CN1173034C - Tsa305基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胰腺特异性基因，该基因包括编码显示于SEQID NO：1的氨基酸序列的碱基序列，该基因对于胰腺癌的研究、诊断和治疗以及在其它领域是特别有效的。

Description

TSA305基因

技术领域

本发明涉及命名为TSA305的基因，该基因编码特异性地在胰腺中表达的蛋白质；更具体地说，涉及与线虫sel-1基因具高水平同源性并且预计具有抗癌活性的上述胰腺特异性基因。本发明还涉及由这样的基因编码的新蛋白质和该蛋白质的特异性抗体。

背景技术

与癌症相关的死亡排名中，胰腺癌在日本和西方国家分别排列在第4和第5位，并且在消化系统的恶性瘤中胰腺癌的预后效果最差(Poston，J.G.等人，Gut，32，800-812(1991))。癌症研究的最终目的是消除导致恶性转化的早期基因变化。如果所述的变化可以区分，可能研制出进行早期诊断的遗传工具，并且可以获得用于更有效地治疗这一致命疾病的新的治疗途径。

同时，已有人报道说：线虫sel-1基因对Notch/lin-12具有抑制作用，该Notch/lin-12在线虫神经发育过程中抑制了外胚层分化为成神经细胞(遗传学，143(1)，237-247(1996)；发育，124(3)，637-644(1997))。当所述的Notch/lin-12被强制表达时，它引起乳腺癌或白血病并且因此被认为是癌症相关的基因。因此认为上述对所述的该癌症相关基因具有抑制作用的sel-1基因对癌症也具有抑制作用。但是目前，这些基因的作用还没有被完全阐明。

对上述基因的生理学作用的阐明和由此获得的信息对阐明疾病如恶性转化和炎症的发病的机理具有重要的意义，不仅在基础科学研究领域而且在药物领域人们都在盼望着对上述基因生理学作用的阐明，以确定如癌症和炎症这样的疾病的病因和研制出用于些疾病的治疗方法。

发明公开内容

本发明的目的在于提供为相关技术领域所需要的上述信息，特别是与sel-1基因具有同源性的编码新的蛋白质的基因。

基于上述目的，本发明人对来源于各种人组织的基因进行了努力的研究，结果，最近成功地分离出和鉴定了编码特异性地在胰腺中表达的蛋白质的基因并且发现利用该基因可以实现上述目的。结果，现在完成了本发明。

因此，本发明提供了胰腺特异性基因TSA305，它包括编码具有显示于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列，特别是TSA305是一个人基因。

本发明也提供了胰腺特异性蛋白质(TSA305蛋白质)，它包括显示于SEQ ID NO：1的氨基酸序列；本发明还提供了能与该蛋白质结合的抗体。

本发明进一步提供了胰腺特异性基因TSA305，它是下面的(a)或(b)中定义的多聚核苷酸，特别是作为人基因的TSA305：

(a)包括显示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列的全部或一部分的多聚核苷酸；

(b)在严谨条件下能够与具有显示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA杂交的多聚核苷酸。

另外，本发明提供了DNA片段形式的上述基因，它可用作为用于基因检测的特异性探针或特异性引物。

在用下面的缩写或标记表述氨基酸、肽、核苷酸、核酸等等时，其缩写或标记使用或遵守了IUPAC-IUB(关于生物学命名的IUPAC-IUB通讯，欧洲生物化学杂志，138：9(1984))，“制作含有核苷酸序列或氨基酸序列的说明书的纲要”(由日本专利局编辑)和相关领域使用的常规标记。

作为本发明基因的具体例子，可以提到的是从命名为“TSA305”的PCR产物的DNA序列推导出的一个基因，它将在后面的实施例部分中被显示。其核苷酸序列显示于SEQ ID NO：3。

所述的基因含有具有显示于SEQ ID NO：2的编码区的人cDNA并且该cDNA编码由显示于SEQ ID NO：1的794个氨基酸残基组成的新的胰腺特异性蛋白质(下文称之为TSA305蛋白质)，该基因全长由7885个核苷酸组成。

利用FASTA程序(Person，W.R.等人，美国科学院年报，85，2444-2448(1988))在GenBank/EMBL数据库中检索的结果，证实本发明的TSA305基因的表达产物，被命名为TSA305蛋白质，与线虫sel-1基因(参见上文中记载的)具有非常高水平的同源性。根据该事实，认为本发明的基因如上文提到的sel-1基因一样对Notch/lin-12应具有抑制作用，该Notch/lin-12被认为是参与胚胎形成的癌症相关基因。

本发明的基因座位是第14染色体的q24.3-q31.1，被认为第14号染色体上存在依赖于胰岛素的糖尿病(IDDM)的致病基因。根据该事实，强烈地暗示本发明的基因与糖尿病有关。

进一步的研究表明本发明的基因的表达产物是含有纤维结合素II型胶原结合域的蛋白质。这样的胶原结合位点紧接N末端，这一点暗示该蛋白质参与纤维形成，并且基于这一点，强烈地暗示本发明的基因参与纤维变性。

另外，由于受测试的所有胰腺癌制剂均没有显示表达了本发明的基因并且该基因主要在正常胰腺中表达，这暗示本发明的基因可能对预测恶性转化有极大的价值。

因此作为本发明提供TSA305基因和其表达产物的结果，本文亦给出了非常适用于阐明、了解、诊断、预防和治疗各种疾病例如乳腺癌、白血病、纤维变性、糖尿病和胰腺癌症，特别是胰腺癌的信息和手段。本发明的基因亦可用于研制诱导本发明的基因表达的新的药物，该药物可用于治疗上文提到的各种疾病。此外，据认为在单个动物或具体组织中，本发明基因的表达的检测或所述基因表达产物的检测或该基因突变(缺失或点突变)的检测或其异常表达的检测可适当地用于阐明或诊断上述疾病。

本发明的基因具体地用含有编码显示于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的基因或是作为含有显示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多聚核苷酸的基因代表。但是，本发明的基因不特定地局限于此，例如可以是在上述特异性氨基酸序列导致某一修饰或具有与上述特异性核苷酸序列有一定水平的同源性的基因。

因此本发明的基因也包括含有编码具有如下衍生的氨基酸序列的蛋白质的核苷酸序列的基因，所述衍生的氨基酸序列来源于通过将显示于SEQ ID NO：1的氨基酸序列缺失、取代或叠加一个或多个氨基酸残基并且仍具有与TSA305同样的活性。如果被修饰的蛋白质是具有与含有显示于SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质的功能相同作用的产物，那么对“缺失、取代或叠加一个氨基酸残基或几个氨基酸残基”的程度和位点没有特别的限制。上面使用的术语“多个”是指2或2个以上，通常是指几个。

在上述氨基酸序列的修饰(突变)等等可天然发生的同时，例如通过突变或转译后的修饰，在天然衍生的基因(例如本发明基因的具体例子)的基础上也可能进行人工修饰。本发明覆盖了具有其它这样的修饰或突变的具有上述特性的所有被修饰的基因，不管其原因和手段如何。

作为上述人工手段的例子，可以提及的有位点特异性诱变(酶学方法，154：350，367-382(1987)；文献同上，100：468(1983)；核酸研究，12：9441(1984)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化学实验，第二系列)1：“Idensi Kenkyubo(基因研究方法)II”，由日本生物化学协会编辑，第105页(1986))和其它遗传工程技术、化学合成手段例如磷酸三酯法或磷酰亚胺方法(美国化学协会杂志89：4801(1967)：文献同上，91：3350(1969)；科学，150：178(1968)；四面体通讯，22：1859(1981)；文献同上，24：245(1983))，和其结合。

对于本发明基因的体现方式，可以提到的基因包括含有显示于SEQ ID NO：3的全部或部分核苷酸序列的多聚核苷酸。该核苷酸序列所含的开放读码框(显示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列)也用作为在上述氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中限定各氨基酸残基的密码子集合体的实例。本发明的基因不限于这一实例，而可以具有其中选定密码子的任意组合的核苷酸序列。可以以常规的方式进行密码子的选择，例如可以考虑在所使用的宿主中惯用的密码子(核酸研究，9：43(1981))。

虽然本发明的基因是以单链DNA核苷酸表示的，例如如SEQ IDNO：2所示，本发明也理所当然地包括具有与所述核苷酸序列互补的核苷酸序列的多聚核苷酸或含有它们两者的成分。它不限于DNA例如cDNA。

