CN1382156A - 与bcl－xl相互作用的多肽pablo及其有关用途 - Google Patents

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Abstract

本发明至少部分涉及包括BCL－XL结合结构域的多肽,PABLO多肽的新的BCL－XL结合结构域,编码这些多肽的核酸分子及其应用。例如,这些多肽和核酸分子可用于调节凋亡(尤其是神经细胞中的凋亡),以及用于治疗或预防能得益于细胞死亡的调节的失调。

Description

与BCL-XL相互作用的多肽PABLO及其有关用途
发明背景
凋亡涉及控制某些分化的细胞类型(例如造血谱系和其它体细胞和干细胞)的量和分布。凋亡首先被描述成以细胞收缩、膜出泡和染色质浓缩最终使细胞片段化为特征的细胞死亡形态图案(Kerr等，1972，Br.J.Cancer 26：239)。经历凋亡的细胞表现出内核小体DNA断裂的特征性图案(Wyllie.1980.Int.Rev.Cytol.69：251；Abrams等人1993，Development.117：29)。
经鉴定编码参与调节凋亡的蛋白的首个基因bcl-2从携带t(14∶18)的B细胞淋巴瘤的染色体断点克隆得到(Tsujimoto等人，1984.Science 226：1097)，它表现出抑制细胞的凋亡易感性(Cory.1994.Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.345：289)。随后对与bcl-2有同源性的几个基因作为了特性鉴定，这些基因包括：al，它编码80氨基酸的蛋白，该蛋白对GM-SCF或LPS反应而在巨噬细胞中迅速诱导产生(Lin等人，1993，J.Immunol..151，1979-1988)；mcl-1，经历巨噬细胞分化的骨髓细胞系中的早期应答基因(Kozopas等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，3516-3520)；和bak，一种可能增强凋亡的bcl-2同源物(Chittenden等人，1995.Nature 374：733；Kiefer等人，1995.Nature 374：736)。与bcl-2相互作用和/或在结构上与bcl-2基因产物有关的其它蛋白质也已被鉴定，例如Bcl-XL和Bcl-xS(Boise等人，1993.Cell 74：957)；Ced-9(Vaux等人，1992.Science 258：1955)和两种DNA病毒蛋白(非洲淋巴瘤病毒LMW5-HL和BHRF-1)。
与Bcl-2蛋白家族密切相关的bcl-x基因产物也保护细胞以防凋亡。Bcl-x缺陷型小鼠的分析提示，它在神经和造血系统发育期间支持不成熟细胞的存活(Motoyama等人，1995.Science 267，1506-1510；Ma等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4763-4767)。人bcl-x的可变剪接可能产生至少两个不同的bcl-x mRNA物种，bcl-xL和bcl-xS。较大的bcl-x mRNA的主要蛋白产物(233氨基酸)Bcl-xL在生长因子减少时抑制细胞死亡(Boise等人，1993.Cell 74，597-608)，其转基因表达改变了胸腺细胞成熟，使成熟胸腺细胞的数量增加(Chao等人，1995.J.Exp.Med.，182，821-828；Grillot等人，1995.J.Exp.Med.，182，1973-1983)。另一方面，Bcl-xS抑制了Bcl-2抑制细胞死亡的能力，使得细胞更容易发生凋亡性细胞死亡。其它的鼠Bcl-x同种型(称为Bcl-xβ和Bcl-xΔTM)已被鉴定。β同种型能抑制神经元中的凋亡(Gonzalez-Garcia等人，1995.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，4304-4308)，ΔTM同种型能抑制B细胞中的凋亡(Fang等人，同上)。
因此，BCL-2蛋白家族包括促凋亡性和抗凋亡性成员(Farrow和Brown，1996，Curr.Opin.Genet.Dev.6：45)。Bcl-2有关的蛋白共同具有的同源性群集在四个保守区域内(称为Bcl-2同源性1-4(BH1-4)结构域)。一个两亲性的α螺旋BH3对于促凋亡性家族成员特别重要(Korsmeyer.1999.Cancer Res.1：1693s-1700s；Chittenden等人，1995.EMBO J 14：5589)。促凋亡性分子仅仅在BH3处与Bcl-2家族有序列同源性。Bcl-xL的BH1、BH2和BH3结构域形成的疏水性断裂负责Bcl-xL和含HB3的死亡激动剂之间的相互作用(Minn等人.EMBO J 1999年2月1日；18(3)：632-43)。
除了在正常发育中起作用外，凋亡还参与了病理性状况，例如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和脊髓性肌萎缩(例如参见Passer等人，J.Biol.Chem.1999/8/20；274：24007)。另外，调节细胞内凋亡的能力在控制不希望的细胞增殖(例如癌细胞增殖)方面是有价值的。因此，能调节凋亡的因子的鉴定可能在研究和治疗应用方面在控制细胞增殖、分化和/或凋亡中有用。
发明概述
本发明至少部分是基于这样一个发现：Pablo及其衍生的多肽与Bcl-xL相互作用，因此可以用作调节各种细胞过程、尤其是神经细胞过程中的调节剂。
因此，本发明一方面提供了一种分离的核酸分子，它包含选自下列的核苷酸序列：a)编码分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域的核苷酸序列，其中所述分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域与SEQ ID NO：2所示的Bcl-xL结合结构域有70％的氨基酸序列相同性；b)编码分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在45℃6X SSC中、然后在50-65℃下用0.2 SSC和0.1％SDS洗涤一次或多次后与编码Bcl-xL结合结构域的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的互补序列杂交；和c)如SEQID NO：1所示的编码分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域的核苷酸序列。
在一个实施方案中，分离的Bcl-xL结合结构域由SEQ ID NO：2的大约419-559位氨基酸或大约429-559位氨基酸所示的氨基酸序列组成。在另一实施方案中，分离的Bcl-xL结合结构域由SEQ ID NO：2的436-489位氨基酸所示的氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，分离的Bcl-xL结合结构域调节神经细胞中的凋亡。
在一个实施方案中，核酸分子编码融合蛋白。
本发明一方面涉及一种分离的多肽，该多肽选自下列：a)包含分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域的多肽，其中所述分离的Bcl-xL结合结构域由与SEQ ID NO：2所示的Pablo Bcl-xL结合结构域有至少70％相同性的氨基酸序列组成；b)包含Bcl-xL结合结构域的多肽，其中所述Bcl-xL结合结构域由与SEQ ID NO：2所示的PabloBcl-xL结合结构域有至少70％相同性的氨基酸序列组成，条件是所述多肽不是全长Pablo多肽；和c)包含SEQ ID NO：2所示的Bcl-xL结合结构域的多肽。
另一方面，本发明涉及一种多肽，该多肽包含SEQ ID NO：2所示的分离的Bcl-xL结合结构域。在另一实施方案中，对Bcl-xL结合结构域作了保守性氨基酸置换。
另一方面，本发明涉及一种由SEQ ID NO：2所示的分离的Bcl-xL结合结构域组成的多肽。
在一个实施方案中，该分离的Bcl-xL结合结构域由SEQ ID NO：2的419-559位氨基酸或429-559位氨基酸组成。在另一实施方案中，分离的Bcl-xL结合结构域由SEQ ID NO：2的436-489位氨基酸组成。
在一个实施方案中，分离的Bcl-xL结合结构域调节神经细胞凋亡。
另一方面，本发明涉及一种融合蛋白，该蛋白包含由分离的Bcl-xL结合结构域组成的第一多肽和非Pablo的第二多肽。
另一方面，本发明涉及一种分离的核酸分子，该核酸分子与编码Bcl-xL结合结构域的SEQ ID NO：1的那部分反义。
本发明还有一个实施方案涉及一种包含权利要求1所述核酸分子的载体。
在另一实施方案中，本发明涉及一种稳定表达SEQ ID NO：2所示的分离的Bcl-xL结合结构域或外源Pablo多肽的神经细胞系。
另一方面，本发明涉及一种非人转基因动物，它包含编码至少一种转基因Pablo蛋白的转基因以及至少一个指导至少一种转基因Pablo蛋白表达的启动子元件。
在一个实施方案中，该Pablo蛋白是人Pablo。
在一个实施方案中，该非人转基因动物是小鼠。
在一个实施方案中，至少一个启动子元件指导组织特异性的表达。
在一个实施方案中，启动子元件主要指导神经细胞中的表达。
在一个实施方案中，至少一个启动子选自Thy1.2启动子和神经元特异性烯醇酶启动子。
在一个实施方案中，转基因Pablo蛋白包含截短的或改变的Pablo蛋白。
在一个实施方案中，转基因Pablo蛋白是Pablo的显性失活突变体。
在一个实施方案中，转基因动物包含可调节的表达系统。
在一个实施方案中，可调节的表达系统是四环素依赖型表达系统，它包含四环素敏感型反式激活蛋白和在转基因启动子元件中的至少一个四环素敏感型反式激活蛋白的识别位点序列。在另一实施方案中，四环素敏感型反式激活蛋白还包含转录阻遏蛋白结构域。
在一个实施方案中，转录阻遏蛋白结构域是KRAB结构域。
另一方面，本发明涉及一种非人转基因动物，它包含一基因组，该基因组中内源性Pablo蛋白已经缺失或改变，从而使该动物中不发生Pablo的功能性表达。
另一方面，本发明涉及一种调节细胞凋亡的方法，该方法包括调节Pablo多肽或其Bcl-xL结合结构域的活性。
另一方面，本发明涉及一种调节细胞凋亡的方法，该方法包括调节Pablo多肽或其Bcl-xL结合结构域的表达。
另一方面，本发明涉及一种治疗对象神经系统失调的方法，该方法包括调节对象细胞中Pablo的表达或活性，从而治疗该对象体内的神经系统失调。
另一方面，本发明涉及一种鉴定化合物的方法，该化合物调节Bcl-xL结合结构域的调节凋亡的能力，该方法包括：
使表达Bcl-xL结合结构域的细胞与测试化合物接触；
测定测试化合物调节Bcl-xL结合结构域活性的能力，从而鉴定出能调节Bcl-xL结合结构域的凋亡调节能力的化合物。
还有一方面，本发明涉及一种鉴定化合物的方法，该化合物能调节Bcl-xL结合结构域与Bcl-xL相互作用的能力，该方法包括：
使含有Bcl-xL结合结构域的无细胞混合物与测试化合物接触；测定测试化合物对Bcl-xL结合结构域与Bcl-xL相互作用能力的调节能力，从而鉴定出能调节Bcl-xL结合结构域与Bcl-xL相互作用能力的化合物。
附图简述
图1表示在转染后30小时，与用空白载体(eGFP)转染的细胞相比，用Pablo转染的大鼠海马神经元100％显示出异常的核形态(从固缩核看出)(**p＜0.01)。
图2显示出不表达Pablo的PC12细胞存活，而诱导Pablo表达(无DOX)的PC12细胞存活较少。
图3显示出在转染/诱导后48小时对于绿色荧光蛋白呈阳性(GFP+)的表达Pablo的PC12细胞百分数。该数据是显示单用eGFP载体(eGFP)或eGFP载体+Bcl-xL(Bcl-xL)转染的表达Pablo的细胞。
图4说明，在转染/诱导后48小时，经含有Bcl-xL的eGFP载体(Bcl-xL)转染的表达Pablo的PC12细胞只有3.5％表现出凋亡的胞核。
图5显示出，与单单表达eGFP载体的细胞相比，表达Pablo的293细胞(单单Pablo)中固缩核没有统计学上有意义的增加。
图6显示出图5中接受单独载体或载体+Pablo的293细胞的转染效率大体相同。
图7显示出，当只测定GFP+细胞时，图5中接受单独载体或载体+Pablo的293细胞中具有固缩核的细胞百分数大体上相同。
图8显示出Pablo转染引起神经细胞凋亡，但不引起非神经细胞凋亡。
图9显示了经eGFP空白载体、有PabloΔ142突变体的eGFP载体或全长Pablo-eGFP构建物转染的GFP阳性神经元存活百分数。
图10显示了Bcl-xLΔTM构建物的核苷酸序列。
图11显示了在酵母双杂交筛选中用作诱饵的Bcl-xL的氨基酸序列。
图12显示了PabloΔ142突变体的核苷酸序列。
图13显示了PabloΔ142突变体的氨基酸序列。
图14是PabloΔ142，Δ70和尾构建物的示意图。
图15表明Pablo全长构建物和Δ70构建物对于大鼠小脑颗粒神经元培养液有毒性，而Δ142和尾构建物没有。
图16显示了全长Pablo的表达和各种Pablo缺失构建物的共转染引起的预计毒性。
图17是为产生图16所示数据所进行的共转染的总结。
发明详述
本发明至少部分是基于这样一个发现：即，Pablo蛋白和从中衍生的新多肽与Bcl-xL相互作用，从而调节了凋亡，尤其是神经细胞凋亡。Pablo Bcl-xL结合结构域已作了特性鉴定。另外，Pablo经证实是第一个通过BH3结构域以外的结构域与Bcl-xL相互作用的促凋亡性多肽。
本发明的这些和其它方面在以下有更详细的描述。
I.定义
本文所用的术语“Pablo”指促凋亡性Bcl-xL结合蛋白。Pablo的核苷酸序列和氨基酸序列以前已被Nagase等人(DNA Research(1996)3：321-324)鉴定，在该文献中称为KIAA0269。Pablo的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：1中，Pablo的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：2中。Pablo多肽包含新的具有Pablo活性的Bcl-xL结合结构域。本文所用的术语“Pablo活性”或“Pablo多肽的活性”包括调节细胞(如神经细胞)凋亡的能力。在一个实施方案中，Pablo活性指根据标准技术在体内或体外测得的Pablo多肽或其部分对Pablo相应性细胞或Pablo结合伙伴的活性。在一个实施方案中，Pablo活性是直接的活性，例如与Pablo-靶分子结合。本文所用的术语“靶分子”或“结合伙伴”是与Pablo蛋白天然结合或相互作用从而实现Pablo介导的功能的分子。与Pablo多肽相互作用的结合伙伴是Bcl-xL分子。
本文所用的术语“凋亡”包括编程性细胞死亡，它可用本领域已知的技术来鉴定。凋亡性细胞死亡可通过细胞收缩、膜出泡和染色质浓缩最终导致细胞片段化来表征。经历凋亡的细胞还表现出核小体间DNA断裂的特性性图案。本文所用的术语“调节凋亡”包括细胞(如神经细胞)的调节性编程性细胞死亡。本文所用的术语“调节凋亡”包括上调或下调细胞中的凋亡。凋亡的调节在下文有更详细的讨论，它可用来改善各种失调，例如神经失调。
本文所用的术语“Bcl-xL结合结构域”包括与Bcl-xL多肽相互作用的结构域，较佳的是与BH3结构域没有显著的氨基酸序列同源性。本文所用的术语“BH3结构域”包括具有氨基酸序列Leu-Ala-Gln-Xaa1-Gly-Asp-Xaa2-Met-Asp的结构域，其中Xaa1是Ile或Val，Xaa2是Gln或Ser(例如参见美国专利5,955,593)。较佳的Bcl-xL结合结构域是哺乳动物如人型。较佳的是，Bcl-xL结合结构域调节细胞(较佳的是神经细胞)中的凋亡。Bcl-xL结合结构域可包含约50、70、90、120、130、140或150个氨基酸。据信，Bcl-xL结合需要最少数目的核心氨基酸残基，然而，最大的Bcl-xL结合活性可能需要额外的氨基酸残基，它们例如起着给Bcl-xL多肽提供额外的接触残基、使核心的Bcl-xL结合结构域稳定或使Bcl-xL结合结构域与Bcl-xL多肽的复合物稳定的功能。较佳的Bcl-xL结合结构域长度约为120-150个氨基酸残基。更佳的，Bcl-xL结合结构域的长度约为130-140个氨基酸。较佳的Bcl-xL结合结构域列于SEQID NO：2中。较佳的Bcl-xL结合结构域位于多肽(例如SEQ ID NO：2所示的多肽)的羧基端。较佳的Bcl-xL结合结构域可包含SEQ ID NO：2中从氨基酸420、440或450位到氨基酸470、480、500、520、540或560位。在一个实施方案中，Pablo Bcl-xL结合结构域不由氨基酸445-559位或氨基酸522-559位组成。在另一个实施方案中，PabloBcl-xL结合结构域包含SEQ ID NO：2的氨基酸419到氨基酸550，或从氨基酸429到氨基酸559。如实施例7所示，已表明Pablo的羧基端结构域起着抑制Pablo的凋亡活性的显性失活突变体的作用，该羧基端包含从大约氨基酸418到大约氨基酸559的氨基酸序列。在较佳的实施方案中，Pablo Bcl-xL结合结构域包括从大约氨基酸436到大约氨基酸483的序列。
至于Bcl-xL结合结构域，术语“分离的Bcl-xL结合结构域”包括从包含全长Bcl-xL结合分子的氨基酸残基(如Pablo)中分离出的结构域。例如，编码分离的Bcl-xL结合结构域的核酸分子由编码Pablo Bcl-xL结合结构域的Pablo核酸分子的该部分组成。同样，分离的Pablo Bcl-xL结合结构域由含有Bcl-xL结合结构域氨基酸残基的Pablo多肽的该部分组成。这些分离的Bcl-xL结合结构域与来自于制备过程的Pablo分子的其余部分分开(例如，与分子的氨基端氨基酸分开或与编码分子氨基端氨基酸的核苷酸分开)。然后，这些分离的Bcl-xL结合结构域和Pablo Bcl-xL结合结构域可与其它核苷酸或氨基酸序列(例如载体序列或融合蛋白等)合并或相连。
“分离的”核酸分子是指那些与天然的核酸来源中存在的其它核酸分子分开的核酸分子。例如，对于基因组DNA，术语“分离的”包括从与基因组DNA天然相连的染色体中分离出的核酸分子。较佳的是，“分离的”核酸分子不含在生物体基因组DNA(该核酸分子从该DNA获得)中天然地接在核酸分子两侧的序列(即，位于核酸分子5′和3′端的序列)。例如，在不同实施方案中，分离的Pablo核酸分子可含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的天然地接在细胞基因组DNA(从该DNA获得该核酸序列)中该核酸序列两侧的核苷酸序列。另外，“分离的”核酸分子(如cDNA分子)可以基本上不含其它细胞物质或培养基(当用重组技术产生时)，或基本上不含化学前体或其它化学物质(当化学合成时)。然而，“分离的”Pablo核酸分子可以和通常在基因组DNA中并不接在Pablo序列两侧的其它核苷酸序列相连(例如，Pablo核苷酸序列可与载体序列相连)。在某些较佳的实施方案中，“分离的”核酸分子(如cDNA分子)也可不含其它细胞物质。然而，Pablo核酸分子被认为是“分离的”的情况不一定是不含其它细胞物质(例如，与其它哺乳动物DNA分开并插入细菌细胞的Pablo DNA分子仍然被认为是“分离的”)。
本文所用的术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”指当从细胞中分离出来或用重组DNA技术产生时基本上不含其它蛋白质、多肽、细胞物质和培养基的蛋白或多肽，或是当化学合成时不含化学前体或其它化学物质。“分离的”或“纯化的”蛋白或其生物活性部分基本上不含获得该Pablo蛋白的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染性蛋白，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质。术语“基本上不含细胞物质”包括Pablo蛋白制剂中蛋白与分离或重组产生该蛋白的细胞组分相分离。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞物质”包括Pablo蛋白制剂含有少于约30％(干重)的非Pablo蛋白(在本文中也称为“污染性蛋白”)，更佳的少于约20％的非Pablo蛋白，还要佳的少于约10％非Pablo蛋白，最佳的少于约5％非Pablo蛋白。当Pablo蛋白或其生物活性部分用重组方法产生时，它最好也基本上不含培养基，即培养基宜少于约20％，更佳的少于约10％，最佳的少于蛋白制剂量的约5％。
术语“基本上不含化学前体或其它化学物质”指，Pablo蛋白的制剂中蛋白与参与该蛋白合成的化学前体或其它化学物质相分离。在一个实施方案中，术语“基本上不含化学前体或其它化学物质”指Pablo蛋白制剂含有少于约30％(干重)的化学前体或非Pablo化学物质，更佳的含有少于约20％的化学前体或非Pablo化学物质，还要佳的含有少于约10％的化学前体或非Pablo化学物质，最佳的含有少于约5％的化学前体或非Pablo化学物质。
本文所用的术语“神经细胞”包括神经细胞(即神经元，例如单极、双极或多极神经元)和神经细胞前体以及神经胶质细胞(例如大神经胶质细胞如少突胶质细胞、神经膜细胞和星形胶质细胞，或小神经胶质细胞)和神经胶质细胞前体。在较佳的实施方案中，用于本发明的神经细胞是哺乳动物如人的从中枢或外周神经系统获得的神经细胞。神经细胞前体也可用来实施本发明的方法。本文所用的术语“神经前体”指未分化的神经细胞，例如神经干细胞和神经祖细胞。本文所用的术语“神经干细胞”指能增殖并产生额外的能在适当条件下分化成神经祖细胞的神经干细胞的未分化的神经细胞。本文所用的术语“神经祖细胞”指衍生自神经干细胞的未分化的神经细胞，它能在合适条件下分化成神经细胞。术语“神经前体”还包括能诱导分化成神经细胞的全能性细胞(例如来自早期胚胎的发育能力没有限制的细胞)。这些前体细胞可用作神经细胞的来源，即，用于本发明的神经细胞可从这些前体细胞衍生获得。本文所用的术语“衍生”(相对于前体细胞)指从全能干细胞和多能干细胞发育或分化而来或以它们为祖先的细胞。获得神经前体细胞(例如神经干细胞和/或祖先细胞)的方法是本领域中熟知的。例如，PCT出版物WO95/12665(1995年5月11日公开)、PCT出版物WO97/02049(1997年1月23日公开)、美国专利5,735,506中(这些文献均纳入本文作为参考)获得的神经干细胞和祖细胞可用于本发明中来产生细胞。
本文所用的术语“调节Pablo活性或表达”包括上调和下调细胞中Pablo的活性或表达(例如在转录或翻译水平上)。
术语“家族”在指蛋白和核酸分子时，指具有共同的结构域或基序且具有本文定义的足够的氨基酸或核苷酸序列同源性的两种或多种蛋白质或核酸分子。这些家族成员可天然存在或非天然存在，可来自相同或不同的动物种类。例如，一个家族可含有人源的第一个蛋白，以及人源的其它不同蛋白，或可含有非人源的同源物。家族成员也可具有共同的功能特征。
本文所用的术语“相互作用”指分子之间的可检测的相互作用，这种相互作用例如可用酵母双杂交试验来检测。术语“相互作用”也包括分子之间的结合“相互作用”。相互作用本质上可以是蛋白-蛋白之间或蛋白-核酸之间。
本文所用的术语“天然存在的”核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如编码天然蛋白)。
本文所用的术语“反义”核酸包括与编码蛋白的“有义”核酸互补(例如，与双链cDNA分子的编码链互补，与mRNA序列互补，或与基因的编码链互补)的核苷酸序列。因此，反义核酸分子可以与有义的核酸分子氢键相连。
本文所用的术语“编码区”指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列，而术语“非编码区”指不翻译成氨基酸的核苷酸序列(例如5′和3′非翻译区)。
本文所用的术语“载体”指能运输已与其相连的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指环状双链DNA环，该环内可连接入额外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA片段可连接入病毒基因组中。某些载体能在其倒入的宿主细胞中自主复制(例如，细菌载体具有细菌复制起点和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在倒入宿主细胞中后整合到宿主细胞基因组中，从而和宿主基因组一起复制。另外，某些载体能指导与它们操作性相连的基因表达。这些载体在本文中称为“重组型表达载体”或简称“表达载体”。通常，用于重组DNA技术的表达载体通常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换，因为质粒是最通常使用的载体形式。然而，本发明还包括其它形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们具有等价的功能。
本文所用的术语“宿主细胞”指这样一种细胞，该细胞中导入了本发明的核酸分子(如本发明的重组表达载体)。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，这些术语不仅指特定的对象细胞，还指该细胞的后代或潜在的后代。由于后代可能会因突变或环境影响而发生某些变化从而使后代可能实际上与母细胞不同，但是它们仍然包括在本文所用术语的范围内。较佳的宿主细胞是哺乳动物细胞，如人细胞。在特别佳的实施方案中，它是神经细胞。
本文所用的术语“异源DNA”或“异源核酸”包括这样的DNA，它并非作为所存在的基因组中天然存在的一部分，或在基因组中所见的位置与其天然存在的位置不同，或与非天然正常连接的DNA操作性相连(即，与异源启动子操作性相连的基因)。异源DNA不是天然存在于该位置上，或对于所导入的细胞不是内源性的，而是从另一细胞获得的。异源DNA可来自相同或不同的动物种类。在一个实施方案中，它是哺乳动物型例如人型。被本领域技术人员认为对于其表达的细胞而言是异源或外来的DNA在本文中均包括在术语“异源DNA”中。相反，术语“内源性”用于核酸时，包括宿主细胞的天然DNA，即，并非导入、而是天然存在于生物体细胞或基因组中(即没有用分子生物学技术改变或导入)的DNA。
术语“异源蛋白质”、“重组蛋白质”和“外源蛋白质”在本说明书中可互换使用，它们均指重组DNA技术产生的多肽，其中编码多肽的DNA通常被插入合适的表达载体中，进而用该表达载体来转化宿主细胞，以产生异源蛋白。即，多肽由异源核酸表达。
本文所用的术语“转基因动物”指非人动物，较佳的是哺乳动物，更佳的是小鼠，其中该动物的一个或多个细胞包括“转基因”。术语“转基因”指这样一种外源DNA，该DNA被整合入可发育成转基因动物的细胞基因组中，并保留在成熟动物的基因组中，例如来指导所编码的基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。
本文所用的术语“同源重组动物”指一种转基因非人动物，较佳的是哺乳动物，更佳的是小鼠，其中内源性基因已经因内源性基因和导入该动物细胞(例如在动物发育前的动物胚胎细胞)的外源性DNA分子之间同源重组而改变。
本文所用的术语“抗体”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，即含有能结合抗原的抗原结合部位(如Fab和F(ab′)2片段、单链抗体、胞内抗体、scFv、Fd或其它片段)的分子。较佳的，本发明的抗体特异性或基本上特异性地结合Pablo分子。本文所用的术语“单克隆抗体”和“单克隆抗体组合物”指只含有一种能与抗原特定表位免疫反应的抗原结合部位的抗体分子群，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”指含有多种能与特定抗原相互作用的抗原结合部位的抗体分子群。因此，单克隆抗体组合物通常表现出对与其免疫反应的特定抗原有单一的结合亲和力。
本文所用的术语“Pablo相关的疾病(失调)”包括因调节Pablo活性或表达而受益的疾病。在一个实施方案中，Pablo相关的疾病是因调节Pablo活性或表达而受益的神经系统疾病。Pablo相关的疾病例子包括受益于细胞死亡增加或减少的中枢或周围神经系统疾病。典型的疾病包括急性和慢性神经变性疾病，如中风、阿尔茨海默病、与阿尔茨海默病有关的痴呆(如Pick病)、帕金森病和其它Lewy弥散性身体疾病，亨庭顿氏病、脊髓性肌萎缩、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、进行性核上性麻痹、癫痫和Jakob-Creutzfieldt病；精神病，如抑郁症、精神分裂、korsakoff精神异常、狂躁症、焦虑症、或恐惧症；认知和记忆障碍，例如健忘或与年龄有关的记忆丧失；和神经性疾病，如偏头痛。与Pablo相关的疾病的其它例子包括涉及不希望有的细胞增殖的疾病，例如癌，尤其是中枢或周围神经系统癌。
II.分离的编码Pablo或其部分的核酸分子
在实施本发明方法中，可用各种试剂来调节细胞中Pablo的活性和/或表达。在一个实施方案中，该试剂是编Pablo多肽或其部分的核酸分子。下面将更详细地描述这些核酸分子。
Pablo多肽的分析已经鉴定出在Pablo多肽C端约130个氨基酸内有一个介导Pablo和Bcl-xL相互作用的蛋白质区域。因此，本发明一方面涉及编码Pablo多肽中与Bcl-xL分子相互作用的部分的核酸分子。
特定蛋白质的氨基酸序列和能编码该蛋白的核苷酸序列之间有通过遗传密码(如下所示)来确定的已知的明确关系。同样，特定核酸分子的核苷酸序列与该核酸分子所编码的氨基酸序列之间也能通过遗传密码来确定的已知的明确关系。
遗传密码
丙氨酸(Ala，A)              GCA，GCC，GCG，GCT
精氨酸(Arg，R)              AGA，ACG，CGA，CGC，CGG，CGT
天冬酰胺(Asn，N)            AAC，AAT
天冬氨酸(Asp，D)            GAC，GAT
半胱氨酸(Cys，C)            TGC，TGT
谷氨酸(Glu，E)              GAA，GAG
谷氨酰胺(Gln，Q)            CAA，CAG
甘氨酸(Gly，G)              GGA，GGC，GGG，GGT
组氨酸(His，H)              CAC，CAT
异亮氨酸(Ile，I)            ATA，ATC，ATT
亮氨酸(Leu，L)              CTA，CTC，CTG，CTT，TTA，TTG
赖氨酸(Lys，K)              AAA，AAG
甲硫氨酸(Met，M)            ATG
苯丙氨酸(Phe，F)            TTC，TTT
脯氨酸(Pro，P)              CCA，CCC，CCG，CCT
丝氨酸(Ser，S)              AGC，AGT，TCA，TCC，TCG，TCT
苏氨酸(Thr，T)              ACA，ACC，ACG，ACT
色氨酸(Trp，W)              TGG
酪氨酸(Tyr，Y)              TAC，TAT
缬氨酸(Val，V)              GTA，GTC，GTG，GTT
终止信号(末端)            TAA，TAG，TGA
遗传密码的一个重要而熟知的特征是它的简并性，对于用来获得该蛋白的大多数氨基酸而言，可由一个以上的核苷酸三联体(如上所述)编码。因此，有多个不同的核苷酸序列能编码一个给定氨基酸序列。这些核苷酸序列被认为在功能上是等价的，因为它们能在所有生物中产生相同的氨基酸序列(虽然某些生物可能比其它生物更有效地翻译某些序列)。另外，有时在给定核苷酸序列中可能会发现有嘌呤或嘧啶的甲基化变体。这些甲基化不影响三核苷酸密码与对应氨基酸之间的编码关系。
鉴于上述内容，可采用编码本发明Pablo多肽(或其部分)的DNA或RNA分子的核苷酸序列，利用遗传密码将DNA或RNA分子翻译成氨基酸序列，从而获得Pablo氨基酸序列。同样，对于任何Pablo氨基酸序列，可根据遗传密码推导出对应的核苷酸序列(由于冗余性，任何给定氨基酸序列会产生多个核酸序列)。因此，本文中关于Pablo核苷酸序列的描述和/或揭示应认为也包括了对该核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或揭示。同样，本文对于Pablo氨基酸序列的描述和/或揭示也应认为包括了对编码该氨基酸序列的所有可能的核苷酸序列的描述和/或揭示。本发明一方面涉及编码Pablo蛋白或其生物活性部分的分离的核酸分子，以及足以用作杂交探针来鉴定编码Pablo的核酸(如Pablo mRNA)的核酸片段，可作为PCR引物用于Pablo核酸分子扩增或突变的片段。应当理解，在讨论Pablo核酸分子(如SEQ ID NO：1所示)的用途时，可使用该核酸分子的片段和全长Pablo核酸分子。本文所用的术语“核酸分子”包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链，但较佳的是双链DNA。
