CN1720442A

CN1720442A - 复制蛋白ciz1

Info

Publication number: CN1720442A
Application number: CNA2003801052554A
Authority: CN
Inventors: C·道
Original assignee: Yorkshire Cancer Research
Current assignee: Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2002-12-05
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2006-01-11
Also published as: WO2004051269A2; ATE534902T1; MXPA05006034A; ES2556704T3; WO2004051269A3; ES2376746T3; AU2003290240A1; EP1570268B1; AU2003290240B2; GB0228337D0; EP1570268A2; US20110070591A1; US7833702B2; US9541555B2; CA2507403C; HUE028241T2; CA2507403A1; EP2316966B1; JP2006508659A; US20060155113A1

Abstract

本发明涉及一种筛选方法，这种方法可鉴定调节DNA复制蛋白CIZ1活性的制剂，该蛋白质可作为癌症治疗中干预的靶标，并包括调节所述活性的制剂。本发明也涉及DNA复制蛋白及其RNA转录物在增生性疾病，例如癌症的预后和诊断中的应用。

Description

复制蛋白CIZ1

技术领域

本发明涉及鉴定调节DNA复制蛋白活性的制剂的筛选方法，所述蛋白质可作为癌症治疗中干预的靶标，并包括调节所述活性的制剂。

本发明还涉及该DNA复制蛋白及其RNA转录物在增生性疾病，例如癌症的预后和诊断中的应用。

背景技术

DNA复制的起始是哺乳动物细胞周期中的一个主要控制点，也是癌症中许多不受调控的基因产物的作用点(Hanahan和Weinberg，2000)。起始过程涉及在细胞周期的G1期中在复制起始点上前复制复合物蛋白的组装，其包括起点识别复合体(ORC)，Cdc6，Cdt1和Mcm蛋白质。然后是第二组蛋白质的作用，其促进DNA聚合酶及其辅助因子，包括PCNA的装载，并转变为S期。起始过程受细胞周期蛋白质依赖蛋白质激酶2(Cdk2)，Cdc7-dbf4和Cdt1抑制剂geminin的调控(见Bell和Dutta的综述，2002)。在S期细胞的细胞核中，复制叉聚集在一起形成几百个复制｀聚点′或工厂(Cook，1999)。复制工厂(replication factory)似乎与细胞核内的结构骨架相连，但形成连接的分子的性质及其在复制叉活性中的作用仍不清楚。

酵母遗传学已经极大地推进了鉴定参与真细胞核DNA复制的蛋白质和分析细胞周期中调节其活性的基本通路。在酵母至人中，这些蛋白质和通路通常是保守的。在沿不同进化通路分化的多细胞生物体中，仍然没有发现复杂性的其他层次。例如，在脊椎动物中涉及神经元分化的几种蛋白质也调控G1-S期的转变(Ohnuma等人，2001)。这些蛋白质包括cdk抑制子剂p21^{CIP1/Waf1/SDI1}，已经发现它参与生长停止后少突角质细胞的分化(Zezula等人，2001)，和其他细胞类型的终末分化(Parker等人，1995)。

DNA复制的起始可在体外用哺乳动物细胞的分离细胞核和胞质提取物重建(Krude，2000；Krude等人，1997；Laman等人，2001；Stoeber等人，1998)。而且，使用重组Cdk2与细胞周期蛋白质E或A的组合物，DNA合成的复制复合体的组装和活化可单独重建(Coverley等人，2002)。我们已经研究了活化步骤，用细胞周期蛋白质A-cdk2体外催化，显示一种未研究的蛋白质，p21-Cip1相互作用锌指蛋白质(Ciz1)，在起始过程阶段发挥作用。以前使用了一种细胞周期蛋白质E-p21的改良的酵母双杂交筛选鉴定了人Ciz1，生物化学分析证实了其与p21的相互作用(Mitsui等人，1999)。提出Ciz1在转录中的潜在作用，但其未被证明，也没有确定有其他的任何功能。最近，该Ciz1基因使用一种体内肿瘤发生模型从人成神经管细胞瘤来源的cDNA文库中分离出来(Warder和Keherly，2003)。我们的分析第一次显示Ciz1在起始DNA复制中的阳性作用。

当重组细胞周期蛋白质A-cdk2在体外活化DNA合成时，染色质结合蛋白质发生许多变化。本发明涉及下列的发现，即cdc6-相关抗原、p85与DNA复制的起始相关，并被细胞周期蛋白质A-cdk2调控。该蛋白质从小鼠胚胎文库中被克隆出，被鉴定为小鼠Ciz1。

体外分析显示Ciz1蛋白质阳性调节DNA复制的起始，其活性受苏氨酸191/2上cdk的磷酸化调控，与控制起始的cdk-依赖性通路相连。与预测的和体细胞形式相比，胚胎形式的小鼠Ciz1是选择性剪接。人Ciz1也是选择性剪接，在与小鼠Ciz1相同的外显子中有差异。已经发现重组胚胎形式的Ciz1可促进哺乳动物DNA复制的起始，小儿肿瘤可表达‘胚胎样’形式的Ciz1。由于不想坚持一种理论，本发明者提出在发育中不适当次数的Ciz1错误剪接产生了胚胎样形式的Ciz1。这加速了不恰当调控的DNA复制，引起癌细胞系的形成或发展。

近年来已经发展出多种技术，其目的是特异地消除基因和/或基因产物。例如，使用反义核酸分子去结合并阻断或灭活靶mRNA分子是抑制基因产物产生的有效手段。

特异消除基因功能的最近技术是通过在细胞中导入双链RNA，也称为抑制性RNA(RNAi)，引起与包含在该RNAi分子内的序列互补的mRNA的破坏。这种RNAi分子含有RNA的两条互补链(一条正义链和一条反义链)，退火后相互形成一条双链RNA分子。RNAi分子一般来自要被消除的基因的外显子或编码序列。

核酸和蛋白质都具有由其碱基或氨基酸序列决定的线性序列结构，同时也是一种三维结构，这种三维结构部分由其线性序列决定，也由这些分子所处的环境所决定。传统的治疗分子是小分子，例如，肽、多肽、或抗体，他们可结合靶分子，以产生促进或拮抗效应。很明显地是核酸分子也具有关于提供必要的结合特性的制剂的潜在作用，这种制剂具有治疗作用。这些核酸分子一般是指适配子(aptamer)。适配子是小的通常稳定的核酸分子，含有靶分子的结合结构区。

适配子至少含有一个修饰的核苷酸碱基。术语“修饰的核苷酸碱基”包括具有共价修饰的碱基和/或糖类的核苷酸。例如，修饰的核苷酸包括具有糖类的核苷酸，所述糖类共价结合在低分子量有机基团上，而不是3’位置上的羟基基团和5’位置上的磷酸基团。因此修饰的核苷酸也包括2′取代糖类如2′-O-甲基-；2-O-烷基；2-O-烯丙基；2′-S-烷基；2′-S-烯丙基；2′-氟代-；2′-卤代或2；叠氮基-细胞核糖、碳环糖类似物a-异头糖；差向异构体糖如阿拉伯糖。木糖或来苏糖。吡喃糖。呋喃糖和景天庚酮糖。

修饰的核苷酸在本领域中是已知的，包括但不限于下面的实例：烷基化嘌呤和/或嘧啶；酰化嘌呤和/或嘧啶；或其他的杂环。这些类型的嘧啶和嘌呤在本领域中是已知的，包括，假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)；N4，N4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosine)；8-羟基-N6-甲基腺嘌呤；4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿嘧啶；5-羧甲基氨甲基尿嘧啶；二氢尿嘧啶；次黄苷；N6-异戊基-腺嘌呤；1-甲基腺嘌呤；1-甲基假尿嘧啶；1-甲基鸟嘌呤；2，2-二甲基鸟嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鸟嘌呤；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；N6-甲基腺嘌呤；7-甲基鸟嘌呤；5-甲基氨甲基尿嘧啶；5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶；β-D-mannosylqueosine；5-甲氧羰基甲基尿嘧啶；5-甲氧基尿嘧啶；2甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯；假尿嘧啶(psueouracil)；2-硫代胞嘧啶；5-甲基-2硫代尿嘧啶，2-硫代尿嘧啶；4-硫代尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；N-尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯；尿嘧啶5-羟基乙酸；queosine；2-硫代胞嘧啶；5-丙基尿嘧啶；5-丙基胞嘧啶；5-乙基尿嘧啶；5-乙基胞嘧啶；5-丁基尿嘧啶；5-戊基尿嘧啶；5-戊基胞嘧啶；和2，6，-二氨基嘌呤；甲基假尿嘧啶；1-甲基鸟嘌呤；1-甲基胞嘧啶；

适配子可采用常规的磷酸二酯连接的核苷酸，使用本领域中已知的标准的固相或液相合成技术来合成。核苷酸之间的连接可使用其他连接分子。例如，连接基团的分子式为P(O)S，(thioate)；P(S)S，(dithioate)；P(O)NR′2；P(O)R′；P(O)OR6；CO；或CONR′2，其中R是H(或一种盐类)或烷基(1-12C)，R6是通过-O-或-S-与附近的核苷酸连接在一起的烷基(1-9C)。

用来特异消除基因和/或基因产物的其他技术集中在调节蛋白质分子的功能或干扰其活性。通过例如从已有的小分子文库中得到的化学抑制剂，可靶向蛋白质。

针对不同的蛋白质异形体，例如可在如小鼠或大鼠中产生抗体，优选单克隆抗体。抗体，也称为免疫球蛋白质，是对外源分子(抗原)有特异性的蛋白质分子。免疫球蛋白质(Ig)是一类结构上相关的蛋白质，包括两对多肽链，一对轻链(L)(低分子量)(κ或λ)，和一对重链(H)(γ，α，μ，δ和ε)，所有4条链通过二硫键连接在一起。H和L链都具有抗原结合区，其在不同的Ig分子之间是具有高度可变性的。另外，H和L链含有不可变或恒定的区域。

L链包括两个结构区。羧基末端结构区实质上在确定类型的L链之间是相同的，称为“恒定”(C)区。氨基末端在L链之间是不同的，构成抗体的结合位点。由于其具有可变性，因此称为“可变”(V)区。

Ig分子的H链有几种类型，α、μ、σ、α和γ(为几种亚类)。组装的Ig分子包括一个或多个单位的两条相同的H和L链，其名称由其所具有的H链派生而来。因此，有5种Ig同工型：IgA、IgM、IgD、IgE和IgG(根据H链的不同具有4个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。关于抗体结构及其各种功能的详细描述可见，UsingAntibody(抗体应用)：实验室手册，Cold Spring Harbour LaboratoryPress。

嵌合抗体是重组抗体，其中小鼠或大鼠抗体的所有V区与人抗体的C区组合在一起。人源化抗体是重组的杂合抗体，其融合了啮齿类抗体V区的互补决定区和人抗体V区的框架区。也可使用人抗体的C区。互补决定区(CDR)是位于抗体重链和轻链的N-末端结构区内的区域，多数V区的变化受此区限制。这些区域在抗体分子的表面形成一些环。这些环为抗体和抗原之间提供了结合表面。

非人动物的抗体可对外源抗体产生免疫反应，并从循环中清除。当注射入人受试者体内时，嵌合和人源化抗体具有较小的抗原性，因为重组杂合抗体内啮齿类(即外源)抗体的量较少，而人抗体区并不激发免疫反应。这产生较轻微的免疫反应，抗体的清除减少。当使用治疗性抗体治疗人类疾病时，这是很明显需要的。人源化抗体被设计为具有较少的“外源”抗体结构区，因此被认为和嵌合抗体相比免疫原性小。

在蛋白质水平寻靶的其他技术包括使用随机产生的可特异结合蛋白质的肽，以及结合蛋白质或蛋白质变异体，并修饰其功能的任何其他分子。

了解DNA复制过程是癌症治疗领域中最关心的事情。已知癌细胞逐渐对化疗制剂产生抗药性，可逃避免疫系统的监测。对于癌症治疗一直需要鉴定一些靶标以便识别新的制剂。DNA复制过程是癌症治疗中药物干预的主要靶标。需要识别调节DNA复制，并引起癌细胞系形成或发展的基因产物，以开发影响其功能的药物。

发明内容

本发明的一个方面，提供了应用Ciz1核苷酸或多肽序列，或其任何片段或变异体，作为鉴定调节DNA复制药物的靶标。

如在此所使用的术语“片段”或“变异体”是指从Ciz1的全长核苷酸或氨基酸序列衍生或从其剪接变异体衍生的任何核酸或氨基酸序列。在本发明的一个实施方式中，该片段具有足够的长度和/或与全长Ciz1具有足够同源性，以保持Ciz1的DNA复制活性。在另一个实施方式中，使用无活性的Ciz1片段。术语“片段”或“变异体”也涉及本文中的Ciz1RNA转录物和蛋白质异形体(或其的一部分)。