此外，如上文提到的，本发明的基因不限于含有显示于SEQ IDNO：2的全部或部分核苷酸序列的多聚核苷酸，它还包括含有与所述的核苷酸具有一定水平的同源性的核苷酸序列的基因。对于这样的基因，可以提到至少能够与包括显示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA在下文提到的严谨条件下杂交并且不能够通过一定条件下的洗涤而从其释放出来的那些。

因此，作为例子，可以提到的有，具有在下面杂交条件下与具有显示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA杂交并且在下述洗涤条件下不从所述的DNA释放的核苷酸序列的基因，杂交条件为：在6×SSC中，65℃过夜，或在37℃在含有50％甲酰胺的4×SSC中过夜；洗涤条件为：用2×SSC在65℃洗涤30分钟。此处，“SSC”是指标准柠檬酸盐水；1×SSC＝0.15氯化钠、0.015M柠檬酸钠。

采用常规的遗传工程技术，基于典型例子的序列的信息，可以很容易地生产和回收本发明的基因(参见，例如，分子克隆，第2版，冷泉港实验室出版社(1989)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化学实验，第二系列)：“Idensi Kenkyubo(基因研究方法)I、II和III”，由日本生物化学协会编辑)。

具体地讲，通过以常规的方式，从表达本发明的基因的合适的来源构建cDNA文库，利用合适的探针或与本发明基因特异性的抗体从所构建的cDNA文库中选择需要的克隆，可以进行上述的生产和/或回收(美国科学院年报，78：6613(1981)；科学，222：778(1983))。

作为上面所述方法的cDNA的来源，可以提到的有：表达本发明基因的各种细胞和组织，从其衍生的培养的细胞等等，特别是胰腺组织。其中从这些细胞或组织分离总的RNA，将mRNA分离和纯化，以及cDNA的获得和克隆等，都可以以常规方式进行。cDNA文库也是可从商业途径获得的，这样的cDNA文库例如可从Clontech实验室公司购买的各种cDNA文库可用于实施本发明。

对用于筛选本发明基因的cDNA文库的方法没有特别的限制，它可以是常规的方法。作为具体的实例，可以提到的是：包括通过利用对由cDNA产生的蛋白具特异性的抗体进行免疫学筛选来筛选相应cDNA克隆的方法，利用选择性地与所需要的DNA序列结合的噬菌斑杂交或菌落杂交技术，和这些方法或技术的组合。

作为所使用的探针的例子，通常可以提到的是基于本发明基因的核苷酸信息而化学合成的DNA。当然，也可以成功地利用如此获得的本发明的基因或其片段。

也可以利用TSA305蛋白质来替代上面的特异性抗体，通过蛋白质相互作用克隆步骤来进行本发明基因的筛选，并且也可以利用包括使用基于本发明基因的核苷酸序列的信息而设计的有义或反义引物作为筛选探针的筛选方法。

根据本发明，通过差异显示技术可以直接比较和调查不同条件下或多个不同的细胞群的细胞中mRNA的表达水平(liand，P.，等人，科学，257：967-971(1992))。

对于获得本发明的基因，可以明智地利用采用PCR技术的DNA/RNA扩增(科学，230：1350(1985))。特别是，当从文库获得全长cDNA是困难的时候，例如可以明智地使用RACE技术(cDNA末端的快速扩增；Jikken Igaku(实验医学)，12(6)：35(1994))，特别是5’-RACE技术(美国科学院年报85：8998(1988))。当使用这样的PCR技术时，可以基于由本发明提供的本发明基因的序列的信息适当地设计所使用的引物并且可以以常规方式合成这些引物。

可以以常规方式，如上文提到的，例如以凝胶电泳来分离和纯化扩增出的DNA/RNA片段。

可以以常规的方式，例如以二脱氧方法(美国科学院年报74：5463(1977))或以Maxam-Gilbert方法(酶学方法，65：499(1980))或以简单和容易的方式利用商品测序试剂盒等等对以上述方式获得的本发明的基因或各种DNA片段进行测序。

通过利用本发明的基因，采用一般的遗传工程技术可以稳定地大量地生产相应的基因产物。因此，本发明也提供了含有本发明TSA305基因的载体(表达载体)，用所述载体转化的宿主细胞和产生TSA305蛋白质的方法，该方法包括培养所述的宿主细胞。

根据一般的重组DNA技术可以实施上述生产方法(参见，例如，科学，224：1431(1984)；生物化学和生物物理研究通讯，130：692(1985)；美国科学院年报，80：5990(1983)，以及上面记载的文献)。

原核生物和真核生物都可用作为上面提到宿主细胞。作为原核宿主细胞，可以提到的是常规使用的各种各样的宿主例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等等，优选的实例包括大肠杆菌菌株，特别是大肠杆菌K12菌株。真核宿主细胞包括脊椎动物细胞和酵母细胞。关于前者，可以明智地使用例如COS细胞(它们是猴细胞)(细胞，23：175(1981))、中国仓鼠卵细胞和其二氢叶酸还原酶-缺失的株系(美国科学院年报，77：4216(1980))；作为后者，可以明智地使用属于酵母属的酵母细胞等。当然，宿主细胞不限于这些。

当原核细胞用作为宿主时，可以明智地使用一表达质粒，该质粒是利用能够在所述宿主细胞中复制的载体构建的，并且所述载体能够在本发明的基因的上游提供启动子和SD序列(Shine和Dalgarno)并且进一步提供起始蛋白质合成所必须的起始密码子(例如ATG)，以便可以表达本发明的基因。通常用作为上面所述载体的是大肠杆菌衍生的质粒，例如pBR322、pBR325、pUC12和pUC13。但是载体不限于这些，可以使用各种已知的载体。作为可在使用大肠杆菌的表达系统中使用的如上述种类的商品载体，可以提到的是例如pGEX-4T(Amersham药物生物技术)、pMAL-C2、pMAL-P2(新英国生物实验室)、pET21、pET21/lacq(Invitrogen)和pBAD/His(Invitrogen)。

对于将脊椎动物细胞用作为宿主的情况下使用的表达载体，可以提到的是通常具有位于待表达的本发明基因上游的启动子、RNA拼接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止序列的载体。如果有必要，它可以进一步含有复制原点。作为所述表达载体的具体例子，可以提到的是具有SV40早期启动子的pSV2dhfr(细胞分子生物学，1：854(1981))等等。除了上面所述，也可以使用各种已知的商品载体。对于可在使用动物细胞的表达系统中使用的所述种类的商品载体，可以提到的载体有：对于动物细胞，载体可以是例如pEGFP-N、pEGFP-C(Clontech)、pIND(Invitrogen)和pcDNA3.1/His(Invitrogen)，对于昆虫细胞，载体可以是例如pFastBac HT(Gibco BRL)、pAcGHLT(PharMingen)、pAc5/V5-His、pMT/V5-His和pMT/Bip/V5-His(后三者：Invitrogen)。

当以酵母细胞用作为宿主时，作为使用的表达载体的具体实例，可以提到的载体是具有酸性磷酸酶基因的启动子的pAM82(美国科学院年报，80：1(1983))等等。用于酵母细胞的其它商品表达载体包括pPICZ(Invitrogen)和pPICZα(Invitrogen)。

对启动子也没有特别的限制。当以大肠杆菌用作为宿主时，明智的是使用色氨酸(trp)启动子、lpp启动子、lac启动子、recA启动子、PL/PR启动子等等。当宿主是芽孢杆菌种时，优选的是SP01启动子、SP02启动子、penP启动子等等。当以酵母种为宿主时所用的启动子，例如可以使用pH05启动子、PGK启动子、GAP启动子或ADH启动子。当动物细胞用作为宿主时，优选的启动子的例子是SV40衍生的启动子、反录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、巨细胞病毒启动子和SRα启动子。

明智的是可以将常规的融合蛋白质表达载体用作为本发明基因的表达载体。对于所述载体的具体例子，可以提到的是用于表达与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合的蛋白质的pGEX(Promega)等等。

对将需要的重组DNA(表达载体)导入到宿主细胞以便将其转化的方法没有特别的限制，可以使用各种常规的方法。可以常规的方法培养所获得的转化体，从而表达/产生由本发明基因编码的需要的TSA305蛋白质并且该蛋白质在转化体细胞内或外或在细胞膜上积累或分泌。

