷和钙处理改变，引起心脏疾病由心脏肥大发展为心力衰竭(Wickenden等(1998)Cardiovascular Research 37：312)。有趣的是，本发明的几种PCIP(例如SEQ ID NO：13、15、17、19、21、23和25所示的9q1、9qm、9qs)结合并调节包含Kv4.2或Kv4.3亚单位的钾通道，而且它们含有钙结合EF-手结构域。可以预期因为这些PCIP基因突变产生的这些钙结合PCIP蛋白本身表达的缺陷或这些PCIP和Kv4.2或Kv4.3通道之间的相互作用缺陷，可使心肌Kv4.3或Kv4.3(Im)电流降低，所以改变PCIP表达或调节这些PCIP与Kv4.2或Kv4.3的作用的治疗药物可能是延缓或阻止心脏肥大病发展为心力衰竭的极其有价值的药物。
本文使用的“钾通道相关疾病”包括特征为钾通道介导活性调节异常的紊乱、疾病或病症。钾通道相关疾病可能有害影响感觉冲动从外周传入大脑和/或运动冲动从大脑传到外周；反射整合；干扰感觉冲动；和情感、智力(例如学习和记忆)或运动过程。钾通道相关疾病可能进一步有害影响刺激心肌纤维收缩的电冲动。钾通道相关疾病包括神经系统相关疾病和心血管疾病。
本文使用的“神经系统相关疾病”包括影响神经系统的紊乱、疾病或病症。钾通道相关疾病和神经系统相关疾病的实例包括认知障碍，例如记忆和学习障碍如遗忘症、失用症、认识不能、遗忘性举名困难、遗忘性空间定向障碍、kluve-Bucv综合征、Alzheimer相关性记忆丧失(Eglen R.M.(1996)Pharmacol.and Toxicol.78(2)：59-68；PerryE.K.(1995)Brain and Cognition28(3)：240-58)和学习不能；影响意识的病症，例如视幻觉、感觉障碍或与Lewy体痴呆有关的delerium；情感分裂紊乱(Dean B.(1996)Mol.Psychiatry 1(1)：54-8)、心境不稳性精神分裂症(Bymaster F.P.(1997)J. Clin.Psychiatry 58(增刊10)：28-36；Yeomans J.S.(1995)Neuropharmacol.12(1)：3-16；Reimann D.(1994)J.Psychiatric Res.28(3)：195-210)、抑郁症(原发性或继发性)；情感障碍(Janowsky D.S.(1994)Am.J.Med. Genetics 54(4)：335-44)；睡眠障碍(Kimura F.(1997)J.Neurophysiol.77(2)：709-16)，例如抑郁症患者的REM睡眠异常(Riemann D.(1994)J.Psychosomatic Res.38增刊1：15-25；Bouring P.(1995)Neuroreport 6(3)：532-6)、睡眠倒错性睡眠异常(Sakai K.(1997)Eur.J.Neuroscience 9(3)：415-23)、睡眠-失眠和睡眠期间体温或呼吸抑制异常(Shuman S.L.(1995)Am.J.Physiol.269(2 Pt 2)：R308-17；Mallick B.N.(1997)Brain Res.750(1-2)：311-7)。神经系统相关疾病的其它实例包括涉及疼痛产生机制的病症，例如与过敏性肠综合征有关的疼痛(Mitch C.H.(1997)J.Med.Chem.40(4)：538-46；Shannon H.E.(1997)J.Pharmac.and Exp.Therapeutics 281(2)：884-94；Bouaziz H.(1995)Anesthesia and Analgesia 80(6)：1140-4；或GuimaraesA.P.(1994)Brain Res.647(2)：220-30)或胸痛；运动障碍(Monassi C.R.(1997)Physiol.and Behav.62(1)：53-9)，例如与运动障碍有关的帕金森氏病(Finn M.(1997)Pharmacol.Biochem.& Behavior57(1-2)：243-9；Mayorga A.J.(1997)Pharmacol. Biochem.& Behavior 56(2)：273-9)；进食障碍，例如与胰岛素分泌增高有关的肥胖(Maccario M.(1997)J.Endocrinol.Invest. 20(1)：8-12；Premawardhana L.D.(1994)Clin.Endocrinol. 40(5)：617-21)；饮水障碍，例如糖尿病性烦渴(Murzi E.(1997)Brain Res.752(1-2)：184-8；Yang X.(1994)Pharmacol.Biochem.& Behavior49(1)：1-6)；神经退行性障碍，例如阿耳茨海默氏病、与阿耳茨海默氏病相关的痴呆(例如Pick病)、帕金森氏病和其它Lewy弥散体病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、癫痫、脊髓小脑性共济失调、癫痫综合征和Jakob-Creutzfieldt病；精神障碍，例如抑郁症、精神分裂症、Korsakoff精神病、燥狂、焦虑症、双相情感障碍或恐怖症；神经障碍，例如偏头痛；脊髓损伤；中风；以及头部损伤。
本文使用的“癫痫”包括大脑正常放电功能异常引起的常见神经障碍。大脑功能正常时，无数微小电荷从大脑神经元细胞传递到机体各个部位。在癫痫患者，这种正常模式受到突然异常强烈的电能爆发干扰，这种异常电能主要影响一个人的意识、机体运动或感觉。这些躯体改变称为癫痫发作。癫痫存在两类发作：发生于大脑一个区域的部分发作和影响到整个大脑神经元细胞的全身性发作。癫痫可能因为出生前、出生期间、出生后的脑损伤；头部创伤；营养不良；某些感染性疾病；脑肿瘤和某些毒物所致。然而，多数病例的原因不详。癫痫发生前可能有称为先兆的感觉不安或感觉不适，预示开始发作。即将发生癫痫发作的体征在不同的患者表现不同，包括视觉现象如光闪烁或“阳光突现(sunburst)”。最近发现癫痫在染色体10q上的遗传连锁，靠近标记D10S192：10q22-q24(Ottman等(1995)Nature Genetics 10：56-60)。癫痫的形式很多，包括：癫痫大发作、杰克逊癫痫发作、进.行性家族性肌阵挛发作(myoclonic progressive familial)、癫痫小发作、Lennox-Gastaut综合征、热性癫痫发作、精神运动性发作和颞叶发作。本文所述观测结果对于研究对部分癫痫的治疗特别有用。
本文使用的“共济失调”包括正常大脑放电功能异常引起的常见神经障碍。1型脊髓小脑性共济失调为常染色体显性疾病，根据与人类主要组织相容性复合物(HLA)的连锁，发现它与6号染色体短臂遗传连锁。参见例如H.Yakura等(1974)N.Engl.J.Med.，291，154-155；和J.F.Jackson等(1977)N.Engl.J.Med. 296，1138-1141。已经证实SCAl与6号染色体短臂上的标记D6S89密切连锁，该标记在HLA的端粒端。参见例如L.P.W.Ranum等，Am.J.Hum.Genet.，49，31-41(1991)；和H.Y.Zoghbi等，Am.J.Hum.Genet.，49，23-30(1991)。本文所述的观测结果对于研究对婴幼儿起病的脊髓小脑性共济失调(IOSCA)的治疗特别有用。
本文使用的“心血管疾病”包括心血管系统例如心脏疾病。心血管疾病的实例包括动脉硬化、缺血再灌注损伤、再狭窄、动脉炎、血管壁重建、心室重建、快速心室起搏、冠状动脉微栓塞、心动过速、心动过缓、压力负荷过高、主动脉弯曲(aortic bending)、冠状动脉结扎(coranary artery ligation)、心血管疾病、心房纤维性颤动、长QT综合征、充血性心力衰竭、窦房结功能失调、心绞痛、心脏衰竭、高血压、心房纤维性颤动、心房扑动、扩张性心肌病、特发性心肌病、心肌梗死、冠状动脉病、冠状动脉痉挛或心律失常。在一个优选实施方案中，所述心血管疾病与异常的Ito电流有关。
部分PCIP家族成员还可以具有共同结构特征，例如本文定义的共同结构域或基序或足够的氨基酸同源性或核苷酸序列同源性。这类PCIP家族成员可以是天然或非天然成员，而且可以属于相同类型或不同类型。例如PCIP家族可以包括第一个人来源的蛋白以及其它人来源的不同蛋白，或者它可包括非人来源的同系物。
例如具有共同结构特征的PCIP家族成员可包含至少一个“钙结合结构域”。本文使用的术语“钙结合结构域”包括参与钙结合的氨基酸结构域，例如EF手(Baimbridge K.G.等(1992)TINS 15(8)：303-308)。钙结合结构域优选具有与以下共有序列基本相同的序列：
EO··OO··O DKDGD G· O··· EF··O O.(SEQ ID NO：41)。O可以为I、L、V或M，“·”表示非主要优选残基位置。所列的每个残基占序列的25％以上，下划线残基占序列的80％以上。人1v蛋白的氨基酸残基126-154和174-202、大鼠1v蛋白的氨基酸残基126-154和174-202、大鼠1vl蛋白的氨基酸残基137-165和185-213、大鼠1vn蛋白的氨基酸残基142-170、小鼠1v蛋白的氨基酸残基126-154和174-202、小鼠1vl蛋白的氨基酸残基137-165和185-213、人9q1蛋白的氨基酸残基144-172、180-208和228-256、人9qm蛋白的氨基酸残基126-154、162-190和210-238、人9qs蛋白的氨基酸残基94-122、130-158和178-206、大鼠9qm蛋白的氨基酸残基126-154、162-190和210-238、大鼠9q1蛋白的氨基酸残基131-159、167-195和215-243、大鼠9qc蛋白的氨基酸残基126-154、162-190和210-238、大鼠8t蛋白的氨基酸残基99-127、135-163和183-211、小鼠9q1蛋白的氨基酸残基144-172、180-208和228-256、猴9qs蛋白的氨基酸残基94-122、130-158和178-206、人p19蛋白的氨基酸残基94-122、130-158和178-206、大鼠p19蛋白的氨基酸残基19-47和67-95、小鼠p19蛋白的氨基酸残基130-158、166-194和214-242包含钙结合结构域(EF手)(见图21)。猴KChIP4a和KChIP4b蛋白的氨基酸残基116-127和152-163包含钙结合结构域。
在另一个实施方案中，根据存在至少一个保守羧基末端结构域鉴定本发明分离的PCIP蛋白，所述末端结构域包含约100-200个氨基酸残基长度、优选150-200个氨基酸残基长度、更优选185个氨基酸残基长度的氨基酸序列，而且包含3个EF手。最好本发明PCIP蛋白包含的羧基末端结构域与大鼠1v、大鼠9q或小鼠p19的185个羧基末端氨基酸残基的同一性至少约70％、71％、74％、75％、76％、80％或更高(见图21、25和41)。
同样具有共同结构特征的PCIP家族成员列于表I并介绍如下。本发明提供全长的人、小鼠和大鼠1v cDNA克隆、1v剪接变异体1v1的全长小鼠和大鼠cDNA克隆、1v剪接变异体1vn的部分大鼠cDNA克隆和这些cDNA编码的蛋白。本发明还提供全长的人和小鼠以及大鼠部分9q1 cDNA克隆、9q1剪接变异体9qm的全长人和大鼠cDNA克隆、9q1剪接变异体9qs的全长的人和猴cDNA克隆、9q1剪接变异体9qc的全长大鼠cDNA克隆、9q1剪接变异体8t的部分大鼠cDNA克隆和这些cDNA编码的蛋白。本发明还提供全长的小鼠和人以及部分大鼠p19 cDNA克隆，以及这些cDNA编码的蛋白。提供p19的全长人cDNA克隆以及代表所述人p19 cDNA的3’末端的部分克隆p193。此外，本发明提供人部分W28559 cDNA克隆和此cDNA编码的蛋白。本发明还提供全长猴克隆KChIP4a和相应的全长剪接变异体KChIP4b和这些cDNA编码的蛋白。
PCIP家族其它成员，例如不具有共同结构特征的PCIP家族成员，列于表II而且介绍如下。本发明提供人全长33b07克隆和大鼠部分长度的33b07克隆以及这些cDNA编码的蛋白。本发明还提供大鼠部分长度1p克隆和此cDNA编码的蛋白。另外，本发明提供大鼠部分长度的7a克隆和此cDNA编码的蛋白。
本发明还提供代表以前鉴定的cDNA的PCIP家族成员(29x、25r、5p、7q和19r)。本文将以前鉴定的这些cDNA鉴定为PCIP家族成员，即为具有本文所述的PCIP活性的分子。因此，本发明提供使用以前鉴定的这些cDNA的方法，例如将这些cDNA用于筛选测定法、诊断测定法、预后测定法和本文所述的治疗方法的方法。
按照采用酵母双杂交测定法测定(详述于实施例1)，根据其作用于大鼠Kv4.3亚单位氨基末端180个氨基酸的能力，初步鉴定本发明的PCIP分子。进一步用其它钾亚单位进行结合研究，以证实PCIP与Kv4.3和Kv4.2的特异性。然后采用原位定位、免疫组化方法、共免疫沉淀和膜片钳法明确证实，本发明的PCIP作用于而且调节钾通道、尤其是包含4.3或4.2亚单位的钾通道的活性。
鉴定了几种人、小鼠、猴和大鼠新的PCIP家族成员，本文称为1v、9q、p19、W28559、KChIP4、33b07、1p和大鼠7a蛋白和核酸分子。编码1v多肽的人、大鼠和小鼠cDNA分别表示为SEQ ID NO：1、3和5，而且示于图1、2和3。大脑新皮质和海马中间神经元、丘脑网状核和内侧松果体缰(medial habenula)、基底前脑和纹状体胆碱能神经元、上丘和小脑颗粒细胞高表达1vmRNA。表达1vmRA的胞体、树突、轴突和轴突末端高表达1v多肽。鉴定了大鼠和小鼠的1v基因剪接变异体，分别表示为SEQ ID NO：7、9和11，参见图4、5和6。1v多肽作用于包含Kv4.3或Kv4.2亚单位的钾通道，而不作用于Kv1.1亚单位。根据RNA印迹分析测定，1v转录物(mRNA)主要在大脑中表达。
8t cDNA(SEQ ID NO：29)编码多肽的分子量约26kD，相当于SEQ ID NO：30(见图15)。8t多肽作用于包含Kv4.3或Kv4.2亚单位的钾通道，而不作用于Kv1.1亚单位。根据RNA印迹分析测定和原位资料，8tmRNA主要在心脏和大脑中表达。8t cDNA是9q的剪接变异体。
还分离了人、大鼠、猴和小鼠9q cDNA。剪接变异体包括人9q1(SEQ ID NO：13；图7)、大鼠9q1(SEQ ID NO：15；图8)、小鼠9q1(SEQID NO：17；图9)、人9qm(SEQ ID NO：19；图10)、大鼠9qm(SEQ IDNO：21；图11)、人9s(SEQ ID NO：23；图12)、猴9qs(SEQ ID NO：25；图13)和大鼠9qc(SEQ ID NO：27；图14)。还测定了9q的基因组DNA序列。外显子1和其侧翼内含子序列(SEQ ID NO：46)见图22A。外显子2-11和侧翼内含子序列(SEQ ID NO：47)见图22B。9q多肽作用于包含Kv4.3或Kv4.2亚单位的钾通道，但是不作用于Kv1.1亚单位。按照RNA印迹分析测定和原位资料，9q蛋白主要在心脏和大脑中表达。大脑新纹状体、海马结构、新皮质锥体细胞和中间神经元、和丘脑、上丘以及小脑高表达9q mRAN。
还分离了人、大鼠和小鼠P19 cDNA。人P19示于SEQ ID NO：31和图16；以及SEQ ID NO：39和图20(3’序列)。大鼠P19示于SEQ IDNO：33和图17，小鼠P19示于SEQ ID NO：35和图18。P19多肽作用于包含Kv4.3或Kv4.2亚单位的钾通道，而不作用于Kv1.1亚单位。按照RNA印迹分析测定，P19转录物(mRNA)主要在大脑表达。
还鉴定了PCIP分子的部分人共生同源物。此共生同源物本文称为W28559，见SEQ ID NO：37和图19。
还鉴定了猴KChIP4a及其剪接变异体KChIP4b、KChIP4c和KChIP4d。猴KChIP4a示于SEQ ID NO：48和图23。猴KChIP4b示于SEQ ID NO：50和图24。猴KChIP4c示于SEQ ID NO：69和图35。猴KChIP4d示于SEQ ID NO：71和图36。
大鼠全长33b07 cDNA的核苷酸序列和大鼠33b07多肽的预定氨基酸序列分别见图26以及SEQ ID NO：52和53。大鼠33b07 cDNA编码蛋白的分子量约44.7kD，而且其长度为407个氨基酸残基。在酵母双杂交测定中大鼠33b07结合rKv4.3N和rKv4.2N，略为优选结合rKv4.2N。
人全长33b07 cDNA的核苷酸序列和人33b07多肽的预定氨基酸序列分别见图27以及SEQ ID NO：54和55。
大鼠部分长度的1p cDNA的核苷酸序列和大鼠1p多肽的预定氨基酸序列分别见图28以及SEQ ID NO：56和57。大鼠1p cDNA编码蛋白的分子量约28.6kD，而且其长度为267个氨基酸残基。在酵母双杂交测定中大鼠1p结合rKv4.3N和rKv4.2N，略为优选结合rKv4.3N。
大鼠部分长度的7s cDNA的核苷酸序列和大鼠7s多肽的预定氨基酸序列分别见图29以及SEQ ID NO：58和59。大鼠7s cDNA编码蛋白的分子量约28.6 kD，而且其长度为270个氨基酸残基。在酵母双杂交测定中大鼠7s结合rKv4.3N和rKv4.2N，略为优选结合rKv4.3N。
本发明的序列如下总结于表I和II中。表I本发明的新型多核苷酸和多肽(除非另有说明，否则为完整长度)
    PCIP   核酸分子类型     来源 SEQ IDNo：DNA  SEQ ID No：蛋白   ATCC
 1v或KChIP1     1v 人(225-875)*     1     2   98994
    1v 大鼠(210-860)     3     4   98946
    1v 小鼠(477-1127)     5     6   98945
    1v1 大鼠(31-714)     7     8   98942
    1v1 小鼠(77-760)     9     10   98943
    1vn(部分) 大鼠(345-955)     11     12   98944
 9q或KChIP2   基因组DNA序列(外显子1和侧翼内含子序列)     人     46
  基因组DNA序列(外显子2-11和侧翼内含子序列)     人     47
    9q1 人(207-1019)     13     14   9899398991
    9q1(部分) 大鼠(2-775)     15     16   98948
    9q1 小鼠(181-993)     17     18   98937
    9qm 人(207-965)     19     20   9899398991
    9qm 大鼠(214-972)     21     22   98941
    9qs 人(207-869)     23     24   98951
    9qs 猴(133-795)     25     26   98950
    9qc 大鼠(208-966)     27     28   98947
    8t(部分) 大鼠(1-678)     29     30   98939
p19或KChIP3     p19 人(1-771)     31     32  PTA-316
    p19(部分) 大鼠(1-330)     33     34   98936
    p19 小鼠(49-819)     35     36   98940
    p19(部分) 人(2-127)     39     40   98949
  W28559     W28559(部分) 人(1-339)     37     38
  KChIP4     KChIP4a 猴(265-966)     48     49
  KChIP4b C末端剪接变异体 猴(265-966)     50     51
  KChIP4c剪接变异体 猴(122-811)     69     70
  KChIP4d剪接变异体 猴(64-816)     71     72
*括号内标示为编码序列的坐标。第一栏表示鉴定的PCIP，第二栏表示鉴定的每个PCIP的不同核酸形式。表II本发明的多核苷酸和多肽(除非另有说明，否则为完整长度)
    PCIP   核酸分子类型     来源 SEQ IDNO：DNA  SEQ ID NO：蛋白    ATCC
 新的33b07     33b07 人(88-1332)     52     53  PTA-316
    33b07 大鼠(85-1308)     54     55
  新的1p     1p(部分) 大鼠(1-804)     56     57
  新的7s     7s(部分) 大鼠(1-813)     58     59
    29x     29x 大鼠(433-1071)     60     61
 29x的25r剪接变异体 大鼠(130-768)     62
    5p     5p 大鼠(52-339)     63     64
    7q     7q 大鼠(1-639)     65     66
    19r     19r 大鼠(1-816)     67     68
*括号内标示为编码序列的坐标。第一栏表示鉴定的4个PCIP家族，第二栏表示鉴定的每个家族的不同核酸形式。还标示了新的分子。
1998年11月17日，将包含编码人、大鼠和猴PCIP的核苷酸序列的质粒保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(1088l，UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，并获得上述保藏号。根据国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约保持这些保藏物。进行这些保藏仅仅是为了方便本领城技术人员，而不是承认根据35 U.S.C. 112必须保藏。
1998年7月8日，将包含编码人p19(EphPl9克隆)和人33b07(Eph33b07克隆)的cDNA分子的克隆保藏于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，保藏号为PTA-316，它为两种茵株的混合物的复合保藏物的一部分，每种菌株带有包含一个特定cDNA克隆的一个重组质粒。(hel9和h33b07混合物的ATCC菌株名称为EphP19h33b07mix)。
为了区别所述菌株和分离带有特定cDNA克隆的菌株，在加有100μg/ml青霉素的LB平板上将一等份所述化合物划线接种为单个集落，使单个集落生长，然后用标准微量制备方法提取质粒DNA。再次，可用NotI消化微量制备的DNA样品，用标准DNA电泳条件在0.8％琼脂糖凝胶上分离制得产物。消化产生以下带型：EphP19：7kb 9(单一带)；Eph33b07：5.8kb(单一带)。
在以下小节中进一步详细地描述本发明的各个方面：I.分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及编码PCIP蛋白或其生物活性部分的分离核酸分子以及足以用作鉴定PCIP编码核酸分子(例如PCIP mRNA)的杂交探针的核酸片段和用作扩增或突变PCIP核酸分子的PCR引物的片段。本文使用的术语“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。所述核酸分子可以是单链或双链的，但是优选双链DNA。
一种“分离的”核酸分子为一种与存在于所述核酸天然来源的其它核酸分子分离的核酸分子。一种“分离的”核酸最好不含所述核酸在产生此核酸的生物体基因组DNA中的天然侧翼序列(即位于所述核酸5’末端和3’末端的序列)。例如在不同实施方案中，所述分离的PCIP核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，此序列为所述核酸分子在产生此核酸的细胞基因组DNA中的天然侧翼序列。此外，当通过重组技术产生时，一种“分离的”核酸分子如cDNA分子可以基本上不含其它细胞物质或培养基，当化学合成时，它基本上不含化学前体或其它化学物质。
可应用标准分子生物学技术和本文提供的序列信息分离本发明的核酸分子，例如具有以下核苷酸序列或其部分的核酸分子：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列。应用完整或部分的以下核酸序列或核苷酸序列作杂交探针：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，用标准杂交和克隆技术(例如按照Sambrook，J.，Fritsh.E.F.，和Maniatis，T.Molecular Clonging：A Labotatory Manual，第二版，Clod SpringHarbor Laboratory.Cold Spring Harbor Laboratory Press.Cold SpringHarbor.NY，1989所述方法)可分离PCIP核酸分子。
此外，应用根据以下序列设计的合成寡核苷酸引物：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，经聚合酶链反应(PCR)可分离包含完整或部分的以下序列的核酸分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列。
应用cDNA、mRNA或基因组DNA作模板和合适的寡核苷酸引物按照标准PCR扩增技术可扩增本发明的核酸。可将如此扩增的核酸克隆入合适的载体，而且通过DNA序列分析进行特征鉴定。而且，利用标准合成技术例如用自动DNA合成仪可制备相当于PCIP核苷酸序列的寡核苷酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的一种分离的核酸分子包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，或这些核苷酸序列中的任一种核苷酸序列的一部分。
在另一个优选的实施方案中，本发明的一种分离的核酸分子包含为以下核苷酸序列互补物的核酸分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，或这些核苷酸序列中的任一种核苷酸序列的一部分。一种与以下核苷酸序列互补的核酸分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，为与以下核苷酸序列足够互补的核酸分子：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，使得它可以与以下核苷酸序列杂交：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，由此形成稳定的双链体。
在再一优选的实施方案中，本发明的一种分离的核酸分子包含的核苷酸序列与以下序列的同一性至少为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高：SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的完整长度核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的完整长度核苷酸序列或这些核苷酸序列中的任一种核苷酸序列的一部分。
而且，本发明的所述核酸分子可只包含以下序列的一部分：SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，例如可用作探针或引物的片段或编码PCIP蛋白的生物活性部分的片段。由克隆PCIP基因决定的核苷酸序列使得可以产生目的是用于鉴定和/或克隆其它PCIP家族成员以及其它物种的PCIP同系物的探针和引物。
所述探针/引物通常包括大致纯的寡核苷酸。所述寡核苷酸一般包含一个核苷酸序列区，该核苷酸序列区在严格条件下与以下序列的至少约12或15、优选约20或25、更优选约30、35、40、45、50、55、60、65或75个连续核苷酸的序列杂交：SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的有义序列；或SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的反义序列；或SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的天然等位基因变异体或突变体。在一个典型实施方案中，本发明的一个核酸分子包含为350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、949、950-1000个或更多个核苷酸长度而且在严格条件下与以下核酸分子或核苷酸序列杂交的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核酸分子或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列。
基于所述PCIP核苷酸序列的探针可用于检测编码相同或同源蛋白的转录物或基因组序列。在优选的实施方案中，所述探针还包含一个与其连接的标记组分，例如所述标记组分可以为一种放射性同位素、一种荧光化合物、酶或酶辅因子。这种探针可用作鉴定异常表达PCIP蛋白的细胞或组织的诊断试验试剂盒的一部分，例如检测受试者细胞样品的PCIP编码核酸的水平，如检测PCIPmRNA水平或确定基因组PCIP基因是突变还是缺失。