本文中使用的术语“调节”是指在缺少特异制剂的情况下正常观察到的水平之上和之下增加或减少DNA复制(即，与制剂的应用直接或间接有关的DNA复制活性的任何变化)。术语“调节”也包括DNA复制空间或暂时结构的改变。

本发明的另一个方面，提供了一种可鉴别调节DNA复制的制剂的筛选方法，其特征在于所述的筛选方法包括应用Ciz1核苷酸或多肽序列或其片段或变异体。

优选的筛选方法包括检测或测量制剂对核酸分子的作用，该分子选自：

a)含有图14、15或21任何一个中所示核酸序列的核酸分子；

b)可与(a)中的核酸序列杂交，并具有Ciz1活性或其变异体的活性的核酸分子；

c)由于a)和b)中序列的遗传密码和待测候选制剂而具有简并核酸序列的核酸分子；

d)源于Ciz基因座上的基因组序列的核酸分子，或与该基因组序列杂交的核酸分子。

在本发明的一个实施方式中，该核酸分子通过删除、取代或添加核酸序列中至少一个的核酸残基而被修饰。

或者，筛选方法包括以下步骤：

(i)制备含有多肽分子，或其活性片段的制剂，该分子由选自下列的核酸分子编码：

a)含有图14、15或21所示核酸序列的核酸分子；

d)源于Ciz基因座上的基因组序列的核酸分子，或与该基因组序列杂交的核酸分子；和

ii)检测或测量所述制剂对所述多肽活性的作用。

检测DNA复制的测定方法在本领域中是已知的。可在体外或体内测定Ciz1，或其衍生的肽片段中存在的活性和潜在的治疗性制剂对该活性的作用。

Ciz蛋白质活性的体外测定方法包括同步化分离的G1期细胞核，补充了细胞周期蛋白质依赖性激酶的S期提取物或G1期提取物。在这些环境中Ciz1或其衍生肽片段的包含体可激发DNA复制的起始，可被可视化监测(通过记录在体外反应中已经掺入荧光核苷酸的细胞核)或测量放射性核苷酸的掺入。对干扰Ciz1蛋白功能的治疗性制剂的测定包括在这些测定中寻找对DNA复制的抑制。制剂对Ciz1细胞核定位、染色质结合、稳定性、修饰和蛋白质-蛋白质相互作用的作用也可在这些测定中被监测。

体内测定将包含建立细胞和小鼠模型，这些细胞和小鼠模型可过度表达或较少表达Ciz1或衍生片段，引起细胞增殖的变化。转基因动物的制备在本领域中通常是已知的，在普通技术人员的知识范围内。治疗性制剂的测定包括分析细胞周期时间、DNA复制的起始和在存在和缺少药物时的癌症发生率，这些药物通过在RNA水平靶向Ciz1及其变异体而影响Ciz1蛋白活性或干扰Ciz1的产生。

在本发明的一个优选方法中，所述的杂交条件是严格的。

严格的杂交/洗涤条件在本领域中是为人所熟知的。例如，核酸杂合物在60℃用0.1xSSC，0.1％SDS洗涤后是稳定的。在本领域中为人所熟知的是如果核酸序列已知，可计算出最佳的杂交条件。通常杂交条件使用了4-6x SSPE(20x SSPE含有175.3g NaCl，88.2g NaH₂PO₄H₂O和7.4g EDTA，溶解在1升中，pH调整至7.4)；5-10x Denhardts溶液(50x Denhardts溶液含有5g Ficoll(400型，Pharmacia)，5g聚乙烯吡咯烷酮和5g小牛血清白蛋白质；100μg-1.0mg/ml超声波降解的鲑鱼/鲱鱼DNA；0.1-1.0％十二烷基磺酸钠；可选择40-60％去离子化甲酰胺。杂交温度可根据核酸靶序列的GC含量而变化，但通常在42°-65℃之间。

在本发明的一个优选方法中，所述的多肽可通过删除、取代或添加多肽序列中的至少一个氨基酸残基而被修饰。

通过一个或多个以任何组合形式存在的取代、添加、删除、截断修饰的或变异的多肽片段和参照多肽，在氨基酸序列上有所差异。优选的变异体中修饰是通过保守氨基酸取代从参照多肽中变化而来。这些取代作用是性质类似的另一个氨基酸取代指定的氨基酸。下列非限制性列举的氨基酸被认为是保守替换(相似的)：a)丙氨酸，丝氨酸和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷胺酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸，亮氨酸，蛋氨酸和缬氨酸和f)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。优选保留了与其变化来源的参照多肽有相同生物学功能和活性的变异体。或者变异体包括生物学功能改变的变异体，例如可作为拮抗剂的变异体，称为“显性失活”变异体。

另外，非保守取代可赋予所需的生物学活性，见Cain SA、WilliamsDM、Harris V、Monk PN。从全分子随机突变的C5a文库中选择新的配体。Protein Eng.2001 Mar；14(3)：189-93，引为参考文献。

根据本发明功能相当的多肽序列是一种变异体，其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基取代，或一个或多个氨基酸残基包含一个取代基。保守的取代是在芳香族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间一个替换另一个；羟基残基Ser和Thr相互交换；酸性残基Asp和Glu交换；酰胺残基Asn和Gln之间的取代；碱性残基Lys和Arg的交换；芳香族残基Phe和Tyr之间的替换。

另外，本发明公开了与本文公开的核苷酸或多肽序列具有至少50％同源性的核苷酸序列，或其片段和功能相当的多肽。在一个实施方式中，该核苷酸或多肽序列与本文图示的核苷酸和氨基酸序列具有至少75％至85％的同源性，较优选至少90％同源性，更为优选的是至少95％同源性，更加优选至少97％同源性，最优选至少99％的同源性。

在本发明的一个优选方法中，所述的核酸分子包含编码图16或图17中的，也包括那些在图20A和20B中所描述的氨基酸序列的核酸序列，或其任何变异体。在本发明的一个更优选方法中，所述的核酸分子包含编码图16或图17中Ciz1氨基酸序列或其变异体的核酸序列，包括在图20A和20B中所述的那些序列。

在本发明的一个更优选的方法中，所述的多肽分子包含图16或17中的Ciz1氨基酸序列或其变异体，包括在图20A和20B中所述的那些序列。在本发明的一个更优选的方法中，所述的多肽分子包含图16或17中的Ciz1氨基酸序列或其变异体，包括图20A和20B中所述的那些序列。

在本发明的一个更优选的方法中，所述的多肽被细胞，优选哺乳动物细胞或动物表达，所述的筛选方法是以细胞为基础的筛选方法。

优选上述细胞自然表达Ciz1多肽。或者所述细胞被编码Ciz1多肽(或其变异分子，例如癌细胞系中的那些)的核酸分子转染。

根据本发明的另一个方面，提供了一种根据本发明的方法可获得的制剂。

优选所述的制剂是介导DNA复制的Ciz1的拮抗剂。或者所述制剂是介导DNA复制的Ciz1的促进剂。

在本发明的一个更优选的方法中，所述的制剂选自：多肽；肽；适配子；化学物质；抗体；核酸；或多肽或核苷酸探针。

该制剂优选含有的序列具有互补性或具有足够同源性，提供与靶标的特异结合，可用来为了诊断目的检测核酸或蛋白质水平。

或者通过本发明的方法鉴定的制剂是治疗性制剂，可用于疾病的治疗。

在本发明的一个实施方式中，制剂是抗体分子，可与图16、17或20中所示的任何序列结合。

优选所述的抗体是单克隆抗体。

或者所述制剂是反义核酸分子，其可结合并因此阻断或使上述(i)中任何核酸序列编码的mRNA失活。

在另一个实施方式中，所述制剂是RNAi分子，其含有两条互补的RNA链(正义链和反义链)，退火后相互结合形成一条双链RNA分子。优选RNAi分子来自Ciz1基因的外序列或来自另一条重叠基因。

在一个实施方式中，未剪接的mRNA被靶向定位，用RNAi抑制剪接变异体的产生。在另一个实施方式中，剪接的变异mRNA被消除，不影响非变异的mRNA。

在本发明的一个优选方法中，所述的肽是寡肽。优选，所述寡肽至少有10个氨基酸的长度。优选所述寡肽的长度为至少20、30、40、50个氨基酸。

在本发明的一个更优选方法中，所述肽是被修饰的肽。

对于本领域普通技术人员很明显的是，修饰的氨基酸包括但不限于例子：4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、N⁶-乙酰赖氨酸、N⁶-甲基赖氨酸、N⁶，N⁶-二甲基赖氨酸、N⁶，N⁶，N⁶-三甲基赖氨酸、环己基丙氨酸、D-氨基酸、鸟氨酸。其他的修饰作用包括具有C₂、C₃或C₄烷基R基团的氨基酸，选择性地被1，2或3个选自卤素(例如F，Br，I)、羟基或C₁-C₄烷氧基的取代基取代。

或者所述肽被乙酰化和/或酰胺化作用修饰。

在本发明的一个优选方法中，多肽或肽被环化作用修饰。环化作用在本领域中是已知的，(见Scott等人，Chem Biol(2001)，8：801-815；Gellerman等人，J.Peptide Res(2001)，57：277-291；Dutta等人，J.PeptideRes(2000)，8：398-412；Ngoka和Gross J Amer Soc Mass Spec(1999)，10：360-363)。

根据本发明的另一个方面，为例如可抑制Ciz1或其变异体的反义或RNAi分子提供了一种载体作为输送手段，因而使表达靶向蛋白质的细胞可被靶向定位。

在本发明的一个实施方式中，病毒载体被用作输送手段。

优选载体包括含有选自下列核苷酸序列的表达基因盒：

a)如图14、15和21中所示，编码Ciz1氨基酸序列的核酸序列；

b)与(a)的核酸序列杂交的核酸分子；

c)由于a)和b)中序列和与上述任何序列的互补序列的遗传密码，具有简并核酸序列的核酸分子；

d)编码Ciz1mRNA前体(即，基因组序列)的核酸序列，其特征在于所述的表达基因盒转录连接于启动子序列。

优选包括该表达基因盒的载体被改造以适合真细胞核细胞基因的表达。所述的适应性作用(adaptation)一般包括的非限制性实例为，提供可介导细胞/组织特异表达的转录控制序列(启动子序列)。这些启动子序列是细胞/组织特异性，诱导性或结构性的。

启动子元件一般也包括称为TATA盒和RNA聚合酶起始选择序列，其作用是选择转录起始位点。这些序列也可结合多肽，其作用尤其是可以促进RNA聚合酶的转录起始选择作用。

适应性作用也包括提供可选择标记物和自主复制序列，其都可促进所述载体在真细胞核细胞或原细胞核细胞宿主内存在。可自主生存的载体是指游离型载体。可促进编码基因的载体表达的进一步适应性作用包括提供转录终止序列。

这些适应性作用在本领域中是为人所熟知的。通常关于表达载体构建和重组DNA技术已发表了大量的文献。请见，Sambrook等人(1989)分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbour Laboratory，Cold SpringHarbour，NY和本文中的一些文献；Marston，F(1987)DNA克隆技术：应用方法第III卷，IRL出版，Oxford UK；DNA克隆：F M Ausubel等人，现代分子生物学方法，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。