用于上述培养的培养基可根据使用的宿主细胞而从各种常规培养基中适当地选择，并且在适用于宿主细胞生长的条件下进行培养。

如果需要，可采用利用其物理和/或化学特性的各种分离程序(参见，例如“seikagaku(生物化学)Data Book II”，第1175-1259页，第一版，第一次印刷，1980年6月23日由Tokyo Kagaku Dojin出版；生物化学，25(25)；8274(1986)；欧洲生物化学杂志，163：313(1987))来分离和纯化由上获得的重组蛋白质(TSA305蛋白)。对于所述的方法，可以具体特别提及的是例如普通的重构处理、用蛋白质沉淀剂的处理(盐析)、离心、渗透休克处理程序、超声处理、超滤、各种层析技术例如分子筛层析(凝胶过滤)、吸收层析、离子交换层析、亲和层析和高效液相层析(HPLC)、透析和这些方法的结合。在上述方法中特别优选的是利用结合了特异性地与本发明的TSA305蛋白质结合的特异性抗体的柱的亲和层析。

因此，本发明进一步提供了例如以上述方式获得的新的TSA305蛋白质本身。如上文提到的方法，所述的蛋白质与线虫的sel-1具有高水平的同源性并且能够对各种癌症产生抑制作用，因此在药物领域是有用的。

该TSA305蛋白质也可用作为生产对所述的蛋白质特异的抗体的免疫原。用作为抗原的成分可以是例如由上面介绍的遗传工程技术产生的蛋白质或其片段。通过利用这样的抗原，获得所需要的抗血清(多克隆抗体)或单克隆抗体是可能的。生产所述抗体的方法本身是本领域内技术人员熟知的，在实施本发明时，也可以按照这些常规方法进行(参见，例如Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化学实验，第二系列)“Men-eki Seikagaku kenkyuho(免疫生物化学方法)”，由日本生物化学协会编辑(1986))。

因此，例如用于免疫接种以获得抗血清的动物可任意地选自于普通动物例如兔子、豚鼠、大鼠、小鼠和鸡，并且可以以常规方法用上文提到的抗原进行免疫接种，收集血液和进行其它步骤。

通过从用上文提到的免疫原对动物的血浆细胞(免疫细胞)和浆细胞瘤细胞进行免疫而制备杂交瘤细胞，从其中选择出所需要的产生抗体的克隆和培养所述的克隆，可以以常规的方法生产单克隆抗体。通常在选择免疫接种的动物时考虑与用于细胞融合的浆细胞瘤细胞的相容性，并且通常优选地使用小鼠或大鼠。可以以类似于上文提到的抗血清的情况进行免疫接种，如果需要，也可以结合使用普通免疫佐剂等等。

对用于细胞融合的浆细胞瘤细胞没有特别限制，但是例如可以使用各种骨髓瘤细胞例如p3(p3/x63-Ag8)(自然，256：495-497(1975))、p3-U1(微生物学和免疫学的目前的课题，81：1-7(1978))、NS-1(欧洲免疫学杂志，6：511-519(1976))、MPC-11(细胞，8：405-415(1976))、SP2/0(自然，276：269-271(1978)等，大鼠中的R210(自然，277：131-133(1979))等等以及从上述所有这些瘤细胞衍生的细胞。

在常规融合加速剂例如聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(HVJ)存在下，采用已知的方法可以进行上述免疫细胞和浆细胞瘤细胞的融合，并且也可以以常规的方式分离需要的杂交瘤(例如，酶学方法，73：3(1981)；Zoku Seikagaku Jikken Koza(生物化学实验，第二系列)，参见上文)。

可以采用常规的方式寻找产生所需要的抗体的细胞系并且从其衍生单克隆抗体。因此，例如可以利用上面提到的本发明的抗原，采用通常用于检测抗体的各种方法，例如ELISA技术(酶学方法，70：419-439(1980))、噬菌斑技术、斑点试验技术、凝结反应技术、乌赫特朗尼氏技术和放射性免疫测定等来完成产生抗体的细胞系的寻找。

例如，通过以常规方式培养所述的杂交瘤和收集培养上清液，或通过将杂交瘤施用到与其相容的哺乳动物，并且在杂交瘤生长之后，收集腹水液，可以从由此获得的杂交瘤收集本发明的抗体。前一方法适用于获得高纯度的抗体，而后一方法适用于大量生产抗体。通过常规手段例如盐析、凝胶过滤和亲和层析可进一步将由此获得的抗体纯化。

根据其结合到本发明的TSA305蛋白质的能力对由此获得的抗体进行定性，并且该抗体可优先地用于上面提到的TSA305蛋白质的纯化以及通过免疫技术测试或区分该蛋白质。因此本发明也提供了这样的新的抗体。

此外，基于本发明披露的本发明基因的序列的信息，例如通过利用所述基因的整个或部分核苷酸序列可以检测单个或各种组织中本发明基因的表达。

例如，通过采用RT-PCR(反相转录聚合酶链反应；E.S.Kawasaki等人，RNA的扩增，PCR方案，方法和应用指南，学术出版社，SanDiego，21-27(1991))的RNA扩增、Northern印迹分析(分子克隆，冷泉港实验室(1989))、原位RT-PCR(核酸研究，21：3159-3166(1993))、原位杂交等用于细胞水平测试的技术或通过NASBA技术(基于核酸序列的扩增；自然，350：91-92(1991))或其它各种技术，可以常规方式进行上述的检测。所有方式均获得了好结果。

当使用RT-PCR技术时，不以任何方式限制使用的引物，只要它们特异于本发明的基因并且能够仅仅特异性地扩增所述的基因就行。基于本发明的遗传信息可以适当地设计其序列。通常，每个引物各具有包括20-30个核苷酸的部分序列。

以这种方式，本发明还提供了在本发明的TSA305基因的检测中可用作为特异性引物和/或特异性探针的DNA片段。

附图简述

附图1是说明本发明的基因在人组织中的分布的照片图，其结果是根据实施例1(2)描述的northern印迹分析检测到的。

附图2是说明正常胰腺细胞和实施例1(4)获得的四个细胞系的RT-PCR分析结果的照片图。TSA305的结果显示于上面部分，作为对照的β2-微球蛋白的结果显示于底下部分。

附图3是说明胰腺癌样品和实施例1(5)获得的其它样品的RT-PCR分析结果的照片图。TSA305的结果显示于上面部分，作为对照的β2-微球蛋白的结果显示于底下部分。

实施本发明的最好方式

下面的实施例用于更详细地阐述本发明。

实施例1

(1-1)通过用(α-³³P)ATP进行标记的显示方法

为了鉴别在组织特异性过程中表达的人基因，使用用(α-³³P)ATP进行标记的显示方法。下面所述的方法的程序基本上根据Liang的方法(Liang，P.等人，科学，257：967-971(1992))。

因此，将分别从13个人组织(成人脑、胎儿脑、肺、肝脏、胃、胰腺、脾脏、乳腺、膀胱、胎盘、睾丸、肾脏和心脏；Clontech的产物)中分离的polyA RNA(0.2微克)与25pmol的3’-锚定的寡聚-dT引物G(T)15MA(M是G、A和C的混合物)在8微升的焦碳酸二乙基酯处理的水中混合，将该混合物在65℃加热5分钟。向该溶液中加入4微升的5×第一链缓冲液(BRL的产物)、2微升的0.1M DTT(BRL的产物)、1微升的250mM DNTPs(BRL的产物)、1微升的核糖核酸酶抑制剂(40单位；Toyobo的产物)和1微升的SuperScript II逆转录酶(200单位；BRL的产物)。各个反应混合物的最终体积是20微升。将各个溶液在37℃保温1小时，然后通过加入30微升的蒸馏水将其稀释2.5倍，将稀释液在-20℃储藏直到使用。

通过在(α-³³P)ATP-标记(Amersham的产品)的3’-锚定的引物存在下进行PCR扩增cDNA。以下述方式进行PCR以扩增该cDNA。因此，20微升的各个PCR混合物含有2微升的RT反应混合物、2微升的10×PCR缓冲液(Takara的产品)、4微升的2.5mM dNTPs、0.25微升的ExTaq DNA聚合酶(5单位/毫升；Takara的产品)、25pmol的(α-³³P)ATP-标记的3’-锚定的寡聚-dT引物和25pmol的5’-引物(编号20，10聚体的脱氧寡聚核苷酸引物，具有任意序列，在本案情况下，显示于SEQ IDNO：4的核苷酸序列)。在下面条件下进行PCR反应。因此，一个循环包括在95℃进行3分钟，40℃进行5分钟，和在72℃进行5分钟；然后进行40个循环，各包括95℃进行0.5分钟，40℃进行2分钟和在72℃进行1分钟，最后，允许反应在72℃进行5分钟。