通过以下步骤可制备编码“PCIP蛋白的生物活性部分”的核酸片段，所述步骤为：分离编码PCIP生物活性(本文描述的PCIP蛋白生物活性)多肽的以下序列的一部分核苷酸序列，所述序列为：SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEO ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列；表达所述PCIP蛋白的编码部分(例如通过体外重组表达)以及评价所述PCIP蛋白的编码部分的活性。
本发明还包括不同于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，但是由于遗传密码的简并性而因此编码与以下核苷酸序列编码蛋白相同的PCIP蛋白的核酸分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列。在另一实施方案中，本发明的一种分离核酸分子所具有核苷酸序列编码的蛋白具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列。
除了SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71所示的PCIP核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列之外，本领域技术人员应该知道在群体(例如人群)中可存在引起PCIP蛋白氨基酸序列改变的DNA序列多态性。因为天然等位基因变异，这种PCIP基因的遗传多态性可存在于一个群体的各个体中。本文使用的术语“基因”和“重组基因”是指包含编码PCIP蛋白、优选哺乳动物PCIP蛋白的可读框而且还可包含非编码调节序列和内含子的核酸分子。
人PCIP的等位基因变异体包括功能性和非功能性PCIP蛋白。有功能的等位基因变异体为保有结合PCIP配体能力和/或调节本文所述的任何一种PCIP活性能力的天然存在的人PCIP蛋白氨基酸序列变异体。有功能的等位基因变异体通常包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的仅一个或多个氨基酸的保守取代，或所述蛋白非重要区的非重要残基的取代、缺失或插入。
无功能的等位基因变异体为不具有结合PCIP配体能力和/或调节本文所述的任何一种PCIP活性能力的天然存在的人PCIP蛋白氨基酸序列变异体。无功能的等位基因变异体通常具有SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72氨基酸序列的非保守取代、缺失或插入或不成熟的截短，或所述蛋白重要残基或重要区的取代、插入或缺失。
本发明还提供所述人PCIP蛋白的非人直向同源物(orthologues)。人PCIP蛋白的直向同源物为分离自非人类的生物体而且具有相同PCIP配体结合和/或可调节人PCIP蛋白的钾通道介导的活性的蛋白。根据包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72基本相同的氨基酸序列，能够容易地鉴定人PCIP蛋白的直向同源物。
而且，编码其它PCIP家族成员、而因此具有不同于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的PCIP序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的核酸分子属于本发明范畴。例如根据人PCIP的核苷酸序列可鉴定另一个PCIP cDNA。而且，编码不同物种的PCIP蛋白、而因此具有不同于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的PCIP序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的核酸分子也属于本发明范畴。例如根据人PCIP的核苷酸序列可鉴定小鼠PCIP cDNA。
利用本文公开的cDNA或其部分作为杂交探针按照严格杂交条件下的标准杂交技术，根据其与本文公开的PCIP核酸的同源性，可分离相当于本发明PCIP cDNA的天然等位基因变异体和同系物的核酸分子。
因此在另一个实施方案中，本发明的分离核酸分子为至少15、20、25、30个或更多核苷酸长度而且在严格杂交条件下与包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列的核酸分子杂交。在另一实施方案中，所述核酸为至少30、50、100、150、200、250、300、307、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、949或950个核苷酸长度。本文所用的术语“在严格杂交条件下杂交”是用以描述在一般彼此相同至少60％的核苷酸序列仍然彼此杂交的条件下的杂交和洗涤条件。所述条件最好这样：一般彼此相同至少约70％、更优选至少约80％、甚至更优选至少约85％或90％的序列仍然彼此杂交。这种严格条件是本领域技术人员已知的，可参阅Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1.-6.3.6。严格杂交条件的优选、非限制性实例为在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃杂交，然后用0.2×SSC，0.1％SDS于50℃、优选55℃而更优选60℃或65℃洗涤一次或多次。在严格条件下与SEQ ID NO：1序列杂交的本发明的一种分离核酸分子最好相当于一种天然核酸分子。本文使用的“天然或天然存在”核酸分子是指具有天然核苷酸序列(例如编码天然蛋白)的RNA或DNA分子。
除了可能存在于群体的PCIP序列的天然等位基因变异体之外，本领域技术人员还知道通过突变可将变化导入SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列，因此使所编码的PCIP蛋白的氨基酸序列发生变化而不会改变所述PCIP蛋白的功能活性。例如可对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列进行核苷酸取代，产生“非必需”氨基酸残基的氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是这样的残基：PCIP野生型序列(例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的序列)中可改变而不会改变其生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所必需的。例如预期本发明PCIP蛋白中保守的氨基酸残基是特别不适合改变的残基。此外，本发明PCIP蛋白和PCIP家族蛋白其它成员之间的保守的其它氨基酸残基也可能不适于改变。
所以，本发明的另一个方面涉及编码活性非必需氨基酸残基改变的PCIP蛋白的核酸分子。这类PCIP蛋白不同于SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，但是仍然保持生物活性。在一个实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码一种蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的同一性至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。
通过在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸的取代、添加或缺失，使得在所编码的蛋白中导入一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失，从而可制备编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的蛋白同源的PCIP蛋白的分离核酸分子。应用标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变可在SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列中导入各种突变。最好在一个或多个预定非必需氨基酸残基位置产生保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”为用具有相似侧链的氨基酸残基取代所述氨基酸残基的取代。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括碱性侧链氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此优选用相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代PCIP蛋白中的预定非必需氨基酸残基。另一方面，在另一个实施方案中，例如通过饱和诱变沿整个或一部分的PCIP编码序列随机引入突变，可筛选所产生的突变体的PCIP生物活性以鉴定保有活性的突变体。诱变SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列后，可重组表达所编码的蛋白，并可测定所述蛋白的活性。
在一个优选实施方案中，可测定一种突变的PCIP蛋白的以下能力：(1)作用于(例如结合)钾通道蛋白或其部分；(2)调节钾通道蛋白或其部分的磷酸化状态；(3)作用于(例如结合)钙而且例如用作钙依赖性激酶，例如以钙依赖性方式磷酸化钾通道；(4)作用于(例如结合)钙而且例如用作钙依赖性转录因子；(5)调节细胞(例如神经元细胞或心肌细胞)的钾通道介导活性以便例如有益地影响所述细胞；(6)调节神经递质的释放；(7)调节细胞膜兴奋性；(8)影响细胞膜静息电位；(9)调节动作电位的波形和频率；以及(10)调节兴奋阈。
除了编码PCIP蛋白的上述核酸分子之外，本发明的另一个方面涉及其反义的分离核酸分子。一种“反义”核酸包含的核苷酸序列与编码一种蛋白的“有义”核酸互补(例如与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补)。因此，一种反义核酸可与一种有义核酸氢键键合。所述反义核酸可与完整的PCIP编码链互补或只与其一部分互补。在一个实施方案中，一种反义核酸分子与一种编码PCIP的核苷酸序列的编码链的一个“编码区”反义。术语“编码区”是指包含可翻译为氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。在另一个实施方案中，所述反义核酸分子与一种编码PCIP的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”是指所述编码区侧翼的不能翻译为氨基酸的5’和3’序列(即也称为5’和3’非翻译区)。
已知本文公开的编码PCIP的编码链序列，可根据Watson和Crick碱基配对原则设计本发明的反义核酸。所述反义核酸分子可与PCIPmRNA的完整编码区互补，但是更优选为仅与PCIP mRNA编码区或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如所述反义寡核苷酸可与PCIPmRNA翻译起始位点周围的区互补。一种反义寡核苷酸可以为例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸长度。应用本领域已知的方法利用化学合成和酶连接反应，可构建本发明的反义核酸。例如，利用天然核苷酸或为了增加所述分子的生物稳定性或增加所述反义核酸和有义核酸形成的双链体的物理稳定性设计的各种修饰核苷酸，例如可使用硫代磷酸衍生物和吖啶取代的核苷酸，能够化学合成反义核酸(例如反义寡核苷酸)。可用于制备反义核酸的修饰核苷酸实例包括5氟尿嘧啶、5溴尿嘧啶、5氯尿嘧啶、5碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，使用以反义方向将核酸亚克隆入其中的表达载体(即插入核酸转录的RNA为目的靶核酸的反义方向，在下一小节中进一步描述)，可生物性产生所述反义核酸。
通常给予接受者本发明的反义核酸分子或原位产生本发明的反义核酸分子，使得它们与细胞mRNA和/或编码PCIP蛋白的基因组DNA杂交或结合，由此例如通过抑制转录和/或翻译而抑制表达所述蛋白。所述杂交是通过常规核苷酸互补性形成稳定双链体完成，或者例如如果为结合DNA双链体的反义核酸分子，则是通过双螺旋大沟的特异性作用完成。本发明反义核酸分子的给予途径的实例包括直接注射到组织部位。或者，可以修饰反义核酸分子以靶向选定细胞，然后系统给予。例如为了系统给予，可以修饰反义分子，以便例如通过所述反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体结合，使它们特异性结合表达在选定细胞表面的受体或抗原。也可以用本文所述的载体将所述反义核酸分子传递给细胞。为了获得足够的细胞内反义分子浓度，优选反义核酸分子处于强polII或polIII启动子控制之下的载体构建物。
在再一实施方案中，本发明的反义核酸分子为α-端基异构(anomeric)核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂交体，其中与常见的β-单位相反，所述链彼此平行排列(Gaultier等(1987)Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。所述反义核酸分子也可以含有2’-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215：327-330)。
在又一实施方案中，本发明的反义核酸为核酶。核酶为具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切割与其具有互补区的单链核酸，例如mRNA。因此，可用核酶(例如锤头核酶，在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334：585-591中有描述)催化切割PCIPmRNA转录物，由此抑制PCIPmRNA的翻译。根据本文公开的PCIPcDNA的核苷酸序列(即SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列)，可设计对PCIP编码核酸具有特异性的核酶。例如可以构建四膜虫L-19IVSRNA的衍生物，其中所述活性部位的核苷酸序列与PCIP编码mRNA中被切割的核苷酸序列互补。参见例如Cech等美国专利第4,987,071号以及Cech等美国专利第5,116,742号。或者可用PCIP mRNA从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Barte1.D.和Szostak，J.W.(1993)Science 261：1411-1418。
或者可通过靶向与PCIP的调节区(例如PCIP启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成阻止靶细胞PCIP基因转录的三螺旋结构，从而抑制PCIP基因表达。一般参阅Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.等(1992)Ann.N.Y.Acad. Sci.660：27-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays14(12)：807-15。
在又一实施方案中，可在碱基部分、糖部分或磷酸主链上修饰本发明的PCIP核酸分子，以改善例如所述分子的稳定性、杂交或溶解性。例如可修饰所述核酸分子的脱氧核糖磷酸主链，以产生肽核酸(参阅Hyrup B.等(1996)Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1)：5-23)。本文使用的术语“肽核酸”或“PNA”是指核酸模拟物如DNA模拟物，其中用假肽主链代替脱氧核糖磷酸主链而且只保有4种天然核碱基(nucleobase)。已经证实PNA的中性主链在低离子强度条件下可与DNA和RNA发生特异性杂交。按照Hyrup B.等(1996)(同上)；Perry-O’Keefe等Proc.Nat1.Acad.Sci.93：14670-675中所述，应用标准固相肽合成方法可合成PNA寡聚物。
PCIP核酸分子的PNA可用于治疗和诊断用途。例如PNA通过例如诱导中止转录或翻译或抑制复制，可用作序列特异性调节基因表达的反义药物或抗基因药物。此外，PCIP核酸分子的PNA可用于分析基因单破基对突变(例如通过PNA控制的PCR钳)；当与其它酶联用时用作‘人工限制酶’(例如Sl核酸酶(Hyrup B.(1996)同上))；或用作DNA测序或杂交的探针或引物(Hyrup B.等(1996)同上；Perry-O’Keefe 同上)。
在另一个实施方案中，通过使亲油基或其它辅助基与PNA连接、形成PNA-DNA嵌合体或利用脂质体或本领域已知的其它药物传递技术，可修饰PCID的PNA(例如以增强其稳定性或促进细胞摄取)。例如可制备兼有PNA和DNA有利特性的PCID核酸分子的PNA-DNA嵌合体。这类嵌合体使得DNA识别酶(例如RNAse H和DNA聚合酶)作用于所述DNA部分，同时PNA部分提供高结合亲和力和特异性。利用根据碱基堆积、所述核碱基之间的键数量以及方向选定的合适长度的接头可连接PNA-DNA嵌合体(Hyrup B.(1996)同上)。按照Hyrup B.(1996)同上和Finn P.J.等(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63所述，可合成PNA-DNA嵌合体。例如，利用标准亚磷酰胺偶联化学在固体支持物上可合成DNA链，而且修饰的核苷类似物如5’-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5’-脱氧-胸苷亚磷酰胺可用作PNA和DNA 5’末端之间的接头(Mag，M.等(1989)Nucleic Acid Res.17：5973-88)。然后逐步偶联PNA单体，以产生5’PNA区段和3’DNA区段的嵌合分子(Finn P.J.等(1996)同上)。或者可用5’DNA区段和3’PNA区段合成嵌合分子(Peterser，K.H.等(1975)Bioorganic Med. Chem.Lett.5：1119-11124)。
在其它实施方案中，所述寡核苷酸可包含其它附属部分例如肽(例如靶向体内宿主细胞受体)或有助于跨细胞膜(参见例如Letsinger等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.US.86：6553-6556；Lemaitre等(1987)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 84：648-652；PCT公布号WO88/09810)或血脑屏障(参见例如PCT公布号WO89/10134)转运的物质。此外，可用引发杂交的切割物质(参见例如Krol等(1988)Bio-Techniques 6：958-976)或嵌入剂修饰寡核苷酸。(参见例如Zon(1988) Pharm.Res 5：539-549)。为此，可将所述寡核苷酸与另一个分子(例如肽、引发杂交的交联剂、转运剂或引发杂交的切割物质)连接。II.分离的PCIP蛋白和抗PCIP抗体
本发明的一个方面涉及分离的PCIP蛋白及其生物活性部分和适合用作产生抗PCIP抗体的免疫原的多肽片段。在一个实施方案中，可采用标准蛋白纯化技术经合适的纯化方案从细胞或组织来源分离天然PCIP蛋白。在另一个实施方案中，用重组DNA技术产生PCIP蛋白。重组表达的代替方法是可用标准肽合成技术化学合成PCIP蛋白或多肽。
一种“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物活性部分基本上不含衍生PCIP蛋白的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白、或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。语言表述“基本上不含细胞物质”包括其中所述蛋白与分离出或重组产生所述蛋白的细胞的细胞组分分离的PCIP蛋白制剂。在一个实施方案中，语言表述“基本上不含细胞物质”包括非PCIP蛋白(本文也称为“污染蛋白”)含量低于约30％(干重)、更优选低于约20％、甚至更优选低于约10％而最优选低于约5％的PCIP蛋白制剂。当所述PCIP蛋白或其生物活性部分为重组产生时，还优选基本上不含培养基，即培养基低于所述蛋白制剂体积的约20％、更优选低于约10％和最优选低于约5％。
语言表述“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括其中所述蛋白与所述蛋白合成涉及的化学前体或其它化学物质分离的PCIP蛋白制剂。在一个实施方案中，语言表述“基本上不含化学前体或其它化学物质”包括化学前体或非PCIP化学物质含量低于约30％(干重)、更优选低于约20％、甚至更优选低于约10％而最优选低于约5％的PCIP蛋白制剂。
本文使用的PCIP蛋白的“生物活性部分”包括参与PCIP分子和非PCIP分子相互作用的PCIP蛋白的片段。PCIP蛋白的生物活性部分包括包含与所述PCIP蛋白的氨基酸序列具有足够同一性或衍生自所述PCIP蛋白氨基酸序列的氨基酸序列的肽，所述PCIP蛋白氨基酸序列例如为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，所述肽包含的氨基酸少于全长PCIP蛋白而且具有PCIP蛋白的至少一种活性。通常生物活性部分包含一个结构域或基序和所述PCIP蛋白的至少一种活性，例如结合钾通道亚单位。PCIP蛋白的生物活性部分可以为例如10、25、50、100、200或更多氨基酸长度的多肽。PCIP蛋白的生物活性部分可以用作开发调节钾通道介导活性的药物的靶。
在一个实施方案中，PCIP蛋白的生物活性部分包含至少一个钙结合结构域。
应该知道的是，本发明PCIP蛋白的优选生物活性部分可包含至少一个以上鉴定的结构域。PCIP蛋白的更优选生物活性部分可包括至少两个以上鉴定的结构域。此外，可用重组技术制备其中所述蛋白的其它区缺失的其它生物活性部分，并且评价其天然PCIP蛋白的一种或多种功能活性。
在一个优选的实施方案中，所述PCIP蛋白具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72所示的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述PCIP蛋白基本上与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72同源，而且保有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的蛋白的功能活性，然而因为天然等位基因变异或诱变而氨基酸序列不同，在上述小节I中有详细的描述。因此，在另一个实施方案中，所述PCID蛋白为包含的一个氨基酸序列与SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多相同的蛋白。
本发明的分离蛋白、优选1v、9q、p19、W28559、KChIPa、KChIP4b、33b07、1p或7s蛋白具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72氨基酸序列足够相同的氨基酸序列，或者它们由与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、 SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71足够相同的核苷酸序列编码。本文使用的术语“足够相同”是指第一种氨基酸或核苷酸序列与第二种氨基酸或核苷酸序列含有足够数量或最小数量的相同或等同(例如具有相似侧链的氨基酸)氨基酸残基或核苷酸，使得第一种和第二种氨基酸或核苷酸序列共有相同结构域或基序和/或相同功能活性。例如共有相同结构域的氨基酸或核苷酸序列在所述结构域的氨基酸序列范围内具有至少30％、40％或50％同一性，优选60％同一性，更优选70％-80％，甚至更优选90-95％同一性，而且包含至少一个、优选两个结构域或基序，这就是本文定义的足够相同。此外，共有至少30％、40％或50％、优选60％、更优选70-80％或90-95％同一性而且共有相同功能活性的氨基酸或核苷酸序列在本文定义为足够相同。
优选蛋白为具有至少一个钙结合结构域而且优选具有一种PCIP活性的PCIP蛋白。其它优选蛋白为具有至少一个钙结合结构域的PCIP蛋白，而且优选由具有在严格杂交条件下与一种核酸分子杂交的核苷酸序列的核酸分子编码，所述杂交的核酸分子包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列。
为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分率，使所述序列排列对齐以进行最佳比较(例如在第一种和第二种氨基酸或核酸序列之一或二者中引入间隙以进行最佳排列而且忽略非同源序列以进行比较)。在一个优选实施方案中，为了比较目的对齐的参考序列长度为参考序列长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％，而更优选至少70％、80％或90％(例如排列对齐第二种序列与具有177个氨基酸残基的SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的PCIP氨基酸序列时，对比至少80个、优选至少100个、更优选至少120个、甚至更优选至少140而甚至更优选至少150、160或170个氨基酸残基)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一种序列的一个位置被与第二种序列相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在该位置相同(本文使用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。所述两种序列的同一性百分率随所述序列共有的相同位置数而变化，同时考虑为了所述两种序列的最佳排列对齐需要引入的间隙数量和每个间隙的长度。
应用数学算法可比较序列并确定两种序列的同一性百分率。在一个优选实施方案中，应用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵和间隙权重为16、14、12、10、8、6或4而长度权重为1、2、3、4、5或6，采用引入GCG软件包的GAP程序(可在http：//www.gcg.com获得)中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法测定两种氨基酸序列的同一性百分率。在又一实施方案中，应用NWSgapdna.CMP矩阵和间隙权重为40、50、60、70或80而长度权重为1、2、3、4、5或6，采用GCG软件包的GAP程序(可在http：//www.gcg.com获得)测定两种核苷酸序列的同一性百分率。在另一个实施方案中，应用PAM120权重残基表、间隙长度补偿(penalty)为12而间隙补偿为4，采用引入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))算法测定两种氨基酸或核苷酸序列的同一性百分率。
本发明的核酸和蛋白序列可进一步用作“查询序列”对公共数据库进行检索，例如以鉴定其它家族成员或相关序列。应用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)可进行这样的检索。可用NBLAST程序、记分＝100、字符长度(wordlength)＝12进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明PCIP核酸分子同源的核苷酸序列。利用XBLAST程序、记分＝50、字符长度＝3进行BLAST蛋白检索，以获得与本发明PCIP蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得比较目的的间隙对齐，可按照Altschul等，(1997)Nucleic AcidsRes.25(17)：3389-3402所述采用间隙BLAST。当采用BLAST和间隙BLAST程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