本发明的核酸分子(如具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸分子或其一部分)可用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息来分离。例如，利用所有或部分的SEQ ID NO：1的核酸序列作为杂交探针，可用标准的杂交和克隆技术(如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.《分子克隆实验指南》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)来分离Pablo核酸分子。
另外，可根据SEQ ID NO：1的序列分别设计的合成寡核苷酸引物通过聚合酶链反应(PCR)来分离包括所有或部分SEQ ID NO：1的核酸分子。
本发明的核酸可用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，用合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增。如此扩增得到的核酸可克隆到合适的载体中，并通过DNA序列分析来表征。另外，可用标准的合成技术(如用DNA自动合成仪)来制备对应于Pablo核苷酸序列的寡核苷酸。
在一个较佳的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包括SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
在另一较佳的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含这样一个核酸分子，它是SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其部分的互补序列。与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列互补的核酸分子是与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列充分互补从而能与SEQ IDNO：1所示核苷酸序列杂交形成稳定的双链的序列。
在其它较佳的实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含这样一种核苷酸序列，它与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列(例如核苷酸序列的整个长度)或该核苷酸序列的一部分(例如SEQ ID NO：1编码的Bcl-xL结合结构域)有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高的同源性。
另外，本发明的核酸分子能仅仅包含SEQ ID NO：1的核酸序列的一部分，例如，能用作探针或引物的片段或编码Pablo蛋白生物活性部分的片段。从Pablo基因克隆测得的核苷酸序列能产生探针和引物，设计用于鉴定和/或克隆其它Pablo家族成员以及来自其它动物种类的Pablo家族同系物。探针/引物通常包含基本上纯化的寡核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸包含在严谨条件下与SEQ ID NO：1的有义序列或SEQ ID NO：1的天然存在的等位基因变体或突变体中至少约12或15个、较佳约20或25个、更佳约30、35、40、45、50、55、60、65、75或100个毗连的核苷酸杂交的核苷酸序列区域。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子包含长度至少约400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、1000或1100个核苷酸、且在严谨杂交条件下与SEQ ID NO：1的核酸分子或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在另一实施方案中，本发明的核酸分子包含SEQ ID NO：1的至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100个毗连的核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子与包含SEQ ID NO：1中至少约300、400、500、600、700、800或900个核苷酸的核酸分子有至少70％的相同性，更佳的有80％的相同性，还要佳有90％的相同性。
基于Pablo核苷酸序列的探针可用来检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。在较佳的实施方案中，探针还包含与其相连的标记基团，例如该标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。这些探针可用作诊断测试试剂盒的一部分，用于鉴定错误表达Pablo蛋白的细胞或组织(尤其是神经细胞或组织)，例如对象细胞样品中编码Pablo的核酸水平，检测Pablo mRNA水平或确定基因组Pablo基因是否突变或缺失。
编码“Pablo蛋白生物活性部分的核酸片段”可以这样来制得：分离出SEQ IDNO：1中编码有Pablo生物活性(例如能结合Bcl-xL)的多肽的核苷酸序列部分，使Pablo蛋白的编码部分表达(例如用体外重组表达)，然后评价Pablo蛋白的编码部分的活性。
由于遗传密码简并性与SEQ ID NO：1不同、但所编码的Pablo蛋白与SEQ IDNO：1编码的蛋白相同的核酸分子均包括在本发明中。因此，在另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子具有编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列。
除了SEQ ID NO：1所示的Pablo核苷酸序列外，本领域技术人员知道，一种群体(例如人群体)中可能存在导致Pablo蛋白质氨基酸序列变化的DNA序列多态性。Pablo基因中的这些遗传多态性可能由于天然等位基因变异而存在于群体的个体中。本文所用的术语“基因”和“重组基因”指这样的核酸分子，它包括编码Pablo蛋白(较佳的是哺乳动物Pablo蛋白)的开放读框，而且还可包括非编码的调控序列和内含子。这些天然的等位基因变异包括功能性和非功能性的Pablo蛋白，通常会导致Pablo基因的核苷酸序列有1-5％的变异。Pablo基因中因天然等位基因变异而产生的且不改变Pablo蛋白功能活性的任何这些核苷酸变异和所得的氨基酸多态性均在本发明范围内。
另外，具有与SEQ ID NO：1的Pablo家族序列不同的核苷酸序列的编码其它Pablo家族成员的核酸分子也在本发明范围内。另外，编码不同动物种类的Pablo蛋白因而具有与SEQ ID NO：1的Pablo序列不同的核苷酸序列的核酸分子也在本发明范围内。
对应于本发明Pablo分子的天然的等位基因变体和同系物的核酸分子可以根据它们与本文公开的Pablo核酸的同源性利用本文公开的cDNA或其部分作为杂交探针根据标准杂交技术来分离。例如，利用所有或部分的SEQ ID NO：1作为杂交探针，用标准杂交技术(如Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.《分子克隆实验指南》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989)来分离Pablo核酸分子。另外，包括所有部分Pablo基因的核酸分子可用根据SEQ ID NO：1序列设计的寡核苷酸引物通过聚合酶链反应来分离。例如，mRNA可利用Chirgwin等人(1979)Biochemistry 18：5294-5299的胍-硫氰酸酯萃取步骤从细胞中分离出来，cDNA可用逆转录酶(例如，Moloney MLV逆转录酶，购自Gibcol/BRL，Bethesda，MD；或AMV逆转录酶，购自Seikagaku，America，Inc.，St.Petersburg，FL)来制得。用于PCR扩增的合成的寡核苷酸引物可根据SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列来进行设计。本发明的核酸分子可用cDNA或基因组DNA作为模板，用合适的寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增。如此扩增得到的核酸可克隆到合适的载体中，并通过DNA序列分析来表征。另外，可用标准的合成技术(如用DNA自动合成仪)来制备对应于Pablo核苷酸序列的寡核苷酸。
在另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子可用数学算法根据共有的核苷酸序列相同性来鉴定。这些算法在下文有更详细的描述(例如见第III章)。
在其它实施方案中，本发明的分离的核酸分子长度至少为15、20、25、30或更多核苷酸，它在严谨条件下与包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序列的核酸分子杂交。在其它实施方案中，核酸分子的长度至少为30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600个核苷酸。本文所用的术语“在严谨条件下杂交”描述了杂交和洗涤条件，在该条件下，相互间有至少30％、40％、50％或60％同源性的核苷酸序列通常保持相互杂交。较佳的，该条件使得相互间有至少约70％、更佳的至少约80％、还要佳的至少约85％或90％同源性的序列通常保持相互杂交。这些严谨的杂交条件是本领域技术人员已知的，并可在Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。较佳的严谨杂交条件非限制性例子是在约45℃下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后于50-65℃用0.2X SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。较佳的，在严谨条件下与SEQ ID NO：1的序列或其互补序列杂交的本发明的分离的核酸分子与天然存在的核酸分子相对应。
本文所用的术语“天然存在”的核酸分子指具有天然具有的核苷酸序列(例如编码天然蛋白)。除了SEQ ID NO：1所示的Pablo核苷酸序列外，本领域技术人员知道，在一个群体内可能存在导致Pablo的核苷酸或氨基酸序列有微小变化的DNA序列多态性。Pablo基因中的这些遗传多态性可能因天然等位基因变异而存在于群体的个体中。这些天然的等位基因变异会使基因核苷酸序列中产生1-2％的变异。Pablo中由天然等位基因变异产生的且不会改变Pablo多肽功能活性的这些核苷酸变异和导致的氨基酸多态性在本发明的范围内。
除了群体中可能存在的Pablo序列的天然存在的等位基因变异外，本领域技术人员可以进一步知道，可通过诱变将微小的变化引入核苷酸序列(如SEQ ID NO：1)中，从而在不改变Pablo蛋白功能活性的条件下改变编码蛋白的氨基酸序列。例如，可对SEQ ID NO：1序列作核苷酸置换，对“非必需”氨基酸残基进行氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是这样一种残基，它能在不改变Pablo分子功能活性的情况下从Pablo核酸分子的野生型序列(例如SEQ ID NO：1的序列)改变得到。本领域技术人员能通过对Pablo相关分子进行氨基酸序列对比并确定非保守的残基来确定非必需的因而可进行取代的残基例子。由于这些残基是不保守的，因此它们更适合进行置换。
因此，本发明另一方面涉及编码Pablo蛋白质的核酸分子，其中该蛋白有对于Pablo活性非必需的氨基酸残基变化。这些Pablo蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO：2不同，但是保留了Pablo的固有活性。在SEQ ID NO：1的核苷酸序列中导入一个或多个核苷酸置换、加入或缺失，制得编码非天然Pablo蛋白变体的分离的核酸分子，从而在所编码的蛋白质内引入一个或多个氨基酸置换、加入或缺失。可用标准技术(如定点诱变和PCR介导的诱变技术)将突变引入SEQ ID NO：1中。可在一个或多个非必需氨基酸残基处进行保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是指一氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替。本领域中已经确定了具有类似侧链的氨基酸残基家族，这些侧链包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、未带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，Pablo中的非必需氨基酸残基可用同一侧链家族中的其它氨基酸残基来代替。
或者，在另一实施方案中，可用饱和诱变在Pablo编码序列的全部或部分中随机引入突变，筛选所得突变体与DNA结合和/或激活转录的能力，以鉴定保留功能活性的突变体。在诱变后，编码的Pablo突变蛋白可在宿主细胞中重组表达，用本领域中现有的测定Pablo活性的试验来测定突变蛋白的功能活性。
本发明另一方面涉及编码Pablo融合蛋白的分离的核酸分子。这些核酸分子包含至少第一个编码全长Pablo蛋白、具有Pablo活性的多肽或肽的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码非Pablo蛋白、多肽或肽的第二核苷酸序列操作性相连。这些核酸分子可用标准的重组DNA技术来制得。
在较佳的实施方案中，可测定突变的Pablo蛋白的以下能力：1)与Bcl-xL结合的能力和/或)调节凋亡(较佳的是神经细胞，例如中枢或周围神经系统的细胞的凋亡)的能力。
除了上述编码Pablo蛋白的核酸分子外，本发明另一方面涉及一种与该核酸分子反义的分离的核酸分子。“反义的”核酸分子包含与编码蛋白质的“有义”的核酸分子互补(例如与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA序列互补)的核苷酸序列。因此，反义核酸分子能与有义的核酸分子氢键结合。反义核酸分子能与整个Pablo编码链互补，或只与其部分互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码Pablo的核苷酸序列编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指含有能翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域。在另一实施方案中，反义核酸分子与编码Pablo的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”指接在编码区侧翼、不翻译成氨基酸的5′端和3′端序列(即，也称为5′和3′非翻译区)。
在给出了本文所公开的编码Pablo的编码链序列后，可根据Watson和Crick碱基配对原则设计本发明的反义核酸分子。反义核酸分子能与Pablo mRNA的整个编码区互补，但是更佳的是仅仅与Pablo mRNA的编码区或非编码区部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸能与Pablo mRNA翻译起始位点周围的区域互补。反义寡核苷酸的长度例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。本发明的反义核酸可用本领域已知的步骤通过化学合成和酶促连接反应来构建。例如，可用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸来化学合成反义核酸(例如反义寡核苷酸)，其中各种修饰的核苷酸被设计成使分子的生物稳定性提高或使反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性提高，例如可使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用来产生反义核酸的修饰的核苷酸例子包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。或者，可在表达载体中反义方向亚克隆入核酸(即，从插入的核酸转录的RNA将是靶核酸的反义方向，这在下文有进一步描述)，通过生物学方法产生反义核酸。
通过将本发明的反义核酸分子给予对象或由其原位产生，从而使它们与编码Pablo蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译来抑制蛋白的表达。杂交可以是通过常规的核苷酸互补形成稳定的双链体，或者，例如在与DNA双链体结合的反义核酸分子情况下，通过双链螺旋体的大凹槽进行特异性相互作用。本发明反义核酸分子的给药途径例子包括直接注射在组织部位。或者，可对反义核酸分子进行修饰，以靶向所选细胞，然后全身给药。例如，对于全身给药，可以修饰反义分子(例如将反义核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体相连)，使它们与所选细胞表面上表达的受体或抗原特异性结合。反义核酸分子也可用本文描述的载体来输送给细胞。为了获得反义分子的足够的胞内浓度，反义核酸分子在强pol II或pol III启动子控制下的载体构建物是较佳的。
在其它实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-异头核酸分子。异头核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂交物，在该双链杂交物中，与通常的β-单元不同，链通常是相互平行的(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子也可包括2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人.(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等人.(1987)FEBS Lett.215：327-330)。
在另一实施方案中，本发明的反义核酸是核酶。核酶是具有核酸酶活性的催化性RNA分子，它能切割有互补区域的单链核酸(如mRNA)。因此，核酶(例如，锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334：585-591))可用来催化性切割Pablo mRNA转录物，从而抑制Pablo mRNA的翻译。对编码Pablo的核酸有特异性的核酶可根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列来设计。例如可构建血膜虫(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中，活性部位的核苷酸序列与编码Pablo的mRNA中待切割的核苷酸序列互补。例如参见，Cech等人，美国专利4,987,071；和Cech等人，美国专利5,116,742。或者，可用Pablo mRNA来从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。例如参见，Bartel，D.和Szostak，J.W.(1993)Science 261：1411-1418。
或者，可靶向与Pablo调控区域(例如Pablo启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，形成防止Pablo基因在靶细胞中转录的三联螺旋结构，抑制基因表达。通常见，Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；和Maher，L.J.(1992)Bioassays 14(12)：807-15。
在另一实施方案中，本发明的Pablo核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上进行修饰，以提高例如稳定性、杂交或分子的溶解度。例如，可修饰核酸分子的脱氧核糖磷酸骨架来产生肽核酸(见Hyrup B.等人(1996)Bioorganic&MedicinalChemistry 4(1)：5-23)。本文所用的术语“肽核酸”或“PNA”指核酸模拟物，例如，DNA模拟物，其中脱氧核糖磷酸骨架被假肽骨架代替，只有四个核碱基被保留。PNA的中性骨架显示出能在低离子强度条件下与DNA和RNA特异性杂交。PNA寡聚物的合成可用标准的固相肽合成程序来进行(如Hyrup B.等人.(1996)同上；Perry-O′Keefe等人，Proc.Natl.Acad.Sci.93：14670-675)。
Pablo核酸分子的PNA可用于治疗和诊断用途。例如，PNA可用作反义或抗基因剂用以序列特异性地调节基因表达，例如诱导转录或翻译停止或抑制复制。Pablo核酸分子的PNA还可用于分析基因中单碱基对突变(例如，用PNA-定向PCR夹)；当与其它酶(例如S1核酸酶(Hyrup.B(1996)同上)合用时，作为“人工限制性酶”；或作为探针或引物用于DNA测序或杂交(Hyrup B.等人(1996)同上；Perry-O′Keefe，同上)。
在另一实施方案中，Pablo的PNA可通过将亲脂性或其它辅助基团与PNA相连(通过形成PNA-DNA嵌合体或利用脂质体或本领域已知的其它药物输送技术)来进行修饰(例如用于增强其稳定性或细胞摄取)。例如，可产生将PNA和DNA的优点结合起来的Pablo核酸分子的PNA-DNA嵌合体。这些嵌合体使得DNA识别酶(例如RNA酶和DNA聚合酶)与DNA部分相互作用，而PNA部分将提供高的结合亲和性和特异性。PNA-DNA嵌合体可用长度合适的接头来连接，该接头的长度根据碱基堆叠、核碱基之间的键数以及取向(Hyrup B.(1996)同上)来加以选择。PNA-DNA嵌合体的合成可如Hyrup B.(1996)(同上)和Finn P.J.等人.(1996)Nucleic Acids Res.24(17)：3357-63中描述的那样来进行。例如，可用标准的磷酰胺偶联化学物质和修饰的核苷酸类似物将DNA链合成在固体载体上，例如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧-胸苷磷酰胺可用于PNA和DNA 5′端之间(Mag，M.等人(1989)Nucleic Acids Res.17：5973-88)。然后分布连接PNA单体，产生具有5′PNA片段和3′DNA片段的嵌合分子(Finn P.J.等人(1996)同上)。或者，可用5′DNA片段和3′PNA片段来合成嵌合分子(Peterser，K.H.等人.(1975)Bioorganic Med.Chem.Lett.5：1119-11124)。
在其它实施方案中，寡核苷酸可包括其它悬挂的基团，如肽(例如用来靶向体内宿主细胞受体)或实现穿膜输送的试剂(例如参见Letsinger等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6553-6556；Lemaitre等人.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：648-652；PCT出版物WO88/09810)或血脑屏障(例如参见PCT出版物WO89/10134)。另外，可用杂交引发的断裂剂来修饰寡核苷酸(例如参见Krol等人.(1988)Bio-Techniques 6：958-976)或嵌入剂。(例如参见Zon(1988)Pharm.Res.5：539-549)。为了这个目的，寡核苷酸可与其它分子偶联(例如肽、杂交引发的交联剂、输送剂或杂交引发的断裂剂)。
反义多核苷酸可从转染子细胞或转基因细胞中的异源表达盒产生。或者，反义多核苷酸可包含给予外部环境(体外培养环境或体内循环系统或间质体液)的可溶的寡核苷酸。外部环境中的可溶性反义多核苷酸显示出能进入细胞质并抑制特异性mRNA种类的翻译。
III.分离的Pablo蛋白、其片段和抗Pablo抗体
在另一实施方案中，可用来调节Pablo活性或表达的试剂是Pablo蛋白及其有生物活性的部分，以及适合用作免疫原来产生抗Pablo抗体的多肽片段。在一个实施方案中，可用标准的蛋白质纯化技术通过合适的纯化技术来从细胞或组织来源中分离出天然的Pablo蛋白质。在另一实施方案中，用重组DNA技术产生Pablo蛋白质。除了重组表达，Pablo蛋白或多肽可用标准的肽合成技术化学方法合成。应当理解，在讨论例如SEQ ID NO：2所示Pablo蛋白的用途时，这些并非全长Pablo多肽的蛋白质的片段(例如SEQ ID NO：2中所示的Bcl-xL结合结构域)以及全长Pablo蛋白可以使用。
本发明另一方面涉及分离的Pablo蛋白。较佳的，该Pablo蛋白包含SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列或其部分。在另一较佳实施方案中，蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其部分。在其它实施方案中，蛋白质与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其部分(例如SEQ ID NO：2中的Bcl-xL结合结构域)有至少50％、至少60％的氨基酸相同性，更佳的有70％的氨基酸相同性，更佳的有80％、还要佳的有90％或95％的氨基酸相同性。Pablo多肽分子的较佳部分是有生物活性的，即，其编码的Pablo多肽部分能结合Bcl-xL和/或调节细胞(较佳的是神经细胞，例如中枢或外周神经系统的细胞)中的凋亡。
Pablo蛋白的生物活性部分包括肽，该肽包含与Pablo蛋白的氨基酸序列有足够的同源性或从其衍生获得的氨基酸序列(例如是Pablo蛋白的改变形式)，该肽的氨基酸比全长Pablo蛋白少(例如是Pablo的截短形式)，并表现出Pablo蛋白的至少一种活性。在一个有关的实施方案中，Pablo蛋白的生物活性部分是Pablo的显性失活突变体。本文所用的术语“显性失活突变体”包括这样一种蛋白质改变形式(例如截短或突变的形式)，当它导入细胞中并表达后，它能抑制或破坏相应的未改变的内源性蛋白的活性。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列之间的相同性百分数，将序列进行对比以获得最适合的比较(例如，为了最适合的排列，第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中可引入孔隙)。在较佳的实施方案中，用于序列对比的参照序列长度至少为参照序列长度的30％，较佳的至少为40％，更佳的至少50％，尤佳的至少60％，还要佳的至少70％、80％或90％。然后比较在相应的g位置的残基，当一个序列中的位置被另一序列中对应位置中的相同残基占据，则该分子在该位置上是相同的。因此，两个序列之间的相同性百分数是两个序列共有的相同位置数的函数(即，相同性％＝相同位置数/位置总数×100)。两个序列之间的相同性百分数是序列共有相同位置数并结合孔隙数、每一孔隙的长度(孔隙是为了两个序列有最优的排列对比而导入的)来加以考虑的。本文所用的氨基酸或核酸的“相同性”等价于氨基酸或核酸的“同源性”。
两个序列之间的序列比较和相同性百分数的测定可用数学算法来实现。用于序列比较的一个非限制性的数学算法是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264中的算法，该算法在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873中有所改进。该算法结合入Altschul，等人.(1990)J.Mol.Biol.215：403的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。BLAST核苷酸搜寻可以采用NBLAST程序评分为100、字长为12来进行，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜寻可用XBLAST程序评分为50、字长为3来进行，以获得与本发明蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得有孔隙的排列对比以便进行比较，采用了Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389中描述的Gapped BLAST。在用BLAST和Gapped BLAST程序时，可采用各程序(例如XLBAST和NBLAST)的缺省参数。见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.用于序列比较的另一较佳的非限制性算法是Myers和Miller，CABIOS(1989)中的算法。将这些算法结合入作为GCG序列对比软件包一部分的ALIGN程序(2.0版)。当用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可采用PAM120权重残基表、孔隙长度罚分为12，孔隙罚分为4。
用于蛋白质序列对比的另一非限制性的数学算法例子是Lipman-Person算法(Lipman和Pearson(1985)Science 227：1435)。当采用Lipman-Person算法时，可采用PAM250权重残基表，孔隙长度罚分为12，孔隙罚分为4，Kutple为2。用于比较核酸序列的较佳的非限制性数学算法例子是Wilbur-Lipman算法(Wilbur和Lipman(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726)。当采用Wilbur-Lipman算法时，可采用窗框为20、孔隙罚分为3，Ktuple值为3。Lipman-Pearson算法和Wilbur-Lipman算法均例如结合入作为DNASTAR序列分析软件包一部分的MEGALIGN程序(例如3.1.7版)中。
其它用于序列分析的算法是本领域中已知的，包括Torelli和Robotti(1994)Comput.Appl.Biosci.10：3中描述的ADVANCE和ADAM；和Pearson和Lipman(1988)PNAS 85：2444中描述的FASTA。
在较佳的实施方案中，用GCG软件包中的GAP程序，用Blosum 62矩阵或PAM250矩阵、16、14、12、10、8、6或4的孔隙权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重，测定两个氨基酸序列之间的相同性百分数。在另一较佳的实施方案中，用GCG软件包中的GAP程序、并用NWSgapdna、CMP矩阵、40、50、60、70或80的孔隙权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重确定两个核苷酸序列之间的相同性百分数。
蛋白质序列对比也可用Geneworks全球蛋白质序列对比程序(2.5.1版)来进行，开放孔隙的罚分为5，长度孔隙的罚分为5，最小对角长度设定为4，最大对角补偿值设定为130，共有截短设定为50％，采用Pam 250矩阵。
本发明的核酸和蛋白质序列能进一步用作“询问序列”来搜索公众数据库，例如来鉴定其它家族成员或有关的序列。这些搜索可用Altschul，等人(1990)J.Mol.Biol.215：430-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)来进行。BLAST核苷酸搜寻可以采用NBLAST程序、评分为100、字长为12来进行，以获得与本发明的Pablo核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜寻可用XBLAST程序、评分为50、字长为3来进行，以获得与本发明Pablo蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得有孔隙的排列对比以便进行比较，可采用Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。在用BLAST和Gapped BLAST程序时，可采用各程序(例如XLBAST和NBLAST)的缺省参数。例如，本发明的核苷酸序列可用缺省的Blastn矩阵1-3来分析(孔隙罚分设定为：存在为11，伸长为1)。本发明的氨基酸序列可用以下缺省设置来分析：Blosum 62矩阵，孔隙罚分设定为存在为11，伸长为1。见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.