用乙醇提取各个PCR反应样品，并且重悬浮于甲酰胺测序染料中，并且允许反应在6％丙烯酰胺-7.5M脲测序凝胶中进行。将凝胶不固定干燥，并进行放射自显影过夜。

(1-2)扩增出的cDNA片段的亚克隆

预先用放射性墨水标记放置了干燥的凝胶的3MM滤纸。通过检测针对该标记物的放射自显影图，将含有所需要的cDNA带的凝胶与3MMM滤纸一起切下，与300微升的蒸馏水搅拌1小时。在去除聚丙烯酰胺凝胶和滤纸之后，在1微升的10毫克/毫升糖原和0.3M NaOAc作为载体存在下，通过乙醇沉淀回收cDNA，将之重新悬浮于10微升的蒸馏水中。对于再扩增，使用5微升的该溶液。PCR条件和引物与第一次PCR中的相同。回收具有合适尺寸的再扩增产物作为第一PCR产物，然后将该PCR产物克隆到pUC118载体(Takara产物)的HincII位点。利用ABI 377自动测序仪(应用生物系统公司的产品)测定核苷酸序列。

将使用从13个人组织分离的mRNA产生的不同的图谱模式进行比较，结果鉴定出了在胰腺中特异性表达的PCR产物。该产物被命名为TSA305。

该产物由371个核苷酸组成。利用FASTA程序(Person，W.R.，等人，美国科学院年报，85，2444-2448(1988))将该核苷酸的数据与在GenBank/EMBL数据库中存在的DNA序列进行比较，表明该PCR产物与其它任何已知的DNA序列没有同源性。

(1-3)cDNA筛选

利用寡聚(dT)+随机6聚体-引导的人正常胰腺cDNA和Uni-ZAP^TM XR(Stratagene的产品)构建人正常的胰腺cDNA文库。采用上面提到的方法分离总的1×10⁶克隆并且利用(α-³³P)dCTP-标记的cDNA片段进行筛选。选择阳性克隆并且在pBlucscript II SK(-)体内切下所插入的cDNA部分。

结果，将约100噬菌斑鉴定为相应的TSA305。基于该结果，计算出所有RNA的转录百分比为约0.01％。与TSA305同源的该装配的cDNA序列(TSA305)包括含有2382核苷酸的开放读码框的7885核苷酸，它编码由794氨基酸残基组成的蛋白质，其分子量为88768道尔顿。

基于该一级序列，表明该基因产物(TSA305蛋白质)是含有纤维结合素II型胶原结合域的蛋白质。

发现其座位是14号染色体上的q24.3-q31.1，其中认为该染色体上存在胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)的致病基因。

本发明的TSA305基因显示与线虫sel-1具有高水平的同源性。

(2)在组织中的表达

为了检测TSA305在组织中的表达概况，利用各种人组织进行northern印迹分析。

对于上述northern印迹分析，使用人MTN(多个组织Northern)印迹I和II(Clontech的产品)。利用具有T3和T7启动子序列的一组引物通过PCR用(α-³³P)dCTP标记cDNA片段。将含有扩增产物的膜进行预杂交(条件参见产物方案)，随后根据产物方案进行杂交。

在杂交之后，洗涤膜并且在-80℃进行放射自显影24小时。结果显示于附图1。

在该附图中，所使用的人组织是心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏、脾脏、胰腺、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和外周血液白细胞。

在该附图中，在胰腺中观察到与TSA305具有同源性的特异性的转录物。

(3)FISH

根据已知的方法，利用0.5微克的各个粘性DNA作为探针，实施FISH进行染色体排列(Takahashi，E.，等人，人类遗传学，86：14-16(1990))。用Provia 100胶片(富士的产品，ISO100)或CCD摄像机系统(应用成像公司，Sightvision的产品)检测FISH。

结果，发现通过R显带法测试100个典型的(原)中期细胞获得的信号定位于第14号染色体的q24.3-q31.1谱带。因此，TSA305在染色体上的定位被鉴定为14 q24.3-q31.1。

(4)由RT-PCR分析表明的在胰腺癌细胞系和胰腺癌组织中转录物的表达

为了检测在人胰腺癌细胞系和胰腺癌组织中TSA305基因是否表达，对四个细胞系(Aspc1(转移性腺癌；国家癌症研究杂志，67：563-569(1981))、Bxpc3(腺癌，未分化的；癌症研究，4：15-23(1986))、MiaPaca2(腺癌；Int.J.Cancer，19：128-135(1977))和PANC1(上皮样的胰腺导管癌；Int.J.Cancer，15：741-747(1975))和9个胰腺癌组织(东京大学医学科学院的Nakamura博士惠赠)进行RT-PCR分析。

因此，用10单位的没有RNA酶的DNA酶I(Boehringer Mannheim的产品)处理利用ISOGEN(Wako的产品)从各个细胞系或胰腺癌组织分离的10微升总RNA，15分钟，随后用苯酚-氯仿重复提取两次，并且用乙醇进行沉淀。利用Superscript I^TM RNA酶H逆转录酶(生命技术公司的产品)，用寡聚-d(T)和随机引物合成单链cDNA。各个产物使用2微升进行PCR扩增。

在25个PCR扩增的循环中使用分别具有显示于SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的核苷酸序列的引物P1和P2S。

在含有25纳克的cDNA、10μM的各引物、2.5mM dNTP和0.25U的Extaq DNA聚合酶(Takara的产品)的20微升的溶液中进行PCR反应。将各个PCR产物溶解于1.5％琼脂糖凝胶，用溴化乙锭染色。

以上述的方式将四个细胞系(泳道1＝Aspc1；泳道2＝Bxpc3；泳道3＝MiaPaca2；泳道4＝PANC1)和正常的胰腺组织(正常的胰腺，泳道5)进行RT-PCR分析。结果显示于附图2。TSA305的结果显示于上面部分，作为对照的β2-微球蛋白的结果显示于底下部分。

根据该附图，发现在任何癌症组织中均没有检测到TSA305的表达，但是仅仅在正常胰腺组织检测到(参见泳道5)。

(5)TSA305基因在胰腺癌中的表达(RT-PCR)

对来自胰腺癌患者的样品(1T，2T，3T，5T，6T，7T，10T和11T)、胰腺癌(肿瘤胰腺)和正常的胰腺(Invitrogen；人正常的胰腺)以及相同患者的癌的部分(23T)和非癌的部分(23N)，采用RT-PCT技术检测TSA305基因的表达。结果如下。

从各个样品提取mRNA并且通过RT-PCR来扩增TSA305的1581-2382bp(801个碱基对)的片段，并进行测试是否有表达的实验。作为浓度对照，使用β2-微球蛋白。结果显示于附图3。

根据该附图，与正常胰腺相比，在所有胰腺癌样品中观察到TSA305基因的表达降低或者没有表达。

工业实用性

根据本发明，提供了新的胰腺特异性TSA305基因和由其编码的蛋白质，并且通过利用这一基因或蛋白质，提供了可用于阐明、诊断、预防和治疗癌症，例如胰腺癌或恶性转化的技术。

                                序列表

<110>大

制药株式会社

<120>TSA305基因

<130>P98-53

<150>JP H9-3433789和H10-126803

<151>1997-11-28和1998-4-20

<160>6

<170>PatentIn 2.0版本

<210>1

<211>794

<212>PRT

<213>正常人胰腺cDNA文库

<400>1

Met Arg Val Arg Ile Gly Leu Thr Leu Leu Leu Cys Ala Val Leu Leu

  1               5                  10                  15

Ser Leu Ala Ser Ala Ser Ser Asp Glu Glu Gly Ser Gln Asp Glu Ser

             20                  25                  30

Leu Asp Ser Lys Thr Thr Leu Thr Ser Asp Glu Ser Val Lys Asp His

         35                  40                  45

Thr Thr Ala Gly Arg Val Val Ala Gly Gln Ile Phe Leu Asp Ser Glu

     50                  55                  60

Glu Ser Glu Leu Glu Ser Ser Ile Gln Glu Glu Glu Asp Ser Leu Lys

 65                 70                   75                  80

Ser Gln Glu Gly Glu Ser Val Thr Glu Asp Ile Ser Phe Leu Glu Ser

                 85                  90                  95

Pro Asn Pro Glu Asn Lys Asp Tyr Glu Glu Pro Lys Lys Val Arg Lys

            100                 105                 110

Pro Ala Leu Thr Ala Ile Glu Gly Thr Ala His Gly Glu Pro Cys His

        115                 120                 125

Phe Pro Phe Leu Phe Leu Asp Lys Glu Tyr Asp Glu Cys Thr Ser Asp

    130                 135                 140

Gly Arg Glu Asp Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Tyr Asp Tyr Lys