本发明还提供PCIP嵌合蛋白或融合蛋白。本文使用的PCIP“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与非PCIP多肽有效连接的PCIP多肽。“PCIP多肽”是指具有相当于PCIP的氨基酸序列的多肽，而“非PCIP多肽”是指具有相当于基本上与PCIP蛋白不同源的蛋白如不同于所述PCIP蛋白而且衍生自相同或不同生物体的蛋白的氨基酸序列的多肽。PCIP融合蛋白的PCIP多肽可以表示PCIP蛋白的全部或一部分。在一个优选的实施方案中，PCIP融合蛋白包含PCIP蛋白的至少一个生物活性部分。在另一个优选实施方案中，PCIP融合蛋白包含PCIP蛋白至少两个生物活性部分。在所述融合蛋白中，术语“有效连接”用以表示所述PCIP多肽和非PCIP多肽按读框彼此融合。非PCIP多肽可与PCIP多肽的N末端或C末端融合。
例如在一个实施方案中，所述融合蛋白为GST-PCIP融合蛋白，其中PCIP序列与GST序列的C末端融合。这种融合蛋白能够促进重组PCIP的纯化。
在另一个实施方案中，所述融合蛋白为在其N末端包含一个异源信号序列的PCIP蛋白。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，通过应用异源信号序列可增强表达和/或分泌PCIP。
本发明的PCIP融合蛋白可加入药用组合物中并给予到接受者体内。所述PCIP融合蛋白可用于影响PCIP底物的生物利用度。PCIP融合蛋白可治疗性用于治疗诸如CNS疾病的钾通道相关性疾病，例如神经退行性障碍，例如阿耳茨海默氏病、与阿耳茨海默氏病相关的痴呆(例如Pick病)、帕金森氏病和其它Lewy弥散体病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、癫痫、脊髓小脑性共济失调和Jakob-Creutzfieldt病；精神障碍，例如抑郁症、精神分裂症、Korsakoff精神病、燥狂、焦虑症或恐怖症；记忆和学习障碍如遗忘症或年龄相关性记忆丧失；以及神经疾病，例如偏头痛。PCIP融合蛋白也可治疗性用于治疗诸如心血管疾病的钾通道相关疾病，例如动脉硬化、缺血再灌注损伤、再狭窄、动脉炎、血管壁重建、心室重建、快速心室起搏、冠状动脉微栓塞、心动过速、心动过缓、压力负荷过高、主动脉弯曲(acortic bending)、冠状动脉结扎、心血管疾病、心房纤维性颤动或充血性心力衰竭。
此外，本发明的PCIP融合蛋白可用作免疫原，以在接受者产生抗PCIP抗体、纯化PCIP配体，以及可用于筛选测定以鉴定抑制PCIP与PCIP底物作用的分子。
最好用标准重组DNA技术产生本发明的PCIP嵌合蛋白或融合蛋白。例如按照常规技术，例如通过应用平端或交错末端的末端连接、限制酶消化产生合适末端、适当补平黏性末端、碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接以及进行酶连接，按照读框将编码不同多肽序列的DNA片段连接在一起。在另一个实施方案中，可用包括自动DNA合成仪在内的常规技术合成融合基因。可用锚引物(anchor primer)对基因片段进行PCR扩增，所述锚引物可在两个连续基因片段之间产生随后可退火的互补突出端，而且可重复扩增产生嵌合基因序列(参见例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley &Sons；1992)。而且，现成的编码一个融合部分(例如GST多肽)的许多表达载体可市售获得。可将PCIP编码核酸克隆入这样的表达载体，使得所述融合部分与所述PCIP蛋白按照读框连接。
本发明还涉及可用作PCIP激动剂(模拟物)或PCIP拮抗剂的PCIP蛋白变异体。通过诱变例如不连续点突变或截短PCIP蛋白可制备PCIP蛋白的变异体。PCIP蛋白激动剂可保持天然形式PCIP蛋白的基本上相同或一个亚型(subset)的生物活性。PCIP蛋白拮抗剂可通过例如竞争性调节PCIP蛋白的钾通道介导活性而抑制天然形式PCIP蛋白的一种或多种活性。所以，用有限功能的变异体治疗可引发特异性生物作用。在一个实施方案中，用具有天然形式蛋白的亚型生物活性的变异体治疗接受者的副作用很小，这是相对于用天然形式PCIP蛋白治疗的副作用而言。
在一个实施方案中，筛选合并的突变体(例如具有PCIP蛋白激动剂或拮抗剂活性的PCIP蛋白的截短突变体)文库，可鉴定用作PCIP激动剂(模拟物)或PCIP拮抗剂的PCIP蛋白变异体。在一个实施方案中，通过核酸水平的联合诱变可制备PCIP变异体的多样化文库，而且它由多样化基因库编码。例如通过将合成寡核苷酸混合物用酶连接入基因序列中，使得一个简并组的潜在PCIP序列可表达为单独的多肽，或者一组较大的融合蛋白(例如噬菌体展示)含有本文所述PCIP序列组，从而可产生PCIP变异体的多样化文库。各种方法可用于从简并寡核苷酸序列制备可能PCIP变异体文库。可用自动DNA合成仪化学合成简并基因序列，然后将合成基因连接入合适表达载体。应用一组简并基因可以保证编码一组需要的潜在PCIP序列的全部序列都在一种混合物中。合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等(1984)Science 198：1056；Ike等(1983)Nucleuc Acid Res.11：477。
另外，可应用PCIP蛋白编码序列的片段文库制备多样化的PCIP片段群，以进行筛选以及随后对PCIP蛋白变异体的选择。在一个实施方案中，可如下制备一个编码序列片段文库：在不同条件下用核酸酶处理PCIP编码序列的双链PCR片段，其中每个分子只发生大约1次切割，使双链DNA变性，使所述DNA复性形成可包括不同切口产物的有义/反义对的双链DNA，用S1核酸酶处理从重新形成的双链体去除单链部分，最后将制备的片段文库连接到表达载体中。用这种方法也可以制备编码不同大小PCIP蛋白的N末端、C末端和内部片段的表达文库。
本领域已知用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物以及筛选cDNA文库中的具有选定特性的基因产物的几种技术。这样的技术适用于快速筛选通过组合诱变PCIP蛋白产生的基因文库。对于筛选大基因文库最广泛使用、适用于高通量分析的技术通常包括以下步骤：将所述基因文库克隆入可复制的表达载体，用所获得的载体文库转化合适细胞，以及在一定条件下表达组合基因，其中对需要活性的检测有助于分离编码检测其产物的基因的载体。recrusive整体诱变(REM)是提高文库的功能突变体频率的新技术，它可与筛选测定联合使用，以鉴定PCIP变异体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering6(3)：327-331)。
在一个实施方案中，可采用基于细胞的测定分析多样化PCIP文库。例如可把表达载体文库转染入通常具有钾通道介导活性的细胞系中。然后利用例如无数酶测定法中的任一种方法或者通过检测释放的神经递质可检测所述PCIP突变体对钾通道介导活性的影响。然后从抑制或增强钾通道介导活性较好的细胞回收质粒DNA，进一步特征鉴定各个克隆。
一种分离的PCIP蛋白或其部分或片段可用作免疫原，以利用制备多克隆抗体和单克隆抗体的标准技术产生结合PCIP的抗体。全长PCIP蛋白可用作免疫原，或者本发明提供用作免疫原的抗原性PCIP肽片段。PCIP抗原肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72所示氨基酸序列的至少8个氨基酸残基，而且包含一个PCIP表位，使得针对所述肽的抗体与PCIP形成特异性免疫复合物。所述抗原肽最好包含至少10个氨基酸残基、更优选至少15氨基酸残基、甚至更优选至少20个氨基酸残基而最优选至少30个氨基酸残基。
所述抗原肽包含的优选表位为位于蛋白表面的PCIP区如亲水区以及高抗原性区。
通常用PCIP免疫原免疫合适接受者(例如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)，从而制备抗体。合适免疫原性制剂可包含例如重组表达的PCIP蛋白或化学合成的PCIP多肽。所述制剂还可包含佐剂，例如弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂或类似的免疫刺激剂。用免疫原性PCIP制剂免疫接种合适接受者可诱导多克隆抗PCIP抗体应答。
因此，本发明的另一方面涉及抗PCIP抗体。本文使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原如PCIP(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子免疫活性部分的实例包括可用酶如胃蛋白酶处理所述抗体产生的F(ab)和F(ab’)2片段。本发明提供结合PCIP的多克隆和单克隆抗体。本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指只包含一种能够与PCIP特定表位发生免疫反应的抗原结合位点的一群抗体分子。因此单克隆抗体组合物通常与特定PCIP蛋白具有单一结合亲和力，所述单克隆抗体组合物与所述特定PCIP蛋白发生免疫反应。
如上所述，用PCIP免疫原免疫合适接受者可制备多克隆抗PCIP抗体。利用固定PCIP，采用标准技术如酶联免疫吸附测定(ELISA)在不同时间可监测免疫接受者的抗PCIP抗体滴度。如果需要的话，可从所述哺乳动物(例如从血液)分离针对PCIP的抗体分子，进一步用周知的技术如A蛋白层析纯化获得IgG部分。免疫接种后合适时间，例如当抗PCIP抗体滴度最高时，可从所述接受者获得抗体产生细胞，将其用以通过标准技术制备单克隆抗体，所述标准技术例如最初由Kohler和Milstein(1975)(Nature 256：495-497)描述的杂交瘤技术(也参见例如Brown等(1981)J.Immunnol.127：539-46；Brown等(1980)J.Biol.Chem.255：4980-83；Yeh等(1976)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：2927-31；和Yeh等(1982)Int.J.Cancer 29：269-75)、较新的人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等(1983)Immunol Today 4：72)、EBV杂交瘤技术(Cole等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)或三瘤(trioma)技术。用于产生单克隆抗体杂交瘤的技术是众所周知的(一般参阅R.H.Kenneth，载于Monoclonal Antibodies：A NewDimension In Biological Analyses，Plenum Publishing Corp.，New York，New York(1980)；E.A.Lemer(1981)Yale J.Biol.Med.，54：387-402；M.L.Gefter等(1977)Somatic Cell Genet. 3：231-36)。简而言之，将永生细胞系(一般为骨髓瘤)与用上述PCIP免疫原免疫的哺乳动物的淋巴细胞(一般为脾细胞)融合，筛选所获得的杂交瘤细胞的培养上清液以鉴定产生结合PCIP的单克隆抗体的杂交瘤。
用以融合淋巴细胞和永生细胞系的许多众所周知的方法中的任一种可用于产生抗PCIP单克隆抗体(参见例如G.Galfre等(1977)Nature 266：55052；上文引用的Gefter等，Somatic Cell Genet；上文引用的Lemer，Yale J.Biol.Med.；上文引用的Kenneth，MonoclonalAntibodies)。而且，一般技术人员知道这类方法的许多改良方法同样有用。一般所述永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系)获自所述淋巴细胞的相同哺乳动物物种。例如可将用本发明免疫原性制剂免疫的小鼠的淋巴细胞与永生化小鼠细胞系融合制得鼠杂交瘤。优选的永生细胞系为对含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。无数骨髓瘤细胞系中的任何一种均可用作按照标准技术的融合配偶体，例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可得自ATCC。一般应用聚乙二醇(“PEG”)使HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后用HAT培养基选择融合获得的杂交瘤细胞，HAT培养基杀死非融合细胞和不能增殖的融合骨髓瘤细胞(非融合的脾细胞因为它们未能转化在数天后就死亡)。例如应用标准ELISA测定，筛选杂交瘤培养上清液中的结合PCIP的抗体，从而检测产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。
制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的一种替代方法是，用PCIP筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)由此分离结合PCIP的免疫球蛋白文库成员，可鉴定以及分离抗PCIP单克隆抗体。用于产生和筛选嗜菌体展示文库的试剂盒可市售获得(例如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01和Stratagene的SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。另外，特别适用于制备和筛选抗体展示文库的方法和试剂实例可参阅例如Ladner等，美国专利第5,223,409号；Kang等，PCT国际公布号WO 92/18619；Dower等，PCT国际公布号WO 91/17271；Winter等，PCT国际公布号WO92/20791；Markland等，PCT国际公布号WO 92/15679；Breitling等，PCT国际公布号WO 93/01288；McCafferty等，PCT国际公布号WO92/01047；Garrard等，PCT国际公布号WO 92/09690；Ladner等，PCT国际公布号WO 90/02809；Fuchs等(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等(1992)Hum.Antibod.Hybridomas 3：81-85；Huse等(1989)Science246：1275-1281；Griffiths等(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等(1992)J. Mol.Biol.226：889-896；Clarkson等(1991)Nature 352：624-628；Gran等(1992)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 89：3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等(1991)Nuc.Acid. Res.19：4133-4137；Barbas等(1991)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 88：7978-7982和McCafferty等，Nature(1990)348：552-554。
另外，可用标准重组DNA技术制备的、同时包含人和非人部分的重组抗PCIP抗体，例如嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体，也属于本发明范畴。这类嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体可用本领域已知的重组DNA技术例如以下文献描述的方法制备，所述文献如下：Robinson等的国际申请号PCT/US86/02269；Akira等的欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等的欧洲专利申请173,494；Neuberger等的PCT国际专利公布号WO 86/01533；Cabilly等的美国专利号4,816,567；Cabilly等的欧洲专利申请125,023；Better等(1988)Science 240：1041-1043；Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-3443；Liu等(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)Proc.Natl. Acad. Sci.USA 84：214-218；Nishimura等(1987)Canc.Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等(1988)J.Natl.Cancer Inst.80；1553-1559)；Morrison，S.L.(1985)Science 229：1202-1207；Oi等(1986)BioTechniques 4：214；Winter的美国专利5,225,539；Jones等(1986)Nature 321：552-525；Verhoeyan等(1988)Science 239：1534；和Beidler等(1988)J.Immunol.141：4053-4060。
抗PCIP抗体(例如单克隆抗体)可用于通过标准技术如亲和层析或免疫沉淀分离PCIP。抗PCIP抗体可促进从细胞纯化天然PCIP以及可促进纯化宿主细胞表达的重组产生的PCIP。而且，抗PCIP抗体可用于检测PCIP蛋白(例如细胞裂解液或细胞上清液中的PCIP蛋白)，以鉴定PCIP蛋白表达的多度和形式。抗PCIP抗体可以作为临床试验方法的一部分诊断性用于监测组织中的蛋白水平，从而例如可以确定特定治疗方案的作用。将所述抗体与可检测物质偶联(即物理性结合)有助于检测的进行。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶实例包辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹黄酰氯或藻红素；发光物质的一个实例为鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白，而合适的放射性物质实例包括125I、131I、35S或3H。III.重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一个方面涉及包含编码PCIP蛋白(或其部分)的核酸的载体、优选表达载体。本文使用的术语“载体”是指能够转运另一种与其连接的核酸的核酸分子。一种类型载体为“质粒”，这种质粒为额外DNA区段可连接入其中的环形双链DNA环。另一种类型载体为病毒载体，其中额外的DNA区段连接入病毒基因组中。部分载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时可整合入宿主细胞的基因组中，所以与所述宿主基因组一起复制。此外，部分载体能够控制与其有效连接的基因的表达。本文将这类载体称为“表达载体”。一般来说，用于重组DNA技术的表达载体常常为质粒形式。在本发明说明书中，“质粒”和“载体”可交互使用，因为所述质粒为最常用形式的载体。然而，本发明包括这样的具有等同作用的其它形式表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
本发明的重组表达载体包含适合在宿主细胞表达本发明核酸形式的本发明核酸，这意味着所述重组表达载体包含根据用以表达的宿主细胞选定的一个或多个调节序列，此调节序列与需要表达的核酸序列有效连接。在重组表达载体中，“有效连接”用以表示目的核苷酸序列以允许表达所述核苷酸序列(例如在体外转录/翻译系统中或当所述载体导入宿主细胞时为在宿主细胞中)的方式与一个或多个调节序列连接。术语“调节序列”表示包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸信号)。例如Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述了这类调节序列。调节序列包括控制核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的调节序列和控制核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的调节序列(例如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应该知道的是，表达载体的设计可取决于诸如转化宿主细胞的选择、需要的蛋白表达水平等这样的因素。本发明的表达载体可导入宿主细胞中，由此产生本文所述核酸编码的蛋白或肽，包括融合蛋白或肽(例如PCIP蛋白、突变型PCIP蛋白、融合蛋白等)。
可以设计本发明的重组表达载体，用以在原核细胞或真核细胞中表达PCIP蛋白。例如可用细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(采用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞表达PCIP蛋白。Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中进一步讨论了合适的宿主细胞。或者例如用T7启动子调节序列和T7聚合酶可体外转录和翻译重组表达载体。
用原核生物表达蛋白最常用含控制融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型启动子或诱导型启动子的载体在大肠杆菌中进行。融合载体在其中编码的蛋白、通常在重组蛋白氨基末端中加入无数氨基酸。这类融合载体通常拥有3个目的：1)增强重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；3)通过用作亲和纯化的配体促进重组蛋白的纯化。通常在融合表达载体中，于融合部分和重组蛋白的接头处导入蛋白酶剪切位点，使得纯化融合蛋白后能够使重组蛋白与融合部分分开。这样的酶和其相关识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白分别与目标重组蛋白融合的pGEX(Phamacia Biotech Inc.；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。
纯化融合蛋白可用于PCIP活性测定(例如下文详细描述的直接测定或竞争性测定)或者用于例如产生PCIP蛋白特异性抗体。在一个优选的实施方案中，用本发明的逆转录病毒表达载体表达的PCIP融合蛋白可用于感染骨髓细胞，然后将其移植入辐射接受者。足够时间(例如6周)后检查接受者的病理学。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等，(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。pTrc载体的目标基因表达取决于杂交trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。pET 11d载体的目标基因表达取决于共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的T7 gn10-1ac融合启动子的转录。带有1acUV 5启动子转录控制下的T7 gnl基因的居住(resident)原噬菌体的宿主株BL21(DE3)或IIMS174(DE3)提供这种病毒聚合酶。
使大肠杆菌中的重组蛋白表达最大化的一种策略是在蛋白酶剪切所述重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达所述蛋白(Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，California(1990)119-128)。另一种策略是改变插入表达载体的核酸的核酸序列，使得每个氨基酸的各个密码子为大肠杆菌优先使用的密码子(Wada等，(1992)Nucleic Acids Res. 20：2111-2118)。可用标准DNA合成技术对本发明的核酸序列进行这种改变。
在另一个实施方案中，所述PCIP表达载体为酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体实例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)Embo J. 6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和picZ(In Vitrogen Corp，SanDiego，CA)。
或者可利用杆状病毒表达载体以昆虫细胞表达PCIP蛋白。可用于在培养昆虫细胞(例如Sf9细胞)表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。
在再一实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6：187-195)。当用于哺乳动物细胞时，常常由病毒调节元件提供表达载体的控制功能。例如常规使用的启动子产生在多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。既适用于原核细胞又适用于真核细胞的其它合适表达系统参阅Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16和17章。
在另一个实施方案中，所述哺乳动物重组表达载体能够控制所述核酸优先在特定细胞类型表达(例如应用组织特异性调节元件表达所述核酸)。本领域已知组织特异性调节元件。合适组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝脏特异性；Pinkert等(1987)GenesDev.1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)、尤其是T细胞受体(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J. 8：729-733)和免疫球蛋白(Banerji等(1983)Cell 33：729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33：741-748)启动子、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund等(1985)Science 230：912-916)和哺乳动物腺体特异性启动子(例如乳清(milk whey)启动子；美国专利第4,873,316号和欧洲申请公布号264,166)。还包括发育调节性启动子，例如鼠类hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science 249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。
本发明还提供包含本发明DNA分子的重组表达载体，所述DNA分子以反义方向克隆入所述表达载体。也就是说，所述DNA分子与调节序列以允许与PCIP mRNA反义的RNA分子表达(通过转录所述DNA分子)的方式有效连接。可以选择与反义方向克隆的核酸有效连接的调节序列，调节序列控制所述反义RNA分子在各种细胞类型持续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或者可以选择控制反义RNA组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调节序列。所述反义表达载体可以为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式，其中在高效调节区控制下产生反义核酸，其活性可用所述载体导入其中的细胞类型测定。对于利用反义基因调节基因表达的讨论，参阅Weintraub，H.等，反义RNA用作遗传分析的分子工具，Reviews-Trends in Genetics Vol.1(1)：1986。
本发明的另一个方面涉及本发明重组表达载体导入其中的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文交互使用。当然这类术语不仅是指具体的接受细胞，而且也指这种细胞的子代细胞或潜在的子代细胞。因为突变或环境影响后代可能发生某些改变，所以实际上这样的子代不可能与亲代细胞相同，但是仍然属于本文使用的术语范畴。
宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如可用细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)表达PCIP蛋白。本领域技术人员知道其它合适宿主细胞。