本发明还提供了Pablo的嵌合或融合蛋白。本文所用的Pablo的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括Pablo多肽以及与其操作性相连的非Pablo多肽。“Pablo多肽”指具有对应于Pablo多肽的氨基酸序列的多肽，而“非Pablo多肽”指该多肽具有的氨基酸序列所对应的蛋白质基本上与Pablo蛋白不同源，例如，与Pablo蛋白不同且从相同或不同生物种类衍生获得的蛋白质。在Pablo融合蛋白中，Pablo多肽能对应于所有一部分Pablo蛋白。在较佳的实施方案中，Pablo融合蛋白包括Pablo蛋白的至少一个有生物活性的部分，例如Bcl-xL结合结构域。在融合蛋白中，术语“操作性相连”指Pablo多肽和非Pablo多肽在符合读框地相互融合。非Pablo多肽可以与Pablo多肽的N端或C端融合。
例如，在一个实施方案中，融合蛋白是有GST-Pablo成员的融合蛋白，其中Pablo成员序列与GST序列的C端融合。在另一实施方案中，融合蛋白是Pablo-HA融合蛋白，其中将Pablo成员核苷酸序列插入载体(如pCEP4-HA载体，Herrscher，R.F.等人.(1995)Genes Dev.9：3067-3082)中，从而使Pablo成员序列与流感病毒血凝素表位尾序列读框融合。该融合蛋白使重组Pablo成员的纯化变得便利。
重组技术产生的融合蛋白和肽可从细胞混合物以及含有蛋白质或肽的培养基中分泌和分离出来。或者，蛋白质或肽可保留在胞质内，然后收获细胞、裂解并分离蛋白质。细胞培养物通常包括宿主细胞、培养基和其它副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域中熟知的。蛋白质和肽可用本领域中已知用来纯化蛋白质和肽的技术从细胞培养液、宿主细胞或两者中分离出来。转染宿主细胞以及纯化蛋白质和肽的技术是本领域中已知的。
较佳的，本发明的Pablo融合蛋白可用标准的重组DNA技术来制得。例如，按照常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段符合读框地连接在一起，例如采用便于连接的平头或错头末端，进行限制性酶消化以得到合适的末端，适当地填平粘端，用碱性磷酸酶处理以免不必要的连接，以及酶促连接。在另一实施方案中，融合基因可用常规技术(包括DNA自动合成仪)来合成。或者，可进行基因片段的PCR扩增，用锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，随后退火，重新扩增产生嵌合的基因序列(例如参见Current Protocols in Molecular Biology编，Ausubel等人.JohnWiley&Sons：1992)。另外，已经编码了一个融合部分(例如GST多肽或HA表位尾序列)的许多表达载体可市售购得。将编码Pablo的核酸分子克隆到该表达载体中，使得该融合部分与Pablo蛋白读框相连。
在另一实施方案中，融合蛋白是N端有异源信号序列的Pablo蛋白。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异源的信号序列可提高Pablo的表达和/或分泌。本发明的Pablo融合蛋白可掺入药物组合物中并给予对象体内。Pablo融合蛋白可能在治疗上可用来治疗疾病(如癌症或阿尔茨海默病)。另外，本发明的Pablo融合蛋白可用作免疫原在对象体内产生抗Pablo抗体。
本发明的Pablo嵌合或融合蛋白宜用标准的重组DNA技术来产生。例如，根据常规技术(例如采用便于连接的平头或错头末端，进行限制性酶消化以得到合适的末端，适当地填平粘端，用碱性磷酸酶处理以免不必要的连接，以及酶促连接)，将编码不同多肽序列的DNA片段连接起来。在另一实施方案中，融合基因可用常规技术(包括DNA自动合成仪)来合成。或者，可进行基因片段的PCR扩增，用锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端，随后退火，重新扩增产生嵌合的基因序列(例如参见Current Protocols in Molecular Biology编，Ausubel等人.John Wiley&Sons：1992)。另外，已经编码了一个融合部分(例如GST多肽)的许多表达载体可市售购得。将编码Pablo的核酸分子克隆到该表达载体中，使得该融合部分与Pablo蛋白读框相连。
本发明还涉及起Pablo激动剂(模拟物)或Pablo拮抗剂作用的Pablo蛋白变异体。Pablo蛋白变体可用诸如不连续的点突变或截短Pablo蛋白等诱变方式来产生。Pablo蛋白激动剂可以基本上保留与Pablo蛋白天然存在的形式相同或其一部分的生物活性。Pablo蛋白的拮抗剂能通过例如竞争性地调节Pablo蛋白的细胞活性来抑制天然型Pablo蛋白的一种或多种活性。因此，通过用功能受限的变体处理，能引发特异性的生物学效果。在一个实施方案中，相对于用天然型Pablo蛋白处理而言，用具有一部分天然型蛋白生物活性的变体处理对象在体内有较少的副作用。
在一个实施方案中，本发明涉及Pablo衍生物，它可通过本领域已知的氧化、还原或其它衍生处理方法来修饰至少一种氨基酸残基而形成。
在一个实施方案中，起Pablo激动剂(模拟物)或Pablo拮抗剂作用的Pablo蛋白变体可通过筛选Pablo蛋白突变体(例如截短突变体)组合文库中具有激动剂或拮抗剂活性的Pablo蛋白来鉴定。在一个实施方案中，通过在核酸水平组合诱变，产生一个由混杂基因库编码的混杂的Pablo蛋白库。混杂的Pablo变体库例如可这样来产生：将合成的寡核苷酸混合物酶促连接成基因序列，使得简并的一系列潜在的Pablo序列可表达成单独的多肽或者其中有该系列Pablo序列的一系列较大的融合蛋白(例如用于噬菌体展示)。从简并的寡核苷酸序列产生潜在Pablo变体文库可采用各种方法。简并的基因序列的化学合成可在DNA自动合成仪中进行，然后将合成的基因连接到合适的表达载体中。一系列简并基因的使用能在一个混合物中提供编码所需潜在Pablo序列的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域中已知的(例如参见Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人.(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人.(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。
另外，可用Pablo蛋白编码序列的片段文库来产生混杂的Pablo片段群，以便筛选并随后选出Pablo蛋白的变体。在一个实施方案中，编码序列片段的文库可这样来产生：在一定条件下用核酸酶处理Pablo编码序列的双链PCR片段(其中每个分子仅仅发生一次切割)，使双链DNA变性，使DNA复性形成双链DNA(该DNA可包括不同切割产物的有义/反义配对)，通过S1核酸酶处理除去重新形成的双链体中单链部分，将所得的片段文库连接入表达载体中。利用该方法，可获得编码Pablo蛋白的不同大小的N端、C端和中间片段的表达文库。
在点突变或截短获得的组合文库中筛选基因产物，以及在cDNA文库中筛选具有所选性质的基因产物的几种技术是本领域中已知的。这些技术可改进用来迅速筛选组合诱变产生的Pablo蛋白的基因文库。适合大量分析的筛选大基因文库所最广泛采用的技术通常包括，将基因文库克隆到可复制的表达载体中，将所得载体库转化合适的细胞，在一定条件下表达该组合基因，该条件下，通过检测所需活性能分离出具有编码所检测产物的基因的载体。递归整体诱变(REM)—一种增强文库中功能性突变体频率的技术—可用于和筛选试验组合用于鉴定Pablo变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等人.(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。
在一个实施方案中，可用基于细胞的试验来分析混杂的Pablo库。例如，可将表达载体库转染到通常合成并分泌Pablo的细胞系中。然后，培养转染的细胞，使Pablo和特定的突变型Pablo分泌，突变体的表达对细胞上清液中Pablo活性的影响可通过例如许多酶促试验来检测。然后，从Pablo活性受抑制或增强的细胞中回收质粒DNA，再进一步鉴定单个克隆。
除了仅仅由天然存在的氨基酸组成的Pablo多肽外，还可提供Pablo多肽模拟物。肽类似物在药物工业中常用作具有与模板肽相似性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物成为“肽模拟物”(Fauchere，J.(1986)Adv.Drug Res.15：29；Veber和Freidinger(1985)TINS 392页；和Evans等人.(1987)J.Med.Chem.30：1229，这些文献均纳入本文作为参考)，通常依靠计算机模型设计来产生。肽模拟物在结构上与治疗上有用的肽相似，可用来产生等价的治疗或预防效果。肽模拟物在结构上与样本多肽(即，具有生物学或药物学活性的多肽，如人Pablo)相似，但是有一个或多个肽键被选自下列的键任选地代替：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-，这些代替方法是本领域中已知的且在下列文献中有进一步的描述：Spatola，A.F.“氨基酸、肽和蛋白质的化学性质和生物活性性质”，B.Weinstein编，Marcel Dekker，New York，267页(1983)；Spatola，A.F.，Vega Data(1983年3月)，卷1，论文3，“肽骨架的修饰”(综述)；Morley，J.S.，Trends Pharm Sci(1980)463-468页(综述)；Hudson，D.等人.，Int J Pept Prot Res(1979)14：177-185(-CH2NH-，-CH2CH2-)；Spatola，A.F.等人.Life Sci(1986)38：1243-1249(-CH2-S)；Hann，M.M.，JChem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(-CH-CH-，顺式和反式)；Almquist，R.G.等人.J.Med.Chem.(1980)23：1392-1398(-COCH2-)；Jennings-White，C.等人.，TetrahedronLett(1982)23：2533(-COCH2-)；Szelke，M.等人.，欧洲申请EP45665(1982)CA：97：39405(1982)(-CH(OH)CH2-)；Holladay，M.W.等人.，Tetrahedron Lett(1983)24：4401-4404(-C(OH)CH2-)；和Hruby，V.J.，Life Sci(1982)31：189-199(-CH2-S-)；上述这些文献均纳入本文作为参考。特别佳的非肽键是-CH2NH-。这些肽模拟物可能具有比多肽实例更显著的优点，例如，生产上更经济，化学稳定性更高，药物性能(半衰期、吸收性、药效、效果等)增强，特异性改变(例如有广谱生物活性)、抗原性减少和其它优点。肽模拟物的标记通常涉及将一个或多个标记直接或通过间隔物(如酰胺基团)共价连接到肽模拟物上非干扰性的位置(可通过定量的结构活性数据和/或分子模型设计来预测)。这些非干扰性的位置通常位于不与该肽模拟物产生治疗效果所要结合的大分子直接接触的位置上。肽模拟物的衍生处理(例如标记)不应对肽模拟物的所需生物或药物活性有很大的干扰。
用相同类型的D-氨基酸来系统性地置换Pablo氨基酸序列中的一个或多个氨基酸(例如用D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可用来产生更稳定的肽。另外，包含Pablo氨基酸序列或基本上相同的序列变化的受约束的肽可用本领域已知的非法来产生(Rizo和Gierasch(1992)Ann.Rev.Biochem.61：387，纳入本文作为参考)；例如，使能形成分子内二硫键使肽环化的内部半胱氨酸残基。
本文确定的Pablo多肽的氨基酸序列使本领域技术人员能产生对应于Pablo肽序列及其序列变体的多肽。这些多肽可由编码Pablo肽序列的多核苷酸在原核或真核宿主细胞中表达来产生。或者，这些肽可用化学方法合成。在重组宿主中表达异源蛋白的方法、多肽的化学合成以及体外翻译均是本领域中熟知的，并且在纳入本文作为参考的以下文献中有所描述：Maniatis等人的《分子克隆实验指南》(1989)第2版ColdSpring Harbor，N.Y.；Berger和Kimmel，《酶学方法》，152卷，Guide to Molecular CloningTechniques(1987)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.；Merrifield，J.(1969)J.Am.Chem.Soc.91：501；Chaiken I.M.(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.11：255；Kaiser等人.(1989)Science 243：187；Merrifield，B.(1986)Science 232：342；Kent，S.B.H.(1988)ann.rev.Biochem.57：957；和Offord，R.E.(1980)Semisynthetic Proteins，Wiley Publishing。
肽通常可用直接的化学合成来制得，并例如用作Pablo/Pablo结合蛋白(如Bcl-xL)相互作用的激动剂或拮抗剂。肽可制成经修饰的肽形式，其N端和/或C端与非肽部分共价连接。在某些较佳的实施方案中，羧基端或氨基端或两者均经过化学修饰。末端氨基和羧基的最常见修饰分别是酰基化和酰胺化。本发明的各个实施方案中可结合入氨基端修饰(如酰化(如乙酰化)或烷基化(例如甲基化))，羧基端修饰(例如酰胺化)、以及其它末端修饰(包括环化)。对于核心序列的某些氨基端和/或羧基端修饰和/或肽延伸能提供有利的物理、化学、生物化学和药物学性质，例如稳定性增强、效力和/或效果提高、抗血清蛋白酶、具有所需的药物动力学性质和其它性质。该肽在治疗上可用来治疗疾病，例如改变患者细胞群的凋亡过程。
分离的Pablo蛋白或其部分或片段也可用作免疫原，利用标准的多克隆和单克隆抗体制备技术来产生Pablo结合抗体。全长Pablo蛋白可用作免疫原，或者，本发明提供了Pablo的抗原性肽片段作为免疫原。Pablo的抗原性肽包括至少8个氨基酸残基，并包括一个Pablo表位，从而使针对该肽产生的抗体与Pablo形成特异性的免疫复合物。抗原性肽宜包含至少10个氨基酸残基，更佳的有至少15个氨基酸残基，更佳的有至少20个氨基酸残基，最佳的有至少30个氨基酸残基。
或者，Pablo多肽的抗原性肽片段可用作免疫原。Pablo多肽的抗原性肽片段通常包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少8个氨基酸残基，并包括Pablo多肽的一个表位，从而使针对该肽产生的抗体与Pablo分子形成了免疫复合物。抗原性肽所包含的表位宜是位于蛋白表面上的Pablo区域，例如亲水性区域。在一个实施方案中，抗体与Pablo分子显著特异性结合。在另一实施方案中，抗体与Pablo多肽特异性结合。
抗原性肽宜包含至少约10个氨基酸残基，更佳的有至少15个氨基酸残基，更佳的有至少约20个氨基酸残基，最佳的有至少约30个氨基酸残基。抗原性肽所包含的表位宜为位于蛋白表面上的Pablo多肽区域，例如亲水性区域，而且是Pablo多肽所特有的。在一个实施方案中，这样的肽对于来自一种动物种类(如小鼠或人)的Pablo蛋白有特异性(即，将跨越种间非保守的Pablo多肽区域的抗原性肽作为免疫原；这些非保守的残基可用诸如本文提供的序列对比方法来确定)。对蛋白质进行标准的疏水性分析，以鉴定亲水性区域。在一个实施方案中，可用包含从约氨基酸436到约氨基酸451的肽片段作为免疫原。
Pablo免疫原通常通过用该免疫原对合适对象(例如家兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)进行免疫接种来制备抗体。合适的免疫原性制备物例如可含有重组表达的Pablo蛋白或化学合成的Pablo肽。该制备物可进一步包括佐剂，例如Freund完全或不完全佐剂或类似的免疫刺激剂。用免疫原性Pablo制备物对合适对象进行免疫接种诱导产生了多克隆抗Pablo抗体应答。
因此，本发明另一方面涉及抗Pablo抗体的使用。多克隆抗Pablo抗体可如上所述通过Pablo免疫原免疫接种合适对象来制得。用标准技术(例如酶联免疫吸附试验(ELISA)，采用固定化的Pablo多肽)监测受免疫对象体内的抗Pablo抗体滴度随时间的变化。如果需要，可从哺乳动物中(例如血中)分离出针对Pablo多肽的抗体分子，并用熟知的技术(例如蛋白质A层析)作进一步纯化，获得IgG级分。在免疫接种后的合适时间，例如当抗Pablo抗体滴度最高时，获得对象的产生抗体的细胞，用标准技术来制备单克隆抗体，该标准技术例如是杂交瘤技术(最初由Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495-497)描述(另见，Brown等人.(1981)J.Immunol 127：539-46；Brown等人.(1980)J.Biol.Chem.255：4908-83；Yeh等人.(1976)PNAS 76：2927-31；和Yeh等人.(1982)Int.J.Cancer 29：269-75))、最近的EBV杂交瘤技术(Cole等人.(1985)，《单克隆抗体和癌症治疗》，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)或三瘤(trioma)技术。生产单克隆抗体杂交瘤的技术是熟知的(通常见R.H.Kenneth《单克隆抗体：生物学分析中的新领域》，Plenum Publishing Corp.，New York，New York(1980)；E.A.Lerner(1981)Yale.J.Biol.Med.，54：387-402；M.L.Gefier等人.(1977)Somatic Cell Genet.，3：231-36)。简言之，将无限增殖细胞系(通常是骨髓瘤)与来自经上述Pablo免疫原免疫的哺乳动物淋巴细胞(通常是脾细胞)融合，筛选所得杂交瘤细胞的培养上清，鉴定产生与Pablo多肽特异性结合单克隆抗体的杂交瘤。
众多熟知的用于融合淋巴细胞和无限增殖细胞系的熟知程序的任一种均适合用于生产抗Pablo单克隆抗体的目的(例如参见，G.Galfre等人.(1977)Nature 266：55052；Gefter等人.Somatic Cell Genet.，同上；Lerner，Yale J.Biol.Med.，同上；Kenneth，单克隆抗体，同上)。另外，一般技术人员会理解，这些方法许多变化方案也是有用的。无限增殖细胞系通常从与淋巴细胞相同的哺乳动物种类获得。例如，将经本发明免疫原性制备物免疫的小鼠淋巴细胞与无限增殖的小鼠细胞系融合，可制得小鼠杂交瘤。较佳的无限增殖的细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，它对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶胸苷的培养基(HAT培养基)敏感。众多骨髓瘤细胞系中的任一种均可根据标准技术用作融合伙伴，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md)。HAT敏感型小鼠骨髓瘤细胞通常用聚乙二醇(PEG)来与脾细胞融合。然后用HAT培养基(它能杀死未融合、未生产性融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞在数天后死亡，因为它们没有转化))筛选融合产生的杂交瘤细胞。用标准的ELISA试验筛选杂交瘤培养上清中结合Pablo分子的抗体，监测产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为制备单克隆抗体分泌型杂交瘤的其它方案，单克隆抗Pablo抗体可通过用Pablo筛选重组组合免疫球蛋白库(例如抗体噬菌体展示文库)来鉴定和分离，从而分离出结合Pablo多肽的免疫球蛋白文库成员。产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是市售的(例如Pharmacia的重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；和StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。另外，特别适合用来产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂例子可在例如以下文献中找到：Ladner等人.美国专利No.5,233,409；Kang等人.国际出版物WO92/18619；Dower等人.国际出版物WO91/17271；Winter等人.国际出版物WO92/20791；Markland等人.国际出版物WO92/15679；Breitling等人.国际出版物WO93/01288；McCafferty等人.国际出版物WO92/01047；Garrard等人.国际出版物WO92/09690；Ladner等人.国际出版物WO90/02809；Fuchs等人.(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Hay等人.(1992)HumAntibod Hybridomas 3：81-85；Huse等人.(1989)Science 246：1275-1281；Griffiths等人.(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等人.(1992)J.Mol.Biol.226：889-896；Clarkson等人.(1991)Nature 352：624-628；Gram等人.(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等人.(1991)Bio/Technology 9：1373-1377；Hoogenboom等人(1991)Nucleic Acids Res.19：4133-4137；Barbas等人.(1991)PNAS 88：7978-7982；和McCafferty等人.Nature(1990)348：552-554。
另外，可用标准重组DNA技术制得的包含人和非人部分的重组抗Pablo抗体，如嵌合和人源化单克隆抗体，均在本发明范围内。这些嵌合和人源化抗体可用本领域已知的重组DNA技术制得，例如用Robinson等人.国际出版物PCT/US86/02269；Akira等人.欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等人.欧洲专利申请173,494；Neuberger等人.PCT申请WO86/01533；Cabilly等人.美国专利4,816,567；Cabilly等人.欧洲专利申请125,023；Better等人.(1988)Science240：1041-1043；Liu等人.(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等人.(1987)J.Immunol.139：3521-3526；Sun等人.(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等人.(1987)Canc.Res.47：999-1005；Wood等人.(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等人.(1988)J.NatlCancer Inst.80：1553-1559)；Morrison，S.L.(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人.(1986)BioTechniques 4：214；Winter美国专利5,225,539；Jones等人.(1986)Nature321：552-525；Verhoeyan等人.(1988)Science 239：1534和Beidler等人.(1988)J.Immunol.141：4053-4060中描述的方法。
另外，人源化抗体可根据美国专利5,565,332中公开的标准程序来制得。在另一实施方案中，抗体链或特异性结合配对成员可这样来制得，用本领域已知的技术(如美国专利5,565,332，5,871,907或5,733,743中所述)使两个载体重组，其中第一个载体含有编码特异性结合配对成员多肽链与可复制基因展示包组件的融合物的核酸分子，第二个载体含有编码单个结合配对成员第二多肽链的核酸分子。
抗Pablo抗体(如单克隆抗体)可通过标准技术(如亲和层析或免疫沉淀)来分离Pablo多肽。抗Pablo抗体有助于从细胞中纯化出天然的Pablo多肽以及宿主细胞中表达的重组产生的Pablo多肽。另外，抗Pablo抗体可用来检测Pablo蛋白(例如在细胞裂解液或细胞上清中)。检测可通过将抗体与可检测物质偶联(即物理连接)来实现。因此，在一个实施方案中，用可检测物质标记本发明的抗Pablo抗体。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射活性物质。合适的酶例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适荧光物质例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰或藻红蛋白；发光物质例子包括鲁米诺；合适放射活性物质例子包括125I，131I，35S或3H。
抗Pablo抗体也可用以下方法获得，该方法包括：
(a)用免疫原性Pablo蛋白或Pablo多肽特有的免疫原性部分对动物进行免疫接种；和
(b)从动物中分离出特异性结合Pablo蛋白的抗体。
因此，在一个实施方案中，抗Pablo抗体例如可用来在胞内抑制蛋白活性。用胞内抗体抑制细胞内蛋白功能是本领域已知的(例如参见Carlson，J.R.(1988)Mol.Cell.Biol.8：2638-2646；Biocca，S.等人.(1990)EMBO J.9：101-108；Werge，T.M.等人.(1990)FEBS Letters 274：193-198；Carlson，J.R.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7427-7428；Marasco，W.A.等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7889-7893；Biocca，S.等人.(1994)Bio/Technology 12：396-399；Chen，S-Y.等人.(1994)HumanGene Therapy 5：595-601；Duan，L等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5075-5079；Chen，S-Y.等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5932-5936；Beerli，R.R.等人.(1994)J.Biol.Chem.269：23931-23936；Beerli，R.R.等人.(1994)Biochem.Biophys.Res.Commun.204：666-672；Mhashilkar，A.M.等人.(1995)EMBO J.14：1542-1551；Richardson，J.H.等人.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3137-3141；PCT出版物WO94/02610(Marasco等人)；和PCT出版物WO95/03832(Duan等人)。
在一个实施方案中，制得一个重组表达载体，该载体编码的抗体链呈这样的形式，当该载体导入细胞后，该抗体链在细胞胞内部分中表达成功能性抗体。为了根据本发明抑制方法来抑制Pablo活性，特异性结合Pablo蛋白的胞内抗体表达在细胞胞质中。为了制备胞内抗体表达载体，通常从分泌Pablo蛋白特异性的单克隆抗体的杂交瘤中分离出编码对目标蛋白(如Pablo)特异性的抗体链的抗体轻链和重链cDNA。分泌抗Pablo单克隆抗体或重组抗Pablo单克隆抗体的杂交瘤可如上所述制得。一旦确定了Pablo蛋白特异性的单克隆抗体(例如，杂交瘤衍生的单克隆抗体或来自组合文库的重组抗体)，就可用标准的分子生物学技术分离出编码单克隆抗体轻链和重链的DNA。对于杂交瘤衍生的抗体，例如可用PCR扩增或cDNA文库筛选方法获得轻链和重链cDNA。对于重组抗体(如噬菌体展示文库的抗体)，可在文库筛选过程中从分离的展示包(如噬菌体)中回收编码轻链和重链的cDNA。本领域中已经知道可制得PCR引物或cDNA文库探针的抗体轻链和重链基因的核苷酸序列。例如，这些序列有许多公开在Kabat，E.a.等人.(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest，第5版，USDepartment of Health and Human Services，NIH出版物No.91-3242，人胚系序列数据库“Vbase”中。
一旦获得，用标准方法将抗体轻链和重链序列克隆到重组表达载体中。为使轻链和重链胞质表达，除去了编码轻链和重链的疏水性前导序列的核苷酸序列。胞内抗体表达载体能以几种不同形式中的一种形式来编码胞内抗体。例如，在一个实施方案中，胞内表达编码全长抗体轻链和重链(如全长抗体)的载体。在另一实施方案中，载体编码全长轻链以及重链的仅仅VH/CH1区域，从而在胞内表达Fab片段。在一个最佳的实施方案中，载体编码单链抗体(scFv)，其中轻链和重链的可变区靠一灵活的肽接头(例如(Gly4Ser)3)来连接，并表达成单链分子。为了抑制细胞的Pablo活性，用标准的转染方法(如本文所述)将编码抗Pablo的胞内抗体的表达载体导入细胞中。
IV.重组表达载体和宿主细胞
本发明另一方面涉及含有编码Pablo蛋白(或其部分)的核酸的载体，较佳的是表达载体。本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，该核酸的形式适合使该核酸在宿主细胞中表达，这意味着重组表达载体还包括一个或多个与待表达核酸序列操作性相连的调控序列，这些调控序列可根据用来表达的宿主细胞来加以选择。在重组表达载体中，“操作性相连”意味着感兴趣的核苷酸序列与调控序列连接的方式使得核苷酸序列能够表达(例如，在体外转录/翻译系统中，或在宿主细胞中(当将载体导入宿主细胞中时))。术语“调控序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸信号)。这些调控序列例如在Goeddel的《基因表达技术：酶学方法》185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)。调控序列包括知道核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的那些序列以及知道核苷酸序列仅仅在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如组织特异性调控序列)。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计可取决于要转化的宿主细胞的选择、所需蛋白表达水平等因素。本发明的表达载体能导入宿主细胞中来产生由本文所述核酸编码的蛋白质或肽(包括融合蛋白或肽)(例如Pablo蛋白，Pablo蛋白的突变型、融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可进行设计来表达原核或真核细胞中的Pablo蛋白或其片段。例如，Pablo蛋白可在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel的《基因表达技术：酶学方法》185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有进一步的讨论。另外，重组表达载体可在体外转录和翻译，例如用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
蛋白在原核细胞中的表达最通常的是在大肠杆菌中进行，通过含有组成型或可诱导的启动子的载体来指导融合或非融合蛋白的表达。融合蛋白将许多氨基酸加入其中编码的蛋白质中，通常是在重组蛋白的氨基端。这些融合载体通常有三个目的：1)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的溶解度；和3)通过在亲和纯化中作为配体来帮助重组蛋白的纯化。通常，在融合表达载体中，在融合部分与重组蛋白的接头处，导入蛋白水解切割位点，以便在纯化融合蛋白后能将重组蛋白与融合部分分开。这些酶及其同源识别序列包括Xa因子、纤维蛋白酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)，pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A结合融合到靶重组蛋白中。
纯化的融合蛋白例如可用于Pablo活性试验(例如下文有详细描述的直接试验或竞争性试验)中，或用来产生对Pablo蛋白特异性的抗体。
合适的可诱导非融合大肠杆菌表达载体例子包括pTrc(Amann等人.(1988)Gene69：301-315)和pET 11d(Studier等人.《基因表达技术：酶学方法》185，Academic Press，San Diego，California(1990)60-89)。pTrc载体的目标基因表达依靠的是杂合的trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。pET 11d载体的靶基因表达依靠的是由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的从T7 gn10-lac融合启动子转录。该病毒聚合酶由携带T7 gn1基因的原噬菌体在lacUV 5启动子转录控制下从宿主株系BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供。
使重组蛋白在大肠杆菌中的表达最大的一种策略是使该蛋白在蛋白水解切割重组蛋白的能力受破坏的宿主细菌中表达(Gottesman，S.，《基因表达技术：酶学方法》185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128)。另一策略是改变要插入表达载体的核酸的核酸序列，从而使每个氨基酸的个别密码子在大肠杆菌中被优先利用(Wada等人.(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本发明的核酸序列的这些改变可用标准的DNA合成技术来进行。