根据本发明，提供了一种可鉴定增生性疾病的诊断方法，包括在其基因组或蛋白质序列中检测Ciz1基因、Ciz1剪接变异体和突变的存在或表达。

所述的诊断方法优选包括下列的一个或多个步骤：

(i)将从待测受试者中分离的样品与可特异结合具有Ciz1活性的多肽或编码具有Ciz1活性的多肽的核酸的制剂接触；和

(ii)检测或测量制剂在所述样品中所述多肽或核酸上的结合；

(iii)使用反转录PCR或实时PCR监测Ciz1同工型的表达并测定表达水平，

(iv)根据该分子构象特性的改变，测定核酸或氨基酸突变的存在。

在一个实施方式中，本发明的诊断方法在体内实施。

在另一个实施方式中，本发明的诊断方法先体外后体内，或在体外实施。

优选的诊断方法提供对样品中Ciz1 RNA或蛋白质变异体的定量检测。

在本发明的一个实施方式中，提供了应用调节Ciz1 RNA或蛋白质或其变异体的制剂作为药物的方法。

优选所述的药物含有本发明的筛选方法鉴定的制剂，结合或联合了药学可接受的载体、赋形剂或稀释液。

所述的药物优选可口服或局部给药或注射给药。在本发明的另一个实施方式中，药物作为气雾剂给药。

在本发明的一个更优选的实施方式中，提供了应用根据本发明的制剂制造用于治疗增生性疾病的药物。所述的增生性疾病优选是癌症。

所述的癌症优选是小儿癌症，选自：成视网膜细胞瘤，成神经细胞瘤，非洲淋巴瘤，成神经管细胞瘤，尤文氏肉瘤家族肿瘤(ESFT)。

在另一个实施方式中，该癌症是癌、腺癌、淋巴瘤或白血病。

在另一个实施方式中，该疾病是肝、肺或皮肤癌或癌转移。

根据本发明的另一个方面，提供了治疗增生性疾病的方法，包括给予动物，优选人，一种根据本发明的方法获得的制剂。

根据本发明的另一个方面，提供了应用根据本发明的制剂制造一种药物，其可减慢细胞的分裂或生长。

本发明也包括在合理化药物设计中应用Ciz1氨基酸序列和蛋白质结构，应用Ciz1核苷酸和其氨基酸序列或变异体筛选化学文库中可与Ciz1特异结合的制剂。

本发明也包括一种试剂盒，其含有通过本发明的方法鉴定的诊断性、预测性或治疗性制剂。

在本发明的另一个实施方式中，一种基于测序芯片的阵列用来检测Ciz1的变化。

具体实施方式

本发明的一个实施方式现在仅通过实施例，并参考以下的图表进行描述：

图1描述了细胞周期蛋白质A-cdk2对晚G1期细胞核的作用。A)在3T全细胞提取物的Western印迹中抗Cdc6抗体VI可检测小鼠Cdc6和第二抗原，其迁移率Mr大约为100kDa(基于Mcm3蛋白质的迁移率，以前估计在接近85kDa处，因此该抗原被命名为p85-为了不引起混淆我们在此仍使用相同的名称)。P85存在于可溶的部分和不溶的细胞核部分中(在体外复制条件下制备)。B)添加了重组细胞周期蛋白质A-cdk2的G1期提取物起始“有复制能力的”晚G1期细胞核中的DNA合成。对照栏显示了仍处于S期(无阴影)的部分细胞核，和那些来自S期细胞的提取物中起始复制的部分细胞核(阴影)。C)15分钟后，在无细胞复制条件下，洗涤细胞核，重新分离染色质部分，通过SDS-Page分离，进行Mcm2和Mcm3的印迹。D)用抗体V1对相同的细胞核进行印迹。在接触诱导起始浓度的细胞周期蛋白质A-cdk2的细胞核中p85抗原更为丰富。抗体V1用来从小鼠胚表达文库中克隆p85基因，后者被鉴定为Ciz1。

图2小鼠Ciz1变异体的对比。预测的全长Ciz1氨基酸序列(′Full′)与小鼠乳腺肿瘤cDNA的克隆(BCO18483)是相同的，而胚胎Ciz1(｀ECiz1′，AJ575057)和黑色素瘤来源的克隆(AK089986)缺少两个不连续的内序列。另外，ECiz1中第一个可获得的蛋氨酸在外显子3(Met84)的中间，将富聚谷氨酰胺区排除在N-末端以外。黑色素瘤来源的AK089986是不完整的，因为它终止在所有小鼠和人的其他克隆C-末端之前的77个密码子。星号表示在D中所示构建物中被定点突变改变的氨基酸。与siRNA靶向的密码子对应的氨基酸有下划线。B)小鼠Ciz1被至少17个外显子编码。编码外显子显示为灰色，另外剪接区是黑色的，未翻译区是白色的。两个可交换的外显子1序列包含在一些Ciz1转录物中(未显示)，但在此所述的两个翻译起始位点上游的另外一个或者翻译起始位点未被发现。C)在ECiz1中的序列特征和推测结构区。显示了预计的细胞核定位序列(NLS)，推计的细胞周期蛋白质依赖性激酶磷酸化位点，C2H2型锌指和与细胞核基质蛋白质matrin3具有同源性的C末端结构区(Nakayasu和Berezney，1991)。ECiz1缺乏的序列位置用三角表示。D)用于无细胞DNA复制实验中的ECiz1和得到的截断和点突变。在A中显示的括号内的数目与全长形式的小鼠Ciz1中的氨基酸位置有关。星号表示被定点突变消除的推测磷酸化位点。

图3显示了Ciz1蛋白和衍生片段在无细胞DNA复制实验中的作用，并举例说明了ECiz1可促进哺乳动物DNA复制的起始A)在S期提取物中孵育的过程中，重组ECiz1激发在“有复制能力的”晚G1期细胞核中DNA复制的起始。直方图显示了在存在或缺少异位ECiz1的情况下，体外(黑色)掺入生物素化核苷酸的细胞核的平均数目，4次独立实验计算标准差。当制备细胞核配方(preparation)时，已经处于S期的细胞核有17％显示是白色的。图像显示了使用或不使用1nMECiz1，细胞核在体外的复制。全部细胞核用二碘化丙锭(红色)复染。B)对重组ECiz1的反应是浓度依赖性的，在nM范围是最灵敏、最适宜的。在本实验和在B-I中显示的所有图中，结果是以起始％来表示，而不是复制％。可从在体外起始的细胞核的数目和“有能力”在体外起始(见方法)的细胞核的数目来计算。C)因为ECiz1 cdk位点突变体T(191/2)A在高浓度下可逃避抑制作用，苏氨酸191/2参与调节Ciz1的DNA复制活性。D)Cdk位点突变体T(293)A可以类似ECiz1的作用曲线激发起始，但浓度较低。E)截断的ECiz1(N末端442)缺少C-末端序列，但可在体外的起始与ECiz1相似。F)在本测定实验中，C末端274没有保留DNA复制活性。G，H，I)在ECiz1蛋白的N-末端三分之二处进行的进一步缺失分析显示当在体外测定时，外显子8的3’的短区是Ciz1发挥功能所必需的。

图4抗Ciz1多克隆抗体的特征和125kDa Ciz1相关条带的鉴定A)考马斯染色的SDS-聚丙烯凝胶显示了纯化的重组ECiz1片段N末端442，使用抗Cdc6抗体V1和抗Ciz1抗体1793和1794对重组N末端442进行western印迹。B)3T3全细胞提取物的Western印迹。在用抗Ciz1抗体1793检测的两条条带中，一条与p85-Ciz1(100kDa)具有相同的迁移率，被抗体V1识别，另一条的表观Mr为125kDa。抗Ciz1抗体1794仅识别Ciz1的125kDa形式(以及大约80kDa的第二抗原)。C)使用抗体V1或抗Ciz1 1793对3T3细胞核提取物的免疫沉淀。两个抗体都可沉淀p85，后者在western印迹中可被相应的抗体识别。P125可被抗体1793沉淀，抗体V1程度小一些，在western印迹中它们均可被1793识别。Mcm3作为对照。

图5内源性Ciz1的免疫荧光分析。Ciz1存在于亚细胞核聚点中，与DNA复制位点重叠A)接触Triton X100之前(未处理)或之后(去垢剂处理)固定于3T3细胞中的内源性Ciz1(红色)，用抗Ciz1抗体1793检测。细胞核用Hoescht33258(蓝色)复染。为了进行比较，用Cdc6特异性单克隆抗体检测出Cdc6(绿色)。B)对于去垢剂处理的细胞核，重组Ciz1的加入可阻断抗体1793的反应性。C)去垢剂拮抗的Ciz1(红色)存在于细胞周期群体中的所有细胞核内，而去垢剂拮抗的PCNA(绿色)仅存在于S期细胞核中。D)去垢剂拮抗的Ciz和PCNA的高放大率共聚焦切片，和显示共定位聚点(黄色)的合并图像。E)在指示的位置处(i和ii)，在D的合并图像上红色和绿色荧光的线性图。F)在D的整个合并图像上绿色聚点与红色相比的交叉相关作图(Rubbi和Milner，2000；van Steensel等人，1996)，和Eii中显示进行thresh-holding荧光后的标记切片(插图)。对于PCNA，在F中插入的红线显示了当Ciz1图像被旋转90°时相关性的消失。标尺为10μM。

图6RNA干扰。Ciz1的缺失可抑制S期A)在4个位点处可靶向Ciz1转录物的siRNA(见图2A)被单独加于周期中的3T3细胞，单次剂量为3nM，以指定的次数监测细胞数目。显示了用siRNA8转染后在16和40小时时细胞群(红色轮廓)或假处理细胞(蓝色轮廓)的图像。B)在接触Ciz1 siRNA(4和8)，或对照GAPDH siRNA后用抗Ciz1 1793(绿色)检测的Ciz1蛋白质。C)在与Ciz1 siRNA(4和8)，或对照GAPDHsiRNA接触24小时后的细胞中Ciz1，GAPDH和β-肌动蛋白转录物的水平。括号中的数字反映了任意单位中的带强度，Ciz1和GAPDH转录物(用β-肌动蛋白标准化)的总体降低表示为百分比。D)用Ciz1 siRNA处理后48小时，将BrdU掺入进DNA(绿色)中的细胞比例在Ciz1缺失的细胞中显著降低。直方图显示4次独立实验的平均结果。E)在用Ciz1siRNA处理的群体中具有去垢剂拮抗性的Mcm3(绿色)的细胞核的数量是增加的。F)在这些条件下，具有去垢剂拈抗性的PCNA(绿色)的细胞核比例也是增加的。所有的细胞核被复染，并以伪彩显示(红色)。

图7Ciz1外显子3/4剪接变异体在小鼠原生殖细胞和胚胎干细胞中表达的RT-PCR分析。在这些细胞类型中，外显子3和/或4是选择性剪接的，但在新生动物心脏中则不是。这些数据与下面的假设是一致的，即全长的Ciz1在新生体细胞组织中是有特别优势的，变异体以更多的频率出现在更早的发育过程和生殖系组织中。

图8小鼠3T3细胞的暂时转染。A.GFP-标记的Ciz1构建物被转染进NIH3T3细胞中或B.在单细胞期被微注射进小鼠受精卵的雄原细胞核中。24小时时，Ciz1和ECiz1定位在细胞核上，形成亚细胞核的斑点图形，而GFP则单独存在于细胞核和胞质中。C.转然后24小时活3T3细胞核的高放大率图像显示了EGFP标记的Ciz1和ECiz1的亚细胞核结构，以及去掉C-末端片段(相当于C末端274)的衍生片段。在缺少C-末端结构区的情况下，转染后24小时GFP-ECiz1分散的位于细胞核内，而GFP-Ciz1则在一起在细胞核内聚集，形成一个或两个大的斑块。D.直至细胞经历有丝分裂，C末端274结构区一直单独位于细胞质内(最可能是由于缺少细胞核定位序列和被动进入细胞核的通道)，但一旦与细胞核结构内部结合，就与染色体凝聚在一起。E.显示了在转染后第一个12小时用BrdU标记的群体中GFP-Ciz1(绿色)，BrdU(红色)和全细胞核(蓝色)的代表性图像。直方图显示了三个单独的标记窗口中与未转染(灰色)细胞的数目相比，掺入BrdU的转染细胞(绿色)的比例。在转染后0-22小时的过程中，当用Ciz1或ECiz1转染时，在BrdU标记的部分中快速周期中细胞表现一致性的增加。使用密集培养获得了相似的结果，其中大多数细胞退出细胞周期，进入静止期。但当转染后22小时，快速周期中细胞与BrDu接触很短的脉冲(20分钟)时，与未转染的对照和单独用GFP转染的细胞相比，在Ciz1和ECiz1转染群体中参与DNA合成的细胞数目是减少的。这表明经过22小时，在表达Ciz1的细胞中DNA合成中止。

图9在转染群体中增殖潜能和细胞形态学的变化。在转染的3T3细胞群中细胞簇增加。A.细胞用GFP标记的Ciz1或ECiz1的N-末端三分之二处(N-末端442)进行转染，并用50μg/ml G418选择下保持。选择3周后，可见细胞聚集体，其中有GFP阳性细胞。

图10儿科癌症中的人Ciz1剪接变异体。在公共数据库中有7个人Ciz1cDNA，但仅有1个来自正常成人组织(B细胞)，它含有所有预测的外显子。其他6个来自胚细胞或儿科癌症。其中的5个选择性剪接，其变化在外显子2、3、6和8中(类似小鼠ECiz1)，也可在外显子4中(类似小鼠ES细胞，原生殖细胞和睾丸)。第6个(AF159025)缺少第一个蛋氨酸，含有单核苷酸多态性，可产生氨基酸取代。所有与预测序列的差异(AB030835)被标记。

图11EST序列分析。在每个图上Ciz1蛋白的示意图被引入作为参考，显示选择性剪接的外显子(黑色)的位置，推测的染色质相互作用结构区(灰色)和预测的锌指(黑色垂直线)。所有EST序列伴随其Genbank登录号，并显示其来源的文库，标在括号中。由于选择性剪接在Ciz1EST中缺少的序列以黄色显示，移码以红色，推测的缺失以灰色显示。产生氨基酸替换的单核苷酸多态性以黑点标示，其中一些发生在共有cdk磷酸化位点中，我们已经发现其对Ciz1活性(蓝点)的调节是很重要的。在癌细胞系MGC102中插入序列的位置用三角指示。

A)来自儿科癌症(paediatric cancer)和成人神经系统癌症的已翻译的EST。

B)来自多种非癌细胞和组织的已翻译的EST。

C)来自白血病、淋巴瘤和正常造血干细胞和淋巴细胞的已翻译的EST。

D)来自癌症的已翻译的EST。

E)来自其他一些癌症的已翻译的EST。

F)在人Ciz1中的选择性剪接区的总结，显示条件性包含序列。

图12在尤文氏肉瘤家族肿瘤细胞系(ESFT)和成神经细胞瘤细胞系中的Ciz1剪接变异体的表达。A.来自6个独立的ESFT细胞系，两个成神经细胞瘤和对照细胞系(HEK293细胞)的整个RNA样品使用4条不同的引物组进行RT-PCR分析。

ESFT细胞系是1)A673，2)RDES，3)SKES1，4)SKNMC，5)TC3，6)TTC466.