载体DNA可以通过常规转化技术或转染技术导入原核细胞或真核细胞。本文使用的术语“转化”和“转染”用以指将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的本领域已知的各种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sanbrook等(Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它实验室手册。
为了稳定转染哺乳动物细胞，已知根据所述表达载体和使用的转染技术，只有小部分细胞可将外源DNA整合入其基因组。为了鉴定和选择这些整合体，一般将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目的基因一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予药物抗性的标记，例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。可以以编码PCIP蛋白的同一载体将编码选择标记的核酸导入宿主细胞，或者可以以单独的载体导入宿主细胞。通过药物选择可鉴定导入核酸稳定转染的细胞(例如导入选择标记基因的细胞存活，而其它细胞死亡)。
可以使用本发明的宿主细胞如培养的原核宿主细胞或真核宿主细胞产生(即表达)PCIP蛋白。因此，本发明还提供利用本发明的宿主细胞产生PCIP蛋白的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用合适的培养基培养本发明的宿主细胞(编码PCIP蛋白的重组表达载体已经导入其中)，使得产生PCIP蛋白。在另一个实施方案中，所述方法还包括从所述培养基或宿主细胞分离PCIP蛋白。
还可以使用本发明的宿主细胞产生非人类转基因动物。例如在一个实施方案中，本发明的宿主细胞为PCIP编码序列已经导入其中的受精卵母细胞或胚胎干细胞。然后可以将这样的宿主细胞用于产生外源PCIP序列已经导入其基因组的非人类转基因动物或用于产生其中内源PCIP序列已经改变的同源重组动物。这样的动物可用于研究PCIP的所述功能和/或活性以及鉴定和/或评价PCIP活性调节物。本文使用的“转基因动物”为其中动物的一个或多个细胞含有转基因的非人类动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物，例如大鼠或小鼠。转基因动物的其它实例包括非人类灵长类动物、绵羊、犬、母牛、山羊、鸡、两栖类动物等。转基因为外源DNA，它整合入由其产生转基因动物的细胞的基因组而且保持在成熟动物的基因组中，因此控制编码基因产物在所述转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。本文使用的“同源重组动物”是通过所述内源基因和导入所述动物的一种细胞(例如产生转基因动物之前的所述动物的胚胎细胞)中的外源DNA分子之间的同源重组改变了内源PCIP基因的非人类动物，优选哺乳动物，更优选小鼠。
如下培育本发明的转基因动物：例如通过微量注射、逆转录病毒感染将PCIP编码核酸导入受精卵母细胞的雄性原核中，让所述卵母细胞在假妊娠雌性代孕动物发育。可将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的PCIP cDNA序列作为转基因导入非人类动物的基因组中。或者人PCIP基因的非人类同系物例如小鼠或大鼠PCIP基因可用作转基因。或者根据其与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的PCIP cDNA序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的杂交(在上文1分小节中有更详细的描述)，可分离PCIP基因同系物，例如另一个PCIP家族成员，并将其用作转基因。所述转基因也可以包含内含子序列和聚腺苷酸信号以增强所述转基因的表达效率。可将组织特异性调节序列与PCIP转基因有效连接，以控制对特定细胞表达PCIP蛋白。通过对胚胎的操作和微量注射获得转基因动物、尤其是诸如小鼠的动物的方法是本领域的常规技术，而且Leder等的美国专利号4,736,866和4,870,009、Wagner等的美国专利号4,873,191以及Hogan，B.，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)中有关于所述方法的描述。类似的方法可用于产生其它转基因动物。根据在所述动物的基因组中存在PCIP转基因和/或在所述动物的组织或细胞中表达PCIPmRNA，可鉴定转基因起始动物。然后可用转基因起始动物繁殖携带所述转基因的另外的动物。而且，携带编码PCIP蛋白的转基因的转基因动物进一步可与携带其它转基因的转基因动物育种。
为了产生同源重组动物，制备至少含有其中导入缺失、添加或取代，由此改变PCIP基因例如破坏PCIP基因功能的一部分的PCIP基因的载体。所述PCIP基因可以为人类基因(例如SEQ ID NO：1的cDNA)，但是更优选为人PCIP基因的非人类同系物(例如SEQ ID NO：3或5的cDNA)。例如小鼠PCIP基因可用于构建适合改变小鼠基因组中的内源PCIP基因的同源重组载体。在一个优选的实施方案中，设计所述载体，使得同源重组时功能性破坏所述内源PCIP基因(即不再编码功能蛋白；也称为“失效”载体)。或者，可设计所述载体，使得同源重组时，使内源PCIP基因突变或者改变内源PCIP基因但是仍然编码有功能的蛋白(例如改变上游调节区，因而改变内源PCIP蛋白的表达)。在同源重组载体中，PCIP基因的改变部分的5’和3’端侧翼为PCIP基因的其它核酸序列，使得所述载体携带的外源PCIP基因和胚胎干细胞的内源PCIP基因发生同源重组。其它侧翼PCIP核酸序列具有足够长度，以与内源基因成功同源重组。通常所述载体包含几千个碱基的侧翼DNA(均在5’和3’末端)(关于同源重组载体的描述参见例如Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503)。将载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)，选择其中导入的PCIP基因与内源PCIP基因同源重组的细胞(参见例如Li，E.等(1992)Cell 69：915)。然后将选定的细胞注射入动物(例如小鼠)的胚泡形成聚集嵌合体(参见例如Bradley，A.，载于：Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：APractical Approach，E.J.Robertso编辑(IRL，Oxford，1987)第113-152页)。然后可以将嵌合胚胎植入合适假妊娠雌性代孕动物，使所述胚胎足月生产。可将其生殖细胞带有同源重组DNA的子代用于繁殖其中通过所述转基因的种系传递使所述动物的全部细胞含有同源重组DNA的动物。在Bradley，A.(1991)Current Opinion in Biotechnology 2：823-829和Le Mouellec等的PCT国际公布号WO 90/11354；Smithies等的WO 91/01140；Zijlstra等的WO 92/0968；和Bems等的WO 93/04169中有关于构建同源重组载体和同源重组动物的方法的更详细描述。
在另一个实施方案中，可产生包含允许调节表达所述转基因的选定系统的转基因的非人类动物。这种系统的一个实例为噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。关于cre/loxP重组酶系统的描述，参阅例如Lakso等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236。重组酶系统的另一个实例为酿酒酵母的FLP重组酶系统(O’Gorman等(1991)Science 251：1351-1355)。如果将cre/loxP重组酶系统用于调节转基因的表达，则需要包含既编码Cre重组酶又编码选定蛋白的转基因的动物。通过构建“双重”转基因动物可以提供这样的动物，例如使两个转基因动物交配，一个转基因动物包含编码选定蛋白的转基因而另一个动物包含编码重组酶的转基因。
按照Wimut，I.等(1997)Nature 385：810-813和PCT国际公布号WO 97/07668以及WO 97/07669中所述的方法也可以产生本文所述的非人类转基因动物的克隆。简而言之，可从转基因动物分离一种细胞例如体细胞，并诱导其脱离生长周期而进入G0期。然后可例如通过应用电脉冲使静止细胞与分离所述静止细胞的相同物种动物的去核卵母细胞融合。然后培养重新构建的卵母细胞，使其发育为桑椹胚或胚细胞，然后将其转移到假妊娠雌性代孕动物。该雌性代孕动物生产的后代为由其分离所述细胞例如所述体细胞的动物的克隆。IV.药用组合物
本发明的PCIP核酸分子、PCIP蛋白片段和抗PCIP抗体(本文也称为“活性化合物”)可加入适合给药的药用组合物中。这种组合物通常包含所述核酸分子、蛋白或抗体和药学上可接受的载体。本文使用的语言“药学上可接受的载体”包括与药物给予匹配的任何一种以及全部溶剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物活性物质的这类介质和物质的应用是本领域周知的。除非任何常规介质或物质与所述活性化合物不匹配，否则设计将其用于所述组合物。添加的活性化合物也可以加入所述组合物中。
配制与其预定的给药途径匹配的本发明药用组合物。给药途径的实例包括胃肠外途径，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(局部用药)、经粘膜和直肠给药。用于胃肠外、皮内或皮下用药的溶液或悬浮剂可以包括以下组分：无菌稀释剂，例如注射用水、生理盐溶液、固体油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的物质，例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制剂可以封装于玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小药瓶中。
适合注射用的药用组合物包括无菌水溶液(溶解于水时)或分散剂以及可临时配制成无菌注射溶液或分散溶液的无菌粉。适合静脉内给药的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须无菌而且其流体程度应该易于注射。在生产和贮存条件下所述组合物必须稳定，而且必须对微生物如细菌和真菌的污染作用防腐。所述载体可以为溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如通过应用诸如卵磷脂的包衣、分散剂时保持需要的颗粒大小以及应用表面活性剂可保持合适的流动性。应用各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等可达到防止微生物的作用。在许多情况下，所述组合物中最好包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。所述组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶可延迟注射组合物的吸收。
可如下制备无菌注射溶液剂：在合适溶剂加入需要量的所述活性化合物(例如PCIP蛋白片段或抗PCIP抗体)以及根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，然后过滤除菌。一般来说，分散剂的制备如下：在含有基础分散介质和需要的以上列举的其它成分的无菌溶媒中加入所述活性化合物。在用于制备无菌注射溶液剂的无菌粉的情况下，制备的优选方法是真空干燥和冷冻干燥，获得活性成分和其上述无菌过滤溶液需要的任何其它成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食载体。它们可灌装密封于明胶胶囊或压制成片。对于口服性治疗给药，可将所述活性化合物与赋形剂混合，并以片剂、锭剂或胶囊剂形式使用。也可以用流体载体配制口服组合物以用作口腔洗剂，其中流体载体中的所述化合物用于口腔、涮洗(swish)以及吐出或咽下。作为所述组合物的一部分可包含药学上匹配的结合物质和/或辅助物质。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含任何以下成分或相似性质的化合物：结合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙调味剂。
对于吸入给药，所述化合物以气雾剂形式从包含合适抛射剂(例如一种气体如二氧化碳)或雾化剂的压力容器或分散器传递给药。
经粘膜或经皮途径也可以系统给药。对于经粘膜或经皮给药，在所述制剂中使用适用于渗透屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域周知的，对于经粘膜给药包括例如去垢剂、胆汁酸盐和梭链孢酸衍生物。通过应用鼻喷雾或栓剂可达到经粘膜给药。对于经皮给药，所述活性化合物配制为本领域周知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。
所述化合物也可以制成直肠给药的栓剂(例如用常规栓剂基质如可可脂和其它甘油酯)或保留灌肠剂形式。
在一个实施方案中，所述活性化合物用保护所述化合物不被机体快速清除的载体一起配制，例如控释制剂，包括植入和微囊传递系统。可使用生物降解、生物适用性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这类制剂的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。这些物质也可以从Alza公司和NovaPharmaceuticals，Inc.市售获得。脂质体悬浮液(包括以抗病毒抗原的单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以按照本领域技术人员周知的方法制备，例如按照美国专利号4,522,811所述方法制备。
特别优选将口服或胃肠外组合物配制为易于给药而且剂量均一的剂量单位形式。本文使用的剂量单位形式是指适合用作需要治疗的接受者的单位剂量的物理独立单位；每个单位包含经预测产生需要治疗效应的预定量活性化合物和需要的药用载体。本发明的剂量单位形式的规格受制于而且直接取决于所述活性化合物的独特特性和需要达到的具体治疗效果，以及调配用于治疗各个个体的这样的活性化合物的技术上固有的限制。
应用例如测定LD50(50％个体致死的剂量)和ED50(50％个体治疗有效的剂量)的细胞培养或实验动物的标准药物方法可测定这类化合物的毒性和治疗效力。毒性和治疗效果的剂量比为治疗指数，它可表示为LD50/ED50比。优选治疗指数高的化合物。尽管可以使用具有毒性副作用的化合物，但是应该小心设计将这类化合物靶向受累组织部位的传递系统，以便使对未感染细胞的潜在损害最小，由此降低副作用。
在配制用于人类的剂量范围时可利用细胞培养测定和动物研究获得的数据。这类化合物的剂量最好在包括几乎没有毒性或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。该范围内的剂量可随使用的剂型和使用的给药途径而不同。对于本发明方法中使用的任何化合物，可根据细胞培养测定初步估计治疗有效剂量。在动物模型中可配制达到包括细胞培养测定的IC50(即实现对症状最大抑制作用的一半的受试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围的剂量。这类信息可用于更精确地确定在人类有用的剂量。例如用高效液相层析可测定血浆水平。
本文定义的蛋白或多肽治疗有效量(即有效剂量)范围为约0.001-30mg/kg体重，优选约0.01-25mg/kg体重，更优选约0.1-20mg/kg体重，甚至更优选约1-10mg/kg、2-9mg/kg、3-8 mg/kg、4-7mg/kg或5-6mg/kg体重。技术人员将认识到，某些因素可影响有效治疗受治疗者需要的剂量，包括但不限于所述疾病或障碍的严重程度、以前的治疗、受治疗者的一般健康状况和/或年龄以及存在的其它疾病。此外，应用治疗有效量蛋白、多肽或抗体治疗受治疗者可以包括单一治疗，或者最好可包括一系列治疗。
在一个优选实施例中，用于治疗受治疗者的抗体、蛋白或多肽范围为约0.1-20mg/kg体重，每周一次，连续约1-10周，优选2-8周，更优选约3-7周，甚至更优选约4、5或6周。还应该认识到的是，用于治疗的抗体、蛋白或多肽的有效剂量在具体治疗过程中可增加或减少。根据本文所述的诊断检测的结果可改变剂量而且是显而易见的。
本发明包括调节表达或活性的物质。一种物质可以是例如一种小分子。例如这样的小分子包括但不限于肽、肽模拟物(peptidomimetics)、氨基酸、氨基酸类似物、多核苷酸、多核苷酸类似物、核苷酸、核苷酸类似物、分子量低于约10,000g/mol的有机或无机化合物(即包括杂有机(heteroorganic)化合物或有机金属化合物)、分子量低于约5,000g/mol的有机或无机化合物、分子量低于约1,000g/mol的有机或无机化合物、分子量低于约500g/mol的有机或无机化合物、以及这样的化合物的盐、酯和其它药学上可接受的形式。
当然，小分子物质的合适剂量取决于在一般技术医师、兽医或研究人员知识范围内的许多因素。例如根据治疗患者或标本的类型(identity)、体型大小和状态，小分子物质的剂量不同，它还取决于给予所述组合物的途径(如果合适的话)和所述执业医师希望所述小分子对本发明的核酸或多肽产生的作用。
典型剂量包括每公斤患者或标本重量毫克量或微克量的所述小分子，例如每公斤约1μg至每公斤约500mg，每公斤约100μg至每公斤约5mg，或者每公斤约1μg指每公斤约50μg。此外，还应该指出的是，小分子的合适剂量取决于所述小分子对需要调节的表达或活性的效力。采用本文所述的测定可确定这样的合适剂量。当为了调节本发明的多肽或核酸的表达或活性，将给予一种动物(例如人类)这些小分子中一种或多种时，例如医师、兽医或研究人员开始可以处方较低剂量，然后逐渐增加剂量，直到获得合适反应。另外，理所当然的是，对任何特定动物接受者的具体剂量水平将取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性、接受者的年龄、体重、一般健康状况、性别和膳食、给药时间、给药途径、排泄速率、任何药物组合和需要调节表达或活性的程度。
此外，可把抗体(或其片段)与治疗部分例如细胞毒素、治疗药物或放射性金属离子结合。细胞毒素或细胞毒性物质包括对细胞有害的任何物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊甙(teneposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾丸激素、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗药物包括但不限于抗代谢剂(例如氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫基鸟嘌呤、阿糖孢苷、5-氟尿嘧啶、decarbazine)、烷化剂(例如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美发仑、卡莫司丁(BSNU)和洛莫司丁(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺式-二氯二氨铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如柔红霉素(以前称为daunomycin)和阿霉素)、抗生素类(例如放线菌素(以前称为更生霉素)、博莱霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
本发明的缀合物可用于改进特定生物反应。所述药物部分不能解释为限于经典的化学治疗药物。例如药物部分可以是具有需要生物活性的蛋白或多肽。这类蛋白可以包括例如一种毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；一种蛋白，例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织凝血酶激活物；或者生物反应调节剂，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-GSF”)或其它生长因子。
将这样的治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的，参阅例如Arnon等，“单克隆抗体在癌症治疗中免疫性靶向药物”，载于：Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“抗体用于药物传递”，载于：Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“在癌症治疗中细胞毒性药物的抗体载体：综述”，载于：Monoclonal Antibodies’84：Biological AndClinical Applications，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；“放射性标记的抗体在癌症治疗中的治疗性应用的分析、结果和前景展望”，载于：Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编辑)，第303-16页(Acadeemic Press 1985)以及Thorpe等，“抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性特性”，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。或者可将一种抗体与第二种抗体缀合形成抗体杂缀合物，如Segal在美国专利号4,676,980中所述。
本发明的核酸分子可插入载体中，并用作基因治疗载体。通过例如静脉内注射、局部给药(参见美国专利5,328,470)或定向注射(参阅例如Chen等(1994)Proc.natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)可将基因治疗载体传递给接受者。所述基因治疗载体的药用制剂可包括在可接受的稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包括基因传递媒介植入其中的缓释基质。另一方面，当可由重组细胞完整地产生完整的基因传递载体例如逆转录病毒载体时，所述药用制剂可包含产生所述基因传递系统的一种或多种细胞。
所述药用组合物可与使用说明书一起装入容器、包装或分配器中。V.本发明的用途和方法
本文所述的核酸分子、蛋白、蛋白同系物和抗体可用于以下一种或多种方法：a)筛选测定；b)预测医学(例如诊断测定、预后测定、监测临床实验和药物基因组学)；c)治疗方法(例如治疗和预防)。本文所述的本发明的PCIP蛋白具有一种或多种以下活性：(1)它作用于(例如结合)钾通道蛋白或其部分；(2)它调节钾通道蛋白或其部分的磷酸化状态；(3)它作用于(例如结合)钙，而且可以例如起作钙依赖性激酶的作用，例如以钙依赖性方式磷酸化钾通道或G蛋白连接的受体；(4)它作用于(例如结合)钙，而且例如可以用作钙依赖性转录因子；(5)它调节细胞(例如神经元细胞或心肌细胞)钾通道介导的活性，以例如有益地影响所述细胞；(6)它调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的染色质形成；(7)它调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的囊泡运输和蛋白转运；(8)它调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的细胞因子的信号活动；(9)它调节钾通道蛋白或其部分与细胞骨架的结合；(10)它调节细胞增殖；(11)它调节神经递质释放；(12)它调节膜兴奋性；(13)它影响膜的静息电位；(14)它调节动作电位的波形和频率；和(15)它调节兴奋阈，因此它可用于例如(1)调节钾通道蛋白或其部分的活性；(2)调节钾通道蛋白或其部分的磷酸化状态；(3)以钙依赖性方式调节钾通道或G蛋白连接的受体的磷酸化状态；(4)作用于(例如结合)钙，而且用作钙依赖性转录因子；(5)调节细胞(例如神经元细胞或心肌细胞)钾通道介导的活性，以例如有益地影响所述细胞；(6)调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的染色质形成；(7)调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的囊泡运输和蛋白转运；(8)调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的细胞因子信号活动；(9)调节钾通道蛋白或其部分与细胞骨架的结合；(10)调节细胞增殖；(11)调节神经递质释放；(12)调节膜兴奋性；(13)影响膜的静息电位；(14)调节动作电位的波形和频率；和(15)调节兴奋阈。
本发明的分离核酸分子可用于例如表达PCIP蛋白(例如在基因治疗应用中通过宿主细胞中的重组表达载体表达)、检测PCIP mRNA(例如检测生物样品中的PCIP mRNA)或检测PCIP基因的遗传改变以及调节PCIP活性，见下文详述。PCIP蛋白可用于治疗其特征为PCIP底物产生不足或过量或产生PCIP抑制剂的疾病。另外，PCIP蛋白可用于筛选天然存在的PCIP底物、筛选调节PCIP活性的药物或化合物以及治疗特征为PCIP蛋白产生不足或过量或产生与PCIP野生型蛋白相比其活性降低或异常的PCIP蛋白形式的疾病(例如诸如神经变性性障碍的CNS疾病，例如阿耳茨海默氏病、与阿耳茨海默氏病相关的痴呆(例如Pick病)、帕金森氏病和其它Lewy弥散体病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、癫痫、脊髓小脑性共济失调和Jakob-Creutzfieldt病；精神障碍，例如抑郁症、精神分裂症、Korsakoff精神病、燥狂、焦虑症、双相性情感障碍或恐怖症；学习或记忆障碍，例如遗忘症或年龄相关性记忆丧失；神经疾病，例如偏头痛；疼痛性疾病，例如痛觉过敏或与骨骼肌疾病相关的疼痛；脊髓损伤；中风以及头部损伤；或者心血管疾病，例如窦房结功能失调、心绞痛、心脏衰竭、高血压、心房纤维性颤动、心房扑动、扩张性心肌病、特发性心肌病、心肌梗死、冠状动脉病、冠状动脉痉挛或心律失常)。此外，本发明的抗PCIP抗体可用于检测和分离PCIP蛋白、调节PCIP蛋白的生物利用度以及调节PCIP活性。
A.筛选测定
本发明提供鉴定调节剂的方法(本文也称为“筛选测定”)，所述调节剂就是结合PCIP蛋白、对例如PCIP表达或PCIP活性具有刺激或抑制作用、或对例如PCIP底物的表达或活性具有刺激或抑制作用的候选或受试化合物或物质(例如肽、肽模拟物、小分子或其它药物)。
在一个实施方案中，本发明提供筛选为PCIP蛋白或多肽或其生物活性部分的底物的候选化合物或受试化合物的测定法。在另一个实施方案中，本发明提供筛选结合或调节PCIP蛋白或多肽或其生物活性部分的活性的候选化合物或受试化合物的测定法。应用本领域已知的组合文库法中无数方法中的任何一种方法可获得本发明的受试化合物，所述方法包括：生物文库；空间寻址(spatially addressable)平行固相文库或溶液相文库；需要去卷积(deconvolution)的合成文库法；‘一珠一化合物’文库法；和采用亲和层析选择的合成文库法。生物文库法限于肽文库，尽管其它4种方法适用于肽文库、非肽寡聚物文库或小分子化合物文库(Lam，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。
在本领域例如在以下文献中可找到合成分子文库方法的实例，所述文献有：DeWitt等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90：6909；Erb等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：11422；Zuckermann等(1994)J.Med.Chem.37：2678；Cho等(1993)Science 261：1303；Carrell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop等(1994)J.Med.Chem.37：1233。
化合物文库可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques13：412-421)、或者存在于珠子上(Lam(1991)Nature 354：82-84)、芯片上(Fodor(1993)Nature 364：555-556)、细菌上(Ladner USP 5,223,409)、孢子上(Ladner USP 409)、质粒上(Cull等(1992)Proc Natl Acad Sci USA89：1865-1869)或存在于噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249：386-390)；(Devlin(1990)Science 249：404-406)；(Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310)；(Ladner同上)。