145                 150                 155                 160

Ala Asp Glu Lys Trp Gly Phe Cys Glu Thr Glu Glu Glu Ala Ala Lys

                165                 170                 175

Arg Arg Gln Met Gln Glu Ala Glu Met Met Tyr Gln Thr Gly Met Lys

            180                 185                 190

Ile Leu Asn Gly Ser Asn Lys Lys Ser Gln Lys Arg Glu Ala Tyr Arg

        195                 200                 205

Tyr Leu Gln Lys Ala Ala Ser Met Asn His Thr Lys Ala Leu Glu Arg

    210                 215                 220

Val Ser Tyr Ala Leu Leu Phe Gly Asp Tyr Leu Pro Gln Asn Ile Gln

225                 230                 235                 240

Ala Ala Arg Glu Met Phe Glu Lys Leu Thr Glu Glu Gly Ser Pro Lys

                245                 250                 255

Gly Gln Thr Ala Leu Gly Phe Leu Tyr Ala Ser Gly Leu Gly Val Asn

            260                 265                 270

Ser Ser Gln Ala Lys Ala Leu Val Tyr Tyr Thr Phe Gly Ala Leu Gly

        275                 280                 285

Gly Asn Leu Ile Ala His Met Val Leu Gly Tyr Arg Tyr Trp Ala Gly

    290                 295                 300

Ile Gly Val Leu Gln Ser Cys Glu Ser Ala Leu Thr His Tyr Arg Leu

305                 310                 315                 320

Val Ala Asn His Val Ala Ser Asp Ile Ser Leu Thr Gly Gly Ser Val

                325                 330                 335

Val Gln Arg Ile Arg Leu Pro Asp Glu Val Glu Asn Pro Gly Met Asn

            340                 345                 350

Ser Gly Met Leu Glu Glu Asp Leu Ile Gln Tyr Tyr Gln Phe Leu Ala

        355                 360                 365

Glu Lys Gly Asp Val Gln Ala Gln Val Gly Leu Gly Gln Leu His Leu

    370                 375                 380

His Gly Gly Arg Gly Val Glu Gln Asn His Gln Arg Ala Phe Asp Tyr

385                 390                 395                 400

Phe Asn Leu Ala Ala Asn Ala Gly Asn Ser His Ala Met Ala Phe Leu

                405                 410                 415

Gly Lys Met Tyr Ser Glu Gly Ser Asp Ile Val Pro Gln Ser Asn Glu

            420                 425                 430

Thr Ala Leu His Tyr Phe Lys Lys Ala Ala Asp Met Gly Asn Pro Val

        435                 440                 445

Gly Gln Ser Gly Leu Gly Met Ala Tyr Leu Tyr Gly Arg Gly Val Gln

    450                 455                 460

Val Asn Tyr Asp Leu Ala Leu Lys Tyr Phe Gln Lys Ala Ala Glu Gln

465                 470                 475                 480

Gly Trp Val Asp Gly Gln Leu Gln Leu Gly Ser Met Tyr Tyr Asn Gly

                485                 490                 495

Ile Gly Val Lys Arg Asp Tyr Lys Gln Ala Leu Lys Tyr Phe Asn Leu

            500                 505                 510

Ala Ser Gln Gly Gly His Ile Leu Ala Phe Tyr Asn Leu Ala Gln Met

        515                 520                 525

His Ala Ser Gly Thr Gly Val Met Arg Ser Cys His Thr Ala Val Glu

    530                 535                 540

Leu Phe Lys Asn Val Cys Glu Arg Gly Arg Trp Ser Glu Arg Leu Met

545                 550                 555                 560

Thr Ala Tyr Asn Ser Tyr Lys Asp Gly Asp Tyr Asn Ala Ala Val Ile

                565                 570                 575

Gln Tyr Leu Leu Leu Ala Glu Gln Gly Tyr Glu Val Ala Gln Ser Asn

            580                 585                 590

Ala Ala Phe Ile Leu Asp Gln Arg Glu Ala Ser Ile Val Gly Glu Asn

        595                 600                 605

Glu Thr Tyr Pro Arg Ala Leu Leu His Trp Asn Arg Ala Ala Ser Gln

    610                 615                 620

Gly Tyr Thr Val Ala Arg Ile Lys Leu Gly Asp Tyr His Phe Tyr Gly

625                 630                 635                 640

Phe Gly Thr Asp Val Asp Tyr Glu Thr Ala Phe Ile His Tyr Arg Leu

                645                 650                 655

Ala Ser Glu Gln Gln His Ser Ala Gln Ala Met Phe Asn Leu Gly Tyr

            660                 665                 670

Met His Glu Lys Gly Leu Gly Ile Lys Gln Asp Ile His Leu Ala Lys

        675                 680                 685

Arg Phe Tyr Asp Met Ala Ala Glu Ala Ser Pro Asp Ala Gln Val Pro

    690                 695                 700

Val Phe Leu Ala Leu Cys Lys Leu Gly Val Val Tyr Phe Leu Gln Tyr

705                 710                 715                 720

Ile Arg Glu Thr Asn Ile Arg Asp Met Phe Thr Gln Leu Asp Met Asp

                725                 730                 735

Gln Leu Leu Gly Pro Glu Trp Asp Leu Tyr Leu Met Thr Ile Ile Ala

            740                 745                 750

Leu Leu Leu Gly Thr Val Ile Ala Tyr Arg Gln Arg Gln His Gln Asp

        755                 760                 765

Met Pro Ala Pro Arg Pro Pro Gly Pro Arg Pro Ala Pro Pro Gln Gln

    770                 775                 780

Glu Gly Pro Pro Glu Gln Gln Pro Pro Gln

785                 790

    <210>2

    <211>2382

    <212>DNA

    <213>正常人胰腺cDNA文库

    <400>2

atgcgggtcc ggatagggct gacgctgctg ctgtgtgcgg tgctgctgag cttggcctcg      60

gcgtcctcgg atgaagaagg cagccaggat gaatccttag attccaagac tactttgaca     120

tcagatgagt cagtaaagga ccatactact gcaggcagag tagttgctgg tcaaatattt     180

cttgattcag aagaatctga attagaatcc tctattcaag aagaggaaga cagcctcaag     240

agccaagagg gggaaagtgt cacagaagat atcagctttc tagagtctcc aaatccagaa     300

aacaaggact atgaagagcc aaagaaagta cggaaaccag ctttgaccgc cattgaaggc     360

acagcacatg gggagccctg ccacttccct tttcttttcc tagataagga gtatgatgaa     420

tgtacatcag atgggaggga agatggcaga ctgtggtgtg ctacaaccta tgactacaaa     480

gcagatgaaa agtggggctt ttgtgaaact gaagaagagg ctgctaagag acggcagatg     540

caggaagcag aaatgatgta tcaaactgga atgaaaatcc ttaatggaag caataagaaa     600

agccaaaaaa gagaagcata tcggtatctc caaaaggcag caagcatgaa ccataccaaa     660

gccctggaga gagtgtcata tgctctttta tttggtgatt acttgccaca gaatatccag     720

gcagcgagag agatgtttga gaagctgact gaggaaggct ctcccaaggg acagactgct     780

cttggctttc tgtatgcctc tggacttggt gttaattcaa gtcaggcaaa ggctcttgta     840

tattatacat ttggagctct tgggggcaat ctaatagccc acatggtttt gggttacaga     900

tactgggctg gcatcggcgt cctccagagt tgtgaatctg ccctgactca ctatcgtctt     960

gttgccaatc atgttgctag tgatatctcg ctaacaggag gctcagtagt acagagaata    1020

cggctgcctg atgaagtgga aaatccagga atgaacagtg gaatgctaga agaagatttg    1080

attcaatatt accagttcct agctgaaaaa ggtgatgtac aagcacaggt tggtcttgga    1140

caactgcacc tgcacggagg gcgtggagta gaacagaatc atcagagagc atttgactac    1200

ttcaatttag cagcaaatgc tggcaattca catgccatgg cctttttggg aaagatgtat    1260

tcggaaggaa gtgacattgt acctcagagt aatgagacag ctctccacta ctttaagaaa    1320

gctgctgaca tgggcaaccc agttggacag agtgggcttg gaatggccta cctctatggg    1380

agaggagttc aagttaatta tgatctagcc cttaagtatt tccagaaagc tgctgaacaa    1440

ggctgggtgg atgggcagct acagcttggt tccatgtact ataatggcat tggagtcaag    1500

agagattata aacaggcctt gaagtatttt aatttagctt ctcagggagg ccatatcttg    1560

gctttctata acctagctca gatgcatgcc agtggcaccg gcgtgatgcg atcatgtcac    1620

actgcagtgg agttgtttaa gaatgtatgt gaacgaggcc gttggtctga aaggcttatg    1680

actgcctata acagctataa agatggcgat tacaatgctg cagtgatcca gtacctcctc    1740

ctggctgaac agggctatga agtggcacaa agcaatgcag cctttattct tgatcagaga    1800

gaagcaagca ttgtaggtga gaatgaaact tatcccagag ctttgctaca ttggaacagg    1860

gccgcctctc aaggctatac tgtggctaga attaagctcg gagactacca tttctatggg    1920

tttggcaccg atgtagatta tgaaactgca tttattcatt accgtctggc ttctgagcag    1980

caacacagtg cacaagctat gtttaatctg ggatatatgc atgagaaagg actgggcatt    2040

aaacaggata ttcaccttgc gaaacgtttt tatgacatgg cagctgaagc cagcccagat    2100

gcacaagttc cagtcttcct agccctctgc aaattgggcg tcgtctattt cttgcagtac    2160

atacgggaaa caaacattcg agatatgttc acccaacttg atatggacca gcttttggga    2220

cctgagtggg acctttacct catgaccatc attgcgctgc tgttgggaac agtcatagct    2280

tacaggcaaa ggcagcacca agacatgcct gcacccaggc ctccagggcc acggccagct    2340

ccaccccagc aggaggggcc accagagcag cagccaccac ag                       2382

<210>3

<211>7885

<212>DNA

<213>正常人胰腺cDNA文库

<220>

<221>cDS

<222>(46)..(2428)