在另一实施方案中，Pablo表达载体是酵母表达载体。用来在酿酒酵母中表达的载体例子包括pYepSec1(Baldari，等人(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz等人.(1987)Gene 54：113-123)，pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和picZ(InVitrogen Corp，San Diego，CA)。
或者，Pablo蛋白可用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。适用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人.(1983)Mol.Cell.Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。
在其它实施方案中，本发明的核酸可用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人.(1987)EMBO J.6：187-195)。当用于哺乳动物表达时，表达载体的控制功能通常由病毒调控元件来提供。例如，常用的启动子从多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40衍生获得。对于其它合适的用于原核和真核细胞的表达系统，见Sambrook，J.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.《分子克隆实验指南》第2版，第16和17章，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989。
在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体能指导核酸在特定细胞类型中优先表达(例如用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件是本领域中已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性例子包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人.(1987)Genes Dev.1：268-277)、淋巴样特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，尤其是T细胞受体的启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ.8：729-733)和免疫球蛋白(Banerji等人.(1983)Cell 33：729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33：741-748)、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等人.(1985)Science 230：912-916)，和乳腺特异性启动子(例如乳清启动子，美国专利No.4,873,316和欧洲专利申请No.264,166)。发育上调控的启动子也包括在内，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science 249：374-379)和α-胎儿球蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev.3：537-546)。
另外，可用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达Pablo多肽。用来在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人.(1983)Mol.Cell.Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。
在另一实施方案中，本发明的核酸可用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pMex-NeoI、pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人.(1987)EMBO J.6：187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能通常由病毒调控元件来提供。例如，常用的启动子从多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40衍生获得。
另外，用于哺乳动物细胞的可诱导调控系统是本领域中已知的，例如通过以下方式来调控基因表达的系统：重金属离子(例如参见Mayo等人.(1982)Cell 29：99-108；Brinster等人.(1982)Nature 296：39-42；Searle等人.(1985)Mol.Cell.Biol.5：1480-1489)，热休克(例如参见Nouer等人.(1991)热休克反应，Nouer，L.编辑，CRC，BocaRaton，FL，167-220页)，激素(例如参见，Lee等人.(1981)Nature 294：228-232；Hynes等人.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2038-2042；Klock等人.(1987)Nature329：734-736；Israel&Kaufman(1989)Nucleic Acids Res.17：2589-2604；和PCR出版物WO94/18317)或四环素(Gossen，M.和Bujard，H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551；Gossen，M.等人.(1995)Science 268：1766-1769；PCT出版物WO94/29442；和PCT出版物No.WO96/01313)。因此，在另一实施方案中，本发明提供了一个重组表达载体，其中Pablo DNA与可诱导真核细胞启动子操作性相连，从而使Pablo蛋白在真核细胞中诱导型表达。
本发明还提供了一个重组表达载体，它包含反义方向克隆到表达载体中的本发明的DNA分子。即，该DNA分子以使与Pablo mRNA反义的RNA分子表达(通过DNA分子转录)的方式与调控序列操作性相连。选择与反义方向克隆的核酸操作性相连的调控序列，它指导反义RNA分子在各种细胞类型中连续表达(如病毒启动子和/或增强子)，或选择指导反义RNA组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调控序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸在高效调控区域控制下产生，其活性可通过导入载体的细胞类型来确定。关于用反义基因调控基因表达的讨论参见Weintraub，H.等人的《基因分析分子工具—反义RNA》综述-遗传学趋势，卷1(1)1986。
本发明另一方面涉及已经导入了本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，这些术语不仅指特定的细胞对象，而且还指该细胞的后代或潜在的后代。由于后代中可能会因突变或环境影响而发生某些变化，这些后代可能实际上与母细胞不同，但是它们仍包括在本文所用的术语范围内。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。例如，Pablo蛋白可在大肠杆菌等细菌细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
载体DNA可用常规的转化或转染技术导入原核或真核细胞中。本文所用的术语“转化”和“转染”指本领域中认可的用来将外来核酸(如DNA)导入宿主细胞中的各种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖-介导的转染，脂转染或电穿孔。转化或转而宿主细胞的合适方法可在Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989以及其它实验室文献中找到。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已经知道，根据所用表达载体和转染技术，只有少部分的细胞基因组中整合入了外源DNA。为了鉴别和选出这些整合体，通常将编码可选择标记(如抗生素抗性)的基因与感兴趣的基因一起导入宿主细胞中。较佳的可选择标记包括赋予药物(如G418、潮霉素和氨甲喋呤)抗性的那些标记。编码可选择标记的核酸可在与编码Pablo蛋白的同一载体上导入宿主细胞，或可在另一载体上导入。通过药物筛选，鉴定经导入核酸转染的细胞(例如已插入可选择标记的细胞将会存活，而其它细胞死亡)。
在经Pablo稳定转染的神经细胞情况下，可制成这些细胞系使得Pablo基因可诱导，例如用PC12 Tet-Off细胞系(购自Clontech；Palo Alto，CA)。例如，通过双稳定表达，可以调节表达的基因，首先是具有tet-控制的反式激活蛋白(tTA)的“调节”质粒的表达，然后是具有Pablo(在四环素响应元件(TRE)的启动子序列控制下)的“响应”质粒表达。市售的调节质粒加入经过工程改造用于潮霉素筛选的载体中，使构建的响应载体包括第二个可选择标记。这些细胞系的构建在所附实施例中有更详细的描述。利用这些方法，Pablo表达可在诸如四环素或四环素相关化合物(如脱氧土霉素)等试剂存在下关闭，在培养基中不加入四环素等试剂时打开。此类细胞系的构建允许通常成毒性的Pablo能在细胞中稳定地表达。
本发明的宿主细胞，例如培养中的原核或真核细胞，可用来产生(即表达)Pablo蛋白。因此，本发明还提供了用本发明宿主细胞来产生Pablo蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培育本发明的宿主细胞(其中已经导入了编码Pablo蛋白的重组表达载体)，从而产生Pablo蛋白。在另一实施方案中，本发明还包括从培养基或宿主细胞中分离出Pablo蛋白。
本发明的某些宿主细胞也可用来产生非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是已经导入了Pablo编码序列的受精的卵母细胞或胚胎干细胞。然后，这些宿主细胞产生已经导入了外源Pablo序列的非人转基因动物，或内源Pablo序列已被改变的同源重组动物。这些动物可用来研究Pablo多肽的功能和/或活性，并可用来鉴别和/或评价Pablo活性的调节剂。本文所用的术语“转基因动物”是非人动物，较佳的是哺乳动物，更佳的是啮齿类动物如大鼠或小鼠，该动物中的一个或多个动物细胞具有转基因。转基因动物的其它例子包括非人灵长类动物、绵羊、狗、奶牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因是整合到发育形成转基因动物的细胞基因组中的外源DNA，该转基因保留在成熟动物的基因组中，从而指导所编码基因产物转基因动物的在一种或多种细胞或组织中表达。本文所用的术语“同源重组动物”是非人动物，较佳的是哺乳动物，更佳的是小鼠，该动物中内源性Pablo基因已经通过内源基因与导入哺乳动物细胞(如发育成动物之前的动物胚胎细胞)的外源DNA分子之间的同源重组而改变。
本发明的转基因动物可以这样来制得：将编码Pablo的核酸导入(例如通过显微注射、逆转录注射)受精卵母细胞的雄性前核中，使该卵母细胞在假孕雌性代孕动物中发育。SEQ ID NO：1的Pablo序列或其部分可作为转基因导入非人动物的基因组中。或者，可用Pablo基因的非人同系物(如小鼠或大鼠Pablo基因)作为转基因。另外，可根据与SEQ ID NO：1(在下文有进一步描述)的Pablo家族cDNA序列杂交来分离Pablo基因同系物(如另一Pablo家族成员)，并用作转基因。这些转基因系统可用来测试针对Pablo的先导化合物的效力，并用来干扰内源Pablo功能，以便揭示Pablo蛋白的发育和稳态作用。
转基因中还可加入内含子序列和聚腺苷酸化信号，以提高转基因表达的效力。可将组织特异性调控序列与Pablo转基因操作性相连，以指导Pablo蛋白在特定细胞(如CNS或神经元)中表达。用于转基因Pablo表达的有用的组织特异性启动子例子包括Thy1.2启动子(例如参见Caroni(1997)J.Neurosci.Methods 71：3-9；Gordon等人.(1987)Cell 50：445-452；Vidal等人.(1990 Genes and Development 5：1136-1148)和神经元特异性烯醇酶启动子(NSE；例如参见Forss-Petter等人.(1990)Neuron 5：187-197；Chen等人.(1998)Mol.Pharmacology 54：495-503)。或者，可有目的地调节的表达系统可用来诱导或抑制转基因系统中Pablo表达所需次数。这对于防止转基因表达的可能的发育致死效果有用。例如，四环素依赖型表达系统已被成功采用(例如参见Furth等人.(1994)PNAS 91：9302-9306；Gossen等人.(1995)Science 268：1766-1769；美国专利No.5,992,927，5,866,755，5,859,310，另见http：//www.clontech.com/tet/)。这些系统也可作些改变，例如可将阻遏区与反式激活蛋白融合，例如参见Deuschle等人.(1995)Mol.Cell.Biol.15：1907-1914)。
通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物(尤其是诸如小鼠等动物)的方法已经变成本领域中的常规方法，例如在美国专利4,736,866和4,870,009(两者均授予Leder等人)、美国专利4,873,191(Wagner等人)和Hogan，B的《小鼠胚胎的操作》(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)中有所描述。采用相似的方法来产生其它转基因动物。转基因起始动物可根据其基因组中Pablo转基因的存在和/或Pablo mRNA在动物组织或细胞中表达来鉴定。然后，可用转基因起始动物来培育携带该转基因的额外动物。另外，携带编码Pablo蛋白的转基因的转基因动物可与携带其它转基因的其它转基因动物进一步杂交。
为了产生同源的重组动物，制得一载体，该载体含有至少一部分Pablo基因，该基因中已经导入一个缺失、增加或置换从而改变(例如功能性地破坏)了Pablo基因。例如，可用小鼠Pablo基因来构建适合改变小鼠基因组中内源Pablo基因的同源重组载体。在较佳的实施方案中，这样来设计载体：在同源重组后，内源性Pablo基因被功能性破坏(即，不再编码有功能的蛋白质；也成为“剔除”载体)。或者，转基因是Pablo基因的显性失活突变体，当其在转基因动物中过度表达时，它通过竞争抑制了内源Pablo的活性。Pablo的显性失活形式宜包含或由Pablo分子的尾部组成。或者，可以这样设计载体：在同源重组后，它会使内源Pablo基因发生突变或改变但仍编码有功能的蛋白(例如，可改变上游调控区，从而来改变内源性Pablo蛋白的表达)。在同源重组载体中，Pablo基因的改变部分的5′和3′端侧接了Pablo基因的其它核酸序列，从而使载体所携带的外源Pablo基因和胚胎干细胞中内源Pablo基因之间的发生同源重组。额外的侧接的Pablo核酸序列具有足够的长度，以使与内源基因之间的同源重组成功。通常，载体中包括了数千碱基的侧接DNA(在5′和3′端)(关于同源重组载体的描述例如参见Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503)。将载体导入胚胎干细胞系(例如电穿孔)中，选出所导入的Pablo基因与内源Pablo基因已经同源重组的细胞(例如参见，Li，E.等人.(1992)Cell 69：915)。然后将所选细胞注入动物(例如小鼠)胚泡中，形成聚集嵌合体(例如参见，Bradley，A.Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells：A Practical Approach，E.J.Robertson编辑(IRL，Oxford，1987)113-152页)。然后，将嵌合的胚胎植入合适的雌性代孕动物体内，使胚胎足月发育。干细胞中具有同源重组DNA的子代可用来繁殖动物，通过转基因的胚系传递使动物的所有细胞具有同源重组的DNA。构建同源重组载体和同源重组动物的方法在下列文章中有进一步的描述：Bradley，A.(1991)Current Opinion in Biotechnology 2：823-829，PCT国际出版物WO90/11354(Le Mouellec等人)；WO91/01140(Smithies等人)；WO92/0968(Zijlstra等人)；和WO93/04169(Berns等人)。所需的剔除也可从市售的单基因座突变型胚胎干细胞文库(例如“OmniBank”，Lexicon Genetics，The Woodlands，Texas；例如参见http：//www.lexgen.com)中确定。
另外，除了上述上述内容外，本领域技术人员会知道本领域已知的用于同源重组的其它方法也可用于本发明。酶辅助的点特异性整合系统是本领域中已知的，可用来将DNA分子整合入第二DNA靶分子中的预定位置。这些酶辅助的整合系统例子包括Cre重组酶-lox靶系统(例如在Baubonis，W.和Sauer，B.(1993)Nucleic Acids Res.21：2025-2029；Fukushige，S.和Sauer，B.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7905-7909中有所描述)、和FLP重组酶-FRT靶系统(例如在Dang，D.T.和Perrimon，N.(1992)Dev.Genet.13：367-375；Fiering，S.等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8469-8473中有所描述)。还可采用例如在PCT出版物WO94/29442和PCT出版物WO96/01313中描述的四环素调节的可诱导的同源重组系统。
例如，在其它实施方案中，可产生转基因非人动物，该动物含有能调节转基因表达的所选系统。该系统的一个例子是噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。有关cre/loxP重组酶系统的描述例如参见Lakso等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6232-6236。重组酶系统的另一例子是酿酒酵母的FLP重组酶系统(O′Gorman等人.(1991)Science 251：1351-1355)。如果用cre/loxP重组酶系统来调节转基因的表达，则需要动物具有编码Cre重组酶和所选蛋白的转基因。这样的动物例如可通过使两种转基因动物(一种有编码所选蛋白的转基因，另一种有编码重组酶的转基因)交配形成“双”转基因动物来得到。
本文描述的非人转基因动物的克隆也可根据Wilmut，I.等人.(1997)Nature385：810-813和PCT国际出版物WO97/07668和WO97/07669中描述的方法来生产。简言之，可以分离出转基因动物的细胞(如体细胞)，诱导其离开生长周期进入G0期。然后，休眠细胞可通过例如电脉冲与分离去除休眠细胞的同种动物的去核卵母细胞融合。然后培育重新构建的卵母细胞，使其发育成桑椹胚或胚细胞，然后转移到假孕雌性代孕动物体内。该雌性代孕动物所生的后代将是分离出该细胞(如体细胞)的动物的克隆。
V.本发明的用途和方法
调节Pablo活性或表达的试剂(例如本文描述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同系物和抗体)可用于下列一种或多种方法：a)治疗方法，例如上调或下调凋亡(较佳的是神经细胞的凋亡)；b)筛选试验；c)预测性药物(例如诊断试验、预后试验、监测临床试验或药物遗传学)。本发明的分离的核酸分子例如可用于表达Pablo蛋白(例如在基因治疗用途中通过宿主细胞中的重组表达载体)，检测Pablo mRNA(例如在生物学样品中)或Pablo基因中的遗传变化，以及调节Pablo活性(下文有进一步的描述)。该Pablo蛋白还可用来治疗以Pablo抑制剂的不足或过度表达为特征的疾病。另外，Pablo蛋白可用来筛选天然存在的Pablo结合蛋白，筛选调节Pablo活性的药物或化合物，以及治疗将受益于Pablo调节的疾病(例如以Pablo蛋白或活性比Pablo野生型蛋白低或异常的Pablo蛋白形式的产生不足或过量为特征)。另外，本发明的抗Pablo抗体可用来检测和分离Pablo蛋白、调节Pablo蛋白的生物利用率，调节Pablo活性(例如调节凋亡)。在本发明的较佳方法中，例如检测、调节Pablo等方法可在神经细胞(如中枢或周围神经系统)中进行。
A.调节Pablo的方法：
本发明提供了调节细胞中Pablo的方法(例如用来鉴定调节Pablo表达和/或活性的试剂)，以及对处于疾病危险(或易患疾病)的对象或患有与Pablo表达或活性异常有关的疾病或受益于Pablo活性调节的疾病的对象进行预后和治疗的方法。
本发明另一方面涉及调节细胞中Pablo表达和/或活性的方法。本发明的调节方法包括使细胞与调节Pablo表达和/或活性的试剂接触，从而使细胞中的Pablo表达和/或活性受到调节。该试剂可通过调节细胞中Pablo蛋白的活性或调节Pablo基因的转录或Pablo mRNA的翻译来起作用。
因此，在一个实施方案中，该试剂抑制Pablo活性。该抑制剂例如可通过直接抑制Pablo促凋亡活性或通过调节负调节Pablo的信号传导通道来起作用。在另一实施方案中，该试剂刺激Pablo活性。刺激性试剂例如可通过直接刺激Pablo促凋亡活性或通过调节导致Pablo活性受刺激的信号传导通道来起作用。典型的抑制剂包括反义Pablo核酸分子(例如抑制Pablo mRNA的翻译)、胞内抗Pablo抗体(例如抑制Pablo蛋白的活性)和Pablo蛋白的显性失活突变体(例如本文所述的尾部构建物)。可用来抑制Pablo蛋白活性的其它抑制剂是抑制Pablo凋亡活性的化学化合物。这些化合物可通过本文所述的筛选这些化合物的筛选试验来鉴定。另外，可用本领域已知的方法设计抑制Pablo凋亡活性的化合物。
根据本发明的另一调节方法，通过使细胞与刺激剂接触，使细胞内的Pablo活性受到刺激。这些刺激剂的例子包括活性Pablo蛋白以及导入细胞中用来提高细胞中Pablo活性的编码Pablo的核酸分子。较佳的刺激剂是编码Pablo蛋白的核酸分子，其中该核酸分子以适合在细胞内表达成活性Pablo蛋白的形式导入该细胞内。为了在细胞中表达Pablo蛋白，通常，首先是利用如本文所述的标准的分子生物学技术将PablocDNA导入重组表达载体中。利用如本文所述的聚合酶链反应(PCR)扩增或筛选合适的cDNA文库，可获得Pablo cDNA。在分离或扩增Pablo cDNA后，如本文所述，将DNA片段导入表达载体中，用标准方法转染入靶细胞中。可用来刺激Pablo蛋白活性和/或表达的其它刺激剂是刺激细胞中Pablo活性和/或表达的化学化合物(如增强Pablo促凋亡活性的化合物)。这些化合物可用筛选这些化合物的筛选试验(在下文有详细描述)来鉴定。
本发明的调节方法可在体外进行(例如使细胞与试剂一起培育，或将试剂导入培养的细胞中)，或者，在体内进行(例如将试剂给予对象，或将试剂导入对象细胞中，例如通过基因治疗)。为了实施体外刺激方法，可用标准方法从对象获得细胞，使细胞在体外与本发明的调节剂一起培育(即培养)，以调节细胞中的Pablo活性。
对于含有核酸(包括编码Pablo蛋白的重组表达载体，反义RNA，胞内抗体或显性失活抑制剂)的刺激剂或抑制剂，可用本领域已知用于将核酸(如DNA)体内导入细胞的方法将试剂导入对象的细胞内。这些方法的例子包括非病毒方法和病毒方法，包括下列：
直接注射：通过将DNA直接注射到细胞内，将裸DNA体内导入细胞(例如参见，Acsadi等人.(1991)Nature 332：815-818；Wolff等人.(1990)Science 247：1465-1468)。例如，可采用将DNA体内在注入细胞的输送装置(例如“基因枪”)。该装置是市售的(例如购自BioRad)。
阳离子脂质：裸DNA可通过将DNA与阳离子脂质复合或将DNA包囊在阳离子脂质体中来体内导入细胞。合适的阳离子脂质配方的例子包括N-[-1-(2，3-二油酰氧)丙基]N，N，N-三乙基氯铵(DOTMA)以及摩尔比为1∶1的1，2-二肉豆寇酰氧-丙基-3-二甲基羟乙基溴铵(DMRIE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(例如参见，Logan，J.J.等人.(1995)Gene Therapy 2：38-49；San，H.等人.(1993)Human Gene Therapy 4：781-788)。
受体介导的DNA摄取：裸DNA还可通过将DNA与细胞表面受体配体相偶联的诸如聚赖氨酸等阳离子复合来将裸DNA体内导入细胞(例如参见Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.263：14621；Wilson等人.(1992)J.Biol.Chem.267：963-967；和美国专利5,166,320)。DNA配体复合物与受体的结合有助于DNA被受体介导的胞吞作用所摄取。可采用与腺病毒外壳(它天然破坏核内体，从而将物质释放入胞质内)相连的DNA配体复合物，以避免复合物被胞内溶酶体降解(例如参见Curiel等人.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8850；Cristiano等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2122-2126)。
逆转录病毒：众所周知，缺陷型逆转录病毒可进行基因转移以用于基因治疗目的(有关综述参见Miller，A.D.(1990)Blood 76：271)。构建重组逆转录病毒，将感兴趣的核苷酸序列结合入逆转录病毒基因组中。另外，可除去部分逆转录基因组，以使逆转录病毒复制缺陷。然后，将复制缺陷型逆转录病毒包装入病毒颗粒中，用标准技术通过使用辅助病毒来使该毒粒感染靶细胞。产生重组逆转录病毒以及用这些病毒体外或体内感染细胞的方法可在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等编，Greene Publishing Associates，(1989)，Sections 9.10-9.14以及其它标准的实验室手册中找到。合适的逆转录病毒的例子包括本领域熟知的pLJ，pZIP，pWE和pEM。合适的包装病毒系的例子包括ψCrip，ψCre，ψ2和ψAm。逆转录病毒已被用来将各种基因在体外和/或体内导入许多不同的细胞类型，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、肌母细胞、肝细胞、骨髓细胞(例如参见Eglitis，等人.(1985)Science 230：1395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：6460-6464；Wilson等人.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3014-3018；Armentano等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：6141-6145；Huber等人.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8039-8043；Ferry等人.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8377-8381；Chowdhury等人.(1991)Science254：1802-1805；van Beusechem等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7640-7644；Kay等人.(1992)Human Gene Therapy 3：641-647；Dai等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10892-10895；Hwu等人.(1993)J.Immunol.150：4014-4115；美国专利4,868,116；美国专利4,980,286；PCT申请WO89/07136；PCT申请WO89/02468；PCT申请WO89/05345；和PCT申请WO92/07573)。逆转录病毒载体依赖于靶细胞分裂，以便使逆转录病毒基因组(和插入基因组的外来核酸)整合入宿主基因组中，从而能稳定地将核酸导入细胞内。因此，可能需要刺激靶细胞的复制。
腺病毒：可对腺病毒基因组进行操作，使其编码和表达感兴趣的基因产物，但是其在正常病毒裂解生命周期中的复制能力丧失。例如参见Berkner等人.(1988)BioTechniques 6：616；Rosenfeld等人.(1991)Science 252：431-434；和Rosenfeld等人.(1992)Cell 68：143-155。从腺病毒株系Ad5型dl324和其它腺病毒株系(例如Ad2，Ad3，Ad7等)获得的合适腺病毒载体是本领域技术人员所熟知的。重组腺病毒是有利的，因为它们不需要分裂的细胞作为有效的基因输送载体，且可用来感染各种细胞类型，包括呼吸道上皮细胞(Rosenfeld等人.(1992)同上)、内皮细胞(Lemarchand等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6482-6486)、肝细胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2812-2816)和肌细胞(Quantin等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2581-2584)。另外，导入的腺病毒DNA(和其中所含的外来DNA)没有整合入宿主细胞基因组中，而是维持附加的形式，从而避免了由于当导入的DNA整合入宿主基因组中后(例如逆转录病毒DNA)插入诱变而可能引起的问题。另外，外来DNA的腺病毒基因组的携带能力比其它基因输送载体大(高达8千碱基)(Berkner等人.同上；Haj-Ahmand和Graham(1986)J.Virol.57：267)。目前所用的大多数复制缺陷型腺病毒载体缺失所有或部分的病毒E1和E3基因，但是保留了多达80％的腺病毒遗传物质。
腺伴随病毒：腺伴随病毒(AAV)是一种天然存在的缺陷型病毒，它需要另一病毒(如腺病毒或疱疹病毒)作为辅助病毒才能进行有效复制和增殖性生命周期。(有关综述见Muzyczka等人.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)158：97-129)。它也是能将其DNA整合入非分裂性细胞的少数病毒之一，并表现出高频率的稳定整合(例如参见Flotte等人.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7：349-356；Samulski等人.(1989)J.Virol.63：3822-3828；和McLaughlin等人.(1989)J.Virol.62：1963-1973)。含有AAV的少达300碱基对的载体可被包装并能整合。外源DNA的空间限制在约4.5kb。可用AAV载体(如Tratschin等人.(1985)Mol.Cell.Biol.5：3251-3260)将DNA导入细胞内。利用AAV载体已经各种核酸导入不同类型的细胞中(例如参见Hermonat等人.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470；Tratschin等人.(1985)Mol.Cell.Biol.4：2072-2081；Wondisford等人.(1988)Mol.Endocrinol.2：32-39；Tratschin等人.(1984)J.Virol.51：611-619；和Flotte等人.(1993)J.Biol.Chem.268：3781-3790)。
特定表达载体系统的以及将核酸导入细胞内的方法的效率可用本领域常用的标准方法来评价。例如，可采用滤膜杂交技术(例如Southern印迹)检测导入细胞的DNA，导入的DNA所转录产生的RNA可用例如Northern印迹、RNA酶保护或逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)来检测。基因产物可用合适的试验如用免疫学检测所产生的蛋白质(如特异性抗体)来检测，或用功能试验来检测基因产物的功能性活性。
本发明的Pablo调节剂可用来治疗多种病理学疾病或失调。在一个实施方案中，该试剂可上调(上调或下调)细胞中的凋亡。例如，在一个实施方案中，可在导致细胞死亡的生理性攻击期间调节细胞内的Pablo表达或活性。例如，在导致细胞死亡的生理性攻击(例如给予药物、肾上腺切除、局部缺血等)期间，可调节Pablo表达。
在另一实施方案中，该方法可用来治疗患病对象，其中该疾病将受益于凋亡的上调。在一个较佳的实施方案中，调节Pablo以增强神经细胞的凋亡，从而促进神经系统癌细胞凋亡。在另一实施方案中，例如在阿尔茨海默病或肌萎缩性侧索硬化(ALS)患者中，在促进神经细胞存活时，下调细胞(较佳的是神经细胞)中的凋亡(Lee，M.1999.J.of Neuropath&Exper.Neurology 58：459；Desjardins，P.和Ledoux，S.1998.Neurosci.Letters.244：69；Yoshihisa等人.1998.Brain Resarch.780：260)。可通过Pablo调节来治疗的其它典型疾病包括其它神经系统疾病。术语“疾病”包括将受益于Pablo活性和/或表达改变的正常情况和多种疾病状况。
1.预防方法
本发明一方面提供了一种预防对象患病的方法，其中该疾病将得益于Pablo活性和/或表达的调节，例如与Pablo表达或活性异常有关的疾病，该方法是：将调节Pablo多肽的表达或其至少一种Pablo活性的试剂或Pablo多肽给予对象。由于Pablo表达或活性异常而引起处于患病危险的对象可用例如本文所述的诊断或预测试验的组合来鉴定。在Pablo遗传的症状表现出来之前，可给予预防剂，从而防止该疾病或失调或延迟该疾病的发展。根据Pablo异常或病情的类型，例如可用Pablo多肽、Pablo激动剂或Pablo拮抗剂来治疗对象。合适的试剂可根据本文描述的筛选试验来确定。
2.治疗方法