在一个实施方案中，一种测定法为基于细胞的测定法，其中使表达PCIP蛋白或其生物活性部分的细胞与受试化合物接触，测定受试化合物调节PCIP活性例如结合钾通道或其部分的能力。通过监测例如表达PCIP细胞例如神经元细胞(如黑质神经元细胞)或心肌细胞释放的神经递质如多巴胺，可测定受试化合物调节PCIP活性的能力。此外，监测例如表达PCIP的细胞如心肌细胞的Ito电流或释放的神经递质，可测定受试化合物调节PCIP活性的能力。应用例如Hamill等1981.Pfluegers Arch.391：85-100)中所述的技术，采用在实施例部分描述的膜片钳技术，可检测细胞电流如Ito电流。所述细胞可以是例如哺乳动物来源。例如通过将PCIP底物与放射性同位素或酶标记物偶联，使得通过检测复合物中的标记PCIP底物可检测PCIP底物与PCIP的结合，从而可测定受试化合物调节PCIP结合底物的能力的能力。例如可用125I、35S、14C或3H直接或间接标记化合物(例如PCIP底物)，通过直接计数放射性辐射或液闪计数检测放射性同位素。或者可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶酶性标记化合物，并通过测定合适底物转化的产物检测酶性标记物。
测定一种化合物(例如PCIP底物)作用于没有标记任何反应物的PCIP的能力也属于本发明范畴。例如在没有标记化合物或PCIP的情况下，可用微型生理仪(microphysiometer)检测所述化合物与PCIP的作用。McConnell，H.M.等(1992)Science 257：1906-1912。本文使用的“微型生理仪”(例如细胞感受器)是利用光寻址电势感受器(light-addressable potentiometric sensor，LAPS)检测细胞酸化其环境的速率的分析装置。该酸化速率的变化可用作化合物和PCIP作用的指标。
在另一个实施方案中，一种测定法是基于细胞的测定法，包括使表达PCIP靶分子(例如钾通道或其片段)的细胞与受试化合物接触，测定受试化合物调节(例如刺激或抑制)PCIP靶分子活性的能力。例如通过测定PCIP蛋白结合或作用于PCIP靶分子例如钾通道或其片段的能力，从而可测定受试化合物调节PCIP靶分子活性的能力。
应用一种上述测定直接结合的方法可测定PCIP蛋白或其生物活性片段结合或作用于PCIP靶分子的能力。在一个优选的实施方案中，通过测定靶分子的活性可测定PCIP蛋白结合或作用于PCIP靶分子的能力。例如可以如下测定靶分子的活性：检测所述靶诱导的细胞第二信使(即细胞内Ca2+、二酰基甘油、IP3等)、检测所述靶对合适底物的催化/酶活性、检测对报道基因的诱导作用(包括与编码检测标记例如荧光素酶的核酸有效连接的靶效应调节元件)、检测靶调节的细胞反应，例如神经递质的释放。
在又一实施方案中，本发明的一种测定是与细胞无关的测定，其中PCIP蛋白或其生物活性部分与受试化合物接触，测定受试化合物结合PCIP蛋白或其生物活性部分的能力。用于本发明的测定的PCIP蛋白的优选生物活性部分包括参与作用于非PCIP分子例如钾通道或其片段的片段，或具有高表面概率记分(score)的片段。如上所述可直接或间接测定受试化合物与PCIP蛋白的结合。在一个优选的实施方案中，所述测定包括使PCIP蛋白或其生物活性部分与一种结合PCIP的已知化合物接触形成测定混合物，使所述测定混合物与受试化合物接触，测定受试化合物作用于PCIP蛋白的能力，其中测定受试化合物作用于PCIP蛋白的能力包括测定受试化合物优选结合PCIP或其生物活性部分的能力，与所述已知化合物比较而言。
在另一个实施方案中，所述测定为一种无细胞测定，其中PCIP蛋白或其生物活性部分与受试化合物接触，测定受试化合物调节(例如刺激或抑制)PCIP蛋白或其生物活性部分的活性的能力。例如应用一种上述测定直接结合的方法通过测定PCIP蛋白结合PCIP靶分子的能力，可测定受试化合物调节PCIP蛋白活性的能力。应用诸如实时生物分子作用分析(real-time Biomolecular Interaction Analysis，BIA)的技术也可以测定PCIP蛋白结合PCIP靶分子的能力。Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.63：2338-2345和Szabo等(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705。本文使用的“BIA”为实时研究生物特异性作用、而没有标记任何反应物(例如BIAcore)的技术。表面细胞质基因组共振(surface plasmon resonance，SPR)的光现象变化可用于指示生物分子之间的实时反应。
在一个替代实施方案中，可通过测定PCIP蛋白进一步调节PCIP靶分子下游效应物活性的能力，从而测定受试化合物调节PCIP蛋白活性的能力。例如可测定效应物分子对合适靶的活性或如上所述可测定效应物与合适靶的结合活性。
在再一实施方案中，所述无细胞测定包括使PCIP蛋白或其生物活性部分与一种结合PCIP蛋白的已知化合物接触形成测定混合物，使测定混合物与受试化合物接触，测定受试化合物作用于PCIP蛋白的能力，其中测定受试化合物作用于PCIP蛋白的能力包括测定PCIP蛋白优选结合或调节PCIP靶分子活性的能力。
本发明的无细胞测定适用于可溶形式和/或膜结合形式的分离蛋白。在其中使用膜结合形式分离蛋白(例如钾通道)的无细胞测定时，可能最好使用增溶剂，使膜结合形式分离蛋白保持为溶液。这样的增溶剂实例包括非离子去垢剂，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(glucamide)、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、TritonX-100、TritonX-114、Thesit、异十三烷基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-乙醇酰胺(cho1amido)丙基)二甲基氨合(amminio)]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、3-[(3-乙醇酰胺丙基)二甲基氨合]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-氨合-1-丙烷磺酸盐。
在本发明以上测定法的一个以上的实施方案中，最好固定PCIP或其靶分子，有助于分离复合形式与非复合形式的一种所述蛋白或所述蛋白两者以及适应所述测定法的自动化。在任何适合盛装所述反应物的容器中可在具有和没有候选化合物的情况下，完成受试化合物与PCIP蛋白的结合或PCIP蛋白与靶分子的作用。这样的容器实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可提供加入一个使得一种所述蛋白或所述蛋白两者与基质结合的结构域的融合蛋白。例如可将谷胱甘肽S转移酶/PCIP融合蛋白或谷胱甘肽S转移酶/靶融合蛋白吸附在谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上或谷胱甘肽衍生微量滴定板上，然后使其与受试化合物混合或者使其与受试化合物和或者非吸附靶蛋白或者PCIP蛋白混合，最后在有助于复合物形成的条件下(例如生理条件的盐和pH)温育所述混合物。温育后，洗涤珠子或微量滴定板各孔去除任何未结合的组分，如果为珠子则固定基质，例如如上所述直接或间接测定复合物。或者，可将复合物与基质解离，用标准技术测定PCIP结合或活性水平。
在本发明的筛选测定中也可以使用将蛋白固定在基质上的其它技术。例如利用生物素和链霉抗生物素蛋白结合可固定PCIP蛋白或PCIP靶分子。可用本领域已知的技术(例如生物素化试剂盒，PierceChemicals，Rockford，IL)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化PCIP蛋白或靶分子，将其固定在链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)的各孔中。或者，可将与PCIP蛋白或靶分子反应但是不会干扰PCIP蛋白与其靶分子结合的抗体衍化至微量滴定板的各孔中，通过抗体结合可将未结合的靶或PCIP蛋白捕获在各孔中。除了以上所述的GST-固定复合物的方法之外，检测这样的复合物的方法包括利用与PCIP蛋白或靶分子反应的抗体免疫检测复合物以及取决于检测与PCIP蛋白或靶分子结合的酶活性的酶联测定法。
在一个优选的实施方案中，使用例如Komada M.等(1999)GenesDev.13(11)：1475-85和Roth M.G.等(1999)Chem.Phys.Lipids.98(1-2)：141-52(其内容通过应用结合到本文中)中所述的测定法，测试候选或受试化合物或物质抑制或刺激PCIP分子调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的囊泡转运和蛋白转运的能力的能力。
在另一个优选实施方案中，使用例如体外激酶测定法测试候选或受试化合物或物质抑制或刺激PCIP分子调节钾通道蛋白或其部分磷酸化状态的能力的能力。简而言之，可在含有氯化镁和氯化锰例如10mM氯化镁和5mM氯化锰的缓冲液中，使PCIP靶分子例如表达这种分子的细胞系的免疫沉淀钾通道与PCIP蛋白和放射性ATP例如[γ-32P]ATP温育。温育后，可在还原条件下通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离免疫沉淀的PCIP靶分子例如钾通道，将其转移到膜例如PVDF膜上并进行放射自显影。放射自显影上可检测带型表明，PCIP底物例如钾通道已经磷酸化。也可以对磷酸化底物进行磷酸氨基酸分析，确定PCIP底物上的哪个残基磷酸化。简而言之，可从SDS凝胶切除放射性磷酸化蛋白带，使其进行部分酸水解。然后可通过单向电泳分离产物，例如用磷酸成象仪进行分析，并与茚三酮染色的磷酸氨基酸标准品比较。也可以使用各种测定法，例如Tamaskovic R.等(1999)Biol.Chem.380(5)：569-78(其内容通过引用结合到本文中)中所述的测定法。
在另一个优选实施方案中，采用例如Liu L.(1999)Cell Signal.11(5)：317-24和Kawai T.等(1999)Oncogene 18(23)：3471-80(其内容通过引用结合到本文中)中所述的测定法，测试候选或受试化合物或物质抑制或刺激PCIP分子作用于(例如结合)钙的能力的能力。
在另一个优选实施方案中，使用例如Okuwaki M.等(1998)J.Biol.Chem.273(51)：34511-8和Miyaji-Yamaguchi M.(1999)J.Mol.Biol.290(2)：547-557(其内容通过引用结合到本文中)中所述的测定法，测试候选或受试化合物或物质抑制或刺激PCIP分子调节细胞染色质形成的能力的能力。
在又一优选实施方案中，使用例如Baker F.L.等(1995)Cell Prolif.28(1)：1-15、Cheviron N.等(1996)Cell Prolif.29(8)：437-46、Hu Z.W.等(1999)J.Pharmacol.Exp.Ther.290(1)：28-37和Elliott K.等(1999)Oncogene 18(24)：3564-73(其内容通过引用结合到本文中)中所述的测定法，测试候选或受试化合物或物质抑制或刺激PCIP分子调节细胞增殖的能力的能力。
在一个优选实施方案中，采用例如Gonzalez C.等(1998)Cell Mol.Biol.44(7)：1117-27和Chia C.P.等(1998)Exp.Cell Res.244(1)：340-8(其内容通过引用结合到本文中)中所述的测定法测试候选或受试化合物或物质抑制或刺激PCIP分子调节钾通道蛋白或其部分与细胞骨架结合的能力的能力。
在另一个优选实施方案中，使用例如Bar-Sagi D.等(1985)J.Biol.Chem.260(8)：4740-4和Barker J.L.等(1984)Neurosci.Lett.C47(3)：313-8(其内容通过引用结合到本文中)中所述的测定法，测试候选或受试化合物或物质抑制或刺激PCIP分子调节膜兴奋性的能力的能力。
在另一个优选实施方案中，使用例如Nakashima Y.等(1999)J.Bone Joint Surg.Am.81(5)：603-15(其内容通过引用结合到本文中)中所述的测定法，测试候选或受试化合物或物质抑制或刺激PCIP分子调节细胞例如神经元细胞或心肌细胞的细胞因子信号活动的能力的能力。
在另一个实施方案中，用一种方法鉴定PCIP表达调节物，其中使一种细胞与候选化合物接触，测定细胞的PCIP mRNA或蛋白表达。比较存在候选化合物的PCIP mRNA或蛋白表达水平与缺乏候选化合物的PCIP mRNA或蛋白的表达水平。然后根据此比较可鉴定所述候选化合物为PCIP表达调节物。例如当存在候选化合物的PCIP mRNA或蛋白表达高于(在统计学上显著高于)缺乏所述候选化合物的表达水平时，则鉴定所述活性化合物为PCIP mRNA或蛋白表达的刺激剂。另一方面，当存在候选化合物的PCIP mRNA或蛋白表达低于(在统计学上显著低于)缺乏所述候选化合物的表达水平时，则鉴定所述活性化合物为PCIP mRNA或蛋白表达的抑制剂。应用本文所述的关于检测PCIP mRNA或蛋白的方法可测定细胞的PCIP mRNA或蛋白表达水平。
本发明的再一方面，在双杂交测定或三杂交测定(参见例如美国专利号5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72：223-232；Madura等(1993)J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques14：920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene 8：1693-1696；和Brent WO 94/10300)中PCIP蛋白可用作“饵蛋白”，以鉴定结合或作用于PCIP(“PCIP-结合蛋白”或“PCIP-bp”)并涉及PCIP活性(在下文实施例部分中更详细描述)的其它蛋白。这样的PCIP-结合蛋白也可能参与PCIP蛋白或PCIP靶的信号传播，作为例如PCIP介导信号途径的下游元件。或者，这样的PCIP-结合蛋白可能为PCIP抑制剂。
双杂交系统的基础是大多数转录因子的模块特性，大多数转录因子由独立的DNA结合结构域和活化结构域组成。简而言之，所述测定利用两种不同DNA构建物。在一种构建物中，编码PCIP蛋白的基因与编码已知转录因子(例如GAL-4)的DNA结合结构域的基因融合。在另一个构建物中，使编码未鉴定蛋白(“捕获物”或“样品”)、得自一个DNA序列文库的DNA序列与编码已知转录因子的活化结构域的基因融合。如果“饵”和“捕获”蛋白能够在体内相互作用形成PCIP依赖性复合物，则所述转录因子的DNA结合结构域和活化结构域紧密靠近。这种密切靠近使得与转录因子效应性转录调节位点有效连接的报道基因(例如LacZ)发生转录。可检测报道基因的表达，分离含有功能性转录因子的细胞集落，用其获得编码作用于PCIP蛋白的蛋白的克隆基因。
本发明还涉及上述筛选测定法鉴定的新型物质。因此，进一步在合适动物模型中使用按照本文所述鉴定的药物也属于本发明范畴。例如在动物模型中可以使用按照本文所述鉴定的药物(例如PCIP调节剂、反义PCIP核酸分子、PCIP特异性抗体或PCIP结合配偶体)，以确定用这种药物治疗的效能、毒性或副作用。或者可在动物模型中使用按照本文所述鉴定的一种药物来确定这种药物的作用机制。此外，本发明涉及用上述筛选测定法鉴定的新型药物进行治疗，例如用于治疗CNS疾病或心血管疾病，见本文所述。B.检测测定
可以多种方式将本文鉴定的cDNA序列的各部分或片段(以及相应的完整基因序列)用作多核苷酸试剂。例如这些序列可用于：(i)将其相应的基因作图于染色体上；因此定位与遗传疾病有关的基因区；(ii)用微量生物样品鉴别个体(组织分型)；以及(iii)有助于法医鉴定生物样品。在以下分小节中描述这些应用。
1.染色体作图
在分离基因的序列(或其一部分序列)后，就可用此序列将基因位置作图在染色体上。这种方法称为染色体作图。因此，可用本文所述的PCIP核苷酸序列的各部分或片段将PCIP基因的位置作图在染色体上。在将这些序列与疾病相关基因联系起来时，重要的第一步是把PCIP序列作图在染色体上。
简而言之，通过由PCIP核苷酸序列制备PCR引物(优选15-25 bp长度)可将PCIP基因作图在染色体上。可用计算机分析PCIP序列，预测不会超过一个以上基因组DNA外显子的引物，因此使扩增过程复杂化。然后可用这些引物对包含人类个体染色体的体细胞杂交体进行PCR筛选。只有含有相当于PCIP序列的人类基因的那些杂交体才产生扩增片段。
通过融合不同哺乳动物的体细胞(例如人体细胞和小鼠细胞)，制备体细胞杂交体。随着人体和小鼠细胞的杂交体的生长和分裂，它们逐渐随机丢失人体染色体，但是保留小鼠染色体。采用小鼠细胞不能生长(因为它们缺乏一种特定的酶)、但是人体细胞可生长的培养基，可保留包含编码需要酶的基因的一个人体染色体。通过采用不同培养基可建立不同系列的杂交细胞系。一个系列的每种细胞系含有或者单个人体染色体或少数人体染色体和整套小鼠染色体，使得容易将各个基因作图到特定人类染色体。(D’Eustachio P.等(1983)Science 220：919-924)。采用具有易位和缺失的人体染色体也可以产生仅含有人体染色体片段的体细胞杂交体。
体细胞杂交体的PCR作图是一种将特定序列定位到具体染色体的快速方法。采用单个热循环仪每天可定位3个或更多序列。采用PCIP核苷酸序列设计寡核苷酸引物，可用特定染色体的各种片段实现亚定位。可类似地用来将PCIP序列作图到其染色体上的其它作图策略包括原位杂交(描述于Fan，Y.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：6223-27)、用标记的流式分选染色体预筛选和与染色体特定cDNA文库杂交的预选择。
可进一步采用DNA序列与展开的中期染色体的荧光原位杂交(FISH)，达到以一个步骤精确定位染色体。用破坏有丝分裂纺锤体的化学物质如秋水仙酰胺阻滞中期分裂的细胞制备展开的染色体。可用胰蛋白酶简短处理染色体，然后用Giemsa染色。每个染色体显示浅带和深带分布型，使得可鉴定各个染色体。FISH技术可用于短至500或600个碱基的DNA序列。但是，1,000个破基以上的克隆以足够信号强度结合独特染色体部位的可能性更高，使检测更简便。优选1,000个碱基、更优选2,000个碱基在合理的时间足以获得良好的结果。关于该技术的综述参阅Verma等，Human Chromosomes：A Manual ofBasic Techniques(Pergamon Press，New York 1988)。
可单独应用染色体作图试剂标记一个染色体或所述染色体上的单一位点，或者可用不同系列试剂标记多个位点和/或多个染色体。优选实际上相当于基因非编码区的试剂用于作图。编码序列在基因家族中可能更保守，所以增加染色体作图的交叉杂交的机会。
一旦序列精确定位作图到染色体，所述序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据可能有关。(这样的数据见于例如V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man，available on-line through Johns HopkinsUniversity Welch Medical Library)。然后可以通过描述于例如Egeland，J.等(1987)Nature 325：783-787的连锁分析(物理邻近基因共同遗传)鉴定作图到相同染色体区的基因和疾病的关系。
此外，可测定患有PCIP基因相关疾病个体和未患PCIP基因相关疾病的个体的DNA序列差异。如果在部分或全部患者观测到一种突变，而没有在任何非患者发现这种突变，则这种突变可能是所述具体疾病的病因。比较患者和非患者一般包括：首先观测染色体结构改变，例如从展开的染色体可见或采用基于所述DNA序列的PCR可检测的缺失或易位。最后，可对数个个体的基因进行完整的测序，证实存在突变而且区别突变与多态性。
2.组织分型
本发明PCIP序列也可用于由微量生物样品鉴别不同个体。例如美国军队正在考虑采用限制性片段长度多态性(RFLP)鉴别其军人。在该技术中，用一种或多种限制酶消化个体基因组DNA，在DNA印迹上进行探测，获得供鉴定的独特带型。这种方法没有现有的“DogTags”的限制，“Dog Tags”可能丢失、转换或被盗，导致难以正确鉴别。本发明的序列可用作RFLP的额外DNA标记(描述于美国专利5,272,057)。
另外，本发明的序列可用于提供测定个体基因组选定部分的真正的逐个碱基的DNA序列的替代技术。所以，本文所述PCIP核苷酸序列可用于制备所述序列5’和3’末端的两种PCR引物。然后可用这些引物扩增个体的DNA，随后对其测序。
用这种方法制备的各个个体不同系列的相应DNA序列可提供独特的个体鉴别，因为每个个体由于等位基因变异而具有一套独特的这样的DNA序列。本发明的序列可用于获得这样的不同个体和组织的鉴别序列。本发明的PCIP核苷酸序列独特地代表部分人类基因组。等位基因变异在一定程度上发生于这些序列的编码区，而更大程度上发生于非编码区。据估计，人类个体发生等位基因变异的频率为约每500个碱基1次。一定程度上本文所述的每种序列可用作标准品，以比较鉴定个体DNA。因为大多数多态性发生于非编码区，所以只需要较少的序列就可区别不同个体。非编码区序列可以一组约10-1,000个引物良好地正确鉴定个体，所述引物各产生一个100个碱基的非编码扩增序列。如果使用预定的编码序列，则用于正确个体鉴定的更合适引物数应该为500-2,000个。
如果使用一组本文所述PCID核苷酸序列的试剂产生用于个体的独特鉴定数据库，则这些相同的试剂以后可用于鉴定所述个体的组织。采用独特鉴定数据库，可用极其微量的组织样品正确鉴定活的或死的个体。
3.部分PCIP序列在法医生物学中的应用
基于DNA的鉴别技术也可以用于法医生物学。法医生物学是利用对犯罪现场发现的生物证据进行遗传分型，作为明确鉴定例如犯罪者的手段的科学领域。为了实现这样的鉴定，可用PCR技术扩增取自非常微量的生物样品的DNA序列，所述生物样品例如为在犯罪现场找到的组织(例如头发或皮肤)、或体液(例如血液、唾液或精液)。然后可将扩增序列与标准品进行比较，由此可鉴定生物样品的来源。
可使用本发明的序列获得针对人类基因组特定基因座的多核苷酸试剂(例如PCR引物)，它通过例如提供另一种“鉴定标记”(例如特定个体独特的另一种DNA序列)可增强基于DNA法医鉴定的可靠性。如上所述，作为限制酶产生的片段构成的分布型的一种准确替代方法，实际的碱基序列信息可用于鉴定。针对非编码区的序列对于此应用特别合适，因为更多的多态性发生于非编码区，使得应用该技术更易于区分不同个体。多核苷酸试剂实例包括至少20个碱基、优选至少30个碱基长度的PCIP核苷酸序列或其部分。
本文所述的PCIP核苷酸序列可进一步用于提供多核苷酸试剂，例如可用于例如鉴定特定组织如大脑组织的原位杂交技术的标记探针或可标记探针。这在提供给法医病理学者的组织不知道来源的情况下可能非常有用。不同系列的这类PCIP探针可用于鉴定不同物种和/或器官类型的组织。
以相似的方式，可使用这些试剂例如PCIP引物或探针筛选污染的组织培养物(即筛除不同细胞类型的混合培养物)。C.预测医学
本发明还涉及预测医学领域，其中诊断测定、预测测定和监测临床试验用于预示(预测)目的，由此预防性治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及这样的诊断测定：用于测定生物样品(例如血液、血清、细胞、组织)的PCIP蛋白和/或核酸表达以及PCIP活性，由此确定一个个体是否患有疾病或障碍或者是否有发生与PCIP表达或活性异常相关疾病的风险。本发明还提供确定个体是否具有发生PCIP蛋白、核酸表达或活性相关疾病的风险的预示(预测)测定法。例如可以测定生物样品中的PCIP基因突变。这样的测定可用于预示或预测目的，由此在发生特征在于PCIP蛋白、核酸表达或活性或者与其相关的疾病之前预防性治疗个体。
本发明另一个方面涉及监测物质(例如药物、化合物)在临床试验中对PCIP表达或活性的影响。
这些物质以及其它物质在以下部分中更详细地描述。
1.诊断测定
检测生物样品中存在或缺乏PCIP蛋白或核酸的典型方法包括：从受试者获取生物样品，使生物样品接触能够测定PCIP蛋白或编码PCIP蛋白的核酸(例如mRNA、基因组DNA)的化合物或物质，以便检测生物样品中存在的PCIP蛋白或核酸。用于检测PCIP mRNA或基因组DNA的优选物质为能够与PCIP mRNA或基因组DNA杂交的标记核酸探针。所述核酸探针可以是例如全长PCIP核酸，例如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核酸或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993或98994保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段，或者为它们的一部分，例如至少15、30、50、100、250或500个核苷酸长度而且足以在严格条件下与PCIP mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。本文描述了用于本发明诊断测定的其它合适探针。
检测PCIP蛋白的优选物质为能够结合PCIP蛋白的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以为多克隆抗体，或者更优选单克隆抗体。可使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab’)2)。关于所述探针或抗体的术语“标记的”意味着包括通过可检测物质与探针或抗体连接(即物理连接)直接标记的探针或抗体，以及利用与另一种直接标记试剂的反应性间接标记的探针或抗体。间接标记的实例包括利用荧光标记的二抗检测一抗，以及用生物素末端标记的DNA探针，这样可用荧光标记的链霉抗生物素蛋白对其进行检测。术语“生物样品”意味着包括从受试者分离获得组织、细胞和生物体液以及存在于受试者体内的组织、细胞和体液。也就是说，本发明的检测方法可用于检测体外以及体内生物样品的PCIP mRNA、蛋白或基因组DNA。例如检测PCIPmRNA的体外技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。检测PCIP蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISa)、蛋白质印迹分析、免疫沉淀和免疫荧光。检测PCIP基因组DNA的体外技术包括DNA印迹杂交。而且，检测PCIP蛋白的体内技术包括将标记的抗PCIP抗体导入受试者体内。例如可用放射性标记物标记抗体，可用标准成象技术检测放射标记物在受试者体内的存在以及部位。
在一个实施方案中，所述生物样品含有受试者的蛋白分子。或者，所述生物样品可能含有受试者的mRNA分子或受试者的基因组DNA分子。优选的生物样品为采用常规方法从受试者分离获得的血清样品或脑脊液。
在另一个实施方案中，所述方法进一步包括从对照对象获得对照生物样品，使对照样品接触能够检测PCIP蛋白、mRNA或基因组DNA的化合物或物质，使得可以检测生物样品中存在的PCIP蛋白、mRNA或基因组DNA，比较对照样品中存在的PCIP蛋白、mRNA或基因组DNA和受试样品中存在的PCIP蛋白、mRNA或基因组DNA。
本发明还包括用于检测生物样品是否存在PCIP的试剂盒。例如，所述试剂盒可包含能够检测生物样品中的PCIP蛋白或mRNA的标记化合物或物质；检测样品PCIP量的方法；比较样品PCIP量与标准量的方法。可用合适容器包装所述化合物或物质。所述试剂盒还可以包含使用所述试剂盒检测PCIP蛋白或核酸的说明书。
2.预测测定
此外，可利用本文所述的诊断方法鉴定患有PCIP表达或活性异常相关疾病或障碍或者可能发生所述疾病或障碍的对象。例如，本文所述的测定法，例如前述的诊断测定法或以下的测定法，可用于鉴定患有PCIP蛋白活性或核酸表达调节异常相关疾病或者可能发生所述疾病的对象，所述疾病例如为神经退行性障碍，例如阿耳茨海默氏病、与阿耳茨海默氏病相关的痴呆(例如Pick病)、帕金森氏病和其它Lewy弥散体病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、癫痫、脊髓小脑性共济失调和Jakob-Creutzfieldt病；精神障碍，例如抑郁症、精神分裂症、Korsakoff精神病、燥狂、焦虑症、双相性情感障碍或恐怖症；学习和记忆障碍如遗忘症或年龄相关性记忆丧失；神经疾病，例如偏头痛；疼痛性疾病，例如痛觉过敏或与骨骼肌疾病有关的疼痛；脊髓损伤；中风以及头部损伤；或者心血管疾病，例如窦房结功能失调、心绞痛、心脏衰竭、高血压、心房纤维性颤动、心房扑动、扩张性心肌病、特发性心肌病、心肌梗死、冠状动脉病、冠状动脉痉挛或心律失常。