成神经细胞瘤细胞系是1)IMR32，2)SKNSH。

B.ESFT和成神经细胞瘤Ciz1外显子3/4/5PCR产物的分析。引物h.3和h4(跨越有潜在可变性的外显子4和6)的产物更详细地进行分析。通过标准的步骤，从琼脂糖凝胶中纯化PCR片段，亚克隆并测序鉴定片段大小变化的来源。7个细胞系的每个细胞系中1和11之间的克隆被测序，结果以表格形式进行总结。来自ESFT细胞系的Ciz1在全部转录物的中31％缺少外显子4，对于一些ESFT细胞系，这个数字接近50％。在这里检测的两个成神经细胞瘤细胞系中更普遍地缺乏DSSSQ。

图13在正常人成纤维细胞(Wi38)和转移性前列腺癌细胞系(PC3和LNCAP)中的Ciz1同工型。A.与非癌细胞系相比，在细胞核部分中两个前列腺癌细胞系含有过量的最大的p125Ciz1蛋白质变异体。B.在DNA复制起始过程中通过蛋白质加工从p125变异体中产生p85(100)模型。

图14显示小鼠mRNA序列的全长。

图15显示人mRNA序列的全长。

图16显示小鼠蛋白质序列的全长。

图17显示人蛋白质序列的全长。

图18显示选择性剪接的人蛋白质序列。在剪接的蛋白质序列中显示的序列是缺失的。

图19显示可被选择性剪接的人mRNA序列。在剪接的蛋白质序列中显示的序列是缺失的。

图20A和B显示通过丢失外显子在人Ciz蛋白质中建立的单一交接序列。交界序列代表了本发明方法鉴定的治疗性制剂靶标的基本位点。

图21A至H显示在人Ciz1mRNA中建立的交接序列。

Ciz1的鉴定针对重组人Cdc6，我们已经开发了一种多克隆抗体(抗体V1)(Coverley等人，2000；Stoeber等人，1998；Williams等人，1998)，以便鉴定和研究一种未知的抗原，其行为与体外DNA复制的起始有关。该抗原的表观Mr为100kDa(称为p85)，很容易在3T3细胞的提取物中被检测到(图1A)。

在无细胞复制实验中使用“有复制能力”的晚G1期细胞核、G1提取物和重组细胞周期蛋白质A-cdk2，DNA合成可被活化。在这些条件下，细胞核将标记的核苷酸插入进新生的DNA中，其方式严格依赖于活性蛋白质激酶的浓度(图1B)。在最佳浓度之上和之下，没有DNA复制的起始发生。但是，可发生与起始作用负相关的其他事件(Coverley等人，2002)。在此我们使用了DNA合成的活化(图1B)，和Mcm2的磷酸化(引起迁移率增加，图1C)，以校正无细胞复制实验中重组细胞周期蛋白质A-cdk2的作用，并将p85的行为与DNA合成的活化联系起来。

在从含有复制起始诱导浓度的细胞周期蛋白质A-cdk2的反应中重新分离的G1细胞核中，与接触更低或更高浓度激酶的细胞核相比，p85抗原更为普遍(图1D)。这表明在一些水平上p85受细胞周期蛋白质A-cdk2的调控，其方式与DNA合成的活化是一致的。在无细胞起始过程中没有其他抗原与此阶段密切相关，因此我们使用抗体V1来克隆小鼠p85基因。

当用于来自11天小鼠胚胎的cDNA表达文库时，抗体V1挑出的两个克隆能够在多轮筛选后仍然存活(见方法)。一个编码小鼠Cdc6，而另一个编码人Ciz1鼠同源物的716个氨基酸(Mitsui等人，1999)。全长人和小鼠Ciz1在氨基酸水平大约具有70％总体同源性，在N和C末端区同源性最大(＞80％)。Ciz1在脊椎动物中是保守的，因为在大鼠和河豚中存在同源物，但在低等真细胞核细胞中没有找到具有很高程度同源性或相似结构区的蛋白质，增加了进化的Ciz1在脊椎动物发育中发挥特殊作用的可能性。

以前关于人Ciz1的出版物(Mitsui等人，1999)证明了其与细胞周期蛋白质p21-CIP1的相互作用，引起了对其作为转录因子，而不是DNA复制因子的可能作用的研究。在本专利申请优先权日后的第二篇发表的文章(Warder和Keherly 2003)指出Ciz1在肿瘤发生中的作用，但没有证明其在DNA复制中的作用，或认识到Ciz1剪接变异体表达的重要性。

多种Ciz1同工型预测的小鼠Ciz1开放可读框和来自小鼠乳腺肿瘤文库(BC018483)的cDNA，含有三个不存在于我们的胚胎克隆(AJ575057)中的区域，此后称为ECiz1(图2A)。ECiz1中的三个可变区似乎是外显子2/3，6和8选择性剪接的结果(图2B)。小鼠黑色素瘤克隆AK089986缺少与ECiz1相同的三个区域中的两个(图2A)，而第三个区域编码N-末端聚谷胺酰胺的延伸，它在人细胞瘤来源的克隆中也是缺失的。来自外显子3/4的第四条序列框在小鼠ES细胞来源的Ciz1转录物和小鼠原生殖细胞中的外显子4中是缺失的(图7)。人Ciz1也可在RNA水平被选择性剪接，产生的转录物排除了与小鼠Ciz1相同的四条序列框的组合(见下)。实际上，小鼠Ciz1 cDNA中所有已知的变化与人有接近的规律，其中一些在氨基酸水平是相同的。这表明不同的Ciz1同工型具有功能显著性。第五个可变区(在小鼠中仍未观察到)在主要来源于癌症的人Ciz1转录物中是选择性剪接的。

数据表明更短形式的Ciz1(缺少选择性剪接的外显子)在发育早期和产生生殖系的细胞谱系中是最普遍的。图7中显示的分析中，仅有来自完全发育成新生心脏的Ciz1显示没有选择性剪接，而所有的胚胎类型细胞均含有选择性剪接形式。

而且，在公共数据库(人或小鼠)中仅有完整Ciz1 cDNA来自非胚胎类型细胞，仅胚胎来源的是选择性剪接的。因此，Ciz1剪接变异体表达似乎优先发生在没有完全分化的细胞类型中。

很显著地，来自儿科癌症的Ciz1 cDNA也是选择性剪接的(见下)。这让我们假设在发育中正常的时刻不能表达合适的Ciz1同工型会引起不当调节Ciz1活性。这将引起没有时间性的增殖和细胞转化。

ECiz1在体外激发DNA的复制在与S期细胞的胞质提取物接触后，晚G1期细胞核可起始DNA的复制，并开始合成新生DNA(Krude等人，1997)。我们使用这种无细胞测定来检验ECiz1，和衍生重组片段对DNA合成的作用(图3)。全长ECiz1蛋白质均可持续增加在体外复制的细胞核的数目，从30％(+/-0.9％)至46％(+/-5.5％)，这表明Ciz1限于在S期提取物中的起始作用(图3A)。以前仅有两种其他类型的蛋白质(细胞周期蛋白质依赖性激酶，Coverley等人，2002；Krude等人，1997；Laman等人，2001，和Cdc6蛋白质，Coverley等人，2002；Stoeber等人，1998)被发现可激发无细胞的起始作用。因此，ECiz1是第一个具有这种特性的蛋白质，还未被认为参与了复制过程。重组ECiz1对无细胞起始作用的正效应说明内源性Ciz1在哺乳动物细胞中DNA复制起一定的阳性作用。

无细胞起始作用的激发是浓度依赖性的，在S期提取物中大约1nMECiz1左右达到峰值活性(图3B)。这就重复了以前用其他重组蛋白质无细胞分析的结果(Coverley等人，2002；Krude等人，1997)，其中在高浓度时，一般起始的激发作用达到峰值，然后回落至未激发的水平。对ECiz1，在高浓度时活性下降的原因仍不清楚。但是，突变研究(见下)表明抑制机制可能是有活性和特异的，而不是因为蛋白质复合体的更高序列组合物中出现的普遍失衡。

ECiz1的下调涉及苏氨酸191/192 体内Ciz1可能是含磷蛋白质，因为它含有大量推测的磷酸化位点，当3T3细胞提取物用λ磷酸酶(未显示)处理时，显示迁移率改变。鼠Ciz1含有两个RXL细胞周期蛋白质结合基序，和5个推测的cdk-磷酸化位点，它们存在于所有已知的变异体中。其中的4个位于含有体外复制活性的ECiz1的N-末端片段中(见下)，1个与外显子6选择性剪接的位点相邻，以排除短DSSSQ序列基序(图2A，C)。如果基序是100％相同的，并在小鼠和人中是选择性剪接的，我们就有理由认为条件性加入可能调节Ciz1活性，鉴定蛋白质的这个区域被认为是有潜在重要性的。我们因此通过遗传手段结合无细胞复制测定，选择集中于cdk位点，其是上游的4个残基，在小鼠和人中也是保守的。以ECiz1开始，191和192位的两个苏氨酸被改变为两个丙氨酸，产生ECiz1T(191/2)A(图2D)。当在体外检测DNA复制活性时，ECiz1T(191/2)A在晚G1细胞核中激发的起始作用可达到与ECiz1相似的程度(图3C)。但不像ECiz1，它在很大范围浓度下可维持对起始作用的激发，可跨越至少3个数量级的幅度。因此，为限制过多ECiz1活性的机制在无细胞的环境中存在并进行运转。在一个单独的构建物中，位点293的苏氨酸也被改变为丙氨酸，产生ECiz1T(293)A(图2D)，但这种改变在体外测定中对ECiz1活性的影响很小(图3D)。

这些结果证明ECiz1活性的下调涉及苏氨酸191/2，可能由此位点磷酸化介导的，细胞周期蛋白质依赖性激酶所引起的。这将Ciz1活性与cdk依赖性通路联系起来，该通路控制所有主要的细胞周期事件，包括DNA复制的起始。

大多数复制复合体蛋白质前体和许多复制叉蛋白质在体内被磷酸化，这通常是通过细胞周期蛋白质依赖性激酶(Bell和Dutta，2002；Fujita，1999)。我们的数据表明p85-Ciz1抗原在细胞核内的积累被细胞周期蛋白质A-cdk2调控(直接或间接)，并显示在苏氨酸191/192上的一个特异共有cdk磷酸化位点参与了Ciz1活性的控制。在无细胞测定中当这个位点被去磷酸化，在很大范围的浓度下Ciz1的活性可维持。因此，正常情况下在此位点的修饰可下调Ciz1的活性。其他保守的cdk磷酸化位点的功能，RXL细胞周期蛋白质结合基序的条件性加入(inclusion)对Ciz1选择性剪接的N-末端部分中的作用仍需要被确定。因此，本文没有发现Ciz1活性和cdk依赖性磷酸化之间简单负相关的关系，这种简单的关系不可能解释整个事件的始末。但到目前为止我们的分析将Ciz1和可控制所有主要的细胞周期转变的cdk依赖性通路联系在一起，因此与我们的主要结论是一致的，即Ciz1参与了DNA复制的起始。

体外复制活性存在于N-术端 Ciz1具有一些C-末端的特征，可将蛋白质锚定在细胞核内。matrin3结构区表明了与细胞核基质之间的相互作用，3个锌指显示了与核酸之间的相互作用。实际上，最近的证据表明人Ciz1可以一种很弱的序列特异方式与DNA结合(Warder和Keherley，2003)。为了确定C-末端结构区对ECiz1复制活性是否很重要，我们将该蛋白质分为两个片段(图2D)。N末端442(含有NLS，两个保守的cdk位点，1个锌指和所有已知的已经观察到可变剪接的位点)可在与ECiz1相同的浓度下激发相似程度的起始作用(图3E)。相反，C-末端部分(C末端274)不含一点复制活性(图3F)。因此，当在体外测定时，matrin3结构区，一个细胞周期蛋白质依赖性激酶磷酸化位点和两个锌指不是ECiz1的DNA复制活性所必需的。但应该注意的是在一定条件下这种分析可反向测定ECiz1的活性，其中定位错误的结果是不可能被检测到的。因此，在体内matrin3结构区和锌指的作用是将Ciz1活性引至细胞核中的特异位点，因而限制了Ciz1活性的范围，这仍然是可能的。