本发明另一方面涉及以治疗为目的的调节Pablo表达或活性的方法。因此，在典型的实施方案中，本发明的调节方法包括使细胞与和该细胞相关的调节Pablo蛋白的一种或多种活性的Pablo多肽或试剂接触。调节Pablo蛋白活性的试剂可以是本文所述的试剂，如核酸或蛋白质，Pablo蛋白的天然存在的靶分子(如Pablo结合蛋白)、Pablo抗体、Pablo激动剂或拮抗剂，Pablo激动剂或拮抗剂的肽模拟物或其它小分子。在一个实施方案中，该试剂刺激一种或多种Pablo活性。这些刺激剂的例子包括活性Pablo蛋白和已经导入细胞内的编码Pablo多肽的核酸分子。在另一实施方案中，试剂抑制一种或多种Pablo活性。这些抑制剂的例子包括，例如，反义Pablo核酸分子、抗Pablo抗体和Pablo抑制剂。这些调节方法可在体外进行(例如使细胞与试剂一起培育)，或在体内进行(例如将试剂给予对象)。因此，本发明提供了治疗受累于某疾病或失调的个体的方法，其中该疾病或失调将得益于Pablo蛋白的调节(例如该疾病得益于免疫反应的上调或下调)，或是以Pablo蛋白或核酸分子的异常的表达或活性为特征。在一个实施方案中，该方法包括给予试剂(例如用本文所述的筛选试验来鉴定的试剂)，或调节(例如上调或下调)Pablo表达或活性的试剂组合。在另一实施方案中，该方法包括给予Pablo蛋白或核酸分子作为治疗来补偿减少或异常的Pablo表达或活性。
在Pablo异常下调和/或提高Pablo活性有可能具有有益效果时，例如当需要增加细胞内的凋亡，如在癌或其它一些不需要的生长等肿瘤形成情况下，或在某类细胞过度产生因子(如激素或生长因子)的情况下，希望刺激Pablo活性。同样，当Pablo异常上调和或减少Pablo活性有可能具有有益效果时，例如当希望减少细胞内凋亡时，希望抑制Pablo活性。需要Pablo调节的典型场合是以凋亡为特征的失调(如局部缺血或肾上腺切除等)的治疗。
B.筛选试验：
本发明提供了一种鉴定调节物的方法(本文也称为“筛选试验”)，该调节物即是Pablo结合蛋白，对例如Pablo表达或Pablo活性有刺激或抑制效果的候选物或测试化合物或试剂(如肽、肽模拟物、小分子或其它药物)。
本发明的测试化合物可用本领域已知的组合文库方法中众多方法的任一种来获得，这些文库包括：生物学库；空间上可寻址的并行的固相或液相库；需要解卷(deconvolution)的合成库方法；“一珠一化合物”的库方法；和采用亲和层析筛选的合成库方法。生物学库方法局限于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚物和小分子化合物库(Lam，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。
合成分子库的方法例子可在本领域中的下列文献中找到：DeWitt等人.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909；Erb等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：11422；Zuckermann等人.(1994)J.Med.Chem.37：2678；Cho等人.(1993)Science261：1303；Carrell等人.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等人.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；和Gallop等人.(1994)J.Med.Chem.37：1233。
化合物库可在溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques 13：412-421)、或在珠上(Lam(1991)Nature 354：82-84)，片上(Fodor(1993)Nature 364：555-556)，细菌上(LadnerUSP 5,223,409)，孢子上(Ladner USP′409)，质粒上(Cull等人.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869)或在噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249：386-390)；(Devlin(1990)Science 249：404-406)；(Cwirla等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310)；(Ladner同上)。
在测试调节剂和天然提取物文库的许多药物筛选程序中，为了在给定时间内找到尽可能多的调节剂，希望有高产量的试验。在无细胞系统中进行的试验(例如可用纯化或半纯化的蛋白质衍生)通常称为“初”筛选，因为它们能产生迅速进展，而且相对容易检测靶分子中由测试调节剂介导的变化。另外，在体外系统中通常忽略了所测试的调节剂的细胞毒性效果和/或生物利用率，相反，该试验主要注重于药物对靶分子的效果(通过与上游或下游元件的结合亲和力改变来表现)。
在一个实施方案中，本发明提供了筛选与Pablo蛋白或多肽或其生物活性部分结合或调节其活性(例如调节Pablo多肽与Bcl-xL相互作用的能力)的候选物或测试化合物的试验。
可用试验来筛选调节剂，该调节剂包括Pablo同系物，它是Pablo多肽的正常细胞功能的激动剂或拮抗剂。例如，本发明提供了一种方法，在该方法中提供了一种指示组合物，该组合物含有具有Pablo活性的Pablo蛋白。该指示组合物能与测试化合物接触。通过测定指示组合物中的变化，就能测得测试化合物对Pablo活性的效果，从而鉴定出调节Pablo蛋白活性的化合物。在测试化合物存在下Pablo活性水平的统计学上显著的变化(如减少或增加)(相对于测试化合物不存在时检测到的水平而言)表明该测试化合物是Pablo调节剂。该指示组合物例如可以是细胞或细胞抽提物。在一个实施方案中，如所附实施例中描述的那样评价Pablo活性。
在本发明所列举的筛选试验中，使感兴趣的调节剂与可能作用于上游的相互作用蛋白(包括其活性的激活剂和抑制剂)或可能作用于Pablo蛋白下游的蛋白接触，无论它们被调节剂正调控还是负调控。然后，在调节剂、上游或下游元件的混合物中，加入含有Pablo蛋白的组合物。检测并定量测定Pablo与其上游或下游元件的相互作用，结果提供了调节剂抑制(或增强)Pablo和Pablo结合元件之间形成复合物的效果的测定手段。
调节剂的效果可通过从各种浓度的测试调节剂所得数据产生剂量反应曲线，评价调节剂的效率。另外，还可进行对照试验来提供用于比较的基线水平。在对照试验中，将分离并纯化的Pablo蛋白加入含有Pablo结合元件的组合物中，在没有测试调节剂存在下定量测定复合物的形成。
在另一实施方案中，本发明的试验是一种无细胞的试验，在该试验中，使Pablo蛋白或其生物活性部分与测试化合物接触，然后测定该测试化合物与Pablo蛋白或其生物活性部分结合的能力。测试化合物与Pablo蛋白的结合可如上所述那样直接或间接测定。在较佳的实施方案中，该试验包括使Pablo蛋白或其生物活性部分与已知结合Pablo的化合物接触，形成试验混合物，使该试验混合物与测试化合物接触，然后测定测试化合物与Pablo蛋白相互作用的能力，其中测试化合物与Pablo蛋白相互作用的能力的测定包括测定测试化合物比已知化合物优先结合Pablo多肽或其生物活性部分的能力。
在另一实施方案中，试验是无细胞的试验，在该试验中，使Pablo蛋白或其生物活性部分与测试化合物接触，然后测定该测试化合物调节(例如刺激或抑制)Pablo蛋白或其生物活性部分的活性的能力。Pablo蛋白能以表达Pablo的细胞裂解液形式、纯化或半纯化的多肽形式、或重组表达的多肽形式提供。在一个实施方案中，该无细胞试验系统还包括细胞抽提物或分离的细胞组件，例如线粒体。这些细胞器可用本领域已知的技术来分离。该无细胞试验系统宜还包含至少一种与Pablo相互作用的靶分子，然后监测测试化合物调节Pablo与靶分子相互作用的能力，从而鉴定出作为Pablo调节剂(例如Bcl-xL活性)的测试化合物。测试化合物调节Pablo蛋白活性的能力可通过例如用诸如实时生物分子相互作用分析(BIA)等技术来实现。Sjolander，S.和Urbaniczky，C.(1991)Anal.Chem.63：2338-2345和Szabo等人.(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705。这里所用的“BIA”是实时研究生物特异性相互作用而不标记任何反应物(例如BIAcore)的技术。可用表面等离子体共振(SFR)的光学现象中的变化来指示生物分子之间的实时反应。
在另一实施方案中，无细胞试验涉及使Pablo蛋白或其生物活性部分与结合Pablo蛋白的已知化合物接触，形成试验混合物，使试验混合物与测试化合物接触，确定测试化合物与Pablo蛋白相互作用的能力，其中测试化合物与Pablo蛋白相互作用的能力的测定包括测定Pablo蛋白优先结合或调节Pablo靶分子活性的能力。
本发明的无细胞试验适合用蛋白的可溶形式和/或膜结合形式(例如，具有与Pablo结合的胞内结构域的Pablo蛋白或受体)。在采用膜结合型蛋白的无细胞试验中，可能需要采用增溶剂，从而使膜结合型蛋白保留在溶液中。这些增溶剂的例子包括非离子洗涤剂，如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(glucamide)、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺，TritonX-100，TritonX-114，Thesit，异三癸基聚(乙二醇醚)n，3-[(3-乙醇酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)、3-[(3-乙醇酰胺丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸酯(CHAPSO)、或N-十二烷基＝N，N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸酯。
Pablo靶分子可以是蛋白质或DNA序列。能检测蛋白-蛋白相互作用的试验(例如免疫沉淀、双杂交试验等)或能检测DNA结合蛋白与DNA靶序列之间相互作用的试验(例如电泳迁移试验、DNA酶I足印试验等)的合适试验是本领域中已知的。通过在测试化合物存在和不存在下进行这样的试验，这些试验可用来鉴定出能调节(例如抑制或增强)Pablo与靶分子相互作用的化合物。
Pablo蛋白与Pablo分子配体结合或相互作用的能力的测定可通过直接结合来实现。在直接结合试验中，可将Pablo蛋白与放射性同位素或酶标记偶联，从而能通过检测复合物中标记的Pablo蛋白来确定Pablo蛋白与Pablo靶分子结合。例如，可用125I，131I，35S或3H直接或间接地标记Pablo蛋白，通过直接计数放射性发射或闪烁计数来检测放射性同位素。或者，可用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶对Pablo分子进行酶促标记，通过测定合适底物转变成产物来检测酶标记。
通常，希望将Pablo或其结合蛋白固定，以便将复合物与一种或两种蛋白的未复合形式分离，并使试验自动化。Pablo在候选试剂存在和不存在的条件下与上游或下游结合元件的结合可在含有这些反应物的适合容器内进行。容器例子包括微量滴定板、试管和微离心管。在一个实施方案中，提供了一个融合蛋白，该蛋白中加入了使该蛋白与基质结合于基质的区域。例如，谷胱甘肽-S-转移酶/Pablo(GST/Pablo)融合蛋白能吸附到谷胱甘肽sepharose珠粒(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生处理的微量滴定板上，然后与细胞裂解液、35S标记的测试调节剂混合，使混合物在诱导形成复合物的条件下(例如在生理性盐和pH条件下)培育，但是可能希望有稍稍更严谨的条件。培育后，洗涤珠粒，除去未结合的标记，固定基质，直接测定放射标记(例如将珠粒置于闪烁体内)，或在随后解离复合物后在上清液中测定放射标记。或者，可使复合物与基质脱离，用SDS-PAGE分离，用标准电泳技术从凝胶中定量测定在珠粒部分中发现的Pablo结合蛋白水平。
该试验中也可采用其它技术来将蛋白质固定到基质上。例如，可利用生物素与链亲和素的偶联来固定Pablo或其关连结合蛋白。例如，可用本领域熟知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制得生物素化的Pablo分子，然后固定在链亲和素涂布的96孔板(Pierce Chemical)孔内。或者，将与Pablo反应但是不干扰与上游或下游元件结合的抗体衍生处理在板孔上，通过抗体偶联将Pablo捕获在孔内。如上所述，在平板的Pablo呈现孔内培育Pablo结合蛋白和测试调节剂的制备物，定量测定孔内捕获的复合物量。检测这些复合物的典型方法，除了上述用于GST固定的复合物的方法外，还包括用与Pablo结合元件反应或与Pablo蛋白反应并与结合元件竞争的抗体来免疫检测该复合物；以及酶联试验，该试验依靠的是检测与结合元件相关的酶活性(内在或外在的活性)。在后一情况中，酶可以与Pablo-BP化学偶联或以与Pablo-BP的融合蛋白形式提供。为了进行说明，将Pablo-BP与辣根过氧化物酶化学交联或基因融合，用该酶的显色底物(如四盐酸3，3′-二氨基-苯扎啶(3，3′-diamino-benzadine)或4-氯-1-萘酚)来测定复合物中捕获的蛋白量。同样，可提供包含蛋白质和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白，通过用1-氯-2，4-二硝基苯检测GST活性来定量测定复合物形成(Habig等人(1974)J.Biol.Chem.249：7130)。
对于依靠免疫检测来定量测定复合物中捕获的一种蛋白质的方法，可采用针对该蛋白的抗体，如抗Pablo抗体。或者，复合物中要检测的蛋白可以是“表位加尾的”融合蛋白形式，该蛋白除了包括Pablo序列外还有第二蛋白，而针对该第二蛋白的抗体是可以市售购得的(例如购自商业途径)。例如，上述GST融合蛋白也可用针对GST部分的抗体来定量测定结合。其它有用的表位加尾包括myc表位(例如参见Ellison等人.(1991)J.Biol.Chem.266：21150-21157)，它包括c-myc的10残基序列以及pFLAG系统(International Biotechnologies，Inc.)或pEZZ-蛋白A系统(Pharmacia，NJ)。
不标记任何相互作用物而测定化合物调节Pablo与其靶分子之间相互作用的能力也在本发明范围内。例如，可用显微生理机能测试计(microphysiometer)来检测Pablo与其靶分子之间的相互作用而无需标记Pablo或靶分子。McConnell，H.M.等人.(1992)Science 257：1906-1912。本文所用的术语“显微生理机能测试计”(如Cytosensor)是利用光可寻址电位传感器(LAPS)来测定细胞使环境酸化的速度的分析仪器。酸化速度的改变可用来表示化合物和受体之间的相互作用。
除了无细胞试验外，本发明提供的Pablo蛋白的获得途径也有助于产生基于细胞的试验，来鉴定小分子激动剂/拮抗剂等。例如，可使细胞在感兴趣的测试调节剂存在和不存在下表达或过度表达重组Pablo蛋白，用试验评价Pablo应答由测试计介导受靶细胞的调节。例如，利用无细胞试验，可以鉴定出使Pablo依赖性反应有统计学上显著变化的调节剂。
可用来表达Pablo的重组表达载体是本领域中已知的(如上所述)。在一个实施方案中，在表达载体中，编码Pablo的序列与调控序列操作性相连，该调控序列使Pablo在指定细胞中组成型或诱导型表达。为了鉴定增强或抑制Pablo活性的化合物，宜采用使Pablo组成型或诱导型表达的重组表达载体。在另一实施方案中，在表达载体中，Pablo编码序列与内源性Pablo基因的调控序列(即，从内源性基因获得的启动子调控区)操作性相连。对于鉴定增强或抑制Pablo转录表达的化合物来说，宜采用这样的重组表达载体，其中Pablo表达受内源性调控序列的控制。
在一个实施方案中，试验是一种基于细胞的试验，它包括使表达Pablo靶分子(如Bcl-xL或另一Pablo胞内相互作用的分子)的细胞与测试化合物接触，测定该测试化合物调节(例如刺激或抑制)Pablo靶分子活性的能力。测定测试化合物调节Pablo靶分子活性的能力可通过例如测定Pablo蛋白与Pablo靶分子或其配体结合或相互作用的能力来实现。
在一个描述性的实施方案中，调节细胞内Pablo的表达活性，测定感兴趣的调节剂对于感兴趣的读数(如凋亡)的效果。在一个实施方案中，转录因Pablo表达或活性的调节而改变的基因调控区(如5′侧启动子和增强子区域)与一标记物(如萤光素酶)操作性相连，该标记物编码的基因产物易被检测到。
在一个实施方案中，以这样的方法鉴定Pablo表达的调节剂：使细胞与候选化合物接触，然后测定细胞中Pablo mRNA或蛋白的表达。将候选化合物存在下PablomRNA或蛋白的表达水平与候选化合物不存在时Pablo mRNA或蛋白的表达水平相比。然后根据这一比较结果，鉴定出作为Pablo表达调节剂的候选化合物。例如，当候选化合物存在下Pablo mRNA或蛋白的表达高于(例如统计学上有意义地高于)化合物不存在时的表达时，该候选化合物鉴定为Pablo mRNA或蛋白表达的刺激物。或者，当候选化合物存在下Pablo mRNA或蛋白的表达低于(例如统计学上有意义地低于)化合物不存在下的表达时，该候选化合物鉴定为Pablo mRNA或蛋白表达的抑制物。细胞中Pablo mRNA或蛋白表达的水平可用本文描述的检测Pablo mRNA或蛋白的方法来测定。
在较佳的实施方案中，测定Pablo蛋白与Pablo靶分子结合或相互作用的能力可通过测定Pablo或靶分子活性的读数来实现。例如，Pablo或靶分子的活性可通过以下方式来测定：检测靶的细胞第二信使(例如Bcl-xL调节的第二信使)，在合适底物上检测靶的催化/酶促活性，检测报道基因(它包含靶反应性调控元件以及与其操作性相连的编码可检测标记物(如氯霉素乙酰转移酶)的核酸)的诱导，或检测靶调节的细胞反应(如凋亡)。例如，Pablo蛋白与Pablo靶分子结合或相互作用的能力的测定可通过例如测定化合物调节凋亡(较佳的在神经细胞中)的能力来实现。凋亡的标志是DNA分解。在该过程早期，这种分解发生于核小体DNA之间的连接区。DNA断裂可能产生双链和单链DNA断裂。用标准技术来测定细胞中的凋亡。例如，细胞群基因组DNA的分解可用琼脂糖凝胶电泳进行分析，或可采用基于3H-胸腺嘧啶或5-溴-2′-脱氧-尿苷的DNA片段化试验。
为了分析个别细胞中的凋亡，可能要用显微镜识别凋亡细胞，因为核染色质浓缩和片段化有特征性的外观。如所附实施例中所述，利用Hoechst染色寻找具有固缩核的细胞，可以测定出个别细胞中的凋亡。或者，通过在酶促反应中用修饰的核苷酸(如生物素-dUTP，DIG-dUTP，荧光素-dUTP)标记游离的3′-OH端，可检测双链和单链的DNA断裂。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将脱氧核糖核苷酸以不依赖模板的方式催化聚合到DNA的3′端。该方法称为TUNEL(TdT介导的dUTP-X切割标记)。或者，通过切口翻译用DNA聚合酶标记游离的3′OH基团。隧道染色(tunnel staining)可用来鉴定具有双链DNA断裂的细胞。已经结合了标记的dUTP的标记的游离的3′OH基团可用流式细胞计数仪和/或荧光显微镜检查来显示。进行这些试验的试剂例如可购自Roche Molecular Biochemical USA(原位细胞死亡检测试剂盒)。另外，膜联蛋白(如膜联蛋白-V-AlexaTM 568，购自Roch molecular Biochemicals USA)可用于此目的。与细胞经历凋亡有关的较早的质膜变化之一是磷脂酰丝氨酸从质膜内叶转移到外层，从而使磷脂酰丝氨酸暴露在细胞表面上。膜联蛋白-V是一种结合磷脂酰丝氨酸的磷脂结合蛋白，它可用作细胞表面上磷脂酰丝氨酸的探针。膜联蛋白-V可与DNA株(如BOBOTM-1)合用，以区分凋亡的细胞和坏死的细胞。
在本发明另一方面，在双杂交试验或三杂交试验中可将Pablo蛋白或其部分用作“诱饵蛋白”(例如参见美国专利5,283,317；Zervos等人.(1993)Cell 72：223-232；Madura等人.(1993)J.Biol.Chem.268：12046-12054；Bartel等人.(1983)Biotechniques 14：920-924；Iwabuchi等人.(1993)Oncogene 8：1693-1696；和BrentWO94/10300)，以鉴定与Pablo结合或相互作用并参与Pablo活性的其它蛋白(“Pablo结合蛋白”或“Pablo-bp”)。一种这样的结合蛋白是Bcl-xL。这样的Pablo结合蛋白还有可能作为例如Pablo介导的信号传导通道中的下游元件，来参与Pablo蛋白或Pablo靶的信号传递。或者，这种Pablo结合蛋白可能是Pablo抑制剂。
双杂交试验基于大多数由可分离的DNA结合和激活结构域组成的转录因子的模块特征。简言之，该试验采用了两种不同的DNA构建物。在一个构建物中，编码Pablo蛋白的基因与编码已知转录因子(如GAL-4)的DNA结合结构域的基因融合。在另一构建物中，来自DNA序列库的编码未鉴定蛋白的DNA序列(“捕获物”或“样品”)与编码该已知转录因子的激活结构域的基因融合。如果“诱饵”和“捕获物”蛋白也能在体内相互作用形成Pablo依赖型复合物，则转录因子的DNA结合和激活结构域可相互靠近。这种靠近使得对转录因子起反应的转录调控部位所操作性相连的报道基因(如LzcZ)转录。检测报道基因的表达，分离出含有功能性转录因子的细胞菌落用来获得编码与Pablo蛋白相互作用的蛋白的克隆基因。
本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒有双杂交系统，该系统有(1)含有Pablo和转录激活结构域的第一杂交蛋白，(2)含有Bcl-xL多肽和DNA结合结构域的第二杂交蛋白，宿主细胞和指导说明书。或者，Pablo多肽可与DNA结合结构域融合，Bcl-xL多肽与激活结构域融合。该试剂盒还可任选包括用来测试其改变第一和第二杂交蛋白之间分子内杂交的能力的一组试剂。
本发明还涉及用上述筛选试验鉴定出的新试剂。因此，在合适动物模型中进一步使用上述鉴定的试剂也在本发明范围内。例如，本文所述的鉴定的试剂(如Pablo调节剂、反义Pablo核酸分子、Pablo特异性抗体或Pablo结合伙伴)可用于动物模型来测定该试剂的处理效果、毒性或副作用。或者，如本文所述鉴定的试剂可用于动物模型，以测定该试剂的作用机理。另外，本发明涉及上述筛选试验鉴定的新试剂用于进行本文所述治疗的用途。
C.合理的药物设计方法
Pablo和Pablo结合多肽(如Bcl-xL多肽)，尤其是在Pablo/Bcl-xL异二聚体中形成直接接触的那些部分，可用于候选物Pablo或Bcl-xL调节剂的合理药物设计(例如抗肿瘤药和凋亡下调剂)。将Pablo鉴定为是本文提供的Bcl-xL的结合伙伴，就能产生基本纯化的Pablo/Bcl-xL多肽复合物和计算模型，该计算模型可用于蛋白质X-射线结晶学或其它结构分析方法，如DOCK程序(Kuntz等人(1982)J.Mol.Biol.161：269；Kuntz ID(1992)Science 257：1978)及其变化方法。潜在的治疗药物可根据所提供的结构信息来合理设计。在一个实施方案中，设计这些药物以防止或增强Pablo多肽：Bcl-xL多肽复合物的形成。因此，本发明可用来设计药物(包括能抑制或促进Pablo与Bcl-xL结合的药物)。
D.检测试验
本文鉴定的cDNA序列的部分或片段(及其对应的完整的基因序列)可以各种方式用作多核苷酸试剂。例如，这些序列可用来：(i)确定各基因在染色体上的图谱；从而确定与遗传疾病有关的基因区域；(ii)从微小的生物样品鉴定个体(对组织分类型)；和(iii)有助于生物样品的法庭鉴定。这些应用在下文有详细描述。
E.预测药物：
本发明还涉及预测医药领域，其中采用诊断试验、预后性试验和监测临床试验进行预后(预测)，从而预防性地处理个体。因此，本发明一方面涉及一种用来确定生物样品(如血液、血清、细胞、组织(较佳的是神经细胞或组织))中Pablo蛋白和/或核酸表达以及Pablo活性的诊断试验，从而确定该个体是否受累于疾病或失调，或有产生与Pablo表达或活性异常有关的失调的危险。本发明还提供了用于确定个体是否有产生与Pablo蛋白、核酸表达或活性相关的失调危险的预后性(预测性)试验。例如，可分析生物样品中Pablo基因中的突变。这些试验可用于预防性或预测性目的，从而在以Pablo蛋白、核酸表达或活性为特征或与之相关的失调开始前，对个体进行预防性治疗。
本发明另一方面涉及在临床试验中监测试剂(例如药物、化合物)对Pablo的表达或活性的影响。
这些和其它试剂在下文有进一步详细描述。
1.诊断试验
检测生物样品中Pablo蛋白或核酸存在或不存在的典型方法是，从测试对象获得生物样品，使该生物样品与能检测Pablo蛋白或编码Pablo蛋白的核酸(如mRNA、基因组DNA)的化合物接触，从而检测出生物样品中Pablo蛋白或核酸的存在。用于检测Pablo mRNA或基因组DNA的较佳试剂是能与Pablo mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。该核酸探针例如可以是Pablo核酸，如SEQ ID NO：1中的核酸或其部分，如长度至少为15、30、50、100、250或500个核苷酸且足以在严谨条件下与Pablo mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。用于本发明诊断试验的其它合适探针在本文中有所描述。
用于检测Pablo蛋白的较佳试剂是能结合Pablo蛋白的抗体，较佳的是具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆、或更佳的，单克隆抗体。可采用完整的抗体或其片段(如Fab或F(ab′)2)。对于探针或抗体，术语“标记的”包括通过将可检测物质与探针或抗体偶联(即物理连接)来直接标记探针或抗体，以及通过与另一直接标记的试剂反应来间接标记探针或抗体。间接标记的例子包括用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，用生物素标记DNA探针的末端，使其能被荧光标记的链亲和素检测到。术语“生物样品”包括从对象分离得到的组织、细胞和生物体液，以及在对象体内的组织、细胞(较佳的是神经细胞或组织)和体液。即，本发明的检测方法可用来检测体外生物样品中和体内的Pablo mRNA、或基因组DNA。例如，Pablo mRNA的体外检测技术包括Northern杂交和原位杂交。Pablo蛋白的体外检测技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，Westem印迹、免疫沉淀和免疫荧光。Pablo基因组DNA的体外检测技术包括Southern杂交。另外，Pablo蛋白的体内检测技术包括将标记的抗Pablo抗体导入对象体内。例如，该抗体可用放射活性标记物作标记，然后用标准的显象技术来检测该标记物在对象中的存在和位置。
在一个实施方案中，生物样品含有来自测试对象的蛋白分子。或者，该生物样品可含有来自测试对象的mRNA分子或基因组DNA分子。较佳的生物样品是用常规方法从对象分离得到的血清样品。
在另一实施方案中，该方法还包括从对照对象获得对照生物样品，使该对照样品与能检测Pablo蛋白、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，从而使得能够检测到生物样品中存在Pablo蛋白、mRNA或基因组DNA，然后将对照样品中Pablo蛋白、mRNA或基因组DNA的存在与测试样品中Pablo蛋白、mRNA或基因组DNA的存在相比较。
本发明还包括检测生物样品中Pablo存在的试剂盒。例如，该试剂盒可包含能检测生物样品中Pablo蛋白或mRNA的标记的化合物或试剂；测定样品中Pablo量的手段；和将样品中Pablo量与标准品比较的手段。化合物或试剂可装入合适的容器内。该试剂盒还可有关于用该试剂盒来检测Pablo蛋白或核酸的说明书。
2.预后性试验
本文描述的诊断方法还可用来鉴别已患有与Pablo表达或活性异常相关的疾病或失调或有患该病危险的对象。例如，本文描述的方法(如前述诊断试验或下述试验)可用来鉴别已患有与Pablo蛋白、核酸的表达或活性相关的失调或有患该失调危险的对象。因此，本发明提供了一种鉴定与Pablo表达或活性异常有关的疾病或失调的方法，在该方法中，从对象获得测试样品，然后检测Pablo蛋白或核酸(如mRNA、基因组DNA)，其中Pablo蛋白或核酸的存在表明该对象患有与Pablo表达或活性异常有关的疾病或失调，或是有患该病的危险。本文所用的术语“测试样品”指从感兴趣对象获得的生物样品。例如，测试样品可以是生物体液(如血清)、细胞样品或组织。
另外，本文描述的预后试验可用来确定是否能给予该对象试剂(例如激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其它药物候选物)来治疗与Pablo表达或活性异常有关的疾病或失调。因此，本发明提供了确定是否能用试剂来有效治疗对象的与Pablo表达或活性异常有关的失调的方法，该方法是，获得测试样品，检测Pablo蛋白或核酸的表达或活性(例如，其中富含Pablo或核酸表达或活性即表明该对象能通过给予该试剂来治疗与Pablo表达或活性异常有关的失调)。
本发明方法还可用来检测Pablo基因中的遗传变化，从而确定具有该改变基因的对象是否有患与Pablo基因有关的失调的危险。在较佳的实施方案中，该方法包括检测对象细胞样品中是否存在以影响Pablo蛋白编码基因完整性或Pablo基因错误表达的至少一个变化为特征的遗传变化。例如，通过确定下列之一的存在，可以检测到这些遗传变化：1)Pablo基因缺失一个或多个核苷酸；2)Pablo基因中加入了一个或多个核苷酸；3)Pablo基因中有一个或多个核苷酸被置换；4)Pablo基因中有染色体重排；5)Pablo基因的信使RNA转录物的水平发生变化；6)Pablo基因有异常修饰，例如基因组DNA的甲基化方式异常；7)Pablo基因的信使RNA转录物存在非野生型的切割方式；8)Pablo蛋白有非野生型的水平；9)Pablo基因的等位基因丢失；和10)Pablo蛋白有不合适的翻译后修饰。如本文所述，本领域中已知有许多试验技术可用来检测Pablo基因中的变化。较佳的生物样品是用常规方式从对象分离得到的组织或血清样品(如神经组织样品)。
在某些实施方案中，变化的检测是在聚合酶链反应(PCR)(例如参见美国专利4,683,195和4,683,202)(例如锚式PCR或RACE PCR)、或连接链反应(LCR)(例如参见Landegran等人.(1988)Science 241：1077-1080；和Nakazawa等人.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：360-364)中使用探针/引物，其中后者特别可用于检测Pablo基因中的点突变(见Abravaya等人.(1995)Nucleic Acids Res.23：675-682)。该方法可包括下列步骤：收集患者的细胞样品，从细胞样品中分离出核酸(例如基因组，mRNA或两者)，使核酸样品与一种或多种引物接触，这些引物能在与Pablo基因(如果有)杂交和扩增的条件下与Pablo基因特异性杂交，以及检测扩增产物的存在或不存在，或检测扩增产物的大小并与对照样品比较长度。预计PCR和/或LCR可能需要用作初步的扩增步骤与本文描述的用于检测突变的任何技术结合使用。
其它的扩增方法包括：自动维持序列复制(Guatelli，J.C.等人.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh，D.Y.等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)，Q-β复制酶(Lizardi，P.M.等人.(1988)Bio-Technology6：1197)或其它任何核酸扩增方法，然后用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子的含量非常低，则这些检测方案特别适用于检测这些分子。
在另一实施方案中，细胞样品的Pablo基因中的突变可通过限制性酶切方式的改变来鉴别。例如，分离样品和对照DNA，任选地扩增，用一种或多种限制性内切核酸酶消化，用凝胶电泳测定片段长度并比较。样品和对照DNA之间片段长度大小不同就表明样品DNA中有突变。另外，可用序列特异性核酶(例如参见美国专利5,498,531)通过核酶切割位点的产生或丧失来确定特异性突变的存在。
在其它实施方案中，可通过使样品以及对照核酸(如DNA或RNA)与含有数百或数千寡核苷酸探针的高密度阵列杂交来鉴定Pablo中的基因突变(Cronin，M.T.等人.(1996)Human Mutation 7：244-255；Kozal，M.J.等人.(1996)Nature Medicine 2：753-759)。例如，可在含有光产生的DNA探针的二维阵列中鉴定Pablo中的基因突变(如Cronin，M.T.等人(同上)所述)。简言之，可用第一杂交探针阵列来扫描样品和对照中的长DNA序列，通过形成依次重叠探针的线性阵列来鉴别序列之间的碱基变化。该步骤允许鉴别点突变。该步骤后是用第二杂交阵列通过使用较小的特异的与所检测到所有变体或突变互补的探针阵列来对具体突变进行特性分析。每个突变阵列由并行的探针系列组成，一组探针与野生型基因互补，另一组与突变基因互补。
在还有一个实施方案中，可用本领域中已知的各种测序反应来直接测定Pablo基因的序列，并通过比较样品Pablo的序列与对应野生型(对照)的序列来检测突变。测序反应的例子包括那些基于Maxam和Gilbert((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：560)或Sanger((1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463)所开发的技术。当进行诊断试验时，预计可用各种自动化测序程序((1995)Biotechniques 19：448)，包括用质谱法测序(例如参见PCT国际出版物WO94/16101；Cohen等人.(1996)Adv.Chromatogr.36：127-162；和Griffin等人.(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38：147-159)。
检测Pablo基因中突变的其它方法包括，用断裂剂保护来检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中错配的碱基(Myers等人.(1985)Science 230：1242)。通常，本领域中“错配断裂”的技术首先是使含有野生型Pablo序列的RNA或DNA与从组织样品获得的潜在突变型RNA或DNA之间杂交形成异源双链体。然后用切割双链体单链区域(例如由于对照和样品链之间碱基对错配而产生)的试剂处理该双链体。例如，可用RNA酶处理RNA/DNA双链体，用S1核酸酶处理DNA/DNA杂交物，用酶消化错配区域。在其它实施方案中，DNA/DNA或RNA/DNA双链体可用羟胺或四氧化锇和哌啶处理，以便消化错误匹配的区域。在消化错误匹配的区域后，在变性聚丙烯酰胺凝胶上分级分离所得物质，确定突变位点。例如参见Cotton等人.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4397；Saleeba等人.(1992)Methods Enzymol.217：286-295。在较佳的实施方案，对对照DNA或RNA作标记进行检测。