或者，可以所述预测测定鉴定患有PCIP蛋白活性或核酸表达调节异常相关疾病(例如钾通道相关疾病)的患者或可能患所述疾病的风险个体。因此，本发明提供鉴定PCIP表达或活性异常相关疾病或障碍的方法，其中从受试者获得受试样品，检测PCIP蛋白或核酸(例如mRNA或基因组DNA)，其中存在PCIP蛋白或核酸就可诊断患有PCIP表达或活性异常相关疾病或障碍的患者或可能患所述疾病的对象。本文使用的“受试样品”是指从目标对象获得的生物样品。例如受试样品可以为生物体液(例如血清)、细胞样品或组织。
此外，本文所述的预测测定可用于确定是否可以给予受治疗者一种药物(例如激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白、肽、核酸、小分子或其它候选药物)，以治疗PCIP表达或活性异常相关疾病或障碍。例如可以用这类方法确定是否可用一种药物有效治疗受治疗者的CNS疾病或心血管疾病。因此，本发明提供确定是否可以用一种药物有效治疗受治疗者的PCIP表达或活性异常相关疾病的方法，在该方法中首先获取受试样品，检测PCIP蛋白或核酸表达或活性(例如其中PCIP蛋白或核酸表达或活性的多度是诊断可给予所述药物治疗PCIP表达或活性异常相关疾病的对象的依据)。
本发明的方法还可以用于检测PCIP基因的遗传改变，由此确定改变基因的对象是否可能患特征为PCIP蛋白活性或核酸表达调节异常的疾病例如CNS疾病或心血管疾病。在优选实施方案中，所述方法包括检测所述对象的细胞样品存在或没有遗传改变，这种改变的特征为至少一种改变影响编码PCIP蛋白的基因的完整性或使PCIP基因表达异常。例如通过明确存在至少一种以下情况可检测这样的遗传改变1)PCIP基因缺失一个或多个核苷酸；2)在PCIP基因中添加一个或多个核苷酸；3)取代PCIP基因的一个或多个核苷酸；4)PCIP基因的染色体重排；5)PCIP基因信使RNA转录物水平的变化；6)PCIP基因修饰异常，例如基因组DNA的甲基化形式修饰；7)存在非野生型剪接形式的PCIP基因信使RNA转录物；8)非野生型PCIP蛋白的水平；9)PCIP基因的等位基因丢失；以及10)PCIP蛋白翻译后不正确的修饰。如本文所述，在本领域中有许多已知的可用于检测PCIP基因改变的测定方法。优选的生物样品为用常规方法从受试者分离的组织或血清样品。
在部分实施方案中，检测PCIP基因改变涉及在聚合酶链反应(PCR)(参见例如美国专利号4,683,195和4,683,202)例如锚式PCR或RACE PCR中使用探针/引物，或者在连接链反应(LCR)(参见例如Landegran等(1988)Science 241：1077-1080；和Nakazawa等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：360-364)中使用探针/引物，其中后者对检测PCIP基因点突变可能特别有用(参见Abravaya等(1995)Nucleic AcidsRes 23：675-682)。该方法可包括以下步骤：从目标对象收集细胞样品，从细胞样品分离核酸(例如基因组、mRNA或二者)，使核酸样品接触一种或多种引物，此引物在PCIP基因(如果存在)可杂交和扩增的条件下特异性与PCIP基因杂交，以及检测扩增产物存在与否，或者检测扩增产物的大小并比较其与对照样品的长度。据预测，PCR和/或LCR可能最好与用于检测本文所述突变的任何技术一起用作初步扩增步骤。
替代的扩增方法包括：自动维持序列扩增(Guatelli，J.C.等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh，D.Y.等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi，P.M.等(1988)Bio-Technology 6：1197)或者任何其它核酸扩增方法，然后用本领域技术人员周知的技术检测所扩增的分子。如果这类分子存在的数量非常少，这些检测方案对检测核酸分子特别有用。
在一个替代实施方案中，通过改变限制酶切割方式可鉴定细胞样品PCIP基因突变。例如，分离样品和对照DNA，扩增(可选)，用一种或多种限制性内切核酸酶消化，以凝胶电泳测定片段长度大小，并进行比较。样品和对照DNA的片段长度大小不同说明样品DNA存在突变。此外，可用序列特异性核酶(参见例如美国专利号5,498,531)通过核酶切割位点的增加或丧失计算出特异性突变存在与否。
在其它实施方案中，可如下鉴定PCIP遗传突变：使样品和对照核酸例如DNA或RNA杂交到含有数百个或数千个寡核苷酸探针的高密度阵列中(Cronin，M.T.等(1996)Human Mutation 7：244-255；Kozal，M.J.等(1996)Nature Medicine 2：753-759)。例如，用含有产生光的DNA探针的二维阵列可鉴定PCIP遗传突变，见Cronin，M.T.等(同上)所述。简而言之，可用第一个探针杂交阵列检测样品和对照中的DNA长序列段，以通过对序列重叠探针进行线性排列而鉴定所述序列之间的碱基变化。这一步骤可鉴定点突变。该步骤后的第二个杂交阵列通过采用与所检测的全部变异或突变互补的较小的特化探针阵列，可特征鉴定特异性突变。每个突变阵列由平行的两个探针组构成，一个探针组与野生型基因互补，而另一个探针组与突变基因互补。
在再一实施方案中，可用本领域已知的各种测序反应中的任何一种直接对PCIP基因进行测序，并通过比较样品PCIP序列与相应野生型(对照)序列而鉴定突变。测序反应的实例包括基于Maxam和Gilbert((1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：560)或Sanger((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463)开发的技术的测序反应。此外，据预测，当进行诊断测定时可使用各种自动测序方法中的任何一种((1995)Biotechniques 19：448)，包括用质谱法测序(参见例如PCT国际公开号WO 94/16101；Cohen等(1996)Adv.Chromatogr.36：127-162；和Griffin等(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38：147-159)。
检测PCIP基因突变的其它方法包括这样的方法：利用对切割物质的保护检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中的碱基错配(Myers等(1985)Science 230：1242)。一般来说，本领域的“错配切割”技术首先用获自组织样品的可能突变的RNA或DNA与含有野生型PCIP序列的(标记)RNA或DNA杂交形成异源双链体。用切割所述双链体的单链区的物质处理所述双链双链体，所述单链区例如为因为对照和样品链的碱基对错配而存在的单链区。例如可用RNA酶处理RNA/DNA双链体，而用S1核酸酶处理DNA/DNA杂交体，以酶性消化错配区。在其它实施方案中，可用羟胺或四氧化锇和哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体，以便消化错配区。消化错配区后，则在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过大小分离所述生成物质，以确定突变位置。参见例如Cotton等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4397；Saleeba等(1992)Methods Enzymol.217：286-295。在一个优选实施方案中，可标记对照DNA或RNA以便进行检测。
在再一实施方案中，所述错配切割反应在已知系统中使用识别双链DNA错配碱基对的一种或多种蛋白(所谓的“DNA错配修复”酶)，从而检测获自细胞样品的PCIP cDNA的点突变并对其作图。例如，大肠杆菌的mutY酶切割G/A错配中的A，而HeLa细胞的胸苷DNA糖基化酶切割G/T错配中的T(Hsu等(1994)Carcinogenesis 15：1657-1662)。根据一个典型实施方案，使基于PCIP序列例如野生型PCIP序列的探针与受试细胞的cDNA或其它DNA制品杂交。用DNA错配修复酶处理所述双链体，如果有的话，可根据电泳方法等检测切割产物。参见例如美国专利号5,459,039。
在其它实施方案中，可用电泳迁移率改变鉴定PCIP基因突变。例如可用单链构象多态性(SSCP)检测突变核酸和野生型核酸之间的电泳迁移率差异(Orita等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2766，此外参见Cotton(1993)Mutat.Res.285：125-144；和Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9：75-79)。使样品的单链DNA片段和对照PCIP核酸变性，并使其复性。单链核酸的二级结构随序列而变化，所产生的电泳迁移率改变使得能够检测甚至单个碱基的变化。可用标记探针标记或检测DNA片段。采用RNA(而不是DNA)增强所述检测的敏感性，其中所述二级结构对序列变化更敏感。在一个优选实施方案中，所述主题方法采用异源双链体分析根据电泳迁移率变化分离双链异源双链体分子(Keen等(1991)Trends Genet 7：5)。
在又一实施方案中，用变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定突变片段或野生型片段在含梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中的移动(Myers等(1985)Natire 313：495)。当把DGGE用作分析方法时，修饰DNA以保证它不完全变性，例如通过PCR加入约40bp富含GC的高熔点DNA的GC夹。在再一实施方案中，使用温度梯度代替变性梯度鉴定对照和样品DNA的迁移率差异(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys Chem265：12753)。
用于检测点突变的其它技术实例包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如可以制备寡核苷酸引物，其中所述已知突变位于中央，然后使其在只有完全匹配才可以杂交的条件下与靶DNA杂交(Saiki等(1986)Nature 324：163)；Saiki等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230)。当等位基因特异性寡核苷酸与杂交膜结合并与标记靶DNA杂交时，使所述寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA或无数不同突变杂交。
或者，可结合本发明使用依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术。用作特异性扩增的引物的寡核苷酸可以在分子中心(这样扩增依赖于不同杂交)(Gibbs等(1989)Nucleic Acids Res.17：2437-2448)或一种引物的3’末端携带目的突变，其中在所述分子中心或3’末端于合适条件下可防止错配或减少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech 11：238)。另外，最好是在所述突变区引入新的限制位点，以实现基于切割的检测(Gasparini等(1992)Mol.Cell Probes 6：1)。据预计，在某些实施方案中，也可以用扩增用的Taq连接酶进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189)。在这样的情况下，只有当在5’序列的3’末端完全匹配，使得可以通过检查扩增存在与否而检测在特异性位点存在已知突变时，才能进行连接。
例如采用预先包装好的诊断试剂盒可进行本文所述的方法，所述试剂盒包含至少一种本文所述的探针核酸或抗体试剂，例如在临床环境(in clinical setting)中可常规使用所述试剂盒，以诊断具有涉及PCIP基因的疾病症状或具有所述疾病家族史的患者。
此外，在本文所述的预测测定中可使用其中表达PCIP的任何细胞类型或组织。
3.监测临床试验效果
监测各种物质(例如药物)对PCIP蛋白的表达或活性的作用(例如调节膜兴奋性或静息电位)不仅适用于基础药物筛选，而且适用于临床试验。例如在具有PCIP基因表达、蛋白水平降低或PCIP活性下调表现的患者的临床试验中，可监测通过本文所述筛选测定确定的增强PCIP基因表达、蛋白水平或上调PCIP活性的药物的效果。或者，在具有PCIP基因表达、蛋白水平增加或PCIP活性上调表现的患者的临床试验中，可监测通过本文所述筛选测定确定的降低PCIP基因表达、蛋白水平或下调PCIP活性的药物的效果。在这样的临床试验中，PCIP基因、优选涉及例如钾通道相关疾病的其它基因的表达或活性可用作具体细胞表型的“读数”或标记。
作为举例，而不是限制本发明，可鉴定在细胞内受到调节PCIP活性(例如以本文所述筛选测定鉴定)物质(例如化合物、药物或小分子)处理调节的包括PCIP在内的基因。因此，为了研究各种物质对钾通道相关疾病的作用，例如在临床试验中，可分离细胞，制备RNA，分别分析PCIP和涉及钾通道相关疾病的其它基因的表达水平。可如下定量基因表达水平(例如一种基因表达形式)：本文所述的RNA印迹分析或RT-PCR，或者用本文所述的一种方法检测所产生的蛋白质量，或者检测PCIP或其它基因的活性水平。由此可见，所述基因表达形式可用作一种标记，指示细胞对所述物质的生理反应。因此，在用所述物质治疗患者之前、治疗期间的不同时间点可检测这样的反应情况。
在一个优选实施方案中，本发明提供监测一种物质(例如激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白、肽、核酸、小分子或用本文所述筛选测定鉴定的其它候选药物)治疗患者的效果的方法，包括以下步骤：(i)在给予所述物质之前从患者获取给药前的样品；(ii)检测给药前样品中的PCIP蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)从所述患者获取一个或多个给药后样品；(iv)检测给药后样品中的PCIP蛋白、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平；(v)比较给药前样品与给药后一个样品或多个样品的PCIP蛋白、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平；以及(vi)相应地改变给予所述患者的药物。例如可能需要增加给予所述药物，以与所检测的结果相比使PCIP表达或活性水平提高，即增强所述药物的效果。或者，可能需要减少给予所述药物，以与所检测的结果相比使PCIP表达或活性水平降低，即降低所述药物的效果。按照该实施方案，甚至在没有可观测的表型反应的情况下，PCIP表达或活性可用作药物效果的一个指标。D.治疗方法
本发明提供治疗PCIP表达或活性异常相关疾病的风险个体(或易感个体)或患者的预防方法和治疗方法。关于治疗的预防方法和治疗方法，根据药物基因组学领域获得的知识，可特别设计或改良这样的治疗方法。本文使用的“药物基因组学”是指将基因组学技术例如基因测序、统计遗传学和基因表达分析应用于临床开发和上市药物。更具体地说，此术语是指研究患者的基因是如何决定其对药物的反应的(例如患者的“药物反应表型”或“药物反应基因型”)。因此，本发明的另一个方面提供根据个体的药物反应基因型用本发明的PCIP分子或PCIP调节剂进行个体化的预防性或治疗性治疗的方法。药物基因组学使临床医师或医师可将预防性或治疗性治疗用于从所述治疗获益最大的患者，而且可避免治疗将发生药物相关性毒性副作用的患者。
1.预防方法
一个方面，本发明提供对接受者预防PCIP表达或活性异常相关疾病或病症的方法，该方法为给予所述接受者一种PCIP或调节PCIP表达或调节至少一种PCIP活性的药物。例如用本文所述任何一种诊断或预测测定或其组合可鉴定PCIP表达或活性异常所致疾病的风险个体。在出现PCIP异常为体征的症状之前给予预防性药物，因此防止疾病或障碍或者抑制疾病加重。例如根据PCIP异常的类型，可将PCIP、PCIP激动剂或PCIP拮抗剂用于治疗所述对象。根据本文所述的筛选测定可确定合适的药物。
2.治疗方法
本发明的另一个方面涉及为了治疗目的调节PCIP表达或活性的方法。因此，在一个典型实施方案中，本发明的调节方法包括：使细胞与PCIP或调节与所述细胞有关的一种或多种PCIP蛋白活性的物质接触。调节PCIP蛋白活性的物质可以是本文所述的一种物质，例如核酸或蛋白、PCIP蛋白的天然靶分子(例如PCIP底物)、PCIP抗体、PCIP激动剂或拮抗剂、PCIP激动剂或拮抗剂的肽模拟物、或其它小分子。在一个实施方案中，所述物质刺激一种或多种PCIP活性。这样的刺激剂实例包括活性PCIP蛋白和导入所述细胞编码PCIP的核酸分子。在另一个实施方案中，所述物质抑制一种或多种PCIP活性。这样的抑制剂实例包括反义PCIP核酸分子、抗PCIP抗体和PCIP抑制剂。可在体外(例如以所述物质培养所述细胞)或体内(例如将所述物质给予所述对象)实施这些调节方法。因此，本发明提供治疗罹患特征为PCIP蛋白或核酸分子表达或活性异常的疾病或障碍的患者的方法。这样的疾病障碍实例包括诸如神经退行性障碍的CNS疾病，例如阿耳茨海默氏病、与阿耳茨海默氏病相关的痴呆(例如Pick病)、帕金森氏病和其它Lewy弥散体病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、癫痫和Jakob-Creutzfieldt病；精神障碍，例如抑郁症、精神分裂症、Korsakoff精神病、燥狂、焦虑症、双相性情感障碍或恐怖症；学习和记忆障碍，例如遗忘症或年龄相关性记忆丧失；神经疾病，例如偏头痛；疼痛性疾病，例如痛觉过敏或与骨骼肌疾病有关的疼痛；脊髓损伤；中风以及头部损伤；或者心血管疾病，例如动脉硬化、缺血再灌注损伤、再狭窄、动脉炎、血管壁重建、心室重建、快速心室起搏、冠状动脉微栓塞、心动过速、心动过缓、压力负荷过高、主动脉弯曲(acortic bending)、冠状动脉结扎、心血管疾病、心房纤维性颤动、长OT综合症、充血性心力衰竭、窦房结功能失调、心绞痛、心脏衰竭、高血压、心房纤维性颤动、心房扑动、扩张性心肌病、特发性心肌病、心肌梗死、冠状动脉病、冠状动脉痉挛或心律失常。在一个实施方案中，所述方法包括给予调节(例如上调或下调)PCIP表达或活性的一种药物(例如用本文所述筛选测定鉴定的药物)或组合药物。在另一个实施方案中，所述方法包括作为治疗给予PCIP蛋白或核酸分子，以补偿PCIP表达或活性降低或异常。
本发明的一个优选实施方案涉及治疗PCIP相关疾病或障碍的方法，它包括给予接受对象治疗有效量的PCIP抗体的步骤。本文定义的治疗有效量的抗体(即有效剂量)为约0.001-30mg/kg体重、优选约0.01-25mg/kg体重、更优选约0.1-20mg/kg体重、甚至更优选约1-10mg/kg、2-9mg/kg、3-8mg/kg、4-7mg/kg或5-6mg/kg体重。熟练技术人员知道，某些因素可影响有效治疗患者所需要的剂量，包括但不限于疾病或障碍严重程度、以前的治疗、所述患者的一般健康情况和/或年龄、以及存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的抗体治疗患者可包括单一治疗，或者最好包括一系列的治疗。在一个优选实施方案中，用于治疗患者的抗体为约0.1-20mg/kg体重，每周一次，连续约1-10周，优选2-8周，更优选约3-7周，甚至更优选约4、5或6周。还应该知道的是，用于治疗的抗体有效剂量在具体治疗过程中可增加或减少。可根据本文所述的诊断测定结果改变剂量。
在PCIP异常下调和/或提高PCIP活性可能具有有益作用的情况下需要刺激PCIP活性。例如，在PCIP下调和/或提高PCIP活性可能具有有益作用的情况下需要刺激PCIP活性。同样，在PCIP异常上调和/或降低PCIP活性可能具有有益作用的情况下需要抑制PCIP活性。
3.药物基因组学
可将本发明的PCIP分子以及根据本文所述筛选测定鉴定的、对PCIP活性(例如PCIP基因表达)具有刺激或抑制作用的各种物质或调节剂给予各个个体，以治疗(预防或治疗)与PCIP活性异常有关的钾通道相关疾病(例如诸如神经退行性障碍的CNS疾病，例如阿耳茨海默氏病、与阿耳茨海默氏病相关的痴呆(例如Pick病)、帕金森氏病和其它Lewy弥散体病、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上麻痹、癫痫、脊髓小脑性共济失调和Jakob-Creutzfieldt病；精神障碍，例如抑郁症、精神分裂症、Korsakoff精神病、燥狂、焦虑症、双相性情感障碍或恐怖症；学习和记忆障碍，例如遗忘症或年龄相关性记忆丧失；神经疾病，例如偏头痛；疼痛性疾病，例如痛觉过敏或与骨骼肌疾病有关的疼痛；脊髓损伤；中风以及头部损伤；或者心血管疾病，例如动脉硬化、缺血再灌注损伤、再狭窄、动脉炎、血管壁重建、心室重建、快速心室起搏、冠状动脉微栓塞、心动过速、心动过缓、压力负荷过高、主动脉弯曲(acortic bending)、冠状动脉结扎、心血管疾病、心房纤维性颤动、长QT综合症、充血性心力衰竭、窦房结功能失调、心绞痛、心脏衰竭、高血压、心房纤维性颤动、心房扑动、扩张性心肌病、特发性心肌病、心肌梗死、冠状动脉病、冠状动脉痉挛或心律失常)。在这样的治疗同时，可考虑药物基因组学(即研究个体基因型和该个体对外源化合物或药物的反应的关系)。对治疗药物的代谢差异可能因为改变剂量和药理活性药物血药浓度之间的关系而产生严重的毒性或导致治疗失败。因此，医师或临床医师可考虑利用从相关药物基因组学研究中获得的知识决定是否给予PCIP分子或PCIP调节剂，以及设计用PCIP分子或PCIP调节剂进行治疗的剂量和/或治疗方案。
药物基因组学涉及因为受累人体的药物分布改变和作用异常而在临床上对药物的反应产生的重要遗传改变。参见例如Eichelbaum.M.等(1996)Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10-11)：983-985和Linder，M.W.等(1997)Clin.Chem.43(2)：254-266。一般来说，可分为两种类型的药物遗传学疾病。它们是作为改变药物作用于机体的方式(改变药物作用)的单因素遗传的遗传病，或者作为改变机体作用于药物的方式(改变药物代谢)的单因素遗传的遗传病。这些药物遗传学疾病可能表现为罕见的遗传缺陷或天然存在的多态性。例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷(G6PD)是常见的遗传性酶病，其中主要临床并发症为摄食氧化性药物(抗疟药、磺胺、镇痛药、硝基呋喃)和进食蚕豆后的溶血。
鉴定预测药物反应的基因的一种药物基因组学方法称为“agenome-wide association”，它主要取决于由已知基因相关标记组成的人类基因组高分辨图(例如人类基因组上60,000-100,000个多态位点或可变位点组成的“双等位基因”基因标记图，其中每一个具有2个突变体)。比较这样的高分辨基因图与每个患者的基因组图，所述患者为参与II/III期药物试验患者数量具有统计学意义的患者，从而鉴定与具体观测到的药物反应或副作用有关的标记。或者可根据人类基因组约1千万个已知单个核苷酸多态性(SNP)的组合制备这样的高分辨图。本文使用的“SNP”是一个区段DNA中的一个核苷酸碱基常见的改变。例如，一个SNP可为每1000个DNA碱基出现1次。一个SNP可能参与疾病过程，而绝大部分可能与疾病无关。如果人们已知基于所述SNP的出现的遗传图，则可根据个体基因组的特定类型SNP将个体分为不同遗传类型。按照这样的方式，在考虑这类遗传相似个体的共同体征的情况下，可对不同遗传相似个体组设计治疗方案。
或者，可用称为“候选基因法”的方法鉴定预测药物反应的基因。按照这种方法，如果已知编码一种药物靶(例如本发明的PCIP蛋白)的基因，则可在人群中非常容易地鉴定出该基因的全部常见变异体，而且可以决定是否具有一种形式的基因相对于另一种形式与特定药物反应有关。
作为一个说明性实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用的强度和持续时间的一个主要决定因素。关于为什么部分患者服用药物标准安全剂量后没有获得预期的药物疗效或者表现为过度药物反应和严重毒性，药物代谢酶遗传多态性(例如N-乙酰基转移酶2(NAT 2)和细胞色素P450酶CYP2D6和CYP2C19)的发现对其提供了一种解释。这些多态性在人群中表现为两种表型：强代谢者(EM)和弱代谢者(PM)。PM的流行率在不同人群是不同的。例如，编码CYP2D6的基因是高度多态性的，在PM中已经鉴定了几种突变，它们均导致缺乏有功能的CYP2D6。CYP2D6和CYP2C19的弱代谢者当他们接受标准剂量时也非常频繁地发生过度药物反应和副作用。如果一种代谢物为活性治疗部分，则PM显示没有治疗反应，如CYP2D6形成的可待因代谢物吗啡介导的可待因镇痛作用所证实的一样。另一极端情况是所谓的对标准剂量没有反应的超速代谢者。近来，已经鉴定超速代谢的分子基础是由于CYP2D6基因扩增。
另一方面，可利用称为“基因表达分型”的方法鉴定预测药物反应的基因。例如给予药物(例如本发明的PCID分子或PCID调节剂)的动物的基因表达可指示毒性相关基因途径是否已经打开。
从一种以上的上述药物基因组学方法获得信息可用于决定合适的剂量和治疗方案，以预防性或治疗性治疗患者。当用PCID分子或PCID调节剂例如用本文所述的一种典型筛选测定鉴定的调节剂治疗患者时，这种认识当用于剂量或药物选择时，可避免副作用或治疗失败，因此增强治疗或预防效率。
进一步通过以下实施例阐明本发明，而不能将其解释为限制本发明。在整个本说明书中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图和序列表均通过引用结合到本文中。
                      实施例
在实施例中使用以下材料和方法。菌株、质粒、饵cDNA和一般微生物技术
在该项研究工作中使用的基本酵母菌株(HF7c、Y187)、饵质粒(pGBT9)和鱼质粒(pACT2)购自Clontech(Palo Alto，CA)。Wyeth-Ayerst Research(865 Ridge Rd.，Monmouth Junction，NJ 08852)提供编码大鼠Kv4.3、Kv4.2和Kv1.1的cDNA。制备包含合成完全培养基但缺乏L-亮氨酸、L-色氨酸和L-组氨酸的标准酵母培养基，按文献所述(Sherman(1991)Meth.Enzymol.194：3-21)对酵母进行遗传操作。利用标准方法进行酵母转化(Gietz等(1992)Nucleic Acids Res.20：1425；Ito等(1983)J.Bacteriol.153：163-168)。用标准方法从酵母菌株分离质粒DNA(Hoffman和Winston(1987)Gene 57：267-272)。饵和酵母菌株构建
通过PCR扩增rKv4.3的前180个氨基酸(描述于Serdio P.等(1996)J.Neurophys 75：2174-2179)，并按读框克隆入pGBT9，获得质粒pFWA2(此后称为“饵”)。将此饵质粒转化入双杂交筛选菌株HF7c，测试其表达和自我活化。通过蛋白质印迹证实所述饵的表达。rKv4.3饵在存在10mM 3-氨基-1，2，3-三唑(3-AT)时不能自我活化。文库构建
Wyeth-Ayerst Research(Monmouth Junction，NJ)提供大鼠中脑组织。用标准方法从该组织提取细胞总RNA(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Coldspring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，(1989))。应用New England Biolabs(Beverly，MA)的Poly-A Spin mRNA分离试剂盒制备mRNA。应用Stratagene(La Jolla，CA)的cDNA合成试剂盒由所述mRNA样品合成cDNA，将其连接入pACT2的EcoRI和XhoI位点，获得双杂交文库。双杂交筛选
基本上按Bartel，P.等(1993)“采用双杂交系统检测多肽-多肽相互作用”，载于：Cellular Interactions in Development：A Practical Approach，Hartley，D.A.编辑，Oxford University Press，Oxford，第153-179页中所述，用rkv4.3饵-大鼠中脑文库的饵-文库对，进行双杂交筛选。基本上按照以前的文献所述(Brill等(1994)Mol.Biol.Cell.5：297-312)进行滤盘β半乳糖苷酶(β-gal)测定。记录并钓取两种报道基因活性(His和β-半乳糖苷酶)均阳性的克隆，从酵母分离质粒，转化入大肠杆菌菌株KC8，纯化DNA质粒，用常规方法对获得的质粒进行测序(Sanger F.等(1977)PNAS，74：5463-67)。特异性实验