内源件Ciz1 抗体V1可识别Cdc6以及P85-Ciz1(图1A)，因此它不适合用于免疫荧光实验，这种实验的目的是显示内源性Ciz1的亚细胞定位。因此我们将构建两种重组ECiz1片段N末端442的新的兔多克隆抗血清，称为抗Ciz1 1793和1794。如所期望的那样，纯化的N末端442在Western印迹上可被抗Ciz1抗体1793和1794识别，但也可被抗体V1识别(图4A)，这支持了下面的结论，即p85(p100)实际上就是Ciz1。

当用于来自生长的3T3细胞的蛋白质提取物时，抗-Ciz1 1793可识别两个抗原，具有125和100kDa的Mr(图4B)，其相应的部分在配方之间是不同的。100kDa区带与被抗体V1识别的细胞周期蛋白质-A反应性抗原共同迁移(图1和4B)，这表明两个抗体在体内识别相同的蛋白质。我们通过免疫沉淀证实可被抗体V1和1793识别的p100-Ciz1区带是相同的蛋白质(图4C)。抗体V1可沉淀一个100kDa的区带，在western印迹上被1793识别，反之亦然。而且，在相同的实验中，1793和抗体V1可沉淀一个125kDa的抗原，抗体V1的程度弱一些，该抗原在western印迹上可被1793识别。我们的观察结合在一起显示100kDa区带实际上是Ciz1(以前认为是p85)，并表明Ciz1蛋白质至少以两种形式存在于细胞周期中细胞中。

除了上述免疫沉淀的证据，其他的几个观察得出的结论是p125也是Ciz1的一种形式。首先，我们的抗Ciz1抗体(1793和1794)共同拥有此带。在免疫荧光实验中两个抗体产生相同的细胞核染色图形，在用Ciz1siRNA处理的细胞中这种图形被破坏(见下)。第二，p100和p125的相应部分在配方之间是不同的，因此这是蛋白酶剪切的结果。第三，我们的结果与Mitsui等人(1999)的结果惊人地相似，其抗人Ciz1单克隆抗体在HEK293细胞中检测到的两个抗原具有的表观Mr为120和95kDa。他们认为人Ciz1蛋白的120kDa形式被加工产生95kDa形式，我们的结果与这种观点是一致的。

在小鼠和人类细胞中被抗体1793识别的125kDa区带在来自未转化的人细胞(Wi38-见后)和小鼠细胞(NIH3T3-未显示)的物质的高分辨率电泳过程中分解成三个Ciz1相关区带。这可能是Ciz1蛋白翻译后修饰或Ciz1转录物选择性剪接的结果。

Ciz1的亚细胞分布抗Ciz1 1793用来显示3T3细胞和HeLa细胞(未显示)中Ciz1蛋白(p85和p125)的亚细胞分布(图5A)。在两种类型细胞中，1793可与细胞核特异抗原反应，可通过加入重组N末端442片段而被阻断(图5B)。不像Cdc6，为了对比而被显示(图5A)，在这个细胞周期群体中的所有3T3细胞中Ciz1可被清晰地检测到。因此，在整个细胞分裂间期Ciz1都存在于细胞核中，尽管数量上有很小的变化，或本方法不能检测到同工型。在去垢剂处理后，在所有细胞核中全细胞核Ciz1染色减弱，这表明Ciz1存在于细胞核中，可作为一种可溶的部分，也可与不溶的细胞核结构结合。

当可溶性蛋白质被洗涤掉时，不溶的被固定的抗原在高放大率下成为点状的亚细胞散斑图(图5C，D)。Ciz1斑点显示了相似的大小范围，并分布为复制“聚点”或“场所”，在此位点DNA的合成在S期发生。为了明确是否Ciz1与复制场所的位点是一致的，我们比较了Ciz斑点与PCNA的位置，后者是S期细胞中的一种复制复合体成分(图5C)。在共聚焦切片中，PCNA聚点的丰度较Ciz1聚点低，但它们几乎所有都与Ciz1是相吻合的(图5D，E，F)。这对于中等大小范围的聚点是特别惊人的。在合并的图像中，PCNA和Ciz1聚点位置之间的重叠产生了黄色的点，而剩余的不与PCNA相吻合的Ciz1聚点是红色的。绿色(单独PCNA)聚点实际上是没有的，这表明Ciz1存在于所有形成DNA复制场所的位点上。

Ciz1也存在于不含PCNA的位点上(图5D)，不像PCNA，在整个细胞分裂间期Ciz1聚点均存在(图5A)。这些观察的一个解释是Ciz1标记了细胞核中的一些位置，在这些位置上含PCNA的复制场所可在S期中形成的，但不是所有这些位点在相同的时间都被使用。仍然要被确定的是在S期Ciz1聚点是否以不同的次数形成DNA复制的活性位点，或其他细胞核的活性也发生在Ciz1结合的位点上。实际上，在这个期，也可能，形成具有不同的活性的Ciz1的100kDa形式和125kDa变异体，它们驻留在具有不同功能的细胞核位点上。

Ciz1对于细胞的增殖是非常重要的至今我们已经阐明了在无细胞测定中p85(p100)-Ciz1的行为与DNA复制的起始有关，重组的Ciz1激发起始的频率，以及Ciz1驻留在与DNA复制场所(machinery)相同的细胞核位点上。但是，这些数据并没有显示Ciz1在增殖细胞中具有很重要的功能。为了验证此问题，我们使用RNA干扰(RNAi)来选择性降低NIH3T3细胞中的Ciz1转录水平。选择了Ciz1内的4个靶序列(见图2A)，在体外产生短的干扰(si)RNA分子。当用于细胞时，48小时后，所有4个Ciz1 siRNA都可限制生长(图6A)，并引起Ciz1蛋白水平的显著降低(图6B)。Ciz1缺失对增殖的作用在转染后23和40小时之间逐渐明显，表明没有Ciz1RNA的第一个细胞周期相对未受影响。在40小时后，对照和Ciz1siRNA处理的细胞差异明显，在Ciz1缺失的群体中没有进一步的增殖。为了证实Ciz1缺失的特异性，在增殖被显著抑制之前24小时监测转录水平(图6C)。在这个点上，在Ciz1转录物的水平降低至GAPDH siRNA处理的对照细胞的42％。这些实验显示Ciz1是细胞增殖所必需的，与DNA复制的基本功能是一致的。

为进一步验证，在siRNA处理后48小时用BrdU脉冲标记细胞以确定参与DNA合成的细胞部分(图6D)。当Ciz1水平降低时，BrdU标记的部分也减少，表明在这些条件下DNA合成是被抑制的。而且，在Ciz1缺失群体中掺入BrdU(大约群体的15％)的细胞被标记的强度较低。因此，在一些Ciz1siRNA处理的细胞中，S期被延缓而不是被完全抑制，其原因可能是不完全的缺失。

DNA的合成被Ciz1siRNA抑制可能是细胞核功能普遍破坏的继发结果。因此，我们仔细观察了一定范围的其他复制蛋白，其水平是以细胞周期依赖性方式被调节的，以了解Ciz1缺失的细胞是否在特殊的点随机停滞或增长。

在真细胞核细胞DNA复制的起始过程中，Mem复合体蛋白质在晚G1期以Cdc6依赖性的方式在复制起始点进行装配。一些时间后，DNA聚合酶及其辅助因子(包括PCNA)逐渐与染色质结合，启始点被活化。这与细胞核输出和大多数Cdc6的蛋白质水解有关，随着DNA合成的延续，Mcm复合体逐渐从染色质上被置换出来(Bell和Dutta，2002)。为了鉴定Ciz1的作用点，我们使用了免疫荧光来监测Mcm3和PCNA。在Ciz1缺失的细胞中(图6E，F)，两种蛋白质在细胞核内都是可检测到的，结合于去垢剂拮抗的细胞核结构上。因此，这些因子不可能直接与Ciz1结合，或为其组装依赖于Ciz1。事实上，在4个独立的实验中，含有去垢剂拮抗染色质结合的Mcm3的细胞平均数目实际上从31％(+/-6％)增加至51％(+/-5％)(图6E)。Mcm3的增加表明Ciz1依赖性步骤发生在复制复合体前体组装后(但在S期完成之前)。在相同的细胞群中，PCNA阳性部分也增加，从32％(+/-5％)至49％(+/-6％)(图6F)，将Ciz作用点的范围缩小至PCNA组装后。因此，Ciz1最可能的作用是在起始过程的后期加速DNA的复制，而不是在S期整个过程中抑制，使Mcm3和PCNA保留在原地。

综合在一起，关于Ciz1的基本功能，我们的无细胞和细胞为基础的研究绘制了一幅相吻合的作用图。它们都表明Ciz1是DNA复制场所的一个新成分，并显示在哺乳动物细胞周期中Ciz1具有阳性作用，其作用可促进DNA复制的起始。

我们系列研究中的三个研究表明在复制复合体前体形成后，Ciz1在起始过程晚期是必需的。首先，p85(p100)-Ciz1抗原在与可活化DNA合成浓度的细胞周期蛋白质A-cdk2接触的细胞核中积累，其意义是Ciz1在此步骤过程中发挥作用，而不是在更早一些的复制复合体组装步骤中发挥作用(Coverley等人，2002)。第二，对晚G1期细胞核的功能学研究显示重组ECiz1可增加体外掺入标记核苷酸的细胞核的数量。因此Ciz1在将准备开始DNA合成的细胞核转变为正在活跃地合成DNA的细胞核的步骤中必须是有活性的。第三，RNA干扰研究针对Mcm复合体形成后和PCNA被组装至DNA上之后，但在这些蛋白质被置换之前的Ciz1依赖性步骤。这些不同系列的研究得到了惊人相似的结论，即Ciz1的作用点将其置于起始作用的后期。

抗-Ciz1 siRNA的治疗策略我们的分析显示Ciz1对细胞增殖是非常重要的，靶向Ciz1是一种可行的限制增殖的策略。我们在许多癌症中观察到的Ciz1的选择性剪接形式(见下)意味着Ciz1可能以一种选择性的方式被靶向，以限制一个群体中一个细胞亚类的增殖。

举例来说，在小细胞肺癌细胞中，当缺少C-末端序列GTTGAGGAGGAACTCTGCAAGCAG时，可将siRNA靶向至在Ciz1转录物中建立的交接序列，或通过使用缺少相应VEEELCKQ序列的Ciz1蛋白来选择特异的化学抑制剂，从而达到这种目的。

因此，本发明也提供了当不存在选择性剪接序列时，在Ciz1转录物和蛋白质中建立的交接序列作为诊断标记物，预后指标或治疗性标靶的应用。

胚胎形式Ciz1定位在细胞核上跨越潜在可变的外显子的RT-PCR分析表明3T3细胞主要表达全长的Ciz1，因此我们对内源性Ciz1的免疫定位工作(图5)就没有必要反映ECiz1的行为，后者缺少几个序列框，因此可能缺少一些用来定位蛋白质的信息。为了直接比较Eciz1和全长Ciz1的定位，被扩增的GFP标记构建物被转染进3T3细胞中(图8A)，并被微注射进小鼠的原细胞核中(图8B)。在所有的实例中，标记的Ciz1和ECiz1都完全在细胞核内，而单独表达GFP的对照构建物则存在于细胞核和胞质内。GFP-Ciz1和GFP-ECiz1在活细胞内都是可见到的，以亚细胞核聚点的形式，类似于通过免疫荧光在固定细胞中所见到的复制聚点。因此，ECiz1缺少的三个序列框似乎对于Ciz1的细胞核定位并不起作用。

在转染后三天的时间中，在GFP-Ciz1和GFP-ECiz1转染的细胞中没有观察到细胞分裂。这些数据表明功能性Ciz1的过度表达对细胞周期有抑制作用(在具有完整调控通路的细胞中)。

合并(coalescence) 当Ciz1 C-末端的三分之一已经被去除的GFP-标记构建物被转染进3T3细胞时，观察到ECiz1和全长Ciz1之间的差异(图8C)。48小时时，FL Ciz1 N-末端(相当于442)已经被合并进大的细胞核内斑点中，其在ECiz1 N-term442转染的群体中仅在第3天后以后逐渐明显。在此时间之前，ECiz1 N-末端442的定位是具有细胞核特异性但分散的图形。因此在Ciz1和ECiz1之间合并能力的差异是可定量的，并受三个选择性剪接外显子(2/3，6或8)其中之一的影响。

像全长Ciz1和ECiz1转染的细胞，用去除C末端三分之一的构建物转染的细胞在三天监测期内没有发现繁殖发生。

C-末端结构区将Ciz1锚定在细胞核结构上如上所述，当C-末端也存在时，Ciz1和ECiz1 N-末端之间的差异被掩盖了(图8A)。而且，仅C-末端片段就可将GFP标记引入染色质中，形成与Ciz1或ECiz1的点状(焦点)不一样的不规则图形，但在有丝分裂过程中仍然附着在染色体上(图8D)。这表明C-末端结构区参与了Ciz1在细胞核结构骨架上的固定。值得注意的是，暂时用C-末端片段转染的细胞持续分裂，引起绿色荧光逐渐变淡。