在还有一个实施方案中，错配切割反应在确定的系统中采用识别双链DNA中错配较佳的的一种或多种蛋白(因此称为“DNA错配修复”酶)，以检测细胞样品所得Pablo中的点突变并作图谱。例如，大肠杆菌的mutY酶切割G/A错配处的A，HeLa细胞的胸腺嘧啶DNA糖基化酶切割G/T错配处的T(Hsu等人.(1994)Carcinogenesis15：1657-1662)。根据一个典型的实施方案，使基于Pablo序列(如野生型Pablo序列)的探针与测试细胞的cDNA或DNA产物杂交。用DNA错配修复酶处理双链体，如果有切割产物，则可通过电泳程序等检测到。例如参见美国专利5,459,039。
在其它实施方案中，可用电泳迁移率的改变来鉴别Pablo基因中的突变。例如，可用单链构象多态性(SSCP)来检测突变型和野生型核酸之间的电泳迁移率差别(Orita等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA：86：2766，另见Cotton(1993)Mutat Res 285：125-144；和Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 9：73-79)。使样品和对照Pablo核酸的单链DNA片段变性，然后使它们复性。单链核酸的二级结构因序列而异，导致的电泳迁移率的变化使得即使单碱基变化也能被检测到。DNA片段可用标记的探针来标记或检测。试验的灵敏度可通过使用RNA(而不是DNA)来增强，其中二级结构对于序列中的变化更为敏感。在鉴定实施方案中，该方法根据电泳迁移率的变化利用异源双链体分析来分离双链的异源双链体分子(Keen等人.(1991)Trends Genet 7：5)。
在另一实施方案中，用变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定突变型或野生型片段在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动(Myers等人.(1985)Nature 313：495)。当用DGGE作为分析方法时，将对DNA加以修饰，以确保其不完全变性，例如通过PCR加上约40bp的高熔点富含GC的DNA(GC夹序列)。在另一实施方案中，用温度梯度代替变性梯度，以鉴别对照和样品DNA的迁移率差别(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys Chem 265：12753)。
用于检测点突变的其它技术例子包括，但不局限于，选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如，制得已知突变位于中央寡核苷酸引物，然后在仅有完全匹配才能杂交的条件下与靶DNA杂交(Saiki等人.(1986)Nature 324：163)；Saiki等人.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6230)。当寡核苷酸与杂交膜连接并与标记的靶DNA杂交时，使这些等位基因特异性寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA或许多不同的突变杂交。
或者，取决于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可结合用于本发明。用作特异性扩增引物的寡核苷酸在分子中央可能携带了感兴趣的突变(因此扩增取决于不同的杂交)(Gibbs等人.(1989)Nucleic Acids Res.17：2437-2448)，或在一个引物的3′端有突变，在合适条件下可防止错配或减少聚合酶延伸(Prossner等人.(1993)Tibtech 11：238)。另外，可能需要在突变区域内导入新的限制性位点，以产生基于断裂的检测(Gasparini等人.(1992)Mol.Cell Probes 6：1)。预计在某些实施方案中，也可用扩增用Taq连接酶来进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189)。在这些情况下，只有5′序列的3′端完全匹配，才会发生连接，使得能够通过寻找扩增的存在与否来检测在特定部位的已知突变。
本文描述的方法可用例如预先包装的试剂盒来进行，该试剂盒包含至少一个本文所述的探针核酸或抗体试剂，它可常规用于例如临床设备以诊断表现出涉及Pablo基因的疾病症状或家族史的患者。
另外，在本文所述的预后试验中可使用表达Pablo的任何类型的细胞或组织。
VI.Pablo调节剂的给予
本发明的Pablo调节剂以适合体内药物给药的生物相容形式给予对象，以便增强或抑制T细胞介导的免疫反应。“适用于体内给药的生物相容形式”指蛋白质的给药形式是蛋白质的治疗效果超出了其毒性效果。术语“对象”包括可引发免疫反应的活的生物，例如哺乳动物。对象的例子包括人、狗、锚、小鼠、大鼠及其转基因动物。本文所述试剂的给药形式可以是任何药物形式，包括单独的治疗活性量的试剂，或与药学上可接受的载体合用。
给予治疗活性量的本发明的治疗组合物定义为达到所需结果的有效的量和所需的剂型和时间。例如，Pablo调节剂的治疗活性量可能因诸如个体的疾病状况、年龄、性别和体重等因素以及肽在该个体内引发所需反应的能力而异。为了提供最优的治疗效果，可调节剂量方案。例如，每日可分开给予数剂，或可根据治疗情况的要求按比例减少剂量。
本发明的治疗或药物组合物可用本领域已知的任何合适途径来给予，这些途径例如包括静脉内、皮下、肌内、经皮、鞘内或脑内，或在活体外处理程序中给予细胞。给药可以是迅速注射，或是在一段时间内缓慢灌输或给予缓释剂。为了治疗中枢神经系统中的组织，可注射给药或灌输入脑脊液(CSF)。当希望将Pablo多肽给予中枢神经系统中的细胞时，可给予能促进Pablo多肽穿过血脑屏障的一种或多种试剂。
Pablo也可与提供所需药物或药物动力学性质的试剂连接或偶联。例如，Pablo能与本领域中已知能促进穿过或输送通过血脑屏障的任何物质(如运铁蛋白受体的抗体)偶联，并通过静脉内注射(例如参见，Friden等人.Science 259：373-377，1993，纳入本文作为参考)。另外，Pablo能与诸如聚乙二醇等聚合物稳定地连接，以获得所需的溶解性、稳定性、半衰期和其它药学上有益的性质。(例如参见Davis等人.EnzymeEng 4：169-73，1978；Burnham，Am J Hosp Pharm 51：210-218，1994，纳入本文作为参考)。
另外，Pablo多肽可以在有助于输送入细胞胞质的组合物中。例如，该肽能与载体部分(例如能将肽输送入细胞胞质的脂质体)偶联。这些方法是本领域中熟知的(例如参见Amselem等人.Chem Phys Lipids 64：219-237，1993，纳入本文作为参考)。或者，可对Pablo多肽加以修饰，以加入特异性的输送肽(该输送体能将Pablo多肽输入细胞)或与这些输送肽融合。另外，可通过显微注射将多肽直接输入细胞。
该组合物通常以药物制剂形式使用。这些制剂用制药领域熟知的方法制得。一种较佳的制剂采用了赋形剂或生理盐溶液，但是预计也可采用其它药学上可接受的载体，如生理浓度的其它非毒性盐，5％的葡萄糖水溶液，无菌水等。本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。对药物活性物质使用这些介质和试剂是本领域中熟知的。除了与该活性化合物不相容的常规介质或试剂外，预计治疗组合物中可采用这些常规介质或试剂。该组合物中还可补充加入活性化合物。组合物中可能希望有合适的缓冲液。如果需要，这些溶液可以是冷冻并保藏与无菌安瓿中，在注射前加入无菌水即可重建。初始的溶剂可以是水性的或非水性。Pablo也可加入固体或半固体的相容基质中，该基质能够植入需要治疗的组织中。
载体还可含有其它药学上可接受的赋形剂，以改变或维持配方的pH、克分子渗透压浓度、粘度、透明度、颜色、无菌性、稳定性、溶解速率或气味。同样，载体还可含有其它药学上可接受的赋形剂，用于修饰或维持释放或吸收或穿透通过血脑屏障。这些赋形剂是通常常规用来配制制剂的那些物质，这些制剂能以单位剂型或多剂型或通过连续或定期灌输来直接灌输的方式肠胃外给药。
给药可根据所用剂型配方的药物动力学参数和给药途径来重复给药。
预计含有Pablo多肽或其片段的某些配方也可口服给药。这些制剂宜是包囊的，和合适载体配制在固体剂型中。合适载体、赋形剂和稀释剂的一些例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、明胶、糖浆、甲基纤维素、甲基和丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁、水、矿物油等。制剂还可包括润滑剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂、防腐剂、增甜剂或调味剂。该组合物可用本领域熟知的程序配制成能在给予患者后迅速、持续或延迟释放活性组分。该制剂还可含有减少蛋白水解分解的物质和/或促进吸收的物质(如表面活性剂)。
为了便于给药，使剂量均一，特别有利的是将肠胃外组合物配制成单位剂型。这里所用的“单位剂型”指物理上不连续的单元，适合用作要治疗的哺乳动物对象的单元剂型；每个单元含有预定量的经计算能产生所需的治疗效果的活性化合物以及所需的药物载体。本发明单位剂型的规格直接取决于：(a)活性化合物的独特特征以及要实现的具体治疗效果，和(b)本领域中将该活性化合物配制成治疗个体敏感性所固有的限制。具体量不难由本领域技术人员根据例如患者的大致体重或身体表面积或要占据的身体空间来计算。剂量也可根据所选特定给药途径来计算。本领域普通技术人员可为确定合适治疗剂量对计算进行所需的细调。本领域技术人员可根据本文靶细胞制剂试验中公开的活性无需作过多实验即可进行计算。结合标准剂量反应研究，可确定确切的剂量。应当理解，实际给予的组合物量将由医师根据有关的情况(包括待治疗的病情、所选的要给予的组合物、个别患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度以及所选的给药途径)来确定。
这些化合物的毒性和治疗效果可用细胞培养或实验室动物中的标准药物方法(如测定LD50(使50％群体死亡的剂量)和EC50(在50％群体中有治疗效果))来确定。毒性和治疗效果之间的剂量比为治疗指数，它可表示成比例LD50/ED50。表现出大治疗指数的化合物是较佳的。尽管可采用表现出毒性副作用的化合物，但应当仔细设计输送系统，使得这些化合物靶向受累组织部位，以便最大程度地减少对于未受感染细胞的潜在损伤，从而减少副作用。
从细胞培养实验和动物研究获得的数据可用于确定人用的剂量范围。这些化合物的剂量宜在具有ED50而有很少或没有毒性的循环浓度范围内。根据所用的剂型和给药途径，该剂量可在该范围内变化。对于用于本发明方法的任何化合物，最初可从细胞培养试验来估计治疗有效剂量。在动物模型中配制一定剂量，使循环的血浆浓度范围内有在细胞培养物中确定的IC50(即，最大症状抑制的半值的测试化合物浓度)。这些信息可用来更准确地确定人中的有用剂量。血浆中的水平例如可用高效液相色谱来测定。
在本发明的领域实施方案中，可将能产生Pablo生物活性形式或Pablo前体(即，容易在体内转变成生物活性形式Pablo的分子)的载体或细胞植入患者体内，治疗性地给予Pablo多肽。在一个方法中，可将分泌Pablo的细胞包囊入半渗透膜中，以便植入患者体内。细胞可以是正常表达Pablo或其前体的细胞，或是经转化而表达Pablo或其生物活性片段或其前体的细胞。细胞宜为人源的，且当患者为人时，Pablo多肽是人Pablo。然而，本文的制剂和方法可用于兽医学和人场合，因此本文所用的术语“患者”或“对象”包括人和兽医患者。
监测试剂(如药物或化合物)对于Pablo蛋白的表达或和活性的影响不仅可用于基础药物筛选，而且还可用于临床试验。例如，在表现出Pablo基因表达、蛋白水平降低或Pablo活性下调的对象的临床试验中，可以监测本文所述的筛选试验所确定的试剂提高Pablo基因表达和蛋白水平或上调Pablo活性的效果。或者，在表现出Pablo基因表达、蛋白水平升高或Pablo活性上调的对象的临床试验中，可以监测本文所述的筛选试验所确定的试剂减少Pablo基因表达和蛋白水平或下调Pablo活性的效果。在这些临床试验中，Pablo基因的表达或活性，较佳的是涉及该疾病的其它基因可用作特定细胞表型的“读出”或标记。
例如，非限制性的是，经能调节Pablo活性的试剂(如化合物、药物或小分子)(例如在本文所述的筛选试验中鉴定出来)处理后在细胞中调节的包括Pablo的基因可被鉴定出来。因此，为了研究例如在临床试验中该试剂对于Pablo相关疾病的效果，可分离细胞，制备RNA，分别分析参与Pablo相关疾病的Pablo和其它基因的表达水平。基因表达水平(即基因表达图案)可用本文所述的Northern印迹分析或RT-PCR，或是用本文描述的一种方法测定所产生的蛋白量，或通过测定Pablo或其它基因的活性水平来定量测定。这样，基因表达图案可作为一种标记来表明细胞对于试剂的生理学反应。因此，这种反应状况可在用试剂处理个体之前或其间的各个时间测定。
在较佳的实施方案中，本发明提供了一种监测试剂(例如激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或通过本文所述筛选试验鉴定的其它药物候选物)对对象的治疗效果的方法，该方法包括下列步骤：(i)在给予试剂前，从对象获得给药前样品；(ii)监测给药前样品中Pablo蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)从对象获得一份或多份给药后样品；(iv)检测给药后样品中Pablo蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性；(v)将给药前样品中Pablo蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性与给药后样品中的Pablo蛋白、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性相比较；和(vi)相应地改变试剂对对象的给药。例如，为了将Pablo表达或活性升高至高于检测的水平，即，提高试剂的效果，可能需要增加试剂的给药。或者，为了将Pablo表达或活性降低至低于所检测的水平，即，减少试剂的效果，可能需要减少试剂的给药。根据该实施方案，Pablo表达或活性可用作试剂效果的指标，即使没有可观察的表型反应时。
在较佳的实施方案中，Pablo调节剂调节对象(该对象将受益于Pablo表达和/或活性的调节)神经细胞中凋亡的能力可通过检测给予试剂后患者病情的改善来测定。本领域普通技术人员可用适合患者具体条件的指标不难测定这些改善情况。当收集活检材料对于患者而言危险增加和/或有害时，通过测定患者病情变化来检测患者的反应是较佳的。
Pablo水平可能在各种病情中会发生改变，因此，Pablo水平的定量测定将提供临床上有用的信息。另外，由于本文已经证实，细胞表达的Pablo水平增加能使该细胞的细胞死亡调控机理向生存力减少的方向移动，因此认为测定细胞(如一组细胞、组织和肿瘤形成等)中的Pablo水平将提供有关该细胞凋亡状况的有用信息。另外，由于Pablo与Bcl-xL相互作用，也希望能测定这些与Pablo相互作用的Bcl-xL家族成员的细胞水平。
另外，在治疗病情中，可外源性地给予含Pablo的组合物，可能希望在血清、任何所需的组织区室或受累组织中达到Pablo多肽的某一目标水平。因此，能监测患者或生物样品(包括从患者获得的组织活检样品)中Pablo多肽的水平是有利的，在一些情况下监测Pablo的水平是有利的，在某些情况下，监测Bcl-xL的水平也是有利的。因此，本发明还提供了检测患者样品中Pablo存在的方法。
VII.本发明的试剂盒
本发明另一方面涉及用于进行本发明的筛选试验、调节方法或诊断试验的试剂盒。例如，用于进行本发明的筛选试验的试剂盒可包括一种含有Pablo多肽的细胞，用于测定Pablo多肽活性的装置和关于使用该试剂盒来鉴定Pablo活性的调节剂的说明。在另一实施方案中，用来进行本发明筛选试验的试剂盒可包括一种含有Pablo多肽的组合物，用于测定Pablo活性的装置和用该试剂盒来鉴定Pablo活性的调节剂的说明。
在另一实施方案中，本发明提供了一种用来进行本发明调节方法的试剂盒。该试剂盒例如可包括：在合适载体中并包装在合适容器中的本发明的调节剂(例如Pablo抑制剂或刺激剂)，以及关于该调节剂用于调节Pablo活性的说明。
本发明另一方面涉及一种用于诊断对象中与Pablo表达和/或活性异常相关的疾病的试剂盒。该试剂盒可包括：用于测定Pablo表达的试剂(例如用于检测Pablo mRNA的核酸探针或用于检测Pablo蛋白的一种或多种抗体)，与对象结果作比较的对照，以及关于用该试剂盒进行诊断的说明。
本申请全文中引用的所有文献的内容，包括文献中的参考文献，出版的专利、公开的专利申请(包括背景)均纳入本文作为参考。除非另有所述，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献内有完全地解释。例如参见，《分子克隆实验指南》第2版，Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor LaboratoryPress：1989)；《DNA克隆》，卷I和II(D.N.Glover编，1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编，1984)；Mullis等人的美国专利4,683,195；《核酸杂交》(B.D.Hames&S.J.Higgins编，1984)；《转录和翻译》(B.D.Hames&S.J.Higgins编，1984)《动物细胞的培养》(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；《固定化细胞和酶》(IRL Press，1986)；B.Perbal，《分子克隆实践指南》(1984)；论文“酶学方法”(Academic Press，Inc.，N.Y.)；《哺乳动物基因转移载体》(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；《酶学方法》卷154和155(Wu等编)，《细胞和分子生物学中的免疫活性方法》(Mayer和Walker编，Academic Press，London，1987)；《免疫学实验手册》，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986)；《小鼠胚胎的操作》(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
                               实施例
本发明将通过下列实施例作进一步描述，但不应认为这些实施例有任何方式的限制。
实施例1.鉴定Pablo作为Bcl-xL结合蛋白
将Bcl-xL表达成与pAS2-1载体中GAL4蛋白结合结构域部分的融合蛋白形式。将人脑库(Adult human brain Matchmaker cDNA，购自Clontech；目录号HL4004AH，52008批)表达成与pACTII载体中GAL4蛋白激活结构域部分的融合物形式。Bcl-xL与库蛋白的功能性相互作用驱动报道基因活性表达。我们利用的报道物表型是组氨酸原养型和β-半乳糖苷酶活性。
用作诱饵的Bcl-xL是从起始密码子到658位核苷酸的人cDNA(SEQ ID NO：3)。它对应于1-211位氨基酸(SEQ ID NO：4)。换句话说，被认为是跨膜区的最后22个氨基酸被除去。
根据Clontech的说明书进行库转化和筛选。在his平板上生长呈阳性且β-半乳糖苷酶活性呈阳性的三个克隆编码了以前鉴定的人脑EST：KIAA0269的一部分(在本文中称为Pablo-促凋亡性Bcl-xL结合蛋白)。如下文所更详细描述的，这些克隆中的两个编码了Pablo最后的大约130个氨基酸(氨基酸429-559)，发现它们足以结合Bcl-xL。
根据KIAA0269的GenBank递交书中报道的ATG和终止密码子周围的序列设计引物，用这些引物来产生编码Pablo全长开放读框的克隆。
测定该试验中鉴别的克隆的序列，确认其与KIAA0269基因库递交书中的序列匹配(登录号D87459)。KIAA0269编码的多肽最初由Nagase等人(DNAResearch(1996)3：321-324)报道，该该文献中将其称为KIAA0269，并描述了它的使用方法。Nagase及其同事最初将KIAA0269已表达的序列标识(EST)片段鉴别为以测定脑中人cDNA克隆序列为目的的项目的一部分。
Pablo是WASP(Wiskott-Aldrich综合征蛋白)蛋白家族的新成员(Derry等人.1994.Cell.78：635；Ramesh等人.1999.Trends Cell Biol.9：15)。WASP家族是肌动蛋白结合蛋白，认为它们参与了细胞骨架微丝组分的重排。这是各种WSAP机组成员组织特异性表达的证据。在保持KIAA的表达图案时，该蛋白与N-WASP(一种神经元特异性WASP家族成员)最同源(Miki等人.1996.EMBO 15：5326)。Bear等人最近的报道(1998，J.Cell.Biol.142：1325)证实Pablo是网柄菌属基因SCAR的人同系物。在另一报道中，Machesky等人(1998 Curr.Biol.8：1347)报道说，Scar1(Pablo)通过与肌动蛋白相关蛋白Arp2/3相互作用来调节肌动蛋白细胞骨架(Machesky等人.1997.Biochem.J.328：105；Mullins等人.1998 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6181)。
Northern印迹表明，Pablo主要在脑中表达，但是在睾丸和卵巢中也有较低水平的表达。
用小鼠Pablo特异性引物通过聚合酶链反应来确认该表达方式。利用FVB/N成年小鼠的组织(四只雄性，四只雌性)，发现Pablo mRNA在神经组织(海马、皮质、纹状体、前嗅觉细胞(anterior olfactory)、小脑和下丘脑)中，而在肝、肾、心脏、肌肉、小肠和胃中没有检测到或几乎没有检测到。
实施例2.Pablo过度表达对小脑颗粒神经元有毒性
利用磷酸钙ProFectin哺乳动物转染系统(Promega Corporation，Madison，WI)按照生产商说明书，用Pablo-eGFP-C2构建物(eGFP载体购自Clontech；Palo Alto，CA)瞬时转染小脑颗粒神经元(CGN)。转染后8小时，获得转染的CGN的图像。每一图像是用共焦显微镜摄取的穿过神经元的光学截面。检测Pablo-eGFP融合构建物的荧光信号。图像表明，在此8小时点时，Pablo蛋白主要位于质膜上。该发现在所检测的30个以上的CGN中是典型的。该蛋白的二级结构没有任何暗示表明其具有跨膜区，因此它是整合膜蛋白。相反，如上所述，它与细胞骨架的肌动蛋白组分相关的蛋白家族有同源性。因此Pablo与质膜相结合，而非在质膜内。
在用Pablo-eGFP构建物转染后24小时获得的另一组图中，位置图案与所获得的不同。在24小时后，Pablo蛋白不局限于质膜该处，而是呈现出分散在整个胞质期间。另外，尽管荧光是分散的，但是却未出现在核位置中。这些发现在所检测的30个以上的神经元中典型的。
在转染后约36小时，细胞体呈现出不规则形状，神经突片段化。Pablo分布继续在除胞核外的整个细胞内分散。到48小时，所有eGFP阳性CGN片段化成碎片。在每个培养物，在每一时间点，未转染的神经元保持健康。
实施例3.Pablo过度表达在原初大鼠海马神经元中有毒性
用磷酸钙ProFectin哺乳动物转染系统(Promega Corporation，Madison，WI)转染盖玻片上的原初大鼠海马培养物(培养10天)。转染后约30小时，将该培养物固定在4％多聚甲醛中，用Hoechst染色，固定在载玻片上。对eGFP阳性细胞的凋亡性胞核进行评分。经eGFP空载体转染的海马神经元有30％在经Hoechst染色后显现出凋亡的胞核(*p＜0.01；与未转染的相比)。与之相比，未转染培养物中为低于5％。因此，转染程序本身看来对培养物有损伤。尽管本底凋亡有此增加，但是在Pablo转染的细胞中见到了显著的凋亡增加。如图1所示，在转染后30小时，经Pablo转染的大鼠海马神经元100％表现出经历凋亡的细胞的核形态异常(由固缩核表明(**p＜0.01，与转染eGFP空载体相比))。
实施例4.Pablo过度表达在PC12细胞中有毒性
用PC12 Tet-Off细胞系(购自Clontech；Palo Alto，CA)获得表达Pablo的稳定的PC12细胞系。构建质粒，用于产生Tet-调控的稳定表达的神经元细胞系。通过两个质粒的双稳定表达来调节表达的基因，首先是具有tet-控制的反式激活蛋白(tTA)的“调节”质粒的表达，然后是具有感兴趣的基因(在此情况下是Pablo)(基因在四环素响应元件(TRE)的启动子序列控制下)的“响应”质粒表达。市售的调节质粒加入经过工程改造用于潮霉素筛选的载体中，使构建的响应载体包括第二个可选择标记。构建响应质粒的原料是pcDNA3.1(-)Zeo(例如参见http：//www.invitrogen.com/vecgif/pcdna3.1zeo.gif)。该载体是zeocin可选择的，但是含有组成型活性CMV启动子。因此，构建的第一步是用NmuI(启动子上游)和NheI(启动子下游，也是多接头中最上游的位点)消化，除去该启动子。使所得不相容的末端变平，连接，使质粒重新环化，得到无启动子的载体。第二步是插入TRE。该元件是通过XhoI和EcoRI消化从pTRE(例如参见http：//www.clontech.com/clontech/vectors/pTRE.html)获得的450bp的片段。用相同切开无启动子的载体，使其接纳TRE插入物，得到适合将Pablo基因置于TRE控制下的TRE驱动的响应载体。该载体有一定程度上有限的多接头，然而只有EcoRI、BamHI和HindIII可作为有用的位点。将Pablo克隆到BamHI位点中。Pablo表达在四环素或四环素相关化合物(如脱氧土霉素)在下关闭，在培养基中不加入四环素时打开。该载体的构建允许通常成毒性的Pablo能在细胞中稳定地表达。
对于转染，简言之，将细胞培养在具有添加剂(10％马血清，5％胎牛血清，抗生素(100U/ml青霉素G钠和100微克/毫升硫酸链霉素)，和2mM L-谷氨酰胺)的DMEM中。约48小时后，将培养基改为含有添加剂和100微克/毫升G418(Gibco BRL)的DMEM。使细胞繁殖，G418浓度降低至50微克/毫升。
将细胞转移到含有脱氧土霉素的培养基中，用Promega Profectin(磷酸钙)系统按照生产商说明书，用含有全长Pablo基因的构建物(约50毫微克DNA)转染细胞。约16小时后，洗涤细胞，并重悬于有添加剂和脱氧土霉素的DMEM中。约48小时后，将细胞置于含有zeocin的DMEM中。
诱导稳定转化的异源PC12-Pablo细胞群48小时，或不作诱导。通过测定这些培养物中MTS(Cell titer 96 Aqueous；Promega)还原活性来检测活细胞。该试验根据的是细胞将四氮唑盐MTS([3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四氮唑，内盐)转变成可溶于组织培养基中的甲产物，在96孔试验板中于490nm下直接测定而不作额外的处理(1-3)。吸光度与培养中活细胞数成正比。数据表示成490nm下的光密度；培养物的光密度越高，含有的活细胞就越多。如图2所示，37℃下培育90分钟后，未诱导(+Dox)培养物的490nm光密度为0.517。与之相比，诱导Pablo表达的培养物的490nm光密度为0.209。
Hoechst染色数据提示，Pablo诱导的细胞死亡是凋亡性死亡。另外，如图1所示，在双杂交筛选中鉴定Pablo，因为它有Bcl-xL结合活性。因此，检查Bcl-xL使Pablo诱导的细胞死亡减弱的能力。用Bcl-xL-eGFP(绿色荧光蛋白)或eGFP空载体瞬时转染稳定的异源PC12-Pablo群。此时，通过除去培养基中的脱氧土霉素，诱导Pablo表达。图3显示出了转染/诱导后48小时呈eGFP+的PC12细胞的百分数。Bcl-xL转染的培养物中约有14％的细胞为eGFP+。经eGFP空载体转染的培养物中只有2.5％的细胞为eGFP+。转染效率的这一明显差异解释为约40％的eGFP转染的细胞正在经历凋亡。相反，只有3.5％的经Bcl-xL-eGFP转染的细胞在转染/诱导后48小时显示出凋亡的胞核(见图4)。因此，eGFP空载体的明显较低的转染效率可能是由于细胞在48小时前死亡。
实施例5.Pablo过度表达对HEK 293细胞没有毒性
利用磷酸钙ProFectin哺乳动物转染系统(Promega Corporation，Madison，WI)，用Pablo-eGFP-C2构建物转染HEK 293细胞。转染后48小时，检查293细胞的共焦图像。此时，细胞和胞核形态是正常的，没有细胞死亡的迹象。Pablo分布分散在胞质中，而胞核内没有。在任何检查时间点(8、24、48小时)，均没有CGN中早期所见的特异性定位于质膜的现象。
表1归纳了3个分开的实验数据，其中6孔板中的HEK293细胞用Pablo-eGFP-C2转染。作为对照，一些培养物用空白eGFP载体转染，而其它保持未转染。在这些实验中，检查Pablo过度表达的毒性，以及Pablo过度表达对于随后攻击(在此例中是星形孢菌素(STS))的易受损性的效果。图5中显示了具有固缩核的细胞百分数，图6显示了GFP+细胞的百分数。图5显示了转染后48小时293细胞的Hoechst染色所解释的固缩核百分数。通过CHI-Squared分析，Pablo转染的培养物与eGFP培养物相比，固缩核没有统计学上有意义的增加。另外，与未转染培养中的星形孢菌素效果相比，Pablo转染的培养物中星形孢菌素引起细胞损失的增加倍数看来并不更为严重。图6表明，三组转染组的转染效率基本上相当。图7中显示了转染后48小时具有固缩核的GFP+细胞百分数。图7报道了特别考察eGFP阳性细胞胞核的数据。同样，单用eGFP和用Pablo-eGFP融合构建物之间没有区别。简言之当Pablo单独表达时，它既没有毒性，也没有早期星形孢菌素攻击的毒性。
表1：HEK 293细胞
        固缩核    GFP+  GFP+和固  固缩核百  GFP+百  GFP+和固缩核
                        缩核      分数      分数    百分数对照      7/1100    n/a   n/a       0.6eGFP      10/690    193   1         1.4        28      0.5单用Pablo   28/1262   318   1         2.2        25      0.3100nM STS   19/516    n/a   n/a       3.7Pablo+STS   69/1058   387   3         6.5        36      0.8
对于表1，在用Pablo转染后48小时观察细胞；用STS处理24小时，在转染后24小时加入。
Pablo转染对神经元和非神经元细胞的效果显示在图8中。如该图所示，除了主要在神经元细胞中表达外，看来Pablo的活性也是神经元细胞特异性的。
关于Pablo在神经元和非神经元细胞中的毒性数据另外列于表II中。该表显示了在用eGFP空载体或含有编码Pablo的核酸分子的载体转染24小时后的凋亡性核酸的百分数。这些数据表明Pablo在所测试的神经细胞中有明显的促凋亡性(p＜0.01)，而在非神经元细胞中没有凋亡性。
表II.用Pablo GFP构建物或空白GFP构建物转染后24小时的凋亡性胞核百分数。
 细胞类型  Pablo-GEP  eGFP
 大鼠CGN  96±2*  11±4
 大鼠海马  100*  24±6
 PC12  85±7*  2±0.5
 SY5Y  93±2*  9±3
 CAD  48±5*  5±1
 HEK 293  0.5  0.3
 HEK 293  13±3  8±3
 S  7±2  3±1
 O  10±4  9±4
 NI-2  是  无
 *p＜0.01实施例6.Pablo的Bcl-xL结合区域的鉴定
SEQ ID NO：2显示了这些实验中所用全长Pablo的氨基酸序列。Bcl-xL酵母双杂交筛选中分离的三个克隆含有Pablo cDNA的一部分。两个克隆编码大约最后130个氨基酸。一个克隆编码最后213个氨基酸。这提示Pablo与Bcl-xL结合的能力在C端的130个氨基酸(从大约氨基酸429-559)内。
构建缺少C端142个氨基酸(氨基酸418-559)的Pablo(Δ142)缺失突变体来确认这些结果。为了构建Pablo(Δ142)，用现有的Pablo-eGFP融合载体和下列两个引物进行PCR反应：
1)tagaattc atg ccg cta gtg aaa aga aac arc g(SEQ ID NO：7)
2)taggatcc acc ttg tgg gag tgg atg aac tgg(SEQ ID NO：8)
引物1是5′方向的引物，它在紧靠ATG起始密码子的5′端有EcoRI位点。引物2是3′方向的引物，它在紧靠Pablo核苷酸#1254(ATG起始密码子后)的3′端有BamHI位点。这两个引物将产生编码Pablo的氨基酸1-418的片段。将该PCR片段克隆到pCR2.1-TOPO(Invitrogen；目录号K4500-01)中。它的EcoRI-BamHI消化物产生PabloΔ142基因，将其克隆到pEGFP-C2的EcoRI和BamHI位点内(Pablo的N端与读框2中的GFP的C端相连；Clontech，目录号为6083-1)。利用合适的引物，对整个Pablo Δ142构建物进行测序和确认。核苷酸序列显示在SEQ ID NO：5中，氨基酸序列显示在SEQ ID NO：6中。
用全长Pablo、Pablo Δ142和eGFP空载体瞬时转染大鼠小脑颗粒神经元。在转染后8、24和42小时，用4％多聚甲醛固定培养物，并用Hoechst染色。将GFP荧光细胞的胞核评为凋亡或正常。该实验的结果显示在图9中。该图表明，Pablo蛋白的大约418-559位氨基酸对凋亡活性负责。
制得第二个Pablo的缺失突变体，它缺少蛋白质羧基端的70个氨基酸，即缺少氨基酸490-559。在引起神经细胞毒性上，该构建物的效果为全长Pablo蛋白的50％。
Δ142突变体(显示出没有神经细胞毒性)和Δ70突变体(显示出有最大活性的50％)中缺失位点之间的区域，即436-489位氨基酸，是Pablo、WAVE2以及WAVE3之间有较大多样性的区域。根据这些结果，该区域可能包含Pablo的Bcl-xL结合结构域。
实施例7.三种Pablo缺失构建物的活性比较