使阳性互作物克隆(interactor clone)进行结合特异性试验，其中采用以前文献所述的接合方案(Finley R.L. Jr.等(1994)PNAS，91(26)：12980-12984)使其暴露于一组相关和不相关的饵。简而言之，将阳性鱼质粒转化入Y187，使所述的一组饵转化入HF7c。在选择培养基板上将转化的鱼和饵细胞划痕为条状，在YPAD板上接合，最后测试报道基因活性。分析
用BLASTN 1.4.8MP程序分析PCIP核苷酸的核酸命中(Altschul等(1990)Basic Local Alignment Search Tool.J.Mol.Biol.215：403-410)。采用BLASTP 1.4.9MP程序分析PCIP蛋白的多肽命中。实施例1：鉴定大鼠PCIP cDNA
通过PCR扩增Kv4.3基因编码序列(编码前180个氨基酸)，并将其克隆入pGBT9，获得GAL4 DNA-结合结构域-Kv4.3(1-180)基因融合物(质粒pFWA2)。用此构建物转化HF7c。在存在10mM3-AT的情况下，在缺乏L-色氨酸的合成完全培养基上而不是缺乏L-色氨酸和L-组氨酸的合成完全培养基上培养获得的菌株，证实{GAL4 DNA-结合结构域}-{vKv4.3(1-180)}基因融合物固有的转录激活活性不高于10mM3-AT允许的阈值。
在本实施例中，进行酵母双杂交测定，其中将包含{GAL4 DNA-结合结构域}-{rKv4.3(1-180)}基因融合物的质粒导入上述的酵母双杂交筛选菌株HF7c。然后用大鼠中脑双杂交文库转化HF7c。获得约6百万个转化体，将其在选择培养基上进行平板培养。进一步特征鉴定在选择培养基上生长并表达β-半乳糖苷酶报道基因的菌落，使其再转化并进行特异性分析。再转化和特异性测试获得3个能够结合Kv4.3多肽的PCID克隆(大鼠1v、8t和9qm)。
如下获得大鼠1v基因的全长序列和8t及9q基因的部分序列。用部分的大鼠PCID序列制备探针，然后用其筛选例如大鼠中脑cDNA文库。采用标准技术对阳性克隆进行鉴定、扩增和测序，以获得全长序列。此外，利用快速扩增现有的大鼠PCIP cDNA末端(采用例如5’RACE，Gibco，BRL)完成转录物的5’末端。实施例2：鉴定人1v cDNA
为了获得人1v核酸分子，在低严格条件下如下筛选由人海马制得的cDNA文库(Clontech，Palo Alto，CA)：用Clontech Express Hyb溶液于42℃预杂交4小时，然后于42℃杂交过夜。所用的探针为用32P dCTP标记的PCR制备片段，它包含大鼠序列的核苷酸49-711。以2×SSC/0.1％SDS于55℃洗涤滤膜6次。应用相同的条件对阳性分离物进行第二轮筛选。采用ABI自动DNA测序系统对由此获得的克隆进行测序，并将其与SEQ ID NO：3所示大鼠序列以及GenBank数据库的已知序列进行比较。然后将文库筛选的最大克隆亚克隆入pBS-KS+(Stratagene，La Jolla，CA)，以确证序列。测定代表1v基因的人同系物的515个碱基对的克隆，它包括一个211个破基对的5’UTR和一个304个碱基对的编码区。为了获得全长cDNA，按照生产商的说明使用3’RACE(Clontech Advantage PCR试剂盒)。实施例3：分离以及特征鉴定1V剪接变异体
按实施例1所述采用双杂交测定分离SEQ ID NO：5所示的小鼠1v和SEQ ID NO：7所示的大鼠1vl剪接变异体。通过筛选小鼠大脑cDNA文库分离SEQ ID NO：7所示的小鼠1vl剪接变异体，通过BLAST检索分离SEQ ID NO：11所示的大鼠1vn剪接变异体。实施例4：分离以及鉴定9Q和其它PCIP
通过数据库检索分离大鼠9q1(SEQ ID NO：15)，用双杂交测定分离大鼠9qm(SEQ ID NO：21)，通过数据库检索鉴定大鼠9qc(SEQ IDNO：27)。按实施例2所述鉴定人9ql(SEQ ID NO：13)和人9qs(SEQ IDNO：23)。通过数据库检索鉴定小鼠9q1(SEQ ID NO：17)、猴9qs(SEQID NO：25)、人p193(SEQ ID NO：39)、大鼠p19(SEQ ID NO：33)和小鼠p19(SEQ ID NO：35)。采用双杂交测定鉴定大鼠8t(SEQ ID NO：29)。通过对鉴定的EST进行数据库检索和测序，从而鉴定W28559序列(SEQ ID NO：37)，基因库登录号为AI352454。发现蛋白序列含有一个与1v、9q1和p19(见图25中的排列对比)高度同源的41个氨基酸的区。然而，该同源区下游的序列不同于PCID家族序列。该序列可能为具有与见于PCID家族成员的相似结构域同源的41个氨基酸的结构域的基因。
采用根据人9qm cDNA序列设计的引物通过筛选BAC基因组DNA文库(Reasearch Genetics)分离人基因组9q序列(SEQ ID NO：46和47)。鉴定了两个阳性克隆(448O2和721I17)，并对其进行了测序。实施例5：1V、8T和9Q mRNA在大鼠组织中的表达
采用针对大鼠1v序列的5’非翻译区和5’编码区(核苷酸35-124；SEQ ID NO：3)(此探针对大鼠1v和大鼠1vl是特异性的)、8t序列的5’编码区(核苷酸1-88；SEQ ID NO：29)(此探针对8t是特异性的)或大鼠9qm序列的5’末端(核苷酸1-195；SEQ ID NO：21)(此探针对全部9q同种型(8t除外)是特异性的)的[32P]-标记的cDNA探针探测大鼠和小鼠多个组织的RNA印迹(Clontech)。采用标准技术杂交各个印迹。采用大鼠1v探针杂交的RNA印迹只在合有大脑RNA的泳道显示2.9kb单一泳带，说明1v表达是大脑特异性的。用大鼠8t探针探测的RNA印迹显示一个明显的2.4kb主带。大鼠8t泳带在包含心脏RNA泳道中最强，而在包含大脑RNA的泳道也有较弱的泳带。用9q cDNA探针杂交的RNA印迹显示一个2.5kb主带和一个小的超过4kb泳带，在大脑和心脏均有明显表达。较小的泳带可能为不完全剪接或加工的9qmRNA。RNA印迹结果进一步表明p19主要在心脏表达。实施例6：1V、8T和9Q在大脑中的表达
采用[35S]-标记的cRNA探针的原位杂交组织化学法(ISHH)和与Rhodes等(1996)J.Neurosci.，16：4846-4860所述相同的杂交方法检测大鼠1v和8t/9q基因在大脑中的表达。用标准PCR方法产生用于制备cRNA探针的模板。简而言之，设计寡核苷酸引物以扩增靶cDNA 3’-或5’-非翻译区的片段，另外加入T7和T3聚合酶的启动子识别序列。因此为了获得针对1v mRNA 3’-非翻译区的300个核苷酸的探针，我们采用了以下引物：5- TAATACGACTCACTATAGGGACTGGCCATCCTGCTCTCAG-3( T7，正向，有义；SEQ ID NO：42)5- ATTAACCCTCACTAAAGGGACACTACTGTTTAAGCTCAAG-3( T3，反向，反义；SEQ ID NO：43)。下划线碱基相对于T7和T3启动子序列。为了获得针对8t和9q mRNA共有的3’非翻译序列的325bp区的探针，采用了以下引物：5- TAATACGACTCACTATAGGGCACCTCCCCTCCGGCTGTTC-3( T7，正向，有义；SEQ ID NO：44)5- ATTAACCCTCACTAAAGGGAGAGCAGCAGCATGGCAGGGT-3( T3，反向，反义；SEQ ID NO：45)。
加工用于ISHH定位1v或8t/9q mRNA表达的大鼠大脑组织切片的放射性自显影显示，1vmRNA在大脑广泛表达，其表达分布形式与标记的神经元细胞一致，而与胶质细胞或内皮细胞完全相反。1vmRNA在皮质、海马和纹状体中间神经元、丘脑网状核、中间松果体缰和小脑颗粒细胞中高度表达。1v mRNA在中脑核(包括黑质和上丘)、数个其它丘脑核以及基底前脑的内侧中隔核和斜纹带状核(diagonal band cuclei)的表达水平中等。
因为用以分析8t和9q表达的探针与在8t和9q mRNA中相同的3非翻译区的区段杂交，所以此探针获得了显示8t/9q mRNA广泛表达于大脑的复合图象，其表达分布型与上述1v表达部分重叠。但是，8t/9qmRNA在纹状体、海马结构、小脑颗粒细胞和新皮质中高达表达。8t/9qmRNA在中脑、丘脑和脑干的表达水平中等。在其中许多区域的8t/9qmRNA似乎集中在中间神经元(主细胞除外)，在所有区域相对于胶质细胞，8t/9q表达似乎集中在神经元。
单标记和双标记免疫组化显示，PCIP和Kv4多肽精确地共同定位于许多细胞类型和大脑区域，PCIP和Kv4 mRNA在这些部位共表达。例如9qm与Kv4.2共同定位于海马颗粒细胞和锥体细胞的胞体和树突、内侧松果体缰核神经元和小脑篮状细胞，而1v与Kv4.3共同定位于后扣带回皮质的第二层神经元、海马中间神经元和一个亚组的小脑颗粒细胞。免疫沉淀分析表明，1v和9qm与Kv4α亚单位在大鼠脑膜(brain membrane)中相互结合(coassociate)。实施例7：在COS和CHO细胞中PCIP和Kv4通道相互结合
基本上按生产商所述(Boehringer Mannheim)采用脂质转染胺+(lipofectamine plus)方法用各个PCIP(KChIP1、KChIP2、KChIP3)单独或与Kv4.2或Kv4.3一起瞬时转染COS1和CHO细胞。转染后48小时，按照以前的文献所述(Bekele-Arcuri等(1996)Neuropharmacology，35：851-865)洗涤细胞，固定并处理以进行免疫荧光显色。使用亲和纯化的抗Kv4通道或PCIP蛋白的兔多克隆抗体或小鼠单克隆抗体，对靶蛋白进行免疫荧光检测。
当单独表达时，PCIP弥散分布于整个COS-1和CHO细胞细胞质中，因此预期PCIP为细胞质蛋白。相反，当单独表达时，Kv4.2和Kv4.3多肽集中于核周ER和Golgi小室内，同时部分免疫反应性集中于细胞外缘。当PCIP与Kv4α亚单位共表达时，PCIP体征性弥散分布明显改变，使得PCIP与Kv4α亚单位精确地共同定位。当PCIP与Kv1.4α亚单位共表达时，不会发生PCIP的重分布，说明PCIP位置改变不是过量表达所致，而是这些PCIP与Kv4家族α亚单位特异性结合。
为了证实PCIP和Kv4多肽紧密结合而不是在共转染细胞上的简单的共同定位，采用上述PCIP和通道特异性抗体进行相互免疫沉淀分析。全部3种PCIP多肽在共转染细胞中与Kv4α亚单位相互结合，证据为抗Kv4.2和抗Kv4.3抗体能够免疫沉淀共转染细胞制备的细胞裂解液的KChIP1、KChIP2和KChIP3蛋白，以及抗PCIP抗体能够免疫沉淀相同细胞裂解液的Kv4.2和Kv4.3α亚单位。以含有去污剂和蛋白酶抑制剂的缓冲液裂解细胞，而且基本上按照以前的文献所述(Nakahira等(1996)J.Biol.Chem.，271：7084-7089)制备用于免疫沉淀反应。按照Nakahira等(1996)J.Biol.Chem.，271：7084-7089以及Harlow E.和Lane.D.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，c1988中所述进行免疫沉淀。免疫沉淀获得的产物通过SDS-PAGE进行大小分级分离，采用标准方法将其转移到硝酸纤维素滤膜上。
为了证实Kv4通道的细胞质N末端足以与PCIP相互作用，使KChIP1或KChIP2与缺乏全部219个氨基酸的细胞质C末端尾的Kv4.3突变体(Kv4.3ΔC)共表达。在瞬时转染的COS-1细胞中，绝大部分Kv4.3ΔC突变体捕获在核周ER和Golgi中，而在细胞外缘观测到极少或没有染色。尽管如此，KChIP1和KChIP2与Kv4.3ΔC在共转染细胞中精确共同定位，而且PCIP抗体有效共同免疫沉淀Kv4.3ΔC，说明这些PCIP与Kv4α亚单位相互作用不需要所述通道的细胞质C末端。实施例8：在天然组织中PCIP和Kv4通道相互结合
为了确定在天然组织中PCIP是否与Kv4亚单位共同定位而且相互结合，采用Kv4特异性抗体和PCIP特异性抗体对大鼠脑膜进行单标记免疫组化分析和双标记免疫组化分析以及相互的共同免疫沉淀分析。大鼠大脑切片的免疫组化染色表明，KChIP1和KChIP2以区域性细胞类型特异性方式与Kv4.2和Kv4.3共同定位。例如，KChIP1与Kv4.3共同定位在海马中间神经元、小脑颗粒细胞和小脑小球，小脑小球是小脑篮状细胞和高尔基氏细胞的树突和苔藓纤维末端特化的突触排列。KChIP2与Kv4.3和Kv4.2共同定位在齿状回颗粒细胞的树突、海马和新皮质锥体细胞的顶端树突和基底部树突、以及包括纹状体和上丘的几种皮质下结构。采用完整大鼠脑制备的突触膜进行共同免疫沉淀分析显示，PCIP(KChIP1、2和3)与大脑钾通道复合物中的Kv4.2和Kv4.3紧密结合。抗PCIP抗体免疫沉淀大脑膜的Kv4.2和Kv4.3，抗Kv4.2和Kv4.3抗体免疫沉淀PCIP。没有一种PCIP多肽被抗Kv2.1抗体免疫沉淀，表明这些PCIP与大脑Kv通道的结合可能是Kv4α亚单位特异性的。总而言之，这些解剖分析和生化分析表明，这些PCIP是天然Kv4通道复合物的内在组分。实施例9：PCIP是钙结合蛋白
为了确定KChIP1、2和3是否结合钙离子，对每种PCIP制备GST-融合蛋白，采用滤膜表层测定(filter overlay assay)(描述于例如Kobayashi等(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.189(1)：511-7)测定GST-PCIP蛋白以及重组PCIP多肽酶性切割GST以结合45Ca2+的能力。全部3种PCIP多肽而不是相关的GST-融合蛋白在此测定中强烈结合45Ca2+。而且，全部3种PCIP多肽在SDS-PAGE上显示钙离子依赖性迁移率变化，说明与该家族其它成员一样，KChIP1、2和3实际上是钙结合蛋白(Kobuyashi等(1993)同上；Buxbaum等Nef(1996)，神经元特异性钙感受器(NCS-1亚家族)，载于：Celio MR(编辑)Guidebook to the calcium-binding proteins。Oxford University Press，New York，第94-98页；Buxbaum J.D.等(1998)Nature Med.4(10)：1177-81)。实施例10：PCIP的电生理特征
因为PCIP，例如KChIP1(1v)、KChIP2(9ql)和KChIP3(p19)与Kv4α亚单位共同定位在大脑而且相互结合在一起，所以另一个重要的问题是确定这些PCIP是否改变Kv4通道的传导特性。为了阐明这个问题，使Kv4.2和Kv4.3单独表达以及与各个PCIP联合表达。按照生产商(Boehring Mannheim.Inc.)所述采用DOTAP脂质转染方法以cDNA瞬时转染CHO细胞。如下鉴定转染细胞：与目的基因一起共转染增强的GFP，然后测定所述细胞是否含有绿色GFP荧光。用膜片钳技术检测CHO细胞的电流(Hamill等1981，Pfluegers Arch.391：85-100)。
大鼠Kv4.2α亚单位在CHO细胞中的瞬时转染导致表达典型的A型K+传导。Kv4.2和KChIP1的共表达显示，KChIP1对所述钾通道具有几个明显作用(图41和表1)。首先，存在KChIP1时Kv4.2电流幅度增加约7.5倍(单独的Kv4.2的幅度＝0.60+/-0.096nA/细胞；Kv4.2+KChIP1＝4.5+/-0.55nA/细胞)。当通过修正为细胞膜表面面积计量标准的细胞电容将Kv4.2电流幅度转化为电流强度时，共表达KChIP1的Kv4.2电流强度增加12倍(单独的Kv4.2＝25.5+/-3.2pA/pF；Kv4.2+KChIP1＝306.9+/-57.9pA/pF)，说明KChIP促进和/或稳定Kv4.2表面表达。在这种电流强度增加的同时，在表达Kv4.2和KCIP1的细胞中观测到Kv4.2电流活化阈明显左移(单独的Kv4.2的活化V1/2＝20.8+/-7.0mV，Kv4.2+KChIP1＝-12.1+/-1.4mV)。最后，当Kv4.2与KChIP1共表达时，Kv4.2失活动力学明显减慢(单独的Kv4.2的失活时间常数＝28.2+/-2.6ms；Kv4.2+KChIP1＝104.1+/-10.4ms)，而与只表达Kv4.2的细胞相比(恢复tau＝272.2+/-26.1ms)，同时表达Kv4.2和KChIP1的细胞的通道从失活恢复快得多(恢复tau＝53.6+/-7.6ms)。
KChIP1、2和3具有显著不同的N末端，但是在C末端“核心”结构域中具有显著的氨基酸同一性。尽管它们具有明显不同的N末端，然而KChIP2和KChIP3对Kv4.2电流强度和动力学的作用非常类似于KChIP1产生的作用(表1)。因此，为了证实含有全部3个EF手的保守C末端核心结构域足以调节Kv4电流强度和动力学，制备N末端截短的KChIP1和KChIP2突变体。KChIP1ΔN2-31或KChIP2ΔN2-67突变体分别截短KChIP1和KChIP2至C末端185个氨基酸核心序列。KChIP1ΔN2-31或KChIP2ΔN2-67与Kv4.2在CHO细胞中共表达产生的Kv4.2电流强度和动力学变化与全长KChIP1或KChIP2产生的效应变化没有区别(表1)。
为了研究这些KChIP调节作用是否是Kv4通道特异性的，使KChIP1与Kv1.4和Kv2.1在非洲爪蟾卵母细胞共表达。用标准体外转录技术(Sambrook等1989，Molecular Cloning：a laboratory manual，ColdSpring Harbor Press)制备卵母细胞cRNA，取1-3ng/卵母细胞cRNA注射入非洲爪蟾卵母细胞中。用双电极电压钳测量卵母细胞电流。KChIP1以乎对Kv1.4或Kv2.1电流没有任何作用(表2)，说明这些功能性作用可能是Kv4通道特异性的。作为KChIP作用的最后对照以及为了证实KChIP对Kv4电流的作用与表达系统无关，在非洲爪蟾卵母细胞表达Kv4.3和KChIPmRNA后，重复上述动力学分析。KChIP1对卵母细胞系统中的Kv4.3的作用非常类似于对CHO细胞的Kv4.2的作用(表1)。
因为这些KChIP结合钙离子，另一个重要问题是确定KChIP1对Kv4.2电流的作用是否是钙离子依赖性的。如下间接阐明这个问题：在每个KChIP1的EF手结构域导入点突变-一个突变体在开始的2个EF手中具有点突变(D199突变为A、G104突变为A、D135突变为A、G140突变为A)，而另一个突变体在所有3个EF手中具有点突变(D199突变为A、G104突变为A、D135突变为A、G140突变为A、D183突变为A而G188突变为A)。这些突变以丙氨酸代替EF手共有序列中两个保守程度最高的氨基酸(图25；Linse，S.和Forsen，S.(1995)决定高亲和力钙结合的决定簇，载于：Means，S.(编辑)Advances in secondmessenger and phosphoprotein research，New York，Ravens Press，30：89-150)。此KChIP1的3个EF手突变体与Kv4.2或Kv4.3在COS细胞中的共表达表明，此突变体与Kv4α亚单位共同定位于COS-1细胞，而且有效共同免疫沉淀。然而，这些EF手的点突变完全消除了KChIP1对Kv4.2动力学的作用(表1)。总之，这些结果说明，KChIP1和Kv4.2的结合作用与钙离子无关，而KChIP1对Kv4.2动力学的调节作用是钙离子依赖性的或者对EF手结构域点突变产生的结构变化敏感。表1KchIP对Kv4通道的功能性作用
电流参数 rKv4.2+载体 rKv4.2+KchIP1 rKv4.2+KchIP1ΔN2-31 rKv4.2+KchIP2 rK.v4.2+KchIP2ΔN2-67 rKv4.2+KchIP3 rKv4.3 rKv4.3+KchIP1
峰值电流(nA/细胞，50MV)峰值电流强度(pA/pF，50mV)失活时间常数(ms，50mV)失活时间常数恢复 0.60*±0.09625.5±3.228.2±2.6272.2 4.5*±0.055306.9*±57.9104.1±10.453.6* 6.0*±1.1407.2*±104.8129.2±14.298.1* 3.3*±0.45196.6*±26.695.1*±8.349.5* 5.8*±1.1202.6*±27.5109.5*±9.636.1* 3.5*±0.99161.7*±21.867.2*±14.1126.1* 7.7μA±2.6---56.3±6.6327.0 18.1μA*±3.8---135.0±15.134.5*
*与对照显著不同。表2KChIP对其它Kv通道的功能性作用
    卵母细胞     卵母细胞
电流参数 HKv1.4 hKv1.4+1v HKv2.1 HKv2.1+1v
峰值电流(μA/细胞，50MV) 8.3±2.0 6.5±0.64 3.7±0.48 2.9±0.37
失活时间常数(ms，50mV) 53.2±2.8 58.2±6.6 1.9s±0.079 1.7s0.078
失活时间常数恢复(sec，-80mV 1.9 1.6 7.6 7.7
活化V1/2(mV) -21.0 -20.9 12.0 12.4
稳态失活V1/2(mV) -48.1 -47.5 -25.3 -23.9
实施例11：KChIP1对KV4-α亚单位在COS-1细胞的表面表达的影响
为了检测KChIP1增强Kv4通道的表面表达的能力，监测KChIP1促进形成Kv4通道和PSD-95的表面共聚簇(surface co-cluster)的能力。使用PSD-95促进显示所述复合物。
为了有助于Kv4.3和PSD-95相互作用，制备嵌合型Kv4.3亚单位(Kv4.3ch)，其中rKv1.4的C末端10个氨基酸(SNAKAVETDV，SEQID NO：73)附加到Kv4.3的C末端。因为rK1.4 C末端10个氨基酸与PSD-95结合而且当PSD-95与Kv4.3 C末端融合时赋予Kv4.3蛋白结合PSD-95的能力，所以使用它们。Kv4.3ch在COS-1细胞中的表达提示，Kv4.3ch多肽捕获在核周的胞质中，而在细胞外缘只有可检测到的最小量的Kv4.3ch免疫反应性。当Kv4.3ch与PSD-95共表达时，PSD-95捕获在核周胞质而且与Kv4.3ch共同定位。但是，当KChHIP1与Kv4.3ch和PSD-95共表达时，观测到Kv4.3ch、KChIP1和PSD-95的大蚀斑样表面共聚簇。三标记免疫荧光证实，这些表面聚簇包含全部3种多肽，相互的共同免疫沉淀分析表明3种多肽在这些表面聚簇中相互结合在一起。对照试验表明，KChI1不会与单独的PSD-95作用，不会与Kv1.4和PSD-95共同定位在表面聚簇中。总之，这些数据表明KChIP1可促进Kv4.3亚单位转运到细胞表面。实施例12：PCIP蛋白的特征鉴定
在此实施例中，比较PCIP蛋白氨基酸序列和已知蛋白的氨基酸序列，鉴定各种不同的基序。
1v多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：3，它是包含216个氨基酸残基的新型多肽。通过序列对比(见图21)鉴定推测参与钙结合的结构域(Linse，S.和Forsen，S.(1995)Advances in Second Messenger andPhosphoprotein Research 30，第3章，第89-151页，Means，AR.编辑，Raven Press，Ltd.，New York)。
8t多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：30，它是包含225个氨基酸残基的新型多肽。通过序列对比(见图21)鉴定推测参与钙结合的结构域(Linse，S.和Forsen，S.(1995)Advances in Second Messenge andPhosphoprotein Research 30，第3章，第89-151页，Means，AR.编辑，Raven Press，Ltd.，New York)。
9q多肽是一种新型多肽，它包含推测参与钙结合的钙结合结构域(Linse，S.和Forsen，S.(1995)Advances in Second Messenger andPhosphoprotein Research 30，第3章，第89-151页，Means，AR.编辑，Raven Press，Ltd.，New York)(见图21)。
p19多肽是一种新型多肽，它包含推测参与钙结合的钙结合结构域(Linse，S.和Forsen，S.(1995)Advances in Second Messenger andPhosphoprotein Research 30，第3章，第89-151页，Means，AR.编辑，Raven Press，Ltd.，New York)(见图21)。
大鼠1vl核苷酸序列的BLASTN 2.0.7检索(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403)揭示，大鼠1vl类似于大鼠cDNA克隆RMUAH89(登录号AA849706)。大鼠1vl核酸分子在核苷酸1063-1488与大鼠cDNA克隆RMUAH89的同一性为98％。
人9ql核苷酸序列的BLASTN 2.0.7检索(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403)揭示，人9q1类似于人cDNA克隆1309405(登录号AA757119)。人9q1核酸分子在核苷酸937-1405与人cDNA克隆1309405(登录号AA757119)的同一性为98％。
小鼠P19核苷酸序列的BLASTN 2.0.7检索(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403)揭示，小鼠P19类似于小家鼠cDNA克隆MNCb-7005(登录号AU035979)。小鼠P19核酸分子在核苷酸1-583与小家鼠cDNA克隆MNCb-7005(登录号AU035979)的同一性为98％。实施例13：重组PCIP蛋白在细菌细胞中的表达
在该实施例中，PCIP作为重组谷胱甘肽S转移酶(GST)融合多肽在大肠杆菌中表达，分离并特征鉴定此融合多肽。具体来说，使PCIP与GST融合，将该融合多肽在大肠杆菌例如菌株BI21中表达。用IPTG诱导GST-PCIP融合蛋白在BI21中表达。通过在谷胱甘肽珠上的亲和层析从诱导BI21菌株的粗制细菌裂解液纯化重组融合多肽。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从细菌裂解液纯化的多肽，测定获得的融合多肽的分子量。
将大鼠1v和9ql克隆入pGEX-6p-2(Pharmacia)。在大肠杆菌细胞中表达获得的重组融合蛋白，按照本领域已知的方法纯化(描述于例如Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，John Wiley &Sons，1992)。采用针对大鼠1v和9ql肽表位的抗体通过蛋白质印迹分析证实纯化蛋白的同一性。实施例14：重组PCIP蛋白在COS细胞中的表达
为了在COS细胞中表达PCIP基因，使用Invitrogen Corporation(San Diego，CA)的pcDNA/Amp载体。此载体含有SV40的复制起点、氨苄青霉素抗性基因、大肠杆菌复制起点、后接多接头区的CMV启动子、SV40内含子和聚腺苷酸部位。将编码完整PCIP蛋白和HA标记(Wi1son等(1984)Cell 37：767)或FLAG标记的DNA片段克隆入所述载体的多接头区，因此使重组蛋白的表达处于CMV启动子的控制之下，其中所述HA标记或FLAG标记与所述DNA片段的3’末端按读框融合。
为了构建所述质粒，采用2种引物经PCR扩增PCIP DNA序列。5’引物包含目的限制位点，其后接约20个自起始密码子开始的PCIP编码序列的核苷酸；3’末端序列包含另一个目的限制位点的互补序列、翻译终止密码子、HA标记或FLAG标记和PCIP编码序列的最后20个核苷酸。用合适的限制酶消化PCR扩增的片段和pCDNA/Amp载体，用CIAP酶(New Enland Biolabs，Beverly，MA)使载体去磷酸化。最好所选定的2个限制位点不同，使得PCIP基因以正确的方向插入。使连接混合物转化入大肠杆菌细胞(可使用菌株HB101、DH5α、SURE，它们可从Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA获得)，将转化培养物平板接种在氨苄青霉素培养基平板上，选择抗性菌落。从转化体分离质粒DNA，并用限制性分析检测其是否存在正确的片段。
然后采用磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质转染或电穿孔以PCIP-pcDNA/Amp质粒DNA转染COS细胞。转染宿主细胞的其它合适方法可参见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989。采用HA特异性单克隆抗体通过放射性标记(可使用35S-蛋氨酸或35S-半胱氨酸，可得自NEN，Boston，MA)和免疫沉淀(Harbow，E.和Lane，D.Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988)检测PCIP多肽的表达。简而言之，以35S-蛋氨酸(或35S-半胱氨酸)标记细胞8小时。然后收集培养基，用去污剂(RIPA缓冲液，150mM氯化钠，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)裂解细胞。用HA特异性单克隆抗体沉淀细胞裂解液和培养基。然后通过SDS-PAGE分析沉淀的多肽。