异位Ciz1促进过早进入S期我们观察了在转染后第一天发生的事件。通过在不同间期用BrdU标记，将转染细胞(绿色)的S期部分与未转染细胞的S期部分进行比较。在包括0-22小时(图8E)0-12小时和0-7小时(未显示)的长标记期限中，与未转染细胞相比，始终有更多的Ciz1和ECiz1转染的细胞参与至DNA合成中。这表明Ciz1和ECiz1对G1-S期的转变有阳性作用，可不按照规定时间促进进入S期。用细胞在转染前以高密度接种的3T3细胞群中获得相似的结果。这样做的目的是尽量减少未转染群体中处于正常细胞周期中S期部分的部分。在这些条件下，转染和未转染群体之间的差异被最大化，很明显地证明了异位Ciz1对DNA复制起始的作用。

相反，当在转染后22小时(图8E)，或10小时或12小时(未显示)时给予短脉冲用BrdU标记的细胞时，在Ciz1和ECiz1转染群体中标记的部分一直在减少。这表明被异位Ciz1或ECiz1诱导的S期是异常的，DNA合成缓慢或终止，在短时间接触BrdU的过程中不足以标记细胞。

因此，异位Ciz1和ECiz1对培养细胞的S期有两种作用。它们可促进DNA的复制，但这种作用却引起了DNA合成的缓慢或终止。

增殖潜能变化的克隆我们也在3周的时间内监测了转染的3T3细胞群体。在用GFP-N末端442或非选择性剪接的相当物转染，在G418选择下生存的细胞中，观察到几百个含有大聚点的细胞(图9A)。这些聚簇含有很大数量的GFP表达细胞，证明了ECiz1 N-末端部分(在此存在复制活性)的过度表达是非致死性的，并表明与未转染细胞相比，过度表达可引起增殖表现型发生改变，包括丧失了接触抑制，不能形成单细胞层。这种Ciz1依赖性变化的行为可引起肿瘤形成。以前从小鼠黑色素瘤中分离了缺少推测的染色质相互作用结构区的类似截断形式的小鼠Ciz1(图2)。

人Ciz1和癌症

公共数据库中的Ciz1 cDNA 如上所述人Ciz1在RNA水平被选择性的剪接，以产生缺少与小鼠胚胎Ciz1相同的外显子中的三个转录物。在公共数据库中已经记录7个人Ciz1 cDNA(图10)，由Mitsui等人(1999)、Warder和Keherly(2003)以及大规模基因组分析项目(NIH-MGC项目，NEDO人cDNA测序项目)提供。仅有1个来自正常的成人组织，它含有所有预测的外显子(AB030835)。其他的来自胚胎细胞(AK027287)，或特别地来自4种不同类型的儿科癌症(成神经管细胞瘤，AF159025，AF0234161，成视网膜细胞瘤，AK023978，成神经细胞瘤，BC004119和非洲淋巴瘤，BC021163)。胚胎形式和癌症来源的形式缺少来自与我们的小鼠胚胎克隆相同的三个区，和与外显子4对应的第4个区的序列框。因此，有限的数据表明选择性剪接形式更主要存在于发育早期。这种相关性以前在科学文献中并没有被注意。在儿科癌症中选择性剪接的Ciz1的存在增加了下面的可能性，即Ciz1错误剪接可能与不合适的细胞增殖有关。

例如，一种可变的外显子编码一个短的保守DSSSQ序列基序，它在小鼠ECiz1和人成神经管细胞瘤中是缺失的。它直接与共有cdk磷酸化位点相邻接，该位点我们已经发现参与了ECiz1功能的调节。DSSSQ序列的条件性加入可能使Ciz1成为蛋白质激酶的ATM/ATR家族调控的目标，可在SQ序列上对蛋白质进行磷酸化，因此限制了对DNA损伤应答引起的Ciz1起始功能。

已表达的序列标记的分析儿科癌症中选择性剪接Ciz1的存在促进了对Ciz1 EST的详细分析。有567个已表达的序列标记(EST)包括在NCBI unigene集合Hs.23476(人Ciz1)中。它们来自很大的正常范围和患病组织和细胞系。序列已经被翻译，并根据预测的全长人Ciz1氨基酸序列被制图。产生氨基酸取代、缺失、移码和超前翻译终结的序列变化已经被记录。

选择性剪接的Ciz1变异体可见于这个EST数据集中，并被记录在此。我们以前报道在人和小鼠Ciz1中选择性剪接的4个序列框(图2)在EST序列中，以及以前未被检测到的缺少来源于序列VEEELCKQ的外显子14的变异体中被观察到。所有这些变异体序列框被合适的剪接位点周而复始地结合。在一个癌来源的数据库中鉴定了第6个可变序列框，是通过加入GCCACCCACACCACGAAGAGATGTGTTTGCCCACGTTCCAGTGCAGGGGTGGAGCACAGCCCGGCTTGTTACAGATAT而产生的。

根据来源的细胞类型对EST进行分组，根据在成人，儿童或胚胎来源的肿瘤细胞之中发生的情况进行基本的划分。为了比较，来自胚胎或成体来源的正常组织的EST包括在内。EST-来源的Ciz1蛋白图谱显示在图11A-E，选择性剪接的外显子总结在图11F中。

人Ciz1N-末端中的三个序列框在成神经管细胞瘤和成神经细胞瘤的转录物中是缺失的(图11A)，并偶尔在其他癌症的Ciz1转录物中缺失。我们已经在第三种癌症，尤因氏肉瘤(见下)中发现了类似的选择性剪接。儿科癌症相关的选择性剪接序列来自外显子2/3(至少两种形式)，外显子4和外显子6。

已经注意到在来自正常细胞(胚胎或成体神经来源)和多种癌症的转录物中有外显子8变异体，其中缺少一个或多个拷贝的富Q-简并重复区。此区中的选择性剪接可产生具有异常活性的Ciz1，因此外显子8变异体的表达或点突变的出现影响此区内剪接，可用作癌症的诊断或预后标志物。外显子8中选择性剪接的简并重复区在下面详述，并概括在图11F中。

在人Ciz1蛋白的C-末端一半，两个序列框被可变性地剪接。其中之一在来源于5个肺癌和肺类癌数据库中的三个，和三个其他的癌数据库的转录物中是缺失的(但很少在来自其他类型细胞的转录物)。

第二个变异体序列框是由于不正常的加入了来自表皮样癌数据库的转录物中的额外序列而产生的(MGC102)。

当这些片段被排除或加入时，在Ciz1蛋白和Ciz1转录物中形成的这些序列和交接序列是在很大范围的各种癌症中选择性抑制细胞增殖的潜在靶标。其他的非变异序列是非选择性抑制细胞增殖的潜在靶标。

除了剪接变异，其他一些非典型的Ciz1转录被发现优先发生在一些癌症中。在横纹肌肉瘤中，Ciz1被超前终止，产生的预计蛋白质缺少C-末端细胞核结合结构区。这将引起不正常的DNA复制，可能是这种类型癌症的治疗性靶标或标志物。

几种转录物含有的点突变可在推测的细胞周期蛋白质依赖性激酶(cdk)磷酸化位点中产生氨基酸取代。在宫颈癌文库MGC12中，这样的情况发生两次。我们已经显示两个cdk磷酸化位点参与了Ciz1活性的限制(图3C和D)，暗示了这些突变在癌细胞增殖放松管制(deregulation)中的作用。其中之一与上面提到的癌来源的突变体是相同的(图11E)。在Ciz1中具有点突变的癌来源转录物也可被RNA干扰所靶向，或具有作为诊断或预后指标的价值。

在儿科癌症中研究Ciz1变异体的表达

在6个尤文氏肉瘤家族肿瘤细胞系(ESFT)和两个成神经细胞瘤细胞系中，使用RTPCR研究Ciz1变异体的表达，使用的引物组跨越已知的Ciz1可变性的三个区(图12A)。这个分析显示与成神经细胞瘤细胞相比，与未转化细胞相比，Ciz1变异体表达的模式在ESFT细胞中是不同的，但很显然在来自相同肿瘤的一组细胞系中是非常相似的。因此，Ciz1变异体的表达对于这些癌症具有预后或诊断的潜在作用。来自相同类型肿瘤的一组细胞系内的小变化可能在预后方面具有价值。

通过亚克隆和测序扩增转录物，我们发现所有6个被检测的ESFT系表达Ciz1的一种外显子4递减形式。因为Ciz1对细胞增殖是很重要的(见下)，这为ESFT细胞的选择性抑制提供了一个可能的路线。检测的来自两个成神经细胞瘤细胞系的转录物很少缺乏外显子4，但经常缺少外显子6编码的序列DSSSQ基序(图12B)。

这个实验性分析证实了儿科癌症表达几种形式的Ciz1，可变化的加入外显子4、6和可能的外显子2/3。

在ESFT、成神经细胞瘤和对照中检测到两种形式的含有外显子8的序列和一种形式的含有VEEELCKQ编码序列的序列，表明这些区对这些儿科癌症中Ciz1的放松管制不起作用。

在所有实例中，与对照(Wi38，HEK293，NIH3T3细胞和原代人成骨细胞)相比，Ciz1RT-PCR产物大多数富集于使用癌细胞系的RNA样品进行的反应中。这与在肿瘤中Ciz1变异体的表达增加使一致的。

在前列腺癌细胞系中分析Ciz1蛋白质的表达

正常未转化的人肺成纤维细胞(和小鼠NIH3T3细胞)表达两种主要形式的Ciz1，在western印迹中通过抗Ciz1多克隆抗体1793可被检测到(图13A)。较大的(大约125kDa)区带可分解为三个不同的区带，以相同的比例存在于Wi38细胞中，但在前列腺癌细胞系PC3和LNCAP中的比例非常不平均(ESFT细胞系的数据未显示)。我们认为这些蛋白质同工型是通过表达可变剪接的外显子而产生的。两种肿瘤细胞系也较Wi38细胞含有更多的Ciz1抗原，与这些癌细胞系中Ciz1的过度表达是一致的。

我们的结果综合在一起(实验和基因组数据的生物信息学分析)支持下面的结论，即Ciz1在很大范围的人类癌症中是失调的。我们已经表明Ciz1蛋白在DNA复制过程中具有阳性作用，因此突变体Ciz1可引起细胞转化，而不是转化的结果。如果Ciz1的放松管制是此过程中的一个普遍步骤，则它就成为开发治疗性药物的一个非常吸引人的靶标。

我们也将这些相关的具体变化与具体的癌症联系在一起，使其成为一种真正的可能，即Ciz1可用作诊断或预后标记。

它们包括：

·在儿科癌症中的该蛋白质N-末端部分(体外含有复制活性)的选择性剪接。

·在已知参与限制Ciz1复制活性的细胞周期蛋白质依赖性激酶磷酸化位点中的点突变。

·在前列腺癌细胞系中Ciz1-p125形式的非典型表达和细胞核结合特性，可能是由于在外显子8或其他外显子中简并重复区的失调性剪接引起的。

·小细胞肺癌和其他癌症中Ciz1的C-末端(可能参与细胞核内Ciz1蛋白的定位)不连续基序(VEEELCKQ)的条件性加入。

·与Wi38正常胚胎肺成纤维细胞、人成骨细胞RNA和小鼠NIH3T3成纤维细胞相比，至今在所有被测的癌症来源细胞系中，Ciz1蛋白和RNA的水平增加(通过Western印迹和RT-PCR检测)。

在图14至21中显示的序列可用来开发治疗性、诊断性或预后性试剂。

材料和方法

克隆根据推荐的方法(Clonetech)，用来自11天龄小鼠胚胎的一个λtriplEx 5′-延伸、全长富集cDNA表达文库(Clonetech ML5015t)感染大肠杆菌XI1 blue。将菌斑转移至在10mM IPTG(Sigma)预浸的0.45微米的硝化纤维素滤膜上。亲和性纯化的抗体V1在PBS中稀释为1/1000，10％脱脂奶粉，0.4％Tween20用于大约3×106菌斑上，之前在缺少抗体的情况下封闭30分钟。两小时后，用相同的缓冲液洗涤滤膜三次，反应斑用辣根过氧化物酶(Sigma)交联的抗兔二抗和强化化学发光法(ECL，Amersham)根据标准的步骤进行显影。43个独立的斑块被挑出，但仅2株噬菌体在进一步的3轮筛选中存活下来。它们转化进BM25.8中被转变为pTriplEx，并进行测序。一个编码小鼠Cdc6(克隆P)和另一个编码一个未知的与人Ciz1同源的小鼠蛋白质(克隆L)。我们称此为胚胎Ciz1(ECiz1)，提交给EMBL，登记号为AJ575057。