<400>3

gcgaaggcga cagctctagg ggttggcacc ggccccgaga ggagg atg cgg gtc          54

                                                  Met Arg Val

                                                    1

cgg ata ggg ctg acg ctg ctg ctg tgt gcg gtg ctg ctg agc ttg gcc       102

Arg Ile Gly Leu Thr Leu Leu Leu Cys Ala Val Leu Leu Ser Leu Ala

      5                  10                  15

tcg gcg tcc tcg gat gaa gaa ggc agc cag gat gaa tcc tta gat tcc       150

Ser Ala Ser Ser Asp Glu Glu Gly Ser Gln Asp Glu Ser Leu Asp Ser

 20                  25                  30                  35

aag act act ttg aca tca gat gag tca gta aag gac cat act act gca       198

Lys Thr Thr Leu Thr Ser Asp Glu Ser Val Lys Asp His Thr Thr Ala

                 40                  45                  50

ggc aga gta gtt gct ggt caa ata ttt ctt gat tca gaa gaa tct gaa       246

Gly Arg Val Val Ala Gly Gln Ile Phe Leu Asp Ser Glu Glu Ser Glu

             55                  60                  65

tta gaa tcc tct att caa gaa gag gaa gac agc ctc aag agc caa gag       294

Leu Glu Ser Ser Ile Gln Glu Glu Glu Asp Ser Leu Lys Ser Gln Glu

         70                  75                  80

ggg gaa agt gtc aca gaa gat atc agc ttt cta gag tct cca aat cca       342

Gly Glu Ser Val Thr Glu Asp Ile Ser Phe Leu Glu Ser Pro Asn Pro

     85                  90                  95

gaa aac aag gac tat gaa gag cca aag aaa gta cgg aaa cca gct ttg       390

Glu Asn Lys Asp Tyr Glu Glu Pro Lys Lys Val Arg Lys Pro Ala Leu

100                 105                 110                 115

acc gcc att gaa ggc aca gca cat ggg gag ccc tgc cac ttc cct ttt       438

Thr Ala Ile Glu Gly Thr Ala His Gly Glu Pro Cys His Phe Pro Phe

                120                 125                 130

ctt ttc cta gat aag gag tat gat gaa tgt aca tca gat ggg agg gaa       486

Leu Phe Leu Asp Lys Glu Tyr Asp Glu Cys Thr Ser Asp Gly Arg Glu

            135                 140                 145

gat ggc aga ctg tgg tgt gct aca acc tat gac tac aaa gca gat gaa       534

Asp Gly Arg Leu trp Cys Ala Thr Thr Tyr Asp Tyr Lys Ala Asp Glu

        150                 155                 160

aag tgg ggc ttt tgt gaa act gaa gaa gag gct gct aag aga cgg cag       582

Lys Trp Gly Phe Cys Glu Thr Glu Glu Glu Ala Ala Lys Arg Arg Gln

    165                 170                 175

atg cag gaa gca gaa atg atg tat caa act gga atg aaa atc ctt aat       630

Met Gln Glu Ala Glu Met Met Tyr Gln Thr Gly Met Lys Ile Leu Asn

180                 185                 190                 195

gga agc aat aag aaa agc caa aaa aga gaa gca tat cgg tat ctc caa       678

Gly Ser Asn Lys Lys Ser Gln Lys Arg Glu Ala Tyr Arg Tyr Leu Gln

                200                 205                 210

aag gca gca agc atg aac cat acc aaa gcc ctg gag aga gtg tca tat       726

Lys Ala Ala Ser Met Asn His Thr Lys Ala Leu Glu Arg Val Ser Tyr

            215                 220                 225

gct ctt tta ttt ggt gat tac ttg cca cag aat atc cag gca gcg aga       774

Ala Leu Leu Phe Gly Asp Tyr Leu Pro Gln Asn Ile Gln Ala Ala Arg

        230                 235                 240

gag atg ttt gag aag ctg act gag gaa ggc tct ccc aag gga cag act       822

Glu Met Phe Glu Lys Leu Thr Glu Glu Gly Ser Pro Lys Gly Gln Thr

    245                 250                 255

gct ctt ggc ttt ctg tat gcc tct gga ctt ggt gtt aat tca agt cag       870

Ala Leu Gly Phe Leu Tyr Ala Ser Gly Leu Gly Val Asn Ser Ser Gln

260                 265                 270                 275

gca aag gct ctt gta tat tat aca ttt gga gct ctt ggg ggc aat cta       918

Ala Lys Ala Leu Val Tyr Tyr Thr Phe Gly Ala Leu Gly Gly Asn Leu

                280                 285                 290

ata gcc cac atg gtt ttg ggt tac aga tac tgg gct ggc atc ggc gtc       966

Ile Ala His Met Val Leu Gly Tyr Arg Tyr Trp Ala Gly Ile Gly Val

            295                 300                 305

ctc cag agt tgt gaa tct gcc ctg act cac tat cgt ctt gtt gcc aat      1014

Leu Gln Ser Cys Glu Ser Ala Leu Thr His Tyr Arg Leu Val Ala Asn

        310                 315                 320

cat gtt gct agt gat atc tcg cta aca gga ggc tca gta gta cag aga      1062

His Val Ala Ser Asp Ile Ser Leu Thr Gly Gly Ser Val Val Gln Arg

    325                 330                 335

ata cgg ctg cct gat gaa gtg gaa aat cca gga atg aac agt gga atg      1110

Ile Arg Leu Pro Asp Glu Val Glu Asn Pro Gly Met Asn Ser Gly Met

340                 345                 350                 355

cta gaa gaa gat ttg att caa tat tac cag ttc cta gct gaa aaa ggt      1158

Leu Glu Glu Asp Leu Ile Gln Tyr Tyr Gln Phe Leu Ala Glu Lys Gly

                360                 365                 370

gat gta caa gca cag gtt ggt ctt gga caa ctg cac ctg cac gga ggg      1206

Asp Val Gln Ala Gln Val Gly Leu Gly Gln Leu His Leu His Gly Gly

            375                 380                 385

cgt gga gta gaa cag aat cat cag aga gca ttt gac tac ttc aat tta      1254

Arg Gly Val Glu Gln Asn His Gln Arg Ala Phe Asp Tyr Phe Asn Leu

        390                 395                 400

gca gca aat gct ggc aat tca cat gcc atg gcc ttt ttg gga aag atg      1302

Ala Ala Asn Ala Gly Asn Ser His Ala Met Ala Phe Leu Gly Lys Met

    405                 410                 415

tat tcg gaa gga agt gac att gta cct cag agt aat gag aca gct ctc      1350

Tyr Ser Glu Gly Ser Asp Ile Val Pro Gln Ser Asn Glu Thr Ala Leu

420                 425                 430                 435

cac tac ttt aag aaa gct gct gac atg ggc aac cca gtt gga cag agt      1398

His Tyr Phe Lys Lys Ala Ala Asp Met Gly Asn Pro Val Gly Gln Ser

                440                 445                 450

ggg ctt gga atg gcc tac ctc tat ggg aga gga gtt caa gtt aat tat      1446

Gly Leu Gly Met Ala Tyr Leu Tyr Gly Arg Gly Val Gln Val Asn tyr

            455                 460                 465