或者，利用合适的限制位点将包含PCIP编码序列的DNA直接克隆入pCDNA/Amp载体的多接头。用上述方法将获得的质粒转染入COS细胞中，采用PCIP特异性单克隆抗体通过放射性标记和免疫沉淀检测PCIP多肽的表达。
将大鼠1v克隆入哺乳动物表达载体pRBG4中。采用LipofectAmine Plus(Gibco BRL)按照生产商的建议转染入COS细胞。采用针对兔或小鼠1v的抗体通过免疫细胞化学和/或蛋白质印迹分析检测表达的1v蛋白。实施例15：鉴定和表征人全长P19
采用RACE PCR鉴定人全长p19序列。p19(也称为KChIP3)的序列示于图16。人p19的氨基酸序列与小鼠p19基因(SEQ ID NO：35)的同一性为92％。
采用人p19蛋白序列的TBLASTN检索揭示，人p19与两个序列同源，所述两个序列为Calsenilin(描述于(1998)Nature Medicine 4：1177-1181)以及为prodynorphin 和c-fos转录的钙离子依赖性调节剂的DREAM(描述于Carrion等(1999)Nature398：80-84)。人p19在核苷酸水平与Calsenilin的同一性为100％(但是3’比公开序列延长)，在核苷酸水平与DREAM的同一性为99％。
使用KchIP特异性抗体，用本领域已知技术，例如RNA印迹、原位杂交、β-gal测定、DNA迁移率测定(描述于例如Carrion等(1999)Nature398：80)和DNA迁移率超变动测定，测定p19(以及其它PCIP家族成员)与presenilin共同定位以及用作转录因子的能力。
适合评价PCIP家族成员与presenilin结合的其它测定为共同免疫沉淀(描述于例如Buxbaum等(1998)Nature Medicine 4：1177)。实施例16：猴KChIP4的鉴定和表征
在本实施例中，描述表征和鉴定编码猴KChIP4a(jlkbd352e01t1)和可变剪接的猴KChIP4b(jlbb231c04t1)、KChIP4c(jlkxa053c02)和KChIP4d(jlkx015b10)的基因。以已知PCIP家族成员的序列TBLASTN检索专门数据库，鉴定了4个克隆jlkb231c04tl、jlkd352e01t1、jlkxa053c02和jlkx015b10。获得4个猴克隆，并对其进行测序。
发现专有猴克隆jlkbb231c04t1和jlkbd352e01t1的序列相当于另一个PCIP家族成员(本文称为KChIP4)的可变剪接变异体。克隆jlkbb231c04t1包含822 bp缺失(相对于jlkd352e01t1)(推测由于剪除外显子所致)，导致丧失最后一个EF手结构域。在克隆jlkbd352e01t1中，保留最后一个EF手结构域，而且C末端与PCIP家族成员1v、9ql和p19的C末端高度同源。KChIP4、1v、9q1和p19的同源C末端的总体同一性在氨基酸水平为71-80％(采用CLUSTALW进行排列对比)。
采用猴KChIP4a作为查询序列检索专门数据库，以BLASTN检索发现了猴KChIP4c和KChIP4d。
猴KChIP4a cDNA的核苷酸序列和KChIP4a多肽的预测氨基酸序列见图23，并分别示于SEQ ID NO：48和49。
猴KChIP4b cDNA的核苷酸序列和KChIP4b多肽的预测氨基酸序列见图24，并分别示于SEQ ID NO：50和51。
猴KChIP4c cDNA的核苷酸序列和KChIP4c多肽的预测氨基酸序列见图35，并分别示于SEQ ID NO：69和70。
猴KChIP4d cDNA的核苷酸序列和KChIP4d多肽的预测氨基酸序列见图36，并分别示于SEQ ID NO：71和72。
图37图示KChIP4a、KChIP4b、KChIP4c和KChIP4d的蛋白序列的对比。
用大鼠KChIP4的3’-非翻译区的DNA片段探测购自Clontech的RNA印迹，RNA印迹实验表明，大鼠KChIP4主要在大脑中表达，在肾脏的表达较弱，而在心脏、大脑、脾脏、肺部、肝脏、骨骼肌或睾丸没有表达。实施例17：鉴定和表征人以及大鼠33b07
在本实施例中，描述了编码大鼠和人33b07的基因的鉴定和表征。采用rKv4.3N作为饵，部分的大鼠33b07(克隆名称为9o)作为阳性克隆从上述酵母双杂交筛选分离。通过检索专门数据库鉴定全长大鼠33b07克隆。
全长大鼠33b07 cDNA的核苷酸序列和大鼠33b07多肽的预测氨基酸序列见图26，并分别示于SEQ ID NO：52和53。大鼠33b07 cDNA编码分子量约为44.7kD、407个氨基酸残基长度的蛋白。
在酵母双杂交测定中，大鼠33b07结合rKv4.3N和rKv4.2N，略微优选结合rKv4.2N。相反，大鼠33b07不结合rKv1.1N，说明大鼠33b07-Kv4N相互作用是特异性的。
根据RNA印迹分析测定，大鼠33b07主要在大脑中表达。
通过检索专门数据库还鉴定了人33b07直向同源物(克隆106d5)。全长人33b07 cDNA的核苷酸序列和人33b07多肽的预测氨基酸序列见图27，并分别示于SEQ ID NO：54和55。人33b07 cDNA编码分子量约为45.1 kD、414个氨基酸残基长度的蛋白。
人33b07在氨基酸水平与人KIAA0721蛋白(GenBank登录号AB018264)的同一性为99％。但是，GenBank登录号AB018264没有功能性annotation。人33b07还与睾丸特异性(Y编码)蛋白(TSP(Y)).SET和核小体装配蛋白(NAP)同源。人33b07在氨基酸204-337与人SET蛋白(GenBank登录号Q01105＝U51924)同一性为38％，在氨基酸334-387的同一性为46％。
人SET也称为HLA-DR相关蛋白II(PHAPII)(Hoppe-Seyler(1994)Biol.Chem.375：113-126)，在某些情况下因为易位事件形成SET-CAN融合基因而与急性非分化白血病(AUL)有关(Von Lindern M.等(1992)Mol.Cell.Biol.12：3346-3355)。可变剪接型SET也称为模板激活因子-Iα(TAF)。发现TAF与髓性白血病的发生有关(Nagata K.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(10)，4279-4283)。人SET还是磷酸酶2A的潜在蛋白抑制剂(Adachi Y.等(1994)J.Biol.Chem.269：2258-2262)。NAP可能参与调节染色质形成，而且影响细胞增殖的调节(Simon H.U.等(1994)Biochem.J.297，389-397)。
因此，因为其与上述鉴定蛋白的同源性，33b07可用作磷酸酶(一种癌基因)的蛋白抑制剂和/或染色质调节剂。33b07与蛋白磷酸酶抑制剂SET的同源性特别引人注目。已知许多通道、尤其是Kv4通道(33b07与其结合)受PKC和PKA磷酸化作用的调节((1998)J.Neuroscience 18(10)：3521-3528；Am J Physiol 273：H1775-86(1997))。因此，33b07可通过调节钾通道磷酸化状态调节Kv4活性。实施例18：鉴定和表征大鼠1p
在本实施例中，描述了编码大鼠1p的基因的鉴定和表征。采用rKv4.3N作为饵，部分大鼠1p作为阳性克隆从上述酵母双杂交筛选分离。
部分长度的大鼠1p cDNA的核苷酸序列和大鼠1p多肽的预测氨基酸序列见图28，并分别示于SEQ ID NO：56和57。大鼠1p cDNA编码分子量约为28.6 kD、267个氨基酸残基长度的蛋白。
在酵母双杂交测定中，大鼠1p结合rKv4.3N和rKv4.2N，略微优选结合rKv4.3N。相反，1p不结合rKvI.1N，说明1p-Kv4N相互作用是特异性的。
根据RNA印迹分析测定，大鼠1p主要在大脑中表达。
采用记分为100而字节长度为3(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403)对大鼠1p氨基酸序列进行BLASTP 1.4检索揭示，大鼠1p类似于人Restin(GenBank登录号P30622；也称为细胞质连接蛋白-170α-2(CLIP-170)，M97501))。大鼠1p蛋白在氨基酸残基105-182与人Restin的同一性为58％，在氨基酸残基115-186与人Restin的同一性为55％，在氨基酸残基173-246与人Restin的同一性为22％，在氨基酸残基169-218与人Restin的同一性为22％，在氨基酸残基217-228与人Restin的同一性为58％。
Restin也称为Reed-Sternberg中间丝结合蛋白。Reed-sternberg细胞是诊断何杰金氏病的肿瘤细胞。据认为，Restin过量表达是何杰金氏病病程中的致病因子(Bilbe G.等(1992)EMBO J.11：2103-13)，而且Restin似乎是连接内吞噬小泡和微管的中间丝结合蛋白(Pierre P等(1992)Cell70(6)，887-900)。
细胞骨架调节钾通道的活性(参见例如Honore E等(1992)EMBO J.11：2465-2471和Levin G等(1996)J.Biol.Chem.271：29321-29328)以及其它通道例如钙离子通道(Johnson B.D.等(1993)Neuron10：797-804)或钠离子通道(Fukuda J.等(1981)Nature 294：82-85)的活性。
因此，根据其与Restin蛋白的同源性，大鼠1p蛋白可能与细胞骨架结合，而且可通过其与细胞骨架的结合调节钾通道例如Kv4的活性。实施例19：鉴定和表征大鼠7s
在本实施例中，描述了编码大鼠7s的基因的鉴定和表征。采用rKv4.3N作为饵，部分大鼠7s作为阳性克隆从上述酵母双杂交筛选分离。大鼠7s是描述于例如van Hille B.等(1993)J.Biol.Chem.268(10)，7075-7080中的人空泡H(+)-ATPase催化亚单位A(登录号P38606和B46091)的大鼠直向同源物。
部分长度的大鼠7s cDNA的核苷酸序列和大鼠7s多肽的预测氨基酸序列见图29，并分别示于SEQ ID NO：58和59。大鼠7s cDNA编码分子量约为28.6 kD、270个氨基酸残基长度的蛋白。
在酵母双杂交测定中，大鼠7s结合rKv4.3N和rKv4.2N，略微优选结合rKv4.3N。相反，7s不结合rKv1.1N，说明7s-Kv4N相互作用是特异性的。
根据RNA印迹分析测定，大鼠7s在大脑和肾脏中的表达水平明显高于在肺部、肝脏、心脏、睾丸和骨骼肌的表达水平。实施例20：鉴定和表征大鼠29x和25r
在本实施例中，描述了编码大鼠29x的基因的鉴定和表征。采用rKv4.3N作为饵，大鼠29x作为阳性克隆从上述酵母双杂交筛选分离。大鼠25r是29x的剪接变异体。它们的5’非翻译区不同，但是它们的编码区在氨基酸水平相同。
大鼠29x cDNA的核苷酸序列和大鼠29x多肽的预测氨基酸序列见图30，并分别示于SEQ ID NO：60和61。大鼠29x cDNA编码分子量约为40.4 kD、351个氨基酸残基长度的蛋白。
大鼠25r cDNA的核苷酸序列示于图31和SEQ ID NO：62。大鼠25r cDNA编码分子量约为40.4 kD、351个氨基酸残基长度的蛋白。
大鼠29x在脾脏、肺部、肾脏、心脏、大脑、睾丸、骨骼肌和肝脏表达，其中脾脏表达水平最高，肝脏表达水平最低。
在酵母双杂交测定中，大鼠29x结合rKv4.3N和rKv4.2N，略微优选结合rKv4.3N。相反，29x不结合rKv1.1N，说明29x-Kv4N相互作用是特异性的。
大鼠29x在氨基酸水平与描述于Starr R.等(1997)Nature 387：917-921的大鼠SOCS-1(细胞因子信号活动的阻抑物)、描述于Endo T.A.等(1997)Nature 387：921-924的JAB以及描述于Naka T.等(1997)Nature 387：924-928的SSI-1(STAT诱导的STAT抑制剂-1)相同。这些蛋白的特征在于它们具有SH2结构域，此结构域结合并抑制JAK激酶，从而调节细胞因子信号活动。
本文使用的术语“SH2结构域”还指Src同源2结构域，包括参与结合磷酸酪氨酸残基如其它蛋白的磷酸酪氨酸残基的约100个氨基酸长度的蛋白结构域。靶位点称为SH2结合位点。SH2结构域具有2个α螺旋和6-7个β链组成的保守3D结构。2个连接的β折叠组成的连续β曲折构成SH2结构域的核心(Kuriyan J.等(1997)Curr.Opin.Struct.Biol.3：828-837)。SH2结构域通过以序列特异性和严格的磷酸化依赖性方式高亲和力地作用于包含磷酸酪氨酸的靶肽，发挥细胞内信号级联放大的调节模块的作用(Pawson T.(1995)Nature 373：573-580)。部分蛋白含有多个SH2结构域，它增强了所述蛋白结合磷蛋白的亲和力或者赋予所述蛋白结合不同磷蛋白的能力。大鼠29x在SEQID NO：61的氨基酸残基219-308含有一个SH2结构域。
酪氨酸磷酸化调节钾通道活性(Prevarskaya N.B.等(1995)J.Biol.Chem.270：24292-24299)。JAK激酶在酪氨酸磷酸化蛋白而且参与调节通道活性(Prevarskaya N.B.等，同上)。因此，基于大鼠29x与SOCS-1、JAB和SSI-1的同源性，大鼠29x可通过调节JAK激酶活性调节钾通道例如Kv4的活性。实施例21：鉴定和表征大鼠5p
在本实施例中，描述了编码大鼠5p的基因的鉴定和表征。采用rKv4.3N作为饵，大鼠5p作为阳性克隆从上述酵母双杂交筛选分离。
大鼠5p cDNA的核苷酸序列和大鼠5p多肽的预测氨基酸序列见图32，并分别示于SEQ ID NO：63和64。大鼠5p cDNA编码分子量约为11.1 kD、95个氨基酸残基长度的蛋白。
在酵母双杂交测定中，大鼠5p以相似强度结合rKv4.3N和rKv4.2N。相反，5p不结合rKv1.1N，说明5p-Kv4N相互作用是特异性的。
根据RNA印迹分析测定，大鼠5p在脾脏、肺部、骨骼肌、心脏、肾脏、大脑、肝脏和睾丸表达。
大鼠5p与大鼠Calpactin I轻链或P10(登录号P05943)相同。P10结合并诱导膜联蛋白II(p36)解聚。P10可用作蛋白磷酸化的调节剂，因为p36单体是酪氨酸特异性激酶的优选靶(Masiakwski P.等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85(4)：1277-1281)。
酪氨酸磷酸化调节钾通道的活性(Prevarskaya N.B.等，同上)。因此，由于大鼠5p与P10的同一性，大鼠5p可以通过调节酪氨酸特异性激酶的活性而调节钾通道例如Kv4的活性。实施例22：鉴定和表征大鼠7q
在本实施例中，描述了编码大鼠7q的基因的鉴定和表征。采用rKv4.3N作为饵，大鼠7q作为阳性克隆从上述酵母双杂交筛选分离。用RACE PCR获得全长大鼠7q。
大鼠7q cDNA的核苷酸序列和大鼠7q多肽的预测氨基酸序列见图33，并分别示于SEQ ID NO：65和66。大鼠7q cDNA编码分子量约为23.5 kD、212个氨基酸残基长度的蛋白。
在酵母双杂交测定中，大鼠7q以相似强度结合rKv4.3N和rKv4.2N。相反，7q不结合rkv1.1N，说明7q-Kv4N相互作用是特异性的。
根据RNA印迹分析测定，大鼠7q在心脏、大脑、脾脏、肺部、肝脏、骨骼肌、肾脏和睾丸表达。
大鼠7q在氨基酸水平与RAB2(大鼠RAS相关蛋白，登录号P05712)相同。RAB2似乎参与囊泡运输和蛋白转运(Touchot N.等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.84(23)：8210-8214)。因此，基于其与RAB2的同源性，大鼠7q可能参与钾通道例如Kv4运输。实施例23：鉴定和表征大鼠19r
在本实施例中，描述了编码大鼠19r的基因的鉴定和表征。采用rKv4.3N作为饵，部分大鼠19r作为阳性克隆从上述酵母双杂交筛选分离。用RACE PCR获得全长大鼠19r。
大鼠19r cDNA的核苷酸序列和大鼠19r多肽的预测氨基酸序列见图34，并分别示于SEQ ID NO：67和68。大鼠19r cDNA编码分子量约为31.9 kD、271个氨基酸残基长度的蛋白。
根据RNA印迹分析测定，大鼠19r在心脏、大脑、脾脏、肺部、肝脏、骨骼肌、肾脏和睾丸表达。
在酵母双杂交测定中，大鼠19r结合rKv4.3N和rKv4.2N，略微优选结合rKv4.3N。相反，19r不结合rKv1.1N，说明19r-Kv4N相互作用是特异性的。
大鼠19r与描述于Dickeson S.K.等(1989)J.Biol.Chem.264：16557-16564的大鼠磷脂酰肌醇(PTDINS)转运蛋白α(PTDINSTP，登录号M25758或P16446)相同。据认为，PTDINSTP参与磷脂酶C-β(PLC-β)信号活动、磷脂酰肌醇转运蛋白(PtdIns-TP)合成、分泌小泡的形成和增强磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns 3-激酶)活性(Cunningham E.等(1995)Curr.Biol.5(7)：775-783；(1995)Nature 377(6549)：544-547；和Panaretou C.等(1997)J.Biol.Chem.272(4)：2477-2485)。
因此，鉴于大鼠19r与PTDINSTP的同源性，大鼠19r可通过PLC-β信号途径和/或PtdIns 3-激酶信号途径调节钾通道例如Kv4活性。大鼠p19r还可能参与钾通道例如Kv4运输。实施例24：人9q的染色体定位
在本实施例中，采用辐射杂交板(radiation hybrid panel)(Panel GB4)对人PCIP 9q进行染色体作图。h9q作图到染色体10q的一个区，而以前已经证实该区包括与部分癫痫的连锁，即D10S192：10q22-q24(Ottman等(1995)Nature Genetics 10：56-60)(见图43)。鉴于这样的观测结果，所以本发明明确证实9q家族蛋白可用作开发抗癫痫药物的靶和医学治疗癫痫的靶。
此外，h9q作图到染色体10q的一个区，而以前已经证实该区包括与IOSCA的连锁，即D10S192和D10S1265：10q24-Nikali(Genomics39：185-191(1997))(见图42和43)。鉴于这样的观测结果，所以本发明明确证实9q家族蛋白可用作开发抗脊髓小脑性共济失调药物的靶和医学治疗脊髓小脑性共济失调的靶。等同实施方案
本领域技术人员将知道或能够仅用常规实验就可确定许多与本文所述的本发明具体实施方案等同的实施方案。以下权利要求书包括这样的等同实施方案。

Claims (53)

1.一种分离的核酸分子，它选自：
a)一种核酸分子，它包含与以下核苷酸序列或其互补序列的同一性至少为60％的核苷酸片列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列；
b)一种核酸分子，它包含含以下核苷酸序列或其互补序列的一种核酸的至少583个核苷酸的片段，所述核苷酸序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列；
c)一种核酸分子，它编码包含与以下氨基酸序列的同一性至少约60％的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列；
d)一种核酸分子，它编码一种多肽的片段，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列，其中所述片段包含以下氨基酸序列的至少15个连续氨基酸残基：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列；以及
e)一种核酸分子，它编码一种多肽的天然等位基因变异体，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列，其中所述核酸分子在严格条件下与包含以下序列的核酸分子杂交：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段。
2.权利要求1的分离核酸分子，它选自：
a)一种核酸分子，它包含以下核苷酸序列或其互补序列：SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列；和
b)一种核酸分子，它编码包含以下氨基酸序列的多肽：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列。
3.权利要求1的核酸分子，它还包括载体核酸序列。
4.权利要求1的核酸分子，它还包括编码异源多肽的核酸序列。
5.一种宿主细胞，它包含权利要求1的核酸分子。
6.权利要求5的宿主细胞，它为哺乳动物宿主细胞。
7.一种人类以外的哺乳动物宿主细胞，它包含权利要求1的核酸分子。
8.一种分离的多肽，它选自：
a)一种多肽的片段，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列，其中所述片段包含以下氨基酸序列的至少15个连续氨基酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列；
b)一种多肽的天然等位基因变异体，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列，其中所述多肽由在严格条件下与包含以下核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子编码：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列；和
c)一种多肽，它由一种核酸分子编码，该核酸分子包含与含以下核苷酸序列的核酸的同一性至少为60％的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列；
d)一种多肽，它包含与以下氨基酸序列的同一性至少为60％的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列。
9.权利要求8的分离多肽，它包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列。
10.权利要求8的多肽，它还包括异源氨基酸序列。
11.一种抗体，它选择性结合权利要求8的多肽。
12.一种产生多肽的方法，包括在表达所述核酸分子的条件下培养权利要求5的宿主细胞，所述多肽选自：
a)一种多肽，它包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列；
b)一种多肽的片段，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列，其中所述片段包含以下氨基酸序列的至少15个连续氨基酸：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列；和
c)一种多肽的天然等位基因变异体，所述多肽包含以下氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：72的氨基酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段编码的氨基酸序列，其中所述多肽由在严格条件下与包含以下核苷酸序列的核酸分子杂交的核酸分子编码：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、 SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：71的核苷酸序列，或以保藏号98936、98937、98938、98939、98940、98941、98942、98943、98944、98945、98946、98947、98948、98949、98950、98951、98991、98993、98994或PTA-316保藏于ATCC的质粒的DNA插入片段的核苷酸序列。
13.检测样品中权利要求8多肽的存在的方法，该方法包括：
a)使所述样品与选择性结合所述多肽的一种化合物接触；和
b)检测所述化合物是否结合所述样品中的多肽，由此检测所述样品中存在的权利要求8多肽。
14.权利要求13的方法，其中结合所述多肽的化合物为一种抗体。
15.一种试剂盒，它包括选择性结合权利要求8的多肽的化合物和使用说明书。
16.检测权利要求1核酸分子在样品中的存在的方法，包括
a)使所述样品和选择性地与所述核酸分子杂交的核酸探针或引物接触；和
b)检测所述核酸探针或引物是否结合所述样品中的核酸分子，由此检测所述样品中的权利要求1核酸分子的存在。
17.权利要求16的方法，其中所述样品包含mRNA分子，并使其与一种核酸探针接触。
18.一种试剂盒，它包括选择性与权利要求1的核酸分子杂交的化合物和使用说明书。
19.鉴定结合权利要求8的多肽的化合物的方法，包括：
a)使所述多肽或表达该多肽的细胞与受试化合物接触；和
b)测定所述多肽是否结合所述受试化合物。
20.权利要求19的方法，其中所述受试化合物与所述多肽的结合采用选自以下的方法检测：
a)通过直接检测受试化合物/多肽结合而检测结合；
b)采用竞争性结合测定法检测结合；和
c)采用检测PCIP活性的测定法检测结合。
21.调节权利要求8的多肽的活性的方法，该方法包括使所述多肽或表达该多肽的细胞与化合物接触，所述化合物的浓度足以结合所述多肽，以调节所述多肽活性。
22.鉴定调节权利要求8多肽活性的化合物的方法，包括
a)使权利要求8的多肽与受试化合物接触；和
b)测定所述受试化合物对所述多肽活性的作用，由此鉴定调节所述多肽活性的化合物。
23.鉴定一种化合物的方法，所述化合物能够治疗特征为PCIP核酸表达或PCIP蛋白活性异常的疾病，所述方法包括检测所述化合物或药物调节权利要求1的PCIP核酸分子的表达或权利要求8的PCIP多肽的活性的能力，由此鉴定能够治疗特征为PCIP核酸表达或PCIP蛋白活性异常的疾病的化合物。
24.权利要求23的方法，其中所述疾病为CNS疾病。
25.权利要求24的方法，其中所述疾病为癫痫。
27.权利要求24的方法，其中所述疾病为脊髓小脑性共济失调。
28.权利要求23的方法，其中所述疾病为心血管疾病。
29.权利要求28的方法，其中所述心血管疾病与Ito电流异常有关。
30.检测以PCIP核酸表达和/或PCIP蛋白活性异常为特征的疾病的风险个体的方法，该方法包括检测所述个体细胞样品是否存在遗传损害，其中所述遗传损害的特征为发生的改变影响编码权利要求8的PCIP多肽的基因完整性或权利要求1的PCIP核酸分子表达异常。
31.权利要求30的方法，其中所述疾病为CNS疾病。
32.权利要求31的方法，其中所述疾病为癫痫。
33.权利要求31的方法，其中所述疾病为脊髓小脑性共济失调。
34.权利要求30的方法，其中所述疾病为心血管疾病。
35.权利要求34的方法，其中所述心血管疾病与Ito电流异常有关。
36.鉴定罹患特征为PCIP核酸表达和/或PCIP蛋白活性异常的疾病的患者的方法，该方法包括从所述患者获取生物样品，检测所述样品是否存在遗传损害，其中所述遗传损害的特征为发生的改变影响编码权利要求8的PCIP多肽的基因完整性或权利要求1的PCIP核酸分子表达异常，由此鉴定罹患特征为PCIP核酸表达和/或PCIP蛋白活性异常的疾病的患者。
37.权利要求36的方法，其中所述疾病为CNS疾病。
38.权利要求37的方法，其中所述疾病为癫痫。
39.权利要求37的方法，其中所述疾病为脊髓小脑性共济失调。
40.权利要求36的方法，其中所述疾病为心血管疾病。
41.权利要求40的方法，其中所述心血管疾病与Ito电流异常有关。
42.治疗罹患钾通道相关疾病的患者的方法，该方法包括给予所述患者权利要求8的PCIP多肽或其部分，从而实现治疗。
43.权利要求42的方法，其中所述疾病为CNS疾病。
44.权利要求43的方法，其中所述疾病为癫痫。
45.权利要求43的方法，其中所述疾病为脊髓小脑性共济失调。
46.权利要求42的方法，其中所述疾病为心血管疾病。
47.权利要求46的方法，其中所述心血管疾病与Ito电流异常有关。
48.治疗罹患钾通道相关疾病的患者的方法，该方法包括给予所述患者权利要求8的PCIP多肽或其部分，从而实现治疗。
49.权利要求48的方法，其中所述疾病为CNS疾病。
50.权利要求49的方法，其中所述疾病为癫痫。
51.权利要求49的方法，其中所述疾病为脊髓小脑性共济失调。
52.权利要求48的方法，其中所述疾病为心血管疾病。
53.权利要求52的方法，其中所述心血管疾病与Ito电流异常有关。
54.用权利要求23的方法鉴定的化合物的用途，用于治疗钾通道相关疾病。
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