细菌表达基于pGEX的细菌表达构建物(Amersham)用来为体外分析产生ECiz1蛋白质。通过将一个来自克隆L的2.3kb SmaI-XbaI(钝末端)片段插入进pGEX-6P-3的SmaI位点中产生pGEX-ECiz1。通过将1.35kb XmaI-XhoI片段插入进XmaI-XhoI消化的pGEX-6P-3中产生pGEX-N末端442，通过将0.95kb XhoI片段插入进XhoI消化的pGEX-6P-3产生pGEX-C末端274。通过定点突变(StratageneQuikchange)使用引物AACCCCCTCTTCCGCCGCCCCCAATCGCAAGA和TCTTGCGATTGGGGGCGGCGGAAGAGGGGGTT，从pGEX-ECiz1产生pGEX-T(191/2)A。使用引物AAGCAGACACAGGCCCCGGATCGGCTGCCT和AGGCAGCCGATCCGGGGCCTGTGTCTGCTT从pGEX-ECiz1产生pGEX-T(293)A。所有克隆的完整性和可读框通过序列证实。

在BL21-pLysS(Stratagene)中产生重组Ciz1、Ciz1片段和点突变作为谷胱甘肽S-转移酶标记蛋白质。它可通过与谷胱甘肽琼脂糖4B(Amersham)的结合从超声破碎和去除杂质的细菌溶解产物中纯化。使用精确蛋白质酶(由制造商推荐，Amersham)从GST标记裂解，重组蛋白质被洗脱进入缓冲液(50mM Tris-HC pH7.0，150mM NaCl，1mMDTT)中。这样产生了在0.2和2.0mg/ml之间浓度的蛋白质配方。为了进行复制测定，在100mM Hepes pH7.8，1mM DTT，50％甘油中制备系列稀释液，这样将不超过1ml蛋白质溶液加入至10ml复制检测液中，得到了所显示的浓度。与以前的观察是一致的(Mitsui等人，1999；Warder和Keherly，2003)，重组Ciz1和衍生片段N-末端442通过SDS-PAGE进行迁移，具有异常的高分子量。如以前所述，在细菌中产生细胞周期蛋白质A-cdk2(Coverley等人，2002)。

抗Ciz1抗体针对细菌表达人Cdc6的对应于氨基酸145-360的的内部片段产生兔多克隆抗体V1(Coverley等人，2000；Stoeber等人，1998；Williams等人，1998)，通过标准的步骤进行亲和纯化(Harlow和Lane，1988)。这种抗体可与内源性p100-Ciz1强烈反应，也与ECiz1 N末端442片段反应。N末端442与Cdc6氨基酸145-360的比对表明共享的抗原决定簇位于小鼠Ciz1的294-298或304-312位。重组N末端442用来产生两个Ciz1特异性多克隆抗血清，称为1793和1794(Abeam)。1793已经被常规用于本文所述的实验中。其特异性的验证可通过交互免疫沉淀和使用抗体V的western印迹分析，加入N末端442(25μg/ml抗体缓冲液，10mg/ml BSA，0.02％SDS，0.1％Triton X100PBS液)，可阻断与内源性抗原决定簇的反应性，siRNA介导消除Ciz1可特异性减少1793细胞核染色。

免疫沉淀非同步化生长的3T3细胞在PBS中洗涤，在添加了无EDTA的蛋白质酶抑制剂混合物(cocktail)(Roche)的提取缓冲液(20mMHepes pH7.8，5mM醋酸钾，0.5mM氯化镁)中漂洗，刮除收集复制提取物。用0.1％Triton X 100溶解细胞，用0.3M NaCl的提取缓冲液提取去垢剂拮抗的沉淀部分。每100μl提取物使用5μl1793或2μl抗体V，4℃孵育1小时。抗原抗体复合物用100μl蛋白质G-琼脂糖(Sigma)提取，珠子用50mM Tris pH7.8，1mM EDTA，0.1％NP40，150mM NaCl洗涤5次。在缓冲液(100mM DTT，2％SDS，60mM TrispH6.8，0.001％溴酚兰)中将复合体煮沸，用6.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。

免疫荧光细胞生长在盖玻片上，并固定在4％多聚甲醛中，需要或不需要简单地预先用0.05％Triton X100PBS处理。内源性Ciz1用根据标准步骤在抗体缓冲液中稀释1/2000的1793血清进行检测。Mcm3用单克隆抗体sc9850(1/1000)检测，Cdc6用单克隆抗体sc9964(1/100)检测，PCNA用单克隆抗体PC10(1/100，所有均来自Santa CruzBiotechnology)检测。双重染色的荧光共聚焦图像的共定位分析根据文献描述进行(Rubbi和Milner，2000；van Steensel等人，1996)。

小鼠3T3细胞如以前所述通过解除静息期而被同步化(Coverley等人，2002)。从解除后17小时(称为“晚G1”期)收集的细胞制备的细胞核用于本文所述的所有无细胞复制实验。这就产生了含有不同比例的S期细胞核，有复制能力的晚G1期细胞核和无反应性的早G1/G0期细胞核的群体。在15小时时制备易感的G1中期3T3提取物(它们一般含有大约5％的S期细胞)。在此描述的无细胞复制实验系列需要大量的标准化提取物，因此使用HeLa细胞，因为它们在大批量的情况下很容易被同步化。从两次连续胸腺嘧啶细胞核苷诱导的S期中断2小时而解除的细胞中制备S期HeLa提取物，其描述见Krude等人，1997。

无细胞DNA复制如文献所述进行DNA复制测定(Coverley等人，2002；Krude等人，1997)。简言之，10μl G1中期或S期提取物(补充了能量再生系统，核苷酸和生物素化dUTP)，和5×10⁴晚G1期细胞核在37℃孵育60分钟。反应中补充了含有细胞周期蛋白质A-cdk2的杆状病毒裂解产物(图B和C)，其中0.1μl裂解产物与1nM纯化的激酶具有相同的特异活性(Coverley等人，2002)。所有重组蛋白质在100mM Hepes pH7.8，1mM DTT，50％甘油中被连续稀释，这样不超过1μl加入至10μl复制测定液中，得到指定的浓度。用50μl 0.5％ TritonX100中止反应，添加50μl 8％多聚甲醛固定5分钟。转移至盖玻片上后，用链霉抗生物素-FITC(Amersham)对细胞核染色，用Toto-3-碘化物(Molecular Probes)复染。在1000X放大倍数下观察定量被标记细胞核的比例，所有具有荧光聚点或高密度均匀标记的细胞核被记为阳性。通过共聚焦显微镜在600X放大倍数下得到体外复制细胞核和二碘化丙锭复染样品的图像。为分析细胞核蛋白质，在与起始条件接触15分钟后，用冷PBS稀释反应液两倍，并轻柔离心而重新分离细胞核。

数据分析和说明在起始测定中应用前，检测同步化G1期细胞核的每个配方，这样就已经确定了处于S期的细胞核的比例(′％S′)。为了达到此目的，在不能诱导DNA合成起始(来自静息期解除后15小时收获的G1中期细胞)，但可有效地支持DNA合成从其体内起始的起始点延伸的提取物中孵育细胞核。在体外的起始测定过程中细胞核的延伸部分有效地掺入了标记的核苷酸，但不提供过多的信息。一般这个部分被预先确定并从原始数据中减去。20％或更少处于S期的同步化群体用来进行起始测定实验。

当3T3细胞从静息期通过本文所使用的方法解除后，不超过总群体的70％进入S期(Coverley等人，2002)。但在体外观察到的通常通过与ECiz1孵育获得的最高复制频率接近50％。对于在此使用的3T3细胞核的G1群，17％处于S期(S％)，在体外任何测定中复制的最大数目为51％(复制％)。因此，34％的群体有能力在体外起始复制(C％)。因此对于图3B-F中的每个数据点，起始％＝(复制％-S％)/C％×100。

RNA干扰使用体外转录的siRNA(Ambion Silencer kit)在增殖的NIH3T3细胞靶向内源性Ciz1，直接针对小鼠Ciz1的4个区。用来产生siRNA的寡核苷酸序列是

siRNA4为AAGCACAGTCACAGGAGCAGACCTGT CTC和AATCTGCTCCTGTGACTGTGCCCTGTCTC，siRNA 8为AATCTGTCACAAGTTCTACGACCTGTCTC 和AATCGTAGAACTTGTGACAGACCTGTCTC，siRNA 9为AATCGCAAGG ATTCTTCTTCTCCTGTCTC和AAAGAAGAAGAATCCTTGCGACCTGTCTC ，siRNA 11为AATCTGCAGCAGTTCTTTCCCCCTGTCTC和AAGGGAAAGAACTGCTGCAGACCTGTCTC。根据低级的二级结构预测和所有已知Ciz1形式(序列4，8，11)表达一致的外显子内的位置选择分布于整个Ciz1转录物中的靶序列，除了已知可被选择性剪接的一个以外(siRNA9)。阴性对照是未处理，假处理(转染试剂，但没有siRNA)和用GAPDH siRNA(Ambion)处理的细胞。Cy3标记siRNAs(Ambion)用来估计转染效率，发现超过95％。RNA干扰实验在24孔板中进行，以每孔2×10⁴细胞，500μl培养基(DMEM含有glutamax添加4％FCS)开始。在使用oligofectamine试剂(Invitrogen)涂板传递后12小时加入siRNA。如果在此没有另外说明，成对使用siRNA(在培养基中以2nM总浓度)，分两次给药，首次用药后24小时以新鲜培养基传递第二次。在首次用药后48小时，通过细胞计数、S期标记和免疫染色评价结果。在给予单次剂量siRNA 24小时处理的细胞中分离的RNA上，在按比例放大5倍的反应中进行Northern印迹。使用Trizol试剂(Invitrogen)制备RNA，样品通过1％琼脂糖进行电泳，转移至Hybond N+尼龙膜(Amersham)上，遵照生产厂商的说明书在50℃与cDNA探针使用NorthernMax试剂盒试剂(Ambion)按顺序杂交。在每次杂交作用之间，使用0.5％SDS溶液在90℃将膜剥下，缓慢冷却至室温。探针为用随机引物DNA标记系统(Gibco BRL)标记[³²P]-dCTP，以下列的顺序应用：i.A来自ECiz1的1.35kb Xmal-Xhol片段。ii.人β-肌动蛋白cDNA(Clontech)和iii.小鼠GAPDH cDNA(RNWAYlaboratories)。膜用2X SSC 0.2％ SDS洗涤两次，每次30-60分钟，然后在0.2X SSC，0.2％SDS中洗涤1次，30分钟，根据所使用的探针，温度为55-65℃。使用Amersham Biosciences Typhoon 9410可变模式成像仪和Image Quant TL软件(v2002)对杂交信号进行定量。区带强度以任意单位表示(括号内)，Ciz1和GAPDH的结果用β-肌动蛋白的结果标准化，并表示为a％。

S期标记通过向培养基中补充20μM溴脱氧尿苷(BrdU，Sigma)20分钟，监测体内经历DNA合成的细胞核部分。在用FITC交联的抗BrdU单克隆抗体(Alexis Biochemicals)根据生产厂商的说明书进行酸处理后对掺入的BrdU进行显影。细胞核用Hoescht 33258复染，并在高放大率(1000X)下评分。

绿荧光蛋白质标记的Ciz1

从UK HGMP Resource Centre(MGC克隆27988)获得全长的小鼠Ciz1cDNA，序列被完全确认。来自这个克隆的一个2.8kb Smal-Xbal(钝端)全长Ciz1片段和来自pTriplEx-克隆L的一个2.3kb Smal-Xbal(钝端)ECiz1片段在框内与强化绿荧光蛋白质(EGFP)被连接进pEGFP-C3的Smal位点(Clontech)中。没有插入物的pEGFP-C3用作对照。使用TransIT-293(Mirus)将构建物转染进NIH3T3细胞中，遵循生产厂商的说明书或微注射进单细胞期小鼠受精卵的雄原细胞核中。用全长EGFP-Ciz1或EGFP-ECiz1转染的正在生长的3T3细胞通过活细胞荧光显微镜分析至转染后三天。通过在细胞培养基中加入核苷酸类似物BrdU，持续如图表图例中所标注的不同时间周期，在转染后第一个24小时监测DNA的合成。如上所述，任何经历DNA合成，同时与BrdU接触的细胞用抗BrdU单克隆抗体染色，产生红色的细胞核。

Ciz1转染的细胞也培养在标准培养基(DMEM Glutamax加10％胎牛血清)中，用50μg/ml G418进行选择，直至1月，产生形态学变化的细胞群。

EST序列分析

制图成为NCBI unigene cluster Hs.23476(人Ciz1)的个体表达序列标记(EST)使用Genejockey翻译，预测的氨基酸序列与预测的全长Ciz1进行序列比较，目的是在癌细胞中鉴定复发性改变。为了排除反映低质量DNA序列的错误，如发生在长测序轮次(long sequencing rub)的结尾，仅距离连续序列末端超过8个氨基酸以上位置的改变才被包含进本分析中。如果后面跟随连续序列，仅包含读码中被后面的第二次变化恢复的移码，和后面跟随终止密码子的移码。因此大多数测序错误被本分析排除。但期望保留许多点突变(包括移码和中止)，导致测序过程中导入错误。因此，本分析的目的是未揭示的一些趋势，重点放在出现不止一次时的点突变。