gat cta gcc ctt aag tat ttc cag aaa gct gct gaa caa ggc tgg gtg      1494

Asp Leu Ala Leu Lys Tyr Phe Gln Lys Ala Ala Glu Gln Gly Trp Val

        470                 475                 480

gat ggg cag cta cag ctt ggt tcc atg tac tat aat ggc att gga gtc      1542

Asp Gly Gln Leu Gln Leu Gly Ser Met Tyr Tyr Asn Gly Ile Gly Val

    485                 490                 495

aag aga gat tat aaa cag gcc ttg aag tat ttt aat tta gct tct cag      1590

Lys Arg Asp Tyr Lys Gln Ala Leu Lys Tyr Phe Asn Leu Ala Ser Gln

500                 505                 510                 515

gga ggc cat atc ttg gct ttc tat aac cta gct cag atg cat gcc agt      1638

Gly Gly His Ile Leu Ala Phe Tyr Asn Leu Ala Gln Met His Ala Ser

                520                 525                 530

ggc acc ggc gtg atg cga tca tgt cac act gca gtg gag ttg ttt aag      1686

Gly Thr Gly Val Met Arg Ser Cys His Thr Ala Val Glu Leu Phe Lys

            535                 540                 545

aat gta tgt gaa cga ggc cgt tgg tct gaa agg ctt atg act gcc tat      1734

Asn Val Cys Glu Arg Gly Arg Trp Ser Glu Arg Leu Met Thr Ala Tyr

        550                 555                 560

aac agc tat aaa gat ggc gat tac aat gct gca gtg atc cag tac ctc      1782

Asn Ser Tyr Lys Asp Gly Asp Tyr Asn Ala Ala Val Ile Gln Tyr Leu

    565                 570                 575

ctc ctg gct gaa cag ggc tat gaa gtg gca caa agc aat gca gcc ttt      1830

Leu Leu Ala Glu Gln Gly Tyr Glu Val Ala Gln Ser Asn Ala Ala Phe

580                 585                 590                 595

att ctt gat cag aga gaa gca agc att gta ggt gag aat gaa act tat      1878

Ile Leu Asp Gln Arg Glu Ala Ser Ile Val Gly Glu Asn Glu Thr Tyr

                600                 605                 610

ccc aga gct ttg cta cat tgg aac agg gcc gcc tct caa ggc tat act      1926

Pro Arg Ala Leu Leu His Trp Asn Arg Ala Ala Ser Gln Gly Tyr Thr

            615                 620                 625

gtg gct aga att aag ctc gga gac tac cat ttc tat ggg ttt ggc acc      1974

Val Aal Arg Ile Lys Leu Gly Asp Tyr His Phe Tyr Gly Phe Gly Thr

        630                 635                 640

gat gta gat tat gaa act gca ttt att cat tac cgt ctg gct tct gag      2022

Asp Val Asp Tyr Glu Thr Ala Phe Ile His Tyr Arg Leu Ala Ser Glu

    645                 650                 655

cag caa cac agt gca caa gct atg ttt aat ctg gga tat atg cat gag      2070

Gln Gln His Ser Ala Gln Ala Met Phe Asn Leu Gly Tyr Met His Glu

660                 665                 670                 675

aaa gga ctg ggc att aaa cag gat att cac ctt gcg aaa cgt ttt tat      2118

Lys Gly Leu Gly Ile Lys Gln Asp Ile His Leu Ala Lys Arg Phe Tyr

                680                 685                 690

gac atg gca gct gaa gcc agc cca gat gca caa gtc cca gtc ttc tta      2166

Asp Met Ala Ala Glu Ala Ser Pro Asp Ala Gln Val Pro Val Phe Leu

            695                 700                 705

gcc ctc tgc aaa ttg ggc gtc gtc tat ttc ttg cag tac ata cgg gaa      2214

Ala Leu Cys Lys Leu Gly Val Val Tyr Phe Leu Gln Tyr Ile Arg Glu

        710                 715                 720

aca aac att cga gat atg ttc acc caa ctt gat atg gac cag ctt ttg      2262

Thr Asn Ile Arg Asp Met Phe Thr Gln Leu Asp Met Asp Gln Leu Leu

    725                 730                 735

gga cct gag tgg gac ctt tac ctc atg acc atc att gcg ctg ctg ttg      2310

Gly Pro Glu Trp Asp Leu Tyr Leu Met Thr Ile Ile Ala Leu Leu Leu

740                 745                 750                 755

gga aca gtc ata gct tac agg caa agg cag cac caa gac atg cct gca      2358

Gly Thr Val Ile Ala Tyr Arg Gln Arg Gln His Gln Asp Met Pro Ala

                760                 765                 770

ccc agg cct cca ggg cca cgg cca gct cca ccc cag cag gag ggg cca      2406

Pro Arg Pro Pro Gly Pro Arg Pro Ala Pro Pro Gln Gln Glu Gly Pro

            775                 780                 785

cca gag cag cag cca cca cag t aataggcact gggtccagcc ttgatcagtg       2458

Pro Glu Gln Gln Pro Pro Gln

        790

acagcgaagg aagttatctg ctgggaacac ttgcatttga tttaggacct tggatcagtg    2518

gtcacctccc agaagaggca cggcacaagg aagcattgaa ttcctaaagc tgcttagaat    2578

ctgatgcctt tattttcagg gataagtaac tcttacctaa actgagctga atgtttgttt    2638

cagtgccata tggagtaaca actttcagtg gctttttttt ttcttttctg gaaacatatg    2698

tgagacactc agagtaatgt ctactgtatc cagctatctt tctttggatc cttttggtca    2758

ttatttcagt gtgcataagt tcttaatgtc aaccatcttt aaggtattgt gcatcgacac    2818

taaaaactga tcagtgttaa aaaggaaaac ccagttgcaa gtttaaacgt gttcgaaagt    2878

ctgaaaatag aacttgcctt ttaagttaaa aaaaaaaaaa aagctatctt gaaaatgttt    2938

tggaactgcg ataactgaga aacttcttac cagtccacat gcaattaaac atattcagca    2998

tatttgttat tttaaaaggg agggttggga ggtttcttat tggtgattgt cacacggtat    3058

accatactcc tctccttcaa agaatgaaag gccttgttaa ggagtttttt gtgagcttta    3118

cttctttgga atggaatata cttatgcaaa accttgtgaa ctgactcctt gcactaacgc    3178

gagtttgccc cacctactct gtaatttgct tgtttgtttt gaatataaca gagccttgat    3238

ccagaagcca gaggatggac taagtgggag aaattagaaa acaaaacgaa ctctggttgg    3298

ggtactacga tcacagacac agacatactt ttcctaaagt tgaagcattt gttcccagga    3358

tttattttac tttgcatttc tttttgcaca aagaacacat caccttcctg aattctttaa    3418

atatgaaata tcattgccag ggtatggctt acagtgacta ctattatcaa tactaaaact    3478

cagagaatca aagatggatt aaactcagtg gttgatgaaa gccaaaacct gtttgtactg    3538

ttctatacta ttcaggtatc tttttatttc tgatagtttt atattataat agaaagccag    3598

ccactgctta gctatcatag tcaccatttt ctcactgtta acattaggaa aatcaaggct    3658

actatgcttc aggattgtct ggttaaatag tatgggaaaa aaactgaaga gtttcaacat    3718

aattacacac gtgaaataat tacagcttaa actgaatttg tatttcattt tattgtcaga    3778

tggtggtgtt caccagcctg tatcttgtct gagactgcat tcgtatctga gcaggttttc    3838

tatgcctact gatgtcagta tgtttatact aaccttcatg cttttttccc agaatccctc    3898

atctgccaga aaacttgaaa agtttattgc ttgtagagtt gtactgcttt gatttttgaa    3958