除了Δ142和Δ70构建物外，还制得只有羧基端142个氨基酸(Pablo的氨基酸418-559)的构建物(尾部构建物)。Δ142构建物和Δ70构建物缺少WH-WASP-同源结构域和酸性结构域(如Suetsuyu，S.等人.1999.Biochem.Biophys.Res.Comm.260：296-302中所示)。尾部构建物缺少碱性结构域、聚脯氨酸结构域，但是含有Bcl-xL结合结构域、WSAP同源结构域和酸性结构域。这些构建物的示意图显示在图14中。
图15表明Pablo全长构建物和Δ70构建物对大鼠小脑颗粒神经元培养物有毒性，而Δ142构建物和尾部构建物则没有毒性。图16归纳了在PC12细胞中进行的共转染。进行图17中所示的四种转染，并监测转染细胞随时间的存活情况。图16显示出全长Pablo过度表达所产生的预期毒性。Δ142构建物的共转染不能减弱毒性。这种转染中的凋亡具有较慢的开始速度，但是所达到的水平与但单用全长Pablo时相同。相反，Pablo与尾部构建物的共转染导致Pablo介导的凋亡几乎完全除去。根据该研究，我们的结论是尾部构建物能以显性失活方式起减少Pablo促凋亡活性的作用。
实施例8.抗Pablo抗体的制备和Western印迹
用Pablo多肽的片段(GIRPSSPVTVLALAHP)作为肽抗原来制备家兔多克隆抗Pablo抗体。亲合纯化该多克隆抗血清，用于Western印迹。用大鼠脑的几个区域(纹状体、皮质、小脑和海马)的裂解液测试抗体，使抗体识别大鼠Pablo蛋白，结果在合适分子量处显现出单一条带。在所测试的两个神经元细胞系(PC12和SY5Y)中见到了相同分子量的条带。在所测试的3种非神经元细胞系(HEK 293；CHO和COS)中没有明显可检测的Pablo蛋白。
实施例9.人Pablo的转基因过度表达
以神经元特异性方式表达全长人Pablo蛋白的转基因模型将用来确认Pablo蛋白的促凋亡作用。该模型将进一步提供测试调节凋亡的先导化合物的效果的方法。为了防止凋亡性因子过度表达可能对胚胎的致死性，采用一种可调节的表达系统，该系统采用了依赖于四环素的表达系统(例如参见，Furth等人.(1994)PNAS 91：9302-9306；Gossen等人.(1995)Science 268：1766-1769)。这里所用的术语“可调节的表达系统”包括调节蛋白表达的系统。为了产生转基因模型，将该系统的组件建立在分开的转基因小鼠系中，然后通过交配使它们成为一个系。
在TRE启动子(四环素响应元件)的方向下产生具有hPablo或hPablo-GFP的cDNA的转基因构建物。TRE通常包含7个串联排列的反式激活蛋白识别位点(“tetO”位点)。第二个转基因构建物插入了在CNS特异性小鼠Thy1启动子方向下的系统反式激活蛋白(tTA)的cDNA(例如参见Caroni(1997)J-Neurosci.Methods 71：3-9；Gorden等人.(1987)Cell 50：445-452；Vidal等人.(1990)Genes and Development 5：1136-1148)。在该构建物中，Thy1基因的5′和3′非翻译区(UTR)接在tTA cDNA的侧面，从而赋予转录物稳定性。或者，还可用更限制性的神经元特异性启动子(如神经元特异性烯醇酶启动子)来指导tTA的表达(NES；例如参见，Forss-Petter等人.(1990)Neuron5：187-197；Chen等人.(1998)Mol.Pharmacology 54：495-503)。
然后，使携带TRE-Pablo构建物和神经元特异性tTA构建物的转基因动物杂交，以使两个转基因基因座在一个基因组中。所得动物将在可调节的条件下在CNS中过度表达Pablo(即，使Pablo在四环素缺陷型条件下表达)。四环素或其类似物(例如脱水四环素、脱氧土霉素或氰基四环素)通常是给予动物的食物和水中，但是也可任选地进行腹膜内(interperitoneal)注射。
实施例10.人Pablo的显性失活突变体的转基因过度表达
用Pablo蛋白的显性失活突变体制得内源性Pablo功能被破坏的转基因模型。在显性失活突变体系统中，破坏通常是通过编码结合和/或底物的突变体与内源性蛋白之间竞争来实现的。产生这样的模型有助于在导致细胞死亡的生理攻击(如局部缺血、药剂、切除肾上腺)期间评价Pablo功能。hPablo的142个羧基端氨基酸代表了这样一种显性突变体(“Pablo-dm”)。将编码Pablo-dm的cDNA导入转基因构建物中，使其CNS-特异性小鼠Thy1.2启动子方向下。在该构建物中，Thy1.2基因的5′和3′非翻译区(UTR)接在Pablo-dm cDNA的侧面。该构建物产生的转基因动物系将在整个CNS中组成型地表达该构建物。
另外还产生了该转基因模型的可调控版本。这是通过采用前述实施例中描述的四环素依赖型表达系统的改进版本来实现的。在该版本中，改进Thy1.2启动子，使其包括一个tetO识别位点。这是通过将tetO短序列插入Thy1.2启动子中-270位的Sma位点或-360位的BglII位点来实现的。用该Thy1.2/tetO启动子来指导Pablo-dm在转基因动物中直接表达。第二个转基因构建物编码了在未修饰的Thy1.2启动子下的修饰的tTA反式激活蛋白。修饰tTA反式激活蛋白的cDNA，使其包括Kid-1基因的KRAB阻遏蛋白结构域，从而编码tTA-KRAB。KRAB阻遏蛋白结构域在与tetO识别位点联系(通过与tTA蛋白融合)后能抑制毗邻的Thy1.2启动子的转录。类似的tTA-KRAB系统在例如Deuschle等人.(1995)Mol.Cell.Biol.15：1907-1914中有所描述。Kid-1 KRAB结构域在例如Elser等人.(1997)J.Biol.Chem.272：27908-27912中有所描述。
用这些构建物产生两个转基因动物系，使它们交配，以使两个基因座在一个品系中。所得品系将在CNS中以四环素依赖型方式(例如在四环素存在下表达)过度表达Pablo-dm突变体。
实施例11.Pablo的转基因剔除
产生一个内源性Pablo功能被除去的动物品系(“剔除”模型)，这将为理解Pablo在发育中所起的作用提供一个手段。另外，可用缺少Pablo功能的活动物来测试针对Pablo功能的前导化合物以评价其副作用。Pablo剔除通过在克隆库(OmniBank；Lexicon Genetics，The Woodlands，Texas；例如参见http：//www.lexgen.com)中鉴别具有合适缺失的胚胎干细胞克隆来产生。当使该胚胎干细胞在代孕母亲动物中足月发育后，它将产生Pablo的转基因剔除。
等价方案
本领域技术人员只需用常规实验就能认识到或能确定本文描述的发明的具体实施方案有许多等价方案。这些等价方案均包括在下列权利要求中。
                  序列表<110>美国家庭用品有限公司<120>与BCL-XL相互作用的多肽PABLO及其有关用途<130>GNN-005CPPC<140>09/425,501<141>1999-10-22<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2625<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(243)..(1919)<400>1cttctcttgc acttgcggat gatgaactgg aataacgatg aaagaaagca catccgatct 60caacattcac gtcctgccct ataaccgatt aattaattga tccccagcta gactagtgtt 120ggagaaatca gcatgttaaa acaactgttg atgatagctg ttggagtaaa gttgcagtgg 180aagctatggc tgcaaaatcg ttaaaatctt caaggtgaac tggcacaaag gttaatctca 240ag atg ccg cta gtg aaa aga aac atc gat cct agg cac ttg tgc cac    287Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His
 1               5                  10                  15aca gca ctg cct aga ggc att aag aat gaa ctg gaa tgt gta acc aat   335Thr Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn
             20                  25                  30att tcc ttg gca aat ata att aga caa cta agt agc cta agt aaa tat   383Ile Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr
         35                  40                  45gct gaa gat ata ttt gga gaa tta ttc aat gaa gca cat agt ttt tcc   431Ala Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser
     50                  55                  60ttc aga gtc aac tca ttg caa gaa cgt gtg gac cgt tta tct gtt agt   479Phe Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser
 65                  70                  75gtt aca cag ctt gat cca aag gaa gaa gaa ttg tct ttg caa gat ata   527Val Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile80                  85                  90                  95aca atg agg aaa gct ttc cga agt tct aca att caa gac cag cag ctt   575Thr Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu
            100                 105                 110ttc gat cgc aag act ttg cct att cca tta cag gag acg tac gat gtt   623Phe Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val
        115                 120                 125tgt gaa cag cct cca cct ctc aat ata ctc act cct tat aga gat gat   671Cys Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp
    130                 135                 140ggt aaa gaa ggt ctg aag ttt tat acc aat cct tcg tat ttc ttt gat   719Gly Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp
145                 150                 155cta tgg aaa gaa aaa atg ttg caa gat aca gag gat aag agg aag gaa   767Leu Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Glu Asp Lys Arg Lys Glu160                 165                 170                 175aag agg aag cag aag cag aaa aat cta gat cgt cct cat gaa cca gaa   815Lys Arg Lys Gln Lys Gln Lys Asn Leu Asp Arg Pro His Glu Pro Glu
            180                 185                 190aaa gtg cca aga gca cct cat gac agg cgg cga gaa tgg cag aag ctg   863Lys Val Pro Arg Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu
        195                 200                 205gcc caa ggt cca gag ctg gct gaa gat gat gct aat ctc tta cat aag   911Ala Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys
    210                 215                 220cat att gaa gtt gct aat ggc cca gcc tct cat ttt gaa aca aga cct   959His Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro
225                 230                 235cag aca tac gtg gat cat atg gat gga tct tac tca ctt tct gcc ttg   1007Gln Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu240                 245                 250                 255cca ttt agt cag atg agt gag ctt ctg act aga gct gag gaa agg gta   1055Pro Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val
            260                 265                 270tta gtc aga cca cat gaa cca cct cca cct cca cca atg cat gga gca   1103Leu Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala
        275                 280                 285gga gat gca aaa ccg ata ccc acc tgt atc agt tct gct aca ggt ttg   1151Gly Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu
    290                 295                 300ata gaa aat cgc cct cag tca cca gct aca ggc aga aca cct gtg ttt   1199Ile Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe
305                 310                 315gtg agc ccc act ccc cca cct cct cca cca cct ctt cca tct gcc ttg   1247Val Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu320                 325                 330                 335tca act tcc tca tta aga gct tca atg act tca act cct ccc cct cca   1295Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro
            340                 345                 350gta cct ccc cca cct cca cct cca gcc act gct ttg caa gct cca gca   1343Val Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala
        355                 360                 365gta cca cca cct cca gct cct ctt cag att gcc cct gga gtt ctt cac   1391Val Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His
    370                 375                 380cca gct cct cct cca att gca cct cct cta gta cag ccc tct cca cca   1439Pro Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro
385                 390                 395gta gct aga gct gcc cca gta tgt gag act gta cca gtt cat cca ctc   1487Val Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu Thr Val Pro Val His Pro Leu400                 405                 410                 415cca caa ggt gaa gtt cag ggg ctg cct cca ccc cca cca ccg cct cct   1535Pro Gln Gly Glu Val Gln Gly Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
            420                 425                 430ctg cct cca cct ggc att cga cca tca tca cct gtc aca gtt aca gct   1583Leu Pro Pro Pro Gly Ile Arg Pro Ser Ser Pro Val Thr Val Thr Ala
        435                 440                 445ctt gct cat cct ccc tct ggg cta cat cca act cca tct act gcc cca   1631Leu Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr Pro Ser Thr Ala Pro
    450                 455                 460ggt ccc cat gtt cca tta atg cct cca tct cct cca tca caa gtt ata   1679Gly Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro Pro Ser Gln Val Ile
465                 470                 475cct gct tct gag cca aag cgc cat cca tca acc cta cct gta atc agt   1727Pro Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser480                 485                 490                 495gat gcc agg agt gtg cta ctg gaa gca ata cga aaa ggt att cag cta   1775Asp Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gln Leu
            500                 505                 510cgc aaa gta gaa gag cag cgt gaa cag gaa gct aag cat gaa cgc att   1823Arg Lys Val Glu Glu Gln Arg Glu Gln Glu Ala Lys His Glu Arg Ile
        515                 520                 525gaa aac gat gtt gcc acc atc ctg tct cgc cgt att gct gtt gaa tat   1871Glu Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr
    530                 535                 540agt gat tcg gaa gat gat tca gaa ttt gat gaa gta gat tgg ttg gag   1919Ser Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu
545                 550                 555taagaaaaat gcattgataa atattacaaa actgaatgca aatgtccttt gtggtgcttg 1979ttccttgaaa atgtttggtc attctagtgt tttgctttct tttccttata ataaatgacc 2039cttttcctcc ataacttttg atttctaagg aaaatattag catacatttc aaactaaatg 2099ttttacagtg gcttatcttt tttttccccc tgaaaagact aatttggtca aataaaccac 2159taagtattaa gcatggacag ctgttgttag agtagcagat tcagtttttt gatatatctt 2219aattgtgtac tttgtgaatt ttaatttaaa gaaagcaact gaaattgaaa tcttgagggc 2279agctgtatct actaatgagc cttattccat ttcctgatgt tttaaaagaa gaaacactgc 2339cttgattata cgaatacact cagaaagtac atttagcttg tagtgttgaa ttctcttaaa 2399ggaatgcttg aattttttca ttattgtttt attgttttta tatacttgcc ttatttgaat 2459gtttagcagt atccccttcc cacttatata ttgtgtgata tgattttgct tgcctatagg 2519agttaaaaac ttttccatgt gaaatactct gacttaaaca tacatgtaac ttacataact 2579gttaagaata acagtctgat ttaataaatg gttcatttta aaagtt                2625<210>2<211>559<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His Thr1               5                  10                  15Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn Ile
         20                  25                  30Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Ala
     35                  40                  45Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser Phe
 50                  55                  60Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser Val65                  70                  75                  80Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile Thr
             85                  90                  95Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu Phe
        100                 105                 110Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val Cys
    115                 120                 125Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly
130                 135                 140Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp Leu145                 150                 155                 160Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Glu Asp Lys Arg Lys Glu Lys
            165                 170                 175Arg Lys Gln Lys Gln Lys Asn Leu Asp Arg Pro His Glu Pro Glu Lys
        180                 185                 190Val Pro Arg Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu Ala
    195                 200                 205Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys His
210                 215                 220Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro Gln225                 230                 235                 240Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu Pro
            245                 250                 255Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val Leu
        260                 265                 270Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala Gly
    275                 280                 285Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu Ile
290                 295                 300Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe Val305                 310                 315                 320Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu Ser
            325                 330                 335Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro Val
        340                 345                 350Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala Val
    355                 360                 365Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His Pro
370                 375                 380Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro Val385                 390                 395                 400Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu Thr Val Pro Val His Pro Leu Pro
            405                 410                 415Gln Gly Glu Val Gln Gly Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu
        420                 425                 430Pro Pro Pro Gly Ile Arg Pro Ser Ser Pro Val Thr Val Thr Ala Leu
    435                 440                 445Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr Pro Ser Thr Ala Pro Gly
450                 455                 460Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro Pro Ser Gln Val Ile Pro465                 470                 475                 480Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser Asp
            485                 490                 495Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gln Leu Arg
        500                 505                 510Lys Val Glu Glu Gln Arg Glu Gln Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu
    515                 520                 525Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser
530                 535                 540Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu545                 550                 555<210>3<211>747<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(21)..(656)<400>3cagctttgac tcatatgaaa atg tct cag agc aac cgg gag ctg gtg gtt gac 53
                  Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp
                    1               5                  10ttt ctc tcc tac aag ctt tcc cag aaa gga tac agc tgg agt cag ttt   101Phe Leu Ser Tyr Lys Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe
         15                  20                  25agt gat gtg gaa gag aac agg act gag gcc cca gaa ggg act gaa tcg   149Ser Asp Val Glu Glu Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser
     30                  35                  40gag atg gag acc ccc agt gcc atc aat ggc aac cca tcc tgg cac ctg   197Glu Met Glu Thr Pro Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu
 45                  50                  55gca gac agc ccc gcg gtg aat gga gcc act ggc cac agc agc agt ttg   245Ala Asp Ser Pro Ala Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu60                  65                  70                  75gat gcc cgg gag gtg atc ccc atg gca gca gta aag caa gcg ctg agg   293Asp Ala Arg Glu Val Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg
             80                  85                  90gag gca ggc gac gag ttt gaa ctg cgg tac cgg cgg gca ttc agt gac   341Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp
         95                 100                 105ctg aca tcc cag ctc cac atc acc cca ggg aca gca tat cag agc ttt   389Leu Thr Ser Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe
    110                 115                 120gaa cag gta gtg aat gaa ctc ttc cgg gat ggg gta aac tgg ggt cgc   437Glu Gln Val Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg
125                 130                 135att gtg gcc ttt ttc tcc ttc ggc ggg gca ctg tgc gtg gaa agc gta   485Ile Val Ala Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val140                 145                 150                 155gac aag gag atg cag gta ttg gtg agt cgg atc gca gct tgg atg gcc   533Asp Lys Glu Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala
            160                 165                 170act tac cgg aat gac cac cta gag cct tgg atc cag gag aac ggc ggc   581Thr Tyr Arg Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly
        175                 180                 185tgg gat act ttt gtg gaa ctc tat ggg aac aat gca gca gcc gag agc   629Trp Asp Thr Phe Val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser
    190                 195                 200cga aag ggc cag gaa cgc ttc aac cgc tgagtcgacc tgcagccaag         676Arg Lys Gly Gln Glu Arg Phe Asn Arg
205                 210ctaattccgg gcgaatttct tatgatttat gatttttatt attaaataag ttataaaaaa 736aataagtgta t                                                      747<210>4<211>212<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>4Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys1               5                  10                  15Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu
         20                  25                  30Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Met Glu Thr Pro
     35                  40                  45Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
 50                  55                  60Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val65                  70                  75                  80Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu
             85                  90                  95Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu
        100                 105                 110His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn
    115                 120                 125Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe
130                 135                 140Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln145                 150                 155                 160Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ala Trp Met Ala Thr Tyr Arg Asn Asp
            165                 170                 175His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val
        180                 185                 190Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu
    195                 200                 205Arg Phe Asn Arg
210<210>5<211>1254<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(1254)<400>5atg ccg cta gtg aaa aga aac atc gat cct agg cac ttg tgc cac aca   48Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His Thr1               5                  10                  15gca ctg cct aga ggc att aag aat gaa ctg gaa tgt gta acc aat att   96Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn Ile
         20                  25                  30tcc ttg gca aat ata att aga caa cta agt agc cta agt aaa tat gct   144Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Ala
     35                  40                  45gaa gat ata ttt gga gaa tta ttc aat gaa gca cat agt ttt tcc ttc   192Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser Phe
 50                  55                  60aga gtc aac tca ttg caa gaa cgt gtg gac cgt tta tct gtt agt gtt   240Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser Val65                  70                  75                  80aca cag ctt gat cca aag gaa gaa gaa ttg tct ttg caa gat ata aca   288Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile Thr
             85                  90                  95atg agg aaa gct ttc cga agt tct aca att caa gac cag cag ctt ttc   336Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu Phe
        100                 105                 110gat cgc aag act ttg cct att cca tta cag gag acg tac gat gtt tgt   384Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val Cys
    115                 120                 125gaa cag cct cca cct ctc aat ata ctc act cct tat aga gat gat ggt   432Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly
130                 135                 140aaa gaa ggt ctg aag ttt tat acc aat cct tcg tat ttc ttt gat cta   480Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp Leu145                 150                 155                 160tgg aaa gaa aaa atg ttg caa gat aca gag gat aag agg aag gaa aag   528Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Glu Asp Lys Arg Lys Glu Lys
            165                 170                 175agg aag cag aag cag aaa aat cta gat cgt cct cat gaa cca gaa aaa   576Arg Lys Gln Lys Gln Lys Asn Leu Asp Arg Pro His Glu Pro Glu Lys
        180                 185                 190gtg cca aga gca cct cat gac agg cgg cga gaa tgg cag aag ctg gcc   624Val Pro Arg Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu Ala
    195                 200                 205caa ggt cca gag ctg gct gaa gat gat gct aat ctc tta cat aag cat   672Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys His
210                 215                 220att gaa gtt gct aat ggc cca gcc tct cat ttt gaa aca aga cct cag   720Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro Gln225                 230                 235                 240aca tac gtg gat cat atg gat gga tct tac tca ctt tct gcc ttg cca   768Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu Pro
            245                 250                 255ttt agt cag atg agt gag ctt ctg act aga gct gag gaa agg gta tta   816Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val Leu
        260                 265                 270gtc aga cca cat gaa cca cct cca cct cca cca atg cat gga gca gga   864Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala Gly
    275                 280                 285gat gca aaa ccg ata ccc acc tgt atc agt tct gct aca ggt ttg ata   912Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu Ile
290                 295                 300gaa aat cgc cct cag tca cca gct aca ggc aga aca cct gtg ttt gtg   960Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe Val305                 310                 315                 320agc ccc act ccc cca cct cct cca cca cct ctt cca tct gcc ttg tca   1008Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu Ser
            325                 330                 335act tcc tca tta aga gct tca atg act tca act cct ccc cct cca gta   1056Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro Val
        340                 345                 350cct ccc cca cct cca cct cca gcc act gct ttg caa gct cca gca gta   1104Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala Val
    355                 360                 365cca cca cct cca gct cct ctt cag att gcc cct gga gtt ctt cac cca   1152Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His Pro
370                 375                 380gct cct cct cca att gca cct cct cta gta cag ccc tct cca cca gta   1200Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro Val385                 390                 395                 400gct aga gct gcc cca gta tgt gag act gta cca gtt cat cca ctc cca   1248Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu Thr Val Pro Val His Pro Leu Pro
            405                 410                 415caa ggt                                                           1254Gln Gly<210>6<211>418<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>6Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His Thr1               5                  10                  15Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn Ile
         20                  25                  30Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Ala
     35                  40                  45Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser Phe
 50                  55                  60Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser Val65                  70                  75                  80Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile Thr
             85                  90                  95Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu Phe
        100                 105                 110Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val Cys
    115                 120                 125Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly
130                 135                 140Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp Leu145                 150                 155                 160Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Glu Asp Lys Arg Lys Glu Lys
            165                 170                 175Arg Lys Gln Lys Gln Lys Asn Leu Asp Arg Pro His Glu Pro Glu Lys
        180                 185                 190Val Pro Arg Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu Ala
    195                 200                 205Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys His
210                 215                 220Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro Gln225                 230                 235                 240Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu Pro
            245                 250                 255Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val Leu
        260                 265                 270Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala Gly
    275                 280                 285Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu Ile
290                 295                 300Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe Val305                 310                 315                 320Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu Ser
            325                 330                 335Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro Val
        340                 345                 350Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala Val
    355                 360                 365Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His Pro
370                 375                 380Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro Val385                 390                 395                 400Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu Thr Val Pro Val His Pro Leu Pro
            405                 410                 415Gln Gly

Claims (34)

1.一种分离的核酸分子，它包含选自下列的核苷酸序列：
a)编码分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域的核苷酸序列，其中所述分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域与SEQ ID NO：2所示的Bcl-xL结合结构域有70％的氨基酸序列相同性；
b)编码分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在45℃6X SSC中、然后在50-65℃下用0.2 SSC和0.1％SDS洗涤一次或多次后与编码Bcl-xL结合结构域的SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的互补序列杂交；
c)如SEQ ID NO：1所示的编码分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中分离的Bcl-xL结合结构域由SEQ ID NO：2的大约419-559位氨基酸或大约429-559位氨基酸所示的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中分离的Bcl-xL结合结构域由SEQ ID NO：2的大约436-489位氨基酸所示的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域调节神经细胞中的凋亡。
5.根据权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码融合蛋白。
6.一种分离的多肽，该多肽选自下列：
a)包含分离的哺乳动物Bcl-xL结合结构域的多肽，其中所述分离的Bcl-xL结合结构域由与SEQ ID NO：2所示的Pablo Bcl-xL结合结构域有至少70％相同性的氨基酸序列组成；
b)包含Bcl-xL结合结构域的多肽，其中所述Bcl-xL结合结构域由与SEQ ID NO：2所示的Pablo Bcl-xL结合结构域有至少70％相同性的氨基酸序列组成，条件是所述多肽不是全长Pablo多肽；
c)包含SEQ ID NO：2所示的Bcl-xL结合结构域的多肽。
7.一种多肽，该多肽包含SEQ ID NO：2所示的分离的Bcl-xL结合结构域。
8.根据权利要求7所述的多肽，该多肽中已经作了保守性氨基酸置换。
9.一种多肽，它由SEQ ID NO：2所示的分离的Bcl-xL结合结构域组成。
10.根据权利要求6所述的多肽，其中所述分离的Bcl-xL结合结构域由SEQ IDNO：2的大约419-559位氨基酸或大约429-559位氨基酸组成。
11.根据权利要求6所述的分离的核酸分子，其中分离的Bcl-xL结合结构域由SEQ ID NO：2的大约436-489位氨基酸组成。
12.根据权利要求6所述的多肽，其中所述分离的Bcl-xL结合结构域调节神经细胞中的凋亡。
13.一种融合蛋白，该蛋白包含由分离的Bcl-xL结合结构域组成的第一多肽和非Pablo的第二多肽。
14.一种分离的核酸分子，该核酸分子与编码Bcl-xL结合结构域的SEQ ID NO：1的一部分反义。
15.一种载体，它包含权利要求1所述的核酸分子。
16.一种神经细胞系，它稳定表达SEQ ID NO：2所示的分离的Bcl-xL结合结构域或异源Pablo多肽。
17.一种非人转基因动物，它包含编码至少一种转基因Pablo蛋白的转基因以及至少一个指导至少一种转基因Pablo蛋白表达的启动子元件。
18.根据权利要求17所述的转基因动物，其中Pablo蛋白是人Pablo。
19.根据权利要求17所述的转基因动物，其中非人转基因动物是小鼠。
20.根据权利要求17所述的转基因动物，其中至少一个启动子元件指导组织特异性的表达。
21.根据权利要求20所述的转基因动物，其中启动子元件主要指导神经细胞中的表达。
22.根据权利要求20所述的转基因动物，其中至少一个启动子选自Thy1.2启动子和神经元特异性烯醇酶启动子。
23.根据权利要求17所述的转基因动物，其中转基因Pablo蛋白包含截短的或改变的Pablo蛋白。
24.根据权利要求18所述的转基因动物，其中转基因Pablo蛋白是Pablo的显性失活突变体。
25.根据权利要求17所述的转基因动物，该转基因动物包含可调节的表达系统。
26.根据权利要求25所述的转基因动物，其中可调节的表达系统是四环素依赖型表达系统，它包含四环素敏感型反式激活蛋白和在转基因启动子元件中的至少一个四环素敏感型反式激活蛋白的识别位点序列。
27.根据权利要求26所述的转基因动物，其中四环素敏感型反式激活蛋白还包含转录阻遏蛋白结构域。
28.根据权利要求27所述的转基因动物，其中转录阻遏蛋白结构域是KRAB结构域。
29.一种非人转基因动物，它包含一基因组，该基因组中内源性Pablo蛋白已经缺失或改变，从而使该动物中不发生Pablo的功能性表达。
30.一种调节细胞中凋亡的方法，该方法包括调节Pablo多肽或其Bcl-xL结合结构域的活性。
31.一种调节细胞中凋亡的方法，该方法包括调节Pablo多肽或其Bcl-xL结合结构域的表达。
32.一种治疗对象神经系统失调的方法，该方法包括调节对象细胞中Pablo的表达或活性，从而治疗该对象体内的神经系统失调。
33.一种鉴定化合物的方法，该化合物调节Bcl-xL结合结构域的调节凋亡的能力，该方法包括：
使表达Bcl-xL结合结构域的细胞与测试化合物接触；
测定测试化合物调节Bcl-xL结合结构域活性的能力，从而鉴定出能调节Bcl-xL结合结构域的凋亡调节能力的化合物。
34.一种鉴定化合物的方法，该化合物能调节Bcl-xL结合结构域与Bcl-xL相互作用的能力，该方法包括：
使含有Bcl-xL结合结构域的无细胞混合物与测试化合物接触；
测定测试化合物对Bcl-xL结合结构域与Bcl-xL相互作用能力的调节能力，从而鉴定出调节Bcl-xL结合结构域与Bcl-xL相互作用能力的化合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040157327A1 (en) * 1999-10-22 2004-08-12 Wyeth Pablo, a polypeptide that interacts with BCL-XL, and uses related thereto
GB0200689D0 (en) * 2002-01-10 2002-02-27 Univ Newcastle Fusion proteins
US20030215852A1 (en) * 2002-04-01 2003-11-20 Wyeth Novel pancortin-Pablo protein interactions and methods of use thereof
MX348062B (es) * 2003-05-16 2017-05-26 Acorda Therapeutics Inc Mutantes que degradan proteoglicanos para tratamiento del snc.
WO2010042225A2 (en) * 2008-10-10 2010-04-15 Dana Farber Cancer Institute Chemical modulators of pro-apoptotic bax and bcl-2 polypeptides
KR101492729B1 (ko) * 2013-08-28 2015-02-12 양기선 성기능 강화용 링
CN113637653B (zh) * 2021-08-05 2023-05-23 云南师范大学 一种活性提高的酯酶突变体Est8-XL及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993016178A2 (en) * 1992-02-12 1993-08-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Sequences characteristic of human gene transcription product
US5656725A (en) * 1995-05-12 1997-08-12 Apoptosis Technology, Inc. Peptides and compositions which modulate apoptosis

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