在567个制图成为Ciz1unigene cluster的序列中，我们已经分析了大多数序列(所有的儿科癌症、前列腺和肺癌、白血病和淋巴瘤，以及很大范围的未患病组织)。一些没有被制图，因为它们是极短的读码或在翻译过程中产生非常短的氨基酸序列，对于一些小量的序列，我们检测与Ciz1编码序列没有同源性。小量的EST被分析排除，因为在所有三个框架中有多个产生同源性延伸的移码，没有表明有体内使用的可读框。它们均来自癌来源物质，通常是腺癌。

Ciz1同工型表达的RT-PCR分析使用trizol试剂，根据推荐的步骤分离RNA，DNAse处理，并使用随机六聚物和superscriptII进行反转录，然后用Ciz1特异引物扩增：-

h/m5 CAGTCCCCACCACAGGCC

h/m2 GGCTTCCTCAGACCCCTCTG

H/m3 ACACAGACCTCTCCAGAGCACTTAG

H/m4 ATGGTGACCTTCAGGGAGC

H4 TCCTTGGCGA TGTCCTCTGG GCAGG

H3 TCCCTCCTCA ACGGCTCCAT GCTGC

H6 CGTGGGGGCGAC TTGAGCGTTG AGO

H1 GATGCCAGGGGT ATGGGGCGCC GGG

H2 TCCGAGCCCT TCCACTCCTC TCTGG

在癌细胞系中分析Ciz1蛋白质异形体

细胞生长在含有10％FCS的DMEM中至亚融合，在添加无EDTA蛋白质酶抑制剂混合物(Roche)的冷hepes缓冲盐水中漂洗，然后刮除收获，并补充0.1％Triton X100。去垢剂不溶的物质(包括细胞核)通过轻柔的离心沉淀，产生上清液(SN)和沉淀部分(P)。这些物质在还原性SDA-PAGE样品缓冲液中被煮沸，蛋白质通过8％SDS-PAGE通过电泳分离。转移至硝酸纤维素上后，用抗Ciz1抗体1793检测Ciz1同工型。在本分析中使用的所有方法在其他地方已经被详细成文发表。

参考文献

Bell，S.P.和Dutta，A.(2002).真细胞核细胞中的DNA复制。AnnuRev Biochem 71，333-74.

Cook，P.R.(1999).复制和转录的结构。Science 284，1790-5.

Corpet，F.(1998).与分级群聚的多序列比对。Nucl.Acids Res.16，10881-10890.

Coverley，D.，Laman，H.和Laskey，R.A.(2002).细胞周期蛋白质E和A在DNA复制复合体组装和活化中的不同作用。Nat Cell Biol 4，523-8.

Coverley，D.，Pelizon，C.，Trewick，S.和Laskey，R.A.(2000).染色质结合的Cdc6持续存在于人细胞的S和G2期，而可溶的Cdc6在细胞周期蛋白质A-cdk2依赖过程中被破坏。J.Cell Sci.113，1929-1938.

Fujita，M.(1999).哺乳动物细胞中DNA复制起始蛋白质的细胞周期调节。Front Biosci 4，D816-23.

Hanahan，D.和Weinberg，R.A.(2000).癌症的特点。Cell 100，57-70.

Harlow，E.和Lane，D.(1988).抗体：实验室手册。New York：ColdSpring Harbour Laboratory Press.

Jones，D.L.，Alani，R.M.和Munger，K.(1997).通过消除p21Cipl-介导的对cdk2的抑制作用，人乳头瘤病毒E7癌蛋白质使人角质细胞的细胞分化和增殖分开。Genes Dev.11，2101-2111.

Krude，T.(2000).使用来自停滞在起始感受状态的细胞的细胞核，在体外起始人DNA的复制。J.Biol.Chem.275，13699-13707.

Krude，T.，Jackman，M.，Pines，J.和Laskey，R.A.(1997).在人无细胞系统中细胞周期蛋白质/Cdk-依赖性起始的DNA的复制。Cell 88，109-119.

Laman，H.，Coverley，D.，Krude，T.K.，Laskey，R.A.和Jones，N.(2001).病毒细胞周期蛋白质/cdk6复合体启动细胞核DNA的复制。Mol.Cell.Biol.2，624-635.

Mercatante，D.R.和Kole，R.(2002).通过反义寡核苷酸控制选择性剪接，作为一种潜在的化疗方式：对基因表达的作用。BiochimBiophys Acta 1587，126-32.

Mitsui，K.，Matsumoto，A.，Ohtsuka，S.，Ohtsubo，M.和Yoshimura，A.(1999).一种新的p21cipl/wafl-相互作用锌指蛋白质Ciz1的克隆和定性。Biochem.Biophys.Res.Com.264，457-464.

Nakayasu，H.和Berezncy，R.(1991).细胞核matrin：主要细胞核基质蛋白质的鉴定。Proc Natl Acad Sci U SA 88，10312-6.

Ohnuma，S.，Philpott，A.和Harris，W.A.(2001).神经系统中的细胞周期和细胞命运。Curr Opin Neurobiol 11，66-73.

Parker，S.B.，Eichele，G.，Zhang，P.，Rawls，A.，Sands，A.T.，Bradley，A.，Olson，E.N.，Harper，J.W.和Elledge，S.J.(1995).肌肉和其他终末分化细胞中p21Cipl的p53-不依赖性表达。Science 267，1024-7.

Rubbi，C.P.和Milner，J.(2000).未活化的p53可与转录位点共同定位在细胞核质和核仁小斑内。Oncogene 19，85-96.

Sherr，C.J.和Roberts，J.M.(1999).CDK抑制剂：G1期进展的阳性和阴性调节物。Genes Dev.13，1501-1512.

Stoeber，K.，Mills，A.D.，Kubota，Y.，Krude，T.，Romanowski，P.，Marheineke，K.，Laskey，R.A.和Williams，G.H.(1998).在哺乳动物无细胞系统中Cdc6蛋白质可引起过早进入S期。EMBO J.17，7219-7229.

van Steensel，B.，van Binnendijk，E.P.，Hornsby，C.D.，van der Voort，H.T.，Krozowski，Z.S.，de Kloet，E.R.和van Driel，R.(1996).糖皮质激素和盐皮质激素受体部分定位在大鼠海马神经元细胞核的不同区室中。J Cell Sci 109(Pt4)，787-92.

Warder，D.E.和Keherly，M.J.(2003).Ciz1，Cipl相互作用锌指蛋白质1结合共有DNA序列ARYSR(0-2)YYAC.J Biomed Sci 10，406-17.

Williams，G.H.，Romanowski，P.，Morris，L.，Madine，M.，Mills，A.D.，Stoeber，K.，Marr，J.，Laskey，R.A.和Coleman，N.(1998).使用针对调节DNA复制的蛋白质的抗体提高宫颈涂片的测定。Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，14932-14937.

Zezula，J.，Casaccia-Bonnefil，P.，Ezhevsky，S.A.，Osterhout，D.J.，Levine，J.M.，Dowdy，S.F.，Chao，M.V.和Koff，A.(2001).p21cip1是少突胶质细胞分化所必需的，与细胞周期的退出无关。EMBO Rep 2，27-34.

Claims

1.Cizl核苷酸或多肽序列，或其任何片段或变异体作为鉴定可调节DNA复制的制剂的靶标的应用。

2.鉴定可调节DNA复制的制剂的筛选方法，其特征在于所述的筛选方法包括Cizl核苷酸或多肽序列，或其任何片段或变异体的应用。

3.根据权利要求2中所述的筛选方法，其特征在于所述的方法包括检测或测量制剂对选自下列的核酸分子的作用：

a)含有图14、15或21任何一个中所示的核酸序列的核酸分子；

b)可与(a)中的核酸序列杂交的核酸分子，其具有Cizl活性或其变异体的活性；

d)源于Ciz基因座上的基因组序列的核酸分子，或与所述基因组序列杂交的核酸分子。

4.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于所述的核酸分子通过缺失、取代或添加所述核酸序列中的至少一个核酸残基来修饰。

5.根据权利要求2中所述的筛选方法，其特征在于所述的方法包括一个或多个以下的步骤：

(i)制备含有多肽分子或其活性片段的配方，该配方由选自下列的核酸分子编码：

a)含有图14、15或21中任何一项所示的核酸序列的核酸分子；

b)可与(a)中的核酸序列杂交，其具有Cizl活性或其变异体的活性的核酸分子；

d)源于Ciz基因座上的基因组序列的核酸分子，或与所述基因组序列杂交的核酸分子；和

ii)检测或测量所述制剂对所述多肽活性的作用。

6.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于所述的多肽通过缺失、取代或添加所述多肽序列中的至少一个氨基酸残基来修饰。

7.根据权利要求3至6中任何一项中所述的方法，其特征在于所述的筛选方法是基于细胞的筛选方法。

8.根据权利要求7中所述的方法，其特征在于所述的细胞天然表达Cizl多肽。

9.根据权利要求7中所述的方法，其特征在于所述的细胞用编码Cizl，或其片段或变异体的核酸分子转染。

10.通过权利要求1至9中任何一项所述的方法鉴定的制剂。

11.根据权利要求10中所述的制剂，其特征在于所述的制剂是介导DNA复制的Cizl的拮抗剂。

12.根据权利要求10中所述的制剂，其特征在于所述的制剂是介导DNA复制的Cizl的促进剂。

13.根据权利要求10至12中任何一项所述的制剂，其特征在于所述的制剂选自：多肽或核酸探针；多肽；肽；适配子；化学物质；抗体；核酸。

13.根据权利要求12中所述的制剂，其特征在于所述的制剂是抗体分子，其可与图16、17或20中所示的任何一条序列结合。

14.根据权利要求12中所述的制剂，其特征在于所述的制剂是反义核酸分子或RNAi，其可结合并因此阻断或使Cizl或其任何变异体的mRNA序列失活。

15.根据权利要求14中所述的制剂，其特征在于所述的制剂可与图14、15或21或权利要求3的(i)b-d部分中所示序列的任何部分结合。

16.作为传递手段，将反义或RNAi分子传递至细胞的载体。

17.根据权利要求16中所述的载体，其特征在于所述的载体包括含有选自下列的核苷酸序列的表达基因盒：

a)如图14、15和21中所示的编码Cizl氨基酸序列的核酸序列；

b)与(a)的核酸序列杂交的核酸分子；

c)由于a)和b)中的序列和与上述任何序列互补的序列的遗传密码，具有简并核酸序列的核酸分子；

d)编码Cizl mRNA前体(即，所述的基因组序列)的核酸序列。

18.根据权利要求17中所述的载体，其特征在于所述的表达基因盒与启动子序列转录性连接。

19.鉴定增生性疾病的诊断方法，其特征在于包括在所述基因组或其蛋白质序列中检测Cizl基因、Cizl剪接变异体和突变的存在或表达。

20.根据权利要求19中所述的诊断方法，其特征在于所述的方法包括一个或多个以下的步骤：

(i)将从待测受试者中分离的样品与可特异结合具有Cizl活性的多肽或编码具有Cizl活性的多肽的核酸分子的制剂接触；和

(ii)检测或测量该制剂在所述样品中的所述多肽或核酸上的结合；

(iii)使用反转录PCR或实时PCR监测Cizl和Cizl同工型的表达并测定表达水平，

(iv)根据所述分子的构象特性改变，测定核酸或氨基酸突变的存在。

21.权利要求1至9中任何一项中所述的方法鉴定的制剂和制药学可接受的载体、赋形剂或稀释液成为药物的应用。

22.权利要求1至9中任何一项中所述的方法鉴定的药物制造可用于增生性疾病治疗中的药物的应用。

23.根据权利要求22中所述的应用，其特征在于所述的增生性疾病是癌症。

24.根据权利要求23中所述的应用，其特征在于所述的癌症是儿科癌症，选自成视网膜细胞瘤、成神经细胞瘤、非洲淋巴瘤、成神经管细胞瘤、尤文氏肉瘤家族肿瘤(ESFT)。

25.根据权利要求23中所述的应用，其特征在于所述的癌症是癌、腺癌、淋巴瘤或白血病。

26.根据权利要求22中所述的应用，其特征在于所述的疾病是肝、肺或皮肤癌或转移癌。

27.治疗增生性疾病的一种方法，其特征在于包括给予动物根据权利要求1至9中任何一项所述的方法鉴定的制剂。

28.权利要求1至9中任何一项所述的方法鉴定的制剂制造可延缓细胞分裂或生长的药物的应用。

29.一种试剂盒，其特征在于含有权利要求1至9中任何一项所述的方法鉴定的诊断性、预后性或治疗性制剂。