gttggggtag tagttagaac tagatttaac tagtctataa tgaacatgaa ggcttttata    4018

tatgaagttg tatacctttt tgtgtttaga gaattatggg aaacctggta agcaaaactt    4078

tcctcccaga taattgcttc caaattcgaa gagttagtca ccaagagagc catatgtatg    4138

aaagcgtatc tgtgaaaggt aggaaactta ccccccctaa gtgtaatgtt gctttaggca    4198

actcttgtaa atagtgagac ttgtttggtc tcttacatgt agagatttga gtgcagttgg    4258

tacagtactt tggtgtctcc accactgtcc cttctccccg cttcaaaata agtgtaatcc    4318

acggtagcag ccacacttcc ttcagaagga actgttataa tttatttaaa agttgaaaaa    4378

ccacccaaga tgactaccaa ctttcacttt ttttcttctg ccatccaccc tcattttccc    4438

tttagcaaga tttttatatc taactttcct tccctccatt gagtacgtgc tttgagaaaa    4498

catttcttaa aacagtgtgt gccacctaag gctggatggg aaagtgcagt cttgttgttc    4558

atataaaaaa cacacttctt attagtttac ccacttgcct ttttctattg ttaatgttct    4618

gaatttcctt ttcttggctt gtttctactt cattttaacc ctgggtcact tgctgccagc    4678

agtttgtgaa tggtgtcttt caaataactt agttcttatg gcttcactta aagactgtct    4738

caaaaatact ttgctctctt cttctttttt gttcatggga catggtacct aagcaaatag    4798

gagttgggtt tggtttttct cctaaaataa tgctcaatac ttacctaatc aaatggcatc    4858

catttgaata aaatgacaat aactaaagct agttaatgtc agtgacatta aactaactcc    4918

aggattcagg agttttaatg ttagaattta gatttaacag atagagtgtg gcttcatttg    4978

tccatggtag cccatctctc ctaagacctt ttctagtctg tcttcctgcc ttcgaacttg    5038

atgacagtaa aaccctgttt agtattctct tgtgcatttg gtttgttggt tagccgactg    5098

tcttgaaact attcattttg cttctagttt tattttacag aggtagcatt ggtgggtttt    5158

tttttttttt tctgtctctg tgtttgaagt ttcagtttct gttttctagg taaggcttat    5218

ttttgattag cagtcaatgg caaagaaaaa gtaaatcaaa gatgacttct tttcaaaatg    5278

tatggccctt ttattgcact tttaactcag atgaatttat aaattattaa tcttgatact    5338

aaggatttgt tacttttttg catattaggt taatttttac cttacatgtg agagtcttac    5398

cactaagcca ttctgtctct gtactgttgg gaagttttgg aaacccctgc cagtgatctg    5458

gtgatgatct gatgatttat ttaaagagcc gttgatgcct ccaggaaact taagtatttt    5518

attaatatat atataggaat ttttttttat tttgctttgt ctttctctcc cttcttttat    5578

cctcatgttc attcttcaaa ccagtgtttt ggaagtatgc atgcaggcct ataaatgaaa    5638

aacacaattc tttatgtgta tagcatgtgt attaatgtct aactacatac gcaaaaactt    5698

cctttacaga ggttcggact aacatttcac atgcacattt caaaacaaga tgtgtcatga    5758

aaacagcccc tttacctgcc aagacaagca gggctatatt tcagtgacag ctggatattt    5818

tgtttctgaa agtgaatctc ataatatata tatgtattac acattattat gactagaagt    5878

atgtaagaaa tgatcagaac aaaagaaaat ttctattttc atgcaaatat ttttcatcag    5938

tcatcactct caaatataaa ttaaaatata acactcctga atgcctgagg cacgatctgg    5998

attttaaatg tgtggtattc attgaaaaga agctctccac ccacttggta tttcaagaaa    6058

atttaaaacg atcccaagga aagatgattt gtatgttaaa gtgactgcac aagtaaaagt    6118

ccaatgttgt gtgcatgaaa aggattcctt ggttatgtgc agggaatcat ctcacatgct    6178

gtttttccta tttggtttga gaaacaggct gacactattc tctttgatta gaaaataaac    6238

tcataaaact cataatgttg atataatcaa gatgttaacc actataaata tgtagaagag    6298

gaagttttaa atagacctta agctggcatt gtgaaggaac accatggtag actctttttg    6358

gtaatggtat tttgtattta atgaaatgca gtataaaggt tggtgaagtg taataataat    6418

tgtgtaaaca aatcctgttt aatagaagag atgtacagaa tcgttttggt actgtatctt    6478

gaaacttgtg aaataaagat tccacttttg gttatcctgt atgctgtaat ataccacaac    6538

caagcaccct ttccagacag acttttttta agctgaatga atccaatttt ttaatgtttt    6598

ttggaaattc agaagcttct gaaaacattc acttgtggca atttgaattt atctttcatt    6658

ttaaactcct gaaattcaga tttttacaag tccaatattg ccctagggag aacatgaatt    6718

tgctaagaaa tgttatcttt taaatctctg atatctttgt cttgaagcag ccttgatatg    6778

tagtaagcgt gattcacttt agcctgatta taatattatt tatctaaagt ttgtttatgc    6838

attgccttgt cccaggaatt ttttaagagg acttgcagag acacgtacca cacagtaaca    6898

tttagactaa atatgctctg agtaaaggag aaatgaaaaa atattaaatc aagagtgaac    6958

atgtacacaa agtgcaattg gaagtgggct acaaatttag cccccagctt cccagcaggc    7018

aactcaaaga ggtaactgag gtaaaatgtt ccagctcaga agcattggat cttggataaa    7078

aagcctacat gatgcaaact gtggcaactg agatgtcaga tctcaagatc tcaaattgta    7138

cttgtgggag cacagtcagt gaccccagat gaccttgact gacctaaaag ttgtggggga    7198

agtcggatgt cagagcctta acaccagcag gtgaccatcc aacctggggc aatgcctgcc    7258

tgttcaccac ttagcctctt tctggcaagt cattagaatg tcctccatct tcattggctg    7318

caacttgatg agctacagcc tctttcctaa cttcctttat gatgctagtt taggttggtt    7378

ataccagctt ggaagtatgc ttagattaag ttacagcaga tacacaaatt agatgcaagt    7438

aaaaaaaatc agaatttctg tagtagaaac tacgaaaaat aaaaaggaaa gtttttactt    7498

tttgggtatt tttttacgaa taagaaaaag tgagcgttaa tcagttcaaa aggaggtact    7558

gctgtgtaat gggctttgta cgttccttct catgtcactt acgtcactac ttcgccatca    7618

aattgaacaa gcttttaatt agatcctgaa aattcactat gctagtagtt tattggtagt    7678

attatatttt gagtagaact ctgattttcc ctagaggcca aattcttttt atctgggtta    7738

atttctttta aacataacaa tgttaatgct gaattgtata ttaaatccca tttctaaaaa    7798

ccacacaatt ttttctcatg taagttgagt ggaatgtggt tagttaactg aatttggaat    7858

gttcatataa ataatttgtt gctgctc                                        7885

<210>4

<211>10

<212>DNA

<213>用于TSA305的PCR的引物序列

<400>4

gatctgacac                                                             10

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>用于TSA305的PCR的引物序列

<400>5

gatcggatcc aggaggatgc gggtccgg                                         28

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>用于TSA305的PCR的引物序列

<400>6

gatcctcgag ttactgtggt ggctgctgct                                       30

Claims (5)

1.一种胰腺特异性基因，它包括编码具有如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的基因，它由SEQ ID NO：2显示的碱基序列定义。

3.一种胰腺特异性基因，它是下面的(a)或(b)定义的多聚核苷酸：

(a)包括SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的多聚核苷酸；

(b)在杂交条件下能够与具有显示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列的DNA杂交的多聚核苷酸，所述杂交条件为：在6×SSC中，65℃过夜，或在37℃在含有50％甲酰胺的4×SSC中过夜，然后在2×SSC中，在65℃洗涤30分钟。

4.一种具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的胰腺特异性蛋白质。

5.能够与权利要求4定义的胰腺特异性蛋白质结合的抗体。

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